FR 2631040 A1 19891110 FR 8805963 A 19880504 DESCRIPTION La presente invention concerne un procede de production d'anhydride carbonique et d'ethanol par fermentation continue muit ietagee. Bien qu'actuellement on ne puisse mettre en doute la faisabilite technique de la production d'ethanol par fermentation continue, economiquement un certain nombre de contraintes pesent sur le deeloppement de cette technique. Ainsi le substrat : sucre, matières amylacées, doit être converti, de façon aussi complete que possible, en alcool avec un rendement approchant la production maximale theorique de 0,51'Kg d'ethanol par Kg de glucose ; de même, la teneur finale en éthanol de jus de fermentation doit hêtre supérieure à 60 g par litre, afin de minimiser le coût énergétique de la distillation et le coût de traitement des vinasses de distillerie. Dans le domaine fermentaire deux types de microorganismes presentent un intérêt industriel. Les levures, principalement du genre Saccharomyces sont bien connues et utilisées depuis fort longtemps en brasserie, vinification... Et, les bactéries appartenant au genre Zymomonas, suscitent, en raison de leur activité métabolique superieure, un intérêt croissant. A concentrations finales d'éthanol identiques, la productivité et le rendement constituent les deux principaux paramètres qui permettent de juger de l'efficacite d'un procédé de fermentation. La vitesse de production etant etroitement liée à la quantite de microorganismes actifs presente dans les fermenteurs, les procédés de fermentation continus doivent pour accrottre leur productivité augmenter la population microbienne active. Pour lutter contre l-es phenomènes de dilution, qui auraient tendance à diminuer la concentration microbienne, engendrés par des taux de dilution importants, ces procédés font appel à des techniques de rétention de microorganismes performants. La demande de brevet européen W EP. 0213005, propose un procédé de fermentation continue mettant en oeuvre des microorganismes floculants, dont la retention dans le systeme est assurée par decantation-recyclage interne. Ce procéde ' permet d'atteindre des concentrations en microorganismes elevées. Il est de plus insensible aux contaminants et permet d'éviter tout moyen mécanique mobile indispensable dans les systemes a décantation externe. En fermentation continue, en cuve melangee unique, il n'est pas possible d'atteindre des concentrations d'ethanol supérieures à 50-70 grammes/litre ; à partir de cette concentration appelee concentration critique, le taux de mortalité des microorganismes dépasse leur taux de croissance ; et ceci d'autant plus que la concentration en éthanol est e 1ev ce. ta valeur de la concentration critique dépend de la souche de microorganisme, de la matière première utilisée et des conditions de fermentation (température, oxygénation...). Par contre, en fermenteur multi-étagé, les concentrations alcooliques obtenues surpassent largement celles obtenues en fermenteur mono-etage. Car, les premiers fermenteurs servent à générer les microorganismes qui assurent, avant leur destruction, la production complementaire dans les etages suivants, en effet la production d'éthanol se poursuit soit jusqu'à épuisement du sucre, soit jusqutà la mort du dernier microorganisme. L'évolution de la concentration de biomasse et d'éthanol en fonction du temps, pour une culture de Zymomonas mobilis est représentée sur la figure 1 du dessin annexé, les concentrations de biomasse (X) en unite D.O à 510 nm sont portées en ordonnées, ainsi que celles d' éthanol (C2H50H) en grammes/litre, et le temps en heures est porte en abscisses (t/h). La courbe 1 correspond à l'évolution de la concentration de biomasse totale, la courbe 2 à celle de la biomasse viable et la courbe 3 à la concentration d'ethanol. L'amelioration de la productivité engendree par le recyclage direct des microorganismes de l'effluent dans le flux d'alimentation d'un système multietagé ne présente qu'un intérêt marginal si la concentration en éthanol de l'ef fluent dépasse la concentration critique, les microorganismes ayant été, en effet, tués, au