FR 2662082 A1 19911122 FR 9006292 A 19900515 La présente invention concerne de nouveaux dérivés de médiateurs endogènes, leurs sels, leur procédé de préparation et leurs applications notamment à lianalyse des médiateurs endogènes, l'analyse ou la purification des récepteurs desdits médiateurs, la visualisation de leurs sites récepteurs, la préparation d'anticorps et l'utilisation desdits anticorps pour l'analyse des médiateurs endogènes. Les messages entre les cellules sont transmis grace à des vecteurs chimiques (hormone ou neuromédiateur) dont la spécificité est assurée par la protéine cible : le récepteur. Les molécules porteuses de l'information peuvent être des peptides ou des molécules de faible poids moléculaire. Parmi celles-ci, un certain nombre présentent simultanément une ou plusieurs fonctions hydroxyle et une ou plusieurs fonctions amine, par exemple les indolamines, les catécholamines (neuromédiateurs) et la thyroxine (hormone) Ces molécules jouent un rôle primordial dans la physiologie : les indolamines et les catécholamines dans l'intégration de l'information dans le système nerveux central et la thyroxine dans la régulation du métabolisme basal. I1 est essentiel d'en assurer le dosage de façon à affiner les diagnostics ou à aider les recherches fonctionnelles.Dans le cas des neuromédiateurs, les sites de liaison des récepteurs assurent la spécificité de la réponse de la cellule effectrice : la modification chimique ponctuelle des ligands endogènes permet de différencier les divers types et sous-types de récepteurs membranaires. Certaines hormones sont présentes au niveau sérique sous forme liée à des protéines porteuses. Ces protéines assurent le transport de ces hormones du lieu de synthèse aux cellules-cibles. Les hormones thyroïdiennes sont présentes sous forme non liée à des taux inférieurs à 1 ns de la quantité totale d'hormones (libre + liée). La modification chimique ponctuelle des hormones thyroïdiennes permet d'améliorer leur dosage. Les Demandeurs ont découvert que l'on peut atteindre ces objectifs grâce à une 0-carboxyméthylation sur le groupement hydroxyphényle des molécules endogènes portant également une amine primaire.. La carboxyméthylation (Gurd, Methods in Enzymology, vol. XI, 1967, p. 532-541) a souvent été utilisée pour bloquer les fonctions amines des amino acides. La carboxyméthylation des groupements hydroxyphényle est décrite comme une réaction parasite (Korman et Clarke, J. Biol. Chem. 221, 1956, p. 113-131). Celle des groupements hydroxyphényle (Spector, 1982) a été utilisée pour coupler la morphine (ne possédant pas de fonction amine) à une protéine en vue de l'obtention d'anticorps. C'est pourquoi la présente demande a pour objet de nouveaux dérivés de molécules biologiquement actives comportant une fonction amine primaire et un noyau hydroxylé, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale I R ' R" -N-A-B-O-CH2 -CO-NH-R (I) dans laquelle A représente une chaîne alcoylène linéaire ou ramifiée renfermant de 1 à 5 atomes de carbone et de préférence 2, la ramification pouvant comporter un groupement sulfhydrile;; B représente un noyau aromatique comportant de 6 à 10 atomes de carbone, le cas échéant substitués et éventuellement un hétéroatome, ou un groupement -B1-X-B2-, dans lequel B1 et B2 ont la signification de B ci-dessus et X représente un atome d'oxygène ou une chaîne alcoyle renfermant de 1 à 4 atomes de carbone, -NH-R représente un reste aminé, et - R' et R" représentent un radical alcoyle renfermant de 1 à 5 atomes de carbone, un atome d'hydrogène ou un radical hydrophobe, ainsi que leurs sels d'addition avec les acides minéraux ou organiques. La chaîne alcoylène représentée par A peut être une chaîne propylène, isopropylène, méthylène, et de préférence éthylène ; elle peut être substituée par un groupement sulfhydrile. Le noyau aromatique peut comporter un seul cycle tel qu'un noyau phényle ou deux cycles, comme par exemple un noyau indole. Un ou plusieurs des atomes de carbone de B peuvent être substitués par un radical choisi parmi les atomes d'halogène tel que chlore, ou des radicaux alcoxy tels qu'éthoxy ou de préférence méthoxy, alcoyle tels que propyle, éthyle, de préférence méthyle, alkylthio tel que méthylthio, polyhalogénoalkyle tel que trifluorométhyle. L'hydroxyle substitué par le radical -CH2-CO-NH-R selon la présente invention peut se trouver en toutes positions mais se trouve notamment sur un cycle phényle du noyau et de préférence dans les positions que ce radical hydroxyle occupe habituellement dans les médiateurs naturels. Lorsque R' et R" représentent un radical alcoyle, il s'agit de préférence d'un radical méthyle ou éthyle. R' et R" représentent avantageusement l'hydrogène. Dans le groupement -B1-X-B2-, B1 et B2 représentent de préférence un noyau phényle éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux tels que des atomes d'halogène, notamment d'iode ou les autres