FR 2666416 A1 19920306 FR 9010987 A 19900830 APPLICATIGN D'UN ANTICORPS MONOCLONAL DE SOURIS SPECIFIQUE DES GLYCOCONJUGUES COMPORTANT UNE STRUCTURE TERMINALE N ACETYL-LACTOSAMINE A LA CLASSIFICATION, AU DIAGNOSTIC ET AU TRAITEMENT DES LEUCEMIES AIGUES MYELOIDES La présente invention concerne une application nouvelle d'un anticorps monoclonal de souris spécifique des glycoconjugués comportant une structure terminale N-acétyllactosamine à la dassification. au diagnostic et au traitement des leucémies aiguës myéloides, notamment lors des purges de moelle ex-vivo avant une autogreffe. Le diagnostic immunologique des leucémies repose sur la mise en évidence à leur surface de déterminants antigéniques au moyen d'anticorps monoclonaux (MoAlB) utilisés soit en immunofluorescence, directe ou indirecte, soit en technique immuno-cytochimique. De très nombreux anticorps sont actuellement disponibles ; ils sont en général classés en fonction de leur spécificité, en classes de diffenciation (CD).Ces anticorps permettent d'établir une distinction entre leucémie lymphoïde et leucémie myéloïde et de reconnaître le degré de maturité des cellules leucémiques. Drexier et Minowada (Leuk Res. 10 : 279-290, 1986) ont décrit certains anticorps monoclonaux, réagissant avec les antigènes myéloides, qui sont intéressants pour l'identification les leucémies myéîoïdes aiguës (AML). Nombre d'anticorps monoclonaux de souris spécifiques de tissu et spécifiques de tumeur reconnaissent les déterminants carbohydrate tels que MY28 (Spitalnik et al, Blood, 66 : 319 - 326, 1985). Il s'agit d' outils utiles pour le diagnostic et la classification de la leucémie aiguê. Certains de ces anticorps peuvent être également utilisés à titre thérapeutique, soit en étant injectés directement au malade, soit, et surtout, en servant à . purger la moelle en cellules leucémiques résiduelles avant une autogreffe. Bast , De Fabritiis et al. (Cancer Res 1985, 45 : 499-503) ont étudié certains anticorps dirigés contre les antigènes exprimés sur les cellules AML mais non sur les cellules de précurseurs normaux quant a leur capacité de purger les greffes avant transplantation autologue de moelle osseuse. Cette dernière utilisation thérapeutique est assez largement répandue dans les leucémies lymphoblastiques aiguës (ALL) et les Iymphomes malins. Par contre, une telle approche est difficile dans les leucémies myéloblastiques aiguës, du fait que les déterminants reconnus par les anticorps antimyéloïdes sur les cellules leucémiques sont également exprimés sur les progéniteurs normaux. Les seuls anticorps monoclonaux utilisés jusqu'à présent pour des purges de moelle dans la leucémie aiguë myéloTde sont ceux du Cri 5 qui ne reconnaissent que la partie la plus mature des popuiations leucémiques, mais ont l'avantage de ne pas être toxiques pour les cellules normales. Un anticorps du CD33 reconnaissant plus largement les cellules leucémiques a été essayé, mais son utilisation a entrainé des échecs de prise de moelle par toxicité sur les progéniteurs normaux. WW. Young, J. Portoukalian et SI. Hakomori ont décrit, (Journal of Biological Chemistry, 256, 10967-10972, 1981) deux anticorps monoclonaux de souris anticarbohydrate dirigés contre les glycosphingolipides comportant une chaîne Lacto-N-glycosyl type il. Un de ces anticorps, dénommé 1 B2 s'est révélé spécifique des glycolipides ayant une structure terminale N-acétyilactosamine non réductrice (Gal1 4GlcNAcp 1 R), ne réagissant pas avec les glycolipides ayant soit une chaîne type I (Galpt 3GlcNAc ssl R), une structure ganglio-série (Gal(3 1 3GaiNAc (31 R) ou une substitution sialosyl ou fucosyl sur le radical N acétyllactosamine. Cet anticorps reconnait les structures du groupe sanguin ABO. Lors des