FR 2656875 A1 19910712 FR 9000159 A 19900109 La présente invention concerne un dispositif de culture en lit fixe et en milieu aérobie de cellules, notamment de cellules de mammifères. La culture des cellules eucaryotes supérieures posent, avec un développement croissant des biotechnologies, des problèmes de rendement qui sont parfois très difficiles à résoudre. Un grand nombre de cultures de cellules de mammifères ne peuvent être effectuées qu'à la surface de supports généralement sphériques, ce qui diminue considérablement le rendement de production. Bien entendu, il est préférable de pouvoir recourir à des cultures en masse, notamment il est intéressant de pouvoir effectuer des cultures en lit fixe. Récemment, on a pu mettre en évidence que l'immobilisation de microorganismes dans des billes de verre microporeuses, organisées en lit fixe, en milieu anaérobie, permettait d'augmenter la productivité volumétrique des cultures correspondantes, voir notamment EP A-155 669. Toutefois ce type de procédé est limité à des cultures en anaérobiose. En effet, pour qu'il soit possible de réaliser une culture en milieu aérobie, conduite dans des bioréacteurs, dont la hauteur du lit fixe est importante, il est nécessaire de prévoir des procédés d'oxygénation souvent drastiques. Parmi ceux-ci, il faut citer soit des systèmes d'agitation, lesquels doivent nécessairement se trouver à l'extérieur du réacteur pour ne pas troubler la culture ou bien des systèmes dans lesquels on fait buller des mélanges gazeux contenant de l'air et/ou de l'oxygène pur. Toutefois ces deux technologies ont l'inconvénient de conduire très rapidement dans des milieux de culture complexes à la formation de mousses qui ne peuvent être cassées sans recourir à des produits qui nuisent grandement à la croissance des cellules.En outre, l'utilisation de systèmes faisant buller des gaz dans un réacteur à lit fixe, conduit très souvent à une flottation des supports de culture et donc à la destruction complète de la structure du réacteur ou endommage directement les cellules attachées à la surface de ces supports. En tout état de cause, ceci trouble la culture et nuit à la bonne diffusion de l'oxygène à travers le lit fixe. Un des objets de la présente invention est de permettre une culture en lit fixe profond de cellules, qu'elles soient eucaryotes ou procaryotes en aérobiose en évitant les inconvénients qui ont été décrits précédemment. Plus particulièrement, il stagit d'un dispositif de culture comportant un réacteur en lit fixe de cellules eucaryotes ou procaryotes dans un milieu de culture en aérobiose, caractérisé en ce que l'oxygénation du milieu de culture est effectué grâce à un mélange gazeux contenant l'oxygène qui est insufflé sous pression dans le milieu de culture à travers au moins une paroi microporeuse. Le passage des mélanges gazeux contenant l'oxygène à travers cette paroi microporeuse se fait par diffusion et ne conduit pas à la formation de bulles. En outre, selon le débit et la pression imposés en mélange gazeux, de même que selon la teneur en oxygène des mélanges gazeux, il est possible de moduler la teneur en oxygène du milieu de culture, voire de staffranchir de l'agitation de la culture. La paroi microporeuse peut être constituée d'une cartouche appelé ci-après cartouche d'oxygénation ou bien être l'une des parois du bioréacteur. Par cartouche d'oxygénation microporeuse, on entend désigner des cartouches contenant des fibres creuses comme les cartouches d'ultrafiltration et de microfiltration par exemple, mais également les membranes microporeuses planes pouvant présenter des configurations variées. Les parois microporeuses sont de préférence constituées de matière non organique telle le carbone, carbosep ND par exemple, et la céramique. L'intérêt d'utiliser des matières non organiques est qu'outre leur résistance, elles sont plus faciles à nettoyer si elles se colmatent et qu'elles peuvent être facilement stérilisées. I1 est bien entendu possible d'utiliser simultanément plusieurs cartouches d'oxygénation microporeuses. La surface d'échange des parois microporeuses est de préférence comprise entre 