FR 2646776 A1 19901116 FR 8906321 A 19890512 UTILISATION DE PREPARATIONS VACCINANTES A BASE D'ADENYL CYCLASE OU DE BACTERIES LES PRODUISANT EN TANT QU'ANTIGENES PROTECTEURS CONTRE LES EFFETS DES BORDETELLA L'invention concerne des vaccins capables de protéger l'homme ou l'animal contre les infections létales provoquées par les Bordetella. Elle vise en particulier l'utilisation de préparations vaccinantes élaborées à partir de Bordetella ou d'adényl cyclane produite par ces bactéries en tant qu'antigènes protecteurs contre les effets toxiques des infections dues aux Bordetella. On sait que les Bordetella, plus particulièrement Bordetella nertussis, Bordetella parapertussis et Bordetella bronchisetica, sont responsables de pathologies respiratoires chez les vertébrés. Ainsi, chez l'homme, B. pertussis est resposnable de la coqueluche, maladie infantile très répandue à travers le monde. La vaccination contre la coqueluche est à ce jour le plus généralement réalisée à l'aide de bactéries entières inactivées. Cependant, ces vaccins ne sont pas toujours dépourvus de toxicité étant donné que les facteurs de virulence sont constitués par les protéines sécrétées par les bactéries et non par ces bactéries elles-mémes. Les protéines, meme après la nort des bactéries, peuvent donc exercer des effets pathologiques graves. Parmi les déterminants de virulence de B. pertussis. on citera les adhésives tels les agglutinogènes (AGG), l'hémagglutinine filamenteuse (FHA) et la toxine de pertussis (PIx), une toxine cytotrachéale (TCT) une toxine dermonécrotique (DN'T) et une adényl cyclase-hémolysine (.C). Cette derniere est synthétisée sous forme d'un large précurseur de 1706 résidus. La partie aminoterminale de la molécule porte l'activité adényl cyclase et la partie carboxytarminale présente une forte homologie avec le produit du gène Hly d'E.coli (hémolysine). Cette adényl cyclase a la propriété d'entre activée par la calmoduline. La recherche de méthodes de prévention mieux adaptées a conduit les inventeurs à étudier le rôle de chacun des déterminants de virulence et à mettre au point un modela d'infection expérimental mimant le processus de la maladie naturelle. Ces travaux ont permis de constater le role de l'adényl cyclane en tant que cstotoxine et en tant qu'antigène protecteur et à développer une nouvelle utilisation des préparations vaccinantes à base d'adényl cyclase ou de préparations bactériennes produisant de l'adényl cyclase. L'invention concerne plus spécialement l'utilisation d'une préparation vaccinante bactérienne élaborée a partir d'une bactérie donnée du genre Bordetella, cette utilisation étant caractérisée en ce qu'elle est mise en oeuvre pour protéger l'homme ou l'animal contre les infections et les effets toxiques causés par une bactérie du genre Bordetella mais différente de celle de la préparation vaccinante. Selon un autre aspect, l'invention vise également l'utilisation d'une préparation vaccinante élaborée à partir d'une adényl cyclase d'une bactérie donnée du genre Bordetella, cette utilisation étant caractérisée en ce qu'elle est mise en oeuvre pour protéger l'homme ou l'animal contre les infections et les effets toxiques causés par une bactérie du genre Bordetella différente de celle dont provient l'adényl cyclase. Les bactéries du genre Bordetella sont choisies parmi B. pertussis, B. parapertussis, et B. bronchiseptica. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, la préparation vaccinante est élaborée à partir de B.bronchisentica ou d'adényl cyclase de B.bronchiseDtica et est mise en oeuvre pour protéger contre les infections et les effets toxiques causés par B. pertussis ou B. parapertussis. On notera que cette protection croisée obtenue à partir de souches de B.bronchiseDtica présente l'avantage d'utiliser des souches à croissance plus rapide que B. pertussis ou B. parapertussis pour élaborer des vaccins contre les infections provoquées par B.Dertussis ou B. parapertussis. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la préparation vaccinante est élaborée à partir de B. pertussis ou d'adényl cyclase de B.ertussis et est mise en oeuvre pour protéger contre les infections et les effets tosiques causés par B.bronchisetica ou B.Daranertussis. Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, la préparation vaccinante utilisée est élaborée à partir de B. parapertussis ou d'adényl cyclase de B. parapertussis et est mise en oeuvre pour protéger contre les infections et les effets toxiques causés par B.t > ertussis ou B.bronchisentica. Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, la préparation vaccinante utilisée est élaborée à partir de B. parapertussis ou d'adényl cyclase de B. parapertussis et est mise en oeuvre pour protéger contre les infections et clefs effets toxiques causés par B. pertussis ou B. bronchiseptica. Les préparations vaccinantes utilisées cidessus, peuvent être associées avec de la FHÀ et/ou de la PTs dans le même inoculum ou non. Dans ce dernier cas, la FHA est administrée en même temps que la préparation vaccinante ou à un temps différent. Les préparations de FHA sont avantageusement obtenues selon, par exemple. la néthode de SATO et al dans Infect. Immun, 1983, 41, 310-320 ou celle d'IX5AIZE5II et al dans Journal of Nicrobiol. Methods, 2, 334-347 (1984). Selon un autre aspect. l'invention vise en tant que vaccins capables d'induire une protection contre les effets toxiques et les infections causées par les Bordetella. des vaccins moléculaires renfermant au moins la partie active de la séquence d'acides aminés representee sur la figure unique, le cas échéant associée. dans le même inoculum ou non, à de la FliA et/ou de la Pis. Ces vaccins sont avantageusement utilisés conformément à l'invention pour effectuer des protections croisées. Dans la mise en oeuvre de l'invention, les préparations vaccinantes à base de bactéries ou d'adényl cyclase produite par ces bactéries, avantageusement purifiée, ainsi que les vaccins élaborés à partir d'adényl cyclase recombinante sont utilisés aux doses et sous les formes d'administration habituelle, en particulier sous les formes classiques administrables par voie intranasale, orale ou parentérale. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans la description des esemples qui suivent et en se reportant à la figure unique qui représente la séquence de nucléotide de la partie active du gène de B.ertussis codant pour l'adényl cyclase et la séquence correspondante d'acides aminés. Le modèle d'infection respiratoire utilisé dans les essais rapportés dans les esemples est un modèle d'infection par voie intranasale. La sélection in vivo à partir d'un poumon de souris infectée par B.rertussis d'un dérivé hyperpathogêne de la souche virulente de B. pertussis 18323S (souche de référence internationale pour les épreuves d'évaluation des vaccins), a permis d'observer chez la souris adulte, après injection des bactéries, par voie intranasale, une alvéolite oedémateuse hémorragique aigue (AOHA), létale en 48-72h. Les analyses des produits des exemples sont effectuées comme suit. L'activité de l'xC est mesurée selon la méthode de White A.A. dans Methods Enzymol., 38C, 41-46, 1974. telle que modfiée par Hanoune et al (J. Biol. Chem., 252, 2039-2046, 1977). Les activités de PTs et de FHA sont mesurées selon la méthode de TUOMANON S. et WEISS A. dans J. Inf. Dis., 152, 118-125, 1985. EXEMPLE 1 : CULTURE DE B. BRONCHISEPTICA ET OBTENTION D'UN SURNAGEANT A CONCENTRATION ELEVEE EN ADENYLATE CYCLASE On effectue une préculture de B.bronchiseDtica 9.73, phase I et d'un variant avirulent, phase I, spontanément, stable de cette souche, pendant 48 heures à 36 C. sur un milieu d'agar modifié Stainer-Scholte supplémenté avec de la cyclodextrine (selon IMAIZUIMI et al dans J. Chim. Microbiol., 17, 781-786, 1983). On transfère ensuite la préculture dans un milieu liquide modifié de Stainer Scholte sans cyclodextrine. La souche de B.bronchisetica 9.73 a été isolée à partir des nasaux d'un lièvre. Les cultures liquides sont soumises à