FR 2623508 A1 19890526 FR 8716096 A 19871120 La présente invention est relative à une pro- téine basique isolée de venin de serpent de la famille des Elapidés, notamment d'un serpent Naja et plus particulière- ment de Naja mossambica pallida et/ou de Naja nigricollis, dénommée phospholipase A2 (PLA2), aux fragments et dérivés de ladite protéine, à leurs procédés d'obtention, à des compositions thérapeutiques utilisables en médecine humaine et/ou vétérinaire, ainsi qu'à des agents de diagnostic contenant ladite protéine et/ou ses dérivés ét/ou ses frag- ments. Il existe à l'heure actuelle de nombreux agents antitumoraux, substances organiques ou inorganiques. Ces différents agents ont une action sur le noyau cellulaire, en particulier celui des cellules tumorales. Selon les sub- stances, il existe plusieurs mécanismes d'action: soit lesdites substances interfèrent avec la biosynthèse des acides nucléiques et des protéines, soit elles interfèrent avec la duplication de l'A D N, soit elles agissent sur le fuseau mitotique. Un certain nombre d'auteurs ont mis en évidence ces différents mécanismes d'action (RALPH R.K. et al., TIBS, 1983, 212-214, LIPPARD, Science, 1982, 218, 4577, 1075-1082, FAUVAUDON, Biochimie, 1982, 64, 457-475). Toutefois, les substances anticancéreuses n'exercent pas spécifiquement leur action sur les cellules cancéreuses. Elles inhibent les divisions cellulaires des cellules saines comme des cellules cancéreuses: elles sont donc toxiques pour tous les tissus o les cellules se re- nouvellent rapidement. Les différentes substances antitumo- rales évoquées présentent donc un grand nombre d'effets In- désirables chez l'homme. L'importance des effets indésirables a conduit à rechercher de nouveaux agents antitumoraux, ayant un mode et un site d'action différents et ne présentant pas les ef- fets indésirables tels que ceux rencontrés avec les sub- stances antitumorales existantes. Récemment, il a été démontré que certaines sub- stances secrétées par des cellules de diverses lignées, telles que, notamment, les lymphocytes B et T, ainsi que les macrophages (Ruddle, Immunol. Today, 1987, 8, 5, 129- ) sont capables de tuer les cellules de certaines ll- gnées tumorales. Les gènes (ADNc) codant pour ces sub- stances ont été clones (GRAY et al., Nature, 1984, 312, 721-724 et PENNICA et al., Nature, 1984, 312, 724-727). On nomme ces substances, facteurs de nécrose des tumeurs(TNF) lU et lymphotoxines (LT); il faut noter que le mécanisme d'action de ces substances est à l'heure actuelle, inconnu. Un autre groupe de substances, est extrêmement intéressant; il s'agit de substances présentes dans les venins de serpent; en effet ceux-ci sont capables de tuer les cellules cancéreuses de nombreuses lignées (CHAIM- MATYAS et al., Life Sciences, 1987, 40, 16, 1601-1607); les auteurs de cette publication ont en particulier montré que les venins de serpent présentent une activité cyto- toxlque vis à vis de certains mélanomes et chondrosarcomes, C. tant in vitro qu'in vivo et que, notamment, le venin de Naja nigricollis présente une forte activité cytotoxique. Cette activité cytotoxique semble fondée sur un mécanisme de lyse membranaire des cellules concernées, totalement différent des mécanismes d'action des substances antitumorales de l'Art antérieur. Le venin de cobra cracheur d'Afrique de l'Est, Naja nigricollis, comme le venin de la plupart des Elapl- dés, renferme trois classes de protéines toxiques: des toxines curarisantes, des cardiotoxines et des phospholi- pases. La cardiotoxine, élément prépondérant du venin est pour une part, responsable de l'action cytotoxique; cependant l'activité cytotoxique du venin total est nette- ment supérieure à celle de la cardiotoxine seule. En outre, l'action cytotoxique du venin est conservée en présence de calcium, un inhibiteur de l'activité cytotoxique des car- diotoxines. Un ou plusieurs facteurs cytotoxiques, autre que la cardiotoxine, existent donc dans le venin