nombreuses recherches effectuées dans le cadre du diagnostic et de la classification des leucémies. ainsi que des purges de moelle ex-vivo avant une auto-greffe, les inventeurs ont découvert que cet anticorps 1 B2 se fixait sur les cellules de la lignée granulomonocytaire normale et leucémique. il permettait d'identifier les cellules myéloides précoces, les monocytes et les granulocytes à partir d'un stade très peu différencié, mais non les cellules de lignée lympho'lde. La majeure partie des cellules de precurseurs normaux n'étaient pas reconnues. En outre. cet anticorps innibait la prolifération des cellules leucémiques clonogènes ce qui permettait d'envisager des applications intéressantes dans les purges de moelle ex-vivo avant une auto-greffe. L'invention a donc pour objet une application nouvelle de l'anticorps monoclonal de souris 182 anticarbohydrate dirigé contre les gfycosphingolipides comportant une chaîne Lacto""N-glycosyl type Il spécifique des glycolipides ayant une structure terminale N-acétyllactosamine non réductrice (Galss1 4GlcNAc(3 1 R), ne réagissant pas avec les glycolipides ayant soit une chaîne type I (Galss153GlcNAc,B1 R), une structure ganglie série (Gal(31 3GalNAc (31 R) ou une substitution sialosyl ou tucosyl sur le radical N-acétyllactosamine, à la classification et au diagnostic des leucémies, ainsi qu'à l'inhibition de la prolifération des cellules leucémiques clonogènes. L'anticorps monoclonal 182 trouve une application toute particulière dans la classification et le diagnostic des leucémies aiguës myéloïdes, par immunofluorescence directe ou indirecte ou par technique immuno enzymatique. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, il est aussi utilisé dans le cas de purges de moelle ex-vivo avant une autogreffe, par incubation avec du complément humain ou de lapin. Avantageusement, son efficacité est améliorée par combinaison avec un autre anticorps monoclonal, tel que le CD15, couplé à des billes magnétiques ou flottantes. Le clone produisant l'anticorps 182 est obtenu par fusion de lymphocytes spléniques de souris immunisée contre des glycolipides portant la structure N-acétyl-lactosamine avec une lignée myélomateuse de souris. L'anticorps monoclonal 182 est une IgM reconnaissant les structures de groupe sanguin ABO. Le dessin annexé. donné a titre d'exemple, permettra de mieux comprendre t'invention, les caractéristiques qu'elle présente et les avantages qu'elle est susceptible de procurer - fig. 1. 3 et 5 représentent les courbes d'analyse par cytométrie à flux avant traitement à la neuramidase respectivement pour les granulocytes, les monocytes et les lymphocytes ayant réagi avec 182. - fig. 2. 4 et 5 representent les courbes d'analyse par cytometie a flux apres traitement a a neuramidase respectivement pour les granulocytes les monocytes et les lymphocytes ayant reagi avec 182. - fig. 7 represente !'expression du 182 sur les cellules des @@@géniteurs normaux et leucémiques. fig. 8 représente l'inhibition de croissance des cellules due à l'action du 1B2, mesurée en immunofluorescence. MATERIEL ET PROCEDES Des cellules ont été récupérées du sang périphérique et de moelle de donneurs sains. Les leucocytes ont été séparés par centrifugation avec double gradient de densité Ficoll (1,077 et 1,092). Les lignées cellulaires humaines suivantes ont été utilisées : K562, lignée cellulaire de souche myéloide ; HL60, lignée cellulaire de leucémie promyélocytique ; KG1, lignée cellulaire de leucémie myéloblastique; Daudi, lignée lymphoma de Burkitt ; MOLT4 et HS82. deux lignées cellulaires T. Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées en milieu RPMI 1640 contenant 10 % de sérum foetal bovin inactivé par la chaleur et 20 mmollL de L-glutamine. Les cellules ont été cultivées 9 3rrC en atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. Les cellules leucémiques ont été obtenues par aspiration de moelle à partir de 190 patients adultes présentant une leucémie aiguë nouvellement diagnostiquée (179 leucémies myéloldes aiguës et 11 leucémies lymphoblastiques aiguës). Le diagnostic a été effectué selon les processus cytologiques et cytochimiques classiques et la classification établie selon les critères FAB (Bennett et al. Ann lntern Med. 103 : 620-629, 1985). Analyse par marqueur de surface Le done produisant l'anticorps 182 a été obtenu par fusion de lymphocytes spléniques de souris immunisée contre des glycolipides portant la structure N-acétyl-lactosamine avec une lignée myélomateuse de souris dans les conditions décrites par Young, Portoukalian et Hakomori dans J. Biol. Chem. 256:10967-10972, 1981. Des cellules mononucléaires de moelle ont été récupérées par sédimentation sur Ficoll-Hypaque, lavées trois fois et remises en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Les échantillons de cytospin ont montré que le pourcentage de cellules blastiques était toujours supérieur à 80 %. Des marqueurs de surface ont été analysés par immunofluorescence indirecte, en utilisant les anticorps monoclonaux suivants: MY7 et My9 (Coulter Imm., Hialeah, FL) dirigés respectivement contre les antigènes CD13 et CD33 (exprimés sur progéniteurs engagés et cellules de lignée myélomonocytaire) CRIS-6 (Dr Viella, Barcelone) dirigé contre l'antigène CD14 (monocytaire) SMy13a (Biosys, Compiegnef contre l'antigène CDl S (exprimé sur les stades les plus matures de la lignée granulocytaire) Myl O (Becton Dickinson , Mountain View, CA) contre CD34 (exprimé sur cellules souches et sur moins de 5 % de cellules normales de moelle) On a ajouté à la suspension du sérum humain AS pour éviter toute fixation non-spécifique du MoAB sur les récepteurs Fc. Les cellules ont été incubées avec les MoABs à 4C pendant 30 min. et lavées avec du PBS. Des fragments Fab'2 chèvre-anti-souris marqués à la fluorescéine ont été ajoutés comme seconde couche (4, 30 min). On a déterminé la fluorescence cellulaire sous microscope Leitz ou on a effectué l'analyse par cytométrie a flux sur SCAN FACS II (Becton-Dickinson). Les contrôles ont été effectués avec un anticorps non réactif (MslgG Kit, Coulter lmmunology). La coloration a été jugée positive quand une quantité de cellules supérieure à 20 % du contrôle ont été colorées. Traitement à la neuraminidase Des cellules (2 x 107) ont été traitées à la neuraminidase (Calbiochem Behring, La Jolla CA) en les mettant en suspension dans 1 ml de PBS contenant 0,1 Ulmf d'enzyme. La suspension cellulaire a eté incubée à 37 C pendant 30 minutes. Les cellules traitées à la neuraminidase ont été ensuite analysées par im munofluorescence. Essais clonopéniques Pour l'essai clonogénique de la lignée ganulo-monocytaire (CFU-GM), on a planté 106cellules par puit (24 Multidish Nunc, Ruskilde, DK) contenant 0.5 ml de milieu Dubelco modifié Iscove (IMDM) supplémenté par 30 % de sérum foetal de veau (FCS. GIBCO, Paisley: Ecosse), 0.8 % de méthylcellulose (Methocel MC, Fluka, Suisse), et 10 ,b de milieu conditionné de lignée cellulaire de carcinome humain de la vessie (HTB9) . On a dénombré les colonies (plus de 50 cellules) après 7 à 10 jours d'incubation à 37*C en atmosphère humidifiée avec 5 % de C02 sous microscope inversé. Pour les études de colonies ganulo-érythrobiastiques monocytaires mégacaryocytaires (CFU-GEMM) et érythroblastiques (BFU-E), on a cultivé des cellules (0,5 x 105) dans 1 mI de IMDM contenant 0,8 % de méthycellulose complémentée avec 1 % d'albumine de sérum de bovin désionisée (fraction V, Sigma), 20 % de FCS, 5 X 