moins partiellement, par l'cthanol. Pour bénéficier à la fois des avantages apportes par le confinement des microorganismes dans le systeme et par la présence d'étages multiples de fermentation, le- recyclage de la biomasse doit s'effectuer au niveau de chaque étage en évitant le transfert d'un étage aval vers un etage amont. Parmi les nombreux procédés connus seuls ceux décrits dans le brevet GB 2.125.064 et la demande européenne EP. 0213.005 présentent ces caractéristiques techniques. Le premier de ces deux procèdes propose une strategie de conduite permettant une optimisation rationnelle du fonctionnement d'un système à étages multiples avec confinement des microorganismes ; tout en reconnaissant la nécessité de procéder à un transfert de biomasse de l'amont vers l'açal, comme c'est d'ailleurs le cas dans tous les procédes continus multietages traditionnels.En effet, en l'absence de transfert, tel qu'on pourrait l'obtenir avec un système de rétention absolue des microorganismes (membrane d'ultrafiltration par exemple), le système evoluerait spontanément soit vers un colmatage ou un blocage de tout écoulement par accumulation excessive de biomasse (pour des concentrations comprises entre 120 et 250 grammes/litre de masse sèche de microorganismes ; cette concentration étant fonction de la souche microbienne et du système d'agitation utilisés), soit vers un arrêt de la croissance provoqué par une augmentation excessive de la concentration d'éthanol et/ou de produits inhibiteurs associés du métabolisme. Ceci peut etre exposé mathématiquement- de manière simple en établissant le bilan matière sur la masse de microorganismes, au niveau du premier étage de fermentation par exemple : - en l'absence de transfert, la variation de la concentration de biomasse dans le temps dX/dt, dans le premier étage de fermentation est donnée par la relation dX/dt = ux où li représente le taux de croissance des microorganismes. Si on élimine la solution triviale x = 0 gramme/litre, un état d'équilibre : dX/dt - 0 sera atteint que pour u = 0 h . Dans ces conditions, le renouvellement des microorganismes détruits par les concentrations élevées d'éthanol, ne serait plus assuré dans les étages suivants. La solution retenue dans le brevet britannique consiste. '. asservir le fonctionnement d'un dispositif de transfert des microorganismes (une pompe par exemple), soit à la concentration d'éthanol dans le premier étage du système, soit à l'activité mesurée par un moyen quelconque (la vitesse de production de C02 par exemple). Le contrôle ne porte que sur le premier étage de fermentation. I1- a été trouvé un procédé de production d'anhydride carbonique et d'éthanol, par fermentation continue multiétagée d'un milieu de culture inoculé par des microorganismes du type bactérie ou levure avec rétention et recyclage des microorganismes, dont le fonctionnement est indépendant de celui d'un système de mesure quelconque. Selon un objet de l'invention, on procède à un transfert maitrisé (régulier, continu ou temporisé) de la biomasse d'un étage de fermentation à l'étage suivant. Dans ces conditions, le débit moyen de transfert ramené à l'unité de volume de l'étage de fermentation est égal au taux de croissance des microorganismes quand l'équilibre est atteint. ta loi de transfert est définie à partir de la connaissance préalable de la relation existant entre la concentration d'éthanol et le taux de croissance du microorganisme. La variation de ra concentration de biomasse dans le temps dX/dt = fiK - (q/q).X, où p représente le taux de croissance des microorganismes et q/v représente le débit moyen de transfert ramené à l'unité de volume du fermenteur. L'équilibre est atteint pour que = Ce type de transfert peut être réalisé soit à l'aide d'une pompe, soit par ouver-ture d'une vanne, soit par un tout autre dispositif adéquat. Dans un tel système, il est d'autant plus nécessaire de transférer les microorganismes actifs des étages amonts vers les étages avals que la concentration finale en éthanol est élevée, ceci afin d'assurer le maintien de la viabilité des microorganismes dans