FR 2657167 A1 19910719 FR 9000457 A 19900116 PROCEDE DE DEPISTAGE PRENATAL IN VITRE DE LA TRISOMIE 21 FOETALE DANS UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE SUSCEPTIBLE DE CONTENIR DE L'hCG ET NECESSAIRE POUR SA MISE EN oeUVRE. La présente invention concerne un procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 dans un échantillon susceptible de contenir de la gonadotropine chorionique humaine ainsi que le nécessaire ou "kit" pour la mise en oeuvre de ce procédé. La gonadotropine chorionique humaine, ci-après dénommée hCG est une hormone glycoprotéique d'un poids moléculaire de 48000 qui est constituée de deux sous-unités polypeptidiques alpha et bêta. La sous-unité alpha est commune à plusieurs hormones, la LH, la FSH, la TSH; la sous-unité bêta confère à l'hormone sa spécificité immunologique. L'activité biologique de lthormone requiert l'association des deux sous-unités alpha et bêta de l'hCG, ci-après dénommée hCG totale. Le dosage de l'hCG totale est utilisé pour le diagnostic de la grossesse, comme cela est proposé notamment dans la demande de brevet français NO 2 407 475. Le dosage de lThCG totale a également été proposé pour le dépistage prénatal de la trisomie 21 foetale (voir notamment RUTA, D. A. et al, The Lancet, 24 septembre 1988, page 752; WHITE, I. et al,The New England Journal of Medicine, Vol. 320, NO. 6, 9 février 1989) Le dosage de l'hCG totale, entre la 14ème et la 18ème et préférentiellement entre 14ème et la 15ème semaine d'aménorrhée, permet de sélectionner un groupe de femmes à risque accru de trisomie 21 foetale. Dans ce groupe, les concentrations sériques en hCG totale se situent au-dessus d'une médiane déterminée chez des femmes à grossesse dite "normale". L'étude clinique rétrospective effectuée par la demanderesse chez des femmes jeunes, moins de 38 ans a permis de confirmer cette observation. Le dosage de l'hCG totale permet de détecter environ 50 % des trisomies. L'invention a pour but d'améliorer la sensibilité du test afin de diminuer le nombre de femmes dans le groupe à risque et donc de diminuer le nombre de caryotypes à effectuer. Un autre but du procédé de l'invention est de s'appliquer à l'ensemble des femmes enceintes, quel que soit leur âge. Ces buts sont atteints selon l'invention qui fournit un procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 dans un échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG caractérisé en ce qu'il comprend - le dosage des chaînes bêta de l'hCG dissociées des chaînes alpha, ci-après dénommées hCG bêta libre, entre la 14ème et la 18même semaine d'aménohrrée; - le dosage des chaînes bêta de 1'hCG dissociées ou non des chaînes alpha, ci-après dénommées hCG bêta totale, dans le même échantillon; hCG bêta libre - la comparaison du rapport hCG bêta totale à hCG bêta libre une valeur seuil correspondant au rapport hCG bêta totale normale, mesurée la même semaine. Les travaux de recherche menés par la demanderesse ont permit d'affiner le dépistage des femmes porteuses de foetus trisomique 21 en complétant le dosage de lthCG totale par celui des chaînes bêta de l'hCG dissociées des chaînes alpha et par celui des chaînes bêta de l'hCG dissociées ou non des chaînes alpha et en comparant le hCG bêta libre rapport hCG bêta totale à une valeur seuil correspondant au hCG bêta libre rapport hCG bêta totale déterminé chez des femmes à grossesse dite "normale" la même semaine d'aménohrrée. Le cumul des deux dosages hCG bêta libre et hCG bêta totale sur un même échantillon permet de détecter 82 % des Trisomies 21 au lieu de 50 % avec le seul dosage de l'hCG totale. Le dosage de l'hCG bêta totale et/ou le dosage de l'hCG bêta libre sont avantageusement réalisés par des tests immunoenzymatiques, immunofluorescents, radioimmunologiques ou de radioimmunoprécipitation. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de l'invention les dosages de l'hCG bêta totale et de l'hCG bêta libre sont réalisés par des tests immunologiques basés sur la méthode du "sandwich". Les tests immunologiques de types "sandwich" reposent sur la formation de complexes ternaires de la substance antigénique à doser, d'un premier anticorps insolubilisé et d'un deuxième anticorps marqué et lié à l'antigène en un site différent de celui reconnu par le premier anticorps. De manière avantageuse les dosages de l'hCG bêta totale et de l'hCG bêta libre sont réalisés de la façon suivante - le dosage de l'hCG bêta totale est réalisé par un test immunologique de type "sandwich" utilisant deux anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG, lesdits anticorps liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non. - le dosage de l'hCG bêta libre est réalisé par un test immunologique de type "sandwich" utilisant deux anticorps spécifiques de la chaîne bêta de lthCG, lesdits anticorps liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles uniquement lorsque les chaînes bêta de l'hCG sont dissociées des chaînes