FR 2689139 A1 19931001 FR 9203528 A 19920324 MOYENS POUR LA CONSERVATION ET LE TRANSPORT DE CELLULES ET POUR LEUR UTILISATION L'invention a pour objet des moyens pour la conservation de cellules, à savoir des particules de gel dans lesquelles sont immobilisées les cellules, et leur procédé d'obtention. L'invention se rapporte également à un dispositif ou kit pour le transport et l'utilisation de cellules pour réaliser des tests invitro. On sait que la demande pour les tests invitro est en forte croissance. Par rapport aux études chez l'animal, ils présentent, en effet, de nombreux avantages tels que rapidité, simplicité, souplesse et moindre coût. Ces tests invitro permettent d'effectuer des études comparatives sur cellules animales et humaines et ainsi d'orienter l'expérimentation animale par le choix de l'espèce dont les résultats sont les plus proches de ceux observés sur les cellules humaines. L'obtention de certaines cellules n'est pas toujours aisée, en particulier celles d'origine humaine ou de gros animaux de laboratoire, comme le chien ou le singe. On mesurera donc la nécessité de disposer de matériel biologique standardisé pour augmenter la fiabilité et la reproductibilité des résultats. Cette standardisation est liée à la méthode utilisée pour conserver les cellules. De manière générale, on conserve les cellules par culture, conservation hypothermique, ou congélation. Les deux premières techniques ne permettent de conservation qu a court terme et moyen terme respectivement en raison de l'évolution des cellules qui ne peut être freinée. La congélation assure une conservation à long terme, mais les cellules étant mises en suspension, on observe une perte de viabilité importante. L'immobilisation par inclusion dans un gel a été peu utilisée mais présente l'avantage de causer peu de dommages cellulaires. Cette technique comprend le passage, au travers d'une filière, d'une suspension des cellules dans une solution aqueuse renfermant le matériau gélifiable, suivi de la gélification des gouttes formées à l'extrémité de la filière en les faisant tomber dans un bain renfermant un agent de polymérisation du matériau gélifiable. Le matériau gélifiable est le plus généralement un alginate, à savoir un hétéropolysaccharide extrait d'algues marines qui présente la propriété de former un hydrogel en présence d'ions Ca2+. Les techniques d'immobilisation décrites à ce jour ne permettent pas toutefois d'assurer avec une fiabilité et une reproductibilité suffisantes une viabilité cellulaire et un maintien à long terme satisfaisant des propriétés fonctionnelles des cellules. En recherchant une solution à ce problème, les inventeurs ont constate qu'en agissant notamment sur la taille de la bille de gel, il était possible d'améliorer de manière inattendue le maintien des fonctions spécifiques des cellules incluses à des niveaux satisfaisants et sur plusieurs jours. L'invention a donc pour but de fournir de nouvelles billes de gel avec inclusion de cellules, particulièrement appropriées pour le stockage de ces cellules, en assurant un maintien à des niveaux élevés de l'expression de leurs fonctions spécifiques. Elle vise également à fournir un procédé d'obtention de ces billes permettant d'immobiliser rapidement et en grand nombre les cellules après leur isolement. L invention a également pour but de fournir un dispositif ou kit permettant de transporter aisément des cellules sous forme de cultures ou immobilisées à température ambiante, ou dans des conditions hypothermiques ou congelées. Elle vise également l'utilisation de ces kits pour effectuer des essais invitro, des études de métabolisme, de pharmacologie ou de toxicologie. Les billes de gel de l'invention, dans lesquelles sont incluses des cellules normales ou transformées, sont caractérisées en ce que leur diamètre n'excède pas 1 mm environ, de préférence 0,7 à 0,9 mm environ. Les cellules sont réparties de manière homogène dans ces billes, à raison notamment, d'environ 0,5 à 2 x 103 cellules par billes, notamment d'environ 103 cellules par billes. D'une manière inattendue, de telles billes assurent la viabilité et le maintien de l'activité fonctionnelle des cellules sur plusieurs jours. I1 est ainsi possible, lorqu'on récupère les cellules libérées ou non du gel, de réaliser des tests in vitro dans des conditions particulièrement satisfaisantes. Le gel de ces billes