FR 2676455 A1 19921120 FR 9106060 A 19910517 Rétrovirus JSRV - Acide nucléique et protéines caractéristiques de ce rétrovirus - Leurs applications au diagnostic et & la thérapie La présente demande concerne un rétrovirus de type JSRV (Jaagsiekte Rétrovirus), son acide nucléique et ses protéines. Le JSRV est responsable de la formation de carcinomes de l'épithélium et en particulier de l'adénomatose pulmonaire des ovins. L'adênomatose pulmonaire des ovins est un adénocarcinome épithélial bronchio-alvéolaire, contagieux, affectant en premier lieu les moutons, mais susceptible de se développer également chez les chèvres. Cette maladie présente des similitudes morphologiques avec le carcinome humain bronchio-alvéolaire. I1 a été avancé (VERWOERD et al, Onderstepoort J Vet Res 47, 275-280, 1980) que la maladie est associée à la présence d'un rétrovirus qui a alors été désigné par le terme rétrovirus JS (JSRV). Une relation de proportionnalité de dose inverse entre l'activité transcriptase inverse (RT) dans un inoculum infectieux et le temps écoulé jusqu'à l'apparition des symptomes cliniques a notamment été envisagée. L'impossibilité de cultiver le virus in vitro a cependant freiné le développement de la caractérisation du rétrovirus et des études moléculaires de ce rétrovirus et de la maladie & laquelle il est associé. Différents travaux par exemple ont été faits pour tenter de caractériser le rétrovirus à partir de tumeurs ou d'extraits de lavages de poumons prélevés chez des moutons infectés. Cependant on a montré que la présence du JSRV chez les moutons infectés est souvent associée à la présence d'au moins un autre virus, un lentivirus ovin. Cette constatation a suscité certains doutes quant b l'interprétation de l'origine de l'activité transcriptase inverse détectée dans des échantillons biologiques d'animaux infectés avec le JSRV. Un élément supplémentaire dans le cadre des recherches sur le JSRV a cependant été donné lorsque SHARP et HERRING (1983, J. Gen. Virol, 64, 2223-2227) ont démontré qu'un sérum dirigé contre l'antigène spécifique de groupe (p27) du virus de singe Mason Pfizer (MPMV), prototype des virus de type D, réagissait avec un échantillon obtenu chez des moutons présentant un adénocarcinome. Un sérum spécifique du virus de la tumeur mammaire de la souris (MMTV), virus prototype de type B ne réagissait pas au contraire avec un tel échantillon. Les auteurs de cet article ont tenté d'utiliser cette réaction immunologique pour caractériser le JSRV.En utilisant un sérum contre la protéine p27 de MPMV et contre un antigène spécifique de groupe (p30) du virus visna maedi (MVV) et une technique d'immunoblot, des expériences pour distinguer les deux virus (JSRV et lentivirus) dans les prélèvements pulmonaires d'animaux infectés par ces deux virus ont été faites. Ceci n'a toutefois pas conduit à isoler le rétrovirus JSRV de façon suffisante pour le caractériser. D'autres éléments ont été recherché. Ils n'ont pas permis de mettre au point des moyens de diagnostic et de traitement spécifiques du JSRV, et par conséquent des moyens utilisables pour la mise en évidence chez les animaux d'une infection par ce virus, et ce de préférence de façon précoce. A cet égard des essais de production d'anticorps monoclonaux par immunisation de souris avec des extraits contenant du JSRV n'ont pas permis d'établir la spécificité de ces anticorps par rapport au JSRV. Les antigènes reconnus par ces anticorps n'ont pas été identifiés. De tels anticorps ne peuvent donc pas être utilisés pour caractériser une infection par le JSRV des animaux infectés, dans la mesure oti ces anticorps sont susceptibles de réagir de façon croisée avec des protéines d'autres virus ou encore avec des protéines présentes dans les cellules normales des animaux infectés (SHARP et al 1983, J. Gen. Virol, 64, 2223-2227). On a également constaté que les animaux pouvaient être infectés par le rétrovirus sans pour autant présenter dans leur circulation des anticorps antirétrovirus. D'autres tentatives ont été faites avec des sondes obtenues & partir de virus connus dont les protéines étaient susceptibles de présenter des réactions croisées avec les protéines du JSRV. Cependant les tests d'hybridation avec de telles sondes n'ont pas permis d'isoler sa séquence. On peut en effet constater que même si des épitopes peuvent être conservés au niveau de certaines protéines du virus et ce par rapport & d'autres rétrovirus ou virus connus, les séquences nucléotidiques restent malgré tout trop différentes pour permettre des réactions d'hybridation utilisables. De plus l'impossibilité de cultiver le virus in vitro rendait impossible l'utilisation des techniques d'amplification génique pour l'amplifier in vitro et donc démontrer sa présence dans les prélèvements biologiques d'animaux infectés. Les recherches effectuées jusqu'à présent ont montré que le virus JSRV n'avait pas été caractérisé sans ambiguïté. Par conséquent son identification nécessitait la connaissance de son génome, élénient qui s'avérait indispensable pour l'utiliser et pour mettre au point des moyens de diagnostic et de traitement de l'infection par le JSRV. Les inventeurs sont maintenant parvenus à surmonter les difficultés rencontrées jusqu'à présent et ont réussi i isoler et séquencer le génome du virus JSRV et & isoler et identifier ses principales protéines et glycoprotéines. L'invention propose donc à partir de ces éléments, de nouveaux moyens susceptibles d'entrer dans des tests de diagnostic spécifiques du JSRV. De plus la connaissance du génome du virus permet d'envisager des moyens de traitement spécifique de la maladie. L'invention concerne donc le rétrovirus JSRV sous forme purifiée, son acide nucléique ainsi que les séquences d'ADN complémentaires de cet acide nucléique. Elle concerne également les produits d'expression de ce génome et notamment les protéines codées par les gènes d'enveloppe (env), les genes gag, pol et pro. L'invention fournit également des moyens pour le diagnostic spécifique d'une infection due au JSRV notamment des glycoprotéines, protéines, polypeptides ou peptides, des anticorps polyclonaux et monoclonaux spécifiques du rétrovirus ainsi que des sondes nucléiques. L'invention propose également des moyens pour la prévention ou la thérapie de la maladie résultant de l'infection par le JSRV. L'invention a pour objet un rétrovirus de type JSRV, susceptible d'infecter notamment les ovins et en particulier les moutons, et capable de provoquer la formation d'une tumeur de type d'un carcinome épithélial caractérisé par une séquence d'ADNc répondant à l'enchainement I représenté & la figure 2, ou un variant de ce rétrovirus, dont tous les antigènes sont reconnus par les anticorps formés contre les antigènes correspondants du rétrovirus répondant & la séquence d'ADNc ci-dessus. Ce rétrovirus est avantageusement sous forme purifiée. En particulier il est dépourvu de cellules entières autre que le JSRV. L'acide nucléique purifié caractéristique du génome du rétrovirus de type JSRV est tel qu'obtenu par mise en oeuvre des étapes suivantes à partir d'un culot semi-purifié de lavage de poumons de moutons infectés par JSRV - extraction au phénol/chlorophorme, - précipitation de l'ARN en présence de NaCl 0,15 M et 2,5 volumes d'éthanol (-20*C, 16h), - centrifugation de l'ARN précipité pendant 30 minutes à 10000 g à 4C, - suspension de l'ARN obtenu par centrifugation dans 500 Al, 0,5 M LiCl; Trischlorhydrate, pH 7,5, 10 mM; EDTA lmM et - purification sur colonne de cellulose oligo (dT) au moyen d'une sonde d'ADNc comportant une amorce oligo (dT) hybridant avec l'ARN, - récupération de la fraction d'ARN correspondant à une bande d'environ 8,7 kb. La taille approximative de 8,7 kb lue sur la bande d'ARN du JSRV obtenue par cette technique ne correspond pas exactement à la taille de l'ARN calculée à partir de la séquence I de la figure 2. La taille réelle est en effet de 7462 nucléotides et donc après l'addition de l'extrémité poly A, la taille de l'ARN génomique est d'environ 7,5 9 7,6 kb. La différence des tailles lue et calculée résulte de l'insuffisance de précision de la détermination des tailles dans les poids moléculaires élevés et des différences de migration de llADN composant les standards, par rapport aux ARN mesurés. Le prélèvement biologique effectué & partir des poumons lavés prélevés chez des moutons infectés par le JSRV peut être obtenu sous forme semi-purifiée conformément à la technique décrite dans les exemples et qui comprend principalement les étapes suivantes - purification au fluorocarbone (fréon) pour éliminer les rétrovirus tels que les lentivirus susceptibles d'être