FR 2651132 A1 19910301 FR 9000935 A 19900126 AGENTS DE PROTECTION DES CELLULES CONTRE LES ESPECES CHIMIQUES A OXYGENE ACTIF ET LEUR PREPARATION La présente invention concerne des agents de protection des cellules contre Les espèces chimiques à oxygène actif. Les agents de protection des celLuLes contiennent des flavonordes biochimiquement actifs et ils sont supposés être utilisables comme constituants de cosmétiques. Les espèces chimiques à oxygène actif sont connues pour provoquer une dégradation des cellules, des mutations, le cancer et le vieillissement par peroxydation des Lipides, dégradation des proteines, altération des acides nucléiques etc. (Leibovitz, B.E. et Siegel B.W. (1980), J. Gerontol., 35,45; Foote, C.S. (1982) "Pathology of Oxygen" (A.P. Autor, éd.) Academic Press, N.Y., 21; Straight, R.C. et Spikes, J.D. (1985), "Singlet Oxygen, vol.IV, Reaction Modes and Product, Part 2" (Frimer, A.A. éd.). Les espèces chimiques à oxygène actif peuvent comprendre L'oxygène singulet, le radical hydroxyLe, Le radical anion superoxyde, le peroxyde d'hydrogène, etc., et de nombreuses études sont en cours sur les composés chimiques et enzymes capables de les inactiver ou de les pièger. Il a déjà été indiqué précédemment que Le carotène (Foote, C.S. et Denny, (1968), j. Am. Chem. Soc., 90,6233) ou l'-tocophérol (Fahrenholtz, S.R. et Doleiden, F.H. (1974), Photochemistry and photobiology, 20, 505-509) présente une activité d'inactivation efficace contre l'oxygène singulet qui a une grande importance biologique pour les cellules de la peau fréquemment exposées à La Lumière solaire. Comme capteurs du radical hydroxyle qui sont connus pour être les plus réactifs vis-å-vis des espèces chimiques à oxygène actif, on peut citer par exemple le mannitol(Martin, J.P. et Logsdon, N.(1987), J. Biol. Chem. 262, 15, 7213-7219), le tryptophane, le formiate, le t-butanol, Méthanol (Bors, W. et Michel, C. (1977) Eur.J. Biochem., 95, 621-627) etc., tandis que-des études sur la superoxyde dismutase, une enzyme de l'organisme vivant transformant le radical anion superoxyde en peroxyde- d'hydrogène et sur la catalase ou la glutathion peroxydase, une enzyme de l'organisme vivant décomposant le peroxyde d'hydrogène en eau et en oxygène sont activement poursuivis en relation avec le vieillissement des cellules (Hans Nohl et Dietmar Hegner (1979), Mechanisms of Ageing and development, 11,145-151). Ces dernières années, certains types de flavonoides présents dans les matières végétales utilisées pour le traitement de maladies très diverses depuis les temps anciens se sont révélés réagir avec diverses espèces chimiques à oxygène actif, à savoir l'oxygène singulet (Sorata, Y., Takahama, U. et Kimura, M. (1984), Biochem, Biophys. Acta. 799,31; Matuura, T., Matsushima, H., Nakashima, R. (1970), Tetrahedron, 26,435; Takahama, U., Youngman, R.J., Elsther, E.F. (1984), Photobiochem. Photobiophys, 7,175-181), Le radical anion superoxyde (Baumann, J., Wurm, G. et Bruchhausèn, F.V. (1980), Arch. Phare. 313,330), le radical hydroxyle (Nasr,C., Pincemail, J., Brasseur, T. Deby, C., Haag,M., Angenot, L., Anton, R. (1987), Ind. Int. Symp. on Plant Flavonoids in Biology and medicine, p69, Husain, S.R., Cillard, J. et Cillard, P. (1987), Phytochemistry, 26,2489), et le peroxyde d'hydrogène (Barz, W., Wiermann, R. (1981) dans Proc. Int. Bioflavonoid Symp., pp185, Barz, W., Koster, J., Weltring, K.M., tractk, D.