FR 2673644 A1 19920911 FR 9102874 A 19910305 OBJET : PRODUCTION DE PLANTES RESISTANTES AUX ATTAQUES DE SCLEROTINIA SCLEROTIORUM PAR INTRODUCTION D'UN GENE CODANT POUR UNE OXALATE OXYDASE I. Problème : la SCLEROTINIOSE LE RESPONSABLE La Sclerotiniose est une maladie fongique importante qui touche un grand nombre de dicotylédones. Le responsable, Sclerotinia sclerotiorum est un champignon polyphage qui présente peu de spécificité d'hôte. LES ATTAQUES Le champignon peut attaquer la plante soit directement au niveau de la tige, soit au niveau des feuilles puis gagner la tige, soit au niveau du capitule floral. Dans les deux premiers cas, la plante fane par rupture d'alimentation. Dans le dernier cas, la fleur fane compromettant la récolte. LES MECANISMES Le champignon produit des enzymes lytiques qui dégradent la paroi cellulaire du végétal infecte et facilitent son développement dans la plante. Ces enzymes jouent un rôle important dans la pathogénicité, mais ne semblent pas suffisantes. Ce champignon produit aussi de l'acide oxalique (Godov et al., 1990). Cet acide oxalique provoque une baisse de pH dans les tissus infectés facilitant l'hydrolyse de la paroi cellulaire par les enzymes lytiques. Une réduction de la production d'acide oxalique ou une dégradation de cet acide oxalique doit permettre une inhibition ou un ralentissement du développement du champignon. II. Solution : DETOXICATION DE L'ACIDE OXALIQUE Pour développer une plante résistante à S. scierotiorum, nous avons choisi d'utiliser la stratégie de détoxication de l'acide oxalique. La dégradation de cet acide limitera la diminution du pH intracellulaire du tissu végétal attaqué, les enzymes lytiques fonctionneront alors trop loin de leur pH optimum pour être réellement actives et efficaces. Il en résultera une baisse de la pathogénicité du champignon. Pour atteindre cet objectif, nous avons décidé d'utiliser l'oxalate oxydase qui catalyse la réaction suivante 02 Cz04Kz --------- 2C02 + H202 oxalate oxydase III. LES ELEMENTS DU SYSTEME LA PROTEINE L'oxalate oxydase est isolée de plantes différentes, généralement des monocotylédones (Pieta et al., 1982), et nous avons commencé notre travail par la purification de la protéine d'orge en utilisant des techniques de chromatographie classique (gels de filtration Superdex G75 et d'échange d'ions MonoQ, Pharmacia) et en suivant l'activiste enzymatique selon le protocole colorimétrique suivant (Obzansky et Richardson, 1983):: Acide oxalique + 02 , 2C02 + H202 oxalate oxydase H202 + MBTH + DMA > indamine + H20 peroxydase MBTH = 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone DMA = N,N,dimethylalinine Ceci, nous a permis de purifier une protéine qui sur gel d'acrylamide en conditions dénaturantes a une masse moléculaire de 26 000 daltons. Une partie de l'oxalate oxydase purifiée a été utilisée pour obtenir des anticorps antioxalate oxydase de lapin ; le reste de la protéine a éte utilisé pour faire le séquengage de la protéine native (Nterminal), ou après clivage au bromure de cyanogène, le séquençage de certains peptides internes.Les résultats obtenus sont les suivants N-terminal : TDPDPLQDF-VDLDGKAVSVNGH S Peptide interne n01 : N-VDFAPGGTNPPHIH Peptide interne n02 : HPQFNVGTEAY L'ADNc La 'comparaison des séquences peptidiques décrites ci-dessus avec les données contenues dans la banque protéique Swiss-Prot nous a permis d'identifier une protéine de blé appelée Germine et publiée en 1989 par Dratewka-Kos et al. Des expériences ont etc réalisées et nous ont permis de déterminer que l'ADNc publié par les auteurs code pour une protéine ae 201 acides aminés et qui présente une activité oxalate oxydase.Pour la suite de la description des expériences présentées dans ce brevet nous reprendrons la numerotation des nucléotides de la figure 2 de l'article des auteurs publiés dans J. Biol. Chem., 264, a8g6-44OO. La séquence de cet ADNc a une longueur de 1 075 nucléotides avec un 5' non traduit de 85 résidus, une phase de lecture ouverte de 672 nucliotides (de ia position 85 à 757) puis un 3' non traduit ae 318 résidus. La comparaison de la séquence protéique déduite de la séquence ae l'ADNc avec celle obtenue par sequençage de la protéine native montre que l'DNc code non seulement pour r oxalate oxydase mature mais aussi pour un peptide signal de 23 acides aminés dans la partie N-terminale. L'oxalate oxydase est aonc synthétisée sous forme d'une préprotéine (peptide signal plus peptide mature) qui est maturee par élimination au peptide signal pour libérer