FR 2688784 A1 19930924 FR 9203224 A 19920318 La présente invention concerne des transporteurs d'oxygène ayant une structure similaire à l'hémoglobine et qui peuvent être utilisés comme substitut sanguin possédant une affinité réduite pour l'oxygène. La médecine d'urgence requiert de grandes quantités de sang en vue de la transfusion. Outre le problème d'approvisionnement et de stockage pouvant se poser, les transfusions font courir des risques de transmission de maladies infectieuses identifiées ou non et nécessitent, par la même, l'utilisation de procédés d'inactivation virale toujours délicats à mettre en oeuvre sur des protéines. I1 est donc souhaitable de pouvoir disposer d'un transporteur d'oxygène artificiel pouvant être substitué au sang dans un usage transfusionnel. C'est l'objet de la présente invention qui propose des transporteurs d'oxygène ayant des structures proches de celle de l'hémoglobine humaine (HbA). L'hémoglobine est le constituant principal du globule rouge, elle a pour fonction essentielle de fixer, transporter et délivrer la quantité d'oxygène nécessaire au fonctionnement normal des tissus. La molécule d'hémoglobine comporte deux parties, une partie protéique, la globine, et des groupements qui abritent des atomes de fer ferreux responsables de la fixation de l'oxygène, l'hème. La globine est un tétramère composé de quatre chaînes identiques deux à deux qui sont nommées, pour les chaînes peptidiques de 141 amino-acides, alpha, et pour les chaînes de 146 amino-acides, chaînes de type bêta ; pour cette raison la globine humaine normale est notée alpha2 bêta2. Le terme de chaîne de type bêta, ou "non alpha", recouvre, non seulement les chaînes bêta, mais également les chaînes dénommées epsilon, gamma ou delta. A chacune des chaînes polypeptidiques est lié un groupe héminique. Normalement chez l'adulte, plus de 95 % de l'hémoglobine sont constitués par du tétramère alpha2 bêta2, c'est-à-dire l'association de deux dimères hétérologues alpha-bêta, associés au complexe catalytique, l'hème, c'est-à-dire, l'hémoglobine A. On trouve 2 % à 3 % d'une hémoglobine constituée de tétramères alpha2 delta2, et des traces d'hémoglobine foetale alpha2 gamma2. La globine étant constituée par des chaînes protéiques, il était tentant d'essayer de préparer ces chaînes par des techniques mettant en oeuvre les ADN recombinants. Les techniques mises en oeuvre ont eu essentiellement pour but de faire synthétiser, par des organismes divers, les chaînes alpha et bêta, ce qui conduit à des procédés lourds d'expression séparée de chacune des chaînes ou des procédés mettant en oeuvre des systèmes de co-expression dont les résultats sont souvent peu satisfaisants. Ainsi, la demande de brevet WO 88/09179 a proposé ce type d'approche, à savoir la synthèse séparée des chaînes alpha et des chaînes bêta, en particulier sous forme de mutants non naturels. L'approche s'étant révélée relativement lourde, une demande de brevet plus récente, WO 90/13645, a proposé d'utiliser directement un dimère notamment de chaînes alpha destinées à être combinées avec des chaînes bêta. Bien que cette approche soit intéressante, elle nécessite, là encore, l'obtention séparée de séquences alpha et de séquences bêta qui doivent être recombinées, même si celles-ci peuvent se présenter chacune sous forme de dimère afin de permettre la formation d'un tétramère.stable. La présente invention a pour objet un transporteur d'oxygène qui ne nécessite la synthèse que d'un seul type de chaîne, ce type de chaîne pouvant être associé sous forme d'un tétramère portant l'hème et capable de fixer de façon réversible l'oxygène. Plus particulièrement, la présente invention concerne un transporteur d'oxygène du type comportant au moins quatre chaînes polypeptidiques de type globine pratiquement identiques, susceptibles de s'associer ou d'être associées entre elles en incorporant l'hème, afin d'assurer une activité de fixation réversible de l'oxygène. Dans la définition précédente, il faut entendre que par la terminologie "chaînes polypeptidiques de type globine" on se réfère aux chaînes de type alpha ou aux chaînes de type beta, et que ces chaînes sont pratiquement identiques, de préférence sont totalement identiques. Ce type de transporteur se distingue donc des transporteurs de la technique antérieure dans lesquels on prévoit toujours deux types de chaînes distinctes qui sont susceptibles de s'associer, comme par exemple des chaînes alpha et bêta, même si, au demeurant, ces chaînes comportent certaines modifications ou se présentent sous forme de chimère. Le transporteur d'oxygène selon la présente invention peut présenter deux modes de réalisation différents. Dans un premier mode de réalisation, les quatre chaînes polypeptidiques sont identiques et leur structure qui emprunte aux chaînes alpha et aux chaînes de type becta, est telle qu'elles vont pouvoir s'associer en reconstituant une interface similaire à l'interface alphal,beta2 qui intervient dans l'association des chaînes alpha et des chaînes bêta de l'HbA naturelle. Dans un second mode de réalisation, les chaînes sont identiques et sont, en particulier, toutes des chaînes bêta qui vont être associées, sous forme d'un tétramère. Plus particulièrement, dans le premier mode de réalisation, la présente invention concerne des transporteurs d'oxygène artificiels tels que décrits précédemment, comportant au moins quatre chaînes polypeptidiques incorporant l'hème et ayant chacune une structure de type globine séquence v - (w) - X - (Y) - Z dans laquelle - V, X, et Z sont des séquences polypeptidiques de type globine, et - (W) et (Y) sont deux séquences polypeptidiques complémentaires susceptibles d'interagir pour constituer une interface qui, lorsqu'elle appartient à deux chaînes disctinctes, est au moins en partie similaire à l'interface alpha1 bêta2, lesdites chaînes pouvant s'associer en reconstituant ladite interface similaire à l'interface alpha1 bêta2 afin d'assurer une activité de fixation réversible et coopérative de l'oxygène. Dans ce type de transporteur d'oxygène selon l'invention, les quatre chaînes polypeptidiques associées dans un tétramère, sont associées "tête-bêche" afin que la mise en regard des séquences W1 de l'une des chaînes avec la séquence Y2 de l'autre chaîne conduise, parallèlement, à la mise en rapport de la séquence Y1 de la première avec la séquence W2 de la seconde pour reconstituer au moins en partie l'interface alphal,bêta2 de l'hémoglobine naturelle. Cette interface entre les chaînes alpha et les chaînes bêta est impliquée dans la transition conformationnelle responsable en partie de la fixation et de la libération de l'oxygène, sa reconstitution permet d'obtenir des transporteurs d'oxygène ayant des propriétés satisfaisantes. Bien entendu, les chaînes polypeptidiques devront présenter des structures qui les rapprochent des chaînes de type alpha ou des chaînes de type bêta. Ainsi, notamment, la séquence polypeptidique de type globine X comportera un ou plusieurs segments hélicoïdaux choisis parmi les segments hélicoïdaux D, E et F des chaînes de type alpha ou bêta, lesdits segments pourront être reliés entre eux par des segments non hélicoïdaux ou par des liaisons simples. La séquence polypeptidique de type globine V comportera un ou plusieurs segments hélicoïdaux choisis parmi les segments hélicoïdaux A, B et C des chaînes de type alpha ou bêta, lesdits segments pourront être reliés entre eux par des segments non hélicoïdaux ou par des liaisons simples La séquence polypeptidique de type globine Z comportera un ou plusieurs segments hélicoïdaux choisis parmi les segments hélicoïdaux G et H des chaînes de type alpha ou bêta, lesdits segments pourront être reliés entre eux par des segments non hélicoïdaux ou par des liaisons simples. Mais, s'il est clair que les segments hélicoïdaux jouent un rôle important dans la structure du tétramère normal et qu'il faudra retrouver ce type de structure dans le tétramère synthétique, il est toutefois possible de prévoir l'association de segments hélicoïdaux d'origine différente, c'est-à-dire soit de type alpha, soit de type bêta, quant aux segments non hélicoïdaux, ils peuvent être des segments ayant la structure de leurs homologues naturels et/ou être de nature différente même si, au demeurant, l'utilisation de séquences homogènes tout alpha ou tout bêta peut être préférée. De façon préférentielle, les segments de la formule générale seront choisis de la manière suivante V alpha = NA + A + AB +B + C W alpha = CE (interface alphal/beta2) X alpha = E + EF + F Y alpha = FG (interface alphal/beta2) Z alpha = G + GH + H + HC V beta = NA + A + B + C W bêta = CD (interface alpha1/béta2) X beta = D + E + EF + F Y bêta = FG (interface alpha1/béta2) Z bêta = G + GH + H + HC Enfin, l'interface alpha1 bêta2 telle qu'elle peut être reconstituée par les chaînes séquencées selon la présente invention est de préférence la suivante ( C2 36Pro Val96 G3 ) ( C3 37Trp Pro95 G2 ) W(bêta-alpha)l ( C6 40Arg Asp91 G1 ) Y(béta-alpha)2 ( C7 41Phe Val93 FG5) Arg92 FG4) Leu91 FG3) ( FG3 91 Leu ( FG4 92Arg ( FG5 93Val Phe41 C7 ) Y(bêta-alpha)1 ( G1 94Asp Arg40 C6 ) W(bêta-alpha)2 ( G2 95Pro Trp37 C3 ) ( G3 96Val Pro36 C2 ) En outre, les différents segments hélicoïdaux ou non pourront également comporter des mutations par rapport à leurs homologues naturels, comme cela sera décrit ci-après. Ces mutations concernent de manière préférée la sous-unité de type bêta, plus stable. On peut citer plus particulièrement les mutations suivantes de la chaîne de type bêta - remplacement de His en position 2 par Met - remplacement de Val en position 23 par Ile (Pagnier et al, 1990) - remplacement de Ala en position 27 par Ser (Baklouti et al, 1986 ; Fessas et al, 1982 ; Huang et al, 1990) - remplacement de Phe en position 41 par Tyr - remplacement de His en position 63 par Phe (Lin et al, 1990 ; Nagai et al, 1987, 1988) - remplacement de His en position 63 par Ile (Lin et al, 1990 ; Nagai et al, 1987, 1988) - remplacement de Val en position 67 par Phe (Lin et al, 1990 ; Nagai et al, 1987, 1988) - remplacement de Val en position 67 par Ile (Lin et al, 1990 ;Nagai et al, 1987, 1988) De telles mutations permettent de diminuer l'affinité intrinsèque du transporteur pour l'oxygène, tout en maintenant un effet de coopérativité. D'autres mutations ont également été décrites et peuvent très bien être incorporées dans les hémoglobines selon la présente invention. I1 peut s'agir notamment de l'une ou de plusieurs des mutations figurant au tableau 1 ci-après. Tableau 1 Variants naturels de l'Hb humaine présentant une diminution de l'affinité pour l'oxygène Mutants de la chaîne a Hémoglobine mutation Références Torino &alpha;43 (CEI)Phe#Val Beretta et al, 1968 Hirosaki a43 (CE1) Phe # Leu Ohba etal, 1975a Moabit a86 (F7) Leu o Arg Knuth et al, 1979 Sétif &alpha;94(G1)Asp#Tyr Wajcman et al, 1972 Titusville &alpha;;94(G1)Asp#Asn Schneider et al, 1975a Mutants de la chaîne ss Hémoglobine mutation Références Raleigh ss1(NA1) Val e ac-Ala Moo-Penn etal, 1977 Connecticut ss21(B3)Asp#Gly