FR 2631973 A1 19891201 FR 8807150 A 19880530 La présente invention est relative a la dé te r- mination de la séquence nucleotidique complète de l'ADN complémentaire de l'ARN génomique de potyvirus, dont celui du virus Y de la pomme de terre, et à l'utilisation de cette séquence pour créer des gènes 'aptes à conférer aux plantes une résistance aux potyvirus, par la création de plantes transgèniques resistantes aux virus phytopathogénes et notamment au potyvirus. Les affections virales posent un probleme aù pathologiste ; en effet, du fait de la dépendance du virus vis à vis des c-ellules-htes, il est difficile de le détruire sans courir le risque d'endommager l'organisme qu'il parasite. Les moyens de lutte sont donc essentiellement préventifs ; on a recours aux vaccins chez les animaux dotés d'un système immunitaire et chez les végétaux, à la sélection sanitaire des semences et â la sélection de variétés résistantes. Les méthodes curatives reposent sur l'utilisation de molécules interférant avec la réplication (analogues de bases tels que l'azidothymidine) lesquelles ne sont pas sans effets secondaires pour l'hôte.Chez les plantes la thermothérapie et la culture de méristèmes permettent de regénerer des plantes saines à partir de plantes infectées (Morel et Martin, 1952). Les potyvirus forment le groupe le plus important de virus végétaux, comprenant plus de 70 membres apparemment distincts. Ces virus sont définis par la structure filamenteuse de leur particule, de 600 à 900 nm de long, contenant environ 5% d'acide nucléique et 95% de protéines. Chaque particule contient une molécule unique d'ARN simplebrin positif de poids moléculaire 3-3.5x106, et les sousunités d'un seul polypeptide de poids moléculaire 32-34xlO3. Ils induisent la formation d'inclusions de formes caractéristiques s'accumulant dans le cytoplasme et parfois dans le noyau. Ils sont transmis naturellement par les aphides sur le mode non-persistant et certains sont également transmissibies par la graine. La transmission des potyvirus par les aphides est dependante de la présence d'une protéine assistante, codée par le génome viral, dans la plante infectée (Pirone and Thornbury, 1983). Ces virus sont souvent interreliés serologiquement. La plupart présentent un spectre d'hôte relativement étroit. Ils infectent un grand nombre d'espèces végétales appartenant aux monocotylédones aussi bien qu'aux dicotylédones. Le virus Y de la pomme de terre (PVY) est le membre-type de ce groupe. Il est pathogene pour diverses solanacées d'intérêt agronomique comme le tabac, le poivron, la tomate et diverses variétés de pomme de terre. Chez cette dernière espèce, les rendements peuvent être diminués de 10 à 80% selon la souche de virus, le cultivar et le moment de l'infection. Le virus Y et le virus de l'enroulement (PLRV, appartenant au groupe des lutéovirus), sont considérés comme les deux plus importants virus affectant la pomme de terre dans le monde. Une infection précoce du tabac par la PVY peut induire une baisse de rendement d'environ 30%, et la maladie des nécroses des nervures, cause par la souche N peut causer une perte complète de la récolte de cette plante. On distingue trois souches principales, carac térisées par les symptômes causés sur des plantes témoins les groupes 0, N, et C. Les virus appartenant au groupe O (souches communes), induisent généralement de sévères symptômes systémiques de gaufrure, et de nécrose à feuilles tombantes chez la pomme de terre, une nécrose systémique chez Physalis floridana et une marbrure systémique chez le tabac. Le groupe N (souches de la nécrose des nervures du tabac), produit une sévère nécrose systémique des nervures chez le tabac, une marbrure systémique chez Physalis floridana et une marbrure peu accentuée chez la majorité des cultivars de pomme de terre. Les virus du groupe C, dont le virus PVC qui n'est pas transmissible par les aphides, produisent des réactions d'hypersensibilité chez de nombreux cultivars de pomme de terre.Ces groupes quoique très appa rentés sérologiquement présentent une grande variabilité intra-groupe. Wr peut dire qu'il n'y a pas de différences sérologiques reproductibles entre Yo, Yn et Yc. Les resul- tats de protection croise inter-groupes qui ont été reportés sont contradictoires (De Bokx et Huttinga, 1981). La séquence de la protéine de capside d'un isolat australien (PVYd), a -révélé 928 d'identité avec la capside du Pepper Mottle Virus (PeMV) et 62% avec celle du Tobacco Etch Virus (TEV), les régions N-terminales de ces protéines présentant les plus grandes divergences (Shukla et al., 1986). L'étude moléculaire des potyvirus est relativement récente. Ces virus sont difficiles à purifier à cause de l'instabilite de leur particule et de leur tendance à former des agregats. Une protéine (VPg) est liée de façon covalente à l'extrémité 5' de L'NON viral (Hari, 1981), qui est polyadénylé à l'extrémité 3' (Hari, 1979). Des études initiales de traduction in vitro" ont suggéré que l'ARN génomique pouvait être traduit en une polyprotéine de haut poids moléculaire, qui serait ensuite maturée en prctéines plus petites (Yeh et Gonsalves, 1985. Hellman et al., 1983). Cette hypothèse a été confirmée par l'analyse de la séquence-nucléotidique des ARNs génomiques du tobacco etch virus (lEVs et du tobacco vein mottling virus (TVMV) (Allison et al., 1986. Domier et al., 1986), ces ARNs coderaient respectivement pour des polyprotéines de 345kD et de 340kD. Ce mécanisme est similaire à celui employé par les picornavirus animaux (Nicklin et al, 1986) et par les Comovirus (Goldbach, 1987). Les clivages protéolytiques chez ces virus se font principalement aux sites Gln-Gly (Picornavirus) et Gln-Gly, Gln-Ser et Gln-Met (Comovirus). En combinant ces données, la taille approximative des cistrons et le site de clivage de la protéine de capside, Domier et al, 1986, ont proposé une -carte de clivage protéolytique de la polyprotéine du TVMV. Le même groupe (Domier et al, 1987) a ultérieurement publié une analyse des homologies de séquences des protéines ainsi définies, avec celles des Picorna-, Como-, et Caulimovirus. Enfin, Carrington et Dougherty (1987) ont démontré que l'une des deux inclusions nucléaires du TEV était une protéase, ce qui a permis à ces Chercheurs de proposer une carte génetique partielle du génome des Potyvirus par comparaison avec des ARNs génomiques des picornavirus Cpoliovirus), comovirus (CPMV), nepovirus (TBRV) et potyvirus (TVMV). En 1985, Sanford et Johnston (J. THEOR. BIOL. 113, 395-40) ont proposé le concept de résistance dérivée du pathogene, qui peut s'énoncer ainsi : des séquences nu cléotidiques issues du pathogène peuvent être utilisées pour modifier l'hôte génétiquement afin qu'il devienne résistant au pathogène. Ceci est possible car le cycle vital d'un parasite, comme celui de tout organisme, résulte d'une somme d'événements moléculaires régulés à divers niveaux. La résistance provient donc d'une interruption du développement du parasite par un de ses genes s'exprimant au mais vais moment, au mauvais endroit, en trop grande quantité ou sous une forme modifiée contre-fonctionnelle. En 1986, Powell-Abel et al. (SCIENCE, 2LZ,738- 743) ont démontré l'existence d'une protection partielle vis-à-vis du virus de la mosaique du tabac (TMV) chez des plantes exprimant un gêne codant pour la protéine de capside de ce virus. Des résultats similaires ont été obtenus avec le virus de la mosaique de la luzerne (AlMV) (Loesch Fries et al., 1987), puis avec le virus X de la pomme de terre (PVX) et le virus de la mosaique du concombre (CMV) (Tumer et al., 1987, EMBO J.,i, 1181-1188 et 1987, NATO ASI Series A Life Science Plenum Press NY & LONDON, pp 351356). Il semblerait que la présence de la protéine de capside dans la cellule prévienne l'entrée du virus ou sa decapsidation : en effet l'inoculation d'ARN viral peut