FR 2674433 A1 19921002 FR 9103739 A 19910327 La présente invention concerne le traitement de l'apoptose de cellules humaines, caractérisée par le dysfonctionnement ou la déficience de certaines populations cellulaires Elle a également pour objet une méthode de sélection d'agents de traitement de l'apoptose dans ses manifestations pathologiques Elle est d'autre part relative à des méthodes de détermination de la capacité de cellules d'individus atteints par un virus HIV à répondre à l'agression par un agent infectieux Le terme apoptose est synonyme des expressions "mort cellulaire programmée" ou " mort induite par l'activation". Dans la présente description il sera essentiellement question d'apoptose L'apoptose est un mécanisme de suicide des cellules qui a pour particularité d'être physiologiquement actif . I1 est impliqué dans la régénération des tissus ainsi que dans l'involution durant l'embryogénèse et la vie adulte et la maturation du systeme immunitaire embryonnaire De ce fait , l'apoptose se différencie de la nécrose qui est une réponse à des agressions de la cellule On sait également que l'apoptose est toujours liée à la réception ou à la non réception par la cellule d'un signal physiologique donné L'apoptose a des conséquences pathologiques d'autant plus grandes qu'elle peut survenir dans des populations cellulaires que l'organisme n'est pas capable de régénérer sous leur forme adulte différenciée , notamment les cellules lymphocytaires à mémoire et les neurones En cas d'apoptose , la capacité de régénération cellulaire de l'organisme peut être aussi dépassée d'un point de vue quantitatif. Dans la présente description le mot "pathologique" concerne également des phénomènes tels que la dégénérescence cellulaire ou le vieillissement impliquant une involution L'apoptose ne concerne que les cellules en cours de disparition, et n'entraîne pas d'effets sur l'environnement tissulaire et cellulaire : elle n'est donc pas un phénomène apparent , sauf si l'on cherche réellement à la mettre en évidence On a déjà montré que , dans le cas des thymocytes non matures ,la mobilisation du récepteur des cellules T (TCR) conduit à l'apoptose . Ce phénomène joue un rôle essentiel dans la sélection du répertoire des cellules T. (Blackman et al., Science 248 ; 1335-1341 ; 1990 ). On sait par ailleurs que certains rétrovirus sont responsables du dysfonctionnement et de l'effondrement du système immunitaire ainsi que du dysfonctionnement et l'involution de certains tissus I1 s'agit notamment de lentivirus provoquant des désordres pathologiques se traduisant par une apparition anormale de suicides cellulaires A titre d'exemple de tels lentivirus , on peut citer les virus SIV chez le singe , FIV chez les félins , BIV chez les bovins , VISNA chez les ovins CAEV chez les caprins et HIV chez l'homme I1 a aussi été montré que les individus infectés par un virus HIV présentent de manière précoce des lacunes dans la réponse d'une famille de lymphocytes T : les lymphocytes T CD4 helper (TH) .Ces lacunes d'ordre qualitatif précèdent des réductions quantitatives de cette population cellulaire et sont caractérisées par une perte sélective de la prolifération en réponse à des antigènes du complexe majeur d'histo-compatibilité de classe II ( MHC-II ) et à un mitogène extrait de Phytolacca americana, dénommé mitogène pockeweed ou PWM dans la suite du texte ; voir notamment Lane et al.( N. Engl. J. Med. 313, 79-84, 1985 ) et Van Noesel et al.( J. Clin. Invest, 86, 293-299, 1990 ). Ces derniers auteurs ont en outre montré que l'anticorps anti-CD28 augmente la prolifération de cellules T chez des patients infectés par le virus HIV1 et permet ainsi une réponse proliférative de thymocytes immatures à l'anti-CD3, et à deux anticorps anti-CD2. De plus , il a été montré récemment que les cellules T adultes humaines et murines normales peuvent aussi subir l'apoptose dans des conditions particulières (Newell, et al. Nature 347 , 286-289 (1990); Janssen O. et al. J. Immunol., 146, 35-39 1991 ) . Dans ce cas , l'apoptose induite par stimulation diffère de celle observée dans les thymocytes immatures Dans des cellules T humaines adultes portant le récepteur TCR gamma-delta et stimulées par l'anticorps anti-CD3, l'addition d'Interleukine-2 induit l'apoptose au lieu de la prévenir ( Janssen et al. J. Immunol.,146, 35-39 , (1991). Les résultats faisant partie de l'état de la technique ne concernent que des cultures