FR 2664278 A1 19920110 FR 9008593 A 19900706 MILIEU REACTIONNEL ET SOLUBILISANT DE PEPTIDES ET PROCEDE DE SYNTHESE DE PEPTIDES UTILISANT CE MILIEU La présente invention a pour objet un milieu réactionnel et solubilisant pour la synthèse de peptides. Elle a aussi pour objet un procédé de synthèse de peptides dans ce même milieu. Il existe un grand nombre de méthodes de synthèse de peptides en phase liquide. Elles ont toutes des points communs de base qui consistent - à protéger éventuellement la fonction de la chaîne latérale d'un amino-acide par un groupe protecteur clivable en fin de synthèse du peptide; - à protéger la fonction amine (N a) dudit amino-acide par un groupement protecteur clivable après la condensation de l'amino-acide; - à activer la fonction acide carboxylique dudit amino-acide protégé; - puis à le condenser avec un acide aminé ou un peptide dont la fonction C terminale est protégée et dont la fonction amine est libre. - le peptide est obtenu par déprotection totale des groupes protecteurs après la condensation de tous les amino-acides. La réaction de condensation peut être réalisé aussi bien en phase liquide homogène qu'en phase hétérogène (par exemple synthèse de Merrifield). En général, la synthèse de peptides nécessite la protection de la fonction carboxylique de l'acide aminé C terminal sous forme d'esters. Dans le cas des synthèses peptidiques en phase homogène, l'ester sera choisi parmi : - les esters méthyliques, benzyliques, tertiobutyliques, - les esters de polymères solubles dans les solvants organiques : par exemple les esters de polyéthers de MUTTER M. et Al Justus Liebigs Annalen der Chemie 1975 pp. 901 . 915. - ou mieux parmi les esters revendiqués dans le Brevet R.P. déposé par la demanderesse ( n FR 89 06700 sur les esters GPC). Dans le cas des synthèses peptidiques en phase hétérogène, - l'ester pourra être notamment un ester de polymères non solubles dans les solvants organiques On peut citer de manière non exhaustive les polymères suivants * le copolymère styrène di vinyl benzène introduit par R.B. MERRIFIELD (J.A.C.S. 1963. 85. p. 2149, 2154) * le polydiméthyl acryiamide -co-Boc--Ala-N'-acroylyl -hexaméthylénédiamine de E. ATHERTON et R.C. SHEPPARD (J.A.C.S. 97 1975 p. 6584.6585) * le polystyrène greffé sur Kel-F (TREGEAR and Al 1966 U.S. Patent 3 700 609 and chem.Abot. 71 p 508241 (1969) ; * la cellulose La mise en oeuvre des synthèses peptidiques en phase hétérogène peut se faire soit en réacteur agité, soit en réacteur colonne, soit par toute autre technique (par exemple utilisation de membrane) Le rendement et la pureté du produit final dépendent beaucoup du rendement de chaque étape, d'une part en raison de l'accroissement géométrique des pertes, et d'autre part en raison des problèmes de séparation du produit désiré d'avec les sous produits. Ce problème s'amplifie au cours de la progression de la synthèse lorsque le nombre d'acides aminés augmente. En outre, dans le cas spécifique où on réalise la condensation en milieu liquide homogène, toutes ces méthodes présentent un même inconvénient leur productivité volumique est faible en raison de la mauvaise solubilité des acides aminés ou des peptides protégés intermédiaires. Cet inconvénient est signalé par de nombreux auteurs tels que M. NARITA, K. ISHIKAWA, J.Y. CHEN et Y. KIM, Int. J.Peptide Protein Res., 24, 580 (1984). E. GROSS and J. MEIENHOFER, The Peptides; Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, 1, 45, (1979). M. MUTTER et E. BAYER, The Peptides; Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, 2, 288 (1980). FUHRHOP and PENZCIN, Organic Synthesis, Verlag Chemie, 4.1.2. Peptides, 219 (1984). a) La productivité par unité de volume est en particulier très faible lorsque l'on utilise des solvants non miscibles à l'eau tels que le chloroforme ou l'acétate d'éthyle A titre d'exemple le nitro 4 benzyl ester de la N-(Nitro-2 phénylsulfényl)-a benzyl-phénylalanyl-N X nitro-L-arginine est synthétisé à raison de 0,016 mole par litre au sein du chloroforme : E. Wünsch, Methoden der Organischem Chemie, XV-2, Synthèse von Peptiden, Georg Thieme Verlag, 108 (1974). Pour sa part, l'ester méthylique de la benzyloxycarbonyl-L-prolyl-L-tyrosine a été préparé à la concentration de 0,050 mole par litre au sein de l'acétate d'éthyle : M. BODANSKY, A. BODANSKY, the practice of peptide synthesis, springer-verlag, 140, 1984. Les solvants miscibles à l'eau présentent des inconvénients spécifiques et ne sont guère plus avantageux. En effet, s'ils permettent parfois de faire la synthèse des peptides en milieu plus concentré, ils en interdisent la purification directe par lavage à l'eau, lequel est nécessaire pour éliminer les réactifs introduits en excès et les produits de la réaction de couplage. De ce fait, les solvants miscibles à l'eau sont habituellement distillés puis remplacés par des solvants non miscibles à l'eau, afin de procéder aux lavages. On revient donc au problème précédent car l'étape de purification nécessite des volumes de solvant très importants, cependant que le traitement de la masse réactionnelle a été rendu plus complexe par l'introduction des opérations supplémentaires de distillation et de redissolution. Ainsi, le dipeptide Z-Cys(S-BZl)-Tyr OEt préparé dans le THF (2 mole/litre) a été tranféré dans l'acétate d'éthyle (0,1 mole/litre) avant d'être lavé à I 'eau. M. BODANSKY, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, 129, 1984. Le dipeptide protégé Z-Lys(Z)-Gly-OEt synthétisé dans l'acétonitrile (0,13 mole/litre) a été purifié après remplacement du solvant initial par de l'acétate d'éthyle (0,05 mole/litre, Ibid 150, 1984) tandis que Z-Ala-Tyr OCH3 a été préparé dans le diméthylformamide (0,3 mole/litre) avant d'être purifié, par lavage à l'eau, en solution dans l'acétate d'éthyle (0,1 mole/litre) (Ibid 148, 1984). L'emploi de ces solvants miscibles à l'eau, qui en général sont polaires, peut amener des inconvénients supplémentaires tant sur le plan de l'hygiène industrielle (DMSO, HMPT), que sur le plan de la sélectivité chimique. D'une manière générale, les solvants polaires favorisent en effet la racémisation de l'acide aminé activé N-protégé, selon la mise au point de D.S. KEMP, Peptides, Analysis, Synthesis, Biology ; I, 354-355, 1979. Ainsi l'obtention de solutions concentrées d'intermédiaires peptidiques dans des solvants organiques non miscibles à l'eau et compatibles avec les normes actuelles de fabrication (Good Manufacturing practices) reste un problème non résolu. C'est pourquoi un des buts de la présente invention est de fournir un milieu réactionnel qui augmente le rendement des condensations peptidiques. Un autre but de la présente invention est de trouver un milieu réactionnel qui permette de faciliter les synthèses et les purifications des peptides, notamment les peptides de 2 à 50 acides aminés en général, et en particulier de 3 à 20 acides aminés, ou amino-acides. Un autre but enfin est de fournir un milieu réactionnel permettant une synthèse peptidique en milieu homogène à des concentrations élevées (par exemple au moins égal à 0,1 en général à 0,2 M. Ces buts et d'autres qui apparaitront par la suite, sont atteints par un milieu réactionnel et solubilisant pour la synthèse et/ou la purification peptidique qui comporte un diluant A choisi dans le groupe des solvants non miscibles à l'eau et un phénol B. La quantité de phénol B est de préférence d'au moins 1/200 du diluant A. Il n'existe pas de limite supérieure stricte. Ainsi, l'utilisation de phénol B (produit pur ou mélange) sans diluant A, fait partie de l'invention dans la mesure où les conditions suivantes sont remplies - Le point de fusion du phénol B est au plus égal à 50 'C (dans la présente description les zéros ne sont pas des chiffres significatifs sauf si cela est spécifié autrement) - Le phénol B peut être séparé d'avec le produit réactionnel par distillation éventuellement ou pression réduite - Le phénol B n'est pas miscible à l'eau en toute proportion - Le phénol B ne forme pas d'émulsion stable susceptible de géner l'élimination des co-produits par lavage à liteau. Les halogéno phénols avantageusement di-, et de préférence mono chloro, ainsi que les alcoyl phénols légers répondent par exemple à ces contraintes. S'ils peuvent être utilisés seuls, les phénols répondant aux dites contraintes constituent également une des sous-classes particulièrement intéressantes des phénols utilisables en mélange avec les diluants A. Il est toutefois préférable qu'il y ait un diluant A et un phénol B. Avantageusement, le rapport massique entre ledit phénol B et ledit diluant A est compris entre 1/200 et 1, de préférence entre 1/20 et 1/2. Les valeurs ci-dessus exprimées en rapport massique conviennent bien pour le phénol lui-même et pour les phénols dont la masse moléculaire n'est pas d'un ordre de grandeur différent de celui du phénol proprement dit (C6 Hs OH). Pour les phénols de poids moléculaires élevés, la concentration en mole par litre est au moins égal à 5 10 2, avantageusement entre 0,1 et 2 de préférence entre 0,5 et 1,5 M. Lorsque les diluants A et les phénols B ne sont pas miscibles en toute proportion, la limite supérieure de la teneur en phénol(s) est la plus basse des deux limites : celle mentionnée ci-dessus et la limite de solubilité. Par l'expression phénol B, il faut comprendre des phénols ou des mélanges de phénols. Les diluants A sont des solvants organiques suffisamment polaires pour dissoudre au moins 1 % de préférence au moins 2 X en masse du phénol (C6 Hs OH) et sont suffisamment hydrophobe pour n'être pas miscible à l'eau en toute proportion. Il est préférable que l'eau ne puisse dissoudre qu'au plus 10 % de diluant A avantageusement au plus 1 X en masse et ce même en présence du phénol B en tant que tiers solvant. Les diluants A peuvent être des mélanges, y compris des fractions pétrolières. Naturellement, dans les conditions opératoires les diluants A doivent être inertes vis-à-vis des phénols et des réactifs de synthèse peptidique utilisés. Les familles préférées de diluants sont choisis dans le groupe constitué par les dérivés aromatiques, les ethers, les esters et les solvants halogénés A titre de paradigmes de membres de ces familles on peut citer comme dérivés aliphatiques halogénés le dichlorométhane, le dichloro-1,2-éthane, le trichloro-1, 1,1- éthane, comme dérivés aromatiques le toluène et comme dérivés aromatiques halogénés le chlorobenzène, comme esters l'acétate d'éthyle et l'acétate d'isopropyle, comme éthers, l'oxyde de tertiobutyle et de méthyle ainsi que l'anisole. Pour des raisons d'économie industrielle, il est préférable que le diluant A soit distillable sous pression atmosphérique ou sous vide primaire ou secondaire. En général le phénol B est choisi dans le groupe des composés répondant à la formule suivante I. (rien - Ar - O - H (I) dans laquelle - Ar représente un radical aromatique monocyclique, polycyclique, hétérocyclique ou non - Les substituants R1, semblables ou différents, représentent