FR 2685868 A1 19930709 FR 9200018 A 19920103 NOUVELLES PREPARATIONS PHARMACEUTIQUES A BASE DE PEPTIDES POUR lA VOIE GENERALE La présente invention se rapporte au domaine de la pharmacotechnie. Elle concerne en particulier de nouvelles préparations pharmaceutiques renfermant comme principe actif un peptide et destinées à être administrées par voie orale, sublinguale ou parentérale. Elle a plus spécifiquement pour objet de nouvelles compositions pharmaceutiques permettant l'administration sous une forme particulièrement adaptée de peptides, et notamment de peptides hormonaux. On sait, en effet, que l'administration des peptides à propriétés thérapeutiques se trouve limitée à quelques voies particulières, compte-tenu de la facilité d'hydrolyse de ces composés au niveau gastrique ou au niveau intestinal. C'est pourquoi jusqu'ici, l'administration des peptides se faisait essentiellement par voie parentérale, par voie sublinguale ou par voie pernasale. La voie parentérale qui est celle qui est la plus utilisée nécessite le recours fréquent et permanent à des injections et tend à devenir une servitude pour le malade. En outre, certains produits injectés ou certains solvants sont sclérosants, et il est nécessaire lorsqu'une veine est endommagée, de trouver une autre veine dans laquelle l'injection est possible et, progressivement, ce problème devient particulièrement aigü. Par ailleurs, l'administration directe, par voie rectale ou même par voie digestive, de peptides s'avère inefficace et il est apparu nécessaire d'adjoindre des agents tensio-actifs qui facilitent le passage de la muqueuse rectale ou digestive mais qui, en outre, sont la cause d'irritations et de phénomènes inflammatoires. Le problème de l'administration digestive de molécules fragiles hydrolysables ou digestibles, par les enzymes du tube digestif, est un problème difficile dont la solution est loin d'avoir été obtenue jusqu'ici. C'est pourquoi, il s'est avéré intéressant de les administrer sous forme particulaire ou micellaire. C'est ainsi que le brevet français nO 2.515.960 décrit l'incorporation de molécules sous forme de particules de polymères submicroscopiques, d'un diamètre inférieur à 500 nm. Ces particules sont formées par polymérisation micellaire d'un monomère dérivé de l'acide acrylique. Toutefois, la polymérisation s'effectuant en solution, est donc limitée à l'utilisation d'un nombre restreint de polymères et ne peut convenir à des polymères naturels ou semi-synthétiques, peu solubles dans l'eau. En outre, l'élimination des monomères et oligomères résiduels est difficile car la filtration des nanoparticules ainsi formées et des nanocapsules est souvent difficile à réaliser. La technique des liposomes unilamellaires a été également proposée mais elle présente l'inconvénient de soumettre à une sonication intense, une solution aqueuse de phospholipides dans l'eau, ce qui entraine des risques importants d'oxydation de ce matériau ainsi que d'autres altérations chimiques liées à la sonication. Un autre mode de réalisation a été décrit dans le brevet français 2.608.942 dans lequel on prépare des systèmes colloidaux dispersibles sous forme de particules sphériques vésiculaires d'une taille inférieure à 500 nm dont la paroi est constituée par une substance polymérique comme l'acide polylactique ou un corps gras dans lequel le principe actif que l'on désire encapsuler, est dissout ou dispersé et le noyau est formé d'une seconde phase liquide constituée par une solution aqueuse ou d'un mélange de solvant renfermant de l'eau et additionnée d'un ou plusieurs agents tensio-actifs, ce procédé étant défini par le fait que le mélange de solvants de la première phase est miscible au mélange aqueux de la seconde phase. Le mélange des deux phases conduit presque instantanément à la formation de nanocapsules et la solution devient blanche laiteuse. Dans ce procédé, la substance que l'on désire incorporer est définie comme étant une huile végétale ou minérale ou toute substance huileuse ou bien encore une substance biologiquement active, un produit de contraste, un réactif biologique, ou bien encore une encre, un lubrifiant ou un agent de traitement de surface. Dans ce procédé, le solvant de la première phase doit être suffisamment volatil pour pouvoir être aisément éliminé et ceci limite le choix d'un tel solvant aux alcools inférieurs, aux cétones inférieures, à certains hydrocarbures. Au contraire, le solvant de la deuxième phase est un liquide qui ne dissout pas le polymère destiné à former la capsule et la substance renfermée dans le noyau, mais qui est miscible au solvant de la première phase. Cette affirmation