FR 2650282 A1 19910201 FR 8910327 A 19890726 Procédé de préparation de chitosan par N désacétylation de chitine La présente invention concerne un procédé de préparation de chitosan par N-désacétylation de chitine en milieu basique. Le chitosan est de la poly-glucosamine, généralement partiellement N-acétylée tandis que la chitine est de la poly-N-acétyl-glucosamine. Cette dernière est obtenue à partir de carapaces de crabes, de crevettes, de langoustes, de homards et de tous les crustacés en général, ou bien encore d'insectes, dé micro-organismes, de champignons ou autres. Pour la préparation de chitosan, la chitine provenant de carapaces de crustacés est préférentiellement utilisée. De nombreuses méthodes de N-désacétylation de chitine sont décrites dans la littérature et certaines d'entre elles sont utilisées en milieu industriel. Elles permettent d'obtenir du chitosan qui présente des degrés de polymérisation et d'acétylation variables en fonction des condi tions opératoires. C'est ainsi que les poids moléculaires du chitosan obtenu peuvent être faibles, c'est-à-dire compris entre 5 et 150 KD, moyens, c'est-à-dire compris entre 150-500 KD, ou forts, c'est-à-dire supérieurs à 500 KD, et que ses degrés d'acétylation peuvent être compris entre O et 40 96. Il faut noter qu'un degré d'acétylation de 40 % constitue une valeur limite au dela de laquelie le chitosan n'est plus soluble dans les acides dilués. Le procédé connu de préparation de chitosan le plus couramment utilisé -consiste à traiter la- chitine avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium ou de potassium concentrée, à température élevée, pendant un temps variable, et généralement sous atmosphère exempte d'oxygène. Le brevet US nO 2 040 879 décrit une préparation de chitosan par mise en présence de chitine avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium - à 40 % poidslpoids à une température de 1150C pendant six heures sous atmosphère d'azote. Le mélange refroidi est ensuite filtré et lavé jusqu'à l'obtention d'un pH neutre. Le produit obtenu est un chitosan dont le degré d'acétylation est approximativement égal à 18 %. Un autre procédé d'obtention de chitosan par N-désacétylation de chitine a été décrit, notamment par R.W. JEANLOZ et E. FORCHIELLI dans "tel. chim. Acta, 33, 1690 (1950)". Il s'agit de la fusion alcaline suivant laquelle la chitine est mélangée à des pastilles d'hydroxyde de potassium. Le mélange est ensuite porté à 1800C pendant 30 minutes sous atmosphère d'azote, puis versé avec précaution dans de ltéthanol. Le précipite gélatineux obtenu est lavé avec de l'éthanol, puis avec de l'eau jusqu'à l'obtention d'un pH neutre dans les bains de lavage. Le chitosan ainsi préparé a un poids moléculaire et un degré d'acétylation semblables à ceux du chitosan obtenu par le procédé conforme au brevet US nO 2 040 879. II a également été décrit de nombreuses variantes de ces procédés dans lesquels le principe de N-désacétylation par des hydroxydes alcalins est conservé, tandis que les temps de réaction, les températures et les concentrations en hydroxydes sont modifiés. Ainsi, il est possible d'obtenir des chitosans acétylés à moins de 10 % en augmentant l'un quelconque de ces paramètres ou plusieurs en même temps. Cependant il est difficile de diminuer le pourcentage d'acétylation sans modifier le degré de polymérisation des molécules. En effet, les conditions drastiques nécessaires à l'hydrolyse de la liaison acétamide en C-2 de l'unité N-acétyl-glucosamine de la chitine sont responsables de l'hydrolyse des liaisons glycosidiques 1-4 entre deux monomères. Ces coupures qui interviennent à n'importe quel niveau le long de la chaine de polymère provoquent une diminution du poids moléculaire moyen de la molécule sans toutefois affecter de façon importante l'indice de polymolécularité. Par ailleurs, tous les procédés utilisés pour la préparation du chitosan, qui font intervenir une N-désacétylation en milieu basique, présentent l'inconvénient de produire des effluents très concentrés en bases, donc très