présents, - purification sur coussin de sucrose (30%) /TNE pour éliminer les composants cellulaires, - centrifugation sur gradient de densité (sucrose 20-48%) jusqu'à séparation du JSRV du LV. Cet acide nucléique est avantageusement obtenu sous la forme polyadénylée. I1 peut être aussi utilisé sans son extrémité poly A. L'acide nucléique du génome du rétrovirus JSRV est constitué par de l'ARN. L'invention concerne aussi l'ADNc correspondant & BR L'invention concerne également toute séquence d'ADN caractérisée en ce qu'elle hybride dans des conditions stringentes, avec l'acide nucléique du génome du rétrovirus correspondant & la séquence I ou avec 1'ADNC correspondant. L'hybridation en conditions stringentes selon l'invention correspond à l'utilisation d'un milieu d'hybridation de composition suivante 5 SSC, 50% formamide, 10 mM PIPES, pH 7,0; 0,5% Denhart, 0,1% SDS & 420C (1 SSC = 0,15 N NaCl, 0,015 M Na3 Citrate) et & BR 0,18 SDS à température ambiante pendant 10 minutes puis une fois dans 2 SSC, 0,1% SDS i 55'C pendant 10 minutes puis deux fois dans 0,1 SSC, 0,1% SDS & 55C pendant 10 minutes. Selon un autre mode de caractérisation, l'ADN complémentaire de L'ART du JSRV peut être caractérisé en ce qu'il comprend les sites de restriction décrits à la figure 3. La séquence d'ADNc correspondant à 1'ARN génomique du JSRV comprend successivement les domaines correspondant aux gènes R-U5-gag-pro-pol-env-U3-R. L'invention concerne par ailleurs une séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend les séquences inverses et complémentaires de l'enchainement nucléotidique I ou toute partie d'une telle séquence hybridant dans des conditions suivantes stringentes avec l'ARN génomique du rétrovirus JSRV ci-dessus décrit ou avec l'ADNc correspondant. Dans la suite du texte on appelera "séquence complémentaire" en ce qui concerne les séquences d'acides nucléiques, les séquences inverses et complémentaires. Le terme "inverse" rend compte de la restauration de l'orientation 5' - 3' de l'acide nucléique complémentaire par la nature des nucléotides, & une séquence donnée. Un ensemble particulier de séquences répondant & BR Une séquence d'ADN particulièrement préférée est celle qui répond i l'enchaînement nucléotidique I représenté & la figure 2. Cet enchaînement correspond & BR L'invention concerne également toute séquence d'ADN complémentaire de la séquence d'ADNc ci-dessus décrite, ainsi que toute séquence d'ADN hybridant avec cet ADNc dans des conditions stringentes telles que décrites précédemment. Entre également dans le cadre de l'invention tout fragment d'ADN caractérisé en ce qu'il est constitué par toute partie d'au moins 10 de préférence d'au moins 15 nucléotides d'une séquence d'ADN ci-dessus décrite, ou d'un ADN hybridant avec 1'ARN génomique du rétrovirus JSRV, ou avec son ADNc. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, un fragment d'ADN tel que défini ci-dessus n'hybride pas dans des conditions stringentes selon l'invention avec l'ADN du génome de cellules animales normales notamment des cellules normales d'ovin par exemple de mouton. Des fragments nucléotidiques particulièrement avantageux pour la réalisation de l'invention sont par exemple les suivants AGTCCTGGGAGCTCTTTGG (U3) AATGGAGCGGTAGGACCA (gag) La seconde amorce, issue de gag figure sous la forme de séquence inverse et complémentaire par rapport & la séquence du gène. Les fragments ci-dessus définis peuvent être marqués par tout marqueur habituellement utilisé notamment des marqueurs radioactifs ou enzymatiques utilisés dans des réactions in vitro et peuvent ainsi constituer des sondes. A cet égard l'invention concerne toute sonde spécifique du virus JSRV répondant & la définition précédente, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un fragment d'ADN choisi parmi les fragments d'ADN ci-dessus décrits, ledit fragment d'ADN étant marqué. Outre l'utilisation & titre de sondes, les fragments ci-dessus décrits peuvent être utilisés en tant qu'amorces nucléotidiques notamment dans le cadre d'une amplification génique par exemple par une réaction du type réaction de polymérisation en chaîne. L'invention concerne également en particulier certaines séquences d'ADN individualisées à l'intérieur de la séquence I et isolées en tant que telles. En particulier l'invention concerne les séquences suivantes - 1'ADN caractérisé en ce qu'il comprend l'enchaînement nucléotidique compris entre les nucléotides 263 et 2098 et correspondant au gène gas, ou une partie de cet enchaînement ayant la capacité d'hybrider spécifiquement avec 1'ARN génomique du rétrovirus JSRV ou avec son ADNc complémentaire. En particulier dans le gène gag l'invention vise le fragment codant pour la protéine p26, qui comprend les nucléotides 1031 & 2018. - 1' ADN caractérisé en ce qu'il comprend l'enchaînement nucléotidique compris entre les nucléotides 1882 et 2859 correspondant au gène pro, ou une partie de cet enchaînement ayant la capacité d'hybrider spécifiquement avec 1'ARN génomique du rétrovirus JSRV ou avec son ADNc complémentaire. - 1'ADN caractérisé en ce qu'il comprend l'enchaînement nucléotidique compris entre les nucléotides 2829 et 5438 correspondant au gène pol, ou une partie de cet enchaînement ayant la capacité d'hybrider spécifiquement avec 1'ARN génomique du rétrovirus JSRV ou avec son ADNc complémentaire. - l' ADN caractérisé en ce qu'il comprend l'enchaînement nucléotidique compris entre les nucléotides 5350 et 7194 correspondant au gène env,ou une partie de cet enchaînement ayant la capacité d'hybrider spécifiquement avec ltARN génomique du rétrovirus JSRV ou avec son ADNc. En particulier dans le gène env, on a identifié le gène codant pour la protéine de surface (SU) comprenant les nucléotides 5350 à 6483 et le gène codant pour la protéine transmembranaire comprenant les nucléotides 6484 à 7119. - l'ADN caractérisé en ce qu'il comprend l'enchaînement nucléotidique compris entre les nucléotides 7178 et 7449 correspondant à la séquence U3, ou une partie de cet enchaînement ayant la capacite d'hybrider spécifiquement avec l'ARN genomique du rétrovirus JSRV ou avec son ADNc. - 1'ADN caractérisé en ce qu'il comprend l'enchaînement nucléotidique compris entre les nucléotides 7450 et 7462 correspondant à la séquence R, ou une partie de cet enchaînement ayant la capacité d'hybrider spécifiquement avec l'ARN génomique du rétrovirus JSRV ou avec son ADNc. - l'ADN caractérisé en ce qu'il comprend l'enchaînement nucléotidique compris entre les nucléotides 14 et 126 correspondant à la séquence U5, ou une partie de cet enchaînement ayant la capacité d'hybrider spécifiquement avec l'ARN génomique du rétrovirus JSRV ou avec son ADNc. Les nucléotides initiaux et terminaux précités sont inclus dans les séquences identifiées. L'invention vise aussi les séquences d'ADN caractérisées en ce qu'elles codent pour les différentes protéines du rétrovirus JSRV et notamment les ADN suivants - 1'ADN caractérisé en ce qu'il code pour les séquences d'acides aminés du gène gag ou toute partie de ces séquences susceptibles d'être reconnues immunologiquement et de façon spécifique par des anticorps formés lors d'une infection par le rétrovirus JSRV dans une espèce donnée. - en particulier l'invention vise 1'ADN codant pour la p26 répondant à la définition précédente - 1'ADN caractérisé en ce qu'il code pour la protéase désignée par pro, ou toute partie de cette séquence susceptible d'être reconnue immunologiquement et de façon spécifique par des anticorps formés lors d'une infection par le rétrovirus JSRV dans une espèce donnée. Cette protéine est la protéase du virus JSRV. - 1'ADN caractérisé en ce qu'il code pour la séquence d'acides aminés désignée par pol, ou toute partie de cette séquence susceptible d'être reconnue immunologiquement et de façon spécifique par des anticorps formés lors d'une infection par le rétrovirus JSRV dans une espèce donnée. La protéine pol correspond & la réverse transcriptase (ou transcriptase inverse). - 1' ADN caractérisé en ce qu'il code pour la séquence d'acides aminés désignée par env, ou toute partie de cette séquence susceptible d'être reconnue immunologiquement et de façon spécifique par des anticorps formés lors d'une infection par le rétrovirus JSRV dans une espèce donnée. Cette protéine d'acides aminés correspond d la protéine d'enveloppe. Elle se présente dans le virus à l'état de glycoprotéine. En particulier il s'agit de l'ADN codant pour tout ou partie de la protéine de surface ou de la protéine transmembranaire. En particulier l'invention a pour but de protéger tout fragment d'ADN caractérisé en ce qu'il code pour un enchaînement d'acides aminés capable de se comporter comme un déterminant antigénique chez un hôte animal auquel il est administré. Dans le cadre de l'invention, un déterminant antigénique, encore appelé épitope, est capable de déclencher la production d'anticorps dirigés contre le JSRV chez un hôte animal auquel il est administré. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, un tel fragment d'ADN est de préférence i la fois spécifique du rétrovirus JSRV et caractérisé en ce que la protéine ou le peptide pour lequel il code n'est pas considéré comme une molécule "du soi" du point de vue immunologique et ce chez l'hôte chez lequel il est administré. De telles molécules "du soi" comprennent les antigènes d'éventuelles formes endogènes de virus proches de JSRV exprimées chez un hôte donné. Avantageusement de tels fragments sont choisis parmi ceux qui codent pour des déterminants qui n'entraînent pas chez l'hôte une tolérance conduisant i une anergie et/ou une délétion clonale des cellules T spécifiques des épitopes du JSRV. De même de tels déterminants antigéniques sont avantageusement dépourvus de réactions immunologiques croisées avec des antigènes tumoraux développés & la suite de l'infection par le JSRV. L'invention concerne également les séquences d'acides aminés isolées répondant aux différentes définitions suivantes - une séquence caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchaînement d'acides aminés gag, ou toute partie de cet enchaînement susceptible de donner lieu à une réaction immunologique spécifique avec des anticorps dirigés contre le rétrovirus JSRV, en particulier chez des animaux de la famille des ovins, infectés par le JSRV, il s'agit en particulier de la protéine p26. L'enchaînement gag comprend aussi une protéine NBP ou protéine de liaison de l'acide nucléique, d'un poids moléculaire d'environ 14 kD commençant à la position du nucléotide 1694 et une protéine d'environ 4 kD. - une séquence caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchaînement de la protéine pro (protéase), ou toute partie de cet enchaînement susceptible de donner lieu & BR --une séquence caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchaînement d'acides aminés pol, ou toute partie de cet enchaînement susceptible de donner lieu à une réaction immunologique spécifique avec des anticorps dirigés contre le rétrovirus JSRV, en particulier chez des animaux de la famille des ovins, infectés par le JSRV. - une séquence caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchaînement d'acides aminés env, ou toute partie de cet enchaînement susceptible de donner lieu i une réaction immunologique spécifique avec des anticorps dirigés contre le rétrovirus JSRV, en particulier chez des animaux de la famille des ovins, infectés par le JSRV, il s'agit en particulier de la protéine de surface et de la protéine transmembranaire. Avantageusement la protéine env est sous forme glycosylée. Elle est produite sous la forme d'un précurseur non glycosylé ayant un poids moléculaire d'environ 69,3 kD (PR 69 env). L'enchaînement env comprend la glycoprotéine de surface SU de poids moléculaire calculé d'environ 46 kD, sous forme glycosylée (gp46) et mature, ainsi que la glycoprotéine transmembranaire mature dont le poids moléculaire calculé est d'environ 31 kD. A l'intérieur de ce groupe de séquences, l'invention concerne de préférence les différentes séquences d'acides aminés correspondant aux enchaînements décrits ci-dessus, sous leur forme glycosylée ou non. L'invention concerne également des anticorps caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement une séquence d'acides aminés répondant & l'une des définitions précédentes. Ces anticorps sont d'une part des anticorps polyclonaux et d'autre part des anticorps monoclonaux. Par reconnaissance immunologique spécifique dans le cadre de l'invention et ce pour les séquences d'acides aminés ou les anticorps, on entend le fait que ces séquences d'acides aminés ou ces anticorps de 1'invention sont capables de former un complexe immunologique du type antigène-anticorps avec respectivement les anticorps induits par le rétrovirus JSRV ou ses protéines, mais sont au contraire dépourvus de réaction respectivement avec des anticorps ou des séquences protéiques présents naturellement chez l'hôte testés ou du fait de la formation d'une tumeur de type carcinome épithélial due au JSRV. Par conséquent ces anticorps particulièrement intéressants sont ceux qui permettent de détecter une infection spécifique par le JSRV et qui ne réagissent pas pour former un complexe immunologique avec des antigènes ayant des épitopes communs avec ceux du JSRV, mais appartenant à des antigènes "étrangers" au JSRV, notamment des antigènes de formes endogènes du JSRV. En d'autres termes de tels anticorps sont spécifiques de la forme exogène du JSRV. L'invention vise également une composition pour le diagnostic in vitro d'une infection par le rétrovirus JSRV dans un prélèvement biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'acides aminés répondant à l'une des définitions cidessus. La glycoprotéine d'enveloppe est ainsi particulièrement intéressante pour ces compositions. Une telle composition peut être mise en oeuvre pour rechercher dans un prélèvement biologique des anticorps spécifiques de la forme exogène du JSRV, anticorps signalant la présence de l'infection par ce rétrovirus. Les prélèvements biologiques utilisés pour réaliser ce diagnostic, peuvent être constitués par tout échantillon de fluide biologique, notamment tout échantillon de sang ou de sérum. Il peut s'agir également d'exudat pulmonaire, de sécrétions de glandes mammaires (lait, col-ostrum). Une autre composition pour le diagnostic in vitro de la présence d'antigènes spécifiques du rétrovirus JSRV, dans un prélèvement biologique, est caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps selon l'une des définitions données précédemment. Une telle composition offre la possibilité de réaliser une immuno-capture des antigènes viraux du JSRV, par des anticorps dirigés contre des antigènes spécifiques de la forme exogène du JSRV. Pour obtenir de tels anticorps spécifiques d'antigènes caractéristiques du rétrovirus JSRV et dépourvus de réaction avec des antigènes de l'hôte animal chez lequel on cherche i détecter l'infection par le rétrovirus ovin, on aura par exemple recours & BR JSRV avec lequel il est immunisé. En effet la présence éventuelle d'antigènes apparentés à ceux du JSRV avec lequel on réalise 1'immunisation, conduirait à l'absence de formation d'anticorps dirigés contre ces antigènes du JSRV, du fait de la tolérance immunitaire. A cet égard pour préparer les anticorps de l'invention, on pourra utiliser des animaux tels que la souris. D'autres moyens pour détecter la présence d'une infection par le JSRV consistent dans la détection de 1'ADN complémentaire ou de L'API génomique de la forme exogène du virus JSRV. A cet égard l'invention a pour objet une composition pour le diagnostic in vitro d'une infection par le rétrovirus JSRV, dans un prélèvement biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend des fragments d'ADN décrits dans les pages précédentes. Dans ce cas le prélèvement biologique testé peut être choisi parmi tout composant tissulaire de l'animal contenant des cellules. Une composition préférée pour rechercher l'ADN ou 1'ARN caractéristique du rétrovirus JSRV est caractérisée en ce qu'elle comprend des fragments d'ADN capables d'hybrider spécifiquement avec différentes régions de 1'ARN génomique du rétrovirus JSRV ou de l'ADNc dérivé de cet ARN, notamment dans des conditions permettant la réalisation d'une amplification génique de l'ARN ou de l'ADNc du rétrovirus JSRV. Des fragments intéressants pour l'utilisation comme amorces sont par exemple les deux fragments expressément précités (primer) qui appartiennent aux régions U3 et gag (figure 2). Les différentes techniques connues pour réaliser des amplifications géniques d'ARN ou d'ADN sont naturellement utilisables dans le cadre de diagnostic in vitro de l'infection par le JSRV. A cet égard on citera plus précisément les techniques décrites par CETUS (EP 0200362 et EP 0229701). On pourra également avoir recours à la "nested PCR" ou PCR nichée selon les techniques connues. Une composition particulièrement avantageuse pour la détection d'acides nucléiques spécifiques du JSRV comprend en outre une sonde répondant à la définition donnée plus haut. L'invention a aussi pour objet un kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par le rétrovirus JSRV, dans un prélèvement biologique, caractérisé en ce qu'il comprend - au moins une séquence d'acides aminés décrite ci-dessus