FR 2648321 A1 19901221 FR 8906669 A 19890512 ! PROCEDE DE TRAITEMENT D'UN PRODUIT ALIMENTAIRE NON LIQUIDE POUR ASSURER SA DECONTAMINATION MICROBIENNE, APPLICATIONS EN PARTICULIER AUX FROMAGES ET PREPARATION-MERE POUR LA MISE EN OEUVRE DUDIT TRAITEMENT L'invention concerne un procédé de traitement d'un produit alimentaire non liquide, par exemple fromages, viandes, poissons, produits végétaux... , en vue d'assurer sa décontamination microbienne en particulier vis-à- vis des bactéries du genre Listéria. Elle s'étend à des préparations permettant de mettre en oeuvre ledit procédé. On sait que les produits alimentaires sont fréquemment l'objet de contaminations microbiennes, provenant notamment des conditions dans lesquelles ils sont actuellement manipulés, transportés et conservés. Par exemple, on a pu démontrer que la généralisation du stockage à froid de ces produits (à des températures de l'ordre de 5 C) réduit le développement naturel de certains agents inhibiteurs qui s'opposaient à la prolifération microbienne. Ainsi, beaucoup de produits alimentaires sont porteurs de germes au moment de leur conditionnement quelles que soient les précautions prises. En particulier, les bactéries du genre Listéria ont récemment produit des intoxications graves, notamment par ingestion de fromages et de viandes contaminés. Actuellement, à l'exception de traitements thermiques drastiques, on ne sait pas éliminer ces bactéries des produits alimentaires par des moyens non dénaturants, compatibles avec la consommation ultérieure desdits produits; il est à noter à cet éqard que les opérations classiques de salaison des viandes ou des fromages préservent les produits de la plupart des microbes gênants, mais n'ont pas d'effet sensible sur le développement de certaines bactéries notamment bactéries du genre Listéria (et également Yersinia, Campylobacter). La présente invention se propose de fournir un procédé de traitement des produits alimentaires non liquides, notamment fromages, viandes, viandes transformées (pités...), poissons, végétaux frais... en vue de les décontaminer de façon très poussée vis-à-vis des microbes susceptibles de se développer sur ces produits, en particulier bactéries du genre Listéria, Yersinia, Campylobacter, groupe des entéro-bactéries, staphylocoques, pseudomonas..., et ce, en l'absence de toute dénaturation du produit sans aucun risque pour le consommateur. Un autre objectif est, dans le cas des fromages, de réaliser une décontamination qui préserve la flore typique de surface de ces fromages, par exemple la flore microbienne constitutive de la morge (bacterium linens) dans le cas des fromages à morge. Le procédé de traitement conforme à l'invention peut s'appliquer à tout produit alimentaire hydraté contenant au moins 20 % d'eau; il consiste à déposer sur la surface dudit produit hydraté une préparation dite système LP, comprenant un mélange d'enzyme lactopéroxydase, de thiocyanate et d'un donneur d'oxygène. Ce dépôt peut être effectué sous forme liquide par imprégnation de la surface du produit au moyen d'une phase aqueuse contenant le système LP (pulvérisation, immersion dans un bain...) ou à sec en saupoudrant la surface du produit au moyen d'une poudre contenant les composants du système LP. Dans le cas d'un produit alimentaire appelé à être conditionné au contact d'un emballage (fromages blancs...), le système LP peut être déposé sur l'emballage qui servira de vecteur lors du conditionnement. Les expérimentations de microbiologie effectuées en laboratoire, de même que les essais sur des échantillons de produits alimentaires ont montré que le système LP précité assurait une très efficace destruction des Listériss et de tous les germes pathogènes habituellement présents dans les produits alimentaires, et ce, en quelques heures ou en quelques jours selon les doses mises en oeuvre. Ce système LP déposé à la surface du produit alimentaire hydraté (fromage, viande...) emprunte l'eau dudit produit, d'abord au moment de la mise en contact (ce qui permet une mise en activité du système en cas de dépôt sous forme de poudre), puis au cours du temps de sorte que l'activité du système se prolonge