laisse planer un doute sérieux sur la réalisabilité d'un tel système car si selon ce brevet, les deux solvants doivent être parfaitement miscibles, ceci ne parait pas être le cas lorsque le solvant de la première phase est un hydrocarbure léger, un hydrocarbure léger chloré ou même une cétone inférieure. Ce procédé d'une réalisation complexe conduit à la formation de nanoparticules d'une taille inférieure à 500 nm dont la paroi extérieure est un polymère formé par nanoprécipitation et dont la forme est régulièrement sphérique. La présence d'agents tensioactifs en quantités importantes est nécessaire pour assurer la stabilité de la suspension. Rien dans ce brevet ne laisse penser à un mode d'administration de molécules fragiles par la voie digestive. L'objet de la présente invention est sensiblement diférent par son mode de réalisation et par la problème technique. il vise à réaliser un mode d'administration de médicaments, particulièrement adapté à la voie digestive ou à la voie parentérale et destiné surtout à permettre l'administration par ces deux voies, sous une forme protégée, de médicaments qui, sans cela, ne passeraient pas la barrière intestinale, soit du fait d'une dégradation enzymatique, soit du fait d'une résorption insuffisante. Ce problème a donc été résolu en réalisant des liposomes, c'est-à-dire des vésicules sphériques d'un diamètre allant du dixième à la dizaine sous une forme protégée, de médicaments qui, sans cela, ne passeraient pas la barrière intestinale soit du fait d'une dégradation enzymatique, soit du fait d'une résorption insuffisante. Ce problème a donc été résolu en réalisant des liposomes, c'est-à-dire des vésicules sphériques d'un diamètre allant du dixième à la dizaine de micromètres, formés de plusieurs parois composée d'une double couche de phospholipides alternant avec un ou plusieurs compartiments aqueux. Ces vésicules ont la propriété de servir de véhicules à des principes actifs solubles ou dispersibles dans l'eau qui se logent dans le compartiment aqueux, des principes actifs lipophiles qui s'insèrent dans les parois des lipides ou pes actifs amphiphiles qui se localisent à la fois dans les compartiments aqueux pour la partie hydrophile et dans les parois lipidiques par leur reste lipophile. Le procédé de préparation de cette nouvelle forme d'administration est caractérisé en ce que l'on dissout dans un solvant organique chloré, un mélange de phospholipides et de cholestérol puis que l'on évapore sous pression réduite le solvant, que l'on disperse le résidu sec dans un bac à ultra-sons dans une solution ou dispersion aqueuse du principe actif à incorporer jusqu'a obtenir la dispersion totale de la phase lipidique dans la phase aqueuse. Il est également possible de réaliser ces mêmes liposomes en mettant en contact la solution lipidique et la solution ou suspension aqueuse de principe actif sous agitation constante à une température croissante jusqu'a évaporation totale du solvant et obtention d'une suspension aqueuse de liposomes. Cette suspension peut ensuite être diluée par des liposomes ne renfermant pas de principe actif et dont la phase aqueuse ne contient qu'une solution d'un agent tampon. On peut donc ajuster à volonté la concentration en principe actif. Le principe actif non fixé aux liposomes est ensuite séparé par filtration notamment sur un gel de polyacrylamide ou sur un gel de dextrane en éluant à l'aide d'un agent tampon. Les suspensions liposomiales obtenues après filtration sur gel, sont conservées à basse température et à l'abri de la lumière. Le procédé selon l'invention comporte donc deux étapes importantes : la formation des liposomes multilamellaires à partir de phosphatidyl choline et la séparation du principe actif non fixé par filtration sur gel. Cependant, il peut être avantageux de procéder à une opération intermédiaire qui permet d'obtenir des liposomes secs, ctest-à-dire sans solvant aqueux. On procède par lyophilisation et on obtient ainsi des formes sèches et non plus en suspension. I1 est possible également d'effectuer une opération supplémentaire de protection qui permet la production de liposomes enrobés, évitant leur destabilisation par les sels biliaires lors du passage dans le duodénum. Les phospholipides utilisés sont des phospholipides d'origine naturelle comme la phosphatidyl choline d'oeuf ou la phosphatidyl choline de soja contenant au moins 98% de phosphatidyl choline. On y ajoute du cholestérol dans un rapport molaire variant de 5:1 à 10:1. On peut encore y ajouter un ester de cholestérol comme un succinate de cholestéryle. On peut, pour obtenir des liposomes chargés négativement, ajouter aux