FR 2666897 A1 19920320 FR 9011720 A 19900919 Colonnes capillaires présentant une charge positive permanente utilisées en electrophorèse capillaire. La présente invention a pour objet la préparation et/ou l'emploi de colonnes capillaires présentant une charge positive permanente utilisées en électrophorèse capillaire permettant de séparer des composés chargés négativement, chargés positivement ou des composés neutres dans un but analytique ou pour la préparation de composés purs. Cette charge positive permanente est fixée à l'intérieur de la colonne capillaire par une liaison covalente. Cette liaison covalente résulte de la combinaison entre la paroi de la colonne capillaire et un composé polymérique ou non-polymérique de structure bifonctionnelle, l'une des fonction présentant une charge positive permanente de nature ammonium quaternaire, l'autre fonction étant un groupement très réactif réagissant avec les hydroxyles de la colonne ou avec la paroi intérieure de la colonne capillaire modifiée chimiquement. Actuellement les colonnes capillaires utilisées dans l'électrophorèse capillaire sont de plusieur types. Les colonnes en Silice fondue non traités présentant des groupements actifs au niveau de surface du type silanols (-SiOH), silyl éthers (-Si-O-Si-). Les désavantages sont nombreux. Des nombreuses classes chimiques ne peuvent pas être séparées convenablement. L'analyse peut etre réalisée seulement si le composé à analyser est neutre ou possède une charge négative faible. Les cations principalement les amines sont adsorbés à la surface et ne peuvent être analysés, uniquement dans des conditions spéciales. Le débit d'électroosmose est trop élevé pour la réalisation de focalisation isoélectrique. Le débit d'électroosmose est trop faible et ne permet pas l'analyse des anions possédant des charges multiples.Beaucoup d'interactions entre les parois de la colonne et les électrolytes sont observées. Les colonnes traitées du type acrylamides présentent les desavantages suivants : la détérioration de la couche acrylamide est possible en dehors de la gamme de pH de 2 à 7,5. Les acrylamides sont instables en présence d'une tension très élevée. La forte inhibition de débit électroosmose entraine un temps d'analyse très long de l'ordre de 30 à 90 minutes. Les colonnes à base d'acrylates conduisent à des liaisons ioniques avec les cations et une forte adsorption. Les colonnes à base de poly(éthylènenéimine) conduisent également à de fortes adsoprtions. Les colonnes capillaires de cette invention sont de deux types ; le type 1 présente une liaison covalente siloxane - Si-O-Si-, le type 2 présente une liaison covalente silicium-carbone Le groupement actif au niveau de la surface est un sel de tétraalkyl ammonium quaternaire. Les avantages des colonnes de type 1 et de type 2 sont : un traitement des colonnes relativement facile à réaliser ; la surface créée à l'intérieur de la colonne possède une grande résistance aux solutions caustiques aussi bien qu'aux acides minéraux. Aucune adsorption de n'importe quelle substance chimique n'est observée. Le débit de l'électroosmose très élevé suivant les conditions, et le temps d'analyse est très court. Toute substance chimique et quelque soit la nature de la charge peut être analysée : les anions à charges multiples, à charge fractionelle peuvent être analysés. Les avantages des colonnes du type 2 sont identiques aux précédentes. De ce fait le but de l'invention est de disposer de plusieurs types de colonnes capillaires utilisables en électrophorèse capillaire dont la structure est identique pour toutes : ces colonnes capillaires présentant une charge positive permanente fixée à la surface intérieure de la colonne capillaire sur une chaine organique liée par une liaison covalente. La colonne capillaire est en verre ou en quartz ou en silice fondue ou en dérivé polymérique ou en matériaux similaires ; elle est utilisée en électrophorèse capillaire. Cette colonne capillaire présente une charge positive permanente, sous forme d'ammonium quaternaire, fixée à la surface intérieure par une liaison covalente, résultant de la combinaison entre la paroi de la colonne capillaire et un composé polymérique ou non-polymérique de structure bifonctionnelle, l'une des fonctions présentant une charge positive permanente de nature ammonium quaternaire, l'autre fonction étant destinée à former la liaison covalente avec la paroi de la colonne capillaire, la liaison covalente peut être sous forme de siloxane -Si-O-Si- résultant de la combinaison d'un groupement constituée d'un atome de silicium et d'un, de deux ou de trois substituants halogènés, tel le chlore ou le brome, soit d'un groupement constitué d'un atome de silicium et d'un, de deux ou de trois substituants alkoxy ou acyloxy réagissant avec les groupements hydroxyles de la surface intérieure du capillaire. La liaison