FR 2673945 A1 19920918 FR 9103169 A 19910315 POLYPEPTIDES PROVENANT DU VENIN DE DENDROASPIS POLYLEPIS ET LEUR UTILISATION COMME MEDICAMENT La présente invention a pour objet de nouveaux polypeptides inhibiteurs des canaux calcium, les anticorps correspondants et l'utilisation desdits polypeptides comme médicaments. Les canaux calcium de type L sont situés dans la membrane externe des cellules musculaires. Ils permettent l'entrée du calcium dans les cellules et participent de façon fondamentale à la régulation de la concentration intracellulaire de calcium qui détermine notamment les opérations de contraction ou de relaxation du muscle lisse vasculaire et du muscle cardiaque. Les inhibiteurs de canaux calcium sont donc particulièrement utilisés en thérapeutique dans le traitement de pathologies cardio-vasculaire telle que l'insuffisance coronarienne et l'hypertension artérielle. Les plus connus d'entre eux sont les molécules de la famille des 1,4 dihydropyridines telles que la nifedipine ou la nitrendipine, les molécules de la famille des phénylalkalamines tel le verapamil ou encore les molécules de la famille des benzothiazépines, tel que le diltiazem. Alors qu'aucune de ces molécules n'est de nature peptidique, on a maintenant découvert un polypeptide extrait du venin de Dendroaspis polylepis et présentant une activité inhibitrice des canaux calcium impliqués dans le couplage excitation-contraction des cellules musculaires lisses et cardiaques; cette inhibition conduit naturellement â une relaxation vasculaire, analogue à celle qu'on observe avec les molécules de la famille des 1,4 dihydropyridines. Le venin de Dendroaspis polylepis est connu pour contenir des dendrotoxines qui sont de petites neurotoxines de 57 à 60 résidus d'acides aminés facilitant la libération de neurotransmetteur cérébraux. H. SCHWEITZ et al., dans TOXICON Vol. 28, No. 7, pp. 847-856, 1990, ont décrit la purification de 28 peptides extraits de Dendroaspis polylepis, dont la moitié fait partie de la famille des dendrotoxines. Les travaux de recherche effectués par les inventeurs ont permis de mettre en évidence, parmi les 14 peptides extraits de Dendroaspis polylepis et ne faisant pas partie de la famille des dendrotoxines, un nouveau polypeptide inhibiteur des canaux calcium de type L. La présente invention a ainsi pour objet ce nouveau polypeptide constitué de 60 résidus d'acide aminé réticulé par des ponts disulfure et dont la séquence linéaire en acide aminés répond à la formule (I) suivante: X Arg Ile Cys Tyr Ile His Lys Ala Ser Leu Pro Arg Ala Thr Lys Thr Cys Val Glu Asn Thr Cys Tyr Lys Met Phe Ile Arg Thr Gln Arg Glu Tyr Ile Ser Glu Arg Gly Cys Gly Cys Pro Thr Ala Met Trp Pro Tyr Gln Thr Glu Cys Cys Lys Gly Asp Arg Cys Asn Lys Y (I) dans laquelle X représente lthydrogène ou un groupement bloquant le groupe amino terminal et Y représente un groupe hydroxy ou un groupement bloquant le groupe carboxyle terminal. les groupements bloquant les groupes amino et carboxyle terminaux sont avantageusement des groupements protecteurs usuels compatibles avec une utilisation pharmaceutique. Parmi les groupements protecteurs de la fonction amino terminal, on peut citer un groupement acyle (par exemple acétyle) ou hydrocarbyloxycarbonyle (en particulier aralkoxycarbonyle ou alkoxycarbonyle, par exemple benzyloxycarbonyle, tertiobutyloxycarbonyle, etc...); on citera également les groupements carboxyles terminaux protégés sous forme d'amide, d'ester (alkyl-ester, benzyl-ester, p-nitrobenzyl-ester, etc. . .) ou dthydrazine (carbobenzoxyhydrazide, t-butyloxy-carbonylhydrazide, trityl-hydrazide, etc...). Les correspondances entre les acides aminés et les abréviations utilisées dans la formule (I) sont les suivantes Ala alanine Cys cystéine Asp acide aspartique Glu acide glutamique Phe phénylalanine Gly glycine His histidine Ile isoleucine Lys lysine Leu leucine Met méthionine Asn asparagine Pro proline Gln glutamine Arg arginine Ser serine Thr thréonine Val valine Trp tryptophane Tyr tyrosine L'invention concerne également les fragments du polypeptide de formule (I) susceptibles