FR 2676043 A1 19921106 FR 9105498 A 19910502 PROCEDE DE TRAITEMENT D'UN MILIEU ENZYMATIQUE CONTENANT DES POLYPHENOLS EN VUE DE PROTEGER L'ACTIVITE ENZYMATIQUE, ET BPPLICATION NOTAMMENT A L'EPURATION D'EAUX RESIDUAIRES L'invention concerne un procédé de traitement d'un milieu enzymatique contenant des polyphénols (initialement ou en formation) en vue d'assurer une protection de l'activité enzymatique. Elle s'étend à une application dudit procédé pour réaliser une épuration d'eaux résiduaires. lies enzymes sont utilisées dans de nombreux secteurs de la technique pour réaliser des transformations diverses ; or, de nombreuses enzymes telles que les enzymes peroxydases ou oxydases et les enzymes de la famille des hydrolases voient leur activité inhibée par les polyphénols, ce qui nuit au rendement de transformation lorsque le milieu enzymatique contient initialement des polyphénols ou lorsque ces composés se forment au cours de la transformation. Actuellement, il est connu d'utiliser la polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) pour protéger l'activité enzymatique notamment des hydrolases ; cette protection provient d'une réaction de complexation de la PVPP avec les polyphénols par l'intermédiaire des liaisons amides de la PVPP qui réagissent avec les groupements OH des polyphénols (publications : "Haslam E., Polyphenol-protein interactions, Biochem. J. 139 (1974) 285-288 ; Fiels J.A. et al., Oxydative detoxification of aqueous bank extracts, part I Autoxidation, part Il Alternative Methods, J. Chem. Biotechnol. 49 (1990) 15-53 ; BASF produits chimiques fins, Notice technique polyvinylpyrrolidone pour l'industrie pharmaceutique types de "KOLLIDONR" 1-46, 1986 ; W.D. Loomis and J.Battaile, Phytochemistry 1966, vol. 5 pp 423 à 438"). Cette utilisation protectrice de la PVPP peut en particulier être mise en oeuvre dans le domaine de l'épuration d'eaux résiduaires qui contiennent des polyphénols, soit à l'origine, soit par polymérisation de phénols ou dérivés phénoliques. Toutefois, la PVPP est un produit très coûteux et l'obtention d'une bonne efficacité exige l'utilisation de quantités qui rendent le procédé onéreux, ce qui explique qu'il n'est pas utilisé en pratique dans le domaine précité. lies problèmes liés à l'inhibition de l'activité enzymatique des milieux contenant des polyphénols sont donc mal résolus à l'heure actuelle. La présente invention se propose de résoudre ces problèmes en fournissant un nouveau procédé de traitement de milieux enzymatiques, qui soit économiquement utilisable dans toutes les applications industrielles. L'objectif de l'invention est de réduire considérablement l'effet inhibiteur des polyphénols envers les enzymes afin de conserver un bon rendement de la catalyse enzymatique quelle que soit la nature de cette dernière, et ce, avec un surcoût réduit, compatible en pratique avec toutes les applications, et notamment celles à faible valeur ajoutée telle que le traitement des eaux résiduaires. L'invention s'applique d'une façon générale à toutes les enzymes d'un type subissant un effet inhibiteur de la part des polyphénols et en particulier aux enzymes peroxydases ou oxydase et aux hydrolases (protéase, cellulase, lipase, hémicellulase, pectinase). lie procédé conforme à l'invention consiste à ajouter au milieu enzymatique contenant des polyphénols (initialement ou en formation) du talc ou une substance talqueuse ou kaolinique dans des conditions appropriées pour réaliser une adsorption au moins partielle des polyphénols sans dénaturation sensible de la ou des enzymes du milieu. lies expérimentations ont montré que le talc et les substances talqueuses et kaoliniques présentent une efficacité remarquable de protection de l'activité enzymatique lorsqu'elles