est formé par un matériau inerte vis-à-vis des cellules. Des matériaux qui conviennent à cet effet comprennent des polymères d'origine végétale ou animale, tels que collagènes ou chitine, ou d'origine synthétique comme les hydrogels, les alginates étant particulièrement préférés. Ils sont utilisés purs ou en mélange. Les types de cellules immobilisées dans ces billes peuvent être très variés d'origine humaine ou animale, ou encore végétale, et provenir de cellules normales ou transformées, c'est-à-dire des cellules tumorales ou modifiées par les techniques du génie génétique, ou encore fusionnées sous forme d'hybridomes. Il peut stagir également de microorganismes et d'organismes unicellulaires, le cas échéant transformés ou transfectés par une ou plusieurs séquences de nucléotides étrangères à leur matériel génétique ou un vecteur les comportant. Des cellules préférées sont constituées par les hépatocytes, compte tenu de l'intérêt de leurs cultures comme modèles alternatifs et/ou complémentaires à l'expérimentation animale pour déterminer le profil métabolique d'une nouvelle molécule et en évaluer ses effets (toxicité et activité). On notera en particulier que les hépatocytes immobilisés dans les billes de gel de l'invention permettent d'améliorer l'étude du métabolisme des molécules par rapport aux microsomes hépatiques utilisés jusqu'à présent. Ils offrent en effet l'avantage de permettre une caractérisation des voies métaboliques de phase I et de phase II, avec une grande simplicité de réalisation, alors que seule la phase I peut être étudiée avec les microsomes hépatiques. Les billes de gel de l'invention renferment ainsi avantageusement des cellules eucaryotes de mammifères, poissons ou mollusques. On citera, en particulier, des kératinocytes ou encore des adipocytes, des astrocytes, des mélanocytes, des hépatocytes, des cellules épithéliales d'origine hépatique ou des cellules endothéliales, des fibroblastes ou des cellules musculaires. Elles peuvent également renfermer des algues. Selon une disposition supplémentaire de l'invention, les billes ci-dessus se présentent le cas échéant à l'état congelé. L'invention vise également un procédé de conservation de cellules normales ou transformées par immobilisation dans des billes de gel comprenant - la mise en suspension des cellules en culture dans une solution aqueuse d'un matériau gélifiable, - le passage de la suspension à travers un dispositif assurant la formation de gouttelettes, - la mise en contact des gouttelettes avec un bain renfermant un agent de polymérisation du matériau gélifiable, et - la récupération et le lavage des billes formées, et l'addition d'un milieu de conservation. Conformément à l'invention, ce procédé est caractérisé en ce qu'on fait passer la suspension cellulaire à travers un capillaire et qu'on insuffle de l'air pour détacher les gouttes dès leur formation à l'extrémité du capillaire. Grâce à ces dispositions, la taille des billes n'excède pas 1 mm de diamètre, de préférence 0,7 à 0,9 mm de diamètre environ. Le cas échéant, l'étape de récupération des billes est suivie d'une étape de congélation. La suspension cellulaire renferme de préférence de 0,5 à 1,5 x 106 cellules/ml environ et plus spécialement de 0,8 à 1,2 x 106, de préférence autour de 1 x 106 cellules/ml. La concentration en matériau gélifiable est de 1 à 3 % environ, notamment de l'ordre de 2 %. Il s'agit d'un matériau inerte, gélifiable, capable de rester sous forme de gel en présence d'ions ou lorsqu'on augmente la température. Il est également important que ce matériau n'emprisonne pas de façon trop intense les cellules et assure une circulation d'oxygène et de nutriments. On choisit en outre un matériau ne subissant pas de modification à la congélation et qui ne se délite pas. Comme indiqué ci-dessus, parmi les matériaux disponibles, les alginates s'avèrent particulièrement satisfaisants. Ils polymérisent en présence de cations divalents tels que le calcium ou le magnésium, de façon réversible si les ions sont complexés par exemple par le citrate ou par 1'EDTA. Lorsqu'on souhaite modifier la viscosité de la suspension, on ajoute des composés appropriés du type de la laminine ou du collagène, notamment du collagène de type I, ou d'autres protéines de la matrice extracellulaire. On soumet avantageusement le matériau gélifiable à une étape de stérilisation avant