FR 2692282 A1 19931217 FR 9207206 A 19920615 CLONAGE DU GENE CODANT POUR LA PROTEINE GP28.5 DE T. GONDII ; FRAGMENTS PEPTIDIQUES ISSUS DE LADITE PROTEINE ET LEURS APPLICATIONS. La présente Invention est relative au clonage du gène codant pour un antigène d'excrétion-sécrétion de 28,5 kDa de toxoplasme, et à l'obtention de fragments peptidiques représentant des épitopes de celui-ci, ainsi qu'à des préparations dudit antigène et de ses fragments, et à leurs utilisations. La toxoplasmose est une des infections à protozoaires les plus répandues, aussi bien chez l'homme que chez l'animal. Elle est responsable d'environ 25% des décès chez les patients atteints du SIDA. L'infection congénitale, cause d'avortements ou de malformations néonatales sévères chez l'homme et les animaux domestiques, pourrait être prévenue. En effet, on sait que la primoinfection induit une immunité de longue durée. Dans la recherche d'antigènes protecteurs permettant le développement d'un vaccin contre la toxoplasmose, différents antigènes ont été étudiés. L'équipe des Inventeurs s'est en particulier intéressée aux antigènes d'excrétion-sécrétion (ESA) des tachyzoites. Il a en effet été établi, au cours d'expérimentations aussi bien chez l'homme que chez l'animal, que les antigènes ESA étaient immunogènes. Il a également été montré que certains des ESA possèdent des épitopes communs avec des antigènes des bradyzoites. Or, les bradyzoites sont la forme résistante du parasite. Différentes approches, comprenant en particulier la production d'anticorps monoclonaux, le marquage à l'or colloidal, et la biologie moléculaire, ont conduit l'équipe des Inventeurs à la caractérisation de quatre antigènes communs [CEARIF et al. Exp. Parasitol., 71:117 (1990)], [CESBRON-DELAUW et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA, 86:7537 (1989)], [DARCY et al., Parasitol. Res. 76:478, (1990)]. Le principal, dénommé Gra2 ou GP28.5,est une glycoprotéine de 28.5 kDa, et il a été montré qu'il était un constituant de la matrice des granules denses des tachyzoites, et qu'il était associé avec le réseau de micro-villosités de la vacuole parasitophore du parasite, après invasion de l'h8te Un antigène de 28 kDa (P28), considéré comme similaire à l'antigène GP28.5, a été décrit par SIBLEY et SHARMA [SIBLEY et al. Infect. Immun. 55:2137 (1987)], et la séquence d'ADN codant pour cet antigène a été clonée par PRINCE et al. [PRINCE et al., Molec. Biochem. Parasitol. 34:3 (1989)]. Les Inventeurs sont maintenant parvenus à obtenir une préparation purifiée de l'antigène GP28.5, et ont démontré l'effet protecteur d'une immunisation par cet antigène contre l'infection par Toxoplasma gondii chez la souris. La présente invention a pour objet une préparation purifiée de l'antigène GP28.5 de T. gondii. Les Inventeurs ont également cloné l'ensemble du gène codant pour cet antigène, et ont localisé les introns et les exons, ainsi que les régions non-codantes en 5' et 3'. Ils ont constaté que la séquence codante présentait des différences avec celle codant pour la P28 publiée par PRINCE et al.. Les Inventeurs ont en outre montré que l'antigène GP28.5 contient plusieurs épitopes majeurs spécifiques des cellules B ; l'un d'entre eux, situé à l'extrémité C-terminale de la molécule, est reconnu par un anticorps monoclonal de souris dénommé TG17-179 [CHARIF et al. Exp. Parasiitol., 71:117 (1990)]. Les Inventeurs ont caractérisé cet épitope et ont montré qu'il comprenait au moins les 5 acides aminés C-terminaux. En outre, ils ont montré que cet épitope est également un épitope majeur reconnu par des anticorps polyclonaux humains dirigés contre T. gondii. La présente invention a également pour objet un fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence représentée dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ. ID. N 1, et qui est celle du gène codant pour l'antigène GP28.5 de toxoplasme. Cette séquence montre que le gène GP28.5 (environ 1.3 kb) est constitué de deux exons (exon 5':251 pb ; exon 3':800 pb) séparés par un intron de 239 pb. Elle présente en 5' une séquence non-codante de 104 bases. Le cadre ouvert de lecture commence à la position 769 ; Un codon ATG initiateur de traduction est présent à la position 886, et le cadre ouvert de lecture se termine à la position 1680 avec un codon TAA. Ce cadre ouvert de lecture code potentiellement pour une protéine de 185 acides aminés dont le poids moléculaire théorique est de 19,8 KDa. Un site potentiel de clivage d'une séquence signal est situé entre les alanines 23 et 24. Le codon TAA est suivi en 3' par une région non-codante de 391 pb. Trois sites potentiels différents d'initiation de la transcription ont été localisés, respectivement à 105, 103 et 102 pb en amont du signal d'initiation de la traduction. Les deux premiers peuvent correspondre à des sites de transcription mineure alors que le troisième est sans doute le site majeur d'initiation de la transcription. La séquence d'acides aminés de GP28.5 diffère de la séquence précédemment publiée par PRINCE et al. par une délétion des soixante-sept acides aminés N-terminaux. Le criblage d'une bande d'expression de T. gondii avec TG 17-179 a permis l'isolation de clones d'ADNc, codant pour la région C-terminale de GP28.5 et dont l'un code seulement pour les 5 résidus C-terminaux. L'Invention englobe également des fragments d'acide nucléique dont la séquence est dérivée de la séquence SEQ. ID. N 1, et qui codent pour des polypeptides représentant des épitopes de l'antigène GP28.5. Ceci comprend les séquences qui, compte tenu de la dégénérescence du code génétique, codent pour ces polypeptides. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, lesdits fragments d'acide nucléique codent pour un polypeptide comprenant au moins les 5 acides aminés C-terminaux de l'antigène GP28.5. Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, lesdits fragments d'acide nucléique codent pour un polypeptide comprenant un fragment N-terminal de l'antigène GP28.5. Selon encore un autre mode de réalisation préféré de l'invention, lesdits fragments d'acide nucléique codent pour un polypeptide comprenant le fragment 127-176 de l'antigène GP28.5. L'Invention a également pour objet des vecteurs recombinants (plasmides, virus, etc...) caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un segment d'ADN tel que défini ci-dessus, codant pour l'antigène GP28.5 de toxoplasme, ou pour un fragment peptidique représentant un épitope de celui-ci. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, lesdits vecteurs sont des vecteurs d'expression, comprenant des séquences propres à contrôler l'expression du gène de l'antigène GP28.5 (promoteur, terminateur, etc...) La présente Invention a également pour objet des cellules eucaryotes ou procaryotes transformées (et en particulier des microorganismes), caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins un vecteur recombinant conforme à l'Invention, tel que défini ci-dessus. L'Invention a également pour objet un polypeptide de 185 acides aminés dont la séquence est celle de l'antigène GP28.5 de toxoplasme, telle que représentée à la liste des séquences, sous le numéro SEQ. ID. N 2. L'Invention englobe, bien entendu, les polypeptides dont la séquence ne diffère de la séquence mentionnée ci-dessus que par quelques acides aminés, en particulier des polypeptides représentant des variants alléliques ou des isoformes de l'antigène GP28.5. L'Invention comprend également des protéines recombinantes comprenant tout ou partie de la séquence de l'antigène GP28.5, éventuellement fusionnée avec une autre séquence polypeptidique ; dans ce cadre, l'Invention a en particulier pour objet - une protéine recombinante comprenant les 59 acides aminés C-terminaux de l'antigène GP28.5 - une protéine recombinante comprenant les 212 acides aminés C-terminaux de l'antigène GP28.5 - une protéine recombinante comprenant les amino-acides 127-176 de l'antigène GP28.5 - une protéine recombinante comprenant les amino-acides 1-129 de l'antigène GP28.5 - une protéine recombinante comprenant les aminoacides 24-129 de l'antigène GP28.5. L'Invention concerne également un procédé de production d'une protéine recombinante telle que définie ci-dessus, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle l'on procède à la mise en culture de cellules transformées telles que définies plus haut, comprenant au moins un fragment d'ADN conforme à l'Invention. Les polypeptides recombinants exprimés chez E. coli conservent des épitopes majeurs impliqués dans la réponse polyclonale à l'antigène GP28.5, et ce bien que l'expression chez E. coli ne maintienne pas l'intégrité structurale de la protéine GP28.5 qui est une protéine glycosylée. Pour permettre l'obtention d'autres épitopes tels que des épitopes de nature glucidique, ou des épitopes correspondant à des structures tertiaires et quaternaires, on choisira de produire la GP28.5 recombinante dans des systèmes eucaryotes tels que, par exemple, les levures ou les baculovirus. Les Inventeurs ont en outre montré que la séquence C-terminale de quinze acides aminés de l'antigène GP28.5 représente un épitope reconnu par un certain nombre de sérums de patients atteints d'infections aigues ou chroniques. Les études d'inhibition réalisées par les Inventeurs montrent que ce peptide est l'épitope majeur de la région C-Terminale de cinquante-neuf acides aminés pour quatre sur douze des sérums obtenus à partir de patients chroniques et pour trois sur douze des sérums obtenus à partir de patients atteints d'infections aigues. En outre, trois sur douze des sérums chroniques et quatre sur douze des sérums aigus montrent une inhibition partielle (35-80% d'inhibition). Toutefois, cinq sur douze des sérums chroniques et cinq sur douze des sérums aigus qui réagissent avec la région C-Terminale de cinquante-neuf acides aminés de GP28.5 ne réagissent pas avec le peptide de quinze acides aminés, ce qui montre que d'autres épitopes B majeurs existent dans cette région de cinquante-neuf acides aminés et notamment dans le fragment correspondant aux amino-acides 127-176 de la séquence dudit antigène GP28.5. En outre, le fait que des sérums négatifs contre la région de cinquante-neuf acides aminés, réagissent avec le peptide de deux-cent-douze acides aminés, suggère que d'autres épitopes plus proches de l'extrémité N Terminale de l'antigène GP28.5, sont reconnus par les sérums humains.Ceci a conduit les Inventeurs à rechercher ces épitopes ils ont ainsi localisé deux régions correspondant aux acides aminés 24-129, de préférence aux acides aminés 55-70 et aux acides aminés 140-160 de la séquence polypeptidique définie ci-dessus. L'Invention comprend également des peptides constituant un épitope de l'antigène GP28.5. Selon un mode de réalisation préféré de l'Invention, ledit peptide comprend au moins les 5 acides aminés C-terminaux de l'antigène GP28.5 Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit peptide comprend entre 5 et 15 acides aminés C-terminaux de GP28.5. Selon une modalité préférée de cette disposition, ledit peptide comprend les 8 acides aminés C-terminaux de GP28.5. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'Invention, ledit peptide comprend les acides aminés 24129 de l'antigène GP28.5. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'Invention, ledit peptide comprend au moins les acides aminés 55 à 70 de l'antigène GP28.5 Selon encore un autre mode de réalisation préféré de l'Invention, ledit peptide comprend au moins les acides aminés 140 à 160 de l'antigène GP28.5 La séquence des 5 acides aminés C-terminaux de l'antigène GP28.5 est reconnue en immuntransfert par l'anticorps monoclonal de souris TG 17-179. Un ELISA compétitif avec des peptides plus longs a montré que l'immunoréactivité était conservée pour des peptides de 8 résidus ou plus, et perdue quand le peptide était réduit aux 6 derniers résidus C-terminaux ou moins. Des expériences avec l'octapeptide dépourvu du résidu glutamine C-terminal ont montré qu'il était alors 20 fois moins actif.En revanche, ni l'addition de résidus à l'extrémité C-terminale, ni la substitution de la fonction COOH terminale ne changent l'immunoréactivité de l'épitope. En outre, des expériences de compétition entre l'anticorps monoclonal TG 17-179 et des sérums de patients infectés ont montré que l'épitope défini par cet anticorps monoclonal est également un épitope majeur pour les anticorps polyclonaux humains. L'Invention a également pour objet des compositions antigéniques caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un antigène pris dans le groupe constitué par - une préparation purifiée de l'antigène GP28.5 - un polypeptide ayant la séquence de l'antigène GP28.5 - un fragment dudit polypeptide représentant un épitope de l'antigène GP28.5. - une protéine recombinante comprenant tout ou partie de la séquence peptidique de l'antigène GP28.5. L'Invention englobe également un procédé de préparation d'anticorps anti-GP28.5, polyclonaux ou monoclonaux, caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on immunise un animal avec une composition antigénique conforme à l'Invention. Les compositions antigéniques conformes à l'Invention permettent également la préparation de réactifs de diagnostic, ou de vaccins anti-toxoplasmes. L'invention englobe également ces réactifs et ces vaccins. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de Description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de clonage du gène codant pour l'antigène GP28.5 de toxoplasme, et d'identification des épitopes spécifiques de cet antigène. Il va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. I) CLONAGE ET EXPRESSION DU GENE CODANT POUR LA GP28.5 DE T. crondii Sauf précision contraire, les techniques de manipulation des acides nucléiques et de clonage moléculaire utilisées dans les exemples qui suivent sont celles décrites par SAMBROOK et al.[A Laboratory Manual (second edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (1989)] L'anticorps TG 17-179 a été obtenu à partir de souris BALB/C immunisées avec des antigènes ESAs comme décrit par CHARIF et al. [CHARIF et al., Exp. Parasitol. 71:114 (1990)]. EXEMPLE 1 : CLONAGE DU GENE CODANT POUR LA GP2 8.5 de T. pondi i 1O) Obtention des toxoplasmes. Des tachyzoites ont été obtenus à partir du fluide péritonéal de souris infectées trois jours auparavant avec la souche RH de Toxoplasma gondii. Les parasites ont été récoltés dans du milieu RPMI 1640 (GIBCO BRL), filtrés à travers des membranes de polycarbonate (diamètre de pores 3 microns) (NUCLEPORE.) et lavés deux fois dans le même milieu. 2() Préparation d'acide nucléique de Toxoplasma gondii. L'ARN total a été isolé de tachyzoltes de Toxoplama gondii de la souche RH par extraction au lithium/urée, et lARN poly (A+) a été purifié par passage sur une colonne d'oligo (DT)-cellulose. 3s) Construction de la banque d'ADNc de tachyzoites. a) Construction dans kgtll La construction de la banque d'ADNc de toxoplasme dans le phage lambda gtll a été décrite par CESBRON-DELAUW et al. [CESBRON-DELAUW et al. Proc. Natl. acad. Sci. USA, 86:7537 (1989)]. La banque, après amplification, a été étalée sur des cellules de E. coli Y1090 et criblée en utilisant l'anticorps monoclonal TG 17-179. Les clones positifs ont été détectés par incubation avec des anticorps anti IgG de souris conjugués à la peroxydase, suivis d'un marquage au 4-chloro-1 naphtol. Trois clones de Xgtll ont été sélectionnés il s'agit des clones FM3, FM1, et FM16, contenant respectivement des inserts de 450, 550, et 650 paires de base. Des fragments de restriction EcoRI de ces clones ont été sous-clonés dans les vecteurs M13 mpl8 et mp19 et séquencés par la méthode de SANGER [FEINBERG et al. Anal. Biochm. 