FR 2657880 A1 19910809 FR 9001239 A 19900202 L'invention concerne l'expression de produits protéiques par utilisation des techniques de l'ADN recombinant, et plus particulièrement l'expression drérythropoïétine humaine biologiquement active à partir de cellules lymphoïdes humaines transfectées de façon stable. La production de protéines à forte valeur ajoutée par culture de cellules eucaryotes connaît actuellement un important développement. L'intérêt des cellules eucaryotes dans la production des protéines recombinantes réside essentiellement dans la capacité de ces cellules à effectuer une maturation des protéines permettant à la fois l'obtention de molécules biologiquement actives ainsi que leur compatibilité vis à vis d'un organisme receveur. C'est le cas par exemple pour des protéines telles que le facteur VIII, le facteur IX ou l'Epo. A l'échelle industrielle, l'amélioration des procédés de culture en masse repose principalement sur l'innovation technologique dans le domaine des bioréacteurs (Mizrahi, Biotechnology 4, 123, 1986; Arathoon and Birch, Science 232, 1390, 1986). Toutefois, les cellules cultivées et les protéines secrétées ont des caractéristiques très diverses et une optimisation systématique des paramètres de culture doit être entreprise pour chaque lignée afin d'atteindre la productivité souhaitée (Martin et al, Biotechnology, 5, 838, 1987). Il est clair que d'importants efforts doivent être fournis pour mettre au point des systèmes à fort potentiel d'expression et de définir les méthodes qui permettent le choix précoce de clones performants. La plupart des systèmes d'expression utilisés actuellement ont été développés à l'aide de cellules eucaryotes d'origine animale (cellules CHO, BHK, Vero etc...) et relativement peu concernent des cellules humaines. L'utilisation de lignées lymphoblastoïdes humaines comme cellules hotes est une méthode avantageuse compte tenu de l'importante capacité de synthèse protéique de ce type cellulaire. D'autre part, les cellules lymphoblastoïdes sont largement utilisées pour la production d'anticorps monoclonaux humains et leur technique de culture a fait l'objet d'importants efforts de recherche à l'INTS. Dans les laboratoires de 1'INTS un milieu de culture défini a été mis au point (Drouet et al, Biosciences 5, 75, 1986 ; brevet 8608494) et son utilisation étendue à la culture continue. La présente invention propose donc d'utiliser des lignées lymphoblastoïdes humaines immortalisées par le virus d'Epstein Barr ou des hétéromyélomes exprimant ou non l'antigène nucléaire EBNA1 de l'EBV pour l'expression de gènes clonés en développant à la fois des vecteurs d'expression à replication autonome dans ces cellules et des systèmes d'intégration stable dans l'ADN cellulaire. Le système épisomal d'expression proposé comporte deux éléments du génome du virus Epstein-Barr, la région OriP qui joue le rôle d'origine de réplication par action en cis sur des séquences porteuses de cet élément et le gène codant pour l'antigène EBNA1 qui permet de promouvoir et de maintenir la réplication autonome en agissant en trans sur OriP. L'Epo est une glycoprotéine de 36 kDa comprenant 40 à 50 % de glucides, qui régule la production des érythrocytes en stimulant la prolifération, la différenciation et la maturation des progéniteurs érythroides (Goldwasser et al, Blood Cells, 10, 147, 1984 ; Browne et al, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, L 1 693, 1986 ; Zanjani et al, Transfusion, 29, 46, 1989). L'Epo humaine est produite dans le rein de l'homme adulte sain et présente dans le plasma à très faible concentration (10 à 20 mU/ml). La protéine mature est constituée d'une seule chaine polypeptidique de 166 acides aminés mais l'Epo urinaire (et la recombinante) ne comporte que 165 acides aminés par élimination de l'arginine C-terminale en position 166 (Recni et al, J. Biol. Chem. 262, 17156, 1987). L'effet stimulant de l'Epo sur la formation des érythrocytes fait de ce facteur un agent thérapeutique majeur dans le traitement de l'anémie des insuffisants rénaux, des malades hémodialysés ainsi que pour le rétablissement postopératoire des patients. Bien qu'on connaisse des méthodes de production de l'po humaine, par exemple un procédé par extraction à partir d'urine de patients aplasiques (Mikake et al, J, Biol. Chem. 252, 5558, 1977), et un procédé par culture tissulaire de cellules tumorales rénales humaines (Sherwood et al, Endocrinology 99, 504, 1976), ces procédés ne permettent pas la production en masse d'Epo hautement purifiée La technologie des ADN recombinants associée à l'utilisation de cellules animales comme cellules hôtes permet aujourd'hui de résoudre ce problème de production d'érythropoïétine. Le clonage de l'ADNc érythropoïétine à partir d'une banque d'ADNc de foie foetal humain, ainsi que le clonage du gène Epo à partir d'une banque génomique ont été décrits par Jacobs et al (Nature 3 13, 806, 1985) puis par Lin et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82. 7580, 1985) et Powel et al (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83, 6465, 1986). L'expression de l'Epo humaine recombinante (Epo HR) a pu être obtenue à l'aide d'un vecteur réplicatif dans des cellules COS (rein de singe) (Brevet Kirwin-Amgen, Inc nO 0148605 A2, Brevet Genetics Institute, Inc n" WO 86/03520). Dans ce système l'expression de l'Epo est transitoire. Une expression stable d'Epo a été décrite dans des cellules CHO dhfr (ovaire de hamster chinois) à l'aide d'un vecteur intégratif contenant le gène DHFR (Brevet Kirin-Amgen, Inc nO 0148605 A2, Brevet Genetics Institute, Inc n" WO 86/03520, Brevet University of Washington n" 0255231A1). L'Epo a également été produite dans des cellules BHK (rein de hamster) (Brevet University of Washington n00255231A1). Dans les deux cas, des lignées stables, sélectionnées pour leur capacité à résister au méthotréxate (MTX) et à exprimer un niveau élevé d'Epo ont été obtenues. Les auteurs montrent également que les lignées cellulaires transfectées expnment et secrètent de l'Epo biologiquement active in vitro et in vivo. De l'Epo HR a également été produite dans des cellules de rein de hamster (BHK) et dans des fibroblastes murins