FR 2646608 A1 19901109 FR 9005679 A 19900504 COMPLEXES POUR LA LOCALISATION ET LE TRAITEMENT DE TUMEURS, ET TROUSSE D'ESSAI COMPRENANT. L'UN DE CES COMPLEXES La presente invention concerne des complexes destinés a être utilisés dans des procédés de localisation et de traitement de tumeurs. La localisation in vivo de tumeurs, comme les astrocytomes dans le cerveau. et la détermination des limites entre des tissus normaux et des tumeurs peuvent être utiles dans des traitements chirurgicaux, radiothérapeutiques et chimiothérapeutiques de tumeurs. Bien que les gliomes ne produisent généralement pas -de métastases. il reapparaissent localement après une résection chirurgicale et le pronostic est alors grave (voir référence bibliographique 1). Ce grave pronostic découle en partie du fait qu'il ntest pas possible d'établir clairement la frontière entre la tumeur et le tissu cérébral normal. et que la barrière hémato encéphalique ne présente qu'une perméabilité restreinte aux agents de visualisation et aux agents thérapeutiques. Que l'on réussisse à y apporter des agents de contraste en résonance magnétique ou des radio-nunucléides pour une imagerie par rayonnement gamma ou par positrons pourraient contribuer à une localisation plus précise des frontières d'une tumeur. Des anticorps monoclonaux préparés contre les tumeurs ont été proposés antérieurement pour être utilisés comme molécules vectrices efficaces pour apporter, la où c'est nécessaire, des agents de contraste et des raalonucléides (2,3). Cependant, l'utilisation de ces anticorps monoclonaux s'accompagne d'inconvénients. Les anticorps sont de très grandes molécules qui peuvent également porter des déterminants antigéniques à réaction croisée qui pourraient causer des problèmes. En outre, les anticorps monoclonaux se lient rarement à plus de 70% des cellules, même dans les tumeurs clonogéniques. En plus des anticorps monoclonaux, on a pensé à utiliser, comme vecteurs d'agents thérapeutiques, divers polypeptides synthétiques comme la polylysine, qui se lie sélectivement aux cellules tumorales plutôt qu'aux cellules cérébrales normales. En dépit des efforts antérieurs, on a encore besoin de procédés sûrs et fiables pour la .localisation de tumeurs, leur traitement et l'administration ciblée de divers agents thérapeutiques à ces tumeurs, ainsi que de complexes que l'on pourrait utiliser dans ces procédés. Dans l'application de la présente invention, une quantité sûre et efficace d'un nouveau complexe d'une polylysine, d'une molécule de liaison et d'un agent d'imagerie ou d'un agent chimiothérapeutique, présentant une charge nette positive élevée, est injectée dans le systeme artériel d'un animal et le complexe est véhiculé jusqu'aux tumeurs et se lie sélectivement aux cellules tumorales, qui présentent une charge nette négative supérieure à celle des cellules non-tumorales.Le procédé est particulièrement utile pour la visualisation de tumeurs à charge polyanionique, comme les tumeurs de Wilms, les tumeurs cérébrales, les carcinomes de petites cellules du poumon et les mélanomes.Les nouveaux complexes de la présente invention comprennent une polylysine, une molécule de liaison et un agent d'imagerie ou un agent chimiothërapeutique. Dans ces complexes. la molécule de liaison n'est pas liée à tous les résidus lysyles de la polylysine, de sorte que les complexes présentent une charge nette positive élevée et se lieront sélectivement aux cellules tumorales, qui présentent une charge nette négative plus élevée que celle de cellules non-tumorales. Le rapport des résidus lysyles à l'agent de liaison vaut généralement d'environ 5/1 à environ 20/1. Les avantages qu'apportent l'utilisation de la polysysine dans ces complexes sont les suivants 1) l'homogénéité chimique du polymère synthétique 2) la facilité avec laquelle on prépare des polylysines présentant différentes tailles moléculaires 3) la facilité avec laquelle on modifie le complexe polymère-agent de liaison avec des radionucléides trivalents ou tétravalents, comme le gadolinium et le zirconium ; 4) la facilité avec laquelle on marque la polylysine avec des radionucléides à l'état de iodure, en utilisant le réactif de Bolton et Hunter. La possibilité que l'on a de choisir des polymères polylysines de faible masse moléculaire peut faciliter l'administration de l'agent de visualisation (ou agent d'imagerie) ou de l'agent thérapeutique à travers les aires dans lesquels la barrière hémato-encéphalique est intacte, siens que l'on ait recours à une perméabilisation à l'aide de mannitol (2). La facilité avec laquelle les polylysines peuvent être modifiees par de multiples nucléides fournit une voie d'approche pour déterminer les doses et les concentrations de polymère nécessaires pour une imagerie réussie chez une population de patients et pour une imagerie et une thérapie simultanées (par exemple avec Gd et 90Y). Enfin, la polylysine n'est pas immunogène, par rapport aux immunoglobulines ; par conséquent, les nouveaux complexes contenant une polylysine sont sélectifs pour toute tumeur comportant des cellules présentant une charge nette négative supérieure à celle des