FR 2683725 A1 19930521 FR 9114119 A 19911115 La présente invention a pour objet une composition cellulaire pour le traitement des organismes humains ou animaux I1 a été établi très récemment , par diverses équipes scientifiques/ que l'injection localisée dans des organismes, atteints par une tumeur, de cellules tumorales syngéniques produisant une interleukine permettait le rejet de ces tumeurs par l'organisme Ceci a été mis en évidence pour l'interleukine-2 par Bubenik et al. ( Immunology Letters, 19 , 279-282, 1988 ; Immunology Letters, 23 , 287-292, 1989 ) et confirmé par Fearon et al. (Cell., 60, 397-403, 1990 ) et par Ley et al.,(European Journal of Immunology 1991, 21 : 851-854; Res. Immunol., 1990, 141:855-863 Les auteurs de ces articles mentionnent que le rejet s'accompagne d'une mémorisation de la réponse . L'animal est ainsi vacciné contre le développement ultérieur d'une tumeur d'un même type , même si celle-ci a été greffée sur un site différent Des cellules cancéreuses syngéniques produisant l'interleukine-4 ont aussi été testées avec des résultats identiques , comme le rapportent Golumbek ( Science , 254 713 - 716 , 1991 ) et Tepper et al. (Cell , 57,503-512, 1989) ainsi que des cellules produisant le facteur de névrose des tumeurs (TNF) comme le décrit Blankenstein et al. (J. Exp. Med., 173, 1047-1052, 1991). Les systemes décrits dans ces publications présentent néanmoins des inconvénients en vue d'une utilisation en thérapie humaine . En effet, dans toutes ces publications , les' cellules produisant les interleukines sont des cellules de l'individu ou d'un individu syngénique , qui ont été modifiées afin qu'elles expriment l'interleukine Dans le cas d'une thérapie humaine , l'inconvénient majeur de cette méthodologie réside dans le fait que les cellules exprimant l'interleukine et injectées à l'organisme risquent de continuer à se développer même après le rejet de la tumeur Un deuxième inconvénient des techniques décrites dans l'art antérieur réside dans le mode d'insertion de 1'ADN codant pour les interleukines Ces méthqdes présentent une bonne efficacité d'intégration de l'ADN mais du fait de l'utilisation de rétrovirus peuvent présenter de graves inconvénients dans le cadre d'une thérapie humaine Elles nécessitent de plus une sélection rigoureuse des transfectants sur une longue période de temps et de ce fait ne peuvent être appliquées sur une large échelle en thérapie humaine notamment I1 n'existe donc pas à la connaissance des demandeurs dans l'art antérieur de techniques fiables faciles à mettre en oeuvre , et compatibles avec les impératifs de santé humaine , permettant de traiter les tumeurs ou affections cancéreuses par des cellules synthétisant des interleukines Le problème principal réside dans une possible survie et un possible développement dans l'organisme traité des cellules injectées codant pour les interleukines Les demandeurs se sont donc attachés à la mise en oeuvre de compositions permettant de traiter de manière transitoire des organismes humains ou animaux par des substances biologiquement actives et ne présentant pas les inconvénients précités Ils ont mis en évidence de manière surprenante que 1'on pouvait utiliser des cellules non syngéniques , et notamment ces cellules allogéniques produisant des substances biologiquement actives pour traiter lesdits organismes . Ils ont ainsi montré en particulier que l'utilisation de cellules non syngéniques permettait une production transitoire d'interleukine dans lesdits organismes De manière tout aussi surprenante , ils ont en outre trouvé que l'on pouvait renforcer le caractère transitoire de la production desdites substances biologiquement actives par une transfection par l'ADN portant les gènes codant pour ces substances sans sélection ultérieure des cellules à injecter La présente invention a donc pour objet une composition destinée à traiter les organismes humains ou animaux, comprenant des cellules exprimant des gènes leur permettant de produire in vivo une ou plusieurs substances biologiquement actives caractérisée en ce que lesdites cellules présentent des caractéristiques génétiques les empêchant de se développer durablement dans l'organisme traité et les rendant susceptibles d'être éliminées artificiellement ou naturellement de l'organisme. Ces substances biologiquement actives peuvent notamment être destinées à traiter de manière transitoire des organismes atteints par une tumeur ou une affection cancéreuse auquel cas lesdites substances peuvent etre des interleukines. Les cellules seront alors choisies de manière à être éliminées après la disparition ou la régression de la tumeur ou de l'affection cancéreuse Ces substances peuvent aussi être des antigènes susceptibles d'induire une réaction immunitaire de type humorale ou cellulaire , tels que par exemple l'antigène HbS décrit dans le brevet français 80.09.041 , un fragment de la glycoprotéine d'enveloppe du virus HIV ou tout autre antigène d'origine virale ou bactérienne, des hormones , des facteurs de croissance ou leurs fragments. Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel de l'invention , les cellules sont choisies afin que les organismes traités possèdent un systeme immunitaire permettant leur élimination . Ainsi , les cellules seront non syngéniques, et préférentiellement allogéniques. Elles pourront néanmoins être aussi xénogéniques , bien que ce type de cellules puisse présenter l'inconvénient d'être rejetées trop rapidement et de ne pas produire une quantité suffisante de substances Mais il est aussi possible , de les modifier pour les faire exprimer des antigènes caractéristiques des cellules humaines , par exemple des antigènes HLA de classe I et leur conférer des caractéristiques équivalentes à celles des cellules allogéniques Une lignée cellulaire particulièrement adaptée est la lignée VERO issue d'une espèce de singe . En effet , ces cellules présentent l'avantage d'avoir été étudiées et utilisées par de nombreuses équipes (voir notamment VERO cells; Origin, Properties and Biomedical Applications, Bunsiti Simizu et Toyozo Terasima, publié par le Département de Microbiologie de l'Ecole de Médecine de l'Université de Chiba, Japon) . Ainsi , leur génétique est assez bien connue ce qui permet de réduire les risques d'infection dues à des rétrovirus Ceci est particulièrement avantageux dans le cadre d'une thérapie humaine Les cellules de la composition selon l'invention peuvent aussi être sensibles à une drogue , ce qui permet ainsi leur élimination par introduction de ladite drogue dans l'organisme . Une telle drogue peut être la gancyclovine à laquelle sont sensibles les cellules portant le gène de la thymidine kinase du virus de ltherpès. Lesdits immunomodulateurs peuvent être notamment 1'IL-2 , 1'IL-4, le TNF ( Tumor Necrosis Factor) et/ou l'interféron gamma Les cellules peuvent produire seules ou en combinaison ces substances . De manière préférentielle , ces substances sont produites en quantités synergique Avantageusement , une telle composition produit l'IL-2 et l'IL-4 en quantité synergique En outre, les cellules de cette composition peuvent porter un marqueur de coloration aisément identifiable . I1 peut s'agir par exemple d'un gène codant pour la luciférase ou la ss-galactosidase . Afin de renforcer le caractère transitoire de l'expression des substances biologiquement actives et en particulier des immunomodulateurs dans les organismes t'raités, les gènes permettant aux cellules de produire ces substances peuvent être introduits dans les cellules par transfection et notamment par transfection sans sélection ultérieure de transfectant stable On obtient un pool de cellules composé en maJeure partie de cellules transfectées par l'ADN dans lesquelles celui-ci ne s'est pas intégré . De cette manière , les gènes et en particulier ceux codant pour les interleukines s'expriment mais leur ADN correspondant est éliminé rapidement au cours des cycles de division . Ceci permet de renforcer le caractère transitoire de l'expression des substances dans les organismes traités La transfection consiste en l'introduction d'ADN nu dans des cellules . Il s'agit d'une technique connue en soi et notamment décrite dans le Manuel Technique de Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 ). On pourra notamment utiliser la précipitation au phosphate de calcium , l'électroporation et occasionnellement des préparations de liposomes telles que la préparation commerciale Lipofectin Reagent (Bethesda Research Laboratories, Lifte Technologies , Inc.). Cette transfection sans sélection ultérieure permet d'éviter les longues étapes de sélection des transfectants stables Les gènes portant les immunomodulateurs peuvent être obtenus par clonage , à partir d'ADN cellulaire notamment , ou par synthèse . On pourra notamment employer pour l'IL-2 et l'IL-4 les préparations d'ADN décrites dans Karasuyama et al. (Eur. J. Immunol. 