FR 2649892 A1 19910125 FR 8909730 A 19890719 La présente invention concerne un produit cytostatique. On sait depuis le début du siècle que l'infiltration de leucocytes constitue un signe histologique de la résistance auxtumeurs (Da Fano Z. Immu- nitatsforsch. 5, 1, 1910). Actuellement un grand nombre de publications ont montré que les macrophages jouent un grand rôle ,dans la résistance aux cellules tumorales, dans des conditions spécifiques ou non spécifiques du point de vue immunologique (voir en particulier Levy et Wheelock, Advanc. Cancer Res. 20, 131, 1974; Schultz et Chirigos, Advanc. Pharmacol. Chemother 17, 157, 1980); (Johnson et coll. Expression and development of macrophage activation for tumor activity, in Contemporary topics in immunobiology 13, Macrophage activation, D.O. Adams and M.G. Hanna Jr., eds, p. 127-146, Plenum Press, New York, 1984). La présente invention est basée sur la d- couverte qu'un granulome induit par des billes de polyacrylamide a un effet cytostatique et que cet effet cytostatique est dû à un produit résultant de la coincubation de polynucléaires et de macrophages. La présente invention a ainsi pour objet un produit cytostatique, caractérisé en ce que a) il peut etre obtenu par coincubation de polynucléaires et de macrophages b) la fraction active présente une masse moléculaire inférieure à 500 daltons c) il présente une bande d'absorption à 267 nm d) il présente un spectre RMN mesuré à 430 MHz présentant des pics à 1,3, 1,9, 2,4, 3,8, 4,4, 6,3 et 7,6 ppm. Le produit cytostatique selon l'invention a une activité cytostatique sur les cellules de la tumeur de Lewis, les cellules du mélanome B16, sur le mastocytome P815, sur les cellules de lignée J774 et les cellules médullaires de souris C57 B /6. Cette activité cytostatique est d'autant plus marquée qu'elle s'exerce sur des cellules à index mitotique élevé. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de ce produit qui est caractérisé en ce que l'on effectue une coincubation de polynucléaires et de macrophages et l'on sépare le produit du surnageant. Le produit selon l'invention peut etre notamment obtenu par coincubation de polynucléaires et de macrophages pendant une durée d'au moins 6 heures et de préférence d'au moins 24 heures à 37il. Le milieu de coincubation peut être notamment une solution saline tamponnée à pH 7,2 (BSS Gibco 042-4 ) à laquelle est ajoutée du glucose à la concentration de 1 pour 1000. Ce milieu sera désigné ci-après BSSG. La présente invention a enfin pour objet une composition thérapeutique comprenant le produit cytostatique à titre d'ingrédient actif. Les compositions thérapeutiques selon-l'invention peuvent être administrées à l'homme ou aux animaux par voie topique, orale ou parentérale. Elles peuvent être sous la forme de préparations solides, semi-solides ou liquides. Comme exemples, on peut citer les comprimés, les gélules, les suppositoires, les solutions ou suspensions injectables, les pommades, les collyres huileux ou aqueux, les collutoires, les solutions nasales et otologiques, ainsi que les formes retard. Dans ces compositions le principe actif est généralement mélangé avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables habituels bien connus de 1'hoxme de l'art. Les compositions thérapeutiques administrables par voie topique peuvent contenir notamment de 0,1 à 5% en poids du principe actif. Les compositions thérapeutiques administrables par voie orale ou parentérale peuvent contenir notamment de 1 à 60 en poids de principe actif. 'La quantité de principe actif administré dépend évidemment du patient qui est traité, de la voie d'administration et de la sévérité de la maladie. Cependant, pour l'administration par la voie orale ou parentérale, on peut administrer environ de 0,1 à 5 mg/jour pour un homme de 70 kg. On décrira ci-après plus en détail des résultats d'essais mettant en évidence le produit et les conditions permettant de l'obtenir, ainsi que les caractéristiques et propriétés de ce produit. 