FR 2649013 A1 19910104 FR 8908918 A 19890703 Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile métabolisable. La présente invention concerne de nouvelles compositions de vaccins et d'injectables fluides, contenant une phase huileuse totalement ou partiellement métabolisable, qui peuvent être utilisés en médecine vétérinaire ou humaine. La vaccination est un moyen de Lutte préventive contre les infections visant à mettre en éveil le système de défense immunitaire, par injection d'antigènes, qui sont souvent des fractions très spécifiques des parois virales ou bactériennes. Les progrès du génie génétique font que les antigènes disponibles sont de plus en plus purifiés, voire totalement synthétiques. Cette pureté est un atout incontestable sur le plan de La sécurité du vaccin, mais elle s'accompagne en général d'une diminution de l'efficacité immunologique. Aussi, la demande d'adjuvants d'immunité, permettant d'accroitre les réponses du système immunitaire à un antigène, estelle de plus en plus forte. Cependant, la présence de ces adjuvants ne doit pas aller à l'encontre de la bonne innocuité des préparations antigéniques modernes. De très nombreux adjuvants d'immunité ont été décrits mais seuls quelques-uns d'entre eux sont utilisés au stade des vaccins industriels, et seuls l'hydroxyde et le phosphate d'aluminium sont autorisés en médecine humaine. Il est cependant reconnu que les vaccins "huileux", dans lesquels Le milieu antigénique est émulsionné avec une huile minérale contenant un émulgateur, sont les plus efficaces, notamment lorsque ces vaccins sont de type E/H. L'adjuvant résultant de l'association d'huile minérale et d'un ester du mannitol est connu sous l'appellation d'adjuvant incomplet de Freund (FIA : "Freund's incomplete adjuvant" dans la littérature) ; sa composition est - huile minérale fluide (type Bayol F) : 85 X - (Arlacel A) monooléate de mannide : 15 X Par distinction, on nomme FCA, l'adjuvant de Freund "complet" qui contient, outre les éléments précités, une mycobac térie tuberculineuse qui potentialise l'effet immunitaire. Ces adjuvants FIA et FCA, connus de longue date, restent aujourd'hui les produits de référence dans le monde entier pour des études immunologiques de laboratoire. On les trouve en particuLier associés à des adjuvants injectables originaux, tels que les muramyl dipeptides (MDP) ou des antigènes obtenus par synthèse chimique ou génétique (VP1, etc.). L'utilisation industrielle des vaccins contenant FIA et FCA est toutefois limitée en raison de la difficulté de leur mise en oeuvre dans des préparations vaccinales injectables et de leur mauvaise tolérance par les sujets vaccinés. En effet, il est connu que les émulsions huileuses obtenues à partir de FIA et FCA sont visqueuses comme de la mayonnaise et relarguent de l'huile. En conséquence, ces préparations sont difficilement injectables à travers des seringues de faible diamètre d'aiguille (0,2 mm). De plus, elles créent, au niveau du site d'injection chez les animaux, des réactions locales avec oedèmes et abcès non acceptables par les Autorités Sanitaires qui rendent l'animal impropre à la consommation en boucherie. Des préparations vaccinales antidiphtériques réalisées avec FCA injectées à des femmes ont même provoqué des intolérances graves, des syndromes d'avortement qui ont prohibé ces adjuvants pour une utilisation courante chez l'être humain. L'exemple d'un vaccin contre la fièvre aphteuse contenant du FIA est décrit ci-dessous afin de mettre en évidence l'efficacité immunologique, les propriétés physico-chimiques et la mauvaise tolérance de ce type de préparation. Exemple 1 On réalise une préparation vaccinale pour le traitement de la fièvre aphteuse chez les bovins à partir d'adjuvant de Freund incomplet CFIA) par mélange sous agitation mécanique d'une partie de FIA et d'une partie de milieu antigénique inactivé. La préparation du milieu antigénique a fait l'objet d'un soin particulier Lors de la