137:266 (1984)]. Le séquençage a montré que ces trois clones codent tous pour l'extrémité C-terminale de GP28.5, et que leur séquence en 5' est identique à celle publiée par PRINCE et al. (publication précitée). b) Construction dans XZapII La banque d'ADNc de tachyzoites a été construite dans le vecteur XZapII, en utilisant le "ZAP cDNA SYNTHESIS KIT" (STRATAGENE). L'ADNc a été synthétisé en utilisant comme matrice 5 Fg d'ARN poly-A des tachyzoltes, à l'aide de la transcriptase inverse (MMLVRT) pour la synthèse du premier brin, et de l'ADN polymérase I et la RNase H pour la synthèse du second brin. Après ligature en 3' d'un adaptateur EcoRI, et après digestion en 5' par XhoI, l'excès d'adaptateur a été éliminé par chromatographie sur acrylamide-agarose (Ac-A 34, IBF). Les ADNc ont ensuite été ligaturés dans le gène LacZ de lZapII ("UNI ZAP XR", STRATAGENE) et encapsidés in vitro ("GIGAPAC II GOLD PACKAGING EXTRACT", STRATAGENE). Avant amplification, la librairie comprend 106 phages recombinants. Après amplification, les phages ont été étalés sur E. coli XLI-Blue et la banque a été criblée avec d'une part, le sérum polyclonal de souris dirigé contre l'antigène GP28.5 purifié (dilution au 1/100) et, d'autre part, l'anticorps monoclonal TG17-179 (dilution au 1/500), tous deux dilués dans du tampon TBS (10 mM TRIS HC1 pH 8, 15mM NaCl). La co-infection des bactéries par Xzapîî et un phage auxilliaire (R408, Stratagène) a permis d'exciser le phagemide pBluescript contenant les inserts d'ADNc clonés. L'ADN simple brin obtenu à partir du phagemide en présence du même phage auxilliaire a été directement employé pour séquencer les inserts d'ADNc par la méthode des di-déoxynucléotides. Le criblage de la banque d'ADNc construite dans le vecteur d'expression XZapII a permis l'obtention d'ADNc plus longs. Le plus long de ceux-ci, dénommé "LcDNA" comprend 1100 pb ; sa séquence en 3' est homologue à celle de la P28 de PRINCE et al., mais est plus courte d'au moins 121 bp en 5'. 4s) Construction d'une banque génomique de Toxoplasme gondii dans le phage EMBL 3 Après digestion partielle de 1'ADN génomique des tachyzoïtes avec MboI, la banque génomique a été construite comme décrit par CESBRON-DELAUW et al. (référence précitée). La banque construite dans le phage EMBL3 a été étalée sur E. coli P2392, et criblée à l'aide d'un fragment de restriction de l'ADNc (fragment EcoR1-SalI de 195 pb), utilisé comme sonde, après marquage préalable au 32p. Les hybridations ont été effectuées à 65 C, dans du tampon 5X DENHARDT [le tampon 50X DENHARDT contient 1% de SAB, 1% de PVP, 1% de Ficoll (w/v)] et 6,6X SSC (10X SSC comprend 3M NaCl, 0,3M NA3C6H507 2 H20, pH 7,2). Un clone génomique dénommé Gra2-EMBL3 a été sélectionné à partir de ce clone, un fragment de 2040 pb, comprenant l'ensemble du gène ainsi que 780 pb de séquence flanquante 5' et 32 pb de séquence flanquante 3' a été sousclone. La figure 1 représente la carte de restriction partielle sur 5 kb du clone génomique Gra2-EMBL3, ainsi que la carte de restriction partielle d'une région de 2040 pb de celui-ci, qui comprend la totalité du gène GP28.5. Cette figure montre également la région transcrite et la région codant pour la protéine GP28.5. L'analyse en Southern blot d'ADN génomique de tachyzolte hybridé avec une sonde d'ADNc de 1100 pb (clone LcDNA) confirme cette carte de restriction. Elle indique également que le gène codant pour GP28.5 n'est probablement pas répété dans le génome des toxoplasmes. La ligne du haut est une carte de restriction partielle du clone génomique Gra2-EMBL3 contenant le gène GP28.5 (ce gène est indiqué par une boîte). Le reste de la figure est un agrandissement d'une région de 2040 pb qui représente un sous-clone du clone génomique GP28.5, et qui contient le gène codant pour GP28.5 ainsi que les séquences flanquantes de 780 pb en 5' et de 32 pb en 3'. Le cadre ouvert de lecture de GP28.5 est indiqué , Le fragment EcoRI-SalI de 195 paires de base qui a été utilisé comme sonde pour le criblage des banques est indiqué sous les cartes de restriction ainsi que les clones de cDNA:LcDNA, FM16, FMI, FM3. La séquence AAAA indique la queue poly-A des transcrits. Les régions codantes sont hachurées. Les sites de restriction sont indiqués par les abréviations suivantes : AI = AccI, AII = AvaII ; B = BglI ; E = EcoRV ; H = HindIII ; N = NaeI ; ND = NdeI PI = PstI ; PII = PvuII ; S = SalI ; SM = SmaI. La séquence complète du gène GP28.5 et des régions 5' et 3' non codantes est montrée dans la liste des séquences en annexe sous le n SEQ ID Nol. Pour déterminer l'organisation du gène GP28.5, la séquence de la banque génomique a été comparée avec la séquence du clone LcDNA. Cette comparaison montre que le gène GP28.5 est constitué de deux exons (exon 5':251 pb ; exon 3':800 pb) séparés par un intron de 239 pb. Le cadre ouvert de lecture commence à la position 769 ; Un codon ATG initiateur de traduction est présent à la position 886, et le cadre ouvert de lecture se termine à la position 1680 avec un codon TAA. Ce cadre ouvert de lecture code potentiellement pour une protéine de 185 acides aminés dont le poids moléculaire théorique est de 19,8 KDa. Un site potentiel de clivage d'une séquence signal est situé entre les Alanines 23 et 24. Le cadre ouvert de lecture est bordé en 3' par une séquence non codante de 32 pb. Un transfert de Northern réalisé sur 1'ARN total de tachyzoltes révèle une seule population d'ARNm codant pour la protéine GP28.5. La taille du messager est estimée approximativement à 1100 pb, ce qui correspond à la taille du clone LcDNA. Pour définir plus précisément le site d'initiation de la transcription, une extension d'amorce a été effectuée avec 1'ARN total de tachyzoites, en utilisant comme amorce un oligo-nucléotide (CM10), correspondant aux positions 888 à 867 de la