FR 2659557 A1 19910920 FR 9003328 A 19900315 L'invention a pour objet un procédé de préparation d'une solution concentrée de Facteur VIII de pureté intermédiaire à partir d'un cryoprécipité. De nombreux procédés ont déjà été décrits, visant à préparer une forme purifiée de Facteur VIII humain, en raison de l'importance industrielle de ce facteur pour les hémophiles et surtout, de la nécessité de disposer de Facteur VIII dépourvu de contaminants, tels que les autres protéines du sang (fibrinogène, fibronectine, immunoglobulines etc.). I1 n'est pas toujours nécessaire de viser de très hauts niveaux de pureté. Dans certains cas, il est intéressant de disposer d'un concentré de pureté intermédiaire, soit pour l'utiliser tel quel dans certaines applications où il n'est pas nécessaire d'avoir du Facteur VIII de très haute pureté, soit pour l'utiliser comme produit de départ pour une ou plusieurs étapes ultérieures de purification. On entend par Facteur VIII de pureté intermédiaire, un Facteur VIII dont l'activité spécifique est aux environs de 1 U/mg. Des techniques de précipitation sélective des protéines contaminantes conduisant à l'obtention de concentrés de Facteur VIII ayant une activité spécifique de 0,6 à 1 U/mg ont déjà été mises au point. On peut citer par exemple l'adsorption sur gel d'alumine, décrite dans le brevet US 4 170 639, mais cette technique ne permet pas une élimination suffisante des protéines indésirables. Le brevet US 3 652 530 décrit une précipitation au polyéthylène glycol suivie d'une adsorption sur gel d'alumine, mais la présence de polyéthylène glycol résiduel rend difficile la mise en oeuvre d'une étape ultérieure d'ultrafiltration. Depuis 1987, le développement des techniques chromatographiques a permis la préparation de Facteur VIII hautement purifié. Cependant, la mise en oeuvre satisfaisante de ces techniques dépend nécessairement de la qualité de la matière première contenant le Facteur VIII soumise à la purification. Ainsi, un cryoprécipité standard remis en solution contient habituellement un taux de fibrinogène et de fibronectine correspondant à 80 96 environ des protéines totales. A cette quantité importante de protéines, correspond une solution adhésive, ayant tendance à colmater, difficilement filtrable et donc mal adaptée aux techniques de chromatographie. Vautre part, il est déjà connu, à partir d'un cryoprécipité, de mettre en oeuvre une étape de précipitation, notamment à l'héparine, afin d'éliminer certaines des protéines contaminantes. On peut citer par exemple le document de brevet WO/8605190 qui décrit la précipitation à l'héparine de protéines contaminantes à partir d'un cryoprécipité, suivie d'une précipitation finale de Facteur VIII. Le Facteur VIII obtenu se trouve donc sous forme de précipité et présente une activité spécifique généralement supérieure à 2 U/mg. Les conditions dans lesquelles le Facteur VIII est obtenu selon ce document sont les suivantes On précipite le fibrinogène et la fibronectine par addition de polysaccharide sulfatée (SPS), plus particulièrement de l'héparine fortement concentrée. Cette quantité élevée peut atteindre 480 U/ml, et est de préférence de 70 à 140 U/ml. On associe à cette forte concentration d'héparine une température supérieure à 15"C. Eventuellement, on précipite ensuite le Facteur VIII restant dans le surnageant en présence de sels forts concentrés. Les conditions indiquées dans ce document présentent un certain nombre d'inconvénients. Tout d'abord, on a constaté que, contrairement à ce qui est indiqué dans la publication de brevet sus-mentionnée, le rendement élevé de Facteur VIII obtenu après précipitation en une seule étape avec une forte concentration d'héparine n'est pas reproductible à partir d'un cryoprécipité standard tel qu'utilisé par la Demanderesse. Ensuite, l'utilisation de fortes concentrations de sels pour précipiter le Facteur VIII pourrait conduire à une altération de sa structure moléculaire et contribuer ainsi à la perte de rendement. L'invention vise notamment, à remédier à ces inconvénients. L'invention vise à fournir, à la différence des procédés connus, une solution concentrée de Facteur VIII de pureté intermédiaire. Elle vise donc plus particulièrement à fournir, à partir d'un cryoprécipité, une solution de Facteur VIII dont l'activité spécifique est relativement faible, c'est-à-dire de l'ordre