radicaux cidessus décrits pour le noyau B. Lorsque X représente une chaîne alcoylène, celle-ci comprend de préférence deux ou plutôt un seul atome de carbone. Le reste aminé R fixé au carboxyle par une liaison amide peut être de toutes natures mais est de préférence un reste apte au marquage, par exemple à l'aide d'un ou plusieurs atomes radioactifs, tel que 1'125I. La nature chimique de ce reste comprendra de préférence un acide aminé qui servira à la liaison avec le reste de la molécule de formule (I). Ce reste aminé sera par exemple une protéine ou un polypeptide renfermant de 2 à 10 acides aminés et de préférence 2 ou 3 acides aminés, ou encore un acide aminé ou une diamine. Lesdits acides aminés seront de préférence les acides aminés naturels ou leurs dérivés amidés ; c'est ainsi par exemple que si le radical R est un dipeptide constitué d'un reste glycyle et d'un reste tyrosyle, on pourra par exemple remplacer le reste tyrosyle par un reste tyrosynamide. La diamine pourra servir au couplage de fluorophores ou à la synthèse de dimères de formule (Il) R' R" N-A-B-O-CH2 -CO-NH-R-NH-CO-CH2 -O-B-A-N-R' R" (I') dans laquelle R, R', R", A et B ont la signification déjà indiquée. Des dérivés préférés selon l'invention sont des dérivés de formule (I) tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce que B représente un noyau phényle, un groupement p-phénoxyphényle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, notamment un groupement 4- (3 ,5-diiodophénoxy) -3, 5-diiodophényle, ou un noyau indole. Parmi ces derniers, pour lesquels B représente un noyau indole, on retient notamment ceux caractérisés en ce que R représente une diamine, une protéine, un acide aminé ou un polypeptide constitué au plus de 5 acides aminés ou des dérivés desdits acides aminés ou polypeptides, et notamment le tryptamine S-O-carboxyméthylglycyl- tyrosinamide (S-CM-GTNH2], ainsi que leurs sels d'addition avec les acides minéraux ou organiques. La présente demande a aussi pour objet un procédé de préparation des dérivés ci-dessus décrits, caractérisé en ce que l'on fait réagir un dérivé de formule (Il) R'R" N-A-B-OH (Il) dans laquelle R', R", A et B ont la signification déjà indiquée, avec un dérivé comportant un groupement protecteur des fonctions amine dans le cas où R'=R"=H, pour obtenir un dérivé de formule (III) Y-HN-A-B-OH (III) dans laquelle A et B ont la signification déjà indiquée et Y représente un groupement protecteur des fonctions amine, facilement clivable, que l'on fait réagir avec un acide halogéno-acétique pour obtenir un dérivé de formule (IV) Y-HN-A-B-O-CH2COOH (IV) dans laquelle A, B et Y ont la signification déjà indiquée, que l'on fait réagir avec un dérivé aminé pour obtenir le dérivé de formule (I) telle que définie cidessus le cas échéant sous forme dimère dans le cas d'une diamine, que l'on isole et, si désiré, salifie. Le dérivé apte à greffer un groupement protecteur des fonctions amine sur le dérivé de formule (II) peut être par exemple un chlorure d'acide t9-fluor- enylméthyl oxycarbonyl (FmocCl), benzyloxycarbonyl (BzCl)] et de préférence un anhydride [le di-t-butyldicarbonate, (BOC) 20, ou l'anhydride citraconique]. La préparation du dérivé de formule (IV) est réalisée de préférence à pH alcalin en présence d'un oxyde métallique tel que l'oxyde de magnésium et d'un acide halogéno-acétique, ce dernier pouvant être un chlorure mais étant de préférence un bromure. La réaction du dérivé de formule (IV) avec le dérivé aminé (R) est réalisée de préférence après activation du groupement carboxylique sous forme d'anhydride mixte par un alkylchlorocarbonate tel que l'éthylchlorofor- mate. On peut utiliser également comme activateurs les chlorures d'acide, les carbodiimides ou la formation préalable d'un ester hydrolysable de N-hydroxysuccinimide. Le clivage du groupement protecteur de l'amine est réalisé si nécessaire par hydrolyse acide, notamment à l'aide d'un acide tel que l'acide trifluoroacétique, ou alkaline, notamment à l'aide de la pipéridine. Les médiateurs de formule (II) et leurs analogues de synthèse sont bien connus par diverses publications et brevets. Le couplage du dérivé de formule (I), ou de l'un de ses sels, à un marqueur peut être réalisé grâce à la présence d'une fonction carboxyle libre dans le résidu R de la formule I, tel que décrit pour la liaison du reste aminé au reste de la molécule de formule I. Si le marqueur est l'iode, le reste aminé comportera une tyrosine (ou une tyrosinamide) ou une histamine. Si le marqueur est une enzyme, le reste aminé comportera des groupements carboxyle ou sulfhydrile. Si le marqueur est un élément fluorescent, le reste aminé comportera une diamine. On retient encore les dérivés de formule I cidessus décrits, caractérisés en ce qu'ils comportent une protéine greffée sur le chaînon O-carboxyméthyle selon les procédés ci-dessus. Les dérivés de formule (I) possèdent de remarquables propriétés: ils ont