FR 2637912 A1 19900420 FR 8813587 A 19881014 OPTRODES A ENZYMES IMMOBILISES ET A SUBSTANCES LUMINESCENTES, PORTABLES ET AUTOMATISEES, POUR LES DOSAGES DES EFFECTEURS DE LA CHAINE RESPIRATOIRE, DES OXYDASES ET DES DESHYDROGENASES, ET PROCEDES DE DOSAGES CORRESPONDANTS. La présente invention porte sur des microsondes optiques à enzymes immobilisés (optrodes enzymatiques > , en particulier portables et automatisées, pour les dosages des effecteurs de la chaîne respiratoire , des oxydases (plusieurs centaines), et des déshydrogénases à NAD+ ou NADP+ (plusieurs milliers)1 les déshydrogénases étant, pour le dosage, couplées à la chaîne respiratoire. L'invention concerne également les procédés de dosage correspondants. De nombreuses applications de ces optrodes sont envisagées, à divers milieux biologiques, en médecine, pharmacie, médecine vétérinaire, agro-alimentaire, traitement des eaux et chimie fine. Selon la présente description, l'expression "effecteurs" englobe aussi bien le ou les substrats spécifiques de chaque enzyme que le ou les inhibiteurs spécifiques, le ou les activateurs spécifiques, les substances inactivatrices spécifiques intervenant dans les réactions enzymatiques mises en jeu, ainsi que les produits résultant desdites réactions. Dans ce qui suit, pour les besoins de l'exposé, et par commodité pratique, il sera essentiellement question des substrats, mais l'invention n'est aucunement limitée à ce type d'effecteurs. L'utilisation d'électrodes de Clark pour la mesure de l'oxygène, associées aux enzymes précités, immobilisés dans un film de gélatine traité au glutaraldéhyde, est de connue, ayant fait l'objet du brevet français n 2 576 318 déposé le 18 janvier 1985 NADP . Le volume de l'échantillon à doser est compris entre 1 et 5 ml.Il est nécessaire d'utiliser industriellement un appareillage lourd, pesant plusieurs kilogrammes, nécessitant par ailleurs l'environnement d'un laboratoire de recherche ou de contrôle Bien que les enzymes immobilises puissent être réutilisés plus de 1000 fois, il reste que les inconvénients de-tels appareils sont nombreux : poids, coût élevé, et également le fait qu'ils ne soient pas utilisables directement par les utilisateurs que sont, par exemple, les médecins ou les patients. Il en va de même dans les cas où il faut suivre très rapidement et en continus l'évolutioh d'une substance, par exemple, en medecine sportive, pour le suivi de l'évolution du L-lactate chez l'athlète sur le terrain. Les problèmes scientifiques et techniques à résoudre consistaient donc dans la mise au point d'un nouveau procédé de dosage pouvant être facilement mis en oeuvre avec des quantités très faibles de substance & doser, grâce à l'utilisation d'un capteur enzymatique sous forme de sonde qui puisse être de petites dimensions. Egalement, en plus de cette miniaturisation, l'invention offre l'avantage complémentaire de permettre le dosage de nombreux substrats différents avec le même dispositif de base auquel est associé un ensemble d'éléments permettant la mesure spécifique et portant chacun l'un des enzymes et/ou la chaîne respiratoire immobilisés. Pour effectuer un dosage, on choisira dans cet ensemble l'élément qui porte l'enzyme approprié pour ce dosage et qui peut être à usage unique ou réutilisable, chaque optrode comprenant un système enzymatique spécifique de la substance à doser. Ainsi, il est maintenant proposé, conformément à la présente invention, des microsondes optiques enzymatiques portables, à affichage automatique du. résultat du dosage et automatisées, et de plus, comme on vient de l'indiquer, pouvant être associées à un Jeu d'éléments de mesure réutilisable ou jetable après un ou plusieurs usages. La présente invention a donc pour objet une série de microsondes optiques à enzymes pour les dosages des effecteurs, contenus dans des milieux biologiques, de la chaîne respiratoire, des oxydases et des déshydrogénases à NAD+ ou NADP+, ces dernières étant, pour le dosage, couplées & la chaîne respiratoire.L'invention est caractérisée par le fait que le matériel enzymatique est immobilisé sous forme réticulée et est associé d un matériel luminescent (fluorescent ou phosphorescent), ledit matériel enzymatique et ledit matériel luminescent constituant ensemble un matériel ou film composite qui est associé å des moyens pour détecter l'augmentation de l'émission de luminescence provoquée par la consommation d'oxygène lors de la transformation catalytique1 par l'enzyme, de la substance & BR du matériel enzymatique, ladite augmentation d'émission étant un parametre représentatif de la concentration de la substance à doser. Une microsonde optique enzymatique selon l'invention constitue ce qui, dans la technique, est dénommé "optrode enzymatique". Dans le cas present, une telle optrode est un capteur enzymatique à matériel luminescent . Dans la suite de la description, on n'utilisera plus que les expressions fluorescence et matériel fluorescent , mais il est bien entendu que l'invention est applicable dans le cas de phosphorescence ou de matériel phosphorescent. Par ailleurs, on entend par chaîne respiratoire , un système multienzymatique membranaire, fonctionnant globalement comme une oxydase transformant stoechiométriquement et spécifiquement un substrat à l'aide de l'oxygène. La chaîne respiratoire provient de bactéries immobilisées, de microorganismes immobilisés, de mitochondries immobilisées, ou de leurs préparations membranaires immobilisées. Ces bactéries et ces microorganismes ont été, dans certains cas, préalablement cultivés sur un milieu dont la composition a entraîné une modification de la synthèse de la flavoprotéine correspondant au composé à doser, ce qui augmente la spécificité du dosage.La chaîne respiratoire immobilisée peut etre utilisée seule (pour une dizaine de substrats > ou permettre de doser le NADH et/ou le NADPH formé par les déshydrogénases à NAD+ et/ou NADP+ dépendantes (pour un millier de substrats), ce qui globalement revient à utiliser des systemes enzymatiques se comportant comme des oxydases (consommant de l'oxygène). Selon l'invention, on peut utiliser toute oxydase capable de transformer spécifiquement un substrat en présence d'oxygène. Le matériel enzymatique est immobilisé par réticulation covalente par des agents pontants, qui sont choisis notamment parmi le glutaraldéhyde, les carbodiimides, le N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]- propionate de sodium et les azotures. Avantageusement, le matériel enzymatique est immobilisé pour constituer le film enzymatique en présence d'au moins une protéine inerte en excès, comme la sérum albumine, l'hémoglobine et/ou la gélatine. Conformément & un premier mode de réalisation de l'invention, l'échantillon aqueux, d'environ 10 pl, est déposé sur la couche de matériel enzymatique immobilisé, séparée du matériel fluorescent par une couche hydrophobe, perméable à l'oxygène. Selon une première variante, la couche