FR 2685004 A1 19930618 FR 9115389 A 19911211 La présente invention a pour objet un procédé de génération d'une diversité structurale ou fonctionnelle dans une séquence peptidique par introduction d'insertions ou délétions de nucléotides dans la séquence nucléotidique codant pour ladite séquence peptidique La présente invention est d'autre part relative à des compositions pharmaceutiques , à des médicaments ou à des réactifs de diagnostic contenant des protéines ou peptides obtenus par ce procédé Les gènes matures codant pour les chaînes composant les immunoglobulines et les récepteurs des cellules T sont assemblés précocement lors du développement des lymphocytes à partir de segments de gènes dits de variabilité ( V ) , de soudure , ou de jonction ( J ) , et dans certains cas de diversité (D) Sept loci sont susceptibles d'être réarrangés par recombinaison de ces fragments Les séquences des signaux de recombinaison ( RSS adjacentes à chaque gêne fournissent les cibles pour la recombinaison . Ces séquences sont composées d'un heptamère palindromique et d'un nonamère riche en adénosine et en thymidine , séparées par une séquence de 12 ou de 23 paires de base . Les réarrangements s'opèrent entre des RSS avec des séquences de séparation de différentes longueurs Deux types de jonction ou soudure sont formés durant la recombinaison : des jonctions codantes créées par la juxtaposition de segments de gènes et des jonctions non codantes formées par des RSS contiguës.Dans ce dernier cas les heptamères sont généralement joints sans insertions de nucléotide ou sans délétions . Les jonctions codantes sont quant à elles sujettes à des modifications importantes Les variations dans les jonctions au cours du réarrangement des segments de gènes codant pour les immunoglobulines constituent une grande source de diversité Plusieurs nucléotides peuvent ainsi être éliminés et deux types d'insertion peuvent être trouvés L'addition de nucléotides de manière aléatoire résulte dans l'insertion de régions dites régions N sur les chaînes lourdes des immunoglobulines . Il a été émis l'hypothèse ( Randau et al ., Molecular and Cellular Biology 1987 , 3.237-3.243 ; que la désoxynucléotidyle transférase (TdT ) est responsable de cette addition aléatoire de nucléotides Les insertions de nucléotides de type P correspondent à la répétition inverse des séquences adjacentes à celles des séquences codantes . On a émis l'hypothèse que leur addition correspond à une étape obligatoire du mécanisme de recombinaison Des expériences de transfection à l'aide d'ADN génomique ont permis d'isoler deux gènes intervenant de manière active dans la recombinaison : les gènes Rag-l et Rag2 ( Oettinger et al. , Science , Volume 248, 1517-1523, 1990). Il a été montré que les gènes Rag-l et Rag-2 sont responsables de la recombinaison site-spécifique Néanmoins, la combinaison des produits des gènes Rag-1 et Rag-2 ne permet pas de reconstituer la diversité des anticorps trouvés in vivo , c'est- -dire ne permet pas de rajouter des séquences N Diverses méthodes ont été mises au point pour tenter de modifier les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines ou des récepteurs. Le brevet EP-368.684 concerne une méthode de clonage des séquences nucléotidiques correspondant aux domaines variables des molécules de la famille des immunoglobulines Cette méthode consiste à fabriquer un ADN complémentaire du domaine variable de l'immunoglobuline Le brevet EP-328.444 quant à lui est relatif à une méthode de modification de la structure d'un anticorps tout en conservant sa spécificité fonctionnelle . Ainsi , des domaines constants notamment sont modifiés par une manipulation classique du génie génétique A la connaissance du demandeur , il n'existe pas de méthode permettant d'obtenir de manière efficace des immunoglobulines modifiées dans leurs structures , et ce avec une grande diversité dans les modifications. Le demandeur s'est donc attaché à la mise en évidence des mécanismes de recombinaison qui permettent à l'organisme d'obtenir une grande diversité dans les immunoglobulines tels que les IgG, les IgM, les IgA, les IgE, et dans les récepteurs des cellules lymphoïdes . Le demandeur s'est aussi attaché à la mise au point d'une méthode générale permettant d'obtenir de manière aléatoire une gamme très diversifiée de mutations , en particulier par insertion aléatoire, dans la séquence nucléotidique correspondant à des protéines, de structures et de fonctions diverses Le demandeur a ainsi montré de manière surprenante que la combinaison des produits d'expression des gènes Rag-l et Rag-2 permet d'obtenir une recombinaison site-spécifique et que l'introduction de la TdT entraîne une diversité de jonction entre les séquences DJ et VDJ équivalentes à celles trouvées in vivo. Le demandeur a d'autre part mis en évidence que l'on pouvait en utilisant les produits de Rag-l et Rag-2 ainsi que la terminale désoxynucléotidyle transférase , obtenir in vitro, la production d'anticorps présentant des réarrangements et qui statistiquement, présentent une grande diversité tant structurelle que fonctionnelle La présente invention a donc pour objet une composition contenant en combinaison dans des quantités synergiques les produits d'expression des gènes Rag-1 et Rag-2 