FR 2687664 A1 19930827 FR 9202082 A 19920224 Composés autoxydables, leur préparation, leur application au dosage de l'activité SOD et nécessaire pour sa mise en oeuvre. La présente invention concerne des nouveaux composés chimiques autoxydables et leur application au dosage de l'activité superoxyde dismutase (SOD). Elle a plus particulièrement pour objet des nouveaux composés chimiques autoxydables, définis plus loin, leur préparation, un procédé de dosage de l'activité SOD, notamment dans des échantillons biologiques, à l'aide de ces composés en tant que réactifs, ainsi que des nécessaires ou kits pour la mise en oeuvre de ce procédé de dosage. Les tissus des organismes aérobies et ceux de l'organisme humain en particulier, sont le siège d'une production continue d'ion superoxyde 2 -, qui résulte du processus de respiration cellulaire, ainsi que de nombreuses voies métaboliques essentielles. Cette production d'ion superoxyde augmente fortement lorsque ces organismes sont soumis à un "stress oxydant" d'origine toxicologique (hyperoxie, irradiation, intoxication par des xénobiotiques générateurs de radicaux libres, notamment) ou physiopathologique (inflammation, ischémie, reperfusion post-ischémique, notamment). I1 est admis par l'ensemble de la communauté scientifique que l'ion superoxyde est très toxique, bien que les mécanismes sous-jacents à cette toxicité restent sujets à controverse (référence 1). Pour se protéger contre les effets délétères de l'ion superoxyde, les organismes aérobies possèdent des systèmes enzymatiques, les superoxyde dismutases (SOD), qui catalysent la dégradation de l'ion superoxyde selon la réac tion de dismutation suivante 2 02 e - + 2 H H202 + 2 Compte tenu du rôle protecteur majeur de cette réaction de dismutation vis-à-vis de la toxicité de l'ion superoxyde, l'activité catalytique des SOD intra- et extracellulaires conditionne la survie des tissus d'un organisme aérobie (références 2 à 5). Le dosage de l'activité SOD présente donc un intérêt majeur pour les chercheurs biologistes comme pour les laboratoires de Chimie Clinique, à condition de pouvoir être réalisé à l'aide d'une méthode sensible, spécifique, rapide et peu complexe. De nombreuses méthodes de dosage de l'activité SOD ont été publiées et critiquées (références 6 à 10), mais il est généralement admis qu'il n'existe toujours pas de compromis satisfaisant entre fiabilité et complexité des méthodes existantes, car la mesure d'une activité SOD pose deux problèmes majeurs qu'aucune des méthodes publiées à ce jour n'a permis de résoudre de façon simple. Le premier problème est celui de la décomposition spontanée de l'unique substrat, l'ion superoxyde, qui est très rapide à pH voisin de 7, et qui bien que fortement ralentie, reste significative à pH 9, pH au-delà duquel certains types de SOD naturelles sont rapidement inactivées. L'obtention d'une concentration stationnaire suffisamment stable requiert donc la présence d'une source dynamique d'ion superoxyde dans la solution de dosage. Les sources électrolytiques requièrent un équipement complexe et une préextraction du catalyseur SOD, ce qui est prohibitif en Chimie Clinique. Les sources photochimiques telles que la riboflavine conduisent à des méthodes non standardisables et de mise en oeuvre complexe. Les sources enzymatiques telles que la xanthine oxydase requièrent des solutions à préparer extemporanément. Elles sont chères, source d'artéfacts et difficilement au tomatisables. Les sources purement chimiques se réduisent à des composés autoxydables tels que la 6-hydroxydopamine, le pyrogallol, l'hydroxylamine ou l'ion sulfite, dont l'autoxydation est généralement inhibée par la SOD. Ces réactifs chimiques donnent rarement des résultats précis et sensibles sur extraits biologiques bruts, et ils requièrent la préparation extemporanée d'une solution anaérobie de réactif; leur utilisation est donc difficilement automatisable. Le second problème tient au fait qu'il est difficile de mesurer directement (dosage "direct") la disparition du substrat superoxyde 02 e - en fonction du temps, ou l'apparition de ses produits de dismutation, l'eau oxygénée H2 2 (peroxyde d'hydrogène) et l'oxygène, compte tenu des concentrations et des pH accessibles dans les conditions d'un dosage d'activité SOD. La seule méthode spectrophotométrique "directe" est celle de MARKLUND (références 11 et 12) qui mesure la vitesse de disparition de l'ion superoxyde à pH 9,5, ce qui ne permet pas le dosage de toutes les SOD naturelles. Cette méthode requiert un spectrophotomètre rapide. Les fortes concentrations d'ion superoxyde et la longueur d'onde (250 nm) utilisées rendent la méthode peu précise, ce qui oblige l'expérimentateur à faire plusieurs mesures pour obtenir une valeur moyenne. De plus, il est nécessaire d'ajouter de la catalase pour éviter l'inactivation de la SOD-Cu/Zn, et il faut repréparer une nouvelle solution de superoxyde de potassium immédiatement avant chaque dosage. Cette méthode spectrophotométrique directe est donc délicate à mettre en oeuvre, et il ne semble pas possible de l'améliorer de façon significative. Le corollaire est que les méthodes populaires, c'est-à-dire auxquelles on a le plus souvent recours, sont généralement indirectes : elles reposent sur la compétition entre l'activité SOD que l'on cherche à mesurer, et la réaction de l'ion superoxyde avec un piégeur chromogène tel que le cytochrome C ferrique ou le nitrobleu de tétrazolium (NBT), dont le produit réactionnel peut être mesuré par spectrophotométrie UV/visible. Un piègeur chimiluminescent, tel que le luminol ou la lucigénine, peut également être utilisé avec une plus grande sensibilité de la mesure, mais les problèmes d'interférences et de disponibilité instrumentale excluent l'utilisation de telles méthodes par un laboratoire non spécialiste. Outre la spécificité souvent insuffisante des réactifs chromogènes vis-à-vis du superoxyde, le principal inconvénient des dosages par compétition est qu'ils requièrent une linéarisation des valeurs d'inhibition (par la SOD), sur 5 ou 6 prises d'échantillons de dilutions croissantes. Enfin, on connaît un certain nombre d'immunodosages de SOD-Cu/Zn ou de SOD-Mn. Certains sont très sensibles, mais ils ne renseignent pas sur l'activité enzymatique de l'échantillon qui dépend notamment du degré d'inactivation éventuelle de l'enzyme. Ils sont par ailleurs longs à mettre en oeuvre et relativement complexes. Artéfacts de mesure et démultiplication du dosage sont donc intrinsèquement liés à toutes les méthodes spectrophotométriques accessibles à la plupart des laboratoires, ce qui ne satisfait pas les besoins des laboratoires de recherche et reste incompatible avec les impératifs de standardisation de la Chimie Clinique. Si l'on a recours à la spectrophotométrie UV/visible, il semble difficile, voire impossible, de mettre au point une méthode de dosage qui soit à la fois sensible, plus spécifique, plus simple et plus fiable que les méthodes existantes, sans avoir recours au suivi en cinétique d'une réaction activée par l'activité SOD plutôt qu'à celui d'une réaction inhibée par l'activité SOD ou à une méthode "directe". A cet égard, une méthode récente (références 13 et 14), utilisant un colorant autoxydable, l'hématoxyline, se distingue des autres, dans la mesure où elle exploite une activation de l'autoxydation du réactif par l'activité SOD. En effet, l'hématoxyline s'autoxyde à pH > 6,5 (référence 13). La vitesse d'autoxydation augmente d'un facteur proche de 100 entre pH 7 et 9. La SOD inhibe cette autoxydation à pH 8,1. Cette observation a conduit à la mise au point d'un dosage, basé sur le suivi spectrophotométrique de la formation dthématéine à 560 nm, qui est accélérée par la SOD à pH alcalin. La mise en oeuvre de cette méthode est délicate du fait de l'instabilité du réactif et elle reste tributaire d'une phase de préparation de l'échantillon (dialyse) pour éliminer les interférences dues à la présence de composés réducteurs, comme par exemple le glutathion. Par ailleurs, l'instabilité du produit d'oxydation mesuré, l'hématéine, et la faible sensibilité du dosage 8,1), liée en partie à la décomposition de lthématéine, mais également à la présence de deux sites d'oxydation (catéchols) potentielle, limitent l'intérêt et l'exploi- tation de cette méthode. En conclusion, la méthode à l'hématoxyline, bien que présentant un certain intérêt, présente des inconvénients rhédibitoires qui ne permettent pas son utilisation générale pour le dosage de l'activité SOD, en particulier dans des échantillons biologiques. La présente invention a notamment pour buts de - disposer d'un réactif stable hors des conditions de mesure, et dont le produit d'autoxydation soit stable pendant. la mesure - augmenter la sensibilité du dosage par rapport à une méthode utilisant 1'hématoxyline (dans des conditions d'activation de l'autoxydation) - pouvoir éliminer les interférences éventuelles les plus probables telles que celles liées à la présence de mercaptans comme le glutathion, par exemple - mettre au point un procédé utilisant un milieu réactionnel de pH inférieur ou égal à 9, de façon à permettre un dosage de l'activité des SOD connues, sans risque d'inactivation rapide. Ces buts sont atteints selon l'invention qui fournit des réactifs chimiques originaux, présentant la propriété de s'autoxyder dans une solution oxygénée, pour conduire à un produit chromophorique dont la cinétique d'apparition est augmentée en présence d'un catalyseur du type SOD. La structure de ces réactifs est caractérisée, en particulier, par un cycle aromatique à fonction catéchol, lié par l'intermédiaire d'un carbone benzylique tertiaire à un cycle aromatique, substitué par un groupement électrodonneur. Le produit d'autoxydation de ces réactifs présente une longueur d'onde d'absorption très différente de celle caractérisant le réactif lui-même et toujours supérieure ou égale à 500 nm. L'invention fournit également un procédé mettant en oeuvre ces réactifs, -qui permet de doser l'activité SOD de tout catalyseur en milieu aqueux, à l'aide d'une seule mesure d'absorption W/visible et dont la simplicité de mise en oeuvre est nettement supérieure à celle des autres méthodes spectrophotométriques préalablement décrites. L'invention fournit en outre un procédé de dosage de l'activité SOD du type décrit ci-dessus, en présence