séquence. Par cette méthode, trois sites potentiels différents d'initiation de la transcription ont été localisés, respectivement à 105, 103 et 102 pb en amont du signal d'initiation de la traduction. Les deux premiers peuvent correspondre à des sites de transcription mineurs alors que le troisième est sans doute le site majeur d'initiation de la transcription. La séquence d'acides aminés de GP28.5 diffère de la séquence précédemment publiée par PRINCE et al. par une délétion des soixante-sept acides aminés N-terminaux. Pour vérifier le fait que cette séquence est bien celle qui code pour l'antigène GP28.5, la séquence en acides aminés correspondante a été comparée à celle de cinq peptides résultants du clivage par la trypsine de l'antigène GP28.5 purifié par HPLC comme décrit ci- dessous. La séquence de ces cinq peptides a été entièrement retrouvée dans la séquence en acides aminés déduite de celle du cadre ouvert de lecture du gène cloné. EXEMPLE 2 : PREPARATION DE PROTEINES RECOMBINANTES COMPRENANT DES FRAGMENTS DE LA SEOUENCE DE GP28.5 1) Protéines de fusion avec la Glutathion-S Transférase - Deux clones d'ADNc représentant des frag ments de la séquence de protéine GP28.5 ont été sousclonés dans le plasmide pGEX-2T [SMITH et al. Gene, 67:31 - 40 (1988)]. Le premier clone, FM16, code pour les cinquante-neuf acides aminés C-terminaux de GP28.5, et le deuxième clone L, représente 212 acides aminés de GP28.5. 5 autres fragments (figure 3) codant pour des portions de la protéine GP28.5 ont également été sousclonés dans les plasmides pGEX-2T et pGEX-3X (SMITH et al., cité) - le premier clone, ptg.Gra2.1, dérivé du clone LcDNA, code pour 212 acides aminés dont les 185 de GP28.5 - le second clone, ptg.Gra2.2, dérivé du clone cDNA FM16, code pour les 59 acides aminés C-terminaux de la protéine GP28.5 - le troisième clone, ptg.Gra2.3, code pour 50 acides aminés (acide aminé 127 à acide aminé 176 inclus, voir figure 3) - le quatrième clone, ptg.Gra2.4, code pour 186 acides aminés - le cinquième clone, ptg.Gra2.5, code pour 129 acides aminés (partie N-terminale de la protéine GP28.5, jusqu'à l'acide aminé 129 inclus) - le sixième clone, ptg.Gra2.6, code pour 171 acides aminés (à partir de l'acide aminé 15 inclus) - le septième clone, ptg.Gra2.7, code pour 155 acides aminés (à partir de l'acide aminé 31 inclus). Les plasmides pGEX-2T et pGEX-3X contenant les inserts d'ADN ont été utilisés pour transformer des bactéries E. coli JM 109. L'expression et la purification des protéines recombinantes ainsi que de la GST seule ont été effectuées selon le protocole décrit par SMITH et JOHNSON (référence précitée). Une culture de E. coli JM 109 au milieu de la phase logarithmique a été stimulée par 0,1 mM de IPTG. Après 1 heure de croissance à 37 , les cellules sont refroidies sur la glace et centrifugées à 4000 rpm pendant 15 minutes Le culot est re-suspendu dans 0,02 M PBS, 0,5 mM PMSF, 1 mM EDTA, 1% TRITON X 100. Les cellules sont soniquées sur la glace et centrifugées à 10 000 g pendant 5 minutes. Les protéines recombinantes sont purifiées à partir du surnageant, par chromatographie d'affinité sur de l'agarose-glutathion. L'expression des protéines recombinantes a été contrôlée par immunotransfert en utilisant l'anticorps monoclonal TG17-179 ou le sérum polyclonal de souris dirigé contre l'antigène GP28.5 purifié. Les protéines recombinantes correspondant aux clones ptg.Gra2.2 (59 acides aminés) et ptg.Gra2.3 (50 acides aminés) ont été purifiées avec un rendement élevé.En revanche, les protéines recombinantes correspondant aux clones ptg.Gra2.1 (212 acides aminés), ptg.Gra2.4 (186 acides aminés) et ptg.Gra2.5 (129 acides aminés) n'ont été obtenus qu'avec des rendements faibles qui semblent dûs à la dégradation des protéines d'une part et à la présence de la séquence signal (les 23 premiers acides aminés de la protéine GP28.5) dans les protéines recombinantes. 2) Protéines de fusion avec la ss-galactosidase Des phages lysogènes recombinants ont été produits à partir du clone original de kgtll FM16, chez E. coli Y1089, selon le procédé décrit par HUYNH et al. [Glover, D.M. ed. vol. 1, 49-78 IRL Press, Oxford (1985)]. Des lysats bruts contenant la ss-galactosidase de type sauvage ou bien la protéine de fusion avec la 5-galactosidase ont été préparés par induction de cultures en phase logarithmique par chauffage à 45"C pendant 20 minutes et addition de isopropyl --D-thiogalacto-pyranoside à une concentration de 10 mM. Après une incubation supplémentaire à 37 C pendant 1 heure, la culture a été concentrée, dans un tampon 0,01 M Tris pH8, 0.1 M EDTA, 10 mM NaCl, puis lysée par addition de 0,25 mg de lysozyme, 0,01 M MgCl2, et 0,2% TRITON X100, et enfin traitée par la DNAseI à 37 C pendant 30 minutes. Les clones FM1 et FM16 réagissent beaucoup plus fortement avec l'anticorps TG 17-179 que le clone FM3. La carte de restriction montre que les inserts EcoRI de 450 pb (FM3), 550 pb (FM1) et 650 pb (FM16) contiennent des séquences qui se chevauchent. Le séquençage de ces clones a révélé que les cadres de lecture en phase avec celui de la ss-galactosidase étaient de seulement 17 pb pour FM3, et 95 pb et 172 pb pour FM1 et FM16 respectivement, le reste des inserts correspondant à la région 3' non traduite plus la queue polyA. I1 apparaît donc que le peptide correspondant aux 5 amino acides C-terminaux de l'antigène GP28.5 codé par