FR 2659013 A1 19910906 FR 9002754 A 19900301 La pressente invention concerne une composition pharmaceutique constitue d'un composant actif qui contribue à agir sur la division des cellules. En particulier, elle peut corriger certaines pathologies hématologiques. Depuis longtemps, la recherche médicale étudie des molécules pour freiner la division des cellules lors des cancers. Mais il n'y a pratiquement pas de médicament commercialisé qui puisse à l'inverse, favoriser la prolifération cellulaire. En médecine, il serait interessant de pouvoir augmenter la prolifération cellulaire des cellules donnant naissance aux globules blancs et aux globules rouges. En effet, il est fréquent d'observer chez les malades des déficits numériques en globules blancs (leucopénie), ou en globules rouges (anémie). Les globules blancs et rouges sont formés dans la moelle osseuse à partir des mêmes cellules primitives. Celles-ci en se divisant un certain ncr:bre de fois vont créer les leucocytes (globules blancs) et les globules rouges, entre autres. Si ces cellules precurseurs ( les progéniteurs) ne se divisent pas suffisamment bien à cuse aplasie médullaire partielle, on observera une leucopénie ou une anémie. Parfois, il y a une association de ces deux pathologies Les globules blancs sont responsables des défenses immunitaires de l'organisme. Tout déficit en globules blancs entraîne une deficience immunitaire. A Inverse, un médicament qui favoriserait une augmentation du nombre des globules blancs provoquerait une augmen- tatioin des défenses immunitaires. On comprend done l'intér^rt d'une médicament qui permettrait de stimuler la multiplication cellulaire des progéniteurs granulomonocytaires de la moelle osseuse en cas d'aplasie mécullaire. L t invention a pour objet une nouvelle composi- ion constituée d'un composant actif : la bêta-alanine. La bêta-alanine est aussi appelée acide 3-amnopropionique. ra beta-alanine (acide 3-aminopropionique) Formule générale: Actuallement on ne connaît pas d'action spécifique de cette molécule sur l'immunité ou sur l'hématopolèse(formation des cellules sanguines). La bêta-alanine est connue et synthétisée depuis plus de o ans. Elle est utilisée dans l'ali- mentation comme apport protéique. Pour connaître la méthode de synthèse de la beta-alanine, on peut se reporter au MEPO INDEX, dixième édition, référence : 1C, 192. La bêta-alanine peut s'acheter dans de nombreuses sociétés chimiques. On la trouve cite dans le livre Aldrich 1985-1986, page 31, référence 23,972-0. ''obtention de la composition selon l'invention consiste sar exemple, en un simple mélange de l'acide 3-aminopropionique en poudre avec un excipient adéquat en poudre. 'et excipient peut être constitué d'amidon, e stéarate ce glycérol, de silice hydraté. La composition selon l'invention peut être présentée sous forme de comprimés. L'activité pharmacologique de la composiion selon l'invention est révélée par la mise n oeuvre des essais suivants: Essai A : Etude de l'effet de la bêta-alaine sur les progéniteurs médullaires granulomonocytaires humains. L'effet toxique ou stimulant directe d'une mollécule sur les progéniteurs hématopolétiques humains peut être évalué in vitro par culture sur milieu semisolide de moelle osseuse normale. On observe agrès quelques jours une inhibition ou une stimulation du clonage des granulo-monocytes par la molécule testée, présent pendant toute la durée de la culture cellulaire. Si la molécule est toxique, il y a une inhibition du clonage. Matériel et Méthode 1) La moelle humaine normale provient de sujets subissant un prélèvement de moelle osseuse en vue d'une greffe de moelle allogènique chez un parent HLA compatible. 2) La bêta-alanine est dissoute dans du sérum physiologique à partir de cristaux purs commercialises sans excipient. t éthode La méthode consiste à mettre en culture en boîtes de Pétri des progéniteurs granulo-monocytaires de moelle osseuse. Les boîtes de Pétri doivent contenir un milieu adéquat pour permettre la culture des cellules. Diverses méthodes sont bien connues des hématologistes. Nous en citerons une. Dans les boites de Pétri, on ajoutera des doses variables de bêta-alanine. Cn étudiera alors si ii y a une stimulation du développement des cultures en présence de bêta-alanine par rapport à des cultures témoins sans bêta-alanine. Voici un exemple de méthod utilisée: Dix millilitres de moelle prélevée sur héparine sans conservateur sont dilués au 1/5ème dans du milieu HBSS et callules lympho-mononucléées sont récupérées après utilisation d'un gradient de Ficoll. près 3 lavages, les cellules sont remises en suspension et cumérées en cellule de vallassez. On ensemence ces cellules en dilution à 2x105 cellules/ml, dans de l'agar à 0,3 % en présence de 1 % de milieu SVF et de 10 % de milieu stimulant provenant de surnageant de culture de lignée U5637. e