alpha. La sous-unité alpha étant commune à plusieurs hormones, on préfère, afin d'éviter toute interférence avec d'autres hormones éventuellement présentes dans l'échantillon biologique, utiliser des anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG. La chaîne bêta pouvant exister soit sous forme libre, soit associée à la chaîne alpha, certains sites ne sont accessibles que lorsque la chaîne bêta est libre, d'autres sites ne sont accessibles que lorsque la chaîne bêta est associée à la chaîne alpha, d'autres enfin sont accessibles que la chaîne bêta soit associée ou non à la chaîne alpha. On préfère donc, afin d'augmenter la spécificité du test, utiliser pour le dosage de I'hCG bêta totale deux anticorps liant l'antigène en deux sites différents accessibles que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non, et pour le dosage de l?hCG bêta libre deux anticorps liant l'antigène en deux sites différents accessibles uniquement lorsque les chaînes bêta de l'hCG sont dissociées des chaînes alpha. Les dosages de 1'hCG bêta totale et de l'hCG bêta libre selon des tests immunologiques basés sur la méthode du "sandwich" peuvent être effectués suivant plusieurs protocoles différents, notamment les trois protocoles suivants - Un premier protocole consiste à mettre en contact l'échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG d'abord avec l'anticorps insolubilisé puis après un éventuel lavage avec l'anticorps marqué; - Un second protocole consiste à mettre en contact l'échantillon biologique d'abord avec l'anticorps marqué puis après un éventuel lavage avec l'anticorps insolubilisé. - Un troisième protocole consiste à mettre en contact l'échantillon simultanément avec les deux anticorps. De manière plus précise le procédé de dépistage de la Trisomie 21 de l'invention comprend, selon le troisième protocole, les étapes suivantes a - mise en contact d'une première fraction de l'échantillon biologique avec deux anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles uniquement lorsque les chaînes bêta de lthCG sont dissociées des chaînes alpha; l'un des anticorps étant marqué, l'autre étant insolubilisé; b - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation du complexe ternaire insoluble; c - séparation de l'échantillon et de l'anticorps marqué ayant pas réagi;; d - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n'ayant pas réagi; e - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (d) avec la quantité d'anticorps marqué mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux étapes (a) à (c), ledit échantillon témoin étant dépourvu de chaîne bêta d'hCG libres, pour déterminer la présence d'hCG bêta libre dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (d) avec la quantité d'anticorps marqué mesurée dans des échantillons contenant des quantités connues de chaînes bêta d'hCG libres et préparés conformément aux étapes (a) à (c) pour déterminer la concentration en hCG bêta libre dans l'échantillon;; f - mise en contact d'une seconde fraction de l'échantillon biologique avec deux anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non; l'un des anticorps étant marqué, l'autre insolubilisé; g - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation du complexe ternaire insoluble; h - séparation de l'échantillon et de l'anticorps marqué n'ayant pas réagi; i - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n'ayant pas réagi;; j - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (i) avec la quantité d'anticorps marqué mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux etapes (f) à (h), ledit échantillon témoin étant dépourvu de chaînes bêta d'hCG, pour déterminer la présence d'hCG bêta totale dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (i) avec la quantité d'anticorps mesurée dans des échantillons contenant des quantités connues de chaîne bêta d'hCG et préparés conformément aux étapes (f) à (h) pour déterminer la concentration en hCG bêta totale dans l'échantillon, k - comparaison du rapport hCG bêta libre / hCG bêta totale à une valeur seuil correspondant au rapport hCG bêta libre / hCG bêta totale normale, mesurée la même semaine d'aménohrrée. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de dépistage de la Trisomie 21 selon l'invention, les dosages de l'hCG bêta libre et de l'hCG bêta totale sont réalisés par des tests immunologiques de type "sandwich" utilisant trois anticorps, un premier anticorps insolubilisé, un deuxième anticorps marqué et un troisième anticorps identique au deuxième anticorps non marqué. L'utilisation d'un troisième anticorps permet de désaturer le deuxième anticorps et ainsi d'éviter l'effet crochet encore dénommé effet "Hook" dû à un excès d'antigène dans l'échantillon, ce troisième anticorps reconnait le même site que le deuxième anticorps mais n'est pas marqué. Pour améliorer la sensibilité et la spécificité du procédé au moins un des anticorps utilisés est un anticorps monoclonal. Selon