FR 2680520 A1 19930226 FR 9110516 A 19910822 PROCEDE DE DETECTION DE NOUVELLES REGIONS HYPERVARIABLES DANS UNE SEQUENCE D'ADN, SEQUENCES DE NUCLEOTIDES CONSTITUANT DES SONDES D T HYBRIDATION ET LEUR APPLICATION BIOLOGIQUE L'invention concerne un procédé de détection de régions hypervariables dans une séquence d'ADN génomique humain ou animal. L'invention concerne également des séquences de nucléotides constituant des sondes pour l'identification par hybridation de régions hypervariables contenues dans un échantillon d'ADN. Dans de multiples circonstances, la détermination de l'identité d ' un individu revêt une grande importance; il s agit par exemple, de la recherche de parenté entre deux personnes, ou d'enquêtes de police visant à rassembler des indices sur la culpabilité d'un individu. Il peut s'agir également de déterminer le pedigree d'un animal, ou encore l'identité génétique de lignées cellullaires. On a récemment mis en évidence dans les génomes humains et animaux des régions contenant un nombre variable de répétitions en tandem, dénommées "VNTR" ou régions hypervariables ou encore "régions mini-satellites; ces régions hypervariables sont constituées de courtes séquences d'ADN répétées en tandem, un nombre de fois très variable d'un individu à l'autre (JEFFREYS A. J et al, Nature (1985), 314, p. 67 73). Les éléments répétés en tandem ne sont pas nécéssairement parfaitement identiques. Ces séquences répétées et dispersées dans le génome présentent la particularité de se transmettre dans la descendance d'un individu. Les régions hypervariables constituent donc une empreinte génétique de l'individu fort utile pour son identification à partir d'un échantillon d'ADN. Les recherches menées sur ce sujet ont permis de mettre en évidence environ 200 régions hypervariables sur les 1 500 que l'on estime exister chez l'homme, et de préparer des sondes d'hybridation pour l'analyse d'ADN humain. L'hybridation d'une telle sonde avantageusement marquée, avec un échantillon d'ADN fragmenté et séparé par électrophorèse, permet d'obtenir des images d'hybridation de la sonde avec les portions d'ADN complémentaires présentes dans l'échantillon. La comparaison de la position, du nombre et de la taille des bandes issues de l'analyse d'ADN provenant de deux échantillons distincts, permet de déterminer si ces échantillons proviennent du génome d'un même individu, de génomes de deux individus directement apparentés ou sans lien de parenté. De telles sondes ont été décrites notamment dans la Demande de Brevet Français au nom de IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES PLC publiée sous le numéro 2 632 656, ainsi que dans la Demande de Brevet Européen au nom de IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES PLC publiée sous le numéro 238 329. Afin d'augmenter la fiabilité de ces analyses d'ADN, il est nécessaire de disposer d'un grand nombre de sondes. Or, les procédés mis en oeuvre pour identifier de nouvelles régions hypervariables et préparer des sondes correspondantes, reposent sur le criblage de banques génomiques et ne sont pas satisfaisants, car certains présentent l'inconvénient d'utiliser des régions mini-satellites déjà connues, et d'autres nécessitent souvent un enrichissement préalable en structures mini-satellites par sélection de taille des fragments criblés. La présente invention vise précisément à fournir une méthode permettant d'isoler de nouvelles régions hypervariables tant dans les espèces animales que dans l'espèce humaine, et de préparer des sondes d'hybridation permettant la détection de séquences d'ADN polymorphes non connues, portant lesdites régions hypervariables, sans rencontrer les inconvénients susmentionnés des techniques de l'art antérieur. Les travaux de recherche menés par les Inventeurs dans le domaine des sondes synthétiques constituées chacune d'un polymère formé de la répétition en tandem d'un oligonucléotide, leur ont permis de trouver un nouveau procédé permettant d'isoler de nouvelles régions hypervariables dans une séquence d'ADN génomique, et de préparer des sondes d'hybridation permettant l'identification de séquences d'ADN polymorphes non connues, portant lesdites régions hypervariables. Le procédé de l'invention pour la détection de nouvelles régions hypervariables dans une séquence d'ADN, est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a - la préparation de polynucléotides formés chacun d'un oligonucléotide quelconque, comprenant de 5 à 20 bases et répété de 4 à 200 fois; b - l'exploration d'une banque génomique par hybridation en conditions faiblement stringentes avec les polynucléotides préparés en (a) et marqués; c - l'analyse par la méthode de Southern des clones ayant réagit avec les polynucléotides; d - la purification et éventuellement le marquage des fragments de restriction détectés par les polynucléotides;; e - l'analyse par la méthode de Southern de l'ADN génomique d'individus non-apparentés ayant réagit en conditions d'hybridation fortement stringentes avec les fragments de restriction obtenus en (d), et la sélection des fragments de restriction correspondants à de nouvelles régions hypervariables. Selon une forme préférée de l'invention, l'étape (b) consiste à explorer une banque de cosmides humain. Le procédé de l'invention permet de manière efficace la détection de nouvelles séquences d'ADN polymorphes portant des région hypervariables; le procédé est facilement mis en oeuvre à partir de la préparation de polynucléotides formés chacun de la répétition en tandem d?un oligonucléotide quelconque. De manière avantageuse, à l'étape (a), on prépare des polynucléotides formés chacun d'un oligonucléotide quelconque, comprenant de 10 à 18 bases, répété de 10 à 60 fois. Des polynucléotides utilisés dans le procédé de l'invention, répondent aux formules suivantes - (AGTCATGGTAGAGC)n - (ACGGAGCGGACGGA)n - (GTAGAGGTTCTGGACT) n - (TTTGAGGTGGATGGAC) n - (AGCTACGGTGTGGACT) n dans lesquelles n est supérieur à 20. Après marquage, ces polynucléotides sont utilisés pour explorer la banque de cosmides et permettent la révélation, par hybridation dans les conditions faiblement stringentes définies ci-après, de cosmides contenant des séquences d'ADN polymorphes. Des conditions d'hybridation faiblement stringentes pour l'exploration de la banque de cosmides peuvent être, par exemple, définies comme suit - hybridation à 500C, 0,9 M ions Na+ - lavages à 550C, 0,15 M ions Na+. Ces conditions d'hybridation autorisent un appariement de 50% environ des polynucléotides avec le cosmide cible. Les polynucléotides mis en oeuvre dans le procédé de l'invention sont marqués par tout marqueur classiquement utilise. Ils peuvent être marqués à l'aide d'un traceur radioactif comme 32p, 35S, 125in 3H, 14C. Le marquage radioactif peut être réalisé selon une méthode quelconque connue de l'homme du métier. Les polynucléotides peuvent être marqués en (3') par addition d'un ou plusieurs déoxyribonucléotides ou ribonucléotides ou d'un analogue de nucléotide tel qu'un didéoxynucléotide, marqués en position alpha par le 32p, en présence de la Déoxynucléotidyl