FR 2624613 A1 19890616 FR 8717616 A 19871215 La présente invention est relative à une phase solide utile pour la réalisation de tests biologiques rapides utilisant le principe de la réaction antigène-anticorps pour révéler par coloration d'un substrat, la présence de substances en quantités infinitesimales (inférieures au nanogramme > ; ces tests biologiques ont pour but de dépister de nombreuses affections mettant en Cause un agent (l'antigène) et la réaction de l'organisme vis-à-vis de cet agent, c'est-à-dire la révélation et le dosage des anticorps contre cet agent, à partir d'une goutte de tout liquide provenant du corps humain (sang, serum, plasma, urines, salive, larmes, liquide céphalo-rachidien, humeurs urétrales, vaginales, lait maternel, liquides prélevés en per-opératoire ou sur des organes- à greffer pour détecter le Sida par exemple), ou bien encore fragments de solides quelconques solubilisés au préalable ou simplement agités avec un peu d'eau. Il existe des dispositifs de détection immunoenzymatique utilisant des antigènes ou des anticorps mais nécessitant d'une part du personnel pour prise de sang, manipulations et d'autre part utilisant un système complexe, coûteux et surtout très long (3 heures) en raison de la-vages répétés suivant des périodes d'incubation d'une demiheure entre chaque phase. Le dispositif selon l'invention permet de remédier à ces inconvénients et de mettre à la disposition de patients, de médeciùs, de petits Centres de Soins, de Transfusion, de Services d'Urgences, etc... toute une gamme de tests rapides, puisque ce dispositif qui ne nécessite qu'une goutte de liquide à analyser, permet un diagnostic dans les quelques minutes suivantes en lisant la réaction antigène-anticorps révélée par une réaction colorée ou par mesure de la radio-activité (RIA) liée & un marquage radioactif. Pour détecter la présence d'un antigène ou anticorps dans un liquide biologique, il faut fixer l'antigène ou l'anticorps correspondant sur une phase so- lide, mettre en contact le liquide biologique avec cette phase solide. Si l'antigène est présent dans ce liquide, il se fixe par l'un de ses épitopes à l'anticorps fixé sur la phase solide, puis il est révélé, dans une seconde étape, par un anticorps marqué (enzyme + colorant ou radioactivité). Si l'anticorps est présent dans le liquide biologique, il se fixe par ses extrémités Fab (NH2) à l'antigène préalablement fixé sur la phase solide, puis est révélé par un second anticorps marqué. Le schéma reproduit & la figure 1 des dessins annexés illustre les réactions qui viennent d'être décrites. Cette technique présente cependant les inconvénients suivants - fragilité de la fixation d'anticorps ou d'antigènes sur la phase solide, que ce soit par des liaisons physiques (électrostatiques, forces de Van der Vaals, hydrogène ou hydrophobes) ou par des liaisons chimiques (covalentes - COOH,-SH ou -NH2) - encombrement stérique sur la phase solide l'accumulation de matériel immunologique sur cette phase provoque des réactions électrostatiques de promiscuité (rejet du matériel à doser, faussant le dosage) par des configurations moléculaires et d'électrostatisme, qui interdisent la promiscuité, comme le montre la figure 2 des dessins annexés - bruit de fond (background) : limite inférieure de la technique de dosage : en dessous d'une certaine concentration, la réponse de cette technique est toujours la même, comme l'illustre, à titre d'exemple, la figure 3 des dessins annexés - limites de lecture dues & la faiblesse de la coloration ou du comptage RIA - mauvais rendement : Une réaction antigène fixé-anticorps à doser ne peut descendre au-dessous de 10 nanogrammes par millilitre - nécessité d'une agitation pour mettre en contact le matériel fixé avec son correspondant dans le liquide testé ; - éloignement trop important du matériel fixé par rapport à son correspondant dans le liquide à tester, comme le montre le schéma représenté å la figure 4 des dessins annexés ; les puits d'une plaque ont un volume de 0,25 ml en sorte que sion on y introduit 0,25 ml de microbilles, la mise en contact est facilitée - Dernier inconvénient : ces phases solides exigent de nombreuses manipulations, des lavages multiples et ne sont pas mobilisables (plaques de 96 puits ou tubes). La courbe représentée à la figure 5 des dessins annexés montre les pertes de matériel immunologique en fonction des lavages. La présente invention a pour but de remédier à ces inconvénients en pourvoyant à une phase solide mobile