de Naja, en particulier de Naja nigricollis. Les phospholipases sont classées en différents groupes, en fonction de leur létalité. Le premier groupe inclus des phospholipases A2 acides ou neutres, présentant une faible toxicité; ces PLA2 assurent essentiellement la digestion des tissus phospholipidiques. Le second groupe O0 est composé de PLA2 extrêmement toxiques; ce sont, soit des molécules basiques monomères, soit des molécules conte- nant une sous-unité basique. On trouve ces composés dans de nombreux venins de serpents, ceux-ci provoquant une paraly- sie rapide des proies. Ils sont caractérisés par une capa- cité de blocage de la libération de l'acétylcholine au ni- veau des terminaisons présynaptiques et par d'autres effets incluant notamment une myotoxicité importante. Le troisième groupe comprend des PLA2 toxiques et fortement basiques; on les trouve dans un certain nombre de venins de serpents, mais leur rôle et leur mécanisme d'action était jusqu'à présent peu connus; la PLA2 basique de Naja nigricollis appartient à cette catégorie. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à une protéine, isolée de venin de serpent Naja, qui présente des propriétés thérapeutiques intéressantes vis à vis de l'homme. C'est aussi un but de l'invention de pourvoir à des fragments de ladite protéine présentant une activité antitumorale tout en n'étant pas toxiques. ZO C'est encore un but de l'invention de pourvoir à des dérivés de ladite protéine obtenus par traitement de celle-ci par un agent approprié et présentant une activité antitumorale tout en n'étant pas toxiques. C'est encore un but de l'invention de pourvoir à un procédé d'isolemement de ladite protéine. C'est encore un but de l'invention de pourvoir à un procédé de préparation des dérivés, et/ou des frag- ments de ladite protéine. C'est également un but de l'invention d'utiliser lesdits dérivés et/ou fragments dans des compo- sitions pharmaceutiques. C'est également un but de l'invention d'utiliser lesdits dérivés et/cu fragments comme agents de détection sélective des cellules tumorales. :0 C'est en outre un but de l'invention de fournir un kit, c:. coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi, pour la Zêtection sélective des cellules tumorales. La présente invention a pour objet une protéine basique du type des phospholipases A2 (PLA2), isolées de venins de serpents, notamment de la famille des Elapidés, caractérisée en ce qu'elle comprend 118 aminoacides, en ce que son poids moléculaire est de l'ordre de 13 325 Daltons, en ce que son point isoélectrique est de l'ordre de 8,6 et en ce qu'elle est obtenue ' partir de venin de serpent de la famille des Elapidés, notamment d'un serpent Naja et plus précisément de Naja nigricollis ou de Naja mossambica pallida, ou le cas échéant par voie de synthèse ou par clo- nage. La masse moléculaire a été déterminée par gel- filtration (PAGE - SDS) en référence à l'alpha-neurotoxlne de Naja nigricollîs (PM: 6 800), au cytochrome C (PM: 12 500), à l'inhibiteur de trypsine de germe de soja (PM: 21 500) et à la sérum albumine bovine (PM 68 000). Selon un mode de réalisation avantageux de la- dite protéine, elle répond à la formule I ci-après: () Asnl-Leu-Tyr-Gln-Phe-Lys-His-Met-Ile-Hlsl '-Cys-Thr- Val-Pro-Ser-Arg-Pro-Val-Val-His2 0-Phe-Ala-Asp-Tyr- Gly-Cys-Tyr-Cys-Gly-Arg30-Gly-Gly-Lys-Gly-Thr-Pro- Ile-Asp-Asp-Leu40-Asp-Arg-Cys-Cys-Gln-Val-His-Asp- Asn-Cys5 O-Tyr-Glu-Lys-Ala-Gly-Lys-Met-Gly-Cys- Trp60-Pro-Tyr-Phe-Thr-Leu-Tyr-Lys-Tyr-Lys-Cys7 o- Ser-Lys-Gly-Thr-Leu-Thr-Cys-Asn-Gly-Arg80-Asn-Gly- Lys-Cys-Ala-Ala-Ala-Val-Cys-Asn90-Cys-Asp-Leu-Val- Ala-Ala-Asn-Cys-Phe-Ala100-Gly-Ala-Pro-Tyr-Ile-Asn- Ala-Asn-Tyr-Asnl"0-Ile-Asp-Phe-Lys-Lys-Arg-Cys- Gln'i8-OH. Les Inventeurs ont mis en évidence que l'action toxique létale de ladite protéine est due à la conjugaison de deux actions, à savoir une action cytotoxique et une ac- 1O tion enzymatique. L'invention a également pour objet les frag- ments et/ou