culture, de la purification et de la concentration des antigènes qui sont dilués dans un milieu type Eagle en présence de tampon phosphaté. La composition de la préparation est donc (poids/poids) : Milieu antigénique 50 X Huile minérale 42,5 X Monooléate de mannide 7,5 X Les caractéristiques physico-chimiques obtenues sur cette préparation sont : Conductivité à ZOOC : 12 microsiemens Viscosité à 200C : 6 500 centistokes pH : 7,6 Stabilité : relargage d'huile au stockage à 40C Aspect microscopique : gouttelettes de taille supérieure à 2 pm Les tests d'efficacité immunologique chez Le bovin montrent une bonne réponse immunitaire avec production persistante d'anticorps circulant 30 jours après la vaccination intramuscu Laire. Expérimentation : Résultats immunitaires fièvre aphteuse bovins - vaccins huileux adjuvant FIA - Dose injectée 5 ml - les résultats (EPP) sont exprimés en pourcentage de nombre d'ani maux protégés vis-å-vis des virus de valences 0, A et C, sur une durée de 3 mois, avec des vaccins de plusieurs lots, stockés à 40C. TABLEAU 1 * o o EPP Vaccin n 1 stocké Vaccin n 2 stocké 1 mois à 40C 24 mois à 40C Virus 0 30 jours 79 | 77 90 jours 60 76 A A 30 jours 85 80 90 jours 70 69 C 30 jours 93 95 90 jours 72 88 mesure de la protection 30 et 90 jours après vaccination pour mesurer L'effet prolongé de l'immunité. L'examen microscopique des effets toxiques sur L'animal de la préparation vaccinale au point d'injection montre la présence importante de nodules et de granulomes et même d'abcès ouverts. L'étendu des régions Lesées est importante. Un examen histologique met en évidence la présence de résidus huileux dans les tissus et une notable augmentation de la taille des ganglions externes. Pour améliorer L'injectabilité de tels vaccins huileux, une technique connue consiste à incorporer, dans le milieu antigénique, une faible proportion- d'un émulgateur hydrophile, le Polysorbate 80 (décrit dans les pharmacopées). La présence de ce produit réduit de façon importante la viscosité de vaccins comme il est montré dans l'exemple 2. Toutefois, on sait que le polysorbate 80, utilisé en biochimie comme agent délipidant, est agressif vis-å-vis des parois cellulaires et donc potentiellement toxique. Exemple 2 La préparation vaccinale réalisée dans l'exemple 1 a été modifiée en ajoutant 1-U de Polysorbate 80 à l'adjuvant FIA. La composition de la préparation devient : Milieu antigénique : 49,5 Z Huile minérale : 42,5 X Monooléate de mannide : 7,5 X Polysorbate 80 : 0,5 Z Les caractéristiques physico-chimiques obtenues sont Conductivité à 200C : 10 microsiemens Viscosité à 200 C : 350 centistokes pH : 7,6 Stabilité : léger anneau d'huile au stockage à 4 C La mesure de la réponse immunitaire à l'injection intramusculaire chez le bovin est sensiblement équivalente à celle obtenue avec la préparation de l'exemple 1, lorsque l'on utilise une préparation selon l'exemple 2, réalisée depuis moins de 1 mois. Par contre, lorsque l'on utilise une préparation selon l'exemple 2 réalisée depuis 1 an et stockée à 4 C dans des conditions stériles, on constate une altération de la phase antigénique et une diminution de la réponse immunitaire avec un taux d'anticorps circulants moins élevé. Ces résultats sont expliqués par la présence de l'émul- sionnant hydrophile Polysorbate 80 (caractérisé par HLB de 15) qui exerce un pouvoir mouillant sur les enveloppes cellulaires des antigènes et solubilise les protéines de surface. Ceci a pour effet de Les dénaturer et de modifier leur aptitude à la création d'anticorps. Ce mécanisme des agents tensioactifs hydrophiles vis-à-vis des micro-organismes est connu et décrit en particulier dans la littérature. Au niveau des résultats de toxicité à l'injection chez l'animal, on observe des phénomènes similaires à ceux obtenus avec Os 10 15 20 25 30 35 la préparation de L'exemple 1, qui sont caractéristiques d'une mauvaise tolérance du vaccin. On trouve des préparations vaccinales commercialisées