une importante affinité pour les récepteurs ou la protéine de transport de la molécule endogène correspondante. Les dérivés objet de la présente demande éventuellement marqués par exemple à l'aide d'un élément radioactif, notamment 1'125I, ou fluorescent ou encore à l'aide d'une enzyme sont utiles notamment pour l'imagerie tant in vivo qu'in vitro des sites de liaison des médiateurs endogènes. Ces propriétés sont illustrées ci-après dans la partie expérimentale. On peut aussi utiliser comme marqueur une protéine portant un or colloïdal ou un produit de contraste. La présente demande a donc également pour objet les dérivés ci-dessus décrits, caractérisés en ce qu'ils sont sous une forme marquée. La présente demande a aussi pour objet l'application des dérivés ci-dessus décrits à la purification des récepteurs des médiateurs endogènes. La protection du groupe amine et la O-carboxyméthylation des hormones thyroïdiennes modulent l'interaction de ces hormones avec leurs protéines porteuses. Cette propriété peut être utilisée pour éliminer la liaison de ces hormones thyroïdiennes natives à ces protéines porteuses. Dans le cadre d'une activité immunoanalytique, la création d'analogues non reconnus par l'anticorps, inhibiteurs de la liaison aux protéines de transport, permet le dosage de l'hormone totale. La présente demande a encore pour objet l'application des dérivés ci-dessus décrits et en particulier les dérivés de la thyroxine O-carboxyméthyle à l'inhibition de la liaison aux protéines de transport, pour le dosage de l'hormone totale. Les dérivés de la présente demande, pour lesquels RNH2 est une protéine, permettent la préparation d'anticorps dirigés contre le médiateur correspondant au reste de la molécule de formule (I). La présente demande a également pour objet l'application des dérivés ci-dessus décrits à l'imagerie des sites de liaison des médiateurs endogènes. La présente demande a tout autant pour objet l'application des dérivés de formule (I) à la préparation d'anticorps dirigés contre les médiateurs endogènes. Le dosage des médiateurs endogènes [de formule (II), R'R"-N-A-B-OH] ou de leurs dérivés pourra être assuré grâce à ces anticorps, en utilisant les dérivés de formule (I) comme traceur. La présente demande a enfin pour objet les kits d'analyse, caractérisés en ce qu'ils renferment l'un au moins des dérivés de formule (I) ci-dessus décrits. Les exemples qui suivent illustrent la présente invention sans toutefois la limiter. PARTIE EXPERIMENTALE A. Synthèse de dérivés de la thyroxine Série d'exemples répondant à la formule générale I R'R" -N-A-B-O-CH2 -CO-NH-R (I) Dans laquelle R' = R" = H A = - CH(COOH)-CH2 B est du type -B1-X-B2- avec X = Oxygène si B1 = B2 = C6H2I2 ; dérivés de la 3,3',5,5'- tétraiodo-L-thyronine ou L-thyroxine (T4) si B1 = C6H2I2 et B2 = C6H3I dérivés de la 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) 1.Synthèse du N-tertiobutyl carbamate-Ocarboxyméthyl T4 (BOC-T4-O-CH2-COOH) ou T3 (BOC-T3-O-CH2- COOH) 1.1. Protection du groupe amine Pour les synthèses du paragraphe A, on utilise la T4 ou de T3 sous forme d'acide libre ou modifié par exemple par amidation. La protection du groupe amine de la T4 et de la T3 est réalisée avec le di-t-butyl dicarbonate t(BOC)2O] (Tarbell et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69, 1972, 730732). A 10 moles de T4 ou de T3 sont ajoutés 30 ,ul de triéthylamine (TEA, 7,2 N) et 240 ,ul de (BOC)2O 50 mM dans le diméthyl sulfoxide (DMSO). 1.2 Carboxyméthylation du groupement hydroxyphényle La solution obtenue précédemment est mélangée volume à volume avec une solution aqueuse d'acide bromoacétique 500 mM, le pH ajusté à 12, en présence d'oxyde de magnésium et d'azote gazeux. L'agitation est maintenue pendant 24 h à l'obscurité. Le milieu est centrifugé 10 minutes à 10 000 tours/minute. 1.3 Purification des produits par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Le surnageant est dilué dans 5 volumes d'acide trifluoroacétique (TFA) 0,05 %. Un ml de ce mélange est injecté dans une colonne de silice greffée ,u Bondapack C 18 (10 tLm, diamètre 3,9 mm, longueur 30 cm). Les dérivés de la T3 sont élués en isocratique pendant 30 mn avec un mélange TFA 0,05 % 50 vol. - méthanol 50 vol. ; puis avec un gradient atteignant 100 % de méthanol en 60 minutes. Pour les dérivés de la T4, le mélange initial d'élution isocratique est composé de TFA 0,05 % 40 vol. - méthanol 60 vol. Le débit est de 1 ml/mn. Les produits initiaux (T3, T4) sont recueillis au cours de la période isocratique. Les dérivés substitués sont recueillis dans le gradient BOC-T3 : 75 % méthanol BOC-T3-O-CH2-COOH : 78 % méthanol BOC-T4 : 80 % méthanol BOC-T4-O-CH2-COOH : 82 % méthanol (Figure 1) Les fractions recueillies sont analysées en spectrophotométrie UV. Les spectres d'absorption en milieu basique et acide sont comparés de façon à déterminer si la substitution a bien eu lieu sur le groupement hydroxyle (Korman Clarke, op. cité). Les dérivés O-carboxyméthylés ne présentent pas de déplacement de spectre en milieu basique (Figure 1). Les fractions contenant le dérivé BOC-T3-O-CH2- COOH et BOC-T4-O-CH2-COOH sont évaporées et lyophilisées. 