FR 2677372 A1 19921211 FR 9106882 A 19910606 La présente invention se rapporte à des séquences nucléotidiques et peptidiques d'une souche européenne, plus particulièrement française, du virus de l'hépatite C, ainsi qu'aux applications diagnostiques et thérapeutiques de ces séquences. Le virus de l'hépatite C est un agent étiologique majeur des infections par les virus auparavant appelé virus "Non-A Non-B". Les infections par le virus C représentent en fait maintenant les formes les plus fréquentes d'hépatites aiguës et d'hépatites chroniques Non-A Non-B (Alter et coll., (1), Choo et coll., (3) ; Hopf et coll., (5) ; Kuo et coll., (8) Miyamura et coll., (11). De plus il existe une association (dont la signification est encore mal comprise) entre la présence d'anticorps anti-HCV et le développement de cancers primitifs du foie. Il a été également montré que le virus de l'hépatite C était impliqué à la fois dans des hépatites chroniques ou aiguës Non-A Non-B liées à des transfusions de produits sanguins ou d'origine sporadique. Le génome du virus de l'hépatite C a été cloné et la séquence nucléotidique d'un isolat américain a été décrite dans EP-A-O 318 216, EP-A-O 363 025, EP-A-O 388 232 et WO-A-90/14436. En outre, on dispose actuellement de données de séquences nucléotidiques de plusieurs isolats japonais concernant à la fois la région structurale et la région non structurale du virus (Okamoto et coll., (12), Enomoto et coll., (4), Kato et coll., (6) ; Takeuchi et coll., (15 et 16). Le virus présente certaines homologies avec le groupe des Flavi et des Pestivirus ; cependant il semble bien former une classe à part, différente des virus connus jusqu'a présent (Miller and Purcell, (10)). Malgré l'avancée considérable qu'à représenté le clonage de l'HCV, plusieurs problèmes persistent - il existe une variabilité génétique importante dans certaines régions du virus qui a permis de décrire l'existence de deux groupes de virus. - le diagnostic de l'infection virale reste difficile malgré la possibilité de détecter des anticorps anti-HCV dans le sérum des malades. Cela est dû à l'existence de résultats faussement positifs et à une séroconversion retardée après infection aiguë. Enfin il existe manifestement des cas où seul la détection de l1ARN du virus permet de mettre en évidence l'infection HCV alors que la sérologie reste négative. Ces problémes ont des implications importantes à la fois en ce qui concerne le diagnostic et la protection contre le virus. Les auteurs de la présente invention ont réalisé le clonage et ont obtenus la séquence nucléotidique partielle d'un isolat français d'HCV (dénommé ci-après HCV El) à partir d'un donneur de sang ayant transmis une hépatite chronique active à un receveur. La comparaison des séquences nucléotidiques et des séquences peptidiques obtenues avec les séquences respectives des isolats américain et japonais a montré qu'il existait - une forte conservation en acides nucléiques dans la région non codante du HCV El, - une importante variabilité génétique dans les régions structurales dénommées El et E2/NS1, - une variabilité génétique moindre dans la région non structurale. La présente invention repose sur des nouvelles séquences nucléotidiques et polypeptidiques du virus de l'hépatite C qui n'ont pas été décrites dans l'état de la technique précité. La présente invention a ainsi pour objet une séquence d'ADN de HCV El comprenant une séquence d'ADN choisie parmi les séquences nucléotidiques d'au moins 10 nucléotides comprises entre les nucléotides (n) suivants : n118 à n138 ; n177 à n202 ; n233 à n247 n254 à n272 et n272 à n288 représentés sur la séquence SEQ ID N"2, et, n156 à n170 ; n170 à n217 ; n267 à n283 et n310 à n334 représentés sur la séquence SEQ ID N 3 ; ainsi que les séquences nucléotidiques analogues résultant de la dégénérescence du code génétique. L'invention a en particulier pour objet les séquences nucléotidiques suivantes : SEQ ID N 2, SEQ ID N 3 et SEQ ID N"4. Les séquences oligonucléotidiques peuvent avantageusement être synthétisées par la technique Applied Bio System. L'invention a également pour objet une séquence peptidique de HCV El comprenant une séquence peptidique choisie parmi les séquences d'au moins 7 aminoacides compris entre les aminoacides (aa) suivants : aa58 à aa66 ; aa76 à aa10l représentés sur la séquence peptidique SEQ ID N"2, aa49 à aa78 ; aag8 à aalll ; aa123 à aa133 ; aa140 à aa149 représentés sur la séquence peptidique SEQ ID N 3 ; ainsi que des séquences peptidiques homologues n'induisant pas de modification des propriétés biologiques et immunologiques. De préférence la séquence peptidique est choisie parmi les séquences d'aminoacides suivants aa58 à aa66 ; aa76 à aa10l représentés sur la séquence peptidique SEQ ID N 2, aa49 à aa78 ; aa98 à aa111 aa123 à aa133 et