FR 2666094 A1 19920228 FR 9010558 A 19900822 La présente invention concerne une bouteille de culture en masse de cellules, en particulier de cellules mammaliennes, comportant un récipient sensiblement cylindrique et transparent destiné à être monté horizontalement et à rotation autour de son axe principal et présentant sur sa paroi une surface interne susceptible de servir de surface d'ancrage aux cellules à cultiver. La culture en masse de cellules mammaliennes permet la production de substances issues de la biotechnologie et/ou du génie génétique, utiles à la production de vaccins, de nouveaux médicaments, etc... Certaines de ces substances ne peuvent actuellement être produites que par cette voie. Les procédés de fabrication impliquent, le plus souvent, la culture de grandes quantités de cellules dans un environnement très strict et bien défini, formé d'un support et d'un milieu nutritif, assurant la croissance et la différenciation cellulaire. On utilise couramment à cet effet des bouteilles du type ciavant, dont le récipient a un diamètre d'environ 11 cm et une longueur de 25 à 30 cm, soit un volume total d'environ 2 litres. Les cellules croissent sur la surface interne du récipient, soit sur une surface utile d'environ 850 cm2, dans un volume de milieu nutritif liquide d'environ 250 ml, c'est a-dire avec un rapport proche de 0.3 ml de milieu par cm2 de surface utile, qui a été déterminé expérimentalement comme donnant le meilleur rendement. Après inoculation des cellules et addition du milieu nutritif, la bouteille est placée sur un dispositif qui assure sa rotation lente autour de son axe principal horizontal; dans ces conditions, les cellules qui se sont ancrées à la paroi de la bouteille sont exposées alternativement au milieu nutritif et à l'air et reçoivent un apport correct en nutriments et en oxygène. La production en masse requiert de très nombreuses bouteilles puisque, à titre indicatif, une bouteille peut contenir entre 100 et 200 millions de cellules pouvant secréter entre 1 et 10 mg de protéines lors d'une production en batch", c'est-àdire une production discontinue par lots, sur une période de 5 à 8 jours. Compte tenu du volume occupé par chaque bouteille et par les mécanismes associés destinés à l'entrainer en rotation, le rapport volume occupé/surface utile de culture est assez médiocre et les installations de production en masse occupent des volumes considérables. On a récemment développé des dispositifs qui permettent une augmentation de la surface utile à la culture cellulaire sur la paroi interne de la bouteille, sans changer le volume total de la bouteille; seul le volume de milieu nutritif est augmenté proportionellement à l'augmentation de la surface utile de culture pour maintenir un rapport proche du rapport optimal de 0.3 ml de milieu par cm2. Les principales modifications connues à l'heure actuelle portent sur l'utilisation d'une paroi ondulée, permettant ainsi d'augmenter la surface intérieure utile dans un rapport d'environ 1.3 à 2. La géométrie précise de la paroi est cependant critique, afin d'éviter de créer des forces de cisaillement trop importantes à l'interface milieu nutritif/paroi, vu la très grande fragilité des cellules mammaliennes qui y sont accrochées.Les résultats obtenus avec de telles bouteilles sont cependant décevants car l'augmentation de la productivité n'est pas proportionnelle à l'augmentation de la surface utile à la culture. Le but de la présente invention est de réaliser une bouteille de culture grâce à laquelle l'augmentation de productivité soit effectivement au moins proportionnelle à l'augmentation de la surface utile offerte à la culture. Conformément à l'invention, ce but est atteint dans une bouteille du type mentionné au début, par le fait qu'au moins un insert est monté et maintenu en place à l'intérieur du récipient, cet insert étant principalement constitué d'une membrane microporeuse transparente, cette membrane étant maintenue à distance de la paroi interne du récipient et présentant elle-même également une surface susceptible de servir de surface d'ancrage aux cellules à cultiver. De préférence, la membrane a une épaisseur suffisante pour que l'insert soit essentiellement autoportant L'homme de métier aurait éventuellement pu penser à augmenter la surface offerte à la culture en introduisant un ou plusieurs inserts dans le récipient. I1 se serait cependant heurté à plusieurs problèmes. Ainsi, il aurait constaté la nécessité de prévoir un insert transparent. Certains matériaux transparents ne sont pas suffisamment rigides ce qui aurait nécessité de leur adjoindre un support, au détriment du coût de la bouteille. Certains autres matériaux transparents rigides se prêtent mal à la