un motif halogène, de préférence fluor, chlore, Brome un groupe -Z-R2, où Z peut être - une simple liaison - un atome d'oxygène ; où R2 représente un atome d'hydrogène, un radical alcoyle ou aryle éventuellement hydroxylés ou mono ou poly halogénés d'au plus 8 atomes de carbone, - où n représente le nombre de substituants et est égal à O ou à un entier au plus égal au nombre de positions substituables sur les noyaux aromatiques et de leurs mélanges. Les groupes alcoyles (tel que défini dans le dictionnaire de la Chimie Duval Presses Scientifiques Internationale PARIS VIe 1959) peuvent notamment être des restes aliphatiques linéaires ou ramifiés d'au plus 6 atomes de carbone ou des restes arylaliphatiques. Le nombre de positions substituables est déterminable aisément à l'aide de règles simples connues de l'homme de métier. Ainsi par exemple quand Ar = phényle s 5 Ar = pyridyle s 4 Ar = naphtyle s 7 Ar = quinolyle s 6 Avantageusement le phénol B a un nombre d'atomes de carbone d'au plus 30 atomes de carbone, de préférence au plus 20 atomes de carbone. Il est souhaitable que les positions vicinales de la fonction phénol soient non substituées ou occupées par des groupes non encombrants. Sont considérés comme encombrants les radicaux reliés aux dites positions vicinales par un carbone tertiaire voire secondaire. Les composés mono cyclique sont ceux qui donnent le meilleur compromis efficacité-coût; on préfère ceux à 6 charnons (noyau pyridinyle ou phényle). Il est également souhaitable que Z-R2 ne puissent signifier plus de trois fois de préférence plus de 2 fois un groupe hydroxyle. Avantageusement, dans la formule I, les radicaux R sont choisis parmi le groupe constitué par - les radicaux méthyles, éthyles, propyles, butyles, - les radicaux trifluorométhyles et pentafluoro éthyle, - les radicaux méthoxy, ethoxy, propyloxy, butyloxy, - phényle, hydroxy phényle, et Ar OH, - les radicaux phényl oxy, hydroxy phényloxy, - atomes de fluor, de chlore et de Brome. Pour ne pas trop alourdir la molécule de phénol, il est souhaitable que dans la formule I n soit au plus égal à 5. Parmi les phénols donnant les meilleurs résultats, il convient de citer - les hydroxy pyridines éventuellement monosubstituées, - les hydroxy quinoleines éventuellement monosubstituées, - les mono halogéno phénols (de préférence mono chloro), - les poly halogéno phénols, (de préférence polyfluoro), - les phénols mono ou disubstitués par des radicaux alkyles de C1 à C4, aloxy de C1 à C4, des perfluoroalkyle de C1 à C2 et le 2, 2 , 2 trifluoro éthyle, - les diphénols, - le phénol au sens étroit, - les naphtols éventuellement mono ou di substitués. Les milieux selon la présente invention permettent de dissoudre un acide aminé éventuellement protégé, et ce à une concentration au moins égale à 0,05 M. L'acide aminé peut être C ou N protégé; dans ce dernier cas, le groupement acide peut être activé sur la fonction acide, par les fonctions acide latérale protégé, les acides aminés peuvent être naturels ou synthétiques. Le milieu selon la présente invention permet également de dissoudre un peptide protégé. Le milieu selon la présente invention permet également de dissoudre des peptides non protégés (HCl, Pro-Gly-NH2; HCl, His-Trp; 2HCL, Arg-Pro) et faire la synthèse. Du fait que le milieu selon la présente invention solubilise à la fois acides aminés, peptides et réactifs de blocage ou d'activation, il permet de réaliser "in situ" les blocages, voire l'activation des acides aminés. Ainsi le milieu selon la présente invention peut jouer un rôle de réactif quand il comporte, outre le phénol B et le diluant A, des acides aminés, peptides, réactifs de blocage et/ou d'activation. Le peptide, y compris l'acide aminé élémentaire, peut être C ou N protégé dans ce dernier cas, le groupement acide peut être activé sur la fonction acide. Bien sûr, les fonctions des acides aminés, autres que les fonctions acide ou amine visées par la synthèse, peuvent être également protégées si nécessaires selon les techniques usuelles en la matière. Le milieu de la présente invention permet d'augmenter notablement la solubilité des peptides en phase organique. I1 permet, en général, de changer l'ordre de grandeur de la solubilité dans le sens favorable, en prenant pour base la solubilité du peptide dans le diluant A organique en l'absence d'additif phénolique. Le milieu permet de réaliser les différentes étapes de la synthèse de peptides dans des conditions permettant un bon rendement volumique. Il augmente en particulier la productivité des étapes de condensation. Parmi les nombreux avantages du milieu selon la présente invention, il convient de souligner que les condensations d'un acide aminé ou d'un peptide N protégé et C activé avec un acide aminé ou un peptide non C protégé, sont très fortement facilitées et accélérées lorsque la réaction a lieu dans ledit milieu. Ceci présente un avantage très appréciable pour la synthèse des oligo peptides (jusqu'à environ vingt chainons, voire cinquante). C'est une des raisons pour lesquelles il convient de faire mention particulière des milieux selon l'invention jouant le rôle de réactif et qui contiennnent comme composants en vue d' une introduction successive ou simultanée a) un diluant A choisi dans le groupe des solvants non miscibles l'eau b) un phénol B c) un oligo peptide de 1 à 50, avantageusement de 1 à 20 acides aminés dont ni le N ni le C terminal n'est protégé. La quantité de phénol B est de préférence d'au moins 1/200 du diluant A. Il