FR 2650758 A1 19910215 FR 8910736 A 19890809 GRANULES A MULTICOUCHES CONTENANT DES SUBSTANCES ACTIVES ENROBEES, LEUR PROCEDE DE FABRICATION, DISPOSITIF POUR LA MISE EN OEUVRE DE CE PROCEDE, ET UTILISATION DES GRANULES OBTENUS. La présente invention porte sur des granules à multicouches contenant des substances actives enrobées, sur un procédé pour les fabriquer, sur un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé, et sur l'utilisation des granules obtenus. La présente invention permet l'inclusion de diverses molécules (métabolites, enzymes, anticorps, polymères, virus), de matière vivante (embryons végétaux, nematodes ou de cellules individualisées vivantes ou tuées (bactéries, champignons, cellules végétales ou animales) ou spécifiquement de graines naturel,les ou artificielles sous formes de granules à structure en multicouches. L'invention concerne un procédé d'encapsulation en multicouches, ainsi qu'un procédé d'enrobage de matière Inerte ou vivante assurant une protection complet de celle-ci. Le coeur des granules est constitué par une matière dure ou molle ou liquide, et il est entouré de deux enveloppes ou plus, d'épaisseurs allant par exemple de 0,1 à 6 millimètres selon la nature de la matière que l'on veut encapsuler. Ces granules trouvent leurs applications dans les domaines de l'agriculture (engrais microbiologiques, granules à propriétés phytostimulantes et phytoprotectrices, semences multienrobées, semences artificielles), de l'élevage (reconstitution de microflores, encapsulation d'hormones, àdjuvants des aliments du bétail). de la pharmacie (inclusions à fonctions polyvalentes enzymatiques et hormonales, inclusions d'antigènes et d'anticorps), de l' gro-alimentaire (protection temporaire de substances biodégradables), de la conservation d'éléments fragiles ne pouvant subir une congélation mais seulement une relative déshydratation ou, au contraire, sous forme granulaire en congélation. Dans les demandes de brevet français nc 77-10 254, 79-28 956, Si-04 474, Si24 403, g3-02 847, 86-08 842, ont été décrits divers procédés d'inclusion directe de microorganismes en vue de la constitution d'inoculums microbiens dans les polymères. Dans la demande de brevet français n 87-06 667, le déposant a revendiqué la conception et le procédé d'encapsulation double ou d'inclusion indirecte concernant la préparation 'inoculu..,s constitues de microorganismes enrobés dans une matrice nutritive elle-mêmie entourée d'une enveloppe et d'une pellicule sous la forme de granulés biodegables, Dans ce procédé 1, les microorganismes sont cultivés dans une matrice nourricière composée d'un extrait nutritif complet et enrobés å l-'aide d'un agent hydrorétenteur, 2) puis cette matrice est encapsulée dans une enveloppe poreuse contenant un autre agent hydrorétenteur, 3) laquelle enveloppe peut être finalement protégée par un pelliculage hydrophile. Cependant aucun de ces procédés n'envisage l'inclusion en multicouches caractérisée en ce qu'elle permet l'obtention d'une structure sphérique ou parasphérique dans laquelle (a) le centre ou coeur est constitué par une matière vivante ou inerte ou chimique (b) les couches enveloppant le noyau sont successives, de nature identique ou avantageusement différente ; (c) un agent filmogène isole finalement le produit (d) le produit final ainsi obtenu selon les étapes (a), (h) et (c) peut à nouveau subir une ou plusieurs encapsulations (ce qui augmente d'autant son volume). On ne pourrait pas encapsuler une semence dans un milieu de bactérisation ou de mycorhization par un procédé tels que décrit dans la demande de brevet français n 87-06 667. En effet, ceci supposerait une étape intermédiaire de séchage de la couche de milieu de bactérisaticn ou de mycorhization entourant la semence, une telle étape conduisant à une destruction d'au moins une partie des microorganismes. Le procédé selon la présente invention met à profit le fait que la matière centrale immobilisée peut être protégée par plusieurs couches de nature différente, et suffisamment protectrices ou adjuvantes ou synergiques pour que la cible soit atteinte plus aisément et plus efficacecent. Le procédé selon la présente invention permet aussi de conserver l'humidité du noyau, ce qui est souvent souhaité pour conserver ses propriétés. AInsI, dans le cas de la bactérisation des semences, on peut retenir 15 environ de l'humidité résiduelle de l'irculun bactérien ràce à l'enrobage pendant plusieurs semaines. La presente invention a donc d'abord pour objet des granules constitués chacun par un noyau enrobé, caractérises par ie fait que l'enrobage comprend deux couches, celle qui est la plus proche du noyau (première couche) ne fournissant pas par elle-même autour du noyau une couche unique, autonome et/ou capable de conserver ses propriétés, et celle située immédiatement après (seconde couche) étant une couche de protection. Conformément à un premier mode de réalisation, le noyau du granule est constitué par un élément dur et relativement lisse, et la première couche, par une matière non auto-porteuse et/ou sensible aux agents extérieurs. Dans ce cas, le noyau a, de préférence, une fore générale sphérique ou para sphérique ou bien possède un rapport 1/D voisin de i. En particulier, le noyau peut être constitué par une semence naturelle ou artificielle, de forme sphérique ou parasphérique, laquelle peut être une graine pré-enrobée. Toutefois, les graines peuvent présenter une forme nonsphérique ou non-parasphérique (graines de laitue), et comporter alors un pré-enrobage leur donnant une forme se rapprochant de la forme sphérique. Le noyau peut être aussi constitué par des embryons végétaux ou par des cals végétaux associés en un massif sphérique ou parasphérique. Conformément à un autre mode de réalisation, le noyau est constitue par une matière molle, semi-liquide ou liquide, par exemple une