FR 2650597 A1 19910208 FR 8910748 A 19890804 Procédés de préparation de molécules biologiques à partir des boues d'une station d'épuration d'eaux usées et produits obtenus. DESCRIPTION La présente invention a pour objet des procédés de préparation de molécules biologiques à partir des boues d'une station d'épuration d'eaux usées et les nouveaux produits obtenus. Le secteur technique de l'invention est celui de la production de molécules biologiques notamment d'enzymes. Les stations d'épuration des eaux résiduelles. notamment des eaux usées qui circulent dans les égouts urbains utilisent un procédé d'épuration biologique ou un procédé physico-chimique. Dans les deux cas ces stations produisent des boues qui peuvent être prélevées dans tous les ouvrages de la station qui effectuent une séparation liquidesolide par exemple sur le décanteur primaire ou secondaire, sur le classificateur, l'épaississeur, la centrifugeuse, le pressoir, le filtre-presse ou le filtre à tambour. etc.. Elles peuvent être prélevées avant ou après déshydratation, avant ou après addition de floculant selon les possibilités de prélèvement offertes par la station et selon que ces boues doivent être transportées ou peuvent être traitées sur place. Ces boues sont riches en molécules biologiques issues du métabolisme cellulaire. Ces molécules biologiques comportent notamment des enzymes, des polysaccharides, des lipides, des protides, des vitamines, des hormones, des glycoprotéines, des lipoprotéines etc... Un obJectif de la présente invention est de procurer un procédé permettant de préparer certaines molécules biologiques, notamment des enzymes, pour un coût inférieur à celui des procédés de préparation qui sont actuellement utilisés et qui partent de tissus animaux ou végétaux ou de cultures de micro-organismes. Un autre objectif de l'invention est de permettre de préparer certaines molécules biologiques notamment certains enzymes en s'affranchissant de la nécessité d'extraire ceux-ci de tissus qu,'il est difficile de se procurer. Les objectifs de l'invention sont atteints par un procédé de préparation de molécules biologiques, notamment d'enzymes, à partir de boues prélevées sur une station d'épuration d'eaux usées, lequel procédé comporte les opérations suivantes - on prélève des boues et, si nécessaire, on les dilue pour obtenir une concentration en matières sèches de l'ordre de 3 à 4 % - on dissocie les flocons composant les boues en ajoutant un agent dénaturant qui inhibe les liaisons intermoléculaires sans altérer les molécules biologiques et on broie - on élimine. la phase solide par un procédé de séparation liquide solide - et on effectue une ultrafiltration de la phase liquide sur une membrane ayant un pouvoir de coupure compris entre 3.000 et 100.000 daltons ce qui permet d'obtenir un retentat ayant une concentration en enzymes élevée. Il est rappelé que le dalton est une unité de masse qui est égale à 1/N gramme, N étant le nombre d'Avograde. Avantageusement, après élimination de la phase solide, on effectue d'abord une micro-filtration tangentielle de la phase liquide sur une membrane ayant un pouvoir de coupure compris entre 0,1 pm et 0,45 pm ce qui permet d'obtenir un filtrat qui contient la majorité des enzymes et on effectue ensuite l'ultrafiltration de ce filtrat. L'agent dénaturant est de préférence un octoxynol qui est utilisé avantageusement en proportion de l'ordre de 0,4 % du volume de boues diluées. L'agent dénaturant peut également être du chlorure de sodium ou de potassium ou de l'urée ou un agent vendu sous le nom commercial "tween 8011 ou polysorbate 80 qui est un copolymère d'oléate de sorbitol et d'oxyde d'éthylène ou du dodécyl sulfate de sodium. Le but de l'invention est de produire des extraits contenant notamment une quantité de protéines enzymatiques suffisants pour pouvoir être commercialisés tel quels pour certains usages industriels ou bien des extraits permettant d'obtenir après une purification plus poussée certaines molécules, notamment certaines enzymes ou des hormones qui sont présentes dans les boues et qui ont une forte valeur marchande. Les travaux de recherche et les analyses effectuées ont montré que l'on peut extraire notamment des boues de station d'épuration les enzymes suivants : phosphatase alcaline, phosphatase acide. estérase, estérase lipase, lipase, protéase, a-galactosidase, #-galactosidase, #-glucoronidase, a-glucosidase, #-glucosidase, N-acétyl-ss glucosaminidase, amylase, catalase... Après avoir exposé brièvement ci-dessus les étapes essentielles d'un procédé d'extraction selon l'invention nous décrivons plus en détail ci-après ces diverses étapes et donnons des exemples concrets. Les boues utilisées peuvent provenir de n'importe quelle station d'épuration d'eau usées, de préférence d'une station d'épuration d'eaux usées urbaines. Cette station peut utiliser un procédé d'épuration biologique ou un procédé physico-chimique. Les essais réalisés montrent que les produits extraits des stations physico-chimique sont#plus riches en phosphatase alcaline et que cet enzyme est plus pur. Les boues peuvent être prélevées dans n'importe quel ouvrage d'une station d'épuration comportant une séparation liquide-solide, par exemple dans un décanteur primaire ou secondaire, dans un classificateur, un épaississeur, une centrifugeuse, un pressoir, un filtre-presse ou un filtre à tambour. Elles peuvent être prélevées avant ou après déshydratation, avant ou après rajout de floculant. Des essais ont été conduits pour déterminer l'influence sur le rendement final de la concentration'initiale des boues en extrait sec. Ces essais ont montré que les rendements en protéines et en phosphatase alcaline augmentent dans le même sens que le taux de dilution tandis que le pourcentage de matière sèche extraite varie en sens inverse de la dilution. En conséquence, on choisit un taux de dilution de l'ordre de 3 à 4 % qui permet d'obtenir un extrait brut contenant environ 25 % de protéines et des rendements de l'ordre de 75 % pour l'ensemble des protéines et de 85 % pour la phosphatase alcaline. Si les boues prélevées sur la station sont plus concentrées on commence donc par les diluer pour obtenir une concentration de l'ordre de 3 à 4 %. Les boues sont des solutions colloïdales composées de flocons et d'un liquide interstitiel. Les études effectuées ont montré que le liquide interstitiel est pauvre en molécules biologiques et que la majorité de celles-ci sont piégées dans les flocons où elles sont maintenues par des liaisons intermoléculaires. La première étape du procédé selon l'invention a pour but de libérer les molécules biologiques en rompant les liaisons intermoléculaires ce qui a pour effet de dissocier les flocons et de solubiliser les molécules biologiques, notamment les enzymes. La dissociation des flocons est obtenue en mélangeant aux boues diluées une faible quantité d'un agent dénaturant ou dissociant qui rompt les liaisons -intermoléculaires et- dissocie les flocons. Plusieurs agents dissociants ont été essayés notamment du "Triton X 100' qui est un octoxynol par exemple de l'octylphenoxy polyéthoxyethanol ou un p isooctylphenyl ether de polyéthylène glycol. On a également essayé du chlorure de sodium ou de potassium, de l'urée, un agent vendu sous le nom "Tween 80" ou polysorbate 80 qui est un copolymère d'oléate de sorbitol et d'oxyde d'éthylène et du dodécyl sulfate de sodium. Les meilleurs rendements en protéines et en phosphatases alcalines ont été obtenus en utilisant une concentration en octoxynol de l'ordre de 0,4 % du volume de boue. Des essais ont été conduits en faisant varier le temps d'homogénéisation c'est-à-dire le temps pendant lequel on laisse agir l'agent associant avant de passer à la phase suivante. Ces essais ont montré que le temps d'homogénéisation doit être suffisant pour permettre une bonne dispersion de l'agent dissociant et une bonne dissociation des flocons sans toutefois atteindre une dénaturation des protéines et des enzymes, Dans la pratique industrielle on utilisera un temps d'homogénéisation de l'ordre de 30 minutes. Avantageusement la dissociation des flocons peut être améliorée en traitant le mélange de boues diluées et d'agent dissociant dans un broyeur colloïdal afin d'obtenir une dilacération de ceux-ci et la mise en solution des molécules organiques. La deuxième étape du procédé selon l'invention est le traitement de la suspension obtenue après dissociation des flocons pour séparer une phase solide constituée par les particules en suspension