FR 2648056 A1 19901214 FR 8907781 A 19890613 La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation de microparticules lipidiques d'aspect microcristallin. Cc type de microparticules, appelé microcristaux, a été décrit par la Demanderesse notamment dans la demande de brevet européen nO 270 460. Dans la présente demande, par "aspect cristallin" on n'entend pas que la structure cristalline soit nécessairement obtenue stricto sensus. Plus précisément, il s'agit de microparticules d'une substance insoluble dans l'eau présentant une affinité pour les phospholipides et d'au moins un phospholipide. Il faut entendre par substance insoluble dans l'eau une substance peu ou pas soluble dans l'eau et par substance présentant une affinité pour les phospholipides un composé chimique plus particulièrement capable d'interagir avec les phospholipides par voie chimique et/ou par voie physique. Ces microparticules offrent principalement l'avantage d'obtenir une microsuspension stable en solution aqueuse d'une substance par ailleurs insoluble en phase aqueuse, ce qui permet de l'administrer notamment lorsqu'il s'agit d'un médicament sous forme injectable ou pulvérisable. En outre, vraisemblablement en vertu d'un effet de pilotage accrû notamment vers les macrophages d'une part, et d'un effet de libération progressif de la substance active d'autre part, des préparations de microparticules donnent des résultats d'activité thérapeutique et de toxicité nettement plus intéressants que les vésicules lipidiques de type liposome. On a décrit dans la demande EP 270 460 un procédé de préparation relativement complexe de ces microparticules d'aspect cristallin, inspiré des procédés utilisés pour la préparation des liposomes. Le procédé décrit dans EP 270 460 comporte essentiellement les étapes suivantes : a) On évapore le ou les solvants d'une solution de phospholipide et de ladite substance, b) On remet le film obtenu après évaporation du ou desdits solvants en suspension dans une solution aqueuse après agitation vigoureuse. Pour remettre le film obtenu à l'étape b) en suspension, ceci était effectué par traitement aux ultrasons. Dans le cadre d'une application industrielle du procédé, la complexité de celui-ci, avec notamment la présence d'une étape d'agitation vigoureuse et notamment de traitement aux ultrasons constitue un inconvénient majeur. On a découvert de façon surprenante selon la présente invention que cette étape de sonication pouvait être supprimée, moyennant un nouveau procédé simplifié objet de l'invention. En effet, la présente invention a pour objet un procédé de préparation de microparticules lipidiques d'aspect microcristallin d'une substance insoluble dans l'eau présentant une affinité pour les phospholipides, et d'au moins un phospholipide, microparticule stable en suspension dans une solution aqueuse, caractérisé en ce que a) on dissout ladite substance et le ou lesdits phospholipides dans un ou des premier(s) solvant(s) organique(s) de ladite substance et du ou desdits phospholipides, et un tiers solvant du ou des dit(s) premier(s) solvant(s) et de l'eau, b) on mélange la solution obtenue de ladite substance et du ou desdits phospholipides à une solution aqueuse dans une quantité inférieure à celle à partir de laquelle on observe soit une démixtion soit une insolubilisation notamment sous forme de précipité de ladite substance et du ou des phospholipides, de manière à obtenir une phase homogène limpide, c) On évapore le ou lesdits premier(s) et tiers solvants en maintenant la solution en phase homogène pendant l'évaporation, pour récupérer une solution aqueuse contenant les microparticules sous forme de micro suspensions. Pour que la solution soit maintenue en phase homogène pendant l'évaporation, on fait en sorte que le tiers solvant ne disparaisse complètement qu'après que l'évaporation du ou desdits premiers solvants organiques ne soit achevée. Pour ce faire, on opérera l'évaporation à une température et pression qui ticnnent compte de la nature des solvants en cause et notamment en ayant recours aux propriétés azéotropiques du mélange. Par tiers solvant, il faut entendre un solvant qui permette de mélanger l'eau et lesdits premiers solvants en une phase homogène. Eventuellement le tiers solvant est un desdits premiers solvants. Dans le procédé, les solvants organiques devront présenter une température d'ébulliton inférieure à celle de l'eau à la pression à laquelle on travaille. Dans certains cas, il peut être avantageux dans le procédé selon l'invention à l'étape c) d'évaporer lesdits solvants à pression réduite. Les quantités de ladite substance et de phospholipide(s) dissoutes dans lesdits solvants doivent être supérieures de préférence au moins 10 fois voire 100 fois à celles qui seraient dissoutes dans la quantité d'eau envisagée dans le procédé. La simplicité du procédé selon la présente invention qui consiste essentiellement à mélanger tous les constituants puis à éliminer les solvants organiques et séparer ainsi une phase aqueuse et une phase organique, les microcristaux étant en suspension dans la phase laqueuse, laisse à penser que dès la mise en présence des différents constituants, une réaction physico-chimique du type complexation se produit, I'étape d'élimination des solvants organiques et de séparation de la phase organique et de la phase aqueuse conduisant à une agrégation sous forme de microparticules. Selon la présente invention, on obtient des microparticules d'aspect de structure et de taille identique et présentant les memes propriétés pharmacologiques avantageuses que celles obtenues par le procédé précédemment décrit dans EP 270 460. Comparé à la préparation de liposomes et à la préparation des microparticules du type microcristaux selon le procédé antérieur, le procédé selon la présente invention est beaucoup plus simpie et plus économique. En outre, les microparticules obtenues sont aussi stables que celles obtenues par l'anàien procédé et donc beaucoup plus stables que les liposomes qui souffrent d'une instabilité qui en limitc considérablement les possibilités d'emploi. Dans un mode particulier de réalisation de