FR 2690341 A1 19931029 FR 9205336 A 19920424 VECTEURS NANOPARTICULAIRES CONTENANT UN MUSCULOTROPE OU UN NEUROTROPE A EFFET DECLENCHE PAR VARIATION DU POTENTIEL DES MEMBRANES DES CELLULES CIBLEES PAR L'ACTIF ENCAPSULE -La plupart des drogues qui sont actives sur la contraction musculaire de la musculature lisse ou striée n'expriment leur activité que sur une phase précise du phénomène de contraction. Les médicaments employés à cet usage sont donc présents dans l'environnement de la fibre contractile à réguler ou à contrôler et peuvent être - captés à n'importe quelle phase de contraction - métabolisés avant d'exprimer leur activité. La présente invention a pour but de vectoriser un principe actif et de ne le délivrer qu'au moment opportun. Ceci est d'autant plus intéressant qu'il est parfois nécessaire d'activer des muscles en hypofonctionnement, et non l'ensemble de la musculature, et, à l'inverse, d'être actif sur les mucles de contraction (hypercontraction) par rapport à l'ensemble de la musculature ne présentant pas d'activité aussi intense. I1 est bon de rappeler le principe global de la contraction musculaire et de se reporter à des ouvrages de physiologie générale ou traitant plus particulièrement de la musculature, des nerfs et de leur régulation. De même, les ouvrages de pharmacologie seront bien appréciés. Toutefois, pour une meilleure compréhension du texte, nous précisons que la contraction musculaire est régie par une succession de phénomènes pouvant être sommairement décrits. Sans entrer dans les détails intimes de la contraction musculaire, il faut rappeler que si l'on dépose une électrode à la surface drun muscle au repos et l'autre à l'intérieur, on observe une différence de potentiel de -80mV, la surface apparaissant positive et l'intérieur de la fibre négatif.Ce courant de base est appelé courant de repos - déterminant ce que l'on appelle le potentiel de repos - et a été démontré par Nobili en 1828 et Matteuci en 1838. Lorsque le muscle se contracte, le courant de repos diminue et se transforme provisoirement en potentiel d'action qui s'exprime par une inversion de potentiel (+ 10 à + 40mV) très brève de l'ordre du centième de seconde (0,1 à 0,001 secondes). L'excitation de la fibre musculaire a pour effet essentiel, mais non exclusif, d'orienter la perméabilité cellulaire aux ions. Un muscle peut être excité à partir d'une information électrique 'mais des phénomènes mécaniques, magnétiques ou chimiques peuvent induire une contraction. Usuellement, la séquence des événements de la contraction à partir d'un nerf peut être décrite comme suit - au repos, l'axone d'un neurone exprime un potentiel de membrane de -80 mV (surface positive - intérieur négatif) - l'excitation de l'axone fait apparaître un potentiel, un train d'ondes électriques appelé potentiel d'action qui se traduit par une inversion provisoire des potentiels jusqu'à une valeur de + 40 à + 50 mV. - A la jonction axone (nerf) - muscle (synapse neuromusculaire) se trouve un élément appelé plaque motrice où le potentiel d'action de l'axone provoque la libération d'un neuromédiateur qui réalisera la transmission de l'information jusqu'à l'élément récepteur du muscle. Le neuromédiateur est rapidement détruit. Le neuromédiateur est souvent synthétisé, stocké et libéré à partir d'une vésicule synaptique. - La fibre musculaire reçoit le neuromédiateur sur un récepteur qui active une succession d'enzymes qui modifieront la perméabilité des membranes, déséquilibrant ainsi l'état ionique des cellules ou d'un syncytium. A chacune de ces étapes, il existe des actifs physiologiques et des drogues suceptibles de perturber son développement. Différents systèmes de transmission d'influx sont utilisés selon les localisations ou les effets. On décrit des systèmes orthosympathiques et parasympathiques avec des effets directs, de rétroaction, inhibiteurs (post potentiel synaptique excitateur PPSE et post potentiel synaptique inhibiteur PPSI). Pour chacun de ces systèmes, il existe des modalités d'expressions sélectives. Le système orthosympathique est dit adrénergique (catécholamine) et le système parasympathique est dit cholinergique. Ainsi pour le système a noradrénergique, il est possible de décrire ** pour les récepteurs - des ligands naturels : adrénaline - dopamine (a), noradrénaline - des ligands agonistes : phénylephrine, clonidine (a2) - des ligands antagonistes : prazosine, alfuzosine (al) ergotoxine (a2) ** pour le métabolisme - les inhibiteurs du captage par les vésicules : réserpine - les activateurs du catabolisme : les M.A.O. (monoamine oxydase) et les COMT (cathecol 0 méthyltransférase) - les inhibiteurs du catabolisme : les I.M.A.O. (iproniazide), les antihistaminiques (anti COMT) - des activateurs de la sécrétion du neuromédiateur éphédrine, tyramine - des inhibiteurs de la sécrétion neuromédiatrice brétylium, guanéthidine - des activateurs du recaptage : le lithium Il existe bien d'autres systèmes que le système aux cathêcolamines. Sommairement, on peut décrire - Les systèmes purinergiques (nucléotide naturel) activés artificiellement par les bases xanthine (cafféine, théophylline) et inhibés par la quinidine. - La neuromédiation cholinergique activée physiologiquement par l'acétyl choline, qui détermine deux types de récepteurs - muscariniques dans le tissu nerveux, le coeur, les muscles lisses et les glandes exocrines et les récepteurs nicotiniques ayant pour agonistes : alcaloïdes du jaborandi (pilocartine) et les curarisants dits acetyl cholinomimétiques. antagonistes : les alcaloïdes des solanacées, la propanthéline, la pirenzépine, d-tubocurarine et ses dérivés de synthèse comme la gallamine, pancuronium... - les systèmes histaminiques avec ses agonistes : histamine (H1, H2), methyl-4-histamine (ho), ipromidine et la clonidine (H2) . antagonistes : mépyramine, prométhazine (H1) et la cimétidine ou la ranitidine (H2). - Les systèmes sérotoniques, surtout presents au niveau central et au niveau périphérique dans les fibres lisses digestives (terminaison sympathiques 5HT1 et 5HT2), les fibres lisses des vaisseaux, des bronches avec comme agonistes la 5 hydroxytryptamine, la buspirone pour les 5HT1 et la kétansérine, miansérine, l'acide lysergique... pour les 5HT2. Il existerait aussi un système de récepteurs 5HT3. - Les systèmes aminoacides neuromédiateurs : GABA, glycine présents dans le néocortex avec comme ligands agonistes l'acide gamma amino butyrique, les barbituriques, les benzodiazépines (canal chlore). Au niveau musculaire, on retrouve l'ensemble des étapes post synaptiques précédemment décrites mais les actifs utilisés seront spécifiques des récepteurs de la plaque motrice et de la contraction du muscle. On citera - Les actifs agissant directement sur le muscle * Les inhibiteurs des mouvements calciques : vérapalmil, diltiazem, nifedipine, amiodarone, etc... qui agissent spécifiquement en développant la phase en plateau du potentiel d'action et donc activent la contractabilité des fibres musculaires par blocage électif des mouvements ioniques à travers le canal calcique (déplacement ionique lent). * Les stabilisants de membranes comme les alcaloïdes du quinquina et notamment la quinidine par diminution de l'excitabilité et de la dépression de la conduction, la lidocaïne et ses dérivés comme la mexilétine qui diminue le potentiel d'action, la phénytoine qui améliore la conduction par une diminution de la pente de dépolarisation et un raccourcissement de la durée du potentiel d'action. L'augmentation de la période réfractaire est possible avec la flécainide alors que la cibenzoline augmente le potentiel d'action. Des produits comme l'aprindine, sont des stabilisants de membrane qui dépriment la pente du potentiel d'action. Toujours au niveau de la membrane cellulaire ou d'un syncytium, on peut trouver des actifs qui inhibent les pompes actives au sodium et potassium : hétérosides cardiotoniques de la digitale, des strophantus, de la scille,... Le système catécholamine post synapsique est concrétisé par des récepteurs aI, a2,ssl, ss2 dont les ligands agonistes ou antagonistes sont résumés dans le tableau ci-dessous Localisation effet agoniste antagoniste de l'excitation &alpha;;1 iris mydriase noradrenaline prazosine (N.A.) . artériale vasoconstriciton adrénaline alfuzosine bronches relachement phénylephrine sphincter contraction mêthoxamine tonus métaraminol éjaculation 2 centraux NA. -clonidine ergotoxine methyldopa PI coeur chrono,ino,dromo+ Acébutotol . lipocyte augmentation des I.P.N.A. acide gras dobutamine métarolol adrénaline aténolol ss2 . coeur relachement I.P.N.A. ss blocante utérus albutérol non sélectif terbutaline pindolol ritodrine alprénolol fénotérol On constate que l'ensemble des ligands naturels ou de synthèse des récepteurs décrits n'agissent qu'à certaines phases de la transmission postsynaptique - soit quand le muscle est au repos pour provoquer une contraction. - soit quand le muscle est soumis au potentiel d'action pour provoquer un relachement. De même, les stabilisants de membranes, les