FR 2672291 A1 19920807 FR 9101102 A 19910131 Composition d'anticorps dirigés contre le récepteur de l'interleukine-2 humaine ou animale. La présente invention se rapporte à une composition comprenant au moins deux anticorps dirigés contre le récepteur de l'interleukine-2 humaine ou animale pour assurer l'inhibition de la liaison de l'interleukine-2 (IL-2). L'interleukine-2 joue un rôle primordial dans la régulation du système immunitaire. On sait que deux glycoprotéines membranaires sont impliquées dans la fixation de ltIL2. I1 s'agit de la chaîne p55 (chaîne a de 55 kDa ou antigène Tac) par laquelle 1'IL-2 se lie à la cellule avec une faible affinité (Kd = 10 8 M) (référence bibliographique 1) et de la chaîne p75 (chaîne S de 75 ou 70 kDa) qui présente une affinité intermédiaire pour 1'IL-2 (.Kd = 10 9M) (2 à 5). Les deux chaînes se combinent pour former le récepteur de l'interleukine-2 (rIL-2) à haute affinité (Kd = 10 11 M) (2 à 6). L'ADNc codant pour chacune des deux chaînes p55 et p75 a été identifié (6 et 7).Au contraire des cellules n'exprimant que la chaîne p55, les cellules ne présentant que Ia chaîne p75 répondent à 1'IL-2 (8 à 10) et l'internalisent (11). On a déjà réalisé un certain nombre d'anticorps monoclonaux dirigés contre la chaîne p55 chez l'homme et l'animal. Certains de ces anticorps ont été utilisés dans le traitement de maladies associées à une activation lymphocytaire, telles que des maladies auto-immunes expérimentales (12, 13), la leucémie à cellules T (14) et, surtout, aux transplantations d'organes (15). L'efficacité d'un anticorps monoclonal anti-p55, le 33B3.1, a été démontrée dans la prévention du rejet précoce d'allogreffes de reins chez l'homme (16 à 18). On connaît également un certain nombre d'anticorps monoclonaux anti-p75, notamment TU27 (19), Miss1 et Mit82 (20), 2-RB (21). Outre l'utilisation de certains de ces anticorps monoclonaux pour inhiber la liaison de 1'IL-2 à son récepteur, on a aussi décrit dans ce dessein l'emploi d'un mélange de deux anticorps monoclonaux dirigés tous deux contre la chaîne p55 (demande de brevet européen EP-A-0.241.811). En analysant l'effet d'anticorps monoclonaux anti-p75, en particulier l'anticorps TU27, sur la prolifération cellulaire d'un clone lymphocytaire T humain induite par l'IL-2, la déposante a trouvé que l'anticorps n t affectait pas la prolifération des cellules lorsque la concentration en IL-2 couvrait le niveau de saturation des récepteurs de haute affinité, ce qui laisse présager un niveau d'inhibition faible ou nul in vivo en présence d'IL-2. En outre, la déposante a trouvé que les anticorps anti-p55 tels que 33B3.1 n'induisaient une inhibition complète de la liaison de l'IL-2 qu'à forte concentration ( > 100 nM). La présente invention a donc pour objectif de fournir une composition d'anticorps, de préférence monoclonaux, induisant à faible concentration une inhibition efficace de la liaison de l'IL-2 et de la prolifération induite par 1'IL-2. La déposante a trouvé, de façon surprenante, que l'utilisation combinée de deux anticorps monoclonaux respectivement anti-p55 et anti-p75 présente un effet de synergie qui se traduit par une très forte inhibition de la prolifération cellulaire à des concentrations en anticorps beaucoup plus faibles que ce qui était utilisé dans l'art antérieur pour des résultats moindres. Ainsi, l'effet inhibiteur de 33B3.1 sur la prolifération induite par l'IL-2 est fortement facilité en présence de TU27, l'inhibition de 50 % de la prolifération étant alors obtenue à des concentrations de 33B3.1 40 fois inférieures. L'invention a donc pour objet une composition comprenant au moins deux anticorps dirigés contre le récepteur de l'IL-2, caractérisée en ce qu'elle comporte un anticorps anti-p55 et un anticorps anti-p75 assurant l'inhibition de