FR 2665447 A1 19920207 FR 9009829 A 19900801 La présente invention se rapporte à un procédé de purification d'une protéine produite par une bactérie, sous forme de corps d'inclusion insolubles. Elle se rapporte en particulier à la purification d'une protéine produite chez Escherichia coli, notamment d'une protéine produite par génie génétique. La technologie des ADN recombinants permet d'obtenir chez E. Coli l'expression de nombreuses protéines hétérologues. Ces protéines sont produites en grande quantité, mais sous forme insoluble. En effet, elles sont précipitées sous forme d'agrégats appelés corps d'inclusion. On a ainsi pu produire par exemple l'hormone de croissance humaine, l'hormone de croissance bovine, des interférons, l'interleukine 2, des activateurs du plasminogène. En particulier, le gène codant pour la pro-urokinase (pro-UK) a pu être cloné et exprimé chez E. coli, (EP 365 894) La pro-urokinase représente la forme native monocaténaire de l'urokinase. L'urokinase est une enzyme du groupe des sérine-protéases connue pour ses propriétés thrombolytiques et fibrinolytiques. L'urokinase a donc trouvé une application importante en clinique, pour la dissolution des thrombus. Cependant l'urokinase, si son action est systémique, peut entrainer un risque hémorragique aux doses couramment employées en thérapeutique. On sait que le système enzymatique de fibrinolyse est placé sous la dépendance du plasminogène, qui peut être activé en plasmine, la plasmine catalysant la dégradation de la fibrine. On distingue les inhibiteurs de la plasmine, comme l'alpha 2 anti-plasmine et les activateurs du plasminogène. La régulation est effectuée grâce à des interactions moléculaires entre le plasminogène, les activateurs du plasminogène et la fibrine. Parmi les activateurs du plasminogène, l'urokinase double chaîne présente une forte affinité pour le plasminogène qu'elle peut activer même en l'absence de fibrine. Ceci la différencie de la pro-urokinase, qui présente également une forte affinité, mais ne semble activer le plasminogène qu'en présence de fibrine, d'où une relative spécificité pour les caillots de fibrine.Cette absence d'activité systémique rend l'utilisation de la pro-urokinase particulièrement intéressante en thérapeutique. La pro-urokinase a tout d'abord été isolée dans l'urine humaine et à partir de différentes cultures cellulaires, mais le gène responsable de son expression a pu être isolé et cloné, pour l'obtention de la protéine recombinante. La production de protéines recombinantes par des bactéries, en particulier par E. coli, se heurte à un problème de purification. En effet, la protéine est secretée au sein de corps d'inclusion, insolubles. Classiquement, on va d'abord concentrer les cellules microbiennes à partir du milieu de culture, par centrifugation ou ultrafiltration. La membrane des cellules est rompue par broyage mécanique ou sonication ou traitement enzymatique et les corps d'inclusion sont récoltés par centrifugation. Lors de cette centrifugation, le surnageant contient les constituants solubles de la bactérie. Mais la fraction particulaire ainsi recueillie, ou pellets, contient outre les corps d'inclusion renfermant les protéines recombinantes, des cellules non broyées, des débris cellulaires et des contaminants protéiques, solubles ou non. Les pellets bruts sont ensuite lavés. Ce lavage est réalisé par une solution tampon aqueuse, afin d'éliminer les contaminants solubles. Toutefois, ceci implique des étapes de mélange et de centrifugation supplémentaires, et ne peut être effectué aisément à grande échelle. Les protéines insolubles présentes dans les pellets sont ensuite mises en solution par dénaturation, en faisant varier la composition du milieu. Ainsi, dans US 4 694 073, la somatotropine recombinante est solubilisée par addition d'urée et/ou de diméthylsulfone. US 518 526 propose comme solution de dénaturation une solution contenant par