FR 2692148 A1 19931217 FR 9207126 A 19920612 COMPOSITION ADJUVANTE L'IMNUNITE HUMORALE ET A NEDIATION CELLULAIRE N'INDUISANT PAS DE REPOSE VIS A-VIS DE DETERNINANTS AUTO-ANTIGENIQUES L'adjuvant Complet de Freund (ACF) est le plus fort immuno-adjuvant connu capable d'augmenter les réponses immunitaires spécifiques humorales et à médiation cellulaire vis-à-vis d'un antigène. I1 se compose de mycobactéries administrées dans une émulsion eau dans l'huile minérale. l'emploi de cet adjuvant en clinique humaine ou vétérinaire est exclu, car il induit des réactions secondaires importantes, notamment induction de polyarthrites et sensibilisation à la tuberculine. I1 est déjà connu que l'on peut reproduire les effets adjuvants sans les effets secondaires des mycobactéries en les remplaçant par une petite molécule de 500 daltons, la N-acétyl muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine, souvent abréviée comme MurNac-L-Ala-D-isoGln, encore dénommée "Muramyl-dipeptide" ou "MDP". Cette molécule consiste en un élément de structure de la paroi mycobactérienne. De nombreux analogues du MDP présentent aussi des activités adjuvantes comme le MDP, ils peuvent être produits par synthèse chimique. Ces analogues, souvent dénommés "Muramyl-peptides" sont en général dérivés du MDP par l'une ou plusieurs des modifications suivantes - remplacement du résidu du L-alanyle de la chaîne peptidique par un autre résidu L-aminoacyle ou par le résidu glycyle, - substitutions sur l'un au moins des groupes carboxyle du résidu D-glutamyle, - substitutions sur les positions 1, 4 et 6 du groupe muramyle. Ces substitutions s'accompagnent parfois d'une modulation des propriétés adjuvantes du MDP. Par exemple les dérivés lipophiles du Muramyl peptide sont souvent de plus forts adjuvants que les dérivés hydrophiles. D'autres types de modifications de la molécule de MDP peuvent cependant altérer le spectre de ses propriétés biologiques de façon plus considérable. Par exemple --et à la notable exception de la N-acétyl muramyl-L- (méthyl) alanyl-D-isoglutamine-- des substitutions du résidu L-alanyle de la chaîne peptidique s'accompagnent le plus souvent de la perte des propriétés adjuvantes du muramyl peptide modifié correspondant. Le remplacement dans le MDP du résidu L-alanyle par un résidu D-alanyle, pour obtenir le "NDP-DD", entraîne même l'apparition de propriétés contraires. Cette molécule est alors douée de propriétés anti-adjuvantes ou immuno-suppressives. Mais pour en revenir aux muramyl peptides doués de propriétés adjuvantes, il est également connu que leur administration avec un antigène dans une émulsion eau dans l'huile minérale permet l'obtention de très fortes réponses spécifiques humorales et à médiation cellulaire. Cette activité est spécialement recherchée dans le cas de certains vaccins prophylactiques ou thérapeutiques destinés à lutter contre des maladies spécialement graves. Parmi ces maladies, on peut citer des maladies virales comme le SIDA, et différents types de cancers dont on sait déterminer les antigènes spécifiques de la tumeur. Dans tous les cas cités, il est nécessaire d'induire de hauts niveaux de réponse humorale et aussi à médiation cellulaire.Ces niveaux de réponses pourraient être obtenus en utilisant de l'Adjuvant Complet de Freund ou plutôt des dérivés lipophiles du NDP, en émulsion eau dans l'huile afin d'éviter les effets secondaires dûs à l'adjuvant complet de Freund. Mais ici s'ajoute un risque qui est lié à la composition des préparations vaccinantes. En effet, celles-ci peuvent contenir des auto-antigènes, c'est-à-dire des structures susceptibles de provoquer une maladie auto-immune. C'est ainsi que a) le virus du SIDA utilisé dans certains vaccins a été cultivé sur des cellules humaines ou des lignées cellulaires dérivées de cellules humaines. Même après purification il y a un risque potentiel de présence d'auto-antigènes dans la préparation vaccinale. b) certains "vaccins anti-cancer", qui font déjà l'objet d'essais cliniques, contiennent des structures comportant à la fois des déterminants antigéniques spécifiques de la tumeur et des déterminants antigéniques du tissu naturel de l'hôte. Or c'est dans le cas de ces pathologies particulièrement graves que le clinicien voudrait être à