substance huileuse. Le noyau peut aussi être constitué par une substance polymérique Suivant un autre mode de réalisation, le noyau et/ou la première couche peuvent constituer une structure d'inclusion d'au moins une substance active, choisie notamment parmi les microorganismes - bactéries, comme les Rhizobsctéries, et champignons, comme les Mycorhizes -, les cellules vivantes ntvr origine animale ou végétale et les ensembles cellulaires constituant des organismes et des individues fonctionnels, et les nématodes entomophages et leurs larves, les métabolites, les enzvmes, les virus, les antigènes, les anticorps et les hormones. Dans le cas ou le noyau etycu la première couche constituent une structure d'inclusion d'au moins une substance active choisie parmi les microorganismes les cellules vivantes les ensembles cellulaires, les nématodes ou leurs larves, ladite substance active est avantageusement enrobée dans un agent constitué par au moins une substance nutritive, notamment par un extrait nutritif complet, d'origine végétale ou animale, et auquel est ajouté, le cas. échéant, un agent hydrorétenteur. Les microorganismes cellules ou ensembles cellulaires sot apportés dans le noyau de préférence sous la forme d'une suspension plus ou moins concentrée. La matrice nourriciere peut constituer un milieu de culture desdits misroorganismes ou autres avant la formation des granules. L'extrait nutritif complet peut etre un extrait d'origine végétale a base d'algues, lesquelles sont choisies notamment parni les especes Fucus, Laminarie et Ascophyllum. ledit extrait stérile étant amené à pH 7, par exemple par de l'oxyde de magnésium. Conformément à un autre mode de réalisation de la présente invention, le noyau est constitué par une structure d'inclusion d'au moins une substance active comprenant (a) un coeur consistant en une matrice enrobant la substance active, ladite matrice étant composée (1) d'au moins un agent d'enrobage dans lequel ladite substance active est enrobée ; et (2) d'au moins un agent hydrorétenteur ; et (b) une enveloppe protectrice poreuse entourant ledit coeur (a) et composée (1) d'au moins un agent filmogène susceptible de subir une dégradation biologique ; et (2) d'au moins un agent hydrorétenteur. Une telle structure d'inclusion est décrite dans la demande internationale PCT n 88-00239 du 11 oi 1988, dont le contenu est incorporé par référence à la présente description. L'agent hydrorétenteur qui peut entrer dans la composition des granules selon l'invention est notamment une argile, comme la bentonite, le kaolin, le talc, la vermiculite et la montmorillonite. Dans les granules selon l'invention, la seconde couche comprend ou est composée d'au moins un agent filmogène. Celui-ci est choisi notamment parmi les alginates, les polypectates, le chitosan, les carraghénanes et d'autres biopolymères. Dans le cas notamment où les granules selon l'invention constituent un inoculum ou une semence enrobée, à l'agent filmogène est associé au moins un agent hydrorétenteur, tel que défini ci-dessus, et, le cas échéant, au moins une substance phytostimulante et/ou au moins une substance phytosanitaire compatible avec les microorganismes, les cellules vivantes et les ensembles cellulaires présents dans le noyau et/ou la premiere couche. Les substances phytostlmulantes sont choisies notamment parmi les nitrates, les substances de croissance, les sels minéraux divers, etc. A titre d'exemple, on peut mentionner l'acide indol acétique et ses analogues, la Cytokinine, le phoséthyl d'aluminium (aluminium-tris-Oéthyl phosphonate). Les substances phytosanitaires sont choisies parmi les fongicides, les insecticides, les molluscicides, et les herbicides compatibles avec les microorganismes, cellules vivantes. ou ensembles cellulaires enrobés. Les granules selon l'invention peuvent en outre comporter une pellicule hydrophile protectrice entourant la seconde couche, et constitué notamment par une argile très hydrophile, ce la bentonite. Conformément a un autre mDde de réalisation de l'inventcn, les granules ont été encore soumis au moins une fois au double enrobage créant es première et seconde couches de nature analogue aux, ou différente des, première et seconde couches telles que définies ci-dessus. Les granules selon l'invention peuvent se présenter sous la forme d'éle.;ents parasphériques dont le diamètre moyen du noyau est compris entre environ 3 et 1C mn, et dont le diamètre moyen d'ensemble est compris entre environ 4 et i2 mn. Des exemples de granules selon l'invention sont les suivants - le noyau est constitue par une semence et la première couche par des microorganismes bénéfiques tels que bactéries et champignons - le noyau est constitué par une semence, et les deux couches d'enrobage sont constituées par des micro organismes bénéfiques, tels que des bactéries et champignons, différents d'une couche à l'autre - le noyau est constitué par une semence de légumineuses, telles que soja, pois et haricot, et la première couche est une couche de bactérlsatlon par les Rhizobium et/ou les Pseudomonas, ou tout autre genre et espéce de microorganismes bénéfiques - le noyau est constitué par une semence, et la première couche est une couche de mycorhization par le champignon mycorhizien Paxillus involutus - le noyau est constitué par une semence de tomate, et la première couche est constituée par un milieu contenant des larves du nématode entomophage Neoplectana carpocapsae - la substance active du noyau est Bradyrhizobium japonicum, et la première couche est constituée par un milieu renfermant Pseudononas fluorescens - tutida, les granules résultants constituant des inoculums permettant de stimuler la modulation des légumineuses et du soja en particulier. La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication de granules selon l'invention, cans lequel on utilise un agent filmogène