et une terminale désoxynucléotidyle transférase ou un ou plusieurs de leurs fragments biologiquement actifs Elle a d'autre part pour objet une composition contenant des séquences nucléotidiques portant les gènes Rag-l et Rag-2 ou des gènes conduisant à la synthèse de fragments ou de dérivés biologiquement actifs des produits des gènes Rag-l et Rag-2 et le gène codant pour la TdT ou un de ses fragments ou dérivés biologiquement actifs , dans laquelle avantageusement les séquences nucléotidiques sont portées par des vecteurs. Elle est en outre relative à une composition comprenant les plasmides p Blue Rec (Kallenbach et al., Nucléic Acid Research ( 18, 6730, 1990) , p Rag-1 et p Rag-2 (Oettinger et al, précédemment cité ). La présente invention a aussi pour objet - un procédé de génération d'une diversité structurale ou fonctionnelle dans une séquence peptidique par délétions ou insertions aléatoires de nucléotides dans une séquence nucléotidique codant pour cette séquence peptidique ledit procédé comprenant la transfection d'une préparation cellulaire par un ou plusieurs vecteurs permettant l'expression des produits des gènes Rag-l, Rag-2 et de la terminale déso- xynucléotidyle transférase ( TdT ) ou de leurs dérivés et par un vecteur identique ou différent portant ladite séquence nucléotidique bordée par une ou plusieurs séquences de recombinaison RSS ou bordée par un ou plusieurs dérivés biologiquement actifs des séquences RSS. - procédé de génération d'une diversité structurale ou fonctionnelle dans une séquence peptidique par délétions ou insertions aléatoires de nucléotides dans une séquence nucléotidique codant pour cette séquence peptidique, ledit procédé comprenant la transfection d'une préparation cellulaire par un vecteur portant ladite séquence nucléotidique bordée par une ou plusieurs séquences de recombinaison RSS ou bordée par un ou plusieurs dérivés biologiquement actifs des séquences RSS , puis dans une seconde étape par un ou plusieurs vecteurs identiques ou différents permettant l'expression des produits des gènes Rag1 , Rag-2 et de la terminale désoxynucléotidyle transférase ou de leurs dérivés . - procédé de génération d'une diversité structurale ou fonctionnelle dans une séquence peptidique par introduction dans la séquence nucléotidique correspondant à cette séquence peptidique d'insertions ou de délétions résultant de la répétition inverse de séquences adjacentes à des séquences de recombinaison RSS ledit procédé comprenant la transfection d'une préparation cellulaire par un ou plusieurs vecteurs permettant l'expression des produits des gènes Rag-l et Rag-2 ou de leurs dérivés et par un vecteur identique ou différent portant ladite séquence nucléotidique bordée par une ou plusieurs séquences RSS ou par un ou plusieurs dérivés biologiquement actifs des séquences RSS - procédé de génération d'une diversité structurale ou fonctionnelle dans une séquence peptidique par introduction dans la séquence nucléotidique correspondant à cette séquence peptidique d'insertions ou de délétions résultant de la répétition inverse de séquences adjacentes à des séquences de recombinaison RSS , ledit procédé comprenant la transfection d'une préparation cellulaire par un vecteur portant ladite séquence nucléotidique bordée par une ou plusieurs séquences RSS ou par un ou plusieurs dérivés biologiquement actifs des séquences RSS , puis dans une seconde étape par un ou plusieurs vecteurs identiques ou différents permettant l'expression des produits des gènes Rag-1 et Rag-2 ou de leurs dérivés De tels procédés permettent ainsi d'introduire des insertions et des délétions dans des séquences nucléotidiques, de manière aléatoire . Ces modifications de séquences permettent ainsi d'accroître à volonté la diversité biologique. De telles méthodes sont notamment des substituts intéressants aux méthodes traditionnelles de mutagénèse et aux méthodes d'obtention d'anticorps monoclonaux par les hybridomes. La possibilité d'obtenir des anticorps monoclonaux par une autre méthode que celle des hybridomes est avantageuse en thérapeutique humaine car les préparations d'anticorps obtenues selon l'invention sont pures On rappelle que l'on entend par séquences N des insertions aléatoires de nucléotides , c'est- -dire qui ne sont pas des répliques de séquences préexistantes au voisinage des RSS. Ces séquences N sont donc créées au hasard et de ce fait présentent une très grande diversité, qui n'est pas dépendante de la séquence nucléotidique au voisinage des RSS. Les séquences P sont par contre des insertions résultant de la répétition inverse des séquences adjacentes aux RSS. De ce fait , elles présentent une moins grande diversité que les régions N. Avantageusement , le ou les vecteurs recombinés portant la séquence nucléotidique correspondant à la séquence peptidique sont transférés dans des bactéries afin de sélectionner les protéines ou les peptides présentant la structure et/ou la fonction souhaitée. Il est à noter qu'il est nécessaire de choisir des vecteurs d'expression des protéines ou peptides adaptés aux cellules, eucaryotes ou procaryotes, utilisées . On peut ainsi utiliser les plasmides pcDNAI ( commercialisé par In Vitrogen) ou pRc/CMV (commercialisé par In Vitrogen) pour les cellules eucaryotes