FR 2650838 A1 19910215 FR 8910720 A 19890809 La presente invention concerne un nouveau procédé pour la production de facteur IX humain ou une protéine présentant in vivo une activité biologique semblable par des cellules eucaryotes supérieures, notamment des cellules d'animaux transgéniques et plus particulièrement des cellules hépatiques. Plus généralement, l'invention vise la mise au point de nouvelles lignées cellulaires productrices de facteur IX actif. Le facteur IX humain est une protéine dépendante de la vitamine K qui est synthétisée dans le foie sous forme d'un zymogène. Avant d'être sécrété dans la circul tion, il subit quatre modifications posttraductionnelles : (i) une gamma-carboxylation de 12 acides glutamiques, (ii) une N-glycosylation, (iii) une béta-hydroxylation de l'acide aspartique en position 64 et (iv) le clivage protéolytique de la séquence signal suivi de celui de la proséquence. Après activation, le facteur IX activé (FIXa) joue un rôle cle dans la voie intrinsèque de la coagulation sanguine. La déficience héréditaire en facteur IX humain conduit à l'hémophilie de type B qui affecte un sujet mâle sur trente mille. A l'heure actuelle, les patients sont traités par injection de facteur IX humain concentré issu du plasma humain de donneurs d'où risques d'infection par des agents pathogènes ou des virus, notamment le virus de l'hépatite ou du Sida. Il est donc particulièrement intéressant de développer des moyens de production de facteur IX humain pur en utilisant les techniques de l'ADN recombinant. Des tentatives pour préparer du facteur IX humain en utilisant ces techniques ont déjà ete faites. En particulier, la Demanderesse a décrit dans des demandes de brevet antérieures, les publications européennes de brevet EP 0167420, EP 0162782 et EP 0251874, des procédés permettant de transformer des cellules hôtes afin de les rendre capables de produire du facteur IX humain. Si parmi toutes les cellules hôtes envisagées, les cellules de mammifères ont donné les résultats les plus intéressants, il a rapidemment été constaté la difficulté à obtenir un produit à la fois actif, homogène et avec un rendement suffisant pour envisager son développement à ltéchelle industrielle. Certains auteurs ont donc proposé de nouvelles constructions devant permettre l'obtention de FIX actif et correctement procéssé. Ainsi CHOO et al. [Nucl. Acids Res. (1987) 15 p871-884] décrit l'expression de FIX dans des souris transgéniques. La construction introduite dans la souris comprend la totalité de l'ADN complémentaire du facteur IX humain, auquel ont été ajoutées un certain nombre de séquences flanquantes en 5' et en 3'. Ces séquences sont sous le contrôle du promoteur de la métallothionéine Ia de mouton. Il est alors nécessaire d'activer la transcription avec du zinc pour obtenir des quantités significatives d'ARN messager dans les souris transgéniques. L'invention se propose de fournir de nouvelles constructions permettant la production de FIX à peu près totalement actif et dépourvu de proséquence en utilisant les animaux transgéniques. Ces constructions peuvent servir d'une part pour l'expression spécifique au niveau de foie des animaux transgéniques et la récupération du FIX produit. Elles peuvent servir plus généralement à la préparation de lignées cellulaires stables produisant FIX å partir de tumeurs dérivées de ces animaux transgéniques. Elles peuvent également servir à la surtransfection de lignées cellulaires stables exprimant des oncogènes en vue de l'obtention de FIX. On peut aussi envisager de croiser des animaux exprimant FIX avec des animaux exprimant des oncogènes afin d'obtenir des doubles transgéniques qui expriment à la fois FIX et les oncogènes et dériver de la même façon des lignées cellulaires stables exprimant FIX à partir des tumeurs formées. Dans la suite de la description, le terme FIX sera utilisé pour désigner le facteur IX humain ou encore une protéine qui présente une structure analogue en conservant le même type d'activité biologique in vivo. Il pourra s'vagir par exemple d'une protéine ayant la même structure primaire que le facteur IX humain avec éventuellement quelques modifications au niveau d'un nombre réduit d'acides aminés (insertion, mutation, délétion), ou encore d'une protéine ne présentant pas exactement les mêmes modifications post-traductionnelles que le facteur IX humain ou bien d'une protéine comportant