FR 2630547 A1 19891027 FR 8805361 A 19880422 La présente invention concerne un nouveau type de marquage froid de peptides, protéines ou plus généralement de molécules de nature peptidique ou protéique, notamment en vue de leur dosage. La présente inventicn concerne en effet des molécules de marquage et les conjugués obtenus par couplage covalent de ces molécules de marquage avec des peptides ou protéines ou plus généralement des molécules de nature peptidique ou protéique. La présente invention concerne de même l'utilisation à titre de traceurs dans des procédés de dosages,de ces peptides ou protéines et autres composés de nature peptidique ou protéique ou à titre d'agents d'imagerie dans le cas de diagnostics in vivo. Dans tout test d'associaìonbiologique, il est essentiel de déterminer la distribution entre les fractions libres et liées. Dans ce but, on incorpore dans le système une quantité de ligandsmarqués (ou traceurs. Les marquages les plus communs font appel à des isotopes 3 131 125 radioactifs (par exemple 3H, I, I) malgré les inconvénients connus de cette approche (instabilité des espèces, difficultés du marquage, coûts élevés, limitations légales, concentration des fournisseurs) dans la mesure où l'emploi des traceurs non radioactifs actuellement proposés présente encore des avantages par trop théoriques (défauts de précision et de sensibilité). Toutefois, ces inconvénients ont stimulé la recherche de méthodes d'analyses froides parmi lesquelles l'emploi de la fluorescence est le plus largement répandu. La Demanderesse a cependant envisagé une alternative organométallique totalement nouvelle.Elle repose sur un faisceau de constatations récentes . il existe une fenêtre dans le spectre infrarouge de toutes les protéines centrée sur 2000 cm 1. les métaux carbonyles (MXCOy) sont, parmi les espèces chimiques, les seuls à posséder des bandes de-vibra tions pures et intenses dans cette région. . une nouvelle génération d'appareils de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (IR-FT), amène cette technique dans la zone de détection de quelques picogrammes de marqueur MXCOy. Cependant cette voie analytique, de portée générale, ne peut présenter tout son attrait que si les méthodes d'introduction des marqueurs MXCOy sont simplifiées et généralisées. Certaines solutions ont déjà été proposées par la Demanderesse dans les demandes de-brevet français FR 82 16 024, FR 87 00 914 et FR 87 04 698 dans lesquelles ont été décrits des traceurs consistant en des complexes entre différents bioréactifs et un composé organométallique. Le but de la présente invention est de proposer d'autres solutions pour des molécules de nature peptidique ou protéique. Dans le cas des peptides et des protéines, l'emploi de traceurs à marqueurs externes est d'usage commun en immunologie, tandis que les exemples avec les haptènes (stéroides, drogues) se multiplient régulièrement. Les isotopes de l'iode (particulièrement 1251) sont presque universellement employés à cet effet en raison des hautes activités spécifiques ainsi atteintes 2000 - 4000 Ci/mmol pour un stéroïde iodé contre 25-100 Ci/mmol pour son équivalent tritié. Les méthodes d'iodation courantes font appel à la chloramine T, la lactoperoxidase, l'iodogène sans oublier le marquage par conjugaison. Ce dernier procédé x été développé pour circonvenir les dommages de l'iocation parfois observés quand 1251 est introduit par substitution directe dans les systèmes protéiques et peptidiques. Il fait appel à une iodation réalisée, dans une première étape sur une copule organique, en absence de la protéine sous examen. Puis, dans une opération ultérieure, ce réactif marqué forme un adduit covalent avec l'espèce biologique concernée. Cette approche est nommée marquage par conjugaison pour la différencier du procédé par substitution. En dépit de ses qualités, cette méthode d'introduction de marqueurs radioactifs n'est pas exempte de difficultés le marqueur substitué est plus volumineux que l'atome d'iode (lui-même comparable au benzène