capable de passer de l'état soluble à l'étant insoluble, caractérisé par le fait que (a) on prend une matière en grains ou une matière visqueuse capable de former des gouttelettes pour constituer le noyau des granules, ou bien on associe entre eux les composants du noyau pour constituer des grains ou une matière visqueuse apte à former des gouttelettes (b) on choisit une matière fluide pour constituer la première couche des granules, ou bien on associe entre eux les composants de la première couche, de façon à obtenir un premier système de consistance fluide, en y ajoutant, le cas échéant, un agent régulateur de viscosité ; (c) on choisit une matière fluide filmogène pour constituer la seconde couche des granules, ou bien on associe entre eux les composants de la seconde couche, de façon à obtenir un second système de consistance fluide, à caractère filmogène, en y ajoutant, le cas échéant, un agent régulateur de viscosité (d) on positionne l'un apres l'autre les grains ou on fait tomber des gouttelettes de la matière de noyau dans le canal centra' d'un dispositif d'injection ; on introduit ledit premier système dans ledit canal central en amont de sa bordure de sortie suivant un espace annulaire, de sorte que le grain ou la gouttelette, en tombant, soit enrobé par ledit premier système ; et cn introduit le second système dans un canal débouchant dans un espace annulaire entourant la sortie du canal central, de façon qu'on obtienne, au niveau de cette sortie, des gouttes de la matière de noyau entourée de la première et de la seconde couche d'enrobage (e) on fait tomber ces gouttes dans un milieu aqueux dans lequel l'agent filmogène de la seconde couche passe à l'état insoluble, de façon a obtenir, par suite du durcissement dudit agent filmogène, des granules dispersés cans ledit milieu (f) on recueille lesdits granules, et, le cas échéant, on les séche (g) si on le souhaite, on enrobe ces granules dans de la matière de pellicule. A l'étape (c) on utilise, comme agent filmogène, un alginate sous forme d'alginate de sodium dans de l'eau pure, et qu'à l'étape (e), on utilise, comme milieu aqueux de formation des granules, un bain de sel de calcium, comme le succinate ou le gluconate, de façon à réaliser le déplacement des ions Na+ par les ions Ca La présente invention a également pour objet un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé par le fait qu'il comporte un corps d'injecteur comprenant - un premier élément doté d'un alésage central - un second élément disposé autour du premier et délimitant un second alésage coaxial à l'alésage central, de diamétre égal ou légèrement supérieur à celui-ci, venant se situer dans son prolongement, lesdits premier et second éléments formant un premier passage annulaire débouchant entre l'alésage central et le second alésage ; - un troisième élément disposé autour-du second et délimitant un troisième alésage coaxial aux deux précédents, de diamètre légèrement supérieur au second alésage, venant se situer dans son prolongement, lesdits second et troisième éléments formant un second passage annulaire débouchant entre le second alésage et le troisième alésage - un canal d'amenée de la matière destinée à former la première couche traversant le troisieme élément et le second élément et débouchant dans le premier passage annulaire - un canal d'amenez de la matière destinée à former la seconde couche traversant le troisième élément et débouchant dans le second passage annulaire ledit dispositif comportant également des moyens pour introduire successivement des grains ou des gouttelettes de matière de noyau dans l'alésage central, et des moyens de réception des grains ou gouttelettes à double enrobage. Le dispositif selon l'invention comporte également des moyens pour faire parvenir sous pression les matières de premiere et de seconde couche dans les canaux d'amenée correspondants. La matière de noyau en grains ou gouttelettes tombe dans le canal central sous l'effet de la gravité, ou bien des moyens sont prévus pour contrôler la tombée des grains ou gouttelettes par pression positive pneumatique en amont du dispositif d'injection ou. par dépression en aval dudit dispositif. Les moyens pour introduire successivement les grains de matière de noyau dans l'alésage central peuvent être constitués par un dispositif pneumatique aspirant les grains un à un dans un réservoir de grains, en les positionnant à chaque fois dans l'entrée de l'alésage central du corps du dispositif d'injection. Les applications des granules obtenus selon i'invention sont les-suivantes - introduction dans les substrats et dans les sols, notamment pour régénérer ceux-ci, des granules contenant des bactéries et/ou des champignons bénéfiques pour les plantes - constitution d'engrais microbiologiques pour les plantes, obtention de granulés à- propriétés phvto stimulantes et phytoprotectrices - obtention de semences naturelles ou artificielles enrcbées par des bactéries (bactérisation) et/cu des champignons bénéfiques (fongisation), ou par des substances stimulant ou retardant la germination - encapsulation d'hormones, se virus, de bactéries ou de levures afin ce e introduire dans des milieux agrc alimenta ires ou tour reconstituer les microflores des appareils digestifs par Incorporation dans les aliments ou par ingestion directe en vue d'une vaccination intestinale, ou encore pour encapsuler des adjuvants pour l'alimentation animale - réalisation d'inclusions à fonctions polyvalentes enzymatiques et hormonales, d inclusions d'antigènes et d'anticorps, à inclusions constituées de produits non-miscibles ou chimiquement peu ou pas compatibles - réalisation de la protection temporaire de substances biodégradables, et de granules consommables à structure multiple dans le domaine de l'agro alimentaire. Pour mieux illustrer l'objet de la présente invention, on décrira ci-après, de