FR 2672300 A1 19920807 FR 9101191 A 19910201 La présente invention a pour objet une xylanase, ainsi que des souches de Bacillus productrices de cette enzyme. Elle concerne également l'utilisation de cette enzyme et de ces bactéries dans le blanchiment de la pâte à papier et la préparation de xylose ou de xylo-oligosaccharides à partir de matières premières végétales , notamment Des utilisations variées des xylanases ont été proposées dans le domaine des biotechnologies , en particulier dans le domaine alimentaire ( Biely , Trends Biotechnol 3 (11): 286-290 , 1985), dans l'industrie du papier (Mora et al., J. Wood Chem. Technol , 6 : 147 - 165 , 1986) ou dans la production de composés chimiques à partir de l'hémicellulose (Reilly P.J., 1981, Xylanases : structure and function In Trends in the biology of fermentations for fuels and chemicals. A.J. Hollaender (Ed) .Plenum, New York) La faisabilité technique de telles applications a été principalement évaluée à l'aide d'enzymes produites par des champignons mésophiles . Cependant , de telles applications pourraient être facilitées par l'utilisation de champignons présentant une meilleure stabilité à la température. Divers bactéries et enzymes sont connues pour la production de xylanases (voir notamment Wong et al., Microbiological Reviews , 52, n 3 , 305-317, 1988). Jusqu'à maintenant , les plus hauts rendements en enzymes ont été obtenus à partir de champignons (Yu et al. Enzyme Microb. Technol. 9:16-24, 1987). Cependant , des souches hyperproductrices de Bacillus, ont été déjà décrites (Okazaki et al . Appl. Microbiol.Biotechnology , 19 : 335-340, 1984; Okazaki et al., Agric . Biol. Chem. 49, 2033-2039, 1985). De telles espèces de Bacillus thermophiles et dégradant le xylane peuvent être de bons candidats pour la production industrielle de xylanases , en raison de leur taux de croissance important et d'une bonne connaissance de leur génétique Les xylanases isolées par Okazaki et al. sont issues de deux souches de Bacillus , appelées Wl et W2 par les auteurs . Dans chacune de ces souches , on a mis en évidence deux composants de l'activité xylanasique appelées I et II. Les composants I dégradent le xylane en xylobiose et en oligomères de degré de polymérisation supérieur , tandis que les composants II produisent en plus des composés précédents, du xylose Les composants I (appelés W1 I et W2.I) ont des poids moléculaires respectifs de 21,5 kDa et 22,5 kDa ainsi que des points isoélectriques de 8,5 et 8,3. Les composants II (W1.II et W2.II) ont quant à eux des poids moléculaires respectifs de 49,5 kDa et 50 kDa. Les deux composants I et II sont inhibés par les ions Hg2+ , et à un moindre degré par Cu2+. De nombreuses autres xylanases ont été isolées à partir de diverses espèces de Bacillus , de Clostridium d'Aspergillus, de Streptomyces ou de Trichoderma entre autres ( Wong et al., 1988 précédemment cités ). La production industrielle de xylanases se heurte à la présence simultanée d'activités contaminantes telles que les cellulases, entraînant des surcoûts de purification. D'autre part , l'utilisation de germes génétiquement modifiés peut présenter des problèmes tels que l'instabilité des plasmides portant les gènes codant pour les xylanases. A la connaissance du demandeur , la meilleure productivité en endoxylanase obtenue par un microorganisme ne produisant pas de cellulase l'a été à partir d'un mutant de Streptomyces lividans dépourvu d'activité cellulosique après introduction d'un plasmide porteur des gènes codant pour les xylanases A et B. Des productivités de l'ordre de 6000 à 10.000 U.I.l/h ont été observées dans les milieux de culture I1 faut néanmoins noter que dans ce cas des problèmes liés à la non-hydrolyse du xylane insoluble par la xylanase A et de stabilité thermique pour la xylanase B ont été rencontrés. (Kluepfel et al. Biochem. J. 267, 47-50, 1990 Aucune des enzymes décrites dans l'art antérieur ne présentait donc , la connaissance du demandeur, des caractères permettant une application industrielle , c'est-àdire une bonne