ou le plasmide pBlue Script. (commercialisé par Stratagen). La présente invention est d'autre part relative à une mise en oeuvre préférentielle du procédé pour l'obtention d'immunoglobulines , en particulier d'anticorps présentant une grande diversité structurelle et fonctionnelle par réarrangements séparés des chaînes légères et lourdes composant les immunoglobulines et co-expression dans une même cellule des deux chaînes Ainsi , ce mode de mise en oeuvre préférentiel permet d'obtenir une grande quantité de cellules exprimant diverses séquences des deux chaînes des immunoglobulines . Une étape ultérieure permet la sélection de l'immunoglobuline spécifique d'un agent pathogène donné par exemple. Avantageusement, la séquence correspondant aux chaînes lourdes utilisées ne comprend que la partie Fab. de ces chaînes . La partie Fc est rajoutée ultérieurement. De manière préférentielle , le réarrangement des chaînes légères est effectué en présence des séquences nucléotidiques des gènes Rag-l et Rag-2 ou de gènes conduisant à la synthèse de dérivés ou de fragments biologiquement actifs des produits de Rag-1 et Rag-2 et le réarrangement des chaînes lourdes est effectué en présence des séquences nucléotidiques des gènes Rag-l et Rag-2 et du gène de la terminale désoxynucléotidyle transférase ou de gènes conduisant à la synthèse de dérivés ou de fragments biologiquement actifs de Rag-l , Rag-2 ou de la TdT. Pour obtenir l'expression des chaînes lourdes des immunoglobulines en utilisera des vecteurs portant les segments V, D et J tandis que pour les chaînes légères les vecteurs porteront les séquences V et J. La présente invention est en outre relative à un procédé pour l'obtention de récepteurs des cellules lymphoïdes, et en particulier des cellules T, présentant une grande diversité structurale et fonctionnelle par réarrangement des chaînes alpha, bêta, gamma et/ou delta des récepteurs des cellules T Elle a de plus pour objet un procédé , comprenant les étapes de a) transfection d'une préparation cellulaire par un ou plusieurs vecteurs portant une séquence nucléotidique codant pour la séquence peptidique dont on veut obtenir la variabilité et par un ou plusieurs vecteurs identiques ou différents permettant l'expression des gènes Rag-1 et Rag-2 ou l'expression des gènes Rag-1, Rag-2 et de la TdT;; b) isolement de l'ADN des vecteurs des préparations cellulaires c) élimination des vecteurs n'ayant pas subi de recombinaison d) transformation d'hâtes cellulaires par les vecteurs résultant de l'étape c) , et e) sélection des hôtes cellulaires exprimant les molécules présentant la structure et/ou la fonction recherchée. De manière avantageuse , ce procédé comprend les étapes de a) co-transfection d'une préparation cellulaire par un ou plusieurs vecteurs portant des gènes codant pour des chaînes légères non réarrangées et par un ou plusieurs vecteurs exprimant des gènes codant pour Rag-1 et Rag-2 r leurs dérivés et/ou leurs fragments , et b) co-transfection d'une autre préparation cellulaire par un ou plusieurs vecteurs portant des gènes codant pour des chaînes lourdes non réarrangées et par un ou plusieurs vecteurs exprimant le gêne de la terminale désoxynucléotidyle transférase ainsi que des gènes codant pour Rag-l et Rag-2 c) isolement de l'ADN des vecteurs des deux préparations cellulaires d) élimination des vecteurs n'ayant pas subi de recombinaison e) transformation d'au moins deux cultures bactériennes respectivement par les préparations de vecteurs obtenus à l'étape d) , amplification et préparation des ADN des vecteurs bactériens , f) mise en place sur un même vecteur des gènes codants pour les chaînes lourdes et légères , g) transformation d'hôtes cellulaires par le vecteur obtenu à l'étape f) , et h) sélection des hôtes cellulaires exprimant des molécules immunoglobulines complètes On appelle hôtes cellulaires toutes bactéries ou cellules eucaryotes pouvant être transformées ou transfectées. On appelle, dans la présente demande , vecteur, toute molécule d'ADN autoréplicative et pouvant être transférée d'une cellule à une autre . On utilise préférentiellement des plasmides dans les étapes a à h mais tout autre vecteur compatible avec les systèmes cellulaires et bactériens employés peut être avantageusement utilise Les vecteurs obtenus à l'étape c) et n'ayant pas subi de recombinaison sont avantageusement éliminés par digestion enzymatique à un site spécifiquement reconnu par une endonucléase de restriction Les cellules préférentiellement utilisées dans les étapes a) et b) sont des fibroblastes ou des cellules lymphoïdes , ou tout autre type cellulaire ou lignée de cellules eucaryotes Il est à noter que les vecteurs utilisés contiennent de préférence , la région précoce de polyome afin de permettre leur réplication à l'état autonome dans des cellules eucaryotes La sélection des bactéries à l'étape h) est avantageusement effectuée par réplique sur filtre des colonies bactériennes obtenues par étalement des bactéries sur boîtes de Pétri et criblage ultérieur [ " Molecular cloning ;; a Laboratory Manual " ( Sambrok et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989)] avec des antigènes pour lesquels l'on veut obtenir des anticorps spécifiques On note de plus, que les vecteurs exprimant