FR 2678282 A1 19921231 FR 9108039 A 19910628 SéQUENCES AMPLIFICATEUR ET S ILENCEUR ISOLES DU PROMOTEUR DE LA GPIIb, ET LEURS APPLICATIONS L'Invention est relative à des séquences régulatrices de l'expression d'un gène, isolées du promoteur du gène codant pour la protéine GPIIb. La protéine GPIIb correspond à la sous-unité a d'une protéine de surface des plaquettes sanguines, dénommée GPIIb-IIIa. La protéine GPIIb-IIIa, qui appartient à la famille des intégrines, est un récepteur spécifique du fibrinogène, de la fibronectine, et du facteur de Von Willebrand. Alors que la sous-unité ss (GPIIIa) de cette intégrine s'exprime dans différents types cellulaires (mégacaryocytes, cellules endothéliales, macrophages, fibroblastes, etc ...), la sous-unité GPIIb n'est exprimée que dans les mégacaryocytes qui sont les cellules précurseurs des plaquettes sanguines. Pour cette raison, il a été proposé d'utiliser cette protéine, dans le cadre d'études sur les mécanismes de l'hématopoièse, pour étudier spécifiquement la mégacaryocytopoièse. Au cours de leurs recherches précédentes, les Inventeurs ont cloné le gène de la GPIIb humaine, [PRANDINI et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 595-601, (1988)]. Ils ont plus particulièrement étudié la région flanquant en 5' la séquence codant pour la GPIIb, et ont identifié une séquence d'l,l kb environ, en amont du codon d'initiation de la GPIIb, qui joue un rôle de promoteur. Ultérieurement, pour caractériser l'activité de ce promoteur, ils ont réalisé des constructions dans lesquelles un gène rapporteur CAT (gène codant pour la chloramphénicol-acétyl-transférase) a été placé sous contrôle dudit promoteur. Les résultats de ces travaux sont exposés dans l'article de UZAN et al. [J. Biol. Chem., 266, 14, 1932-1939,(1991)]. Ces travaux ont permis d'identifier différentes régions du promoteur qui inter agissent avec des facteurs nucléaires se fixant à 1'ADN. Ils ont en particulier identifié une région centrée sur le nucléotide -54 (les positions des nucléotides sont localisées à partir de la première base de la séquence codant pour la GPIIb), qui est similaire au site de liaison d'un facteur nucléaire de type El, une région localisée aux alentours de -233 qui contient une séquence consensus CCAAT (qui est à rapprocher du site de liaison CAAT existant dans le gène de lla-globine). Ils ont également localisé deux domaines respectivement centrés sur les positions -345 et -540, fixant des protéines ubiquitaires, présentes dans différents types cellulaires. Enfin, ils ont localisé deux autres domaines respectivement centrés sur les positions -460 et -510, qui interagissent avec des protéines qui ne sont présentes que dans des cellules mégacaryotiques. Ils ont en outre constaté que la délétion de la région contenant ces deux domaines induit une diminution significative de l'activité du promoteur (de l'ordre de 60*). Cette région apparaît donc comme contenant une séquence de régulation positive spécifique des mégacaryocytes. La mise en évidence de telles régions de régulation présente un grand intérêt pratique, dans la mesure où elle permet d'envisager d'intervenir sur la régulation des gènes présents dans les mégacaryocytes, ou introduits dans ces derniers par génie génétique.Ceci permet d'obtenir des modèles précieux pour élucider le mécanisme de la thrombogénèse, aussi bien in-vitro dans des cultures cellulaires, que in-vîvo, par exemple dans des animaux transgéniques. il est toutefois nécessaire, pour pouvoir utiliser les propriétés de telles séquences de régulation, de connaître à la fois leur localisation et leur mécanisme de fonctionnement Les Inventeurs, en poursuivant leurs travaux, ont maintenant démontré le rôle de certaines des séquences de régulation présentes dans le promoteur de la GPIIb, et en outre, ont mis en évidence de nouvelles séquences ayant une fonction de régulation. Ils ont ainsi constaté qu'un fragment d'ADN de 192 pb correspondant à la séquence située entre la position -598 et la position -406, et comprenant les domaines D et E de fixation des protéines nucléaires, comprenaient un domaine amplificateur ("enhancer"). En effet, ils ont montré que les propriétés de ce fragment sur l'augmentation de l'expression du gène sont conservées quelque soit son orientation et sa situation par rapport au promoteur, que