FR 2686900 A1 19930806 FR 9201065 A 19920131 La présente invention concerne de nouveaux polypeptides ayant une activité de stimulation des colonies de granulocytes humain, leur préparation et des compositions pharmaceutiques les contenant. La présente invention concerne en particulier des polypeptides chimères composés d'une partie biologiquement active constituée par tout ou partie du G-CSF ou d'un variant du G-CSF, et d'une structure stabilisatrice essentiellement protéique lui conférant de nouvelles propriétes biologiques. Le G-CSF humain est un polypeptide sécrété de 174 acides aminés, ayant un poids moléculaire de 18 kD environ. Il a été isolé initialement à partir d'une lignée cellulaire cancéreuse (EP 169 566), et son gène a été cloné, séquencé, et exprimé dans différents hôtes cellulaires par les techniques du génie génétique (EP 215 126, EP 220 520). Un ARNm codant potentiellement pour une forme du G-CSF ayant 177 acides aminés a par ailleurs été mis en évidence [Nagata S. et al., EMBO J. 5 (1986) 575-581]. Le G-CSF possède la capacité de stimuler la différentiation et la prolifération de cellules progénitrices de la moelle osseuse en granulocytes.A ce titre, il possède la capacité de stimuler les capacités protectrices de l'organisme contre l'infection en favorisant la croissance des polynucléaires neutrophiles et leur différentiation aboutissant à la maturité. il est ainsi capable d'activer les fonctions prophylactiques de l'organisme, et peut être utilisé dans différentes situations pathologiques dans lesquelles le nombre de neutrophiles est anormalement faible, ou dans lesquelles le système immunitaire doit être renforcé. De telles situations surviennent par exemple à la suite des traitements de chimiothérapie anticancéreuse, lors de greffes, et en particulier de greffes de moelle osseuse, ou lors des leukopénies. L'un des inconvénients du G-CSF actuellement disponible réside dans le fait qu'il est dégradé rapidement par l'organisme une fois administré. Ceci est d'autant plus sensible que le G-CSF est généralement utilisé à des doses faibles. De plus, l'utilisation de doses plus importantes n'a pu permettre d'améliorer les capacités thérapeutiques de cette molécule et peut induire des effets secondaires indésirables. Ces phénomènes d'élimination et de dégradation in vivo constituent donc pour l'instant un obstacle à l'exploitation de l'activité biologique du G CSF en tant qu'agent pharmaceutique. La présente invention permet de remédier à ces inconvénients. La présente invention fournit en effet de nouvelles molécules permettant une exploitation optimale sur le plan thérapeutique des propriétés biologiques du G-CSF. La demanderesse a en effet mis en évidence que l'activité optimale du G-CSF se manifestait lorsque le G-CSF était présent à faible dose et pendant un temps prolongé. La demanderesse a maintenant réalisé des molécules capables de maintenir dans l'organisme une activité G-CSF pendant un temps suffisamment long. De plus, la demanderesse a montré qu'il est possible d'exprimer dans des hôtes cellulaires à des niveaux élevés des fusions génétiques générant des chimères présentant de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et les propriétés biologiques désirables du G-CSF.En particulier, les polypeptides hybrides de l'invention conservent leur affinité pour les récepteurs du G-CSF, et sont suffisamment fonctionnels pour conduire à la prolifération et à la différentiation cellulaire. Les molécules de l'invention possèdent par ailleurs une distribution et des propriétés pharmacocinétiques particulièrement avantageuses dans l'organisme et permettent le développement thérapeutique de leur activité biologique. Un objet de la présente invention concerne donc des polypeptides recombinants comportant une partie active constituée par tout ou partie du G-CSF, ou d'un variant du G-CSF, et une structure stabilisatrice essentiellement protéique. Au sens de la présente invention, le terme variant du G-CSF désigne toute molécule obtenue par modification de la séquence comprise entre les résidus Thr586 et Pro759 de la séquence présentée sur la Figure 1, conservant une activité G-CSF, c'est-à-dire la capacité de stimuler la différenciation des cellules cibles et la formation de colonies de granulocytes. Cette séquence corresponds à celle du G-CSF mature décrite par Nagata et al. [EMBO J. 5 (1986) 575-581 j. Par modification, on doit entendre toute mutation, substitution, délétion, addition ou modification consécutive à une action de nature génétique et/ou chimique.De tels variants peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité de la molécule