Terminal Transférase; les polynucléotides peuvent également être marqués en (5') à l'aide d'une kinase, par exemple la T4 Polynucléotide Kinase; il s'agit dans ce cas du transfert sur les polynucléotides du phosphate radioactif d'un nucléotide marqué en position gamma. Les polynucléotides peuvent encore être marqués à chaque extrémité par adjonction d'une séquence quelconque radiomarquée en présence d'une ligase. Ils peuvent aussi être marqués par "Random Priming" ou également lors de leur synthèse chimique en y incorporant un ou plusieurs ribonucléotides ou déoxyribonucléotides radioactifs. La méthode de détection de l'hybridation dépendra du marqueur radioactif utilisé et pourra reposer sur l'autoradiographie, la scintillation liquide, le comptage de rayonnement gamma ou tout autre technique permettant de détecter le rayonnement émis par le marqueur radioactif. Un marquage non radioactif peut également être utilisé, en associant aux polynucléotides des groupements présentant des propriétés immunologiques, comme un antigène ou un haptène, une affinité spécifique pour certains réactifs comme un ligand, des propriétés permettant la complétion de réactions enzymatiques comme une enzyme ou un substrat d'enzyme. Les polynucléotides peuvent être marquées par "Random Priming" ou lors de la synthèse chimique en incorporant un ou plusieurs ribonucléotides ou déoxyribonucléotides marqués non radioactivement. Le marquage non radioactif peut encore être réalisé par incorporation à l'extrémité (3') d'un ou plusieurs déoxyribonucléotides ou ribonucléotides ou d'un analogue de nucléotide tel qu'un didéoxynucléotide comportant l'un de ces groupements.Le marquage peut aussi être fait directement par modification chimique de l'oligonucléotlde, comme la photobiotinylation ou la sulfonation. Il peut également être réalisé par addition en (31) ou (5') de molécules traceuses par réaction chimique après synthèse; les polynucléotides peuvent encore être marqués à chaque extrémité par adjonction d'une séquence quelconque portant des molécules traceuses, en présence d'une ligase. La méthode de détection et de révélation de l'hybridation dépendra du marqueur non radioactif utilisé. Après exploration de la banque de cosmides, l'analyse par la méthode de Southern des clones ayant réagit avec les polynucléotides conduit à des fragments de restriction, lesquels après purification constituent des séquences de nucléotides qui peuvent être avantageusement marquées en vue de l'analyse en Southern blot de l'ADN génomique d'individus non-apparentés. Cette analyse en Southern blot conduit à la détection par hybridation, dans les conditions fortement stringentes définies ci-après, de nouvelles régions hypervariables. Des conditions d'hybridation fortement stringentes pour l'exploration en Southern blot de l'ADN génomique d'individus non-apparentés, peuvent être, par exemple, définies comme suit - Hybridation à 65 ou 700C, 0,9 M ions Na+; - Lavages à 650C, 0,015 ou 0,15 M ions Na+. La présente invention concerne également les séquences de nucléotides pour l'identification par hybridation d'une région hypervariable détectée par le procédé décrit précédemment. Les séquences de nucléotides constituant les fragments de restriction ayant permis, selon le procédé de l'invention, la détection et l'isolement de nouvelles régions hypervariables, peuvent être avantageusement mises en oeuvre comme sondes d'hybridation pour l'identification de ces nouvelles régions hypervariables. Une première séquence de nucléotides pour l'identification par hybridation d'une région hypervariable, détectée par le procédé selon l'invention, mis en oeuvre avec le polynucléotide de formule (AGTCATGGTAGAGC) n, n étant supérieur à 20, correspond au fragment de restriction AluI de 3,8 kb environ du cosmide contenant la portion d'ADN génomique humain située en position 6q27, et présentant 97 % d'hétérozygocie; lequel cosmide cloné dans le vecteur pWEl5 introduit dans Echerichia Coli a été déposé à la "Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes" (CNCM) à L'INSTITUT PASTEUR, le 14 août 1991 sous le NO I-1134. Cette première séquence sera désignée dans la description expérimentale qui suivra par "CEB4". Une deuxième séquence de nucléotides pour l'identification par hybridation d'une région hypervariable détectée par le procédé selon l'invention, mis en oeuvre avec le polynucléotide de formule (ACGGAGCGGACGGA)n, n étant supérieur à 20, correspond au fragment de restriction d'environ 4 kb obtenu après hydrolyse par AluI et HaeIII du cosmide contenant la portion d'ADN génomique humain située en position 7q et présentant 93 % d'hétérozygocie; lequel cosmide cloné dans le vecteur pWEî5 introduit dans Echerichia. Col a été déposé à la CNCM, le 14 août 1991 sous le NO I-1135. Cette deuxième séquence sera désignée dans la description expérimentale qui suivra par "CEB13". Une troisième séquence de nucléotide pour l'identification par hybridation d'une région hypervariable détectée par le procédé selon l'invention, mis en oeuvre avec le polynucléotide de formule (ACGGAGCGGACGGA)n, n étant supérieur à 20, correspond au fragment de restriction d'environ 3,8 kb obtenu après hydrolyse par HaeIII et HinfI du cosmide contenant la portion d'ADN génomique humain située en position lp et présentant 98 % d'hétérozygocie, lequel cosmide cloné dans le vecteur pie15. introduit dans Echerichia. Coli a été déposé à la CNCM, le 14 aout 1991 sous le NO I-1136. Cette troisième séquence sera désignée dans la description expérimentale qui suivra par "CEB1S". Une quatrième séquence de nucléotide pour l'identification par hybridation d'une région hypervariable détectée par le procédé selon l'invention, mis en oeuvre avec le polynucléotide de formule (GTAGAGGTTCTGGACT) n, n étant supérieur à 20, est constitué de motif unitaire suivant 5' GTTGAGGGGGAGGGAGGGTGGTTGCGGAGGTCCCTGG 3' répété en tandem environ 100 fois. La séquence de nucléotides ci-dessus, sera désignée dans la description expérimentale qui suivra par "CEBl"; elle correspond au fragment de restriction Alul de environ 3,8 kb du cosmide contenant la portion d'ADN génomique humain située en position 2q37.3 et présentant 93 % d'hétérozygocie, lequel cosmide est cloné dans le vecteur pWE15 introduit dans Echerichia. Coli. Une cinquième séquence de nucléotides pour l'identification par hybridation d'une région hypervariable détectée par le procédé selon l'invention mis en oeuvre avec le polynucléotide de formule (GTAGAGGTTCTGGACT) nt n étant supérieur à 20, est constitué du motif unitaire suivant 5' GAGGAGAGGGTGGCGGT 3' répété en tandem environ 400 fois. La séquence de nucléotides ci-dessus, sera désignée dans la description expérimentale qui suivra par "CEB2"; elle correspond au fragment de restriction HinfI d'environ 6 kb du cosmide contenant la portion d'ADN génomique humain située en position 20q13.1 et présentant 57 % d'hétérozygocie, lequel cosmide est cloné dans le vecteur pWE15 introduit dans Echerichia. Coli. Une sixième séquence de nucléotides pour l'identification par hybridation d'une région hypervariable détectée