FR 2669340 A1 19920522 FR 9014690 A 19901119 COMPOSES A LIBERATION PROGRESSIVE D'OLIGOMERES DE LA GLUCOSAMINE, PROCEDE DE PREPARATION ET APPLICATIONS De manière générale, la présente invention concerne les oligomères de la glucosamine, en tant qu'agents ou principes actifs dans différentes applications, notamment thérapeutiques, cosmétiques, alimentaires et diététiques, et traitement des plantes et végétaux. Par oligomère de la glucosamine, on entend un polymère de cette dernière, ayant un degré de polymérisation inférieur ou égal à 100, le distinguant des polymères de plus haut poids moléculaire, assimilables à des chitosanes pratiquement complètement N-désacétylés. On pressent tout l'intérêt et l'action des oligomères de la glucosamine, quand on sait que dans beaucoup d'applications du chitosane, ce sont en fait les formes dégradées de ce dernier, correspondant à une diminution du degré de polymérisation, qui sont en fait actives. Ainsi, on se réfèrera aux documents suivants - le document WO-A-8907395 démontrant qu'un chitosane a un effet bénéfique sur les plantes et végétaux, notamment leur croissance, leur résistance au gel, etc... - la publication de MM. Thomas CHANDY et Chandra P. SHARMA, ayant pour titre "Chitosan as a biomaterial", BIOMAT., ART. CELLS, ART.ORG., 18 (1), 1-24 (1990), qui indique le rôle favorable des chitosanes, notamment pour l'épithélisation, en particulier de tissus parodontaux, pour traiter les troubles du foie, les maladies osseuses. Dans la présente discussion et description, on réservera le terme "chitosane", sans autre complément qualificatif, aux formes partiellement (mais jamais totalement) N-désacétylées de la chitine. Dans la description ci-après, lorsque le chitosane est complètement désacétylé, ceci sera dit expressément. Différents documents ont décrit, et on sait obtenir des oligomères de la glucosamine, selon le procédé général suivant - obtention d'un chitosane complètement désacétylé ; cf publication de MM. DOMARD et RINAUDO, ayant pour titre "Preparation and characterization of fully deacetylated chitosan", Int 3 Biol.Macromol., 1983, Vol 5, February - puis hydrolyse ou dégradation enzymatique du chitosane complètement N-désacétylé, pour obtenir un mélange d'oligomères de la glucosamine, de degrés de polymérisation différents ; séparation par chromatographie de ce mélange, pour obtenir différentes fractions d'oligomères ; isolement des oligomères des différentes fractions séparées ; cf "Glucosamine oligomers : 1. Preparation and characterization", Int. J.Biol.Macromol., 1989, Vol 11, October. Dans toutes les applications exposées précédemment, mettant en oeuvre des oligomères de la glucosamine, un problème central, comme pour le chitosane, concerne la durée de vie desdits oligomères, en tant qu'agents ou principes actifs. Mais ce problème est dans le cas présent exacerbé par la masse moléculaire relativement faible des oligomères considérés. On sait en effet que ces oligomères peuvent être entraînés rapidement en solution, dégradés, altérés sous l'effet de différents agents physiques, chimiques, etc... Et il est donc essentiel de trouver une forme de ces oligomères permettant la libération progressive, contrôlée, ou retardée de ces agents ou principes actifs, "in situ", c'est-à-dire à l'endroit même où ils agissent ou interviennent. S'agissant d'un chitosane, diverses solutions à effet retard ont été proposées, telles que réticulation entre elles des macromolécules de degrés de polymérisation différents par l'intermédiaire de liaisons covalentes, complexation des mêmes macromolécules avec des métaux lourds, ou encore association de type électrostatique par polyanion-polycation. Ainsi, si on se réfère au document WO-A-8907395, on propose d'introduire dans la solution de chitosane traitante, un fixateur dont le rôle est d'empêcher, ou tout au moins limiter la dégradation du chitosane, une fois la solution traitante appliquée. Les fixateurs retenus sont choisis parmi l'oxyde de potassium tribasique, etc.... ; un tel fixateur interagit avec les différentes macromolécules de chitosane, par réticulation ou complexation avec les métaux