procédé selon l'invention, l'évaporation des solvants organiques et la récupération de la solution aqueuse se font en utilisant une installation du type évaporateur rotatif ou bien par une installation plus adaptée aux grandes quantités de solvant, tel qu'un évaporateur à film ascendant (6), l'évaporation se faisant sous pression réduite et la solution aqueuse étant entrainée par les vapeurs de solvants organiques avant d'être séparée par condensation de la phase organique. Avantageusement, dans ce mode de réalisation de l'invention, on peut soumettre la phase aqueuse récupérée contenant les microparticules à un deuxième cycle d'évaporation, voir à plusieurs cycles d'évaporation. A titre de premiers solvants organiques utiles dans le procédé selon l'invention, on peut citer les solvants de polarité intermédiaire tels que le méthanol, I'éthanol, le chloroforme, le dichlorométhane ou des mélanges de ceux-ci. A titre de tiers solvants, on peut citer les alcools tels que le méthanol et l'éthanol, I'acétone et le THF. On utilisera en particulier un alcool, notamment le méthanol ou l'éthanol à titre de tiers solvant. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les solvants organiques utilisés dans le procédé consisteront dans un mélange de chloroforme et de méthanol. Dans ce cas, le chloroforme s'évaporant normalement à 61,2"C à pression atmosphérique, c'est-à-dire au dessus de la température d'ébullition du méthanol (64,7"C) on opérera l'évaporation à la température de l'azéotrope chloroforme (81 % - méthanol (15 %) - eau (4 %)) dont la température d'ébulliton n'est que de 52,6CC à pression atmosphérique. Comme solution aqueuse utile dans le procédé selon la présente invention, on utilisera avantageusement des solutions salines telles qu'une solution de NaCI, par exemple à concentration à 0,9 %. De préférence, selon la présente invention, le rapport molaire phospholipide(s)/substance est compris entre 0,1 et 10. Si le rapport molaire est inférieur ou égal 2, notamment compris entre 0,8 et 2 et de préférence voisin de 1, on observe une interaction spécifique avec production homogène optimum de microparticules dont la taille moyenne est comprise entre 0,1 et 1 p. Dans certains cas, il peut être intéressant d'ajouter un ou des stérols pour renforcer l'activité de la substance active, en particulier du cholestérol ou de l'ergostérol. En général, selon l'invention, on utilisera de préférence comme phospholipide de la phosphatidylcholine. La phosphatidylcholine peut être préparée à partir de lécithine de jaune d'oeuf, de soja hydrogéné ou non ou de tout autre source industrielle de lécithine. Comme autre phospholipide utile dans le procédé, on peut utiliser la phosphatidyléthanolamine, la phosphatidylsérine, la phosphatidylinositol, la phosphatidylglycérol, la 3'-O-lysylphosphatidylglycérol, la diphsophatidylglycérol, cette liste étant bien entendu non limitative. Le procédé selon l'invention est particulièrement intéressant pour préparer des microparticules de médicaments antimycotiques, macrolides polyènes, tels que la nistatine et l'amphotéricine B et leurs dérivés aminoacyles qui présentent également une activité antifongique. Lorsque dans le procédé selon l'invention, ladite substance est l'amphotéricine B et le phospholipide de la phosphatidylcholine, avantageusement ces deux constituants sont mis en présence en quantité équimolaire pour former des microparticules lipidiques d'aspect cristallin. Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, 1'Amphotéricine B et la phosphatidylcholine sont dissouts dans un mélange chloroforme/méthanol 1:1 en volume, auquel on rajoute une solution saline dans une quantité comprise entre 1/20 et 2/10 du volume de la solution organique d'Amphotéricine B et de phosphatidylcholine. Le traitement des infections mycotiques causées par Candida et Aspergillus est difficile e? habituellement mal toléré. Peu de médicaments sont actifs contre ces deux types de microorganismes. Les antimycotiques macrolides polyènes tels que la nystatine et l'amphotéricine B en sont les produits les plus utilisés et caractérisés par une activité tant sur J'espèce Aspergillus que l'espèce Candida. L'autre classe importante est celle des dérivés azoles dont fait partie le kétoconazole mais dont l'activité plus restreinte ne s'exerce que sur les infections causées par Candida. L'utilisation clinique de l'Amphotéricine B est très fortement limitée par deux inconvénients majeurs - en premier lieu, sa grande insolubilité qui nécessite son administration en solution dans du désoxycholate de sodium, - en second lieu, la toxicité intrinsèque de déoxychlotate s'additionne à l'activité toxique de l'Amphotéricine B proprement dite qui s'exerce surtout au niveau des reins et de la moelle osseuse. Cependant quelque soient ses effets secondaires, cet antibiotique reste efficace dans les infections fongiques qui auraient un pronostic mortel sans ce traitement. Dans ce contexte, il est apparu important de diminuer la toxicité de 1'Amphotéricine B en modifiant sa pénétration intracellulaire. En effet, un facteur très important pour l'efficacité des antimycotiques en général, et pour 1'Amphotéricine B en particulier, est la nécessité d'induire une action antibiotique qui soit synergique avec celle des cellules hôtes, responsables des défenses anti infectieuses de l'organisme. Il a en effet été démontré que les polymorphonucléaires et les macrophages peuvent maîtriser avec succès relatif, des infections mycotiques dans la mesure où ces cellules peuvent phagocyter les microorganismes et les contrôler dans leur système lysosomial. Des médicaments antimycotiques doivent dès lors, non seulement réduire la multiplication des agents infectieux présents dans le milieu extracelîblaire mais pouvoir exercer également leur action à l'intérieur des phagosomes et lysosomes de polymorphonucléaires et macrophages. Or, très peu de choses sont connues de la pénétration intracellulaire des macrolides polyènes et tout laisse supposer par ailleurs que ces substances s'acumulent au niveau des membranes pericellulaires et ne parviennent dès lors atteindre les compartiments