inhibiteurs des canaux calciques et les modulateurs des pompes Na+/K+ n'agissent qu'à certaines phases du cycle contraction (potentiel d'action)/décontraction (potentiel de membrane ou potentiel de repos) mais doivent être présents avant l'arrivée du potentiel d'action. La présente invention est caractérisée par l'utilisation de formes vectorisées encapsulant un actif, à des concentrations comprises entre 20 % et 10-6 % et des concentrations comprises entre 10 % et 10-5 %, destiné à modifier l'activité des cellules ou des syntitiums. La forme galénique représentant le vecteur exprime une charge électrique de signe opposé à la phase du cycle contraction/décontraction pendant laquelle l'actif doit manifester son rôle (différent parfois du moment où il doit exprimer son activité). Pour mieux comprendre l'intérêt de l'invention, nous décrivons un exemple non limitatif utilisant les techniques de synthèses décrites dans le brevet 8904275 portant sur la synthèse de liposomes et de nanocapsules. Ces techniques s'appliquent à la synthèse de vecteurs lamellaires constitués de phospholipides (liposomes), de vecteurs matriciels (nanosphères) ou encore de vecteurs capsulaires constitués par une paroi délimittant un volume interne (nanocapsules). L'expérimentateur souhaite activer la contraction d'une fibre striée cholinergique à l'étant de repos. Il engendre une contraction longue et intense en utilisant un vecteur exprimant un potentiel zéta négatif et encapsulant de l'acétyl choline ou mieux des alcaloïdes du jaborandi telle la pilocarpine. L'expression d'une telle charge négative sera obtenue par la formation des nanocapsules telles - Acide cholique ............ 1,5 % - Acide linoléïque .......... 0,2 % - Palmitate de saccharose ... 1,5 % - Pilocarpine base .......... 0,01 % - Eau déminéralisée .....,... 5 % OS 100 ml On note que les nanocapsules ainsi formées ont une taille de 20 à 2 000 nm centrée sur 200 nm, très inférieure à celle des cellules et un potentiel zéta de -50 mV. 1 ml de sérum de nanocapsules dans 100 ml de milieu nutritif provoque une contraction longue et intense d'un fragment d'intestin isolé. La durée de la contraction est d'environ 20 fois plus longue que celle obtenue par le chlorhydrate de pilocarpine (hydrosoluble). Une formulation à peu près identique mais constituée de liposomes aurait pu donner un résultat assez semblable. A l'inverse, si l'on souhaite obtenir un relachement du tonus musculaire, il sera intéressant de noter l'action du bromazépam ou de la terbutaline avec la formulation suivante. - Phosphatidylcholine ................. 5 % - Quinidine .......................... 0,5 % - Cholestérol ......................... 0,1 % - Procaïne base ....................... 0,2 % - Tocophérols y et 6 (majoritaires) ... 0,2 % - Bromazépam .......................... 0,015 % - Sérum glucosé QS .................... 93,985 % 1 % de ce sérum est susceptible de rendre résistant à la contraction un organe isolé tel un fragment du tractus intestinal même si le nutritif est additionné d'acétylcholine. Le vecteur se caractérise par une taille de 170 nm et un potentiel zéta de + 5 mV. La même formule sans bromazépam ne développe pas le même effet. L'intérêt du bromazépam est d'être moins hydrosoluble que les benzodiazépines : diazépam, ...etc. Toutefois, les vésicules formées selon la formulation - Lécithine de soja hydrogénées à 95 % de dipalmitoyl phosphatidylcholine .. 6 % - Palmitate d'ascorbyl ................ 0,1 % - Tocophérolsy etô (majoritaires) .... 0,2 % - Albutérol ........................... 0,5 % - Palmito-stéarate de saccharose ...... 0,2 % - Sérum mannitolé 5 % 93 % développent la même activité alors que la taille de 150 nm inférieure à celle des cellules exprime un potentiel zéta de -20 -à -30 mV. Ceci peut être du au fait que l'albutérol est un ss2 agoniste (stimulant) qui manifeste une activité lorsque la fibre est contractée par fibrillation (passage alternatif très rapide du potentiel de repos au potentiel d'action).Le neuromédiateur ss2 agoniste a une action décontractante, il doit donc exprimer son activité en phase de potentiel de repos (charge positive à la surface de la membrane) pour maintenir celle-ci au potentiel le plus bas. Les particules de très petites tailles (infracellulaires) peuvent être attirées par la fibre en raison d'un potentiel différentiel d'environ 14 mV. Des formulations de nanocapsules constituées de palmitate d'ose (palmitate de saccharose), d'ester ou d'amides d'acide gras et d'acide aminé en remplacement des