du fixateur, pour conduire à l'effet retard recherché. De telles solutions sont bien souvent inacceptables pour le milieu ou le substrat traité, notamment s'il est vivant, en raison de la toxicité des agents liants utilisés. La présente invention a eu pour objet de trouver un moyen ou solution de libération contrôlée, souvent appelée "retard", remédiant aux inconvénients discutés précédemment, et spécifique aux oligomères de la glucosamine. Par la caractérisation d'une nouvelle forme physico-chimique des oligomères en question, mise en évidence par le protocole expérimental exposé ci-après, la présente invention a apporté une solution particulièrement simple au problème identifié précédemment. Cette nouvelle forme peut être obtenue, à l'état solide, selon le procédé général décrit précédemment, mais en observant, ce qui n'avait jamais été fait auparavant, un temps de repos ou latence pour le ou les oligomères isolés, avant toute utilisation ou consommation postérieure de l'oligomère. La mise en solution de la nouvelle forme identifiée précédemment génere un pseudo-équilibre entre le ou les agrégats isomoléculaires de l'oligomère d'une part, et la forme isolée du même oligomère d'autre part, conduisant progressivement à la dissociation desdits agrégats, et au relargage de la forme isolée du même oligomère. On obtient ainsi une forme retard particulièrement efficace, sans aucune adjonction d'un agent liant ou réticulant, ou d'une autre nature ; dans la forme selon l'invention, les oligomères sont associés les uns aux autres, de manière isomoléculaire, c'est-à-dire avec le même degré de polymérisation ou Ja même masse moléculaire, uniquement par des forces physiques qu'il apparaît aujourd'hui difficile de caractériser, mais néanmoins existantes comme montré ci-après. Par "association directe", on entend le fait qu'entre les oligomères associés, de même degré de polymérisation, il n'existe aucune liaison covalente directe ou indirecte, par un agent de réticulation par exemple. Comme montré ci-après, au surplus, la forme nouvelle selon l'invention, à l'état solide, se montre très stable dans le temps. La présente invention présente en outre les caractéristiques suivantes, considérées isolément ou en combinaison - le composé selon l'invention, mis en solution, comprend en mélange plusieurs agrégats isomoléculaires constitués respectivement par des multiples différents de l'oligomère de base, par exemple dans des proportions pondérales décroissantes pour les multiples les plus élevés - le composé selon l'invention comprend plusieurs oligomères de degrés de polymérisation respectivement différents, chaque oligomère étant présent en solution sous la forme d'un mélange d'au moins un agrégat isomoléculaire tel que défini précédemment, et de la forme isolée dudit oligomère - les groupements aminés de l'oligomère sont sous forme neutre, à l'état -NH2, auquel cas, en solution, la proportion pondérale de l'agrégat associant deux molécules de l'oligomère de base est au moins égale à 10 %, ou les groupements aminés du même oligomère sont sous forme cationique, c'est-à-dire à l'état -NH3, auquel cas, en solution, la proportion pondérale de l'agrégat associant deux molécules de l'oligomère de base est au moins égale à2% - l'oligomère de base a un degré de polymérisation compris entre 2 et 100, et de préférence compris entre 20 et 30 - le composé selon l'invention est à l'état solide, après précipitation suivie d'une éventuelle lyophilisation - dans ses différentes applications, le composé selon l'invention peut être utilisé sous forme dissoute dans un solvant, ou supporté dans un ou sur un support en suspension dans un milieu de dispersion. S'agissant du procédé selon l'invention, on peut en outre noter les caractéristiques complémentaires suivantes - le mélange d'oligomères est séparé par chromatographie d'exclusion stérique, auquel cas la phase d'élution de la chomatographie est un système acétate d'ammonium-acide acétique - on isole les oligomères de même degré de polymérisation, sous forme neutre, c'est-à-dire à l'état -NH2 pour les groupements aminés, notamment par précipitation dans