FR 2658383 A1 19910823 FR 9002100 A 19900221 PROCEDE MECANIOUE DE SEPARATION ET DE REPIQUAGE DES PLANTES MULTIPLIEES IN VITRO SOUS FORME DE TOUFFES ET DISPOSITIF POUR LE METTRE EN OEUVRE. i a présente invention concerne le domaine de la micropropagation des plantes in vitro. Dans ce système de production, de jeunes boutures sont repiquées dans des bocaux contenant un mélange de produits nutritifs additionnés d'un agent gélifiant assurant à ce milieu une consistance flasque. Tous ces éléments (bocaux, milieu de culture et boutures) sont stériles au moment du repiquage.Un fois réalisé ce repiquage, les bocaux de culture in vitro sont conservés de manière stérile en chambre de culture pendant un cycle au cours duquel se déroule un processus de multiplication: de N boutures présentes au moment du repiquage, on passe à N touffes à la fin de ce cycle; chaque touffe peut être constituée de 2 à 3 pousses, voire plus, en suppiément de la bouture d'origine et produites par prolifération axillaire à partir de celle-ci. Dans ce système de production, il n'existe dans l'état actuel de la technique aucun procédé mécanique pour repiquer in vitro les pousses au début du cycle de multiplication ni de système mécanique pour l'éclatement des touffes produites au terme de chaque cycle de multiplication. Pour ce qui concerne le repiquage des pousses dans les bocaux, il est, dans l'état actuel de la technique, réalisé à la main en prenant une à une chaque pousse avec un pince brucelle puis en la plantant dans le milieu gélosé. Quant au découpage des touffes en ses différentes pousses, qui a lieu en fin de cycle de multiplication, il est effectué à la main, touffe par touffe en Incisant au scalpel les massifs entre les différentes pousses.Toutes ces opérations de découpage et de repiquage sont réalisées de manière stérile en flambant périodiquement les outils et en ouvrant les bocaux sous des enceintes à flux laminaires stériles. Ainsi, I'invention a pour premier objet un procédé de repiquage ainsi que de séparation des microboutures par centrifugation. Dans une première étape du procédé, les microboutures à repiquer sont placées dans les orifices en forme d'entonnoir d'une plaque. Dans une variante du procédé, du sable fin sera ajouté au pied des microboutures après positionnement de celles-ci dans les orifices de cette plaque. La plaque étant placée dans le bocal et celui-ci refermé, une centrifugation des bocaux est alors opérée. Par ce fait, les microboutures sont envoyées sur le milieu de culture et ainsi mécaniquement repiquées. La deuxième étape du procédé consiste à centrifuger les bocaux contenant les microboutures une fois celles-ci multipliées.Au cours de cette centrifugation, dite centrifugation de découpage, la force centrifuge commence par expulser le milieu de culture gélosé au travers d'une grille située à la base du bocal. Puis, la plaque à orifices susdite s'abaisse jusqu'à sectionner les différentes microboutures entre elles. Le second objet de l'invention est un dispositif permettant de mettre en oeuvre ce procédé; il comprend: -Une centrifugeuse équipée de loges articulées au moyen de charnières à ressort de rappel. Dans ces loges seront positionnés les bocaux à centrifuger. -Un bocal spécialement conçu comprend: - Un cadre intérieur monté sur un jeu de 4 ressorts à compression. - Placée sur ce cadre, une plaque à orifices en forme d'entonnoirs à embout constitué de lamelles souples. - Une plaque grillagée et située à la base du bocal comprenant des plots à aiguilles, sur lesquelles les microboutures viennent s'empaler pendant la centrifugation de repiquage. - Un fond amovible servant à l'évacuation du milieu gélosé pendant la centrifugation de découpage. De toute façon, I'invention sera mieux comprise au cours d'une description détaillée falsant référence aux figures suivantes: La figure 1 représente le bocal vu en coupe transversale, suivant sa face la plus courte. La figure 2 représente le détail des ressorts am ortisseurs Internes au bocaux. La figure 3 représente le détail de la plaque à orifices en profil d'entonnoir. La figure 4 représente la centrifugeuse. La figure 5 représente le détail de la loge à bocal située dans la centrifugeuse. La figure 6 montre la position du bocal dans la loge pour la centrifugation de repiquage. La figure 7 montre la position du bocal dans la loge pour la centrifugation de découpage. La figure 8 représente les microboutures-mères positionnées sans grande précision dans les orifices à profil d'entonnoir. La figure 9 présente le bocal pendant la centrifugation de repiquage. La figure 10 présente le bocal en fin de cycle de culture, les microboutures-mères ayant produit à leur base des microboutures-filles. La figure il représente une vue détaillée de la base des microboutures pendant la centrifugation de découpe. La figure 12 représente la même situation que la figure 11 mais dans une variante particulière de la forme des plots. ta figure 13 présente le bocal à la fin de la centrifugation de découpage. Le premier élément du dispositif permettant de mettre en oeuvre le procédé comprend un bocal en forme de parallélépipède rectangle que l'on peut voir en figure 1; il est constitué de: 1 1 couvercle (1) se fermant et s'ouvrant par simple mouvement vertical, épousant parfaitement la forme du boitier en le recouvrant extérieurement grâce à des dimensions (longueurs et largeurs) ajustées sur celles du boitier. 