FR 2687679 A1 19930827 FR 9211103 A 19920917 OLIGOTHIONUCLEOTIDES La présente invention concerne des composés chimiques nouveaux, ainsi que leurs applications. Les composés chimiques selon la présente invention sont des composés oligonucléotides constitués au moins en partie par un oligo 4'-thio-ribonucléotide ou un oligo 4'-thio-2'désoxyribonucléotide comportant un enchaînement de 4'thionucléotides. Les composés selon l'invention peuvent présenter la configuration anomérique naturelle bêta ou la configuration anomérique non naturelle alpha. Ainsi sont représentés par les formules (a) et (b) respectivement des 4'-thionucléotides alpha(a) et bêta(b) (a) et (b) représentent des 4'-thionucléosides, il faut rajouter un phosphate en 5' pour obtenir des nucléotides. Dans ces conditions, de multiples utilisations à finalités biologiques et même pharmacologiques déjà connues pour les oligonucléotides peuvent être envisagées et ceci avec plus d'efficacité. Plus précisément, la présente invention a pour objet des composés chimiques constitués par un oligo4'-thioribonucléotide ou un oligo-4'-thio-2'désoxyribonucléotide, caractérisés en ce qu'ils comportent un enchaînement de 4'-thioribonucléotides ou 4'-thio-2'désoxyribonucléotides respectivement, enchaînement pouvant être facultativement lié à un agent effecteur, notamment un radical correspondant à un agent d'intercalation ou un radical chimique ou photoactivable, tel qu'un radical porteur d'une fonction réagissant directement ou indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détection facile et sensible. En particulier, l'invention a pour objet les nouveaux dérivés oligo-4'-thionucléotides, leur préparation et leur emploi notamment comme sondes permettant la détection d'une séquence définie d'acides nucléiques, comme nucléases artificielles spécifiques de séquences d'ADN ou d'ARN ou bien comme agents de blocage sélectif de l'expression d'un gène qu'il soit endogène (par exemple, gène oncogène) ou exogène (par exemple ADN ou ARN de virus, de parasites ou de bactéries). Dans les demandes de brevet français FR 8301223 (2 540 122) et FR 8411795 (2 568 254) ont été décrits des composés chimiques constitués par un oligonucléotide ou un oligodésoxynucléotide comportant un enchaînement de nucléotides naturels ou modifiés, c' est-à-dire des bêta-nucléotides, sur lesquel se trouve fixé par une liaison covalente au moins un groupe intercalant, qui possèdent la propriété de bloquer sélectivement l'expression d'un gène et qui, de ce fait, sont particulièrement utiles en thérapeutique comme substances antivirales, antibiotiques, antiparasitaires ou antitumorales. Dans la demande internationale PCT WO 83/01451, a été décrite une méthode pour bloquer la traduction de L'ART messager (ARNm) en protéine par hybridation de l'ARNm avec un oligonucléotide ayant la séquence complémentaire de l'ARNm, l'oligonucléotide étant stabilisé sous forme phosphotriester Dans la demande internationale WO 88/04301 ont été décrits des oligonucléotides de configuration anomérique alpha présentant des appariements parallèles avec des séquences complémentaires. La Chimiothérapie par les oligonucléotides antisens concerne des cibles à ARN ou à ADN de tous les organismes vivants (cellules, bactéries, parasites, virus ou oncogènes). L'utilisation d 'oligonucléotides antisens synthétiques ayant la même structure que les acides nucléiques naturels se heurte principalement en milieu biologique à des problèmes de sensibilité aux nucléases et de pénétration cellulaire. Pour pallier ces limites, des analogues oligonucléotidiques susceptibles d'être plus résistants vis à vis des nucléases et de mieux pénétrer dans les cellules à travers la membrane cytoplasmique ont été synthétisés. Il a en effet été décrit dans la technique antérieure des dérivés de composés oligonucléotides résistant mieux aux dégradations enzymatiques dont la partie phosphate était modifiée en thiophosphate ou méthylphosphonate notamment. Toutefois ces dérivés présentent une chiralité au niveau du phosphate susceptible de générer des diastéréoisomères insolubles. La présente invention fournit une nouvelle classe d'oligonucléotides chimères les 4'-thio-oligonucléotides dans lesquels l'oxygène intracyclique du cycle furannose a été remplacé par un atome de soufre. Il a en effet maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, que la substitution de l'oxygène par un soufre sur la partie sucre des nucléosides plutôt que sur le groupement phosphate d'une part, assure la solubilité des oligomères et, d'autre part, pourrait accroître leur pénétration dans la cellule cible, la substitution de l'oxygène par l'élément soufre rendant la molécule plus lipophile. Les dérivés de 4'-thionucléotides forment des complexes d'hybridation avec les séquences complémentaires d'ARN beaucoup plus stables que ceux formés avec l'ADN et que, vis-à-vis des ARNs, les dérivés de 4'-thionucléotides forment des complexes d'hybridation plus stables que les dérivés de bêta-nucléotides naturels. Parmi les composés, selon la présente invention, on peut citer plus particulièrement les composés oligomères bêta de formule dans laquelle les radicaux B peuvent être identiques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nucléique éventuellement modifiée, activable et/ou comportant un groupement intercalant les radicaux X peuvant être identiques ou différents et représentent chacun un oxoanion O , un thioanion S , un groupe alkyle, un groupe alcoxy, aryloxy, un groupe aminoalkyle, un groupe aminoalcoxy, un groupe thioalkyle, un radical alkyle ou alcoxy substitué par un hétérocycle azoté ou un groupement -Y-Z R et R', qui peuvent être identiques ou différents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement -Y-Z ou Y'-Z' Y et Y' identiques ou différents représentent chacun un radical alcoylène droit ou ramifié -alk- ou un radical choisi parmi avec U = O, S ou N En particulier, Y et Y' représentent un radical choisi parmi avec U = O, S ou N E peut avoir les mêmes significations que X excepté Y-Z ou Y'-Z'; L représente O, S ou -NH-;; n et n' représentent un nombre entier y compris O J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy Z et Z', identiques ou différents, représentent chacun OH ou un radical correspondant à un agent effecteur, notamment un radical correspondant à un agent d'intercalation ou un radical porteur d'une fonction qui réagit directement ou indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détection facile et sensible. Dans cette formule I, on utilise la représentation condensée des nucléotides suivante qui correspond à la formule développée sur laquelle ont été mentionnées les extrémités (3') et (5'). Il convient de remarquer que la formule I représente un enchaînement de 4'-thionucléotides qui peuvent être identiques ou différents, de configuration D ou L, n indiquant simplement le nombre de nucléotides compris dans la molécule ; n est de préférence un nombre compris entre I et 50, et de préférence encore entre 1 et 25. On cite en particulier les produits pour lesquels L représente l'oxygène ; R et R' représentent l'hydrogène et B une base nucléique naturelle, soit adénine, thymine, cytosine ou guanine quand J = H et adénine, uracile, cytosine et guanine quand J = OH. Les agents d'intercalation sont des produits connus dans les techniques relatives aux acides nucléiques ; ce sont des composés capables de "s'intercaler" dans la structure des ADN ou des ARN, c'est-à-dire capables de s'insérer entre les plateaux de base des acides nucléiques. Les agents d'intercalation peuvent être choisis parmi les composés polycycliques ayant une configuration plane tels que l'acridine et ses dérivés, la furocoumarine et ses dérivés, la daunomycine et les autres dérivés de l'anthracycline, la l,10-phénanthroline, la phénanthridine et ses dérivés, la proflavine, les porphyrines, les dérivés du dipyrido [1,2-a 3',2'-d] imidazole, l'ellipticine ou l'ellipticinium et leurs dérivés et le diazapyrène et ses dérivés. Les radicaux chimiques réactifs peuvent être des radicaux pouvant réagir directement ou indirectement avec une chaîne de nucléotides pour former une liaison covalente ou pour la modifier chimiquement, ou pour la couper. De préférence, ces radicaux chimiques réactifs sont activables, par exemple, par voie chimique, biochimique ou photochimique. Les radicaux réactifs activables peuvent être choisis parmi l'acide éthylène-diamine-tétraacétique, l'acide diéthylène-triaminepentaacétique, les porphyrines, la l,l0-phénanthroline, l'azido-4 acétophénone, l'éthylène-imine, la bêta-chloroéthylamine, le psoralène et leurs dérivés, et les composés aromatiques absorbant les radiations du proche ultra-violet ou du visible ou pouvant réagir chimiquement avec les constituants nucléiques. Plus particulièrement, les radicaux chimiquement activables en présence d'ions métalliques, d'oxygène et d'un agent réducteur (acide éthylène-diamine-tétraacétique, acide diéthylène-tri-amine-pentaacétique, porphyrine, phénanthroline) induisent la coupure dans des séquences d'acides nucléiques situées dans leur voisinage. Par irradiation dans le domaine du visible ou du proche ultra-violet, il est possible d'activer les dérivés qui absorbent ces radiations et de réaliser des réactions de pontage ou des réactions photo-induites (coupure et modification des bases nucléiques) des acides nucléiques sur lesquels est fixé l'oligothionucléotide porteur du groupement activable. Parmi les radicaux Z et Z' peuvent être plus particulièrement cltés - les radicaux dérivés de l'acide éthylène-diamine-tétra-acétique de formule - les radicaux dérivés de l'acide diéthylène-triamine-pentaacétique, - les radicaux dérivés de la méthylpyrroporphyrine de formule - les radicaux dérivés de la phénanthroline de formule - les radicaux dérivés de l'acridine:: - les radicaux dérivés de la proflavine R représentant un groupement amino (NH2) ou azido (N3) - les radicaux dérivés de la biotine - les radicaux dérivés de l'azido-4 acétophénone de formule Le radical B peut être, de préférence, choisi parmi les bases nucléiques naturelles (thymine, adénine, cytosine, guanine, uracile) mais il est possible d'utiliser des bases nucléiques modifiées.Peuvent être cités l'amino-2 adénine et ses dérivés substitués, par exemple, sur l'atome d'azote N6 par un radical aminoalkylène ou par un radical azidophénylalkylène, la guanine substituée sur l'atome d'oxygène o6, par exemple, par un groupement (w-alkylène)-9-acridine, la (w-aminoalkyl)-amino-8-adénine et ses dérivés substitués sur le radical amino en w par un groupe acridine, ou les dérivés halogénés ou azidés tels que le bromo-5 uracile, l'azido-8 adénine, la 7-déazaadénine, la 7-déazaguanine. I1 est possible également d'utiliser des dérivés des bases nucléiques comportant un groupement intercalant ou un groupement chimiquement ou photochimiquement activable. Ainsi, la fonctionnalisation de C ou T par un groupement aziridine en position 4 conduit à la formation de pontages covalents CH2-CH2 entre les deux brins complémentaires sur respectivement G et A. Donc, plus particulièrement, le radical B est alors choisi parmi la 4-azido-cytosine ou la 4-azido-thymine. De préférence, le radical X représente un oxoanion. Cependant, le radical X peut représenter un radical alkyle contenant 1 à 7 atomes de carbone (méthyle, éthyle, propyle), un radical alcoxy dont la partie alkyle contient 1 à 7 atomes de carbone (méthoxy, éthoxy, diméthyl-2,2 propyloxy), un radical aminoalkyle ou aminoalcoxy de formule générale RlR2N-alk-A- dans laquelle A représente une liaison ou un atome d'oxygène, -alk- représente un radical alkylène contenant 1 à 10 atomes de carbone et R1 et R2, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle contenant 1 à 7 atomes de carbone ou forment ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont liés un hétérocycle azoté saturé à 5 ou 6 chaînons, étant entendu que le groupement R1R2Npeut être quaternarisé, ou un radical alcoylthio dont la partie alcoyle contient 1 à 7 atomes de carbone. Dans la formule (I), le radical -alk- est de préférence un radical alcoylène droit ou ramifié ayant de 1 à 10 atomes de carbone. En particulier, à partir des fonctions alcool terminales 3' ou 5' de l'oligothionucléotide, l'effecteur Z peut donc être introduit via une chaîne (CH2)n liée à une fonctionnalisation Z', de natures diverses à la partie osidique de l'oligomère. A partir de la formule suivante 3' ou -O-Z'1 -(CH2)n-effectuer (Z) 5' on obtiendra, selon ce que représente Z'1, par exemple - un phosphate ou méthyl phosphonate de formule U = O, N ou S - un éther de formule générale - un ester de formule générale ou encore - un carbamate de formule générale En général, n' est compris entre 1 et 10. La présente invention concerne également les composés précédents sous forme de sel avec des bases ou des acides, et les composés sous forme racémique, ou sous forme d'isomètres R ou S optiques purifiés ou en mélange, de formule (I). La présente invention concerne de préférence les composés précédents de formule (I) dans la série D. On cite en particulier les produits composés D-oligothionucléotide de formule générale dans laquelle J et X sont définis comme précédemment pour les composés de formule (I) et B représente une base nucléique naturelle. Les oligonucléotides selon la présente invention peuvent se présenter sous forme de séquences homogènes, comme dans les composés de formule (I) ou sous forme d'oligomères mixtes, c'est-à-dire sous forme de séquences particulières incluses dans d'autres types d'oligonucléotides de type ADN ou ARN, modifiés ou non au niveau de l'enchaînement phosphate, ces derniers corresondant à des composés de formule (I), dans lesquels l'oxygène intracyclique du cycle furannose est rétabli. La présente invention a donc également pour objet des composés oligomères mixtes caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des composés oligothionucléotides selon l'invention liés à des oligonucléotides de type ADN ou ARN. On entend ici par "oligonucléotides de type ADN ou ARN" une séquence d'acides nucléiques de type ADN ou ARN modifiés ou non au niveau de l'enchaînement phosphate et dans lesquels l'hétéroatome intracyclique du cycle furannose des nucléotides est l'oxygène. La présente invention a notamment pour objet des composés oligomères mixtes constitués par une séquence oligothionucléotidique selon l'invention, comprenant une séquence oligonucléotidique de type ADN ou ARN en son sein ou à une de ses extrémités. Dans un mode de réalisation particulier, donc, la séquence oligonucléotidique, de type ADN ou ARN, est encadrée par deux séquences d'oligothioribonucléotides. Les nouveaux produits de formule générale (I) ou oligomères mixtes en comportant peuvent être préparés par voie chimique par des procédés connus et, en particulier, ceux qui sont décrits dans les demandes de procédés connus et, en particulier, ceux qui sont décrits dans les demandes de brevets français FR 8301223 (2 540 122) et FR 8411795 (2 568 254), WO 88/04301 et FR 88 122648. Les composés oligothionucléotides notamment de formule (I) peuvent être préparés par voie chimique par des procédés dans lesquels on applique des synthèses au phosphodiester, au phosphotriester, au phosphoramidite ou à l'hydrogénophosphonate classiques pour des oligonucléotides. Dans ces procédés, on prépare tout d'abord la chaîne de 4'-thionucléotides, les différents groupements non mis en oeuvre étant protégés, puis on élimine enfin les groupements protecteurs pour obtenir les produits recherchés. On cite en particulier un procédé de synthèse de composés oligothionucléotides selon