20 et 10 000 cm2/1 de lit fixe, et la porosité est comprise entre environ 0,1 et environ 10 um, notamment environ 0,1 à environ 0,2 ijm lorsqu'il s'agit de membranes de microfiltration et ayant un seuil de coupure de 0,5 à 500 KD lorsqu'il s'agit de membranes d'ultrafiltration. Selon un mode privilégié de l'invention, on utilise une surpression du mélange gazeux variant de 0 à 50 bars par rapport à la pression du milieu. Comme cela a été dit, il est possible de faire varier la teneur en oxygène de ce mélange gazeux. Ainsi, la pression partielle d'oxygène dissous sera de préférence régulée de 100 à 150 mm de Hg. Dans certains cas, il sera possible d'utiliser de l'oxygène pur. La vitesse linéaire du milieu de culture dans le lit fixe peut varier de 0,5 cm/min à environ 50 cm/min. Le réacteur de culture proprement dit peut être de tout type connu pour permettre des cultures en volume. I1 comporte de préférence un système permettant de contrôler les paramètres d'oxygénation afin de réguler l'apport d'oxygène. Ce réacteur est de préférence à lit fixe avec des supports poreux immobilisant les cellules en culture. Selon un mode préféré de l'invention, les cellules, dépendantes ou non d'un support, sont immobilisées dans un lit fixe de support notamment de billes microporeuses. Ces billes microporeuses sont de préférence à base de verre borosilicaté qui peut être éventuellement modifié en surface par des groupements OH, NH2 ou non modifié chimiquement. Le diamètre de ces billes peut varier de 0,5 à 5 mm. La taille des pores est alors de 60 à 300 pm et la surface spécifique varie de 60 à 80 m2 par litre de support. On utilise de préférence des billes de diamètre de 3 à 5 mm pour assurer une diffusion correcte du milieu de culture dans le lit fixe. Le système de culture selon l'invention permet de cultiver de 0,05 à environ 2.107 cellules par ml de lit fixe. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le milieu de culture est prélevé dans le réacteur puis envoyé dans une cartouche d'oxygénation comportant ladite paroi microporeuse et à travers laquelle est insufflé le mélange gazeux comprenant l'oxygène. Puis le milieu de culture oxygéné est réinjecté dans le biogénérateur. Comme on pourra le constater, dans la description de la figure 1, la réinjection du milieu de culture peut se faire par l'intermédiaire d'un second réservoir contenant du milieu de culture dont la composition est contrôlée en continu tant pour ses caractéristiques que pour ce qui concerne son pH et sa teneur en oxygène. C'est à partir de ce réservoir de milieu que le réacteur est réalimenté. Lorsque la culture est destinée à la préparation d'un métabolite qui est excrété dans le milieu, ce métabolite peut être prélevé à partir du milieu de culture avant ou après l'étape d'oxygénation. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules sont immobilisées dans un lit fixe de billes poreuses en verre borosilicaté et le milieu de culture circule dans le lit préférentiellement de bas en haut pour assurer l'apport de nutriments et d'oxygène et l'élimination des métabolites toxiques. Le lit fixe dont le rapport hauteur/diamètre optimum est de 1, est relié à une cuve de milieu de culture dans laquelle température, pH et pression d'oxygène sont régulés. L'oxygénation du milieu de culture peut être assuré sur le circuit du milieu reliant le lit fixe au bioréacteur contenant le milieu, au moyen de cartouches d'oxygénation microporeuses qui sont soumises à un balayage d'air, d'oxygène ou d'un mélange de ces deux gaz, asservi à la mesure de la tension d'oxygène dissous du réservoir de milieu de culture. Une mesure de la tension d'oxygène dissous en sortie du lit fixe peut donner accès à la quantité d'oxygène dissous, consommée par les cellules immobilisées dans le lit fixe. Le milieu de culture contenant la molécule d'intérêt peut être renouvelée selon un mode discontinu ou continu et le rapport volume du lit fixe/volume du bioréacteur peut varier de 5 à 0,25. Bien entendu, il peut être envisagé d'autres modes de réalisation du système selon l'invention. Par exemple, le dispositif nécessaire à ltoxygénation, peut