par le procédé selon l'invention mis en oeuvre avec le polynucléotide de formule (GTAGAGGTTCTGGACT)n, n étant supérieur à 20, correspond au fragment de restriction d'environ 2,5 kb obtenu après hydrolyse par HaeIII et HinfI du cosmide contenant la portion d'ADN génomique humain située en position 6q27 et présentant 95 % d'hétérozygocie, lequel cosmide cloné dans le vecteur pWEî5 introduit dans Echerichia. Coli a été déposé à la CNCM, le 14 août 1991 sous le NO I-1133. Cette sixième séquence sera désignée dans la description expérimentale qui suivra par "CEB3". Une septième séquence de nucléotide pour l'identification par hybridation d'une région hypervariable détectée par le procédé selon l'invention, mis en oeuvre avec le polynucléotide de formule (GTAGAGGTTCTGGACT) n, n étant supérieur à 20, est constitué du motif unitaire suivant 5' CTGTGCACCACCCAGGTCGAATCTCGGCTCACTGCGACCTC TGCCTCCGCGTAG 3' répété en tandem environ 50 fois. La séquence de nucléotides ci-dessus, sera désignée dans la description expérimentale qui suivra par "CEB5"; elle correspond au fragment de restriction HaeIII d'environ 3 kb, du cosmide contenant la portion d'ADN génomique humain située en position 13q34.1 et présentant 80 % d'hétérozygocie, lequel cosmide est cloné dans le vecteur pWE15 introduit dans Echerichia. mi. Les séquences de nucléotides peuvent être marquées par tout marqueur classiquement utilisé tel qu'énoncé précédemment pour les polynucléotides. invention concerne naturellement aussi les polynucléotides et séquences de nucléotides complémentaires des précédentes et donc capables de s'apparier avec la même portion d'ADN en raison de sa nature bicaténaire. Font aussi partie de l'invention les polynucléotides et séquences de nucléotides dans la séquence desquelles les thymines sont remplacées par des uraciles ou dans lesquelles une des quatre bases est remplacée par une inosine. L'invention concerne également tout polynucléotide et séquences de nucléotides ne se distinguant des précédentes au niveau de leur séquence que par additions et/ou suppressions et/ou substitutions d'un ou plusieurs nucléotides, dès lors que celles-ci n'entraînent pas de modification des propriétés d'hybridation desdits polynucléotides ou séquences nucléotidiques. L'invention concerne aussi un procédé d'amplification génétique d'une région hypervariable détectée par le procédé de l'invention, lequel procédé d'amplification consiste à fixer par hybridation aux extrémités de ladite région hypervariable, une séquence amorce de 17 à 30 bases judicieusement choisie parmi tout ou partie des séquences flanquantes des régions hypervariables, telle qu'elle peut être obtenue à partie des cosmides, puis à mettre en oeuvre un processus d'extension enzymatique à l'aide d'ADN-polymérase, suivi d'un processus de dénaturation, et à répéter le cycle hybridation-extension-dénaturation, connu sous le nom de PCR et décrit par la Société CETUS, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence constituant la région hypervariable de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. L'invention concerne également un procédé pour l'identification d'une région hypervariable détectée par le procédé conforme à l'invention, consistant à mettre en contact une séquence d'ADN dénaturée et fixée sur un support , avec une séquence de nucléotides selon 1 r invention marquée et constituant une sonde, dans un milieu et des conditions permettant une hybridation, puis par la détection des hybrides produits, à mesurer les quantités et les localisations de la sonde marquée sur la séquence d'ADN étudiée. L'invention concerne enfin l'utilisation des séquences de nucléotides selon l'invention, éventuellement marquées, dans des procédés pour le diagnostic de maladies héréditaires ou tumorales. Parmi celles-ci on peut citer la recherche de pertes d'allèles ou de régions chromosomiques dans des tumeurs, ou l'identification de régions tumorales grâce aux sondes hypervariables à taux de mutation important. Outre les caractéristiques qui précèdent, l'invention comporte d'autres détails qui ressortiront de la description qui suit et qui se réfèrent à des exemples de réalisation et de mise en oeuvre du procédé de l'invention, étant entendu que ces exemples ne sauraient constituer une quelconque limitation à la portée des revendications. I - MATERIEL ET METHODE 1) Préparation des polynucléotides Les polynucléotides ont été préparés selon la méthode décrite par VERGNAUD et al. dans Electrophoresis 1991, 12, 134-140. Il s'agit de polymères formés d'oligonucléotides synthétiques répétés de sequence quelconque en tandem. Les oligonucléotides rapportés dans le Tableau 1 ci-après ont été préparés, et polymérisés de façon à disposer de polynucléotides de quelques centaines de bases. Tableau 1 Polynucléotide Séquence % G+C Lavage 14C1 GATCGCTCTCTCGA 57% 4XSSC 60 C 14C2 GGCAGGATTGAAGC 57% 2XSSC 57 C 14C3 AGCTAAGCCTAGCA 50% 1XSSC 55 C 14C4 AACTGCCCCCTCTT 57% 3XSSC 63 C 14C5 GACAAACAGAGCAA 43% 1XSSC 55 C 14C6 CGAGCCAAACGCTA 57% lXSSC 50 C 14C7 TCCTAGAATTTTCT 29% 3XSSC 45 C 14C8 GGCCGTAGCGCGGT 79% 1XSSC 50 C 14C9 ATGCACCGTCGCAC 64% 1XSSC 60 C 14C10 GTGAAACGTCTTCC 50% 3XSSC 45 C 14C11 AGTCATGGTAGAGC 50% 1XSSC 55 C 14C12 GTTTCTCCAACAGA 43% 1XSSC 50 C 14C13 AGCCGTCTGTTTTC 50% 1XSSC 50 C 14C14 CTGAAAACGATGGG 50% 1XSSC 55 C 14C15 CCGTAGCAGGTAGA 57% 1XSSC 50 C 14C16 GGTAGAGGCAACTC 57% 3XSSC 57 C 14C17 CAAAAGTCAGGCGT 50% 1XSSC 55 C 14C18 TGATTTAAGTCCAA 29% 3XSSC 45 C 14C19 GGGTGCTCGGGTAC 71% lXSSC 60 C 14C20 CCCCGCTCAGGTAC 71% 3XSSC 55 C 14C21 ACGGAGCGGACGGA 71% 1XSSC 55 C 16C1 AACAGCTATGACCATG 44% 3XSSC 57 C 16C2 GTAGAGGTTCTGGACT 50% 2XSSC 55 C 16C3 ACAATTACGCAGTACT 37% 2XSSC 60 C 16C4 TTTGAGGTGGATGGAC 50% 2XSSC 60 C 16C5 ACGACACGCCTCCACA 62% 2XSSC 65 C 16C6 TAAATTTAGATCGGCA 31% 2XSSC 60 C 16C17 AGAACCAGGCTCAGGG 63% 2XSSC 55 C 16C18 GTAGAcGTTCTGcACT 50% 2XSSC 55 C 16C19 GTAGtGTTcCTGGACT 56% 2XSSC 55 C 16C20 GTAGAGcTTCTGcAgT 50% 2XSSC 55 C 16C21 GgAGAGGTTgTGGACT 56% 2XSSC 55 C 16C22 GTAGAGGggCTGGACT 63% 2XSSC 55 C 16C23 GTAGAGGTTggGGACg 63% 2XSSC 55 C 16C27 AGCTACGGTGTGGACT 56% 1XSSC 55 C 2) Exploration d'une banque de cosmides humains Une banque de cosmides humains fournie par STRATAGENE CLONING SYSTEM (Référence 951202, mâle, placenta, dans le vecteur plasmidique pWEî5) a été utilisée comme recommandé par le fournisseur en utilisant des membranes du type GeneScreen NEN. Environ 300 000 cosmides ont été explorés avec les polynucléotides 14C11, 14C21, 16C2, 16C4 et 16C27. Pour ce faire, les filtres ont été hybridés avec les sondes sus-mentionnées dans un tampon : 2 % SDS 0,45 M Na2PO4 , pH 7,2 , 0,5 % de lait en poudre , 1 mM EDTA , une nuit à une température de 50 OC, et lavés deux fois au moins 30 minutes dans les conditions mentionnées au Tableau l (1 X SSC = 0,15 M NaCl , 15 mM citrate de sodium). 