polluants. De plus, les conditions opératoires particulièrement agressives (concentrations élevées en base, hautes températures), très difficiles à stabiliser, ne permettent pas l'obtention de chitosans présentant des qualités reproductibles et sont susceptibles de dégrader le chitosan qui s'en trouve affecté dans ses propriétés. Ces procédés sont mal- adaptés aux impératifs de la production industrielle que sont la productivité et la rentabilité pour une qualité constante du produit. L'un des objectifs du procédé selon l'invention est donc de remédier à ces inconvénients, en diminuant sensiblement, d'une part, les concentrations en hydroxydes alcalins intervenant dans la réaction qui sont traditionnellement comprises entre 40 et 50 % poids/poids et, d'autre part, la température de réaction qui jusqu'alors était supérieure à 1000C. A cet effet, le procédé de préparation de chitosan par N-désacéty lation de chitine en milieu aqueux alcalin et à chaud, qu'elle propose, est caractérisé en ce qu'au moins un alcool est utilisé au moins partiel le ment comme solvant dans le milieu réactionnel. Cette disposition permet de diminuer de façon importante la proportion de base forte par :rapport à celle prévue dans tous les procédés connus. De plus, la présence d'un solvant alcoolique, agissant comme nucléophile en présence de bases minérales à fortes concentrations, permet de réaliser la réaction à des températures peu élevées pendant des durées réactionnelles qui peuvent être très courtes. Les concentrations en base sont comprises entre 23 et 28 % poids/poids, au lieu de 40 à 50 % poids/ poids, dans les techniques usuelles. La température de réaction est inférieure à 1000C et peut être abaissée jusqu'à 20-250C, tandis que. les temps de réaction sont compris entre 2 et 100 heures suivant la température de réaction. De préférence, I'alcool est de l'éthanol et la base est un hydroxyde alcalin tel que l'hydroxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium, et est présente en quantité sensiblement égale à la masse d'eau du milieu réactionnel. Par rapport à la technique de préparation divulguée dans le brevet US n" 2 040 879 et constituant l'art antérieur le plus proche, la quantité de chitine traitée avec la même quantité de base peut être de quinze à vingt fois supérieure. En effet, un paramètre important dans la N-désacétylation de chitine est le rapport eau/hydroxyde alcalin. Ce rapport est généralement compris entre 1,5 et 1, ce qui correspond à des solutions contenant 40 à 50 % en masse d'hydroxydes alcalins. Les quantités de solutions utilisées dans les réactions sont généralement importantes par rapport à la quantité de chitine à traiter, en raison de la faible masse volumique de ce produit lorsqu'il est sous forme de poudre ou de copeaux. L'hydroxyde alcalin est ainsi en très large excès par rapport au nombre de liaisons acétamide à hydrolyser: -Dans le procédé selon le brevet US n" 2 040 879 ou les procédés dérivés, ce très large excès d'hydroxyde alcalin est toujours retrouvé, car il est nécessaire d'utiliser de grands volumes de solution afin d'obtenir ,un milieu réactionnel suffisamment fluide pour être agité et atteindre des conditions de température homogènes dans tout le mélange. Lorsque, conformément à l'invention, un diluant tel que l'éthanol est utilisé, la même quantité de chitine peut être hydrolysée dans le même volume total, mais la quantité de solution concentrée d'hydroxyde alcalin peut être fortement réduite. L'éthanol étant un solvant des hydroxydes alcalins et de l'eau, un milieu homogène fluide est obtenu autour des particules de chitine. De plus, dans un milieu concentré en hydroxyde alcalin, I'éthanol peut s'ioniser sous la forme d'ion éthylate qui peut intervenir dans la réaction d'hydrolyse de la liaison acétamide en C-2 de la chitine, mais également de la liaison osidique entre deux monomères du polysaccharide. Ces possibilités d'hydrolyse des liaisons osidiques sont mises à profit pour l'obtention par cette méthode de chitosan de faible poids moléculaire. Suivant