FR 2680174 A1 19930212 FR 9109941 A 19910805 NOUVEAUX COMPOSES PEPTIDIQUES, INHIBITEURS DE L'ADSORPTION DU HIV SUR SES CELLULES CIBLES La présente invention est relative à une nouvelle classe de produits chimiques ayant une activité antivirale et en particulier une activité inhibant la fixation du virus VIH. Ces nouveaux composés peptidiques inhibiteurs de la fixation du virus HIV-1 sur des cellules d'une lignée lymphoblastoïde humaine sont décrits ci-après. Les applications thérapeutiques desdits produits inhibiteurs font partie de la présente invention. Les virus HIV ont été décrits par F. Barré-Sinoussi et al. (Science, 1983, 220, 868:871) et par Clavel et al. (Science, 1986, 233, 343:346). Dans le présent document, on utilisera indifféremment les termes "VIH" ou "HIV" pour désigner ces virus. Dans la propagation de l'infection rétrovirale, l'adsorption du virus sur la membrane cellulaire représente une étape préliminaire qui dépend de la liaison de la glycoprotéine virale Gel20 au récepteur cellulaire CD4 présent dans certains groupes de lymphocytes T et de cellules du système immunitaire. L'inhibition de ce phénomène peut donc constituer une cible intéressante pour la chimiothéråpie antivirale. Plusieurs substances douées de propriétés -inhibitrices envers l'infection à VIH (héparine, polysulfate de pentosan, sulfate de dextran, PVAS et PAVAS) et certains peptides courts et hydrophobes (Pro-Phe) ont récemment été décrits pour des propriétés semblables (Finberg et al., Science, 1990, 249, 287:291). Nous avons constaté que la substance "P" ou des peptides, acylpeptides, peptide esters et peptides amides C-terminaux, analogues de la partie N-terminale et hydrophile de la Substance P Arg-Pro-Lys-Pro-OH ont une activité inhibitrice sur la liaison du virus HIV-1 avec la surface de cellules lymphoblastoïdes humaines. A titre d'exemple, la substance P a été décrite dans J. Physiology, 1931, 72, 74:87 par Von Euler et Gaddum puis caractérisée par Chang et al. (J. Biol. Chem., 1970, 245, 4784) Les peptides préférés selon l'invention répondent à la formule générale A-Arg-Pro-Lys-Pro-R A = Boc, H, CH3-CO-, CH3-(CH2)m-CO- ; m =2,4,6,10 Boc = terbutyloxycarbonyl R = -OH, -OCH3, -NH-(CH2)n-CH3 ; n = 3, 5, 7, 11 Il s'agit notamment des produits P1, P2, P3, P4 et P5 suivants P1 = H-Arg-Pro-Lys -Pro-OH P2 = H-Arg-Pro-Lys-Pro-OCH3 P3 = CH3-(CH2)10- CO -Arg-Pro-Lys-Pro-OCH3 P4 = H-Arg-Pro-Lys-Pro-NH-(CH2) l--CH3 P5=CH3-(CH2)10-CO-Arg-Pro-Lys-Pro-OH produits nouveaux dont les activités inhibitrices ont été évaluées en utilisant des tests de screening in vitro de substances à activité antivirale. La Figure 1 représente la formule développée des dérivés décrits. I - SYNTHESE DES DERIVES PEPTIDIQUES 1) Schéma des svnthèses a La Boc Proline méthylester ou Boc Proline alkylamide est déprotégée par l'acide trifluoracétique à 40% dans le dichlorométhane à 25 C. La déprotection est suivie par chromatographie sur couche mince (plaques de silice Merck, solvant:méthano Vchlo roforme 1/9 volume). Le couplage avec la N&alpha; Boc-L- (w carbobenzoxy) lysine est effectué à -15 C en présence de N-methylmorpholine, le dérivé proline étant en léger excès (M. Bodanszky et A. Bodanszky - In : "The Practice of Peptide Synthesis" : Springer Verlag Berlin, 1984, p. 109:110). L'agent de couplage est le chloroformiate d'isobutyle. Le dipeptide formé : Boc Lys (Z)-Pro-R est ensuite déprotégé sur la partie N-terminale par l'acide trifluoracétique à 40%. Ce processus est répété jusqu'à l'obtention du tétrapaptide A-Arg-Pro Lys-Pro-R, lequel est finalement