et une phase liquide. Cette séparation peut être réalisée par exemple par centrifugation ou par filtration ou par tout autre procédé connu permettant la séparation de la phase solide et'de la phase liquide. La phase solide constitue un déchet. La phase liquide contient les molécules biologiques en solution. Cette solution est soumise à une micro-filtration tangentielle sur des membranes microporeuses, par exemple sur des membranes organiques ayant un pouvoir de coupure compris entre 0,1 et 0,45 pm. Cette micro-filtration donne une première phase liquide retenue par la membrane ou retentat qui contient des macromolécules de haut poids moléculaire notamment les polysaccharides, ainsi que les microorganismes et une partie des protéines présentes dans les boues. Elle donne une deuxième phase liquide passant à travers la membrane ou filtrat qui contient la majorité des enzymes présents dans les boues ainsi que d'autres molécules organiques de faible poids moléculaire. Par exemple des essais au cours desquels on a réalisé une microfiltration sur des membranes ayant un pouvoir de coupure de 0,45 pm ont montré que sa % à 90 % des phosphatases alcalines se trouvaient dans le filtrat. Les essais réalisés à partir des boues de stations d'épuration des eaux usées de plusieurs villes ont montré que le filtrat obtenu après micro-filtration sur des membranes ayant un pouvoir de coupure de 0,45 pm contient entre 0,7- g et 3g de protéines par litre de filtrat selon la station d'épuration et selon le point de prélèvement des boues. Les concentrations sont faibles et il est préférable de traiter le filtrat issu de la micro-filtration pour obtenir des produits ayant une teneur en protéines plus élevée. Cette étape de concentration est réalisée par ultrafiltration du filtrat issu de la micro-filtration sur des membranes ayant un pouvoir de coupure compris entre 3.000 et 100.000 daltons. On rappelle que l'ultra-filtration est une technique très utilisée pour la séparation des molécules. Elle consiste à filtrer sous pression un liquide contenant des molécules en solution ou en suspension sur des membranes dont le pouvoir de coupure est de l'ordre des dimensions des molécules à séparer. Dans le cas présent on effectue. une ultra-filtration pour conserver le maximum de protéines dans le retentat et pour éliminer l'eau et les petites molécules minérales ou organiques. Selon la station d'épuration où les boues ont été prélevées on obtient après ultra-filtration un retentat ayant une teneur totale en protéines comprise entre 8 et 25 g/litre de filtrat. Des analyses enzymatiques de ce retentat ont montré la présence dans celui-ci notamment des activités enzymatiques suivantes par gramme d'extrait sec phosphatase alcaline : 1,5 à 50 Unités - protéase : 2 å 30 Unités - ffi glucuronidase : 2.000 à 20.000 Unités Selon la station sur laquelleles boues ont été prélevées, le rétentat obtenu après ultra-filtration présente, de plus, une ou plusieurs des activités enzymatiques suivatnes par gramme d'extrait sec - ss galactosidase : 0 à 2 unités; - lipase : 80 à 300 unités; - catalase : 200 à 1500 unités. Les unités d'activité enzymatique sont celles qui sont utilisées habituellement pour des analyses enzymatiques. Par exemple l'unité de phosphatase alcaline est la quantité de cet enzyme qui catalyse l'hydrolyse d'une micromole- p-nitrophenyl phosphate par minute à une température de 250C et un pH = 8. L'unité de protéase est égale à la quantité de cet enzyme qui hydrolyse la caséine en produisant une couleur équivalente à une micromole de tyrosine par ml et par minute à pH = 7 et une température de 3700. L'unité de ffi galactsosidase est la quantité de cet enzyme qui hydrolyse une micronole d'O-nitrophényl-#-D-galactoside en nitrophénol et D-galactose par minute à pH = 7,5 et une température de 3000.. Les résultats des analyses enzymatiques réalisées sur des échantillons de retentat de l'ultrafiltration montrent que par le traitement d'une tonne (poids sec) de boues il est possible d'obtenir notamment - 0,22 à 1,2 millions d'unités de phosphatase alcaline - 13 à 27 millions d'unités de lipase - 0,3 à 2,7 millions d'unités de protéase - 34 à 79 millions d'unités de catalase - 150 à 750 millions d'unités de ss-glucuronidase ; - 