FR 2667876 A1 19920417 FR 9012756 A 19901016 Procédé ex vivo d'évaluation de l'état de l'infection! par un rétrovirus VIH, d'une population de cellules mononucléées sanguines et ses applications. La présente invention concerne un procédé ex vivo permettant d'évaluer l'état de l'infection, par un rétrovirus VIH, d'une population de cellules sanguines mononucléées, et ses applications. On savait déjà quantifier l'infection par un rétrovirus VIH d'un échantillon de sang par des techniques recourant aux dilutions limites, à la culture en puits, puis à la détection antigénique. Les techniques en question sont cependant longues et coûteuses à réaliser, notamment de par le grand nombre de dilutions successives qu'il est nécessaire d'effectuer. En outre, l'utilisation de ces techniques n'a pas débouché sur des applications du type aide au diagnostic, suivi de l'efficacité d'un médicament, etc., faute notamment de critères de jugement appropriés et de la lourdeur de ces techniques. En effet, il n'existe à ce jour pas d'autre critère de jugement, permettant par exemple de qualifier l'efficacité d'un médicament quel qu'il soit, que les critères cliniques dont les principaux inconvénients sont la lenteur et la lourdeur trop bien connues des essais qu'ils imposent. L'invention a donc pour objectif un procédé permettant d'évaluer l'état de l'infection d'une population sanguine, qui soit facile, rapide et peu onéreux à réaliser. Un autre objectif de l'invention est de fournir des procédés permettant notamment de décider du lancement d'un traitement, d'évaluer l'activité anti-virale de substances, d'apprécier les meilleures formulations médicamenteuses, d'améliorer le suivi thérapeutique à moyen et long termes, de titrer les cellules produisant des virus résistant à un traitement et de déterminer le degré d'infectiosité d'un porteur. L'invention a donc pour objet un procédé ex vivo consistant à déterminer, dans une population de cellules sanguines mononucléées contenues dans un prélèvement de sang infecté par un rétrovirus VIH, les proportions de cellules infectées productives et de cellules infectées quiescentes. Par cellules infectées productives, on entend des cellules infectées par le rétrovirus et en cours ou en passe d'expression rétrovirale. Par cellules infectées quiescentes, on entend des cellules infectées par le rétrovirus mais dont l'expression de l'ARN viral n'a pas été initiée. De préférence, on détermine en outre la proportion de cellules infectées par le rétrovirus VIH dans ladite population. Pour détecter les cellules infectées productives, on soumet une quantité déterminée de cellules de ladite population à un traitement inhibant la multiplication cellulaire mais permettant aux cellules infectées productives de propager le virus pendant quelque temps, puis l'on met les cellules traitées en co-culture avec des lymphocytes permissifs à l'infection par le VIH et l'on détecte les cellules infectées productives initiales par un test quelconque, par exemple un test ELISA immunologique. En effet, les cellules infectées productives, c'est-à-dire en cours ou en passe d'expression rétrovirale au moment du traitement inhibiteur, peuvent tout de même former in vitro des ARN VIH matures et propager leur matériel infecté durant les 24 à 48 heures de leur survie post-traitement inhibiteur. De préférence, ledit traitement est une irradiation gamma à dose létale, notamment à 45 GY, ou encore un traitement chimique par inhibiteur de la synthèse d'ADN, par exemple la mitomycine C. Pour détecter les cellules infectées dans le prélèvement, on met une quantité déterminée de cellules de ladite population en co-culture avec des lymphocytes permissifs à l'infection par le VIH et l'on détecte la présence de l'infection par un test quelconque, par exemple un test ELISA immunologique. Dans un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, la détermination de la proportion de cellules répondant positivement aux tests de détection précités s effectue sur un petit nombre de dilutions de la population prélevée, de préférence seulement deux ou trois dilutions, et avec plusieurs répliques, de préférence au moins quatre, pour chaque dilution. De fagon particulièrement avantageuse, les suspensions de cellules sont diluées de 5 en 5 et, de préférence, on utilise les deux dilutions 5.105 et 1.105 cellules mononucléées par ml et l'on calcule les résultats sur l'ensemble en prenant indistinctement en compte les valeurs obtenues avec l'une ou l'autre des concentrations de cellules du patient. Les répliques des dilutions sont réparties sur plaques multipuits et mélangées, de préférence dans les puits1 à un nombre adéquat de lymphocytes permissifs en milieu de culture approprié, notamment à raison d'une concentration faible de 3,5.105 lymphocytes par puits. Ces répartitions peuvent être utilisées aussi