FR 2667943 A1 19920417 FR 9012661 A 19901011 DISPOSITIF ET PROCÉDÉ POUR LA DETERMINATION OUALITATIVE ET OUANTTrATIVE RAPIDE DE LA PRESENCE D'UN LIGAND REACTIF DANS UN FLUIDE La presente invention est relative à un dispositif et un procédé pour la determination qualitative et quantitative rapide d'un ligand dans un fluide.L'invention s'applique plus particulièrement,mais non limitativement,à la detection de la presence d'antigènes ou d'anticorps ans un fluide biologique,à la detecetion de substances toxiques,de virus ou de bacteries dans un fluide quelconque (eaux,produits fluides des industries agro-alimentaires, effluents industriels,fluides biologiques,etc..),au dosage chimique de substances (telles qu'hormones, vitamines, enzymzes, medicaments,etc..), presentes dans un fluide (notemment biologique). Les methodes de determination de la presence ou de la concentration de substances antigeniques dans des fluides biologiques,par voie immunologique,sont à present bien connues;elles sont basées sur la formation d'un complexe entre la substance antigenique à determiner et un ou plusieurs anticorps,l'un des composants du complexe pouvant être marqué par un element radioactif(tel que l'iode 125,par exemple),pour permettre sa detection et/ou son analyse quantitative après separation de l'antigène ou de l'anticorps marqué complexé,de l'antigène ou de l'anticorps marqué non complexé. Dans les methodes de determination immunologique par competition,la substance antigenique contenue dans l'echantillon de liquide à analyser,entre en competition avec une quantité connue d'antigène marqué pour une quantité limitée de sites de fixation de l'anticorps: la quantité d'antigène marqué liée à l'anticorps est inversement proportionnelle à la quantité d'antigène contenue dans l'echantillon. Les tests immunometriques utilisent un antigène marqué : la quantité d'anticorps marqué associée au complexe est proportionnelle à la quantité de substance antigenique contenue dans l'echantillon. Des tests immunometriques particulièrement adaptés à la detection d'antigènes polyvalents,c'est à dire de substances antigeniques capables de se complexer avec au moins deux anticorps en même temps,consistent à utiliser une quantité d'anticorps non marqué lié à un support solide insoluble dans le liquide à analyser,et une quantité d'anticorps soluble portant un indicateur,tel qu'un isotope radioactif,qui permet la detection ou la determination quantitative du complexe ternaire formé entre l'anticorps en phase solide,l'antigène et l'anticorps marqé.Ces methodes consisitent à mettre tout d'abord en contact l'anticorps lié à la phase solide avec l'echantillon à analyser,pour extraire l'antigène de l'echantillon,par formation d'un complexe binaire entre l'anticorps en phase solide et l'antigène.Après une periode d'incubation,le support solide est lavé pour en eliminer le residu d'echantillon liquide,y compris l'antigène eventuel n'ayant pas reagi,puis mis en contat avec une solution contenant une quantité connue d'anticorps marqué.Après une seconde periode d'incubation pour permettre à l'anticorps marqué de se complexer avec l'antigène lié au support solide par l'intermediaire de l'anticorps non marqué,le support solide est lavé une seconde fois pour enlever l'anticorps marqué n'ayant pas reagi;puis la presence d'anticorps marqué sur le support solide lavé est detectée (par exemple par mesure du rayonnement emis,si l'indicateur est un rayonnement radioactif) et eventuellement soumise à un processus de determination quantitative. Ces methodes sont connues sous le nom de methodes sandwich ou bi-site ,du fait que l'antigène porte deux anticorps liés à sa surface en deux sites differents.Elles sont decrites par WIDE dans Radioimmunoassay Methods (Kirkham et Hunter,E et S. Livingstone,Ed. Edimbourg,1970,p 199-206). Des applications specifiques (test de detection de l'antigène de l'hepatite) sont decrites dans le Brevet des Etats Unis d'Amerique N" 3 867 517; des variantes de ces methodes ( simultanées ou inverses ) sont decrites par JEONG et al.dans Comparison of RIA with a single incubation two-site immunoradiometric assy (IRMA) as applied to the determination of human thyroïd stimulating hormone (-rSH) ,Bio-Rad Laboratories,1979; dans le Brevet des Etats Unis d'Amerique N" 4 174384 (marquage de deux anticorps par un chromophore fluorescent (fluoresceïne) et par un chromophore qui absorbe la lumière emise par la fluoresceine); dans le Brevet des Etats Unis d'Amerique N" 4098 876.Ces methodes utilisaient initialement des anticorps polyclonaux,dont la sensibilité est insuffisante en raison de l'existence d'une reactivité croisée avec d'autres antigènes.Le Brevet français Hybridtech N" 81 15030 publié sous le N" 2487 983,a proposé de remplacer dans ces tests immunometriques,les anticorps polyclonaux par des anticorps monoclonaux,pour augmenter de façon importante la sensibilité de ces methodes. Le Brevet français LIOTIA N 82 16973,publié sous le N" 2514 511,decrit un dispositif et un procédé pour determiner la presence d'antigènes dans des fluides biologiques,par la methode ELISA,tout en eliminant les operations de lavage et de dilution qu'elle necessite et en reduisant la durée d'incubation.Le dispositif proposé comprend une matrice formée d'un ruban en papier de nitrocellulose ou de diazobenzyloxymethyle (DBM),en gel poreux tel le polyacrylamide,agarose ou collagène,dans les pores duquel l'antigène peut être piégé ou bien il peut être reticulé avec le gel par l'intermediaire des groupes amines du ligand et des groupes carboxyles portés par la matrice,ou bien d'un ruban de cellulose ou de fibres de matière plastique à l'interieur duquel sont piégées des particules ou des billes qui contiennent le ligand.Conformément à ce brevet LIOITA,le dispositif comprend: - une première zone qui contient des antigènes et des anticorps liés à une enzyme,ces anticorps etant situés dans la dite première zone de telle manière qu'ils soient eliminés de cette première zone quand ils ont reagi avec des antigènes non liés contenus dans l'echantillon à tester, traversant cette première zone,mais qu'ils n'en soient pas eliminés en l'absence de tels antigènes, - et une seconde zone contenant une substance capable de reagir avec les dits anticorps liés à une enzyme,pour produire une reaction colorée revelant la presence des dits anticorps. De façon specifique,le dispositif de dosage immunologique decrit par le brevet Liotta,comprend un stratifié à trois couches de matrice poreuse dont la première est impregnée d'un anticorps specifique lié à une enzyme,la seconde couche poreuse contient un antigène de reference immobilisé (lié), et la troisième couche contient un substrat produisant une couleur,qui reagit avec l'enzyme liée à l'anticorps.L'antigène libre à doser present dans l'echantillon à analyser,mis en contact avec la première couche,diffuse dans la seconde,puis dans la troisième couche.L'antigène libre present dans l'echantillon entre en competition avec l'antigène de reference lié,immobilisé dans la seconde couche,pour se combiner à l'anticorps lié à une enzyme.Si l'anticorps lié à une enzyme se combine à l'antigène libre,il diffuse librement vers la troisième couche et produit une reaction colorée.Par contre,si l'echantillon à analyser ne contient pas d'antigène,tous les anticorps liés à une enzyme possèdent des sites de liaison libres et se combinent avec l'antigène immobilisé present dans la seconde couche;l'anticorps lié à une enzyme,qui se combine à l'antigène immobilisé dans la seconde couche,ne diffuse pas dans la troisième couche et aucune reaction coloré ne se produit.Le bervet français LIMITA 87 08007,publié sous le N" 2599 845 decrit une variante de ce dispositif,qui ne comprend que deux couches,dont la couche superieure porte l'antigène avec les deux anticorps reactifs et dont la couche inferieure contient un substrat chromogène,les deux zones (zone de piegeage et zone de substrat) pouvant egalement être juxtaposées. Le Brevet americain HYBRIDTECH N" 4632901 (et la demande internationale PCT correspondante N" 85/05451) decrit un procédé et un dispositif de realisations d'immunoassays qui ne necessitent pas le recours à des etapes d'incubation de longue durée associées à plusieurs lavages,et permettent par leur simplicité,la mise en oeuvre par un medecin,à sa consultation,et même par le patient chez lui.Ce dispositif comprend un premier element poreux constitué par une membrane ou un filtre auquel est lié un anticorps,monoclonal ou polyclonal,qui reconnait l'antigène que l'on cherche à identifier,et un deuxième element,qui est absorbant et comporte des passages capillaires perpendiculaires à ses surfaces stiperieure et inferieure; ;ce second element est en communication capillaire avec la membrane,ou analogue,poreuse,qui forme le premier element du dispositif,et presente une dimension de pores telle qu'il induise