(1985), Ann. Proc. Phytochem. Soc. Eur., 25,307; Miller, E., Schreier, P. (1985), Food Chem. 17,143). En outre, en ce qui concerne les flavonoides, L'activité de piégeage des radicaux libres (Wolf Bors et Manfred Saran (1987), Free Rad. Res. Comms., vol.2, n04-6,289-294) et t'activité de répression de la peroxydation des lipides (Younes, M., Siegers, C.P. (1981) Planta Medica, 43,240) ont déjà été étudiées et on a également étudié-l'act-;vité--inhibitrice pour une enzyme oxydante de l'organisme vivant telle que la lipoxygenase etc. (Baumann, J., Bruchhausen, F.V. et Wurm, G. (1980), Prostaglandins, vol.20, n04, 627). Cependant, malgré les nombreuses études précitées, les flavono;des n'ont pas pu être utilisés dans la pratique comme agents de protection des cellules contre les espèces chimiques à oxygène actif, car ces études 1) concernent pour la plupart uniquement la réaction physicochimique ; ou 2) n'ont pas pu s'écarter du niveau enzymatique même dans le cas du traitement de la réaction biochimique ; ou 3) n'ont pas pu expliquer le mécanisme même si leur efficacité plus ou moins éLevée en clinique est reconnue. Dans ces conditions, une conséquence inévitable a été que des méthodes expérimentales quantitatives et significatives du point de vue biochimique et biologique n'ont pas été mises au point. La demanderesse a porté son attention sur le fait que si l'on mettait au point des méthodes expérimentales quantitatives et significatives du point de vue biochimique-biologique, les flavonoides seraient utilisables comme agents de protection des cellules contre les espèces chimiques à oxygène actif car les flavonoides ont une grande utilité en raison de leurs diverses activités résultant de leurs structures variées et de leurs teneurs élevées dans les matières végétales. Partant de ce fait, la demanderesse a essayé dans un premier stade de mettre au point et d'établir les méthodes expérimentales, et elle a effectué dans un second stade des études quantitatives au moyen des méthodes expérimentales ainsi obtenues. Par conséquent, La présente invention fournit une méthode expérimentale quantitative et efficace du point de vue biochimique et biologique nécessaire pour le développement d'agents protecteurs des cellules contre les espèces chimiques à oxygène actif, elle choisit des flavono;des présentant l'effet le plus prononcé au moyen de la méthode ainsi obtenue et elle interprète le mécanisme de l'activité ; en conséquence, la présente invention est precieuse pour permettre l'utilisation pratique des agents protecteurs des cellules contenant des flavonoides biochimiquemet actifs. La présente invention concerne un procédé pour mesurer quantitativement L'activité de protection des cellules des flavonoides contre Les espèces chimiques à oxygène actif au moyen d'une expérience de photohémolyse des érythrocytes significative du point de vue biochimique-biologique. L'expérience de photohémolyse des érythrocytes a été effectuée pour interpréter le mécanisme de l'hémolyse par les espèces chimiques à oxygène actif ou par La lumière (Epiling, G.A. et Sibley, M.T. (1987), Photochem. Photobiol., 46,39; LamoLa, A.A. et Doleidon, F.H. (1980), Photochem. Photobiol., 31,597, Valenzeno, D.P. (1984) Photochem. Photobiol., 40,681), mais elle n'a pas été utilisée dans une expérience quantitative, car divers facteurs influants sur cette expérience n'ont pas été suffisamment pris en considération. La demanderesse a supposé que si les conditions expérimentales permettant une mesure quantitative et significative du point de vue biochimique-biologique étaient établies, l'expérience ci-dessus serait plus simple que L'expérience sur l'animal et pourrait fournir --des informations très utiles en peu de temps. Elle a poursuivi les études pour aboutir~ à la présente invention. Comme conséquence des études sur les effets de divers flavonordes en utilisant la méthode expérimentale de photohémolyse des érythrocytes mise au point, les faits nouveaux suivants ont été établis : 1) En plus de la réaction de dégradation physico-chimique directe par les espèces chimiques à oxygène actif, une réaction biochimique secondaire est responsable de La photohémolyse des érythrocytes. 2) Les flavonoides peuvent être classés en pLusieurs groupes, à savoir un groupe réagissant directement par voie physico-chimique avec Les espèces chimiques à oxygène actif (myricétine, quercétine, etc.), un groupe agissant principalement dans le stade de réaction biochimique secondaire (galangine, kaempférol, etc.) et un groupe agissant dans les deux stades ((-)-epigallocatéchine, ba1caléine). 