lysosomiaux intracellulaires que grâce au flux membranaire de la surface vers les espaces intracellulaires. L'invention a apporté une solution à ces problèmes en proposant une nouvelle forme galénique de l'Amphotéricine B basée sur l'interaction de ce médicament avec la phosphatidylcholine pour former une suspension de microparticules évoquée ci-dessus. Cette formule galénique permet en premier lieu d'administrer l'Amphotéricine B sans avoir recours à du désoxycholate et elle permet de décroître très significativement la toxicité aiguë des produits après injection intraveineuse. Ces microparticules ont la même activité que l'Amphotéricîne B solubilisée par du désoxycholate contre des Candida extracellulaires et sont plus actifs in vitro dans les infections intracellulaires à macrophages. Les propriétés des microparticules d'Amphotéricine B ont également été comparées avantageusement à celles des liposomes contenanr le même macrolide polyène et qui sont également préconisées comme transporteur capable de réduire les effets secondaires de l'amphotéricine. Ces liposomes Amphotéricine B ont déjà fait l'objet de plusieurs essais cliniques (1,2). Si la formulation sous forme de microparticules selon l'invention est tres avantageuse pour les substances telles que l'amphotéricine B, compte tenu de forte baisse de toxicité obtenue, il doit être bien entendu que d'autres substances actives peuvent également être utilisées pourvu qu'elles présentent une affinité pour un phospholipide. Certaines ont été mentionnées à titre non limitatif dans la demande EP 270 460 D'autres caractéristiques et avantages de la presente invention apparaîtront à la lumière de la description qui va suivre faisant référence à des figures. - La figure 1: représente une installation d'évaporateur à film ascendant. - La figure 2 : représente la taille moyenne des microparticules d'Amphotéricine B produites par le procédé selon l'invention. - La figure 3 : représente la fréquence en % de la distribution des tailles des microparticules du lot 5 produites par Je procédé selon l'invention. - La figure 4 : représente la fréquence cumulée en % de la distribution des tailles des microparticules du lot 5. - La figure S: représente l'activité hémolytique de l'Amphotéricine B sous forme de complexe au deoxycholate (Fungizone#) et de microparticules produites selon le procédé de l'invention et non lyophylisées (lot 3) vis à vis de sang humain (figure Sa) et murin. - La figure 6 : représente l'activité hémoly;que de l'Amphotéricine B sous forme de Fungizone et de microparticules lyophilisées produites selon le procédé de l'invention (lot 5) vis à vis du sang humain après 45 min à 450C. - La figure 7 : représente l'évolution pondérale des souris après administration d'Amphotéricine B sous forme de Fungizone# ou de microparticules préparées selon le procédé selon l'invention. - La figure 8 : représente la survie des souris après administration i.v. d'Amphotéricine sous forme de Fungizone# ou de microparticules préparées selon le procédé selon l'invention (lot 2). - La figure 9 : représente la survie des souris après administration i.v. d'Amphotéricine B sous forme de microparticules préparées selon le procédé selon l'invention (lot 3). - La figure 10: représente la mortalité au jour 14 due à !'Amphotéricine B administrée i.v. à des souris sous forme de Fungizone#, de liposomes et de microparticules EXEMPLE 1: PRODUCTION DE MICROPARTICULES D'AMPHOTERSCINE B 1. MATIERES PREMIERES Amphotéricine B : l'Amphotéricine a est un antibiotique macrolide polyène insoluble dans l'eau à pH neutre. II est produit par Streptomyces nodosus et son poids moléculaire est de 924. Phosphatidylcholine : La L-&alpha;-phosphaticylcholine (ou L-&alpha;-lécithine) est un phospholipide amphipatique dont la fonction polaire de l'ester d'acide phsophorique entraîne une certaine hydrophilie tandis que du côté acide gras la molécule est hydrophobe. Le caractère amphiphile de la phosphatidylcholine est mis à profit comme émulsionneur et solubilisateur de substances hydrophobes en milieux aqueux. Son poids moléculaire est de 785. La L-&alpha;-phosphatidylcholine est préparée chromatographiquement à partir de jaune d'oeufs frais et est pure à 99 %. 2. METHODE DE PREPARÂTION 2.1 A partir d'un gramme d'Amphotéricine Les préparations de microparticules d'Amphotéricine B ont été réalisées en utilisant un évaporateur à film ascendant de QUICK FIT (voir figure 1). Dans un erlen de 5 litres, on dissout I gramme d'Amphotéricine B et 0,85 grammes de L-42-phosphatidylcholine (egg lécithine pure supérieure à 99 %) dans 1, 5 Litres d'un mélange de chloroforme-méthanol (1:1 en volume), auxquels on rajoute, quand la solution est limpide, 200 ml de NaCI 0,9 %. Le solvant est enlevé sous vide dans l'évaporateur à film ascendant. La température maximale de la solution, en haut de l'évaporateur est de 35 - 45 C. Après séparation des phases, on récupère la phase aqueuse contenant les microparticules, que l'on soumet à un deuxième cycle d'évaporation. Le système est rincé à j'aide d'eau distillée et le volume final est amené à 200 ml à l'aide d'un évaporateur rotatif, dont le bain chauffant ne dépasse pas 40 C. On récupère généralement 82 à 86 % de 1'Amphotéricine sous forme d'une suspension de microparticules à la concentration comprise entre 4 et 5 mg/ml. 2.2 A partir de deux Rrammes d'Amphotéricine B Idem qu'en A, mais 2,0 g d'Amphotéricine + 1,7 g de phosphatidylcholine dans 3 litres de chloroforme-méthanol (1:1) + 200 ml de NaCI 0,9 %. On récupère 83 % de l'Amphotéricine sous forme de 260 ml d'une suspension de microparticules à 6,3S mg en Amphotéricine/ml. La phase organique est exempte d'Amphotéricine B. 2.3 Lyophylisation Les suspensions de microparticules sont lyophylisées après addition des excipients suivants 2.3.1 Fioles contenant 5 mg d'Amphotéricine B sous forme de microparticules Lactose : 80 mg Citrate de Na : 8 mg phosphate de Na : 7,5 mg Après reconstitution par 1,0 ml d'eau distillée, chaque fiole lyophilisée contient 5,0 mg d'Amphotéricine B sous forme de microparticules de taille moyenne, d'environ 0,7 pm formées par interaction