lécithines donnent les mêmes effets. Un observateur attentif notera que l'ensemble des formules particulaires citées comporte d'importants groupements hydrophiles qui seront portés à l'extérieur de la paroi. Leur intérêt est triple 1. Renforcer la couche de Stern de manière à porter le potentiel le plus loin du vecteur, augmentant ainsi sa probabilité de rencontre avec la membrane des cellules à cibler avec lesquelles le vecteur va fusionner en utilisant des molécules hydrophiles tels les acides aminés ou les glucides comme la saccharose, le lactose, le glucose, le galactose, le mannose, le fructose à l'état de monomère, polymérisé, entre eux, sous forme linéaires ou ramifiées à une concentration variant de 5 % (g pour 100 g) à 5.10-3 % (ou 5.10-5) par rapport à la masse globale de la préparation. 2. Assurer la non fusion des vecteurs entre eux, leur structure très lipidique n' exprime pas en elle-même un potentiel zéta, seule l'eau de la couche de Stern exprime 'une charge électrique (les lipides sont neutres électriquement). Si cette eau n' est pas fixée, les vésicules auront tendance à fusionner entre elles. 3. Limiter l'effet toxique de l'intéraction vecteurscellules ciblées. En effet, les parois et membranes constituant les nanocapsules ne sont pas dotées des mêmes propriétés que la membrane des cellules ciblées. REVENDICATIONS 1 - Vecteurs de taille inférieure à celle des cellules vers lesquelles ils doivent transporter un actif pour qu'ils y expriment leur activité, caractérisés en ce qu'ils sont porteurs de charges électriques de surface permettant l'électroattraction, à un instant donné, avec les cellules qu'ils ont pour cible, ces cellules ayant un potentiel électrique de surface variable dans le temps en intensité ou en signe. 2 - Vecteurs, selon la revendication 1, de taille inférieure aux cellules pour lesquelles ils présentent une affinité pendant un temps déterminé, caractérisés en ce qu'ils ont un diamètre compris entre 20 et 2 000 nm. 3 - Vecteurs, selon les revendications 1 à 2, exprimant une affinité pour des cellules dont la charge électrique est sujette à variation, portant à leur surface une charge électrique complémentaire à un instant donné, caractérisés en ce qu'ils sont de nature nanocapsulaire dont la paroi porte à l'extérieur des groupements hydrophiles permettant d'agrandir la couche électrique dite couche de stern. 4 - Vecteurs, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, exprimant une affinité pendant un temps déterminé, pour des cellules grâce à une charge électrique de surface complémentaire à celle de la cellule concernée caractérisés par leur nature liposomiale et constitués principalement de phospholipides. 5 - Vecteurs, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, de taille infracellulaire (inférieure à 2 um), caractérisés en ce qu'ils contiennent un agent neurotrope à des concentrations comprises entre 10-6 t (g pour 100 g) et 20 % (g pour 100 g). 6 - Vecteurs, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, de taille inférieure à 2 um, caractérisés en qu'ils contiennent un musculotrope et pour être actifs sur des cellules ou des syncytiums à des concentrations comprises entre 10-6 % (g pour 100 g) et 20 % (g pour 100 g). 7- Vecteurs, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu ils contiennent des stabilisants de membrane, régulateurs des canaux ioniques : calcium, sodium, potassium, chlore tels les alcaloïdes, l'amiodarone, le vérapalmil, la procaïne et ce d'une manière non limitative. 8- Vecteurs, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisés en ce qu'ils portent à leur surface externe, pour augmenter les dimensions de la couche électrique de Stern, des molécules hydrophiles telles des glucides comme la saccharose, le lactose, le glucose, le galactose, le mannose, le fructose à l'état monomère polymérisé entre elles, linéaires ou ramifiées pour une concentration variant de 10 % (g pour 100 g) à 10-5 % par rapport à la masse globale de la préparation. 9 - Vecteurs, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisés en ce qu'ils portent à leur surface externe des molécules hydrophiles peptidiques à l'état d'acides aminés ou de polypeptides linéaires ou ramifiées à une concentration variant de 20 % (g pour 100 g) à 10-6 % par rapport à la masse globale de la préparation. 10 - Vecteurs, selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisés en ce qu'ils entrent dans la composition de produits destinés à modifier l'activité électrique des cellules ou des syntitiums.