cellulaires in vitro et ne mentionnent aucune application thérapeutique. De plus , les publications connues des Demandeurs ne mentionnent pas l'existence et encore moins le rôle du phénomène d'apoptose dans la perte de la prolifération des cellules T issues de patients infectés par un virus HIV , et ne donnent aucune explication quant à la perte sélective de réponse de patients infectés par les virus HIV vis-à-vis de certaines maladies ou vis-à-vis de certains antigènes Les demandeurs se sont donc attachés à trouver un agent thérapeutique efficace, notamment visà-vis des maladies liées au virus HIV Dans le cadre de leurs travaux , ils ont également apporté une explication du phénomène de perte de réponse à l'égard de certains antigènes ou de certaines maladies rencontrées en particulier dans le cas d'infections par les virus HIV , en vue d'applications thérapeutiques et préventives vis-à-vis de ces maladies .Ils ont ainsi montré de manière surprenante que le mécanisme responsable de cette perte de réponse , est du type apoptose Selon l'invention , il a été trouvé que l'on pouvait inhiber in vivo l'apoptose pathologique La présente invention a donc pour objet un médicament contenant un agent inhibant in vivo l'apoptose pathologique Un tel agent sera choisi parmi ceux capables:: - soit de bloquer la réception ou la transduction de signaux conduisant au suicide des cellules , et en particulier capables d'inhiber l'activation d'une endonucléase nucléaire entraînant la fragmentation du génome de la cellule , tel que la cyclosporine , ou un inhibiteur de la synthèse protéique tel que la cycloheximide - soit d'apporter ou de générer un co-signal permettant à la cellule de se différencier et de se multiplier normalement tel qu'un anticorps anti-CD28 ou une association d'un agent entraînant la stimulation de la phosphokinase C tel qu'un ester du phorbol , avec l'interleukine 1 - soit d'entraîner à eux seuls la prolifération et la différenciation cellulaires et de générer des cellules qui ont perdu la capacité à se suicider dans des conditions pathologiques , par exemple , la phytohémagglutinine ( PHA ), des cellules allogéniques irradiées , un anticorps anti-CD2, ou un anticorps anti-CD3. - soit d'inhiber les signaux qui rendent une cellule susceptible de répondre à une activation par une apoptose pathologique Les cellules allogéniques irradiées sont des cellules provenant d'un individu génétiquement différent quant à son système HLA. Un tel médicament est notamment destiné au traitement des maladies liées au rétrovirus et en particulier liées au lentivirus , tels que les virus HIV chez l'homme et SIV , FIV , BIV , VISNA et CAEV chez l'animal La présente invention a d'autre part pour objet l'utilisation d'un agent tel que précédemment défini pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement des maladies précédemment citées Elle concerne d'autre part une composition pharmaceutique contenant une quantité pharmaceutiquement efficace d'un agent tel que défini précédemment en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants pharmaceutiquement acceptables Une telle composition est destinée au traitement de maladies liées au rétrovirus et en particulier liées au lentivirus Le traitement des patients atteints par ces maladies se fera d'une manière connue en soi et préférentiellement par voie parentérale ou intraveineuse La présente invention concerne d'autre part une méthode de détermination de la déficience qualitative du répertoire immunologique d'individus vis- -vis d'un agent infectieux comprenant au moins les étapes de - stimulation in vitro des lymphocytes dans un milieu contenant au moins un anticorps anti-CD28 en présence d'un ou plusieurs antigènes spécifiques de l'agent infectieux, et - mesure de la cinétique de prolifération des lymphocytes L'objet de la présente invention est d'autre part une méthode de détermination de la capacité des lymphocytes d'un individu à répondre à l'agression par un agent infectieux comprenant au moins les étapes de - stimulation in vitro des lymphocytes dans un milieu contenant au moins un anticorps anti-CD28 en présence d'un ou plusieurs antigènes spécifiques de 1 'agent infectieux,et - mesure de la cinétique de prolifération des lymphocytes La présente invention est de plus relative à une méthode de stimulation in vitro de lymphocytes issus de patients atteints d'une maladie liée aux rétrovirus par traitement des lymphocytes