FR 2692594 A1 19931224 FR 9207571 A 19920622 DESCRIPTION Certains des concepts et procédés de base auxquels il est fait référence ci-dessous sont décrits dans un autre brevet déposé simultanément et intitulé "PROCEDE D'ANALYSE DE L'ORDRE GLOBAL DES SEQUENCES D'ADN/ARN't. La présente description s'articule en SEPT parties, chacune de ces parties s'appuie sur des exemples résultant, le plus souvent, d'expériences in-vitro publiées. dans chacune de ces sept parties, nous progressons successivement de la mise en évidence d'intéractions globales entre régions non codantes et codantes jusqu'à la caractérisation fine des indicateurs de notre procédé permettant de contrôler, réguler et optimiser l'expression des protéines considérées. Dans tous les cas la direction des régulations ou optimisations issues de notre procédé est coréllée et va dans la même direction que les résultats observés in-vitro. Ces sept parties seront les suivantes: - 1 - Preuve de l'existence d'un ordre global reliant les régions non exprimées et le gène effectif. - 2 - Evaluation prédictive de combinatoires entre régions codantes et non codantes. - 3 - Mise en évidence de l'effet à longue distance des sites promoteurs usuels (boite TATA, etc...). - 4 - Eléments de contrôle et de régulation macroscopiques. - 5 - Eléments de contrôle et de régulation fins. - 6 - "Langage global de contrôle et de régulation de l'expression des gènes". - 7 - Optimisation globale de la partie codante du gène. PARTIE I: PREUVES DE L'EXISTENCE D'UN ORDRE GLOBAL reliant les régions non traduites (précurseur 5' et terminal 3') et le gène (partie traduite. On considère l'ARNm complet du TGFbetal (figure 1). Pour simplifier: bien qu'il s'agisse d'ARNm, nous utilisons la lettre T (base T) alors que, normalement, s'agissant d'ARNm, nous aurions du utiliser la lettre U (base U). On va bâtir des sous-ensembles à partir de tout ou partie des 3 tronçons de séquences suivantes constituant l'ARNm: - Le précurseur 5'. - Le gène codant. - Le terminal 3'. - On va perturber cet enchainement naturel constituant le témoin. - on va comparer les mesures d'ordre global entre le témoin et les situations dégénérées. Parmi les dizaines d'expériences effectuées, toutes vont dans le même sens: TOUTES LES DEGRADATIONS DE SEQUENCES EXPLOREES DEGRADENT EGALEMENT LE NOMBRE ET LE VOLUME DES RESONANCES. Voici quatre de ces expériences les plus significatives. La figure 2 schématise les combinatoires de tronçons relatives à chacune de ces 4 expériences. Première PREUVE: perturbation par retournement (antisens) du tronçon précurseur - figure 2 (1) La totalité des résonances se divise en deux catégories: les résonances internes è chaque tronçon et les résonances à cheval entre deux tronçons. Les résonances étant pratiquement symétriques, à la nuance près que l'on ne recherche que le tiers des résonances partant des frontières de codons Ainsi, du fait de cette quasi-symétrie, la perturbation ci-dessus va pratiquement conserver toutes les résonances internes aux tronçons. Les résultats focaliseront donc les résonances sur les relations inter-tronçons, résonances auxquelles nous nous intéresserons désormais. On les détecte aisi: il s'agit de résonances dont la base d'origine et la base d'extrémité se situent dans deux tronçons distincts. La figure 3 présente les distributions des ces résonances pour le témoin - figure 3 (1) - et pour le cas perturbé (précurseur retourné) - figure 3 (2) - il s'agit, rappellons-le, de résonances situées "à-cheval" entre le précurseur et le gène. On remarque que: - le nombre des résonances est réduit dans un rapport de 3. - Le volume des résonances (somme des longueurs) est réduit dans un rapport supérieur à 14. - les très longues résonances ( > 1597) sont au nombre de 19 pour le témoin et inexistentes pour le perturbé (rappellons que le nombre réel de résonances est environ 3 fois supérieur et que ces longueurs couvrent plus de la moitié de la séquence, longue de 3378 bases). - la plus longue résonance pour le cas perturbé est de 377, elle est donc précédée de 86 résonances de longueurs supérieures chez le témoin - figure 3 (3) et (4) - Enfin, la matrice de distribution des résonances par type et par base est plus consistente dans le cas du témoin et disparate dans le cas