à cet égard),et peut conduire à des altérations physiologiques du traceur. des problèmes occasionnels de déplacement par du maté riel non marqué (en raison de la présence de populations d'anti-corps de haute affinité pour le pont de liaison) ne sont pas à négliger. l'iodotyrosine ou l'iodohistamine peuvent se lier elles-mêmes à des protéines du sérum et conduire à des arterfacts. Pour pallier à ces inconvénients, sans compter l'emploi de la radioactivité, la présente invention propose donc un nouveau type de marquage de peptides et protéines par un composé organométallique de formule générale ML xy dans laquelle Mx représente un ou plusieurs métaux éventuellement différents, et Ly représente un ou plusieurs ligands complexant le ou les métaux. Selon l'invention, ces composés organométalliques et partant les parties libres ou liées en comprenant, sont avantageusement détectés et dosés par spectroscopie Infrarouge à transformée de Fourier lorsque ce composé possède au moins un ligand carbonyle libre, mais pourront être également détectés par le biais du métal avec des méthodes telles que la spectroscopie d'absorption atomique ou une visualisation par microscopie électronique pour des métaux lourds, tels que l'osmium ou le ruthénium, ceci par exemple dans le cadre de dosages de récepteurs de peptides ou de dosages immunologiques de protéines. Il était intéressant d'associer les potentialités analytiques liées à une chimie organométallique de façon à créer un type inusité de biosondes froides, sous réserve, bien sûr, que la modification structurale soit judicieusement introduite de façon à préserver les facultés de reconnaissance des peptides vis-à-vis de leurs récepteurs, par exemple. Le problème à-résoudre est d'ordre essentiellement chimique et fait appel aux moyens d'introduction des biosondes - froides- organométalliques. Pour ce faire, la présente invention a donc pour objet une molécule de marquage permettant le marquage d'un peptide ou d'une protéine ou plus généralement d'un composé de nature peptidique ou protéique, caractdrisde en ce que ladite molécule de marquage com porte 1) au moins un site organique insaturé, notamment avec. une insaturation carbonée, tel qu'une triple liaison C=C ou un noyau aromatique complexé(e) par un compo sé organométallique de formule M L et 2) au moins une fonction carboxyle et/ou amine, la fonc tion carboxyle étant éventuellement protégée ou activée et la fonction amine étant éventuellement protégée. Ces groupes protecteurs des fonctions amine et carboxyle, ainsi que le groupe d'activation des fonctions carboxyles sont bien connus dans la chimie des peptides. Selon un premier mode de réalisation de la présente invention, la molécule de marquage consiste en une molécule de formule (I3 formule dans laquelle n est un nombre entier compris entre 1 et 6, de pré- férence n = 2 M L représente le composé organométallique tel que défini xy ci-dessus Z représente H ou un groupe de protection ou d'activa tion de la fonction COOH. On peut citer notamment les molécules pour lesquelles R' est choisi en fonction du peptide à marquer, notamment pour des peptides solubles dans l'eau, on aura de préférence R' = -SO3Na. Pour des peptides solubles dans le THF ou le DMF, on aura de préférenceR' = -H ou un alkyl infé rieur en C1 à C7 tel que C3 R est un alkyl inférieur en C1 à C7, de préférence R = -CH3. L'intérêt de cette molécule outre le fait qu'elle soit très stable et facilement synthétisable,est sa grande faculté de réaction avec un peptide en vertu du groupe d'activation du type N-hydroxysuccinimidyle qu'elle comporte. On peut également citer le-cas où que l'on prépare à partir de d'une molécule de formule (I) avec Z = H en présence de de paradiméthylsulfonîophénolméthylsulfonate Cette molécule présente également une grande faculté de couplage peptidique en milieu aqueux et est donc très intéressante pour coupler les peptides solubles dans l'eau. Selon un autre mode de réalisation de'la présente invention, lamolécule de marquage consiste