FR 2662358 A1 19911129 FR 9104645 A 19910416 La présente invention a pour objet un nouvel hexapeptide, la réalisation de la synthèse de ce nouvel hexapeptide, la mise en évidence des propriétés diurétiques et natriurétiques de ce nouvel hexapeptide, ainsi que les compositions pharmaceutiques diurétiques et natriodiurétiques contenant le nouvel hexapeptide ou certains de ses fragments et dérivés. Certaines expérimentations réalisées sur des extraits naturels de la lymphe de chien ont permis de mettre en évidence que ces extraits présentaient une activité diurétique. Selon la présente invention on a procédé à l'extraction d' un hexapeptide a partir de la lymphe de chien, le H-Ala-Ser Asp-Gl u-Thr-Gl y-OH, dont la séquence H-Ala-Ser-Asp-Glu-Thr-Gly correspond a la séquence C terminale de la céruloplasmine. Selon la présente invention, on a réalisé la synthèse de ce nouvel hexapeptide, et on a mis en évidence ses propriétés diuretiques et natri rétiques. Le nouvel hexapeptide selon l'invention a la structure suivante H-Ala-Ser-Asp-Glu-Thr-Gl y-OH dans laquelle Ala représente la L-Alanine, Ser représente la L-Serine, Asp représente l'acide L-Aspartique, Glu représente l'acide L-Glutamique, Thr représente la L-Threonine, Gly représente la Glycine, et dans laquelle la chaîne aminoacide présente a son extrémité gauche une terminaison amine et à son extrémité droite une terminaison carboxylique. La formule développée est la suivante Ala Ser Asp Glu Thr Gly \f \ f NH2-CH-CO - NH-CH-CO - NH-CH-CO - NH-CH-CO - NH-CH-CO - NH-CHz-COOH I I I I CH2 CH2 CH3 CH2 i CHz CH I I OH COOH CH2 CH3 OH COOH Le poids moléculaire de l'hexapeptide selon l'invention est de 578,5. Le spectre de Résonance Magnétique Nucléaire du proton à 300 MHz de l'hexapeptide de l'invention en solution dans le Diméthylsulfoxyde (DMSO) deutéré met bien en évidence selon le tableau donné ci-après la présence de toutes les fonctions de 1' hexapeptide. Spectre de RMN du proton a 300 MHz de 1 'hexapeptide en solution dans le DMSO deutéré Déplacements chimiques trouvés # (en ppm par rapport au TMS), attribution des raies et comparaison avec les références données par : "K. WUTRRICH NMR in Biological Research Peptides and Proteins North Holland Publishing Co. (Amsterdam)". # nombre attribution référence 8.60 1 8.35 1 7.95 2 5NH 7.83 a 8.21 7.80 1 4.55 1 4.40 1 4.30 1 4.15 1 5 C7t CH 4.34 a 4.63 4.00 1 3.90 1 ss CH Thr 3.93 3.70 2 # CH2 Gly 3.76 3.60 2 ss CH2 Ser 3,60 2.55 2,44 2.65 2 ss CH2 Asp 2.70 2.25 2 # CH2 Glu 2.26 1.95 2 ss CH2 Glu 1.87 1.30 3 ss CH3 Ala 1.22 1.05 3 # CH3 Thr 1.07 Par ailleurs l'Aminogramme de l'hexapeptide de l'invention après hydrolyse chlorhydrique tel qu'il est représenté dans la figure 1, avec en ordonnées la densité optique sous une lumière monochroma tique de longueur d'oside a 440 nm, et en abscisses le temps de rétention, fait bien apparaître la présence de 6 acides aminés ainsi que leurs proportions équimoléculaires. Les références 1 a 6 correspon dent respectivement aux acides Asp, Thr, Ser, Glu, Gly, Ala. Selon la présente invention, on a également mis en évidence l'activité diurétique ou natriodiurétique des fragments dipeptides du nouvel hexapeptide, savoir, les dipeptides H-Thr-Gly-OH, -H-Asp-Glu-OH, H-Ala-Ser-OH. On a également étudié l'activité diurétique ou natriodiurétique des sels dérivés prodrogues de 1 hexapeptide et de ses segments -ou résidus, des isomères de position &alpha; et ss sur l'acide asparti que, dans lesquels les terminaisons ont été remplacées par un acide aminé, un peptide, un ester, un acyle, une amide, ou tout autre groupe protecteur. De même on a étudié l'activité des sels de cuivre des composés