FR 2657527 A1 19910802 FR 9001193 A 19900201 La présente invention concerne de nouveaux vecteurs rétroviraux, d'origines aviaires, d'intégration et d'expression d'au moins un gène hétérologue dans des cellules aviaires. La présente invention constitue un développement des inventions décrites dans les demandes de brevets européen EP 178 996 et international WO 89/03877 au nom de la présente demanderesse. I1 conviendra de s'y reporter si nécessaire pour la meilleur intelligence de la présente invention. Par gène hétérologue, on entend désigner un gène qui ne se trouve pas dans le génome aviaire d'origine et de préférence qui ne se trouve pas dans le génome d'un virus. I1 peut s'agir d'un gène utile codant pour une protéine d'intérêt industriel destinée à être obtenue par culture cellulaire ou bein d'un gène pouvant présenter un intérêt particulier pour l'élevage des oiseaux, notamment les poulets ou les cailles, ou encore un gène codant pour une protéine immunogène destinée à servir de vaccin, ou encore il peut s'agir d'un gène marqueur en particulier de résistance à un antibiotique. Les rétrovirus sont maintenant largement utilisés pour le transfert de gène à cause de leur efficacité élevée en ce qui concerne à la fois leur pénétration à travers la membrane cellulaire et l'intégration de leur génome dans l'ADN de la cellule hôte. Les vecteurs rétroviraux dans lesquels les séquences étrangères insérées sont transcrites directement sous le contrôle de promoteurs internes, sont particulièrement intéressants. Ils permettent une traduction efficace de 1'ARN transcrit sous la forme d'une protéine native. Toutefois, on observe des interférences fonctionnelles entre les promoteurs viraux et internes. C'est pourquoi on a développé selon la présente invention une nouvelle génération de vecteurs rétroviraux aviaires. Ces vecteurs portent des mutations dans leurs longues séquences répétées terminales (séquence LTR) qui inactivent la transcription du provirus intégré sans affecter l'expression des promoteurs internes. Ces vecteurs sont appelés SIN ("self inactivating"), c'est-à-dire auto-inactivants. Plus précisément, la présente invention a pour objet un vecteur viral d'intégration et d'expression d'au moins un gène hétérologue dans des cellules aviaires, caractérisé en ce qu'il est constitué à partir du génome proviral d'un rétrovirus aviaire et qu'il comprend entre deux séquences LTR aviaires le(s)dit(s) gène(s) hétérologue(s) qui se trouve(nt) sous le contrôle de promoteur(s) interne(s) hétérologue(s), des délétions ou des mutations dans la LTR 3' ayant été effectuées de manière à inactiver les promoteurs viraux présents dans les LTR. Les modifications de structures du génome viral apportées par les vecteurs selon l'invention inactivent totalement les promoteurs viraux présents dans les LTR des formes provirales intégrées dans les cellules cibles du transfert. Par promoteur interne hétérologue, on entend désigner un promoteur qui ne se trouve pas dans le génome d'un rétrovirus aviaire et que l'on a placé entre les deux séquences LTR. Dans un mode de réalisation selon l'invention, le promoteur ou la séquence enhancer, selon les cas, de la LTR 3t du génome viral sont délétés en tout ou partie. Le virus issu de ce génome introduit dans le génome des cellules infectées un provirus dont la LTR 5' est copié sur la LTR 3r selon le processus classique de synthèse de l'ADN proviral à partir de L'ART virionique. Plus précisément, on effectue une délétion dans la région U3 de la LTR 3'. En particulier, on peut procéder à des mutations ou délétions ponctuelles dans les boîtes CAAT et TATA ou éliminer lesdites boîtes. Etant donné que la région U3 de la LTR 3' sert de matrice pour la synthèse de la région correspondante de la LTR 5' dans la transcription inverse, toute mutation dans U3 dans la LTR 3' apparaît dans les deux LTR après un cycle de réplication virale. C'est pourquoi la mutation qui détruit le promoteur de la LTR 3' donne naissance à un provirus inactif dans les cellules infectées. Toutefois, on a observé qu'une transcription à partir d'un promoteur interne, peut toujours avoir lieu. Dans le cas où on utilise une LTR 3' issue d'un virus dont les LTR sont naturellement très peu actives, il suffit alors de procéder à des délétions ou mutations ponctuelles pour inactiver les promoteurs viraux présents dans les LTR. On peut citer comme LTR 3' naturellement très peu active celle du virus RAV-0. Dans les vecteurs selon l'invention, les gènes hétérologues (gènes de sélection ou gène utile) sont de façon appropriée sous le contrôle de promoteurs internes hétérologues. Toutefois, dans le cas du gène de sélection, celui-ci peut être animé directement par la LTR 5' et non pas associé à un promoteur interne propre, le gène hétérologue utile étant sous le contrôle de promoteurs internes hétérologues. Dans les génomes des vecteurs SIN selon l'invention, on peut intégrer des unités transcriptionnelles dans lesquelles le gène hétérologue est associé à son propre promoteur dans son génome d'origine, à titre de promoteur interne hétérologue. Dans les cellules infectées, seuls ces promoteurs internes seront alors fonctionnels. Le fonctionnement correct de ces vecteurs a été vérifié et les résultats sont présentés ci-après. D'une part, l'expression des gènes insérés est initiée au niveau de leurs promoteurs internes respectifs. D'autre part, dans les cellules infectées les LTR des vecteurs deviennent inactives. Enfin, les vecteurs ne peuvent ressortir des cellules infectées, même après infection de ces dernières avec un virus assistant (helper) compétent. Les vecteurs selon l'invention apportent par conséquent une grande sécurité d'utilisation puisque dans les cellules infectées d'une part, les LTR inactives ne peuvent altérer le fonctionnement des séquences génétiques adjacentes au site d'insertion du provirus, et d'autre part le provirus ne peut plus générer de virus transmissible. Dans un mode de réalisation particulier, les vecteurs ont été construits à partir d'éléments de génome issus des rétrovirus RAV-1, RAV-2 et AEV. On peut citer notamment des constructions vectorielles constituées essentiellement à partir du génome du rétrovirus RAV-2 dans lequel les boîtes CAAT et TATA ont été délétées dans la LTR 3' dudit génome. Dans un mode de réalisation, le vecteur comporte comme LTR 3': - la séquence U3 de la LTR de RAV-2 dans laquelle les boîtes CAAT et TATA ont été délétés, et - les séquences R et U5 de la LTR de RAV-l. De façon appropriée, les vecteurs selon l'invention comportent deux gènes hétérologues, à savoir un gène de sélection