FR 2626373 A1 19890728 FR 8800691 A 19880122 La présente invention concerne un procédé de préparation d'ur. traceur, notamment utile au dosage d'un agent immunologique. Par définition, un traceur, utile au dosage d'une molécule particulière, est constitué soit de cette molécule qui a été marquée par une des différentes techniques connues de l'homme de l'art, soit dlun anticorps dirigé contre cette molécule et marqué par l'une desdites techniques. Dans le cadre de la présente invention, un traceur sera constitué d'un agent immunologique dont on veut effectuer le dosage, ou de l'anticorps correspondant, et auquel on aura fixé une enzyme de .-.arquage. Les traceurs sont bien évidemment nécessaires aux dosages de type compétitif. L'instabilité des traceurs utilisés lors des dosages immunochimiques pose des problèmes. En effet, un pourcentage important de résultats faussement positifs ou faussement négatifs, pourra être attribué à une destabilisation accidentelle ou prématurée du traceur qui sera incompatible avec les dosages automatisés. C'est pourquoi, la présente invention propose un nouveau procédé de préparation d'un traceur notamment utile pour le dosage d'un agent immunologique. Le procédé selon l'invention comprend le couplage de l'agent immunologique, ou de l'anticorps correspondant, et d'une enzyme de marquage au moyen d'un polymère préalablement activé, dans des conditions propres à assurer la stabilité du traceur obtenu. Cette méthode de préparation d'un traceur est, en outre, d'une technologie plus légère que celle employée classique- ment. De préférence, selon la présente invention, l'activité du polymère est réalisée à l'aide d'une triazine comportant au moins deux sites réactionnels. Ces sites réactionnels sont notamment choisis parmi les halogènes tels que le chlore. La triazine peut alors avoir la formule (I) suivante dans laquelle X est quelconque: De préférence, dans la formule (I), X est un atome de chlore, la triazine correspondante étant alors le chlorure de cyanuryle. Le polymère activé est, selon la présente invention, l'agent de couplage permettant de fixer l'enzyme de marquage sur l'agent immunologique. I1 s'agira, de préférence, de P.G.,ce polymère s'étant révélé particulièrement performant dans le cadre de la présente invention. Différentes enzymes de marquage peuvent être utilisées. On utilisera de préférence la peroxydase. Enfin, l'agent immunologique que l'on peut doser au moyen du traceur préparé selon la présente invention peut être quelconque : il peut s'agir d'un antiqène, d'un naptène ou d'un anticorps. De préférence, cependant, le traceur préparé selon la présente invention permettra de doser un médicament contenant au moins une fonction amine ou le 6 béta-hydroxycortisol. Le 6 béta-hydroxycortisol est un métabolite du cortisol dont la concentration urinaire constitue un témoin indirect de l'induction enzymatique des monooxygénases hépatiques. En outre, l'augmentation du taux urinaire en 6 béta-hydroxycortisol est révélatrice de nombreuses maladies dont l'hypercortisolémie et la toxémie. I1 est donc essentiel de pouvoir doser ce métabolite et les tentatives déjà effectuées en vue de ce dosage se sont heurtées à un problème de préparatIon et de stabilité du traceur. Ce problème a été résolu grâce à la stabilité et à la facilité de synthèse du traceur préparé selon le procédé de la présente invention. Le procédé selon llinvention comporte généralement deux étapes principales, à savoir l'activation du polz- mère puis le couplage de la molécule à doser avec une enzyme de marquage au moyen du polymère activé. Ainsi, par exemple, dans le cas où le polymère choisi est le P.E.C-., l'activation de ce polymère avec une ou plusieurs triazines comporte une réaction chimique entre une ou plusieurs fonctions -OH du P.E.G. et au moins un atome de chlore présent sur une triazine. I1 s'en suit un dégagement d'C1 et la fixation d'une ou plusieurs molécules de P.E.G. sur une ou plusieurs triazlnes. Le P.E.G. ainsi activé va permettre le couplage proprement dit entre, par exemple, une molécule de 6 bétahydroxycortisol et une enzyme de marquage telle que la péroxydase, comportant au moins un groupement rH2 accessible dans sa structure. Pour effectuer ce couplage, on met en présence successivement ou simultanément, le P.E.G.