10-5 de mercaptoéthanoi et 2 Ulml d'éryttropoiétine (Terry Fox Lab. Vancouver, CA). Les colonies érythroîdes (plus de 50 cellules hémoglobinisées) et les colonies mixtes ont été comptées après 14 jours de culture à 3TC dans une atmosphère humidifiée à 5 % de C02. Le système de culture utilisé pour les examens des cellules des progéniteurs leucémiques (CFU-L) était le même que celui utilisé pour le CFU GM normal. Purge des cellules clonogéniques réactives aux anticors provenant de la moelle normale et d'échantillons leucémiques On a déterminé la cytotoxicité complément dépendante avec l'anticorps des colonies par incubation des cellules mononucléaires de moelle avant mise sur plaque avec 182 (100 } mol) additionné de complément lapin néonate à faible toxicité (C) (Centre de Transfusion Sanguine, Besancon) à une dilution finale de 1:3 pendant 30 min. à 37"C suivi de deux lavages avec IMDM. Les cellules clonogéniques ont été considérées positives contre I'antigène 1B2 quand on avait un abaissement de 40 % ou plus de récupération de la colonie comparativement au contrôle avec C seul. RESULTATS Distribution de 182 sur les leucocytes normaux 182 réagit avec les granulocytes normaux, les monocytes mais non avec les lymphocytes. Dans de la moelle normale non traitée, 60 à 70 % des cellules ont été reconnues, mais seulement 1wu20 % après séparation Ficoll. L'analyse par cytométrie à flux de la liaison des cellules normales est presentée aux figures 1 pour les granulocytes. 3 pour les monocytes et 5 pour les lymphocytes. Le traitement à la neuraminidase augmente l'intensité de coloration des granulocytes et des monocytes. Les lymphocytes traités à la neuraminidase sont devenus positifs pour 182 (fig. 2, 4 et 6) Distribution de 1B2 sur les lignées cellulaires leucémiques et les cellules leucémiques. Les lignées cellulaires KG1 (leucémie myéloïde aiguë), HL60 (leucémie promyelocytique) et K562 (leucémie cellulaire de souche positive Philadelphie) ont été positives pour 182. Par contre, la lignée Daudi de cellules lymphoïdes de Burkitt et deux lignées cellulaires T, MOLT4 et HS82 se sont révélées négatives. Les cellules blastiques de 179 patients AML ont été examinées par microscopie à fluorescence. Sur 179 échantillons, 152, soit 85 % se sont révélés positifs. Comme on le voit dans le tableau après, toutes les sousclasses cytologiques FAB ont été reconnues, mais le pourcentage d'échantillons reconnus était légèrement plus élevé dans les classes M2 (93 %) et M3 (94 %) que dans les sousclasses M5 (87 %), M4 (76 %) et M1 (74 loi. REACTIVITE DE 1B2 SUR DES CELLULES DE LEUCEMIE MYELQIDE AIGUE ET INDIFFERENCIEE SELON LA CLASSIFICATION FAB Soustvpe FAB MO M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 182-positif 5 17 37 15 19 54 3 2 182 négatif 3 6 3 1 6 8 0 0 %positif 63 74 93 94 76 87 100 100 Une majorité de leucémies non différenciées (63 %) ont également été colorées. La réactivité de 182 a été comparée à celle d'autres anticorps myéloïdes. Les anticorps monoclonaux CD11, CD13, CD14, CD15, CD33 et CD34 ont identifié respectivement 31 %, 76 %, 42 %, 70 %, 38 % et 49 % des échantillons. La concordance (rapport entre les échantillons également positifs ou négatifs et les échantillons examinés) de la coloration de 182 était de 38 % avec CD11, de 72 % avec CD13 (p=0,04), de 46 % avec CD14, de 74 % avec CD15 (p Combiné au CD13 ou au CD15, 182 a identifié respectivement 169J177 et 1701178 des échantillons étudiés (96 %). Sur 1 1 des cas de leucémie lymphoblastique aiguë étudiés (ALL commun : 8 cas, ALL cellules-T 3 cas) un seulement était positif pour 182. Ce cas faisait apparaître un phénotype de ALL commun, une anomalie chromosomique t (9;22) et était également positif pour CD13, CD15 et CD34. Expression