la traversée de liquide à travers le premier element sans application de moyens externes.La membrane filtrante peut être du Nylon portant des groupes NH2 auxquels les anticorps sont liés par covalence ,par couplage à l'aide de glutaraldehyde et l'element absorbant peut être en matière filtrante fibreuse telle que fibres d'acetate de cellulose,de polyester,de polyolefine,etc..Ces deuxelements peuvent être separés l'un de l'autre par un autre element poreux ( en polyethylène par exemple) qui ne fixe pas d'anticorps de façon non-specifique et empêche que de l'anticorps marqué ne se fixe de façon non-specifique sur la surface superieure de l'element absorbant. De même la demande de Brevet Europeen ABBOTT Laboratories N" 186 100 decrit un dispositif qui vise à determiner la presence ou la quantité d'une substance dans un echantillon à tester,et qui comprend une matrice fibreuse poreuse non-absorbante,telle que de verre,impregnée d'un polymère hydrophobe qui forme un revêtement de surface sur au moins une partie de la matrice et auquel est fixé un reactif,par exemple un anticorps ou un antiène,capable de reagir avec la substance recherchée dans l'echantillon,ce dispositif pouvant être associé à une couche de matière absorbante sous-jacente et/ou à une couche de matière fibreuse telle que fibres de verre ou papier-filtre en cellulose,qui recouvre la matrice fibreuse et peut jouer le rôle de pré-filtre. La demande de Brevet europeen MUREX Corp. N" 206561 fait egalement connaître un dispositif de diagnostic qui comprend un element filtrant comportant au moins une zone de reaction associée à au moins une zone peripherique,un element absorbant associé à uniquement à la zone peripherique du premier element et un element de maintien du filtre en position appropriée.La reaction qui se produit dans la zone de reaction peut aussi bien être une separation par filtration qu'un couplage immunologique et c'est dans la même zone, qu'apparaissent les signaux de lecture de la reaction.L'echantilion liquide parvient sur le filtre par un entonnoir dont l'orifice de decharge est calculé de telle manière que son diamètre soit suffisant,en combinaison avec la pression du liquide dans l'entonnoir,pour que le liquide se decharge sur la surface superieure du filtre mais ne traverse pas ce dernier,la pression hydrostatique etant,par la suite,ajustée de telle manière que le liquide penètre dans le filtre par gravité et est diffusé à travers ce dernier par action capillaire,sans le traverser perpendiculairement de part en part. Tous ces dispositifs ont en commun un element filtrant,poreux,à travers lequel s'ecoule l'echan tilion liquide à tester.La filtration est rendue selective par la presence à ce niveau,immobilisé,d'un ligand identique à celui recherché : si l'on dose un antigène,cet element filtrant doit obligatoirement immobiliser un antigène strictement identique, destiné à stopper les anticorps marqués (deposés sur une première couche) n'ayant pas trouvé d'antigène dans l'echantilion;si l'on dose un anticorps,l'element filtrant selectif doit immobiliser un anticorps strictement identique destiné à stopper les antigènes marqués (deposés dans une couche superieure) qui n'ont pas rencontré d'anticorps correspondant dans l'echantillon. Un problème important se pose alors : par exemple,les antigènes immobilisés sur cet element filtrant selectif,perdent certainement au moins leur conformation quaternaire et tertiaire,quand ils ne sont pas completement denaturés : ils ne sont plus reconnus par les anticorps marqués qui poursuivent alors leur migration vers la membrane de lecture pour donner un faux resultat positif. De plus,de nombreux antigènes sont de très petite taille (haptènes) et se fixent souvent sur un support par leur zone immunogène,qui ne peut plus être reconnue par les anticorps. Martinek,Mozhaev et Berezin (Dokl.Acad.Nauk. SSSR 239 : p.483, 1978) ont fait un travail remarquable sur la denaturation des proteines par sulfure oxydation-reduction : les ponts disulfure sont irreversiblement rompus et la molecule se deroule,les epitopes se divisent et le site antigenique n'est plus reconnu. Mattiasson,Danielson,Hermansson et Mosbach (FEBS Letters. 85 : p 203,1978) ont mis en evidence les changements qui interviennent dans les structures des proteines quand ces dernières ne se trouvent plus dans leurs conditions physiologiques,et proposent toute une serie de solutions interessantes. A l'inverse,la litterature est abondante sur les hautes qualités de resistance,de conservation et de stabilité des immunoglobulines.C'est la raison pour laquelle le procédé objet de la presente invention se propose d'utiliser des immunoglobulines convenablement preparées et choisies pour stopper un anticorps marqué quand il n'est pas saturé en antigène,et le laisser descendre vers le substrat quand il est saturé en antigène.De même,elles stoppent un antigène marqué qui n'a pas rencontré d'anticorps dans l'echantfflon,et laissent passer les complexes antigènes marqués + anticorps de l'echantillon.Ces immunoglobulines fixées sur l'element filtrant selectif,remplissent cette mission par action soit sur l'enzyme qui marque l'anticorps (ou l'antigène) deposé sur la première couche,soit sur l'anticorps marqué lui même (en se fixant sur ses sites Fab restés libres,par exemple),soit sur les deux : les immunoglobulines fixent l'enzyme de marquage (en l'absence de complexe antigène + anticorps) ET l'anticorps (ou l'antigène) supportant ce marquage (et restés insaturées par le ligand correspondant). Dans ces conditions,à la difference de tous les procédés cités plus haut,l'element filtrant selectif acquiert un caractère universel: qui ne depend plus specifiquement du ligand recherché. Exemple : en deposant sur la couche superieure du dispositif un anticorps marqué du type IgG1 de souris,specifique de la FSH humaine (Follicle stimulating hormone),et marquée d'une certaine façon par la peroxydase : l'element filtrant selectif comprend,immobilisé,une immunoglobuline antiperoxydase convenablement selectionnée et preparée : si l'echantillon ne contient pas de FSH,l'IgG1 de souris,marquée peroxydase,non saturée en antigène FSH,va être stoppée dans sa migration (vers la zone de lecture) par l'immunoglobuline antiperoxydase preparée d'une certaine façon.Par contre,si l'echantillon contient de la FSH,il y a formation de complexes IgG1 marquée peroxydase + FSH; ces complexes ne sont pas reconnus par l'imunogiobuline antiperoxydase car les diverses techniques de preparation detaillées plus loin,font que la FSH liée aux IgG1 marquées,masque les sites (de la peroxydase) choisis à l'avance comme etant les sites immunogènes reconnus par l'immunoglobuline anti-peroxydase immobilisée sur l'element filtrant selectif. L'arrêt des IgG1 marquées au niveau de ce dernier element,n'est pas specifiquement dû à l'absence de FSH mais plutôt à la non-saturation des IgG1 reconnaissant la FSH.Les immunoglobulines immobilisées sur l'element filtrant selectif vont donc reconnaître et stopper toutes les IgG1 marquées peroxydase non saturées par leur antigène propre,les mêmes immunoglobulines immobilisées agissant ainsi quelquesoit l'antigène: c'est donc une phase selective univer selle. Elle ne necessite plus,comme avant,d'être identique au ligand recherché : Exemple : dans le dosage de la FSH,il fallait fixer de la FSH sur cette phase selective : les anticorps marqués anti FSH deposés sur une première couche,ne rencontrant pas de FSH dans l'echantillon, etaient stoppées par la FSH de cette phase selective.Il fallait donc immobiliser de la FSH sur la phase selective. Or,le procédé objet de la presente invention,se propose de detecter plusieurs substances en même temps dans une strategie de pré-screening : si au moins une des substances recherchées est presente dans l'echantillon,il convient alors de pratiquer des dosages plus ciblés.Exemple: dosage des marqueurs tumoraux de la sphère digestive (Alpha foeto proteine pour le foie,CA 19-9 pour le pancreas,Antigène carcino embryonnaire pour le colon,etc..).Si au moins un de ces marqueurs est en excès (option semi-quantitative detaillée plus loin),le procédé le revèle,orientant le medecin vers la sphère digestive pour des examens plus détaillés. 