Moo-Penn et al, 1981 Moscva 1324 (B6) GIy # Asp Idelson et al, 1974 Auckland ss25 (B7) Gly # Asp Williamson etal, 1987 Knossos 1327 (B9) Ala # Ser Baklouti et al, 1986; Fessas et al, 1982 Rothschild 1337 (C3) Trp Arg Gacon etal, 1977 Hazebrouck ss38(C4)Thr#Pro Bloquit et al, 1984 Hammersmith ss42(CDl)Phe#Ser Dacie et al, 1967;Ohba et al, 1975b Bucuresti 1342 (CD1) Phe # Leu Bratu etal, 1971; Keeling et al, 1971 Tableau 1 (suite) Sendgagi ss-42(Cdl)Phe#Val Ogata et al, 1986 Chervely 1345 (CD4) Phe # Sg Yeager et al, 1983 Okaloosa 1348 (CD7) Leu # Arg Charache etal, 1973 Bologna 1361 (E5) Lys # Ment Marinucci et al, 1981 J-Cairo 1365 (E9) Lys o Gln Garel etal, 1976 Chico 1366 (E10) Lys e Thr Shih etal, 1987 Bristol ss-67(E11)Val#Asp Steadman et al, 1970 Seattle ss70(E14)Ala#Asp Kurachietal, 1973 Vancouver 1373 (E17) Asp Tyr Jones etal, 1976 Korle-Bu 1373 (E17) Asp # Asn Konotey-Ahulu etal, 1968;; Wajcman & Jones, 1977 Mobile ss73(E17)Asp#Val Schneider et al, 1975b Tilburg 1373 (E17) Asp # Gly Bernini & Giordano, 1988 Aalborg ss74(E18)Gly#Arg Williamson et al, 1990 Calais 1376 (E20) Ala # Pro Wajcman etal, 1991 Providence ss82 (EF6) Lys # Asn e Asp Bonaventura etal, Moo-Penn etat, 1976 Pyrgos 1383 (EF7) Gly # Asp Tatsis etal, 1976 Agenogi ss90 (F6) Glu o Lys Miyaji et al, 1966 Roseau Point-.e à Pitre 1390 (F6) Glu # Gly Mérault et al, 1985 Cribbeau ss91(F7)Leu#Arg Ahem et al, 1976 Kansas ss102 (G4) Asn # Thr Bonaventura & Riggs, 1968 Beth Israel ss102(G4)Asn#Ser Nagel et al, 1976 Saint-Mandé ss102(G4)Asn#Tyr Arous et al, 1981 Burke 13107 (G9) Gly -4 Arg Tumeretat, 1976 Yoshizuka ss108(G10)Asn#Asp Imamura et al, 1969 Presbyterian 13108 (G10) Asn # Lys Moo-Penn etal, 1978 Tableau 1 (suite) Peterborough 13111 (G13) Val # Phe King etal, 1972 New-York ss113(G15)Val#Glu Ranney et al, 1967 D-Punjab ss121 (GH4) Glu e Oln Baglioni, 1962 La Desirade ss129(H7)Ala#Val Mérault et al, 1986 Yamagata ss132 (H10) Lys o Asn Harano etal, 1990 Hope ss136 (H14) Gly -4 Asp Minnich et al, 1965 Himeji ss140 (H18) Ala # Asp Ohba etal, 1986 NB:n'ont été pris en compte que les hémoglobines contenant une seule mutation soit dans 1: sous-unité a, soit dans la sous-unité ss. Comme cela a été indiqué précédemment, les séquences W et Y doivent permettre de reconstituer une interface alpha1 bêta2 de HbA ou similaire qui est impliquée dans la transition R T. C'est pourquoi, les segments (W) et (Y) seront similaires aux segments C/CD et FG/G de l'interface alphal bêta2 de l'hémoglobine humaine, mais il est possible de la modifier si besoin est en prévoyant certaines mutations ponctuelles. Les éléments essentiels impliqués dans la structure de l'interface alphal bêta2 sont les suivants: Chaîne Chaîne Chaîne Chaîne Bêta Alpha Bêta Alpha 37Trp 38Thr Tyrl45 Tyrl40 40Arg 41Thr AsnIO2 Asn97 41 Phe 42Tyr Glu 101 Val96 96Leu 9îLeu Asp99 Asp94 97His 92Arg His97 Arg92 98Val 93Val Phe41 Tyr42 99Asp 94Asp Arg40 Thr41 100Pro 95Pro Gln39 Lys40 101Glu 96Val Trp37 Thr38 145Tyr 140Tyr Pro36 Pro37 On peut prévoir les mutations figurant au tableau 2 ci-après. Tableau 2 Exemples de mutations de résidus situés à l'interface &alpha;1ss2 Site mutation particularité de la mutation 1340 (C6) Arg# Asp charge négative encombrement plus faible que Arg Arg#Val hydrophobe fort encombrement stérique Arge Ala hydrophobe faible encombrement stérique Arg# Ser groupement hydroxyle faible encombrement stérique Arg# Lys propriétés proches de celle de Arg 1341 (C7) PheeTyr groupement hydroxyle possibilité de liaison H ss101 (G3) Glu#Ala hydrophobe faible encombrement stérique ss102 (G4) Asn#Ala hydrophobe faible encombrement stérique Asn# Gly encombrement stérique nul Parmi les chaînes polypeptidiques plus particulièrement intéressantes, il faut citer les chaînes mixtes alpha,bêta, c'est-à-dire notamment les chaînes constituées de l'extrémité N-terminale d'une chaîne de type bêta de la globine, et de l'extrémité C-terminale de la chaîne alpha de la globine ; ou, réciproquement, une chaîne constituée de l'extrémité N-terminale d'une chaîne alpha de la globine et de l'extrémité C-terminale d'une chaîne de type bêta de la globine-. Ces sous-unités chimériques seront notées, respectivement, NH2bêta-alphaCOOH ou NH2alpha-bêtaCOOH. La jonction alpha-bêta se situera de préférence au niveau de la zone flexible de la poche de l'hème, c'est-à-dire dans le segment EF. Le polypeptide le plus intéressant comporte ltextrémité N-terminale de la chaîne bêta de la globine fusionnée jusqu'à l'amino-acide 73 compris à la partie C-terminale de la chaîne alpha de la globine à partir de l'amino-acide 69 compris. Ce type de molécule chimérique associée sous forme tétramérique est représenté à la figure 8 sur laquelle on a visualisé les interfaces alpha bêta reconstituées dans le tétramère. Il est possible de prévoir que deux chaînes polypeptidiques soient reliées par une séquence, de préférence peptidique, située entre la séquence Z de l'une et la séquence V de l'autre, les deux chaînes sont ainsi solidaires, ce qui favorise la stabilité du tétramère. Les deux chaînes peuvent également être reliées par réticulation ou par tout type d'interaction biochimique comme par exemple des liaisons de pontage covalent (dérivés de diaspirine ou de pyridoxal phosphate). Le transporteur d'oxygène selon l'invention comportera une structure héminique ; il peut s'agir d'une molécule d'hème naturel ou bien d'une métalloporphyrine dans laquelle l'atome de fer est remplacé par un autre métal notamment le cobalt. Dans le second mode de réalisation de l'invention, le