constituée par des microsphères de diamètre -moyen de 100 microns qui peuvent supporter à leur surface du matériel -immunologique dont la fixation est solide, qui sont stables dans une large fourchette de pH et de températures, qui évitent la gêne et l'encombrement stérique, permettent de diminuer le bruit de fond, d'amplifier la lecture des faibles dosages, d'augmenter le rendement de la réaction antigène -anticorps, réduisent considérablement le temps d'agitation et de lecture, et enfin réduisent à zéro l & distance matériel fixé - matériel à doser. La présente invention a pour objet une phase solide mobile constituée par des microbilles-dont chacune comprend - une matrice présentant à sa surface des fonctions chimiques susceptibles de fixer solidement un revêtement d'activation - un revêtement d'activation apte à fixer un ligand - un ligand propre à capturer la molécule à -do- ser dans un milieu liquide. Conformément à la présente invention, la matrice doit répondre aux critères suivants : porosité, solidité, fiabilité (ne pas provoquer d'intéractions non spécifiques), rigidité et surtout doit présenter à sa surface des fonctions chimiques (-OH, Amide, -CONH2) susceptibles de fixer solidement le revêtement désiré (c'est l'activation). Le verre poreux a été éliminé, tous les essais ayant conclu à une activation très difficile. La cellulose présente de nombreux avantages mais est responsable de nombreuses intéractions non spécifiques. Le polystyrène, malgré de notables progrès dans son activation, ne fixe pas plus de 100 nanogrammes de protéines par cm2 et a présenté au cours des essais un très mauvais WRE (Washing Reduce Effect) : les lavages nécessaires après fixation des protéines immunologiques, emportent une grande partie de ces protéines. Certains sucres (polysaccharides) apparemment intéressants par le très grand nombre de groupements -OH (6 par molécule) se sont révélés fragiles (cassants), peu poreux et peu rigides. Selon un mode de réalisation avantageux des microbilles conformes à la présente invention, leur matrice est constituée par une association de limaille d'aluminium, magnétite, floquet acrylique et hydroxyapatite en quantités sensiblement égales - La limaille d'aluminium apporte la rigidité, la stabilité aux variations de température et de pH, ainsi qu'une neutralité chimique et électrostatique, évitant ainsi les intéractions indésirables. - La limaille de magnétite, n'apporte qu'une facilité 4e manipulation : elle permet de séparer à l'aide d'un aimant collé contre le tube, les microbilles du li quide du lavage ou du liquide biologique à tester. Ses défauts (cassante, ionisée Fe2o3++ instable,..) sont neutralisés par un revêtement périphérique.approprié, qui est le floquet acrylique. - Le floquet acrylique apporte un élément précieux : un grand nombre de fonctions amides -CONH2 qui vont fixer solidement le revêtement des microbilles. - L'hydroxyapatite est un phosphate cristal lisé (Cas (PO4)2)3 Ca(OH) 2 présentant un intérêt considé- rable : elle présente à sa surface des ions positifs (Ca++) et négatifs (PO1") permettant une fixation chimique de première qualité du ligand. D'autre part, les essais ont permis de constater que les molécules de poids moléculaire très élevé, et qui posent pour cela des problèmes de fixation, sont si so- lidement fixées, qu'il est impossible de les éluer malgré un tampon phosphate 2 M, alors qu'une élution normale se fait avec des tampons compris entre 0,001 et 0,25 M. Selon un autre mode de réalisation avantageux des microbilles conformes à la présente invention, le revêtement d'activation qui recouvre la surface de leur matrice et est propre à fixer un ligand approprié est constitué par un activateur dont la molécule comprend un groupe -CH=C- réactif et notamment par le glutaraldéhyde. En effet pour permettre à ces microbilles de fixer un ligand, il faut les activer pour plusieurs raisons - nécessité d'un intermédiaire entre la surface des billes et l'a molécule à doser, intermédiaire solide et stable réagissant par une face avec la microbille et par l'autre face avec la molécule à doser - nécessité d'espacer les sites de liaison pour éviter l'empêchement stérique. L'activation qui présente le meilleur rapport qualité, facilité / toxicité, instabilit6, est l'activation au glutaraldéhyde selon le schéma représenté à la figure 9 des dessins annexés. Elle est suffisante pour fixer toute protéine par sa fonction amine -NH2 sur le site -CH=C- du glutaraldéhyde selon le schéma Protéine. Par contre, pour fixer une immunoglobuline par son fragment Fc (COOH), il faut - soit ajouter un bras d'espacement se terminant par -NH2 pour se lier à -COOH. Le meilleur se révèle être le HMD (hexaméthylènediamine) NH2-(CH2)6-NH2 - soit suractiver la surface des billes. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux des microbilles conformes à la présente invention, celles-ci comportent un agent de suractivation de leur surface lié à l'agent de revêtement d'activation. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit agent de suractivation est constitué par la protéine A, pour la fixation des IgG. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit agent de suractivation est constitué par la protéine G, pour la fixation des IgG. Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit agent de suractivation est constitué par la protéine A et la protéine G fixées au revêtement d'activation de la matrice des microbilles. Selon un autre mode de réalisation avantageux des microbilles conformes à la présente invention, le ligand est pris dans le groupe qui comprend les anticorps, les antigènes, les immunoglobulines, les antigènes fixés sur des sites appropriés d'immunoglobulines elles-mêmes, fixées selon le cas, au revêtement d'activation ou à l'agent de suractivation porté par la matrice de chacune des microbilles. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère aux dessins annexés et à des exemples de réalisation de ltob- jet de la présente invention il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et dessins et les parties descriptives correspondantes, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. La figure 6 illustre la composition des microbilles conformes å la présente invention, tandis que la figure 7 illustre la suractivation par les protéines A et- G d'une microbille activée par du glutaraldéhyde. Exemple 1 : production des microbilles. 1.1 Production de la matrice On fait bouillir 100 cm3 d'eau dans un réci- pient approprié dans lequel on verse 100 cm3 de CaCl2 et 100 cm3 de Na2HPO4. On agite doucemment. I1 se forme de la brushite CaHPO4 et 2 NaCl. On jette l'eau et on laisse refroidir en ajoutant de la soude NaOH et agitant 1 minute. Puis on verse 100 cm3 de limaille d'aluminium mélangée auparavant à 100 cm3 de limaille de magnétite, en agitant continuellement pour bien mélanger les composants. On laisse refroidir. On passe à l'eau froide pour éliminer toutes les impuretés. On décolle la plaque formée.et on la place dans un concasseur électrique. On tamise à 100 microns. On lave cette poudre et on la place dans un vase en verre posé sur un aimant puissant. Toutes les billes incom plètes, les débris d'aluminium et les impuretés flottent alors que les microbilles de qualité se collent au fond.On sépare les microbilles et on les rince avec la solution suivante : Tampon 0,01 M acétate d'ammonium pH 4 1 M, chlorure de sodium pH 7 0,01 M Tampon TRIS-HC1 pH 8,5 1.2 Mise en place du revêtement d'activation On place les billes de matrice obtenues, dans un tampon phosphate 100 mM pH 6,8 pour éliminer toutes les interférences. Les tampons doivent être préparés avec de l'eau 3 fois distillée et stérile. On ajoute 100 cm3 de glutaraldéhyde à 25 % et on incube 24 heures à 37 C, on rince avec un tampon phosphate pH 7,6 , 0,5 M et on maintient à 4 C en présence d'un bactériostatique & 0,015 % type Merthiolate ou azide de sodium. 1.3 Fixation du ligand 1.3.1 fixation d'un antigène On place les microbilles activées, dans une so- lution de 100 ml de tampon phosphate 0,5 M, pH 7,6 + 5 mg d'un antigène. On soumet à agitation pendant 18 heures à +4"C, puis on lave avec 10 volumes du tampon phosphate susdit. 1.3.2. Fixation d'un anticorps. Pour fixer 1 mg d'anticorps, on utilise 0,25 ml de microbilles activées, que l'on rince avec 10 volumes d'eau désionisée stérile, après quoi l'on ajoute 3 volumes de tampon phosphate 0,5 M, pH 7,6 dans lesquels a été ajouté 1 mg d'immunoglobulines lyophilisées ou en solution. Après agitation pendant toute une nuit, en maintenant à +4 C, on rince avec le tampon précité pour éliminer les Ig non fixées, puis on traite par un même volume d'un tampon à pH 7,5-8,5 , à +4 C, on rince, on ajoute un bactériostatique et on maintient à +4 C. Les microbilles obtenues sont prêtes à l'emploi ; leur diamètre est avantageusement de 100 microns, leur surface de 0,0314 mm2 et leur volume de 0,0005236 mm3. Cette solution semble, en effet la plus performante : on fixe en premier lieu une Ig x en