les anticorps ou les récepteurs des cellules lymphoïdes recherchés peuvent être modifiés ultérieurement de façon à permettre l'expression d'immunoglobulines complètes dans des cellules eucaryotes et en particulier de façon à permettre leur glycosylation Les modes de mise en oeuvre des étapes a) à h') sont à la portée de l'homme du métier .On peut de manière générale, se référer au " Molecular cloning; a Laboratory Manual" ( Sambrok et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York , 1989 Des mises de modes en oeuvre pratiques de ces étapes sont aussi décrites dans l'article de Huse et al. ( Science volume 246, 1275-1281, 1989 ). Notamment , le vecteur utilisé dans l'étape a) peut être le plasmide p Blue Script contenant une cassette du type fragment EcoRI- NotI de lambda Lcl décrit dans cet article dans lequel sont insérés un segment V et un segment J fusionné à la région constante de la chaîne légère . Les segments VL et JL sont bordés par leurs séquences signal de recombinaison. Le vecteur utilisé pour la co-transformation de l'étape b) peut être le plasmide p Blue Script contenant une cassette du type fragment NotI-EcoRI de lambda Hc2 décrit dans cet article dans lequel sont insérés un segment V, un segment D et un segment J fusionné à la région CHî de la chaîne lourde. Les segments VH, DH, et JH sont bordés par leurs séquences signal de recombinaison. Les vecteurs d'expression des gènes Rag-l et Rag-2 utilisés dans les étapes a) et b) peuvent être ceux décrits par Oettinger et al. ( Science, 248, 1517-1523, 1990 ). Le vecteur de clonage portant le gène codant pour la terminale désoxynucléotidyle transférase peut être en particulier le plasmide pMTdT qui est un pcDNAII dans lequel a été inséré 1'ADN complémentaire de la terminale désoxyribonucléotide transférase de souris Ce plasmide qui a été déposé le 10 Décembre 1991 auprès de la Collection Nationale de Culture des Microorganismes de l'institut Pasteur sous le n I 1160 est un autre objet de la présente demande. L'article de Huse et al. précédemment cité mentionne d'autre part plus particulièrement des modes de mise en oeuvre pratiques qui peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention En particulier , les vecteurs utilisés dans les étapes a) et b) peuvent être obtenus à partir d'une librairie construite comme décrit dans cet article Cette librairie peut être obtenue en clonant les fragments des chaînes légères et lourdes dans respectivement les vecteurs issus du phage lambda , lambda Lcl et lambda Hc2. Ces vecteurs qui servent au clonage dans l'étape initiale de la construction de la librairie peuvent être excisés et donner naissance à un plasmide contenant des morceaux d'oligonucléotides correspondant aux chaînes lourdes et légères. Ces vecteurs contiennent divers sites de restriction, et une séquence codante pour le peptide leader du gène bactérien PelB qui a été précédemment utilisé avec succès dans E. coli pour secréter des fragments Fab , un site de liaison des ribosomes , et sur le vecteur lambda Hc2 une séquence correspondant au décapeptide tag situé à l'extrémité C terminale de l'insertion de la chaîne lourde . Le peptide tag permet la purification des produits d'expression par passage sur des colonnes d'immuno-affinite L'ADN à la base de la fabrication de la librairie des chaînes lourdes est préférentiellement de l'ADN humain afin de minimiser les risques de rejet par l'organisme dans le cas d'utilisation de ces anticorps en thérapeutique humaine. La mise en oeuvre de l'étape f), qui est la mise en place sur un même vecteur des gènes codant pour les chaînes lourdes et légères peut-être effectuée comme décrite page 1278 de l'article de Huse et al. précédemment cité On digère ainsi la librairie de chaînes légères par I'endonucléase de restriction coupant à un site unique , on déphosphoryle les extrémités 5' résultantes , et on digère ensuite les produits , par une autre endonucléase de restriction Eco R1 coupant à un site unique L'ADN des vecteurs composant la librairie des chaînes lourdes est clivé par l'endonucléase Hind-III puis déphosphorylé et digéré par l'endonucléase Eco R1. Les ADN ainsi préparés sont mélangés et réunis par ligation Après ligation , seuls les clones qui résultent de la combinaison d'un fragment issu de la librairie de chaînes lourdes et d'un fragment issu de la librairie de chaînes légères , reconstituent un phage viable Pour la construction des librairies des chaînes lourdes et légères, on peut utiliser des préparations d'ADN messagers isolées à partir de cellules de l'organisme ou d'hybridomes . On synthétise alors dans un système d'amplification par PCR des ADN complémentaires correspondants. Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans " Molecular cloning a Laboratory Manual ( Sambrok et al. 1989 , précédemment cité ). La sélection des bactéries exprimant les molécules complètes de l'étape h) est suivie par une étape de sélection des clones synthétisant les molécules que l'on souhaite obtenir L'assemblage des parties des chaînes lourdes et des chaînes légères ainsi obtenu peut conduire uniquement à l'obtention du fragment Fab. Le vecteur est alors modifié de façon à pouvoir coder pour le fragment Fc . Le produit d'expression de ce vecteur est alors un anticorps. Dans le cas de la sélection de clones synthétisant des anticorps , une méthode de sélection peut être celle utilisée par Huse et al. ( précédemment cité ) pour la sélection de clones synthétisant des anticorps dirigés à l'encontre du paranitrophényle phosphonamidate (NPN) La méthode utilisée dans cet article consiste à faire des doubles sur feuille de nitrocellulose de clones étalés sur des boîtes de milieu de culture gélifié et de tester l'hybridation du NPN couplé à du sérum d'albumine bovine marqué à l'125i La présente invention a de plus pour objet des compositions pharmaceutiques, des médicaments et des réactifs de diagnostic contenant les produits obtenus par l'un des procédés objet de la présente invention. En particulier , les produits d'expression dans des cellules eucaryotes ou procaryotes transfectées par des plasmides recombinants portant des gènes originaires du lapin ou de la souris peuvent être utilisés dans des coffrets de diagnostic humain ou vétérinaire . La présente invention a en outre pour objet des compositions immunogènes et des anticorps obtenus par l'un des procédés selon l'invention La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples de mise en oeuvre suivants dans lesquels La figure 1 représente les séquences des jonctions formées sur le plasmide pBlueRec après co-transfection avec pRag-1 et p Rag-2 dans des fibroblastes NIH-3T3 La figure 2 représente les séquences des jonctions formées sur le plasmide pBlueRec après co-transfection avec des vecteurs codant pour Rag-1 , Rag-2 et la TdT dans des fibroblastes NIH-3T3. La figure 3 représente les séquences de jonctions formées sur pBlueRec après co-transfection avec des vecteurs codant pour Rag-1 et Rag-2 dans les lignées cellulaires BW1J, CHO-K1 et A.9 Sur ces trois figures , les séquences des plasmides recombinés sont alignées avec la séquence du plasmide d'origine pBlueRec qui est la première séquence en partant du haut des figures Sur ces trois figures , les nucléotides supposés être dus à des insertions de type P sont soulignés dans les parties centrales des figures , tandis que les insertions de type N figurées dans ces mêmes parties ne sont pas soulignées. Les délétions sont représentées par des lignes discontinues. EXEMPLES Matériels et méthodes utilisés dans les exemPles Lianée cellulaire Les fibroblastes d'embryons de souris NIH-3T3 ( ATCC CRL 6442) et les cellules A9 dérivées des cellules L , ( ATCC CRL 6319) sont cultivés dans du DMEM complémenté avec 10% de sérum de foetus de veau Les cellules d'hépatomes de souris BW1J sont cultivées comme indiqué par Cassio D. & Weiss M.C.( Somat Cell Genet, 5, 719-738, 1979) Les cellules d'ovaires d'hamster chinois CHO-K1 (ATCC CCL 61 ) sont cultivées dans du RPMI , complémentées avec 10% de sérum de foetus de veau Les cellules pré-B BASP-l ( Choquet et al.,Science, 235, 1211-1214, 1987) sont cultivées dans du RPMI complémenté avec 10% de sérum de foetus de veau et 50 pm de ss-mercapto- éthanol. Clonage du gène codant pour la terminale désoxynucléotidyle transférase de souris De l'ARN est préparé à partir de thymus de souris vieilles de 5 semaines comme décrit par Auffray et Rougeon (Europe J. Biochem., 107, 303-314, 980 ) , du thiocyanate de guanidine 4M étant utilisé à la place d'urée 6M. L'ARN poly-A est purifié en utilisant une chromatographie cellulose oligo DT et est analysé par Northern blot . La synthèse du simple brin est effectuée à partir de 5 pg d'ARN poly-A initialisé avec de l'oligo DT en utilisant la transcriptase inverse du MMLV ( commercialisée par BRL). La synthèse du double brin est effectuée en présence d'ADN polymérase I et de RNase H Des adaptateurs double brin portant des extrémités BstX1 sont liés au CDNA préparé de manière adéquate et clonés dans le site de restriction BstX1 du pCDNA2 ( commercialisé par In Nitrogen ). La librairie d'ADN complémentaire de thymus de souris est criblée avec deux oligo-nucléotides mélangés correspondent respectivement aux séquences 121-142 et 14711494 de la séquence de l'ADN complémentaire de la TdT de souris Les clones d'ADN complémentaire positifs et que l'on suppose suffisamment longs pour contenir entièrement le gène codant pour la TdT de souris sont séquencés sur les deux brins par la méthode de la di-désoxyterminaison ( Sanger et al., PNAS, 74, 5463-5467 , 1977) Vecteurs utilisés. Le plasmide pBlueRec est décrit par Kallenbach et al.( (1990) Nucleic Acid Research 18 , 6730) p Rag-1 et p Rag-2 ont été fournis par Oettinger et al. (précédemment cité). L'ADN complémentaire de la TdT de souris est cloné dans le pCDNA1. L'expression de Rag-l , Rag-2 et de la TdT sont sous le contrôle du promoteur du CMV. Mise en évidence de la recombinaison spécifique Les transfections sont effectuées par electroporation en suivant les indications données par Chu et al .( Nucleic Acid Research Res., 15, 1311-1326, 1987 ). 2.106 cellules sont transfectees avec 2,5 g de pBlueRec avec ou sans 6 g de p Rag-l ou 4,8 g de p Rag-2. Pour déterminer l'effet de la TdT sur l'insertion de région N , 4,5 p g du vecteur d'expression de la TdT sont ajoutés aux trois vecteurs mentionnés ci-dessus Les cellules sont récoltées après 40 à 48 heures d'incubation à 370C , lavées avec du PBS et 1'ADN plasmidique est préparé selon Birnboim et Doly ( Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523, 1979 ). Les culots d'ADN sont resuspendus dans 20 pl d'eau stérile . 