FR 2679921 A1 19930205 FR 9109652 A 19910730 La présente invention concerne un procédé permettant d'obtenir une souche bactérienne assurant l'expression d'une séquence codante déterminée, en particulier dans une bactérie du type corynébactérie. Parmi les problèmes qui se posent lors de la production de polypeptides et/ou de protéines par des techniques utilisant les ADN recombinants, il faut citer les difficultés liées à la construction des systèmes d'expression, notamment la formation de constructions non conformes - présence de séquences codantes inversées, - présence de séquences dupliquées non souhaitées, - présence de séquences étrangères par exemple. C'est pourquoi, la présente invention concerne plus particulièrement un procédé permettant d'éviter ce type d'inconvénient et présentant, en outre, des avantages qui seront énoncés dans le cours de la présente description. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé, permettant d'obtenir une souche bactérienne assurant l'expression d'une séquence codante déterminée, du type mettant en oeuvre un plasmide réplicatif ou non comportant les éléments permettant l'expression de ladite séquence dans ladite souche, caractérisé en ce que - ledit plasmide comporte au moins un gène marqueur sous le contrôle des éléments d'expression de ladite séquence et qui est séparé de ceux-ci par un site de restriction BstXI non palindromique, - en ce que ladite séquence codante déterminée est insérée dans le site BstXI, - en ce que le plasmide ainsi obtenu est utilisé pour transformer ladite souche, et - en ce que l'on sélectionne les souches transformées par le plasmide. L'élément clé du procédé selon la présente invention est l'utilisation du site de restriction BstXI. Ce site présente la structure suivante CCANNNNNNTGG les lettres N représentant un nucléotide quelconque. Cette séquence permet donc le choix d'une séquence nucléotidique intermédiaire de 6 N qui soit non palindromique, c'est-à-dire non identique à sa séquence complémentaire, et, comme cela sera vu dans la suite, permet également la création d'un codon de départ à l'extrémité 5' de la séquence codante et d'un codon ATG à l'extrémité 3' de la séquence codante. Cette séquence permet également de choisir avantageusement la nature du deuxième codon en relation avec la séquence codante choisie et du dernier codon de la séquence codante. Ce dernier codon peut être un codon stop ; dans ce cas, la construction utilisant le gène marqueur est réalisée dans une souche d'E. coli possédant un suppresseur du codon stop correspondant. La possibilité d'utiliser un site de restriction non palindromique du type Bst XI permet d'utiliser un ADN double brin contenant la séquence codante déterminée, avec deux extrémités 3' débordantes différentes et, dans ces conditions, d'avoir une insertion de la séquence codante toujours dans le bon sens, ce qui constitue un avantage très important pour la séquence des acides aminés du peptide produit lorsque l'on réalise ce type de construction. En outre, le site BstXI devra présenter, de préférence, la structure: CCATGXXX3' débordant à l'extrémité 5' de la séquence codante, ladite séquence codante sous forme d'ADN double brin étant alors insérée par l'une de ses extrémités 3' débordantes complémentaire c'est à dire 3'CYYY(X et Y étant des bases complémentaires). Le codon ATG est le codon de départ de la traduction de cette séquence. Il est ainsi possible de contrôler parfaitement la construction du plasmide et d'éviter la présence de séquences indésirables. Enfin, lors de l'insertion de la séquence codante dans BstXI ce site est détruit, il est alors possible de contrôler facilement les constructions en effectuant une digestion par BstXI, seuls les plasmides non digérés ont intégré la séquence. Bien que ces constructions puissent être appliquées à d'autres espèces bactériennes, elles seront ci-après plus particulièrement décrites dans le cadre de plasmides destinés à la transformation de corynébactéries. I1 doit être entendu que par "corynébactérie" on désigne non seulement les Corynebacteriums, mais également les bactéries apparentées telles que Brevibacterium. Les éléments d'expression de ladite séquence comportent essentiellement un promoteur et un site de fixation des ribosomes. Parmi les éléments d'expression utilisables dans les corynébactéries, on utilisera plus particulièrement le promoteur Ptac qui est un promoteur fort, hybride trp/lac, inductible par IPTG et qui se révèle fonctionnel chez les corynébactéries comme chez E. coli. Mais il est possible d'utiliser d'autres promoteurs, par exemple, comme cela sera décrit ci-après, des promoteurs de gène de structure de corynébactérie, par exemple le promoteur de la gdhA. Les éléments d'expression peuvent également comporter des séquences d'ADN assurant la régulation de l'expression des gènes en aval. Parmi les éléments assurant une bonne