dès lors qu'elle est susceptible de donner lieu & une réaction immunologique spécifique avec des anticorps formés contre le rétrovirus JSRV, ou une composition selon la description ci-dessus, - un témoin négatif constitué par un échantillon biologique de composition identique ou similaire & BR - des moyens pour détecter la réaction immunologique. Le témoin négatif utilisé peut être constitué par un échantillon biologique tel qu'obtenu & partir d'un animal apparenté du point de vue biologique et génétique å celui chez lequel on réalise le test, non infecté par le JSRV. Des moyens pour détecter la réaction immunologique de type antigène-anticorps sont par exemple constitués par des anticorps de type IgG susceptibles de réagir avec l'anticorps anti-JSRV complexé avec l'antigène du rétrovirus. Ces IgG sont avantageusement marquées, par exemple par un marqueur radioactif ou un marqueur enzymatique. L'invention vise aussi un kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par le rétrovirus JSRV, dans un prélèvement biologique, caractérisé en ce qu'il comprend - des anticorps ci-dessus décrits, - un témoin négatif constitué par un échantillon biologique de composition identique ou similaire & BR L'invention vise aussi un kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par le rétrovirus JSRV, dans un prélèvement biologique, caractérisé en ce qu'il comprend - des amorces d'ADN, d'ADNc ou d'ARN constituées par des fragments d'ADN décrits ci-dessus et/ou les séquences complémentaires de ces fragments d'ADN et/ou les ARN correspondants, - une polymérase par exemple thermostable, - une sonde ci-dessus décrite pour révéler la présence éventuelle d'un produit d'amplification génique, Entrent également dans le cadre de l'invention des compositions immunogènes caractérisées en ce qu'elles comprennent des séquences d'acides aminés choisies parmi les séquences décrites précédemment et spécifiques du rétrovirus ovin JSRV. La protéine pro (protéase) ou des peptides immunogènes de la protéase peuvent être avantageusement intégrés dans de telles compositions. Une composition immunogène peut aussi comprendre le rétrovirus JSRV sous forme inactivée, ou mort. De telles compositions peuvent être utilisées dans le cadre d'une vaccination des animaux susceptibles d'être atteints par le JSRV afin de prévenir l'infection. L'administration de telles compositions doit être réalisée de façon à permettre la production d'anticorps protecteurs contre le rétrovirus JSRV. A cet égard on pourra avoir recours à l'administration & BR Les protéines ou peptides de l'invention peuvent être obtenus par les techniques de synthèse chimique connues ou par la technique de l'ARN recombinant. De même les acides nucléiques de JSRV peuvent être produits par synthèse selon les méthodes classiques. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent également dans les exemples et les figures qui suivent - Fiqure 1 : représentation des clones ADNc caractérisés et séquencés en regard de leur localisation sur le génome de JSRV. Le clone PCR-gag a été obtenu par PCR après transcriptase inverse de 1'ARN génomique du virus en présence d'un oligonucléotide amorce spécifique, pris dans la région gag. L'amorce en amont est située dans la région U5. La polyadénylation se fait normalement loin du signal de polyadénylation. figure 2 : la séquence I présentée comporte 7462 nucléotides, son extrémité 5' est la première base de R dans le gène gag de JSRV, l'extrémité 3' est la dernière base de R marquant la fin du génome. Sa structure génétique est donc R-U5-gag-pro-pol-env-U3-R. Les abréviations citées correspondent aux définitions suivantes PBS : Site de liaison de l'amorce (Primer Binding Site) NBP : Protéine de liaison & l'acide nucléique (Nucleic acid Binding Protein) Amorce PCR gag (primer PCR gag) SA : Accepteur de fragment d'ARN épissé (Splice Acceptor) TM : Protéine transmembranaire (Transmembrane) SU : Protéine de surface (Surface Protein) PPT : Extrémité Poly-Purine (Poly Purine Tract) Amorce PCR U3 (Primer PCR U3) - Figure 3 : la figure 3 correspond à la carte de restriction de la séquence de JSRV. - Fiqure 4 : la figure 4 montre l'ARN Northern blot, extrait à partir d'un culot obtenu après lavage de poumons , purifié sur coussin, qui contient & la fois les antigènes de JS et de LV.La ligne JS+LV représente une sonde d'ADNc amorcée avec un oligo dT à partir de 1'ARN migré sur les 3 lignes.La ligne LV est une sonde ADN de SA320 (clone moléculaire de SA-OMVV de la souche MVV. La ligne MP est une sonde MPMV. Figure 5 : sédimentation d'un extrait de concentré JS+LV obtenu après purification au fréon et centrifugation sur gradient selon la description donnée dans les exemples. Détermination de la densité test RDP et analyse immunoblot pour détecter la présence de la p26 de JS et de la p25 de LV. H: fraction du pic de forte densité contenant l'antigène p26 de JSRV. L: fraction du pic de faible densité contenant l'antigène p25 de LV. - Figure 6 : analyse Western blot des fractions obtenues sur gradient après extraction au fréon et séparation à l'équilibre de densité. A: serum anti NPNV utilisé & la dilution 1:500 pour détecter la p26JS. B: serum anti MVV(p30) utilisé à une dilution 1:500 pour détecter p25LV. - Figure 7 : analyse Northern blot de l'ARN purifié à partir des fractions de forte (H) et de faible (L) densité contenant les particules JSRV et LV. La ligne J+L représente l'ARN poly A+ (100 ng) du culot de lavage des poumons non purifiés à l'équilibre de densité, contenant & la fois JSRV et LV comme le montre la figure 4. Les lignes H et L représentent 1'ARN poly A des fractions de forte et de faible densité respectivement, du gradient illustré sur la figure 5. Sous le bloc JS, une sonde d'ADNC amorcée avec un oligo dT & 1'ARN des fractions de forte densité a été utilisée. Sous le bloc LV, une sonde représentative de SA320, un clone moléculaire de SA-OMVV a été utilisé (Quérat et al Virology 175, 434-447). Figure 8 A : résultat d'un Northern blot de 1'ARN du culot de lavage de poumons JS, contenant & la fois JSRV et LV, hybridé avec l'insert du clone JS 46.1 (ligne 46.1) et avec une sonde spécifique de LV (ligne LV). B : ARN extrait (en utilisant la méthode GuHCl) & BR i la fois dans les lignes JS et LV). Les sondes étaient les clones 46.1 JS (ligne JS) et le clone moléculaire SA320 (ligne LV). Lambda représente une sonde lambda contre l'ADN lambda digéré par HindIII en tant que marqueur d'ADN. - Figure 9 : représentation schématique de l'organisation génétique du clone JS46.1 (la représentation n'est pas & l'échelle réelle) et des sites de restriction enzymatique. Figure 10 : alignement de la région env traduite du clone JS 46.1 et de celle du virus MMTV. Les deux tirets indiquent les résidus identiques et les tirets uniques les résidus homologues. L'alignement a été réalisé en utilisant la séquence de 97 acides aminés du clone JS 46.1 dans la région de l'enveloppe et les 688 résidus de la protéine d'enveloppe de MMTV en utilisant le programme Kanehisa et la matrice de données de mutation de Dayhof f. MATERIELS ET METHODES Production du virus et purification Le virus JSRV a été produit par injection intratrachèenne à des agneaux nouveaux-nes, de virus extrait au fréon, llextraction ayant été réalisée à partir de lavages de poumons préalablement lavés. Lorsque les moutons infectés ont présenté des signes cliniques avancés de la maladie, des lavages de poumons ont été faits avec un milieu de culture qui a été clarifié selon la description donnée par WERWOERD et al (Onderstepoort J. Vet. Res, 1983, 50, 309-316). Après décongélation, du fluorocarbone (2 volumes) (Fréon 113, Du Pont, Wilmington, Del) a été ajouté et le mélange a été agité pendant 3 minutes. Après séparation de phase dans un rotor Beckman JA20 (10 minutes, 10 000 rpm) le surnageant a été collecté et l'interphase a été à nouveau extrait une fois avec 0,1 N de chlorhydrate Tris (pH 7,5; 0,1 M NaCl; 0,001 N EDTA (TNE)).La phase aqueuse combinée a été déposée sur une couche de 2,5 ml de sucrose à 30% dans du TNE et centrifugée dans un rotor Beckman SW41 (1 heure, 35 000 rpm). Le culot a été resuspendu dans 1 ml de TNE et soit déposé sur un gradient de sucrose 20-488 dans un rotor SW41 (16 heures, 25 000 rpm) pour purification complémentaire, soit utilisé pour extraction d'ARN directement. Les gradients ont été fractionnés (fraction de 1 ml) et des échantillons ont été repris pour la détermination de leur densité (5 l), de l'activité transcriptase inverse (20 ?Ll) pour l'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide- sodium dodecyl sulfate (SDS PAGE, 15 1). Analyse protéique Des échantillons (15 l) ont été pris directement à partir des fractions du gradient et resuspendus dans 30 l d'un tampon de charge comprenant un échantillon 2 X Laemmli puis portés & ébullition pendant 5 minutes (LAEMMLI, U.K., 1970, Nature 227, 680-685 > . Les échantillons ont été séparés dans un gel (0,1% SDS, 12,5% acrylamide : bis- acrylamide (30:1)) en utilisant un appareil & gel Nini- Proteine II (Bio-Rad Laboratories) en utilisant le protocole décrit par le fabricant.L'électrophorese des protéines a été faite à 200 V pendant 30 minutes puis les protéines obtenues ont été transférées sur membrane de nitrocellulose (Schleicher et Schuell BA 83) en utilisant la cellule de transfert d'électrophorèse semi-sèche de Biod-Rad Laboratories & 5mA/cm2 pendant 18 minutes. Les sites de liaison non spécifiques sur la nitrocellulose ont été bloqués avec 3% de BSA/PBS pendant 1 heure. Les anticorps primaires constitués par, soit le sérum de chèvre anti-p27 de MPNV soit le sérum de lapin anti-p30 de NW ont été utilisés selon les proportions 1:500 dilué dans 3% BSA/PBS. L'incubation a été réalisée pendant 2-16 heures à température ambiante. Les filtres ont été lavés avec du PBS contenant 0,1% de Tween 20 (3 x 10 minutes). L'anticorps secondaire était soit un sérum contenant des IgG alcalines conjugées anti-chèvre ou anti-lapin (chaîne H et L) (Bio Sys) dans des proportions de 1:500 dilué dans 3% BSA/PBS. L'incubation a été faite pendant 1 heure puis les conjugués libres ont été éliminés par lavage selon la description précédente. Les filtres ont été plongés pendant 2 minutes dans un tampon de susbtrat (0,1 N chlorhydrate-Tris pH 9,5; 0,1 M NaCl; 0,5 N NgCl2 > avant d'ajouter un substrat fraichement préparé (45 gel NBT et 35 Ctl BCIP (Promega) dans 10 ml de tampon substrat). La réaction a été arrêtée par rincage des filtres à l'eau du robinet pendant 5 minutes. Extraction d'ARN Une extraction avec du chloroforme/chlorophénol a été utilisée pour purifier l'ARN viral à partir du virus JSRV semi-purifié. Les fractions sélectionnées à partir des résultats de Western Blot ont été combinées, diluées avec 2,5 volumes de TNE et centrifugées dans un rotor Beckman SW 50,3 (40 minutes, 40 000 rpm). Les culots de centrifugation ont été resuspendus dans 400 l TNE (volume final) et digérés avec 10 g de protéinase K en présence de 0,58 SDS (15 minutes, 37 C). Après l'extraction au phénol/chloroforme, l'ARN a été précipité avec du NaCl 0,15M et 2,5 volumes d'éthanol (-200C, 16 heures).Après centrifugation (30 minutes, 10 000g, 4 C) l'ARN a été resuspendu dans 500 l de 0,5 M LiCl, Tris-chlorhydrate pH 7,5 lOniN, EDTA lmM et purifié en utilisant une colonne de cellulose oligo dT. Le virus non purifié a été repris sur un coussin de sucrose, resuspendu dans'200 îl TNE et l'ARN a été extrait selon la méthode décrite par SAMBROOK et al (1989 "Molecualr cloning : A laboratory manual" 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory). En résumé un mélange GuSCN (4 M GuSCN, 1M Tris-hydrochlorure pH 7,5; 1% 2 B-Mercapto- ethanol) a été ajouté au virus pour obtenir un volume final de 1215 l.Après addition de 135 il 5% sarcosyle de sodium, le mélange a été déposé sur une solution de 5,4 M CsCl et centrifugé dans un rotor Beckamn SW 50,1 (20 heures, 40 000 rpm, 200C > . Le culot d'ARN a été dissous dans 0,5 M LiCl/Trischlorhydrate pH 7,5; EDTA 1mM (TE) et l'ARN polyadénylé a été purifié sur une colonne de cellulose oligo dT (Type 3, Collaboration Research Incorporated). Test de l'activité transcriptase inverse Des échantillons (20 l) ont été pris directement & partir des gradients fractionnés à l'équilibre de densité et ajoutés à 55 ?l d'un mélange test selon la description de YORK et al, 1989, Virology 171, 394-400. Analyse de l'ARN Les échantillons d'ARN ont été séparés dans de l'agarose 1% contenant 7,2% de formaldéhyde (37-40%) et 1 x NOPS (0,2 M) contenant 5 mM d'acétate de sodium et 1 mM EDTA pH 7,0 selon la description de QUERAT et al, 1987, Virology 158, 158-167. L'ARN (long) dans 3 l a été mélangé avec 9 l de tampon de charge, chauffé pendant 10 minutes à 68 C, puis chargé. L'électrophorèse a été réalisée en 2,5 heures à 100 V/2,5 mA. 150ng d'ADN lambda digéré au site HindIII a été dissous dans un tampon de charge d'ARN et traité de la même façon que les échantillons d'ARN. Les échantillons d'ARN ont été transférés sur une membrane de nylon (Amersham, Hybond N) conformément à la description de THOMAS, 1980, Proc. Natl. Aca. Sci. USA 77, 5201-5205 et fixés sur une membrane par exposition aux radiations W pendant 5 minutes. Une préhybridation a été faite pendant 4 heures & 42iC dans un mélange de préhybridation contenant 5 x SSPE, 50% formamide (v/v), 0,1% SDS, 50 yg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé. Les sondes ont été ajoutées au mélange de préhybridation frais, contenant 10% de sulfate de dextrane (w/v) et hybridées pendant 20 heures à 42'C sous agitation douce. Les répliques Northern (Northern blots) obtenues ont été rincées dans 3 solutions de 2 x SSPE suivies par les lavages suivants : 15 minutes 2 x SSPE contenant 0,1% SDS & 420C répété une fois puis 15 minutes dans 0,1 x SSPE, 0,1% SDS à 42-C et finalement pendant 15 minutes dans 0,1% SSPE contenant 0,1% SDS & BR Southern étaient celles des répliques Northern avec un lavage supplémentaire dans 0,1% SSPE contenant 0,1% SDS à 550C sauf indication contraire. Les filtres ont été ensuite exposés pendant 1 nuit à un film Kodak X-Omat S à -70'C, en sandwich entre 2 écrans intensifiants. Préparation des sondes Des sondes d'ADNc marquées radioactivement ont été préparées par transcription inverse de l'ARN viral natif polyadénylé. En résumé 1'ARN poly A+ (100ng) a été ajouté & 20 l de mélange de test de transcriptase inverse contenant 10 mM acétate de magnésium, 10 mM dithiothreitol, 10 mM Tris-chlorhydrate pH 8,2; 50 mx KC1; 200 M dATP; dGTP; dTTP; 10 îN dCTP, 100ng oligo (dT) (P-L Biochemicals); 20 unités de transcriptase inverse Beard (Life Science Inc); 0,5 unités d'ARNase block II (Stratagene) et 60 yCi de (&alpha;-32p) dCTP 3000 Ci/mmol (Amersham Int. Plc). Les échantillons ont été incubés pendant 2 heures & 42*C avant que la réaction ne soit arrêtée avec 2,5 l (20% SDS) et 10 l (0,2 N EDTA).Après digestion avec long de protéinase K à 42"C, le mélange a été dénaturé avec 0,25 N de NaOH (46C, 30 minutes), neutralisé puis extrait avec un volume égal de phénol/chloroforme. L'ADNc a été précipité avec de l'éthanol et resuspendu dans du TNE. L'activité spécifique finale de la sonde était environ 107 cpm/yg. Les sondes d'ADN ont été préparées par polymérisation d d'ADN par initiation multiple en utilisant des hexanucléotides en tant qu'amorces, la polymérisation est en fait au hasard, en présence de (a-32P) dCTP (3000 CI/mmol) et du grand fragment de 1'ADN polymérase de E.coli tel que décrit dans FEINBERG et al, 1983, Anal. Biochem. 132, 6-13 et FEINBERG et al, 1984, Anal. Biochem. 137, 266-267. La spécificité finale des sondes ainsi obtenues était d'environ 5 x 108 cpm/jg. Clonage de JSRV L'ADNc a été synthétisé à partir du pic d'ARN viral à forte densité en utilisant un kit de synthèse d'ADNc (Amersham) conformément à la procédure décrite pour la réaction de 1 g dans les instructions du fabricant. L'ADNc, environ 50ng, a été ligaturé à des séquences de liaison (linkers) Eco.RI phosphorylées (Promega) digéré avec Eco.RI et purifié par élution & BR JSRV digéré par Eco.RI ont été ligaturés à 1 g de fragment (bras) lambda Zap II Eco.RI prédigéré/phosphorylé au niveau de Eco.RI puis encapsidé en utilisant un extrait d'encapsidation Gigapack II selon ce qui est décrit par le fabricant (Stratagene). Les plaques positives ont été identifiées par criblage des répliques sur nylon des plaques étalées en utilisant des sondes d'ADNc obtenues à partir d'une amorce d'oligo dT à partir d'ARN isolé des fractions à forte densité du pic de gradient de sucrose, riches en JSRV. Les conditions d'hybridation et de lavage ont été celles décrites pour les Northern blots. Les plasmides recombinants bluescript (phagemides) ont été produits in vivo en utilisant R408 comme phage auxiliaire, suivant le protocole décrit par le fournisseur (Stratagene). Des préparations en grande quantité du plasmide ont été faites et purifiées en utilisant la méthode de lyse alcaline suivie d'une purification sur gradient de CsCl comme le décrit SAMBROOK et al, 1989 Molecular cloning : A laboratory manual" 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory. RESULTATS Identification de 1'ARN des virus JS et LV La source principale du rétrovirus JSRV était constituée par des lavages de poumons de moutons infectés expérimentalement avec