de i'antigène 182 sur les cellules des progéniteurs normaux et leucémiques Elle a été étudiée sur 10 moelles normales par analyse de la récupération des colonies après traitement des cellules mononucléaires avec 182 et du complément de lapin. La récupération moyenne (+DS) était de 69 % (+ 6) par rapport au controle au iour 7 pour les colonies granulomonocytaires (CFU-GM), de 93 % ( + 4) au jour 14 pour CFU-GM, de 92 % ( + 4) pour les colonies granuloérythroblastiques monocytaires mégacaryocytaires (CFU-GEMM) et de 234 % (; 31 %) pour les colonies érythroblastiques (BFU-E). L'expression de 182 sur les cellules clonogéniques leucémiques a été étudiée dans 36 cas de leucémie myéloide aiguë et comparée au pourcentage de lyse de cellules fraîches. Le pourcentage de lyse de cellules clonogéniques variait de 10 à 100 %. Une lyse de cellule clonogénique égale ou supérieure à 40 % a été observée sur 33 des 36 échantillons. Une lyse de cellules clonogéniques égale ou supérieure à 90 % a été notée dans 13 cas. Il existe une corrélation statistique entre le pourcentage de lyse de cellules fraîches et le pourcentage de lyse de cellules clonogéniques. Les résultats sont représentés à la figure 7 pour chaque colonie. Le pourcentage de récupération des colonies (déterminé par marquage en immuno- fluorescence) est porté en abcisse et le rapport coloniesl105 cellules en ordonnée. Dans 28 cas. une lyse de cellules clonogéniques a été aussi obtenue avec l'anticorps 8.27 (CD 15) plus un complément, et avec un cocktail de 8.27 plus 182 plus complément. Avec le CD15 seul, une inhibition de croissance de la colonie égale ou supérieure à 90 % a été obtenue dans 11 cas (39 %). Avec le cocktail, une inhibition égaie ou supérieure à 90 % a été observée dans 19 cas (68 %), une compléte inhibition (100 %) dans 10 cas qui ne présentaient aucune croissance. L'analyse de ces résultats révèle que la distribution de 1B2 sur les cellules hémopoiétiques normales est très proche de celle du Cri 5. En immunofluorescence, 1B2 colore les granulocytes et, avec une intensité plus faible, les monocytes. L'exposition à la neuraminidase permet la coloration des lymphocytes qui sont presque totalement négatifs avant traitement et augmente la coloration des cellules myéloides. Ces résultats concordent avec ceux obtenus avec les anticorps monoclonaux dirigés vers les structures carbohydrate. 182 reconnait la plupart des cas de leucémie myéloïde aiguë. Quoique l'antigène 182 ait été trouvé sur un plus grand pourcentage de FAB M2 et M3, la positivité de 182 ne permet pas de prévoir une classification cytologique. La comparaison de la réactivité de 182 et de celle des anticorps monoclonaux myéloldes largement utilisés permet de constater que CD13 et CD15 identifient également une majorité d'échantillons AML. La concordance ente les résultats obtenus avec 182 et CD15. et avec 182 et CD13 est bonne mais non complète. En combinaison avec l'anticorps monoclonai CD13 ou Cl15, 1B2 identifie 96 % des échantillons AML. Ce chiffre est légèrement supérieur à celui observé avec une combinaison de CD13 et CD15 (91 % des cas reconnus) et permet d'utiliser 182 pour le diagnostic de routine de la leucémie myélolde aiguë. Par contre, un cas seulement de leucémie lymphoblastique aiguë a été identifié. Cet échantillon était aussi positif pour CD15 et CD13. On a déjà mentionné une réponse positive de certains cas de leucémie lymphoblastique aiguë pour les marqueurs myéloîdes tels que CD13 et CD33. Les inventeurs ont déterminé que l'antigène CD15 (et d'autres marqueurs myélolde) peuvent être exprimés sur la surface de certaines cellules de leucémie lymphoblastique aiguë, particulièrement celles présentant le chromosome Philadelphie. Comme l'antigène