FR 2665179 A1 19920131 FR 9009501 A 19900725 La présente invention se rapporte à un procédé d'hydroxylation enzymatique d'un méthylène acyclique ou cyclique en position allylique, respectant les autres fonctions présentes sur la molécule. En particulier, la présente invention se rapporte à un procédé de synthèse de composés de type stéroides hydroxylés enok d'une double liaison. Elle concerne également l'utilisation de molécules ainsi synthétisées à titre d'agent cytotoxique actif sur des cellules ayant un fort potentiel de prolifération. Les stéroïdes sont des molécules comportant un squelette cyclopentanophénanthrénique, largement répandues dans le monde vivant, et présentant une grande importance physiologique. On retrouve ainsi cette structure dans les acides biliaires, les hormones sexuelles ou corticoldes, certaines vitamines, et les cardénolides d'origine végétale. Un grand nombre d'entre eux possède un potentiel ou des propriétés thérapeutiques, et il est donc particulièrement utile de disposer d'une méthode simple et peu coûteuse pour en faire la synthèse. Une étape clé de cette synthèse est constituée par l'hydroxylation sélective de certaines positions du squelette. Parmi les stéroîdes présentant un intérêt, les cardénolides constituent un groupe de stéroïdes à 23 carbones qui existent sous forme de glucosides dans différentes plantes, principalement dans la famille de la digitale, du lys et de la renoncule des champs. Beaucoup de ces glucosides possèdent une activité cardiotonique considérable et certains sont utilisés en thérapeutique, comme la digitaline, la digitoxine et la digoxine. Schématiquement, la partie aglucone de ces molécules est caractérisée par la présence d'une chaine latérale du type "buténolide" (lactone insaturée), d'un 14-hydroxyle en position cis par rapport au méthyl 18 et d'un 3-hydoxyle. On retrouve par exemple cette structure dans la molécule de digitoxigénine de formule Les sucres qui forment un glucoside avec le stéroïde par une liaison établie avec l'hydroxyle en C-3 comprennent le glucose, la rhamnose, ainsi qu'un certains nombre de sucres inhabituels, tel le 2, 6didesoxyhexose, souvent méthylé en C-3. La manière de construire uneO(, , lactone sur C17 structure cyclique nécessaire à l'activité pharmacologique de ce type de composé a été décrite notamment par Marini-Bettolo et al (Can. J. Chem, 1981, 59, 1403-1404)-. On utilise classiquement des dérivés , #3 ène, céto-17 comme composé de départ et l'éthoxyacétalide de lithium, lep furyl de lithium et le méthoxy-2 furyl de lithium comme réactifs. Ces procédés de synthèse ne sont pas utilisables à l'échelle industrielle, car ils présentent un certain nombre d'inconvénients. Le temps nécessaire pour obtenir le produit est relativement long et de plus, la synthèse se fait dans des conditions drastiques (solvants organiques, température élevée).D'autre part, le rendement de la réaction est faible (de l'ordre de 10%) et la purification du produit difficile, vu les nombreux produits additionnels qui apparaissent lors de la réaction. Enfin, le matériel de départ est à la fois très coûteux et très difficile à se procurer. Un autre groupe de composés stéroides présentant un intérêt potentiel en thérapeutique est constitué par les oxystérols, dont la structure dérive directement de celle du cholestérol par la présence d'une ou plusieurs fonctions oxygénées portées soit par les cycles, soit par la chaine latérale du cholestérol. On a d'abord attribué aux oxystérols un rôle dans l'inhibition de la synthèse du cholestérol. Les oxystérols ont ensuite été étudiés en tant qu' agents antiproliférants. Dans une revue récente, SMITH & JOHNSON (Free Radical Biology and Medicine, 1989, 7, 285-332) répertorient les cellules de mammifères atteintes in vitro par ces composés. Par une approche totalement différente, CHENG & coll (J. Chem. Res., 1977, 217, 2501-2521) ont isolé et identifié des principes actifs antitumoraux à partir de médicaments utilisés dans la pharmacopée chinoise traditionnelle. Ainsi la drogue Bombix Cum Botryte contient du 753 hydroxycholestérol qui présente une activité cytotoxique sur des cellules en culture présentant une multiplication importante, tels les lymphomes (YAC-1 et RDM4 de souris) (Cancer Biochem. Biophys. 