1 boitier (2), présentant comme détails particuliers: - 1 bourrelet externe (3). Ce bourrelet est un épaississement situé sur les 2 faces les plus longues du boitier aux deux tiers environ de la hauteur de celui-ci en partant de la base; dans la direction perpendiculaire à ces 2 faces, I'épaisseur de ce bourrelet mesure environ 2 centimètres. Celui situé sur le flan gauche des bocaux est plus grand que celui situé sur le flan droit et il présente une lumière interne permettant au bourrelet du flan droit de s'introduire à l'intérieur de celui-ci lorsque l'on veut ranger les bocaux en position accouplés les uns aux autres sur des étagères. - 1 rebord (4) situé à la base des 4 faces internes du boitier et servant de cale support pour la plaque basale (8). - 4 ergots (5) situés à l'extérieur des 2 faces les plus longues du boitier, à la même hauteur que le rebord susdit (4) et en une position proche des coins du boitier. 1 fond amovible (6), de même forme que le couvercle mais avec les différences suivantes: La hauteur de ses faces verticales est d'un tiers à la moitié de la hauteur du boîtier. Il comprend 4 orifices (7) situés dans l'épaisseur des 2 faces verticales les plus longues du fond et de telle manière qu'ils se retrouvent en face des 4 ergots susdits (5) lorsque le fond du boitier est amené en sa position la plus basse. 1 plaque grillagée, dite "plaque basale" (8) munie de plots (9) surmontés chacun d'une aiguille (10). Le profil des arêtes de ces plots peut être soit en forme de goulot de bouteille comme sur la figure 1, soit, dans une autre variante, à bord droit, comme en figure 12. 1 cadre rectangulaire (11) épousant les dimensions Internes du boitier et reposant sur une série de 4 ressorts métalliques à compression (12) situés en chaque coin du bocal. . 1 plaque grillagée amovible (13) épousant les dimensions internes du boitier et percée d'orifices qui dans leur épaisseur présentent un profil d'entonnoir (14). Pour certains détails du bocal, on se reportera aux figures 2 et 3 qui montrent que: Les 4 ressorts à compression (12) sont enserrés chacun par 4 tringles verticales (15) de telle manière qu'ils restent toujours cylindriques et verticaux lors de leur compression. Lors de la compression de ces ressorts la plaque à entonnoir s'abaisse, les tringles métalliques (15) traversant la plaque dans les mailles de sa grille (13). La partie conique correspondant au col des entonnoirs est en matière pleine (14). La partie située entre ces entonnoirs est en grille à maille de 1 à 2 mm. L'embout cylindrique de l'entonnoir (16) est constitué de 6 à 8 lamelles rectangulaires en métal souple et pouvant être soit parfaitement jointives en position naturelle soit séparées quelque peu lorsqu'une faible force est exercée à l'extrémité de ces lamelles dans le sens perpendiculaire à l'axe de l'embout. L'extrémité de ces lamelles est coupante. Le second éiément du dispositif permettant de mettre en oeuvre le procédé comprend une centrifugeuse. Celle-ci présentée en figure 4 comprend: 1 caisson cylindrique (17) pouvant tourner autour d'un axe vertical. 1 moteur électrique (18). 1 série de loges (19) disposées à équidistance sur la paroi interne du caisson de la centrifugeuse. Ces loges destinées à y recevoir les bocaux sont articulées autour de charnières à axe horizontal (20) fixées d'une part sur le fond extérieur des loges et d'autre part sur la paroi interne du caisson de la centrifugeuse. Cette articulation (autour d'un axe de type X Y sur la figure 4) permet à la loge de passer d'une position initiale où son fond est horizontal à une position extrême où ce fond est vertical et adossé à la paroi interne du caisson de la centrifugeuse. Comme on peut le voir en figure 5, ces loges comprennent un ressort de rappel (21) situé sous le fond de la loge le long de l'axe de la charnière; ce ressort maintient la loge en position horizontale lorsqu'aucune autre force que le poids de la loge n'est exercée.Les deux faces verticales les plus longues des loges comprennent une première rainure (22) dont la largeur est plus grande que celle du bourrelet (3) du bocal et dont la profondeur est égale à la hauteur de la loge; cette rainure est située de manière que le bocal introduit par ses bourrelets (3) dans celle-ci est adossé à la face verticale de la loge la plus proche de l'axe de rotation de la