incorporation des cellules. L'étape de congélation est réalisée en utilisant un agent cryoprotecteur capable d'éviter la formation de cristaux intracellulaires et de réduire la taille des cristaux dans la bille. Les quantités de cet agent mises en oeuvre varient selon les espèces. Elles sont par exemple de 16 à 18 % environ pour les hépatocytes de rat, de l'ordre de 12 % pour ceux d'homme, ou encore d'environ 14 % pour ceux de hamster. Pour les autres types de cellules, elles sont de l'ordre de 12 *. Ces pourcentages sont en volume. Comme agent cryoprotecteur approprié, on citera le diméthylsulfoxyde (DMSO). Avant de procéder à une diminution de température, on laisse en contact les cellules avec l'agent cryoprotecteur, puis on applique un gradient de température approprié afin de ne pas détruire les cellules. Pour la décongélation, on opère dans un bainmarie, en utilisant avantageusement un agent de dilution du cryoprotecteur. Les cellules immobilisées selon l'invention peuvent être utilisées à la température physiologique de 37"C, (mammifères) ou conservées à température inférieure, notamment de 15"C (poissons et mollusques) ou proche de 0 C, en particulier de 4"C dans un milieu additionné de polyéthylène glycol (PEG) tel que celui décrit par Poullain et al. dans Hepatology, vol 15, n" 1, 1992, p 97-106. Elles présentent des activités fonctionnelles tout à fait satisfaisantes pour la réalisation de tests in vitro. Ainsi, dans le cas par exemple des hépatocytes, on constate une conservation de ces activités durant 4 jours à 37 C, comme le montrent les résultats rapportés dans les exemples ci-après. Vis-à-vis d'agents toxiques, leur sensibilité est comparable à celle d'hépatocytes en culture. Ils conservent en outre leur capacité de métaboliser les médicaments comme les hépatocytes en culture. L'invention vise également un dispositif ou kit pour le transport de milieux de culture et de cellules, ce dispositif étant directement utilisable pour la réalisation de tests. Ce dispositif, qui comprend au moins une cuvette et un bouchon en un matériau inerte vis-à-vis de cultures cellulaires et stérilisable est caractérisé en ce que l'intersection entre la cuvette et le bouchon se réalise sous la forme d'une génératrice, le bouchon comprenant une partie inférieure destinée à être immergée dans le liquide de la cuvette, dont la paroi forme un angle avec la paroi latérale de la cuvette, cet angle et la hauteur de la partie immergée étant tels que le volume de liquide déplacé est suffisant pour chasser l'air de la cuvette, la partie supérieure du bouchon comportant un rebord déterminant, avec le rebord de la cuvette, un volume résiduel dans lequel est logé un matériau absorbant, destiné à recevoir l'excès de volume de liquide déplacé. Grâce à ces dispositions, aucune bavure ne se produit à la fermeture et à l'ouverture des cuvettes. Un tel dispositif est particulièrement approprié pour le transport de milieux de culture sous forme de plaques microtests comportant une pluralité de puits. Un kit correspondant est caractérisé en ce qu'il comprend - une plaque support avec une pluralité de cuvettes utilisables pour réaliser des tests invitro, - un couvercle d'étanchéité comprenant une pluralité de cavités dont la forme, la dimension et la position permettent d'assurer une fermeture étanche des cuvettes lorsqu'on applique le couvercle sur la plaque support. - une plaque absorbante vis-à-vis du milieu de culture, formée d'une pluralité d'ouvertures correspondant à celles des cuvettes, de manière à les entourer lorsqu'on applique la plaque absorbante sur la plaque support. De manière avantageuse, ces kits comprennent en outre les réactifs nécessaires à la réalisation d'un test donné, ainsi que le cas échéant le protocole d'utilisation. En vue de leur transport, ils comportent également des moyens pour rendre solidaires le couvercle et la plaque support. Les cuvettes présentent généralement une forme cylindrique. Les cavités de la plaque support présentent alors une forme cylindro-conique et comprennent une partie inférieure destinée à être immergée dans le liquide de la cuvette, dont la paroi forme un angle avec la paroi latérale de la cuvette, cet angle et la hauteur de cette partie immergée étant tels que le volume de liquide déplacé est suffisant pour chasser l'air de la cuvette, la partie supérieure des cavités déterminant avec