FR 2657622 A1 19910802 FR 9001137 A 19900131 La présente invention concerne de nouveaux polypeptides impliqués dans la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides, et en particulier du coenzyme Bol2. Elle concerne également le matériel génétique responsable de l'expression de ces polypeptides, ainsi qu'un procédé permettant leur préparation. Elle concerne enfin un procédé d'amplification de la production de cobalamines, et plus particulièrement du coenzyme B12, par les techniques d'ADN recombinant. La vitamine B12 fait partie des vitamines du groupe B. Il s'agit d'une vitamine hydrosoluble qui a été identifiée comme étant le facteur permettant de traiter des malades souffrant d'anémie pernicieuse. Elle est généralement prescrite pour stimuler l'hématopoïèse chez les sujets fatigués, mais elle est aussi utilisée dans de nombreux autres cas qui comprennent les troubles hépatiques, des déficiences nerveuses ou comme stimulant de l'appétit, principe tonifiant, ainsi qu'en dermatologie (Berck, 1982, Fraser et al., 1983). Dans les élevages industriels d'animaux non ruminants, l'alimentation étant essentiellement à base de protéines d'origines végétales, il est nécessaire d'incorporer aux rations alimentaires de la vitamine B12 à des quantités de 10 à 15 mg par tonne d'aliments (Barrère et al., 1981). La vitamine B12 fait partie d'une classe de molécules appelées cobalamines, dont la structure est présentée à la figure 1. Les cobamides diffèrent des cobalamines par la base du nucléotide inférieur qui n'est plus le 5,6-diméthylbenzimidazole, mais une autre base, par exemple, le 5-hydroxybenzimidazole, pour la vitamine B12-facteur III synthétisée entre autre par Clostridium thermoaceticum et Methanosarcina barkeri (Iron et al., 1984). Ces similitudes structurales expliquent que les voies métaboliques de biosynthèse des cobalamines et des cobamides soient communes pour la majeure partie. Les cobalamines sont synthétisées presque exclusivement par des bactéries, selon un processus complexe et encore très mal connu, qui peut se diviser en quatre étapes (figure 2) i) synthèse de luroporphyrinogène III (ou urotgen III), puis ii) transformation de l'uro'gen III en acide cobyrinique suivie de iii) la transformation de celui-ci en cobinamide et iv) la construction de la boucle nucléotidique inférieure avec incorporation de la base particulière (5,6-diméthylbenzimidazole dans le cas des cobalamines). Pour le coenzyme B12, il est probable que l'addition du groupement 5t-désoxyadénosyl se produit peu après que le noyau corrine soit synthétisé (Huennekens et al., 1892). Dans le cas des cobamides, seule l'étape de synthèse et d'incorporation de la base inférieure est différente. La première partie de la biosynthèse des cobalamines est très bien connue puisqu'elle est commune à celle des hèmes ainsi qu'à celle des chlorophylles (Battersby et al., 1980). Elle fait intervenir successivement la o-aminolevulinate synthase (EC 2.3.137), la 6-aminolévulinate déhydrase (EC 4.2.1.24), la porphobilinogène déaminase (EC 4.3.1.8) et llurolgen III cosynthase (EC 4.2.1.75) qui transforment le succinyl CoA et la glycine en uro'gen III. Toutefois la première étape se fait chez certains organismes [par exemple E.coli (Avissar et al., 1989) et chez les bactéries méthanogènes (Kannangara et al., 1989), par exemples par la conversion grâce à un complexe multienzymatique de l'acide glutamique en acide a-aminolévulinique. Entre lurotgen III et l'acide cobyrinique, seuls trois dérivés d'intermédiaires ont été purifiés à ce jour ; il s'agit des Facteurs FI, FII et FIII qui sont des produits d'oxydation respectivement des trois intermédiaires précorrine-1, précorrine-2 et précorrine-3 qui correspondent aux dérivés mono-, di- et triméthylés de l'urotgen III (figure 3) ; ces intermédiaires sont obtenus par des transferts successifs de groupements méthyl à partir du SAM (S-adénosyl-L-méthionine) sur lurotgen III aux positions C2, C7 et C20 respectivement.Les autres réactions qui ont lieu pour donner l'acide cobyrinique sont, outre cinq autres transferts de groupements méthyl à partir du SAM en C17, C12, C1, C15 et C5, l'élimination du carbone en C20, la décarboxylation en C12 et l'insertion d'un atome de cobalt (figure 4). Ces étapes de biosynthèse ont été déduites à partir d'expériences effectuées in vitro sur des extraits acellulaires de Propionibacterium shermanii ou de Clostridium tetanomorohina. Dans ces extraits, l'acide cobyrinique est obtenu par transformation de lturotgen III, après incubation dans des conditions appropriées en anaérobiose (Batterby et al., 1982).Aucun intermédiaire entre le précorrine-3 et l'acide cobyrinique, pouvant être transformé en corrinoïdes par incubations ultérieures avec des extraits de bactéries productrices de cobalamines, n'a été isolé à ce jour. La difficulté d'isoler et d'identifier ces intermédiaires est liée à i) leur grande instabilité ii) leur sensibilité à l'oxygène et iii) leur faible niveau d'accumulation in vivo. Dans cette partie de la voie, seule une enzyme de Pseudomonas denitrificans a été purifiée et étudiée ; il s'agit de la SAM.uro'gen III méthyltransférase (Blanche et al., 1989) appelée SUMT. Entre l'acide cobyrinique et le cobinamide, les réactions suivantes sont effectuées i) addition du groupement 5'-désoxyadénosyl (s'il s'agit du coenzyme B12 qui doit être synthétisé), ii) amîdation de six des sept fonctions carboxyliques par addition de groupements amines, iii) amidation de la dernière fonction carboxylique (chaîne d'acide propionique du noyau pyrrole D) par addition du R-1-amino-2-propanol (figure 2). Il n'a pas été élucidé s'il existait réellement un ordre dans les amidations (Herbert et al., 1970). Enfin, aucun dosage d'activité dans cette partie de la voie n'a été décrit sauf en ce qui concerne l'addition du groupement 5'-désoxyadénosyl (Huennekens et al., 1982). La dernière étape de la biosynthèse d'une cobalamine, par exemple le coenzyme B12 comprend quatre phases successives décrites sur la figure 5 (Huennekens et al., 1982), à savoir i) la phosphorylation du groupement hydroxyl du résidu aminopropanol du cobinamide pour donner le cobinamide phosphate, puis ii) l'addition d'une guanosine diphosphate par réaction avec la guanosine 5'-triphosphate ; le composé obtenu est le GDP-cobinamide (Friedmann, 1975) qui iii) réagit avec le 5,6-diméthylbenzimidazole, lui-même synthétisé à partir de la riboflavine, pour donner l'adénosyl- cobalamine 5'-phosphate (Friedmann et al, 1968) qui iv) par déphosphorylation conduit au coenzyme B12 (Schneider et Friedmann, 1972). Parmi les bactéries capables de produire des cobalamines, on peut citer notamment Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter Bacillus megaterium Clostridium sticklandii Clostridium tetanomornhum Clostridium thermoaceticum Corvnebacterium XG Eubacterium limosum Methanobacterium arboPhilicum Methanobacterium ivanovii Methanobacterium ruminant ium Methanobacterium thermoautotrohicum Methanosarcina barkeri Propionobacterium shermanii Protaminobacter ruber Pseudomonas denitrificans Pseudomonas putida Rhizobium melitoti Rhodopseudomonas sphaeroides Salmonela typhimurium Sviruîina platensis Stretomvces antibioticus Streptomyces aureofaciens Streptomyces griseus Streptomvces olivaceus Au niveau industriel, en raison de la grande complexité des mécanismes de biosynthèse, la production des cobalamines, et en particulier de la vitamine B12, est exclusivement microbiologique. Elle est réalisée par des cultures en grands volumes des bactéries Pseudomonas denitrificans, Propionobacterium shermanii et Propioni- bacterium freudenreichii (Florent, 1986). Les souches utilisées pour la production industrielle sont issues de souches sauvages; elles peuvent avoir subi de nombreux cycles de mutation au hasard puis de sélection de clones améliorés pour la production de cobalamines (Florent, 1986). Les mutations sont obtenues par mutagénèse avec des agents mutagènes ou par traitements physiques tels que des traitements aux rayons ultra-violets (Barrère et al., 1981). Par cette méthode empirique, des mutations au hasard sont obtenues et améliorent la production de cobalamines.Par exemple, il est décrit qu'à partir de la souche originale de Pseudomonas denitrificans initialement isolée par Miller et Rosenblum (1960, brevet US 2 938 822) la production de ce microorganisme a été graduellement augmentée en dix ans, par les techniques citées ci-dessus de 0,6 mg/l à 60 mg/l (Florent, 1986). Pour les bactéries du genre Prooionibacterium, EPropionobacterium shermanii (ATCC 13673) et freudenreichii (ATCC 6207) les mêmes valeurs de production semblent être décrites dans la littérature ; par exemple une production de 65 mg/l a été décrite (brevet Euroreen 87920). Toutefois, aucun crible n'a encore été décrit permettant de sélectionner ou de repérer facilement soit des mutants surproducteurs de cobalamines soit des mutants nettement améliorés dans leur production de cobalamines. Au niveau génétique, peu de travaux ont été effectués à ce jour. Le clonage de gènes cob (codant pour des enzymes impliquées dans le procédé de biosynthèse) a été décrit chez Bacillus megaterium (Brey et al., 1986). Onze groupes de complémentation ont été identifiés par complémentation de mutants cob de Bacillus mecraterium avec des plasmides portant différents fragments d'ADN de Bacillus meaaterium. Ces gènes sont groupés sur le même locus, porté par un fragment de 12 kb. Des études ont également été menées sur les gènes cob de Salmonella tvPhimurium. Sans que le clonage de ceux-ci ait été décrit, il a été montré que presque tous les gènes de biosynthèse des cobalamines sont regroupés entre les minutes 40 et 42 du chromosome (Jeter et Roth, 1987). Seul le locus cvsG, qui doit permettre la transformation de lurotgen III en précorrine-2 ne fait pas partie de ce groupe de gènes. Toutefois, l'activité codée par ce locus, ainsi que ses propriétés biochimiques n'ont pas été décrites. En outre, des phénotypes ont été associés aux mutations cob. Chez Salmonella tvPhimurium et chez Bacillus meaaterium, les mutants cob ne montrent plus de croissance sur milieu minimum avec de l'éthanolamine comme source de carbone ou comme source d'azote (Roof et Roth, 1988). Ceci est dû au fait qu'une enzyme du catabolisme de l'éthanolamine, l'éthanolamine ammonia-lyase (EC 4.3.1.7), a pour cofacteur le coenzyme Bols; les mutants cob ne synthétisant plus de coenzyme B12, ils ne peuvent plus croître avec l'éthanolamine comme source de carbone et/ou comme source d'azote. Des mutants metE de Salmonella typhimurium n'ont plus qu'une homocystéine-méthyltransférase (EC 2.1.1.13) méthylcobalamine dépendante.Les mutants cob de Salmonella typhimurium metE sont auxotrophes pour la méthionine (Jeter et al., 1984). Chez Pseudomonas denitrificans et Aarobacterium tumefaciens des phénotypes associés à une déficience totale en synthèse de cobalamines n'ont pas été décrits à ce jour. Enfin, des travaux sur Pseudomonas denitrificans (Cameron et al., 1989) ont abouti au clonage de fragments d'ADN portant des gènes cob de cette bactérie. Ceux-ci sont répartis en quatre groupes de complémentation portés par au moins 30 kb dwADN. Au moins quatorze groupes de complémentation ont été identifiés par complémentation hétérologue de mutants cob dtAarobacterium tumefaciens et de Pseudomonas Putida avec des fragments d'ADN de Pseudomonas denitrificans portant des gènes cob. Cependant, jusqu'à maintenant, aucun de ces gènes n'a été purifié, et aucune séquence nucléotidique n'a été décrite. De même, aucune identification protéique, ni aucune fonction catalytique attribuée au produit de ces gènes n'ont été décrites. De plus, aucune amélioration de production de cobalamines par les techniques d'ADN recombinant n'a pu être obtenue. L'amplification de gènes cob de Bacillus meaaterium ne procure pas, chez la souche à partir de laquelle ils ont été clonés, une amélioration de production de cobalamines (Brey et al., 1986). Chez Salmonella tvphimurium, des études physiologiques ont été menées afin de déterminer des conditions dans lesquelles une forte transcription des gènes cob étudiés était observée (Escalante et Roth, 1987).Dans ces conditions, il n'y a pas d'amélioration de la production de cobalamines, bien que des gènes de la voie de biosynthèse soient plus exprimés que dans les conditions standard de culture. La présente invention résulte de l'identification précise de séquences d'ADN codant pour des polypeptides impliqués dans la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides. L'invention a pour objet ces séquences d'ADN, ainsi que toute séquence d'ADN homologue résultant de la dégénérescence du code génétique,et que les séquences d'ADN, de toute origine (naturelle,synthétique, recombinante) qui hybrident et/ou qui présentent des homologies significatives avec ces séquences ou avec des fragments de celles-ci et qui codent pour des polypeptides impliqués dans la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides. L'invention a aussi pour objet les gènes contenant ces sequences d'ADN. Les séquences d'ADN selon la présente invention ont été isolées à partir d'une souche industrielle, Pseudomonas denitrificans SC510, dérivée de la souche MB580 (brevet US 3 018 225), par complémentation de mutants cob de A.tumefaciens et P.putida. Les clones obtenus ont pu être analysés précisément, notamment par cartographie à l'aide d'insertions d'un dérivé du transposon Tn5. Ces études génétiques ont permis de localiser les gènes cob sur la carte de restriction et de réaliser leur séquençage. Une analyse des phases ouvertes a ensuite permis de mettre en évidence les régions codantes de ces fragments d'ADN. La présente invention a aussi pour objet l'utilisation de ces séquences nucléotidiques pour cloner les gènes cob d'autres bactéries. En effet il est connu que pour des protéines catalysant les mêmes activités, les séquences sont conservées avec, comme divergence, la divergence évolutive (Wen-Hsiung et al., 1985). Il est montré dans la présente invention qu'il y a une homologie significative entre les sequences nucléotidiques de differents microorganismes codant pour des polypeptides impliqués dans la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides. Les differences qui apparaissent résultent de la dégénérescence évolutive, et de la dégénérescence du code génétique qui est liée au pourcentage en GC du génome du microorganisme étudié (Wen-Hsiung et al., 1985). Selon la présente invention, une sonde peut être faite avec une ou plusieurs des séquences d'ADN de Pseudomonas denitrificans notamment, ou avec des fragments de celles-ci, ou avec des séquences analogues présentant un degré de dégénérescence spécifique, au niveau de l'usage des codons et du pourcentage en GC de l'ADN de la bactérie que l'on veut étudier. Dans ces conditions, il est possible de détecter un signal d'hybridation spécifique entre la sonde et des fragments d'ADN génomique de la bactérie étudiée ; ce signal d'hybridation spécifique correspond à l'hybridation de la sonde avec les gènes cob isafonctionnels de la bactérie. Les gènes cob ainsi que leurs produits peuvent ensuite être isolés, purifiés et caractérisés. l'invention fournit ainsi un moyen permettant, par hybridation, d'accéder aux sequences nucléotidiques et aux polypeptides impliqués dans la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides de tout microorganisme. La présente invention a également pour objet un ADN recombinant contenant au moins une séquence d'ADN codant pour un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides, et notamment, un ADN recombinant dans lequel la ou lesdites séquences sont placées sous le contrôle de signaux d'expression. A cet égard, on peut en particulier positionner en 5' de la séquence d'ADN des régions promotrices. De telles régions peuvent être homologues ou hétérologues de la séquence d'ADN. En particulier, des promoteurs bactériens forts, tels que le promoteur de l'opéron tryptophane PtrP ou de l'opéron lactose Piac de E.coli, le promoteur gauche ou droit du bactériophage lambda, les promoteurs forts de phages de bactéries, telles que les corynebactéries, les promoteurs fonctionnels chez les bactéries gram-négatives, tel que le promoteur Ptac de E.coli, le promoteur PxviS des gènes du catabolisme du xylène du plasmide TOL, le promoteur de l'amylase de Bacillus subtilis Papy, pourront être utilisés. On peut citer également les promoteurs dérivés de gènes glycolytiques de levures, tels que les promoteurs des gènes codant pour le phosphoglycérate kinase, la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, la lactase ou l'énoiase, qui pourront être utilisés lorsque l'ADN recombinant sera introduit dans un hôte eucaryote. Un site de fixation des ribosomes sera également positionné en 5' de la séquence d'ADN et il pourra être homologue ou hétérologue, tel le site de fixation des ribosomes du gène cil du bactériophage lambda. Des signaux nécessaires à la terminaison de la transcription pourront être placés en 3' de la séquence d'ADN. L'ADN recombinant selon la présente invention peut ensuite être introduit directement dans une cellule hôte compatible avec les signaux d'expression choisis ou être cloné sur un vecteur plasmidique pour permettre d'introduire de manière stable la séquence d'ADN en question dans la cellule hôte. Un autre objet de i'inventio concerne les plasmides ainsi obtenus contenant une séquence d'ADN codant pour un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides. Plus précisément, ces plasmides contiennent aussi un système de réplication fonctionnel et un marqueur de sélection. L'invention a aussi pour objet les cellules hôtes dans lesquelles une ou plusieurs sequences d'ADN telles que définies précedemment, ou un plasmide tel que défini ci-avant, à été introduit. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production de polypeptides impliqués dans la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides. Selon ce procédé, on transforme ne cellule hôte avec une séquence d'ADN telle que décrite précédemment, on cultive cette cellule transformée dans des conditions d'expression de ladite séquence, puis on récupère les polypeptides produits. Les cellules hôtes qui pourront être utilisées dans ce but sont aussi bien des procaryotes que des eucaryotes, des cellules animales ou des cellules végétales. Préférentiellement, elles seront choisies parmi les bactéries et, en particulier, les bactéries du genre E.coli, P.denitrificans, A.tumefaciens ou R.melitoti. Une autre utilisation des séquences d'ADN selon la présente invention réside dans un procédé d'amplification de la production de cobalamines et/ou de cobamides, par les techniques d'ADN recombinant. En effet, si la limitation du flux métabolique de la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides est due à une limitation dans l'activité d'une enzyme dans la voie de biosynthèse, l'augmentation de cette activité par augmentation de l'expression de cette même enzyme à laide des techniques d' ADN recombinant (amplification génique, substitution des signaux de transcription-traduction par des signaux plus efficaces ...) conduira à une augmentation de la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides. il est possible également que la limitation de la production de cobalamines et/ou de cobamides résulte d'une régulation biochimique. Dans ce cas, le ou les gènes cob correspondant à l'enzyme régulée pourront être mutagénisés in vitro spécifiquement afin d'obtenir des gènes mutés dont les produits auront perdu les régulations allant à l'encontre d'une amélioration de la production. Le procédé selon la présente invention consiste à transformer un microorganisme producteur de cobalamines et/ou de cobamides, ou seulement potentiellement producteur de ces composés (c'est-à-dire déficient dans une ou plusieurs des étapes de la biosynthèse), avec une séquence d'ADN telle que définie plus haut, puis à cultiver ce microorganisme dans des conditions d'expression de ladite séquence et de synthèse des cobalamines et/ou des cobamides, et enfin à récupérer les cobalamines et/ou les cobamides produits. Un tel procédé est applicable en particulier à tous les microorganismes producteurs cités page 4, et plus spécifiquement aux microorganismes du genre P. denitrificans, Rhizobium melitoti, ou Aarobactérium tumefaciens.Dans un mode de réalisation préféré, le microorganisme est P. denitrificans, et en particulier, la souche SC510. Concernant les microorganismes potentiellement producteurs, les séquences d'ADN utilisées seront celles correspondant aux étapes de la biosynthèse que le microorganisme ne peut réaliser. A l'aide de la présente invention et par les diverses stratégies exposées ci-dessus, une amélioration de la production de cobalamines et/ou de cobamides pour tout microorganisme producteur, ou potentiellement producteur, de cobalamines et/ou de cobamides, pourra être obtenue. il suffira de cultiver ce microorganisme recombiné dans des conditions appropriées pour la production de cobalamines et pour l'expression des séquences d'ADN introduites. Cette culture pourra se faire en batch ou bien en continu, et la purification des cobalamines pourra se faire par les méthodes déjà utilisées au niveau industriel (Florent, 1986).Ces méthodes comprennent entre autre i) la solubilisation des cobalamines et leur conversion en leur forme cyano (par exemple en traitant le moult de fermentation à la chaleur, avec du cyanure de potassium en présence de nitrite de sodium), puis ii) la purification des cyanocobalamines en différentes étapes qui peuvent être par exemple a) ltadsorption sur différents substrats tels que l'amberlite IRC50, le Dowex 1x2 ou lamberlite XAD 2 suivie d'une élution avec un mélange eau-alcool ou eau phénol, puis b) l'extraction dans un solvant organique et enfin c) la précipitation ou cristallisation à partir de la phase organique soit par addition de réactifs ou dilution dans un solvant approprié, soit par évaporation. La présente invention montre de plus qu'il est possible, par les techniques d'ADN recombinant, d'améliorer la production de cobalamines d'une bactérie productrice de cobalamines en cumulant des améliorations. Ceci revient à obtenir une première amélioration comme cela est décrit ci-dessus puis à améliorer cette amélioration toujours à l'aide des techniques d'ADN recombinant, ctest-à-dire par exemple en amplifiant des gènes de biosynthèse des cobalamines. Un autre objet de la présente invention concerne les polypeptides impliqués dans la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides. La séquence en acides aminés de ces polypeptides est décrite, ainsi que certaines de leurs caractéristiques physicochimiques. Une activité enzymatique ou des propriétés spécifiques ont également été associées à chacun d'entre-eux. En particulier, la présente invention a pour objet tous les polypeptides, ou des dérivés ou des fragments de ces polypeptides, qui sont codés par les séquences d'ADN décrites précédemment, et qui sont impliqués dans la voie de biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides. De plus, l'utilisation des sondes d'hybridation décrites précédemment permet, à partir de gènes isolés dans d'autres microorganismes, de caractériser et d'isoler les polypeptides isofonctionnels d'autres microorganismes. De cette manière, la présente invention montre que la séquence d'une protéine COB de Pseudomonas denitrificans est significativement homologue aux séquences de protéines d'autres microorganismes présentant le même type d'activité. Entre ces protéines COB catalysant la même réaction chez des microorganismes différents, seules les distances évolutives ont introduit des variations (Wen-Hsiung et al., 1985). La présente invention à egalement pour objet ces polypeptides isofonctionnels. L'attribution d'une activité enzymatique particulière est le résultat d'une analyse qui peut être effectuée selon diverses stratégies. En particulier, des études d'affinité in vitro, vis-à-vis du SAM (S-adénosyl-L-méthionine), permettent d'attribuer à une protéine capable de fixer le SAM, une activité méthyltransférase, et donc son implication dans une des étapes de transfert des groupements méthyl qui se produisent entre lurotgen III et l'acide cobyrinique. Un autre moyen d'apprécier l'activité de ces polypeptides consiste à doser les intermédiaires de la voie de biosynthèse des cobalamines qui sont accumulés chez des mutants incapables d'exprimer ces polypeptides (identifiés par des expériences de complémentation). Ces analyses permettent de déduire que le polypeptide en question a pour substrat l'intermédiaire accumulé, ce qui permet de situer et de définir son activité dans la voie de biosynthèse. La présente invention décrit également un procédé de dosage des activités enzymatiques de la voie de biosynthèse, applicable à toute souche productrice de cobalamines et/ou de cobamides. Ces dosages permettent de purifier à partir de toute souche productrice de ces composés, l'activité enzymatique dosée.A partir de cette activité purifiée, la séquence NH2-terminale de la protéine COB en question, ou bien celle des sous-unités de cette protéine, peut être effectuée, ce qui permet d'identifier le ou les gènes de structure qui codent pour l'activité en question. Pour Pseudomonas denitrificans, les gènes de structure qui codent pour des activités de la voie de biosynthèse sont identifiés en trouvant pour chaque séquence NH2-terminale, la protéine COB ayant la même séquence NH2-terminaie. La présente invention décrit aussi un procédé permettant l'identification et le dosage, chez des souches productrices de cobalamines, d'intermédiaires de la voie de biosynthèse des cobalamines ou d'autres corrinoïdes. Ces intermédiaires peuvent être dosés aussi bien dans des moûts de culture que dans les cellules elles-mêmes.Les intermédiaires qui peuvent être dosés sont tous les corrinoïdes qui se trouvent dans la voie de biosynthèse après l'acide cobyrinique à savoir outre l'acide cobyrinique, l'acide cobyrinique monoamide, l'acide cobyrinique diamide, l'acide cobyrinique triamide, l'acide cobyrinique tétraamide, l'acide cobyrinique pentaamide, l'acide cobyrique, le cobinamide, le cobinamide phosphate, le GDP-cobinamide, le coenzyme Bl2-phosphate et le coenzyme Bol2. Les formes non adénosylées de ces produits peuvent aussi être dosées par cette technique. D'autres objets et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples et des dessins suivants, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Définition des termes employés et abréviations. ACDAS: acide cobyrinique a,c-diamide synthase ADN recombinant: ensemble de techniques qui permettent soit d'associer au sein du même microorganisme des séquences d'ADN qui ne le sont pas naturellement, soit de mutagéniser spécifiquement un fragment d'ADN. ATP: adénosine 51-triphosphate BSA: sérum albumine bovine CLHP: Chromatographie liquide à haute performance. cluster: groupe de gènes. Cob: correspond au phénotype de niveau réduit (au moins 10 fois moins que le contrôle) de production de cobalamines. Codon stop: codon de terminaison de traduction Corrinoides : dérivés de l'acide cobyrinique possédant le noyau corrine dGTP: 21-désoxyguanosine 5t-triphosphate DMBI: diméthylbenzimidazole dNTP: 2' -désoxyribonucléosides 5' -triphosphates DTT: dithiothréitol gène cob: gène impliqué dans la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides à partir de l'urotgen III. gène cor: gène impliqué dans la biosynthèse des corrinoides à partir de llurolgen III. kb: kilobases ORF: phase ouverte pb: paires de bases PPAHBY: protéine porteuse d'acide hydrogénobyrinique protéine COB: protéine intervenant soit comme catalyseur dans la voie de biosynthèse des cobalamines, soit comme protéine régulatrice dans le réseau de régulation des gènes cob, soit les deux. protéine COR: protéine intervenant soit comme catalyseur dans la voie de biosynthèse des corrinoides, soit comme protéine régulatrice dans le réseau de régulation des gènes cor, soit les deux. SAM: S-adénosyl-L-méthionine. SDS: sodium dodécyl sulfate SP2MT: SAM-L-méthionine:précorrine-2 méthyltransférase SUMT: SAM:urolgen III méthyltransférase Uro'gen III: uroporphyrinogène III. Légendes des figures: Figure 1: Structure du coenzyme B12; le groupement 51-déoxyadénosyl est remplacé par un groupement CH3 pour la méthylcobalamine, par un groupement cyano pour la cyanocobalamine, par un groupement hydroxyl pour l'hydroxocobalamine. Figure 2: Biosynthèse des cobalamines et différentes étapes de cette biosynthèse. X: ligands axiaux du cobalt; le ligand en a peut être différent du ligand en b. R: ligand en a du cobalt qui définit le type de cobalamine (voir figure 1). Figure 3: Structures de l'urotgen III, du précorrine-l, du précorrine-2 et du précorrine-3. Figure 4: Formules développées de l'uro'gen III et de l'acide cobyrinique. Entre llurolgen III et l'acide cobyrinique il se produit 8 transferts de méthyles SAM-dépendants successivement en C2, C7, C20, C17, C12, C1, C15 et C5, une décarboxylation en C12, l'élimination du carbone en C20 et l'insertion de l'atome de cobalt. X: ligands axiaux du cobalt; le ligand en a peut être différent du ligand en b. Figure 5: Dernières étapes de la biosynthèse des cobalamines. Afin de clarifier le schéma des détails du noyau corrine ont été omis. Les cinq étapes enzymatiques sont représentées: 1, cobinamide kinase; 2, cobinamide phosphate guanylyltransférase; 3, cobalamine 5'-phosphate synthase; 4, cobalamine 51-phosphate phosphohydrolase; 5, nicotinate nucléotide:DMBI phosphoribosyltransférase. Figure 6: Cartes de restriction des fragments Ri de 8753 pb et ClaI-HindIII-HindIII-HindIII de 5378 pb. Ne figurent que les 20 enzymes de restriction qui coupent le moins fréquemment l'ADN. Les sites de coupure de chaque enzyme sont indiqués par un trait vertical. Figure 7: Séquence nucléotidique des deux brins du fragment ClaI- HindIII-HindIII-HindIII de 5378 pb de Pseudomonae denitrificans. Le brin situé en haut est à lire 5' vers 3' dans le sens gauche droite qui correspond à ltorientation gauche droite du fragment séquencé présenté à la figure 6. Le site ClaI se trouve à la position 23 (début du site de coupure) car sur cette séquence se trouvent des sites de restriction PstI, SalI et XbaI qui sont apparus lors des clonages dans des multisites en vue du séquençage. La séquence du fragment ClaI-HindIII-HindIII-HindIII commence donc à la position 23. Figure 8: Séquence nucléotidique des deux brins du fragment ECoRI de 8753 pb de Pseudomonas denitrificans. Le brin situé en haut est à lire 5' vers 3' dans le sens gauche droite qui correspond à llorientation gauche-droite du fragment de la carte de restriction présentée à la figure 6. Figure 9: Analyse des probabilités des phases codantes d'après usage des codons en utilisant le programme de Staden et MacLachlan (1982) sur les 6 phases de lecture du fragment ClaI-HindIII-HindIII-HindIII de 5378 pb. Pour les phases qui appartiennent au même brin codant, la phase la plus probable correspond à celle où une ligne pointillée, non interrompue par des codons stop, est plaçée sous la ligne de probabilité de cette phase. Cette analyse permet de caractériser la phase ouverte ayant la meilleure probabilité d'être codante par rapport aux autres phases du même brin d'ADN, cette probabilité étant fonction de l'usage des codons de gènes déjà séquencés provenant des bactéries du genre Pseudomonas (version 59 de Genbank). 1. Analyse de la sequences correspondant aux nucléotides 1 à 1200. Cette analyse permet à'identifier la phase ouverte 1. Elle commence à l'ATG en position 549 et se termine au TGA en position 1011. 2. Analyse de la sequence correspondant aux nucléotides 1000 à 2200. Grâce à cette analyse, la phase ouverte 2 est identifiée. Elle commence à 1'ATG en position 1141 et se termine au TGA en position 1980. 3. Analyse de la sequence correspondant aux nucléotides 1800 à 3400. Grâce à cette analyse, la phase ouverte 3 est identifiée. Elle commence à l'ATG en position 1980 et se termine au TGA en position 3282. 4. Analyse de la sequence correspondant aux nucléotides 3000 à 4500. Grâce à cette analyse, la phase ouverte ouverte 4 est identifiée. Elle commence à llATG en position 3281 et se termine au TGA en position 4280. 5. Analyse de la sequence correspondant aux nucléotides 3800 à 5378. Grâce à cette analyse, la phase ouverte 5 est identifiée. Elle commence au GTG en position 4284 et se termine au TGA en position 5253. Figure 10: Analyse des probabilités des phases codantes d'après usage des codons en utilisant le programme de Staden et MacLachlan (1982) sur les 6 phases de lecture du fragment EcoRI de 8753 pb. Pour les phases qui appartiennent au même brin codant, la phase la plus probable correspond à celle où une ligne pointillée, non interrompue par des codons stop, est plaçée sous la ligne de probabilité de cette phase. Cette analyse permet de caractériser la phase ouverte ayant la meilleure probabilité d'être codante par rapport aux autres phases du même brin dlADN, cette probabilité étant fonction de l'usage des codons de gènes déjà séquencés provenant des bactéries du genre Pseudomonas (version 59 de Genbank). 1. Analyse de la sequence correspondant aux nucléotides 650 à 1650. Grâce à cette analyse, la phase ouverte 6 est identifiée. Elle commence à 1'ATG en position 736 et se termine au TGA en position 1519. 2. Analyse de la sequence correspondant aux nucléotides 1400 à 3100. Grâce à cette analyse, la phase ouverte 7 est identifiée. Elle commence à 1'ATG en position 1620 et se termine au TAG en position 2997. 3. Analyse de la sequence correspondant aux nucléotides 2700 à 3700. Grâce à cette analyse, la phase ouverte 8 est identifiée. Elle commence à 1'ATG en position 3002 et se termine au TGA en position 3632. 4. Analyse de la sequence correspondant aux nucléotides 3500 à 4100. Grâce à cette analyse, la phase ouverte 9 est identifiée. Elle commence au GTG en position 3631 et se termine au TGA en position 4366. 5. Analyse de la sequence correspondant aux nucléotides 4150 à 5150. Grâce à cette analyse, la phase ouverte 10 est identifiée. Elle commence à llATG en position 4365 et se termine au TGA en position 5127. 6. Analyse de la sequence correspondant aux nucléotides 5000 à 6000. Grâce à cette analyse, la phase ouverte 11 est identifiée.Elle commence au GTG en position 5126 et se termine au TGA en position 5867. 7. Analyse de la sequence correspondant aux nucléotides 5700 à 7200. Grâce à cette analyse, la phase 12 est identifiée. Elle commence à l'ATG en position 5862 et se termine au TAA en position 7101. 