n'existe pas de limite supérieure stricte. Avantageusement, le rapport massique entre ledit phénol B et ledit diluant A est compris entre 1/200 et 1, de préférence entre 1/20 et 1/2. Les valeurs ci-dessus exprimées en rapport massique conviennent bien pour le phénol lui-même et pour les phénols dont la masse moléculaire n'est pas d'un ordre de grandeur différent de celui du phénol proprement dit (C6 Hs OH). Pour les phénols de poids moléculaires élevés, la concentration en mole par litre est au moins égale à 5-10-2, avantageusement entre 0,1 et 2 de préférence entre 0,5 et 1,5 M. Lorsque les diluants A et les phénols B ne sont pas miscibles en toute proportion, la limite supérieure de la teneur en phénol(s) est la plus basse des deux limites : celle mentionnée ci-dessus et la limite de solubilité. La teneur en oligo-peptide, lequel dans la présente acception comprend le cas de l'acide amino non condensé, est avantageusement au moins égal à 102~M de préférence 0,1 M. La concentration supérieure correspond à la limite de solubilité étant bien entendu que l'on peut utiliser une suspension d'oligo peptide si sa solubilité dans le milieu est jugée insuffisante par l'homme de métier. La présente invention vise également un procédé de synthèse de peptides éventuellement protégés en milieu liquide, où l'on part d'un peptide ou d'un amino acide initial, protégé éventuellement sur sa fonction acide et en ce que l'on ajoute un aminoacide activé sur la fonction acide et protégé sur la fonction amine, dans lequel les réactifs sont dissous dans le milieu selon l'invention. De la même manière, la présente invention vise aussi un procédé de synthèse de peptides éventuellement protégés en milieu liquide, où l'on part d'un amino acide ou peptide initial, solubilisé selon l'invention et que l'on condense un autre peptide ayant sa fonction acide C terminale activée et sa fonction amine N-terminale protégée, dans lequel les réactifs sont dissous dans un milieu selon l'invention. Par exemple la fonction amine est protégée par un groupe carbamate ou par réaction avec un composé bétadicarbonylé. Avantageusement, la fonction acide des réactifs N-protégés est activée par un chlorure d'acide organique ou minéral, par un chloroformiate d'alkyle, par un carbodiimide ou par un ester activé par leur carbonyl di imidazole, ou par un acyle imidazole. Après condensation d'un amino-acide ou d'un peptide -N protégé avec le peptide ou l'amine acide initial, la fonction amine -N-terminale est libérée par toute méthode, et, avantageusement par hydrogénolyse ou par solvolyse acide ou basique ou par photolyse. L'amino-acide ou le peptide C-terminal protégé (de préférence par esteri fi cati on ou par amidation) initial est , en général introduit dans le milieu réactionnel, puis l'acide aminé ou le peptide activé sur sa fonction acide et protégé sur sa fonction amine est ajouté, l'ordre d'addition des réactifs étant indifférent, après réaction les co-produits et les excès de réactifs sont éliminés de la phase organique par lavage avec des solutions aqueuses acides, basiques ou neutres, puis la fonction amine est libérée, et enfin un nouvel acide aminé ou un nouveau peptide activé sur sa fonction acide et protégé sur sa fonction amine, est introduit. De manière surprenante, le milieu potientialise la réactivité des peptides avec les acides aminés et améliore significativement la cinétique de la condensation. Un avantage important du procédé est qu'il permet d'éliminer de la phase organique concentrée les réactifs en excès et les co-produits de condensation par simple lavage à l'eau, facilité par l'effet antiémulsionnant des phénols, effet contasté au cours de l'étude qui a mené à la présente invention. Les réactifs en excès sont par exemple des amino acides ou peptides activés et N-protégés, soit des amino-acides ou peptides C-protégés, soit encore des catalyseurs servant à accélerer le couplage tels que l'hydroxy benzotriazole, l'imidazole, le N-hydroxysuccinimide, etc Le milieu selon la présente invention permet également d'augmenter la productivité des étapes de clivage des groupes protecteurs.Il permet en outre, de réaliser aussi bien le clivage des groupes acidosensibles comme par exemple le t-butyloxycarbonyl, au moyen de réactifs courants tels que l'acide trifluoracétique ou l'acide chlorhydrique, que le clivage des groupes hydrogénolysables, comme par exemple le benzyloxycarbonyl, les éthers et esters benzyliques ou le groupe nitro protégeant la fonction guanidino de la chaîne latérale de l'arginine. Ledit milieu permet la coupure des groupes basolabiles tels que le sulfofluorényl-méthyl- oxycarbonyle par des réactifs courants tels la diéthylamine ou la pipéridine. Il permet aussi la coupure des groupes protecteurs photolysables. Il permet également la coupure des groupes protecteurs par réduction électrochimique. Un avantage important du procédé est, en phase homogène, qu'il permette l'élimination des catalyseurs des étapes de clivage par des opérations simples : les catalyseurs acides ou basiques, peuvent être éliminés par lavage aqueux tandis que les catalyseurs d'hydrogénolyse tels que le palladium absorbé sur charbon sont éliminables par filtration ; le peptide ou intermédiaire peptidique restant en solution organique concentrée. Un autre avantage du procédé de solubilisation est qu'il est compatible avec toutes les opérations nécessaires à la synthèse des peptides et qu'il permet un enchaînement direct entre les différentes étapes de condensation, de