FR 2657016 A1 19910719 FR 9000455 A 19900116 PEPTIDES DERIVANT DE LA GLYCOPROTEINE D'ENVELOPPE DU VIRUS-HIV-2, LEURS APPLICATIONS A LA DETECTION D D'UNE INFECTION DUE A CE VIRUS ET A LA VACCINATION CONTRE LE SIDA La présente invention a pour objet des peptides antigéniques susceptibles d'être reconnus par des anticorps induits chez l'homme par les rétrovirus du type HIV-2 selon la nomenclature définie dans la revue Nature. L'invention concerne également des peptides ayant des propriétés immunogènes ou susceptibles d'être rendus immunogènes in vivo. L'invention concerne en outre des applications de ces peptides à la fabrication de composition pour le diagnostic in vitro du SIDA chez l'homme et à la production de compositions immunogènes et de compositions vaccinantes contre le rétrovirus HIV-2. De même, l'invention concerne les applications aux mêmes fins des anticorps susceptibles d'être induits ln VlVo par les peptides immunogènes ou rendus immunogènes et, leurs applications à la production de principes actifs de médicaments contre certaines formes de SIDA. L'invention concerne aussi l'utilisation de ces peptides dans des procédés de diagnostic invitro de certaines formes de SIDA chez l'homme ainsi que les nécessaires ou kits de diagnostic pour la mise en oeuvre desdits procédés. Un premier rétrovirus dénommé HIV-1 a été décrit dans la demande de brevet européen NO 138 667 du 14 septembre 1984. Un second rétrovirus dénommé HIV-2 a été décrit dans la demande de brevet européen NO 239 425 du 22 janvier 1987. Ces deux rétrovirus ont pour cibles préférencielles les lymphocytes T4 humains et présentent un effet cytopathogène à l'égard de ces lymphocytes. Les lysats des virus HIV-2 contiennent des protéines du noyau dénommées protéines qaq et pol qui présentent une homologie de 60 % avec les protéines gag et pol correspondantes des virus HIV-1, et des protéines de l'enveloppe dénommées protéines env qui présentent seulement une homologie de 40 % avec les protéines env correspondantes des virus HIV-1 . Ces lysats ont été utilisés dans des tests de diagnostic du SIDA. Afin d'augmenter la spécificité de ces tests, il a été proposé de substituer aux lysats viraux des produits qui ne dérivent pas de cellules infectées par le virus, comme des peptides synthétiques ou des peptides obtenus d'organismes recombinants. Les études effectuées sur les différentes protéines du virus HIV-2 ont permis de reconnaître des peptides ayant des séquences identiques ou proches des séquences contenues dans les protéines aag, ou dans les protéines env de HIV-2. De tels peptides ont été décrits dans la demande de brevet français NO 2 610 632. La présente invention concerne de nouveaux peptides correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe gp41 de HIV-2. Ces peptides peuvent notamment être utilisés pour le diagnostic invitro chez l'homme d'une infection par le virus HIV-2; ils permettent une discrimination poussée entre les infections dues à des virus HIV-2 et celles dues à des virus HIV-1. Un autre but de la présente invention est de fournir des peptides antigéniques dont la séquence en aminoacides est modifiée de façon à prévenir la formation de ponts disulfures non désirés. Pour désigner ci-après les résidus d'aminoacides entrant dans la constitution des peptides selon l'invention, on aura recours à la nomenclature internationale désignant chaque acide aminé naturel par une lettre majuscule unique selon le tableau de correspondance suivant A Alanine C Cystéine D Acide aspartique E Acide glutamique F Phenylalanine G Glycine H Histidine I Isoleucine K Lysine L Leucine M Méthionine P Proline A Arginine S Sérine T Thréonine V Valine W Tryptophane Y Tyrosine Q Glutamine N Asparagine Les peptides de l'invention répondent à la formule suivante XAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCZ (I) dans laquelle X représente un groupe NH2 libre ou amidé par un ou deux groupes alcoyle comprenant de 1 à 5 atomes de carbone et Z représente soit un groupe OH libre ou alcoxyle et contenant alors un groupe alcoyle comprenant de 1 à 5 