des délétions dans les régions non essentielles à l'activité biologique. L'invention a donc pour objet en premier lieu un vecteur d'expression de FIX dans une cellule eucaryote supérieure, comprenant un gène codant pour FIX et les éléments assurant son expression dans ladite cellule, caractérisé en ce qu'il comprend, en amont du gène codant pour FIX, une partie au moins du promoteur du facteur IX humain suffisante pour permettre l'expression de FIX dans ladite cellule. La structure générale du géne génonique humain codant pour FIX est représentée à la figure 1. Cegène est porté par le chromosome X, il comporte 35000 bases et peut être subdivisé en 8 exons désignés par les lettres de A à H sur la figure et séparés par 7 introns CANYON et al. (1984) EMBO J. 3 p1053-1060]. Il comprend également des séquences flanquantes non codantes en 5' et 3'. Suivant une caractéristique avantageuse de l'invention, il est intéressant de combiner le promoteur avec un gène codant pour FIX qui comprend tous les exons codant pour FIX et au moins une partie d'un intron associé au gène génomique humain. On désignera ci après par minigène un gène codant pour FIX qui comprend plus que ltADN complémentaire mais moins que le gène genomique. Comme cela apparaîtra plus en détail dans la suite de la description, differents gènes de FIX ont eté préparés en association avec au moins une partie du promoteur de FIX humain pour être exprimes dans des cellulés eucaryotes supérieures. En particulier il est intéressant d'utiliser un gène codant pour FIX qui comprend tous les exons codant pour FIX et au moins une partie de l'intron 1 associé au gêne génomique humain. Le gène codant pour FIX pourra également se rapprocher encore plus du gène gênomique humain et comporter en particulier au moins une séquence flanquante en 5' et / ou en 3' naturellement associés au gène génomique humain et / ou un signal de polyadénylation. Comme indiqué précédemment, l'invention est particulièrement utile pour l'expression spécifique de FIX dans le foie d'animaux transgeniques. Dans ce cas, le vecteur selon l'invention est de préférence sous forme lineaire et pratiquement depourvu de tout ADN bactérien. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de FIX à l'aide des vecteurs selon l'invention. Selon ce procédé, on introduit un vecteur selon 11 invention dans un ou plusieurs oeufs d'un animal et on réimplante le ou les oeufs obtenus, on recherche les descendants exprimant FIX, on prélève le plasma des descendants sélectionnés et on extrait FIX produit. Pour rechercher les descendants exprimant FIX, on isole de l'ADN à partir de la queue de nouveau-nés et on effectue une analyse- Dot Blot dudit ADN en utilisant une sonde radioactive, marquée à l'isotope 32P, d'ADN complémentaire de FIX humain. Pour isoler FIX actif sur les animaux sélectionnés, le plasma d'animaux d'une même lignee est prélevé par ponction cardiaque, rassemblé puis passé sur une colonne d'immunoaffinité chargée en anticorps monoclonaux A7, calcium dépendants, selon la procédure décrite dans le brevet US 4786726. FIX purifié est élué de la colonne par l'agent chélatant EDTA. Différents animaux peuvent être utilisés pour appliquer ce type de technique. On peut citer en particulier les souris qui ont déjà donné des résultats pour l'expression de transgènes. Enfin, on peut envisager à plus long terme, de mettre en oeuvre l'invention pour la préparation de lignees cellulaires stables produisant FIX actif en utilisant la technique décrite dans la demande de brevet EP-A 0298807 au nom de la Demanderesse. Un tel procédé est caractérisé par la succession d'étapes suivantes: - on prépare un vecteur selon l'invention comportant également une séquence oncogène ainsi que les éléments assurant son expression dans une cellule eucaryote supérieure, - on introduit ledit vecteur dans un ou plusieurs oeufs d'un animal et on réimplante le ou les oeufs obtenus, - on recherche les descendants ayant intégré oncogène et qui développent des tumeurs, - on prélève et on cultive sur un milieu approprié les cellules tumorales ainsi obtenues et qui produisent FIX afin d'obtenir une lignée cellulaire. On peut envisager aussi une variante du procéde de préparation d'une lignée cellulaire stable produisant FIX actif, selon laquelle : a) on prépare un vecteur selon l'invention, on l'introduit dans un ou plusieurs oeufs d'un animal et on réimplante le