de matériel fluorescent renferme une substance active sensible a l'oxygène adsorbée sur un support, séparée du matériel enzymatique par un film hydrophobe et perméable a l'oxygène. Le support est avantageusement constitue par des grains de silice, du silicate d'alumine ou des résines obtenues par copolymérisation de styrène et de divinylbenzene et connues sous la dénomination d'Amberlite. Quant au film hydrophobe, perméable a l'oxygène, il est par exemple constitué par une polyoléfine, comme le polypropylène, ou par un polymère fluoré, comme le polytétrafluoréthylène , connu aussi sous le nom de Teflon, ou encore par une résine de silicone, par exemple de polydxméthylsiloxane. Selon une deuxième variante, la substance fluorescente active est directement formée en couche mince, par exemple, par sublimation, par évaporation (sous vide ou à partir d'un solvant > . Dans le cas des deux variantes précédentes, le film ou couche hydrophobe peut être soit rapporté, soit formé sur place å partir de solutions, de dispersions ou d'aérosols, ce dernier cas convenant notamment au PTFE. Selon une troisième variante, la substance fluorescente active est piégée dans un film polymérique, par exemple, dans un film de type résine de silicone. Conformément a un second mode de réalisation de l'invention, la substance fluorescente active est conditionnée sous forme de microcapsules, de microémulsions ou de liposomes, et elle se trouve alors au sein du matériel enzymatique. Dans l'un quelconque des modes de réalisation précités, on peut incorporer un film opaque d la lumière. Ce film peut être intercalé par exemple, entre deux des couches de la structure, rapporté au-dessus du matériel composite ou bien faire partie intégrante de l'une des couches . La substance fluorescente active est choisie par exemple dans la famille du pérylene : où R1 à R4 ont diverses significations, le térylène étant le compose pour lequel R1 = R2 = R3 = R4 = H. Avantageusement, la substance active est le pérylène 3,9-dicarboxylate d' isobutyle, (composé pour lequel et R2 = R4 = H), appelé souvent dans la littérature dibutyrate de pérylène et vendu sous le nom de Sol vent green 5 par la Société BASF AG. Toutefois, on peut utiliser d'autres agents fluorescents choisis pour accroître la sensibilité a l'oxygène, ou pour modifier la longueur d'onde d'émission de fluorescence ou celle de son excitation. Le matériel composite enzymatique fluorescent peut être placé sur une plaque-support transparente. Suivant une premiere forme de réalisation, l'optrode à enzymes selon l'invention comporte un support présentant un évidement destiné à recevoir le matériel composite, éventuellement sur sa plaque-support, ledit support comportant des chemins optiques pour l'excitation de la substance fluorescente et l'émission de la fluorescence, le matériel composite constituant un élément de mesure amovible, jetable après usage, ou réutilisable, plusieurs éléments de mesure de ce type pouvant être associés successivement au support. Suivant une deuxième forme de réalisation, l'optrode selon l'invention comporte un support transparent, sur lequel est disposé le matériel composite, et une cuve & circulation rapportée contre ledit support, de telle sorte que l'échantillon * doser pénètre dans ladite cuve, vienne en contact avec la couche enzymatique du film et sorte ensuite de ladite cuve. Les faisceaux d'excitation et d'émission de fluorescence peuvent être transmis par l'intermédiaire d'une fibre optique. Quant aux moyens de détection, ils sont avantageusement constitués par - des moyens d'excitation, destinés à exciter la substance fluorescente et disposés en amont du film composite - un premier filtre optique interposé entre lesdits moyens d'excitation et le film composite, et destiné à améliorer la sélectivité de la longueur d'onde d'excitation - un photodétecteur destiné à capter l'émission de fluorescence, disposé en aval du film composite - un deuxième filtre optique interposé entre le film composite et ledit photodétecteur, et destiné à améliorer la sélectivité de la longueur d'onde de fluorescence - des moyens de détection et d'amplification disposés en sortie dudit photodétecteur - des moyens de traitement numérique du signal analogique fourni par les moyens de détection et d'amplification - des moyens d'affichage ou de commande de périphériques pilotés par les moyens de traitement numérique. Avantageusement, afin d'améliorer la qualite du signal, on peut utiliser une modulation de l'excitation conjointement b une détection synchrone du signal de sortie du photodétecteur. La présente invention porte également sur un procédé de dosage, par voie enzymatique, des effecteurs, contenus dans des milieux biologiques, de la chaîne respiratoire, des oxydases et des déshydrogénases à NAD+ ou NADP+, ces dernières étant, pour le dosage, couplées & la chaîne respiratoire.Ce procédé est caractérisé par le fait qu'on immobilise sous la forme d'un film réticulé le matériel enzymatique, et on l'associe un un matériel luminescent L'optrode selon la présente invention, telle qu'elle vient d'être définie ci-dessus, est applicable en médecine , pharmacie, médecine vétérinaire, industrie agroalimentaire, traitement des eaux, écotoxicologie, chimie fine, technologies spatiales et autres. Pour mieux illustrer l'objet de la présente invention, on en décrira plus en détail ci-après, à titre d'exemples purement illustratifs et non limitatifs, plusieurs modes de réalisation représentés sur le dessin annexé. Sur ce dessin - la Figure 1 est une vue schématique en coupe, à échelle agrandie, d'une optrode à enzymes immobilisés, thermostatée, conforme à un premier mode de réalisation è l'invention - la Figure 2 est une vue, à échelle encore agrandie, du détail D de l'optrode de la Figure 1, qui montre le matériel ou film composite (matériel enzymatique et matériel fluorescent) - la Figure 3 est une vue en perspective éclatée de l'optrode de la Figure 1 - la Figure 4 est une vue schématique en coupe à échelle agrandie d'une optrode à enzymes immobilisés, thermostatée, conforme å un second mode de réalisation de l'invention - la Figure 5 est une vue, & échelle encore agrandie, du détail D de la Figure 1 ou 4 - la Figure 6 est une vue en perspective éclatée de l'optrode de la Figure 4 - la Figure 7 est une vue de détail analogue aux Figures 2 et 5, montrant une variante de matériel composite enzymatique et fluorescent pouvant être utilisée dans l'optrode conforme au mode de réalisation représenté sur les Figures l et 4 - la Figure 8 est un schéma de montage opto-électronique d'une optrode de la présente invention ; et - la Figure 9 est une courbe d'étalonnage obtenue avec l'optrode de la Figure i ou de la Figure 4. Si l'on se réfère maintenant aux Figures 1 å 3, on voit que l'on a désigné par l, dans son ensemble, une optrode a enzyme immobilisé, dont l'équipement optoélectronique complémentaire est représenté sur la Figure 8 