bien dans l'étape de détermination de la proportion de cellules infectées dans la population que dans celle de la détermination de la proportion de cellules productives, la proportion de cellules productives par rapport à l'ensemble des cellules infectées étant ensuite calculée par une simple règle de trois. Ces co-cultures en dilutions semi-limites et en répliques multiples permettent d'estimer la fréquence des cellules positives par un compromis optimum entre le nombre limité de cellules du patient dont on peut disposer et la sensibilité de la détection et de la quantification virale. Le gain de temps par rapport aux méthodes de dilutions limites usuelles est considérable et la sensibilité de la mesure n est pas compromise. De préférence, des lymphocytes permissifs sont des lymphocytes normaux, de sujets sélectionnés, stimulés à la phytohémagglutinine (PHA). De préférence, le test de détection est un test ELISA usuel, ou des IgG naturelles de sujet VIH+ sans symptômes sont insolubilisées et capturent les antigènes VIH produits par la culture ; cette immuno-capture est révélée par des anticorps d'animaux immunisés contre le virus VIH. L'invention a encore pour objet l'application de ce procédé à l'aide au diagnostic et au pronostic des infections VIH, l'aide à la décision et à la conduite thérapeutiques dans ces infections, l'évaluation rapide de l'efficacité des traitements thérapeutiques et la quantification des rétrovirus résistant à ces traitements, la recherche des meilleures formulations en cours de traitement, l'évaluation de la contagiosité, notamment de la mère pour son enfant in utero ; les mères contaminantes auront des taux de cellules infectées du sang plus élevés que les mères non contaminantes, la recherche systématique de substances antivirales anti-VIH sur des modèles animaux pertinents, ou sur des modèles animaux de rétrovirus apparentés, par exemple SIV. En effet, d'une manière générale, on peut considérer qu il existe une relation directe entre les taux de cellules productives/quiescentes et la morbidité. Des taux d'infection détectés après traitement inhibiteur qui sont nuls ou faibles correspondent à de faibles taux de réplication in vivo et ne sont associés à aucune maladie mineure clinique ou immunologique (sujets asymptomatiques), tandis que des taux élevés, correspondant à des taux de réplication élevés, précèdent, ou coïncident avec, une maladie majeure ou une lymphopénie CD4 (sujets à un stade progressif ou à lymphopénie) L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'un exemple du procédé selon l'invention, d'un essai sur des sujets à des stades variés de la maladie, d'un essai sur l'efficacité de l'AZT et de l'application du procédé selon l'invention à l'évaluation d'un traitement. Test ex vivo d'expression de VIH radio-résistants (R-HEV). Des suspensions de cellules mononucléées de sang de sujets infectés par un VIH, obtenues sur gradients Ficoll/Hypaque, sont tout d'abord soumises à trois sources constantes et convergentes de rayons gamma (192Cs) dans un irradiateur, pour un total de 4500 rads (45 Gy). Les cellules irradiées sont ensuite réparties dans des puits de culture. Pour chaque échantillon de cellules irradiées, on réalise 2 fois 4 répliques, avec respectivement 5.105 et 1.105 cellules. Dans l'heure qui suit l'irradiation, on ajoute des lymphocytes normaux (3,5.105) stimulés à la phytohémagglutinine à chaque réplique, avec 2 ml de milieu de culture frais constitué de milieu RPMI 1640 supplémenté avec 1 % de glutamine, i % de pyruvate, 70 UI d'interleukine 2 recombinante humaine (Roussel Uclaf, France) et 10 % (vol./vol.) de sérum bovin foetal (Flow Laboratories). On cultive ensuite les mélanges de cellules ainsi obtenus pendant 10 à 11 jours en atmosphère humide à 5 % de C02 et 95 % d'air (en volume). On récupère ensuite les surnageants de culture, exempts de cellules. On traite alors les surnageants de culture avec du Triton X-100 et l'on détecte les antigènes VIH. Les surnageants dont le rapport signal/seuil est supérieur à 3 sont considérés comme virus-positifs. La valeur de R-HEV pour une suspension cellulaire donnée est calculée comme le pourcentage de puits de culture virus-positifs de deux séries combinées de 4 répliques. On effectue par ailleurs sur des échantillons équivalents, de même provenance, le meme test en l'absence d'irradiation. Par recoupements, on obtient ainsi la proportion de cellules infectées dans un échantillon donné et les proportions respectives de cellules infectées productives et de cellules infectées quiescentes. Essai. Une étude mettant en oeuvre le test R-HEV décrit ci-dessus a été menée sur des sujets séropositifs à VIH-1 (sujets asymptomatiques, sujets à un stade progressif et sujets à lymphopénie CD4). Pour comparaison, il a été réalisé parallèlement une détection d'antigènes VIH dans