l'alcool isopropylique, puis traitement du précipité dans une solution ammoniacale - on peut aussi isoler les oligomères de même degré de polymérisation sous forme cationique, c'est-à-dire à ltétat -NH3 pour les groupements aminés, notamment par précipitation dans l'alcool isopropylique, puis Traitement du précipité par un acide minéral fort. Dans un mode préférentiel de mise en oeuvre du procédé, on choisit pour la séparation des oligomères une colonne de chromatographie présentant en combinaison les caractéristiques suivantes - un support de silice greffée à l'aide de groupements organiques hydrophiles - un nombre de plateaux par mètre supérieur à 16 000 - un domaine de résolution compris entre DP 2 et DP 100 pour des polysaccharides. La présente invention est maintenant décrite de manière générale et expérimentale, en référence aux résultats des analyses chromatographiques et spectrales représentées par les figures 1 à 7 jointes, selon lesquelles: - Figure 1 est le chromatogramme obtenu sur colonne "Protein-Pack" 200 SW (Waters), correspondant à la distribution totale d'un chitosane complètement désacétylé, hydrolysé par HCl 12N à 72"C pendant une heure - Figure 2 est le chromatogramme obtenu sur colonne "Protein-Pack" 200 SW (Waters), correspondant à un oligomère de DP 39,5 avec un indice de polymolécularité de 1,03, préparé par un seul fractionnement de l'hydrolysat, selon Figure 1 - Figure 3 est un cliché de diffraction des rayons X d'un oligomère de DP 39 isolé sous forme -NH2, et maintenu au repos pendant plusieurs mois - Figure 4 est le chromatogramme obtenu sur colonne "Protein-Pack" 200 SW (Waters) d'un oligomère de DP 9 (C = 5 g/l) isolé sous forme -NH2, et maintenu au repos pendant 4 jours - Figure 5 est le chromatogramme obtenu sur colonne "Protein-Pack" 200 SW (Waters) d'un oligomère de DP 39 (C = 5 g/l) isolé sous forme -NH2, et maintenu au repos pendant plusieurs mois - Figure 6 est le chromatogramme obtenu sur colonne "Protein-Pack" WS 803 F (Shodex) d'un oligomère de DP 39 (C = 5 g/l) isolé sous forme -NH2, et maintenu au repos pendant plusieurs mois - Figure 7 est le chromatogramme obtenu sur colonne "Protein-Pack" 200 SW (Waters) d'un oligomère de DP 39 (C = 25 g/l) isolé sous forme -NH2. Tout d'abord, le procédé d'obtention des composés selon la présente invention est de manière générale conforme à celui décrit dans la publication introduite précédemment, et ayant pour titre :"Glucosamine oligomers : 1. Preparation and characterization" ; mais comme déjà dit, c'est l'addition d'une étape de repos de l'oligomère isolé à l'état solide, qui a conduit à l'identification de la forme retard selon la présente invention. La séparation des fractions d'oligomères peut être obtenue plus rapidement et avec une meilleure efficacité, sur des colonnes de chromatographie d'exclusion stérique d'un type particulier, identifié ci-après, et ce pour des degrés de polymérisation compris entre 15 et 100. On part de chitosanes produits en France par la Société Abertechnologies. Leur masse moléculaire importe peu ; par contre, pour des raisons de commodité, il est préférable que leur taux d'acétylation résiduel soit inférieur à 15 % ou, mieux encore, inférieur à 3 %. Dans le premier cas, on pourra obtenir leur désacétylation totale après deux étapes successives, alors qu'une seule étape suffira dans le deuxième cas. Les colonnes de chromatographie sélectionnées selon les caractéristiques précédentes sont par exemple celles de type "R-otein-Pack" 200 SW ou 300 SW vendues par la Société Waters (Millipore), ou WS 800 vendues par la Société Shodex, ou tout autre support de silice greffée à l'aide de substances organiques hydrophiles. Pour une séparation à l'échelle préparatîve, on utilise les systèmes correspondants existant dans le commerce. L'éluant de chromatographie est un tampon acétate d'ammonium/ acide acétique (0,15 M en acétate d'ammonium, à pH 4.5). En utilisant un tampon acide acétique-acétate d'ammonium pour éluant, il est possible d'obtenir une séparation chromatographique des oligomères de la glucosamine, sur des colonnes de silice greffée, de type "Protein-Pack", telles