FR 2681609 A1 19930326 FR 9111726 A 19910924 La présente invention est relative à des lignées de cellules endothéliales cérébrales immortalisées, à leur procédé de préparation et à leurs applications en tant que modèle d'étude de la physiopathologie cérébrale et plus particulièrement en tant que modèle cellulaire de la barrière hémato-encéphalique. I1 est difficile, à l'heure actuelle, de disposer de systèmes permettant l'analyse des cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique. En dépit des travaux effectués dans le domaine de la culture des cellules endothéliales cérébrales, l'étude de ces cellules est encore difficile, en raison notamment de la durée de vie limitée de ces cellules en culture (de l'ordre de douze passages) conduisant, de plus, à des changements phénotypiques considérables concomitamment au vieillissement cellulaire (DURIEU-TRAUTMANN et al., J. Neurochem., 1991). Les Inventeurs se sont, en conséquence, donné pour but de pourvoir à un modèle d'étude des cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique, ne pré- sentant pas les inconvénients des cultures de ces cellules et permettant l'étude des processus neuro- et immuno- chimiques impliqués dans le contrôle de l'activité de la barrière hémato-encéphalique. La présente invention a pour objet des lignées de cellules endothéliales cérébrales de mammifère, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par transfection de cellules endothéliales cérébrales par un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire, éventuellement associé à au moins un gène marqueur et en ce que les lignées ainsi transfectées sont immortalisées et présentent le phénotype non transformé de cellules endothéliales cérébrales différenciées. De telles lignées cellulaires présentent, de manière surprenante, au moins l'une des propriétés suivantes des cellules endothéliales cérébrales - expression des marqueurs endothéliaux, - sécrétion de produits spécifiques de 1 ' endothélium (endothéline, facteur vasorelaxant par exemple), - activité y-GT, - expression de récepteurs de neurotransmetteurs tels que les récepteurs B adrénergiques, et - existence de jonctions serrées. Conformément à l'invention, ledit gène marqueur est avantageusement un gène codant pour la résistance à un antibiotique. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite lignée, elle est obtenue par transfection de cellules endothéliales de capillaires cérébraux bovins par le plasmide pSV3 néo contenant le gène néo de la résistance à la néomycine et un fragment de l'oncogène T de SV40. Le plasmide pSV3 néo est plus particulièrement décrit dans l'article au nom de Southern et Berg, (J. Mol. Appl. Genet., 1982, 1, 327-341). Cette lignée cellulaire a été dénommée SV-BEC par les Inventeurs. Conformément à l'invention, ladite lignée a été déposée sous le n I-1143 en date du 19 septembre 1991 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite lignée, elle est obtenue par transfection de cellules endothéliales de capillaires cérébraux de rat par un plasmide contenant la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine. Cette lignée cellulaire a été dénommée RBE-4 par les Inventeurs. Conformément à l'invention, ladite lignée a été déposée sous le n I-1142 en date du 19 septembre 1991 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'institut Pasteur. Ledit fragment oncogène viral ou cellulaire et/ou le gène marqueur sont sous le contrôle soit d'un promoteur homologue, soit d'un promoteur hétérologue, aptes à permettre l'expression dudit fragment immortalisant. De manière inattendue, lesdites lignées sont immortelles, présentent un phénotype non transformé de cellules endothéliales cérébrales différenciées, possèdent une activité de prolifération illimitée et présentent certaines des propriétés des cellules endothéliales cérébrales de la barrière hémato-encéphalique, permettant notamment leur utilisation comme modèle cellulaire in vitro de la barrière hémato-encéphalique. Parmi les propriétés que ces lignées endothéliales immortalisées ont conservé, on peut citer - l'expression d'un antigène apparenté au facteur VIII, - l'expression de l'enzyme de conversion de l'angiotensine, - une activité t-glutamyl transférase, - la capacité de sécréter de l'endothéline-l, - la présence de jonctions serrées. