FR 2646161 A1 19901026 FR 8909933 A 19890724 La présente invention concerne de nouvelles lipopolyamines de formule générale sous forme D, L ou DL, leurs sels, leur préparation et leur emploi. Dans la formule générale (I), - n est un nombre entier compris entre 1 et 5 inclusivement, - m est un nombre entier compris entre 2 et 6 inclusivement, - R représente un atome d'hydrogène ou un radical de formule générale: dans lequel X représente un groupement méthylène (-CH2-) ou un groupement carbonyle (-CO-), et R3 et R41 identiques ou différents, représentent chacun un radical aliphatique saturé CH2ps,2 OU insaturé CpXH2ps ou CpjH2p~2, P étant un nombre entier compris entre 11 et 21 inclusivement, étant entendu que - quelles que soient les valeurs de m et n, un seul des symboles R représente un radical de formule générale (II) - lorsque n est compris entre 2 et 5, les valeurs de m dans les différents fragments peuvent être identiques ou différentes. D'un intérêt tout particulier sont les produits de formule générale (I) dans laquelle n est égal à 3 et les valeurs de m dans les fragments sont identiques ou différentes et représentent 3 ou 4, et R représente un radical de formule générale (II) dans lequel R3-X- et R4-X- représentent chacun un radical alcanoyle contenant 12 à 22 atomes de carbone. Plus particulièrement intéressant encore est la 5-carboxyspermylamide de la dipalmitoylphosphatidyléthanolamine (DPPES). Selon l'invention, les nouvelles lipopolyamines de formule générale (I) peuvent être obtenues par action sur un produit de formule générale dans laquelle m et n sont définis comme précédemment, R5 représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy et les symboles Z représentent un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que - quelles que soient les valeurs de m et n, un seul des symboles R5 représente un radical carboxy - lorsque n est compris entre 2 et 5, les valeurs de m des différents fragments peuvent être identiques ou différentes, d'un produit de formule générale dans laquelle R3, R4 et X sont définis comme précédemment, suivie du remplacement des groupements protecteurs Z par un atome d'hydrogêne. Lorsque l'on fait réagir un produit de formule générale (IV) sur un produit de formule générale (ici), il est particulièrement avantageux de traiter préalablement -la fonction acide du produit de formule générale (III) par le N-hydroxysuccinimide en opérant dans un solvant organique choisi parmi les hydrocarbures aliphatiques halogénés (chlorure de méthylène) et les éthers (tétrahydrofuranne) en présence d'un imide tel que le dicyclohexylcarbodiimide, avant d'effectuer la condensation du produit de formule générale (IV).La condensation de l'ester mixte sur le produit de formule générale (IV) s'effectue généralement dans un solvant organique (chloroforme, éthanol) en présence d'une base organique telle que la triéthylamine à une température comprise entre 30 et 50 C Généralement, on utilise un groupement protecteur Z qui est facilement remplaçable par un atome d'hydrogène sans toucher au reste de la molécule. Il est particulièrement avantageux d'utiliser comme groupement protecteur le radical t.butoxycarbonyle qui est facilement remplaçable par un atome d'hydrogène au moyen d'un acide (acide trifluoroacétique). Les produits de formule générale (III) dans laquelle n est supérieur à t peuvent être obtenus à partir de ltornithine par cyanoalkylation suivie de réduction des fonctions nitriles en fonctions amines, puis protection des fonctions amines ainsi obtenues. Les produits de formule générale (IV) sont des produits connus qui sont facilement accessibles. Les nouveaux produits de formule générale (I) présentent la propriété, dispersés dans l'eau, de former des nanoparticules unilamellaires, qui sont instables en milieu ionique, et qui s'associent fortement, par leur partie cationique, avec l'ADN plasmidique ou oligonucléotidique en le compactant et en le recouvrant d'une couche lipidique. En utilisant un excès de charges cationiques par rapport à l'acide nucléique, les complexes lipide/ADN peuvent être adsorbés sur les membranes cellulaires facilitant ainsi la capture de l'ADN par les cellules. Les produits de formule générale (I) constituent des vecteurs spécifiques, non toxiques, biodégradables et de grande efficacité pour réaliser la transfection de cellules eucaryotes (lignées cellulaires, cultures primaires). Selon l'invention, la transfection est réalisée en mettant en contact une suspension de cellules en absence de sérum avec un mélange transfectant obtenu, au moment de sa mise en oeuvre, à partir d'une solution de la lipopolyamine de formule générale (I) et d'une solution de l'ADN dans un milieu convenable. Il est particulièrement avantageux d'opérer en milieu très dilué (1 à 5 nanomolaire) et d'utiliser un excès (de 2 à 5 fois) de charges de la lipopolyamine par rapport à l'ADN. La durée de la transfection peut être comprise entre 10 minutes et 48 heures indépendamment de la nature des cellules. Le procédé selon l'invention présente l'avantage de pouvoir s'appliquer à des lignées cellulaires d'origines diverses (incluant par exemple LMKT, Ras4, CHO, F9, Bu4, s49, Hela et AtT2O) ainsi qu'à des cellules primaires sans qu'il soit