FR 2684686 A1 19930611 FR 9115146 A 19911206 MILIEUX DE CULTURE POUR DES CELLULES D'INVERTEBRES MARINS. L'Invention est relative à un nouveau milieu de culture cellulaire convenant pour des cultures de cellules d'invertébrés marins, en particulier pour des cultures de cellules de mollusques. Les cultures de cellules d'invertébrés sont apparues dans les années 1930. Elles se sont principalement orientés vers les cultures de cellules d'insectes, en raison de leurs nombreuses applications en virologie et en pathologie. Ces cultures ont depuis connu un grand essor et sont maintenant pratiquées à l'échelle industrielle pour la production de protéines recombinantes (système à baculovirus). Il n'en va pas de même pour les autres invertébrés, et particulièrement pour les mollusques ; les tentatives de culture de cellules de mollusques ont été assez nombreuses, mais ponctuelles et peu suivies ; peu d'espèces ont été mises en culture, et les travaux entrepris n'ont pas abouti à la mise au point d'un milieu de culture autorisant une prolifération cellulaire significative in vitro. Les premiers milieux de culture de cellules de mollusques marins, se composaient d'eau de mer filtrée, tamponnée, et additionnée d'antibiotiques, de glucides et d'azote sous forme d'acides aminés ou d'extrait de protéines [VAGO et CHASTANG, C.R. Acad. Sci., 250, 2751-2753 (1960)]. Puis des connaissances analytiques sur la compositions de l'hémolymphe (le fluide extracellulaire baignant les cellules des invertébrés) ont été acquises, et la composition des milieux de cultures a été calquée sur la composition de l'hémolymphe : le milieu de culture est la reconstitution artificielle la plus fidèle possible de la composition organique et minérale et des caractéristiques physico-chimiques de l'hémolymphe de l'animal mis en culture [CHERNIN, J. Parasitol., 49, 353-364 (1963)]. Cependant, la composition de l'hémolymphe varie entre les divers groupes d'invertébrés, et au sein d'un même genre, entre les espèces. Cette composition présente en outre une grande variabilité intraspécifique : la composition de l'hémolymphe d'huître varie par exemple en fonction des saisons et de l'habitat. Il faut donc préalablement à toute mise en culture, étudier au préalable et de manière très complète la composition de l'hémolymphe de chaque espèce mise en culture, ce qui implique un travail analytique préliminaire très complexe et très lourd. De plus, les milieux mis au point par cette méthode doivent être modifiés à chaque changement d'espèce cultivée. Un effort de standardisation des milieux de culture de cellules d'invertébrés a été entrepris en 1969 par VAGO et QUIOT [Ann. Zool. Ecol. Anim., 1, 281-288 (1969)]. Ils ont établi différentes formulations, sur la base du rapport Na/K, de la pression osmotique et du pH de l'hémolymphe des espèces cultivées. Les milieux de culture ainsi mis au point se décomposent ainsi en - une partie constante comprenant une fraction organique (glucides, lipides et acides aminés), des antibiotiques, et des sérums (vitamines et facteurs de croissance non spécifiques). - une partie qui varie en fonction des espèces mises en culture, comprenant une fraction minérale (sels minéraux en proportions spécifiques, permettant d'ajuster la pression osmotique à la valeur désirée), une fraction spéciale (vitamines et facteurs de croissance spécifiques), et une fraction permettant de tamponner le pH à la valeur désirée. Les caractéristiques physico-chimiques des milieux respectent celles de l'hémolymphe des espèces cultivées : pour les mollusques marins, les cellules sont généralement cultivées entre 15. et 25 C, à pH variant entre 6,8-7,0 et 7,2-7,4 et à la même pression osmotique que celle de l'hémolymphe, soit entre 900 et 1100 mosmol/l. Les suppléments de culture utilisés sont très variés : suppléments dit "indéfinis", dont