FR 2687155 A1 19930813 FR 9201558 A 19920212 La présente demande concerne de nouveaux dérivés hexapeptidiques, le procédé de préparation et l'application à titre de médicament de ces nouveaux dérivés. On sait que l'endothéline est un puissant vasoconstricteur extrait à partir d'endothélium aortique de porc. Ce peptide qui a été isolé récemment comporte 21 amino acides, présente 2 ponts disulfures et a pour formule (- A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. M. Yanagisawa, H. Kurihara, S. Kimura, Y. Tomobe, M. Kobayashi, Y. Mitsui, Y. Yazaki, K. Goto & BR T. Masaki, Nature, (1988) 332, p. 411-415). Ce peptide est désigné dans ce qui suit sous le nom de ET1. La nomenclature utilisée est celle de la commission IUPAC-IUB (1984) European J. Biochem 183, 9-37. Ce peptide qui renferme 21 résidus d'amino-acides, 2 ponts disulfures est capable de contracter à de très faibles doses les cellules des muscles lisses (artères et veines) de différentes espèces de mammifères (homme, chien, chat, cochon, cobaye, rat, lapin..). En essayant de raccourcir la chaine et de remplacer certains restes d'amino-acides de l'endothéline par d'autres amino-acides, la demanderesse a préparé par synthèse de nouveaux dérivés hexapeptidiques renfermant seulement cinq ou six aminoacides dans lesquels l'activité vasoconstrictrice a pratiquement disparu et qui présentent de plus, la propriété de bloquer et de se fixer sur les récepteurs naturels de l'endothéline. Les produits présentent ainsi une activité qui s'opposera à toute action d'une libération ultérieure de l'endothéline. Ces produits presentent en outre, l'intérêt de pouvoir être préparés par synthèse totale en grandes quantités. La présente demande a ainsi pour objet de nouveaux dérivés hexapeptidiques répondant à la formule générale (I) x1-x2-x3-Ile-X5-X6 (I) dans laquelle X1 représente un atome d'hydrogène ou un résidu d'histidine, d'acétyl-histidine, ou de D-histidine, X2 représente un résidu d'alanine, de leucine, de tryptophane, de phenylalanine ainsi que leurs homologues en série D, X3 représente un résidu d'alanine, d'acide aspartique ainsi que leurs homologues en série D, X5 représente un résidu d'isoleucine, d'alanine, de valine, de norleucine, de leucine et d'acide aspartique ainsi que leurs homologues en série D, X6 représente un résidu de tryptophane, de leucine, d'isoleucine, de norleucine et leurs homologues en série D, étant entendu que X1 ne peut représenter un résidu d'histidine lorsque X2 représente un résidu de leucine, X3 un résidu d'acide aspartique, X5 un résidu d'isoleucine et X6 un résidu de tryptophane. Parmi les nouveaux dérivés hexapeptidiques, tels que définis ci-dessus, on retient notamment ceux caractérisés en ce que X1 représente un atome d'hydrogène, un résidu d'histidine ou de D-histidine, X2 représente un résidu d'alanine ou de leucine, ainsi que leurs homologues en série D, X3 représente un résidu d'alanine ou d'acide aspartique, ainsi que leurs homologues en série D, X5 représente un résidu d'isoleucine, ainsi que ses homologues en série D, X6 représente un résidu de tryptophane, ainsi que son homologue en série D. Parmi ces derniers, on retient de préférence les dérivés peptidiques dans lesquels X1 représente un atome d'hydrogène ou un résidu d'histidine, X2 représente un résidu d'alanine ou de leucine, X3 représente un résidu d'alanine ou d'acide aspartique, Xg représente un résidu d'isoleucine, x6 représente un résidu de tryptophane ou de D-tryptophane. Parmi les nouveaux dérivés hexapeptidiques préférés de l'invention, on retient plus particulièrement l'un des dérivés peptidiques suivants His-Ala-Ala-Ile-Ile-Trp , His-Leu-Asp-Ile-Ile-D-Trp , His-Leu-Ala-Ile-Ile-Trp Leu-Ala-Ile-Ile-Trp , His-Leu-Ala-Ile-Ile-D-Trp Leu-Ala-Ile-Ile-D-Trp , His-Ala-Asp-Ile-Ile-Trp , His-Ala-Asp-Ile-Ile-D-Trp , Ala-Ala-Ile-Ile-Trp. Parmi les nouveaux dérivés hexapeptidiques tels que définis ci-dessus, on retient tout particulièrement les déri- vés peptidiques suivants His-Ala-Ala-Ile-Ile-Trp , His-Leu-Ala-Ile-Ile-Trp L'invention a également pour objet, un procedé de prepa- ration des nouveaux dérivés hexapeptidiques tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce que l'on effectue une synthèse en phase solide en introduisant séquentiellement sur un support de type polystyrène réticulé les amino-acides dûment protégés, à l'aide d'un agent de couplage, déprotège les amino-acides, et libère de la résine la chaîne peptidique ainsi formee, pour obtenir le dérivé peptidique de formule (I) ainsi recherché. Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre, le procédé ci-dessus décrit est caractérisé en ce que - le support de type polystyrène réticulé est une résine de type "Boc-Trp-CM" ou de type "Boc-D-Trp-CM" dans laquelle Boc est un groupement tertiobutyloxycarbonyl, Trp est un groupement tryptophyl et D-Trp est un groupement D-tryptophyl et CM désigne le support de polystyrène réticule, - l'agent de couplage est le (benzotriazol-l-yloxy) tris(diméthylamino) phosphonium hexafluorophosphate ou Bop, - la libération du support de la chaîne peptidique ainsi que la déprotection des amino-acides est effectuée au moyen de l'acide fluorhydrique en opérant à basse température de préférence vers 0 C. Les nouveaux dérives hexapeptidiques, objet de la présente invention présentent de très intéressantes propriétés pharmacologiques ; on note en particulier un remarquable effet antagoniste pratiquement pur contre l'hypertension induite par 1'endothéline et un effet antiischémique, l'activité vasoconstrictrice de l'endothéline étant abolie. Certaines de ces propriétés sont illustrees plus loin dans la partie expérimentale. Ces propriétés justifient l'utilisation des nouveaux dérivés hexapeptidiques répondant à la formule (I) ci-dessus à titre de médicaments. La présente invention a ainsi également pour objet, l'application à titre de médicaments des nouveaux dérivés hexapeptidiques tels que definis par la formule générale (I) ci-dessus. Parmi les médicaments, objet de l'invention, on retient notamment les médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les produits de formule (I) dans laquelle X1 représente un atome d'hydrogène, un résidu d'histidine ou de D-histidine, X2 represente un résidu d'alanine ou de leucine, ainsi que leurs homologues en série D, X3 représente un résidu d'alanine ou d'acide aspartique, ainsi que leurs homologues en série D, X5 représente un résidu d'isoleucine, ainsi que ses homologues en série D, X6 représente un résidu de tryptophane, ou de D-tryptophane. Parmi ces derniers on retient de préférence les médicaments renfermant les nouveaux dérives peptidiques tels que définis ci-dessus, dans lesquels X1 représente un atome d'hydrogène ou un résidu d'histidine, X2 représente un résidu d'alanine ou de leucine, X3 représente un résidu d'alanine ou d'acide aspartique, X5 représente un résidu d'isoleucine, X6 représente un résidu de tryptophane ou de D-tryptophane. Parmi les médicaments préférés de l'invention, on retient plus particulièrement ceux constitues par l'un des dérivés peptidiques suivants His-Ala-Ala-Ile-Ile-Trp , His-Leu-Asp-Ile-Ile-D-Trp His-Leu-Ala-Ile-Ile-Trp , Leu-Ala-Ile-Ile-Trp , His-Leu-Ala-Ile-Ile-D-Trp Leu-Ala-Ile-Ile-D-Trp , His-Ala-Asp-Ile-Ile-Trp , His-Ala-Asp-Ile-Ile-D-Trp Ala-Ala-Ile-Ile-Trp. Parmi les médicaments de l'invention on retient tout particulièrement les dérivés peptidiques suivants His-Ala-Ala-Ile-Ile-Trp , His-Leu-Ala-Ile-Ile-Trp Ces médicaments trouvent, par exemple, leur emploi dans le traitement de tous les spasmes vasculaires, dans le traitement des post-hémorragies cérébrales, dans le traitement des spasmes coronariens, des spasmes vasculaires périphériques ainsi que dans le traitement des insuffisances rénales. Ces médicaments peuvent également être utilisés dans le traitement de l'infarctus du myocarde, dans la prévention des resténoses post-angioplastie , dans le traitement de l'athérosclérose, de certaines formes d'hypertension, ainsi que dans le traitement de l'asthme. La dose usuelle, variable selon le produit utilisé, le sujet traité et l'affection en cause, peut être par exemple de 1 à 300 mg par jour par voie intraveineuse chez l'homme. L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques qui renferment au moins un derivé précité à titre de principe actif. A titre de principe actif, les dérivés peptidiques répondant à la formule génerale (I), peuvent être incorporés dans des compositions pharmaceutiques destinées à la voie digestive ou parentérale. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme par exemple, les comprimés simples ou dragéifiés, les gélules, les capsules, les granulés, les suppositoires, les préparations injectables, les aérosols ; elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le ou les principes actifs peuvent être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou emulsifiants, les conservateurs. I1 va être donné maintenant à titre non limitatif, des exemples de mise en oeuvre de l'invention. EXEMPLE 1 : His-Leu-Asp-Ile-Ile-D-Trp STADE A : Assemblage de la chaîne pentidique On utilise un support de type "Boc-D-Trp-CM-support" dans laquelle Boc est un groupement tertiobutyloxycarbonyl, Trp représente un groupement tryptophyl et CM-support désigne le support de polystyrène réticulé. Le support renfermant 0,6 mmol Trp/g a été préparé par la méthode au fluorure de potassium selon la technique décrite par Horiki K., Igano K. & Inouye K. K.(1978) Chemistry Lett., 165-168. Tous les aminoacides sont N-proteges par le groupement tertiobutylcarbonyl, les groupements protecteurs des chaînes latérales ont eté les suivants - ester de cyclohexyl pour l'acide aspartique, - Nim-tertiobutyloxycarbonyl pour l'histidine, - le D-tryptophane n'est pas protégé. Les réactions de couplage ont été effectuées en utilisant le Bop ou (benzotriazol-l-yloxy tris (diméthylamino) phosphonium hexafluorophosphate. Un cycle de couplage peut être résumé comme suit Déprotection 1 - Traitement avec une solution d'acide trifluoroacétique (50 t) dans le dichlorométhane contenant 3 % d'éthanedi thiol pendant 1 minute. 2 - Vidange puis traitement avec une solution d'acide tri fluoroacétique à 50 % dans le dichlorométhane contenant 3 % d'ethanedithiol pendant 30 minutes. 3 - Vidange puis lavage avec de l'isopropanol contenant 5 % d'ethanedithiol. 4 - Lavage au dichlorométhane, 2 fois. Couplave : 1 - Addition de Bop et de Boc-acide aminé. 2 - Addition de diisopropyléthylamine (6 équivalents) puis de solvant (dichlorométhane ou diméthylformamide) sous agi tation. 3 - Après réaction négative à la ninhydrine lavage 2 fois au dichlorométhane. Les tests de contrôle utilisant la ninhydrine ont été effectués suivant le procédé décrit par Kaiser, E., Colescott, R.L., Bossinger, C.D. & Cook, P.I. (1970) Anal. Biochem. 24, 595-598. Avant le traitement par l'acide fluorhydrique le dernier groupement Boc est élimine par l'acide trifluoroacétique. Au départ de 1 g de résine " Boc-Trp-CM-resine" on a ainsi obtenu en operant manuellement 1,5 g de complexe chaîne peptidique protégee, résine que l'on utilise directement au stade suivant. STADE B : Libération du complexe chaîne peptidique proteaée- résine On fait réagir 1,5 g de complexe chaîne peptidique protégée-résine pendant 60 minutes avec 15 mol d'acide fluorhydrique à 0 C en présence d'anisole (1 ml). La résine est lavée à l'éther ; le peptide brut est extrait par une solution aqueuse d'acide acétique à 20 t. Après lyophilisation, on obtient 250 mg de produit brut. On lyophilise la fraction obtenue et recueille finalement 30 mg de produit attendu. EXEMPLES 2 à 9 En opérant de la même manière qu'à l'exemple 1, mais avec d'autres amino-acides, on a préparé les 8 autres peptides qui figurent ci-après EXEMPLE 2 : His-Ala-Ala-Ile-Ile-Trp EXEMPLE 3 t His-Leu-Ala-Ile-Ile-Trp EXEMPLE 4 : Leu-Ala-Ile-Ile-Trp EXEMPLE 5 : His-Leu-Ala-Ile-Ile-D-Trp EXEMPLE 6 : Leu-Ala-Ile-Ile-D-Trp EXEMPLE 