FR 2642174 A1 19900727 FR 8900660 A 19890120 PARTICULES SUBMICRONIQUES, UTILISATION DANS LE DOMAINE DES REACTIONS IMMUOLOGIQUES DU TYPE ANTIGENE/ANTICORPS DOMAINE DE L'INVENIION La présente invention concerne en tant que produits industriels nouveaux des particules submicroniques revêtues par un antigène ou un anticorps. Ces particules sont "invisibles" ou "transparentes" quand elles sont exposées à un rayonnement électromagnétique, tel que la lumière visible et les UV, et deviennent "visibles" par agglutination quand elles sont exposées audit rayonnement après mise en contact avec un anticorps ou respectivement un antigène. La présente invention concerne également l'utilisation de ces particules dans les dosages immunologiques mettant en oeuvre des réactions du type antigène/anticorps. ART ANTERIEUR les techniques imnunologiques ont pris une place importante au sein de l'analyse biomédicale On les emploie aujourd'hui pour quantifier ou doser de nombreuses substances parmi lesquelles on peut notamment citer les protéines, les haptènes, les hormones, les médicaments et les anticorps. Leur principe repose sur la fixation chimique d'un anticorps (ou d'un antigène) sur un support particulaire. Le complexe support particulaire/anticorps ou antigène constitue un réactif; ce réactif, mis en présence de l'antigène (ou de l'anticorps) correspondant agglutine rapidement. Cette agglutination s 'accompagne d'une importante augmentation de l'absorbance du milieu, en fonction de la taille des particules. La particule constitue donc un élément amplificateur passif de l'agglutination se traduisant par une augmentation nette de l'absorbance. Parmi les techniques connues, trois groupes de méthodes se sont imposés en immunoanalyse. le premier groupe comprend les méthodes de turbidimétrie et de néphélométrie. I1 s'agit de méthodes de mise en oeuvre rapide, mais peu sensibles et uniquement utilisables pour les fortes concentrations protéiques surtout pour la turbidimétrie qui implique des concentrations protéiques supérieures à 100 g/ml. La néphélométrie est plus sensible (domaine d'utilisation de l'ordre de 20pug/ml), mais requiert un matériel très "spécialisé" et un traitement préalable des échantillons qui restreignent fortement les possibilités d'utilisation. Le second groupe comprend les méthodes dites de LAURELL et de MANCINI. I1 s'agit de méthodes simples, mais de réalisation lente et non automatisable. Elles s'appliquent à des concentrations protéiques supérieures à 20y1g/ml pour la méthode de M CINQ et à 5olg/ml pour la méthode de LAURELL. Les temps d'analyse sont de plusieurs heures et souvent de plus de 24 heures. Le troisième groupe comprend les méthodes dites à marquage, notamment les méthodes immunoenzymologiques (EIA) et radioimmunologiques (RIA). leur mise en oeuvre nécessite un appareillage coûteux ; les dosages comportent plusieurs étapes réactionnelles séparées par des lavages ; leur automatisation reste complexe et les temps d'analyse difficilement inférieurs à deux heures. Ces méthodes, par contre, permettent des sensibilités inférieures à 1 ng/ml et s'appliquent à toute substance biologique présente à des concentrations se situant avantageusement dans la gamne de 10 ng/ml à 1 mgíml. Cette situation justifie et explique les efforts de recherche entrepris aujourd'hui pour le développement de nouvelles méthodes d'immunodosage palliant les inconvénients précités en vue d'améliorer les conditions d'utilisation des techniques des deux premiers groupes lorsque la grande sensibilité des méthodes ElA et RIA n'est pas absolument nécessaire. On sait en particulier que des auteurs se sont attachés depuis 1970 à affiner le mode de détection des réactions immunologiques de type antigène/anticorps des deux premiers groupes précités. Ainsi a été envisagée l'utilisation de microparticules de latex revêtues d'un antigène ou d'un anticorps pour la mise au point de dosages quantitatifs par turbidimétne, par néphélométrie et par comptage de particules. Dans le domaine de la turbidimétrie (par mesure de l'absorbance de la lumière) on cornait des articles de A.M. BEERARD, A. VYSKOCLL et R.R. LAUWERYS, Clin. Chem., 27 (No 6), pages 832-837, (1981) et de A.M. BERNARD et R.R. LAUWERYS, Clin. Chim. Acta, 119, pages 335-339, (1982), l'utilisation de particules submicroniques de latex (diamètre moyen : 0,79 micromètre) revetues d'anticorps anti-ss2 anti-2nicroglobuline pour le dosage de p2-n1croglobuline par mesure de l'absorbance à 360 nm; de l'article de Y. MAYNARD et al., Clin. Chem., 32 (No 5), pages 752-757, (1986), l'utilisation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-IgG pour le