FR 2649891 A1 19910125 FR 8909650 A 19890718 ANTICORPS MONOCLONAUX DIRIGES CONTRE LES PROENZYMES DE LA CATHEPSINE B-LIKE ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIOVES L'invention concerne des anticorps monoclonaux reconnaissant les proenzymes de la cathepsine B-like, en abréviation (PCBL). La cathepsine B, désignée par (CB) en abréviation, est une cystéine protéinase lysosomale présente dans les tissus de mammifères. Dans le cas de tumeurs malignes, on observe la sécrétion d'une protéinase de ce typer dite cathepsine B-like (CBL). Mais ce sont surtout les proenzymes de la cathepsine B-like (PCBL) qui sont sécrétés par les cellules cancéreuses. Les PCBL doivent également être étudiés dans le cas des déficits immunitaires et dans certaines pathologies, notamment inflammatoires. La maturation des PCBL passe par plusieurs stades correspondant à des formes de poids moléculaires différents, l'une de 45 à 47 kDa, l'autre ae 36 kDa, la CBL ayant un poids moléculaire de 33 kDa. On mesure l'intérêt de la mise en évidence dans ces pathologies de la présence des PCBL, sous leurs différentes formes, avant maturation de ltenzvme CBL, afin d'établir un diagnostic. La spécificité des réactifs disponibles à ce jour pour mettre en évidence les PCBL dans les fluides et tissus biologiques et pour les quantifier n'est cependant pas suffisante pour établir des diagnostics de haute fiabilité. La recherche par les inventeurs de réactifs plus satisfaisants les a conduits, en utilisant des PCBL présentant un degré de pureté élevé, à développer des anticorps ne donnant lieu à des réactions immunologiques qu'avec les PCBL. L'invention a donc pour but de fournir, à titre de nouveaux produits, des anticorps monoclonaux dirigés contre les PCBL. Selon un autre aspect, l'invention a pour but de fournir les souches d'hybridomes productrices de ces anticorps. Selon encore un autre aspect, l'invention a pour but de mettre à profit la haute spécificité de ces anticorps monoclonaux vis-å-vis des PCBL pour détecter la présence éventuelle de ces derniers dans un échantillon biologique, permettant ainsi de diagnostiquer le développement d'une pathologie. Les anticorps monoclonaux de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils présentent une spécificité élective pour les PCBL et qu'ils reconnaissent sur ces PCBL des épitopes qui, d'un anticorps à l'autre, diffèrent. Il résulte de cétte spécificité élective des anticorps monoclonaux de l'invention qu'ils ne réagissent ni avec les enzymes matures ; la cathepsine B-like, les cathepsines B, H et L, et la papaïne, mais reconnaissent de manière sélective l'une et/ou l'autre forme des PCBL. Ainsi, les anticorps monoclonaux de l'invention sont sélectivement dirigés contre les PCBL correspondant aux formes de poids moléculaires de l'ordre de 45-47 kDa et/ou 36 kDa. De telles formes sont décrites par Keppler et al dans Biol. Chem. Hoppe-Seyler, vol 369, suppi. p.185-190, mai 1988. Grâce à leurs propriétés de reconnaissance spécifique des PCBL, les anticorps monoclonaux sont utilisables pour effectuer des quantifications des différentes formes de ces PCBL. L'expression spécificité élective" pour les PCBL signifie que les anticorps monoclonaux se lient spécifiquement aux PCBL dans les conditions de Western-blot (ou de dot-blot) et d'ELISA décrites dans les exemples 1 et 2 ci-après. En revanche, dans ces conditions, on n'observe pas de réaction des anticorps monoclonaux de l'invention avec les enzymes satures. Les anticorps monoclonaux de l'invention sont encore caractérisés en ce que - ils appartiennent à la classe des IgGl-k, - ils possèdent un poids moléculaire d'environ 150 kDa, et - ils présentent une haute affinité pour les PCBL. Selon un autre aspect, les anticorps monoclonaux anti-PCBL de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par un procédé comprenant les étapes - d'immunisation d'un animal, selon les techniques classiques, avec des PCBL purifiés, - de fusion de cellules de l'animal productrices d'anticorps dirigés. contre les PCBL avec des cellules de myélome de souris, - de sélection des hybridomes capables de produire des anticorps spécifiques vis-å-vis des PCBL, - de clonage de ces hybridomes, et - de purification des anticorps monoclonaux produits à partir d'ascites L'ixsunisation est avantageusement réalisée selon la technique décrite par Ternynck et Avrameas