les derniers étages du fermenteur. Ainsi, dans le premier étage, l'augmentation du débit de transfert q se traduit par une augmentation du taux de croissance p et une diminution de la concentration alcoolique. Cette observation conduit à maintenir dans le premier étage du fermenteur une concentration alcoolique P1 d'autant plus faible que la concentration finale désirée d'éthanol est élevée. A titre de simplification, on admet qu'il existe une relation linéaire entre le taux de croissance p et la concentration d'éthanol P = w dans laquelle u est le taux de croissance maximal, en l'absence de limitation et PC la concentration critique d'éthanol, à partir de laquelle les microorganismes meurent. Soit P2 la concentration d'éthanol à atteindre à la sortie du deuxieme étage. Pour des raisons économiques, P2 est supérieure à Pc Le taux de croissance dans le deuxième étage est donc négatif. En régime permanent, en négligeant les fuites de biomasse, la mortalité cellulaire est compensée par l'apport de biomasse provenant du premier étage. Un bilan matière sur le deuxième étage de fermentation donne q.X1 + 2X2V2 =0 = > q = - 2 (X2/X1)V2 où X1 et X2 sont les concentrations de biomasse dans les deux étages, fixées principalement par les caractéristiques du système de rétention. En remplacent 2 par son expression, on obtient où 1 = q/v1 On a donc Il apparatt clairement selon cette équation que la concentration P1 sera d'autant plus faible que la concentration P2 sera élevée. Selon un autre objet de l'invention, on calcule le volume de chaque étage de fermentation, et du premier en particulier, de manière telle que, pour le débit nominal de fonctionnement du système de fermentation et pour une concentration finale d'éthanol déterminée, le transfert de biomasse des étages amonts vers les étages avals s'effectue par débordement dès que la concentration de biomasse dépasse les capacités de rétention des différents étages. Une telle conduite implique une croissance continue des microorganismes dans le premier étage ; le volume V1 sera donc calculé à partir de la relation suivante : (Q/V1).P1 = #1.X1max d'où V1 = volume du premier étage Q = débit d'alimentation P1 = concentration d'éthanol à ltequisibre dans le premier étage #1 = activité fermentaire spécifique des microorganismes Xlmax = concentration limite en microorganismes dans le premier étage. Pour une levure floculante X1max est de l'ordre de 90 à 120 g/litre. Pour Zymomonas floculant X1max est de l'ordre de 70 à 80 g/litre. P1 est défini de la même façon que précedemment. Par ailleurs, il est nécessaire que le système de rétention des microorganismes dans chaque étage permette le débordement d'un étage à l'autre. Cette contrainte exclut donc l'utilisation de système de rétention de type membrane. I1 est établi que dans les systèmes où les microorg-anismes sont présents sous la forme d'une phase solide (cellules incluses, films microbiens, flocs), des gradients de concentration des substrats et produits du métabolisme apparaissent, pouvant entratner des modifications de la vitesse de réaction ou même des changements de métabolisme. Dans le cas de la fermentation alcoolique par levures floculantes, il a été montré que les gradients de concentration de glucose et d'éthanol étaient insuffisants pour modifier sensiblement la cinétique réactionnelle. Par contre, pour le CO2, le gradient est suffisant pour entratner la formation de bulles au centre des plus gros flocs. Traditionnellement, les fermenteurs -'utilisés pour- la culture de microorganismes floculants sont du type réacteurs à lit fluidisé : les flocs sont maintenus en suspension dans un réacteur tubulaire d'axe vertical par l'écoulement vers le haut du milieu de fermentation. Pour des microorganismes comme Zymomonas, ce principe de fonctionnement est satisfaisant : lors de la formation de la bulle de C02, il y a rupture locale du floc. tes liens cellule-cellule étant brisés de facon irréversible, le floc éclate. Il y a donc auto régulation de la taille des particules. Avec les levures, la situation est différente : si, lors de la rupture, le floc n'est