ce domaine amplificateur est actif aussi bien sur le promoteur de la GPIIb, que sur un promoteur hétérologue. Ils ont également montré que les deux domaines D et E étaient nécessaires à l'activité de l'amplificateur.Enfin, les Inventeurs ont constaté que, contrairement à ce que l'on pensait jusqu'à présent, cet amplificateur n'était pas actif uniquement dans les mégacaryocytes, mais également dans les cellules de la lignée érythrocytaire. En outre, les Inventeurs ont localisé dans le promoteur de la GPIIb, un nouveau domaine, dont la fonction n'avait pas été soupçonnée jusqu'alors. Ce domaine qui est situé dans la séquence comprise entre les positions -78 et -107 du promoteur de la GPIIb, remplit une fonction de type silenceur ("silencer") , ce silenceur est inactif dans les cellules de la lignée mégacaryocytaire. Les Inventeurs ont également mis en évidence une séquence comprise entre -les positions -29 et -13 du promoteur de la GPIIb, et qui contient un domaine dont la présence est indispensable pour assurer l'expression basale non tissu-spécifique de ce promoteur. La présente Invention a pour objet une séquence d'ADN constituant un amplificateur pour contrôler l'expression d'un gène dans les cellules des lignées érythrocytaires ou mégacaryocytaires, laquelle séquence est caractérisée en ce qu'elle comprend deux domaines - un domaine comprenant une séquence homologue de la séquence (I) suivante (I) 5' TCCTAGAAGGAGGAAGTGGGTAAATG 3' 3' AGGATCTTCCTCCTTCACCCATTTAC 5' - et un domaine comprenant une séquence homologue de la séquence suivante (II) (II) 5' CTCAGGTTTTATCGGGGGCAGCAGCT 3' 3' GAGTCCAAAATAGCCCCCGTCGTCGA 5'. La séquence I est celle du domaine (E) située entre les positions -526 et -501 du promoteur de la GPIIb, la séquence II est celle du domaine (D) située entre les positions -476 et -451 du promoteur de la GPIIb. Au sens de la présente Invention, on entend par séquence homologue, toute séquence ne différant des séquences de l'invention que par la substitution, la délétion ou l'addition d'un petit nombre de bases, a condition, bien entendu, que ces séquences conservent les propriétés fonctionnelles essentielles des séquences de l'invention. Dans le cas des séquences mentionnées ci-dessus, il est essentiel que soit conservés , pour la séquence I, le motif GG CC (correspondant aux positions -515 et -516 du promoteur de la GPIIb), et pour la séquence II, le motif TC AG (correspondant aux positions -463 et -464 du promoteur de la GPIIb) ; ces motifs sont en effet indispensables à l'activité amplificateur. Selon un mode de réalisation préféré de la séquence amplificateur conforme à l'invention, elle est constituée par une séquence homologue de celle du frag ment d'ADN situé entre les positions -599 et -405 du promoteur de la GPIIb. L'invention a également pour objet une séquence d'ADN constituant un silenceur, inhibant l'effet de la séquence amplificateur définie ci-dessus, et inactif dans les cellules de la lignée mégacaryocytaire, laquelle séquence est caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence homologue de la séquence (III) suivante (tir) 5' GCCCTTTGCTCTGCCCGTTG 3' 3' CGGGAAACGAGACGGGCAAC 5' Selon un mode de réalisation préféré d'une séquence silenceur conforme à l'invention, elle est constituée par une séquence homologue de la séquence (IV) suivante (IV) 5' CTATAGCCCTTTGCTCTGCCCGTTGCTCAG 3' 3' GATATCGGGAAACGAGACGGGCAACGAGTC 5' La séquence III correspond à la séquence comprise entre -102 et -83 dans le promoteur de la GPIIb. La séquence IV correspond à la séquence comprise entre -107 et -78 dans le promoteur de la GPIIb. L'Invention a également pour objet des frag ments d'ADN recombinant, comprenant au moins un exemplaire d'une séquence amplificateur telle que définie plus haut, et/ou au moins un exemplaire d'une séquence silenceur telle que définie plus haut. Ces fragments d'ADN recombinant sont destinés à servir de base à d'autres constructions, dans lesquelles ils sont associés à un promoteur sous contrôle duquel on désire faire exprimer un gène, en particulier dans des cellules des lignées érythrocytaires ou mégacaryocytaires. L'invention a également pour objet, des vecteurs recombinant s (virus, plasmides, etc...) comprenant au moins un fragment d'ADN recombinant tel que défini plus haut, éventuellement associé à un promoteur, et à un