isolés par un anticorps anti-CD28. Enfin, la présente invention concerne une méthode de sélection d'un agent inhibant in vivo l'apoptose pathologique comprenant au moins une étape de mise en contact de cellules infectées par un lentivirus tel qu'un virus HIV , avec un antigène respectivement en présence et en absence dudit agent et consécutivement de stimulation par ledit antigène Une différence de réponse entre les cellules cultivées en présence et en absence dudit agent constituerait un indice de l'activité inhibitrice de cet agent L'anticorps anti-CD28 préférentiellement utilisé pour la mise en oeuvre de la présente invention est l'anticorps monoclonal de souris 15 E8 commercialisé par la Société JANSSEN La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples d'application suivants, dans lesquels La figure la est un diagramme illustrant la prolifération de cellules de patients infectés par le virus HIV1 et d'individus sains en présence de phytohemagglutinine (PHA) , de PWM, de super-antigènes d'entérotoxine B de staphylocoque ( SEB ) ou de toxine tétanique ( TT ). La figure lb est un diagramme montrant l'effet de l'anticorps anti-CD28 sur la prolifération de cellules de patients infectés par le virus HIV1 , en présence de PWM , de SEB ou de TT La figure 2a illustre la mortalité de cellules mononucléaires du sang périphérique ( PBMC de patients infectés par le virus HIV1 (colonnes 1 ) et d'individus sains ( colonnes 2 ) , en présence de cycloheximide , de cyclosporine A ( CSA ) , d'anticorps anti-CD28, de PWM , ou de SEB La figure 2b illustre la mortalité cellulaire de cellules PBMC de patients atteints par le virus HIV1 (colonnes 1 ) et d'individus sains ( colonnes 2) desquelles on a éliminé les cellules T CD4+ ou les cellules T CD8+ , en présence ou en absence d'anticorps anti-CD28 , de PWM ou de SEB. La figure 3 illustre les résultats obtenus après incorporation de thymidine tritiée dans des cellules de patients atteints par un virus HIV en présence de PWM , ou de PHA. La figure 4 est un autoradiogramme représentant l'hybridation de RNA total de cellules PBMC de patients atteints par le virus HIV , cultivées en présence de PWM ou de PHA , avec une sonde d'ADN complémentaire du récepteur de l'interleukine-2. La figure 5 est un cliché d'un gel d'électrophorèse de DNA de cellules PBMC de patients infectés par le virus HIV1, cultivées en présence de PMW ou de SEB et d'individus sains Les figures 6a et 6b représentent respectivement des photographies en microscopie électronique de cellules PBMC d'individus sains et de patients atteints par le virus HIV1 EXEMPLE 1 Prolifération in vivo des lvmphocvtes T de patients asymptomatiques infectés par le virus HIV1 a) Stimulation par des activateurs polyclonaux. La prolifération des lymphocytes T de 38 patients infectés par le virus HIV-1 et de 20 individus sains a été testée en réponse aux activateurs polyclonaux phytohé- hémagglutinine , concanavaline A mitogène pockweed (PWM) , anticorps monoclonal anti-CD3 et en réponse à la stimulation par l'antigène de la toxine tétanique TT Les cellules T mémoires spécifiques de l'antigène TT étant rares , et pouvant avoir été éliminées chez des patients infectés par le virus HIV la réponse à la mobilisation des récepteurs de cellules T par l'utilisation des superantigènes de l'entérotoxine B du staphylocoque ( SEB) a aussi été testée. Les SEB se lient aux molécules MHC-II et agissent avec des molécules Vss des récepteurs de cellules T (TCR) exprimés par jusqu'à 30% des cellules T normales , et induisent la prolifération des cellules T normales matures (Marrack et Kappler , J. Science 248 , 705-711 , 1990) et l'apoptose chez les thymocytes immatures (Genkinson et al. J. Immun. 19, 2175-20177 1989 Pour évaluer l'intensité de la réponse , on a effectué les mesures après l'incorporation de la thymidine tritiée dans les cellules . (figure la ). Les patients infectés par le HIV comprenaient 26 hommes et 12 femmes , 25 patients étant au stade de CDC II A (pas d'anormalité biologique , cellules CD4 > 500 /mm3 et en moyenne de 856 /mm3 ) et 13 d'entre eux étaient au stade CDC IIB ( anormalité biologique , cellules CD4 L'infection par le HIV était attribuée pour 15 des patients à des relations homosexuelles , pour 14 des patients à des relations hétérosexuelles , pour 7 des patients à l'utilisation d'une drogue intraveineuse et pour 2 des patients à la transfusion sanguine Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ont été obtenues sur Ficoll-Hypaque et ont été cultivées comme décrit par Reed et al.