JSRV, ce rétrovirus étant souvent associé dans des tests sérologiques avec un lentivirus (LV). LV est utilisé dans le contexte de cette invention pour représenter au sens large tous les isolats ovins de NVV. Le test sérologique utilisé met en oeuvre la technique de Western blot et les sérums contre les antigènes spécifiques de groupes, de NPNV et LV. Cette technique a permis d'identifier et de distinguer les virus JSRV et LV respectivement. Sharp et al 1983 J Gen Virol 64, 2223-2227 ont décrit qu'un sérum anti-MPNV p27 réagit avec la protéine de 26 kD du JSRV (JS p26).On rappelle que XPXV est l'abréviation anglaise du virus de singe de Mason Pfizer (Nason Pfizer Monkey Virus). Ce sérum ne donne pas de réaction croisée avec les protéines de LV alors qu'un sérum anti-p30 de LV réagit uniquement avec la protéine de 25 kD de LV (LV p25) Vigne et al 1982 J. Virol 42, 1046-1056 et ne réagit pas de façon croisée avec les antigènes JSRV. L'ARN polyadénylé a été extrait & partir de culot partiellement purifié obtenu par lavage de poumons de moutons (extraction au fréon et passage sur un coussin de sucrose 308) contenant & la fois JS et LV, puis a été analysé par la technique de Northern blot. Pour identifier les bandes ARN, une sonde d'ADNc obtenue avec une amorce oligo dT à partir du même ARN a été utilisée. Deux bandes d'ARN correspondant à la taille envisagée du génome du rétrovirus ont été observées sur chaque côté du marqueur lambda digéré avec HindIII et comportant 9,4 kb (figure 4; ligne JS + LV). L'utilisation d'une sonde spécifique de LV au niveau de la ligne JS + LV a révélé que la bande d'ARN supérieure correspond à l'ARN génomique de LV (figure 4; ligne LV). Cependant, l'utilisation d'une sonde spécifique de MPMV sur le même ARN n'a conduit à aucune hybridation même dans des conditions de faible stringence (figure 4; ligne MP). L'empreinte la moins intense présente sur la ligne JS + LV correspond aux ARN ribosomaux 28 et 18 S, présents à de fortes concentrations dans les préparations d'ARN faites & partir de virus partiellement purifiés, même après sélection avec la sonde oligo dT. Ces résultats ont permis d'envisager que la bande d'ARN inférieure, correspondant & environ 8,7 kb (poids moléculaire lu) représentait 1'ARN génomique de JSRV. Ce résultat a été vérifié par purification complémentaire des virus. Analyse de l'ARN après séparation & l'équilibre de densité des deux virus On a montré que JSRV et LV présentaient des densités différentes lorsqu'ils étaient séparés sur des gradients de sucrose 20-50% à l'équilibre de densité. JSRV avait une densité légèrement supérieure à celle de LV. On a maintenant effectué une séparation de leurs ARN génomiques. La figure 5 montre la densité sur sucrose et les profils d'activité de 1'ARN dépendante de l'ADN polymérase (RDP), lorsqu'un échantillon obtenu par lavage des poumons contenant JS + LV a été séparé i l'équilibre de gradient et les fractions sélectionnées analysées. Les échantillons de chaque fraction ont également été testés pour la protéine p26 de JS la protéine p25 de LV par la technique de Western blot (figure 6). Deux pics RDP ont été observés. L'un présente une densité plus forte et il correspond à une plus forte intensité de la p26 de JSRV (figure 6A, fractions 3, 4 et 5). Ces fractions ont été désignées par régions de forte densité (H) (f (figure 5).Un second pic d'activité RDP correspondait aux fractions dans lesquelles la p25 de LV était la plus intense (figure 6, fractions 6, 7 et 8). Ces fractions sont désignées comme les régions de plus faible densité (L) (figure 5). Lorsque des concentrations équivalentes d'ARN isolé la la fois des fractions H et des fractions L ont été testées avec une sonde d'ADNc obtenue avec une amorce oligo dT à partir de l'ARN des fractions de forte densité (H) (figure 4, bloc JS, lignes H et L) et une sonde spécifique des lentivirus (figure 4, bloc LV, ligne H et L), des fractions de forte densité contenant JSRV contenaient plus d'ARN de 8,7 kb que les fractions de faible densité LV. La sonde spécifique des lentivirus a détecté l'ARN génomique de 9,4 kb de façon plus importante dans les fractions de faible densité du gradient.Comme 1'ARN de 8,7 kb est le plus souvent associé avec le pic d'activité de transcriptase inverse forte forte densité la ou la p26 de JSRV est la plus intense, on a pu conclure qu'il représente l'ARN génomique de JSRV. De plus les fractions de forte densité qui contiennent JSRV sont presque dépourvues d'ARN génomique de lentivirus. Clonage de l'ADNc L'ARN poly A+ de JS, obtenu à partir d'extraits de lavages pulmonaires sérologiquement sélectionnés pour leur forte quantité de JSRV par rapport aux lentivirus, s'est révélé après analyse contenir principalement de 1'ARN de 8,7kb. L'ADNc obtenu à partir d'une amorce oligo (dT), a été fait à partir de cette préparation riche en ARN de 8,7 kb (sélection sur colonne de cellulose oligo (dT) à partir des fractions de forte densité), et après ligation d'un linker Eco.RI et digestion parEco.RI, l'ADNc a été cloné au site Eco.RI du vecteur de clonage lambda Zap Il. Comme la quantité était limitée 1'ADNc n'était pas méthylé. Lorsque la bande d'ADNc a été criblée en utilisant la sonde d'ADNc obtenue avec une amorce oligo (dT) i partir de cet ARN poly A, un nombre de clones positifs a été isolé. Le clone contenant le plus grand insert a été sélectionné, caractérisé et séquencé et a permis de localiser un insert de 2,1 kb. Ce clone a été désigné par JS 46.1. Des sondes marquées radioactivement du clone JS 46.1 ont hybridé avec 1'ARN de 8,7 kb (figure 8A) de même qu'avec 1'ARN isolé à partir de 6 préparations différentes de JSRV obtenues à partir de moutons infectes expérimentalement et ayant également pour origine le même institut d'Afrique du Sud. L'extrait obtenu à partir d'un animal infecté naturellement avec JSRV en France, qui était sérologiquement dépourvu d'infection par LV, contenait et hybridait avec une bande d'ARN de taille identique (figure 8B) qui hybridait à la sonde JS 46.1, confirmant le rôle du virus JSRV et de 1'ARN génomique de 8,7 kb dans la maladie. A partir d'une carte de restriction enzymatique du clone JS 46.1, deux fragments Eco.RI-SacI et Eco.RI XhoI contenant environ 300 paires de bases chacun et représentant les extrémité 3' et 5' du clone, ont respectivement été isolés. Les sondes de ces deux fragments ont hybridé avec l'ARN de 8,7 kb confirmant que le clone entier était spécifique pour la même espèce d'ARN. Cependant les données relatives à la séquence du clone JS 46.1 ont révélé que l'insert était en fait composite (figure 9). Il consistait en un segment de 661 bp qui présentait les caractéristiques typiques de l'extrémité 3' des rétrovirus, c'est à dire une partir du gène env, dont une partie codant potentiellement pour 97 acides aminés, une séquence poly Purine, une séquence TATA et une extrémité poly A d'environ 60 nucléotides en longueur.Anormalement lié & cette séquence poly A, on trouve un fragment de 1520 bp qui présente une homologie avec le gène pol des autres rétrovirus. Ceci a été déterminé par comparaison de la séquence en acides aminés traduite & partir des deux segments JS 46.1 avec celle des autres rétrovirus. En accord avec les résultats sérologiques, le gène EtL de JSRV présentait la plus grande homologie avec les rétrovirus de type B et D. Cependant malgré cette homologie du fragment pol de JS 46.1 plus grande avec sa contrepartie chez les oncovirus de type B que chez les oncovirus de type D, la région env de JS 46.1 ne présentait pas d'homologie significative avec le gène env de MPNV ou de SRV-1. En particulier il ne présentait pas le peptide immunosuppresseur conservé qui est partagé par XPNV, le virus REV-A associé i la réticuloendothéliose et de nombreux autres rétrovirus de type C (SONIGO et al, 1986, Cell 45, 375-385).AU contraire le gene env de JS 46.1 est apparenté à MMTV (Mouse Nammary Tumour virus) (prototype type B) et au gène env du Rétrovirus Endogène Humain (HERV-K) (figure 10 > . DISCUSSION On a donc démontré que 1'ARN génomique du rétrovirus JSRV est constitué par un ARN de 8,7 kb. On a également vérifié que les particules de JSRV sont morphologiquement distinctes des lentivirus ovins. On a constaté de façon inattendue que l'insert de 2,1 kb était composite, consistant en une partie pol et une partie env/U3 liée anormalement à la séquence poly A. Il n'y avait pas de site ECO.RI ni aucun autre site de restriction par des enzymes, commun à l'endroit de la liaison entre les deux segments, ceci marquant l'existence d'une ligature franche, qui s'est produite pendant l'étape de ligature. La lise en évidence de sites