FR 2647807 A1 19901207 FR 8907243 A 19890601 L'invention se rapporte à de nouveaux catalyseurs enzymatiques utilisables pour la transformation de composés organiques par hydrolyse ou synthèse de la fonction ester. L'utilisation d'enzymes catalysant l'hydrolyse ou la synthèse de la liaison ester dans le domaine de la synthèse organique, pour les lipides en particulier, fait partie depuis quelques années des méthodes fréquemment employées. De telles enzymes sont désignées ci-après sous la dénomination enzyme lipolytique qui recouvre aussi bien les lipases classiques, les phospholipases ainsi que les esterases. Il est en effet bien connu que les enzymes de ce type qui catalysent l'hydrolyse des esters d'acides gras peuvent catalyser également, après adaptation des conditions opératoires, les réactions d'esterification et les réactions analogues telles que l'alcoolyse et la transterification. L'expression "hydrolyse ou synthèse de la fonction ester" désigne dans la présente demande l'ensemble de ces réactions. Ces enzymes lipolytiques sont des protéines présentant une certaine fragilité lorsqu'on les compare aux autres catalyseurs connus en chimie. Cette relative fragilité entraine un manque de stabilité pouvant conduire dans certains cas à une inactivation du pouvoir catalytique. Pour pallier cet inconvénient, la solution retenue habituellement consiste à immobiliser l'enzyme sur un support. Dans le cas d'enzymes d'origine fongique, une solution intéressante consiste à utiliser la lipase naturellement immobilisée dans son mycélium d'origine. Un tel procédé est décrit notamment dans le brevet français 2585365 de la demanderesse. Cette solution n'est malheureusement pas utilisable dans le cas d'enzymes d'origine microbienne non fongique, (bactéries, levure), ou d'enzymes d'extraction, enzymes pancréatiques ou gastriques, et il est alors nécessaire pour immobiliser l'enzyme d'utiliser des supports minéraux classiques. L'association ou l'adsorption d'enzymes sur silice, célite, terre de diatomées, etc... a déjà été décrite par exemple dans les demandes de brevet européen 064855 du 4.5.82 et 035883 du 3.6.1981. Il existe même actuellement des lipases commerciales fixées sur support. Cependant, les procédures impliquées pour la fixation, par exemple, celles décrites par EIGTVED et Al "A new immobilized lipase for interesterification and ester synthesis". Proc. AOCS Conference, Cannes, France, 1985 ou SONOMOTO et Al, IXth Enzyme Engineering Conference, Santa Barbara, Ca USA 1987, comportent des étapes de purification et de greffage chimiques qui rendent le catalyseur final relativement coûteux. L'invention concerne de nouveaux catalyseurs à base d'enzymes lipolytiques associées à un support minéral, susceptibles de réaliser l'hydrolyse ou la synthèse de liaison ester en milieu organique et présentant une bonne stabilité et d'un coût de préparation peu elevé. L'invention a pour objet de nouveaux catalyseurs enzymatiques pour l'hydrolyse ou la synthèse, en milieu organique; de la liaison ester comprenant au moins une enzyme lipolytique associée à un support minéral caractérisés en ce que le support minéral est du talc. Les catalyseurs de l'invention permettent de réaliser en milieu organique - La synthèse ou l'hydrolyse d'esters carboxyliques, réactions pour lesquelles l'enzyme sera une lipase, une esterase ou une phospholipase A1, A2 ou B. - La synthèse ou l'hydrolyse d'esters phosphoriques, réactions pour lesquelles l'enzyme sera une phospholipase C ou D. On entend par esters carboxyliques les composés organiques comportant la fonction dans laquelle X est soit l'oxygène, soit le soufre et R un reste hydrocarboné. Les esters phosphatïdiques sont des triglycerides dont l'une au moins des fonctions alcool du glycerol est esterifiée par un ester phosphorique. La formule ci-après schématise un exemple d'ester phosphatïdique : Les diverses phospholipases, selon leur type catalyseront des réactions d'hydrolyse spécifiques. La phospholipase A1 hydrolysera la fonction ester du carbone 1. La phospholipase A2 hydrolysera la fonction ester du carbone 2. La phospholipase B hydrolysera simultanément les 2 fonctions ester. La phospholipase C hydrolysera la fonction ester de l'acide phosphorique côté glycerol. La phospholipase D hydrolysera la fonction ester du reste amino-ethyle. La réaction est mise en oeuvre en milieu organique, c'est-à-dire, dans un milieu dont la phase continue est organique et dont la teneur en eau est faible. La quantité maximale d'eau présente dans le milieu