une forme de mise en oeuvre préférée de l'invention la marque des anticorps marqués est choisie dans le groupe comprenant un isotope radioactif, une enzyme, une substance fluorescente, une molécule chargée électriquement, une particule colorée, la biotine, un composé organométallique et l'examen est effectué au moyen d'une méthode adaptée, radiométrique, fluorimétrique, enzymatique, électrique, colorimétrique ou par absorption des rayonnements infra-rouges. L'invention a également pour objet de fournir un nécessaire ou "kit" pour la mise en oeuvre du procédé de dépistage de la Trisomie 21 selon l'invention, comprenant au moins - une quantité donnée de deux anticorps monoclonaux spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG et liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles uniquement lorsque les chaînes bêta de l'hCG sont dissociées des chaînes alpha; l'un des anticorps étant marqué, l'autre étant insolubilisé; - une quantité donnée de deux anticorps monoclonaux spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non; l'un des anticorps étant marqué, l'autre insolubilisé; - des réactifs permettant la détection des anticorps marqués. De manière avantageuse le "kit" précédent comprend une quantité donnée de deux anticorps monoclonaux non marqués spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG, chacun liant l'antigène en un site identique de celui reconnu par chacun des anticorps marqués. Le procédé de dépistage de la Trisomie 21 selon l'invention repose sur le dosage de l1hCG bêta libre et de l'hCG bêta totale, ces deux dosages peuvent être réalisés comme décrit précédemment en parallèle sur deux fractions du même échantillon mais ils peuvent être également réalisés simultanément sur une fraction unique de l'échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG. Le dosage simultané de l'hCG bêta libre et de l'hCG bêta totale peut alors être effectué selon les quatres protocoles suivants 1) Le dosage simultané de l'hCG bêta libre et de l'hCG totale est effectué selon un test immunologique de type "sandwich" utilisant les quatre anticorps spécifiques de la chaînes bêta de l'hCG suivants - un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha; - un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le premier anticorps;; - un troisième anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha; - un quatrième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le troisième anticorps. L'échantillon est mis en contact avec ces quatres anticorps pendant une durée suffisante pour la formation d'une part des complexes ternaires insolubles du premier anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG libre et du deuxième anticorps, et d'autre part des complexes ternaires insolubles du troisième anticorps, de l'hCG totale et du quatrième anticorps. On mesure les quantités des deuxième et quatrième anticorps marqués engagées dans les complexes ou n'ayant pas réagi et l'on met en relation les quantités mesurées avec des standards et des témoins afin de déterminer les concentrations en hCG totale et en hCG bêta libre. La concentration en hCG bêta totale est déterminée en additionnant les concentrations en hCG bêta libre et en hCG totale. 2) Le dosage simultané de l'hCG bêta libre et de lthCG totale est effectué selon un test immunologique de type "sandwich" utilisant les trois anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG suivants - un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que la chaîne bêta de l'hCG soit dissociée ou non de la chaîne alpha; - un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant donc différent de celui reconnu par le premier anticorps;; - un troisième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha, ledit site étant donc différent de ceux reconnus par le premier et le deuxième anticorps. Le premier anticorps va lier toute les chaînes bêta de l'hCG quelles soient libres ou associées aux chaînes alpha, le deuxième anticorps va reconnaître spécifiquement les chaînes bêta libres et le troisième anticorps va reconnaître spécifiquement les chaînes bêta associées aux chaîne alpha, les deuxième et troisième anticorps étant marqués différemment il sera possible de mesurer sélectivement les concentrations en hCG totale et en hCG bêta libre. L'échantillon est mis en contact avec ces trois anticorps pendant une durée suffisante pour la formation d'une part des complexes ternaires insolubles du premier anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG libre et du deuxième anticorps, et d'autre part des complexes ternaires insolubles du premier anticorps, de l'hCG totale et du deuxième anticorps. On mesure les quantités des deuxième et troisième anticorps marqués engagées dans les complexes ou n'ayant pas réagi et l'on met en relation les quantités mesurées avec des standards et des témoins afin de déterminer les concentrations en hCG totale et en hCG bêta libre. La concentration en hCG bêta totale est déterminée en additionnant des concentrations en hCG bêta libre et hCG totale. 