selon le procédé de L'exemple 2, associant de l'adjuvant FIA et un émulsionnant hydrophile. Le brevet belge BE-A-648053 de Phitips décrit un vaccin contre la brucellose réalisé dans des conditions similaires, et qui présente une notable réduction de la viscosité par rapport aux préparations réalisées avec l'adjuvant FIA seul. L'utilisation d'huiles métabolisables telles qu'huiles végétales, squalène, squalane à la place d'huiles minérales a permis dans certains cas d'obtenir des vaccins de type E/H bien mieux tolérés. WeilbeL et coll. ne notent que de petits nodules de 3 à 4 mm chez les humains vaccinés au moyen d'un vaccin grippal contenant de L'huile d'arachide (P.S.E.B.H 143, 1053 - 1056 (1973), cependant, les réponses immunitaires enregistrées sont en général plus faibles et la protection moins longue avec ce type de vaccins qu'avec les vaccins sur huile minérale. Ceci peut être expliqué par une dégradation plus rapide du vaccin dans l'organisme. Les exemples rapportés dans le brevet anglais 1 081 796 (1965) de L.B HOLT sont bien représentatifs de ce phénomène (tableau A) Tableau A Evolution du taux d'anticorps avec 2 vaccins huileux adjuvés FIA ou huile d'amande douce. TAUX D'ANTICORPS ANTIGENE DIPHTERIA TOXOID TETANUS TOXOID B PERTUSIS 6 sem. 13 sem. 6 sem. 13 sem. 6 sem. 13 sem. ADJUVANT FIA 0,32 0,26 5,0 0,41 20 431 huile végétale + 0,10 0,07 0,30 0,20 20 31 mannide mono oléate Une autre carectéristique particulièrement désavantageuse de ces vaccins sur huile métabolisable est leur viscosité qui rend Leur injection difficile et douloureuse. Les vaccins adjuvés par du squaLène ou du squalane décrit dans le brevet européen 0 117 934 ont une viscosité supérieure à 4 000 mPa.s. De meme, ceux décrits dans l'article de WOODHOUR (PSEBM 116, 516-523, 1964) et contenant de l'huile d'arachide et du monostéarate d'aluminium sont présentés comme "highly' viscous WATER-in-oi t émulsion . Il a été trouvé, de façon tout a fait inattendue, que l'adjonction d'une huile métabolisable aux vaccins contenant une huile minérale (ou de manière générale non métabolisable) permettait d'en améliorer considérablement la tolérance sans en modifier de façon significative l'efficace immunologique a condition que les vaccins obtenus soient stables et très fluides. L'obtention de ces préparations fluides, stables, tota Lement ou partiellement métabolisables, a été rendue possible grâce à L'utilisation d'émulgateurs non toxiques, faiblement hydrophiles, obtenus à partir d'acides gras liquides, de mannitol ou de glycé rol. Les vaccins (ou préparations injectables) de t'invention sont caractérisés par 4 grandeurs physico-chimiques importantes - fluidité : La viscosité mesurée par un appareil à mobile tournant du type BROOKFIELD doit être inférieure à 800 centistokes ZOOC pour être injectable à travers une aiguille de seringue dont le diamètre est de 0,2 mm ; - stabilité : la préparation émulsionnée ne doit pas déphaser, c'est-à-dire libérer la phase antigénique interne ni la phase huileuse dans des conditions de stockage normales pour ce type de produit ; - conductivité : elle détermine le caractère huileux ou aqueux de la phase continue de l'émulsion.Pour des valeurs inférieures à 20 microsiemens environ, on obtient une phase continue huileuse à température ambiante ; - aspect microscopique : les tailles de gouttelettes de phase antigénique dispersées sont inférieures à 10 pm et peu dispersées. Mis à part le milieu antigénique, ou les principes actifs spécifiques à chaque préparation injectable, les autres constituants (huiles, émulgateurs) doivent répondre à des critères précis définis ci-après. Définition de l'huile Les huiles fluides sont choisies parmi les huiles minérales, végétales ou animales connues pour leur faible toxicité. Elles doivent être liquides à la température de stockage (+4 C) ou, au moins, donner des émuLsions liquides à cette température. On choisira en particulier des huiLes minérales à chaine linéaire