façon plus détaillée, la préparation de granules selon l'invention, e référence au dessin annexé. Sur ce dessin - la Figure i est une vue en coupe, à échelle agrandie, d'un granule selon l'Invention - la Figure 2 est une vue schématique en coupe transverale d'un dispositif d'injection selon l'invention - les Figures 3A à 3C sont des vues schématiques illustrant le fonctionnement de l'appareillage de fabrication des granules dans son ensemble - la Figure 4 est une photographie (grossissement x 10) de semences et de granules selon l'Exemple 1. Le granule 1 représenté sur la Figure 1 se compose d'un noyau 2, par exemple une graine sensiblement sphérique, comportant un pré-enrobage classique 2a. Le diamètre d du noyau pré-enrobé est de l'ordre de 3-10 mm. Le noyau pré-enrobé est entouré par une couche 3 de milieu de bactérisation ou de mycorhization protégeant ia semence et permettant la croissance de la plante. La couche 3 est elle-meme entourée par une couche 4 de matière filmogene durcie et d'agent hydrorétenteur. Le dIamètre d'ensemble D est de l'ordre de 4 à 12 nm. La Figure 2 représente, en coupe, un dispositif d'injection 5 permettant de fabriquer des granules selon l'inventicn. Ce dispositif comporte un premier élément 6 comportant un alésage central 7. La paroi extérieure de l'élément 6 comporte deux décrochements successivement 8, 9 et se termine par une partie tronconique 10. Un second élément 11, de fore cylindrique se terminant suivant une fore tronconique, vient se placer autour du premier en venant en appui contre le décrochement 8. L'élement 11 délimite, à l'extrémité opposée, un alésage 12 venant se situer sensiblement dans le prdlonge- ment de l'alésage 7. L'élément 11 délimite avec l'élément 6 un passage 13 d'abord cylindrique, puis tronconique, débouchant entre les alésages 7 et 12, et il comporte, dans sa partie cylindrique, une gorge périphérique 14. Enfin, le dispositif d'injection 5 comprend un troisieme é élément 15 entourant le second et comportant un alésage 15 coaxial aux alésages 7 et 12, mais de diamètre légèrement supérieur à ceux-ci. I1 est également formé entre les éléments Il et 15 un passage 17, d'abord cylindrique, puis tronconique, débouchant entre les deux alésages 12 et 16. Le dispositif d'injection est complété par deux tubes latéraux 18 et 19, disposés dans le même plan de coupe, mais décalés en hauteur l'un par rapport à l'autre. Le tube 18, d'amenée de la matière de premiere couche 3, traverse les éléments 15 et 11 et débouche dans le passage 13, entre le décrochement 9 et la paroi tronconique 10. Le tube 19, d'amenée de la matière de seconde couche 4, traverse l'élément 15 et débouche dans le passage 17, au droit de la gorge 14 de l'élément 11. Pour rendre plus efficace l'enrobage du noyau, les matiéres arrivant par les tubes 18 et 19 peuvent suivre une trajectoire en spirale au niveau des passages respectivement 10 et 17. A. Aspiration du novau Le réservoir à noyaux 2C étant en position haute, une pompe à vide crée une forte dépression dans le bras 21 qui s'abaisse et un noyau est aspiré. B. Positionnement du novau et invention des matières de premier et de seconde couches Le réservoir à noyaux 20 redescend en position basse et le bras 21 vient positionner le noyau au centre de l'alésage central 7 du dispositif d'injection 5. Les matières de première et second couches sont injectées sous pression dans les tubes respectivement 18 et 19 du dispositif 5 à l'aide d'une double pompe avec motoréducteur et régulateur électronique, et elles se répartissent dans les passages respectivement 13 et 17 du dispositif injecteur 5. Dans chaque tube, la pression peut être régulée précisément et séparément en fonction de la viscosité des matériaux utilisés ainsi qu'en fonction du volume et de la forme des noyaux à encapsuler. C. Lâcher d noyau et ancapsulation Le réservoir à noyaux 20 est en position basse. La dépression qui mantient le noyau à l'extrémité du bras 21 est coupée automatiquement, et le noyau tombe dans l'alésage central 7 du dispositif. d'injection 5 et subit instantanément le double enrobage. Le noyau enrobé tombe ensuite dans le bain de réticulation 22 ou il séjournera un temps variable (une minute à 30 minutes) jusqu'à ce que l'enveloppe périphérique soit suffisament calcifiée pour former.une capsule souple et résistante. Le diamètre de l'alésage central 7 et du dispositif d'injection varie en fonction du volume et de la forme du noyau à encapsuler. Le degré de viscosité des matériaux augmente légèrement avec les dimensions du noyau Diamètre du Diamètre du canal noyan (mm) central (mm) 4,0 à 4,8 6 4,8 à 5,5 8 5,5 à 8,2 10 6,7 à 9,3 11 à 12 Le fonctionnement du dispositif d'injection qui vient d'être décrit sera exposé en référence avec les Figures 3A à 3C. Sur ces Figures, les chiffres de référence 20, 21 et 22 désignent respectivement - un réservoir à noyaux - um dispositif pneumatique de prélèvement et de positionnement des noyaux -un bac de réticulation. Exemple 1 Bactérisation des semences de sota tar le Bradyrhizobium japonicum. (1) La bacterie symbiotique Bradyrhizobium japonicum souche "G 49" est cultivée dans un milieu YEM à base d'extrait de levure et de mannitol Mannitol 10 g/l, Extrait de levure DIFCO 1 g/l, K2HPO4 0,5 g/l, MgSO4#7H2O 1 g/l, FeCl3 0,004 g/l, NaCl 0,2 g/l. On ajuste le pH à 6,8. La culture a lieu en agitation à 280C et à l'obscurité. Après 4 jours de culture environ, la phase stationnaire correspondant à 1.109 bactéries par millilitre est atteinte. (2) On augmente alors la viscosité du milieu bactérien en v mélangeant 9% de poudre d'algue stérile (poudre de Laminaria diaitata, référence ALGOVERT D, Société SOBALG), de façon à obtenir une viscosité d'environ 70 centipoises, mesurée au viscosimètre (viscosimètre TV CONTRAVES basé sur le principe de la mesure de vitesse de cisaillement par un couple rotatif). (3) Par