dégénéré - figure 3 (5) et (6) Seconde PREUVE: perturbation par modification des pseudo-codons du précurseur tout en respectant les contraintes du code génétique: Nous avons recherché un moyen moins brutal de perturbation du tronçon précurseur. Aussi, bien que les codons du précurseur ne soient pas traduits selon la table du code génétique, une altération relativement légère consisterait à modifier au hasard ces codons en s'assurant que chacun d'entre eux continue de correspondre au même acide aminé après altération qu'avant altération.En clair, le précurseur réel et le précurseur perturbé produiraient, s'ils étaient traduits, strictement la même séquence polypeptidique d'acides aminés. La figure 4 représente, de la même façon que ci-dessus, l'écart évident des nombres et volumes de résonances entre le témoin et la séquence relative au précurseur perturbé. - le nombre des résonances est réduit dans un rapport de 27%. - le volume des résonances est réduit dans un rapport de 3.4. - les très longues résonances ( > 1597) sont au nombre de 19 pour le témoin et inexistentes pour la séquence perturbée. - de manière générale, bien que franches, les différences sont plus atténuées que dans le cas de la perturbation première. Troisième PREUVE: région terminale remplacée par une seconde copie du gène - figure 2 (4) - Désormais, après nous être limités au couple précurseur-gène, nous allons étendre l'étude au triplet précurseur-gène-terminal. Remplacer la région terminale par une perturbation, fût-elle la recopie du gène lui-même, constitue une perturbation forte. La figure 5 détaille ces résultats. Comme nous le montrons dans le brevet "PROCEDE D'ANALYSE DE L'ORDRE GLOBAL DES SEQUENCES D'ADN", le fait de dupliquer la région codante du gène renforce les résonances de type FFF et LLL tandis que le résonances LFF (dont nous allons démontrer le rôle majeur de contrôle et de régulation) disparaissent dès que l'on supprime la région terminale. Quatrième PREUVE: substitutions réciproques des tronçons précurseurs et terminales - figure 2 (5) - Nous remplaçons la séquence précurseur-gène-terminal par la séquence perturbée terminal-gène-précurseur. En d'autres termes, le nouveau promoteur devient le terminal originel tandis que le nouveau terminal devient le promoteur originel. La figure 6 détaille ces résultats. La perturbation a pour effêt de réduire les très grandes résonances (LUCAS en particulier). En conclusion: LES INTERACTIONS ENTRE REGIONS CODANTES ET NON CODANTES SONT DETRUITES DES QUE L'ON PERTURBE LES TRONCONS DE GENES CORRESPONDANTS. LES OPERATEURS D'ANALYSE DE L'ORDRE GLOBAL DES GENES MESURENT LE SENS ET LA DIRECTION DE CETTE PERTURBATION. PARTIE Il: EVALUATION PREDICTIVE DE COMBINAISONS ENTRE REGIONS CODANTES ET NON CODANTES: LE PROCEDE ILLUSTRE ICI SERA: il est possible de simuler l'impact qui résulterait de différentes combinaisons entre diverses régions précurseur, diverses régions codantes et diverses régions terminales. Cela permet d'évaluer, avant d'effectuer les travaux in-vitro correspondants, quel serait 1' impact de ces combinaisons. Nous illustrerons cette combinatoire à partir de la BETAGLOBINE. Nous disposons (figure 7) des TROIS tronçons respectifs dés: - précurseur. - gène (région traduite). - terminal. correspondant aux DEUX bétaglobines respectives: - de l'homme. - du lapin. On remarque (figure 8) les différences importantes entre ces deux gènes, en particulier (*) dans la région terminale il y a, chez l'homme une longue insersion de séquence, inexistente chez le lapin. Nous avons simulé l'impact de QUATRE parmi les HUIT (2**3) combinaisons possibles: - précurseur HOMME + gène HOMME + terminal HOMME (fig 10-1). - précurseur LAPIN + gène LAPIN + terminal LAPIN (fig 10-1). - précurseur HOMME + gène LAPIN + terminal HOMME (fig 10-1). - précurseur LAPIN + gène HOMME + terminal LAPIN (fig 10-2). Les résultats considèrent toutes les résonances à cheval entre le précurseur et le gène (dont l'origine est dans le précurseur et l'extrémité dans le gène ou dans le terminal) dans la figure 10, et celles à cheval entre gène et terminal dans la figure 11. Contrairement à la partie I, les combinaisons semblent ici VIABLES. PARTIE III: MISE EN EVIDENCE DE L'EFFET A LONGUE DISTANCE DE PROMOTEURS USUELS ("boites