de mercaptans, grâce à l'utilisation d'un réactif rapide des groupements thiols qui permet d'éliminer les interférences correspondantes, en particulier celles qui sont dues à la présence de glutathion ou d'albumine dans l'échantillon. Selon l'un de ses aspects, l'invention a pour objet les composés répondant à la formule générale I dans laquelle n = 1 ou 2, R1 = -OR4 ou -NR5R6, R2 = hydrogène, -OR4, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), ou bien -CH2- ou -CH2-CH2-, pour former un cycle par liaison avec le substituant phényle, en position méta par rapport à R1 et R3 = hydrogène, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone) ou -OR4 (à condition que R2 soit différent de -OR4), avec R4 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), R5 = hydrogène, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), -CH2COOH, -C6HsCOOH ou -C6HsSO3H et R6 = hydrogène, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone) ou -CH2COOH. Les composés répondant à la formule générale I définie ci-dessus peuvent être préparés selon les procédures générales décrites plus loin, ' généralement à partir de produits commerciaux. Toutefois, les composés dans lesquels R5 représente - C6HsCOOH ou -C6HsSO3H sont obtenus à partir du synthon de type parabromodiphénylamine substitué de façon appropriée. Ce synthon est préparé selon la procédure générale suivante. Le paranitrophénol est alkylé au moyen d'un ester de l'acide chloroacétique. Le dérivé obtenu est saponifié, puis amidifié avec de la parabromoaniline. L'amide correspondant est soumis à la réaction de Smiles (référence 15) pour conduire au dérivé diphénylaminé correspondant. Ce dernier est réduit, diazoté et substitué de façon appropriée pour conduire au synthon désiré. Procédure générale de synthèse des composés de la série I (R2= hydrogène ou alkyle et RS = hydrogène ou alkyle) La 5,6-dihydroxindan-1-one ou la 6,7-dihydroxy-1tétralone (préparée à partir du vératrole), convenablement protégée par un groupe alkyle ou aralkyle comme par exemple le groupe méthyle ou benzyle, ou par un groupe de type silyle comme par exemple le groupe terbutyldiméthylsilyle, est traitée soit directement, soit après mono- ou bisalkylation préalable (de la position en a de la fonction cétone) à l'aide d'un agent alkylant tel que l'iodure de méthyle par exemple, par le réactif organomagnésien correspondant au bromure de phényle substitué en para par un groupement oxygéné, tel que par exemple le groupe méthoxy, ou azoté, tel que par exemple le groupe diméthylamino. Les intermédiaires, ainsi obtenus, sont réduits puis déprotégés pour conduire aux composés de la série I. Le schéma réactionnel qui suit illustre cette procédure. i : R1PhMgBr (R1 en position para) il : réduction puis déprotection iii : base, R2X iiii: base, R3X P : groupe protecteur Procédure générale de synthèse des composés de la série II (R2 ou R3 = -OR4). Ces composés sont obtenus par hydratation des alcènes, intermédiaires de synthèse des composés de la série I, après hydroboration et oxydation; puis les alcools ainsi obtenus sont éventuellement alkylés avec un halogénure d'alkyle comme par exemple l'iodure de méthyle, et enfin déprotégés. Le schéma réactionnel qui suit illustre cette procédure. i : 1) BH3 : 2) H202, NaOH ii : déprotection iii : base, R4X P : groupe protecteur Procédure générale de synthèse des composés de la série III (R2=-CH2- ou -CH2-CH2- formant un cycle par liaison avec le substituant phényle en position méta par rapport à R1) Pour synthétiser ces. composés, le produit de crotonisation entre le 3,4-dihydroxybenzaldéhyde, protégé de façon appropriée, et la 1-tétralone ou l'indan-1-one convenablement substituées, est soit directement, soit indirectement (après préparation de l'homologue supérieur par l'intermédiaire d'un dérivé cyclopropanique) réduit par hydrogénation catalytique en dérivé saturé correspondant. Ce dernier est cyclisé en présence d'acide polyphosphorique et l'alcène ainsi obtenu est réduit puis déprotégé pour conduire au composé de la série III recherché. Le schéma réactionnel qui suit illustre cette procédure. i : ii : réduction (ou préparation de l'homologue supérieur puis réduction) iii : acide polyphosphorique iiii : réduction iiiii : déprotection P : groupe protecteur Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé de dosage de l'activité superoxyde dismutase (SOD) dans un milieu liquide, procédé qui utilise l'activation de l'autoxydation d'un réactif par l'activité SOD, caractérisé en ce que ledit réactif est un composé répondant à la formule générale I définie ci-dessus. Lorsque le dosage de l'activité SOD doit être réalisé dans un milieu renfermant un ou plusieurs composés comprenant un ou plusieurs groupements thiol, tel que notamment un milieu biologique, le pouvoir réducteur de ces derniers est susceptible de provoquer des interférences qu'il convient d'éliminer. De telles interférences peuvent être facilement évitées en ajoutant au milieu dans lequel le dosage est effectué au moins un réactif choisi parmi les composés de types pyridinium et quinoléinium dont l'utilisation en tant que "piégeurs de mercaptans" fait l'objet de la demande de brevet français no. 91 14782 déposée le 29 novembre 1991 au nom de BIOXYTECH et qui a pour titre :" Réactifs piégeurs de mercaptans, leur préparation et leurs applications". Ces. réactifs répondent aux critères suivants - spécificité vis-à-vis des mercaptans dans les conditions opératoires utilisées, - rapidité de réaction, - non-interférence avec les autres réactifs utilisés dans le dosage de l'activité SOD. Plus précisément, selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé de dosage de l'activité superoxyde dismutase (SOD) dans un milieu liquide contenant un ou plusieurs mercaptan(s), notamment un milieu biologique, procédé qui utilise l'activation de l'autoxydation d'un réactif par l'activité SOD, caractérisé en ce que ledit réactif est un composé répondant à la formule générale I définie ci-dessus et en ce que le milieu contient en outre une quantité, capable de piéger totalement lesdits mercaptans par S-alkylation, d'au moins un composé répondant à la formule générale Il dans laquelle z1 = alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), benzyle, p nitrobenzyle, phényle, o,p-dinitrophényle, -CH2-COOH ou -CH2-CH2-COOH;; Z4 = hydrogène et Z5 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), ou Z4 et Z5 forment ensemble, avec les deux atomes de carbone intermédiaires, un cycle phényle; X= halogénure, sulfonate, fluorosulfonate, phospho nate, tétrafluoroborate ou tosylate; et soit z2 = vinyle, et Z3 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone) (composés 2-vinyliques), soit Z3 : vinyle, et z2 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone) (composés 4-vinyliques). On entend par "sulfonate" un anion de formule générale R-SO3 dans laquelle R représente par exemple trifluorométhyle. Ces composés sont en partie connus ou peuvent être synthétisés par analogie à des procédés utilisés pour la synthèse de composés connus. Ainsi les composés 2-vinyliques peuvent être synthétisés comme suit. Le dérivé initial (pyridine ou quinoléine substituée) est soumis à la méthode de Comins (référence 16), à l'aide de bromure de vinylmagnésium. Le composé ainsi obtenu est oxydé avec, par exemple, de la tétrachloro-l,4- benzoquinone (parachloranil) ou du soufre Sg. L'alkylation de l'azote hétérocyclique est réalisée à l'aide d'un agent alkylant, par exemple le tétrafluoroborate de triméthyloxonium, le sulfate de méthyle, le bromure de benzyle, le fluorodinitrobenzène, l'iodoacétate de sodium ou le 3-bromopyruvate de sodium, choisi selon la signification de Z1. L'exemple 9 de la partie expérimentale qui suit illustre la préparation d'un composé de ce type. Par ailleurs, les composés 4-vinyliques peuvent être synthétisés comme suit. L'aldéhyde hétérocyclique correspondant (fonction aldéhyde, -CHO, en position 4) est soumis à la réaction de Wittig, avec, par exemple, le bromure de triphénylméthylphosphonium, ou à la réaction de Peterson, avec, par exemple, le chlorométhyltriméthylsilane. L'alkylation de l'azote hétérocyclique est réalisée à l'aide d'un agent alkylant, par exemple le tétrafluoroborate de triméthyloxonium, le sulfate de méthyle, le bromure de benzyle, le fluorodinitrobenzène, l'iodoacétate de sodium ou le 4bromopyruvate de sodium, choisi selon la signification de Z1. L'exemple 10 de la partie expérimentale qui suit illustre la préparation d'un composé de ce type. Le procédé selon l'invention, notamment lorsqu'il met en oeuvre au moins un "piégeur de mercaptans" défini cidessus, permet de doser l'activité SOD de tout catalyseur en milieu aqueux, à l'aide d'une seule mesure d'absorption UV/visible dont la simplicité de mise en oeuvre est nettement supérieure à celle des méthodes spectrophotométriques préalablement décrites. Ce nouveau procédé de dosage constitue donc un outil de choix pour les recherches biologiques en général ainsi qu'en Chimie Clinique, en particulier pour l'élaboration de nécessaires ou kits de dosage ou de diagnostic. Dans ce dernier cas, ce dosage est susceptible d'apporter une information médicalement utile dans des états physiopathologiques tels que les maladies d'origine inflammatoire ou ischémique, les états de choc, les états infectieux, les maladies systémiques et les maladies autoimmunes, les tumeurs, les états de malnutrition, les maladies associées au vieillissement, les affections dégénératives, les anémies hémolytiques et les syndrômes d'intoxication par des polluants de l'environnement ou par des médicaments. Les échantillons humains sur lesquels cette méthode peut être utilisée sont notamment les érythrocytes, le plasma sanguin, les plaquettes, les globules blancs, le liquide synovial, le liquide céphalo-rachidien, l'urine ou tout extrait tissulaire. De plus, cette méthode de dosage peut être mise en oeuvre pour effectuer les études de pharmacocinétique nécessaires au développement et à l'utilisation de nouveaux médicaments présentant une activité SOD. Cette méthode de dosage peut également être utilisée pour le contrôle de qualité de préparations cosmétiques ou pharmaceutiques présentant une activité SOD. D'une façon générale, cette méthode de dosage peut être utilisée par les chercheurs, sur tout échantillonbio- logique ou toute