FR 2653019 A1 19910419 FR 8810074 A 19880726 La présente invention concerne une nouvelle glycoprotéine extraite de graines de Croton mongue, qui est une Euphorbiacée tropicale malgache. Cette glycoprotéine présente d'excellentes propriétés antitumorales et antimétastasiques. L'invention concerne également un procédé pour l'obtention de cette glycoprotéine ainsi que les compositions pharmaceutiques La contenant. Découverte pendant la seconde guerre mondiale, la chimiothérapie s'est avérée un moyen précieux pour améliorer les résultats obtenus par la chirurgie et La radiothérapie dans la lutte contre les maladies tumorales. En effet, si pour un diagnostic précoce où la dissémination des cellules malignes est limitée, la chirurgie et la radiothérapie sont souvent efficaces, elles sont malheureusement impuissantes lorsque Les cellules malignes ont envahi L'organisme entier, formant des métastases dont beaucoup sont physiquement indétectables.La plus petite tumeur détectable est d'environ 1 g et représente déjà 10 ceLLuLes. Dans ces conditions, deux méthodes sont susceptibles de donner des résultats : la chimiothérapie et L'immunothérapie. La chimiothérapie, en particulier, a donné des résultats indiscutables. Un grand nombre d'agents antitumoraux ont été découverts, mais souvent les réactions toxiques obligent à l'interruption du traitement. Dans d'autres cas, il est fréquent d'obtenir d'abord une régression spectaculaire de la tumeur, puis d'assister à la reprise de sa croissance, malgré la poursuite du traitement. Il faut, en effet, plusieurs décennies pour mettre au point, par tatonnements successifs, une méthode de traitement du cancer, étant donné tes longs délais d'observations nécessaires à l'éva- luation des résultats et à celle du rapport dose efficace/dose toxique qui peut d'ailleurs varier d'une malade à L'autre. On continue donc à rechercher systématiquement des substances actives nouvelles et à déterminer leur mécanisme d'action. Les recherches en cours portent notamment sur les toxines protéiques, telles que la ricine et L'abri ne. Les toxines protéiques agissant sur la synthèse protéique in vivo sont de deux types : les bicaténaires et les monocaténaires. Les bicaténaires comme La ricine ont une chaîne effectrice, la deuxième servant à la transporter sur les membranes cellulaires. Elles peuvent aussi être transportées par des lectines telles que la concanavaline A ou dirigées spécifiquement sur des cellules cancéreuses à L'aide d'anticorps monoclonaux. Sans ces transporteurs, la chaîne effectrice est sans effet sur les cultures de cellules et in vivo. Les toxines monocaténaires n'ont pas besoin d'un transporteur pour agir in vivo. Les inventeurs ont maintenant trouvé une glycoprotéine qui est une toxine monocaténaire présentant à la fois des propriétés antitumorales et antimétastasiques. La glycoprotéine selon L'invention, dénommée "monguine",a été extraite des graines de Croton mongue par le procédé décrit dans BIOCHIMIE,68, (1986) 1225-1230. Ce procédé consiste en une extraction par homogénéisation en milieu aqueux acétique suivie d'une séparation par centrifugation, relargages et dia lyses et d'une purification par chromatographies successives sur Sephadex. La monguine est thermostable. Après un traitement à 95"C pendant 60 min, sa toxicité chez la souris reste inchangée.;Elle peut être conservée plusieurs mois à -20 C sans perte appréciable de sa toxicité. Elle est soluble dans L'eau distiLlée et dans Les solutions éthanoL/eau ou acétone/eau (1:1, v/v). Par contre, elle est insoluble dans Les soLvants organiques, tels que Le chloroforme ou Le tétrachlorure de carbone. Elle réagit positivement avec ta ninhydrine. Son poids moléculaire déterminé par électrophorèse est de 9 000 daltons. Sa composition en acides aminés, déterminée par un analyseur Durrum D500 sur des échantilLons hydrolysés par une solution d'acide chLorhydrique 6 N à 100"C pendant 24 heures, est indiquée dans le tabLeau ci-après. Les résidus de demi-cystéine et de méthionine ont été dosés après oxydation par L'acide performique selon la méthode décrite par S. MOORE Cl Biol. Chem. 238, (1963), 