3) Lorsque des flavonoides agissant respectivement dans des stades différents ont été traités ensemble, l'activité a été augmentée d'une manière synergique. 4) Parmi les flavonoides essayés le gallate de (-)-épigallocatéchine a présenté une forte activité dans les deux stades et la galangine a présenté d'une manière surprenante une activité particulièrement forte dans le stade de la réaction biochimique secondaire. La demanderesse a choisi les matières végéta Les contenant tes flavonoides biochimiquement actifs en grandes quantités de la manière décrite ciaprès en vue de mettre au point les agents protecteurs des cellules contre les espèces chimiques à oxygène actif en appliquant les résultats de L'étudie ci-dessus, et elle a préparé des agents protecteurs des cellules à partir des extraits. 1) Cammellia sinensis L., gallate de (1)épigallocatéchine (teneur : 8X des feuilles sèches). 2) Alpinia officinarul Hance ; (galangine teneur : IX dans les racines sèches). 3) Scutellaria baicalensis Georgi ; ba;caléine et ses glycosides (teneur 3X dans les racines sèches). Le procédé de préparation de la solution contenant l'extrait total est le suivant : le procédé est caractérise en ce qu'on extrait les matières végétales seches avec de l'eau ou une solution aqueuse d'éthanol, de propylèneglycoL, de butylèneglycols ou de glycérols, en ce qu'on ajoute de l'eau ou une solution aqueuse de butylèneglycols, de glycérol à la solution contenant l'extrait et en ce qu'on La fait vieillir dans une chambre froide. Cette solution peut être utilisée elle-même comme agent de protection des cellules. La description détaillée et le procéde de préparation de l'extrait purifié seront donnés dans les exemples ci-dessous. Essai 1 : Mesure de l'activité de protection des cellules des flavono;des contre les espèces chimiques à oxygène actif. 1) Préparation des échantiLlons Divers flavono;des, à savoir la galangine, le gallate de (-)-épigaLlocatéchine (EGCG), la quercétine, le kaempférol, La myricétine, la 3-hydroxyflavone, la rutine, l'apigénine, la chrysine, l'acacétine, la ba;caline, la flavone, la 7,8-benzoflavone, la (-)épicatéchine, la (+)-catéchine, la silybine, la dihydrorobinétine, la taxifoline et l'aromadendrine et, comme témoin, L'-tocophérol (chacun 4 mmoles) ont été dissous dans 1,0l d'éthanol pour obtenir des échantillons. 2) Mesure Du sang prélevé sur un lapin a été centrifugé à 3 000 tours/min. pendant 5 minutes et lavé pour obtenir des érythrocytes qui ont été dilués dans du sérum physiologique pour préparer une suspension 7 d'érythrocytes (érythrocytes 6x10 /3,5 ml). Six tubes à essais en Pyrex de 10 ml de 1,0 cm de diamètre ont eté préparés, et l'on a introduit dans chacun d'eux 3,5 ml de la suspension. Trois des six tubes à essais ont été pris comme groupe témoin, et on leur a ajouté respectivement 50 Fl d'éthanol. Les trois autres tubes à essais ont été pris comme groupe d'essais et on leur a ajouté 50 ;L d'échantillon respectivement, puis on les a soumis à une préincubation dans L'obscurité pendant 30 minutes.Lorsque la préincubation était terminée, on a ajouté 0,5 ml d'une solution aqueuse de rose bengale (12 frM) comme photosensibilisant, et les ouvertures ont été bouchées hermétiquement avec du para-film. Dans une botte hexahedrique rectangulaire de 50x20x25 cm, dont l'intérieur a été peint dans une couleur foncée et équipée d'une lampe fluorescente de 20W, les tubes à essais ont été disposés à une distance de 5cm de la Lampe et irradiés pendant 15min. Le but de L'addition du photosensibilisant et de l'irradiation par la lumière était de produire des espèces chimiques à oxyène actif. Lorsque l'irradiation était terminée, les tubes à essais ont été maintenus à l'obscurité et les transmittances à 700nom ont été mesurées à des intervalles de 15 minutes. A cette longueur d'onde, l'augmentation de transmittance de la suspension d'érythrocyte était proportionnelle à l'hémolyse des érythrocytes. Toutes les expériences décrites ci-dessus ont été effectuées à une température ambiante constante de 270C, et les activités de protection des cellules des echantillons contre les espèces chimiques à oxygène actif ont été définies comme le temps de demi-hémolyse (en minutes) nécessaire pour photohémolyser 50X des érythrocytes ajoutés dans les conditions ci-dessus. 