3) Identification des séquences d'ADN polymorphes L'ADN des cosmîdes a été préparé selon des protocoles conventionnels (SAMBROOK et al. 1989), digéré avec des enzymes de restriction courantes fournies par la Société APPLIGENE, telles que : Alun, HaeIII, Sau3A, HinfI, et utilisées selon les recommandations du fabricant, puis soumis à une électrophorèse et analysé en Southern blot, selon la méthode décrite par Sambrook et al. (1989).Les fragments de restriction précédemment détectés au niveau des cosmides par hybridation, dans des conditions faiblement stringentes, avec les polynucléotides 14C11, 14C21, 16C2, 16C4 ou 16C27, sont identifiés par hybridation dans des conditions similaires, et I'ADN correspondant, dénommé "CEB", est alors purifié par électroélution et marqué par random priming, selon la méthode décrite par FEINBERG et VOGELSTEIN (1983), en utilisant du dCTP(32P). Dans certains cas , la totalité du cosmide peut aussi être utilisée en tant que sonde après neutralisation des séquences d'ADN répétitives, comme décrit par BLONDEN et au.(1989). 4) Hybridations par transfert Southern Les hybridations par transfert Southern blot ont été effectuées de la manière décrite par VERGNAUD et al. dans Electrophoresis (1991), 12, 134-140. Une concentration de la sonde comprise entre 0,1 et 0,2 million dpm/ml est suffisante. Les membranes ont été exposées avec deux écrans amplificateurs et un film du type KODAK XAR5, pendant 1 à 4 nuits à -80 OC. 5) Séuencase Le séquençage a été réalisé selon la méthode de SANGER et al. (1977) dite de terminaison de chaîne dideoxy, avec la version SEQUENASE 2.0 fournie par UNITED STATES BIOCHEMICAL CORP. L'ADN double brin a été séquencé de la manière décrite par JONES et SCHOFIELD (1990) 6) Analvse de séaréoation et de liaison L'analyse de liaison à d'autres marqueurs a été réalisée en utilisant le programme de Liaison développé par LATHROP et al. (1985). Les données ont été obtenues par l'analyse de ségrégation dans 40 familles, fournies par un panel commun de familles du Centre d'Etude du Polymorphisme Humain. L'hétérozygocie est établie à partir des grand-parents, ou à partir des parents si aucun grand-parent n'est accessible. 7) Hybridation in situ Les préparations cytogénétiques ont été obtenues à partir de lymphocytes. Les ADN de cosmides (CEB) sont marqués par nick-translation avec du dUTP-11digoxigenine (BOEHRINGER) comme décrit par le fabricant. La sonde, à une concentration finale de 1 à 3 fg/ml, et l'ADN humain total sonifié, à une concentration finale de 200 à 300 Fg/ml sont dénaturés par la chaleur (10 minutes dans l'eau bouillante) et mis dans un tampon d'hybridation 2 X SSC , 20 mM Na2HPO4 , 20 mM Na2H2PO4 50 % formamide déionisé, 1G % sulfate de dextran, 0,1 % SDS, 1 % solution de Denhart. Après dénaturation, 20 Wl sont utilisés pour chaque plaque de préparation cytogénétique. Après addition d'une bande de plastique, les plaques sont incubées pendant 16 heures à 420C dans une chambre de séchage; puis elles sont lavées deux fois dans un tampon 2 X SSC pendant 5 minutes à 420C. Les plaques sont ensuite immergées pendant une durée d'au moins 10 minutes dans une solution PBS , 0,1 % Tween 20 , 1 % BSA. Après addition de 70 Rl d'une solution d'anticorps anti-FITC digoxigenin-conjugué, diluée au 1/8ère, les plaques sont incubées dans l'obscurité pendant 45 minutes; puis elles sont rincées dans une solution PBS, 0,1 % Tween 20.Avant observation, les plaques sont colorées avec 50 Rl d'une solution de iodide de propidium à 0,3 Wg/ml. Les plaques ont été photographiées avec un film Ektachrome 400 en utilisant un photomicroscope ZEISS II. II - RESULTATS 1) Isolement des séquences d'ADN polymorphes G. VERGNAUD et al. (Electrophoresis 1991, 12, 134-140) ont montré que des sondes d'ADN synthétiques formées d'un court oligonucléotide polymérisé détecte des locus polymorphes dans le génome humain. Afin d'étudier la possibilité d'identifier de nouvelles régions hypervariables, les Inventeurs ont exploré une banque de cosmides avec les sondes polynucléotidiques 14Cll, 14C21, 16C2, 16C4 et 16C27. L'analyse en Southern blot de l'ADN génomique humain total, digéré par des enzymes traditionnelles telles que HinfI ou HaeIII, est rapportée à la figure 1 en annexe. La figure 1 représente le profil d'hybridation obtenu avec 6 individus sans lien de parenté en utilisant les polynucléotides 14C11, 16C2 et 16C4 également utilisés pour explorer la banque de cosmides humains (Dans la figure 1, la zone de taille est comprise entre 0,5 et 10 kb). Il apparaît que les polynucléotides 14C11 et 16C2 détectent un faible nombre de bandes, alors que le polynucléotide 16C4 donne une traînée dans la zone de faible poids moléculaire (inférieure à 2 kb) . Les polynucléotides 14C21 et 16C27 détectent un faible nombre de bandes. Conformément aux résultats précédents, le nombre de spots obtenu après exploration des 300 000 clones de la banque de cosmides est de l'ordre de 1 000 pour le polynucléotide 14C11, 250 pour le polynucléotide 16C2, 6 000 pour le polynucléotide 16C4, 600 pour le polynucléotide 14C21 et 1500 pour le polynucléotide 16C27. Parmi ceux-ci, les Inventeurs ont sélectionné respectivement 8, 10, 27, 10 et 11 cosmides donnant le signal le plus fort. Des polymorphismes différents ont alors été identifiés dans l'un des 8 cosmides sélectionnés ayant réagit avec le polynucléotide 14C11, dans 4 des 10 cosmides sélectionnés ayant réagit avec le polynucléotide 16C2, dans 3 des 27 cosmides sélectionnés ayant réagit avec le polynucléotide 16C4, dans 3 des 10 cosmides sélectionnés ayant réagit avec le polynucléotide 14C21, dans 8 des 11 cosmides sélectionnés ayant réagit avec le polynucléotide 16C27. Deux des quatre polymorphismes identifiés avec le polynucléotide 16C2 ont été obtenus deux fois, il s'agit des fragments d'ADN CEB5 provenant du cosmide 61 et du fragment CEB3 provenant du cosmide 66. Dans l'un des cas, les inserts cosmidiques sont différents, comme l'indique leurs cartes de restriction; ce qui suggère qu il s'agit de deux clones indépendants du meme bous, et qu'en conséquence le polynucléotide 16C2 ne permet pas d'accéder à un grand nombre de locus du génome humain. Dans l'autre cas, les inserts cosmidiques donnent la même carte de restriction avec l'enzyme BlnfI, ce qui est probablement dû à l'utilisation d'une banque amplifiée.De même, les dix clones détectés par 14C21 correspondent à 3 locus seulement, l'un obtenu sept fois, et un autre deux fois. Trois des huit locus isolés par 16C27 ont été obtenus deux fois. Ces résultats permettent d'estimer que l'exploration de la banque de cosmides avec les polynucléotides 14C11 et 16C4, a conduit à un enrichissement en régions hypervariables d'au moins 3 à 5 fois supérieur à une exploration au hasard (BOWDEN et al., 1989). Et de manière plus intéressante, l'exploration avec le polynucléotide 16C2 a conduit à un enrichissement en régions hypervariables 20 fois supérieur environ à ce que permet une exploration au hasard; parmi les 10 clones cross-hybridant avec le polynucléotide 16C2, 6 contiennent un locus hautement polymorphe, correspondant à 4 régions hypervariables différentes. L'exploration avec le polynucléotide 14C21 a conduit à un enrichissement en régions hypervariables 20 fois supérieur environ à ce que permet une exploration au hasard et l'exploration avec le polynucléotide 16C27 a conduit à un