expression il faut prévoir de pouvoir placer à la fin de la séquence codante un élément d'arrêt de traduction, sous forme d'un ou plusieurs codons stop, la construction est alors sélectionnée dans une souche de E. coli possédant un suppresseur de codon stop correspondant. On peut également prévoir de placer en aval de BstXI un élément d'arrêt de transcription. Les séquences codantes utilisées peuvent, bien entendu, être des séquences codant pour l'expression d'amino acides, de peptides, de polypeptides ou de protéines et comporter, en outre, des éléments assurant l'expression et la sécrétion de ces différents produits par les corynébactéries. La séquence codante pourra être naturelle, synthétique ou mixte. Dans le cas d'une séquence synthétique, le choix de la séquence codante permet la constitution - d'une séquence d'acides aminés quelconque - d'une séquence d'acides aminés répétitive à n répétitions du type (aa 1 ...... aax) n; - d'une séquence répétitive contenant en position COOHterminale aa x un acide aminé chargé positivement ou négativement.Cet acide aminé peut permettre d'améliorer l'expression génétique mais permet avantageusement (i) d'isoler le polypeptide du fait de son caractère ionique marqué (ii) de cliver par protéase spécifique le polypeptide en unité (aal aal) de base (iii) d'enlever si nécessaire l'acide aminé terminal aax par des carboxy peptidases spécifiques - d'une séquence répétitive contenant en portion NH2 ou COOH terminale aal ou axa un acide aminé conférant un avantage désiré. Dans l'exemple, la séquence exprimée code pour un polypeptide de structure (ala-gln)20. La séquence ala gln peut être libérée par traitement enzymatique ultérieur. On peut prévoir d'autres polymères de ce type tels que Ala-Gln-Tyr ou Ala-Gln-Lys ou Ala-Gln-Met qui peuvent être libérés par traitement enzymatique ou chimique. Le choix des codons de la séquence codante peut influencer l'expression dans les corynébactéries, il convient de préférence de prévoir une séquence ayant une richesse en GC de l'ordre de 50 à 60 %. Dans le cas de l'exemple la séquence codant pour (AQ)20 est CCX CAG avec X = A ou T ou C ou G, en effet si aucun des codons n'est préféré pour l'alanine, par contre le codon CAG est très nettement préféré pour la glutamine. Dans ce cas, le pourcentage de CC est de l'ordre de 75 %, ce qui peut constituer une limitation, c'est pourquoi on envisage l'utilisation de polymères comportant 3 amino-acides dont le troisième est riche en A et T pour ramener le pourcentage à 55 %. Tyr et Lys ou Met possèdent deux A ou T dans les deux premières bases de leur codon et permettent donc de faire descendre le pourcentage en GC de 75 % à environ 60 %, ce qui devient plus proche du pourcentage en GC trouvé chez les corynébactéries. D'autres part, bien sûr, l'intérêt industriel pour ces deux acides aminés en position COOH-terminal de Glutamine (Q) a été considéré et existe. Dans le cadre de la présente invention, il faut citer également l'expression de gènes tels que la gdhA tel qu'il est représenté à la figure 1, du codon de départ au codon stop. Les signaux d'expression de ce gene tels que représentés peuvent être également utilisés pour la réalisation de cassettes d'expression, notamment du type décrit précédemment. Les plasmides mis en oeuvre peuvent être des plasmides réplicatifs, c'est-à-dire comporter une origine de réplication dans les corynébactéries, par exemple l'origine de réplication pBLl. Ils pourront également comporter des origines de réplication fonctionnelles dans d'autres bactéries, notamment dans E. coli, afin de faciliter la construction des plasmides en cause. I1 est également possible de prévoir des plasmides non réplicatifs chez corynébactéries mais comportant des séquences homologues chromosomiques permettant l'intégration de ces séquences dans le chromosome de corynébactéries. Le gène marqueur peut être, bien entendu, de type très varié pour autant qu'il soit fonctionnel chez corynébactérie, il pourrait s'agir d'un gène de sélection positif ou négatif tel qu'une résistance spécifique, néanmoins dans l'état actuel des recherches ces gènes ne sont pas aisément disponibles. On utilisera donc de préférence le gène EGA de la cellulase de C. thermocellum (celA) qui confère le phénotype Cmc+, mais il est possible d'utiliser d'autres gènes marqueurs, notamment lacZ. Dans le cas où le gène marqueur est celA, les bactéries transformées sont sélectionnées pour le caractère Cmc+ et après insertion de la séquence codante dans BstXI par analyse de restriction avec BstXI comme indiqué précédemment. Dans le procédé selon l'invention, on prévoiera que le gène marqueur puisse être facilement éliminé après vérification de la construction notamment en plaçant des sites de restriction entre le gène marqueur et la séquence codante. La présente invention concerne également des cassettes d'expression comportant tout ou