pour le(s) récepteur(s) du G-CSF, celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases, celui d'augmenter son efficacité thérapeutique ou de réduire ses effets secondaires, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques. Des polypeptides de l'invention particulièrement avantageux sont ceux dans lesquels la partie biologiquement active possède: (a) la séquence peptidique comprise entre les résidus Thr586 et Pro759 de la séquence présentée sur la Figure 1, ou, (b) une partie de la structure (a), ou, (c) une structure dérivée des structures (a) ou (b) par modifications structurales (mutation, substitution addition et/ou délétion d'un ou plusieurs résidus) et ayant une activité biologique identique ou modifiée.Ce dernier type de polypeptides comprend par exemple les molécules dans lesquelles certains sites de glycosylation ont été modifiés ou supprimés, ainsi que des molécules dans lesquelles un, plusieurs, voire tous les résidus cystéine ont été substitués. I1 comprend également des molécules obtenues à partir de (a) ou (b) par délétion de régions n'intervenant pas ou peu dans l'activité, ou intervenant dans une activité indésirable, et des molécules comportant par rapport à (a) ou (b) des résidus supplémentaires, tels que par exemple une méthionine Nterminale ou un signal de sécrétion. Plus préférentiellement, les polypeptides chimères de l'invention comprennent une partie active de type (a). La partie active des molécules de l'invention peut être couplée à la structure stabilisatrice protéique, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un peptide de jonction. De plus, elle peut constituer l'extrémité N-terminale comme l'extrémité C-terminale de la molécule. Préférentiellement, dans les molécules de l'invention, la partie active constitue la partie C-terminale de la chimère. Comme indiqué plus haut, la structure stabilisatrice des polypeptides de l'invention est essentiellement protéique. Préférentiellement, cette structure est un polypeptide possédant une demie-vie plasmatique élevée. A titre d'exemple, il peut s'agir d'une albumine, une apolipoprotéine, une immunoglobuline ou encore une transferrine. I1 peut également s'agir de peptides dérivés de telles protéines par modifications structurales, ou de peptides synthétisés artificiellement ou semi-artificiellement, et possédant une demie-vie plasmatique élevée. Par ailleurs, la structure stabilisatrice utilisée est plus préférentiellement un polypeptide faiblement ou non-immunogénique pour l'organisme dans lequel les polypeptides de l'invention sont utilisés. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la structure stabilisatrice est une albumine ou un variant de l'albumine et par exemple la sérum-albumine humaine (SAH). Il est entendu que les variants de l'albumine désignent toute protéine à haute demie-vie plasmatique obtenue par modification (mutation, délétion et/ou addition) par les techniques du génie génétique d'un gène codant pour un isomorphe donné de la sérum-albumine humaine, ainsi que toute macromolécule à haute demie-vie plasmatique obtenue par modification in vitro de la protéine codée par de tels gènes. L'albumine étant très polymorphe, de nombreux variants naturels ont dèjà été identifiés, et plus de 30 types génétiques différents ont été répertoriés [Weitkamp L.R. et al., Ann. Hum. Genet. 37 (1973) 219]. Plus préféren- tiellement, la structure stabilisatrice est une albumine mature. A titre d'exemples on peut citer des polypeptides de l'invention comportant, dans le sens N-terminal -- > C-terminal, (i) la séquence de la SAH mature couplée directement à la séquence du G-CSF mature (cf. Figure 1), ou (ii) la séquence du G-CSF mature couplée par l'intermédiaire d'un peptide de liaison à la séquence de la SAH mature. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation des molécules chimères décrites ci-avant. Plus précisément, ce procédé consiste à faire exprimer par un hôte cellulaire eucaryote ou procaryote une séquence nucléotidique codant pour le polypeptide désiré, puis à récolter le polypeptide produit. Parmi les hôtes eucaryotes utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomvces, Kluvveromyces. Pi chia Schwanniomvces. ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, etc... Parmi les champignons susceptibles d'être utilisés dans la présente invention, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries telles que Escherichia coli ou appartenant aux genres Corynebacterium, Bacilles ou Streptomyces. Les séquences nucléotidiques utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent être préparées de différentes manières. Généralement, elles sont obtenues en assemblant en phase de lecture les séquences codant pour chacune des parties fonctionnelles du polypeptide. Celles-ci peuvent être isolées par les techniques de l'homme de l'art, et par exemple directement à partir des ARN messsagers (ARNm) cellulaires, ou par reclonage à partir d'une banque d'ADN complémentaire (ADNc) isolé à partir de cellules productrices, ou encore il peut s'agir de séquences nucléotidiques totalement synthétiques. I1 est entendu de plus que les séquences nucléotidiques peuvent également être ultérieurement modifiées, par exemple par les techniques du génie génétique, pour obtenir des dérivés ou des variants desdites séquences. Plus préférentiellement, dans le procédé de l'invention, la séquence nucléotidique fait partie d'une cassette d'expression comprenant une région d'initiation de la transcription (région promoteur) permettant, dans les cellules hôtes, l'expression de la séquence nucléotidique placée sous son contrôle et codant pour les polypeptides de l'invention. Cette région peut provenir de régions promoteurs de gènes fortement exprimés dans la cellule hôte utilisée, l'expression étant constitutive ou régulable. S'agissant de levures, il peut s'agir du promoteur du gène de la phosphoglycérate kinase (PGK), de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GPD), de la lactase (LAC4), des énolases (ENO), des alcools deshydrogénases (ADH), etc...S'agissant de bactéries, il peut s'agir du promoteur des gènes droit ou gauche du bactériophage lambda (PL, PR), ou encore des promoteurs des gènes des opérons tryptophane (Ptrp) ou lactose (Par). En outre, cette région de contrôle peut être modifiée, par exemple par mutagénèse in vitro par introduction d'éléments additionnels de contrôle ou de séquences synthétiques, ou par des délétions ou des substitutions des éléments originels de contrôle. La cassette d'expression peut également comprendre une région de terminaison de la transcription fonctionnelle dans l'hâte envisagé, positionnée immédiatement en aval de la séquence nucléotidique codant pour un polypeptide de l'invention. Dans un mode préféré, les polypeptides de l'invention résultent de l'expression dans un hôte eucaryote ou procaryote d'une séquence nucléotidique et de la sécrétion du produit d'expression de ladite séquence dans le milieu de culture. I1 est en effet particulièrement avantageux de pouvoir obtenir par voie recombinante des molécules directement dans le milieu de culture. Dans ce cas, la séquence nucléotidique codant pour un polypeptide de l'invention est précédée d'une séquence "leader" (ou séquence signal) dirigeant le polypeptide naissant dans les voies de sécrétion de l'hâte utilisé.Cette séquence "leader" peut être la séquence signal naturelle du G-CSF ou de la structure stabilisatrice dans le cas où celle-ci est une protéine naturellement sécrétée, mais il peut également s'agir de toute autre séquence "leader" fonctionnelle, ou d'une séquence "leader" artificielle. Le choix de I'une ou l'autre de ces séquences est notamment guidé par l'hâte utilisé. Des exemples de séquences signal fonctionnelles incluent celles des gènes des phéromones sexuelles ou des toxines "killer" de levures. En plus de la cassette d'expression, un ou plusieurs marqueurs permettant de sélectionner l'hôte recombiné peuvent être additionnés, tels que par exemple le gène URA3 de la levure S. cerevisiae, ou des gènes conférant la résistance à des antibiotiques comme la généticine (G418) ou à tout autre composé toxique comme certains ions métalliques. L'ensemble constitué par la cassette d'expression et par le marqueur de sélection peut être introduit directement dans les cellules hôtes considérées, soit inséré préalablement dans un vecteur autoréplicatif fonctionnel. Dans le premier cas, des séquences homologues à des régions présentes dans le génôme des cellules hôtes sont préférentiellement additionnées à cet ensemble; lesdites séquences étant alors positionnées de chaque côté de la cassette d'expression et du gène de sélection de façon à augmenter la fréquence d'intégration de l'ensemble dans le génôme de l'hâte en ciblant l'intégration des séquences par recombinaison homologue.Dans le cas où la cassette d'expression est insérée dans un système réplicatif, un système de réplication préféré pour les levures du genre Kluvveromvces est dérivé du plasmide pKD1 initialement isolé de K. drosophilarum; un système préféré de réplication pour les levures du genre Saccharomvces est dérivé du plasmide 2,u de S. cerevisiae. De plus, ce plasmide d'expression peut contenir tout ou partie desdits systèmes de réplication, ou peut combiner