235]. Le tryptophane a été déterminé après hydrolyse avec de L'acide méthanesulfonique selon la méthode de LIU et CHANG CJ. Biol. Chem. 246 (1971) 2842]. La présence de deux résidus demi-cystéines après l'oxydation performi que indique la présence d'un pont disulfure intrachaine. Le spectre ultraviolet de la monguine comporte deux maximums d'absorption, l'un à 280 nm et à 228 nm. TABLEAU I Composition en acides aminés de la monguine acides aminés nb. de résidus/mole Asp + Asn 17 Thr 4 Ser 7 Glu X Gln 24 Pro 3 Gly 9 Ala 4 Cys 2 Val 3 Met 1 ILe 3 Leu 1 Tyr 1 Phe 1 His 4 Lys 1 Trp 1 Arg 2 Total des résidus 88 De plus La monguine contient 1 résidu de mannose, 2,4 résidus de galactose et 0,34 résidu de N-acétylglycosamine. Ses conditions d'extraction, ses comportements - en éLectrophorèse sur geL de polyacrylamide non dénaturant - en électrochromatographie - en HPLC-traduisenr son caractère hydrophile. Ceci est confirmé par sa composition en acides aminés, particulièrement riche en Glx et Asx. Ceci est également en accord avec le pH isoélectrique qui est de 3,7, ainsi qu'avec sa migration sur l'électrode acide en focalisation isoélectrique. Les résuLtats obtenus - avec le gel de polyacrylamide en présence de SDS - avec l'électrochromatographie après carboxyméthylationavec le dosage des groupements-SH par le DTNB, confirmé par la composition en acides aminés donnant 2 résidus cystéine - concourent à mettre en évidence sa structure monocaténaire avec un pont disulfure intrachaine. La monguine inhibe la biosynthèse des protéines in vitro (20 à 40 mg/ml) au niveau de l'étape d'élongation en bloquant les ribosomes sous la forme de polysomes. Aux memes doses, elle inhibe complètement la synthèse des protéines dans les cellules cancéreuses alors qu'elle est sans effet sur celles des cellules normales. Ceci a été mis en évidence en étudiant le profil des polysomes sur gradient de saccharose dans deux systèmes différents, à savoir le lysat de réticulocytes de lapin et les cellules d'hépatomes en culture traités par la monguine par rapport à des témoins non traités. In vivo elle est distribuée dans tout l'organisme des animaux testés et présente une forte élimination urinaire. De plus, eLle n provoque pas in vivo de Lésions hépatiques majeures même avec des doses Létales ou sublétales peu de temps avant le moment de la mort. Sa dose létale 50 (DL50). chez la souris est de 12 mg/kg à 24 h et de 11,4 mg/kg à 48 h. Elle est donc nettement moins toxique que les toxines du groupe de la ricine ou de l'abrine, la DL50 de la ricine étant chez la souris de 3,5 lig/kg à 24 h et de 2 lig/kg à 48 h et chez le rat de O,7ug à 48 h. En conséquence, elle ne provoque pas une augmentation importante du taux de la transaminase glutamique - oxaloacétique TGO (EC 2:6.1.1) et de la transaminase glutamique - pyruvique TGP (EC 2:6.1.2). L'urémie et la glycémie sont peu touchées. La monguine est active à la fois sur les tumeurs et sur les métastases permettant ainsi une survie illimitée des animaux guéris. Elle a en effet des propriétés anticancéreuses vis-à-vis des ascites de Krebs II (40 à 80 1% de survie selon la dose) et antimétastasiques vis-à-vis du carcinome de LEWIS (plus de 70 % d'inhibition des métastases après une injection unique avec des doses relativement faibles). On notera de plus que la monguine possède des propriétés antibactériennes. Des tests préliminaires ont été effectués sur la croissance de Bacillus subtilis, dans des milieux pauvres (milieu minimal MMG défini par ANAGNOSTOPOULOS et SPIZIZEN, 1961). Les résultats ont montré que, en milieu MMG, la monguine inhibe d'une façon nette la croissance de Bacillus subtilis à partir de 250vug/ml. Une relation dose-effet a été observée avec une dose de monguine de 500 sg/ml, le diamètre du cercle d'inhibition de la multiplication cellulaire ayant doublé. La monguine selon l'invention peut être utilisée en thérapeutique humaine pour le traitement des cancers. Elle peut-être administrée par injection seule ou en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable ou un autre médicament anticancéreux lorsque cela s'avère nécessaire. Ainsi la présente invention concerne donc les agents antitumoraux et antimétastasiques contenant à titre d'ingrédient actif une quantité efficace de monguine. La présente invention va être maintenant décrite plus en détail par les exemples ci-après: EXEMPLE 1: extraction de la monguine. On a laissé gonfler des graines de Croton mongue (100g) pendant une nuit dans de l'acide acétique à 5 % à 40 C selon un procédé similaire à celui utilisé pour ltextraction de l'abrine gOLSNES et al. EUR. J. BIOCHEM. 