FR 2668063 A1 19920424 FR 9012811 A 19901017 LIPOSOMES D'EAUX THERMALES STABILISES DANS UN GEL D'ADN La présente invention concerne des compositions à base d'eau thermale comportant des liposomes d'eau thermale stabilisés dans un gel d'ADN, utiles notamment en dermatologie et en cosmétologie. Les liposomes sont des micro-vésicules constitués d'une ou plusieurs bicouches lipidiques délimitant un espace aqueux central et en cas de liposomes multi-lamellaires, un comportement aqueux entre deux bicouches. Ces structures sont composées de phopholipides auxquels on ajoute fréquemment des stérols tels que le cholestérol pour en augmenter la stabilité. Les liposomes peuvent être classés selon leur taille et leur caractère uni ou multi-lamellaire. MLV (Multi-Lamellar Vesicles) : diamètre 100 à 5000 nm (plusieurs bicouches) LUV (Large Unilamellar Vesicles) : diamètre 200 à 2000 nm (1 bicouche) SUV (Small Unilamellar Vesicles) : diamètre 20 à 80 nm (1 bicouche) Des techniques permettant d'obtenir de grandes quantités de liposomes ont été développées dans l'industrie (ultra-dispersion, sonication, lipopred.) Réf. PUIS JEUX F., DELATTRE J. - Les liposomes. Application thérapeutiques. Technique et Documentation, Lavoisier Paris, 1985. Ces micro-vésicules sont capables d'interéagir avec les cellules dont les membranes sont de nature identique à celle du liposome. La dermatologie et la cosmétologie constituent des secteurs prometteurs pour l'exploitation des liposomes. Les principales études concernant la peau sont relatives aux liposomes de corticoldes. Il semblerait que la micro-encapsulation des corticoldes diminue la pénétration percutanée du produit et augmente sa concentration au niveau des sites locaux : épiderme et derme. Réf. WOHLRAB W., HASCH J. - Penetration Kinetics of liposomal hydrocortisone in human skin. Dermatologica, 174, 18-22, 1987. D'autres substances ont été incorporées mais les études sont trop parcellaires pour être généralisées : 1'EGF (Epidermal Growth Factor) aiderait à la cicatrisation des plaies : les superoxydes dismutases auraient localement une action anti-inflammatoire. Malheureusement les vésicules de liposomes sont très fragiles dans les formulations utilisées et elles sont souvlent détruites avant d'atteindre leur cible. De nombreux auteurs ont mentionné l'utilisation d'agents gélifiants pour stabiliser les vésicules liposomiales sous forme de gel aqueux. Les principaux agents gélifiants utilisés sont : la gélatine, les polymères carboxyvinyliques, les polymères métacryliques, les copolymères de polydimethylsiloxane et plus récemment, le collagène. La stabilisation des liposomes dans un gel aqueux avec les agents gélifiants actuellement utilisés ne permet pas d'obtenir une stabilité de la formule supérieure à 3 mois à la température de 40"C. La présente invention permet de pallier à cet inconvénient majeur en stabilisant les liposomes dans un gel d'acide désoxyribonucléique, Selon l'invention, l'ADN sera de l'ADN hautement polymérisé selon des procédés connus de l'homme de l'Art (ci-après "ADN HP") et disponible commercialement. On peut citer en particulier de l'ADN présentant une masse moléculaire comprise entre 500.000 et 1 500 000 de préférence entre 800.000 et 1.200.000. La composition selon l'invention contient avantageusement de 0,1 à 10 % en poids d'ADN et plus particulièrement de 0,5 à 5 6. Selon l'invention, on incorpore dans les liposomes des eaux thermales et plus particulièrement l'eau d'AVENE ou l'eau de CAUTERETS. L'eau d'AVENE présente des vertus thérapeutiques utiles dans le traitement des eczémas, prurits, psoriasis, retards de cicatrisation, brûlures. Des études fondamentales ont elles aussi apporté leur caution à l'efficacité de l'EAU D'AVENE. C'est ainsi que plusieurs séries d'études ont permis de démontrer que