FR 2673287 A1 19920828 FR 9102381 A 19910225 DISPOSITIF BIOLOGIQUE DE CONTROLE DE LA CONSERVATION A TEMPERATURE POSITIVE DE SUBSTANCES PERISSABLES ET SON PROCEDE DE FABRICATION En vue d'assurer leur conservation, les denrées périssables sont entreposées à des températures voisines ou inférieures au point de congélation de l'eau, notamment pour limiter ou inhiber la croissance de microorganismes susceptibles d'affecter la qualité hygiénique de ces produits. Ce respect de la qualité repose sur une maîtrise totale de la chaîne du froid, pour lequel des témoins dits de "temps-température" ont été réalisés.Ces témoins, tels que ceux décrits dans les brevets nO 2.329.987 ; 2.361.074 ; 2.370.269 ; 2.471.596 2.553.512; 2.560.992; 2.611.042; 2.522.669, sont basés sur la réaction irréversible de substances chimiques (composés acétyléniques, par exemple) ou biochimiques (enzymes), mises en contact à un instant donné de l'entreposage, ou lors de la fusion de composés à une température déterminée. Malgré leurs qualités, ces témoins cryogéniques ont l'inconvénient de mettre en oeuvre des substances chimiques souvent incompatibles avec les produits destinés à l'alimentation humaine ou animale. Par ailleurs, leur réalisation est souvent délicate, ce qui les rend trop coûteux pour une diffusion de grande consommation et limite considérablement leur champ d'application.En outre, il est difficile de les transposer à des températures positives, car si aux températures de congélation l'inertie thermique des produits surgelés est grande, il n'en va pas de même aux températures positives, lorsqu'il n'existe pas de glace pour amortir pendant suffisamment longtemps l'élévation de température. C'est le cas de la majorité des produits dits "frais", qui doivent être maintenus à des températures comprises entre OOC et +100C, notamment les produits alimentaires de "quatrième et cinquième gammes" (légumes prédécoupés et lavés, plats préparés sous vide, viandes, etc...) dans lesquels l'acidité naturelle est souvent insuffisante pour limiter la prolifération microbienne. L'invention faisant l'objet de la présente demande de brevet se propose de pallier les inconvénients décrits ci-dessus en réalisant un témoin biologique de conservation. leauel consiste en un contenant, de préférence un tube ou microtube à essais, renfermant un milieu de culture ensemencé en bactéries acidifiantes couramment utilisées dans l'industrie alimentaire, l'ensemble garantissant une innocuité totale. La mise en évidence de la non-conservation à la température requise se manifeste par le changement de coloration d'un indicateur de pH résultant de l'apparition d'un acide organique, notamment l'acide lactique provenant de la dégradation d'un sucre fermentescible, lors de la prolifération bactérienne qui se produit en un temps déterminé, tenant compte des conditions normales de manutention des produits en question. Lors de l'entreposage normal au froid des denrées périssables, donc non stériles, la croissance des microorganismes (notamment celle des bactéries), est considérablement ralentie, puisqu'elle garantit la durée de conservation des produits. Dans le dispositif selon l'invention, on utilise isolément ou en association, des souches de bactéries acidifiantes dont la cinétique de croissance aux températures d'entreposage est du même ordre que celle des microorganismes présents dans le produit. L'un des principaux avantages de la présente invention est donc de simuler de façon homothétique le développement des microorganismes pouvant être présents dans le produit, puisqu'on réalise une véritable croissance parallèle. Un autre avantage du témoin de conservation selon l'invention réside dans sa simplicité de fabrication dans la mesure où il ne nécessite qu'un milieu de culture bactériologique stérilisé, une ou plusieurs souches de bactéries acidifiantes, un milieu dont le point de fusion est judicieusement choisi dans lequel la ou les souche(s) de bactéries acidifiantes est (sont) incluse(s), un moyen permettant la stérilisation, la réfrigération et le mélange du milieu avec une dilution de la suspension bactérienne, un moyen de distribution par micropompe doseuse et un moyen permettant le conditionnement dudit milieu ensemencé à basse température (voisine de 