FR 2623520 A1 19890526 FR 8716210 A 19871123 La présente invention concerne un procédé continu de préparation de la L-carnitine par voie enzymatique. Ce composé et certains. de ses esters sont utilisés en thérapeutique humaine. De nombreux procédés de préparation de la L-carnitine, ou acide L-triméthylamino-4 hydroxy-3 butyrique, ont été décrits. dont certains mettent en oeuvre des réactions catalysées par des enzymes. Un procédé. particulièrement intéressant est celui ,décrit dans le brevet français FR-A-2 398 046 qui consiste en une réduction enzymatique asymétrique de la 3-déhydrocarnitine. ou acide triméthylamino-4 oxo-3 butyrique, selon le schéma réactionnel 3-déhydrocarnitine L-carnitine La réaction est catalysée par la carnitine déshydrogénase (CDH) et le cofacteur que constitue le nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) est régénéré. in situ, soit par une réaction enzamatique, par exemple, par oxydation du glucose en présence de glucose déshydrogénase (GDHZ, d'un formiate en présence de formiate déshydrogénase (FDH) ou de l'éthanol en présence d'alcool déshydrogénase (ADH), soit par réduction chimique, par exemple. par l'action d'un dithionite alcalin. Différents perfectionnements' à ce procédé ont été décrits et notamment, dans les demandes de brevet EP-A-2s0 422 et -EP-A-240 423 l'utilisation d un milieu réactionnel de force ionique d'au-moins 0,5 M dans le cas de l'utilisation du système formiate/FDH pour régénérer le cofacteur. Lorsque ces procédés sont mis en oeuvre dans des réacteurs classiques, la bioconversion s'arrête environ 48 heures après la charge des réactifs dans l'appareil, quelles que soient les quantités de produits mises en jeu, ce qui entraîne, notamment, la consommation d'une quantité non négligeable d'enzymes et de cofacteur par kilo de L-carnitine produite. Le procédé de la présente invention supprime cet inconvient et diminue sensiblement le prix de revient de la fabrication de la L-carnitine, puisqu'il permet une production continue pendant plusieurs centaines d'heures avec un rendement de 90 à 100X. En outre, la purification de la L-carnitine est simplifiée et se fait avec d'excellents rendements, ce qui est un autre avantage de 1 invention. Ce procédé. qui met en oeuvre la réduction de la 3-déhydrocarnitine par le NADH en présence de carnitine déshydrogénase avec régénération simultanée du NADH à partir du NAD formé, consiste à introduire en continu, dans un réacteur contenant les enzymes. la 3-déhydrocarnitine et l'agent réducteur du NAD+, le NAD+ étant soit également introduit en continu dans le réacteur soit présent dans le réacteur sous forme greffée à un polymère hydrosoluble, à soumettre le milieu réactionnel dans un circuit en dérivation sur le réacteur, à une ultrafiltration et à récupérer la L-carnitine dans l'ultrafiltrat séparé. I1 est en général préférable d'introduire de temps en temps dans le milieu réactionnel, de petites quantités supplémentaires d'enzymes pour maintenir le rendement élevé de la bioconversion. Suivant une caractéristique de l'invention, on opère dans un réacteur de bioconversion classique, qui est relié à une source d'alimentation en fluides et qui comporte, en dérivation, un circuit constitué d'une unité d'ultrafiltration et d'une pompe qui assure l'extraction du milieu réactionnel du réacteur, sa circulation dans l'unité d'ultrafiltration et le retour du retentat au réacteur. Le réacteur est de préférence thermostaté et muni d'un moyen d'agitation. Le conduit d'introduction de fluide dans le réacteur est reiié à un ou des ré servoirs contenant la déhydrocarnitine, l'agent réducteur du NAD et éventuellement le cofacteur sous la forme de NARD , plus stable. La déhydrocarnitine n'étant stable qu'en milieu acide. et à basse température,elle est avantageusement stockée dans le réservoir à température inférieure à la température- ambiante, de préférence inférieure à 5-C, et sous forme