et un gène utile. Lorsque le vecteur est construit à partir du génome du rétrovirus de l'érythroblastose aviaire (AEV), les gènes hétérologues sont avantageusement placés en positions des oncogènes v-erbA et v-erbB. On entend par gène de sélection un gène marqueur de résistance notamment de résistance à une drogue analogue à un antibiotique. On peut citer en particulier le gène hygroR de résistance à l'hygromycine G418 et le gène néo R de résistance à la néomycine. Bien entendu, les gènes marqueurs qui ont été cités ne le sont qu'à titre d'exemples purement illustratifs. I1 est possible d'utiliser tout autre gène de résistance comme gène marqueur. On entend par gène utile un gène codant pour une protéine d'intérêt autre qu'un gène de sélection. Dans un mode de mise en oeuvre approprié, les gènes hétérologues sont placés sous le contrôle de promoteurs internes hétérologues. Dans un mode de mise en oeuvre des vecteurs selon l'invention, le gène de sélection est placé sous le contrôle du promoteur simien SV40 et le gène hétérologue utile est placé sous le contrôle du promoteur métallothionéine humain IIa (MTIIa). Dans un autre mode de mise en oeuvre, le gène de sélection est animé directement par la LTR 5' et non pas associé à un promoteur propre. Le sens de transcription d'un gène hétérologue inséré dans le vecteur doit être opposé à celui de la LTR dans le cas où ledit gène hétérologue contient une séquence de contrôle de polyadénylation. Dans le cas contraire, le gène hétérologue pourra être inséré dans le sens de transcription de la LTR, le transcrit dudit gène utilisant alors le signal polyA fourni par la LTR 3'. Dans le cas où le gène hétérologue inséré contient des introns, ce gène doit obligatoirement être inséré dans le sens de transcription inverse, afin d'éviter toute interférence entre les signaux de contrôle d'épissage de ce gène et ceux du génome viral. Dans un mode de réalisation, le gène de sélection est inséré dans le sens de transcription rétroviral et le gène utile est inséré dans le sens opposé par rapport à celui de la transcription rétrovirale. On a utilisé à titre d'exemple de gène hétérologue utile le gène codant pour l'histone H5 et on a montré que l'expression de H5 dans des fibroblastes de caille ou de poulet normaux ou transformés n a pas affecté significativement les propriétés de croissances des cellules transformées, mais a inhibé la prolifération des fibroblastes normaux. Compte tenu du fait que les rétrovirus aviaires sont des virus à ARN, la terminologie virus pourra parfois désigner le génome proviral sous forme d'ADN de même que dans certains cas le gène étranger pourra être sous forme d'ARN, en particulier lorsqu'il est inséré dans le génome d'un virion. Les techniques permettant de passer d'une forme ADN à la forme ARN et réciproquement, sont connues et sont la transcription et la transcription reverse. Le virus recombinant peut être utilisé tel quel sous forme de virions ARN ou de génome proviral sous forme d'ADN comportant l'insertion d'un gène étranger lui aussi sous forme d'ADN et correspondant à la transcription reverse de L'ART du virus, peut être intégré dans un vecteur à ADN tel qu'un plasmide, un cosmide, ou un phage par exemple. Pour des raisons de commodité, les constructions ont été réalisées tout d'abord sur des plasmides comportant une séquence composite d'ADN correspondant au transcrit reverse d'un vecteur rétroviral à ARN d'un virus tel que décrit précédemment. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un vecteur selon l'invention caractérisé en ce qu'on effectue des délétions ou des mutations dans la LTR 3' aviaire de manière à inactiver les promoteurs viraux présents dans lesdites LTR ou on utilise une LTR 3' d'un virus dont les LTR sont naturellement très peu actives et en ce qu'on insère le(s)dit(s) gène(s) hétérologue(s) sous le contrôle d'un promoteur interne hétérologue ou du promoteur de la LTR 5'. Dans un mode de mise en oeuvre du procédé, on insère dans le vecteur pDAl au site XbaI une cassette transcriptionnelle d'un gène hétérologue. Par exemple, la cassette transcriptionnelle du gène hétérologue consiste dans le vecteur pBOB tel que représenté à la figure 6 dans lequel on insère ledit gène hétérologue au niveau des sites de restriction du polylinker compris entre la séquence d'initiation de transcription sous forme du promoteur MTIIa et la séquence de terminaison de transcription et de polyadénylation dérivée du gène de l'histone H5, ladite cassette étant encadrée par deux site XbaI permettant son isolement puis son insertion au site XbaI unique du vecteur pDAl. La présente invention concerne en outre un procédé de modification de cellules caractérisé en ce qu'on effectue une transfection ou infection selon les cas desdites cellules avec des vecteurs selon l'invention. La présente invention concerne donc des cellules transfectées ou infectées par les vecteurs selon l'invention qu'ils soient sous forme de plasmide ou de virus respectivement. I1 est évident que la transfection primaire sera en général effectuée avec des vecteurs-de type plasmidique, c'est-à-dire que le rétrovirus aviaire sera sous forme de l'ADN de son génome mais en présence de l'ADN d'un virus assistant des cellules transfectées vont dans ce cas se transformer et libérer les virus recombinants qui vont pouvoir transfecter d'autres cellules. Ce type de processus permet également de constituer des stocks de virus vecteurs utilisables par la suite à la place des vecteurs plasmidiques. Les rétrovirus tels que AEV, RAV-l, RAV-2 sont défectifs pour leur réplication. Pour se répliquer, ces virus nécessitent la présence dans la même cellule hôte d'un virus assistant fonctionnel comme il est connu de l'home de l'art. La présente invention a également pour objet un procédé de modification de cellules caractérisé en ce qu'on effectue une co-infection ou co-transfection selon les cas avec un virus assistant qui comporte les gènes assurant la réplication dudit vecteur. Les cellules modifiées selon l'invention peuvent être diverses mais sont de préférence des cellules aviaires, de type hématopoiétique, germinale ou de type fibroblastique. Les cellules préférées pour la mise en oeuvre des vecteurs de l'invention sont les fibroblastes d'embryon de poulet ou de caille. Enfin, l'invention concerne le procédé de préparation d'un protéine déterminée dans lequel on cultive les cellules modifiées par un vecteur selon l'invention dans lequel un gène étranger code pour ladite protéine et en ce que Iton récupère la protéine de la culture cellulaire. D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée d'un exemple de réalisation donné à titre purement illustratif et comme modèle pour l'intégration et l'expression d'un gène hétérologue, en utilisant le gène de l'histone H5. La description qui va suivre est faite en référence aux figures 1 à 6. Figure 1. Schéma illustrant le transfert de la délétion de la 3'LTR à la 5'LTR. (1) Un vecteur retroviral delété dans le promoteur de 3'LTR et portant un gène étranger (X) avec son propre promoteur (P), est transfecté dans des cellules helper. (2) Après intégration, 1'ADN proviral est transcrit à partir du promoteur de 5'LTR, et les transcrits viraux contenant la délétion dans la région U3 sont encapsidés dans des particules virales infectieuses. (3) Dans des cellules infectées par ces particules virales dépourvues de helper, 1'ARN viral est transcrit par transcription inverse dans une moléculke d'ADN double-brin montrant une région U3 délétée dans les deux LTR.Ainsi, dans ces cellules, la transcription virale est abolie et seule la transcription à partir du promoteur interne peut avoir lieu. Le triangle indique la délétion; case hachurée: région U3; case pointillée: région U5; arase claire: région R. Figure 2. (A). Structure de LTR normales (en haut) et délétées (en bas). La localisation des signaux de régulation transcriptionnelle est indiquée. Les zones hachure et pointillée dans la région U3 représentent respectivement les réglons du enhancer et du promoteur. La région U3 délétée (provenant de 1'ADN proviral RAV-2) a été liée, par les linkers Clal, aux régions R et U5 de la LTR de RAV-1. Le triangle pointillé indique ltétendue de la délétion. (B). Structure des vecteurs rétroviraux. Dans pTIN3', dérivé d'AEV, le gène de résistance à la néomycine (neo) est transcrit dpuis la LTR virale, alors que dans pDAI, il est transcrit à partir du promoteur de SV40 interne (SV). pDAl, dérivé essentiellement de RAV-2, contient une région U3 délétée dans la 3'LTR. pDAHY et pDAH5 ont été dérivés de pDAl en insérant respectivement les gènes hph (résistance a lthygromycine) et H5. Les flèches indiquent la direction transcriptionnelle des différents gènes. Dans pDAHY, la région codant pour hph, liée au site de polyadénylation du gène de la thymidine kinase (Tk), a été placée sous le contrôle du promoteur de SV40. Dans pDAH5, le promoteur de la métallothionéine humaine MT-IIA (lIT) a eté utilisé pour transcrire le gène H5 contenant son propre signal de polyadénylation (Pol H5). Cases hachurée, claire et pointillée: respectivement LTR de AEV, RAV-2 et RAV-1; SD et SA respectivement donneur et accepteur d'éplssage; AU3: région U3 délétée; Xo: Xhol; X: Xbal; C:Clal. L'échelle (en paires de kilobases:kb) est indiquée en bas. Figure 3 Analyse par Southern blotting de cellules QT6 infectées par DAH5. 15 zg d'ADN, isolé de cellules infectées (bandes 5 et 7) et non infectées (bandes 4 et 6), ont été digérés par Xbal (bandes 4 et 6) ou Xhol (bandes 6 et 7). Apres électrophorese et transfert sur nitrocellulose, la plage de transfert ("blot") a eté hybridée avec une sonde de H5 spécifique. Les quantité de fragment de restriction correspondant à 10, 1 et 0,1 copies de gène H5 par génome (respectivement bandes 1, 2 et 3) ont été traitées en parallèle. Lambda ADN digéré par EcoRI et HindIII a été utilisé comme marqueur de taille. Une représentation schématique de la carte de restriction de DAH5 est montré au bas de la figure. F re 4 Essai de protection par la nucléase S1 de 1'ARN cytoplasmique transcrit dans des cellules QT6. 20 pg d'ARN cytoplasmique, isolé de cellules non infectées (bande 1) et de cellules infectées par DAH5 (bandes 2 et 5), ont été hybridés avec la sonde de H5. Dans les bandes 3 et 4, les cellules ont été traitées respectivement avec 50 mM et 100 :rnlI de ZnC12, avant l'isolement de l'ARN. Dans la bande 5, des cellules infectées ont été maintenues pendant 50 générations sans sélection par G418 avant l'extraction.Un fragment de 1025 pb isolé de pMTH5 et représentant la sonde de H5 (bande 6) a protége 315 nucléotides après digestion Sl. Les chiffres dans la marge gauche représentent les tailles, en nucléotides, des fragments utilisés comme marqueurs de poids moléculaire. Figure 5 : Détection par Western blotting de H5 dans des cellules QT6 infectées. Les protéines nucléaires, isolées de cellules QT6 infectées par DAH5 (bandes 1, 2 et 3) ou de cellules QT6 non infectées (bandes 4, 5 et 6), ont été soumises à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS et transférées sur nitrocellulose. H5 a été détectée après incubation avec des anticorps anti-H5 et la protéines A 125I. Les cellules ont été traitées avec 100 mM de ZnC12 (bandes 2 et 5). Les bandes 7, 8 et 9 représentent l'équivalent de 0,5 ijg, 1 ug et 2 Cig de H5 purifiée, et les bandes 10, 11 et 12 montrent la quantité de H5 présente dans 5.106, 10.106 et 20.106 érythrocytes de poulet. Figure 6 : représente pBOB. Ce plasmide a été construit à partir de la cassette de transcription H5 contenant le promoteur MTIIA, la séquence codante de H5 et la séquence polyA. La séquence codante de H5 a été éliminée par digestion EcoRI + SmaI et remplacée par un oligonucléotide de synthèse présente figure 6. on peut envisager de remplacer le promoteur MTIIA par un autre promoteur. Le transfert et l'expression de l'histone H5 ont été effectués dans des fibroblastes aviaires normaux et transformée par un vecteur rétroviral SIN. Le vecteur, appelé pDAH5, a été obtenu par mutation dans la LTR 3' en éliminant les boîtes CAAT et TATA. La séquence codant pour H5 insérée dans pDAH5 a été contrôlée par le promoteur de métallothionéine MT-IIA humaine. L'infection de cellules de caille QT6 par le virus DAH5 a conduit à l'intégration d'une copie de gène H5 étranger par génome et à la formation de transcrits d'ARNm initiés correctement et de protéine H5. Cependant, l'expression de la séquence H5 exogène était constitutive et non inductible par ions Zn ++. Le taux de H5 dans les cellules QT6 était équivalent de celui d'un érythrocyte de poulet mature. L'expression de H5 dans des cellules QT6 transformées infectées par DAH5 ou des fibroblastes d'embryon de poulet transformés par AEV-ES4 a eu seulement de légers effets sur la vitesse de croissance et n'a pas inhibé la réplication cellulaire. Inversement, l'expression de H5 dans des fibroblastes de caille et de poulet normaux a été spectaculaire : les cellules ont acquis l'aspect de fibroblastes sénescents, elles poussaient très lentement et les noyaux semblaient compacts, elles étaient souvent dépourvues de cytoplasme. L'analyse de la modification post-traductionnelle de H5 dans les cellules