FR 2673953 A1 19920918 FR 9103027 A 19910313 L'invention concerne un procédé de séquençage non radioactif d'ADN, utile notamment, dans le séquençage direct des gènes pour le diagnostic des maladies génétiques. Elle s'applique en particulier à l'étude des prédispositions aux maladies cardiovasculaires, aux troubles du métabolisme et en cancérologie. La deuxième moitié des années 1980 a été marquée, en génétique humaine, par la possibilité d'accéder à certaines techniques moléculaires extrêmement sophistiquées. Ces techniques permettent l'analyse moléculaire d'un certain nombre de gènes dont la moindre modification (mutation) est responsable de maladies génétiques graves telles que la mucoviscidose et la myopathie ainsi que l'étude de génomes viraux directement impliqués dans certains cancers notamment les papillomasvirus de type HPV 16, 18, 33 impliqués dans les cancers du col de l'utérus.Ces techniques ouvrent aussi la voie à la recherche non seulement de gènes de prédisposition à certaines maladies auto-immunes tels que le lupus érythémateux disséminé, et la sclérose en plaques, les maladies cardiaques, les tumeurs transmises héréditairement notamment dans le cas de Rb ou gène du rétinoblastome, bientôt dans celui de la polypose rectocolique, de l'anémie de Fanconi et de l'ataxie télangiectasie mais également de gènes de prédisposition au développement de cancers divers (familles à cancers) tels que les oncogènes ou les anti-oncogènes modifiés (oncogènes ras, myc, bic12..., anti-oncogènes Rb et p53 essentiellement). Ainsi, l'enjeu diagnostique des années 90 est fondé sur la technologie moléculaire qui permettra l'étude et le dépistage des maladies génétiques, des virus engendrant des maladies graves (papillomavirus, virus du sida, de l'hépatite B), par exemple des prédispositions à certaines formes de maladies cardiaques, nerveuses et des prédispositions à certains cancers. L'une des étapes préliminaire et indispensable à l'étude d'un gène est la détermination de sa séquence, cette étape permettant de définir la structure du gène, ses particularités ainsi que les homologies éventuelles avec d'autres gènes. Différentes méthodologies de séquençage ont été mises au point. La plus simple, la méthode de Sanger, consiste à faire synthétiser par une polymérase le brin complémentaire au brin que l'on désire séquencer. L'élongation est réalisée en utilisant les quatre désoxynucléotides usuels dont l'un est radioactif (32p ou 35 S), en combinaison avec un didéoxynucléotide spécifique, ddNTP, dont l'absence de groupement hydroxyle en 3' aura comme conséquence l'arrêt de l'élongation.La taille du fragment au nucléotide près, permet de déterminer la position du ddNTP dans la chaîne en élongation, et donc la position de la base complémentaire du brin que l'on séquence. L'autre méthode, la méthode de Maxam et Gilbert, est elle aussi basée sur l'obtention de fragments, dont la taille permet de définir la position d'une des quatre bases. Des fragments d'ADN simples ou doubles brins, marqués radioactivement à l'une de leurs extrêmités sont clivés partiellement et spécifiquement au niveau d'une des bases dans quatre tampons réactionnels différents. Après séparation des fragments selon leur taille, sur gel de polyacrylamide dénaturant, la lecture de la séquence peut se faire directement sur le gel. La caractéristique commune de ces procédés au moins à leur début, était d'avoir recours à la radioactivité afin de révéler la séquence. Or il est certain que le développement de ces technologies implique qu'elles soient fiables, rapides, peu coûteuses, mais qu'elles soient surtout indépendantes de la radioactivité afin que son utilisation soit accessible à tous les centres spécialisés. L'un des buts de la présente invention est de proposer un procédé de séquençage non radioactif. Un autre but de la présente invention est de procurer un procédé de séquençage pour le diagnostic des maladies génétiques dans lesquelles les mutations du gène en cause varient d'un individu à l'autre. Un autre but de l'invention est de procurer un tel procédé de séquençage qui soit facilement mis en oeuvre et facilement automatisé. Un autre but de l'invention est de procurer un