sous la forme de son schéma de montage. L'optrode 1 comprend un support 2, réalisé par exemple en laiton et présentant une forme d'ensemble parallélépipédique, avec deux pans coupés égaux formés le long de deux arêtes paralleles inférieures, le support 2 étant considéré dans la position de mesure, telle que représentée sur le dessin. Ainsi, le support 2 est délimité par une paroi supérieure 3, par une paroi inférieure 4, par deux parois latérales opposées 5 (non représentées dans la vue an coupe > , perpendiculaires aux précédentes, et, enfin, par deux parois parallèles opposées 6, qui sont perpendiculaires à la paroi supérieure 3 en lui étant rattachées, et qui sont reliées F la paroi inférieure 4 par deux parois obliques 7. Dans la paroi supérieure 3, est formé un évidement central 8, délimité par un fond 9 et par une paroi latérale cylindrique 10. Par ailleurs. dans le porte-optrode 2, sont pratiqués, dans le plan transversal médian parallèle aux parois latérales 5, deux chemins optiques symétriques Il et 12, debouchant tout deux côte å côte dans le fond 9, en partant chacun d'une paroi oblique 7. Le fond 9 de l'évidement 8, qui est parallèle & la paroi 3, reçoit, successivement, comme on peut le voir sur la Figure 3 - une plaque-support 13, transparente ou translucide, réalisée, par exemple, en poly (Plexiglas), en forme de disque, de diamètre légèrement inférieur au diamètre interne de l'évidement 8 - un film adhésif double face 14 de m me forme que la plaque-support 13, dont la face inférieure 14a vient se fixer sur la face supérieure de la plaque-support 13, et dont 1' autre face 14b reçoit un matériel fluorescent 15 ; ce dernier est constitué par des grains, par exemple de silice d'une granulométrie moyenne de 15 pm, sur lesquels est adsorbée une substance fluorescente active constituée, par exemple, par du pérylène 3.9-dicarboxylate d'isobutyle, lesdits grains étant rassemblés au-dessus de la partie centrale de l'évidement 8 - un film 16, perméable à l'oxygène et hydrophobe, réalisé, par exemple, en polypropylene ou en polytétrafluoréthylène (PTFE), de forme circulaire, de diamètre inférieur à celui de la plaque-support 13 et du film adhésif 14, et qui vient s'appliquer sur les grains de matériel fluorescent 15, adhérant principale ment par sa bordure sur la face supérieure 14b du film 14 et maintenant en place lesdits grains 15 - un film opaque 16a, sensiblement de memes dimensions que le film 16 ; on peut du reste se dispenser du film opaque 16a à la condition de choisir un film 16 lui même opaque ; et - une couche 17 de materiel enzymatique immobilisé sous forme de film réticulé, par exemple, en présence de sérum albumine par le glutaraldéhyde. Le film composite enzymatique fluorescent 18 Un tel élément de mesure est, préalablement à chaque dosage, introduit dans l'évidement 8 du support 2, et il est maintenu dans ledit évidement 8 par un anneau 19, réalisé par exemple en laiton, d'un diamètre extérieur correspondant sensiblement au diamètre de la plaque-support 13. Le film composite 18 présente une épaisseur totale de quelques centaines de pm, chacune des couches 14, 15, 16, 16a et 17 présentant une épaisseur allant de 10 pm å 500 pm. Ce film composite 18 sur son support se présente notamment sous la forme d'une pastille d'environ 10 mm de diamètre, pouvant être à usage unique et remplaçable rapidement ou réutilisable. Le montage opto-électronique de l'optrode 1 est maintenant décrit en liaison avec la Figure 8. Le dispositif 20 d'excitation de la substance fluorescente est avantageusement, dans le cas où la substance fluorescente est constituee par du perylène 3,9-dicarboxylate d'isobutyle adsorbé sur des grains de silice, une diode électroluminescente bleue, sur la sortie de laquelle est disposé un filtre optique 21 destiné å améliorer la sélectivité de la longueur d'onde d'excitation (#1 = 470 nm dans le cas précité). L'excitation du matériel fluorescent 15 pourrait être également effectuée par une diode-laser, si la longueur d'onde d'excitation de la substance fluorescente est supérieure à 650 nm. Le dispositif de détection 22, destiné à capter 1' émission de fluorescence, est disposé en aval du film composite 18 placé sur son support 13. Toujours dans le cas précité, ce dispositif 22 est avantageusement constitué par une photodiode au silicium, un deuxième filtre optique 23 étant interposé entre le film composite 18 et ladite photodiode 22, afin d' améliorer la spécificité de la longueur d'onde de fluorescence . Sur la Figure 1, le ensemble émetteur, constitué par le dispositif d'excitation 20 et le filtre 21 a été représenté, en place dans l'entrée du canal 11, alors que l'ensemble récepteur, constitué par le filtre 23 et la photodiode 22 est représenté en place dans la sortie du canal 12, le trajet du rayonnement ayant également été symbolisé sur cette Figure 1 Crespectivement X1 et X2 > . Le dispositif ainsi décrit permet de suivre l'évolution de l'oxygène transmis à la substance fluorescente du matériel 15 lors de la réaction au niveau de la couche enzymatique 17. Le signal analogique, délivré à la sortie de la photodiode 22, est amplifié en 24, puis traité numériquement en 25, les résultats étant affichés en 26 sous forme de la concentration de la substance dosée, exprimée en g/litre ou en molarité (M > . Un oscillateur 27 est prévu pour coopérer avec le dispositif d'excitation 20 ainsi qu'avec le dispositif de détection 24, l'ensemble constituant un dispositif connu sous le nom de détection synchrone. Les données du traitement numérique 25 peuvent également servir à piloter divers périphériques ou actionneurs tels que, par exemple, imprimante, pompe, échantillonneur 28. Sur cette Figure 1, on a également fait figurer, sur la surface libre de la couche enzymatique 17, une goutte 28 d'un échantillon à doser, l'optrode 1 permettant en effet de doser de tels échantillons de volume très faible, de l'ordre de la goutte, soit environ 10 pl, dont il n'est pas nécessaire de mesurer le volume exact, car on extermine des concentrations. La substance spécifique à doser dépend de la nature de l'enzyme qui est immobilisé dans la-couche 17, et qui est, comme indiqué ci-dessus, la chaine respiratoire, une oxydase ou une déshydrogénase a NAD+ ou NADP+, associée pour le dosage. à la chaîne respiratoire. La substance spécifique à doser est transformée catalytiquement par l'enzyme en consommant de l'oxygène, cette diminution d'oxygène accroissant l'émission de la substance fluorescente. Si l'on se réfère maintenant aux Figures 4 & 6, on voit que l'on a désigné par 101, une optrode à enzyme immobilisé, incorporant à cet effet une cuve circulation 129, adaptée pour doser en flux continu des substances biologiques lors d'une fermentation par exemple. Cette optrode peut être intégrée dans le schéma de montage opto-électronique de la Figure 8. Cette derniere optrode présente une forme parallélépipédique. Dans l'une des parois 130 