exemple du chlorhydrate de guanidine, de l'urée, du SDS ou du Triton. Les composés insolubles doivent ensuite être éliminés par centrifugation, ce qui donne des résultats imparfaits. La protéine est ensuite renaturée par suppression des agents dénaturants dans son environnement ; ceci est réalisé en diluant la solution de dissolution. On peut ensuite procéder à des étapes de purification ultérieures par chromatographie d'échange d'ions ou filtration sur gel. C'est pourquoi la présente invention concerne un procédé de purification d'une protéine secrétée sous forme de corps d'inclusion insolubles par une bactérie, caractérisé en ce que a) on récolte les corps d'inclusion sous forme de pellets par broyage des cellules microbiennes et centrifugation, b) on met les pellets en suspension avec une solution de substance hydrosoluble pouvant être gélifiée, c) on injecte goutte à goutte le mélange des pellets et de la solution de substance hydrosoluble, dans une solution de gélification, par exemple une solution contenant des cations multivalents, réalisant ainsi l'encapsulation des pellets dans la substance gélifiée, d) on met les pellets encapsulés en présence d'une solution de dissolution contenant au moins un agent chaotropique et éventuellement un agent réducteur, e) on obtient la protéine dénaturée et purifiée en solution. Certaines protéines, en particulier les protéines hétérologues dont le gène est introduit dans le génôme de la bactérie sont maturées par celle-ci sous forme de corps d'inclusion. Ces corps d'inclusion, qui présentent un indice de réfraction les différenciant, forment des agrégats insolubles dans le cytoplasme. Afin de récupérer la protéine sous forme purifiée, il faudra tout d'abord isoler les corps d'inclusion. Pour cela on réalise un broyage mécanique des cellules microbiennes, préalablement concentrées par centrifugation, microfiltration ou ultrafiltration. Après le broyage, une centrifugation de 4 000 à 5 000 g permet de séparer les pellets qui sont remis en suspension dans une solution tampon ; en particulier, on peut utiliser du tampon Tris- HC1 10 mM, pH 8,5. De préférence, l'ensemble de ces étapes est conduit à une température proche de 4"C, afin d'inhiber les protéases pouvant être présentes dans la préparation. La suspension des pellets dans une solution d'une substance hydrosoluble pouvant être gélifiée peut être réalisée par mélange d'une solution de cette substance avec la suspension de pellets. Elle peut également être réalisée en ajoutant cette substance sous forme de poudre à la suspension de pellets. Par substances hydrosolubles pouvant être gélifiées, on entend des substances qui, sous l'effet d'une solution de gélification par exemple d'une solution présentant un certain pH ou par exposition à des cations multivalents, vont donner une masse conservant sa forme, essentiellement sous forme de gouttelettes solides. Parmi ces substances, on peut citer les gommes de polysaccharide naturelles comme la pectine et les alginates de métal alcalin. Les substances préférées sont les alginates, en particulier l'alginate de sodium. Ces alginates de métaux alcalins sont gélifiés en présence de cations multivalents, en particulier par injection goutte à goutte dans une solution contenant un cation multivalent, notamment dans une solution de chlorure de calcium. L'ion de métal alcalin est remplacé par échange par un ion multivalent et la substance, en se gélifiant, va encapsuler les pellets. Cette capsule est formée d'un gel réticulé, qui emprisonne les composes insolubles. Mais cette capsule reste perméable aux substances en solution. C'est pourquoi l'étape suivante va consister à dénaturer les protéines présentes sous forme insoluble. Pour cela, les pellets encapsulés sont mis en présence d'une solution de dissolution. Cette solution contient au moins un agent chaotropique, dont le rôle est de provoquer la dissociation des protéines en altérant