3) Le dosage simultané de l'hCG bêta libre et de l'hCG bêta totale est effectué selon un test immunologique de type "sandwich" utilisant les trois anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG suivants - un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de lthCG en un site accessible que la chaîne bêta de l'hCG soit dissociée ou non de la chaîne alpha; - un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur et liant la chaîne bêta de lthCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant donc différent de celui reconnu par le premier anticorps;; - un troisième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non, ledit site étant donc différent de ceux reconnus par le premier et le deuxième anticorps. Le premier anticorps va lier toutes les chaînes bêta de l'hCG quelles soient libres ou associées aux chaînes alpha, le deuxième anticorps va reconnaître spécifiquement les chaînes bêta libres et le troisième anticorps va reconnaître toutes les chaînes bêta de l'hCG quelles soient libres ou associées aux chaînes alpha, le deuxième et le troisième anticorps étant marqués différemment il sera possible de mesurer sélectivement et directement les concentrations en hCG bêta totale et en hCG bêta libre. L'échantillon est mis en contact avec ces trois anticorps pendant une durée suffisante pour la formation d'une part des complexes ternaires insolubles du premier anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG associée à la chaîne alpha et du deuxième anticorps, et d'autre part des complexes quaternaires insolubles du premier anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG libre, du deuxième et du troisième anticorps. On mesure les quantités des deuxième et troisième anticorps marqués engagées dans les complexes ou n'ayant pas réagi et lton met en relation les quantités mesurées avec des standards et des témoins afin de déterminer directement les concentrations en hCG bêta totale et en hCG bêta libre. 4) Le dosage simultané de l'hCG bêta libre et de l'hCG bêta totale est effectué selon un test immunologique de type "sandwich" utilisant les quatre anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG suivants - un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de lthCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha; - un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le premier anticorps;; - un troisième anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha; - un quatrième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de lthCG en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de lthCG soient dissociées ou non, ledit site étant donc différent de ceux reconnus par le premier, le deuxième et le troisième anticorps. Le premier anticorps va lier uniquement les chaînes bêta de l'hCG libres, le deuxième anticorps va reconnaître spécifiquement les chaînes bêta libres, le troisième anticorps va reconnaître spécifiquement les chaînes bêta de l'hCG associées aux chaînes alpha et le quatrième anticorps va lier toutes les chaînes bêta de l'hCG quelles soient libres ou associées aux chaînes alpha; le deuxième et le quatrième anticorps étant marqués différemment il sera possible de mesurer sélectivement et directement les concentrations en hCG bêta totale et en hCG bêta libre. L'échantillon est mis en contact avec ces quatres anticorps pendant une durée suffisante pour la formation d'une part des complexes ternaires insolubles du troisième anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG associée à la chaîne alpha et du quatrième anticorps, et d'autre part des complexes quaternaires insolubles du premier anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG libre, du deuxième et du quatrième anticorps. On mesure les quantités des deuxième et quatrième anticorps marqués engagées dans les complexes ou n 'ayant pas réagi et l'on met en relation les quantités mesurées avec des standards et des témoins afin de déterminer directement les concentrations en hCG bêta totale et en hCG bêta libre. Les quatres protocoles précédents reposent sur le marquage différent des deux anticorps marqués, dans le cas dtun dosage immunoenzymatique on peut par exemple utiliser un anticorps marqué par la phosphatase et un anticorps marqué par la peroxydase, la mesure sera effectuée simultanément et sélectivement en révélant chaque enzyme avec son substrat. Ces dosages simultanés permettent un meilleur rendement du procédé de dépistage de la Trisomie 21 de l'invention, qui peut alors être mis en oeuvre en utilisant les nécessaires ou "kit" suivants Un premier kit comprenant au moins - une quantité donnée d'un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha; - une quantité donnée d'un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de lthCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le premier anticorps;; - une quantité donnée d'un troisième anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de lthCG est associée à la chaîne alpha; - une quantité donnée d'un quatrième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le troisième anticorps; - des réactifs permettant la détection des anticorps marqués. Un second kit comprenant au moins - une quantité donnée d'un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que la chaîne bêta de l'hCG soit dissociée ou non de la chaîne alpha; - une quantité donnée d'un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha; - une quantité donnée d'un troisième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de llhCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de 1'hCG est associée à la chaîne alpha; - des réactifs permettant la détection des anticorps marqués. Un troisième kit comprenant au moins - une quantité donnée d'un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que la chaîne bêta de l'hCG soit dissociée ou non de la chaîne alpha; - une quantité donnée d'un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha; - une quantité donnée d'un troisième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non; - des réactifs permettant la détection des anticorps marqués. Un quatrième kit comprenant au moins - une quantité donnée d'un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha; - une quantité donnée d'un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le premier anticorps; - une quantité donnée d'un troisième anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha;; - une quantité donnée d'un quatrième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de lthCG soient dissociées ou non; - des réactifs permettant la détection des anticorps marqués. Il est admis que dans un même échantillon la concentration en chaîne bêta libre est très inférieure à la concentration en chaînes bêta associées aux chaînes alpha; aussi le procédé de dépistage in vitre de la trisomie 21 selon l'invention, peut être effectué en première approximation à partir des dosages dans un même échantillon de l'hCG bêta libre et de l'hCG totale, entre la 14ème et la 18ème semaine d'aménohrrée, et en comparant le rapport hCG bêta libre /hCG totale à une valeur seuil correspondant au rapport hCG bêta libre /hCG totale normale, mesurée la même semaine. Cette valeur seuil est mesurée chez des femmes à grossesse dite "normale" la même semaine d'aménohrrée. La présente invention a été décrite au moyen d'exemples de mise en oeuvre sans pour autant être limitée à la forme particulière de ces exemples. De nombreuses modifications peuvent être envisagées sans sortir de l'étendue de l'invention, notamment en ce qui concerne les protocoles de dosage de l'hCG bêta totale, de l'hCG totale et de lthCG bêta libre. REVENDICATIONS 1 - Procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 dans un échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG, caractérisé en ce qu'il comprend - le dosage de l'hCG bêta libre, entre la 14ème et la 18ème semaine d'amenohrrée; - le dosage de l'hCG bêta totale dans le même échantillon; - la comparaison du rapport hCG bêta libre / hCG bêta totale à une valeur seuil correspondant au rapport hCG bêta libre / hCG bêta totale normale, mesurée la même semaine. 2 - Procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dosage de l'hCG bêta totale et/ou le dosage de l'hCG bêta libre sont réalisés par des tests immunoenzymatiques, immunofluorescents, radioimmunologiques ou de radioimmunoprécipitation. 3 - Procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les dosages de l'hCG bêta totale et de l'hCG bêta libre sont réalisés par des tests immunologiques basés sur la méthode du "sandwich". 4 - Procédé de dépistage prénatal in vitro de la trisomie 21 selon la revendication 3, caractérisé en ce que le dosage de lthCG bêta totale est réalisé par un test immunologique de type "sandwich" utilisant deux anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG, lesdits anticorps liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non, et en ce que le dosage de l'hCG bêta libre est réalisé par un test immunologique de type "sandwich" utilisant deux anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG, lesdits anticorps liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles uniquement lorsque les chaînes bêta de l'hCG sont dissociées des chaînes alpha. 