de plus grande dimension de la cuve 129, est pratiqué un évidement central 131, délimite par un fond 132 et par une paroi latérale cylindrique 133. Dans cette dernière, debouchent deux canaux obliques respectivement 134 et 135, s'ouvrant tous deux dans des parois latérales opposées 136a, 136b de la cuve a circulation 129. Le canal 134 constitue le canal d'entrée de l'échantillon contenant la substance à doser, et le canal .35, le canal de sortie. De plus, tout autour de l'évidement 131, est pratiqué dans la paroi 130, une gorge 137 destinée å recevoir un joint torique 138 dont le rôle est indique plus loin. La paroi 130 comporte également quatre trous d'angle 139 dont le role est également indiqué plus loin. Sur la paroi 130, est rapporté un support 102 an Plexiglas, en forme de plaquette rectangulaire, aux angles de laquelle sont pratiqués des trous traversants 140, en correspondance avec les trous 139, pour le passage de vis 141 servant a l'assemblage support 102 sur la cuve à circulation 123, lesdites vis 141 étant reçues dans les trous 139 en position assemblée de l'optrode 101. Sur la face 102a du support 102, destinée a venir s'appliquer contre la paroi 130 de la cuve à circulation 129, est appliqué un film composite 118, constitué, comme on peut le voir par exemple sur la Figure 5. par un film 113 de matériel fluorescent fermé, dans ce cas, par un dérivé du pérylène emprisonné dans une matrice hydrophobe de silicone, et par un film enzymatique réticulé 117, le film 115 se trouvant contre le support 102, et le film enzymatique 117, tourné du cbté de l'échantillon a doser 128. Entre le film 115 de matériel fluorescent, et le film enzymatique 117, peut être intercalée une couche opaque $116a perméable à l'oxygène. Dans la position assemblée, l'échantillon 128 entre par le canal 134, circule dans l'évidement 131 Où il est an contact avec la couche enzymatique 117, et il sort par le canal 135. L'étanchéité est assurée par le joint torique 13?. Des moyens de mise en circulation des échantillons et des moyens de thermostat ion sont prévus. Sur la Figure 4, on a également schématise les ondes d'excitation (#1) et d'émission de fluorescence (#2). Ces dernières sont transmises avantageusement par l'intermédiaire d'une fibre optique multibrin en Y 142 d'environ 5 mm de diamètre, par exemple. Par ailleurs, il va de soi qu'une fibre optique, telle qu'elle vient d'etre décrite, peut également etre utilisée dans le cas de l'optrode 1 représentée sur la Figure 1, moyennant le remplacement des canaux 11 et 12, par un canal perpendiculaire au fond 9 de l'évidement central 8 et joignant ce fond 9 à la paroi inférieure 4 de l'optrode. Sur la Figure 7, on a représenté une variante 218 des films composites 18, 118, qui est constituée d'une couche enzymatique 217, formée, par exemple, par de la sérum albumine réticulée, dans laquelle sont piégés les enzymes, ladite couche 217 renfermant également des liposomes d'un diamètre de l'ordre de 100 nm emprisonnant une substance fluorescente 215. Dans cet exemple, un film opaque 216a peut être placé au-dessus du film enzymatique 217 et, vu sa position, sera obligatoirement perméable au substrat å doser 228 et perméable à l'oxygène. Par ailleurs, il va de soi que les films du type des films 18 et 218, tels qu'ils viennent d'être décrits, peuvent être utilisés dans une optrode du type de celle représentée sur la Figure 4, auquel cas les films opaques respectivement 16a et 216a ne sont pas nécessaires. Réciproquement, le film 118, tel que décrit en référence avec la Figure 4, pourrait aussi bien être incorporé dans une optrode du type de celle représentée sur la Figure 1, auquel cas on peut lui adjoindre, entre les films 115 et 117, un film opaque 116a, perméable A l'oxygène. On décrira maintenant des exemples de préparation = du film composite enzymatique fluorescent, ainsi que des exemples de dosage à l'aide des optrodes qui viennent d'être décrites. Dans ces exemples, les pourcentages indiqués sont donnés en poids/volume sauf indication contraire. EXEMPLE 1 : Préparation d'un éliment de mesure fluorescent tel que décrit en référence avec les Figures 1 à 3 On mélange, dans un ballon rodé, 1 g de silice à chromatographie de granulométrie 15 m , 1 mg de dibutyrate de térylène, et 10 ml de dichlorométhane anhydre. On évapore le tout & à évaporateur rotatif, Jusqu' obtention d'une poudre sèche de couleur Jaune qui constitue la substance fluorescente active. On pourrait, le cas échéant, remplacer l'évaporation à l'évaporateur rotatif par une filtration du mélange sur papier-filtre, en faisant suivre par un séchage à l'étuve à 50-C. Ceci obligerait cependant à utiliser une plus grande quantité de dibutyrate de pérylene, ce qui présente l'inconvénient d'être moins precis quant à la quantité finale de colorant adsorbé sur la silice. Un film adhésif double face (Scotch 3M > (film 14 > est collé, par sa face 14a, sur la plaque-support 13 en Plexiglas, comme représenté sur la Figure 3. Sur la face adhésive libre 14b du film 14, est déposée, à travers un masque d'un diamètre de 4 mm, une petite quantité de la poufre fluorescente précédemment préparée (matériel fluorescent 15). Cette poudre est légèrement tassée pour assurer le collage et éliminer le surplus. Le masque est bt5, et il est remplace par un autre masque, d'un diamètre de 6 mm, au travers duquel est vaporisé parcimonieusement et en plusieurs fois, un aérosol de PTFE. Apres séchage spontané, le film hydrophobe 16 de PTFE recouvre intimement les grains de silice sur lesquels est adsorbé le dibutyrate de pérylène. C'n peut maintenant déposer, sur le film 16, de 10 à 50 l d'une solution d'enzyme mélangée à une proteine inerte, l'ensemble étant immobilise suivant l'un des modes opératoires indiqués ci-après, et étaler cette solution sur le matériel fluorescent 15 déjà préparé en profitant de la zone externe de l'adhésif, qui est encore libre pour assurer un bon collage de ce matériel enzymatique 17. EXEMPLE 2 : Préparation d'un élément de mesure fluorescent tel que décrit en référence avec les Figures 4 à 6. Cn prépare une solution-mère à environ 10 M de dibutyrate de pérylène dans du dichlorométhane anhydre Une résine de silicone, polymérisable à froid, de type polydiméthylsiloxane (commercialisée sous la dénomination RTV 128 par la Société General Electric Silicone France ) est diluée avec cette solution-mère, de telle manière qu'après évaporation du solvant, la proportion de dibutyrate de pérylène dans la résine de silicone soit inférieure à 0,1%. 