ayant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 16 et exemptes de composés aromatiques. Des exemples connus sont le MARCOL 52 (produit par ESSO France) et Le DRAKEOL 6VR (produit par PENRECO USA). On peut également utiliser des huiles minérales synthétiques teLles que Les polyisobuténes ou les polyisoprènes. - Parmi les huiles végétales, on choisira des huiles insa turées riches en acide oléique qui sont biodégradables et connues pour leur pouvoir immunogène, par exemple les huiles d'arachide, d'olive, de sésame, de soja, de germe de blé, etc. Pour les huiles animales, les mêmes critères de tolérance et d'efficacité immunologique permettent d'utiliser par exemple du squalène, du squalane, de l'huile de spermaceti. Un mélange des huiles citées précédemment est avantageusement utilisé dans le cadre de la présente invention. Définition du système émulgateur IL doit être adapté pour donner des préparations injectables de type E/H fluides et stables. Il se compose d'un ou plusieurs agents tensioactifs ayant en mélange un caractère Lipophile ou faiblement hydrophile carac térisé par un nombre HLB (HydrophiLe - Lipophile - Balance) compris entre 2 et 9. Les émulgateurs sont de préférence obtenus par condensation d'un acide gras Liquide à 200C sur un sucre (mannitol, glucose, saccharose) ou du glycérol. Les acides gras préférés sont ceux ayant au moins 16 atomes de carbone et en particulier les acides oléique, linoléique, ricinoléique, cêtostéarique. On utilise de préférence les esters de mannitol notamment les oléates obtenus dans des conditions de synthèses particulières, par anhydrisation de La chaine carbonée polyhydroxylée du mannitol qui se cyclise en 1-4 ou en 2-6. L'hydrophilie des esters obtenus peut être modifiée par greffage de fonctions hydrophiles telles qu'alcool, polyols, oxyde d'éthylène, oxyde de propylène, acide carboxylique, amine, amide... Tous les émulgateurs utilisés doivent être pharmaceutiquement acceptables pour un usage en injectable, notamment etre dépourvus de métaux lourds, et présenter des indices d'acide ou de peroxyde très faibles. Il est également souhaitable qu'ils satisfassent les normes de tests d'innocuité tels que, par exemple, celui décrit par S.S. BERLIN (annals of allergy 20, 473 1962). Il est également souhaitable que Les émulgateurs utilisés forment avec l'huile choisie une phase homogène, limpide et stable qui sera émulsionnée avec le milieu aqueux propre chaque préparation injectable. Les émulgateurs décrits dans le tableau B répondent aux exigences ci-dessus. Its sont utilisés dans les préparations injectables décrites dans Les exemples 3 à 9 pour former des émulsions fluides et stables. Exemple 3 Cet exemple montre l'importance de la fluidité des vaccins sur leur tolérance par des animaux. On réa lise deux vaccins porcins contre la maladie d'AUJESZKY contenant Le même milieu antigénique inactivé à la ss- propiolactone. Les caractéristiques du vaccin A selon l'invention et du vaccin B (contenant un adjuvant type FIA sont mentionnées dans le tableau 3 - 1. Le vaccin A se caractérise par une faible viscosité, une bonne injectabilité : it contient l'émulgateur 2 décrit dans le tableau (B). Les deux vaccins contiennent la même huile minérale fluide. L'expérimentation a eu lieu sur 2 lots de 6 porcs auxquels ont été administrés 2 fois, à 15 jours d'intervalle, 2 ml de vaccin par voie I.M. L'analyse sérologique et l'examen histologique ont eu lieu 59 jours après la première vaccination. Les résultats sont consignés dans le tableau 3 - 2. On peut y remarquer- que les taux d'anticorps sont voisins pour les 2 vaccins, mais que Le vaccin A est beaucoup mieux toléré que le vaccin B, pour lequel 2 porcs ont présenté des comportements anormaux après chaque vaccination. Aux niveaux des sites d'injection, nécroses et suppurations - totalement inacceptables par les auto rités sanitaires - sont pratiquement absentes du groupe A. Les granulomes macrophagiques et les