ci-dessus. Les expérimentations ont également porté sur un dérivé parti culier du peptide H-Asp-Glu-OH, à savoir, l'acide N N acétyl-L- aspartyl-L-glutamique, sous sa forme ou , et sous sa forme e , et sous la forme de ses sels. Les sels de cuivre de la forme OC ont été particulièrement étudiés. On a également étudié l'activité de certains homologues du dipeptide &alpha; H-Asp-Glu-OH, comme le dérivé ( N-acétyl-Asp-Asp obtenu par le remplacement dans le o & N acétyl-Asp-Glu de l'acide glutamique par l'acide aspartique, et le o( N acétyl Asp-Arg obtenu par le remplacement de l'acide glutamique par l'arginine, ainsi que leurs isomères de position. La synthese de l'hexapeptide a pu être effectuée à partir de dérivés d'acides aminés convenablement protégés. Les réactions de couplage choisies ont été effectuées de façon qu'il n ' y ait pas de possibilité d'altération des centres d'asymétrie. Différentes mé thodes peuvent être utilisées et trois d'entre elles sont décrites ci-après dans des exemples de préparations de 1' hexapeptide, et de ses segments dipeptidiques, H-Thr-Gly-OH, H-Asp-Glu-OH, et de leurs sels et dérivés, tels -que l'acide N acétyl -L-aspartyl-L-glutami que sous ses formes &alpha; et ss. Exemple No. 1: Préparation de l'hexapeptide L-Alanyl-L-Seryl L-aspartyl-L-glutamyl-L-Thréonyl-Glycine (H-Ala Ser-Asp-Glu~Thr-Gly-OH ) par la méthode sur support solide (noté - 5) ) de Merrifield Le dérivé FM0C-Gly-R (FMOC = 9-fluorenylmethoxycarbonyl) contenant 0,6 millimole de glycine par gramme fut le point de départ pour la réalisation de cinq cycles de couplage analogue au premier qui nous est décrit complètement ci-après. I1 comprend les étapes sui vantes - déprotection du FMOC par une solution de pipéridine a 50% dans le chlorure de méthylène. - lavages au chlorure de méthylène, diméthylformamide, eau/dioxane 1/1, diméthylformamide et chlorure de méthylène - couplage avec FMOC-Thr-(tBu)-OH, 2,5 fois en excès pendant 2 heures en présence de dicyclohexylcarbodiimide ( DCCI 2,5 équi valents) et d ' hydroxybenzotriazole (HOBT 3,5 équivalents ) dans le chlorure de méthylène avec une petite quantité de diméthyl formamide pour solubiliser L'HOT - lavages au chlorure de méthylène, dimethylformamide, chlorure de méthylène, éthanol et à nouveau chlorure de méthylène - recouplage dans les mêmes conditions que le couplage avec aupara vant déprotonation éventuelle des fonctions amines libres par la diisopropyléthylamine en solution à 0,75 % dans le chlorure de méthylène, puis lavages au chloroforme et au chlorure de méthylène - acétylation par l'anhydride acétique en présence de DIPAE pendant 20 minutes dans le mélange DMF/CH2CL2 - lavages au DMF, éthanol, chlorure de méthylène. Le rendement de chaque couplage a été estimé > 99,5 % d'après le test colorimétrique de Kaiser. Au cinquième cycle on utilise le dérivé BOC-Ala-OH au lieu du dérivé FMOC et on obtient finalement le dérivé peptide résine suivant BOC-Ala-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Glu (OtBu) Thr (tBu)-Gly La -coupure du peptide de la résine et la deprotection finale ont été réalisées en une seule opération d'une heure dans l'acide trifluoracétique La solution dans; le TFA a été concentrée sous bon vide, le résidu dissous dans l'acide acétique et précipité dans un mélange 1/1 éther éthylique/éther de pétrole. Le spectre de résonance magnétique nucléaire du proton a 300 MHz dans le DMSO deutéré du produit obtenu correspond bien à celui de lthexapeptide. Il en est de même pour l'aminogramme. Exemple No. 2 : Préparation du dipeptide-L Thréonyl-Glycine (H-Thr-Gly-OH) Le couplage a été réalisé dans le chlorure de méthylène entre le benzyloxycarbonyl