le rebord de la cuvette un volume résiduel dans lequel est logé ledit matériau absorbant. L'épaisseur du couvercle entre les cavités est appropriée pour éviter un effet ventouse lors de l'ouverture du kit. Au moment de l'utilisation du kit, chaque cuvette est remplie du milieu de culture approprié pratiquement jusqu'au bord de la cuvette. Lorsqu'on applique le couvercle, la partie inférieure cylindro-conique des cavités touche le liquide du milieu de culture et fait remonter, au fur et à mesure qu'on l'enfonce, le liquide entre les parois de la cavité et la cuvette, en chassant l'air. Lorsque la cavité s'appuie le long d'un cercle contre le bord supérieur de la cuvette, le liquide pénètre dans le volume résiduel et est absorbé par l'élément formant joint, ce qui assure une étanchéité totale. L'absence d'air permet d'éviter le dessèchement des cultures. Ces kits permettent un transport aisé des liquides sans précautions particulières, dans un sens quelconque, c'est-à-dire à l'endroit ou à l'envers, et plus spécialement des milieux de culture, et ce dans des conditions anaérobies. Etant prêts à l'emploi, ils permettent une réalisation rapide de test invitro dans de nombreux domaines. On citera en particulier la pharmacie, la bactériologie, la cosmétologie, le diagnostic, la biologie moléculaire, la toxicologie, le contrôle de l'environnement, de produits, des études de pollution et l'industrie agro-alimentaire. L'invention fournit donc les moyens d'utiliser la cellule comme un réactif biologique standard avec contrôle de qualité. I1 peut s'agir de cellules en culture en monocouche ou en suspension, congelées, ou encore immobilisées comme exposé plus haut. Les cellules sont d'origine animale ou humaine, ou encore végétale ou proviennent de microorganismes et sont normales ou transformées. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans les exemples qui suivent de modes de réalisation des billes et de kits pour le transport de milieux de culture. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 5 qui représentent respectivement - les figures la et lb, le niveau d'activité des cellules immobilisées dans les billes de l'invention, pour une propriété donnée, par rapport aux cultures conventionnelles d'hépatocytes, - la figure 2, l'effet toxique de l'érythromycine sur des hépatocytes de différentes espèces, animales ou humaines, en culture ou bien immobilisés selon 1 'invention, - les figures 3a à 3c, la synthèse protéique, la production d'urée et le taux de cytochrome P450 mesurés sur des hépatocytes en culture ou immobilisés, à 37"C et 4"C - les figures 4a à 4d les niveaux d'activité d'hépatocytes de différentes espèces pour des propriétés données, comparés aux hépatocytes en culture conventionnelle, - la figure 5, un kit cellulaire conforme à l'invention, et - la figure 6, une coupe en perspective d'une cuvette avec son couvercle d'étanchéité Exemple 1 : Procédé de formation de billes de gel avec inclusion d' hépatocytes. Réactifs - solution d'alginate de sodium (Sigma extrait de Macrocystis Pyrifera, basse viscosité) à 3,3 % (p/v) dans une solution aqueuse de NaC1 0,9 % (p/v) à pH 7,4 contenant 5 mM d'Hépès, stérilisé à l'autoclave à 130 C pendant 30 minutes, - milieu de culture : 50 % de milieu Leibovitz L15 et 50 % de milieu essentiel minimum/milieu 199, 75/25 contenant 10 pg/ml d'insuline, 0,2 mg/ml de sérum albumine bovine, 100 pg/ml de streptomycine et 100 UI/ml de pénicilline, - solution de coulage : solution aqueuse de CaC12 à 1,1 % (p/v) (75 mM) et de NaC1 à 0,3 % (p/v) à pH 7,4 contenant 5 mM d'Hépès et 0,2 % (v/v) d'émulsifiant B (Sigma), - solution de lavage : tampon Hépès à pH 7,6 constitué de 2,38 g Hépès, 8 g Nazi, 0,2 g KC1, 0,1 g Na2HPO4 par litre d'eau. Immobilisation Des hépatocytes d'origine humaine ou animale isolés avec une viabilité de 90 % et maintenus à 4"C sont mis en suspension dans le milieu de culture à la concentration de 3 x 106/ml. Deux volumes de la solution d'alginate sont ajoutés lentement à 1 volume de suspension cellulaire. La concentration cellulaire est en final de 1 x 106/ml dans une solution d'alginate à 2,2 %. Les cellules sont passées à un débit de 1 ml/min dans un générateur de gouttelettes à flux d'air. Ce générateur, non représenté, comporte un conduit d'amenée de la suspension d'hepatocytes dans l'alginate, muni en son milieu d'un capillaire à travers lequel