l'EAU D'AVENE exerce un effet inhibiteur sur la dégranulation des basophiles humains. Elle inhibe également la migration des polynucléaires dont le rôle dans l'inflammation cutanée est important. L'eau de CAUTERETS sulfurée présente, sous forme de liposomes, un intérêt en dermatologie et plus particulièrement dans les traitements suivants ; psoriasis, eczémas, acnée, prurit, séborrhée, alopécie. La composition de 1'EAU D'AVENE est la suivante ANION mg/1 HC03 (bicarbonates) 218,4 Cl (chlorures) 5,8 504 (sulfates) 12,4 NO3 (nitrates) 1,1 NO2 (nitriles)............... F (f luorures 0,12 PO4 (phosphates) 0,1 Br (bromures) 0,1 CATIONS Ca++ (calcium)................. 40,8 Mg++ (magnésium)............... 22,7 K+ (potassium)............... 1,0 Na+ (sodium).................. 4,8 Li+ (lithium)................. Fe++ (fer)..................... Mn++ (manganèse)............... Sr++ (strontium) 0,13 L'eau de CAUTERETS a la composition suivante : ANIONS mg/1 HCO-3 (Bicarbonate).................. 25 CO 3 (Carbonates) 23,4 H3SiO4 (Silicates)................... 32,8 Cl (Chlorures) 45 SO4 (Sulfates)...................... 31,5 NO 2 (Nitrites) 2 NO 3 (Nitrates) PO4-(Phosphate)................... F (Fluorures) 2,2 HS (Sulfures) traces O3 (Sulfites)...................... traces O3 (Triosulphates)................. 5,6 CATIONS Ca- (Calcium)...................... 5 Mg- (Magnésium).................... 0,12 Na- (Sodium)....................... 63,6 K (Potassium) 1,S NH+ (Ammonium).................... Mn-4 (Manganèse)................... Al + (Aluminium)................... Zn+ (Zinc)........................ Cu- (Cuivre)...................... Li+ (Lithium)..................... 0,18 Bien entendu, selon la présente invention, toutes autres eaux thermales présentant un intérêt en thérapeutique et/ou cosmétologique, peuvent également être micro-encapsulés afin de permettre une pénétration ciblée de ces eaux au niveau de l'épiderme et du derme; Selon une caractéristique additionnelle de la présente invention, la composition contient éventuellement en outre, un principe actif associé tel que un agent antibactérien et plus particulièrement le phenonip, 1'ENTA, l'acide benzoïque, le parahydroxybenzoate de butyle, l'acide sorbique. un principe vitaminique associé tel que la vitamine E, la vitamine C. ou encore une huile telle que de l'huile de bourrache ou de l'huile d'argan. Bien entendu, la liste ci-dessus n'est pas limitative. Ce principe actif associé sera alors présent en particulier dans une quantité 0 de 5 % et le plus souvent de 0,1 à 3 % en poids de la composition. La composition selon la présente invention contient de façon avantageuse de 0,1 à 10 % en poids de lipides et plus particulièrement de 0,5 à 5 %, le rapport en poids (lipides)/(eau thermale encapsulée dans les liposomes) est environ de 1/3. Dans un mode de réalisation, les liposomes utilisés dans la présente invention sont de type multilamellaires préparés selon le brevet français 2 634 375. Dans ce mode de réalisation particulier, les gels de liposomes sont préparés de la manière suivante a) les liposomes On prépare une phase liquide constituée essentiellement par une solution de lipides amphiphiles et éventuellement un dit principe actif associé de nature lypophile dans un solvant organique et plus particulièrement l'éthanol. Cette phase est alors ajoutée sous agitation modérée, dans une solution d'eau thermale contenant éventuellement un dit principe associé de nature hydrophile. Après évaporation sous pression réduite, on obtient une suspension de concentration voulue en liposomes. Les lipides amphiphiles peuvent être des glycolipides, des phospho-aminolipides, et notamment les phospholipides, par exemple les lécithines (d'oeuf, de soja, etc...). Le solvant est de préférence un alcool miscible à l'eau en toutes proportions, notamment