tel procédé pouvant être utilisé plus particulièrement pour la détection des prédis positions aux maladies cardiovasculaires, aux troubles du métabolisme et en cancérologie. Dans le cas de maladies associées à une mutation ponctuelle apparaissant avec une fréquence élevée, comme dans le cas de la mucoviscidose, il est possible de prévoir une sonde à DNA correspondant à cette portion mutée et ainsi mettre en évidence la présence ou l'absence de ladite mutation. Lorsque les mutations peuvent être nombreuses, il n'est pas possible de prévoir autant de sondes que de mutations possibles. Ainsi dans le cas des phénomènes tumoraux associés aux gènes de la p53, il existe actuellement près de 30 mutations ponctuelles différentes qui ont été décrites (à partir de 25 tumeurs) ; encore cette liste de mutation ne peut être considérée comme exhaustive. En tout état de cause, l'utilisation de plus de 30 sondes spécifiques n'est pas envisageable. Toutefois, dans ce type de pathologie, si la présence d'une mutation donnée peut avoir une valeur pronostique on pourra alors envisager une nouvelle génération d'outils anti-tumoraux (oligonucléotides anti-sens, anticorps spécifiques d'épitopes caractéristiques de formes mutées par exemple), et la mise en place de cartographie des tumeurs qui, à côté des descriptions des anatomopathologistes classiques, permettront de définir un traitement individualisé. C'est l'un des buts de la présente invention de permettre, grâce à un procédé de mini séquençage non radioactif des parties du gène comportant des régions "hot spots", de mettre à la disposition du praticien des moyens de diagnostic permettant d'envisager la prévention et le traitement de ce type de maladie. La présente invention concerne un procédé de séquençage d'un fragment d'ADN caractérisé en ce que a) on isole au moins un fragment d'ADN contenant la zone à séquencer b) on effectue le séquençage direct de ladite zone sans utiliser de composés radioactifs c) on fait migrer les fragments obtenus par séquençage sur un support d) on révèle les fragments d'ADN après migration sur le support ou sur un support de transfert en les mettant en présence d'un composant ayant une affinité pour 1'ADN et qui comporte un élément marqueur détectable et e) les ADN détectés sont lus pour déterminer la séquence du fragment d'ADN Ce procédé est plus particulièrement utilisable pour le mini séquençage de parties de gène comprises entre 50 et 100 nucléotides. Ces zones variables génétiquement peuvent comporter des mutations importantes. L'isolement d'au moins un fragment d'ADN pourra être effectué par une méthode quelconque, notamment à l'aide des méthodes utilisées lors de séquençages traditionnels, mais on préférera utiliser la méthode PCR qui permet d'amplifier la séquence intéressante en utilisant des amorces consensuelles situées de part et d'autre de ladite séquence variable. Le séquençage des produits d'amplification peut être réalisé par l'une quelconque des méthodes de séquençage connues et rappelé précédemment, ainsi que par leur différentes variantes et adaptations. Pour l'essentiel, ces techniques de séquençage conduisent à des fragments d'ADN de masses moléculaires diverses dont une des extrémités est connue, la masse moléculaire permettant d'attribuer une position au nucléotide d'extrémité. Le produit de séquençage est ensuite déposé sur un support sur lequel on le fait migrer, notamment par électrophorèse. Cette technologie est connue, le gel est en général un gel de polyacrylamide utilisé dans des conditions dénaturantes pour permettre une séparation totale et reproductible des fragments. Suivant la nature du composant utilisé par la suite pour la détection du fragment d'ADN, il peut être nécessaire de prévoir un transfert du gel de migration sur un support de transfert notamment une membrane ou même des supports moins réactifs. En effet, le composant assurant en quelque sorte la révélation de l'ADN peut être amené à réagir sur le gel de migration. Les membranes utilisées pour ce type de transfert sont connues il peut s'agir notamment de membranes, en polyamide (nylon), dérivé de cellulose, (nitro-cellulose), ou membranes notamment minérales. Leurs