des dérivés de ladite protéine, présentant une activité cytotoxique identique ou analogue à celle de la- dite protéine. _- Ces dérivés et/ou fragments, outre qu'ils pré- sentent une activité cytotoxique analogue à celle de la phospholipase A2 ne présentent pas l'activité enzymatique de cette dernière, en sorte qu'ils ne sont pas toxiques, l'une des composantes de la conjugaison d'actions précitée étant absente,.lesdits.dérivés présentant cependant une ac- tivité antitumorale sélective.. Parmi lesdits fragments, elle englobe, entre autres: - un peptide caractérisé en ce qu'il est Z5 constitué d'un fragment de la PLA2, en ce qu'il présente la séquence en amino-acides suivante, qui correspond aux amino-acides en positions 1 à 8 de ladite protéine: -Asnl-Leu-Tyr-Gln-PheLys-Asn-Met8, - un peptide caractérisé en ce qu'il est constitué d'un fragment de PLA2, en ce qu'il présente la séquence en amino-acides suivante, qui correspond aux amino-acides en positions 55-59 de ladite PLA2: -Gly55-Lys-Met-Gly-Cys59-, - un peptide caractérisé en ce qu'il est constitué d'un fragment de PLA2, en ce qu'il présente la ó séquence en amino-acides suivante, qui correspond aux amino-acides en positions 44-50 de ladite PLA2. -Cys4 4-Gln-Val-His-Asp-Asn-Cys5O-. L'invention englobe également les dérivés de ladite protéine, caractérisés en ce que cette dernière est modifiée au niveau de l'une des histidines présente dans sa séquence, par fixation sur cette dernière d'un groupe al- kyle de formule R-CH2-X, dans laquelle X est un atome d'halogène, de préférence de brome, et R est un groupe ali- phatique ou aromatique comprenant de 1 à 20 atomes de car- bone. Selon un mode de réalisation avantageux de ces dérivés, l'agent alkylant est fixé sur l'histidine en posi- tion 47 de la protéine selon l'invention. _: Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, l'agent alkylant fixé sur l'histidine 47 est du bromure de bromophénacyle. La présente invention a également pour objet des conjugués, caractérisés en ce que lesdits protéine, fragments et/ou dérivés, sont couplés à une substance de transport sélectif vers une cible appropriée, notamment vers une cellule tumorale. Selon une disposition préférée, ladite molécule de transport est une hormone, notamment un stéroïde, ou une 251 immunoglobuline. Selon une autre disposition préférée, ladite molécule de transport est une immunoglobuline, polyclonale ou monoclonale. La présente invention a également pour objet un 3 procédé d'obtention de la phospholipase A2 (PLA2) selon l'invention, caractérisé en ce que ladite protéine est ex- traite de venin de serpent de la famille des Elapidés, no- tamment de serpent Naja, et plus particulièrement de Naja nigricollis ou de Naja mossambica pallida. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à l'invention, l'extraction est réalisée par chromatographie par échange d'ions suivie d'une élution par un éluant approprié. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'éluant est un sel alcalin d'un acide or- ganique faible, notamment de l'acétate d'ammonium. Selon une autre disposition avantageuse, les fractions éluées présentant une activité enzymatique sont soumises à une deuxième chromatographie par échange d'ions. La protéine ainsi isolée est soumise à une chromatographie liquide haute performance afin d'être puri- fiée. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de dérivés selon l'invention, carac- térisé en ce que dans une première étape, on isole la phos- pholipase A2 (PLA2), selon le procédé décrit ci-dessus, en ce que dans une seconde étape, l'on met en contact ladite phospholipase A2 avec un agent alkylant de type R-CH2-X, o X est un atome d'halogène, de préférence de brome, et R est un groupe aliphatique ou aromatique comprenant de 1 à 20 atomes de carbone, pour modifier la phospholipase au niveau de l'une des histidines présente dans sa séquence, par fixation de l'agent alkylant sur. ladite histidine. Selon une disposition préférée de ce mode de mise en oeuvre, l'agent alkylant se fixe sur l'histidine 47 de ladite PLA2. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'agent alkylant est du bromure de 3È bromophénacyle. En variante, les dérivés de la phospholipase A2 sont obtenus par un procédé de génie génétique, caractérisé en ce que le cDNA codant pour ladite protéine est modifié par voie génétique au niveau du fragment 44-50 tel que dé- fini ci-dessus. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de fragments selon l'invention, carac- térisé en ce que lesdits fragments sont obtenus par coupure protéolytique, notamment trypsique et/ou chymotrypsique. La présente invention a aussi pour objet une composition thérapeutique qui comprend une quantité active d'au moins un dérivé de la phospholipase A2 et/ou un frag- ment de celle-ci, couplé ou non à une molécule de trans- port, comme principe actif, notamment pour le traitement des cancers, lequel dérivé et/ou fragment est éventuelle- ment associé à tout véhicule adapté à son administration. La présente invention a également pour objet un agent de détection de cellules tumorales, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un dérivé et/ou fragment de la phospholipase A2 obtenu conformément à la présente invention. La présente invention a en outre pour objet un kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi pour la détection de cellules tumorales, caractérisé en ce qu'il comprend: - une quantité appropriée, éventuellement subdivisée en doses unitaires, de dérivé ou fragment selon l'invention, - éventuellement une quantité appropriée de 2 tampons, diluants, réactifs, nécessaires à la mise en oeuvre de ladite détection. Selon un mode de réalisation avantageux dudit kit, le dérivé est la pBp-PLA2, obtenu par fixation de bro- mure de bromophénacyle sur l'histidine 47 de la phospholi- 3o pase A2 selon l'invention. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui res- sortiront de la description qui va-suivre, qui comprend un exemple de préparation d'un dérivé de phospholipase A2 ainsi qu'un compterendu d'expérimentations effectuées pour démontrer l'activité cytotoxique spécifique vis-à-vis des cellules tumorales des dérivés et/ou fragments selon l'invention, ainsi que la bonne tolérance desdits dérivés et/ou fragments en comparaison avec la phospholipase A2 de venin de Naja nigricollis. I1 doit être bien entendu, toutefois, que cet exemple et ce compte-rendu d'expérimentations sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. -10 Exemple A: Extraction et purification de la PLA2 Le venin lyophilisé provient de l'Institut Pasteur. 3 g de venin sont dissous dans 15 ml d'eau. Après centrifugation, la solution est déposée sur une résine s échangeuse d'ions (Bio-rex 70, Biorad) à laquelle on ap- plique un gradient linéaire d'acétate d'ammonium entre 0,14 M et 1,4 M. Quatre des 10 fractions ainsi séparées possè- dent une activité hydrolytique vis-à-vis de la lécithine de jaune d'oeuf, comme l'indiquent des expériences réalisées 2W au pH-stat selon une méthode décrite précédemment (DENNIS E.A., J.Lipid Res., 1986, 14, 152159). La plus basique d'entre elles, nommée PLA2, est soumise à une nouvelle chromatographie sur résine Bio-Rex 70 en présence d'un gra- dient linéaire compris entre 0.60 M et 0.95 M. La PLA2 est enfin soumise à une chromatographie liquide à haute perfor- mance en phase inverse sur une colonne butyl à larges pores Nucléosîl 5 gm. L'enzyme est éluée par un gradient d'acétonltrile, dans un mélange eau-acide trifluoro- acétlque. Le profil d'élution est montré sur la figure 1, qui représente le profil d'élution du venin de Naja nigri- collis, après chromatcgraphie sur résine échangeuse d'ions Biorex 70. La résine, au préalable, a été équilibrée dans un tampon d'acétate d'ammonium 0,14 M, pH 7,4. Le venin a ensuite été appliqué au sommet d'une colonne (30 x i cm). Une fraction, non retenue est éluée immédiatement. Elle renferme une