infiltrats inflammatoires observés sont les témoins d'une réaction immunitaire intense. Tableau 3 - 1 Caractéristiques des vaccins porcins Aujeszky Vaccin A Vaccin B Caractéristiques de l'adjuvant Composition huile minérale huile minérale 90 % 89 % émulgateur monooléate de 2 : 10 % mannide 11 % Viscosité (mPa.s) 35 40 Indice de réfraction 1,459 1,461 Caractéristiques du vaccin Composition % W/W Adjuvant 70 Adjuvant 50 Milieu 30 Milieu 50 Viscosité (BROOKFIELD M2V12) 37 mPa.s 1870 mPa.s Sens E/H E/H Conductivité 0,2 S 0,4 S Stabilité 4 C > 12 mois > 12 mois Aspect microscopique gouttes 1 gouttes 1-5 Tableau 3 - 2 Résultats de la vaccination Vaccin A Vaccin B Sérologie Titre en anticorps (Log 2) 2,5 2,0 (moyenne sur 5 animaux) Histologie (fréquence sur 6 porcs) Nécrose 1 3 Suppuration 0 3 Fibrose 5 5 Atrophie musculaire 5 6 Granulomes macrophagiques ou 5 4 lymphocytaires Infiltrat inflammatoire diffus 2 2 Réaction générale (modification du comportement) 0 2 ExempLe 4 On réalise un vaccin antiaphteux pour bovins par mélange sous agitation mécanique d'une partie d'adjuvant contenant l'émul- gateur 1 et d'une partie du milieu antigénique inactivé. L'adjuvant contient 5 Z d'une huile végétale. Les caractéristiques physico-chimiques de t'adjuvant et du vaccin obtenu sont donnnées ci-dessous (tableau 4 - 1). Le test d'efficacité immunologique donne les résultats résumés dans le tableau 4 - 2 qui peuvent être comparés à La préparation de L'exemple 1. L'activité est maintenue sur des préparations stockées jusqu'à 2 ans. La tolérance de la préparation injectée par voie intramusculaire chez le bovin est bonne. L'examen histologique révèle une inflammation Légère des tissus au point d'injection avec présence de peu de nodules et de granulomes. La résorption de l'inflammation et la disparition microscopiques du produit injecté sont obtenues dans les 15 jours suivant L'injection. TabLeau 4 - 1 Caractéristiques du vaccin antiaphteux Caractéristiques de L'adjuvant Composition huiLe d'arachide 5 X huile minérale fluide 84 X émulgateur 1 11 X Aspect Liquide huileux Limpide, jaune clair, stable Viscosité 40 mPa.s Indice d'acide 0,1 Indice de réfraction 1,460 environ Densité 0,85 Caractéristiques du vaccin antiaphteux Conductivité à 20 C 1,5 microsiemens Viscosité à 200C 250 centistokes Stabilité à 4 C trés léger anneau d'huile Aspect microscopique goutteLettes de taiLle inférieure à 1 pm Centrifugation pas de séparation après 30 min à 3 000 tr/min. Tableau 4 - 2 Résultats immunitaires fièvre aphteuse bovine Dose injectée 5 ml. Les résultats (EPP) sont exprimés en pourcentage d'animaux protégés vis-å-vis des virus de Valences O, A et C sur une durée de 3 mois post-vaccinale, avec des vaccins de plusieurs lots stockés durant plusieurs mois à 40C. Vaccin lot Vaccin lot Vaccin lot Vaccin lot EPP n 3 stocké n 3 stocké n 4 stocké n 4 stocké 1 mois 24 mois 1 mois 3 mois Virus 0 30 j 90 99 99 90 90 j 88 99 99 86 Virus A 30 j 86 92 97 82 90 j 93 90 99 85 Virus C 30 j 97 99 99 97 90 j 92 97 99 85 Exemple 5 On vaccine des souris avec des- vaccins constitués - d'un milieu antigénique à 100 ug/ml d'albumine bovine - d'un adjuvant huileux contenant soit une huile de synthèse (vaccin 5A), soit une huile de synthèse et une huile végétale (vaccin 5B). Ces deux vaccins sont fluides et stables. Leurs caractéristiques physico-chimiques sont données dans le tableau 5 - 1. Des Lots de 10 souris SWISS sont vaccinés par 0,1 ml de ces vaccins. Un lot témoin reçoit le milieu antigénique non adjuvé. Les taux d'anticorps, mesurés au cours du temps par une technique ELISA, sont donnés dans Le tableau 5 - 2. On constate que les deux vaccins adjuvés se comportent de la même façon bien que le vaccin 5B contienne une huile métabolisable, et sont nettement plus efficaces que le vaccin non adjuvé. On remarquera l'apparition rapide des anticorps avec le vaccin contenant l'huile métabolisable. Tableau 5 - 1 Caractéristiques physico-chim@ques du vaccin BSA Vaccin 