enrichissement en régions hypervariables 30 fois supérieur environ à ce que permet une exploration au hasard. Ces résultats indiquent que les polynucléotides les mieux appropriés à l'exploration d'une banque génomique totale sont ceux détectant un nombre limité de bandes en Southern blot, sans traînée dans les zones de faible poids moléculaire et quelques dizaines à quelques centaines de colonies par génome équivalent. Le Tableau 2 ci-dessous rapporte l'origine cosmidique et la taille des fragments de restriction correspondant aux séquences d'ADN polymorphes, ainsi que le polynucléotide ayant permis leur détection. Tableau 2 Fragment cosmide taille enzyme de polynucléotide (kb) restriction CEB1 53 3,8 Alul 16C2 CEB2 54 6 HinfI 16C2 CEB3 66 2,5 HaeIII+HinfI 16C2 CEB4 83 3,8 AluI 14C11 CEB5 61 3 HaeIII 16C2 CEB13 101 4 AluI+HaeIII 14C21 CEB1S 102 3,8 HinfI+HaeIII 14C21 La figure 2 représente les profils d'hybridation en conditions fortement stringentes de trois générations d'un panel commun de familles fourni par le CEPH, avec les fragments cosmidiques CEB2 issu du cosmide 54, CEB3 issu du cosmide 66, CEB4 issu du cosmide 83, CEB5 issu du cosmide 61, CEB6 issu du cosmide 16 et CEB7 issu du cosmide 4.Dans la figure 2, les carrés représentent les hommes et les cercles les femmes, le nombre indiqué sur chaque carré ou cercle correspond au numéro d'identification de l'individu au CEPH; une échelle sur le côté des figures indique la taille en kilobases. Les bandes détectées à la figure 2 n'appartiennent pas au "fingerprint" révélé par les polynucléotides. Les Inventeurs ont séquencé en partie certaines des régions hypervariables qui ont été isolées. Dans certains cas ces inserts peuvent être clivés par une enzyme de restriction et les fragments de digestion ont été également séquencés. Dans d'autres cas, les inserts ont été sous-clonés dans le vecteur pUC et les deux extrémités ont été séquencées par séquençage d'ADN double brin. Les 5 inserts étudiés contiennent des séquence répétées en tandem. Le séquençage effectué a permis de déterminer 3 fragments d'ADN constituant un motif unitaire répété en tandem 2 à 500 fois, et correspondant à de nouvelles régions hypervariables. Il s'agit des fragments CEBl issu du cosmide 53, CEB2 issu du cosmide 54, et CEB5 issu du cosmide 61. CEB1 : 5' GTTGAGGGGGAGGGAGGGTGGTTGCGGAGGTCCCTGG 3' CEB2 5' GAGGAGAGGGTGGCGGT 3' CEB5 5' CTGTGCACCACCCAGGTCGAATCTCGGCTCACTGCGACCTC TGCCTCCGCGTAG 3' Ces résultats et la corrélation observée par les Inventeurs entre la taille des allèles et l'intensité des bandes indiquent que le polymorphisme observé est bien dû aux variations du nombre de répétitions en tandem. Le motif unitaire répété comporte 7 à 8 bases en commun avec 1'oligonucléotide synthétique correspondant formant le polynucléotide; dans quatre cas, les inventeurs ont constaté que le motif unitaire est riche en base G. Malgré cela, aucune des séquences ne contient la séquence consensus GNNGTGGG définie par NAKAMURA et al. (1988). 2) Origine de la détection des cosmides ne contenant pas de récrions hypervariables avec le polynucléotide 1 6C4 Les Inventeurs ont séquencé les fragments s'hybridant avec le polynucléotide 16C4, issus de deux cosmides parmi ceux ne semblant pas détectés de séquences polymorphes en Southern blot et se trouvant contenir de courtes séquences (TGGA)n (BOYLAN et al., 1990). Ceci, n' est a posteriori pas surprenant, car le polynucléotide 16C4 est un multiple de 4 et contient deux fois le motif TGGA. Il apparaît en conséquence, que la majeure partie des clones détectés par le polynucléotide 16C4 correspond à des mini-satellites de cette sorte.Ainsi, seulement 3 (cosmides 4, 16 et 35) des 27 clones, soit 10 %, contiennent des locus hautement polymorphes (Le fragment CEB10 issu du cosmide 37 n'est pas hautement polymorphe). 3) Localisation chromosomique p a r hvbridation in situ Le tableau 3, ci-dessous rapporte la localisation par hybridation in situ de neuf cosmides contenant des locus polymorphes. Dans le tableau 3 - le "nombre D" correspond au numéro d'enregistrement attribué à la séquence de nucléotides du sous-fragment (CEB) par le GENOME DATA BASE (Baltimore, MD, USA); - "in situ" indique la caractéristique cytogénétique standard du cosmide, crest à dire sa localisation sur le chromosome par rapport au centromère; - "zone de taille de 1'allèle" indique la taille du fragment détecté par le polynucléotide en Southern en précisant l'enzyme de restriction utilisée;; - "hétérozygocie" indique sur 100 individus non-aparentés, le nombre d'hétérozygotes pour l'allèles - "liaison avec" indique le nom d'un marqueur proche connu, dont le nombre D figure entre parenthèses; - "Lod;" indique la distance génétique avec cet autre marqueur et le degré de certitude de cette liaison. Tableau 3 Cos- D Détecté In Sous- Zone de Hétéro- Liaison Lod; e mide avec poly- Situ fragments taille de zygocie avec nucléotide l'allèle (%) (Enzymes) 4 D10S112 16C4 10q26.3 CEB7 1,8-3kb 50 VTR4 31;0,01 (HaeIII) (D10S6) 16 D8S139 16C4 8q24.3 CEB6 2,5-3,3kb 38 CHTl6,8 4,5;0,01 (HaeIII) (TG) 35 16C4 20q13.3 37 D1S153 16C4 1p36.3 CEB10 1,8-2,7kb 7 CRI-L336 6,2;0,00 (5 allèles) (D1S47) 53 D2590 16C2 2q37.3 CEB1 (HinfI) (D2S61) 54 D20S33 16C2 20q13.1 CEB2 (HinfI) (D20S4) 61 D13S107 16C2 13q34 CEB5 1,5-4kb 80 HT39 15;;0,08 (HaeIII) 66 D6S132 16C2 6q27 CEB3 500bp-9kb 95 CRI-T22 9;0,04 (HaeIII) (D6S25) 83 D6S133 14C11 6q27 CEB4 2,5-9kb 97 CRI-T22 11;0,04 (PvuII) (D6525) Huit des neuf cosmides contenant des locus polymorphes présentent une localisation simple. La figure 3 représente la localisation des cosmides 1 ,2, 6, 8, 10, 11, 13 et 20 (indiqués par une flèche dans la figure) sur les idiogrammes des chromosomes humains. Le cosmide 54 montre, dans toutes les métaphases observées, un signal majeur sur la bande 20q13.1, et un second signal faible sur la bande 11q13.4. 4) Localisation chromosomique par analyse de liaison L'analyse de liaison est résumée dans le Tableau 2 ci-dessus. Huit sous-fragments (CEB1 à CEB7 et CEB10) détectent uniquement un locus dans des conditions d'hybridation fortement stringentes. Cela a été caractérisé dans le panel commun de famille du CEPH, et les attributions régionales au chromosome ont été obtenues par analyse de liaison avec d'autres marqueurs déjà cartographiés (Base de données du CEPH version 3). Un cosmide (cosmide 35) détecte deux ou plus locus hautement polymorphes dans des conditions d'hybridation fortement stringentes et aucune localisation nota été entreprise pour ce qui concerne les systèmes polymorphes. 