5.100 à 152.000 unité de P-g?lactosidase - 64.000 à 31 millions d'unités d'a galactosidase. A titre de comparaison la phosphatase alcaline est obtenue habituellement à partir d'intestin de veau et on obtient à partir d'une tonne de matière sèche entre 2 et 5 millions d'unités de phosphatase alcaline. La catalase est extraite d'un escargot (Helix pomatia) et on obtient par tonne de matière sèche environ 150 millions d'unités de ss- glucuronidase Ces quelques chiffres montrent qu'une tonne de boues sèches permet d'obtenir un produit contenant simultanément plusieurs enzymes en quantités comparables et même supérieures à celles que l'on peut obtenir séparément à partir de tissus animaux spécifiques dont l'approvisionnement est difficile. Les concentrations en certaines enzymes du retentat de l'ultrafiltration sont suffisantes pour pouvoir vendre celui-ci à l'état brut. Par exemple des extraits bruts de lipase ayant une activité spécifique comprise entre 0,6 et 1,2 U/mg de protéines sont commercialisés pour des applications dans le domaine de la dépollution des effluents et de la fabrication des produits de nettoyage. L'activité spécifique de la lipase dans le retentat de l'ultrafiltration varie entre 1,4 U/mg de protéines et 2,67 U/mg de protéines selon la station d'épuration où les boues sont prélevées. Ces teneurs sont donc tout à fait comparables et même supérieures à celles des produits commercialisés à ce jour. Les quantités de protéines que l'on peut extraire d'tne tonne de boue séchée varient entre 3Kg et 19 Kg selon la station sur laquelle ces boues sont prélevées. On peut également faire subir au retentat de l'ultra filtration un traitement de purification pour en extraire certains enzymes purifiés pour atteindre une activité spécifique suffisante. On peut extraire du retentat de l'ultra-filtration notamment de la phosphatase alcaline, de la protéase, de la ss glucuronidase etc... Avantageusement le concentrat de l'ultra-filtration est concentré par lyophilisation (séchage à basse température et en dépression) qui permet d'obtenir une poudre déshydratée. Le procédé selon l'invention peut permettre également de récupérer d'autre produits utiles, notamment des produits de. haut poids moléculaire présents dans le retentat de la micro-filtration et des molécules de poids moléculaire inférieur à une limite comprise entre 3.000 et 100.000 daltons qui peuvent être récupérés dans l'ultra-filtrat après déshydratation de ceux-ci. On décrit ci-après à titre d'exemple des essais de laboratoire qui ont été exécutés sur des boues prélevée dans deux stations d'épuration différentes. Exemple n01 Des boues ont été prélevées sur une station d'épuration biologique des eaux usées d'une ville de 35.000 habitants. Des boues concentrées ont été prélevées après déshydratation par rajout d'un floculant et passage dans un filtre à bandes. Ces boues concentrées ont été diluées avec de l'eau pour obtenir une solution contenant environ 3,75 % de matière sèche. On a prélevée 5 litres de cette solution diluée. On a ajouté à ces 5 litres de solution environ 20 grammes d'octoxynol et on a brassé le mélange pour l'homogénéiser. On a ensuite centrifugé le mélange pendant environ 30 minutes dans une Centrifugeuse de type "Beckman" thermostatée à 40C, réglée pour fournir une accélération centrifuge de 15.000 g. La phase liquide surnageante a été ultra-filtrée sur une membrane ayant un pouvoir de coupure de 10.000 daltons. Le retentat a été lyophilisé. Des dosages enzymatiques du produit lyophilisé ont donné les résultats suivants - phosphatase alcaline : ~ 45 Unités - lipase : 3.220 Unités - protéase : 61 Unités - amylase : 85 Unités - ss galactosidase : 1,04 Unités - ffi glucuronidase - :30.000 Unités - catalase ~ : 7.061 Unités. Par ce traitement de 5 litres de boue diluée on a obtenu 12 grammes de produit sec lyophilisé contenant 20,5 r de protéines. Exemple n02 Des boues ont été prélevées sur une station de traitement physico-chimique. traitant les eaux usées d'une grande ville d'un million d'habitants. Ces boues ont été prélevées en cours de traitement de déshydratation après addition d'un floculant. On a prélevé quatre litres de boues ayant une teneur de 4,6 % de matière sèche auxquelles on a ajouté 1,5 litres d'eau