cellules non-tumorales, et ils peuvent être utilisés pour une poly-imagerie ou pour des poly-thérapies. L'avantage principal des immunoglobulines, comme les anticorps, réside dans la spécifité de ces protéines pour des tumeurs particulières, ainsi que dans leur toxicité relativement faible, comparée à celle de la polylysine qui est toxique à des concentrations supérieures à 1,0 mg pour 100 mg de poids corporel (8,10, 11). Toutefois, la sensibilité inattendue des procédés dans lesquels on utilise les complexes de la présente invention permet d'utiliser ces complexes à des concentrations non-toxiques de polylysine. Dans la préparation des complexes préférés de la présente invention, la polylysine est couplée, par liaison covalente, à une molécule de liaison, ledit anhydride de I'acide l'acide diéthylène-triamine-pentaacétique (DTPA), avec un rapport des résidus lysyles au DTPA situé dans la gamme de 5 à 20 résidus lysyles par molécule de DTPA. Ce rapport garantit que les complexes présenteront une charge nette positive adéquate pour se lier aux cellules tumorales présentant une charge négative nette supérieure à celle des cellules non-tumorales. La valeur préférée du degré de polymérisation de la polylysine se situe dans la gamme de 50 à 100. Le complexe polylysine-DTPA est de préférence séparé d'avec les réactifs à faible masse moléculaire par chromatographie par filtration sur gel, sur Sephadex G-25. Les agents de visualisation et les agents chimiothérapeutiques, comme des ions métalliques paramagnétiques (par exemple gadolinium, manganèse), des émetteurs de positrons (par exemple 9or), des émetteurs de rayonnement gamma (par exemple 153Gd) ou des émetteurs de rayonnement bêta (par exemple 90Y), peuvent alors être ajoutés au complexe polylysine-DTPA, par exemple par échange au citrate, et les substances présentes à faible masse moléculaire peuvent être séparées du complexe polylysine-DTPA-ion métallique par filtration sur gel.La présence d'un composant paramagnétique dans le complexe permet 1 imagerie par résonance magnétique, la présence d'un emetteur de positrons permet l'imagerie par tomographie par émission de positrons (TEP) et la présence d'un émetteur de rayonnement bêta dans le complexe fournit un agent de radiothérapie. Dans le mode préféré d'utilisation des complexes de la présente invention" un complexe choisi est injecté dans le système artériel, dans la région où l'on suspecte la présence d'une tumeur, de telle façon que la concentration de polylysine soit inférieure à 100 pg pour 100 g de poids corporel. Quand on utilise le complexe dans un procédé d'imagerie, on effectue alors l'imagerie par résonance magnétique ou par TEP de façon classique, après un délai convenable (24 à 96 heures) pour obtenir un contraste maximal entre la tumeur et le tissu environnant. On a trouvé que les nouveaux complexes de polysyline-DTPA et des ions métalliques IsjGd et 8 9 Zr se lient aux cellules d'astrocytome C6 et de glioblastome U87 MG, six à huit fois plus facilement qu'ils ne se lient aux cellules endothéliales du cerveau ou de l'aorte, et qu'ils fournissent des images de qualité supérieure. De nombreuses tumeurs comportent des cellules présentant une charge nette négative supérieure à celle des cellules non-tumorales. La polylysine.présente dans les complexes de l'invention contribue à conférer à ceuxci une charge positive qui augmente leur tendance à se lier aux cellules tumorales. Par conséquent, la charge nette positive élevée présente sur les complexes polylysine-DTPA-ion métallique, préparés comme on va le décrire, entrain la liaison sélective des complexes aux cellules tumorales Les ingrédients nécessaires à la préparation des complexes de la présente invention peuvent être fournis sous forme de trousse, dans un but de commodité pour les utilisateurs.En outre, les nouveaux complexes de la présente invention peuvent également être fournis avec d'autres ingrédients à utiliser dans des trousses d'essai pour l'analyse in vitro des cellules tumorales, de fragments de cellules tumorales ou de protéines tumorales spécifiques dans le liquide rachidien ou le plasma. Dans la description qui va suivre, on va décrire l'efficacité des compositions de polylysine, DTPA et s3Gd ou 89Zr ou 125I, dans la réalisation images d'astrocytome C6 in vivo dans un cerveau de rat. On va maintenant décrire les produits de départ et les procédés utilisés dans la mise en oeuvre de 1' invention. -Le bromhydrate de polylysine marqué à la fluoresceine (degré de polymérisation 88, masse moyenne mesurée par diffusion de lumières, la polylysine nonmodifiée (degré de polymérisation 299, par diffusion de lumière, et 267, par mesure de viscosité) et le dianhydride de DTPA ont été achetés chez Sigma (St. Louis, Montana). Les réactifs de Bolton-Hunter pour 153Gd et 125I (12) ont été achetés chez DuPont-New England Nuclear (Boston, Massachusetts) . Le 89Zr a été produit à partir d une cible en yttrium, grâce à la réaction 89Y(p,n)89Zr dans le faisceau de protons de 11 MeV du cyclotron de l'Université du Wisconsin, département de Physique médicale (CTI, Inc.). On purifie le 89Zr sans entraîneur selon le procédé de Scadden et Ballou (13).Le s9Zr est couplé au polylysine-DTPA le jour où il est produit à partir de l'yttrium. 