8. Analyse de la sequence correspondant aux nucléotides 7000 à 8000. Grâce à cette analyse, la phase ouverte 13 est identifiée. Elle commence à 1'ATG en position 7172 et se termine au TTG en position 7931. Figure 11: Construction des plasmides pXL556, pXL545 et pXL723. Un fragment ClaI-EcoRV de 2,4 kb contenant les gènes cobA et cobE est excisé du fragment de 5,4 kb, puis purifié. Un "linker" EcoRI est ajouté au site EDQRV, puis le fragment est inséré dans le pXL59 entre les sites ClaI-EcoRI. Le plasmide ainsi construit est nommé pXL556. La construction est comparable pour le pXL545: un fragment ClaI-HindIII-HindIII de 1.9 kb est excisé du fragment de 5,4 kb, puis purifié. Ce fragment contient uniquement le gène CobE. Un "linker" EcoRI est ajouté au site HindIII, puis le fragment est inséré dans le pXL59 entre les sites ClaI-EcoRI. Le pXL723 est construit comme suit: Un fragment EcoRV-HindIII de 2.3 kb est excisé du fragment de 5,4 kb, purifié, puis les extrémités sont remplies par le grand fragment de l'ADN polymérase I de E. coli. Ce fragment est cloné dans le pRK290 (Ditta et al., 1981) digéré par puis traité avec le large fragment de 1'ADN polymérase I de E. coli. afin de remplir les extrémités. Les sites de restrictions qui sont figurés entre parenthèse correspondent à des sites qui ont disparus après traitement avec le large fragment de l'ADN polymérase I de E. coli. 1 , fragment PstI-SalI de RSF1010 (De Graff et 1., 1978); 2, fragment PstI-BamHI de pACYC177 (Bagdasarian et AiL., 1981); 3, fragment BamHI-SatI contenant l'opéron lactose de E. coli sans son promoteur, l'opérateur, le site d'initiation de la traduction et les 8 premiers codons non essentiels de lacZ (Casadaban et al., 1983); 4, fragment Sau3AI de Pseudomonas putida KT2440 (Bagdasarian et al., 1981); ori, origine de réplication; nic, site de relaxation; mob , locus essentiel pour la mobilisation; Kmr géne de résistance à la kanamycine (Bagdasarian et al., 1981); B, BamHI; C, Ç1 I; E, EcoRI; H, HindIII; PstI; S, SStI; Sa, SalI; X, XhoI; Xb, XbaI. Figure 12: Etudes des insertions des transposons TnlSpr et Tn5 sur le fragment de 5378 bp. Les insertions du transposon Tn5 sur le plasmide pXL723 sont figurées comme à la figure 14; celles du transposon Tn5Spr, dans le chromosome de la souche G2 Rifr, sont encadrées; les insertions dans le chromosome de SC510 Rifr de cassettes portant le gène de résistance à la kanamycine (1630 et 1631) sont représentées avec une flèche, selon l'orientation de la transcription du gène de résistance à la kanamycine, sous le numéro de l'insertion.Les phases ouvertes déduites de la séquence sont portées sur cette figure (de cobA à cobE); des signes + ou - sont représentés sous chaque insertion de transposon ou de cassette de résistance pour indiquer que l'insertion est inactivationnelle (-) ou non (+) soit pour la complémentation de différents mutants (cas des insertions de transposons TnS) ou que l'insertion abolit la production de cobalamines de la souche dans laquelle elle a lieu. I1 y a une absence de complémentation lorsque le mutant recombiné synthétise moins de trois fois moins de cobalamines que le niveau de synthèse de la souche dont le mutant dérive. Les inserts des plasmides pXL545 , pXL1500, pXL1397 et pXL302 sont représentés avec les sites de restriction se trouvant à leurs extrémités.Ces inserts sont clonés dans les plasmides à large spectre d'hôte pXL435 et pXL59 (Cameron et 1., 1989) Le plasmide pXL545 correspond au plasmide pXL545 décrit à la figure 11 avec en plus le fragment DLmHI de 2 kb du pHP45 (Prentki et Krisch) contenant un gène de résistance à la spectinomycine cloné au site BamHI du pXL545; le plasmide pXL1500 correspond au fragment BglII-SstI de 4.2 kb présenté sur cette figure cloné aux sites BamHI et SstI du pKT230 (Bagdasarian et al., 1981) présenté à la figure 30; le plasmide pXL1397 correspond au fragment HindIII-SstI de 2.4 kb désigné sur la figure inséré entre les sites HindIII et SstI du multisite du pXL435 (Cameron et al., 1989) décrit sur la figure 30; le plasmide pXL302 correspond au fragment EcoRI-HindIII de 2.3 kb tel qu t il est décrit sur la figure inséré entre les site EcoRI et HindIII du pXL59 (Cameron et al., 1989), décrit sur la figure 30, le site HindIII utilisé étant le site se trouvant dans le multisite de clonage du pXL59; le pXL723 est décrit à la figure 11 tout comme le pXL545. Des signes + ou - sont représentés au dessus de chacun de ces inserts pour indiquer s'il y a complémentation par le plasmide en question des insertions chromosomiques représentées au-desssus. C, ClaI; E, EcoRI; H, HindIII; RV, EcoRV, EcoRV; Sau, Sau32AI; S, SstI; Figure 13: Construction des plasmides pXL253 et pXL367. Le fragment EcoRI de 8.7 kb est excisé, puis purifié à partir du plasmide pXL151. il est cloné au site EcoRI du pKT230 pour donner le pXL253.Ce même fragment est inséré au site EcoRI du pRK290 (Ditta et 1., 1981) pour donner le pXL367. 1, fragment PstI- SstI de RSF1010 (De Graff et al., 1978); 2, fragment PstI- BamHI de pACYC177 (Bagdasarian et al., 1981); ori, origine de réplication; nic, site de relaxation; mob , locus essentiel pour la mobilisation (Bagdasarian et li., 1981); B, BamHI; C, ClaI; E, EcoRI; H, HindIII; F, Pst; S, SstI; Sa, SstI; X, XboI; Xb, I; tetr gène de résistance à la tétracycline; Kmr , gène de résistance à la kanamycine. Figure 14: Etudes des insertions des transposons Tn3lacz et Tn5 sur le fragment EcoRI de 8.7 kb cloné dans pRK290 (Ditta et al, 1980). Les insertions des transposons Tn3lacz sont soulignées au contraire de celles des transposons Tn5 Les phases ouvertes déduites de la séquence (cobF à cobM) sont portées sur cette figure et les huit groupes d'insertions inactivationnelles (numérotés de 1 à 8 sont présentés; des signes + ou - sont représentés sous chaque insertion de transposon pour indiquer que l'insertion est inactivationnelle (-) ou non (+) pour la complémentation de différents mutants). il y a une absence de complémentation lorsque le mutant recombiné synthétise moins de trois fois moins de cobalamines que le niveau de synthèse de la souche dont le mutant dérive.Ces groupes d'insertions inactivationnelles correspondent aux mutants suivants: 1, G615; 2, G614 et G616; 3, G613 et G164; 4, G620; 5, G638; 6, G610 et G609; 7, G612; 8, G611. Ces mutants sont des mutants Cob d'Agrobacterium tumefaciens déjà décrits (Cameron et 1, 1989). Une carte de restriction du fragment de 8.7 kb est portée au bas de la figure. Figure 15: Les séquences codantes de chacun des gènes du fragment de 5,4 kb, respectivement cobA à cobE, sont indiquées. La séquence des protéines COBA à COBE codées par ces séquences, figurent sous leur séquence codante respective, cobA à cobE. La composition en acides aminés de chaque protéine, en nombre et en pourcentage, respectivement de COBA à COBE, est présentée ainsi que le poids moléculaire, l'index de polarité, le point isoélectrique, la densité optique à 260 nm et à 280 nm d'une solution à 1 mg/ml de protéine purifiée. Le profil dthydrophilicité de chaque protéine, respectivement de COBA à COBE, est représenté; il a été calculé d'après le programme de Hopp et Woods (1981). Les valeurs positives correspondent à des régions de la protéine qui sont hydrophiles. En abscisse la position des acides aminés est indiquée tandis qu'en ordonnée la valeur de l'index d'hydrophilicité est figurée; lorsque cette valeur est positive, cela indique que la région de la protéine est hydrophile. Figure 16: Les séquences codantes de chacun des gènes du de 8,7 kb, respectivement cobF à , sont indiquées. Les séquences des protéines COBF à COBM codées par ces séquences, figurent sous leur séquence codante respective, cobF à cobM. La composition en acides aminés de chaque protéine, en nombre et en pourcentage, respectivement de COBF à COBM, est présentée ainsi que le poids moléculaire, l'index de polarité, le point isoélectrique, la densité optique à 260 nm et à 280 nm d'une solution à 1 mg/ml de protéine purifiée. Le profil dthydrophilicité de chaque protéine, respectivement de COBF à COBM, est représenté; il a été calculé d'après le programme de Hopp et Woods (1981). Les valeurs positives correspondent à des régions de la protéine qui sont hydrophiles.En abscisse la position des acides aminés est indiquée tandis qu'en ordonnée la valeur de l'index d'hydrophilicité est figurée; lorsque cette valeur est positive, cela indique que la région de la protéine est hydrophile. NB. Nous avons fait commencer la protéine COBF à l'ATG situé à la position 736; il est possible que l'ATG situé à la position 751 soit le véritable codon d'initiation de cette protéine. Figure 171 Réaction catalysée par l'acide cobyrinique ,diamide synthase. L'ACDAS catalyse l'amidation des fonctions acides carboxyliques des chaines acétate périphériques ffi et S de l'acide cobyrinique pour donner l'acide cobyrinique diamide; le donneur du groupement amine utilisé dans le test enzymatique est la L-glutamine; il donne par désamination l'acide L-glutamique. X correspond aux ligands axiaux du cobalt qui peuvent être différents l'un de l'autre. Figure 18: Réaction catalysée par la SP2MT. La SP2MT catalyse le transfert d'un méthyle du SAM au dihydrosirohydrochlorine ou précorrine-2 pour donner le précorrine-3. Le groupement méthyle est transféré à la position C20 du noyau porphyrine. Figure 29: Structure de l'acide hydrogénobyrinique et de l'acide hydrogénobyrinique ,;-diamide. Figure 20: Affinités des protéines COBA et COBF pour le SAM. Les courbes donnent en unités arbitraires la radioactivité à la sortie de la colonne de TSK-125 pour chaque protéine appliquée sur cette colonne. Les temps de rétention sont indiqués en minutes et le pic de radioactivité corrrespondant au SAM libre est observé au temps de 10 min 30 sec. Figure 21: Comparaison des séquences de COBA et de COBI. Seules les régions 1, 2 et 3, de forte homologie, sont présentées. Les signes = sont plaçés entre les résidus identiques et - entre les résidus homologues (H K R, L I V M, A G S T, Y F W, D E Q N B Z, P, C). Figure 22: Comparaison des séquences primaires des protéines COBA de Pseudomonas denitrificans et CYSG de E. soli. L'alignement a été fait suivant le programme de Kanehisa, 1984. Les signes = sont placés entre les résidus identiques et - entre les résidus homologues (H K R, L I V M, A G S T, Y F W, D E Q N B Z, P, C). Les régions 1, 2, 3 correspondent aux zones de forte homologie entre les protéines. Figure 23: Comparaison des séquences de CYSG de E. coli avec des protéines COB de Pseudomonas denitrificans (COBA, COBF, COBI, COBJ, COBL et COBM). Les comparaisons portent sur les régions 1, 2 et 3, de fortes homologies, qui existent entre CYSG, COBA et COBI. Les positions sur les séquences protéiques des régions présentant des homologies sont présentées sur la figure. Nous avons considéré les groupes de résidus homologues suivants: H K R, L I V M, A G S T, Y F W, D E Q N B Z, P, C. Si, à une même position, il se trouve au moins 3 résidus homologues, nous avons encadré ces acides aminés. Figure 24: Construction des plasmides pxL1148 et pXL1149. Le pxL1148 est construit comme suit: le fragment BamHI- BamHI-SstI-SstI de 1.9 kb du fragment de 8,7 kb contenant les gènes cobH et cobI est purifié, et des "linkers" XbaI et EcoRI sont plaçés respectivement aux extrémités BamHI et SstI. Ce fragment est ensuite inséré entre les sites Par et EcoRI du plasmide à large spectre d'hôte pXL59 (Cameron et al., 1989) pour donner le plasmide pXL1148. Le pxL1149 est construit comme le pxL1148 si ce n'est que le fragment initialement purifié est le fragment BamHI-BamHI ssatI de 1.5 kb au lieu du fragment contenant en plus le petit fragment SstI de 400 pb utilisé pour le pXL1148. Le fragment subit ensuite les mêmes traitements enzymatiques et le même clonage dans le pXL59. 1, fragment PstI-SstI de RSF1010 (De Graff et al., 1978); 2, fragment pst-BamHI de pACYC177 {Bagdasarian et al., 1981); 3, fragment BamHI-SstI contenant l'opéron lactose de E. coli sans promoteur, opérateur, site d'initiation de la traduction et les 8 premiers codons non essentiels de lacz (Casadaban et al., 1983); 4, fragment Sau3AI de Pseudomonas putida KT2440 (Bagdasarian et LI., ., 1981); ori, origine de réplication; nic, site de relaxation; Kmr gène de résistance à la kanamycine; mob , locus essentiel pour la mobilisation (Bagdasarian et al., 1981); B, BamHI; C, ClaI; E, EcoRI; H, HindIII; P, PstI; S, SstI; Sa, SalI;X, XboI; Xb, XkaI. Figure 25: Protéines totales des souches SC510 Rif, SC510 Rifr pKT230, SC510 Rifr pXL1148, SC510 Rifr pXL1149 analysées en PAGE-SDS à 10% comme cela est décrit. Les bactéries ont été cultivées pendant 4 jours en milieu PS4, puis des lysats des protéines totales ont été effectués. Piste 1, SC510 Rifr; piste 2, SC510 Rifr pXL1149; piste 3, SC510 Rifr pXL1148; piste 4, SC510 Rifr pKT230. Les masses moléculaires des marqueurs de masse moléculaire sont indiquées. Les positions où les protéines COBI et COBH migrent sont indiquées. Figure 26: Construction des plasmides pXL1496 et pXL1546. Le plasmide pX1496 permet de surexprimer la protéine COBF chez E. coli et le plasmide pXL1546 permet de surexprimer COBF chez Pseudomonas denitrificans. Le fragment EcoRI-XhoI de 2.2 kb est excisé et purifié à partir du fragment de 8.7 kb estexcisé et purifié à partir du plasmide pXL151 (Cameron et 1., 1989). il est ensuite cloné au site EcoRI du phage M13mpl9 pour donner le plasmide pXL1405. Ensuite, un site NdeI est introduit par mutagénèse dirigée, comme cela est décrit précédemment, à la position 733 de ce fragment; de cette manière une site NdeI se trouve juste sur le codon d'initiation présumé du gène cobF. Le nouveau plasmide ainsi obtenu est nommé pXL1406.Un fragment NdeI-SphI-SphI de 1.5 kb, contenant le gène cobF à partir de son codon d'initiation présumé, est purifié après digestion partielle par les enzyme appropriées et ligaturé avec les fragments appropriés du plasmide pXL694 (fragment EcoRI-NdeI de 120 pb contenant des signaux d'expression de L. coli -voir texte- et fragment EcoRI-SphI de 3.1 kb contenant le gène de résistance à l'ampicilline, les fonctions de réplication du plasmide ainsi que les terminateurs de l'opéron rrnB de E. coli comme cela est décrit dans le texte). Le plasmide ainsi construit est nommé pXL1496. Le pXL1546 est construit comme suit: le fragment EcoRI-BamHI- BamHI de 2 kb du pXL1496 est purifié par digestion partielle avec les enzymes appropriées; ce fragment contient les signaux d'expression de E. coli, suivis du gène cobF , puis la partie 5T du gène cobG, elle-même suivie des terminateurs de l'opéron rrnB de E. coli comme cela est décrit dans le texte. Ce fragment est cloné dans le plasmide multihôte pKT230 (Bagdasarian et al., 1981) décrit sur la figure 30. B, BamHI; C, ClaI; E, EcoRI; H, HindIII; P, PstI; S, SstI; Sa, SalI; X, XboI; Xb, XboI; Kmr, gène de résistance à la kanamycine; Amp, gène de résistance à l'ampicilline. Figure 27: Protéines totales des souches SC510 Rifr, SC510 Rifr pKT230, SC510 Rifr pXL1546 analysées en PAGE-SDS à 10% comme cela est décrit. Les bactéries ont été cultivées pendant 4 jours en milieu PS4, puis des lysats des protéines totales ont été effectués. Piste 1, SC510 Rifr; piste 2, SC510 Rifr pKT230; piste 3, SC510 Rifr pXL1546. Les masses moléculaires des marqueurs de masse moléculaire sont indiquées. La position où la protéine COBF migre est indiquée. Figure 28: Protéines totales des souches E. coli B et E. coli B pXL1496 analysées en PAGE-SDS à 10 % comme cela est décrit. Piste 1, E. coli pXL1496 cultivée en absence de tryptophane; piste 2, E. coli pXL1496 cultivée dans les mêmes conditions en présence de tryptophane; piste 3, E. coli cultivée en absence de tryptophane; piste 4, E. coli cultivée dans les mêmes conditions en présence de tryptophane. Les masses moléculaires des marqueurs sont indiquées. La position de migration de la protéine COBF est indiquée. Figure 29: Construction des plasmides pXL525 et pXL368. Le plasmide pXL368 est construit comme suit: Le fragment EcoRI-ClaI de 2.4 kb (contenant les gènes cobA et cobE) est purifié à partir du plasmide pXL556, ce qui permet d'obtenir ce fragment avec un site BamHI et un site XbaI aux extrémités; ce fragment est cloné dans le pXL203 aux sites BamHI et XbaI. Pour la construction du pXL525 un "linker" XbaI est ajouté au site EcORI situé à ltextrémité droite du fragment EcoRI de 8.7 kb; ce fragment EcoRI-XbaI de 8.7 kb est ensuite cocloné avec le fragment EcoRI-XbaI de 2.4 kb provenant du pXL556 et contenant cobA et cobE. Les sites de restrictions qui sont figurés entre parenthèse correspondent à des sites qui ont disparus après traitement avec le large fragment de l'ADN polymérase I de E. coli. 1 , fragment FatI-SatI de RSF1010 (De Graff et al., 1978); 2, fragment PatI-BamHI de pACYC177 (Bagdasarian et al., 1981); ori, origine de réplication; niçl site de relaxation; moh , locus essentiel pour la mobilisation; Kmr, gène de résistance à la kanamycine (Bagdasarian et al., 1981); B, BamHI; C, ClaI; E, EcoRI; H, HindIII; P, PstI, S, SstI; Sa, SalI; X, Chez; xb, XbaI; tet, gène de résistance à la tétracycline; Ampr et Amp, gène de résistance à l'ampicilline. Figure 30: Plasmides, du groupe d'incompatibilité Q, à large spectre d'hôte chez les bactéries gram-négatives. Ces plasmides sont décrits dans une précédente publication (Cameron et al., 1989) et sont utilisés dans la présente invention. 1, fragment PstI-SatI de RSF1010 (De Graff et al., 1978); 2, fragment PstI-BamHI de pACYC177 (Bagdasarian et al., 1981); 3, fragment BamHI-SatI contenant l'opéron lactose de E. coli sans promoteur, opérateur, site d'initiation de la traduction et les 8 premiers codons non essentiels de îacZ (Casadaban et al., 1983); 4, fragment Sau3AI de Pseudomonas putida KT2440 (Bagdasarian et al., 1981); ori, origine de réplication; nic, site de relaxation; Kmr gène de résistance à la kanamycine; Smr, gène de résistance à la streptomycine ; mob , locus essentiel pour la mobilisation (Bagdasarian et al., 1981); B, BamHI; C, ClaI; E, EcoRI; H, HindIII; P, PstI; s, SatI; Sa, SalI, X, XhoI; Xb, XbaI. Figure 31: Temps de rétention de différents étalons corrinoïdiens (1 mg/étalon) sur le système de séparation de décrit à l'exemple 7. La colonne utilisée est une colonne de Nucléosil C-18 (Macherey-Nagel). Au niveau de chaque pic d'absorbance un numéro est représenté correspondant au corrinoïde décrit ci-dessous. Le temps de rétention est porté en abscisse et l'absorbance à 370 nm se trouve en ordonnée. 1, acide cobyrinique; 2, acide cobyrinique diamide; 3, acide cobyrinique ;-amide; 4, acide cobyrinique -aW,;-diamide; 5, acide cobyrinique -amide; 6, acide cobyrinique c,g-diamine; 7, acide cobyrinique a,-diamide; 8, acid cobyrinique a,f,;- triamide; 9, acide cobyrinique tetraamide; 10, acide cobyrinique pentaamide; 11, acide cobyrique; 12, GDP cobinamide; 13, cobinamide phosphate; 14, cobinamide; 15, cyanocobalamine 5'-phosphate; 16, cyanocobalamine. Le temps de rétention figure en abscisse tandis que l'absorbance à 371 nm se trouve en ordonnée. Techniques générales de clonage, de biologie moléculaire et de biochimie. Les méthodes classiques de biologie moléculaire telles que la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium-bromure d'éthidium, les digestions par des enzymes de restriction, ltélectrophorèse sur gel, l'électroélution des fragments d'ADN à partir de gels d'agarose, la transformation dans L. coli, etc, sont décrites dans la littérature (Maniatis et al., 1982, Ausubel et al., 1987). Les enzymes de restriction ont été fournies par New-England Biolabs (Biolabs), Bethesda Reseach Laboratories (BRL) ou Amersham Ltd (Amersham). Les oligonucléotides "linkers" ont été fournis par Biolabs. Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille sur des gels d'agarose 0.7 % ou acrylamide 8 %, purifiés par électroélution, extraits au phénol, précipités à méthanol puis incubés dans un tampon Tris-HCl pH 7.4 50 mM, MgC12 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en présence d'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) Si nécessaire, les fragments d'ADN ayant des extrémités 5' proéminentes sont déphosphorylés par un traitement à la phosphatase alcaline d'intestin de veau (CIP, Pharmacia) à 370C pendant 30 mn dans le tampon suivant: glycine 100 mM, MgCl2 1 mM, ZnCl2 1 mM, pH 10.5.La même technique est utilisée pour la déphosphorylation des extrémités 3' proéminentes ou franches, mais le traitement est de 15 mn à 370C puis de 15 mn à 56 OC. L'enzyme est inactivée par chauffage du mélange réactionnel à 680C pendant 15 mn en présence de SDS 1% et de NaCl 100 mM suivi d'une extraction au phénol-chloroforme et d'une précipitation à méthanol. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes est effectué par le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli (Biolabs). La réaction est effectuée à température ambiante pendant 30 mn dans un tampon Tris-HCl pH 7.2 50 mM, dNTPs 0.4 mM, MgSO4 10 mM, DTT 0.1 mM, BSA 50 mg/ml. Le remplissage des extrémités 3' proéminentes est effectué en présence de l'ADN polymérase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fabriquant. La digestion des extrémités proéminentes est effectuée par traitement limité à la nucléase S1 (BRL) selon les recommandations du fabriquant. Des oligonucléotides "linkers" sont ajoutés sur des extrémités de fragments d'ADN comme cela est déjà décrit (Maniatis, 1982). La mutagénèse in vitro par oligodéoxynucléotides est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al., 1985, en utilisant le kit distribué par Amersham. Les ADN ligaturés sont utilisés pour transformer la souche rendue compétente: E. coli MC1060 [ D(lacIOPZYA)X74, galU, galK, strAr, hadR] pour les plaamides ou E. coli TGI [D(lan proA,B), supE, thi, hsdD5/ F' traD36, proA+, B+, lacIq, lacZDM15] pour les formes réplicatives de phages dérivés du bactériophage M13. Les ADN plasmidiques sont purifiés suivant la technique de Birnboim et Doly, 1979. Les minipréparations d'ADN plasmidique sont faites suivant le protocole de Klein et a,L., 1980. Les préparations d'ADN chromosomiques de bactéries gram-négatives sont réalisées comme cela a été déjà décrit (Cameron et Al., 1989) Les sondes radioactives sont préparées par translation de coupure suivant la méthode déjà détaillée (Rigby et al., 1977). Les hybridations entre des séquences d'ADN ainsi que l'immobilisation des acides nucléiques sur membranes de nitrocellulose sont effectuées comme cela a été décrit (Cameron et al., 1989).Lors de clonages pour lesquels il y a une faible probabilité de trouver le clone recombinant recherché, ceux-ci sont trouvé après hybridation sur filtre comme cela est déjà décrit (Maniatis et al., 1982). La séquence nucléotidique de fragments d'ADN est réalisée par la méthode de terminaison de chaînes (Sanger et 1., 1977). Dans le mélange réactionnel le dGTP est remplacé par le 7-déaza dGTP, ceci afin d'éviter les compressions de bandes lors de l'électrophorèse sur gel d'acrylamide, provoquées par le pourcentage en GC élevé de l'ADN. Les milieux de culture utilisés pour la partie bactériologique ont déjà été présentés (Maniatis et al., 1982). Les cultures en milieu PS4 sont réalisées comme cela est déjà décrit (Cameron et al., 1989); les souches de Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr et G2 Rifr sont cultivées en milieu PS4 comme suit: des Erlenmeyers de 250 ml contenant 25 ml de milieu PS4, avec si besoin l'antibiotique sélectif pour le plasmide porté par chaque souche, sont ensemencés avec une dilution au 1/100 de préculture saturée en milieu L (Miller 1972), avec, si besoin est, l'antibiotique sélectif pour le plasmide porté par chaque souche; ces cultures sont incubées 6 jours à 300C, puis les moûts sont analysés pour leur titre en cobalamines ou bien l'activité enzymatique de certaines enzymes de la voie. Les souches d'Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas putida et de Rhizobium meliloti sont cultivées à 300C; sauf spécifications, elles sont cultivées en milieu L. Les conjugaisons bactériennes sont réalisées comme cela est déjà décrit (Cameron et al., 1989). Les extraits de protéines totales sont réalisés comme cela est déjà décrit (Ausubel et al., 1987). Les électrophorèses (SDS-PAGE) d'analyse des protéines en gel d'acrylamide en conditions dénaturantes sont effectuées comme cela est déjà décrit (Ausubel et aiL., 1987). L'appareil PhastSystem (Pharmacia) utilisant le système de tampons discontinus de Laemli (Laemli, 1970) est aussi utilisé; différents gels sont utilisés en fonction des poids moléculaires des protéines à analyser ainsi que leur pureté: PhastGel gradient 8-25 PhastGel Homogeneous 12.5 La coloration est effectuée soit au bleu de Coomassie à l'aide du PhastGel Blue R (Pharmacia), soit au nitrate d'argent en utilisant le PhastGel silver Kit (Pharmacia) en se conformant aux instructions du fabriquant. Les séquences NH2-terminales des protéines sont déterminées par la technique de dégradation d'Edman en utilisant un séquenceur automatisé (Applied Biosystems modèle 407A) couplé à un appareil de CLHP pour l'identification des dérivés phénylthiohydantoïnes. EXEMPLE 1 - Isolation de fragments d'ADN de P.denitrificans contenant des gènes Cob Cet exemple décrit l'isolation de deux fragments d'ADN de Pseudomonas denitrificans portant des gènes Cob. Ces deux fragments ont été mis en évidence par des expériences de complémentation de mutants Cob d'A.tumefaciens et P.Putida (Cameron et al., 1989). Ces mutants Cob ont été obtenus par mutagénèse avec la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine selon la technique de Miller (Miller et al., 1972), ou par insertions du transpon Tn5. De cette manière, des souches incapables de synthétiser les cobalamines ont été mises en évidence, et en particulier, le mutant cob G572 de P.Putida, et les mutants Cob G164, G609, G610, G611, G612, G613, G614, G615, G616, G620, G634, G638 et G643 de A. tumefaciens. Parallèlement, une banque d'ADN génomique de P.denitrificans est réalisée dans un vecteur mobilisable à large spectre d'hôte, pXL59, par digestion, en présence d'enzymes de restriction, de 5 pg d'ADN (Cameron et al., 1989). Par complémentation, plusieurs plasmides ont pu être isolés, permettant de complémenter les mutants cob de P.utida et d'A.tumefacien. Parmi ceux-ci on notera plus particulièrement les plasmides pXL151 et pXL157. Ces plasmides ont été isolés et deux fragments d'ADN ont pu être excisés, purifiés et analysés par restriction. Ces fragments sont présentés sur la figure 6: Un fragment ClaI-HindIII-HindIII- -HindIII de 5,4 kb et un fragment EcoRI-EcoRI de 8,7 kb. EXEMPLE 2 - Séquençage des fragments d'ADN isolés Cet exemple illustre le séquençage de fragments d'ADN portant des gènes cob de Pseudomonas denitrificans SC510. 2.1. Séquençage d'un fragment ClaI-HindIII-HindIII-HindIII de 5,4 kb Ce fragment est contenu dans le plasmide pXL157 décrit dsnsltexemple 1. Après excision, des sous fragments du fragment de 5,4 kb ont été clonés dans les phages M13mp18, ou Mt3mp19 (Norrander et al., 1983), ou M13tg130, ou M13tg131 (Kieny et al., 1983) dans les deux orientations. Des délétions ont été ensuite réalisées in vitro par la méthode de Henikof f (1987). Ces délétions ont ensuite été séquencées avec le "primer universel" comme amorce de synthèse des réactions de terminaison de chaîne. Le recouvrement entre ces différentes délétions a permis d'établir la séquence totale, sur les deux brins, du fragment de 5,4 M > kb (figure 7). Ce fragment comprend 5378 pb.Sur la séquence décrite à la figure 7 figurent, avant le site ClaI, trois sites de restriction (PstI, SalI et XbaI) qui sont apparus lors du clonage du fragment en question en vue du séquençage dans des multisites de clonage. Lorsque par la suite nous nous référerons, dans la présente invention, à la séquence de ce fragment ClaI-HindIII-HindIII-HindIII, ce sera à la séquence présentée à la figure 7 où les 22 premières bases ne correspondent pas à de l'ADN de Pseudomonas denitrificans (ainsi toutes les positions de site de restriction ou de début de phase ouverte se réfèrent à la séquence présentée à la figure 7). 2.2 Séquence nucléotidique dun fragment EcoRI-EcoRI de 8,7 kb Ce fragment est porté par le pXL151 décrit dans l'exemple 1. Le site EcoRI ainsi que les 70 pb adjacentes situées à la droite de ce fragment proviennent du pXL59 qui est le vecteur qui a servi à construire le pXL151 par clonage d'un fragment Sau3AI de Pseudomonas denitrificans SC510. Après excision, des sous fragments du fragment de 8,7 kb ont été clonés dans les phages M13mp18, ou M13mp19 (Norrander et al., 1983), ou M13tg130, ou M13tg131 dans les deux orientations (Kieny et al., 1983). Des délétions ont été ensuite réalisées in vitro par la méthode de Henikof f (1987). Ces délétions ont ensuite été séquencées avec le "primer universel" comme amorce de synthèse des réactions de terminaison de chaîne. Le recouvrement entre ces différentes délétions a permis d'établir la séquence totale, sur les deux brins, du fragment de 8,7 M > kb (figure 8). Ce fragment comprend 8753 pb. A partir de ces séquences nucléotidiques, des cartes de restriction ont été obtenues pour les enzymes qui coupent le moins fréquemment (figure 6). Le pourcentage en bases GC de l'ADN de Pseudomonas denitrificans SC150 est relativement élevé (67 %) et se traduit par des compressions sur les gels de séquence. Pour éviter ces problèmes deux solutions sont apportées i) l'utilisation du 7-déaza-dGTP au lieu du dGTP dans les réactions de séquence pour diminuer les structures secondaires qui se forment pendant l'électrophorèse dans le gel de séquence et ii) le séquençage des deux brins. EXEMPLE 3 - Analyse de ces séquences nucléotidiques : détermination des phases ouvertes Les séquences nucléotidiques des fragments ClaI-HindIII HindIII-HindIII de 5,4 kb (figure 7) et EcoRI-EcoRI de 8,7 M > kb (figure 8) permettent de définir des phases ouvertes. Comme il s'agit d'ADN à haut pourcentage en GC, les phases ouvertes sont nombreuses vu la faible fréquence de codons d'arrêt de traduction. Une étude de la probabilité des phases codantes d'après usage des codons en utilisant la méthode de Staden et MacLachlan (1982) est réalisée.Elle caractérise les phases ouvertes qui ont la meilleure probabilité d'être codantes par rapport aux autres phases du même brin d'ADN, cette probabilité est fonction de l'usage des codons de gènes déjà séquencés provenant des bactéries du genre Pseudomonas. De cette manière - Cinq phases ouvertes sont caractérisées pour le fragment ClaI-HindIII-HindIII-HindIII de 5,4 kb. Elles sont nommées phases 1 à 5 et leurs positions sur la séquence du fragment de 5,4 kb sont les suivantes (sur la séquence 5'' du site ClaI vers les sites HindIII): Tableau : Phases ouvertes probables du fragment ClaI-HindIII HindIII-HindIII de 5,4 kb.Les positions sur la séquence correspondent aux positions sur la séquence décrite à la figure 7 ; le brin codant est le brin 5 3 correspondant au brin supérieur sur cette figure. Codon de Poids moléculaire Numéro de la démarrage Codon en kD phase de la stop traduction de la protéine codée 1 549 1011 15.5 2 1141 1980 29.2 3 1980 3282 45.7 4 3281 4280 35.0 5 4284 5253 34.1 Les représentations des probabilités que ces phases ouvertes soient des phases codantes, avec parallèlement celles observées sur les autres phases (5 au total) sont portées sur la figures 9. Ces cinq phases sont codées par le même brin.Quatre d'entre elles (phases ouvertes 1 à 4) présentent les caractéristiques de phases codantes en couplage traductionnel (Normak et al., 1983), à savoir que le codon d'initiation de traduction de la phase x+1 chevauche le codon de terminaison traduction de la phase x ou bien que ceux-ci sont très proches. - Huit phases sont caractérisées pour le fragment EcoRI-EcoRI de 8,7 kb. Elles sont nommées phases 6 à 13 et leurs positions sur la séquence du fragment de 8,7 kb sont portées sur le tableau ci-dessous. Tableau : Phases ouvertes probables du fragment EcoRI 8,7 kb. Les positions sur la séquence correspondent aux positions sur la séquence décrite sur la figure 8 ; sur cette figure, le brin codant est le brin supérieur. Poids moléculaire Numéro de la Codon de Codon phase démarrage stop en KD de traduction de la protéine codée 6 736 1519 28.9 7 1620 2997 46.7 8 3002 3632 22.0 9 3631 4366 25.8 10 4365 5127 27.1 il 5126 5867 26.8 12 5862 7101 42.9 13 7172 7931 26.8 Les représentations des probabilités de ces phases ouvertes, avec parallèlement celles observées sur les autres phases (6 phases au total) sont portées sur la figure 10. Ces huit phases sont codées par le même brin. Six d'entre elles (de 7 à 12) présentent les caractéristiques de phases codantes en couplage traductionnel (Normark et al., 1983), à savoir que le codon d'initiation de traduction de la phase x+1 chevauche le codon de terminaison de traduction de la phase x ou bien que ceux-ci sont très proches. EXEMPLE 4 - Etudes génétiques sur les fragments d'ADN portant des gènes cob Cet exemple montre la relation qui existe entre les différentes phases ouvertes identifiées précédemment et les gènes impliqués dans la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides portés par ces mêmes fragments. Ces gènes sont identifiés par une étude génétique comme décrit ci-dessous. 4.1 - Etude génétique du fragment de 5,4 kb Le plasmide pXL723 est le plasmide pRK290 (Ditta et al., 1980) contenant le fragment EcoRI-HindIII de 2264 pb, correspondant à la partie droite du fragment étudié, cloné au site EcoRI du pRK290 (figure 11). La construction des autres plasmides utilisés dans cette étude (pXL302, pXL1397, pXL545 , pXL545, pXL1500) est décrite dans la légende des figures 11 et 12. Des insertions ont été obtenues sur le plasmide pXL723 en utilisant la technique de Bruijn et Lupski, 1984. Les insertions du transposon Tn5 sur le plasmide pXL723 ont été sélectionnées, puis cartographiées dans le fragment de 5,4 kb (figure 12). Le pXL723 complémente le mutant Cob G572 de Pseudomonas Dutida et le mutant Cob G634 d'Acrobacterium tumefaciens. Ces insertions se classent en deux groupes d'insertions inactivationnelles: soit celles qui ne permettent plus de complémenter le mutant Cob G572, soit celles qui abolissent la complémentation du mutant Cob G634 (figure 12). Les insertions qui inactivent la complémentation du mutant G572 sont cartographiées dans la phase ouverte 4 (il s'agit des insertions 15, 27, 68, 81 et 97) la phase ouverte 4 correspond donc à un gène cob. Celui-ci est nommé cobC.Les insertions qui inactivent la complémentation du mutant G634 sont cartographiées dans la phase 5 (ce sont les insertions 66 et 107, figure 12); la phase ouverte 5 correspond donc à un gène cob. Celui-ci est nommé cobD. Par ailleurs des insertions avec un transposon Tn5Spr ont été réalisées. Le transposon Tn5Sp r a été construit au laboratoire en clonant au site BamHI du transposon Tn5 (Jorgensen et al., 1979) une cassette BamHI contenant le gène de résistance à la spectinomycine provenant du plasmide pHP45Q (Prentki et Krisch, 1984). Ces insertions ont été faites dans le chromosome de la souche de Pseunomonas denitrificans SBL27 Rif r. La souche SBL27 est une souche de Pseudomonas denitrificans dont SC510 dérive par plusieurs mutagénèses. SBL27 produit 10 fois moins de cobalamines que SC510 sur milieu PS4. Sur 10000 clones de la souche SBL27 Rif r, portant chacun une insertion du transposon, plus de 30 d'entre eux avaient perdu la capacité de synthétiser des cobalamines. Certains de ces clones possédaient une insertion dans le fragment étudié dans cet exemple. Ces insertions ont été cartographiées par analyses de restriction selon la méthode de Southern (Southern, 1975). Les sites d'insertions du transposon chez ces différents mutants sont portés sur la figure 12. Une de ces insertions numérotée 2639 se trouve dans le gène cobC; cette insertion est complémentée par le plasmide pXL302 qui porte un fragment contenant le gène cobC (figure 12). Deux insertions, nommées 2636 et 2638, sont dans la phase ouverte 3.Ces mutants sont bloqués dans la biosynthèse des cobalamines, et ils sont complémentés par le plasmide pXL1397 qui ne contient que la phase ouverte 3, mais non complémentés par le plasmide pXL302 qui contient les gènes cobC et cobD (figure 12). Ces deux insertions sont donc dans un autre gène. A la phase ouverte 3 nous associons le gène cobB. Une insertion 2933 est placée dans la phase ouverte 2 ; elle est complémentée par le plasmide pxL1500 qui contient la phase ouverte 2 ; cette insertion est non complémentée par le plasmide pXL1397 qui contient le gène cobB et qui complémente les deux insertions dans cobB. Il s'agit donc ici d'une insertion dans un autre gène; à la phase ouverte 2 nous associons un gène nommé cobA. Une cassette de résistance à la kanamycine provenant du plasmide pUC4K (Barany et al., 1985) a été introduite au site NotI du fragment ClaI (position 0 sur la séquence)-RsaI (position 1686 sur la séquence) cloné dans un plasmide pUC8 (Viera et Messing, 1982) ; il s'agit du site Noti situé à la position 771 dans la phase 1 (voir la séquence sur la figure 7); deux insertions ont été retenues correspondant chacune à une orientation différente de la cassette de résistance. Ces fragments portant chacun une insertion de la cassette de résistance ont été clonés dans le plasmide pRK404 (Ditta et al.) pour donner les plasmides pXL1630 et 1631.Ces plasmides ont été introduits par transfert conjugatif dans la souche de Pseudomonas denitrificans SC510 Rif r, puis par une série de cultures-dilutions en absence de l'antibiotique sélectif pour le plasmide (la tétracycline), des doubles recombinants ayant échangé le fragment plasmidique avec le fragment chromosomique et ayant perdu le plasmide ont été trouvés. Deux souches ont ainsi été caractérisées i) l'une est nommée SC510:1631 Rifr, dans cette souche, la cassette de résistance à la kanamycine se trouve insérée, dans le chromosome au site NotI (se trouvant dans la phase 1); les polarités des transcriptions du gène de résistance à la kanamycine et celle de la phase ouverte 1 sont opposées, ii) l'autre insertion est nommée SC510:1630 Rif r; la cassette de résistance est insérée au même site, mais la transcription du gène de résistance à la même polarité que celle de phase ouverte 1 entière. Ces deux souches ont toutes les deux un taux de synthèse de cobalamines au moins 100 fois inférieur à celui de SC510. Le plasmide pXL545Q correspond au plasmide pXL545 dans lequel la cassette de résistance à la spectinomycine, du plasmide pHP45Q a été insérée au niveau du site BamHI. Ce plasmide (figure 12) qui contient le fragment Clal-Hindîli de 814 pb (où seule la phase ouverte 1 est entière) complémente seulement le mutant SC510:1630 Rifr. Ceci suffit à définir un nouveau gène puisque ce mutant est complémenté par un plasmide qui contient uniquement la phase ouverte 1 entière. La phase ouverte 1 correspond à un gène de la voie de biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides. Ce gène est nommé cobE.L'absence de complémentation du mutant SC510:1631 Rifr par le plasmide pXL5459 est peut être due au fait que les gènes cobA, cobB, cobC, cobD et cobE, ou une partie d'entre eux, appartiennent au même opéron et que l'insertion dans cobE qui conserve une transcription dans le sens de transcription de l'opéron peut être complémentée seulement par l'expression en trans du gène cobE. Au contraire le mutant SC510:1631 Rif r lui ne peut être complémenté que par un plasmide qui permet l'expression en trans des gènes cobA à cobE. Le fragment ClaI-HindIII-HindIII-HindIII de 5,4 kb contient donc cinq gènes cob nommés cobA, cobB, cobC, cobD et cobE. 4.2 - Etudes génétiques du fragment de 8,7 kb Le plasmide pXL367 est le pRK290 (Ditta et al., 1980) contenant le fragment EcoRI de 8,7 kb cloné au site EcoRI (figure 13). Des insertions du transposon Tn5 sur le plasmide pXL367 ont été sélectionnées en utilisant la technique déjà décrite (de Bruijn et Lupski, 1984). Les insertions dans le fragment de 8,7 kb ont été cartographiées. De la même manière des insertions du transposon Tn31acZ ont été obtenues selon la méthode déjà décrite (Stachel et al., 1985) et cartographiées. 