stabilité thermique , une aptitude importante à la dégradation des substrats et une obtention par des souches super-productrices Le demandeur a donc montré de manière surprenante que certaines souches de Bacillus produisaient des xylanases thermostables et présentant une activité de dégradation importante De manière encore plus surprenante , le demandeur a montré que ces souches de Bacillus excrétaient en grande quantité de telles enzymes , sans produire de quantités notables de cellulases. La présente invention a donc pour objet des souches de Bacillus hyper productrices en xylanase, et en particulier les souches enregistrées sous les n I-1017 et I-1018 auprès de la Collection Nationale de Cultures des Microorganismes de 1'Institut Pasteur Ces souches ont été isolées à partir de fumier Les bactéries se présentent comme des bâtonnets courts et droits formant des spores et ayant une taille moyenne de 0,5p par 2,5p. Elles sont généralement seules ou appariées , présentent une coloration gram positive et les spores sont ovales et centrales Ces souches sont strictement aérobies , aucune croissance n'étant observée en l'absence d'oxygène et le nitrate n'est pas utilisé en tant qu'accepteur d'électrons. Le pH optimal de croissance et de production de xylanase est de 7,8 tandis que les pH limites pour la croissance se situent entre 6,5 et 8,5 et la température maximale est de 63"C . Outre le xylane, ces souches utilisent le xylose le glucose , le saccharose , le maltose ainsi que l'amidon. Le fructose , l'arabinose , la cellulose, la pectine ainsi que la chitine ne sont pas utilisées . De plus , la croissance est inhibée par une concentration de 5% en chlorure de sodium. Le contenu en G+C de l'ADN de ces souches déterminé par dénaturation thermique est de 57,5% en mole. Ces souches sont bien différenciées des autres souches productrices de xylanases , comme indiqué sur le tableau I, du fait des temps de culture et de leur productivité en xylanase différents La souche I-1018 a été obtenue par mutagénèse de la souche I-1017. La souche I-1018 possède les mêmes caractéristiques générales que la souche I-1017, mais présente une hyperproduction en xylanase La présente invention a d'autre part pour objet une xylanase caractérisée en ce qu'elle possède une masse moléculaire de 22 kDa environ , et un point isoélectrique d'environ 7,7. Cette enzyme présente d'autre part avantageusement une grande stabilité à 60"C, pendant au moins 24 heures, et un pH d'activité optimale compris dans la gamme allant de 4,8 à 7, et préférentiellement d'environ 6. Il est à noter que le pHi de cette enzyme est assez élevé mais néanmoins inférieur au pHi des xylanases de masse moléculaire voisine produites par des Bacillus, notamment celles décrites par Okazaki et al.(1985, publication précédemment citée ). Le pH 6 correspond à un pH optimal, mais l'activité reste supérieure à 80% dans la gamme comprise entre 4,8 et 7. Cette enzyme est de plus inhibée par Hg2+, mais ne l'est pas par Ag2+ (1 mM), ni par le SDS à 0,1%. La constante de Michaelis (Km) vis-à-vis du xylane de bouleau est de 0,9g/l. Les oligosaccharides neutres produits par cette enzyme à partir de xylane de bouleau (5g/l de xylane de bouleau ; 500 U/l , 60 C) sont composés - pour des temps très courts d'incubation enzymatique (15 minutes ), de xylotriose et de xylo-oligosaccharides de degrés de polymérisation supérieurs. - pour des temps d'incubation longs ( 24 à 72 heures) de xylobiose , de xylotriose et de xylotétraose , ce dernier en très faible quantité Cette endoxylanase est notamment excrétée par Bacillus , et en particulier par les souches I-1017 et I-1018 de Bacillus précédemment décrites . Elle est excrétée dans le milieu de culture Le milieu de culture de ces souches est notamment caractérisé par une absence d'activité endo-B-1,4-glucanasique (cellulase) et par la présence d'une très faible activité ss- xylosidasique contaminante (environ 0,06 U.I./ml de surnageant de culture pour les deux souches ). I1 est à noter que le surnageant de culture peut être