7 pl de la solution d'ADN sont digérés par Dpnl afin d'éliminer les plasmides qui ne sont pas répliqués. 40 pl d'une bactérie compétente XL1-Blue (commercialisée par Stratagène) sont transformés par électroporation et étales sur des boîtes d'Agar LB contenant du XGal (80 pg/ml) , de l'IPTG ( 150 pM ) de l'ampicilline (100 pg/ml) et de la tetracycline ( 10 Hg/ml) . La fréquence de réarrangement est calculée comme la quantité de colonies bleues x 3 sur le nombre total de clones. Séguencage des clones recombinants Les colonies bleues sont repiquées et isolées sur des boîtes d'agar LB contenant du XGal , de l'IPTG, de l'ampicilline et de la tétracycline Les préparations d'ADN sont effectuées selon la méthode décrite par Sambrok et al. ( Molecular cloning, Laboratory Manual précédemment cité ) , puis traitées par de la RNase durant deux heures à température ambiante avant d'effectuer le séquençage du double brin EXEMPLE 1 ComParaison des fréquences de recombinaison dans les fibroblastes NIH-3T3 et dans les lignées cellulaires précurseurs des cellules B en présence de Rag-1 et Rag-2. L'activité recombinatoire due à Rag-1 et Rag-2 dans les fibroblastes NIH-3T3 a été testée par transfection transitoire p Rag-1 et p Rag-2 sont co-transfectés dans des fibroblastes NIH3 avec le plasmide substrat pour la recombinaison pBlueRec. Après 48 heures , 1'ADN plasmidique est isolé et testé chez E.Coli pour la recombinaison La séquence LacZ de pBlueRec est interrompue par un fragment d'ADN de 280 paires de bases flanquée de deux RSS. Le réarrangement site-spécifique va éliminer l'insertion et dans un cas sur trois va restaurer le cadre de lecture correcte , donnant naissance à des clones bleus après transformation de E.Coli. Ce test rapide permet d'examiner un nombre important de réarrangements Des expériences de transfection avec p Rag-1 ou p Rag-2 seuls ne donnent pas naissance à des clones recombinants. Comme indiqué sur le tableau I , on observe une frequence de recombinaison importante quand les deux plasmides sont co-transfectés . De plus , la fréquence ( moyenne géométrique= 1,26 ) est comparable à celle observée après transfection du substrat de recombinaison dans les cellules pré B , BASAL ( moyenne géométrique = 1,46 ). Afin de comparer les jonctions codantes formées après la recombinaison modulée par p Rag-l et p Rag-2 dans les fibroblastes , avec les jonctions observées dans les cellules lymphoïdes , les jonctions sur les plasmides réarrangés obtenues après transfection des cellules NIH-3T3 sont séquences Les séquences indiquées sur la figure 1 représentent des éléments de recombinaison indépendants , c'est-à-dire issus de différentes expériences de transfection Sept jonctions sur 17 présentent ni délétions ni insertions Quatre jonctions ont des délétions sur un côté et quatre autres ont des délétions sur les deux côtés Seulement une jonction présente une insertion de type P de deux paires de bases associée à une délétion de deux paires de bases sur un des côtés de la jonction La dernière jonction présente une délétion d'une paire de base et une addition d'un nucléotide , qui peut être attribuée à l'heptamère et est probablement due à une excision imprécise. EXEMPLE 2 Co-transfection par Rag-1 et Raa-2 et TdT des fibroblastes NIH-3T3. Afin de tenter de reconstituer, la diversité jonctionnelle observée dans des cellules préB ou préT, des fibroblastes NIH-3T3 sont transfectés avec le vecteur d'expression de la TdT ainsi qu'avec p Rag-l , p Rag-2 et pBlueRec. Les plasmides recombinants sont séquences Des transfections témoins effectuées avec le vecteur pCDNAl sans l'ADN complémentaire de la TdT n'entraîne aucune insertion de régions N Comme l'indique la figure 2, 88 % des jonctions montrent qu'il y a eu insertion de régions N . La plupart des régions N sont de 1 à 4 nucléotides avec une moyenne de 3 nucléotiques par jonction On observe neanmoins une insertion exceptionnelle de 18 nucléotides La TdT incorpore plus efficacement les résidus G que d'autres nucléotides . La fréquence des insertions de nucléotides de type P semble augmenter dans cette expérience. il doit cependant être remarqué qu'il est impossible de les distinguer des régions N EXEMPLE 3 Effet de Rag-1 et Raq-2 dans différents tyPes de lignées cellulaires différenciées On a montré dans les exemples précédents , que Rag-1 et Rag-2 sont capables d'entraîner une activité de recombinaison dans des cellules relativement indifférenciées que sont les fibroblastes NIH-3T3. On a donc testé l'activité de ces deux gènes dans des cellules dans des états différenciés . Les résultats obtenus dans les lignées cellulaires BW1J , CHO-K1 et A9 sont indiqués sur le tableau 2. On observe des variations entre les différentes lignées cellulaires, mais de manière surprenante, les fréquences de réarrangement dans des lignees BW1J et CHO-K1 sont clairement supérieures à celles obtenues pour les fibroblastes 3T3. Les réarrangements peuvent être détectés 13 heures après la co-transfection avec pBlueRec , p Rag-l et p Rag-2. Le séquençage des plasmides recombinés montre que des délétions aux jonctions codantes ont lieu