partie des signaux d'expression de la gdhA, ou tout ou partie de la gdhA telle que représentée à la figure 1, ainsi que les souches exprimant ce type de cassettes, notamment les souches de corynébactéries. Les souches bactériennes, notamment de corynébactéries, obtenues font également partie de la présente invention et pourront être utilisées dans le cadre de procédés permettant l'expression et la sécrétion des peptides, des polypeptides et/ou des protéines par des procédés de fermentation qui sont connus et sans qu'il soit nécessaire de revenir en détail sur les conditions de ces différentes étapes. La transformation des corynébactéries par des plasmides est réalisée de préférence par électroporation (Bonamy C., Guyonvarch A., Reyes O., David F. and Leblon G. (1990) FEMS Microbiology Letters 66 263-270) ou par tout autre procédé approprié. Les conditions de fermentation permettant la préparation d'amino acides, peptides et/ou protéines dépendent évidemment du type de produit obtenu ainsi que de la souche spécifique mise en oeuvre, il s'agit là d'éléments qui doivent être déterminés spécifiquement pour chaque souche en fonction des connaissances de l'homme de métier. Les exemples ci-après permettront de mieux mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention et sont décrits en se référant aux figures suivantes Figure 1 : séquence de gène de structure de la gdhA de Corynebacterium melassecola, Figure 2 : différents adaptateurs utilisés dans les exemples, Figure 3 : structures de pPROKcelA et pPROK(AQ)20celA Figure 4 : détail de la fusion du polypeptide AQ avec EGA, Figure 5 : structure de pCGL125AQcelA. EXEMPLE I Construction d'un plasmide permettant le clonage de peptides (figure 3) Pour cette construction, une étape de sous-clonage de celA a été réalisée. Le gène celA disponible sous forme d'un fragment HindIII de 3,5kb contenant la région promotrice, le gène et le début d'un autre gène non identifié, a été sous-cloné sous forme d'un fragment HindlII-EcoRI de 2,6kb délété du morceau de gène inconnu, dans un vecteur réplicatif d'E. coli, le pMTL23. Le site EcoRI a été introduit par mutagénèse dirigée (P. Scarmato, Organibio) immédiatement derrière le terminateur de transcription du gène. Ce sous-clonage intermédiaire, compte tenu des sites de restriction introduits est nécessaire à l'étape suivante de clonage ; en particulier le clonage dans le polylinker de pMTL23 permet l'introduction d'un site de restriction NcoI juste derrière le site EcoRI, ce qui permet de sortir le fragment contenant la région codante de celA sous forme d'un fragment NaeI-NcoI. Cette étape permet également de disposer d'un gène celA dépourvu de séquences non identifiées en 3'. Le clonage de celA sous forme d'un fragment HindIII-EcoRI a été réalisé dans le plasmide pMTL23 en utilisant la souche réceptrice d'E. coli TG1. La souche d'E. coli possédant ce plasmide est bien dotée du phénotype CMC+ associé à l'expression de 1'EGO ; l'analyse des fragments de restriction obtenus est conforme à ce qui est attendu. La construction de pPROK-celA est la suivante On utilise le plasmide pPROK-l de 4,6kb disponible chez Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA, USA). Ce plasmide réplicatif chez E. coli contenant le promoteur tac (Brossius et coll. Gene 27:161, 1984) est hydrolysé par EcoRI-NcoI. On introduit ensuite dans cette restriction les adaptateurs DGFI/DGF2 de la figure 2 sous forme EcoRI-Blunt, ces adaptateurs créent le site BstXI. Puis on introduit celA sous forme NaeI(blunt)-NcoI à partir de la construction précédente. Le plasmide ainsi obtenu est dénommé pPROK-celA. I1 comporte le gène EGA de celA sous le contrôle du promoteur tac séparé par un site BstXI introduit grâce aux adaptateurs DGF1/DGF2. EXEMPLE 2 Construction d'un plasmide permettant l'expression de séquences AQ multiples Pour réaliser l'insertion d'une séquence codant pour 20 unités Ala-Gln (AQ) on utilise un deuxième couple d'oligonucléotides de synthèse dénommés DGF5/DGF6 (figure 2) qui correspondent au gène synthétique 5' CAG[AQ]20CAGGCA 3' 3' CCGTGTC[AQ]20GT 5' [AQ] représentant la séquence codant pour Ala-Gln. Les extrémités des séquences de DGF5 et DGF6 sont compatibles avec le site BstXI et la séquence peut donc être clonée dans ce site. Les séquences d'extrémités de DGF5 et DGF6 sont telles que, d'une part, elles orientent la direction du clonage, et, d'autre part, elles détruisent le site BstXl à la suite du clonage. L'utilisation d'adaptateurs non phosphorylés évite d'introduire plusieurs gènes synthétiques en tandem. Après digestion du pPROK-celA par BstXI et ligation du gène synthétique, on obtient : pPROK(AQ)20celA ayant la structure représentée figure 3. La figure 4 détaille plus particulièrement la structure du site de fusion AQ/EGA et montre l'intérêt du site BstXI utilisé. Ce site est de structure CCATGGCAATGG On constate qu'il comporte un