des éléments dérivés du plasmide pKD1 aussi bien que du plasmide 2. En outre, les plasmides d'expression peuvent être des vecteurs navettes entre un hôte bactérien tel que Escherichia coli et la cellule hôte choisie. Dans ce cas, une origine de réplication et un marqueur de sélection fonctionnant dans l'hâte bactérien sont requises. Il est également possible de positionner des sites de restriction entourant les séquences bactériennes et uniques sur le vecteur d'expression: ceci permet de supprimer ces séquences par coupure et religature in vitro du vecteur tronqué avant transformation des cellules hôtes, ce qui peut résulter en une augmentation du nombre de copies et en une stabilité accrue des plasmides d'expression dans lesdits hôtes. Par exemple, de tels sites de restriction peuvent correspondre aux séquences telles que 5' GGCCNNNNNGGCC-3' (sil) ou 5'-GCGGCCGC-3' (NotI) dans la mesure où ces sites sont extrêmement rares et généralement absents d'un vecteur d'expression. Après construction de tels vecteurs ou cassette d'expression, ceuxci sont introduits dans les cellules hôtes retenues selon les techniques classiques décrites dans la littérature. A cet égard, toute méthode permettant d'introduire un ADN étranger dans une cellule peut être utilisée. I1 peut s'agir notamment de transformation, électroporation, conjugaison, ou toute autre technique connue de l'homme de l'art. A titre d'exemple pour les hôtes de type levure, les différentes souches de Kluvveromvces utilisées ont été transformées en traitant les cellules entières en présence d'acétate de lithium et de polyéthylène glycol, selon la technique décrite par Ito et al. [J. Bacteriol. 153 (1983) 1631. La technique de transformation décrite par Durrens et al [Curr.Genet. 18 (1990) 7] utilisant l'éthylène glycol- et le diméthylsulfoxyde a également été utilisée. Il est aussi possible de transformer les levures par électroporation, selon la méthode décrite par Karube et al. [FEBS Letters 182 (1985) 901. Un protocole alternatif est également décrit en détail dans les exemples qui suivent. Après sélection des cellules transformées, les cellules exprimant lesdits polypeptides sont inoculées et la récupération desdits polypeptides peut être faite, soit au cours de la croissance cellulaire pour les procédés "en continu", soit en fin de croissance pour les cultures "en lots" ("batch"). Les polypeptides qui font l'objet de la présente invention sont ensuite purifiés à partir du surnageant de culture en vue de leur caractérisation moléculaire, pharmacocinétique et biologique. Un système d'expression préféré des polypeptides de l'invention consiste en l'utilisation des levures du genre Kluvveromvces comme cellule hôte, transformées par certains vecteurs dérivés du réplicon extrachromosomique pKDl initialement isolé chez K. marxianus var drosophilarum.Ces levures, et en particulier K. lactis et K. fragilis sont généralement capables de répliquer lesdits vecteurs de façon stable et possèdent en outre l'avantage d'être incluses dans la liste des organismes G.R.A.S. ("Generally Recognized As Sale"). Des levures privilégiées sont préférentiellement des souches industrielles du genre Kluvveromvces capables de répliquer de façon stable lesdits plasmides dérivés du plasmide pKDl et dans lesquels a été inséré un marqueur de sélection ainsi qu'une cassette d'expression permettant la sécrétion à des niveaux élevés des polypeptides de I'invention. La présente invention concerne également les séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides chimères décrits ci-avant, ainsi que les cellules recombinantes, eucaryotes ou procaryotes, comprenant de telles séquences. La présente invention concerne aussi l'application à titre de médicament des polypeptides selon la présente invention. Plus particulièrement, l'invention a pour objet toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs polypeptides tel que décrit ci-avant. Plus particulièrement, ces compositions peuvent être utilisées dans toutes les situations pathologiques dans lesquelles le nombre et/ou l'activité des granulocytes doivent être stimulées. Notamment, elles peuvent être utilisées pour la prévention ou le traitement des leukopénies ou de certaines leucémies, ou dans le cas de greffes ou de traitement anticancéreux, pour renforcer ou restaurer le système immunitaire. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LISTE DES FIGURES Les représentations des plasmides indiquées dans les Figures suivantes ne sont pas traçées à l'échelle et seuls les sites de restriction importants pour la compréhension des clonages réalisés ont été indiqués. Figure 1: Séquence nucléotidique du fragment de restriction HindIII du plasmide pYG1259 (chimère prépro-SAH-G.CSF). Les flèches noires indiquent la fin des régions "pré" et "pro" de la SAH. Les sites de restriction MstII et SstI (sac) sont soulignés. La séquence peptidique provenant du G-CSF est en italique (résidus Thr586 à Pro759, la numérotation des acides aminés corresponds à la protéine chimère mature). Figure 2 : Schématisation des chimères du type SAH-G.CSF (A), du type G.CSF-SAH (B) ou G.CSF-SAH-G.CSF (C). Abréviations utilisées: M/LP, méthionine initiatrice de la traduction, éventuellement suivie d'une séquence signal de sécrétion; SAH, sérum-albumine humaine mature ou un de ses variants; G.CSF, peptide dérivé du G-CSF et ayant une activité identique ou modifiée. La flèche noire indique l'extrémité N-terminale de la protéine mature. Figure 3 : Carte de restriction du plasmide pYGIOS et stratégie de construction des plasmides d'expression des protéines chimères de la présente invention. Abréviations utilisées: P, promoteur transcriptionnel; T, terminateur transcriptionnel; IR, séquences répétées inversées du plasmide pKDI; LPSAH, région "prépro" de la SAH; Apr et Kmr désignent respectivement les gènes de résistance à l'ampicilline (E. coli) et au G418 (levures). Figure 4 : Caractérisation du matériel sécrété après 4 jours de culture (erlenmeyers) de la souche CBS 293.91 transformée par les plasmides pYG1266 (plasmide d'expression d'une chimère du type SAH G.CSF) et pKan707 (plasmide contrôle). Dans cette expérience les résultats des panneaux A, B, et C ont été migrés sur le même gel (SDS-PAGE 8,5%) puis traités séparemment. A, coloration au bleu de coomassie; standard de poids moléculaire (piste 2); surnageant équivalent à 100 ,ul de la culture transformée par les plasmides pKan707 en milieu YPL (piste 1), ou pYG1266 en milieu YPD (piste 3) ou YPL (piste 4). B, caractérisation immunologique du matériel sécrété après utilisation d'anticorps primaires dirigés contre le G-CSF humain: même légende qu'en A à l'exception que des standards biotinilés de poids moléculaire ont été utilisés. C, caractérisation immunologique du matériel sécrété après utilisation d'anticorps primaires dirigés contre l'albumine humaine: surnageant équivalent à 100 ,tl de la culture transformée par les plasmides pKan707 en milieu YPL (piste 1), ou pYG1266 en milieu YPD (piste 2) ou YPL (piste 3). EXEMPLES TECHNIQUES GENERALES DE CLONAGE. Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénolchloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & BR Sons, New York, 1987]. Les enzymes de restriction ont été fournies par New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham et sont utilisées selon les recommandations des fournisseurs. Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de 1'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes est effectué par le fragment de Klenow de 1'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [polyméras e-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-3501 est effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques est effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham. Les transformations de K. lactis avec 1'ADN des plasmides d'expression des protéines de la présente invention sont effectuées par toute technique connue de l'homme de l'art, et dont un exemple est donné dans le texte. Sauf indication contraire, les souches bactériennes utilisées sont E. coli MC1060 (lacIPOZYA, X74, valu, galK, strAr), ou E. coli TGI (lac, proA,B, supE, X, hsdD5 / F'traD36, proA+B+, lacis, lacZ, M15). Les souches de levures utilisées appartiennent aux levures bourgeonnantes et plus particulièrement aux levures du genre Kluyveromyces. Les souche K. lactis MW98-8C (, uraA, arg, , K+, pKD1") et K. lactis CBS 293.91 ont été particulièrement utilisées; un échantillon de la souche MW98-8C a été déposé le 16 Septembre 1988 au Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) à Baarn (Pays Bas) où il a été enregistré sous le numéro CBS 579.88. Les souches de levures transformées par les plasmides d'expression codant pour les protéines de la présente invention sont cultivées en erlenmeyers ou en fermenteurs pilotes de 21 (SETRIC, France) à 28"C en milieu riche (YPD: 1% yeast extract, 2% Bactopeptone, 2% glucose; ou YPL: 1% yeast extract, 2% Bactopeptone, 2% lactose) sous agitation constante. EXEMPLE 1: CONSTRUCTION D'UN FRAGMENT DE RESTRICTION MSTII/HINDIII INCLUANT LA PARTIE MATURE DU G-CSF HUMAIN. Un fragment de restriction MstII-HindIll incluant la forme mature du G-CSF humain est généré, par exemple selon la stratégie suivante: un fragment de restriction