en un acide aminé naturel ou non naturel de formule II formule dans laquelle x représente H ou un groupe de protection de la fonction amine et Y représente H ou un groupe de protection ou d'activa tion de la fonction carboxyle et R1 représente une chaine de dérivation d'un acide aminé naturel ou non naturel comportant une triple liaison CC complexée par un composé organométallique du type ML. xy Ce type de molécule de marquage présente l'avantage supplémentaire de pouvoir être couplé à un peptide ou une protéine par l'intermédiaire, soit de la fonction amine, soit de la fonction carboxyle de l'acide aminé avec, soit la fonction carboxyle, soit la fonction amine respectivement du peptide ou de la protéine. On peut citer à titre d'exemple de molécule de marquage selon ce type de réalisation de l'invention la norleucine acétylénique complexée de formule III formule dans laquelle X et Y ont les significations données précédemment. On peut citer notamment les groupes acétyle eut BOC pour la protection de la fonction amine et les groupes alkylesinférieurs en C1 à C7 pour la protection de la fonction carboxyle. La fonction carboxyle peut être activée notamment par le groupe succinimidyle ou le groupe nitrophénate. Dans les composés organométalliques selon la présente invention, il est possible d'utiliser des métaux des groupes VI, VII, VIII et IX de la classification périodique, notamment le chrome, le molybdène, le tungstène, le manganèse, le cobalt, le nickel, le technétium, le rhénium, le ruthénium, et l'osmium. Les ligands de ces composés organométalliques peuvent être très variés, notamment CO, CS, CSe,,CNRl, phényle, P(R2,R3,R4), cyclopentadiényle (Cp), R1 étant notamment un radical alkyle ou -COR5 et R2, R3, R4 et R5 étant notamment des radicaux phényle ou phénoxy substitué ou non, alkyle ou alcoxy en C1 à C7 substitué ou non ou bien un atome d'halogène, R5 pouvant être -N(CH2CH2Cl)2. Les composés M L peuvent comporter plusieurs xy métaux et jusqu'd 12 ligands. Parmi les composés organométalliques, on peut citer par exemple Co2(CO)6, M3(CO)10 avec X = Ru ou Os ou encore Mo2Cp2(CO)4, W2Cp2(CO)4. La présente invention a aussi pour objet un procédé de préparation d'une molécule de marquage, caractérisé en ce qu'on fait réagir une molécule comportant 1) un site organique insaturé, notamment'avec une insatu ration carbonée, tel qu'une triple liaison ou un noyau aromatique, et 2) au moins une fonction carboxyle et/ou amine éven tuellement protégée ou activée, que l'on complexe notamment dans le TffF ou un mélange méthanol/acide acétique avec un composé organométallique du type MLy On utilise donc le site organique insaturé, tel que la triple liaison, pour former des petits clusters qui présentent comme avantage déterminant de doter la molécule de marquage obténue d'une grande stabilité, ce ce qui la rend aisément manipulable. Avantageusement, la complexation par le composé organométallique M L en présence de THF se fera après protection des fonctions amine et/ou carboxyle, la molécule comportant au moins une triple liaison et au moins unefonction amine et/ou carboxyle. La présente invention a également pour objet des conjugués comportant la molécule de marquage, liée à un peptide ou une protéine par l'intermédiaire d'une liaison peptidique du type lien amide entre une fonction amine ou carboxyle, éventuellement protégée ou activée de la molécule de marquage et, respectivement, une fonction carboxyle ou amine du peptide ou de la protéine. La présente invention a donc également pour objet un procédé de préparation d'un conjugué selon l'invention, caractérisé en ce qu'on couple la molécule de marquage et le peptide ou la protéine par l'intermédiaire d'un lien amide entre la fonction amine ou carboxyle éventuellement protégée ou activée de la molécule de marquage et, respectivement, une fonction carboxyle ou amine du peptide ou de la protéine. Lorsque la molécule de marquage comporte une fonction amine et une fonction carboxyle, le couplage avec un peptide ou une protéine se