surmonter la protection observée dans les p-lantes transgé niques (Nelson et al., 1987 VIROLOGY, LLA, 126-132). Le fait que cette protection se traduise par un retard dans l'apparition des lésions sur les feuilles inoculées, suggère un effet inhibiteur à des stages plus tardifs de l'infection, comme une réduction du taux de multiplication ou un blocage du transport du virus de cellule à cellule. Les Ruteurs de ces travaux établissent un parallèle avec le phénomène de la protection croisée ou l'infection d'une plante par une souche peu virulente d'un virus la protège contre les effets d'une infection ultérieure par une autre souche du même virus (Fulton, 1980, ANN. REV. PHYTOPATH., 2k, pop. 67). Les raisons de ces observations pourraient être multiples. Il a été montre, pour plusieurs virus, que la protéine de capside, outre son rôle structural, possède une fonction régulatrice.Dans les étapes précoces de l'infection, la protéine de capside du virus de la mosaïque de la luzerne aurait un rôle dans la fixation de la polymé- rase sur l'extrémité 3' de l'ARN, et donc une action activatrice de la synthèse du brin négatif, et dans les étapes tardives elle la réprimerait, rendant la synthèse globale d'ARN non symétrique, en faveur de la production du brin positif (Houwing et Jaspars, 1987). Similairement la protéine capsidiaire du bactériophage QB aurait un double rôle régulateur négatif, en réprimant la replication virale, tout en favorisant la traduction de son propre gêne, et en supprimant la traduction du gène codant pour la polymérase, en se fixant sur son domaine d'initiation (Bernardi, 1972 Robertson, 1975).Exploitant ces dernières données, Grumet, Sanford et Johnston, (1987, MOLECULAR STRATEGIES FOR CROP PROTECTION, ALAN R. LISS INC pp. 3-12) ont démontré la va lidité du concept de résistance dérivée du pathogène, en obtenant de forts niveaux de résistance à ce bactériophage chez des souches d'E.coli exprimant sa protéine de capside, et ce, même à des multiplicités d'infection importantes. L'inhibition du cycle viral semblerait donc se situer au moins lors d'une étape précoce : décapsidation ou entrée du virus dans les cellules ; ceci est suggéré par le fait que 1 > ARN nu conserve son pouvoir infectieux. Dans les plantes transgéniques, le virus ne pourrait donc débuter son cycle de réplication. Ceci diffère des expériences de protection faisant appel aux propriétés de l'ARN satelllite du CMV, dans lesquelles un virus apparenté le "Tomato aspermy virus" (TAV), quoique ne produisant pas de symptômes sur les plantes transformées, est parfaitement capable de s'y répliquer. Cette observation peut faire craindre le risque de créer des plantes qui seraient des réservoirs d'un virus, inoffensif pour elles et indétectable, mais pouvant se propager à d'autres especes. Ce risque paraît exclu dans l'hypothèse où une telle inhibition pourrait être obtenue en utilisant un gène codant pour la capside. Le problème majeur posé par la construction d'un gène codant pour la protéine de capside du PVY était l'absence de codon d'initiation de la traduction permettan-t la synthèse de la protéine par la machinerie cellulaire. Il aurait été possible d'utiliser un codon AUG en phase situé en amont du gène. Le premier se trouvant à 57 nucléotides du premier codon, il y aurait production d'une protéine rallongée de 19 acides aminés par rapport à la protéine de capside maturée du virus et sa fonction pourrait en être altérée. De plus, ce codon ne se trouvait pas dans un contexte optimal de traduction du type A--AUGG (Kozak, 1986). A ce propos, il faut noter que les Articles relatant l'expression d'un tel gène dans les plantes et l'établissement d'un phénotype de résistance font état d'une forte accumulation de la protéine, de 0,1 à 0,8% des protéines solubles.Pour obtenir cette accumulation, au moins deux facteurs relativement prédictibles doivent être optimisés lors de l'assemblage du gène : la force du promoteur utilisé et la nature des séqüences précédant et entourant le codon d'initiation. En conséquence, la présente invention s'est donné pour but ae construire un gène codant pour la pro téine de capside de potyvirus et en particulier de PVY, dans des conditions telles que sa fonction ne puisse pas être altérée, en fusionnant -une séquence ATG synthetique avec l'extrémité 5' de la séquence codant pour la capside de potyvirus. Les potyvirus ont la particularité d'avoir comme produit de traduction, une polyprotéine unique qui ne donne des proteines fonctionnelles qu'après clivage protéolytique en des endroits précis de la polyproteine, par une protéase spécifique précisément codée par le génome viral par suite, la présente invention s'est également donné pour but de pourvoir à un système propre à bloquer l'action de la protéese dans ie but d'empêcher l'apparition des pro tétines virales et, par voie de conséquence, des symptômes de l'infection virale des végétaux concernés. La présente invention a pour objet des plantes transgéniques résistantes a l'infection par des potyvirus, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues à partir de lignées cellulaires végétales, notamment d'espèces végétales susceptibles d'être infectées par des potyvirus, modifiées par introduction d'un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus. Selon un mode de realisation de l'invention, lesdites plantes transgéniques sont caractérisées en ce que le gène introduit est un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus, résultant de la fusion d'une séquence ATG synthétique avec l'extrémité 5' de la séquence d'ADNc codant pour ladite protéine de capside de potyvirus, dont la partie codante est pourvue de signaux de régulation de l'expression génétique dans une cellule végétale. Bien entendu, les semences issues de ces plantes transgéniques et utilisées pour la reproduction de celles-ci entrent dans le cadre de la présente invention. La présente invention a également pour objet un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus, caractérise en ce qu'il résulte de la fusion d'une séquence ATG synthétique avec l'extrémité 5' de la séquence d'ADNc codant pour ladite protéine de capside de potyvirus. Selon un mode de realisation de ce gène, il comprend la sequence en nucléotides (I) suivante (I) GCA AAU GAC ACA NUU GAU 8590 GCA GGA GGA AGC AAC AAG AAA GAU GCA AAA CCA GAG CAG GOC AGC AUC 8638 CAO CCA AAC CCO AAC AAA GGA AAG OAU AAG GAU @@@ AAU GCA CGC ACA 8686 UCU OOO ACA CMU ACU OUG CCG AGA MUC AAG OCU AUC ACG UCC AAA AUO 8734 AGA AUG CCC ACA AGC AAG OGA GCA ACC OUG CUA AAC UUA GAA CAU UUG 8782 CUU GAO UMU GCU CCA CAA CAA AUU GAU AUU UCA AAU ACU CGC GCA ACU 8830 CAA UCA CAG UU@ GAU ACO UGG UAU GAG GCA OUG CGG AUG GCA UAC OAC 8878 AUA GGA GAA ACU GAG AAG CCA ACU CUG AUG AAU GGG CUU @UG @@@ UGG 8926 UGC MUU GAR AAU GGA ACC UCG CCA AAU DUC AAC @@@ GUU UGG GUU AUG 8974 AUG GAU GGG AAU GAA CAA GUU GAG UAC CCO UUO AAA CCA AUC OUU OAG 9022 AAU GCA AAA CCA ACC CUU AGG CAA AUC AUO GCA CAU UUC UCA GAU OUU 9070 GCA GAA DCG UAU AUM GAA AUG CGC AAC AAA AAG GAA CCA UAU AUO CCA 9118 CGA UAU GGU UUA AUU CGA AAU CUG CGG GAU AUG GGU UUA GCG CGU UAU 9166 GCC UUT GAC UUT UAU GAG GUC ACA UCA CGA ACA CCA OUG AGG OCU AGG 9214 GAA GCG CAC AUU CAA AUG AAG GCC GCA GCA UUG AAA UCA GCC CAA CCU 9262 CGA CUU UUC GGG UUG GAC GGU GGC AUC AGU ACA CAA GAG GAG AAC ACA 9310 GAG AGG CAC ACC ACC GAG GAU GUC UCU CCA AGU AUG CAU ACU CUA CUU 9358 GGA GUC AAG AAC AUG UGAUGUAGUGUCUCUCCGGACGAUAUAUAAGLUAUUUACAUAUGC 9417 AGUAAGUAUUUUGGCUUUUCCUGUACUACUUUUAUCAUARUUAAUAAUCGUUUGARUAUUACUG 9481 GCAGAUAGGGGUGGUAUAGCGAUUCCGUCGUUGUUAGUGACCUUAGCUGUCGGUUCUGUAUUAU 9545 UARGUCUUAGAUAAAAAGUGCCGGGUUGUUGUUGUGUGACUGAUCUAUCGAUUAGGUGAUGCUG 9609 UGAUUCUGUCAUAGCAGUGACUAUGUCUGGAUUUAGUUACUUGGGUGAUGCUGUCAUUCUGUCA 9673 UAGCAGUGACUGUAAACUUCAAUCAOGAGACA(N) 9704 La presente invention a en outre pour objet une séquence d'NDN constituée