pas soumis à des contraintes de cisaillement suffisantes pour séparer les deux fragments, les cellules adhèrent à nouveau les unes aux autres après le départ de la bulle. Le floc n'est donc pas obligatoirement divisé. Ceci peut conduire à la formation -de flocs sphérotdes creux (0 - 0,5 - 1 cm, e = 2 mm), à activité fermentaire, qui occupent-un volume important. Il Importe donc de contrôler la taille des flocs, de manière à éviter l'apparition de zones inactives ou la flottation des agrégats, pour les particules les plus grosses, tout en évitant la disruption trop intense des flocs qui conduirait à une perte importante d'efficacité. On ignore en effet généralement que le volume occupé par une masse donnée de levures floculantes est directement lié à l'intensité de l'agitation. La figure 2 du dessin annexé illustre ce phénomène par l'intermédiaire du volume occupé par la biomasse, porté en ordonnées V en litres, en fonction du temps de sédimentation en minutes t(mn) porté en abscisses et de la vitesse d'agitation (rpm), la courbe 1 rorrespond à une vitesse de 200 rpm, la courbe 2 à une vitesse de 300 rpm et la courbe 3 à une vitesse de 500 rpm. Pour une même population de levures floculantes, dans un réacteur à turbine, le volume occupé par les flocs sédimentés après arrêt de l'agitation est fonction d'une part du temps de sédimentation, d'autre part de la vitesse de rotation préalable de la turbine. Le sédiment se compacte lentement, la durée de ce phénomène est nettement supérieure à celle du mélange dans un fermenteur et ne permet pas à un floc brisé par l'agitation de retrouver sa compacité maximale. En conséquence, une agitation trop intense se traduit par une perte de volume utile dans le fermenteur. L'agitation est optimale lorsqu'elle permet la rupture des flocs fragilisés par l'apparition d'une bulle de C02 en leur centre. Ce résultat est atteint - soit par agitation pneumatique en injectant un gaz dans la cuve de fermentation, avec un débit compris entre 0,2 et 2 volumes de gaz par volume de milieu et par minute. Le gaz peut être de l'air, ou du C02 de fermentation recyclé ou un mélange des deux ; - soit par agitation mécanique'a l'aide d'un agitateur du type hélice marine ou du type ancre, avec une vitesse en bout de pale de l'ordre de 0,1 à 0,2 m/s. Les conditions d'agitation sont ajustées en tenant compte, d'une part de la concentration de biomasse a maintenir en suspension, d'autre part de la vitesse de fermentation qui produit elle-même un dégagement gazeux contribuant a l'agitation. Toujours en vue d'accrottre de façon rationnelle le rendement d'un système de fermentation à étages multiples avec rétention ou confinement des microorganismes, il est intéressant de procéder à une alimentation en substrat répartie sur les différents etages de fermentation. Ceci permet en effet d'éviter toute inhibition par excès de substrat au niveau du premier étage. Et par ce moyen de l'alimentation en substrat, on contrôle la ou les concentrations en éthanol à l'équilibre dans les différents étages. I1 est donné ci-après des exemples qui illustrent l'invention à titre non limitatif. EXEMPLE 1 Fermentation alcoolique avec Zymomonas mobilis I 411 (Institut Pasteur) floculé dans un fermenteur continu bi-étagé, représenté à la figure 3 du dessin annexé. Cette installation comprend les fermenteurs la, lb, munis des décanteurs internes 2a, 2b et des surverses 3a, 3b le circuit de surverse 3, l'alimentation 4a, 4b en milieu nutritif constituée par les couronnes d'alimentation 4.1 à la base des fermenteurs, les pompes doseuses du milieu nutritif 4.2, la pompe doseuse en eau 4.3 et le prechauffeur 4.4, et les circulations des gaz 5a, 5b, sur le circuit desquelles on trouve les rotamètres 5.1 (servant à mesurer la production de C02) les condenseurs 5.2, les rotamètres 5.3 pour mesurer la recirculation des gaz (recyclage du C02), en 5.4 un court-circuit, les compresseurs 5.5, les filtres 5,6 et les couronnes d'injection de gaz 5.7 à la base des fermenteurs.L'installation comporte en outre les dispositifs de régulation des mousses 6, les dispositifs 7 de régulation