( Proc. National Acad. Sci.USA 83, 3982-3986 (1986)) Les PBMC sont incubées à une densité cellulaire de 2,5.105/ml durant 3 jours avec du milieu de culture sans adjuvant , du milieu contenant de la phytohémagglutinine (PHA) à lOg/ml , du mitogène pokeweed (PWM) à 10p/ml , du superantigène d'entérotoxine B de staphylocoque ( SEB) à 1 Hg/ml , ou durant 6 jours avec l'antigène ( TT ) à 10 pg/ml La prolifération des cellules T des patients HIV+ à la Concanavaline A (lOg/ml), à l'anticorps monoclonal CD3 (Groux et al . Nature , 339, 152-154, 1989 ) est seulement légèrement réduite ( résultat non indiqué sur la figure ) de même que la prolifération en présence de PHA. Sur la figure la chaque cercle représente la moyenne de cultures effectuées en triplica , les barres horizontales représentant la moyenne des résultats pour chaque traitement. Ces résultats montrent que, tandis que des cellules T des individus témoins prolifèrent en réponse à tous les stimulis , des cellules T des patients infectés par le virus HIV répondent de manière moindre à la stimulation par le PWM , le SEB ou l'antigène TT (figure la). b) Stimulation en présence d'un anticorps anti-CD28. On a également fait des essais en incorporant de la thymidine tritiée dans des cellules T de 19 des patients infectés par le HIV (figure 1 b ) en réponse à la prolifération par les PWM, SEB ou TT , en l'absence ou en présence d'anticorps anti- CD28. Dans cet exemple ainsi que dans ceux qui suivent l'anticorps anti-CD-28 est fourni par la Société JANSSEN (anticorps monoclonal de souris 15 E8). Des cellules ont été préparées et utilisées comme décrit pour la figure la et l'anticorps anti-CD28 a été ajouté à une concentration de lOyg/ml La figure lb montre que l'anticorps anti-CD28 augmente la prolifération des cellules T témoins en présence de PWM ou de SEB Par contre les anticorps CD5 ( A5O,gamma 1, CD43 (BlB6,gamma 1) ,CD44 (P245,gamma 2a) , et CD45R (ALB11, gamma 1, Immunotech) à des concentrations de 10 pg/ml ne stimulent pas la prolifération des cellules T des patients HIV+ ( résultats non indiqués sur la figure ). EXEMPLE 2: Mortalité des cellules T et des cellules mononucléaires du sans périphérique de patients infectés par le virus HIV après culture in vitro en présence de PWM et de SEB. 1) La figure 2 a) illustre la mort cellulaire de PBMC de patients infectés par le virus HIV ainsi que de témoins , après culture in vitro en présence de PWM et de SEB. Les résultats mentionnés sur la figure 2a) représentent la moyenne plus ou moins l'écart type d'expérimentations effectuées sur 20 patients différents infectés par le virus HIV ( colonnes 1 ) et de 20 individus non infectés ( colonne 2). La mortalité cellulaire est mise en évidence par la perméabilité au bleu trypan .Les PBMC sont cultivées avec une densité cellulaire initiale de 2,5 105/ml en 48 heures dans du milieu de culture sans adjuvant , du milieu contenant du PWM ( 10 mg/ml ) ou des SEB ( lHg/ml) en l'absence ou en présence de cycloheximide ( 50 pg/ml ) de cyclosporine A ( CsA ) à 200 ng/ml ou d'anticorps monoclonal anti-CD28 ( lO;ig/ml) L'addition de PWM ou de SEB aux cellules PBMC de patients atteints par le virus HIV ( colonnes 1 est suivie après 48 heures de culture par respectivement jusqu'à 60 et 30% de morts cellulaires, tandis qu'aucune mortalité cellulaire n'est observée à 48 heures pour les PBMC non stimulées de patients infectés par le virus HIV (colonnes 2 ), ainsi que pour les PBMC témoins stimulées ( colonnes 2 ) qui montrent jusqu'à 95% de viabilité (figure 2 a). La culture des cellules en présence d'anticorps monoclonal CD3 n'entraîne pas de mortalité des cellules T (résultats non indiqués sur les figures ). Apres 48 heures de culture en milieu sans adjuvant , la mortalité cellulaire de base des cellules PBMC de 40 patients infectés par le virus HIV ne dépasse jamais 10% (en moyenne 5,3 %). 