tétramère est constitué essentiellement de quatre polypeptides identiques ayant chacun une structure de type bêta-globine. Ce type de tétramère dénommé bêta4 sera, de préférence, constitué par des chaînes de type bêta comportant l'une des mutations citées précédemment. Il pourra, comme cela a été décrit, être préparé par association de dimères, ces dimères étant formés par liaison des extrémités N et C terminales de deux sous-unités. Le transporteur d'oxygène selon l'invention présente en général une affinité pour l'oxygène diminuée par rapport à l'hémoglobine naturelle, de préférence, cette affinité est diminuée d'au moins 20 96 par rapport à celle de l'hémoglobine naturelle. Le transporteur selon la présente invention est, de préférence, obtenu par culture d'un organisme transformé produisant ladite chaîne, il peut s'agir de cellules eucaryotes comportant une séquence d'ADN codant pour ladite chaîne sous la dépendance d'éléments d'expression assurant l'expression de ladite séquence dans ladite cellule hôte. La technologie des ADN recombinants permettant l'expression d'une séquence peptidique est maintenant largement connue et n'a pas à être décrite en détail. La cellule hôte est de préférence une cellule eucaryote et de préférence une levure et/ou une cellule eucaryote supérieure ou un animal transgénique. Quant au système d'expression, il peut s'agir soit de plasmides à réplication autonome, soit de plasmides permettant l'intégration dans le génome de la cellule hôte. Les séquences codantes pouvant être sous la dépendance d'un promoteur hétérologue mais efficace dans l'hâte ou bien d'un promoteur homologue, ou bien encore d'un promoteur chromosomique. Il est possible également de prévoir des systèmes assurant, par exemple, la sécrétion de ces chaînes polypeptidiques. Dans ce qui suit, on donnera des exemples de système d'expression des chaînes polypeptidiques selon la présente invention qui ne pourront, en aucun cas, être considérées comme des limitations. L'obtention des tétramères est, la plupart du temps, spontanée, elle peut être favorisée suivant la structure exacte du tétramère par des conditions particulières de mise en solution, notamment dans certaines conditions de pH et/ou de force ionique. L'introduction d'un groupe héminique peut être spontanée, en particulier chez les eucaryotes, et les tétramères obtenus sont "héminisés" sans qu'il y ait lieu de prévoir une étape spécifique. La plupart du temps l'hume sera rajouté lors d'une étape ultérieure. La présente invention concerne également des procédés permettant la préparation de ces chaînes polypeptidiques par des techniques mettant en oeuvre les ADN recombinants et l'éventuelle formation du tétramère, comme cela a été décrit précédemment (Hoffman et al, 1990 ; Nagai & Thogersen, 1984, 1987 ; Nagai et al, 1985 ; Tame et al, 1991 ; Wagenbach et al, 1991). Enfin, la présente invention concerne l'utilisation des chaînes à titre de médicament, notamment pour le transport d'oxygène en combinaison avec un support acceptable dans le domaine transfusionnel. Les exemples ci-après permettront de mieux mettre en évidence certaines caractéristiques et avantages de la présente invention. Dans ce qui suit - la Figure 1 schématise la séquence nucléotidique et en amino-acides de la chaîne alpha, - la Figure 2 schématise la séquence nucléotidique et en amino-acides de la chaîne bêta, - la Figure 3 schématise la structure spatiale de la chaîne bêta, avec indication de la nomenclature des hélices, - la Figure 4 représente le schéma du plasmide pATPrTet, - la Figure 5 représente le schéma du plasmide pATPr cIIFX bêta, - les Figures 6 et 7 schématisent la préparation du vecteur pATPr cIIFX bêta Gb, - la Figure 8 représente le schéma de la structure spatiale d'un dimère selon l'invention, notamment la reconstitution de l'interface alpha1 bêta2 - la Figure 9 schématise les étapes de la construction du vecteur pATPr Chim beta73-alpha69. Afin de mieux comprendre la structure de l'hémoglobine, on pourra se reporter à des articles tels que celui de Max F. Perutz (1987) in Molecular Basis of Blood Diseases ainsi qu'à des ouvrages tels ceux de Dickerson & Geis (1983) et Fermi & Perutz (1981). Sur la figure 1 on a représenté la structure en amino-acides de la chaîne alpha et sur la figure 2 la structure en amino-acides de la chaîne bêta. La configuration spatiale de la chaîne bêta est représentée à la figure 3 avec la nomenclature des différents segments qui vont de l'extrémité NH2 terminale vers l'extrémité COOH terminale NA, A, B, C, CD, D, E, EF, F, FG, G, GH, H et HC quant à la chaîne alpha elle présente la structure NA, A, AB, B, C, CE, E, EF, F, FG, G, GH, H et HC. Les segments A, B, C, E, F, G et H présentent une structure sensiblement hélicoîdale alors que les segments de jonction ne présentent pas une telle structure. Les acides aminés sont numérotés soit à partir de l'extrémité N-terminale par ordre croissant, soit en affectant à un acide aminé la désignation de son hélice et son rang dans celle-ci. Le 36ème acide aminé de la chaîne bêta est la Proline, il est bêta 36(C2) Pro, c'est-à-dire le deuxième acide aminé de l'hélice C. PRODUCTION DE LA PROTEINE DE FUSION DANS E. COLI Les manipulations portant sur 1' ADN ont été effectuées en utilisant essentiellement les techniques classiques décrites par Sambrook et al dans le manuel "Molecular Cloning". Sauf indication contraire, les digestions par les enzymes de restriction ou de modification sont réalisées selon les indications des fabricants (Amersham, Boehringer