nécessaire d'optimiser ou de modifier les conditions de mise en oeuvre du procédé. Par ailleurs, les lipopolyamines de formule générale (I) permettent de transfecter des cellules fragiles (cellules hypophysaires intermédiaires ou antérieures, cellules chromaffin, neurones périphériques ou centraux) qu'il n'était pas possible de transfecter par application de méthodes classiques (coprécipitation au phosphate de calcium ou les techniques au dextrane). Enfin, les agents de transfection selon l'invention ne manifestent pas de toxicité vis-à-vis des cellules transfectées. Ils ne manifestent pas de toxicité aiguë chez le rat après injection intracérébrale ou systémique. La présente invention a pour objet également une solution alcoolique ou aqueuse stable d'une lipopolyamine de formule générale (I) utilisable pour la réalisation de transfections cellulaires. Généralement, on prépare des solutions à I mg/ml qui permettent la réalisation d'environ 50 transfections. L'exemple suivant, donné à titre non limitatif, montre comment l'invention peut être mise en pratique. EXEMPLE On traite pendant 12 heures la L-5-carboxy-tétra-t.butoxycarbonylspermine (1 équivalent) par la N-hydroxysuccinimide (1,1 équivalent) en présence de dicyclohexylcarbodiimide (1,1 équivalent) en opérant dans un mélange chlorure de méthylène-tétrahydrofuranne. L'ester obtenu est traité par la dipalmitoylphosphatidyléthanolamine (1 équivalent} en présence de triéthylamine (1 équivalent) dans un mélange chloroforme-éthanol pendant 12 heures à 40-C. Après traitement du mélange réactionnel, on obtient, avec un rendement de 55 ZI la tétra-t.butoxycarbonyl-5-carboxyspermylamide de la dipalmitoylphosphatidyléthanolamine dont les groupements protecteurs sont éliminés par l'acide trifluoroacétique dans le chlorure de méthylène. On obtient ainsi la 5-carboxyspermylamide de la dipalmitoylphosphatidyléthanolamine (DPPES) sous forme de tétratrifluoroacétate. La structure du produit obtenu est confirmée par le spectre de résonance magnétique nucléaire du proton à 200 z dans le mélange chloroforme deutéré-méthanol deutéré (1-1 en volumes) (déplacements chimiques 8 en ppm) : 0,85 t, (CH3)2J ; Lm, Zx (CH2)123 ; 1,5-1,65 (m, 2 x CH2CO2) ; 1,8-2,1 (m, 4 x CH2CH2N+) ; 2,3 (tt, 2 x CH2CH2CO2) ; 2,9-3,1 (m, 5 x CH2N+) ; 3,2 (bm, CH2NDCO) ; 3,75-4,05 (m, CHN+, 2 x CH20P) ; 4,15-4,40 (2 x dd, CO2CH2) ; 5,20 (OCH). REVENDICATIONS 1 - Nouvelle lipopolyamine sous forme D, L ou DL caractérisée en ce qu'elle répond à la formule générale dans laquelle - n est un nombre entier compris entre 1 et 5 inclusivement, - m est un nombre entier compris entre 2 et 6 inclusivement - R représente un atome d'hydrogène ou un radical de formule générale:: dans laquelle X représente un groupement méthylène ou un groupement carbonyle et R3 et R41 identiques ou différents, représentent chacun un radical aliphatique saturé Cp*H2ps,2 ou insaturé CpsH2pa ou CpsH2p~2, p' étant un nombre entier compris entre 11 et 21 inclusivement, étant entendu que - quelles que soient les valeurs de m et n, un seul des symboles R représente un radical de formule générale (II) - lorsque n est compris entre 2 et 5, les valeurs de m dans les différents fragments peuvent être identiques ou différentes, ainsi que ses sels. 2 - Nouvelle lipopolyamine selon la revendication caractérisée en ce que n est égal à 3 et les valeurs de m dans les fragments sont identiques ou différentes et représentent 3 ou 4 et R représente un radical de formule générale (II) dans lequel R3-X- et R4-X- représentent chacun un radical alcanoyle contenant 12 à 22 atomes de carbone, et ses sels. 3 - La 5-carboxyspermylamide de la dipalmitoylphosphatidyléthanolamine. 4 - Procédé de préparation d'une lipopolyamine selon la revendication 1 pour laquelle R représente un radical de formule générale (II) caractérisé en ce que l'on fait réagir un produit de formule générale dans laquelle R3, R4 et K sont définis comme dans la revendication 1, avec un ester avec le N-hydroxysuccinimide du produit de formule générale dans laquelle m, n, R5 et Z sont définis comme dans la revendication 5 en opérant dans un solvant organique choisi parmi les hydrocarbures aliphatiques chlorés et les alcools en présence d'une base organique choisie parmi les amines tertiaires, puis remplace les groupements protecteurs Z par un atome d'hydrogène, et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel. 5 - Utilisation d'une lipopolyamine selon l'une des revendications 1 à 3 pour la transfection de cellules eucaryotes caractérisée en ce l'on mélange dans un milieu convenable une solution aqueuse diluée d'un produit selon l'une des revendications 1 à 3 avec une solution aqueuse diluée de l'ADN plasmidique ou oligonucloétidique puis met en contact le mélange transfectant avec une suspension de cellules à transfecter. 6 - Utilisation selon la revendication 5 caractérisée en ce que l'on transfecte des lignées cellulaires ou des cultures primaires. 7 - Une solution éthanolique d'un produit selon l'une des revendications 1 à 3 pour réaliser la transfection selon l'une des revendications 5 ou 6. 8 - Une solution aqueuse d'un produit selon l'une des revendications 1 à 3 pour réaliser la transfection selon l'une des revendications 5 ou 6.