le clone FM3, est suffisant pour obtenir une réaction antigénique. II) PURIFICATION DE L'ANTIGENE GP28.5 EXEMPLE 3 : PURIFICATION DE L'ANTIGENE GP28.5 PAR HPLC. 1010 tachyzoites de la souche RH ont été lavés deux fois avec 10 mM PBS, pH 7,2. Après centrifugation à 1000 g pendant 10 minutes, le culot a été incubé toute la nuit à 4 C sous agitation douce, à une concentration de 109 parasites/ml dans du tampon TEN (10 mM TRIS-HCL, pH 7,4 ; 2 mM EDTA ; 150 mM NaCl) additionné de 1% de NONIDET P40, de 100 U/ml d'aprotinine et de 40pM de PMSF. Après centrifugation à 3500 g pendant 20 minutes, le surnageant a été récupéré et filtré sur une membrane MILLIPORE de 0,22 Fm. Les protéines de tachyzoîtes extraites au NP40 ont été purifiées par chromatographie HPLC en phase inverse sur une colonne VYDAC C18 (300 A, taille des particules : 7 Fm, dimensions de la colonne 500x9mm). 8 ml d'extrait de protéines brutes ont été chargés sur la colonne C18 à 0% de solvant B [le solvant A est constitué de 0,5% v/v de TFA dans l'eau ; Le solvant B est un mélange 25/75/0,45 (v/v) d'eau/acétonitrile/TFA].Après 10 minutes d'élution isocratique, les protéines sont éluées avec un gradient de 0 à 100% de solvant B, pendant une durée de 180 minutes, à une vitesse d'élution de 2 ml par minute, et détectées à 215 nanomètres. Pour localiser l'antigène GP28.5, chaque fraction HPLC a été lyophilisée, et le lyophilisat a été dilué dans 100 W1 d'un mélange TEN/PBS, [10 mM, pH 8 (v/v)]. 1 Cil de chaque fraction a été testé par dot-blot en utilisant l'anticorps monoclonal TG17-179. 10 F1 (ce qui correspond à environ 12 g de protéine purifiée) de chacune des fractions qui ont montré une réaction positive, ont été déposés sur gel d'acrylamide en présence de 2-ME, Une coloration du gel au nitrate d'argent a permis de vérifier leur homogénéité et leur pureté.Un gel similaire a été réalisé et utilisé pour le transfert électrophorétique sur membrane de nitro-cellulose. L'antigénicité des fractions a été évaluée en incubant la membrane avec l'anticorps monoclonal TG17-179. La détection a été faite avec des anticorps anti-IgG de souris, marqués à la peroxydase. Le composant majeur de l'éluat est la protéine GP28.5. Le seul contaminant décelé est une protéine de 65 KDa. qui est également reconnue par l'anticorps TG17-179, et qui peut donc représenter soit un dimère de GP28.5, soit un antigène apparenté. III) PROPRIETES INMUNOLOGIOUES DE L'ANTIGENE GP28.5 ET DE SES FRAGMENTS EXEMPLE 4 : IMMUNISATION DES SOURIS ET ESSAIS DE PROTECTION. Des souris femelles OF1 âgées de 8 à 10 semaines ont été immunisées de la façon suivante quarante-deux, trente-cinq, vingt-sept et sept jours avant l'infection, les antigènes suivants - ESA correspondant à la sécrétion de 5.107 tachyzoïtes ou bien, - 15 Fg de GP28.5 purifiée par HPLC ont été mis en suspension dans 100 111 de PBS, émulsifié avec 100 111 d'adjuvant incomplet de FREUND et administrés par injection sous-cutanée. Des souris témoin ont été traitées selon le même protocole par du PBS additionné de 100 F1 d'adjuvant incomplet de FREUND. Le jour de l'infection, les sérums ont été collectés, puis une suspension de 1200 kystes dans 0,3 ml de PBS, pH7,2 a été administrée oralement. Les sérums des souris immunisées avec les ESA ou la GP28.5 purifiée par HPLC ont été testés par transfert immuno-électrophorétique, contre des antigènes ESA de tachyzoites extraits au NP40, afin de déterminer s'ils reconnnaissent l'antigène GP28.5. Il apparaît que le profil d'immuno-réactivité est sensiblement le même que la révélation soit faite avec l'immunsérum de souris ou bien avec l'anticorps monoclonal TG17-179 dans les deux cas, trois bandes d'environ 100, 65 et 28 KDa sont révélées. Les deux bandes de poids moléculaire le plus élevé qui sont reconnues par l'anticorps TG17-179 représentent probablement des polymères de GP28.5 La figure 2 représente le pourcentage de souris survivantes après l'infection. Cette figure montre que, alors que seulement 25% des souris témoin immunisées uniquement avec l'adjuvant incomplet de FREUND survivent 15 jours après l'infection, 75% des souris immunisées avec l'antigène GP28.5 purifié par HPLC sont encore vivantes 50 jours après l'infection. Lorsque les souris sont immunisées avec les antigènes ESA, 45% survivent 50 jours après l'infection. Ces résultats montrent que l'immunisation avec l'antigène GP28.5 purifié par HPLC conduit à une protection significative. EXEMPLE 5 REACTIVITE DES SERUMS HUMAINS AVEC LES PRO TEINES RECOMBINANTES ET RECONNAISSANCE DE L'EPITOPE C-TERMINAL Les sérums humains ont été obtenus à partir de patients porteurs d'une infection chronique par Toxoplasma gondii (TG positif). Des sérums de patients sains ont été utilisés comme témoin (TG négatif). Le test a été réalisé par ELISA, et la révélation faite en utilisant des anticorps anti-IgG humaines biotinylées ; la fixation de ces anticorps a été décelée en utilisant des complexes streptavidine-biotine marqués à la peroxydase. Le substrat de peroxydase utilisé est 1'OPD et la densité optique a été mesurée à 492 nm et exprimée par rapport à un témoin réalisé en utilisant comme antigène la GST, selon la formule suivante: DO = DO du sérum réagissant avec la protéine recombinante de 59 acides aminés - DO du sérum réagissant avec la GST. Dans ces conditions, la moyenne de la densité optique des sérums TG-négatifs était de 0,23. 