QT6 a montré qu'une phosphorylation peut être impliquée dans les effets différentiels de la protéine dans des cellules normales et transformées. I - MATERIEL ET METHODES 1. Construction d'un vecteur rétroviral pour le transfert et l'expression de la séquence codante pour H5 Le principe des vecteurs SIN est illustré sur la figure 1. La construction du vecteur pTXN3' a été publiée récemment (3 et WO 89/03877). Le génome de pDAl est dérivé du génome du virus associé au sarcome de Rous-2 (RAV-2) après modification de la LTR 3'. On a construit une LTR aviaire mutée par délétion de la région U3 isolée de la LTR du virus de la leucose aviaire RAV-2 entre les nucléotides -149 et -15 (en regard du site cap transcriptionnel : nucléotide +1). C'est-à-dire que la séquence en aval du site Sphl dans U3 a été supprimée. Cette délétion a éliminé les boîtes CAAT et TATA mais a laissé intact la région de enhancer située en amont de la position -149 (6,16, 22). La région U3 de RAV-2 délétée a ensuite été liée aux régions R et U5 isolées de la LTR de RAV-1. C'est-à-dire que la séquence délétée de U3 a été remplacée par le fragment Taql-Sstl dérivé de la LTR de RAV-1. Ce fragment contient essentiellement les séquences R et U5 et 14 nucléotides résiduels de U3. Le linker Clal a été inséré à la jonction des fragments dérivés de RAV-1 et RAV-2. La LTR hybride présente donc une délétion de 134 nucléotides qui a éliminé les boîtes CAAT et TATA. La LTR délétée ainsi reconstituée a été utilisée pour remplacer la LTR 3' normale dans le vecteur pDAl. Le vecteur pDAl a été construit à partir de RAV-2 et il porte une cassette transcriptionnelle contenant le gène néo lié au promoteur précoce de SV40 inséré dans le même sens de transcription de la transcription virale (figure 3). Plus précisément, le fragmen Xhol interne du génome de RAV-2 a été éliminé et remplacé par une cassette contenant dans l'ordre des séquences gag portant ainsi XbaI, le enhancer et le promoteur précoce du virus simien SV40 et la séquence codant pour le gène de la néomycine phosphotransférase bactérienne (néo) (25). Comme virus témoin, on a construit le génome pDAHY dérivé de pDAl en insérant une cassette contenant la séquence codant pour l'hygromycine B phosphotransférase (hph) entre le promoteur précoce de SV40 et le signal de polyadénylation de HSV Tk. Cette cassette de transcription a été insérée dans le sens opposé par rapport au gène néo. Plus précisément, le vecteur pDAHY a été dérivé de pDAl en insérant au site Xbal une cassette contenant la séquence codant pour l'hygromycine B phosphotransférase bactérienne (hph) (11). Ce gène a été mis sous le contrôle du enhancer et du promoteur précoce de SV40. Le signal de polyadénylation du gène de la thymidine kinase (Tk) de l'herpes virus (HSV) a été ajouté à l'extrémité 3'. Comme contrôle supplémentaire, le virus pTXN3', un vecteur qui exprime le gène néo de la LTR virale, a été utilisé en parallèle. Le génome du vecteur pDAH5 a été construit à partir de pDA1 en insérant une cassette de transcription contenant la séquence codant pour H5 lié au promoteur du gène de la métallothionéine MT-IIA humaine. Dans cette construction, la séquence H5 fournit son propre signal de polyadénylation et elle a été insérée en direction anti-sens par rapport à la transcription rétrovirale. Plus précisément, le génome pDAHS a été construit à partir de pDA1 en insérant à XbaI une cassette contenant la séquence codant pour H5 avec son propre signal de polyadénylation lié au promoteur MT-IIA (13). L'unité de transcription de H5 en tant que cassette de transcription du gène hph a été inséré dans le sens opposé par rapport à la transcription commandée par la LTR. Tous ces génomes rétroviraux ont été transfectés dans la lignée de cellules helper G qui libéraient uniquement des vecteurs rétroviraux dépourvus de virus assistants (helper free) (24). Le titre du virus DAH5 dépourvu d'assistant (helper free) était de 100 rfu/ml (unité formant résistance/ml) comme déterminé par sa capacité d'induire la résistance à G418 chez les cellules de caille QT6 réceptrices. 2. Cellule. Les fibroblastes d'embryon de poulet (CEF) ont été préparés et cultivés comme décrit précédemment (9). Les fibroblastes d'embryon de caille (QEF) ont été préparés et cultivés dans les memes conditions Les cellules de poulet AEY-ES4, les fibroblastes de caille QTE (17) et les cellules helper de caille G (24) ont été cultivés dans le milieu de culture CEF. Les cellules AEV-ES4 étaient dérivées de CEF infectés par le virus AEV-ES4 (9); ces cellules ont été maintenues en culture pendant plusieurs mois avant d'être utilises La sélection pour les colonies de cellules néomycine-résistantes a été faite en présence de G418 (Gibco) a une concentration de 200 Rglml. 3. Transfections et infections Les cellules helper G ont été transfectées par la méthode du polybrène-diméthyl sulfoxyde (14). Les suspensions virales ont été recueillies pendant des périodes de 12 heures a partir des cellules du producteur sous-confluentes (3 ml par boite de 100 mm), puis centrifugées pendant 15 min à 2500 g et filtrées sur des filtres liant faiblement les protéines (Milliporej. Les cellules, ensemecées a raison de 5.105 cellules par boite de 60 mm, ont été infectées avec 1 ml de solution virale pendant douze heures, puis sélectionnées dans G418. Les colonies résistantes ont été évaluées 10 à 15 tours après l'infection. 4. Induction par le zinc du promoteur de HT-lIA dans les cellules infectées. Les cellules ont été incubées pendant 24 h dans le milieu de culture CEF supplémenté avec 50 pM ou 100 pM de ZnCl2 (Merck). Le ZnCl2 a été préparé sous forme de solution de réserve 10 mM dans un tampon salin isotonique et stocké a +4 C. 5 Cinétique de croissance des cellules infectées. Les cellules ont été ensemencées a raison de 5.105 cellules par boite de 60 mm et le milieu a ensuite eté change chaque jour. A chaque délai, une ou trois boites par type cellulaire ont été trypsinisées et les cellules ont été décomptees. 