solution artificielle susceptible de présenter une activité SOD. Selon un mode préféré de réalisation, le procédé de dosage de l'activité superoxyde dismutase d'un échantillon, notamment biologique, repose sur une mesure spectrophotométrique de la vitesse d'autoxydation d'un composé de formule générale I ci-dessus, en l'absence et en présence dudit échantillon. Plus précisément, selon un mode préféré de réalisation, l'invention a pour objet un procédé de dosage de l'activité superoxyde dismutase (SOD) dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à 10) déterminer la vitesse maximale d'autoxydation Vs d'un composé de formule générale I en présence de l'échantillon, au moyen de l'évolution de l'absorbance en fonction du temps, à la longueur d'onde caractérisant l'apparition du produit d'autoxydation du composé de formule générale I utilisé, dans un milieu réactionnel tamponné à une valeur de pH de 8,0 à 9,0, en déclenchant la réaction par ajout d'un aliquot d'une solution-mère du composé de formule générale I 20) déterminer, dans les mêmes conditions, la vitesse maximale d'autoxydation Vc du même composé en l'absence de l'échantillon ; et 30) déterminer la concentration en SOD de l'échantillon au moyen de la différence des mesures effectuées et d'une courbe d'étalonnage établie dans les mêmes conditions opératoires. Le milieu réactionnel est avantageusement constitué par un tampon aminé, comme par exemple le 2-amino-2méthyl-1,3-propanediol (AMPD), contenant de l'acide diéthylènetriaminepenta-acétique (DTPA) 0,1 mM et permettant de fixer le pH à une valeur comprise dans la gamme de 8,0 à 9,0, à la température de mesure, par exemple par un ajout de soude ou d'acide chlorhydrique, selon la nature du tampon considéré. Ce milieu réactionnel doit être équilibré à la température de travail et saturé d'air à cette température. La température de travail choisie, par exemple 370C, doit être maintenue constante pendant les mesures. La réaction est déclenchée par l'ajout dans le milieu réactionnel (avec ou sans SOD) d'un aliquot d'une solution-mère de l'un des composés de formule générale I dans une solution aqueuse ou dans un solvant organique miscible à l'eau, tel que par exemple l'acétonitrile, le diméthylformamide ou le diméthylsulfoxyde, ou encore dans un mélange d'un tel solvant organique avec de l'eau distillée. Pour s'affranchir d'une préparation extemporanée de cette solution-mère ou d'une préparation anaérobie de celle-ci, la solution-mère peut être préparée en présence d'un dérivé du bore, tel que l'acide borique par exemple, qui permet d'obtenir une solution de réactif stable pendant une durée qui dépend des concentrations respectives du réactif et du dérivé du borde, de la nature respective du réactif et de ce dérivé et des conditions de stockage de la solution-mère de réactif. Ainsi une solution du réactif BXT 01050 décrit ci-après (exemple 7), préparée dans le mélange diméthylsulfoxyde/eau distillée à 50/50 (volume/volume) contenant de l'acide borique, telle que le rapport des concentrations en acide borique et en réactif soit égal à 150, est stable au moins 1 mois si la solution est conservée entre 0 et 80C. Après homogénéisation de la solution, l'évolution de l'absorbance est enregistrée en fonction du temps, à la longueur d'onde caractérisant l'apparition du produit d'autoxydation du réactif utilisé (525 nm, par exemple, pour le réactif BXT 01050), afin de déterminer la vitesse maximale d'autoxydation. La détermination de l'activité SOD dans un échantillon biologique est effectuée en déterminant la différence des vitesses mesurées en présence (Vs) et en l'absence de l'échantillon (VC). Cette différence peut être reportée par exemple en ordonnée d'une courbe d'étalonnage qui a été établie dans les mêmes conditions opératoires à partir, par exemple, d'un standard de SOD. Cette courbe d'étalonnage peut être tracée en représentant, en fonction de la concentration du standard utilisé, la variation de la différence de vitesse d'autoxydation mesurée en présence (VSOD) et en absence de ce standard (Vc). Toutefois, selon un mode préféré de mise en oeuvre, cette courbe d'étalonnage est tracée en représentant la variation de l'inverse de la différence des vitesses en question, en fonction de l'inverse de l'activité du standard. Selon l'intensité de l'activité SOD à mesurer, la sensibilité du dosage dans la gamme de pH utilisée (8,0 à 9,0) est adaptable en modifiant par exemple un ou plusieurs des paramètres suivants : concentration en composé de formule générale I choisi, concentration du tampon et température de mesure. La vitesse d'autoxydation du réactif utilisé peut être modulée également en faisant varier la concentration d'un dérivé du bore dans le milieu réactionnel. L'existence, dans un échantillon, notamment biologique, de composés interférant avec le dosage se manifeste le plus souvent par une diminution de la vitesse mesurée en présence de l'échantillon, par rapport à celle mesurée en son absence. Dans le cas d'interférences liées à la présence de mercaptans, tels que par exemple le glutathion, l'introduction dans le milieu réactionnel d'un "réactif piégeur de mercaptans" tel que défini plus haut est alors nécessaire. Ainsi le tétrafluoroborate de 1,4,6-triméthyl-2- vinylpyridinium (composé de l'exemple 9), par exemple, sera incorporé à une concentration cinquante fois supérieure à celle du glutathion pour le dosage de l'activité SOD dans un lysat érythrocytaire. Si l'existence, dans un échantillon, notamment biologique, d'un composé susceptible d'introduire une activation artéfactuelle de l'autoxydation du composé de formule générale I ou composé chromogène est suspectée, une combinaison telle que celle décrite ci-dessous, qui fait intervenir une seconde mesure effectuée dans des conditions d'inhibition de l'autoxydation, doit être entreprise. De même, dans le cas de l'exploration de milieux, notamment biologiques, présentant une faible activité SOD, la sensibilité et la précision du dosage peuvent être accrues en combinant à la mesure faite dans des conditions d'activation de l'autoxydation, une mesure effectuée dans des conditions d'inhibition de l'autoxydation. L'invention a donc également pour objet un procédé du type décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comporte également une mesure effectuée dans des conditions d'inhibition de l'autoxydation. Le milieu réactionnel utilisé pour cette seconde mesure se distingue du milieu décrit précédemment par l'emploi d'un tampon à un pH compris dans la gamme de 7,2 à 7,8, notamment un tampon phosphate constitué par exemple par un mélange adéquat de dihydrogénophosphate de potassium et dthydrogénophosphate hydrogénophosphate dipotassique, toutes choses étant égales par ailleurs. On mesure, dans ces conditions opératoires, la vitesse maximale d'autoxydation du composé de formule générale I utilisé en absence (V'C) et en présence de l'échantillon (V's). La détermination de l'activité SOD dans l'échantillon est alors obtenue au moyen de (Vs - VC - V'S + V'C). Comme précédemment, la valeur obtenue peut être reportée en ordonnée d'une courbe d'étalonnage, qui a été établie dans les mêmes conditions expérimentales et qui donne la variation de (VS-VC-V'S+V'C) en fonction de la concentration du standard utilise. La nouvelle méthode de dosage selon l'invention utilisant comme réactif un composé de formule générale I est, de par son principe, une méthode de mesure spécifique de l'activité SOD. Elle est sensible, rapide et d'une mise en oeuvre aisée, et est de plus entièrement automatisable elle est donc adaptée au traitement de grandes séries d'échantillons, comme cela peut être le cas en Chimie Clinique. De plus, les interférences liées à la présence de mercaptans, fréquemment rencontrés dans les échantillons biologiques, sont facilement éliminées par l'utilisation d'au moins un "réactif piégeur de mercaptans" tel que défini plus haut, sans autre phase supplémentaire de traitement de I 'échantillon. Enfin, les conditions opératoires très modulables de ce procédé de dosage lui confèrent une souplesse d'emploi permettant de l'adapter à des échantillons, notamment biologiques, très divers et donc de prendre en compte les besoins particuliers éventuels de certains utilisateurs, comme cela est le cas en Recherche. Des exemples d'application du nouveau procédé de dosage de l'activité SOD à l'aide de quatre composés de formule générale I, dans le cas d'un lysat érythrocytaire sont donnés, à titre illustratif, dans la partie expérimentale qui suit. L'invention a également pour objet un nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre du procédé de dosage de la SOD selon l'invention. Ce nécessaire ou kit comprend essentiellement, en tant que réactif, un composé de formule générale I, telle que définie ci-dessus. Selon un mode avantageux de réalisation, le nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre du procédé de dosage de l'activité SOD selon l'invention comprend en outre un ou plusieurs composé(s) piégeur(s) de mercaptans, de formule générale II, telle que définie ci-dessus. Selon un mode préféré de réalisation, l'invention a également pour objet un nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre du procédé de dosage ' de l'activité SOD selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement - un composé de formule générale I en solution ou en poudre, en présence d'acide borique ou d'un dérivé de ce dernier, - un ou plusieurs composé(s) piégeur(s) de mercaptans de formule générale II, en solution ou en poudre, et - un tampon à base de AMPD, tamponnant dans la gamme de pH de 8,0 à 9,0. PARTIE EXPERIMENTALE I Préparation de composé de formule générale I Toutes les réactions sont effectuées sous atmosphère inerte d'azote, sauf indication contraire. Les spectres de masse (SM) sont enregistrés sur un appareil R10-10B de la Société Nermag. Le mode d'ionisation utilisé est soit l'impact électronique (IE) à 70 électronsvolts, soit l'ionisation chimique (IC). Les spectres 1H RMN sont enregistrés sur un appareil de type Gemini-200 de la Société VARIAN. Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm par rapport au tétraméthylsilane. Les multiplicités sont exprimées comme suit : "s" pour singulet; "d" pour doublet; "t" pour triplet et "m" pour multiplet. Les points de fusion (pF) sont enregistrés avec un appareil de la Société Gallenkamp et sont donnés non corrigés. A. Composés de la série I. Exemple 1 : Préparation du 5,6-dihydroxy-1-(4-hydroxyphényl)indane (BXTOiO4l) 5, 6-Diméthoxy-3- (4-méthoxyphényl) indène A une suspension de magnésium (0,24 g, 10 mmol) dans 5 ml de THF anhydre, on ajoute une petite portion de 4bromoanisole. le mélange est chauffé légèrement pour initier la réaction, puis le reste de dérivé bromé (1,87 g, 10 mmol), en solution dans 5 ml de THF, est ajouté goutte à goutte en 15 min. Après 1 h de reflux, le magnésium a disparu. Le mélange, ainsi obtenu, est refroidi à température ambiante et on ajoute une solution de 5,6diméthoxyindan-l-one (1,92 g, 10 mmol) dans 10 ml de THF anhydre. La solution brune obtenue est agitée pendant 20 h dans ces conditions puis hydrolysée par addition d'une solution saturée de NH4Cl. On extrait le mélange avec de l'AcOEt.Les phases organiques rassemblées sont lavées avec une solution aqueuse saturée de NaCl et séchées sur Na2SO4. Après évaporation du solvant, on obtient une huile jaune (3,43 g) qui est reprise par 5 ml d'acide acétique glacial. La solution est agitée 15 min à température ambiante puis chauffée à 700C pendant 15 min. La solution refroidie à OOC est versée lentement dans 50 ml d'une solution saturée de NaHCO3. On extrait le mélange avec de l'AcOEt. Les phases organiques rassemblées sont lavées avec une solution aqueuse saturée de NaHCO3, séchées sur MgSO4 et évaporées. Le produit brut (2,84 g) ainsi obtenu est purifié par chromatographie, en éluant avec un mélange AcOEt/hexane (1:3), pour fournir un solide blanc (1,97 g, 70 %). Caractéristiques physiques *pF : 111,0-112,00C (AcOEt/hexane=1:3). *RMN 1H (CDCl3) : 3,62 (d, J=2,16 Hz, 2H); 4,05 (s, 3H); 4,08 (s, 3H); 4,12 (s, 3H); 6,58 (t, J=2,16 Hz, 1H); 7,19 (d, J=8,67 Hz, 2H); 7,29 (s, 1H); 7,32 (s, 1H); 7,72 (d, J=8,67 Hz, 2H). *SM (IE): 282 (100), 267 (55), 251 (19), 181 (24), 165 (35), 152 (51), 84 (53). 5,6-Diméthoxy-1-(4-méthoxyphényl)indane Une solution de 5,6-diméthoxy-3- (4-méthoxyphényl)indène (1,5 g, 5,32 mmol) dans 60 ml d'éthanol est hydrogénée dans un autoclave en présence de palladium sur charbon (à 10 %, 25 mg) sous 5 bars d'hydrogène pendant 1,5 h. Après filtration du catalyseur, l'évaporation du solvant fournit une huile qui se solidifie progressivement (1,5 g, 100 %). Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDC13) : 1,99 (m, 1H); 2,45 (m, 1H); 2,90 (m, 2H); 3,72 (s, 3H); 3,79 (s, 3H); 3,87 (s, 3H); 4,24 (t, J=7,97 Hz, 1H); 6,48 (s, 1H); 6,82 (s, 1H); 6,84 (d, J=8,70 Hz, 2H); 7,50 (d, J=8,70 Hz, 2H). *SM : 284 (100), 269 (26), 253 (59), 241 (17), 177 (21), 165 (35) , 152 (28) , 115 (28) , 84 (25) , 77 (26) 5, 6-Dihydroxy-1- (4-hydroxyphényl) indane A une solution du phénylindane précédemment obtenu (50 mg, 0,86 mmol) dans 2 ml de CH2Cl2, refroidie à -700C, est ajoutée goutte à goutte une solution de BBr3 dans CH2Cl2 (1,0 M, 3,1 ml, 3,1 mmol). La solution rouge obtenue est réchauffée à température ambiante et agitée pendant 0,5 h à cette température. Le mélange réactionnel est versé dans un mélange d'eau glacée et d'AcOEt. La phase aqueuse est saturée par NaCl puis extraite deux fois à l'AcOEt.Les phases organiques rassemblées sont lavées avec une solution aqueuse saturée de NaCl, séchées sur MgSO4 et évaporées à sec pour donner une huile jaune (480 mg) qui est chromatographiée (éluant : AcOEt/hexane=1:l), pour conduire au composé attendu (solide blanc, 400 mg, 93 %). Caractéristiques physiques *RMN 1H (acétone-d6): 1,90 (m, 1H); 2,41 (m, 1H); 2,79 (m, 2H); 4,08 (t, J=7,97 Hz, 1H); 6,39 (s, 1H); 6,75 (s, 1H); 6,77 (d, J=8,70 Hz, 2H); 6,98 (d, J=8,70 Hz, 2H); 7,77 (s, large, 3H). *SM (IE): 242 (100), 225 (61). Exemple 2 : Préparation du 5,6-dihydroxy-1-(4 hydroxyphinyl)-2,2-dimAthylindane (BXT01045) 5, 6Diméthoxy-2-méthylindan-1-one et 5, 6-diméthoxy-2 2-dimé- thylindan-1-one Un mélange de diisopropylamidure de lithium (LDA, 1,5 M dans du cyclohexane, 7,5 ml, 11,3 mmol) et de 15 ml de THE anhydre est refroidi à -780C. On y ajoute goutte à goutte une solution de 5,6-diméthoxyindan-1-one (1,92 g, 10 mmol) dans 5 ml de THF. Le mélange est agité 30 min à -780C. On ajoute de l'iodure de méthyle (0, 93 ml, 15 mmol). Après 30 min à -780C, la solution est réchauffée à température ambiante et agitée à cette température pendant 4 h. On refroidit à nouveau la solution à -780C et ajoute goutte à goutte la même quantité de LDA que précédemment. Après 30 min, on ajoute du MeI (0,93 ml, 15 mmol). On agite 30 min à -780C puis 4 h à température ambiante. Le mélange réactionnel est hydrolysé par addition d'une solution aqueuse saturée de NH4Cl. On extrait avec de l'AcOEt. Les phases organiques sont lavées avec une solution aqueuse saturée de NaCl, séchées sur MgSO4 et évaporées à sec pour donner un solide jaune (2,23 g) .Une chromatographie, en utilisant un mélange AcOEt/hexane (1:9) comme éluant, donne la 5,6-diméthoxy-2,2-diméthylindan-1-one (1,35 g, 61 %) et la 5,6-diméthoxy-2-méthylindan-1-one (0,43 g, 21, %) . Caractéristiques physiques de la 5,6-diméthoxy-2,2- diméthylindan-1-one *RMN 1H (CDC13): 1,64 (s, 6H); 2,85 (s, 2H); 3,85 (s, 3H); 3,91 (s, 3H); 6,80 (s, 1H); 7,12 (s, 1H). *pF : 134,0-134,50C (EtOH) Caractéristiques physiques de la 5,6-diméthoxy-2 méthylindan-1-one *RMN 1H (CDC13): 1,22 (d, J=7,41 Hz, 3H); 2,63 (m,2H); 3,23 (dd, J=9,24-16,85 Hz, 1H); 3,84 (s, 3H); 3,90 (s, 3H); 6,81 (s, 1H); 7,11 (s, 1H). *pF : 106,0-106,50C (EtOH) 1-Hydroxy-5 6-diméthoxy-1- (4-méthoxyphényl) -2, 2-diméthyl- indane A une suspension de magnésium (72 mg, 3 mmol) dans 6 ml de THF anhydre, est ajoutée une petite portion de 4bromoanisole. Le mélange est chauffé au léger reflux pour initier la réaction, puis le reste de dérivé bromé (0,56 g, 3 mmol), en solution dans 5 ml de THF, est ajouté goutte à goutte en 15 min. Après 1 h de reflux, le magnésium est consommé. De la 5, 6-diméthoxy-2, 2-diméthylindan-1-one (0,66 g, 3 mmol) est ajoutée par petites portions.La solution est agitée 1 h à température ambiante, puis chauffée au reflux 4 h. 10 ml d'une solution aqueuse saturée de NH4Cl sont ajoutés à OOC. On extrait le mélange avec de l'AcOEt. les phases organiques rassemblées sont lavées avec une solution aqueuse saturée de NaCl, séchées sur MgSO4 et évaporées pour donner une huile jaune (1,20 g) . Une purification par chromatographie (éluant:AcOEt/hexane=1:5) permet d'isoler le produit attendu (0,65 g, 66 %). Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDC13) : 0,62 (s, 3H); 1,13 (s, 3H); 2,60 (d J=15,10 Hz, 1H); 2,86 (d, J=15,10 Hz, 1H); 3,77 (s, 3H); 3,79 (s, 3H); 3,89 (s, 3H); 3,91 (s, 1H); 6,71 (s, 1H); 6,79 (s, 1H); 6,83 (d, J=9,00 Hz, 2H); 7,19 (d, J=9,00 Hz, 2H). 5,6-Diméthoxy-1-(4-méthoxyphénylY-2,2-diméthylindane Du borohydrure de sodium (1,40 g, 36,7 mmol) et du trichlorure d'aluminium (0,82 g, 6,1 mmol) sont ajoutés à une solution du précédent produit (0,39 g, 1,25 mmol) dans 15 ml de THF anhydre. Le mélange est chauffé au reflux. Il se colore immédiatement en rose, puis en rouge et finalement devient incolore. Après 20 h de reflux, le mélange réactionnel est versé dans un mélange de 20 g de glace et 5 ml de HCl (1N). On sature la phase aqueuse avec NaCl et on l'extrait avec AcOEt. Les phases organiques sont lavées avec une solution aqueuse saturée de NaCl, séchées sur MgSO4 et évaporées à sec pour fournir une huile incolore. Une chromatographie, en éluant avec un mélange AcOEt-hexane (1:10), donne le produit attendu (0,39 g, 66 %). Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDCl3) : 0,63 (s, 3H); 1,19 (s, 3H); 2,72 (s, 2H); 3,74 (s, 3H); 3,79 (s, 3H); 3,87 (s, 3H); 3,91 (s, 1H); 6,56 (s, 1H); 6,78 (s, 1H); 6,83 (d, J=8,86 Hz, 2H); 6,98 (d, J=8,86 Hz, 2H). 5,6-Dihydroxy-1-(4-hydroxyphényl)-2,2-diméthylindane A une solution du dérivé précédemment obtenu (0,39 g, 1,25 mmol) dans 2 ml de CH2Cl2, refroidie à -700C, on ajoute goutte à goutte une solution de BBr3 dans CH2Cl2 (1,0 M, 4,86 ml, 4,86 mmol). La solution rouge obtenue est réchauffée à température ambiante et on l'agite pendant 1 h à cette température. Le mélange réactionnel est versé dans un mélange d'eau glacée et d'AcOEt. La phase aqueuse est saturée par NaCl, puis extraite deux fois à l'AcOEt. les phases organiques rassemblées sont lavées avec une solution aqueuse saturée de Nazi, séchées sur MgSO4 et évaporées à sec, pour donner une huile légèrement rouge (410 mg) qui est chromatographiée (éluant : AcOEt/hexane=1: 1), pour conduire au composé attendu (0,29 mg, 86 %). Caractéristiques physiques *RMN 1H (acétone-d6) : 0,71 (s, 3H); 1,17 (s, 3H); 2,60 (s, 2H); 3,80 (s, 1H); 6,46 (s, 1H); 6,72 (s, 1H); 6,75 (d, J=8,74 Hz, 2H); 6,89 (d, J=8,74 Hz, 2H). *SM (IE) : 270 (87), 227 (100), 107 (16). Exemple 3 : Préparation du 5,6-dihydroxy-1-(4-hydroxy phényl)-2-méthylindane (BXT01048) 5,6-Diméthoxy-3-(4-méthoxyphényl)-2-méthylindène A une suspension de magnésium (42 mg, 1,750 mmol) dans 5 ml de THF anhydre, est ajoutée une petite portion de 4-bromoanisole. Le mélange est chauffé au léger reflux pour initier la réaction puis le reste de dérivé bromé (330 mg, 1,75 mmol), en solution dans 5 ml de THF, est ajouté goutte à goutte en 15 min. Après 1 h de reflux, le magnésium est consommé. Le mélange, ainsi obtenu, est refroidi à température ambiante puis on ajoute une solution de 5,6diméthoxy-2-méthylindan-1-one (300 mg, 1,46 mmol) dans 5 ml de THF. La solution brune obtenue est agitée pendant 18 h, puis hydrolysée par addition d'une solution aqueuse saturée de NH4Cl. On extrait le mélange avec de l'AcOEt.Les phases organiques rassemblées sont lavées avec une solution aqueuse saturée de NaCl, puis séchées sur Na2SO4. Après évaporation du solvant, on obtient une huile jaune (0,54 g) qui est reprise par 2 ml d'acide acétique glacial. La solution obtenue est agitée 1 h à température ambiante. La solution, refroidie à OOC, est versée lentement dans 50 ml d'une solution saturée de NaHCO3. On extrait le mélange avec de l'AcOEt. La phase organique est lavée avec une solution aqueuse saturée de NaHCO3, séchée sur MgSO4 et évaporée. Le produit brut (530 mg) ainsi obtenu est purifié par chromatographie, en éluant avec un mélange AcOEt/hexane (1:9), pour fournir une huile incolore (0,25 g, 58 %). Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDC13) : 2,09 (s, 3H); 3,35 (s, 2H); 3,82 (s, 3H); 3,86 (s, 3H); 3,89 (s, 3H); 6,78 (s, 1H); 7,00 (d, J=8,70 Hz, 2H); 7,04 (s, 1H); 7,33 (d, J=8,70 Hz, 2H). 