une caractéristique avantageuse de l'invention, un agent réducteur est ajouté dans le milieu réactionnel afin de minimiser les phénomènes d'oxydation par l'oxygène de l'air. Cet agent réducteur peut être par exemple le borohydrure de sodium. Ce produit agit comme un protecteur contre les réactions secondaires indésirables d'oxydation par l'oxygène de l'air. En effet, les conditions basiques de la réaction et les températures élevées favorisent les réactions d'oxydation par l'oxygène, qui sont responsables en partie de l'hydrolyse des liaisons glycosidiques de la chitine et du chitosan en cours de réaction, et donc de la diminution systématique et non toujours souhaitée du poids moléculaire moyen. En présence de ce produit réducteur, les réactions secondaires d'oxydation sont minimisées et il n'est pas nécessaire de réaliser la Ndésacétylation sous atmosphère d'azote. Ce. produit est éliminé totalement sous forme d'acide borique Ou de borate non toxiques, au cours des opérations de purification du chitosan en milieu acide. Il est évident que la méthode objet de l'invention peut être réalisée sans borohydrure de sodium et en l'absence de gaz inerte, en présence de gaz inerte seul ou en présence de borohydrure de sodium et de gaz inerte selon la qualité du chitosan que l'on désire obtenir. Conformément à un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, le procédé consiste à réaliser successivement les étapes suivantes - préparation d'une solution hydroalcoolique, par exemple eau/ éthanol absolu, contenant un agent réducteur tel que le borohydrure de sodium à une concentration de l'ordre de 0,1 à 0,5 % poids/volume, - incorporation d'une base minérale solide telle que l'hydroxyde de sodium dans la solution hydroalcoolique en quantité sensiblement équivalente en masse à l'eau présente, - mélange sous forte agitation dans un réacteur éventuellement équipé d'un système de réfrigération en vue d'obtenir une solution visqueuse biphasique, - mise à la température de réaction, qui est comprise entre 20 et 1000C, - de cette solution visqueuse biphasique constituant le milieu réactionnel, - ajoût de la chitine à l'état sec, à raison de 5 à 35 % poids/volume dans ce milieu réactionnel, - et agitation dudit milieu réactionnel pendant 2 à 100 heures. Une fois la réaction menée à terme, le milieu est versé dans 2 à 10 fois son volume d'eau déminéralisée ou non. Le produit solide est collecté par filtration ou centrifugation, et est lavé à l'eau jusqu'à l'obtention d'effluents à pH compris entre 8 et 9,5. A ce stade, le produit solide peut être récupéré et séché ou bien encore lavé à nouveau par l'éthanol ou d'autres solvant organiques polaires et/ou apolaires. Sa purification peut etre affinée en procédant à une dissolution en milieu acide suivie d'une précipitation en milieu alcalin ou par tout autre moyen approprié et connu en soi. Le rendement de la réaction est supérieur à 93 %. Le chitosan obtenu est d'une qualité excellente et reproductible. I1 possède toutes les caractéristiques qu'on attend de lui pour ses diverses applications dans le domaine médical, pharmaceutique, agro-alimentaire ou autres. Le rapport volume d'éthanol/masse de solution aqueuse de soude à 50 % poids/poids et les paramètres température et temps de réaction définissent les caractéristiques physiques et physicochimiques du chitosan préparé. Le rapport volume d'éthanol/masse de solution aqueuse de soude à 50 % poidsjpoids peut varier de 1 à 3 suivant le poids moléculaire moyen souhaité. Des poids moléculaires moyens élevés, supérieurs à 500 KD sont obtenus lorsque ie rapport est proche de 1, ces poids moléculaires sont diminués lorsque le rapport augmente, les autres paramètres température et temps de réaction restant inchangés. La température de réaction peut varier de 20 à' 1000C, mais à 90"C et pour un rapport voisin de 1, les poids moléculaires moyens obtenus pour le chitosan sont toujours supérieurs à 500 KD. Lorsque la température augmente (1 00 C), et pour un même temps de réaction, le degré d'acétylation diminue