FR 2673291 A1 19920828 FR 9102575 A 19910227 La présente invention concerne un procédé d'authentification de l'origine d'un produit constitué d'un mélange de composés organiques par marquage isotopique. La mise sur le marché, après de nombreuses et onéreuses études de certains mélanges de composés organiques, fabriqués industriellement, pose souvent des problèmes au niveau de la commercialisation. En effet, nombreux sont les produits qui sont rapidement victimes d'essais de contretypage, spécialement quand ils rencontrent un succès commercial. Il est souvent difficile de lutter contre ces tentatives de contrefaçon, par manque de moyens permettant de différencier avec sécurité le produit d'origine du produit contrefaisant et assurant une authentification du produit d'origine. Il serait également intéressant de pouvoir repérer, sur un produit fini, quand et dans quelles conditions il a été fabriqué et, pour cela de disposer d'un procédé de marquage fiable et infalsifiable des différents lots de fabrication. On sait d'autre part que l'élément carbone est un élément présent dans toutes les matières organiques et tout spécialement dans toutes les molécules constituant la matière vivante. Le carbone possède deux isotopes naturels stables non radioactifs : le 12C et le 13c et un isotope naturel émetteur de rayonnements bêta, le 14C. L'abondance relative des deux isotopes naturels non radioactifs (environ 98,92 % pour le 12C et environ 1,08 % pour le 13C), varie dans les molécules carbonées d'origine naturelle en fonction d'un certain nombre de paramètres tels que le mode de production : vole végétale ou voie microbiologique. D'autre part, pour une même origine d'espèce (qu'elle soit végétale, microbienne ou autre), différents facteurs environnementaux : géographiques, dimatiques...peuvent conduire à des modifications de la répartition isotopique D'infimes différences dans les rapports 12CO13C ont donc une signification réelle et peuvent révéler une origine et il est bien évident que la mesure de la variation de ce rapport isotopique, & un très haut niveau de sensibilité, sur un élément présent dans toutes les molécules fait de la connaissance de ce rapport C/13C un outil universel de traçage des molécules organiques. La mesure de ce rapport consiste å compter dans un échantillon de molécules pures le nombre des atomes de l'isotope 13 et le nombre des atomes de l'isotope 12 du carbone. Pour ce faire il faut ramener les molécules complexes à l'état de molécule monocarbonée, le C02 dont on peut compter le nombre de chaque isotopomère. L'analyse isotopique par spectrométrie de masse isotopique ou IRMS (isotope ratio mass spectrometry) permet de faire ce dénombrement. Cette technique consiste à mesurer l'intensité des faisceaux d'ions correspondant aux isotopomères de C02 de masse: 4445 et 46 à l'aide d'un spectromètre de masse à champ fixe et collecteurs multiples (un par faisceau d'ions). Cette mesure d'intensité des faisceaux d'ions permet de calculer le rapport 13C112C. Les différentes phases de la détermination de ce rapport isotopique sont donc les suivantes - transformation de la molécule organique en CO2 - isolement et purification du C02 - mesure du rapport isotopique iSCi 2C sur le C02 ainsi purifié. La mesure de ce rapport isotopique a déjà permis de déterminer avec certitude tant l'origine géographique de différents produits naturels que les altérations qui ont pu y strie apportées frauduleusement. C'est ainsi que J. DUNBAR et A.T.Wilson dans Analytical Chemistry, vol 54, 3,Mars 1982, 59~592 ont pu déterminer l'origine géographique de la caféine par analyse des isotopes stables. Une analyse isotopique du même type (J. Agaric. Food Chem. 1987, 35, 758 760) a permis de déceler, dans du lus d'oranges, l'introduction frauduleuse de sucre. D.A. Krueger et H.W. Krueger dans Jal of Agricultural and Food Chemistry, 1985, 33, 323-325 précisent que l'on a souvent essayé de falsifier les extraits de vanille par de la vanilline synthétique dérivée de la lignine. Cette falsification pouvait toutefois autre fadement détectée par analyse isotopique, le rapport 13c/l2C du carbone dans la vanilline provenant de la vanille