FR 2679142 A1 19930122 FR 9109069 A 19910718 La présente invention concerne un procédé de protection de prothèses, implants et/ou de cathéters, de matériaux implantables provisoires ou définitifs, contre la colonisation et l'infection bactérienne, ainsi que l'équipement permettant d'obtenir cette protection. L'imprégnation de cathéters par des quinolones a été décrite dans la demande de brevet européen EP 328 421. Cependant l'adhésion de ces agents antibactériens sur les matériels médicaux étant difficile, il en résulte une protection insuffisante pour éviter les infections bactériennes consécutives à la mise en place de la prothèse. L'imprégnation de cathéters par des biguanides est également décrite dans la demande de brevet japonais 60 036 064. Ces protections sont néanmoins insuffisantes et peuvent entraîner des problèmes toxicologiques lors du relargage des biguanides. Malgré les recherches entreprises, les cas d'infections en présence de matériel étranger sont en très forte progression. Les infections provoquées par l'implantation de prothèses peuvent etre notamment à l'origine d'endocardites et font appel à des traitements difficiles, voire impossibles. L'échec de ces traitements conduit le plus souvent à l'ablation du matériel ; il stensuit un coût social important et un risque non négligeable pour le patient. La présente invention permet de pallier aux problèmes de fixation et de toxicité de la substance antibactérienne, et conduit de ce fait à une efficacité améliorée. Il a été trouvé un procédé de protection selon lequel la prothèse est imprégnée successivement 1) par une solution d'un biguanide défini par la formule générale dans laquelle R1 représente un radical alcoyle, aminoalcoyle, phényle éventuellement substitué (par un atome d'halogène ou un radical hydroxy, alcoyle, alcoyloxy ou carboxy), naphtyle ou cyano, R2 représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle et n représente un nombre entier allant de 1 à 6, étant entendu que les portions et radicaux alcoyle cités ci-dessus sont droits ou ramifiés et contiennent 1 à 4 atomes de carbone, puis 2) par une solution d'un agent antibactérien capable d'être redistribué progressivement en milieu aqueux, puis la prothèse ainsi imprégnée est séchée. Les agents antibactériens convenables sont choisis parmi la classe des quinolones, des p-lactames, l'acide fusidique, la fosfomycine, la teicoplanine, ltaztréoname ou l'imipenème. Le procédé selon l'invention permet non seulement de protéger contre la prolifération bactérienne, mais de surcroît en utilisant le biguanide comme agent d'adhésion permet de résoudre le double problème de la mauvaise adhérence des quinolones et d'autres antibiotiques sur les prothèses, implants et cathéters et de la toxicité des biguanides lorsqu'ils servent eux-mêmes de substance antibactérienne. Ce procédé présente l'avantage de pouvoir être appliqué à n t importe quelle sorte de prothèses utilisables en médecine et d'assurer une diffusion de l'antibiotique directement à partir du matériel implanté. A titre d'exemple, les cathéters, implants et prothèses peuvent être choisis parmi des cathéters urinaires, des sondes, des cathéters vasculaires et intra-artériels, des prothèses valvulaires cardiaques, des prothèses artérielles, des stimulateurs cardiaques, des prothèses orthopédiques, des implants oculaires ou dentaires, des shunts de dérivation entre 2 segments de l'appareil circulatoire, ainsi que des fils de suture. Le procédé selon l'invention s'applique à des matériels de constitution variés comme des matières plastiques, des métaux ou des fils de suture. Les solutions de biguanide employées sont avantageusement choisies parmi les solutions aqueuses ou organiques dans des solvants tels que les alcools (par exemple éthanol, méthanol), le propylèneglycol, les polyéthylèneglycols ou le glycérol. A titre non limitatif les biguanides préférés sont la chlorhexidine : hexaméthylène bis[(p-chlorophényl)-5 biguanide] -1,1', l'alexidine : hexaméthylène bis[(éthyl-2 hexyl)-5 biguanide]-1,1' ou 1 t hexaméthylène bis [aminohexylbiguanide3 -1,1'. Les solutions contenant l'antibiotique, seront adaptées à la nature et à la classe de l'antibiotique choisi. A titre d'exemple, dans le cas des quinolones des solutions dans les alcools (éthanol par exemple) ou dans des solvants chlorés, seront particulièrement adaptées, dans le cas des (3-lactames, on utilisera plus spécialement les solvants suivants : eau distillée, éthanol, méthanol. A titre d'exemple, parmi les classes d'antibiotiques citées précédemment, les produits ci-après sont particulièrement préférés péfloxacine, norfloxacine, sparfloxacine, énoxacine, ciprofloxacine, ofloxacine, fléroxacine, loméfloxacine, témafloxacine, amoxicilline, oxacilline , ceftriaone, cefsulodine, ceftazidime. L'efficacité du