CD15, le 182 est exprimé sur la surface d'une minorité de progéniteurs myéloldes, mais non sur les progéniteurs érythroîdes ou mixtes. L'expression de l'antigène 182 sur les cellules de progéniteurs leucémiques s'est révélée hétérogene. A la différence de ce que l'on a noté pour d'autres marqueurs de surface, dont l'expression est fréquemment différente sur les cellules fraîches et sur les cellules progéniteurs, les inventeurs ont pu observer une corrélation entre le pourcentage de cellules clonogéniques positives 182 et le pourcentage de lyse de l'ensemble de la population touchée. Leurs propres études avec les anticorps CD15 a confirmé ce manque de corrélation. Dans le cas de 182, l'étude de cellules leucémiques fraîches permet donc de provoir la destruction du CFU-L. L'autotansplantation de la moelle osseuse est une approche pleine de promesse pour le traitement de la leucémie mélo'ide aiguë. La réinfusion de cellules leucémiques avec la geffe est un inconvénient possible avec cette méthode. Du fait de la présence d'antigènes myéloldes à la surface des cellules progéniteurs, une purge de la moelle par un anticorps monoclonal additionné d'un complément n'a pas été étudiée sur une gande échelle dans la leucémie myéloïde aiguë. Des études précliniques ont été effectuées avec les anticorps monoclonaux CDl 5 * CD33 et VlM-D2 en vue d'arriver à une destruction sélective des cellules AML sans toxicité pour les précurseurs normaux. Les inventeurs ont pu montrer que, dans environ un tiers des cas, une destruction de plus de 90 % des cellules clonogéniques était obtenue avec 182 et un tour de complément humain ou de lapin, ce qui est similaire à ce qui a été indiqué dans les expériences précédentes. Les résultats obtenus sont rassemblés à la figure 8 indiquant en abcisse le pourcentage d'inhibition et en ordonnée les résultats en immunofluorescence. Cette destruction, pour intéressante qu'elle soit peut encore être améliorée pour assurer une purge satisfaisante dans la majorité des leucémies myéloïdes aiguës. On a obtenu en effet une efficacité encore meilleure en combinant l'anticorps 182 avec un autre anticorps et notamment avec l'anticorps Cl15, couplé à des billes magnétiques ou flottantes, ce qui fait de ce cocktail un bon candidat pour la purge ex-vivo de la moelle osseuse dans la leucémie myélo?de aiguë. REVENDICATIONS 1 - Application de l'anticorps monoclonal de souris 182 anticarbohydrate dirigé contre les glycosphingolipides comportant une chaîne Lacto-N-glycosyl type 11 spécifique des glycolipides ayant une structure terminale Facétyllactosamine non réductrice (Galpt- > 4GlcNAcss1- > R), ne réagissant pas avec les glycolipides ayant soit une chaîne type I (Galp19 3GlcNAcItR), une structure ganglitserie (Galss1- > 3GalNAcss1- > R) ou une substitution sialosyl ou fucosyi sur le radical N-acétyllactosamine, à la classification et au diagnostic des leucémies, ainsi qu*à I'inhibition de la prolifération des cellules leucémiques clonogènes. 2 - Application selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'anticorps 182 est utilisé pour la classification et le diagnostic des leucémies aiguës myéloldes par immuno-fluorescence directe ou indirecte ou par technique im muno-enzymatique 3 - Application selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'anticorps 1B2 est utilisé lors des purges de moelle ex-vivo avant une autogreffe par incubation avec du complément humain ou de lapin. 4 - Application selon l'une quelconque des revendications 1 a 3 caractérisée en ce que l'anticorps 182 est combiné à un autre anticorps monoclonal, couplé à des billes magnétiques ou flottantes. 5 - Application selon la revendication 4 caractérisée en ce que l'autre anticorps monoclonal est le CD15