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une lignée cellulaire conforme à l'invention, caractérisé en ce que on cultive des cellules endothéliales cérébrales appropriées dans un milieu de culture convenable, supplémenté en sérum et en facteur de croissance, on les transfecte entre le 2ème et le 6ème passage avec un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire et éventuellement au moins un gène marqueur, notamment un gène codant pour la résistance à un antibiotique et on sélectionne les cellules transfectées sur un milieu de sélection adapté audit gène marqueur, si nécessaire. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit fragment nucléique comprend un gène codant pour la résistance à la néomycine et un fragment d'un oncogène viral, tels qu'un fragment de l'oncogène T de SV40 et un fragment contenant la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 ou d'un oncogène cellulaire. La présente invention a également pour objet un modèle d'étude et d'identification des systèmes biochimiques et cellulaire de la barrière hémato-encéphalique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une lignée cellulaire selon l'invention. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : Préparation d'une lignée cellulaire conforme à l'invention : cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux bovins (lignée SV-BEC). Des cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux bovins sont isolées à partir du cortex cérébral traité à la collagénase (DURIEU-TRAUTMANN et al., J. Neurochem., 1991 56, 3, 775-781) ; ces cellules ne sont pas contaminées par des cellules vasculaires de muscle lisse ou des péricytes. Elles sont mises en culture dans des boîtes recouvertes de gélatine à 0,2 % (p/v) contenant un milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's Medium) supplémenté en sérum bovin fétal à 10 % (v/v), en glutamine 2 mM et en FGFb à 1 ng/ml et du glucose à 1 g/l. Elles sont soumises à un passage hebdomadaire réalisé par resuspension dans de la trypsine-EDTA [0,05 %-0,02 % (p/v)] à 1 à 10 dilutions ; le milieu est changé tous les 3 jours. La technique de coprécipitation au phosphate de calcium est utilisée pour la transfection desdites cellules, au 5ème passage, avec le plasmide pSV3 néo (10 Rg), contenant un fragment de l'oncogène SV40 et le gène de résistance néo au médicament dénommé G418 (WHITLEY et al., Mol. Cell. Endocrinol., 1987, 52, 279284). Après sélection dans un milieu contenant 800 Rg/ml de G418, les cellules présentes sont clonées par dilution limite. On obtient ainsi le clone SV-BEC. EXEMPLE 2 : Caractéristiques de la lignée SV-BEC. La lignée cellulaire obtenue à l'exemple 1 possède un certain nombre des caractéristiques des cellules endothéliales cérébrales. A. Phénotvne endothélial différencié a) Besoins en FGFb et en gélatine des cellules SV-BEC immortalisées Lorsque les cellules sont ensemencées à faible densité (5.103 cellules/cm2) dans des boîtes de culture de tissus et cultivées sur un milieu supplémenté en sérum, [DMEM supplémenté en sérum bovin fétal (10 %) et glutamine (2 mM)], les cellules endothéliales cérébrales bovines (CECB) prolifèrent à faible taux, tandis que les SV-BEC arrêtent de proliférer après 3-4 jours en culture. Les figures 1A et 1B, qui comportent en abscisse le nombre de jours et en ordonnées le nombre de cellules/cm2 (x 10-), illustrent l'effet du FGFb sur la prolifération des cellules SV-BEC (figure 1A) et des cellules CECB (figure 1B). L'addition de FGFb (1 ng/ml) (figure 1A, courbe -O- et figure 1B, courbe -À-), améliore de manière importante le taux de croissance des deux types cellulaires. La confluence est atteinte après 5 jours, après addition de FGFb chaque jour. La densité cellulaire maximale obtenue avec les cellules SV-BEC, dans ces conditions, est seulement de 65 à 70 % de la densité obtenue avec les cellules CECB. Les taux de croissance des deux types cellulaires sont similaires, avec un temps de doublement de la population d'environ 12 heures, pendant la phase logarithmique. Les figures 2A et 2B, qui comportent en abscisses les concentrations en FGFb et en ordonnées le nombre de cellules/cm2 (x 10-3) illustrent l'effet de quantités croissantes de FGFb sur les cellules SV-BEC (figure 2A) et sur les cellules CECB (figure 2B) en pré- sence ou en