agitation à 150 t/min. pendant 15 heures à 36 C, dans un erlenmeyer de 1 litre contenant 250 ml de milieu. On poursuit la culture jusqu'à l'obtention d'une densité optique DOsso = 1,2 : 0,2. Les bactéries sont alors éliminées par centrifugation à 5000 s g durant 25 min. Les surnageants de culture sont conservés à -300C jusqu'à utilisation ou concentrés directement. Aus fins de concentration, on filtre, sur des filtres de type Millipore" HAWP de 0.45 um, 3 litres de surnageant de culture contenant environ 10 ug de protéines et 0,1 unité d'enzyme par ml. On retient ainsi plus de 90% de l'activité enzymatique sur les filtres. 80% environ de cette activité peuvent etre récupérés par incubation des filtres dans 40 ml d'un tampon A constitué par du Tris.HCL, 50 mM. pH 8 contenant 6 mM de MgCl2 et 0,1% de Triton X.100R. Le matériau insoluble est élimine par centrifugation durant 30 min. à 15000 s g à 4 C. L'activité spécifique du surnageant de culture concentre est de 115 unités par milligramme de protéine. Une suspension bactérienne de la souche 9.73 a été injectée par voie intranasale à une souris ; 48 heures après les poumons ont été prélevés et broyés et un clone hémolytique isolé, à savoir le clone 9.73S. Ce clone a été déposé le 12 mai 1989 à la CNCM sous le n I-858. Ce clone est hémolytique. et synthétise de grandes quantités d'adényl cyclase. Une suspension bactérienne de ce clone provoque un oedème hémorragique au niveau du poumon chez la souris. EXEMPLE 2 : PROCEDE D 'OBTENTION D 'ADENYL CYCLASE EXTRACYTOPLASMIQUE PURIFIEE SOUS FORME LIBRE On ajoute 40 ml de surnageant de culture concentré à 0,8 à 1 ml d'Affigel-calmoduline1 et on agite lentement le mélange à 4:C pendant 18 heures. Plus des 2/3 de l'activité enzymatique sont retenus sur le gel. On fait sédimenter l'Affigel-calmoduline par centrifugation à 300 x g pendant 1 minute, on lave à plusieurs reprises avec NaCl 0,5 M dans le tampon A. On récupère l'adényl cyclase à partir du gel à l'aide de 2,5 ml d'urée 8,8 M dans le tampon A. On élimine l'urée par filtration sur une colonne de Séphadex G-25t, équilibrée avec le tampon A. Cette préparation enzymatique possède une activité spécifique de 1100 unités/mg de protéine. On peut la conserver à -80 C sans perte d'activité sur plusieurs semaines. EXEMPLE 3 : PROCEDE D'OBTENTION D'ADENYL CYCLASE PURIFIEE A PARTIR D'EXTRAITS BACTERIENS On soumet une culture de bactéries exprimant de l'AC activable par de la calmoduline à un traitement avec de l'urée 8M durant environ 2 heures à température ambiante. On récupère le surnageant qui constitue l'extrait bactérien et on le met en contact avec le gel Affigel-calmoduline dans les conditions rapportées cidessus. On obtient une préparation enzymatique de pureté élevée présentant sensiblement la même activite specifique. EXEMPLE 4 : ETUDE DE LA SECRETION DE AC, de PTx et de FRA. ET DE LA DL50 DE SOUCHES DE BORDETELLA Dans le tableau 1 ci-après, on indique les résultats obtenus en dosant les facteurs de virulence AC, PTx et FHA et en mesurant la DL5C (dose tuant 50% des souris dans un lot) de différentes souches de Bordetella. Il s'agit de souches de B. pertussis (BP), B. parapertussis (BPP) et B. bronchiseptica (BB) correspondant soit aux souches hyperpathogènes, qui secrètent de grandes quantités d'adényl cyclase (ces souches portent la référence S dans le tableaua), soit aux souches parentales des souches hyperpathogènes. TABLEAU 1 AC PTx FHA DL50 BP 18323 20 1 2 3 108 BP18323S 180 4 2 10t BP81.14 2 (+) BP8144S 6 (+) BP8132 1 (+) 32 3.2 108 BP8132S 3 (+) 32 BPP632 8 - 64 2 108 BPP632S 35 - 84 BB973S 110 - 16 4 10@ Ces résultats mettent en évidence la production élevée d'adényl cyclase par des souches hyperpathogènes, plus spécialment par B. bronchiseptica 973s et B.ertussis 183235. La sécrétion de la PIx est également augmentée chez les dérivés hyperpathogènes comme le montrent les résultats relatifs à B. pertussis alors que la sécrétion de la FHA reste la même chez les deus souches. B.bronchiseDtica et