dispositif selon l'invention a pu être mise en évidence dans les conditions suivantes : MATERIEL ET METHODE ETUDE DES MODALITES DE FIXATION DE L'ANTIBIOTIQUE - sur des microplaques de polyvinyl (NUNC) et polystyrène (DYNATECH) - sur des cathéters de polyuréthane La concentration de biguanide nécessaire ainsi que la nature du solvant est étudiée (eau distillée, alcool éthylique, alcool méthylique). Sur les microplaques, une étude de faisabilité est réalisée, puis une étude sur les conséquences de la fixation de l'antibiotique sur les propriétés d'adhésion de différents germes. Sur les cathéters, une étude de faisabilité est réalisée avec des modalités de fixation faisant varier les concentrations de l'antibiotique. Les cathéters coatés sont testés pour déterminer leur activité résiduelle en clorhexidine, pour étudier la concentration d'antibiotique fixée, pour étudier la stabilité en fonction du temps de ce coating. MODALITES DU "COATING" a) Fixation sur des plaques de microtitration Les plaques sont incubées une nuit à température ambiante en présence de chlorhéxidine à concentration variable (tableau I, colonne 2 à 11). Les plaques sont ensuite rincées à l'eau distillée ou non et séchées. L'antibiotique est alors distribué dans les cupules de la colonne 7 à la colonne 11 (tableau II). L'incubation est à nouveau réalisée pendant une nuit. Les plaques sont alors vidées, séchées à l'étuve et conservées à température ambiante recouvertes pour éviter toute contamination par des bactéries de l'environnement. Elles sont utilisées dans un délai minimun de 8 à 60 jours après le coating, afin de vérifier la stabilité de la fixation de l'antibiotique. Tableau I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH B CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH C CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH D CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH E F G H Tableau II 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A CH CH CH CH CH CH+P CH+P CH+P CH+P CH+P B CH CH CH CH CH CH+P CH+P CH+P CH+P CH+P C CH CH CH CH CH CH+P CH+P CH+P CH+P CH+P D CH CH CH CH CH CH+P CH+P CH+P CH+P CH+P E F CH : Chlorhexidine P : Pefloxacine L'efficacité de la fixation de l'antibiotique est réalisée en appréciant les propriétés antibiotiques et antiadhérentielles de l'antibiotique fixé sur les cupules vis à vis de germes sensibles et/ou résistants. La méthode utilisée pour l'étude des propriétés d'adhérence est celle décrite par CHRISTENSEN G.D. et coll., J. Clin. Microbiol., 22, 996-1006 (1985). Une suspension bactérienne (inoculum de 106 UFC/ml obtenu par dilution d'une culture d'une nuit) est distribuée dans les cupules de la microplaque à tester. Après une période dtincubation de 6 heures à l'étuve à 370C, les cupules sont vidées, rincées à trois reprises par du tampon phosphate pH=7 puis les bactéries restées adhérentes sont fixées à l'alcool et révélées par coloration par le cristal violet. Une lecture des densités optiques (DO) est réalisée au spectromètre (540 nm). Les résultats des cupules ayant fixé l'antibiotique sont exprimés en pourcentage d'adhésion par rapport au témoin (cupules vierges) et par rapport aux cupules chlohexidine seule. Chaque expérience est réalisée sur la même plaque dans quatre cupules au moins et sur trois plaques différentes. Les résultats sont exprimés par la moyenne des pourcentages d'adhérence et une étude statistique est réalisée par le test t de STUDENT. b) Fixation sur des cathéters Etudes in vitro Les modalités de fixation de l'antibiotique sont étudiés en faisant varier : les concentrations en chlorhéxidine et les concentrations en antibiotique. Une étude de stabilité des cathéters en fonction du temps est réalisée par mesure de l'activité antibiotique des cathéters conservés pendant deux mois. L'activité antibiotique est apprécié in vitro par la méthode de KIRBY-BAUER. Les morceaux de cathéters sont implantés verticalement dans une gélose inoculée par inondation avec un germe choisi (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Micrococcus lutea, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens...) Après incubation, une nuit à 370C, les diamètres d'inhibition sont mesurés, comparés à ceux des cathéters non coatés et des cathéters témoins chlorhéxidine. Il a ainsi été démontré en faisant varier les concentratoins en antibiotique (par exemple la péfloxacine), que la fixation est dosedépendante. ETUDE DE RELARGUAGE DE L'ANTIBIOTIQUE - Epuisement de l'antibiotique dans une solution tampon qui est renouvelée pour connaître la libération de l'antibotique en cas de renouvellement liquidien. Etude in vivo Des morceaux de cathéters coatés avec de la péfloxacine sont implantés en intrapéritonéal selon un modèle dtinfection sur cathéter. Après mise en place des cathéters, une infection est