10 à 100 l de cette solution de dibutyrate de pérylène/silicone/solvant sont déposés sur une lamelle de microscope en verre (épaisseur : 100 m ; diamètre : 12 mm), préalablement dégraissée, nettoyée et séchée. Après évaporation du solvant, le film de silicone, hydrophobe et perméable à l'oxygène, est laissé 24 heures jusqu'à polymérisation complète, ce qui constitue le matériel fluorescent 115 qui est hydrophobe et perméable à l'oxygène , puis 20 à 50 l de solution d'enzyme et de protéine inerte sont étalés à sa surface et immobilisés comme décrit à l'Exemple I, ce qui constitue le matériel enzynaticue 117. EXEMPLE 3 A - Préparation de films enzymatiques avec la chaîne respiratoire des bactéries al) Mode opératoire de la culture de bactéries entraînant l'induction de la synthèse d'une flavoprotéine Escherichia coli K12, de la souche 3300, a été cultivé à 37'C sur un milieu minimum.minéral aéré (référence n' 63, concentré 2 fois), contenant KH2PO4 ........................... 10,6 g/l ; K2HPO4 ........................... 174 g/l ; (NH4)2SO4................... 4 g/l ; MgSO4.7H2O ....................... 0,4 mg/l ; FeSO4.7H2O ....................... 0,001 mg/l Thiamine ......................... 1 mg/ml, ajusté à pH 7,2 avec de la potasse 1 M. On a introduit, dans le milieu, à chaque fois, 10 g/l de modificateur. Quatre cultures différentes ont été effectuées, comportant chacune un modificateur différent pour induire les flavoprotéines correspondant respectivement aux substrats ^ doser, à savoir lactate (racémique), succinate, malate (racémique) et glycérol, en vue de constituer des optrodes respectivement à L-iactate, succinate, L-malate et glycéro-phosphate. Les bactéries ont été récoltées en phase exponentielle par centrifugation et remises en suspension dans le même milieu minimum, sans source de carbone, à raison de 0,1 à 1 g de bactéries par ml à l'état humide. Après agitation violente, à 37"C. pendant I heure, pour éliminer la plupart des substrats endogènes respiratoires, on a lavé les bactéries trois fois avec un tampon phosphate de K C0,2M, pH : 7,8) et on les a remises en suspension, à raison de 1 g de bactéries.humides par ml dans un tampon phosphate de K CO,O5M, p 7,8 > , contenant du MgS04 Avant utilisation, on effectue une décongélation rapide à 37-C. L'activité respiratoire n'est pas modifiée après une conservation à -80 C pendant plus d'un an. a2 > Mode opératoire de la culture de bactéries entraînant une répression catabolique Escherichia coli est cultivé sur l'un des milieux de culture habituel, minimum ou riche, auquel on a ajouté 10 g/l de glucose. On peut aussi cultiver a est la souche thermophile PS3 dans un milieu riche contenant 10 g/l de glucose. Avec cette souche, les enzymes de la chaine respiratoire sont thermostables, et également plus stables d 35-C, température habituelle du dosage. La récolte, l'isolement et la conservation des bactéries ainsi cultivées se font comme précédemment. On obtient ainsi les optrod es à NADH, NADPH, pyruvate et D-lactate, dont les flavoprotéines sont constitutives. En revanche, les flavoprotéines inductibles mentionnées en Aal) ci-dessus sont réprimées cataboliquement par le glucose. B - Procédé d'inversion de la polarité de la membrane plasmique bactérienne Cette étape est optionnelle ; elle-est conduite lors de la préparation d'une optrode convenant au dosage de NADH, NADPH, de l'acide pyruvique et de ses sels, qui sont des substrats ne passant pas librement la membrane plasmique des bactéries entières en suspension (le site d'action de flavoprotéines spécifiques se trouvant accessibles sur la face interne de ces membranes). La suspension bactérienne préalablement obtenue est traitée par l'une des deux méthodes qui suivent pour inverser la polarité des membranes bactériennes Action des ultrasons : de 2 a 5 ml de suspension bactérienne sont soumis 4 fois durant 10 secondes, à C, à l'action d'un appareil å ultrasons comportant une sonde de 0,6 cm de diamètre - Mét hode de la ore-se de French : la suspension bactérienne est passée dans un fractionnateur de cellules a 15'C et sous une pression d'environ 1600 bars. Dans les deux type de traitement, les bactéries entières et les fragments de membrane externe sont éliminés par une centrifugation à 60 000 g, pendant 20 minutes. Le surnageant est un cassage brut contenant, entre autres, des vésicules de membrane interne inversées, avec les flavoprotéines de la chaîne respiratoire accessibles au NADH, NADPH et au pyruvate (et également au D- et L-lactate, L-malate, 3-glycérophosphate et au succinate?. C - Immobilisation Les bactéries, ou les préparations membranaires sont mélangées avec une solution de sérum albumine à 15 mg/ml de concentration finale, ou bien, en variante, à 15 mg/ml d'hémoglobine ou encore à une solution aqueuse de 50 mg/ml de gélatine On lave immédiatement 3 fois avec une solution aqueuse de lysine (0,1 M, pH = 7,6) dans du tampon phosphate (0,1 M, pH = 7, 6 > . La lysine permet, lors des lavages, l'élimination de l'excès de glutaraldéhyde. Le matériel composite peut être conservé à 4-C, en l'absence d'oxygène, dans ce dernier tampon contenant en outre 0,5 mM d'azoture de sodium. EXEMPLE 4 : Dosages du L-lactate A.- Dosage du L-lactate à l'aide de E. coli E. coli, cultivé comme décrit, en milieu minimum, sur D-L-lactate, présente une activité induite préférentiellement pour la respiration du L-lactate. La respiration du L-lactate est globalement équivalente d une L-lactate oxydase L-Lactate + 1/2 02 chaîne respiratoire Pyruvate + H20 Ces bactéries sont immobilisées par le glutaraldéhyde comme ci-dessus en présence d'un excès de sérum albumine, de -D-L-lactate--et de MgS04. Le KM apparent global, désigné ci-après par KM est de 5 mM en tampon 20 mM de phosphate de K à pH 7,5. Le signal de fluorescence exprimé en % du Vmax apparent varie avec les concentrations connues de L-lactate selon la Figure 9, qui est une courbe d'étalonnAge de l'optrode enzymatique. On observe, sur cette figure, pour des concentrations de L-lactate inférieures à la concentration KM)) divisée par 10 (zone 1 > , une pseudolinéarité de la vitesse initiale de la réaction. Le dosage des concentrations de L-lactate inconnues s'effectue alors avec une erreur inférieure à 2%. Quand la concentration de L-lactate s'accroit Jusqu'à la concentration du substrat égale à KM (zone 2), l'incertitude augmente, et elle augmente encore plus à des concentrations supérieures à (zone 3). On préférera doser le L-lactate avec cette optrode à enzymes (protéines membranaires de la chaîne respiratoire) entre 0,05 mM et 1 mM, domaine de concentrations de la gamme étalon. Sachant que la concentration de L-lactate dans le yoghourt est aux environs de 80 mM, dans le vin de 15 mM, dans le sang d'un sportif après un effort physique moyen d'environ 4 mM, et dans le jus de fruit d'environ 3 mM, il conviendra de diluer respectivement et directement ces milieux biologiques dans le tampon du dosage, c'est-à-dire respectivement 30 fois, 6 fois, 1,6 fois, et 1,2 fois. Pour doser le L-lactate dans le lait, qui contient moins de 1 mM de L-lactate, on immobilise un autre enzyme. B - Dosage du L-lactate à l'aide de la L-lactate oxydase de Pediococcus species. Pour doser le L-lactate dans le lait, qui contient moins de 0,1 mM de L-lactate, l'optrode utilisée à l'Exemple 4A est insuffisamment