FR 2682114 A1 19930409 FR 9112176 A 19911003 Vaccin de sous-unité contre les infections à Neisseria meningitidis et sous-unités correspondantes à l'état pu rifié La présente invention a pour objet une composition pharmaceutique vaccinale destinée à la prévention des méningites causées par Neissena m en ingitidis. D'une manière générale, les méningites sont soit d'origine virale, soit d'origine bactérienne. Les bactéries principalement responsables sont : meningitidis et Haemophilus influenzae, respectivement impliquées dans environ 40 et 50 % des cas de méningites bactériennes. On dénombre en France, environ 600 à 800 cas par an de méningites à N. meningitidis. Aux Etats-Unis, le nombre de cas s'élève à environ 2500 à 3 000 par an. L'espèce N. meningitidis est sub-divisée en sérogroupes selon la nature des polysaccharides capsulaires. Bien qu'il existe une douzaine de sérogroupes, 90 % des cas de méningites sont attribuables à 3 sérogroupes : A, B et C. I1 existe des vaccins efficaces à base de polysaccharides capsulaires pour prévenir les méningites à N. meningitutts sérogroupes A et C. Ces polysaccharides tels quels ne sont pas ou peu immunogéniques chez les enfants de moins de 2 ans et n'induisent pas de mémoire immunitaire. Toutefois, ces inconvénients peuvent être surmontés en conjuguant ces polysaccharides à une protéine porteuse. Par contre, le polysaccharide de N. meningitidis groupe B n'est pas ou peu immunogène chez l'homme, qu'il soit sous forme conjuguée ou non. Ainsi, il apparait hautement souhaitable de rechercher un vaccin à l'encontre des méningites induites par N. meningitidis notamment du sérogroupe B autre qu'un vaccin à base de polysaccharide. A cette fin, différentes protéines de la membrane externe de N. menihgîttdis ont déjà été proposées. Il s'agit en particulier du récepteur membranaire de la transferrine humaine. D'une manière générale, la grande majorité des bactéries ont besoin de fer pour leur croissance et elles ont développé des systèmes spécifiques d'acquisition de ce métal. En ce qui concerne notamment N. mernngîtidis qui est un pathogène strict de l'homme, le fer ne peut être prélevé qu'à partir des protéines humaines de stockage du fer e.g., l'hémoglobine, la ferritine, la transferrine et la lactoferrine puisque la quantité de fer sous forme libre est négligeable chez l'honrne (10-18 M), en tout cas insuffisante pour permettre la croissance bactérienne. Ainsi, N. meningitidis possède un récepteur de la transferrine humaine et un récepteur de la lactoferrine humaine qui lui permettent de fixer ces protéines chélatrices du fer et de capter par la suite le fer nécessaire à sa croissance. Le récepteur de la transferrine de la souche N. meningitidis B16B6 a été purifié par Schryvers et al (WO 87/12591). Ceci a permis de mettre en évidence la structure multimérique de ce récepteur qui est essentiellement constitué de 2 types de sous-unités: une sous-unité d'une masse moléculaire apparente élevée de 100 kD et une sous-unité d'une masse moléculaire apparente moindre d'environ 70 kD, telles que révélées après électrophorèse d'un gel de SDS PAGE. Schryvers et al a par la suite proposé d'utiliser ce récepteur à des fins vaccinales. De manière surprenante, on a maintenant trouvé que la sous-unité de haut poids moléculaire ne pourrait pas induire la production d'anticorps de type neutralisant. Seule la plus petite des 2 sous-unités du récepteur serait capable de remplir cette fonction. En conséquence, l'invention propose: i) . La sous-unité de moindre poids moléculaire du récepteur de la transferrine humaine d'une souche de N. meningttidis, un fragment ou un analogue de ladite sous-unité, sous forme purifiée; c'est-à-dire dissociée et isolée de la sous-unité de haut poids moléculaire dudit récepteur; et ii) Une composition pharmaceutique vaccinale qui comprend à titre d'agent thérapeutique la sous-unité de moindre poids moléculaire du récepteur de la transferrine humaine d'au moins une souche de N. meningittdis, un fragment