équimolaire entre l'Amphotéricine B et la Phosphatidylcholine. Composition après reconstitution - Amphotéricine B : 5,0 mg/ml - Phosphatidylcholine : 4,25 mg/ml - Lactose : 80,0 mg/ml - Citrate de Na : 8,0 mg/ml - Phosphate de Na : 7,5 mg/ml - NaCI : 0,7S % Conservation Après reconstitution, la solution doit être conservée à 4"C pendant 7 jours maximum et ne doit pas être congelée. Aspect Suspension jaunâtre de microparticules ayant une taille moyenne de + 0,7 pm. 2.3.2 Fioles contenant 100 mg d'Amphotéricine B sous forme de microparticules La suspension de micro particules est centrifugée, les microparticules sont resuspendues et diluées à 100 mg dans 4 mi d'eau distillée et on y ajoute 70 mg de lactose. lH2O 40 mg de citrate 3Na.2H2O 30,4 mg Na2HPO4 7,4 mg NaH2PO4.lH2O Après Iyophylisation les fioles contiennent 100 mg d'Amphotéricine B sous forme de microparticules. EXEMPLE 2 : METHODE DE CONTROLE ET CARACTERIST1QUES PHYSICOCHIMIQUES DES MICROPARTICULES 1. DOSAGE 1.1 Dosage de l'amphotéricine B par spectrophotometrie a) matière première : I'absorbance à 405 nm d'une solution d'Amphotéricine B à environ 50 g/ml diméthyl sulfoxide est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre. La concentration est calculée en utilisant la formule : conc. (mg/ml) A405t35.5 b) sous forme de microparticules : à 50 l de la suspension de MP à environ 5 mg/ml, on ajoute dans l'ordre I ml de méthanol et 1 ml d'HCI 1 N. L'absorbance à 405 nm de la solution est lue et la concmentration en Amphotéricine B est calculée en utilisant la formule : conc. (mg/ml) = A405/0,934. 1.2 DosaRe de la phosphatidylcholine Le dosage des phospholipides dont la phosphatidylcholine est réalisé par un test colorimétrique enzymatique (3) à l'analyseur ABBOTT. Le test est basé sur la libération de la choline par l'action de la phospholipase D sur la phosphatidylcholine puis sur l'action de la choline-oxydase sur la choline qui libère de la bétaine ct de l'H202. En présence de péroxydase, l'X2O2 produite réagit avec le phénol et l'amino-4-phenazone pour former la (monoimino p-benzoquinone) 4-phenazone dont l'absorbance est lue à 500 nm. 2. CONTRÔLES PHYSIQUES Les préparations de microparticules sont contrôlées par - examen de l'aspect macroscopique : les suspensions de microparticules (MP) d'Amphotéricine EN ont un aspect laiteux jaunâtre, uniforme de couleur et d'aspect, sans agrégats apparents. Les microparticules ne sédimentent et ne forment un dépôt qu'après quelques heures ; la remise en suspension est cependant aisée. - microscopie optique : la suspension de microparticules est observée au microscope à fond noir (objectif 40 x , oculaire 20 x). L'examen permet de détecter la présence d'agrégats ou de micro-agrégats. Les microparticules observées en microscopie optique sur fond noir semblent homogènes au poind de vue taille. II y a peu de micro-agrégats. Les microparticules ont une forme non sphérique et irrégulière. - détermination des dimensions des microparticules et de leur distribution: la taille moyenne des microparticules est déterminée à l'aide d'un Nano-Sizer de Coulter Electronics, Ltd. (Harpenden, U.K.). La distribution des tailles est déterminée à l'aide d'un "Particle Sizer" de Fritsch (Fritsch Laser - Particle Sizer - Analysette 22 ; Idar oberstein, Allemagne). Les microparticules produites à l'échelle du Laboratoire ont une taille moyenne mesurée au nanosizer de +/- 0,7 pm. La taille moyenne des microparticules obtenues selon la production pilote est comprise entre 0,3 et 0,8 pm suivant la préparation. Après lyophilisation, la taille moyenne des microparticules est comprise entre 0,6 et 1,3 pm (figure 2). - tamissage moléculaire - recherche de ladite substance libre : La présence d'Amphotéricine B libre peut être mise en évidence par tamissage moléculaire d'un aliquot de la suspension de microparticules sur une colonne remplie de gel sepharose 68 (PHARMACIA Fine Chemicals, Upsala, Suède), éluée par du NaCI 0,9 %. Les microparticules sortent dans un volume correspondant au volume mort de la colonne et l1Amphotéricine B libre ainsi que la L4- phosphatidylcholine sortent dans un volume correspondant au volume total de la colonne. La limite de détection du pourcentage d'Amphotéricine et de P.C. libre est de 0,1 %. Le dosage de l'Amphotéricine se fait par mesure de l'absorbance à 405 nm tel que décrit précédemment.La fréquence (%) de la distribution des tailles est illustrée à la figure 3 et la fréquence cumulée, en %, est représentée à la figure 4. La taille médiane est de 0,99 pm et la taille moyenne de 1,69 pm. 50 % des microparticules ont une taille comprise entre 0,6 et 1,7 um et 90 % des micro particules ont une taille comprise entre 0,25 et 5,2 um. Aucune particule n'a une taille supérieure à 16 pm, et seulement 0,1 % des microparticules ont une taille supérieure à 12 um. 3. STRUCTURE Les microparticules d'Amphotéricine B peuvent être caractérisées chimiquement comme étant composées d'Amphotéricine B et de Lç -phosphatidylcholine dans un rapport molaire de 1, et peuvent donc être représentés de la façon suivante, n étant inconnu EXEMPLE 3 : ETUDE PHARMACOeTOXICOLOGIQUE La toxicologie et la pharmacologie de l'Amphotéricine B sous forme de microparticules ont été comparées à celles de l'Amphotéricine B sous forme de complexe avec le déoxycholate (DOC), qui est la forme commerciale de l'Amphotéricine B (Fungizone)) ainsi qufà celle de liposomes multilamellaires tels que décrits par SCULIER ;ot al. (2). Ces liposomes sont composés de phosphatidylcholine, cholestérol et stéarylamine dans un rapport molaire 4:3:1, ont un diamètre moyen de 0,1 pm et un rapport molaire lipide-Amphotéricine d'environ 70. 