gène que l'on désire faire exprimer sous contrôle dudit promoteur. L'invention a en outre pour objet, des cellules procaryotes ou eucaryotes transformées par au moins un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. L'Invention trouve de nombreuses applications dans l'étude et le traitement des maladies hématologiques, et en particulier des thromboses, où elle fournit des outils permettant d'étudier et de modifier éventuellement le comportement de lignées cellulaires, en particulier celui de la lignée érythrocytaire et de la lignée mégacaryocytaire. Elle permet également de moduler de façon tissu-spécifique, l'expression de différents gènes, en les plaçant sous contrôle des séquences amplificateur et/ou silenceur, ou au contraire, en supprimant ce contrôle. il est par exemple envisageable de faire exprimer spécifiquement dans des plaquettes sanguines des gène ubiquitaires. Ces applications peuvent être mises en oeuvre aussi bien in-vitro, en cultures cellulaires, que in-vivo, par exemple en permettant l'obtention d'animaux transgéniques dans lesquels il serait possible de contrôler la thrombogénèse. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de Description qui va suivre, qui se réfère à des exemples donnant la démonstration des propriétés amplificateur ou silenceur de séquences conformes à l'invention. I1 doit bien être entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 - CARACTERISATION DU DOMAINE AMPLIFICATEUR Un fragment Hind III/Pvu I de 192 pb, correspondant à la séquence comprise entre les positions -598 et -406 du promoteur de la GPIIb, est inséré dans le plasmide pBLCAT3 [LUCKLOW et al. Nucleic Acid. Res., 15, 1311-1326 (1987)]. Trois constructions différentes sont effectuées. Dans deux d'entre elles le fragment de 192 pb est inséré en amont du promoteur de SV40, soit en orientation directe, soit en orientation inverse. Dans la troisième construction, le fragment d'ADN de 192 pb est inséré en orientation directe, en aval du gène codant pour la CAT. Des cellules HEL (type mégacaryocytaire), Hela (lignée épithéliale) et K562 (type érythrocytaire) sont transfectées avec les plasmides obtenus. Un témoin est réalisé en transfectant les mêmes cellules avec le plasmide pBLCAT3.L'activité CAT est mesurée dans toutes les cellules (on attribue arbitrairement à l'activité CAT mesurée dans les cellules transfectées par le plasmide pBLCAT3 la valeur 1). Dans ces conditions, les cellules HEL et K562 transfectées par les plasmides comprenant le fragment de 192 Pb ont une activité CAT augmentée (variant entre 3,6 et 6,3), alors que les cellules Hela transfectées par les mêmes plasmides ont une activité similaire à celle des cellules témoins (0,7 à 1,6) (Figure 1). I1 apparaît donc que le fragment d'ADN de 192 pb augmente l'activité d'un promoteur (promoteur de SV40), et ce, indépendamment de sa position et de son orientation ; il possède donc les caractéristiques d'un amplificateur. il s'agit en outre d'un amplificateur spécifique de certains tissus, dans la mesure où il est actif dans les cellules des lignées mégacaryocytaires et érythroides, mais pas dans les cellules épithéliales (Hela). EXEMPLE 2 - ANaLYSE DE LA REGION AMPLIFICATEUR I1 est connu (UZAN et al., J. Biol. Chem., 266, 14, 1932-1939,(1991)) que deux régions dénommées respectivement Domaine D et Domaine E, présentes sur le fragment de 192 Pb, interagissent avec des protéines nucléaires présentes dans les mégacaryocytes. Les Inventeurs ont maintenant recherché si cette interaction était en rapport avec l'activité amplificateur, et quelles étaient les régions des Domaines D et E qui étaient plus précisément impliqués dans cette interaction. Des oligonucléotides synthétiques de séquences identiques à celles des Domaines D et E ont été incubés avec des extraits nucléaires de cellules HEL. Après incubation, ces oligonucléotides ont été partiellement méthylés et analysés par déplacement sur gel. Les complexes ADN/protéines ont été élués, fragmentés par la technique de MAXAM et GILBERT, et les fragments ont été analysés sur gel de polyacrylamide. Cette expérimentation permet de montrer que dans le domaine D les nucléotides -463 et -464 interviennent dans la liaison ADN/protéines, tandis que dans le domaine E, ce sont les nucléotides -516 et -515 qui sont impliqués. Des expériences de