35, (1973) 179. Le mélange obtenu a ensuite été mis- an suspension dans 500 ml d'acide acétique à 5 % et homogénéisé à 40 C dans un mélangeur WARING à des séquences de 10 x 30 secondes avec des intervalles de 5 minutes. L'homogéneisat estensuite centrifugé à 16000 x g pendant 40 minutes à 4 C. Le gâteau de centrifugation et la graisse ont été éliminés. Le surnageant jaune-vert a été ensuite dialysé pendant 48 heures contre de l'eau distillée et ensuite contre un tampon Tris-HCl 10 mM pH 8 pendant 24 heures. A la fin de la dialyse, le précipité formé a été éliminé par centrifugation à 16600 x g pendant 30 minutes. Le surnageant vert-clair obtenu constitue l'extrait brut. Cet extrait brut a été chromatographié sur une colonne de DEAE-cellulose, prééquilibrée avec du tampon Tris-HCl 10 mM pH 8. La colonne a d'abord été lavée avec 200 ml du même tampon et ensuite successivement avec 100 ml de tampon Tris-HCl 10 mM pH 8 contenant 50 mM de NaCl et 300 ml d'un gradient linéaire de NaCl allant de 65 mM à 350 mM. On a noté l'absorption à 280 nm des fractions obtenues. La toxicité des fractions obtenues a été détérminée sur des lots de 5 souris Swiss mâles choisies au hasard et pesant environ 25 g. La fraction toxique obtenue a été fractionnée sur une colonne de Sephadex G.25. L'élution.a été réalisée avec du tampon Tris-HCl pH 8,0. La fraction toxique recueillie sur Sephadex G-25 a été ensuite soumise à une autre filtration sur Sephadex G-15. La première fraction qui a été exclue de ce gel est la toxine pure qui a été dénommée monguine. Les caractéristiques des différentes fractions obtenues au cours de la phase de purification ainsi que les rendements figurent dans le tableau II ci-après: TABLEAU II Fractions Protéines Volume Concentration Total Rendement Total Toxicité rela (mL) (mg/ml) (mg) % mg/kg tive chez la graines souris Extrait brut 12,5 31,50 394 100 3940 1 Fraction de DE-52 5 2,40 120 3,02 120 13,2 Fraction obtenue sur Sephadex G-25 3 0,43 1,3 0,33 13 73,25 Toxine pure obtenue sur Sephadex G-15 1,5 0,35 0,52 0,13 5,2 90 La composition en acides aminés de la toxine pure obtenue sur Sephadex G-15 est celle indiquée dans le tableau I. La DL50 de la monguine a été déterminée en utilisant la méthode de REED et MUENCH EAM. J. Hyg. 27 (1938) 4937, le volume injecté étant de 0,5 ml. Comme indiqué précédemment la DL50 à 24 h est de 12 mg/kg chez la souris. EXEMPLE 2 : Action de la monsuine sur la tumeur de Krebs II Le modèle expérimental utilisé dans cet exemple est la tumeur de Krebs II. On a inoculé la tumeur de Krebs II à des souris Swiss pesant environ 28+2 g et on a noté les variations de poids des souris après L'inoculation. Cinq souris n'ont reçu aucun traitement après L'inoculation de la tumeur et constituent le lot témoin. Une série de quatre souris a été traitée par injection avec la monguine à raison de 18,75 g par souris, ce qui correspond au 1/16 de ta DL50, au 8e jour après L'inoculation de la tumeur. Les résultats obtenus sont rassemblés sur les figures 1 et 2 sur lesquelles on a indiqué le poids des souris en ordonnées Cen grammes) et le temps après L'inoculation en abscisses (en jours). La figure 1 illustre les variations de poids de la série de souris témoins. On peut noter que, Les 2 premiers jours après l'inoculation, on assiste à une diminution de poids des souris. A partir du troisième jour, le développement de la tumeur se traduit par une augmentation rapide du poids. Les 5 souris témoins, ayant pris en moyenne 10 g, sont toutes mortes le 15e jour après l'inoculation de la tumeur. Sur la figure 2 sont portées les variations de poids d'une série de 4 souris