être implanté à l'extérieur du biogénérateur, soit par des cartouches d'oxygénation microporeuses ou bien par une paroi spécifique prévue dans le réacteur. Lorsque l'oxygénation est effectuée dans le réacteur, ces échanges pourront alors être optimisés par un dispositif d'agitation de la culture qui accroît le transfert des gaz issus de la ou des cartouches d'oxygénation microporeuses situées dans le bioréacteur. Le système de culture selon l'invention présente donc plusieurs avantages. I1 résout de, par sa conception, les problèmes de transfert d'oxygène, notamment dans le système à deux compartiments, un réacteur et un réservoir acellulaire, ce qui donne la possibilité de réaliser un apport d'oxygène en boucle externe sur des cartouches d'oxygénation de type fibres creuses microporeuses (oxygénateurs médicaux, cartouches de microfiltration) ou membranes de carbone poreux (type CARBOSEP).En effet, l'oxygène peut être transféré à des taux élevés ne limitant pas la croissance ou la productivité du système cellulaire et ce, sans faire de mousse même si le milieu de culture contient des protéines et en assurant en parallèle un dégazage du milieu en CO2. Ceci facilite la régulation du pH des cultures ce qui n'est pas possible lorsque le système ne comporte pas de cartouche d'oxygénation. Le second avantage de ce mode d'oxygénation réside dans le fait de pouvoir sous-dimensionner la cuve "réservoir de milieu" par rapport à la cuve constituant le lit fixe du fait du haut coefficient de transfert de l'oxygène atteint sur une cartouche dont la surface peut varier de 1 à 5 m2. Dans le cas des cultures en biogénérateurs agités classiques, les problèmes d'oxygénation des cultures sous de hautes densités se posent pour des tailles de biogénérateur supérieures à 100 litres utiles. L'oxygénation par tubes de silicone ne peut s'envisager que jusqu'à l'échelle 80-100 litres utiles en effet à raison de 4 mètres par litre ce ne sont pas moins de 400 mètres de tuyau qui sont à enrouler dans un biogénérateur de 100 litres utiles, et au-delà de 100 litres utiles ce n'est plus possible matériellement, faute de place. Le troisième avantage du dispositif de culture en lit fixe par rapport aux systèmes de culture sur microsupports poreux ou non poreux (CULTISPHER-C ou CYTODEX 1 à 3) en cuve agité est le fait que les surnageants sont très peu chargés en particules en suspension (cellules mortes, débris cellulaires, fragments de billes) ce qui permet de se passer de l'étape de microfiltration des surnageants avant les étapes de chromatographie sur colonne (gain de rendement). Le quatrième avantage du système de culture en lit fixe est la possibilité de faire fonctionner le système en mode perfusion sans avoir à mettre au point un système assurant la séparation en continue surnageant/ cellules ou surnageant/microsupports ce qui n'est pas possible de façon simple dans le cas des cultures sur microsupports ou en suspension en cuve agitée classique. Le système de culture selon l'invention se révèle particulièrement utile pour la culture de cellules de mammifères, qu'elle soit tamponnée ou non, notamment dans la production de protéines humaines telles que le facteur VIII ou des variants, facteur Von Willebrand à partir de la culture de cellules CHO, et autres protéines d'origine eucaryote. La présente invention concerne également les substances biologiques obtenues à partir du dispositif de culture selon l'invention. Les exemples et figures donnés ci-dessous, à titre non limitatif, permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. La figure 1 représente un dispositif de culture selon la présente invention. La figure 2 représente la comparaison de la productivité en facteur VWF d'un système de culture sur microsupports poreux en cuve agitée et d'un système de culture en lit fluidisé. Le dispositif utilisé dans la réalisation des exemples est le dispositif représenté dans la figure 1. Ce dispositif reprend d'une part le réacteur à lit fixe de billes poreuses 1 et d'autre part un réservoir contenant un milieu de culture 2. Le réacteur 1 comporte un garnissage de billes poreuses 3 dont la nature sera