FR 2648151 A1 19901214 FR 8907622 A 19890608 MINI-SATELLITE BOVIN SPECIFIQUE AU CHROMOSOME Y DES BOVINES La possibilité de déterminer le sexe d'animaux à l'état embryonnaire, constitue un sujet d'études et de recherches de première importance. Cette préoccupation revêt notamment un intérêt particulier dans le cas du bétail. En effet, la valeur économique du bétail depend souvent du fait que les animaux sont de sexe mâle ou femelle. Chez les mammifères, une méthode générale de sexage d'embryons consiste à séparer avant fécondation in vitro les spermatozoïdes portant le chromosome sexuel Y, de ceux portant le chromosome sexuel X. Cependant, en dépit des nombreuses recherches réalisées, il n'existe pas à ce jour de méthode de sexage efficace basee sur la séparation des spermatozoïdes porteurs des chromosomes X et Y. Le développement des techniques de transfert d'embryons, et des techniques de conservation des embryons, telles que la cryo-préservation, a conduit d'autre part les scientifiques à imaginer des méthodes de sexage utilisables avec des embryons dont le développement est à un stade prècoce, notamment avant leur implantation dans une femelle réceptrice. Ces différents procédés montrent des efficacites variables. Ils sont basés, soit sur une analyse cytogénétique des cellules embryonnaires, soit sur la recherche de la présence de l'antigène H-Y caractéristique du génome mâle. D'autres procédés consistent en des tests colorimétriques révélateurs de l'activité G6PD glucose 6-phosphate dèshydrogénase (Anderson, G.B. 1986. Voir bibliographie). La possibilité de déterminer le sexe d'embryons humains en utilisant des sondes d4ADN spécifiques du chromosome Y humain, a été également déjà montrée (West, J.D., et al., 1987). Les séquences Y spécifiques chez les animaux domestiques seraient des outils potentiellement très puissants pour déterminer le sexe des embryons de préimplantation avant leur transfert dans une mère receveuse, de même dans le cadre des recherches pour la séparation des spermatozoïdes portant le chromosome Y ou X. Une telle séquence mâle-spécifique chez le cochon à d'ailleurs été récemment publiée (McGraw et al., 1988). Au niveau moléculaire très peu est connu au sujet du chromosome Y bovin. Le bétail présente deux chromosomes sexuels métacentriques qui se distinguent aisément des autosomes acrocentriques. Le chromosome Y ne représente que 2.2% de la longueur chromosomique totale et est beaucoup plus petit que le chromosome X. Leonard et al. (1987) faisait état d'une séquence Y spécifique bovine dont 2000 à 2500 copies seraient présentes, cartographiées ultérieurement sur le bras court du chromosome Y par Popescu et al. (1988). Bondioli et al. (1989) ont isolé trois fragments chromosiques spécifiques au bovin mâle et présents à 2600, 600 et 20 copies par génome respectivement. La séquence nucléotidique de ces fragments n'a pas été déterminée. Ces fragments ont servi comme sondes dans le sexage d'embryons bovins et ont donné des résultats fiables avec un échantillon contenant l'ADN de deux cellules embryonnaires, (approximativement 15ng). La durée de ces essais est de 8 jours, ce qui exige la congélation des embryons après le prélèvement des cellules. La demande de brevet européen 235.046 publiée le 02/09/1987, décrit une sonde d'ADN spécifique du génome mâle de ruminants, pour la détermination du sexe d'embryons, permettant d'obtenir un résultat significatif avec 50 ng d'ADN. La demande de brevet PCT WO 86/07095 publiée le 04/12/1986, décrit également des sondes d'ADN spécifiques du génome mâle de bovins, s'hybridant d'une façon beaucoup plus importante avec un échantillon d'ADN mâle qu'avec un échantillon d'ADN femelle, lorsque les hybridations sont réalisées dans les mêmes conditions. Il était connu d'autre part, que le génome humain ou animal comporte des séquences hypervariables, consistant en des fragments d'ADN se répétant de façon monotone et dont une fraction est polymorphe : le nombre de fragments d'ADN répétés différant d'un individu à l'autre, pour un lieu donné dans le génome. Une partie importante du génome est composée de ces séquences répétées en tandem appelées "ADN satellite". Selon la méthodologie utilisée au départ pour leur étude : centrifugations isopycniques, électrophorèse dans des gels d'agarose, les séquences satellites étaient distribuées dans trois classes de tailles différentes : macro-satellites, midisatellites et mini- satellites. Si les macrosatellites semblent localisées dans les régions hétérochromatiques (Singer, 1982), par contre les mini-satellites sont répartis sur l'ensemble du génome avec cependant des concentrations plus importantes dans les régions proterminales (Royle et al., 1988). Le seul midi-satellite décrit à ce jour a été cartographié sur le bras court du chromosome humain nO 1 en lp (Nakamura et al., 1987b). La fonction de ces satellites pour autant qu'elle existe reste encore à déterminer. L'organisation des séquences répétées en tandem, caracteristique importante de tout satellite, dépend d'une évolution concertée de ces répétitions. I1 est admis que cette évolution concertée résulterait d'une série successives de "crossing-over" inégaux (ou de tout autre mécanisme se conformant au modèle dit du "card deck" (Doolittle, 1985)), qui sont favorisés par la structure de repétitions en tandem mêmes. Le mécanisme de "crossing over" inégaux, que ce soit entre chromatides soeurs ou entre chromosomes homologues, est compatible avec les polymorphismes de taille de même qu'avec le polymorphisme de sites internes observés pour les satellites. On estime généralement que les séquences satellites représentent -238 du génome bovin. Huit macro-satellites bovins ont été décrits au départ, parmi lesquels cinq ont probablement évolués à partir d'un ancêtre commun (Singer, 1982). Aucun satellite étudié dans les premières publications ne s'hybridait de manière significative aux chromosomes Y ou X (Kurnit et al., 1973). La génération d'empreintes génétiques avec un certain nombre de sondes minisatellites suggère l'existence, dans cette espèce aussi, de plusieurs familles de minisatellites hypervariables (Georges et al., 1988). Trois régions du chromosome Y humain sont caractérisées par des séquences satellites : (1) La région hétérochromatique du bras long, essentiellement formée par DYZ-1 et DYZ-2, les représentants Y spécifiques des satellites humains 3 et 1 respectivement (Goodfellow et al., 1985). (2) Un satellite alpha DYZ-3 Y spécifique a été reconnu dans la région centromérique (Goodfellow et al., 1985). (3) Au moins deux séquences répétées en tandem sont cartographiées dans la région pseudoautosomale (Simmler et al., 1987). Dans la présente demande, une séquence satellite