constituants des liposomes, du phosphate de dicetyle ou un ester acide de cholestérol. Les proportions respectives des trois constituants varient de 5:1=1 à 10:1=1. Les vésicules lipidiques formées sont maintenues en suspens ion dans une solution aqueuse de citrate de sodium dont le pH varie selon la concentration de 2,5 à 4,5 et de préférence de 2,8 à 3,0. Les constituants lipidiques sont mis en solution dans un solvant inerte comme un solvant chloré choisi dans le groupe formé du chloroforme, du chlorure de méthylène, du dichloréthane, du tétrabromoéthane et de l'hexafluoroacétone. La préférence est donnée aux solvants à point d'ébullition le plus bas qui permettent ainsi une évaporation plus facile et plus rapide. Le chlorure de méthylène constitue le solvant le plus efficace selon l'invention. La solution lipidique peut être également additionnée d'un agent tensio-actif non ionique comme un Tween, un Span, un Palmitostéarate de sucre ou un copolymère d'oxyde de propylène et d'oxyde d'éthylène. La teneur en agent tensio-actif qu'il est possible d'incorporer dans la solution lipidique varie dans de larges proportions et notamment de 1 à 20% du poids des phospholipides. Une teneur allant de 5 à 15% est particulièrement envisagée. La filtration sur gel de polyacrylamide ou de dextranne s'effectue sur une colonne garnie d'un tel gel, formée notamment avec un polymère vendu sous la marque SEPHAROSE et notamment le SEPHAROSE 6B. L'éluant de filtration est un mélange du tampon citrate de départ additionné de chlorure de sodium. Les populations liposomiales obtenues ne sont pas homogènes et il existe quel que soit le mode de préparation, deux tailles différentes de vésicules, l'une allant de 120 à 180 nm et l'autre allant de 750 à 1750 nm. Toutefois, pour la même composition lipidique et le même mode de préparation, la taille des vésicules mesurée au compteur Coulter N4ND montre une bonne reproductibilité. Au microscope électronique, les liposomes selon l'invention montrent une structure plurilamellaire. Les principes actifs peu résorbables ou hydrolysables, de nature peptidique qu'il est possible d'incorporer dans les liposomes selon l'invention, sont de nature très variée et peuvent englober aussi bien des petits peptides, des globulines, des protéines, des micromolécules, comme le TRH, la lysine vasopressine, la vasopressine, la desglycinamide vasopressine, les fragments d'ACTH, les encéphalines ainsi que des peptides à chaine plus longue comme le CCK, les analogues de CCK, les insulines naturelles ou modifiées chimiquement, la proinsuline et les insulines polymériques, la somatotrophine, 1'EGF, la calcitonine, la thyrocalcitonine, le facteur natriurétique, la polylysine, la FSH, la LRH, les gonadorelines, la buséréline, les peptides intestinaux (VIP, ProVIP, preproVIP ..) et d'une manière générale, tout peptide naturel ou d'origine synthétique ou d'origine génétique présentant un degré de solubilité dans l'eau suffisant pour assurer son incorporation dans la phase aqueuse des liposomes. La lyophylisation des liposomes ainsi chargés s'effectue dans des plaques de polyéthylène percés d'alvéoles sphériques dans lesquelles, la suspension de particules vésiculaires est déposée puis évaporée par cryodessication. La suspension de liposomes neutres dépourvus de principe actif est préparée dans les mêmes conditions en remplaçant pour chacune d'elles, la solution aqueuse tamponnée de principe actif, par une solution tampon à pH 3,0 environ et en utilisant une concentration en phospholipides de 50 pmol/ml environ. Cette suspension est mélangée avec la suspension aqueuse tamponnée de principe actif de sorte que la concentration finale du mélange est diminuée dans une proportion allant par exemple de 1 à 10. La filtration sur gel d'acrylamide a pour effet d'éliminer l'excès de principe actif resté absorbé en surface des liposomes et dont la présence serait inutile en raison de la dégradation dans le tube digestif ou éventuellement nocive lorsque le principe actif est une substance très active. Dans un mode d'exécution préféré du procédé selon l'invention, le principe actif incorporé est une hormone peptidique comme l'insuline et notamment l'insuline de porc ou l'insuline humaine, la calcitonine, l'ocytocine. La teneur en principe actif et notamment en insuline déterminée par une méthode de chromatographie liquide haute performance, permet de constater que le principe actif retenu par les vésicules multilamellaires avant filtration, peut varier dans de très larges proportions. Dans le cas d'une insuline, il est de l'ordre de 1,5 à 2,5 UI par pmol et après filtration de 0,03 à 0,10 U/pmol. Le