1l est donc impossible d'immobiliser tous ces marqueurs sur la même phase selective pour stopper les anticorps marqués deposés sur la couche superieure du dispsositif: chacun des marqueurs a son propre pIC,pI,etc..et les techniques de fixation varient d'une proteine à l'autre: certains marqueurs ne possedent pas de residu lysine : le même blocking ne peut pas être utilisé dans ce cas,etc.. Par contre il est possible de deposer sur la couche superieure du dispositif une association d'anticorps marqués peroxydase,chacun specifique d'un marqueur donné.Ils seront tous stoppés par la même immunoglobuline anti peroxydase,s'il n'existe aucun marqueur.S'il existe au moins un marqueur,son anticorps specifique sera donc saturé et ne sera pas reconnu par l'immunoglobuline anti peroxydase immobiliséee sur l'element filtrant selectif,et migrera vers la zone de revelation. La presente invention s'est en consequence donné pour but de pourvoir à un dispositif et un procédé pour la determination qualitative et quantitative rapide de la presence d'un ligand reactif,dans un fluide,repondant mieux aux necessités de la pratique que les dispositifs et procédés visant aux mêmes buts proposés dans l'art anterieur, notemment en ce que le moyen de selection entre un complexe antigène+anticorps et un des ligands seul,non complexé,est plus simple et facile,en ne faisant pas intervenir directement et specifiquement le ligand recherché,ce qui donne un caractère universel au procédé. La presente invention a pour objet un dispositif pour la determination qualitative et quantitative rapides de la presence d'un ligand reactif, dans un fluide,du type comprenant une première zone de reaction contenant un reactif marqué,notemment un anticorps ou un antigène marqué,destiné à reagir avec le ligand recherché,une seconde zone,dite selective,destinée à neutraliser le reactif marqué deposé dans la première zone s'il n'est pas saturé par le ligand inexistant dans l'echantillon,et une troisième zone,dite de revelation,lequel dispositif est caractérisé en ce qu'il comprend en combinaison:: - une première zone de reaction qui comprend une membrane poreuse permeable prevue pour recevoir un echantillon du fluide à tester et dfestinée à être associée à au moins un reactif convenablement marqué,apte à reconnaître le (ou les) ligand (s) recherché(s) eventuellement contenu(s) dans l'echantillon - une seconde zone de reaction,totalement distincte et separée de la première, comprenant une phase solide poreuse permeable contenant un reactif de reference,non marqué,apte à reconnaître le (ou les) reactif(s) marqué(s) (deposé dans la première zone),mais seulement quand ce (ou ces) reactif (s) marqué(s) est saturé par son ligand.Ce reactif de reference etant totalement independant du ligand. - une troisième zone de reaction,egalement poreuse et impermeable,totalement distincte et separée de la seconde zone,contenant des moyens de revelation de la reaction qui s'est eventuellement produite dans la première ou la seconde zone de reaction. Selon un autre mode de realisation avantageux du dispositif conforme à la presente invention,la première zone de reaction est propre à recevoir une phase solide avantageusement supportée par la première membrane,qui comprend au moins un reactif marqué de façon appropriée,notemment par une enzyme,un radioisotope,un produit chimique chromophore,fluorescent ou chemiluminescent,ce reactif marqué etant avantageusement un anticorps ou un antigène. Selon un autre mode de realisation avantageux du dispositif conforme à la presente invention,la phase solide contenant un reactif non marqué qui se trouve dans la seconde zone de reaction,est constituée par un support insoluble sur lequel est fixé le dit reactif (immunoglobuline notemment) non marqué,qui correspond soit à l'enzyme de marquage des reactifs de la première zone,soit au(x) reactif(s) lui même de la dite première zone de reaction,lequel support insoluble est choisi parmi les microsphères,les microplaques,les gels (polyacrylamide,agarose,etc..) ou autres supports bien connus. Selon un autre mode de realisation avantageux du dispositif conforme à la presente invention,la troisième zone de reaction contient un substrat chromogène quand il est prevu que la lecture de la reaction doit se faire par colorimetrie. Selon un autre mode avantageux de realisation du dispositif conforme à la presente invention,le dispositif comporte au dessus de la première zone de reaction,une zone supplementaire destinée à neutraliser une certaine quantité seulement de ligand recherché,cette quantité correspondant à un seuil limite considéré comme normal dans l'echantillon.La quantité de ligand excedentaire,quand elle existe,traverse alors cette zone supplementaire pour reagir avec les reactifs marqués dans la première zone decrite plus haut et plus tard avec le reste du dispositif. Ce qui permet un dosage semi-quantitatif. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de realisation,la zone supplementaire est une membrane,avantageusement associée à un reactif (notemment un anticorps) capable de fixer (et donc de neutraliser) une certaine quantité seulement de ligand recherché, laquelle quantité correspondant à un seuil limite considéré comme normal dans l'echantillon;ce qui permet un dosage semi-quantitatif. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de realisation,le reactif non marqué destiné à neutraliser une certaine quantité seulement de ligand,peut être associé fixé,immobilisé,à la première ouà la seconde zone de reaction. Conformément à la presente invention,il est possible de realiser des dosages quantitatifs,en associant la troisième zone de reaction à un appareillage de quantification connu en lui même,tel que RLA,spectrophotomètre,etc.. Selon un mode de realisation avantageux du dispositif conforme à la presente invention,les zones de reaction sus dites sont superposées pour former de haut en bas : un etage superieur contenant la première zone de reaction,un etage median contenant la seconde zone de reaction et un etage inferieur contenant la troisième zone de reaction,et eventuellement un etage supplementaire au dessus de l'etage superieur, pour la zone de reaction supplementaire dans le cas de dispositif de dosage semi-quantitatif. La presente invention a egalement pour objet un procédé de determination qualitative et quantitative rapide de la presence d'un ligand reactif dans un fluide,qui est caractérisé en ce qu'au cours d'une première etape,un echantillon de fluide à analyser est mis en contact dans une première zone de reaction,avec un reactif marqué tel qu'un anticorps ou un antigène marqué, notemment,en ce qu'au cours d'une seconde etape,le produit de cette première reaction entre en contact dans une seconde zone de reaction,avec un second reactif,non marqué,possedant la particularité de reconnaître si le reactif marqué de la première zone est ou non,saturé en ligand recherché,cette reconnaissance etant totalement independante du ligand recherché puisque ce reactif de cette seconde zone est le même quelquesoit le ligand recherché dans l'echantillon,procédé caractérisé enfin en ce qu'au cours d'une troisième etape,le produit de la première ou de la deuxième reaction entre en contact dans une troisième zone de reaction,avec des moyens de revelation de la presence - ou de l'absence - du ligand que l'on cherche à detecter. Selon un mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la presente invention,l'echantillon de fluide est mis en contact,avant la première etape du procédé decrit ci dessus,avec un reactif non marqué destiné à neutraliser ou fixer une certaine quantité seulement de ligand recherché,correspondant à un seuil limite considéré comme normal dans l'echantillon;la quantité excedentaire de ligand,si elle existe,entre alors en contact avec les reactifs des differentes zones successives comme decrit plus haut. Le dispositif conforme à la presente invention,representé à la figure 1 (Representatinn schematique en coupe orthogonale d'un mode de realisation du dispositif conforme à la presente invention) comprend de bas en haut un support A qui porte une pastille de cellulose ou autre matrice à large porosité et impregnée d'un spot de substrat chromogène B,au dessus de laquelle est disposée une membrane C de porosité beaucoup plus serrée,impregnée du reactif de reference non marqué.Une membrane D de porosité large,est impregnée du reactif marqué qui reconnaitra le ligand eventuellement present dans l'echantillon.Ce dernier sera deposé dans l'orifice E d'une plaque F identique à A, enserrant ainsi l'empilement des pastilles. Les ligands que l'on cherche à detecter à l'aide de ce dispositif sont des antigènes ou des anticorps mais aussi toutes sortes de substances chimiques ou biologiques.Les applications sont très nombreuses;l'on peut citer parmi elles le depistage precoce de cancers,les dosages enzymatiques,le diagnostic d'affections virales ou microbiennes,le depistage des maladies autoimmunes,le dosage des facteurs de croissance tels l'EGF (Epidermal Growth Factor),le FGF (Fibroblast Growth Factor),les TGF ransforming Growth Factor - et ss),le TNF (Tumor Necrosis Factor),les IGF (Insuline-like Growth Factor),le PDGF (Platelet Derivated GF),les CSF (Colony Stimulating Factor),etc.. tous plus ou moins impliqués dans des processus neoplasiques,le dosages des cytokines (Interleukines 1 à ;;r,interferon,B et gamma,erythropoietine,etc),le dosage des recepteurs membranaires de ces facteurs de croissance et de ces cytokines : le taux de ces recepteurs membranaires