NIH/3T3 (Brevet University of Washington, nO 0225 231 Al) et Goto et al, Biotechnology 6 67 1988 (Brevet Snow Brand Milk Products Co Ltd nO 0236059 A2), ainsi que dans des cellules épitheliales de souris (C127) à l'aide d'un replicon viral (BPV) (Brevet Integrated Genetics, Inc nO 0267678 Al). Une Epo HR a été produite dans des cellules d'insecte infectées par un baculovirus recombinant (Wojchowski et al, Biochim. Biophys. Acta 910, 224, 1987) et dans les levures (Elliot et al, Gene 79, 167, 1989). Bien que globalement assez efficaces en termes quantitatifs, les systèmes d'expression utilisés présentent tous divers inconvénients. Par exemple l'Epo HR produite dans les cellules d'insecte n'est pas correctement glycosylée (absence d'acides sialiques) et l'hormone produite est biologiquement inactive in vivo (Quelle et al, Blood 74, 652, 1989). Cette observation s'accorde bien avec le rôle des glucides, et plus particulièrement de l'acide sialique, sur l'activité biologique de l'hormone qui est connu depuis longtemps (Lowg et al, Nature 185, 102, 1960 ; Goldwasser and Kung, J. Biol. Chem. 247, 5159, 1972). Bien que l'Epo HR produite par les cellules CHO soit biologiquement active et utilisée en thérapeutique humaine (Eschbach et aI, N. Engl. J. Med. 316, 73, 1987), ces cellules ainsi que les cellules BHK engendrent des complications d'exploitation à l'échelle industrielle à cause de leur mode de culture (cellules attachées). Par ailleurs on observe une hétérogénéité de glycosylation en particulier du taux de sialylation qui est crucial pour l'activité biologique in vivo (Sasaki et al, Biochemistry 27, 8618, 1988 ; Takeuchi et al, J. Biol. Chem. 263, 3657, 1988 ; Tsuda et al, Biochemistry 27, 5646, 1988 Fukuda et al, Blood , 84, 1989). Pour éviter les difficultés liées au mode de culture dépendant du support des cellules précitées, le groupe Sumitomo Chemical Compagny Ltd (brevet nO 0232034) utilise des cellules humains, en particulier des cellules Namalwa, qui ont un taux de multiplication cellulaire élevé et dont le mode de culture est la suspension. L'Epo HR produite par ces cellules possède des caractéristiques proches de celles de l'Epo urinaire et est biologiquement active in vitro et in vivo (Yanagi et al, DNA, 8. 419, 1989 ; Gene 76, 19, 1989). Un inconvénient de ce système est la tumorigénicité de ces cellules, dérivées d'un lymphome de Burkitt. C'est pourquoi la présente invention propose une lignée de cellules lymphoblastoïdes produisant une protéine déterminée, caractérisée en ce qu'elle a été transformée par un vecteur d'expression de ladite protéine comportant - un promoteur efficace dans des cellules humaines d'origine hématopoïétique, - une séquence leader ligaturée en 5' de la séquence codant pour ladite protéine, - un signal de polyadénylation en 3' de la séquence codante. En effet, considérant que les cellules hôtes les plus appropriées pour la production d'érythropoïétîne humaine restent les cellules humaI nes, l'utilisation, à des fins de production, de cellules lymphoblastoïdes humaines qui sont, soit établies à partir des leucocytes du sang périphérique d'un individu sain, soit obtenues par transformation in vitro à l'aide du virus Epstein-Barr (EBV), paraît la plus satisfaisante. De telles cellules prolifèrent de manière indéfinie en culture mais elles ne sont pas malignes et en particulier elles ne sont pas clonogéniques en agar ou tumorigéniques chez les souris nude (Tursz, MédecinelSciences, 6 (suppl.), 42, 1989). Dans les deux cas, ces cellules synthétisent l'antigène nucléaire EBNA-1 de l'EBV.Un troisième type de lignée peut également être utilisé, par exemple d'un hétéromyélome obtenu par fusion d'une lignée de lymphocytes B humains transformés in vitro par l'EBV et d'un myélome de souris. Par suite de la perte de certains chromosome humains, cette cellule est EBNA-. L'INTS a acquis une excellente expérience dans le développement et la production d'anticorps monoclonaux humains produits par des cellules lymphoïdes immortalisées in vitro par l'EBV. La production est facilitée par le fait que les cellules poussent en suspension et la culture est réalisée selon le mode batch ou en culture continue. Par ailleurs, un milieu de culture pauvre en protéines a été établi afin de faciliter la purification des immunoglobulines secrétées par ces cellules (brevet INTS n F2600076). D'autre part, la capacité de synthèse et de sécrétion élevée d'immunoglobulines conservée après immortalisation de ces cellules rend compte de leurs potentialités sécrétrices pour la production d'une protéine étrangère. Un tel système peut donc être avantageusement utilisé pour la production de protéines recombinantes. Comme des lignées d'hétéromyélomes homme-souris se sont avérés d'un grand intérêt pour stabiliser des cellules lymphoïdes B produisant des anticorps humains monoclonaux (Teng et al, PNAS 80, 7308, 1983), nous utiliserons de telles cellules d la fois comme partenaire de fusion des lignées lymphoïdes B productrices de protéines recombinantes et comme cellule hôte pour la production stable des protéines recombinantes après transfection par les vecteurs d'expression. L'invention concerne donc des lignées de cellules lymphoblastoïdes humaines et des hétéromyélomes capables de produire un grand nombre de protéines, notamment de l'Epo humaine, le mode de culture de ces cellules et la purification d'une Epo active à partir des surnageants de culture. Les plasmides décrits spécifiquement dans cette invention sont des vecteurs d'expression du gène de l'Epo mais peuvent être tout aussi bien utilisés comme vecteurs d'expression de l'ADNc de l'Epo dont l'isolement est décrit dans cette invention, de même que pour l'expression d'autres protéines. Pour préparer une lignée cellulaire productrice d'Epo, il faut d'abord construire un vecteur d'expression. Ce vecteur d'expression, doit contenir une unité de transcription fonctionnelle dans la cellule hôte choisie. Le promoteur d'un virus comme l'Adenovirus 5 (Ad5) capable de se répliquer dans des cellules humaines d'origine hématopoïétique (Iymphoïdes et myéloïdes) est approprié. On peut également prévoir une séquence leader, par exemple, le promoteur majeur tardif (MLP) de l'Ad2, couplé à une copie ADNc de la séquence leader tripartite d'Ad2 (qui permet une augmentation de l'efficacité de traduction de 1'ARN messager) est ligaturé à l'extrémité 5' de l'ADN codant pour l'Epo et un signal de polyadénylation notamment le signal dérivé du virus SV40 est ligaturé à l'extrémité 3'. Une séquence activatrice de la transcription efficace dans les lymphocytes humains est de préférence ajoutée en amont du MLP. La séquence activatrice du gène E1A d'Ad5 est utilisée. Le vecteur comportera également un gène marqueur, par exemple un gène de sélection dominant d'origine bactérienne; c'est le gène codant pour la xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (XGPRT) qui est présent sur les vecteurs spécifiquement décrits pour permettre de sélectionner les cellules transformées (Mulligan and Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 2072, 1981). Pour une traduction optimale de l'ARN messager, notamment de l'Epo, la région d'Ad5 codant pour les ARN VAI et VAII est ajoutée sur le vecteur d'expression. La structure de ce plasmide de base pTS17 est représentée sur la Figure 1. L'invention propose également deux procédés qui permettent d'obtenir l'établissement de lignées stables productrices d'Epo. Dans un premier procédé le vecteur contenant le gène Epo est intégré dans les chromosomes de la cellule hôte. Dans le second procédé le vecteur contenant le gène Epo se réplique de façon autonome dans le noyau des cellules. L'avantage de ce second système est d'éviter de placer le gène Epo sous l'influence de séquences en cis, comme cela peut se produire après intégration chromosomique. Dans le premier cas, un fragment d'ADN murin d'origine mitochondriale est ajouté au vecteur pour donner des plasmides tels que le plasmide pTS39 (Figure 2). Ce fragment a été décrit comme permettant une multimérisation en tandem du vecteur au cours de l'intégration dans le génome de cellules de mammifères (Lutfalla et al. Somatic Cell. and Mol. Genetics 11, 223, 1985) et par conséquent devrait permettre une expression plus élevée d'Epo. Dans le second cas, la région oriP du virus EB ou bien la région OriP et le gène EBNA-1 d'EBV sont ajoutées au vecteur pour donner des plasmides tels que respectivement les plasmides pTS53 et pTS59 (Figure 3). La protéine EBNA-1 agit en trans sur la région oriP. Elle permet de promouvoir et de maintenir la réplication autonome de la séquence d'ADN qui porte oriP. Ce mécanisme de replication autonome a été partiellement élucidé par Sugden et collaborateurs (Yates et al, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 8 1 3806, 1984 (Sugden) et al, Mol. Cell. Biol. 5, 410, 1985; Reissman et al, Mol. Cell. Biol. 5, 1822, 1985, Yates et al, Nature 313, 812, 1985 ). L'efficacité d'un tel système à diriger la synthèse de protéines recombinantes a été récemment démontrée, par exemple dans le cas du TNF (Kioussis et al, EMBO J. 6, 355, 1987), de l"INF-t et de l'EGF-R (Young et al. Gene 62 171, 1988) et de l'hémagglutinine du virus de l'influenza (Jalanko et al, Gene 7 287, 1989). Ce système est également utilisable pour construire des banques d'ADNc et le clonage direct de gènes par des techniques d'expression (Margolskee et al, Mol. Cell. Biol. 8, 2837, 1988). En général le nombre de copies du vecteur est de 20 à 200 par cellule selon les promoteurs et séquences activatrices utilisées (Jalanko et al, Biochem. Biophys. Acta 949, 206, 1988 ; Hauer et al, Nucleic Acids Res. 1 7, 1989, 1989). Une variante du système épisomal consiste à utiliser une cellule exprimant la protéine EBNA-1 de manière constitutive et des vecteurs d'expression ne contenant que la séquence oriP.Une telle cellule peut être construite par intégration du gène EBNA-1 dans une lignée HepG2 (Luftalla et al, Gene ff6, 27, 1989) ou bien, comme dans cette invention, par immortalisation de cellules humaines lymphoïdes B par le virus d'Epstein-Barr (Thoda et al, Cancer Res. 3 8, 3560, 1978 ; Anderson and Gusetta, In vitro 20, 856, 1984). La méthode utilisée pour introduire l'ADN dans les cellules lymphoblastoïdes est l'électroporation (Potter et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA; 81, 7161, 1984). Les cellules lymphoblastoïdes humaines utilisées comme cellules hôtes, proviennent de trois sources distinctes - de 1'ATCC sous la référence CCL156 RPMI 1788 pour les cellules établies à partir des leucocytes du sang périphérique d'un individu sain (Huang and Moore, J. Natl. Cancer Inst. 34, 1119, 1969) - de l'INTS en ce qui concerne les lymphocytes B prélevés chez un donneur sain et immortalisés in vitro par l'EBV selon un protocole décrit à 1'INTS pour la production d'anticorps monoclonaux humains (Goossens et al, J. Immunol. Methods, 101, 193, 1987). - de l'INTS en ce qui concerne l'hétéromyélome 1C5E2 obtenu par fusion d'une lignée de lymphocytes B humains transformés in vitro par l'EBV (H2D5D2B6) et d'un myélome de souris (B6Ag) Par suite de la perte de certains chromosomes humains, cette cellule est EBNA-. - de 1'ATCC sous la référence CRL 1668 en ce qui concerne l'hétéromyélome SHMD33 (EBNA-) obtenu par fusion d'une cellule de myélome humaine (FU-266 cloné E-I) avec le myélome de souris P3X63Ag 8,653 (Teng et al, PNAS 80, 7308, 1983). - de l'INTS en ce qui concerne l'hétéromyélome obtenu par fusion du clone producteur d'Epo 156 0,5 F8 avec l'hétéromyélome SHMD33. Les cellules transformées productrices d'Epo HR sont propagées dans des flacons ou boîtes de culture en milieu Iscove, 10 % SVF. L'Epo HR secrétée dans le milieu de culture est purifiée par des méthodes qui dérivent de celles décrites, pour la purification de l'Epo issue de sources naturelles (Miyake et al, J. Biol. chem. 252, 5558, 1977 ; Krystal et al, Blood 67, 71, 1986). Le gène humain de l'Epo utilisé dans l'invention a été isolé à partir d'une banque d'ADN génomique à l'aide d'un oligonucléotide de synthèse déduit de la séquence du gène. L'ADNc de l'Epo a été isolé à partir des ARN totaux d'une tumeur rénale humaine produisant de l'Epo par la méthode de polymérisation en chaine (PCR), à l'aide de deux oligonucléotides de synthèse encadrant l'ARN messager de l'Epo. Les paragraphes suivants donnent une description