dosage, dans des microcuvettes, dtimmunoglobulines sériques. Dans le domaine de la néphélométrie (par mesure de la diffusion de la lumière) on cornait de l'article de J. GRANGE et al. , Journal of Immunological Methods, 18, pages 365-375, (1977) l'utilisation de billes de latex submicroniques (diamètre moyen 0,3 micromètre) revetue d'un anticorps, anti-IgG de lapin, pour le dosage d'IgG de lapin. Les billes de latex sont constituées par du polystyrène carboxylé contenant les groupes COOR pour fixer le ligand, dans le cas d'espèce l'anticorps anti-IgG de lapin. Dans le domaine du comptage des particules, on connais l'utilisation de particules de polystyrène submicroniques (diamètre moyen : 0,8 micromètre) revêtues d'IgG humaine pour apprécier l'agglutination en présence d'un moyen agglutinant, tel que le Facteur rhumatode, de l'article de C.L. CAMBIASO et P.L. MASSON "automated determination of circulating immune complexes by particules countering imrmnoassay (PACIA)", Protides and Biological Fluids, 1-4, (1979); les deux articles précités de A.M. BEZNARD et al.; et, l'exposé de J.C. MARESCHAL intitulé "Une nouvelle génération de dosages urmunologiques, non-isotopiques par comptage de particules de latex" présenté au cours des XXXbmes journées nationales de l'APDILA tenues à Paris les 16 et 17 novembre 1985, qui rappelle les difficultés rencontrées au cours des mesures inpliquant l'agglutination des latex, telles que la difficulté de quantifier la réaction d'agglutination, la fréquence élevée d'agglutination non spécifique et le manque de sensibilité. En bref, les méthodes turbidimétriques, néphélométriques et de comptage de particules sont limitées par plusieurs inconvénients à savoir - difficultés à réaliser des suspensions stables et standardi sées, - autoagglutination spontanée des latex sensibilisés par un anti corps ou un antigène, - faible plage de mesure de la courbe d'étalonnage (variation de la densité optique (DO) n'excédant pas 0.3 à 0.4), - manque de sensibilité et de reproductibilité, - traitement du réactif particulaire avant emploi, dans certains cas (pour désaggrégation), et mauvaise stabilité du réactif, - mise en oeuvre délicate et détection parfois complexe. Ces inconvénients ont fait que ces méthodes n'ont pas été exploitées malgré leur intérêt pratique. On connait enfin de l'article de J. WINKLES et al., "Enhanced-Latex-Agglutination Assay for C-Reactive Protein in Serum, with Use of a Centrifugai Analyzer", Clin. Chem., 33 (No 5), pages 685-689, (1987), l'utilisation de particules sphériques subnicroniques de latex de polystyrene (diamètre moyen : 0,057 micromètre) sur lesquelles a été absorbé un anticorps, dans le cas d' espèce un anticorps anti-Protéine C réactive, pour apprécier par comptage de particules (de préférence), turbidimétrie ou néphélométrie l'agglutination résultant de la mise en contact du complexe sphères de latex/anti Protéine C réactive avec la Protéine C réactive (en abrégé : CRP). La technique décrite par J. WINKLES et al. implique un traitement par ultrasons (en anglais : "sonication") jugé essentiel pour l'adsorption de l'anticorps anti-CRP sur les sphères de latex. Ce traitement par ultrasons exige l'utilisation d'un matériel onéreux (à savoir le générateur d'ultrasons et son enceinte) et la mise en oeuvre de modalités opératoires compliquées perturbant ou limitant les possibilités de reproduction de ladite technique. Voir à cet effet les indications données dans ledit article page 686, colonne de gauche, lignes 37-58, et, page 688, colonne de droite, lignes 54-62. En bref, la technique de J. WINKLES et al., pour les dosages ininunologiques du type antigène/anticorps exige des traitements et conservations à une température se situant entre -20 et + 49C et la mise en oeuvre d'un champ d'ultrasons pendant une durée de 60 s; si cette durée est supérieure à 60 s, elle entraîne une surchauffe détruisant le complexe sphères de latex/anticorps, et si le traitement par ultrasons est incomplet, la sensibilité du dosage avec le complexe sphères de latex/anticorps résultant diminue considérablement et on est conduit à des résultats de dosage aberrants. BUT DE L'INVENTION I1 existe un besoin d'une technique de dosage immunologique relativement simple, différente des techniques ElA et RIA, permettant de pallier les inconvénients précités de l'art antérieur, assurant une détermination rapide facilement automatisable et accessible à tout laboratoire d'analyse ou de recherche avec un vaste champ d'application, et permettant d'atteindre un seuil de sensibilité d'au moins 100 ng/ml. OBJET DE L'INVENTIoN Selon 1 t invention on préconise une nouvelle solution