bovine localisée dans la région péricentrique du choromosome Y est décrite. Les premières étapes de l'isolement de cette séquence ont pu être effectuées gracie à une séquence décrite par SHIN et al. (1985). Cette publication décrit une séquence d'ADN isolée dans le gène Per de la Drosophile, qui se répète de façon monotone et code pour environ 50 thréonines et glycines alternées. Le bon fonctionnement de ce gène Per est notamment responsable chez a 3 Drosophile, de certains comportements périodiques. La séquence d'ADN codant pour ce gène Per présente également un haut degré de polymorphisme (Yu, Q., et al. , 1987). Dans l'article de SHIN et al. référencée cidessus, il a été montré que cette région "minisatellite" du gène Per était capable de s'hybrider avec des échantillons d'ADN provenant de différentes espèces de vertébrés, telles que le poulet, le chat, la souris et l'homme. On a pu ainsi cloner un fragment d'ADN de q suris appelé pSP64.2.5EI, homologue en partie au gène Per et dont la séquence nucléotidique comprend une région mini-satellite comportant les motifs ACNGGN et TCAGGC dans lesquels N représente l'un quelconque des 4 nucléotides adénine, cytosine, guanine et thymine (Shin et al 1985). Utilisé comme sonde, ce fragment particulier d'ADN, pSP 64.2.5EI, reconnait un grand nombre de séquences polymorphes chez l'homme et différentes espèces animales, donnant lieu à des empreintes génétiques (Georges et al. 1987b & 1988). L'utilisation de cette sonde sur de l'ADN de bétail, ayant subi une restriction par l'une des enzymes de restrictions HaeIII, HinfI, ou MboI, présente chez les femelles une image d'empreinte génétique typique alors que l'image chez les mâles est masquée par un signal intense (figure 1). I1 a donc été montré que cette sonde, déjà connue pour sa capacité à détecter des régions d'ADN mini-satellites dans le génome humain ou animal, était également capable de détecter la présence du chromosome Y dans un échantillon d'ADN de ruminants. (voir demande de brevet français 88/10706). Ce phénomène a suggéré aux inventeurs que pSP64.2.5EI redonnant en dehors des différents locus autosomaux des séquences Y spécifique chez le bétail. Suite à cette observation fortuite, les inventeurs ont utilisé ce clone pSP64.2.5EI apparenté à "Per" dans la première étape de l'isolement de la séquence susceptible d'être spécifique au chromosome Y bovin. Ils ont ensuite cloné et caractérisé cette séquence d'ADN, qui a une taille de 4.2kb et qui a été appelée, btDYZ-l, et cartographiée dans la région du centromère Y. La séquence btDYZ-l a été digérée par l'enzyme de restriction EcoRI, et le fragment EcoRI de 1.2 kb de cette séquence btDYZ-l, appelé Y1.2 a été séquence. Il a été ainsi constaté que ce fragment est formé d'un motif (appelé "X") de 40 paires de bases répété 17 fois et dont la divergence entre les unitts est de 27%. Les motifs X sont séparés l'un de l'autre par des séquences riches en TG, (appelé "Z"), de longueur variable. Les désignations X et Z sont définies plus précisément ci-dessous. Utilisant les segments btDYZ-1 ou Y1.2 comme sondes dans des expériences d'hybridation, les inventeurs ont ensuite démontré que - ces segments d'ADN spécifique du chromosome Y permettent de réaliser le sexage du bovin à partir de 100 picogrammes d'ADN bovin (l'équivalent d'environ 15 cellules); - que ces segments d'ADN reconnaissent une séquence présente sur le chromosome Y au nombre de 100.000 copies environ; - par hybridation in situ que les segments d'ADN clonés correspondent à une zone péricentrique du chromosome Y bovin; - que les segments clones, utilisés comme sonde, mettent en évidence un polymorphisme de taille de fragments de restrictions (RFLP), par exemple avec Hae III, spécifique au chromosome Y et permettent de déterminer des relations de filiation basées. uniquement sur la transmission de matériel Y; - que les nouvelles sondes moléculaires sont utilisables pour le sexage d'autres espèces de bovinés. En outre, dès que la séquence précise de Y1.2 était elucidée, la technique de réaction de polyinérisation en chaine (PCR) a pu être utilise pour amplifier la séquence. La présence d'ADN du chromosome Y bovin a ainsi pu être détectée à partir de 0.5 pg d'ADN génomique bovin purifié. Les séquences amplifiées ont été directement visualisés par fluorescence après addition de bromure d'ethidium. L'invention a pour objet une séquence nucléotidique isolée spécifique au chromosome Y des différentes espèces de la sous-famille des bovinés caractérisée en ce qu'elle comprend - soit la séquence Aa-[(X)p-(Z)n-(W)q]m-Bb dans laquelle X = CNNTTNTCAGCCCTGTGCCCTGGNRAYTGTGNAANNNGTT N = l'une quelconque des 4 nucléotides thymine (ou uracile), guanine, adénine et cytosine; R = purine; Y = pyrimidine, ou un fragment de cette séquence à condition qu'au moins 12 nucléotides consécutifs soient présents, ou une séquence présentant au moins 70% d'homologie avec celle-ci; Z = une sequence nucléotidique riche en TG contenant au moins 50%, de préférence 80% en TG, w = n'importe quelle séquence nucléotidique qui n'est pas X ou Z; A et B = séquences nucleotidiques essentiellement exemptes de séquences présentes dans le chromosome Y bovin; p > l nO q # 0 mrl a = O ou i b = O ou 1 et les séquences X, Z et W peuvent être dans l'ordre indiqué o0 dans un ordre différent; à condition que la séquence X représente au moins 1*, de préférence au moins 30X, de la longueur totale de la partie [(X)p-(Z)n-(W)q]m et que lorsque les valeurs de p, n; q et/ou m sont supérieures à 1, les multiples exemplaires des séquences X, Z, W et/ou [X-Z-W] respectivement peuvent être identiques ou différents; - soit la séquence A@-[S]-Bb dans laquelle S = la séquence complémentaire de la séquence (X > p - (Z)n - (W)q ). ou une séquence qui hybride avec la séquence [(X)p-(Z)a-(W)q]. L'invention concerne également une sonde nucléotidique et son utilisation dans un procédé pour la détection de la présence d'ADN spécifique au chromosome Y des différentes espèces de la sousfamille des bovinés, ladite sonde comportant la séquence [(X)p-(Z)n-(W)q]n. telle que définie plus haut, et éventuellement les moyens appropriés pour la detection d'hybrides formés. N'importe quelle longeur de sonde peut être utilisée, la longueur étant choisie ou déterminée par la méthode de préparation de la sonde. Si, par exemple, la sonde est fabriquée par synthèse chimique, cette dernière peut avantageusement être réalisée de manière à obtenir ladite sonde constituee de jusqu'å +100 motifs de la séquence X. Un autre objet de l'invention est un procédé de détection de la présence d'ADN spécifique au chromosome Y des différentes especes de la sousfamille des bovinés dans un échantillon d'ADN de boviné, caractérisé