la composition chimique n'est pas précisée, tels que l'hémolymphe homologue ou hétérologue inactivée, à 5 ou 10%, le sérum de veau foetal à 10%, le sérum bovin, le sérum de cheval, les extraits d'organes ou d'animaux entiers, les extraits embryonnaires de poulet, ou suppléments dits "définis" tels que : hydrolysats protéiques, acides aminés, vitamines, facteurs de croissance spécifiques ou non spécifique, etc... La Demande PCT US 88/03325 décrit par exemple, un procédé de culture de cellules de manteaux d'huîtres destinés à la production perlière, dans un milieu comprenant, une solution saline simulant le milieu naturel associé au tissu du manteau d'huître ; des acides aminés, des sucres assimilables, et un supplément tel que de l'hémolymphe, des extraits de gonade de mollusques, un extrait de levure ou du sérum de veau foetal. L'utilisation de tels milieux permet le maintien en cultures primaires de cellules adultes, donc différenciées de mollusques, pendant des périodes allant de quelques jours à plusieurs mois. Toutefois, ces cultures ne présentent pas de figures de mitoses, ou très peu et uniquement durant les premiers temps de la culture. L'index mitotique des cellules est très faible dans les cultures de cellules de corps blanc d'Octopus vus gares et 1 à 5 / ' dans les cultures de cellules somatiques de Bivalves marins. Les cultures secondaires réalisées à partir de cultures primaires sont maintenues en survie pendant des périodes allant de quelques jours à plusieurs semaines ; elles ne peuvent pas être repiquées. A la différence des cellules adultes, les cellules de larves de Crassostrea gigas et de Crassostrea virginica semblent se diviser activement en culture primaire. Leur culture s'est cependant toujours faite sur de courtes périodes, suite à des contaminations qui apparaissaient et se développaient rapidement aux dépens des cellules cultivées. Les cellules de larves de Biomphalaria glabrata se divisent activement et peuvent être repiquées pendant plusieurs générations. Les cultures primaires issues d'explants contiennent des cellules en suspension et des cellules adhérentes, qui forment un tapis confluent au bout de 7 à 15 jours de culture ; les cellules en suspension, les cellules adhérentes, ou l'ensemble des cellules des cultures primaires, peuvent être repiquées dans un nouveau récipient de culture, en culture secondaire. Les cultures secondaires ne forment pas de tapis confluent et ne peuvent donc pas être à nouveau repiquées. Les cellules survivent in vitro, sans proliférer de manière significative ; leur maintenance dépend des conditions de culture (présence/absence des explants, densité d'ensemencement, ...) et des caractéristiques des milieux de culture utilisés. Il n'existe pas à l'heure actuelle de lignée cellulaire immortelle établie à partir d'une culture de cellules de mollusques. Tous les résultats concernant la culture in vu trio de cellules de mollusques sont convergents : ces cellules peuvent être maintenues en survie pendant des périodes de culture plus ou moins longues, mais elles ne prolifèrent pas de manière significative. Cette absence de croissance est probablement liée à une inadéquation entre les conditions de culture pratiquées et les besoins réels des cellules. La présente Invention, qui a été réalisée par la Demanderesse en collaboration avec le Laboratoire de Biologie des Invertébrés Marins du Museum d'Histoire Naturelle, s'est fixé pour but de fournir des milieux de culture répondant mieux que les milieux de l'art antérieur aux besoins des cellules d'invertébrés marins, en particulier de mollusques, et en particulier permettant une survie plus longue, et une meilleure prolifération de ces cellules en culture. Pour cela, les Inventeurs ont mis au point un milieu de culture qui comprend, outre un milieu minéral et organique de base, un supplément