dans Ixmunol. Rev., 1986, vol. 94, p. 99-112.Il est particulièreient intéressant d'utiliser des souris de Biozzit qui sont de bonnes produtrices d'anticorps. Pour l'étape de fusion, on a recours notamment d'une part à des cellules provenant des ganglions poplités, d'autre part à des cellules de myélome SP2/0 de souris Balb/c. Les ascites sont produites par injection des clones à des souris irradiées au préalable, par exemple des souris Balb/c. Les anticorps monoclonaux récupérés à partir des ascites sont purifiés par chromatographie d'affinité. Des résultats satisfaisants sont obtenus en utilisant une colonne de Protéine A-SépharoseR. Les anticorps monoclonaux selon l'invention de grand intérêt en tant que réactifs de diagnostic sont des anticorps monoclonaus murins produits par des hybridomes résultant de la fusion de cellules de myélome SP2/0 de souris avec des cellules de ganglions poplités de souris de BIOZZIR, préalablement immunisées avec des préparations de PCBL purifiés. De tels anticorps comprennent ceux produits par les clones N 1-890, I-891 et I-892 déposés le 17 juillet 1989 à la Collection Nationale de Culture de 'licroorganismes (CECI). L'invention concerne également les souches d'hybridomes productrices des anticorps monoclonaus définis ci-dessus. Ces hybridomes sont caractérisés en ce qu'ils sont formés de cellules hybrides résultant de la fusion des cellules de myélome de souris avec une cellule de souris produisant des anticorps, après immunisation de la souris avec des PCBL purifiés sous forme 36 et/ou I5-47 kDa, lesdites cellules hybrides étant capables de produire des anticorps spécifiques des PCBL. Les clones des hybridomes producteurs d'anticorps présentent l'avantage d'être homogènes sur le plan cellulaire et d'une grande stabilité. Pour la fusion, on utilise plus spécialement des cellules de myélome SP2/0 et, comme cellules productrices d'anticorps, des cellules de ganglions poplités de souris de BIOZZIR, , bonnes productrices d'anticorps. La préparation de ces hybridomes entre également dans lé cadre de l'invention et comprend les étapes de fusion et de sélection, définies ci-dessus en rapport avec les hybridomes. Les propriétés spécifiques des anticorps monoclonaux de l'invention sont mises à profit pour le dosage in vitro de PCBL dans le sérum et autres liquides biologiques, par différentes méthodes utilisées en immunologie, telles que les méthodes RIA, IRMA ou ELISA, pour détecter notamment des cancers: des pathologies inflarmatoires des déficits immunitaires, ou encore d'autres pathologies. Pour réaliser un dosage immunologique de type sandwich, on utilise deux anticorps monoclonaux réagissant avec deux épitopes différents d'une même forme de PCBL. Le deuxième anticorps monoclonal est couplé à un marqueur permettant la mise en évidence de la réaction isounologique. Il peut s'agir d'un marqueur chimique comme la biotine capable de se fixer à un révélateur tel que l'avidine-peroxydase, ou d'un radiomarqueur, tel que l'iode radioactif, ou encore d'un marqueur enzymatique, tel que la peroxydase, par exemple. La méthode de détection in vitro de PCBL selon l'invention comprend également - la mise en contact d'un échantillon biologique provenant d'un patient susceptible d'être atteint par une malacdie s'accompagnant de la sécrétion de PCBL, avec un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps, et - la détection de la liaison immunologique éventuelle de l'anticorps monoclonal aux PCBL des cellules de l'échantillon biologique. L'échantillon biologique est une préparation tissulaire telle qu'une coupe au cryostat par exemple. En général, l'anticorps monoclonal porte un marqueur tel que défini ci-dessus. Cette méthode de diagnostic est particulièrement utile en immunohistochimie. La méthode de détection in vivo par immunolocalisation de PCBL selon l'invention comprend - une injection par voie intraveineuse d'un anticorps monoclonal, tel que défini ci-dessus portant un marqueur radioactif permettant de localiser, par scintigraphie externe ou tout autre procédé, une tumeur maligne ou groupe de cellules sécrétant les PCBL, après réaction immunologique entre l'anticorps marqué et les PCBL. Outre leur application comme réactifs de diagnostic in vitro et in vivo, les anticorps monoclonaux de l'invention sont utilisables comme réactifs de laboratoire à des fins de recherche. L'invention concerne également un kit pour détecter in vitro la présence de PCBL de 45-47 kDa dans un échantillon biologique selon la méthode ELISA. Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend - une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titrage, - une préparation d'anticorps monoclonal spécifique du PCBL de 45-47 kDa selon l'invention servant de première couche, - une préparation d'un autre anticorps monoclonal réagissant avec un autre épi tope de la forme 15-47 kDa selon l'invention servant de deuxième couche, cet anticorps monoclonal comportant un marqueur, - un système de détection spécifique de l'anticorps monoclonal parqué - des solutions tampons appropriées pour les réactions issunologiques et pour les réactions de détection. Les propriétés des anticorps monoclonaux de l'invention sont également mises à profit en thérapeutique, pour l'élaboration dtissunotoxines. Les inunotoxines sont caractérisées en ce qu'elles sont constituées par les anticorps monoclonaux de l'invention en association avec une toxine. D'une manière générale, l'invention vise des agents thérapeutiques anti-PCBL, élaborés à partir d'un anticorps monoclonal tel que défini plus haut, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent. =!tPLE 1 : OETNWTIbN DE SOUCHES D 'HYBRIDOMES PRODUCTRICES D 'ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-PCBL On immunise des souris de Biozzi (bonnes productrices d'anticorps) par injection, dans le coussinet plantaire des pattes arrières, de PCBL purifiés selon le procédé décrit par keppler et al (voir référence ci-dessus). Les préparations purifiées de PCBL comprennent les formes de 45-47 kDa et de 36 kDa. On effectue deux injections à 20 jours d'intervalle, avec une préparation de PCBL renfermant de l'adjuvant de Freund complet. Cinq jours après la dernière injection, on fusionne les cellules des ganglions poplités de ces souris avec des cellules de yéloies SP2/O de souris Balb/c. On sélectionne trois hybridones 3-A, 3-B et 3-C qui sont clones. On produit des ascites chez des souris Balb/c préalablement irradiées avec une dose de 400 rad de rayons X, en injectant les cellules des clones, puis on purifie les anticorps monoclonaux sur colonne de Protéine A-Sépharose. Dans le tableau ci-dessous, on rapporte les résultats obtenus avec les clones 3A2, 3B1 et 3C2, relatifs aux réactions immunologiques avec les PCBL purifiés. HYBRI- CLONES ' CLASSE SPECIFICITE EPITOPES DOMES 3A 3A2 IgGi-k PCBL 36kDa c 3B 3B1 IgG-k PCBL 45kDa d 3C 3C2 IgG-k PCBL 45kDa e Par la technique du Western-blot après électrophorèse en gel de polyacrylamide + SDS, on constate que les clones 3A2, 3B1 et 3C2 réagissent spécifiquement avec les PCBL : le clone 3A2 réagit avec la forme 36kDa, et les clones 3B1 et 3C2 avec la forme 45kDa. En utilisant la méthode ELISA et par dotblot, on a observé que la fixation de l'un de ces anticorps monoclonaux marqué, par exemple par de la biotine, n'était inhibée que par le même anticorps non marqué, ceci pour les anticorps monoclonaux 3A2, 3B1, et 3C2. Les anticorps monoclonaux, 3A2, 3B1, et 3C2 sont donc dirigés contre des épitopes différents. En opérant selon cet exemple, il est possible d'obtenir d'autres hybridomes produisant également des anticorps monoclonaux dirigés contre les PCBL. EXEMPLE 2 : PROTOCOLE DU "DOUBLE SANDWICH ELISA" (pour une plague de micro ELISA à 96 puits ou tout autre support) 1) "Revêtement" par l'anticorps monoclonal 3C2 : Dilution à 10 g/ml dans le tampon phosphate salin (PBS) stérile, 100 l par puits : 1 h à 370C, avec un couvercle adhésif, Lavage 3 fois au PBS-Tween@ 20 (å 0,05%). 2) Saturation avec l'albumine (par exemple de sérum bovin) Dilution à 1% dans le PBS stérile 200 ul par puits : 2 h à 370C Lavage 3 fois. 3) Solutions antigéniques: Dilution dans le PBS-TweenR20 (0,05%)-SAB (1%) - Blancs : (8 en double) - Gamme Etalon : ascite cancéreuse de référence diluée au 1/15 ; 1/30 ; 1/60 ; ... : 1/1920 (chaque dilution en double) - Sérums pathologiques ou normaus : dilutions au 1/50 (32 sérums en double) 100 l par puits : 2 h à 37 C Lavage 4 fois. 4) Anticorps monoclonal 3B1 marqué à la hiotine Dilution à 0,7 g/ml dans le PBS-Tween@ 20 (0,05%)-SAB (0,5%) 100 l par puits : une nuit (17 h) à 4 C Lavage 4 fois. 5) Avidine -peroxydase en excès dans le PBS stérile-SAB (0,2%) 100 l par puits : 15 min. à 370C Lavage 4 fois. 6t Substrat de la peroxydase 