d'un sel d'acide fort, tel que l'acide chlorihydrique, qui est neutralisé dans le réacteur. par exemple, par réaction avec NH4OH. Par ailleurs. lorsque l'agent réducteur est un formiate, celui-ci peut être introduit soit sous forme d'acide formique en même temps que la déhydrocarnitine soit sous forme d'un sel comme le formiate d'ammonium; dans ce cas il ne sera mélangé à la déhydrocarnitine que juste avant son arrivée dans le milieu réactionnel ou même dans ledit milieu. Le réacteur peut aussi être équipé d'une arrivée de fluide pour permettre d'introduire au cours de l'opération de bioconversion une solution d'acide ou de base, en fonction du système enzymatique utilisé, pour maintenir le milieu au pH optimum d'activité des enzymes; le réacteur est alors aussi équipé d'une sonde de mesure du pH qui plonge dans le milieu réactionnel. Enfin, comme on a constate que pour avoir un rendement optimum, sur une période supérieure à plusieurs jours, il était préférable d'ajouter de temps en temps des enzymes au milieu réactionnel, le réacteur peut aussi comporter un moyen d'introduction de ces enzymes. Le circuit d'ultrafiltration comporte avantageusement avant l'unité d'ultrafiltration un filtre de microfiltration, ce qui permet d'éliminer les particules en suspension dans le milieu, qui proviennent essentiellement des extraits enzymatiques, et qui sin-on pourraient colmater la membrane d'ultra-filtration. Cette membrane est choisie de façon à retenir les molécules de masse moléculaire supérieure à 5000 et de préférence à 20000. L'unité de filtration comprend un moyen de soutirage de l'ultrafiltrat qui contient, notamment, la L-carnitine. La pompe du circuit d'ultrafiltration, placée en général avant le filtre, est choisie de telle sorte que le débit du liquide au niveau de la membrane soit suffisant pour ne pas entrainer son colmatage, tout en ne provoquant pas une dénaturation rapide des enzymes. phénomène qui augmente avec la vitesse de recirculation du milieu réactionnel. Le réacteur peut être aussi muni d'un capteur de niveau du liquide, sur lequel est asservi la pompe du circuit d'introduction des réactifs qui permet de ne pas dépasser un volume donné de milieu de bioconversion dans le réacteur. On préfère maintenir le volume sensiblement constant au cours de l'opération grace à un système de régularisation de niveau. Une installation pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention est représentée à titre d'exemple sur la figure unique qui représente schéma tiqùement l'installation utilisée dans le cas où le système réducteur du NAD + est composé de formiate déshydrogénase et de formiate. Cette installation est constituée d'un réacteur à double enveloppe 10 dans lequel arrive une tubulure d'introduction 110, alimentée par une pompe à deux voies 1t, chacune des voies étant reliées aux tubes 120 et 130 qui plongent respectivement dans les liquides des réservoirs 12 et 13; le réservoir 13 destiné à contenir la déhydrocarnitine est à double enveloppe. Les doubles enveloppes des réservoirs 10 et 13 sont reliées à des circuits- de fluides thermostatés. La pompe 11 est asservie à un capteur de niveau 14 qui plonge dans le réacteur 10. Le circuit d'ultrafiltration qui est en dérivation au réacteur 10 comprend une tubulure d'entrée 210 plongeant dans le réacteur 10, une pompe 20 assurant la circulation du milieu réactionnel, un filtre 21, puis l'unité d'ultrafiltration 22 qui comporte une membrane 23 et est équipée d'un conduit de sortie de l'ultrafiltrat 220 qui débouche dans un moyen de récupération de l'ultrafiltrat 24, et d'une tubulure de sortie du liquide filtré 230 qui débouche dans le réacteur 10. Le réacteur 10 contient en outre une sonde de mesure du pH 15 connectée à un dispositif 16 qui déclenche l'arrivée dans le réacteur par une tubulure 170 d'une solution de base contenue dans le réservoir 17, pour maintenir le pH à une valeur constante prédéterminée. Un mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention est décrit en détail dans ce qui suit en utilisant l'installation représentée sur le dessin annexé. Le réacteur 10 est tout d'abord chargé avec une solution aqueuse contenant les enzymes. le cofacteur NAD libre ou greffé sur un polymère hydrosoluble de haut poids moléculaire qui ne peut pas traverser la membrane d'ultrafiltration; on introduit aussi de préférence des le départ de l'agent réducteur du NAD pour opérer en concentration saturante du substrat pour l'enzyme de régénération. On peut aussi introduire au départ dans le milieu de la L-carnitine à la concentration que l'on veut maintenir lors du fonctionnement en continu du réacteur, ce qui évite la mise en oeuvre d'un réacteur "batch", classique. Le pH est ajusté à la valeur convenable et la température du milieu est établie à une valeur convenant à la bioconversion. Dans le cas du procédé mettant en oeuvre le système enzymatique CDH, NAD et FDH. on introduit dans le réacteur les enzymes CDH et FDH. du NAD et du formiate d'ammonium, on ajuste le pH à 7,5 par introduction d'une solution aqueuse de NH40H; et on porte le milieu à 30'C; il est inutile d'introduire un agent antibactérien dans le milieu si l'on introduit, au départ, .un sel dans le milieu réactionnel pour augmenter la force ionique du milieu jusqu'à une valeur supérieure à 0,5, ce qui permet la mise en oeuvre d'une quantité réduite d'enzymes comme décrit dans EP-A-240 423. Le pH est maintenu au cours de la bioconversion par introduction, à l'aide de la tubulure 170, d'une solution aqueuse de NU4 OH provenant du réservoir 17. D'autre part, le réservoir 13 est rempli d'une solution aqueuse de chlorhydrate de 3-déhydrocarnitine, dans laquelle est éventuellement introduit du NAD+, si celui du réacteur n'est pas greffé sur un polymère. Le réservoir 12 est rempli d'une solution aqueuse d'une base pour neutraliser le sel de déhydrocarnitine et éventuellement de l'agent réducteur du NAD Dans le cas du système réducteur FDH/for miate, on met de préféence une partie, ou la totalité, de l'acide formique nécessaire à la régénération du NAD+ dans le réservoir t3 et l'ammoniaque nécessaire à la neutralisation du sel de déhydrocarnitine et de l'acide formique dans le réservoir 12, qui peut contenir aussi du formiate d'ammonium si l'acide formique est en défaut dans le réservoir 13. Le réservoir 17 est rempli d'une solution aqueuse de NH OH, par exemple de concentration aN. La pompe il d'alimentation du réacteur 10 et celle de circulation du circuit d'ultrafiltration 20 sont mises en route, lorsque les différents réservoirs ont été chargés. Le débit des pompes est réglé comme il a été dit précédemment, de façon que la membrane d'ultrafiltration ne se colmate pas, que les enzymes ne soient pas dénaturées rapidement et que la réduction de la déhydrocarnitine soit pratiquement complate. Ce débit dépend des concentrations des réactifs en solution et de la nature de ces réactifs; en géné- ral, les liquides sont introduits, goutte à goutte, dans le réacteur 10 par les conduits 110 et 230. Il est en général nécessaire d'augmenter progressivement la pression sur la membrane 23, qui a tendance à se colmater malgré la présence-du filtre 21. Lorsque la pression transmembranaire atteint des valeurs incompatibles avec les propriétés mécaniques de la membrane choisie, on peut connecter le circuit d'ultrafiltration sur une autre membrane; on peut faire de même pour changer de filtre, mais celui-ci peut aussi entre remplacé lors d'une courte interruption de la circulation du liquide dans le circuit d'ultra filtration. L'ultrafiltrat isolé dans le réservoir 24 est prélevé. traité pour en séparer la L-carnitine. Pour cela, on l'acidifie jusqu'à pH 3 par addition d'acide minéral concentré, de préférence d'acide sulfurique. La solution acide est alors passée sur une colonne contenant une résine cationique forte, sous