dit "indéfini" (c'est-à-dire un supplément de type sérum ou hémolymphe, dont la composition chimique exacte ne peut pas être déterminée avec précision), et un nouveau supplément, de composition définie, ces trois constituants associant entre eux différents facteurs actifs sur la croissance cellulaire. Bien que l'activité d'un grand nombre des facteurs composant le nouveau supplément défini sur la croissance des cellules de mammifères et d'autres vertébrés soit déjà connue, les Inventeurs ont constaté que ces facteurs étaient également actifs sur les cellules de mollusques, et qu'en outre, en associant entre eux certains de ces facteurs sélectionnés, on observe une amélioration inattendue de la viabilité des cultures de cellules d'invertébrés marins. La présente Invention a pour objet une composition utilisable comme supplément défini pour un milieu de culture cellulaire destiné à la culture des invertébrés marins, laquelle composition est caractérisée en ce qu'elle comprend, au moins une hormone choisie dans le groupe comprenant l'insuline, les IGF (Insuline like Growth Factor), 1-'hydrocortisone et les glycocorticoldes, au moins un facteur de croissance choisi dans le groupe comprenant 1'EGF (Epidermal Growth Factor), le FGF (Fibroblast Growth Factor), et le PDGF (Platelet Derived Growth Factor), au moins une substance ou un extrait lipidique choisie dans le groupe comprenant l'Ex-Cyte VLE, l'extrait de jaune d'oeuf, et la prostaglandine F2a, et au moins un agent protecteur choisi parmi les inhibiteurs de radicaux libres. Selon un mode de réalisation préféré du supplément défini pour cultures cellulaires conforme à l'Invention, il comprend entre 10 et 100 Rg/ml d'insuline bovine, entre 10-6 et 10-4 M d'hydrocortisone, entre 5 et 50 ng/ml de EGF, entre 1 et 25 ng/ml de PDGF, entre 0,2 et 2% (V/V) d'extrait de jaune d'oeuf, entre 0,05 et 0,2% V/V d'Ex-cyte VLE, entre 10 9 et 2 x 10 8M de prostaglandine F2a, entre 10 et 100 Fg/ml de catalase. Les Inventeurs ont en outre constaté que l'effet du supplément conforme à l'Invention était considérablement augmenté lorsque ledit supplément est associé à un supplément de type "indéfini" tel que du sérum de veau foetal, ou de l'hémolymphe d'huître. L'Invention englobe également des milieux de cultures cellulaires adaptés à la culture de cellules d'invertébrés marins, lesquels milieux sont caractérisés en ce qu'ils comprennent un milieu de base comprenant des sels minéraux, des sucres, des acides aminés, et des vitamines, auquel est additionné un supplément défini pour cultures cellulaires conforme à l'Invention. Selon un mode de réalisation préféré des milieux de cultures cellulaires conforme à l'Invention, ils comprennent en outre un supplément indéfini choisi dans le groupe constitué par le sérum de veau foetal ou 1 'hémolymphe d'huître. Les milieux conformes à l'Invention sont constitués par exemple d'une base minérale et organique du commerce (RPMI 1640, LEIBOVITZ L-15, ...) à laquelle sont ajoutés des sels minéraux (NaCl, KC1, CaC12, Mec12, MgSO4), des antibiotiques (pénicilline, streptomycine) et des suppléments de composition indéfinie (sérum de veau foetal, hémolymphe, ...) et un supplément de composition définie conforme à l'Invention. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en culture de cellules de mollusques dans le milieu conforme à l'Invention. I1 va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Les expérimentations décrites ci-dessous ont été effectuées sur des cultures de cellules de coeur d'huître creuse Crassostrea gigas. Le milieu de base utilisé est un milieu commercial, par exemple du milieu LEIBOVITZ L-15 (SEROMED), enrichi en sels minéraux. La composition du milieu de base complet est indiquée dans le tableau I suivant TABLEAU I SELS MINERAUX g/l Nacl 28,2 KC1 0,94 CaCl2 0,73 MgSO4 - 7H2O 1,19 MgCl2 - 6H2O 