24 heures après la préparation, une picomole de 8 9 Zr sans entraîneur contient 300 pCi. On dissout le bromhydrate de polylysine dans un tampon bicarbonate (0.1 mole/l, pH 9,0) ; puis on ajoute immédiatement à la polylysine le DTPA, dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) anhydre. On prépare des complexes polylysine-DTPA comportant une molécule de DTPA pour 16 résidus lysyles. Pour préparer ces complexes, on ajoute à de la polylysine du dianhydride de DTPA, dissous dans du DMSO, en un rapport de 1 molécule de dianhydride de DTPA pour 10 résidus lisyles. On laisse la réaction se poursuivre pendant 60 minutes à 25'C puis on fait passer les réactifs sur des colonnes de Sephadex G-25 (colonnes PD-10, produit- de Pharmacia, Piscataway, New Jersey), équilibrées au préalable avec un tampon citrate (0,1 mole/l, pH 5,5). Le produit polylysine-DTPA apparaît dès qu'un volume d'éluant correspondant au volume mort de la colonne s'est écoulé.De façon semblable, mais avec des valeurs différentes du rapport des quantités des réactifs, on prépare des complexes polylysine-DTPA présentant d'autres rapports DTPA/lysine. Dans le tampon citrate, on fait réagir la polylysine modifiée par du DTPA avec du chlorure de gadolinium (Aldrich Chem., Milwaukee, Wisconsin) dissous dans le même tampon citrate. On fait ensuite passer les chélates polylysine-DTPA-Gd à travers des colonnes de filtration sur gel Sephadex G-25, équilibrées au préalable avec une solution à 0,15 mole/l de chlorure de sodium, de façon à séparer le gadolinium libre d'avec le complexe polylysine-DTPA-Gd. On peut préparer de façon semblable les complexes contenant des ions de zirconium et d'autres métaux. On cultive les cellules d'astrocytome C6 dans du milieu de Ham F-10, complété avec 2,58 de sérum foetal de veau (Hyclone Lab, Logan Utah), 15% de sérum de cheval (Gibcol, 100 ug de streptomycine et 100 unités de pénicilline par ma. et 1,2 g de tampon bicarbonate par litre. Des rats mâles Wistar Furth pesant chacun plus de 300 g ont été achetés chez Harlen Sprague Dawley (Indianapolis). On anesthésie les rats avec de l'hydrate de chloral, et on pratique à la fraise un trou de 0,5 mm de diamètre dans leur crâne, au-dessus du cortex frontal gauche de chaque rat, à 3 mm à gauche de la ligne médiane. On prend 6 rats et on leur injecte à chacun 2.106 cellules d'astrocytome de C6 dans 10 iil de milieu de Ham F-10 contenant 0,5t d'agarose (Sigma). A deux autres rats, on injecte le même milieu, mais sans cellules tumorales. Huit -jours plus tard, on anesthésie les rats avec de l'hydrate de chloral et on réalise des images de leur cerveau par résonance magnétique, pour visualiser les sites d'injection des cellules tumorales. Dans les animaux, on introduit un cathéter par l'artère fémorale, jusqu'à l'aorte ascendante.Puis on injecte dans l'aorte 500 zl de sérum physiologique, contenant 100 pg de polylysine marquée au 125I (Bolton-Hunter), ou bien 100 pg de polylysine marquée aux 153Gd et 157Gd, ou bien 100 ijg de polylysine marquée au 89Zr. Chaque rat a reçu 0,23 mCi de 89Zr. On laisse les animaux récupérer pendant trois jours supplémentaires, pour permettre la baisse du niveau de base du rayonnement. Le 11èe jour après l'implantation des tumeurs, on anesthésie les animaux avec de l'hydrate de chloral et on en réalise des images à l'aide de l'appareil d'imagerie par résonance magnétique Sigma, à l'aide de l'enroulement d'extrémité GE (17 cm de diamètre).On obtient des images pondérées au Tl avec une épaisseur de 3 ou de 4 mm (TR:600 ; TE:20). Des échantillons de sang sont prélevés sur les rats pendant qu'ils sont sous anesthésie, et ces échantillons sont conservés pour l'analyse des radionucléides ; les rats sont sacrifiés par exsanguination, placés dans un appareil de tomographie par émission de positrons par groupe de 4, et soumis à un comptage pendant 14 heures. Les images provenant de cet appareil sont produites par un appareil CTI Inc., modèle 933/04-12. Il fournit une tomographie par positrons en 4 anneaux et 7 tranches avec une résolution spatiale (transversale) de 5 mm en largeur à mi-hauteur, et une résolution axiale de 6 mm en largeur à mi-hauteur. On prélève le cerveau et les reins de chaque animaux après l'obtention des images. On prélève le foie, les poumons, la rate, la glande thyrolde, les testicules, un os, le coeur et le pancréas de l'animal N 3 (il s'agit d'un animal qui a reçu la tumeur Les trois radionucléides sont tous dosés dans les échantillons de tissu par analyse à l'aide d'un compteur de type Ge (Li) (spectromètre gamma germanium à 15% de renaement). On réalise une étude histologique sur tous les échantillons de cerveau pour vérifier la localisation des cellules C6 implantées. Des coupes (10 iim) de cerveau fixées au formol et congelées sont prélevées, colorées à la thionine et recouvertes d'un matériau d'enrobage DePex (Gurr Microscopy Ltd) et d'une lame couvre-objet. On examine ces coupes à l'aide d'un microscope Leitz-DADS et on les photographie. On va