cultures sont faites en quadriplicate, en boîtes ce Pétri de 35 nm et incubées à 370 C sous 5 % de gaz carbonique, en atmosphére saturée en humidité. Les colonies sont décomptées au jour 12 au microscope inverse sous forme de groupements de cellules granuleuses ou macrophagique de plus de 5O cellules. La bêta-alacine dont on teste ia toxicité éventuelle sur les granulo-monocytes est incluse dans l'agar pendant toute la durée de la culture, sous un volume final dans ce milieu de culture inférieur à 10 . On étudie l'effet de différentes concentrations de bêta-alanine. Pour cela on dépose, selon les séries de cultures, des doses de bêta-alanine pure allant due O à I60 microgrammes pour 2 x IOD cellules ensemencées,dans les boites de Pétri Résultats : On constate une stimulation du clonage (voir tableau 1). La bêta-alanine augmente de 116 70 le nombre de granolo- monocytes présents dans le milieu de culture, par rapport aux milieux témoins sans bêta-alanine. Il y a une stimulation de l'hématopoièse. On observe une accélération ce la multiplication et de la différen ciation cellulaire des progéniteurs granulo-monocytaires inactifs de la moelle osseuse, en polynucléaires, monocytes nu macrophages circulants actifs. Il y a moins de cellules à rester au repos entre deux divisions. Elles se divisent plus rapidement que dans les cultures témoins (sans bêta-alanine). ssai 3 étude de l'effet de l'azidothymidine (3'-azido-3'désoxythymidine) sur les progéniteurs médullaires granulo-monocytaires humains. On procèce exactement comme précédemment, seule la molécule testée et les dosages changent. On teste cette fois l'azidothymidine dont la dénomination chimique est 3'-azido-3'déscxythymidine. Formule générale de la 3'-azido-3'désoxythymidine: Cette molécule est plus connue sus le nom de zidovudine, elle est commercialisée en France, sous le nom de RETROVIR (.N'arque déposée). Elle est principalement utilisée pour inhiber la réplicationh des virus du SIDA. Son emploi en médecine s'accompagne souvent chez les malades d'une toxicité. On observe en particulier fréquemment une baisse du nombre des leucocytes et l'existence d'une anémie. L'azidothymidine dans nos expériences, est obtenue à partie de gelules-du médicament Retrovlr (arque déposée). Le contenu est dissout dans du sérum physiologique puis les excipients sont éliminés par une filtration adéquate et suffisante. Les dosages testes vont de G à60microgrammespour 2 x IO5 cellules ensemencées. Résultats On constate une inhibition de la prolifération cellulaire des granulo-monocytes en présence de 5 microgrammes d'azidothymidine (voir tableau 2). Cette inhibItion est forte (- 87 %) et s'accentue avec des doses plus élevées d'azidothymidine. Essai C : étude de l'effet de la bêta-alanine et de l'azidothymidine ensemble, sur les progéniteurs granolomonocytaires. Cn recommence le me type d'expériences mais en ettant n présence ensemble la bêta-alanine et l'azidothymidine. Ils sont associés dans la proportion de 1/3 d'azido- thymicne pour 2/3 de bêta-alanine, e poids. Les doses testées vont de C à 800microgrammes pour l'azidothymidine et pour 2xIO5 cellules, selon les séries de cultures. Pour la bêta-alanine on teste donc deux fois plus e poids. Les doses utilisées vont de C à 160Cmicrogrammes pour 2 x IO5 cellules ensemencées, dans les boites de Pètri Résultats: La toxicité de l'azidot'nymidine est beaucoup moins Importante en présence de bêta-alanine. Avec 12 microgrammes d'azidothymidine et 24microgrammes de bêta-alanine, on constate une inhibition de -24 % de la multiplication callulaire, (voir tableau 3). Comparativament, la toxicite de 12microgrammes d'azidothymidine seule (voir tableau 2 ) provoque une inhibition de -97 %. La toxicité est quatre fois moins importante dans est exemple lorsque l'azidothymidine est associé de la bêta-alanine. Pour les autres dosages test-s on retouve aussi une diminution de toxicité par rapport à la dose d'azidothymidine testée seule. Il y a donc avanta--e 7 associer l'azido- thymidine avec la bêta-alanine pour diminuer la toxicité de l'azidothymidine sur l'héxatopoièse des leucocytes. L'azydothymidine est un médicament antiviral contre les rétrovirus du SIDA. Dans la malade du SIDA, y a déjà une diminutIon du nombre des leucocytes. 