lyophilisé sans perte notable d'activité xylanasique et se conserve congelé pendant au moins un an sans perte d'activité Les activités endo-ss-1,4-glucanasiques ont été déterminées par la mesure des sucres réducteurs libérés à partir de carboxyméthylcellulose (CMC) à 1% ou d'Avicel (1%) dans du tampon acétate de sodium 50 mM pH 6 .L'activité ss- xylosidasique a été déterminée par la mesure de la libération des p-nitrophénol à partir de p-nitrophényl-ss-D-xyloside (0.1%) dans du tampon acétate de sodium 50 mM pH 6. Une unité d'activité xylanasique (U.I.) est définie comme une micromole d'équivalent xylose réducteur libéré par minute à 60 C. La concentration de sucre réducteur est déterminée par la méthode de Kidby et Davidson (Anal. Biochem., 55: 321325 , 1973). L'enzyme purifiée quant à elle se conserve sous forme congelée dans l'éthylèneglycol à 20% sans perte notable d'activité pendant un an La présente invention a encore pour objet un procédé d'obtention de la xylanase telle que précédemment décrite comprenant les étapes suivantes - concentration du surnageant de culture de Bacillus par ultrafiltration - passage sur colonne échangeuse d'ions, telle qu'une colonne de Q-Sépharose Fast Flow, (Pharmacia). - passage sur colonne d'interactions hydrophobes, telle qu'une colonne de phényl sépharose (Pharmacia) La concentration du surnageant peut notamment être effectuée par ultrafiltration sur membrane de polysulfone à seuil d'exclusion supérieur à 10 kDa. Ce procédé permet d'obtenir une préparation de xylanase substantiellement pure La présente demande est d'autre part relative à un procédé de production de la xylanase précédemment décrite comprenant les étapes - de croissance des bactéries dans un milieu contenant un substrat de croissance tel que du glucose, et - de production de xylanase induite par alimentation en continu de la culture par des xylo-oligosaccharides en quantités appropriées La présente invention a également pour objet l'utilisation de la xylanase précédemment décrite dans le blanchiment de la pâte à papier Un avantage de cette xylanase réside dans le fait que le degré d'hydratation de la pâte à papier a peu d'importance . il n'est pas obligatoire de diluer beaucoup la pâte pour obtenir une bonne attaque enzymatique L'utilisation de cette xylanase comme auxiliaire dans le blanchiment de la pâte à papier est d'autant plus intéressante que les préparations sont dépourvues de contaminants cellulasiques Cette xylanase peut aussi être utilisée pour la préparation de xylose ou de xylo-oligosaccharides à partir de matières premières d'origine végétale , qui sont des matières premières peu coûteuses et renouvelables (par exemple rafles de maïs ). La présente invention est illustrée sans être pour autant limite par les exemples d'applications qui suivent La figure 1 représente l'évolution de cultures discontinues de la souche I-1017. La figure 2 représente l'évolution d'une culture en continu de la souche I-1017 alimentée en continu par des solutions de xylo-oligosaccharides à différentes concentrations La figure 3 représente la production de xylanases comparée des souches I-1017 et I-1018 en présence de différentes concentrations de xylo-oligosaccharides La figure 4 représente la libération de xylooligosaccharides, à partir de pâte Kraft non blanchie , par différentes concentrations de xylanase. La figure 5 représente la libération de xylooligosaccharides à partir de rafles de maïs broyées EXEMPLE 1 Sélection de la souche I-1017 Différents échantillons de sol, de compost et de fumier ont été utilisés comme inoculum afin d'enrichir en souches xylanolytiques . Après 24 heures d'incubation , les activités xylanasiques sont testées dans les surnageants de culture , et les trois enrichissements montrant les activités les plus importantes sont dilués et étalés sur du milieu agar contenant du xylane Un milieu de culture de base contenant des minéraux et des vitamines (Zeikus et Wolfe , J. Bacteriol. 