5,6-Diméthoxy-1-t4-méthoxyphényl)-2-méthylindane Une solution du phénylindène précédent (240 mg, 0,81 mmol) dans 5 ml d'AcOEt est hydrogénée sous 106 Pa environ (10 atm) d'hydrogène, en présence de 20 mg de palladium sur charbon (à 10 %) pendant 2 h. Le catalyseur est éliminé par filtration, puis le filtrat est évaporé à sec, pour donner le produit attendu pur (0,24 g, 99 %). Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDCl3) : 0,69 (d, J=6,96 Hz, 3H); 2,58 (dd, J=6,9614,30 Hz, 1H); 2,80 (m, 1H); 2,96 (dd, J=7,04-14,30 Hz, 1H); 3,75 (s, 3H); 3,77 (s, 3H); 3,88 (s, 3H); 4,25 (d, J=7,68 Hz, 1H); 6,63 (s, 1H); 6,80 (d, J=8,78 Hz, 2H); 6,81 (s, 1H); 6,88 (d, J=8,78 Hz, 2H). *SM (IE) : 298 (100), 283 (25), 267 (44), 252 (7); 238 (12), 167 (42), 149 (42) , 135 (33); 84 (62) 5,6-Dihydroxy-1-(4-hydroxyphényl)-2-méthylindane A une solution du phénylindane précédemment obtenu (0,23 g, 0,77 mmol) dans 2 ml de CH2C12, refroidie à -700C, est ajoutée goutte à goutte une solution de BBr3 dans CH2C12 (1,0 m, 3,0 ml, 3,0 mmol). La solution rouge obtenue est réchauffée à température ambiante et agitée pendant 0,5 h à cette température. Le mélange réactionnel est versé dans un mélange d'eau glacée et d'AcOEt. La phase aqueuse est saturée par NaCl, puis extraite deux fois à l'AcOEt.Les phases organiques rassemblées sont lavées avec une solution aqueuse saturée de Nazi, séchées sur MgSO4 et évaporées à sec, pour donner une huile jaune (0,20 g) qui est chromatographiée (éluant : AcOEt/hexane=1:1), pour conduire au composé attendu (0,18 mg, 91 %). Caractéristiques physiques *RMN 1H (acétone-d6) : 0,63 (d, J=6,96 Hz, 3H); 2,45 (dd, J=7,32-14,22 Hz, 1H); 2,68 (m, 1H); 2,84 (dd, J=7,04-14,22 Hz, 1H); 4,13 (d, J=7,42 Hz, 1H); 6,50 (s, 1H); 6,73 (m, 5H); 7,53 (s, 1H); 7,55 (s, lH); 8,06 (s, 1H). *SM (IE) : 256 (100), 241 (23), 239 (46), 227 (27) Exemple 4 : Préparation du 1-(4-dimAthylaminophinyl)- 5,6-dihydroxyindane (BXT01049) 5, 6-Dihydroxyindan-1-one De la 5,6-diméthylindan-1-one (3,13 g; 16,3 mmol) est dissoute dans 10 ml de dichlorométhane séché sur tamis 3A. A cette solution, jaune clair, est ajoutée, à -700C, une solution de tribromure de bore dans le dichlorométhane (1M; 28 ml, 28 mmol), goutte à goutte. Le milieu réactionnel vire au bordeaux. La température du milieu est ramenée à température ambiante, puis la solution est agitée pendant 2 h 30. Le milieu réactionnel est versé dans 50 g de glace, puis extrait avec de l'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont lavées avec une solution aqueuse saturée en NaCl, puis séchées sur MgSO4.Le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit brut (2,3 g; 87 %) est utilisé tel quel pour l'étape suivante. 5,6-Di(terbutyldiméthylsilyloxy)indan-1-one A une solution de la 5,6-dihydroxyindan-1-one, précédemment décrite, (2 g; 12,2 mmol) dans 40 ml de DMF séché sur tamis 3A, refroidie à OOC, on ajoute du chlorure de terbutyldiméthylsilyle (7,35 g; 49,8 mmol) et l'imidazole (3,82 g; 56,1 mmol). La température est maintenue 10 min à OOC, puis 16 h à température ambiante. Le produit est extrait avec de l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée avec une solution aqueuse saturée en NaCl, puis séchée sur MgSO4. Le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit désiré est purifié par chromatographie avec un éluant : hexane/acétate d'éthyle (8:2) et obtenu sous forme d'un solide beige (4,5 g; 94 %). Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDCl3) : 0,195 (s, 6H); 0,205 (s, 6H); 0,92 (s, 18H); 2,60 (t, J=7,63 Hz, 2H); 2,95 (t, J=7,63 Hz, 2H); 6,85 (s, 1H); 7,15 (s, 1H). 5 . 6-Di (terbutyldiméthylsilyloxy) -3- (4-diméthylaminophényl) indène Du magnésium (124 mg, 5,1 mmol) est recouvert par 1 ml de THF distillé et chauffé à 600C sous agitation. Une solution de 4-bromo-N,N-diméthylaniline (1,02 g, 5,1 mmol) dans 5 ml de THF distillé est ajoutée goutte à goutte en 20 min. Le mélange réactionnel est chauffé au reflux du THF pendant 1 h. A cette solution jaune vert, on ajoute une solution de 5, 6-di (terbutyldiméthylsilyloxy) indan-1-one (2 g, 5,1 mmol) dans 10 ml de THF distillé, goutte à goutte, en 5 min, à température ambiante. Le milieu est porté au reflux pendant 20 h. le mélange réactionnel, de coloration violette, est hydrolysé par une solution aqueuse saturée en chlorure d'ammonium, puis extrait avec de l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée avec une solution aqueuse saturée en NaCl, puis séchée sur MgSO4. le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit désiré est purifié par chromatographie avec un éluant : hexane/acétate d'éthyle (9/1) et obtenu sous forme d'une huile (0,9 g; 36 %). Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDCl3) : 0,16 (s, 12H); 0,95 (s, 18H); 2,94 (s, 6H); 3,50 (d, J=2,03 Hz, 2H); 6,30 (t, J=2,03 Hz, 1H); 6,75 (m, 2H); 6,95 (s, 1H); 7,08 (s, 1H); 7,45 (d, J=7,85 Hz, 2H). 5,6-Di(terbutyldiméthylsilyloxy)-1-(4-diméthylaminophényl)- indane Une solution du composé précédent (0,9 g; 1,82 mmol), dans 10 ml de méthanol et 2 ml d'acétone, est agitée en présence de palladium sur charbon (à 10 %, 60 mg), à température ambiante sous pression d'hydrogène (5 bars), pendant 3 h. La suspension est filtrée, puis le filtrat est évaporé à sec sous pression réduite. Le produit désiré est purifié par chromatographie avec un éluant : hexane/acétate d'éthyle (9/1) et obtenu sous forme d'un solide beige clair (0,64 g; 71 %). Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDC13) : 0,08 (s, 6H); 0,18 (s, 6H); 0,90 (s, 9H); 0,95 (s, 9H); 1,90 (m, 2H); 2,45 (m, 2H); 2,90 (s, 6H); 4,17 (t, J=8,07 Hz, 1H); 6,4 (s, 1H); 6,7 (m, 2H); 7,05 (m, 2H); 7,20 (s, 1H). 5,6-Dihydroxy-1-(4-diméthylaminophényl)indane Le produit précédemment obtenu (0,56 g; 1,12 mmol) est dissous dans 5 ml de THE distillé, puis additionné d'une solution molaire de fluorure de tétrabutylammonium (2,26 ml; 2,26 mmol) dans le THF, sous agitation et à température ambiante. L'agitation est maintenue pendant 1 h à cette température. Après addition d'eau, le produit est extrait avec de l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée avec une solution aqueuse saturée en NaCl, puis séchée sur MgSO4. Le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit désiré est purifié par une double chromatographie 1ère purification: éluant: hexane-acétate d'éthyle (6/4) 2ème purification: éluant: dichlorométhane-méthanol (95/5). Le produit désiré est obtenu sous forme d'une huile mauve (190 mg; 62 %). Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDC13) : 1,96 (m, 2H); 2,44 (m, 2H); 2,89 (s, 6H); 4,1 (t, J=7,2 Hz, 1H); 6,4 (s, 1H); 6,73 (d, J=6,7 Hz, 2H); 6,77 (s, 1H); 7,05 (d, J=6,7 Hz, 2H). *SM (IE) : 269 (100), 254 (10), 240 (9), 225 (28), 77 (10). *CLHP (chromatographie liquide haute performance) : (colonne : phase inverse RP18; longueur : 15 cm; éluant dichlorométhane-méthanol (94/6); débit : 1 ml/min, longueur d'onde d'observation : 254 nm); temps de rétention : 2,37 min; pureté : 99,1 t. B. Composés de la série II Exemple 5 : Préparation du 2,5,6-trihydroxy-1-(4 hydroxyphEnyl)indane (BXT01035) 2-Hydroxy-5,6-diméthoxy-1-(4-méthoxyphényl)indane A une solution de 5,6-diméthoxy-3-(4- méthoxyphényl)indène (1,0 g, 3,55 mmol) dans 10 ml de THF anhydre, on ajoute à OOC, une solution de BH3.THF (1,0 M, 4,26 ml, 4,26 mmol), en 15 min. Le mélange obtenu est agité 1 h à la même température puis 4 h à température ambiante. La solution est refroidie à OOC et 3,5 ml d'eau sont ajoutés goutte à goutte, puis 7 ml de NaOH Caractéristiques physiques *pF : 128,0-129,00C (AcOEt/hexane=1:4). *RMN 1H (CDC13) : 1,96 (d, J=4,68 Hz, 1H, échangeable avec D2O); 2,84 (dd, J=6,79, 15,39 Hz, 1H); 3,21 (dd, J=6,9215,39 Hz, 1H); 3,73 (s, 3H); 3,79 tus, 3H); 3,87 (s, 3H); 4,05 (d, J=6,23 Hz, 1H); 4,39 (m, 1H); 6,46 (s, 1H); 6,81 (s, 1H); 6,87 (d, J=8,64 Hz, 2H); 7,07 (d, J=8,64 Hz, 2H). *SM (IE) : 300 (100), 282 (18), 257 (27), 239 (5), 165 (7), 121 (15). 2 5,6-Trihydroxy-1-(4-hydroxyphényl)indane Du tribromure d'aluminium (2,67 g, 10,0 mmol) est mélangé avec 24 ml d'éthanethiol. Le phénylindane précédent (300 mg, 1,0 mmol) est ajouté en une seule portion. Après 62 h à température ambiante, l'éthanethiol est évaporé, puis le résidu est traité avec 15 ml d'eau à OOC. Le mélange est extrait avec de l'AcOEt. Les phases organiques rassemblées sont lavées avec une solution aqueuse saturée de NaCl, séchées sur Na2SO4 et évaporées à sec pour conduire à une huile jaune (250 mg). Une purification par chromatographie, en utilisant un mélange AcOEt/hexane (1:1) comme éluant, donne le produit attendu (solide blanc, 140 mg, 54 %). Caractéristiques physiques *RMN 1H (acétone-d6) : 2,68 (dd, J=6,31-15,02 Hz, 1H); 3,06 (dd, J=6,59-15,30 Hz, 1H); 3,90 (d, J=6,53 Hz, 1H); 4,20 (d, J=5,28 Hz, 1H); 4,29 (m, 1H); 6,30 (s, 1H); 6,68 (s, 1H); 6,76 (d, J=8,47 Hz, 2H); 6,96 (d, J=8,47 Hz, 2H); 7,57 (s, 1H); 7,63 (s, 1H); 8,18 (s, 1H). *SM (IE) : 258 (100) , 240 (40) , 229 (13) , 215 (39), 183 (27), 165 (32), 107 (46), 77 (28) Exemple 6 : Préparation du 5,6-dihydroxy-1-(4- hydroxyphényl ) - 2 -méthoxyindane (BXT01040) 2,6-Dihydroxy-3-(4-hydroxyphényl)indène A une solution de 5,6-diméthoxy-3-(4méthoxyphényl)indène (0,60 g, 2,23 mmol) dans 2 ml de CH2Cl2, refroidie à -700C, on ajoute goutte à goutte une solution de BBr3 dans CH2Cl2 (1,0 M, 9,60 ml, 9,60 mmol). La solution rouge obtenue est réchauffée à température ambiante et agitée pendant 1 h à cette température. Le mélange réactionnel est versé dans un mélange d'eau glacée et d'AcOEt. La phase aqueuse est saturée par NaCl, puis extraite deux fois à l'AcOEt.Les phases organiques rassemblées sont lavées avec une solution aqueuse saturée de NaCl, séchées sur MgSO4 et évaporées à sec, pour donner un solide rouge (0,62 g) qui est utilisé directement dans l'étape suivante. Caractéristiques physiques *RMN 1H (acétone-d6) : 3,28 (d, J=2,10 Hz, 2H); 6,31 (t, J=2,10 Hz, 1H); 6,88 (d, J=8,45 Hz, 2H); 7,03 (s, 1H); 7,07 (s, 1H); 7,44 (d, J=8,45 Hz, 2H); 7,72 (s large, 2H); 8,53 (s large, 1H). *SM (IE) : 240 (96), 222 (7), 194 (32), 181 (15), 165 (27), 152 (14), 43 (100). 