phospholipase A2 comme en témoigne la présence d'un astérisque. Apres élution de cette fraction, on ap- plique un gradient d'acététe d'ammonium entre 0,14 M et 1,4 M au même pH. La phospholipase A2 la plus toxique, égale- ment indiquée par un astérisque, est éluée dans la dernière fraction, c'est-à-dire la plus à droite sur la figure. C'est cette fraction qui est soumise à une nouvelle chroma- tographie sur résine Biorex, puis à une HPLC. Exemple B: Préparation de la PLA2 -pBp: La PLA2 obtenue selon l'exemple A est mise en contact avec du bromure de para bromophénacyle (pBp), dont on salt qu'il interagit préférentiellement sur l'histidine du site actif des phospholipases (VOLWERK et al., Blochem, 1974, 13, 1446-1454). Les conditions expérimentales de ce traitement sont les suivantes: 150 nmoles de PLA2 sont solubilisées dans 2 ml de tampon cacodylate de sodium (0,1 M), conte- nant 0,1 M de NaCi, pH 6. On ajoute à cette solution un l excès de pBp (5 fois molaire) dans 50 ml d'acétone. Après 5 heures d'agitation continue dans le noir et à 30'C, le pH du mélange réactionnel est ramené à 3 par addition d'acide acétique glacial. L'échantillon est lyophilisé, puis soumis à une chromatographie liquide à haute performance (colonne butyl à larges pores). Le produit est élué dans un gradient d'hydrophobicité croissante (acétonitrile). TESTS PHARMACOLOGIQUES EXEMPLE 1: Comparaison des séquences de la PLA2 et de son dérivé pBp. & - Séquence en amino-acides de la PLA2. La séquence en amino-acides complète de la phosphollpase basique de venin de Naja nigricollis, est déterminée sur la base des peptides obtenus par clivage au moyen de bromure de cyanogène et par protéolyse au moyen de A. Lytlcus lysylendopeptidase et S. aureus V8 protéase. 1I La protéine comprend 118 amino-acides et possède 14 restes l/2 cystine. Le fractionnement de la phospholipase traitée au bromure de cyanogène et carboxyméthylée, fourni 3 peptides de 8, 49 et 61 amino-acides respectivement. D'autres fragmentations permettent d'obtenir d'autre séquences. Le recouvrement de ces différentes sé- quences a permis d'établir celle le la PLA2. - Dérivé pBp. O Le dérivé pBp-PLA2 a perdu une histidine par molécule et son coefficient d'extinction molaire à 276,5 nm est de 45 500. EXEMPLE 2: Toxicité comparée de la PLA2 et de ses dérivés. La PLA2 et ses dérivés ont été injectés séparément à des souris (18-20g Balb c, femelles) par voie intraveineuse. La PLA2 et ses dérivés sont dissous dans 0,3 ml de soluté phy- siologique. Une dose de 10 mg de PLA2 non modifié est mor- telle pour chaque souris. En revanche, une dose de 2,3 mg de PLA2-pBp est non létale pour chaque souris. dé11 - TABLEAU I PROTEINES DL5o PLA2 native basique 5,7 + 0,2.10-10 moles (7,7 + 0,3 mg) CNBr - PLA2 > 1,63.10-7 moles pBp - PLA2 > 1,60.10-7 moles Le tableau I montre les DL50 de la PLA2, du dé- YO rivé pBp - PLA2 et du dérivé traité au CNBr. La toxicité a été mesurée en injectant les doses indiquées, solubilisées dans 0,3 ml de soluté physiologique, dans la veine de la queue de la souris Balb c (20 + i g). La survie est obser- vée 24 heures après l'injection puis, si nécessaire, chaque jour pendant une semaine au moins. Le signe > signifie, 1X qu'à la dose indiquée, les souris qui ont eu une injection, ne sont pas mortes. La PLA2 est caractérisée par une activité lé- tale importante. En opposition, les deux dérivés sont non toxiques. EXEMPLE 3: Mesure de l'activité cytotoxique de la PLA2 et de son dérivé pBp. Les mesures des activités cytotoxiques de la phosphollpase PLA2 et de son dérivé pBp s'effectuent de la manière suivante: une suspension de cellules d'une souche homogène définie, contenant 3,5.106 cellules par ml dans un milieu PBS-DULBECCO, sans calcium et sans magnésium, reçoit des quantités variables de phospholipase ou de son dérivé. L'incubation se poursuit une heure à 37 C. Un colorant, le bleu trypan, est ajouté au milieu. Seules les cellules cy- tolysées fixent ce colorant. La