par un gene codant pour la protéine de capside de potyvirus tel que défini plus haut, pourvue de signaux de régulation de l'expression génétique dans une cellule végétale. La presente invention a, de plus, pour objet un procédé d'obtention d'un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus, caractérisé en ce qu'un fragment d'un ADN synthétique comportant un codon ATG est inséré en un point choisi de la séquence d'ADNc codant pour la protéine de capside, les plasmides contenant la jonction voulue étant alors isoles par hybridation avec un oligonucléotide synthétique couvrant pour moitié la séquence du fragment d'ADN synthétique et pour moitie la séquence de l'extrémité 5' de la séquence du gène codant pour la protéine de capside de potyvirus. La présente invention a en outre pour objet un procédé d'obtention de 1'ADNc de l'ARN génomique de potyvirus, qui est caractérisé en ce que le premier brin d'VDNc est synthétisé par action de la transcriptasereverse sur l'ARN génomique de potyvirus en utilisant des hexamères aléatoires comme amorceurs du premier brin, l'hybride ARN/ADN obtenu est converti en ADN double-brin par l'action conjointe de trois enzymes, la RnaseH. d'E.coli, qui dégrade partiellement la partie ARN de l'hybride, créant des amorces sur lesquelles agit la DNApolymérase, qui déplace la coupure en synthétisant de l'ADN par son activité 3'- > 5' et en dégradant l'ARN par son activité 5'- > 3', les fragments d'ADN ainsi créés sont joints par la ligase d'E. coli, l'ADNc double-brin est alors traité par la S1-nucléase, la réparation de ses extrémités est réalisée à l'aide de la T4-DNA-polymérase et l'4DNc est séparé suivant sa taille sur du gel-d'agarose à bas point de fusion, puis ligaturé dans un site de coupure SmaI d' un vecteur approprié et les plasmides recombinants sont introduits dans E. coli, recueillis et sequencés par une méthode de séquençage appropriée. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, d'autres clones sont obtenus par insertion d'ADNc double-brin dans un plasmide approprié et sont partiellement séquencés par la méthode des délétions ou par sous-clonage de fragments de restriction dans un vecteur approprié, la sélection desdits clones étant réalisée par hybridation avec un mélange d'oligonucléotides synthétiques de 20 meres déduits de la séquence en arnino-acides de l'extrémité N-terminale de la protéine de capside. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de la séquence nucleotidique complete de l'ARN genomique de potyvirus, qui est caractérisé en ce qu'on réalise le séquençage par plusieurs méthodes combinées comprenant le séquençage de clones provenant d'une banque d'ADNc, par amorçage par oligoDT et par extension par dG/dC, le séquençage de clones obtenus par initiation de l'nDNc simple-brin a l'aide d'hexamères aléatoires, ainsi que par séquençage d'RRN purifié et de plasmides, a l'aide d'oligonucléotides synthétiques. La présénte invention a, en outre, pour objet la séquence d'ADN complémentaire de l'ARN génomique du virus Y de la pomme de terre (PVY), qui est obtenue en mettant en oeuvre le procédé défini plus haut et qui comprend lOkb environ. A cet égard, le présente invention englobe tout fragment de l'ADNc de l'ARN génomique oe potyvirus correspondant à l'extrémité 3' du génome de potyvirus et contenant la séquence codante pour la protéine de capside du PVY. La présente invention a en outre pour objet la séquence nucleotidique complète de l'ARN genomique de PVY. qui est caractérisée en ce qu'elle comprend 9704 bases suivies d'une extrémité poly-R, en ce qu'une région noncodante à l'extrémité 5', qui comprend 185 bases, précède l'unique et longue phase de lecture ouverte, en ce que ladite phase code pour une polyproteine de 3063 aminoacides et en ce qu'elle est suivie d'une région non-codante de 331 bases à l'extremité 3'. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite séquence complète de l'ARN genomique de potyvirus, celle-ci est représentée par la séquence en nucléotides et en amino-acides (II) suivante AAUUAAAACAACUCAAUACAACAUAAGAAAAACAACGCAAAAACACUCAUAAACGCUCAUUCUC 84 ACUCAAGCAACUUGCUAAGUUUCAGUUUAAAUCAUUUCCUUGCAAUUCUCUAGAACAAUAUUGG 128 AAACCAUUUCAACUCAACAAGCAAUUUCAUCACUUCCAACCAAUUUCAGAUCCUCAAUG GCA 190 Met Alc ACU UAC AUG UCA ACA AUC UGU UUT GGU UCG UUT GAA UGC AAG CUA CCA 238 Thr Thy Met Ser Thr Ile Cys Phe Gly Ser Phe Glu Cys Lys Leu Pro UAC UCA CCA GCC UCU UGC GAG CAU AUU GUG AAG GAA CGA GAA GUG CCG 286 Tyr Ser Pro Aic Ser Cys Glu Ris Ile Val Lys Glu Arg Glu Vol Pro GCU UCC GUU GAU CCU UUC GCA GAU CUG GAA ACA CAA CUU- AGU GCA CGA 334 Alc Ser Val Asp Pro Phe Ala Asp Leu Glu Thr Gln Leu Ser Ala Arg UUG CUC AAG CAA AAA UAU GCU ACU GUU CGU GUG CUC AAA AAC GGU ACU 382 Leu Leu Lys Gln Lys Tyr Ala Thr Val Arg Val Leu Lys Asn Gly Thr UUT ACG UAC CGA URC AAG ACU GAU GCC CAG AUA AUG CGC AUU CAG AAG 430 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Glu Lys Val Arg Ser Gln CUA AAA GAA UUC UCA AAU UUG GAU GGU UCU GCA UGU GAG GAG AAU UUA 5518 Leu Lys Glu Phe Ser Asn Leu Asp Gly Ser Ala Cys Glu Glu Asn Leu AUA AAG AGG UAU GAG UCG UUG CAG UUC GUU CAU CAC CAA GCU GCG ACG 5566 Ile Lys Arg Tyr Glu Ser Leu Gln Phe Val His His Gin Ala Ala Thr UCA CUU GCA AAG GAU CUC AAG UUG AAG GGG AUU UGG AAC AAG UCA UUA 5614 Ser Leu Ala Lys Asp Leu Lys Leu Lys Gly Ile Trp Asn Lys Ser Leu GUG GCU AAA GAC UUG AUC AUA GCA GGC GCU GUU GCA AUU GGU GGA AUA 5662 Val Ala Lys Asp Leu Ile Ile Ala Gly Ala Val Ala Ile Gly Gly Ile GGA CUC AUA UAU AGU UGG UUC ACA CAA UCA GUU GAG ACU GUG UCU CAU 5710 Glu Leu Ile Tur Ser Trp Pha Thr Gln Ser Val Glu Thr Val Ser His CAA GGG AAA AAU AAA VCC AAA AGA AUC CAA GCC UUG AAG UUT CGC CAU 5758 Gin Gly Lys Asn Lys Ser Lys Arg Ile Gln Ala Leu Lys Phe Arg His GCU CGU GAC AAA AGG GCU GGC UUT GAA AUU GAC AAC AAU GAU GAC ACA 5806 Ala Arg Asp Lys Arg Ala Gly Phe Glu Ile Asp Asn Asn Asp Asp Thr AUA GAG GAA UUC UUC GGA UCU GCA UAC AGG AAA 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CAG AAA UUG CAU 6574 Leu Ile Lys Met Pro Lys Asp Pha Pro Val Phe Pro Gln Lys Leu His UUC CGA GCU CCU ACA CAG AAU GAA AGA AUU UGU UUA GUU GGA ACC AAC 6622 Phe Arg Ala Pro Thr Gln Asn Glu Arg Ile Cys Leu Val Gly Thr Asn UUC CAA GAG AAG UAU GCU UCG UCG AUC AUC ACA GAA ACA AGC ACU ACU 6670 Phe Gln Glu Lys Tyr Ala Ser Ser Ile Ile Thr Glu Thr Ser Thr Thr UAC AAU AUA CCA GGC AGC ACA UUC UGG AAG CAU UGG AUU GAA ACA GAU 6718 Tyr Asn Ile Pro Gly Ser Thr Phe Trp Lys His Trp Ile Glu Thr Asp AAU GGA CAU UGU GGA CUA CCA GUG GUG AGC ACC GCC GAU GGA UGU AUA 6766 Asn Gly His Cys Gly Leu Pro Val Val Ser Thr Ala Asp Gly Cys Ile GUC GGC AUU CAC AGU CUG GCA AAC AAU GCA CAC ACC ACG AAC UAC UAC 6814 Val Gly Ile His Ser Leu Ala Asn Asn Ala His Thr Thr Asn Tyr Tyr UCA GCC UUC GAU GAA GAU UUT GAA AGC AAG UAC CUC CGA ACC AAU GAG 6862 Ser Ala Phe Asp Glu Asp Phe Glu Ser Lys Tyr Leu Arg Thr Asn Glu CAC AAU GAA UGG GUC AAG UCU UGG GUU UAU AAU CCA GAC ACA GUG UUG 6910 His Asn Gly Trp Val Lys Ser Trp Val Tyr Asn Pro 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Val GCA GAA GCG UAU AUA GAA AUG CGC AAC AAA AAG GAA CCA UAU AUG CCA 9118 Ala Glu Ala Tyr Ile Glu Met Arg Asn Lys Lys Glu Pro Tyr Met Pro CGA UAU GGU UUA AUU CGA AAU CUG CGG GAU AUG GGU UUA GCG CGU UAU 9166 Arg Tyr Gly Leu Ile Arg Asn Leu Arg Asp Met Gly Leu Ala Arg Tyr GCC UUT GAC UUT UAU GAG GUC ACA UCA CGA ACA CCA GUG AGG GCU AGG 9214 Ala Phe Asp Phe Tyr Glu Val Thr Ser Arg Thr Pro Val Arg Ala Arg GAA GCG CAC AUU CAA AUG AAG GCC GCA GCA UUG AAA UCA GCC CAA CCU 9262 Glu Ala His Ile Gln Met Lys Ala Ala Ala Leu lys Sar Ala Gln Pro CGA CUU UUC GGG UUG GAC GGU GGC AUC AGU ACA CAA GAG GAG AAT ACA 9310 Arg Leu Phe Gly Leu Asp Gly Gly Ile Ser Thr Gln Glu Glu Asn Thr GAG AGG CAC ACC ACC GAG GAU GUC UCU CCA AGU AUG CAU ACU CUA CUU 9358 Glu Arg His Thr Thr Glu Asp Val Ser Pro Ser Met His Thr Leu Leu GGA GUC AAG AAC AUG UGAUGUAGUGUCUCUCCGGACGAUAURURRGUAUUUACAUAUGC 9417 Gly Val Lys Asn Met AGUAAGUAUUUUGGCUUUUCCUGUACUACUUUUAUCAUAAUUAAUAAUCGUUUGAAUAUUACUG 9481 GCAGAUAGGGGUGGUAUAGCGAUUCCGUCGUUGUUAGUGACCUUAGCUGUCGGUUCUGUAUUAU 9545 UAAGUCUUAGRUAAAAAGUGCCGGGUUGUUGUUGUGUGACUGAUCUAUCGAUUAGGUGAUGCUG 9609 UGAUUCUGUCAUAGCAGUGACUAUGUCUGGAUUUAGUUACUUGGGUGAUGCUGUGAUUCUGUCA 9673 UAGCAGUGACUGUAAACUUCAAUCAGGAGACA(N) 9704 (II) Conformement à l'invention, la position de la sequence de la protéine de capside dans la séquence d'ARN susdite est telle que son extrémité N-terminale se situe en position 2796 de la polyprotéine. Egalement conformément à l'invention, l'ARN génomique de potyvirus qui répond à la séquence (II) définie plus haut est caractérisé en qu'il code pour au moins huit protéines présentant des poids moléculaires respectifs de 31, 62, 38, 71, 5,6, 55, 60 et 30 KDa. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : Clonage et séquençage de l'ADN com- plémentaire de l'ARN génomique du potyvirus Y de la pomme de terre (PVY) Mise au point des conditions d'obtention de l'ADNc de l'hRN du PVY. La synthèse d'ADN complementaire est traditionnellement considérée comme un processus délicat faisant appel à de nombreuses étapes enzymatiques successives. L'ARN du PVY étant une molécule unique de grande taille (9.8kb) constitue un materiel de choix pour l'optimisation de cette technique. LJADNc a été synthétisé par la méthode de GUBLER et HOFFMAN (1984). Dans cette méthode le premier brin est synthétisé de façon classique par action de la transcriptase-reverse, et l'hybride ARN/ADN obtenu est converti en NDN double-brin par l'action conjointe de 3 enzymes : la RNaseH d'E. coli dégrade partiellement la partie ARN de l'hybride, créant des amorces pour la DNA-polymérase I qui déplace la coupure en synthétisant de l'ADN par son activité 3'- > 5' tout en dégradant l'ARN par son activité 5'- > 3', les f;agments d'ADN ainsi créés sont joints par la ligase d'E. coli choisie à cause de son incapacité à joindre des QDNs à bouts francs. La concentration optimale en KCl pour obtenir de longs rétrotranscrits d'QRN viraux est de 140mM. Grâce à l'excellente qualité de l'QRN disponible et sans doute aussi à l'absence de fortes structures secondaires, il a été possible de synthétiser un ADNc premier brin complet (environ lOkb) en utilisant de la transcriptase-reverse du virus du myéloplastome aviaire (Genofit et Life Science). Afin d'augmenter la masse d'ÀDNc synthétise, on a ajouté un deuxième aliquot d'enzyme (25-30 unités pour 2ug d'QRN dans un volume réactionnel de 201) ainsi que 10 unités de RNasin après 30' de réaction à 43 C et on a poursuivi l'incubation pendant 30'. L'utilisation d'amorces aléatoires à la place de l'oligodT a permis d'augmenter le rendement d'un facteur 5 à 10 mais au détriment de la taille des produits synthétisés. La réaction de synthèse du deuxième brin a lieu dans le même tube que la synthèse du premier brin, après augmentation de volume. Cette augmentation de volume est apparue critique pour obtenir une conversion reproductible de 80 à 100 % , elle doit être d'au moins 10 fois. Il a été montré que l'ajout de la DNQ-ligase de E. coli n'est pas nécessaire pour la conversion complète en ADN double-brin d'un ARN de petite taille tel que le messager codant pour la globine (GUBLER et HOFFMQN, 1984). Un traitement à la RNase A a été inclus à la fin de la synthèse du deuxième brin ; afin d'obtenir des extrémités parfaitement franches, l'étape de réparation a lieu pendant un temps très court en l'absence de nucléotides permettant à la DNA-polymérase du phage T4 une résection des extrémités 3' de l'ADN ; les nucléotides sont ajoutés et l'incubation se poursuit alors normalement. 2. Clonage et séquençage de l'gDNc. Initialement, deux librairies d'ADNc de l'ARN génomique du PVY ont été construites, par la méthode d'addition d'extensions homopolymériques dans le vecteur pTZ 19 (Pharmacia), chacune d'elles contenant environ 150 clones, l'une par amorçage du premier brin avec des amorces aléatoires et l'autre par amorçage avec de l'oligodT. Le criblage de cette dernière librairie avec un mélange d'oligonucléotides synthétiques de séquence GC(A/G)AATGATAC(A/T)AT(C/T/A)GA(T/C)GC, déduite de celle des premiers acides aminés de la protéine de capside du PVYn, ANDTIDA, a permis de sélectionner une vingtaine de clones. En se basant sur la taille de l'insertion qu'ils contenaient, les plasmides pY139 (lkb), pY118 (1.8kb) et pY117 (3.6kb) ont été choisis pour être séquencés.La sequence partielle des plasmides pY139 et pY118 a été réalisée par une méthode de delétions séquentielles basée sur les propriétés de coupure de la DNQse I en présence d'ions Mn2+ (LIN et al., 1985) et celle du plasmide pY117 par sous-clonage de fragments de restriction engendrés par les enzymes Rusa, Ddel, Hinfl et Taql dans le vecteur Bluescript KS+ (Stratagene). L'insertion contenUe dans le plasmide pY139 s'est avérée provenir d'un ADNc initié sur une séquence de 5 adénines correspondant à deux lysines en positions 176 et 177 de la séquence protéique auparavant publiée (SHULKA et al., 1986). EXEMPLE 2 : Synthèse d'ADN complémentaire. PREMIER BRIN Mélanger ARN PolyA+ et H20, incuber 1' à 80 C, refroidir dans la glace, - ARN 2-3 g - H20 pour un volume final de 1 9 l Rjouter dans l'ordre - RNAsin 1 ul Biotec 10 / l - oligo pdT 1 pi 2 g/ l ou amorces aléatoires 4 g/ l - tampon RT 5x 4 pi - dNTPs 2 pi lOmM AGT, 5mM C - alpha-32P-dCTP 1 pi 800Cie/mmole - NaPPI 80mM 1 l TOTAL 19 l Mélanger (sans bulles) : préincuber 2' à 43'C Reverse-Transcriptase 1 l (Genofit 25-30 / l) - 43 C 30 - Reverse-Transcriptase 1 l - RNasin 1 pi - 43 C 30' Mettre dans la glace et prélever 2x1 l pour calculer la masse d'ADNc synthétisé et pour un gel alcalin. DEUXIEME BRIN Ru mélange ler brin 18 pi ajouter - H20 qsp 200 ul volume final - tampon 5x 40 pi - DNAPolymérase 50 Amersham - DNAligase (E. coli) 2 Biolabs - B-NAD 10 mM 2 l 3. 3mg/500 l - préparé extemporanément - RNaseH 1.5 z BRL - 16 C 2 h. - 22'C 30' température ambiante - CDTA 0,5M 10 pi - RNaseA (2 g/ l) 2 l - 37 C 15' - Phénol 100 pi Vortex - Chloroforme 100 l - centrifuger 5' 10000rpm Prélever la phase aqueuse, laver la phase organique avec 50pl TC, combiner les deux phases aqueuses (250 pl) - extraire deux fois avec 500p1 d'éther - NH4Rc BM 125 pi - ETOH 95 % 850 pi mélanger - -80'C 5' Rechauffer à température ambiante - centrifuger 30' 10000rpm Prélever le surnageant, vérifier la RA dans le culot au moniteur. Resuspendre dans 50 l de TC en vortexant pour récupérer l'ADN collé à la paroi du tube. Ajouter - NH4RC 25 ul - ETOH 95 % 200 l mélanger - glace 10' - centrifuger 15' 10000rpm Prélever le surnageant, compter (normalement presque plus de RA) - ETOH 70 % 800 ul - centrifuger 5' Prélever le surnageant, vérifier la RA dans le culot et le sécher moderément. R ce stade l'ADNc peut être cloné par addition d'extensions homopolymériques ("tailing"). REPARATION DES EXTREMITES Resuspendre l'ADN dans 42 l d'eau en incubant 5' à 55 C. - rajouter tampon T4Pol lOx 5 l - RNaseH 0.5 p - Rasez (2 g/ l) 1 ul - T4DNApolymérase 4 (Amersham) - 37 C 1' exonucléase 3'- > 5' - dNTPs 2 l (10mM AGT, 5mM C) - 37 C 30' - Klenow Polymérase 2 p - température ambiante 10' - glace 10' - CDTA 2 l 0.5M - phénol 25 l - chloroforme 25 l -Vortex - centrifuger 5' 10000rpm Prélever le surnageant, réextraire la phase organique avec 50 ul de TC, combiner les deux phases aqueuses. - extraire deux fois avec 200 ul d'éther - NH4AC 8M 50 ul - ETOH 95 % 400 ul mélanger - -80 C 5' réchauffer à temp. ambiante - centrifuger 15' 10000rpm Prélever le surnageant, vérifier RA dans le culot, le rincer à l'ETOH 70 %, sécher modérement. L'ADNc est prêt pour un clonage à bouts francs ou l'addition de linkers/adapteurs. TAMPONS ler BRIN 5x : 250mM Tris-HCl pH 8.3 à 43'C (8.9 à 22'C) 750mM KCl 50mM MgCl 2 50mM DTT 2ème BRIN 5x : 250mM Tris-HCl pH 7.5 500mM