74% des cinquante-neuf sérums TG-positifs étaient au dessus de cette densité optique. La corrélation avec un test conventionnel des anticorps anti-TG est de : R = 0,74 P. Malgré cette corrélation, des patients possédant de 50 à 100 UI/ml d'IgG anti-TG montrent des valeurs très dispersées de niveaux d'anticorps contre la protéine recombinante FM16 (les densités optiques s'échelonnent entre 0,35 et 1,5). I1 semble donc qu'un niveau homogène d'anticorps anti-TG puisse en fait réfléter des réponses variées à l'antigène GP28.5. Dix sérums négatifs en ELISA contre la protéine contenant les cinquante-neuf acides aminés ont été testés en immunotransfert contre la protéine de fusion contenant les 212 acides aminés (clone LcDNA). Huit de ces sérums réagissent avec la protéine comprenant les 212 acides aminés, alors que 7 des sérums de contrôle réagissent négativement. I1 est probable que ces sérums recon naissent des épitopes présents sur la protéine de 212 acides aminés, et plus proches de l'extrémité N-terminale que ceux portés par la protéine comprenant les cinquanteneuf acides aminés. La fixation de TG 17-179 à l'antigène recombinant FM16 a été testée en ELISA compétitif en présence de sérums de patients infectés ; le sérum a été ajouté à une dilution de 1/100 à la solution de l'anticorps monoclonal. Ces essais de compétition entre TG 17-179 et des sérums de patients infectés montrent que les anticorps polyclonaux humains réagissent avec l'épitope C-terminal de la GP28 .5 : parmi les 12 sérums humains testés, 10 inhibent à des degrés variés la fixation de TG 17-179 à la protéine de fusion FM16. La réactivité des protéines de fusion produites par les clones FM1 et FM3 avec l'anticorps TG 17-179 a également été testée ; FM1 et FM16 réagissent beaucoup plus fortement avec l'anticorps TG 17-179 que le clone FM3. Or, le séquençage de ces clones a révélé que le cadre de lecture en phase avec celui de la 13-galactosidase, est de seulement 17 pb pour FM3, et 95 pb et 172 pb pour FM1 et FM16 respectivement. I1 apparaît donc que le peptide codé par le clone FM3, et correspondant aux 5 amino acides C-terminaux de l'antigène GP28.5 est suffisant pour obtenir une réaction antigénique. Cependant, dans la mesure où il est également apparu que la liaison de l'anticorps monoclonal TG 17-179 à ce peptide FM3 est plus faible qu'aux peptides codés par les clones plus longs FM1 et FM16, les Inventeurs ont entrepris de déterminer la longueur optimale de l'épitope. EXEMPLE 6 : IMMUNOREACTIVITE DE PEPTIDES SYNTHETIOUES CORRESPONDANT A L'EXT MITE C-TERMINALE DE GP28.5 Des peptides se chevauchant et couvrant la séquence carboxy-terminale de GP28.5 (1 à 15 résidus) ont été synthétisés, en utilisant la méthode de MERRIFIELD [J. AM. Chem. Soc. 85, 214962154 (1963)]. Ils ont été testés par ELISA compétitif avec la protéine de fusion FM16. Les quinze acides aminés terminaux de GP28.5 contiennent l'épitope réagissant avec l'anticorps monoclonal TG17-179. La capacité de ce peptide à inhiber la réactivité en ELISA contre la protéine recombinante contenant les cinquante-neuf acides aminés, de sérums obtenus à partir de patients atteints d'infections aigues ou chroniques a été testée. Les deux types de sérums (aigu et chronique) sont inhibés, à un degré varié, par le peptide C-Terminal de quinze acides aminés. Pour les sérums chroniques, le pourcentage d'inhibition varie de 8 à 100% et on n'observe aucune corrélation avec la densité optique de départ. Le faible taux d'inhibition observé pour certains sérums peut être dû à la présence d'anticorps à faible affinité pour ce peptide. Toutefois, même en multipliant par dix la concentration du peptide, le pourcentage d'inhibition n'est pas augmenté.La spécificité de l'inhibition a été démontrée en utilisant comme témoin un peptide de séquence différente et de longueur similaire. Le pourcentage d'inhibition des sérums aigus varie de 15 à 90% et est également indépendant de la densité optique de départ. I1 apparaît donc que la réponse polyclonale à l'antigène GP28.5 implique une réactivité avec les quinze acides aminés C-Terminaux, réactivité dont le degré varie suivant les individus. En revanche, le degré de cette réponse ne varie apparemment pas entre l'infection aigue et l'infection chronique, aucune différence dans le pourcentage d'inhibition moyen pour chacun des deux groupes n'ayant été observée. Dans le cas de peptides présentant moins de 15 acides aminés, les résultats sont les suivants L'inhibition la plus forte de la liaison de l'anticorps monoclonal TG 17-179 à la protéine de fusion est obtenue avec des peptides comprenant entre 11 et 15 résidus. L'inhibition est toutefois obtenue avec l'octapeptide comprenant les 8 résidus C-terminaux. La liaison de TG 17-179 à l'heptapeptide C-terminal est 8 fois moins importante que sa liaison à l'octapeptide. Enfin l'immunoréactivité du peptide synthétique est perdue quand il comprend 6 acides aminés Cterminaux ou moins. L'octapeptide dépourvu de sa fonction COOH et l'octapeptide comprenant deux résidus C-terminaux additionnels (Alanine) ont été également été testés. Ces deux peptides ont pratiquement la même activité que l'octapeptide C-terminal : ceci montre que la fonction carboxyle n'est pas nécessaire à l'immunoréactivité de l'épitope reconnu par TG 17-179. Des mêmes peptides ont été testés en ELISA direct. Dans ces conditions l'immunoréactivité en