5 - Procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 dans un échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG, selon l'une quelconques des revendications 3 et 4, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a - mise en contact d'une première fraction de l'échantillon biologique avec deux anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles uniquement lorsque les chaînes bêta de l'hCG sont dissociées des chaînes alpha; l'un des anticorps étant marqué, l'autre étant insolubilisé; b - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation du complexe ternaire insoluble; c - séparation de l'échantillon et de l'anticorps marqué n'ayant pas réagi; d - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n ayant pas réagi;; e - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (d) avec la quantité d'anticorps marqué mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux étapes (a) à (c), ledit échantillon témoin étant dépourvu de chaîne bêta d'hCG libre, pour déterminer la présence d'hCG bêta libre dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (d) avec la quantité d'anticorps marqué mesurée dans des échantillons contenant des quantités connues de chaînes bêta d'hCG libres et préparés conformément aux étapes (a) à (d) pour déterminer la concentration en hCG bêta libre dans l'échantillon;; f - mise en contact d'une seconde fraction de l'échantillon biologique avec deux anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non; l'un des anticorps étant marqué, l'autre insolubilisé; g - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation du complexe ternaire insoluble; h - séparation de l'échantillon et de l'anticorps marqué n'ayant pas réagi; i - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n ayant pas réagi;; j - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (i) avec la quantité d'anticorps marqué mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux étapes (f) à (h), ledit échantillon témoin étant dépourvu de chaîne bêta d'hCG, pour déterminer la présence d'hCG bêta totale dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (j) avec la quantité d'anticorps mesurée dans des échantillons contenant des quantités connues de chaîne bêta d'hCG et préparés conformément aux étapes (f) à (h) pour déterminer la concentration en hCG bêta totale dans l'échantillon, k - comparaison du rapport hCG bêta libre /hCG bêta totale à une valeur seuil correspondant au rapport hCG bêta libre /hCG bêta totale normale, mesurée la même semaine. 6 - Procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que les dosages de l'hCG bêta libre et de l'hCG bêta totale sont réalisés par des tests immunologiques de type "sandwich" utilisant trois anticorps, un premier anticorps insolubilisé, un deuxième anticorps marqué et un troisième anticorps identique au deuxième anticorps non marque. 7 - Procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce qu'au moins un des anticorps utilisé est un anticorps monoclonal. 8 - Procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que la marque des anticorps marqués est choisie dans le groupe comprenant un isotope radioactif, une enzyme, une substance fluorescente, une molécule chargée électriquement, une particule colorée, la biotine, un composé organo-métallique et l'examen est effectué au moyen d'une méthode adaptée, radiométrique, fluorimétrique, enzymatique, électrique, colorimétrique ou par absorption des rayonnements infra-rouges. 9 - Nécessaire pour la mise en oeuvre d'un procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 dans un échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG, selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend au moins - une quantité donnée de deux anticorps monoclonaux spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles uniquement lorsque les chaînes bêta de lthCG sont dissociées des chaînes alpha;; l'un des anticorps étant marqué, l'autre étant insolubilisé - une quantité donnée de deux anticorps monoclonaux spécifiques de la chaîne bêta de l1hCG liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non; l'un des anticorps étant marqué, l'autre insolubilisé, - des réactifs permettant la détection des anticorps marqués. 10 - Nécessaire pour la mise en oeuvre d'un procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 dans un échantillon selon la revendication 9, carâctérisé en ce qu'il comprend une quantité donnée de deux anticorps monoclonaux non marqués, spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG, chacun liant l'antigène en un site identique de celui reconnu par chacun des anticorps marqués. il - Procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on effectue le dosage simultané de l'hCG bêta libre et de l'hCG totale selon un test immunologique de type "sandwich" utilisant les quatres anticorps spécifiques de la chaînes bêta de l'hCG suivants - un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha; - un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le premier anticorps;; - un troisième anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha; - un quatrième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le troisième anticorps. 12 - Procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on effectue le dosage simultané de l'hCG bêta libre et de lthCG totale selon un test immunologique de type "sandwich" utilisant les trois anticorps spécifiques de la chaînes bêta de l'hCG suivants - un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que la chaîne bêta de l'hCG soit dissociée ou non de la chaîne alpha; - un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant donc différent de celui reconnu par le premier anticorps;; - un troisième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha, ledit site étant donc différent de ceux reconnus par le premier et le deuxième anticorps. 