déprotégé sur les chaînes latérales par l'acide fluorhydrique anhydre (voir Bodanszky p. 174). * La purification est faite par chromatographie sur gel et chromatographie en phase inverse à haute performance (HPLC) sur silice gréffée. L'absence de racémisation est vérifiée par couplage de l'hydrolysat avec le réactif de Marfey et HPLC. Les critères de pureté sont HPLC, spectométrie de masse (FAB), RMN et analyse d'acides aminés. * Les pseudopeptides ont été synthétisés dans le but d'éviter la dégradation par les protéases et de modifier la structure de la séquence peptidique de référence (Arg-Pro-Lys-Pro). A-Ar-Pro-v(CH2-NH)-Lys-Pro-R A = Boc-, H-, CH3-CO-, CH3-(CH2)m-CO-; m =2,4,6,10 R = -OH -OCH3, -NH-(CH2)n-CH3; n = 3, 5, 7, 11 Ces pseudopeptides ont été synthétisés par élongation de chaîne comme les peptides homologues correspondants. La liaison méthylène amino -V(CH2-NH)-, liaison peptidique réduite est obtenue par condensation selon la méthode de Sasaki et Coy (Peptides, 1989, 8, 119:121). Ainsi, on condense un Boc-aminoaldéhyde avec la fonction amine d'un acide aminé ou d'un peptide. La base de Schiff formée intermédiairement est réduite in situ par le cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN). Les critères de pureté sont là encore définis par HPLC, spectrométrie de masse (FAB), RMN et analyse d'acides aminés. La formule développée des dérivés décrits est présenté sur le schéma n"l. L'activité inhibitrice de ces composés peptidiques sur la fixation du virus HIV-1 sur ces cellules cibles a été évaluée selon le procédé suivant. II - ETUDE DE L'INHIBITION DE L'ADSORPTION DU HIV A LA SURFACE DES CELLULES-CIBLES PAR UNE ANALYSE EN CYTOMETRIE DE FLUX A - MATERIEL UTILISE POUR CETTE ETUDE 1) Les molécules testées Les peptides P1, P2, P3, P4 et P5 ont été synthétisés selon le procédé de synthèse décrit ci-dessus. Ces produits ont été dissous dans l'eau, conservés et congelés à -20"C. 2) Le virus HIV-I Le virus HIV (souche LAV-1) a été produit sur des cellules lymphoblastoïdes T infectées (lignée CEM-LAV-1). Tous les 3 ou 4 jours, les cellules sont centrifugées, resuspendues dans du nouveau milieu et mélangées à 50% avec des CEM non infectées à la concentration finale de 0,5.106 cellules par millilitre. Le virus présent dans le surnageant a été concentré 150 fois par une précipitation avec 10% de polyéthylène glycol pendant 24 heures à 4"C. Après centrifugation à 5 000 rpm pendant 30 mn, le culot a été resuspendu dans un tampon NTE (pH 8) (NaCl 0,1M, Tris 0,01M, EDTA 0,0001M), déposé sur un coussin de sucrose 30-40% et centrifugé une heure à 26 000 rpm (Rotor Kontron TST 28-38). Le virus purifié a été récupéré. dilué dans du tampon NTE (pH 8) puis concentré par centrifugation à 26 000 rpm pendant 1 heure. Le culot a été resuspendu dans le tampon NTE, aliquoté et stocké à -80"C. Le virus HIV-1 utilisé pour cette étude a un titre supérieur à 108 UI/ml (UI : Unité Infectieuse) pour les cellules MT4 et un titre de 109 cpm/ml en dosage de transcriptase inverse. 3) Les cellules Sup T1 (Smith et al., Cancer Research, 1984, 44 5657:5660) Il s'agit d'une lignée continue de cellules lymphoblastoïdes humaines. Ces cellules sont cultivées en milieu RPMI 1640 10% SVF (Flow), 1% PSN (pénicilline, streptomycine, néomycine (GIBCO), 1% glutamine (GIBCO)). A) Les anticorps a) Anti-CP 110 (anti glycoprotéine d'enveloppe du VIH-1) Cet anticorps a été produit par Genetic System, il est utilisé au 100ème dans une solution de PBS, BSA 1%, Azide 0,1% (PBA). b) Anti-souris biotinylé: Cet anticorps est commercialisé