mI-HindIII est d'abord obtenu par la technique d'amplification enzymatique PCR en utilisant les oligodéoxynucléotides Sq2291 (5'-CAAGGATCCAAGCTTCAGGGCTGCGCAAGGTGGCGTAG3', le site Hindffi est souligné) et Sq2292 (5'-CGGGGTACCTTAGGCTTAA CCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3', le site BglII est souligné) comme amorce sur le plasmide BBG13 servant comme matrice. Le plasmide BBG13 comporte le gène codant pour la forme B (174 acides aminés) du G CSF mature humain, obtenu auprès de British Bio-technology Limited, Oxford, England.Le produit d'amplification enzymatique d'environ 550 nucléotides est ensuite digéré par les enzymes de restriction KpnI et HindIII et donné dans le vecteur pUCl9 coupé par les mêmes enzymes, ce qui génère le plasmide recombinant pYG1255. Ce plasmide est la source d'un fragment de restriction MstII-HindIII, dont la séquence est incluse dans celle de la Figure 1. Un fragment de restriction MstII-HindE codant pour la même séquence polypeptidique peut également être généré par la technique d'amplification PCR à partir des cDNA correspondants, dont la séquence est connue [Nagata S. et al., EMBO J. 5 (1986) 575-581].Ces cDNA peuvent être isolés par les techniques de l'homme de l'art, par exemple en utilisant le kit distribué par Amersham, à partir d'une lignée cellulaire humaine exprimant le G-CSF, et par exemple la lignée cellulaire CHU-2 qui dérive d'un carcinome humain [Nagata S. et al., Nature 319 (1986) 415-418]. EXEMPLE 2: FUSIONS EN PHASE TRADUCTIONNELLE ENTRE LA SAH ET LE G-CSF HUMAIN. E.2.1. Fusion traductionnelle du type SAH-G.CSF. Le plasmide pYG404 est décrit dans la demande de brevet EP 361 991. Ce plasmide comporte un fragment de restriction HindIII codant pour le gène de la prépro-SAH précédé des 21 nucléotides naturellement présents immédiatement en amont de l'ATG initiateur de traduction du gène PGK de S. cerevisiae. Plus particulièrement, ce fragment comporte un fragment de restriction HindIII-MstII correspondant à la totalité du gène codant pour la prépro-SAH à l'exception des trois acides aminés les plus C-terminaux (résidus Leucine-Glycine-Leucine).La ligature de ce fragment avec le fragment MstII-HindIII du plasmide pYG1255 permet de générer le fragment Hindi du plasmide pYG1259 qui code pour une protéine chimère dans laquelle la forme B du G-CSF mature est positionné par couplage génétique en phase traductionnelle en Cterminal de la molécule de SAH. La séquence nucléotidique de ce fragment de restriction est donnée à la Figure I, ainsi que la séquence polypeptidique de la chimère correspondante. E.2.2. Fusion traductionnelle du type G.CSF-SAH. Dans un mode réalisation particulier, les techniques combinées de mutagénèse dirigée et d'amplification PCR permettent de construire des gènes hybrides codant pour une protéine chimère (Figure 2, panneau B) résultant du couplage traductionnel entre un peptide signal (et par exemple la région prépro de la SAH), une séquence incluant un gène ayant une activité G-CSF, et la forme mature de la SAH ou un de ses variants moléculaires. Ces gènes hybrides sont préférentiellement bordés en 5' de l'ATG initiateur de traduction et en 3' du codon de fin de traduction par des sites de restriction HindIII. E.2.3. Fusion traductionnelle du type G.CSF-SAH-G.CSF. Ces mêmes techniques de mutagénèse dirigée et d'amplification de l'ADN in vitro permettent de construire des gènes hybrides dans lesquelles une séquence codant pour une activité G-CSF est couplée aux extrémités N- et C- terminales de la SAH ou un de ses variants moléculaires (Figure 2, panneau C). Ces gènes hybrides sont préférentiellement bordés en 5' de l'ATG initiateur de traduction et en 3' du codon de fin de traduction par des sites de restriction HindllI. EXEMPLE 3: CONSTRUCTION DES PLASMIDES D'EXPRESSION. Les protéines chimères des exemples précédents peuvent être exprimées dans les levures à partir de promoteurs fonctionnels, régulables ou constitutifs, tels que, par exemple, ceux présents dans les plasmides pYGIOS (promoteur LAC4 de Kluvveromvces lactis), pYGI06 (promoteur PGK de Saccharomvces cerevisiae), pYG536 (promoteur PHOS de S. cerevisiae), ou des promoteur hybrides tels que ceux portés par les plasmides décrits dans la demande de brevet EP 361 991. Par exemple, le fragment de restriction HindIII du plasmide pYG1259 est cloné dans le site de restriction HindIII du plasmide d'expression pYG1OS, ce qui génère le plasmide d'expression pYG1266 (Figure 3). Le plasmide pYGIOS corresponds au plasmide pKan707 décrit dans la demande de brevet EP 361 991 dans lequel le site de restriction HindIII a été détruit par mutagénèse