de pH, les dispositifs de régulation de températures 8, une pompe de transfert 9 de la biomassé, un temporiseur 10, et des orifices de prelèvement 11.1 des milieux nutritifs, 11.2 en vue de l'échantillonnage des fermenteurs et 11.3 pour ltéchantilloanage de la surverse du ler étage et 3b pour celui de la surverse du 2ème étage. ta fermentation a été conduite dans un premier étage de fermentation la, d'un volume Vlde 1 litre, et dans un second étage de fermentation lb, d'un volume V2de 2 litres. Le débit d'alimentation du ler étage de fermentation Q1 est de 1,82 litre/heure et celui du second étage de fermentation Q2 est de 0,32 litre/heure. ta concentration en sucre du milieu d'alimentation du ler étage de fermentation S 1 est de o 150 g/l, celle du milieu d'alimentation du second étage de fermentation S 2 est de 540 g/l. o La concentration en éthanol à la sortie du ler étage est de 60 g/litre et celle en sortie du second étage est de 90 g/litre. Le débit de transfert (q) de la biomasse obtenu par pompage temporisé du premier fermenteur vers le second est de 0,02 litre/h ; l'évacuation de la biomasse du deuxième étage se fait par débordement. Dans les deux fermenteurs la tempErature est semblable de 30 C. Dans le premier étage de fermentation le pH est 4,9, et le pH du second est de 4,8. Les milieux de fermentation sont agités par l'intermédiaire des gaz de fermentation, le taux de recirculation étant de lt6 vvm dans le premier étage et de 0,8 vvm dans le second étage. ta productivité globale en éthanol est égale à QI + Q2 .P2 = 66 grammes/litre/heure V1 + V2 Les sucres résiduels sont à une concentration de 20 grammes/litre. Le rendement d'utilisation des sucres est de 90,5 Z et le rendement de conversion des sucres est de 0,48 grammes d'éthanol par gramme de sucre consommé. EXEMPLE 2 Le dispositif expérimental est le même que précédemment, mais le débit d'alimentation du premier étage est porte-s 3,3 I/h -et celui du second étage à 0,3 l/h. tes concentrations des deux alimentations en sucre sont respectivement de 150 et 650 g/l. La concentration de biomasse dans le premier étage atteint 70 g/l. te transfert de biomasse se fait alors par débordement dans le second étage. ta concentration d'éthanol atteint 92 g/l dans le second étage, avec une concentration en sucre résiduel de 10 g/l. La productivité globale est égale-à 110 g/l/h. Le rendement d'utilisation des sucres est de 95Z et le rendement de conversion est de 0,505 gramme d'éthanol par gramme de sucre consommé (soit 99Z du rendement théorique maximal). Exemple 3 : Fermentation alcoolique avec une levure floculée Saccharomyces cerevisiae 38A (INRA MONTPELLIER IPV) dans un fermenteur continu bi-étagé représenté sur la figure 4 du dessin annexé. Le système biétage comprend les fermenteurs 1Q et lb, les décanteurs 2a et 2b, les surverses 3a et 3b et le circuit de surverse 3 entre les fermenteurs la et lb, (débit Q1), les alimentations en substrat 4a et 4b (débits QI et Q2), les circuits de circulation des gaz de recyclage du C 2 5a, 5b. L'installation comporte en outre en 6a et 6b les moyens de mesure instantanée du C02 produit dans le premier et le second fermenteur, et par le circuit 7 où le débit en sortie du système est Q1 + 02. ta fermentation est conduite dans les mêmes conditions générales que précédemment ; le substrat est constitué par les égouts P2 de sucrerie. Le débit d'alimentation Q1 du premier étage de fermentation est de 1,45 litre/heure et celui du second étage Q2 est de 1,30 litre/heure ; le volume du premier étage étant de 2 litres et celui du second étage de 5 litres. tes transferts de biomasse sont assurés par débordement. La concentration de biomasse est de 110 g/l dans le premier étage et de 80 g/l dans le deuxième. La concentration en sucres du milieu d'alimentation du premier étage est de 110 g/litre, et celle du second étage est de 250 g/litre. La quantité de sucre résiduel en sortie du 2ème étage est de 10 g/litre. La concentration en éthanol en sortie du ler étage P1 est de 51 g/litre et celle en'sottie du 2ème étage est de 80 g/litra. La productivité globale en