l'invention sans agent effecteur, caractérisé en ce que on réalise une synthèse supportée selon la méthode au phosphoroamidite comportant - une protection en 3' et 5' des 4'-thionucléotides ou oligo4'-thionucléo tides de départ avec par exemple du diméthoxytrityl en 5' et du diisopropyîaminophosphoramidite de méthyle en 3', - la fonctionnalisation d'un support solide incorporant un dérivé 4'-thio nucléosidique par un lien par exemple succinyle entre le groupement hydroxyle-3' du dérivé 4'-thionucléosidique et un groupement amino du support solide, - l'élongation de la chaîne oligothionucléotidique dans un réacteur synthétiseur, - enfin le décrochage, la déprotection et la purification de l'oligothionu- cléotide prolongé. On cite également un procédé de synthèse de composés oligothionucléotides incorporant un agent effecteur selon l'invention caractérisé en ce que l'on part d'un oligothionucléotide sans agent effecteur, ou d'un oligomère mixte en comprenant, protégé en 5', dont on fait réagir la terminaison OH 3' avec une fonction non protégée d'un bras difonctionnel dont la deuxième fonction est protégée et après dé protection du produit résultant, on lie ledit produit à l'agent effecteur par la deuxième fonction libre du bras difonctionnel. La terminaison OH 3' de l'oligomère protégé en 5' peut être estérifiée avec un acide aminohexanoîque, dont la fonction amine est protégée. Un procédé de préparation en phase solide de séquences oligothionucléotides selon la méthode au phosphoramidite, objet dela présente invention, comporte les étapes essentielles suivantes - On immobilise un dérivé 4'-thionucléoside protégé par l'intermédiaire d'une de ses fonctions hydroxyle en 3' ou, le cas échéant, 2' sur un support solide. - On assemble sur ce support dans un réacteur synthétiseur manuel ou automatique la chaîne d'oligothionucléotide protégée par condensation de monomères constitués de 4'-thionucléosides protégés substitués par des groupes phosphoramidites en 3', le cas échéant, la fonction hydroxyle en 2' des riboses étant protégée par les groupes Ctmp ou TBDMS. - Les oligothionucléotides sont obtenus après décrochage de l'oligomère obtenu du support et élimination des groupes protecteurs. De façon appropriée, l'assemblage de l'oligothionucléotide se fait par condensation, en présence d'un agent activateur, desdits monomères entre leur fonction en 3' et la fonction 5' du composé 4'-thionucléoside immobilisé pour le premier monomère ou d'un composé intermédiaire polythionucléotide protégé fixé sur ledit composé thionucléoside immobilisé pour les mono mères suivants. Notamment, l'agent activateur pour la condensation desdits mono mères peut être choisi parmi le tétrazole et ses dérivés, tels que le para-nitrophényl tétrazole. Avantageusement, le groupe phosphoramidite en 3' desdits monomères est un groupe N,N dialkylaminophosphoramidite de formule avec R1 qui représente un alkyle en C1 à C7 éventuellement substitué identique ou différent, tel que CH3, (CH3)2CH. R2 qui représente un alkyle en C1 à C7 éventuellement substitué, tel que CH3, CH2CH2CN. En particulier, le groupe phosphoramidite en 3' desdits monomères est le diisopropylaminophosphoramidite de méthyl (R 1 = (CH3)2CH et R2 = CH3) ou le cyano-2 éthyl diisopropylaminophosphite (R 1 = (CH 3)2CH et R2 = CH2CH2CN). De façon appropriée, les groupes hydroxyles desdits monomères et dudit composé 4'-thionucléoside immobilisé peuvent être protégés en 5' par le groupe DmTr. Le composé 4'thionucléoside immobilisé peut être fixé sur le support solide via un groupe divalent succinyle entre un de ses groupements OH en 2' ou 3' qui se trouve ainsi estérifié, et un groupement amino du support. Le support solide peut être constitué par une longue chaîne alkylamine fixée sur un polymère, un gel de silice ou des billes de verre poreuses. On peut citer comme groupe fonctionnel permettant la fixation ou étant lié sur support solide doté d'un groupe amino, le groupe de formule avec p = 1 à 5, dans lequel R4 représente H un groupe d'activation tel que C6 Cl5 ou un radical NH lié à un support solide tel que le radical NH d'une chaîne alkylamine fixée sur un polymère, gel de silice ou billes de verre poreuses. Un intérêt des composés homogènes ou mixtes selon la présente invention, comprenant une chaîne d'oligo-thio-nucléotides, est aussi de pouvoir envisager leur utilisation indépendamment d'agents effecteurs, notamment d'agents intercalants, puisque ces nouvelles substances oligonucléotides assurent la reconnaisance de la séquence d'acide nucléique complémentaire, notamment d'ARN, avec une stabilité très accrue ; la fonction de l'agent intercalant étant d'augmenter la stabilité du complexe d'hybridation, sa présence n est plus obligatoire. Les composés selon l'invention, par leur grande affinité spécifique des séquences oligothionucléotidiques pour des séquences nucléiques complémentaires, sont en effet supérieurs aux oligonucléotides actuels dont l'affinité pour les séquences complémentaires est plus faible. Les composés, selon la présente invention, sont donc utilisables de manière plus efficace, à titre de sondes d'hybridation, mais également comme composants de purification pour des séquences déterminées d'ADN ou d'ARN. Ces composés peuvent également être utilisés pour détecter des mutations au niveau d'un ADN ou d'un ARN de manière plus efficace. Les composés de la présente invention, par la propriété des séquences oligothionucléotidiques de se fixer fortement sur la séquence nucléique complémentaire, puis d'induire la coupure de la chaîne d'acides nucléiques en ce site, notamment lorsqu'ils sont couplés à un agent de coupure, sont utilisables à titre de nucléases artificielles spécifiques de séquences. Ils peuvent être utilisés comme réactifs en biologie moléculaire ou en génie génétique. La présence de la fonction hydroxyle en 2', le cas échéant, permet en outre d'envisager leur utilisation comme ribozymes artificiels, que ce soit sous forme de séquences oligothioribonucléotidiques homogènes ou mixtes, c'est-à-dire associées à des oligonucléotides de type ADN ou ARN. L'objet de la présente invention est également l'application des composés selon l'invention pour réaliser le blocage spécifique des gènes cellulaires ou d'agents pathogènes préalablement choisis (virus, bactéries, parasites). Les composés selon l'invention sont donc aussi utilisables à titre de médicaments. Les nouveaux produits de formule générale (r) selon l'invention et les produits de formule générale (I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B représente une base nucléique naturelle forment des complexes d'hybridation avec les séquences complémentaires d'ARN beaucoup plus stables que ceux qui sont formés avec l'ADN. En particulier, les produits de formule (I) dans lesquels J = OH (oligothioribonucléotides) s'apparient de manière plus stable avec des séquences d'ARN complémentaires que les produits de formule (I) dans lesquels J = H (oligothiodésoxyribonucléotides). Compte tenu du fait que les cibles des molécules anti-sens en thérapies sont les gènes ARN messagers, cette propriété des oligothioribonucléotides est tout à fait intéressante. Cette différence de stabilité des complexes d'hybridation permet une inhibition préférentielle des ARNs messagers et des ARNs viraux sans risque important de provoquer des effets indésirables au niveau de l'ADN du génome. De plus, vis-à-vis des ARNs, les produits selon l'invention forment généralement des complexes plus stables que ceux qui sont obtenus à partir des oligonucléotides naturels. Les composés oligoth iorib onucléotides selon l'invention, notamment de formule (I) (J = OH), présentent en outre un certain nombre de caractéristiques intéressantes, notamment pour une application comme agent antisens - la configuration bêta naturelle est respectée, - ils sont isoélectriques des ARN naturels, - ils n'ont pas de chiralité au niveau de la liaison phosphodiester, - ils sont plus lipophiles que les analogues naturels à cause de la présence de l'atome de soufre. Les séquences des oligothionucléotides, couplés ou non à un agent intercalant ou à un groupement activable chimiquement ou photochimiquement, comportant un enchaînement de nucléosides pyrimidiques sont capables de se fixer sur une double hélice d'ADN ou d'ARN comportant une séquence de bases puriques adjacentes associées par liaison hydrogène à la séquence complémentaire des bases pyrimidiques. Cette fixation implique la formation locale d'une triple hélice dans laquelle les bases pyrimidiques de l'oligothionucléotide forment des liaisons hydrogène (de type Hoogsteen ou Hoogsteen inversé) avec les bases puriques de la double hélice. Dans ce contexte, les oligothionucléotides forment des complexes plus stables que les oligonucléotides correspondants et ils permettent d'induire des réactions irréversibles (pontage, modification ou coupure) sur une double hélice d'ARN ou d'ADN. Les nouveaux produits de formule générale (I) selon l'invention et les produits de formule générale (I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B représente une base nucléique naturelle, qui possèdent la propriété de se fixer fortement sur la séquence nucléique complémentaire, ou oligomères mixtes en comprenant, peuvent être utilisés comme sondes pour détecter la présence d'une chaîne de nucléotides complémentaires. Cette détection est facilitée par la présence d'un groupe fluorescent ou d'un groupe biotine dans ces molécules. La structure non naturelle des oligothionucléotides confère des propriétés d'antigénicité rendant ainsi possible la préparation d'anticorps spécifiques dirigés contre des oligothionucléotides éventuellement couplés à un agent intercalant ou contre leurs complexes avec un ADN ou un ARN naturels. Dans un but diagnostique ou pronostique, les oligothionucléotides, éventuellement couplés à un agent intercalant, ou oligommères mixtes en comprenant, peuvent être attachés de façon covalente à un support solide. Le couplage à un marqueur luminescent ou générateur d'une réaction colorée, luminescente ou fluorescente permet de les utiliser comme sondes de séquences d'ADN ou d'ARN dans un but diagnostique ou pronostique. Les oligothionucléotides selon l'invention sont beaucoup plus résistants vis-à-vis des nucléases que les dérivés de nucléosides naturels. Cette stabilité vis-à-vis de l'hydrolyse enzymatique permet l'utilisation des produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), ou oligomères mixtes en comprenant, dans des expérimentations in vivo ou in vitro en présence de nucléases. De ce fait, les oligothionucléotides selon l'invention présentent des avantages incontestables sur les dérivés de bêta-nucléosides déjà connus. Les composés oligothioribonucléotides de formule (I) pour lesquels J = OH sont plus résitants à la dégradation enzymatiques que les composés oligothiodésoxyribonucléotides de formule I pour lesquels J = H. Dès lors, comme on l'a vu, un autre objet de la présente invention concerne l'application des nouveaux produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), et des produits de formule générale (I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B représente une base nucléique naturelle, en particulier les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, au blocage spécifique de gènes cellulaires ou d'agents pathogènes préalablement choisis (virus, bactéries, parasites), en particulier les ARNm. Les nouveaux produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), et les produits de formule générale (I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B représente une base nucléique naturelle, en particulier les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, sont particulièrement utiles comme médicaments permettant de bloquer les gènes indésirables exogènes (virus, bactéries, parasites) ou endogènes (gènes cellulaires, oncogènes), en particulier les ARNm.L'expression de ces gènes peut être bloquée en agissant soit directement sur 1'ADN ou L'ART porteur de l'information génétique, soit sur L'ART messager, copie du gène, en bloquant alors toute traduction par hybridation ou par hybridation puis pontage ou modification ou coupure de L'ART messager ou viral choisi comme cible. Ce blocage peut être réalisé en utilisant un produit selon l'invention, notamment de formule générale (I), ou un produit de formule générale (I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B représente une base nucléique naturelle, en particulier les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, dont la séquence est complémentaire de celle d'une région non complexée d'un ARN ou d'un ADN et, en particulier, d'un ARN messager. L'hybridation, suivie ou non du pontage, de la modification ou de la coupure de L'ART messager ou viral, empêche la synthèse de L'ART ou de la protéine correspondante ou l'expression des fonctions virales ou parasitaires. Si cet ARN ou cette protéine est vital pour le virus, la bactérie ou le parasite, les produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), et les produits de formule générale (I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B représente une base nucléique naturelle, en prticulier les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, constitueront des médicaments à activité antivirale, antibactérienne ou antiparasitaire. Si cet ARN ou cette protéine n'est pas vital pour l'organisme, il est possible d'en supprimer sélectivement les effets. Dans ce cas, les produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), et les produits de formule générale (r) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B représente une base nucléique naturelle, en particulier les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, constitueront soit des médicaments à activité antitumorale lorsque le gène visé ou son ARN messager code pour une protéine impliquée dans la transformation cellulaire, soit des médicaments capables de supprimer le caractère de résistance aux antiviraux, aux antibiotiques ou aux antiparasitaires lorsque la protéine codée est responsable de l'inactivation des antibiotiques, des antiviraux ou des antiparasitaires. Des effets cytotoxiques spécifiques peuvent être obtenus par action d'un produit selon l'invention, notamment de formule (I), ou d'un produit de formule générale (I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B représente une base naturelle, en particulier les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, sur une fonction cellulaire indispensable à la cellule cible. Les oligomères mixtes d'oligothioribonucléotides selon l'invention, comprenant une séquence oligonucléotidique d'ADN où l'oxygène intracyclique est rétabli, sont particulièrement intéressants dans une utilisation comme agent antisens. Ces oligomères mixtes sont susceptibles d'être hautement sélectifs dans la mesure où la "fenêtre" de structure ADN est seule substrat de la RNAse H après appariement de l'antisens avec sa séquence cible complémentaire d'ARNm, la dite RNAse H induisant alors la coupure du complexe ADN/ARN. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre. La Figure 1 représente la courbe de stabilité thermique du duplex bêtadT5(SrT)dT6/bêtadC2A12C2 comparativement à celle du duplex naturel bêtadT12/bêtadC2A12C2 La Figure 2 représente la courbe de digestion enzymatique de bêta(SrT)dT îî. Dans la description qui suit, l'abréviation rS ou 5r précède un thioribonucléotide. 