2) La figure 2b concerne des expérimentations similaires . Les cellules PBMC d'un patient infecté par le virus HIV ( colonnes 1 ) et d'un individu non infecté (colonnes 2) ont été purifiées par élimination des cellules T CD4 + ( cellules CD 8 ) ou des cellules T CD8 + ( cellules CD 4) par incubation avec respectivement des anticorps IOT4 ou IOT8 suivie par incubation avec des particules magnétiques couvertes d'anticorps IgG de chèvre anti-souris La qualité de l'élimination est mesurée par cytofluorométrie ( Epix Coulter Clone ) et montre que la contamination cellulaire est inférieure à 1% . Les cellules sont cultivées comme décrit pour la figure la). Les résultats représentent la moyenne de trois mesures de la mortalité cellulaire après 48 heures .La prolifération est mesurée par incorporation de la thymidine tritiée après 3 jours Les cellules CD4 des individus non infectés prolifèrent en réponse au PWM ( 5250 + 651 CPM ) et au SEB ( 21.642 + 2.317 CPM ) , tandis que les cellules témoins CD8 et les cellules CD4 et CD8 des patients infectés par le virus HIV ne prolifèrent pas après 5 jours. L'addition d'anticorps anti-CD28 aux cellules CD4 des patients infectés par le virus HIV restaure la capacité de ces cellules à proliférer lors de stimulation par le PWM et le SEB , mais n'a pas d'effet sur les cellules de patients infectés par le HIV non stimulées ou sur des cellules CD8 témoins 3) La figure 3 illustre la prolifération des cellules PBMC de patients infectés par le virus HIV et d'individus sains après addition de PWM ou de PHA, après incorporation de thymidine tritiée dans les cellules T de 3 patients infectés par le virus HIV (ABC et B') et d'un individu sain ( D ) en réponse à la stimulation par le PMW à lOg/ml ( colonnes A,B et C, et colonne D) ou par le PHA à lOpm/ml (colonne B'). Les colonnes B et B' représentent les résultats obtenus avec des PBMC du même patient infecté par le virus HIV. Tous les résultats sont la moyenne (+/- l'écart type) de cultures effectuées en triplicate. EXEMPLE 3 Synthèse des ARN messagers codant pour le récepteur à l'Interleukine-2. La figure 4 illustre l'expression des RNA messagers codant pour le récepteur à l'interleukine 2 (IL-2R) de PBMC de patients infectés par le virus HIV et d'individus sains après addition de PWM ou de PHA Les mêmes patients (A, B, C, B' et D ) que dans la figure 3 ont été repris . Cette expression est mesurée sur les mêmes cellules après 2 heures , 6 heures et 16 heures . Ces RNA messagers n'étaient pas détectés avant la stimulation Les expérimentations ont été effectuées par extraction des ARN totaux cellulaires de 107 PBMC par le RNAzol (Cinna-Biotex, Friendwood, USA ) selon les instructions du fabricant. Les échantillons de RNA totaux ( environ lOg/ml) sont fractionnés en fonction de leur taille dans des gels d'agarose à 1% contenant du formaldéhyde et sont transférés sur des filtres HYBOND-N (Amersham).Les filtres sont ensuite hybridés avec des sondes de cDNA marquées au phosphate 32 ( IL2R humain) et lavés avec une solution 0,1 SSC , 0,1 % SDS à 55 C. Les tailles relatives des mRNA IL-2R qui hybrident avec la sonde sont en accord avec les valeurs de 3,5 kb précédemment publiées EXEMPLE 4: Dégradation de 1'ADN cellulaire La figure 5 représente I'électrophorèse sur gel d'agarose de DNA extrait de PBMC de patients infectés par le virus HIV ou d'individus sains après culture durant une nuit dans un milieu de culture avec ou sans adjuvants. Ces gels ont été obtenus par lyse dans 4 ml d'un tampon de lyse hypotonique (5 mM Tris pH 7,4, 5mM EDTA , 0,5 % Triton X100) de 15.106 cellules centrifugées à 200 g durant 10 mn. Les lysats sont ensuite centrifugés à 13.000 g durant 15 minutes . Le DNA des surnageants est concentré par précipitation à 20"C dans 50% d'isopropanol , 130mM NaCl. Après centrifugation à 13.000 g, les précipités sont séchés à l'air et resuspendus dans lOmM Tris pH 8, lmM EDTA. Tous les échantillons sont déprotéinisés par une extraction au phénol/chloroforme et une double extraction par un mélange chloroforme/alcool isoamylique (24:1). Après électrophorèse sur des gels fins d'agarose à 2% durant 12 heures à 30 V, le DNA est visualisé par coloration au bromure d'éthidium. Le puits 1 de la figure 5 correspond au marqueur de poids moléculaire . Le puits 2 correspond au DNA de cellules PBMC d'individus sains incubés avec du PWM. Les puits 3 à 11 correspondent au DNA de cellules PBMC de 7 patients infectés par le virus HIV incubés respectivement avec du milieu sans adjuvant (puits 3) , du milieu comprenant du PMW (puits 4 à 6, 8 et 9 ) , et du milieu comprenant du SEB (puits 10 et 11). Les puits 3 et 4 correspondent au même patient La figure montre que les DNA des puits 4 à 6 et 8 à 11 ont un profil de dégradation caractéristique de l'apoptose, les bandes d'ADN dégradé étant des multiples de 200 paires de bases La dégradation de ces