KCl 25mM MgCl2 25mM DTT 250 g/ l BSA T4DNAPolymérase lOx cf. Maniatis et al. (1982) - Toutes les solutions servant à la synthèse du premier brin doivent être dépourvues de traces de RNase, c'est-àdire faites avec de l'eau traitée au diéthylpyrocarbonate (100ml d'eau stérile + 1ml de DEPC 10 % dans l'éthanol, laisser agir 1 heure, restériliser). - ne pas trop sécher les culots d'ADNc car ils peuvent devenir insolubles, sécher moins de 1' dans un "Speedvac" ou rincer à l'éthanol 95 % et laisser évaporer. - à la fin de la synthèse du 2ème brin, les deux précipitations successives éliminent 99 % de la radioactivité nonincorporée, vérifier la présence d'un culot d'ADNc au moniteur à cette étape (et aux autres). - pour observer la taille de l'ADNc premier brin : ajouter Sug de glycogène (ou tRNA) à 1 l du melange réactionnel, précipiter deux fois en présence d'acétate d'ammonium 2.5M, reprendre dans un tampon de gel alcalin (cf. MANIATIS et al. 1982). - dans ces conditions, les deux brins sont marqués ; on peut ne marquer que le deuxième brin en ne rajoutant le 32P-dCTP qu'au début de sa synthèse. - Calcul des quantités d'ADN synthétisé A lui de mélange réactionnel, ajouter 4p1 d'eau, déposer 2u1 sur deux filtres Whatman GF/C, sécher, laver l'un d'eux trois fois dans lOml de TCA 10 %, rincer à l'acétone, sécher. Déposer dans deux fioles à scintillation, ajouter 5ml d'eau et compter la radioactivité sur le canal 32P ou 3H, calculer le pourcentage d'incorporation X. dCTP 0.5mM = > 10nmoles/20 l 10 x X = Ynmoles de dCTP incorporées 4 x Y s'quantité totale de nmoles incorporées (ACGT) Poids moléculaire moyen d'un dNTP = 350g donc : 4 x Y x 350 = poids d'ADN synthétisé. - Le pourcentage de conversion d'ARN en ADNc peut aller de 15 à 50 % suivant la qualité de l'ARN, le pourcentage de synthèse du deuxième brin est de 80 à 100 %. EXEMPLE 3 : Clonage d'ADNc par addition d'extensions homopolymériques. 1. Préparation du vecteur - Digérer 40ug de vecteur (pUC, pT2, Bluescript) par Pstl, faire deux digestions succesives, ou mieux, purifier le plasmide linéaire sur gel. - Resuspendre à 1 g/ l dans de l'eau, - Pour allonger 10 g de vecteur (environ 10pmoles d'extrémités pour ces plasmides) Mélanger - tampon TdT 10x 5 ul - Tris-HCl 1M pH 6.8 1.5 ul - BSA lmg/ml 5 l - dGTP lmM 5 l - H20 20.5 ul - alpha-32PdGTP 800Cie/mmole 1 l Préincuber 5' à 37 C. mettre dans la glace. Ajouter - ADN 1 g/ l 10 ul - Terminal-transférase 2 l Pharmacia 27 / l TOTAL 50 ul Prélever aussitôt 2 x 1 l et déposer sur deux filtres GF/C pour évaluer le bruit de fond (il vaut mieux faire les mesures de R en double). - incuber 5' à 25 C, stopper dans la glace - prélever 2 x 1 l pour mesurer la R totale 2 x 1 l pour mesurer la RA incorporée -(RA incorporée-bruit de fond) - % incorporation = x 100 RA totale 100 moles dGTP = 100pmoles/ l =@ 5000pmoles/50 l % incorporation x 5000 = pmoles incorporées pmoles incorporées = nombre de nucléotides ajoutés pmoles d'extrémités - la taille optimale des extensions est de 15 à 25 nucléotides, la réaction étant à peu près linéaire on peut donc réincuber à 25 C pendant un temps défini par la première incubation. - inactiver l'enzyme 5' à 65-C, extraire au phénol/chloroforme, deux fois à l'éther, précipiter à l'éthanol en 2.5M acétate d'ammonium, reprendre à 20ng/ l dans du TE. 2 Préparation de l'ADNc. - l'ADNc doit etre séparé des amorces de synthèse qui présentent, du fait de leur petite taille, un très grand nombre d'extrémités. Cette séparation peut se faire soit sur colonne de Séphadex G100. soit sur colonne de 8iogel A50 qui présente l'avantage-de séparer l'ADN suivant la taille. Les colonnes sont coulées dans une pipette ae 1ml, de diamètre interne le plus faible possible. - l'ADN est repris dans du tampon de colonne (TC + 0.4M LiCl), dissous 5' à 65 C, centrifugé 5' pour éliminer tout débris insoluble, ajusté à 5 % en glycérol et chargé sur la colonne. - L'élution est suivie au moniteur et les fractions contenant de l'ADN sont mélangées et précipitées à l'éthanol (dans le cas d'une colonne Biogel A50, seules les fractions de la partie ascendante du pic de R sont conservées, ce qui correspond à des molécules de plus de 800pdb). - Il est assez difficile d'estimer le nombre d'extrémités que représente l'ADNc du fait ae son hétérogénéité de taille et des imprécisions sur la mesure de son poids : il est donc avantageux d'effectuer une gamme d'allongement sur une partie de l'échantillon. - Mélanger : Tampon Tdt 10 x 4 ul Tris Hol 1M pH 6.8 1.2 ul BSA lmg/lml 4 ul dCTP lmM 4 ul H20 qsp 40 ul - Incuber 5' à 25 C - Ajouter : ADNc x ul 5Q-lOOng Terminal-transférase 1.5 ul - Prélever des aliquots de 5 ul toutes les 30 secondes, stopper dans la glace et inactiver l'enzyme 5' à 65'C. - Utiliser 2.5 l de chaque aliquot pour une hybridation avec 20ng de vecteur dans 50 l de TE + 0,15M NaCl, incuber 90' à 58 C. 10' à température ambiante, conserver dans la glace ou congeler. Ne pas oublier le témoin vecteur sans ADNc. - Transformer 200 ul de bactéries compétentes avec 25 l de chaque mélange d'hybridation. - Compter les clones recombinants par différence avec le contrôle et/ou sélection bleu/blanc et/ou hybridation sur colonies avec 10-20ng d'ADNc marqué par amorçage aléatoire. - une fois déterminé le meilleur temps d'allongement, retraiter dans ces conditions la même quantité d'RDNc : on peut encore optimiser l'efficacité de clonage en hybridant des quantités variables d'ADNc avec 20ng de vecteur. EXEMPLE 4 - Obtention de clones par amorçage de l'SDNc sur l'ARN viral à l'aide d'hexamères aléatoires. La méthode décrite ci-après permet d'obtenir en une seule étape tous les clones nécessaires à l'obtention du gène codant pour la protéine de capside, puis de les séquencer et d'ordonner les données obtenues par un traitement informatique. Ce tyDe de technique de séquençage est cpu ram- ment employé pour l'analyse de fragments définis d'ADN clones, mais n'avait pas été employé, de façon systématique, pour obtenir la séquence nucléotidique de grands ARNs. Une méthode analogue mais comportant l'insertion de l'QDNc, après digestion par des enzymes de restriction, a été décrite par Goelet et al. (1984) pour obtenir des portions de la séquence de l'RRN du TMV. Une librairie d'ADNc initié avec des amorces aléatoires, traité a la nucléase Si, répare et ligature dans le site Smal du vecteur polyvalent Bluescript, a été construite. Ce plasmide contient l'origine de réplication du phage M13 et permet d'obtenir de l'ADN simple brin apres superinfection de la souche par un phage tel que M13K07. Environ 150 clones de cette librairie ont été séquencés, certains d'entre eux ont également été séquences directement sur l'ADN plasmidique (Chen and Seeburg, 1985). Ces données ont été analyses grâce au programme de séquençage "shotgun" implanté sur l'ordinateur du Centre Interuniversitaire de Traitement de l'Information (CITI Il). En combinant les séquences venant de ces clones et celles (partielles) de pY139, pY118 et pY117, près de 90% de l'information génétique totale ont été obtenus. Les 10% restants ont été séquencés de façon plus rationnelle à l'aide d'oligonucléotides synthétiques, en séquençant des plasmides sur le brin complémentaire ou en lisant des séquences plus loin de l'amorce à l'aide de l'ADN-polymé- rase du- phage T7 (Sequenase, US8). La séquence de l'extrémité 5' du génome a été realisée directement sur l'Arn viral avec une amorce synthétique. Un intérêt de la méthode ainsi expérimentée est que la séquence obtenue provenant de plusieurs ADNc clonés indépendamment, permet d'analyser la variabilité du génome viral. En effet, à cause de l'infidélité des ARN polymérases virales et de l'absence de systeme de correction, les génomes des virus à ARN présentent souvent une certaine microhétérogenéité. Ceci a été proposé comme étant une cause de leur évolution rapide (Steinhauer