fera avantageusement avecSla fonction amine de la molécule de marquage protégée et sa fonction carboxyle activée, ce couplage se faisant par exemple dans le THF en présence de DCC (dicyclohexylecarbodiimide). Les conjugués selon l'invention peuvent également être préparés par couplage d'une molécule comportant 1) au moins un site organique insaturé, notamment avec une insaturation carbonée, tel qu'une triple liaison CEC ou un noyau aromatique et 2) au moins une fonction carboxyle et/ou amine couplage avec une protéine ou un peptide, la complexation du composé organométallique de formule MXLy sur la triple liaison CC, se faisant après le couplage. La présente invention a également pour objet l'utilisation des conjugués selon l'invention, à titre de traceurs dans le cadre de dosages pour diagnostics in vitro ou à titre d'agents d'imagerie dans le cadre de diagnostics in vivo. La présente invention sera maintenant explicitée à 11 aide des exemples détaillés qui vont suivre. EXEMPLE I - MARQUEUR FROID DU TYPE 1) Syn~thelse Un tel complexe a été synthétisé avec R' = H et M1 = Co(CO)3, Mo(CO)2Cp, W(CO)2Cp, c'est-d-dire à partir de complexe M2L2(CO)4, selon le schéma Un tel complexe a été synthétisé avec R' = H et SO3Na. Mode opératoire Synthèse de a)tM13 = Co(COX3 , R' = H A une solution de 0,5.10-3 mole de Co2(CO)8 (0,t88 g) dans 10 cm3 de THF distillé est ajoutée goutte à goutte une solutionde 0,5.10-3 mole d'hexyne-4 oate de N-succinimidyle (0,104 g) dans le THF (6 cm3). On laisse agiter 4 heures. Le solvant est évaporé et le résidu est repris dans 2 cm3 de CH2Cl2 puis purifié sur plaque de silice (éluant : CH2Cl2). On isole des cristaux rouges : m = 0,132 g. b) [M1] = Mo(CO)2Cp R' = H A une solution de 0,5;10-3 mole de Cp2Mo2(CO)4 (0,217 g) dans 10 cm3de THF distillé est ajoutée goutte àgoutte une solution de 0,5.10-3 mole d'hexyne-4 oate de N-succinimidyle (0,104 g) dans le THF (6 cm3). Après évaporation du solvant, le résidu est repris par CH2Cl2 (3 cm3) et purifié sur plaque de silice (éluant : CH2Cl2). On obtient des cristaux rouges m = 0,150 g. c) rM13 = W(Co)2Cp R' = H Même mode opératoire avec 0,5.10 3mole de Cp2W2(CO)4 (0,305) 0,5.10-3 mole d'hexyne-4 oate de N-succinimidyle (0,104 g) Après purification, on isole un solide rouge m = 0,14 g. 2) Couplage peptidique Le couplage avec un aminoacide HPheOMe (Phe r phénylalanine) a été réalisé selon le schéma Ce produit a été caractérisé en RMN. RMN 'H (CD2Cl21 Brucker 250, 6 ppm) : 2,0 (CH2 m), 2,66 (CH3-C=C, s), 3,03 (CH2, m), 3,15 (CH2, m), 3,71 (O-CH31 s), 4,83 (CH, m), 5,24 (2 Cp, 2 s), 5,88 (HN, d), 7,11 m), 7,26 m). IR (KBr) # CO = 1973, 1895, 1823 cm 1 masse. (Spectromètre quadrupole Riber-Maf R 10-10 en DCI-NH3) 708 (M + 1). Ce complexe permet donc de coupler et partant de marquer des peptides solubles dans le THF ou le DMF. Lorsque R' = SO3Na1 on peut en outre marquer les peptides solubles dans veau. Mode opératoire Une solution de 0,5.10 3 mole de chlorhydrate de l'ester méthylique de la phénylalanine (HpheOCH3,HCl) (0,107 g) dans 5 cm3 de DMF est neutralisée par la quantité équivalente de triéthylamine (0,5.10 3 mole). Cette solution est ajoutée à une solution de 0,5.10-3 mole dans le THF (10 cm3) du complexe préparé précédemment avec a) CM13 = Co(CO)6 R' = H. Après agitation pendant 4 heures, le solvant est évaporé, le résidu est repris par CH2C12 et purifié sur plaque de silice (éluant CH2Cl2 + Acétate d'éthyle 5 %). On isole des cristaux rouges m = 0,197 g. b) EM13 = CP Mo(CO)2 R = H. Après agitation pendant 6 heures, le solvant est évaporé, le résidu est repris par CH2Cl2 et purifié sur plaque de silice (éluant CH2Cl2 + Acétate d'éthyle 5 %). On isole des cristaux rouges m = 0,15 g. c) CM13 = Cp W(CO)2 R' = H Même mode opératoire que précédemment. Après purification, on isole des cristaux-rouges m-= 0,14 g. n =- 2 R = CH3 M L = x y Co2 L'acide hexyne-4 oique(10 mole ; 1,12 g) et le paradiméthylsulfoniophénolméthylsulfonate (10 2mole 2,66 g) sont dissous dans CH3CN et le D.C.C. (2,66 g 10 2 mole) est