par la Société Amersham (Réf. RN 1001). I1 est utilisé et dilué au 25ème dans la solution PBA. La révélation de cet anticorps est obtenue par la streptavidine phycoérytllrine (Becton Dickson). B) METHODE D'ETUDE DE LA FIXATION DU VIRUS HIV-1 A SA CELLULE-CIBLE Cette mthode a été décrite par Mac Dougal et al., Journal of Immunoiogy, 1986 137, 2937:2944). Les cellules SupT1 (5.105 cellules) ont été lavées deux fois dans la solution PBA et- incubées -indi5iduellement avec 10-6 M de chaque produit P1, P2, P3, P4 et P5 respectivement (échantillons 11, 12. 13, 9a et l0a) pendant 30 mn à 37 C, puis 1 ,ug de virus HIV-1 concentré a été ajouté et l'ensemble a été maintenu à 37 C pendant 30 mn. Les cellules ont été incubées avec l'anticorps anti-GP110 puis avec l'anticorps anti-souris biotinylé et finalement avec la Streptavidine phycoérythrine. Chaque incubation se fait à 4 C pendant 30 mm et les cellules sont lavées 2 fois avec la solution PBA. après chacune de ces étapes. Préalablement à l'analyse au cytofluorographe (Ortho), les cellules ont été resuspendues dans la solution PBA additionnée de 1% formol. Pour ces expériences, plusieurs contrôles ont été réalisés * Contrôles positifs - Contrôle de la fixation du virus HIV-I et du système de révélation Les cellules ont été incubées avec le virus HIV-1, puis respectivement avec l'anti-GP110, l'anti-souris biotinylé et la streptavidine phycoérythrine (échantillon I et la). - Contrôle du blocage de la fixation du virus HIV-1 avec l'aiiticorps OKT4a (Ortho Diagnostics) Les cellules ont été incubées avec l'anticorps OKT4a, puis respectivement avec le virus HIV-1, 1'anti-GP110, l'anti-souris biotinylé et la streptavidine phycoérythrine (échantillons 2 et 2a). k Contrôles négatifs Les cellules ont été incubées avec du milieu, puis respectivement avec l'anti-GPl 10, l'anti-souris biotinylé et la streptavidine phycoérythrine (échantillons 3 et 3a). Les cellules ont été incubées avec chacun des produits individuellement, puis successivement avec du milieu, de l'anti GP110, de l'anti-souris biotinylé et de la streptavidine phycoérythrine (échantillons 4, 5, 6 et 4a, 5a). - Contrôle de la présence de la molécule CD4 Les cellules ont été incubées avec l'anticorps OKT4a puis un antisouris fluorescent (échantillons 6a et 7). - Controle de l'effet des substances sur la fixation de l'anticorps OKT4a sur la molécule CD4 (échantillons 8, 9, 10 et 7a, 8a). C - RESULTATS Le Tableau I présente les résultats de l'analyse au cytofluorographe des échantillons P1, P2 et P3. Dans nos conditions expérimentales 53% des cellules fixant le virus HIV-1 sont détectées (échantillon 1). Lorsque la fixation du virus HIV-1 est bloquée par la préincubation des cellules avec l'anticorps anti-CD4 (OKT4a) seulement 1% de cellules fluorescentes sont détectables (échantillon 2). Les produits Pi, P2 et P3 ne modifient pas la fixation de l'anticorps OKT4a sur les cellules SupT1. Le prétraitement des cellules avec les produits permet une diminution significative de la fixation du virus HIV-1 avec les produits P1 et P3 (respectivement échantillons il et 13) et un blocage total de la fixation avec le produit P2 (échantillon 12). Le Tableau II montre les résultats obtenus avec les produits P4 et P5. Les différents témoins présentent les mêmes observations que précédemment décrites pour les produits P1, P2 et P3. Les prétraitements des cellules avec les produits P4 et P5 montrent une diminution de la fixation du virus HIV-1 (échantillons 9 et 10) comparativement à la fixation du virus HIV-1 sur ces cellules non