1986, 9, 75-83), les cellules HTC (cellules tumorales de foie de rat) (Biochem. Biophys. Res. Commun., 1984, 120, 192-198), les fibroblastes de rat d'origine cardiaque (C.R. Acad. Sci. Paris, 1984, 299, 221-225) et les cellules épithéliales de foie de rat (Cell Biol. Toxicol., 1989, 5, 261-270). Par contre, les cellules dont le potentiel de division est plus faible et qui atteignent un certain degré de différenciation en culture, comme les cellules cardiaques et les hépatocytes de rat nouveau-né en culture, ne sont pas altérées par cette molécule. La cytotoxicité du 7,3 hydroxycholestérol se manifeste par un arrêt de la croissance cellulaire, suivi des modofications morphologiques qui précèdent le détachement et la lyse rapide des cellules. RONG & coll (C.R. Acad. Sci. Paris, 1985, 300, 89-94) ont montré que les sels de sodium du 3,7-bis hémisuccinate de 7,3 hydroxycho- lestérol possèdent une activité antitumorale, injectés par voie intrapéritonéale à des souris porteuses en tumeur ascitique, du carcinome transplantable Krebs-II. On aussi montré, chez le rat Sprague-Dawley femelle, que le (22 R)-cholest-5-ène3, 7/322-triol réduisait efficacement le développement de tumeurs induites par du 7,12-diméthylbenz % ) anthracène (Iversen et al. Virchows Archiv B, 1986, 51, 313-320). I1 est généralement admis, que l'effet cytotoxique des oxystérols résulte de la superposition de plusieurs phénomènes, dont les plus importants sont l'inhibition de la synthèse du cholestérol par inhibition d'une enzyme clé (1'HMGR), et une déstabilisation des membranes plasmiques. Dans ce contexte, et dans une perspective thérapeutique à long terme, les inventeurs ont étudié les effets et le mécanisme d'action du hydroxycholestérol sur des lignées spontanément transformées obtenues à partir de cultures primaires d'astrocytes de rat nouveau-né (cellules normales). Dans le système nerveux central (SNC), les astrocytes (cellules gliales) ont gardé la potentialité de se multiplier, phénomène qui se manifeste dans certains états pathologiques comme la gliose réactionnelle (inflammation) et le formation de glioblastomes (néoplasie). Or, une publication récente montre que le 7 hydroxycholestérol est métabolisé dans les astrocytes transformés, en ester d'acides gras. La voie de synthèse chimique classique utilisée pour obtenir des 7P hydroxycholestéryl ester fait appel au 7 céto cholestérol comme produit de départ. Après estérification du OH en 3, on opère une réduction de la fonction par NaBH4. On obtient les deux isomères etÛavec un rendement de 70% pour l'isomère F . Ce procédé est difficilement transposable à l'échelon industriel étant donné sa durée. C'est pourquoi la présente invention se rapporte à un procédé doux d'hydroxylation d'un radical méthylène acyclique ou cyclique en position allylique, caractérisé en ce que l'on fait réagir sur ce radical méthylène, une peroxydase, des ions iodure et du peroxyde d'hydrogène (H202) pour obtenir un composé hydroxylé en d'une double liaison. La péroxydase utilisée est de préférence la lactopéroxydase (LPO), les ions iodures proviennent en général de KI et le péroxyde d'hydrogène peut être généré in situ. Contrairement aux méthodes d'hydroxylation classiques, ce procédé ne fait pas intervenir de réducteur puissant. Le radical OH est fourni par la décomposition de H202, catalysée par la lactopéroxydase, enzyme disponible dans le commerce à un coût modéré. La réaction peut être menée à des températures comprises entre 200C et 40"C, et respectera des fonctions présentes sur la molécule. La présente invention concerne donc un procédé d'hydroxylation d'un