4,1 Na2HP04 0,19 KH2P 4 0,06 SUCRES g/l D(+) Galactose Na-Pyruvate 0,55 TABLEAU I (suite) ACIDES AMINES g/l L-Alanine 0,225 L-Arginine 0,5 L-Aspargine 0,25 L-Cystéine 0,12 Glycine 0,2 L-Histidine 0,25 L-Isoleucine 0,125 L-Leucine 0,125 L-Lysine 0,075 L-Méthionine 0,075 L-Phénylalanine 0,125 L-Sérine 0,2 L-Thréonine 0,3 L-Tryptophane 0,02 L-Tyrosine 0,3 L-Valine 0,1 L-Glutamine 0,294 (au moment de l'emploi) TABLEAU I (suite) VITAMINES g/l D-Pantolénate de Ca Chlorure de choline 10-3 Acide Folique I-Inositol 2 x Nicotinamide Pyridoxine - HCl 10-3 Riboflavine-5 phosphate-Na 0,1 x 10-3 Thiamine monophosphate 10-3 ROUGE DE PHENOL 0,01g/l ANTIBIOTIQUES g/l Pénicilline 0,128,2 Streptomycine 0,94 A ce milieu est ajouté un supplément défini conforme à l'Invention sous forme de solution-stock FP(1) concentrée préparée à l'avance, répartie en aliquots et conservée à -20'C. La composition de cette solution stock est indiquée dans le tableau II suivant TABLEAU II HORMONES Insuline bovine (PENTEX-MILES) 500 Rg/ml Hydrocortisone (SIGMA) 10-3 FACTEURS DE CROISSANCE rh EGF (UBI) 250 ng/ml rh PDGF (UBI) 100 ng/ml TABLEAU II (suite) LIPIDES (Cholestérol, acides gras, phospholipides Egg yolk Extract (MILES) 10% (V/V) Ex-Cyte VLE (MILES) 1% (V/V) Prostaglandine F2a (SIGMA) 10-7 M AGENTS PROTECTEURS Catalase (SIGMA) 500 Rg/ml En outre, l'un ou l'autre des suppléments indéfinis suivants peuvent être ajoutés au milieu - Sérum de Veau Foetal (SVF) [PAA GmbH] décomplémenté (30' à 56 C) - Hémolymphe homologue [hémolymphe d'huître creuse (C. gigas) prélevée par ponction de la cavité péricardique des huîtres durant l'hiver, (Octobre Mars), filtrée sur 0,2 pin et congelée à -20 C] inactivée par chauffage 30' à 56 C). Le pH des milieux est ajusté à 7,0-7,5, leur pression osmotique à 1000-1100 mosmol/l et les cultures sont incubées à 18-25-C sous air : 80% N2, 20% 02, 0,03% CO2. Test de viabilité cellulaire Le test de viabilité cellulaire choisi est le dosage de la réduction du MTT (bromure de (-3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5 diphényl tétrazolium) par les succinate déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes. Ce test est effectué selon le protocole suivant Les cellules sont ajustées à des dilutions successives dans le milieu de culture et ensemencées dans des microplaques 96 puits : 100 jil de suspension cellulaire/puit, 3 répétitions/dilution ; 10 A1 d'une solution de MTT à 5 mg/ml dans PBS sont ajoutés à chaque puits ; la microplaque est incubée 6 h à 20 C ; 100 F1 d'HCl 0,04 N dans isopropanol sont ajoutés dans chaque puits ; la plaque est agitée 10 minutes ; la DO (densité optique) est lue à k = 570 nm contre k réf. = 630 mn. Seules des cellules vivantes peuvent réduire le MTT en formazan. A un instant donné et dans un état physiologique donné, la quantité de formazan formée (DO 570 nm/DO 630 nm) est directement proportionnelle au nombre de cellules viables en culture. Cette linéarité est respectée sur 24 h pour une gamme de 0,1 à 1,5.106 cellules viables/ml. La capacité des cellules à réduire le MTT (dDO/d nombre de cellules viables) est spécifique d'une population de cellules donnée, dans un état physiologique donné. Cette capacité varie au cours des cultures. Ce test apporte donc une indication globale sur le nombre, l'activité et la viabilité des cellules en culture ; il permet de distinguer entre mort, survie et prolifération des cellules ; il permet de mesurer une activation cellulaire, même en l'absence de prolifération. Les cellules de coeur d'huître C. gigas ont été cultivées, en cultures primaires à partir d'explants, ou bien en cultures secondaires, dans des milieux différents, respectivement a) le milieu de base b) le milieu de base additionné de 10% V/V de solution stock de supplément défini FP(1) c) le milieu de base additionné de 10% V/V de solution stock de