par les étapes successives suivantes - l'amplification spécifique d'au moins une partie de 1'ADN spécifique au chromosome Y de boviné par la réaction de polymerisation en chaîne (P.C.R.), cette amplification s'effectuant par l'intermediaire d'au moins une amorce nucléotidique, la ou lesdites amorce(s) nucléotidique(s) étant choisie(s) afin d'être soit identique(s), soit complementaire(s) à un segment de la séquence [(X)p-(Z)n-(W > qii définie cidessus, ce- segment contenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence X, soit capable d'hybrider avec ce segment, - la détection de la présence d'ADN spécifiquement ainplifié La séquence W peut être n'importe quelle séquence nucléotidique qui n'est pas X ou Z, par exemple, des linkers, des adapteurs, etc, et ne nuit pas à la spécificité de la sonde, à condition que la séquence X représente au moins 1%, et de préférence au moins 30S de la longueur totale de la partie t a-(W)qiu. Les séquences A et B peuvent être n'importé quelles séquences nucléotidiques, respectivement identiques où différentes,- qui sont essentiellement exemptes de séquences présentes dans le chromosome Y de boviné, par exemple des séquences plasmidiques. La spécificité élevée de la séquence X pour le chromosome Y de bovin permet d'obtenir un signal différentiel entre de 1'AD mâle et femelle, même quand la séquence X ne représente qu'une proportion très faible de la séquence entière. La nature hautement répétitive de la séquence permet l'utilisation de toute une gamme de séquences définie dans la formule générale ci-dessus, la séquence la plus petite qui peut être utilisée étant une séquence de 12 nucléotides consécutifs de la séquence X. Par "capable d'hybrider", il faut comprendre des séquences présentant au'moins 708 d'homologie et qui s'hybrident dans des conditions non-stringentes. La caractérisation de Y1.2 et, par conséquence de btDYZ-l, a révélé que son organisation presente un motif répétées en tandem reminiscent des séquences des familles de satellites, caractérisé neanmoins par une divergence inter-motif peu habituelles. Cette divergence touche les deux parties du motif de répétition : une unité longue de 40 paires de bases appelée par convenance "X" et présentant une divergence moyenne entre unités de 27%, et une partie riche en TG, appelée par convenance "Z", de longueur très variable, qui pourrait résulter de dérapage lors de la réplication. Ces expériences de caractérisation ont été effectuées sur la séquence Y1.2. La nature hautement répétitive et le nombre très élevé de copies du motif répété par chromosome Y ont été interpétés comme signifiant que la séquence totale byDYZ-1 a la même structure que Y1.2. Une étude plus étendue de la séquence totale de btDYZ-l pourrait mettre en évidence un degré d'organisation supérieur présentant une conservation plus importante entre les répétitions, comparable à celle observée dans les satellites alpha humains (Willard et Waye, 1987). Si non, la divergence inter-répétitions pourrait alors refléter une mauvaise homogénéisation des répétitions en tandem résultant éventuellement de l'hémizygocité du chromosome Y. Le nombre de copies du motif répété a été estimé à 1 x 105 copies par chromosome Y. Si on présume que la longueur moyenne du motif répété est de 60 paires de bases, le satellite bt-DYZ-1 s'étend sur environ 6Mb, ou un dixième du chromosome Y bovin. Aucune ressemblance n'était trouvee entre btDYZ-l et les 6 séquences satellites bovines suivantes 1706, 1709, 1711a, 1711b, 1715 et 1720b. Pourtant, on aurait pu s'attendre à une homologie avec l'une ve ces séquences satellites bovines par analogie avec le satellite Y spécifique humain DYZ-3 évidemment apparenté à la famille satellite alpha humain. Le polymorphisme génétique mis en évidence par btDYZ-l dans la sous-famille des Bovins, et dont on suppose qu'il résulte d'un réarrangement des sites de restrictions interne par des "crossing-over" inégaux entre chromatides soeurs ou tout autre mécanisme apparenté, constitue en fait un outil précieux dans l'étude de la généalogie mâle. La possibilité de sexer des embryons des différentes espèces de la sous-famille des bovinés avant implantation est d'un intérêt évident. Le nombre éleVé de copies du motif répété ainsi que la localisation centromérique fait de btDYZ-1 une sonde particulièrement appropriée à cette fin. En effet, on pourrait s'attendre à trouver d'autres séquences hautement répétées provenant de la région hétérochromatique du bras long du chromosome Y de boviné par analogie avec d'autres espèces. Néanmoins, des pertes importantes d'hétérochromatine du bras long ont ét rapportées chez des hommes phénotypiquement normaux, ce qui rend le sexage par ces sondes risqué (Gtodfellow et al., 1985). Les inventeurs ont montré qu'avec la sonde de l'invention, un signal différentiel entre mâles et femelles peut être obtenu avec S 100 pg d'ADN, ce qui correspond à + 15 cellules. En déposant sur une surface plus petite, cette limite peut être réduite d'avantage, par exemple, si on dépose quelques cellules embryonnaires sur des membranes de nitrocellulose ou de nylon, une technique qui a été appelée "embryo blot", et en procédant comme pour les hybridations de colonies. (Voir exemples; hybridations "Dot Blot"). De cette manière un signal différentiel peut être obtenu avec au moins 50 pg d'ADN. La sonde de l'invention peut être utilisée pour effectuer des hybridations in situ. Cette technique d'hybridation in situ permet non seulement de déterminer le vexe d'un membre de la sous-famille des bovinés, mais peut aussi être utilisée dans le cadre de l'invention pour des études de karyotype et de localisation chromosomique. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la réaction de polymérisation en chaine (PCR) est utilisée, pour amplifier lADN male présent dans un échantillon, tout en profitant de l'amplification naturelle de la séquence cible. De cette manière, un signal différentiel peut être obtenu a partir d'une seule cellule qui pourrait être isolée par aspiration, après avoir percé la zona pellucida. La technique de base de la P.C.R. est bien décrite dans la littérature [par exemple, R.K. Saiki et al. 1988]. Pour la P.C.R., il est préférable d'utiliser deux amorces. Au moins, une des amorces doit correspondre à la séquence de 40 bases, X, ou à un fragment comportant au moins 12 bases consécutives de la séquence X. Par "correspondre", il faut entendre dans ce contexte "être identique" ou "être complémentaire" ou "être capable d'hybrider avec". Il peut aussi être envisagé d'utiliser une amorce qui corresponde à la région de jonction entre les deux séquences X et Z, à condition qu'au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence X soient présents. L'utilisation d'une amorce qui contient uniquement des nucléotides de la séquence Z est à éviter en raison du fait que des séquences riches en TG sont également présentes dans le génome de boviné femelle. Une telle amorce pourrait donc conduire à l'amplification d'ADN femelle, et l'obtention d'un signal différentiel entre mâle et femelle serait part conséquence compromise. De préférence, deux amorces sont utilisées pour la PCR qui correspondent chacune à au mqins 12 nucléotides consécutifs de la séquence X, et plus préférablement, à au moins les 12 nucléotides qui forment les extrémités 5' et 3' respectivement de la séquence X. De cette façon, aucun ADN femelle n'est amplifié. La ou les sonde(s) peut (vent) être synthétisée(s) chimiquement à partir de la séquence connue. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, l'ADN amplifié par la PCR est visualisé par fluorescence après addition de bromure d'ethidium (EtBr). Cette technique, mise au joint par les inventeurs et appelée "Drop Stain" (coloration de goutte), s'est révélée particulièrement bien adaptée a l'amplification de la séquence de l'invention. Cette méthode implique l'addition de EtBr directement au mélange réactionnel de la PCR, sans avoir à séparer les fragments de taille différente sur un gel d'agarose. Cependant, dans certaines conditions, l'utilisation d'un tel gel, facilite l'interprétation des résultats obtenus. La mise en évidence d'ADN par fluorescence d'EtBr ne fonctionne que lorsqu'il y a une quantité minimum d'ADN présente dans l'échantillon. La Figure 12 (c),: 3, montre qu'au moins 50 ng d'ADN doivent être présents pour donner un signal visible. Dans la méthode de l'invention, seul un dixième du volume réactionnel final de la PCR (qui contient à l'origine 100 pg ou 10 pg d'ADN génomique purifié,-dit ADN cible) est mesuré, ce qui veut dire que initalement, 10 Da ou 1 Da d'ADN cible est appliqué au gel d'agarose ou est présent dans un ,puit de microtitration. Un signal visible issu d'un tel échantillon ne peut être donc dû qu'à l'amplification de l'ADN cible. Des concentrations trop élevées d'amorce (2 O.1 ug/100p1 chacune) ou d'ADN cible (2 100 pg/100ul) peuvent donner des résultats ambigus lorsqu'on utilise la méthode "Drop Stain" (Voir Fig. 12 (b) : A3 - A8 et B5 - B8). Dans ces conditions, les résultats peuvent être analysés et interprêtés plus précisément par électrophorèse sur un gel d'agarose. Des quantités trop élevées d'amorce donnent naissance à un signal visible correspondant à une bande discrète de poids moléculaire faible sur le gel (voir Fig. 12, , H6, H7, H8, H14, H15 et H16), et peuvent conduire å des hybridations non-spécifiques (et donc à des amplifications non-spécifiques) qui se caractérisent par une légère trainée dans les échantillons femelles (Fig. 12 (a), lanes 4, 6, 8, 14 et 16). Il est à noter que lorsque 0.1 ug de chaque amorce est utilisé il n'y a aucune amorce résiduelle dans des échantillons qui contiennent de 1'ADN de boviné génomique male (Fig. 12', H5 et H13) et une trainee d'ADN spécifiquement amplifiée est visible sur le gel d'agarose (Fig. 12, lanes 5 et 13). En revanche, en présence d'ADN bovin génomique femelle, aucun ADN amplifié n'est visible mais une bande discrète de poids moléculaire bas, qui correspond aux amorces, est mise en évidence. En utilisant ainsi un gel d'agarose, on peut donc faire la différence entre ADN male et femelle, même avec des quantités élévées d'amorce (0.1 ug/100u1 chacune). Par contre, la méthode "Drop Stain" où il n'y a pas de séparation de fragments selon leur taille sur un gel, ne peut pas être utilise pour le sexage avec une telle quantité d'amorce parce que un signal visible est produit à la fois par l'ADN amplifié et par les amorces (Fig. 12b, A5, A6, B5 et B6). En dehors, de l'avantage lié à l'utilisation de concentration faible d'amorce et évoqué dans les paragraphes précédents, c'est-à-dire - l'ADN des amorces ne produit pas de signal fluorescent de fond qui contribuerait au signal global d'EtBr (Fig. 12*, Hl - H4 et H10 - H12), des faibles quantités d'amorces semblent aussi offrir un autre avantage - le poids moléculaire moyen des fragments d'ADN synthétisés au cours de la PCR augmente lorsque la concentration d'amorce initiale diminue jusqu'a une concentration minimum. Une comparaison entre la gamme de poids moléculaire synthétisée avec 1.0 ug d'amorce d'un côté et avec 0.1 ug d'amorce de l'autre côté (voir Fig. 12 (a) voies 13 et 15) 10 pg d'ADN cible mâle étant présent dans chaque cas, montre d'une manière très claire ce phénomène : la gamme des tailles obtenues passe de La concentration d'ADN cible joue également un rôle important dans l'amplification : - lorsque l'ADN cible est présent à raison de moins de 100 pg, des appariements non-spécifiques entre les amorces et de l'ADN cible femelle semblent ne pas avoir lieu, et aucun ADN femelle n'est amplifie (Fig. 12', voies 12, 14 et 16). Ces observations peuvent donc être résumées de la façon suivante - concentration faible d'amorce ('0.05 çg) pas de bruit de fond, et signal très fort. - concentration faible d'ADN cible (de l'ordre de r absence d'appariement non-spécifique entre l'amorce et leADN cible, donc, absence d'amplification d'ADN femelle. Les inventeurs ont appliqué ces procédures, dans l'amplification spécifique d'ADN mâle à un échantillon qui ne contient que l'ADN correspondant à une seule cellule (~ 6 pg ADN) et ont pû par la suite déterminer le sexe du bovin donneur à partir de cette quantité d ' ADN. Normalement, la PCR donne comme résultat un mélange réactionnel qui, sur un gel, donne une ou des bandes discrètes correspondant à des poids moléculaires bien définis. Ce phénomène est dû à l'amplification d'un ou plusieurs loci spécifiques qui sont flanqués par les sites d'appariement des amorces utilisées, ces sites étant présents à simple copie. Par contre, dan d'un cycle de la PCR servent à leur tour d'amorces pour le cycle suivant. Cela donne une population de molécules d'ADN de longueurs différentes (ce qui se caractérise sur un gel d'agarose par une traînée au lieu des bandes distinctes normalement observées) avec un poids moléculaire moyen qui augmente lorsque le nombre de cycles augmente; les petits molécules disparaissent en raison du fait qu'elles ont servi d'amorces; Ce phénomène, qu'on peut appeller "autoamorce", peut s'accompagner plus tard d'éventuels appariements non-spécifiques des régions riches en TG synthét,isées au cours des premiers cycles aux nombreuses régions contenant des TG et qui se trouvent dans la plupart des génomes. Il est à noter que l'amplification spécifique d'ADN mâle, dépend entièrement de l'appariement spécifique initial des amorces à la séquence mâle de 40 