sera fonction de la réaction mise en oeuvre. Par exemple, dans le cas d'une estérification, la teneur en eau sera inférieure à 100 ppm, dans le cas d'une alcoolyse, elle sera inférieure a 1%, mais dans le cas d'une hydrolyse où l'eau est un élément de la réaction, elle pourra atteindre quelques %. Selon la réaction envisagée, il sera parfois avantageux, par exemple pour une esterification ou une alcoolyse, d'éliminer par tout moyen convenable l'eau ou l'alcool formé lors de la réaction et ainsi de déplacer son équilibre. On choisira comme enzymes lipolytiques, les enzymes, notamment les lipases et les phospholipases, permettant l'hydrolyse ou la synthèse de la liaison ester sur des composés organiques, tels que - les esters - les couples acide organiques ou gras avec alcool polyol amine thiol - les triglycerides - les glycerides partiels - les phospholipides - les lysophosphatides - les acides phosphatïdiques Les enzymes lipolytiques peuvent être d'origine animale végétale ou microbienne, y compris les lipoprotéines lipases. Elles peuvent être de type classique, avec site à sérine ayant un fonctionnement à pH neutre 7/8 ou de type acide, avec site a thiol, ayant un fonctionnement à pH 3 à 6. Les phospholipases sont d'origine quelconque et de tous les types possibles, Al, A2, B, C, D. L'originalité des catalyseurs de l'invention réside essentiellement dans le choix d'un support minéral particulier : le talc qui est associé à l'enzyme lipolytique à mettre en oeuvre. Le talc est une association de silicates de magnesium comprenant au moins 25% poids de phyllosilicate de formule théorique Si4 10 Mg3 (OH)2- Dans ce phyllosilicate, chaque feuillet octaédrique de brucite Mg3 (OH)2 4+ est pris entre 2 feuillets tétraédriques Si 04 4- En fait, le terme talc désigne le phyllosilicate associé en mélange à d'autres minéraux. Le mélange comprend de 0 à 70% poids d'autres silicates de magnesium tels que la chlorite de formule théorique 9Mg0, 3A12 03, 5Si 2 8H20 silicate du genre du talc dans lequel l'alumine est substitué en quantité variable au magnesium dans le feuillet brucite. Le mélange peut comprendre de 0 à 2% d'impuretés minérales telles que dolomie, Ca, Mg CO3, Fe2 03... Le talc est inerte et stable, chimiquement et biologiquement. I1 résiste à des températures de 1000C sans se décomposer. I1 est doué de propriétés hydrophobes, d'où son affinité pour les milieux organiques. La chlorite possède des propriétés voisines, mais l'hydrophobie des faces de type talc, est équilibrée par une certaine hydrophilie des autres faces. Les catalyseurs enzymatiques de l'invention présentent l'originalité, outre leur faible coût lié à la facilité de mise en oeuvre, d'apporter un effet de stabilisation, mais également, ce qui en plus est inattendu, un effet d'activation, notamment dans un domaine de température où usuellement l'activité de l'enzyme décroit ou même s'annule. L'association du talc choisi et de l'enzyme lipolytique souhaitée peut se faire selon des processus physiques très variés : tels que par exemple - Précipitation par solvant La solution de l'enzyme est mélangée au talc, et un solvant tel que l'acétone est ajouté à la suspension. L'enzyme précipite et s'associe au talc. I1 suffit ensuite de filtrer et d'évaporer la phase liquide pour obtenir la préparation finale. - Séchage par évaporation Le mélange talc/solution enzymatique est évaporé sous vide à une température convenable jusqu' obtention du produit sec final. - Séchage par lyophilisation Le mélange talc/solution enzymatique et congelé en couche mince, puis l'eau est éliminée par lyophilisation. - Séchage par atomisation La suspension talc/solution enzymatique est pulvérisée dans un courant d'air chaud (à une température compatible avec une activité finale convenable de la préparation), et la poudre séchée obtenue est récupérée par un cyclone. Le terme d'association enzyme-talc signifie que l'on crée entre l'enzyme et le support non pas une liaison chimique mais simplement une liaison de nature physique. La préparation du catalyseur enzymatique peut se faire à partir d'une solution enzymatique brute ou à partir d'une solution purifiée d'enzymes. La solution enzymatique contiendra soit une seule enzyme, soit un mélange d'entre elles selon les fonctions à assigner'au catalyseur final. Les applications du catalyseur ainsi préparées sont multiples, et concernent tous les domaines d'application des enzymes lipolytiques. Les applications suivantes sont plus particulièrement visées - Préparation d'arômes naturels par