L Thréonine (Z Thr OH) et le tosylate de glycinate de benzyle (TosOH, H-Gly-OBZl) par addition d'un équivalent de dicyclohexylcarbodiimide (DCCI) et un équivalent de triéthylamine (TEA). La déprotection a été réalisée par l'hydrogène en présence de charbon palladié à 10% dans un mélange methanol-acide acétique. Le peptide libre a été cristallise dans l'acétone anhydre. Exemple No. 3 : Préparation du dipeptide Acide L-Aspartyl-L-Gluta mique (H-Asp-Glu-OH) Ce dipeptide fut obtenu à partir de l'anhydride N formyl-L aspartique par couplage avec l'acide L glutamique en solution dans l'eau à 0 C, le pH étant maintenu à 8,5 par addition automatique de soude 10 N. L' i N formyl peptide obtenu cristallise avec séparation de 1 'isomè- re ot après déminéralisation de la solution. La déformylation finale a été réalisée à 65 C en présence d'acide chlorhydrique N/5. L'&alpha; dipeptide a été cristallisé sous forme de sel dissodique. Exemple No. 4 : Préparation du dipeptide N-acetyl-L-Aspartyl-L- Glutamique (N-Ac-Asp-Glu) Ce dérivé a été préparé de la même façon que le précedent peptide décrit dans l'exemple No. 3, à partir de l'anhydride N acétal aspartique. Le mélange d'isomères &alpha; et ss (&alpha; 70%, ss 30%) a été séparé pour isoler l'isomère ss pur. L'activité diurétique et natriodiurétique des composés de l'invention a été déterminée par la mesure de la diurèse de groupe de deux rats mâles Wistar (200 g.) éveillés, à jeun depuis 18 heures mais hydratés. Ces rats étaient auparavant choisis. Pour cela huit jours avant l'essai, ils subissaient un test de diurèse. Les animaux qui s'écartaient de la norme n'étaient pas utilises pour les mesures d'activité. Le jour de ltessai, chaque rat était gavé par sonde oesophagienne avec une solution de CINa à 9 /oo à raison de 4% du poids corporel (V/poids). Immédiatement après, ces animaux recevaient par voie intrapéritonéale - le lot témoin 2ml de NaCl à 9 /oo - les lots essais 2 ml d'une solution de NaCl à 9 /oo renfermant le peptide à tester. La posologie est rapportée en mg/kg; 1 'effet sur la diurèse est exprimé en pourcentage par rapport à la diurèse du lot témoin mesurée pendant 4 heures après l'administration intrapéri tonéale. L'excrétion sodée est exprimée en mEq/h/kg. La mesure de sodium a été réalisée au photomètre à flamme après dilution de l'urine au 1/100. L'activité natriurétique est calculée en pourcentage par rapport à l'excrétion sodée des rats témoins. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant. RESULTATS OBTENUS Posologie - Dose 0,1 mg/Kg/jour Produits expérimentés activité activité diurétique natriurétique H-Ala-Ser-Asp-Glu-Thr-Gly-OH + 50 à 60 % + 33 % (TFA) H-Asp-Glu-OH , 2 Na + + 50 % + 30 % HBr, H-Thr-Gly-OH + 30 % 0 Mélange des isomères &alpha; et ss de -N-Ac-Asp-Glu + 60 % + 50 % (&alpha; 70 % , ss 30 %) Sels de Cuivre du Mélange N-Ac-Asp-Glu + 60 % + 60 % (&alpha; 70 %, ss 30 %) Isomère ss pur N-Ac-L-Asp-L-Glu 0 0 N-Ac-Asp-Asp-OH 0 0 N-Ac-Asp-Arg-OH - 8 % 0 I1 ressort du tableau des résultats des expérimentations que 1 ' hexapeptide selon l'invention présente une très bonne activité diurétique (+ 50 à 60 %) et une bonne activité natriurétique (+ 33%), que le dérivé dipeptide H-Asp-Glu-OH présente la même activité que l'hexapeptide et correspond bien de ce fait à la séquence active de l'hexapeptide. Les autres fragments dipeptides de 1 'hexapeptide, tels que le dipeptide H-Thr-Gly-OH, présentent une activité diurétique moindre (+ 30 %) et ne présentent pas d'activité natriurétique. Par ailleurs les résultats des experimentations montrent bien que les dérivés du fragment actif dipeptide H-Asp-Glu-OH, conservent la même remarquable