Manheim; New England Biolabs). L' ADNc codant pour la protéine de fusion cIIFX bêta globine a été cloné par Nagai et al (1985) dans le phage M13 mplO. La construction M13 mplO cIIFX bêta nous a été fournie sur demande au Medical Research Council (Cambridge, Grande-Bretagne). EXEMPLE 1: Construction du vecteur d'expression p AT Pr CIIFX bêta Gb Le vecteur de base pAT Pr Tet présente une origine de réplication dérivée de pBR 322 et porte le gène de résistance à la tétracycline. I1 permet l'expression de protéines hétérologues sous le contrôle du promoteur Pr du phage lambda. L'activité de ce promoteur est réprimée par le répresseur CI (allèle CI857, thermosensible). Le promoteur Pr est bloqué à 30 C. L'élévation de la température à 42" C inactive le répresseur et induit la transcription à partir du promoteur Pr (figure 4). Préparation de I' ADN plasmidique Les bactéries E. coli CAG 1139 portant le plasmide sont mises en culture à 37 C (1 L milieu LB) jusqu'à obtention d'une DO à 600 nm d'environ 0,4. On ajoute du chloramphénicol à une concentration finale de 170 ,ug/ml, et on continue l'incubation à 37 C pendant 12-16 heures. Les bactéries sont lysées par traitement avec une solution de NaOH-SDS, et 1'ADN plasmidique est purifié à partir du culot bactérien par précipitation avec le polyéthylène glycol. Le protocole utilisé est très exactement celui décrit par Sambrook et al (1989). 10 ug d' ADN plasmidique pAT Pr Tet ainsi purifié sont incubés en présence de 5 unités d'endonucléase de restriction BamHI, 10 minutes à 37 C (digestion ménagée). La forme linéaire du plasmide est séparée sur gel d'agarose 0,8 %, et recueillie par électroélution. L'ADN est précipité par L'méthanol après extraction au phénol/chloroforme. Le précipité est repris dans 90 jil d'eau distillée et traité par la nucléase de haricot mung (mung bean nuclease, New England Biolabs) de façon à obtenir le codon d'initiation ATG sous forme d'extrémité franche.Après extraction au phénol/chloroforme et précipitation par l'éthanol, 1' ADN est dissout dans 90 ,ul d'eau et incubé en présence de 100 unités d'endonucléase de restriction XhoI (figure 6). Le fragment BamHI/Xho de 4500 bp est séparé par électrophorèse sur gel d'agarose, recueilli par électroélution, et précipité par l'éthanol après extraction au phénol/chloroforme. Préparation de la séquence à insérer La séquence codant pour la protéine de fusion a été obtenue par la technique de PCR à partir de la forme réplicative double brin du phage M13 mplO (10 ng). La forme réplicative double brin est préparée selon la technique indiquée ci-dessus pour 1' ADN plasmidique, à partir d'un culot bactérien E. coli, souche JM 101. Un site reconnu par l'endonucléase de restriction SnaBI est introduit à l'extrémité 5' de la séquence codante. La coupure par cette enzyme génére une extrémité franche correspondant au premier nucléotide du premier codon de la protéine de fusion. Un site reconnu par l'endonucléase de restriction XhoI est créé à l'extrémité 3', immédiatement après le codon stop (Fig. 7). Le produit de PCR est précipité par l'éthanol après extraction au phénol/chloroforme. Le précipité est repris par 90 pl de tampon Tris-HCl 10 mM/ EDTA lmM. L'ADN est traité par les endonucléases de restriction SnaBI (15 unités, 2 heures, 37 C) puis Xhol (25 unités, 2 heures, 37 C). I1 est précipité par l'éthanol après extraction au phénol/chloroforme. Le précipité est repris dans 10 Cil de tampon Tris-HCl 10 mM/EDTA 1 mM.L'insertion dans le vecteur d'expression est réalisée en utilisant un rapport vecteur/insert de 1/5 (soit 3 Crl de la solution d'ADN vecteur et 3 Ill de la solution d'insert). Le mélange est incubé en présence de T4 ADN ligase, 4 heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est utilisé pour transformer des bactéries CAG 1139 compétentes (traitement CaCI2). Les bactéries transformées sélectionnées par la résistance à la tétracycline sont testées pour ~ l'expression de la protéine de fusion. Le vecteur ainsi obtenu pAT Pr cIIFX bêta dirige la synthèse d'une protéine de fusion cIIFX bêta globine contenant - les 31 résidus N-terminaux de la protéine CII du phage lambda - le tétrapeptide Ile-Glu-Gly-Arg, séquence reconnue par le facteur de coagulation X activé, ce qui permet de libérer la sous-unité bêta globine après purification de la protéine de fusion - la bêta globine. EXEMPLE 2 : Expression de la protéine dans Escherichia coli La souche E. coli CAG 1139 portant le plasmide pAT Pr cIIFX bêta est incubée à 30 C dans du milieu M9 (Na2HPO4 50 mM/KH2PO420 mM/NaCl 8,5 mM/NH4C120mM/MgSO4 0,1mM) contenant 2 g de glucose, 20g d'extrait de levure et 0.5 g de vitamine B1 par litre) en présence de tétracycline (10 mg par litre). Lorsque l'absorbance à 600 nm atteint 0,8-1,2, on élève rapidement la température à 42" C, et l'on continue l'incubation pendant 3-4 heures. Le culot bactérien est congelé à -80" C. EXEMPLE 3 : Extraction et purification de la protéine de fusion Le culot bactérien (100 g poids humide) est décongelé et mis en suspension dans 100 ml Tris-HCl 50 mM, pH 8/ saccharose 25 % (p/v)/EDTA 1 mM. Les bactéries sont lysées par incubation en présence de 200 mg de lysozyme (30 minutes dans la glace). On ajoute du MgC12, du MnCl2 et de la DNase I de façon à obtenir des concentrations finales respectives de 10 mM, 1 mM et 10 llg/ml. Après 30 min d'incubation à température ambiante, on ajoute au lysat 200 ml de NaCI 0,2M/ acide désoxycholique 1 % (p/v)/Nonidet P-40 1,6 % (v/v)/Tris-HCl 20 mM, pH 7,5/EDTA 2 mM.Le précipité