détaillée de l'invention. I1 est entendu que cette invention n'est pas restreinte à la production d'Epo recombinante par des cellules humaines mais s'étend également à la production de n'importe quelle protéine recombinante à l'aide des systèmes d'expression décrits dans l'invention. La présente invention concerne également un procédé de production de protéines caractérisé en ce qu'on cultive dans un milieu de culture approprié une lignée cellulaire telle que décrite précédemment et en ce qu'on récupère la protéine désirée. Ce procédé est plus particulièrement utile dans la préparation de l'Epo et de ses analogues, c'est-à-dire les fragments actifs et les variants de l'Epo. Les exemples ci-après permettront de mieux mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. Sur les figures annexées, Figure 1 : Plasmide de base (pTS17) servant à la construction des vecteurs de type intégratif (pTS39) et réplicatifs (pTS53 et pTS59). E : sequence activatrice du gène ElA d'Ad5 ; MLP : promoteur majeur tardif d'Ad2 ; L: copie ADNc de la séquence leader tripartite d'Ad2 ; Epo région codante du gène de l'Epo ; pA : signal de polyadénylation du virus SV40 ; XGPRT : gène bactérien codant pour la xanthine guanine phosphorybosyl transférase ; VA : gènes d'AdS codant pour les ARN VA. Figure 2 : Vecteur d'expression de type intégratif pTS39. ADN mito : fragment d'ADN murin d'origine mitochondriale. Un second gène de sélection (DHFR) est placé en position bicistronique en aval de la région codante du gène de l'Epo. I1 n'est pas utilisé comme agent de sélection dans l'invention. Un tel vecteur présente cependant l'avantage d'être utilisable également dans des cellules dhfr- voire dhfr+, afin de permettre une amplification génique en présence du MTX. Figure 3 : Vecteurs d'expression de type réplicatif pTS53 et pTS59. SV : enhancer et promoteur précoce du virus SV40 ; oriP : origine de réplication du virus EBV ; EBNA : gène EBNA1 du virus EBV. Figure 4 : Protocole de clonage du gène de l'Epo. Figure 5 : Protocole de clonage de l'ADNc de l'Epo. Figure 6 : Construction des vecteurs pTS39, pTS53 et pTS59. E ; séquence activatrice du gène E1A d'Ad5 ; MLP : promoteur majeur tardif d'Ad2 ; L123 : séquence leader tripartite d'Ad2 CAT . gène bactérien codant pour la chloramphénicol acétyl transférase ; pA : signal de polyadénylation du virus SV40 ; Lî polylinker du pUC18 ; L2 : polylinker de synthèse ; VA : gènes VA d'AdS codant pour les ARN VA ; XGPRT : gène bactérien codant pour la xanthine-guanine-phosphoribosyl transférase ; Epo : région codante du gène de l'Epo ; mito : fragment d'ADN murin d'origine mitochondriale ; DHFR : ADNc murin codant pour la dihydrofolate reductase ; oriP : origine de réplication du virus EBV ; EBNA : gène EBNA1 du virus EBV. ISOLEMENT DU GENE HUMAIN DE L'ERYTHROPOIETINE Nous avons choisi de cribler une banque d'ADN génomique avec un oligonucléotide de 30-mer : 5'-CGTGATATTCTCGGCCICCTTGGCCTCCAA- 3' déduit de la séquence du gène (Lin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA X, 7580, 1985). Cette sonde est complémentaire inversée de l'ARN messagers et elle reconnaît la séquence de l'Epo en position 129-159 (la base nO 1 représentant l'initiation de la traduction). Avant d'utiliser cette sonde pour cribler une banque, les conditions d'hybridation ont été testées en Southern. Ces conditions étant contrôlées nous avons criblé une banque d'ADN génomique provenant de Clontech (ref ML 10006). Le vecteur de clonage est EMBL 3, il contient des fragments insérés d'ADN humain de 12 à 20 kb. Nous avons étalé 107 clones répartis sur 10 boîtes de 15 cm de diamètre. Trois séries de filtres, répliques de ces boîtes, ont été lavées et hybridées avec les sondes oligonucléotidiques marquées à l'aide de la T4 polynucléotide kinase. L'activité spécifique de cette sonde était de 109 cpm/g. Les conditions d'hybridation ont été les suivantes -Pré-hybridation : 6 SSC, 2 X Denhardt's, 0,005 % Tétra-sodium disphosphate (Nappi), 100 llg/ml sperme de saumon, 520C pendant 4 h. -Hybridation : 6 SSC, 2 X Denhardt's, 0,05 % Nappi, 20 Rg/ml tARN 520C pendant la nuit avec la sonde Epo (106 cpm/ml par filtre). -Lavage : 2XSSC température laboratoire, 2 X SSC 0,005 % Napi 3 x 20 min. à 520C. Dans ces conditions classiques environ 1/20 à 1/30 des clones par filtre sont révélés, tous en triplicate. Statistiquement, en fonction de la représentativité de la banque, nous devrions avoir au maximum 3 clones par filtre qui hybrident spécifiquement avec cette sonde. Afin d'obtenir ce résultat, différentes conditions d'hybridation et de lavage ont été réalisées sur 9 clones prélevées à l'issu du criblage primaire -pré-hybridation et hybridation en 3xSSC au lieu de 6 X SSC, -température d'hybridation et de lavage à 550C et 570C -lavage supplémentaire en 1 X SSC, 0,05 % Nappi à 520C pendant 20 min et/ou 0,1 SSC, 0,05 % Nappi à 520C pendant 20 min. Un criblage tertiaire puis quaternaire a ensuite été réalisé pour aboutir à la caractérisation de 3 clones purs hybridant très fortement avec la sonde. L'ADN de ces 3 phages a été amplifié, puis analysé. Afin de contrôler la présence du gène Epo dans son intégralité, nous avons construit la carte de restriction de ces 3 clones, recherché la présence des extrémités 3' et 5' du gène Epo en utilisant deux sondes oligonucléotidiques reconnaissant les bornes de ce gène. Ce travail nous a permis de montrer que deux clones parmi les trois contenaient le gène Epo dans son intégralité. Des fragments de restriction contenant le gène Epo dans son intégralité ont été sous clonés dans un vecteur d'amplification du type pUC. Ainsi les deux fragments de restriction B amHI-HindIII de 5.4 kb et BglII-Bg;lII de de 4 kb ont été sous clonés suivant la procédure résumée dans la Figure 4. ISOLEMENT DE L'ADNc HUMAIN DE L'EPO Nous avons isolé les ARN totaux d'une tumeur rénale humaine exprimant de façon constitutive l'Epo. A partir de ces ARN totaux la fraction ARN poly A+ a été isolée par passage sur colonne d'oligo-dT. Nous avons alors contrôlé par la technique de Northern que cette population d'ARN poly(A+) exprimait le messager codant pour l'Epo. Pour cloner l'ADNc de l'Epo, deux techniques peuvent être utilisées : soit la construction d'une banque d'ADNc et criblage avec une sonde spécifique de l'Epo, soit le clonage direct de l'ADNc de l'Epo par la méthode PCR. Nous avons choisi la deuxième méthode.Pour cela, deux sondes encadrant l'ADNc de l'Epo ont été choisies INTS 10 : 5'-CTGGAGTGTCCATGGGACAG-3' Cet oligonucléotide (20-mer) est en position 694 par rapport à l'adénosine 1 de l'ATG (initiation de la traduction du messager Epo). Cet oligonucléotide reconnaît la séquence inverse complémentatire de l'ARNm de l'Epo et borne la partie 3' de l'ADNc. .INTS 9 : 5'-AGGCGGGAGATGGGGTGC-3' Cet oligonucléotide (20-mer) est dans le même sens que l'ARNm et borne la partie 5' de l'ADNc de l'Epo (position-10 par rapport à l'adénosine 1 du codon d'initiation). La sonde INTS 10 nous permet de recopier la matrice ARNm de l'Epo en utilisant la reverse transcriptase. L'ARNm est ensuite dégradé à la soude pendant 1 heure à 650C. Cet ADNc simple brin peut-être alors amplifié par la technique PCR en utilisant les deux sondes bornant l'ADNc : INTS 10 et INTS 9. Nous avons ainsi amplifié un fragment d'ADN de 723 pb qui a été, après électrophorèse, cloné dans un vecteur d'amplification du type pUC puis séquencé. Le protocole de clonage de l'ADNc de l'Epo est résumé dans la Figure 5. CONSTRUCtION DES VEGIBURS D'EXPRESSION - VECTEURS DE TYPE INTEGRATIF Le vecteur d'expression de type intégratif pTS39 représenté sur la Figure 2 a été construit de la façon suivante Le plasmide de départ est le pMLP10 (Ballay et al, Hepadna Viruses, 481, 1987, Alan R. Liss, Inc.) schématisé dans la Figure 6. Le plasmide pMLPCAT dérive du pMLP 10 par insertion du fragment HindIII-BamHI du pHp34-CAT contenant le gène CAT et les signaux de maturation de SV40 (P. Gilardi et al, Nucleic Acid Research 20. 7877-7887, 1984) entre les sites HindIII et BamHI du pMLP10. Le plasmide pTS1 a ensuite été obtenu par insertion du polylinker EcoRI-HindIII de pUC18 au niveau du site NruI du pMLPCAT.Le plasmide pTS2 dérive du pTS1 par insertion de l'oligonucléotide de synthèse suivant -AGCTTGCGGCCGCGGTTACCAGATCTACGCGTGTT-3' -ACGCCGGCGCCAATGGTCTAGATGCGCACAA-5' contenant les sites rares NotI, SacII, BstEII, BglII, MluI entre les sites HindIII-HDaI du pTS1. pTS5 est ensuite obtenu en insérant le fragment HindIII du pAG60VA (contenant les gènes VAI et VAII d'AdS) au niveau du site XbaI du pTS2. Le plasmide pTS17 dérive du pTS5 par insertion du fragment PvuII de pAGT40 (contenant le gène XGPRT sous le contrôle du promoteur et des signaux de maturation du gène Tk du virus HSV1) au niveau du site SmaI de pTS5.Le plasmide pTS29 a ensuite été obtenu en insérant le fragment génomique BstEII-BglII (contenant le gène de l'Epo) entre les sites Hindîli et BglIII du pTS17. pTS37 dérive de pTS29 par insertion du fragment EcoRI-PvuI du p81 (contenant une séquence d'ADN mitochondrial) au niveau du site SacI du pTS29. Enfin, pTS39 a été obtenu en insérant le fragment BamHî-BglII du pTG1086 (contenant la région codante du cDNA DHFR murin) au niveau du site BglII de pTS37 (Figure 6). -VECTEURS DE TYPE REPLICATIF Deux vecteurs de type réplicatif ont été construits -pTS53, dans lequel la séquence OriP nécessaire a l'obtention d'un réplicon a été isolée à partir du plasmide p220.2 (Sugden et al. Mol. Cell. Biol. 5, 410, 1985) à l'aide de l'enzyme AccI et insérée dans le site SacI du vecteur pTS29 (Figures 3 et 6). - pTS59 dans lequel les séquences OriP et EBNA-1 de l'EBV ont été isolées à partir du plasmide pTS48 (variant du p220.2 contenant le gène EBNA-1 sous le contrôle de l'enhancer et du promoteur précoce du virus SV40) à l'aide des enzymes Eco RI et BamHl puis insérées dans le site SacI du vecteur pTS29 (Figures 3 et 6). Ce dernier vecteur a été construit dans le but d'observer l'effet d'une surexpression de EBNA-1 sur le nombre de copies de replicons dans une cellule EBNA+, et également d'obtenir un réplicon dans une cellule EBNA TRANSFECTION DES CELLULES ET SELECTION DES TRANSFORMANTS La transfection est réalisée avec un électropulsateur "Bioblock" 68701. Deux solutions acqueuses sont préparées préalablement Le milieu de fusion : Inositol 250 mM, KH2PO4 1 mM, Mg Acétate 0,5 mM, Ca Acétate 0,1 mM ; pH 7,4. Le milieu post-fusion : NaCl 132 mM, KCI 8 mM, KH2PO4 1 mM, Mg Acétate 0,1 mM, Ca Acétate 0,1 mM ; pH 7,4. Après 2 jours de culture, les cellules sont lavées et ajustées à 4.107/ml dans le milieu de fusion. La suspension est incubée 10 min à 0 C en présence de l'ADN à transfecter (5 ug/106 cellules). Un échantillon de la suspension est placé entre les électrodes de l'appareil et l'électroporation est conduite dans les conditions suivantes : 4 impulsions rectangulaires à 1 seconde d'intervalle de durée 100 uS, avec un champ électrique de 1.500 V/cm2. Immédiatement après le choc électrique la suspension est diluée au 1/20 puis incubée 20 min à 370C. La viabilité des cellules se situe entre 20 et 60 %. Les cellules sont ensuite mises en culture à une concentration de 0,5 106 cellules/ml. 48 heures après la transfection un aliquot du surnageant est prélevé pour le dosage de l'Epo. Les cellules sont alors cultivées en milieu sélectif (Iscove, 10 % SVF dialysé, acide mycophénolique 1 ug/ml, xanthine 250 ug/ml). Après 14 a 21 jours de sélection sur le pool, des clonages par dilution limite sont réalisés en microplaques de 96 puits en présence de cellules nourricières (lymphocytes humains totaux, irradiés à 4000 rds, issus de donneurs sains). PRODUCTION D'EPO HR PAR LES CELLULES TRANSFORMEES * Cellules CCLl56 - avec le vecteur d'expression pTS39 (système intégratif) Environ 6.106 cellules CCL156 sont transfectées par électroporation avec 30 ug d'ADN plasmidique, puis soumises 48 h après transfection, au milieu sélectif. La population résistante est clonée par dilution limite en présence de cellules nourricières (lymphocytes humains irradiés). Parmi les différents clones obtenus, le clone 156 0,5 AF8 secrète environ 100 unités d'Epo par ml de milieu de culture/72 h et a été suivi à long terme en présence et en absence de pression de sélection. Les résultats présentés sur le Tableau 1 montrent que ce clone est stable sur 48 passages soit environ 7 mois de culture en l'absence de pression de sélection. Des