est multiplié par 100 ou 1000 dans de nombreux cancers,le dosage d'hormones mais surtout le dosage des recepteurs de ces hormones car il est très recemment apparu qu'il existait des relations entre le taux de recepteurs de ces hormones et certains cancers (prostate pour la testosterone,sein pour les oestrogènes,etc) et qu'une association excès de recepteurs aux facteurs de croissance + effondrement des recepteurs de l'oestrogène etait de mauvais pronostic dans le cancer du sein par exemple et impliquait un traitement hormonal en plus des traitements chirurgicaux et ionisants,le dosage des leucotriènes et des prostaglandines dans les processus inflammatoires graves,le dosage de leurs recepteurs,le depistage d'allergies (IgE),le dosage de neuromediateurs,des recepteurs de ces neuromediateurs (effondrés dans de nombreuses pathologies de senilité cerebrale) surtout depuis la découverte du troisème recepteur de la dopamine (D3) qui se revèle être la veritable cible à traiter dans les psychopathies graves alors que les traitements anterieurs visaient à bloquer les recepteurs D1 et D2 avec le cortège bien connu d'effets secondaires graves (contractures musculaires,ebriété,etc),inexistants quand on bloque le recepteur D3,le dosage de medicaments,etc..Cette enumeration n'est pas exhaustive ni limitative;;elle veut simplement mettre en evidence le grand nombre d'examens,autrefois compliqués et coûteux,rendus faciles et abordables par le procédé objet de la presente invention,pour le benefice d'un depistage systematique et precoce d'affections graves. La figure 2 montre les diferents reactifs du procédé: - les reactifs marqués (1) qui reconnaissent le ligand à detecter sont essentiellement des anticorps ou des antigènes,deposés à l'etage superieur sur la membrane D,en solution dans un melange complexe decrit plus loin et visant à la conservation et la stabilité du materiel de marquage surtout (enzymes sensibles à lalumière et à l'oxygène de l'air par exemple,soit une substance fluorescente,un radio-isotope,tout produit chimique susceptible de donner une reaction colorée avec un substrat approprié) - les reactifs (2) de l'etage median C sont de preference mais pas exclusivement des immunoglobulines qui piègent,mais uniquement en absence de ligand dans l'echantfflon,les reactifs marqués de l'etage superieur,de plusieurs façons differentes ou combinées:: - soit en piegeant l'enzyme de marquage (dans les procédés colorimetriques) toujours en absence de ligand,par l'intermediaire d'une imunoglobuline anti enzyme specifique de cette enzyme - soit en piegeant le reactif marqué quand c'est un anticorps,par l'intermediaire d'une immunoglobuline anti-Fab specifique des sites NH2 des anticorps marqués de l'etage superieur,sites libres puisqu'il n'y a pas de ligand dans l'echantillon. Si par contre il existe un ligand dans l'echantillon,les sites Fab de l'anticorps marqué de l'etage superieur,sont saturés en ligand ét ne seront pas reconnus par les immunoglobulines anti-Fab. - soit en piegeant les deux : l'enzyme de marquage et l'anticorps marqué,toujours en l'absence de ligand dans l'echantillon, par l'intermediaire d'une association d'immunoglobulines : une anti-enzyme et une anti-Fab.L'absence de ligand rend ces deux derniers sites accesssibles aux immunoglobulines dirigées contre eux.Tandis que la presence de ligand,vient masquer l'enzyme (sans l'inhiber pour autant) et occupe les sites Fab des anticorps marqués de l'etage superieur. Ces immunoglobulines de l'etage median jouent donc un rôle capital et ceci quelquesoit le ligand,ce qui fait leur caractère universel.ll faut neanmoins preciser que les anticorps marqués de l'etage superieur (dans le cas de dosages d'antigenes), doivent: - être de la même origine (ex: IgG1 de souris) pour que les immunoglobulines (ex: anti6 Fab d'IgG1 de souris) de l'etage median les reconnaissent sans difference,quelquesoit le ligand à doser - porter le même marquage (ex: peroxydase) pour que les immunogiobulines (ex: antiperoxydase) de l'etage median les reconnaissent tous et les piegent,sauf si l'antigène recherché vient masquer les molecules de peroxydase et empêche ainsi les immunoglobulines antiperoxydase de recnnaître la peroxydase portée par les anticorps marqués.Ces derniers traversent alors cette phase selective pour aller colorer le substrat en B. - être marqués d'une certaine manière : il faut que l'enzyme soit fixée le plus près possible des sites Fab des anticorps de l'etage superieur: de telle sorte que la presence d'un ligand volumineux comme par exemple un recepteur membranaire (400 kD),masque completement l'enzyme (sans pour autant l'inhiber): l'utilisation d'anticorps marqués F(ab)'2 est donc preferable aux anticorps entiers. Ces trois exigences peuvent être satisfaites en même temps si l'on fait appel,dans l'etage median C, aux immunoglobulines dites HYBRIDES : un site NH2 reconnait l'enzyme de marquage,l'autre site NH2 reconnait l'extremité Fab libre des anticorps marqués de l'etage superieur: ainsi la même immunoglobuline est capable de pieger solidement par deux sites differents,un anticorps marqué qui n'a pas rencontré d'antigène dans l'echantillon. Ces immunoglobulines de l'etage median peuvent être avantageusement supportées par des microsphères (latex,agarose,polystyrène, polyarylamide,gels divers,etc.. ) portant un reactif,destiné à retenir les reactifs marqués restés libre à l'etage superieur. Dans ces conditions,si l'on recherche un antigène dans une goutte de fluide biologique,en cas de reaction positive,l'antigène present dans le fluide se lie à l'anticorps marqué contenu dans la pastille D;le fluide contenant le complexe antigène-anticorps marqué precité traverse la couche de microspheres deposées en C,sans être retenu par ces dernières puis parvient sur la membrane B de revelation contenant un substrat qui est ainsi coloré par contact avec le fluide examiné. En cas de reaction negative,c'est à dire si l'echantillon examiné ne contient pas d'antigène,l'anticorps marqué de l'etage superieur est retenu par le reactif non marqué fixé sur les microsphères en C,et ne vient pas colorer le substrat en B. Les modalités sont les mêmes,mutatis mutandis,si c'est un anticorps que l'on recherche dans le fluide. Si on veut obtenir un dosage semi-quantitatif (Figure 3),une pastille supplementaire appelée C0,placée au dessus de la pastille D,immobilise et neutralise par l'intermediaire de reactifs appropriés (3),une certaine quantité seulement de ligand recherché,correspondant à une quantité considérée comme normale dans le fluide.La quantité excedentaire de ligand,si elle existe,traverse cette membrane C0 pour reagir normalement avec les reactifs des zones decrites plus haut. La figure 4 illustre le dosage qualitatif d'antigènes avec obtention d'un resultat positif: on y voit le complexe (5) antigène-anticorps marqué formé traverser l'etage mediant sans être retenu,pour aller vers la zone de revelation B tandis que les anticorps restant (6) non saturés en antigènes sont piegés en C. La figure 5 illustre le dosage qualitatif d'anticorps avec obtention d'un resultat positif: les antigènes marqués (7) saturent les anticorps seriques recherchés et traversent l'etage median tandis que les antigenes marqués restés libres (8) sont piégés en C. EXEMPLE 1 :DOSAGE DU EGF-R (RECEPTEUR DE L' EPIDERMAL GROWTH FACTOR' 1 - Les supports: En B : Papier Durieux No 122 En C: Nylon Pall Porosité 0.45 ju epaisseur 100 microns En D : Papier Wathman traité au prealable par lait ecrémé 5% 2 - Les reactifs: En B : un spot de 2,ul de la solution suivante: * 3-3'-5-5' Tetra Methyl Benzidine à 1 mglml * Glucose Oxydase 1000 Wml * Tampon Citrate 0.01 M En C Anticorps Goat Anti-Peroxydase Sigma Ref P 5774 En D : Monoclonal Anti EGF - Receptor: Clone No 29.1.1. Mouse IgG1 Marqué Peroxydase.