1) Effet cytostatique du granulome induit par des microbilles de polyacrylamide sur des cellules de la tumeur de Lewis. a) Méthode Le granulome a été induit selon la technique décrite par Fauve (J. Immunol. Methods 64, 345, 1983) chez un groupe de souris. Les souris utilisées étaient des souris C 57 B1/6 & ées de 6 à 8 semaines dépourvues de germes pathogène, alimentées par des boulettes stériles et de l'eau acidifiée stérilisée et maintenues dans des cages stérilisées. Les microbilles de polyacrylamide ont été préparées par chauffage d'une suspension à 15% de Biogel P4 de 74 à 37 microns de diamètre (Biorad) dans une solution saline tamponée au phosphate dépourvue d'endotoxines et stérile, pendant 10 minutes à 90'C, dégazage à pression réduite et autoclavage pendant 30 minutes sous 105 Pa. Le gel a été lavé 3 fois avec la solution saline, on a laissé le gel sédimenter pendant 15 h à 4C et on a éliminé le surnageant. 1 ml de gel contenait 100-150 mg de billes de polyacrylamide (également désignées ci-après microbilles). Les souris ont été anesthésiées, la peau du dos a été rasée, désinfectée et incisée à 5 mm derrière le cou. On a crée à l'aide d'une aiguille un espace sous cutané dans lequel on a injecté 0,5 ml de gel. On a refermé l'incision avec deux agrafes chirur gicales puis on a massé le dos des souris pour répartir le gel. k différents intervalles de temps on a tué les souris et pré-levé le site inflammatoire (granulome). Le prélèvement a été rincé avec 5 ml de BSSG à 4'C et on a séparé les microbilles par filtration sur un tamis à mailles de 37 microns On a centrifugé la suspension cellulaire à 600 g pendant 15 minutes à 4-C et on l'a lavée trois fois avec du BSSG refroidi à la glace. Après remise en suspension dans 0,5 ml de BSSG on a compté les cellules dans un hemocytomètre Thoma sous contraste de phase. L'effet cytostatique antitumoral a été mis en évidence sur des cellules de la tumeur de Lewis (3LL). Ces cellules 3LL ont été obtenues de la façon suivante Les cellules 3LL ont été injectées toutes les 3 ou 4 semaines par voie sous cutanée dans la patte de souris C 57 Bl/6. Les cellules 3LL ont été recueillies par biopsie des tumeurs primaires sous cutanée ou de foyers métastasiques des poumons.Les cellules 3LL ainsi obtenues ont fait l'objet de passages in vitro dans du milieu Minimum Essential Medium Eagle (MEM) complété par 10a de FCS (sérum de veau foetal), L glutamine et antibiotiques et incubés à 37-C sous une atmosphère contenant 7,5\ de C02 En opérant comme décrit précédemment on a injecté à un autre groupe de souris un mélange du même gel contenant des billes de polyacrylamide à 10-15% et de 5.105 cellules 3LL. Deux autres groupes ont reçu le même traitement mais ont été irradiées 4 jours avant (source de cobalt 60, 44 R/1, 1000 R). Pour tous les groupes, on a ensuite inS troduit les suspensions de cellules dans des tubes de Falcon et on ajoute 0,04 micro Ci de 125IUdR (Amersham)/tube. On a laissé incuber pendant 24 heures puis centrifugé les tubes et lavé avec deux fois une solution de NaCl à 0,90 % et on a compté dans le culot avec un compteur. gamma (Appareil Berthold, RFA) la radioactivité normalement fixée par les cellules tumorales. b) Résultat On donnera dans le tableau I ci-après les résultats obtenus au bout de 24 h après induction du granulome. Tableau r F.ffet du granulome induit par des billes de polyacrylamide sur des cellules de la tumeur de Lewis. Nombre de % de Coups/min. Traitement Cellules trou- cellulles après incubade la souris vées dans le de tumeur tion avec granulome 125IUdR X 104 Microbilles P4 772 + 42 0 295 + 76 Microbilles P4+5x10 CT 492 + 85 12,5 355 + 187 