DNA est supprimée par addition de CsA au milieu contenant le PWM ( colonne 7 correspondant au même patient que la colonne 6 ). EXEMPLE 5 Etat cellulaire des PBMC de patients infectés par le HIV La figure 6a représente une photographie en microscopie électronique de PBMC d'un patient infecté par le virus HIV après une incubation de 24 heures dans un milieu sans adjuvant. La figure 6b représente les mêmes cellules incubées dans un milieu contenant 5 pg/ml de PWM. Les cellules ayant différents degrés de concentration chromatique peuvent être observées sur cette figure et sont caractéristiques de l'apoptose. Les flèches sur cette figure les désignent EXEMPLE 6: Effet de l'anticorps anti-CD28 sur la restauration de la capacité des lvmphocvtes à proliférer 1") Récupération de la prolifération par costimulation par l'antigène tétanique et l'antigène grippal , en présence d'anti-CD28. Des cellules de patients sont stimulées soit par la toxine tétanique ( TT ) soit par un antigène grippal (GP ) en présence ou en l'absence de l'anticorps anti-CD28 Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau I ci-après . Ces résultats montrent que dans le cas de la toxine tétanique , la présence de l'anticorps anti-CD28 permet dans les cultures des lymphocytes desdits patients de restaurer la capacité à proliférer On retrouve ces résultats dans le cas de sept patients sur dix en présence d'antigène grippal (GP). L'antigène grippal étant un antigène couramment rencontré , il est possible que les trois patients dont les lymphocytes ne prolifèrent pas en présence d'anticorps anti-CD28 , l'aient déjà rencontré et que les cellules mémoires dirigées contre cet antigène aient été éliminées de ce fait 2") Mise en évidence de la nécessité de la présence de l'anticorps anti-CD28 lors de la première stimulation pour la rééducation des cellules Des lymphocytes ont été stimulés ( JO ) après purification , par la toxine tétanique (TT) par la phytohémagglutine ( PHA ) et par le mitogène pockeweed (PWM). La prolifération est mesurée par l'incorporation de thymidine tritiée au bout de 6 jours ( j 6). Parallèlement les cellules sont cultivées en présence de toxine tétanique ou du superantigène de l'entéroxine staphylococcique B (SEB) avec ou sans anticorps anti-CD28. Après 10 jours de culture , alors que les cellules sont revenues au repos , elles sont restimulées par les mêmes stimulis qu'à J O On observe quand la première stimulation de lymphocytes de patients infectés par le virus HIV a été effectuée en présence de TT ou de SEB sans CD28 , qu'il n'est pas possible de réobtenir une prolifération même si ces lymphocytes sont restimulés par l'anticorps anti-CD28. Par contre , les cellules précultivées en présence de l'anticorps anti-CD28 prolifèrent en présence des antigènes TT ou SEB. Les résultats sont résumés dans le tableau II. 3 ) Restauration de la capacité des lvmphocvtes à proliférer en réponse au PWM et au SEB après une première stimulation par la PHA. Des lymphocytes de patients infectés par le virus HIV sont stimulés soit directement ( JO ) avec la phytohémmaglutinine (PHA) , le mitogène pockeweed (PWM ) ou l'entérotoxine staphylococcique B (SEB) , ou préstimulées par le PHA pendant 10 jours Les cellules sont restimulées après 10 jours dans les mêmes conditions qu'à JO. Les résultats sont rassemblés dans le tableau III. On observe que la stimulation des cellules par un adjuvant tel que le PHA, PWM ou le SEB permet la restimulation au bout de 10 jours en présence de PHA. EXEMPLE 7 Restauration de la capacité des lvmphocvtes à proliférer par stimulation par des cellules alloqéniques . La restauration de la capacité des lymphocytes à proliférer après une première stimulation par des cellules allogéniques et en réponse au PWM et au SEB a été testée Parallèlement , on a testé la capacité à proliférer après une première stimulation par la PHA. Les patients ayant subi une première stimulation par le PHA ou par les cellules allogéniques (RLM ou réaction lymphocytaire mixte ) sont restimulés après dix jours de culture ( J10). Le tableau IV ci-après illustre les résultats obtenus. Ce tableau montre donc que par rapport au témoin, les cellules ayant subi une première stimulation par des cellules allogéniques présentent une prolifération équivalente à celles qui ont été stimulées par la PHA. CONCLUSION: Une caractéristique essentielle de l'apoptose est sa dépendance quant à l'activation de la cellule