profitant des fortes capacités de fixation des Ig. L'antigène à doser se fixera sur les sites Fab et sera révélé par une Ig y dirigée contre l'epitope y encore libre sur l'antigène. Pour doser une Ig, il suffira de fixer préalablement un antigène sur les Ig déjO fixées. L'Ig recherchée se fixe par ses sites Fab sur l'antigène. Elle sera révélée par une Ig anti-Fragment Fc, marquée. La longueur et la grande masse de ce convoi ne posent aucun problème. La détectabilité est multipliée par 10, tandis que tous les inconvénients de la fixation directe d'antigènes (bruit de fond, gène stérique,...) sont considérablement diminués, les Ig fixées se comportant comme d'excellents bras d'espacement. Les figures 10 et 11 illustre respectivement un ligand pour la recherche d'antigène et un ligand pour la recherche d'anticorps. Exemple 2 : Préparatlon de microbilles suractivés Les microbilles activées obtenues conformément à l'exemple 1.2, sont placées dans une solution de 100 ml de tampon phosphate 0,5 M, pH 7,6 contenant 5 mg -de protéine A lyophilisée. On soumet à agitation (sur Titertek force 4 par exemple) pendant 18 heures à +4 C, on lave avec 10 volumes du tampon ci-dessus. Pour bloquer les groupes aldéhyde libres res- tants du glutaraldéhyde, on traite avec un tampon d'éthanolamine ou de Tris 0,1 M, pH 7,5-8,5 pendant .3 heures à +4 C, puis on rince avec 10 volumes de tampon phosphate 0,5 M, pH 7,6 contenant 0,15 M NaCl ; on équilibre ensuite avec 1 volume de tampon phosphate 0,5 M, pH 7,6 contenant un bactériostatique approprié. Sur ces microbilles suractivées, on fixe le ligand comme décrit à l'Exemple 1.3 et l'on obtient des microbilles prêtes à l'emploi, comme représenté à la figure 8 des dessins annexés. Exemple 3 : Dssaoe d'antiaenes On place 0,25 ml de microbilles prêtes à l'emploi, clest-à-dire revêtues de protéines A et de l'anticorps spécifique de l'antigène, dans un tube minisorb de NUNC (qui n'adsorbe que très peu de matériel immunologique) ou dans un tube en verre déjd préparé par des blo quants de surface. On y ajoute 0,75 ml de tampon phosphate 0,5 M, pH 7,6 et 1 ml du sérum à analyser, on ferme le tube et on agite horizontalement 3 minutes à la main ou sur agitateur en cas de séries. On place un aimant contre les parois du tube et on jette tous les liquides. On ajoute 1 ml de l'Ig marquée spécifique de l'antigène et on agite 3 minutes. On place l'aimant contre le tube et on jette tous les liquides. On rince avec le même tampon. Si le marquage est radioactif, on compte les coups. S''il est enzymatique, on ajoute 1 ml de substrat + chromogène et on mesure la réaction colorée en D.O. ExemPle 4 : Dosaae d'anticorps On place 0,25 ml de microbilles suractivées comme décrit à l'Exemple 2 et préparées comme décrit à l'Exemple 1, avec un antigène correspondant à l'anticorps recherché. On ajoute 1 ml de sérum à analyser, l'anticorps recherché se fixe sur l'antigène. On jette les liquides, on rince et on ajoute 1 ml à 1/2000 d'une Ig marquée, spécifique du segment Fc de l'anticorps recherché. On rince plusieurs fois et on lit la réaction. Les performances constatées sont les suivantes - 1 ml de microbilles, présentant une surface réactive de 600 cm2 fixe 3,3 mg de protéine A - Comme 1 mg de protéine A fixe 12 mg d'IgG, 600 cm2 de microbilles fixent 40 mg d'IgG, soit 0,066667 mg ou 66667 nanoaramme~pv 33 par comparaison : Les mêmes microbilles sans protéine A ne fixent que 4333 ng/cm2. Une surface de polystyrène, même activée, ne fixe que 400 ng/cm2 et seulement 100 ng/cm après 6 la- yages. .- On augmente encore les performances de détectabilité de cette méthode notamment par chauffage des IgG à fixer, à 135'C pendant quelques minutes. Le segment Pc est dénaturé à cette température et se fixe encore plus solide ment à la protéine A. Le segment Fab reste intact à cette température - I1 est possible d'effectuer un dosage par cette méthode avec seulement une goutte de sang de 50 til, les seuils de détectabilité très bas enregistrés, permettant le microdosage sur sang total - Un problème peut se poser pour les très faibles concentrations : cf schéma gène stérique. L'Ig mar.