(Yarden et al.J.BIOL.Chem.,260,315 (1985)) Deposé en solution de D-Glucose 0.1 M in PBS 3 - Mode operatoire proprement dit: 3 a - Confection des pastilles et technique de marquage des anticorps -1: Dissoudre 30 mg de PBQ (p - benzoquinone) dans 1 ml d'ethanol. - 2 : Diluer 1 mg d'anticorps Monoclonal Goat Anti-Receptor dans 0.15 ml de NaCl 0.15 M contenant 0.05 ml de phosphate tampon 1 M à pH 6. -3: Ajouter 0.05 mI de la solution de PBQ de 1) à la dilution d'anticorps de 2).Incuber 1 heure au noir et à temperature ambiante. - 4 : Eliminer l'excès de PBQ par dialyse exhaustive (une nuit) -5: Ajouter 4 mg de Peroxydase.Agiter au vortex quelques minutes. - 6 : Ajouter 0,1 ml de tampon Carbonate NaHCO3 1 M pH 9 et incuber 48 heures à 4"C - 7 : Dialyse extensive (une nuit) contre PBS à travers filtre Millipore 0.22 M .Conserver au noir et à 4"C. Les pastilles Wathman sont baignées dans un bain de lait ecrémé à 5% puis rincées et sechées. Sur chaque pastille on depose 5 jtl de la solution d'anticorps marqués obtenus,dilués à 1/1000 dans du PBS.Sechage sous vide poussé puis stocker sous vide,au noir et à 40C. 3 b : La phase selective: La pastille de nylon Immunodyne Pall 0,45 M de porosité, est plongée pendant une heure dans un bain de la solution suivante: - Anticorps Goat Anti-Peroxydase 1 microgramme / ml -Pbs Après une heure,rincer avec PBS glacé puis pratiquer un blocking par bain dans la solution suivante pendant une heure: - Bovine Serum Albumine 2% - PBS glacé. Puis rincer plusieurs fois avec la solution suivante: - Thimerosal 0.01 % - Tris Buffer Saline (TBS) pH 7.4 Secher et garder sous vide sauf deux pastilles pour le contrôle de qualité suivant: Contrôles de qualité : Figure 6 - On prend une pastille de phase selective et on la baigne dans une solution d'anticorps anti - EGF-R,marqués peroxydase : Pastille T - On prend une seconde pastille de phase selective et on la baigne dans une solution en excès de EGF-R (Recepteurs EGF) ET d'anticorps anti-EGF-R: Pastille T+ Pendant ces bains de 15 minutes on prepare les pastilles temoins: - Deux pastilles de Nylon sont preparées exactement de la même façon que la phase selective sauf qu'il n'y a pas d'anticorps anti-peroxydase.Elles ne doivent rien retenir normalement: Pastilles TT. L'une des pastilles TT est baignée en compagnie de la pastille T- dans une solution d'anticorps marqués anti EGF-R.L'autre est baignée dans la solution d'anticorps marqués anti-EGF-R saturés en EGF-R. Rinçage et sechage puis on depose sur chaque pastille 54 d'une solution de chromogène suivante: (TMB lmg/ml,H202 0.01 volume,Tampon citrate 0.1M) La figure 6 illustre les resultats obtenus: - Dans le bain de la solution d'anticorps marqués anti EGFR,la,pastille T- a fixé l'anticorps anti EGFR marqué peroxydase qui colore la solution chromogène deposée,en bleu;la pastille TT reste incolore : n'a rien fixé du tout,il n'y a pas d'anticorps anti EGFR marqués peroxydase qui s'y fixent,il n'y a donc pas de retention parasite. - Dans la solution d'anticorps marqués anti EGFR saturés en EGFR,la pastille T+ n'a pas pu fixer ces anticorps : à cause de l'antigène lié à eux,leur peroxydase est devenue inaccessible aux anticorps anti peroxydase prealablement fixés sur la pastille phase selective,ils ont été eliminés au rinçage.La depose de la solution chromogène n'a rien coloré.La pastille temoin TT n'a rien fixé du tout egalement. 4 - Mode d'execution: 1 ml de PBS est versé dans 2 tubes en polypropylène numerotés 0 et 1 Dans le tube 1 on ajoute 2 M1 d'une solution de recepteurs membranaires de l'EGF obtenus par traitement de membranes de cellules de carcinome mammaire (detergent,centrifugations successives pour eliminer les noyaux,les membranes,etc.puis dialyse extensive de 24 heures et passage sur colonne Sephadex). 50 Ml du tube 0 sont deposés dans l'orifice E du dispositif (D0) 50 nul du tube 1 sont deposés dans l'orifice du dispositif (D1) Resultats Après 30 secondes on retourne les dispositifs.Le spot de TMB de D1 est bleu tandis que celui de DO reste incolore. : Figure 7 EXEMPLE 2: DOSAGE QUALITATIF DE L'HCG (Human chorionique gonadotr.! Les suports,les reactifs de B (spot TMB) et C (phase selective d'anticorps anti4peroxydase) sont identiques à l'exemple 1. Seule la pastille D est differente : elle contient des anticorps IgG1 de souris marqués peroxydase,specifiques de la sous unité ss-HCG,à raison d'un spot de 5 l contenant 5 nanogrammes de ces anticorps. Mode d'execution: Cinq tubes numerotés 0 à 4 contiennent une solution d'Hcg in Pbs à concentration croissante exprimée en Unités Internationales: 0 - 12,5 - 25 - 50 - 100 U.I./like de PBS Cinq dispositifs de dosage qualitatif d'HCG sont numerotés: DO-D12,5-D25-D50-D100 On depose 50,ul du tube 0 sur le dispositif D, 50,ul du tube 1 sur le dispositif D12,5, 50M1 du tube 2 sur le dispositif D25, 50 l du tube 3 sur le dispositif D50, 50 l du tube 4 sur le dispositif Dito. On attend 30 secondes l'ecoulement total des fluides et on retourne le dispositif pour la lecture du signal de coloration du TMB,signal evalué 0 à +++: Resultats N du tube 0 1 2 3 4 Concentr en Ulil 0 12,5 25 50 100 Signal 0 + ++ +++ +++ EXEMPLE 3: DOSAGE SEMi-OUATTlTATIF DE L'INTERLEUKINE-1 Les supports sont identiques à l'exemple 1. Les reactifs en B (spot TMB) et en C (anticorps anti peroxydase) sont identiques aussi. En D : Anticorps Rabbit Anti Human Interleukine 1ss obtenus de Genzyme Corp. (Koch Light Ltd.,England) marqués Peroxydase. En C0 : Membrane de Nylon Pall de porosité 0.45 microns,de 100 microns d'epaisseur traitée par un bain d'une solution très diluée (0.1 M%Iml) d'anticorps anti IL-lB cité ci dessus,puis rincée et saturée par BSA 5% et PBS glacé et encore rincée pour eliminer la BSA en excès.Secher et conserver à 40Cette membrane C0 va pieger l'IL-lB contenue dans l'echantillon à analyser à hauteur de 505 picogrammes par ml,c'est à dire 5 UI d'IL-lB/ml.La quantité d'IL-lB excedentaire,si elle existe,va traverser C0 et se lier aux anticorps marqués en D puis traverser C sans se lier aux anticorps anti-peroxydase,et arriver enfin en B pour la revelation: coloration du TMB. Tandis que si le taux d'IL-lss est inferieur ou egal à 5 UUml dans l'echantillon,les anticorps non marqués immobilisés en CO piegent l'IL-lB tandis que les anticorps marqués anti IL-lB presents en D,ne reçoivent pas d'IL-lss et migrent avec le fluide de l'echantillon vers Ie bas,vers C où ils sont piegés par les anticorps anti peroxydase.Il n'y aura pas d'anticorps marqués peroxydase en B et donc pas de coloration. La figure 8 : illustre un dosage semi-quantitatif d'IL-lss negatif à droite (IL-lss ~ 5 Wml) et positif à gauche (IL-lB -5 Ut/mi) Exemple 4: DOSAGE SEM1-OUANTITATIF DE L'ANTIGENE CARCINO-EMBRYONNAIRE Mêmes supports.Mêmes reactifs en B (Substrat chromogène) Reactifs: - En C: Goat Anti Mouse IgG Fab specific Ref M 6898 Sigma - En D : Anticorps monoclonaux Mouse anti-ACE marqués peroxydase : Ref 69.186.1 de Miles Lab. - En CO : Anticorps anti ACE non marqués,immobilisés sur Nylon Mode operatoire: - Preparation de la membrane C0: Une solution très diluée d'anticorps anti-ACE (0.1,ug/ml) sature,selon le protocole Pall,une membrane en nylon de type Immunodyne 0.45 M de porosité et 100M d'epaisseur.Après une agitation douce d'une heure,rinçage et bain de blocking (BSA 5%,PBS) puis trois rinçages au PBS glacé et sechage.Conserver à sec et au noir,sous vide. Cette pastille C0 ainsi preparée piège l'ACE (2,5 nannogrammes /ml) considéré comme seuil limite dans le sang d'un adulte normal (non fumeur et femme non enceinte). Preparation de la membrane D (Anticorps marqués) La solution d'anticorps Mouse anti-ACE, marqués peroxydase est diluée à 1,ug/ml dans une solution de PBS et de D-Glucose à 5%.0n depose 5Ml de cette solution sur les pastilles de papier Wathman prealablement saturé par du lait ecrémé à 5%. Preparation de la membrane C (Phase selective) Les pastilles de nylon Pall: Immunodyne sont baignées pendant une heure à temperature ambiante dans la solution d'anticorps de Goat anti Mouse IgG Fab diluée à 1,ccg/ml de PBS.Puis rinçages et blocking comme decrit plus haut,puis rinçage final et conserver à 40C au noir et sous vide.Cette membrane piège les anticorps marqués,Mouse anti-ACE,quand ils ne sont pas saturés en ACE car les anticorps anti-ACE sont issus de souris et les anticorps de cette phase selective ne reconnaissent que la partie Fab des anticorps de souris : Mouse anti ACE,libres de tout ACE;l'ACE excedentaire (au dessus de 2,5 ng/ml de serum) dans l'echantillon va se lier aux sites Fab des anticorps marqués Mouse anti ACE,et ces sites Fab vont se trouver masqués par l'ACE et ne seront donc pas reconnus par les anticorps anti Mouse Fab fixés dans la membrane C.Les complexes Anticorps marqués anti-ACE + l'ACE excedentaire qui a debordé la membrane C0,vont traverser cette phase selective C pour migrer avec le fluide de l'echantillon vers la zone de revelation B. Tandis que les anticorps marqués Mouse anti-ACE restés libres de tout ACE vont être piégés en C par les anticorps anti Mouse Fab. MODE D'EXECUTION: Six tubes de polypropylène sont numerotés 0 - 1 - 2 - 3 - 5 - 10. Ils contiennent de l'ACE in PBS aux concentrations suivantes: Tube 0: Temoin sans ACE. Tube 1: 1 ng d'ACE/ml - Tube 2:2 ng/ml - Tube 3 : 3 ng/ml Tube 5: 5 ng / mlTube 10: 10 ng/ ml Six dispositifs semi-quantitatifs sont numerotés D0-D 1-D2-D3-D5-D 10. 