méthylène acyclique ou cyclique en position allylique, caractérisé en ce que le composé de départ comporte au moins une fonction ester non protégée, et en ce que cette fonction ester est retrouvée intacte dans le composé après hydroxylation. Le radical méthylène allylique est de préférence - un carbone secondaire (1) fixé sur le schéma Ia suivant C C = CH2 Ia (2) (1) dans lequel le carbone (2) est relié de préférence à un hydrogène ou à d'autres carbones. A titre d'exemple de composé de ce type, on peut citer des dérivés l'hydroxylation étant effectuée sur le carbone distal de la double liaison avec migration de cette dernière. Ce type de composé pouvant comporter d'autres substituants, sous réserve qu'il n'y ait pas d'autres carbones méthyléniques allyliques. - ou bien un carbone secondaire (1) fixé selon le schéma Ib suivant dans lequel (A) est une structure cyclique qui est de préférence de type prégnane ; par exemple le carbone méthylénique étant en position 7 du système cyclique d 5 pregnène. A titre d'exemple, on peut citer l'hydroxylation étant effectué sur une position &alpha; à 'a la double liaison (6-7). Ce type de composé pouvant comporter d'autres substituants sous réserve qu'il n'y ait pas d'autres carbones méthyléniques-allyliques. C'est ainsi que la présente invention se rapporte à un procédé d'hydroxylation, caractérisé en ce que l'on fait réagir la LPO, KI et H 202 sur de l'acétate 3, 22-23 norcholène de formule; et en ce qu'on obtient de l'acétate 3, ol 23,617-20 norcholène de formule; en une seule étape. L'acétate 3, fl 22-23 norcholène est obtenu à partir de l'acide ol 3, cholanique. Ce composé, dont le prix d'achat est peu élevé, est facilement transformé en ol 3, ss 22-23 norcholène selon la méthode de Vaida & al (Tétrahédon Lett., 1968, 50, 5173-5174) modifiée. L'acétate 3, ol 23,A17-20 norcholène permet ensuite, par une série de réactions schématisées ci-dessous, l'obtention d'un cardénolide aglucone Cette méthode est simple, demande peu d'énergie, sa durée est courte et son prix de revient bas, vu le coût faible des réactifs. En outre, la réaction présente un bon rendement et permet la préparation du produit à l'échelle semi-macro, avec peu de produits additionnels. En effet, du fait de sa spécificité, l'utilisation d'un enzyme comme catalyseur favorise l'obtention d'un produit majeur. Cette voie de synthèse permet ltactivation des carbones 17, 20 et 23. De ce fait, d'autres transformations peuvent être effectuées avant d'obtenir le produit final. Par cette méthode, des produits possédant une plus grande activité pharmacologique et une moindre toxicité peuvent être obtenus. Selon un autre aspect de I 'invention, le procédé d'hydroxylation est caractérisé en ce que l'on fait réagir une péroxydase, des ions iodure, et le péroxyde d'hydrogène, sur un mono ester en C3 de cholestérol de formule dans laquelle R représente une chaîne carbonique correspondant à un acide gras, et en ce qu'on obtient un ester de 7 hydroxycholestérol de formule; sous forme d'un mélange d'esters de 7R et7 3 hydroxycholestérol. Les acides gras sont des constituants universels de tous les composés lipidiques, et sont en majorité à nombres pairs d'atomes de carbone (au moins 4) et à chaîne linéaire. Les acides gras naturels peuvent être saturés ou insaturés, en général ils présentent alors de 2 à 6 doubles liaisons ; il existe également des acides gras naturels à triple liaison. Ces acides gras peuvent estérifier la fonction alcool en 3 de la molécule de cholestérol. Contrairement aux monoesters du 7 céto cholestérol utilisés pour la préparation des dérivés hydroxy, les monoesters du cholestérol sont facilement disponibles à un coût peu élevé. La réaction se fait en une seule étape, à une température comprise entre 20"C et 370C, dans un solvant organique lipophile. On obtient un mélange d'isomèrest etpde 7 hydroxycholestérylesters à des proportions de 50% et 50% respectivement. Le rendement peut