que vendues par Waters ou Shodex. La séparation, obtenue selon un processus d'exclusion stérique, s'avère plus performante, tout en recouvrant un domaine de séparation beaucoup plus large que sur une colonne de type Biogel P60 ; un exemple de chromatogramme est donné sur la figure 1, pour un hydrolysat de chitosane d'environ une heure dans de l'acide chlorhydrique environ 12 N à 72"C. Les courbes d'étalonnage log (masse moléculaire) en fonction du volume d'élution montrent que la limite de séparation (volume exclu) correspond par exemple à un degré de polymérisation (DP) voisin de 100, pour une colonne de type 200 5W (Waters), et de 500 sur une colonne de type WS 803 F (Shodex). I1 est de plus possible, avec ce type de colonnes, de séparer une distribution donnée en fractions de polymolécularité très faible. Cette séparation s'avère là aussi beaucoup plus efficace qu'avec une colonne de type Biogel P60, puisqu'en une seule opération, il est possible, comme le montre l'exemple de la figure 2, de collecter une fraction de DP centré sur 39,5 avec un indice de polymolécularité égal à 1,03 ; ceci n'est habituellement obtenu qu'après trois fractionnements successifs sur une colonne du type Biogel P60. Les composés contenus dans les fractions séparées par chromatographie peuvent être isolés selon deux types de structure : la structure saline ou cationique correspondant à la forme ammonium (-NH+3) de la fonction amine primaire du motif glucosamine, et la structure neutre correspondant à la forme amine libre (-NH2 ) du même motif. L'anion associé à la forme ammonium peut être choisi parmi n'importe lequel des acides. Si l'on prend l'exemple d'un chlorure, la fraction est concentrée au maximum, puis précipitée par de l'alcool isopropylique, lavée et séchée. Le précipité est redissous dans l'eau, et la solution est lyophilisée, après addition de la quantité stoechiométrique (en très léger excès) d'acide chlorhydrique. I1 faut toutefois noter qu'il est préférable d'utiliser des acides forts, non organiques, lesquels donnent des sels beaucoup plus stables à l'état solide. Pour la forme amine libre, il suffit après concentration de la fraction, d'ajouter de l'ammoniaque dilué jusqu'à atteindre un pH de 9, 5, où la précipitation est totale. Le précipité est alors lavé à l'eau, puis lyophilisé après centrifugation et redispersion dans l'eau. Dans les deux cas, les composés solides obtenus sont stockés dans des flacons bouchés. Si l'on considère les oligomères de la glucosamine, tels qu'obtenus précédemment, quel que soit leur degré de polymérisation (DP-2 à 100 par exemple), ou la forme selon laquelle ils sont isolés, on note l'apparition de structures cristallines dans les échantillons, avec un taux de cristallinité qui dépend de la durée de stockage de l'échantillon, atteignant un pallier avant 3 mois. Cette cristallisation en phase solide évolue avec le temps, à partir de germes créés lors de l'isolement des composés, et grâce à l'intervention de molécules d'eau présentes dans les échantillons, à des teneurs toujours supérieures ou égales à 10 % en poids. Les clichés de diffraction de la figure 3 montrent que les formes cristallines obtenues seraient en fait des allomorphes du chitosane, de type "tendon". Lorsqu'on dissout un oligomère de la glucosamine dans l'eau, immédiatement après son isolement, l'analyse chromatographique de la solution obtenue donne un chromatogramme tout-à-fait superposable à celui que l'on avait obtenu avant son isolement. Ce résultat est observé quelle que soit la forme (-NH3 ou -NH2) de la fraction isolée, indépendamment des divers paramètres de préparation de la solution (pH, température, concentration, etc...). Lorsqu'on opère de la même façon avec un oligomère ayant été stocké, sous forme solide, après plusieurs jours voire plusieurs mois, on obtient un chromatogramme comme ceux représentés sur la figure 4. Comme pour le cas précédent, on retrouve un pic correspondant exactement à la distribution dont est issu l'oligomère. Par contre, ce pic est accompagné d'une succession de pics secondaires, apparaissant à des volumes d'élution de masses moléculaires