1. TOXICOLOGIE 1.1 Toxicité in vitro 1.1.1 Toxicité vis à vis d'étythrocvtes L'effet hémolytique de l'Amphotéricine B sous forme de complexe au déoxycholate (Fungizone ou sous forme de microparticules a été essayé vis à vis de globules rouges humains ou murins, suivant le protocole décrit par METHA et al. (METHA et al., Biochim. Biophys. Acta 770 (1984), 230-234). Protocole Les globules rouges provenant d'aliquots de sang humain ainsi que de sang murin (souris OFI femelles de 25-30 grammes) receuillis sur EDTA sont lavés 3 fois puis dilués à 2 % dans du NaCI 0,9 % et répartis dans des tubes à essai. Après addition de quantités croissantes de Fungizone# (O à 30 ug final/ml) ou de microparticules d'Amphotéricine B (0 à 1000 pg en Amphotéricine/ml, les érythrocytes sont incubés à 37 C pendant 45 minutes. Après centrifugation des échantillons à 3000 RPM pendant 10 minutes, l'effet hémolytique est déterminé par la mesure de l'absorbance à 550 nm de surnageant, qui reflète la quantité d'hémoglobine libérée. Résultats Microparticules non lyophilisées L'hémolyse des érythrocytes humains (figure 5a) et murins (figure 5b) par la Fungizone# est total après 45 Minutes, à la concentration de 30 pg/ml. Les doses hémolysant 50 % (DH50) et 10 % (DH10) des érythocytes sont calculées par interpolation des données et sont reprises dans le tableau ci-dessous. Tableau 1: Effet hémolysant de l'Amphotéricine B sous forme de Fungizones et de microparticules vis à vis des érythrocytes humains et murins DH10* DH50** ( g/ml) ( g/ml) Erythrocytes humains Complexe DOC (Fungizone#) 1,4 6,8 Microparticules 150 > 150 Erythrocytes murins Complexe DOC (Fungizone#) 1,8 6, 9 Micropartîcules 97 > 150 4 DH10 = dose hémolysant 10 96 des érythrocytes après 45 min à 35 C *+ DH50 = dose hémolysant 50 96 des érythrocytes après 45 min à 37 C Microparticules lyophilisées L'hémolyse de érythrocytes par le complexe Amphotéricinedéoxycholate (complexe DOC ou Fungizone# et par les microparticules d'Ampho B lyophilisées puis remises en su 1.1.2 Toxicité vis à vis de macrophages La cytoxicité in vitro de l'Amphotéricine B sous forme de Fungizon de microparticules et de Jiposomes a été déterminée sur la lignée continue de macrophages murins 3774-G8 cultivés dans du milieu RPMI enrichi de 10 % de sérum de veau foetal. Ces macrophages sont infectés à raison de 104 Candida trorncalis pour 105 macrophages. La cytotoxicité est déterminée par la diminution de l'activité enzymatique réductrice des macrophages vis-à-vis des sels tétrazolium (4). La cytotoxicité est exprimée sosu forme de la concentration d'Amphotéricine B qui réduit de 50 % L'activité enzymatique (CT50). Les résultats repris au Tableau 2 indiquent que sous forme de liposomes, 1'Amphotéricine B est 4 fois moins toxique in vitro que sous forme de complexe au déoxycholate. Sous forme de microparticules, 1'Amphotéricine B est encore moins toxique in vitro : 33 fois moins cytotoxique que la Fungizone et 7,7 fois moins toxique que sous forme de Jiposomes. Formulation CT50( M) CT50rel.a Complexe DOC (Fungizone 4,0 Li prosomes 17 4,2 Microparticules 132 33 aCT50rel : rapport des CT501CT50 du complex Doc 1.2 Toxicité in vivo 1.2.1 Toxicité aiguë 1.2.1.1 Résultats préliminaires chez la souris (LD50) L'Amphotéricine B sous forme de complexe au déoxycholate (Fungizon, de liposomes et de microparticules a été injectée par voie i.v. à des souris OF1 femelles de 25 à 31 grammes, à raison de 5 à 6 souris par dose. L'observation des animaux a porté sur une période de 14 jours après l'administration (mortalité et poids corporel). Microparticules préparées selon le procédé selon l'invention MP lot 2 Dans cette expérience à la dose de 4 mg/kg, la induit une perte de poids moyenne de 20 % en 2 jours et aucune souris ne survit plus de 2 jours (figures 7 et 8). Aux doses de 10 et 15 mg en Amphotéricine/kg, les microparticules du lot n'induisent pas de perte de poids, malgré le décès de 2 souris sur 6 à la dose de 13 mg/kg. A 20 mg/kg les microparticules induisent 100 % de mortalité dans les 24 heures. MP lot 3 Au cours de cette expérience, à la dose de 2 mg/kg, aucune perte de poids ni de mortalité n'est observée après administration i.v. de Fungizon. Aux doses de 3 et 4 mg/kg, les pertes de poids (2S % avec 1 nadir aux jours 4-5) sont réversibles, malgré une importante mortalité (80 %) à la dose de 4 mg en Amphotéricine/kg. Aucune souris ne survit plus de 48 heures à l'administration i.v. de 4 mg/kg de Fungizone2)- (figure 9). Les microparticules à 16 mg en Amphotéricine/kg induisent 40 % de mortalité et une perte de poids moyenne de 20 % au jour 4, perte de poids qui est récupérée au jour 15. Aux doses plus élevées, la mortalité est totale au jour 6 (dose de 22 mg en Amphotéricine/kg), au jour 3 (dose de 28 mg en Amphotéricine/kg) et au jour 2 (34 mg en Amphotéricine/kg). Détermination de la LD50 Les résultats des expériences précédentes permettent de calculer une valeur provisoire de la LDSo pour I'Amphotéricine B sous forme de complexe au déoxycholate (FungizoneS3, de liposomes et de microparticules. Les pourcentages de mortalité au jour 14 sont portés en graphique en fonction du logarithme de la dose (figure 10). Les LDSo sont calculées par régression linéaire du probit du % de mortalité en fonction du logarithme de la dose et les valeurs obtenues sont reprises au tableau 3. Tableau 3 : Toxicité aiguë de l'Amphotéricine B sous forme de complexe au déoxycholate (Fungizone#), de liposomes ou de micro particules LD50 Intervalle de Formulation mBE conf iance (p Complexe DOC (Fungizone#) 2,5 1,8 - 3,5 3,4 3,1 - 3,9 Liposomes 33,S 24,9 - 4S,2 Microparticules préparation lot 2 15,7 15,0 - 16,4 préparation lot 3 15,4 14,3 - 16,6 Les résultats indiquent que la dose induisant la mort de 50 96 des souris, 14 jours après administration i.v. unique des produits (LD50) est de 2,5 mg/kg pour l'amphotéricine B sous forme de liposomes, de 33,5 mg/kg sous forme de liposomes et de 15,4 à 18,3 mg/kg sous forme de microparticules. Les microparticules préparées selon le procédé selon l'invention ne différent pas entre elles au point de vue LD50. Sous forme de microparticules l'Amphotéricine est donc environ de 4,5 à 7,4 fois moins toxique que sous forme de complexe au déoxycholate, au point de vue toxicité aiguë. Sous formes de liposomes, l'Amphotéricine B est 10 à 13 fois moins toxique que sous forme de complexe au DOC. 2. PHARMACOLOGIE 2.1 Activité antifongique in vitro 2.1.1. Modèles d'infections extra cellulaires L'activité antifongique directe de l'Amphotéricine B sous forme de complexe DOC (Fungizone , Jiposomes et microparticules) a été déterminée sur Candida tropicalis en utilisant les microparticules préparées suivant le procédé de Laboratoire (EP 270 460). L'activité antifongique directe de l'Amphotéricine B sous forme de microparticules préparées suivant le précédé pilote et lyophilisées a été comparée à celle de la Fungizont sur diverses levures et champignons dans les laboratoires de l'institut de Médecine Tropicale à Anvers. 