sur de très longues périodes. La réaction enzymatique qui se produit à la surface du produit solide est surprenante en l'état actuel des connaissances enzymologiques, car il est bien connu que les seules réactions enzymatiques énergiques (c'est-à-dire bénéficiant d'une vitesse élevée) sont obtenues en milieu liquide aqueux, les réactions enzymatiques dans les matériaux solides étant toujours très lentes et peu efficaces. Il est ainsi très inattendu que le système LP qui est par ailleurs connu puisqu'il se développe naturellement dans le lait (avec la xanthine oxydase comme donneur d'oxygène) soit apte à décontaminer un produit alimentaire solide par un simple traitement de surface, et au surplus & détruire des bactéries aussi résistantes que les bactéries du genre Listéria. Le système LP est strictement non toxique et parfaitement compatible avec un usage alimentaire puisqu'il se trouve contenu dans certaines sécrétions des mammifères (salive, lait...). Le donneur d'oxygène du système peut être un péroxyde, les proportions préférentielles étant alors les suivantes, rapportées à 1 g d'enzyme lactopéroxydase: entre 1 et 4 g de thiocyanate et une quantité de péroxyde capable de libérer entre 0,4 et 2 g d'oxygène moléculaire. Le donneur d'oxygène peut aussi etre le système glucose-oxydase, les proportions préférentielles étant alors les suivantes, rapportées à 1 g d'enzyme lactopéroxydase: entre 1 et 4 g de thiocyanate et entre 0,050n et 0,100 g de glucose-oxydase. Les essais ont mis en évidence que l'efficacité du système LP est bonne en effectuant le dépôt en quantité telle que le poids d'enzymes lactopéroxydase soit au moins égal à 2.10-4 mg par cm2 de surface du produit alimentaire. En pratique pour limiter les coûts, on déposera le système LP de sorte que la quantité de lactopéroxydase soit comprise entre 2.10-4 et 35.10-4 mg par cm2 de produit alimentaire. Dans le cas d'un dépôt sous forme liquide, le système LP peut éventuellement être préalablement mélangé à d'autres agents, notamment: sel tampon régulateur de pH, (citrate, phosphate, acétate...) ou sel d'ionisation (NaCl, KC1,... ) qui permettent d'obtenir une phase aqueuse présentant les conditions optimales de stabilité du système LP (pH autour A de 5,5, pouvoir ionique correspondant à 10 g de NaCl par 1.); agent mouillant (sucre-ester) pour améliorer le contact de la phase aqueuse avec la surface du produit alimentaire et obtenir une bonne homogénéité du traitement; agent fixateur filmogène (méthylcellulose, carboxy-méthylcellulose, acétate ou propionate de polyvinyle...) en vue de mieux fixer le système LP sur la surface du produit alimentaire. Il est également possible d'associer au système LP des composés actifs, notamment lactoferrine LF ou lysozyme qui apporte une activité antimicrobienne complémentaire et réalise un effet de synergie avec le système LP dans la destruction des bactéries, en particulier des bactéries du genre Listéria comme l'ont montré les études de microbiologies. Egalement un ou des agents fongicides, en particulier natamycine, acide sorbique et ses sels peuvent être ajoutés au système pour lui conférer un effet fongicide. L'invention s'étend à des applications particulières des procédés susdéfinis, en particulier pour décontaminer les fromages vis-à-vis des bactéries du genre Listéria. De préférence, le système LP à déposer sur la surface du fromage est mis en solution et/ou en suspension dans une phase aqueuse en concentration telle que le poids de lactopéroxydase par litre d'eau soit compris entre 10 et 500 mg. Dans le cas d'un fromage soumis au cours de sa fabrication à une opération de salage précédant une période de maturation, le traitement de surface au moyen du système LP est effectué au moins une fois au cours de la période de maturation. Lorsqu'il s'agit d'un fromaqe à période de maturation longue supérieure à 30 jours, l'on applique de préférence un premier traitement de surface dans un délai compris entre 10 et 20 jours après salage, et au moins un autre traitement avant emballage. L'invention s'applique très favorablement pour traiter des fromages, dits fromages à morge, comprenant une pâte molle