centrifugeuse, comme on peut le voir en figure 6. De même, une deuxième rainure (23) est creusée dans les 2 mêmes faces de la loge: sa profonde est de 3 à 4 centimètres et sa position est proche de la première rainure mais située plus près de la face articulée de la loge, comme le montre la figure 5. Le fonctionnement de l'invention peut être décrit de la manière suivante: Au démarrage d'un cycle de multiplication in vitro, les microboutures (25) sont déposées de manière aseptique dans les cônes des entonnoirs (14), la grille porteuse de ceuxci (13) étant sortie du bocal, comme le montre la figure 8. Dans une variante particulière de l'invention, on positionne tout d'abord les microboutures au fond du col de l'entonnoir; puis un aliquot de sable fin sec et stérile (24) est versé dans ces entonnoirs, de telle manière que ce sable se place spontanément de façon homogène tout autour de la base de ces microboutures; dans une 3 éme étape, on versera une pluie d'eau stérile assurant à ce sable une compacité et une densité plus élevée. Les entonnoirs une fois remplis, la grille à entonnoirs est déposée à l'intérieur du boitier (2) du bocal (préalablement remplis de milieu de culture) sur le cadre (11). Le couvercle (1) du bocal est alors refermé. Les bocaux ainsi remplis sont alors posés dans la centrifugeuse (17) au fond des loges (19). Avant d'opérer cette centrifugation, on positionne le bocal de manière que son fond amovible (6) repose complètement sur le fond de la loge (19) comme cela est montré en figure 6. Pour cela on mettra le bourrelet (3) dans la rainure la plus profonde de la loge (22). Une fois déposé les bocaux dans les loges, celles-ci présentent une légère inclinaison (10 à 20 ) avec l'horizontale du fait de la compression des ressorts (21) par le poids des bocaux. Puis le moteur de la centrifugeuse (18) est mis en route; les bocaux se mettent progressivement en position perpendiculaire à leur position d'origine du fait de la compression des ressorts (21) situés à la charnière (20) des loges (19) et de la paroi de la centrifugeuse (17). A l'intérieur du bocal centrifugé, le fond de celui-ci étant parvenu en position verticale, la force centrifuge entraine les microboutures au fond de l'embout des entonnoirs et, du fait de l'élasticité des lamelles (16), illustrée en figure 3wle diamètre de cet embout s'élargit et laisse passer les microboutures (figure 9); celles-ci, continuant leur trajectoire sous l'effet de la force centrifuge atteignent le milieu de culture (26) et, quelques millimètres plus au dessous viennent s'empaler sur les aiguilles (10) prolongeant des plots verticaux (9). Dans une variante particulière de l'invention, du sable (24) additionné comme expliqué précédemment aura pour effet d'entrainer par frottement les microboutures, aidant ainsi le forçage de l'embout de l'entonnoir. Pendant cette centrifugation, la plaque à entonnoirs, s'abaissera quelque peu du fait de la compression des 4 ressorts internes au bocal (12) en coulissant le long des tringles (15), atteignant finalement la position "B" comme l'illustre la figure 2 Pendant le ralentissement de la centrifugeuse, les ressorts de rappel des loges (21) ramènent celles-ci en position proche de l'horizontale, position atteinte à l'arrêt de la centrifugeuse. De même à l'intérieur du bocal. le ressort (12) se redétend et le cadre (11) portant la plaque à orifices en entonnoir (13) reprend sa position initiale CA" en figure 2 ). A la fin de cette opération on dispose de microboutures repiquées in vitro par ce moyen mécanique. Les bocaux sont alors transférés en chambre de culture pour y séjourner pendant une période de 3 à 4 semaines environ. Au sortir de cette période les microboutures (25) se seront multipliées en ayant produit à leur base des microboutures axillaires (27) comme on le voit sur la figure 10. Afin d'opérer mécaniquement la séparation des différentes pousses présentes au sein de chaque touffe, on soumettera à nouveau les bocaux à une centrifugation. Lors de cette centrifugation de découpe, on adoptera les quelques modifications suivantes: La position des bocaux dans les loges sera modifiée de manière que le fond du bocal ne repose plus dans ie fond de la loge. Pour cela, on fera reposer le bocal par son bourrelet (3) dans la rainure la plus haute (23) de la loge, comme cela est montré en figure 7. Pendant cette centrifugation, se déroulent les évènements suivants: Comme vu en figure 13, le fond amovible du bocal (6) coulisse vers l'arrière jusqu'à ce qu'il repose sur le fond de la loge (19); la grille support des plots (8), retenue par la cale (4) est alors traversée par le milieu gélosé (26). Celui-ci est ainsi évacué dans le fond du bocal (6). Dans cette situation et comme le montre la figure 13, I'encoche de retenue du fond (7) n'a pas atteint l'ergot de blocage (5) avant que le fond du bocal (6) ne repose dans celui de la loge (19). Dans un deuxième temps, la vitesse de centrifugation est augmentée, ce qui entraine les événements suivants: L'angle formé par la rencontre des microboutures axillaires (27) avec la microbouture-mère augmente jusqu'à ce que les microboutures-filles (27) se retrouvent en position inclinée plus proche de l'horizontale. Comme on peut le voir en détail sur la figure 11, la grille à entonnoir, soumise à une force centrifuge suffisante, s'abaisse en comprimant les ressorts (12) au point que les embouts des entonnoirs viennent à sectionner les différentes microboutures-filles présentes autour de la base de la microbouture-mère. Cette section est opérée par laminage entre le bord coupant des lamelles de l'embout des entonnoirs et le profil du nez des plots; pour compléter cette section la course verticale de ces entonnoirs à l'encontre de ces plots provoque l'écartement des lamelles (16) au point que toutes les liaisons pouvant persister entre les différentes microboutures entre elles se retrouvent rompues (figure 13). Dans une variante particulière montrée en figure 12, on opère la même section mais avec des plots à bords droits (9). Dans ce cas la séparation des microboutures-filles résulte de la simple section dûe à la course verticale du bord coupant de l'embout de l'entonnoir le long de l'arête du nez du plot. A l'arrêt de la centrifugeuse, on collectera les pousses-mères (25) au centre des entonnoirs et les pousses-filles (27) isolées à la surface de la grille support des plots (8). L'invention peut intéresser les entreprises produisant et commercialisant de vitroplants. Le dispositif selon l'invention permet de remplacer les opérations manuelles de repiquage et de découpage des pousses, qui sont très lentes, par un système mécanique utilisant la force centrifuge. Par ce remplacement, le coût de production des vitro-plants pourra s'abaisser dans des proportions importantes et rendre accessible au système de production par micropropagation in vitro un plus grand nombre d'espèces qu'aujourd'hui et pour de beaucoup plus grandes quantités de plantes. REVENDICATIONS 1) Procédé mécanique de repiquage et de séparation des microboutures multipliées in vitro sous forme de touffes. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'une première centrifugation (centrifugation de repiquage), appliquée à des bocaux contenant les microboutures à repiquer, entrane le mouvement de celles-ci en direction du milieu de culture gélosé au point qu'elles viennent à s'y planter. Une deuxième partie de ce procédé consiste à opérer une centrifugation aux bocaux contenant les microboutures multipliées (touffes) et provoquer ainsi, outre l'évacuation du milieu de culture, l'abaissement d'une grille à orifices coupants qui opère la séparation des microboutures par section aux aisselles de celles-ci (centrifugation de découpage). 2) Le dispositif selon l'invention et qui permet au procédé d'étire appliqué est caractérisé en ce qu'il comporte: - Un bocal comprenant une grille amovible (13) à maille et percée d'orifices à profil en forme d'entonnoir dont les cols, destinés à recevoir les microboutures, sont en matière pleine (14) et les embouts constitués de lamelles métalliques souples à bords coupants (16). - Un cadre intérieur au bocal (11) qui, monté sur ressorts (12) et sur lequel est posée la plaque à orifices en forme d'entonnoir, s'abaisse en direction du milieu de culture pendant la centrifugation de découpage. - Une grille (8) d'évacuation du milieu de culture, située à la base du bocal, retenue par des cales (4), et sur laquelle sont fixés des plots (9) munis d'aiguilles (10), sur lesquelles les microboutures viennent s'empaler pendant la centrifugation de repiquage - Un fond amovible (6) od s'évacue le milieu de culture lors de la centrifugation de découpage. 3) Procédé selon la revendication i et caractérisé en ce qu'un aliquot de sable fin et sec (24) est versé a la base des microboutures placées dans les entonnoirs puis arrosé avant d'opérer la centrifugation de repiquage. 4) Dispositif permettant la mise en oeuvre de l'invention et caractérisé en ce qu' une centrifugeuse (17) contient en sa face interne des loges articulées (19) dont la position horizontale pour le fond de ces loges est privilégiée par un ressort de rappel (21) mais dont l'orientation perpendiculaire devient possible pendant les centrifugations. Ces loges comportent 2 rainures, l'une profonde (22) et l'autre de quelques centimètres (23) permettant un placement du bocal selon 2 positions possibles: la première, basse, où le bocal est posé sur le fond de la loge; la seconde, haute, où le bocal est suspendu à l'intérieur de la loge. 5) Dispositif selon l'invention et caractérisé en ce que le bocal possède des bourrelets externes (3) de dimensions différentes sur les faces droite et gauche du bocal de telle manière que l'un puisse venir s'embosser dans l'autre.