l'absence de gélatine. La concentration de FGFb nécessaire pour une prolifération cellulaire optimale, est de 0,25 ng/ml pour les cellules SV-BEC (figure 2A : boîtes de culture recouvertes de gélatine : courbe ; boîtes sans gélatine : courbe O) et de 0,5 ng/ml pour les cellules CECB (figure 2B : boîtes de culture recou vertes de gélatine : courbe À ; boîtes sans gélatine courbe O). Dans l'essai illustré aux figures 2A et 2B, le FGFb est ajouté au jour 0 et au jour 3. Les réponses prolifératives des deux types cellulaires sont significativement améliorées lorsque les cellules sont ensemencées sur des boîtes de culture recouvertes de gélatine. A confluence, les cellules SV-BEC forment une monocouche de cellules, inhibées par contact. b) Immunochimie Par analyse immunocytochimique, il apparaît que les cellules SV-BEC expriment un antigène apparenté au facteur VIII ainsi que l'enzyme de conversion de l'angiotensine, deux marqueurs spécifiques des cellules endothéliales. De plus, ces cellules sont colorées par l'agglutinine Griffonia simpl i ci fol i a (Sigma) fluorescente, qui est également un marqueur spécifique des cellules endothéliales cérébrales. Pour ces trois tests, les cellules ont été cultivées sur des lamelles de couverture recouvertes de gélatine. Elles sont fixées avec un mélange méthanol : éthanol (1:1) à 22 C pendant 20 min, ces cellules sont d'abord incubées avec des anticorps dirigés contre l'antigène apparenté au facteur VIII ou l'enzyme de conversion de l'angiotensine, puis avec des anticorps biotynilés et finalement elles sont colorées à la streptavidine fluorescente. Ces résultats sont observés à l'aide d'un microscope standard (Nikon) équipé avec une illumination en épifluorescence. L'agglutinine Griffonia simplicifolia, marquée à la fluorescéine est utilisée au 1/400 dans un tampon PBS. Toutes les incubations sont de 60 minutes à température ambiante. Les cellules SV-BEC sont donc de vraies cellules endothéliales différenciées, comme le montrent la présence d'antigène apparenté au facteur VIII (figure 3B), d'enzyme de conversion de l'angiotensine (figure 3A) et l'immunocoloration avec l'agglutinine Griffonia simplicifolia (figure 3C). c) Sécrétion de substances vasoactives Les cellules SV-BEC sont également testées pour la synthèse et la sécrétion de substances vasoactives, en comparaison avec les cellules CECB. En utili sant un radioimmunoessai, on détecte une immunoréactivité apparentée à celle de l'endothéline-l dans un milieu conditionné (figure 4). Les courbes de dilution générées par ces milieux conditionnés sont parallèles à la courbe standard obtenue avec l'endothéline-l (ET-1). De plus, la sécrétion observée est linéaire en fonction du temps et atteint un plateau au bout de 24 heures. Le protocole du RIA est le suivant un antisérum de lapin spécifique de l'endothéline (dilution finale de 1/300) est incubé dans du DMEM supplémenté en sérum bovin fétal (10 %), en pré- sence de différentes concentrations d'endothéline non marquée synthétique ou de milieu conditionné, pendant 2 heures à 37 C (volume final : 80 F1). De 1' [125I]ET-l (10 000 cpm dans 40 F1) est alors ajoutée et l'incubation est de 16 heures à 4 C. L'[125I]ET-l libre et liée sont séparées par addition de Protéine A-Sépharose&commat;. Après 1 heure à température ambiante, les tubes sont centrifugés, les culots lavés avec un tampon et la radioactivité liée est comptée. La figure 4 illustre les résultats d'un tel essai et comporte en abscisse la concentration en endothéline-l (log fmol/tube) et en ordonnées le rapport lié/libre (%). Les milieux conditionnés obtenus à partir de SV-BEC (courbe -m-) et à partir de CEBC (courbe ---) sont comparées avec la courbe standard (courbe -O-). B. Absence de tumoripénicité Les cellules SV-BEC ne sont pas transformées en effet, comme précisé ci-dessus, elles présentent une inhibition de contact et leur prolifération est dépendante du FGFb exogène. C. Expression des maraudeurs de la barrière hémato-encé Dhalicrue : - Le protocole utilisé est le suivant Les cellules sont rincées avec un tampon PBS froid, pH 7,4, puis fixées dans du glutaraldéhyde 2 % (v/v) dans un tampon cacodylate 0,1 M, pendant 60 min à 4'C. Après un rinçage rapide dans le même tampon, les cellules sont à nouveau fixées, soit dans du ferro-osmium [Os04 1%,K4Fe(CN)60,8 %] dans un tampon cacodylate pendant 30 min, soit dans de l'OsO4 aqueux 1 % et de l'acétate d'uranyle 1 % dans de l'éthanol 50 %. Ces cellules sont ensuite déshydratées dans de l'éthanol puis retirées des boîtes de culture à l'aide d'un traitement court avec du butyl-2-3-époxy-propyléther. Les monocouches sont soigneusement récupérées et transférées sur de petites capsules de polyéthylène et incluses dans un mélange EPON&commat;, en utilisant de l'époxy1-2-propane comme solvant intermédiaire. De fines sections sont colorées de manière conventionnelle avec du citrate de plomb et de l'acétate d'uranyle et observées dans un appareil Philipps CM12 à 80 kv. - Résultats : La morphologie ultrastructurale des cellules SV-BEC est observée au microscope électronique. La figure 5 illustre une coupe verticale d'une monocouche confluente ; de nombreuses jonctions serrées intercellulaires sont visibles (voir les flèches), caractéristiques de la barrière hémato-encéphalique. De plus, une activité t-glutamyl transférase significative est mesurée dans les cellules confluentes SV-BEC (11,2 nmol.mg prot l.min 1), également spécifique de la barrière hémato-encéphalique, selon le protocole de mesure de l'activité 7-glutamyl transpeptidase décrit dans ORLOWSKI et MEISTER (Proc. Natl. Acad. Sci., 1970, 37, 1248-1255). D. Coexoression des récepteurs ssl et t2 adréneraipues * Liaison aux récepteurs. - Protocole : Pour la mesure de la liaison des ligands 5- adrénergiques, les cellules sont détachées après un court traitement à la trypsine-EDTA, lavées et remises en suspension (environ 107 cellules/ml) dans une solution salée de Hank supplémentée avec de 1'HEPES 20 mM, pH 7,4 et de la sérumalbumine bovine (1 mg/ml). Les cellules (106) sont incubées dans le tampon avec des quantités croissantes de [3H] CGP 12177, dans un volume final de 300 1 à 37 C pendant 60 min. La liaison non spécifique est mesurée en présence de (+) alprénolol 3.10-5 M. La réaction est arrêtée par addition d'l ml de tampon froid, et les échantillons sont immédiatement filtrés sur des filtres en fibre de verre GF/C (Whatman). Après lavages, la radioactivité retenue sur les filtres est comptée par scintillation liquide. - Résultats : La liaison du [3H] CGP 12177, un antagoniste 5-adrénergique hydrophile, est utilisée pour évaluer le nombre de sites de liaison ss-adrénergiques présents à la surface des cellules SV-BEC. Une analyse Scatchard des données de liaison à saturation indiquent 3819 + 229 sites/cellule et une constante de dissociation (KD) de 899 + 113 pM figure 6). La figure 6 comporte en abscisse la concentration en [3H] CGP 12177, en nM et en ordonnée la quantité liée en fpmol/106 cellules. * Couplage des récepteurs à l'activité adénylate cyclase : accumulation d'AMPc cellulaire. - Protocole : Des aliquots de 106 cellules sont incubés dans un tampon (solution salée de Hank, HEPES 20 mM, pH 7,4, IBMX (3-isobutyl-1-méthyl-xanthine) 0,5 mM) avec des quantités croissantes de (-) iso-protérénol dans un volume final de 200 1 à 37 C pendant 10 min. L'inhibition de l'accumulation d'AMPc cellulaire est testée avec de l'(-)isoprotérénol 3.10-8, en présence de différentes concentrations de ligand CGP 2071A adrénergique Bl-sélectif. Le contenu en AMPc est mesuré comme décrit dans CHAPOT et al. (Hybridoma, 1989, 8, 535-543), en utilisant le kit Amersham [3H] cAMP. - Résultats : La figure 7A montre que 1' (-)isoprotérénol induit une augmentation du taux d'AMPc d'un facteur 6. Ces données indiquent une valeur de 1'EC50 de 5 nM pour l'(-)isoprotérénol. Une inhibition biphasique de l'effet de l'(-)isoprotérénol est observée en présence de CGP 20712A, suggérant l'existence de deux populations de récepteurs ss-adrénergiques comme dans les cellules endothéliales d'origine (figure 7B). Une analyse informatique de ces données révèle que 36 % des récepteurs ont une affinité importante pour le CGP 20712A (IC50 - 29 pM) et que 65 % ont une faible affinité (IC50 = 1 nM). Ces valeurs sont en accord avec les affinités connues du CGP 20712A pour les récepteurs '31 et ss2 adrénergiques (MARULLO et al., Bio/Technology, 1989, 7, 923-927). La figure 7A, qui comporte en abscisse la concentration en (-)isoprotérénol (log M) et en ordonnées la quantité de pmol d'AMPc/106 cellules, illustre l'effet de l'isoprotérénol sur la