sensible. Pour effectuer ce dosage, on immobilise un autre enzyme, par exemple, une oxydase comme la L-lactate oxydase de Pediococcus species présentant un KM)) inférieur, un meilleur Vmax et la possibilité d'introduire plus d'enzyme dans le film enzymatique. L'utilisation de cet enzyme permet d'augmenter, pour une plus faible concentration à mesurer, la sensibilité et le signal du dosage. On peut alors doser entre 0,005 mM et 0,1 mM de L-lactate, domaine de concentrations de la gamme étalon. De fait, on peut choisir, parmi plusieurs dizaines de chaînes respiratoires induites pour la respiration du L-lactate provenant de divers colibacilles, diverses bactéries ou diverses levures par exemple, et parmi divers enzymes utilisant le L-lactate, ces enzymes peuvent être purifiés ou non; provenir de divers microorganismes ou de divers tissus animaux ou végétaux et de diverses espèces du monde vivant. Il s' agit essentiellement d'une centaine d'oxydases et d'un millier de déshydrogénases à NAD+ et NADP , ces dernières étant, pour le dosage, couplées à la chaîne respiratoire. C - Dosage du L-lactate à l'aide d'autres enzymes. Le dosage du L-lactate peut ainsi s'effectuer avec des optrodes à enzymes différents. On peut se procurer la plupart de ces enzymes (oxydases et déshydrogénases > auprès de divers fournisseurs d'enzymes. On peut utiliser des microorganismes induits par le D-L-lactate et immobilisés. On peut notamment utiliser la L-lactate oxydase immobilisée à partir de Mvcobacterium smegmatis ou de Bacillus stearo-thermophilus, les déshydrogénases à NAD+ et NADP , telles que les L-lactate déshydrogénases de muscle de lapin, de poitrail de pigeon, de boeuf, de porc, de poulet, de chien et de truite, de coeur de rat, de boeuf, de porc et de poulet, de glande surrénale de boeuf, de foute de poulet, d'érythrocytes humains, de queue de langouste, de semence de taureau et de bulbe de pomme de terre. On choisira l'enzyme qui, à l'état de film immobilisé, présentera å la fois la meilleure stabilité et les meilleures constantes cinétiques : KM , Le pH optimum peut ne pas être un facteur limitant, car on peut diluer l'échantillon biologique dans le tampon du dosage. Le KM)) pour le L-lactate est, en revanche, très important. On choisira le système enzymatique proche du KM , ce ce qui limitera les dilutions et facilitera le dosage. Le seVmax) > élevé et l'augmentation de la concenration d'enzyme permettent d'augmenter la sensibilité du dosage. Les conditions d'immobilisation faisant varier la charge ou le degré d'hydrophobicité du polymère enzymatique permet également de moduler les paramètres cinétiques permettant l'optimisation du dosage ( KM , Vmax , tampon, pH et force ionique > . Dans chaque cas, une courbe d'étalonnage de pseudo ordre 1 sera établie. On cherchera à éviter des dilutions compliquées, tout en obtenant un signal compatible avec les optrodes enzymatiques de l'invention. Pour les milieux biologiques, les dilutions peuvent être automatisées, si nécessaire. L'optrode enzymatique mesurant une concentration d'oxygène, le trouble persistant après dilution d'un milieu biologique, tel que le sang ou le yoghourt, n'est pas un handicap pour le dosage. La rapidité (moins de 30 secondes) permet l'obtention du résultat quasiment instantanément et évite de figer l'échantillon qui sinon évolue pendant les délais des dosages actuels (les dosages traditionnels durent au moins 30 minutes, sans compter le temps nécessaire au transport jusqu'au laboratoire d'analyse > . Dans le cas ou le succinate, par exemple, est présent dans l'échantillon de L-lactate à doser, pour éviter une interférence au niveau de la chaine respiratoire , on introduit préalablement à la mesure, un volume connu d'une solution aqueuse de fumarate de sodium ou de malqnate de sodium, de telle sorte que la concentration finale soit de 100 mM à 300 mM, concentrations inhibant spécifiquement la mesure du succinate. La courbe d'étalonnage n'est pas modifiée. Dans le cas de la médecine sportive, la partie Jetable de l'optrode enzymatique (matériel enzymatique et matériel fluorescent) peut étre remplacée manuellement en moins de 10 secondes. Le montage de la Figure 1 est alors préféré. Le dosage est effectué en moins de 15 secondes et peut être directement effectué sur une microgoutte de sang (environ 10 pl) sans traitement de l'échantillon. Il n'y a aucun risque de contamination bactérienne ou virale du sportif. Cela permet de suivre l'effort du sportif par le taux de L-lactate dans le sang. Avec une prise toutes les 10 minutes pendant 24 heures, un seul appareil permet d'établir les courbes d'accumulation de L-lactate dans le sang d'au moins 10 sportifs. Dans le cas du suivi de fermentation lactique, on Fréfèrera la cuve à circulation (Figure 2) dosant successivement et automatiquement des échantillons toutes les 2 ou 3 minutes. EXEMPLE 5 : Dosages de l'acide succiniaue ou de ses sels à des concentrations comprises entre 0. 1 mM et 2 mM (domaine de la gamme étalon). On réalise ce dosage avec une optrode préparée avec E. coli cultivé en milieu minimum en présence de succinat e. Dans ces conditions, on a préférentiellement une activité globalement équivalente à une succinate oxydase. succinate + 0? chaîne respiratoire fumarate + HzO En cas d'interférence avec les autres métabolites de la chaîne respiratoire, on préfèrera utiliser ces mêmes bactéries chauffées à 57-C pendant 2 heures avant leur immobilisation. Ce chauffage n'a aucune influence sur la respiration du succinate, mais il diminue au moins d'un facteur de 10, la plupart des autres activités respiratoires contaminantes, telle que celle du L-lactate. Les bactéries induites et chauffées sont immobilisées comme décrit ci-dessus (en présence d'un excès de sérum albumine > par le glutaraldéhyde, en présence de succinate et de MgS04. Les applications sont multiples (métabolisme et industrie des peintures et des laques > . EXEMPLE 6 : Dosages du NADH ou du NADPH å des concentrations comprises entre 0,05 et 1 ir (domaine de la gamme étalon). On effectue ce dosage en préparant l'optrode avec E. coli cultivé à 37 C, ou la souche PS3 cultivée à 65'C, sur un milieu riche en présence de glucose. Les bactéries sont cassée avant immobilisation par le glutaraldéhyde en présence d'un excès de sérum alumine, de NAD+ et de MgSO4. Pour le-dosage du NADH, il est préférable d'ajuster le pH de l'échantillon vers 7,6 et vers 5,8 pour le NADPH. La réaction chimique peut s'écrire H+ + NAD (P)H + 1/2 O2 chaine respiratoire NAD(P)+ H2O Le dosage des déshydrogénases à co-facteurs NAD+ et NADP+ s'effectue de la même façon en co-immobilisant la déshydrogénase spécifique et la chaîne respiratoire avec l'excès de sérum albumine en présence de NAD+ et du MgSO4. Le NAD+ protège à la fois la chaîne respiratoire et les déshydrogénases. On peut prendre l'exemple ci-dessous de l'alcool déshydrogénase (ADH). Le dosage de plusieurs milliers d'effecteurs des déshydrogénases est alors possible. EXEMPLE 7 : Dosas de l'éthanol à des concentrations comprises entre 0,01 et 0.2 mM gamme étalon). Des vésicules inversées d'E. colis cultivé sur glucose, présentant une respiration du NADH, sont co-immobilisés avec 2 UI/ml d'alcool déshydrogénase de levure, en présence d'un excès de sérum albumine, de NAD+ 10 TLM et de MgSO4, par le glutaraldéhyde. Les réactions chimiques sont les suivantes Ethanol + NAD+ éthanal + NADH + chaine respiratoire + + + NADH + 1/2 02 > respiratoire + H+ + NADH + NAD Bilan: Ethanol + 1/2 2 / éthanal + H20. 