traitées par une injection de 18,75 g de monguine/souris. Avant le traitement, La même remarque qu'avec les témoins peut être faite sur Le développement de la tumeur : d'abord, diminution de poids les 2 premiers jours, ensuite poussée normale. Ce phénomène est constaté à chaque expérience. Après traitement, on a observé une hétérogénéité des résultats suivant les souris : avec 2 souris sur 4, on nia pas eu de cas de guérison ; elles sont mortes le 15e jour après l'inocuLation de la tumeur, comme les témoins. Avec une souris parmi les 2 restantes (souris A de la figure 2), on a observé une chute de poids 24 h après le traitement, et qui a continué jusqu'au 2e jour, puis une reprise de poids continuelle pendant 3 jours, après quoi, il y a eu rechute de poids jusqu'à disparition complète de La tumeur. Ensuite, le poids de la souris guérie s'est stabilisé. Pour la 4e souris traitée (souris B), la tumeur a continué à se développer pendant 8 jours après le traitement, après quoi, on a assisté à une chute de poids spectaculaire jusqu'à disparition de la tumeur. Les 2 souris considérées comme guéries ont survécu pendant plus de 90 jours sans réapparition de la tumeur. On a répété la même expérience en utilisant la monguine à des doses correspondant respectivement au 1/8 et au 1/4 de La DL50. La figure 3 montre les variations de poids d'une série de 4 souris traitées par 37,5 ug de monguine/souris, le 8e jour après l'inoculation de la tumeur, ce qui correspond au 1/8 de la DL50. Avec les 4 souris, on a eu tout de suite une chute de poids 24 h après le traitement, qui s'est poursuivi jusqu'au 2e jour, mais le 3e jour, 3 souris ont repris du poids à la suite duquel 2 sont mortes Le 15e jour, et une le 17e jour. L3 souris survivante a continué à perdre du poids jusqu'à la régression complète de l'ascite. Cette souris guérie a survécu pendant plus de 90 jours sans réapparition de la tumeur. La figure 4 illustre les variations de poids d'une série de 4 souris traitées par 75 g de monguine/souris, le 8e jour après L'inoculation de la tumeur, ce qui correspond au 1/4 de la DL50. Avec les 4 souris, on a observé une chute de poids 24 h après le traitement. Ensuite, avec 3 souris sur 4, on a assisté le 2e jour après le traitement, à une reprise de poids pendant 48 h après quoi on a de nouveau noté une chute jusqu'à disparition complète de l'ascite. Ces 3 souris guéries ont survécu pendant plus de 90 jours. Une des 4 souris, après reprise continuelle de poids à partir du 2e jour du traitement, est morte le 17e jour. Dans le tableau III, on a exprimé, avec Le bilan de ces résultats, le pourcentage de survie des souris traitées par rapport aux souris témoins, et le pourcentage de survie supérieur à 90 jours, en fonction des doses croissantes de monguine. Ces résultats ont été confirmés par d'autres expériences réalisées dans les mêmes conditions, en opérant, pour chaque dose, sur 5 souris. Trois doses ont été utilisées DL50 , DL50 , DL et ont été injectées après 8 jours de l'inocu- 8 4 3 lation de la tumeur. Un autre lot a servi de témoin. La figure 5 et le tableau IV illustrent les résultats obtenus. Les résultats obtenus au cours de cette étude mettent en évidence un effet antitumoral de la monguine conduisant à une rémission définitive pour un nombre important d'animaux. Il est important de noter que la monguine semble avoir un effet retardé, c'est-à-dire que l'efficacité ne se fait sentir qu'à partir du 7e et du 9e jour après traitement, pour la faible dose, et à partir du 5e jour pour les autres doses. De tous les cas de guérison observés, une seule est immédiate, la régression de la tumeur commence dès le lendemain du traitement et se poursuit jusqu'à la disparition complète sans reprise de croissance. Dans 3 autres cas (figure 3), L'effet est également immédiat, mais il y a reprise de l'augmentation de poids après 2 jours, puis diminution définitive après 4 jours. TABLEAU III Activité antitumorale de la monguine Dose mg de Nombre Nombre de % % survie 90 jours monguine par d'animaux survivants survie kg de souris O 5 O 0 O 0,75=@50/16 4 2 50 50 1,5 =@@50/8 4 I 25 25 DL50/4 4 3 75 75 Chaque