covalente peut aussi être sous forme de liaison silicium-carbone résultant de la combinaison au niveau de la paroi de la colonne capillaire d'un groupement vinylique et de groupements d'hydrure de silicium -SiH préalablement formés par la transformation de silanol -SiOH en halogénures de silicium -SiX, X étant un halogénure du type chlore ou brome suivies d'une réduction en hydrure de silicium -SiH. La colonne capillaire présentant une charge positive permanente peut être due à la combinaison entre une substance bifonctionnelle polymérique ou non-polymérique comprenant un ou plusieurs sels d'ammonium quaternaire et un ou plusieurs alkoxysilanes, réagissant avec la paroi intérieure de la colonne capillaire et conduisant à une fixation sous forme de liaison covalente. La colonne capillaire présentant une charge positive permanente peut aussi être due à la combinaison entre une substance bifonctionnelle polymérique ou non-polymérique comprenant un ou plusieurs sels d'ammonium quaternaire et un ou plusieurs groupes vinyliques, réagissant avec la paroi intérieure de la colonne capillaire et conduisant à une fixation sous forme de liaison covalente. La colonne capillaire peut aussi être due à la combinaison entre une substance bifonctionnelle polymérique ou non-polymérique comprenant un ou plusieurs amines primaires, secondaires ou tertiaires et un ou plusieurs alkoxysilanes, réagissant avec la paroi intérieure de la colonne capillaire et conduisant à une fixation sous forme de liaison covalente, les amines étant transformées en ammonium quaternaire par action d'halogénures d'alkyle soit avant la fixation sur la paroi intérieure de la colonne capillaire soit in situ après fixation. La charge positive permanente peut aussi être due à la combinaison entre une substance bifonctionnelle polymérique ou non-polymérique comprenant un ou plusieurs amines primaires, secondaires ou tertiaires et un ou plusieurs groupes vinyliques, réagissant avec la paroi intérieure de la colonne capillaire et conduisant à une fixation sous forme de liaison covalente, les amines étant transformées en ammonium quaternaire par action d'halogénures d'alkyle soit avant la fixation sur la paroi intérieure de la colonne capillaire soit in situ après fixation. La charge positive permanente peut également être due à la combinaison entre une substance bifonctionnelle polymérique ou non-polymérique comprenant un ou plusieurs groupes nitriles et un ou plusieurs groupes alkoxysilanes, réagissant avec la paroi intérieure de la colonne capillaire et conduisant à une fixation sous forme de liaison covalente, les groupes nitriles étant transformés en ammonium quaternaire par réduction du nitrile en amine primaire, elle-même transformée en ammonium quaternaire par réaction d'halogénures d'alkyle soit avant la fixation sur la paroi intérieure de la colonne capillaire soit in situ après fixation. La colonne capillaire présentant cette charge positive permanente peut encore être due à la combinaison entre une substance bifonctionnelle polymérique ou non-polymérique comprenant un ou plusieurs groupes nitriles et un ou plusieurs groupes halosilanes, pour lequel l'atome d'halogène peut être le chlore ou le brome réagissant avec la paroi intérieure de la colonne capillaire et conduisant à une fixation sous forme de liaison covalente, les groupes nitriles étant transformés en ammonium quaternaire par réduction du nitrile en amine primaire, elle-même transformée en ammonium quaternaire par réaction d'halogénures d'alkyle soit avant la fixation sur la paroi intérieure de la colonne capillaire soit in situ après fixation. La charge positive permanente peut encore être due à la combinaison entre une substance bifonctionnelle polymérique ou non-polymérique comprenant un ou plusieurs groupes époxy et un ou plusieurs groupes alkoxysilanes, réagissant avec la paroi intérieure de la colonne capillaire et conduisant à une fixation sous forme de liaison covalente, les groupes époxy étant transformés en ammonium quaternaire par réaction dans un premier temps avec une amine primaire ou une amine secondaire conduisant à un amino-alcool transformé en ammonium quaternaire par réaction d'halogénures d'alkyle soit avant la fixation sur la paroi intérieure de la colonne capillaire soit in situ après fixation. La substance bifonctionnelle comprenant un ou plusieurs sels d'ammonium quaternaire et un ou plusieurs alkoxysilanes est sélectionnée parmi les composés suivants, chlorure de n-octadecyldiméthyl- [3 -(tri-méthoxysilyl)- propyl] ammonium, chlorure de n-tétradecyldimethyl(3-triméthoxy silylpropyl)ammonium, chlorure de N-(triméthoxysilyloctyl)triméthyl- ammonium, chlorure de N-(3-triméthoxypropyl-N-méthyl-N, N-diallylammonium, chlorure de N-triméthoxysilylpropyl-N,N, N-triméthylammonium, chlorure de N-triméthoxysilylpropyl-tri-n-butylammonium, le composé