caractéristiques devront bien entendu être adaptées au processus mis en oeuvre. L'un des procédés utilisables pour le transfert sur la membrane, est un électro-transfert, qui est un procédé décrit notamment dans le brevet US 44 52 901. L'étape d consiste à mettre les fragments d'ADN ayant migrés en présence d'un composant ayant une affinité pour l'ADN et qui comporte un élément marqueur détectable, ceci afin de permettre la détection ultérieure des fragments. L'un des éléments caractéristiques de la présente invention est le fait que ce composant présente une affinité pour l'ADN quelle que soit la séquence en cause, c'est-à-dire qu'il ne s'agit pas d'une sonde donc d'un fragment d'ADN complémentaire de la séquence en cause. Ce type de composant est choisi par exemple parmi les amines, les métaux, les protéines histones les anticorps anti-ADN. Parmi ces composés, il faut citer notamment les polyamines tels que la polylysine ou la polyarginine, la protamine, et les polyamines biogénétiques spermine, spermidine par exemple. On peut également utiliser les anticorps qu'ils soient monoclonaux ou polyclonaux anti DNA monobrins. Parmi les métaux il faut citer par exemple l'argent, le mercure et l'or. On peut aussi prévoir lors du séquençage d'utiliser pour la production des fragments de séquençage des éléments non naturels ; ainsi des analogues de nucléotides et utiliser pour la détection des substances spécifiques pour ces éléments non naturels de l'ADN utilisés dans le séquençage par exemple des anticorps spécifiques. Parmi les nucléotides non naturels, il faut citer les dérivés sulfurés qui sont détectables par des anticorps, les dérivés iodés qui sont détectables par des protéines avides d'iode telles que la thyroglobuline et que l'on peut marquer directement par la phosphatase alcaline ; enfin des dérivés mercurés qui sont détectés par les métaux s'amalgamant avec le mercure. Ce composant ayant une affinité pour l'ADN comporte un élément marqueur détectable, c'est-à-dire que l'on peut détecter visuellement ou bien à l'aide d'un appareil analyseur. Ce marqueur détectable peut être partie intégrante du composant ou bien être conjugué avec un élément marqueur tels que enzyme, fluorochrome ou métal, tel que l'or colloïdal. Cette conjuguaison peut être effectuée par voie chimique, notamment par l'intermédiaire de liaisons amides covalentes ou bien par des liaisons de type avidine biotine par exemple. Le signal de détection généré par l'élément en cause, peut être obtenu directement ou par l'intermédiaire d'un substrat, par exemple dans le cas de l'enzyme par l'intermédiaire d'un substrat coloré. Ainsi, parmi les enzymes utilisées, il faut citer notamment les phosphatases alcalines, la $ galactosidase, la peroxydase ; en présence d'un substrat incolore approprié, ces enzymes le transforme en produit coloré qui précipite in situ. Les bandes ainsi révélées peuvent être lues par tout moyen approprié visuellement, ou par l'intermédiaire d'un analyseur de bande, c'est-à-dire lu par "scanner" et analysé par ordinateur. Cette technique de mini-séquençage direct non-radioactif des régions 'hot-spots" des gènes est une véritable innovation. D'une part elle doit mettre le séquençage à la portée de tous les laboratoires non agréés pour la radioactivité, d'autre part elle donne un accès direct à l'information génétique sans risque de faux-négatifs ou de faux-positifs et sans problèmes de bruit de fond, troubles rencontrés parfois avec les sondes nucléiques. Ceci, alors que les appareils de séquençage automatique proposés actuellement sont encore à l'état de prototypes (manipulations difficiles et résultats pas toujours fidèlement reproductibles), et que leur coût très élevé les rend inaccessibles à la très grande majorité des laboratoires. Ce procédé, selon l'invention, est déclinable à tous les systèmes pour lesquels une analyse génétique est indispensable : ces situations (très grand nombre de mutations pour un gène donné dans une pathologie donnée) sont hélas les plus fréquemment rencontrées en pathologie humaine. Parmi les applications possibles de cette technique, le dépistage des prédispositions génétiques aux maladies métaboliques permettant un traitement