maintenant décrire les résultats obtenus au cours de ces expériences. Le bromhydrate de poly-L-lysine (degré de polymérisation 88) est modifié par liaison covalente avec l'agent chélatant, DTPA ou le réactif de Bolton-Hunter au 125I. On fait ensuite réagir le complexe polylysine-DTPA, soit avec l'émetteur de positrons 8 9 Zr, soit avec le gadolinium stable paramagnétique et l'émetteur de rayonnement gamma 15 3 Gd. Le 8 9 Zr est produit dans le cyclotron de 11 meV par la réaction 89Y(p,n)89Zr, et purifié par des techniques de solubilisation fractionnée utilisant un acide et des solvants organiques. Les complexes polylysine-DTPA-nucléide et polylysine-iode sont séparés, par chromatographie sur gel, du nucléide ou des ions métalliques non liés.On implante, dans le crâne de rats Wistar Furth, des astrocytomes C6, et 8 jours plus tard, on leur injecte, par un cathéter placé dans l'aorte, les complexes polylysine-nucléide. Le lîble jour après l'implantation des tumeurs, on obtient des images des rats par résonance magnétique, ainsi que par tomographie par émission de positrons, On prélève les organes des rats et on dose chaque nucléide par comptage au Ge(Li). On prépare des coupes gelées des cerveaux1 et on les colore avec de la thionine pour mettre en évidence la croissance de la tumeur et les frontières entre la tumeur et le tissu cérébral normal.L'intensité de signal des images obtenues par résonance magnétique, pondérées au Tl, met en évidence l'effet d'augmentation du complexe polylysine-DTPA-Gd : la région centrale de la tumeur présente une faible intensité de signal r alors que la région périphérique présente une intensité élevée de signal, dans tous les cas. Le comptage au Ge(Li) indique une quantité de 3 à 8 fois plus élevée de 8 9 Zr dans l'hémisphère contenant la tumeur, par rapport à l'hémisphère ne contenant pas la tumeur, chez 4 des 5 rats ayant survécu 11 jours avec la tumeur implantée. La tomographie par émission de positrons donne la répartition du complexe polylysine-DTPA-89Zr dans tout le corps.Les organes majeurs marqués sont la tumeur, les reins, la rate, le thymus, le coeur, les os, les testicules et le foie, avec une radioactivité normalisée en nombres de coups par seconde et par gramme. Des études cytologiques des coupes colorées à la thionine mettent en évidence une bonne corrélation avec la morphologie de la tumeur, telle qu'elle est indiquée par l'imagerie par résonance magnétique. Ces observations suggèrent que les complexes polylysine-DTPA-Gd et polylysine-DTPA-89 Zr peuvent être utiles .pour la détection des frontières entre les astrocytomes et les tissus cérébraux normaux par imagerie par résonance magnétique et peut-être par tomographie par émission de positrons. Les complexes polylysine-DTPA-nucléide à émission bêta peuvent être utiles pour la radiothérapie in sîtu de ces tumeurs. Dans la description qui va suivre, on décrira d'abord les images, obtenues par résonance magnétique, des cerveaux de rats auxquels on a injecté des astrocytomes C6. On décrira les images obtenues par résonance magnétique avant et après injection de polylysine modifiée. On décrira également les images obtenues par résonance magnétique chez des rats ne présentant pas de tumeur, auxquels on a injecté la polylysine modifiée. On discutera ensuite des tomographies par émission de positrons réalisées chez les rats. Puis on décrira la répartition des complexes polylysine-DTPA-nucléide dans le cerveau et les autres organes, telle qu'on l'a déterminée par comptage au Ge(Li). On discutera finalement les résultats de l'étude histologique de la tumeur in situ. A) Imagerie par résonance magnétique des cerveaux des rats On prend des images des cerveaux des rats le 8pèle jour après l'implantation des tumeurs Les images des cerveaux de tous les rats portant des tumeurs sont semblables. Ces images sont obtenues avant l'injection des polylysines (degré de polymérisation 88) marquées au gadolinium, au zirconium ou à l'iode. On peut observer qu'un certain degré d'asymétrie peut être détecté à ce stade (animaux 2 et 3) et qu'un animal présente une faible intensité de signal sur les images pondérées au Tl, dans la région d'implantation de la tumeur (animal 6). Au contraire. les animaux témoins, qui ont subi uneinjection d'agarose exempt de cellules, ne présentent aucune caractéristique inhabituelle dans le même plan de section (animal 8). Les images sont prises pour une épaisseur 'de 3 mm. Le lla6 jour après l'implantation des tumeurs et le 3pèle jour après l'injection des polylysines (degré de polymérisation 88) marquées aux radionucléides, on observe une région centrale circulaire de faible intensité de signal sur les images pondérées au Tl et, dans la même -région pour l'animal 2, une circonférence d'intensité de signal élevée. L'augmentation de l'intensité de signal à la -périphérie est également observée sur l'image adjacente obtenue par imagerie par résonance magnétique à 3 mm sur cet animal. Les images obtenues par résonance magnétique sur l'animal 3 présentent également une faible intensité de signal au centre sur les images pondérées au Tl et une intensité de signal