mesure du nombre de cel- lules cytolysees permet d'apprécier l'activité cytotoxique du composé étudié. La quantification de cette activité cy- totoxique est donnée par la concentration du composé qui tue 50 % des cellules étudiées (AC50), bruit de fond dé- duit. Le tableau II ci-après montre les concentrations cy- totoxiques (AC50%) de la PLA2 et de son dérivé pBp vis-à- vis de huit lignées cellulaires dont cinq sont tumorales et trois sont saines. TABLEAU II SOUCHES CELLULAIRES PLA2 PLA2-pBp ACso(M) AC50so(M) Transformées MCF7 (Ho) 1,5.10-6 3.10-5 HLGO (Ho) 3.10-6 5,5.10-5 i0D SK-N-SH (Ho) 5.10-6 4.10-6 BW (Mu) 3.10-6 > 8.10-5 C13T (Mu) 3.10-6 3.10-5 Normales Cellules péritonéales murines 10-5 > 8.10-5 Cellules spléniques murines 10-6 > 4. 10-5 2O Lymphocytes T murins 5.10-6 > 8.10-5 Ce tableau indique les concentrations de phos- pholipase A2 (PLA2) ou modifiée (pBp-PLA2), qu'il est né- cessaire de mettre en oeuvre, afin de tuer des cellules transformées ou normales. L'expression > x (o x représente une concentration exprimée en mole/l), indique qu'en pré- sence de ladite concentration de la PLA2 ou de son dérivé, les cellules concernées ne meurent pas. * On voit que la PLA2 naturelle, est cytotoxique pour l'ensemble des souches cellulaires étudiées, qu'elles soient saines ou tumorales. En revanche, le dérivé PLA2-pBp se caractérise par une cytotoxicité sélective pour les cel- lules tumorales. Quatre des cinq souches transformées sont détruites par cette substance tandis que les trois lignées cellulaires saines ne sont pas altérées. La figure 2 montre la cinétique de cytolyse des cellules FL, en présence de différentes concentrations de PLA2 de venin de Naja nigricollis; en abscisse on a le temps en heures, et en ordonnées, on a le pourcentage de cytolyse: C correspond à 2 pM de PLA2 Q correspond à 1 pM de PLA2 Io + correspond à 0,5 pM de PLA2 x correspond à 0,25 pM de PLA2 I correspond à 0 pM de PLA2 La lyse membranaire des cellules est révélée par un test de pénétration au Bleu Trypan. f Cette figure montre que la PLA2 basique est fortement cytotoxique et que l'effet cytotoxique de la PLA2 dépend à la fois du temps d'incubation et de la concentra- tion en PLA2. EXEMPLE 4: Mesure de l'activité enzymatique de O20 la PLA2 et de ses dérivés. L'activité enzymatique correspond à la quantité d'enzyme qui hydrolyse par minute 1 pmole de phosphatldyl- chollne à 5,5.10-2 M, en présence de Triton X100 0,11M à 'C, pH8. Les valeurs de Vmax sont déterminées dans les 2c- mêmes conditions, en utilisant 10-8 M de PLA2. Le tableau III cl-après montre que la PLA2 ba- sique présente une activité lipolytlque sur la lécithine de jaune d'oeuf. L'activité catalytique est nettement supé- rieure en présence de Ca++ qu'en présence de Sr++ et n'est pas détectée en présence d'EDTA, même à des concentrations en PLA2 égales à 10-6 M. TABLEAU III Act. Enzymatique Km Vmax (pmoles de PLA2) (mM) (PM NaOH/min.) PLA2 (Ca++) 20+2 7,53+0,20 500+14 PLA2 (Sr++) 59+3 7,51 0,20 170 10 PLA2 (EDTA) aucune CNBr-PLA2 (Ca++) 294+11 16,30+0,25 34+5 a pBp-PLA2(Ca++) aucune Le dérivé pBp-PLA2, selon l'invention ne pré- sente pas d'activité enzymatique détectable; le dérivé CNBr-PLA2 présente une activité catalytique faible mais significative. La figure 3 montre la lyse de cellules FL après mn d'incubation en présence de différentes concentra- tions de PLA2 (avec 46 mM EDTA, 52mM Sr++, 2mM Ca++) et de dérivés chimiquement traités au bromure de cyanogène ( et au bromure de para bromophénacyle ( i). Ces expérimen- tations ont été menées à 37: C, sauf pour U(2mM Ca++ à 4e C). Les autres conditions sont celles de la figure 2. On a en abscisse, la concentration en protéine en PM et en ordonnées, le pourcentage de cellules lysées. 