culture de cellules, et d'autres matériaux rigides se prêtant éventuellement à la culture de cellules ne sont pas transparents. Ces problèmes l'auraient dissuadé de mettre en oeuvre ce type de solution. L'invention concerne également un procédé d'assemblage d'une telle bouteille. Selon un premier aspect, ce procédé est caractérisé en ce que l'on utilise un récipient formé de trois pièces: une paroi cylindrique transparente, un flasque de fermeture d'extrémité et un flasque d'extrémité doté d'un goulot , que l'on assemble la paroi cylindrique et le flasque d'extrémité doté du goulot, notamment par soudage aux ultrasons, que l'on roule une membrane et on la fixe le long de ses bords pour lui conférer une forme sensiblement cylindrique, que l'on assemble ladite membrane avec des bagues entretoises , que l'on introduit l'insert ainsi formé par la membrane et ses bagues entretoises concentriquement dans le récipient, puis que l'on fixe sur ce dernier ledit flasque de fermeture d'extrémité, notamment par soudage aux ultrasons. Selon un second aspect ce procédé est caractérisé en ce que l'on forme un récipient cylindrique transparent moulé par soufflage d'une seule pièce et que l'on forme au cours du moulage des reliefs de montage sur le flasque de fermeture d'extrémité du récipient et régulièrement espacés autour de l'axe de celui-ci, que l'on forme au cours du moulage un goulot sur l'autre flasque d'extrémité du récipient, que l'on forme par ailleurs plusieurs inserts par roulage de membranes de façon à leur conférer une forme sensiblement cylindrique et par soudage desdites membranes le long de leurs bords, que l'on monte une bague de support à chaque extrémité de chaque membrane cylindrique, que l'on introduit successivement lesdits inserts dans le récipient par ledit goulot, celui-ci ayant un diamètre légèrement supérieur à celui desdits inserts, que l'on dispose les inserts régulièrement autour de l'axe du récipient et en engagement des bagues de support sur les reliefs de montage du flasque de fermeture d'extrémité, puis que l'on introduit par le goulot une plaque entretoise pour lesdits inserts. Les détails et avantages de l'invention apparaitront plus clairement à la lecture de la description qui va suivre, en se référant aux dessins annexés, dans lesquels: la figure 1 est une vue éclatée montrant les différents composants d'un premier mode de réalisation d'une bouteille de culture selon la présente invention, et la figure 2 est une vue assemblée, avec arrachements partiels, d'un second mode de réalisation. La bouteille de culture illustrée à la figure 1 comprend un récipient cylindrique 10 réalisé en matériau transparent, fermé à une extrémité par un flasque de fermeture ou fond 12 et à l'autre extrémité par un flasque de dessus 14 doté d'un goulot 16, de façon connue en soi. A l'intérieur du récipient 10 est monté un insert 18, constitué principalement d'une membrane 20, transparente également, enroulée et refermée sur elle-même le long d'une ligne de collage ou de soudure 22 de manière à former un cylindre, et d'une épaisseur suffisante pour que l'insert soit essentiellement autoportant. Dans ce mode de réalisation, il est prévu un insert unique disposé coaxialement dans le récipient 10 autour de l'axe XX de celui-ci et d'une longueur sensiblement égale à celle du récipient. La membrane 20 présente elle-même également une surface susceptible de servir de surface d'ancrage aux cellules à cultiver, par exemple suite à un traitement de surface. La membrane de l'insert 18 est maintenue dans le récipient par des bagues entretoises 24, 26 disposées aux extrémités de l'insert. Comme illustré, une bague entretoise extérieure 24 entoure l'insert à chaque extrémité et porte sur la paroi interne du récipient de façon à maintenir la membrane 20 à une distance sensiblement régulière de cette paroi interne, de préférence une distance permettant une observation au microscope de la surface intérieure de la membrane au travers de la paroi transparente du récipient et de la membrane transparente successivement. Pour des microscopes d'usage courant, cette distance sera de l'ordre de 4 à 5 millimètres. Il est en effet nécessaire d'inspecter régulièrement l'état de la culture cellulaire tant sur le plan macroscopique afin de détecter toute bouteille dont la culture aurait éte contaminée de façon détrimentale, que sur le plan microscopique afin de suivre régulièrement son évolution. En complément, une bague entretoise intérieure 26 est engagée à chaque extrémité de l'insert afin de maintenir, en coopération avec la bague extérieure 24, la forme cylindrique de l'insert 18. Le flasque de fermeture 12 comporte en son centre un relief 28 circulaire en saillie dont le