3) Résultats Les résultats sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous, qui montre que plusieurs flavono;des tels que galangine, EGCG etc. ont une activité supérieure à celle de l' -tocopherol. Tableau 1 : Effet de protection des cellules des flavono;des contre les espèces chimiques à oxygène actif. Echantillon Temps de demi-hémolyse (min.) galangine 1800 EGCG 400 quercétine 315 kaempférol 280 myricétine 160 baïcaléine 106 fisétine 87 morne 55 3-hydroxyflavone 46 rutine 32 apigénine 51 chrysine 50 acacétine 45 baïcaline 32 flavone 25 7,8-benzoflavone 50 (-)-épicatéchine 42 (+)-catéchine 41 silybine 49 dihydrorobinétine 41 taxifoline 33 aromadendrine 33 -tocophérol 45 &alpha;-tocophérol 45 témoin 32 Essai 2 : Activité synergique de La galangine et de l'EGCG. La galangine et l'EGCG ont été combinés-dans le rapport molaire de 3:1-1:3 pour préparer des échantillons (4mM) et des mesures ont été effectuées de la même manière que dans l'essai 1. La comparaison des resultats avec ceux de l'essai 1 montre que la galangine et l'EGCG ont une nette activité synergique. Tableau 2 : Synergie de la galangine et de l'EGCG. Echantillon Temps de demi-hémolyse (min.) galangine + EGCG(1:1) > 2000 galangine + EGCG(3:1) > 2000 galangine + EGCG(1:3) > 2000 galangine 1800 EGCG 400 &alpha;-tocophérol 45 témoin 32 Exemples 1-6 : Préparation de la solution contenant L'extrait total. Pour 1,0 kg de matières végétales sèches obtenues à partir de feuilles de Camellia Sinensis L., de racines d'Alpinia officinarum, de racines de Scutellaria baicalensis Georgi, de feuilles de Ginkgo biloba L., d'écorces de fruits de Citrus tangerina Hort. et de Tanaka et de feuilles d'Acacia catechu Willd, on a ajouté 10kg d'éthanol à SO(V/V)X et, après avoir extrait le mélange à la temperature ambiante pendant 7 jours, on a ajouté 8,0 kg d'eau à la solution contenant l'extrait. La solution obtenue a été vieillie en chambre- froide à ?OOC et -f;ttrée---pour donner à chaque fois 16 kg de solution contenant l'extrait total. Essai 3 : Mesure de l'activité de protection des cellules de l'extrait total de matières végétales. Cet essai a été effectué pour mesurer l'activité de protection des cellules des solutions contenant un extrait total obtenues dans les exemples 1 à 6. L'essai a été effectué de la même manière que dans l'essai 1 excepté que les solutions diluées par L'éthanol (1- 10) de la solution contenant L'extrait total ont été utilisées comme échantillons. Les résultats sont donnés dans le tableau 3 ci-dessous. D'après les résultats, on peut voir que les extraits totaux d'Alpinia et de Camellia contenant respectivement de La galangine et de l'EGCG présentent une excellente activité, et l'on estime que ces solutions peuvent être utilisées elles-mêmes comme agents de protection des cellules. Tableau 3 : Activité de protection des cellules de l'extrait total Source d'extrait total Temps de demi-hémolyse (min.) Camellia 800 Alpinia 420 Scutellaria 290 Ginko 55 Citrus 38 Acacia 42 Témoin 32 Exemple 7 : Activité synergique dans l'extrait total obtenu à partir de Camellia et d'Alpinia Des solutions contenant des extraits totaux obtenus à partir de feuilles de Camellia Sinensis L. et de racines d'Alpinia officinarum Hance respectivement, ont été combinées dans le rapport de 1:1 (en poids de base) et essayées de La même manière que dans l'essai 3. La mesure montre que le temps de demi-hémolyse est de 1200 min. Exemple 8 : Préparation d'un extrait purifié de Camellia Sinensis L. A 1,0 kg de feuilles sèches de Camellia Sinensis L., on ajoute 10 kg d'eau et on extrait Le mélange obtenu pendant deux heures à 800C