ajouté à la-solution. Le mélange est agité pendant 12 heures à une température en dessous de OOC; Le dicyclohexylurée est filtré, le solvant évaporé. On obtient une huile. L'huile est reprise dans 10 cm3 de THF distillé. On ajoute une solution de 10 2 mole de Co2(CO)8 (3,42 g). Le mélange est agité 2 heures, puis le solvant est évaporé. On obtient une huile : M = 2 g. EXEMPLE III - MARQUEUR DU TYPE ACIDE AMINE COMPLEXE 1) Complexation par le cobalt et le molybdène a) Synthèse Ce marqueur a été synthétisé avec M1 = Co(CO)3 , Mo(CO)2Cp c'est-à-dire à partir de composés organométalliques M2L2(CO)4 avec #X = CH3-CO pour M = Mo et L = Cp et Y = C2H5 pour M = Co et L = CO avec des rendements de 66 % et de 75 % et #X = BOC(1) pour M = Co et L = CO Y = CH3 avec rendements de 44 %. La première réaction sur 1 diversement protégé (schéma 1) (par exemple N-acétyl et ester éthylique) conduit sans aucune altération structurale au cluster attendu. (1) (terbutyloxycarbonyl) Schéma 1 a) X = CH3-CO Y = C2H5 M= Mo L = Cp Rdt = 66 % b) X - CH3CO Y = C2H5 M = Co L - CO Rdt = 75 Z c) X -BOC Y = CH3 M = Co L = CO Rdt = 44 % Mode opératoire 1") X = CH3-CO, Y = C2H51 M = Co, L = CO -3 A une solution de Co2(CO)8 (0,155 g ; 0,45.10 mole) dans le THF (10 cm3) est ajoutée goutte à goutte une solution de norleucine acétylénique protégée (X = CH3-CO, Y = C2H5) (0,089 g, 0,45.10 mole) dans le THF (6 cm3). On laisse agiter 2 heures à température ambiante. Après évaporation du solvant, le résidu-est repris par CH2Cl2. On purifie sur plaque de silice (éluant : Acétate d'éthyle). On isole des cristaux rouges m = 0,169 g. 20) X = CH3-CO, Y = C2H5 t M = Mo, L = Cp Même mode opératoire que précédemment. A une solution de Cp2Mo2(CO)4 (0,195 g ; 0,4S.10 3mole) dans le THF (10 cm3) est ajoutée goutte à goutte une solution de norleucine acétylénique protégée (0,089 g ; 0,45.10 3mole) dans le THF (6 cm3). Le mélange est agité 2 heures à température ambiante. Le solvant est évaporé, le résidu est repris par CH2Cl2 et purifié sur plaque de silice (éluant : Acétate d'éthyle). On isole des cristaux rouges : m = 0,191 g. 3 ) X = Boc, Y = CH3, M = Co, L = CO Même mode opératoire qu'en 10). On obtient après purification des cristaux rouges m = 0,1-04 g. Les produits obtenus se purifient très aisément par chromatographie sur couche mince et avec des rende-ments convenables. Toutes les caractéristiques spectrales (R.M.N., I.R. masse) concordent avec la structure attendue. Resultats analytiques des composés obtenus. 2a Anal. Elem. : C 45,66, H 3,96 N 2,22 Mo 30,42 trouvé : C 45,38, H 4,07 N 2,23 Mo 29,56 RMN -rH (CDC13, Varian T60)-TMS stand.(# en ppm) 6 = 1,45 2b Anal. Elem. C 39,75, H 3,10 N 2,89, Co 24,43 trouvé 39,69 H 3,25 b N 2,81 Co 24,66 RMN- 1H (CDC13 Varian T 60, TMS stand . 6 en ppm) 2c R.M.N.IH (CDC13, Brucker 250, TMS stand. 6ppm) 6 :: 1,43(CH3)3-C,s), 2,63(CH3-C5C,8), 3,48(CH,m) masse (spectrometre quatrupôle Riber Mag R 10-10 en DCI - NH3) 545 (M'NH,+), 528(M+1)527(M) b) Couplage-peptidique On a réalisé le couplage avec HPheOCH3. il peut se faire par deux voies différentes qui sont représentées sur les schémas 2 et 3 ci-après et qui-illustrent les deux possibilités . soit couplage après complexation, soit couplage avant complexation de la molécule de mar quage avec le composé organométallique avec les groupes d'activation suivants Nous obtenons par ces deux approches des rendements sensiblement voisins mais qui n'ont pas été optimises. Les clusters sont caractérisés par R.M.N., I.R. et spectrométrie de masse suivants. Mode opératoire a) ComElexation A une solution de Co2(CO)8 (0,218g 0,63.10-3 mole) dans le THF (10 cm3) est ajoutée goutte à goutte une solution de norleucine acétylé nique activée (0,17 g ; 0,63.10 3mole) dans le THF (6 cm3). Le mélange est agité 2 heures. b) Couplage~avec~HpheOCH3~ Le chlorhydrate de l'ester méthylique de la -3 phénylalanine (HpheOCH3, HCl) (0,63.10 mole 0,13 g) mis en solution dans 3 cm3 de DMF est neutra lisé par la quantité équivalente de triéthylamine (88 l). Cette