atomes de carbone. Les peptides, selon l'invention, peuvent être préparés par les techniques classiques de synthèse peptidique en phase solide soit par condensation successive des résidus d'acides aminés dans l'ordre requis, soit par condensation des résidus d'acides aminés sur un fragment préalablement formé et contenant déjà plusieurs acides aminés dans l'ordre approprié ou encore par condensation de plusieurs fragments préalablement préparés, en prenant soin de protéger, au préalable, toutes les fonctions réactives portées par les résidus d'acides aminés ou les fragments, excepté les fonctions amine et carboxyle engagées dans la liaison peptidique formée lors de la condensation. Selon un exemple de préparation d'un peptide selon l'invention, on fixe sur une résine, par l'intermédiaire de son groupe carboxylique le résidu C dont la fonction amine est protégée par un groupe terbutyloxycarbonyl, puis après avoir déprotégé la fonction amine en lavant la résine avec de l'acide trifluoroacétique dans du dichlorométhane, on couple en présence de diméthylformamide le second résidu d'acide aminé V dont la fonction amine est protégée comme précédemment, on fixe ainsi les uns après les autres les résidus d'acides aminés. Après déprotection la fonction amine du résidu N-terminal A peut par exemple être acétylée par action d'un excès d'anhydride acétique en présence de diisopropyléthylamine. Les chaînes latérales des acides aminés trifonctionnels doivent être protégées notamment par les groupes suivants : le cyclohexyl pour l'acide glutamique, le benzyl pour la thréonine, le tosyl pour l'arginine, le paraméthylbenzyl pour la cystéine, le 2,6-dichlorobenzyl pour la tyrosine, le fluorénylméthyloxycarbonyl ou le 2chlorobenzyloxycarbonyl pour la lysine. Après avoir éliminé tous les groupes protecteurs, le peptide selon l'invention est libéré du support solide comme indiqué précédemment . Le produit brut est lyophilisé et purifié par chromatographie en phase liquide à moyenne pression permettant d'obtenir des peptides purs à environ 70%; les produits sont alors purifiés par chromatographie en phase liquide à haute pression permettant d'obtenir des peptides purs à 95%. De manière avantageuse au moins un des résidus C de la formule (I) est délété, substitué ou protégé. La modification des peptides de l'invention au niveau d'au moins un des résidus C vise à prévenir la formation de pont disulfure, notamment lors de la préparation en phase liquide d'un mélange de peptides de l'invention ou d'un mélange de peptides de l'invention avec d'autres peptides. Parmi les moyens de substitution ou de protection d'au moins un des résidus C, on préfère - la substitution d'au moins un des résidus C par un résidu S. - la substitution d'au moins un des résidus C par un résidu A. - la substitution d'au moins un des résidus C par un résidu acide gamma amino butyrique. - La protection d'au moins un des résidus C par un groupement acétamidométhyl. - La substitution des deux résidus C par un résidu D et un résidu E liés par un pont amide. - La formation d'un pont disulfure entre les deux résidus C. Outre les peptides précités, l'invention concerne les peptides modifiés par insertion et/ou délétion et/ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, pour autant que les propriétés antigéniques ou immunogènes desdits peptides ne sont pas modifiées, ainsi que ceux dans lesquels la liaison peptidique (-CO-NH-) est remplacée, par exemple, par les structures suivantes -CO-N(CH3)- , -CH2-CH2-, -CO-CH2ou encore dans lesquels le squelette peptidique présente un ou plusieurs groupes intercalés tels que les groupes -CH2-, NH-, -O-. La présente invention englobe également les peptides dans lesquels les résidus d'acides aminés présentant un carbone asymétrique sont sous forme D ou L. L'invention concerne également les oligomères des monomères constitués des peptides de l'invention ainsi que la composition antigénique contenant au moins un desdits peptides, ou au moins un oligomère de ce peptide reconnaissant spécifiquement la présence d'anticorps anti HIV-2. On