-actizé avec le 6 béta-hydroxycortisol et avec l'enzyme de marquage. Cette dernière, comportant un groupement NXz, réagit avec une fonction chlore resté libre d'une triazine. De la même fanon, le 6 béta-hydroxycortisol, possédant une fonction Ct dans sa structure, réagit avec un atome de chlore resté libre d'une triazine. Ces deux réactions engendrent la formation de HC1 et la fixation de l'enzyme et au 6 béta-flydroxycortisol sous la forme d'une macromolécule comportant une ou plusieurs triazines. Le procédé selon l'invention peut comprendre, en outre, préalablement au couplage proprement dit, une étape d'activation de l'agent immunologique etsou de l'enzyme de marquage utilisées. Cette activation sera notamment destinée à introduire des groupements fonctionnels tels que -OH ou -NH2 sur l'agent immunologique ou sur l'enzyme de marquage et qui ne possèderaient pas, à l'état libre,de fonction propre à assurer leur ancrage sur une triazine. Enfin, le procédé selon l'invention peut comprendre, outre les étapes mentionnées ci-dessus, une étape finale de dialyse ou de filtration destinée à éliminer d'éventuels produits ae réactions parasites qui ont pu avoir lieu lors du couplage, et notarrr.ent, les produits ne comportant pas d'enzyme de marquage. La présente invention s'étend bien évidemment aux traceurs obtenus par le procédé de l'invention, ces traceurs comportant une ou plusieurs triazines dont les fonctions réactionnelles ont été remplacées par au moins une liaison aux polymère, enzyme de marquage et/ou agent immunologique. Ces traceurs peuvent, par exemple, posséder l'une des structures suivantes II ou III dans lesquelles -NH-E représente 1 'enzyme de marquage, -O-C représente l'agent immunologique, S-0- ou -O-P-O représente le polymère et X est quelconque, mais est, de préférence, un site réactionnel tel que le chlore. De préférence, les traceurs de la présente invention auront une structure similaire à celle représentée par III. En effet, l'étude de l'étape de couplage a révélé qu'une molécule de triazine dont 2 sites réactionnels sont déjà occupés par des molécules telles que le P.E.G. ou le 6 béta-hydroxycortisol, voit rarement son troisième site réactionnel éventuel réagir avec une troisième moins cule telle que l'enzyme de marquage. Mais de nor'.treuses autres structures de traceurs envisageables à l'évidence par l'homme de l'art sont obtenues sous la forme de macromolécules par le procédé de la présente invention. De préférence, ces macromolêcules comme portent une molécule d'agent immunologique par molécule de polymère activé. La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants et de la figure unique qui représente les résultats obtenus lors du dosage du 5 Lêta-hydroxycor- tisol. EXEMPLE 1 Présaration d'anticorcs anti-6 béta-hYdroxvcortisol Afin d'obtenir un inmunogène, le 6 béta-hydroxycortisol (molécule hapténique) est couplé à une protéine porteuse. Ce couplage est réalisé en deux étapes 1.1. formation d'un bras réactif sur le 6 béta-hydroxy cortisol afin d'obtenir le 21 hemissuccinoxv 6 béta hydroxycortisol Le 6 béta-OH-cortisol (25 mg) est mis en contact avec de l'anhydride succinique (50 mg) dans de la pyridine (5 ml), mis sous agitation 5 heures à température ambiante puis 12 heures à 40C. Une extraction est effectuée sur cette synthèse. 50 ml d'H,O sont additionnés, le pH est ajusté à 4,8 à l'aide d'acide chlorhydrique concentré. Les stéroïdes sont extraits 3 fois avec 20 ml d'acétate d'éthyle. Le solvant est évaporé à sec sous pression réduite. Les différents composés sont séparés sur couche mince en plaque préparative avec indicateur fluorescent. La migration est obtenue avec un mélange chloroforme, méthanol, acide acétique (70; 10 ; 0,1 ; V/V). Le 21 hémissuccinoxy 6 béta-OH-cortisol est extrait au méthanol. Après évaporation du solvant et recristallisation, le produit ne présente qu'un seul pic en HPLC et un maximum d'adsorption en UV à 238 nm. 1.2. Couplage du 21 hémissuccinoxy 6 béta-hydroxycortisol sur de la serum albumine bovine (BSA) Le 21 hémissuccinoxy 6 béta-OH-cortisol (14 mg) est dissous dans 7 ml de D.M.F. Sous agitation à 4 C sont ajoutés la tributylamine (140 ssl) et le chloroformiate d'éthyl (70 l). 