and Holland, 1987). Le protocole suivi est celui décrit à l'Exemple 2. EXEMPLE 5 : Construction d'un gène codant pour la protéine de capside de PVY La méthode retenue est dérivée de celle décrite par KALYAN et Al (GENE-1986, 42, 331-337) qui permet d'ajouter un fragment d'ADN synthétique dans un point choisi d'une séquence, l'épissure pouvant être contrôlée a la base près, grâce à l'emploi d'un crible très sensible basé sur les caractéristiques de l'hybridation moléculaire d'une sonde oligonucléotidique. On part d'un plasmide pY-118 dans lequel on veut insérer un ADNc de 1,8kbcorrespondant à l'extrémité 3' du génome du PVY. A l'aide de l'exonucléase 8al31, des délétions ont été créées dans le plasmide, à partir d'un site unique HindIII situé a environ- 400 paires de bases en 5' de la séquence GCRATGQCACA, correspondant aux premiers acides aminés de la protéine de capside. Les fragments délétés ont alors été ligaturés avec un adapteur synthétique de séquence (VA), (VB) 5' GATCCGAAGGAGAAACCATG 3' 20mere (V) 3' GCTTCCTCTTTGGTACp 5' 16mere (VB) dont seul le 16mere est phosphorylé, puis l'excès d'adapteurs a été éliminé, les extrémités 5' phosphorylées, et les plasmides recircularisés et introduits dans E.coli. le choix de la séquence de ces adapteurs a été fait en tenant compte de la séquence consensus définie par Joshi (1987), qui a comparé les régions 5' de 79 gènes végétaux. consensus : 5' TAAACAATGGCT 3'. Des altérations ont été introduites par rapport à ce consensus afin de créer un site de restriction Ncol englobant la jonction avec le gene de capside et de placer une séquence Stine-Dalgarno pour permettre une éventuelle expression dans E. coli. Environ 3000 colonies ont été criblées par hybridation avec un oligonucleotide marqué au 32p de séquence (VI) ci-après 16mere 5' TTTGGTAGCGTTTACT 3' (VI) comprenant 8 bases homologues à l'adapteur et 8 bases homologues au début du gène de la capside, ce qui a permis de mettre en évidence par hybridation la présence de la jonction voulue. Les conditions d'hybridation ont été celles de Sartoris et coll (1987) (4x(G+C)+2x(n+T)) x 20 0.9M Na Température d'hybridation = nb de bases soit 55"C pour cette sonde oligonucléotidique, les lavages étant effectués en 0.9M Na à température ambiante, puis pendant. 5 minutes à la température d'hybridation - 3'C. Température d'Hybridation r 4(G+C)+2(A+T)-5 à 10'C 0,9M Na mais semblent plus discriminantes . Un premier clone positif a été obtenu, son insertion n'a pu être libérée par une digestion avec les enzymes BamHl (site créé par addition des adapteurs) et HpaII (site placé à 16 paires de bases en aval du codon d'arrêt de traduction naturel du gène) car la procedure n'a pas créé le site BamHI escompté, l'insertion a donc été isolée grâce à la présence du site Ncol englobant la séquence ATG, ses extrémités remplies à l'aide de la polymérase de Klenow, et transférée dans le plasmide pUCl3l8 linéaire au site Xbal aux extrémités comblées de la même façon. Ceci a permis de reconstituer la séquence A- ATGG, ce qui a été vérifie par séquençage. Le fragment a alors été excisé du plasmide en utilisant les sites BamHI dupliqués de ce dernier et transféré dans les vecteurs d'expression pMarcel70 et pMRKE70. Par la suite deux nouveaux clones positifs ont été isolés possédant bien le site BamHI, ce qui permet de preserver le consensus introduit dans l'adapteur. La séquence codante a été isolée en digérant par les enzymes BamHI et HpaII, ses extrémités comblées et elle a été clonie dans le même plasmide pUC1318 afin d'ajouter des sites BamHI aux deux extrémités. Le fragment a alors été excise et inséré dans les mêmes vecteurs d'expression (cf Figure unique annexée). A noter que ces vecteurs d'expression ne possèdent qu'un seul site de restriction permettant l'insertion de la séquence susdite, qui sera ensuite transcrite. Ces vecteurs pMARCEL 70 et pMRKE70 ont été créés à partir des vecteurs pMARCEL19 et pMRKE35 respectivement, et contiennent un promoteur construit à partir de celui de L'BARN 35 S en dupliquant une region d'activation transcriptionnelle située de -343 à -90 par rapport au site d'initiation de la transcription (KAY et Al., 1987), lequel promoteur a pour avantage de produire 10 fois plus de transcripts que celui dont il est issu. EXEMPLE 6 : expression dans des plantes du gène codant conforme à l'invention La séquence insérée dans les vecteurs d'expression pMARCEL 70 et pMRKE 70, obtenue à l'Exemple 5 a été introduite par électroporation dans des protoplastes de tabac et de pomme de terre. Les colonies cellulaires obtenues sont résistantes à la kanamycine. Le même gène a également eté introduit dans des protoplastes de laitue, dans les memes conditions, dans le but d'obtenir une protection contre le virus de la mosaïque de la laitue, pour vérifier l'hypothèse selon laquelle en raison des similarités de séquences entre les protéines de capside des potyvirus, la protéine de capside de l'un d'eux est en mesure de protéger des plantes contre un autre potyvirus. Des plantes transgeniques ont été obtenues à partir des colonies cellulaires susdites ; leur résistance à divers potyvirus est en cours d'évaluation. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de realisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention REVENDICATIONS 1 ) Plantes transgéniques resistantes à l'infection par des potyvirus, caracterisées en ce qu'elles sont obtenues à partir de lignees cellulaires vegetales, notamment d'espèces vegétales susceptibles d'être infectées par des potyvirus, modifiées par introduction d'un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus. 2") Plantes transgèniques selon la Revendication 1, caractérisées en ce que le gène introduit est un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus, résultant de la fusion d'une séquence ATG synthétique avec 1 extrémité 5' de la séquence d'ADNc codant Pour ladite protéine de capside de potyvirus. 3") Semences pour la reproduction de plantes trangéniques, caractérisees en ce qu'elles sont issues de plantes trangêniques selon l'une quelconque des Revendications 1 et 2. 4") Gène codant pour la protéine de capside dé potyvirus, caractérisé en ce qu'il résulte de la fusion d'une séquence ÀTG synthétique avec l'extrémité 5' de la séquence d'ADNc codant pour ladite protéine de capside de potyvi rus. 5 ) Gène selon la Revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence en nucléotides (I) suivante (I) GCA AAU GAC ACA NUU GAU 8590 GCA GGA GGA AGC AAC AAG AAA GAU GCA AAA CCA GAG CAG GOC AGC AUC 8638 CAO CCA AAC CCO AAC AAA GGA AAG OAU AAG GAU @@@ AAU GCA CGC ACA 8686 UCU OOO ACA CMU ACU OUG CCG AGA MUC AAG OCU AUC ACG UCC AAA AUO 8734 AGA AUG CCC ACA AGC AAG OGA GCA ACC OUG CUA AAC UUA GAA CAU UUG 8782 CUU GAO UMU GCU CCA CAA CAA AUU GAU AUU UCA AAU ACU CGC GCA ACU 8830 CAA UCA CAG UU@ GAU ACO UGG UAU GAG GCA OUG CGG AUG GCA UAC OAC 8878 AUA GGA GAA ACU GAG AAG CCA ACU CUG AUG AAU GGG CUU @UG @@@ UGG 8926 UGC MUU GAR AAU GGA ACC UCG CCA AAU DUC AAC @@@ GUU UGG GUU AUG 8974 AUG GAU GGG AAU GAA CAA GUU GAG UAC CCO UUO AAA CCA AUC OUU OAG 9022 AAU GCA AAA CCA ACC CUU AGG CAA AUC AUO GCA CAU UUC UCA GAU OUU 9070 GCA GAA DCG UAU AUM GAA AUG CGC AAC AAA AAG GAA CCA UAU AUO CCA 9118 CGA UAU GGU UUA AUU CGA AAU CUG CGG GAU AUG GGU UUA GCG CGU UAU 9166 GCC UUT GAC UUT UAU GAG GUC ACA UCA CGA ACA CCA OUG AGG OCU AGG 9214 GAA GCG CAC AUU CAA AUG AAG GCC GCA GCA UUG AAA UCA GCC CAA CCU 9262 CGA CUU UUC GGG UUG GAC GGU GGC AUC AGU ACA CAA GAG GAG AAC ACA 9310 GAG AGG CAC ACC ACC GAG GAU GUC UCU CCA AGU AUG CAU ACU CUA CUU 9358 GGA GUC AAG AAC AUG UGAUGUAGUGUCUCUCCGGACGAUAUAUAAGLUAUUUACAUAUGC 9417 AGUAAGUAUUUUGGCUUUUCCUGUACUACUUUUAUCAUARUUAAUAAUCGUUUGARUAUUACUG 9481 GCAGAUAGGGGUGGUAUAGCGAUUCCGUCGUUGUUAGUGACCUUAGCUGUCGGUUCUGUAUUAU 9545 UARGUCUUAGAUAAAAAGUGCCGGGUUGUUGUUGUGUGACUGAUCUAUCGAUUAGGUGAUGCUG 9609 UGAUUCUGUCAUAGCAGUGACUAUGUCUGGAUUUAGUUACUUGGGUGAUGCUGUCAUUCUGUCA 9673 UAGCAGUGACUGUAAACUUCAAUCAOGAGACA(N) 9704 6 ) Sequence d'ADN caractérisée en ce qu'elle est constituée par un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus, selon l'une quelconque des Revendications 4 et 5, pourvue de signaux de régulation de l'expression génétique dans une cellule végétale. 