2.1.1.1 Activité directe vis à vis de Candida tropicalis Protocole L'activité antifongique directe de l'Amphotéricine B sous forme de Fungizonei) de microparticules ou de liposomes est mesurée sur la croissance de Candida tropicalis dans du milieu RPMI contenant 20 96 de sérum de vekau foetal. L'inhibition de la croissance après 16 h est observée pour des concentrations croissantes en Amphotéricine B (14 concentrations allant de 0,012 à 100 nM > . La concentration minimale inhibitrice (MIC) est la concentration la plus faible à laquelle on n'observe pas de croissance de Candida. Résultats La MIC de 1'Amphotéricine B sous forme de microparticules ou sous forme de Fungizone est identique (tableau 4). Par contre, 1'Ampho- téricine B encapsulée dans des liposomes composés de phosphatidylcholine, cholestérol et stéarylamine dans un rapport molaire 4:3:1, est 8 fois moins active que l'Amphotéricine libre. Tableau 4 : MIC de l'Amphotéricine B sous forme de Fungîzone de liposomes ou de microparticules, vis à vis de Candida tropicalis Formulation MIC (pM) Complexe DOC (Fungizone#) 0,2 Liposomes 1,56 Microparticules 0,2 2.1.1.2 Activité directe vis à vis de diverses levures et champignons 2.1.1.2.1 Protocole Matériel Levure Candida albicans (10) Candida lusitaniae (9) Candida tropicalis (10) Torulopsis glabrata (10) Candida krusei (10) Candida parapsilosis 110) Candida guilliermondii (10) Candida (pseudotropicalis) kefyr (8) Cryptococcus neoformans (45) Sporothrix schenckii : 20 souches 17 patients du Perou 1 Sud-Africain (sporotrichose généralisée) 2 du Brésil Milieu de culture Yeast morphology Agar (Difco) pH 7,3 (tampon phosphate Solution mère d'antifongiques en eau distillée. Concentrations finales en 0,016 ; 0,032 ; 0,063 ; 0,125 ; 0,25 ; 0,5 ; 1 ; 2 ; 5 ; 10 Inoculum Suspension de levures ou de la phase levure de S. schenckii Environ 107CFU en eau distillée (= standard N 2 Mc Farland) Ensemencement Les boîtes de Petri son ensemencées à l'aide d'un multipoint inoculator (Denley - Tech Limited). L'inoculum étant d'environ 104CFU. Incubation Pour les levures : 25 C S. schenckii : 370C Lecture Après 48 h, la croissance est comparée à celles des boites témoins sans antifongiques. La concentration minimale inhibitrice (CMI) en pg/ml est celle à laquelle aucune croissance n'est visible à l'oeil nu près 48 h. 2.1.1.2.2 Résultats : les résultats sont repris dans le tableau 5 Tableau 5 : Activité de l'Amphotéricine B sous forme de complexe DOC (Fungizone R) et de wicroparticules vis à vis de diverses levures et champignons CMI en g/ml après 48h CANDIDA ALBICANS (CA) F* L4 F L4' 1 66259 stonatis Rwanda AIDS 0.25 0.25 0.25 0.5 2 66197 vaginitis B 0.25 0.25 0.5 0.5 3 66010 vaginitis Spanje sero A 0.5 0.25 0.5 1 4 66011 vaginitis Spanje sero B 0.5 0.25 0.5 1 5 66063 mondspoellag B 0.25 0.25 0.25 1 6 66172 mondspoeling B 0.25 0.25 0.25 1 7 66185 aondspoeling B? > 0.5 > 0.5 2 5 8 64251 ?B 0.125 0.25 0.125 0.5 9 39971 baby - Iumbaal vocht B 0.25 0.25 0.25 0.5 10 66188 vaginitis 0.25 0.25 0.25 0.5 CANDIDA LUSITANLAE (CL) 1 57996 nagel B 0,5 1 0.5 1 2 61700 leukemie B > 2 > 2 > 10 > 10 3 64180 nagel B > 2 > 2 > 10 > 10 4 65996 mond B 0.5 1 5 65911 mond B 0.5 1 6 59819 mond B 0.5 1 0.5 1 7 60758 hemocultuur B > 2 > 2 > 10 > 10 9 66274 nagel B 0.5 1 10 66297 risicopatient B 0.5 1 * = FungizoneR R L4, L4' et L5 = lots de microparticules d'Amphotéricine B lyophilisés préparées selon l'invention dans des conditions différentes. Tableau 5 :(suite 1) CMI en g/ml après 48h CANDIDA TROPICALIS (CT) F L4 F L4' 1 66013 urine Spanje 0.25 0.25 0.25 0.5 2 66070 Prond B 0.5 0.25 0.5 1 3 66003 mond FIV + 0.5 0.25 0.5 1 4 66189 vaginitis B 0.25 0.25 0.5 1 5 66222 hemocultuur > 0.5 > 0.5 2 5 6 66263 stomatitis Rwanda 0.5 0.5 0.5 2 7 66234 vaginits B 0.5 0.5 0.5 2 8 64485 lumbaal vocht Kinshasa 0.5 0.5 0.5 2 9 65940 vaginites Spanje 0.5 0.5 0.5 2 10 65444 tongveger B 0.5 > 0.5 0.5 2 TORULOPSIS GLABRATA (TG) i 61764 sputum vrow pediatrie B (Leuven) 0.5 > 0.5 0.5 1 2 61770 long B tLeuven) 0.25 0.5 0.25 0.25 3 63748 vaginitis Spanje(Martine2)0.5 0.5 4 63865 infectie na verwijderen van beupprothese NL 0.5 0.5 5 64109 vaginitis B 0.5 0.5 0.5 1 6 64542 hewocultuur B 0.5 > 0.5 0.5 1 7 66224 mondveger B 0.5 0.5 0.5 1 8 66305 longiecretie B 0.5 0.5 9 63228 mondspoeling B? 0.5 0.5 10 49124 vaginitis (Dr Zaouk Tableau 5:(suite 2) CMI en g/ml après 48H CANDIDA KRUSEI (CK) F L4 F L4' 1 66175 (ayeloide leukemie) 0.5 > 0.5 0.5 1 hemocultuur B 2 65993 hemocultuur B > 0.5 > 0.5 1 2 3 65934 vaginitis Spanje 0.5 > 0.5 0.5 1 4 65935 vaginitis Spanje 0.5 > 0.5 0.5 1 5 63045 expectoration B 0.5 > 0.5 0.5 1 6 64714 hemocultuur B 0.5 > 0.5 1 2 7 62928 urine B > 0.5 > 0.5 0.5 1 8 57994 urine B 0.5 > 0.5 1 1 9 58080 keelveger B 0.5 > 0.5 1 1 10 60699 urine B > 0.5 > 0.5 1 2 CANDIDA PARAPSILOSIS (CP) 1 66326 etter gehoorgang B 0.125 0.5 2 65995 hemocultuur 0.5 1 3 64708 sputum 0.5 1 4 63447 nagel B 0.5 1 5 63554 osteitis Rwanda 0.5 1 6 63267 ooretter B 0.5 1 7 63210 nagel 0.5 1 8 62746 hemocultuur Rwanda 0.5 1 9 62675 nagel B 0.5 1 10 63263 teen B 0.5 1 Tableau 5:(suite 3) CMI en g/ml après 48h CANDIDA GUILLIERMONDII (Cc) F L4 1 65994 nagel 8 0.5 0.5 2 66215 mondspoeling BIV+ 0.5 0.5 3 66193 hemocultuur B 0.5 0.5 4 66176 hemocultuur myeloide leukemie B 0.25 0.5 5 62001 nagel B 0.5 0.5 6 60664 huid B 0.5 0.5 7 66071 schilfers teen B 1 2 8 64763 huidschilfers B 0.5 0.5 9 11013 hand B 0.25 0.5 10 62652 nekwonde B 0.5 0.5 CANDIDA (PSEUDOTROPICALIS) KEFYR (CP) 1 66058 vaginitis 0.5 1 2 63145 vaginitis 0.5 1 3 58114 expectorations B 0.5 1 4 58130 zwarte tong, post AB B 0.5 1 5 34441 dierenziektenbestrijding Torhout B 0.5 2 6 57676 koe B 0.5 1 7 39219 urine B 0.5 1 8 66199 vaginitis B 0.5 1 Tableau 5:(suite 