élevée à la circonférence.L'image de la région contenant la tumeur de l'animal 6 indique également une faible intensité de signal en image pondérée au T1 dans la région centrale et une intensité de signal élevée à la circonférence. Toutefois, l'hémisphère droit présente également une large région centrale à faible intensité de signal. Ce dernier point est significatif car les résultats des comptages de polylysine-DTPA-89Zr, effectués sur les organes et indiqués ci-dessous pour le rat 6, indiquent une répartition telle que la quantité de poîylysine-DTPA-8'Zr est plus élevée dans l'hémisphère droit que dans le gauche. Une étude semblable du cerveau d'un rat témoin (animal 8) ne révèle pas de surface présentant un aspect du type donné par une tumeur.Parmi les 6 rats auxquels on a injecté des cellules tumorales 5 ont survécu jusqu'au 11ère après l'implantation de la tumeur ; tous les cinq présentaient une croissance de tumeur identifiée et les images de ces cerveaux, obtenues par résonance magnétique, indiquaient la localisation et la morphologie de la tumeur. L'intensité de signal élevée aux frontières de la tumeur est cohérente avec une augmentation de la relaxation des protons de liteau, provoquée par la localisation du complexe polylysine-DTPA Gd dans la tumeur. La zone centrale de 1'astrocytome C6 dans le cerveau de rat est souvent nécrotique, observation cohérente avec les images à faible intensité de signal obtenues. La région de la tumeur est nettement résolue dans les coupes de 3 mm d'épaisseur, lorsque l'on utilise l'enroulement d'extrémité.La coupe histologique de tumeur indique qu'il n'y a pas d'hémorragie dans la région de la tumeur ou dans la région environnante du cerveau. B) Tomographie par émission de positrons des rats portant une tumeur et des rats témoins Les tomographie des rats par émission de positrons ont été obtenues dans 7 plans, de la face dorsale à la face ventrale des rats. On prend simultanément des images de quatre rats et l'on utilise des sources annulaires pour corriger leur position dans l'appareil. Pour chaque groupe d'animaux, la prise d'images dure 10 heures ou plus, pour que l'on obtienne les données pour reconstruire l'lmage. Ces images révèlent que la plus grande partie du complexe polylysine-DTPA-8 9 Zr est localisée dans les reins: et que le mufle est une seconde région constituant une source majeure de positrons.Sous ce rapport: il est intéressant de noter que les animaux, qui ont tous reçu 300 mg de polylysine, avaient du sang dans les urines et que deux d'entre eux présentaient- des saignements de nez. Un examen plus poussé des tomographies indique que le cerveau présente effectivement une activité importante d'émission de positrons. Il est difficile de certifier la localisation de la source Zr dans l'hémisphère droit ou gauche par tomographie par émission de positrons. L'avantage apparent de la tomographie par émission de positrons sur l'imagerie par résonance magnétique est une évaluation rapide de la répartition de la source Zr dans le corps entier, ainsi que la faible concentration de polylysine nécessaire pour l'obtention d'images.L'imagerie par résonance magnétique sépare nettement la zone de la tumeur d'avec les zones restées normales du cerveau, et permet de délimiter la zone de la tumeur. C) Répartition de la polylysine marquée avec un nucléide dans les organes Pour la détermination du nombre de coups par seconde pour chaque nucléide dans les organes, on sépare le cerveau en les hémisphères droit et gauche. Dans tous les cas, les cellules tumorales sont implantées dans la région frontale gauche du cerveau. Le tableau I cides sous donne les nombres de coups par seconde et par gramme de tissu, . rapportés au corps entier du rat, pour chaque animal. La distribution des nucléides est déterminée à l'aide d'un appareil de comptage au Ge(Li). On dose le 89Zr à partir du pic à 909 keV, le 153Gd à partir du pic à 105 keV et le 12 5 I à partir du pic à 27 keV. On - utilise une fraction aliquote de la substance polylysine-nucléide injectée pour calculer la répartition des radionucléides dans les organes. Sur le tableau I, on peut observer que la quantité de Zr est de trois à huit fois plus élevée dans l'hémisphère gauche (contenant la tumeur) que dans l'hémisphère droit, chez quatre des cinq rats survivants auxquels on avait injecté des cellules tumorales. Chez l'un des rats qui présentait une tumeur C6, l'hémisphère droit présentait une radioactivité plus importante. Dans le cas du gadolinium, on observe une localisation également plus importante dans l'hémisphère gauche, mais le rapport de la quantité de gadolinium trouvée dans l'hémisphère gauche à celle trouvée dans l'hémisphère droit est inférieur à celui observé pour Zr. Il existe une certaine disproportion entre les répartitions de Gd et de Zr. même si ces deux éléments sont chélatés avec le DTPA sur des polylysines de taille identique.Ceci suggère soit que le DTPA-Gd se sépare de la chaîne de polylysine à une autre vitesse que le DTPA-Zrr soit que le métabolite de polylysine-DTPA-Gd se localise différemment de celui de polylysine-DTPA-89Zr. Comme le