éthanol Q1 + Q2 x P2 = 32 gramme/litre/heure. V1 + V2 Le tendement d'utilisation des sucres est de 94,5 % et le rendement de conversion des sucres est de 0,48 gramme d'éthanol par gramme de sucre consommé (soit 90% du rendement théorique maximal)-. REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'anhydride carbonique et d'éthanol par fermentation continue multiétagée d'un milieu de culture inocule par des microorganismes du type bactérie ou levure avec rétention et recyclage des microorganismes caracterisé en ce qu'on procède à un transfert maîtrisé régulier et continu de la biomasse d'un étage de fermentation à l'étage suivant. 2. Procédé de production d'anhydride carbonique etd'éthanol par fermentation continue multiétagée selon la revendication I, caractérisé en ce qu'on procéde à un transfert maitrisé temporisé de la biomasse d'un étage de fermentation-a l'étage suivant. 3. Procédé de production d'anhydride carbonique et d'éthanol par fermentation continue multiétagée selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le débit moyen de transfert de la biomasse d'un étage de fermentation a l'étage suivant est calculé de manière à compenser la perte de viabilité de la biomasse dans les étages avals. 4. Procédé de production d'anhydride carbonique et d'éthanol par fermentation continue multiétagée d'un milieu de culture inoculé par des microorganismes du type bactérie ou levure avec rétention et recyclage des microorganismes selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce-que le volume de chaque étage de fermentation, et du premier en particulier est tel que pour le débit nominal de fonctionnement du système de fermentation, et pour une concentration finale d'éthanol déterminée, le transfert de biomasse des étages amonts vers les étages avals s'effectue par débordement. 5. Procédé de production d'anhydride carbonique et d'éthanol par fermentation continue mult Lét agée selon une quelconque des revendications de I à 4, caractérisé en ce qu'on procéde å une alimentation en substrat répartie sur les différents étages de fermentation. 6. Procédé de production d'anhydride carbonique et d'éthanol par fermentation continue multiétagée selon la revendication 5, caractérisé en ce que par l'intermédiaire de l'alimentation en substrat on contrôle la concentration en éthanol à ltequilibce dans les différents étages. 7. Procédé de production d'anhydride carbonique et d'éthanol par fermentation continue multiétagée selon une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la taille et la densité des agrégats cellulaires est contrôlée par injection d'air, de C02ou d'un mélange d'air et de C02 avec un débit compris entre 0,2 et 2 v.v.m. (volumes de gaz par volume de culture et par minute) de préférence 0,8 à 1,5 v.v.m. 8. Procedé de production d'anhydride carbonique et d'éthanol par fermentation continue multiétagée selon une quelconque des revendications 1: 6, caracterise en ce que la taille et la densité des agrégats cellulaires est contrôlée par brassage mécanique avec un mobile d'agitation du type -hélice marine ou ancre avec une vitesse en bout de pale n'exédant pas 0,2 m/s. 9. Installation de fermentation bi-étagée en vue de la production d'anhydride carbonique et d'éthanol pour la mise en oeuvre du procédé selon une quelconque des revendications 1 a 6, caractérisée en ce qu'elle comprend les fermenteurs (la) et lb), munis des décanteurs internes (3a) et (3b) et du circuit de surverse 3 entre les deux fermenteurs, des circuits d'alimentation en milieu nutritif (4a)(4b) constitué par les couronnes d'alimentation (4.1) gaz la base des fermenteurs, et muni des pompes doseuses du milieu nutritif (4,2) des pompes doseuses en eau (4.3) et d'un préchauffeur (4e4? les circuits (5a) et (5b) de recyclage de l'anhydride carbonique mùnis des rotåmètres (5.1), des condenseurs (5.2), des filtres (5.6) et des couronnes d'injection de gaz de recyclage (5.7). 10. Installation de fermentation bi-étagée selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'elle comporte en outre une pompe de transfert de la biomasse (9) et un temporiseur (10).