de 1 U/mg, et ce avec un rendement opératoire très satisfaisant, de l'ordre de 75 à 90 %. L'invention vise également à fournir une solution de Facteur VIII bien adaptée à la mise en oeuvre ultérieure d'autres étapes de purification, notamment par chromatographie d'échange d'ions, ou par gel filtration. Les inventeurs ont trouvé que ce but est atteint, lorsque l'on soumet un cryoprécipité à une double précipitation contrôlée quant aux quantités d'agents de précipitation, quant à la température et quant au pH, de façon à éliminer en deux étapes les protéines indésirables, et à récupérer le Facteur VIII avec un haut rendement sous forme de solution clarifiée. C'est pourquoi, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'une solution concentrée de Facteur VIII de pureté intermédiaire qui comprend les étapes suivantes a) on solubilise un cryoprécipité b) on soumet la solution obtenue à une première précipitation, en lui ajoutant un polysaccharide sulfaté en quantité comprise entre 5 et 20 U/ml de solution, en ajustant le pH à une valeur comprise entre 6.7 et 7.3, et en abaissant la température à une valeur comprise entre 10 et 160C c) on sépare le culot du surnageant d) on soumet le surnageant à une seconde précipitation en ajoutant un gel d'hydroxyde d'aluminium en quantité comprise entre 100 et 200 g/kg de cryoprécipité de départ et en ajustant le pH à une valeur comprise entre 5.8 et 6.3 e) on sépare le culot du surnageant f) on récupère le surnageant, qui est une solution concentrée de Facteur VIII. Selon le procédé conforme à l'invention, on associe donc une faible quantité de polysaccharide sulfaté lors de la première précipitation, permettant d'éliminer surtout le fibrinogène et la fibronectine, et une deuxième précipitation en présence du gel d'hydroxyde d'aluminium permettant d'éliminer la majorité des facteurs vitamine K dépendants et des autres contaminants protéiques. Parmi les polysaccharides sulfatés (SPS) utilisables, on peut citer par exemple une mucopolysaccharide polysulfatée, le pentosan polysulfate, le chondroitin sulfate, le dextran sulfate, l'héparine. On utilisera de préférence l'héparine. Suivant un mode de réalisation avantageux du procédé conforme à l'invention, pour mettre en oeuvre l'étape a), on ajoute au cryoprécipité un volume de solution tampon correspondant à 4 à 8 fois le poids du cryoprécipité. Dans ces conditions, on minimise le risque de précipitation du Facteur VIII avec le fibrinogène et la fibronectine et on favorise l'obtention d'un rendement élevé en Facteur VIII dans la solution lorsque les différentes étapes du procédé ont été mises en oeuvre. A cette fin, on peut utiliser les solutions tampons couramment employées, telles que par exemple un tampon tris-Hcl, imidazole, citrate etc. En ce qui concerne le pH, il est préférable d'opérer le plus près possible de la neutralité pour favoriser l'action de la SPS sans risquer de précipiter le Facteur VIII. C'est pourquoi, suivant un mode de réalisation avantageux de l'invention, on ajuste le pH à 7.1 dans l'étape b). Suivant un autre mode de réalisation avantageux, on effectue l'étape b) à une température de 14"C. De préférence, la quantité de SPS, notamment d'héparine utilisée à l'étape b) est de 10 U/ml. Dans le cas où la solution concentrée de Facteur VIII finalement obtenue doit être soumise à une étape ultérieure de purification, en particulier une chromatographie d'échange d'ions, il est particulièrement intéressant que la précipitation soit effectuée avec une quantité d'héparine très faible. En effet, dans ces conditions, le faible taux d'héparine résiduel dans la solution concentrée de Facteur VIII ne risque pas d'interférer avec la fixation du Facteur VIII sur le support de chromatographie. On pourra donc utiliser directement la solution concentrée. Dans les procédés connus qui comprennent une étape de type a), celle-ci est effectuée à température ambiante. Toutefois, on peut également prévoir de les effectuer toutes deux aux températures préférées prévues pour l'étape b), c'est-à-dire entre 10 et 160C, de préférence à 14"C. Enfin, en ce qui concerne l'étape d), on ajustera de préférence le pH à 6. La solution concentrée ainsi obtenue peut être facilement stockée, par exemple pour être utilisée ensuite directement. Elle subira alors les traitements classiques de concentration ultérieure par