100 l par puits : 20 min. à 200C à l'obscurité EXEMPLE 3 : DOSAGE DES PCBL 45-47 kDa DANS LE SERUM PAR LA METHODE RIA ou IRMA Le -principe du dosage est sensiblement le même que pour l'exemple 2, mais la détection des PCBL retenus par l'anticorps monoclonal 3C2, s'effectue au moyen de l'anticorps monoclonal 3B1 radiomarqué, suivie d'un comptage. Ce dosage s'applique à des sérums ou à d'autres liquides biologiques, dilués au préalable. REVENDICA TIONS 1. Anticorps monoclonaux dirigés contre des précurseurs de protéinases, caractérisés en ce que a) ils sont dirigés spécifiquement contre des épitopes de PCBL, ne donnant lieu à aucune réaction immunologique croisée avec les enzymes matures, la cathepsine B-like. les cathepsines B, H et L, et la papaïne, b) ils reconnaissent sur les PCBL des épitopes qui, d'un anticorps à l'autre, peuvent différer. 2. Anticorps monoclonaux selon la revendication 1, caractérisés en ce que - ils appartiennent à la classe IgGi-k, - ils possèdent un poids moléculaire d'environ l5OkDa, - ils présentent une haute affinité pour les PCBL. 3. Anticorps monoclonaus anti-PCBL, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par un procédé comprenant les étapes - d'immunisation d'un animal, selon les techniques classiques, avec des PCBL purifiés, - de fusion des cellules productrices d'anticorps dirigés contre les PCBL avec des cellules immortelles de myélomes de souris, - de sélection des cellules hybrides capables de produire des anticorps spécifiques vis-à-vis des PCBL, et - de purification des anticorps monoclonaus produits. 4. Anticorps monoclonaus anti-PCBL, caractérisés en ce qu'ils sont sécrétés par les clones déposés à la CNC'.I sous les numéros I-890, I-891 et I-892 le 17 juillet 1989. 5. Hybridomes caractérisés en ce qu'ils sont capables de sécréter un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6. Clones déposés à la CNCM sous les numéros I-890, I-891 et I-892 le 17 juillet 1989. 7. Procédé pour la préparation d'un hybridome selon la revendication 5 ou 6, par fusion selon les techniques habituelles entre des cellules de myélome de souris et des cellules productrices d'anticorps provenant d'une souris préalablement immunisée avec l'antigène PCBL, suivie d'une sélection de celles des cellules hybrides qui sont capables de produire les anticorps monoclonaus anti-PCBL. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les cellules de myélome sont des cellules de myélome SP2/O provenant de souris Balb/c et que les cellules productrices d'anticorps monoclonaux sont des cellules de ganglions poplités provenant de souris de Biozzi, bonnes productrices d'anticorps. 9. Méthode de détection in vitro de la présence de PCBL dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend: - la mise en contact d'un échantillon biologique provenant d'un patient susceptible d'être atteint par une maladie s'accompagnant de la sécrétion de PCBL, avec un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps, et - la détection de la liaison immunologique éventuelle de l'anticorps monoclonal aus PCBL des cellules de l'échantillon biologique. 10. Kit pour la détection in vitro de PCBL de 45-47 kDa dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend - une phase solide appropriée serant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titrage, - une préparation d'anticorps monoclonal spécifique du PCBL de 45-47 kDa selon l'une des revendications 1 & 4 servant dé première couche, - une préparation d'un autre anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 servant de deuxième couche, cet anticorps monoclonal réagissant avec un autre épitope de la forme 45-47 kDa comportant un Marqueur, - un système de détection spécifique de l'anticorps monoclonal marquà; - des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection. 11. Contposition d'anticorps monoclonal anti-PCBL, caractérisée en ce qu'elle est destinée a l'injection par voie intraveineuse et comprend un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 4 portant un marqueur radioactif, permettant de localiser par scintigraphie externe ou tout autre procédé, une tumeur maligne ou groupe de cellules sécrétant les PCBL, apres réaction immunologique entre l'anticorps Marqué et les PCBL. 12. Immunotoxines caractérisées en ce qu'elles sont constituées d'un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 associé a une toxine.