de posséder une activité inhibitrice des canaux calcium. L'homme de l'art dispose des moyens permettant 6'identifier ceux des polypeptides de séquences plus courtes qui entrent danse champ de l'invention.On peut mentionner à titre de moyen général lui permettant d'effectuer cette identification, le traitement du polypeptide de formule (I) avec une protéase clivant le polypeptide dans un site peptidique choisi, après séparation les fragments ainsi obtenus sont testés pour leur activité inhibitrice des canaux calcium de type L. Les polypeptides précédents peuvent être modifiés dès lors qu'il conserve l'activité pharmacologique définie précédemment. En conséquence, l'invention englobe encore les variants desdits polypeptides s'en distinguant par exemple par insertion et/ou délétion et/ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés. On entend aussi par variants, les polypeptides dans lesquels la liaison peptidique (-CO NH-) est remplacé par des structures -CO-N(CH3)-, -CH2 CH2-, -CO-CH2-, ou encore, ceux dans lesquels le squelette peptidique présente un ou plusieurs groupes intercalés tels que les groupes -CH2-, -NH-, -O-. la présente invention concerne également les polypeptides dans lesquels les aminoacides présentant un carbone asymétrique sont sous forme D ou L. Les polypeptides de l'invention comportent plusieurs résidus cystéines susceptibles de forme entre eux des ponts disulfures, ces ponts disulfure confère aux polypetides une structure réticulé. Ainsi, les inventeurs ont mis en évidence quatre ponts disulfure dans le peptide de formule (I). Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par purification à partir du matériel biologique que constitue le venin de Dendroaspis polylepis par des techniques de chromatographie ou de précipitation. Les polypeptides de l'invention ou ses fragments peuvent aussi être obtenus par des techniques du génie génétique selon des techniques analogues à celles utilisées par exemple pour l'obtention de l'insuline humaine, ou encore être préparés de manière classique par synthèse chimique.La synthèse chimique consiste par exemple à condenser plusieurs fragments préalablement formés par couplages successifs des différents résidus d'acides aminés dans l'ordure approprié, en prenant soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par les résidus d'acides aminés ou les fragments, exceptées les fonctions amine et carboxyle engagées dans la liaison peptidique formée lors de la condensation. La présente invention a également pour objet des anticorps formés contre les polypeptides de l'invention. Anticorps qui peuvent être polyclonaux, ou monoclonaux et produits alors par tout hybridome préparé selon les méthodes classiques de fusion cellulaire entre des cellules spléniques, activées in vitro par un polypeptide de l'invention ou provenant d'un animal immunisé contre ledit polypeptide, et des cellules d'une lignée de cellule myélomateuse. Les anticorps monoclonaux précédent peuvent être avantageusement utilisés pour sélectionner parmi les polypeptides de l'invention ceux qui présentent une activité inhibitrice des canaux calcium de type L. Le polypeptide de formule (I) se signale par d'intéressantes propriétés pharmacologiques et peut par conséquent être utilisé en thérapeutique comme médicament. L'invention concerne donc aussi l'utilisation du polypeptide de formule (I) ou de tout fragment peptique ou variant approprié issu de ce dernier, en tant qu'inhibiteur des canaux calcium de type L. Les polypeptides de l'invention présentent un puissant effet sur les canaux calcium cardiaques et vasculaires, mais sont sans effet sur les canaux calcium des neurones et du muscle strié, et en conséquence ne présente ni neurotoxicité ni myototoxicité. Les variations intracellulaires de calcium joue un rôle majeur dans le processus de contraction musculaire mais également dans les processus de prolifération cellulaire, ainsi une hyperprolifération des cellules de muscles lisse et des cellules endothéliales est à l'origine des processus dlarthérosclérose. Comme inhibiteur des canaux calcium cardiaques et