ailleurs, un mélange homogène à base d'alginate de sodium (1,5%) et de kaolin (10%) est préparé de façon à obtenir une viscosité de 350 à 400 centipoises et constituera l'enveloppe de l'ensemble. (4) Grâce à une double pompe à rythme d'injection cyclique et réglable, les matières (2) et (3) sont respecti vement injectées dans les deux canaux du dispositif d'injection de la Figure 2. (5) Simultanément, un dispositif pneumatique, dont la source d'aspiration est fournie par un compresseur dépresseur, permet de positionner l'une après l'autre les graines au niveau de l'alésage central de diamètre 8 mm du dispositif d'injection (Figure 2). (6) Dans ce dernier, chaque graine de soja est enrobée par le milieu bactérien (2), puis par le milieu d'enveloppe (3). (7) La graine doublement enrobée sort par l'orifice inférieur du canal central du dispositif d'injection et tombe dans un bac de solution saturée de gluconate de calcium, ce qui conduit au durcissement de l'enveloppe. (8) 'Au.bout d'une minute environ, la graine encapsulée est sortie du bain et immédiatement séchée. A partir d'un milieu bactérien contenant 1.109 Bradvrhizobium iaDonicum par millilitre, la semence de soja encapsulée portera environ 1.108 bactéries (numération immédiate par la technique dtimmunofluorescence indirecte) avant séchage et environ 1.107 bactéries après un séchage d'une heure à 500C (cf. Tableau 1). Sur la Figure 4 du dessin annexé, est désignée par 23 une graine de soja et par 24 un granule obtenu selon cet Exemple. Deux de ces granules ont été coupés en deux pour laisser voir l'interieur. Exemple 2 Bactérisation des semences de soja, de pois et de betteraves par le Pseudomonas fluorescens. Les bactéries Pseudomonas fluotescens souche "L26-1" et "M3" sont cultivées dans un milieu succinate Acide succinique 4 g/l, K2HPO4 6 g/l, KH2PO4 3 g/l, (NH4)SO4 1 g/l, MgSO4#7H2O, 0,2 g/l. On ajuste le p à 7,. La culture a lieu en agitation à 26 C et à l'obscurité. Aprés 48 heures de culture environ, la phase stationnaire correspondant à 1.109 bactéries par millilitre est atteinte. Comme dans l'Exemple 1, on suit alors les étapes (2) à (8). On utilise des semences de soja et de pois nues. Les semences de betterave sont pré-enrobées. Alors que, pour les graines de soja et de betteraves enrobées, le diamètre du canal central du dispositif d'injection est de 8 mn, pour les graines de pois ridé, il est de 10 mn. A partir d'un milieu bactérien contenant 1.109 Pseudomonas fluorescens par millilitre, les semences de sojas, de pois et de betterave encapsulées porteront après chaque séchage environ 1.107 bactéries (numeration par la technique de dilution automatique à l'ensemenceur spirale sur milieu gélosé) ; cf. Tableau 1. Exemple 3 Bactérisation des semences de tomate par le Pseudomonas solanacearum avirulent. La souche 2515 de Pseudomonas solanacearum que l'on utilise est un mutant avirulent résistant à la kanamycine induit par le transposon TM 5 dérivée de la souche GMI 1229 (BOUCHER et al, Journal og Generall Microbiology, 131, 2449-2457 (1985)), qui provient elle-même d'un dérivé spontané résistant à la streptomycine et à la rifamycine de la souche sauvage GM 1000 (=GUY TO 3) isolée à partir de tomate à KOUROU, Guyane Française (DIGAT B., why and ho to distinguish Pseudomonas solanacearum strains, causal agent of the bacterial wilt of Solanaceous and Musaceous crops in the Caribbean zone. Proceedings of Caribbean Food Crops Society Vol VI: 86-91, i968). La culture est réalisée en agitation à 28CC et à l'obscurité dans un milieu LPG: Extrait de levure (Difco) 5 g/l Peptone pancréatique trypsique (Difco) 5 g/l, Glucose 10 g/l. On ajuste le pH à 7,0. Au bout de 48 heures environ, la phase stationnaire correspondant à 1.109 bactéries par millilitre est atteinte. Comme dans l'Exemple 1, on suit les étapes (2) à (8). On utilise les semences de tomate prè-enrobées. A partir d'un milieu bactérien contenant 1.109 cellules de Pseudononas solanacearun par millilitre, les semences de tomate encapsulées porteront environ 1.108 bactéries (numération par la technique de dilution automatique à l'ensemenceur spirale sur milieu gélosé) (cf. Tableau 1). TABLEAU 1 Bactérisation des semences par encapsulation Nombre * de bactérie présentes sur les semences avant et après séchage (1 h à 50 C). Type Type Concentration de milieu Avant Apres de semerce de battérie bactérien (bact/ml) Séchage Séchage Pseudomonas fluorescens M3 4,67 # 109 2.63 # 103 2,35 # 108 SOIA Pseudomonas fluorescens G26 2,43 # 109 2,82 # 108 2,47 # 108 Statertrizobuten jasoni@@sum G49 6,97 # 109 4,07 # 108 3,55 # 107 SOIA Pseumdomonas fluorescens M3 4,67 # 109 6,00 # 108 5,81 # 107 BATTERIE Pseudotinas fluorescens M3 1,40 # 109 1,11 # 108 5,03 # 107 (présenrobée) 2,43 # 109 2,04 # 108 1,17 # 107 TOMATE Pseudomonas solanateuam 2515 3,21 # 109 2,75 # 108 1,62 # 107 (pré-enrobéeI *La numérotation bactérienne est réalisée par la technique de dilution automatique à ensemenceur spirale sur milieu gélosé et par la technique sérologique d'immunofluorescence indirecte (pour le Bradyrhizobium) Les chiffres indiqués représentent la moyenne de trois répértitions. Exemple 4 Mycorhization des semences de betterave par le champignon mvcorhizien Paxillus Involutus. Une souche de champignon mycorhizien Paxillus involutus, isolée de bouleau (Betulus alba) sélectionnée pour ses effets stimulants sur la croissance des plantes, est cultivée dans un milieu nutritif "MMM" (MARX 1969). La culture est réalisée en agitatioh (100 t/minute). Au bout de 21 jours de culture à 200C, la suspension mycélienne est broyée durant 10 secondes au mélangeur "Waring Blender". On- augmente alors la viscosité du milieu mycorhizien en y mélangeant 7,5% de poudre d'algue stérile (poudre de Laminaria digitata, référence "Algovert" Societe SOBALS) de façon à obtenir une viscosité d'environ 65 centipoises (mesurée