sont disposées dans le milieu enzymatique avec une concentration appropriée pour leur permettre d'adsorber totalement ou au moins partiellement les polyphénols sans dénaturer la ou les enzymes du milieu. lie talc présente un effet dénaturant à l'égard de certaines enzymes qui a priori conduirait à en proscrire l'utilisation, mais l'on a pu mettre en évidence qu'il existe une plage de concentration moyenne où il est possible, à la fois, de bénéficier d'un effet de protection efficace et d'éviter une dénaturation notable des enzymes.Cette plage dépend du milieu et de l'enzyme concernée ; la quantité de talc ajoutée en pratique sera telle que - la concentration du milieu en polyphénol reste ou devienne inférieure au seuil de concentration inhibitrice de la ou des enzymes concernées par les polyphénols, - la proportion talc/enzyme soit inférieure au seuil de dénaturation de la ou des enzymes concernées par le talc. La première condition définit la quantité minimale de talc ou substance talqueuse à ajouter au milieu pour assurer une adsorption suffisante des polyphénols, de sorte que leur effet inhibiteur sur les enzymes soit réduit de façon significative. La seconde condition définit la quantité maximale de talc à ajouter pour que les enzymes ne soient pas dénaturées de façon significative. Ainsi, en combinant les deux conditions, on obtient un bon compromis qui assure un effet global positif de protection de l'activité enzymatique dans le milieu considéré. lie talc et les substances talqueuses sont des produits courants de faible coût (rapport de coût de 1 à 150 par rapport à la PVPP), de sorte que le procédé de l'invention présente un intérêt économique majeur. On entend par talc soit le minéral silicate de magnésium hydraté, soit le minéral chlorite (silicate de magnésium et d'aluminium hydraté), soit un mélange des deux, associé le cas échéant à d'autres minéraux (dolomite...). On entend par "substances talqueuses" une substance issue du talc et conservant ses propriétés d'adsorption vis-à-vis des polyphénols (telle que talc calciné obtenu par traitement thermique du talc ou talc ayant subi des traitements de surface). lie procédé de l'invention s'applique aux milieux enzymatiques contenant initialement des polyphénols le talc ou la substance talqueuse est alors ajouté de façon à réaliser une adsorption de ces polyphénols en vue d'en ramener la concentration au-dessous du seuil de concentration inhibitrice. L'enzyme peut être de tout type sensible au polyphénol, et la réaction enzymatique quelconque : par exemple, le procédé de l'invention est particulièrement bien adapté pour protéger des enzymes de la famille des hydrolases telles que protéase, cellulase, lipase, hémicellulase ou pectinase, qui sont amenées à réaliser, en présence de polyphénols, des catalyses enzymatiques (par exemple clarification des jus de fruits).Il est à noter que, en même temps que le talc ou la substance talqueuse, il peut être avantageux d'ajouter au milieu, des enzymes peroxydases en vue d'accroltre le degré de polymérisation des polyphénols et de favoriser leur adsorption par le talc. lie procédé de l'invention peut également s'appliquer à des catalyses enzymatiques au cours desquelles se forment des polyphénols ; le talc, ou la substance talqueuse ou kaolinique, est alors ajouté de façon à réaliser une adsorption, de préférence sensiblement totale, des polyphénols au fur et à mesure de leur formation. Ce procédé peut en particulier s'appliquer pour traiter un milieu contenant initialement une enzyme peroxydase ou oxydase, un peroxyde et des phénols ou dérivés phénoliques. lie procédé ci-dessus décrit s'applique tout particulièrement à l'épuration d'eaux résiduaires contenant des phénols et/ou dérivés phénoliques (effluents provenant des industries papetières, industries textiles, des fabrications de peinture...) ; dans cette application, l'épuration consiste, de façon classique, à ajouter aux eaux à traiter une enzyme peroxydase de Raifort (HRP) et un peroxyde, en vue de réaliser la polymérisation des phénols et dérivés, en polyphénols. Selon l'invention, l'on ajoute également aux eaux à traiter du talc ou une substance talqueuse ou kaolinique en vue d'adsorber les polyphénols formés et l'on réalise une filtration des eaux pour éliminer les matières précipitées. L'on évite ainsi la perte d'efficacité des enzymes, qui est constatée dans les procédés d'épuration classique en raison de l'effet inhibiteur des polyphénols formés (aucune solution économiquement envisageable n'étant à l'heure actuelle à la disposition des professionnels de l'épuration d'eaux pour pallier cet effet inhibiteur). De plus, le talc ou la substance talqueuse possède un effet d'adsorption des polyphénols formés, ce qui facilite leur séparation du milieu par filtration. lies expérimentations réalisées dans l'application précitée ont montré que les conditions optimales de mise en oeuvre étaient les suivantes - addition de 50 à 300 grammes de talc ou substance talqueuse par gramme de phénols ou dérivés phénoliques contenus dans les eaux, - mise en oeuvre de 104 à 105 unités d'enzymes (5 à 50 mg) par gramme de phénols ou dérivés phénoliques, - utilisation du talc ou substance talqueuse de surface spécifique comprise entre 3 et 12 m2/g. Par ailleurs, le mode de mise en oeuvre préférentiel du procédé consiste à ajouter d'abord aux eaux résiduaires le talc ou la substance talqueuse et le peroxyde, à homogénéiser le milieu, puis à ajouter l'enzyme ; on minimise ainsi l'effet de dénaturation de l'enzyme par le talc. On peut en particulier utiliser du talc ou du talc calciné ; ce dernier peut notamment être obtenu à partir du talc, par le procédé décrit dans le brevet FR n0 85.11840. L'on a pu constater que la combinaison des deux substances précitées (talc calciné, talc) donnait un effet favorable, en traitant les eaux résiduaires en séquences successives utilisant d'abord le talc calciné puis le talc. Une explication possible de cet effet de synergie est la suivante : la catalyse enzymatique produit des polyphénols de poids moléculaires différents, qui sont formés à des moments différents ; le talc calciné parait adsorber préférentiellement certaines formes précoces de polyphénols (qui sont particulièrement inhibitrices de l'activité enzymatique), cependant que l'action dénaturante du talc calciné est moindre que celle du talc, ce qui conduit à l'utiliser en phase initiale de la catalyse. Il est à noter que, à la fin de la catalyse enzymatique, l'on peut avantageusement ajouter une nouvelle quantité de talc en vue d'accroltre l'adsorption des polyphénols formés et leur séparation lors de la filtration (l'effet dénaturant du talc n'étant plus à craindre à ce stade). On atteint alors une remarquable efficacité de dépollution vis-à-vis des phénols initiaux et des polyphénols formés. En particulier, la réaction enzymatique en présence de talc calciné puis de talc pourra durer entre 20 minutes et 180 minutes : la nouvelle quantité de talc est alors ajoutée à l'issue de celle-ci, l'adsorption des polyphénols formés se produisant pendant une durée comprise entre 15 minutes et 60 minutes. Le procédé de l'invention est illustré ciaprès par des exemples de mise en oeuvre ; les conditions expérimentales de ces exemples sont identiques et sont les suivantes L'ensemble des solutions sont préparées dans du tampon acétate 0,1 M, pH : 4,5. - polluant : solution de phénol à 1054,5 > iM 108 mg.l#1, - peroxyde : H202 à 2 mM, - enzyme: peroxydase de Raifort "BOEHRINGER MANNHEIM" grade Il - 10400 U.1-i - 5,2 mg.l#1 (substrat galacol, H202), - température : 25 C, - protecteur de l'activité enzymatique: quantité égale à 20 mg. La quantité de protecteur est additionnée à 1 cm3 de la solution de phénol ; le mélange est homogénéisé puis une fraction de l'eau oxygénée est rajoutée (0,325 cm3). Le milieu est préincubé sous agitation (5 mn) puis l'enzyme est rajoutée (0,2 cm3 ; 2,08 unités) ; 15 mn après, 0,325 cm3 d'eau oxygénée est à nouveau rajouté. L'évolution de la cinétique d'oxydation est déterminée par analyse HPLC du phénol résiduel et des polyphénols. lies milieux sont filtrés avant analyse. En l'absence de protecteur, des essais sont réalisés selon la même procédure pour servir de témoins. Il est à remarquer que - les quantités de protecteur ajoutées correspondent à 200 g par gramme de phénol, - la quantité d'enzyme à 0,2.105 unité (environ 10 mg) par gramme de phénol. lies conditions d'analyse effectuée au moyen de l'appareillage HPLC ("High Performance liiquid Chromatography") sont les suivantes - détection W 270 nm, - éluant 60/eau, 1 cm3/mn, 40/méthanol, - colonne phase inverse "Hewlett Packard ODS hypersil" (100 mm x 4,6 mm). EXEMPLE 1 Conditions de l'essai protecteur : talc (désigné par talc A mélange de 94 % de minéral talc, 4 52; de chlorite et 2 % de dolomite et divers), - granulométrie du protecteur D99 = 20 micromètres, D50 = 4 micromètres), - surface spécifique du protecteur 7,4 m2/g, - durée de la réaction : 30 minutes. Résultat des analyses à l'issue de la réaction - quantité de phénol restant en solution dans le milieu liquide : 155 micromoles /1, à comparer à 203 micromoles/l obtenues pour le témoin, - taux de polyphénol restant en solution dans le milieu liquide (mesuré par l'aire du pic HPLC) : 104 à comparer à 25.104 pour le témoin. L'efficacité de la catalyse enzymatique est très significativement améliorée par le talc A. EXEMPLE 2 - protection chlorite (minéral chlorite à 99,5 %), - granulométrie : D99 = 15 micromètres, d50 = 4 micromètres, - surface spécifique : 6 m2/g, - durée de la réaction : 30 minutes. Résultats - phénol résiduel : 170 micromoles/l (contre 203 pour le témoin), - taux de polyphénol : 1,1.104 (contre 25.104 pour le témoin). L'efficacité est du même ordre que précédemment. EXEMPLE 3 - protecteur : kaolin (mélange de kalonite et de mica), - granulométrie D99 = 9 micromètres, D50 = 2 micromètres, - surface spécifique : 11 m2/g, - durée de la réaction : 30 minutes. Résultats - phénol résiduel : 147 micromoles (contre 203 pour le témoin), - taux de polyphénol: 4,3.104 (contre 25.104 pour le témoin). lie kaolin a un effet protecteur comparable à celui du talc, mais son action d'adsorption des polyphénols formés est moindre. EXEMPLE 4 - protecteur : talc calciné (mélange de 90 % de talc minéral, 8 % de chlorite et 2 % de dolomite et divers, calciné par le procédé du brevet FR 85.11840), - granulométrie : Dg9 = 50 micromètres, D50 = 10 micromètres, - surface spécifique : 3,5 m2/g, - durée de la réaction : 30 minutes. Résultats - phénol résiduel : 141 micromoles (contre 203 pour le témoin), - taux de polyphénol : 21.104 (contre 25.104 pour le témoin). Ce protecteur présente une bonne efficacité de protection de l'activité enzymatique ; par contre, son action d'adsorption des polyphénols formés est faible et ceuxci se retrouvent en grande partie dans le milieu liquide. Dans l'application à l'épuration des eaux résiduelles, on utilisera avantageusement le talc calciné en combinaison avec du talc comme décrit à l'exemple 5. EXEMPLE 5 - protecteur d'abord talc calciné de l'exemple 4 (durée de réaction : 5 mn avec ce talc calciné), puis talc A de l'exemple 1 (durée de réaction : 25 mn), - proportion talc calciné par rapport