TATA, CAAT" etc...). LE PROCEDE ILLUSTRE ICI SERA: Contrairement à l'état de l'art, où l'on ne considère ces promoteurs (figure 12) que sur un plan ANALYTIQUE et LOCAL, nous démontrons que ces promoteurs ont un impact TRES SENSIBLE et A LONGUE DISTANCE dans les relations entre régions codantes et non codantes. Ils controlent L'EXPRESSION DES GENES non à des niveaux locaux et positionnels mais à des niveaux plus globaux et flous (le terme flou signifie ici que la position -25 à -30 par exemple pour TATA n'est pas une règle stricte). Du reste, certains gènes ne possèdent pas des promoteurs si explicites. Nous savons MESURER l'impact global de tels promoteurs. Pour cela, nous étudierons les 2 gènes GMCSF chez l' HOMME et chez la SOURIS (figure 13). Nous ALTERONS la boite TATA par différentes mutations dont nous mesurons l'effet au niveau de l'ordre global des gènes (ces mutations identiques à celles de la partie VI). La figure 14 montre comment la suppression de la boite TATA altère fortement les résonances, mais, exclusivement celles de type LFF. Nous montrerons plus loin que c'est précisément ce type de résonances LFF qui contrôle l'expression. La figure 14 (14-2 et 14-3) continue de démontrer l'extrême sensibilité pour de petites mutations de la boite TATA. L'analyse fine des figures 14 et 15) met en évidence: - L'hyper-sensibilté des résonances aux altérations de cette région TATA. - L'invariance de certains types de résonances malgré ces altérations. - Le début de mise en évidence d'éléments de LANGAGE de CONTROLE de l'expression des gènes. PARTIE IV: ELEMENTS DE CONTROLE ET DE REGULATION MACROSCOPIQUES: LE PROCEDE ILLUSTRE ICI SERA: Nous savons MESURER et CONTROLER, en termes de résonance, l'impact global des régions PROMOTEUR et de REGULATION POSITIVES ET NEGATIVES. Ces résultats sont CORELLES avec les expériences in-vitro de mutagénèse de ces régions conduites préalablement, et indépendamment de notre découverte. Quand on sait que ces régions de régulation controlent directement les RENDEMENTS dans L'EXPRESSION DES PROTEINES, la maitrise informationnelle de ces paramètres permet donc d'industrialiser ce procédé au niveu opérationnel de la production BIOTECHNOLOGIQUE. Nous expérimenterons à partir d'un gène très riche sous ces aspects de régulation: le TGF BECTA1 (références THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTERY vol 264 numeros 1, 12 et 22: "Charscterization of the promoter region of human TGF BETA1 gene". "Promoter sequence of the human TGF BETA1 gene responsive to TGF BECTA1 autoinduction". "Activation of the second promoter of the TGF BECTAI gene by TGF BETA1 and Phorbol Ester occurs through the same target sequences T . Dans ces articles, les biologistes ont (grossièrement) localisés "1' enhancer" (activateur), deux régions de régulation négatives, et une région de régulation positive (voir leur localisation dans la figure 16). Pour cela, ils ont assemblé un gène chimère expérimental composé des 1373 premières bases du promoteur (qui en comporte 2202) suivies du "vecteur d'expression" CAT ("chloramphenicol acetyltransferase). La séquence complète du TGF BECTA1 (figure 16) est accessible dans la banque de données de gènes GENBANK sous les points d'accès J04431 et HUMTGFB.TGFB. Bien que les expériences des biologistes n'aient été faites qu'avec ce vecteur CAT et non avec le gène complet du TGF, nous avons, pour notre part, validé les influences des différentes régions de contrôle ala fois sur le TGF BETA1 complet (les résultats ci-dessous) et sur le gène chimère "précurseur TGF tronqué" + CAT. Les résultats sont assez bien corellés entre eux mais, surtout, les "sens" de régulation positive ou négative sont décelés par notre procédé). Enfin, et surtout, ces résultats sont corellés avec ceux des expériences invitro des biologistes ayant consisté à supprimer certaines régions. La figure 17 détaille une partie des résultats (résonances traversant la jonction précurseur-gène pur la séquence complète d TGF (précurseur + gène + terminal) La figure 18 mesure les résonances traversant la jonction gèneterminal). On notera la grande sensibilité des résonances LFF sur la base G (repérées par les types 3 4). Nous verrons dans la partie partie VI le rôle de contrôle du sens de la régulation (+/-) joué