leur configuration spatiale ou leur conformation ; la solution peut contenir également au moins un agent réducteur, qui va rompre les ponts disulfures des protéines. Parmi les agents chaotropiques, on peut citer l'urée et le chlorhydrate de guanidine. L'un des agents préférés est le chlorhydrate de guanidine 6M. Parmi les agents réducteurs, on peut citer le 2-mercaptoéthanol et le dithiothreitol. Un agent préféré est le 2-mercapto-éthanol 50 mM. Par action de cette solution de dissolution, les protéines dénaturées sont solubilisées et libérées des particules encapsulées. Les protéines passent à l'extérieur de la capsule, alors que les contaminants insolubles restent emprisonnés. La capsule doit résister au milieu dénaturant. Dans les étapes suivantes, la protéine va être renaturée. Pour cela, après élimination des particules insolubles, on va diluer progressivement la solution par addition de tampon. La concentration en agents dénaturants décroit donc et la protéine se renature avec un excellent rendement. Le rendement de récupération de la protéine est proche de 100 %. On procède ensuite à la purification finale de la protéine, par chromatographie d'échange d'ions et chromatographie hydrophobe. Cette technique est reproductible et facilement extrapolable à grande échelle. Elle rend inutile l'étape de centrifugation de la solution de dissolution, l'élimination des composés insolubles étant réalisée par encapsulation. L'encapsulation des pellets permet d'effectuer plus facilement leur lavage. La présente invention concerne donc un procédé de purification tel qu'il a été défini, caractérisé en ce qu'on lave par une solution tampon les pellets encapsulés, avant de réaliser l'étape de dissolution. De manière préférée, on utilise une solution tampon Tris- HC1 10 mM, pH 8,5 contenant 0,1 96 de Triton X-100 dans laquelle on laisse incuber les pellets encapsulés, sous agitation douce, à basse température (4 - 6"C). Cette étape permet l'élimination des composés solubles, et les pellets encapsulés sont remis en suspension dans du tampon avant d'être mis en présence de la solution de dissolution. Les pellets bruts obtenus après broyage et centrifugation des cellules microbiennes peuvent être lavés avant d'être encapsulés. L'invention se rapporte également à un procédé de purification d'une protéine secrétée sous forme de corps d'inclusion, caractérisé en ce qu'on lave et on homogénéise les pellets avant de réaliser la suspension. En particulier, les pellets peuvent être lavés par du tampon Tris- HCl 10 mM, pH 8,5 contenant 0,1 % de Triton X-100. Les pellets lavés sont concentrés par microfiltration et remis en suspension dans du tampon Tris- HCl 10 mM, pH 8,5. La présente invention se rapporte à un procédé de purification d'une protéine, caractérisé en ce que la protéine est secrétée par une souche d'Escherichia coli. En effet, on a pu sélectionner des souches de cette bactérie particulièrement aptes à produire des protéines. Ces protéines peuvent se trouver secrétées sous forme de corps d'inclusion. E. coli est un hôte de choix pour le clonage de gènes. C'est pourquoi la présente invention se rapporte à un procédé de purification d'une protéine caractérisé en ce que la protéine est une protéine recombinante, produite par E. coli. On peut introduire chez E. coli le gène de nombreuses protéines, dans un vecteur d'expression fonctionnel dans la bactérie. Notamment, la présente invention concerne un procédé de purification d'une protéine, caractérisé en ce que la protéine secrétée par E. coli est la pro-urokinase recombinante (pro-UK). Le tableau suivant montre un mode de mise en oeuvre du procédé optimisé de purification et de renaturation de la pro-urokinase. Etape volume protéine temps litres grammes heures Fermentation 300 12 Centrifugation (pâte cellulaire) 75 - 4 3 passages en homogénéiseur (broyage 300 - 5 mécanique des cellules) Centrifugation (pellets) 30 1000 4 Concentration