supplément défini FP(1), et de 10% V/V de supplément indéfini (sérum de veau foetal). Le comportement des cellules dans ces différents milieux a été déterminé - sur les cellules en culture primaire, par l'observation de la morphologie cellulaire, l'évaluation de la migration et du rendement cellulaire total, et l'évaluation de la viabilité et de l'adhérence cellulaire. - sur les cellules en culture secondaire, par la mesure de la capacité des cellules à réduire le MTT (test MTT pratiqué selon le protocole décrit ci-dessus), ainsi que par l'observation de la morphologie cellulaire, l'évaluation de la densité, de la viabilité et de l'adhérence cellulaire. Les résultats sont les suivants 1) Capacité des cellules à réduire le MTT - En présence de 10% de supplément FP(1) la capacité des cellules à réduire le MTT augmente de 25 à 30% - En présence de 10% de supplément FP(1) + 10% de sérum de veau foetal, la capacité des cellules à réduire le MTT augmente de 100%. 2) Autres caractéristiques des cultures cellulaires En présence de 10% de FP(1) ou bien de 10% de FP(1) + 10% de SVF, la densité cellulaire n'augmente pas significativement : il n'y a pas de prolifération cellulaire significative ; en revanche, la supplémentation par 10% de FP(1) + 10% de SVF prolonge la durée de survie des cultures secondaires : il reste environ 40% de cellules survivantes au bout de 15 jours de culture, alors qu'il en reste moins de 30% lorsque les cultures sont effectuées dans le milieu de base sans supplément les cultures secondaires en présence de 10% de SVF preuvent être maintenues en survie pendant plus de 3 mois. I1 apparaît donc que le supplément conforme à l'Invention, augmente l'activité mitochondriale des cellules en culture in vitra. Le supplément conforme à l'Invention agit en outre en synergie avec d'autres suppléments tels que le sérum de veau foetal. L'activation métabolique ne s'accompagne pas de la prolifération des cellules. I1 apparaît donc que le supplément pour milieu de culture conforme à l'Invention permet d'améliorer la viabilité de cultures de cellules adultes différenciées de invertébrés marins. REVENDICATIONS 1) Composition utilisable comme supplément pour un milieu de culture cellulaire convenant à la culture des invertébrés marins, en particulier des mollusques, laquelle composition est caractérisée en ce qu'elle comprend, au moins une hormone choisie dans le groupe comprenant l'insuline, les IGF (Insuline like Growth Factors), l'hydrocortisone et les glucocorticoi des, au moins un facteur de croissance choisi dans le groupe comprenant 1'EGF (Epidermal Growth Factor), le FGF (Fibroblast Growth Factor) et le PDGF (Platelet Derived Growth Factor), au moins une substance ou un extrait lipidique choisie dans le groupe comprenant l'Ex-Cyte VLE, l'extrait de jaune d'oeuf, et la prostaglandine F2a, et au moins un détoxifiant choisi parmi les inhibiteurs de radicaux libres. 2) Supplément pour cultures cellulaires selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend entre 10 et 100 Rg/ml d'insuline bovine, entre 10-6 et M 4 M d'hydrocortisone, entre 5 et 50 ng/ml de EGF, entre 1 et 25 ng/ml de PDGF, entre 0,2 et 2% (V/V) d'extrait de jaune d'oeuf, entre 0,05 et 0,28 d'Ex-cyte VLE, entre 10-9 et 2 x l08M de prostaglandine F2a, entre 10 et 100 Rg/ml de catalase. 3) Milieux de cultures cellulaires adaptés à la culture de cellules d'invertébrés marins, lesquels milieux sont caractérisés en ce qu'ils comprennent un milieu de base comprenant des sels minéraux, des sucres, des acides aminés, des vitamines auquel est additionné un supplément pour cultures cellulaires selon la Revendication 1. 4) Milieux de cultures cellulaires selon la Revendication 3, caractérisés en ce qu'ils comprennent en outre un supplément choisi dans le groupe constitué par le sérum de veau foetal ou l'hémolymphe d'huître.