29 insertions du transposon Tn5 et 13 insertions du transposon Tn31acZ ont ainsi été cartographiées. La position précise de ces insertions sur le fragment de 8,7 kb est portée à la figure 14. Des plasmides, portant chacun une seule insertion dans le fragment de 8,7 kb, ont été introduits par transferts conjugatifs dans les mutants Cob d'Acrrobacterium tumefaciens G164, G609, G610, G611, G612, G613, G614, G615, G616, G620, G638.Ces mutants sont tous complémentés par le pXL367. Les insertions qui ne permettent plus la complémentation des différents mutants ont été recherchées. Elles correspondent à une insertion dans le gène responsable de la complémentation du mutant correspondant. Les résultats des complémentations des différents mutants pour leur caractère de production de cobalamines (phénotype Cob) sont portés sur la figure 14. Si le mutant recombiné produit moins de trois fois moins de cobalamines que ne produit le même mutant avec le plasmide pXL367, il est considéré comme étant non complémenté. Sur les mutants étudiés, G164, G609, G610, G611, G612, G613, G614, G615, GEl 6, G620, G638, on observe huit classes différentes d'insertions inactivationnelles de transposons conduisant à un phénotype muté. Ces classes caractérisent des insertions par l'absence de complémentation d'un ou plusieurs mutants par les plasmides pXL367 portant ces mêmes insertions. Chaque classe correspond donc à un gène muté. On observe que les insertions appartenant à une même classe sont positionnées les unes à côté des autres. Huit classes d'insertions sont ainsi observées qui permettent de définir huit gènes. Chaque classe d'insertions définit un fragment minimum qui doit être contenu dans le gène correspondant. La figure 14 démontre un parfait recoupement entre les régions délimitées par chaque classe, au niveau de la carte de restriction, et les phases ouvertes décrites ci-dessus (exemple 3). On constate en effet que, pour chaque classe d'insertions, les transposons sont toujours insérés dans une partie du fragment de 8,7 kb qui est contenue dans une seule phase ouverte. A chaque classe d'insertions, est donc associée une phase ouverte et une seule. Les phases ouvertes indiquées ci-dessus codent donc chacune pour une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides. Les phases ouvertes correspondent chacune à des gènes impliqués dans la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides. Ces phases ouvertes sont appelées cobF, cobG, cobH. cobI, cobJ cobK. cobL et cobM pour les phases 6 à 13 respectivement. La position de ces gènes par rapport à la carte de restriction est représentée sur la figure 14. EXEMPLE 5 - Gènes et protéines des fragments de 5,4 kb et de 8,7 kb 5.1 - Fragment de 5,4 kb Cinq gènes (cobA, cobB cobC cobD et cobE) sont donc définis sur le fragment ClaI-HindIII--HindIII-HindIII de 5,4 kb. Ils codent respectivement pour les protéines COB suivantes: COBA, COBB, COBC, COBD et COBE. Les parties codantes des gènes (cobA à cobE) sont décrites à la figure 15, ainsi que les séquences des protéines COBA à COBE.Des propriétés de chacune de ces protéines sont aussi présentées (composition en acides aminés, point isoélectrique, index de polarité et profil dthydrophilicité). D'après les profils dthydrophobicité, qui ont été réalisés d'après les programmes de Hopp et Woods (1981), toutes les protéines COBA à COBE sont vraisemblablement des protéines solubles, par opposition à des protéines membranaires, puisque l'on constate l'absence de longs domaines hydrophobes. Nous avons, pour toutes les séquences en acides aminés des protéines, indiqué comme premier acide en position NH2-terminale une méthionine. il est entendu que celle-ci peut être enlevée in vivo (Ben Bassat et Bauer, 1984).On sait que des règles concernant l'excision in vivo de la méthionine NH2-terminale par la méthionine aminopeptidase ont été proposées (Hirel et al., 1989). Ces cinq séquences protéiques ont été comparées aux protéines de Genpro, qui est une extraction protéique de Genbank augmentée des parties codantes putatives supérieures à 200 acides aminés, suivant le programme de Kanehisa (1984). Aucune homologie significative n'a pu être mise en évidence avec les paramètres utilisés avec la version 59 de Genbank. 5.2 - Fragment de 8,7 kb Huit gènes sont donc définis sur le fragment de 8,7 kb. Ces gènes cobF à cobM, codent respectivement pour les protéines COB suivantes : COBF, COBG, COBH, COBI, COBJ, COBK, COBL, COBM. Les parties codantes des gènes (cobF à cobM) sont décrites sur la figure 16, ainsi que les séquences des protéines COBF à COBM. Des propriétés de chacune de ces protéines sont aussi présentées (composition en acides aminés, poids moléculaire, point isoélectrique, index de polarité et profil d'hydrophilicité). D'après les profils d'hydrophilicité, qui ont été réalisés suivant les programmes de Hopp et Woods (1981), toutes les protéines COBF à COBM sont vraisemblablement des protéines solubles, par opposition à des protéines membranaires, puisque l'on constate l'absence de grands domaines hydrophobes.Nous avons, pour toutes les séquences en acides aminés des protéines COB, indiqué comme premier acide aminé en position NH2-terminale une méthionine. il est entendu que celle-ci peut être excisée in vivo (Ben Bassat et Bauer, 1984). On sait que des règles concernant l'excision in vivo de la méthionine NH2-terminale par la méthionine aminopeptidase ont été proposées (Hirel et al., 1989). Ces huit séquences protéiques ont été comparées aux protéines de Genpro, qui est une extraction protéique de Genbank (version 59) augmentée des parties codantes putatives supérieures à 200 acides aminés, suivant le programme de Kanehisa (1984). Aucune homologie significative n'a pu être mise en évidence avec les paramètres utilisés sur la version 59 de Genbank. EXEMPLE 6 - Etudes enzymatiques 6.1 - Identification de protéines COB et de leurs gènes à partir d'aegivités enzymatiques purifiées Cet exemple décrit comment, à partir d'une protéine purifiée, après avoir établi sa séquence NH2-terminale, il est possible de trouver le gène de structure correspondant parmi des genes cob séquencés. 1. Identification de la protéine COBA codée par le gène cobA La purification de la SUMT de Pseudomonas denitrificans a été décrite (F. Blanche et al., 1989). La séquence NH2-terminale de la protéine ainsi purifiée a pu être réalisée selon la technique décrite ci-dessus. Les dix premiers acides aminés ont été identifiés 1 2 3 4 5 6 7 B 9 10 Met Ile Asp Asp Leu Phe Ala Gly Leu Pro La séquence NH2-terminale de la protéine COBA (figure 15) correspond exactement à cette séquence. Le poids moléculaire de la SUMT purifiée estimé par électrophorèse PAGE-SDS à 12,5 % est de 30 000. La protéine COBA a un poids moléculaire déduit de sa séquence de 29 234 (figure 15). Les correspondances entre les séquences NH2-terminales et les poids moléculaires indiquent clairement que la protéine COBA correspond à la SUMT. Le gène cobA est le gène de structure de la SUMT. 2. Identification de la protéine COBB codée par le gène CobB a) Dosage de l'activité acide cobyrinique a,c-diamide synthase Cet exemple illustre le dosage d'une activité de la voie de biosynthèse des corrinoïdes qui n'a encore jamais été décrite. il s'agit de l'acide cobyrinique a,c-diamide synthase (ACDAS) qui catalyse l'amidation de deux fonctions acides carboxyliques du noyau corrine ou descobaltocorrine aux positions a et c (figure 17). Le donneur de groupement NH2 est la L-glutamine et la réaction consomme 1 molécule d'ATP par amidation de chaque fonction acide carboxylique.Le dosage qui est décrit ci-dessous s'applique à la réaction de diamidation de l'acide cobyrinique; avec quelques modifications (détection en CLHP à 330 nm en particulier) il s'applique à la réaction de diamidation de l'acide hydrogénobyrinique. Le mélange d'incubation (250 ijl de tris-HCl 0,1 M pH 8) contenant ATP (1 mM), Mol 2 (2,5 mM), glutamine (100 M), acide cobyrinique (50 M) ou acide hydrogénobyrinique (50 pM), cobyrinique a,c-diamide synthase (environ 1 unité d'activité) est incubé durant 1 heure à 30*C. A la fin de l'incubation, 125 ijl d'une solution aqueuse de KCN (2,6 g/l) et 125 pl dHCl 0,2 M sont ajoutés au mélange qui est ensuite chauffé à 80-C pendant 10 minutes puis centrifugé 5 minutes à 5 000 g. 50 pl du surnageant de centrifugation sont analysés en CLHP. Ils sont injectés sur une colonne Nucleosil 5-C18 de 25 cm et élués avec un gradient de 0 à 100 de tampon B dans A en 30 minutes ; tampon A : phosphate de potassium 0,1 M pH 6,5, 10 mM KCN ; tampon B phosphate de potassium 0,1 M pH 8, 10 mM KCN/acétonitrile (1/1). Les corrinoïdes sont détectés grâce à leur absorption UV à 371 nm. L'unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour synthétiser 1 nmole de groupements amides par heure dans les conditions décrites. b) Purification de l'activité acide cobyrinique a,c-diamide synthase de Pseudomonas denitrificans Cette expérience illustre comment une protéine de Pseudomonas denitrificans intervenant dans la voie de biosynthèse des cobalamines peut être purifiée. A partir du dosage décrit à l'exemple 6.1.2 a), la purification de l'acide cobyrinique a.c-diamide synthase de Pseudomonas denitrificans est réalisée comme décrit ci-dessous. Dans une expérience typique de purification, 7 g de cellules humides de la souche SC 510 Rifrdans laquelle on a introduit le plasmide pXL1500 (voir exemple 4.1. pour la description du pXL1500 ainsi que la figure 12) sont suspendues dans 30 ml de Tris-HCl 0,1 M pH 7,7 et soniquées durant 15 minutes à 4 C. L'extrait brut est ensuite récupéré par centrifugation 1 heure à 50 000 g puis 10 ml de cet extrait sont injectés sur une colonne de Mono Q HR 10/10 équilibrée avec le même tampon. Les protéines sont éluées avec un gradient linéaire de KCl (0 à 0,5 M). Les fractions contenant l'activité enzymatique (mises en évidence grâce au test décrit à l'exemple 6.2 b) sont regroupées et concentrées à 2,5 ml.Après dilution avec 1 ml de Tris-HCl .25 mM pH 7,7, les protéines sont fractionnées sur une Mono Q HR 5/5 en utilisant le gradient de KCl (0 à 0,5 M) précédent. Les fractions actives sont regroupées, 1 ml de Tris-HCl 0,1 M pH 7,7 contenant 1,7 M de sulfate d'ammonium est ajouté à l'échantillon qui est ensuite chromatographié sur une colonne de Phényl-Superose (Pharmacia) avec un gradient décroissant de sulfate d'ammonium (1,0 M à 0 M). Les fractions contenant l'activité recherchée sont rassemblées et chromatographiées sur une colonne Bio-Gel HPHT (Bio-Rad) avec un gradient de phosphate de potassium (0 à 0,35 M). Après cette étape, l'enzyme est pure à plus de 95 %. Elle ne présente aucune protéine contaminante en PAGE-SDS. La pureté de la protéine est confirmée par l'unicité de la séquence NH2-terminale. Son poids moléculaire dans cette technique est de 45 000. Les différentes étapes de purification de l'ACDAS, avec leur facteur de purification et leur rendement sont portées sur le tableau ci-dessous. Tableau : Purification de l'ACDAS Etape de vol Protéines Activite spé. purification (ml) (mg) protéines) Rendement purification Extrait brut 10 200 8.5 - MonoQ 10/10 12 15.1 108 96 12.7 MonoQ 5/5 3 3.75 272 60 32 Phényl-Superose 1 O. 865 850 43 100 Bio-Gel HPHT 2 0.451 1320 35 155 ce facteur est calculé d'après l'augmentation de l'activité spécifique des fractions au cours de la purification. c) Séquence NH 2-terminale de l'acide cobyrinique a. c-diamide synthase de Pseudomonas denitrificans et identification du gène de structure de Pseudomonas denitrificans codant pour cette activité Cet exemple illustre comment la séquence NH2-terminale d'une protéine qui intervient dans la voie de biosynthèse des cobalamines permet d'identifier le gène de structure qui code pour cette protéine. La séquence NH 2-terminale de 1' acide cobyrinique a, c-diamide synthase de Pseudomonas denitrificans purifiée comme décrit à l'exemple 6.1.2 b) a été réalisée comme décrit précédemment. 15 résidus ont été identifiés 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Ser Gly Leu Leu Ile Ala Ala Pro Ala Ser Gly Ser Gly Lys Thr La séquence NH2-terminale de la protéine COBB (figure 12) correspond exactement à cette séquence, si ce n'est que dans la séquence présentée sur la figure 12, une méthionine précède la séquence peptidique déterminée par séquençage direct. il en résulte que la méthionine aminoterminale est certainement excisée in vivo par la méthionine aminopeptidase (Ben Bassat et Bauer, 1987). Le poids moléculaire de l'ACDAS purifiée estimé par électrophorèse PAGE-SDS à 12,5 est de 45 000. La protéine COBB a un poids moléculaire déduit de sa séquence de 45 676 (figure 15). Les correspondances entre les séquences NH2-terminales et les poids moléculaires indiquent clairement que la protéine COBB correspond à l'ACDAS.Le gène cobB est le gène de structure de l'ACDAS. 3. Identification de la protéine COBI codée par le gène Cobi a) Dosage d'une activité S-adénosyl-L-méthionine:précorrine-2 méthyltransférase Cet exemple illustre le dosage d'une activité enzymatique de la voie de biosynthèse des corronoïdes qui n'a encore jamais été décrite. Il s'agit de la S-adénosyl-L-méthionine:-2 méthyltransférase (SP2MT) qui catalyse le transfert d'un groupement méthyl de la S-adénosyl-L-méthionine (SAM) au précorrine-2 pour donner le précorrine-3 (figure 18).Les facteurs II et III, produits d'oxydation respectivement du précorrine-2 et du précorrine-3 ont déjà été purifiés à partir d'extraits cellulaires de Propionibacterium shermanii (Battersby et MacDonald, 1982, Scott et al., 1984); le précorrine-2 et le précorrine-3 sont reconnus comme des intermédiaires présumés de biosynthèse du coenzyme B12 mais ils n'ont jamais été purifiés comme tels. Pour cette raison, l'activité correspondante n'a jamais été ni dosée, ni purifiée auparavant. Le substrat de la réaction enzymatique, précorrine-2, est une molécule très labile qu'il n'est pas possible de conserver car elle s'oxyde spontanément en présence de traces même infimes d'oxygène (Battersby et MacDonald, 1982).Le principe de ce test enzymatique repose donc sur la possibilité de générer extemporanément, à laide d'un extrait enzymatique de la souche SC510 Rifrdans laquelle on a introduit le plasmide pXL1500, le précorrine-2 à partir du SAM et d'acide 5-aminolévulinique. L'incubation doit être effectuée en conditions de stricte anaérobie. Les fractions contenant la SP2MT sont incubées dans 1 ml de Tris-HCl 0,1 M pH 7,7 en présence de 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 100 WM [methyl-9H]-SAM (1 'ici), 0,8 mM acide 6-aminolévulinique et 6 mg d'extrait enzymatique brut de la souche de Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr pXL1500 pendant 3 heures à 30 ex La souche SC510 Rif r pXL1500 contient une forte activité SUMT (F. Blanche et al., 1989). Les composés tétrapyrroliques produits durant l'incubation sont fixés sur une colonne d'échangeur d'anions DEAE-Sephadex et estérifiés dans le méthanol à 5 % d'acide sulfurique en l'absence d'oxygène. Les dérivés diméthylés et triméthylés de l'uro'gen III sont ensuite séparés par chromatographie sur couche mince de silice en utilisant le dichlorométhane/méthanol (98,3/1,7) comme système éluant (F. Blanche et al., 1989). L'activité de la SP2MT est exprimée par le rapport de la quantité de dérivés triméthylés obtenus sur l'ensemble des dérivés (di- et tri-) méthylés produits ramenée, à la quantité de protéine. L'extrait de SC510 Rifr pXL1500 introduit dans le test ne présente pas d'activité SP2MT détectable dans les conditions de dosage (le ratio précorrine-3 produits sur précorrine-2 produits durant le test est inférieur à 0,05). b) Purification de la S-adénosyl-L-méthionine:précorrine-2 méthyltransférase de Pseudomonas denitrificans Cette expérience illustre comment une protéine de Pseudomonas denitrificans intervenant dans la voie de biosynthèse de cobalamines peut être purifiée lorsqu'un dosage de l'activité en question existe. La protéine est purifiée à partir de cellules de SC510 Rif r contenant le plasmide pXL253. il s'agit du plasmide pKT230 sur lequel a été inséré le fragment EcoRI de 8,7 kb (figure 13). Dans une expérience typique de purification, 50 g de cellules humides de la souche SC150 Rifrdans laquelle a été introduit le plasmide pXL253 sont suspendues dans 250 ml de phosphate de potassium 0,1M pH 7,7, 5 mM DTT et soniquées durant 15 minutes à 4 ex. Après centrifugation à 50 000 g durant 1 heure, le surnageant est passé à travers une colonne de DEAE-Sephadex (10 ml de gel) pour éliminer les composés tétrapyrroliques. Le pH de l'extrait brut ainsi obtenu est ajusté à pH 7,7 avec KOH 0,1 M.Les protéines précipitant entre 33 % et 45 % de saturation en sulfate d'ammonium sont collectées et dissoutes dans 40 ml de Tris-HCl 0,1M pH 7,7, 5 mM DTT. Cette solution est passée à travers une