5,6-Dibenzyloxy-1-(4-benzyloxyphényl)indène Le produit brut de l'étape précédente (0,62 g) est dissous dans 8 ml d'acétone. On y ajoute du K2CO3 (1,85 g, 13,38 mmol) et du bromure de benzyle (1,73 g, 10,0 mmol). Le mélange est chauffé au reflux pendant 18 h. Le solide est filtré, puis le filtrat est évaporé à sec. Le résidu est directement chromatographié en éluant avec un mélange AcOEt/hexane (1:5), pour donner le produit attendu (0,82 g) qui est utilisé directement dans l'étape suivante. Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDCl3) : 3,36 (d, J=1,83 Hz, 2H); 5,11 (s, 2H); 5,13 (s, 2H); 5,17 (s, 2H); 6,37 (t, J=1,83 Hz, 1H); 7,01 (d, J=8,72 Hz, 2H); 7,17 (s, 1H); 7,25-7,60 (m, 18H). 5,6-Dibenzyloxy-1-(4-benzyloxyphényl)-2-hydroxyindane A une solution du phénylindène ci-dessus (0,82 g, 1,61 mmol) dans 8 ml de THF anhydre, est ajoutée, à température ambiante, une solution de BH3.THF Hz THF (1,0 M, 3,20 ml, 3,20 mmol), en 15 min. Le mélange obtenu est agité 3,5 h à température ambiante. La solution est refroidie à 0 C et 3,5 ml d'eau sont ajoutés goutte à goutte, puis 7 ml de NaOH Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDCl3) : 2,02 (s large, échangeable avec D20, 1H); 2,81 (dd, J=7,00-15,26 Hz, 1H); 3,17 (dd, J=6,64-15,26 Hz, 1H); 4,03 (d, J=6,28 Hz, 1H); 4,34 (m, 1H); 5,01 (s, 2H); 5,06 (s, 2H); 5,15 (s, 2H): 6,57 (s, 1H); 6,86 (s, 1H); 6,92 (d, J=8,72 Hz, 2H)-; 7,40 (d, J=8,72 Hz, 2H); 7,24-7,50 (m, 15H) *SM (IC, NH3) : 546 (MNH4+). 5, 6-Dibenzyloxy-1- (4-benzyloxyphényl) -2-méthoxyindane On mélange l'alcool précédent (0,26 g, 0,49 mmol) avec de la potasse en poudre (0,11 g, 1,97 mmol). On y ajoute 3 ml de DMSO suivi immédiatement d'iodure de méthyle (0,14 g, 9,85 mmol). Le mélange est agité à température ambiante pendant 3 h. 5 ml d'eau sont ajoutés. Le mélange est extrait avec de l'AcOEt. Les phases organiques rassemblées sont lavées avec une solution aqueuse saturée de NaCl, séchées sur MgSO4 et évaporées pour donner une huile jaune. La purification de cette huile par chromatographie (éluant : AcOEt/hexane=l:9) fournit le produit attendu (0,26 g, 97 %). Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDCl3) : 2,85 (dd, J=7,01-15,35 Hz, 1H); 3,23 (dd, J=6,78-15,35 Hz, 1H); 3,38 (s, 3H); 4,04 (m, 1H); 4,12 (d, J=6,25 Hz, 1H); 5,03 (s, 2H); 5,08 (s, 2H); 5,14 (s, 2H); 6,60 (s, 1H); 6,88 (s, 1H); 6,93 (d, J=8,64 Hz, 2H); 7,10 (d, J=8,64 Hz, 2H); 7,30-7,60 (m, 15H). 5,6-Dihydroxy-1-(4-hydroxyphényl)-2-méthoxyindane Une solution du composé précédent (0,26 g, 0,48 mmol) dans 10 ml d'AcOEt est hydrogénée sous environ 105 Pa (1 atm) d'hydrogène en présence de palladium sur charbon (à 10 %, 10 mg). La réaction est terminée après 12 h. On filtre le catalyseur, puis le solvant est évaporé sous pression réduite pour donner une huile jaune. Ce produit brut est purifié par chromatographie (éluant : AcOEt/hexane = 1:4), pour fournir le produit attendu (solide blanc : 92 mg, 71 %). Caractéristiques physiques *RMN 1H (acétone-d6) : 2,68 (dd, J=6,15-15,62 Hz, 1H); 3,15 (dd, J=6,25-15,62 Hz, 1H); 3,24 (s, 3H); 4,01 (m, 1H); 4,04 (d, J=6,25 Hz, 1H); 6,29 (s, 1H); 6,70 (s, 1H); 6,76 (d, J=8,24 Hz, 2H); 6,98 (d, J=8,24 Hz, 2H), 7,62 (s large, 2H); 8,17 (s large, 1H). *SM (IE) : 272 (100), 240 (81), 227 (18). C. Composés de la série III Exemple 7 : Préparation du 5,6,6a,llb-tétrahydro- 3,9,10-trihydfoxybenzolc]fluorène (BXT01050) 2-(3,4-Diméthoxybenzylidène)-6-méthoxy-1-tétralone On mélange de la 6-méthoxy-1-tétralone (7,04 g, 40 mmol) et du 3,4-diméthoxybenzaldéhyde (6,44 g, 40 mmol) avec 100 ml d'éthanol absolu. On agite pendant 0,5 h pour dissoudre le maximum de réactifs. On commence à introduire du chlorure d'hydrogène gazeux. On constate une réaction exothermique qui permet de dissoudre complètement tous les réactifs. On refroidit de temps en temps le ballon avec un bain de glace pour que la température ne dépasse pas 800C. Le mélange est ainsi saturé de chlorure d'hydrogène au bout d'l h pour donner une couleur rouge intense. On laisse reposer ce mélange à température ambiante pendant 2 h. On verse le mélange réactionnel dans un mélange de 400 ml d'eau et 40 ml de NaOH aqueux (3 N). On agite vigoureusement pendant 3 h à température ambiante. Le solide précipité est filtré sur verre fritté, lavé à l'eau et finalement séché sous vide, sur P2O5, pour donner un solide (12,35 g, 95 %). Une petite quantité de produit est recristallisée dans le mélange AcOEt/hexane=1 :2. Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDC13) : 2,89 (t, J=6,96 Hz, 2H); 3,12 (dt, J=1,706,96 Hz, 2H), 3,85 (s, 3H); 3,89 (s, 3H); 3,90 (s, 3H); 6,68 (d, J=2,48 Hz, 1H); 6,85 (dd, J=2,48-8,67 Hz, 1H); 6,88 (d, J=8,14 Hz, 1H); 6,95 (d, J=1,64 Hz, 1H); 7,04 (dd, J=1,648,14 Hz, 1H); 7,78 (s, 1H); 8,08 (d, J=8,67 Hz, 1H). *SM (IE) : 324 (87), 323 (100), 309 (38), 293 (39), 281 (11) . *pF : 109,0-110,00C (AcOEt/hexane=1:2). 2-(3,4-Diméthoxybenzyl)-6-méthoxy-1-tétralone A une solution du composé précédent (35,0 g, 0,107 mol) dans 550 ml d'AcOEt, sont ajoutés 2,0 g de palladium sur charbon (à 10 %). Le mélange est hydrogéné sous environ 2.105 Pa (2 atm) d'hydrogène pendant 1 H. Le catalyseur est éliminé par filtration et le filtrat est évaporé à sec, pour donner 38,4 g d'un produit brut qui est dissous à chaud dans 100 ml d'AcOEt. On ajoute 130 ml d'hexane. On filtre les cristaux formés (23,56 g). Le filtrat est évaporé à sec. Le résidu est chromatographié en éluant avec un mélange AcOEt/hexane (1:4), pour donner 6,03 g du produit attendu, pur. Rendement :29,59 g (84 %). Caractéristiques physiques pF : 101,0-102,00C (AcOEt/hexane=1:2). *RMN 1H (CDCl3) : 1,67-1,83 (m, 1H); 2,00-2,14 (m, 1H); 2,51-2,72 (m, 2H); 2,84-2,96 (m, 2H); 3,34-3,48 (m, 1H); 3,82 (s, 3H); 3,84 (s, 3H); 3,85 (s, 3H); 6,64 (d, J=2,36 Hz, 1H); 6,74-6,84 (m, 4H); 8,02 (d, J=8,74 Hz, 1H). *SM (IE) : 326 (35), 175 (9), 151 (100), 107 (13), 91 (17), 77 (11). 5,6-Dihydro-3,9,10-triméthoxybenzorclfluorène 15,0 g d'acide polyphosphorique sont mélangés avec la tétralone obtenue précédemment (1,04 g, 3,2 mmol), puis chauffés à 80-900C pendant 4 h. Après avoir refroidi le mélange à température ambiante, 10 g d'eau glacée et 20 ml d'AcOEt sont ajoutés. On sépare la phase organique et extrait la phase aqueuse avec de l'AcOEt. Les phases organiques rassemblées sont lavées avec une solution aqueuse saturée de NaHCO3 puis avec NaCl (sat.), séchées sur MgSO4 et évaporées à sec, pour donner un solide (0,91 g) qui est purifié par chromatographie en éluant avec un mélange AcOEt/hexane (1:6). On obtient le produit attendu (0,61 g) et le produit de départ (0,24 g). le rendement de cette réaction, par rapport au produit consommé, est de 81 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDC13) : 2,59 (t, J=7,77 Hz, 2H); 2,89 (t, J=7,77 Hz, 2H); 3,39 (s, 2H); 3,84 (s, 3H); 3,90 (s, 3H); 3,94 (s, 3H); 6,84 (m, 2H); 7,08 (s, 1H); 7,38 (s, 1H); 7,72 (d, J=9,24 Hz, 1H). *pF : 146,5-147,00C (AcOEt/hexane=l:4) . *SM (IE) : 308 (100), 293 (14) , 277 (38), 202 (24), 176 (33), 165 (17), 152 (21) 5,6, 6a1lb-Tétrahydro-3 9, 10-triméthoxybenzoFcl fluorène A une solution du précédent produit (0,90 g, 2,92 mmol) dans 30 ml d'AcOEt, on ajoute 0,15 g de palladium sur charbon (à 10 %). Le mélange est hydrogéné sous une pression d'environ 8.105 Pa (8 atm) d'hydrogène pendant 5 h. Le catalyseur est éliminé par filtration et le filtrat est évaporé à sec, pour donner le produit attendu, pur (0,90 g, 99 %). Caractéristiques physiques *pF : 77,0-79,00C (AcOEt/hexane=l:4). *RMN 1H (CDC13) : 1,45-1,65 (m, 1H); 1,66-1,80 (m, 1H); 2,75 (dd, J=6,96-15,10 Hz, 1H); 2,68-2,87 (m, 3H); 3,15 (dd, J=6,96-15,10 Hz, 1H); 3,79 (s, 3H); 3,80 (s, 3H); 3,84 (s, 3H); 4,21 (d, J=6,68 Hz, 1H); 6,66 (d, J=2,64 Hz, 1H); 6,76 (s, 1H); 6,78 (s, 1H); 6,83 (dd, J=2,64-8,38 Hz, 1H); 7,33 (d, J=8,38 Hz, 1H). *SM (IE) : 310 (100), 295 (23) , 279 (46), 267 (15), 189 (24), 121 (23). 5 6r6at11b-Tétrahydro-3,9,10-trihydroxybenzorclfluorène A une solution du composé précédemment obtenu (0,57 g, 1,84 mmol) dans 4 ml de CH2C12, refroidie à -700C, on ajoute goutte à goutte une solution de BBr3 dans CH2Cl2 (1,0 M, 6,5 ml, 6,5 mmol). La solution rouge obtenue est réchauffée à température ambiante et agitée pendant 0,5 h à cette température. Le mélange réactionnel est versé dans un mélange d'eau glacée et d'AcOEt. La phase aqueuse est saturée par NaCl, puis extraite deux fois à l'AcOEt. Les phases organiques rassemblées sont lavées avec une solution aqueuse saturée de NaCl, séchées sur MgSO4 et évaporées à sec, pour donner une huile jaune (0,50 g). Une chromatographie de 0,28 g de cette huile (éluant AcOEt/hexane=1:l) permet d'isoler le composé attendu (0,24 g, 87 %). Caractéristiques physiques *RMN 1H Hz, 1H); 6,54 (d, J=2,54 Hz, 1H); 6,66 (s, 1H); 6,68 (s, 1H); 6,71 (dd, J=2,54, 8,34 Hz, 1H); 7,18 (d, J=8,34 Hz, 1H); 7,50 (s large, 2H); 7,83 (s large, 1H). *SM (IE) : 268 (82), 251 (31) , 240 (100) , 161 (21) , 145 (26), 77 (30) Exemple 8 : Préparation du 5,6,6a,7,8,12b-hexahydro 2,3,10-trihydroxy-benzo[c]phénanthrène (BXT010051) 2'-(3,4-Diméthoxyphényl)tétral-6-méthoxy-2-spiro-1'cyclopropan-1-one A un mélange d d'ioduré de triméthylsulfoxonium (4,40 g, 20 mmol) et d'hydrure de sodium (à 80% dans l'huile minérale, 0,80 g, 20 mmol) sont ajoutés 10 ml de DMSO. Le mélange est agité. à température ambiante pendant 1,5 h. On rajoute 30 ml de DMSO, puis on ajoute, par petites portions, la 2-(3,4-diméthoxybenzylidène)-6-méthoxy-1-tétra- lone décrite précédemment en 15 min. Le mélange est agité pendant 18 h à température ambiante et ensuite hydrolysé par l'addition de 50 ml d'une solution aqueuse saturée de NH4Cl. On extrait le mélange avec de 1'AcOEt. Les phases organiques rassemblées sont lavées à l'eau, séchées sur MgSO4 et évaporées sous pression réduite, pour donner une huile incolore (7,0 g). La purification de cette huile par chromatographie, en éluant avec une mélange AcOEt/hexane (1:4), fournit le produit désiré (5,41 g, 85%). Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDCl3): 1,26 (dd, J=4,24-7,08 Hz, 1H); 1,68 (m, 1H); 1,85 (m, 2H); 2,70 (m, 2H); 2,94 (dd, J=7,08-8,24 Hz, 1H); 3,83 (s, 3H); 3,85 (s, 3H); 3,86 (s, 3H); 6,64 (d, J=2,52 Hz, 1H); 6,77 (m, 3H); 6,82 (dd, J=2,52-8,50 Hz, 1H); 8,00 (d, J=8,72 Hz, 1H). *SM (IE) : 338 (100), 323 (12), 200 (20), 176 (19), 151 (73), 91 (29), 77 (51) 2-(3g4-Diméthoxyphényléthyll-6-méthoxy-1-tétralone Une solution du dérivé cyclopropanique précédemment obtenu (1,0 g, 2,96 mmol) et d'acide paratoluènesulfonique (300 mg) dans 20 ml de CH2C12 est agitée à température ambiante pendant 5 h. Cette solution est ensuite lavée avec une solution aqueuse saturée de NaHCO3, séchée sur MgSO4 et évaporée sous pression réduite pour donner une huile jaune (1,05 g). La purification de ce produit par chromatographie (éluant : AcOEt/hexane=1:4) donne un solide (0,57 g) qui est un mélange des deux alcènes isomères. 