même d'induire chez l'hôte de fortes réponses humorales et à médiation cellulaire, mais à l'encontre des seuls déterminants antigéniques spécifiques des agents pathogènes qui en sont la cause (cas du SIDA) ou des déterminants antigéniques tumoraux. De telles réponses sont spécialement recherchées dans le cas de certains vaccins prophylactiques ou thérapeutiques destinés à lutter contre des maladies spécialement graves, parmi lesquelles des maladies virales comme le SIDA, et différents types de cancers, lorsque l'on sait identifier les antigènes spécifiques de la tumeur.Mais dans ces exemples on voit que si l'on induit une très forte réponse immunitaire vis-à-vis des structures susceptibles d'évoquer une réponse protectrice, on risque d'induire également une réaction auto-immune liée à une réaction vis-à-vis des structures de l'hôte présentes dans la composition administrée contenant le vaccin. C'est ce que l'on observe effectivement dans des modèles expérimentaux où des auto-antigènes sont administrés avec un adjuvant de type "Adjuvant Complet de Freund", ou un adjuvant incomplet de Freund (AIF) contenant du MurNac-L-Ala-D-isoGln 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycérol ou "MDP-GDP". C'est pourquoi il est tout à fait inattendu qu'une molécule de la famille des Nuramyl-peptides lipophiles se soit révélée douée de propriétés uniques. En effet le N-acétyl-muramyl-D-alanyl D-(-(Sn dipalmytoyl)glycérol > isoglutamine (Mur Nac-D-Ala-DîsoGln 1,2 -dipalmitoyl-sn-glycérol ou MDP DD-GDP) est aussi fortement adjuvant que les autres Muramyl-peptides lipophiles, en particulier lorsqu'il est administré sous forme de dispersion eau dans l'huile et quand son action s'exerce vis-à-vis de déterminants antigéniques étrangers à l'hôte. En revanche, même lorsqu'il est administré dans une émulsion eau-dans-l'huile, il n'induit pas de maladie auto-immune liée à une réponse vis-à-vis de déterminants auto-antigéniques. Le MDP-DD-GDP, de formule est une molécule en soi connue. I1 est fait plus spécifiquement référence au brevet européen n 85.400921.4/0165123 dans lequel est décrit un procédé pour sa préparation. Ce brevet était plus particulièrement relatif à une classe de molécules, parmi lesquelles le MDP-DD-GDP, choisies en raison de leur action d'activation des macrophages. L'invention concerne donc plus particulièrement une composition pharmaceutique mettant en oeuvre le MDP-DD-GDP pour son application en tant qu'adjuvant susceptible d'induire une réponse sélective vis-à-vis d'antigènes étrangers à l'organisme de l'hôte (hétéro-antigènes) en l'absence de toute induction de maladie auto-immune liée à une réponse vis-à-vis de déterminants auto-antigéniques. Bien que cette action puisse se manifester à l'occasion d'une administration sous forme d'une solution aqueuse monophasée, il est préférable de le mettre en oeuvre sous la forme d'une dispersion biphasée, injectable, à base d'une solution aqueuse et d'un constituant hydrophobe pharmaceutiquement acceptable. Ce constituant est souvent de nature lipidique. Mais plus généralement le constituant hydrophobe pharmaceutiquement acceptable intervenant ou devant intervenir dans la constitution de la dispersion biphasée susdite est choisi de telle façon que sa présence au sein de la dispersion contenant le MDP-DD-GDP induise un renforcement de la réponse humorale ou de la réponse à médiation cellulaire, ou de préférence des deux à la fois, chez l'hôte receveur vis-à-vis de l'antigène vaccinant administré à l'hôte en présence du MDP-DD-GDP. Ce constituant hydrophobe consistera le plus souvent en une huile minérale, par exemple huile de paraffine, ou végétale. Des émulsions eau dans l'huile végétale utilisables pour la constitution de compositions adjuvantes sont décrites, par exemple dans le brevet français ne7504003. Le composé hydrophobe peut aussi être à la base de lipides susceptibles de former des liposomes. Référence est de nouveau faite au brevet européen n"0165123 déjà identifié plus haut, pour ce qui concerne la constitution de tels liposomes. I1 peut encore être formé d'un détergent hydrophobe. Le composé hydrophobe peut aussi être à base de polymères polyoxylènepolyoxypropylène, tels que ceux connus sous la marque PLURONIC et/ou d'esters polyoxyéthyléniques