dirigée (oligodeoxynucleotide Sq1053: 5'-GAAATGCATAAGCTCTTGCCATTCTCACCG-3') et dont le fragment SalI-SacI codant pour le gène URA3 a été remplacé par un fragment de restriction SalI-SacI comportant le promoteur LAC4 (sous la forme d'un fragment SalI-HindIII) et le terminateur du gène PGK de S. cerevisiae (sous la forme d'un fragment HindIII-SacI). Le plasmide pYG1OS est mitotiquement très stable en l'absence de généticine (G4218) et permet d'exprimer la protéine chimère à partir du promoteur LAC4 de K. lactis notamment quand la source carbonnée est du lactose. Dans une autre exemplification, le clonage du fragment de restriction HindIII du plasmide pYG1259 dans le site HindIII du plasmide pYG106 génère le plasmide pYG1267. Les plasmides pYG1266 et pYG1267 sont isogéniques entre eux à l'exception du fragment de restriction SalI-HindIII codant pour le promoteur LAC4 de K. lactis (plasmide pYG1266) ou un variant du promoteur PGK de S. cerevisiae (plasmide pYG1267). EXEMPLE 4: TRANSFORMATION DES LEVURES. La transformation des levures appartenant au genre Kluvveromyces, et en particulier les souches MW98-8C et CBS 293.91 de K. lactis s'effectue par exemple par la technique de traitement des cellules entières par de l'acétate de lithium (Ito H. et al., J. Bacteriol. 153 (1983) 163168), adaptée comme suit. La croissance des cellules se fait à 280C dans 50 ml de milieu YPD, avec agitation et jusqu'à une densité optique à 600 nm (D 0600) comprise entre 0,6 et 0,8; les cellules sont récoltées par centrifugation à faible vitesse, lavées dans une solution stérile de TE (10 mM Tris HCl pH 7,4; 1 mM EDTA), resuspendues dans 3-4 ml d'acétate lithium (0,1 M dans du TE) pour obtenir une densité cellulaire d'environ 2 x 108 cellules/ml, puis incubées à 300C pendant 1 heure sous agitation modérée.Des aliquotes de 0,1 ml de la suspension résultante de cellules compétentes sont incubés à 30"C pendant 1 heure en présence d'ADN et à une concentration finale de 35% de polyéthylène glycol (PEG4000, Sigma). Après un choc thermique de 5 minutes à 42"C, les cellules sont lavées 2 fois, resuspendues dans 0,2 ml d'eau stérile et incubées 16 heures à 28"C dans 2 ml de milieu YPD pour permettre l'expression phénotypique de la fusion ORFl-APH exprimée sous contrôle du promoteur Pkl; 200 Ill de la suspension cellulaire sont ensuite étalés sur boites YPD sélectives (G418, 200 ug/ml). Les boites sont mises à incuber à 28"C et les transformants apparaissent après 2 à 3 jours de croissance cellulaire. EXEMPLE 5: SECRETION DES CHIMERES. Après sélection sur milieu riche supplémenté en G418 les clones recombinants sont testés pour leur capacité à sécréter la forme mature des protéines chimères entre SAH et G-CSF. Quelques clones correspondant à la souche K. lactis CBS 293.91 transformée, par exemple, par les plasmides pYG1266 (gène hybride de type prépro-SAH-G.CSF) ou pKan707 (vecteur témoin) sont mis à incuber en milieu liquide complet sélectif à 28 C. Les surnageants cellulaires sont récupérés par centrifugation quand les cellules atteignent la phase stationnaire de croissance, concentrés 10 fois par précipitation pendant 30 minutes à -20 C dans une concentration finale de 60% d'éthanol, puis testés après électrophorèse en gel d'acrylamide à 8.5%, soit directement par coloration du gel d'acrylamide par du bleu de coomassie (Figure 4, panneau A), soit après immunoblot en utilisant comme anticorps primaires des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre le G-CSF (Figure 4, panneau B) ou un sérum polyclonal de lapin dirigé contre l'albumine humaine (Figure 4, panneau C). Lors des expériences de détection immunologique, le filtre de nitrocellulose est d'abord incubé en présence de l'anticorps spécifique, lavé plusieurs fois, incubé en présence d'anticorps de chèvre anti-lapin biotinylés, puis incubé en présence d'un complexe avidine-péroxydase en utilisant le "kit ABC" distribué par Vectastain (Biosys S.A., Compiègne, France). La réaction immunologique est ensuite révélée par addition de diamino-3,3' benzidine tetrachlorydrate (Prolabo) en présence d'eau oxygénée, selon les recommandations du fournisseur.Les résultats de la Figure 4 démontrent que la protéine hybride SAH-G.CSF est reconnue à la fois par des anticorps dirigés contre l'albumine humaine et le G-CSF humain. EXEMPLE 6: PURIFICATION ET CARACTERISATION MOLECULAIRE DES PRODUITS SECRETES. Après précipitation éthanolique du surnageant de culture correspondant à la souche CBS 293.91 transformée par le plasmide pYG1266 par exemple, le culot est resolubilisé dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 8.0; le protéine SAH-G.CSF est