de plus en plus élevées, dont la proportion pondérale décroît avec celle-ci. La courbe d'étalonnage en masse de la colonne chromatographique utilisée permet de montrer que ces pics sont centrés sur des volumes d'élution correspondant à des masses molaires exactement multiples de celles du pic principal.On a ainsi une solution contenant une distribution d'agrégats isomoléculaires d'un même oligomère, qui a pour masse moléculaire celle de l'oligomère isolé contenu dans le pic principal. L'utilisation d'une colonne chromatographique ayant un domaine de séparation plus étendu (figure 4) permet de démontrer que l'on peut observer ainsi l'élution d'agrégats ayant jusqu'à plus de quinze fois la masse moléculaire correspondant au pic principal.Les spectres infra-rouges et RMN permettent de montrer qu'aucune modification de la structure chimique n'est intervenue, et que le phénomène n'est dû qu'à des associations réversibles d'oligomères, dépendant principale ment de la structure du produit de départ (-NH3 ou NH2), et par suite de la nature et de l'énergie de la cohésion des cristaux contenus dans l'échantillon solide du composé ayant servi à préparer les solutions. Ce phénomène a lieu de manière limitée avec un oligomère isolé sous forme acide, alors que pour le même oligomère isolé sous forme -NH2, selon les conditions, il peut représenter jusqu'à plus de 60 % du comportement de l'échantillon en solution (figure 7).Ce phénomène correspond donc à un processus de dissolution retard, et ne peut être comparé au comportement d'associations classiques des chitosanes de haute masse moléculaire, puisqu'il n'est pas créé dans la solution et évolue à l'inverse de ce qui est observé pour un chitosane de haut poids moléculaire. Ce phénomène diminue par exemple avec le temps, contrairement au processus observé avec un chitosane de haut poids moléculaire. Le comportement décrit ci-dessus existe pour tous les oligomères de DP compris entre 2 et 100, en particulier lorsqu'ils sont isolés sous forme -NH2, avec toutefois un optimum se situant dans le domaine des DP compris entre 20 et 30. Au-delà d'un DP de 100, ce phénomène décroît progressivement lorsque la masse augmente. Le phénomène diminue aussi lorsqu'on chauffe les solutions, lorsqu'on diminue la concentration, ou lorsqu'on laisse vieillir les solutions. Cependant, dans tous les cas, il ne disparaît jamais totalement et il existe toujours un pseudo-équilibre entre les oligomères agrégés et les oligomères isolés. Ainsi, si la proportion d'oligomères isolés augmente avec le temps, au détriment des oligomères agrégés, cet accroissement ne dépasse pas 25 %, même après plusieurs semaines de stockage de la solution. Cet effet est d'autant moins important que la concentration initiale en oligomère est élevée. Le phénomène observé est un pseudo équilibre correspondant à un mécanisme de dissolution retard. En effet, si, par chromatographie, on sépare la fraction comprenant les oligomères isolés, de la fraction contenant tous les oligomères agrégés, on montre que dans la deuxième fraction l'équilibre est déplacé vers la formation d'oligomères isolés, après dissolution de cette fraction sans l'isoler, et que par contre la première fraction correspondant aux oligomères isolés ne subit aucune modification en solution. De plus, si l'on prépare une solution à une concentration donnée, la même solution, après avoir été concentrée dix fois, redonne exactement le même chromatogramme que celui de la solution de départ. Enfin, si l'on isole les produits contenus dans une solution ayant vieilli de telle sorte que la proportion d'oligomères isolés ait largement augmenté, le processus de cristallisation à l'état solide se développe à nouveau, et le chromatogramme d'une solution (à la même concentration que ci-dessus) préparée par exemple une semaine après l'isolement montre à nouveau une augmentation de la part des oligomères agrégés. Pour terminer, le mélange caractérisant la présente invention peut être obtenu de façon contrôlée, que ce soit en solution, à l'état solide, ou lors de processus alternant successivement solution et état solide. L'invention décrite