traitées (échantillon la). III - CONCLUSIONS Dans ces conditions expérimentales, cinq produits étudiés modifient la fixation du virus HIV-1 sur les cellules SupT1. A la concentration de 10-6M, les produits ci-après conduisent au blocage de la fixation du virus dans les rapports suivants: Formule inhibition P1 = H-Arg-Pro-Lys-Pro-OH 89 P2 = H-Arg-Pro-Lys-Pro-OCH3 96 P3 = CH3-(CH2)10-CO-Arg-Pro-Lys-Pro-OCH3 89 P4 = H-Arg-Pro-Lys-Pro-NH-(CH2)1 1-CH3 85 P5 = CH3-(CH2)10-CO- Arg-Pro-Lys-Pro-OH 80 La présente invention couvre également les dérivés de ces substances et en particulier des dérivés non hydrolysables par modification notamment des liaisons peptidiques, si ces dérivés conservent une activité inhibitrice équivalente aux produits d'origine. TABLEAU I Analyse au cytofluographe des échantillons Pl, P2 et P3 ECHANTILLONS Nomenclature Pourcentage de cellules utilisée fluorescentes * Témoins positifs: =Cellules puis virus HIV-1 puis anti-CP110 puis anti-souris 1 53% biotinylé puis streptavidine phycoérythrine = Cellules puis OKT puis virus IIIV-l puis anti-CP110 puis 2 1% anti-souris biotynylé puis streptavidine phycoérythrine *Témoins négatifs: : = Cellules puis milieu anti-GP110 puis 3 2% anti-souris biotinylé puis streptavidine phycoérythrine = Cellules puis produit puis milieu puis anti-GPI 1 10 puis anti-souris biotinylé puis streptavidine phycoérythrine Produit P1 4 1% Produit P2 5 1% Produit P3 6 1% * Contrôle de la molécule CD+ =Cellules puis anticorps OKT4a puis anti-souris 7 99% fluorescent = Cellules puis produit puis anticorps OKT4a puis anti-souris fluorescent Produit P1 8 98% Produit P2 9 98% Produit P3 10 96% *Expérience:: = Cellules puis produit puis virus HIV-1 puis anti-GP110 puis anti-souris biotinylé puis streptavidine pheycoérythrine Produit P1 11 11% Produit P2 12 4% Produit P3 13 11% TABLEAU II Analyse au cytofluographe des échantillons P4 et P5 ECHANTILLONS Nomenclature Pourcentage de cellules utilisée fluorescentes * Témoins positifs: = Cellules puis virus HIV-1 puis anti-GP110 puis anti-souris 1a 53,41% biotinylé puis streptavidine phycoérythrine = Cellules puis OKT4a puis virus HIV-1 anti-GP110 puis 2a 8,57% anti-souris biotinylé puis streptavidine phycoérythrine * Témoins négatifs: : = Cellules puis milieu puis anti-GP110 puis 3a 10,47% anti-souris biotinylé puis streptavidine phycoérythrine = Cellules puis produit puis milieu puis anti-C,PI 10 puis anti-souris biotinylé puis streptavidine phycoérythrin Produit P4 4a NT* Produit PS Sa NT* * Contrôle de la molécule CD4: = Cellules puis anticorps OKT4a puis anti-souris 6a 95,5% fluorescent = Cellules puis produit puis OKT4a puis anti-souris fluorescent Produit P4 7a 89,28% Produit P5 8a 92,20% * Expérience: = Cellules puis produits puis virus HIV-1 puis anti-GP110 puis anti-souris biotinylé puis streptavidine phycoérythrine Produit P4 9a 19,43% Produit P5 10a 15,15% NT*: non testés. R E V E N D I C A T I O N S 1/ Nouvelles substances inhibitrices d'une infection à VIH de formule générale A-Arg-Pro-Lys-Pro-R - dans laquelle A désigne Lin groupe choisi parmi: Boc-, H-, CH3-CO-, CH3-(CH2)m-CO- avec m = 2. 4 6, 10. -dans laquelle R représente un groupe choisi parmi -OH, -OCH3, NH-(CH2)n-CH3 avec n = 3,5, 5, 7, Il. 2/ Nouvelles substances inhibitrices de la fixation du virus HIV-1 sur une lignée continue de cellules lymphoblastoïdes humaines, substances caractérisées par la séquence peptide et/ou pseudo-peptidique : Arg-Pro Lys-Pro. 3/ Utilisation des produits de l'invention, selon les revendications 1 et 2, pour la préparation d'un médicament.