2 Le KM global, dans ces conditions, est de 1=t On peut ainsi doser l'éthanol lors de fermentations alcooliques, dans le sang, dans le vin, dans le vinaigre, dans la bière, dans le jus de fruit, dans l'industrie des solvants et l'industrie des carburants, par exemple. Des dosages plus sensibles utilisent d'autres alcools déshydrogenases à NAD+ ou NADP+ ou des alcools oxydases. D'autres déshydrogénases, spécifiques d'autres substances que l'éthanol, à co-facteurs NAD+ ou NADP+ peuvent être utilisées à la place de l'alcool déshydrogénase. Ces enzymes permettent de doser quelques milliers d'effecteurs tels que par exemple : le glucose, le glycerol, le méthanol, certains stéroïdes, la cortisone, le cholestérol, le L-lactate, le L-malate, le pyruvate et le glutamate. Ces effecteurs peuvent être doses dans divers milieux biologiques provenant de divers champs d'applications, tels la médecine , la médecine vétérinaire, la pharmacie, l'agroalimentaire (fermentations, vin, alcools, vinaigres, Jus de fruits, bière) ; la chimie fine (parfums, cosmétiques > et l'écotoxicologie. Les inhibiteurs et inactivateurs peuvent permettre de suivre leur concentration en écotocoxilogie et en défense civile par exemple. L'automatisation permet d'effectuer des expériences biologiques dans l'espace. EXEMPLE 8 : Dosages du pyruvate A - Dosage du pyruvate à l'aide de E. coli. E. coli,, cultivé comme décrit ci-dessus sur glucose en milieu minimum, présente une activité constitutive pour la respiration du pyruvate, cette activité est globalement équivalente à une pyruvate oxydase. pyruvate + 1/2 02 chaîne respiratoire acide acétique + H20 + CO2 Les vésicules membranaires sont immobilisées par le glutaraldéhyde, commeci-dessus, en présence d'un excès de sérum albumine et de 5mM de TPP, de 5 pM de FAD et de 200 -mM de D,L-lactate ou de pyruvate. Le KM global, dans les conditions du dosage, est de 20 mM en tampon maléate de K pH 6,0 à 35-C. Afin d'éliminer, si nécessaire, la plupart des. autres oxydations de la-chaine respiratoire, qui pourraient interférer avec le dosage , les vésicules bactériennes peuvent être chauffées 2 heures à 57'C. On peut également éliminer la respiration du succinate en l'inhibant par le malonate ou le fumarate. On préférera doser le pyruvate avec cette optrode à enzymes (protéines membranaires de la chaîne respiratoire) entre 0,2 mM et 4 mM, domaine de la gamme étalon. On peut doser le pyruvate dans les fermentations lactiques. Pour doser la contamination bactérienne dans le lait (pyruvate ( 0,3 mM), il faut utiliser une autre source d'enzymes comme, par exemple, dans les conditions suivantes: B - Dosage du pvruvate à l'aide de la pyruvate oxydase de Pediococcus species (POP). 2 UI/ml sont immobilisées par le glutaraldéhyde en présence d'un excès de sérum albumine avec les divers protecteurs, dans les mêmes conditions que ci-dessus (TPP, FAD, pyruvate et MgSO4). La réaction chimique s'écrit pyruvate 4 Pi + 2 POP acétyl-phosphate + CO2 + H2O Le dosage s'effectue en 20 mM de phosphate de K, à pH 7,0, à 35 C, avec les divers effecteurs cités ci-dessus. Le KM)) pour le pyruvate est de 0,5 mM, le pyruvate peut être dosé entre 0,05 mM et 0,1 mM, domaine de la gamme etalon. Ce dosage convient à la mesure de la contamination du lait par les bactéries (le dosage du pyruvate par un dosage biochimique est déjà utilisé par plusieurs pays - le dosage avec l'optrode enzymatique présente de nombreux avantages : durée, coût et facilité > . Le dosage du pyruvate ouvre de nombreuses applications étant donné le rôle de plaque tournante joué par le pyruvate dans le métabolisme (applications en médecine, dans les fermentations et dans l'industrie des arômes par exemple). EXEMPLE 9 : Mesures automatisées. par les optrodes à enzymes. de la variation de concentration d' oxygène. La consommation d'oxygène provoquée par l'oxydation des métabolites catalysée spécifiquement par les matériels enzymatiques est mesurée par l'optrode à fluorescence. L'échantillon à doser, d'environ 10 pl, est déposé automatiquement sur le matériel enzymatique immobilisé qui est isolé par une couche hydrophobe, perméable à l'oxygène, du matériel fluorescent sensible à la consommation d'oxygène. La sonde est, selon le montage de la Figure l, en cas d'optrodes jetables et remplaçables automatiquement, ou de la Figure 4, permettant un flux continu et successif de métabolite et de solution de rinçage L'optrode (matériel enzymatique + matériel fluorescent) est, dans ce deuxième cas, séquentiellement exposée 1) au tampon saturé d'oxygène à 3S C, 2 > à l'air, pour finir de saturer la sonde d'oxygène, 3) à l'échantillon dilué dans le tampon saturé d'oxygène à 35-G. La pente de la vitesse initial de consommation d'oxygène (augmentation de fluorescence) est calculée par les microprocesseurs et comparée automatiquement avec la courbe étalon obtenue préalablement avec diverses concentrations connues de métabolites (aux environ de un dixième de KM du matériel enzymatique immobilisé) Le dosage est effectué en moins de 15 secondes, le processus de rinçage et de saturation par l'oxygène de la sonde prend environ 1 minute. Le dosage peut ainsi être répété automatiquement. Le résultat permet de régler plus de 500 fois divers automatismes (pompes, vannes, additifs et arrêts > . La miniaturisation et l'automatisation permettent, par exemple, d'effectuer des expériences biologiques dans des conditions d'apesanteur comme dans la recherche spatiale. On notera que, dans un appareil conforme à l'invention, on utilise, pour chaque substance à doser, un enzyme spécifique immobilisé et un système informatique à programme interchangeable, ce qui permet d'obtenir des optrodes à enzyme à usages multiples. Il est bien entendu que les modes de réalisation de l'invention ci-dessus décrits ne sont aucunement limitatifs et pourront donner lieu à.toutes modifications désirables sans sortir pour cela du cadre de la présente invention. REVENDICATIONS 1 - Optrode à enzyme pour les dosages des effecteurs, contenus dans des milieux biologiques, de la chaîne respiratoire, des oxydases et des déshydrogénases à NAD+ ou NADP+, ces dernières étant, pour le dosage, couplées à la chaîne respiratoire, caractérisée par le fait que le matériel enzymatique (17 ; 117 ; 217) est immobilisé sous forme réticulée, et est associé à un matériel luminescent (fluorescent ou phosphorescent) (15; 115 ; 215), ledit matériel enzymatique (17 ; 117 ; 217) et ledit matériel luminescent (15 ; 115 ; 215) constituant ensemble un matériel ou un film composite (18 ; 118 ; 218) qui est associé à des moyens pour détecter l'augmentation de l'émiseion de luminescence provoquée par la consommation d'oxygène lors de la transformation catalytique, par l'enzyme, de la substance à doser, l'échantillon a doser (28 ; 128 ; 228) ayant été amené au contact du matériel enzymatique, ladite augmentation d'émission étant un parametre représentatif de la concentration de la substance à doser. 