aa140 à aa149 représentés sur la séquence peptidique SEQ ID N"3. La séquence peptidique est en outre avantageusement choisie parmi les séquences peptidiques SEQ ID N"2, SEQ ID N"3 et SEQ ID N04. L'invention a également pour objet une séquence nucléotidique codant par une séquence peptidique telle que définie ci-dessus. L'invention a en outre pour objet une sonde polynucléotidique comprenant une séquence d'ADN telle que définie précédemment. L'invention a également pour objet un peptide immunogène comportant une séquence peptidique telle que définie précédemment. Les séquences peptidiques selon l'invention peuvent être obtenues par des méthodes de synthèse classique ou par application de techniques de génie génétique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour une séquence peptidique selon l'invention dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression et culture de ces cellules. L'invention a également pour objet des plasmides ou des vecteurs d'expression comprenant une séquence d'ADN codant pour une séquence peptidique telle que définie précédemment ainsi que des hôtes tranformés avec ce vecteur. Les plasmides préférés sont ceux déposés à la CNCM le 5 juin 1991 sous les numéros I-1105, I-1106 et 1-1107. L'invention a également pour objet des anticorps monoclonaux dirigés contre une séquence peptidique selon l'invention ou une séquence immunogène d'un tel polypeptide. Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être préparés selon une technique classique. A cet effet, les polypeptides peuvent être couplés si nécessaire à un agent immunogène, tel que l'anatoxine tétanique, par un agent de couplage tel que le glutaraldéhyde, un carbodiimide ou une benzidine bis diazotée. La présente invention englobe également les fragments et les dérivés d'anticorps monoclonaux selon l'invention. Ces fragments sont notamment les fragments F(ab')2 qui peuvent être obtenus par clivage enzymatique des molécules d'anticorps avec la pepsine, les fragments Fab' qui peuvent être obtenus par réduction des ponts disulfure des fragments F(ab')2 et les fragments Fab qui peuvent être obtenus par clivage enzymatique des molécules d'anticorps avec la papaïne en présence d'un agent réducteur. Ces fragments, ainsi que des fragments Fc, peuvent être également obtenus par génie génétique. Les dérivés d'anticorps monoclonaux sont par exemple des anticorps ou des fragments de ces anticorps auxquels sont liés des marqueurs tels qu'un radioisotope. Les dérivés d'anticorps monoclonaux sont également des anticorps ou des fragments de ces anticorps auxquels sont liées des molécules thérapeutiquement actives. L'invention a également pour objet une trousse d'analyse pour la détection de séquences nucléotidiques spécifiques de la souche HVC El comportant une ou plusieurs sondes telles que définies précédemment. L'invention a également pour objet un procédé de diagnostic in vitro par mise en évidence des antigènes spécifiques de HCVE1 dans un prélèvement biologique pouvant contenir lesdits antigènes, dans lequel on met en présence le prélèvement biologique avec un anticorps ou un fragement d'anticorps, tels que définis précédemment; ainsi qu'une trousse de diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé. L'invention a également pour objet un procédé de diagnostic in vitro par mise en évidence des anticorps spécifiques de HCVE1 dans un prélèvement biologique pouvant contenir lesdits anticorps, dans lequel on met en présence un prélèvement biologique avec un antigène comportant un épitope correspondant à une séquence peptidique ainsi qu'une trousse de diagnostic pour la détection d'anticorps spécifiques, comprenant un antigène comportant un épitope correspondant à une séquence peptidique telle que définie précédemment. Ces procédés peuvent être basés sur une méthode radioimmunologique de type RIA, RIPA ou IRMA ou une méthode immunoenzymatique de type WESTERN-BLOT sur bandelettes ou de type ELISA. L'invention a également pour objet une composition thérapeutique comprenant des anticorps monoclonaux ou des fragments d'anticorps monoclonaux ou des dérivés d'anticorps monoclonaux tels que définis précédemment. Avantageusement, les dérivés d'anticorps monoclonaux sont des anticorps monoclonaux ou des fragments de ces anticorps liés à une molécule thérapeutiquement active. L'invention a également pour objet une composition immunogène comportant une séquence immunogène telle que définie précédemment éventuellement liée à une protéine porteuse, ladite séquence immunogène étant susceptible d'induire des anticorps protecteurs ou des lymphocytes T cytotoxiques. Comme protéines porteuses on peut utiliser des anatoxines telles que l'anatoxine tétanique. En variante on peut également utiliser des immunogènes constitués selon la technique du MAP (Multiple Antigenic