préférentiel étant le chlorure de N-(triméthoxy silyloctyl)triméthylammonium. La substance bifonctionnelle comprenant un ou plusieurs sels d'ammonium quaternaire et un ou plusieurs groupes vinyliques est sélectionnée parmi les composés suivants, l'iodure de hexallyl-éthylènediammonium, l'iodure de octallyl-diethylene-triammonium, l'iodure de decallyl-triéthylènetétrammonium, l'iodure de dodécallyl-tétraéthylènepentammonium, l'iodure de tétradécallyl-pentaéthylènehexammonium, le composé préférentiel étant le hexabromure de tétradecaallyl-pentaéthylènehexammonium La substance bifonctionnelle comprenant une ou plusieures amines primaires, secondaires ou tertiaires et un ou plusieurs alkoxysilanes est sélectionnée parmi les composés suivants, 4-Aminobutyldiméthylméthoxysilane,4-Aminobutyltriéthoxysilane ,(aminoéthyl aminoéthyl)phenethyltriméthoxysilane,N-2-aminoéthyl) -3 - aminopropylmé thyldiméthoxy silane,N-(2-aminoethyl-3 -aminopropyl)-triméthoxysilane, N-(2-aminoethyl-3 -aminopropyl) -tris-(2-éthylhexoxy) silane, N-(2-aminohexyl-3 -aminopropyl) triméthoxysilane,4-aminophényltrimétho xysilane ,3 - (1 -aminopropoxy) -3,3 -diméthyl- l-propényltriméthoxysilane, 3 aminopropyl-tris (methoxyethoxyethoxy) silane ,3 - aminopropyl-diméthyleth oxysilane,3-aminopropylméthyldiéthoxysilane, 3 - aminopropyltriétho- xysilane, 3 - aminopropyltriméthoxysilane,3 -aminopropyltris(triméthylsilyl oxy) silane,J-aminoundecyltriméthoxysilane,3 - [2-N-benzylaminoethylamino propylitrimethoxysilane ,B is- (2-hydroxyethyl) -3 -aminopropyltriethoxysila ne, Bis [3-(triéthoxysilyl)propyl] amine, Bis [3 -(triméthoxysilyl)propyl] éthylenediamine ,(cyclohexylaminométhyl)méthyldiéthoxysilane, (cyclohexylaminométhyl)diméthyléthoxysilane, (N,N-diéthyl-3-aminopropyl)trimethoxysilane ,dimethylméthoxysilylpropyldiéthylènetriamine, diméthylméthoxysilylpropylpentaéthylènehexamine, N-méthylamino propyltriméthoxysilane,méthyl[2-(3 -triméthoxy silylpropylamino)éthyla mino]-3-propionate,N-phénylaminopropyltriméthoxysilane, 3 -(N-.s tyryl méthyl-2-aminoéthylamino)propyltriméthoxysilane,N-( [3 -(triéthoxysilyl) propyl] -2,4-dintrophénylamine,N- [3 -(triéthoxysilyl)propylj -4 ,5-dihydroimi dazole,triméthoxysilylpropyldiéthylènetriamine, N-(3-triméthoxysilyl propyl)pyrrole, le composé préférentiel étant le diméthylméthoxysilylpro pylpentaéthylènehéxamine. La substance bifonctionnelle comprenant une ou plusieures amines primaires, secondaires ou tertiaires et un ou plusieurs vinyliques est sélectionnée parmi les composés suivants, N-allyl-éthylènediamine, N,N-diallyl-éthylènediamine ,N,N,N-triallyl-éthylènediamine,N,N,N,N tétrallyléthylènediamine, N-allyldiéthylènetriamine,N,N-diallyldiéthylènetriamine,N,N,N-triallyl- diéthylènetriamine,N,N,N,N-tétrallyldiéthylènetriamine, N,N,N,N,N-pental lyldiéthylènetriamine,N,N,N,N,N,N-hexallyldiéthylènetriamine ,N,N,N,N,N,N- hexallyl-pentaéthylènehexamine, le composé préférentiel étant le N,N,N,N,N,N-hexallylpentaéthylènehexamine. La substance bifonctionnelle comprenant une ou plusieurs groupes nitriles et un ou plusieurs alkoxysilanes est sélectionnée parmi les composés suivants, 3-(cyanoéthoxy)-3,3-dimethyl- l-propényltriméthoxysilane, 2-cyanoéthyltriéthoxysilane,2-cyanoéthyltriméthoxysilane,(cyanométhyl- phènethyl)triméthoxy silane ,3 -cyanopropyldiméthylméthoxylsilane, 3-cyanopropyltriéthoxysilane le composé préférentiel étant le bromure de 3-c yanopropyldiméthylméthoxy silane La substance bifonctionnelle comprenant une ou plusieurs groupes nitriles et un ou plusieurs halosilanes est sélectionnée parmi les composés suivants ,(3 -cyanobutyl)trichlorosilane,2-cyanoéthylméthyldichloro silane, 2-cyanoéthyltrichloro silane,3 -cyanopropyldimethylchloro silane, 3 -cyanopropylmethyldichloro silane, 3 -cy anopropyltrichloro silane, le composé préférentiel étant le 3-cyanopropyldiméthylchlorosilane dérivés. La substance bifonctionnelle comprenant une ou plusieurs groupes époxy et un ou plusieurs groupes alkoxysilanes est sélectionnée parmi les composés suivants, (3 -glycidoxypropyl)bis (triméthylsiloxy)méthylsilane, 3 -glycidoxypropyldiméthyléthoxysilane,(3 -glycidoxypropyl)méthyldiétho xysilane ,3 -glycidoxypropylméthyldiisopropenoxysilane,(3 -glycidoxypro- pyl)triméthoxysilane, le composé préférentiel étant le 3-glycidoxypropyldiméthyléthoxysilane. Préparation de la Colonne Capillaire L'ensemble de ces traitements concerne la face interieure des colonnes capillaires. Méthode A mettant en jeu une substance bifonctionnelle comprenant un groupement ammonium quaternaire-alkoxysilanes. figure 1 Monter la cassette qui contient la colonne capillaire de silice fondue non-traitée sur l'appareil d'électrophorèse capillaire. Brancher l'appareil afin d'assurer le rinçage de la colonne par de l'acide chlorhydrique 0,1M. Le rinçage est assuré pendant 15 minutes. Rincer à nouveau par de l'eau distillée durant 10 