technique pour les dosages immunologiques du type antigène/anti- corps par agglutination de particules de latex revêtues d'un antigène (ou d'un anticorps) lorsque lesdites particules sont mises en contact avec l'anticorps (ou respectivement l'antigène) correspondant. Cette nouvelle solution technique repose sur l'utilisation de particules de latex submicroniques (ctest- -dire ayant des dimensions ou diamètres moyens inférieurs à 1 micromètre), sensiblement sphériques, revêtues d'une substance immunologique choisie parmi les antigènes et respectivement les anticorps, et telles que (a) le diamètre moyen (d) desdites particules est inférieur à 200 nm et est avantageusement situé dans la gamne allant de 5 à 100 nm, (b) le latex desdites particules comporte une fonctionnalité réactive assurant la fixation par covalence de ladite substance immunologique, (c) lesdites particules revêtues de ladite substance inmunologique en suspension dans un milieu liquide aqueux étant "invisibles" ou "transparentes" quand elles sont exposées à un rayonnement ayant une longueur d'onde (A) nettement supérieure au diamètre moyen (d) desdites particules, et (d) lesdites particules revêtues de ladite substance immunologique en suspension dans un milieu liquide aqueux devenant "visibles" par agglutination quand elles sont exposées audit rayonnement après mise en contact avec une substance choisie parmi les anticorps et respectivement les antigènes correspondant à ladite substance imrmnologique fixée sur lesdites particules. En d'autres termes, on préconise suivant un premier aspect de 1'invention des particules de latex submicroniques, revêtues d'une substance ismunologique choisie parmi les antigènes et respectivement les anticorps, lesdites particules, qui sont utiles dans les dosages ittinunologiques du type antigène/anticorps, étant caractérisées~en ce que (a) leur diamètre moyen (d) est inférieur à 200 nm, (b) le latex desdites particules comporte une fonctionnalité réactive assurant la fixation par covalence - de ladite substance iwrmnologique, (c) lesdites particules revêtues de ladite substance inarmnologique en suspension dans un milieu liquide aqueux étant invisibles quand elles sont exposées à un rayonnement ayant une longueur d'onde ( > ) supérieure au diamètre moyen (d) desdites particules, et (d) lesdites particules revêtues de ladite substance imunologique en suspension dans ledit milieu liquide aqueux devenant "visibles" par agglutination quand elles sont exposées audit rayonnement après mise en contact avec une substance choisie parmi les anticorps et respectivement les antigènes et qui correspond à ladite substance inzunologique fixée sur lesdites particules. Selon un autre aspect de l'invention on préconise l'utilisation desdites particules revêtues par et liées par covalence à- un antigène ou un anticorps dans le domaine des dosages immunologiques. les procédés de dosage suivant l'invention comprennent - la détermination directe d'un anticorps par agglutination après mise en contact dudit anticorps avec un réactif constitué par des particules de latex liées chacune par covalence à un antigène; - la détermination directe d'un antigène par agglutination après mise en contact dudit antigène avec un réactif constitué par des particules de latex liées chacune par covalence à un anticorps; et, - l'inhibition de l'agglutination du réactif latex/antigène en présence de l'anticorps correspondant et dosage indirect de l'antigène libre (notamnent par compétition) ou vice-versa. Ces procédés de dosage sont insensibles à la température et peuvent être mis en oeuvre à une température de 4 à 600C, et notamnent à une température usuelle dans le domaine immunologique située dans la ganme de 15 à 370C. La nouvelle solution technique suivant l'invention, qui repose notamment sur le changement invisibilité/visibilité des particules par agglutination se distingue de l'enseignement des solutions techniques de l'art antérieur sus-visé. Elle se différencie en particulier de la solution technique de l'article de J. GRANGE et al. précité, qui prévoit l'utilisation de particules de latex présentant une fonctionnalité réactive avec les antigènes ou anticorps (dans le cas d'espèce un latex de polystyrène carboxylé c'est-à-4ire comportant des groupes COOH) pour la fixation par covalence de la substance inmunologique, en ce sens que ledit article ne décrit ni ne suggère l'utilisation de particules ayant un diamètre moyen inférieur à 200 mi. Elle se différencie également de la solution technique de 1'article de J. Sl2{KLES et al. précité, qui prévoit l'utilisation de particules de latex ayant un diamètre moyen de 