mises au point de culture en grands volumes sont en cours : en roller, le clone 0,5 A F8 secrète 80 à 100 U Epo/ml sur trois jours de culture en milieu pauvre en protéines CK4 ou CK4N (milieu de base : mélange Iscove-Ham F12 (1:1); CK4: suppléments : albumine humaine 50 mg/l, transferrine humaine (saturée à 30 % par ajonction de FeC13) 1 mg/l, insuline bovine 3 mg/l, acide linoléique 1 mg/l, putrescine 10 1M, éthanolamine 20 I1M; CK4N, idem plus ribonucléotides: Adenosine 100 mg/l, Cytidine 100 mg/l, guanosine 100 mg/l, Uridine 100 mg/l). Ce taux de sécrétion peut être renouvelé 3 fois si le milieu est changé tous les 3 jours. Un essai d'amplification au méthotrexate (MTX) du gène DHFR a été réalisé sur ce clone entretenu sans milieu sélectif. Pour des doses de MTX inférieures ou égales à 20 nM la cellule sauvage résiste autant que le clone. Par contre, en présence de MTX 50 nM aucun clone de cellule sauvage ne résiste alors que 24 clones de 0,5 AF8 sont obtenus. Un dosage préliminaire réalisé par un test ELISA indique que 10 clones sécrètent entre 500 et1000 U Epo/ml. Un test de sécrétion réalisé au 4ème passage sur les clones cultivés en présence de MTX 50 nM permet de sélectionner un clone, 0,5 AF8E2, qui secrète 260 U Epo/ml, soit 446 U Epo/106 cellules. - avec le vecteur d'expression pTS53 (système réplicatif) La réplication autonome du vecteur est assurée par la présence de la région oriP de l'EBV sur le plasmide et celle de la protéine EBNA-I synthétisée par la cellule. Cinq clones ont été obtenus selon la technologie décrite précédemment. L'un d'entre eux, le clone C2, a été suivi sur 22 passages, soit 3 mois en présence de milieu sélectif et secrète 80 à 100 unités d'Epo par ml de culture/72 h (Tableau 2). En absence de milieu sélectif (17ème passage) la sécrétion en 72 h n'est plus que de 18 U Epo/lO 6cellules alors qu'en milieu sélectif elle est de 66 U Epo/106 cellules. - avec le vecteur pTS59 (système réplicatif) La réplication autonome du vecteur est assurée par la présence de la région OriP sur le vecteur et par la surexpression de la protéine EBNA-1 par la cellule. Le suivi de l'expresion d'Epo HR sur 21 jours après la transfection, en présence de milieu sélectif, montre que les cellules transfectées par pTS59 secrètent de 0,5 à 29 U Epo/ml/106 cellules de J 2 à J 21, alors que la sécrétion des cellules transfectées par pTS53 dans les mêmes conditions, varie de 0,16 à 3 U d'Epo/ml/10 6 cellules. Ce résultat suggère que le vecteur pTS59 qui possède le gène EBNA-1 se répliquerait plus efficacement que pTS53 qui ne contient que la région oriP. Cependant, le clonage des cellules transfectées par pTS59 s'avère difficile ; actuellement deux clones seulement ont pu être obtenus et ils n'expriment qu'une faible quantité d'Epo HR. Une première analyse en Southern blot de l'extrait de Hirt (ADN de petit poids moléculaire) sur le clone C2 indique que le vecteur pTS53 se réplique à raison de 2 à 3 copies par cellule. * Cellules immortalisées in vitro par EBV (INTS LE-6B4) Les cellules LE6B4 sont transfectées avec les 3 vecteurs pTS39, pTS53 et pTS59. Les dosages d'Epo effectués à différents temps après la transfection sont positifs : en particulier pour pTS59 on détecte 29 U Epo/ml/106 cellules après 21 jours de sélection. * Les hétéromyélomes (INTS 1C5E2) Les cellules 1C5E2 ont été transfectées dans une expérience préliminaire par la technique des liposomes (Felgner et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 7413, 1987). Les dosages d'Epo effectués 48 h après transfection n'indiquent aucune activité détectable. Cependant, après 7 jours en milieu sélectif, les surnageants présentent une faible activité détectée en ELISA. Des clonages en dilution limite ont été réalisés ; un premier dosage a permis de détecter deux clones positifs en test RIA : le clone îC5pTS59-2 (5 mU/ml) et le clone lC5pTS59-B4 (20 mU/ml). I1 est donc possible de faire exprimer de l'Epo HR à des hétéromyélomes. De ce fait, un hétéromyélome EBNA-, la lignée SHMD33 (ATCC CRL 1668) a été transfecté par le vecteur intégratif pTS39 et le vecteur réplicatif pTS59 et les clones stables sont en cours de sélection. Cet hétéromyélome sera également utilisé comme partenaire de fusion avec le clone 0,5 AF8 (vecteur pTS39 + hôte CCL156) afin de sélectionner un clone EBNA- hautement producteur d'Epo HR. DETECTION DE L' ACTIVITE BIOLOGIQUE IN VITRO ET IMMUNOLOGIQUE DE L' EPO HR Culture d'érythroblastes de foie foetal L'activité de l'Epo est mesurée in vitro d'après l'incorporation de 59Fe par les érythroblastes de foie foetal de souris (prélevés au 13è jour de gestation) cultivés en 26 heures selon une méthode dérivée de celle décrite par Stephenson et al, Endocrinology 88, 1519, 1971. Les embryons sont prélevés stérilement sur des souris Balb/c (Charles River france). Dans certains cas, des érythroblastes spléniques sont obtenus après induction d'une anémie intense chez les souris après injection de phénylhydrazine selon la méthode de Krystal (Exp. Hematol. 11, 649, 1983). Les cellules sont dissociées mécaniquement et mises en suspension en milieu RPMI 1640 (Tambourin et al, Biomedicine 19, 112, 1983 ; Goldwasser et al, Endocrinology 97, 315, 1975) à la concentration 1,6 x 106 cellules/ml contenant 7 % de sérum de veau foetal, 85 uM d'albumine et 0,4 uM de transferrine humaine. Selon les cas un milieu sans sérum est utilisé dans lequel des phospholipides naturels (soja, ovolecithine) purifiés ou synthétiques (32 x10-3M) et du cholestérol (1,6 x 10-3 M) sont solubilisés en chloroforme, secondairement évaporé sous courant d'azote. Les lipides en solution d'albumine à 1 mg/ml en RPMI sont dispersés par les ultrasons en glace fondante (Boffa et coll, Exp. Hématol. 10. 