pb. Puisque cet appariement initial ne peut pas avoir lieu avec de l'ADN femelle, l'unité de 40 pb n étant pas présent, aucun brin d'ADN n'est amorcé et le polymerase Taq est incapable de synthétiser de 1 'ADN. Pour résumer : le choix de l'amorce De cette façon, un signal différentiel clair entre mâle et femelle est obtenu avec la méthode "Drop Stain". Cette technique de détection avec le bromure d'ethidium appelée par les inventeurs "Drop stain", évite donc de devoir faire appel aux méthodes coûteuses et peu commodes de séparation par électrophorèse sur gel, et permet de déterminer très rapidement le sexe d'un boviné d partir d'une quantité d'ADN extrêmement faible. De plus, puisque les séquences amplifiées sont constituées de régions Pu-Py alternantes, qui adoptent dans des conditions salines appropriées une conformation dite en Z-DNA, une autre façon de détecter rapidement 1'ADN cible serait constituée par un test du type ELISA faisant appel à des anticorps anti-Z-DNA. Cette procédure réduirait de manière importante le temps requis pour un diagnostic de sexe par rapport au temps requis par une procédure d'hybridation d'une sonde. Disposer d'une séquence Y spécifique pourrait aussi faciliter la recherche de méthodes de séparation des spermatozoïdes portant le chromosome Y des spermatozoïdes portant le chromosome X, séparation qui reste un but important de l'élevage. La sonde de l'invention peut être utilisée dans de rrdct ns séparées pour vérifier la fiabilité de ces méthodes de séparation. La figure 1 montre des empreintes de transfert selon la méthode de Southern, appelée "Southern Blot" obtenues avec de 1'ADN génomique bovin digéré par HaeIII et la sonde pSP64.2.5EI apparentée a "Per". La figure 2 montre les "Dot Blots" de quantités variées d'ADN bovin mâle et femelle avec la sonde btDYZ-1 (a), et avec de 1'ADN bovin génomique {b). Un signal positif est obtenu même avec 100 pg d'ADN male, tandis que les échantillons d'ADN femelle étaient toujours négatifs. L'empreinte obtenu avec de 1'ADN génomique total comme sonde montre que des quantités comparables avaient été utilisées pour chaque sexe. La figure 3 montre la séquence Y1.2 de manière à faire ressortir son organisation en motifs répétés en tandem. Chaque motif répété se compose de deux parties distinctes : une unité longue de 40 paires de bases dont la séquence consensus est illustrée, ainsi que les déviations de cette séquence consensus pour chaque unité; et une séquence riche en TG de longueur très variable de motif en motif. Il est à noter que la séquence consensus de 40 bases est CNNTTNTCAGCCCTGTGCCCTGGNRAYTGTGGNAANNNGTT dans laquelle seuls les nucléotides qui sont conservés en raison de 280% ont été retenus. Les nucléotides qui sont conservés à La figure 4 montre l'estimation du nombre de. copies du motif répété par génome mâle. Des quantités définies d'ADN mâle et de Y1.2 ont été hybridées å la sonde Y1.2, permettant l'estimation du nombre de copies à environ 105. Des quantités équimolaires de vecteur (ds M13mpl8) servaient comme contrôle de contamination éventuelle de la sonde avec de l'ADW de M13. La figure 5 est un histogramme qui montre la répartition des grains d'argent apurés hybridation in situ de btDYZ-l sur des chromosomes métaphasiques de taureau. L'histogramme a été fait selon la méthode de Fries et al. La figure 6 montre un étalement de plaque métaphasique bovin avant et après hybridation avec la sonde btDYZ-l. La plaque était colorée avec la moutarde de quinacrine (å gauche) et avec Giemsa (d droite) après hybridation. La flèche indique des grains spécifiques au chromosome Y. Les triangles indiquent des accumulations de grains dans des noyaux interphasiques et représentent sans doute des signaux provenant de séquences Y. La figure 7 montre le polymorphisme du satellite btDYZ-1 dans la race bovine Bleu Blanc Belge. L'image obtenu montre clairement que le taureau nO 5 possède une variante de btDYZ-1 différente aux 4 autres. Les ADN étaient digérés par HaeIII et la sonde utilisée était btDYZ-l. Les marqueurs de taille sont en Kb. La figure 8 montre la conservation de la séquence btDYZ-1 dans la famille Bovinae. Un signal différentiel clair est obtenu entre mâles et femelles avec la sonde btDYZ-1 sur des taches de 100ng d'ADN génomique chez toutes les espèces testées de la sousfamille Bovinae. Aucun signal différentiel n'était observé chez d'autres mammifères, par exemple d'autres Bovidae comme les moutons. La figure 9 montre la séquence Y1.2, les parties soulignées étant les séquences utilisées comme amorce dans la P.C.R. La figure 10 (a) et (b) montrent des images Polaroïd des "Drop Stains" obtenus après la réaction P.C.R. Un dixième du volume réactionnel total de la PCR était mesuré. La figure 11 montre les fragments obtenus par la digestion avec EcoRI de btDYZ-1, et le fait que la séquence Y1.2 constitue le fragment EcoRI de 1.2kb produit de cette digestion. La Figure 12 (a), (b) et (c) montre les résultats obtenus après l'amplification spécifique de l'ADN male au moyen de la PCR. La Figure 13 est un schéma des étapes et cycles successives de la PCR. EXEMPLES Dans les exemples qui suivent, les matériaux et méthodes suivants sont utilisés Extractions d'ADN, restrictions et hybridation de Southern blot Les procédures d'extraction d'ADS, de restriction par digestions enzymatiques et hybridations de Southern blots sont décrits ailleurs (Georges et al., 1987). L'hybridation de "Dot Blots" étaient réalisées selon Anderson et Young (1985) : une feuille de nitrocellulose est immergée dans l'eau, transférée sur du papier Whatman 3MM et transférée pendant 30 minutes dans une solution 20 x ssc. Le filtre est séché à la température ambiante. L'échantillon d'ADN gnomique bovin est appliqué sur le filtre sous la forme d'échantillons de 1 pu dans un tampon TE (Tris-HCl 10 m, pH 8, EDTA 1 mM, pH 8). Les échantillons sont mis à sécher à la température ambiante. L'ADN est dénaturé en plaçant le filtre pendant 5 minutes sur une feuille de papier Whatman 3 MM saturée avec NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M. Ensuite, le filtre est transféré pendant 30 secondes sur un papier Whatman 3 m saturé avec du Tris-HCl 0,5 M, pH 7,4, puis sur un papier Whatman 3 MM saturé avec NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 7,4 pendant 5 minutes. Le filtre est mis à sécher à l'air et cuit à 800C pendant 2 heures. Les conditions de préhybridation, d'hybridation et de lavage sont stringentes, définies ci-dessous. Afin de permettre une normalisation du signal obtenu avec la sonde, des doubles des filtres sont mis à hybrider dans les mêmes conditions avec 500 ng d'ADN génomique bovin, marqué radioactivement avec l'isotope 32 du phosphore par la méthode