être optimalisé par l'adaptation des solvants, de la concentration des réactifs et de la température de réaction, en fonction du type d'isomère désiré. La présente invention concerne également les esters d'acide gras en C3 dephy droxycholestérol substitués ou non qui peuvent notamment être obtenus par le procédé selon l'invention. Les acides gras comportent de préférence de 6 à 24 atomes de carbone et peuvent comporter une ou plusieurs insaturations Dans un aspect préféré de l'invention, le produit de départ est choisi parmi le groupe des esters de cholestérol comprenant le palmitate, l'oléate, l'héxénoate, le décénoate et l'arachidonate de cholestérol. L'acide palmitique est un acide gras aliphatique saturé de formule générale C16H3202. Les acides oléique, hexénoîque et décénoîque sont des acides gras monoéthéniques ayant respectivement pour formule brute C18H3402, C6H1002 2 et CloHl802. 2 L'acide arachidonique possède quatre doubles liaisons et répond à la formule C20HO2. Pour les applications cytotoxiques et antitumorales, dans le procédé d'hydroxylation selon l'invention d'un monoester en C3 du cholestérol, on isole du mélange réactionnel l'isomère 7 de l'hydroxy cholestéryl ester obtenu, ledit isomère appartenant au groupe comprenant notamment les esters d'acide palmitique, oléique, hexénoîque, décènoique, et arachidonique. La présente invention se rapporte également à une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un mono ester d'acide gras en C3 de 78 hydroxycholestérol de préférence choisi dans le groupe comprenant le palmitate, l'oléate, l'héxénoate, le décénoate, et l'arachidonate, et un support acceptable pour son administration. En particulier, la présente invention concerne l'utilisation d'un mono ester en C3 de 7 hydroxycholestérol et d'un acide gras tel que défini plus haut, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de cellules possédant un fort potentiel de prolifération. En effet, cette composition est utile en tant qu'agent cytotoxique. Selon un autre aspect de l'invention, on utilise un ester en C7 du 78 hydroxylcholestérylester décrit précédemment. Dans le cas où des composés plus hydrophiles sont recherchés, une molécule particulièrement intéressante est représentée par le 7-phosphoénol-pyruvate-3 oléate cholestéryl. Les composés liposolubles du 7P hydroxycholestérol peuvent être mis sous forme de liposomes ou d'association avec des phospholipides tels que ceux utilisés dans la préparation des liposomes, phosphatidylcholine notamment. Ils peuvent également être associés, au sein des liposomes, à des gangliosides de type GM1 et GTlb. Cette association entre des gangliosides et des esters en C3 du 78 hydroxycholestérol permet d'obtenir un vecteur de plus petite taille et plus hydrophile. Ces liposomes vont être administrés par voie parentérale avec un support acceptable. Ces compositions présentent une grande affinité pour le tissu nerveux, riche en lipides. La présente invention se rapporte donc à la préparation d' une composition pharmaceutique comprenant au moins un monoester en C3 du hydroxycholestérol sous forme de liposomes, et utile en tant qu'agent antitumoral. Selon un aspect de 11 invention, cette composition pharmaceutique est caractérisée en ce qu'elle est utile sur des tumeurs du système nerveux, en particulier des glioblastomes. L'injection de liposomes contenant de la phosphatidylcholine et certains esters du 7jsshydroxycholestérol fait régresser de façon significative des glioblastomes sous-cutanés induits chez le rat. Selon un autre aspect de l'invention, la composition pharmaceutique comprenant un monoester du 78 hydroxycholestérol sous forme de liposomes, est utilisée en tant qu'agent anti-inflammatoire, du système nerveux, en particulier dans des glioses réactionnelles. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. On se référera aux figures suivantes ci-annexées FIGURE 1: Gliose réactionnelle ; traitement au cholestéryl-oléate. FIGURE 2 : Gliose réactionnelle ; traitement au 7jB -OH-CH. FIGURE 3 : Gliose réactionnelle ; traitement au 7P -OH-cholestéryl-3- oléate. FIGURE 4 : Tumeur sous-cutanée induite chez le rat par l'inocula tion de cellules C6. FIGURE 5 : Traitement des tumeurs sous-cutanées au cholestéryl oléate. FIGURE 6 : Traitement des tumeurs sous-cutanées au 7ZB-OH-choles- téryl-3-oléate. EXEMPLE 1 : MATERIELS ET REACTIFS - Couches minces de silice (TLC) sans ou avec indicateur de fluorescence F254 (Merck, RFA) - Colonne HPLC : colonne de silice (Su, 3,9 mm x 15 cm) (Waters, USA) - Appareillage HPLC (Waters Associated, USA) - Chromatographie en phase gazeuse (colonne capillaire du type SE30) couplée à la spectrométrie de masse (LKB 9000, Suède) - RMN 200 ou 400 MHz (Bruker, RFA) - Microscopie électronique (Philips EM300, Pays-Bas) - Sonicateur (Sonimasse S20 ou Soniprep 150, France) - Microscopie à constrate de phase ou à lumière (Nikon, Japon) - Lampe à UV (Bioblock, France) - Lactoperoxydase (EC 1.11.1.7, 60 UI/mg protéines, Sigma, USA) - H202 (Prolabo RP, Normapur, France) - Anticorps de lapin anti GFAP (Glial Fibrillary Acid Protein) (Dakopatts, Danemark) - Anticorps secondaires couplés à la peroxydase (Biosys, France) - Les clones de cellules (glioblastomes) ont été fournis par le Prof. Benda (Science, 1968, 161, 370-371). - Les autres réactifs et solvants sont du type Analar. HPLC Les produits extraits des TLC sont élués à 500 P.S.I. dans du n-heptane-isopropanol (99:1 v/v) (débit de 1,5 ml/min) et détectés par un spectrophotomètre à 220 nm. Après évaporation et dilution dans le solvant approprié ou/et silylation (Kupferberg et al., Biochim. Biophys. Acta., 1989, 1013, 231-238). Les échantillons récoltés sont soumis à l'analyse par RMN et/ou par spectrométrie de masse couplée à la chromatographie en phase gazeuse (GC-MS) GC-MS: - GC : Colonne : 25 m, diamètre interne 0,32 mm (SE30) Gaz vecteur : hélium 15 P.S.I. Programme de température : 100"C à 300"C (3"C/min) Injecteur du type ROS (280"C) - SM : Température de séparation : 250 C Température de la source : 250 C Energie électronique : 70eV Potentiel d'accélération : 3500 V RMN: Les composés à analyser ont été dissous dans du CD Cl3. EXEMPLE 2 : SYNTHESE DU DIOL 3, 23, lS 17-20 NORCHOLENE (Icl) 4 mg d'ol 3, A 22-23 norcholène sont prelevés à partir d'une solution de chloroforme (CHC13) et le solvant évaporé dans un ballon sous atmosphère d'azote, 0,9 ml de diméthylsulfoxide est ajouté au résidu et le tout est chauffé à 30 C pendant quelques minutes. A cette solution sont ajoutés dans l'ordre - 15 ml de tampon phosphate (50 mM, pH 6,0, Pi) - 1 ml de Pi contenant 15 mg de KI - 450 1ll de Pi contenant 450 llg de LPO. La réaction est initiée en ajoutant 300111 de H202 H,O, 2 à 1,3 % toutes les 15 sec et ceci 10 fois de suite. Le mélange du milieu réactionnel est réalisé par un barreau magnétique. Le milieu réactionnel est ensuite extrait successivement avec 20 ml, 5 ml et 5 ml de CHC13. Les phases chloroformiques rassemblées sont séparées avec 10 ml H202. La phase organique est alors filtrée sur du sulfate de sodium anhydre et évaporée. La chromatographie des produits se fait sur TLC avec trois élutions successives dans le système de solvants (cyclo-hexane-acétate d'étyle, 2:1 v/v) et les produits sont détectés soit à 254 nm, soit par le réactif de Macala et coll. (J. Lipid Res., 1983, 24, 1243-1250). Les produits sont extraits de la silice par du CHCl3 (1:1 v/v) évaporés et soumis à l'analyse. RESULTATS Le spectre RMN montre l'apparition de deux pics à 0,67 et 0,73 ppm, auxquels nous attribuons la résonance du méthyle-18 de deux produits isomères géométriques. Nos raisons sont les suivantes - le méthyl-21 apparaît comme deux "singlets" à la place du "doublet" observé pour le produit de départ (ol 3, A 22-23 norcholène) - des protons vinyliques ne sont pas détectés - au voisinage du proton-3, deux protons additionnels sont détectés. Leur forme