au talc A 3 pour 1, - durée globale de la réaction : 30 minutes. Résultats - phénol résiduel : 127 micromoles/l, - taux de polyphénol : 13.10#. On abaisse significativement la quantité résiduelle de phénol, mais le taux de polyphénol demeurant dans le milieu liquide reste plus élevé que dans l'exemple 1. Le phénol résiduel étant l'image de l'activité enzymatique, la combinaison des deux protecteurs conduit à une excellente protection de cette activité. EXEMPLE 6 Cet exemple, qui optimise les conditions d'épuration d'eaux résiduaires contenant des phénols et/ou polyphénols (ou dérivés) est réalisé selon la procédure de l'exemple 5, mais à l'issue de la réaction enzymatique (30 minutes), on ajoute une nouvelle quantité de talc A (150 g par gr de phénol initial) : en effet à ce stade, on ne craint plus une dénaturation de l'enzyme qui a déjà agi ; ce talc est laissé en présence du milieu pendant 20 minutes et l'on réalise la filtration. Résultats - phénol résiduel : 127 micromoles/l, - taux de polyphénol : O. On a ainsi mis au point un remarquable procédé d'épuration d'eaux résiduaires. EXEMPLE 7 - protecteur talc (désigné par talc B mélange de 93 ffi de minéral talc, 5 % de chlorite et 2 % de dolomite et divers), - granulométrie : D99 = 15 micromètres, D50 = 3,7 micromètres, - surface spécifique : 8,6 m2/g. Cet exemple a été mené en laissant agir l'enzyme, d'une part, pendant 30 minutes au cours d'un premier essai, d'autre part, pendant 150 minutes au cours d'un second essai. Résultats: - - phénol résiduel ler essai : 165 micromoles/l (contre 203 pour le témoin), 2sème essai : 103 micromoles/l (contre 162 pour le témoin), - taux de polyphénol : . 1er essai : 2,5.104 (contre 25~104), . 2ème essai : 0 (contre 9.104). Une durée plus grande conduit à un abaissement des phénols résiduels (réaction enzymatique plus longue) et du taux de polyphénol (adsorption plus complète sur le talc) ; toutefois, elle présente l'inconvénient d'accroltre le dimensionnement des installations. EXEMPLE 8 Cet exemple a été effectué avec trois protecteurs de surfaces spécifiques différentes, et un temps de réaction de 30 minutes - protecteur 1 : talc (désigné par talc C mélange de 90 % de minéral talc, 8,5 % de chlorite et 1,5 % de dolomite et divers) : D99 = 50 micromètres, D50 = 10 micromètres ; surface spécifique : 3,6 m2/g. - protecteur 2 : talc B de l'exemple 7 (surface spécifique = 8,6 m2/g), - protecteur 3 : talc (désigné par talc D mélange de 96 % de minéral talc, 1 % de chlorite et 3 % de dolomite et divers) ; D99 = 30 micromètres, D50 = 5,5 micromètres ; surface spécifique : 10,2 m2/g. Résultats - phénol résiduel protecteur 1 : 191 micromoles/l, protecteur 2 : 165 micromoles/l, protecteur 3 : 156 micromoles/l, (contre 203 pour le témoin). - taux de polyphénol protecteur 1 : 2,2.104, protecteur 2 : 2,5.104, . protecteur 3 : 1,5~104, (contre 25.104 pour le témoin). L'efficacité de dépollution augmente avec la surface spécifique du protecteur. REVENDICATIONS 1/ - Procédé de traitement d'un milieu enzymatique contenant des polyphénols en vue d'assurer une protection de l'activité enzymatique, la ou les enzymes contenues dans le milieu étant d'un type subissant un effet inhibiteur de la part des polyphénols, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on ajoute au milieu enzymatique du talc ou une substance talqueuse ou kaolinique dans des conditions appropriées pour réaliser une adsorption au moins partielle des polyphénols sans dénaturation sensible de la ou des enzymes du milieu. 