quantité d'AMPc dans les cellules SV-BEC et la figure 7B, qui comporte en abscisse la concentration en CGP 20712A (log M) et en ordonnée le pourcentage d'AMPc accumulé, illustre l'inhibition de cet effet par le CGP 20712A. EXEMPLE 3 : Préparation d'une lignée cellulaire conforme à l'invention : cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux de rat Lewis (lignée RBE-4). - Des cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux de rat Lewis sont immortalisées par transfection avec un plasmide contenant la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine sous contrôle du promoteur SV40 (figure 8), selon la même technique que celle de l'exemple 1, après mise en culture de ces cellules dans des boîtes recouvertes de collagène, contenant un milieu a-MEM/F10 (2/3 1/3), supplémenté en sérum de veau foetal à 10 %, en bFGF 1 ng/ml, en glutamine et en pénicilline/streptomycine. EXEMPLE 4 : Caractéristiques de la lignée RBE-4. La lignée cellulaire obtenue à l'exemple 3 possède certaines des caractéristiques des cellules endothéliales cérébrales, étudiées selon les mêmes protocoles que ceux de l'exemple 2 - Morphologie de cellules endothéliales non transformées. - Expression de marqueurs endothéliaux : facteur VIII, enzyme de conversion de l'angiotensine. - Jonctions serrées et activité Y-GT inductibles. - Présence de récepteurs de neurotransmetteurs (ss-adrénergiques, par exemple). - Sécrétion d'endothéline, de PGE2 ; pas de sécrétion de prostacycline, en accord avec l'origine microvasculaire de ces cellules. - Expression des antigènes d'histocomptabilité régulable par l'interféron-. - En présence d'astrocytes primaires, les cellules RBE-4 forment un réseau de structures tubulaires, rappelant des capillaires. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon-plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1') Lignées de cellules endothéliales cérébrales de mammifère, caractérisées en ce qu'elles sont obtenue par transfection de cellules endothéliales cérébrales par un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire, éventuellement associé à au moins un gène marqueur et en ce que les lignées ainsi transfectées sont immortalisées et présentent le phénotype de cellules endothéliales différenciées. 2 ) Lignée cellulaire selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par transfection de cellules endothéliales de capillaires cérébraux bovins par le plasmide pSV3 néo contenant le gène néo de la résistance à la néomycine et un fragment de l'oncogène T de SV40. 3 ) Lignée cellulaire selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle a été déposée sous le n I1143 en date du 19 septembre 1991 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur. 4 ) Lignée cellulaire selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par transfection de cellules endothéliales de capillaires cérébraux de rat par un plasmide contenant la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine. 5 ) Lignée cellulaire selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle a été déposée sous le n I1142 en date du 19 septembre 1991 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur. 6 ) Procédé d'obtention d'une lignée cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que on cultive des cellules endothéliales cérébrales appropriées dans un milieu de culture convenable, supplémenté en sérum et en facteur de croissance, on les transfecte entre le 2ème et le 6ème passage avec un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire et éventuellement au moins un gène marqueur et on sélectionne les cellules transfectées sur un milieu de sélection, adapté audit gène marqueur, si nécessaire. 7 ) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit fragment nucléique comprend un gène codant pour la résistance à la néomycine et un fragment d'un oncogène viral ou cellulaire 8 ) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le fragment d'oncogène viral est choisi dans le groupe qui comprend des fragments d'oncogène T de SV40 et des fragments contenant la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2. 9 ) Modèle d'étude et d'identification des systèmes biochimiques et cellulaire de la barrière hémato-encéphalique, caractérisé en ce qu'il comprend une lignée cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.