1-SYNTHESE DE THIONUCLEOTIDES. I. 1- Les premières synthèses de thiosucres ont été effectuées entre 1960 et 1970. Deux exemples sont donnés: La synthèse de derivés du Sthio-D-ribofurannose se fait selon le schéma 1: SCHEMA 1 Ce composé est obtenu en 8 étapes à partir du -Lyxose avec un rendement global de 6 %. - R. L. WHISTLER, W. E. DICK, T. R. INGLE, R. M. ROWELL et B. URBAS, J. Org. Chem., 1964, 29, 3723-3725. - B. URBAS et R. L. WHISTLER, J. Org. Chem., 1966, 31 813-816. - E. J. REIST, D. E. GUEFFROY et L. GOODMAN, J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 5658-5663. - R. L. WHISTLER et J. N. BeMILLER dans " Methods in Carbohydrate Chemistry", R. L. WHISTLER et M. L. WOLFROM, Eds., Academic Press, Inc., New york, 1962, Vol. L p.79. Les dérivés du 4-thio-2-désoxy-D-ribofurannose ont été obtenus selon le schema 2 SCHEMA 2 Cette synthèse en 14 étapes conduit au methyl 2-désory 4-thio-D-erythro-pentofurannoside avec un rendement global de 8 %. - Y. L. FU et M. BOBEK, J. Org. Chem., 1976, 41, 3831-3834. - Y. L. FU et M. BOBEK, dans n Nucleic Acid Chemistry ", L. TOWSEND et R. S. TIPSON, Eds., 1978, PartI pp. 183-194. - U. G. NAYAK et R.L. WHISTLER, Liebigs Ann. Chem., 1970,741, 131-138. De façon semblable, les dérivés du 4-thio-D-arabinofuranose ont été obtenus: - R. L. WHISTLER, U. G. NAYAK et A. W. PERKIN Jr., J. Org., Chem., 1970, 35. 519-521. I. 2. Les nucléosides correspondants ont ensuite été synthétisés: a) En serie 4'-thio-2'-désoxy-D-ribofurannose - Y. L. FU et M. BOBEK dans n Nudeic Acid Cheimstry ", L. TOWSEND, R. L. TIPSON, Eds., John Wiley & Sons, New York, 1978, p. 317. b) En serie 4'-thio-D-ribofurannose - E. J. REIST, D. E. GUEFFROY et L. GOODMAN, J. Am. Chem. Soc. , 1964, 86. 5658-5663. - E. J. REIST, D. E. GUEFFROY et L. GOODMAN, Chem. Ind., 1964, 13641365. - B. URBAS et R. L. WHISTLER, J. Org. Chem., 1966, 31, 813-816. - M. BOBEK, R. L. WHISTLER et A. BLOCH, J. Med. Chem., 1970, 13 411-413 - M. BOBEK, A. BLOCH, R. PARTHASARATHY et R. L. WHISTLER, J. Med. Chem., 1975, 18, 784-787 - M. BOBEK, R. L. WHISTLER et A. BLOCH, J. Med. Chem., 1972, 15 168171. - N. OTOTANI et R. L. WHISTLER, J. Med. Chem., 1974, 17, 535-537 - M. W. PICKERING, j. T. WITKOWSKI et R. K. ROBBINS, J. Med. Chem., 1976, 19, 841-842. - A. K. M. ANISUZZAMAN et M. D. AMIN, J. Bangladesh Acad. Sci.,1978, 2 D.J. HOFFMAN et R.L. WHILTLER, Biochemistry, 1970, 9, 2367-2370 c) Dans d'autres series: - R.G.S. RITCHIE et W. A. SZAREK, J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1973,686. - E. J. REIST, L. V. FISCHER et L. GOODMAN, J. Org. Chem., 1968, 33, 189 - R. L. WHISTLER, L. W. DONER et U. G. NAYAK, J. Org. Chem., 1971, 36, 108-110. Ces nucléosides sont obtenus par les voies traditionnelles de la synthèse des nucléosides en série oxygénée. Soit par la méthode aux sels de métaux lourds: Traitement de l'hétérocycle chloromercurique avec le chlorosucre correspondant. - M. BOBEK, R. L. WHISTLER et A. BLOCH, J. Med. Chem., 1972, 15, 168-171. - D. E. GUEFFROY et L. GOODMAN, Chem. & Ind., 1964, 1364-1365. - E. I. REIST, M. BOBEK, R. L. WHISTLER et A. BLOCH, J. Med. Chem., 1970, 13, 411-413. - E. J. REIST, D. E. GUEFFROY et L. GOODMAN, J. Am. Chem.Soc., 1964, 86, 5658-5663. - E. J. REIST, L. V. FISCHER et L. GOODMAN, J. Org. Chem., 1968, 33. 189-192. Soit par la méthode de HILBERT et JOHNSON, - par condensation de la base pyrimidinique avec le thiochlorosucre correspondant. - B. URBAS et R. L. WHISTLER, J. Org. Chem., 1966, 31, 813-816. - par condensation des dérivés silylés des bases et des thiochlorosucres correspondants. - M. BOBEK, A. BLOCH, R. PARTHASARATHY et R. L. WHISTLER, J. Med.,Chem., 1975, 18, 78s787. - R. L. WHISTLER, L. W. DONER et U. G. NAYAK, J. Org. Chem., 1971, 36, 108110. - N. OTOTANI et R. L. WHISTLER, J. Med. Chem., 1974, 17 535-537. - par la reaction de fusion du 3-cyano 1,2,4 triazole et du 1,2,3,5 tétra-O-acétyl-; thio-D-ribofurannose. - M. V. PICKERING, J. T. WITKOWSKI et R. K. ROBINS, J. Med. Chem., 1976, 19, 841-842. - par la méthode de VORBRUGGEN et NIEDBALLA par condensation de l'adenine et du 1,2,3,5 tétra-acétyl thioribofurannose en présence de catalyseur FRIEDEL et CRAFTS. - A. K. M. ANISUZZAMAN et M. D. AMIN, J. Bangladesh Acad. Sci., 1978, 2, 59-64. Depuis peu, la synthèse de thionucléosides a de nouveau connu de l'intérêt. Ainsi, le 2',3',5' tri-Q-benzyl 4'-thio-B-D-xylofurannosyl uracile a été obtenu par une voie originale selon le schema 3: - M. W. BREDENKAMP, C. W. HOLZAPFEL et A. D. SWANEPOEL, Tétrahedron Lett., 1990, 31, 2759-2762. - M. W. BREDENKAMP, C. W. HOLZAPFEL et A. D. SWANEPOEL, S. Afr. J. Chem., 1991, 44, 31-33. (i = oxyde de dibutyl étain; ji = MsCI; iii = BnCI; iv = iodure de tétra-butylammonium, carbonate de barium; v = Hg(OAc)2 t AcOH; vi = Méthode d'HlLBERT JOHNSON modifiée.) SCHEMA 3 La synthèse d'analogues pyrimidiniques de 4'-thio 2'-désoxy nucléosides a été publiée. - M. R. DYSON, P. L. COE et R. T. WALKER, J. Med. Chem., 1991, 34, 2782-2786. par la méthode de HORTON et MARKOVS. - D. HORTON et R. A. MARKOVS, Carbohydrare Res., 1980, 80,356 Elle est illustrée par le schéma 4: (i = HgC12, CdCO3) SCHEMA 4 D'une façon semblable, les 2'-désoxy4'-thiocytidine, 2'-désoxy-4'-thiouridine et 4'thiothymidine ont été obtenus par J. A. SECRIST III et Coll. (j. A. SECRIST, K. N. TIWARI, J. M. RIORDAN et J. A. MONTGOMERY, J. Med. Chem., 1991, 34, 2361 2366); (j. A. MONTGOMERY et J. A. SECRIST III, PCT Int. Appl. WO 9104.033 ) à partir du 2-désoxy-4-thio-ss-D-érythro-pentofurannose synthétisé selon BOBEK et Coil. (Y. L. FU, M. BOBEK, J. Org. Chem;, 1976, 41, 3831-3834.) en utilisant le TMSTf comme catalyseur de couplage. La synthèse du 4'-thio 2'-désoxy-D- ribofurannose a fait l'objet d'un brevet et de publications: - European Patent Application, 0421 777 Al. R. T. WALKER. - M. R. DYSON, P. L. COE et R. T. WALKER, J. Chem. Soc. Chem. Comm., 1991,741-742. - M. R. DYSON, P. L. COE et R. T. WALKER, Carbohydrate Res., 1991, 216, 237-248. Elle est décrite sur le schéma S (i = HCl/MeOH, ii = BnBr/THF, iii = BnSH/HCl, iv = Ph3P/DHAD/BxOH/THF, v = MeONa/ MeOH/ CH2C12, vi = MaCl/Pyr., vii = NaI/CO3Ha/Acetone, viii = BCl3 / CH2C12, ix = p toluoytCl, x = Ac2O/H2SO4) SCHEMA 5 Des ribothionucléosides dérivés des pyrimidines ont fait l'objet du même brevet. Mais la synthèse du thioribofurannose de départ a été réalisée selon la méthode de E. J. REIST. - E. J. REIST, D. E. GUEFFROY et L. GOODMAN, J. Am. Chem. Soc., 1964, 84, 5658. I. 3.SYNTHESE DES SYNTHONS DU 4'-THIO-BETA-D-RIBOFURANNOSE NECESSAIRES A L'OBTENTION DE THIOOLIGOMERES. On a réalisé la synthèse du L-thioLyxofurannose et du D-thioRibofurannose en 7 étapes à partir du D-ribose et du L-lyxose respectivement avec 29 et 21 % de rendement respectivement. Cette synthèse est illustrée sur le schéma 6. (i = MeOH, HCI; ii = BnBr, KOH; iii = HCL,H20,dioxane; iv = BnSH, HCI; v = MesCL, pyr.; vi = NBu4I, BaCO3; vii = Hg(OAc) SCHEMA 6 La synthèse pour obtenir le thio-D-ribofurannose utilise le L-lyxose comme produit de départ comme dans la synthèse de WHISTIER (page 19). Cette stratégie est appelée stratégie Ct ---C4 . En effet, l'atome de soufre est tout d'abord introduit en position anomère et une substitution nucléophile SN2 entre l'atome de soufre porté par le carbone anomère (C1) et le carbone C4 porteur d'un OH activé par un groupement Mesyl (Ms) est ensuite effectuée.Cette stratégie appliquée à la synthèse du 4-thio-D-ribofurannose et du 4-thio-L-lyxofurannose ressemble à celle que WALKER a utilisé pour parvenir à la série 2-desoxy-D-ribofurannose ( Brevet Eur. Pat. 0421 777 A 1 page 6). Par exemple, le produit 5 (Schéma 5) de WALKER est semblable à notre produit 10 (Schema 6) en série L-Lyxofurannose. BnO s BnO HO Onc + ç > ~~~~~~~~~~ BnO I 8 II B BnO OBn BnO OBn HO OH 13 B = T 14a. 14ss B = T 18&alpha; la,' B = U 15a. 15ss B = U iga. 1g,' B = C isa 16,' B = C 20&alpha;, 20ss B = A 17a. 17,' B = A 21a, 21ss (i = BSA, TMSTf,CH3CN;; ji = BBr3, CH2C12) SCHEMA 7 La synthèse des thionucléosides de l'uracile, de la thymine et de la cytosine a été effectuée en utilisant le bis-triméthylsilyl acétamide (BSA) comme agent silylant et le triméthylsilyl trifluorométhane sulfonate (TMSTf) comme agent de couplage. Les nucléosides a et fi ont été obtenus avec 74 , 77 et 70 % de rendement respectivement . La synthèse des thionucleosides de l'adenine a été réalisée par le SnCl4 dans l'acetonitrile. Les nucleosides a et B sont obtenus avec 58 % de rendement (Schéma 7). II. SYNTHESE D'OLIGO THIONUCLEOTIDES SUR SUPPORT SOLIDE. La synthèse supportée des fi oligothioribonucléotides a été effectuée à l'aide d'un synthétiseur GENE modèle APPLIED BIOSYSTEM 318A selon la méthode aux phosphoramidites. Elle est semblable à celle décrite pour la série fi oligodésoxyribonucléotide naturelle par CARUTHERS et Coll. (S. L. BEAUCAGE et M. H. CARUTHERS, Tétrahedron Lett., 1981, 22, 1859-1862; L. J. Mc BRIDE et M. H. CARUTHERS, Tétrahedron Lett., 1983, 24, 245-248.) et à celle décrite par USMAN et Coll.pour les oligoribonucléotides (N. USMAN, K. K. OGILVIE, M. Y. JIANG et R. J. CEDERGREN, J. Am. Chem. Soc., 1987, 109, 78457854.). Cette synthèse a nécessité: I) La préparation de synthons B thioribonucléoside phosphoramidites s correspondant aux bases T, U, C, A et G. II) La fonctionnalisation du support solide incorporant un dérivé B thioribonucléosidique. III) L'élongation de la chaîne oligothioribonucléotidique à l'aide d'un synthétiseur automatique. IV) Enfin, au terme du nombre requis de cycles de synthèse, l'oligothionucléotide a été décroché de son support, déprotégé et purifié. 11.1 - Synthèse du phosphoramidite des bêta-thioribonucléoside 26 a-d. fi. 1. 1 Synthèse des dérivés 5'-DmTr-2'-O-TBDMS (Schéma 8) Le problème majeur dans la synthèse chimique des oligoribonucléosides est la présence de l'hydroxyle en 2' dans le cycle ribose ou thioribose qui demande une protection séIective. La sélection d'un groupement protecteur pour l'hydroxyle en 2' doit correspondre à plusieurs critères, il doit etre stable: - sous les conditions de couplage pendant la déprotection des groupements protecteurs en 5' pour permettre l'extension de la chaîne. - pendant l'oxydation dans le cas de la méthode aux phosphites triesters. - pendant le masquage qui suit le couplage. - pendant la déprotection des groupements protecteurs des amines exocycliques. - pendant la déprotection des phosphates. - et dans le cas des synthèses sur support solide pendant le clivage de t'oligomère du support. Finalement ce groupement protecteur doit être enlevé sous des conditions très douces pour éviter une attaque de la fonction hydroxyle en 2' libéree sur la liaison phosphodiester adjacente. Un nombre important de stratégies pour protéger les hydroxyles en 2' ont été développées et illustrent les difficultés dans le choix du schéma de protection des groupements hydroxylés. (C. B. REESE, Nucléosides Nucléotides, 1985, 4, 117-127; R. KIERZECK, M. H. CARUTHERS, C. E. LONGFELLOW, D. SWINTON, D. H. TURNIER et S. M. FREIER, Biochemistry, 1986, 25, 7840-7846; S. IWAI et E. OHTSUKA, Nucleic Acids Res., 1988, 16, 9443-9456; C. LEHMANN, Y. Z. XU, C. CHRISTODOULOU, Z. K. TAN et M. J. GAIT, Nucleic Acids Res., 1989, 17, 2379-2390; T. TANAKA, S. TAMATSUKURI, et M. IKEHARA, Nucleic Acids Res., 1986, 14, 6265-6279.). L'utilisation de groupements protecteurs aikylsilyl et notamment le ten-butyldiméthylsilyl (TBDMS) pour l'hydroxyle en 2' a facilité la synthèse des oligoribonucléotides. Le groupement TBDMS est suffisament stable dans des conditions acides ou basiques et est facilement enlevé par le fluorure de tétra-butyl ammonium dans le THF pour etre utilisé dans la stratégie en phase solide (N. USMAN, K. K. OGILVIE, M. Y. JIANG et R. L. LEDERGEN, J. Am. Chem. Soc., 1987, 109, 7845-7854; N. USMAN, K. NICOGHOSlAN, R. L. CEDERGREN et K. K. OGILVIE, Proc. Natl. Sci. USA, 1988, 85, 5764-5768.; S. A. SCARINGE, C. F. FRANCKLYN et N. USMAN, Nucleic Acids Res., 1990, 18, 5433-5441.;K. K. OGILVIE et M. J. NEMER, Tétrahedron Lett., 1980, 21, 4159; R. T. PON et K. K. OGILVIE, Nucléosides Nucléotides, 1984, 3, 485; R. T. PON et K. K. OGILVIE, Tétrahedron Lett., 1984, 25, 713.). On a donc appliqué en série ss oligothioribonucléotide le schéma de protection utilisé pour les nucléosides oxygénés (Schéma 8). A savoir les protections: - Benzoyl pour l'adénine et la cytosine, isoButyl pour la guanine en tant que protection des groupements amino exocycliques. - Diméthoxytrityl (DmTr) pour protéger les hydroxyles primaires en 5'. - tert-butyldiméthymsilyl (TBDMS) pour protéger l'hydroxyle secondaire en 2'. - Methoxy pour la protection des phosphates. La première étape permet de protéger l'hydroxyle libre en 5' par un groupement acide labile le DmTr (Schéma 8). Ainsi le dérivé nucléosidique 22 est traité par le chlorure de diméthoxytrityle ( 1,27 équivalents molaires) dans la pyridine anhydre sous atmosphère inerte. Après traitement usuel du melange réactionnel, le dérivé diméthoxytritylé li est purifié par chromatographie sur gel de silice et isolé avec des rendements variant de 70 à 80 % . . Les caractéristiques physico-chimiques de ces dérivés 23 (R.M.N., Masse) sont en accord avec les strutures proposées. (i = DmTtCI, pyr. ii = TBDMSCI, pyr.) Les abréviations ont les significations suivantes: a- B = T = Thymine b- B = U = Uracile. c- B = CBz = N-Benzoyl-$Cytosine. d- B = ABz = N-Benzoyl-6-Adenine. e- B = GPal = N-Palmitoyl-2-Guanine. Dmtr = Diméthoxy4,4'-trityl. iPr = Isopropyl. Bz = Benzoyl. TBDMS = tertbutyldiméthylsilyl. (iPr)2P(Cl)OMe = Chloro, (N,N diisopropylamino, méthoxyphosphine).. SCHEMA 8 La deuxième étape (Schéma 8) consiste en la protection de l'hydroxyle secondaire en 2'. Or, durant la silylation un mélange de 2'-O-silyl 24 et de son régioisomère 3'-O-siiyl 25 est obtenu (K. K. OGILVIE et D. W. ENTWISTLE, Carbohyd. Res., 1981, 89, 203-210; K. K. OGILVIE, A. L. SCHIFMAN et C. L. PENNEY, Can. J. Chem., 1979, 57, 2230; G. H. HAKIMELAHI, Z. A. PROBA et K. K. OGILVIE, Can. J. Chem., 1982, 60, 1106.). Ces isomères doivent ête séparés avec beaucoup de soins sur colonne de gel de silice afin d'obtenir le dérivé 2'-O-TBDMS 24 avec une pureté supérieure à 99,95 % mesurée par CLPH. En effet, si ce n'est pas le cas, les étapes ultérieures nous conduiront à des mélanges d'oligothionucléotide 5'-3' attendus avec l'isomère indésirable 5'-2'. En conséquence, la pureté du 5'-O-DmTr-2'-O-silyl 24 est primordiale pour une bonne synthèse. Ainsi, l'obtention des composés 5'-DmTr-2'-O-TBDMS 24 a tout d'abord été réalisée selon la méthode d'OGILVIE et Coll. (K. K. OGILVIE, A. L. SCHIFMAN et C. L. PENNEY, Can. J. Chem., 1979, 57, 2230.) qui consiste à condenser 23 avec du chlorure de tertbutyldiméthylsilyle (TBDMSCl) (1,2 equivalent molaire) dans la pyridine en présence d'imidazole (2,6 equivalents molaires). En fin de réaction, on obtient un mélange de dérivé 2'-O-TBDMS 24 et de son isomère 3'-O-TBDMS 25. Le composé attendu 24 est séparé du mélange par chromatographie sur colonne de gel de silice. n est ensuite possible par une réaction d'équilibration d'obtenir 24 à partir de son isomère 3'-O-TBDMS 25 (S. S. JONES et C. B. REESE, J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 1979, 2762.). Cette migration du groupement TBDMS est intramoléculaire et s'effectue via un intermédiaire possédant un atome de silicium pentavalent. L'isomérisation du dérivé 3'-O TBDMS obtenu précédemment aprés une première séparation chromatographique est effectuée dans l'éthanol à température ambiante pendant une nuit. Les deux isomères de position ainsi obtenus sont à nouveau séparés par chromatographie sur colonne de gel de silice. Cette opération d'isomérisation suivie d'une purification est répétée trois fois. Cependant les rendements en 5'-DmTr-2'-O-TBDMS 24 obtenus par cette méthode ( 40 à 50 % selon les bases) ne nous ont pas paru satisfaisants. Nous en avons