ou une pâte pressée, à flore microbienne de surface. Les essais ont montré que la flore microbienne de ces fromages n'était pas sensiblement affectée par le traitement, de sorte que les caractéristiques du fromage ne sont pas modifiées. Le procédé peut s'appliquer à tout autre produit alimental:e hydraté pour lequel un problème de contamination notamment par les bactéries du genre Listéria peut se poser, en particulier: viandes (pièces de viandes, carcasses, viandes hachées...) ou de charcuterie, poissons (filets de poissons, poissons entiers), crustacés, végétaux après récolte. L'invention s'étend à une préparation-mère destinée à la fabrication du système LP sus-visé préalablement à la mise en oeuvre du procédé de traitement. Cette préparation-mère comprend essentiellement un mélange d'enzyme lactopéroxydase, de thiocyanate notamment thiocyanate de potassium, et un donneur d'oxygène, avec l.e cas échéant des additifs: lactoferrine LP, composés fongicides, sels tampons, sels d'ionisation, agents mouillants, agents fixateurs.. La lactopéroxydase est actuellement extraite du lait ou du lactosérum par des procédés traditionnels de chromatographie. Le thiocyanate est un composé disponible sur le marché; le thiocyanate de potassium est choisi de préférence en raison de sa solubilité et de son faible coût. Le donneur d'oxygène peut être un péroxyde d'hydrogène, de magnésium, ou un perborate, qui sont des composés courants disponibles sur le marché. Il peut également être un système enzymatique: glucose-oxydase, qui est disponible dans le commerce et peut être utilisé après purification de l'enzyme par chromatographie. La préparation-mère sus-visée se présente sous la forme d'une poudre ou d'un liquide concentré, qui est utilisé après dilution soit dans un autre agent pulvérulent (poudre) soit dans une phase aqueuse (liquide concentré). De préférence, le donneur d'oxygène de cette préparation-mère est isolé des autres constituants afin d'éviter une réaction prématurée, les constituants n'étant mis en contact que peu de temps avant l'opération de traitement de surface. L'isolement peut s'effectuer très simplement par conditionnement séparé des produits (sachets séparés pour la poudre, compartiments séparés dans le cas du liquide). Dans le cas de la poudre, il est également possible d'isoler le donneur d'oxygène par le procédé décrit dans la demande de brevet français n 2.600.250, la mise en contact des composants s'effectuant par hydrosolubilisation. Dans le cas d'une préparation-mère liquide, celle-ci peut aussi être mise en solution dans un polyalcool anhydre, notamment du glygérol, qui bloque la réaction enzymatique, celle-ci étant libérée par mise en solution aqueuse. La description qui suit fournit un résumé des études microbiologiques effectuées ainsi que des exemples d'expérimentation dans le cas de fromages. 1/ Etudes microbioloqinues Ces études ont eu pour objet de vérifier et de quantifier les activités bactéricides, in vitro, de deux systèmes LP (LP1, LP2) fabriqués extemporanément à partir d'une poudre lyophilisée de lactopéroxydase mise en solution aqueuse à des doses variables avec les autres constituants. Composition LP1 - lactopéroxydase: doses en mg/l: 0,5 ou 1, ou 5, ou 10, thiocyanate de potassium: 25 mg/l, - glucose-oxydase: i mg/l. Composition LP2 - lactopéroxydase: doses en mg/l: 5 ou 1 ou 0,5, thiocyanate de potassium: 25 mg/l, - glucose-oxydase: 1 mg/l, - lactoferrine: 50 mg/1. Ces systèmes ont été mis au contact de suspensions microbiennes à raison de 5.105 à 7.106 micro- *sJaT;Tel slTnpoid xnap ap la 'lelppA^ a6eîTsua un,p aTljed q SpsTiepJ suawalosT,p lueuaAoJd çZ sa;uawTidxa,l, quo saquajpjjip saqonos sToJl 'eiTigsTI el inod aTdwaxa Jd -nealqe% al suep aplod Isa auuaAow el la sau bowoq pip quo slelinsga sal saluaJpUJTp suOTloalloo ap lueuaAoJd (g la Z aiqua) sa4enos sinaTsnTd pluawTadxa e uo 'SaTjIleq ap allTwej anbe4o. nod oZ () ( ++++++ + ++++ ++++ ++: 0: oTJqT^) (.......