Peptide). Outre la séquence peptidique immunogène, la composition immunogène peut contenir un adjuvant doué de propriétés immunostimulantes. Parmi les adjuvants que l'on peut utiliser figurent les sels minéraux tels que l'hydroxyde d'aluminium, des composés hydrophobes ou des surfactants tels que l'adjuvant incomplet de Freund, le squalane ou des liposomes, des polynucléotides synthétiques, des microorganismes ou composants de microorganismes tels que le marabutide, des molécules artificielles synthétiques telles qe l'imuthiol ou le levamisole, ou encore des cytokines telles que les interférons i ou des interleukines. L'invention a également pour objet un procédé de dosage d'une séquence peptidique telle que définie précédemment comprenant l'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre cette séquence peptidique. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une séquence peptidique telle que définie précédemment, comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour la séquence peptidique dans un vecteur d'expression, la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression et la culture des cellules. On décrira ci-après plus en détail l'obtention de l'ADN des séquences de la souche HCV El en se reportant aux figures annexées sur lesquelles - La figure 1 représente la localisation des régions du HCVE1 amplifiées et séquencées - La figure 2 représente la comparaison de la séquence nucléotidique du HCVE1 (1), dans la région non codante, avec les séquences d'un isolat américain (2) et de deux isolats japonais :HCJ1 (3) et HCJ4 (4) décrits respectivement dans WO-A-90/14436 et par Okamoto et coll. (12) - La figure 3 représente la comparaison de la séquence nucléotidique du HCVE1 (1), dans la région El, avec les séquences d'un isolat américain (HCVpt) (2) décrit dans WO 90/14436 et de trois isolats japonais : HCVJ-1 (3), HCJ1 (4) et HCJ4 (5) décrits dans Takeuchi et coll. (15) ; Okamoto et coll., (12) - La figure 4 représente la comparaison de la séquence en aminoacides, dans la région El, du HCVE1 (1) avec l'isolat américain ; HCVpt (2) et les isolats japonais :HCVJ1 (3), HCJl (4) et HCJ4 (5) ; les régions variables sont encadrées - La figure 5 représente la comparaison de la séquence nucléotidique, dans la région E2/NSl, du HCVE1 (1) avec l'isolat américain HCVpt (2) décrit dans WO-A90/14436 et les isolats japonais HCJ1 (3), HCJ4 (4) et HCVJ1 (5) décrits par Okamoto et coll., (12) ;Takeuchi et coll., (15) ; - La figure 6 représente la comparaison de la séquence en aminoacides, dans la région E2/NS1, du HCVE1 (1) avec l'isolat américain HCVpt (2) et les isolats japonais HCJ1 (3), HCJ4 (4) et HCVJ1 (5) ; les régions variables sont encadrées ; - La figure 7 représente le profil d'hydrophilicité du HCVE1 dans la région E2/NS1 ; les régions hydrophobe sont localisées sous la ligne médiane - La figure 8 représente la comparaison de la séquence nucléotidique, dans la région NS3/NS4, du HCVE1 (1) avec l'isolat américain HCVpt (2) décrit dans WO-A90/14436 et de l'isolat japonais HCVJ1 (3) décrit par Kubo et coll., (7) ; - La figure 9 représente la comparaison de la séquence en aminoacides, dans la région NS3/NS4, du HCVE1 (1) avec l'isolat américain HCVpt (2) et l'isolat japonais HCVJ1 (3). I - Obtention des séquences nucléotidiques 1) Préparation de 1'ARN HCVE1 L'ARN d'HCVEl a été préparé comme précédemment décrit dans EP-A-O 318 216 à partir du sérum d'un donneur de sang français atteint d'une hépatite chronique, anti-HCV positif (anti-C100) (Kubo et coll., (7) 100 ul de sérum ont été dilués dans un volume final de 1 ml, dans le tampon d'extraction suivant : 50 mM tris-HCl, pH.8, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mg/ml de protéinase K, et 0,5* de SDS. Après digestion par la protéinase K pendant 1h à 37"C, les protéines ont été extraites avec un volume de phénol saturé avec du TE (10 mM Tris-HCl, pH.8, 1 mM EDTA). La phase aqueuse a été ensuite extraite 2 fois avec 1 volume de phénol/chloroforme (1:1) et 1 fois avec 1 volume de chloroforme. La phase aqueuse a été alors amenée à une concentration finale de 0,2 M d'acétate de sodium et les acides nucléiques ont été précipités par addition de deux volumes d'éthanol. Après centrifugation les acides nucléiques ont été suspendus dans 30 ul d'eau distillé stérile traité au DEPC. 2) Transcription reverse et amplification Un ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé en utilisant comme amorce soit des oligonu cléotides spécifiques de l'HCV représenté au tableau I ci-après, soit un mélange d'hexanucléotides non spécifiques du HCV et la transcriptase reverse murine. Une PCR (Polymerase Chain Reaction) a été effectuée sur 40 cycles aux températures suivantes : 94"C (1 mn), 55"C (1 mn), 72"C (1 mn), sur l'ADNc ainsi obtenu en utilisant des couples d'amorces