minutes puis par de la soude 0,1M pendant 10 minutes. Rincer ensuite pendant 10 minutes par de l'eau distillée. Faire passer à travers la colonne une solution aqueuse à 25% (v/v) de chlorure de N-(triméthoxysilyloctyl)triméthylammonium. Rincer à nouveau par de l'eau distillée. Un traitement supplémentaire par une solution aqueuse d'acide camphosulfonique 0,1M peut être réalisé afin d'obtenir un contre-ion. Méthode B mettant en jeu une substance bifonctionnelle comprenant un groupement amines-alkoxysilanes.figure 2 Monter la cassette qui contient la colonne capillaire de silice fondue non-traitée sur l'appareil d'électrophorèse capillaire. Brancher l'appareil afin d'assurer le rinçage de la colonne par de l'acide chlorhydrique 0,1M. Le rinçage est assuré pendant 15 minutes. Rincer à nouveau par de l'eau distillée durant 10 minutes puis par de la soude 0,1M pendant 10 minutes. Rincer ensuite pendant 10 minutes par de l'eau distillée. Faire passer à travers la colonne une solution aqueuse à 25% (v/v) de diméthylméthoxysilylpropylpentaéthylènehéxamine. Rincer à nouveau par de l'eau distillée. Faire passer à travers la colonne une solution méthanolique à 25% (v/v) d'iodure de méthyle durant une période de l'ordre de 10 minutes. Ensuite laver la colonne au moyen du méthanol pendant 5 minutes environ. Rincer à nouveau par de l'eau distillée. Un traitement supplémentaire par une solution aqueuse d'acide camphosulfonique à 0,1M peut être réalisé afin d'obtenir un contre-ion. Grâce à cette préparation de la colonne, plusieurs centaines d'analyses électrophorétiques ont été réalisées. Méthode C mettant en jeu une substance bifonctionnelle comprenant un groupement époxy-alkoxysilanes figure 3 Monter la cassette qui contient la colonne capillaire de silice fondue non-traitée sur l'appareil d'électrophorèse capillaire. Brancher l'appareil afin d'assurer le rinçage de la colonne par l'acide chlorhydrique 0,1M. Le rinçage est assuré pendant 15 minutes. Rincer à nouveau par de l'eau distillée durant 10 minutes puis par de la soude 0,1M pendant 10 minutes. Rincer ensuite pendant 10 minutes par de l'eau distillée. Faire passer à travers la colonne une solution aqueuse à 25% (v/v) de 3-glycidoxypropyldiméthyléthoxysilane. Rincer à nouveau par de l'eau distillée. Faire passer à travers la colonne une solution de tetrahydrofurane à 25% (v/v) de diéthylènetriamine durant environ de 30 minutes. Rincer à nouveau par de l'eau distillée suivie par un rinçage par du méthanol. Faire passer à travers la colonne une solution méthanolique à 25% (v/v) de l'iodure de méthyle durant environ 10 minutes. Laver ensuite la colonne au moyen du méthanol pendant 5 minutes environ. Rincer à nouveau par de l'eau distillée pendant 10 minutes. Un traitement supplémentaire par une solution aqueuse d'acide camphosulfonique à 0,1M peut être réalisé afin d'obtenir un contre-ion. Grâce à cette préparation, plusieurs centaines d'analyses électrophorétique s peuvent être réalisées. Méthode D mettant en jeu une substance bifonctionnelle comprenant un groupement nitriles-alkoxysilanes figure 4 Monter la cassette qui contient la colonne capillaire de silice fondue non-traitée sur l'appareil d'électrophorèse capillaire. Brancher l'appareil afin d'assurer le rinçage de la colonne par l'acide chlorhydrique 0,lu. Le rinçage est assuré pendant 15 minutes. Rincer à nouveau par de l'eau distillée durant 10 minutes puis par de la soude 0,1M pendant 10 minutes. Rincer ensuite pendant 10 minutes par de l'eau distillée. Faire passer à travers la colonne une solution aqueuse à 25% (v/v) de 3 -cyanopropyldiméthylméthoxy silane. Rincer à nouveau par de l'eau distillée. Faire passer à travers la colonne une solution de tétrahydrofurane anhydre à 1% (P/v) d'hydrure de lithium aluminium de durant environ 60 minutes. Rincer ensuite par une solution de tetrahydrofurane anhydre pendant 5 minutes environ. Rincer à nouveau par de l'eau distillée pendant 5 minutes suivie par un rinçage par du méthanol pendant 10 minutes. Faire passer à travers la colonne une solution méthanolique à 25% (v/v) de l'iodure de méthyle durant environ 10 minutes. Laver ensuite la colonne au moyen du méthanol pendant 5 minutes environ. Rincer à nouveau par de l'eau distillée. Un traitement supplémentaire par une solution aqueuse d'acide camphosulfonique à 0,1M peut être réalisé afin d'obtenir un contre-ion. Grâce à cette préparation, plusieurs centaines d'analyses électrophorétiques peuvent être réalisées. Méthode E mettant en jeu une substance bifonctionnelle comprenant un groupement ammonium quaternaire- vinylique figure 5 Monter la cassette qui contient la colonne capillaire de silice fondue non-traitée sur l'appareil d'électrophorèse capillaire. Brancher l'appareil afin d'assurer le rinçage de la colonne par l'acide chlorhydrique 0,1M. Le rinçage est assuré pendant 15 minutes. Rincer