l'éthanol. La solution de lipides amphiphiles peut contenir en outre une substance de nature lipophile destinée à modifier les caractéristiques physiques (charge électrique, rigidité) ou chimique de la paroi telle que du cholestérol, de la stéarylamine, de l'acide phosphatidique, etc... La concentration des lipides dans le solvant peut être de 0,1 à 10 % en poids, de préférence 1 à 5 % en poids. Il est avantageux que le volume de solvant utilisé pour la phase (1) soit compris entre 30 et 100 % ; par exemple environ 50 %, du volume d'eau de la phase (2), afin d'obtenir des liposomes de petite taille (notamment de 100 à 300 nm). Ainsi l'invention permet d'obtenir des médicaments, notamment sous forme injectable et des produits cosmétiques qui sont très stables. b) préparation du gel de liposomes A la suspension précédente, on introduit sous agitation modérée l'ADN (notamment l'ADN HP) ainsi qu'éventuellement les conservateurs et des parfums. L'invention permet d'obtenir des liposomes d'eaux thermales parfaitement stabilisés dans un gel. Ces formulations obtenues selon la présente invention, peuvent être utilisées en dermocosmétologie notamment par application topique lorsque la composition comporte un véhicule pour application topique, il peut s'agir de gel conditionné en tube ou système mécanique à pompe, ou de composition aérosol délivrée sous forme de gel. Les exemples suivants sont destinés à illustrer l'invention sans pour autant présenter un caractère limitatif. EXEMPLE 1 : Préparation du lot de 5 kg de liposomes d'eau d'AVENE à 2 % de liposomes. Matière première: 1 - Phase organique - Phospholipide (Lipoïde 80)o SEPPIC 100 g - Cholestérol BP 15 g - Ethanol 95C 2,5 litres 2 - Phase aqueuse - Eau d'AVENE 5 litres - EDTA disodique 10 g Mode opératoire 1 - Préparation de la phase organique I Dans 2,5 litres d'éthanol, on introduit sous forte agitation à température ambiante, 100 g de phospholipide, 10 g de cholestérol et 10 g de phénonim. On poursuit l'agitation 1/2 heure jusqu'à dissolution et obtention d'une phase homogène, jaune pâle. 2 - Préparation de la phase aqueuse II Dans 5 litres d'eau d'Avène, on introduit sous agitation, 10 g d'EDTA disodique. 3 - Préparation des liposomes On introduit la phase organique I à l'aide d'un Kremlin et d'une pompe péristaltique, par filets, dans la phase aqueuse II. L'addition sous forte agitation à l'aide d'un Rayneri dure 15 mn. La phase organique doit être introduite en dehors dlu cône d'agitation. I1 se forme une phase laiteuse. On évapore sous pression réduite 2,7 litres (éthanol + eau). La température du bain-marie est de 50 C. On obtient une solution laiteuse de 4,8 litres â 2 % de liposomes que l'on complète à 5 litres avec de l'eau d'AVENE. EXEMPLE 2 : Préparation de la composition de liposomes d'eau thermale stabilisés par un gel d'ADN HP. A la solution laiteuse précédente contenant 2 % de liposomes, on introduit sous agitation modérée et par petites fractions, 100 g d'ADN Hp (commercialisé par la société JAVERNECH). La dissolution s'effectue lentement à température ambiante. Après 1 heure d'agitation, on obtient une formulation stabilisée contenant 2 % de gel d'ADN Hp et 2 % de liposomes. EXEMPLE 3 : Formulations Dans les formulations ci-après, la quantité (en poids) d'eau thermale encapsulée dans les liposomes est de l'ordre de 3 fois celle des lipides constituant les liposomes. FORMULATION 1 Lipides 2 % ADN HP 2 % Phénonip 0,5 % EDTA 0,2 % Eau d'Avène q.s.p. 100 FORMULATION 2 Lipides 2 % ADN HP 0,5 % Phenonip 0,5 % EDTA 0,2 % Eau d'Avène q.s.p. 100 FORMULATION 3 Lipides 2 % ADN HP 0,1 % Phenonip 0,5 % EDTA 0,2 % Eau d'Avène q.s.p. 100 FORMULATION 4 Lipides 0,5 % ADN HP 0,2 % Parahydroxybenzoate de butyle 0,2 % Eau florale 1 % Eau d'Avène q.s.p. 100 FORMULATION 5:: Lipides 2 % ADN HP 0,5 % Acide sorbique 0,3 % Eau de Cauterets q.s.p. 100 FORMULATION 6 Lipides 1 % ADN HP 0,5 % Vitamine C 1 % Phenonip 0,5 % Eau florale 1 % Eau de Cauterets q.s.p. 100 FORMULATION 7 Lipides 2 % ADN HP 0,5 % Extrait de Ginkgo 1 % Phenonip 0,5 % Eau florale 1 % Eau thermale q.s.p. 100 FORMULATION 8 Lipides 0,1 % ADN HP 0,5 % Huile de bourrache 1 % Phenonip 1 % Eau thermale q.s.p. 100 FORMULATION 9 Lipides 10 % ADN HP 5 % Vitamine E 0,5 % Phenonip 1 % Eau thermale q.s.p. 100 EXEMPLE 4 : Etude de stabilité L'étude de stabilité a été effectuée à 40"C sur des formulations contenant 2 % de liposomes d'eau thermale d'Avène. La visualisation est réalisée au microscope électronique, cette visualisation est effectuée chaque mois après avoir procédé à la coloration négative des liposomes à l'aide d'une solution à 2 % de phosphotungstate de sodium. Les résultats de cette étude sont résumés dans le tableau suivant: 12345 789 I tO 11 12 gélifia Carbopol 941 (0,5%) + + + Carbopol 910 (0,5Z) + + + Eudispert HV (0,5r) + + + + Eudispert MV (0,5r) + + + Dimethycone + + + + copolyol (2 %) 1 Collagéne (5 % + + + + + ADN HP (0,1%) + + i + + + + + + I ADN HP (0,5 %) + + + + + + + + + + + + ADN HP (2 % + + + + + + + + + + I + + ~ = Bonne stabilité (liposome 300 + 30 nm) Augmentation taille des liposomes (par fusion membranaire) - = Séparation des phases (instabilité de la formule). Les observations photographiques montrent que les liposomes sont bien dispersés dans un réseau de l'ADN HP sans que leur forme et leur taille soient altérées et confirme la stabilité surprenante des liposomes dans cette formulation. REVENDICATIONS I. Composition à base d'eau thermale caractérisée en - ce qu'elle comporte des liposomes d'eau thermale stabilisés dans un gel d'acide desoxyribonucléique. 2. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'acide desoxyribonucléique utilisé est hautement polymérisé (ADN HP). 3. Composition selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisée en ce qu'elle contient 0,1 % à 10 % de lipides. 4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle contient de 0,1 à 10 % d'ADN. 5. Composition selon l'une des revendications I à 4, caractérisée en ce qu'elle contient un principe actif associé qui est un agent antibactérien et plus particulièrement le phenonip, l'EDTA, le parahydroxybenzoate de butyle, l'acide sorbique. 6. Composition selon l'une des revendications I à 5, caractérisée en ce qu'elle contient un principe actif associé qui est la vitamine E, la vitamine C, l'huile de bourrache, l'huile d'argan, un extrait de ginkgo biloba. 7. Composition selon les revendications I à 6, caractérisée en ce que l'eau thermale utilisée est plus particulièrement l'eau de Cauterets ou de l'eau d'Avène. 8. Composition selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que la compostion comporte 0,1 à 3 % en poids dudit principe actif associe. 9. Composition selon les revendications 1 à 8 caractérisée en ce qu'elle comporte en outre un ou des véhicules appropriés pour une utilisation en cosmétologie notamment en dermocosmétologie. 10. Procédé de préparation d'une composition comportant un gel de liposomes selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'il comporte les étapes suivantes I ) On prépare une phase liquide constituée essentiellement par une solution de lipides amphiphiles et éventuellement un dit principe actif associé de nature lipophile dans un solvant organique et plus particulièrement l'éthanol, 2) Cette phase est alors ajoutée sous agitation modérée, dans une solution d'eau thermale contenant éventuellement un dit principe actif associé de nature hydrophile, 3) Après évaporation sous pression réduite, on obtient une suspension de concentration voulue en liposomes, 4) A la suspension précédente, on introduit sous agitation modérée dudit ADN