est recueilli par centrifugation à 5000 g, 10 min, remis en suspension dans du Triton X-100 1 % (v/v)/EDTA 1 mM et centrifugé à nouveau. Les lavages dans la solution de Triton X-100 sont renouvelés jusqu'à obtention d'un précipité compact. Le précipité de protéine est dissout dans une solution de guanidine-HCl 6M/Tris-AcOH 25 mM, pH 5,0/EDTA 1 mM/dithiothreitol I mM. La solution est équilibrée dans un tampon urée 8M/Tris-AcOH 25 mM, pH 5,0/EDTA 1 mM/dithiothreitol I mM par filtration sur une colonne de Sephadex G-25, puis déposée sur une colonne de CM-Sepharose (4 x 10 cm) équilibrée avec le même tampon. La protéine de fusion est éluée à l'aide d'un gradient linéaire formé par 500 ml d'urée 8M/Tris-AcOH 25 mM, pH 5,0/EDTA lmM/dithiothreitol 1 mM et 500 ml du même tampon additionné de NaCI qsp une concentration de 0,2 M. La protéine de fusion est ensuite purifiée par filtration sur colonne de Sephacryl S-200 (5 x 60 cm) en milieu guanidine-HCl 5 M/Tris-HCl 50 mM, pH 8,0/EDTA 1 mM/dithiothreitol 1 mM.Les fractions contenant la protéine sont rassemblées, dialysées contre de l'eau et lyophilisées, ou dialysées contre le tampon de clivage pour être traitées immédiatement par le facteur X active. Après purification de la protéine de fusion et hydrolyse trypsique, la présence de la mutation et le profil peptidique sont vérifiés par chromatographie liquide haute performance (Baudin-Chich et al, 1987). EXEMPLE 4 : Clivage de la protéine de fusion par le facteur Xa La protéine lyophilisée est dissoute dans une solution d'urée 8M/Tris-HCl 50 mM, pH 8.0/EDTA 1 mM/dithiothreitol 1 mM, puis dialysée contre le tampon de clivage : urée 0,5M/Tris-HCl 50mM, pH 8,0/CaCI2 I mM. La protéine de fusion est incubée à 0 C en présence de facteur X activé par le venin de vipère de Russel immobilisé sur Sepharose 6B activé au bromure de cyanogène (rapport enzyme/substrat 1,5 % p/p). La qualité du clivage est vérifiée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS. Après dialyse contre de l'eau, la protéine est lyophilisée. EXEMPLE 5 : Construction du mutant bétaH2M La mutation est introduite dans 1'ADN en utilisant un oligonucléotide initiateur synthétique de séquence dC AGG AGT CAG CAT CAC CCT ACC C. Cette séquence est complémentaire à celle de l'ADNc codant pour la sous-unité bêta de globine encadrant le codon de l'histidine bêta (NA2). Le triplet introduit CAT (au lieu de GTG) est altéré de telle sorte à coder pour une méthionine. La mutagénèse est réalisée en utilisant la réplication du phage M13 dans lequel est inséré l'ADNc codant pour la chaîne bêta de globine (Nagai & Thogersen, 1984), par la méthode de Nakamaye & Eckstein (1986) préconisée par Amersham (Kit Amersham). Le produit de la réaction de mutagénèse est utilisé pour transformer des bactéries compétentes E. coli, souche JM 101 selon les méthodes classiques (Nagai & Thogersen, 1987 ; Sambrook et al, 1989).Les phages portant la mutation sont détectés par séquençage de 1' ADN (méthode de Sanger, 1977). La séquence complète de l'ADNc codant pour la protéine de fusion est vérifiée de façon à s'assurer de l'intégrité de la séquence codante. La séquence codante contenant la mutation est traitée comme décrit ci-dessus pour être insérée dans le vecteur d'expression. EXEMPLE 6: Construction du mutant bêtaH21 La mutation est introduite dans l'ADNc en utilisant l'oligo- nucléotide initiateur dAGG AGT CAG GAT CAC CCT ACC C. Le triplet GAT (pour GTG) permet de coder pour une isoleucine. EXEMPLE 7 : Construction du mutant bêtaF41Y La mutation est introduite dans l'ADNc en utilisant l'oligonucléotide initiateur dGGA CTC AAA GTA CCT CTG GGT. Le triplet GTA (pour GAA) permet de coder pour une tyrosine. EXEMPLE 8: Construction du vecteur pAT Pr Chim bêta73-alpha69 La construction codant pour la chimère bêta-alpha globine est construite par PCR à partir de deux plasmides - le plasmide pAT Pr bêta, portant le gène bêta globine (exemple 1), - un plasmide portant l'ADNc alpha globine : alpha. On utilise les amorces suivantes Nsi : 5' GCA TTT AAT GCA TTG ATG CC 3' Ch : 5' TTT CTC GAG TTA ACG GTA TTT GGA 3' D : 5' GTG CCT TTA GTG ATG CCG TGG CGC ACG TGG ACG ACA TGC C 3' D inv : 5' TCC ACG TGC GCC ACG GCA TCA CTA AAG GCA C 3' Le fragment codant pour CIIFX NH2(1-73)bêta est amplifié à partir du vecteur pAT Pr bêta en utilisant les amorces Nsi et Dinv. Les conditions sont les suivantes Tampon PCR 5 Cil Mix 12 p1 Amorce Nsi 5 ,ul (à 10 pM) Amorce Dinv 5 l (à 10 pM) Plasmide pAT Pr bêta 10 ng (1 l) Taq polymérase (Cetus) 1 ,ul HO qsp 50 ,ul On réalise 27 cycles 97 C: 30 sec 58 C : 1 mn 70 C : 2 mn = (2 sec/cycle) Le produit de PCR est précipité par l'éthanol après extraction au phénol/chloroforme. Le fragment correspondant à la taille recherchée est recueilli par électroélution après électrophorèse sur gel d'agarose. Le fragment codant pour alpha(69-141)COOH de l'alpha globine est amplifié à partir du plasmide alphalpJW101 (Wilson et al, 1978) en utilisant les amorces D et Ch. Les conditions sont les suivantes Tampon PCR 5 l Mix 12 l Amorce D 5 pl (à 10 M) Amorce Chim6 5 l (à 10 M) Plasmide alphal 1 l (= 10 ng) Taq polymérase (Cetus) 1 p1 HO qsp 50 l On réalise 27 cycles de la même manière que pour la première amplification. Il est purifié comme précédemment. Une troisième amplification est effectuée à partir des deux fragments purifiés en utilisant les amorces Nsi et Ch. Les conditions sont les suivantes Tampon PCR 5 l Mix 12 l Amorce Chim6 5 l (à 10 pM) Amorce Nsi 5 p1 (à 10 pM) ADN obtenu par la première PCR 1 l (environ 50 ng) ADN