5) Etude d'un locus hypermutable : Sonde CEB1 issu du cosmide 53 Les familles du CEPH comprennent généralement trois générations, les grand-parents, les parents et les enfants; chaque individu est identifié par un numéro composé du nombre de la famille suivi de deux chiffres, les pères sont 01 et les mères 02. Le Tableau 4, ci-après, rapporte les mutations détectées avec le sous-fragment CEB1. Dans le tableau 4 - 51 enfants n'ont reçu aucun allèle dont la taille correspond à un allèle provenant du père; l'un d'entre-eux (1344 08) présente apparemment deux allèles anormaux (aa). Un "1" indique que l'individu a reçu l'allèle du grand-père pour la seconde région hypervariable correspondant au sous-fragment CEB11 provenant du cosmide 53; un "2" présente la même signification en ce qui concerne la grand-mère.Ceci n' a pas pu être déterminé (ND) quand le sous-fragment CEB11 n'est pas instructif, ou quand les grand-parents ne sont pas accessibles; - la variation de taille (+, -, m) : la différence de taille correspond au nouvel allèle diminué de la taille estimée de l'allèle parental (m indique la présence d'un allèle entre les deux allèles parentaux); - la nouvelle taille de l'allèle : les tailles des allèles parentaux sont données seulement lorsque la taille estimée de l'allèle est inconnue; - la recombinaison : indique l'état de recombinaison des deux côtés du sous-fragment CEB1 (NI non instructif, ND : non déterminé); "yes" indique une recombinaison chez l'individu avec la zone 33-cM. Tableau 4 Individu Allèle Variation Nouvelle Recombinaison parental de taille perdu taille(bp) l'allèle(kb) 13291 04 ND + 2,1(1,3 & 2,0) No 13293 04 1 +100 1,5 No 13293 06 1 +300 1,7 No 13293 07 1 -100 1,3 No 13294 04 1 +100 3,0 No 13294 07 2 +500 2,4 ND 1331 08 2 -100 2,4 No 1331 17 2 -100 2,4 No 1332 05 2 +100 1,6 No 1332 06 2 +300 1,8 No 1333 03 ND m 2,9(1,5 & 3,0) No 1333 05 ND + 3,3(1,5 & 3,0) No 1334 05 2 +200 4,6 NI 1334 08 1 -200 2,4 NI 1340 03 2 -100 2,2 Yes 1340 05 2 +100 2,4 Yes 1341 02 ND + 2,7(2,0 & 2,6) NI 1341 04 1 -100 2,3 NI 1341 08 1 +100 2,5 NI 1341 09 2 -100 2,6 NI 1344 03 ND m 2,6(1,7 & 2,7) NI 1344 08 2 aa 1,8 & 3,4 NI 1346 06 ND m 4,9(4,8 & 5) ND 1346 07 ND + 5,1(4,8 & 5) ND 1346 09 NO m 4,9(4,8 & 5) ND 1349 03 2 -1800 400bp No 1349 06 1 +200 2,1 No 1350 04 1 +100 5,1 ND 1350 05 1 -500 4,4 No 1350 06 1 +100 5,1 ND 1362 10 ND m 2,1(2,0 & 2,2) Yes 1362 12 ND + 2,8(2,0 & 2,2) Yes 1377 01 ND + 2,1(1,7 & 1,9) ND 1377 02 ND m 3,2(2,5 & 3,5) ND 1408 09 1 -100 3,2 No 1413 04 2 +100 3,7 No 1413 16 2 -100 3,5 Yes 1420 13 2 +500 2,9 No 1423 04 l -100 3,0 No 1424 10 ND m 1,1(1,0 & 4,3) No 66 08 2 +600 2,6 NI 12 05 ND m 3,5(1,1 & 4,8) No 12 06 ND + 4,9(1,1 & 4,8) No 02 04 ND + 3,5(2,2 & 3,2) Yes 17 06 ND + 4,0(0,9 & 3,7) NI 17 07 ND + 3,9(0,9 & 3,7) NI 17 08 ND m 3,5(0,9 & 3,7) NI 35 05 ND + 5,8(2,5 & 5,6) ND 35 08 ND m 5,3(2,5 & 5,6) ND 884 05 1 +200 2,2 Yes 102 08 ND m 1,2(0,4 & 1,3) Yes 104 04 ND + 3,9(1,8 & 3,8) ND 104 06 ND m 3,5(1,8 & 3,8) ND 104 08 ND + 3,9(1,8 & 3,8) ND La figure 4 représente les profils d'hybridation en conditions fortement stringentes de trois générations d'un panel commun de familles fourni par le CEPH, avec les fragments cosmidiques CEB1 et CEB11 issus du cosmide 53, en tant que sondes, et en utilisant l'enzyme de restriction HinfI. Dans la figure 4, les carrés représentent les hommes et les cercles représentent les femmes; les nombres font référence aux numéros d'identification du CEPH. Les cercles noirs indiquent les individus avec un nouvel allèle (fléché). Dans l'exemple de la figure 4, CEB11 est homozygote chez le père, en conséquence de quoi, l'origine de la région flanquante déterminée par CEB11 ne peut pas être identifiée chez les grand-parents. La caractérisation de CEB1 dans le panel fourni par le CEPH révèle la présence de néo-mutations (présence d'un allèle absent chez les parents) chez 51 des 310 enfants étudiés et chez 3 parents. Les erreurs d'échantillonnage peuvent être exclues comme source de contradiction car 5 autres séquences détectant des locus hautement polymorphes ont été utilisées comme sondes sur la même membrane. En outre, chez toutes les mutations sauf une, l'allèle anormal était d'origine paternelle. Une telle source paternelle ne semble pas pouvoir être causée par des erreurs d'échantillon. Le cosmide 53, dont est issu CEB1, a été localisé par hybridation in situ, au niveau de la bande 37 du bras du chromosome 2q. L L'analyse de liaison utilisant le sous-fragment CEB1 montre qu'il s'agit d'une région comprenant cinq marqueurs RFLP dans 33 cM (hommes) (O'CONNELL et al., 1989). Lorsque le cosmide 53 entier est utilisé comme sonde en Southern, plus de deux bandes supplémentaires apparaissent dans les mêmes conditions d'hybridation. Ceci indique l'existence d'une autre région hypervariable, correspondant au sousfragment CEB11. Aucune recombinaison n'a été observée entre CEB11 et CEB 1, ceux-ci étant séparés de moins de 40 kb. Aucune néo-mutation n'a été observée avec CEB11 dans le panel de familles fourni par le CEPH.Dans les familles pour lesquelles CEB11 est instructif et chez lesquelles une mutation au niveau de CEB1 apparaît, l'origine grand-parentale de l'allèle muté peut être déterminée (comme l'indique le Tableau 4). Les mutations, au niveau des allèles transmis par le grand-père et la grand-mère, ont été observées dans une même famille (famille 13291), et dans deux familles (familles 13291 et 13293) ayant les mêmes grand-parents paternels. Une fréquence égale de mutations a été observée pour tous les allèles issus du grand-père et de la grand-mère paternel. Le tableau 4 résume les résultats observés en ce qui concerne l'origine grand-parentale de l'allèle impliqué dans les 51 cas de mutations, et fourni également une estimation de la différence entre la taille attendue et la taille observée des allèles. La figure 5 représente la distribution en taille des allèles HinfI observé avec le fragment CEB1. Dans cette distribution, la taille des allèles observée chez les grand-parents du panel fourni par le CEPH et celle des allèles des parents sans parent accessible ont été estimées. De même lorsque seulement une bande a été visualisée et transmise, l'individu a été considéré comme homozygote et l'allèle compté deux fois, ce qui conduit à sous-estimer le nombre de petits allèles. Les mutations au niveau du locus détecté par le fragment CEB1 ne semblent pas corrélées à une taille d'allèle importante. Toutefois, il semble qu'il y ait un lien entre l'augmentation de la taille de l'allèle et les cas de mutation; en effet, dans le cas de 30 mutations la taille de l'allèle a augmenté, alors que cette taille a baissé dans le cas de 12 mutations. Dans 12 mutations, la variation de taille est inconnue car l'origine de l'allèle n'a pu être déterminée et la taille du nouvel allèle est comprise entre les tailles des deux allèles parentaux. L'analyse de liaison multilocus en rapport avec d'autres marqueurs génétiques rapportés dans cette région par O'CONNEL et al. (1989), a permis de déterminer l'agencement suivant : 5.1.25 - MCOE32 (MCT106 - CEB1) - EKZ105 - YNA4. Aucun recombinant n'a été observé entre les locus détectés par CEB1 et MCTl06. Comme l'indique le tableau 4, des recombinaisons entre les marqueurs flanquants instructifs ont pu être déterminées dans 29 des méioses impliquées dans des néo-mutations au niveau du locus détecté par CEB1. Des recombinaisons ont été observées dans seulement 8 cas, ce qui est identique à la fréquence des cas de recombinaison observés dans les méioses sans mutation apparente. En conséquence, il ne semble pas que les mutations détectées par le fragment CEB1 