provoquée par injection d'un inoculum de Staphylococcus aureus variable selon les expériences. Cet inoculum est injecté soit 24 heures après la mise en place des cathéters, soit juste après cette implantation Après 24 et 48 heures, les souris sont sacrifiées, les cathéters sont prélevés, traités par sonication, trypsine pour décrocher les bactéries adhérentes et cultivés sur gélose pour numérer leur contamination bactérienne. Des prélèvements concomittants sont réalisés : foie, rate et sang. Ces expériences sont réalisées par rapport à des lots témoins de souris sur lesquelles sont implantés des cathéters non fixés avec l'antibiotique. Dans les liquides d'élution des cathéters, sont réalisés les dosages de l'antibiotique présent ainsi que sur les cathéters prélevés l'antiobiotique résiduel est dosé par implantation directe du cathéter dans la gélose c) Etudes de fixation sur des implants métalliques Des morceaux métalliques (d'acier ou d'alliage de titane constituant des exemples de matériaux utilisés pour les prothèses métalliques) sont fixés avec la péfloxacine dans les mêmes conditions, puis testés par implantation des échantillons dans la gélose. d) Etudes de la fixation sur des fils de suture : après fixation selon les mêmes procédés, les fils séchés et conservés pendant 15 jours à 2 mois sont testés pour leur activité antibiotique sur des géloses ensemencées avec des germes divers et ce par rapport à des fils témoins non coatés ou ayant fixé seulement la chlohexidine. RESULTATS I - RESULTATS AVEC LES PLAOUES DE MICROTITRATION Fixation de la péfloxacine Les plaques sont dans un premier temps incubées une nuit à température ambiante avec la chlorhédixine (CH) aux concentratons de 0,2%, 1%, 2%, 10% en eau distillée, alcool éthylique et alcool méthylique. Certaines sont lavées et séchées, d'autres simplement lavées avant la distribution sur la moitié de la plaque de la péfloxacine à concentrations variables. Les résultats montrant l'influence du lavage des plaques après le temps de fixation de CH et avant l'antibiotique sur l'activité antiadhérentielle vis à vis d'acinetobacter montrent que la fixation est plus efficace si un lavage n'est pas effectué avant l'imprégnation par l'antibiotique. Des concentrations variables de chlorhexidine sont étudiées. Les résultats de l'activité antiadhérentielle de la péfloxacine, sur des germes sensibles et sur des germes résistants montrent que l'activité la plus importante est obtenue avec une concentration en chlorhexidine de 10%. II - RELARGUAGE DE LA PEFLOXACINE FIXEE SUR CATHETER Un catheter imprégné par une solution contenant 10 % de chlorhexidine et par une solution à 2 g/l de péfloxacine est placé dans 1 ml de tampon. On mesure la concentration en péfloxacine dans le tampon après 1 et 24 heures d'incubation à 370C : 2,4 et 2,6 mg/l respectivement. Le tampon initial est enlevé puis un dosage est effectué après incubation à 370C une nuit. Le taux résiduel est alors de 0,3 mg/l. Cette expérience permet de montrer qutil est possible de relarguer l'antibiotique dans le milieu à partir du cathéter. Ce relarguage est effectif dès 1 à 24 heures. III - ETUDE IN VIVO Les résultats montrent que si l'inoculum bactérien est injecté 24 heures après mise en place des cathéters coatés, aucune protection significative n'est obtenue . Par contre, si l'innoculum est injecté le même jour que la mise en place des cathéters (ce qui correspond au modèle d'infection en chirurgie humaine), une différence significative est observée sur les moyennes en log UFC/ml sur les cathéters avec un inoculum de 106 UFC/ml. Cette différence est plus significative si les cathéters sont prélevés au temps 48 heures. De même avec un inoculum bactérien de 10 UFC/ml, si la protection assurée par les cathéters coatés est non significative après 24 heures elle est significative après 48 heures. Sur les cathéters péfloxacine infectés, la colonisation bactérienne est également significativement diminuée par rapport aux catéthers témoins contaminés. IV - ETUDE SUR DES IMPLANTS METALLIOUES Dans les conditions décrites précédemment une fixation de la péfloxacine est obtenue après traitement par immersion dans une solution de chlorhexidine à 10% d'alliages de titane et de fragments en acier inoxydable. Les résultats montrent un accroîssement du diamètre d'inhibition par rapport au témoin non imprégné, pour tous les germes étudiés. D'une manière générale, le procédé de protection selon l'invention est mis en oeuvre par trempage de la prothèse, de l'implant ou du cathéter dans une solution contenant de 20 à 100 g/l de biguanide, éventuellement lavage, trempage dans une solution contenant 1 à 100 g/l d'antibiotique, puis éventuellement lavage, et séchage. La durée du trempage n'est pas un facteur indispensable à la réalisation de l'invention. Cependant