au viscosimètre TV CONTRAVERS) Comme dans -l'Exemple 1, on suit les étapes (3) à (8). Les semences de betterave utilisées ont été préalablement enrobées. Le diamètre du canal central du dispositif d'injection est de 8 mn. Exemple 5 Encapsulation des semences de tomate par des larves du nématode entomophaqe Necaplectana carpooapsae (= Steinernema feltiae). Lors de la germination des semences, certaines radicules peuvent être attaquées par des larves d'insectes lépidoptères présentes dans le sol. L'une des possibilités de les combattre consiste à encapsuler les semences avec des nématodes entomophages de façon à mettre au point une méthode de lutte biologique. Avant d'être encapsulées, les semences de tomate (Lycopersicon esculentum) sont enrobées selon un procédé classique. Des larves du nématode entomophage Necaplectana carpocapsae sont obtenues à partir des larves de Galleria mellonella. Elles sont récoltées et lavées durant 10 minutes dans un bain de Merseptyl (ethyl-mercuri-thiosalicylate de sodium à 1#) et rincées dans le liquide stérile de RINGER. La concentration de la suspension est d'environ 5 000 nématodes par millilitre. On augmente alors la viscosité de la suspens ion en y ajoutant 9% de poudre d'algue stérile (poudre de Laminaria digitata, référence "Algovert", Société SOBALG), de façon à obtenir une viscosité d'environ 70 centipoises (mesurée au viscosimétre TV CONTRAVERS). Comme dans l'Exemple 1, on suit alors les étapes (3) à (85. Le diamétre du canal central de l'injecteur est de 8 mm. La survie des nématodes est érifiee apres une conservation de 48 heures à - 4cC par dissection des semences encapsulées et observation G la température du laboratoire à la loupe stéréoscopique A partir d'une suspension contenant 5.103 larves de Naoaplectane carpocapsse par millilitre, la semencede tomate portera environ 5 # 10 nématodes. Exemple 6 Obtention de granulés à multicouches contenant deux espèces bactériennes différentes utilisables pour stimuler la nodulation du soi a. La bactérie symbiotique Bradvrhizobium japonicum souche "G 49" provoque chez le soja l'apparition de nodosites racinaires qui permettent la fixation de l'azote et l'air. La demande de brevet canadien n 227 336 décrit la stimulation de cette nodulation causée par certaines souches bacteriennes du groupe Pseudomonas fluorescens-putida I1 semble donc intéressant d'obtenir des structures granulaires associant en multicouches séparées ces deux types de bactéries, afin de bactériser les sols aptes à la culture du soja. - D'une part, on forme d'abord un granule de Bradvrhizobium iaponicum d'un diamètre de 6 millimètres contenant environ 108 bactéries selon le procédé déjà décrit par la demanderesse dans la demande de brevet français n 87 06 667. - D'autre part, cn obtient un milieu d'une viscosité de 70 centipoises contenant la bactérie Pseudomonas fluorescens souche "1 3", à raison de 109 cellules bactériennes par millilitre en suivant les Etapes (1) et (2j de l'Exemple 1. - Puis, comme à l'Exemple 1, on suit les Etapes (3) et (4) Les granules bactériens contenant le Bradyrhizobium japonicum sont positionnés l'un après l'autre au niveau du canal central de diamètre 10 mm. - Dans l'injecteur, chaque granule de Bradvrhizobium est enrobé par le mIlieu bactérien à Pseudomonas puis par l'enveloppe - Puis comme à l'Exemple 1, on suit les étapes (7) et (8). A partir d'un milieu bactérien contenant 1.109 Pseudomonas par millilitre, le granule de Bradyrhizobium portera environ 1 # =18 Pseudomonas. Les granules obtenus pourront être enfouis dans le sol au moment du semis de soja. REVENDICATIONS 1 - Granules constitués chacun par un noyau (2) enrobé, caractérisés par le fait que l'enrobage comprend deux couches (3, 4), celle (3) qui est la plus proche du noyau (2) (première couche) ne fournissant pas par elle-même autour du noyau (2) une couche unique, autonome et/ou capable de conserver ses propriétés, et celle (4) située immédiatement après (seconde couche) étant une couche de protection. 2 - Granules selon la revendication 1, caractérisés par le fait que le noyau (2) est constitué par un élément dur et relativement lisse, et la première couche (3), par une matière non auto-porteuse et/ou sensible aux agents extérieurs. 3 - Granules selon la revendication 2, caractérisés par le fait que le noyau (2) est de forme générale sphérique ou parasphérique ou ayant un rapport 1/D voisin de 1. 4 - Granules selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisés par le fait que le noyau (2) est constitué par une semence naturelle ou artificielle. 5 - Granules selon la revendication .4, caractérisés par le fait que la semence est une graine pré-enrobée. 6-- Granules selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisés par le fait que la semence présente une forme non-spherique ou non-parasphérique et comporte un préenrobage lui donnant une forme se rapprochant de la forme sphérique. 7 - Granulés selon la revendication 1, caractérisés par le fait que le noyau (2) est constitué par des embryons végétaux ou par des cals végétaux associés en un massif sphérique ou parasphérique. 8 - Granules selon la revendication I, caractérisés par le fait que le noyau (2) est constitué par une matière molle, semi-liquide ou liquide. 9 - Granules selon la revendication 8, caractérisés par le fait que le noyau (2) est constitué par une substance huileuse. 10 - Granules selon la revendication 1, caractérisés par le fait que le noyau (2) est constitué par une substance polymérique. 11 - Granules selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisés par le fait que le noyau (2) et/ou la premiere-couche (3) constituent une structure d'inclusion d'au moins une substance active, choisie notamment parmi les microorganismes, - bactéries, comme les Rhizobactéries, et champignons, comme les Mycorhizes -, les cellules vivantes d'origine animale ou végétale, les ensembles cellulaires constituant des organismes et des individus fonctionnels, les nématodes entomophages et leurs larves, les métabolites, les enzymes, ies virus, les antigènes, les anticorps et les hormones. 