de Feinberg et ai. (1983). Clonage de btDYZ-1 : 500 ug d'ADN bovin male purifié étaient digérés complètement par MboI et séparés selon la taille par centrifugation dans un gradient de sucrose 10-40%. Après dialyse et précipitation, les fractions > 2kb étaient ligués dans un vecteur pUC13 clivé par BamHI et déphosphorylé. Le clonage ' est fait par transformation dans des bactéries compétentes DH5a (Hanahan, 1985). L'hybridation sur colonies est effectuée selon les procédures habituelles. Séquençage d'ADA': Le sequençage des ADN est fait en utilisant la T7 DNA Polymerase (Pharmacia) engagée dans la réaction de terminaison des chaines, après sous-clonage dans le vecteur Mi3mpl8 et la production de délétions progressives unidirectionnelles par l'exonucléase III. Préparation des chromosomes et identification Des étalements de plaques chromosomiques étaient préparés à partir de lignées cellulaires fibroblastiques par la technique de détachement mitotique. La lignée cellulaire fibroblastique était établie à partir de tissu de foetus bovin mâle. Les chromosomes étaient marqués et identifiés selon Fries et al. (1988). Préparation des sondes : Pour les expériences d'hybridations in situ l'insert de 4.2-kb était marqué par trois nucléotides tritiés (Shin et al., 1985 & Fries et al., 1986). L'activité spécifique des sondes était de t 10 dmp/ug. Hybridation in situ L'hybridation des sondes aux préparations chromosomiques selon Fries et al. (1988) était basée sur la méthode de Harper et Saunders (1981). Les lames d'étalement des plaques chromosomiques sont plongées dans une émulsion K2 d'Ilford pour effectuer les autoradiographies et sont développées après 24 heures d'exposition à 4 C. CONDITIONS D'HYBRIDATION Dans les exemples, les conditions d'hybridation suivantes ont été appliquées A - Conditions non-strinqentes Préhybridation: 35% formamide 6 x SSC 5mM EDTA 0.025% PLE (poudre de lait écrémé) incubation pendant 2 heures à température ambiante. Hybridation idem préhybridation avec la sonde ADN. incubation 12 heures à 420C. Lavage 1 X 1 heure 650C 2 X SSC 0.1% SDS B - Conditions stringentes Préhybridation 50% formamide 6 X SSC (20X) 5mM EDTA (0.5M) 0.25% PLE 100ug/ml ADN sperm d'hareng (lOmg/ml) denaturé. 5 min. à 1000C Hybridation : idem préhybridation, sans ADN sperm d'hareng avec la sonde ADN. incubation 12 heures à 42 C, avec agitation modérée. Lavage 2 X 20 min. temp. amb. 4 X 20 min. 650C 1 X 20 min. 650C 2 X 20 min. 650C 2 X SSC 0.1% SDS 2 X SSC 0.1% SDS 1 x ssc t0 1% SDS 0.1 X SSC 0.1% SDS 1) Clonaqe de btDYZ-1 Afin d'isoler les séquences Y specifiques, 500 pg d'ADN mâle était complètement digérés par MboI et les fragments > 2-kb isolés dans un gradient de s:icrose, puis clonés dans pUC13. Comme prévu à partir des images chez les femelles, au-delà de cette limite de taille, très peu de fragments autosoinaux présentaient une réaction croisée. De plus, en vertu de la distribution des tailles attendues pour un clivage par MboI cette classe devrait être fortement enrichie en séquences Y spécifiques. Si la distribution des longueurs des fragments de restrictions est exponentielle, selon Bishop et al. (1983) les fragments > 2-kb représenteraient +10- du total des fragments MboI (soit +104 fragments) parmi lesquels +20 seraient Y spécifique, ce que laissait supposer les Southern blots. En conséquence +1 clone positif était attendu sur 500 clones criblés. Cette estimation simplifiée ne tient pas compte de la décroissance de l'efficience de clonage avec la taille des fragments a cloner. Apres deux tours de criblage avec la sonde pSP64.2.5EI dans des conditions non-stringentes, dix clones étaient retenus sur +2500 colonies au départ. Ces clones ont servi à leur tour comme sondes sur des "Southern blots" d'ADN mâles et femelles clivés par MboI. A haute stringence, deux de ces clones ont donné un signal sexe spécifique. L'un de ceux-ci, appelé btDYZ-1, donnait un signal très intense chez les mâles et sur ces bases, il a été retenu pour une analyse plus approfondie. La figure 2 montre des "dot blots" d'ADN mâles et femelles hybridés avec la sonde bt DYZ-1 dans des conditions stringentes. Après 16 heures d'exposition un signal positif est visible même sur 100 pg d'ADN mâle, les taches d'ADN femelles restant complètement négatives. Au moins 3 des huit clones restants ont donné des signaux locus spécifiques hypervariables 2) Organisation des rénétitions en tandem L'analyse de-restriction du clone btDYZ-l montre que l'insert est long de 4.2-kb et ne présente pas de sites de restrictions pour XbaI, AccI, SalI, PstI, SphI, SstI, KpnI et SmaI, mais possède deux sites internes EcoRI produisant trois fragments de 0.9, 2.1 et 1.2-kb respectivement (Fig. 11). Le fragment EcoRI-SstI de 1.2-kb a été sous cloné dans M13mpl8 donnant un clone qui a été appelé Y1.2. Ce clone a été ensuite completement séquence par la méthode de terminaison de channe par les dideoxynucléotides, après production de délétions progressives unidirectionnelles par l'exonucléase III. La figure 3 montre que ce fragment est formé d'un motif répété 17 fois en tandem composé de deux parties distinctes : une unité de 40 paires de bases dont la divergence moyenne entre les unités est 27% séparées par une deuxième partie riche en TG de longueur très variable (12 à 63 paires de bases). Cette séquence répétée est présente à environ 105 copies par génome mâle, estimation faite par comparaison de l'intensité des taches d'ADN Y1.2 avec celle obtenue avec de l'ADN bovin mâle, utilisant une sonde faite à partir du fragment EcoRI d'1.2-kb (Fig. 4), et dans des conditions stringentes. L'hybridation croisée observée initialement entre le clone pSP64.2.5EI apparenté au clone btDYZ-1, dans des conditions non-stringentes, pourrait donc être due à l'abondance "en phase" de quadruplets TGTG présents dans la séquence de pSP64.2.5EI (Shin et al., 1987). 3) Localisation Péricentrigue (Hybridation in situ) La distribution des grains d'argent sur les chromosomes métaphasiques hybridés avec btDYZ-l et après autoradiographie est représentée dans l'histogramme de la figure 5. Une plaque métaphasique avant et après hybridation est montrée dans la figure 6. Au total 610 grains étaient localisés sur ou touchant des chromosomes, dans 34 plaques métaphasiques préphotographiées. De ces grains 268 étaient associés au chromosome Y qui représente 2.1* de la longueur du génome bovin haploïde (n'existant qu'en une seule copie par cellule). Aux bandes Ypl3q12 étaient associés 148 grains, indiquant une concentration de grains dans la région centromrique du chromosome Y. Une évaluation statistique de la distribution des grains d'argent par unité de lorieur chromosomique et en supposant une distribution de Poisson, indique que le signal de btDYZ-1 était significatif pour la région Ypl3-q12. 