soit associées à des "crossing-over" inégaux. III - DISCUSSION L'étude effectuée met en évidence, de manière surprenante, la possibilité d'utiliser des polymères d'oligonucléotides quelconques, répétés en tandem, pour identifier de nouvelles régions hypervariables. La réussite d'une telle identification est corrélée au nombre de clones fortement positifs obtenus lors de l'exploration de la banque. Le polynucléotide 16C2 a permis d'identifier approximativement 60 clones par génome équivalent, et 6 à 10 cosmides testés ont détecté des polymorphismes, correspondant à 4 locus polymorphes différents. Au contraire, les polynucléotides 14Cll et 16C4 ont permis de détecter un large nombre de clones, respectivement environ 250 et 1 500 cosmides par génome équivalent, et seulement un locus polymorphe a été trouvé sur les 8 clones testés après sélection avec le polynucléotide 14C11.Avec le polynucléotide 16C4, 3 des 27 clones qui ont été testés ont permis de détecter des polymorphismes. Ces résultats indiquent que l'efficacité de la sélection peut être augmentée en utilisant uniquement les polynucléotides qui détectent seulement quelques dizaines de colonies par génome équivalent. Cela ne constitue pas une limitation au procédé de détection de régions hypervariables selon l'invention car un grand nombre de polynucléotides peut être testé, et une région mini-satellite donnée peut être détectée indépendamment par différents polynucléotides. Environ 200 régions hypervariables ont été détectées à ce jour en explorant des banques de cosmides avec des oligonucléotides enrichis en Guanine, identiques aux motifs répétés isolés des séquences minisatellites isolées précédemment (NAKAMURA et al. ,1987, 1988). On estime à environ 1500 le nombre minimum de tels locus chez l'homme. De nouvelles techniques permettant la détection de nouvelles régions hypervariables sont nécessaires à la construction des cartes génétiques. Le procédé de l'invention peut être comparé à l'utilisation de sondes VNTR clonées détectant des familles de VNTR proches. La différence principale tient au nombre illimité de nouveaux polynucléotides, et au fait que certains d'entre-eux détectent par hybridation en conditions faiblement stringentes un petit nombre de cosmides dont une forte proportion contient un locus hypervariable.Inversement, lorsqu'un nombre limité de sondes multilocus est accessible, et lorsque ces sondes détectent de nombreux locus du génome humain (ROYLE et al., 1988), il peut être nécessaire de construire une banque spéciale enrichie en séquences mini-satellites pour retirer les fragments monomorphes cross-hybridant avec la sonde, afin d'obtenir une meilleure efficacité d'identification de régions hypervariables; la procédure généralement utilisée consiste à cloner des fragments de grande taille, après digestion par des enzymes de restriction telles que Sau3A (MboI), HaeIII (WONG et al., 1987; ARMOUR et al., 1990; GEORGES et al., 1991); ce qui peut avoir pour conséquence, que les minisatellites avec une prédominance de petits allèles soient difficiles à obtenir. Les résultats de l'étude rapportée dans le cadre de la description de l'invention, confirment que les VNTR sont regroupés dans les régions télomériques du génome humain. Il est donc intéressant de remarquer que les nouvelles régions hypervariables détectées dans le cadre de l'invention présentent une distribution similaire à celle des VNTR déjà identifiés. Les polynucléotides utilisés chez l'homme dans le procédé de l'invention sont également utilisables chez une grande variété d'espèce, comme la souris, le rat, les bovins, les chiens et les chevaux. En ce qui concerne les sondes de l'invention, l'une d'entre-elles détecte un locus qui apparaît hautement mutable. Bien que l'ADN utilisé dans la présente étude provienne de lignées cellulaires de lymphoblastes transformés, il est peu probable que les mutations soient apparues lors de la culture des cellules (ARMOUR et al., 1989). La présente invention rapporte la preuve directe de l'existence chez l'homme d'une région hypervariable hautement mutable (CEB1), laquelle mutation apparaît principalement en meïose mâle.La mise en évidence de locus à taux de mutation différents chez llhomme et chez la femme constitue un indice encourageant pour rechercher d'autres locus hypermutables, et la localisation de ces locus permettrait la construction d'une carte du génome humain corrélée à d'autres observations concernant par exemple les taux de recombinaison différents entre l'homme et la femme. A l'inverse aucune mutation n'a été observée avec la sonde CEB11, correspondant à une région hypervariable détectée sur le même cosmide que CEB1. Les séquences de nucléotides de CEB1 et de MS1 (65% GC; 5G 1C) sont extrêmement riches en Guanine et Cytosine et contiennent un brin riche en Guanine; de nombreux autres locus VNTR montrent la même distribution sans taux de mutation élevé. Les mutations détectées par CEB1 ne sont pas liées aux tailles de l'allèle comme le montre le tableau 4 et la figure 5. Toutefois il semble y avoir un lien entre l'augmentation de taille de l'allèle et les cas de mutation. L'isolement de sites hypermutables est également important pour comprendre la nature des réarrangements survenant dans la génération de la variabilité du locus VNTR.L'hypothèse selon laquelle les nouveaux allèles sont générés par un échange inégal entre régions homologues a déjà été étudiée pour trois locus. Une simple mutation d'origine maternelle au niveau du locus D17S5 a été caractérisée au niveau moléculaire par WOLFF et al. (1988), et 36 mutations ont été observées dans le panel du CEPH au niveau du locus D1S7 (MS1). L'analyse génétique avec des RFLPs informatifs flanquants a été appliquée à 12 mutations dans la perspective de détecter des cas de "crossingover" (WOLFF et al., 1989). Le locus D1S8 (MS32) a été étudié en cartographiant les variations internes de plus de 60 mutants méiotiques (JEFFREYS et al., 1990). Dans tous les cas, il apparaît que les nouveaux allèles ne sont pas générés par des "crossing-over" inégaux. Les données préliminaires rapportées dans la présente étude suggèrent fortement que les mutations au niveau du locus détecté par la séquence de nucléotide CEB1 ne sont également pas générées par un échange inégal entre homologues. Vingt-neuf cas de mutation sont apparus chez des individus doublement informatifs pour les marqueurs flanquants dont une région 33-cM, et seulement 8 individus montrent une recombinaison dans la région. En conséquence, la question de l'origine de l'ADN additionnel dans l'allèle dont la taille a augmenté en raison de mutations reste posée. La cartographie des variants internes comme décrit par JEFFREYS et al. (1990), appliquée à la région hypervariable définie par CEB1 pourrait être une approche prometteuse pour répondre à cette question. REFERENCES BIBLIOGRAPHIOUES 1. ARMOUR, J. A. L., PATEL, I., THEIN, S.L., FEY, M.F.,AND JEFFREYS, A.J. (1989) Genomics 4: 328334. 2. ARMOUR, J. A. L.,POVEY, S., JEREMIAH, S., AND JEFFREYS, A.J. (1990) Genomics 8: 501-512. 