irradiation +Microhilles P4+5x105 CT 8 # 2 95 2997 # 1348 irradiation +Microbilles P4 2,5 + 1 0 45 + 4 t CT = cellules tumorales 3LL. Il apparat à la lecture de ce tableau que lorsqu'on ajoute des cellules tumorales 3tt aux microbilles, le nombre total de cellules du granulome est plus faible (36i) et parmi ces cellules seules 12,5% ont la morphologje des cellules tumorales #LL. Après incubation avec IUdR la radioactivité n'est pas notablement supérieure à celle obtenue avec les cellules inflammatoires seules. Lorsqu'on irradie les souris avant l'injection de microbilles et de cellules tumorales, le nombre total de cellules du granulome est considérablement plus faible. 95b de ces cellules sont des cellules tumorales. En outre après l'incubation avec 125fUdR, la radioactivité est près de 9 fois plus élevée que sans irradiation. Ces résultats mettent en évidence que le granulome induit par les microbilles et qui est constitué de polynucléaires et de macrophages est cytostatique vis-à-vis des cellules 3LL. 2) Effet cytostatique de cellules de granulome sur des cellules de la tumeur de Lewis. a) Méthode On a produit des granulomes comme en 1) en injectant des microbilles et on a déterminé pour chaque durée d'incubation le pourcentage de macrophages par rapport à l'ensemble macrophages + polynucléaires. On a par ailleurs ajouté dans un rapport 10/1 les cellules du granulome à des cellules tumorales 3LL dans des tubes Falcon 2001F contenant également 0,5 ml de MEM additionné de 10% de FCS. Après 5 h d'incubatiion à 37-C dans une atmosphère à 7,5t de C02, on a ajouté 0,04 microcurie de 125IUdR par mi d'échantillon testé. Cette même concentration a toujours été utilisée par la suite. Après 18 h d'incubation à 37'C dans une atmosphère à 7,5% de C02 on traite les tubes comme décrit en 1) et on a mesuré la radioactivité. b) Résultats On a représenté sur la figure 1 en fonction du temps après l'induction du granulome par l'injection des microbilles, d'une part le pourcentage de macrophages et d'autre part le pourcentage d'incorporation de 125IUdE par les cellules 3LL. Il apparaît que le pourcentage d'incorporation de 125IUdR diminue rapidement jusqu'à 48 heures et que pendant cette période le pourcentage de macrophages augmente. Entre 48 h et 96 heures après l'induction, le pourcentage de macrophages est presque constant et le pourcentage de fixation de 125IUdR diminue légèrement. On a représenté sur la Fig. 2 le pourcentage d'incorporation de 125IUdR pour des cellules de granulomes prélevées au bout de 48 h avec des différents rapports cellules de granulome/cellules 3LL. On constate que l'effet cytostatique est pratiquement le meme pour les rapports 10/1 et 20/1. 3) Mise en évidence de la nécessité d'une interaction entre les polynucléaires et les macrophages pour l'obtention d'une activité cytostatique. a) Méthode On a cultivé comme au paragraphe 2) des cellules 3LL. 1) seules 2) en présence de cellules de granulome datant de 6 heures (G6) (90% de polynucléaires) 3) en présence de macrophages de moelle osseuse (M) 4) en présence de G6 et de macrophages (M) 5) en présence de macrophages (M) et de G6 tuées 6) en présence de macrophages (M) et du surnageant de G6 tuées, puis on ajoute l'125IUdR et laisse incuber comme décrit précédemment. Les macrophages (M) ont été obtenus par la méthode suivante On a recueilli la moelle osseuse de fémurs de souris C 57B /6. Après lyse des erythrocytes avec un tampon de Gey (NH4Cl 35,0 g, KCl 1,85 g, Na2HP04,12H20 1,5 g, KH2PO4 0,12 g, glucose 5,0 g, rouge phénol 50 mg pour 1 1. de solution), on a lavé les cellules par centrifugation. On a mis les cellules en suspension dans du RPMI 1640 (Gibco) complété-par 10t de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur et le milieu L 929 (Stanley et Heard J. Biol. Chem. 252, 4305,1977). On a