à nouveau par de l'eau distillée durant 10 minutes puis par de la soude 0,1M pendant 10 minutes. Rincer ensuite pendant 10 minutes par de l'eau distillée. Rincer à nouveau par une solution de tetrahydrofurane anhydre pendant 5 minutes environ. Faire passer à travers la colonne la chlorure de thionyle pendant 2 à 3 heures. Rincer ensuite par une solution de tetrahydrofurane anhydre pendant 5 minutes environ. Faire passer à travers la colonne une solution de tetrahydrofurane anhydre à 1% (P/v) du hydrure de lithium aluminium durant environ 60 minutes. RinCer ensuite par une solution de tétrahydrofurane anhydre pendant 5 minutes environ. Faire passer une solution de isopropanol anhydre à 0,1 g% d'acide chloroplatinique et 10% de N-allyle-éthylènediamine pendant 1 heure. Rincer à nouveau par de l'isopropanol suivies par du méthanol pendant 10 minutes pour chacune. Faire passer à travers la colonne une solution méthanolique à 25% (v/v) de l'iodure de méthyle de l'ordre de 10 minutes. Laver ensuite la colonne au moyen du méthanol pendant 5 minutes environ. Rincer à nouveau par de l'eau distillée. RESULTATS Grâce à ce type de préparation, plusieurs centaines d'analyses électrophorétiques ont été réalisées avec la même colonne. Grâce a ce type de colonne nous avons pu séparer des substances chimiques de faible poids moléculaire et de structure chimique voisine. Des substances présentes dans un sérum humain et dans les urines humaines ont pu être séparées sans interférences de la part des constituants normaux de sérum ou des urines. Une séparation des divers substances acides de charges multiples réalisées avec l'un des colonnes traitées est présentée dans la figure G . Les substances séparées sont indiquées sur la figure 6. I1 faut remarquer que toutes ces composés ne peuvent pas être séparés simultanément dans aucun cas avec une colonne traitée autrement ou non-traitée. Surtout, l'ensemble des acide de charges multiples tel que l'acide sulfo-5-salicylique, l'acide trimesique, l'acide phthalique, l'acide isophthalique, l'acide hydroxy-5 isophthalique, et l'acide amino-5 isophthalique ne peuvent pas être séparés des autres acides, qui ne possèdent qu'un groupement chargé au cours du même essai, lors de l'emploi d'autre type de colonne Les conditions employés pour cette separation sont marquées dans la figure (i. D'autres acides ont été séparés du mélange acide oxalique, acide maléique, acide succinique, acide fumarique, acide citrique, acide D-tartarique.figure Le exemple décrits ci-devant montrent les étendus de cette invention ; de nombreuses colonnes capillaires chargés positivement d'une manière permanente ont été réalisées et permettent cette excellente séparation indiquée ci-devant. OCH3 H3C CH3 surface | + interieure H3CO-Si-(CH2-N+ de la colonne I capillaire OCH3 H3C Cl OH OH H3C CH3 surface I \ / interieure = Si-O-Si- (CH2)8 N+ de la colonne capillaire I I C1 OH H3C Cl Revêtement final Figure 1 : Méthode A mettant en jeu une substance bifonctionnelle comprenant un groupement ammonium quaternaire-alkoxysilane CH3 H I I H3CO Si CH2- CH2- CH2- NCH2-CH2-N CH2- CH2-N CH3 H H3 surface interieure g de la colonne 2 capillaire I CH3 H surface I surface -"-si CH2-CH2-NCH2-CH2-N : la colonne O- S1i-CH2--CH2-CH2--N capillaire CH3 llH13 CH3I CH3I + CH3OH CH3 H3C CH3 surface I interieure ~~~Si-O- Si- CH2 CH2- CH2- CH3 la teollioeUree t CH3 capillaire CH3 I- ' H3 L CH3 cH33 Revêtement final Figure 2 :Méthode B mettant en jeu une substance bifonctionelle comprenant un groupement amines-alkoxysilane CH3 surface interieurt si~ OH + - Si-CH2- CH2- CH2-o-CH2- CH2- CH2 denibe - I capillaire CH3 O (3-Glycidoxypropyl) diméthyl éthoxysilane l CH3 surface "teneur -. de tube =Si- O - Si- CH2- CH2- CH2- O-CH2- CH2- CH2 I O capillaire CH3 H H / / N-CH2- CH2- N-CH2- CH2- N H H H N diéthylènetriamine CH3 H surface "It"eur su~ o ~ si, CH CH,- CK2 -. de tube Si- O - Si- CH2- CH2- CH2- O- CH2- CH-CH2- N-CH2- CH2-N- CH2- CH2- N capillaire CH3 1H H H H CH3 OH CHI + CH3OH CH3 H3C CH3 H3C CH3 H3C CH3 surface interieur -. indeIT =Si- O-Si- CH2- CH2- CH2- O-CH2- CH- CH2- N- cnr CHr N- cH2- N I I i i \ i \ capillaire CH3 OH I- CH3 I- CH3 I- CH3 Revêtement final Figure 3: Méthode C mettant en jeu une substance bifonctionelle comprenant un groupement époxy-alkoxysilane CH3 I H,CO Si- CH,- CH2- CH2- C=N CH3 (cyanopropyl-3) diméthylméthoxysilane surface inteneure g Si-OH de la colonne capillaire CH3 surface I interieure g Si0 Si-CH,-CH,-CH2-C~N de la colonne I capillaire CH3 LAlH4 CH3 surface interieure = Si-O-Si- si~ CH2- CH2- CH2- CH2-NH2 de la colonne capillaire CH3 CH3 CH3I + CH3OH CH3 H3C CH3 surfice | interieure Si 2 Si - CH2- CH2- CH2- CH2- N+ de la colonne capillaire CH3 H3C I Revêtement final Figure 4 :Méthode D mettant en jeu une substance bifonctionelle comprenant un groupement nitrile-alkoxysilane surface