7 ) Procédé d'obtention d'un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus, caractérisé en ce qu'un fragment d'un ADN synthétique comportant un codon ATG est insére en un point choisi de la séquence d'ADNc codant pour la protéine de capside, les plasmides contenant la jonction voulue étant alors isolés par hybridation avec un oligonucléotide synthétique couvrant pour moitié la séquence du fragment d'ADN synthétique et pour moitie la séquence de l'extremité 5' de la séquence du gène codant pour la proteine de capside de potyvirus. 8) Procede d'obtention de l'ÀDNc de l'ARN génomique de potyvirus, caractérisé en ce que le premier brin a'ADNc est synthétisé par action de la transcriptasereverse sur l'ARN génomique de potyvirus en utilisant des hexamères aléatoires comme amorceurs du premier brin, l'hybride ARN/ADN obtenu est converti en ADN double-brin par l'action conjointe de trois enzymes, la RnaseH d'E. coli, qui dégrade partiellement la partie ARN de l'hybride, créant des amorces sur lesquelles agit la DNA-polymérase, qui déplace la coupure en synthetisant de l'ADN par son activité 3'- > 5' et en dégradant l'ARN par son activite 5'- > 3', les fragments d'ADN ainsi créés sont joints par la ligase d'E. coli. l'ÀDNc double-brin est alors traité par la S1-nucléase, la réparation de ses extrémités est realisée à l'aide de la T4-DNA-polymerase et l'ÀDNc est sépare suivant sa taille sur du gel d'agarose à bas point de fusion, puis ligaturé dans un site de coupure SmaI d'un vecteur approprié et les plasmides recombinants sont introduits dans E-Coli, recueillis et séquences Par une méthode de séquençage appropriée. 9 ) Procéde selon la Revendication 8, caractérisé en ce aue d'autres clones sont obtenus par insertion d'ÀDNc double-brin dans un plasmide approprié et sont partiellement séquencés par la méthode des délétions ou par sous-clonage de fragments de restriction dans un vecteur approprié, la sélection desdits clones étant réalisée par hybridation avec un melange d'oligonucléotides synthétiques de 20 mères déduits de la séquence en aminoacides de l'extrémité N-terminale. de la protéine de capside. 10 ) Procédé d'obtention de la séquence nucléotidique complete de l'ARN génomique de potyvirus, caractérisé en ce qu on réalise le séquençage par plusieurs méthodes combinées comprenant le séquençage de clones provenant d'une banque d'ADNc, par amorçage par oligoDT et par extension par dG/dC, le séquençage de clones obtenus par initiation de l'ÀDNc simple-brin à l'aide d'hexaméres aléatoires, ainsi que par séquençage d'ARN purifié et de plasmides à l'aide d'oligonucléotides synthétiques. 11 ) Séquence d'ADNc de L'BARN génomique de PVY, caractérisée en ce qu'elle est obtenue en mettant en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des Revendications 8 et 9 et en ce qu'elle comprend 10kb environ. 12') Fragment de l'ÀDNc de l'ARN génomique de potyvirus selon la Revendication 11, caractérisé en ce qu'il correspond à l'extrémité 3' du génome de potyvirus et en ce qu'il contient la séquence codante pour protéine de capside du PVY. 13 ) Séquence nucléotidique complete de l'ARN génomique de PVY, obtenue en mettant en oeuvre le procédé selon la Revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend 9704 bases suivies d'une extrémité poly-A, en ce qu'une région non-codante à l'extrémité 5', qui comprend 185 bases, précède l'unique et longue phase de lecture ouverte, en ce que ladite phase code pour une polyproteine de 3063 amino-acides et en ce qu'elle est suivie d'une region non-codante de 331 bases à l'extrémité 3'. 14 ) Séquence selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle est représentée par la séquence en nucléotides et en amino-acides (Il) suivante AAUUAAAACAACUCAAUACAACAUAAGAAAAACAACGCAAAAACACUCAUAAACGCUCAUUCUC 84 ACUCAAGCAACUUGCUAAGUUUCAGUUUAAAUCAUUUCCUUGCAAUUCUCUAGAACAAUAUUGG 128 AAACCAUUUCAACUCAACAAGCAAUUUCAUCACUUCCAACCAAUUUCAGAUCCUCAAUG GCA 190 Met Alc ACU UAC AUG UCA ACA AUC UGU UUT GGU UCG UUT GAA UGC AAG CUA CCA 238 Thr Thy Met Ser Thr Ile Cys Phe Gly Ser Phe Glu Cys Lys Leu Pro UAC UCA CCA GCC UCU UGC GAG CAU AUU GUG AAG GAA CGA GAA GUG CCG 286 Tyr Ser Pro Aic Ser Cys Glu Ris Ile Val Lys Glu Arg Glu Vol Pro GCU UCC GUU GAU CCU UUC GCA GAU CUG GAA ACA CAA CUU- AGU GCA CGA 334 Alc Ser Val Asp Pro Phe Ala Asp Leu Glu Thr Gln Leu Ser Ala Arg UUG CUC AAG CAA AAA UAU GCU ACU GUU CGU GUG CUC AAA AAC GGU ACU 382 Leu Leu Lys Gln Lys Tyr Ala Thr Val Arg Val Leu Lys Asn Gly Thr UUT ACG UAC CGA URC AAG ACU GAU GCC CAG AUA AUG CGC AUU CAG AAG 430 Pha Thr Tyr Arg Tyr Lys Thr Asp Ala Gln Ile Met Arg Ile Gln Lys AAA CUG GAG AGG AAG GAU AGG GAA GAA UAU CAC UUC CAA AUG GCC GCU 478 Lys Leu Glu Arg Lys Asp Arg Glu Glu Tyr His Phe Gln Met Ala Ala CCU AGU AUU GUG UCA AAA AUU ACU AUA GCU GGC GGA GAU CCU CCA UCA 526 Pro Ser Ile Val Ser Lys Ile Thr Ile Ala Gly Gly Asp Pro Pro Ser AAG UCU GAG CCA CAA GCA CCA AGA GGG AUC AUU CAU ACA ACU CCA AGG 574 Lys Ser Glu Pro Gln Ala Pro Arg Glu Ile Ile His Thr Thr Pro Arg AUG CGU AAA GUC AAG ACA CGC CCC AUA AUA AAG UUG ACA GAA GGC CAG 622 Mat Arg Lys Val Lys Thr Arg Pro Ile Ile Lys Leu Thr Glu Gly Gln AUG AAU CAC CUC AUU AAG CAG AUA AAA CAG AUU AUG UCG GAG AAA AGA 670 Met Asn His Leu Ile Lys Gln Ile Lys Gln Ile Met Ser Glu Lys Arg GGG UCU GUC CAC UUA AUU AGU AAG AAA ACC ACU CAU GUU CAA UAU AAG 718 Gly Ser Val His Leu Ile Ser Lys Lys Thr Thr His Val Gln Tyr Lys AAG AUA CUU GGU GCA UAC UCC GCA GCG GUU CGA ACU GCA CAU AUG AUG 766 Lys Ile Leu Gly Ala Tyr Ser Ala Ala Val Arg Thr Ala His Met Met GGU UUG CGA CGG AGA GUG GAC UCC GAU GUG AUA UGU GGA CAG UUG GAC 814 Gly Leu Arg Arg Arg Val Asp Ser Asp Val Ile Cys Gly Gln Leu Asp UUT UGC AAC GUC UCG CUC GGA CGG ACA AAU GGU UCC AAU CAA GUC CGC 862 Phe Cys Asn Val Ser Leu Gly Arg Thr Asn Gly Ser Asn Gln Val Arg ACU AUC AAC AUA CGA AGG GGU GAU AGU GGA GUC AUC UUG AAC ACA AAA 910 Thr Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asp Ser Gly Val Ile Leu Asn Thr Lys AGC CUC AAA GGC CAC UUT GGU AGA AGU UCA GGA GGC UUG UUC AUA GUG 958 Sar Leu Lys Gly Mis Phe Gly Arg Ser Ser Gly Gly Leu Phe Ile Val CGU GGA UCA CAC GAA GGG AAA UUG UAU GAU GCA CGU UCU AGA GUU ACU 1006 Arg Gly SEr His Glu Gly Lys Leu Tyr Asp Ala Arg Ser Arg Val Thr CAG AGU AUU UUA AAC UCA AUG AUC CAG UUT UCG AAU GCC GAC AAU UUT 1054 Gin Ser Ile Leu Asn Ser Met Ile Gln Phe Ser Asn Ala Asp Asn Phe UGG AAG GGU CUG GAC GGU AAU UGG GCA CGA AUG AGA UAU CCU UCG GAU 1102 Trp Lys Gly Leu Asp Gly Asn Trp Ala Arg Met Arg Tyr Pro Ser Asp CAC ACA UGU GUA GCU GGU UUA CCU GUC GAA GAU UGU GGU AGG GUA GCU 1150 His Thr Cys Val Ala Gly Leu Pro Val Glu Asp Cys Gly Arg Val Ala GCA UUG AUG GCA CAC AGU AUC CUU CCG UGC UAU AAG AUA ACU UGC CCC 1198 Ala Leu Met Ala His Ser Ile Leu Pro Sys Tyr Lys Ile Thr Cys Pro ACC UGU GCU CAA CAG UAU GCC AGC UUG CCA GUU AGC GAU CUG UUT AAG 1246 Thr Cys Ala Gln Gln Tyr Ala Ser Leu Pro Val Ser Asp Leu Phe Lys CUA UUG CRU AAA CAU GCA AGA GAU GGU UUG AAU CGA UUG GGA GCG GAU 1294 Leu Leu His Lys His Aia Arg Asp Gly Leu Asn Arg Leu Gly Ala Asp AAA GAC CGG UUT AUA CAU GUU AAU AAG UUC UUG AUA GCG UUA GAG CAU 1342 Lys Asp Arg Phe Ile His Val Asn Lys Phe Leu Ile Ala Leu Glu His CUA ACU GAA CCG GUG GAC CUG AAU CUC GAG CUU UUC AAU GAG AUA UUT 1390 Leu Thr Glu Pro Val Asp Leu Asn Leu Glu Leu Pha Asn Glu Ile Pha AAA UCC AUA GGG GAG AAA CAG CAA GCA CCG UUC AAG AAU UUA AAU GUC 1438 Lys Ser Ile Gly Glu Lys Gln Gln Ala Pro Phe Lys Asn Leu Asn Val UUA AAU AAU UUC UUC CUG AAA GGA AAA GAA AAU ACA GCU CAU GAA UGG 1486 Leu Asn Asn Phe Phe Leu Lys Gly