57 in, en ce sens que, suivant l'invention, on supprime le traitement aux ultrasons particulièrement compliqué et opère à des températures plus pratiques (notamment 15-370C) que celles recomnandées (-20 à + 40C) par ledit article. Elle se différencie en outre par le fait que le réactif iuunologique est stable pendant de longues périodes (notamment supérieure à I an) et peut être utilisé directement sans traitement préalable quelle qu'en soit la nature. DESCRIPTION DEAm DE Dw L'INVENrI6N Suivant l'invention par les expressions "particules invisibles" et "particules visibles" on entend le fait que, d'une part, les particules dites invisibles ou transparentes n'absorbent ni ne diffusent le rayonnement électromagnétique, tel que la lumière, traversant le milieu contenant lesdites particules sans déviation substantielle dudit rayonnement, et d'autre part, les particules dites visibles absorbent et/ou diffusent ledit rayonnement électromagnétique. Par le terme "ligand" on entend ici l'antigène ou l'anticorps lié par covalence à chaque particule de latex. Par 1 expression "réactif immunologiquefl on entend l'ensemble constitué par les particules de latex et la substance imsunologique choisie parmi les anticorps et respectivement les antigenes qui est liée par covalence à chacune desdites particules. Par les termes "substance ou composé correspondant (homologue, complémentaire et/ou conjugué) d'un anticorps ou d'un antigène), on entend l'antigène, ou respectivement l'anticorps, qui réagit avec 11.anticorps, ou respectivement l'antigène, du réactif imnunologique. Le terme "antigène" désigne ici tout antigène proprement dit mais également toute substance à partir de laquelle on est susceptible de générer un anticorps; parmi les substances pouvant générer des anticorps on peut notamment citer les haptènes, les peptides, les médicaments comportant au moins un fragment peptidique, et, les alcaloides. Comne indiqué ci-dessus, il est essentiel que les particules de latex utiles selon l'invention aient un diamètre moyen (d) inférieur à 200 nm, de préférence inférieur ou égal à 100 nm, et mieux situé dans la gamme allant de 5 à 100 nm. le rayonnement électromagnétique utilisé selon l'invention pour apprécier la variation de l'agglutination lors de la réaction du réactif ininunologique avec son conjugué doit alors avoir une longueur d'onde ) nettement supérieure au diamètre moyen (d) des particules de latex. De façon avantageuse ladite longueur d'onde sera située dans la gamme allant de 300 à 1000 rin. De préférence on fera appel à un rapport A/d supérieur ou égal à 5. Il est également important que le latex présente une fonctionnalité réactive avec la substance iminnologique. Conviennent à cet effet les latex comprenant des fonctions acide carboxylique (COOH), des fonctions hydroxyle (OH), des fonctions amino primaires (NH2), des fonctions amino secondaires (NHR), des fonctions thiol (SH), des fonctions carboxamide (CONH2 ou ou des fonctions carboxylate (COOR"), où R, R' et R" sont des groupes de blocage usuels dans le domaine immunologique. R peut notamment représenter un reste hydrocarboné notanment un radical alkyle en -C; R' peut notamment représenter un reste hydrocarboné notamment un groupe allyle en C1-C4, phényle ou benzyle;R" peut notamment représenter un reste hydrocarboné notamment un radical alkyle en C14 tel que méthyle, éthyle, isopropyle, t-butyle ou s-butyle. En pratique les groupes réactifs de la fonctionnalité réactive avec la substance inriunologique représenteront approximativement 100 à 450 micro-équivalents par gramme de latex. Parmi les latex qui conviennent on peut notamnent mentionner les latex polyacryliques, polyméthacryliques, polyacrylates et polyméthacrylates, en particulier les latex de poly(méthacrylate d'alkyle en C1-C4), par exemple le poly (méthacrylate de butyle) et le poly(méthacrylate de méthyle) comportant, selon le pH du milieu des groupes COOH et/ou COOR" (dans lesquels le nombre total de groupes COOH et COOR" présents représente 250 à 300 micro-équivalents par gramme de latex). Conviennent également les homopolymères ou copolymères tels que les polystyrènes et polyvinyltoluènes, et les copolymères de styrène/divinylbenzène et de styrène/butadiène, qui comportent chacun une fonctionnalité réactive telle que visée ci-dessus. Les latex à fonctionnalité réactive sont utilisables soit directement pour couplage covalent du ligand par réaction chimique, soit après extension latérale de chaine au moyen d'un bras bifonctionnel. Parmi les composés bifonctionnels utiles pour la réalisation du bras ou pont bifonctionnel qui conviennent selon 1'invention on -peut