par microfiltration 5 500 2 Encapsulation de pellets dans des particules d'alginate de calcium, 7 350 10 étapes de lavage et de filtration Dissolution des pellets dans un mélange de guanidine-HCl 6M et 50 300 15 de 2-mercaptoéthanol 50mM, tampon Tris-HCl l0mM, pH 8,5 (4"C) 1 ère procédure de dilution de la solution 300 300 1 de dissolution dans de l'urée 6,5 M tampon Tris-HCl l0mM pH 8,0, EDTA 5mM (15 C) 2ème procédure de dilution avec du tampon Tris-HCl l0mM, pH 8,0, EDTA 1250 300 14 5mM (15"C) 67 L'efficacité de la renaturation de la pro-urokinase est déterminée en traitant la pro-UK par la plasmine de façon à obtenir l'urokinase, puis en mesurant l'activité de l'urokinase sur le substrat L-pyroglutam yl-glycyl-L-arginine-p-nitroanilide, la plasmine étant alors inhibée par l'aprotinine. Les protéines sont dosées par le réactif de Bradford. EXEMPLE 1 ENCAPSULATION DE PELLETS DANS DES PARTICULES D'ALGINATE DE CALCIUM La préparation de pellets utilisée a été lavée 2 fois avec du tampon Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 contenant du Triton X-100 à 0,1%. 15 ml de pellet sont mélangés avec 2,5 ml de tampon Tris HCl pH 8,5, 10 mM et 17,5 g d'alginate de sodium à 40 g/l dans l'eau. Ce mélange est ensuite injecté goutte à goutte dans 200 ml d'une solution de chlorure de calcium 100 mM à 4"C. La gélification conduit à des particules de 1 mm de diamètre environ. La quantité de particules correspondant à 5 ml de pellet est incubée pendant 18 heures à 4"C sous agitation douce intermittente, dans 125 ml de solution standard de dissolution. Cette solution contient du chlorhydrate de guanidine 6 M et du 2-mercapto-éthanol 50 mM. Après renaturation, on mesure l'activité de la pro-urokinase obtenue. Des pellets de contrôle sont soumis à une procédure standard de dissolution et de renaturation, sans encapsulation. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 1. Tableau 1 Solution de dissolution Protéine Protéine Activité Activité Activité totale pro-UK totale spécifique mg/ml mg U/ml U U/mg Pellet encapsulé 0,22 687 1 400 4 380 000 6 400 Pellet non encapsulé contrôle 0,24 750 760 2 380 000 3 200 U : quantité d'enzyme qui libère 0,1275 nanomole de nitroaniline à partir de L-pGLU-GLY-ARG-p-nitroanilide (S-2444, Kabi-Vitrum, Suède), par à 37 C, pH 8,8. EXEMPLE 2 ENCAPSULATION DE PELLETS DANS UN GEL D'ALGINATE DE CALCIUM, LAVAGE DES PELLETS ENCAPSULES, DISSOLUTION ET RENATURATION SUCCESSIVES DE LA PRO-UROKINASE Les matériaux insolubles (cellules, débris cellulaires, corps d'inclusion...) peuvent facilement être encapsulés dans un gel d'alginate de calcium. Cette méthode a été utilisée afin d'évaluer la possibilité de remplacer certaines étapes de centrifugation par de simples lavages des pellets encapsulés. I1 faut noter qu'une procédure spéciale de lavage peut facilement être introduite (en utilisant du chlorhydrate de guanidine, en particulier). - Préparation de pellets lavés sans opération d'encapsulation 10 g de pellets (teneur en protéine : 60 %) ont d'abord été centrifugés à 4"C (10 min, 10 000 rpm). Le culot obtenu a été lavé 2 fois avec du tampon Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 contenant du Triton X-100 à 0,1 ob. Le culot ensuite obtenu a finalement été mis en suspension dans le même tampon ne contenant pas le Triton X-100 (masse finale de la suspension 10 g). - Encapsulation des pellets et lavage des pellets encapsulés 10 g de pellets (non lavés ; teneur en protéine : 60 -Ó) ont été mélangés avec 3,3 g d'une solution d'alginate de sodium à 4 %. L'opération d'encapsulation a été réalisée comme précédemment décrit. Les pellets encapsulés ont été ensuite lavés une fois avec du tampon Tris-HCl 10 mM, pH 8,5, contenant du Triton X-100 à 0,1 ó. La suspension de pellets encapsulés lavés a été mélangée avec la solution contenant la guanidine et l'agent réducteur dans la proportion de 1 g de préparation initiale pour 5,75 ml de