2 - Optrode à enzyme selon la revendication 1, caractérisée par le fait que le matériel enzymatique (17 117 ; 217) est immobilisé par réticulation covalente par des agents pontants. 3 - Optrode à enzyme selon la revendication 2, caractérisée par le fait que les agents pontants sont choisis parmi le glutaraldéhyde, les carbodiimides, le N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]-propionate de sodium (SPDP > et les azotures. 4 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée par le fait que le matériel enzymatique (17 ; 117 ; 217) est immobilisé pour constituer le film enzymatique, en presence d'au moins une protéine inerte en excès, comme la sérum albumine, l'hémoglobine et/ou la gélatine. 5 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait que l'échantillon aqueux à doser (28 ; 128 ; 228) est appliqué sur le matériel enzymatique immobilisé (17 ; 117 ; 217) séparé, par un film hydrophobe perméable à l'oxygène (16 116a ; 216a), du matériel fluorescent (15 ; 115 ; 215). 6 - Optrode à enzyme selon la revendication 5, caractérisée par le fait que la couche de matériel fluorescent (17 > par le film (16) hydrophobe et perméable à l'oxygène. 7 - Optrode à enzyme selon la revendication 6, caractérisée par le fait que le support adsorbant -est constitué par des grains de silice, du silicate d'alumine (kaolin) ou des résine obtenues par copolymérisation de styrène et de divinylbenzène. 8 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée par le fait que le film (16) hydrophobe et perméable à l'oxygène est un film en polyoléfine, polymère fluoré, ou en silicone, ledit film pouvant être soit rapporté, soit formé sur place à partir de solutions, de dispersions ou d'aérosols. 9 - Optrode à enzyme selon la revendication 5, caractérisée par le fait que la substance fluorescente active est directement formée en couche mince, par exemple par sublimation, évaporation sous vide ou à partir d'un solvant, ladite couche pouvant être soit rapportée, soit formée sur place à partir de solutions, de dispersions ou d'aérosols. 10 - Optrode à enzyme selon la revendication 5, caractérisée par le fait que la substance fluorescente active est piégée dans un film polymérique (115), par exemple, dans un film du type résine de silicone. 11 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait que la substance fluorescente active est conditionnée sous forme de microcapsules, de microémulasions ou de liposomes (215), et qu'elle se trouve au sein du matériel enzymatique (217). 12. - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée par le fait qu'elle peut incorporer un film (16a ; liSa ; 216a), opaque à la lumière, adapté pour éviter toute influence parasite de la lumière ambiante, ledit film pouvant être constitué par l'une des couches ou films de la structure, en dehors de la couche de matériel fluorescent. 13 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée par le-fait que la subêtance fluorescente active est choisie parmi les dérivés du pérylène ou d'autres substances fluorescentes sensibles à l'oxygène. 14 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 1S, caractérisée par le fait que le film composite enzymatique et fluorescent est place sur une plaque-support transparente (13 ; 102 ; 213). 15 - Optrode à enzyme selon la revendication 1 à 14, caractérisé par le fait qu'elle comporte un support (2) comportant un évidement (8) destiné à recevoir le matériel composite (1S) éventuellement sur sa plaque-support (13), ledit support (2) comportant des chemins optiques (11 ; 12) pour l'excitation de la substance fluorescente et l'émission de la fluorescence, le matériel composite (1S) constituant un élément de mesure amovible, jetable ou réutilisable après usage, plusieurs éléments de mesure de ce type pouvant être associés successivement au support.(2). 16 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé par le fait qu'elle comporte un support tr-ansparent (102), sur lequel est disposé le film composite (118), et une cuve à circulation (129) rapporte contre ledit support (102), de telle sorte que l'échantillon à doser (128) pénetre dans ladite cuve 17 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisée par le fait que les faisceaux d'excitation et d'émission de fluorescence peuvent être transmis par l'intermédiaire d'une fibre optique (142), cette fibre optique pouvant également être utilisée avec l'optrode (1). 18 - Optrode 9 enzyme selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisée par le fait que les moyens de détection sont constitués par - des moyens d'excitation (20), destinés à -exciter la substance. fluorescente et disposés en amont du film composite - un premier filtre optique (21) interposé entre lesdits moyens d'excitation (20) et le film composite (18 118 t 218), et destiné à améliorer la sélectivité de la longueur d'onde d'excitation - un photodétecteur fluorescence, disposé en aval du film composite (18 ; 118 ; 218 > - un deuxième filtre optique composite (18 ; 118 ; 218) et ledit photo détecteur (22), et destiné à améliorer la sélectivité de la longueur d'onde de fluorescence - des moyens de détection et d'amplification (24) disposés en sortie dudit photodétecteur (22) - des moyens de traitement numérique du signal analogique fourni par les moyens de détection et d'amplification - des moyens d'affichage périphériques traitement numérique. 19 - Optrode à enzyme selon la revendication 18, caractérisée par le fait qu'il est prévu un modulation (27) de l'excitation (20) conjointement à une détection synchrone du signal de sortie du photodétecteur (22). 20 - Procédé de dosage par voie enzymatique des effecteurs, contenus dans des milieux biologiques, de la chaîne respiratoire, des oxydases et des déshydrogénases à NAD+ ou NADP +, ces dernières étant, pour le dosage, couplées à la chaîne respiratoire, caractérisé par le fait qu'on immobilise sous la forme d'un film réticulé le matériel enzymatique et on l'associe à un matériel luminescent ; on applique l'échantillon contenant la substance à doser sur le film enzymatique ; on détecte l'augmentation de l'émission de luminescence qui est provoquée par la consommation d'oxygène lors de la transformation catalytique, par l'enzyme, de la substance à doser, ladite augmentation d'émission étant un paramètre représentatif de la concentration de la substance à doser.