forme NH4+, telle que celle commercialisée sous le nom de Amberlite R ER 151; la L-carnitine et les autres anions qui se sont fixés, sont élués de la colonne, de préférence après son rinçage à l'eau déminéralisée, par une solution aqueuse de NH40H 2N et l'éluat, de pu=11 environ, est passé, pour éliminer les anions présents, sur une colonne de résine anionique forte, en partie sous forme OH , telle que celle commercialisée sous le nom de Dowex 1X2 et l'éluat incolore est isolé. Cet éluat est concentré sous vide et le résidu obtenu isolé. La L-carnitine qui constitue la majeure partie du résidu, peut etre purifiée comme suit : on dissous le résidu dans le minimum d'alcool isobutylique vers 65-C puis on refroidit la solution alcoolique jusqu'à température ambiante et on ajoute environ un volume d'acétone pour précipiter la L-carnitine pure, celle-ci est alors isolée par filtration et séchée. Le rendement de cette purification est d'au moins 85X : ce rendement est supérieur à celui obtenu lorsqu'il faut séparer la L-carnitine formée du système enzymatique utilisé pour la bioconversion en, discontinu. Dans ce qui suit on décrit des exemples de mise en oeuvre de-l'invention. EXEMPLE On introduit dans un réacteur de 1 litre, 500 ml d'une solution aqueuse contenant 0,16 mole de L-carnitine amphotère, 0.16'mole de NH4Cl, 0.32 mole de HCO2NH4. 0,4 mmole de NAD +, 625 unités de CDH,et 400 unités de FDH. La CDH a été extraite -de Pseudomona-s Putida comme décrit dans FR-A-2 398 046 et la concentration de l'extrait mesurée en oxydant la carnitine. La FDH a été extraite de Pichia Pastoris. On introduit aussi au départ et ensuite chaque jour 60 mg de chloramphénicol dans le réacteur. Le pH est ajusté à 7,5 par addition d'une solution aqueuse de NH40H 8N; le milieu est maintenu à 30'C pendant toute l'opération. On remplit le réservoir 13, t hermostaté à avec une solution aqueuse de déhydrocarnitine (0,6in), d'acide formique (0,64M) et de NAD+ (0,8 mM) et -le réservoir 12 avec une solution aqueuse de NU 4OH (0,64M). Le débit de la pompe 11 est de 15 ml/heure pour chaque voie. L'unité d'ultrafiltration 22- comporte une membrane 23 de type VMS commercialisée par AMI CON dont 2 le seuil de coupure est de 5000, qui a 43 cm de surface et 90 mm de diamètre. Le débit de la pompe 20 estde 12 ml/minute, ce qui donne une vitesse linéaire de balayage de 22 cm/seconde. La pression transmombranairo est maintenue entre 0,5X105 et 105 Pa, ce qui donne un débit d'ultrafiltrat voisin de 30 ml/heure, et par conséquent l'extraction d'un volume de réacteur toutes les 17 heures. Au bout de 80 heures, la concentration en L-carnitine dans l'ultrafiltrat est de 0,30 M. EXEMPLE2 On a introduit dans un réacteur de 1 litre, 500 ml d'une solution aqueuse contenant 0,3 mole de L-carnitine, 0,25 mole de formiate d'ammonium, 0,25 mmole de NARD , 1100 U de CDH et 560 U de FDH; le pH et la température ont été ajustés comme décrit dans l'exemple 1, et le réacteur a été alimenté par une solution aqueuse de 3-déhydrocarnitine 1,2 M, d'acide formique 1,2 M et de NAD+ 1,0 mM à partir du réservoir 13 à 4ic et par une solution aqueuse de formiate d'ammonium 1,0 M et NH40H 1,3 M à partir du réservoir 12. Les débits et les conditions d'ultrafiltration étaient identiques à celles décrites à l'exemple 1. On a ajouté 640 U de FDH en trois fois, au bout de 22 heures, 47 heures et 141 heures et 560 U de CDH au bout de 47 heures. En 200 heures, on a isolé un volume d'ultrafitrat correspondant à 12 fois le volume du réacteur; la concentration de l'ultrafiltrat en L-carnitine était de 0,6 M, ce qui représente 95Z de rendement. EXEMPLE3 On a introduit dans un réacteur de 1 litre, 500 ml d'une solution aqueuse contenant de la L-carnitine (1,0 M), du formiate d'ammonium (0,5 M), du NAD+ (0,5 mM), de la CDH (2600 U) et de la FDH (1100 U}. Le réservoir 13 contenait une solution de 3-dehydrocarnitine (2,0 M), d'acide formique (2,0 M) et