peut réaliser l'oligomérisation par toute technique de polymérisation d'un peptide, la polymérisation étant effectuée jusqu'à l'obtention d'un oligomère contenant le nombre de monomères permettant d'obtenir l'immunogénicité souhaitée. L'invention concerne encore les conjugués obtenus par couplage des peptides de l'invention à des molécules porteuses, ainsi que la composition immunogène contenant au moins un desdits peptides ou au moins un oligomère de ce peptide ou ce peptide conjugué à une molécule porteuse, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour la préparation de vaccins induisant la production d'anticorps contre lesdits peptides en quantité suffisante pour inhiber efficacement le rétrovirus HIV-2. A titre d'exemple de molécules porteuses on peut citer des protéines naturelles comme l'anatoxine tétanique, l'ovalbumine ou des sérums albumines. Les peptides de l'invention possèdent des propriétés antigéniques et peuvent donc être utilisés dans des procédés de détection d'une infection par le virus HIV-2. L'invention a donc également pour objet un procédé de diagnostic in vitro de l'infection par le rétrovirus HIV-2, dans un échantillon biologique tel que le sérum humain comprenant de manière générale - la mise en contact de cet échantillon biologique avec au moins un des peptides selon l'invention ou un conjugué de ce peptide avec une molécule porteuse; - la détection de la présence éventuelle de complexes antigène-anticorps. La détection des complexes antigène-anticorps éventuellement formés est avantageusement effectuée par des tests immunoenzymatique, immunofluorescents, radioimmunologique ou des tests de radioimmunoprécipitation. L'invention concerne donc aussi les peptides précédents marqués notamment par un isotope radioactif, une enzyme, une substance fluorescente, une molécule chargée électriquement, une particule colorée, la biotine, un composé organo-métallique. A titre d'exemple des procédés de détection des anticorps anti-HIV-2 sus-mentionnés, on peut citer notamment un test immunoenzymatique indirect dans le sérum ou le plasma humain comprenant les étapes suivantes - Dépôt d'une quantité déterminée d'un peptide de l'invention ou d'une composition contenant ledit peptide dans les puits d'une plaque de microtitration; - Distribution des sérums ou plasma à étudier dilués, ainsi que des sérums de contrôle positifs et négatifs, dans lesdits puits; - Incubation pendant une durée suffisante pour permettre la fixation des anticorps sériques éventuellement présents aux peptides de l'invention spécifiques de HIV-2; - Lavage de la microplaque; - Introduction dans les puits d'un conjugué anti-IgG humaine marqué à la péroxydase se liant aux immunoglobulines du sang retenues sur la phase solide; - Elimination de la fraction non liée;; - Révélation de la présence éventuelle de l'enzyme par un substrat chromogène; - Détection et comparaison avec les sérums de contrôle. Parmi les procédés de détection des anticorpsanti-HIV-2 selon l'invention, on peut citer en outre, un test sérologique immunoenzymatique indirect rapide comprenant les étapes suivantes - Dépôt d'une d'une quantitée déterminée d'un peptide de l'invention sur une membrane, saturée puis séchée; - Filtration au travers de cette membrane d'un sérum à tester (ou plasma ou sang total); suivi du dépôt d'un conjugué (par exemple anti-IgG humain couplé à la peroxydase); - Après lavage, la réaction est révélée par dépôt d'un substrat chromogène de la peroxydase. Seuls les anticorps anti-HIV-2 fixés aux peptides sont révélés dans cette réaction par un petit spot.Un témoin interne de validation est inclus dans le test; - La présence d'un spot coloré en position du dépôt préliminaire du peptide ainsi que la présence du contrôle de validation interne permet l'interprétation positive (présence d'anticorps-anti-HIV-2) pour l'échantillon considéré en un temps de trois minutes. L'invention concerne enfin des nécessaires ou kits pour le diagnostic invitro de l'infection par le rétrovirus HIV-2, dans un échantillon biologique comprenant: - une quantité donnée