il est avantageux d'effectuer un trempage pendant 1 à 24 heures dans chacune des solutions. Les prothèses et/ou les cathéters imprégnés selon le procédé de la présente invention sont capables de relarguer progressivement la substance antibactérienne dans le milieu d'implantation pendant au moins 24 à 48 heures, et ainsi de conduire à la prévention de la contamination bactérienne des matériels utilisés. La présente invention concerne également le dispositif de protection des prothèses, implants et/ou cathéters obtenu selon le procédé décrit précédemment et capable de relarguer progressivement la substance antibactérienne fixée à la surface. L'intérêt de ce dispositif est considérable du fait de son efficacité et de son absence de toxicité puisque le biguanide n'est pas ou très peu relargué dans le milieu d'implantation. Selon la présente invention, l'imprégnation des prothèses, des implants et/ou des cathéters peut être effectuée indifféremment au préalable, par exemple consécutivement à la fabrication de la prothèse, ou au moment de l'emploi. La présente invention concerne également un équipement permettant de procéder facilement à l'imprégnation du catéther, de l'implant ou de la prothèse. Un tel équipement est constitué : a) d'une solution contenant 20 à 100 g/l du biguanide de formule générale (I) par exemple appelée solution N01 et destinée à la première imprégnation et b) d'une solution contenant 1 à 100 g/l de la substance, antimicrobienne par exemple appelée solution N02 et destinée à la seconde imprégnation. La mise en oeuvre du procédé selon l'invention est ainsi facilitée dans les cas où les prothèses et/ou cathéters sont fournis sans dispositif de protection antibactérienne. Alternativement, par exemple dans le cas de substances pouvant présenter des problèmes de stabilité en solution pendant un temps prolongé, il est bien entendu qu'un tel équipement peut aussi comprendre à la place du flacon de solution prête à l'emploi un flacon de solvant et la quantité convenable de la substance qui sera dissoute extemporanément par l'utilisateur au moment de l'emploi. L'imprégnation par la solution du biguanide peut également être réalisée dès la fabrication du matériel à implanter, la deuxième imprégnation pouvant être envisagée au moment de l'emploi, par exemple dans le cas d'un antibiotique peu stable. REVENDICATIONS 1 - Procédé de protection de prothèses, implants et/ou cathéters, de matériaux implantables provisoires ou définitifs, contre la colonisation et l'infection bactérienne, caractérisé en ce que lton imprègne successivement le matériel à protéger : a) par une solution d'un biguanide de formule générale :: dans laquelle R1 représente un radical alcoyle, aminoalcoyle, phényle éventuellement substitué (par un atome d'halogène ou un radical hydroxy, alcoyle, alcoyloxy ou carboxy), naphtyle ou cyano, R2 représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle et n est un nombre entier allant de 1 à 6, étant entendu que les portions et radicaux alcoyle sont droits ou ramifiés et contiennent 1 à 4 atomes de carbone, puis b) par une solution d'un agent antibactérien capable d'être redistribué progressivement en milieu aqueux, puis sèche le matériel ainsi imprégné. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le biguanide est la chlorhexidine, l'alexidine ou l'hexaméthylène bis aminohexyl biguanide] -1,1'. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent antibactérien est choisi parmi les quinolones, les t3-lac- tames, l'acide fusidique, la fosfomycine, la teicoplanine, ltaztréoname ou l'imipenème. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 3, caractérisé en ce que l'agent antibactérien est la péfloxacine. 5 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2 caractérisé en ce que l'on utilise une solution contenant 20 à 100 g/l de biguanide. 6 - Procédé selon l'une des revendications 1, 3 ou 4 caractérisé en ce que lton utilise une solution contenant de 1 à 100 g/l d'agent antibactérien. 7 - Dispositif de protection des prothèses implants et/ou cathéters, capable de redistribuer progressivement en milieu aqueux une substance antibactérienne fixée à sa surface, caractérisé en ce qutil est obtenu selon le procédé de la revendication 1. 8 - Equipement pour l'imprégnation de prothèses, dtimplants et/ou de cathéters avant leur emploi, de manière à permettre la redistribution progressive d'une substance antibactérienne dans le milieu d'implantation, caractérisé en ce qu'il est constitué a) dtune solution contenant 20 à 100 g/l d'un biguanide selon la revendication 1 et b) dtune solution contenant 1 à 100 g/l d'une substance antibactérienne telle que définie dans la revendication 1, ou alternativement constitué des doses de produits et de solvants nécessaires à préparer ces solutions au moment de leur emploi