ou un analogue de ladite sous-unité ; en l'absence de la sous unité de haut poids moléculaire dudit récepteur; iii) L'usage thérapeutique de la sous-unité de moindre poids moléculaire du récepteur de la transferrine humaine d'au moins une souche de N. meningitidis, un fragment ou un analogue de ladite sous-unité ; en l'absence de la sous-unité de haut poids moléculaire dudit récepteur; et iv) Une méthode de vaccination à l'encontre des infections à N. meningifidis, qui comprend l'acte d'administrer une quantité efficace d'un point de vue thérapeutique de la sous-unité de moindre poids moléculaire du récepteur de la transferrine humaine d'au moins une souche de N. meningitidis, un fragment ou un analogue de ladite sous-unité, en l'absence de la sous-unité de haut poids moléculaire dudit récepteur, à un sujet ayant besoin d'un tel traitement. D'une manière générale, la sous-unité de moindre poids moléculaire peut être obtenue sous forme purifiée (c'est-à-dire dissociée et isolée de la sousunité de haut poids moléculaire) notamment à partir d'un récepteur de la transferrine. Ce dernier peut être isolé à partir d'une souche de N. meningindis préalablement cultivée dans un milieu carencé en fer sous forme libre, notamment selon la méthode de Schryvers et al, WO 90/12591, décrite de manière similaire dans Schryvers et at, Infect. Immun. (1988) 56 (5): 1144. Puis le récepteur purifié est soumis à l'action d'un agent fortement dénaturant tel que l'urée 8M ou la guanidine HC1 6M. Les sous-unités dissociées sont finalement séparées par des méthodes chromatographiques classiques telles qu'une chromatographie d'échange d'ions ou de gel de filtration. De manière alternative, la sous-unité de moindre poids moléculaire peut être produite en mettant en oeuvre les techniques du génie génétique. Le fragment d'ADN codant pour cette sous-unité peut être exprimé dans un système d'expression hétérologue (e.g. bactérie, levure, cellule de mammifère). La sous-unité est dans ce cas-là recueillie à partir d'une culture et purifiée. Ces méthodes sont en outre parfaitement adaptées à la production des fragments ou des analogues de la sous-unité. Par "fragment de la sous-unité de moindre poids moléculaire", on signifie un peptide ayant une séquence d'acides aminés qui est incluse dans la séquence de la sous-unité. Par "analogue de la sous-unité de moindre poids moléculaire", on signifie une protéine ayant une séquence d'acides aminés qui présente un degré d'homologie d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, de manière tout à fait préférée d'au moins 95 % avec la séquence de la sous-unité. Aux fins de la présente invention, il est bien entendu qu'un tel fragment ou un tel analogue doit conserver les propriétés immunogènes de la sous-unité. D'une manière générale, Ia sous-unité de moindre poids moléculaire utile aux fins de la présente invention peut avoir pour origine une souche de N. meningitidis de n'importe quel sérogroupe. De manière avantageuse, elle a pour origine une souche de N. meningitidis sérogoupe B. Selon un aspect de l'invention tout à fait préféré, elle a pour origine la souche de N. meningitidis B16B6 , aussi appellée 2394 (B:2a:P1.2:L23) ou 2169 (B:9:P1.9:L3.7) qui sont publiquement disponibles auprès de la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 rue du Dr Roux 75015 Paris sous les numéros d'enregistrement respectifs LNP N 1511 et LNP N 1520. Une composition pharmaceutique selon l'invention est notamment utile pour prévenir ou atténuer les effets d'une infection à N. menîngitidis. Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier on associe l'agent thérapeutique selon l'invention avec un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie sous-cutanée, par voie intra-musculaire ou par voie intra veineuse, par exemple sous forme de suspension injectable. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. Le dosage approprié varie en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité ou du mode d'administration. Enfin une composition selon l'invention peut contenir une ou plusieurs sous-unités de moindre poids moléculaire selon qu'elles proviennent de différentes souches de N; meningittdts. Ainsi, selon un aspect particulier de l'invention, une composition pharmaceutique avantageuse comprend la sousunité de moindre poids moléculaire du récepteur de la transferrine humaine de la souche 2394 et la sous-unité de moindre poids moléculaire du récepteur de la transferrine humaine de la souche 2169. L'invention est décrite plus en détails dans les exemples ci-après. EXEMPLE 1: Purification de la sous-unité de moindre poids moléculaire du récepteur de la transferrine, à partir de la souche 2394 1A- Culture Un lyophilisat de la souche N. meningifidis 2394 est repris dans environ 3. ml de bouillon Muller Hinton (BMH, Difco). La suspension bactérienne est ensuite étalée sur le milieu solide Muller Hinton contenant du sang cuit (5 %). Après 24 h d'incubation à 37"C dans une atmosphère contenant 10 % de CO2, la nappe bactérienne est recueillie pour ensemencer 150 ml de BMH pH 7,2, répartis en 3 erlens de 250 ml. L'incubation est poursuivie pendant 3 h à 37"C sous agitation. Chacune des 3 cultures ainsi réalisées permet d'ensemencer 400 ml de BMH pH 7,2 supplémentés avec 30 pu d'éthylènedismine - di (ohydroxyphenyl - acetic acid) (EDDA, Sigma), qui est un agent chélatant du fer sous forme libre. Après 16 h de culture à 37"C sous agitation, les cultures sont contrôlées pour leur pureté par observation au microscope après une coloration de Gram. La suspension est centrifugée, le culot contenant les germes est pesé et conservé à -20 C. lB - Purification La méthode de purification est essentiellement telle que décrite par Schryvers et al (supra). Le culot bactérien obtenu en 1A est décongelé, puis remis en suspension dans 200 ml de tampon Tris HCl 50 mM, pH 8,0 (tampon A). La suspension est centrifugée pendant 20 min à 15 000 xg à 4"C.Le culot est récupéré, puis remis en suspension dans du tampon A à la concentration finale de 150 g/l. Des fractions de 150 ml sont traitées pendant 8 min à 800 bars dans un lyseur de cellules travaillant sous haute pression (Rannie, modèle 8,30H). Le lysat cellulaire ainsi obtenu est centrifugé pendant 15 min à 4"C à 15 000 xg. Le surnageant est récupéré, puis centrifugé pendant 75 min à 4"C à 200 000 xg. Après élimination du surnageant, le culot est repris dans du tampon A et après dosage dqprotéines selon Lowry, la concentration de la suspension est ajustée à 5 mg/ml. A 1,4 ml de la suspension de membranes on ajoute 1,75 mg de transferrine humaine biotynylée selon le procédé décrit par Schryvers. La concentration finale de la fraction membranaire est de 4 mg/ml. Le mélange est incubé 1 heure à 37"C puis centrifugé à 100 000 xg pendant 75 min à 4"C. Le culot de membranes est repris par le tampon A contenant du NaCI 0,1M et incubé pendant 60 min à température ambiante. Après solubilisation, on ajoute à cette suspension un certain volume de N Lauroyl Sarkosine à 30 to (p/v) et d'EDTA 500 mM de façon que les concentrations finales en Sarkosyl et EDTA soient de 0,5 % et SmM respectivement. Après une incubation de 15 min à 37"C sous agitation, on ajoute 1 ml de résine strepavidine-agarose (Pierce) préalablement lavée en tampon A. La suspension est incubée 15 min à température ambiante puis centrifugée à 1 000 xg pendant 10 min. La résine est ensuite conditionnée dans une colonne et l'éluat direct est éliminé. La résine est lavée par 3 volumes de colonne de tampon Tris-HCl 50 mM pH 8,0 contenant NaCl 1M, EDTA 10 mM Sarkosyl 0,5 % (tampon B) puis par un volume de colonne de tampon B contenant de la guanidine HC1 750 mM. Le récepteur de la transferrine est ensuite élué par le tampon B contenant de la guanidine HCl 2M. L'éluat est collecté en fractions, chacune de volume égal à un volume de colonne, dans des tubes contenant un volume de colonne de Tris Cl 50 mM pH 8,0, NaCl 1M. La densité optique à 280 nm de l'éluat est mesurée en sortie de colonne à l'aide