ou les oeufs obtenus, b) on prépare un vecteur comportant une séquence oncogène ainsi que les éléments assurant son expression dans une cellule hépatique, on l'introduit dans un ou plusieurs oeufs d'un autre animal et on réimplante le ou les oeufs obtenus, c) on recherche d'une part les descendants ayant intégré le gène codant pour FIX et l'exprimant, d'autre part les descendants ayant intégré l'oncogène et qui développent des tumeurs, d) on croise deux descendants tels que sélectionnés à l'étape c), e) on recherche les doubles transgéniques exprimant les deux transgènes, f) on prélève et on cultive sur un milieu approprié les cellules tumorales obtenues et qui produisent FIX afin de aeriver une lignée cellulaire. Suivant des variantes de ces procédés, avant d'être cultivés, les cellules tumorales prélevées sont reinjectées dans un autre animal pour induire le développement de nouvelles tumeurs dont les cellules seront cultivées pour obtenir une lignée cellulaire; les cellules tumorales prélevées et cultivées sont celles d'un animal d'une génération suivante développant également des tumeurs. D'autres caracteristiques et avantages de l'invention apparaitront au cours de la description ci-après, illustrée par les figures suivantes: - la figure 1 représente schématiquement le gène génomique humain de FIX,la position des exons (de A à H), la localisation des séquences reconnues par les oligonucléotides utilisés pour cribler la banque génomique (de [1] à [6J), et les inserts du gène FIX clonés dans les trois vecteurs lambda. - la figure 2 représente schématiquement la structure du plasmide pTG3960 en précisant de quels plasmides proviennent ses fragments et à partir de quel vecteur lambda ces derniers ont été construits. Les exons de FIX sont signalés par les lettres due A a H. - la figure 3 représente schématiquement la structure du plasmide pTG3954 en précisant de quels vecteurs proviennent ses différents fragments. Les exons de FIX sont signalés par les lettres de A à H. - la figure 4 représente schématiquement la structure du plasmide pTG3962 en précisant de quels plasmides proviennent ses différents fragments. Les exons de FIX sont signalés par les lettres de A à H (rectangles clairs), le premier exon non codant du gène de l'alpha-antitrypsine par le chiffre 1 et la partie de l'exon c-myc par le chiffre 2 (rectangles noirs). - la figure 5 présente l'analyse par électrophorèse des ARN préparés à partir des différents tissus d'une lignée de souris transgeniques exprimant FIX humain ("C", pour souris contrôle et "T", pour test). - la figure 6 présente l'analyse des ARN messagers issus du foie de souris transgéniques exprimant FIX humain; (1) et (2) souris de la lignee TMTG3960-1, "C" souris contrôle; (3) souris de la lignée TMTG3962-18; (4) souris de la lignée TMTG3954-9; et (5) et (6) souris de la lignée TMTG3954-58. - la figure 7 représente l'analyse par Western blot de FIX recombinant humain isolé du plasma des souris transgéniques; (1) et (2) souris de la lignée TMTG3954-58; "C" souris contrôle, (3), (4), (5) et (6) souris de la lignée TMTG3960-1, "S" FIX Stago et (7) et (8) souris de la lignée TMTG3954-9. EXEMPLE 1 : Clonage du gène génomique codant pour FIX humain (ci après désigne par gène de FIX). Le gène de FIX est cloné à partir d'une banque d'ADN génomique provenant d'une lignée de cellules lymphoblastoïdes humaines (GM1202A) contenant quatre chromosomes X. La banque réalisée dans le bacteriophage lambda EMBL3 tFrischauf A.M. et al. (1983) J. Mol. Biol. 170 p827-842] est criblée à l'aide des oligonucléotides synthétiques (21, 22 et 25 mer) suivants 5' AAGTACAAGCTGAGCTGTATT 3' [1) 5' TGCCATGATCATGTTCACGCG 3' [2] 5' CTCAGTACAGGAGCAAACCACCTTG 3' [3] 5' TAGAATTTACATAGTCCACATCAGG 3' [4] 5' GTCTCTACTAGCTGTAGATTGC 3' [5] 5' GATTATAGGCGTGAGCCACTG 3' [6] répartis dans les différentes portions du gène (figure 1). Les trois clones lambda obtenus (figure 1) couvrent une grande partie du gène, seule une région de l'intron 6 (6,7 kilo bases, kb) n'est pas représentée. Les huit exons, de A à H et les séquences adjacentes 5' (5 kb) et 3' (10 kb) du gène de FIX sont clonés - l'insert dans lambdaTGl9Sl comprend les 5 kb de la région promotrice et la partie couvrant les quatre premiers exons du gène de FIX, - l'insert dans lambdaTG1952 comprend 2,3 kb de l'intron 6, l'intron 7, les exons G et H du gène de FIX et les 10 kb de la séquence adjacente en