solution est ajoutée à la précédente. On laisse agiter 3 heures. Après filtration et évaporation du solvant, le résidu est repris par 3 cm3 de CH2CH2 et purifié sur plaque de silice (éluant éther éthylique 95. Acétate d'éthyle : 5). On isole des cristaux rouges : m = 0,11 g. Même mode opératoire que précédemment avec Cp2 Mo2 (CO)4 : (0,63.10-3 mole ; 0,273 g) -3 Norleucine : (0,63.10 mole ; 0,17 g) HpheOCH3 HCl : (p,63.10-3 mole ; 0,13 g). Après purification, on isole des cristaux rouges : m = 0,14 g. Même mode opératoire que précédemment avec Co2(CO)8 : (0,63.10-3 mole, m = 0,218 g) Norleucine activé : (0,63.10 3 mole, m = 0,180 g) Après purification, on obtient des cristaux rouges : m = 0,15 g. 4 ) Complexation d'un dipeptide protégé A une solution de (0,59.10 3mole ; 0,205 g) de Co2(CO)8 dans le THF (10 cm3) est ajoutée goutte à goutte une solution de dipeptide (0,59.10 -3mole; 0,236 g) dans le THF (6 cm3). Le mélange est agité 4 heures. La solution est évaporée, le résidu est repris par CH2Cl2 et purifié sur plaque de silice (éluant : CH2Cl2). On isole des cristaux rouges : m = 0,11 g). 3a : Anal. Elem. : C 46,77 H 3,59 N 4,54 trouvé 47,60 3,76 4,72 RMN H (CDCl3, Bruker 250,TMS stand. #ppm) :" 1,94 (CH3-CO,s), 2,59(CH3-CC-,s), 3,25(2CH2,m), 4,54 (CH,m), 4,84(CH,m), 6,35(NH,d), 6,89(NH,d), 7,25(C6H5) masse (spectrometre quadrupôleRiber mag R-10-10 en DCI-NH3) 617(M+1) 634 (M+NH4b 3b RMN H(CDCl3, Bruker 250, TMS stand. 6ppm) : 6 1,97(CH3-CO,s), 2,67(CH3-C-C,s), 3,0(2CH2,m), 3,71 (C02-CH3,s), 3,97(CH,m), 4,80(CH,m) 5,18-5,24(2Cp), masse (spectrometre quadrupôle Riber-Mag R-10-10 en DCI-NH3) 765 (M+1) 4 RMN H(CDCl3, Brucker 250, TMS stand., #ppm) : " 1,40((CH3)3C, s),2,53(CH3-C#C,s), 3,45(2CH2,m), 3,76(-C02-CH3, s), 4,40(CH,m), 4,64(CH,m), 5,01(NH,d), masse (spectrometre quadrupôleRiber mag R-10-10 en DCI - NH3) 691(M-1+NH4+), 675(M+1), 674(M) C) Couplage avec un dipeptide Enfin, le couplage peptidique d'un aminoacide complexé avec un dipeptide conduisant à un tripeptide complexé a été réalisé selon le schéma Mode opératoire a) Complexation de la norleucine acétylénique mono protégé. A une solution de C-t67.10 4 mole de Cp2 Mo2 (CO)4 (0,029 g) ds le THF (10 cm3) est ajoutée goutte à goutte une solution de 0,67.10 mole d'acétyl-norleucine acétylénique (0,011 g) dans le THF (6 cm3). Le mélange est agité 2 heures. b) A cette solution, on ajoute 0,67.10 -4 mole de D.C.C. (0,0139 g). On laisse agiter 1 heure, puis on ajoute une solution du dipeptide Asp(OBz) CONH2 (0,67.10-4 mole , 0,024 g) dans le THF (2 cm ). Le mélange est agité 12 heures à température ambiante. Après évaporation, le résidu est repris par 2 cm3 de CH2Cl2 et purifié sur plaque de silice (éluant acétate d'éthyle). On obtient des cristaux rouges m = 0,016 g). 5 RMN 'H (acétone d6, Brucker 250, 6 ppm) : 6 1,98 (CH3-CO, s), 2,85 (CH3-C#C, s), 3,15 (CH2, m), 4,16 (CH, m), 5,34 {2 Cp, 2L), 7,43 (NH, d), 11 (COOH, s). IR (KBr) 9 C#O = 1972, 1909, 1833. masse (Spectromètre quadrupole Riber-Mag R-10-10 en DCI-NH3) : 604 (M + 1). 6 RMN 'H (acétone d6, Brucker 250, 6 ppm) : # : 2,05 (CH3-CO, s), 2,87 (CH3-CEC, s), 3,0(CH2, m) 4 (CH, m), 4,64 (CH, m), 4,66 (CH, m), 5,098 (CH2 s), 5,35 (2 Cp, 2 s), 6,57 (NH2, s), 6,86 (NH2, s), 7,25 m), 7,55 (NH, d), 7,7 (NH, d), 8,0 (NH, d). IR (KBr) v C=O = 1975, 1903, 1829. masse (Spectromètre quadrupole Riber-Mag R-10-10 en DCI-NH3) : 955 (M + 1). Ces résultats sont directement extrapolables au marquage de peptides d'intérêt biologique ; notamment le tuftsin Tyrs-Lys-Pro-Arg (inhibiteur de macrophage) puis des enképhalines : Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu, enfin de la substance P : Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Sar-Leu Met-NH2. 2) Complexation par le ruthénium et l'osmium On s'est attaché au marquage de la norleucine acétylénique protégée, en greffant un cluster d'osmium et de ruthénium sur lasfonction acétylénique La synthèse peut être schématisée ainsi : Les réactifs Ru3(CO)11(CH3CN) et Os3(CO)11(CH3CN) ont été préparés selon les méthodes décrites dans la littérature (Ru3(CO)11(CH3CN) : G.A. Foulds, B.F.G. Johnson et J. Lewis, J. Organometal. Chem., 1985, 296, 147. Os3(CO)11(CH3CN) : B.F.G. Johnson, J. Lewis et D.A. Pippard, J. Chem. Soc., Dalton, 1981, 407). 