spécifiques du HCV (Tableau I ci- dessous). Les différentes amorces HCV ont été fabriquées à partir de la séquence du HCV prototype (HCVpt), isolé d'un chimpanzé chroniquement infecté (Bradley et coll., (2) ; Alter et coll., (1), EP-A-O 318 216). La séquence nucléotidique de la région 5' du gène E2/NS1 a été obtenue en utilisant une stratégie dérivée de la technique d'amplification à partir d'une seule amorce indépendante de la séquence "Sequence Independent Single Primer Amplification" (SISPA) décrite par Reyes et coll., (13).Elle consiste à ligaturer des adaptateurs doubles brins aux extrémités du DNA synthétisé avec une amorce HCV-spécifique localisée en 5' de la séquence du HCVpt (amorce NS1A du Tableau I). Ensuite, une amplification semi-spécifique est effectuée en utilisant une amorce HCV-spécifique ainsi qu'une amorce correspondant à l'adaptateur. Cette approche permet d'obtenir des produits d'amplification s'étendant en 5' de l'amorce utilisée pour la synthèse de l'ADNc. Tableau I. Séquence des amorces et des sondes. a) amorcesa : NS3 (+) 5' ACAATACGTGTGTCACC (3013-3029) NS4 - (-) 5' AAGTTCCACATATGCTTCGC (3955-3935) NS1A (-) 5' TCCGTTGGCATAACTGATAG (83-64) NS1B (+) 5' CTATCAGTTATGCCAACGGA (64-83) NS1C (-) 5' GTTGCCCGCCCCTCCGATGT (380-361) NS1D (+) 5' CCCAGCCCCGTGGTGGTGGG (183-202) NSlE (-) 5' CCACAAGCAGGAGCAGACGC (860-841) NCA (+) 5' CCATGGCGTTAGTATGAGT (-259- -239) NCB (-) 5' GCAGGTCTACGAGACCTC (-4- -23) E1A (+) 5' TTCTGGAAGACGGCGTGAAC.(470-489) E1B (-) 5' TCATCATATCCCATGCCATG (973-954) b)sondesa :: NS3/NS4 (+) 5'CCTTCAGGATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGT (3058-3097) NS1 (+) 5' CTGTCCTGAGAGGCTAGCCAGCTGCCGACCCCTTACCGAT (5-44) NSlB/C (+) 5 'AGGTCGGGCGCGCCCACCTACAGCTGGGGTGAAAATGATA (210-248) NC (+) 5' GTGCAGCCTCCAGGACCCCC (-235- -216) E1 (-) 5' CTCGTACACAATACTCGAGT (646-627) a. Les séquences nucléotidiques et leurs localisations correspondent au HCV prototype (HCV pt) (EP-A-0 318 216 et WO-A-90/14436). 3) Clonage et séquençage Les produits d'amplification ont été clonés dans le M13 mpl9 ou dans le bactériophage lambda gt 10 comme décrit par Thiers et coll. (17). Les sondes utilisées pour le criblage des séquences d'ADN sont représentées au tableau I précédent. La séquence nucléotidique des inserts a été déterminée par la méthode utilisant des dideoxy-nucléotides décrite par Sanger et coll., (14). II - Etude des séquences nucléotidiques de l'isolat français (HCVE1) La localisation des différents produits d'amplification ayant permis l'obtention de la séquence nucléotidique de l'isolat HCV El dans des régions non structurales et structurales ainsi que dans la région non codante du virus, est schématisée sur la figure 1. 1) Séquence nucléotidique du HCV El dans la région 5' non codante La région 5' non codante du HCV El amplifiée et séquencée est appelée SEQ ID N"1. Elle correspond à un fragment de 256 paires de bases (pb) localisée en position -259 à -4 sur l'HCV pt tel que décrit dans WO-A-90/14436. La comparaison de la séquence du HCV El avec celles préalablement publiées montre une très forte conservation en acides nucléiques (Fig.2). 2) Séquences nucléotidique et peptidique du HCV El dans la région structurale Les séquences nucléotidiques correspondent vraisemblablement à deux régions codant pour les protéines d'enveloppe du virus (actuellement désignées, comme les régions El et E2/NS1). Pour la région El, la séquence obtenue pour le HCV El correspond à la moitié 3' du gène. Elle a été dénommée SEQ ID N"2. Cette séquence de 501 pb est localisée en position 470 et 973 sur la séquence du HCV pt tel que décrit dans WO-A-90/14436. La comparaison de cette séquence avec celles préalablement décrites montre une importante variabilité génétique (Fig.3). En effet, selon les isolats étudiés on peut observer une divergence de 10 à 27 % en acides nucléiques et de 7 à 20 % en acides aminés comme représenté au Tableau II ci-après. De plus, la comparaison de la séquence peptidique met en évidence l'existence de deux régions hyper variables encadrées sur la figure 4. Pour la région E2/NS1, les données de séquence du HCV El ont été obtenues à partir de trois produits d'amplification se chevauchant (Fig.l). La séquence consensus ainsi obtenue (1210 pb) contient la totalité du gène E2/NS1, et a été dénomée SEQ ID N"3. La séquence de la région E2/NS1 du HCVE1 est située en position 999 et 2209 par rapport à la séquence du HCV pt décrite dans WO-A-90/14436. La comparaison des séquences du HCVE1 avec les isolats précédemment décrits montre une divergence de 13 à 33 % en ce qui concerne les acides nucléiques et de 11 à 30 % en ce qui concerne les acides aminés (Fig.5 et 6, Tableau II). La variabilité la plus importante est observé en 5' du gène E2/NS1 (Fig.5). La comparaison en acides aminés montre l'existence de quatre régions hyper variables encadrées sur la Fig.6. Le profil d'hydrophilicité de la région E2/NS1 (Kyte et Dolittle, (9)) est donné sur la figure 7. Une région hydrophile entourée de deux régions hydrophobes sont observées. Les deux régions hydrophobes correspondent vraisemblablement à la séquence signal ainsi qu'au segment transmembranaire. Enfin, la région centrale possède dix sites potentiels de glycolisation (N-X-T/S), conservés sur les différents isolats (Fig.6). 