aval du signal de polyadénylation, - l'insert dans lambdaTGl958 part de lexon B et s'étend jusqu'à 0,47 kb en aval de l'exon F (il recouvre l'insert de lambdaTG1951 sur 7 kb). EXEMPLE 2 : Assemblage du gène de FIX et différentes constructions réalisées. A. Construction d'un plasmide portant le gène de FIX sous le contrôle de son promoteur (pTG3960) Le fragment SalI de 15 kb du clone lambdaTG1958 est sous-cloné dans le vecteur ppolyIII-I* [Lathe et al. (1987) Gene 57 pl93-2013 qui porte entre autre les sites de restriction suivants : BglII, NotI, XhoI, PstI, SalI, HindIII, EcoRV, EcoRI, BamHI, XhoI, NotI et AatII. Cette construction correspond à pTG3911. Un linker synthétique porteur de sites de restriction uniques (SfiI, EcoRI, KpnI, BamHI, XhoI et NotI) est introduit entre les deux sites EcoRI du cosmide pCV00l [Choo et al. (1986) Gene 46 p277-286] qui sont détruits lors de l'insertion pour générer le plasmide pTG3909. Les fragments BamHI-EcoRI (4,3 kb) et EcoRI-EcoRI (1,8 kb) isolés du clone lambdaTG1952 sont clonés entre les sites BamHI-EcoRI de pTG3909 pour donner pTG3914. L'orientation du fragment EcoRI est vérifiée par digestion enzymatique. Le fragment de 6,2 kb (les deux fragments précédents plus un fragment de vecteur, EcoRI-AatII) portant la partie 3' du gène de FIX (correspondant aux exons G et H) est resorti du cosmide par digestion BamHI-AatII et cloné entre les mêmes sites de pTG3911 pour donner le plasmide pTG3921. L'insert SalI de lambdaTG1951 est sous-cloné dans le site SalI du plasmide pAT153 [Twigg A.J. et Sherrat D. (1980) Nature 283 p216-2183, pour donner le plasmide pTG3927. La partie centrale de l'intron 1 est eliminée par digestion PvuII suivie d'une ligation. Le plasmide qui n'a plus les deux fragments PvuII (3,65 kb et 1,13 kb) internes à l'intron 1 et qui a retenu le fragment PvuII (4,38 kb) porteur des exons B et C est appelé pTG3952. L'insert SalI de pTG3952 est repassé dans le vecteur ppolyIII-I* pour donner le plasmide pTG3956 qui dispose de sites uniques en 5'.Le fragment XhoI-SnaBI de pTG3956 est introduit entre les sites XhoI-SnaBI de pTG3921-pour donner le plasmide pTG3960 (figure 2) qui porte - 5 kb de la séquence promotrice de FIX, - 22 kb du gène de FIX (1'intron 1 est tronqué de ces deux fragments PvuII et l'intron 6 de 7,1 kb du fait de la délétion supplémentaire d'un fragment de 0,46 kb due à l'utilisation du site BamHI le plus en aval de l'intron, - quelques centaines de paires de bases de séquences génomiques 3 t en aval du signal de pblyadénylation. Toutes les constructions sont réalises dans la souche E. coli 5K à l'exception de la dernière étape de clonage. Le plasmide pTG3960 est obtenu par transformation de la souche E. coli BJ. B. Construction d'un minigène FIX sous le contrôle du promoteur de FIX humain (pTG3954, figure 3) Le fragment de 6,2 kb portant l'extrémité 3' du gène de FIX est resorti du cosmide pTG3914 par digestion ClaI-AatII et cloné entre les sites ClaI-AatII du vecteur pAT153, générant le plasmide pTG3924. Cette construction est passée dans la souche E. coli GM33 (dam ). Les séquences génomiques comprises entre les sites BclI et BglII sont éliminées et remplacées par un fragment BclI-BglII (2,34 kb) provenant du phage lambdaTG1951 et portant l'extrêmité 5' de l'exon B et la partie 3' de l'intron 1. Le clonage est effectué dans la souche E. coîl 5K et permet l'obtention du plasmide pTG3926.Il subsiste 0,6 kb de séquences génomiques issues de l'intron 6 entre les sites BamHI et BglII qui sont éliminées lors de la dernière étape de clonage. Le plasmide pTG3926 est transféré dans la souche E. coli GM33 (dam') afin de pouvoir reconstituer la partie de l'ADN complémentaire entre les exons B et H en integrant le fragment BclI (1,4 kb) isolé du plasmide pTG397 décrit dans la publication européenne de brevet EP-A-0162782 (qui porte l'ADN complémentaire de FIX humain) pour donner le plasmide pTG3951. La partie promotrice, l'exon A et le reste de l'intron 1 sont isolés du plasmide pTG3910 qui provient du clonage du fragment SalI de lambdaTG1951 dans le vecteur ppolyIII-I*. Le fragment XhoI-BglII de pTG3910 est intégré entre ces mêmes sites dans pTG3951. Le plasmide obtenu appelé pTG3954 (figure 3) porte donc un minigène de FIX comprenant la partie de 5 kb du promoteur, l'exon A, le premier intron complet, les exons de B à H sous forme d'un ADN complémentaire et quelques centaines de