complexe'polylysine-DTPA-Gd contient plus d'ions métalliques (on ajoute du Gd froid) que le complexe au Zr, il est possible que le métal en excès dans le complexe de Gd-DTPA affecte la répartition du nucléide. Le marquage à l'iode donne des résultats équivalents dans les deux hémisphères. Ceci est en accord avec un fait connu, la perte d'iode chez les protéines marquées å l'iode, en présence de sérum et d'autres fluides tissulaires. Zr est l'élément de marquage préféré pour ces observations, et l'iode est le moins avantageux des trois nucléides étudiés. Tableau I Répartition de chacun des trois dérivés de polylysine DTPA-nucléide dans les hémisphères cérébraux droit et gauche 89Zr 153Gd 125I Rat gauche droit gauche droit gauche droit 2 0,212 0,063 0,030 0,021 0,004 0,004 3 0r851 0,108 0,051 0,034 0,008 0,006 4 0,300 0087 0,038 0x020 0,007 0t003 5 0,365 0,057 0r060 0031 0,007 0r009 6 0,713 1521 0,031 0262 0,005 0,006 7 0,O75 0,062 0,047 0,054 0r006 0r007 8 0.078 0,068 0,063 0,027 0,015 0,010 La répartition des nucléides dans les autres organes du corps est illustrée sur le tableau Il à l'aide du rat 3 pris comme exemple. Ce tableau révèle que les organes présentant les teneurs les plus élevées en Zr sont les reins, la rate, le coeur, le thymus, les os et les testicules. On pouvait s'attendre à la forte teneur en nucléide de la rate, du coeur, du thymus et des testicules. puisque la polylysine a été injectée directement dans l'aorte. La tomographie des rats par émission de positrons reflète les nombres de coups attendus sur un compteur au Ge(Li), et l'on peut utiliser la tomographie par émission de positrons pour suivre au cours du temps la répartition du complexe polylysine-DTPA 89Zr dans les organes.Avec le cas des reins pour référence, le rapport de la teneur en Zr à teneur en Gd prend une valeur différente pour plusieurs organes, et l'on trouve que l'absorption de Zr est élevée dans les os et faible dans le foie, alors que l'absorption de Gd est forte dans le foie. Tableau Il Répartition des complexes polylysine-DTPA-nucléide dans les organes du rat numéro 3 (en nombres de coups par seconde et par gramme de tissu, normalisés au corps entier) 89Zr 153Gd 125I Rein 12,472 1,739 1,276 Os ' 2r500 0,323 0,004 Coeur 3,208 0,950 0,016 Foie 0,922 2,844 0,092 Poumons 1,414 0,243 0,005 Testicules 2,604 0,040 0,000 Thymus 3,055- 0,617 0,012 Rate 5,520 9,193 1,351 Pancréas 1,427 0,678 0,027 D) Etude histologique de l'astrocytome C6 dans le cerveau Des coupes, colorées à la thionine de cerveaux de rats fixés à la formaline révèlent clairement des amas de cellules tumorales. Ces cellules tumorales sont localisées en des endroits discrets de l'hémisphère gauche, englobant les cortex frontal et pariétal.Les emplacements de ces tumeurs dans le cerveau, révélés par l'étude histologique, se recoupent avec les sites révélés par imagerie par résonance magnétique. L'étude histologique permet de voir que la tumeur s 'infiltre dans le tissu cérébral normal situé autour d'elle. La tumeur proprement dite contient de petites cellules rondes, ainsi que des cellules rondes plus grandes qui possèdent des noyaux pâles et une chromatine condensée. L'étude histologique confirme que les tumeurs C6 se developpent chez les rats adultes de race Wistar Furth, que le type et la structure cellulaires sont en accord avec les propriétés de la lignée tumorale C6, et que les images obtenues in vivo par résonance magnétique sont en accord avec l'aspect histologique du tissu.On n'a pas mis en évidence de remaniements hémorragiques dans la tumeur ou le tissu cérébral environnant, même si l'on peut voir une zone centrale nécrotique dans quelques tumeurs. D'après ce qui précède, il est évident que les dérivés de polylysine contenant du DTPA chélaté à des ions paramagnétiques comme Gd améliorent les images obtenues par résonance magnétique de tumeurs intracérébrales. La répartition du complexe polylysine DTPA-89Zr, déterminée à l'aide d'un compteur au Ge(Li), montre que la quantité de ce complexe est plus grande d'un facteur de 3 à 8 dans l'hémisphère contenant la tumeur que dans l'autre hémisphère. Ces données constituent la première utilisation réussie d'un véhicule sélectif vis- & vis des tumeurs, la polylysine, pour administrer du Gd paramagnétique et du 8 9 Zr émetteur de positrons, in vivo, à un gliome de rat (modèle congénital) dans des buts d'imagerie neuroradiologique. Ce système d'administration exalte la relaxation des protons de l'eau dans la zone de l'astrocytome C6. On a également administré la preuve du principe selon lequel on peut utiliser un complexe polylysine-DTPA-89Zr pour la réalisation d'images de tumeurs intracraniales par tomographie par émission de positrons. Ces résultats sont en accord avec notre étude antérieure (3) qui indique que les cellules d'astrocytome C6 et les cellules de glioblastome U87 MG fixent in vitro de 6 à 8 fois plus de polylysine-DTPA-89Zr que ne le font des cellules endothéliales provenant du cerveau ou de l'aorte. D'autres chercheurs ont obtenu précédemment des images de tumeur C6 par résonance magnétique, in vivo, en utilisant un serpentin. de diamètre interne 10 