ensemencé des boites de cultures Falcon 3003 F avec les cellules et on a incubé les cultures à 37'C avec 5% de C02 dans une atmosphère humide. On les a additionné de 5 ml de milieu complet au 4ème jour. Le 6ème jour on a recueilli les cellules non adhérentes.On les centrifuge à 150 g pendant 10 minutes et les remet en suspension. b) Résultats Les résultats sont donnés dans le Tableau II suivant. Tableau II Effet cytostatique de polynucléaires de granulomes et de macrophages de moelle osseuse Coups par minute % d'in après corporation incubation de 125IUdR avec 125IVdR 1 5x1O4-CT (1) 11620 + 540 100 2 " +2x105G6(2) 11610 + 550 100 3 " +105 M(3) 7340 + 580 63 4 " +105 M+2x105G6 3210 + 420 28 5 " +105M+8x105G6 5660 + 630 49 tuées 6 " +105M+filtrat 7870 # 490 de 8x105G6tuées (1) CT = cellules tumorales 3LL (2) G6 = cellules de granulomes de 6h (3) M = macrophages de moelle osseuse Ces résultats mettent en évidence l'absence d'activité cytostatique de G6 seules et la faible activité des macrophages seuls. En revanche on observe une forte activité cytostatique lorsqu'on fait incuber G6 avec des macrophages. Si on conserve une certaine activité cytostatique avec des cellules de G6 tuées, l'activité cytostatique diminue fortement lorsqu'on sépare les polynucléaires des macrophages par l'intermédiaire d'une membrane poreuse. 4) Mise en évidence de la nécessité d'un contact entre les polynucléaires et les macrophages pour l'obtention d'une activité cytostatique a) Méthode On a ajouté des cellules de granulomes de 6 et 48 heures à des puits de culture soit libres, soit inclus dans des chambres de diffusion de Marbrook utiç lisant des filtres Millipore de porosité 0,22 micrométres puis on a fait incuber avec 2 IUdR comme décrit précédemment. b) Résultats Les résultats sont donnés dans le Tableau III suivant. Tableau III Effets cytostatiques de polynucléaires et de macrophages mélangés ou séparés Coups/minute % d'incor après incuba- poration tion avec de 125IUdR 125IUdR 1 5x104 CT(1) 18380+2530 100 2 " +5x105G48(2) 845+ 135 5 3 " +5x105G48(2) en chambre de diffusion 3210+ 405 18 4 : +105M(3) 13400 # 100 73 5 " + 2x105G6(4) 17440+ 360 95 6 " +105M+2x105G6 3150+ 170 17 7 " +105M+2x105G6 en chambre de diffusion 10340+ 295 56 (1)- CT = cellules tumorales 3LL (2) G48 = cellules de granulomes de 48h (3) M = macrophages de moelle osseuse (4) G6 = cellules granulomes de 6h Ces résultats mettent en évidence une forte activité cytostatique des cellules de granulomes de 48 h (G48), activité qui ne diminue que faiblement lorsque le contact est empêché. En revanche avec les cellules de granulomes de 6h, l'activité cytostatique n'est importante qu'après incubation avec des macrophages et cette activité cytostatique diminue fortement si l'on empêche le contact entre les polynucléaires et les macrophages.Ceci met en évidence la nécessité d'une coincubation entre des polynucléaires et des macrophages pour obtenir l'activité cytostatique. 5) Influence du temps d'incubation sur l'activité cytostatique a) Méthode On a réalisé des essais cytostatiques vis-àvis des cellules 3LL du surnageant obtenu après incubation de cellules de granulomes de 48h dans du MEM et sans sérum de veau foetal. On a fait varier le temps d'incubation. b) Résultats Les résultats sont donnés dans le tableau IV ci-après. Tableau IV Influence du temps d'incubation sur l'activité cytostatique de surnageant de cellules de granulome Temps Coup/min. après % d'incorporation d'incubation incubation avec de 125IVdR 125IUdR 0 20060 + 323 100 4 h 16046 + 332 80 7 h 14300 + 1000 71 10 h 12377 + 630 61 20 h 1995 + 90 10 48 h 8000 + 310 40 Ces résultats mettent en évidence une activité cytostatique notable après un temps d'incubation de 10 h, l'activité cytostatique étant importante au bout de 20h d'incubation. Des résultats identiques ont été obtenus