clivage de groupes protecteurs et de purification par lavage à l'eau sans changement de solvant, et éventuellement sans isolement du peptide. Il permet donc la synthèse répétitive de peptides. Du fait de la répétitivité de la synthèse, le procédé de la présente invention peut être avantageusement mis en oeuvre sous une forme automatisée. Le procédé est particulièrement intéressant pour la synthèse de peptides peu solubles dans les solvants organiques tels que les peptides renfermant des résidus glycyle, arginyle, glutaminyle, asparaginyle, serinyle, thréonyle et prolinyl. En ce qui concerne les paramètres non visés par la présente description, le procédé selon la présente invention est réalisé dans des conditions usuelles. Les peptides issus de la synthèse peuvent être utilisés éventuellement pour la synthèse de médicaments, vaccins, produits agroalimentaires ou phytosanitaires. La présente invention est illustrée par des exemples non limitatifs suivants. Protocole des essais de solubilisation Les solubilités de l'intermédiaire peptidique ont été déterminées comme suite à la température de 25 'C. Une quantité pesée exactement de l'intermédiaire peptidique est placée dans un tube en pyrex. Le solvant ou mélange de solvants à l'essai est alors introduit à l'aide d'une pipette de précision de façon à obtenir un rapport masse de peptide/volume de solvant égal à 8g/100cm3. Le tube fermé par un bouchon à vis est alors placé sur un agitateur de marque HEIDOLPH, modèle TOP-MIX, vibrant à sa vitesse maximale durant 60 secondes. Dans le cas où le solide est entièrement dissous, la solubilité est notée > 8g/100cm3, sinon le volume de solvant est doublé et le processus recommencé. A l'issue de 4 dilutions successives sans dissolution totale, les mesures sont reprises sur une quantité plus faible de solide. Lorsque la solubilité dans un solvant donné a été trouvée inférieure à 0,05g/100cm3, il a été en outre vérifié que le chauffage à 40'C et une agitation supplémentaire de 4 minutes ne changent pas le résultat. Remarques : . la composition des mélanges solvant/additif est exprimée pondérabl ement. SOLUBILISATION DE DIFFERENTS PEPTIDES EXEMPLE 1 : Chlorhydrate de l'ester méthylique de la L-serinyl-L-tyrosine. (HCl, Ser-Tyr-OCH3) RESULTATS Solubilité dans le dichlorométhane : S Solubilité dans le mélange dichlorométhane/phénol ; 4/1 : 8 > s > 4g/100cm3 Exemple 2 : Trifluoracétate de l'ester méthylique de la L-tryptophanyl-L-serinyl-L-tyrosine (CF3 COOH, Trp-Ser-Tyr-OCH3): Les solubilités mesurées comme dans l'exemple 1 sont les suivantes . dans le dichlorométhane : s . dans le mélange dichlorométhane/phénol ; 4/1 : 8 > s > 4g/100cm3. Exemple 3 : Ester méthylique de la L-tryptophanyl -L-serinyl -L-tyrosi ne (Trp-Ser-Tyr-OCH3) : Solubilités mesurées comme dans l'exemple 1 dans le dichlorométhane : 8g/100cm3 . dichlorométhane/t-butyl-4-phénol ; 4/1 : s > 8g/100cm3 . dichlorométhane/diméthoxy-2,6-phénol ; 4/1 : s > 8g/100cm3 . dichlorométhane/diméthyl-2,6-phénol ; 4/1 : s > 8g/100cm3 . dichlorométhane/dichloro-2,6-phénol ; 4/1 : s > 8g/100cm3 . dichlorométhane/hydroxy-2-pyridine ; 5/1 : s > 8g/100cm3 dichlorométhane/méthoxy-2 phénol ; 4/1 : s > 16g/100 cm3 dichlorométhane/trifluorométhyl-3-phénol ; 4/1 : s > 8g/100cm3 . dichlorométhane/pentafluoro-2,3,4,5,6 phénol ; 4/1 : s > 8g/100cm3 . acétate d'éthyle : s Exemple 4 : Chlorhydrate du -L-histidinyl-L-tryptophane (HCl, His,Trp) : Solubilités mesurées comme dans l'exemple 1. . dichlorométhane : s Solubilités mesurées comme dans l'exemple 1 . dichlorométhane : s s > 4g/100cm3 . dichlorométhane/méthoxy-4-phénol ; 4/1 : 2 > s > 1g/100cm3 . dichlorométhane/hydroxy-2-pyridine ; 5/1 : s 5 0,3g/100cm3 . dichlorométhane/trilfuorométhyl-3-phénol ; 4/1 : 8 > s > 4g/100cm3 . chloro-2-phénol : 8 > s > 4g/100cm3 . pentafluorophénol/dichlorométhane ; 1/4 : 8 > s > 4g/100cm3 Exemple 6 :Dichlorhydrate de la -L-arginyl-L-proline ( 2 HCl, Arg-Pro) Solubilités mesurées comme dans l'exemple 1 . dichlorométhane : s s > lg/100cm3 ExemDle 7 : Chlorhydrate du L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamide (HCl, Leu-Arg-Pro-Gly-NH2) Solubilités mesurées comme dans l'exemple 1 . dichlorométhane : s s > 1g/100cm3 . dichlorométhane/pentafluoro-2,3,4,5,6-phénol ; 4/1 : 4 > s > 2g/100cm3 . chloro-2-phénol : 4 > s > 2g/100cm3 . dichlorométhane/tertiobutyl-4-phénol ; 4/1 : 1 > s > 0,5g/100cm3 .dichlorométhane/hydroxy-2-pyridine ; 5/1 : s = 1 g/100cm3 A titre comparatif,le diméthylformamide, additif qui ne fait pas partie de l'invention, a été essayé .dichlorométhane/diméthylformamide ; 4/1 : s Exemple 8 : Chlorhydrate du L-prolyl-glycinamide (HCl, Pro-Gly-NH2). Solubilités mesurées comme dans l'exemple 1 . dichlorométhane : s 16g/100cm3 .dichlorométhane/méthoxy-4-phénol ; 4/I : 8 > s > 4g/100cm3 . dichlorométhane/chloro-2-phénol ; 2/1 : 2 > s > lg/100cm3 . dichlorométhane/hydroxy-2-pyridine ; 5/1 : 4 > s > 2g/100cm3 A titre comparatif le diméthyl formamide, additif qui ne fait pas partie de l'invention a été essayé . dichlorométhane/diméthylformamide ; 4/1 : s Exemole 9 : N-#-Trifluoracétyl-L-Lysyl-L-proline (Lys (TFA)- Pro) Solubilités mesurées comme dans l'exemple 1 : . dichlorométhane : s 20 g/100cm3 . dichlorométhane/tertiobutyl-4-phénol ; 4/1 : s > 8 g/100cm3 . dichlorométhane/diméthoxy-2,6-phénol ; 4/1 : s > 8 g/100cm3 . dichlorométhane/diméthyl-2,6-phénol ; 4/1 : s = 8 g/100cm3 . dichlorométhane/hydroxy-2-pyridine ; 5/1 : s > 8 g/100cm3 .dichlorométhane/dichloro-2,6-phénol ; 4/1 : s > 8 g/100cm3 . dichlorométhane/méthoxy-2-phénol ; 4/1 : s > 8 g/100cm3 . dichlorométhane/trifluorométhyl-3-phénol ; 4/1 : s > 8 g/100cm3 . dichlorométhane/chloro-2-phénol ; 4/1 : s > 8 g/100cm3 . dichlorométhane/pentafluoro-2,3,4,5,6-phénol ; 4/1 : s > 8,g/100cm3 acétate d'éthyle/phénol ; 9/1 : s = 8 g/100cm3 Exemple 10 :Ester méthylique de la N-tertiobutyloxycarbonyl-pentaglycine (Boc-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-OCH3) : ( Boc gly5 OCH3) La solubilité dans le dichlorométhane a été mesurée par HPLC, avec étalonnage externe, sur une solution saturée de Boc-Gly5-OCH3. Les autres solubilités ont été mesurées comme dans l'exemple 1. . dichlorométhane : s = 0,33 g/100cm3 . dichlorométhane/phénol ; 20/1 : s = 0,5 g/100cm3 . dichlorométhane/phénol ; 4/1 : s = 4 g/100cm3 . anisole : s 8 g/100cm3 . dichlorométhane/chloro-2-phénol ; 4/1 : 2 > s > 1 g/100cm3 . dichlorométhane/méthoxy-4-phénol ; 4/1 : 4 > s > 2 g/100cm3 ExemDle 11 :Ester benzylique de la N-tertiobutyloxycarbonyl-pentaglycine (Boc-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-O-CH2-Ph) La solubilité dans le dichlorométhane a été mesurée par HPLC par étalonnage externe sur le surnageant d'une solution saturée ; les autres solubilités ont été mesurées comme dans l'exemple 1 . dichlorométhane : s = 0,07 g/100cm3 dichlorométhane:phénol ; 9/1 : s > 5 g/100cm3 A titre comparatif des additifs ne faisant pas partie de l'invention, ont été essayés . dichlorométhane/trifluoroéthanol ; 9/1 : s Exemple 12 : Ester méthylique de l'acide N-benzyloxy-carbonyl-B benzyl -L-aspartyl -ami no-1-cycl opropane-carboxyl ique (Z-Asp-(OBzl)- Acc-OCH3) Solubilités mesurées comme dans l'exemple 1 . oxyde de méthyle et de tert. butyle : s : > 1,2 g/100cm3 . chlorobenzène : s 20 g/I00cm3 . anisole : s > 2,5 g/100cm3 . anisole/tert.butyl-4-phénol ; 4/1 : s > 25 g/100cm3 . acétate d'éthyle : s = 2,5 g/100cm3 acétate d'éthyle/hydroxy-2 pyridine (solution saturée) 10 > s > 5g/100cm3 SYNTHESE DE PEPTIDES Exemple 13 :Ester propylique de l'acide L-aspartyl-amino-I-cyclopropane-carboxylique (Asp-Acc-Opr). Remarque : ce dipeptide ester est un édulcorant présentant un pouvoir sucrant environ 200 fois supérieur à celui du saccharose selon C. MAPELLI, M. GARY NEWTON, C.E. RINGOLD et C.H. STAMMER, Int. J.Peptide Protein Res. 30, 498-510 (1987). Retape 1 : Condensation à la concentration de 0,66 mole/litre de CH2 CL2 (soit 320 g). Dans un réacteur tri col en pyrex de 100cm3, refroidi par un bain d'eau à 17'C et inerté par un courant d'azote sec, sont chargés successivement, sur un pied d'anisole (37,5cm3) agité, les solides suivants L'acide N-benzyloxycarbonyle-B benzyl-aspartique (25 moles), Le N-éthyl-N'-(diméthylamino-3 propyl) carbodiimide chlorhydrate de (30 mmoles) et l'hydroxypyridine (42,5 mmoles). La suspension se fluidifie rapidement et conduit à une solution à laquelle sont ajoutés tour à tour au bout de 15 minutes L'amino-1-cyclopropane carboxylate de propyle (30 mmoles) et le tertiobutyl-4-phénol (5g). Après une nuit sous agitation, le mélange réactionnel est lavé à 30'C par 25 cm3 d'acide chlorhydrique 2N puis à 3 reprises par 13 cm3 d'une solution aqueuse constituée de 10 cm3 d'eau déminéralisée et de 3 cm3 de saumure saturée en NacL. Les phases aqueuses réunies sont contre-extraites par 2,5 cm3 d'anisole. EtaDe 2 : Hydrogénolyse des groupes protecteurs enchaînée avec l'étape de condensation. La phase organique (40 cm3 est transférée dans un réacteur en pyrex tri col de 200 cm3 contenant 100 cm3 d'eau distillée et 2,8 g de palladium à 3 % sur carbone, préalablement inerte sous azote. Le mélange porté à 55'C est placé à pression ambiante sous courant d'hydrogène durant 4 heures. Retape 3 : Isolement du peptide Le mélange réactionnel est filtré sur millipore 5 A, le catalyseur est lavé sur le filtre par 10 cm3 d'eau à 35'C à 2 reprises. La phase organique est décantée et écartée. La phase aqueuse est lavée par 30 cm3 d'acétate d'éthyle à 3 reprises puis concentrée par distillation sous vide jusqu'à une masse résiduelle de 60 g. Il se produit spontanément une cristallisation. La suspension, additionnée de 240 cm3 d'acétone est filtrée sur verre frité de porosite n 4. Le solide lavé à l'acétone et séché à poids constant pèse 4,41 g. Le filtrat concentré à sec est dissous dans 11 cm3 d'eau. L'addition d'acétone (66 cm3) permet d'isoler un second lot de solide pesant après séchage sous vide 1,52 g. Résultats L'ester propyl ique de 1 'acide L-aspartyl -amino-l-cycl oprane-carboxy'li que monohydraté, ainsi obtenu avec un rendement de 86 X, est un solide blanc fondant à 179'C. Son spectre RMN 1H enregistré à 360 Mhz en solution dans le DMSO est conforme. Analyse élémentaire : C 11, H 18, N 2, 05, 1H20 Calculé : C 47,83 ; H 7,3 ; N 10,14 ; 0 34,76 Trouvé: C 47,69 H 7,1 ; N 10,01 ; 0 34,81 Teneur en eau (Karl Fischer) : 6,48 X. Dosage potentiométrique Fonction amine : 102 X Fonction acide : 98 % Exemple 14 A titre de comparaison un essai selon l'exemple 13 dans lequel on omet soit l'addition de tertiobutyl-4 phénol, soit l'addition d'hydroxy-2 pyridine conduit rapidement à un mélange réactionnel inagitable. PURIFICATION DE PEPTIDES PAR EXTRACTION LIOUIDE-LIOUIDE Exemple 15 : Ester benzylique de la glycyl-glycyl-L-phénylalanyl-L-leucine (Gly-Gly-Phe-Leu-OBzl) En vue d'une purification de ce tétrapeptide, par lavage à l'eau à l'issue de sa synthèse, la partition de ce peptide entre le dichlorométhane et l'eau a été étudiée comme suit. Une solution de chlorhydrate de Gly-Gly-Phe-Leu-OBzl (0,9 mmole) dans le dichlorométhane (12 cm3) est agitée fortement en présence d'une solution aqueuse de KHC03 (2 N ; 3 cm3). Ce mélange fournit une émulsion qui reste stable durant plusieurs jours. Un essai comparatif a été réalisé en présence de phénol Exemole 16 Un essai de partition réalisé selon l'exemple 15 après addition de 3,9g de phénol à la solution organique, fournit après une agitation identique deux phases liquides limpides, dont la décantation est totale en moins de 15 minutes. L'analyse HPLC montre que la phase aqueuse renferme seulement 0,4 % du tétrapeptide engagé. Exemple 17 : Ester benzylique de la N-tertiobutyloxycarbonyl-L-phénylalanyl-L-valine (Boc-Phe-Val-OBzl). Dans un réacteur en verre pyrex de 50 cm3 sont introduits successivement à température ambiante 1 'ester hydroxy-2 pyridinique de la N-tert. butyloxycarbonyl -L-phénylal anine (3,6 mmoles ; 1,23 g) Le chlorhydrate de l'ester benzylique de la Valine (3 mmoles ; 0,73g) Le dichlorométhane (15 cm3) puis sous agitation la N-méthyl morpholine (3 mmoles). Après 68 heures à température ambiante le mélange réactionnel est lavé successivement par 5 cm3 d'acide sulfurique dilué (95p pH2), par 5 cm3 d'eau, puis par 5 cm3 de KHCO3. 2N en solution dans l'eau. Il se forme alors une émulsion stable. Au contraire, lorsque l'on emploie un mélange dichlorométhane/phénol (9/1) comme solvant de réaction, tous les lavages se déroulent sans difficulté et les décantations sont rapides. EXEMPLE 18 Suiet : Etude de l'influence du phénol au cours d'un couplage peptidique. Couplage étudié Boc-Phe-O-Py + HCl, Val-OBzl + NMM CH2 Cl2 (avec ou sans phénol) Boc-Phe-Val OBzl + HCl, NMM Mode oDératoire Le couplage a été réalisé en mettant en contact dans du chlorure de méthylène à reflux, d'une part 1,2 équivalent d'ester hydroxy 2 pyridinique de N ter butyloxy L phénylalanine (Boc-Phe-OPy) et du chlorhydrate d'ester benzylique de la valine (Val OBzl) un équivalent en présence de N méthyl morpholine (NMM). On a mesuré la disparition de Val OBzl et l'apparition dudit peptide. La corrélation est parfaite aux indéterminations de mesures près. Les résultats sont rassemblés dans le tableau suivant, dans lequel on fait apparaître le rendement de peptide et, ce qui est beaucoup plus significatif des problèmes d'activation et de cinétique, le Val OBzl résiduel. Deux types d'essais ont été réalisés en milieu parfaitement homogène, d'une part avec du phénol C6 H50H dans du chlorure de méthylène (10 % en masse de phénol), et d'autre part sans phénol. Les résultats montrent une différence de cinétique extrêmement significative, puisqu'on obtient 90 X du dit peptide en 2 heures dans le chlorure de méthylène seul, et en 20 minutes dans le mélange chlorure de méthylène phénol 10 % en masse. RESULTATS : Dans le tableau est précisé le rendement de couplage ainsi que le pourcentage de Val OBzl au cours du temps. @ TEMPS # TEMPS I 10 mn # 30 mn # I heure # 2 2 h 30 Rendement sans #OH 56% 80% 86% 95% de Couplage avec #OH 78% 93% 96% 99% Val OBzl sans #OH 44% 20% 14% 5% Résiduel I # avec OH I I I I 22% 7% 4% 1% Exemple 19 Influence de l'ortho-crésol sur la cinétique d'un couplage peptidique. RECTION CH2C12 BocPheOSu + LeuOH + DIPEA ------- BocPheLeuOH + HOSu, DIPEA 1,2 éq 1 éq léq avec ou sans o.crésol 7,2 éq Mode opératoire Le couplage a été réalisé en mettant en contact dans le chlorure de méthylène à température ambiante, d'une part 1,2 équivalent d'ester d'hydroxysuccinimide de N-tert-butyloxycarbonyl -L-phénylal anine (BocPheOSU) et 1 équivalent de leucine libre (LeuOH) en présence de 1 équivalent de dii sopropyl éthyl ami ne (DIPEA). Deux types d'essais ont été réalisés en milieu hétérogène (la leucine est insoluble), d'une part avec 7,2 équivalents d'orthocrésol et d'autre part sans ortho-crésol. On a mesuré l'apparition du peptide formé BocPheLeuOH. SOLVANT Rendement de BocPheLeuOH/Leucine 1 h 2 h # CH2Cl2 9 9 % 17 X I CH2Cl2/o.crésol 57% 72% Les résultats montrent une influence importante de l'orthocrésol sur la cinétique de couplage. On multiplie par six la formation de dipeptide en 1 heure de réaction en présence d'ortho-crésol. REVENDICATIONS 1) Milieu réactionnel et solubilisant pour la synthèse et/ou la purification peptidique caractérisé par le fait qu'il comporte avantageusement un diluant A choisi dans le groupe des solvants non miscibles à l'eau et un phénol B. 2) Milieu selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le rapport massique entre ledit phénol B et ledit diluant A est compris entre 1/200 et 1 de préférence entre 1/20 et 1/2. 3) Milieu selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que ledit diluant est choisi dans le groupe constitué par les aromatiques, les ethers, les esters et les solvants halogénés. 4) Milieu selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé par le fait que ledit phénol est choisi dans le groupe des composés répondant à la formule générale suivante I. (Rl)n - Ar - O - H (I) dans laquelle : - Ar représente un radical aromatique monocyclique, polycyclique, hétérocyclique ou non - Les substituants R1, semblables ou différents, représentent - un motif halogène, de préférence fluor, chlore, Brôme - un groupe -Z-R2, où Z peut être - une simple liaison; - un atome d'oxygène; où R2 représente un atome d'hydrogène, un radical alcoyle ou aryle éventuellement hydroxylés ou mono ou poly halogénés d'au plus 8 atomes de carbone, -n représente le nombre de substituants et est égal à O ou à un entier au plus égal au nombre de positions substituables sur les noyaux aromatiques et de leurs mélanges 5) Milieu selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé par le fait que ledit phénol B a un nombre d'atomes de carbone d'au plus 30 atomes de carbone de préférence au plus 20 atomes de carbone. 