utilisé une autre, plus récente, mise au point par OGILVIE ( G. H. HAKIMELAHI, Z. A. PROBA et K. K. OGILVIE, Can. J. Chem., 1982, 60, 1106.) qui permet l'introduction préférentielle du TBDMS en position 2' des ribonucléosides 8. Cette technique préconise l'utilisation de sels d'argents. Ainsi le 5'-diméthoxytrityl li est condensé avec du chlorure de TBDMS (1,3 équivalents molaires) en présence de nitrate d'argent (1,2 équivalent molaires) et de 3,7 équivalents de pyridine dans le THF anhydre. Après purification par chromatographie sur colonne de gel de silice on obtient 56 % de rendement en 24 et 27 % en 5'-DmTr-3'-O-TBDMS 25. En conséquence, le 5'-DmTr-2'-O-TBDMS 24 est obtenu dans ces nouvelles conditions en une seule étape avec un meilleur rendement, mais la sélectivité d'introduction du groupement TBDMS en 2' n'est pas ameliorée . II.1.2 Synthèse des dérivés phosphoramidites 26 a-d (Schéma 9) Les quatre ss thioribonucléosides phosphoramidites N-protégés 26 a-d sont ensuite obtenus à partir des 5'-DmTr-2'-OTBDMS B thioribonucléosides N-protégés correspondants 24 (Schéma 9). Le dérivé nucléosidique 24 a été traité par du chloro N, N diisopropylamino méthoxy phosphine ( 2,5 équivalents molaires) en présence de N,N,N diisopropyl éthylamine (DIEA) dans le dichlorométhane sous atmosphère inerte. Le dérivé phosphoramidite 26 a été purifié par chromatographie sur gel de silice et lyophilisé dans le benzène, les phosphoramidites 26 a-d sont obtenus avec des rendements variant de 78 à 80 % selon la nature de la base. i = (iPr)2P(Cl)OMe, DIVA, DMAP, CH2C12) SCHEMA 9 Les analyses des spectres de RMN du 31p et du 1H de 26 montrent clairement que nous obtenons une seule paire de diastéréoisomères ce qui établit la pureté régioisomèrique des composés obtenus. En effet, quelques auteurs (R. KIERZEK, M. H. CARUTHERS, C. E. LONGFELLOW, D. SWINION, D. H. TURNER et S. M. FREIER, Biochemistry, 1986, 25, 7840-7846.) avaient émis l'hypothèse que les groupements silylés en position 2' n'étaient pas stables dans les conditions de la phosphorylation. Cependant, il a été montré (W. K. KOHLER, W. SCHLOSSERM, G. CHARUBALA et W. PFLEIDLERER, Chemistry and Biology of Nucléosides and Nucléotides, Academic Press, New York, 1978, pp 347-358; K. K. OGILVIE et D. W. ENTWISTLE, Carbohydrate Res., 1981, 89, 203-210; N. USMAN, K. K. OGILVIE, M. Y. JIANG et R. J. CEDERGREN, J. Am. Chem. Soc., 1987, 109, 7845-7854.) que les groupes alkylsilyles migrent dans les solvants protiques comme le méthanol ou dans les solutions aqueuses comme le mélange pyridineleau, mais ces groupements silylés sont stables dans les solvants anhydres et notamment dans les bases non protiques comme la pyridine anhydre (K. K. OGILVIE, D. W. ENTWISTLE, Carbohydrate Res., 1981, 89, 203-210; W. KOHLER, W. SCHLOSSER, G. CHARUBALA et W. PFLEIDERER, Chemistry and Biology of Nucleosides and Nucleotides, Academic Press, New York, 1978, pp 347-358.). D'autre part, il a été clairement démontré en série ribonucléotide que l'utilisation des 2'-O-silyl ribonucléosides dans la synthèse d'oligoribonucléotides conduit exclusivement à des liaisons 5'-3' (K. K. OGILVIE, M. J. NEMER, Tetrahedron Lett., 1980, 21, 4159; R. T. PON et K. K. OGILVIE, Tetrahedron Lett., 1984, 25, 713; R. T. PON, et K. K. OGILVIE, Nucleosides Nucleotides, 1984, 3, 485;P. J. GAREGG, I. LINDH, J. STAWINSKI, et R. STROMBERG, Tetrahedron Lett., 1986, 27, 4055-4058). La synthèse de phosphoramidites n'est pas stéréospécifique et la formation en quantités égales des deux diastéréoisomères est due à la chiralité de l'atome de phosphore de configuration R ou S. La formation de ces deux produits n'est pas génante dans la mesure où les réactions d'oxydation ultérieures suppriment cette chiralité. II. 2. PARTIE EXPERIMENTALE Méthode générale pour la préparation des 5'-O-diméthoxytrityl N-acyl 4'-thio-B-Dribonucléosides 23a-d. A une solution de N-acyl B-D-thioribonucléoside 23a-d (1mmole) dans la pyridine anhydre (5.6ml) est ajouté du chlorure de diméthoxytrityle (1.27mmole, 430mg). Le mélange réactionnel est agité à température ambiante sous atmosphère inerte pendant 90 à 120 min puis du méthanol (1ml) est ajouté. Après 10 minutes d'agitation supplémentaire, le mélange réactionnel est versé sur une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium (25ml) et les produits sont extraits avec du dichlorométhane (2 x 20ml). Les phases organiques sont lavées avec de l'eau (2 x 100ml) puis séchées sur sulfate de sodium et filtrées. Le filtrat est évaporé sous pression réduite et le résidu obtenu est chromatographié sur une colonne de gel de silice.L'élution est effectuée avec un mélange CH2Cl2/MeOH : 98/2 en présence de triéthylamine 1 %; les fractions contenant le produit sont évaporées à sec et les nucléosides 23a-d sont obtenus sous forme d'une huile. 1-[4'-thio-5'-O-diméthoxytrityle-ss-D-ribofurannosyl]Thymine 23 a. Rendement: 68 %. Spectrométrie de masse FAB > 0 NOBA m/z = 577 [M+H]+, 303 tDmTr]+ RMN 1H (DMSOd6, 360MHz) s 11,24, (s, 1 H, NH); 7,44, (s, 1 H, H6); 6,87-7,30, ( m, 13 H, H Aromatiques); 5,83, (d, 1 H, H1', J1',2' = 7,0); 5,53, (d, 1 H, OH2', JOH,2' = 5,8); 5,30, (d, I H, OH3', JOH,3' = 4,7); 4,14, ( dd, 1 H, H2t, J2',1' = 6,9, J2',3 = 3,0); 4,00, (t, 1H, H'3,J3',2'=3,0, J3',4'=3,0); 3,69, (s, 6H, OMe); 3,30, (dd, 1H, H4'); 3,13, (m, 2 H, H5', H5"); 1,60, (s, 3 H, CH3). 1-[4'-thio 5'-O-diméthoxytrityle ss-D-ribofurannosyl]Uracile 23 b. Rendement 70%. RMN 1H (DMSOd6, 360 MHz) s 11.31, (s, 1 H, NH); 7.70, (d, 1 H, H6, J6,5 = 8.0), 7.40-6.89, (m, 13 H, H aromatiques du groupement dmTr); 5.84, (d, 1 H, H1., J1',2' = 5.7), 5.53, (d, 1 H, OH2', JOH2',2' = 5.6), 5.48, (d, 1 H, Hs, J5,6 = 8.0); 5.26, (d, 1 H, OH3., JOH3',3' = 4.45); 4.02, (m, 2 H, H2', H3.); 3.74, (s, 6 H, OMe); 3.31, (m, 3 H, H4', H5', H5''). Spectrométrie de masse FAB > 0 NOBA m/z = 563 [M+H] +, 303 [DmTr]+ 1-[4'-thio 5'-O-diméthoxytitrityle ss-D-ribofurannosyl]N-4-benzoylCytosine 23 c Rendement 69 %. RMN 1H (DMSOd6, 250 MHz) S 11.32, (s, 1H, NH); 8.40, (d, 1H, Hs, J6,5 = 7.5); 8.01, (d, 2H, Ho du groupement benzoyle); 7.63, (d, 1H, Hs, J5,6 = 7.3); 7.44, (m, 17H, H aromatiques du groupement DmTr et Hm,p du groupement benzoyle); 5.88,(d, 1H, H1,, J1',2' = 4.1); 5.73, (d, 1H, OH2', JOH,2' = 5.2); 5.27,(d, 1H, OH3., JOH,H3' = 5.7); 4.06, (m, 1H, H2',J2',1' = 4.0, J2',3' = 3.7, J2',OH = 5.2); 4.03,(m, 1H, H3', J3',2' = 3.7, J3',4' = 5.3, J3',OH = 5.7); 3.76,(s, 6H, OCH3 du groupement DmTr); 3.43,(m, 3H, H4', H5' et H5"). Spectrométrie de masse FAB > 0 NOBA m/z = 666 [M+H]+, 517 [M+H-0CONH2]+, 303 LDmTr]+ 1-[4'-thio 5'-O-diméthoxytrityle ss-D-ribofurannosyl]N6-benzoylAdénine 23 d Rendement 70 % RMN 1H (DMSOd6, 250 MHz) S 11.25,( s, 1H, NH); 8.63, (s, 1H, H8); 8.57, (s, 1H, H2); 8.04, (d, 2H, Ho du groupement benzoyle); 7.51, (m, 13H, H aromatiques du groupement DmTr); 6.92, (d, 3H, Hm,p du groupement benzoyle); 5.98, (d, 1H, H1', J1',2' = 5.8); 5.75, (d, 1H, OH2., JOH,2' = 3.5); 5.45, (d, 1H, OH3., JOH,3' = 2.5); 4.70, (m, 1H, H2'); 4.26, (m, 1H, H3,); 3.74,( s, 6H, OCH3 du groupement DmTr); 3.53, (m, 3H, H4', H5' et H5"). Spectrométrie de masse FAB > 0 NOBA m/z = 690 [M+H1+, 303 [DmTr]+ Méthode générale pour la préparation des 2'-O-tert-butyldiméthylsilyl-4'-thio-5'-O- diméthoxytrityl-N-acyl-ss-D-ribonucléosides 24 a-e et de leur isomère 3'-TBDMS 25 a-e. A une solution de 5'-O-diméthoxytrityl 4'-thio N-acyl B-D-ribonucléoside 23 a-d (1mmole) dans le THF anhydre (lOml) est ajouté du nitrate d'argent (1.2mmole, 203mg). Le mélange réactionnel est alors agité 5 minutes à température ambiante avant l'addition du chlorure de ten-butyldiméthylsilyle (TBDMSCl, 1.3mmole, 195mg) et de la pyridine anhydride (3.7mmole, 0.193ml). L'agitation à température ambiante est alors prolongée pendant 24 h, puis la solution hétérogène est filtrée avant d'entre versée dans une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 5% (30ml). Les produits sont extraits avec du dichlorométhane (3x20ml) et les phases organiques sont lavées avec de l'eau puis séchées sur sulfate de sodium et filtrées.Le filtrat est évaporé à sec et le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice en utilisant comme éluant un mélange de CH2Cl2/AcOEt : 95/5 puis de CH2Cl2/AcOEt:80/20 . Les fractions contenant le produit désiré (2'-O-TBDMS, 24 a-d) sont regroupées et évaporées à sec. L'isomère 3'-O-TBDMS 25 a-d est ensuite obtenu. 1-[2'-O-tert-butyldiméthylsilyl-4'-thio-5'-O-dimfiéthoxytrityl-8-D-ribofurannosyl] Thymine 24 a. Rendement: 33 . Spectrométrie de masse FAB > 0 NOBA m/z = 691 [M+HJ+, 713 [M+Na]+. RMN 1H (DMSOd6, 300MHz): s 11,36, (s, 1 H, NH); 7,58, (s, 1 H, H6); 7,33-6,90, ( m, 13 H, H Aromatiques); 5,89, (s, 1 H, H1', J1.,2, = 6,1); 5,27, (m, 1 H, OH3'); 4,20, (dd, 1H, H2', J2',1' = 6,10, J2',3' = 3,5); 3,97, (m, 1H, H3'); 3,73, (s, 6 H, OMe); 3,36, ( m, 1 H, H4,); 3,25, ( m, 2 H, H5', H5"); 1,58, ( s, 3 H, CH3); 0,81, ( s, 9 H, tert-butyl); 0,0, (d, 6 H, Me2Si). 1-[2'-O-tert-butyldiméthylsilyl-4'-thio-5'-O-diméthoxytrityl-ss-D-ribofurannosyl] Uracile 24 b. Rendement 56%. Tf = 114 C. RMN 1H (DMSOd6, 360 MHz): s 11.20, (s, 1 H, NH); 7.81, (d, 1 H , H6, J6,5 = 8.1); 7.30-6.89, (m, 13 H, H aromatiques du groupement dmTr) 5.84, (d, 1 H, H1', J1',2' = 5.5); 5.50, (d, 1 H, H5, J5,6 = 8.1); 5.23, (d, 1 H, OH3X, JOH3',3' = 4.7); 4.11, (q, 1 H, H2S, J2',1' = 5.5, J2',3' = 3.5); 3.95, (m, 1 H, H3'); 3.74, (s, 6 H, OMe); 3.38, (m, 2 H, H4',H5' J4'5' = 3.28, (m, 1 H, H5"); 0.82, (s, 9 H, tert-butyl); 0.05, (m, 6 H, Me2Si). Spectrométrie de masse FAB > 0 NOBA m/z = 677 [M+H]+, 619 LM+H-tert-butane]+, 303 [dmTrl+ 1-[2'-O-tert-butyldiméthylsilyl-4'-thio-5'-O-diméthoxytrityl-ss-D-ribofurannosyl] N4-benzoylCytosine 24 c. Rendement 32%. RMN 1H (DMSOd6, 250 MHz): s 11.31, (s, 1H, NH); 8.51, (d, 1H, H6, J6,5 = 7.3); 8.01, (d, 2H, Ho du groupement benzoyle); 7.51, (m, 14H, H aromatiques du groupement DmTr et H5); 6.93,( d, 3H, Hm,p du groupement benzoyle); 5.93,(d, 1H, h1', J1',2' = 3.0); 5.20, (d, 1H, OH3', JOH,H3' = 5.0); 4.14,(m, 1H, H2'); 4.00,(m, 1H, H3'); 3.76,(s, 6H, OCH3 du groupement DmTr); 3.38,(m, 3H, H4', H5,et H5"); 0.86, (s, 9H, tertbutyl); 0.60, (d, 6H, Me2Si). Spectrométrie de masse FAB > O NOBA m/z 780 [M+H]+, 303 [DmTr]+ 1-[2'-O-tert-butyldiméthylsilyl-4'-thio-5'-O-diméthoxytrityl-ss-D-ribofurannosyl] N6-benzoylAdénine 24 d Rendement 35 % RMN 1H (DMSOd6, 250 MHz): S 11.25,( s, 1H, NH); 8.64, (s, 1H, H8); 8.61, (s, 1H, H2); 8.04, (d, 2H, Ho du groupement benzoyle); 7.51, (m, 13H, H aromatiques du groupement DmTr); 6.95, (d, 3H, Hm,p du groupement benzoyle); 6.01, (d, 1H, Hls, J1',2' = 5.8); 5.48, (d, 1H, OH3', JOH,3' = 2.5); 4.70, (m, 1H, H2'); 4.26, (m, 1H, H3'); 3.75,( s, 6H, OCH3 du groupement DmTr); 3.53, (m, 3H, H4',H5' et H5"); 0.82, (s, 9H, tert-butyl); 0.50, (d, 6H, Me2Si). Spectrométrie de masse FAB > 0 NOBA m/z 804 [M+H]+, 303 [M+H]+ 1-[3'-O-tert-butyldiméthylsilyl-4'-tho-5'-O-diméthoxytrityl ss-D-riborannosyl] Thymine 25 a Rendement 13%. RMN 1H (DMSOd6, 360 MHz): s 11.34, (s, 1H; NH); 7.46, (s, 1H, H6); 7.89-7.30, (m, 13H,H aromatique); 5.87, (d, 1H, H1', J1',2'=7.8); 5.46, (d, 1H, OH2', JOH,2' = 5.1); 4.13, (m, 1H, H3'); 4.11,(m, 1H, H2', J2',1' = 7.8, JOH,2' = 5.1); 3.73, (s, 6H, OMe); 1.66, (s, 3H, CH3); 0.84,(s, 9H, tert-butyl); 0.50,(d, 6H,Me2Si). 1-[3'-O-tert-butyldiméthylsilyl-4'-thio-5'-O-diméthoxytrityl ss-D-ribofurannosyl] Uracile 25 b. Rendement 27% Tf = 109-C. RMN 1H (DMSOd6, 360 MHz): ô 11.30,(s, 1 H, NH); 7.70, (d, 1 H, H6, J6,5 = 8.0); 7.30-6.89, (13 H, H aromatiques du groupe-ment dmTr); 5.84, (d, 1 H, H1,, J1',2' = 7.3); 5.57, (d, 1 H, H5, J5,6 = 8.0); 5.46, (d, 1 H, OH2', J0H2',2' = 5.1); 4.12, (t, 1 H, H3' J3S,2S = 3.1, J3, 4, = 3.1); 4.03, (m, 1 H, H2'); 3.74, (s, 6 H, OMe); 3.41, (m, 1 H, H4'); 3.21, (m, 2 H, H5', H5"); 0.08, (s, 9 H, tert-butyl); 0.02, (m, 6 H, Me2Si). Spectrométrie de masse FAB > 0 NOBA m/z 677 [M+H]+, 619 [M+H-tert-butane]+, 303 [dmTr]+. Ce composé a été mis en présence avec une solution éthanol/triéthylamine 0.25% (v/v) pendant une 12H à température ambiante pour donner en proportion égale un mélange 24 b et 25 b. 1-[3'-O-tert-butyldiméthylsilyl-4'-thio-5'-O-diméthoxytrityl ss-D-ribofurannosyl] N4-benzoyl Cytosine 25 c. Rendement 31 %. RMN 1H (DMSOd6, 250 MHz): S 11.33, (s, 1H, NH); 8.40, (d, 1H, H6, J6 > 5 = 7.4); 8.01, (d, 2H, Ho du groupement benzoyle); 7.60, (m, 14H, H aromatiques du groupement DmTr et H5); 6.92, ( d, 3H, Hm,p du groupement benzoyle); 5.92,(d, 1H, H1', J1',2' = 5.3); 5.60, (d, 1H, OH2', JOH2', JOH,2' = 5.0); 4.15, (m, 2H, H2', H3'); 3.75, (s, 6H, OCH3 du groupement DmTr); 3.38,(m, 3H, H4', H5' et H5"); 0.79, (s, 9H, tert-butyl); 0.00, (d, 6H, Me2Si). Spectrométrie de masse FAB > O NOBA m/z 780 [M+H]+. 303 [DmTr]+ 1-[3'-O-tert-butyldiméthylsilyl-4'-thio-5'-O-diméthoxytrityl ss-D-ribofurannosyl] N6-benzoyl Adénine 25 d. Rendement 29 . RMN 1H (DMSOd6, 250 MHz): 6 11.25,( s, 1H, NH); 8.64, (s, 1H, H8); 8.61, (s, 1H, H2); 8.04, (d, 2H, Ho du groupement benzoyle); 7.51, (m, 13H, H aromatiques du groupement DmTr); 6.95, (d, 3H, Hm,p du groupement benzoyle); 6.01, (d, 1H, H1', J1,2 = 5.8); 5.79, (d, 1H, OH2 > , JOH,2' = 3.5); 4.70, (m, 1H, H2'); 4.26, (m, 1H, H3'); 3.75,( s, 6H, OCH3 du groupement DmTr); 3.53, (m, 3H, H4',H5' et H5"); 0.82, (s, 9H, tert-butyl); 0.01, (d, 6H, Me2Si). Spectrométrie de masse FAB > 0 NOBA m/z 804 [M+H]+, 303 [M+H]+ Méthode générale de préparation des 8-D-ribonucléoside phosphoramidites 26 a-d A une solution des composés 24a-d (1 mmole) dans du dichlorométhane anhydre (3.8ml) sont ajoutés sous atmosphère inerte d'argon la N,N,N-diisopropyléthylamine (4 mmoles, 0.7ml), la chloro N,N-diisopropylaminométhoxyphosphinef (2.5mmole), 0.48ml) et la 4 N,N-diméthylaminopyridine (0.2mmole, 24.4mg). Le mélange réactionnel est agité de 40 à 90 minutes à température ambiante puis est dilué avec de l'acétate d'éthyle (35ml). La solution résultante est lavée avec de la saumure (4x50ml) puis avec de l'eau (2x50ml). La phase organique est séchée sur sulfate de sodium, filtrée et évaporée sous pression réduite. Le résidu est chromatographié sur colonne de gel de silice et l'élution est réalisée à l'aide d'un mélange de cyclohexane, de dichlorométhane et de triéthylamine (100/0/0.1 à 50/50/0.1). Les produits 26 a-d sont obtenus sous la forme d'une poudre blanche après lyophilisation dans le benzène. 1-[2'-O-tert-butyldiméthylsilyl-3'-N,N-diisopropylméthoxyphosphoramidite-4'thio5'-O-diméthoxytrityle-ss-D-ribofurannosyl]Thymine 26 a (mélange diastéréoisomérique) Rendement: 89%. RMN 31P (CD3CN): s 151,32 et 150,03. RMN 1H : 7 7.99, (s, 1 H, NH), 7.65, (d, 1 H, H6); 7,35-6.80, (m, 13 H, H aromatiques ); 5.97, (m, 1 H, H1.); 4,25, (m, 1 H, H2'); 4.13, (m, 1 H, H3'); 3.78, (s, 6 H, OMe); 3.68, (m, 1 H, H4'); 3.54, (m, 2 H, H5', H5"); 3.35 (m, 3 H, MeO du groupement phosphoramidite); 3,25, (m, 2 H, CH des groupements isopropyle); 1,60, (m, 3 H, CH3); 1.15, (m, 12 H, CH3 des groupements isopropyle); 0.86, (s, 9 H, tert-butyl); 0.05, (m, 6 H, Me2Si).Spectrométrie de masse FAB > 0 NOBA m/z = 852 [M+H]+ 1-[2'-O-tert-butyldiméthylsilyl-3'-N,N-diisopropylméthoxyphosphoramidite4'thio-5'-O-diméthoxytrityle-ss-D-ribofurannosyl]Uracile 26 b (mélange diastéréoisomérique) Rendement 78 %. RMN 31p (CDCl3): s 150.65 et 150.50. RMN 1H (CD3CN,250 MHz): s 7.99, (s, 1 H, NH), 7.22, (m, 1 H, H6); 7.30-6.89, (m, 13 H, H aromatiques du groupement DmTr); 5.90, (m, 1 H, H1.); 5.50, (m, 1 H, H5); 4.13, (m, 2 H, HT, H3'); 3.80, (s, 6 H, OMe du groupe DmTr); 3.58, (m, 3 H, H4, H5', H5"); 3.42, (m, 2 H, 2 CH des groupements isopropyle); 3.30 (m, 3 H, MeO du groupement DmTr); 1.19, (m, 12 H, CH3 des groupements isopropyle); 0.84, (s, 9 H, tea-butyl); 0.05, (m, 6 H, Me2Si). Spectrométrie de masse FAB > 0 NOBA m/z = 534 LM+H-DmTrH]+ 1-[2'-O-tert-butyldiméthylsilyl-3'-N,N-diisopropylméthoxyphosphoramidite4'thio-5'-O-diméthoxytrityle-ss-D-ribofurannosyl] N4-benzoyl Cytosine 26 c. Rendement 75 . RMN 31P (CD3CN): s 151,30 et 150,05 Spectrométrie de masse FAB > O PEG m/z 941 [M+H]+, 637 [M+H-DmTrH]' 303 [DmTrj+. 