ci-dessus trouve un champ d'applications très large comprenant les domaines de la cosmétologie, la pharmacie, la médecine, l'agriculture et l'alimentation (diététique). D'une façon générale, l'utilisation des formes selon l'invention des oligomères de la glucosamine, et de leurs propriétés particulières, peut se faire : en solution, en émulsion, en encapsulation (liposomes, gels, etc...), ou à l'état solide. L'invention concerne l'utilisation des oligomères comme principes ou agents actifs, soit directement, soit avec un effet retard, seuls ou associés à d'autres principes ou agents actifs. En pharmacie, en plus de ce qui a été énoncé dans le cas général, on peut utiliser conjointement du chitosane, déjà connu pour favoriser le mécanisme d'effet retard de divers principes actifs. En médecine, elle s'applique plus particulièrement à la cicatrisation et à tout processus de développement cellulaire. Dans l'agriculture, les composés selon l'invention seront utilisés comme biostimulants ou bioprotecteurs, soit sous forme solide, en particulier dans le cas des plantes d'ornement, soit en pulvérisation foliaire où le mécanisme d'alternance solution solide se produira in situ. Dans le processus expérimental décrit ci-après, par DP on entend un degré de polymérisation d'une molécule donnée, dans tous les cas où il sera inférieur ou égal à 15, alors qu'au dessus de cette valeur il correspondra à la moyenne géométrique du degré de polymérisation moyen en nombre et en poids Par "nmère" on appelle toute agrégation de n molécules du même oligomère, entre elles. EXEMPLE 1 Préparation des oligomères Un échantillon de chitosane provenant d'un lot Abertechnologies est désacétylé totalement selon la méthode décrite par A. DOMARD et col., Int. 3. Biol. Macromol. (1983) 5, 49. Le chitosane totalement désacétylé ainsi préparé est hydrolysé selon la méthode proposée par A. DOMARD et col7 Int. J. Biol. Macromol. (1989) 11, 297, dans de l'acide chlorhydrique 12 N à 72"C. Un exemple de distribution obtenue pour un temps d'hydrolyse d'environ 1 heure est donné sur la figure 1. L'étude chromatographique est réalisée avec des solutions à 5g/l, dont on injecte 20 pl dans une colonne "Protein Pack" 200 SW Waters (Millipore), avec un débit de 0,5 ml/minute et un enregistrement de 1 cm/minute. Les oligomères de DP 415 sont préparés selon la méthode décrite précédemment. Pour les fractions de DP; 15, un exemple de séparation est réalisé en injectant 20 1 de solution à 50g/l d'un hydrolysat donné. On collecte plusieurs fois de suite une fraction, toujours la même, correspondant à un intervalle de 250 lul de volume élué. La solution est ensuite concentrée et réinjectée pour analyse. Un exemple de fraction obtenue est représentée sur la figure 2. Le calcul des masses moyennes à l'aide de la courbe d'étalonnage M=f (Log Ve) donne pour cet exemple DPp = 40,2 et DPn = 38,9, soit un indice de polymolécularité Ip = 1,033, largement inférieur à 1,1. L'opération est avantageusement réalisée sur du matériel préparatif. Quels qu'ils soient, les oligomères peuvent être isolés sous forme acide, après concentration des solutions les contenant jusqu'à la limite de solubilité de l'acétate d'ammonium, en utilisant l'alcool isopropylique comme précipitant. La suspension est alors lavée et centrifugée trois fois de suite avec cet alcool, puis lyophilisée après redissolution dans l'eau. Après une nouvelle dissolution, on ajoute la quantité d'acide choisi (à peine supérieure à la stoechiométrie) de façon à préparer un forme saline donnée. Le produit est alors isolé par lyophilisation. On tiendra compte du fait que certaines formes salines sont instables au cours du temps et libèrent l'acide en régénérant la forme amine libre. Le chlorhydrate peut être, par exemple, considéré comme stable.Pour la forme -NH2, dans le cas des oligomères de DP EXEMPLE 2 Cristallisation à l'état solide des oligomères de la glucosamine Tout oligomère de la glucosamine de DP compris entre 2 et 100, quelle que soit sa structure chimique (-NH3 + ou -NH2), donne après plusieurs mois de stockage un cliché de diffraction des rayons X (sous forme de