675, 1982). La suspension cellulaire est répartie en volume de 200 ul dans les puits à fond rond des plaques de culture "Nunclon". Après une incubation de 21 heures à 370C en présence de 0,7 % de CO2, la 5 9 Fe-transferrine est incorporée dans les puits, les plaques sont agitées et remises en incubateur pour une incubation prolongée de 5 heures. Chaque échantillon est analysé à 3 ou 4 concentrations protéiques. L'activité de chaque dose résulte d'une quadruple détermination. Le taux d'incorporation du 59 fie sur l'hème extrait par la méthyléthylcetone ou dans les cellules est mesuré en fonction du logarithme de la dose de l'échantillon et les résultats sont exprimés en milliunité/ml ou par mg de protéine. L'étalon est de l'Epo humaine de recombinaison titrant 100.000 U/mg. Son activité spécifique a été définie d'après les échantillons d'Epo humaine issus de la seconde préparation de Référence Internationale (Annable et al, Bull. Wld. Hlth. Org. 47, 99, 1972). Culture de progéniteurs érythroïdes de moelle osseuse ou de sang périphérique. Les effets de l'Epo HR sur la maturation des BFUe et des CFUe ont été déterminés en culture de précurseurs cellulaires érythroïdes sur méthylcellulose en milieu IMDM dépourvu de sérum (Cormier et al, Cell Différentiation, 17 261, 1985. L'Epo HR, comme l'Epo humaine urinaire, détermine la différenciation et la maturation des BFUe issus de la moelle osseuse de souris ou du sang périphérique humain. L'effet-dose de l'Epo HR sur le développement des CFUe est comparé avec celui donné par 1'Epo naturelle. Détection par tests radio- immunologiques Le dosage radioimmunologique de l'Epo HR a été réalisé dans les surnageants cellulaires selon deux procédés Par précipitation par double anticorps en phase soluble: Un immunsérum de lapin anti-Epo urinaire humaine monospécifique (Terry Fox Lab, Vancouver) est incubé avec un étalon d'Epo H ou un échantillon à doser pendant 16 h à 40C. Après ce délai, 2000 cpm 1251-Epo HR (Amersham) sont ajoutés et les préparations sont incubées 2 h à 40C. La dilution de l'immunsérum choisie est celle qui donne une radioactivité fixée de 20 à 30 %. La dilution finale de l'immunsérum se situe entre 10-4 et 10-5, Après une incubation de 2 h à 200C avec des immunoglobulines de chèvre anti-Fc de lapin, la radioactivité du culot est mesurée. Par précipitation par double anticorps en phase solide sur Tachisorb: Les réactifs sont répartis en un seul temps sur plaques de microtitration Dynatech 96 puits sous un volume final de 220 ul. Après une incubation de 2 heures sous agitation horizontale rotative à la température ambiante, la récolte s'effectue sur filtre de fibres de verre sur appareil Skatron. La distribution concerne successivement l'Epo de la gamme ou de l'échantillon sous un volume de 100 ul, I'immun sérum anti Epo 10 ul, 125 I-Epo HR 10 ul et le Tachisorb R 100 ul. Après transfert en tube de polystyrène des échantillons sur fibres de verre, la radioactivité est mesurée. La gamme de mesure de la méthode est comprise entre 1 et 100 mU. Les surnageants des cellules transformées possèdent des activités pouvant atteindre 800 Ulml alors que les surnageants cellulaires avec vecteur anti-sens sont dépourvus d'activité. Il y a toujours une excellente correlation entre les dosages biologiques in vitro et le dosage radioimmunologique. DETECTION ET MESURE DE L'ACTIVITE BIOLOGIQUE IN VIVO DE L'EPO HR L'activité in vivo de l'Epo produite dans les surnageants de culture des cellules lymphoblastoïdes transformées est testée après injection à des souris rendues polyglobuliques par transfusion afin d'inhiber la synthèse d'Epo endogène (Jacobson. et al Proc. Soc. Exp. Biol. Med, 94, 243, 1957). Les résultats indiquent que l'Epo produite par les cellules lymphoblastoïdes présente une puissante activité biologique comparable à celle de l'Epo HR produite par des cellules CHO (Brevet Kirin-Amgen nO 0148605 A2). Les résultats traduisent une étroite corrélation avec les dosages biologiques in vitro d'après la seconde préparation de référence internationale d'Epo urinaire humaine. PURIFICATION ET ISOLEMENT DE L'EPO HR 1er exemple Surnageant de culture cellulaire en milieu pauvre en protéines (CK4). La concentration du milieu de culture est réalisée par ultrafiltration sur membrane PM10 Amicon ou par filtration tangentielle sur Minitan équipé d'une membrane PLGC suivie par un lavage en solution en glucose 12,5 mM, galactose 12,5 mM, PEG 6000 0.1 mg/ml Beta-mercaptoethanol 10-4 M, jusqu'à une résistivité du filtrat > 5000 Ohms. Le concentrat lyophilisé est chromatographié sur Ultrogel AcA44 en tampon acétate de Ca 10 mM, NaCl 100 mM, phénol 5,6 10-4 M, glucose 12,5 mM, galactose 12,5 mM, PEG 6000 0,1 mg/ml pH 6,8. Les fractions actives sont concentrées par ultrafiltration et Iyophilisées. Le produit est ensuite traité par HPLC sur colonne TSK 545 DEAE en tampon acétate 0,048 mM, CaC12 3mM, glucose 12,5 mM, galactose 12,5 mM, PEG-6000 0,1 mg/ml, Betamercaptoethanol 10-4 M puis élution par un gradient de molarité discontinue de NaCl. Le rendement en activité est voisin de 75- %. Après dialyse et concentration, le produit est chromatographié sur CM affigel blue en tampon phosphate 10 mM, NaCl 150 mM pH 7,2. L'Epo est éluée par une molarité de 1,15 M NaCl. L'activité spécifique de l'Epo HR est supérieure à 100.000 U/mg. 2ème exemple Le concentrat des milieux de culture obtenu sur membranes d'ultrafiltration est traité sur DEAE Séphacel à 40C en tampon acétate 48 mM, CaCl2 3mM, phénol 5,4 10-4 M, pH 4,5. L'activité retenue est éluée en NaCl 0,6 M. Après concentration et dialyse, l'éluat est soumis à une filtration sur Ultrogel AcA44, puis la fraction active détectée par RIA est chromatographiée en HPLC-DEAE en présence de réducteurs et d'hexoses stabilisants. L'Epo HR éluée en tampon pH 5,5, à faible molarité de NaCl, est concentrée sur membrane Amicon PM10 puis chargée sur une colonne de WGA Sépharose 6MB en tampon PBS à 40C. Son élution est obtenue par N-acetylglucosamine 0.5 M. En électrophorèse sur gel en gradient de polyacrylamide de 4 à 30 % et SDS un composant de 34 KDa est observé dans les préparations issues du sépharose WGA. Ce composant est identifié en immunoblot par des immunoglobulines polyclonales anti Epo HR et des anticorps monoclonaux anti Epo HR. Un composant minoritaire migrant sur une zone de 42 kDa est observé dans certaines préparations. Ce composant n'est pas reconnu en immunoblots par des immuns sérums polyclonaux anti Epo HR. Ce résultat est confirmé par la détection radioimmunologique et par l'analyse en culture d'érythroblastes de foie foetal de souris des éluats d'électrophorèse préparative en gel de polyacrylamide