2.1) Complexation par Ru3(CO)11(CH3CN) Ru3(CO)11(CH3CN) est préparé à partir de 300 mg de Ru3(CO)12 (4,7.10 mole), dans 220 ml de dichlorométhane, 15 ml d'acétonitrile et 0,9 ml d'une solution de triméthylamine oxyde dans le méthanol à 50 g/l (4,8. 10-4 mole). Le solvant est ensuite éliminé par évaporation sous pression réduite et remplacé par 10 ml de THF. 100 mg (5,46.10-4 mole) de norleucine acétylénique protégé 1 est ajouté à cette solution. Après deux heures d'agitation, le produit est purifié par chromatographie sur plaques (éluant : CH2Cl2/cyclohexane/CH3CN : 35/60/10). Après extraction du produit par THF et évaporation, on recueille 250 mg de complexe 7a (M = Ru) (rendement : 60 %). La recristallisation dans un mélange dichlorométhane/pentane fournit des cristaux oranges, F 1000C. IR (KBr) vCO en cm-1= 2097 m, 2048 F, 2025 F, 1998 F, 1879 f. RMN 1H (CDCl3, 250 MHz, TMS stand., 5 ppm): 2,04 (CH3CO, s ), 2,31 ( CH3C=C, s ), 2,50-3,00 ( CH2, massif large ), 3,78 ( CH3COO, s ), 4,88 ( CH, m ), 6,02 (NH, massif ). Masse (impact électronique): 766 ( M+ ), 738 ( M±CO), 710 ( M±2CO), 682 ( M±3CO ), 654 ( M±4CO ), 626 ( M±5CO ), 598 (M±6CO). 2.2) Complexation par Os3(CO)11(CH3CN) : A 200 mg de Os3(CO)12(2,2.10 4 mole) dissous dans 100 ml de dichlorométhane et 10 ml d'acétonitrile sont additionnés 0,8 ml d'une solution de triméthylamine oxyde dans le méthanol à 40 g/l (4,3.10-4 mole). L'avancement de la réaction est suivi par CCM (éluant : THF/pentane : 1/3). Lorsque tout le produit de départ a disparu, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le solide jaune de Os3(CO)11 La recristallisation dans un mélange dichlorométhane/ pentane fournit des cristaux oranges, F 1140C. Le spectre RMN 1H révèle la présence de deux complexes de la norleucine RMN 1H (CDCl3, 250 MHz, TMS stand., 6 ppm): -Complexe majoritaire ( 70% ): 2,02 (CH3CO, s ), 2,46 ( CH3CçC, s ), 2,59 et2,82-( CH2, m, m ), 3,77 ( CH3COO, s ), 4,75 ( CH, m ), 6,05 (NH, massif ). -Complexe minoritaire (30% ) 2,01 (CH3CO, s ), 2,54 ( CH3C=C, s ), 2,59 et 2,82 ( CH2, m, m ), 3,77 ( CH3COO, s ), 4,75 ( CH, m ), 5,90 (NH, massif ). Ces deux complexes sont actuellement non séparables par chromatographie classique sur plaques. IR ( KBr ) vCO en cm1- 2099 f, 2060 F, 2054 F, 2021 m, 2005 m, 1845 tf. Masse ( impact électronique ) 1033 ( M+), 1005 ( M± CO ), 977 ( M±2CO) ,949 ( M±3CO ), 921 ( M±4CO ), 893 ( M±5CO ), 865 (M±6CO), 837 ( M±7CO ), 809 (M±8CO). REVENDICATIONS 1. Molécule de marquage permettant le marquage d'un peptide ou d'une protéine, ou plus généralement d'un composé de nature peptidique ou protéique, caractérisée en ce que ladite molécule de marquage comporte 1) au moins un site organique insaturé, notamment avec une insaturation carbonée, tel qu'une triple liaison C=C ou un noyau aromatique complexé(e) par un composé organométallique de formule M L dans laquelle Mx représente un ou plusieurs métaux éventuellement diffé rents et L représente un ou plusieurs ligands éventuellement y différents, complexant le ou les métaux, et, 2) au moins une fonction carboxyle et/ou amine, la fonc tion carboxyle étant éventuellement protégée ou activée et la fonction amine étant éventuellement protégée. 2. Molécule de marquage selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle répond à la formule générale (I) formule dans laquelle n est un nombre entier compris entre 1 et 6, de pré férence n = 2 M L représente le composé organométallique tel que défini xy précédemment Z représente H ou un groupe de protection ou d'activa tion de la fonction carboxyle. 3. Molécule de marquage selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle répond à la formule formule dans laquelle n est un nombre entier compris entre 1 et 6, de préférence n = 2 M L représente le composé organométallique tel que xy défini précédemment R' est choisi notamment parmi-H,-SO3Na, les alkyls inférieurs en C1 à C7, et R est choisi parmi les alkyls inférieurs en C1 à C7. 