3) Séquence nucléotidique et peptidique du HCV El dans la région non structurale Les données de séquence du HCV El dans la région non structurale correspondent aux parties 3' et 5' terminales des gènes NS3 et NS4, respectivement (Fig.l). La séquence obtenue pour le HCV El (943 pb) est localisée en position 4361 à 5303 sur la séquence du HCV pt et a été dénomée SEQ ID N"4. L'homologie de séquences est de 95 % avec l'isolat HCV pt et de 78,6 % avec un isolat japonais (Fig.8, Tableau II précédent). En ce qui concerne la comparaison en acides aminés, une homologie de 98 % et 93 % a été observée avec les isolats HCV pt et japonais, respectivement (Fig.8, Tableau II précédent). Ainsi, la comparaison de la séquence nucléotidique de l'isolat HCV El avec celle des isolats américain et japonais montre que l'isolat français est distinct des isolats précédemment décrits. Elle met en évidence l'existence de régions fortement variables dans les protéines d'enveloppe. La variabilité de la région non structurale étudiée est plus faible. Enfin, la région 5' non codante montre une forte conservation. Ces résultats ont des implications à la fois pour le diagnostic et la prévention contre le HVC. En ce qui concerne le diagnostic, la définition de régions hyper variables et de régions conservées peut conduire à - la définition de peptides synthétiques permettant l'expression d'épitopes spécifiques des différents groupes d'HCV. Pour la protéine d'enveloppe El, des peptides pour la détermination d'épitopes spécifiques de types sont avantageusement définis dans une région comprise entre les acides aminés 75 à 100 (Fig.4). De même, pour la protéine E2/NS1 des peptides permettent la caractérisation d'épitopes spécifiques sont synthétisés dans des régions comprises de préférence entre les acides aminés 50 à 149, (Fig.6). L'expression de la totalité ou d'une partie des séquences clonées, en particulier des clones correspondants aux régions de l'enveloppe du virus, permet l'obtention de nouveaux antigènes pour la mise au point de réactifs diagnostiques ainsi que pour la réalisation de compositions immunogènes. Enfin l'obtention d'une bonne partie de la séquence en nucléotides de cet isolat permet la réalisation d'ADN complémentaire de longueur complète pouvant être utilisé pour une meilleure compréhension des mécanismes de l'infection virale et également dans des buts de diagnostic et de prévention. Tableau II. Divergence en acides nucléiques (a.n.) et acides aminés (a.a.) entre 1'isolat français (HCVE1) et les isolats Américain (HCVpt) et Japonais (HCVJ1, HCJ1, HCJ4). HCVpt HCVJ1 HCJ1 HCJ4 HCVE1 El a.n. 10,6 27,3 10,4 26,5 a.a. 7,2 19,9 8,4 20,5 HCVE1 E2/NS1 a.n. 12,8% 33,2% 14,5% 29,8% a.a. 12,2% 29,7% 15,6% 26,1% HCVE1 NS3/NS4 a.n. 5,2% 21,4% - a.a. 2,2% 6,9t - REFERENCES 1. Alter, H.J., Purcell, R.H., Shib, J.W., Melpolder, J.C, Houghton, M., Choo, Q. -L. & Kuo, G. (1989). Detection of antibody to hepatitis C virus in prospectively foilowed transfusion recipients with acute and chronic non-A, non-B hepatitis. New England Journal of Medicine 321, 1494-1500. 2. Bradley, D.W., Cook, E.H., Maynard, J.E., Mc Caustland, K.A., Ebert, J.W., Dolana, G.H., Petzel, R.A., Kantor, R.J., Heilbrunn, A., Fields, H.A. & BR Murphy, B.L. (1979). Experimental infection of chimpanzees with antihemophilic (factor VIII) materials : recovery of virus-like particles associated with Non-A, Non-B hepatitis. 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Thiers, V., Nakajima, E.N., Kremsdorf, D., Mack, D., Schellekens, H., Driss, F., Goude, A., Wands, J., Sninsky, J., Tiollais, P. & Brechot, C. (1988). Transmission of hepatitis B from hepatitis B seronegative subjects. Lancet ii, 1273-1276. Symboles des acides aminés A Ala alanine C Cys cytéine D Asp acide aspartique E Glu acide glutamique F Phe phénylalanine G Gly glycine H His histidine I Ile isoleucine K Lys lysine L Leu leucine M Met méthionine N Asn asparagine P Pro proline Q Gln glutamine R Arg arginine S Ser serine T Thr thréonine V Val valine W Trp tryptophane Y Tyr tyrosine LISTE DES SEQUENCES I - INFORMATION GENERALE (1) DEMANDEUR : INSTITUT PASTEUR (2) TITRE DE L'INVENTION Nouvelles séquences nucléotidiques et peptidiques du virus de l'hépatite C. Applications et diagnos tiques et thérapeutiques. (3) NOMBRE DE SEQUENCES : 4 Il - INFORMATION POUR SEQ D N"1 CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES TYPE : Séquence nucléotidique LONGUEUR : 256 NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARN viral ORIGINE ORGANISME : virus hépatite C CARACTERISTIQUE LOCALISATION DE L'ADN : région 5' non codante DESCRIPTION DE LA SEQUENCE CCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGTACAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATA 60 GTGGTCTGCGGAGCCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGA 120 TCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGT 180 GTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAG 240 GTCTCGTAGACCGTGC 256 Il - INFORMATION POUR SEQ ID N"2 TYPE :Séquence nucléotidique et sa protéine correspondante LONGUEUR : 501 paires de bases 166 acides aminés NOMBRE DE BRINS : simple CARACTERISTIQUE : ADN codant pour une séquence peptidique appartenant à la protéine d'enveloppe El. (moitié 3' du gène de El) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE TT CTG GAA GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAC CTT 38 Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu 12 CCT GGT TGC TCT TTC TCT ATC CTC CTC CTG GCC CTG CTC 77 Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Leu Leu Leu Ala Leu-Leu 25 TCT TGC CTG ACT GTG CCC GCG TCA GCC TAC CAA GTA CGC 116 Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Val Arg 38 AAT TCT CGC GGC CTT TAC CAT GTC ACC AAT GAT TGC CCT 155 Asn'Ser Arg Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro 51 AAC TCG AGT ATT GTG TAC GAG ÁCG GCC GAT AGC ATT CTA 194 Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Thr Ala Asp Ser Ile Leu 64 CAC TCT CCG GGG TGT GTC CCT TGC GTT CGC GAG GGT AAC 233 His Ser Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn 77 ACC TCG AAA TGT TGG GTG GCG GTG GCC CCT ACA GTC GCC 272 Thr Ser Lys Cys Trp Val Ala Val Ala Pro Thr Val Ala 90 ACC AGA GAC GGC AGA CTC CCC ACA ACG CAG CTT CGA CGT 311 Thr Arg Asp Gly Arg Leu Pro Thr Thr Gln Leu Arg Arg 103 CAT ATC GAT CTG CTC GTC GGG AGC GCC ACC CTC TGC TCG 350 His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser 116 GCC CTC TAT GTG GGG GAC TTG TGC GGG TCC GTC TTC CTC 389 Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu 129 GTC GGT CAA TTG TTC ACC TTC TCC CCC AGG CGC CAC TGG 428 Val Gly Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp 142 ACA ACG CAA GAC TGC AAC TGT TCC ATC TAC CCC GGC CAC 467 Thr Thr Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His 155 GTA ACG GGT CAC CGC ATG GCA TGG GAT ATG ATG A 501 Val Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp'Met Met 166 IV - INFORATION POUR SEQ ID N03 TYPE : Séquence nucléotidique et sa protéine correspondante. LONGUEUR : 1210 paires de bases 403 acides aminés NOMBRE DE BRINS : simple CARACTERISTIQUES : ADN codant pour la protéine E2/NS1 (totalité du gène E2/NS1) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE A ATG GCT CAA CTG CTC AGG GTC CCG CAA GCC ATC TTG 37 Het Ala Gln Leu Leu Arg Val Pro Gln Ala Ile Leu 12 GAC ATG ATC GCT GGT GCC CAC TGG GGA GTC CTA GCG GGC 76 Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly 25 ATA GCG TAT TTC TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCG AAG GTC 115 Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val 38 CTC- CTA GTG CTG TTG CTG TTC GCC GGC GTC GAT GCG GAA 154 Leu Leu Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu 51 ACC TAC ACC ACC GGG GGG AGT ACT GCC AGG ACC ACG CAA 193 Thr Tyr Thr Thr Gly Gly Ser Thr Ala Arg Thr Thr Gln 64 GGA CTC GTC AGC CTT TTC AGT CGA GGC GCC AAG CAG GAC 232 Gly Leu Val Ser Leu Phe Ser Arg Gly Ala Lys Gln Asp 77 ATC CAG CTG ATC AAC ACC AAC GGC AGC TGG CAC ATT AAT 271 Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 90 CCK ACA GCT TTG AAC TGT AAT GAG AGC CTC GAC ACC GGC 310 Arc Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu Asp Thr Gly 103 TGG GTA GCG GGG CTC TTC TAT TAC CAC AAA TTC AAC TCT 349 Trp Val Ala Gly Leu Phe Tyr Tyr His Lys Phe Asn Ser 116 TCA GGC TGC CCC GAG AGG ATG GCC AGC TGC AGA CCC CTT 388 Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met Ala Ser Cys Arg Pro Leu 129 GCC GAT TTC GAC CAG GGC TGG GGC CCT ATC AGT TAT GCC 427 Ala Asp Phe Asp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala 142 AAC GGA ACC GGC CCT GAA CAC CGC CCC TAC TGC TGG CAC 466 Asn Gly Thr Gly Pro Glu His Arg Pro Tyr Cys Trp His 155 TAC CCC CCA AAG CCT TGT GGT ATC GTG CCA GCA CAG ACC 505 Tyr Pro Pro Lys Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Gln Thr 168 GTA TGT GGC CCA GTG TAT TGC TTC ACT CCT AGC CCC GTG 544 Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val 181 GTG GTG GGG ACG ACC AAT AAG TTG GGC GCA CCC ACT TAC 583 Val Val Gly Thr Thr Asn Lys Leu Gly Ala Pro Thr Tyr 194 AAC TGG GGT TGT AAT GAT ACG GAC GTC TTC GTC CTT AAT 622 Asn Trp Gly Cys Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn 207 AAC ACC AGG CCA CCG CTG GGC AAT TGG TTC