paires de bases de la partie 3' adjacente en aval du signal de polyadénylation. C. Exemple comparatif : construction diun plasmide portant le gène de FIX sous le contrôle du promoteur de l'alphal antitrypsine (alphalAT), (pTG3962, figure 4) La région promotrice du gène humain de alphalAT (dont la séquence a été publiée par Long G.L. et al. (1984) [Biochemistry 23 p4828-4837]) allant du site KpnI (position -1,5 kb par rapport au site d'initiation de la transcription) jusqu'au site KpnI situé dans le premier intron est cloné dans le vecteur pUC18 tYanisch-Perron C. et al. (1985) Gene 33 p103-119]. Cette portion du gène inclut donc le premier exon de alphalAT qui n'est pas codant et la partie 5' de l'intron 1 munie d'un site donneur d'épissage. Le site XbaI du polylinker de pUC18 est utilise pour introduire la séquence synthétique suivante XbaI (*) HpaI 5' TCTAGACTTGCTTCCCTTGCTGTGCCCCCTCCAGCAGACAGCCACGACGGTTAAC c-myc XbaI TCTAGA portant un site accepteur d'épissage (*) permettant l'epissage correct du transcript (la coupure se faisant entre G et C) et un site de clonage a extrêmités franches (HpaI) pour permettre la fusion avec le gène de FIX au niveau de régions exoniques.La séquence de ce fragment synthétique est identique à la portion du gène c-myc murin comprise entre le site XbaI situé 34 nucléotides en amont du site accepteur d'êpissage de l'intron 1 et le dernier nucléotide en 5' de l'ATG initiateur de c-myc [Ora B. et al. (1983) EMBO J. 2 p2375-2383]. Le site HpaI remplace donc la séquence correspondant à l'ATG initiateur et le premier codon. L'orientation de l'oligonucléotide synthétique est vérifiée par séquençage. Cette construction correspond au plasmide pTG3925. Pour pouvoir joindre le gène de FIX à cette construction, il est nécessaire de créer un site à extrêmité franche par mutagénèse dirigée dans le premier exon (exon A). Un fragment HindIII (4 kb) de lambdaTG1951 portant la partie 5' de la région promotrice du gène de FIX, l'exon A, et environ 600 pb de l'intron 1 est sous-cloné dans le vecteur M13TG130 [Kieny M.P. et al. (1983) Gene 26 p91-99] et un site SmaI est créé par mutagenèse dirigée en utilisant l'oligonucléotide suivant 5' GCATAACCCGGGCTAGCAG 3' Ce site est creé deux nucléotides en amont de llATG initiateur du gène de FIX. L'insert HindIII ainsi muté est réintégré dans le vecteur ppolyIII-I* donnant le plasmide pTG3913. La partie promotrice et le début du gène de alphalAT muni du site accepteur d'épissage sont isolés du vecteur pTG3925 par digestion EcoRI-HpaI et intégré entre les sites EcoRI-SmaI du plasmide pTG3913 générant le plasmide pTG3953. La fusion entre les deux fragments génomiques detruit les sites de clonage HpaI et SmaI et se fait dans une zone exonique (deuxième exon). L'ATG initiateur est fourni par le gène de FIX. Le sequençage de la zone de fusion (entre la séquence synthétique correspondant à c-myc murin et l'exon A de FIX) HpaIOSmaIO ...CAGACAGCCACGACGGTTGGTTATG... c-myc FIX indique qu'un nucléotide est perdu lors du clonage. La partie 5' du gène de FIX comportant l'intron 1 tronqué est reconstituée afin d'appliquer la même stratégie que précédemment pour l'assemblage du gène complet. A cet effet le fragment EcoRV-SalI isolé du plasmide pTG3952 est cloné entre les mêmes sites de pTG3953, donnant le plasmide pTG3957. Le plasmide final correspondant aux séquences génomiques de FIX sous le contrôle du promoteur alphalAT, pTG3962 (figure 4) est obtenu en insérant le fragment XhoI-SnaBI (9,9 kb) de pTG3957 entre les mêmes sites de pTG3921. Cette dernière étape de clonage est réalisée dans la souche E. coli BJ alors que les précédents sont réalisés dans la souche E. coli 5K. Dans pTG3962 (figure 4) le premier exon non codant du gène de alphalAT est conservé. Dans toutes les constructions, des sites uniques sont conservés en 5' de la région promotrice afin de pouvoir intégrer un bloc d'expression d'un oncogène susceptible d'induire l'apparition de cellules hépatiques tumorales exprimant de façon stable FIX humain recombinant en utilisant la technique décrite dans la publication européenne de brevet EP-A-0298807. Ce bloc comportera par exemple le promoteur de alphalAT et le premier exon non codant du gène de alphaNST fusionnés aux deux exons codants de c-myc. EXEMPLE 3 : Expression du FIX recombinant dans les souris transgéniques Pour tous les plasmides préparés précédemment, pTG3954, pTG3960 et pTG3962 