colonne de Sephadex G-25 éluée avec du Tris-HCl 10 mM pH 7,7, 5 mM DTT et les protéines collectées sont injectées sur une colonne de DEAE-Trisacryl-M. Les protéines sont éluées avec un gradient linéaire de 0 à 0,25 M KCl et les fractions contenant l'activité SP2MT sont regroupées et passées une seconde fois à travers une colonne de Sephadex G-25 comme ci-dessus. La fraction protéique est injectée sur une colonne d'Ultrogel HA (IBF) équilibrée dans le Tris-HCl 10 mM pH 7,7, 5 mM DTT.Les protéines sont éluées avec un gradient linéaire de 0 à 50 mM de phosphate de potassium pH 7,8 contenant 5 mM DTT. Les fractions contenant l'activité recherchée sont regroupées et injectées sur une MonoQ HR 5/5 (Pharmacia) équilibrée avec du Tris-HCl 50 mM pH 7,7, 5 mM DTT. La SP2MT est éluée avec un gradient linéaire (0 à 0,25 M) de KCl. A la sortie de l'étape MonoQ, l'électrophorèse en PAGE-SDS (12,5 %} avec coloration aux sels d'argent révèle que l'enzyme est pure à plus de 99 %. Ceci est confirmé par l'unicité de la séquence NH 2-terminale de la protéine. Le poids moléculaire calculé à partir de i'électrophorèse en conditions dénaturantes (PAGE-SDS à 12,5 %) est de 26 500. Les étapes de purification de la SP2MT avec leurs rendements, sont décrites dans le tableau ci-dessous. Tableau : Purification de la SP2MT Etape de Vol Protéines Facteur de purification (ml) (mg) purification Extrait brut 300 6000 Précipitation 40 1530 3.9 (33-45 %) DEAE-Trisacryl-M 57 355 16.9 Ultrogel HA 30 71 85 MonoQ HR 5/5 12 33.5 179 1ce facteur est calculé d'après le rendement en protéines. c) Séquence NH2-terminale de la SP2MT et identification du gène de structure codant pour cette activité Cet exemple illustre comment la séquence NH2-terminale d'une protéine qui intervient dans la voie de biosynthèse permet d'identifier le gène de structure qui code pour cette protéine. Dans l'exemple présent, il s'agit du gène de structure de la SP2MT. La séquence NH2-terminale de la protéine purifiée a été réalisée comme décrit précédemment. Les 15 premiers acides aminés ont été identifiés 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Ser Gly Val Gly Val Gly Arg Leu Ile Gly Val Gly Thr Gly Pro La séquence NH 2-terminale de la protéine COBI (figure 16) correspond exactement à cette séquence, si ce n'est que dans la séquence présentée sur la figure 16 une méthionine précède la séquence peptidique déduite de la séquence nucléotidique. il en résulte que la méthionine aminoterminale est certainement excisée in vivo par la méthionine aminopeptidase (Ben Bassat et Bauer, 1987). Le poids moléculaire de la SP2MT purifiée estimé par électrophorèse pu PAGE-SDS à 12,5 % est de 26 500.La protéine COBI a un poids moléculaire déduit de sa séquence en acides aminés de 25 846 (figure 16). Les correspondances entre les séquences NH 2-terminales et les poids moléculaires indiquent clairement que la protéine COBI correspond à la SP2MT. Le gène cobI est le gène de structure de la SP2MT. 4. Identification de la protéine COBH codée par le gène cobH a) Purification d'une protéine porteuse d'acide hydrogénobyrinique à partir d'une culture d'une souche recombinée de Pseudomonas denitrificans Cet exemple illustre comment une protéine qui lie un intermédiaire ou un composé dérivé d'un intermédiaire de la voie de biosynthèse des cobalamines peut être purifiée. Il s'agit d'une protéine porteuse d'acide hydrogénobyrinique (PPAHBY). L'acide hydrogénobyrinique correspond à l'acide cobyrinique sans atome de cobalt au centre de la molécule (figure 19). il s'agit soit d'un intermédiaire de biosynthèse, soit d'un sous-produit de la biosynthèse.Il y a toute raison de penser qu'une protéine qui lie soit un intermédiaire de biosynthèse, soit un produit dérivé de cette biosynthèse, est une protéine qui intervient dans la biosynthèse des cobalamines. Nous donnons donc ici la description de la purification de cette protéine. Le test de purification étant la fluorescence du composé qui est lié à la protéine. La souche utilisée pour la purification de la PPAHBY est un dérivé d'une souche de Pseudomonas denitrificans; il s'agit de la souche SC510 Rifr portant le plasmide pxL253. il s'agit du plasmide pKT230 sur lequel a été cloné, au site EcoRI, le fragment de 8,7 kb (figure 13). Dans une expérience typique de purification, 50 g de cellules humides de la souche SC510 Rifr pXL253, obtenues après culture en milieu PS4, sont resuspendues dans 200 ml de tampon phosphate de potassium 0,1 M pH 7,7 et soniquées durant 12 minutes. Après centrifugation à 50 000 g durant 1 heure, le surnageant est passé à travers une colonne de DEAE-Sephadex (10 ml de gel) pour éliminer les composés tétrapyrroliques. Le pH de la solution est ensuite immédiatement ajusté à 7,7 avec une solution 1 M KOH. La fraction protéique précipitant entre 40 et 60 % de saturation en sulfate d'ammonium est collectée par centrifugation et dissoute dans 50 ml de Tris-HCl 0,1 M pH 7,7. Cet échantillon est ensuite injecté sur une colonne d'Ultrogel ACA 54 (volume de gel 1000 ml) et les protéines sont éluées à un débit de 60 ml/h avec du Tris-HCl 50 mM pH 7,7.Les fractions contenant la protéine à purifier, visualisées en détection de fluorescence (excitation 330 nm ; émission 2550 nm), sont regroupées et injectées sur une colonne de DEAE-Trisacryl M équilibrée avec du Tris-HCl 50 mM pH 7,7 et éluées avec un gradient de 0 à 0,2 M KCl. Les fractions fluorescentes sont regroupées, passées à travers une colonne de Sephadex G25 équilibrée en Tris-HCl 10 mM pH 7,7. La fraction protéique est injectée sur une colonne d'Ultrogel HA équilibrée avec du Tris-HCl 10 mM pH 7,7 et les protéines sont éluées avec un gradient de 0 à 0,1 M de phosphate de potassium pH 7,7. Les fractions fluorescentes sont regroupées et amenées à 0,65 M en sulfate d'ammonium, puis injectées sur une colonne de Phényl Sépharose CL 4B équilibrée avec du phosphate de potassium 10 mM pH 7,7, à 0,65 M sulfate d'ammonium. Les protéines sont alors éluées avec un gradient linéaire de 0,65 à 0 M de sulfate d'ammonium. Les fractions contenant la protéine sont regroupées. La protéine ainsi obtenue est pure à plus de 99 % (d'après les résultats d'électrophorèse PAGE-SDS à 12,5 % et coloration aux sels d'argent). La pureté de la protéine est confirmée par l'unicité de la séquence NH2-terminale. Son poids moléculaire calculé à l'aide de cette technique est de 22 000. Les étapes de purification de la PPAHBY avec leurs rendements sont décrites sur le tableau ci-dessous. Tableau : Purification de la PPAHBY Etape de Vol Protéines Facteur de purification (ml) (mg) purification Extrait brut 250 6000 Précipitation 50 2350 2.6 (40-60 %) Ultrogel ACA 54 70 655 9.2 DEAE-Trisacryl M 30 271 22 Ultrogel HA 22 93 65 Phényl Sépharose 12 31 194 1ce facteur est calculé d'après le rendement en protéines c) Séquence NH2-terminale de la protéine porteuse de l'acide hydrogénobyrinique et identification de son gène de structure Cet exemple illustre comment la séquence NH2-terminale d'une protéine qui intervient dans la voie de biosynthèse permet d'identifier le gène de structure qui code pour cette protéine. La séquence NH 2-terminale de cette protéine a été réalisée comme décrit précédemment. 15 résidus ont été identifiés 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 li 12 13 14 15 Pro Glu Tyr Asp Tyr Ile Arg Asp Gly Asn Ala Ile Tyr Glu Arg La séquence NH2-terminale de la protéine COBH (figure 16) correspond exactement à cette séquence, si ce n'est que dans la séquence présentée sur la figure 16 une méthionine précède la séquence peptidique déterminée par le séquençage décrit ci-dessus. Il en résulte que la méthionine aminoterminale est certainement excisée in vivo par la méthionine aminopeptidase (Ben Bassat et Bauer, 1987). Le deuxième résidu étant une proline, cette excision est conforme aux règles déjà énoncées (Hirel et al., 1989). Le poids moléculaire de la PPAHBY purifiée estimé par électrophorèse PAGE-SDS à 12,5 % est de 22 000.La protéine COBH a un poids moléculaire déduit de sa séquence de 22 050 (figure 16). Les correspondances entre les séquences NH2-terminales et les poids moléculaires, des protéines COBH et PPAHBY, indiquent clairement que la protéine COBH correspond à la PPAHBY. cobH est le gène de structure de la PPAHBY et cette protéine intervient dans la biosynthèse des cobalamines. On peut penser que si on trouve, in vivo, l'acide hydrogénobyrinique lié à cette protéine, l'acide hydrogénobyrinique est soit le substrat, soit le produit de la réaction catalysée par la protéine COBH soit un analogue de ces derniers. 6.2 - Détermination des propriétés de protéines COB par mesures d' intermédiaires de biosynthèse accumulés Cet exemple illustre comment il est possible d'attribuer à une protéine COB de Pseudomonas denitrificans une activité enzymatique. Cette activité est attribuée d'après des données obtenues concernant les intermédiaires de biosynthèse accumulés chez le ou les mutants Cob bloqués dans l'étape en question. En effet si un mutant accumule un intermédiaire de biosynthèse, il est très probable que ce mutant est bloqué dans l'étape qui a pour substrat l'intermédiaire en question. 1. Propriétés des protéines COBC et COBD Les mutants Cob G643 (Awrobacterium tumefaciens) et G572 (Pseudomonas Putida) déjà décrits dans les exemples 1 et 4 sont bloqués dans l'étape correspondant à la protéine COBC. En effet ces deux mutants ne sont pas complémentés par les insertions inactivantes de transposons Tn5 qui se trouvent dans le gène cobC. Les deux souches G643 et G572, ainsi que les souches parentes non mutées C58-C9 Rif r et KT 2440 Rif r (Cameron et al., 1989)3 ont été cultivées en milieu PS4' (qui correspond à du milieu PS4 contenant 100 fois moins de cobalt que le PS4 décrit précédemment) 3 jours comme cela est décrit ci-dessus.Du 57CoC12 a été ajouté aux cultures (2,5 HCi/0,1 Hm pour une culture de 25 ml). Les corrinoïdes intracellulaires ont été analysés. Les souches parentes n'accumulent pas de corrinoïdes autres que du coenzyme B12. Les deux mutants, G643 et G572, accumulent de l'acide cobyrique adénosylé dans des proportions respectives de il % et 6 %. Ces proportions en % sont calculées par rapport au niveau de coenzyme B12 synthétisé par la souche parente. Outre l'acide cobyrique, le mutant G643 accumule de l'acide cobyrinique pentaamide dans une proportion de 2 %; l'acide cobyrinique pentaamide est l'intermédiaire qui précède l'acide cobyrique. L'étude de ces mutants fait ressortir qu'ils sont bloqués après l'acide cobyrique.Tous ces mutants Cob sont soit bloqués entre lurotgen III et le cobinamide, soit entre le cobinamide et les cobalamines. Les mutants G643 et G572 sont bloqués entre lurotgen III et le cobinamide. Or si ces mutants sont bloqués avant le cobinamide et accumulent tous les deux de l'acide cobyrique, les protéines pour lesquelles ils codent ne peuvent intervenir que dans l'étape enzymatique (appelée cobinamide synthase) qui catalyse l'amidation de l'acide cobyrique par un résidu aminopropanol pour donner le cobinamide; elles peuvent aussi éventuellement intervenir dans la synthèse du substrat de la réaction qui apporte l'aminopropanol, si ce n'est l'aminopropanol lui-même. Le gène cobC code pour une protéine qui est soit la cobinamide synthase, soit une de ses sous-unités. Les mutants Cob G634 d'Aarobacterium tumefaciens et G2639 de SBL27 Rif r (exemple 4.1) qui sont bloqués dans l'étape correspondant au gène cobD ont été analysés de la même manière. Ces deux mutants ne sont pas complémentés par les insertions inactivationnelles dans le gène cobD (exemple 4.1). Le seul corrinoïde intracellulaire trouvé chez ces mutants est de l'acide cobyrique adénosylé. Comme les mutants précédents, ces mutants codent pour une protéine intervenant dans la transformation de l'acide cobyrique en cobinamide ou bien éventuellement en la synthèse de l'autre substrat de la réaction. Ces deux gènes différents (cobC et cobD) codent pour deux protéines qui interviennent dans la même étape. 2. Propriétés des protéines COBF à CORON Les mutants d'Actrobacterium tumefaciens déjà décrits dont on connaît, d'après l'étude décrite à l'exemple 4.2, dans quels gènes chacun d'entre eux est bloqué, ont été étudiés. Ce sont les mutants G612 (cobF), G615 (cobG), G616 (cobH), G613 (cobI), G611 (cobJ), G620 (cobK), G638 (cobL) et G609 (cobM) ; nous avons figuré entre parenthèses le gène de Pseudomonas denitrificans responsable de la complémentation de ces mutants (exemple 5) qui correspond donc au gène muté chez ce mutant. Ces mutants ont été cultivés en milieu PS4 comme cela est décrit précédemment avec du cobalt marqué.Après quatre jours d'incubation, les mutants ont été analysés pour leur contenu intracellulaire en corrinoïdes et descobaltocorrinoïdes. Tableau : Intermédiaires accumulés par des mutants d'Aarobacterium tumefaciens bloqués dans les gènes du fragment 8,7 kb de Pseudomonas denitrificans Descobaltocorrinoïdes Corrinoïdes intracellulaires Gène Souches intracellulaires en 4 en % des cobalamines muté HAB HABM HABD C58-C9" 100 100 100 coenzyme B12100 G612 5 5 64 cobinamide 2,2 cobF coenzyme B1234 G615 5 5 84 coenzyme B1217 cobG G616 35 10 10 coenzyme B12 13 cobH G613 5 5 57 coenzyme B12 cobI G611 5 5 65 coenzyme B12 cobJ G620 12 5 10 coenzyme B12 cobK G638 5 5 47 coenzyme B12 cobL G609 5 5 33 coenzyme B12 cobM HAB : acide hydrogénobyrinique HABM : acide hydrogénobyrinique monoamide HABD : acide hydrogénobyrinique diamide * en fait il s'agit de la souche C58-C9 RifrNalr déjà décrite (Cameron et al., 1989) 1les valeurs sont exprimées en % des mêmes intermédiaires accumulés chez la souche parente non mutée C58-C9 RifrNalr. Ces résultats montrent que tous les mutants n'accumulent aucun corrinoïde (à l'exception du mutant inactivé dans le gène cobF, GEl 2, qui lui, accumule du cobinamide mais à un niveau faible équivalent à 2,2 % des cobalamines synthétisées par la souche non mutée). Toutefois, certains mutants (G612, G615 et G616) ont des niveaux de cobalamines qui représentent plus de 10 % du niveau de cobalamines de la souche parente. Il est probable que tous ces mutants sont bloqués au moins avant l'acide cobyrinique diamide. Tous ces mutants accumulent de l'acide hydrogénobyrinique et de l'acide hydrogénobyrinique diamide en quantités inférieures à la souche non mutée; ils sont donc très probablement bloqués avant l'acide hydrogénobyrinique.Nous pouvons conclure que tous les gènes cobF à cobG codent pour des protéines qui interviennent avant l'acide hydrogénobyrinique. On sait que le mutant G613 est muté dans le gène cobI qui code pour la SP2MT, intervenant bien avant l'acide hydrogénobyrinique. Pour ce mutant, les résultats du présent exemple, concernant l'accumulation d'intermédiaires, sont en parfait accord avec l'étape inactivée chez ce mutant, à savoir que ce mutant n'accumule aucun intermédiaire après l'acide hydrogénobyrinique à un niveau supérieur à ce que l'on observe avec la souche non mutée. Ce résultats est pour les gènes cobF, cobJ, cobL et cobM cohérent avec ceux de l'exemple 6.7 où il est proposé que ces gènes codent pour des protéines qui catalysent des transferts de méthyl SAM dépendants et donc qui interviennent avant l'acide hydrogénobyrinique.A l'exception de cobI qui est le gène de structure de la SP2MT ces gènes interviennent après le précorrine-3. En effet comme ce ne sont ni les gènes de structure de la SUMT et de la SP2MT ils interviennent forcément après, c'est-à-dire après le précorrine-3 (tous les gènes cob décrits dans la présente invention interviennent entre lurotgen III et les cobalamines). Ces gènes cobF à cobH et cobJ à cobL codent pour des enzymes qui interviennent entre le précorrine-3 et l'acide hydrogénobyrinique.Comme il n'a pas été démontré que l'acide hydrogénobyrinique est un intermédiaire de biosynthèse, nous pouvons aussi choisir le premier corrinoide qui est retrouvé accumulé chez des mutants, à savoir l'acide cobyrinique diamide pour lequel il est reconnu qu'il s'agit d'un intermédiaire de biosynthèse (Friedman, 1975). Formulé autrement, nous pouvons dire que les gènes cobF à cobH et cobJ à cobL codent pour des enzymes qui interviennent entre le précorrine-3 et l'acide cobyrinique diamide. 6.3 - Détermination de l'activité de protéines COB par études d'affinité vis-à-vis du SAn Cet exemple illustre comment il est possible, à partir de protéines COB purifiées de Pseudomonas denitrificans, de mettre en évidence in vitro une activité de fixation du SAM. Si une protéine COB possède une telle activité, cela signifie que cette protéine COB est une méthyltransférase de la voie et qu'elle intervient dans un des transferts des huit groupements méthyl qui se produisent entre l'urotgen III et l'acide cobyrinique. a) Test d'affinité pour le SAn sur une protéine purifiée Le test repose sur le principe suivant lequel les méthyltransférases de la voie de biosynthèse des cobalamines ont certainement un site de fixation du SAM. Ce site doit être mis en évidence par une affinité du SAM plus élevée que pour toute protéine qui ne fixe pas le SAM spécifiquement. Après incubation de la protéine à étudier en présence d'un excès de SAM radioactif, celle-ci est séparée du SAM libre par une chromatographie de perméation de gel. La radioactivité retrouvée dans la fraction du poids moléculaire de la protéine correspond au SAM fixé durant l'incubation. La chromatographie est effectuée à 2*C pour limiter au maximum la libération du SAM lié durant la séparation. La protéine (environ 10 pg) est incubée durant 10 minutes à 300C dans 200 pl de Tris-HCl 0,1 M pH 7,7 avec 5 nmoles de (méthyl-3H-SAM (1 pCi). Après incubation, 100 pl du mélange sont immédiatement injectés sur une colonne de TSK-125 (Bio-Rad) éluée à 1 ml/minute avec le mélange de sulfate de sodium 50 mM/dihydrogénophosphate de sodium 20 mM pH 6,8 préconisé par le distributeur de cette colonne. Des fractions de 0,5 ml sont collectées et comptées en scintillation liquide. Les temps de rétention de la protéine et du SAM sont obtenus directement d'après l'enregistrement de l'absorbance de l'éluat à 280 nm. b) Etude in vitro de la fixation du SAN sur les protéines COBA et COBF de Pseudomonas denitrificans 1. Purification des protéines COBF et COBA La protéine COBF de Pseudomonas denitrificans est purifiée comme cela est décrit ci-après. Dans une expérience typique de purification, 5 g de cellules humides de la souche SC150 Rifrdans laquelle a été introduit le plasmide pXL1546 ( voir ex.7.3) obtenues après culture en milieu PS4 sont resuspendues dans 30 ml de Tris-HCl 0,1 M pH 7,7 et soniquées durant 15 minutes à 4ec. L'extrait brut est ensuite récupéré par centrifugation 1 heure à 50 000 g et le surnageant est passé sur une colonne de DEAE-Sephadex (1 ml de gel) pour éliminer les composés tétrapyrroliques présents. 