4) Polymorhisme et Conservation Evolutive- Les ADN de 5 taureaux de la race Bleu Blanc Belge. restreint par HaeIII ont été hybridés dans des conditions stringentes avec la sonde btDYZ-l. L'image obtenue (figure 7) montre clairement que 4 de ceux-ci partagent une variante du chromosome Y alors que le dernier possède une variante différente. Le polymorphisme génétique du satellite btDYZ-1 est un outil nous permettant d'étudier la généalogie des males bovins. Une telle étude pourrait également s'étendre aux différentes espèces de la sous famille des Bovinés. En effet, une image nette m le-spFcifique est obtenue chez les taureaux de la race Bleu Blanc Belge (Bos Taurus), Zébu (Bos Indicus), Yack (Bos Mutus), Gaur (Bos Gaurus), Bison d'Amérique (Bison Bison), et le buffle d'Afrique (Svncerus Caffer) (figure 8). Toutes ces espèces appartiennent à la sous famille des Bovinés, ayant divergé il y a environ 25 x 10' années ou moins, en remontant l'arbre évolutif menant à Bos Taurus. Par contre, aucun signal différentiel entre mâles et femelles ne pouvait être observe chez d'autres mammifères parmi lesquels les moutons, même lorsque des conditions moins sévères d'hybridation et de lavage étaient utiJislses. 5) tmplification avec P.C.R. Les amorces utilisées étaient deux oligonucléotides longs de 18 bases chacune Ces séquences ont été choisies å partir de la séquence Y1.2 (voir Fig. 9, les amorces étant soulignées) et synthétisées chimiquement avec un "DNA synthesizer"" [modèle 381A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA EUA.]. Ces séquences sont illustrées ci-dessous amorce (S368) 5' AGGGCACAGGGCTGAGAA 3' amorce (S370) 5' GT . 3' La P.C.R. était effectuée dans des tubes Eppendorf de 500 l dans un volume final de 1001, qui est constitué de 50mM KCl, 10 mM Tris (pH8), 1.5 mM MgCl2, 0.01% (p/v) gelatine, 200uM chacun de dATP, dCTP, dTTP et dGTP, 90 nM (0.05 g) chacune des deux amorces oligonucléotidiques et 2.5 unités de Taq Polymerase [Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Etats-Unis] et le tout était recouvert d'huile minérale. Des quantités variées (100-0.îpg) d'ADN purifié de genome bovin (mâle et femelle) ont été soumis à 40 cycles dans un 'DNA Thermal Cycler [Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT, Etats-Unis]. Pour commencer, les échantillons sont chauffés jusqu'à 930C pendant 1 minute, puis des cycles qui consistent en une étape de dénaturation pendant 1 minute à 930C, une étape de reappariement pendant 1 minute à 550C, et une étape de polymérisation à 720C pendant 2 minutes, sont déclenchés. Après 40 cycles complets, les échantillons sont conservés à 720C pendant 6 minutes, et le PCR est terminé par refroidissement à 150C (voir Fig. i3). Pour effectuer une première visualisation après électrophorèse en gel d'agarose, du tampon de transfert (4 ul) était ajouté à 10 ul (1/10) du mélange réactionnel de la PCR (100 pl) et était soumis à l'électrophorèse horizontale sur un gel de 0,7% agarose dans un tampon TAE (Tris-acetate 40 mM, EDTA 2mM, pH +.7.8). Après migration pendant + 2 heures à + 100 volts, le gel était coloré pendant 20 - 30 minutes dans une solution de 1-2 ug EtBr/ ml Tampon TAE et puis était visualisé avec un transluminateur U.V. . La technique "Drop Stain" permet la visualisation immédiate d'ADN amplifié après la réaction PCR décrite ci-dessus sans devoir passer par l'étape de separation de fragments sur gel d'agarose. La détection d'ADN de chromosome Y bovin spécifiquement amplifié est effectuée dans des plaques de microtitration à 96 puits auxquelles est ajouté lOul de mélange réactionnel de la PCR (ce qui représente un dixième du volume réactionnel total), suivi de 15p1 de solution de bromure d'ethidium (3.3ug/ml Tris-HCl 10mM, EDTA lmM, pH 8.0). L'ADN amplifié est visualisé immédiatement sur un transluminateur à rayons U.V. (302 nm) (Fig. 12 (b)). Une courbe standard était obtenue en mettant des quantités déterminées (0, 25, 50, 100, 250 et 500 ng) d'ADN bovin génomique purifié, dans les plaques de microtitration à 96 puits et en adjustant le volume a 10 ul par l'addition de Tris-HCl 10 mM, EDTA lmM, pH 8.0 (Fig. 12 (C)). La visualisation s'effectuait par "Drop Stain" comme indiqué ci-dessus. Une photo Polaroid du "Drop Stain" (Fig 10") montre que i'utilisation des amorces de l'invention dans une réaction PCR permet l'amplification spécifique de 1'ADN du chromosome Y bovin à partir de '0.5g d'ADN purifié de génome de bovin et donne un signal différentiel clair même avec cette très faible quantité d'ADN. Ce signal est reproductible, comme le démontre la figure 10b, quand 1'ADN provenant de bovins mâle et femelles est soumis à ce test. Cette expérience peut être répétée en utilisant comme échantillon d'ADN une seule cellule d'embryon bovin obtenue par exemple par aspiration, après avoir percé la zona pellucida (technique de Bondioli et,al. 1989). Cette méthode de "Drop Stain" évite donc la nécessité d'utiliser des techniques coûteuses et longues de la séparation par électrophorèse sur gel et ce, parce que aucun ADN femelle n'est amplifié. L'amplification de 0.5pg d'ADN mâle bovin permet d4obtrijr un signal trés clair même a partir a'un dixième du mélange réactionnel total de la PCR (Fig 10a). BIBLIOGRAPHIE - Anderson, G.B. 1986. Identification of sex in mammalian embryos. Dans "Genetic Engineering of animais. An agricultural perspective" Ed. Warren Evans et Alexander Hollaender, Plenum. - Anderson, M.L.., Young, B.D. 1985. Quantitative filter hybridization. in "Nucleic Acid Hybridization", pp73-111, Eds. B. D. Hames and S.J. Higgins, IRL Press, Oxford. - Bishop, D.T., Williamson, J.A., Skolnick, M.H., 1983. A model for restriction fragment length distribution. American Journal of Humain Genetics 35, 795-815. - Bondioli, K.R. Ellis, S.B., Pryor, J.H. williams, M.W. Harpold, M.M. 1989. The use of male-specific chromosomal DNA fragments to détermine the sex of bovine preimplantation embryos. Theriogenology 31, 1, 95-104. - Doolittle, W.F., 1985. RN.k mediated gene conversion ? 