GGC TGC ACC 661 Asn Thr Arg Pro Pro Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr 220 TGG GTG AAC TCA TCT GGA TTT ACT AAA GTG TGC GGA GCG 700 Trp Val Asn Ser Ser Gly Phe Thr Lys Val Cys Gly Ala 233 CCT CCC TGT GTC ATC GGA GGA GCG GGC AAT AAC ACC TTG 739 Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu 246 TAC TGC CCC ACT GAC TGT TTC CGC AAG CAT CCG GAA GCT 778 Tyr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala 259 ACA TAC TCC CGA TGT GGC TCC GGT CCT TGG ATC ACG CCC 817 Thr Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro 272 AGG TGC CTG GTT GGC TAT CCT TAT AGG CTC TGG CAT TAT 856 Arg Cys Leu Val Gly Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr 285 CCC TGT ACT GTC AAC TAC ACC CTG TTC AAG GTC AGG ATG 895 Pro Cys Thr Val Asn Tyr Thr Leu Phe Lys Val Arg Met 298 TAC GTG GGA GGG GTC GAG CAC AGG CTG CAA GTC GCT TGC 934 Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Gln Val Ala Cys 311 AAC TGG ACG CGG GGC GAG CGT TGT AAT CTG GAC GAC AGG 973 Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asn Leu Asp Asp Arg 324 GAC AGG TCC GAG CTC AGT CCG CTG CTG CTG TCT ACC ACA 1012 Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr 337 CAG TGG CAG GTC CTC CCG TGT TCC TTT ACG ACC TTG CCA 1051 Gln Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro 350 GCC TTG ACT ACC GGC CTC ATC CAC CTC CAC CAG AAC ATC 1090 Ala Leu Thr Thr Gly Leu île His Leu His Gln Asn Ile 363 GTG GAC GTG CAA TAT TTG TAC GGG GTG GGG TCA AGC ATT 1129 Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser Ser Ile 376 GTG TCC TGG GCC ATC AAG TGG GAG TAC GTC ATT CTC CTG 1168 Val Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Ile Leu Leu 389 TTT CTC CTG CTT GCA GAC GCG CGC GTC TGC TCC TGC TTG 1207 Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu 402 TGG 1210 Trp 403 V - INFORMATION POUR SEQ ID N"4 TYPE : Séquence nucléotidique et sa protéine correspondante. LONGUEUR : 943 paires de bases 313 acides aminés NOMBRE DE BRINS : simple CARACTERISTIQUE : ADN codant pour une séquence de la régon non structurale (parties 3' et 5' terminales des gènes NS3 et NS4 respective ment) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE AC AAT ACG TGT GTC ACC CAG ACA GTC GAC TTC AGC CTT 38 Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu 12 GAC CCT ACC TTC ACC ATT GAA ACA ACA ACG CTT CCC CAG 77 Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr.Thr Thr Leu Pro Gln 25 GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT CGG GGC AGG ACT GGC 116 Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly Arg Thr Gly 38 AGG GGG AAG CCA GGC ATT TAC AGA TTT GTG GCA CCT GGA 155 Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly 51 GAG CGC CCC TCC GGC ATG TTC GAC TCG TCC GTC CTC TGC 194 Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys 64 GAG TGC TAT GAC GCA GGC TGT GCT TGG TAT GAG CTC ACG 233 Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr 77 CCC GCC GAG ACC ACA GTC AGG CTA CGA GCA TAC ATG AAC 272 Pro Ala Glu Thr Thr Val Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn 90 ACC CCG GGA CTT CCC GTG TGC CAA GAC CAT CTT GAG TTT 311 Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp His Leu Glu Phe 103 TGG GAG GGC GTC TTC ACG GGT CTC ACC CAT ATA GAC GCC 350 Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala 116 CAC TTC CTA TCC CAG ACA AAG CAG AGT GGG GAA AAC CTT 389 His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu 129 CCT TAC CTG GTA GCG TAC CAA GCC ACC GTG TGC GCT AGG 428 Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg 142 GCC CAA GCC CCT CCC CCG TCG TGG GAC CAG ATG TGG AAG 467 Ala Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys 155 TGC TTG ATT CGT CTC AAG CCC ACC CTC CAT GGG CCA ACA 506 Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu His Gly Pro Thr 168 CCC CTG CTA TAC CGA CTG GGC GCT GTT CAG AAT GAA GTC 545 Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu Val 181 ACC CTG ACG CAC CCA ATC ACC AAA TAT ATC ATG ACA TGC 584 Thr Leu Thr His Pro Ile Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys 194 ATG TCG GCT GAC CTG GAG GTC GTC ACG AGT ACC TGG GTG 623 Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val 207 CTC GTG GGC GGC GTT CTG GCT GCT TTG GCC GCG TAT TGC 662 Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys 220 CTA TCC ACA GGC TGC GTG GTC ATA GTA GGC AGG GTC ATT 701 Leu Ser Thr Gly Cys Val Val Ile Val Gly Arg Val Ile 233 TTG TCC GGG AAG CCG GCA ATC ATA CCC GAC AGG GAA GTC 740 Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val 246 CTC TAC CGG GAG TTC GAT GAG ATG GAA GAG TGC TCT CAG 779 Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ser Gln 259 CAC TTG CCA TAC ATC GAG CAA GGG ATG ATG CTC GCC GAG 818 His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met Leu Ala Glu 272 CAG TTC AAG CAG AAG GCC CTC GGC CTC CTG CAA ACA CGG 857 Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Arg 285 TCC CGC CAG GCA GAG GTC ATC ACC CCT GCT GTC CAG ACC 896 Ser Arg Gln Ala Glu Val Ile Thr Pro Ala Val Gln Thr 298 AAC TGG CAG AGA CTC GAG GCC TTC TGG GCG AAG CAT ATG 935 Asn Trp Gln Arg Leu Glu Ala Phe Trp Ala Lys His Met 311 TGG AAC TT 943 Trp Asn 313 REVENDICATIONS 1. Séquence peptidique de HCVE1 comprenant une séquence peptidique choisie parmi les séquences d'au moins 7 aminoacides compris entre les aminoacides (aa) suivants : aa58 à aa66 et aa76 à aal0l représente tés sur la séquence peptidique SEQ ID N"2, aa49 à aa78; aa98 à aalll ; aa123 à aa133 et aa140 à aa149 représentés sur la séquence peptidique SEQ ID N"3 ainsi que des séquences peptidiques homologues n'induisant pas de modification des propriétés biologiques et immunologiques. 2. Séquence peptidique de HCV El comprenant une séquence peptidique choisie parmi les séquences d'aminoacides suivants : aa58 à aa66 et aa76 à aal0l représentés sur la séquence peptidique SEQ ID N"2, aa49 à aa78 ; aa98 à aalll ; aa123 à aa133 et aa140 à aa149 représentés sur la séquence peptidique SEQ ID N"3 ; ainsi que des séquences homologues n'induisant pas de modification des propriétés biologiques et immunologiques. 3. Séquence peptidique de HCV El comprenant une séquence peptidique choisie parmi les séquences peptidiques SEQ ID N"2, SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4 ainsi que des séquences homologues n'induisant pas de modification des propriétés biologiques et immunologiques. 4. Séquence nucléotidique codant pour une séquence peptidique selon la revendication 1 ou la revendication 2. 5. Séquence peptidique immunogène comportant une séquence peptidique selon la revendication 1 ou 2. 6. Vecteur d'expression comprenant une séquence d'ADN codant pour une séquence peptidique selon l'une des revendication 1, 2 et 3. 7. Plasmide comprenant une séquence d'ADN codant pour une séquence peptidique selon la revendication 3, choisi parmi les plasmides déposés à la CNCM le 5 juin 1991 sous les n" I-1105, I-1106 et I-1107. 8. Hôte transformé avec un vecteur selon la revendication 6. 9. Anticorps monoclonaux humains ou murins dirigés contre une séquence peptidique selon l'une des revendications 1, 2 ou 3. 10. Fragments Fab, Fab', F(ab')2 ou Fc d'anticorps monoclonaux selon la revendication 9. 11. Dérivés d'anticorps monoclonaux comprenant des anticorps monoclonaux selon la revendication 9 ou des fragments selon la revendication 10 auxquels sont liés des marqueurs ou des molécules thérapeutiquement actives. 12. Hybridomes produisant des anticorps monoclonaux selon la revendication 9. 13. Procédé de diagnostic in vitro par mise en évidence des antigènes spécifiques de HCVE1 dans un prélèvement biologique pouvant contenir lesdits antigènes, dans lequel on met en présence le prélèvement biologique avec un anticorps ou un fragement d'anticorps, tels que définis dans les revendications 9 et 10. 14. Trousse de diagnostic pour la détection d'antigènes spécifiques de HCV El comprenant un anticorps ou un fragment d'anticorps tels que définis à la revendication 9 ou 10 qui provoque une réaction immunologique avec un antigène HCV. 15. Procédé de diagnostic in vitro par mise en évidence des anticorps spécifiques de HCV El dans un prélèvement biologique pouvant contenir lesdits anticorps, dans lequel on met en présence un prél vement biologique avec un antigène comportant un épitope correspondant à une séquence peptidique selon la revendication 1, 2 ou 3. 16. Trousse de diagnostic pour la détection d'anticorps spécifiques de HCV El comprenant un antigène comportant un épitope correspondant à une séquence peptidique selon la revendication 1, 2 ou 3. 17. Composition thérapeutique comprenant des anticorps monoclonaux selon la revendication 9, des fragments d'anticorps monoclonaux selon la revendication 10 ou des dérivés d'anticorps monoclonaux selon la revendication 11. 18. Composition thérapeutique selon la revendication 17, dans laquelle les dérivés d'anticorps monoclonaux sont des anticorps monoclonaux ou des fragments de ces anticorps liés à une molécule thérapeutiquement active. 19. Composition immunogène comportant une séquence immunogène selon la revendication 5 liée à une protéine porteuse, ladite séquence immunogène étant susceptible d'induire des anticorps protecteurs ou d'induire des lymphocytes T cytotoxiques. 20. Procédé de dosage d'un polypeptide selon les revendications 1, 2 ou 3 comprenant l'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre un polypeptide selon la revendication 1, 2 ou 3 ou une séquence immunogène d'un tel polypeptide. 21. Procédé de préparation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour le polypeptide dans un vecteur d'expression, la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression et la culture de ces cellules.