naturelle différant de celui provenant de la vanilline synthétique, dérivée de la lignine ou d'autres sources. Les fraudeurs ont essayé de masquer cette falsification en ajoutant à la vanilline dérivée de la lignine de la vanilline enrichie en 13C, spécialement par utilisation de (méthyl- 13C) vanilline comme source d'excès de l3C. La présente invention s'est donné pour objet de proposer un procédé permettant d'obtenir une signature isotopique non radioactive, discrète et caractéristique d'un produit constitué d'un mélange de composés organiques. On utilise pour ce faire les procédés d'analyse isotopique mentionnés ci avant et spécialement la spectrométrie de masse isotopique qui permet de mesurer les valeurs du rapport 13CI 12C dans des molécules organiques transformées en CO. La valeur de ce rapport permet, comme on l'a déjà vu, d'authentifier l'origine et les caractéristiques d'une molécule donnée. L'originalité du procédé selon l'invention consiste à procéder en premier lieu à une analyse séparative du mélange de composés organiques constituant le produit, & répérer une ou plusieurs molécules caractéristiques, à mesurer l'abondance isotopique en 13C de cette ou de ces molécules et enfin à modifier l'enrichissement en 13C de cette ou de ces molécules par addition de la ou des mêmes molécules dont la richesse en 13C a été préalablement augmentée ou diminuée. Cette modification volontaire par ajout d'une ou de plusieurs molécules enrichies en 13C provoquant une variation voulue de la composition isotopique du mélange de composés organiques constituant un produit et notamment un produit obtenu industriellement permet donc de constituer une signature discrète, infalsifiable, parfaitement inoffensive (à la différence des produits soumis à un marquage radioactif)) et qui n'est détectable que par des moyens analytiques spécialisés et spécialement par spectrométrie de masse isotopique. Cette modification volontaire ne modifie en aucune façon les caractéristiques physiques, chimiques, organoleptiques du produit, non plus que son domaine d'action propre. La présente invention concerne également les produits industriels revêtus de la signature isotopique appliquée selon le procédé décrit ci-avant. Les différentes étapes du procédé selon l'invention vont maintenant être décrites. La première étape consiste à effectuer une analyse séparative du produit que l'on désire revêtir de la signature d'authentification. Cette analyse se fait par tout moyen connu en soi ; selon un mode de réalisation de l'invention on l'effectue par chromatographie en phase gazeuse. On peut ainsi effectuer une évaluation semiquantitative des composants préférés du marqueur potentiel. L'examen du chromatogramme permet en effet de repérer les pics les plus caractéristiques d'un ou de plusieurs constituants du mélange et de déterminer ceux qu'il pourrait être indiqué d'enrichir en 13C. L'étape suivante consiste à déterminer le profil GC-MS (chromatographie en phase gazeuse - spectrométrie de masse) du produit ; la comparaison des résultats obtenus avec des spectres de masse connus et référencés permet d'identifier les marqueurs probables. Dans la troisième étape, on détermine le profil isotopique 13C de l'échantillon gazeux contenant du C02 issu du produit à marquer par GC-IRMS (chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse isotopique). Cette obtention du profil isotopique permet alors de choisir la ou les molécules susceptibles de servir de marqueurs préférentiels que l'on enrichira en 13ce Le ou les marqueurs sélectionnés (il peut s'agir de produits du commerce) sont ensuite ajoutés au produit ; une chromatographie gazeuse du produit marqué permet de contrôler l'intégrité du produit marqué par rapport au produit original. Enfin, la détermination du profil isotopique 13C du produit marqué permet de contrôler la signature isotopique. Le dessin annexé, donné a titre d'exemple, permettra de mieux comprendre l'invention, les caractéristiques qu'elle présente et les avantages qu'elle est susceptible de procurer: Fig. 1 est le chromatogramme en phase gazeuse d'un produit que l'on désire authentifier Fig. 2 est le profil du produit, obtenu en couplant