2. s Comme le montre cette figure, les courbes doses -réponses obtenues avec la PLA2, en présence ou en absence de calcium, en présence ou en absence strontium, en pré- sence ou en absence d'EDTA, sont identiques. On a vérifié que la présence de fortes concen- trations de cations divalents ou d'EDTA ne modifie pas la stabilité des cellules pendant la période d'incubation. La lyse membranaire des cellules est réalisée sur des cellules FL à 37' C ou à 4 C pendant 60 mn, mais aucune différence significative n'a été observée pour les ZB courbes à 4 C. Deux dérivés de la PLA2 ont également été tes- tés; il s'agit du pBp-PLA2, selon l'invention, obtenu après traitement au bromure de bromophénacylle et du dérivé résultant du clivage de la PLA2 au moyen de bromure de cya- nogène en milieu acide. La figure 3 montre que le dérivé pBp-PLA2 pos- sède une activité cytotoxique vis-à-vis des cellules FL, alors que le dérivé traité au CNBr ne présente pas d'activité cytotoxique. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1') Protéine basique du type des phospholipases A2 (PLA2), isolées de venins de serpents, notamment de la famille des Elapidés, caractérisée en ce qu'elle comprend 118 amino-acides, en ce que son poids. moléculaire est de l'ordre de 13 325 Daltons, en ce que son point isoélectrique est de l'ordre de 8,6 et en ce qu'elle est obtenue à partir de venin de serpent de la famille des Elapidés, notamment d'un serpent Naja et plus particu- fO lièrement de Naja nigricollis ou de Naja mossambica pal- lida, ou le cas échéant par voie de synthèse ou par clonage. 2:) Protéine selon la revendication 1, caracté- risée en ce qu'elle répond à la formule I ci-après (I) Asnl-Leu-Tyr-Gln-Phe-Lys-His-Met-Ile-His'l -Cys-Thr- Val-Pro-Ser-Arg-Pro-Val-Val-His20-Phe-Ala-Asp-Tyr- Gly-Cys-Tyr-Cys-Gly-Arg30-Gly-Gly-Lys-Gly-Thr-Pro- Ile-Asp-Asp-Leu40-Asp-Arg-Cys-Cys-Gln-Val-His-Asp- Asn-Cys5O0-Tyr-Glu-Lys-Ala-Gly-Lys-Met-Gly-Cys- Trp6 -Pro-Tyr-Phe-Thr-Leu-Tyr-Lys-Tyr-Lys-Cys7 - Ser-Lys-Gly-Thr-Leu-Thr-Cys-Asn-Gly-Arg80-Asn-Gly- Lys-Cys-Ala-Ala-Ala-Val-Cys-Asn9O0-Cys-Asp-Leu-Val- Ala-Ala-Asn-Cys-Phe-Ala'00-Gly-Ala-Pro-Tyr-Ile-Asn- Ala-Asn-Tyr-Asnl'0-Ile-Asp-Phe-Lys-Lys-Arg-Cys- S Glnal8-OH. 3') Fragment de la protéine selon l'une quel- conque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il est constitué par un peptide présentant la séquence en amino-acides suivante, qui correspond aux amino-acides en positions 1 à 8 de ladite protéine: -Asnl-Leu-Tyr-Gln-Phe-Lys-Asn-Met8, 4 ) Fragment de la protéine selon l'une quel- conque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il est constitué par un peptide présentant la séquence en amino-acides suivante, qui correspond aux amino-acides en positions 55-59 de ladite protéine: -Gly55-Lys-Met-Gly-Cys59-, ) Fragment de la protéine selon l'une quel- conques des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il est constitué par un peptide présentant la séquence en amino-acides suivante, qui correspond aux amino-acides en positions 44-50 de ladite protéine. -Cys44-Gln-Val-His-Asp-Asn-Cys50-. 6') Dérivés de la protéine selon l'une quel- conque des revendications 1 et 2, caractérisés en ce que ladl.t - -uéine est modifiée au niveau de l'une des histi- dines présente dans sa séquence, par fixation sur cette dernière d'un groupe alkyle de formule R-CH2-X, dans la- quelle X est un atome d'halogène, de préférence de brome, et R est un groupe aliphatique ou aromatique comprenant de 1 à 20 atomes de carbone. 7 ) Dérivés selon la revendication 6, caractérisés en ce que l'agent alkylant se fixe sur l'histidine en position 47 de la protéine selon les reven- dications 1 et 2. 8:) Dérivés selon la revendication 6 ou la re- vendication 7, caractérisés en ce que l'agent alkylant fixé sur l'histidine 47 est du bromure de bromophénacyle. 2 I 9' 9) Conjugués, caractérisés en ce que la pro- téilne selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, les fragments et/ou dérivés selon l'une quelconque des revendi- cations 3 à 8, sont couplés à une substance de transport sélectif vers une cible appropriée, notamment vers une cel- 3^ lule tumorale. ) Conjugués selon la revendication 9, carac- térisés en ce que ladite molécule de transport est une hor- mone, notamment un stéroïde, ou une immunoglobuline. 