10 mg de protéines (0,7 ml) de cet extrait sont ensuite injectés sur une colonne de MonoQ HR 5/5 équilibrée avec le même tampon. Les protéines sont éluées avec un gradient linéaire de KCl (0 à 0,25 M). La protéine COBF est éluée avec 0,20 M de KCl. Elle est diluée deux fois avec du Tris-HCl 0,1 M pH 7,7 et purifiée une seconde fois sur une MonoQ HR 5/5. L'électrophorèse en PAGE-SDS avec révélation au bleu de Comassie est utilisée pour visualiser la protéine. Cette technique montre d'autre part que COBF est d'une pureté de 95 % environ après cette étape de purification. La séquence NH2-terminale de la protéine purifiée a été réalisée comme cela est décrit précédemment .Deux séquences NH2-terminales apparaissent en même temps sur chaque cycle de dégradation; ce sont les séquences suivantes dans les proportions indiquées Séquence 1 (34 % d'abondance) 1 2 3 4 5 E 7 8 9 10 11 Ala Glu Ala Gly Met Arg Lys Ile Leu Ile Ile Séquence 2 (66 % d'abondance) 1 2 3 4 S E 7 8 9 10 11 Met Arg Lys Ile Leu Ile Ile Gly Ile Gly Phe La séquence 1 correspond à la séquence NH2-terminale de la protéine COBF qui est donnée sur la figure 16, si ce n'est que la méthionine aminoterminale est excisée suivant des règles déjà énoncées (Hirel et al., 1989) par la méthionine aminopeptidase (Ben Bassat et Bauer, 1989).La séquence 2, présente en quantité la plus importante, correspond à la même protéine mais dont l'initiation de traduction se serait faite non pas au codon ATG d'initiation de la traduction que nous avions supposé, mais à celui situé 5 codons en aval sur la phase codante (figure 16). En effet les acides aminés de cette séquence sont exactement ceux que l'on trouve sur la séquence de la protéine COBF à partir de la deuxième méthionine (acide aminé n- 6) de cette séquence (figure 16). Dans ce cas la méthionine aminoterminale n'est pas excisée ce qui confirme les règles déjà énoncées (Hirel et al., 1989). Il y a chez la souche SC510 Rifr portant le plasmide pal1546, deux initiations de traduction, d'une part celle correspondant au codon méthionine positionné à la bonne distance, sur notre construction, de la séquence de Shine et Delgarno et d'autre part celle qui se fait au deuxième codon méthionine se trouvant sur la séquence du gène cobF présenté à la figure 16. De cela, il ressort que probablement la protéine COBF commence non pas à la méthionine indiquée sur la figure 16 mais à celle se trouvant 5 acides aminés plus loin. De toute manière, ce résultat montre qu'il s'agit bien de la protéine COBF qui est exprimée et que celle-ci est exprimée avec une forme allongée de 4 acides aminés. Lors de la purification les deux formes protéiques sont purifiées. Dans cet exemple, nous appellerons protéine COBF purifiée le mélange de ces deux protéines purifiées. La protéine COBA de Pseudomonas denitrificans est purifiée comme cela est décrit précédemment (Blanche et al., 1989). 2. Fixation du SAM La fixation du SAM sur ces deux protéines est étudiée comme cela est décrit précédemment à l'exemple 6.6 a). La sérum albumine bovine et la protéine COBH purifiée sont utilisées comme contrôles négatifs. Pour les protéines COBA et COBF on observe un pic de radioactivité à la sortie de la colonne de TSK-125 au temps de sortie de ces protéines (figure 20). Dans ce test, la protéine COBI présente la même propriété de fixation du SAM. A l'opposé, il nty a pas de tels pics de radioactivité avec la BSA et la protéine COBH. Ce test met en évidence la fixation in vitro du SAM sur les protéines COBA, COBI et COBF. Ces résultats montrent que COBA, COBI et COBF sont des SAM-méthyltransférases.Ce résultat est tout à fait en accord avec les activités de COBA et COBI puisqu'il s'agit respectivement de la SUMT et de la SP2MT de Pseudomonas denitrificans. La protéine COBF est donc probablement une SAM méthyltransférase de la voie de biosynthèse des cobalamines. Ce test confirme que COBF est une méthyltransférase. 6.4 - Déteriinatioa de l'activité de protéines COB par études d' homologies de séquences Cet exemple illustre comment par des comparaisons entre les séquences de diverses protéines COB de Pseudomonas denitrificans il est possible de trouver les protéines COB qui sont des SAM-méthyltransférases de la voie de biosynthèse des cobalamines. Les protéines COBI et COBA sont toutes les deux des SAM méthyltransférases de la voie de biosynthèse. Ces deux protéines ont été comparées suivant le programme de Kanehisa, 1984. Cette comparaison fait ressortir trois régions de forte homologie (figure 21). Dans chacune de ces régions il y a plus de 45 % d'homologie stricte entre les deux protéines. Trois régions de forte homologie entre COBA et CYSG sont également présentées (figure 22); ce sont les mêmes régions de COBA qui présentent une forte homologie avec COBI. Ces régions de fortes homologies entre COBA, CYSG et COBI présentent de l'homologie avec d'autres protéines COB. Il s'agit des protéines COBF, COBJ, COBL et COBM (figure 23). En ce qui concerne la région 1, les protéines COBF, COBL et COBM présentent des homologies significatives par rapport à toutes les protéines de Genpro, qui est une extraction protéique de Genbank (version 59) augmentée des parties codantes putatives supérieures à 200 acides aminés, suivant le programme de Kanehisa (1984). En ce qui concerne la région 2, les protéines COBJ, COBL et COBM présentent des homologies significatives par rapport à toutes les protéines de Genpro (version 59). En ce qui concerne la troisième région d'homologie, COBJ, COBL et COBM présentent des homologies significatives par rapport à toutes les protéines de Genpro (version 59). Les comparaisons de séquences permettent donc de mettre en évidence que quatre protéines COBF, COBJ, COBL et COBM présentent des homologies significatives avec les régions conservées des séquences de trois types de méthyltransférases COBA, COBI et COBF. Les protéines COBG, COBH et COBK ne présentent pas d'homologies significatives avec les régions conservées des méthylases. La protéine COBF ne présente d'homologie significative avec les autres protéines que dans la région 1. Ces homologies doivent correspondre probablement au fait que toutes ces protéines sont des méthyltransférases. Ce résultat recoupe les données biochimiques décrites sur COBF concernant la capacité qu'a cette protéine à lier le SAM in vitro (exemple 6.3).Ces homologies, d'une part, permettent de confirmer que COBF est une SAM méthyltransférase de la voie de biosynthèse des cobalamines et d'autre part mettent en évidence que COBJ, COBL et COBM pourraient être des SAM méthyltransférases de la voie de biosynthèse des cobalamines. Ces resultats montrent egalement l'homologie qui existe entre les protéines COB de P.denitrificans et les protéines isofonctionnelles d'autres microorganismes. EXEMPLE 7 - Expression de protéines COB 7.1 - Expression chez Pseudomonas denitrificans Cet exemple illustre que l'amplification d'un gène de structure d'une protéine COB de Pseudomonas denitrificans chez Pseudomonas denitrificans conduit à l'amplification de l'activité de la protéine COB. 1 - Expression de la Protéine COBA Le plasmide pXL557 correspond plasmide pXL59 dans lequel le fragment BqlII-EcoRV (respectivement aux positions 80 et 2394 sur la sequence de la figure 15) de 2,4 kb du fragment de 5,4 kb a été cloné (figure 11 > . Ce fragment contient les gènes cobA et cobE. Le plasmide pXL545 contient uniquement le gène cobE. Sa construction a été décrite dans l'exemple 4.1. Ces deux plasmides ont été introduits par transfert conjugatif chez SC510 Rifr. Les souches SC510 Rif r, SC510 Rifr pXL59, SC510 Rif r pXL557 et SC510 Rif r pXL545 ont été cultivées en milieu PS4. A 4 jours, les cultures ont été arrêtées et les activités SUMT ont été dosées suivant un protocole standard déjà décrit (F. Blanche et al., 1989). Les activités sont portées ci-dessous. Tableau : Activité SUNT de BC510 Rif r et de quelques unes de ses dérivées SUMT dosée Souche nmole/h/mg de protéines SC510 Rifr 0.05 SC510 Rifr pXL59 0.04 SC510 Rifr pXL557 2.10 SC510 Rifr pXL545 0.05 Il ressort clairement de ces résultats que seul le plasmide pXL557 entraîne chez SC510 Rif r une nette augmentation de l'activité SUMT (un facteur 50).Cette augementation résulte de l'amplification de cobA et non de cobE puisque le plasmide pXL545, qui ne permet que l'amplification de cobE, ne provoque pas d'augmentation d'activité SUMT. Ce résultat confirme que cobA est le gène de structure de la SUMT de Pseudomonas denitrificans. Ce résultat montre que l'on peut obtenir une amplification de l'activité SUMT chez Pseudomonas denitrificans par amplification du gène de structure de la SUMT de Pseudomonas denitrificans. 2 - ExPression de la Protéine COBI Un fragment provenant du fragment d'ADN de 8,7 kb, contenant le gène de structure de la SP2MT (cobI), est cloné sur un plasmide à large spectre d'hôte chez les bactéries gram-négatives, puis ce plasmide est ensuite introduit par conjugaison chez Pseudomonas denitrificans SC510 Rif r L'activité S-adénosyl-L-méthionine:précorrine-2 méthyltransférase de la souche est ensuite mesurée par rapport à celle de la souche portant le vecteur. Le fragment BamHI-BamHI-SstI-SstI de 1,9 kb contenant les gènes cobH et cobI est purifié à partir du fragment de 8,7 kb. Des "linkers" XbaI et EcoRI sont placés respectivement aux extrémités BamHI et SstI après que celles-ci aient été remplies avec l'ADN polymérase du bactériophage T4. Le fragment est ensuite inséré entre les sites XbaI et EcoRI du plasmide à large spectre d'hôte pXL59. Il porte la résistance à la kanamycine. Le plasmide ainsi obtenu est nommé le pXL1148 (figure 24). Par ailleurs un plasmide voisin a été construit : le fragment BamHI-BamHI-SstI de 1,5 kb contenant seulement le gène cobH en entier et la partie 5 du gène cobI a été purifié à partir du fragment de 8,7 kb. Des "linkers" XbaI et EcoRI ont été ajoutés aux sites BamHI et SstI respectivement après que ceux-ci aient été remplis ou digérés avec l'ADN polymérase du phage T4. Ce fragment a ensuite été inséré entre les sites EcoRI et XbaI du pXL59 pour donner le plasmide pXL1149. Les plasmides pXL1148 et pXL1149 ne diffèrent que par la présence sur pXL1148 du fragment SstI-SstI de 0,3 kb qui contient l'extrémité 3' du gène cobI. pXL1148 possède le gène de structure entier de cobI au contraire de pXL1149.Les deux plasmides contiennent le gène cobH. Ces deux plasmides ont été introduits par conjugaison chez SC510 Rifr. Les souches SC510 Rifr, SC510 Rifr pXL59, SC510 Rifr pXL1148 et SC510 Rif r pXL1149 sont cultivées en milieu PS4. Après 4 jours de culture, les cellules sont récoltées et les activités SP2MT sont dosées comme cela est décrit dans l'exemple 6.1.3 a). Le résultat de ces dosages est porté ci-dessous avec les activités de SP2MT définies comme à l'exemple 6.1.3 a). Tableau : Activités SP2MT de diverses souches dérivées de Pseudomonas denitrificans Souche Activité SP2MT en % SC510 Rifr 5 SC510 Rifr pXL59 5 SC510 Rifr pXLll48 75 SC510 Rifr pXLli49 5 Ipour 500 pg d'extrait brut introduit dans le test. L'activité est exprimée en % comme cela est défini à l'exemple 6.1.3 a). Seul le plasmide pXL1148 apporte une augmentation sensible de l'activité SP2MT. Au contraire le plasmide pXL1149 ne donne pas de résultats différents de ceux observés avec les contrôles SC510 Rifr et SC510 Rif r pXL59.Le pXL1148 est le seul plasmide à contenir le gène cobI et il est le seul à amplifier l'activité SP2MT; ce résultat confirme que le gène de structure de la SP2MT de Pseudomonas denitrificans est le gène cobl. De plus, si les protéines totales de ces différentes souches sont séparées par électrophorèse en conditions dénaturantes (PAGE-SDS à 10 % d'acrylamide) on observe spécifiquement dans le cas du pXL1148 la présence d'une bande qui correspond à une protéine ayant un poids moléculaire de 25 000 (figure 25). Le poids moléculaire de cette protéine correspond à celui de la protéine COBI. Le plasmide pXL1148 permet d'obtenir chez Pseudomonas denitrificans la surproduction de la protéine COBI. 3 - ExPression de COBF L'expression est obtenue en positionnant en amont du gène cobF le promoteur PApt de E.coli et le site de fixation des ribosomes du gène cII du bactériophage lambda. L'expression ainsi obtenue est beaucoup plus élevée que celle observée par simple amplification génique grâce au même plasmide multicopie. Le fragment EcoRI-BamHI-BamHI de 2 kb du pXL1496 (exemple 7.2.1 infra) est purifié (figure 26). Ce fragment contient le promoteur PtrP de E.coli et le site de fixation des ribosomes du gène cII du bactériophage lambda en amont du gène cobF. En aval du gène cobF se trouve le terminateur de l'opéron rrnB de E.coli. Ce fragment est cloné aux sites EcoRI-BamHI du plasmide pKT230 pour donner le pXL1546 (figure 26). Le pKT230 est un plasmide du groupe d'incompatibilité Q qui se réplique chez presque toutes les bactéries gram-négatives (Bagdasarian et al., 1981); ce plasmide porte la résistance à la kanamycine.Le plasmide pXL1546 et pKT230 sont introduits, par conjugaison, chez SC510 Rif r Les souches SC510 Rif r, SC510 Rif r pKT230 et SC510 Rif r pXL1546 sont cultivées en milieu PS4 comme cela est décrit précédemment. Après quatre jours de culture, les protéines totales des différentes souches sont analysées en PAGE-SDS à 10 %. Comme cela est montré à la figure 27, on observe dans l'extrait de SC510 Rifr pXL1546 une protéine d'un poids moléculaire de 32 000 qui est surexprimée; cette protéine co-migre avec la protéine qui est surexprimée par E.coli B pXL1496 (exemple 7.2.1 infra).De plus cette protéine est spécifiquement exprimée dans la souche SC510 Rif r contenant le pXL1546 où elle représente au moins 20 % des protéines totales. Par contre on n'observe pas cette protéine dans les protéines totales des souches SC510 Rif r et SC510 Rif r pKT230. Cette protéine surexprimée est donc la protéine COBF. 4 - ExPression de COBH Cet exemple décrit l'amplification d'un fragment d'ADN de Pseudomoas denitrificans contenant le gène cobH. La protéine qui est codée par ce gène est purifiée; il s'agit de la protéine COBH autrement appelée protéine porteuse de l'acide hydrogénobyrinique. Le plasmide pXL1149, décrit à l'exemple 7.1.2, ne contient sur l'insert d'ADN provenant du fragment de 8,7 kb que le gène cobH en entier. Chez SC510 Rif r, ce plasmide, contrairement au vecteur, entraîne la surexpression d'une protéine de poids moléculaire 22 000 (figure 25). 7.2 - Expression chez E.coli Cet exemple illustre comment une protéine COB de Pseudomonas denitrificans peut être surproduite chez E.coli. La surproduction est obtenue en positionnant en amont du gène cob le promoteur PtrP de E.coli et le site de fixation des ribosomes du gène cII du bactériophage lambda. Cet exemple montre que des protéines COB de Pseudomonas denitrificans peuvent être surexprimées chez E.coli. 1 - ExPression de COBF Le fragment EcoRI-XhoI de 2250 pb du fragment EcoRI de 8,7 kb (aux positions respectives 0 et 2250 sur la sequence présentée à la figure 8) a été cloné dans le phage M13mp19 (Norrander et al., 1983) entre les sites EcoRI et SalI. Le plasmide ainsi construit est nommé pXL1405. Un site NdeI a été introduit par mutagénèse dirigée de manière à ce que les trois dernières bases (ATG) de ce site de restriction constituent le site d'initiation de traduction du gène cobF. Cela revient à modifier les trois bases qui précèdent l'ATG du gène cobF GAA (le G est à la position 733 sur la séquence présentée sur la figure 8) en CAT.Le fragment N I-SPhI-SPhI (figure 26) contenant le gène cobF est ensuite purifié; ce fragment de 1,5 kb est ensuite cloné entre les sites NdeI-SphI du plasmide pXL694 (Denèfle et al., 1987). Le plasmide ainsi construit est nommé pXL1496 (figure 26). Sur le fragment EcoRI-NdeI de 120 pb (qui provient du pXL694) qui précède le gène cobF sont présents des signaux de régulation de l'expression génétique de E.coli. Ces signaux sont constitués par la région [-40+1] du promoteur PtrP de E.coli, puis par 73 pb qui contiennent le site de fixation des ribosomes du gène cII du bactériophage X (Denèfle et al., 1987). En aval du gène cobF se trouvent les terminateurs de l'opéron rrnB de E.coli (sur le fragment HindIII-BamHI). Le plasmide pXL1496 a été introduit par transformation dans la souche de E.coli (Monod et Wollman, 1947).L'expression du gène cobF a été étudiée comme cela est déjà décrit (Denèfle et al., 1987) dans des conditions où le promoteur PtrP est soit réprimé (présence de tryptophane), soit non réprimé (absence de tryptophane). Le milieu où l'expression a été réalisée est du milieu minimum M9 (Miller, 1972) supplémenté par 0,4 % de glucose, 0,4 % de casaminoacides, 10 mM thiamine et 40 pg/ml de tryptophane dans le cas où l'on veut réprimer le promoteur PtrP. La souche E.coli B pXL1496 a été cultivée à 37 C dans le milieu décrit ci-dessus avec 100 iig d'ampicilline. Comme il est montré sur la figure 43, l'absence de tryptophane entraîne l'expression d'une protéine d'un poids moléculaire de 32 000. En effet dans l'extrait de protéines totales de E.coli B pXL1496 analysé en PAGE-SDS (figure 28) on observe clairement une protéine d'un poids moléculaire de 32 000 D qui représente entre 1 et 4 % des protéines totales.Cette protéine est présente en quantités nettement moins importantes dans l'extrait des protéines totales de E.coli B pXL1496 cultivée dans les mêmes conditions, mais en présence de tryptophane. Le poids moléculaire de la protéine qui est exprimée dans ces conditions est proche du poids moléculaire de la protéine COBF déduit de la séquence en acides aminés de la protéine qui est 28 927 (figure 16). La protéine qui est ainsi exprimée chez E.coli est la protéine COBF. EXEMPLE 8 - Amplification de la production de cobalamines par les techniques d'ADN recombinant 8.1 - Amplification chez P.denitrificans Cet exemple illustre comment une amélioration de la production de cobalamines est obtenue