par cette résonance 3 4. La figure 19, qui recense TOUTES les résonances met en évidence sur le type 3 4 le sens de la régulation: - passage de 92126 à 91690 si régulation N1- supprimée (fig 19-1). - pasyP de 92126 à 85131 si "enhancer supprimé (fig 19-1 19-2). - passaye de 92126 à 80829 si régulation N2- supprimée (fig 19-2). - passage de 92126 à 101383 si régulation Pt supprimée (fig 19-3). Paradoxalement, donc, une réduction de la séquence de 129 bases de la région P+ (soit 3 %) provoque une augmentation des volumes de résonance 3 4 (LFF G) de 10%. Des analyses plus fines ont de plus permis de localiser dans la séquence les positions de ces longues résonances de régulation. Noirs noterons cependant l'aspect assez grossier de ces régions. PARTIE 5: ELEMENTS DE CONTROLE ET DE REGULATION FINS: LE PROCEDE ILLUSTRE ICI SERA: le même que précédemment mais nous agirons maintenant sur un autre gène (bétaglobine) dont la localisation des régions de régulation est connue de manière plus FINE qu dans la partie IV. Ici encore, nos résultats seront corellés: - avec les résultats des biologistes. - avec les résultats établis dans la partie IV. La séquence complète de la bétaglobine a déja été présentée dans la partie II (figure 7). La figure 21 localise avec précision CINQ régions de régulation négative (N1 à N5) et UNE région de régulation positive (P). Différentes mutations ayant été expérimentées pour chacune de ces régions ctest au total QUINZE gènes que nous allons étudier: le gène témoin, le gène à région P+ mutée, le gène où les cinq régions négatives sont mutées (noté N1 dans les figures de simulations), onze mutations élémentaires négatives: notées Nij (exp N11) avec i le niveau de mutation ponctuelle (figure 21) et j le numéro de la mutation (1 à 5). Enfin, nous rajouterons un gène mutant hybride d'autres bétaglobines non humaines. Dans la figure 22, nous étudions les résonances à cheval sur la région CCAAT. L'analyse fine des résonances 3 4 (LFF G) mais aussi 3 3 (LFF A) respecte assez bien l'ordre positif - témoin négatif. La mutation de la région de régulation P+ (une seule base mutée) conduit à la plus forte valeur: 2489 (parmi 14 cas étudiés) en 3 4 (LFF G) et à la plus faible valeur: 984 en 3 3 (LFF A). Voir repère fig 22-2. Fig 22-5, le gene "étranger" se remarque. La figure 23 détaille les résonances traversant la jonction précurseur-gène (base 150) pour trois cas: les 5 régions N1 mutées, le gène témoin et la région p+ mutée: on y constate (fig 23-1) la hiérarchisation, dès le début du précurseur entre les grandes résonances 3 4 (LFF G) de longueurs 199 et 123, hiérarchisation très prononcée selon l'ordre P+ > témoin > N1-. Dans la figure 24 nous avons trié les résonance par ordre décroissant, ce qui illustre encore la même hiérarchisation entre les trois cas. Dans la figure 25, nous étudions la sensibilité à un décalage de la région P+ plus loin dans le précurseur (en base 107, soit AU-DELA du site "CAP" (voir figure 21). D'après notre évaluation des mécanismes de régulation, nous pensions ainsi conserver et maintenir la régulation positive; c'est effectivement ce qui se produit (gène noté GLOFULP3 dans la figure 25). La figure 26 détaille et compare la mutation P+, le témoin, et la nouvelle mutation positive (déplacée) "GLOFULP3". PARTIE VI: "LANGAGE GLOBAL DE CONTROLE ET DE REGULATION DE L'EXPRESSION DES GENES": LE PROCEDE ILLUSTRE ICI SERA: Un message de type binaire apparaît en particulier pour les résonances 3 1 (LFF T), l'absence, ou la présence, alternées de telles résonances autour de l'ensemble TATA délimite à un niveau plus élevé que TATA les notions de précurseur. En effet, si (figure 27), on montre cote-à-cote l'ensemble des résonances 3 1 (LFF T) pour la BETAGLOBINE TGF BETA1 (avec vecteur CAT) à droite: on observe des séquences successives et très nettes de régions contigues riches en 3 1 ou, au contraire, totalement dépourvues de 3 1. Précisément, dans la BETAGLOBINE, la région TATA-CAP est riche en 3 1 (promoteur) tandis qu'elle est bordée, en amont et en aval, de régions dépourvues de 3 1. Rappelons, pour le TGF BETA1 que la mutation relative à l'enhancer a été très grossière. On peut suggérer d'y rechercher l'enhancer réel plutot en début de la grande région enhancer (de 400 bases) approximativement localisée par les biologistes. PARTIE VII: OPTIMISATION GLOBALE DE LA PARTIE CODANTE D'UN GENE: LE PROCEDE ILLUSTRE ICI SERA: L'ordre global des gènes permet D'OPTIMISER l'expression d'un gène en altérant les codons du gène de manière à conserver les mêmes acides aminés et à accroitre 11 ordre global observé par nos opérateurs. Le procédé fin est le suivant: 1) Observer l'ordre global du gène réel (avec ou sans ses régions précurseur et terminales. 