la suspension cellulaire est forcée de passer. Le principe de ce générateur est de forcer les gouttelettes d'alginate de très petite taille à se détacher de l'extrémité d'un capillaire, grâce à un flux coaxial (pression de 1 bar). Les gouttelettes obtenues tombent dans la solution de coulage et se solidifient sous forme de billes. Après environ 4 minutes au plus, les billes sont lavées 2 fois avec la solution de lavage et prêtes à l'emploi. Les billes obtenues ont un diamètre de 0,7 à 0,8 mm, elles contiennent 250 à 300 cellules dont la viabilité est de 87 %. Exemple 2 : Application de cette technique à d'autres types cellulaires En opérant comme décrit précédemment, on réalise l'immobilisation par inclusion dans le gel d'alginate de cellules épithéliales d'origine hépatique ou de kératinocytes. On observe dans chaque cas le maintien de la viabilité et du fonctionnement cellulaire de même qu'une reproductibilité parfaite des résultats. Avec les kératinocytes et les cellules épithéliales d'origine hépatique, on procède à une conservation à 4"C de 1 jour, suivie d'une récupération aux fins d'utilisation des cellules par dissociation des billes. Exemple 3 : Etude des cellules immobilisées Evaluation des propriétés fonctionnelles d'hépatocytes immobilisés 1 - L'activité d'hépatocytes de rat immobilisés dans des billes de 0,7 à 0,8 mm de diamètre a été évaluée après 4 heures et 48 heures d'immobilisation à 370C et comparée à celle de cellules maintenues en culture conventionnelle selon 10 critères fonctionnels différents. Sur la figure la, on a rapporté les résultats obtenus concernant - la synthèse protéique (SP) et lipidique (SL), - la production d'urée (PU), - la conjugaison du paracétamol (CP) - la dééthylation de la phénacétine (DP) La figure lb donne les résultats concernant - les taux de glycogène (GLY) et de glutathion (GLUT), - la dééthylation de l'éthoxyresorufine (EROD), - la déalkylation de la pentoxyrésorufine (PEROD), et - la conjugaison de la résorufine (RESO). Les symboles et se rapportent aux mesures (moyennes de 4 ou 5 expériences) réalisées respectivement après 4 et 48 h d'immobilisation. On constate que la plupart des activités fonctionnelles restent égales ou supérieures à 70 % de leur niveau mesuré dans les cellules en culture (témoin) à 4 h et 48 h. Ces résultats démontrent qu'il est possible de conserver des hépatocytes immobilisés pendant 48 h ou plus, capables d'exprimer des fonctions spécifiques à des niveaux tout à fait satisfaisants. Etude de la sensibilité des cellules immobilisées aux agents toxiques. Trois paramètres classiques de cytotoxicité ont été retenus dans une série d'essais et adaptés - le dosage d'une enzyme, la lacticodéshydrogénase extracellulaire (libérée dans le milieu de culture) - la mesure de la réduction d'un sel de tétrazolium (MTT) par dosage colorimétrique qui correspond à l'activité des déshydrogénases cellulaires - la captation du rouge neutre (RN) par les lysosomes En outre, la morphologie des cellules a été observée par la coloration des cellules mortes et un test de fluorescence des cellules vivantes. La CI 50 (50 % d'inhibition d'activité) d'un agent toxique a été déterminée à partir de 6 concentrations en triplicate pour chaque expérience. La valeur indiquée est une valeur moyenne lorsque plusieurs expériences indépendantes ont été réalisées. Quatre espèces différentes ont été étudiées. 1 - Hépatocytes de rat Cinq molécules ont été testées - 4 médicaments connus pour induire une toxicité hépatique in vivo : l'érythromycine, la perhexiline, la quinidine et l'éthionamide - 1 pesticide : le méthomyl de la famille des carbamates. On a rapporté dans le tableau qui suit les valeurs de CI 50 (g/ml) pour les 5 composés testés, selon les critères LDH extracellulaire et réduction d'un sel de tétrazolium, le MTT. Tableau Composés CI 50 (pg/ml) Libération de LDH Réduction du MTT Erythromycine cellules 272 263 billes 366 173 Perhexiline cellules 9,1 9,4 billes 7,9 7,1 Quinidine cellules 97 63 billes 100 51 Ethionamide cellules 553 595 billes 586 495 Methomyl cellules 194 191 billes 215 139 Les valeurs de CI 50 sont très comparables pour les 5 molécules entre les cellules immobilisées et les cellules en culture conventionnelle. Les différences n'excèdent pas un facteur de 1,5, c'est-à-dire dans la zone d'incertitude du dosage correspondant. Les courbes de cytotoxicité se sont avérées très similaires. L'observation morphologique aboutit à des conclusions identiques. 