+..:: :.... .....:-q) (à) (++ ++: +: ++++: +: 0:s TIuowopnaD) (.: ) ++++ ++ +++++: +: 0: eiauowes) (à à..:à...:: ..:à..::) ::::: : -oDoo+daJS) (+++ ++:: ++++:++++:+: 0: snooooo) (:::: ::: -4de4s) (àsà: ---- -- -à - - ( +++:+:: ++++: ++: 0:: a) ( s s:-DeqoIXdwe3) OT ( às s -----sà):- --- ---- (++ ++ ++ 0 ++++:+++ ++: 0 etuTsaA) ( às s ----sà-- -- -- -- (. .. :) ( () (T) (o) (01): (ç) (T): ('O):auuaeTalDeq) ( Zdl: d Zdl Tdld:Id Idl Idl: Idl: a Wej) (:: ) sa4onos sa;uajpjjTp sael Da^B snualqo sleslnspi sal awnsfl snossap-TD nealqel al 'uaTaloeq quawa.qwoupp un,p aTiATs '3 oLú ap ainqeuadwal aun sainaq i ?Jnp e uoTieqnouT,l 'uo;TTsodwoD ap Tw jed sawsTue6Jo L. I Z89 z +: signifie une réduction du nombre de bactéries d'un facteur 10 par rapport au témoin (existence d'une activité dont l'intensité demeure faible), ++: idem, mais facteur 100 (activité moyenne), +++: idem, mais facteur 1 000 (bonne activité), ++++: idem, mais facteur 10 000 (excellente activité). On constate que, à dose suffisante, l'activité est bonne ou excellente pour la plupart des germes expérimentés et en particulier pour les germes les plus gênants qui sont difficiles à éradiquer par d'autres procédés: Listéria, Yersinia, Campylobacter. 2/ Traitement de fromages Un lot de fromages du type pâte molle genre munster (hydratation à environ 55 %) a été traité selon le procédé de l'invention, cependant qu'un lot témoin identique était fabriqué simultanément dans les mêmes conditions sans le traitement. Ces fromages ont été préparés par coagulation de lait standardisé pasteurisé (75 C, 15 s) additionné de chlorure de calcium (0,09 M), de ferments lactiques (106 cellules/ml), de Brevibacterium Linens (104 cellules/ml) et de Présure Animale (0,25 ml/l de lait). Le caillé est divisé, égoutté et placé dans des moules cylindriques leur conférant une surface de 300 cm2. Après 22 heures d'égouttage, les fromages sont salés au sel sec (2 %). Chaque fromage est alors ensemencé en germes Listéria pour simuler une contamination, au moyen d'un ml d'une suspension de Listéria dont la population variait entre 103 et 107 bactéries par ml, cette suspension étant répartie uniformément sur la surface de chaque fromage. La moitié des fromages ensemencés est traitée conformément à l'invention en cours de maturation en imprégnant chaque fromage par pulvérisation homogène sur toute la surface au moyen d'un ml d'une solution du système LP contenant: 20 mg/l de lactopéroxydase, 25 mg de thiocyanate de potassium et 2 mg de glucose-oxydase. * 2648321 Des échantillons de fromages des lots-témoins et des lots d'essais ont été prélevés après 4 jours de maturation à 15 C (95 % d'humidité) et les populations de Listéria ont été dénombrées sur ces prélèvements par la méthode FDA avec subculture. On constate, au terme de 4 jours de maturation, que tous les fromages traités au moyen du système LP sont rigoureusement exempts de germe Listéria, alors que les témoins présentent des nombres de germes supérieurs à 103 par cm2 de surface. Des analyses au terme de 7 jours de maturation ont confirmé l'absence totale de Listéria sur les fromages traités. REVENDICATIONS 1/ - Procédé de traitement d'un produit alimentaire non liquide pour assurer sa décontamination microbienne, en particulier vis-à-vis des bactéries du genre Listéria, caractérisé en ce qu'il est appliqué à un produit hydraté contenant au moins 20 % d'eau et en ce qu'il consiste à déposer sur la surface dudit produit hydraté une préparation dite système LP, comprenant un mélange d'enzyme lactopéroxydase, de thiocyanate et d'un donneur d'oxygène. 2/ - Procédé de traitement selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on dépose le système LP sur la surface du produit en imprégnant ladite surface au moyen d'une phase aqueuse dans laquelle les composants du système LP sont solubilisés et/ou dispersés. 3/ - Procédé de traitement selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'imprégnation de la surface du produit est réalisée en immergeant ledit produit dans un bain de la phase aqueuse contenant le système LP. 4/ - Procédé de traitement selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'imprégnation de la surface du produit est réalisée en pulvérisant sur ladite surface la phase aqueuse contenant le système LP. / - Procédé de traitement selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on dépose le système LP sur la surface du produit en saupoudrant ladite surface au moyen d'une poudre contenant les composants du système LP. 6/ - Procédé selon l'une des revendications 1, 2, 3, 4 ou 5 pour traiter un produit alimentaire appelé à être conditionné au contact d'un emballage, caractérisé en ce que le système LP est déposé sur l'emballage en vue de venir au contact de la surface du produit lors du conditionnement. 