de NAD+ (1,0 mM). Le réservoir 12 contenait une solution de formiate d'ammonium (0,1 M) et d'ammoniaque (3,5 M). Les conditions opératoires étaient identiques à celles de l'exemple 2. Au bout de 44 heures, l'activité de la CDH dans le milieu n'était plus que de 760 U et la concentration de la L-canitine de 0,7 M. La quantité totale de L-carnitineisolée dans l'ultrafiltrat n'était que de 0,88 M ce qui correspond à 67' de rendement. EXEMPLE 4 On a introduit dans un réacteur de 1 litre, 500 ml d'une solution aqueuse contenant de la L-carni tine (0,1 M), du formiate d'ammonium (0,5 M), du NAD (0,5 mM), de la CDH (1720 U) et de la FDH (850 U), Les réservoirs 12 et 13 contenaient les mêmes solutions qu à l'exemple 3 et les conditions opératoires étaient identiques. -On a, par contre, introduit régulièrement dans le réacteur des enzymes - après 18 heures : 300 U de CDH et 300 U de FDH - après 47 heures : 800 U de CDH et 300 U de FDH - après 187 heures: 600 ü de CDH et 300 U de FDH - après 212 heures: 600 U de CDH et 200 U de FDH Dans ces conditions, le réacteur a fonctionné 352 heures avec des rendements instantanés, voisin de 90X. EXEMPLES Dans un réacteur classique contenant 50 ml d'une solution dans un tampon phosphate (50 mM pH 7,5) de formiate d'ammonium (0,5 M). on introduit 40 U de CDM, 25 U de FDH, du NAD (0.4 mM) greffé sur un polyéthylène glycol de masse moléculaire moyenne 20000, Le réacteur est alimenté ä 0,75 ml/h avec une solution de déhydrocarnitine (1,6 M) conservé à i'C et le pH et la température sont contrôlés comme à l'exemple 1. Au bout de 24 heures, le volume est de 69 ml et la concentration en L-carnitine de 340 mM; le rendement est par conséquent de 817.. Cet exemple montre qu'un NAD+ greffé sur un polymère hydrosoluble peut etre utilisé à la place du NAD+ pour la réaction de réduction de la déhydrocarnitine et donc peut être utilisé dans la présente invention. REVENDICATIONS 1. Procédé enzymatique de préparation de la L-carnitine par réduction de la 3-déhydroCarnitine par le NADH en présence de carnitine déshydrogénase. et d'un système réducteur de NARD , caractérisé en ce que le réacteur contenant les enzymes est alimenté en continu en 3-déhydrocarnitine et en agent réducteur du NAD , le NAD étant soit également introduit en continu dans le réacteur soit présent dans le réacteur sous forme greffé à un polymère hydrosoluble. et le milieu réactionnel est soumis à une ultrafiltration dans un circuit monté en dérivation sur le reacteur et la L-carnitine est récupérée dans l'ultrafiltrat séparé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on introduit des enzymes dans le réacteur en cours d'opération lorsque la productivité diminue. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la 3-déhydrocarnitine est introduite sous forme d'un de ses sels stables avec un acide fort qui est neutralisé dans le réacteur. 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes. caractérisé en ce que le système réducteur du NAD est un système enzymatique. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la force ionique du milieu réactionnel est supérieure à 0,5. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que le système réducteur est composé d'un sel d'acide formique et de formiate déshydrogénase. 7. Procédé selon la revendication 6. carac térisé en ce que le sel d'acide formique est le formiate d'ammonium. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que le pH du milieu réactionnel est maintenu autour de 7,5 et sa température autour de 30C. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la L-carnitine est isolée de l'ultrafiltrat par fixation sur une résine cationique forte, suivi d'un passage de l'éluat de cette résine sur une résine anionique et évaporation du solvant du liquide élué. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la L-carnitine est purifiée par précipitation dans un mélange d'alcool isobutylique et d'acétone.