et distribution complexes suggèrent des effets à longue distance sur le déplacement chimique (chemical shift) de ces derniers. L'apparition de deux protons dans un champ magnétique bas et la complexité de leur spectre indiquent la présence d'une double liaison ( t 17-20). La structure probable du composé est donc du dihydroxy-3, 23, d 17-20 norcholène sous forme de deux isomères géométriques. La RMN du produit Ici acétylé confirme notre analyse. Le rendement de cette synthèse enzymatique est de 90 %. EXEMPLE 3 : SYNTHESE DE L'ACETATE 3, A 22-23 NORCHOLENE 4 mg d'ol 3, A 22-23 norcholène sont dissous dans 2 ml de CHCl3 et 100p1 de pyridine anhydre et 300 Cil d'anhydre acétique sont ajoutés. Le milieur réactionnel est continuellement mélangé à température ambiante pendant 24 h. Après évaporation sous azote les produits sont fractionnés et détectés comme décrit dans l'exemple précédent. EXEMPLE 4 : SYNTHESE DE L'ACETATE 3, ol 23, A 17-20 NORCHOLENE La préparation des réactifs et la synthèse se font à 300C. 4 mg d'acétate 3, A 22-23 norcholène sont prélevés à partir d'une solution chloroformique et le CHCl3 évaporé dans un ballon sous atmosphère d'azote ; 1 ml de diméthyl-sulfoxide est ajouté au résidu et sont ajoutés ensuite dans l'ordre: - Il ml de Pi (goutte à goutte) - 500 Crl de Pi contenant 7,5 mg de KI - 1,7 ml d'une solution composée de 1 ml d'H202 à 1,3 % et de 0,7 ml contenant 200 llg de LPO. Au bout de 1 h sont ajoutés quelques cristaux de I2 sublimé (2 mg environ) et au bout de 6 heures sont ajoutés - 500 p1 de Pi contenant 7,5 mg de KI - 1 ml du202 à 1,3 % - 0,2 ml de Pi contenant 200 4g de LPO. Cette dernière opération est répétée après 24 h. L'extraction, le fractionnement et la détection des produits se font selon l'exemple 2. RESULTATS La silylation de Ic et la GC-SM montrent la masse du composé supposé moins un fragment de 42 de masse (M-42) ; la masse 42 correspond à un fragment de l'acétyle, clivé lors de l'impact électronique. Ce résultat démontre la présence des groupements acétyle et hydroxyle. La RMN, qui montre la disposition du "doublet" (méthyle 21) résonnant à 1,02 et 1,03 ppm et des "quadruplet" et "quintuplet" résonnant à 4,83 et 5,82 ppm respectivement (protons 23 et 22), plaide en faveur de la migration de la double liaison 22-23 entreles carbones tertiaires (n 17-20). L'apparition d'un "triplet" à 3,12 ppm, d'un autre centré à 3,65 ppm et dédoublé ainsi que d'un "doublet" centré à 3,90 ppm plaide en faveur du groupement (-CH2[C22]-CH2OH[C23j à proximité de la double liaison (t 17-20). Le rendement de cette synthèse enzymatique est de 70 %. EXEMPLE 5 : SYNTHESE DU 7P -OH-CHOLESTERYL-PALMITATE (C16:0) 40 pg de cholestéryl-palmitate sont prélevés à partir d'une solution chloroformique et le CHCl3 évaporé sous azote ; 100 pi de diméthylsulfoxide et 200 pI d'éther [(CH3CH2)O] sont ajoutés au résidu et la solution chauffée successivement à 100"C pendant 20 min et à 1200C pendant 15 min dans une enceinte hermétique.La solution est équilibrée à 370C et la réaction se fait à cette température. 670 p1 de Pi sont ajoutés (goutte à goutte) ainsi que 200 pi de Pi contenant 200 pi de LPO, 50 1ll de Pi contenant 750 pg de KI et 10 pi de Pi à 1,3 % de H202 toutes les 15 sec et ceci 10 fois. Après 30 min d'incubation, le cycle (LPO, KI, H2O2) est répété une seconde fois et au bout de 1 h les produits sont extraits avec 4 ml de CHC13, les phases chloroformiques sont rassemblées et rincées avec 4 ml d'H2 O deux fois.Après évaporation, les produits sont fractionnés sur TLC avec trois élutions successives dans le système de solvants hexaneéther (8:2 v/v). Les produits sont ensuite détectés et extraits de la silice comme décrit dans l'exemple 2. EXEMPLE 6 : SYNTHESE DU 7 -OH-CHOLESTERYL-OLEATE (Ci 8:1) 40 pg de cholestéryl-oléate sont prelevés à partir d'une solution chloroformique et le CHCl3 évaporé sous azote ; 100 ,ul de diméthylsulfoxide et 100 1ll de benzène sont ajoutés et le milieu soniqué pendant 30 sec à 180 p d'amplitude à température ambiante. 