2. Conjugaison des dérivés O-carboxyméthylés avec le radical R-NH2 2.1 Allongement de la chaîne latérale nouvellement créée On peut créer une liaison amide entre le groupement carboxyméthyle et un amino-acide, une chaîne peptidique ou une protéine native ou modifiée. Le groupement carboxyle du BOC-T3-O-CH2-COOH ou BOC-T4-O-CH2-COOH est activé par l'éthylchloroformate (ECF,7 ,ul additionné de 7 ,ul de TEA dans 5 ml de diméthylformamide). Un volume de cette solution tel que 1'ECF soit équimolaire avec le produit à activer est versé sur le lyophylisat. Après 5 mn d'activation à 4"C, on ajoute un volume égal de solution aqueuse de R à une concentration 50 fois supérieure à celle du dérivé carboxyméthylé. R peut être l'histamine ou Gly-Tyr, Tyr-Gly, Cys, Gly-Cys, sous forme d'acide libre ou d'amide. Les produits sont séparés par CLHP sur colonne IL Bondapack C18 en gradient TFA 0,05 % - Méthanol. 2.2 Préparation de dérivés macromoléculaires 2.2.1. Greffe des dérivés BOC-T3-O-CH2-CO-NH-R sur des protéines. Les dérivés obtenus en A.1.3. ou A.2.1. ou sous forme acide libre, sont activés par l'éthylchloroformate (voir A.2.1.) et greffés sur une protéine native (BSA, sérum albumine de boeuf) ou modifiée (Gly-BSA). On sépare par dialyse les dérivés BOC-T3-O-CH2 CO-NHR des dérivés couplés à la BSA, du type BOC-T3-O-CH2 CO-NH-R-BSA avec R = His, Gly-Tyr, Tyr-Gly, Cys, Gly-Cys Le groupement amine de ces dérivés peut être déprotégé selon A.3. 2.2.2. Greffe des dérivés T3-O-CH2-CONH-Cys ou T3-O-CH2-CONH-Gly-Cys sur des protéines. Des protéines sont modifiées par adjonction d'un agent de réticulation hétérobifonctionnel du type Nhydroxysuccinimide, par exemple le succinimidyl-4-(Nmaléimidométhyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) la réaction (Ishikawa et al., 1983, J. Immunoassay 4, 209327) a lieu à pH 7,3 dans le tampon phosphate. La protéine dont les résidus NH2 sont ainsi activés est séparée par dialyse. Les dérivés T3-O-CH2-CONH-Cys ou T3 -O-CH2 -CONH- Gly-Cys (amidés) sont conjugués par le groupe sulfhydrile aux protéines modifiées, à pH 6,5. Les produits sont séparés par dialyse, on obtient des dérivés de formule générale T3-O-CH2-CO-NH-Cys S-SMCC-BSA. 3. Préparation du O-carboxyméthyl thyroxine (T4-O-CH2-COOH) On procède à la déprotection du groupement amine par adjonction de 200 ,ul de TFA (200 mg) au dérivé BOC-T3-O-CH2-COOH ou BOC-T4-O-CH2-COOH lyophilisés et refroidis à -20 C. Après une minute d'action, le TFA est évaporé sous azote gazeux. 4. Iodation des dérivés On ajoute à 1 nmole de T3, de BOC-T3 ou de BOC T3-O-CH2-COOH, 1 mCi de [125I]Na (2000 Ci/mmole, NEN) et 10 l de chloramine T (CT lmg/ml). Après 90 sec., la réaction est arrêtée par 50 ,ul de métabisulfite de sodium (MBS) pendant 2 mn. Après adjonction de 20 ,ul de méthanol et agitation, on dilue dans 1,5 ml de TFA (0,05 %). La séparation des produits de la réaction se fait selon le protocole décrit en A.1. pour les dérivés T4. Les produits sont exclus dans le gradient méthanol respectivement à : [125I]T4 62 % ; BOC t125I]T4, 80 % BOC[125I]T4-OCH2COOH, 82 %. Les dérivés radiomarqués sont dilués dans le méthanol. Le BOC [1251]T4-O-CH2-COOH est déprotégé comme indiqué en A.3. B. Caractéristiques de la liaison des dérivés thyroxine sur les "binding protéines" de la thyroxine. Du sérum humain normal (100 l) est additionné des dérivés préparés selon A.4. (0,1 l). On précipite par 500 41 de charbon dextrane pendant 5 mn à 4"C. Après centrifugation, 10 mn à 1000 tours/mn, on compte l'activité du culot. La liaison persistant par rapport à la liaison initiale est de 99,9 % pour la (125I]T4, de 80 % pour le BOC(125I]-T4-O-CH2-COOH et de 75 gs pour le (125I)T4-O-CH2- COOH. C. Synthèse de dérivés de la sérotonine Série d'exemples répondant à la formule générale I R'R"-N-A-B-O-CH2-CO-NH-R, dans laquelle R' = R" H A = -CH2 -CH2- B = noyau indole (OH en 5, aminoéthyl en 3) 1. Synthèse du N-tertiobutyl carbamate, 5-Ocarboxyméthyl tryptamine [BOC-S-CM] Dérivé de formule type (IV) Y-HN-A-B-O-CH2-COOH 1.1. Protection du groupe amine La protection du groupement amine de la 5-HT est réalisée avec le di-t-butyldicarbonate [(BOC)2O] (Tarbell et al., 1972). On procède au mélange de volumes égaux d'oxalate de sérotonine 50 mM et de (BOC)20 50 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) en présence de triéthylamine (TEA). La réaction est immédiate à température ambiante. 