du sorbitane, notamment de ceux commercialisés sous la marque TWEEN 20.Le composé hydrophobe peut également être formé par des microsphères, ayant des tailles normalement inférieures à 7 microns. L'invention présente un intérêt tout particulier, lorsqu'elle est appliquée à l'induction d'une réponse vaccinante et plus généralement immunogène à l'égard d'un antigène non dépourvu de déterminants antigéniques caractéristiques du soi ou susceptibles de croiser immunologiquement avec ces déterminants antigéniques. Ceux-ci peuvent soit appartenir à l'antigène vaccinant, soit être associés à lui dans des conditions faisant obstacle à une purification complète préalable de l'antigène vaccinant. On l'a vu, cette situation, peut se présenter chaque fois que l'antigène vaccinant a été produit, par exemple dans des cellules humaines ou animales (par exemple virus inactivés ou fractions de virus cultivés dans ces cellules). L'invention trouve une application particulièrement intéressante dans la constitution -ou pour la production- de compositions pharmaceutiques vaccinantes contenant un virus HIV inactivé, ou un antigène anti-tumoral ou encore certains antigènes parasitaires susceptibles de donner lieu à des réactions croisées avec certaines structures de l'hôte. I1 va de soi que chaque fois qu'une préparation de l'antigène vaccinant implique un risque de présence de déterminant auto-antigénique ou croisant avec les déterminants du soi à l'issue de cette préparation, il convient de le considérer comme "principe vaccinant non totalement dépourvu de constituants autoantigéniques". En particulier l'invention trouve une application avantageuse en combinaison avec tout virus ou fraction de virus obtenu par culture dans des cellules humaines ou de mammifères, ou encore avec tout antigène dont les conditions d'obtention introduisent un risque de contamination par des éléments de structure appartenant à des cellules humaines ou de mammifères en particulier des cellules de la lignée blanche. I1 est entendu que la composition pharmaceutique telle qu'elle est vient d'être définie peut être préparée de façon extemporanée. Par ailleurs, si l'antigène est souvent administré en même temps que les autres constituants de la composition pharmaceutique, l'invention ne saurait être limitée à ce cas de figure précis. L'administration du MDP-DD- GDP sous forme de dispersion biphasée d'une part, et celle de l'antigène vaccinant, d'autre part, peuvent également être faites de façon non simultanée, la seule condition étant que les intervalles de temps qui s'écoulent entre ces administrations distinctes soient tels que l'effet d'adjuvant immunologique de la préparation contenant le MDP-DD-GDP à l'égard de l'antigène vaccinant puisse se manifester. En d'autres termes l'expression "composition pharmaceutique" telle qu'elle est utilisée ci-dessus, couvre aussi bien des compositions formées à partir des divers constituants nommés et se trouvant dans un stade de prémélange, que l'ensemble de ces différents constituants pris isolément mais réunis au(x) moment(s) de leur (s) administrations (s) respective (s) aux patients (humains ou animaux) dans des conditions permettant l'obtention des résultats sus-indiqués. Les proportions relatives dans l'émulsion de la solution aqueuse et du constituant hydrophobe sont choisies de façon telle qu'une émulsion suffisamment stable, notamment au moment de l'administration, soit susceptible d'être formée entre la solution aqueuse et le constituant hydrophobe. En particulier, lorsque le constituant hydrophobe est constitué par une huile minérale, la proportion de cette dernière sera de préférence de 50 % à 90 % (volume/volume) par rapport à la totalité du mélange. I1 va de soi que ces intervalles ne sont indiqués qu'à titre d'exemples. Ils n'ont aucun caractère limitatif. L'invention sera encore davantage illustrée par les exemples qui suivent. Comme on pourra le constater, les tests mis en oeuvre sont d'une très grande sévérité, puisque le animaux recevant la préparation capable d'induire une auto-immunisation sont frappés de paralysie et meurent. Exemple 1: Absence d'induction d'une maladie auto-immune (l'encéphalomyélite allergique) chez le cobaye après administration de la protéine basique de myéline