tout en chauffant, puis on concentre le filtrat à un volume de 1/5 à 500C. On ajoute au concentré 5 kg d'éthanol et, après avoir mélangé et filtré, on concentre le filtrat à sec à 500C pour obtenir 809 d'extrait purifié contenant de l'EGCG. Exemple 9 : Extraction de la galangine. A 1009 de racines sèches d'Alpinia officinarum Hance,-on-ioute i,0kg d'acétate d'ethyle. On chauffe le mélange obtenu sous reflux pendant 2 heures et, après refroidissement, on le filtre. On concentre Le filtrat. On soumet le concentré à une chromatographie sur colonne avec du gel de silice (gel de silice 2009, diamètre de la colonne 4cm, n-hexane : acétate d'éthyle = 3:1(V/V)) pour obtenir les fractions contenant de la galangine, après quoi on Les fait recristalliser dans un mélange de n-hexanol et d'acétate d'éthyle 1:1(V/V), ce qui donne 0,99 de galangine. Exemple 10 : Préparation d'un agent de protection des cellules. On dissout 89 de l'extrait purifié de Camellia Sinensis L. obtenu dans l'exemple 8 et 0,99 de ta galangine obtenue à partir d'Alpinia officinarum Hance dans L'exemple 9 dans 1,6kg de la solution contenant l'extrait total obtenue à partir de Scutellaria ba;calensis Georgi dans l'exemple 3 pour préparer l'agent de protection des cellules. L'agent de protection des cellules ainsi obtenu a été essayé de la même manière que dans l'essai 3, et la mesure a montré un temps d-e demi-hémolyse supérieur à 2000 min. REVENDICATIONS 1. Agent de protection des cellules contre les espèces chimiques à oxygène actif prépare à partir d'extraits totaux ou purifiés de matières végétales choisies parmi les feuilles de Camellia sinensis L., des racines d'Alpinia officinarum Hance et des racines de Scutellaria baicalensis Georgi qui contient au moins un flavonotde biochimiquement actif constitue par du gallate de (-)-epigallocatéchine, de la galangine ou de la bafcaleinc conne constituant actif. 2. Agent de protection des cellules suivant la revendication 1, dans lequel L'agent de protection des cellules est caractérisé en ce qu'il contient de la (-)-épigallocatéchine et de la galangine dans le rapport molaire de 1:3 à 3:1. 3. Agent de protection des cellules suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on combine la solution contenant l'extrait total de Camellia sinensis L. et la solution contenant l'extrait total de Alpinia officinarum Hance. 4. Agent de protection des cellules suivant la revendication 1, dans lequel L'agent de protection des cellules est préparé en dissolvant l'extrait purifie contenant du gallate de l'(-)-épigallocatechine obtenu à partir de Camellia sinensis L. et de La galangine extraite d'Alpinia officinarum Hance dans la solution contenant L'extrait total de Scutellaria ba;calensis Georgi. 5. Procédé de préparation d'un agent de protection des cellules selon la revendication 1 qui est carac terse en ce qu'on extrait les matières végétales avec de l'e':hanol aqueux, en ce qu'on ajoute de L'eau à la solution contenant l'extrait dans les mimes quantites et en ce qu'on fait vieillir le mélange obtenu. 6. Procédé de préparation de gallate de (-)épigallocatechine qui est caractérisé en ce qu'on extrait les feuilles de Camellia sinensis L. avec de l'eau à raison de 10 fois Leur poids à 800C, en ce que, après filtration,on concentre le filtrat à un volume de 1/5, en ce qu'on ajoute au concentré de l'éthanol à raison de trois fois son poids, en ce qu'on elioine le précipité par filtration et en ce qu'on concentre le filtrat à sec. 7. Procédé de préparation de la galangine- qui est caracterisé en ce qu'on effectue une chromatographie sur colonne avec du gel de silice sur l'extrait par l'acétate d'éthyle d'Alpinia officinarum Hance pour obtenir des fractions contenant de la galangine, puis on recristallise les fractions dans un mélange hexane:acétate d'éthyle=1:1(V/V. 8. Composition cosmétique qui est caracterisee en ce qu'elle comprend un agent de protection des cellules comprenant au moins un flavonoide seLon la revendication 1.