explicitée dans les exemples. La mesure de la pression partielle d'oxygène est effectuée dans le réacteur 1 par l'intermédiaire du dispositif 5 qui mesure la pression partielle en oxygène dissous. Le surnageant de culture 6 est prélevé à la partie supérieure pour être envoyé dans la cartouche d'oxygénation dont les caractéristiques seront également décrites plus en détail dans les exemples. Cette cartouche d'oxygénation a été alimentée en un mélange air + oxygène par l'intermédiaire d'une électrovanne 7, le trop plein gazeux étant éliminé par l'évent 8. L'électrovanne est commandée par le système de mesure de pression d'oxygène 9 qui contrôle cette donnée dans le réservoir de milieu 2. Après oxygénation, le milieu de culture est injecté dans le réservoir de milieu 2 dans lequel la pression en oxygène est contrôlée par l'intermédiaire du dispositif de mesure de pression d'oxygène et de teneur en oxygène 9. De même, le pH est contrôlé par ledit pHr 11 et l'addition d'air et de CO2 est effectuée éventuellement par des tuyauteries annexes telles que 12.L'arrivée de milieu destinée à maintenir celui-ci dans des conditions satisfaisantes pour la culture est effectuée par les tuyauteries d'arrivée 13 et le retrait du milieu par des tuyauteries de soutirage 14 qui viennent prélever le milieu du réservoir. L'homogénéité du milieu est assurée par un système d'agitation 15. La température du réservoir de milieu et du lit fixe est mesurée au moyen de sondes 4 et 10. Une pompe 16 recycle le milieu dans le réacteur 1 en partie basse par l'intermédiaire de tuyauteries 17. D'autres caractéristiques de ce dispositif apparaîtront à la lecture de l'exemple ci-après. EXEMPLE 1 Dans un dispositif tel que décrit précédemment, on a effectué la culture d'un clone de cellules CHO transformées afin de produire du facteur Von Willebrand recombinant qui sera appelé parfois ci-après VWF. Les conditions expérimentales sont indiquées ci-après DONNEES EXPERIMENTALES INOCULUM : 0,5 à 2.10 6 cellules/ml de lit fixe. PHASE D'ATTACHEMENT : 4 à 24 heures pendant lesquelles la vitesse linéaire du flux est limitée à 0,5 à 3-5 cm/mn. PHASE DE CROISSANCE : La vitesse linéaire du flux est progressivement augmentée de 0,5 à 3-5 cm/mn. REGULATION DE L'OXYGENE DISSOUS : Dans le réservoir la tension d'oxygène dissous est régulée à 75-100 % de la saturation par de l'air. REGULATION DU pH Le pH est régulé à 7,00-7,25. DENSITES CELLULAIRES EN FIN DE CULTURE 107 à 2.107 cellules/ml. DUREE DE LA CULTURE 30 à 150 jours. Dans le cadre de cette étude, deux types de supports poreux ont été comparés. Ce sont - CULTISPHER-C larges pores (LP), diamètre 80-180 llm (à sec) microsupports poreux à base de gélatine bovine, densité 1.04 g/ml. Surface spécifique = 2-4 m2/g de poids sec, soit 5 à 10 fois la surface spécifique du Cytodex 1 (support non poreux). Utilisé en suspension en cuve agitée, - SIRAN SCHOTT référence 035/02/300 diamètre 3-5 mm, macrosup ports poreux, taille des pores : 60-300 llm. densité : 0,50 g/ml Utilisé sous forme de lits fixes. Ces deux supports ont été évalués avec le même clone : CHO TG 2330-B32A-1000-6 dont la productivité en milieu à 10 % de SVF est de 400 à 600 mU vWFrec/106 cellules/24H. En milieu sans sérum (4mg de protéine/l) utilisé au cours de la phase de production dans ces deux essais la productivité est réduite d'un facteur 2. Les supports SIRAN SCHOTT ont été testés dans un système de culture comportant deux cuves de 1 l utile (SGI) connectées entre elles selon la figure I. Le volume du lit fixe de billes poreuses a été fixé à 1 litre. Le ratio hauteur du lit fixe/diamètre du lit fixe à été fixé à 1. L'oxygénation est assuré par une cartouche de fibres creuses microporeuses à 0,22 ,um de surface totale 0,80 m2 (CD MEDICAL) sur laquelle un mélange air-O2 est injecté. Les supports CULTISPHER-G LP ont été utilisés à la concentration de 4 g/l dans un réacteur agité classique de l l utile SGI, l'oxygénation étant assurée par un enroulement de silicone de 4m de longueur dans lequel de l'oxygène pur est injecté. Dans le cas des supports CULTISPHER-G le milieu de culture (1 litre) a été renouvelé en totalité