ultrafiltration, de lyophilisation et de conditionnement. Elle pourra également servir comme matière première pour des étapes de purification ultérieure, par immunopurification, par chromatographie d'échange d'ions, par gel filtration, par interaction hydrophobe... Généralement, avant d'être soumise à ces étapes de purification ultérieure, la solution de Facteur VIII pourra être soumise à une étape d'inactivation virale. Une telle étape peut par exemple être réalisée par la mise en oeuvre du procédé désigné sous l'appellation procédé SD et décrit par exemple dans les brevets US 4 481 189 et 4 540 573. La mise en oeuvre détaillée du procédé conforme à l'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants illustrés par les figures 1 et 2, lesquelles représentent - Figure 1 : un diagramme montrant ltévolution du rendement en facteur VIII (96) en fonction de la concentration en héparine (U/ml) utilisée lors de l'étape b) de précipitation effectuée à l40C. - Figure 2 : un diagramme montrant la relation entre le taux de protéines résiduelles en solution (mg/ml) et la valeur du pH lors de la deuxième précipitation. - Figure 3 : un diagramme montrant l'évolution du taux d'héparine résiduelle (mg/ml) en fonction de la concentration en héparine (U/ml). Dans tous les exemples qui suivront, on utilise les données communes suivantes 1) préparation du cryoprécipité On centrifuge du sang humain collecté en présence de citrate de sodium, afin d'éliminer la fraction cellulaire. Le plasma obtenu est congelé à -40 C dans des poches plastiques. On procède ensuite en trois étapes successives pour obtenir le cryoprécipité - prédécongélation du plasma: il est réchauffé progressivement de manière à ce que sa température passe de -40 C à -11 C en 8 heures - décongélation du plasma : on élimine les poches plastiques puis on place le plasma congelé dans un broyeur pendant environ 2 minutes.On maintient la température de la solution obtenue entre 0 et 0,50C - séparation du cryoprécipité : on centrifuge la suspension à une température comprise entre 1 et 40C. 2) Préparation d'une solution concentrée de Facteur VIII Le cryoprécipité est repris dans quatre fois son volume en poids d'un tampon Tris-HCl 20 mM à pH 7.0. Le pH est ensuite ajusté à 7.1 avec de l'acide acétique 0.5 N. On ajoute ensuite de l'héparine standard commercialisée par la société LEO France à une concentration de 10 U/ml de solution, et on abaisse simultanément la température du milieu à 14"C. Pour récupérer le surnageant, on procède à une centrifugation à 4000 t/mn pendant 15 minutes. On ajoute au surnageant une quantité d'AL(OH)3 correspondant à 110 g/kg de cryoprécipité de départ et on ajuste le pH à 6,0 avec de l'acide acétique 0.5 N. Comme précédemment, on procède à une centrifugation à 4000 t/mn pendant 15 minutes pour récupérer le surnageant. 3) Inactivation virale de la solution concentrée de Facteur VIII On ajoute 1 mM de CaC12 dans la solution concentrée obtenue puis on ajuste le pH jusqu'a une valeur de 7 avec NaOH 0,1 N. Ensuite, on ajoute à la solution un mélange d'inactivation virale de façon à atteindre une concentration finale de 1 % de Tween 80 et 0,3 % de TnBP (volume/volume). La solution est incubée pendant pendant 6 heures à 24"C. 4) Méthodes d'essais a) détermination de la quantité de Facteur VIIIc : par dosage chromogénique après neutralisation de l'héparine en excès b) détermination de la quantité totale de protéines : à l'aide des réactifs commercialisés par Biorad ; c) détermination de la quantité de fibrinogène : par les réactifs de la société Behring (immunodiffusion radiale simple) d) détermination de la quantité de fibronectine par les réactifs de la société Behring (immunodiffusion radiale simple) e) détermination de la quantité d'héparine par dosage chromogénique. Exemple 1 On part d'un cryoprécipité dont l'analyse est indiquée ci-après les valeurs sont rapportées par rapport à 1 1 de plasma, soit 6.5 g de cryoprécipité Avant précipitation à l'héparine Facteur VIII(c) (U) 346.5 Protéines totales (mg) 840 Activité spécifique du Facteur VIII (U/mg) 0.41 Fibrinogène (mg) 410 Fibronectine (mg) 50 On soumet 20 g du cryoprécipité ainsi défini à l'ensemble des étapes définies précédemment. Exemple 2 Les conditions sont identiques à celles de l'exemple 1, sauf que la concentration d'héparine est de 16 U/ml au lieu de 10 U/ml. Le tableau I