ECO.RI "naturels" et de l'absence de séquences ECO.RI non associées aux linkers, aux extrémités 3' et 5' de l'insérat composite, implique l'existence d'au moins deux sites ECO.RI dans le génome JSRV c'est & BR RlVZNDICATIOMS 1/ Rétrovirus de type JSRV, ayant la capacité d'infecter les animaux notamment de la famille des ovins et en particulier les moutons, et capable de provoquer la formation d'une tumeur du type d'un carcinome épithélial, caractérisé par une séquence d'ADNc répondant à l'enchaînement I suivant ou un variant de ce rétrovirus, dont tous les antigènes sont reconnus par les anticorps formés contre les antigènes correspondants du rétrovirus répondant à la séquence d'ADNc I. GCTTGGTATCAGCCGTTCTGGTCTGATCCTCTCAACCCCATCTTTTGTCTTTCTCAGTTTCTTAGCGGGGACCGT 10 20 30 40 50 60 70 1 3 AGGAGGAGTAGTAAGGTATATAGTTGAGAGTATAAATATGGGTCTCTCGCATAGTCGTCAGTTGTTTGTGCATAT 235 245 255 265 275 285 295 1 2 LeuSerValMetLeuLysHisArgGlyIleThrValSerLysThrLysLeuIleAsnPheLeuSerPheIleGlu 3 GTTATCTGTAATGTTAAAACATAGGGGGATCACTGTTTCTAAAACTAAATTAATTAATTTTCTTTCATTTATTGA 310 320 330 340 350 360 370 1 2 GluValCysProTrpPheProArgGluGylThrValAsnLeuGluThrTrpLysLysValGlyGluGlnIleArg 3 GGAAGTTTGCCCTTGGTTTCCTAGGGAAGGCACAGTGAATTTGGAGACATGGAAGAAGGTGGGAGAGCAAATTCG 385 395 405 415 425 435 445 1 2 ThrHisTyrThrLeuHisGlyProGluLysValProValGluThrLeuSerPheTrpThrLeuIleArgAspGys 3 GACGCATTATACCTTACACGGCCCTGAAAAGGTCCCTGTCGAGACATTATCTTTTTGGACATTGATTCGTGACTG 460 470 480 490 500 510 520 1 2 LeuAspPheAspAsnAspGluLeuLysArgLeuGlyAsnLeuLeuLysGlnGluGluAspProLeuhisThrPro 3 CCTGGATTTTGATAATGATGAATTGAAACGTTTAGGAAATTTGTTAAAACAGGAAGAAGATCCTCTCCATACCCC 535 545 555 565 575 585 595 1 2 AspSerValProSerTyrAspProProProProProProProSerLeuLysMetHisProSerAspAsnAspAsp 3 TGATTCGGTACCTAGTTATGATCCTCCTCCTCCTCCTCCGCCATCTCTGAAAATGCACCCTTCTGATAATGATGA 610 620 630 640 650 660 670 1 2 SerLeuSerSerThrAspGluAlaGluLeuAspGluGluAlaAlaLysTyrHisGlnGluAspTrpGlyPheLeu 3 TTCACTTTCATCTACAGATGAGGCAGAATTAGACGAGGAAGCTGCTAAGTATCATCAAGAAGATTGGGGTTTTTT 685 695 705 715 725 735 745 1 2 AlaGlnGluLysGlyAlaLeuThrSerLysAspGluLeuValGluCysPheLysAsnLeuThrIleAlaLeuGln 3 AGCACAAGAAAAAGGGGCATTAACATCTAAAGATGAATTGGTTGAGTGCTTTAAAATCTTACTATTGCCTTACA 760 770 780 790 800 810 820 1 2 AsnAlaGlyIleGlnLeuProSerAsnAsnAsnThrPheProSerAlaProProPheProProAlaTyrThrPro 3 GAATGCAGGGATTCAGCTTCCTAGTAATAACAATACCTTTCCCTCTGCTCCGCCTTTTCCTCCTGCTTATACTCC 835 845 855 865 875 885 895 l 2 ThrValMetAlaGlyLeuAspProProProGlyPheProProProSerLysHisMetSerProLeuGlnLysAla 3 CACTTGTTATGGCTGGCCTTGATCCCCCTCCCGGGTTTCCTCCGCCGTCTAAACATATGTCTCCATTGCAAAAGGC 910 920 930 940 950 960 970 ATTAAGACAGGCACAACGACTCGGTGAAGTTGTTTCTGATTTCTCTCTTGCCTTTCCTGTCTTCGAAAATAACAA 985 995 1005 1015 1025 1035 1045 1 2 GlnArgTyrTyrGlySerLeuProPheLysGlnLeuLysGluLeuLysIleAlaCysSerGlnTyrGlyProThr 3 1 2 AlaProPheThrIleAlaMetIleGluSerLeuGlyThrGlnAlaLeuProProAsnAspTrpLysGlnThrAla 3 2 ArgAlaCysLeuSerGlyGlyAspTyrLeuLeuTrpLysSerGlyPhePheGluGlnCysAlaArgIleAlaAsp 3 TAGGGCATGTCTCTCAGGGGGAGATTATTTATTATGGAAATCTGAATTTTTTGAACAATGTGCTCGTATAGCTGA 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1 2 ValAsnArgGlnGlnGlyIleGlnThrSerTyrGluMetLeuIleGlyGluGlyProTyrGlnAlaTrhAspThr 3 TGTTAACCGACAGCAAGGTATACAGACCTCCTATGAAATGTTGATTGGCGAAGGCCCTTATCAGGCTACTGATAC 1285 1295 1305 1405 1415 1425 1435 1 2 GlnLeuAsnPheLeuProGlyAlaTyrAlaGlnIleSerAsnAlaAlaArgGlnAlaTrpLysLysLeuProSer 3 GCAGCTTAATTTCTTACCTGGTGCATATGCACAAATATCGAATGCGGCTCGACAGGCATGGAAAAAACTTCCTAG 1360 1370 1380 1390 1400 1410 1420 1 2 SerSerThrLysThrGluAspLeuSerLysValArgGlnGlyProAspGluProTyrGlnAspPheValAlaArg 3 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1 AsnSerLeuTyrLeuGlnProAsnIleSerGlyThrLysTyrGlyAspValGlyValThrGlyPheLeuTyrPro 2 3 AATAGCCTGTATTTACAGCCCAATATTAGCGGAACCAAATATGGTGATGTGGGAGTTACAGGATTTTTATATCCC 6160 6170 6180 6190 6200 6210 6220 1 ArgAlaCysValProTyrProPheMetLeuIleGlnGlyHisMetGluIleThrLeuSerLeuAsnIleTyrHis 2 3 CGAGCTTGTGTTCCTTACCCATTCATGTTGATACAAGGCCATATGGAAATAACGCTGTCATTAAATATTTATCAT 6235 6245 6255 6265 6275 6285 6295 1 LeuAsnCysSerAsnCysIleLeuThrAsnCysIleArgGlyValAlaLysGlyGluGlnValIleIleValLys 2 3 CTAAACTGTTCTAATTGTATACTTACTAACTGTATTAGAGGAGTAGCCAAAGGAGAACAAGTTATCATAGTAAAA 6310 6320 6330 6340 6350 6360 6370 1 GlnProAlaPheValMetLeuProValGluIleAlaGluAlaTrpTyrAspGluThrAlaLeuGluLeuLeuGln 2 3 CAGCCTGCTTTTGTAATGCTGCCCGTTGAAATAGCTGAAGCATGGTATGACGAGACTGCTTTAGAATTATTACAA 6385 6395 6405 6415 6425 6435 6445 3 CGTATTAATACGGCTCTTAGCCGTCCTAAGAGAGGCTTGAGCCTAATTATCCTGGGTATAGTATCTTTAATCACC 6460 6470 6480 6490 6500 6510 6520 1 LeuIleAlaThrAlaValThrAlaCysValSerLeuAlaGlnSeIleGlnAlaAlaHisThrValAspSerLeu 2 3 CTAATAGCTACTGCTGTTACGGCTTGCGTATCTTTAGCACAATCCATTCAAGCTGCACATACAGTGGATTCCTTA 6535 6545 6555 6565 6575 6585 6595 1 SerTyrAsnValThrLysValMEtGlyThrGlnGluASpIleAspLysLysIleGluAspArgLeuSerAlaLeu 2 3 TCATATAATGTTACTAAAGTAATGGGAACTCAAGAGGATATAGATAAGAAAATAGAAGATAGGTTATCAGCTCTG 6610 6620 6630 6640 6650 6660 6670 1 TyrAspValValArgValLeuGlyGluGlnValGlnSerIleAsnPheArgMetLysIleGlnCysHisAlaAsn 2 3 TATGATGTAGTTAGAGTCCTAGGAGAACAAGTTCAGAGCATTAATTTTCGCATGAAAATCCAGTGTCATGCTAAT 6685 6695 6705 6715 6725 6735 6745 1 TyrLysTrpIleCysValThrLysLysPRoTyrAsnThrSerAspPheProTrpASpLysValLysLysHisLeu 2 3 TATAAATGGATTTGTGTTACAAAAAAGCCTTATAATACTTCTGATTTTCCATGGGATAAAGTAAAAAAACATTTG 6760 6770 6780 6780 6800 6810 6820 1 GlnGlyIleTrpPheAsnThrAsnLeuSerLeuASpLeuLeuGlnLeuHisAsnGluIleLeuAspIleGluAsn 2 3 CAAGGAATTTGGTTCAATACTAATCTATCGTTAGATCTTTTACAACTACATAATGAAATTCTTGACATTGAGAAT 6835 6845 6855 6865 6875 6885 6895 1 SerProLysAlaThrLeuAsnIleAlaAspThrValAspAsnPheLeuGlnAsnLeuPheSerAsnPheProSer 2 3 TCGCCAAAGGCTACCTTAAATATAGCCGATACCGTCGATAATTTCTTGCAAAATTTATTTTCTAATTTCCCTAGT 6910 6920 6930 6940 6950 6960 6970 1 LeuHisSerLeuTrpLysThrLeuIleGlyLeuGlyIlePheValIleIleIleAlaIleValIlePheValPhe 2 3 CTTCATTCATTGTGGAAAACCCTGATCGGTCTAGGAATATTTGTGATAATTATTGCTATCGTAATCTTTGTATTT 6985 6995 7005 7015 7025 7035 7045 1 ProCysValValArgGlyLeuValArgAspPheLeuLysMetArgValGluMetLeuHisMetLysTyrArgThr 2 3 CCCTGTGTCGTTCGTGGTCTCGTTCGTGATTTTTTAAAGATGAGAGTTGAAATGCTACATATGAAATATAGAACT 7060 7070 7080 7090 7100 7110 7120 1 2 3 3 AGGATTCTTGAAAGCTCTTAAGGTTCGGATGTTTGCTGCCGGCATTACTTCACAGAAATGACGGGAAATCTGATT 7285 7295 7305 7315 7325 7335 7345 2 3 ATGTAAGAATCCGGTGATTGTGTAAAAATCCGGTGGGTGTAGTTTGAGATGAATAAACAGGTTATGTAATGTACT 7360 7370 7380 7390 7400 7410 7420 1 2/ Acide nucléique purifié caractéristique du génome du rétrovirus JSRV tel qu'obtenu par mise en oeuvre des étapes suivantes & partir d'un échantillon semi-purifié de lavage de poumons de moutons infectés par un rétrovirus JSRV - extraction au phénol/chlorophorme, - précipitation de 1'ARN de l'échantillon en présence de NaCl 0,15 N et 2,5 volumes d'éthanol pendant 16h à -200C, - centrifugation de l'ARN précipité, pendant 30 minutes à 10000 g à 4 C, - suspension de l'ARN obtenu par centrifugation dans 500 1 d'un mélange, 0,5 M Licol; Trischlorhydrate, pH 7,5, 10 mM; EDTA lmM et - purification sur une colonne de cellulose oligo (dT), - récupération de la fraction d'ARN polyadénylé correspondant à une bande d'environ 8,7 kb. 3/ Séquence d'ADN caractérisée en ce qu'elle correspond à l'ARN génomique du rétrovirus JSRV, cette séquence répondant à l'enchaînement I. 4/ Séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle hybride dans des conditions stringentes avec l'ARN génomique du rétrovirus JSRV selon la revendication 2 ou avec l'ÂDNc selon la revendication 3, ou encore avec une séquence d'ADN complémentaire de l'ADNc selon la revendication 3. 5/ Séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchaînement nucléotidique I, ou toute partie de cet enchaînement hybridant dans des conditions stringentes avec l'ARN génomique du rétrovirus JSRV selon la revendication 2 ou avec l'ADNc selon la revendication 3 6/ Séquence d'ADN selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'en outre elle n'hybride pas dans des conditions stringentes avec 1'ADN du génome de cellules animales non infectées par le JSRV. 7/ Séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisée en ce qu'elle est sous forme d'ADN double brin. 8/ Fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend un enchaînement d'au w ins 10 de préférence d'au moins 15 nucléotides d'une séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, ledit fragment étant le cas échéant marqué. 