1.2. Carboxyméthylation du groupement hydroxyphényle La protection par le BOC n'est pas utile pour certains dérivés de la sérotonine qui, comme la bufoténine, possèdent une amine tertiaire, les résidus R' et R" de la formule générale étant des groupes méthyle. Le reste de la molécule (résidus A et B) étant identiques à la sérotonine, on peut procéder directement à la O-carboxyméthylation de la bufoténine dans les mêmes conditions que celles décrites ci-après pour le BOC-S. La solution obtenue en C.l.l. est mélangée volume à volume avec une solution aqueuse d'acide bromo acétique 500 mM, le pH ajusté à 12 en présence d'oxyde de magnésium et d'azote gazeux. Le pH, l'absence d'oxygène et de lumière sont maintenus constants pendant 24 heures. Le milieu est centrifugé 5 mn à 10 000 tours/mn. 1.3. Purification par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) La séparation du dérivé carboxyméthyl-O-5- tryptamine-BOC (BOC-S-CM) de la sérotonine BOC (BOC-S) et des produits d'oxydation se fait par CLHP. Le surnageant est dilué dans deux volumes d'une solution aqueuse à 1 % d'acide trifluoroacétique. 1,8 ml de ce mélange est injecté dans un CLHP sur colonne de silice greffée Ultrasphère ODS C18 (5 4m, diamètre 4,6 mm, longueur 15 cm), par élution isocratique (H2O-TFA 0,05 %, 55 vol, méthanol 45 vol). L'élution est suivie par spectrophotométrie. La séparation des produits de carboxyméthylation de la bufoténine a lieu sur colonne 4 Bondapack C18, en élution isocratique TFA 0,05 % 93 vol, acétonitrile 7 vol. Les fractions recueillies sont analysées en spectrophotométrie. Les spectres d'absorption en milieu basique et acide sont comparés de façon à déterminer si la substitution a bien eu lieu sur le groupement hydroxyle (Korman Clarke, op. cité). Les fractions contenant le dérivé BOC-S-CM sont évaporées et lyophilisées. 2. Conjugaison de dérivés O-carboxyméthylés avec le radical R-NH2. 2.1. Allongement de la chaîne latérale nouvellement créée. On peut créer une liaison amide avec une chaîne peptidique après activation du groupement acide du BOC-S-CM par ltéthylchloroformate (ECF). La solution d'activation est composée de 5 ml de diméthylformamide (DMF), 7 41 de TEA et 7 41 d'ECF. Un volume de cette solution tel que l'ECF soit équimolaire avec le BOC-S-CM est versé sur le dérivé BOC-S-CM lyophilisé. Après 5 minutes d'activation à 4"C, on ajoute un volume égal de solution aqueuse de glycyl-tyrosinamide (ou d'histamine, ou de Tyr-Gly, Gly-Tyr, Gly-Gly, Gly-Cys sous forme d'acides libres ou amides) à une concentration 50 fois supérieure à celle du BOC-S-CM. Les produits de la réaction sont séparés par CLHP sur colonne Ultrasphère ODS C18, par élution isocratique (H20, pH 6 60 vol, méthanol 40 vol). Les fractions contenant le dérivé sérotoninepeptide (BOC-S-CM-GTNH2) sont évaporées et lyophilisées. 2.2. Préparation de dérivés macromoléculaires 2.2.1. Greffe de dérivés BOC-S-CM-R sur protéine Les dérivés obtenus en C.1.3. ou C.2.1. ou sous forme acide libre sont activés par ltéthylchloroformate (voir C.2.1.) et greffés sur une protéine native (BSA) ou modifiée (Gly-BSA). On sépare par dialyse les dérivés BOC-S-CM-R des dérivés couplés à la BSA du type BOC-S-CM-R-BSA. Le groupement amine de ces dérivés peut être déprotégé selon C.3. 2.2.2. Greffe de dérivés S-CM-Gly-Cys sur des protéines. Les protéines sont modifiées par adjonction d'agents hétérobifonctionnels (voir A. 2.2.2.). Le dérivés S-CM-Gly-Cys est greffé sur les protéines précédentes par le groupe sulfhydryle. Les produits sont séparés par dialyse, on obtient des dérivés de type S-CM-Gly-Cys-S-SMCC-BSA. 3. Déprotection du groupe amine On verse 200 41 de TFA (200 mg) sur le dérivé de type BOC-S-CO-NHR (avec R = H, Gly-TyrNH2, His, Gly-Tyr OH, Tyr-GlyNH2, Gly-GlyOH, Gly-Cys) lyophilisé et refroidi à -20 C. Après une minute d'action, le TFA est évaporé sous azote gazeux. Les produits de la réaction sont séparés par CLHP sur colonne Ultrasphère ODS C18, par élution isocratique (TFA 0,05 % dans l'eau 65 vol, méthanol 35 vol). Les fractions contenant le dérivé présentant le groupement amine libre (S-CM-GTNH2) sont évaporées et lyophilisées. 4. Iodation des dérivés S-CM-R Lorsque le radical R comporte une histamine ou une tyrosine, il est possible de procéder à une iodation par la chloramine T. On ajoute à 10 41 de S-CM-R (lnmole en milieu PBS), îmCi de 125INa (2000 Ci/mmole, NEN) et 20 41 de CT (1 mg/ml). Au bout de 90 secondes, la réaction est arrêtée par 50 41 de MBS 50 mM. On dilue dans 1,6 ml de TFA 1 %. La séparation des produits de la réaction a lieu par CLHP sur colonne ss Bondapack C18 par élution isocratique (TFA 0,05 % dans l'eau 72 vol, méthanol 28 vol). Les fractions obtenues sont comptées en spectrométrie gamma et diluées dans une solution de Krebs. Leur affinité pour les sites de liaison 5-HT1 est déterminée sur des coupes de cerveau de rat. D. Etude de la liaison des dérivés de la sérotonine sur les récepteurs centraux La distribution des sites de liaison du récepteur à haute affinité de la sérotonine (5-HT1) est hétérogène dans le système nerveux central du rat (Pazos et Palacios, Brain Research, 346, 1985, p. 205-230, Ségu et al., Brain Research, 384, 1986, p. 205-217). De plus, le contenu en sous-types de sites 5-HT1 varie selon la structure anatomique concernée. Le protocole de préparation des coupes de cerveau est commun à toutes les études qui vont suivre. Les animaux sont décapités après anesthésie à l'hydrate de chloral (400 mg/kg poids brut). Les cerveaux, rapidement extraits de la boîte crânienne, sont congelés par immersion dans l'isopentane refroidi par l'azote liquide. Des coupes de 20 4m, réalisées au cryostat à -20 C, sont montées sur lames gélatinées et conservées à -20 C. Les coupes sont pré-incubées 1 heure à 4"C dans une solution de Krebs (NaCl 118 mM ; KCl 4,8 mM Cas12 1,2 mM, MgCl2 1,2 mM, Tris HCl 30 mM pH 7,4) pour éliminer les ligands endogènes. 