6. Analyse d'BDN et d'ARN. Un ADN de haut poids moléculaire a été extrait comme décrit précédemment (10). Après digestion de 15 Rg par des enzymes de restriction appropriées, les fragments ont été séparées par éleotrphorese sur des gels d'agarose à 0,8%. L'ADN a ensuite été transféré sur des filtres en nitrocellulose et hybridé avec une sonde marquée amorcée au hasard. Les filtres ont eté finalement lavés dans des conditions extrêmement rlgoureuses et exposés å une pellicule Kodak-X-Omat. La sonde utilisée était un fragment EcoRI-Xmnl dérivé de pMTH5 L'ARN cellulaire total a été purifié apres lyse des cellules dans un tampon contenant 1 mM de Dithiotreitol et 0,2% de Nonidet P40 essentiellement comme décrit précédemment (10). Des expériences de cartographie S1 ont été effectuées conformément a Favaloro et al. (8).Un fragment de restriction BamHI-Pstl contenant la séquence codant pour H5 a été isolé à partir de pMTH5 et marqué å l'extrémité 5' par [Y-32P3ATP et la polynucléotide kinase. La sonde a été coprécipitée avec 10 g d'ARN total et remlse en suspension dans le tampon d'hybrldatlon S1 contenant 40 mM de Pipes [pipérazine N-N' bis(aclde 2-éthane sulfonlque, pH 6,4), 400 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA] L'hybridation a été effectuée pendant 6-9 h à 56"C, puis les hybrides ont été digérés avec 800 U de nuclease S1 par ml de tampon de digestion (30 mM d'acétate de sodium pH 4,5, 250 mM de NaCl, 2 mM de ZnSO4) pendant 30 min à 31"C. L'ADN résistant a la nucléase S1 a été finalement passé dans un gel de polyacrylamide à 6% et exposé à une pellioule Kodak-X-Omat. L'identité des fragments protegés a été déterminée par comigration avec des marqueurs de poids moléculaire approprié. 7. Transfert électrophorétique des protéines sur papier de nitrocellulose. Les histones totales ont été extraites avec H2S04 des noyaux purifiés (19). Les extraits rassemblés ont été dialysés et lyophilises. Les histones ont ete analysées par électrophorése sur gel de polyacrylamide-SDS tdodésyl sulfate de sodium) (15). L'électrtranstert du gel de polyacrylamide sur papier de nitrocellulose a été effectue pendant 1 heure à 24 V et les filtres ont été finalement incubés avec des anticorps anti-H5 et la protéine A marquée au 125I, 1-10.105 cpm (Amersham Corp.). La production d'anticorps chez des lapins immunisés par H5 a eté rapportée précédemment (18) Les anticorps anti-H5 ont été purifiés immunospécifiquement par chromatographie d' affinité avec H5 conjuguée au Sepharose 4B. Leur immunoréactivité a été contrôlée par radlolmmunodosage en phase solide (19). 8. Insunofluorescence. Les cellules ont été cultivées sur des lames Lab Tek (Miles laboratories), puis fixées dans l'éthanol absolu sulvl d'acétone a température amblante. Après lavage avec PBS-PMSF [10 mM de tampon de phosphate de sodium, pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 0,1 mM de phényl méthyl sulphonyl fluorure], les cellules ont été incubées pendant 30 min a 4"C avec des anticorps anti-H5 purifies par affinlté. Des anticorps anti-lapin marqués à la fluorescéine ont ensuite été ajoutés et les cellules colorées ont été examinées au microscope Olympus équipé d'une épi-illumination. Des photomicrographies ont été prises avec une caméra Olympus et une pellicule couleur Kodak. Des temps d'exposition et de déve ioppement constants ont été utilises pour l'impression. 9. Analyse de phosphorylation de la protéine H5. Les cellules ont été incubées pendant 4 h dans un milieu essentiel mlnlmal exempt de phosphates, puis elles ont été marquées pendant 4 h dans le même milieu par 2 mCi de H3P04 marqué au 32P (Amersham Cors.) Les histones riches en lysine ont été extraites avec de l'acide perchloriche a 5% et soumises à une électrophorèse comme décrit plus haut. La phosphorylation de H5 a été détectée après transfert du gel sur papier de nitrocellulose et autoradiographie de la plage de transfert ("blot").La même plage de transfert ("blot") a été utilisée pour la détection de la protéine H5 avec un anticorps anti-H5 et un conjugué protéine A-peroxydase de raifort (Amersham) H5 a été finalement visualisée par incubation dans 10 mM de Tris, pH 7,4 0,0254; de H202, 0,04% de 4-amlnoantlpyrlne (Sigma) et 0.2 de phénol. II - RESULTATS 1. Analyse de l'JDN et de ARN viraux dans les cellules QT6 infectées par DAH5. Des cellules QT6, une lignée de fibroblastes de caille transformés chimiquement (17), ont été infectées par une réserve de virus DAH5 dépourvu d'assistant ("helper free") puis sêleotrionnées par G418 et amplifiées dans des cultures polyclonales. Ces cellules n'ont pas libère de virus et les surnageants des cultures surinfectées par un virus assistant (helper) normal étaient incapables de transmettre la résistance à G418.. Etant donné qu'aucun virus n'a pu être retrouvé, nous concluons que dans les cellules infectées par DA115, le provirus intégré est inactif du point de vue de la transcription. Pour déterminer la présence, l'organisation et le nombre de copies du vecteur d'ADN introduit, un ADN de haut poids moléculaire provenant de cellules QT6 infectées ou non infectées a été préparé. 15 pg d'ADN ont été digérés par des enzymes de restriction et ont été examinés par la méthode du Southern blotting avec une sonde contenant la région codant pour H5 (fig. 3). L'enzyme de restriction Xhol coupe deux fois a l'intérieur du vecteur et la présence d'un fragment de 4,6 kilobases (kb) est par conséquent caractéristique des gènes intacts H5 et neo.Le fragment attendu de 4,6 kb a été détecté dans les cellules infectées (bande 7), mais il n'était pas present dans l'ADN des cellules non infectées (bande 6).Pour tester plus précisément la présence d'un fragment HTII-H5 intact, l'ADN de cellules GT6 infectées et non infectées a été coupé par Xbal. Comme prevu, un fragment de 2,1 kb a été détecté dans les cellules infectées (bande 5) et n'a pas été détecté dans les cellules non infectées (bande 4) Ces données montrent que les provirus insères n'ont pas subi de réarrangements majeurs et présentaient la structure attendue. Les fragments de haut poids moléculalre observés dans les cellules infectées et non infectées correspondent au gène H5 endogène. A partir des intensités des bandes & 2,1 et 9,5 kb dans les cellules infectées, on a estlmé qu'un gene H5 exogène s'était intégré par genome cellulaire.Pour confirmer cette estimation, on a comparé l'intensité de la bande de 2,1 kb å celle donnée par une quantité connue de séquences 115. 