l'enzyme active mature. Pour la suite nous utiliserons soit la partie codant pour la préprotéine (nucléotides 86 à 757), soit seulement la partie codant pour la protéine mature (de la position 155 à 757). Dans ce dernier cas, nous devrons placer un codon AUG (codant pour une méthionine) devant le codon ACC (codant pour la thréonine, premier acide aminé de la protéine mature). Les attaques de plantes par S. sclerotiorum se faisant essentiellement par la tige ou par la plante il est intéressant de pouvoir exprimer l'oxalate oxydase soit dans les tissus chlorophylliens et pour cela nous utiliserons le promoteur de la petite sous-unité de la ribulose-1,5- bisphosphate carboxylase d' Helianthus annuus (PSUHa, Waksman et al., 1987) soit dans différents tissus du végétal et pour cela nous utiliserons le promoteur ubiquitaire de l'ARN 35S au virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV 35S) dont une partie a été dupliquée et qui est nommée "double CaMV" (cf demande de brevet français 91 02 872). LES GENES CHIMERES Les quatre gènes chimères utilisés sont les suivants A. Promoteur double CaMV suivi de la partie de l'ADNc de l'oxalate oxydase codant pour la préprotéine (peptide signal plus peptide mature) et du terminateur nos obtenu à partir du gène de la nopaline synthase de pTi 37(Bevan et al., 1983). B. Promoteur double CaMV suivi de la partie de l'ADNc de l'oxalate oxydase codant seulement pour la protéine mature suivi du terminateur nos. C. Gène identique à "A" mais avec le promoteur de la petite sous-unité de la ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase de tournesol (PSUHa) à la place du double CaMV. D. Gène identique à "B" mais avec le promoteur de la PSUHA à la place du double CaMV. Chaque gène chimère est introduit dans la cellule végétale par un système utilisant Agrobacterium ou tout autre système connu par ailleurs pour transformer les cellules végétales. Des plantes sont régénérées à partir de ces cellules transformées. Elles présentent une tolérance accrue au S. scierotiorum. IV. EXEMPLES: 1. PREPARATION DES DEUX SEQUENCES CODANTES: A. Préprotéine : on l'obtient à partir de l'ADNc décrit précédemment digéré par Hind III (en position 66). L'extrémité -cohésive obtenue est rendue franche par traitement à la polymérase de Klenow. Cet ADN est ensuite digéré par Nhe I (en position 811). Parallèlement le plasmide pUC 19 (Yanisch-Perron et al., 1985) est digéré par Sac I. L'extrémité cohésive obtenue est rendue franche par traitement à la polymérase de klenow. Ensuite le plasmide est digéré par Xba I (compatibible avec Nhe I). Le fragment d'ADNc et le plasmide préparés ci dessus sont ligaturés. Le nouveau plasmide ainsi obtenu est dénommé pRPA-oxo-01 et sa carte est présentée figure 1. B. Protéine mature : On l'obtient à partir de l'ADNc décrit ci-dessus après digestion par BstN I (en position 173). Le fragment obtenu et le linker ayant pour séquence: 5' 3' ATGACCGACCCAGACCCTCTCC TACTGGCTGGGTCTGGGAGAGGT 3' 5' sont ligaturés. Ceci conduit à une modification de la séquence N-terminal de la protéine mature qui passe de TDPDPLQ à MTDPDPLQ. Ce fragment d'ADNc est ensuite digéré par Nhe I (en position 811) pour être ensuite ligaturé avec le plasmide pUC19 préparé comme décrit dans le paragraphe ci-dessus. Le nouveau plasmide ainsi constitué est appelé pRPA-oxo-02 et sa carte est présentée figure 1. 2. PREPARATION DES GENES CHIMERES: a. Préparation des vecteurs comprenant le promoteur et le terminateur nos: - Exemple double CaMV: On obtient ce vecteur à partir du plasmide pRPA-BL-410 (décrit dans le brevet sur le peptide de transit optimisé) que lVon digère avec EcoR I et SalI pour enlever le gène de structure "peptide de transit optimisé-zone codant pour l'EPSPS mature", pRPA-BL-410 délété (voir figure 1). - Exemple PSUHa: On obtient ce vecteur à partir du plasmide pRPA-BL-207 (décrit dans le brevet PH 688) que l'on digère avec Eco RI et Hind III pour enlever la zone codant pour la nitrilase, pRPA-BL-207 délété (voir figure 1). b. Construction des gènes chimères pRPA-oxo-03: Il s'obtient en digérant pRPA-oxo-01 par Eco RI et Sal I. Le fragment obtenu qui code pour la préprotéine est ensuite inséré entre les sites Eco RI et Sal I respectivement en aval du double CaMV et en amont du terminateur nos. pRPA-oxo-04: Il s'obtient en digérant pRPA-oxo-02 par Eco RI et Sal I. Le fragment obtenu qui code pour la protéine mature est ensuite inséré entre les sites Eco RI et Sal I respectivement en aval du double CaMV et en amont du terminateur