la liaison de l'IL-2 à son récepteur et de la prolifération cellulaire. Par anticorps dans le sens de l'invention, on entend aussi bien les anticorps eux-mêmes que des fragments d'anticorps tels que Fab, F(ab')2 et Fv Ces fragments peuvent être notamment obtenus par voie chimique ou génétique. L'anticorps anti-p55 et/ou l'anticorps anti-p75 sont de préférence des anticorps monoclonaux. Par récepteur de l'IL-2 dans le sens de l'invention, on entend aussi bien le récepteur à haute affinité constitué par l'ensemble des chaînes p55 et p75, que lesdites chaînes seules, notamment la chaîne p75 qui présente une affinité intermédiaire permettant la liaison de l'IL-2. Parmi les anticorps monoclonaux utilisables dans la combinaison selon l'invention, on peut citer, pour les anticorps anti-p55, notamment 33B3.1, et, pour les anticorps anti-p75, notamment TU27. L'invention s'applique également aux combinaisons d'anticorps anti-p55 et anti-p75 qui ont été modifiés par voie chimique ou par recombinaison génétique, y compris les anticorps chimériques "humanisés", par exemple par le procédé décrit dans la demande de brevet FR-A-2 641 468, ainsi qu'aux anticorps bispécifiques que l'on peut dériver d'anticorps anti-p55 et anti-p75, par des procédés connus chimiques ou génétiques. Les proportions relatives d'anticorps anti-p55 et anti-p75 peuvent varier dans d'assez larges proportions. Dans la combinaison 33B3.1/TU27 le rapport peut aller de 99/1 à 1/99, le rapport optimal étant estimé à 63+20/37+20. Les proportions pour d'autres combinaisons peuvent être déterminées par des essais in vitro ou calculées à partir des rapports optimaux de la combinaison 33B3.1/TU27, en proportion des affinités respectives'pour le récepteur de l'IL-2. La composition selon l'invention est utilisable notamment comme agent actif contre les rejets d'organes et de greffes de moelle, contre les leucémies et lymphomes CD25-positifs ainsi que contre les pathologies auto-immunes telles que le diabète de type 1, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante, la sclérose en plaques et la myasthénia gravis. L'invention a donc également pour objet un procédé de traitement de ces maladies dans lequel on administre par voie parentérale, notamment par voie intraveineuse, la composition objet de l'invention, de préférence entre 1 et 50 mg par jour dans un véhicule isotonique contenant les excipients appropriés. L'invention va être maintenant décrite plus en détail dans la description détaillée suivante, se référant au dessin annexé dans lequel - La figure 1 montre l'effet de TU27 et 33B3.1 sur la liaison de haute affinité de l'IL-2 aux cellules 4AS. Les cellules 4AS ont été incubées à 37"C pendant 30 mn avec des concentrations croissantes d'IL-2 marquée à l'iode 125, seule (i) ou en présence de TU27 (40 nM) (), 33B3.1 (20 nM) (J., ou en présence de TU27 et 33B3.1 dans les mêmes concentrations (e). La liaison non spécifique a été mesurée en présence d'un excès (100 fois) d'IL-2 non marquée (+). Le graphique A représente les courbes de liaison. Le graphique B représente l'analyse Scatchard après soustraction de la liaison non spécifique. - La figure 2 montre l'inhibition de la liaison de TU27 marqué à l'iode 125 aux cellules 4AS, par l'IL-2. Les cellules 4AS ont été incubées à 37"C pendant 45 mn avec 2 nM de TU27 marqué et avec des concentrations croissantes d'IL-2, en l'absence (À) et en présence (I) de 20 nM de 33B3.1. - La figure 3 montre l'effet de TU27 et 33B3.1 sur la prolifération cellulaire IL-2-dépendante. Les cellules 4AS ont été réparties dans des plaques à 96 puits avec des cellules DAB irradiées et des concentrations croissantes d'IL-2, en l'absence (A) ou en présence de 70 nM de TU27 (-) ou de 660 nM de 33B3.1 (e). - La figure 4 montre l'effet de synergie de TU27 et 33B3.1 sur