diamètre correspond au diamètre intérieur de la bague entretoise 26, de telle sorte que ce relief forme une portée d'appui et de centrage pour cette bague entretoise. Selon une variante non représentée, lorsque le flasque de fermeture est réalisé par moulage, les bagues entretoises 24, 26 ne forment pas des composants distincts mais sont constituées par des reliefs venus de moulage avec le flasque, comme il apparaitra clairement à l'homme de métier. Une autre variante consiste à prévoir les bagues entretoises 24, 26 d'une seule pièce, avec une rainure de réception de l'extrémité de la membrane. Lors de l'assemblage, on roule tout d'abord la membrane sur elle-même et on la referme par collage ou soudage le long de la ligne 22 ou ses bords se rejoignent. Les deux extrémités de la membrane cylindrique sont alors engagés entre les bagues entretoises 24, 26 et maintenus par serrage, soudage ou collage. Par ailleurs, le flasque de dessus 14 est soudé sur la paroi cylindrique 18 du récipient, par exemple par soudage aux ultra-sons. L'ensemble formé par la membrane 20 et les bagues 24 et 26 est alors introduit dans le récipient par son extrémité gauche si l'on considère la figure, puis le flasque de fermeture ou fond 12 est mis en place et soudé à la paroi cylindrique du récipient 10, également par soudage aux ultra-sons. La membrane 20 est une membrane microporeuse, et de préférence du type dont les pores sont sensiblement droits et traversent la membrane de part en part. Il est alors possible de la réaliser en un matériau transparent au départ et d'une épaisseur suffisante pour que la membrane soit essentiellement autoportante, sa transparence étant conservée du fait que les pores sont d'une densité suffisamment faible. On sait obtenir de tels pores par des procédés dans lesquels on bombarde la membrane au moyen de faisceaux de particules à haute énergie, par exemple tels que produits dans un cyclotron, comme enseigné par exemple dans la demande de brevet PCT WO 87/05850. Des essais avec des membranes en téréphtalate de polyéthylène ou en polycarbonate de bisphénol-A d'une épaisseur comprise entre 30 et 100 micromètres ont donné des résultats satisfaisants. Les pores ont un diamètre compris entre 0.3 et 0.6 micromètres, et de préférence de l'ordre de 0.5 micromètres. En utilisant de telles membranes microporeuses, on a constaté que la productivité de la bouteille de culture augmente de façon supérieure à l'augmentation de la surface utile que représente la surface interne de la membrane 20. Sans que cet effet soit totalement expliqué, il semble que la membrane microporeuse constitue un support tel que les cellules s'y accrochent en s'orientant suivant leur polarisation intrinsèque, comme dans un tissu vivant, étant de plus constaté que les cellules s'accrochent uniquement à la surface intérieure de la membrane. Du fait que les cellules ont en règle générale la forme de bâtonnets allongés polarisés au niveau de leurs petites extrémités, elles s'y accrochent donc par l'une de ces petites extrémités, ce qui permet l'accrochage d'un plus grand nombre de cellules par unité de surface.De plus, les extrémités polarisées des cellules étant précisément les zones par lesquelles s'effectuent les échanges entre la cellule et le milieu nutritif ou l'air, ces échanges peuvent s'effectuer efficacement puisque ces extrémités sont effectivement totalement exposées au milieu nutritif et à l'air tant au niveau de l'extrémité accrochée le long de la membrane microporeuse qu'au niveau de l'extrémité opposée. Des essais conduits avec une bouteille dotée d'un tel insert concentrique, dans laquelle la surface totale offerte aux cellules est supérieure de 60% par rapport à une bouteille dépourvue d'insert ont abouti à une augmentation de productivité de 80%. Sur des surfaces conventionnelles, au contraire, les cellules s'accrochent en s'orientant au hasard et en adoptant une forme plus ramassée que la forme en bâtonnet, ce qui limite le nombre de cellules par unité de surface et réduit l'efficacité de leurs échanges avec le milieu nutritif et avec l'air. En complément, la membrane microporeuse peut avoir subi un traitement de surface physico-chimique pour promouvoir l'accrochage de cellules, comme connu de l'homme de métier. Selon une variante non représentée de ce mode de réalisation, il est prévu au moins deux inserts tels que l'insert 18 décrit ci-avant, disposés concentriquement dans le récipient 10, autour de l'axe XX. Le nombre d'inserts qu'il est ainsi possible de disposer sera limité dans la pratique par la nécessité de pouvoir observer au microscope ou à l'oeil nu chacun d'eux, soit par exemple en prévoyant que les inserts aient des longueurs différentes selon leurs diamètres, soit