les résultats de chromatographie gazeuse et de spectrométrle de masse Fig. 3 est le profil isotopique 13C du produit en spectrométrie de masse isotopique Fig. 4 est le chromatogramme en phase gazeuse du produit marqué 15C Fig. 5 est le profil isotopique 13C en spectrométrie de masse isotopique du produit marqué obtenu Sur le chromatogramme représenté à la figure 1 on a porté en ordonnées les intensités (I) et en abscisses les temps de rétention (T).On voit sur ce chromatogramme de nombreux pics caractéristiques qui permettent de procéder à une évaluation semi-quantitative des composants préférés pour le marquage et de déterminer parmi les différentes molécules constituantes du produit celle ou celles qu'il pourra être indiqué d'enrichir en 13C. La détermination du profil couplé : chromatographie gazeuse, spectrométrie de masse (GS-MS) est représentée à la figure 2 : les intensités (I) sont portées en ordonnées et les masses atomiques (M) en abscisses. Cette détermination permet, en se référant aux données connues et publiées, de reconnalire parmi d'autres, dans le cas du produit étudié, les molécules suivantes, : (A) acétate de benzyl, (B) dtronellol, (C) héliotropine, (D) anthranilate de méthyl, (E) eugénol. Le système GC-MS permettant d'effectuer cette détermination est composé d'un chromatographe gazeux capillaire et d'un détecteur sélectif de masse, tous deux contrôlés par ordinateur. La colonne est une colonne en silice fondue (30 m de long et 0,25 mm de diamètre intérieur), revêtue d'une phase stationnaire en méthylsilicone (épaisseur: 0,12 fi ). La colonne est reliée directement au spectrophotomètre de masse. Le profil isotopique 13C du produit est ensuite déterminé par couplage de chromatographie gazeuse et de spectrométrie de masse isotopique; les résulttats sont rassemblEs a la figure 3 où sont portées, en ordonnées le rapport (8 01au) des variations en 13C de l'échantillon étudié par rapport à un échantillon C02 de référence et en abscisses les temps de rétention. Ce profil est déterminé sur un spectromètre VG lsochrom Il tel que celui décrit par P.A. Freedeman, E.C.P. Gillyon, E.J. Jumeau dans International Laboratory, 7-8 (1988) 22-29. Dans cet appareil, les composants du mélange organique constituant le produit sont séparées par chromatographie en phase gazeuse sur une colonne capillaire sans dérivation. Une fois passés dans la colonne de chromatographie, ils pénètrent dans une four à combustion CuO porté à 80onc où les composants organiques sont transformés en C02.. Le spectromètre de masse isotopique détermine alors l'enrichissement en 15C de chaque composé par les mesures du rapport 13C112C du C02 généré à partir de chaque composé du mélange Il s'agit d'un spectromètre de masse à champ fixe mesurant l'intensité des ions issus d'un échantillon gazeux contenant du C02, grFce à trois collecteurs indépendants réglés sur les masses : 44 - 45 - 46. Pour obtenir des mesures exactes, l'abondance en 13C est mesurée par rapport à un échantillon de C02 de référence dont l'abondance en t 5C est connue avec précision. Une fois ce choix effectué, (acétate de benzyl par exemple dans le cas représenté aux figures) et le taux d'enrichissement ou d'apauvrissement en 13C déterminé, on ajoute du 13C acétate de benzyl au produit en quantité variable de 1 -2-5-lOppm. La figure 4 représente le chromatogramme gazeux du produit marqué et l'on constate que la répartition et la forme générale des pics n'a pas varié par rapport aux résultats portés a la figure 1. Enfin (fig. 5), la mesure, en spectromètrie de masse isotopique, de l'abondance isotopique du produit d'origine marqué au 13C acétate de benzyl permet de contrôler la signature isotopique appliquée audit produit. Cette mesure est exprimée en 80100 comme dans la figure 3 et constitue la signature isotopique du produit. On voit à la figure 5 les résultats différents obtenus en faisant varier la quantité de marqueur 13C (1 ppm, 2 ppm, 5 ppm et 10 ppm). La sensibilité du dosage est telle que, pour certains composés & l'échelle de 10 ppm, il est possible de réaliser 20 marquages différents. La sélection de trois composants permettrait alors d'assurer 8000 