codon de départ ATG ainsi que le codon codant pour l'alanine, GCA et un 2ème codon ATG pour l'insertion d'une methionine après la séquence codante déterminée. L'insertion de l'adaptateur DGF5/DGF6 ne peut se faire que dans un sens et n'introduit aucune base étrangère à l'objet visé. Ce plasmide est traité par BamHI et traité par ligation avec le produit de restriction du plasmide pCGL125 traité par la même enzyme. Le plasmide pCGL125 (figure 5) est un plasmide fonctionnel de Brevibacterium lactofermentum CGL/2005 (B1 15) comportant une origine de réplication pBL1. Par transformation de ladite souche par le plasmide pCGL125-(AQ)20-celA et sélection des souches transformées on obtient une souche selon la présente invention. Dans toutes les fusions qui sont réalisées, la traduction commence par une méthionine immédiatement suivie par (AQ)20 ; on a également pris la précaution de border (AQ)20 par une méthionine en COOH-terminal ; la détection du polypeptide AQ fusionné ou non à la protéine CelA peut se faire grâce à des anticorps spécifiques ou par détection analytique après purification sommaire de la protéine de fusion et hydrolyse au bromure de cyanogène ou inversement. Les propriétés particulières des peptides répétés permettent une séparation aisée. REVENDICATIONS 1) Procédé permettant d'obtenir une souche bactérienne assurant l'expression d'une séquence codante déterminée du type mettant en oeuvre un plasmide réplicatif ou non comportant les éléments permettant l'expression de ladite séquence dans ladite souche, caractérisé en ce que -ledit plasmide comporte au moins un gène marqueur sous le contrôle des éléments d'expression de ladite séquence et qui est séparé de ceux-ci par un site de restriction BstXI non palindromique, -ladite séquence codante déterminée est insérée dans le site BstXI, -le plasmide ainsi obtenu est utilisé pour transformer ladite souche, et -on sélectionne les souches transformées par le plasmide. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gène marqueur est séparé de la séquence codante par au moins un site de restriction. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le site BstXI présente la CCATGXXX3' à l'extrémité 5' de la séquence codante et en ce que la séquence codante est insérée sous forme d'une ADN double brin à extrémité 3' débordante complémentaire 3'CYYY (X et Y étant des bases complémentaires), le codon ATG étant le codon de départ de la traduction de cette séquence. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la bactérie est une corynébactérie. 5) Procédé selon l'une des revendications I à 4, caractérisé en ce que les éléments d'expression comportent le promoteur Ptac. 6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la séquence codante code pour l'expression d'un polypeptide ou d'une protéine. 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence codante comporte des éléments assurant la sécrétion de ladite protéine ou dudit polypeptide. 8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le plasmide comporte une origine de réplication fonctionnelle dans ladite bactérie. 9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit plasmide comporte une séquence choisie parmi - un élément d'arrêt de traduction à la fin de la séquenc codante - un élément d'arrêt de transcription en aval du site BstX1. 10) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le plasmide comporte des éléments permettant son intégration chromosomique. 11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la séquence codante est une séquence codante pour un polymère d'un ou plusieurs amino acides répétés. 12) Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'unité répétée dans la séquence répétitive contient en position COOH terminale un acide aminé chargé positivement ou négativement. 13) Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le caractère ionique du polypeptide permet son isolement. 14) Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'acide aminé chargé permet le clivage par une protéase spécifique du polypeptide à son niveau. 15) Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que l'acide aminé chargé peut être enlevé par une carboxypeptidase spécifique. 16) Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le gène marqueur est le gène ECA. 17) Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que la séquence codante comporte tout ou partie du gène gdha correspondant à la figure 1. 18) Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que le plasmide comporte tout ou partie des éléments d'expression de la gdhA de la figure 1. 19) Procédé mettant en oeuvre un plasmide comportant tout ou partie du gène de la gdhA de la figure 1. 20) Souche bactérienne obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 19. 21) Procédé de production d'amino acides, de polypeptides et/ou de protéines mettant en oeuvre une souche selon la revendication 20.