3. BLONDEN, L.A.J., DEN DUNNEN, J. T., VAN PASSEN, H. M. B., WAPENAAR, M. C., GROOTSCHOLTEN, P. M., GINJAAR, F. B., BAKKER, E., PEARSON, P. L., AND VAN OMMEN, G.J.B. (1989), Nucleic Acids Res. 17: 5611-5621. 4. BOWDEN, D. W., MÜLLER-KAHLE, H;, GRAVIUS, T. C., HELMS, C., WATT-MORGAN, D., GREEN, P., AND DONIS KELLER, H. (1989), Am. J. Hum. Genet. 44: 671-678. 5. BOYLAN, K. B., AYRES, T.M., POPKKO, B., TAKAHASHI, N., HOOD, L. E., AND PRUSINER, S. B. (1990), Genomics 6: 16-22. 6. FEINBERG, A. P., AND VOGELSTEIN, B. 1983, Anal. Biochem. 132: 6-13. 7. 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REVENDICATION 1) Procédé de détection d'une nouvelle région hypervariable dans une séquence d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a - la préparation de polynucléotides formés chacun d'un oligonucléotide quelconque, comprenant de 5 à 20 bases et répété de 4 à 200 fois; b - l'exploration d'une banque génomique par hybridation en condition faiblement stringente avec les polynucléotides préparés en (a) et marqués; c - l'analyse par la méthode de Southern des clones ayant réagit avec les polynucléotides; d - la purification et éventuellement le marquage des fragments de restriction détectés par les polynucléotides;; e - l'analyse par la méthode de Southern de 1'ADN génomique d'individus non-apparentés ayant réagit en conditionS d'hybridation fortement stringentes avec les fragments de restriction obtenus en (d), et la sélection des fragments de restriction correspondants à de nouvelles régions hypervariables. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que à l'étape (b) on explore une banque de cosmides humains. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que à l'étape (a), on prépare des polynucléotides formés chacun d'un oligonucléotide quelconque, comprenant de 10 à 18 bases, répété de 10 à 60 fois. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on prépare un polynucléotide répondant à la formule suivante (AGTCATGGTAGAGC)n dans laquelle n est supérieur à 20. 5) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on prépare un polynucléotide répondant à la formule suivante (ACGGAGCGGACGGA)n dans laquelle n est supérieur à 20. 6) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on prépare un polynucléotide répondant à la formule suivante (GTAGAGGTTCTGGACT)n dans laquelle n est supérieur à 20. 7) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on prépare un polynucléotide répondant à la formule suivante (TTTGAGGTGGATGGAC)n dans laquelle n est supérieur à 20. 8) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on prépare un polynucléotide répondant à la formule suivante (AGCTACGGTGTGGACT) n dans laquelle n est supérieur à 20. 9) Séquence de nucléotides pour l'identification par hybridation d'une région hypervariable détectée par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10) Séquence de nucléotides pour l'identification par hybridation d'une région hypervariable détectée par le procédé selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle correspond au fragment de restriction AluI d'environ 3,8 kb du cosmide contenant la portion d'ADN génomique humain située en position 6q27 et présentant 97 % d'hétérozygocie, lequel cosmide cloné dans le vecteur pWEî5 introduit dans Echerichia. Coli a été déposé à la CNCM le 14 août 1991- sous le NO I-1134. 11) Séquence de nucléotides pour l'identification par hybridation d'une région hypervariable détectée par le procédé selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle correspond au fragment de restriction de 4 kb obtenu après hydrolyse par AluI et HaeIII du cosmide contenant la portion d'ADN génomique humain située en position 7q et présentant 93 % d'hétérozygocie, lequel cosmide cloné dans le vecteur pWE15 introduit dans Echerichia. Coli a été déposé à la CNCM le 14 août 1991 sous le NO I-1135. 12) Séquence de nucléotides pour l'i,dentification par hybridation d'une région hypervariable détectée par le procédé selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle correspond au fragment de restriction de 3,8 kb obtenu après hydrolyse par HinfI et HaeIII du cosmide contenant la portion d'ADN génomique humain située en position lp et présentant 98 % d'hétérozygocie, lequel cosmide cloné dans le vecteur pWEî5 introduit dans Echerichia. Coli a été déposé à la CNCM le 14 août 1991 sous le NO I-1136 13) Séquence de nucléotides pour l'identification par hybridation d'une région hypervariable détectée par le procédé selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comporte le motif suivant 5' GTTGAGGGGGAGGGAGGGTGGTTGCGGAGGTCCCTGG 3' répété en tandem environ 100 fois. 14) Séquence de nucléotides pour l'identification par hybridation d'une région hypervariable détectée par le procédé selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comporte le motif suivant 5' GAGGAGAGGGTGGCGGT 3' répété en tandem environ 400 fois. 15) Séquence de nucléotides pour l'identification par hybridation d'une région hypervariable détectée par le procédé selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle correspond au fragment de restriction d'environ 2,5 kb obtenu après hydrolyse par HaeIII et HinfI du cosmide contenant la portion d'ADN génomique humain située en position 6q27 et présentant 95 % d'hétérozygocie, lequel cosmide cloné dans le vecteur pWEî5 introduit dans Echerichia. Coli a été déposé à la CNCM le 14 août 1991 sous le NO I-1133. 16) Séquence de nucléotides pour l'identification par hybridation d'une région hypervariable détectée par le procédé selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comporte le motif suivant 5' CTGTGCACCACCCAGGTCGAATCTCGGCTCACTGCGACCTC TGCCTCCGCGTAG 3' répété en tandem environ 50 fois. 17) Procédé d'amplification génétique d'une région hypervariable, caractérisé en ce qu'il consiste à fixer par hybridation aux extrémités de ladite région hypervariable, une séquence amorce de 17 à 30 bases judicieusement choisie parmi tout ou partie des sequences flanquantes des séquences de nucléotides selon les revendications 9 à 16, puis à mettre en oeuvre un processus d'extension enzymatique à l'aide d'ADNpolymérase, suivi d'un processus de dénaturation, et à répéter le cycle hybridation-extension-dénaturation, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence constituant la région hypervariable de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycle mis en oeuvre. 18) Procédé pour l'identification d'une région hypervariable détectée par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on met en contact une séquence d'ADN dénaturée et fixée sur un support, avec une séquence de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 9 à 16, marquée et constituant une sonde, dans un milieu et des conditions permettant une hybridation, et en ce que par la détection des hybrides produits on mesure les quantités et les localisations de la sonde marquée sur la séquence d'ADN étudiée. 19) Procédé pour le diagnostic de maladies héréditaires ou tumorales, caractérisé en ce que l'on utilise au moins une séquence de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 9 à 16, éventuellement marquée.