4. -Molécule de marquage selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle répond à la Eormule générale 5. Molécule selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle répond à la formule générale II formule dans laquelle X représente H ou un groupe de protection de la fonction amine Y représente H ou un groupe de protection ou d'activa tion de la fonction carboxyle R1 représente une chaîne de dérivation d'un acide aminé naturel ou non naturel et comporte une triple liaison C=C complexée par un organométallique du type M L 6. Molécule de marquage selon la revendi cation 5 , caractérisée en ce qu'elle répond à la formule générale III dans laquelle X, Y et M L ont les significations données précédemment. xy 7 . Molécule de marquage selon l'une des revendications 5 ou 6 , caractérisée en ce que le groupe de protection de la fonction amine est choisi parmi le groupe acétyl et le groupe BOC, le groupe de protection de la fonction carboxyle est un alkyl inférieur en C1 à C7, le groupe d'activation de la fonction carboxyle étant choisi parmi le groupe succinimidyle et le groupe nitrophénate. 8. Molécule de marquage selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que les métaux du composé organométalliques sont choisis parmi les métaux des groupes VI, VII, VIII et IX de la classification périodique, notamment le chrome, le molybdène, le tungstène, le manganèse, le cobalt, le nickel, le technétium, le rhénium, le ruthénium et l'osmium. 9. Molécule de marquage selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que les ligands L du composé organométallique sont choisis parmi CO, CS, CSe, CNR1, P(R2R3R4) cyclopentadiényle (Cp), thinylé R1 étant notamment un radical alkyle ou -COR5. et R2, R31 R4 et R5 étant notamment des radicaux phényle ou phénoxy substitué ou non, alkyle ou alcoxy en C1 à C7 substitué ou non ou bien un atome d'halogène, R5 pouvant être -N(CH2CH2Cl)2. 10. Procédé de préparation d'une molécule de marquage selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on fait réagir une molécule comportant 1) aumoins un site organique insaturé, notamment avec une insaturation carbonée, tel qu'une triple liaison ou un noyau aromatique, et 2) au moins une fonction carboxyle et/ou amine, éventuelle ment protégée ou activée qui se complexe sur le site insaturé, notamment dans le THF ou un mélange méthanol/acide acétique, avec un composé organométallique du type MxLy 11.Conjugué comportant la molécule de marquage selon l'une des revendications précédentes, liée à un peptide ou une protéine par l'intermédiaire d'uneliaison peptidique du type lien amide entre la fonction amine ou carboxyle éventuellement protégée ou activée de la molécule de marquage et respectivement une fonction carboxyle ou amine du peptide ou de la protéine. 12. Procédé de préparation d'un conjugué selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on couple ta fonction amine ou carboxyle éventuellement protégée ou activée de la molécule de marquage avec une fonction carboxyle ou amine respectivement du peptide ou de la protéine. 13. Procédé de préparation d'un conjugué selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on couple une molécule comportant au mcins un site organique insaturé, tel qu'unie triple liaison C=C et au moins une fonction carboxyle et/ou amine par l'intermédiaire de ladite fonction carboxyle et/ou amine à un peptide ou une protéine par l'intermédiaire respectivement d'une de ses fonctions amine ou carboxyle, le site organique insaturé étant complexé par un composé organométallique de formule M L après ledit couplage. 14. Utilisation des conjugués selon les revendications 11 et 12, à titre de traceur dans le cadre de dosages pour des diagnostics in vitro, et à titre d'agents d'imagerie pour des diagnostics in vitro, et à titre d'agents d'imagerie pour des diagnostics in vivo.