11 ) Conjugués selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, caractérisés en ce que ladite molé- i9 cule de transport est une immunoglobuline, polyclonale ou monoclonale. 12') Procédé d'obtention de la phospholipase A2 (PLA2) selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ladite protéine est extraite de venin de serpent de la famille des Elapidés, notamment de serpent Naja, et plus particulièrement de Naja nigricollis ou de Naja mossambica pallida. 13') Procédé selon la revendication 12, Io caractérisé en ce que l'extraction est réalisée par chromatographie par échange d'ions suivie d'une élution par un éluant approprié. 14;) Procédé selon l'une quelconques des revendications 12 et 13, caractérisé en ce que l'éluant est 1-: un sel alcalin d'un acide organique faible, notamment de l'acétate d'ammonium. ') Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que les fractions éluées présentant une activité enzymatique sont soumises à une deuxième chromatographie par échange d'ions. 16 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que la protéine ainsi isolée est soumise à une chromotographie liquide haute performance afin d'être purifiée. 26- g17') Procédé d'obtention de dérivés selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que dans une première étape, on isole la phospholipase A2 (PLA2), en mettant en oeuvre le procédé selon l'une quel- conque des revendications 12 à 16, en ce que dans une se- conde étape, l'on met en contact ladite phospholipase A2 avec un agent alkylant de type R-CH2-X, o X est un atome d'halogène, de préférence du brome, et R est un groupe ali- phatique ou aromatique comprenant de 1 à 20 atomes de car- bone, pour modifier la phospholipase au niveau de l'une des histidines présente dans sa séquence, par fixation de l'agent alkylant sur ladite histidine. 18 ) Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'agent alkylant se fixe sur l'histidine 47 de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 et 2. 19 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 et 18, caractérisé en ce que l'agent al- kylant est du bromure de bromophénacyle. ) Procédé d'obtention des dérivés selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le cDNA codant pour la protéine selon l'une quel- conque des revendications 1 et 2 est modifié par voie géné- tique au niveau du fragment 44-50 de ladite protéine. 21V) Procédé d'obtention de fragments selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que lesdits fragments sont obtenus par coupure protéoly- tique, notamment trypsique, et/ou chymotrypsique. 220) Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité active d'au moins un dé- rivé et/ou d'au moins un fragment, éventuellement couplés à une substance de transport sélectif vers une cible appro- priée, notamment vers une cellule tumorale, selon l'une quelconque des revendications 3 à 11, comme principe actif, notamment pour le traitement des cancers, lequel dérivé et/ou fragment est éventuellement associé à tout véhicule adapté à son administration. 23') Agent de détection des cellules tumorales, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un dérivé et/ou un fragment selon l'une quelconque des re- vendicatlons 3 à 11. 24') Kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi pour la détection de cellules tumorales, caractérisé en ce qu'il comprend: - une quantité appropriée, éventuellement subdivisée en doses unitaires, de dérivé et/ou fragment se- lon l'une quelconque des revendications 3 à 8, - éventuellement une quantité appropriée de tampons, diluants, réactifs, nécessaires à la mise en oeuvre de ladite détection. ') Kit selon la revendication 24, caractérisé en ce que le dérivé est de la pBp-PLA2, obtenu par fixation de bromure de bromophénacyle sur l'histidine 47 de la pro- io téine selon l'une quelconque des revendications 1 et 2.