les sérums correspondants. La production de VIH-1 par les cellules mononucléées après irradiation et amplification en présence des lymphocytes normaux stimulés à été rapprochée de la détection d'antigènes VIH-1 dans le sérum. Le procédé a montré une plus grande sensibilité que la détection d'antigènes dans le sérum, cette dernière méthode n'ayant pas détecté d'antigènes chez 1/3 des sujets présentant une maladie majeure SIDA-dépendante ou une lymphopénie CD4, alors que tous étaient positifs par le procédé selon l'invention. Les taux d'expression de VIH-1 mesurés par R-HEV sont en relation avec l'existence ou non d'une maladie : des valeurs de R-HEV nulles ou faibles correspondent à des faibles taux de réplication in vivo et ne sont associées à aucune maladie majeure ni à aucune maladie mineure clinique ou immunologique (asymptomatique), tandis que des taux de réplication élevés précèdent, ou coïncident avec, une maladie majeure ou une lymphopénie CD4 (sujets à un stade progressif ou à lymphopénie). L'expérience de l'AZT En monothérapie à dose pleine ou minimisée (1200 mg/jour en 3-4 prises versus 500 mg en une prise), l'AZT réduit sans ambiguïté chez près de 2/3 des patients traités (45 sujets) les taux d'infection cellulaires VIH, en agissant d'abord et surtout sur les taux d'expression active, plus et plus tôt que sur les taux d'infection latente. Ceci est surtout vrai dans les 4 premiers mois du traitement, moins vrai plus tardivement (chez la plupart des sujets "répondeurs" à l'AZT, l'effet anti-VIH du traitement est mesurable dès les 2-3 premières semaines du traitement lorsque nous avons mesuré un échappement total à l'AZT, cela a presque toujours anticipé un échappement persistant les mois suivants). Evaluation d'un traitement. Le procédé de l'invention s'applique notamment à la recherche de la meilleure formulation médicamenteuse parmi les drogues alors disponibles, lors d'une phase d'essais in vivo de courte durée (six semaines à trois mois au plus) et des meilleures modalités de ce traitement en terme de posologie, fréquence, mode et horaires d'administration. Alors que la détermination de la variation de la charge virale instantanée est utilisée pour évaluer rapidement l'efficacité d'un traitement, le suivi d'un traitement à moyen et long termes fait notamment intervenir l'exposition de l'organisme à une charge rétrovirale VIH, des taux durablement élevés annonçant à terme une évolution progressive et des taux durablement faibles de virus en circulation accompagnant des évolutions non ou faiblement progressives. Les corrélations entre l'évolution clinique dans les premiers mois du traitement et les variations iatrogènes de la charge virale cellulaire paraissent assez bonnes ; à plus long terme (2-3 ans), la simple persistance (voire la reprise à ses taux pré-thérapeutiques de la réplication rétrovirale) est corroborée par une évolution fatale ou morbide chez environ 4/5 des patients traités. Dans les premières semaines du traitement à l'essai, on étudie ses effets virologiques mesurables (sans omettre ses effets toxiques ou aggravatifs éventuels). C'est dès la phase I de tolérance/toxicité/pharmacologie que peut et doit être donnée la qualification virologique d'un traitement et de ses doses puisque les taux de propagation rétrovirale quotidienne sont suffisamment élevés chez les sujets proposés aux essais thérapeutiques pour qu'on puisse en juger aussi vite (compte tenu de ces taux de propagation quotidienne, c ' est dès la première semaine qu'une "très bonne" drogue anti-VIH chez le malade est repérée). Si un anti-rétroviral n'influençait pas in vivo les taux d'infection VIH dans les 2-3 premiers mois, il apparaitrait hautement improbable qu'il y parvienne secondairement (tout au moins à lui seul). On quantifie la "grandeur" thérapeutique anti-VIH de l'agent médicamenteux en se fondant sur la diminution de l'intégrale des jours d'exposition rétrovirale cumulée, que l'on peut étalonner sur la prévalence des spécimens longitudinaux d'un sujet donné montrant une diminution significative des taux d'infection instantanée. A partir de l'expérience de l'AZT d'une part, et des concepts pathogéniques développés ici d'autre part, on établit une échelle de valeur graduant les médications anti-VIH en termes de capacité (de minimales à maximales) à inhiber l'infection VIH en cours, en référant le maximum empirique d'inhibition aux taux constatés ches les "vrais" non progresseurs asymptomatiques à CD4 durablement normaux. Dans notre système, cela représente moins d'une cellule infectieuse radio-résistante sur trois millions de cellules mononucléées et moins d'une sur 400.000 cellules infectieuses totales. On évalue deux paramètres l'inhibition de la propagation rétrovirale (= cellules infectieuses quiescentes ou radio-sensibles) et inhibition de l'expression rétrovirale (= cellules infectieuses productives ou radio-résistantes). Le minimum (empirique) pour qu'un anti-rétroviral "mérite" la qualification d'anti-rétroviral est par exemple qu'il montre chez plus de 50 % des sujets testés une réduction au moins significative (par exemple 0,4 log) des taux d'infection VIH sur au moins deux des quatre échantillons prélevés sous traitement dans les six premières semaines (résultats obtenus avec le médicament dans les six premières semaines du traitement à l'essai - le comptage viral sera effectué tous les dix jours à partir du T0 pendant six semaines). Au cours du suivi en phase II/III ( ces phases ne seront entreprises avec telle ou telle drogue, en combinaison ou en monothérapie, qu'après avoir satisfait aux critères d'efficacité anti-rétrovirale minimale au cours de la phase I), les systèmes d'évaluation quantitative de la charge rétrovirale devront aussi être utilisés (sans restriction des patients, chaque sujet traité étant potentiellement "informatif" puisqu'il est son propre contrôle) afin de déterminer si les taux d'infection VIH restent "bas", taux référencés soit aux taux d'infection observés chez les non-progresseurs stables, soit au minimum aux taux d'infection pré-morbides du patient en question et montrant chez lui une réduction encore significative de ces taux d'infection. REVENDICATIONS. 1. Procédé ex vivo consistant à déterminer, dans une population de cellules sanguines mononucléées contenues dans un prélèvement de sang infecté par un rétrovirus VIH, les proportions de cellules infectées productives et de cellules infectées quiescentes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on détermine en outre la proportion de cellules infectées par le rétrovirus VIH. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu on soumet une quantité déterminée de cellules de ladite population à un traitement inhibant la multiplication cellulaire mais permettant aux cellules infectées productives de propager le virus pendant quelque temps, puis l'on met les cellules traitées en co-culture avec des lymphocytes permissifs à l'infection par le VIH et l'on détecte les cellules infectées productives initiales par un test approprié. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit traitement est une irradiation gamma à dose létale. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit traitement est un traitement chimique par inhibiteur de la synthèse d'ADN, notamment la mitomycine C. 6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on met une quantité déterminée de cellules de ladite population en co-culture avec des lymphocytes permissifs à l'infection par le VIH et l'on détecte la présence de I1 infection par un test approprié. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce qu'on travaille sur un petit nombre de dilutions de la population prélevée, de préférence deux ou trois dilutions, et avec plusieurs répliques, de préférence au moins quatre, pour chaque dilution. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les suspensions de cellules sont diluées de 5 en 5. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on utilise les deux dilutions 5.105 et 1.105 cellules mononucléées par ml et l'on calcule les résultats sur l'ensemble en prenant indistinctement en compte les valeurs obtenues avec l'une ou l'autre des concentrations de cellules du patient. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que les répliques des dilutions sont réparties sur des plaques multipuits et mélangées à un nombre adéquat de lymphocytes permissifs en milieu de culture approprié. 11. Procédé selon l'ensemble des revendications 9 et 10, caractérisé en ce qu on utilise une concentration faible de 3,5.105 lymphocytes permissifs par puits. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 11, caractérisé en ce que les lymphocytes permissifs sont des lymphocytes normaux, de sujet sélectionnés, stimulés à la phytohémagglutinine. 13. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 à l'aide au diagnostic et au pronostic des infections VIN. 14. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 à l'aide à la décision et à la conduite thérapeutiques dans les infections VIH. 15. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 à l'évaluation rapide de l'efficacité des traitements thérapeutiques et la quantification des rétrovirus résistant à ces traitements. 16. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 à la recherche des meilleures formulations en cours de traitement. 17. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 à l'évaluation de la contagiosité, notamment de la mère pour son enfant in utero. 18. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 à la recherche systématique de substances anti-virales anti-VIH sur des modèles animaux pertinents ou sur des modèles animaux de rétrovirus apparentés.