1-[2'-O-tert-butyldiméthylsilyl-3'-N,N-diisopropylméthoxyphosphoramidite4'thio-5'-O-diméthoxytrityle-ss-D-ribofurannosyl] N6-benzoyl Adénine 26 d. Rendement 71%. RMN 31p (CDC13): 6 151,26 et 150,01 Spectrométrie de masse FAB > O PEG m/z 964 [M+HJ+, 600 [M+H-DmTrH] 303 [DmTr)+. II. 3 Fonctionalisation du support solide (Schéma 10). Le support solide ou LCA-CPG ( Long Chain Alkylamine Controlled Pore Glass) P-1 a tout d'abord été activé par une solution d'acide trichloroacétique à 3 % dans le dichlorométhane à température ambiante pendant 2 à 3 heures afin de libérer le plus grand nombre de groupements amino, ce qui conduit au maximum de sites réactifs sur la surface des billes de verre. Le support ainsi activé P-2 est alors fonctionnalisé par couplage avec de l'anhydride succinique dans la pyridine en présence de 4-DMAP ce qui conduit à P-3. Dans l'étape suivante, le nucléoside 3'-silylé 25 est utilisé puisqu' il a été obtenu pendant la réaction de silylation des thioribonucléosides et n'est pas nécessaire pour la synthèse d'oligothionucléotides contenant la liaison phosphodiester 3'-5'.Ainsi, P-3 activé par le 1 (3-diméthylaminopropyl) 3-éthylcarbodiimide (DEC) en présence de 4-DMAP est mis en réaction dans la pyridine anhydre avec le 5'-O-DmTr-3'-OTBDMS ss-D-thioribonucléoside 25. Les sites non utilisés du support sont masqués à l'aide de pipéridine. Une dernière étape de masquage à l'anhydride acétique en présence de collidine dans le THI' conduit à P-6. La quantité de nucléoside fixée sur le support est déterminée par spectrophotométrie U. V. en mesurant la quantité de cation diméthoxytrityle libéré après un traitement par une solution à 10 % d'acide trichloroacétique dans le dichlorométhane. Le degré de fonctionnalisation varie de 21 à 38 ,amole par gramme de support suivant la nature de la base nucléosidique. (i = TCA3%, CH2C12; il = anhydride succinique, DMAP, Pyr.; iii = 5'-o-DmTr-4'-thio-3'-o-TBDMS-II- d-ribonucléoside, DMAP, NEt3, DEC Pyr.; iv = pentachlorophénol; v = pipéridine; vi = Ao2O 0.5M dans THF) SCHEMA 10 II. 4. Synthèse automatisée des thiooligonucléotides (Schéma 11). Les thiooligonuciéotides ont été synthétisés sur un synthétiseur à ADN (Applied Biosystems modèle 381 A). Le cycle d'élongation comporte quatre étapes importantes: Détritylation du nucléoside ou de l'oligonucléotide fixé sur le support solide. Condensation du phosphoramidite activé par le tétrazole sur l'hydroxyle 5' libre du nucléoside ou de 1'oligonucléotide. Masquage des fonctions 5'-hydroxyles qui n'ont pas réagi. Oxydation des fonctions phosphitetriester en phosphotriester. DmT,O 10 oye DmTF 7ssS0 TO"' N Dn:iJYXn ILS nXsl Ho P orrirro 5 04) tS O.ai s tatrI. C l' o > a W TION IbO TlOMSC O d CCWJDENIATKIN s Oc M | I I9 I I P > O\$8 W L LIASPUMK Mo MAnIAO 'a I Orff h z Y TH\Prldlu I TaW OXrDATI dmRO o=to 0ue 0=H0P79 o oteaz Oth!-.noI ---e Y DEPROTECT ON HoS ET DECROCMAOk SCHEMA il Chaque synthèse a été effectuée sur une colonne contenant 40 mg de support solide. Le rendement de chaque incorporation est de 98 % évalué en mesurant la concentration des cations diméthoxytrityles récupérés après chaque couplage par traitement du support à l'acide trichloroacétique. Des lavages sont effectués entre chaque étape. et la durée d'un cycle d'élongation est de 21,1 minutes pour la synthèse de l'homododécamère 4'-thio-B-D-ribonucléotide (BrSU12) (Tableau 1). Numéro Etape Temps (sec.) Solvant et Réactifs 1 Séchage et 24 MeCN-Argon Lavage 2 Détritylation 80 TCA à 3% dans CH2C12 3 Séchage et 74 MeCN-Argon Lavage 4 Couplage 915 amidite 0.1M(24eq.)+MeCN +tétrazle 0.5M(10eq.)+MeCN 5 Séchage 45 argon 6 Masquage 23 Méthylimidazole-THF Ac2O/lutidine/THF::I/1/8 7 Séchage 11 argon 8 Oxydation 43 12 0.1M dans THF/Pyr./H20 40/10/1 9 Lavage 53 MeCN TABLEAU 1: Cycle d'élongation utilisé pour la synthèse du BrSU12. 11. 5. Décrochage, Déprotection et Purification du thiooligomère. Après avoir réalisé les étapes de déprotection des méthoxyphosphate diesters au thiophénol, le décrochage du dodécamère du support solide par l'ammoniaque, la déprotection des hydroxyles par le TBAF, le thiooligomère a été dessalé sur une colonne d'exclusion G-25 DEAE Sephadex où sur une colonne ionique A-25 Sephadex DEAE et purifié par CLHP en phase inverse. 11.6. PARTIE EXPERIMENTALE. Exemple I: Synthèse de l'homododécamère BrSU12. I-1 Synthèse du support solide: Le support solide P-1 (2,415 g) est mis en suspension avec une solution (50 ml) d'acide trichloroacétique à 3 % dans CH2Cl2 anhydre. Après 4 h 15 d'agitation, 50 ml d'une solution de triethylamine et de diisopropylamine (9:1) est ajoutée et après 5 mn d'agitation la solution est filtrée. Le support solide P-2 ainsi obtenu est lavé par du dichlorométhane (2 x 50 ml) puis par de l'éther (50 ml) et mis à sécher. Le support solide P-2 est ensuite mis en suspension dans de la pyridine anhydre (14,5 ml) en prèsence d'anhydride succinique (0,48 g) et de DMAP (0,0805 g). La suspension est agitée pendant 20 heures puis filtrée. Le support solide P-3 est alors lavé avec de la pyridine anhydre (50 ml), du dichlorométhane (2 x 50 ml) et de l'éther (2 x 50 ml) puis mis à sécher sous vide. Condensation du support solide P-3 avec le 1-[3 '-O-tert-butyldiméthylsilyi-2 '- hydroxy-4'thio-5'-O-diméthoxytrityle-ss-D-ribofurannosyl]Uracile 25 b Un mélange de P-3 (2,415 g) de 1-[3'-O-tert-butyldiméthylsilyl-2'-hydroxy-4'thio-5'-Odiméthoxytrityle-ss-D-ribofurannosyl]Uracile 25 b (333 mg, 1 éq.) de la DMAP (29,5 mmg, 0,5 éq.) de la triethylamine (0,146 mg, 202 yl, 0,003 éq.) et du DEC (920 mg, 10 éq.) dans 29 ml de pyridine anhydre est agité 3 jours à température ambiante. On ajoute ensuite du pentachiorophénol (321 mg, 2,5 éq.) et on laisse sous agitation 24 heures supplémentaires. Le support solide est alors filtré, rincé avec de la pyridine anhydre (2 x 50 ml) puis avec du dichlorométhane (2 x 50 ml) et de l'éther (2 x 50 ml). Immédiatement après, on traite le support solide P-5 par 25 ml de pipéridine. Après agitation à température ambiante pendant 24 heures, le support solide est filtré, lavé par du dvichlorométhane (2 x 50 ml) puis de l'éther (2 xS0 ml) et mis à sécher sous vide. Le support solide sec (2,415 g) est mis en prèsence d'une solution d'anhydride acétique (0,5 M) dans le THF (15 ml) et d'une solution de collidine (0,5 M) dans le THF (15 ml). Après 4 heures de réaction, le support solide est lavé avec de la pyridine anhydre (2 x 50 ml), du dichlorométhane (2 x 50 ml), du THF (2 x 50 ml) et de l'éther (2 x 50 ml). P-6 ainsi obtenu est mis à sécher sous vide. I-2) Détermination du taux de fonctionnalisation du support solide P-6. Cette détermination s'effectue par dosage des groupements DmTr libérés en milieu acide. On pèse exactement 38,0 mg de P-6 qui sont mis en suspension dans 3,4 ml d'une solution d'acide para-toluène sulfonique (0,1 M) dans l'acétonitrile. Le mélange est agité 15 mn puis soniqué pendant 2 mn. On ajuste alors le volume à 10 ml avec la solution 0,1 M d'acide para-toluène sulfonique dans l'acétonitrile. On prélève 0,3 ml de cette solution à laquelle on ajoute 5 ml de la solution 0,1 M d'acide para-toluène sulfonique. La lecture de la DO (0,317 unité de DO) à 500 nm nous permet de calculer le degré de fonctionnalisation du support P-6 qui est dans ce cas de 21 zmole/gramme de support solide. I-3) Synthèse automatisée de l'homododécamère BrSU12. La synthèse est effectuée sur une colonne contenant 39,8 mg de support solide fonctionnalisé à 21 zmolelg de résine, soit 0,835 Samole (1 éq) de 4'-thiouridine. Chaque-cycle d'élongation nécessite un excés de synthon phosphoramidite (20 Nmole, 24 éq) soit 240 zmole au total pour la synthèse du dodécamère. Le synthétiseur prélevant 200y1 d'une solution 0,1 M de synthon dans l'acétonitrile par incorporation. La durée d'un cycle d'élongation est de 21,1 mn (Tableau 1). L'étape de couplage a été considérablement augmentée (900 s contre 45 s dans le cas d'un désoxynucléoside) à cause de la moindre réactivité du synthon ribonucléotide. Le dosage des cations diméthoxytrityles libérés à chaque étape de détritylation a permis d'évaluer le rendement moyen d'incorporation de l'unité thioribonucléotidique à 98,7 %. I-4) Décrochage, déprotection et purification du thio homododécamère BrSU12. Le support solide portant le thio-homododécamère BrSU12 est traité par 5 ml d'une solution de thiophénol, triéthylamine, dioxane 1, 2 (11212) pendant une demi-heure à température ambiante. La solution de thiophénol est alors filtrée et le support lavé par une solution d'ammoniaque 32 % dans l'ethanol 95 (3/1: v/v) (3 x 500 l) pour décrocher le thio-homododécamère du support solide. La solution ainsi obtenue est évaporée, reprise par 500 yl d'eau puis lyophilisée. L'oligomère est alors dissout dans 300 N1 d'une solution de TBAF (1,1 M) dans le THF. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation pendant 24 heures. La réaction est alors stoppée avec 300 pl d'une solution aqueuse d'acétate d'ammonium (0,05 M). La solution est évaporée à sec, coévaporée 3 fois avec de l'eau et le résidu chromatographié sur colonne de gel d'exclusion Sephadex G-25. Les fractions contenant le thiooligomère sont rassemblées, évaporées à sec et analysées par CLPH. Analyse et Purification du thio-oligomère BrSU12 obtenu. L'analyse CLPH du thiooligomère a été éffectuée sur une colonne Beckman C-18 RP 3 s x LODS Ultrasphère dans les conditions de gradient suivantes: A: 10 % d'acétonitrile dans une solution aqueuse 0,05 M d'acétate de triéthylammonium. B: 15 % d'acétonitrile dans une solution aqueuse 0,05 M d'acétate de triéthylammonium. Gradient: A-B-B-A 20' 10' 5' Temps d'analyse: 30'. Dans ces conditions, on constate que le thiooligomère est pur à 92,73 % . On effectue alors une purification de BrSU12 sur colonne semi-préparative Nucléosyl avec un gradient: A--------------B----------B----------A 15' 10' 5' On obtient dans ces conditions le BrSU12 avec une pureté de 94,42 % suffisante pour les études ultérieures. Exemple II: Synthèse du dodècamère B (SrT)1 dTll. II-1) Synthèse du support solide. Le support solide fonctionnalisé à 1 mole pour 35 mg de résine de 2'-désoJythymidine ainsi que les synthons 1-( 5'-O-DmTr-3'-O-N,N-diisopropylamino cyanoéthyl phosphine, 2'-désoxy-B-D-ribofurannosyl thymine sont commercialisés par Applied Biosystems. II-2) Synthèse automatisée de ss (SrT)1 dT11. La synthèse est effectuée sur une colonne contenant 35 mg de support solide soit 1 zmole de 2'-désoxythymidine. Chaque cycle d'élongation nécessite un excès de synthons phosphoramidite (20 moles, 20 éq) soit 220 zmole de synthons 2'-désoxythymidine et 20 moles de synthon 4'-thio-thymidine 5. Le synthétiseur prélevant 200 moles par incorporation d'une solution 0,1 M de chaque synthon dans l'acétonitrile. La durée d'un cycle d'incorporation d'une unité désoxythymidine est de 5,5 mn .Alors qu'elle est de 20,1 mn pour un cycle d'incorporation du synthon 4'-thiothymidine. L'augmentation de la durée du cycle d'incorporation du synthon chimère est due à l'étape de couplage de 909 ' contre 36 ' pour le synthon 2'-désoxythymidine. Le dosage des cations diméthoxytrityles libérés à chaque étape de détritylation a permis d'évaluer le rendement moyen d'incorporation de l'unité 2'-désoxythymidine à 98,5 % et 93,5 % pour le synthon 4'-thiothymidine. II-3) Décrochage,déprotection et purification du B (SrI)l dT11 Le support solide portant l'oligomère B (SrT)1 dT11 est traité par une solution d'ammoniaque (32 %) dans l'méthanol 95 (3/1, v/v) (3 x 500 ,ul) pendant 3 cycles de 20 mn chacun afin de décrocher 1'oligomère de son support, puis le dodécamère est incubé pendant 2 hr dans une étuve sèche dans le même mélange afin de déprotéger les fonctions cyanoéthyl et méthoxy. L'oligomère est ensuite évaporé sous vide, repris par 500 y1 d'eau et lyophilisé. La déprotection des groupements TBDMS est effectuée selon le protocole mis au point dans l'exemple I. Le résidu obtenu est chromatographié sur colonne de gel de DEAE Sephadex A-25. Les fractions contenant 1'oligomère sont rassemblées, évaporées à sec et analysées par CLPH. Analyse et Purification du B (SrT)l dT11 par CLPH. L'analyse CLPH de l'oligomère a été effectuée sur une colonne Beckman C 18 RP 3 IL Ultrasphère dans les conditions de gradient suivantes: A: 6 % d'acétonitrile dans un tampon acétate de triethyl ammonium 0,05 M. B: 20 % d'acétonitrile dans un tampon acétate de triethyl ammonium 0,05 M. A---------------B--- -------B 15' 10' Temps d'analyse : 25 mn. Dans ces conditions, I'oligomère est pur à 49,3 %. une purification de ss (SrT)1 dT11 est alors éffectuée par CLPH semi-préparative avec une colonne Nucleosyl dans les conditions de gradient suivantes: A---------------B-------------B 15' 5' Le 12-mer présente alors un temps de rétention de 12,99 mn et une pureté supérieure à 99 %. II-4 : Synthèse du dodécamère B dT5 (SrT) dT6 II-4.1) Synthèse du support solide. Le support solide défini dans l'exemple II a été utilisé. II-4.2) Synthèse autcmatisée de tdT5 (SrT) dT6 Les mêmes conditions de synthèse mises au point pour la synthèse de B ( SrT)1 dT11 ont été utilisées. Le dosage des cations diméthoxytrityles libérés à chaque étape de détritylation a permis d'évaluer le rendement moyen d'incorporation de l'unité 2'-désoxythymidine à 99,3 % et à 96,1 % pour le synthon 4'-thiothymidine II-4.3) Décrochage et purification du pdT5 (SrT) dT6 Le traitement de cet oligomèrea été effectué selon le protocole mis au point dans l'exemple II. L'analyse et la purification CLHP, réalisée dans les mêmes conditions de gradient révèle un temps de rétention de 13,18 minutes et une pureté spectrophotométrique à 260nm de 100 %. III. SYNTHESE AUTOMATISEE DE 4'-THIOOLIGORIBONUCLEOTIDES ET OLIGOMERES MIXTES On dércrit la synthèse d'un 4'-thio-ribo-oligomère homogène 1 dirigé sur la séquence acceptrioe d'épissage du gène tat du VIR. On-montre qu'il est ensuite possible d'obtenir des oligomères mixtes comprenant une séquence limitée d'ADN présentant des liaisons phosphodiesters ( séquence 4 ) ou phosphorothioates ( séquence 5 ). De telles séquences mixtes 5'-(4'-S-ARN / ADN / 4'-S-ARN)-3' 4 et 5 peuvent être utilisées dans une approche antisens et sont susceptibles d'être hautement sélectives dans la mesure où la "fenêtre" de structure ADN sera seule substrat de la RNAse H après appariement de l'antisens avec une cible complémentaire. Il est à noter que la "fenêtre" ADN (phosphodiester ou phosphorothioate) peut être de longueur variable - dans les séquences 4 et 5 il y a six désoxynucléotides - et que cette "fenêtre" peut être incluse à n'importe quelle position de l'oligomère, même aux extrémités 5' et / ou 3'. Complémentairement, cette possibilité ouvre la voie à la conception de ribozymes artificiels (homogènes ou non) comportant des séquences d'oligo-ribonucléotides 4'-ARN. On a synthétisé un certain nombre de 4'-thio-oligoribonucléotides homogènes (4'-S ARN) sur un synthétiseur à ADN (Applied Biosystems modèle 381A) en utilisant le procédé général décrit pre'ced'ereet. C'est le cas notamment: du 4'-Sr-(A-C-A-C-C-C-A-A-U-U-C-U), 1 du 4'-Sr-(U-U-U-U-U-U), (4'-SrU6), 2 et du 4'-Sr-(U-U-U-U-U-U-3'-P-CH2-CH2-CH2-OH). (4'-SrU6-3'n-prOH), 3. L'expression 4'-Sr veut dire : oligoribonucléotide de configuration ss où l'oxygène du cycle furannose des sucres est remplacé par un atome de soufre. 