pour les diluer. On a ensuite dissocié les flocons et homogénéisé la solution dans un broyeur de type " Ika" après avoir ajouté à la solution 20 grammes d'octoxynol. Le liquide ainsi obtenu a été ensuite centrifugé pendant 30 minutes dans une centrifugeuse de type "Beckman" thermostatée à 40C sous une accélération de 15.000 g. On a récupéré 3,7 litres de liquide surnageant que l'on a soumis à une filtration tangentielle sur une membrane ayant un pouvoir de coupure de 0,45 pm. On obtient ainsi un concentrat retenu par la membrane de 500 ml. On dilue à nouveau ce concentrat jusqu'à 3.700 ml dans de l'eau puis on le fait passer à nouveau sur le filtre tangentiel afin de récupérer au maximum les protéines retenues dans ce concentrat. On répète deux fois cette étape de dialyse. Le filtrat final a un volume de 10.100 ml. On effectue ensuite une ultra-filtration. du filtrat précédent sur une membrane ayant un pouvoir de coupure de 10.000 daltons. On obtient ainsi 500 ml de retentat qui est lyophilisé. Cette fraction lyophilisé représente 7,61 grammes de matière sèche contenant 12,4 % de protéines (pourcentage en poids). Une analyse enzymatique du produit lyophilisé a donné les résultats suivants - phosphatase alcaline : 344 Unités - lipase : 1.520 Unités - protéase : 25 Unités; - ss galactosidase : 2,5 Unités - ss glucuronidase : 99.430 Unités - catalase : 5.232 Unités. Ces deux exemples montrent que l'on obtient des produits dont les activités enzymatiques principales ont le même ordre de grandeur à partir des boues prélevées'sur des stations de traitement utilisant un procédé d'épuration biologique ou un procédé physico-chimique. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de molécules biologiques, notamment d'enzymes, à partir des boues d'une station d'épuration d'eaux usées caractérisé par la suite d'opérations suivantes - on prélève des boues et si nécessaire on les dilue pour obtenir une concentration en matières sèches de l'ordre de 3 à 4 % - on dissocie les flocons composant les boues en ajoutant un agent dénaturant qui inhibe les liaisons intermoléculaires sans altérer les molécules biologiques et on broie; - on élimine la phase solide par un procédé de séparation liquide-solide et on effectue une ultra-filtration de la phase liquide sur une membrane ayant un pouvoir de coupure compris entre 3.000 et 50.000 daltons, ce qui permet d'obtenir un retentat ayant une concentration en enzymes élevée. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que après élimination de la phase solide, on effectue d'abord une microfiltration tangentielle de la phase liquide sur une membrane ayant-un pouvoir de coupure compris entre 0,1 pm et- 0,4 pm, ce qui permet d'obtenir un filtrat qui contient la majorité des enzymes. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit agent dénaturant est un oxtoxynol. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que la quantité d'octoxynol utilisée est de l'ordre de 0,4 % du volume de boues diluées. 5. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit agent dénaturant est du chlorure de sodium ou de potassium, ou de l'urée ou un copolymère d'oléate de sorbitol et d'oxyde d'éthylène ou du dodecyl sulfate de sodium. 6. Procédé selon l'une quelconque de revendication 1 à 5 caractérisé en ce que ledit agent dénaturant est ajouté en même temps que la solution de boues est homogénéisée dans un broyeur. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que l'étape d'élimination de la phase solide est réalisée par centrifugation de la solution. 8. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'étape .de micro-filtration tangentielle comporte plusieurs dialyses du retentat qui est dilué plusieurs fois avec de l'eau et qui est à nouveau filtré pour récupérer un maximum d'enzymes. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que le retentat de l'ultrafiltration est déshydraté par lyophilisation. 10. Produit obtenu par un procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il contient une proportion de protéines comprise entre 5 et 25 % du poids total et il présente les activités enzymatiques suivantes par gramme d'extrait sec - phosphatase alcaline : .1,5 à 50 Unités - protéase : 2 à 30 Unités - ss glucuronidase : 2.000 à 20.000 Unités