en ménageant dans les inserts des fenêtres pour observer les inserts intérieurs, ou encore observant par transparence à travers les membranes des inserts successifs pour autant que celà soit possible. Selon la variante illustrée à la figure 2, les inserts 18 sont au nombre de quatre et disposés régulièrement autour de l'axe XX du récipient 10. Ce nombre n'est bien entendu pas limitatif et on comprendra qu'il pourra s'agir de tout nombre entier supérieur ou égal à deux. Le diamètre de chaque insert est tel qu'il subsiste un passage tant entre chaque insert 18, 18' et la paroi du récipient 10 qu'entre deux inserts consécutifs 18, 18'. L'observation au microscope de la surface interne de chaque insert peut s'effectuer dans la zone où l'insert est le plus proche de la paroi du récipient, ce qui suffit dans la pratique. Ce mode de réalisation se prête bien à la production de récipients moulés par soufflage en une seule pièce. Avantageusement, le flasque de fermeture ou fond sera doté au cours de la fabrication de reliefs de montage 31 régulièrement espacés, dans chacun desquels s'engage un tenon d'une bague de support 30 à une extrémité de la membrane cylindrique, le fond 12 lui-même constituant une plaque entretoise pour le maintien en place des inserts. Le diamètre du goulot 16 sera bien entendu légèrement supérieur à celui des inserts puisque ceux-ci ne peuvent être mis en place que par cette voie. Du côté du goulot est également prévue une plaque entretoise 32, dotée d'autant d'échancrures semicirculaires 34 qu'il y a d'inserts 18, également mise en place par le goulot 16. Par ailleurs, les extrémités d'insert opposées au fond 12 sont également pourvues d'une bague de support 33. Dans ce cas les inserts seront plus courts que le récipient 10 puisque leur ensemencement en cellules doit s'effectuer par leur extrémité disposée du côté du goulot 16. Des essais conduits avec une bouteille dotée de quatre inserts et présentant une augmentation de surface de 80t ont abouti à une augmentation de productivité de pratiquement 100%. Dans les deux modes de réalisation il est prévu des passages aux deux extrémités de chaque insert pour permettre l'écoulement du milieu nutritif liquide dans les deux sens entre l'intérieur et l'extérieur de l'insert. Ces passages pourront être avantagement ménagé dans les bagues entretoises 24, 26 et/ou dans les reliefs des flasques du récipient. De tels passages 36 ont été illustrés à la figure 1. REVENDICATIONS 1. Bouteille de culture en masse de cellules, en particulier de cellules mammaliennes, comportant un récipient (10) sensiblement cylindrique et transparent destiné à être monté horizontalement et à rotation autour de son axe principal (XX) et présentant sur sa paroi une surface interne susceptible de servir de surface d'ancrage aux cellules à cultiver, caractérisée en ce qu'au moins un insert (18) est monté et maintenu en place à l'intérieur du récipient (10), cet insert étant essentiellement constitué d'une membrane (20) microporeuse transparente, cette membrane étant maintenue à distance de la paroi interne du récipient et présentant elle-même également une surface susceptible de servir de surface d'ancrage aux cellules à cultiver. 2. Bouteille de culture en masse de cellules selon la revendication 1, caractérisée en ce que la membrane (20) a une épaisseur suffisante pour que l'insert (18) soit essentiellement autoportant 3. Bouteille de culture selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que l'insert (18) est essentiellement cylindrique. 4. Bouteille de culture selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend un insert cylindrique unique (18) disposé sensiblement coaxialement dans le récipient (10). 5. Bouteille de culture selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux inserts cylindriques disposés sensiblement coaxialement dans le récipient. 6. Bouteille de culture selon l'une ou l'autre des revendications 4 et 5, caractérisée en ce que lesdits inserts (18) ont une longueur sensiblement égale a celle dudit récipient (10). 7. Bouteille de culture selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisée en ce que chaque insert cylindrique (18) est maintenu dans ledit récipient par ses extrémités au moyen de bagues entretoises (24, 26). 8. Bouteille de culture selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit récipient comprend un flasque de fermeture d'extrémité (12) et que ledit flasque comporte au moins un relief (28) formant portée d'appui pour une bague entretoise (26). 9. Bouteille de culture selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit récipient comprend un flasque de fermeture d'extrémité (12) et que ledit flasque comporte au moins un relief constituant une bague entretoise. 