15 jig d'ADN génomique aviaire représentent 6,106 génomes aviaires. Les bandes 1, 2 et 3 contiennent respectivement 6.1O, 6.106 et 6.107 copies de plasmide pNTH5 digéré par EcoRI.Si on compare l'intensité d'hybridation du fragment de 0,8 kb de la bande 2 au fragment de 2,1 kb de la bande 5, nous confirmons qu'une copie du provirus DAH5 a été insérée par génome Pour déterminer les taux de transcrits spécifiques du gène H5 dans des cellules QT6 infectées par DAH5 et non infectées, une analyse quantitative avec la nucléase S1 a été utilisée (fig. 4) La sonde d' ADN était un fragment BamHI-Pstl de 1026 pb isolé du plasmide pMTH5. Ce fragment contient le promoteur de MT-IIA et 216 nucléotides de la séquence codant pour H5. Les transcrits initiés au promoteur de MT-IIA doivent être protégés sur une longueur de 316 pb (13). Comme prévu, un fragment protégé de près de 315 nucléotides a été détecté avec l'ARN de cellules OT6 infectées par DAHS (bandes 2 à 5). Un fragment protégé de la meme taille a été détecté dans des cellules QT6 infectées par DAH5 maintenues en culture pendant 50 générations sans'sélection par G418 (bande 5). Aucun fragment protégé nta été détecté avec 1'ARN de cellules QT6 non infectées (bande 1). Le promoteur de NT-IIA humaine peut être induit par des métaux lourds tels que Zn++ (23). Pour tester l'expression régulée du gène H5 a partir du promoteur interne, des QT6 infectées ont été exposées pendant 24 h à 50 pM (bande 3) ou 100 pM de ZnCl2 (bande 4) avant isolement de l'ARN. La quantité d'ARNm de H5 n'a pas augmenté significativement par rapport a l'ARN des cellules non infectées (bande 2). On peut en conclure que la transcription de la séquence codant pour H5 a été efficacement et correctement initiée dans les cellules QT6 et que l'addition de Zn++ n'a pas augmenté le degré de transcription.De plus la séquence codant pour H5 une fois transférée dans les cellules QT6 était exprimee de façon stable pendant au moins 50 générations de cultures libérées de la sélection par G418. 2. Expression de la protéine H5 dans des fibroblastes QT6 infectés par le virus DAIS. La synthèse de l'histone H5 a été mesurée dans des cellules QT6 infectées par DAH5 et non infectées. Les histones totales ont été extraites de noyaux purifiés isolés des cellules respectives. Les protéines ont été analysées par electrophorese sur gel de polyacrylamide, transférées sur nitrocellulose et la présence de H5 a été détectée après incubation de la plage de transfert ("blot") avec un anticorps anti-H5 et la protéine A-125I (fig. 5). Cet anticorps n'a donné aucun signal lorsqu'il a été testé contre les histones totales de cellules QT6 non infectées traitées avec 0 (bande 6), 50 p! (bande 5j ou 100 Pu de ZnCl2 (bande 4).Un signal nettement visible avec la même mobilité de H5 purifiée (bandes 7, 8, 9) ou de H5 d'histones totales d'érythrocytes de poulet (bandes 10, 11, 12), a ete detecte avec les histones totales de 5.106 cellules oT6 infectées par DAH5 traitées avec 100 zN de ZnCl2 (bande 1), 50 pH de ZnCl2 (bande 2) ou pas de ZnC12 (bande 3).Pour tenter de quantifier la production de H5 dans des cellules QT6 infectées, des quantités connues de H5 purifiée, 0,5 g (bande 7), l g (bande SI et 2 Mg (bande 9), ou d'histones totales extraites de 5.106 (bande 10), 10 106 (bande 11) ou 20.106 (bande 12) érythrocytes de poulets adultes ont été soumises à une électrophorese sur le même gel.A partir de ces résultats, on peut conclure que la quantité de H5 présente dans 5.10o cellules QT6 infectées par DAH5 est équivalente à la quantité de H5 produite par 5,106 érythrocytes de poulets adultes et que le ZnCl2 n'a pas augmenté le degre de production de 115. La localisation nucléaire de H5 dans les cellules QT6 infectées par DAH5 a ete confirmee par immenofluorescence. 3. Propriétés des cellules OT6 et des fibroblastes transfornés par SEV-ES4 exprinant la protéine H5. Des cultures de QT6 infectées par DA115 ont développé de grands foyers denses contenant des cellules phénotypiquement non différentes de cellules QT6 non infectées ou de cellules infectées par le virus témoin TXN3' . De la meme façon, des fibroblastes de poulet transformes par le rétrovirus aviaire AEV-ES4, ont été infectés par DAH5. Ces cellules ont développé des foyers ne pouvant être distingués de ceux de cellules infectées par TXN3' et ils n'ont pas pu ètreamplifiées(non montré).Pour examiner de façon plus approfondie si la protéine H5 pouvait avoir un certain effet sur les cellules transformées, on a compare la cinétique de croissance de cellules QT6 non infectées à celle de QT6 infectées par DH5 ou par TXN3'. Les trois types cellulaires ont été ensemencés individuellement a la même densité dans des boites de 60 mm et cultivés dans les mêmes conditions. Ensuite, à différents délais, les cellules ont été trypsinisées et décomptées. On peut voir que les cellules QT6 infectées par DAH5 ont présenté une croissance plus lente que les cellules QT6 non infectées ou infectées par TXN3'. Les temps de génération ont pu être estimés à 20 h pour les cellules QT6 témoins et 4 25 h pour les cellules OT6 produisant la protéine 115. On peut donc conclure que l'expression de la protéine H5 ne semble avoir que peu d'effet sur la croissance des cellules OTS et les fibroblastes transformés par AEV-ES4 . 4, Expression et effets de la protéine E5 dans des fibroblastes normaux. Des fibroblastes d'embryon de poulet (CEF) et des fibroblastes d'embryon de caille (QEF) ont été infectés soit par le virus DAH5 soit par les virus témoins, TXN3 ou DAHY. Dix tours après sélection dans un milieu contenant G418, des grands clones denses de fibroblastes ont été observés dans les cultures de cellules de caille et de poulet infectées par chaque virus témoin. Dans toutes les cultures infectées par DAH5 seulement quelques petits agrégats de cellules dispersées ont été observés. Ces cellules poussaient très lentement et elle n'ont pas pu être efficacement repiquées, en conséquence, elles n'ont pas pu être amplifiées.De plus, la plupart de ces cellules semblalent malades et présentaient une morphologie aplatie étoilée identique à celle de fibroblastes sénescents Les mêmes observations ont été faites dans six expériences indépendantes en utilisant des fibroblastes secondaires de poulet ou de caille. Etant donné que les cellules infectées par le virus témoin DAHY semblaient aussi saines que des fibroblastes normaux, l'effet observé avec le virus DAH5 est le plus probablement dû à l'expression de la séquence codant pour H5. Comme ces cellules se développaient tres mal, on n'a pas pu effectuer d'analyse moléculaire et en conséquence l'expression de la protéine H5 a été analysée par immunofluorescence ; une coloration selon Giemsa Wright du même champ a été effectuee pour distinguer les noyaux et le cytoplasme. Les fibroblastes de poulet normaux infectés par DAHS ont présenté une fluorescence hétérogène lorsqu'ils ont été traités avec anti-H5 Toutes les cellules présentaient des noyaux fluorescents et l'intensité de la fluorescence est en bonne corrélation avec la structure de la chromatine. Les noyaux hautement condensés présentaient la fluorescence la plus vive, tandis les noyaux avec une chromatine moins condensée présentaient une faible fluorescence. Certains noyaux hautement condensés semblalent être expulsés des cellules. Inversement, les fibroblastes normaux non infectés n'ont pas présenté de fluorescence significative et ils contenalent des noyaux avec une chromatine dispersée typique. 