1. Déplacement par les dérivés S-CM-R de la liaison à haute affinité de la sérotonine sur coupes de cerveau de rat. 1.1. Protocole d'incubation des coupes Les incubations ont lieu pendant 60 minutes à 20"C dans une solution de Krebs contenant 10 4M de pargyline, 5,7 10-4 M d'acide ascorbique, 2 nM de [3H]5-HT (NEN, As = 30 Ci/mmole) et des concentrations croissantes de dérivés S-CM-R. La liaison non spécifique est déterminée sur des coupes homothétiques dans les mêmes conditions mais en présence de 5-HT 10-5 M. Après incubation, les coupes sont rincées trois fois pendant 20 secondes dans l'eau distillée et séchées par un courant d'air chaud. Les coupes sont apposées à un film (Amersham) pendant six semaines, en présence d'étalon ([3H] microscale, Amersham). Les films sont développés 6 minutes avec du D19 Kodak, rincés et fixés avec AL4 (Kodak). L'analyse quantitative des radioautogrammes est menée avec un système d'analyse d'images (Ségu et al, J. Neurosci. Methods, 31, 1990, p. 197-208). 1.2. Résultats La liaison spécifique de la t3H]5-HT est déplacée de façon monophasique par la 5-HT avec un IC50 de 2 nM. Le S-O-CH2-COOH (S-CM) déplace avec un IC50 de 1000 nM, le S-CM-Gly-TyrNH2 et le S-CM-Tyr-GlyNH2 déplacent la liaison de façon biphasique avec des IC50 de 20 nM pour le premier site et de 400 nM pour le deuxième. 2. Analyse des sites de liaison des dérivés iodés sur les récepteurs centraux du rat. 2.1. Protocole d'incubation des coupes. Les incubations ont lieu pendant 60 minutes à 20"C dans une solution de Krebs contenant 10 4M de pargyline, 5,7 10-4 M d'acide ascorbique, 10 g/l de sérum albumine bovine (fraction V, sigma), et 0,03 nM du dérivé S-CM-[1251]-R. La liaison non spécifique est déterminée sur des coupes homothétiques dans les mêmes conditions mais en présence de 5 HT 10-5 M. Après incubation, les coupes sont rincées deux fois pendant 1 mn dans l'eau distillée et séchées par un courant d'air chaud. Les coupes sont apposées à un film (Amersham) pendant une semaine, en présence d'étalons ([125I] microscale, Amersham). Les films sont développés 6 mn avec du D19 Kodak, rincés et fixés avec AL4 (Kodak). L'analyse quantitative des radioautogrammes est menée avec un système d'analyse d'images (Ségu et al., op. cité). 2.2. Distribution du marquage avec les fractions S-CM[125I]R 2.2.1. Marquage par le S-CM[125I]His Les fractions de la préparation du dérivé S-CM [12 5I]His (A.4.) ne marquent pas les coupes de cerveau de rat. 2.2.2. Marquage par le S-CM-G[125I]TNH2 Parmi les fractions recueillies lors de la préparation du dérivé iodé du S-CM-GTNH2 (A.4.), seule la dernière fraction est retenue de façon spécifique sur les coupes de cerveau de rat. Cette fraction correspond au S CM-G[125I]TNH2. L'observation des radioautogrammes montre au niveau mesencéphalique un marquage intense de la substance noire (SN) et du subiculum dorsal (SD) et aucun marquage de l'hippocampe (H). Cette dernière structure est connue pour contenir presque exclusivement des sites de liaison de type 5-HT1A, alors que les autres contiennent des sites de type 5-HT1B (Hoyer et al, Eur. J. Pharmacol., 118, 1985, p. 112). Au niveau antérieur, le striatum (ST) est marqué : il contient surtout des sites 5-HTîB, les plexus choroïdes (Px) contenant des sites 5-HT1C ne le sont pas. On peut en conclure que le S-CM-G[125I]TNH2 est un marqueur spécifique des sites de liaison à haute affinité de la sérotonine de type 1B. 3) Analyse de sites de liaison du S-CM G[125I]TNH2 chez le cobaye Dans le système nerveux central du cobaye, les structures anatomiques contenant des sites de type 5-HT1A et la pharmacologie de ces sites sont les mêmes que chez le rat. Par contre, la pharmacologie des sites contenus dans la substance noire du cobaye est différente de celle des sites de la même structure chez le rat (Heuring and Peroutka, J. Neurosci., 7, 1987, p. 894-903). Aussi ces sites sont-ils désignés sous le vocable 5-HT1D. Avec la même méthode de traitement des coupes que celle utilisée en 2 pour le rat, on a démontré que chez le cobaye (figure 6), le S-CM-G[125I]TNH2 marque la substance noire (figure 6C) et pas l'hippocampe (figure 6B). Le S-CM-G[125I]TNH2 est un marqueur des sites à haute affinité de la sérotonine de type 1D. Ce dérivé de la 5-HT