0,53 g de ce dernier mélange est repris par 15 ml d'AcOEt. La solution est hydrogénée, en présence de palladium sur charbon Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDC13): 1,80 (m, 2H); 2,24 (m, 2H); 2,42 (m, 1H), 2,66 (m, 2H); 2,92 (m, 2H); 3,81 (s, 3H); 3,82 (s, 3H); 3,84 (s, 3H); 6,64 (d, J=2,36 Hz, 1H); 6,77 (m, 3H); 6,79 (dd, J=2,36-8,80 Hz, 1H); 7,97 (d, J=8,72 Hz, 1H). *SM (IE): 340 (2,5), 176 (100), 164 (16), 151 (12). 5,6,7,8-Tétrahydro-2,3,10-triméthoxy-benzo rcl phénanthrène. 8 g d'acide polyphosphorique sont mélangés avec la tétralone obtenue précédemment (0,41 g, 1,21 mmol), puis chauffés à 80-900C pendant 2,5 h. Après avoir refroidi le mélange à température ambiante, 20 g d'eau glacée et 20 ml d'AcOEt sont ajoutés. On décante la phase organique et extrait la phase aqueuse avec de l'AcOEt. Les phases organiques rassemblées sont lavées avec une solution aqueuse saturée de NaHCO3 puis avec une solution aqueuse saturée de NaC1, séchées sur MgSO4 et évaporées à sec pour donner un solide (0,38g) qui est purifié par chromatographie en éluant avec un mélange AcOEt/hexane (1:9). On obtient le produit attendu (0,19 g; 49%). Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDC13): 2,31 (m, 4H); 2,66 (m, 4H); 3,80 (s, 3H); 3,82 (s, 3H); 3,89 (s, 3H); 6,77 (m, 3H); 7,08 (s, 1H); 7,44 (d, J=8,42 Hz, 1H). *SM (IE) : 322 (100), 307 (10), 291 (19), 189 (18), 161 (18) 5,6,6a,7,8,12b-Hexahydro-2,3,10-triméthoxy-benzorcl phénanthrène A une solution du précédent produit (170 mg, 0,50 mmol) dans 10 ml d'AcOEt, sont ajoutés 20 mg de palladium sur charbon (à 10%). Le mélange est hydrogéné sous une pression de 8.105 Pa, environ (8 atm) pendant 2,5 h. Le catalyseur est éliminé par filtration et le filtrat est évaporé à sec pour donner une huile. Cette huile est purifiée par chromatographie, en éluant avec un mélange AcOEt/hexane (1:9), pour donner le produit désiré (150 mg, 88%). Caractéristiques physiques *RMN 1H (CDC13): 1,53 (m, 2H); 1,81 (m, 1H); 2,00 (m, 1H); 2,32 (m, 1H); 2,75 (m, 4H); 3,77 (s, 3H); 3,78 (s, 3H); 3,81 (1H, caché par les OMe); 3,85 (s, 3H); 6,65 (m, 4H); 6,99 (d, J=9,16 Hz, 1H). *SM (IE) : 324 (100), 309 (5), 296 (33), 293 (37), 203 (36), 189 (86), 173 (39) 5,6,6a,7,8,12b-Hexahydro-2,3,10-trihydroxy-benzo rc1 phénanthrène A une solution du dérivé précédemment obtenu (150 mg, 0,37 mmol) dans 1 ml de CH2C12, refroidie à -700C, est ajoutée goutte à goutte une solution de BBr3 dans CH2C12 (1,0 M, 1,5 ml, 1,5 mmol). La solution rouge obtenue est réchauffée à température ambiante et agitée pendant 0,5 h à cette température. Le mélange réactionnel est versé dans un mélange d'eau glacée et d'AcOEt. La phase aqueuse est saturée par NaCl, puis extraite deux fois à l'AcOEt. Les phases organique s rassemblées sont lavées avec une solution aqueuse saturée de NaCl, séchées sur MgSO4 et évaporées à sec, pour donner une huile jaune (0,18 g).Une chromatographie de cette huile (éluant : AcOEt/hexane=l:1) permet d'isoler le composé attendu (91 mg, 87%). Caractéristiques physiques *RMN 1H (acétone -d6): 1,53 (m, 2H); 1,90 (m, 2H); 2,32 (m, 1H); 2,75 (m; 4H); 3,67 (d, J=4,76 Hz, 1H); 6,48 (s, 1H); 6,55 (s, 1H), 6,59 (m, 2H); 6,88 (d, J=8,88 Hz, 1H); 7,51 (s large, 2H); 7,95 (s large, 1H). *SM (IE) : 282 (100), 265 (16) , 254 (53), 175 (26), 161 (36), 115 (31), 91 (22), 77 (24) II Préparation de composés de formule générale II ("réactifs piégeurs de mercaptans11) Exemple 9 : Préparation du tétrafluoroborate de 1,4,6triméthyl-2-vinylpyridinium Synthèse de la 4,6-diméthyl-2-vinylpyridine A une solution de 2,4-diméthylpydirine (20 g; 0,186 mol; LANCASTER), dans 200 ml de THF fraîchement distillé, refroidie à -200C et sous atmosphère inerte, on ajoute du chlorure de benzoyle (29,12 g; 0,186 mol; JANSSEN) dans 100 ml de THF. Le mélange réactionnel est agité à cette température pendant 20 minutes.Puis du bromure de vinylmagnésium (186 ml d'une solution 1,0 M dans le THF) est additionné et la solution est agitée à température ambiante pendant 0,5 h. Le solvant est évaporé sous pression réduite et le résidu est repris par 300 ml d'éther terbutylméthylique. Après lavage du milieu réactionnel avec une solution saturée de NH4C1, la phase organique est séchée sur MgSO4 et le produit désiré est purifié par chromatographie sur colonne de silice MERCK F254 (éluant = hexane/AcOEt, 9:1). Rendement = 39,5 g (83 %), huile incolore. Le produit précédent est repris par 500 ml de toluène et additionné de p-chloranil Rendement = 11,1 g (54,2 %), huile jaune pâle. Caractéristiques physiques * RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) 2,20 ppm (s, 3H); 2,50 ppm (s, 3H); 5,25-5,45 ppm (dd, 2H, J = 11,9-18,7 Hz); 6,60-6,90 ppm (m, 3H). * SM (DIC, NH3) : MH+ = 134(100). DIC = désorption par ionisation chimique. Synthèse du tétrafluoroborate de 1,4,6-triméthyl-2- vinylpyridinium: A une solution de 4,6-diméthyl-2-vinylpyridine (0,61 g; 4,13.10-3 mol) dans 4,0 ml de chlorure de méthylène sous atmosphère inerte on ajoute, en une portion, du tétrafluoroborate de triméthyloxonium (0,50 g; 3,76.10-3 mol). La suspension est laissée réagir pendant 2 h à 250C. La suspension est filtrée et le produit est séché sous vide. Rendement = 0,162 g (18 %), cristaux blancs. Caractéristiques physiques * RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) 2,60 ppm (s, 3H); 2,85 ppm (s, 3H); 4,20 ppm (s, 3H); 6,00 ppm (d, 1H, J=12,8 Hz); 6,25 ppm (d, 1H, J=19,2 Hz); 7,27 ppm (dd, 1H, J=12,8-19,2 Hz); 7,82 ppm (s, 1H); 7,95 ppm (s, 1H). * SM (IE, 70eV): (M+) 148(10); 147(18); 133(34); 121(100); 106(25); 91(31); 77(52); 49(77). * Microanalyse Calculé (Jii) : C 51,10; H 6,00; N 6,00 Trouvé (%) : C 49,80; H 6,08; N 5,96. Exemple 10 : Préparation du tétrafluoroborate de 1 méthyl-4-vinylquinoléinium Synthèse de la 4-vinylquinoléine Une solution de 4-quinoléinecarboxaldéhyde (5 g; 3,18.10-2 mol) dans 32 ml de benzène, sous atmosphère inerte, contenant de l'iodure de triphénylméthylphosphonium (26 g; 6,36.10-2 mol) est ajoutée à une solution de soude (96 ml; 5N). Le système biphasique est agité à 450C pendant 30 minutes. Après décantation, la phase aqueuse est extraite par de l'acétate d'éthyle (3x100 ml). Les phases organiques sont réunies et lavées par une solution d'HCl 1N (2x30 ml), puis la phase aqueuse est neutralisée par du NaHCO3 et extraite par du chlorure de méthylène (3x100 ml). La phase organique est séchée sur MgSO4.Le produit désiré est purifié par chromatographie sur colonne de silice MERCK F254 (éluant = cyclohexane/AcOEt, 8:2). Rendement = 2,8 g (60 %). Caractéristiques physiques * RMN 1H (200 MHz, CDC13) 5,60 ppm (d, 1H, J=10 Hz); 5,95 ppm (d, 1H, J=14 Hz);7,30-7,55 ppm (m, 4H); 7,60-7,75 ppm (t, 1H, J=4 Hz);8,07 ppm (t, 2H, J=6 Hz); 8,85 ppm (d, 1H, J=4 Hz). Synthèse du tétrafluoroborate de 1-méthyl-4-vinyl quinoléinium A une solution de 4-vinylquinoléine (0,72 g; 4,64.10-3 mol) dans un mélange acétonitrile/acétone (2,5/1) est ajouté sous atmosphère inerte, en une portion, du tétrafluoroborate de triméthyloxonium (1,58 g; 10,7.10-3 mol). La suspension est laissée réagir pendant 1 h à 250C. Le solvant est évaporé sous pression réduite, le résidu est repris par du 2-propanol (25 ml) puis agité pendant 30 minutes à température ambiante. Après addition d'éther éthylique (25 ml), la suspension est filtrée. Le produit désiré est séché sous vide. Rendement = 0,93 g (60,4 %). Caractéristiques physiques * RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) 4,30 ppm (s, 3H); 6,25 ppm (d, 1H, J=12,5 Hz); 6,65 ppm (d, 1H, J=17,5 Hz); 7,85-8,00 ppm (dd, 1H, J=12,5 17,5 Hz); 8,10 ppm (d, 1H, J=7 Hz); 8,35 ppm (dd, 2H, J=10-10 Hz); 8,57 ppm (d, 1H, J=10 Hz); 8,72 ppm (d, 1H, J=10 Hz); 9,35 ppm (d, 1H, J=7 Hz). * SM (FAB) glycérol-NOBA : ion positif M+ = 170(100) ion négatif M- = 87 87(100). FAB = bombardement par atomes rapides (Fast Atom Bombardment). NOBA = alcool méta-nitrobenzylique. * Microanalyse Calculé (%) : C 56,00; H 4,60; N 5,40. Trouvé (%) : C 55,56; H 4,35; N 4,12. III. Exemples d'applications Les protocoles opératoires décrits ci-après sont des exemples d'application du procédé de dosage utilisant respectivement les réactifs BXT 01041 (décrit à l'exemple 1), 01048 (décrit à l'exemple 3), 01049 (décrit à l'exemple 4) et 01050 (décrit à l'exemple 7), pour mesurer l'activité SOD dans un lysat érythrocytaire. Exemple 11 : Procédure de dosage utilisant le réactif BXT 01041 On utilise un coffret contenant les réactifs décrits ci-dessous. Ce coffret de réactifs doit être stocké à une température comprise entre 0 et 40C. Description des réactifs R1 : Solution de BXT 01041 2.10-3 M dans le mélange DMSO/H2O, 50/50 (v/v) contenant de l'acide borique 0,15 M. (A conserver entre 0 et 40C pendant les mesures; stable environ 1 mois après préparation, dans les conditions de stockage mentionnées ci-dessus) R2 : Solution de tétrafluoroborate de 1,4,6-triméthyl 2-vinylpyridinium 5.10-2 M dans du DMSO contenant 25 % (p/v) d' éthylène-glycol. (A conserver entre 0 et 40C pendant les mesures; stable au moins 1 mois après préparation). E : Ethanol absolu/chloroforme, 62,5/37,5 (v/v). (A conserver entre 0 et 40C pour la préparation de l'échantillon). T : Tampon AMPD 0,05 M/HCl pH = 8,8, contenant du DTPA 0,1 mM. (Laisser équilibrer à l'air et à 370C avant les mesures) Préparation de l'échantillon On centrifuge au moins 100 fl de sang total à 40C et 3000 tr/min pendant 10 minutes. On élimine le surnageant. On lave le culot érythrocytaire avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 % (refroidie entre 0 et 40C) puis on centrifuge à 40C et 3000 tr/min pendant 10 minutes. On élimine le surnageant. On reprend le culot érythrocytaire avec 4 fois son volume d'eau distillée refroidie entre 0 et 40C et on mélange. A 125 Fl de ce lysat érythrocytaire au 1/5ème, d'une part, et à 125 pl d'eau distillée, d'autre part on ajoute 200 Fl du mélange E, (refroidi entre 0 et 40C). On mélange bien chacune des solutions et on centrifuge à 40C et 3000 tr/min pendant 10 minutes. Le surnageant ainsi obtenu servira au