7 : His-Ala-Asp-Ile-Ile-Trp EXEMPLE 8 : His-Ala-Asp-Ile-Ile-D-Trp EXEMPLE 9 : Ala-Ala-Ile-Ile-Trp. Chaque produit des exemples 1 à 9 a été sequencé et sa masse a été vérifiée en spectrométrie de masse. EXEMPLE 10 : On a préparé un soluté injectable répondant à la formulation suivante - Produit de l'exemple 2 1 mg - excipient aqueux stérile 2 ml EXEMPLE 11 = On a préparé des comprimés répondant à la formule suivante - Produit de l'exemple 2 2 mg - excipient q.s.p. un comprimé terminé à 150 mg (composition de l'excipient : lactose, amidon, talc, stéarate de magnesium). ETUDE DE L'ACTIVITE SUR RECEPTEUR DE L'ENDOTHELINE On effectue une préparation membranaire à partir de cortex postérieur plus cervelet de rat. Le tissu est broyé au POLYTRON dans un tampon Tris 50 mM pH = 7,4. Après 30 minutes à 25 C (B.M.) l'homogénat est centrifugé à 30000 g pendant 15 minutes (2 centrifugations avec reprise intermediaire dans le tampon Tris pH. 7,4). Les culots sont remis en suspension dans un tampon d'incubation (Tris 25 mM, pepstatine A 5 microg/ml, aprotinine 3 microg/ml, PMSF 0,1 mM, EDTA 3mM, EGTA lmM pH 7,4). On répartit des aliquotes de 2 ml dans des tubes à hémolyse et ajoute de la 125I Endothéline (environ 50000 dpm/tube) et le produit à étudier. (Le produit est d'abord testé à 3*10 5 M en triple). Lorsque le produit testé déplace de plus de 50 % la radioactivité liée specifiquement au récepteur, il est testé à nouveau selon une gamme de 7 concentrations afin de déterminer la concentration qui inhibe de 50 % la radioactivité liée spécifiquement au récepteur. On détermine ainsi la concentration inhibitrice 50 %. La liaison non spécifique est déterminée par addition d'endothéline à 10 6 M (en triple). On incube à 25 "C pendant 60 minutes, remet au bain-marie à 0 C, pendant 5 minutes, filtre sous pression réduite, rince au tampon Tris 7,4 et compte la radioactivité en présence du scintillant Triton. Le résultat est exprimé directement en concentration inhibitrice 50 % (CI50), c'est-à-dire en concentration de produit étudié exprimée en nM, nécessaire pour deplacer 50 % de la radioactivité spécifique fixée sur le récepteur étudié. Résultat Les CI50 trouvées pour les produits des exemples 1 à 9 sont données dans le tableau I ci-après, en nanomoles. TABLEAU I EXEMPLES CI 50 1 I > 10.000 2 100.000 3 45.100 4 100.000 ETUDE DE L'ACTIVITE VASOCONSTRICTRICE ET DE L'ANTAGONISME DES EFFETS DE L'ENDOTHELINE CHEZ LE RAT DEMEDULLE Des rats mâles Sprague-Dawley sont anesthésiés au nembutal (60 mg/kg) injecté par voie intrapéritonéale. Les animaux sont ensuite démédullés, mis sous assistance respira toire (1 ml/100 g - 50 insuflations par minute), puis les nerfs vagues sont sectionnés. Une artère carotide est cathête- risée pour enregistrer la pression artérielle et les produits à étudier sont injectés dans la veine pudendale. étude de l'activité vasoconstrictrice Les animaux reçoivent l'endothéline 1 ou le composé à tester en injections cumulées par voie veineuse, les adminis trations etant espacées de 2 minutes. L'augmentation de pression artérielle moyenne (PAm) induite par chaque composé est mesurée et exprimee en pourcen tage de variation par rapport à la pression initiale. étude de l'activité antagoniste de l'endothéline Dix minutes après l'injection intraveineuse du solvant ou des composés à tester, les animaux reçoivent des administra tions d'endothéline 1 de façon cumulative (1, 3, 10 et 30 Ag/kg i.v.) chaque 2 minutes. Lactivité antagoniste est exprimée en pourcentage d'inhibition de la réponse pressive de l'endothéline admi nistrée seule, aux doses de 3 et 10 pg/kg. Résultats L'activité vasoconstrictrice du composé des exemples 1 et 3 est donnée dans le tableau II ci-après Tableau II Exemple Doses % d'augmentation de PAm (mg/kg) ationdePAm 2 10 +8% 3 2 + 23 % L 'activité antagoniste du composé des exemples 1 et 3 est donnée dans le tableau III ci-après Tableau III Exemple Doses Pourcentage d'inhibition des (g/kg) réponses à l'endothéline