0 C) dans des contenants en matériau transparent munis d'un bouchon creux. Un troisième avantage du dispositif selon l'invention réside dans l'innocuité totale des réactifs mis en oeuvre, ce qui autorise pleinement leur utilisation dans les industries ali mentaires, puisque ledit milieu ne contient que des nutriments de qualité alimentaire ou réputés sans toxicité particulière. Un quatrième avantage du dispositif selon l'invention réside dans l'emploi de bactéries acidifiantes, de préférence des bactéries lactiques sélectionnées, utilisées dans l'industrie alimentaire et dont le caractère non pathogène a été largement démontré. Un autre avantage résulte de la grande sensibilité du test dû à la nature biologique du témoin de conservation. En effet, les microorganismes ne se développent que si les conditions sont favorables. Pour la plupart des bactéries aérobies mésophiles (non psychrotrophes), la limite inférieure de la température de croissance est voisine de +8"C. Il y a donc une corrélation évidente entre le démarrage des souches incluses dans le témoin et la prolifération de celles qui sont éventuellement présentes dans le produit mis en conservation. Un autre avantage est lié à la présence d'un temps de latence naturel de la culture. En effet, l'un des inconvénients majeurs des témoins de conservation non biologiques réside dans leur faible inertie thermique : dès que la température critique est atteinte, la réaction se produit, généralement selon le principe du "tout ou rien", tout au moins dans les procédés les plus simples, donc les moins fiables. Dans le dispositif selon l'invention, les bactéries exigent un certain temps d'exposition à la température critique avant d'atteindre la phase exponentielle de croissance où la réaction devient visible. De plus, la cinétique de croissance suit sensiblement les variations de température, les durées d'exposition à une température donnée sont donc intégrées dans la culture: elles peuvent accélérer ou arrêter complètement la croissance en fonction de la température ambiante. Cette progression du développement bactérien est directement visible sur le témoin selon l'invention, du fait de la diffusion de l'acidité entre le point d'inoculation situé à la surface du milieu de culture et le fond du tube qui peut se trouver à plusieurs centimètres de la surface. Le témoin selon l'invention possède donc un effet tampon original qui reflète les variations cumulées de tempé rature que peut subir le produit conservé, conservant ainsi sa mémoire thermique. Pour réaliser un témoin biologique de conservation à température positive, selon l'invention, on peut procéder de la manière suivante: - Bouillon de culture pour Bactéries Lactiques (BBL), DIFCO(E) ou autre à raison de 55 g/I, ajusté à pH 7,5-8,0 par NaOH 0,1 N, additionné de 10 à 200 rn/lg de pourpre de bromophénol, de bleu de bromophénol, de pourpre de chlorophénol ou de tout autre indicateur coloré de pH ou d'oxydo-réduction compatible avec la survie des microorganismes.On peut aussi, sans que cela affecte l'unité de l'invention, remplacer le milieu BBL par un milieu plus simple ne contenant, par exemple, que S à 20 g/l de substrat nutritif (hydrolysat trypsique de caséine, par exemple) et un sucre fermentescible tel que le glucose, le lactose ou tout autre sucre utilisable et compatible avec la survie des microorganismes mis en culture, rajouté à raison de 5 à 25 g/I de milieu. On y ajoute entre 10 et 25 g/l d'un gélifiant couramment utilisé en bactériologie tel que l'agar-agar. Le milieu de culture est stérilisé selon une méthode connue, à une température voisine de 1200C pendant un temps voisin 20 minutes. Le dispositif selon l'invention est visible sur la Planche 1. Le milieu de culture préparé comme ci-dessus, est distribué stérilement à raison de 0,2 à 10 ml dans un contenant (1) qui peut être un microtube ou un tube à essais d'une capacité de 0,2 à 10 ml muni d'un bouchon creux (2). Les tubes sont ensuite refroidis à une température voisine de 0 C. Par ailleurs, la souche pure ou le mélange de souches de bactéries acidifiantes sélectionnées susceptibles d'abaisser le pH du milieu sont utilisées à l'état lyophilisé. Ces bactéries sont choisies en particulier dans le groupe des Bactéries lactiques mésophiles