après incubation dans du BSSG. 6) Activité cytostattque sur différentes cellules. On 'a mesuré l'activité cytostatique des cellules de granulome après 48 h d'incubation ainsi que l'activité du surnageant. Les résultats sont donnés dans le Tableau V ci-après. On constate avec toutes les cellules utili- sées- un effet cytostatique net s'exerçant non seulement envers des cellules de tumeurs malignes : tumeur de Lewis (TC), mélanome B16 (B16) mastocytome P815 (P815), mais aussi envers des cellules murines de lignée (J774) et même avec des cellules de moelle osseuse de souris. TABLEAU V 125IUdR cpm + 5.105 surnageant de cellules Cellules seules cellules de graanulome incupation 48h de granulome incubées 48h T.C.(1) (5,104) 14,241 # 172 4,628 # 84 3,899 # 143 B16 (5.104) 5,327 # 23 n.d.(2) 470 # 32 P815 (5.104) 17,445 # 675 10,482 # 521 2,384 # 68 J774 (5.104) 5,988 # 83 556 # 24 578 # 99 B.M.C.(3) (5.105) 8,300 # 370 n.d. 334 # 21 (1) T.C. : cellules de la tumeur de Lewis (2) n.d. non déterminé (3) B.M.C. : cellules de moelle osseuse 7) Isolement du produit cytostatique selon l'invention. a) Méthode Après incubation de cellules de granulome de 48 h dans du MEM ou du BSSG pendant 18 h on a effectué une ultrafiltration du surnageant sur des membranes Amicon dé divers seuils d'ultrafiltration. On a constaté par incubation avec 25IUdR que la fraction douée d'une activité cytostatique avait une masse moléculaire inférieure à 500 daltons. On a lyophilisé la fraction active et on l'a redissoute dans de l'eau distillée stérile à la concentration de 25 mg/ml et on l'a soumise à une chromatographie liquide haute performance (colonne Waters Brownlee RP300, élution avec H20 et alcool isopropylique, débit 1 mlXmin.). On a enregistré l'absorption à 226 nm (mesurée avec un détecteur LKB 2238-02). b) Résultats Ces résultats sont rapportés sur la Fig. 3 où l'on a donné en fonction du volume d'élution - le 8 d'alcool isopropylique. - l'absorption à 226 nm - le pourcentage d'incorporation de 125IUdR par les cellules 3LL Il apparat que le produit actif est dans le pic n 9. En outre, la fraction correspondante a un spectre de fluorescence à une longueur d'onde d'excitation de 295 nm qui est parallèle à celui du trytophane. 8) Caractéristiques du produit cytostatique selon l'invention. On a reporté sur la figure 4, le spectre d'absorption du produit selon l'invention entre 200 et 300 nm. On observe un maximum d'absorption à 267 nm. On a reporté sur la figure 5 le spectre de RMN enregistré à 430 MHz. On observe différents pics (1) 7,6 ppm noyau aromatique (2) 6,3 ppm (3) 4,4 ppm -CO-NH (4) 3,8 ppm -CHO ou -CH = S ou -CH = N (5) 1,3, 1,9 et 2,4 ppm CH2 aliphatique 9) On a étudié l'influence de différentes substances connues pour interférer avec le métabolisme cellulaire en les ajoutant au milieu de culture utilisé lors de l'incubation des celles de granulomes. Aucune modification du pic observé par HPtC (cf. Fig. 3 pic 9) n'a été observée après addition de cycloheximide : 10 5 - 10 8M actinomycine 10-5 - 10-8M dexamethasone : 10-5 - 10-8M indomethacine : 10 6 - 10 8M Ce dernier produit a exerce une activité inhibitrice à 10-5M. REVENDICATIONS 1 Produit cytostatique, caractérisé en ce que a) il peut être obtenu par coincubation de polynucléaires et de macrophages b) la fraction active présente une masse moléculaire inférieure à 500 daltons c) il présente une bande d'absorption à 267 nm d) il présente un spectre RMN mesuré à 430 Hz présentant des pics à 1,3, 1,9, 2,4, 3,8, 4,4, 6,3 et 7,6 ppm. 2. Procédé d'obtention d'un produit cytostatique selon la revendication 1, caractérisé en cè que l'on effectue une coincubation de polynucléaires et de macrophages et l'on sépare le produit du surnageant. 3. Composition pharmaceutique comprenant à titre d'ingrédiept actif un produit selon la revendication 1.