cm (17). Ils ont injecté, à des rats présentant des tumeurs C6 intracérébrales, du DTPA-Gd (17) et ils ont obtenu des images des cerveaux de ces rats. Le traitement au DTPA-Gd augmente la relaxation des protons de l'eau et fournit un contraste en imagerie par résonance magnétique. Le complexe DTPA-Gd pénètre la région de la tumeur dans le cerveau de façon passagers, en résultat du fonctionnement compromis de la barrière hémato-encéphalique. L'arrivée et le départ du complexe DTPA-Gd sont relativement rapides, parce que le DTPA n'est pas fixe par la tumeur. L'avantage du complexe polylysine-DTPA-Gd, par rapport au complexe DTPA-Gd, réside dans la fixation sélective de la polylysine à la surface des cellules tumorales. En raison du fait que la polylysine est fixée par la tumeur, on peut réaliser l'imagerie après que le taux de substance contrastante (c'est-à-dire la polylysine) dans le sang a baissé jusqu'à de très faibles valeurs. Le rapport signal/bruit est donc augmenté grâce à l'utilisation de la polylysine. On peut également utiliser la polylysine pour administrer simultanément plusieurs nucléides ou agents chimio-thérapeutiques, à cause de l'abondance des groupes epsilon-amino sur le polymère. Ceci permet une analyse de l'administration de médicaments ou des effets du dosage des radiations, par comparaison d'une image obtenue par tomographie par émission de positrons avec une image obtenue par résonance magnétique. La polylysine présente des propriétés toxiques à des concentrations dépassant 1,5 mg pour 100 g de poids corporel chez le rat (10,11). Toutefois, les concentrations de 89Zrr Gd et 90Y, de l'ordre de la picomole, requises pour l'imagerie par tomographie par émission de positrons pour l'imagerie par résonance magnétique ou pour la radiothérapie, sont inférieures de plusieurs ordres de grandeur aux concentrations toxiques. On a utilisé la polylysine comme agent complexant pour poly-I/poly-C dans la chimiothérapie des tumeurs (18), et pour administrer du méthotréxate à des cellules d'ovaire (19). On peut donc trouver une solution au problème de la toxicité. Les astrocytomes C6 constituent un bon modèle des gliomes humains, parce que la tumeur produit la substance S-100 (20), la glutathione-S-transférase (21) et le facteur de maturation névroglique (22). L'imagerie réussie de cette tumeur in vivo possède des applications directes à l'imagerie de gliomes de cerveau humain in yivo. Chez l'homme, le complexe polylysine-DTPA-nucléide aura une utilité plus grande que chez le rat. On opère facilement le placement du cathéter dans l'artère carotide, dans la zone de la tumeur, et l'on distingue facilement la masse tumorale par tomographie par émission de positrons. La taille du cerveau de rat (0,8-1,0 cm en dimension dorsale/ventrale) est à peu près celle d'une tranche unique (5 mm) en tomographie par émission de positrons. Dans un cerveau humain, cette résolution apporte l'information nécessaire pour déterminer les frontières de la tumeur et l'à-propos d'une chirurgie.' Les polymères polylysines préférés pour l'emploi dans les complexes de la présente invention sont les polypeptides ou les homopolymères de lysine présentant une masse moléculaire d'environ 5000 à environ 20.000 daltons. On peut les produire selon le procédé décrit dans le brevet U.S. N 3.215.684. On peut utiliser toute polylysine qui se lie de façon covalente à l'agent chélatant et qui possède une charge nette positive adéquate pour être attirée par les cellules tumorales et s'y fixer, ainsi qu'un rapport de toxicité favorable. L'agent chélatant préféré pour- être utilisé dans la présente invention est le DTPA (acide diéthylène-triaminepenta-acétique), connu également sous le nom d'acide pentétique. La fonction de l'agent chélatant est de se lier de façon covalente à la polylysine et aux ions métalliques qui sont les agents thérapeutiques ou d'-magerie. On peut préparer le DTPA comme décrit dans le brevet U.S. N 2.384.816. Les autres agents chélatants que l'on pourraient utiliser englobent l'acide éthylènediamine-tétra-acétique et le DOTA. Des représentants des agents métalliques que l'on peut utiliser comme agents d'imagerie par résonance magnétique dans les nouveaux complexes de la présente invention sont des ions paramagnétiques, comme ceux du gadolinium, du manganèse et du cobalt. Des représentants des ions métalliques que l'on peut utiliser comme agents d'imagerie par tomographie par émission de positrons sont ceux de 89Zr, 52Mn ou 55Co. Un représentant des ions que l'on peut utiliser comme agent d'imagerie par caméra gamma est 111In. Des représentants des ions métalliques que l'on peut utiliser comme agents thérapeutiques dans les complexes de la présente invention sont 90Y et 211At (astates. Deux autres techniques présentant une utilité clinique dans l'étude des tumeurs sont possibles en raison de la fixation des complexes ou des sondes contenant de la polylysine à des cellules tumorales a) on peut soumettre des échantillons de liquide rachidien à une centrifugation à faible vitesse, 1000 x g pendant 10 minutes, pour récupérer toute cellule ou tout fragment de cellule présent. Le