l'inhibition de la prolifération cellulaire IL-2-dépendante. Les cellules 4AS ont été réparties dans des plaques à 96 puits avec des cellules DAB irradiées, 250 pM d'IL-2 et (graphique A) des concentrations croissantes de 33B3.1 en l'absence (A) ou en présence (A) de 70 nM de TU27 ou (graphique B) des concentrations croissantes de TU27 en l'absence (i) ou en présence (A) de 25 nM de 33B3.1. MATERIELS ET METHODES 1 - Cellules Le clone 4AS, disponible chez les auteurs des articles référencés 22 et 23, est issu d'une série de clones produits par dilutions limites à partir d'une allogreffe de rein rejetée (22, 23). Il a été cultivé en milieu RPMI 1640 (GIBCO, Glasgow, Ecosse) supplémenté avec 10 % de sérum humain (CTS, Nantes, France) et 1 nM de rIL-2 (Roussel Uclaf) et a été stimulé pendant une semaine en présence de cellules B transformées par l'EBV et irradiées. Ces cellules B ont été isolées à partir de splénocytes du donneur de greffon rénal et sont disponibles chez les mêmes auteurs. Cette lignée cellulaire (appelée lignée cellulaire DAB) a été cultivée en milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10 * de sérum de veau foetal (SEBAK, Paris, France). 2 - AnticorPs et IL-2. L'anticorps monoclonal TU27 est une IgG1 de souris dirigée contre la chaîne p75 du rIL-2 humain (19). Il a été purifié à partir de liquide d'ascite (fourni par K. Sugamura, Tohoku University, Japon) par chromatographie d'affinité sur une colonne de protéine A (Bio-Rad, Richmond, USA), dialysée contre du PBS, puis les échantillons ont été stockés à -20 C. L'anticorps TU27 a été déposé sous la référence FERM P 10509, FERM BP 2510 auprès de la collection japonaise : Fermentation Research Institute (FR1), 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken 305 Japon. L'anticorps monoclonal 33B3.1 est une IgG2a de rat dirigée contre la chaîne p55 du rIL-2 humain (24, 25) et est commercialisé par IMMUNOTECH (France) sous la dénomination IOT 14a. L'IL-2 utilisée est une molécule recombinante hautement purifiée produite dans Escherichia coli et a été fournie par les Laboratoires Roussel Uclaf, Romainville, France. 3 - Marquage radioactif de l'IL-2 et des anticorps monoclonaux. L'IL-2 couplé à l'iode 125 provient de New England Nuclear (Boston, Massachusetts, USA). Sa radioactivité spécifique est comprise entre 300 et 1000 cpm/fmol. TU27 et 33B3.i ont été marqués à l'iode 125 par la méthode à l'iodogène (26). La radioactivité spécifique se situait entre 1500 et 2500 cpm/fmol. 4 - Essais de liaison. Les cellules 4AS sont soumises au préalable à un "lavage" de 1'IL-2 par préincubation -pendant deux heures à 37"C dans un milieu exempt d'IL-2. Les cellules ont été ensuite centrifugées, lavées trois fois et remises en suspension dans du PBS contenant 0,5 % de BSA. Des échantillons de 25 iil par puits de suspension cellulaire (entre 0,5 et 2.106 cellules par puits selon le cas) ont été répartis sur des plaques à 96 puits (NUNC, Roskilde, Danemark), avec des concentrations croissantes de ligand marqué dans un volume final de 50 iil par puits.Après une incubation de 45 mn (ligand = anticorps) ou de 30 mn (ligand = IL-2) à 37"C sous agitation, des cellules de chaque puits ont été déposées sur une couche d'huile de paraffine au dibutylphtalate, centrifugées et les fractions radioactives liées ou non liées aux cellules ont été séparées et comptées comme cela est décrit dans la référence 27. Les capacités de liaison maximales (Bmax) des ligands et leurs constantes de dissociation respectives (Kd) ont été déterminées par analyse Scatchard. 5 - Compétition. Les cellules ont été préparées et réparties comme ci-dessus. Le ligand marqué a été ajouté à concentration fixe à des concentrations croissantes de compétiteurs non marqués. Après incubation à 37"C pendant 30 mn (IL-2) ou 45 mn (anticorps), les fractions liées et non liées aux cellules ont été déterminées comme cela a été décrit ci-dessus. 