5A 5B Caractéristiques de L'adjuvant Composition Polyisobutène 89X Polyisobutêne 44 émulgateur 2 11X huile amande douce à 45X émulgateur 3 11% Viscosité mPa.s 45 50 Aspect liquide limpide Liquide limpide clair jaune Caractéristiques du vaccin Sens E/H E/H Conductivité à 200C 0,9 us 1,2 s Viscosité mPa.s à 200C 100 130 Stabilité > 12 mois > 12 mois Aspect émulsion émulsion homogène homogène Tableau 5 - 2 Taux d'anticorps chez la souris vaccinée par les vaccins BSA Jours après vaccination 14 28 56 125 Vaccin non adjuvé 60 157 102 105 Vaccin 5A 590 2420 3800 4560 Vaccin 5B 1400 2540 3760 4640 ExempLe 6 Une préparation injectable contenant des principes actifs hormonaux est réalisée par mélange d'une partie d'une suspension aqueuse et d'une partie d'un adjuvant huileux contenant des huiles métabolisables (squalène et huile d'amandes douces 84 X) et une huile non métabolisable (squalane : 5 X) et l'émulgateur (3) : 11 Z. Le vaccin obtenu a les caractéristiques suivantes SENS E/H CONDUCTIVITE 0,14 ,uS VISCOSITE 305 mPa.s STABILITE 40C et 2O0C > 6 mois Ces caractéristiques, en particulier viscosité et stabilité, ne peuvent être obtenues que grâce à la formùlation spécifique de l'adjuvant huileux. En effet, un vaccin ayant le même rapport eau/huile mais formulé à partir de squalène et de monooléate de mannitol traditionnel est très visqueux (4400 mPa.s) d'injection extrêmement difficile et douloureuse, et peu stable (exsudation d'huile importante à 4 et 200C). La préparation selon l'invention a une efficacité suffisante et ne provoque chez le primate qu'une légère rougeur au point d'injection qui disparaît au bout de quelques jours Exemple 7 On réalise un vaccin Aujeszky par mélange de 30 parties d'un milieu viral inactivé titrant 2.10 9 DCP 50/ml et de 70 parties d'un adjuvant huileux contenant une huile végétale et l'émulgateur 3. Le tableau 7 - 1 donne les caractéristiques de l'adjuvant et du vaccin obtenu. 2 ml de vaccin sont injectés à un lot de 5 porcs suivi d'un rappel à 15 jours. Une épreuve de résistance est pratiquée 15 jours après rappel. L'abattage et l'examen histologique ont eu lieu 5 semaines après le rappel. Les résultats de l'expérimentation montrent dans tous les domaines une très bonne tolérance du vaccin. Ces résultats peuvent être comparés à ceux obtenus avec un vaccin huileux classique contenant un adjuvant type FIA et présentés à l'exemple 3 (vaccin B). Il convient de noter tout particulièrement l'absence d'hyperthermie excessive, de nécroses et suppurations, La présence de granulomes macrophagiques discrets traduisant la réponse immunitaire et confirmant la bonne résistance à l'épreuve infectieuse. Tableau 7 - 1 Caractéristiques physico-chimiques du vaccin et de son adjuvant Caractéristiques de L'adjuvant Composition Huile minérale fluide 44 X Huile d'arachide raffinée 44 X Emulgateur 3 12 X Aspect liquide huileux, jaune pailLe, Limpide, stable, homogène. Viscosité à 200C 20 cPs Indice de réfraction 1,466 Indice dthydroxyle 13 Indice de saponification 105 Caractéristiques du vaccin Sens EIH Conductivité à 200C 1,9 pS Viscosité à 200C 38 mPa.s Aspect microscopique homogène - gouttes de 1 m Stabilité à 40C > 12 mois Tableau 7 - 2 Résultats expérimentaux de La vaccination porcine Hyperthermie à la vaccination 0 au rappel brève chez 2 animaux à l'épreuve intense mais brève ( 48 h) Réactions générales à la vaccination ) légère inflammation point au rappel ) d'injection disparaissant ) en 48 h à l'épreuve O Mortalité (après l'épreuve) O Histologie (fréquence sur 5 porcs) (Nécrose 0 (Suppuration O (Fibrose o (Atrophie musculaire 5 (légère) (Granulomes macrophagiques 5 (disséminés, discrets) Tableau B Caractéristiques physico-chimiques d'émulgateurs utilisables dans l'invention Emulgateur Référence 1 2 3 4 5 Huile S S S S S S Solubilité* Eau I D I I I D H.L.B. (approximatif) 2,6 5 6,5 3 2 3 Indice de réfraction 1,4750 - 1,4765 1,4748 - 1,4758 1,4740 - 1,4750 - - Indice d'hydroxyle 89 - 100 