50 microlitres du tube 0 sont deposés dans le dispositif DO 50 l de 1 dans D1, SOMîde 2dans D2, 50 l de 3 dans D3, 50 M1 de 5 dans D5, 50 l de 10 dans D10. On attend 30 secondes l'ecoulement complet des fluides des echantillons puis on retourne les dispositifs pour la lecture de la coloration du spot de TMB. Resultats: No du tube 0 1 2 3 5 10 (Taux ACE en nglmi) SIGNAL 0 0 0 + ++ +++ Noté 0 à +++ EXEMPLE 5: DOSAGE QUANTITATIF RADIO-ACflF DU CA 125: Figure 9 Le CA 125 est un marqueur tumoral unique pour le diagnostic et le suivi de cancers gynecologiques et en particulier de carcinome de l'ovaire.Il est associé à une glycoproteine de haut poids moleculaire qui n'existe pas dans les ovaires normaux mais qui est retrouvée en abondance dans les adenocarcinomes ovariens. Le taux de concentration serique ou plasmatique du CA 125 des ujetx normaux est de 8.7 + 8.9 Unités / ml. 99% de la population normale a des concentrations de CA 125 35 U/ml.L'Unité correspond à un certain poids defini de glycoproteine portant le determinant antigenique CA 125 (environ 1 nanogramme) Le dispositif utilisé va comprendre de haut en bas :Figure 9 - la plaque F avec son orifice E pour deposer l'echantillon - la membrane D portant des anticorps Mouse IgG1 (fragment Fab) anti CA 125 marqués radio activement - la membrane C portant des anticorps anti Mouse IgG1 fragment Fab - une epaisse membrane permeable M,poreuse,de cellulose saturée par de la caseine à 5% pour ne pas retenir de substances et destinée à etablir une separation entre la phase selective C et la membrane de lecture B : ce qui permet au compteur placé sous B de ne pas entrer en contact avec les anticorps radioactids piégés en C,et donc d'eviter des faux positifs - la phase de lecture B : une membrane en nylon qui absorbe le produit des reactions en C et D: c'est à dire qui absorbe les eventuels complexes anticorps marqués radioactivement + l'antigène recherché.Cette membrane B est apte à entrer en contact intime avec le capteur d'un lecteur ou d'un compteur de radioactivité,pour evaluer l'intensité du signal en fonction du nombre des anticorps marqués radioactifs,complexés à leur antigène qui parviennent en B. - La plaque transparente A est à son tour perforée d'un orifice de 5 m de diametre dans lequel viendra s'enfoncer le capteur du compteur de radioactivité. Mode operatoire: Membrane D: 10 mm de diametre,en papier Durieux N0122 baigné quelques heures dans une solution de lait ecrémé à 5% in eau deionisée puis rincé au PBS et seché Le lendemain,on note la face de depose de ces membranes par un petit trait au crayon noir et on depose S 5M1 de la solution suivante: - Anticorps Mouse IgG1 F(ab')2 Anti-CA 125 marqués à l'Indium 111: 1 microgramme par ml (Ref OC 125, CI Saclay) - Sucrose 5% - Thimerosal 0,01% - NaCl 0.9% - Acetate buffer 0.1 M pH 5 (Les 50,ul de l'echantillon vont diluer ces 5M1 de tampon - > 0.01M) Sechage sous vide poussé à froid et stockage au froid en attendant l'assemblage avec les autres membranes) Membrane C: en nylon Pall 0.45 M de porosité et 100,u d'epaisseur,10 mm de diamètre,baignée quelques heures dans la solution suivante: - Anticorps Goat Anti Mouse IgG1 F(ab')2 specific (Ref Sigma 6898) dilués à 1 microgramme par ml de PBS puis rinçage et blocking avec bain de BSA 5% in PBS 1 heure à 37"C puis rinçage final au PBS glacé,sechage et stockage au froid en attendant l'assemblage des diverses membranes. Membrane M : la preference est allée à la fibre de verre Wathman d'epaisseur 0.25 mm baignée pendant 3 heures dans de la caseine à 5% in TRIS pH 6 puis rincée avec PBS plusieurs fois Ainsi preparée,elIe constitue une excellente separation.entre C et B,sans pour autant retenir anormalement les eventuels complexes qui la traversent. Membrane B : Nylon NYTRAN de Schleicher et Schull sans la moindre preapration: elle absorbe les eventuels anticorps radioactifs qui ont echappé à C et traversé M.Elle est apte à venir en contact avec un compteur radioactif de coups par minute (cpm sur la figure 9) Mode d'execution : En regard de l'orifice de la plaque transparente A on depose dans l'ordre: - la membrane B - la pastille de fibre de verre M - la membrane C - la membrane D - en regard de D,la plaque F est soudée à l'ensemble et perforée de l'orifice E dans lequel on deposera l'echantillon. On prend 8 tubes numerotés de 1 à 8. Ils contiennent le serum provenant de la même patiente chez laquelle a été decouvert un cystadenocarcinome ovarien.lls montrent l'evolution du CA125 - Tube 1 jour du diagnostic - Tubes 2,3,4: au cours des 5 mois de la chimiotherapie - tube 5 : à la fin de la radiotherapie - tube 6 : 2 mois après la radiotherapie - tube 7: 3 mois après la radiotherapie - tube 8: 6 mois après la radiotherapie On prend 8 dispositifs de dosage radioactifs de CA 125 et on les numerote D1 à D8. 50,ul du tube 1 sont ainsi deposés sur le dispositif D1, 50mol de 2 sur D2, 50,ul de 3 sur D3,etc.. On attend chaque fois 30 secondes on insère le dispositif dans la fente d'un appareillage de lecture de radioactivité etalonné à cet effet (1 U de CA 125 correspondant à un certain nombre de coups par minutes) L'insertion du dispositif doit se faire de telle sorte que la membrane B soit au contact etroit avec le capteur du compteur,de la même façon qu'une carte magnetique de telephone ou une carte bancaire. Les resultats sont notés et transposés sur une courbe: Figure 10 N0 du tube Correspond à: Signal en U/ml 1 Decouverte tumeur 390 2 3 mois de chimiotherapie 80 3 4 mois de chimiotherapie 31 4 5 mois de chimiotherapie 7 5 4 mois de radiotherapie 2 6 2 mois sans soins 37 7 3 mois sans soins 59 8 6 mois sans soins:rechute 495 EXEMPLE 6: DOSAGE SEMI-OUANTITATIF DE PLUSIEURS MAROUEURS TUMORAUX AVEC LA MEME GOUTTE D'ECHANTILLON: CA 19-9 + CA 15-3 + ACE Le principe : Pré-screening:Si au moins un des marqueurs est très augmenté,le test se colorera en bleu.ll conviendra alors d'orienter les recherches vers l'un des marqueurs pris isolément comme dans l'exemple 4 Ce dosage est très important pour le depistage et le suivi de cancereux opérés pour prevenir rapidement les metastases : les taux d'ACE ou dde CA 19-9 reviennent en quelques mois à la normale après la chirurgie et l'irradiation des tumeurs.Par contre les recidives peuvent être silencieuses et invisibles même avec des examens techniques sophistiqués (la fibroscopie digestive ne peut deceler des microtumeurs recidivantes,et quand ces dernières sont importantes,il est souvent trop tard;alors que le dosage des marqueurs en association est capable de depister de telles recidives plus tôt). Le CA 15-3 est decrit dans la litterature comme etant un antigène associé au cancer du sein et defini par deux anticorps monoclonaux differents: 115 D8 (Hilkens et al.Int.J.Cancer (1984) 34 : 197-206) et DF3 (Kufe et al. Hybridoma (1984) 3 : 223-232) Le taux de concentration en CA 15-3 dans le serum ou le plasma de sujets normaux est de 13,7 +5,2 Unités / ml. 99,cor % de la population normale a une concentration de CA 15-3 30 U/ml Le CA 19-9 est le determinant antigenique associé aux tumeurs du pancreas: c'est un derivé sialylé du pentasaccharide du groupe sanguin LEWIS A (Lacto-N-fucopentaose-lI).Ce determinant antigenique qui se repète est porté soit par un ganglioside à la surface des membranes cellulaires soit par une proteine de type mucine dans le serum. 1 Unité est = à 0.8 nanogrammes de glycoproteine de type mucine portant le determinant antigenique CA 19-9. Le taux de concentration du CA 19-9 dans le serum ou le plasma de sujets normaux est de 8,4 Unités / ml + 7,4 Unités/ml. 99,5 % de la population normale a des concentrations de CA 19-9 a 37 Unités / ml. Les marqueurs tumoraux presentent un inconvenient important : ils peuvent être augmentés chez certaines personnes non cancereuses, et peuvent être à des taux normaux chez des cancereux.Par contre,pris en association,leur specificité est plus nette. Exemple: cancers gastriques : (H.J.Staab - Tübingen - Germany) - Augmentation du CA 19-9 dans: 76% des cas - Augmentation de l'ACE dans: 59 % des cas - Augmentation ACE+CA 19-9: 94 % des cas Autre exemple : Adenocarcinome du sein: (May-Levin et al.3e Congrès International Hormones et Cancer.Hambourg.RFA,6-11 Septembre 1987 : Etude comparative à differents stades du cancer du sein ) - sans metastases : Augmentation du CA 15-3 dans 30 à 50 % des cas du CA 15-3 ET ACE dans 90 % des cas - avec metastases : Augmentation du CA 15-3 dans 75 % des cas du CA 15-3 ET ACE dans 95 % des cas 1l est impossible de fixer en C (la phase selective) tous les antigènes identiques à ceux que I'on cherche à detecter (Brevets anterieurs),pour pieger les anticorps marqués provenant de D non saturés en antigènes : pour plusieurs raisons: - Une association de CA 15-3,CA 19-9 et ACE fixés en C,entraine un encombrement sterique prejudiciable à la reconnaissance de leurs sites antigeniques par les anticorps marqués provenant de B;ces derniers risquent donc de ne pas être piegés et d'aller colorer B,en faux positif. - Cette gêne n'existe pas avec des immunoglobulines differentes,car fixées par leur extrêmité Fc et convenablement orientées vers l'antigène recherché (ce qui permet leur utilisation en C0 pour neutraliser la quantité d'antigène etablie à l'avance) - Les antigènes sont rares et coûteux alors que leurs anticorps ne le sont pas. - Leur conservation sur la phase selective est aleatoire car leur structure tertiaire se modifie alors que les immunglobulines en