4) CMI en g/ml après 48h SPOROTHRIX SCHENCKII F L4 L4' IV 63582 > 10 > 10 RV 63583 5 > 10 RV 63584 0.5 1 RV 63585 0.5 1 RV 63586 > 10 > 10 RV 63587 0.5 2 RV 63588 0.5 1 RV 63590 > 10 > 10 RV 63592 > 10 > 10 RV 63593 0.5 1 RV 63594 0.5 5 RV 63595 0.5 5 RV 63596 1 0.5 RV 63597 5 > 10 RV 63603 0.5 1 RV 63604 0.5 1 RV 63605 2 5 RV 66551 2 5 RV 66553 0.5 2 RV 66557 0.5 2 RV 14980 > 10 > 10 RV 66552 10 > 10 RV 66558 0.25 1 RV 66559 0.25 2 RV 66600 RV 66601 0.25 1 RV 66603 > 10 > 10 RV 66604 10 > 10 RV 66606 0.25 1 RV 66607 CMI en g/ml après 48h F L4 L4' RV 66609 0.25 5 RV 66610 1 > 10 IV 66611 > 10 > 10 RV 66612 c 0.125 1 RV 66618 0.5 2 RV 66621 0.25 2 RV 66627 5 > 10 RV 66629 1 5 RV 66631 2 0.5 RV 66632 2 > 10 RV 66636 10 > 10 RV 66637 2 2 RV 66639 RV 66643 RV 66646 2 5 RV 66651 > 10 > 10 RV 14970 10 > 10 RV 14955 > 10 > 10 RV 52146 10 > 10 RV 63602 RV 52147 Tableau 5 :(suite 6) CMI en g/ml après 48h CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS F L4 F L5 1 45979 8 - 0.0063 0.5 2 45977 C - a 0.0063 0.5 3 45978 C - K 0.0063 0.5 4 45980 D - &alpha; 0.0063 0.5 5 45981 D - a 0.0063 0.5 6 66216 para Europa AIDS 0.25 0.5 7 66513 var neoformans Hexico AIDS 0.25 0.5 8 66534 " 0.25 0.5 9 66440 var grattii Mexico AIDS 0.25 0.5 10 66536 " 0.'5 Il 55446 A omgeving Afrika 0.25 0.25 12 55447 A " 0.25 0.25 13 55448 A " 0.5 0.5 14 55449 A " 0.25 0.25 15 55450 A " 0.25 0.25 16 5637@ A omgeving Maleisië 0.5 0.5 17 56375 A " 0.5 0.5 18 56376 A " 0.5 0.5 19 56377 A " 0.25 0.25 20 56378 A " 0.5 0.5 21 53960 A para Afrika 0.5 0.5 22 54034 A " 0.5 0.5 23 54138 A " 0.25 0.25 24 54424 A " 0.5 0.5 25 54427 A " 0.25 0.25 26 56056 A para Peru 0.25 0.25 27 53806 A para Europa 0.25 0.25 28 54830 A " 0.5 0.5 29 55032 B var. gattii Maleisie para 0.125 0.1'5 Tableau 5:(suite 7) CMI en g/ml après 48 h F L5 30 55033 B n 0.125 0.125 31 55034 B " 0.125 0.125 32 55035 B l 0.125 0.125 33 3463 B " Zaïre para 0.125 0.125 34 20185 B 2 " 0.125 0.125 35 48370 B " China para 0.125 0.125 36 52644 C 2t USA para 0.125 0.125 37 52645 C " " 0.125 0.125 38 57477 D para Europa 0.125 0.125 39 51276 D " 0.125 0.125 40 36214 D " 0.125 0.125 41 34802 D t 0.125 0.125 42 62692 D prim. huid 0.125 0.125 43 32908 D sapro > 1 > 1 44 32910 D sapro > 1 > 1 45 33370 A/D para Europa 0.125 0.125 Les résultats indiquent que les CMI obtenues avec les MP lot 4 et lot 4' sont en général 1 a 4 fois plus élevées que celles obtenues avec la Fungizone 1sur Candida Albicans, C. Lusitanise, C. Tropicalis, Torulopsis Clabrata. C. Krusei, C.Parapsilcsis, C.Guilliermondii et C.Kefyr ainsi que sur Sporothrix Schenckii. Sur Cryptococcus neoformans, les MP (lot 4 et lot 5) sont aussi actives que la Pungizone R sur 35 des 45 souches, 2 fois moins actives sur 5 des 45 souches et beaucoup moins actives sur les souches B-X, C-&alpha;, D-&alpha; C-a et B-a. 2.1.2 Modèle d'infection intra cellulaire L'activité antifongique de l'Amphotéricine B vis à vis d'infections intracellulaires est déterminée in vitro en utilisant comme modèle la lignée de macrophages J-774-G8 infectés par Candida Tropicalis. L'activité de l'Amphotéricine B sous forme de microparticules est comparée à celle de l'Amphotéricine B sous forme de complexe DOC (Fungizone#) ainsi qu'à celle de l'Amphotéricine entrappée dans les liposomes multilamellaires. 2.1.2.1 Protocole Les macrophages J-77448 cultivés dans du milieu RPMI contenant 10 mM MES pH7.2 supplémenté par 10 % de plasma humain délipidé sont infectés à raison de 1 Candida tropicalis par 10 macrophages. L'action des médicaments est mesurée dans des boites LIMBRO à 24 puits contenant 105 macrophages infectés, adhérant sur des lamelles de verre, et la gamme de concentrations testées varie de 0,048 pM à 100 pM. Le pourcentage de cellules infectées est déterminé après 16 h de coculture. Sur lames de microscope, on compte après coloration au MAY-GRUNA'ALD-GIEMSA, le nombre de macrophages total (NT) ainsi que le nombre de marcrophages infectés par des Candida (Ni). Le pourcentage d'infection est le rapport Ni/NT (exprimé en %) La concentration, exprimée en pM, qui réduit de 50 % I'infection intracellulaire (IC50) est ensuite déterminée. 2.1.2.2 Résultats Les résultats, repris au Tableau 6, montrent que les microparticules sont 2 fois plus actives que la Fungizone(E) et 8 fois plus actives que les liposomes vis à vis de l'infection intracellulaire. Tableau 6 : Activité de l'Amphotéricine B sous forme de Fungizone , de Jiposomes ou de microparticules vis à vis d'infections intracellulaires (macrophages J-774G8 infectés par Candida tropicalis) Formulation IC50 ( M) Complexe DOC (Fungizone 0,2 Liposomes 0,8 Microparticules 0,1 Ces études de l'activité des microparticules Amphotéricine B sont très importantes pour s'assurer de la capacité de ces microparticules de pénétrer dans les cellules phagocytaires telles les polymorphonucléaires et les macrophages. Les résultats du Tableau 6 illustrent que la Fungizone est aussi active sur les formes intracellulaires que sur les formes extracellulaires alors que les microparticules comme les liposames sont plus actives sur les formes intracellulaires que sur les formes extracellulaires. La pénétration intracellulaire des microparticules, à l'intérieur des macrophages, a par ailleurs pu être confirmée par des observations microscopiques. 