90 - 105 90 - 110 87 - 100 20 - 90 Indice de saponification 164 - 172 147 - 160 120 - 140 157 - 170 166 - 186 Pureté Métaux lourds ppm 20 max. 20 max. 20 max. 20 max. 20 max. 20 max. Peroxydes mmol/kg 2 max. 2 max. 2 max. 2 max. 2 max. 2 max. Indice d'acide 1 max. 1 max. 1 max. 1 max. 1 max. 1 max. Eau % 2 max. 2 max. 2 max. 2 max. 2 max. 2 max. Définition chimique ou nom Mannide monolléate Montanide 888 Montanide 103 Montanide 9208 Mannide dioléate Lécithine de soja commercial Montanide 80 # # # # purifié LIPOID S 75 # * S = Soluble - I = Insoloble - D = Dispersible. (1) marque déposée SEPPIC France (2) marque déposée LIPOID R.F.A. Exemple 8 La même expérimentation que celle décrite à l'exemple 7 a été réalisée avec un vaccin contenant 70 parties d'un adjuvant composé de squalane d'un ester d'acide gras et d'un émulgateur légèrement hydrophile décrit sous référence 2 dans le tableau B et 30 parties de milieu antigénique Aujeszky. Le vaccin obtenu est très fluide et s'injecte facilement. Ses performances et ses caractéristiques sont données dans les tableaux 8 - 1 et 8 - 2. On notera à nouveau l'absence de réactions d'intolérance importantes comparativement au vaccin classique de l'exemple 1B. Tableau 8 - 1 Caractéristiques physico-chimiques du vaccin porcin Aujeszky Caractéristiques de L'adjuvant Composition Oléate d'éthyle 6 X Squalane 83 X Emulgateur 2 11 X Aspect liquide, limpide, transparent, jaune très clair (Viscosité à 200C 20 mPa.s (Indice de réfraction -1,492 environ Caractéristiques du vaccin Type E/H Viscosité à 20 C 88 mPa.s Conductivité à 20 C 0,03 S Stabilité à 40C légère exsudation d'huile Tableau 9 Résultats d'une vaccination anticollibacillaire chez le lapin Sérologie * jours : 0 15 24 rappel 42 84 Vaccin exemple 9 0 9,5 11 # 11,3 10,6 Vaccin adjuvé FIA 0 6 7 8 8 Réactions observées ** jours 1 4 5 19 | 31 50 Vaccin exempLe 9 0 20 27 0 35 0 Vaccin adjuvé FIA 0 30 40 10 60 10 Taux d'anticorps exprimé en log base 2 de la dernière dilution agglutinante - Moyenne géométrique. Diametres moyens des érythèmes observés (mm) au point d'injec tion. Tableau 8 - 2 Résultats expérimentaux de la vaccination porcine Hyperthermies à la vaccination très légères au rappel > 41 0C 24 h à l'épreuve intenses mais brèves Réactions générales à la vaccination 0 au rappel légère infLammation au site d'injection à l'épreuve peu prononcées Mortalité (après l'épreuve) 0 Histologie (fréquence sur 5 porcs) (Abcès caséeux 2 (Suppuration O Fibrose 1 Atrophie musculaire 5 Granulomes macrophagiques 3 Exemple 9 Un vaccin anticollibacillaire a été réalisé pour une vaccination chez le lapin. Le milieu antigénique est une suspension de facteur d'attachement K 88 ab dans du sérum physiologique, à une concentration telle que la D O de cette suspension soit de 0,5 à 540 nm. L'adjuvant utilisé est celui décrit à L'exemple 7 et au tableau 7 - 1. Le vaccin contient 1/3 de milieu antigénique et 2/3 d'adjuvant. Ses caractéristiques sont les suivantes. SENS E/H CONDUCTIVITE à 2O0C 2,0 pS VISCOSITE à 2O0C 40 mPa.s Des Lapins néozélandais de 6 semaines sont vaccinés par 1 ml de vaccin puis un rappel est effectué à 29 jours. Les taux d'anticorps sont mesurés par une technique de micro-agglutination. Le tableau 9 donne les résultats obtenus avec ce vaccin ainsi qu'avec un vaccin huileux classique formulé avec adjuvant de Freund incomplet (formule 50/50 ; viscosité > 3 000 mPa.s). Les taux en anticorps avec le vaccin selon l'invention sont supérieurs ou égaux à ceux mesurés avec le vaccin classique. Les réactions au site d'injection sont très importantes avec le vaccin classique, surtout après le rappel. Elles le sont beaucoup moins et régressent plus rapidement avec le vaccin de cet exemple. Exemple 10 Pour réaliser une préparation vaccinale contre la maladie de Newcastle chez les volailles, nous avons utilisé un adjuvant constitué de : Huile minérale fluide DRAKEOL 6VR 82 X Huile de soja 5 X Emulgateur 2 13 X Cet adjuvant Liquide, limpide