general ont une aptitude extraordinaire de stabilité même à sec. Mode operatoire: Les supports,la membrane B (TMB) sont les mêmes qu'en exemple 1. La membrane D va supporter les anticorps monoclonaux marqués peroxydases differents specifiques de chaque antigène recherché: - Anticorps DF3 (Cie Oris Industrie) Anti CA 15-3 - Anticorps Anti ACE (Abbott CEA EIA Monoclonal) - Anticorps NS 116 Anti CA 19-9 (International CIS) - tous provenant de souris et appartenant à la categorie d'immunoglobulines IgG1 - tous marqués peroxydase sur leur segment Fab - tous dilués à 1 microgramme par ml dans du PBS,thimerosal 0.01% et D-Glucose 5% La membrane C (phse selective) va suporter les deux types d'immunoglobulines citées plus haut dans l'exemple 4 (dosage ACE) - Goat Anti Fab de Mouse IgG1 - Goat Anti-Peroxydase Cette association s'est revelée très interessante car beaucoup plus efficace: les anticorps mar qués provenant de la membrane D,non saturés en antigène (marqueur par exemple),sont fixés beaucoup plus efficacement par leur fragment Fab resté libre ET par l'enzyme qu'ils supportent,non masqué par l'antigène.Alors que ce dernier,quand il se lie aux anticorps marqués,masque l'enzyme ET le site Fab. Les membranes C sont baignées pendant deux heures dans une solution des deux anticorps cités in PBS puis rincées dans du PBS glacé et saturées en blocking comme decrit plus haut (Bain de BSA 5% puis rinçages et sechage) ;stockage à l'abri de la lumière et au froid. - Les membranes C0,sont baignées dans une solution contenant les anticorps NON marqués dirigés contre les trois marqueurs,et diluée à 0.1 microgramme parmi pour chaque anticorps.Cette membrane va pieger jusqu a. - 30 U/ml de CA 15-3 -37 Ulmi de CA 19-9 - 7 nglml d'ACE Si le taux de l'un de ces marqueurs excède ces limites,la quantité excedentaire de marqueur va traverser la membrane CO et se conjuguer aux anticorps marqués de D,traverser C avant d'aller colorer B. Confection du dispositif: Sur une plaque transparente A on depose: - une pastille de substrat: B - une pastille de phase selective: C - une pastille d'anticorps marqués melangés : D - une pastille de pré-phase selective C0 d'anticorps dirigés contre une certaine quantité seulement des trois marqueurs. Sur cet ensemble,on depose et soude une plaque F perforée d'un orifice E en regard des pastilles,et dans lequel seront deposés les echantillons. Mode d'execution: On prend quatre tubes numerotés 0 à 3.Ils contiennent: - Tube 0: : les trois marqueurs en quantité normale: - CA 15-3: ~ 30 Unités/ml (Oris) - CA 19-9: ~ 37U/mi(IntCis) - ACE (Ref C 7292 Sigma) : -7 ng/ml - Tube 1 : seul l'ACE est > à 7 ng/ml - Tube 2: seul le CA 19-9 est > à 37 U/ml - Tube 3 : seul le CA 15-3 est > à 30 U/ml On prend quatre dispositifs de dosage semiquantitatif des trois marqueurs tumoraux avec la même goutte et on les numerote DO à D3: On depose 50 Ml du tube 0 sur le dispositif D0,50 l du tube 1 sur le dispositif D1, 50 cul de 2 sur D2, 50 Ml de 3 sur D3. On attend 45 secondes (au lieu de 30 secondes pour les dispositifs precedents en raison de la membrane C0) et on retourne les dispositifs: Resultats: N du tube Marqueur en excès SIGNAL 0 aucun 0 1 ACE ++ 2 CA 19-9 ++ 3 CA 15-3 ++ Cet exemple n'est pas limitatif: etant donnée la faible quantité d'anticorps non marqués en C0 ou ceux marqués utilisés en D (5 nanogrammes de chaque) ,il s'est avéré possible d'associer plusieurs types d'anticorps specifiques de plusieurs marqueurs,ce qui permet d'aboutir à un test universel si on utilise les marqueurs des cancers les plus repandus,et donc à un depistage de masse. I1 s'est egalement revélé possible d'associer non seulement des anticorps de marqueurs entre eux,mais egalement des anticorps de plusieurs facteurs de croissance,mais egalement aussi des anticorps de marqueurs AVEC des anticorps de facteurs de croissance,ou des anticorps de recepteurs ou enfin une association des trois elements: anticorps : de marqueurs + de facteurs de croissance ou recepteurs de ces facteurs de croissance. Exemples de dispositifs: 1 - Cancers digestifs: EGF (Epidermal Growth Factor)+ TGF (Transforming Growth Factor) + Marqueurs ACE + AFP + CA 19-9 L'excès de l'un de ces marqueurs dans la goutte d'echantillon,provoque la coloration en B et doit faire orientter vers des examens plus ciblés sur l'appareil digestif. 2 - Cancers du sein: EGF-R (Recepteurs de l'EGF) + PR (Recepteurs Progesterone) + ER ( Recepteurs de l'Oestrogène) ±CA 15-3 + ACE Une augmentation du taux des recepteurs hormonaux 3 - Suivi des nouveaux protocoles de traitements par TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes) dopés à l'interleukine-2 : la reponse optimale est une elevation de: IL-i (Interleukine 1) + TNF (Tumor Necrosis Factor) Dans cet exemple,c'est le signal positif semi-quantitatif (IL-1 et TNF au dessus d'un certain seuil) qui est favorable. De même dans tous les dosages semi-quantitatifs où c'est le deficit en certains ligands,qui est pathologique: - l'insuline - le glucagon - les complexes vitaminiques - etc.. Le dispositif utilisé pour tous ces exemples se presente sous l'aspect d'une carte enserrant les diverses membranes du procédé mais la succession de ces membranes peut très bien s'inserer dans d'autres structures comme par exemple au fond des puits des plaques ELISA,ou bien cette succession de membranes peut se faire de manière horizontale: la migration des fluides de l'echantillon ne se faisant plus de haut en bas mais d'une extrêmité à l'autre d'une bandelette par exemple. Tous ces exemples de dosage et d'une manière generale toutes les associations de dosage dans le même test,ne sont que des exemples illustrant les facilités apportées par le procédé faisant l'objet de la presente invention.Les combinaisons peuvent être illimitées et en fait,les divers dispositifs à venir ne seront que le reflet de la necessité d'un pré-screening pour un depistage massif et regulier de maladies malignes debutantes. ll faut enfin signaler LA proteine du cancer appelée CP ( Cancer Procoagulant .Stuart G.Gordon,Barbara A.Cross.Cancer Research 550, 6229-6234,0ctober 1sot,1990): c'est une cysteine proteinase exprimée par les cellules cancereuses (impliquée dans les coagulations anormales observées au debut de nombreux cancers) mais jamais par les cellules normales,ce qui lui donne une très haute specicifité (90%) alors que la specificité de l'ACE est basse (50%) du fait qu'il est secrété par bon nombre de cellules normales (sujets fumeurs,femmes enceintes,etc..) Elle permettrait de depister 80 % des cancers,surtout les cancers peu evolués.Ce serait en quelque sorte une proteine specifique des etats debutants: elle correspondrait ainsi parfaitement avec la très bonne sensibilité du procédé objet de la presente invention. REVENDICATIONS 1 - Procédé de determination qualitative et quantitative rapide de la presence d'un ligand reactif dans un fluide,caracterisé en ce que des reactifs non marqués convenablement choisis (notemment tel qu'un anticorps )et immobilisés sur un support,sont aptes à reconnaître et pieger des reactifs marqués (notemment tels qu'un antigène ou un anticorps marqués) specifiques d'un ligand precis,les dits reactifs non marqués immobilisés n'etant plus specifiques du ligand recherché mais des reactifs marqués,de telle sorte qu'un reactif marqué complexé à son ligand n'est pas piégé par le reactif immobilisé tandis qu'un reactif marqué non complexé à son ligand sera piégé par les reactifs immobilisés aboutissant ainsi à une phase selective dite universelle car independante du ligand recherché. 2 - Procédé selon la revendication 1,caracterisé en ce que l'echantillon de fluide est mis en contact dans une première zone,au cours d'une première etape du procédé de dosage qualitatif,avec un reactif marqué (notemment tel qu'un anticorps ou un antigène) pour permettre à une reaction ligand-reactif de se produire,après quoi le produit eventuel de la reaction est mis en contact dans une seconde zone au cours d'une seconde reaction avec un reactif non marqué qui est le même quelque soit le ligand recherché et qui est apte à pieger le reactif marqué s'il n'est pas complexé au ligand recherché,ou à ne pas pieger le reactif marqué si ce dernier est complexé au ligand recherché,après quoi le produit de la première ou de la seconde reaction entre en contact dans une troisième zone au cours d'une troisième reaction avec des moyens de revelation de la presence ou de l'absence du ligand recherché dans l'echantillon. 