50 mg de BSA dissous dans 2 ml d'H2O et alcalinisés par la tributylamine (75 l) sont additionnés à la solution précédente. Le conjugué obtenu après 18 heures de réaction à 4 C sous agitation est dialysé pendant 24 heures contre de l'eau distillée. Pour l'obtention des anticorps, on inocule des lapins (fauves de Bourgogne) avec l'agent immunogène obtenu à l'issu de l'étape de couplage ; puis on recueille périodiquement les immunsérums. Les anticorps obtenus servent au dosage immunochimique du 6 béta-OF-cortisol et à la validation du traceur préparé de la façon suivante. EXEMPLE 2 Préparation du traceur Le polyéthylène glycol (P.E.G.) est activé à l'aide de chlorure de cyanuryle puis mis en présence du 6 béta-OH-cortisol et de peroxydase. 2.1. Activation du P.E.G. Le P.E.G. 6 000 (5g) est mis en présence de chlorure de cyanuryle (1,9 g) dans : 5 ml de toluène. L'ensemble est chauffé à reflux pendant 48 heures sous atmosphère d'azote. La solution est ensuite refroidie et évaporée sous vide. Le produit obtenu est repris à l'aide de CH2Cl 2 Le P.E.G. activé est précipité à l'éther, filtré et séché au dessicateur. 2.2. Couplage du.6 béta-OH-cortisol et de la peroxydase La synthèse se fait dans un tampon borax phosphate pH = 8 50 mM. 2 mg de 6 béta-OH-cortisol et 20 mg de P.E.G. activés sont dissous dans 2 ml de tampon et mis sous agitation 4 heures à température ambiante. 20 mg de péroxydase sont additionnés à la solution et laissés 1 heure à température ambiante puis 16 heures à 4"C. La réaction est stoppée avec 16 mg de glycine. Le traceur est séparé sur colonne de chromatographie G25 avec un tampon tris pH 6,8 50 mM comme éluant. Le traceur ainsi préparé est employé dans le dosage immunochimique du 6 béta-OH-cortisol effectué de la façon suivante EXEMPLE 3 Dosage immunochimiaue du 6 béta-OH-cortisol 100 ssl de solution d'IgG anti 6 béta-OH-cortisol dilué dans un tampon phosphate 0.1 M pH 7,2 sont distribués dans les puits des plaques de microtitration et sont incubés pendant 16 heures à température ambiante. La plaque est ensuite lavée 3 fois avec du tampon phosphate + tween (0,02 t) puis 120 ssl d'une solution de BSA à 1 % sont distribués dans chaque puits (incubation 30 min). Après un lavage, 50 l de traceur dIlué dans un tampon phos- phate pH 7,2 0,1 M BSA 0,1 % et 50 l de 6 béta-OH-cortisol ou 50 l de ce même tampon sont ajoutés dans chaque puits et incubés pendant 2 heures à température ambiante. Les plaques sont lavées et 100 l de substrat de la pérox1- dase sont ajoutés. Après 30 min d'incubation à l'obscurité, la réaction enzyma- tique est arrêtée à l'aide d'une solution d'acide sulfurique 1N et les lectures sont effectuées à une longueur d'onde de 492 nm. La détection du 6 béta-OE-cortisol est possible entre 0,5 et 1 ng/ml. Le résultat montre un seuil de détection inférieur à celui obtenu avec un traceur classique. En outre, contrairement à la technique antérieure, la stabilité du traceur de la présente invention est excellente. Après 10 jours à 37 C son activité est de 75 % alors que la péroxydase dans les mêmes conditions a une activité résiduel- le de 2 %. EXEMPLE 4 : Dosage immunochimique de la "molécule A" (Médicament ayant dans sa structure une amine secondaire). I - Préparation d'anticorts anti- molécule A La molécule A (un haptène) est couplée à une protéine porteuse afin d'obtenir un immunogène : I- 1 fixation d'un bras réactif sur la molécule A afin d'obtenir le dérivé molécule A hémissucinate. Dans 10 ml de pyridine sont dissous 2 mmoles de molécule A et 4 mmoles d'anhydride succinique. Cette solution est agitée pendant 24 heures à température ambiante. Elle est