dans les trois lignées cellulaires testées (figure 3). Une seule insertion de nucléotide de type P est trouvée à la jonction d'un clone recombinant obtenu après transfection des lignées A9. CONCLUSION. L'ensemble de ces résultats montre qu'on obtient dans des lignées non différenciées des délétions nucléotidiques après co-transfection par p Rag-1 et p Rag-2. On observe de plus des insertions nucléotidiques de type P telles que définies par Lafaille et al. ( Cell, 59, 859-870, 1989) On remarque de plus que la co-expression de Rag-1, Rag-2 et TdT dans des cellules non différenciées conduit à des insertions de type N. L'ensemble de ces résultats indique donc que Rag-1 et Rag-2 suffisent à induire une recombinaison site-spécifique mais que la présence de la TdT , en combinaison avec Rag-1 et Rag-2, est nécessaire pour obtenir des insertions de type N qui sont le reflet de l'expression de la diversité de synthèse des immunoglobulines et des récepteurs des cellules lymphoïdes TABLEAU 1 Réarrangements dans les fibroblastes et dans les précurseurs de cellules B AmpR R= 3x Bleu x 10-2 Lignée cellulaire ADN Total Bleu Total NIH-3T3 pBlueRec 70.000 0 0 pBlueRec,pRag1 34.860 0 0 pBlueRec,pRag2 12.140 0 0 pBlueRec,pRag1,pRag2 144.000 183 0,38 pBlueRec,pRag1,pRag2 38.000 128 1 pBlueRec,pRag1,pRag2 60.000 1059 5,3 BASP-1 pBlueRec 14.400 186 1,3 pBlueRec 14.800 237 1,6 pBlueRec 12.960 190 1,5 R = fréquence de recombinaison. TABLEAU 2 Fréquence de réarrangement dans trois lignées cellulaires de cellules B AmpR R= 3x Bleu x 10-2 Lignée cellulaire ADN Total Bleu Total A9 pBlueRec 16.800 0 0 pBlueRec,pRag1,pRag-2 5.620 71 3,8 BW1J pBlueRec, 12.000 0 0 pBlueRec,pRag1-pRag-2 5.600 83 4,4 pBlueRec,pRag1-pRag2 1.800 8 1,3 pBlueRec 16.000 1050 19,6 CHO-K1 pBlueRec 3.434 0 0 pBlueRec,pRag1,pRag2 2.300 38 4,9 pBlueRec,pRag1,pRag2 1.996 149 22,3 R = fréquence de recombinaison. REVENDICATIONS 1. Composition contenant des séquences nucléotidiques portant les gènes Rag-1 et Rag-2 ou des gènes conduisant à la synthèse de fragments ou de dérivés biologiquement actifs des produits des gènes Rag-1 et Rag-2 et le gène codant pour la TdT ou un de ses fragments ou dérivés biologiquement actifs. 2. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques sont portées sur des vecteurs. 3.Composition comprenant les plasmides pBlueRec , p Rag-l et p Rag-2. 4. Composition contenant en combinaison dans des quantités synergiques les produits d'expression des gènes Rag-1 et Rag-2 et une terminale désoxynucléotidyle transférase ou un ou plusieurs de leurs fragments ou dérivés biologiquement actifs. 5. Procédé de génération d'une diversité structurale ou fonctionnelle dans une séquence peptidique par délétions ou insertions aléatoires de nucléotides dans une séquence nucléotidique codant pour cette séquence peptidique ledit procédé comprenant la transfection d'une préparation cellulaire par un ou plusieurs vecteurs permettant l'expression des produits des gènes Rag-1, Rag-2 et de la terminale désoxynucléotidyle transférase ( TdT ) ou de leurs dérivés et par un vecteur identique ou différent portant ladite séquence nucléotidique bordée par une ou plusieurs séquences de recombinaison RSS ou bordée par un ou plusieurs dérivés biologiquement actifs des séquences RSS. 6. Procédé de génération d'une diversité structurale ou fonctionnelle dans une séquence peptidique par délétions ou insertions aléatoires de nucléotides dans une séquence nucléotidique codant pour cette séquence peptidique, ledit procédé comprenant la transfection d'une préparation cellulaire par un vecteur portant ladite séquence nucléotidique bordée par une ou plusieurs séquences de recombinaison RSS ou bordée par un ou plusieurs dérivés biologiquement actifs des séquences RSS , puis dans une seconde étape par un ou plusieurs vecteurs identiques ou différents permettant l'expression des produits des gènes Rag1 , Rag-2 et de la terminale désoxynucléotidyle transférase ou de leurs dérivés . 7. Procédé de génération d'une diversité structurale ou fonctionnelle dans une séquence peptidique par introduction dans la séquence nucléotidique correspondant à cette séquence peptidique d'insertions ou de délétions résultant de la répétition inverse de séquences adjacentes à des séquences de recombinaison RSS ledit procédé comprenant la transfection d'une préparation cellulaire par un ou plusieurs vecteurs permettant l'expression des produits des gènes Rag-1 et Rag-2 ou de leurs dérivés et par un vecteur identique ou différent portant ladite séquence nucléotidique bordée par une ou plusieurs séquences RSS ou par un ou plusieurs dérivés biologiquement actifs des séquences RSS 8.Procédé de génération d'une diversité structurale ou fonctionnelle dans une séquence peptidique par introduction dans la séquence nucléotidique correspondant à cette séquence peptidique d'insertions ou de délétions résultant de la répétition inverse de séquences adjacentes à des séquences de recombinaison RSS , ledit procédé comprenant la transfection d'une préparation cellulaire par un vecteur portant ladite séquence nucléotidique bordée par une ou plusieurs séquences RSS ou par un ou plusieurs dérivés biologiquement actifs des séquences RSS , puis dans une seconde étape par un ou plusieurs vecteurs identiques ou différents permettant l'expression des produits des gènes Rag1 et Rag-2 ou de leurs dérivés . 