7/ - Procédé de traitement selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on dépose sur la surface du produit un système LP contenant, rapporté à 1 g d'enzyme lactopéroxydase, entre 1 et 4 9 de thiocyanate et une quantité de péroxyde capable de libérer entre 0,4 et 2 g d'oxygène moléculaire. 8/ - Procédé de traitement selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on dépose sur la surface du produit un système LP contenant, rapporté à 1 g d'enzyme de lactopéroxydase, entre 1 et 4 9 de thiocyanate et entre 0,050 et 0,100 9 de glucose-oxydase constituant le donneur d'oxygène. 9/ - Procédé de traitement selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que l'on dépose sur la surface du produit le système LP en quantité telle que le poids d'enzymes lactopéroxydase soit compris entre 2.10-4 et 35.10-4 mg par cm2 de surface du produit. / - Procédé de traitement selon la revendication 2, caractérisé en ce que la phase aqueuse à déposer sur la surface du produit est préalablement préparée avec ajout d'au moins un agent du groupe suivant: sel tampon régulateur de pH, sel d'ionisation, agent mouillant, agent fixateur filmogène. 11/ - Procédé de traitement selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on ajoute au système LP à déposer sur la surface du produit, au moins un composé du groupe suivant: lactoferrine, lysozyme, composé fongicide. 12/ Application du procédé conforme à l'une des revendications 1 à 11 pour traiter un fromage en vue d'assurer sa décontamination vis à vis des bactéries du genre Listéria. 13/ - Application selon la revendication 12, caractérisée en ce que le système LP à déposer sur la surface du fromage est mis en solution et/ou en suspension dans une phase aqueuse en concentration telle que le poids de lactopéroxydase par litre d'eau soit compris entre 10 et 500 mg. 14/ - Application selon l'une des revendications 12 ou 13 pour traiter un fromage soumis au cours de sa fabrication à une opération de salage précédant une période de maturation, caractérisée en ce que le traitement de surface au moyen du système LP est effectué au moins une fois au cours de la période de maturation. / - Application selon la revendication 14 pour traiter un fromage à période de maturation longue supérieure à trente jours, caractérisée en ce que l'on applique un premier traitement de surface dans un délai compris entre 10 et 20 jours après salage, et au moins un autre traitement avant emballage. 16/ - Application selon la revendication 15 pour traiter des fromages, dits fromages à morge, comprenant une péte molle ou une péte molle pressée, à flore microbienne de surface. 17/ - Application du procédé conforme à l'une des revendications 1 à 11 pour traiter des carcasses et pièces de viande, poissons entiers et filets, crustacés. 18/ - Application du procédé conforme à l'une des revendications 1 à 11 pour traiter des végétaux après récolte. 19/ - Préparation-mère permettant de fabriquer une préparation, dite système LP, destinée à la mise en oeuvre du procédé de traitement conforme à l'une des revendications I à 18, comprenant un mélange d'enzyme lactopéroxydase, de thiocyanate notamment thiocyanate de potassium, et d'un donneur d'oxygène. / - Préparation-mère selon la revendication 19, se présentant sous la forme d'une poudre conditionnée de façon que le donneur d'oxygène soit isolé des autres constituants. 21/ - Préparation-mère selon la revendication 19, se présentant sous la forme d'un liquide conditionné en deux compartiments séparés de façon que le donneur d'oxygène soit isolé des autres constituants. 22/ - Préparation-mère selon la revendication 19, se présentant sous forme liquide en solution dans un polyalcool anhydre, notamment glycérol.