obtenu par la deuxième PCR 3 p1 (environ 50 ng) Taq polymérase (Cetus) 1 p1 H20 qsp 50 p1 On effectue 35 cycles 97 C: 30 sec 55 C : 1 mn 70 C : 2 mn + (2 sec/cycle) Le produit de PCR est précipité par l'éthanol après extraction au phénol/chloroforme, puis purifié. I1 est inséré dans le plasmide pAT Pr Tet aux sites Nsil et Xhol.Ce vecteur permet d'exprimer une protéine de fusion comprenant - les 31 acides aminés N-terminaux de la protéine CII du phage lambda, - la séquence Ile-Glu-Gly-Arg reconnue par le facteur Xa, - une sous-unité chimérique de 146 acides aminés, constituée par les résidus N terminaux 1 à 73 inclus de la chaîne bêta de globine et les résidus C terminaux 69 à 141 de la chaîne alpha (chimère NH2(1-73)bêta-alpha(69141)COOH). La figure 9 schématise les étapes de la construction. Ce plasmide est exprimé chez E. coli, souche CAG 1139 (Grossman et al, 1983, Cell, 32, 151-159). Cette souche de phénotype : F thi leu thr LacY TonA SupE galK Lon 100 est transformée par la méthode conventionnelle de traitement au CaC12. La culture est effectuée en milieu LB en présence de tétracycline 50 pg/ml à 30 C ; quand la DO atteint 0,8-1,2, l'expression de la protéine d'ADN est induite par passage à 42" C. Après 2 heures, il est possible de mettre en évidence la synthèse de la chaîne (bêta-alpha) sur gel de SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie par comparaison avec un échantillon de culture de CAG 1139 non transformée. On estime que la quantité en chaîne bêta-alpha atteint 20 % des protéines totales. La construction a été séquencée pour vérifier qu'il n'y avait pas de mutation lors des PCR successifs. EXEMPLE 9: Caracterisation fonctionnelle des hémoglobines recombinantes Mesures dans les conditions d'équilibre: Après purification des solutions d'Hb, les spectres d'absorbance sont enregistrés et comparés au spectre de l'Hb A native oxygénée (spectrophotomètre Cary 219, Varian, Palo Alto, Ca, USA). Ces spectres permettent de tester la présence de méthémoglobine ou d'hémichrome (Szebeni et al, 1984). Les mesures de l'affinité pour l'oxygène à l'équilibre sont effectuées à l'aide d'un système automatique commercial (Hemox analyzer, TCS, Southampton PA, USA) (Asakura, 1979) associant la mesure simultanée de l'absorbance à deux longueurs d'onde par spectrophotométrie et celle de la pression partielle de l'oxygène par polarographie à l'aide d'une électrode à oxygène (YSI 5331). Dans les conditions habituelles les courbes de désoxygénation sont enregistrées dans des solutions d'Hb (60 à 100 pM en hème) dans un tampon 50 mM bisTris, 100 mM NaCI, pH 7,2 à 25"C, 50 M d'EDTA et 20 llg/ml de catalase sont ajoutés au tampon pour limiter l'oxydation de l'hémoglobine.La concentration de NaCl, le pH peuvent être modifiés pour tester les différentes propriétés de l'Hb recombinante (effet Bohr, effecteurs anioniques). D'autres effecteurs naturels (2,3 diphosphoglycérate) ou non naturels (IHP, dérivés du clofibrate) peuvent être ajoutés à la solution au début de l'enregistrement. Typiquement la solution est d'abord équilibrée sous un mélange gazeux dont la pression partielle en oxygène est d'au moins 350-450 mmHg pour assurer une saturation initiale quasi-complète de l'hémoglobine. La solution est alors désoxygénée lentement en admettant de l'azote pur dans la cuvette de mesure. La durée de l'enregistrement est de 45 à 60 min pour assurer les conditions d'équilibre. Ces conditions d'équilibre sont démontrées par la superposition des courbes de désoxygénation et de ré-oxygénation.La concentration d'Hb est mesurée après transformation en cyanmethémoglobine (epsilon540 = il mM -1) La quantité de methémoglobine (Hb oxydée) formée pendant l'enregistrement est mesurée par spectrophotométrie selon la méthode de Benesh et al (1973). 200 à 300 couples de valeurs (Abs/PO2) sont en général enregistrés et stockés sur bande magnétique à l'aide d'un calculateur. Les valeurs de P50 (PO2 de demi-saturation et index de l'affinité pour l'oxygène) et n50 (index de la coopérativité) sont calculés à partir des mesures enregistrées entre 40 et 60 % de saturation par régression linéaire selon l'équation empirique de Hill ; l'ensemble des données des courbes d'équilibre sont ajustées à l'équation du modèle allostérique à deux états quaternaires (Monod et al, 1965) à l'aide de l'algorithme de régression itérative non-linéaire par moindres carrés (Bevington, 1969) comme décrit en détail dans Kister. et al, (1987). La vitesse d'auto-oxydation de l'hémoglobine est mesurée par spectrophotométrie de la solution (100 M hème) incubée dans un tampon 100 mM Phosphate à 37 C'en fonction du temps (0 > 24 h). La stabilité thermique est mesurée par incubation des solutions (300 uM hème) à 65" C en fonction du temps (0 - > 120 min). Mesures cinétiques Les mesures cinétiques sont effectuées dans les solutions d'Hb recombinantes équilibrées sous I ou 0,1 atm de monoxyde de carbone (CO). Dans ces études on mesure spécifiquement la vitesse de recombinaison du CO à l'hémoglobine après sa photodisssociation par un éclair de lumière laser (Marden et al, 1988). Les études de photodissociation sont pratiquées à l'aide d'un système laser 10-ns (Quantel YG 585) délivrant 160 mJ à 532 nm. L'énergie du faisceau de photodissociation peut être modifiée pour étudier les conditions de photolyse partielle. Les échantillons sont étudiés dans des cuvettes de 1 ou 2 mm de trajet optique. Le faisceau de détection à 436 nm est quasi colinéaire avec le faisceau de photodissociation. L'intensité de lumière