tous les deux jours, alors que dans le système lit fixe, le milieu a été renouvelé en totalité chaque jour. La figure 2 représente les évolutions des productions cumulées des deux systèmes. Sur la période J5-522 la production cumulée du système lit fixe est de 41 000 unités (ELISA STAGO) alors que dans le système CULTISPHER-G LP la production cumulée est dans le même temps de 18 000 unités. Le rapport est de 2,28 en faveur du système de culture en lit fixe sur billes SIRAN SCHOTT. Sur la période de production du système lit fixe 35-328 60 000 unités de vWFrec ont été produites soit 2500 unités par jour en moyenne dans 2 litres de surnageant. La productivité moyenne définie par la quantité moyenne d'unités de facteur Von Willebrand produites par litre de réacteur et par jour s'établie donc à 2500 unités/jour.litre pour le système lit fixe (si on considère le volume lit fixe comme le volume du réacteur) et à 1000 Unités/jour.litre pour le système de culture sur microsupports Cultispher-G LP. Le gain en productivité est donc de 2.50 en faveur du système lit fixe. REVENDICATIONS 1. Dispositif de culture comportant un réacteur en lit fixe de cellules eucaryotes ou procaryotes dans un milieu de culture en aérobiose, caractérisé en ce que l'oxygénation du milieu de culture est effectué grâce à un mélange gazeux contenant de l'oxygène qui est insufflé sous pression dans le milieu de culture à travers au moins une paroi microporeuse. 2. Dispositif de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce que la paroi microporeuse a une porosité d'environ 0,1 à environ 10 um et de préférence d'environ 0,1 à environ 0,2 ,um. 3. Dispositif de culture selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'oxygène est insufflé à travers des fibres creuses ou une membrane microporeuse. 4. Dispositif de culture selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que la paroi microporeuse est constituée d'un matériau non organique choisi de préférence parmi le carbone et la céramique. 5. Dispositif de culture selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la surface d'échange de la paroi microporeuse est comprise entre 20 et 10 000 cm2/l de lit fixe. 6. Dispositif de culture selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la surpression du mélange gazeux est compris entre 0 à 50 bars par rapport à la pression du milieu. 7. Dispositif de culture selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la vitesse linéaire du milieu de culture dans le lit fixe est comprise entre 0,5 cm/min et environ 50 cm/min. 8. Dispositif de culture selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un lit fixe de billes microporeuses sur lequel sont immobilisées les cellules en culture. 9. Dispositif de culture selon la revendication 8, caractérisé en ce que le diamètre des billes microporeuses varie de 0,5 à 5 mm et de préférence d'environ 3 à environ 5 mm. 10. Dispositif de culture selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce qu'il s'agit de billes de verre borosilicaté ayant une surface spécifique de 60 à 80 m2 par litre de support. 11. Dispositif de culture selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la densité de culture est comprise entre environ 0,05 7 à environ 2.10' cellules par ml de lit fixe. 12. Dispositif de culture selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le milieu de culture est prélevé dans le réacteur, envoyé dans une cartouche d'oxygénation comportant ladite paroi microporeuse à travers laquelle est insufflé le mélange gazeux contenant l'oxygène, puis en ce que le milieu de culture oxygéné est injecté dans le biogénérateur. 13. Dispositif de culture selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comporte un réservoir contenant du milieu de culture qui sert à réalimenter le biogénérateur. 14. Dispositif de culture selon les revendications 11 et 13, caractérisé en ce que, lors du prélèvement de milieu de culture, on recupère essentiellement un métabolite et/ou son produit de réaction avant ou après l'oxygénation. 15. Dispositif de culture caractérisé en ce que les cellules cultivées sont des cellules de mammifère.