- quée est bivalente (se fixant à 2 antigènes) mais peut se fixer par un seul antigène. La mesure indiquera alors le double de la concentration réelle. Pour y remédier, la meilleure solution est d'utiliser des fragments Fab marqués, comme représenté à la figure 12 des dessins annexés. Avantages : UN segment Fab pour UN antigène. Inconvénients : Les segments Fab ont une détectabilité inférieure aux Ig complètes. Pour y remédier-: choisir des Fab de très haute affinité et au besoin, amplifier la réponse avec un second Fab marqué dirigé contre le précédent. - il est en outre possible de placer dans le tube des microbilles activées contre différentes affections par exemple : 0,25 ml de billes pour HIV1, 0,25 pour HIV2, 0,25 l'hépatite. Une réaction positive indiquera qu'une des trois infections est présente, permettant d'orienter les examens suivants. Il sera intéressant de fixer un groupe de marqueurs tumoraux de la sphère digestive, ou gynécologique ou respiratoire. En cas de réaction positive, il est procédé & une exploration organe par organe avec des tests identiques mais ne supportant que les marqueurs de l'organe exploré. Une réaction positive orientera les examens spécialisés (Fibroscopie, Biopsies,...). L'utilisation des microbilles conformes à l'invention a permis, lors des essais, de franchir des seuils de détectabilité nouveaux. Elle procure de nouvelles perspectives en hormonologie, do sages des marqueurs tumoraux, et de l'antigène HIV qui est virtuellement indétectable, complétant ainsi le dépistage des anticorps dont -la négativité est fréquente et la positivité tardive chez un nombre de plus en plus grand de personnes contaminées. Si le seuil de détectabilité de l'antigène HIV est atteint par cette méthode, elle intéressera toute la virologie. Elle est également destinée à la détection précoce et rapide de nombreuses affections (Syphilis, Hépatites,...) et à obtenir des indications biologiques rapides telles les groupages sanguins, l'évaluation d'Enzymes circulants et enfin le diagnostic d''affections difficiles å apprécier (Rage, Paludisme,...). Les microbilles conformes à la présente invention sont capables d'être utilises à' titre d'exemples non limitatifs pour Le diagnostic des affections virales, Le diagnostic des affections microbiennes, Les dosages enzymatiques, Les maladies auto-immunes et maladie d 'Alzheimer, Les groupages sanguins rapides, Le dépistage de cancers, Le dosage de médicaments circulants, La détection d'allergènes. Diagnostic d'allergies, Les dosages des récepteurs membranaires, Les dosages d'hormones, Les dosages divers (Anions Cations de l'ionogramme, métaux, et d'une manière générale tous les éléments de la Classification de Mendeleieff). Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir å l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1. Phase solide utile pour la réalisation de tests biologiques rapides, constituée par des microbilles, caractérisée en ce Rue chacune de ces microbilles comprend - une matrice présentant à sa surface des fonctions chimiques susceptibles de fixer solidement un revêtement d'activation - un revêtement d'activation apte à fixer un ligand - un ligand propre à capturer la molécule å doser dans un milieu liquide. 2. Phase solide selon la revendication 1, caractérisée en ce que la matrice de chacune des microbilles est constituée par une association de limaille d'aluminium, magnétite, floquet acrylique et hydroxyapatite en quantités sensiblement égales. 3. Microbilles selon l'une quelconque des.re- vendications 1 et 2, caractérisées en ce que le revêtement d'activation qui recouvre la surface de leur matrice et est propre à fixer un ligand approprié est constitué par un activateur dont la molécule comprend un groupe -CH=C- réactif sur lequel vient se fixer une protéine. 4. Microbilles selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce qu'elles comportent un agent de suractivation de leur surface lié à l'agent de revêtement d'activation. 5. Microbilles selon la revendication 4, caractériées en ce que ledit agent de suractivation est constitué par la protéine A, pour la fixation des IgG. 6. Microbilles selon la revendications 4, caractérisées en ce que ledit agent de suractivation est constitué par la protéine G pour la fixation des IgM. 7. Microbilles selon la revendication 4, caractérisées en ce que ledit agent de suractivation est consti tué par la protéine A et la protéine G fixées au revêtement d'activation de la matrice des microbilles. 8. Microbilles selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisées en ce que le ligand est pris dans le groupe qui comprend les anticorps, les antigènes, les immunoglobulines, les antigènes fixées sur des sites appropriés d'immunoglobulines, elles-mêmes fixées selon le cas, au revêtement d'activation ou à l'agent de suractivation porté par la matrice de chacune des microbilles.