poudre) mettant en évidence la présence de structures cristallines. La figure 3 donne un exemple de cliché réalisé avec une fraction de DP 39, ayant été stockée plusieurs mois après avoir été isolée sous la forme amine libre. La même étude réalisée sous la forme (-NH3+) donne aussi une raie intense à 4,35 A. EXEMPLE 3 Phénomènes de dissolution retard i - Un oligomère de DP 9 isolé sous forme -NH2 donne, après 4 jours de stockage, le chromatogramme représenté sur la figure 4 où l'on note, en plus du pic principal ceux correspondant aux volumes d'élution des "n-mères" de DP 18, 27 et 36, soit des "dimères", "trimères" et "tétramères" du DP 9. ii - Une fraction d'oligomères centrée sur DP 39, isolée sous forme -NH2, à l'état solide, donne après 6 mois de stockage le chromatogramme représenté sur la figure 5, où l'on note en plus du pic principal correspondant aux molécules isolées, la présence de pics centrés sur les volumes d'élution de molécules de DP 81, 119, etc..., correspondant au "dimère", "trimère", etc... de ltoligomère de DP 39. iii - L'utilisation d'une colonne de domaine de séparation plus large (figure 6) permet de mettre en évidence la proportion décroissante, avec leur masse, des "n-mères" supérieurs. iiii - La proportion du pic principal correspondant aux molécules isolées est toujours supérieure ou égale à 90 %, lorsque l'oligomère a été isolé sous forme acide. Lorsqu'il a été isolé sous forme amine libre, une solution d'une fraction centrée sur DP 39, préparée à une concentration de 25 g/l, montre que la proportion des pics des "n-mères" peut dépasser 65 96 de-l'échantillon (figure 7 ). EXEMPLE 4 Stabilité du phénomène i - Rôle de la concentration Le rôle de la concentration sur la distribution des molécules entre le pic correspondant aux molécules isolées et ceux des "n-mères" est donné dans l'exemple représenté dans le tableau ci-dessous pour une fraction de DP 39. concentration en 96 pic 96 pics g/l molécules des formes de la solution injectée isolées agrégées agregees 25 34 66 5 36 64 1 43 57 0,2 58 42 Inversement, si l'on prépare une solution à une concentration donnée par exemple à 5 g/l, et si on la concentre ensuite 10 fois (50g/1) à l'évaporateur rotatif, les chromatogrammes obtenus à partir des deux solutions sont tout à fait superposables. ii - L'effet du vieillissement des solutions avec le temps est illustré dans le tableau ci-dessous pour une fraction de DP 54 préparée à 5 g/l. I âge de la o pics pics B pics solution molécules du dg nasses (minute s) isolées " djrncere" supérieures 30 60 27 13 3 0 60 27 13 72 63 27 10 129 69 26 9 1440 71 24 5 iii - Si l'on injecte une solution d'une fraction de DP 28, et si on recueille les volumes correspondant aux "n-mères", on peut observer la régénération du pic principal avec le temps comme on le montre dans le tableau suivant. âge de la %, pic % pics solution molécules supérieurs (jour) isolées 0 0 100 2 35 65 6 65 35 8 68 32 9 76 24 iiii - On peut enfin montrer le rôle de la température sur une solution de DP 39 (1 g/l) I Conditions de Prr > nortion (S'o) pics Proportion des préparation molétules--isolées "n-rnères" ambiante 1 minute à 90"C 45 55 1 minute à 100oC 49 51 De plus, une solution de la fraction de DP 39 préparée à 2"C montre un accroissement de 12 % de la proportion des pics des masses supérieures, par rapport à la proportion que l'on obtient à la température ambiante. REVENDICATIONS 1/ Composé comprenant au moins un oligomère de la glucosamine de degré de polymérisation relativement faible, caractérisé en ce que, mis en solution, il comprend en mélange, d'une part au moins un agrégat isomoléculaire associant directement et uniquement par voie physique plusieurs molécules de l'oligomère de base, dont la masse moléculaire totale est un multiple de celle dudit oligomère de base, et d'autre part la forme isolée dudit oligomère de base, c'est-à-dire à l'état non agrégé. 