3. CONCLUSIONS La toxicité de l'Amphotéricine B peut être nettement diminuée par son incorporaion dans des liposomes. Ces liposomes conservent leur activité sur des Candida in vitro et in vivo chez la souris. Plusieurs dizaines de malades ont déjà été traités par ces liposomes amphotéricine B aux Etats-Unis dans l'équipe de LOPEZ-BERENSTEIN et en Belgique à l'institut Bordet (1,2,5). Ces essais cliniques ont confirmé la meilleure tolérance et la moindre toxicité de cette forme galénique et ont fourni des indices singificatifs d'une activité accrue. Le groupe de recherche d'lRE-CELLTARG a mis au point des microparticules constituées d'Amphotéricine B et de phosphatidylcholine. Ces microparticules se distinguent des liposomes par leur rapport molaire lipide/amphotéricine voisin de 1, contrairement aux liposomes où ce rapport varie de 90 à 70. Ces microparticules n'ont en outre pas la structure microscopique des liposomes. L'effet hémolysant des microparticules est réduit d'au moins 50 fois par rapport à l'Amphotéricine sous forme de Fungizone et la toxicité cellulaire étudiée in vitro sur des macrophages m,t en évidence une toxicité réduite de 33 fois par rapport à la Fungizone et 8 fois par rapport aux liposomes. La toxicité aiguë de ces microparticules après administration intraveineuse exprimée en LD50 est 5 à 7 fois plus faible que l'Amphotéricine B et 2 fois plus élevée que celle des liposomes. L'activité antifongique de l'Amphotéricine B sous forme de microparticules a été déterminée in vitro et s'avère d'une manière générale voisine de celle de la Fungizone et probablement supérieure à celle de l'Amphotéricine B sous forme de liposomes. En outre1 lors d'une étude réalisée sur macrophages en culture infectés par Candida tropicalis, les rapports des concentrations ipduisant les activités cytotoxiques/activités antifongiques intracellulaires pour les trois forme d'Amphotéricine B, sont de 20 pour l'Amphotéricîne B libre (Fungizone ), 21 pour les liposomes et 1320 pour les microparticules. Cette dernière forme paraît donc dans ce cas beaucoup moins cytotoxique tout en restant plus active que les produits de référence. Les résultats enregistrés in vitro montrent une capture très active des microparticules par les macrophages, qui pourrait expliquer la grande activité de ces microparticules chargées d'Amphotéricine B se retrouvent concentrés dans le même compartiment intracellulaire probablement lysosomial. BIBLIOGRAPHIES 1. LOPEZ-BERENSTEIN G. and JULIANO R.L. Applications of liposomes to the delivery of antifungal agents in Liposomes. From Biophysics to therapeutics. 2. SCULIER J.P., COUNE A., BRASSINNE C., LADURON C., HOLLAERT C. Premiers essais d'utilisation intraveineuse de liposome ultrasonique en thérapeutique humaine Médecine/sciences 3 (1987) 41-44 3. TAKAYAMA et al. Clin. chim. Acta 79 (1977) 93-98 4. MOSMANN C.T. J. Immunol. methods 65 (1983) 55-63 5. SHIRKODA A., LOPEZ-BERENSTEIN G., HOLBERT J.M., LUNA M.A., Hepatosplenic fungal infection : CT and pathologic evaluation after treatment with liposomal AMB. Radiology 159 (1986) 349-353 6. Analytical chemistry vol. 21 n0 4 April 1949 page 527-528, William Bartholomey REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de microparticules lipidiques d'aspect microcristallin dtune substance insoluble dans l'eau présentant une affinité pour les phospholipides, et d'au moins un phospholipide, microparticules stables en suspension dans une solution aqueuse, caractérisé en ce que a) on dissout ladite substance et le ou lesdits phospholipides dans un ou des premiers solvant(s) organique(s) de ladite substance et du ou desdits phospholipides, et un tiers solvant du ou desdit(s) premier(s) solvant(s) et de l'eau, b) on mélange la solution obtenue de ladite substance et du ou desdits phospholipides à une solution aqueuse dans une quantité inférieure à celle à partir de laquelle on observe soit une démixtion soit une insolubilisation notamment sous forme de précipité de ladite substance et du ou des phospholipides, de marnière à obtenir une phase homogène limpide, c) On évapore lesdits premiers et tiers solvants en maintenant la solution en phase homogène pour récupérer une solution aqueuse contenant les microparticules sous forme de microsuspensions. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'étape c) I'évaporation desdits premiers solvants se fait avant l'évaporation totale du tiers solvant. 3. Procédé selon la revendication I ou 2, caractérisé en ce que l'évaporation des solvants organiques et la récupération de la solution aqueuse se font en utilisant une installation de type évaporateur à film ascendant, I'évaporation se faisant sous pression réduite et la solution aqueuse étant entrainée par les vapeurs de solvants organiques avant d'être séparée par condensation de la phase organique 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on soumet la solution aqueuse récupérée contenant les microparticules à un deuxième cycle d'évaporation. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le rapport molaire entre le ou les phospholipides et ladite substance est compris entre 0,1 et 10. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le rapport molaire est compris entre 0,8 et 2, de préférence voisin de 1. 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le phospholipide est de la phosphatidylcholine. 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le(s) dit(s) premier(s) solvant(s) organique(s) de la solution de phospholipide et de ladite substance sont choisis parmi les solvants organiques usuels de polarité intermédiaire tels que le chloroforme, le dichlorométhane, le méthanol et l'éthanol. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le tiers solvant est choisi parmi le méthanol, l'éthanol, l'acétone et le THF. 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les solvants organiques consistent en un mélange de chloroforme et de méthanol, I'évaporation du chloroforme se faisant par évaporation de l'azéotrope chloroforme-méthanol-eau avant l'évaporation du méthanol restant. Il. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution de ladite substance et du ou des phospholipides comporte également un ou des stérols tel que du cholestérol ou de l'ergostérol. 12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution aqueuse est une solution saline. 13. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la solution aqueuse est une solution de NaCI 0,9 96. 14. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite substance est choisie parmi les agents anti mycotiques, macrolides, polyène. 15. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ladite substance est choisie parmi Ja nistatine, I'amphotéricine B et leurs dérivés antifongiques. 16. Microparticules lipidiques d'aspect microcristallin stables en suspension dans une solution aqueuse comportant une substance insoluble dans l'eau et au moins un phospholipide, obtenues par un procédé selon l'une des revendications précédentes.