d'au moins un peptide selon 1 invention, ou un mélange de ces peptides, ou un conjugué de ce peptide avec une molécule porteuse; - au moins un réactif pour la constitution d'un milieu propice à la réalisation d'une réaction immunologique; - un ou plusieurs réactifs éventuellement marqué pour la détection des complexes antigène-anticorps formés lors de la réaction immunologique; - au moins un échantillon de contrôle dépourvu d'anticorps ou contenant une quantité connue d'anticorps reconnus par lesdits peptides. Une étude comparative a été réalisée afin de montrer que les modifications effectuées sur le peptide ne changent pas sa fonctionnalité antigènique. Cette étude a consisté à tester sur des sérums de réactivité connue, le peptide natif de formule AIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVC (I) ainsi que ce peptide dont les deux résidus C ont été, d'une part substitués par deux résidus S et d'autre part, liés par un pont disulfure. Chacun des trois peptides a été utilisés dans un test de diagnostic sérologique sur plaque de microtitration, selon le même protocole suivant Sensibilisation des plaques de microtitration - Les peptides sont repris en milieu liquide. Après dilution en tampon à une concentration de 3 ug/ml, les cupules des microplaques sont sensibilisées par 100ul de cette solution, 16 heures à 370C; - Les plaques sont ensuite vidées et 300 ul de solution de saturation sont ajoutés; incubation 2 heures à température du laboratoire; - Après quatre cycles de lavages, les plaques sont séchées à 37 OC avant utilisation (stockage en sac étanche avec déssicant); Realisation de la réaction - Après prélavage de la plaque de microtitration sensibilisée, 100 ul de l'échantillon (sérum de réactivité connue dilué au 1/25) sont déposés par cupules. Des témoins de manipulation sont inclus dans chaque série, l'incubation est effectuée pendant 15 minutes à température ambiante. - Après un second lavage (4 cycles) afin d'éliminer les anticorps sériques non fixés, on distribue 100 ul d'anticorps anti-IgG humain couplé à la peroxydase (polyclonal d'origine caprine); l'incubation est effectuée 15 minutes à température ambiante; - Un dernier cycle de lavage est ensuite effectué, et le conjugué peroxydase est révélé par 50 ul de substrat OPD (Ortho-phénylènediamine) en présence d'H202; cette incubation est conduite pendante 5 minutes à l'obscurité; - Après apparition de la coloration, la réaction de chromogénèse est arrêtée par 100 ul d'HCl (1N). La densité optique (DO) est ensuite lu à 492 nm. Résultats Dans cette étude l'antigènicité du peptide natif de formule (I) est comparée avec celle de sa forme substituée sérine (2 résidus S à la place de 2 résidus C) ainsi qu'avec celle de sa forme cyclisée (2 résidus C liés par un pont disulfure). L'étude a porté sur les 13 sérums suivants testés en double - 6 sérums anti-HIV-2; - 3 négatifs; - 2 anti-HIV-l; - 2 anti-p24 isolé; ainsi que sur les 3 témoins de manipulations : témoins négatif, anti-HIV-l et anti-HIV-2. Les résultats exprimés en DO sont rapportés dans le tableau ci-dessous. PEPTIDE NATIF PEPTIDE SUBSTITUE NUMERO REACTITE DE FORMULE (I) PEPTIDE CYCLISE SERINE SERUM SERUM DO à 432 nm DO à 432 nm DO à 432 en duplicate en duplicate en duplicate 1 Anti-HIV-2 2,672 - 2,682 2,691 - 2,717 2,681 - 2,691 2 Anti-HIV-2 2,508 - 2,505 2,518 - 2,519 2,416 - 2,417 3 Anti-HIV-2 2,399 - 2,372 2,383 - 2,399 2,328 - 2,313 4 Anti-HIV-2 2,247 - 2,252 2,253 - 2,188 2,252 - 2,190 5 Anti-HIV-2 1,951 - 1,956 1,911 - 1,949 1,762 - 1,781 6 Anti-HIV-2 1,916 - 1,957 1,857 - 1,887 1,869 - 1,867 7 Négatif 0,051 - 0,109 0,054 - 0,062 0,059 - 0,057 8 Négatif 0,076 - 0,068 0,060 - 0,065 0,073 - 0,074 9 Négatif 0,042 - 0,042 0,041 - 0,043 0,040 - 0,043 10 Anti-HIV-l 0,091 - 0,094 0,066 - 0,067 0,123 - 0,183 11 Anti-HIV-l 0,148 - 0,143 0,092 - 0,089 0,066 - 0,125 12 Anti-P24 0,076 - 0,063 0,053 - 0,55 0,063 - 0,055 13 Anti-P24 0,064 - 0,073 0,061 - 0,069 0,056 - 0,051 Témoin négatif Négatif 0,042 - 0,041 0,036 - 0,045 0,028 - 0,021 Témoin HIV-1 Anti-HIV-l 0,016 - 0,016 0,021 - 0,049 0,003 - 0,004 Témoin HIV-2 Anti-HIV-2 2,072 - 2,073 2,039 - 2,039 1,976 - 1,920 Une réactivité homologue est enregistrée pour les trois peptides testés, avec parfois des signaux plus forts sur la forme substituée sérine. Les modifications effectuées sur le peptide natif ne changent pas sa fonctionnalité antigènique car elles ne diminuent pas la réactivité. Ces modifications évitent l'éventuelle polymérisation du peptide (auto-polymérisation, cyclisation aléatoire par les cystéines) et permettent ainsi le mélange éventuel des peptides de l'invention avec d'autre peptides comprenant des groupements -SH libres, tels que les cystéines. Ces modifications augmentent en outre l'homogénéité de production lots à lots des peptides de 1 'invention. REVENDICATIONS 1 - Peptide répondant à la formule XAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCZ dans laquelle X représente un groupe NH2 libre ou amidé par un ou deux groupes alcoyle comprenant de 1 à 5 atomes de carbone et Z représente soit un groupe OH libre ou alcoxyle et contenant alors un groupe alcoyle comprenant de 1 à 5 atomes de carbone. 2 - Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins un des résidus C est délété, substitué ou protégé. 3 - Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'au moins un des résidus C est substitué par un résidu S. 4 - Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'au moins un des résidus C est substitué par un résidu A. 5 - Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'au moins un des résidus C est substitué par un résidu acide gamma amino butyrique. 6 - Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'au moins un des résidus C est protégé par un groupement acétamidométhyl. 7 - Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que les résidus C sont substitués par un résidu D et un résidu E liés par un pont amide. 8 - Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que les résidus C sont liés par un pont disulfure. 9 - Composition antigénique contenant au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou au moins un oligomère de ce peptide, caractérisée en ce qu'elle reconnait spécifiquement la présence d'anticorps anti-HIV-2. 10 - Composition immunogène contenant au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou au moins un oligomère de ce peptide ou ce peptide conjugué à une molécule porteuse, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour la production de vaccins, caractérisée en ce quelle induit la production d'anticorps contre lesdits peptides en quantité suffisante pour inhiber efficacement le rétrovirus HIV-2. 11 - Procédé de diagnostic in vitro de l'infection par le rétrovirus HIV-2, dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend - la mise en contact de cet échantillon biologique avec au moins un peptide selon l'une des revendications 1 à 8 ou un conjugué de ce peptide avec une molécule porteuse; - la détection de la présence éventuelle de complexes antigène-anticorps. 12 - Procédé de diagnostic in vitro de l'infection par le rétrovirus HIV-2, dans un échantillon biologique selon la revendication 11, caractérisé en ce que la détection des complexes antigène-anticorps éventuellement formés est effectuée par des tests immunoenzymatique, immunofluorescents, radioimmunologiques ou des tests de radioimmunoprécipitation. 13 - Nécessaire pour la mise en oeuvre d'un procédé de diagnostic in vitro de l'infection par le rétrovirus HIV-2, dans un échantillon biologique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend - une composition peptidique contenant au moins un peptide selon l'une des revendications 1 à 8, ou un conjugué de ce peptide avec une molécule porteuse; - au moins un réactif pour la constitution d'un milieu propice à la réalisation d'une réaction immunologique; - un ou plusieurs réactifs éventuellement marqué pour la détection des complexes antigène-anticorps formés lors de la réaction immunologique; - au moins un échantillon de référence dépourvu d'anticorps ou contenant une quantité connue d'anticorps reconnus par ladite composition peptidique.