2 - Hépatocytes d'autres espèces On indique ci-après les résultats obtenus avec des hépatocytes provenant de 3 autres espèces : chien, singe et homme et traités à l'érythromycine. On rapporte sur la figure 2 les valeurs de CI50 (valeurs de concentration modifiant de 50 % la valeur d'un paramètre) en pg/ml pour les hépatocytes maintenus en culture (cellules) ou immobilisés (billes) de rat, de chien, de singe et d'homme selon les critères LDH extracellulaire, réduction de MTT et captation du rouge neutre Les comportements des cellules immobilisées et des cellules en culture conventionnelle sont similaires : le test du rouge neutre est le critère le plus sensible ; les hépatocytes de singe sont plus résistants que ceux des autres espèces. Quatre activités enzymatiques du métabolisme des médicaments : la sulfoconjugaison et la glucuroconjugaison du paracétamol, la dééthylation de la phénacétine et la Nacétylation du procaïnamide, ont été mesurées dans les hépatocytes de 4 espèces, après 4 ou 24 h de culture. Les résultats obtenus sont rapportés sur les figures 4a à 4d et concernent des hépatocytes de rat, de chien, de singe et de deux donneurs humains, immobilisés dans des billes et des hépatocytes en culture En ordonnées, on a indiqué la quantité en picomoles de métabolite formé/h/pg dlADN. Etude de l'activité fonctionnelle d'hépatocytes de rat après conservation dans le milieu Leibovitz additionné de polyéthylène glycol sans air (les cellules sont conservées dans un récipient entièrement rempli de milieu). On a comparé les synthèses protéiques et d'urée et le taux de cytochrome P450 d'hépatocytes en culture et d'hépatocytes inclus dans des billes, à 37"C et à 4"C. La synthèse protéique et la production d'urée ont été mesurées 4 h après la récupération des cellules ; le taux de cytochrome P-450 étant dosé directement. Les résultats obtenus sont rapportés sur les figures 3a à 3c qui représentent respectivement en fonction du temps la synthèse protéique en cpm/2h/pg d'ADN, la production d'urée en nanomoles/2h/pg d'ADN et le taux de cytochrome P450 en picomoles/pg d'ADN. Les symboles des courbes de ces figures correspondent respectivement O aux cellules à 37"C, aux cellules à 4"C, aux billes à 37"C, et # aux billes à 4"C Au cours des premières 24 h à 4"C, l'activité métabolique n'est pas entièrement inhibée puisqu'elle suit l'évolution observée à 37"C (de 35 à 100 %). Au-delà du premier jour à 4"C, les taux sont stabilisés avec des diminutions peu importantes entre le ler et le 4ème jour : 10 à 48 % pour la synthèse protéique, 1 à 4 * pour la production d'urée et de 7 * pour le taux du cytochrome P-450. L'activité fonctionnelle des cellules immobilisées ou en culture conservées pendant 4 jours à 4"C est donc maintenue à un niveau proche du taux de départ. D'autres propriétés ont été évaluées à savoir la sulfoconjugaison et la glucuroconjugaison du paracétamol, la dééthylation de la phénacétine et le taux de glutathion. Les mesures ont été effectuées après 18-20 h de conservation (durée de transport envisageable), à 4"C et 20"C (pour tenir compte de la dérive de la température possible au cours du transport). On constate que les niveaux fonctionnels des cellules conservées, comparés au témoin, sont maintenus à un taux variant de 70 à 100 % pour les cellules en culture et de 50 à 90 * pour les billes. En outre, on observe que le taux de récupération des cellules après une conservation de 24 h à 4"C est élevé par rapport aux mesures effectuées dans les cellules cultivées en parallèle. - 95 % du taux d'ADN pour les cellules en culture, - 86 % des cellules immobilisées sont récupérées avec une viabilité de 75 %. Il est à noter que les hépatocytes immobilisés et mis en présence de substrats comme le paracétamol produisent une quantité importante de métabolites. Les résultats ci-dessus mettent en évidence que les billes de l'invention de faible taille constituent une moyen de stockage des cellules de grand intérêt. Leur conservation en vue d'un transport peut être réalisée dans des conditions permettant de conserver un bon niveau fonctionnel aux cellules. Dans le mode de réalisation de la figure 5, on a représenté un kit cellulaire conforme à l'invention pour le transport de milieux de culture. Ce kit comprend un boîtier 1 destiné