les sequences dérivées de pBR322 sont retirées par digestion par des enzymes de restriction. Le fragment portant l'unité de transcription de FIX est purifié sur gradient de sucrose et injecté dans le pronucléus mâle d'un oeuf fertilisé. de souris hybrides de première génération issues du croisement d'une souris femelle C57/Bl6 avec un mâle SJL selon la technique connue de l'homme du metier. L'ADN des tissus de la queue des nouveau-nés est isolé de manièrè a vérifier l'intégration du gène codant pour FIX dans le génome de l'animal par analyse Dot-blot en utilisant une sonde correspondant à 1'ADN complémentaire de FIX humain (pTG397, décrit dans la publication européenne de brevet EP-A-0162782) marquée à l'isotope 32P. Du sang est prélevé sur les animaux positifs a l'hybridation et le niveau d'expression de FIX (FIX) exprimé en ssg/ml est déterminé dans le sérum par méthode ELISA en utilisant la trousse de dosage Diagnostica Stago (Asserachrom IX:Ag Réf. 0410). Le test est spécifique de FIX humain et montre peu ou pas de réaction croisée avec FIX murin. Tableau 1 Plasmide n de la sexe FIX fondatrice yg/ml pTG3960 I m 6,97 83 f 3,47 pTG3962 18 m 1,82 pTG3954 9 m 36,40 58 m 8,02 Le tableau 1 montre que l'expression la plus élevée est obtenue avec les constructions qui portent le promoteur du gène du facteur IX humain (pTG3954 et pTG3960) et qu'il n'est pas nécessaire d'avoir la totalité des introns pour obtenir un niveau élevé d'expression du gène codant pour FIX (pTG3954). EXEMPLE 4 : Transmission à la descendance. Les fondateurs (fond.) sont accouplés à des souris hybrides (C57 B16 X SJL) et le nombre total de nouveau-nés (tot.) et de nouveau-nés exprimant FIX (FIX) sont denombrés dans les générations F1 et F2, et le pourcentage (%) de souriceaux auxquels le gène codant pour FIX a été transmis est déterminé. Tableau 2 Plasmide n du F1 F2 fond. tot. FIX % tot. FIX pTG3960 1 91 9 10 112 30 27 83 6 1 17 - - pTG3962 18 11 4 36 58 16 28 pTG3954 9 8 1 13 23 10 44 58 40 14 35 3 3 100 Le tableau 2 montre que le gène codant pour FIX est transmis à la descendance de façon mendelienne a l'exception des animaux dérivés de la lignée TMTG3960-1 (plasmide utilisé lors de l'injection du pronucléus du fondateur - numéro du fondateur) qui présente une transmission de 10 % à la génération F1. Néanmoins, le gène de FIX est ensuite transmis à peu près de façon mendelienne à la descendance, génération F2 suggérant une distribution en mosaïque du transgène dans les cellules de fondateur. EXEMPLE 5 : Analyse de l'ARNm de FIX dans les souris transgéniques L'ARN total de plusieurs tissus (rein, rate, intestin et foie) est preparé à partir de souris transgéniques de la lignée TMTG3960-l (promoteur FIX, gène de FIX). Ces ARN sont séparés par électrophorèse sur gel 1 t agarose-formaldêhyde, transférés sur membrane nylon et hybridés à une sonde humaine radioactive marquée a l'isotope 32P (900 pb de la séquence. 3' non traduite du gène de FIX clonées dans ppolyIII-I*). La figure 5 montre que les ARN.messagers de FIX humain (environ 3 kb) sont détectés uniquement dans les tissus hépatiques des souris transgéniques de la lignée TMTG3960-l alors qu'aucun signal n'est détecté pour les ARN isolés des tissus autres que le foie ni dans le foie d'animaux contrôle. Des animaux transgéniques qui expriment le gène de FIX spécifiquement au niveau du foie ont donc été obtenus. D'autre part, lorsque les ARN messagers issus du foie de toutes les lignées de souris transgéniques sont analysés avec la même sonde, l'intensité du signal est globalement comparable au niveau d'expression (figure 6 > . EXEMPLE 6 : Analyse de FIX. A. Analyse de FIX par Western blot Du plasma est prélevé des souris transgéniques issues des lignées TMTG3960-1, TMTG3954-9 et TMTG3954-58. Une fraction est precipitée par le barium et après redissolution analysée par Western blot. La figure 7 montre que la protéine recombinante a une masse moléculaire similaire à celle de FIX isolé du plasma humain, ce qui indique que le produit obtenu est glycosylé (une protéine non glycosylée a une masse moléculaire plus faible, 50 kDa). I1 convient de noter que le produit recombinant semble plus homogène que FIX d'origine plasmatique qui forme toujours une bande diffuse sur le gel. B. Activité coagulante de FIX On détermine la concentration de FIX humain dans le plasma des souris des différentes lignées. Les résultats sont indiqués