12 - Granules selon la revendication 11, caractérisés par le fait que le noyau (2) et/ou la première couche (3J constituent une structure d'inclusion d'au moins une substance active choisie parmi les microorganismes bactéries, comme les Rhizobactéries, et champignons, comme les Mycorhizes -, les cellules vivantes d'origine animale ou végétale et les ensembles cellulaires constituant des organismes et des individus fonctionnels, et les nématodes entomophages et leurs larves, ladite substance active étant enrobée dans un agent constitué par au moins une substance nutritive, notamment par un extrait nutritif complet, d'origine végétale ou animale, et auquel est ajoute, le cas echéant, un agent hydrorétenteur. 13 - Granules selon la revendication 1, caractérisés par le fait que le noyau (2) est constitué par une structure d'inclusion d'au moins une substance active comprenant (a) un coeur consistant en une matrice enrobant la substance active, ladite matrice étant composée (1) d'au moins un agent d'enrobage dans lequel ladite substance active est enrobée ; et (2) d'au moins un agent hydrorétenteur ; et (b) une enveloppe protectrice- poreuse entourant ledit coeur (a) et composée (1) d'au moins un agent filmogène susceptible de subir une dégradation biologique ; et (2) d'au moins un agent hydrorétenteur. 14 - Granules selon l'une des revendications 12 et 13, caractérisés par le fait que l'agent hydrorétenteur est une argile, comme la béntonite, le kaolin, le talc, la vermiculite et la montmorillonite. 15 -- Granules selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisés par le fait que la seconde couche (4) comprend ou est composée d'au moins un agent filmogène. 16 - Granules selon la revendication 15, caractérisés par le fait que l'agent filmogène est choisi parmi les alginates, les polypectates, le chltosan, les oarraghénanes et d'autres biopolymeres. 17 - Granules selon la revendication 16, constituant notamment un insculum ou une semence enrobée, caractérisés par le fait qu'à l'agent filmogène est associé au moins un agent hydrorétenteur, choisi entre autres parmi les argiles comme la bentonite, le kaolin, le talc, la verniculite et la montmorillonite, et, le cas échéant, au moins une substance phytostlmulante et/ou au moins une substance phytosanitaire compatible avec les microorganismes, les cellules vivantes et les ensembles cellulaires présents dans le noyau et/ou la première couche. 18 - Granules selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisés par le fait qu'ils comportent en outre une pellicule hydrophile protectrice entourant la seconde couche, et constituée notamment par une argile très hydrophile, comme la bentonite. 19 - Granules selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisés par le fait qu'ils ont été encore soumis au moins une fois au double enrobage créant des première et seconde couches de nature analogue aux, ou différente des, première et seconde couches (3 et 4) telles que définies à la revendication 1. 20 - Granules selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisés par le fait qu'ils se présentent sous la forme d'éléments parasphériques dont le diamètre moyen du noyau est compris entre environ 3 et 10 mm, et dont le diamètre moyen d'ensemble est compris entre environ 4 et 12 mm. 21 - Granules selon la revendication 6, caractérisés par le fait que le noyau (2) est constitué par une semence, et la première couche (3) par des mioroorganismes bénéfiques tels que bactéries et champignons. 22 - Granules selon la revendication 6, caractérisés par le fait que le noyau (2) est constitué par une semence, et les deux couches d'enrobage (3 et 4) sont constituées par des mlcroorganismes bénéfiques, tels que des bactéries et champignons, différents d'une couche à l'autre. 23 - Granules selon la revendication 6, caractérisés par le fait que le noyau (2) est constitué par une semence de légumineuses, telles que soja, pois et.haricot, et la première couche (3r est une couche de bactérisation par les Rhizobium et/ou les Pseudomonas, ou tout autre genre et espèce de microorganismes bénefiques. 24 - Granules selon la revendication 6, caractérisés par le fait que le noyau (2) est constitué par une semence, et la première couche est une couche de myoorhization par le champignon nycorhizien Paxillus involutus. 25 - Granules selon la revendication 6, caractérisés par le fait que le noyau (2) est constitué par une semence de tomate, et la première couche (3) est constituée par un milieu contenant des larves du nématode entomophage Neotlectana carpocapsae. 26 - Granules selon la revendication 13, caractérisés par le fait que la substance active du noyau (2) est Bradvrhlzobium japonicum et que la première couche (3) est constituée par un milieu renfermant Pseudomonas fluorescens Dutida, les granules résultants constituant des inoculums permettant de stimuler la nodulation des légumineùses et du soja en particulier. 