13 - Procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on effectue le dosage simultané de l'hCG bêta libre et de l'hCG totale selon un test immunologique de type "sandwich" utilisant les trois anticorps spécifiques de la chaînes bêta de l'hCG suivants - un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que la chaîne bêta de l'hCG soit dissociée ou non de la chaîne alpha; - un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de lthCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant donc différent de celui reconnu par le premier anticorps;; - un troisième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non, ledit site étant donc différent de ceux reconnus par le premier et le deuxième anticorps. 14 - Procédé de dépistage prénatal in vitro de la trisomie 21 selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on effectue le dosage simultané de l'hCG bêta libre et de l'hCG totale selon un test immunologique de type "sandwich" utilisant les quatre anticorps spécifiques de la chaînes bêta de 1'hCG suivants - un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne beta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha;; - un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le premier anticorps; - un troisième anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha; - un quatrième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociée ou non, ledit site étant donc différent de ceux reconnus par le premier, le deuxième et le troisième anticorps. 15 - Nécessaire pour la mise en oeuvre d'un procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 dans un échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG, selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend au moins - une quantité donnée d'un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha; - une quantité donnée d'un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le premier anticorps;; - une quantité donnée d'un troisième anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha; - une quantité donnée d'un quatrième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le troisième anticorps; - des réactifs permettant la détection des anticorps marqués. 16 - Nécessaire pour la mise en oeuvre d'un procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 dans un échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG, selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend au moins - une quantité donnée d'un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que la chaîne bêta de l'hCG soit dissociée ou non de la chaîne alpha; - une quantité donnée d'un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha;; - une quantité donnée d'un troisième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha; - des réactifs permettant la détection des anticorps marqués. 17 - Nécessaire pour la mise en oeuvre d'un procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 dans un échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG, selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend au moins - une quantité donnée d'un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que la chaîne bêta de lthCG soit dissociée ou non de la chaîne alpha; - une quantité donnée d'un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha;; - une quantité donnée d'un troisième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l1hCG en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non; - des réactifs permettant la détection des anticorps marqués. 18 - Nécessaire pour la mise en oeuvre d'un procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 dans un échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG, selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend au moins - une quantité donnée d'un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha; - une quantité donnée d'un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le premier anticorps;; - une quantité donnée d'un troisième anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de lthCG est associée à la chaîne alpha; - une quantité donnée d'un quatrième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non; - des réactifs permettant la détection des anticorps marqués. 19 - Procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 dans un échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG, caractérisé en ce qu'il comprend - le dosage de l'hCG bêta libre, entre la 14eue et la 18ème semaine d'amenohrrée; - le dosage de l'hCG totale dans le même échantillon; - la comparaison du rapport hCG bêta libre / hCG totale à une valeur seuil correspondant au rapport hCG bêta libre / hCG totale normale, mesurée la même semaine.