solution. Ainsi, pour lg de préparation de pellets initiale, le volume de solution de dissolution est de 6,75 ml pour les pellets non encapsulés et de 5,4 ml pour les pellets encapsulés. Tableau 2a : Lavage des pellets encapsulés et non encapsulés Quantité Protéines, mg initiale de protéines, mg 1 er lavage 2ème lavage Pellets encapsulés 720 76 Pellets non encapsulés 720 85 90 Tableau 2b :Composition de la solution de renaturation Protéines Protéines Volume Activité Activité Activité totales pro-UK totale spécifique mg/ml mg ml U/ml U U/mg Pellet 0,26 351 1 350 1 860 2 511 000 7 200 encapsulé Pellet non 0,24 405 1 687 700 1 181 000 2 900 encapsulé Tableau 2c : Comparaison de la récupération de l'activité pro-UK et des protéines récupérées, selon que les pellets sont encapsulés ou non. Activité Protéines pro-UK % Récupération par rapport Récupération à la quantité relative introduite % % Pellets encapsulés 49 87 213 Pellets non encapsulés 56 100 100 Ces résultats mettent en évidence que, en plus de la rétention de composés non solubilisés lors de l'opération de dissolution, l'encapsulation de pellets dans un gel d'alginate de calcium présente l'avantage de permettre un lavage efficace des pellets avant dissolution sans nécessiter des opérations lourdes de centrifugation. EXEMPLE 3 : DISSOLUTION DE PELLETS EN UTILISANT DES LOTS SUCCESSIFS DE CHLORHYDRATE DE GUANIDINE 5 ml de suspension de pellets sont mélangés avec 2,5 ml de tampon Tris- HCl, 10 mM, pH 8,5. Cette solution est ajoutée à 7,5 ml d'alginate de sodium SG-500 à 4 % (p/v) (Mero-Rousselot-Satia, France). Après homogénéisation, le mélange d'alginate de sodium et de pellets est injecté goutte à goutte dans une solution de chlorure de calcium 100 mM à 4"C. Après agitation douce des particules ou billes dans la solution de chlorure de calcium pendant 15 mn, les pellets encapsulés sont lavés deux fois en utilisant du tampon Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. Les pellets encapsulés sont introduits dans 125 ml de la solution standard de dissolution. Après une première période de dissolution d'une durée de 9 heures à 20"C, la solution de chlorhydrate de guanidine est éliminée et on procède à un deuxième lot de dissolution dans les mêmes conditions. L'activité et l'activité spécifique de la pro-UK sont rapportées dans le tableau 3. Le total des unités de pro-UK récupérées après encapsulation des pellets dans des particules d'alginate de calcium est largement supérieur à la pro-UK récupérée avec la procédure standard (+ 180 %). L'activité spécifique de cette préparation est trois fois plus élevée que celle de la solution standard. Une électrophorèse (SDS-PAGE) du premier lot de dissolution montre une bande correspondant à un poids moléculaire de 30 kD d'intensité plus faible que celle obtenue avec la procédure standard de dissolution. TABLEAU 3 : DISSOLUTION DE PRO-UROKINASE DANS DU CHLORHY DRATE DE GUANIDINE 6 M ET 2-MERCAPTO-ETHANOL 50 mM APRES ENCAPSULATION DES PELLETS DANS UN GEL D'ALGINATE DE CALCIUM. ESSAI STANDARD Solution de Activité Activité dissolution Activité Protéine spécifique Activité Protéine spécifique U/ml mg/ml U/mg U/ml mg/ml U/mg. 1 420 1ère étape 1 060 de 1 470 510 dissolution ----- 860 1 320 0,125 10 560 560 -- 640 0,19 3 370 350 2ème étape 530 de 620 disolution -- 500 0,05 10 000 Activité Activité Activité Proteiné spécifique Activité Protéine spécifique Total U mg U/mg U mg U/mg récupéré (5 ml pellet) 5 686 000 547 10 400 2 000 000 594 3 370 EXEMPLE 4 DISSOLUTION DE PRO-UK EN UTILISANT DES PARTICULES D'ALGINATE DE CALCIUM DANS UNE COLONNE 7 ml de sus pension de pellets sont mélangées avec 2,5 ml de tampon Tris 10 mM, pH 8,5. Cette solution est mélangée avec 7 ml d'alginate de sodium SG-500 à 4 % (p/v) à 4"C. La procédure a été alors identique à celle utilisée dans l'exemple 3. Les particules d'alginate de calcium ont été introduites dans une colonne de 1,5 x 9 cm. La colonne est