parallèlement au poids moléculaire. En revanche, lorsque la température est diminuée, les autres conditions restant égales, un poids moléculaire élevé est obtenu, mais le degré d'acétylation augmente. Enfin, le temps de réaction peut varier de 2 à 100 heures en fonction de la température du milieu et du rapport volume d'éthanol/masse de la solution aqueuse de soude à 50 % poids/poids. En règle générale, lorsque le temps de réaction augmente, on observe une diminution du poids moléculaire ainsi qu'une diminution du degré d'acétylation, quelle que soit la température et la valeur du rapport. A titre d'exemple, lorsque la température est proche de 20-25"C, un temps de réaction de 72 h est nécessaire pour l'obtention d'un chitosan de poids moléculaire compris entre 30 et 150 KD, et d'un degré d'acétylation compris entre 20 et 35 90. Ces valeurs peuvent évidemment varier en fonction de la masse moléculaire et donc de l'origine de la chitine de départ. Lin autre paramètre important dans la réaction N-désacétylation du procédé de l'invention est le rapport volume de chitine/volume de milieu réactionnel. La qualité du chitosan obtenu dans la réaction est dépendante de l'homogénéité des conditions de température dans le volume réactionnel. L'agitation est donc importante et son efficacité dépend de la fluidité de la suspension chitine-milieu d'hydrolyse. Cette fluidité est elle même fonction de la masse volumique de la poudre de chitine utilisée et donc de la granulométrie et de la porosité de la chitine. En règle générale, la proportion en masse de chitine par rapport au volume de milieu réactionnel est comprise entre 7 et 10 % suivant la masse volumique de la chitine utilisée - 7 % de chitine poids/volume pour une masse volumique inférieure à 350 g/l - 10 % de chitine poids/volume pour une masse volumique supérieure à 350 g/I. Ces valeurs peuvent être évidemment diminuées mais peuvent atteindre 30 % pour une chitine de masse volumique très supérieure à 350 g/l. La présente invention sera mieux comprise et ses avantages ressortiront bien de la description qui suit, d'exemples non limitatifs de mise en oeuvre du procédé de préparation de chitosan par N-désacétylation de chitine en milieu basique. Le protocole général du procédé est le suivant A une solution hydroalcoolique eau-éthanol, contenant 0,1-0,5 % poids/volume de borohydrure de sodium est ajouté lentement de l'hydroxyde de sodium solide en quantité équivalente en masse à l'eau présente dans la solution hydroalcoolique. Le mélange est réalisé dans un réacteur muni d'un réfrigérant et sous forte agitation. La solution visqueuse biphasique constituant le milieu réactionnel obtenue est portée à la température de réaction (20-1000C) et la chitine est ajoutée à l'état sec. Le milieu est agité suivant les cas pendant 2 à 100 h, puis est versé dans 2 à 10 fois son volume d'eau déminéralisée ou non.Le produit solide est collecté par filtration ou centrifugation, et lavé à l'eau jusqu'à l'obtention d'effluents à pH 8-9,5. Le produit peut être séché tel quel ou lavé par de l'éthanol ou d'autres solvants organiques polaires et/ou apolaires. II peut être purifié par dissolution en milieu acide suivie d'une précipitation en milieu alcalin ou par toute autre méthode. Exemple 1 Au mélange constitué de 450 g d'eau déminéralisée et 1350 ml d'éthanol absolu sont ajoutés 1,8g de borohydrure de sodium en poudre. Après dissolution complète, 450g d'hydroxyde de sodium en perles sont ajoutés. La dissolution effectuée dans un réacteur s'accompagne d'une forte élévation de température du milieu qui est tempérée par le système de réfrigëration dont est équipé le réacteur. La solution visqueuse biphasique obtenue est portée à la température de 90 + 1"C. Lorsque celle-ci est stabilisée, 150g de chitine non purifiée sous forme de poudre sèche de masse volumique égale à 280g/1 sont ajoutés en une fois au milieu réactionnel. Après 4 heures de réaction, au cours de laquelle une agitation permanente est maintenue, le milieu est versé dans 10 kg d'eau déminéralisée et après 15 