taux d'incorporation s'échelonne donc de 0,25 à 65% de principe actif par rapport à la quantité théorique introduite. La présence d'une charge négative dans la paroi des liposomes améliore de façon significative l'encapsulation des principes actifs peptidiques à l'intérieur des liposomes, lorsque ceux-ci ont une structure basique. Les exemples suivants illustrent l'invention, ils ne la limitent en aucune façon EXEMPLE I MISE NJ POINT D'UNE FORIUïULATION D'INSULINE DESTlNLz A UNE VOIE NON PllB= Composition Les matières premières utlisées sont la phosphatidylcholine de soja, d'un poids moléculaire d'environ 800, contenant au minimum 98% de phosphatidylcholine, du cholesterol de lanoline, d'un poids moléculaire de 387, et du phosphate de dicétyle, d'un poids moléculaire de 560. Ces trois composants sont associés dans un rapport molaire 7/2/1 et additionnés d'acétate de tocoférol, utilisé comme antioxydant dans la proportion d'une mole pour 100 moles de phosphatidylcholine. Les vésicules lipidiques sont en suspens ion dans une solution aqueuse de tampon citrate à pH 3,0, ainsi composée : solution de citrate disodique 0,1 M contenant 20/00 de méthylparaben : 399 ml, acide chlorhydrique concentre : 3,3 ml et eau distillée q.s.p 1000 ml. La solution mère d'insuline est une solution à 100 UI/ml d'insuline porcine, également tamponnée à pH 3,0 ainsi préparée : insuline porcine : 192,3 mg, tampon citrate pH 3,0 q.s.p 50 ml. Modes de préparation Trois méthodes de préparations ont été réalisées. Quelle que soit la méthode, le mélange lipidique a été préparé avec 200 mg de phosphatidylcholine, 28 mg de cholestérol, 20 mg de phosphate de dicétyle et 1,2 mg d'acétate de tocoférol. MET9oDE I Les constituants lipidiques sont dissous dans 20 ml de dichlorométhane, puis le solvant est éliminé dans un évaporateur rotatif (Buchi), en ballon d'un litre, sous pression réduite (trompe à eau) et à 370C. Le film résiduel est dispersé à température ambiante, par agitation dans un bac à ultra-sons (Bransonic 220V), pendant 30 mn, dans 10 ml de la solution tamponnée d'insuline à 50 UI/ml. Cette sonication est suivie d'une période de repos de 2 heures, à température ambiante. La suspension est ensuite refroidie et soumise à une nouvelle sonication par sonde (Branson 450W), 6 minutes dans un bain de glace (pour maintenir la température inférieure à 400C), à l'air libre. MET90DE II Les constituants lipidiques sont dissous dans 20 ml de dichlorométhane contenant une quantité de Tween 60 représentant 10% en poids des phospholipides. La solution aqueuse tamponnée d'insuline est additionnée sous agitation constante à l'Ultraturax et à l'air libre, à une température croissant jusqu'à 600C en 20 minutes. Après arrêt du chauffage, l'agitation est maintenue 40 minutes. Elle permet l'évaporation totale du solvant organique et l'obtention d'une suspension dont la concentration lipidique est de 25 pmol/hl (soit 20 mg/ml). NETEoeE III Ls constituants lipidiques sont dissous dans 5 ml de propylène glycol, maiontenu à 600C (jusqu'à dissolution). La solution tamponnée d'insuline (50 ml) est chauffée à 300C et introduite dans un bain à ultra-sons (Bransonic 220V), avec une agitation douce à l'Ultraturax (Osi). La solution lipidique à 600C est injectée à faible débit (5ml en 1 à 2 minutes) au sein de la solution d'insuline maintenue sous agitation et sonication. L'agitation à l'Ultraturax est poursuivie 2 inutes après l'injection et la sonication, 30 minutes. Le bain de sonication doit être refroidi par de la glace de façon à maintenir la température inférieure à 400C. Après un repos d'une heure, une nouvelle sonication de 30 minutes est effectuée, dans le bac toujours refroidi par de la glace. Quelle que soit la méthode de préparation, la filtration des suspensions lipidiques est nécessaire pour éliminer la solution d'insuline restée libre. Cette opération a été réalisée par deux techniques TECBNIQUE I La séparation de l'insuline libre s'effectue par filtration sur gel de Sépharose 6B (colonne de 25 cm de hauteur et 1,6 cm de section). L'éluant de filtration est le tampon citrate de préparation additionné de 0,6% de chlorure de sodium. Son débit est de 0,5 ml/mn. Le volume de chaque fraction recueillie est de 3 ml. Les vésicules lipidiques sont filtrées entre la 5ème et la 8ème fraction et l'insuline libre, à partir de la 12ème. TECNIJE II La séparation de l'insuline libre s'effectue par ultrafiltration tangentielle, sur Minitan acrylique (Millipore), en utilisant un filtre de polysulfone PTNK 300 KD. Pour cette opération, 100 ml de suspension lipidique sont passés en circuit continu au-travers de la cellule Minitan, à