interieure SSiOH de la colonne capillaire Colonne Chlorure de thionyle (SOC12) surface interieure z- Si-Cl de la colonne capillaire | LiAlH4 surface interieure 1--Si-K de la colonne capillaire H l'acide chloroplatinique H N-- CH,- CH- N N - CH2- CH2- N K 8 f H N-allyle-éthylènediamine surface intérieure 5 de la colonne capillaire H CH3I + CH30H NCH2-CH2-NX H H M r surface interieur S Si de colonne S CH3 CH3 ,iS \ H3C CH3 I- CH3 Revêtement Final Figure 5: Méthode E mettant en jeu une substance bifonctionelle comprenant un groupement amine-vinylique TIME CHANNEL B: ABSORBANCE -0.001 0.050 Identification des Pics 1. I'acide sulfo-5 salicylique 2. l'acide salicylique 3. I'acide trimesique 4. Acide toluene-4 sulfonique 5. de la Colonne 5. I'acide nitro-5 isophthalique Dimensions de la Colonne 6. l'acide phthalique 7. Lm ID x 365 Cl OD x 67 cm 7. I'acide nitro-2 benzoique 75 ijin ID x 365 Fm OD x 67 cm 8. I'acide isophthalique 9. Tapon 9. I'acide nitro-3 benzoique 6 Tampon 10. l'acide hydroxy-5 isophthalique . . I 1. I'acide acétique In. I'acide amino-5 isophthalique 95 mM de l'acide actique 12. l'acide amines4 salicylique 9 50 mM de la sel sodique de acide acétique 13. I'acide benzoique dans l'eau 14. I'acide anthracene-9 carboxylique 15. Conditions 15. I'acide nitre4 phenylacetique Autres 16. 16. I'acidenaphthalene-2acetique 17. I'acide hydroxy-4 benzoique 2 3 1 200 nm détection UV 18. acide sulfanilique \ / 12 Detector vers l'anode ! 19. 1 acide diméthoxy-3,4 benzoique 72 20KV 28a 20. l'acide dihydroxy-2,3 benzoique Injection par pression 2 seconds 21. Acide amino-4 benzoique 10 20 Concentration des Pics 1 l 13 19 22.2 to 22.4 g'mI de chaque compos il 21 16 7 14 4 15 5.0 30.0 Figure 6 : Electrophorègramme de diverses substances acidiques TIME CHANNEL A: ABSORBANCE -0.010 0.080 4 Identification des Pics 1. I'acide oxalique 2. l'acide maleique 3. I'acide succinique 4. I'acide fumarique 5. I'acide citrique 6. I'acide tartarique-D Concentration des Pics 222 to 244 llglml 2 de chaque composé Dimensions de la Colonne 75 CLm ID x 365 CLm OD x 67 cm Tampon 10 mM de l'acide trifluoroacétique 20 mM Sodium Trifluoroacetate dans l'eau Autres Conditions 6 200 nm detection Uv l Detector vers l'anode 20RV 42La 3 0.0 30.0 Figure 7: Electrophorègramme de diverses substances acidiques REVENDICATIONS 1. Colonne capillaire en verre ou en quartz ou en silice fondue ou en dérivé polymérique ou en matériaux similaires, utilisée en électrophorèse capillaire, présentant une charge positive permanente, sous forme d'ammonium quaternaire, fixée à la surface intérieure par une liaison covalente, résultant de la combinaison entre la paroi de la colonne capillaire et un composé polymérique ou non-polymérique de structure bifonctionnelle, l'une des fonctions présentant une charge positive permanente de nature ammonium quaternaire, l'autre fonction étant destinée à former la liaison covalente avec la paroi de la colonne capillaire, en ce que la liaison covalente peut être sous forme de siloxane -Si-O-Si- résultant de la combinaison d'un groupement constituée d'un atome de silicium et d'un, de deux ou de trois substituants halogènés, tel le chlore ou le brome, soit d'un groupement constitué d'un atome de silicium et d'un, de deux ou de trois substituants alkoxy ou acyloxy réagissant avec les groupements hydroxyles de la surface intérieure du capillaire, en ce que la liaison covalente peut être obtenu soit sous forme de liaison silicium-carbone -Si-C- résultant de la combinaison au niveau de la paroi de la colonne capillaire d'un groupement vinylique et de groupements d'hydrure de silicium -SiH préalablement formés par la transformation de silanol -SiOH en halogénures de silicium -SiX, X étant un halogénure du type chlore ou brome suivies d'une réduction en hydrure de silicium -SiH. 2. Colonne capillaire présentant une charge positive permanente selon la revendication 1 due à la combinaison entre une substance bifonctionnelle polymérique ou non-polymérique comprenant un ou plusieurs sels d'ammonium quaternaire et un ou plusieurs alkoxysilanes, réagissant avec la paroi intérieure de la colonne capillaire et conduisant à une fixation sous forme de liaison covalente. 3. Colonne capillaire présentant une charge positive permanente selon la revendication 1 due à la combinaison entre une substance bifonctionnelle polymérique ou non-polymérique comprenant un ou plusieurs sels d'ammonium quaternaire et un ou plusieurs groupes vinyliques, réagissant avec la paroi intérieure de la colonne capillaire et conduisant à une fixation sous forme de liaison covalente. 