endothéline 3 pg endothéline 10 pg 2 5 - 27 - 19 10 - 60 - 33 3 2 - 24 - 12 REVENDICATIONS 1) Nouveaux dérivés hexapeptidiques répondant à la formule générale (I) X1-X2-X3-Ile-X5-X6 (I) dans laquelle X1 représente un atome d'hydrogène ou un résidu d'histidine, d'acétyl-histidine, ou de D-histidine, X2 représente un résidu d'alanine, de leucine, de tryptophane, de phenylalanine ainsi que leurs homologues en série D, X3 représente un résidu d'alanine, d'acide aspartique ainsi que leurs homologues en série D, X5 représente un résidu d'isoleucine, d'alanine, de valine, de norleucine, de leucine et d'acide aspartique ainsi que leurs homologues en série D, X6 représente un résidu de tryptophane, de leucine, disoleu- cine, de norleucine et leurs homologues en série D, étant entendu que X1 ne peut représenter un résidu d'histidine lorsque X2 représente un résidu de leucine, X3 un résidu d'acide aspartique, X5 un résidu d'isoleucine et X6 un résidu de tryptophane. 2) Dérivés hexapeptidiques selon la revendication 1, caractérisés en ce que X1 représente un atome d'hydrogène, un résidu d'histidine ou de D-histidine, X2 représente un résidu d'alanine ou de leucine, ainsi que leurs homologues en série D, X3 représente un résidu d'alanine ou d'acide aspartique, ainsi que leurs homologues en série D, X5 représente un résidu d'isoleucine, ainsi que ses homologues en série D, X6 représente un résidu de tryptophane, ainsi que son homologue en série D. 3) Dérivés hexapeptidiques selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que X1 représente un atome d'hydrogène ou un résidu d'histidine, X2 représente un résidu d'alanine ou de leucine, X3 représente un résidu d'alanine ou d'acide aspartique, Xg représente un résidu d'isoleucine, X6 représente un résidu de tryptophane ou de D-tryptophane. 4) Dérivés peptidiques selon la revendications 3, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par l'un des dérivés peptidiques suivants His-Ala-Ala-Ile-Ile-Trp His-Leu-Asp-Ile-Ile-D-Trp , His-Leu-Ala-Ile-Ile-Trp , Leu-Ala-Ile-Ile-Trp , His-Leu-Ala-Ile-Ile-D-Trp Leu-Ala-Ile-Ile-D-Trp , His-Ala-Asp-Ile-Ile-Trp His-Ala-Asp-Ile-Ile-D-Trp Ala-Ala-Ile-Ile-Trp. 5) Dérivés hexapeptidiques selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 3, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par l'un des dérivés peptidiques suivants His-Ala-Ala-Ile-Ile-Trp , His-Leu-Ala-Ile-Ile-Trp 6) Procédé de préparation des nouveaux dérivés hexapeptidiques tels que définis à la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue une synthèse en phase solide en introduisant séquentiellement sur un support de type polystyrène réticulé les amino-acides dûment protégés, à l'aide d'un agent de couplage, déprotège les amino-acides, et libère de la résine la chaîne peptidique ainsi formée, pour obtenir le dérivé peptidique de formule (I) ainsi recherché. 7) Procedé selon la revendication 6, caractérisé en ce que - le support de type polystyrène réticulé est une résine de type "Boc-Trp-CM" ou de type "Boc-D-Trp-CM" dans laquelle Boc est un groupement tertiobutyloxycarbonyl, Trp est un groupement tryptophyl et D-Trp est un groupement D-tryptophyl et CM désigne le support de polystyrène réticulé, - l'agent de couplage est le (benzotriazol-l-yloxy) tris(diméthylamino) phosphonium hexafluorophosphate ou Bop, - la libération du support de la chaîne peptidique ainsi que la déprotection des amino-acides est effectuée au moyen de l'acide fluorhydrique en opérant à basse température de préférence vers 0CC. 8) Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouveaux dérivés hexapeptidiques tels que définis par la formule générale (I) de la revendication 1. 9) Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouveaux dérivés hexapeptidiques tels que définis à l'une quelconque des revendications 2, 3, 4 ou 5. 10) Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif, l'un au moins des médicaments tels que définis à l'une quelconque des revendications 8 ou 9.