mentionner les diamines et les aminoacides comprenant un groupe amino en position terminale par rapport au groupe carboxylique, couse par exemple l'acide -aminocaproSque; ce bras ou pont est ensuite activé pour le couplage covalent. En variante on peut utiliser une couche moléculaire de liaison (albumine ou polymère organique tel que la polylysine) entre le latex et le ligand. De façon avantageuse les particules de latex utilisées selon 1'invention présenteront une granulométrie sensiblement uniforme, d étant inférieur à 200 nm, de préférence inférieur à égal à 100 nm et mieux situé dans la gamme allant de 5 à 100 rm. La particularité majeure des latex est leur faculté à former des suspensions stables pouvant être déstabilisées de façon spécifique dans des conditions définies, dans le cas d'espèce la réaction antigène/anticorps. Suivant l'invention, les particules sensibilisées par un antigène ou un anticorps, par exemple un haptène, conservent les propriétés inhérentes au latex et celle de la substance imnunologique couplée. Lesdites particules restent monodispersées durant le stockage et s'agrègent 'uniquement en présence de l'élément complémentaire du système ligand/antiligand, la fixation pouvant être soit directe soit réalisée par l'intermédiaire d'un bras bifonctionnel ou d'une couche protéique ou polymère organique. Eu égard à la fonctionnalité réactive, la présence de groupements fonctionnels tels que COOH ou autres précités, à la surface des particules de latex permet un couplage covalent avec les groupements fonctionnels du ligand. De façon non limitative les couples fonctionnels suivants sont avantageusement utilisés NH2 /NH2, -COOH/NH2, -NH21COOH, -SH/SH, -OH/NH2 et -NH2/OH. Bien entendu d'autres combinaisons de couples fonctionnels connus dans la technique sont également envisageables. Des exemples non limitatifs de couplage par covalence sont donnés ci-après pour information -Activation des groupements COOH du latex par un carbodimide hydrosoluble (par exemple, 1'EDAC ou le morphocarbodiimide ou tout autre carbodiimide soluble) réagissant avec les groupements du du ligand à un pH compris entre 3 et 8 dans un milieu dépourvu de groupements aminés libres. L'acti vation peut se faire en deux temps avec élimination de l'excès de réactif de couplage (méthode préférentielle) ou directement en un temps. le ligand est ensuite ajouté en proportion adéquate, puis le latex est saturé et sta bilisé. -Activation des groupements CH du latex par un carbo diamide et greffage d'un bras intermédiaire : les latex activés par le carbodiimide sont, dans un premier temps, "dérivatisés" à l'aide d'une diamine en excès (dans cette technique, on utilise habituellement une diamine alipha tique comprenant de 2 à 10 atomes de carbone afin d'éloigner le ligand de la surface, le rendant plus réactif, et de créer des groupements NH2. Les particules ainsi obtenues et dites " dérivatisées" sont ensuite activées par le glutaraldéhyde (dont l'excès est éliminé) ou le carbodiimide. Après activation, elles réagissent avec les groupes NE2 ou Cf du ligand. L'utilisation de latex à fonctionnalité réactive comportant d'autres groupements réactifs confère de nouvelles possibilités de couplage covalent -latex aminé (NH2) ou carboxylé (COOR) activé par un carbodiimide ou un 2-éthoxy-1-(2H)-quinoléinecarboxylate, notamment le 2-éthoxy-1-(2H)-quinoléinecarboxylate d'éthyle (EEDQ), -latex aminé activé par diazotation ou par le glutaral dénude, -latex hydroxylé (OH) activé par le bromure de cyano gène, les oxirannes, le chlorure de tosyle, le periodate, la benzoquinone ou analogues, -latex à groupements ester (COOR") activé par le gluta raldéhyde, -latex à groupements amide (COTIR') activé par le gluta raldéhyde. Dans le mode de sensibilisation des particules de latex et de fixation du ligand par covalence, les conditions expérimentales, à savoir le pH, la force ionique, le volume, la température, la durée et la concentration du ligand seront ajustées en fonction de la nature du produit à doser de façon à assurer -une parfaite stabilité du réactif inmunologique particulaire dans un milieu biologique approprié, -une réactivité maximale et une reproductibilité efficace, et -une excellente conservation du réactif innnmoîogique au stockage (on a observé à la fin d'une durée de conservation de 12-18 mois à + 40C aucune dégradation ou inactivation substantielle dudit réactif). D'un point de vue pratique, on constate que, quel que soit le tampon, l'augmentation du pH et de la force ionique entraîne une stabilisation du réactif immunologique, d'une part, et provoque une diminution proportionnelle de la réactivité, d'autre