B. parapertussis. qui synthétisent les mêmes facteurs que B. pertussis à l'exception de la PTs, induisent chez la souris une alvéolite oedémateuse hémorragique semblable à celle induite par B.Dertussis. En revanche, une souche dérivée de la souche virulente B. pertussie 8132, la souche B.P.348 et hébergeant un transposon Tn5 dans le gène de structure de l'AC, inactivant celui-ci, est incapable d'induire une AOHA chez la souris Ce mutant sécrète, cependant, tous les autres facteurs de virulence, en particulier la Pis. L'ensemble de ces résultats désigne l'AC comme facteur responsable de l'alvéolite oedémateuse hémorragique chez la souris. EXEMPLE 5 1. EXPERIENCES DE PROTECTION ACTIVE A PARTIR DE VACCINS BACTERIENS Des expériences de protection (contre B.Dertussis) ont été réalisées à l'aide de différents vaccins bactériens (généralement 3 injections souscutanées de 250ul de suspension bactérienne, contenant lot bactéries/ml, chauffées à 560C, à une semaine d'intervaLle). On rapporte dans le tableau 2 ci-apres les résultats obtenus en utilisant pour l'élaboration des vaccins bactériens des souches de B.bronchisoetica 9.738 ainsi que des souches de B. pertussis 183235, B. parapertussis 63.25 et B. avium (Blike Hewouet) La souche de B. pertussis est administrée deux semaines après la dernière immunisation : on injecte SOul par voie intranasale de 10' bactéries de la souche de B. pertussis 183235 vivantes. SOUCHE INJECTEE EPREUVE LETALE (B. pertussis) 0 10110 B. bronchlseptica 0/10 B, pertussis 0/10 B.parapertuseis S110 B. avlum 0/10 On constate que les souris vaccinées à l'aide de préparations de B. bronchiseptica sont totalement protégées contre une épreuve létale de B.Dertussis, (protection croisée), comme celles vaccinées avec B. pertussis. En revanche, les souris vaccinées avec des préparations de B.avium ne sont pas protégées. ce qui joue en faveur du rôle de l'AC dans l'induction de l'alvéolite oedémateuse hémorragique. 2. EXPERIENCES DE PROTECTION ACTIVE A PARTIR D'ANTIGENES PURIFIES On utilise des antigènes purifiés. Les préparations d'AC sont purifiées, soit à partir du surnageant de culture (70* de l'enzyme sont sécrétés par la bactérie), soit à partir des bactéries en opérant avantageusement selon le procedé de la demande de brevet FR 2606789 du 17.11.86. Des souris ont été immunisées avec differentes doses d'antigène (3 injections sous cutanées à une semaine d'intervalle, de 250 l d'antigène dans du tampon tris 10m'! pH7 contenant lmg/ml d'Am---) avant de faire l'épreuve létale de B. pertussis. Pour l'épreuve létale. on injecte par voie intranasale 50p1 de suspension bactérienne de la souche virulente et hyperpathogène 18323S, 2 semaines après la dernière immunisation. La concentration en bactéries de la suspension est de 10@ dans l'essai a. 2 x 10' dans l'essai b, et 107 dans l'essai c. Dans le tableau 3 ci-dessous, on a rapporté les résultats de protection obtenus contre une souche de B.ertussis (BP 183235) à différentes concentrations, apres injection d'AC, d'xC recombinante d'un vaccin, de Ps et de FHA. L'AC recombinante est avantageusement telle que décrite dans la demande de brevet FR 2621597 du 24.7.87. Il s'agit d'un fragment correspondant au gène de structure de l'AC qui a pu être exprimé dans E.coli. Ce fragment qui porte l'activité adényl cyclase et le site de fisation de la calmoduline a été purifié à homogénéité (voir figure unique). Ac ACres VACCIN PTx FMA O a : epreuve letale BP. 18323S 10/DL50 3/0.9@ 3/1.5 3/1.9@ 3/2@@ @/10@@ 9/12 1/10 0/40 0/22 20/22 20/22 b : epreuve letale BP. 18323S 20/DL50 3/2@@ 3/10@ 5/10 3/10 10/10 c : epreuve letale BP. 18323S 1/DL50 3/6@@ 3/@@@ 3/@@@ 3/@@@ 3/10@ 0/10 0/10 0/10 0/10 5/10 5/10 Les résultats de létalité sent a@primés en nombre de souris mortes sur le mombre de souris totales Les résultats obtenus montrent l'obtention d'une synthèse d'anticorps antiAC et une protection des souris, après immunisation avec de l'AC (trois immunisations de 1,5 l d'AC).Cette protection est quasi totale lorsque l'épreuve