ou thermophiles. Les germes les mieux adaptés se rencontrent parmi les genres Lactobacillus, Streptococcus et Leuconostoc, leurs espèces et leurs sous-espèces, présents dans les matières premières et produits alimentaires transformés. Le Iyophilisat renfermant les bactéries acidifiantes à raison de 103 à 109 germes par gramme, finement tamisé, est incorporé dans un composé organique susceptible de fondre à une température comprise entre +4 et +100C et compatible avec la survie des microorganismes.Ces composés sont choisis en particulier parmi les esters du glycérol, notamment le glycérol trioctanoate ou tricapryline (point de fusion IOOC), le glycérol tnacétate ou triacétine (point de fusion 4.10C), le laurate de benzyle (point de fusion 8.50C), , le butanediol (point de fusion 7.6"C) ou les esters de l'éthanol et du méthanol, notamment le cinnamate d'éthyle (point de fusion 6.5"C), le monoheptane dioate d'éthyle (point de fusion 100C), le monosuccinate d'éthyle (point de fusion 80C) l'oetadécènoate d'éthyle (point de fusion 5.8"C), l'octanedioate de diéthyle (point de fusion 5.90C), le décanedioate de diéthyle (point de fusion 5"C), le tridécanoate de méthyle (point de fusion 6.5 C), le laurate de méthyle (point de fusion 5.20C), et leur mélange de manière à fixer précisément le point de fusion. Ces subtances sont caractérisées par leur non-toxicité et leur compatibilité de proximité avec les produits destinés à l'alimentation. La poudre lyophilisée est mélangée intimement avec le composé organique de façon quelconque, mais de préférence au moyen d'un homogénéiseur à ultra-sons. La souche bactérienne, homogénéisée dans son milieu fusible, est déposée à raison d'environ 100 à 500 tUcm2 selon Ia souche choisie, sur un support destiné à être fixé sur le contenant rempli du milieu de culture. Le support peut être, par exemple, constitué d'un bouchon creux (2) et le contenant, un tube ou microtube à essais (1). Ce remplissage qui doit s'effectuer à température positive, supérieure au point de fusion du composé fusible choisi, est suivi d'un refroissement à une température inférieure au point de surfusion du même composé. Quand le milieu est solidifié, le support peut être installé sur le contenant rempli du milieu gélosé stérile, tout en maintenant un espace de tête de 1 à 10 mm entre les contenus de chaque élément. L'ensemble est maintenu, jusqu'à utilisation, à une température inférieure au point de fusion dudit composé. Le dispositif peut être introduit directement dans l'emballage du produit à contrôler ou sur l'emballage même au moyen d'un dispositif adhésif quelconque; il peut également être stocké jusqu'à utilisation, par conservation au froid à une température inférieure à OOC et, de préférence, dans les conditions habituelles de stockage des produits congelés. La stabilité du dispositif à température positive comprise entre OOC et la température de fusion du composé fusible est d'au moins 8 semaines sans qu'il soit noté d'altération décelable de la fiabilité du dispositif. Lors de la mise en oeuvre du dispositif, le témoin est fixé à une température inférieure au point de liquéfaction du fusible sur l'emballage du produit destiné à être contrôlé. En cas d'élévation anormale de la température au delà de la température critique de changement d'état du fusible, les germes acidifiants contenus dans le fusible liquéfié entrent en contact avec le milieu nutritif sous-jacent. Le développement de la population microbienne entraîne alors une acidification progressive du milieu qui conduit au virage de l'indicateur coloré. Le délai d'apparition du virage peut être réglé en ajustant la concentration en germes acidifiants incorporés dans le fusible. Il dépend également de la température ultérieure de conservation. Exemple 1: Lorsque les germes acidifiants sont constitués d'un mélange de bactéries lactiques mésophiles à hauteur de 108 bactéries par gramme et si la température reste supérieure ou égale au point de fusion de la tricapryline (100C), l'évolution de la couleur de l'indicateur de pH du rouge violacé au jaune apparaît dans les conditions suivantes: T" IOOC : T"C 200C : TOC 30 C: (fusion à 100C) Début de virage 24 heures. Début de virage: 4 heures. Début de virage: 2 heures. Fin de virage : 6 