précoce de la maladie est une application de choix. Elle permet d'envisager une attitude préventive : hygiène de vie, surveillance, régime et/ou thérapeutique : prétraitement ou traitement médicamenteux. Parmi les maladies de ce type détectable par cette technique il faut citer L'hypercholestérolémie familiale (gène concerne : le gène du récepteur au LDL (Low-density-Lipoprotein receptor). Les dyslipoprotéinémies (gène concerné les gènes de l'apolipoprotéine E, C2 et C1). Les pathologies précoces des artères coronaires (gène concerne : les gènes de l'apolipoprotéine Al, C3 et A4). L'exemple ci-après est destiné à mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention. Exemple 1 Actuellement près de 30 mutations ponctuelles différentes ont été décrites pour le gène de la p53 comme cela a été indiqué précédemment (à partir d'environ 25 tumeurs). Ces mutations sont somatiques car, lorsque l'on analyse le gène de la p53 dans un tissu sain il n'est pas muté. L'ensemble des mutations ponctuelles décrites dans le gène de la p53 est localisé dans la région centrale. Ce gène est constitué de 11 exons qui s'étendent sur 20 kilobases. La région codante correspond à 1179 paires de bases : la p53 humaine est donc composée de 393 acides aminés. Toutes les mutations sont concentrées entre les codons 120 et 309, affectant donc systématiquement un des cinq domaines conservés au cours de l'évolution. Ces mutations, activant le pouvoir oncogène de la p53, se répartissent en quatre "hot spots" (points chauds) définis schématiquement par quatre régions : les régions A (codons 132-143), B (codons 174-179), C (codons 236-248), D (codons 272-281). Au vu de ces données, il est clair que la technique la plus adaptée pour identifier rapidement une mutation à partir d'une biopsie ou d'un tissu sain est la technique de séquençage décrite précédemment. Pour ce faire, à partir d'un prélèvement biologique et par des méthodes qui sont connues, on isole la région codante pour la p53 humaine et l'on amplifie les quatre régions de points chauds définis précédemment en utilisant la méthode PCR et des amorces situées de part et d'autre des régions A,B,C et D. Chacun des mélanges d'amplification obtenu est ensuite séquence avec des nucléotides non radioactifs déposés sur un gel de polyacrylamide dénaturant et soumis à une électrophorèse dans des conditions habituelles de séquençage. Ensuite, le gel d'électrophorèse est électro-transféré sur une membrane en nylon. C'est cette membrane en nylon qui sera révélée pour lecture de la séquence. Cette membrane après séchage, est saturée pendant environ 30 minutes par immersion dans une solution propre à bloquer les sites non spécifiques de la membrane, c'est-à-dire les sites de la membrane qui ne sont pas déjà occupés par les acides nucléiques. Cette solution de saturation est par exemple une solution de protéines de lait à 250 milligrammes de BSA par millilitre (sérum albumine bovine) à 25 milligrammes par millilitre, de Tween à 0,3 % dans un tampon 50 mM Tris-HCl pH8, EDTA 1 mM, NaCl 25 mM (tampon TEN). La membrane est ensuite mise en contact d'une solution de protamine couplée à des molécules de phosphatase alcaline par l'intermédiaire d'une liaison chimique. Cette incubation s'effectue pendant environ 15 minutes à la température ambiante. La protamine-phosphatase alcaline est diluée dans la solution bloquante décrite précédemment. La membrane est ensuite lavée avec une solution de Brij à 0,3 %, 0,5 M NaCI (2 millilitres par centimètre carré). Enfin, la détection est réalisée par l'utilisation d'un système colorimétrique. Le procédé colorimétrique, en lui-même connu, utilise la transformation du napthtol-phosphate en naphtol par la phosphatase alcaline. Le naphtol peut alors se combiner à un certain composé, tel que celui connu sous la dénomination Fast-Red, et ainsi transformer un substrat incolore et soluble en un produit coloré et insoluble qui précipite in situ. I1 est possible d'utiliser d'autres systèmes colorimétriques comme celui utilisant le BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) et le NBT (nitro-bleu de tétrazolium). La lecture s'effectue de visu directement ou bien après "scannérisation" et