un débit de 450 à 500 ml/mn, sous une contre-pression réglée à 40 KPascals, ce qui permet un débit de filtrat de 0,5 à 1,5 ml/mn. Le volume de la suspension lipidique, concentré par élimination du filtrat, est réajusté à 100 ml, en cours de filtration, avec le tampon citrate de préparation. La solution d'insuline libre est éliminée dans le filtrat à chaque passage de la suspension lipidique au-travers de la membrane, et ses différentes fractions peuvent être recueillies à l'aide d'une tubulure latérale du circuit filtrant. La concentration insulinique des différentes fractions de filtrat est déterminée par dosage (HPLC) et la filtration est arrêtée lorsque cette concentration est inférieure à 2 UI/ml, ce qui correspond à un volume total de filtrat recueilli de tordre de 5 à 600 ml (soit 5 à 6 fois le volume initial de suspension lipidique). Conservation Les suspensions d'insuline obtenues par les différentes méthodes peuvent être conservées à 40C et à l'abri de la lumière, ou lyophilisées telles quelles, après répartition par aliquots de 2 ml en flacons de 15 ml, pendant 24 heures. Dosage de la quantité d'insuline fixée Ce dosage a été effectué par une méthode de chromatographie liquide haute performance (HPLC), en système isocratque, avec une colonne Kromasil C4, 5 pm, 100 A, de 25 cm de longueur, associée à une précolonne Kromasil C4, 5 gm, 100 A, de 1,8 cm, destinée à arrêter la majeure partie des phospholipides. La solution éluante est un mélange de 2 solvants A et B, en proportions respectives 590 ml/410 ml, filtré sur Millipore 0,45 pm et additionné de 0,2% d'acétonitrile (v/v). Le solvant A est composé d'acétonitrile : 100 ml et de tampon pH 3,3 q.s.p 1000 ml et le solvant B, d'acétonitrile : 500 ml et de tampon pH 3,3 : 500 ml.Le tampon pH 3,3 est préparé par élange de sulfate d'ammonium : 39,6 g, acide sulfurique 2N : 0,7 ml (q.s.p pH 3,3) et eau distillée : q.s.p 1000 ml. Le volume d'injection de l'échantillon à doser est fixé à 100 l. Le temps de rétention de l'insuline sur la colonne est de l'ordre de 11 mn. Cette méthode de dosage a été mise au point avec la solution aqueuse tamponnée d'insuline utilisée pour la préparation des suspensions lipidiques. Elle a une bonne sensibilité (1,9 pg d'insuline détectable, soit 0,05 UI), ainsi qu'une spécificité et une reproductibilité satisfaisantes. Les résultats sont exprimés en unités d'hormone/ml de l'échantillon à analyser. Le taux de phospholipides des suspens ions insuliniques peut être déterminé par la méthode enzymatique de Takayama, à l'aide de kits réactifs de la Société Biomérieux. Les concentrations en insuline peuvent ainsi être exprimées en UI/pmol de phospholipides. Résultats Les concentrations en insuline des formulations obtenues par les trois méthodes de préparation ont été calculées. Les résultats en sont les suivants METHODE I : a permis de fixer une quantité d'insuline de l'ordre d'1 UI/ml de suspension, soit 0,45 UI/pmol de phospholipide, ce qui correspond à un rendement de l'ordre de 22% de la quantité initiale d'hormone mise en oeuvre. De plus, la reproductibilité des résultats d'un lot de préparation à un autre s'est avérée être satisfaisante. NET90DE II : n'a fourni qu'une fixation infime d'insuline et ne peut donc être retenue. L'hormone a sans doute été dégradée par l'utilisation de Tween à température élevée. NET90rvE III :a présenté deux avantages : elle a procuré à la fois un taux de fixation d'insuline plus important que les deux méthodes précédentes, et une préparation quantitative de suspension lipidique chargée en insuline, grâce au mode de filtration rapide adopté. Dans le cas de suspension contenant une concentration lipidique de 25 pmol/ml, le taux d'insuline fixée a été de 15 UI/ml, soit 0,74 UI/pmol de phospholipide et un rendement de l'ordre de 37%. Pour des préparations contenant 50 pmoles de phospholipide /ml, le taux de fixation hormonale a atteint 25 UI/ml, soit 0,60 UI/pmol de phospholipide et un rendement de 60% de la quantité initiale. EXEMPLE II ETUDE DE L'INCORPORATION D'UNE HORMONE PEPTIDIQUE DANS DES LIPOSOMES Au cours de précédents travaux, il a été montré la possibilité de préparer des suspensions liposomiales d'insuline présentant un rendement d'encapsulation satisfaisant et une bonne reproductibilité des résultats d'un lot de préparation à un autre. La méthode de préparation adoptée a été la méthode de Bangham et la composition lipidique sélectionnée, un mélange de phosphatidylcholine d'oeuf ou de soja et de cholestérol associés à un lipoïde de charge négative, dont la présence s'est avérée indispensable pour l'obtention d'une fixation quantitative d'hormone. On