jours. Fin de virage: 8 heures. Fin de virage: 6 heures. Si, après fusion, le produit est ramené à une température inférieure à +70C, l'acidification peut se poursuivre car le contact demeure permanent entre l'inoculum et le milieu de culture, mais sa cinétique est très lente et le début de virage n'apparaît qu'au delà d'une quinzaine de jours. Exemple 2 : Lorsque les germes acidifiants sont constitués d'un mélange de bactéries lactiques mésophiles à hauteur de 108 bactéries par gramme et si la température reste supé rieure ou égale au point de fusion du cinnamate d'éthyle (6.50C), l'évolution de la couleur de l'indicateur de pH du rouge violacé au jaune apparaît dans les conditions suivantes: T 7 C: T C 20 C: T 30 C: (fusion à 6,50C) Début de virage: 6 jours. Début de virage : 4 heures. Début de virage : heures. Fin de virage : 15 jours. Fin de virage: 8 heures. Fin de virage : heures. REVENDICATIONS 1) Dispositif biologique de contrôle de la conservation de substances périssables maintenues à température positive, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un milieu de culture pour mi croorganismes et d'un inoculum de microorganismes vivants, les deux éléments étant maintenus séparés dans un ensemble unique tant que les conditions requises de conservation sont maintenues. 2) Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'inoculum de microorganismes vivants est constitué de bactéries acidifiantes, susceptibles de dégrader les sucres fermentescibles en acides organiques, associé à un composé fusible aux températures compnses entre +4 et +100C, compatible avec la survie desdites bactéries. 3) Dispositif selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les bactéries acidifiantes présentes dans l'inoculum sont choisies dans le groupe des Bactéries Lactiques mésophiles et thermophiles et, notamment, dans les genres Lactobacillus, Streptococcus et Leuconostoc, leurs espèces et leurs sous-espèces. 4) Inoculum selon 1, 2 et 3, caractérisé en ce que les bactéries acidifiantes sélectionnées sont utilisées à l'état lyophilisé, en souches pures ou en mélange, à raison d'une concentration finale dans le composé fusible comprise entre 103 et 109 germes par gramme. S) Inoculum selon 1, 2, 3,4, caractérisé en ce que le composé fusible contenant les bactéries est choisi parmi des substances ne présentant pas de toxicité reconnue pour les bactéries lactiques utilisées ainsi que pour l'homme, notamment le glycérol trioctanoate ou tricapryline (point de fusion l00C), le glycérol triacétate ou triacétine (point de fusion 4.10C), le laurate de benzyle (point de fusion 8.50C), , le butanediol (point de fusion 7.6"C) ou les esters de l'étha- nol et du méthanol, notamment le cinnamate d'éthyle (point de fusion 6.50C), le monoheptane dioate d'éthyle (point de fusion lO0C), le monosuccinate d'éthyle (point de fusion 80C) l'octadécènoate d'éthyle (point de fusion 5.8"C), l'octanedioate de diéthyle (point de fusion 5.9"C), le décanedioate de diéthyle (point de fusion 5"C), le tridécanoate de méthyle (point de fusion 6.50C), le laurate de méthyle (point de fusion 5.20C), et leur mélange de manière à fixer précisément le point de fusion. 6) Inoculum selon 1, 2, 3, 4, 5, caractérisé en ce que sa mise en oeuvre se fait à l'état fondu du composé fusible, suivie d'un refroidissement à une température inférieure à la température de surfusion dudit composé. 7) Inoculum selon 6, caractérisé en ce que sa mise en oeuvre se fait à raison d'un volume de 100 à 500 pLl/cm2 et contenant de 103 à 109 germes lyophilisés par gramme de mélange fusible. 8) Dispositif selon les revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'acidification du milieu de culture sous-jacent est conditionnée par la liquéfaction préalable du fusible contenant l'inoculum bactérien et entraîne la modification progressive de couleur d'un indicateur coloré de pH. 9) Dispositif selon les revendications 1 à 8, appliqué en insertion à l'emballage, permettant de contrôler la conservation à température positive de produits périssables tels que les matières premières alimentaires et leurs produits de transformation d'origine animale, végétale et microbienne, ainsi que les produits pharmaceutiques, réactifs de laboratoire et produits de la photographie.