2/ - Procédé de traitement d'un milieu enzymatique selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on ajoute du talc en quantité appropriée pour que - la concentration du milieu en polyphénol reste ou devienne inférieure au seuil de concentration inhibitrice de la ou des enzymes concernées par les polyphénols, - la proportion talc/enzyme soit inférieure au seuil de dénaturation de la ou des enzymes concernées par le talc. 3/ - Procédé selon la revendication 2 pour le traitement d'un milieu contenant initialement une enzyme peroxydase ou oxydase, un peroxyde et des phénols ou dérivés phénoliques, caractérisé en ce que, au cours de la réaction enzymatique de polymérisation des phénols en polyphénols, l'on ajoute le talc de façon à réaliser une adsorption, de préférence sensiblement totale, des polyphénols au fur et à mesure de leur formation. 4/ - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 pour le traitement d'un milieu contenant initialement des polyphénols et une enzyme de la famille des hydrolases, en particulier protéase, cellulase, lipase, hémicellulase ou pectinase, caractérisé en ce que l'on ajoute le talc de façon à réaliser une adsorption des polyphénols contenus dans le milieu. 5/ - Procédé selon la revendication 4, dans lequel l'on ajoute, en même temps que le talc, des enzymes peroxydases en vue d'accroltre le degré de polymérisation des polyphénols et favoriser leur adsorption par le talc. 6/ - Procédé selon l'une des revendications 1, 2, 3, 4 ou 5 en vue de réaliser une épuration d'eaux résiduaires contenant des phénols et/ou dérivés phénoliques, consistant à ajouter aux eaux à traiter une enzyme peroxydase de Raifort (HRP) et un peroxyde, en vue de réaliser la polymérisation des phénols et dérivés en polyphénols, caractérisé en ce que l'on ajoute également aux eaux à traiter du talc ou une substance talqueuse ou kaolinique en vue d'adsorber les polyphénols formés et en ce que l'on réalise une filtration des eaux pour éliminer les matières précipitées. 7/ - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on ajoute aux eaux résiduaires à épurer - entre 50 et 300 grammes de substance talqueuse par gramme de phénols ou dérivés phénoliques contenus dans les eaux, - entre 104 et 105 unités d'enzymes par gramme de phénols ou dérivés phénoliques contenus dans les eaux. 8/ - Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que l'on ajoute du talc ou une substance talqueuse de surface spécifique comprise entre 3 et 12 m2/g. 9/ - Procédé selon l'une des revendications 6, 7 ou 8, caractérisé en ce que lton ajoute d'abord aux eaux résiduaires le talc ou la substance talqueuse et le peroxyde, l'on homogénéise le milieu, puis l'on ajoute l'enzyme de façon à minimiser l'effet de dénaturation de l'enzyme par le talc ou la substance talqueuse. 10/ - Procédé selon l'une des revendications 6, 7, 8 ou 9 mis en oeuvre pour favoriser l'élimination des polyphénols dans les eaux résiduaires, caractérisé en ce que lton utilise le talc. 11/ - Procédé selon l'une des revendications 6, 7, 8 ou 9 mis en oeuvre pour favoriser l'élimination des phénols ou dérivés phénoliques dans les eaux résiduaires, caractérisé en ce que l'on utilise du talc calciné comme substance talqueuse. 12/ - Procédé selon l'une des revendications 6, 7, 8 ou 9, caractérisé en ce que l'on traite les eaux résiduaires en utilisant d'abord le talc calciné puis le talc. 13/ - Procédé d'épuration selon la revendication 12, caractérisé en ce que, à la fin de la catalyse enzymatique, on ajoute une nouvelle quantité de talc en vue d'accroltre l'adsorption des polyphénols formés et leur séparation lors de la filtration. 14/ - Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que - l'on ajoute la nouvelle quantité de talc au terme d'une durée comprise entre 20 minutes et 180 minutes après mise en présence des produits, - l'on laisse ensuite l'adsorption des polyphénols formés se produire pendant une durée comprise entre 15 minutes et 60 minutes.