4. Colonne capillaire présentant une charge positive permanente selon la revendication 1 due à la combinaison entre une substance bifonctionnelle polymérique ou non-polymérique comprenant un ou plusieurs amines primaires, secondaires ou tertiaires et un ou plusieurs alkoxysilanes, réagissant avec la paroi intérieure de la colonne capillaire et conduisant à une fixation sous forme de liaison covalente, les amines étant transformées en ammonium quaternaire par action d'halogénures d'alkyle soit avant la fixation sur la paroi intérieure de la colonne capillaire soit in situ après fixation. 5. Colonne capillaire présentant une charge positive permanente selon la revendication I due à la combinaison entre une substance bifonctionnelle polymérique ou non-polymérique comprenant un ou plusieurs amines primaires, secondaires ou tertiaires et un ou plusieurs groupes vinyliques, réagissant avec la paroi intérieure de la colonne capillaire et conduisant à une fixation sous forme de liaison covalente, les amines étant transformées en ammonium quaternaire par action d'halogénures d'alkyle soit avant la fixation sur la paroi intérieure de la colonne capillaire soit in situ après fixation. 6. Colonne capillaire présentant une charge positive permanente selon la revendication 1 due à la combinaison entre une substance bifonctionnelle polymérique ou non-polymérique comprenant un ou plusieurs groupes nitriles et un ou plusieurs groupes alkoxysilanes, réagissant avec la paroi intérieure de la colonne capillaire et conduisant à une fixation sous forme de liaison covalente, les groupes nitriles étant transformés en ammonium quaternaire par réduction du nitrile en amine primaire, elle-même transformée en ammonium quaternaire par réaction d'halogénures d'alkyle soit avant la fixation sur la paroi intérieure de la colonne capillaire soit in situ après fixation. 7. Colonne capillaire présentant une charge positive permanente selon la revendication 1 due à la combinaison entre une substance bifonctionnelle polymérique ou non-polymérique comprenant un ou plusieurs groupes nitriles et un ou plusieurs groupes halosilanes, pour lequel l'atome d'halogène peut être le chlore ou le brome réagissant avec la paroi intérieure de la colonne capillaire et conduisant à une fixation sous forme de liaison covalente, les groupes nitriles étant transformés en ammonium quaternaire par réduction du nitrile en amine primaire, elle-même transformée en ammonium quaternaire par réaction d'halogénures d'alkyle soit avant la fixation sur la paroi intérieure de la colonne capillaire soit in situ après fixation. 8. Colonne capillaire présentant une charge positive permanente selon la revendication 1 due à la combinaison entre une substance bifonctionnelle polymérique ou non-polymérique comprenant un ou plusieurs groupes époxy et un ou plusieurs groupes alkoxysilanes, réagissant avec la paroi intérieure de la colonne capillaire et conduisant à une fixation sous forme de liaison covalente, les groupes époxy étant transformés en ammonium quaternaire par réaction dans un premier temps avec une amine primaire ou une amine secondaire conduisant à un amino-alcool transformé en ammonium quaternaire par réaction d'halogénures d'alkyle soit avant la fixation sur la paroi intérieure de la colonne capillaire soit in situ après fixation. 9. Colonne capillaire présentant une charge positive permanente selon l'une quelconque des revendications 1 à 2 caratérisées en ce que la substance bifonctionnelle comprenant un ou plusieurs sels d'ammonium quaternaire et un ou plusieurs alkoxysilanes est sélectionnée parmi les composés suivants, chlorure de n-octadecyldiméthyl- [3 -(triméthoxy- silyl)propyl] ammonium, chlorure de n-tétradecyldimethyl(3 -triméthoxy silylpropyl)ammonium, chlorure de N-(triméthoxysilyloctyl) triméthylammonium, chlorure de N-( 3 -triméthoxypropyl-N-méthyl-N, N-diallylammonium, chlorure de N-triméthoxy silylpropyl-N,N, N-triméthylammonium, chlorure de N-triméthoxy silylpropyl-tri-n- butylammonium, le composé préférentiel étant le chlorure de N-(triméthoxy silyloctyl) triméthylammonium . I 0. Colonne capillaire présentant une charge positive permanente selon l'une quelconque des revendications 1 et 3 caratérisées en ce que la substance bifonctionnelle comprenant un ou plusieurs sels d'ammonium quaternaire et un ou plusieurs groupes vinyliques est sélectionnée parmi les composés suivants, l'iodure de hexallyl-éthylènediammonium, l'iodure de octallyl-diethylene- triammonium, l'iodure de decallyl-triéthylènetétrammonium, l'iodure de dodécallyl tétraéthylènepentammonium,l'iodure de tétradécallyl- pentaéthylène hexammonium, le composé préférentiel étant le hexabromure de tétradecaallyl-pentaéthylènehexammonium il. Colonne capillaire présentant une charge positive permanente selon l'une quelconque des revendications 1 et 4 caratérisées en ce que la substance bifonctionnelle comprenant une ou plusieures amines primaires, secondaires ou tertiaires et un ou plusieurs alkoxysilanes est sélectionnée parmi les composés suivants, 4-Aminobutyl diméthylméthoxysilane,4-Aminobutyltriéthoxysilane,(aminoéthyl- aminoéthyl)phenethyltriméthoxysilane,N-2- aminoéthyl)-3 -aminopropyl méthyldiméthoxysilane,N-(2-aminoethyl-3 -aminopropyl) -triméthoxy- silane, N-(2-aminoethyl-3 -aminopropyl)-tris- (2-éthylhexoxy) silane, N-(2-aminohexyl-3 - aminopropyl)triméthoxysilane,4-aminophnyltrimet hoxysilane,3-(l -aminopropoxy) ,3-diméthyl- 1 -propényltriméthoxy- silane, 3 -aminopropyl-tris(methoxyethoxyethoxy) silane, 3 -aminopropyl dimethylethoxysilane,3-aminopropylméthyldiéthoxysilane, 3-aminopro pyltriéthoxysilane, 3-aminopropyltriméthoxysilane, 3-aminopro pyltris(triméthylsilyloxy)silane, J-aminoundecyltriméthoxysilane, 3 - [2-N-benzylaminoethylaminopropyl] trimethoxysilane,B is-(2-hydroxye thyl)-3 -aminopropyltriethoxysilane, Bis [3 -(triéthoxysilyl)propyl] amine, B is [3 -(triméthoxysilyl)propyl]ethylenediamine,(cyclohexylaminométhyl) méthyldiéthoxy silane, (cyclohexylaminométhyl)diméthyléthoxysilane, (N,N-diéthyl-3 -aminopropyl)trimethoxysilane,dimethylméthoxysilylprop yldiéthylènetriamine, diméthylméthoxysilylpropylpentaéthylènehexa mine, N-méthylaminopropyltriméthoxysilane, methyl[2- (3-triméthoxy silylpropylamino)éthylamino] -3 -propionate,N-phénylaminopropyl- triméthoxysilane, 3 -(N-styrylméthyl-2-aminoéthylamino)propyltri- méthoxysilane, N-(t3-(triéthoxysilyl)propyl]-2,4-dintrophénylamine, N- [3 -(triéthoxysilyl)propyl]-4,5-dihydroimidazoleXtriméthoxy silyl propyldiéthylènetriamine, N-(3-triméthoxysilylpropyl)pyrrole, le composé préférentiel étant le diméthylméthoxysilylpropylpenta- éthylènehéxamine 12.Colonne capillaire présentant une charge positive permanente selon l'une quelconque des revendications 1 et 5 caratérisées en ce que la substance bifonctionnelle comprenant une ou plusieures amines primaires, secondaires ou tertiaires et un ou plusieurs vinyliques est sélectionnée parmi les composés suivants, N-allyl-éthylènediamine, N,N-diallyl-éthylènediamine ,N,N,N-triallyl-éthylènediamine,N,N, N,N-tétrallyléthylènediamine,N-allyldiéthylènetriamine, N,N-diallyldiéthylènetriamine,N,N,N-triallyldiéthylènetriamine, N,N,N, N- tétrallyldiéthylènetri amine, N,N,N,N,N-pentallyldiéthylènetriamine, N,N,N,N,N,N-hexallyldiéthylènetriamine,N,N,N,N,N,N-hexallyl-pentaéthy- lènehexamine, le composé préférentiel étant le N,N,N,N,N,N-hexallyl- pentaéthylènehexamine. 13. Colonne capillaire présentant une charge positive permanente selon l'une quelconque des revendications 1 et 6 caratérisées en ce que la substance bifonctionnelle comprenant une ou plusieurs groupes nitriles et un ou plusieurs alkoxysilanes est sélectionnée parmi les composés suivants, 3 -(cyanoéthoxy)-3 ,3 -dimethyl-1-propényltriméthoxysilane, 2-cyanoéthyltriéthoxy silane,2-cyanoéthyltriméthoxysilane,(cyano méthylphènethyl)triméthoxysilane, 3 -cyanopropyldimthylméthoxy- silane, 3-cyanopropyltriéthoxysilane le composé préférentiel étant le 3 -cyanopropyldiméthylméthoxysilane 14.Colonne capillaire présentant une charge positive permanente selon l'une quelconque des revendications 1 et 7 caratérisées en ce que la substance bifonctionnelle comprenant une ou plusieurs groupes nitriles et un ou plusieurs halosilanes est sélectionnée parmi les composés suivants, (3-cyano butyl)trichlorosilane,2-cyanoéthylméthyldichloro- silane, 2-cyanoéthyltrichlorosilane,3 -cyanopropyldimethylchloro silane, 3 -cyanopropylmethyldichloro silane, 3 -cyanopropyltrichloro silane, le composé préférentiel étant le 3-cyanopropyldiméthylchlorosilane and related substances. 15. Colonne capillaire présentant une charge positive permanente selon l'une quelconque des revendications 1 et 8 caratérisées en ce que la substance bifonctionnelle comprenant une ou plusieurs groupes époxy et un ou plusieurs groupes alkoxysilanes est sélectionnée parmi les composés suivants, (3-glycidoxypropyl)bis(triméthylsiloxy) méthylsilane, 3-glycidoxypropyldiméthyléthoxysilane, (3-glycidoxy propyl)méthyldiéthoxysilane, 3 -glycidoxypropylméthyldiisopro penoxysilane, (3-glycidoxypropyl)triméthoxysilane, le composé préférentiel étant le 3-glycidoxypropyldiméthylethoxy silane. 16. Colonne capillaire présentant une charge positive permanente selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, en ce que la préparation du revêtement intérieur de la colonne capillaire est réalisée selon les étapes suivantes : lavages successifs par l'acide chlorhydrique, par de l'eau, par de la soude, par de l'eau, puis traitement par la substance bifonctionnelle qui par exemple et d'une manière non limitative peut être le chlorure de N-(triméthoxysilyloctyl) triméthylammonium ; puis lavage à l'eau suivie éventuellement par un traitement par de l'acide campho sulfonique. 17. Colonnes capillaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 caractérisées en ce qu'elles permettent de séparer des composés chargés négativement, chargés positivement ou des composés neutres dans un but analytique ou pour la préparation de composés purs.