200 pi de Pi contenant 200 pg de LPO ainsi que 50 pi de Pi contenant 75 pg de KI sont rapidement ajoutés. La réaction est initiée avec l'addition de 10 pI de Pi contenant 1,3 % de H202 dix fois toutes les 15 sec.Le cycle LPO/KI/H202 est répété après 30 min et au bout de 1 h les produits sont extraits, chromatographiés et identifiés comme décrits aux exemples 5 et 2 respectivement. RESULTATS DE SYNTHESE ENZYMATIQUE DU 7p-OH-CH3 PALMITATE OU OLEATE Les esters en C-3-OH (C16:0 et C18:1) du 7Jl3-OH-CH ont été synthétisés par voie chimique selon le schéma II et ont servi de témoins à l'identification de ces mêmes molécules synthétisées enzymatiquement (LPO) par GC-SM, vu les micro-quantités de matériel utilisées. L'analyse en GC-SM montre clairement l'obtention des 7Z-OH-cholestéryl-palmitate et oléate respectivement. Le rendement de la réaction est de 10 % et celui des isomères d et, , 50% et 50 % respectivement. EXEMPLE 7 : GLIOSES REACTIONNELLES IN VIVO ET TRAITEMENT Préparation des liposomes (phosphatidylcholine,PC,/stéroldes) PC et dérivés stéroïdes sont dissous dans du CHCL3-méthanol (2:1 v/v), le solvant évaporé et I ml de KCL (0,15 M) ajouté. La suspension est soniquée dans un bain de glace (5x1 min à 30 sec d'intervalle, 18 pm d'amplitude), centrifugée 13.000g pendant 20 min, le surnageant prélevé et concentré 5 fois sous azote. CERVEAU Des rats agés de 6 jours sont anesthésiés par une injection intrapéritonéale d'imalgène 500 (2 mg/10 g) et de valium (0,05 ml/10 g) et placés ensuite dans un appareil stéréotaxique afin de subir une lésion électrolytique au niveau du striatum. Pour cela, une sonde dentaire isolée, sauf à la pointe, est descendue jusqu'au niveau du striatum selon les coordonnées stéréotaxiques par rapport au lambda. A ce niveau, un courant de 2mA est appliqué pendant 10 sec 2 pi de suspension de liposomes contenant 20 llg de PC et 2 llg de stérols ou d'oxystérols divers sont injectés dans le site de lésion. MOELLE EPINIERE Après section complète de la moelle épinière au niveau de T8 chez des rats de 250 g- (Sprague, Dawley, EFFA, Credo), 5 pi d'une sus pension de liposomes contenant 500 pg de PC et 50 pg d'esters du 7ss-OH-CH (C18:0 ou C18:1) sont injectés à 0,5 mm de la section, en aval. DETECTION DES ASTROCYTES REACTIFS La GFAP, marqueur structural spécifique des astrocytes, est détectée sur des coupes paraffines par le système d'anticorps, antianticorps à la GFAP couplé à la peroxydase. L'addition de 4-chloro-naphtol et d'H202 révèle la présence de GFAP. EFFET DES ESTERS DU 7p-OH-CH SUR DES GLIOSES REACTIONNELLES ET DES GLIOBLASTOMES SOUS-CUTANES C-3-OH IN VIVO L'injection de liposomes contenant du 7SB-OH-CH (C18:1) montre une forte atténuation de la gliose réactionnelle dans le SNC (fig. 3) par rapport à l'injection de 7p-OH-CHj (fig. 2) ou de CH (C18:1) (fig. 1). De même, l'injection de liposomes contenant soit du PC, soit du PC/CH, soit du PC/CH (C16:0), et, soit du PC/9-OH-CH (C18:0) s'est montrée inefficace. L'injection de liposomes PC/7p-OH-CH (C18-1) à côté du site lésion de moelle épinière atténue aussi la gliose réactionnelle secondaire. EXEMPLE 8 : INDUCTION DE TUMEURS SOUS-CUTANEES IN VIVO ET TRAITEMENT Les cellules C6 (passage 55-57) sont injectées par voie sous-cutanée au niveau des épaules à raison de 106 cellules/200 ,ul de NaCI 9 %O dans des rats (26 g) de 3 semaines selon Ledig et coll. (Revue de l'Alcoolisme, 1986, 31, 1-11) ; lorsque les tumeurs se développent (2 semaines après l'inoculation des cellules C6), 50 pi d'une sus pension de liposomes contenant 1 mg de PC et 100 llg de cholestéryl-oléate ou de -OH-cholestéryl-oléate sont injectés dans les tumeurs. Les animaux sont photographiés 48 h après. RESULTAT SUR LES GLIOBLASTOMES SOUS-CUTANES La figure 4 montre une tumeur développée chez un rat mâle par inoculation de cellules C6 ; alors que l'injection de liposomes contenant PC/CH (C18:1) n'a pratiquement aucun effet (fig. 5), celle de liposomes contenant PC/7k-OH-CH (C18:1) fait regresser la tumeur d'une façon significative (fig. 6). REVENDICATIONS 1) Procédé d'hydroxylation d'un radical méthylène acyclique ou cyclique en position allylique, caractérisé en ce que l'on fait réagir sur ce radical méthylène, une péroxidase, des ions iodure et du péroxyde d'hydrogène (H2O2) pour obtenir un composé hydroxylé en d'une double liaison. 