ci-après récapitule certains paramètres du procédé et leur évolution au cours des différentes étapes. Le rendement final en Facteur VIII après les étapes b) + c) est indiqué en dessous des rendements propres à chaque étape. TABLEAU I Exemple 1 Exemple 2 Exemple 3 (comparatif) Paramètre A B C D A B C D A B C D Rendement 100 90 89 92 100 89 92 80 100 37 --- --en FVIII(%) 80 81 Concentration en protéines 23 14.8 7.1 8.2 23 13.8 7.8 7.8 35 2.8 --- --totales (mg/ml) Taux d'élimination des proté- --- 36 53 --- --- 40 49 --- --- 92 --- --ines (%) Activité spécifique 0.41 0.59 1.06 --- 0.4 --- --- --- 0.43 2.08 --- --du FVIII (U/mg) A : au départ, après solubilisationdu cryoprécipité - B : après précipitation à l'héparine - C : après la deuxième précipitation - D : après inactivation virale Exemple 3 Dans cet exemple, on part du même cryoprécipité que dans les exemples 1 et 2 ; simplement, au lieu de mettre en oeuvre les conditions de température et de concentration d'héparine telles qu'indiquées dans ces exemples, on reprend les conditions indiquées dans la publication de brevet WO86/05190, c'est-à-dire une seule précipitation à 25"C et avec 110 U/ml d'héparine. On obtient les résultats comparatifs tels qu'indiqués dans la colonne "exemple 3 (comparatif)" du tableau I. I1 résulte de cet exemple comparatif que lorsqu'on met en oeuvre les conditions de températures et de concentration d'héparine de la publication de brevet WO 86/05190, on obtient un rendement en Facteur VIII après la précipitation à l'héparine très inférieur à celui qui est obtenu selon l'invention. La succession de deux précipitations contrôlées selon l'invention permet donc de favoriser l'obtention d'un rendement final très satisfaisant en Facteur VIII. La figure 1 illustre ce résultat de façon complémentaire. La figure 2 montre que les conditions de la seconde précipitation, notamment le pH, sont également importantes pour obtenir un taux de protéines résiduelles faible dans le surnageant, et donc obenir une bonne efficacité d'élimination du fibrinogène, de la fibronectine et des protéines vitamine K dépendante. Enfin, il résulte clairement de la figure 3 qu'un excès d'héparine n'est pas utilisé pour précipiter les protéines mais reste dans le surnageant, ce qui justifie le choix d'une faible quantité d'héparine. Or, une trop grande quantité d'héparine résiduelle dans le surnageant peut être préjudiciable à la mise en oeuvre d'une étape ultérieure de chromatographie d'échange d'ions. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une solution concentrée de Facteur VIII de pureté intermédiaire comprenant les étapes suivantes a) on solubilise un cryoprécipité b) on soumet la solution obtenue à une première précipitation, en ajoutant un polysaccharide sulfaté (SPS) en quantité comprise entre 5 et 20 U/ml de solution, en ajustant le pH à une valeur comprise entre 6.7 et 7.3, en abaissant la température à une valeur comprise entre 10 et 160C c) on sépare le culot du surnageant d) on soumet le surnageant à une seconde précipitation en ajoutant un gel d'hydroxyde d'aluminium en quantité comprise entre 100 et 200 g/kg de cryoprécipité de départ, en ajustant le pH à une valeur comprise entre 5.8 et 6.3 e) on sépare le culot du surnageant f) on récupère le surnageant qui est une solution concentrée de Facteur VIII. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la SPS est l'héparine. 3. Procédé selon la revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que pour mettre en oeuvre l'étape a), on ajoute au cryoprécipité un volume de solution tampon correspondant à 4 à 8 fois le poids du cryoprécipité. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que dans l'étape b) on ajuste le pH à 7.1. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que dans l'étape b), on abaisse la température à 14"C. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que dans l'étape b), on ajoute la SPS, de préférence l'héparine en quantité égale à 10 U/ml de solution. 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les étapes a) et b) sont toutes deux effectuées à une température comprise entre 10 et 160C, de préférence à 14 C. 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que dans l'étape d) on ajuste le pH à 6. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que après ltétape f) on soumet le surnageant à une étape d'inactivation virale.