mutations de ces nucléotides ont donc été effectuées [Mutations réalisées dans le phage M13 en utilisant le kit Oligonucléotide Directed In Vitro Mutagenesi. System Version 2, RPN 1523 (AMERSHAM)]. Les résultats sont illustrés par la figure 2, qui montre qu'une mutation, soit dans le Domaine E, soit dans le Domaine D, suffit à abolir totalement l'effet de la séquence amplificateur ; une mutation des 2 domaines à la fois n'a pas d'effet supplémentaire. Pour vérifier que cette observation, faite dans le cas d'un promoteur hétérologue, était également valable quand l'amplificateur était situé dans le promoteur de la GPIIb, les mêmes mutations ont été introduites séparément ou individuellement dans le plasmide dénommé -813, comprenant un fragment d'ADN correspondant à la séquence de 813 pb en 5' du codon d'initiation de la GPIIb, lequel fragment est placé au site XbaI du plasmide pBLCAT3, en amont de la séquence codant pour la CAT. Dans cette condition, une mutation dans le domaine D ou dans le domaine E produit une diminution de 60% de l'activité CAT. La même diminution est observée quand le fragment de 192 pb est excisé de la construction. Ceci montre que le Domaine D et le Domaine E sont tous deux nécessaires à l'activité de l'amplificateur. EXEMPLE 3 - CARACTERISATION DE LA SEQIJENCE SILENCEUR Des fragments du promoteur du gène de la GPIIb sont obtenus par délétions successives de l'extrémité 5' d'un segment d'ADN -643/+33 du gène de la GPIIb, en utilisant l'Exonucléase III comme décrit par UZAN et al. (publication précitée). Les fragments ainsi obtenus sont insérés dans le vecteur pBLCAT3 au site DaI en amont du gène CAT, et ce vecteur est utilisé pour transfecter des cellules HEL et Hela. Au fur et à mesure des délétions, les Inventeurs ont observé que, de façon surprenante, alors que l'activité CAT dans les cellules HEL diminuait (ce qui correspond à la perte de la séquence amplificateur), une activité CAT apparaissait dans les cellules Hela. A partir de la position -173, on observe une perte progressive de la spécificité de tissu, l'activité CAT étant équivalente dans les cellules HEL et les cellules Hela. Les Inventeurs ont donc postulé l'existence, dans cette région du promoteur, d'une séquence de régulation négative, et ont entrepris de la caractériser. Pour cela, les mutants obtenus par délétion de l'extrémité 5', comme décrit ci-dessus, ont été utilisés pour transfecter des cellules de la lignée K562 (cette lignée érythrocytaire n'exprime pas la protéine GPIIb). La figure 3 illustre les résultats obtenus. Ces résultats sont exprimés en activité CAT relative, par rapport à l'activité obtenue avec une construction contenant le fragment -643/+33 de la région promoteur de la protéine GPIIb (dans cette construction, l'amplificateur ne s'exprime pas dans les cellules K562). En abscisse, sont indiqués les emplacements des différentes délétions. Ces résultats montrent que l'activité de la région de régula tion négative diminue aux environs de la position -170, cette activité étant minimale entre les positions -103 et -73. Pour vérifier le rôle de cette région du promoteur, les inventeurs ont procédé à des mutations de cette région et de régions immédiatement adjacentes. Les séquences des fragments étudiés ont été remplacées par d'autres séquences ne présentant aucun rapport entre elles, synthétisées par la technique de l'amplification en chaîne par polymérase comme décrit dans la publication de M. KAMMANN et al. [Nucleic Acid. Res. li : 13, 5404, (1989)]. La première amplification est effectuée en utilisant sur le plasmide pBLIIbCAT3 une amorce 5' de 20 pb du plasmide pBLIIbCAT3 située à 80 pb en amont du site de clonage [le plasmide pBLIIbCAT 3 est décrit par UZAN et al. (publication précitée)].L'amorce 3 de 50 pb contient les régions suivantes - 2 séquences de 15 pb chacune, homologues à celles du promoteur sauvage, et qui encadrent la région à étudier - 1 région centrale de 20 pb dans laquelle la séquence du promoteur sauvage est substituée par une séquence totalement différente. Cette première amplification est effectuée en utilisant 10 ng de plasmide pBLIIbCAT3 comme matrice. Après purification, le fragment d'ADN obtenu à l'issue de cette première étape d'amplification est utilisé comme matrice pour une seconde amplification, en même temps qu'un fragment