3 - Procédé selon la revendication 1,caracterisé en ce que l'echantillon de fluide est mis en contact dans une première zone au cours d'une première etape du procédé de dosage semiquantitatif,avec un premier reactif non marqué apte à pieger une certaine quantité seulement de ligand recherché, après quoi la quantité excedentaire de ligand,si elle existe,est mise en contact dans une seconde zone au cours d'une seconde reaction avec un reactif marqué,après quoi le produit eventuel des première et seconde reactions est mis en contact dans une troisième zone au cours d'une troisième reaction avec un reactif non marqué capable de pieger les reactifs marqués s'ils ne sont pas complexés à leur ligand,et à ne pas pieger ces reactifs marqués si ces derniers sont complexés au ligand excedentaire recherché,les laissant filtrer au cours d'une quatrième reaction vers une quatrième zone contenant des moyens de revelation de la presence eventuelle d'un excès du ligand que l'on cherche à detecter,aboutissant ainsi à un dosage semiquantitatif du dit ligand. 4 - Procédé selon la revendication 1,caracterisé en ce que l'echantillon de fluide est mis en contact dans une première zone au cours d'une première etape du procédé de dosage quantitatif,avec un premier reactif (tel qu'un anticorps ou un antigène notemment) marqué par un isotope radioactif,pour permettre à une reaction reactif marqué - ligand de se pro duire, après quoi le produit eventuel de cette première reaction est mis en contact dans une seconde zone avec des reactifs non marqués capables de pieger le reactif marqué si ce dernier n'est pas complexé à son ligand,et capables de ne pas pieger ce reactif marqué si ce dernier est complexé à son ligand,après quoi le produit eventuel de cette seconde reaction est mis en contact dans une troisième zone,avec des moyens de comptage radioactif aptes à fournir une evaluation quantitative precise du reactif marqué radioactif qui a traversé avec son ligand la membrane selective objet de la revendication numerotée 1;;les moyens de comptage radioactif pouvant egalement evaluer au niveau des deux premières zones la radioactivité piegée pour la comparer à la radioactivité detectée par un autre capteur au niveau de la troisième zone,aboutissant ainsi à un comptage precis et une evaluation precise du ligand dans l'echantillon. 5 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la première zone de reaction contiént plusieurs reactifs marqués,chacun des reactifs etant specifique d'un ligand precis eventuellement present dans l'echantillon à tester;si au moins un des reactifs marqués detecte son ligand dans l'echantillon,le complexe reactif marqué + ligand detecté ne sera pas piégé dans la seconde zone de reaction par le reactif non marqué immobilisé dans cette seconde zone,et la traverse pour être en contact avec des moyens de revelation dans une troisième zone de reaction,tandis que si aucun des ligands recherchés n'est present dans l'echantillon,tous les reactifs marqués seront piégés dans la seconde zone de reaction par le reactif non marqué et aucun signal ne sera emis par la troisième zone de reaction;;aboutissant ainsi à une detection d'au moins un parmi plusieurs ligands avec la même goutte d'echantillon,en une seule manipulation. 6 - Dispositif pour la determination qualitative et quantitative rapide de la presence d'un ligand reactif,dans un fluide,caractérisé en ce qu'il comprend en combinaison: - une première zone de reaction qui comprend une membrane (D),prevue pour recevoir un echantillon de fluide à tester et destinée à être associée à au moins un reactif convenablement marqué non immobilisé apte à reconnaître le ou les ligands recherché(s) eventuellement contenu(s) dans le dit echantillon - une seconde zone de reaction distincte de la première comprenant une membrane (C) contenant un reactif de reference immobilisé,non marqué,apte à reconnaître et pieger le reactif marqué provenant de la première zone quand ce reactif marqué n'est pas complexé à un ligand;;et apte à ne pas pieger ce reactif marqué quand ce dernier est lié à son ligand - un troisième zone de reaction distincte des deux precedentes et qui contient sur une membrane (B),des moyens de revelation de la reaction qui s'est eventuellement produite dans la première ou la seconde zone de reaction le dit dispositif etant en outre caractérisé en ce que ces trois zones membranaires sont en mate riau poreux permeable tel que nylon, nitrocellulose, cellulose,agarose,polyacrylamide,etc -l'ensemble etant avantageusement enserré entre deux plaques dont la superieure est perforée d'un orifice pour y deposer la goutte d'echantillon,tandis que la plaque inferieure est transparente pour lire le resultat quand il s'agit d'un signal colorimetrique. 7 - Dispositif selon la revendication 6 caracterisé en ce que le dispositif de dosage semiquantitatif comprend au dessus de la première zone de reaction,une zone comprenant un reactif hon marqué specifique du ligand recherché et destinée à pieger une certaine quantité seulement de ligand correspondant au seuil considéré normal dans l'echantillon,la quantité excedentaire de ligand,si elle existe, se lie selon le procédé decrit dans la première revendication et dans le dispositif decrit dans la revendication 6,avec les reactifs marqués de la première zone;après quoi le complexe reactif marqué + ligand excedentaire traverse la seconde zone contenant des reactifs non marqués sans être piégé avant d'être mis en contact avec les moyens de revelation de la troisème zone de reaction. 8 - Dispositif pour la determination quantitative rapide d'un ligand reactif,dans un fluide,caracterisé en ce qu'il comprend en combinaison: - une première zone de reaction (D) prevue pour recevoir un echantillon de fluide à analyser et destinée à être associée à un ou des reactifs convenablement marqué(s) par un isotope radio actif,et apte(s) à reconnaître le ou les ligands recherché(s) eventuellement contenu(s) dans le dit echantillon - une seconde zone de reaction (C) distincte de la première comprenant une membrane qui contient,immobilisé,un reactif de reference non marqué,apte à reconnaître et pieger le ou les reactifs marqués radioactivement provenant de la première zone quand ils ne sont pas complexés à leur ligand respectif,et apte à ne pas pieger les dits reactifs marqués radioactivement quand ils sont complexés à leur ligand respectif - une membrane (M) en matériau à large pores de type cellulose, destinée à etablir une separation entre les reactifs marqués piégés dans la seconde zone et la membrane de lecture constituant la troisième zone - une troisième zone (B) comprenant une membrane absorbant les reactifs marqués complexés à leurs ligands,et qui traversent la seconde zone de reaction et la membrane (M);la dite membrane etant apte à entrer en contact intime avec un capteur ou un compteur ou un quelconque appareillage de quantification de la radioactivité absorbée dans cette membrane. Le dispositif conforme à cette revendication se presente ainsi sous la forme d'une carte fine sur laquelle on depose une goutte d'echantillon avant de l'inserer dans la fente d'un appareillage de comptage radioactif. 9 - Dispositif de determination quantitative rapide de la presence d'un ligand reactif,dans un fluide,caracterisé en ce qu'il comprend: - un support de type plaque ELISA 96 puits presentant,immobilisés sur ses parois un ou des reactifs (notemment un ou des anticorps differents,specifique(s) du ou des ligand(s) recherché(s)) capables de reconnaitre et fixer des reactifs marqués (notemment des immunoglobulines marquées se liant aux sites Fab des anticorps non marqués immobilisés) si ces reactifs immobilisés ne sont pas complexés à leur ligand recherché dans l'echantillon;les dits reactifs marqués ne reconnaissant et ne se fixant plus aux reactifs immobilisés si ces derniers ne sont pas complexés à leur ligand. - une pellicule de protection thermosoudée sur la plaque 10 - Procédé de determination quantitative rapide de la presence d'un ligand reactif tel qu'un antigène,dans un fluide, caracetrisé en ce que le fluide de l'echantillon est deposé au cours d'une première etape de ce procédé,dans un des puits de la plaque decrite dans la revendication 9, pour mettre en contact l'anticorps specifique de l'antigène recherché,cette fois-ci immobilisé sur les parois du puits et convenablement orienté,avec l'antigène eventuellement present dans l'echantillon; après quoi le puits est rincé au cours d'une seconde etape de ce procédé;après quoi une solution de reactif marqué (immunoglobuline marquée specifique du site Fab de l'anticorps non marqué immobilisé, notemment) est deposée dans le puits au cours d'une troisième etape;après quoi le puits est à nouveau rincé pour eliminer le reactif marqué non lié aux anticorps immobilisés,avant qu'un moyen de revelation vienne mesurer la quantité de reactif marqué lié à l'anticorps non marqué (non complexé à son antigène) immobilisé sur les parois du puits;le moyen de revelation etant un compteur de radioactivité si le marquage est radioactif,une solution chromogène si le marquage est enzymatique,aboutissant ainsi à la determination quantitative d'un antigène dont le taux va être inversement proportionnel à l'intensité du signal: eliminant ainsi le problème du bruit de fond.