part. C'est pourquoi on préconise pour la préparation du réactif immunologique un ajustement global, qui permet de pallier l'aspect antinomique sus-visé, et qui fait appel à un milieu aqueux liquide comprenant de l'eau et un moyen tampon, ayant un pH dans la gamne allant de 5 à 9, ayant une force ionique située dans la gamme de 0,01 à 0,5, et contenant, le cas échéant, pour stabiliser les particules de latex, un mélange inerte de protéines et d'aminoacides, et pour amplifier la réaction ultérieure du réactif imnunologique avec la substance complémentaire ou conjuguée, un alcool polymère. De façon pratique, la réaction du réactif iiiinunologique avec la substance complémentaire ou conjuguée sera effectuée dans un milieu liquide aqueux ayant un pH de 5-9, une force ionique de 0,010,5 et contenant le cas échéant un alcool polymère et/ou une substance choisie parmi les protéines et les aminoacides inertes. Le procédé de dosage que l'on préconise suivant l'invention, qui met en oeuvre une réaction du type antigène/anticorps est caractérisé en ce qu'il consiste (a) à mettre en contact, dans un milieu liquide aqueux ayant un pE dans la gamne de 5 à 9 et une force ionique dans la gamme de 0,01 à 0,5, (i) des particules ayant un diamètre moyen (d) inférieur à 200 nrn et revêtues d'une substance immunologique choisie parmi les antigènes et les anticorps et liée par covalence à chacune desdites particules, avec (ii) une substance complémentaire ou conjuguée de ladite substance imnunologique, et (b) à apprécier l'évolution de l'agglutination par exposition à un rayonnement ayant une longueur d'onde (4 située dans la gamme de 300 à 1000 rm, telle que le rapport,4/d /d soit supérieur ou égal à 5. Dans ce procédé, on apprécie soit l'agglutination proprement dite soit l'ihhibition de 1'agglutination. La température que 1 'on préconise pour la mise en oeuvre de ce procédé est située dans la gamme de 4 à 600C et mieux de 15 à 370C. De préférence, le dosage sera réalisé par turbidimétrie. Le dosage par turbidimétrie offre l'avantage de permettre une utilisation aisée par tout laboratoire équipé uniquement d'un photomètre ou d'un spectrophotomètre (travaillant à une longueur d'onde comprise entre 300 et 1000 nm) ou équipé d'un appareillage automatique et sophistiqué (type analyseur centrifuge tel que l'analyseur "Cobas Bio". Le dosage peut également être réalisé par néphélométrie ou par comptage de particules avec, en contre-partie, une utilisation plus restrictive, compte tenu du coût de 1 'appareillage. La sensibilité du dosage suivant l'invention est d'une manière générale d'au moins 100 ng/ml. Dans certains cas, le seuil de sensibilité, notamment par néphélométrie, pourra être inférieur, et égal à au moins 10 ng/ml. La durée du dosage est comprise entre 30 et 600 s. Un tel dosage est applicable à la détermination quantitative d'antigènes et d'anticorps d'une part, de toutes substances susceptibles de générer des anticorps telles que les haptènes, les peptides, les médicaments comportant au moins un fragment peptide, et les alcalotdes, d'autre part, dans divers milieux biologiques, tels que plasma, sérum, urine, liquide céphalorachidien, et extraits biologiques, pour divers secteurs de la technique tels que la santé animale, la santé humaine, ledomaine agro-alimentaire, l'environnement et analogues. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de réalisation nullement limitatifs mais donnés à titre dtillus- tration. ExI 1 Préparation du réactif immunologique On fait appel à un latex de poly(méthacrylate de butyle) sous la forme de billes ayant un diamètre de 67 nm fabriqué par la société dite RHONE PQULENC. La fonctionnalité réactive de ce latex est constituée par des groupes COOH et/ou COOR" selon le PH du milieu7 la teneur totale en groupe réactifs COOH et COOR" représentant une quantité de 250 à 300 micro-équilavents par gramne de latex. La fixation par covalence de la substance imnunologique .(i.e. l'antigène ou l'anticorps) est réalisée en deux étapes. L'activation préalable des fonctions carboxyle et/ou carboxylate du latex par un carbodiimide est suivie par le couplage du ligand. Al ml de latex à 10 X p/v on ajoute 5 mg de carbodiimide. Après incubation à 500 C ou à température ambiante (de 10 minutes à 2 heures) les billes de latex sont lavées plusieurs fois et mises en présence de 1 à 30 mg d'antigène ou d'anticorps dilués (de préférence 5 à 10 mg) pendant 10- à 30 minutes. Une substance aminée est finalement ajoutée pour saturer les sites libres sous un volume permettant une utilisation directe du réactif (0,75% p/v final). SEMPLE 2 Dosage des PDF sur sérum Dans la cuve de