transmise est détectée par un photomultiplicateur (1P28 Hamamatsu, Japon) et enregistrée sur un oscilloscope digital (Lecroy 9400). Les données sont ensuite transférées dans un microcalculateur IBM pour les calculs des changements d'absorbance et l'analyse des données. Les simulations cinétiques sont basées sur le modèle allostérique à deux états. Typiquement la courbe enregistrée pour l'Hb A native montre l'existence de deux vitesses de recombinaison du CO à l'hémoglobine: l'une est rapide et correspond à la recombinaison à l'état R de forte affinité pour le ligand la deuxième est plus lente et correspond à la recombinaison à l'état T de faible affinité. Les expériences de cinétiques permettent de tester très rapidement la fonctionalité des Hb recombinantes avec le minimum d'échantillon. REFERENCES Ahern et al, FEBS Lett 1976, 69, 99-102. Arous et al, FEBS lett 1981, 26, 114-116. Asakura, Critical Care Medicine 1979, 7, 391-395 Baudin-Chich et al, Acta Haemathol. 1987, 78, 127-129. Bihoreau et al, Protein Science, sous presse. Baglioni, Biochim. Biophys, Acta 1962, 59, 437-449. 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REVENDICATIONS 1) Transporteur d'oxygène du type comportant quatre chaînes polypeptidiques de type globine, pratiquement identiques, susceptibles de s'associer ou d'être associées entre elles afin d'assurer une activité de fixation réversible de l'oxygène. 2) Transporteur d'oxygène artificiel selon la revendication 1, comportant quatre chaînes polypeptidiques pratiquement identiques incorporant I'hème et ayant chacune une structure de type globine séquence V - (W) - X - (Y) - Z dans laquelle - V, X, et Z sont des séquences polypeptidiques de type globine, et - (W) et (Y) sont deux séquences polypeptidiques complémentaires susceptibles dtinteragir pour constituer une interface qui, lorsqu'elle appartient à deux chaînes disctinctes, est au moins en partie similaire à l'interface alpha1 bêta2, lesdites chaînes pouvant associer en reconstituant ladite interface similaire à l'interface alphal bêta2 afin d'assurer une activité de fixation réversible de l'oxygène. 3) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la séquence polypeptidique de type globine correspondant à X comporte un ou plusieurs segments hélicoïdaux choisis parmi les segments hélicoïdaux D, E et F des chaînes de type alpha ou bêta, lesdits segments pouvant être reliés entre eux par des segments non hélicoïdaux ou par des liaisons simples. 4) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence polypeptidique de type globine correspondant à Z comporte un ou plusieurs segments hélicoïdaux choisis parmi les segments hélicoïdaux G et H des chaînes de type alpha ou bêta lesdits segments pouvant être reliés entre eux par des segments non hélicoïdaux ou par des liaisons simples. 5) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la séquence polypeptidique de type globine correspondant à V comporte au moins un ou plusieurs segments hélicoïdaux choisis parmi les segments A, B et C des chaînes de type alpha ou bêta, lesdits segments pouvant être reliés entre eux par des segments non hélicoïdaux ou par des liaisons simples. 6) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que chaque chaîne est constituée de l'extrémité N-terminale d'une chaîne de type bêta de la globine comportant le segment CD, et de l'extrémité C-terminale de la chaîne de type alpha de la globine comportant le segment FG. 7) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que chaque chaîne est constituée de l'extrémité N-terminale d'une chaîne de type alpha de la globine et de l'extrémité C-terminale d'une chaîne de type bêta de la globine. 8) Transporteur d'oxygène selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'extrémité N-terminale de la chaîne bêta de la globine est fusionnée jusqu'à l'amino-acide 73 compris à la partie C-terminal de la chaîne alpha de la globine à partir de l'amino-acide 69 compris. 9) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications I à 8, caractérisé en ce que deux chaînes polypeptidiques sont reliées, notamment par une séquence peptidique, entre la séquence Z de l'une et V de l'autre. 10) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les quatre chaînes polypeptidiques sont des chaînes de type bêta globine. 11) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comporte des séquences provenant de globine de type alpha ou bêta humaine ayant subi au moins une mutation. 12) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'hume comporte une substitution de l'atome de fer par un autre métal. 13) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il présente une affinité pour l'oxygène diminuée par rapport à l'hémoglobine naturelle. 14) Transporteur d'oxygène selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il présente une affinité pour l'oxygène diminuée d'au moins 20 % par rapport à l'hémoglobine naturelle. 15) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que la chaîne peptidique est obtenue par culture d'un organisme transformé produisant ladite chaîne. 16) Transporteur d'oxygène selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'organisme transformé est une cellule eucaryote comportant une séquence d'ADN codant pour ladite chaîne sous la dépendance d'éléments d'expression assurant l'expression de ladite séquence dans ladite cellule hôte. 17) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient un transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 à 14, dans un véhicule acceptable physiologiquement.