6) Milieu selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé par le fait que les positions vicinales de la fonction phénol sont non substituées ou occupés par des groupes non encombrants. 7) Milieu selon l'une des revendications 4 à 6 caractérisé par le fait que le radical -Ar est un aromatique monocyclique ayant de préférence 6 charnons. 8) Milieu selon l'une des revendications 4 à 7 caractérisé par le fait que dans la formule I, les radicaux R sont choisis parmi le groupe constitué par - les radicaux méthyles, éthyles, propyles, butyles, - les radicaux trifluorométhyles et pentafluorométhyle, - les radicaux méthoxy, ethoxy, propyloxy, butyloxy, - phényle, hydroxy phényle, et Ar OH, - les radicaux phényl oxy, hydroxy phényloxy, - atomes de fluor, de chlore et de Brôme. 9) Milieu selon l'une des revendications 4 à 8 caractérisé par le fait que dans la formule I n est au plus égal à 5. 10) Milieu selon l'une des revendications 1 à 6, 8 et 9 caractérisé par le fait que ledit phénol A est choisi dans le groupe constitué par les - hydroxy pyridines éventuellement monosubstituées, - hydroxy quinoleines éventuellement monosubstituées, - les mono halogéno phénols (de préférence mono chloro), - les poly halogéno phénols, (de préférence polyfluoro), - les phénols mono ou di substitués par des radicaux alkyles de C1 à C4, alkoxy de CI à C4, des perfluoroalkyle de C1 à C2 et le 2,2,2, trifluoro éthyle, - les phénols, - le phénol au sens étroit, - les naphtoles éventuellement mono ou di substitués. 11) Milieu selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé par le fait qu'il comporte en outre un peptide avantageusement de 1 à 50 chaînons, un acide C protégé. 12) Milieu selon la revendication 11 caractérisé par le fait que ledit peptide est C protégé. 13) Milieu selon la revendication 11 caractérisé par le fait que ledit peptide aminé est N protégé. 14) Milieu selon la revendication 13 caractérisé par le fait que ledit peptide aminé est activé sur la fonction acide. 15) Milieu selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé par le fait qu'il comporte en outre un peptide dont ni le C ni le N terminal n'est protégé. 16) Milieu selon la revendication 15 caractérisé par le fait que la concentration en ledit peptide est au moins égale à 10peptide est C protégé. 17) Milieu selon la revendication 15 caractérisé par le fait que le dit peptide est un acide amino, de préférence naturel. 18) Procédé de synthèse de peptides éventuellement protégés en milieu liquide, ou l'on part d'un peptide ou d'un amino acide initial, dont ni le C ni le N terminal n'est protégé sur sa fonction acide et en ce que l'on ajoute un aminoacide activé sur la fonction acide et protégé sur la fonction amine, caractérisé par le fait que les réactifs sont dissous dans le milieu selon l'une des revendications 1 à 10. 19) Procédé de synthèse de Peptides éventuellement protégés en milieu liquide, où l'on part d'un peptide ou d'un amino acide initial, protégé sur sa fonction acide et en ce que l'on ajoute un aminoacide activé sur la fonction acide et protégé sur la fonction amine, caractérisé par le fait que les réactifs sont dissous dans le milieu selon l'une des revendications 1 à 10. 20) Procédé de synthèse de Peptides éventuellement protégés en milieu liquide où l'on part d'un amino acide ou peptide initial, solubilisé selon la revendication 1 et que l'on condense un autre peptide ayant sa fonction acide C terminale activée et sa fonction amine N-terminale protégée, caractérisé par le fait que les réactifs sont dissous dan un milieu selon l'une des revendications 1 à 10. 21) Procédé selon l'une quelconque des revendications 18, 19 et 20 caractérisé par le fait que la fonction amine est protégée par un groupe carbamate ou par réaction avec un composé bétadicarbonylé. 22) Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, caractérisé en ce que la fonction acide C-Terminale du peptide ou de l'amino acide initial est protégée de préférence par estérification ou par amidation. 23) Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, caractérisé en ce que la fonction acide des réactifs N-protégés est activée par un chlorure d'acide organique ou minéral, par un chloroformiate d'alkyle, par un carbodiimide ou par un ester activé ou par un acyle imidazole. 24) Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, caractérisé en ce qu'après condensation d'un amino acide ou d'un peptide-N protégé avec le peptide ou l'amino acide initial, la fonction amine-N-terminale est libérée par hydrogénolyse ou par acidolyse ou par basolyse. 25) Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 24 caractérisé en ce que l'amino-acide ou le peptide C-terminal protégé ou non protégé est introduit dans le milieu réactionnel, puis l'acide aminé ou le peptide activé sur sa fonction acide et protégé sur sa fonction amine est ajouté, l'ordre d'addition des réactifs étant indifférents. Après réaction, les co-produits et les excès de réactifs sont éliminés de la phase organique par lavage avec des solutions aqueuses acides, basiques ou neutres, puis la fonction amine est libérée et enfin un nouvel acide aminé ou un nouveau peptide activé sur sa fonction acide et protégé sur sa fonction amine, est introduit.