3'n-prOH signifie qu'une fonction n-propanol est fixée sur le groupement phosphate introduit à l'extrémité 3' de l'oligoribonucléotide. De plus; des oligomères mixtes comprenant des séquences d'oligodésoxynucléotides phosphodiester ou phosphorothioate ont été obtenus et les modifications apportées au cycle d'élongation sont décrites en prenant comme exemple les séquences suivantes: 4'-Sr-(U-U-U)-d(T-T-T-T-T-T)-4'-Sr-(U-U-U)/P11, [4'-SrU3-dT6-4'-SrU3/P11], 4. et 4'-Sr-(U-U-U)-d(T-T-T-T-T-T)-4'-Sr-(U-U-U)/F3PS5P3, [4'-SrU3-dT6-r'-SrU3/P3PS5P3], 5. où 4'-Sr a déja été défini comme précedemment, Px correspond au nombre de liaisons phosphodiesters entre les unités nucléotidiques et PSy au nombre de liaisons phosphorothioates entre les unités nucléotidiques. Les thiooligoribonucléotides ont été synthétisés sur un synthétiseur à ADN (Applied Biosystems modèle 381 A). 111-1) Synthèse des 4r-fhiooligoribonucléotides : 4'-Sr(A-C-A-C-C-C-A-A-U-U-C-U), 1, 4-SrU6, 2 et 4'-SrU6-3'n-prOH, 3. Le cycle d' élongation comporte quatre étapes importantes: a) Détritylation du nucléoside ou de l'oligonucléotide fixé sur le support solide dans le cas de 4'-SrU6 et de 4'-Sr-(A-C-A-C-C-C-A-A-U-U-C-U), ou bien détritylation du bras n-propanol fixé sur le support solide ou de l'oligonucléotide fixé sur le lien n propanol dans le cas de 4'-SrU6-3'n-prOE. b) Condensation du phosphoramidite activé par le tétrazole sur l'hydroxyle 5' libre du nucléoside ou de l'oligonucléotide dans le cas de 4'-SrU6 et de 4'-Sr-(A-C-A-C-C-C A-A-U-U-C-U) ou bien sur l'hydroxyle libre du bras n-propanol ou sur l'hydroxyle en 5' de l'oligonucléotide dans le cas de 4'-SrU6-3'n-prOH. c) Masquage des fonctions 5'-hydroxyles qui n'ont pas réagi. d) Oxydation des fonctions phosphitetriesters en phosphotriesters. Chaque synthèse a été effectuée sur une colonne contenant 40 mg de support solide Le rendement de chaque incorporation est de 98 % évalué en mesurant la densité optique des cations diméthoxytrityles libérés après chaque couplage par traitement du support à l'acide trichloroacétique. Des lavages sont effectués entre chaque étape et la durée d'un cycle d'élongation est de 21,46 minutes pour la synthèse des trois oligomères précités (Tableau 1). ETAPES TEMPS (secondes) SOLVANTS ET REACTIFS Lavage-séchage 25 CH3CN / Argon. Couplage 915 Nucléoside phosphoramidite 0,1 M (20 eq.) dans CH3CN + tétrazole 0,5 M(IO eq.) dans CH3CN. Lavage-séchage 41 CH3CN / Argon. Oxydation 36 12(0,1 M) dans THF / Pyr / H2O (40/10/1). Lavage-séchage 59 CH CN I ARGON. Masquage 23 Méthylimidazole-THF: 1 Ac2O/lutidine/THF:1/1/8:1. Lavage-séchage 71 CH3CN/Argon. Détritylation 98 TCA à 3% dans CH Ct Lavage-séchage ~ 33 CH CN / Argon. TABLEAU 1: Cycle d'élongation utilisé pour la synthèse de 4'-Sr-(A-C-A-C-C-C-A-A-U-U C-U), , 4'-SrU6, 2 et 4'-SrU6-3'n-prOH, 3. III-2 Synthèse des oligomères mixtes 4'-SrU3-dT6-4'-SrU3 / Pllet 4'-SrU3-dT6s4'-SrU3 / P3PS5P3. III-2-1 Oligonucléotide 4'-SrU3-dT6-4'-SrU3/P11,4. La synthèse automatisée de cet oligonucléotide reprend les quatre étapes décrites au II-1. Chaque synthèse a été effectuée sur une colonne contenant 40 mg de support solide. Le rendement de chaque incorporation est de 98 %. La durée d'un cycle d'élongation par monomère 4'-Sr-U est de 21,43 minutes contre 6,73 minutes pour un monomère dT Cette différence est dûe à l'augmentation du temps de couplage d'une entité 4'-Sr-U qui est de 915 secondes contre 36 secondes pour dT (tableau 2). ETAPES TEMPS (secondes) SOLVANTS ET REACTIFS Lavage-séchage 25 CH CN / Argot Couplage 4!-Sr-U 915 Nucléoside phosphoramidite 0,1 M (20 eq.) dans CH3CN + tetrazole dT 36 0,5 M (10 eq.) dans CH3CN. Lavage-séchage 41 CH3CN/Argon. Oxydation 36 I2(0,1 M) dans THF/Pyr/H2O (40/10/1). Lavage-séchage 59 CH CH3CN / ARGON. Masquage 23 Méthylimidazole-:1 Ac2O/lutidine/THF:1/1/8:1. Lavage-séchage 71 CH3CN / Argon. Détritylation 98 TCA à 3% dans CH2Cl2. Lavage-séchage 33 CH3CN/Argon. TABLEAU 2 : Cycle d'élongation utilisé pour la synthèse de 4'-SrU3-dT6-4'-SrU3 / Pll, 4. III-2-2Oligonucléotide 4'-SrU3-dT6-4'-SrU3/P3PS5P3, 5. Les mêmes conditions de synthèse automatisée ont été appliquées à ce dodécamère mixte comportant à la fois des liaisons phosphodiesters et phosphorothioates. La synthèse a été effectuée à l'échelle d'une mole soit sur une colonne contenant environ 40 mg de support solide fonctionnalisé à 21 mole / g. Le rendement moyen d'incorporation est de98%. Lors de l'introduction d'une liaison internucléotidique de type phosphorothioate, l'étape d'oxydation définie au paragraphe IV-2-1 été 4, Tableau 2) a été remplacée par une étape oie sulfurisation de 51 secondes utilisant le réactif de Beaucage (*sul- fone-carboxythio2nhydride derivative of benzene" dissout dans i 'acétonitrile à une concentration de 0,05 M. Les autres étapes du cycle d'élongation demeurént mchangées. I 11-3 Décrochage, Déprotection et Purification des 4'-thiooligoribonactéotides (4'-S-AEN). Après avoir réalisé les étapes de déprotection des méthoxyphosphotriesters en phosphodiesters par traitement au thiophénol, les 4'-thio-oligoribonucléotides ont été séparés des supports solides par un traitement à l'ammoniaque. Les groupements TBDMS introduits sur les hydroxyles en 2' ont été déprotégés par une solution de TBAF dans le THF. Les thio oligomères sont ensuite dessalés sur une colonne de gel d'exclusion DEAE Sephadex G-25 puis purifiés par CLHP en phase inverse. III-4 PARTIE EXPERIMENTALE. Exemple I: Synthèse des hexamères: 4'-SrU6, 2 et 4'-SrU6-3'n-prOH, 3. I-I Synthèse des supports solides: Le support solide nécessaire à la synthèse de 4'-SrU6. 2 est le même que celui utilisé pour la synthèse de BrSU12. La synthèse de 4'-SrU6-3'-n-prOH, 3 nécessite l'utilisation du support solide universel: A partir de l'intermédiaire P-3 décrit dans le Brevet n 92 01275, un mélange de 1-O-DmTr-propanol-3 (1 éq.), de DMAP (29,5 mg, 0,5 éq.), de triethylamine (0,146 mg, 0,003 éq.) de DEC (920 mg, 10 éq.) et de P-3 (2,415 g) est agité dans 29 ml de pyridine anhydride pendant trois jours à température ambiante. Du pentachlorophénol (321 mg, 2,5 éq.) est ajouté et l'agitation du mélange réactionnel est poursuivie pendant 24 heures supplémentaires. Le support solide est alors filtré, rincé avec de la pyridine anhydre (2 x 50 ml) puis avec du dichlorométhane (2 x 50 ml) et de l'éther (2 x 50 ml). Le support solide est ensuite traité par la pipéridine, puis par une solution d'anhydride acétique et de collidine dans le THF selon le protocole défini précedemment. 1-2) Détermwnation du taux defonctionnatisation du support solide. Cette détermination a été effectuée en utilisant le mode opératoire décrit précédemment. Le taux de fonctionnalisation du support solide a été évalué à 16,4 Elle de n-propanol par gramme de résine. 1-3-) Synthèse automatisée des l'hexamères 4'-SrU6, 2 et 4'-SrU6-3'n-prOEI, 3. 1-3-1) Synthèse automatisée de l'hexamère .4'-SrU6, 2. La synthèse est effectuée sur une colonne contenant 39,4 mg de support solide fonctionnalisé à 21 ,umole / g de résine, soit 0,827 ,umole (1 éq) de 4'-thiouridine. Chaque cycle d'élongation nécessite un excés de synthon phosphoramidite (16,75 mole, 20,3 éq) soit 100,5 mole au total en solution 0,1 M dans l'acétonitrile.La durée du cycle d'élongation définie dans la tableau 1 est de 21,46 minutes. Le dosage des cations - diméthoxytrityles libérés à chaque étape de détritylation a permis d'évaluer le rendement moyen d'incorporation de l'unité thioribonucléotidique à 98,3 %. I-3-2) Synthèse autssomatisée de l'hexamère 4'-SrU6-3'n-prOH, 3. La synthèse est effectuée sur une colonne contenant 36,2 mg de support solide fonctionnalisé à 16,4 mole de n-propanol par gramme de résine soit 0,82 iimole (1 éq.) de n-propanol. La synthèse totale de 4'-SrU6-3'n-prOll, 3 nécessite 95,9 mg de synthon phosphoramidite (114,8 mole, 20 éq.) dissout dans 1,14 ml d'acetonitrile. La durée d'un cycle d'élongation est de 21,46 minutes. Le rendement moyen par couplage est de 98,3 %. 1-4) Décrochage, déprotection et purification de 4'-SrU6, 2 et 4'-SrUr3 'n-prOH, 3. Le traitement utilisant successivement du thiophénol, de l'ammoniaque et une solution de TBAF, commun aux deux hexamères est décrit précédemment. 1.4-1) Analyse et Purification de l'hexamère 4- & U6, 2. L'analyse CLPH du thio-oligomère a été effectuée sur une colonne SFCC Nucleosyl C-18 N125 2P789 dans les conditions de gradient suivantes: A: 10 % d'acétonitrile dans une solution aqueuse 0,05 M d'acétate de triéthylammonium. B: 15 % d'acétonitrile dans une solution aqueuse 0,05 M d'acétate de triéthylammonium. Gradient: A-20'#B-10'#B Temps d'analyse : 30 minutes, débit:1 ml / min. Dans ces conditions, l'hexamère 4'-SrU6, 2 présente une pureté spectrophotomètrique à 260 nm de 95,3 %. Une purification en CLPH préparative sur une colonne nucleosyl semi-préparative avec un débit de 2 ml/ min et un éluant isocratique de 12 % d'acétonitrile dans une solution aqueuse d'acétate de triéthylammonium 0,05 M nous permet d'obtenir le 4'-SrU6, 2 avec une pureté spectroscopique de 97,7 %. I-4-2) Analyse et purification de l'hexamère 4'-Sr-U6-3'n-prOH,3. L'analyse est effectuée dans les mêmes conditions de colonne et de gradient que pour l'hexamère 4'-SrU6. Le 4'-SrU6-3'n-prOH, 3 a été obtenu avec une pureté spectroscopique à 260 nm de 51,6 %. Cette pureté est portée à 92 % aprés purification par CLPH préparative effectuée dans un gradient de 10% à 13% d'acétonitrile dans une solution aqueuse d'acétate de triéthylammonium 0,05 M en 15 minutes, suivi d'un pallier à 13 % d'acétonitrile dans une solution aqueuse d'acétate de triethylammonium 0,05 M pendant 10 minutes. Exemple II: Synthèse du dodècamère mixte : 4'-SrU3-dT6-4'-SrU3 /P11, 4. 1I-1) Synthèse du support solide Le support solide utilisé pour cette synthèse est identique à celui nécessaire à la synthèse du BrSU12. II-2) Synthèse automatisée du 4'-SrUrdT 4'-SrU3 /Pll, 4. La synthèse du dodécamère est effectuée sur une colonne contenant 39,3 mg de support solide soit 0,819 ,umole de 4'-thiouridine. Chaque cycle d'élongation nécessite un excès de synthon 4'thio-uridine phosphoramidite (16,75 llmole, 20,3 éq) soit 100,5 lmole de synthon 4'-thiouridine dissout dans 1,2 ml d'acétonitrile (0,083 M) et un excés de synthon désoxythymidine phosphoramidite (20 éq., 16,38 Rmole) soit 98,28 ,umole de dT en solution 0,1 M dans l'acétonitrile. La durée d'un cycle d'incorporation d'une unité désoxythymidine est de 6,73 mn, alors qu'elle est de 21,43 mn pour un cycle d'incorporation du synthon 4'-thio-ribouridine. Le dosage des cations diméthoxytrityles libérés à chaque étape de détritylation a permis d'évaluer le rendement moyen d'incorporation à 98,0 %. II-3) Décrochage, déprotection et purification du 4'-SrU3-dT6-4'-SrU3/P11, 4. Les étapes de décrochage de l'oligomère du support solide et de déprotection des liaisons internucléotidiques phosphotriester au thiophénol sont identiques à celles décrites dans l'exemple I II-3-I) Analyse et Purification du 4'-SrU3-dT6-4'-SrU3/P11,4, par CLPH. L'analyse CLPH de l'oligomère 4 a été effectuée sur une colonne SFCC Nucléosyl C18 N125 2P789 dans un gradient de 10 % à 15 % d'acétonitrile dans une solution aqueuse d'acétate de triéthylammonium 0,05 M pendant 20 minutes (débit 1 ml /min, temps d'analyse : 30 min). Dans ces conditions, le dodécamère mixte présente une pureté spectrophotométrique à 260 nm de 92,5 Une purification par CLPH semi-préparative sur une colonne Nucleosyl avec un débit de 2 mli min dans le même gradient augmente la pureté spectrophotométrique de la séquence mixte 4'-SrU3-dT6-4'-SrU3 / P11, 4 à 99,5 %. EXEMPLE m- Synthèse automatisée du 4'-SrU3-dT6-4'-SrU3 / P3PS5P3, 5. III-I) Synthèse du support solide. Le support solide utilisé est le même que celui décrit dans l'exemple I. 111-2) Synthèse automatisée du 4'-SrU3-dT6-4'-SrU3/P3PS5P3, 5. La synthèse du dodécamère est effectuée sur une colonne contenant 39,5 mg de support fonctionnalisé soit 0,831 llmole (1 éq.) de 4'-thiouridine. Chaque cycle d'élongation nécessite un excés de synthon 4'-thiouridine phosphoroamidite (16,75 mole, 20,3 éq.) soit 100,5 mole de 4' Sr-U au total et un excés de 20 éq. (16,38 llmole) de synthon désoxythymidine soit 98,28 pmole pour la synthèse entière. La durée d'un cycle d'incorporation d'une désoxythymidine est de 7,7 minutes contre 21,43 minutes pour l'incorporation d'une 4'-thiouridine. Le dosage des cations diméthoxytrityles libérés indique un rendement moyen d'incorporation des synthons de 98,7 %. IH-3) Décrochage, déprotection et purification du 4'-SrU3-dT6-4'-SrU3/. /P3PS4 > 3, 5. Le traitement de cet oligomère est identique à celui défini dans l'Exemple I. L'analyse et la purification CLHP, réalisée sur une colonne SFCC Nucleosyl C18 N125 2P789 dans un gradient de 10% à 20 % d'acétonitrile dans une solution aqueuse d'acétate de triéthylammonium 0,05 M pendant 20 minutes (débit 1 ml / min, temps d'analyse: 30 min) montre une pureté spectrophotomètrique à 260 nm de 85 %. La purification par CLPH semi-préparative sur une colonne Nucleosyl semi-préparative avec un débit de 2 ml / min dans des conditions isocratiques à 19 % d'acétonitrile dans une solution aqueuse d'acétate de triéthylammonium 0,05 M augmente la pureté de l'oligomère à 99,1 %. Exemple IV: Synthèse du dodécamère anti "tat": 4'-Sr-(A-C-A-C-C-C-A-A-U-U-C-U), l. I Synthèse du support solide Le support solide utilisé pour cette synthèse automatisée est identique à celui décrit dans l'exemple L IV-2) Synthèse automatisée du dodécamère anti"tat": 4'-Sr-(A-C-A-C-C-C-A-A-U-U-C-U), 1 La synthèse de cet hétérododécamère, complémentaire du site accepteur d'épissage du gène tat du Vin est effectuée sur une colonne contenant 38,5 mg de support solide fonctionnalisé, soit sur 0,808 mole de 4'-thiouridine (1 éq.).Chaque cycle d'élongation utilise un excés de 25,24 éq (20,4 mole) en synthon 4'-thioadénosine phosphoroamidite, 13,5 éq. (10,97 llmole) en synthon 4'-thiocytidine et 30 éq. (24,25 mole) en synthon 4'-thiouridine. La durée d'un cycle d'incorporation est de 20,71 minutes et le dosage des cations diméthoxytrityles indique un rendement moyen d'incorporation des synthons phosphoramidites de 93,6 %. IV-3) Décrochage, déprotection et purification du 4 ~Sr-(A-C-A-C-GC-A-A- U- U-G U), L Le support solide portant le dodécamère 4'-Sr-(A-C-A-C-C-C-A-A-U-U-C-U), l est traité par 5 ml d'une solution de thiophénol / triéthylamine / dioxanne (1/2/1) pendant une demiheure à température ambiante. La solution de thiophénol est alors filtrée et le support solide est lavé avec 3 x 3 ml de méthanol, puis par une solution d'ammoniaque 32 % dans l'éthanol 95 (311: viv) (3 x 500 l) afin de décrocher l'oligomère de son support. La solution obtenue est mise à incuber dans une étuve séche thermostatée à 55 C pendant 5 heures afin de déprotéger les groupements protecteurs des bases hétérocycliques.Elle est ensuite évaporée, reprise dans 500 1 d'eau et lyophilisée. L'oligomère lyophilisé est alors dissout dans 300 1ll d'une solution de TBAF (1,1 M) dans le THF. Le mélange réactionnel est laissé à température ambiante pendant 24 heures. La réaction est alors stoppée avec 300 ,ll d'une solution aqueuse d'acétate d'ammonium 0,05 M.La solution est évaporée à sec, co-évaporée avec 3 portions de 500 1ll d'eau et la résidu est dessalé sur une colonne de gel d'exclusion DEAE Sephadex G-25. Les fractions contenant le 4'-thio-oligomère sont rassemblées, évaporées à sec, redissoutes dans 1,2 ml d'eau et filtré sur filtre millipore avant d'être analysée par CLPH IV-4) Analyse et purification du 4'-Sr-(A-C-A-C-C-C-A-A-U-U-C-U), 1, L'analyse