9.Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que le ou les vecteurs recombinés portant la séquence nucléotidique correspondant à la séquence peptidique sont transférés dans des bactéries afin de sélectionner les protéines présentant la structure et/ou la fonction souhaitée. 10. Procédé selon l'une des revendications 5 à 9, pour l'obtention d'immunoglobulines et notamment d'anticorps présentant une grande diversité structurelle et fonctionnelle par réarrangement séparé des chaînes légères et lourdes et co-expression des deux chaînes 11. Procédé selon l'une des revendications 5 à 9, pour l'obtention de récepteurs des cellules lymphoïdes , et en particulier des cellules T , présentant une grande diversité structurale et fonctionnelle par réarrangement des chaînes alpha, bêta, gamma et/ou delta des récepteurs des cellules T. 12. Procédé selon la revendication 10 , caractérisé en ce que le réarrangement des chaînes légères est effectué en présence des séquences nucléotidiques des gènes Rag-l et Rag-2 ou de genes conduisant à la synthèse de dérivés ou de fragments biologiquement actifs des produits des gènes Rag-l et Rag-2. 13. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que le réarrangement des chaînes lourdes est effectué en présence des séquences nucléotidiques des gènes Rag-1, Rag-2, et du gène de la terminale désoxynucléotidyle transférase ou de gènes conduisant à la synthèse de dérivés ou de fragments biologiquement actifs de Rag-1, Rag-2 et de la TdT. 14. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8 , comprenant les étapes de a) transfection d'une préparation cellulaire par un ou plusieurs vecteurs portant une séquence nucléotidique codant pour la séquence peptidique dont on veut obtenir la variabilité et par un ou plusieurs vecteurs identiques ou différents permettant l'expression des gènes Rag-1 et Rag-2 ou l'expression des gènes Rag-1, Rag-2 et de la TdT; b) isolement de l'ADN des vecteurs des préparations cellulaires c) élimination des vecteurs n'ayant pas subi de recombinaison ; d) transformation d'hôtes cellulaires par les vecteurs résultant de l'étape c) , et e) sélection des hôtes cellulaires exprimant les molécules présentant la structure et/ou la fonction recherchée. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite séquence peptidique est une chaîne alpha, bêta, delta, ou gamma des récepteurs des cellules lymphoïdes ou un de leurs fragments ou un de leurs dérivés. 16. Procédé selon l'une des revendications 10, 12 et 13 , comprenant les étapes de a) co-transfection d'une préparation cellulaire par un ou plusieurs vecteurs portant des séquences nucléotidiques codant pour des chaînes légères non-réarrangées et par un ou plusieurs vecteurs exprimant les gènes Rag-1 et Rag-2 leurs dérivés et/ou leurs fragments, et b) co-transfection d'une autre préparation cellulaire par un ou plusieurs vecteurs portant des séquences nucléotidiques codant pour des chaînes lourdes non-réarrangées et par un ou plusieurs vecteurs exprimant le gène de la terminale désoxynucléotidyle transférase ainsi que les gènes Rag-1 et Rag-2 , leurs dérivés et/ou leurs fragments c) isolement de l'ADN des vecteurs des deux préparations cellulaires d) élimination des vecteurs n'ayant pas subi de recombinaison , e) transformation d'au moins deux cultures bactériennes respectivement par les deux préparations obtenues à l'étape d) , amplification et préparation des ADN des vecteurs bactériens f) mise en place sur un même vecteur des gènes codant pour les chaînes lourdes et légères , g) transformation d'hôtes cellulaires par le vecteur obtenu à l'étape f) , et h) sélection des hôtes cellulaires exprimant des molécules d'immunoglobulines complètes 17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que les vecteurs obtenus à l'étape c) et n'ayant pas subi de recombinaison sont éliminés par digestion enzymatique. 18. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que les préparations cellulaires sont des fibroblastes ou toute autre cellule eucaryote. 19. Plasmide pMTdT portant le gène de la terminale désoxyribonucléotidyle transférase déposé auprès de la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes sous le N I 1160. 20. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que le vecteur exprimant la terminale désoxyribonucléotidyle transférase est le plasmide selon la revendication 19 21. Composition pharmaceutique contenant une quantité efficace d'au moins une protéine ou peptide obtenu par le procédé selon l'une des revendications 4 à 18 et 20 en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables 22. Médicament contenant au moins une protéine ou peptide obtenu par le procédé selon l'une des revendications 4 à 18 et 20 23. Réactif de diagnostic contenant au moins une protéine ou un peptide obtenu par le procédé selon l'une des revendications 4 à 18 et 20 24. Coffret pour le diagnostic comprenant au moins l'un des réactifs selon la revendication 22. 25. Composition immunogène contenant au moins une protéine ou un peptide obtenu par le procédé selon l'une des revendications 4 à 18 et 20. 26. Anticorps obtenu par le procédé selon l'une des revendications 4 à 18 et 20.