1988,18:97). De plus , les cellules utilisées dans la composition selon 1'invention peuvent posséder des gènes leur permettant de produire des antigènes spécifiques de la tumeur ou de l'affection cancéreuse à traiter , afin d'accroître la réaction de l'organisme vis-à-vis de ces antigènes. L'introduction de quantités supplémentaires d'antigène tumoral peut être aussi effectuee par addition aux cellules produisant les interleukines d'antigène synthétisé par voie chimique. La composition selon l'invention peut comprendre plusieurs types cellulaires , chaque type cellulaire exprimant un immunomodulateur , ou être constituée d'un même type cellulaire produisant un ou plusieurs immunomodulateurs Pour les raisons de simplicite de mise en oeuvre il peut ainsi être intéressant de préparer des lignées cellulaires qui n'expriment qu'une seule interleukine Toutefois , il peut aussi être avantageux que des mêmes cellules produisent des associations d'interleukine En outre , la présente invention concerne l'utilisation des cellules ainsi définies pour la fabrication d'un médicament pour le traitement d'organismes humains ou animaux atteints par une tumeur ou une affection cancéreuse ainsi que des médicaments ou des vaccins contenant lesdites cellules On notera de plus , que de telles compositions sont destinées préférentiellement à être utilisées sous la forme d'injections localis oes , mais peuvent aussi être utilisées de manière systemique Les quant tés d'interleukines produites par ces cellules doivent être modulées en fonction du type de tumeur A titre d'exemple , une expression de l'ordre de 1000 unités internationales d'IL-2 / mil/106 cellules est efficace Néanmoins , pour des tumeurs à croissance lente des doses plus faibles peuvent être efficaces Les présentes compositions sont préférentiellement utilisées dans le traitement de tumeurs solides mais peuvent être utilisées dans le traitement de tout autre type de tumeur ou affection cancéreuse La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples de mise en oeuvre suivants dans lesquels - la figure 1 est un diagramme représentant l'évolution du pourcentage de survie des souris en fonction du nombre de jours après le traitement par diverses compositions de cellules produisant de 1'interleukine-2. - les figures 2A à 2C représentent l'évolution du taux de survie des souris en présence de diverses proportions de cellules produisant respectivement de l'IL-2 ( figure 2A) de l'IL-4 (figure 2B) et de l'IL-2 et de l'IL-4 (figure 2C). - les figures 3A à 3E sont des courbes illustrant l'évolution de la croissance de cellules tumorales en l'absence de cellules allogéniques ( figure 3A ) en présence de cellules allogéniques ne synthétisant pas 1'IL-2 ( figures 3B et 3C ) et en présence de cellules allogéniques produisant de 1'interleukine-2 ( figures 3D et 3E ). Les figures 4A à 4I montrent l'effet de cellules secrétant des interleukines sur le rejet de tumeurs de Lewis fraîchement implantées .La figure 4A est un témoin sans injection d'aucune cellule . Les figures 4B à 4D correspondent à l'injection de doses croissantes de cellules P815 nontransfectées . Les figures 4E à 4G correspondent à l'injection de cellules P815 produisant de l'IL-2 tandis que les figures 4E et 41 correspondent à l'injection de cellules P815 synthétisant respectivement 1'IL-4 et une combinaison de cellules synthétisant l'IL-2 et 1'IL-4 EXEMPLE 1- Effet dans un système syngénicrue de cellules P815 produisant de 1'IL-2 sur la croissance de cellules tumorales P815 dans les souris DBA/2. Les plasmides utilisés pour transfecter les cellules ont été décrits par Karasuyama et al. (précédemment cités ). La souche P815 ainsi que la souche P815 ( IL-2) sont décrites par Ley et al. ( European Journal of Immunology 1991, 21, 851-854) . Cette souche cellulaire possède 1'haplotype H-2d comme la souche de souris DBA/2. Les transfections par l'ADN plasmidique ont été effectuées par précipitation au phosphate de calcium (Maniatis et al., précédemment cités) Les animaux ont été conservés dans les animaleries selon les procédés standards et sacrifiés quand les tumeurs ont atteint des volumes importants afin d'éviter toute souffrance inutile Le clone P815 (IL-2) utilisé exprime 3500 unités/ml/l06 cellule/jour, comme déterminé par le test CTLL (Baker et al. J. Exp. Med., 149; 273, 1979). Des quantités équivalentes de cellules ont été injectées dans différents animaux avec des proportions de P815 ( IL-2 ) par rapport au P815 variants de 25% à 1,5 %. La figure 1 montre que l'on obtient une protection totale ( 100% survie des souris ) avec 25% de cellules P815 (IL-2 ) pour un total de 5.106 cellules injectées par voie sous-cutané . On obtient une protection à peu près totale avec 12,5 % tandis que pour des proportions plus faibles ( 6%, 3% et 1,5 %) , la croissance tumorale bien que retardée