vasculaires, les polypeptides de l'invention sont particulièrement appropriés pour le traitement de pathologies cardio-vasculaires telle que l'hypertension, ainsi que pour le traitement de llarthérosclérose. Pour les indications précédentes, la dose dépend du mode d'administration et du traitement désiré. En général, on obtient des résultats satisfaisant lorsque le polypeptide est administré à une dose quotidienne comprise entre 0,6 mg/kg et environ 6 mg/kg. Chez l'homme, l'administration est effectuée par exemple par voie intraveineuse, en doses fractionnées jusqu'à 3 fois par jour, sous forme de doses unitaires contenant de 0,2 mg/kg à environ 2 mg/kg de substance active. Les polypeptides de l'invention peuvent être administrés sous forme libre ou sous forme dl,un sel pharmaceutiquement acceptable. De tels sels présentent le même ordre d'activité que les formes libres et peuvent être facilement préparés selon les méthodes conventionnelles. L'invention concerne par conséquent, les polypeptides sous forme libre ou sous forme d'un sel pharmaceutiquement acceptables, pour l'utilisation en tant que médicaments. En tant que médicament, les polypeptides sont administrés sous forme d'une composition pharmaceutique comprenant un polypeptide de l'invention, sous forme libre ou sous forme d'un sel pharmaceutiquement acceptable, en association avec un véhicule ou diluant pharmaceutiquement acceptable. De telles compositions, qui font également partie de l'invention, peuvent se présenter pour lladministration par voie entérale, par exemple sous forme de comprimés, ou pour l'administration par voie parentérale, par exemple sous forme de solutions ou de suspensions injectables par voie intraveineuse ou musculaire, ou encore pour l'administration sous forme de pulvérisation nasale. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et qui sont illustrés par les figures en annexe, étant entendu que ces exemples ne sauraient être interprétés comme tendant à réduire la portée des revendications. I - Purification du polypeptide de formule (I) 500 mg de venin de Dendroapis polylepis aussi dénommé mamba noir est dissout dans 7,5 ml d'acide acétique 1 %, puis chargé sur une colonne sephadex G50 (3 x 39 cm) - Le matériel biologique est élué en 4 pics avec le même solvant à un débit de 72 ml/heure; le troisième pic correspond à la fraction peptidique et contient 85 % du matériel biologique en poids sec. La densité optique de l'éluat est enregistré à 280 nm. Cette fraction peptidique est regroupé et un tiers est est chargé directement sur une colonne HPLC de type TSK SP 5 PW (21,5 x 150 mm) commercialisé par la Société BECKMANN) préalablement équilibré avec de l'acide acétique à 1 % ajusté à pH 3 avec de l'ammoniaque (solvant A) . La figure 1 représente l'élution des fractions peptidiques A à N, par un gradient linéaire du solvant A au solvant B constitué d'acétate de sodium 1 M, en 100 minutes au débit de 8 ml/minute. La fraction E est ensuite directement chargée sur une colonne de type RP18 (25 x 250 mm), 7 , commercialisée par la Société MERCK. La figure 2 représente I'élution des fractions peptidiques El, E2 et E3, par un gradient linéaire de 10 à 40 % d'acétonitrile dans l'eau contenant 0,5 % d'acide trifluoroacétique et 0,9 % de triéthylamine, en 75 minutes au débit de 8 ml/minute. Le polypeptide de formule (I) correspond à la fraction E3. Les purifications HPLC ont été effectuées avec un appareil Waters (pompe 501, injecteur U6K, formeur automatique de gradient et spectrophotomètre 481) équipé avec un intégrateur-enregistreur Shimadzu CR3A. La fraction E3 a été lyophilisée et dessalée sur une colonne de trisacryl GF05M (2,5 x 20 cm) avec de l'acide acétique 1 % comme éluant, et reliophylisée pour donner le polypeptide de formule (I) pur qui est conservé et stocké séché à - 200 C. Le polypeptide de formule (I) représente 2,8 % du venin en poids sec, sa masse moléculaire est de 7043 et son coefficient d'extinction à 280 nm ,est de 11510. II - Etude pharmacologique On donne ci-après des résultats d'études pharmacologiques mettant en évidence les propriétés du