a poursuivi ces études avec plusieurs objectifs - améliorer le rendement d'encapsulation, en utilisant comme lipoïde de charge, l'hémisuccinate de cholestérol au lieu du phosphate de dicétyle. - diminuer les effets secondaires éventuels en évaluant la concentration minimale efficace pour une bonne encapsulation de l'hormone, dans le cas de l'utilisation du phosphate de dicétyle. - limiter le coût de la préparation en utilisant de la phosphatidylcholine de soja au lieu de la phosphadidylcholine d'oeuf. - améliorer la conservation des préparations en lyophilisant les suspensions lipidiques d'insuline. - envisager un autre mode de préparation quantitative, en vue d'une application industrielle de la formulation mise au point. Préparation de liposomes d'insuline chargés négativement par de l'hémisuccinate de cholestérol Ces liposomes ont été composés de phosphatidylcholine d'oeuf ou de soja, de cholestérol et d'hémisuccinate de cholestérol dans les rapports molaires 7/2/1, 7/1/1 et 7/0/2. Les résultats sont présentés dans le Tableau I. Ils montrent que les taux de fixation de l'hormone obtenus dans ces conditions sont bien inférieurs à ceux observés en utilisant le phosphate de dicétyle. L'hémisuccinate de cholestérol ne peut donc pas être utilisé comme lipoïde de charge. Préparation de liposomes d' insuline chargés négativement par du phosphate de dicétyle à différentes concentrations Ce lipoïde de charge a été introduit à trois concentrations, dans les rapports molaies phospholipide,, cholestérol, lipoïde suivants 7/2/0,5 - 7/2/1 - 7/2/2. Les taux d'encapsulation obtenus avec les trois formulations, reportés dans le Tableau 2, montrent que le meilleur rapport molaire des trois constituants lipidiques est de 7/2/1. C'est celui qui sera retenu pour la formulation des liposomes chargés en insuline. Comparaison des taux d'encapsulation de hormone, selon la nature du phospholipide utilisé Trois lots de liposomes d'insuline ont été préparés, en utilisant de la phosphatidylcholine d'oeuf, de la phosphatidylcholine de soja (moins riche en acides gras saturés que celle d'oeuf) et de la phosphatidylcholine de soja partiellement hydrogénée (donc plus riche en acides gras saturés que la précédente). Les caractéristiques des liposomes obtenus ainsi que les rendements d'encapsulation, reportés dans le Tableau 3, montrent que la phosphatidylcholine de soja permet des taux de fixation d'hormone du même ordre que la phosphatidylcholine d'oeuf et, présentant l'avantage d'un moindre coût, sera adoptée comme phospholipide, pour la formulation des suspensions liposomiales. En revanche, la forme partiellement hydrogénée ne présente pas d'intérêt dans les conditions de la mise au point. Lyophilisation des suspensions liposomiales Des essais de lyophilisation ont été effectués, pendant 24 heures, sur des aliquots de suspension de 2 ml, en présence et en l'absence de mannitol. Le dosage du taux d'insuline fixé a été pratiqué avant et après lyophilisation. De plus, la taille des vésicules liposomiales a été déterminée dans les mêmes conditions. Les résultats, présentés dans le Tableau 4, montrent que la présence de mannitol modifie considérablement la taille des vésicules et n'améliore en rien la stabilité des préparations. Une lyophilisation réalisée sur la solution d'insuline libre montre que cette opération ne dénature pas l'hormone qui ne présente pas de changement dans ses caractéristiques chromatographiques (mêmes temps de rétention et hauteur du pic pour l'insuline lyophilisée ou non). Les suspensions liposomiales peuvent donc être lyophilisées sans mannitol pour conserver leur stabilité. Préparation quantitative de suspensions liposomiales Les résultats présentés ci-dessus se rapportent à des suspensions liposomiales préparées selon la méthode de Bangham. Cette méthode ne permet de préparer que de faibles quantités de suspensions, d'un volume de 20 ml maximum. En effet, la préparation de volumes supérieurs (100 ml) a conduit à des suspensions dont la talle des vésicules étaient très hétérogène et le taux de fixation de l'hormone beaucoup plus faible. Ces inconvénients sont sans doute liés à la difficulté de soniquer des volumes importants de suspensions liposomiales. Pour tenter de préparer des volumes plus importants, avec un taux d'encapsulation satisfaisant et une homogénéité des suspensions, on opère selon une autre méthode. Les constituants lipidiques (phosphatidylcholine de soja, cholestérol et phosphate de dicétyle), sont dissous dans 5 ml de propylène glycol maintenu à 600C. La solution d'insuline tamponnée à pH 3,0 est chauffée à 300C et introduite dans un bain à ultra-sons, sous