entraîne néanmoins la mort des animaux Sur cette figure , le temps en abscisse est exprimé en jour , l'ordonnée représentant le pourcentage de survie des souris En utilisant un clone de P815 ( IL-2 ) exprimant dix fois moins d'IL-2 ( 350 unités/ml/106 cellules/j) , on observe qu'une proportion plus importante de cellules P815 ( IL-2 est nécessaire pour obtenir le rejet En conséquence , une production locale relativement importante d'IL-2 est nécessaire pour conférer une protection. EXEMPLE 2 Effet svneraioue de cellules produisant de 1'IL-2 et de 1'IL-4 sur le reiet de tumeurs dans un système syngénicue. Un clone de P815 ( IL-4 ) exprimant environ 5000 unités/ml/l06 cellules/jour comme détermine par le test CTLL a été isolé On a ensuite testé l'effet de cellules P815 ( IL-2 seules ( figure 2A ) de cellules P815 ( IL-4 ) seules ( figure 2B ) et de mélanges en même quantité de cellules P815 ( IL-2 et P815 ( IL-4 ) ( figure 2 C Les figures 2A et 2B montrent que 12% de cellules transfectées suffisent pour obtenir une protection quasitotale , de l'ordre de 80%. Avec seulement 3% de cellules transfectées on observe plus de protection. Les résultats de la figure 2C montrent quant à eux que liron observe une protection totale pour une proportion de 12% de cellules P815 ( IL-2 ) et P815 ( IL-4 ) soit pour une quantité de 6% de cellules P815 ( IL-2 ) et 6% de cellules P815 ( IL-4 ) . Pour une proportion totale de 6% du mélange (3% de P815 ( IL-2 ) et 3% de P815 (IL-4) ) on obtient une protection à peu près totale Même avec une proportion totale de 1% de cellules P815 ( IL-2 ) et P815 ( IL-4 ) c'est-à-dire 0,5% de chaque type cellulaire un rejet assez significatif est observé. On peut donc conclure par comparaison avec les essais effectués en présence de P815 ( IL-2 ) ou de P815 ( IL4 ) seules que l'association de ces cellules présentent un effet synergique EXEMPLE 3 Utilisation de cellules allopénicues produisant de 1'IL-2 . Des cellules L transformées d'haplotype H-2k exprimant 111L-2 et appelées LMI (IL-2 ) ont été isolées La lignée cellulaire LMI de souris exprime la molécule d'adhésion ICAM-l et est dérivée des cellules L (décrites dans le brevet français 80.09.041). La lignée LMI a été décrite par Christian JAULIN ("Analyse structurale et fonctionnelle des antigènes d'histocompatibilité de classe I , Thèse de doctorat de l'Université Paris XI , 1991 On injecte à des souris DBA/2 d'haplotype H-2d un mélange de 5.105 cellules P815 et de 106 ou de 5.106 cellules LMI ( IL-2 ) . Les figures 3A à 3E illustrent les résultats obtenus. Ces figures montrent que les cellules allogéniques LMI exprimant 1'IL-2 confèrent une protection supérieure visà-vis de la croissance des cellules P815 co-injectées à celles conférées par des cellules~LMI n'exprimant pas 1'IL-2. Les conditions opératoires des figures 3A à 3E sont les suivantes: Figure 3A 5.105 cellules P815, Figure 3B 5.105 P815 + 106 cellules L Figure 3C 5.105 cellules P815 + 5.106 cellules L, Figure 3D 5.105 cellules P815 + 106 cellules LMI (IL-2) Figure 3E 5.105 cellules P815 + 5.106 cellules LMI (IL-2 Sur les cinq souris correspondant à la figure 3D deux sont totalement protégées , une développe une tumeur très tardivement tandis que les deux dernières font des tumeurs rapidement Dans les conditions opératoires de la figure 3E une seule souris fait une tumeur rapidement les quatre autres étant totalement protégées Sur les figures 3A à 3E , les chiffres indiqués en abscisse correspondent au nombre de jour après injection, tandis que l'ordonnée indique le volume de la tumeur en cm3. EXEMPLE 4 Effet de cellules alloqéniaues produisant des Interleukines à l'encontre de tumeurs de Lewis 5.105 cellules isolées de tumeurs de Lewis fralchement implantés ( haplotype H-2b ) mélangées avec différentes quantités de P815 ( IL-2 ) ou de P815 ( IL-4 sont injectées à des souris C57/B16 (haplotype H-2b). Les cellules P815 sont d'haplotype H2d. Les figures 4A à 41 sont réalisées dans les conditions suivantes Figure 4A 5.105 cellules de Lewis Figure 4B 5.105 cellules de Lewis + 5.1O5 cellules P815 Figure 4C 5.105 cellules de Lewis + .106 cellules P815 , Figure 4D 5.105 cellules de Lewis + 2.106 P815, Figure 4E 5 105 cellules de Lewis + 5.105 P815 (IL2) Figure 4F 5.105 cellules de Lewis + ,106 P815 (IL2), Figure 4G 5.105 cellules de Lewis + 2.106 P815 (IL2), Figure 4H 5.105 cellules de Lewis + 106 P815 (IL-4), Figure 41 5.105 cellules de Lewis + 5.1O5 P815 (IL2) + 5.105 P815 (IL-4) Sur ces figures , l'abscisse indique que le nombre de jour après le traitement et l'ordonnée indique le volume des