dans le tableau 3. La concentration est déterminée par test Elisa, désignée par FIX dans le tableau et exprimée en g/ml. Les différentes lignées sont identifiées par le numéro de la lignée (par exemple TMTG3960-1) suivi de la génération (par exemple I pour génération F1), suivi d'un numéro correspondant aux différentes souris. On peut noter que la concentration de FIX quantifiée chez les animaux de première genération de la lignée TMTG3960-1 est supérieure a celle determinée chez le fondateur (voir tableau 2) car ce dernier est mosaïque. Sur ces mêmes prélévements, l'activité de FIX humain est déterminée par un test de coagulation par la technique de dosage un temps [Austen and Rhymes (1975) A laboratory manual of blood coagulation, Blackwell Scientific]. L'activité est déterminée en U/ml par rapport a un plasma humain témoin (Stago lU/ml). Le plasma murin présente un bruit de fond important (de l'ordre de lU/ml). La préincubation des échantillons de plasma avec un anticorps polyclonal spécifique anti FIX humain réduit le niveau d'activité à celui du plasma murin. La différence entre la valeur sans anticorps et avec anticorps correspond à l'activité due à FIX humain recombinant qui est ensuite rapportée en ssg/ml dans le tableau 3 et désigné par activité de FIX (lU/ml = 5 ssg/ml de FIX dans du plasma humain normal pris en référence). On a indiqué dans le tableau 3 le rapport activité de FIX/FIX qui correspond au pourcentage de FIX recombinant actif dans les échantillons de plasma de souris transgéniques (%). Tableau 3 Animal FIX activité de FIX g/ml 4g/ml TMTG3960-1 I 3 25,5 22 86 -1 I 29 22,5 21 93 -1 I 46 29,2 22 75 TMTG3962-18 II 8 3,9 4,4 113 -18 II 9 2 2,3 116 TMTG3954-58 I 24 9,6 7,3 76 -9 II 16 19,8 19,8 100 Le tableau 3 montre que dans le plasma de souris transgéniques, FIX recombinant humain est biologiquement actif puisque les niveaux d'activité coagulante du produit recombinant correspond bien à la quantité mesurée dans le plasma murin, et ceci pour toutes les lignées. C. Test de précipitation au citrate de barium La qualité du produit est également vérifié par test de précipitation au sel de barium [Bajaj S.P. et al. (1981) J. Biol. Chem. 256 p253-259]. Les protéines gamma carboxylées s'adsorbent et coprécipitent avec le citrate de barium (sel insoluble) alors que les protéines non gamma carboxylees restent en solution. La quantité de FIX recombinant (tot) dans le plasma des souris transgéniques est déterminée avant traitement. Après traitement du plasma par le citrate de barium, la fraction adsorbée (ads) donc gamma carboxylée est redissoute puis quantifiée par test ELISA. Les quantités sont rapportées au volume de l'échantillon et donc données en ng. Le rapport Ads/tot exprimé en pourcentage (%) quantifie la proportion de FIX humain gamma carboxyle. Tableau 4 Animal ELISA en ng tot Ads. TMTG3960-1 I 3 1429 981 69 -1 I 46 1630 1104 67 -1 III 6 573 504 S8 TMTG3962-18 II 8 103 102 99 -18 II 9 152 152 100 TMTG3954-58 I 24 370 343 93 -9 II 16 536 440 82 Le tableau 4 montre que. la majorité du produit recombinant obtenu est gamma carboxylé puisque détecté dans la fraction insoluble. Par comparaison avec FIX humain d'origine plasmatique, on obtient un taux de précipitation de 80 à 100 % selon les expériences. D. Purification et caractérisation de FIX obtenu å partir des lignées TMTG3960-l et TMTG3954-9 FIX recombinant obtenu a partir d'animaux issus des lignées TMTG3960-1 et TMTG3954-9 est purifié par chromatographie d'immunoaffinité. La fraction eluée est passée sur HPLC phase réverse pour désaler le produit et la séquence N-terminale déterminée par dégradation d'Edman. Les résultats obtenus avec FIX issu des deux lignées indiquent que le produit sécrété dans le sang des animaux transgeniques correspond à FIX mature. On ne détecte aucune trace de précurseur de FIX. Le produit recombinant est donc homogène et correctement processé. La souche E. coli BJ transformée par le plasmide pTG3960 a été déposée le 19 juillet 1989 auprès de la C.N.C.M. 25, rue du Dr. ROUX 75724 PARIS sous le numéro I-893. REVENDICATIONS 1. Vecteur d'expression de FIX dans une cellule eucaryote supérieure comprenant un gène codant pour FIX et les éléments assurant son expression dans ladite cellule, caractérisé en ce qu'il comprend, en amont du gène codant pour FIX une partie au moins du promoteur du facteur IX humain suffisante pour permettre l'expression de FIX dans ladite cellule. 