agitation douce à ltultra-turrax. La solution lipidique à 600C est injectée à faible débit (5 ml en 1 à 2 mn) au sein de la solution d'insuline encore sous agitation et sonication. L'agitation à l'Ultra-turrax est poursuivie 2 mn après l'injection et la sonication, 30 mn. Le bain de sonication doit être refroidi par de la glace de façon à maintenir la température inférieure à 400C. Après un repos d'l heure, une nouvelle sonication de 30 mn est effectuée dans le bac toujours refroidi par de la glace. La séparation de l'insuline libre s'effectue par ultrafiltration tangentielle, sur Ninitan acrylique (Millipore), en utilisant un filtre de polysulfone PTNK 300KD. Cette méthode de filtration permet de traiter un volume de 100 ml de suspension liposomiale. Associée au mode de préparation précédemment décrit (qui lui-même s'applique à des volumes de suspensions élevés), elle permet d'envisager avec succès une préparation industrielle de suspensions liposomiales. Les caractéristiques des préparations obtenues par cette méthode sont présentées dans le Tableau 5. L'un des avantages est notamment l'augmentation significative du rendement d'encapsulation de l'hormone. 'IIABLEW 1 Influence de la nature du lipoïde de charge liposomes chargés négativement par de l'hémisuccinate de cholestérol Nature du Composition Taux d'insuline fixée Rendement phospholipide lipidique UI/ml UI/pmol PL Phosphatidylcholine d'oeuf 7/2/1 0,15 0,025 1,24 % 7/1/1 0,20 0,04 1,80 % 7/0/2 0,33 0,051 2,50 % Phosphatidylcholine de soja 7/2/1 1,80 0,273 13,65 % 7/1/1 2,11 0,217 10,85 % 7/0/2 2,15 0,233 11,64 % - La composition lipidique est- exprimée en rapport molaire du phosphatidylcholine, cholestérol et d'hémisuccinate de cholestérol. - Le rendement est exprimé en pourcentage de la quantité théorique d'insuline fixée, soit 2 UI/pmol de phospholipide. TABLEAU 2 Influence de la concentration en phosphate de dicétyle Nature du Composition Taux d'insuline fixée Rendement phospholipide lipidique UI/ml UI/pmol PL Phosphatidylcholine d'oeuf 7/2/1 4,34 0,97 48 % 7/2/2 1,72 0,60 30 % Phosphatidylcholine de soja 7/2/0,5 4,96 0,34 17 % 7/2/1 2,20 0,98 49 % 7/2/2 0,80 0,37 18 % Phosphatidylcholine de soja partiellement hydrogénée 7/2/1 0,72 0,18 9 % BLEAU 3 Influence de la nature du phospholipide Nature du Tailles des Taux d'insuline fixée Rendement phospholipide vésicules UI/ml UI/rmol PL Phosphatidylcholine d'oeuf 225+160nm : 85% 4,34 0,97 48 % 1400+400nm : 15% Phosphatidylcholine de soja 130+ 20nm : 80% 2,20 0,98 49 % 1200+200nm : 20% Phosphatidylcholine de soja partiellement hydrogénée 160+ 80nm : 50% 0,72 0,18 9-% 700+300nm : 50% - La composition lipidique des 3 formulations était : phospholipide, cholestérol et phosphate de dicétyle, dans un rapport molaire 7/2/1. TABLEAU 4 Essai de lyophilisation influence de la charge en mannitol Nature du Tailles des Taux d'insuline fixée Rendement phospholipide vésicules UI/ml UI/pmol PL Solution d'insuline à SOUl/mI lyophilisée sans mannitol 54,0 lyophilisée avec mannitol 48,7 Liposomes composés de phosphatidylchol ine de soja non lyophilisés 140+ 60nm : 70% 1,83 0,75 37,5 % 1600+340nm : 30% lyophilisés sans mannitol 200100nm : 45% 2,31 0,99 50 % 2100650nm : 55% lyophilisés avec mannitol 600 150nm : 35% 2,29 0,88 44 % 60001000nm : 65% TABLEAU 4B Essai de lyophilisation stabilité des préparations après 2 mois Nature de la Tailles des Taux d'insuline fixée Rendement préparation vésicules UI/ml UI/pmol PL Liposomes composés de phosphatidylcholine de soja non lyophilisés 200+ 80nm : 70% 1,65 0,60 30 % 5000+1300nm : 30% lyophilisés sans mannitol 170+ 40nm : 40% 1,70 0,65 32 % 3700900nm : 60% lyophilisés avec mannitol 200 30nm : 20% 1,15 0,45 23 % 410500nm : 80% TABLEAU 5 Essai de préparation quantitative de liposomes Mode de Tailles des Taux d'insuline fixée Rendement préparation vésicules UI/ml UI/pmol PL Bangham 270+ 70nm : 65% 9002000nm : 35% 0,80 0,18 9,2% injection de solution glycolique 210+ 85nm : 60% 1300+400nm : 40% 2,0 0,68 34 8 Les deux modes de filtration des suspensions liposomiales (filtration sur gel ou filtration sur Ninitan acrylique) ont donné des rendements d'encapsulation sensiblement identiques. Compte tenu des rendements d'encapsulation satisfaisants obtenus par mise en jeu d'un mode de préparation quantitative des liposomes d'insuline, des essais biologiques ont été effectués sur le rat. Les résultats obtenus permettent d'envisager la mise au point d'une forme sèche, adhésive, facilitant l'administration des préparatiQns, notamment par voie digestive ou par voie perlinguale. ETUDE PHARMACOLOGIQUE EXPERIMENTATION D'UNE PREPARATION A ACTIVITE HYPOGLYCEMIANTE 4 lots