mesure sont introduits successivement 15111 de standard ou d'échantillon à doser et 500 )tl (en spectrophotométrie) ou 200 1 (sur Cobas Bio) de billes de latex revêtues d'un anticorps et diluées en tampon de réaction (concentration finale 0,075X) [préparées selon l'exemple 1 à partir d'un anticorps anti-PDF (généré selon une méthode connue en soi à partir d'un ou plusieurs PDF -Produit de dégradation du fibrinogène)]. La lecture est effectuée à 600 nm au bout de 60 à 600 s de réaction en lecture manuelle sur spectrophotomètre ou 30 à 180 s en lecture automatique sur "Cobas Bio" ou tout autre mesure cinétique.La rapidité de la réaction permet également une lecture en cinétique entre 60 s et 600 s manuellement (figure 1), ou entre 30 s et 600 s sur analyseur "Cobas Bio" (figures 2a et 2b). L'effet de zone est observé pour des concentrations supérieures à 500, g/m1 dans l'échantillon. Une prédilution supplémentaire permet d' éliminer tout risque d'erreur par excès d'antigène. le seuil de détection dans le milieu réactionnel se situe à 100 ng/ml. La figure 1 donne les courbes d'étalonnage 1A, 1B et 1C pour des durées de réaction de 2,5 et respectivement de 10 minutes dans le système absorbance A (en ordonnées) / concert tration finale en PDF (exprimée enALg/ml en abscisses), sous une exposition à un rayonnement de 600 nm. La figure 2a donne les courbes des cinétiques obtenues lors du dosage des PDF dans le système densité optique D (en ordonnées) / durée de réaction T (exprimée en secondes, en abscisses) pour des concentrations finales de PDF de O (combe 2A); 0,75 (courbe 2B); 1,5 (courbe 2C); 3 (courbe u)); 4,5 (courbe 2E) et 7,5oLg/ml (courbe 2F), sous une exposition à un rayonnement de 600 nm, au moyen d'un analyseur "Cobas Bio". De même la figure 2b donne les courbes des cinétiques obtenues lors du dosage des PDF dans le système densité optique D (en ordonnées) / durée de réaction T (exprimées en minutes en abscisses) pour des concentrations finales en PDF de O (courbe 2'A); 0,4 (courbe 2'B); 0,9 (courbe 2'C); 1,8 (courbe 2'D); 3,75 (courbe 2'E) et 7,5 g/ml (courbe 2'F) sous une exposition à un rayonnement de 600 nm, au moyen d'un analyseur "Cobas Bio". EXEMPLE 3 Dosage direct de l'Antithrombine III (AT III) 50 > X1 de standard ou d'échantillon prédilué 80 fois sont mélangés aux latex-anticorps [préparés selon l'exemple 1 à partir d'anti-AT III ] dilués sous un volume de 500 l dans le tampon de réaction (0,075 % p/v final). La lecture est effectuée à 600 nm après 2 à 10 minutes de réaction. La gamme d'étalonnage est comprise entre O et 200 % d'AT III plasmatique, ce qui correspond à des valeurs comprises entre O et 3,7vu g/ml dans le milieu réactionnel (figure 3). La figure 3 donne la courbe d'étalonnage à 600 nin de l1AT III plasmatique (en abscisses concentrations finales en AT III en g/m1 et en AT III plasmatique correspondante exprimée en %; avec en ordonnées la densité optique D) après 5 minutes d'incubation. EXEMPLE 4 Dosage indirect des PDF On introduit préalablement dans la cuve de mesure 200l d'anticorps, dans le cas d'espèce un anti-PDF, et 600yt1 de PDF libres prédilués. On déclenche ensuite la réaction en ajoutant les billes de latex sensibilisées par des PDF (à 0,75X) [préparées selon l'exemple 1 à partir de PDF fixés sur lesdites billes] afin d'obtenir un volume final de 1 ml. les concentrations en PDF à doser, se traduisant par une inhibition de la réaction, sont exprimés en fonction de la variation de la densité optique ou de ltabsorbance mesurée à 600 nm sur spectrophotomètre. La figure 4 ci-après donne la courbe d'inhibition de l'agglutination du réactif latex/PDF dans le système densité optique D (en ordonnées), concentration des PDF (exprimée enpug/ml en abscisse) à 600 nm. Conformément à l'invention on préconise des nécessaires ou trousses de dosages contenant notamment en suspension dans un liquide aqueux (i) des microsphères de latex destinées à être liées par covalence avec la substance immunologique de l'utilisateur, ou (ii) des réactifs imnunologlques dans lesquels chaque microsphère est déjà liée par covalence à une substance imunologique pour constituerZ notamment un réactif imnunologique utile en particulier dans le domaine de l'hémostase, tel que latex/PDF, latex/anti-PDF, latex/anti-AT III ou latex/AT III. REVENDICATIONS 1. Particules de latex subucroniques, revêtues d'une substance immunologique choisie parmi les antigènes - et respectivement les anticorps, lesdites particules, qui sont utiles dans les dosages immunologiques du type antigène/anticorps, étant caractérisées en ce que (a) leur diamètre moyen (d) est inférieur à 200 rini, (b) le latex