2) Procédé d'hydroxylation selon la revendication 1, caractérisé en ce que la péroxydase est une lactopéroxydase. 3) Procédé d'hydroxylation selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les ions iodure sont fournis par du iodure de potassium (KI). 4) Procédé d'hydroxylation selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le composé de départ comporte au moins une fonction ester non protégée, et en ce que cette fonction ester est retrouvée intacte dans le composé après hydroxylation. 5) Procédé d'hydroxylation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le radical méthylène allylique est un carbone secondaire fixé selon le schéma Ia suivant CH2 C = CH2 (Ia) (2) (1) dans lequel le carbone 2 est relié de préférence à un hydrogène ou à d'autres carbones. 6) Procédé d'hydroxylation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on fait réagir la péroxydase, les ions iodure, et le péroxyde sur de l'acétate 3, 1\ 22-23 norcholène de formule: et en ce qu'on obtient de l'acétate 3, ol 23,A17-20 norcholène de formule: en une seule étape. 7) Procédé d'hydroxylation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le méthylène allylique est un carbone secondaire (1) fixé selon le schéma Ib suivant dans lequel (A) est une structure cyclique qui est de préférence de type prégnane. 8) Procédé d'hydroxylation selon la revendication 7, caractéri sé en ce que l'on fait réagir une péroxydase, des ions iodure, et le péroxyde d'hydrogène, sur un mono ester en C3 de cholestérol de formule (III): dans laquelle R représente une chaîne carbonique correspondant à un acide gras, et en ce qu'on obtient un ester de 7 hydroxycholestérol de formule sous forme d'un mélange d'esters de 70 et 7 ,B hydroxycholestérol. 9) Procédé d'hydroxylation selon la revendication 8, carac térisé en ce que le composé de départ de formule (III) est choisi dans le groupe comprenant le palmitate, l'oléate, l'héxénoate, le décénoate et l'arachidonate de cholestérol. 10) Procédé d'hydroxylation selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on isole du mélange réactionnel l'isomère 7 i3 de l'hydroxycholestéryl ester obtenu, ledit isomère appartenant au groupe comprenant les esters d'acide palmitique, oléique, hexénoîque, décènoique et arachidonique. 11) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un mono ester en C3 de 78 hydroxycholestérol choisi dans le groupe comprenant le palmitate, oléate, l'héxénoate, le décénoate, et l'arachidonate, et un support acceptable pour son administration. 12) Composition pharmaceutique selon la revendication 11, caractérisée en ce que le mono ester de 78 hydroxycholestérol est sous forme de liposomes, et/ou associé avec des phospholipides ou des gangliosides. 13) Utilisation d'une composition selon l'une des revendications Il et 12 pour la préparation de médicaments ayant une activité cytotoxique, utile notamment dans le traitement de maladies mettant en jeu des cellules à haut potentiel de prolifération. 14) Utilisation d'une composition selon l'une des revenditions Il à 13, caractérisée en ce que le médicament est actif en tant qu'agent antitumoral. 15) Utilisation d'une composition pharmaceutique selon l'une des revendication 11 à 14, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement de tumeurs du système nerveux, en particulier de glioblastomes. 16) Utilisation d'une composition pharmaceutique selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement de glioses réactionnelles.