109: 707713, 1972 ) et de l'extrait de levure (0,2%) a été complémenté avec de l'aga (2%) et du xylane d'avoine (0,5%). Après stérilisation , du KHC03 (25 mM) est ajouté à partir d'une solution stock stérile 1M au milieu d'isolement des souches mélangé . Les boîtes de Pétri ensemencées sont incubées à 55"C dans des jarres fermées Les colonies formant des zones claires sont purifiées . Les isolats les plus producteurs (souche I-1017 sont sélectionnés et caractérisés. L'enrichissement ainsi que la croissance des cultures sont effectués de manière aérobie dans un bain-marie agité dans des bouteilles fermées de 125 ml contenant 10 ml de milieu . La température d'incubation est de 55 C et le milieu est tamponné à pH 7 par addition de KHC03 50 mM. EXEMPLE 2 Croissance de la souche I-1017. La cinétique de production des xylanases est effectuée à 55 C dans des fermenteurs de 2 litres dans un volume initial de milieu de 1,5 litre .Après stérilisation 50 ml d'une solution lM KHC03 sont ajoutés et le pH est ajusté à 7,8 et maintenu à cette valeur. La concentration d'oxygène dissous est régulée et maintenue à un taux de saturation de 70% La figure 1 représente la croissance de la souche I1017 en culture discontinue sur du xylane d'avoine à 0,5 %. La souche I-1017 produit jusqu'à 110 unités de xylanase/ml. Durant les premières heures de culture, une accumulation transitoire de sucres réducteurs est observée . Cette accumulation est due à la présence dans l'inoculum de petites quantités de xylanase qui catalysent une hydrolyse rapide de la fraction soluble de xylane en xylo-oligosaccharides La croissance bactérienne permet alors la consommation des xylo-oligosaccharides et la synthèse de xylanase qui débute juste après que leur concentration devienne limitante pour la croissance des bactéries La production de xylanase est à peu près constante durant 4 heures (30 U.I.ml/h On observe une grande variabilité dans la production de xylanase en fonction de l'activité xylanase préalable de l'inoculum , de l'importance de la phase stationnaire et des caractéristiques physiques du xylane b) Influence de la quantité de xylo-oligosaccharides sur la croissance de la souche I-1017. Afin d'obtenir des conditions de culture reproductibles , la production de xylanase a été testée dans des cultures alimentées par une solution en présence de xylooligosaccharides. La figure 2 montre l'influence de la concentration en xylo-oligosaccharides . La concentration en sucre initiale est de 2 g/l. Le substrat est consommé pendant la phase de croissance exponentielle durant laquelle aucune production de xylanase n'est détectée Quand la concentration de substrat commence à devenir limitante pour la croissance , on observe une synthèse de xylanase immédiate . Le taux et aussi la durée de production de l'enzyme sont dépendants de la fourniture de substrat qui varie de 0,26g/h à 0,67 g/h , avec un flux de substrat de 24 ml/h et un volume initial du milieu de culture de 1,5 1. La flèche sur la figure 2 correspond à l'addition des xylo-oligosaccharides. La production d'enzymes la plus importante (230 U.I./ml) est obtenue quand on fournit le substrat à un taux de 0,36g/h. Des quantités de substrats supérieures entraînent un raccourcissement de la période de production des xylanases Quand le glucose est utilisé à la place de xylooligosaccharides , la production de xylanase est considérablement diminuée (14 U.I./ ml) et dure moins de 2 heures D'autre part , l'utilisation de glucose comme substrat initial de croissance ne modifie pas le rendement en xylanase par comparaison à l'utilisation de xylooligosaccharides. Afin de préparer les xylo-oligosaccharides comme substrats dans des cultures en continu , on incube une suspension de xylane d'avoine à 5% durant 8 heures à 60 C et à pH6 en présence de 5 unités de xylanase par ml. Cette suspension est ensuite centrifugée et le surnageant est récupéré puis autoclavé. EXEMPLE 3: Purification de la xylanase à partir de culture de la souche I-1017. Le procédé de purification de la xylanase comprend les étapes suivantes - concentration du surnageant de culture de Bacillus, par