série représente des souris traitées par une dose de monguine. TABLEAU IV Activité antitumorale de la monguine Dose mg de Nombre Nombre de % % Survie 70 jours monguine par d'animaux survivants survie kg de souris 0 5 0 0 0 1,5 = DL50/8 5 4 80 80 3 = DL50/4 5 3 60 60 4 = DL50/3 5 2 40 40 Chaque série représente des souris traitées par une dose de monguine. Les résultats obtenus permettent d'envisager l'utilisation de La monguine comme agent antitumoral pour les raisons ci-après DL - la mortaLité des souris traitées avec des doses supérieures à 8 sembLe être due à la fois à la toxicité de la monguine et 8 aux effets de la tumeur. Elle ne peut être attribuée à la toxicité de la monguine seule. En effet, des tests de toxicité, réalisés sur des souris saines, en injectant les mêmes doses utilisées pour le traitement, ont pu mettre en évidence une absence de nocivité ; les animaux qui survivent 24 h à la DL50 survivent indéfiniment d'une façon générale - une dose mortelle de monguine ne provoque pas de lésions importantes dans le foie des animaux traités, comme on a pu le constater par étude au microscope électronique à transmission. EXEMPLE 3 : Action de la monsuine sur le carcinome de LEWIS Le modèle utilisé dans cet essai est le carcinome de LEWIS qui est induit chez la souris C57 Black/6 femelle (âgée de 6 à 8 semaines) par injection intramusculaire dans la patte de 2.105 cellules 3LL (jour O). La tumeur primaire grandit comme une tumeur solide dont la section peut être mesurée. Les cellules métastasantes passent rapidement dans la circulation sanguine (après 4-5 jours) et s'implantent dans te poumon où des nodules peuvent être detectés à partir du 15e jour après l'inoculation. Les souris commencent à mourir après le 20e jour à cause des métastases pulmonaires. Deux types de traitement ont été envisagés avec la monguine 2 A - les souris portant des tumeurs macroscopiques (2,56 + 0,08cm, l'écart type étant calculé sur La moyenne de 6 animaux) ont été traitées au jour 14 par la monguine administrée par voie intrapéritonéale à raison de 2 mg/kg. B - la monguine (2 mg/kg i.p.) a été administrée 8 heures après l'injection intramusculaire de cellules 3LL. On a mesuré la section des tumeurs et le nombre de nodules cancéreux dans les poumons au jour J21 après l'un des traitements A ou B. Traitement A : Section de la tumeur nombre de nodules administration primaire pulmonaires de la monguine à J14 Animaux témoins 4,82 -+ 0,10 cm2 14 + 2 à J21 (n = 6) Animaux traités 3,28 # 0,25 cm 5 # 1 à J21 (n = 6) inhibition 32 % inhibition 74 % Traitement B administration 2 19,7 + 2,5 de la monguine 5,44 + 0,16 cm à JO (8 h après l'inoculation) Animaux témoins (n = 9) à J21 Animaux traités 5,90 + 0,31 17 + 4 (n = 9) à J21 La monguine a causé un effet cytotoxique clair vis-à-vis des cellules tumorales lorsqu'elle a été injectée à un animal porteur de tumeur macroscopique et après implantation de métastases (traitement A). Un traitement effectué tôt après l'implantation de la tumeur primaire (traitement B) retarde initialement la croissance de la tumeur solide ; il y a ensuite une croissance exponentielle qui rejoint celle des animaux témoins et les métastases se développent normalement. Ceci indique que la monguine a un effet cytotoxique sur des tumeurs existantes qui ne semble pas être dû au système immunitaire. Il n'y a pas d'effet retard. REVENDICATIONS 1. Agent antitumoral et antimétastasique, caractérisé en ce qu'il est constitué par la monguine, glycoprotéine extraite de Croton mongue, de poids moléculaire 9000, dont le spectre ultraviolet présente deux maximums d'absorption à 280 nm et 228 nm et dont la composition en acides aminés et en sucres est la suivante acides aminés nb. de résidus/mole Asp + Asn 17 Thr 4 Ser 7 Glu + Gln 24 Pro 3 GLy 9 Ala 4 Cys 2 Vat 3 Met 1 Ile 3 Leu 1 Tyr 1 Phe 1 His 4 Lys 1 Trp 1 Arg 2 Total des résidus 88 Sucres mannose 1 galactose 2,4 N-acétylglucosamine 0,34 2. Agent antitumoral et antimétastasique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la monguine est en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable approprié pour L'injection.