à être fermé par un élément 2. Le boîtier comporte une pluralité de cuvettes cylindriques 3. Le couvercle d'étanchéité 4 est destiné à venir s'appliquer sur les cuvettes du boîtier et comprend autant de cavités 5 qu'il y a de cuvettes. Le couvercle d'étanchéité, le boîtier 1 et l'élément de fermeture 2 sont réalisés en un matériau plastique, non cytotoxique, inerte vis-à-vis des milieux de culture à traiter et résistant aux irradiations effectuées aux fins de stérilisation. On citera par exemple les polyvinyles ou les polystyrènes, les polyuréthanes, les polymères fluorés étant particulièrement appropriés. La plaque absorbante 6 comporte des ouvertures cylindriques en nombre égal à celui des cuvettes. Les dimensions de ces ouvertures correspondent à celles des cuvettes de manière à pouvoir venir s'appliquer sur leur contour. Dans une variante, la plaque absorbante 6 est solidaire du couvercle d'étanchéité 4. La plaque absorbante 6 est réalisée en un matériau absorbant vis-à-vis du milieu de culture tel que le papier. Sur la figure 6, on a représenté une coupe en perspective du système d'étanchéité assuré par les cavités emboîtées dans les cuvettes. La cavité 5 présente une forme cylindro-conique. La partie supérieure de la cavité, qui correspond à la partie non emboîtée dans la cuvette, forme un rebord qui détermine avec le rebord de la cuvette un logement 8. La plaque absorbante 6 est appliquée contre le rebord de la cuvette. Le liquide déplacé lorsqu'on enfonce les cavités dans les cuvettes remonte entre les parois des cuvettes et les parois des cones et entraîne l'air qui se trouve à la surface des cuvettes remplies de milieu de culture ou de conservation. Ce liquide déplacé vient se loger dans le volume résiduel qui forme un anneau autour de chaque cuvette où il est absorbé par le matériau de la plaque 6. Ce système assure donc une étanchéité parfaite. Quelle que soit la position du dispositif, aucune bavure ne peut se produire après fermeture et à l'ouverture, et le milieu de culture peut être transporté dans des conditions anaérobies. REVENDICATIONS 1/ Billes de gel dans lesquelles sont incluses des cellules normales ou transformées, caractérisées en ce que leur diamètre n'excède pas 1 mm environ, de préférence 0,7 à 0,9 mm, ces billes étant le cas échéant sous une forme congelée. 2/ Billes selon la revendication 1, caractérisées en ce que le gel est formé par un matériau inerte vis-à-vis des cellules, pur ou en mélange, d'origine animale tels que les collagènes ou la chitine, ou d'origine végétale, ou encore synthétique comme les hydrogels, en particulier par un alginate. 3/ Billes selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce que des cellules immobilisées sont d'origine animale, humaine ou végétale ou qu'il s'agit de microorganismes ou d'organismes unicellulaires. 4/ Billes selon la revendication 3, caractérisées en ce qu'il s'agit de kératinocytes, d'adipocytes, d'astrocytes, de mélanocytes, d'hépatocytes, de cellules épithéliales d'origine hépatique, de cellules endothéliales, de fibroblastes ou des algues. 5/ Procédé de conservation de cellules normales ou transformées par immobilisation dans des billes de gel selon l'une des revendications 1 à 4, comprenant la mise en suspension de cellules en culture dans une solution aqueuse d'un matériau gélifiable, le passage de la suspension à travers un dispositif assurant la formation de gouttelettes, la mise en contact des gouttelettes avec un bain renfermant un agent de polymérisation du matériau gélifiable, et la récupération et le lavage des billes formées, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'on fait passer la suspension cellulaire à travers un capillaire et qu'on insuffle de l'air pour détacher les gouttes dès leur formation à l'extrémité du capillaire. 6/ Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la suspens ion cellulaire renferme de préférence de 0,5 à 1,5 x 106 cellules/ml environ et plus spécialement de 0,8 à 1,2 x 106, de préférence autour de I x 106 cellules/ml. 7/ Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que la concentration en matériau gélifiable est de 1 à 3 a environ, de préférence de 1'ordre de 2 %. 8/ Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que le matériau gélifiable est un alginate et qu'il est polymérisé à l'aide d'un sel d'un cation divalent tel que le calcium ou le magnésium.