activité diurétique et natriurétique que le fragment dipeptide H-Asp-Glu-OH lui-même. En particulier le dérivé acyle dans son mélange d'isomères o & et P montre une excellente activité diurétique et une excellente activité natriurétique. Les sels de cuivre de ce dernier composé présentent une activité diurétique et natriurétique encore meilleure. Par opposition, lorsque l'on modifie la structure du dipeptide H-Asp-Glu-OH en remplaçant l'acide glutamique par un autre acide aminé tel que l'acide aspartique ou l'arginine, les composés obtenus ne présentent plus aucune activité intéressante, ainsi que le montrent les résultats obtenus pour les dérivés Ac Asp-Asp-OH et Ac-Asp-Arg-OH. De même il apparaît clairement que seuls les isomères 0E des peptides de la présente invention peuvent présenter une activite diurétique et natriurétique intéressantes, alors que les isomères ne montrent aucune activité. Enfin si l'on compare l'activité diurétique et natriureti- que des produits de la présente invention avec celle d'un agent diurétique connu tel que le furosemide, on constate que pour obtenir une activité comparable à celle des produits de la présente invention administrés à une dose journalière de 0,1 mg/kg, il est nécessaire d'administrer 10 à 15 mg/kg de furosémide. Ceci signifie que les peptides selon la présente invention sont 100 à 150 fois plus actifs que le furosémide, ce qui est tout à fait remarquable. Les peptides selon la présente invention peuvent être utilisés comme composés actifs dans des préparations pharmaceutiques présentant des propriétés diurétiques ou natriodiurétiques. Etant donné que ces peptides sont des produits naturels constitués de L-aminoacides et sont graduellement hydrolysés dans l'organisme en produisant des L-aminoacides ou d'autres peptides, ils présentent une très faible - toxicité. - Il-s ne stimulent pas la production d'anticorps et ne provoquent pas de - chocs anaphylactiques. Leurs remarquables propriétés diurétiques et natriodiuretiques et cette absence de toxicité, leur permettent d'être les ingrédients actifs de compositions pharmaceutiques. La dose- ~journblière en composes actifs qui peut être administrée est située entre 0,1 mg/kg et 0,6 mg/kg et se situe de préférence à 0,3 mg/kg. Les compositions pharmaceutiques diurétiques et natriodiurétiques contenant les peptides de 1' invention, peuvent être adminis trées, comme le sont les autres compositions pharmaceutiques contenant des peptides, en particulier par voie parentérale, par exemple par voie intrapéritonéale, intraveineuse ou intramusculaire. L'unite thérapeutique pour administration par voie intrapéritonéale contient environ 5 mg de substance active. Les compositions pharmaceutiques peuvent également être administrées par voie orale. REVENDICATIONS 1- Composition diurétique contenant comme substance active un dipeptide de structure H-Thr-Gly-OH, dans laquelle Thr représente la L-Thréonine, Gly représente la Glycine, ou un de ses sels. 2 - Compositions diurétiques ou natriodiurétiques contenant comme substance active les dérivés prodrogues du dipeptide selon la revendication 1, dans lesquels les terminaisons ont été remplacez, par un acide aminé, un peptide, un ester, un acyle, une amide, ou tout autre groupement protecteur. 3 - Compositions diurétiques ou natriodiurétiques contenant comme substances actives les sels ou complexes de cuivre des composés actifs présents dans les compositions selon les revendications 1 et 2. 4 - Compositions diuretiques ou natriodiuretiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 , caractérisées en ce que l'unité thérapeutique administrable contient environ 5 mg de substance active.