SDS. Selon les cas, une étape de purification complémentaire est réalisée soit sur CM Affigel blue, soit sur HA-Ultrogel.ou en HPLC filtration en milieu SDS 0,1 %. Le poids moléculaire apparent de l'Epo HR en gel de polyacrylamide de SDS est de 34 kDa. L'activité spécifique obtenue est supérieure à 120.000 U/mg en culture d'érythroblastes et en RIA avec des rendements compris entre 20 et 30 %. Tableau 1 Production d'Epo HR par les cellules lymphoïdes CCL 156 (clone 156.05AF8) transformées avec le vecteur intégratif pTS39. Milieu sélectif Nombre Indice Sécrétion de de d'Epo passages Multiplication U/ml/72 h Oui 22 3.7 38 30 nd 38 38 2 40 50 4.6 160 52 3.8 107 Non 13 3.1 42 21 nd 43 29 1.8 52 41 5.2 146 43 6.0 87 48 9.8 86 Tableau 2 : Production d'Epo HR par les cellules lymphoïdes CCL 156 (clone C2) transformées avec vecteur replicatif pTS53 (avec pression de sélection). Nombre Indice de Secrétion Epo de passages Multiplication U/ml/72h 5 3.5 70 8 5 90 12 4 115 22 3 99 REVENDICATIONS 1) Lignée de cellules lymphoblastoïdes produisant une protéine déterminée, caractérisée en ce qu'elle a été transformée par un vecteur d'expression de ladite protéine comportant - un promoteur efficace dans des cellules humaines d'origine hématopoïétique, - une séquence leader ligaturée en 5' de la séquence codant pour ladite protéine, - un signal de polyadénylation en 3' de la séquence codante. 2) Lignée selon la revendication 1, caractérisée en ce que le promoteur est un promoteur provenant d'un virus capable de se répliquer dans des cellules humaines d'origine hématopoiétiques. 3) Lignée selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'une séquence activatrice de transcription efficace dans les lymphocytes humains est ajoutée en amont du promoteur. 4) Lignée selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le promoteur, la séquence activatrice et la séquence leader proviennent d'Adenovirus. 5) Lignée selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un vecteur comportant, en outre, un gène marqueur. 6) Lignée selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le gène marqueur est un gène de sélection dominant d'origine bactérienne. 7) Lignée selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le vecteur est autoréplicatif et comporte une origine de réplication efficace dans les cellules lymphoblastoïdes. 8) Lignée selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'origine de réplication provient du virus d'Epstein-Barr : oriP. 9) Lignée selon la revendication 8, caractérisée en ce que la lignée exprime également la protéine EBNA-1 qui agit en trans sur oriP. 10) Lignée selon la revendication 9, caractérisée en ce que le gène codant pour EBNA-1 est porté par le vecteur d'expression. 11) Lignée selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le vecteur est intégratif et ne comporte pas d'origine de réplication, mais un fragment d'ADN murin d'origine mitochondriale. 12) Lignée selon la revendication 11, caractérisée en ce que le vecteur intégratif comporte l'ADNc murin codant pour la dihydrofolate réductase (DHFR), placé en position bicistronique en aval de la séquence codante de la protéine. 13) Lignée selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que le vecteur comporte la séquence suivante - E - MLP - L123 - P - pA - E étant la séquence activatrice de la transcription d'un Adenovirus, - MLP est le promoteur d'un Adenovirus, - L est la séqùence leader du même Adenovirus, - P est la séquence codant pour la protéine, - pA est un signal de polyadénylation 14) Lignée selon la revendication 13, caractérisée en ce que: - E est la séquence activatrice du gène ElA de l'Adénovirus 5, - MLP est le promoteur majeur tardif de l'Adénovirus 2, - L123 est la séquence tripartite de l'Adénovirus 2, - pA est le signal de polyadénylation dérivé du virus SV40. 15) Lignée selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que P est la séquence codant pour l'érythropoïétine ou une protéine ayant l'activité de l'érythropoïétine, 16) Lignée selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que le gène de sélection est le gène codant pour la xanthineguanine phosphoribosyl -transférase (XGPRT). 17) Lignée selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisée en ce que le vecteur comporte également la région d'AdS codant pour les ARN VAI et VAII. 18) Lignée selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisée en ce que la lignée de cellules lymphoblastoïdes qui est transformée par le vecteur d'expression est une lignée établie à partir des leucocytes du sang périphérique d'un individu sain. 19) Lignée selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisée en ce qu'elle est déposée à l'ATCC sous la référence CCL156 RPMI 1788. 20) Lignée selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une lignée de cellules immortalisées in vitro par l'EBV à partir de lymphocytes B d'un donneur sain. 21) Lignée selon l'une des revendications 1 à 17 et 20, caractérisée en ce qu'elle est issue de l'INTS sous la référence LE6B4. 22) Lignée selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisée en ce que la lignée lymphoïde B humaine transformée in vitro par 1'EBV (H2D5D2B6) est fusionnée avec un myélome de souris (B6Ag) et qu'elle a perdu le gène EBNA1. 23) Lignée selon l'une des revendications 1 à 17 et 22, caractérisée en ce qu'elle est issue de l'INTS sous la référence 1C5E2. 24) Lignée selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisée en ce qu'il s'agit dtune lignée d'hétéromyélome SHMD33 (EBNA-) obtenu par fusion d'une lignée de myélome avec un myélome de souris (P3X63Ag8, 653) 25) Lignée selon une des revendications 1 à 17 et 24 caractérisée en ce qu'elle est déposée à l'ATCC sous la référence CRL 1668. 26) Lignée selon l'une des revendications 1 à 23, caractérisé en ce que la séquence codant pour l'Epo utilisée est obtenue à partir d'une banque génomique humaine. 27) Procédé de production de protéines, caractérisé en ce qu'on cultive dans un milieu de culture approprié une lignée cellulaire selon l'une des revendications 1 à 24 et en ce qu'on récupère la protéine désirée. 28) Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'on prépare l'érythropoïétine.