ensuite évaporée, on obtient un précipité qui est lavé à l'eau et filtre. Le produit attendu est synthétisé avec un rendement de 92 %. I- 2 Couplaae du dérivé molécule A hémissucinate sur la BSA (sérum albumine bovine). Solution A : A 0,07 mmole de molécule A hémissucinate sont dissous dans 1,5 ml de DMF. 50 l de tri-N butvlamine et 12,5 ssl d'isobutylchloroformiate sont additionnés à la solution. L'ensemble est mis sous agitation pendant 30 min dans la glace. Solution B 125 mg de BSA sont dissous dans 2,25 ml de DMF, 3 ml d'H2O et 0,125 ml de NaOH 1 N. La solution est mise dans la glace sous agitation. Après 30 min, on additionne B dans A et on laisse 16 heures sous agitation à 40C. Le produit est ensuite dialysé contre de l'eau distillée pendant 48 heures puis lyophilisé. Le taux de couplage est de 10 molécules A par molécule de BSA. L'immunogène a été injecté à des lapins et les immunsérums ont été prélevés périodiquement. Les IgG ont été purifiées et ont servi à la mise au point d'un dosage immunochimigue et au test du nouveau traceur de la présente invention. Couplage de la molécule A et de la péroxydase La synthèse se fait dans un tampon borax phosphate pH 8, 50 mM. 1 mg de molécule A et 10 mg ae P.E.G. (6 000) activé (l'activation se fait comme pour l'exemple précédent) sont additionnés dans 1 ml ce tampon. Après 4 heures à température ambiante sous agitation,10 mg de péroxydase sont dissous dans la solution et ''ensemble est laissé 30 min à température ambiante puis 15 heures à 40C, toujours sous agitation. La réaction est stoppée par 8 g de glycine. Le traceur ainsi obtenu est purifié et séparé sur colonne de chromatographie G 25 avec un tampon phosphate pH 7,2 0,1 M. Dosage irmur.ochimisue de la mole cule A il se déroule comme le dosage du 6-B-hydroxycortisol. Grâce au procédé de la présente invention, on a pu mettre en évidence que le traceur obtenu est reconnu par les anticorps et donc que la molécule A est présente. En outre, il peut aussi être déplacé par la molécule A se trouvant à l'état libre. Ces deux propriétés prouvent que le traceur de la présente invention est compatible avec le dosage immunochimique et qu'il permet le dosage de ce médicament. REVENDICt.TIC > iS 1. Procédé de préparation d'un traceur,notanment utile au dosage dlun agent immunologique ou de l'anticorps correspondant, caractérisé en ce que l'on couple l'agent immunologique ou l'anticorps ccrrespondant,et une enzyme de marquage au moyen d'un polymère préalablement activé, dans des conditions propres à assurer la stabilité du traceur obtenu. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé sé en ce que le polymère est préalablement activé par une triazine comportant au moins deux fonctions réactionnelles telles que des halogènes. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la triazine est le chlorure de cyanuryle. 4. Procédé selon l'une quelconque des reszendi- cations 1 à 3, caractérisé en ce que le polymère est le P.E.G. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 4, caractérisé en ce que l'enzyme est la sé- roxydase. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'agent immunologique est un antigène ou un haptène. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérise en ce que l'agent immunologique est le 6 béta-hydroxycortisol ou l'un de ses dérivés. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'agent immunologique est une molécule médicamenteuse contenant une fonction amine. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'agent immunologique est un anticorps. 10. Procédé selon l'une quelconque des revaaica- tions 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte, préalablement au couplage, une étape d'activation de l'agent immunologique etZou de l'enzyme de marquage. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, une étape de dialyse. 12. Traceur obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 13. Traceur selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il comporte une molécule d'agent immunologîique par molécule de polymère activé.