analyse par ordinateur. Cette lecture peut immédiatement donner pour chacun des points chauds de la p53 son identification par comparaison avec les mutations décrites. Le développement de la technique de séquençage froid, appliqué à la p53, permet d'affiner le diagnostic à un niveau moléculaire et même, dans certains cas, de pronostiquer le devenir des maladies cancéreuses et de procéder à l'étude et au dépistage de nombreuses maladies génétiques. De tels outils moléculaires devront orienter ou renforcer les résultats donnés par les anatomopathologistes en apportant, pour la première fois dans de tels diagnostics, une analyse génétique moléculaire particulièrement fine. REVENDICATIONS 1/ Procédé de séquençage d'un fragment d'ADN caractérisé en ce que a) on isole au moins un fragment d'ADN contenant la zone à séquencer, b) on effectue le séquençage direct de ladite zone sans utiliser de composé radioactif, c) on fait migrer les fragments obtenus par séquençage sur un support, d) on révèle les fragments d'ADN après migration sur le support ou sur un support de transfert en les mettant en présence d'un composant ayant une affinité pour l'ADN et qui comporte un élément marqueur détectable, et e) les ADN détectés sont lus pour déterminer la séquence du fragment d'ADN. 2/ Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que dans l'étape a) le fragment d'ADN comportant la zone à séquencer est isolé en utilisant la méthode PCR et deux amorces situées de part et d'autre de la zone à sequencer. 3/ Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que le support utilisé pour la migration est un gel et en ce que le support de transfert est une membrane. 4/ Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que les fragments obtenus par séquençage sont transférés sur le support de transfert par électro-transfert. 5/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le composant utilisé dans l'étape d comporte une matrice ayant une affinité pour 1'ADN de séquençage quelque soit la séquence en cause et qui est conjuguée avec un élément marqueur détectable. 6/ Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que la matrice ayant une affinité pour l'ADN est choisie parmi les amines, les métaux, les protéines histones, les anticorps anti-ADN. 7/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que la substance ayant une affinité pour l'ADN est une substance ayant une affinité spécifique pour des éléments non naturels de l'ADN utilisés dans le séquençage. 8/ Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que la substance ayant une affinité pour l'ADN est un anticorps spécifique des éléments non naturels de 1'ADN utilisé dans le séquençage. 9/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que l'élément marqueur détectable est une enzyme, un fluorochrome ou l'or colloïdal. 10/ Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que l'enzyme est visualisée grâce à un substrat incolore qui donne un produit coloré sous l'action de l'enzyme. 11/ Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que la substance ayant une affinité pour l'ADN est choisie parmi - la polylysine - la polyarginine - la protamine - ou les polyamines biogéniques tels que spermine, spermidine. 12/ Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les éléments non naturels de 1'ADN sont choisis parmi les nucléotides sulfurés et en ce que la substance ayant une activité spécifique pour les fonctions sulfure est un anticorps. 13/ Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les éléments non naturels de l'ADN sont des dérivés iodés et en ce que la substance ayant une activité pour ces éléments est une protéine avide d'iode. 14/ Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les éléments non naturels de 1'ADN sont des dérivés mercurés et en ce que la substance ayant une activité pour ces éléments est un métal s'amalgamant avec le mercure. 15/ Procédé selon l'une des revendications 9 à 14 caractérisé en ce que l'enzyme est choisi parmi les phosphatases alcalines, la galactosidase, la peroxydase, la glucosidase. 16/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 15 caractérisé en ce que les ADN détectés sont lus par un analyseur de bande.