2) Fabriquer de nombreux gènes "synonimes" (une centaine ou des milliers) en altérant au hasard (ou suivant le codon usage") chaque codon en l'obligeant à produire le même acide aminé. on obtient donc, par exemple 100 gènes qui conduisent TOUS à la même séquence polypeptidique d'acides aminés. 3) De ces multiples simulations, on obtient un profil moyen des résonances (tables 4 x 8 donnant nombres et volumes de résonances par types et par bases). 4) Parmi tous ces gènes on retiendra celui ou ceux: - qui entrent dans le profil moyen. - dont la matrice 4x4 est la plus "saillante" et contrastée avaleurs soit très fortes soit très faibles). On a établi en effet que cette propriété caractérise les gènes réels vis-à-vis de gènes bruités selon le procédé ci dessus (voir J,C PEREZ chaos, DNA and Neuro-computers: a golden link" in SPECULATIONS IN SCIENCE AND TECHNOLOGY October 1991 U.K). - qui, si l'on considère les intéractions gène/précurseur et gène/terminal, maximisent les paramètres de régulation et d'activation étudiés ci-dessus. Ce procédé permet donc de contrôler et optimiser l'expression des gènes en agissant indépendamment ou simultanément sur les parties codantes et non codantes. Nous avons expérimenté la méthode sur de nombreux gènes (Interférons, facteur nécrosant des tumeurs etc...). Nous démontrerons l'efficacité de la méthode sur les 2 gènes d'expression de 7'INTERLEUKINE-6: les gènes PT911 et PT13SNCO (figures 28 et 29). Précisément, la figure 28 s'appuie sur un article qui a vérifié que le type d'altération que nous préconisons n'altérait pas (dans l'absolu) l'expression de la protéine (nous pensons qu il altère très certainement le rendement). PT911 est donc le vrai gène de référence (réel). PTI3SNCO est le gène dégradé selon le code génétique. La figure 30 démontre que cette dégradation aveugle faite par le hiologiste a BRISE l'ordre à grande distance qui controlait tant le gène seul que le gène dans son environement (régions non codantes). Par exemple (fig 30-1), la mutation divise le nombre des résonances par 3.3 et le volume des résonances par 5.3 (au niveau des résonances à cheval entre précurseur et gène). D'autres combinaisons entre précurseurs et parties codantes respectives des deux gènes vont dans la même direction (fig 30-3 et fig 30-5). Le repère 30-7 analyse et détaille la totalité des résonances. oit, le gène réel est très supérieur au gène dégradé... Saurons-nous optimiser ce gène réel et proposer un gène plus optimal, conduisant donc, très probablement, à une EXPRESSION ACCRUE DE LA PROTEINE ? C'est l'objet de la figure 31, qui ne repose que sur 100 simulations de gènes chimères syonimes. Nous proposons un gène optimal (fig 31-2). Sa distribution de résonances apparaît très supérieure à celle de PT911. La figure 32 compare les résonances entre les trois gènes: - le gène dégénéré PT13SNCO (à gauche). - Le gène réel PT911 (au centre). - Le gène optimisé OPTI1 (à droite). La force de cette dernière figure servira de conclusion à ce brevet. 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Les revendications secondaires concernent: 2) Toute utilisation du procédé visant à améliorer non i'eypression des gènes (relldements) mais les FONCTIONALITES des protéines (ne serait-ce, paradoxalement, que par des mutations de codons synonimes sur la seule partie traduite du gène, tel que cela est décrit dans la partie VII de la description. 3) Toute utilisation qui reposerait sur une méthode dérivée de l'ordre global des gènes (dans l'esprit des revendications du brevet "PROCEDE D'ANALYSE DE L'ORDRE GLOBAL DES SEAUENCES D'ADN ET D'ARN". 4) Toute utilisation des applications précises décrites à des fins industrielles (sang artificiel, gènes chimères, bio-matériaux), ou thétapies géniques (cancer, SIDA, maladies génétiques, etc...).