références. Il convient de noter que, pour un analyste non informé exactement du choix et de la dose des marqueurs, il est impossible d'identifier les éléments marqués par chromatographie, même si celle-ci est suivie d'une spec trographie de masse. La même source de marquage peut bien entendu être employée pour plusieurs produits industriels. Il est bien évident que, sans sortir du cadre de l'invention, la transformation du ou des composés organiques en C02 peut se faire par tout processus autre que la combustion, et notamment par réaction chimique, biochimique, enzymatique. Ouand le produit & authentifier se présente directement sous forme de C02, le processus analytique débute par une étape d'i8dement-purification et le C02 passe directement dans le spec trimètre de masse isotopique. Il peut par exemple s'agir de l'air expiré par un être vivant. L'échantillon gazeux peut aussi provenir d'effluents ou de résidus atmosphériques de réacteurs chimiques ou biotechndogiques dont un constituant de réac tion est transformé en CO2. De même un substrat peut être métabolisé par un système enzymatique de telle sorte que l'un des atomes de carbone soit transformé en C02. Dans tous ces cas, on peut alors modifier, par addition d'un marqueur comme mentionné plus haut, l'enrichissement naturel en 13C du substrat sur ce site carboné. La présente invention permet d'agir sur de nombreux marqueurs par enrichissement ou appauvrissement en 13C et établir ainsi une scare de visite" du produit ou du lot de produit & étudier. Le procédé selon l'invention trouve de nombreuses applications tant dans le marquage de lots de produits industriels, que dans le contrôle ou le diagnostic de processus chimiques ou biochimiques se déroulant dans des systèmes in vivo, in vitro, ex vivo ou synthétiques appartenant aux règnes animal, végétal ou minéral. On peut citer, par exemple, le traçage, avec des abondances très faibles en 15C et sur des échantillons très petits, des acides aminés par réaction avec la ninhydrine, suivi d'une mesure de l'enrichissement du C02 résultant de la réaction et d'une modification volontaire de la teneur en 13C par introduction d'un marqueur dans le substrat. Dans le cas d'air expiré par un être vivant, il est possible de suivre l'évolution d'un substrat marqué au l5C et dont le site marqué est oxydé in vivo sous forme de C02. REVENDICATIONS 1 - Procédé d'authentification de l'origine d'un produit constitué d'un mélange de composés organiques par marquage isotopique caractérisé en ce qu'il consiste à procéder à une analyse séparative du mélange de composés organiques constituant le produit, à repérer une ou plusieurs molécules caractéristiques du mélange, à mesurer l'abondance isotopique en 13C de cette ou de ces molécules et enfin a modifier l'enrichissement en 13C de cette ou de ces molécules par addition de molécules similaires mais dont la richesse en 13C a été préalablement augmentée ou diminuée. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'analyse séparative du mélange de composés organiques constituant le produit est effectuée en chromatographie gazeuse. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la ou les molécules caractéristiques sont repérées par un couplage chromatographie en phase gazeuse - spectrométrie de masse du produit. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la mesure de l'abondance isotopique en 13C est effectuée par spectrométrie de masse isotopique sur les ions issus d'un échantillon gazeux contenant du C02. 5 - Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que la mesure de l'abondance isotopique en 13C est effectuée sur du C02 résultant de la combustion de la ou des molécules organiques. 6 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la mesure de l'abondance isotopique en 13C est effectuée sur du C02 résultant d'une transformation chimique, biochimique ou enzymatique de la ou des molécules organiques. 7 - Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 & l'authentification d'un produit industriel 8 - Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 au contrôle des réactions chimiques, biochimiques ou enzymatiques se déroulant dans des systèmes vivants.