10. Bouteille de culture selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisée en ce que, le récipient (10) étant réalisé par moulage, ledit relief est venu de moulage avec ledit flasque (12). 11. Bouteille de culture selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux inserts cylindriques (18, 18') disposés sensiblement régulièrement autour de l'axe (XX) du récipient (10). 12. Bouteille de culture selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle comprend quatre inserts. 13. Bouteille de culture selon l'une ou l'autre des revendications 11 et 12, caractérisée en ce que lesdits inserts cylindriques (18, 18') sont maintenus dans ledit récipient (10) par leurs extrémités au moyen de plaques entretoises (32). 14. Bouteille de culture selon la revendication 13, caractérisée en ce que ledit récipient (10) comprend un flasque de fermeture d'extrémité (12) et que ledit flasque comporte au moins un relief (30) constituant une plaque entretoise. 15. Bouteille de culture selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisée en ce que ledit récipient (10) comprend un flasque (14) pourvu d'un goulot d'accès (16) et que ledit goulot d'accès a un diamètre intérieur légèrement supérieur à celui des inserts cylindriques (18, 18'). 16. Bouteille de culture selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisée en ce que lesdits inserts (18, 18') ont une longueur légèrement inférieure à celle du récipient (10). 17. Bouteille de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisée en ce que ladite membrane (20) comporte des pores traversants sensiblement droits et d'une densité suffisamment faible pour conserver sa transparence. 18. Bouteille de culture selon la revendication 17, caractérisée en ce que lesdits pores ont un diamètre compris entre 0.3 et 0.6 micromètres. 19. Bouteille de culture selon l'une ou l'autre des revendications 17 et 18, caractérisée en ce que la membrane (20) est en téréphtalate de polyéthylène ou en polycarbonate de bisphénol-A. 20. Bouteille de culture selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisée en ce que la membrane (20) a une épaisseur comprise entre 30 et 100 micromètres. 21. Bouteille de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisée en ce que ladite membrane (20) a subi un traitement de surface physico-chimique. 22. Bouteille de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, caractérisée en ce qu'une partie au moins de la membrane (20) de chaque insert (18) est située à une distance de la paroi du récipient (10) permettant son observation au microscope depuis l'extérieur du récipient. 23. Procédé d'assemblage d'une bouteille de culture selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisé en ce que l'on utilise un récipient (10) formé de trois pièces: une paroi cylindrique transparente, un flasque de fermeture d'extrémité (12) et un flasque d'extrémité (14) doté d'un goulot (16), que l'on assemble la paroi cylindrique et le flasque d'extrémité doté du goulot, notamment par soudage aux ultrasons, que l'on roule une membrane (20) et on la fixe le long de ses bords (22) pour lui conférer une forme sensiblement cylindrique, que l'on assemble ladite membrane avec des bagues entretoises (24, 26), que l'on introduit l'insert ainsi formé par la membrane et ses bagues entretoises concentriquement dans le récipient, puis que l'on fixe sur ce dernier ledit flasque de fermeture d'extrémité, notamment par soudage aux ultrasons. 24. Procédé d'assemblage d'une bouteille de culture selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, caractérisé en ce que l'on forme un récipient (10) cylindrique transparent moulé par soufflage d'une seule pièce et que l'on forme au cours du moulage des reliefs de montage(31) sur le flasque de fermeture (12) d'extrémité du récipient et régulièrement espacés autour de l'axe (XX) de celui-ci, que l'on forme au cours du moulage un goulot (16) sur l'autre flasque d'extrémité (14) du récipient, que l'on forme par ailleurs plusieurs inserts par roulage de membranes de façon à leur conférer une forme sensiblement cylindrique et par soudage desdites membranes le long de leurs bords, que l'on monte une bague de support (30, 33) a chaque extrémité de chaque membrane cylindrique, que l'on introduit successivement lesdits inserts dans le récipient par ledit goulot, celui-ci ayant un diamètre légèrement supérieur à celui desdits inserts, que l'on dispose les inserts régulièrement autour de l'axe (XX) du récipient et en engagement des bagues de support (30, 33) sur les reliefs de montage (31) du flasque de fermeture d'extrémité (12), puis que l'on introduit par le goulot (16) une plaque entretoise (32) pour lesdits inserts.