avec du MDP-DD-GDP en émulsion eau dans l'huile. La protéine basique de myéline est un autoantigène connu pour sa capacité à induire une réaction immunologique vis-à-vis de la myéline présente dans la moelle épinière et le cerveau. Les animaux sont des cobayes mâles Hartley. Ils reçoivent dans les coussinets des pattes arrières, 50 Sg de protéine basique. Les témoins négatifs reçoivent l'antigène dans une émulsion d'Adjuvant Incomplet de Freund (huile seule) et les témoins positifs dans une émulsion d'Adjuvant Complet (huile + mycobactéries). Les lots expérimentaux reçoivent l'adjuvant incomplet additionné de 50 g MDP-GDP (Mur-Nac-L-Ala-D-isoGln- GDP) ou de MDP-Thr-GDP (Mur-Nac-L-Thr-D-isoGln-GDP) ou de MDP-DD-GDP. Les animaux sont pesés toutes les semaines, les signes cliniques apparaissent après 10 jours et les animaux meurent entre le 12ème et 19ème jours. Après 3 semaines, on pratique des cuti-réactions sur les animaux sains et sur les animaux qui ont réchappé à la maladie. On prélève également du sang par ponction cardiaque afin de doser les anticorps par ELISA. Le tableau 1 fournit des indications sur le nombre d'animaux de chaque groupe qui s'est trouvé affecté des signes cliniques caractéristiques de l'encéphalomyélite allergique : perte de poids, paralysie des pattes arrières puis généralisée, incontinence. - le nombre d'animaux morts par groupe, - les titres en anticorps anti-protéine basique de myéline, - enfin, la présence de cuti-réaction positive (lorsqu'elle a été testée) chez les survivants. NT signifie "non-testé". On voit sur le tableau 1, que seuls le lot témoin négatif et le lot ayant reçu comme adjuvant le MDP DD-GDP échappent à la maladie. Néanmoins, les animaux ayant reçu le MDP-DD-GDP ont synthétisé des anticorps et ont eu des réactions cutanées positives, quand on a pratiqué une cuti-réaction avec la protéine basique. TABLEAU 1 Signes Morts/ Titre Cuti Imnunisation cliniques Total Anticorps réactions Protéine basique + AIF 0/5 0/5 5.000 0 Protéine basique + ACF 8/8 6/8 17.000 NT Protéine basique + AIF + MDP-GDP 10/11 5/11 22.000 Protéine basique + AIF + MDP-L-Thr-GDP 6/6 6/6 NT NT Protéine basique + AIF + MDP-DD-GDP 0/11 0/11 15.000 ++ Sur le tableau 2, on voit l'évolution du poids. La moyenne des poids est donnée pour chaque lot. TABLEAU 2 Semaine Semaine Semaine Semaine Imnunisation 1 2 3 4 Protéine basique + AIF 510 537 620 695 Protéine basique + ACF 500 560 425 450 ** Protéine basique + AIF + MDP-GDP 480 550 546 480 * Protéine basique + AIF + MDP-L-Thr-GDP 480 549 466 - Protéine basique + AIF + MDP-DD-GDP 490 568 638 685 * : 2 survivants ** : 3 survivants On constate à l'examen de ce tableau que l'injection de la protéine basique ne s'accompagne pas d'une perte de poids, bien au contraire, des animaux traités, lorsque ceux-ci n'ont reçu en sus de la protéine basique, que 1'AIF, ou à la fois 1'AIF et le MDP-DD-GDP, alors que l'on enregistre une perte de poids (dans la mesure où d'ailleurs les animaux survivent) chez ceux des animaux qui ont reçu en sus de la protéine basique, soit de 1'ACF, soit de 1'AIF et du MDP-GDP, soit encore de 1'AIF et du MDP-Thr-GDP. Exemple 2: Absence de synergie toxique entre le MDP-DD-GDP et les endotoxines; Des souris Swiss femelles de 25 g reçoivent par la voie veineuse de l'eau physiologique, soit seule (témoin négatif), soit contenant des dérivés lipophiles du MDP à la dose de 300 g. Deux heures plus tard elles reçoivent toujours par voie veineuse 25 yg d'endotoxine (lipopolysaccharide de S. Enderitidis). On voit sur le tableau 3 que le MDP-GDP a sensibilisé les souris à l'administration d'endotoxine contrairement au MDP-DD-GDP et au MDP Thr-GDP. TABLEAU 3 Molécule testée (300gag) LPS Norts/Total après 24h 25 Ag 0/12 MDP-GDP 25 Ag 12/12 NDP-Thr-GDP 25 gg 0/12 MDP-DD-GDP 25 ?g 0/12 Exemple 3: Les dérivés lipophiles ont été testés (selon la méthode décrite dans la Pharmacopie Européenne) pour leur activité pyrogène et le MDP-DD-GDP s'est révélé 10 fois moins pyrogène que le MDP-GDP. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique exerçant une action adjuvante sélective de l'immunité mettant en oeuvre une réponse humorale ou une réponse à médiation cellulaire, de préférence les deux à la fois, à l'encontre d'antigènes déterminés, en l'absence de toute induction de maladie auto-immune liée à une réponse vis-à-vis de déterminants auto-antigéniques, caractérisé en ce que le principe adjuvant de cette composition pharmaceutique est constitué par le MDP-DD-GDP de formule 2. Procédé selon la revendication 1, appliqué à la préparation d'une composition de vaccin contre un agent pathogène auquel correspondent les susdits antigènes, cette composition contenant alors ces antigènes. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, pour la production de compositions vaccinantes contre un agent pathogène non dépourvu de déterminants antigéniques caractéristiques du soi ou de déterminants antigéniques susceptibles de croiser immunologiquement avec des structures du soi. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'antigène est un virus ou une fraction de virus obtenu par culture dans des cellules humaines ou de mammifères. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'antigène est un antigène dont les conditions d'obtention introduisent un risque de contamination par des éléments de structure appartenant à des cellules humaines ou de mammifères, en particulier des cellules de la lignée blanche. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'antigène est un virus HIV atténué ou un antigène vaccinant de ce virus. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'antigène est un antigène antitumoral. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'antigène est un antigène de parasite susceptible de donner lieu à des réactions immunologiques croisées avec certaines structures de l'hôte. 9. Composition pharmaceutique mettant en oeuvre le MDP-DD-GDP de formule au sein d'une dispersion biphasée, injectable, à base d'une solution aqueuse et d'un constituant hydrophobe pharmaceutiquement acceptable. 10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que le MDP-DD-GDP s'y trouve en association avec un antigène vaccinant. 11. Composition selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que le constituant hydrophobe consiste en une huile minérale, par exemple huile de paraffine, ou végétale. 12. Composition selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que le constituant hydrophobe est à base de lipides susceptibles de former des liposomes. 13. Composition selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que le composé hydrophobe est à base de polymères polyoxylène-polyoxypropylène, tels que ceux connus sous la marque PLURONIC et/ou d'esters polyoxyéthyléniques du sorbitane, notamment de ceux commercialisés sous la marque TWEEN 20. 14. Composition selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisée en ce que l'antigène est un antigène non dépourvu de déterminants antigéniques caractéristiques du soi ou un antigène susceptible de croiser immunologiquement avec ces déterminants antigéniques du soi. 15. Composition selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisée en ce que le constituant hydrophobe pharmaceutiquement acceptable est choisi de telle façon que sa présence au sein de la dispersion contenant le MDP-DD-GDP induise chez l'hôte receveur un renforcement de la réponse humorale ou de la réponse à médiation cellulaire ou, de préférence, les deux à la fois. 16. Composition selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisée en ce que l'antigène est un virus HIV atténué ou un antigène vaccinant de ce virus. 17. Composition selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisée en ce que l'antigène est un antigène antitumoral. 18. Composition selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisée en ce que l'antigène est un antigène de parasite susceptible de donner lieu à des réactions immunologiques croisées avec certaines structures de l'hôte. 19. Composition selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisée en que l'antigène est un virus ou une fraction de virus obtenu par culture dans des cellules humaines ou de mammifères. 20. Composition selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisée en ce que l'antigène est un antigène dont les conditions d'obtention introduisent un risque de contamination par des éléments de structure appartenant à des cellules humaines ou de mammifères, en particulier des cellules de la lignée blanche.