polypeptide de formule (I). - Le polypeptide de formule (I) bloque aux concentrations de 10-6 à 10-8 M les contractions de différents muscles lisses, contractions spontanées (veine porte, utérus) ou contractians induites par dépolarisation par le potassium (aorte) ou par le Bay K 8644 qui est un activateur du canal calcium lent. On a représenté à la figure 3, la relaxation par le polypeptide de formule (I) d'une aorte de rat préalablement contractée par 40 mM de K+ (o) ou par 300 nM de Bay K 8644 - Le polypeptide de formule (I) bloque aux concentrations de 10-6 à 10-9 M les contractions spontanées induites par stimulation électrique ou par le Bay K 8644.On a représenté à la figure 4, l'effet inotropique négatif du polypeptide de formule (I) sur une oreillette gauche de rat uniquement stimulée électriquement (o) ou stimulée électriquement et par le Bay K 8644 - L'injection du polypeptide de formule (I) à des rats génétiquement hypertendus produit une baisse très significative de la pression artérielle avec seulement peu d'effet sur le rythme cardiaque. - Le polypeptide de formule (I) est sans effet sur les canaux calcium des neurones et du muscle strié et n'a donc ni neurotoxicité, ni myotoxicité (DL 50 > 20 fg/g chez la souris). Les polypeptides de l'invention sont les premiers inhibiteurs de canaux calcium de nature peptidique décrits à ce jour. Les peptides qui sont présents dans les venins ont la plupart du temps, leur équivalent hormonal chez les mammifères. Ainsi la sarafotoxine, peptide extrait du venin de serpent Atractaspis Engaddensis est un peptide vasoconstricteur nouvellement décrit (C. TAKASEKI et al. (1988) TOXICON, 26, 543-548; C. TAKASEKI et al. (1988) NATURE, 335, 303); il existe chez les mammifères et chez l'homme en particulier, un équivalent structural et fonctionnel de cette toxine appelé endothéline (M. YANAGISAWA et au.(1988) NATURE 332, 411415). L'endothéline est une hormone vasoconstrictrice fabriquée par les cellules endothéliales vasculaires et impliquée dans la contraction du muscle lisse correspondant. il est donc probable qu il existe chez l'homme une hormone vasodilatatrice de structure analogue au polypeptide de formule (I) et qui soit impliquée dans la régulation physiologique de la vasorelaxation. Une telle hormone pourrait être mise en évidence en testant les anticorps de l'invention sur des échantillons biologiques humains. RENDICATIONS 1) Polypeptide présentant une activité inhibitrice des canaux calcium de type L constitué par tout ou partie de la séquence en acides aminés suivante X Arg Ile Cys Tyr Ile His Lys Ala Ser Leu Pro Arg Ala Thr Lys Thr Cys Val Glu Asn Thr Cys Tyr Lys Met Phe Ile Arg Thr Gln Arg Glu Tyr Ile Ser Glu Arg Gly Cys Gly Cys Pro Thr Ala Met Trp Pro Tyr Gln Thr Glu Cys Cys Lys Gly Asp Arg Cys Asn Lys Y dans laquelle X représente l'hydrogène ou un groupement bloquant le groupe amino terminal et Y représente un groupe hydroxy ou un groupement bloquant le groupe carboxyle terminal. 2) Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte 60 résidus d'acide aminé réticulé par quatre ponts disulfures dont la séquence linéaire en acides aminés répond à la formule suivante X Arg Ile Cys Tyr Ile His Lys Ala Ser Leu Pro Arg Ala Thr Lys Thr Cys Val Glu Asn Thr Cys Tyr Lys Met Phe Ile Arg Thr Gln Arg Glu Tyr Ile Ser Glu Arg Gly Cys Gly Cys Pro Thr Ala Met Trp Pro Tyr Gln Thr Glu Cys Cys Lys Gly Asp Arg Cys Asn Lys Y (I) dans laquelle X représente l'hydrogène ou un groupement bloquant le groupe amino terminal et Y représente un groupe hydroxy ou un groupement bloquant le groupe carboxyle terminal. 3) Anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il reconnait immunologiquement un ou plusieurs polypeptides selon l'une des revendications 1 à 2. 4) Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 2, sous forme libre ou sous forme d'un sel pharmaceutiquement acceptable, pour l'utilisation comme médicament. 5) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, sous forme libre ou sous forme d'un sel pharmaceutiquement acceptable en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.