2. Vecteur selon la revendication 1 caractérisé en ce que le gène codant pour FIX comprend tous les exons codant pour FIX et au moins une partie d'un intron associé au gène génomique humain. 3. Vecteur selon la revendication 2 caractérisé en ce que le gène codant pour FIX comprend tous les exons codant pour FIX et au moins une partie de l'intron 1 associé au gène genomique humain. 4. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le gène codant pour FIX comprend les éléments suivants du gène génomique humain - I'exon A, - l'intron 1, tronqué de deux fragments PvuII respectivement de 3,6 kb et 1,3 kb, - les exons B à F séparés par les introns 2 à 5, - l'intron 6, tronqué de 7,1 kb, - les exons G et H séparés par l'intron 7 5. Vecteur selon l'une des revendications 1 a 3 caractérisé en ce que le gène codant pour FIX comprend les éléments suivants du gène génomique humain - l'exon A, - l'intron 1, - les exons B à H dépourvus des introns 2 à 7. 6. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le gène codant pour FIX comprend au moins une séquence flanquante en 5' et/ou en 3' naturellement associée au gène génomique humain et/ou un signal de polyadénylation. 7. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 6 pour l'expression de FIX dans des cellules hépatiques d'animaux transgéniques caractérisé en ce qu'il se trouve sous forme linéaire et pratiquement dépourvu de tout ADN bactérien. 8. Procédé de préparation de FIX caractérisé en ce qu'il comprend la succession d'étapes suivantes a) on introduit un vecteur selon l'une des revendications 1 à 7 dans un ou plusieurs oeufs d'un animal et on réimplante le ou les oeufs obtenus, b) on recherche les descendants exprimant FIX, c) on prélève le plasma des descendants sélectionnés et on extrait FIX produit. 9. Procédé selon la revendication 8 caractérise en ce que pour sélectionner les descendants exprimant FIX, on isole l'ADN à partir de la queue de nouveau-nés et on effectue une analyse Dot Blot dudit ADN en utilisant une sonde radioactive marquée a l'isotope 32p, d'ADN complémentaire du facteur IX humain. 10. Procédé selon l'une des revendications 8 a 9 caractérisé en ce que l'animal est une souris. 11. FIX susceptible d'être obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 8 a 10. 12. Procédé de préparation d'une lignée cellulaire stable produisant FIX actif caractérisé en ce que a) on prépare un vecteur selon l'une des revendications 1 à 7 comportant également une-séquence oncogène ainsi que les éléments assurant son expression dans une cellule eucaryote supérieure, b) on introduit ledit vecteur dans un ou plusieurs oeufs d'un animal et on réimplante les oeufs obtenus, c) on sélectionne les descendants ayant intégré l'oncogène et qui developpent des tumeurs, d) on prélève et on cultive sur un milieu approprié les cellules tumorales ainsi obtenues et qui produisentFIX afin d'obtenir une lignée cellulaire. 13. Procédé de préparation d'une lignée cellulaire stable produisant FIX actif caractérisé en ce que a) on prépare un vecteur selon l'une des revendications 1 à 7, on l'introduit dans un ou plusieurs oeufs d'un animal et on réimplante le ou les oeufs obtenus, b) on prépare un vecteur comportant une séquence oncogène ainsi que les éléments assurant son expression dans une cellule hépatique, on l'introduit dans un ou plusieurs oeufs d'un autre animal et on réimplante le ou les oeufs obtenus, c) on recherche d'une part les descendants ayant intégré le gène codant pour FIX et l'exprimant, d'autre part les descendants ayant intégré l'oncogène et qui développent des tumeurs, d) on croise deux descendants tels que sélectionnés à l'étape c), e) on recherche les doubles transgéniques exprimant les deux transgènes, f) on prélève et on cultive sur un milieu approprié les cellules tumorales obtenues et qui produisent FIX afin de dériver une lignée cellulaire. 14. Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13 caractérisé en ce que avant d'être cultivées les cellules tumorales prélevées sont réinjectées dans un autre animal pour induire le développement de nouvelles tumeurs dont les cellules seront cultivées pour obtenir une lignée cellulaire. 15. Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13 caractérisé en ce que les cellules tumorales prélevées et cultivees sont celles d'un animal d'une génération suivante developpant également des tumeurs.