CLPH analytique du dodécamère 1 a été éffectuée sur une colonne SFCC Nucléosyl C18 N125 2P789 dans un gradient de 10% à 15 % d'acétonitrile dans une solution aqueuse d'acétate de triéthylammonium 0,05 M avec un débit de 1 ml / min et un temps d'analyse de 30 minutes. Le chromatogramme indique une pureté spectrophotométrique à 260 nm de 44,9 %. Une purification par CLPH semi-préparative sur une colonne Nucléosyl C18 semi-préparative en utilisant le même gradient avec un débit de 2 ml / min et un temps d'analyse de 30 minutes amène la pureté spectroscopique du 4'-Sr-(A-C-A-C-C-C-A-A-U-U-C-U), 1 à 100 %. Le tableau 2 résume les températures de fusion obtenues dans les deux expériences. Concentration ssSrU12/polyrA C BrU12/polyrA C en NaCl Hypochromicité % Hypochromicité % 1M 46 C 25% encours 0.1M 33 C 25% en cours Tableau 2 Températures de fusion des duplex de dodécamères Concentration 3 zM en chaque oligomère. L'analyse de ces résultats montrent que le duplex BSrU12 / polyrA présente une bonne stabilité thermique représentée par le Tm de 46 C obtenu à une concentration de l M en Nazi. Exemples III et IV : Expériences de fusion des duplex BSrU12 / BdC2A12C2 et ssrU12/ssdC2A12C2. Les températures de fusion obtenues dans les deux expériences sont résumées dans le tableau 3. Concentration ssSrU12/ssdC2A12X2 C ssrU12/ssdC2A12C2 C en NaCI Hypochromocité % Hypochromocité % 1M 27'C 9.3 % en cours 0.1M 5 C 5.6% encours Tableau 3 Températures de fusion des duplex de dodécamères Concentration 3 zM en chaque oligomères Exemple IV : Expérience d'autohybridation de i'oligomère BSrU12. Afin de vérifier les résultats précédents, il est nécessaire de s'assurer que le dodécamère BSrU12 ne conduit à aucune autohybridation. Pour cela, on a effectué une expérience d'auto hybridation du dodécamère BSrU12 à deux concentrations en NaCI (1 M, et 0,1 M). Les courbes d'hybridation ne présentent pas l'allure sigmoïdale caractéristique mais IV. PROPRIETE D'HYBRIDATION des B-4'-thio-oligoribonucléotides La spectrophotométrie U. V. permet d'étudier les acides nucléiques et de mettre en évidence la formation de duplex, la température de fusion étant une des caractéristiques d'un duplex. L'empilement et l'appariement des bases des acides nucléiques sont accompagnés d'une diminution de l'absorbtion U.V. (Hypochromicité).Ainsi par spectrophotométrie U.V., il est possible de controler la formation ou la dissociation d'un duplex. (W.SANGER, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag, .New- York, 1984, pp. 141-149). Lorsque la température d'une solution contenant une double hélice (ADN ou ARN) est lentement augmentée, l'absorbtion U.V. croit nettement tout au long de la dissociation. Le point d'inflexion de la courbe d'allure sygmoidale de la variation d'absorbance en fonction de la température est appelée température de fusion ou Tm et correspond à la co-existence de brins séparés et de brins appariés dans un rapport 50/50. L'analyse des courbes de fusion des duplex B-4'-thiooligoribonucléotide / B oligodésoxyribonucléotide et B-4' -thiooligoribonucléotide / B-oligoribonucléotide permettra de définir la stabilité thermique de tels duplex par la mesure de la température de fusion. Ces expériences d'hybridation sont menées en respectant une stoechiométrie 1 / 1 entre les deux brins complémentaires, en présence d'un tampon 1 M NaCl, 10 mM cacodylate de sodium. Une forte concentration en NaCl favorise en effet, les appariements en solvatant les charges négatives autour des atomes de phosphore des deux oligonucléotide. Nous avons donc effectué ces expériences d'hybridation dans un autre tampon : 0,1 M Nazi, 10 mM cacodylate de sodium. IV. 1. RESULTATS ET DISCUSSION Exemples I et Il : Expériences de fusion des duplex BSrU12 /polyrA et BrU12 / polyrA. Ces expériences permettent de mettre en évidence l'influence de l'atome de soufre en position 4' du dodécamère modifié sur la stabilité thermique du duplex en comparant les Tm obtenus avec ceux du duplex naturel. obéissent à l'équation A = k+T où A est l'absorbance à 260 nm, T la température et k une constante. Aucun point d'inflexion ne peut être visualisé sur une telle droite. Nous pouvons donc conclure que le dodécamère BSrU12 ne s'auto-apparie pas. La comparaison des températures de fusion des duplex ssSrU12/ ssdC2A12C2 (Tableau 2) et ssSrU12 / polyrA (Tableau 3) montre une stabilite thermique de l'homoduplex ARN/ARN (Tm = 46 C) nettement supérieure à celle de l'hétéroduplex ARN/ADN (Tm = 27- c) d'autre pan, aucune auto-hybridation de BSrU12 n'a été constatée. Exemple VI et VII: Expérience de fusion des duplex ssdT5(SrT)dT6 BdC2A12C2 et BdT12 / ssdC2A12C2 Cette expérience permet d'évaluer la stabilité thermique du duplex BdTs(SrT)dT6 / ssdC2A12C2 comparativement à celle du duplex naturel BdT12 / BdC2Al2C2 (Figure 1). Les températures de fusion de ces duplex sont indiquées dans le Tableau 4. Concentration ssdT5(SrT)dT6/ssdC2A12C2 C ssdT12/ssdC2A12C2 C en NaCl Hyperchromicité % Hyperchromicité % 1M 40 C 18 % 45 C 20,5 % Tableau 4 Température de fusion des duplex BdTs(SrT)dT6 / ssdC2A12C2 et ssdt12/ssdC2a12C2 Concentration en chaque oligomère 10 zM Au vu de ces résultats, il apparait que la stabilité thermique. du duplex modifié est inférieure à celle du duplex naturel. Cependant la différence de 5 * C existante entre les deux températures de fusion est trop faible pour conclure à un mésappariement. En effet, certains auteurs (Y.KAWASE, S.IWAI, H.INOUE, K.MIURA et E.OKTSUKA, Nucleic Acid Research, 1986, 14, 7727) ont montré que l'existence d'un seul mésappariement dans un duplex de 13 unités nucléotidiques se traduisait par une diminution de Tm supérieure à 10 C. On peut donc conclure que l'unité 4'-thio-nucléotidique s'apparie bien avec la 2' désoxyadénosine mais avec une affinité inférieure à celle de la 2'-désoxyt:hymidine comme le confirme la différence de Tm de S C obtenue (Tableau 4). IV. 2. PARTIE EXPERIMENTALE Méthode Générale pour les expériences d'hybridation A - Dosage des oligomères complémentaires. Afin de réaliser l'expérience d'hybridation, il est nécessaire de connaître la concentration en chaque oligomère pour respecter la stoechiométrie 1:1 entre les deux brins complémentaires. Selon la loi de BEER-LAMBERT A = slc, les absorbances des oligomères ont été mesurées à 80'C afin d'éliminer le phénomène d'empilement des bases créant une perturbation de l'hyperchromicité due à l'existence de structures tertiaires. On peut donc connaitre les coefficients d'extinction moléculaire des dodécamères à 80'C selon la relation #265(SrU12) = 12 s265(rU). B - Conditions d'hybridation. Les expériences d'hybridation sont effectuées avec un spectrophotomètre UVIKON 810 (KONTRON), couplé à un microordinateur IBM compatible. La température est controlée par un programateur de température HUBER PD 415 connecté à un bain thermostaté (HUMER MINISTAT). Les cuves U.V. sont en quartz de 1 cm de long et une circulation continuelle d'azote est utilisée pour les températures inférieures à 20 o C. Avant l'expérience, 3 ssM (Exemples I à V) ou 10 M (Exemples VI et VII) d'oligomères complémentaires sont mis en présence dans une quantité suffisante pour 1000 yl de tampon 1 M NaCI et 10 mM cacodylate de sodium. ajusté à pH 7 (Exemples I à VII).Ce mélange est chauffé à 80'C pendant 1 heure, puis refroidit jusqu'à - 20'C selon une pente de température de 0,5 C par minute. Les valeurs d'absorbance et de température sont collectées toutes les 30 secondes La même expérience est effectuée en utilisant une quantité suffisante pour 1000 tcl de tampon d'hybridation 0,1 M NaCl, 10 mM cacodylate de sodium ajusté à pH 7 afin d'évaluer la stabilité thermique du duplex dans ce tampon favorisant moins les appariements Exemple I:Stabilité thermique du duplex BSrU12 / polyrA I-I Dosage des oligomères Concentration de BSrU12 = 0.351mM Concentration de polyrA = 4,61 mM 1-2 Conditions d 'hybridation 3 zM (8,55 l) de BSrU12 et 3 M (7,79 l) de polyrA sont mis en présence de 983,6 4 des tampons d'hybridation (1 M NaCI, 10 mM cacodylate de sodium ou 0,1 M NaCl, 10 mM cacodylate de sodium) Exemple II: Stabilité thermique du duplex ssrU12 / polyrA en cours Exemple III :Stabilité thermique du duplex ssSrU12 / BdC2A12C2 III-1 Dosage des oligomères Concentration de ssSrU12 = 0,351 mM Concentration de ssdC2A12C2 = 0,369 mM 111-2 Conditions d 'hybridation 3 zM (8,55 l) de BSrU12 et 3 M (8,11 l) de BdC2Al2C2 sont mis en présence de 983,3 l des tampons d'hybridation (1 M NaCI, 10 mM cacodylate de sodium ou 0,1 M NaCI, 10 mM cacodylate de sodium) Exemple IV:: Stabilité thermique du duplex BrU12 / BdC2A12C2 Cen cours) IV-1 Dosage des oligomères Concentration de ssrU12 = Concentration de BdC2A12C2 = 0,369 mM III-2 Conditions d 'hybridation 3 zM ( l) de ssrU12 et 3 M (8,11 l) de ssdC2A12C2 sont mis en présence de 4 des tampons d'hybridation (1 M NaCl, 10 mM cacodylate de sodium ou 0,1 M NaCI, 10 mM cacodylate de sodium) Exemple V:Expérience d'autohybridation de 1' oligomère BSrU12 V-I Dosage des oligomères Concentration de BSrU12 = 0,351 mM V-2 Conditions d 'hybridation 6 iM (17,10 4) de BSrU12 sont mis en présence de 986,9 4 des tampons d'hybridation (1 M NaCl, 10 mM cacodylate de sodium ou 0,1 M NaCl, 10 mM cacodylate de sodium) Exemple VI: Stabilité thermique du duplex ssdT5(SrT)dT6 / ssdC2A12C2 VI-I Dosage des oligomères Concentration de ssdT5(SrT)dT6 = 1,33 mM Concentration de ssdC2A12C2 = 0,369 mM VI-2 Conditions d'hybridation 10yM (7,49,u1) de BdTs(SrT)dT6 et 10 M (22,5 l) de BdC2A12C2 sont mis en présence de 970 l de tampon d'hybridation 1M NaCl, 10 mM cacodylate de sodium. Exemple VII: Stabilité thermique du duplex BdT12 / BdC2A12C2 VII-1 Dosage des oligomères Concentration de BdT12= 1,196 mM Concentration de ssdC2A12C2 = 0,369 mM VII-2 Conditions d'hydridation 10 M (8,36 l) de BdT12 et 10 M (22,5 4) de ssdC2A12C2 sont mis en présence de 969,1 l de tampon d'hybridation 1 M NaCl, 10 mM cacodylate de sodium. t. PRQPRIETES D'HYBRIDATION DES 4'-S-ARN ET OLIGOMERES MIXTES Les expériences d'hybridation sont menées en respectant la stoechiométrie 1/1 entre les deux brins complémentaires en présence d'un tampon 1 M NaCI, 10 mM cacodylate de sodium. Une forte concentration en NaCl favorise en effet les appariements en solvatant les charges négatives autour des atomes de phosphore des deux oligonucléotides.Nous avons aussi effectué ces expériences d'hybridation dans un autre tampon 0,1 M NaCI, 10 mM cacodylate de sodium V-1- RESULTATS ET DISCUSSION Les expériences de fusion des duplex: [4'-SrU3-dT6-4'-SrU3/P11]/polyrA, [4/polyrA] [4'-SrU3-dT6-4'-SrU3/P11]/d(C2A12C2), [4/d(C2A12C2) [4'-SrU3-dT6-4'-SrU3 i P3PS5P3] /polyrA, L5/ polyrA] [4'-SrU3-dT6-4'-SrU3/P3PS5P3]/d(C2A12C2), [5/d(C2A12C2)] sont effectuées à deux concentrations en NaCl et permettent d'évaluer l'influence des liaisons phosphorothioates sur la stabilité d'hybridation comparativement aux oligonucléotides possédant des liaisons phosphodiester normales. NaCl concentration (M) Duplex Tm C 1 4/polyrA 45 1 5/polyrA 36 1 4/d(C2A12 C 31 1 5/2(C2A12C2) 19 0.1 4/polyrA 32 0.1 5/polyrA 24 0.1 4/d(C2A12C2) 10 0.1 5/d(C2A12C2) 3 TABLEAU 3 : Résultats des expériences de fusion. Le dodécamère mixte 5 présentant à la fois des liaisons internucléotidiques de type phosphodiester et phosphorothioates (P3PS5P3) induit une diminution de la valeur du Tm d'environ 2 C par lien phosphorothioate. Par contre, l'oligomère 4 présente des valeurs de Tm qui sont équivalentes à celles obtenues pour le dodécamère ssrSU12 avec les deux séquences complémentaires poly rA et d(C2A12C2). Ces résultats (tableau 3) indiquent que les oligomères de séquence mixte 4 et 5 présentent une bonne stabilité thermique avec des séquences d'ARN complémentaires. V-2) PARTIE EXPERIMENTALE. METHODE GENERALE POUR LES EXPERIENCES D'HYBRIDATION A - Dosage des oligomères complémentaires. Afin de réaliser les expériences d'hybridation, il est nécessaire de connaître la concentration de chaque oligomère pour respecter la stoechiométrie 1/1 entre les deux brins complémentaires. Selon la loi de BEER-LAMBERT A = elc, les absorbances des oligomères ont été mesurées à 80 C afin d'éliminer le phénomène d'empilement des bases créant une perturbation de l'hyperchromicité dûe à l'existence de structures tertiaires. On peut donc connaître les coefficients d'extinction moléculaire des dodécamères à 80 C selon une relation semblable à a265(SrU12) 12 s265(SrU). B - Conditions d'hybnaation. es expériences d'hybridation sont effectuées avec un spectrophotomètre UVIKON 810 (KONTRON), couplé à un microordinateur IBM compatible. La température est controlée par un programmateur de température HUBER PD 415 connecté à un bain thermostaté (HUER MIN1STAT). Les cuves U.V. sont en quartz de 1 cm de long et une circulation continuelle d'azote est utilisée pour les températures inférieures à 20 C, Avant l'expérience, 3 ,uM (Exemples I à IV) d'oligomères complémentaires sont mis en présence dans une quantité suffisante pour 1000 l de tampon 1 M NaCl et 10 mM cacodylate de sodium. ajusté à pH 7 Ce mélange est chauffé à 80 C pendant 1 heure, puis refroidit jusqu'à - 20 C selon une pente de température de 0,5 C par minute. Les valeurs d'absorbance et de température sont collectées toutes les 30 secondes. La même expérience est effectuée en utilisant une quantité suffisante pour 1000 Ill de tampon d'hybridation 0,1 M NaCl, 10 mM cacodylate de sodium ajusté à pH 7 (Exemples I à IV) afin d'évaluer la stabilité thermique du duplex dans ce tampon favorisant moins les appariements. Exemple I : Stabilité thermique du duplex [4'-SrU3-dT6-4'-SrU3 I Plus / polyrA, 4/polyrA I-1 Dosage des oligomères Concentration de 4 = 0.821mM. Concentration de polyrA = 4,61 mM. 1-2 Conditions d'hybridation 3 iiM (3.65 l) de 4 et 3 ,uM (7,79 l) de polyrA sont mis en présence de 988.5 l des tampons d'hybridation (1 M NaCl, 10 mM cacodylate de sodium ou 0,1 M NaCI, 10 mM cacodylate de sodium). Exemple ll : Stabilité thermique du duplex 4'-SrU3-dT6-4'-SrU3 / P11 / dC2A12C2, 4/dC2A12C2. II-I Dosage des oligomères Concentration de 4 = 0.821 mM Concentration de dC2A12C2 = 0,369 mM II-2 Conditions d'hybridation 3 RM (3.65 l) de 4 et 3 M (8,11 l) de dC2A12C2 sont mis en présence de 988.2 l des tampons d'hybridation (1 M NaCl, 10 mM cacodylate de sodium ou 0,1 M NaCI, 10 mM cacodylate de sodium) Exemple m: Stabilité thermique du duplex [4'-SrU3-dT6-4'-SrU3 / P3PS5P31 / polyrA, 5/polyrA. III-I Dosage des oligomères Concentration de 5 = 0.40 mM. Concentration de polyrA = 4,61 mM. 111-2 Conditions d'hybridation 3 M(7.5 l) de 5 et 3 M(7,79 l) de polyrA sont mis en présence de 984.7 l des tampons d'hybridation (1 M NaCl, 10 mM cacodylate de sodium ou 0,1 M NaCl, 10 mM cacodylate de sodium) Exemple IV: Stabilité thermique du duplex [4'-SrU3-dT6-4'-SrU3/P3PS5P3I/dC2A12C2, 5/polyrA. IV-I Dosage des oligomères Concentration de 5 = 0.40 mM. Concentration de dC2A12C2 = 0,369 mM. IV-2 Conditions d'hybridation 3 M (7.5 pl) de 5 et 3 pM (8.11 l) de dC2A12C2 sont mis en présence de 984.4 l des tampons d'hybridation (1 M NaCl, 10 mM cacodylate de sodium ou 0,1 M NaCl, 10 mM cacodylate de sodium). VI- ETUDES ENZYMATIQUES La reconnaissance des acides nucléiques par des enzymes est en majeure partie d'ordre structural. Le remplacement de l'hétéroatome naturel du sucre d'un oligonucléotide confére à celui-çi une forte résistance à la dégradation par les nucléases. L'étude de l'hydrolyse des 4'-thio-oligoribonucléotides B par ces nucléases permet de confirmer que le remplacement de l'oxygène intracyclique par un atome de soufre confère bien une meilleure stabilité enzymatique. Exemple I: Etude de la dégradation enzymatique