alors purifiée par chromatographie d'affinité, par exemple sur Bleu-Trisacryl (IBF). Une purification supplémentaire par chromatographie d'échange d'ions peut être effectuée si nécessaire. Après élution, les fractions contenant la protéine sont réunies, dialysées contre de l'eau et lyophilisées avant caractérisation: le séquençage (Applied Biosystem) de la protéine hybride sécrétée indique la séquence N-terminale attendue de l'albumine (Asp Ala-His...), démontrant une maturation correcte de ladite protéine. REVENDICATIONS I. Polypeptide recombinant comportant une partie active constituée par tout ou partie du G-CSF ou d'un variant du G-CSF couplé à une structure stabilisatrice essentiellement protéique. 2. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que la partie active présente une structure choisie parmi (a) la séquence peptidique comprise entre les résidus Thr586 Pro759 de la séquence donnée sur la Figure 1, (b) une partie de la structure peptidique (a) ayant conservé l'activité biologique du G-CSF, et, (c) une structure dérivée des structures (a) ou (b) par modifications structurales (mutation, substitution, addition et/ou délétion d'un ou plusieurs résidus), et ayant conservé l'activité biologique du G-CSF, ou une activité modifiée. 3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que la partie active est couplée à l'extrémité N-terminale de la structure stabilisatrice. 4. Polypeptide selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisé en ce que la partie active est couplée à l'extrémité C-terminale de la structure stabilisatrice. 5. Polypeptide selon l'une des revendications I à 4 caractérisé en ce que la structure stabilisatrice est un polypeptide possédant une demievie plasmatique élevée. 6. Polypeptide selon la revendication 5 caractérisé en ce que le polypeptide possédant une demie-vie plasmatique élevée est une protéine telle qu'une albumine, une apolipoprotéine, une immunoglobuline ou encore une transferine. 7. Polypeptide selon la revendication 5 caractérisé en ce que le polypeptide possédant une demie-vie plasmatique élevée est dérivé par modification(s) structurale(s) (mutation, substitution, addition et/ou délétion d'un ou plusieurs résidus, modification chimique) d'une protéine selon la revendication 6. 8. Polypeptide selon l'une des revendications 5 à 7 caractérisé en ce que la structure stabilisatrice est un polypeptide faiblement ou nonimmunogénique pour l'organisme dans lequel il est utilisé. 9. Polypeptide selon la revendication 5 caractérisé en ce que la structure stabilisatrice est une albumine ou un variant de l'albumine. 10. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 11. Séquence nucléotidique selon la revendication 10 caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence "leader" permettant la sécrétion du polypeptide exprimé. 12. Cassette d'expression comprenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 10 ou 11 sous le contrôle d'une région d'initiation de la transcription et éventuellement d'une région de terminaison de la transcription. 13. Plasmide autoréplicatif comportant une cassette d'expression selon la revendication 12. 14. Cellule recombinante eucaryote ou procaryote dans laquelle a été inséré une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 10 ou Il ou une cassette d'expression selon la revendication 12 ou un plasmide selon la revendication 13. 15. Cellule recombinante selon la revendication 14 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure, d'une cellule animale, d'un champignon ou d'une bactérie. 16. Cellule recombinante selon la revendication 15 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure. 17. Cellule recombinante selon la revendication 16 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure du genre Saccharomyces ou Kluyveromyces. 18. Procédé de préparation d'un polypeptide tel que défini dans l'une des revendications I à 9 caractérisé en ce que l'on cultive une cellule recombinante selon l'une des revendications 14 à 17 dans des conditions d'expression, et on récupère le polypeptide produit. 19. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 20. Composition pharmaceutique selon la revendication 19 destinée à être utilisée dans toutes les situations pathologiques dans lesquelles le nombre et/ou l'activité des granulocytes doivent être stimulées. 21. Composition pharmaceutique selon la revendication 20 destinée à la prévention ou au traitement des leukopénies ou de certaines leucémies. 22. Composition pharmaceutique selon la revendication 20 utilisable dans le cas de greffes ou de traitement anticancéreux, pour restaurer le système immunitaire.