ultrafiltration sur membrane de polysulfone à seuil d'exclusion de 10 kDa. - passage sur colonne échangeuse d'ions Sépharose Fast Flow , (Pharmacia). - passage sur colonne d'interactions hydrophobes phényl Sépharose (Pharmacia ). Les résultats de cette purification sont rassemblés dans le tableau II. Cette purification montre que l'endoxylanase est la protéine majeure parmi les protéines excrétées dans le milieu de culture (environ 50% des protéines totales excrétées ). EXEMPLE 4 Nutavénèse de la souche I-1017. Des cultures de la souche I-1017 ont été effectuées sur un milieu contenant du xylane et de l'éthylméthane sulfonate (EMS) Les cellules traitées sont lavées deux fois incubées toute la nuit et étalées sur un milieu agar-xylane Les clones sont cultivés dans des microtubes en verre (8 x 35 mm) remplis avec 100 microlitres d'un milieu de culture complémenté avec du xylane d'avoine (0,5%). Les microtubes sont fermés à l'aide de bouchons de silicone afin d'éviter l'évaporation et incubés durant 24 heures à 55"C sur agitateur. Pour la sélection de mutants 96 échantillons sont testés en parallèle ; 20 pl de chaque culture de microtube sont transférés à l'aide d'une pipette multicanaux dans des microtubes de polypropylène où l'hydrolyse du xylane est effectuée à la température ambiante . Les réactions sont initiées par l'addition de 300 p1 de suspension de substrat dans chaque tube et arrêtées par 400 pl d'acide 3,5dinitrosalicylique. Après ébullition durant 15 minutes, 50 pl de chaque tube sont transférés dans une plaque de microtitration afin de lire la densité optique Les clones montrant les activités xylanasiques les plus importantes sont retestés par cinq repiquages successifs et comparés avec la souche parentale. Des mutants ayant un accroissement significatif d'activité xylanase ont été sélectionnés parmi 500 clones isolés après mutagénèse avec l'EMS Ces mutants montrent une augmentation de l'activité xylanase dans des cultures discontinues sur milieu contenant du xylane La productivité de xylanase des mutants est aussi déterminée dans des cultures alimentées en continu .Avec un flux de xylo-oligosaccharides de 0,36 g/h , le rendement de xylanase du mutant I-1018 n'est pas augmenté de manière significative (moins de 10% ) par rapport à celui de la souche sauvage I-1017 comme le montre la figure 3 qui montre la croissance différentielle des souches I-1017 et I-1018 à deux concentrations en xylo-oligosaccharides Quand le flux en xylo-oligosaccharides est augmenté à 0,67g/h , la souche I-1018 par exemple montre une augmentation de deux fois supérieure de la production de xylanase par rapport à la souche I-1017 (souche parentale ). L'obtention de mutant et l'optimisation des conditions de culture alimentées en continues permettent une augmentation d'un facteur 3 dans la production de xylanase par comparaison avec les cultures en discontinu de la souche sauvage sur du xylane. Ces taux d'enzymes élevés (jusqu'à 392 U.I./ml ) sont obtenus en 7 heures de culture et la productivité de xylanase , par I-1018 est donc considérablement supérieure à celle des meilleures souches de champignons et de bactéries (Bertrand et al., Biotechnol. Bioeng., 33:791-794,1989) (Yu et al. 1987 précédemment cité) productrices de xylanase qui nécessitent plusieurs jours avant d'obtenir de tels taux d'enzymes EXEMPLE 5 Traitement de pâtes à papier (Kraft non blanchies) par la xylanase On a traité 8.5 g de pâte humide (correspondant à lg de poids sec) provenant de pin maritime et renfermant 60 mg de xylane , par 25 ml de tampon (contenant diverses concentrations de xylanase ) à 60"C pendant 24 heures. Les cinétiques de libération de xylooligosaccharides sont représentées à la figure 4 . On a montré une libération conjointe de dérivés de la lignine (par mesure de la densité optique à 280 nm). EXEMPLE 6: Obtention de xvlo-oliqosaccharides à partir de rafles de maïs broyées. 