d'un détecteur UV. Les fractions correspondant au pic d'élution sont recueillies, dialysées contre du tampon phosphate 10 mM, pH 8,0 contenant de l'urée 0,5 M, puis concentrées sur une cellule de concentration de type Amicon équipée de membrane dont le seuil de coupure est de 10 000 daltons à la concentration finale d'environ 3 mg de protéine/ml. Une certaine quantité d'urée est ajoutée à la solution concentrée de façon que la concentration finale en urée soit de 8M, la concentration finale de la solution protéique restant comprise entre 2 à 3 mg/ml. La solution est incubée pendant 6 jours à 4"C. Le mélange est ensuite chromatographié sur une résine échangeuse d'anions (Q-Sépharose Pharmacia) préalablement équilibrée dans le tampon Tris-HCl 50 mM pH 8,0 contenant de l'urée SM. Dans ces conditions, la sous-unité de haut poids moléculaire est directement recueillie dans l'éluat direct tandis que la sous-unité de poids moléculaire moindre est éluée par un gradient linéaire de 0 - 1M NaCI dans le tampon Tris-HCl urée. La densité optique à 280 nm est mesurée en sortie de colonne à l'aide d'un détecteur UV. Les fractions correspondant au pic d'élution sont recueillies, dialysées contre du tampon phosphate 10 mM, pH 8,0 contenant du Sarkosyl 0,05 % et lyophilisées. Le lyophilisat est repris dans de l'eau à une concentration 10 fois supérieure. La solution est dialysée une seconde fois contre du tampon phosphate 50 mM pH 8,0 contenant du Sarkosyl 0,05 % (tampon C) puis la solution est filtrée sur une membrane de porosité 0,22 > im. Le contenu en protéines est déterminé et ajusté à 1 mg/ml par addition de tampon C, sous conditions aseptiques. Cette préparation est conservée à 7onc. EXEMPLE 2: Purification de la sous-unité de moindre poids moléculaire du récepteur de la transferrine, à partir de la souche 2169. La culture de la souche 2169 et la purification de la sous-unité de moindre poids moléculaire du récepteur de la transferrine sont effectuées dans des conditions identiques à celles décrites dans l'Exemple 1. EXEMPLE 3: Composition pharmaceutique vaccinale destinée à prévenir des infections à N. meningitidis. La solution stérile obtenue dans 1' Exemple 1 ou 2 est décongelée. Afin de préparer un litre de vaccin renfermant 200yug/ml d'un principe actif, on mélange stérilement les solutions suivantes: - Solution contenant la sous-unité du récepteur 2394 (ou 2169) à 1 mg/ml dans du tampon C 200 ml - Eau physiologique tamponnée (PBS) àpH6,0 300 ml - Hydroxyde d'aluminium à 10 mg A1+ + +/ml 50 ml - Merthiolate à 1 % (p/v) dans du PBS 10 ml - PBSqsp 1000 ml Revendications 1. La sous-unité de moindre poids moléculaire du récepteur de la transferrine humaine d'une souche de N. meningitidis, un fragment ou un analogue de ladite sous-unité, sous forme purifiée. 2. La sous-unité de moindre poids moléculaire du récepteur de la transferrine humaine d'une souche de N. meningitidis, sous forme purifiée. 3. La sous-unité de moindre poids moléculaire du récepteur de la transferrine humaine d'une souche de N. meningitilzs sérogroupe B, sous forme purifiée. 4. Une composition pharmaceutique vaccinale qui comprend à titre d'agent thérapeutique la sous-unité de moindre poids moléculaire du récepteur de la transferrine humaine d'au moins une souche de N. meningitidis, un fragment ou un analogue de ladite sous-unité; en l'absence de la sous-unité de haut poids moléculaire dudit récepteur. 5. Une composition pharmaceutique vaccinale selon la revendication 4, qui comprend à titre d'agent thérapeutique la sous-unité de moindre poids moléculaire du récepteur de la transferrine humaine d'au moins une souche de N. meningitidis ; en l'absence de la sous-unité de haut poids moléculaire dudit récepteur. 6. Une composition pharmaceutique selon la revendication 5, qui comprend la sous-unité de moindre poids moléculaire du récepteur de la transferrine humaine d'au moins une souche de N. meningitidis sérogroupe B, en l'absence de la sous-unité de haut poids moléculaire dudit récepteur.