27 - Procédé de préparation des granules tels que définis à l'une des revendications 1 à 26, dans lequel on utilise un agent filmogène capable de passer de l'état soluble à l'état insoluble, caractérisé par le fait que (a) on prend une matière en grains ou une matière visqueuse capable de former des gouttelettes pour constituer le noyau (2 > des granules (1), ou bien on associe entre eux les composants du noyau pour constituer des grains ou une matiére visqueuse apte à former des goutte lettes (b) on choisit une matière fluide pour constituer la première couche (4 > des granules (1) ou bien on associe entre eux les composantes de la première couche, de façon à obtenir un premier système de consistance fluide, en y ajoutant, le cas échéant, un agent régulateur de viscosité (c) on choisit une matière fluide filmogène pour constituer la seconde couche (4) des granules (1), ou bien on associe entre eux les composants de la seconde couche, de façon à obtenir un second système de consistance fluide, à caractère filmogène, en y ajoutant, le cas échéant, un agent régulateur de viscosité (d) on positionne l'un après l'autre les grains ou on fait tomber des gouttelettes de la matière de noyau dans le canal central d'un dispositif d'injection (5) ; on introduit ledit premier système dans ledit canal central en amont de sa bordure de sortie suivant un espace annulaire, de sorte que le grain ou la goutte lette, en tombant, soit enrobé par ledit premier système ; et on introduit le second système dans un canal débouchant dans un espace annulaire entourant la sortie du canal central, de façon qu'on obtienne, au niveau de cette sortie, des gouttes de la matière de noyau entourée de la première et de la seconde couche d'enrobage (e) on fait tomber ces gouttes dans un milieu aqueux dans lequel l'agent filmogène de la seconde couche passe à l'état insoluble, de façon à obtenir par suite du durcissement dudit agent filmogène, des granules dispersés dans ledit milieu (f) on recueille lesdits granules (1), et, le cas écheant, on les seche ; (g) si cn le souhaite, on enrobe ces granules (1) dans de la matière de pellicule. 28 - Procédé selon la revendication 27, caractérisé par le fait qu'à l'étape (c), on utilise, comme agent filmogène, un alginate sous forme d'alginate de sodium dans de l'eau pure, et qu'à l'étape (e), on utilise, comme milieu aqueux de formation des granules, un bain de sèl de calcium, comme le succinate ou le gluconate, de façon à réaliser le déplacement des ions Na par les ions caf 29 - Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé tel que-défini à l'une des revendications 27 et 28, caractérisé par le fait qu'il comporte un corps d'injecteur comprenant - un premier élément (6) doté d'un alésage central (7) ;; - un second élément (11) disposé autour du premier (16) et délimitant un second alésage (12) coaxial à l'alésage central (7), de diamètre égal ou légèrement supérieur à celui-ci, venant se situer dans son prolongement, lesdits premier et second éléments (6 et 11) formant un premier passage annulaire (10) débouchant entre l'alésage central (7) et le second alésage (12) - un troisième élément (15) disposé autour du second (11) et délimitant un troisième alésage (16) coaxial aux deux précédents (7 et 12v, de diamètre légèrement supérieur au second alésage (12), venant se situer dans son prolongement, lesdits second et troisième éléments (11 et 15) formant un second passage annulaire (17 > débouchant entre le second alésage (12) et le troisième alésage (16) - un canal (18) d'amenée de la matière destinée à former la première couche (3), traversant le troisième élé ment (15! et le second élément (11) et débouchant dans le premier passage annulaire (10) - un canal (19) d'amenée de la matière destinée à former la seconde couche (4), traversant le troisième élé- ment (15 > et débouchant dans le second passage annulaire (17) ledit dispositif comportant également des moyens (21j pour introduire successivement des grains ou des goutteletter de matière de noyau dans l'alésage central, et des moyens i22j de réception des grains ou gouttelettes à double enrobage. 30- - Dispositif selon la revendication 27, caractérisé par le fait qu'il comporte des moyens pour faire parvenir sous pression les matières de premiere et de seconde couche dans les canaux d'amenée correspondants (18 et 19). 31 - Dispositif selon l'une des revendications 27 et 28, caractérisé par le fait que la matière de noyau en grains ou gouttelettes tombe dans le canal central sous l'effet de la gravité, ou bien des moyens sont prévus pour contrôler la tombée des grains ou gouttelettes par pression positive pneumatique en amont du dispositif d'injection (5) ou par dépression en aval dudit dispositif (5). 32 - Dispositif selon l'une des revendications 27 à 29, caractérisé par le fait que les moyens pour introduire successivement les grains de matière de noyau dans le canal central sont constitués par un dispositif pneumatique aspirant les grains un à un dans un réservoir de grains, en les positionnant à chaque fois dans l'entrée de l'alésage central du corps du dispositif d'injection (5). 33 - Utilisation des granules tels que définis a la revendication 1, pour introduire dans les substrats et dans les sols, notamment pour régénérer ceux-ci, des granules contenant des bactéries et/ou des champignons bénéfiques pour les plantes, pour constituer des engrais microbiologiques pour les plantes, pour obtenir des semences naturelles ou artificielles enrobées par des bactéries (bactérisation) et/ou des champignons bénéfiques (fongisation; , ou par des substances stimulant ou retardant la germination. 34 - Utilisation des granules tels que définis à la revendication 1, pour l'encapsulation d'hormones, de virus, de bactéries ou de levures, afin de les introduire dans des milieux agro-alimentaires ou pour reconstituer les microflores des appareils digestifs par incorporation dans les aliments ou par ingestion directe en vue d'une vaccination intestinale, ou encore pour encapsuler des adjuvants pour l'alimentation animale. 35 - Utilisation des granules tels que définis à la revendication 1, pour réaliser des inclusions à fonctions polyvalentes enzymatiques et hormonales, des inclusions d'antigènes et d'anticorps, des inclusions constituées de produits non-miscibles ou chimiquement peu ou pas compatibles. 36 - Utilisation des granules tels que définis à la revendication I, pour réaliser la protection temporaire de substances biodégradables, et des granules consommables à structure multiple dans le domaine de l'agro-alímentaire.