transestérification de triglycérides à l'aide de lipases spécifiques de certains acides gras, tels que les acides gras à chaines courtes. - Préparation d'acides gras polyinsaturés par hydrolyse spécifique de certaines associations de triglycérides. - Préparation de lysolécithines par utilisation de phospholipases et des phospholipases A2 en particulier. - Utilisations en synthèse organique dédoublement de mélanges racémiques d'esters, d'alcools, ou d'acides chiraux . transestérification de phospholipides Les catalyseurs enzymatiques de l'invention sont illustrés par les exemples ci-après dans lesquels différents types de talc seront utilisés et qui correspondent aux références suivantes 00 : talc standard broyé à 50 - qualités pharmaceutiques blancheur 90 avec une teneur en talc minéralogique de 90% 15 MOO : talc standard broyé à 15 PE 8224 : talc standard broyé encore plus finement ( PE 8223 : talc 15 M00 traité å l'alcool polyvinylique (PVA) PE 8213 : talc 15 M00 traité par 1% d'aminosilane 00C : talc chloriteux - qualité ordinaire blancheur 84 teneur en talc minéralogique de 45% et une teneur en chlorite de 55% PE 8225 : talc OOC broyé très finement ( Extra Steamic 0 : talc 00C rebroyé à la vapeur EXEMPLE I La réaction choisie est l'éthanolyse de triglycérides. Deux lipases de Candida Cvlindracea (= Candida rugosa) d'origine Sigma et Meito Sangyo sont colyophilisées avec du talc "(Extra Steamic 0"), à raison de 20% d'enzyme par rapport au support minéral. La réaction est opérée dans la matière grasse laitière anhydre (MGLA) à l'état fondu pendant 20 H à 40 C. La proportion d'esters obtenue est exprimée en mg pour 100 mg d'esters potentiels obtenus de façon non spécifique par éthanolyse chimique. Les résultats obtenus sont les suivants Tableau 1 I Rendement en esters, mg pour 100 mg Lipase I Enzyme libre | Enzyme associée au C. cylindracea talc sigma I 1 15,7 Meito Sangyo 0 11,0 EXEMPLE II Dans les mêmes conditions, d'autres lipases donnent des résultats différentes qui figurent dans le tableau 2 ciaprès Tableau 2 I | Rendement en esters, % Lipases Origine Enzyme libre Enzyme/Talc Rohm J Pseudomonas Sp 1 19,8 1 23,5 Sigma Pancreas porc 0 5,5 Gist Brocades Mucor Meihei 0 1,9 EXEMPLE III Cet exemple illustre les résultats obtenus dans les mêmes opérations avec différentes qualités de talc L'enzyme utilisée est la lipase de Candida Cylindracea, dans les conditions opératoires de l'exemple 1. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 3 ciaprès Tableau 3 Référence du talc | Rendement en esters, S 1 00 1 6,6 1 1 15 M00 | 9,8 00C 11,7 Extra Steamic 0 1 15,7 PE PE 8224 | 10,1 I PE 8225 | 19,8 I PE 8213 | 6,6 I PE 8223 | 11,8 Témoin enzyme libre 0 EXEMPLE IV Cet exemple illustre, dans les mêmes conditions que l'exemple 2 en utilisant l'enzyme de Rohm (lipase de Pseudomonas sp) l'effet de l'association enzyme/talc sur une stabilisation de l'activité vis-å-vis de la température (exprimée en % comme dans l'exemple 1). Les résultats obtenus figurent dans le tableau cidessous. Tableau 4 I Rendements en esters Température I J I 40 50 60 Enzyme libre 1 19,8 1 0 1 0 IEnzyme associée au talc r | (Extra Stéamic 0) 23,5 24,8 20,9 EXEMPLE V Cet exemple illustre la mise en oeuvre des phospholipases en association avec le talc. L'enzyme utilisée ici est une phospholipase pancréatique (lécithase de NOVO), mise en oeuvre libre ou associée à du talc Extra Steamic 0, en milieu méthyl-tertiobutyl-éther/acétone 85-15, à 37 C pour l'hydrolyse de la lécithine de soja. La proportion utilisée est de 1 g de lécithine pour 70 ou 150 mg d'eau destinée à l'hydrolyse. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 5 ciaprès. Les valeurs indiquées correspondent aux milligrammes d'acides gras libérés en 20 H par g de lécithine. Les deux dernières lignes visent des expériences menées à 48 C. Tableau 5 Acides gras libérés en 20 h (mg) Quantité d'eau utilisée 70 mg 150 mg Enzyme/talc I 294 1 367 Enzyme libre 53 282 Enzyme /talc (48 C) - 488 Enzyme libre (48 C) - 305 REVENDICATIONS 1- Catalyseurs enzymatiques pour la mise en oeuvre de la réaction d'hydrolyse ou de synthèse, en milieu organique, de la liaison ester en présence d'un catalyseur constitué d'une enzyme lipolytique associée à un support minéral caractérisés en ce que ce support est constitué par une association de silicates de magnésium. 2- Catalyseurs selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'association des silicates de magnésium comprend au moins 25% en poids d'un phyllosilicate de formule Si4 Oio Mg3 (OH)2.