6 - Essai de prolifération. Les cellules 4AS ont été réparties dans des plaques à 96 puits à raison d'une quantité de 10 000 cellules par puits dans 200 gl de milieu RPMI 1640 + 10 % de sérum humain. On a ajouté ensuite des cellules stimulantes (20 000 cellules DAB irradiées par puits) et diverses concentrations d'IL-2. Après 72 h d'incubation à 370C en incubateur, les cellules ont été incubées pendant 16 h en présence de thymidine tritiée (0,25 pCi par puits) (Amersham, Les Ulis, France), récoltées (appareil de récolte PHD, Watertown, Massachusetts, USA) et l'incorporation de thymidine a ensuite été déterminée. INTERACTION DE TU27 ET DE 33B3.1 AVEC LA LIAISON A HAUTE AFFINITE DE L'IL-2. L'influence de TU27 et de 33B3.1 sur la liaison de 1'IL-2 avec les cellules 4AS a été d'abord analysée à 37"C par addition des compétiteurs en même temps que llIL-2 marquée (figure 1). Dans le domaine des concentrations étudiées (jusqu'à 2 nM), la liaison de llIL-2 est caractérisée par une prédominance de la composante à haute affinité (Kd = 60 pM, 2600 sites/cellule) et l'apparition d'une composante à faible affinité.A une concentration (26 nM) induisant une inhibition complète de la liaison de 1'IL-2 sur des cellules YT.2C2 (clone dérivé d'une lignée cellulaire du type NK humain ; référence bibliographique 4) qui n'expriment que la chaîne p75, l'anticorps TU27 n'a que faiblement inhibé la liaison de 1'IL-2 aux cellules 4AS et le Kd de la liaison à llIL-2 n'a été que légèrement affecté (Kd = 75 pM) (figure lB). L'anticorps 33B3.1, qui est inactif vis-à-vis des cellules YT.2C2 du fait de l'absence de la chaîne p55, a présenté un effet inhibiteur bien supérieur à TU27 sur la liaison de 1'IL-2 aux cellules 4AS. Comme cela ressort des analyses Scatchard (figure lB), l'anticorps 33B3.i induit la disparition complète de la composante à haute affinité. La liaison de l'IL-2 en présence de 33B3.1 s'est caractérisée par une affinité intermédiaire (Kd = 1,36 nM). Le nombre de sites de liaison à affinité intermédiaire (2500 sites/cellule) était analogue au nombre de sites de liaison à haute affinité mesuré en l'absence de 33B3.1, suggérant que 33B3.1, en se fixant sur p55, a pour effet de transformer les structures à haute affinité par libération de la composante à affinité intermédiaire. En outre, les composantes à affinité intermédiaire observées en présence de 33B3.1 étaient complètement inhibées par TU27 (figure 1) avec un effet demi-maximal observé au voisinage de 1 nM, montrant que cette composante correspondait bien à des chaînes p75 isolées. On considère maintenant l'effet de 1'IL-2 sur la liaison de TU27 (figure 2). L'IL-2 inhibe complètement la liaison de TU27 sur les cellules 4AS et cet effet a été observé à des concentrations faibles d'IL-2 (constante d'inhibition Ki = 20 pM) correspondant à sa liaison à haute affinité. Par lui-même, 33B3.1 n'a pas d'effet sur la liaison de TU27 et inversement. Par contre, en présence de 33B3.1, l'IL-2 n'inhibe la liaison de TU27 qu'à des concentrations environ 50 fois supérieures. Dans ce cas, la constante d'inhibition était de K. = 890 pM. Ces résultats confortent le schéma selon lequel l'anticorps 33B3.1, en se fixant aux chaînes p55, libère la composante à affinité intermédiaire pour 1'IL-2 (p75). EFFET DE TU27 ET DE 33B3.1 SUR LA PROLIFERATION IL-2-DEPENDANTE DES CELLULES 4AS Stimulées par un allo-antigène (lignée cellulaire DAB), les cellules 4AS ont proliféré proportionnellement à la quantité d'IL-2 (figure 3). La prolifération demi-maximale a été observée pour 200 pM d'IL-2, une valeur correspondant à la liaison d'IL-2 au récepteur à haute affinité. L'ajout en excès de 33B3.1 (660 nM) dans le milieu de culture