1 g (poids sec) de poudre de rafles de maïs (granulométrie > 100 mesh) ont été suspendus dans 100 ml de tampon acétate de sodium 50 mM pH 6 contenant 1000 U.I. de xylanase et incubés à 60"C pendant 18 heures. La figure 5 montre qu'il est possible dans ces conditions de transformer jusqu'à 38% du xylane en oligosaccharides (xylo-oligosaccharides et arabino-xylo oligosaccharides ). Ces composés peuvent être utilisés tels quels ou comme précurseurs de xylose et d'arabinose. TABBLEAU I Comparaison de la production de xylanases par les souches selon l'invention et par des soucher de l'art antérieur. Souche Substrat Productivité Temps de Références de croissance xylanase culture (U.I.*ml-h-) (h) Clostridium glucose 0,65 40 Brodel, B., E.Samain, thermolactium and P.Debeire 1990. Biotechnol.Lett.12(1) :65-70 Clostridium xylane 0,78 72 Berenger,J.F.,C.Frixon J. stercrarium Bigliardi, and N.Creuzet. 1985.Can.J.Microbiol.31; 635-642 Thermoascus xylane 2,40 240 Yu, E.K.C., L.U.L. Tan, auriantacus M.K.H.Chan,L.Deschatelets and J.N.saddler.1987. Enzyme Microb.Technol. 9:16-24 Thielavia Solka-Floc* 1,04 18 Merchant,R.,F.Merchant, terrestris and A.Margaritis. 1988 Biotechnol.Lett. 10(7):513-516 Streptomyces xylane 16,76 72 Bertrand,J.L.,R.Morosoli lividans A F.Shareck,and D.Kluep fel.1989.Biotechnol. Bioeng.33(6):791-794 * Solka-Floc : cellulose purifiée contenant de 5 à 7% d'hémicellulose TABLEAU I (suite) Comparaison de la productionde xylanases par les souches selon l'invention et par des souches de l'art antérieur Souche Substrat Productivité Temps de Références de xylanase culture croissance (U.I.*ml-h-) Streptomyces xylose 3,25 65 Kluepfel,D,S.Vats-Mehta lividans F.Aumont, F.Shareck,and R.Morosoli 1990.Biochem. j.267:45-50 Bacillus sp. xylosee 2,47 48 Okazaki W.,T.Akiba,K.Horialcalophile koshi,and R.Akahoshi.1984. appl.Microbiol.Biotechnol 19:335-340 Bacillus sp. xylo- 44 7 selon l'invention oligosaccharides Bacillus sp. mutant xylo- 78,4 7 selon l'invention oligosaccharides koshi,and R.Akahoshi.1984. TABLEAU II Etapes Fractions Volume Protéines Activité Activité ( %) totales xylanasique spécifique Rende (mg) totale(U.I.) (U.I./mg) ment Surnageant de culture 1500 216 232000 1071 100 I Comcentration 150 197 225000 1142 97 II Q Sépharose Fast Flow 250 142 204250 1438 88 III Phényl Sépharose 205 72 143500 1993 62 REVENDICATIONS 1. Souche de Bacillus productrice de xylanase enregistrée sous le n I-1,017 auprès de la Collection Nationale de Cultures des Microorganismes de l'institut Pasteur 2. Souche de Bacillus productrice de xylanase enregistrée sous le n"I-1.018 auprès de la Collection Nationale de Cultures des Microorganismes de l'institut Pasteur 3. Xylanase caractérisée en ce qu'elle possède une masse moléculaire de 22 kDa environ, et un point isoélectrique d'environ 7,7. 4. Xylanase selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est stable à 60"C environ 5. Xylanase selon l'une des revendications 3 et 4 caractérisée en ce que son pH d'activité optimale est compris dans la gamme allant de 4,8 à 7 et est préférentiellement d'environ 6. 6. Xylanase selon l'une des revendications 3 à 6 caractérisée en ce qu'elle est secrétée par Bacillus. 7. Xylanase selon la revendication 6 , caractérisée en ce qu'elle est secrétée par l'une des souches de Bacillus selon l'une des revendications 1 ou 2. 8. Procédé d'obtention de xylanase purifiée selon l'une des revendications 3 à 7 , comprenant les étapes suivantes - concentration de surnageant de culture de Bacillus, - passage sur colonne échangeuse d'ions - passage sur colonne d'interactions hydrophobes 9. Procédé de production de xylanase selon l'une des revendications 6 et 7 comprenant les étapes - de croissance des bactéries dans un milieu contenant un substrat de croissance tel que du glucose , et - de production de xylanase induite par alimentation en continu de la culture par des xylo-oligosaccharides en quantités appropriées. 10. Utilisation de la xylanase selon l'une des revendications 3 à 7 dans le blanchiment de la pâte à papier 11. Utilisation de la xylanase selon l'une des revendications 3 à 7 dans la préparation de xylooligosaccharides à partir de matières premières d'origine végétale .