5 H5 est phosphorylée dans les cellules OT6. Il ressort résultats obtenus -que l'expression de la protéine H5 n'a qu'un table effet sur la croissance de cellules transformées. Ainsi, comme étape suivante, on a : recherché des modifications post-traductionnelles possibles de cette protéine entraînant son inactivation dans ces cellules Etant donné que la phosphorylation pourralt etre impliquée dans l'inactivation de H5 aux stades précoces de l'érythropoièse normale (27), on a examiné l'étendue de la phosphorylation de H5 dans les cellules QT6. Des cellules QT6 infectées par DAH5 et non infectées ont été incubées en présence de H3P04 marqué au 32p Les histones riches en lysine ont ensuite été extraites, soumises à une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide-SDS, transférées sur nitrocellulose et l'importance de la phosphorylation a été directement analysée par autoradiographiede la plage de transfert ("blot"). Une protéine phosphorylée, absente dans les cellules QT6 témoins (bande 1) a été détectée dans des cellules QT6 infectées par DAH5 (bande 2). Pour identifier cette protéine, la même plage de transfert ("blot") a été traitée avec un anticorps anti-H5, un conjugué protéine A-peroxydase et la 4-amino-antipyrine comme substrat.La protéine H5 a été détectée dans les cellules QT6 infectées par DAH5 (bande 4! et dans les histones totales extraites d'érythrocytes de poulet (bande 5), tandis qu'aucune zone n'a été observée dans les cellules QT6 témoins (bande 3). La protéine phosphorylée détectée dans la bande 2 a en gros la meme mobilité que la protéine H5 identifiée dans les bandes 4 et 5. Nous pouvons donc conclure que la protéine H5 est phosphorylée dans les cellules QT6 infectées par DAH5. 6. Discussion Cet exemple démontre le transfert et l'expression efficaces de l'histone H5 dans des fibroblastes normaux et transformés. Le vecteur SIN décrit dans cette étude a été construit à partir du virus de la leucose aviaire RAV-2. La délétion des séquences du promoteur dans la 3'LTR conduit à l'intégration d'un provirus inactif dans les cellules infectées. Le vecteur a transféré une copie de séquence H5 étrangère dans le genome de chaque cellule infectée Il a été trouve que ce transfert est tres stable étant donne que la séquence H5 insérée était encore présente dans des cellules cultivées pendant 50 générations sans pression selective. Dans les cellules infectées avec le vecteur SIN de DAH5, les séquences H5 étaient transcrites à partir du promoteur de ET-IIA interne. Etant donné qu'aucun virus vecteur n'a pu être récupéré des cellules infectées même après surinfection avec un virus auxiliaire, aucune transcription n'a été initiée à partir de la 5'LTR. Le vecteur SIN décrit ici est tout à fait fiable et efficace. On n'a pas observé d'effets significatifs des ions Zn++ sur l'efficacité de transcription de H5 dans les cellules infectées. Même sans stimulation, l'unité de transcription de H5 intégrée était actlve. L'actlvlté constitutive du promoteur de MT-IIA et son absence de réponse aux ions Zn++ dans le vecteur de DAH5 pourraient être inhérentes a ce promoteur dans une cellule aviaire, ou pourraient être dues aux effets stimulateurs créés par le promoteur de SV40 proximal ou les LTR La quantité de H5 produite par cellule QT6 infectée par DAH5 est semblable à celle trouvée dans des érythrocytes aviaires matures C'est pourquoi, les effets de H5 dans les cellules infectées peuvent être comparés aux conditions physiologiques natlves. L'expression de H5 dans des fibroblastes transformés, c'est-d-dire des fibroblastes de caille QTS ou des fibroblastes d'embryon de poulet transformés par AEV-ES4, n'a pas inhibé leur croissance in vitro. Des QT6 infectées par DAH5 ne présentent qu'une faible augmentation de leur temps de génération, de 20 à 25 heures, mais leur capacité de croître comme une lignée établie n'a pas été diminuée. Ce résultat montre explicitement que la production constante de H5 a peu d'effet sur le phénotype de fibroblastes transtormés. Les fibroblastes de caille ou de poulet normaux exprimant la protéine H5 exogène présentaient un potentiel de croissance très limite et n'ont pu être ni repiques ni développés. De plus, ces cellules ressemblent a des cellules sénescentes avec une morphologie aplatie, un cytoplasme vacuolisé et des noyaux condensés. La condensation de la chromatine dans ces cellules était directement liée a l'expression de H5 étant donne que les noyaux plus condenses ont présenté la fluorescence la plus vive lorsqu'ils ont été traités avec l'anticorps anti-H5. De plus, certains noyaux avec une chromatine hautement condensée étaient expulses des cellules. Ces donnees montrent par conséquent que H5 presente des effets très différents dans des fibroblastes normaux et transformés. Le rôle biologique de H5 a été régulièrement lié a l'idée qu'il s'agit d'un répresseur général. Ce point de vue est confirmé par le le fait que, lorsque les noyaux ont été réactivés par la fusion d'érythrocytes de poulet avec des cellules HeLa, les évenements précoces constates comprennent une décondensation de la chromatine, une initiation de synthèse d'ARN et une disparition de H5 (2) Une étude récente réalisée par micro-injection de H5 dans des myoblastes de rat L6 en prolifération, lignée cellulaire qui concserve le potentiel de se différencier en myotubules, a montre que la migration et la localisation de H5 dans les noyaux étaient liées a la diminution de la taille des cellules, la vacuolisation du cytoplasme, le tassement des noyaux et l'inhibition de la transcription et de la réplication (4). Le fait que H5 est hautement phosphorylée dans les cellules OT6 transformées infectées rappelle le processus observé dans l'érythropoièse normale. La présence de H5 a été détectée à un niveau réduit dans des érythroblastes en état de division précoce. Dans ces cellules, la protéine nouvellement synthétisée est transportée dans le noyau ou elle est modifiée par un processus impliquant la phosphorylation unidirectionnelle continue pendant laquelle neuf groupements phosphorylés peuvent être introduits. Aux stades terminaux de la maturation des érythrocytes, la protéine phosphorylée est déphosphorylée et ce dernier évènement est en bonne corrélation avec l'arrêt de la synthèse d'ADN et d'ARN et la condensation de la chromatine (5, 26). On n'a pas pu analyser l'étendue de la phosphorylation de H5 dans des fibroblastes normaux infectés par DAH5 étant donné que ces cellules