nos. pRPA-oxo-05: Il s'obtient en digérant pRPA-oxo-01 par Eco RI et Hind III. Le fragment obtenu qui code pour la préprotéine est ensuite inséré entre les sites Eco RI et Hind III respectivement en aval du promoteur PSUHa et en amont du terminateur nos. pRPA-oxo-06: Il s'obtient en digérant pRPA-oxo-02 par Eco RI et Hind III. Le fragment obtenu qui code pour la protéine mature est ensuite inséré entre les sites Eco RI et Hind III respectivement en aval du promoteur PSUHa et du terminateur nos. Tableau 1: Représentation shématique des quatre gènes chimères: Identification Promoteur Zone codante Terminateur oxalate oxydase pRPA-oxo-03 dCaMV préprotéine nos pRPA-oxo-04 dCaMV mature nos pRPA-oxo-05 PSUHa préprotéine nos pRPA-oxo-06 PSUHa mature nos 3. RESISTANCE DE COLZAS TRANSGENIQUES: a. Transformation Chaque vecteur tel que décrit ci-dessus est introduit dans la souche non-oncogène d'Agrobacterium tumefaciens EHA 101 (Hood et al., 1987) porteuse du cosmide pTVK 291 (Komari et ai.,1986). La technique de transformation du colza variété Westar suit essentiellement celle décrite par Boulter et al. (1990), en utilisant une concentration en bactéries de 2,5x109 par ml (DO 600nm = 1). b. Régénération La technique de régénération suit essentiellement celle décrite par Boulter et al. (1990). Les plantes sont enracinées sur le milieu de De Block et al. (1989). Elles sont ensuite conduite à floraison en serre. c. Mesure de la résistance du Colza à S. sclerotiorum. In vitro - Disques foliaires : la résistance est mesurée par pesée de la masse de trois disques foliaires au bout de 11 jours de croissance sur un milieu MS avec hormones additionné de 1 mM d'acide oxalique. Dans ces conditions, on observe que pour les disques foliaires issus de Colzas modifiés avec l'un des gènes chimères pRPA-oxo-03, pRPA-oxo-04, pRPA-oxo-05 et pRPAoxo-06, la masse des disques foliaires augmente nettement, alors que, pour les disques foliaires issus de Colzas non modifiés, la masse stagne ou même diminue. - Elongation racinaire : la résistance est aussi mesurée in vitro par mesure de l'élongation racinaire au bout de deux jours de croissance sur eau additionnée de 5 mM d'acide oxalique. On observe alors que les racines de plantes de Colzas modifiés, avec l'un des gènes chimères pRPA-oxo-03, pRPA-oxo-04, sont capables de pousser et de s'allonger, alors que les racines de Colzas non modifiés ne présentent, dans ces conditions, aucune croissance. In vivo La résistance in vivo est mesurée en serre après contamination des plantes de Colza issues de la régénération, dès l'apparition des premières fleurs, soit par dépôt de spores de S. sclerotiorum sur les pétales, l'infection des feuilles se faisant alors naturellement lors de la défloraison, soit par dépôt directement sur les feuilles de omycelium ou d'un pétale imprégné de mycelium. Les plantes modifiées par l'un des gènes chimères pRPA-oxo-03, pRPA-oxo-04, pRPAoxo-05 et pRPA-oxo-06 ne laissent pas se développer le champignon et ne présentent aucun symptôme de pourriture caractéristique de la sclerotiniose, alors que des plantes non modifiées sont vite envahies de pourriture caractéristique du développement de S. sclerotiorum. ADNc de oxalate oxydase H ATG ACC B TAA N Il Il l l l l 6686 155172 760 811 pRPA-oxo-Ol ESc/HATG ACCB TAA N/X S H \ t 1 I - I I I I I I pRP A-oxo-02 E E SclATG TAA N/X S H I I I I I I I gestion \ digestion E/s dCMV E pRPA-oxo-03 digestion E/S pRPA-BL-410 \ / / de' le' s m~ X X / l diGestion E/H pRPA-oxo-04 PSUHa ~~~~~~~~~~~~~ digeston E/H E pRPA-oxo-05 pRPA-BL-207 / délété / H nos lpRP A-oxo-06 Figure 1: Procédure d'obtention des quatres gènes chimères à partir des deux gènes de structure, pRPA-oxo-O 1 et pRPA-oxo-02.H, Hind III; B, BstN I; N, Nhe I; E, Eco RI; Sc, Sac I; S, Sal I et X, Xba i. REVENDICATIONS 1)séquence ADN codant pour une oxalate oxydase. 2)Protéine oxalate oxydase utilisable pour la résistance des plantes aux maladies provoquées par Sclerotinia sp. 3)Gène chimère caractérisé en ce qu'il comprend comme séquence codante un ADN selon la revendication 1. 4)Vecteur pour la transformation des plantes,caractérisé en ce qu'il comprend un gène chimère selon la revendication 3 5)Cellule végétale transformée ,caractérisée en ce qu'elle contient un vecteur selon la revendication 4. 6)plante transformée issue d'une cellule selon la revendication 5. 7)Plante selon la revendication 6,caractérisée en ce qu'elle est une dicotyledone. 8)Plante selon la revendication 7,caractérisée en ce qu'elle est du colza.