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Séquence nucléotidique contenant une partie spécifique au chromosome Y des différentes espèces de la sous-famille des bovinés, caractérisée en ce qu'elle comprend - soit la séquence Aa-[(X)p-(Z)a-(W)g]m-Bb dans laquelle X = CNNTTNTCAGCCCTGTGCCCTGGNRAYTGTGNAANNNGTT N = l'une quelconque des 4 nucléotides thymine (ou uracile) , guanine, adénine et cytosine; R = purine; Y = pyrimidine, ou un fragment de cette séquence à condition qu'au moins 12 nucléotides consécutifs soient présents, ou une séquence présentant au moins 70% d'homologie avec celle-ci; Z = une séquence nucléotidique riche en TG contenant au moins 50%, de préférence 80% en TG, W = n'importe quelle séquence nucléotidique qui n'est pas X ou Z; A et B = séquences nucléotidiques -essentiellement exemptes de séquences présentes dans le chromosome Y bovin; prl n > O q 2 O m > 1 a = O ou 1 b = O ou l et les séquences X, Z et W peuvent être dans l'ordre indiqué où dans un ordre différent; à condition que la séquence X représente au moins 1%, de préférence au moins 30%, de la longueur totale de la partie [(X)p- et que lorsque les valeurs de p, n; q et/ou m sont supérieurs à 1, les multiples exemplaires des séquences X, Z, W et/ou [X-Z-W] respectivement peuvent être identiques ou différents; - soit la séquence Aa-[S]-Bb dans la laquelle S = la séquence complémentaire de la séquence f ou une séquence qui hybride avec la séquence [(X)p-(Z)@-(W)q]m. 2. Sequence selon la revendication 1, caractérisée en ce que a, b, n et q prennent tous la valeur O, et p et m prennent chacun la valeur 1. 3. Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence Y1.2 comme illustré dans la figure 3. 4. Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence Z a une longueur de l'ordre de 12 à 63 nucléotides. 5. Sonde nucléotidique pour la détection de la présence d'ADN spécifique au chromosome Y des différentes espèces de la sous-famille des bovinés dans un échantillon d'ADN de boviné dans des conditions qui permettent l'hybridation entre la sonde et l'ADN de boviné, caractérisée en ce que ladite sonde comprend la séquence [(X)p-(Z)@-(W)q)m de la revendication 1 et éventuellement des moyens appropriés pour la détection des hybrides formés. 6. Procédé de détection de la présence d'ADN spécifique au chromosome Y des différentes espèces de la sous-famille des bovinés, caractérisé en ce qu'on met en contact un échantillon d'ADN de boviné et une sonde salon la revendication 5, dans des conditions qui permettent une hybridation de la sonde et l'échantillon d'ADN. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - la fixation de l'échantillon biologique sur un support approprié, 1'ADN dudit échantillon étant rendu accessible à une hybridation ultérieure, - la réalisation d'une pré-hybridation dudit échantillon obtenu à l'étape précédente de façon à diminuer l'adsorption non-spécifique de la sonde sur le support, - la mise en contact dudit échantillon obtenu à l'étape précédente avec ladite sonde nucléique, la mise en contact etant réalisée dans un milieu et des conditions propres à permettre une hybridation de la sonde avec l'échantillon, - le lavage du support contenant les hybrides formés, - la detection d'un signal spécifique du chromosome Y dans le cas d'ADN provenant d'un mâle. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou ?, caractérisé en ce que l'échantillon d'ADN consiste en un fragment d'ADN, un embryon entier, une ou des cellule(s) embryonnaire(s) ou des spermatozoïdes. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que les conditions d'hybridations sont stringentes. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérise en ce que l'échantillon d'ADN contient au moins 50 pg d'ADN, et plus particulièrement environ 100 pg. 11. Procédé de détection de la présence d'ADN spécifique au chromosome Y des différentes espèces de la sous-famille des bovinés dans un échantillon d'ADN de boviné, caractérisé par les étapes successives suivantes - l'amplification spécifique d'au moins une partie de l'ADN spécifique au chromosome Y de boviné par la réaction de polymerisation en chaîne (P.C.R.), cette amplification s'effectuant par l'intermédiaire d'au moins une amorce nucléotidique, le ou lesdites amorce(s) nucléotidiqu;e(s) étant choisie(s) afin d'être soit identique, soit complémentaire à un segment de la séquence [(X)p~{Z).~(W)q]. définie dans la revendication 1, ce segment contenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence X, soit capable d'hybrider avec ce segment, - la détection de la présence d'ADN spécifiquement amplifié. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'amplification spécifique est effeotue par l'intermédiaire de deux amorces nucléotidiques. 13. Procédé selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce que l'échantillon d'ADN consiste en un fragment d'ADN, une ou des cellule(s) embryonnaire(s) ou des spermatozoïdes. 14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les amorces sont les séquences 5' AGGGCACAGGGCTGAGAA 3'; 5' GGCGACTGTGCAAC GT 3' 15. Procédé selon les revendications 11 et 12, caractérisé en ce que l'échantillon biologique contient au moins 0,5 pg d'ADN. 16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la concentration des amorces est d'environ 90 nM (0.05 ug/lOOul) 17. Procédé selon les revendications 11 et 13, l'ADN amplifié est visualise par l'addition de bromure d'ethidium 18. Séquence nucléotidique isolée, capable de jouer le rôle d'amorce dans la réaction de polymérisation en chaine (P.C.R.! pour l'amplification d'ADN spécifique au chromosome Y des différentes espèces de la sous-famille des bovinés, caractérisé en ce qu'elle est identique ou complémentaire à un segment de la séquence [(X)P-(Z)D-(W)a] définie dans la revendication 1, ce segment contenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence X, ou en ce qu'elle est capable d'hybrider avec ce segment. 19. Utilisation de la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour la détermination du sexe d'embryons des différentes espèces de la sous-famille des bovinés 20. Utilisation de la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour la vérification de la fiabilité des méthodes de séparation de spermatozoXdes portant le chromosome sexuel Y et ceux portant le chromosome sexuel X. 21. Utilisation de la séquence selon l'une des revendications 1 à 4 pour étudier la généalogi- mâle d'espèces appartenant à la sous-famille des bovines en exploitant le polymorphisme mis en évidence par ladite séquence sur le chromosome Y. 22. Kit pour le sexage des différentes espèces de la sous-famille des bovinés caractérisé en ce qu'il comprend - au moins une sonde telle que définie dans la revendication 5, - les solutions tampons et composés nécessaires pour la préparation des milieux d'hybridation et de préhybridation, - éventuellement un ADN mâle témoin. 23. Kit pour le sexage des différentes espèces de la sous-famille des bovinés caractérisé en ce qu'il comprend - au moins une séquence amorce telle que définie dans la revendication 19, - les quatre desoxynucleotides dATP, dCTP, dTTP ou dUTP et dGTP, - les solutions tampons et composés nécessaires pour l'affection de la réaction de polymérisation en chaîne, - éventuellement un ADN mâle témoin, - éventuellement des moyens appropriés pour la détection ce l'ADN amplifié.