la transcription des gènes et la synthèse des protéines dans les cellules mourantes . L'activation des cellules T de patients infectés par le virus HIV après addition de PWM est montrée par l'expression des mRNA p55 correspondant aux récepteurs à l'interleukine-2 à des niveaux équivalents et avec des cinétiques équivalentes à celle observée dans des cellules T d'individus sains ( figure 4 De plus , l'addition d'un inhibiteur de synthèse protéique ( la cycloheximide ) ou de cyclosporine A empêche l'apoptose des cellules T des patients infectés par le virus HIV stimulées par le PMW ou le SEB ( figure 2a et figure 3 ). Il est à noter que parmi les stimulis qui induisent 1'apoptose dans des thymocytes immatures normaux , et parmi les co-signaux qui empêchent ce processus , seul un nombre limité a le même effet visà-vis de cellules T de patients infectés par le HIV. Dans les thymocytes immatures , la plupart des stimulis induisant la prolifération de cellules T adultes normales , incluant l'anticorps CD3 conduisent à l'apoptose, et l'addition de co-signaux tels que l'interleukine-l, l'interleukine-2 ou des esters de phorbol évite non seulement l'apoptose mais permet aussi une prolifération en réponse au stimuli Dans les cellules T de patients infectés par le virus HIV, l'anticorps CD3 induit la prolifération cellulaire et parmi les divers co-signaux ( interleukine 1, interleukine 2, interféron gamma anticorps CD5, CD28, CD 43, CD44 et CD 45R ou ester de phorbol ) qui ont été ajoutés aux cellules T de patients infectés par le virus HIV, seul l'anticorps CD28 évite la mort induite par le TWM et le SEB et restaure la prolifération au PMW , au SEB et au TT (figure lb et figure 2a) Sans que cette interprétation puisse être considérée comme une restriction à la présente invention , l'ensemble des résultats semble indiquer que les cellules CD4 TH des patients infectés par le virus HIV sont programmées in vivo pour un procédé de suicide par apoptose après une activation par une stimulation définie , incluant la mobilisation des récepteurs des cellules T (TCR) par les modes du complexe majeur d'hincompatibilité de classe II. Etant donné que les anticorps anti-CD28 rétablissent la possibilité de proliférer après stimulation par l'antigène TT, les cellules T spécifiques du tétanos semblent présentes chez les patients infectés par le virus HIV. Quoique de telles cellules sont trop rares pour permettre une mise en évidence de leur mort , l'induction de l'apoptose semble être le mécanisme le plus probable pour expliquer leur absence de réponse in vitro Chez les patients infectés par le HIV, moins de 0,1% des cellules T CD4 du sang périphérique sont infectées par le HIV , ce qui exclut la possibilité que l'apoptose soit due directement à l'infection des cellules TABLEAU I Récupération de la prolifération à l'antigène tétanique et à I'antiqène grippal Patient N CD28 TT TT+CD28 GP GP +CD28 27 321 857 6789 321 642 50 133 254 3540 478 361 67 117 266 1617 297 189 28 244 522 15259 521 17621 52 200 478 1852 521 3218 58 81 76 4079 316 11613 54 154 284 1943 581 3194 44 432 562 4681 1916 3186 66 43 530 1218 1648 3250 68 540 730 1602 4140 2691 TABLEAU II Délétion des clones spécifiques et restauration des lymphocytes T spécifiques par addition de l'anti-CD28 milieu de restimulation Milieu de milieu + TT + TT+CD28 +PHA + PWM culture seul Patient 1 Jo 521 285 1076 P1 TT+CD28 265 4568 12716 impatient 2JO 350 157 1549 i-P2 TT 103 883 342 P2 TT+CD28 362 6167 17958 tP2 SEB 63 72 112 18616 219 P2 SEB+CD28 127 1119 1843 28617 3237 Témoin Jo 680 3930 3290 TT 569 7091 4382 T TT+CD28 618 .8882 5416 T SEB 128 ::3150 4102 27341 6721 SE T SEB+CD28 147 1397 7110 13247 3127 TABLEAU III Restauration de la capacité des lymphocytes à proliférer en réponse au PWM et au SEB après une première stimulation par la PHA milieu de stimulation Milieu + PHA + PWM +SEB sans adjuvant patient 1 JO 405 12443 727 1024 P1 (PHA) J1O 163 14130 3178 11206 patient 2 JO 177 14987 305 682 iP2(PHA)J10 387 24103 1 18029 22785 patient 3 JO 251 9070 545 3999 eP3 (PHA)J1O 124 12192 2152 15303 Patient 4 JO 529 14714 1660 2141 P4 (PHA) J1O 429 20035 3760 16347 TABLEAU IV Restauration de la capacité des lymphocytes à proliférer en réponse au PWM et au SEB après une première stimulation par le PHA ou par des cellules allogéniques milieu de stimulation milieu + PHA + PWM + SEB sans stimulus Patient 1 JO 139 13.750 1.751 5.562 P1 (PHA) J1O 384 16.279 19.383 P1 (RLM) J1O 2033 12.444 17.378 Patient 2 JO 365 15.464 1.617 4.676 P2 (RLM) J10 564 6.092 10.797 REVENDICATIONS 1. Médicament contenant un agent inhibant in vivo l'apoptose pathologique, ledit agent pouvant être sélectionné par un procédé comprenant au moins les étapes de - mise en contact d'au moins deux préparations cellulaires infectées par un rétrovirus avec un agent d'activation cellulaire , tel que du mitogène pockweed respectivement en présence et en absence dudit agent , et - comparaison de la prolifération des deux préparations cellulaires. 