de rats normoglycémiques, mis à jeun 8 heures avant l'épreuve, sont considérés ler lot de 5 rats : témoins non traités, servent à déterminer les variations chronobiologiques de la glycémie 2ème lot de 5 rats : traités par voie intra-péritonéale, servent de témoins d'activité de la préparation 3ème lot de 10 rats : gavés par voie intra-buccale ou perlinguale 4ème lot de 10 rats : gavés par voie intra-gastrique, servent à évaluer l'activité de la préparation, après administration orale. Des prises de sang veineux seront effectuées sur l'ensemble des animaux à jeun, puis 30 mn, 1 heure, 2,3,4,5, 12 et 24 heures après administration des différentes préparations chez les animaux traités et chez les témoins servant à déterminer les variations spontanées de la glycémie. Ces prélèvements sont effectués en ayant soin d'éviter tous stress ou anesthésie des animaux, susceptible de provoquer une perturbation de leur glycémie. Le meilleur moyen consiste à traiter des animaux porteurs d'un catheter permanent de prélèvement. Les doses de préparation,se présentant sous forme liquide, sont déterminées par HPLC au préalable. REVENDICATIONS L'invention a pour objet 1 - Un procédé de préparation de nouvelles compositions pharmaceutiques permettant l'absorption des principes actifs peu résorbables ou susceptibles d'être hydrolysés, caractérisé en ce que l'on forme, au préalable, des liposomes multilamellaires par dissolution d'un mélange de phospholipides et de cholestérol dans un solvant chloré, qu'on évapore le solvant sous pression réduite, qu'on disperse le résidu sec dans une solution ou duspension aqueuse du principe actif à incorporer, jusqu'à ce que la phase lipidique soit répartie d'une manière homogène dans la phase aqueuse, qu'on filtre les vésicules ainsi formées par fixation sur gel de polyacrylamide ou de cellulose modifiée et que l'on élue à l'aide d'une solution tampon à base de citrates. 20- Un procédé selon la revendication 10 dans lequel on additionne la phase lipidique avec un ou plusieurs agents acidifiants et on obtient des liposomes multilamellaires chargés négativement. 30- Un procédé selon la revendication 10 ou la revendication 20 dans lequel l'agent acidifiant est choisi dans le groupe constitué par le phosphate de dicétyle et un ester acide de cholestéryle. 40- Un procédé selon la revendication 30 dans lequel l'ester acide de cholestéryle est l'hémisuccinate de cholestéryle. 5 - Un procédé selon la revendication 10 dans lequel la phase aqueuse des liposomes est additionnée d'un agent tensio-actif non ionique. 60- Un procédé selon l'une des revendications 1 à 50 dans lequel les vésicules recueillies après dispersion, sont lyophilisées avant la filtration sur gel. 70- Un procédé selon l'une des revendications 1 à 60 dans lequel les liposomes multilamellaires renfermant un principe actif sont ajustés à la teneur désirée par des liposomes neutres ne contenant pas de principe actif. 80- Un procédé selon la revendication 10 dans lequel la filtration des liposomes est effectuée sur colonne de Séphadex. 9 - Un procédé selon la revendication 10 ou la revendication 80 dans lequel les liposomes sont élués au moyen d'un tampon acide citrique et citrate de sodium, additionné de chlorure de sodium. 10 - Un procédé selon la revendication 10 dans lequel le principe actif incorporé dans les liposomes multilamellaires est une molécule peptidique susceptible d'être hydrolysé dans le tube digestif, d'origine naturelle, synthétique ou génétique. 11 - Une composition pharmaceutique formée de liposomes multilamellai res éventuellement chargés négativement contenant à titre de principe actif une ou plusieurs molécules peptidiques dans la phase aqueuse du liposome, additionné éventuellement de liposomes neutres, ces liposomes étant préparés selon le procédé des revendications 1 à 10. 120- Une composition pharmaceutique selon la revendication 110 dans laquelle le principe actif peptidique est une insuline humaine ou animale ou une insuline produite par génie génétique. 13 - Une composition pharmaceutique selon la revendication 110 dans laquelle le principe actif peptidique est une calcitonine humaine ou animale, ou une calcitonine produite par génie génétique. 140- Une compositon pharmaceutique selon la revendication 110 dans laquelle le principe actif peptidique est choisi dans le groupe constitué par le TRH, la lysine vasopressine, la vasopressine, la desglycinamide vasopressine, les fragments d'ACTH, les encéphalines, le CCK, les analogues de CCK, la somatotrophine, l'EGF, le facteur natriurétique, la polylysine, la FSH, la LRH, les gonadorelines, la buséréline et les peptides intestinaux.