71 serait souhaitable de ne pas aggraver ce déficit n globules blancs avec des doses d'azidothymidine trop toxiques sur ces globules blancs. Jusqu' 3 présent, la toxicité de l'azidothymidine a toujours t un gros handicap pour traiter les malades. L'adjonction de la bêta-alanine à l'azidothymidine peut donc constituer un avantage important pour la thérapie des malades traités par azidothymidine. Des molécules autres que l'azidothymidine, toxiques sur l'hématopolèse auraient probablement avantage être associées à la bêta-alanine. De nombreux médicaments sont connus pour pouvoir provoquer parfois une aplasie médullaire partielle . Dans ces cas, il faudrait étudier l'intérêt probable d'une association de ces médicaments avec la bêta-alanine. Dans la mesure où la bêta-alanine favorise l'augmentation du nombre des leucocytes, elle contribue à restaurer une immunité normale chez des malades ayant une défi- science immunitaire de leurs leucocytes. Il est trés probable que la bêta-alanine puisse aussi corriger certaines anémies en globules rouges provoquées par une déficience de l'hématopoièse. n effet, les cellules qui donnent naissance aux globules rouges dans la moelle osseuse sont au départ de l'hématopoièse les mêmes es que celles qui donneront naissance après différenciation aux leucocytes. La beta-alanine fait la preuve d'une action in vitro sur la multiplication des cellules. Il est envisageable d'utiliser la bêta-alanine dans l'industrie pour stimuler en in vitro des cultures industrielles de cellules, en particulier pour les leucocytes. il est donc possible d'utiliser la beta-alanine pour l'obtention d'une substance ayant pour but de stimuler la multiplication et la différenciation cellulaire. La composition selon l'invention peut être administrée suivant le poids et la superficie corporelle ces doses journalières comprisses entre 50 milligrammes et quatre grammes du produit actif en poids. De préférence, on utilisera des doses journalières comprises entre 100 milligrammes et 2,5 grammes. TABLEAU I bêta-alanine 0 g 5 g 12 g 20 g 30 g 40 g 60 g 100 g 160 g nombre de 28 34 39 43 44 50 51 61 42 52 50 54 64 64 60 68 63 67 colonies 30 29 46 53 49 50 48 53 50 49 65 50 65 68 65 65 66 65 moyenne 30 45 48 53 48 55 65 65 65 % de stimulation 0% 50% 60% 76% 60% 83% 116% 116% 116% TABLEAU 2 Zidovudine 0 g 5 g 12 g 24 g 30 g 60 g nombre de 31 33 5 6 2 1 0 0 0 0 0 0 colonies 31 34 5 5 0 1 0 0 0 0 0 0 moyenne 32 5 1 0 0 0 % d'inhibition 0% -84% -97% -100% -100% -100% Zidovudine : autre nom de l'azidothymidine ou 3'-azido-3'désoxythymidine g : microgramme TABLEAU 3 Zidovudine 0 g bêta-alanine 0 g 5 g 12 g 20 g 30 g 40 g 60 g 100 g 160 g nombre de 145 130 69 87 93 98 78 73 78 64 83 69 61 46 24 26 24 28 9 10 2 1 0 0 colonies 99 112 96 88 86 91 61 75 67 53 75 76 41 24 25 20 23 9 8 0 1 0 0 moyenne 121 85 92 72 63 76 50 25 24 9 1 0 % d'inhibition 0% -30% -24% -40% -48% -37% -58% -79% -80% -02% -99% -100% Zidovudine : autre nom de l'azidothymidine. g : microgramme -REVENDICATTIONS 1. - Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, a titre de composant actif de la bêta-alanine,(scide 3-aminopropionique) 2. - Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend le composant actif en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 3. - ComposItion pharmaceutique selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme appropriée pour une administration orale. -Composition pharmaceutique selon le revendication 2, caractérisée en ce qu'elle se pressente sous une forme appropriée pour être inJectable. 5. - Ccposition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à fl, caractérisée en ce qu'elle contient - 50 n ring de bêta-alanine n étant une valeur comprise entre 2 et 80. 6. - Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de composants actifs de la beta-alanine et de l'azidothymidine (3'-azido-3'désoxythymidine). 7. - Utilisation de la bêta-alanine (acide 3-aminopropionique) pour l'obtention d'une substance ayant pour but de stimuler la multiplication et la différenciation cellulaire. 8. - Utilisation de la bêta-alanine (acide 3-aminopropionique) pour l'obtention d'un médicament ayant pour but de stimuler l'hématopoièse des granulomonocytes en particulier lors de maladies présentant une leucopénie d'origine médullaire. 9. - Utilisation de la beta-alanine (acide 3-aminopropionique) pour l'obtention d'un médicament ayant pour but d'accélérer la multiplication et la différenciation cellulaire des progéniteurs granulomonocytaires inactifs de la moelle osseuse, en polynucléaires, monocytes ou macrophages circulants. 10. - Utilisation de la bêta-alanine selon l'une quelponque des revendications 7 à 9 pour l'obtention d'un médicament ayant pour but d'augmenter le nombre des leucocytes dans le sang lors de leucopunies d'origine médullaire. 11. - Utilisation de la beta-alanine selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 pour l'obtention d'un médicament ayant pour but de contribuer a restaurer une immunité normale en cas de déficience immunitaire des leucocytes. 12. - Utilisation de la bêta-alanine selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 pour l'obtention d'un médicament ayant pour but de diminuer la toxicité de l'azidothymidine (3'-azido-3'désoxythymidine) en particulier sur les leucocytes. 13. - Composition pharmaceutique caractérisée en ce quelle est obtenue par la mise en oeuvre de l'une quelconque des revendications 7 à 12.