2. Médicament selon la revendication l,caractérisé en ce que l'agent est capable de bloquer la réception ou la transduction de signaux conduisant au suicide des cellules 3. Médicament selon la revendication 2,caractérisé en ce que l'agent est capable d'inhiber l'activation d'une endonucléase nucléaire entraînant la fragmentation du génome de la cellule 4. Médicament selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'agent apporte ou génère un co-signal permettant à la cellule de se différencier et de se multiplier normalement. 5. Médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent à lui seul entraîne la prolifération et la différenciation cellulaires et génère des cellules qui ont perdu la capacité à se suicider dans des conditions pathologiques 6. Médicament selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'agent est capable d'inhiber les signaux qui rendent une cellule susceptible de répondre par une apoptose pathologique à une activation 7. Médicament selon la revendication 2 , contenant de la cyclosporine, ou un inhibiteur de synthèse protéique tel que la cycloheximide. 8. Médicament selon la revendication 4 contenant un anticorps anti-CD28 ou une association d'un agent entraînant la stimulation de la phosphokinase C , tel qu'un ester du phorbol, avec l'interleukine I. 9. Médicament selon la revendication 5 contenant un agent mitogène tel que la phytohémagglutinine (PHA) , des cellules allogéniques irradiées , un anticorps anti-CD2 ou un anticorps anti-CD3. 10. Médicament selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est destiné au traitement et à la prévention des maladies liées aux rétrovirus et en particulier liées aux lentivirus , tels que les virus HIV chez l'homme et SIV, FIV, BIV , VISNA et CAEV chez l'animal 11. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité pharmaceutiquement efficace d'un agent tel que défini dans l'une des revendications 1 à 9 en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants pharmaceutiquement acceptables 12. Composition pharmaceutique selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement et à la prévention des maladies liées aux rétrovirus et en particulier liées aux lentivirus , tels que les virus HIV chez l'homme et SIV, FIV , BIV, VISNA et CAEV chez l'animal 13.Utilisation d'un agent tel que défini dans l'une des revendications 1 à 9 pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement et à la prévention des maladies liées aux rétrovirus et en particulier liées aux lentivirus , tels que les virus HIV chez l'homme et SIV, FIV, BIV, VISNA et CAEV chez l'animal. 14. Méthode de détermination de la déficience qualitative du répertoire immunologique d'un individu vis-àvis d'un agent infectieux comprenant au moins les étapes de - stimulation in vitro des lymphocytes dans un milieu contenant au moins un anticorps anti-CD28 en présence d'un ou plusieurs antigènes spécifiques de l'agent infectieux, et - mesure de la cinétique de prolifération des lymphocytes. 15. Méthode de détermination de la capacité des lymphocytes d'un individu à répondre à l'agression par un agent infectieux comprenant au moins les étapes de - stimulation in vitro des lymphocytes dans un milieu contenant au moins un anticorps anti-CD28 en présence d'un ou plusieurs antigènes spécifiques de l'agent infectieux, et - mesure de la cinétique de prolifération des lymphocytes. 16. Méthode de stimulation in vitro de lymphocytes issus de patients atteints d'une maladie liée aux rétrovirus par traitement des lymphocytes isolés par un anticorps anti CD28. 17. Méthode de sélection d'un agent inhibant in vivo l'apoptose pathologique comprenant au moins une étape de mise en contact de cellules infectées par un lentivirus , tel qu'un virus HIV avec un antigène respectivement en présence et en absence dudit agent et, consécutivement de stimulation par ledit antigène.