desdites particules comporte une fonctionnalité réactive assurant la fixation par covalence ~de ladite substance immunologique, (c) lesdites particules revêtues de ladite substance iuuunologique en suspension dans un milieu liquide aqueux étant invisibles quand elles sont exposées à un rayonnement ayant une longueur d'onde (A) supérieure au diamètre moyen (d) desdites particules, et (d) lesdites particules revêtues de ladite substance imsunologique en suspension dans ledit milieu liquide aqueux devenant "visibles" par agglutination quand elles sont exposées audit rayonnement après mise en contact avec une substance choisie parmi les anticorps et respectivement les antigènes correspondant à ladite substance iuuunologique fixée sur lesdites particules. 2. Particules suivant la revendication 1, caractérisées en ce que ladite substance immunologique qu'elles comportent est liée directement par covalence à chaque particule par l'intermédiaire de la fonctionnalité réactive de ladite particule. 3. Particules suivant la revendication 1, caractérisées en ce que ladite substance imnunologique qu'elles comportent est liée par covalence à chaque particule par l'intermédiaire d'un bras bifonctionnel lié par une de ses extrémités à ladite particule. 4. Particules suivant la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles possèdent un diamètre moyen inférieur ou égal à 100 nm et mieux compris dans la gamme de 5 à 100 tin. 5. Particules suivant la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles présentent un diamètre moyen (d) tel que le rapportÀ/d soit supérieur ou égal à 5. 6 Particules suivant la revendication 1, caracrisées en ce qu'elles ont été é-laborées à partir d'un latex présentant une fonctionnalité réactive notamment choisie parmi les groupes carboxyliques (COOH), les groupes hydroxyle (OH), les groupes amino primaires (NE2), les groupes amino secondaires (NHR), les groupes thiol (SH), les groupes carboxamide (CONHi ou CONHR'), et les groupes carboxylate (COOR"), où R, R' et R" sont des groupes de blocage usuels dans le domaine immunologique, R pouvant notamnent représenter un reste hydrocarboné notamnent un radical alkyle en C1-C4, R' pouvant notamment représenter un reste hydrocarboné notamment un groupe alkyle en C1-C4, phényle ou benzyle, et, R" pouvant notamment représenter un reste hydrocarboné notamment un radical alkyle en C1-C4 tel que méthyle, éthyle, isopropyle, t-butyle ou s-butyle. 7. Particules suivant la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles ont été élaborées à partir d'un latex dans lequel les groupes réactifs de la fonctionnalité réactive représentent approximativement 100 à 450 micro-équivalents par gramne de latex. 8. Utilisation de particules de latex suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans le domaine des dosages imnunologiques du type antigène/anticorp. 9. Procédé de dosage mettant en oeuvre une réaction du type antigène/anticorps, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste (a) à mettre en contact, dans un milieu liquide aqueux ayant un pH dans la gamme de 5 à 9 et une force ionique dans la gamme de 0,01 à 0,5, (i) des-particules ayant un diamètre moyen (d) inférieur à 200 nm et revêtues d'une substance immunologique choisie parmi les antigènes et les anticorps et liée par covalence à chacune desdites particules, avec (ii) une substance complémentaire ou conjuguée de ladite substance immunologique, et (b) à apprécier l'évolution de l'agglutination par exposition à un rayonnement ayant une longueur d'onde (A) située dans la gamme de 300 à 1000 nm, telle que le rapport /d soit supérieur ou égal -à 5. 10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que la température de la mesure d'évolution de l'agglutination est - située dans la gamne de 4 à 600C et de préférence dans la gamne de 15 à 370C. 11. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que la durée du dosage est comprise entre 30 et 600 secondes. 12. Procédé suivant la revendication 9 dans lequel on mesure l'agglutination desdites particules. 13. Procédé suivant la revendication 9 dans lequel on mesure l'inhibition de l'agglutination. 14. Nécessaire pour dosage immunologique, caractérisé en ce qu'il comprend, en suspension dans un liquide aqueux, des particules de latex submicroniques selon la revendication 1, lesdites particules étant choisies parmi l'enseitible constitué par (i) les particules devant être liées par covalence à la substance iumunologique de l'utilisateur, et (ii) les particules préalablement revêtues par une substance imimmologique où la substance imrmnolo- gique est liée par covalence à chacune des parti cules.