chez Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr par amplification de gènes cob de Pseudomonas denitrificans SC510. a) Amélioration de la production de cobalamines chez Pseudomonas denitrificans par levée d'une étape limitante dans la biosynthèse des cobalamines Cet exemple illustre comment la productivité en cobalamines de souches de Pseudomonas denitrificans peut être améliorée par amplification de gènes cob de Pseudomonas denitrificans. Cette amélioration résulte de la levée d'une étape limitante de la voie de biosynthèse. Le plasmide pXL367 est décrit à l'exemple 4.2 (figure 13). Ce plasmide correspond au pRK290 (Ditta et al., 1981) dans lequel le fragment EcoRI de 8,7 kb a été inséré. Ce plasmide pXL367 procure une amélioration de la biosynthèse de cobalamines chez la souche SC510 Rifr. Les souches SC510 Rifr, SC510 Rifr pRK290 et SC510 Rifr pXL367 sont cultivées en erlenmeyer dans du milieu PS4 suivant les conditions décrites dans les protocoles expérimentaux. On observe une amélioration du titre de production due à la présence du plasmide pXL367. En effet la souche SC510 Rif r pXL367 produit 30 % de plus de cobalamines que les souches SC510 Rif r et SC510 Rif r pRK290. Cette amélioration n'est pas due à l'amplification de n'importe quels gènes de Pseudomonas denitrificans mais à l'amplification spécifique de gènes portés par le fragment EcoRI de 8,7 kb. En effet le plasmide pXL723 décrit sur la figure 11 ne donne aucune amélioration et le même titre de production est observé avec ce plasmide qu'avec les souches SC510 Rif r et SC510 Rifr pRK290. b) Amélioration de la production de coenzyme B12 chez Pseudomonas denitrificans par levée de deux étapes limitantes dans la biosynthèse des cobalamines Cet exemple illustre comment la productivité en cobalamines de souches de Pseudomonas denitrificans peut être améliorée par amplification de gènes cob de Pseudomonas denitrificans. Cette amélioration résulte de la levée de deux étapes limitantes de la voie de biosynthèse. Le fragment ClaI-EcoRV de 2,4 kb issu du fragment de 5,4 kb (contenant les gènes cobA et cobE) est cocloné avec le fragment EcoRI de 8,7 kb sur le plasmide à large spectre d'hôte pXL203. Le plasmide ainsi construit est appelé pXL525 (figure 29). Ce plasmide est introduit chez SC510 Rif r par conjugaison. La souche SC510 Rif r pXL525 produit 20 % de cobalamines de plus que SC510 Rif r pXL367. L'amplification des gènes cobA et cobE permet de lever une nouvelle étape limitante chez SC510 Rif r dans la biosynthèse des cobalamines. La souche SC510 Rif r de Pseudomonas denitrificans est améliorée dans le présent exemple par la levée successive de deux étapes limitantes. Cet exemple montre que la levée de deux étapes limitantes dans la biosynthèse des cobalamines peut conduire à des améliorations supplémentaires de production. 8.2 - Amélioration de la productivité de cobalamines chez Aqrobacterium tumefaciens Cet exemple illustre l'amélioration de la production de cobalamines d'une souche productrice de cobalamines par l'amplification de gènes cob de Pseudomonas denitrificans SC510. La souche utilisée est une souche de bactérie gram-négative ; il s'agit d'une souche dAqrobacterium tumefaciens. Les plasmides décrits dans les exemples 4.2 et 9.1, pXL367 et pXL525 ainsi que le vecteur pRK290 (Ditta et al., 1981) et le plasmide pXL368 (figure 29), sont introduits par transfert conjugatif chez la souche d'Actrobacterium tumefaciens C58-C9 Rif r (Cameron et al., 1989). Les souches C58-C9 Rifr, C58-C9 Rifr pRK290, C58-C9 Rifr pXL367, C58-C9 Rif r pXL368 et C58-C9 Rif r pXL525 sont cultivées en milieu PS4 à 30*C comme cela est décrit précédemment. Les cobalamines produites sont dosées comme cela est décrit précédemment. Les titres de productions sont portés sur le tableau ci-dessous. Tableau : Titres de vitamine B12 produite par différentes souches d' Aorobacterium tumefaciens recombinantes. Souche Vitamine B12 en mg/l C58-C9 Rifr 0.4 C58-C9 Rifr pRK290 0.4 C58-C9 Rifr pXL367 0.8 C58-C9 Rifr pXL368 0.8 C58-C9 Rifr pXL525 1.2 Comme il apparaît clairement sur le tableau ci-dessus, la production de cobalamines est améliorée chez la souche d'Acrrobacterium tumefaciens utilisée. Deux plasmides différents améliorent la production de cobalamines de la souche d'Acrobacterium tumefaciens utilisée: pXL367 et pXL368. Ces plasmides contiennent respectivement le fragment écoRI de 8,7 kb (gènes cobF à cobM) et le fragment ClaI-EcoRV de 2,4 kb (gène cobE et cobA).Séparément, ils améliorent la production de cobalamines d'Agrobacterium tumefaciens C58-C9 Rif r d'un facteur 2; ce résultat montre qu'il est possible d'améliorer la production de cobalamines d'une souche d'Actrobacterium tumefaciens en amplifiant des fragments portant des gènes cob de Pseudomonas denitrificans. Dans le cas présent on peut parler d'amélioration hétérologue, c'est-à-dire d'amélioration de la production de cobalamines d'une souche moyennant l'amplification de gènes cob d'une autre souche. Les améliorations de production de cobalamines apportées par les différents fragments de Pseudomonas denitrificans contenant des gènes cob sont cumulables, ctest-à-dire qu'en mettant sur le même plasmide les deux fragments qui sont séparément clonés sur le pXL367 et le pXL368, on observe des améliorations additives en ce sens que le plasmide pXL525 apporte chez Aorobacterium tumefaciens C58-C9 Rifr une amélioration de production supérieure à celle apportée par chacun des fragments clonés séparément sur le même vecteur. 8.3 - Amélioration de la productivité de cobalamines chez Rhizobium meliloti Cet exemple décrit l'amélioration de la production de cobalamines d'une autre souche productrice de cobalamines. Le plasmide décrit à l'exemple 9.2, pXL368, ainsi que le vecteur pRK290 (Ditta et al., 1981) sont introduits par transfert conjugatif chez la souche Rhizobium meliloti 102F34 Rif r (Leong et al., 1982). Les transconjugants: 102F34 Rif r, 102F34 Rifr pRK290 et 102F34 Rif r pXL368 sont cultivés en milieu PS4 à 30 C comme cela est décrit précédemment. Les cobalamines produites sont dosées comme cela est décrit précédemment. Les titres de productions sont portés sur le tableau ci-dessous. Tableau : Titres des cobalamines produites par différentes souches de Rhizobium meliloti recombinantes Souche Vitamine B12 en mg/l 102F34 Rifr 0.4 102F34 Rifr pRK290 0.4 102F34 Rifr pXL368 0.8 Comme il apparaît clairement sur le tableau ci-dessus, la production de cobalamines est améliorée chez la souche de Rhizobium meliloti utilisée. Le plasmide pXL368 améliore la production de cobalamines de la souche de Rhizobium meliloti utilisée. Ce plasmide contient le fragment ClaI-EcoRV de 2,4 kb (gènes cobA et cobE); il améliore la production de cobalamines de Rhizobium meliloti 102F34 Rifr d'un facteur 2.Ce résultat montre qu'il est possible d'améliorer la production de cobalamines d'une souche de Rhizobium meliloti en amplifiant des fragments portant des gènes cob de Pseudomonas denitrificans. Dans le cas présent on peut parler d'amélioration hétérologue, c'est-à-dire d'amélioration de la production de cobalamines d'une souche moyennant l'amplification de gènes cob d'une autre souche. EXEMPLE 9 - Dosage des corrinoides et des descobaltocorrinoïdes dans les moûts et les cellules de souches productrices de corrinoïdes Cet exemple illustre comment il est possible d'identifier et de doser les différents corrinoïdes et descobaltocorrinoïdes produits par différentes souches productrices de cobalamines. Ce dosage permet entre autre de doser le coenzyme Bols, Les moûts (ou les cellules seules) sont cyanurés comme cela a déjà été décrit (Renz, 1971). Après centrifugation, une aliquote du surnageant est passée à travers une colonne de DEAE-Sephadex qui est ensuite lavée avec un tampon phosphate 0,1 M. Les fractions recueillies sont regroupées et dessalées sur une cartouche Sep-Pàk C-18 (Waters). Après évaporation et resuspension dans l'eau (100 ijl à 1 ml suivant la quantité de corrinoïdes présents), les corrinoïdes sont identifiés et dosés par CLHP sur une colonne de Nucléosil C-18 (Macherey-Nagel). La colonne est éluée à 1 ml/mn avec un gradient d'acétonitrile (de 0 % à 100 %) dans du tampon phosphate de potassium 0,1 M contenant 10 mM de KCN. Les corrinoides sont visualisés en détection U.V. à 371 nm et/ou par la détection spécifique du 57Co (si la culture a été effectuée en présence de 57CoC12) à l'aide d'un détecteur Berthold LB 505. Ils sont donc identifiés et par comparaison de leur temps de rétention avec des étalons. De même, les "métalfree-corrinoïdes't (acide hydrogénobyrinique, acide hydrogénobyrinique monoamide et acide hydrogénobyrinique diamide) sont visualisés en détection U.V. à 330 nm.Par cette technique les intermédiaires suivants sont sépares: l'acide cobyrinique, l'acide cobyrinique monoamide, l'acide cobyrinique diamide, l'acide cobyrinique triamide, l'acide cobyrinique tétraamide, l'acide cobyrinique pentaamide, l'acide cobyrique, le cobinamide, le cobinamide phosphate, le GDP-cobinamide, la B12-phosphate et la vitamine B12. Les formes adénosylées de ces produits sont aussi séparées et dosées par cette technique. Pour ce faire, l'étape initiale de cyanuration est supprimée et la colonne CLHP est éluée avec du tampon dépourvu de KCN. Nous donnons à la figure 31 les temps de rétention de différents étalons séparés par ce système et identifié à la sortie de la colonne par absorbance U.V. Un échantillon de la souche SC510 Rif R a été déposé le 30 janvier 1990 au Centraal Bureau voor Schimmelcultures à Baarn (Pays-Bas) où il a été enregistré sous la référence CBS 103.90. Références bibliographiques. Ausubel F. M., Brent R., Kinston R. E., Moore D. D.,Smith J. A., Seidman J. G. and K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York. Bagdasarian, M., R. Lurz, B. Rückert, F. C. Franklin, M. M. Bagdasarian, J. Frey, and K. Timmis. 1981. Specific-purpose plasmide cloning vectors. Il. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene 16:237-247. Barrère G, Geneste B., Sabatier A., 1981. Fabrication de la vitamine B12: l'amélioration d'un procédé. Pour la Science, 49, 56-64. Battersby A. R., Fookes C. J. R., Matcham G. W. J., MacDonald E., 1980. Biosynthesis of the pigments of life: formation of the macrocycle. Nature, 285, 17-21. Battersby, A. R., and E. 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Séquence d'ADN selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les gènes cobA, cobB, cobC, cobD, cobE, cobF, cobG, cobH, cobI, cobJ, cobK, cobt, cobM présentés aux figures 15 et 16, les homologues de ces séquences résultant de la dégénérescence du code génétique, les séquences d'origine naturelle, synthétique ou recombinante, qui hybrident et/ou qui présentent des homologies significatives avec ces séquences d'ADN ou avec des fragments de celles-ci, et qui codent pour des polypeptides impliqués dans la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides. 3. Gène contenant une séquence d'ADN selon lune des revendications précédentes. 4. ADN recombinant caractérisé en ce qu'il contient au moins une séquence d'ADN selon lune des revendications I à 3. 5. ADN recombinant selon la revendication 4 caractérisé en ce que lesdites séquences d'ADN sont placées sous le contrôle de signaux d' expression. 6. ADN recombinant selon la revendication 5 caractérisé en ce que les signaux d'expression peuvent être homologues ou hétérologues de la séquence d'ADN. 7. ADN recombinant selon l'une des revendications 4 à 6 caractérisé en ce qu'il fait partie d'un plasmide d'expression. 8. Plasmide caractérisé en ce qu'il contient au moins une séquence d'ADN codant pour un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides, et des séquences permettant leur expression. 9. Plasmide selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il contient un ADN recombinant selon l'une des revendications 4 à 7, un système de réplication, au moins un marqueur de sélection. 10. Plasmide selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le plasmide pXL1500 contenant les gènes cobA, cobB, cobC, cobD, cobE, les plasmides pXL723 et pXL302 contenant les gènes cobC et cobD, le plasmide pXL1397 contenant les gènes cobB et cobC, les plasmides pXL368 et pXL557 contenant les gènes cobA et cobE, les plasmides pXL545 et pXL545 n contenant le gène cobE, les plasmides pXL367 et pXL253 contenant les gènes cobF, cobG, cobH, cobI, cobJ, cobK, cobL, cobM, le plasmide pXL1148 contenant les gènes cobH et cobI, le plasmide pXL1149 contenant le gène cobH, les plasmides pXL1496 et pXL1546 contenant le gène cobF, le plasmide pXL525 contenant les gènes cobA, cobE, cobF, cobG, cobH, cobI, cobJ, cobK, cobL, cobM. 11. Cellule dans laquelle a été introduite une séquence d'ADN selon l'une des revendications 1 à 7 ou un plasmide selon l'une des revendications 8 à 10. 12. Polypeptide caractérisé en ce qu'il est impliqué dans la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides. 13. Polypeptide selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence d'ADN selon lune des revendications 1 à 7. 14. Polypeptide selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il intervient dans la transformation du précorrine-3 en acide cobyrinique. 15. Polypeptide selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il contient tout ou partie des sequences peptidiques COBF, COBG, COBH, COBJ, COBK, COBL, et COBM présentées à la figure 16. 16. Polypeptide selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il catalyse le transfert d'un groupement méthyl aux positions C1, C5, C12, C15, ou C17 intervenant entre le précorrine-3 et l'acide cobyrinique. 17. Polypeptide selon la revendication 16 caractérisé en ce qu'il contient tout ou partie des séquences peptidiques COBF, COBJ, COBL et COBM présentées à la figure 16. 18. Polypeptide selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il intervient dans la transformation de l'acide cobyrique en cobinamide. 19. Polypeptide selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'il contient tout ou partie des séquences peptidiques COBC et COBD présentées à la figure 15. 20. Polypeptide selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il possède une activité S-adénosyl-L-méthionine:précorrine-2 méthyl transférase (SP2MT). 21. Polypeptide selon la revendication 20 caractérisé en ce qu'il contient tout ou partie de la séquence peptidique COBI présentée à la figure 16. 22. Polypeptide selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il possède une activité acide cobyrinique et/ou hydrogénobyrinique a,c-diamide synthase. 23. Polypeptide selon la revendication 22 caractérisé en ce qu'il contient tout ou partie de la séquence peptidique COBB présentée à la figure 15. 24. Polypeptide selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il possède la capacité de lier in vivo l'acide hydrogénobyrinique. 25. Polypeptide selon la revendication 24 caractérisé en ce qu'il contient tout ou partie de la séquence peptidique COBH présentée à la figure 16. 26. Polypeptide selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il contient tout ou partie de la séquence peptidique COBE présentée à la figure 15. 27. Polypeptide selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les protéines COBA, COBB, COBC, COBD, COBE, COBF, COBG, COBH, COBI, COBJ, COBK, COBL, COBM présentées aux figures 15 et 16. 28. Procédé de production des polypeptides selon les revendications 12 à 27 caractérisé en ce que on introduit dans une cellule hôte une séquence d'ADN selon les revendications 1 à 7, ou un plasmide selon les revendications 8 à 10 contenant une telle séquence, on cultive cette cellule recombinante dans des conditions d'expression de ladite séquence, et on récupère les polypeptides produits. 29. Procédé selon la revendication 28 caractérisé en ce que la cellule hôte peut être choisie parmi les procaryotes, les eucaryotes, les cellules animales ou végétales. 30. Procédé selon la revendication 29 caractérisé en ce que la cellule hôte est une archaebactérie ou une eubactérie. 31. Procédé selon la revendication 30 caractérisé en ce que la cellule hôte est E.coli, Pseudomonas denitrificans, Rhizobium melitoti, ou Asrobacterium tumefaciens. 32. Procédé permettant d'augmenter la production de cobalamines et/ou de cobamides caractérisé en ce que on introduit dans un microorganisme producteur de ces composés, ou potentiellement producteur de ces composés, une ou plusieurs séquences d'ADN codant pour un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides, on cultive le microorganisme ainsi obtenu dans des conditions de synthèse des cobalamines et/ou des cobamides et d'expression de ladite séquence, on récupère les cobalamines et/ou les cobamides produits. 33. Procédé selon la revendication 32 caractérisé en ce que l'on introduit dans le microorganisme une ou plusieurs séquences d'ADN selon lune des revendications 4 à 7, ou un plasmide selon les revendications 8 à 10 contenant de telles séquences. 34. Procédé selon la revendication 33 caractérisé en ce que la séquence d'ADN introduite dans le microorganisme code pour un polypeptide catalysant une étape limitante de la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides. 35. Procédé selon la revendication 33 caractérisé en ce que les séquences d'ADN introduites dans le microorganisme codent pour des polypeptides catalysant des étapes limitantes de la biosynthèse des cobalamines et/ou des cobamides. 36. Procédé selon lune des revendications 32 à 35 caractérisé en ce que le microorganisme est choisi parmi P. denitrificans, R. melitoti, A. tumefaciens. 37. Procédé selon la revendication 36 caractérisé en ce que le microorganisme est P. denitrificans. 38. Procédé selon la revendication 37 caractérisé en ce que le microorganisme est P. denitrificans SC510 RifR. 39. Procédé selon l'une des revendications 32 à 38 caractérisé en ce que l'on introduit dans le microorganisme un plasmide selon la revendication 10. 40. Procédé selon les revendications 32 à 39 caractérisé en ce que l'on introduit dans la souche P. denitrificans SC510 RifR le plasmide pXL525. 41. Procédé selon les revendications 32 à 40 caractérisé en ce que les cobalamines et/ou les cobamides produits sont récupérés par solubilisation, conversion en forme cyano, et purification. 42. Procédé selon les revendications 32 à 41 caractérisé en ce que la cobalamine est le coenzyme B12.