alimentée avec une solution standard de dissolution à un débit de 22 ml par heure pendant les six premières heures puis à 5 ml par heure pendant les six heures suivantes. L'expérience est menée à 40C. Le contenu en protéines est suivi dans l'éluent en mesurant continuellement l'absorbance à 280 mn. Les résultats sont rapportés dans les tableaux 4 et 5. Seulement 50 % des protéines sont éluées de la colonne d'alginate de calcium à cause des faibles vitesses de diffusion entre le gel et la solution de dissolution (Tableau 5). TABLEAU 4 : DISSOLUTION DE PRO-UK DANS DU CHLORHYDRATE DE GUANIDINE 6 M ET 2- MERCAPTO-ETHANOL 50 mM APRES ENCAPSULATION DES PELLETS DANS UN GEL D'ALGINATE DE CALCIUM. Praction contenant Volume Activité Activité Protéine Protéines Activité la protéine ml U/ml totale mg/ml totales spécifique U mg U/mg 1 22 1260 693000 0,10 33 12600 2 30 1430 1072000 0,11 82 13000 3 22 1210 665000 0,10 35 12100 4 22 890 490000 0,10 55 8900 5 22 880 484000 0,10 55 8800 6 11 1190 327000 0,12 33 9900 7 10 1110 227000 0,15 37 7400 8 11 1100 303000 0,12 33 9200 Total 150 1150 4311000 0,11 405 10640 Témoin 175 1100 4812000 0,18 788 6110 TABLEAU 5: RECUPERATION DE PRO-UK APRES ENCAPSULATION DE PELLETS DANS UN GEL D'ALGINATE DE CALCIUM ET DISSOLUTION DE PRO-UK DANS UNE COLONNE A LIT FIXE Volume de Activité Pro-UK Protéine Activité solution de spécifique dissolution ml U % mg % U/mg Essai 150 4 311 000 89 405 51 10 640 Témoin 175 4 812 000 100 788 100 6 110 REVENDICATIONS 1) Procédé de purification d'une protéine secrétée sous forme de corps d'inclusion insolubles par une bactérie, caractérisé en ce que a)on récolte les corps d'inclusion sous forme de pellets par broyage des cellules microbiennes et centrifugation, b) on met les pellets en suspens ion avec une solution de substance hydrosoluble pouvant être gélifiée, c) on injecte goutte à goutte le mélange des pellets et de la solution de substance hydrosoluble, dans une solution de gélification, réalisant ainsi l'encapsulation des pellets dans la substance gélifiée, d) on met les pellets encapsulés en présence d'une solution de dissolution contenant au moins un agent chaotropique et éventuellement un agent réducteur, e) on obtient la protéine dénaturée et purifiée en solution. 2) Procédé de purification selon la revendication 1, caractérisé en ce que on lave par une solution tampon les pellets encapsulés avant de réaliser l'étape de dissolution e). 3) Procédé de purification selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on lave les pellets avant de réaliser la suspension de l'étape b). 4) Procédé de purification selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la substance hydrosoluble pouvant être gélifiée est de l'alginate de sodium. 5) Procédé de purification selon l'une des revendications I à 4, caractérisé en ce que la solution de gélification contient des cations multivalents. 6) Procédé de purification selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la solution de gélification est une solution de chlorure de calcium. 7) Procédé de purification selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'agent chaotropique est choisi parmi l'urée et le chlorydrate de guanidine. 8) Procédé de purification selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le composé réducteur est le 2 mercapto-éthanol. 9) Procédé de purification selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la protéine est secrétée par une souche d'E. coli. 10) Procédé de purification selon la revendication 9, caractérisé en ce que la protéine secrétée est une protéine recombinante. 11) Procédé de purification selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que la protéine secrétée est la pro-Urokinase. 12) Procédé de purification selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les pellets encapsulés sont introduits dans une colonne à lit fixe avant d'être mis en présence de la solution de dissolution.