présente les caractéristiques suivantes : Indice acide inférieur à 0,5 Indice hydroxyle voisin de 11 Indice de réfraction de 1,459 Le vaccin est réalisé par mélange sous agitation mécanique de 7 parties d'adjuvant et de 3 parties de milieu allantoidien contenant les antigènes Newcastle inactivés. Les caractéristiques physico-chimiques du vaccin sont : Conductivité à 20 0C inférieure à 1 microsiemens Viscosité à ZOOC 45 centistokes Stabilité pas de relargage d'huile, ni de déphasage du milieu à 40C après 3 mois. La préparation reste également stable à 37 C durant plus d'une semaine. Des vaccins stockés 12 mois à 40C et 1 mois à température ambiante, ainsi qu'un témoin constitué des antigènes viraux inac tivés sans adjuvant et un vaccin à virus vivants sont injectés aux animaux. L'étude est effectuée sur 3 séries de 10 poulets EOPS du type LEGHORN âgés de 4 semaines. L'injection se fait par voie souscutanée dans la région du cou par dose de 0,5 ml. La mesure de l'efficacité immunologique est effectuée par titrage de l'inhibition de l'hémagglutination. On prélève le sang de la volaille vaccinée dans la veine de l'aile au temps To, 4, 8, 12, 18 semaines et on mesure la teneur en hémagglutinine. - Titre d'inhibition de l'hématoagglutination To 4 sem. 8 sem. 12 sen. 18 sem. I (témoin) 10 9 10 8 8 2 (vaccin selon l'invention) 210 230 190 150 160 3 (vaccin virus vivants) 305 210 120 70 50 On constate la supériorité de l'activité immunologique obtenue avec le vaccin de L'invention par rapport au témoin. Contrairement à ce qui est observé avec le vaccin à virus vivants, l'activité persiste après plus de 4 mois, ce qui permet d'assurer la protection immunitaire des poulets vis-à-vis de la fièvre de Newcastle tout au long de leur durée de vie. Sur le pLan toxicité, on ne révèle aucune mortalité de la volaille vaccinée avec Le vaccin selon l'invention, alors qu'un certain nombre de poulets (5 X) sont morts peu après injection du vaccin à virus vivants. REVENDICATIONS 1. Emulsion injectable utilisable comme vaccin ou vecteur de principe actif ayant une phase continue huileuse présentant une bonne tolérance dans les conditions normales d'injection à un homme ou un animal, caractérisée par : une viscosité inférieure à 800 mPa.s à 20 c et constituée d'au moins : - 20 à 90 % d'un adjuvant huileux liquide à 4 C contenant au moins un ou plusieurs émulgateurs, appropriés et pharmaceuti quement acceptables, - un mélange en toute proportion d'une ou plusieurs huiles métabolisables avec une ou plusieurs huiles non métabo li sables, - 10 à 80 Z d'une phase hydrophile contenant les principes actifs ou antigènes. 2. Emulsion selon La revendication 1, dont l'huile métabolisable est d'origine végétale. 3. Emulsion selon la revendication 1, dont L'huile métabolisable est d'origine animale. 4. Emulsion selon la revendication 1, dont l'huile métabolisable est un ester résultant de la condensation d'un acide gras contenant de 12 à 24 atomes de carbone avec un alcool ou de la condensation d'un alcool gras contenant de 12 à 24 atomes de carbone avec un acide. 5. Emulsion selon la revendication 1, dont l'huile métabolisable est une huile de synthèse de type alcane, alcène ou alcyne dont le nombre d'atomes de carbone moyen est d'au moins 16. 6. Emulsion selon la revendication 1, dont l'huile non métabolisable est d'origine minérale ou animale et possède un nombre moyen d'atomes de carbone au moins égal à 16. 7. Emulsion selon L'une des revendications 1 à 7, dont l'huile non métabolisable représente de 2 à 95 Z, de préférence 10 à 50 Z de L'adjuvant huileux. 8. Emulsion selon l'une des revendications 1 à 6, dont le ou les émulgateurs sont obtenus par condensation d'un acide gras liquide à 20 C contenant au moins 16 atomes de carbone avec un polyol. 9. Adjuvant huileux limpide et stable constitué d'au moins une des huiles décrites dans l'une des revendications 1 à 7 et d'un ou de plusieurs émulgateurs décrits dans La revendication 8.