liquide rachidien ne contient normalement pas de cellules mais- il peut contenir des cellules ou des fragments de cellule de tumeur du système nerveux central. Le culot résultant est remis en suspension dans du sérum physiologique contenant un tampon bicarbonate, et on ajoute å la suspension de la polylysine radio-marquée.On soumet la suspension de cellules à une nouvelle centrifugation, sous l'action de la même force que celle indiquée ci-dessus, et le culot est récupéré et lavé trois fois avec un tampon. On soumet ensuite le culot à un comptage pour déterminer le nombre de cellules par unité de volume du liquide rachidien. b) On peut faire incuber des échantillons de liquide rachidien ou de plasma sanguin avec des sondes à base de polylysine (polylysine seule, complexe polylysine DTPA-ion métallique, polylysine-fluorescéine, ou une autre sonde fluorescente). On soumet le mélange à une centrifugation à faible vitesse, inférieure à 2000 x g, pendant 10 minutes. Qn remet les culots en suspension dans un tampon bicarbonate, et on les place sur des membranes de nitrocellulose pure. Les sondes à la polylysine se fixent avec avidité à la membrane de nitrocellulose, même si la polylysine est complexée avec d'autres substances. Les complexes polylysine-cellule tumorale adhèrent eux aussi à la membrane. On peut alors faire incuber les cellules fixées à la membrane avec des immunoglobulines qui sont spécifiques pour certains types particuliers de cellules tumorales. Ces immunoglobulines sont disponibles dans le commerce ou peuvent être préparées. On peut ensuite utiliser les protocoles classiques du "Western blotting", pour réaliser des essais en taches, qui permettent d'identifier les fragments de cellules tumorales adhérant à la membrane de nitrocellulose.En particulier, l'immunoglobuline anti-tumeur initiale peut avoir diverses ofigines, c'est-à-direl qu'elle peut provenir du patient, d'une souris, d'un mouton, d'une chèvre, etc.. En fonction de l'origine de l'immunoglobuline initiale, on fait incuber avec la membrane dé nitrocellulose une seconde immunoglobuline lc'est-à-dire IgG et IgM antihomme, anti-souris, anti-mouton ou anti-chèvre), couplée à une molécule comme une peroxydase ou une phosphatase. La membrane est lavée après chaque étape. Enfin, on fait incuber la membrane avec un substrat approprié qui donne un nouveau signal (par exemple une couleur ou un signal électrique). Les complexes de la présente invention, lorsqu'ils sont utilisés in vivo comme agents de diagnostic ou comme agents thérapeutiques, sont de préférence combinés avec des diluants classiques pharmaceutiques ou de diagnostic, comme de l'eau stérile pour injection USP, du lactose, des sels, etc., et emballés sous forme de préparations stériles. Ces préparations contiennent normalement une quantité sûre et efficace des ions métalliques qui sont des agents connus d'imagerie ou de diagnostic, pour l'usage que l'on envisage pour eux. Références bibliographiques 1. Lyons BE, Strohbehn JW, Roberts DW, Wong TZ et Britt RH, Interstitial microwave hyperthermia for the treatment of brain tumors. Dans Hyperthermia in Cancer Treatment, Edité par Anghileri LJ et Robert J., CRS Press Inc., vol. 3, pages 25-46, 1986. 2. 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Complexe conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de liaison est l'acide diéthylène-triamine-penta-acétique (DTPA). 3. Complexe conforme à la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'agent d'imagerie est un ion métallique paramagnétique. 4. Complexe conforme å la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent d'imagerie est du zirconium. 5. Complexe conforme à la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent d'imagerie est du gadolinium 6. Complexe conforme à la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'agent d'imagerie est un agent d'imagerie par résonance magnétique. 7. Complexe conforme à l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il y a une molécule d'agent de liaison pdur 5 à 20 groupes lysyles. 8. Complexe tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes, destiné å être utilisé en imagerie pour le diagnostic d'une tumeur présentant une charge nette négative chez un animal. 9. Complexe tel que défini dans la revendication 6, destiné à être utilisé dans l'obtention sélective d'images d'une tumeur présentant une charge nette négative chez un animal. 10. Complexe tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant un agent chimiothérapeutique destiné à être utilisé dans le traitement d'une tumeur présentant une charge nette négative chez un animal. 11. Trousse d'essai pour le diagnostic de cellules, fragments de cellule et protéines spécifiques d'une tumeur présentant une charge nette négative dans un fluide corporel, ladite trousse comprenant un complexe conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 7. 12. Complexe tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, destiné à être utilisé dans la préparation d'une composition pour l'imagerie de diagnostic ou le traitement d'une tumeur présentant une charge nette négative chez un animal.