minutes d'agitation, le chitosan est collecté par filtration. Il est dispersé dans lO kg d'eau déminéralisée et la suspension est agitée pendant 30 minutes. Le chitosan est récupéré par filtration et séché sous courant d'air chaud (600C) pendant 1 heure. - rendement = 95 % - degré d'acétylation (mesuré par potentiométrie) = 25 % - Poids moléculaire = supérieur à 500.000 Daltons - Pourcentage de NaOH dans le milieu réactionnel = 23 % poids/poids - Rapport Volume d'éthanol =1,5 masse de la solution aqueuse de NaOH à 50 % poids/poids(g) Exemple 2 -Borohydrure de sodium NaBH4 = 1,8g - chitine 150g, masse volumique 280g/l - eau déminéralisée = 450g - hydroxyde de sodium = 450g - éthanol absolu = 1350ml La température de réaction est fixée à 250C et le temps de réaction sous agitation à 72 h. - rendement = 89 % - degré d'acétylation = 18 % - poids moléculaire = 35.000 Daltons - pourcentage de NaOH dans le milieu réactionnel = 23 % poids/poids - rapport volume d'éthanol (ml) =1,5 masse de la solution aqueuse de NaOH à 50 % poids/poids(g) Exemple 3 - Chitine 120g, masse volumique 200 g/l - NaOH = 450g - eau = 450g - éthanol absolu = 900 ml - Borohydrure de sodium NaBH4 = 1,35g La température de réaction est fixée à 90"C et le temps de réaction sous agitation à 4h. - Rendement = 89 % - Degré d'acétylation = 15 % - Poids moléculaire = environ 500.000 Daltons - Pourcentage de NaOH dans le milieu réactionnel = 28 % poids/poids - Rapport volume d'éthanol (ml) =1 masse de la solution aqueuse de NaOH à 50 % poids/poids(g) Revendications 1 - Procédé de préparation de chitosan par N-désacétylation de chitine en milieu aqueux alcalin et à chaud, caractérisé en ce qu'au moins un alcool est utilisé au moins partiellement comme solvant dans le milieu réactionnel. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la température de réaction est comprise entre 20 et 1000C. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caracté risé -en ce que le'tempos de réaction varie entre 2 et 100 heures suivant la température de réaction 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'alcool est de l'éthanol et la base est un hydroxyde alcalin tel que l'hydroxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium. 3 - Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 4, caracté risé en ce que la base est présente en quantité sensiblement égale à la masse d'eau du milieu réactionnel. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caracté risé en ce qu'un agent réducteur est ajouté dans le milieu réactionnel. 7 - - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que cet agent réducteur est le borohydrure de sodium. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 7, caractérisé en ce qu'il consiste à réaliser successivement les étapes suivantes: - préparation d'une solution hydroalcoolique, par exemple eau/éthanol absolu, contenant un agent réducteur tel que le borohydrure de sodium à une concentration de l'ordre de 0,1 à 0,5 % poids/volume, - incorporation d'une base minérale solide telle que l'hydroxyde de sodium dans la solution hydroalcoolique en quantité sensiblement équivalente en masse à l'eau présente, - mélange sous forte agitation dans un réacteur éventuellement équipé d'un système de réfrigération en vue d'obtenir une solution visqueuse biphasique, - mise à la température de réaction, qui est comprise entre 20 et 1000cl de cette solution visqueuse biphasique constituant le milieu réactionnel, - ajoût de la chitine à l'état sec à raison de 5 à 35 % poids/volume dans ce milieu réactionnel, et agitation dudit milieu réactionnel pendant 2 à 100 heures. 9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le rapport volume d'éthanol sur masse de solution aqueuse de soude à 50 96 poids/poids varie entre 1 et 3 suivant le poids moléculaire moyen souhaité. 10 - Procédé selon l'une quelconque des revéndications 1 à 9, caractérisé en ce que la proportion en masse de chitine par rapport au volume de milieu réactionnel est comprise entre 7 et 30 % suivant la masse volumique de la chitine utilisée.