présente une affinité préférentielle pour les sites 5-HT1B et 5-HT1D par rapport aux sites 5-HT1A et 5-HT1C, ce qui fait de ce ligand un outil important d'analyse des récepteurs à haute affinité de la 5-HT. Il est aujourdthui le seul à présenter une sélectivité aussi importante, sans se lier à d'autres types de récepteurs non 5-HT (comme les ss-adrénergiques). Par ailleurs, il est le seul à marquer les 5-HT1D. Il peut donc être utilisé pour les études de récepteurs de ce type chez l'homme et leur variation dans les- maladies neurodégénératives (chorée de Huntington). LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : Purification des produits de la carboxyméthylation de la N-BOC-T3 A : chromatogramme après CLHP 4 Bondapack C18 0-30 mu : TFA 0,05 % 50 vol, méthanol 50 vol 30-80 mn : gradient méthanol 100 gs. La hauteur des pics n'est pas absolue car il s'agit de deux profils d'élution différents superposés. B : spectre d'absorption du BOC-T3 en milieu acide (Ac) et alcalin (Al). Ordonnées : D.O. Abscisses : longueur d'ondes de 220 à 350 nm. Le spectre est déplaçable en milieu basique, comme pour la T3. C : spectre d'absorption du BOC-T3-OCH2-COOH en milieu acide (Ac) et alcalin (Al). Ordonnées : D.O. - Abscisses : longueur d'ondes de 240 à 350 nm. Le spectre n'est pas dépla çable en milieu basique. Figure 2 : Purification des produits de la carboxyméthylation de la sérotonine-N-BOC (BOC-S) A : chromatogramme après CLHP sur Ultrasphère ODS C18 en isocratique H2O-TFA 0,05 % 55 vol, méthanol 45 vol. En ordonnées : densité optique (D.O.) pour diverses longueurs d'ondes (indiquées à droite). En abscisses, le temps en minutes. B spectre d'absorption ajusté à 280 nm du produit sortant à 28 minutes, le BOC-S (trait plein) et de celui sortant à 36 minutes, le BOC-S-CM (trait pointillé). Ordonnées : D.O., abscisses : longueurs d'ondes 200 à 350 nm. C : spectre d'absorption du BOC-S-CM en milieu acide (Ac) et alcalin (Al). Ordonnées : D.O. Abscisses : longueur d'ondes 200 à 350 nm. D : spectre d'absorption de la sérotonine en milieu acide (Ac) et alcalin (Al). Ordonnées D.O. - Abscisses : longueur d'ondes 200 à 350 nm. E : spectre d'absorption du BOC-S- en milieu acide (Ac) et alcalin (Al). Ordonnées : D.O.- Abscisses : longueur d'ondes 200 à 350 nm. Remarquer que le spectre est déplacé en milieu basique comme pour la sérotonine (figure 1D). Ce n'est pas le cas du BOC-S-CM (figure 1C) qui est substitué sur le OH. Figure 3 : Purification des produits de la conjugaison du BOC-S-CM et du GTNH2 A chromatogramme après CLHP sur Ultrasphère C18 en isocratique H20 pH 6 60 vol, méthanol 40 vol. Ordonnées : D.O. pour diverses longueurs d'ondes (indiquées à droite). En abscisses, le temps en minutes. B : spectre d'absorption ajusté à 280 nm du produit sortant à 18 minutes, le GTNH2 (trait plein) de celui sortant à 35 minutes, le BOC-S CM (trait pointillé court) et de celui sortant à 48 minutes, le BOC-S-CM-GTNH2 (trait pointillé long). Ordonnées : D.O. - Abscisses longueur d'ondes de 200 à 350 nm. C : spectre d'absorption du BOC-S en milieu acide (Ac) et alcalin (Al). Ordonnées : D.O. Abscisses : longueur d'ondes de 200 à 350 nm. D : spectre d'absorption du GTNH2 en milieu acide (Ac) et alcalin (Al). Ordonnées : Abscisses : longueur d'ondes de 200 à 350 nm. E : spectre d'absorption du BOC-S-CM-GTNH2 en milieu acide (Ac) et alcalin (Al). Ordonnées D.O. - Abscisses : longueur d'ondes de 200 à 350 nm. Remarquer que le déplacement du spectre en milieu alcalin ne correspond pas du tout à celui d'une sérotonine non substituée sur le OH (figure 2C), tout en étant plus déplacé que le spectre du BOC-S-CM (figure 1C). On observe un déplacement vers les grandes longueurs d'ondes, comme pour le GTNH2 (figure 2D), mais cette modification est moins élevée en D.O. Figure 4 : Purification des produits de déprotection de l'amine du BOC-S-CM-GTNH2 A : chromatogramme après CLHP sur C18 Bondapack en isocratique H20-TFA 0,05 % 65 vol, méthanol 35 vol. Ordonnées : D.O. pour 280 et 300 nm - Abscis ses, temps en minutes. B : spectre d'absorption ajusté à 280 nm du produit sortant à 24 minutes, le S-CM (trait plein) et celui sortant à 30 minutes, le S-CM GTNH2 (trait pointillé). Le spectre du produit sortant à 60 minutes, le BOC-S-CM-GTNH2 est identique à celui montré sur la figure 2B. C : spectre d'absorption du S-CM-GTNH2 en milieu acide (Ac) et alcalin (Al). Ordonnées D.O. - Abscisses longueur d'ondes de 200 à 350 nm. Remarquer que le déplacement du spectre en fonction du pH est identique à celui obtenu pour le BOC-S-CM-GTNH2 montré sur la figure 2E. Figure 5 Analyse des sites de liaison du S-CM-G[125I]- TNH2 chez le rat - Coupes (10 clam) de cerveau de rat incubées dans S-CM-G[125I]TNH2 0,03 nM. A : au niveau antérieur Px : plexus choroïdes ; St : striatum B : au niveau mésencéphalique SD : subiculum dorsal ; SN : substance noire H : hippocampe C : liaison non spécifique au niveau més encéphalique