tumeurs exprimé en mm3 Ces résultats montrent donc que les cellules P815 (IL-2) confèrent une haute et reproductible protection tandis que les cellules P815 non transfectées ne confèrent pas ce type de protection Les cellules P815 IL-4 ( figure 4H) confèrent aussi une protection bien que plus faible que celle conférée par les P815 ( IL-2 ) On observe par contre pas de synergie entre l'effet des P815 ( IL-2 ) et l'effet des P815 ( IL-4) (figure 41 mais au contraire un effet plutôt antagoniste En conclusion , l'ensemble de ces résultats a permis de montrer - que la thérapie par des cellules exprimant des gènes d'interleukines est possible pour des tumeurs spontanées, et non seulement pour des tumeurs induites chimiquement comme e décrit dans l'art antérieur - l'utilisation de cellules allogéniques est possible et permet le rejet des tumeurs - il est possible par transfection sans sélection, de cellules ou transfection transitoire, d'obtenir une synthèse d'interleukine suffisante pour permettre le rejet de tumeurs - la délivrance par expression transitoire d'une substance biologiquement active est possible , ainsi que - l'utilisation de cellules allogéniques comme porteur d'un antigène étranger à l'hôte susceptible d'induire une reaction immunitaire de type humorale ou cellulaire REVENDICATIONS 1. Composition destinée à traiter les organismes humains ou animaux comprenant des cellules exprimant des gènes leur permettant de produire in vivo une ou plusieurs substances biologiquement actives, caractérisée en ce que lesdites cellules présentent des caractéristiques génétiques les empêchant de se développer durablement dans l'organisme traité et les rendant susceptibles d'être éliminées artificiellement ou naturellement de l'organisme 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les cellules sont telles que les organismes traités possèdent un système immunitaire permettant leur élimination 3. Composition selon l'une des revendications 1 et 2, destinée à traiter les organismes atteints par une affection cancéreuse ou une tumeur, caractérisée en ce que lesdites substances biologiquement actives sont des immunomodulateurs. 4. Composition selon la revendication 3 , caractérisée en ce que les cellules présentent des caractéristiques génétiques les rendant susceptibles d'être éliminées après la disparition ou la régression de la tumeur ou de l'affection cancéreuse 5. Composition selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisée en ce que lesdits immunomodulateurs sont 1'IL-2, 1'IL-4, le TNF et/ou l'interféron gamma 6. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que les cellules sont allogéniques ou xénogéniques pour les organismes traités . 7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que les cellules sont sensibles à une drogue et sont éliminées par introduction de ladite drogue dans l'organisme 8. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite substance est la gancyclovine , auquel cas les cellules portent le gène de la thymidine-kinase du virus de l'herpès. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications 3 à 8 , caractérisée en ce que lesdites cellules produisent en quantités synergiques les immunomodulateurs. 10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que les cellules produisent 1IL-2 et 1'IL4 en quantités synergiques 11. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 , caractérisée en ce que les cellules portent un marqueur de coloration. 12. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisée en ce que les gènes ont été introduits dans les cellules par transfection. 13. Composition selon l'une quelconque des revendications 3 à 12 , caractérisée en ce que les cellules possèdent de plus des gènes leur permettant de produire des antigènes spécifiques de la tumeur ou de l'affection cancéreuse à traiter 14 . Composition selon l'une quelconque des revendications 3 à 13 , caractérisée en ce que les cellules sont composées de plusieurs types cellulaires produisant chacun un ou plusieurs immunomodulateurs et/ou un antigène spécifique de la tumeur à traiter. 15. Composition selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que lesdites substances sont des antigenes susceptibles d'induire une réaction immunitaire de type humorale ou cellulaire. 16. Utilisation des cellules définies dans l'une des revendications 3 à 14 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement d'organismes humains ou animaux atteints par une tumeur ou une affection cancéreuse 17. Médicament ou vaccin contenant des cellules définies dans l'une des revendications 1 à 15