fonction de la longueur du peptide décroît plus rapidement elle en effet perdue pour des peptides de longueur inférieure à 10 résidus. En conséquence, il apparaît qu'en ELISA direct, l'anticorps monoclonal nécessite un peptide plus long que dans le test par inhibition. Dans ce cas particulier, il est peu probable que ceci soit dû à une mauvaise absorption des peptides les plus courts sur la plaque de microtitration, étant donné la nature hydrophobique des amino-acides desdits peptides. Des peptides dépourvus de résidus C-terminaux ont également été synthétisés : alors que l'incubation de TG 17-179 avec l'octapeptide synthétique couvrant l'ensemble des résidus C-terminaux inhibe la liaison de la protéine de fusion recombinante, l'heptapeptide cor respondant dépourvu du résidu glutamine carboxy-terminal est 64 fois moins actif en tant que compétiteur, et l'hexapeptide dépourvu des deux résidus carboxy-terminaux est 104 fois moins actif. REVENDICATIONS 1) Préparation de protéines, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une préparation antigénique purifiée de l'antigène GP28.5 de T. gondii. 2) Fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence représentée dans la liste des séquences en annexe sous le n SEQ. ID N 1, et qui est celle du gène codant pour l'antigène GP28.5 de toxoplasme. 3) Fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce que sa séquence est dérivée de la séquence SEQ. ID. N 1, et en ce qu'il code pour un polypeptide comprenant un épitope de l'antigène GP28.5. 4) Fragment d'acide nucléique, selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide comprenant au moins les 5 acides aminés C-terminaux de l'antigène GP28.5. 5) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide comprenant un fragment N-terminal de l'antigène GP28.5. 6) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide comprenant le fragment 127-176 de l'antigène GP28.5. 7) Vecteurs recombinants caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un fragment d'acide nucléique selon l'une quelconque des Revendications 1 à 6. 8) Vecteurs recombinants selon la Revendication 7, caractérisés en ce qu'ils comprennent en outre des séquences propres à contrôler l'expression du gène de l'antigène GP28.5. 9) Cellules eucaryotes ou procaryotes transformées, caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins un vecteur recombinant selon l'une quelconque des Revendications 6 ou 7. 10) Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend 185 acides aminés, et en que sa séquence est celle de l'antigène GP28.5 de toxoplasme. 11) Protéine recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence de l'antigène GP28.5, éventuellement fusionnée avec une autre séquence polypeptidique. 12) Protéine recombinante selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend les 59 acides aminés C-terminaux de l'antigène GP28.5 13) Protéine recombinante selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle comprend les 212 acides aminés C-terminaux de l'antigène GP28.5 14) Protéine recombinante selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend les aminoacides 127-176 de l'antigène GP28.5. 15) Protéine recombinante selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend les aminoacides 1-129 de l'antigène GP28.5. 16) Protéine recombinante selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend les aminoacides 24-129 de l'antigène GP28.5. 17) Procédé de production d'une protéine recombinante selon l'une quelconque des Revendications 10 à 16, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on procède à la mise en culture d'une cellule transformée selon la Revendication 9. 18) Fragment peptidique caractérisé en ce qu'il constitue un épitope de l'antigène GP28.5. 19) Fragment peptidique selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les 5 acides aminés C-terminaux de l'antigène GP28.5. 20) Fragment peptidique selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend entre 5 et 15 acides aminés C-terminaux de Go28,5. 21) Fragment peptidique selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il comprend les 8 acides aminés C-terminaux de GP28.5. 22) Fragment peptidique selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les acides aminés 24-129, de préférence 55 à 70 de l'antigène GP28.5. 23) Fragment peptidique selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les acides aminés 140 à 160 de l'antigène GP28.5. 24) Compositions antigéniques caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un antigène pris dans le groupe constitué par - une préparation purifiée de l'antigène GP28.5 selon la revendication 1 - un polypeptide ayant la séquence de l'antigène GP28.5, selon la revendication 10 - un fragment dudit polypeptide représentant un épitope de l'antigène GP28.5, selon une quelconque des revendications 18 à 23 - une protéine recombinante comprenant tout ou partie de la séquence peptidique de l'antigène GP28.5, selon une quelconque des revendications 11 à 16. 25) Procédé de préparation d'anticorps anti GP28.5, caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on immunise un animal avec une composition antigénique selon la revendication 24. 26) Utilisation de compositions antigéniques selon la revendication 24 pour l'obtention de réactifs de diagnostic. 27) Utilisation de compositions antigéniques selon la revendication 24 pour l'obtention de vaccins.