établie en présence de 5-HT 10-5 M Remarquer que Px et H ne sont pas marqués (alors qu'ils contiennent respectivement des sites 5-HT1C et 5-HTîA) et que St, SD et SN (qui possèdent des sites 5-HT1B) sont marqués. Figure 6 : Analyse des sites de liaison du S-CM-G[1251]- TNH2 chez le cobaye - Coupes (10 ,um) de cerveau de rat incubées dans S-CM-G(125I]TNH2 0,03 nM. A : au niveau antérieur Px : plexus choroïdes ; St : striatum B : au niveau hippocampe SD : subiculum dorsal ; H : hippocampe C : Niveau substance noire SN : substance noire Remarquer que Px et H ne sont pas marqués (alors qu'ils contiennent respectivement des sites 5-HTlC et 5-HT1A) et que St, SD et SN (qui possèdent des sites 5-HT1D) sont marqués. REVENDICATIONS 1. Les dérivés de molécules biologiquement actives comportant une fonction amine primaire et un noyau hydroxylé ainsi que leurs sels d'addition avec les acides minéraux ou organiques, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale I R'R" N-A-B-O-CH2 -CO-NH-R (I) dans laquelle A représente une chaîne alcoylène linéaire ou ramifiée renfermant de 1 à 5 atomes de carbone B représente un noyau aromatique comportant de 6 à 10 atomes de carbone, le cas échéant substitués et éventuellement un hétéroatome, ou un groupement -B1-X-B2-, dans lequel B1 et B2 ont la signification de B ci-dessus et X représente un atome d'oxygène ou une chaîne alcoylène renfermant de 1 à 4 atomes de carbone, -NH-R représente un reste aminé, et R' et R" représentent un radical alcoyle renferment de 1 à 5 atomes de carbone, un atome d'hydrogène ou un radical hydrophobe, ainsi que leurs sels d'addition avec les acides minéraux ou organiques, 2. Les dérivés de formule (I) tels que définis à la revendication 1, ainsi que leurs sels d'addition avec les acides minéraux ou organiques, caractérisés en ce que B représente un noyau phényle, indole ou un groupement pphénoxyphényle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, notamment un groupement 4 (3,5-diiodophénoxy)-3,5-diiodophényle. 3. Les dérivés selon la revendication 2, ainsi que leurs sels d'addition avec les acides minéraux ou organiques, caractérisés en ce que R représente une diamine, une protéine, un acide aminé ou un polypeptide constitué au plus de 5 acides aminés ou des dérivés desdits acides aminés ou polypeptides, et notamment le tryptamine 5-O-carboxyméthylglycyltyrosinamide (S-CM-GTNH2], ainsi que leurs sels d'addition avec les acides minéraux ou organiques. 4. Le tryptamine-5-O-carboxyméthylglycyltyrosinamide ainsi que ses sels d'addition avec les acides minéraux ou organiques. 5. Procédé de préparation des dérivés de formule (I) tels que définis à la revendication 1, ainsi que de leurs sels d'addition avec -les acides minéraux ou organiques, caractérisé en ce que l'on fait réagir un dérivé de formule (II) R'R" N-A-B-OH (11) dans laquelle R', R", A et B ont la signification déjà indiquée, avec un dérivé comportant un groupement protecteur des fonctions amine dans le cas où R' = R"= H, pour obtenir un dérivé de formule (III) Y-HN-A-B-OH (III) dans laquelle A et B ont la signification déjà indiquée et Y représente un groupement protecteur des fonctions amine, facilement clivable, que l'on fait réagir avec un acide halogéno-acétique pour obtenir un dérivé de formule (1V) Y-HN-A-B-O-CH2 COOH (IV) dans laquelle A, B et Y ont la signification déjà indiquée, que l'on fait réagir avec un dérivé aminé pour obtenir le dérivé de formule (I) telle que définie cidessus le cas échéant sous forme dimère de formule (I') R' R" -N-A-B-O-CH2 -CO-NH-R-NH-CO-CH2 -O-B-A-N-R' R" (I') dans le cas d'une diamine, que l'on isole et, si désiré, salifie. 6. Les dérivés selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils se présentent sous une forme marquée, le marqueur pouvant être un élément radioactif, en particulier 125I, une molécule fluorescente, une enzyme, une protéine portant un or colloïdal ou un produit de contraste. 7. Application des dérivés selon l'une quelconque des revendications 4 et 6 à l'imagerie des sites de liaison des médiateurs endogènes. 8. Application des dérivés selon l'une quelconque des revendications 4 et 6 à la purification des récepteurs des médiateurs endogènes. 9. Les dérivés selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils comportent une protéine greffée sur le chaînon O-carboxymethyle selon les procédés de la revendication 5. 10. Application des dérivés selon la revendication 9, à la préparation d'anticorps dirigés contre les médiateurs endogènes et leurs dérivés. 11. Application des dérivés selon les revendications 1 à 4 et en particulier les dérivés de la thyroxine O-carboxyméthyle à l'inhibition de la liaison aux protéines de transport, pour le dosage de l'hormone totale. 12. Kits d'analyse pour le dosage des médiateurs et de leurs dérivés, caractérisés en ce qu'ils renferment l'un au moins des dérivés selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, 6, 9 et 11.