2/ Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, mis en solution, il comprend en mélange plusieurs agrégats isomoléculaires, constitués respectivement par des multiples différents de l'oligomère de base. 3/ Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend plusieurs oligomères de degrés de polymérisation respectivement différents, chaque oligomère étant présent en solution sous la forme d'un mélange d'au moins un agrégat isomoléculaire et de la forme isolée dudit oligomère. 4/ Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les groupements aminés de l'oligomère sont sous forme neutre, à l'état -NH2. 5/ Composé selon la revendication 4, caractérisé en ce que, en solution, la proportion pondérale de l'agrégat associant deux molécules de l'oligomère de base est au moins égale à 10 %. 6/ Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les groupements aminés de l'oligomère sont sous forme cationique, à l'état -NH3. 7/ Composé selon la revendication 6, caractérisé en ce que, en solution, la proportion pondérale de l'agrégat associant deux molécules de l'oligornère de base est au moins égale à 2 %. 8/ Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'oligomère de base a un degré de polymérisation compris entre 2 et 100, et de préférence compris entre 20 et 30. 9/ Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est sous forme solide. 10/ Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est sous forme dissoute dans un solvant, ou supporté dans ou sur un support en suspension dans un milieu de dispersion. 11/ Produit de traitement comprenant à titre d'agent actif au moins un oligomère de la glucosamine de degré de polymérisation relativement faible, caractérisé en ce que l'agent actif est un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, permettant une libération progressive dudit oligomère. 12/ Produit selon- la revendication 11, en tant que médicament. 13/ Produit selon la revendication 11, en tant que produit agrochimique ou phytosanitaire. 14/ Produit selon la revendication 11, en tant qu'aliment ou produit diététique. 15/ Produit selon la revendication 11, en tant que produit cosmétique. 16/ Procédé pour la préparation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que - de manière connue en soi, on obtient ou on part d'un chitosane complètement désacétylé, on hydrolyse ce dernier pour obtenir un mélange d'oligomères de la glucosamine, de degrés de polymérisation respectivement différents, on sépare ce mélange pour obtenir différentes fractions d'oligomères, on isole les oligomères des différentes fractions séparées - de manière nouvelle, on laisse reposer un oligomère ainsi isolé, à l'état solide, pour obtenir un mélange, notamment cristallisé, d'au moins un agrégat et de la forme isolée dudit oligomère. 17/ Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'on sépare le mélange d'oligomères par chromatographie, d'exclusion stérique. 18/ Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on choisit une colonne de chromatographie pPésentant en combinaison les caractéristiques suivantes - elle est obtenue à partir d'un support de silice greffée à l'aide de groupements organiques hydrophiles - elle présente un nombre de plateaux par mètre au moins égal à 16000. - son domaine de résolution est compris entre DP 2 et DP 100 pour des polysaccharides. 19/ Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la phase d'élution de la chromatographie est un système acétate d'ammonium-acide acétique. 20/ Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'on isole les oligomères de même degré de polymérisation, sous forme neutre, c'est-à-dire à l'état -NH2 pour les groupements aminés, notamment par précipitation dans l'alcool isopropylique, puis traitement du précipité dans une solution ammoniacale. 21/ Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'on isole les oligomères de même degré de polymérisation sous forme cationique, c'est-à-dire à l'état -NH + pour les groupements aminés, notamment par 3 précipitation dans l'alcool isopropylique, puis traitement du précipité par un acide minéral fort. 22/ Procédé de mise en oeuvre d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ledit composé est mis en solution ou en suspension, et éventuellement mélangé à d'autres produits, du type excipient, adjuvant, et conditionné dans une forme d'administration ou traite ment.