létale est réalisée avec une quantité de bactéries égale (10? bactéries vivantes) ou 10 fois supérieure à la dose létale 50 (108 bactéries vivantes) ; elle est de 60% lorsque l'épreuve létale est réalisée avec une quantité de bactéries égale à 20 fois la dose létale 50 (2.10e bactéries létales). Une protection totale a été obtenue après immunisation de souris avec l'AC recombinante, lorsque l'épreuve létale est réalisée avec une quantité de bactéries égale à la dose létale 50. Les immunisations réalisées avec de -la FHA n'ont pas montré d'effet protecteur de cette toxine maigrie la présence d'anticorps chez les souris immunises et ceci meme lorsque l'épreuve létale est réalisée avec une quantité faible de bactéries. Les expériences réalisées avec la PTs montre une protection partielle après deux immunisations avec 2ug de PTx lorsque l'épreuve létale est 10 fois supérieure à la dose létale 50 mais il faut préciser que, dans ce cas, la synthèse d'anticorps antiPTs est très faible. Lorsque les souris sont immunisées avec 3 fois 2pg de PTx. la synthèse d'anticorps est plus importante et nous obtenons une protection totale lorsque l'épreuve létale est réalisée aVec une quantité de bacteries égale à la dose létale 50. D'après l'ensemble de ces résultats, l'adényl cyclase constitue la cytotoxine responsable de l'alvéolite oedémateuse hémorragique observée chez la souris infectée par B.ertussis et constitue un antigène protecteur contre ces lésions. La PTs et la FHA ne joueraient aucun role dans l'induction de cette AOHA mais pourraient être des antigènes protecteurs de ces lésions en inhibant l'adhésion des bactéries sur l'épithélium respiratoire. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une préparation vaccinante bactérienne élaborée a partir d'une bactérie donnée du genre Bordetella, pour la préparation d'un antigène protecteur pour l'homme ou l'animal contre les infections et les effets toxiques causés par une bactérie du genre Bordetella mais différente de celle de la préparation vaccinante. 2. Utilisation d'une préparation vaccinante élaborée a partir d'une adényl cyclase d'une bactérie donnée du genre Bordetella, pour la préparation d'un antigène protecteur pour l'homme ou l'animal contre les infections et les effets toxiques causes par une bactérie du genre Bordetella différente de celle dont provient l'adényl cyclase. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les bactéries du genre Bordetella sont choisies parmi B.pertussis, B. parapertussis, et B.bronchiseptica. 4.Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que la préparation vaccinante est élaborée a partir de B.bronchiseptica ou d'adényl cyclase de B.bronchiseptica et qu'elle est mise en oeuvre pour préparer un antigène protecteur contre les infections et les effets toxiques causés par B.pertussis ou B.parapertussis. 5. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que la préparation vaccinante est élaborée a partir de B.pertussis ou d'adényl cyclase de B.pertussis et qu'elle est mise en oeuvre pour préparer un antigène protecteur contre les infections et les effets toxiques causés par B.bronchiseptica ou B. parapertussis. 6. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que la préparation vaccinante est élaborée a partir de B.paraPertussis ou d'adenyl cyclase de B.parapertussis et qu'elle est mise en oeuvre pour préparer un antigène protecteur contre les infections et les effets toxiques causés par B.pertussis ou B.bronchiseptica. 7. Vaccins capables d'induire une protection contre les effets toxiques et les infections causées par les Bordetella, caractérisés en ce qu'il s'agit de vaccins molécu Lzires renfermant au moins la partie active de la séquence d'acides aminés représentée sur la figure, le cas échéant associée, dans le même inoculum ou non, à de la FHA et/ou de la PTx. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 a 6, caractérisée en ce que les préparations vaccinantes sont associées dans le même inoculum ou non avec de la FHA et/ou de la PTx.