du dodécamère B(SrT)dT11 par la phosphodiestérase de rate de veau. La phosphodiestérase de rate de veau. est une exonucléase qui dégrade les oligomères à partir de leurs extremités 5' libre libérant ainsi des nucléotides 3' phosphate. Cette étude nous permettra d'évaluer la résistance à la dégradation enzymatique induite par la présence en position 5' d'une unité 4'-thionucléotidique dans l'oligomère B(SrT)dT11 comparativement à la dégradation enzymatique de l'homologue naturel oxygéné 6dT12 La stabilité comparative des deux dodécamères BdT12 et B(SrT)dT11 envers l'hydrolyse par la phosphodiestérase de rate de veau est présentée dans le tableau 5. La différence de comportement entre les deux dodécamères est importante, en effet seulement 23% de l'oligomère B(SrT)dT11 a été hydrolysé en 25 minutes alors que dans le même laps de temps le 12-mer BdT12 a été dégradé à 93 % .Dodécamère Dégradation en 0 min - Dégradation en 25 min BdT12 0% 93% B(SrT)dT11 0% 23 Tableau S Cinétique de dégradation de BdT12 et B(SrT)dT11 par la phosphodiestérase de rate de veau L'évolution au cours du temps de la dégradation enzymatique des deux dodécamères a été suivie par CLHP.Nous avons pu tracer la courbe de digestion enzymatique de B(SrT)dT11 en fonction du temps : A = Ao e-kt (Figure 2, A) où: -Ao est l'aire initiale du 12-mèr -A est l'aire du 12-mer à l'instant t -t est le temps -k est la constante de vitesse de premier ordre de la dégradation Cette courbe (Figure 2) permet de calculer, en utilisant le logiciel de régression curviligne EUREKA, k = 0,.016min~l et le temps de demi-vie du dodécamère egresseion 2/k = 43 min De la même façon, la courbe de digestion enzymatique de BdT12 en fonction du temps : A = An e-kt a pu être tracée. (Schéma 13). On constate que la cinétique de dégradation de ssdT12 est beaucoup plus rapide que celle de B(SrT)dT11; en effet le temps de demi-vie s'établit à 1 minute pour le dodécamère naturel. La cinétique de dégradation enzymatique de l'oligomére modifié B(SrT)dT11 par l'extrémité 5' présente un temps de demi-vie nettement supérieur à celui de la dégradation du BSrU12. Ces résultats montrent que l'introduction d'une unité thio ribonucléotidique à l'extrémité 5' d'un oligomère stabilise ce dernier vis à vis de la phosphodiéstérase de rate de veau. Une solution d'oligonucléotide (20 4, 3 unités d'absorbance à 260 nm) est diluée dans un tampon Acétate d'ammonium 0,125 M (pH 7,0), d'EDTA 2,5mM et de Tween 80 0,0625% (80 L). On ajoute une solution commerciale de phosphodiestérase de rate de veau (2 4, concentration finale 0,008 unité/ml) et le mélange est incubé à 37 C. A des temps déterminés, des fractions aliquotes sont prélevées (5 4), chauffées à 100-C pendant une minute et analysées par CLHP. Conditions d'analyse CLHP. Les analyses ont été effectuées sur une colonne PVDI ( Polyvinylimidazole SFCC-Shandon) protégée par une précolonne et un préfiltre. L'élution est réalisée selon un gradient linéaire en 20 minutes de 0,1 M à 0,4 M KC1 dans 20 mM KH2P04 à pH 6 contenant 20% d'acetonitrile. Le débit était fixé à 1 ml/min et la détection U.V. à 260 nm. EXEMPLE Il Etude des activités de type substrat des hexamères 4'-SrU6, 4'-SrU6-3'n-proOH comparativement aux caractères substrat des hexamères ssrU6 et &alpha;rU6 vis-à-vis de différentes nucléases purifiées. Quatre nucléases typiques ont été utilisées: - L'endonucléase S1, spécifique du simple brin d'ADN hydrolyse les liaisons phosphodiesters de façon aléatoire. - La phosphodiestérase de rate de veau (CSP) est une 5'-exonucléase qui dégrade les oligonucléotides à partir de leur extrémité 5' et libère des nucléotides 3'-phosphates. - La phosphodiestérase de venin de serpent (VSP) est une 3'-exonucléase-3' qui libère des nucléotides 5'-phosphate après avoir dégradé lloligomère par son extrémité 3'. - La ribonucléase A dégrade un oligoribonucléotide après les résidus pyrimidiques. Ces quatre enzymes ont été obtenus auprès de Boehringer Mannheim. De façon générale, une unité de densité optique à 260 nm de chaque hexamère est mis en présence d'une certaine concentration d'enzyme considérée puis est diluée en quantité suffisante pour 1000 l de tampon de digestion enzymatique. Différents tampons de digestion ont été utilisés en fonction de la nature de enzyme (Tableau 4). Concentration finale en Temoins de dinastion Enzyme enzyme (unités d'activité enzymatique/ml) enzymatique CSP 13.10-3 EDTA 0.025 mM pH7 Ac0NH4+0.125 mM Tris, HCI 0.1 N VSP 6.10-4 pH=9.4 MgCl2 0.01 M ~ AcONa 0.05N Si 20 NaCl 0.3 M pH 4.7 ÂcZn 0.1 M NaCI 300mM RNAse A 2.10-2 Tris, HCI 10 mM pH 7.4 EDTA S mM Tableau 4 : Concentrations en enzyme et tampons de digestion utilisés L'échantillon mère est divisé en 10 fractions aliqoutes de 100 l avant d'être congelé à -18 C. Une fraction aliquote de 100 l est prélevée et incubée à l'étuve sèche thermostatée à 37 C pendant un temps t puis est analysée par CLHP analytique. L'étude de l'aire du signal correspondant à l'hexamère permet de mesurer une cinétique de dégradation dont le temps de demi-vie est calculé (Tableau 5) Temps de demie-vie (min) Nuclsseases &alpha;rU6 ssrU6 ssSrU6 ssSrU63'(CH2)3OH 5'-exonucléase Phosphodiestérase de rate de veau * 17 3900 3 '-exonucléase Phosphodiestérase de venin de serpent 110 1 76 250 Endonucléase * 120 930 Ribonucléase * 670 * Aucune dégradation observée après 4 jours d'incubation Tableau 5 :Dégradations enzymatiques. L'hexamère 4'-SrU6, 2 présente une grande résistance enzymatique comparée à celle du rU6 vis à vis de quatre nucléases (CSP, S 1, RNase-A et VSP). La résistance à la 3'-exonucléase est fortement augmentée par l'introduction d'une liaison phosphodiester propanol sur l'extrémité 3' du 4'-SrU6 S'n-prOH, 3. CONCLUSION. Ces études ont montré que: a) les 4'-thio-oligoribonucléotides homogènes ou mixtes, se lient avec une bonne stabilité thermodynamique avec un ARN complémentaire. b) la substitution de l'oxygène cyclique par un atome de soufre induit une forte résistance à la dégradation enzymatique( cf la comparaison des temps de demie-vie de ss-rU6 et 13-S-rU6) L'ensemble de ces données implique que les 4'-thio-oligoribonucléotides peuvent être considérés comme agents antisens sous forme de séquences homogènes ou inclus dans des oligomères mixtes. De plus, la présence de la fonction hydroxyle en 2' permet d'envisager :leur utilisation comme ribozymes artificiels que ce soit sous forme de séquences homogènes ou mixtes associées à des oligonucléotides de type divers ADN ou ARN modifiés ou non au niveau de l'enchainement phosphate. REVENDICATIONS 1. Composés chimiques constitués par un oligo-4'-thio-2'désoxyribonucléotide ou un oligo 4'-thioribonucléotide, caractérisés en ce qu'ils comportent un enchaînement de 4'-thio-2'désoxyribonucléotides ou 4'-thioribonucléotides respectivement, enchaînement pouvant être facultativement lié à un agent effecteur, notamment un radical correspondant à un agent d'intercalation ou un radical chimique ou photoactivable, tel qu'un radical porteur d'une fonction réagissant directement ou indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détection facile et sensible. 2. Composés chimiques selon la revendication 1 constitués par un oligo 4'-thioribonucléotide ou un oligo 4'-thio-2'-désoxyribonucléotide, caractérisés en ce qu'ils comportent un enchaînement de 4-thioribonucléotides ou 4-thio-2'-déoxyribonucléotides respectivement non lié à un radical effecteur. 3. Composés selon la revendication 1 ou 2 caractérisés en ce qu'ils ont pour formule dans laquelle les radicaux B peuvent être identiques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nucléique éventuellement modifiée, activable et/ou comportant un groupement intercalant et rattachée au cycle glycosidique selon une configuration anomérique alpha non naturelle;; les radicaux X peuvent être identiques ou différents et représentent chacun un oxoanion O , un thioanion S , un groupe alkyle, un groupe alcoxy, un groupe thioalkyle, un radical alkyle ou alcoxy substitué par un hétérocycle azoté ou un groupement -Y-Z R et R', qui peuvent être identiques ou différents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement -Y-Z ou Y'-Z' Y et Y' identiques ou différents représentent chacun un radical alcoylène droit ou ramifié -alk- ou un radical choisi parmi avec U = O, S ou N E peut avoir les mêmes significations que X excepté Y-Z ou Y'-Z'; J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy;; Z et Z', identiques ou différents, représentent chacun OH ou un radical correspondant à un agent effecteur, notamment un radical correspondant à un agent d'intercalation ou un radical porteur d'une fonction qui réagit directement ou indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détection facile et sensible. n est un nombre entier y compris 0 L représente un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un groupe -NH-. 4. Composés selon la revendication 3, caractérisés en ce que Y et Y' représentent un radical choisi parmi avec U = O, S ou N et n' est un nombre entier notamment de 1 à 10. 5. Composés selon la revendication 3 caractérisés en ce que L représente l'oxygène, R et R' représentent un atome d'hydrogène et B représente une base nucléique naturelle. 6. Composés selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisés en ce que- l'agent d'intercalation Z ou Z' est choisi parmi les composés polycycliques ayant une configuration plane. 7. Composés selon la revendication 6 caractérisés en ce que l'agent d'intercalation Z ou Z' est choisi parmi l'acridine et ses dérivés, la furocoumarine et ses dérivés, la daunomycine et les autres dérivés de l'anthracycline, la 1,l0-phénanthroline, la phénanthridine et ses dérivés, la proflavine, les porphyrines, les dérivés du dipyrido [1,2-a:3'-d] imidazole, l'elliptîcine ou l'ellipticinium et leurs dérivés et le diazapyrène et des dérivés. 8. Composés selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisés en ce que les groupes chimiques réactifs Z ou Z' sont choisis parmi l'acide éthylène-diamine-tétraacétique, l'acide diéthylènetriaminepentaacétique, les porphyrines, la 1,1 0-phénanthroline, l'azido-4 acétophénone, l'éthylèneimine, la bêta-chloroéthylamine, le psoralène et leurs dérivés. 9. Composés selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisés en ce que le radical B est un radical correspondant à la thymine, l'adénine; la 2-aminoadénine et ses dérivés substitués, la cytosine, la guanine et ses dérivés substitués, l'uracile, le bromo-5 uracile, l'azido-8 adénine, la 7-déazaadénine, la 7-déazaguanine, la 4-azido-cytosine, la 4-azido-thymine et les dérivés de ces bases comportant un groupement intercalant et/ou un groupement chimiquement ou photochimiquement activable. 10. Composés selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisés en ce qu'il s'agit de composés oligothioribonucléotides de formule I pour lesquels J = OH. 11. Composés oligomères mixtes caractérisés en ce que ils sont constitués par des composés selon l'une des revendications 1 à 10 liés à des oligonucléotides de type ADN ou ARN modifiés ou non au niveau de l'enchaînement phosphate et dans lesquels l'hétéroatome intracyclique du cycle furannose des nucléotides est l'oxygène. 12. Composés oligomères mixtes caractérisés en ce que ils sont constitués par un composé selon l'une des revendications 1 à 10, notamment de formule (I), comprenant, à une ou à chacune de ses extrémités, une séquence oligonucléotidique de type ADN ou ARN modifiée ou non au niveau de l'enchaînement phosphate, dans lequel l'hétéroatome du cycle furannose des nucléotides est l'oxygène. 13. Composés oligomères mixtes selon la revendication 12 caractérisés en ce que ils sont constitués par un composé oligothioribonucléotidique selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant une séquence de type ADN modifiée ou non au niveau de l'enchaînement phosphate dans les nucléotides de laquelle l'hétéroatome du cycle furannose des nucléotides est l'oxygène. 14. Composé oligomère mixte selon la revendication 13, caractérisé en ce que la dite séquence d'ADN, dans laquelle l'hétéroatome du cycle furannose est l'oxygène, est encadré par deux séquences du type thioribonucléotidique. 15. Procédé de préparation de composés selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'on applique des synthèses au phosphodiester, phosphotriester, phosphoramidite ou hydrogénophosphonate en utilisant des 4thionucléosides pour des séquences oligothionucléotidiques et en ce que l'on prépare les dérivés totalement protégés et que l'on élimine les groupements protecteurs. 16. Procédé de synthèse des composés sans agent effecteur selon l'une des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que, pour préparer les séquences oligothionucléotidiques, on réalise une synthèse supportée selon la méthode au phospohoroamidite comportant - une protection en 3' et 5' des 4'thionucléotides ou oligo-4'thionucléotides de départ avec par exemple du diméthoxytrityl en 5' et du diisopropyla minophosphoramidite de méthyle en 3', - la fonctionnalisation d'un support solide incorporant un dérivé 4'thio nucléosidique par un lien par exemple succinyle entre le groupement hydroxyle-3' du dérivé 4'thionucléosidique et un groupement amino du support solide, - l'élongation de la chaîne oligothionucléotidique dans un réacteur synthétiseur, - enfin le décrochage, la déprotection et la purification de l'oligothio- nucléotide prolongé. 17. Procédé de synthèse de composés incorporant un agent effecteur selon l'une des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que l'on part d'un oligothionucléotide sans agent effecteur, ou oligomère mixte en comprenant, protégé en 5', dont on fait réagir la terminaison OH 3' avec une fonction non protégée d'un bras difonctionnel dont la deuxième fonction est protégée et après déprotection du produit résultant, on lie ledit produit à l'agent effecteur par la deuxième fonction libre du bras difonctionnel. 18. Application des composés selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que lesdits composés sont utilisés à titre de sondes d'hybridation ou comme composants de purification pour des séquences détérminées d'ADN ou d'ARN en simple brin ou en double hélice dans un but diagnostique ou pronostique. 19. Application des composés selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que les composés sont utilisés pour détecter des mutations au niveau d'un ADN ou d'un ARN. 20. Application des composés selon l'une des revendications à 13, caractérisée en ce que ces composés sont utilisés pour réaliser le blocage spécifique de gènes cellulaires ou d'agents pathogènes préalablement choisis, tels que des virus, bactéries ou des parasites. 21. Application d'un dérivé selon l'une des revendications l à 13 pour bloquer sélectivement l'expression d'un gène soit par hybridation, soit par coupure sélective, soit par modification chimique du gène ou de son ARN messager d'origine cellulaire, virale, bactérienne ou parasitaire. 22. Application d'un dérivé selon l'une des revendications 1 à 13 pour bloquer sélectivement l'expression d'un ARN viral soit par hybridation, soit par coupure, soit par modification chimique de L'ART viral ou de sont ARN messager. 23. Application des composés selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'ils sont utilisables à titre de nucléases artificielles spécifiques de séquences ou ribozyme artificielle. 24. A titre de médicaments, des composés selon l'une des revendications 1 à 13, utilisables comme antiviraux, antitumoraux, antibiotiques ou antiparasitaires ou dans toute pathologie où un gène est anormalement exprimé soit par mutation, soit par dérégulation.