s st traduit par une inhibition complète de la prolifération. En revanche, TU27 n'a pas eu d'effet significatif sur la prolifération IL-2-dépendante des cellules 4AS, même pour de faibles concentrations, sub-optimales, d'IL-2, que l'anticorps ait été ajouté en même temps que 1'IL-2 ou qu'il ait été préincubé pendant 1 h avec les cellules, avant l'addition d'IL-2. Des expériences réalisées sur d'autres clones de cellules T ont donné des résultats similaires. Les courbes de réponse en fonction des doses d'anticorps ont montré que 33B3.1 inhibait la prolifération induite par IL-2 des cellules 4AS (figure 4A) avec un effet demi-maximal observé à 7,5 nM. Une inhibition complète de la prolifération par 33B3.1 n'était observée qu'à concentration élevée ( > 100 nM). Cependant, lorsque TU27 était présent à une concentration de 70 nM, la courbe de réponse en fonction de la dose de 33B3.1 était largement décalée vers les faibles concentrations. Dans ce cas, l'inhibition demi-maximale de la prolifération était obtenue avec seulement 0,2 nM de 33B3.1, c'est-à-dire environ 40 fois moins d'anticorps. D'autres expériences (figure 4B) ont montré que, alors que TU27 seul à des concentrations importantes de 50 pM à 320 nM, avec ou sans préincubation, n'avait pas d'effet sur la prolifération induite par IL-2, cet anticorps montrait un effet inhibiteur en présence de 33B3.1. L'anticorps 33B3,1 à 25 nM induit une inhibition de 70 * environ de la prolifération et les 30 f restants sont complètement inhibés par TU27 (effet demi-maximum observé à 1 nM). REFERENCES BIBLIOGRAPHIOUES 1 - W.C. GREENE et al., 1985, J. Exp. Med. 162:363. 2 - M. SHARON et al., 1986, Science 234:859. 3 - M. TSUDO et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4215. 4 - K. TESHIGAWARA et al., 1987, J. Exp. Med. 165:223. 5 - R.J. ROBB et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2002. 6 - M. HATAKEYAMA et al., 1989, Science 244:551. 7 - T. NIKAIDO et al., 1984, Nature 311:631. 8 - H. M. WANG et al., 1987, J. Exp. Med. 166:1055. 9 - M. TSUDO et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5394. 10 - L. T. BICH-THUY et al., 1987, J. Immunol. 139:1550. 11 - R.J. ROBB et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1201. 12 - N. S. HAYOSH et al., 1987, J. Immunol. 138:3771. 13 - V. E. KELLEY et al., 1988, J. Immunol. 140:59. 14 - T. A. WALDMANN et al., 1985, Cancer Res. 45:45595. 15 - J. P. 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Composition comprenant au moins deux anticorps dirigés contre le récepteur de l'interleukine-2, caractérisée en ce qu'elle comporte un anticorps anti-p55 et un anticorps anti-p75 assurant l'inhibition de la liaison de l'interleukine-2 à son récepteur. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'anticorps anti-p55 et/ou l'anticorps anti-p75 sont des anticorps monoclonaux. 3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comporte l'anticorps 33B3.1 dirigé contre la chaîne p55 et l'anticorps TU27 dirigé contre la chaîne p75. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'un au moins des anticorps est un anticorps chimérique. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les deux anticorps sont liés sous forme d'anticorps bispécifique. 6. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que le rapport de 33B3.1/TU27 est compris entre 99/1 et 1/99. 7. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que le rapport de 33B3.1 / TU27 est de 63 + 20 / 37 +20 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comme agent actif contre les rejets d'organes et de greffes de moelle, contre les leucémies et lymphomes CD25-positifs ainsi que contre les pathologies auto-immunes telles que le diabète de type 1, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante, la sclérose en plaques et la myasthénia gravis.