9/ Fragment d'ADN selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les suivants: AGTCCTGGGAGCTCTTTGG AATGGAGCGGTAGGACCA 10/ ADN selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend l'enchaînement nucléotidique compris entre les nucléotides 263 et 2098 correspondant au gène gag, ou une partie de cet enchaînement ayant la capacité d'hybrider spécifiquement avec 1'ARN génomique du rétrovirus JSRV selon la revendication 1 ou avec son ADNc. 11/ ADN selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend l'enchaînement nucléotidique compris entre les nucléotides 1882 et 2859 correspondant au gène pro, ou une partie de cet enchaînement ayant la capacité d'hybrider spécifiquement avec 1'ARN génomique du rétrovirus JSRV selon la revendication 1 ou avec son ADNc. 12/ ADN selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend l'enchaînement nucléotidique compris entre les nucléotides 2829 et 5438 corespondant au gène pol, ou une partie de cet enchaînement ayant la capacité d'hybrider spécifiquement avec 1'ARN génomique du rétrovirus JSRV selon la revendication 1 ou avec son ADNc. 13/ ADN selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend l'enchaînement nucléotidique compris entre les nucléotides 5350 et 7194 corespondant au gène env, ou une partie de cet enchaînement ayant la capacité d'hybrider spécifiquement avec 1'ARN génomique du rétrovirus JSRV selon la revendication 1 ou avec son ADNc. 14/ ADN selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend l1enchaînement nucléotidique compris entre les nucléotides 7178 et 7449 correspondant å la séquence U3, ou une partie de cet enchaînement ayant la capacité d'hybrider spécifiquement avec 1'ARN génomique du rétrovirus JSRV selon la revendication 1 ou avec son ADNc. 15/ ADN selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend l'enchaînement nucléotidique compris entre les nucléotides 7450 et 7462 correspondant & la séquence R, ou une partie de cet enchaînement ayant la capacité d'hybrider spécifiquement avec 1'ARN génomique du rétrovirus JSRV selon la revendication 1 ou avec son ADNc. 16/ ADN selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend l'enchaînement nucléotidique compris entre les nucléotides 14 et 126 correspondant à la séquence U5, ou une partie de cet enchaînement ayant la capacité d'hybrider spécifiquement avec 1'ARN génomique du rétrovirus JSRV selon la revendication 1 ou avec son ADNc. 17/ ADN du rétrovirus JSRV, caractérisé en ce qu'il code pour la séquence d'acides aminés gag, ou toute partie de cette séquence susceptible d'être reconnue immunologiquement et de façon spécifique par des anticorps formés contre le rétrovirus JSRV selon la revendication 1. 18/ ADN du rétrovirus JSRV, caractérisé en ce qu'il code pour la séquence d'acides aminés pro, ou toute partie de cette séquence susceptible d'être reconnue immunologiquement et de façon spécifique par des anticorps formés contre le rétrovirus JSRV selon la revendication 1. 19/ ADN du rétrovirus JSRV, caractérisé en ce qu'il code pour la séquence d'acides aminés pol, ou toute partie de cette séquence susceptible d'être reconnue immunologiquement et de façon spécifique par des anticorps formés contre le rétrovirus JSRV selon la revendication 1. 20/ ADN du rétrovirus JSRV, caractérisé en ce qu'il code pour la séquence d'acides aminés env, ou toute partie de cette séquence susceptible d'être reconnue immunologiquement et de façon spécifique par des anticorps formés contre le rétrovirus JSRV selon la revendication 1. 21/ ADN selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce qu'il code pour un enchaînement d'acides aminés capable de se comporter comme un déterminant antigénique. 22/ Séquence d'acides aminés, caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchaînement d'acides aminés gag, ou toute partie de cet enchaînement susceptible de donner lieu i une réaction immunologique spécifique avec des anticorps dirigés contre le rétrovirus JSRV selon la revendication 1, en particulier chez des animaux de la famille des ovins, infectés par le JSRV. 23/ Séquence d'acides aminés selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les protéines p26, p14 ou p4. 24/ Séquence d'acides aminés, caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchaînement d'acides aminés pro, ou toute partie de cet enchaînement susceptible de donner lieu i une réaction immunologique spécifique avec des anticorps dirigés contre le rétrovirus JSRV selon la revendication 1, en particulier chez des animaux de la famille des ovins, infectés par le JSRV. 25/ Séquence d'acides aminés, caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchaînement d'acides aminés pol, ou toute partie de cet enchaînement susceptible de donner lieu à une réaction immunologique spécifique avec des anticorps dirigés contre le rétrovirus JSRV selon la revendication 1, en particulier chez des animaux de la famille des ovins, infectés par le JSRV. 26/ Séquence d'acides aminés, caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchaînement d'acides aminés env, ou tout ou partie de cet enchaînement susceptible de donner lieu à une réaction immunologique spécifique avec des anticorps dirigés contre le rétrovirus JSRV selon la revendication 1, en particulier chez des animaux de la famille des ovins, infectés par le JSRV. 27/ Séquence d'acides aminés selon la revendication 26, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les glycoprotéines gp46 ou gp31 ou le précurseur PR 69 env. 28/ Séquence d'acides aminés, caractérisée en ce qu'elle répond & l'enchaînement selon l'une quelconque des revendications 22 & à 29/ Séquence d'acides aminés selon l'une quelconque des revendications 22 à 28, caractérisée en ce qu'elle permet la production d'anticorps protecteurs contre le rétrovirus JSRV,chez un animal donné. 30/ Anticorps, caractérisé en ce qu'il reconnait spécifiquement une séquence d'acides aminés selon l'une quelconque des revendications 22 & 29. 31/ Anticorps selon la revendication 30, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps monoclonal. 32/ Composition pour le diagnostic in vitro d'une infection par le rétrovirus JSRV dans un prélèvement biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'acides aminés selon 1'une quelconque des revendications 22 à 29. 33/ Composition pour le diagnostic in vitro de la présence d'antigènes spécifiques du rétrovirus JSRV, dans un prélèvement biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps selon l'une quelconque des revendications 30 ou 31. 34/ Composition pour le diagnostic in vitro d'une infection par le rétrovirus JSRV, dans un prélèvement biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend des fragments d'ADN selon la revendication 9 ou la revendication 10. 35/ Composition selon la revendication 32, caractérisée en ce qu'elle comprend des fragments d'ADN capables d'hybrider spécifiquement avec différentes régions de 1'ARN génomique du rétrovirus JSRV ou de l'ADNc dérivé de cet ARN, notamment dans des conditions permettant la réalisation d'une amplification génique de 1'ARN ou de l'ADNc du rétrovirus JSRV. 36/ Composition selon la revendication 35, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une sonde selon la revendication 10. 37/ Kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par le rétrovirus JSRV, dans un prélèvement biologique, caractérisé en ce qu'il comprend - au moins une séquence d'acides aminés selon l'une quelconque des revendications 22 A 29, dès lors qu'elle est susceptible de donner lieu & une réaction immunologique spécifique avec des anticorps formés contre le rétrovirus JSRV, ou une composition selon la revendication 32, - un témoin négatif constitué par un échantillon biologique de composition identique ou similaire i celle du prélèvement biologique testé à l'exception du fait qu'il est dépourvu de JSRV, - des moyens pour detecter la réaction immunologique. 38/ Kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par le rétrovirus JSRV, dans un prélèvement biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : - des anticorps selon l'une quelconque des revendications 30 ou 31, - un témoin négatif constitué par un échantillon biologique de composition identique ou similaire à celle du prélèvement biologique testé à l'exception du fait qu'il est dépourvu de JSRV, - des moyens pour détecter la présence d'un complexe immunologique. 39/ Kit pour le diagnostic in vitro dune infection par le rétrovirus JSRV, dans un prélèvement biologique, caractérisé en ce qu'il comprend - des amorces d'ADN, d'ADNc ou d'ARN constituées par des fragments d'ADN selon la revendication 8 et/ou les séquences complémentaires de ces fragments d'ADN et/ou les ARN correspondants, - une polymérase par exemple thermostable, - une sonde selon la revendication 9, pour révéler la présence éventuelle d'un produit d'amplification génique, 40/ Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend des séquences d'acides aminés selon l'une des revendications 22 i 29. 41/ Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend un rétrovirus JSRV selon la revendication 1 & l'état inactif.