n'ont pas pu être amplifiées. Le mécanisme exact d'interactlon de H5 avec 1'ADN dans la chromatine n'est pas connu. Cependant, on peut envisager un mécanisme qui permet à la cellule de traiter de grandes quantités de E5 sans détérioration du métabolisme cellulaire. La phosphorylation de H5 produit une protéine qui a moins d'affinité pour l'ADN, par neutralisation des charges.C'est pourquoi, les acides aminés modifiés doivent être localisés dans des domaines qui sont décisifs pour cette interaction, c'est-a-dire la région C-terminale (résidus 100-182) qui est la région qui contribue le plus à la condensation de la chromatine par neutralisation partielle des phosphates de 1'ADN. La H5 non modifiée montrant plus d'affinité pour les structures d'ordre supérieur de chromatine et d'ADN, se lierait étroitement à 1'ADN, spéciatement aux régions riches en A-T, en se condensant etlou en changeant sa conformation (20) et, de cette manière, en bloquant la liaison de la machinerie de transcription et de réplication. I1 sera intéressant d'étudier les voies métaboliques qui sont directement responsables de la phosphorylation de H5 dans des cellules transformées et leur relation avec l'expression d' oncogènes Etant donné que les fibroblastes QT6 et AEV-ES4 sont transformés par des évènements initiaux différents, il est probable que les deux processus activent des H5-kinases communes. L'analyse des modifications de H5 dans diverses cellules infectées par DANS peut être utile pour définir le rôle de cette protéine dans la réplication et la différenciation cellulaires et dans la connaissance des mécanismes de transformation oncogénique. BIBLIOGRAPHIE 1. Affolter, M., J. Cote, J. Renaud and A. Ruiz-Carillo. 1987. Regulation of histone and BA-globin gene expression during differentiation of chicken erythroid cells. mol. Cel. Biol. 7, 3663-3672. 2. Appels, R., L. Bolund and R.N. Ringertz. 1974. Biochemical analysis of reactivated chick erythrocyte nuclei isolated from chick HeLa heterokaryons. J. Mol. 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Bonner. 1986. histones and their modifications. CRC Crit. Rev. Biochem. 20:201-210. REVENDICATIONS 1. Vecteur viral auto-inactivant d'intégration et d'expression d'au moins un gène hétérologue dans des cellules aviaires, caractérisé en ce qu'il est constitué à partir du génome proviral d'un rétrovirus aviaire et qu'il comprend entre deux séquences LTR aviaires lesdit(s) gène(s) hétérologue(s) qui se trouve(nt) sous le contrôle d'un promoteur interne hétérologue, des délétions ou des mutations dans la LTR 3' ayant été effectuées de manière à inactiver les promoteurs viraux présents dans les LTR. 2. Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le promoteur ou la séquence enhancer de la LTR 3' ont subi une délétion complète ou partielle. 3. Vecteur selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que la séquence LTR a subi des délétions dans la région U3. 4. Vecteur selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les boîtes CAAT et TATA ont été délétées. 5. Vecteur selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il a été construit à partir d'éléments de génomes issus des rétrovirus RAV-l, RAV-2 et AEV. 6. Vecteur selon Itune des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est construit essentiellement à partir du génome du rétrovirus RAV-2 dont la LTR 3' comprend la séquence U3 de la LTR de RAV-2 dans laquelle les boîtes CAAT et TATA ont été délétées et les séquences R et U5 de la LTR de RAV-1. 7. Vecteur selon l'une des revendications I à 3, caractérisé en ce que la LTR 3' est issue d'un virus dont les LTR sont naturellement très peu actives et a subi des délétions ou mutations ponctuelles. 8. Vecteur selon la revendication 7 caractérisé en ce que la LTR 3' est issue du virus RAV-0. 9. Vecteur selon selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte deux gènes hétérologues, à savoir un gène utile placé sous le contrôle d'un promoteur interne hétérologue et un gène de sélection placé sous le contrôle d'un promoteur interne hétérologue ou du promoteur de LTR 5'. 10. Vecteur selon la revendication précédente, caractérisé en ce que lesdits gènes hétérologues remplacent les oncogènes v-erbA et v-erbB. 11. Vecteur d'intégration et d'expression d'un gène étranger caractérisé en ce qu'il est du type plasmidique et comporte une séquence composite d'ADN transcrit reverse d'un vecteur viral ARN selon l'une des revendications 1 à 9. 12. Vecteurs pDAI, pDAY et pDAH5 tels que représentés à la figure 2b. 13. Procédé de préparation d'un vecteur selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on effectue une ou des délétion(s) ou mutation(s) dans la LTR 3' aviaire de manière à inactiver les promoteurs viraux présents dans lesdites LTR, et on insère lesdits gènes hétérologues sous le contrôle d'un promoteur interne hétérologue ou du promoteur de la LTR 5'. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'on insère dans le vecteur pDA1 au site XbaI (marqué X sur la figure 2b) une cassette transcriptionnelle d'un gène hétérologue. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la cassette transcriptionnelle du gène hétérologue consiste dans le vecteur pBOB représenté figure 6 dans lequel on insère ledit gène hétérologue au niveau des sites de restriction d'un polylinker compris entre une séquence d'initiation de transcription sous forme du promoteur métallothionéine humain IIa MTIIA et d'une séquence de terminaison de transcription et de polyadénylation dérivée du gène de l'histone H5, la cassette pBOB étant encadrée par deux sites XbaI qui permettent son isolement puis son insertion au site XbaI unique du vecteur pDAl. 16. Procédé de modification de cellules, caractérisé en ce qu'on effectue une infection ou une transfection desdites cellules avec des vecteurs rétroviraux selon l'une des revendications I à 12. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'on effectue une co-infection ou co-transfection avec un virus assistant qui comporte les gènes assurant la réplication dudit vecteur rétroviral. 18. Cellule modifiée par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 16 et 17. 19. Cellule selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'il s'agit de cellules aviaires. 20. Cellule selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'il s'agit de fibroblastes embryonnaires de poulet ou de caille. 21. Procédé de préparation d'au moins une protéine déterminée par culture de cellules selon l'une des revendication 18 à 20, le gène étant un gène étranger codant pour ladite protéine, la protéine étant récupérée après culture.