AccI-EcoRI de 664 pb obtenu à partir du plasmide pBLIIbCAT3. Ce fragment comprend 280 pb de la séquence codante pour la CAT. Pour cette seconde amplification, on utilise une amorce 3' correspondant à un fragment du gène de la CAT situé à 140 pb en aval du site d'initiation ; l'amorce 5' est la même que celle utilisée dans la première amplification. Trois types de mutants sont réalisés de la sorte - le premier, correspondant à la mutation de la séquence -83 à -102 du promoteur de la GPIIb est dénommé ci-après IIb S1 - le deuxième, correspondant à la mutation de la séquence -63 à -82 de la GPIIb est dénommé ci-après IIb S2 - et le troisième, correspondant à la mutation de la séquence -99 à -128 est dénommé ci-après IIb S3. Ces mutants sont ensuite introduits dans le lieur multisite du plasmide pBLCAT3, à la place d'un fragment excisé entre les sites HindIII et BamHI. Les plasmides obtenus sont utilisés pour transfecter des cellules des lignées HEL, Hela, K562 et Nalm 6 (lignée précurseur des lymphocytes B). L'activité CAT est mesurée dans les cellules transfectées - Dans les cas des mutants IIbS1, aucune différence d'activité n'est observée, dans la lignée HEL, entre les cellules transfectées par le plasmide mutant et les cellules transfectées par le plasmide sauvage ; il n'en est pas de même dans les cellules de lignées K562, Hela, Nalm 6, où l'on n'observe pas d'activité CAT lorsque les cellules sont transfectées par le plasmide de type sauvage, alors que cette activité apparaît lorsque les cellules sont transfectées par le plasmide mutant. - Dans le cas des mutants IIbS2 et IIbS3, l'activité CAT s'exprime dans les cellules HEL, et ne s'exprime pas dans les cellules K562, Hela et Nalm 6, que ces cellules soient transfectées par les plasmides mutants ou par le plasmide sauvage. Ceci montre que la région -83/-102 du promoteur de la GPIIb possède (ou contient une séquence possédant) une activité de type silenceur, qui s'oppose, dans les cellules n'appartenant pas à la lignée mégacaryocy taire, à l'activité de l'amplificateur. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente Invention. REVENDICATIONS 1) Séquence d'ADN constituant un amplificateur pour contrôler l'expression d'un gène dans les cellules des lignées érythrocytaires ou mégacaryocytaires, laquelle séquence est caractérisée en ce qu'elle comprend deux domaines - un domaine comprenant une séquence homologue de la séquence (I) suivante (I) 5' TCCTAGAAGGAGGAAGTGGGTAAATG 3' 3' AGGATCTTCCTCCTTCACCCATTTAC 5' - et un domaine comprenant une séquence homologue de la séquence suivante (II) (il) 5' CTCAGGTTTTATCGGGGGCAGCAGCT 3' 3' GAGTCCAAAATAGCCCCCGTCGTCGA 5'. 2) Séquence amplificateur selon la Revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence homologue de celle du fragment d'ADN situé entre les positions -599 et -405 du promoteur de la GPIIb. 3) Séquence d'ADN constituant un silenceur, inhibant l'effet de la séquence amplificateur selon la Revendication 1, et inactif dans les cellules de la lignée mégacaryocytaire, laquelle séquence est caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence homologue de la séquence (III) suivante (iii) 5' GCCCTTTGCTCTGCCCGTTG 3' 3' CGGGAAACGAGACGGGCAAC 5' 4) Séquence silenceur selon la Revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence homolgue de la séquence (IV) suivante (IV) 5' CTATAGCCCTTTGCTCTGCCCGTTGCTCAG 3' 3' GATATCGGGAAACGAGACGGGCAACGAGTC 5' 5) Fragments d'ADN recombinant comprenant au moins un exemplaire de la séquence amplificateur selon les Revendications 1 ou 2, et/ou au moins un exemplaire de la séquence silenceur selon l'une quelconque des Revendications 3 ou 4. 6) Vecteurs recombinants comprenant au moins un fragment d'ADN recombinant selon la Revendication 5, éventuellement associé à un promoteur, et à un gène que l'on désire faire exprimer sous contrôle dudit promoteur. 7) Cellules procaryotes ou eucaryotes transformées par un vecteur recombinant selon la Revendication 6. 8) Application de séquences amplificateur et/ou de séquences silenceur selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, à la modulation de l'expression des gènes dans des cellules en culture. 9) Application de séquences amplificateur et/ou de séquences silenceur selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, à l'obtention d'animaux transgéniques.