dosage, respectivement pour l'échantillon (débarrassé de l'hémoglobine) et pour le témoin. Les surnageants doivent être conservés entre 0 et 40C pour les mesures. Procédure de dosage Les mesures sont effectuées à 370C dans un spectrophotomètre dont les cuves de mesure sont thermostatées. Le mélange réactionnel correspondant à chaque dosage est préparé extemporanément selon les proportions données dans le tableau ci-dessous pour des cuves de 1 ml. Chaque réaction est déclenchée par l'ajout de 10 fl de réactif R1. Après homogénéisation du milieu, l'évolution de l'absorbance est enregistrée immédiatement et suivie pendant 1 min 30 s. La mesure d'absorbance est effectuée à 501 nm dans des cuves de 1 cm de trajet optique, contre de l'air. Pour chaque mesure, le milieu réactionnel défini dans le tableau ci-dessous doit être incubé pendant 1 minute à 370C avant ajout du réactif R1. TEMOIN ECBANTILLONS R2 20 Rl 20 pil Blanc échantillon * 40 1 ECHANTILLONS 40 pil T 930 pLl 930 Rl (*) : Eau distillée ayant subi la même procédure d'extraction que le lysat érythrocytaire. Pour chacune des mesures, on détermine la vitesse maximale d'autoxydation, exprimée en unités d'absorbance par minute, en soustrayant la valeur d'absorbance relevée au bout de 20 s de celle relevée au bout de 80 s, ce qui correspond à une phase d'oxydation linéaire, en fonction du temps, du réactif BXT 01041. Expression des résultats Soient VC et Vs les vitesses correspondant respectivement au témoin et à l'échantillon, l'activité SOD de celui-ci est calculée à l'aide de l'équation de la droite d'étalonnage présentée sur la figure 1 qui représente les variations de l'inverse de la différence (Vs-Vc) exprimé en min/variation de l'absorbance (min/A abs.), en fonction de l'inverse de la concentration en activité SOD, exprimé en ml/U. Cette droite permet de déterminer la valeur de l'abscisse correspondant à une valeur d'ordonnée expérimentalement mesurée. On multiplie alors l'inverse de cette abscisse par le facteur de dilution D. Les résultats sont alors exprimés en unités d'activité SOD par ml d'échantillon, selon Unités d'activité SOD= 1/{ 0,026 x [1/(VS-Vc)] - 0,075 } x D L'unité U d'activité SOD définie dans cette méthode présente l'avantage unique de fournir une référence invariable, compte tenu de l'absence de réactifs protéiques ou enzymatiques peu stables, tels que la xanthine oxydase. L'utilisation de cette unité est fortement recommandée, mais l'utilisateur peut la traduire en valeur pondérale d'une SOD purifiée avec laquelle il aura préalablement construit une courbe d'étalonnage. Une telle estimation pondérale sera fortement affectée par le pourcentage d'enzyme inactive présent dans la préparation. Les résultats peuvent aussi être exprimés par exemple en U/ml de sang total ou en U/mg de protéines érythrocytaires. Remarques Le contrôle de la procédure de dosage peut être effectué en dosant l'activité SOD d'un lysat érythrocytaire préparé comme décrit précédemment et conservé à -700C sous forme d'aliquots pour servir de témoin. L'activité SOD de tels aliquots est stable au moins 6 mois à -700C. Le dosage doit être effectué sur un aliquot décongelé extemporanément. Exemple 12 : Procédure de dosage utilisant le réactif BXT 01048 Identique à l'exemple 11, excepté que - Dans R1, le réactif BXT 01041 est remplacé par le réactif BXT 01048. - L'évolution de l'absorbance est suivie à 505 nm. La figure 2 annexée représente les variations de l'inverse de la différence (Vs-Vc), exprimé en min/variation de l'absorbance (min/Nabs.) en fonction de l'inverse de la concentration en activité SOD, exprimé en ml/U, dans cet exemple. Unités d'activité SOD= 1/ {0,028 x [1/(VS-Vc)] - 0,077 } x D Exemple 13 : Procédure de dosage utilisant le réactif BXT 01049 Identique à l'exemple 11, excepté que - R1 est remplacé par R3 qui est défini de la façon suivante solution de BXT 01049 2.10-3M dans le mélange DMSO/H20 à 50/50 (v/v), contenant de l'acide borique 0,1M. - L'évolution de l'absorbance est suivie à 522 nm pendant 1 min. - La vitesse maximale d'autoxydation est obtenue en soustrayant la valeur d'absorbance relevée au bout de 20 s de celle relevée au bout de 50 s. La figure 3 annexée représente les variations de l'inverse de la différence (Vs-Vc), exprimé en min/variation de l'absorbance (min/A abs.) en fonction de l'inverse de la concentration en activité SOD, exprimé en ml/U, dans cet exemple. Unités d'activité SOD= 1/(0,023 x [l/(VS-VC)] - 0,063} x D. Exemple 14 : Procédure de dosage utilisant le réactif BXT 01050 Identique à l'exemple 11, excepté que - R1 est remplacé par R4 qui est défini de la façon suivante solution de BXT 01050 2.10-3 M dans le mélange DMSO/H2O à 50/50 (v/v), contenant de l'acide borique 0,3M. - L'évolution de l'absorbance est suivie à 525 nm pendant 1 min. - La vitesse maximale d'autoxydation est obtenue en soustrayant la valeur d'absorbance relevée au bout de 20 s de celle relevée au bout de 50 s. La figure 4 annexée représente les variations de l'inverse de la différence (Vs-Vc), exprimé en min/variation de l'absorbance (min/A abs.) en fonction de l'inverse de la concentration en activité SOD, exprimé en ml/U, dans cet exemple. Unités d'activité SOD= 1/{0,070 x [1/(VS-VC)] - 0,102} x D. REFERENCE S 1. FRIDOVICH I. (1986), Biological effects of the superoxide radical; Arch. Biochem. Biophys. 247, 1-11. 2. FRIDOVICH I. (1986a), Superoxide dismutases; Adv. Enzymol. 58, 61-97. 3. FRIDOVICH I. 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REVENDICATIONS 1.- Composés de formule générale I dans laquelle n = 1 ou 2, R1 = -OR4 ou -NR5R6, R2 = hydrogène, -OR4, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), ou bien -CH2- ou -CH2-CH2-, pour former un cycle par liaison avec le substituant phényle, en position méta par rapport à R1 et R3 = hydrogène, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone) ou -OR4 (à condition que R2 soit différent de -OR4), avec R4 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), R5 = hydrogène, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), -CH2COOH, -C6HsCOOH ou -C6HsSO3H et R6 = hydrogène, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone) ou -CH2COOH. 2.- Procédé de dosage de l'activité superoxyde dismutase (SOD) dans un milieu liquide, procédé qui utilise l'activation de l'autoxydation d'un réactif par l'activité SOD, caractérisé en ce que ledit réactif est un composé répondant à la formule générale I, définie à la revendication 1. 3.- Procédé de dosage de l'activité superoxyde dismutase (SOD) dans un milieu liquide contenant un ou plusieurs mercaptan(s), notamment un milieu biologique, procédé qui utilise l'activation de ltautoxydation d'un réactif par l'activité SOD, caractérisé en ce que ledit réactif est un composé répondant à la formule générale I définie à la revendication 1 et en ce que le milieu contient en outre une quantité, capable de piéger totalement lesdits mercaptans par S-alkylation, d'au moins un composé répondant à la formule générale Il dans laquelle Z1 = alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), benzyle, p nitrobenzyle, phényle, o,p-dinitrophényle, -CH2-COOH ou -CH2-CH2-COOH;; Z4 = hydrogène et Z5 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), ou Z4 et Z5 forment ensemble, avec les deux atomes de carbone intermédiaires, un cycle phényle; X= halogénure, sulfonate, fluorosulfonate, phospho nate, tétrafluoroborate ou tosylate; et soit z2 = vinyle et Z3 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone); soit Z3 : vinyle, et z2 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone) 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que, dans la formule générale II, X = trifluorométhylsulfonate. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'il repose sur une mesure spectrophotométrique de la vitesse d'autoxydation d'un composé de formule générale I, en l'absence et en présence de l'échantillon à doser. 6.- Procédé de dosage de l'activité superoxyde dismutase (SOD) dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à 10) déterminer la vitesse maximale d'autoxydation Vs d'un composé de formule générale I en présence de l'échantillon, au moyen de l'évolution de l'absorbance en fonction du temps, à la longueur d'onde caractérisant l'apparition du produit d'autoxydation du composé de formule générale I utilisé, dans un milieu réactionnel tamponné à une valeur de pH de 8,0 à 9,0, en déclenchant la réaction par ajout d'un aliquot d'une solution-mère du composé de formule générale I ; 20) déterminer, dans les mêmes conditions, la vitesse maximale d'autoxydation Vc du même composé en l'absence de l'échantillon ; et 30) déterminer la concentration en SOD de l'échantillon au moyen de la différence des mesures effectuées et d'une courbe d'étalonnage établie dans les mêmes conditions opératoires. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend l'ajout d'un dérivé du bore, notamment l'acide borique, pour moduler la vitesse d'autoxydation du composé de formule générale I. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce qu'on utilise une solution aqueuse d'un composé de formule générale I en présence d'un dérivé du bore, notamment l'acide borique pour stabiliser le composé de formule générale I hors des conditions de mesure. 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'on combine à la mesure faite dans des conditions d'activation de l'autoxydation du composé de formule générale I, une mesure effectuée dans des conditions d'inhibition de cette autoxydation, dans une gamme de pH de 7,2 à 7,8. 10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisé en ce que le composé de formule générale I est le S,6,6a,lîb-tétrahydro-3,9,10- trihydroxybenzo[c]fluorène. 11.- Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement, en tant que réactif, un composé de formule générale I. 12.- Nécessaire ou kit selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un ou plusieurs composé(s) piégeur(s) de mercaptans de formule générale II. 13.- Nécessaire ou kit selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement : - un composé de formule générale I en solution ou en poudre, en présence d'acide borique ou d'un dérivé de ce dernier, - un ou plusieurs composé(s) piégeur(s) de mercaptans de formule générale II, en solution ou en poudre, et - un tampon à base de AMPD, tamponnant dans la gamme de pH de 8,0 à 9,0.