Lys Glu Asn Thr Ala His Glu Trp CAG GUA GCU CAA UUG AGU UUG CUC GAA UUA GCA AGG UUC CAG AAG AAC 1534 Gln Val Ala Gln Leu Ser Leu Leu Glu Leu Ala Arg Phe Gln Lys Asn AGA ACU GAU AAC AUC AAG AAA GGU GAU AUA UCU UUC UUC AGA AAU AAA 1582 Arg Thr Asp Asn Ile Lys Lys Gly Asp Ile Ser Phe Phe Ary Asn Lys UUA UCU GCC AAG GCA AAC UGG AAU CUG UAU UUG UCG UGC GAC AAC CAG 1630 Leu Ser Ala Lys Ala Asn Trp Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Asp Asn Gln CUG GAU AAA AAU GCA AAC UUC CUC UGG GGA CAA AGG GAG UAU CAU GCU 1678 Leu Asp Lys Asn Ala Asn Phe Leu Trp Gly Gln Arg Glu Tyr His Ala AAG CGG UUT UUC UCA AAC UUC UUT GAG GAA AUU GAU CCA GCA AAG GGA 1728 Lys Arg Phe Phe Ser Asn Phe Phe Glu Glu Ile Asp Pra Ala Lys Gly UAC UCA GCA UAU GAA AUC CGC AAG CAU CCA AGU GGA ACA AGG AAG CUC 1774 Tyr Ser Ala Tyr Glu Ile Arg Lys His Pro Ser Gly Thr Arg Lys Leu UCA AUU GGU AAC UUA GUU GUC CCA CUU GAU UUA GCU GAG UUT AGG CAG 1822 Ser Ile Gly Asn Leu Val Val Pro Leu Asp Leu Ala Glu Phe Arg Oln AAG AUG AAA GGU GAC UAU AGG AAA CAA CCA GGG GUC AGC AAA AAG UGC 1870 Lys Met Lys Gly Asp Tyr Arg Lys Gln Pro Gly Val Ser Lys Lys Cys ACG AGU UCG AAA GAU GGU AAU UAU GUG UAU CCC UGU UGU UGC ACA ACA 1918 Thr Ser Ser Lys Asp Gly Asn Tyr Val Tyr Pro Cys Cys Cys Thr Thr CUU GAU GAU GGU UCA GCC AUU GAA UCA ACA UUC UAU CCA CCA ACU AAA 1966 Leu Asp Asp Gly Ser Ala Ile Glu Ser Thr Phe Tyr Pro Pro Thr Lys AAG CAC CUU GUR AUU GGC AAU AGU GGU GAC CAA AAA UUT GUU GAU UUA 2014 Lys His Leu Val Ile Gly Asn Ser Gly Asp Gln Lys Phe Val Asp Leu CCA AAA GGG GAU UCG GAG AUG UUA UAC AUU GCC AAG CAG GGU UAU UGU 2062 Pro Lys Gly Asp Ser Glu Mat Leu Tyr Ile Ala Lys Gln Gly Tyr Cys UAU AUU AAC GUG UUT CUU GCA AUG CUG AUU AAC AUU AGC GAC GAG GAU 2110 Tyr Ile Asn Val Phe Leu Ala Met Leu Ile Asn Ile Ser Glu Glu Asp GCA AAG GAU UUC ACA AAG AAA GUU CGC GAC AUG UGU GUG CCA AAG CUU 2158 Ala Lys Asp Pha Thr Lys Lys Val Arg Asp Met Cys Val Pro Lys Leu GGA ACC UGG CCA ACU AUG AUG GAU UUG GCG ACC ACU UGU GCU CAA AUG 2206 Gly Thr Trp Pro Thr Met Met Asp Leu Ala Thr Thr Cys Ala Gln Met AGA AUA UUC UAU CCU GAC GUA CAU GAU GCA GAA UUG CCC AGA AUA UUG 2254 Arg Ile Phe Tyr Pro Asp Val His Asp Ala Glu Leu Pro Arg Ile Leu GUU GAC CAU GAC ACU CAA ACG UGU CAU GUG GUU GAC UCA UUT GGC UCG 2302 Val Asp His Asp Thr Gln Thr Cys His Val Val Asp Ser Phe Gly Ser CAG ACA ACU GGA UAU CAU AUU CUA AAA GCA UCC AGC GUG UCU CAA CUU 2350 Gln Thr Thr Gly Tyr His Ile Leu Lys Ala Ser Ser Val Ser Gln Leu AUC UUG UUT GCA AAU GAU GAA UUA GAA UCU GAU AUA AAA CAU UAU AGA 2398 Ile Leu Phe Ala Asn Asp Glu Leu Glu Ser Rap Ile Lys His Tyr Arg GUU GGU GGU GUU CCU AAU GCU AGC CCU GAA CUU GGG UCC ACA AUA UCA 2446 Val Gly Gly Val Pro Asn Ala Ser Pro Glu Leu Gly Ser Thr Ile Ser CCU UUC AGA GAA GGA GGA GUU AVA AUG UCU GAG UCG OCA GCO CUG AAA 2494 Pro Phe Arg Glu Gly Gly Val Ile Met Ser Glu Ser Ala Ala Leu Lys CUG CUU UUG AAG GGA RUU UUT AGA CCU AAG GUG AUG AGA CRG UUG CUG 2342 Leu Leu Leu Lys Gly Ile Phe Arg Pro Lys Val Met Arg Gln Leu Leu UUA GAU GAG CCU UAC CUG UUG AUU CUA UCA AUA CUA UCC CCU GGC AUA 2590 Leu Asp Glu Pro Tyr Leu Leu Ile Leu Ser Ile Leu Ser Pro Gly Ile CUG AUG GCU AUG UAU AAU AAU GGG AUU UUT GAA CUU GCG GUG AGG UUG 2638 Leu Met Ala Met Tyr Asn Asn Gly Ile Phe Glu Leu Ala Val Arg Leu UGG AUU AAU GAG AAA CAA UCC AUA GCU AUG AUA GCA UCG CUA CUA UCA 2686 Trp Ile Asn Glu Lys Gln Ser Ile Ala Met Ile Ala Ser Leu Leu Ser GCU UUA GCC CUA CGA GUG UCA GCG GCA GAA ACA CUC GUC GCA CAG AGG 2734 Ala Leu Ala Leu Arg Val Ser Ala Ala Glu Thr Leu Val Ala Gln Arg AUU AUA AUU GAU GCU GCA GCU ACA GAC CUC CUU GAU GCU ACG UGU GAU 2782 Ile Ile Ile Asp Ala Ala Ala Thr Asp Leu Leu Asp Ala Thr Cys Asp GGG UUC AAC CUA CAU CUA ACG UAC CCC ACU GCA UUG AUG GUG UUG CAA 2830 Gly Phe Asn Leu His Leu Thr Tyr Pro Thr Ala Leu Met Val Leu Gln GUU GUU AAG AAU AGA AAU GAA UGU GAU GAU ACC CUA UUC AAG GCG GGU 2878 Val Val Lys Asn Arg Asn Glu Cys Asp Asp Thr Leu Phe Lys Ala Gly UUT CCA AGU UAC AAC ACG AGC GUC GUA CAG AUU AUG GAA AAA AAU UAU 2926 Pha Pro Ser Tyr Asn Thr Ser Val Val Gln Ile Met Glu Lys Asn Tyr CUA AAU CUC UUG AAC GAU GCU UGG AAA GAU UUA ACU UGG CGA GAA AAU 2974 Leu Asn Leu Leu Asn Asp Ala Trp Lys Asp Leu 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GAG AUU GUC UGC 3358 Arg Arg Glu Ile Glu Leu Met Gln Ile Glu Lys Asn Glu Ile Vol Cys AUG GAG CUA UAU GCA AGU UUA CAG CGC AAA CUU GAA CGC GAU UUC ACA 3406 Met Glu Leu Tyr Ala Ser Leu Gln Arg Lys Leu Glu Arg Asp Phe Thr UGG GAU GAG UAC AUU GAG UAU UUG AAG UCA GUA AAC CCU CAG AUA GUU 3454 Trp Asp Glu Tyr Ile Glu Tyr Leu Lys Ser Val Asn Pro Gln Ile Val CAG UUT GCU CAA GCG CAG AUG GAA GAA UAU GAU GUG CGA CAC CAG CGU 3502 Gln Pha Ala Gln Ala Gln Met Glu Glu Tyr Asp Val Prg His Gln Arg UCC ACA CCA GUU GUU AAA AAU UUG GAA CAA GUG GUA GCA UUT AUG GCU 3530 Ser Thr pro Val Val Lys Asn Leu Gln Gln Val Val Als Phe Met Ala UUA GUC AUC AUG GUG UUT GAU GCU GAA AGG RGU GAU UGC GUG UUC AAA 3598 Leu Val Ile Met Val Phe Asp Ala Glu Arg Ser Asp Cys Val Phe Lys ACU CUC AAU AAA UUT AAG GGU GUC CUU UCC UCA CUO GAU UAU GAA GUU 3646 Thr Lau Asn Lys Phe Lys Gly Val Leu Ser Ser Leu Asp Tyr Glu Val AGA CAU CAG UCC UUA GAC GAU GUG AUC AAG AAU UUT GAU GAG AGG AAU 3694 Arg His Gln Ser Leu Asp Asp Val Ile Lys Asn Phe Asp Glu Arg Asn GAG AUU AUU GAU UUT GAA UUG AGU GAG GAC ACA AUU CGA ACU UCA UCA 3742 Glu Ile Ile Asp Phe Glu Leu Ser Glu Asp Thr Ile Arg Thr Ser Ser CUG CUA GAU ACA AAG UUT AGU GAU UGG UGG GAU CGA CAA AUC CAG AUG 3790 Val Leu Asp Thr Lys Phe Ser Asp Trp Trp Asp Arg Gln Ile Gln Met GGA CAU ACA CUU CCA CAU UAC AGA ACU GAG GGG CAC UUC AUG GAA UUT 3838 Gly His Thr Leu Pro His Tyr Arg Thr Glu Gly His Phe Met Glu Phe ACA AGA GCA ACU GCU GUU CAA GUG GCU AAU GAC AUU GCC CAU AGC GAA 3886 Thr Arg Ala Thr Ala Val Gln Val Ala Asn Asp Ile Ala His Ser Glu CAC CUA GAC UUT UUA GUA CGG GGA GCU GUU GGG UCU GGA AAG UCA ACU 3934 His Leu Asp Phe Leu Val Arg Gly Ala Val Gly Ser Gly Lys Ser Thr GGG UUG CCU GUU CAU CUU AGU GUG GCC GGA UCU GUG CUU UUA AUU GAA 3982 Gly Leu Pro Val His Leu Ser Val Ala Gly Ser Vol Leu Leu Ile Glu CCA ACG CGA CCA CUA GCG GAG AAC GUU UUC AAA CAG CUA UCU AGU GAA 4030 Pro Thr Arg Pro Leu Ala Glu Asn Val Phe Lys Gln Leu Ser Ser Glu CCA UUC UUC AAG AAG CCA ACA CUG CGU AUG CGU GGA AAU 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6238 Pro Glu Arg Glu Leu Glu Leu Arg Gln Thr Gly Pro Ala Val Glu Val GAU GUG AAG GAC AUA CCA GCA CAG GAG GUG GAG CAU GAA GCU AAA UCG 6286 Asp Val Lys Asp Ile pro Ala Gln Glu Vol Glu His Glu Ala Lys Ser CUC AUG AGA GGC UUG AGA GAC UUC AAC CCA AUU GCC CAA ACA CUU UGU 6334 Leu Met Arg Gly Leu Arg Asp Pha Asn pro Ile Ala Gln Thr Val Cys AGG CUG AAA GUA UCU GUU GAA UAU GGG GCA UCA GAG AUG UAC GGU UUT 6382 Arg Leu Lys Val Ser Val Glu Tyr Gly Ala Ser Glu Met Tyr Gly Pha GGA UUT GGA GCA UAC AUA GUA GCG AAC CAC CAU UUA UUT AGG AGU UAC 6430 Gly Phe Gly Ala Tyr Ile Val Ala Asn His His Leu Phe Arg Ser Tyr AAU GGU UCC AUG GAG GUG CAA UCC AUG CAC GOU ACA UUC AGG GUG AAG 6478 Asn Gly Ser Met Glu Val Gln Ser Met His Gly Thr Phe Arg Val Lys AAU CUA CAC AGU UUG AGC GUU CUG CCA AUU AAA GGU AGG GAC AUC AUC 6526 Asn Leu His Ser Leu Ser Val Leu Pro Ile Lys Gly Arg Asp Ile Ile CUC AUC AAA AUG CCG AAA GAU UUC CCU GUC UUT CCA CAG AAA UUG CAU 6574 Leu Ile Lys Met Pro Lys Asp Pha Pro Val Phe Pro Gln Lys Leu His UUC CGA GCU CCU ACA CAG AAU GAA AGA AUU UGU UUA GUU GGA ACC AAC 6622 Phe Arg Ala Pro Thr Gln Asn Glu Arg Ile Cys Leu Val Gly Thr Asn UUC CAA GAG AAG UAU GCU UCG UCG AUC AUC ACA GAA ACA AGC ACU ACU 6670 Phe Gln Glu Lys Tyr Ala Ser Ser Ile Ile Thr Glu Thr Ser Thr Thr UAC AAU AUA CCA GGC AGC ACA UUC UGG AAG CAU UGG AUU GAA ACA GAU 6718 Tyr Asn Ile Pro Gly Ser Thr Phe Trp Lys His Trp Ile Glu Thr Asp AAU GGA CAU UGU GGA CUA CCA GUG GUG AGC ACC GCC GAU GGA UGU AUA 6766 Asn Gly His Cys Gly Leu Pro Val Val Ser Thr Ala Asp Gly Cys Ile GUC GGC AUU CAC AGU CUG GCA AAC AAU GCA CAC ACC ACG AAC UAC UAC 6814 Val Gly Ile His Ser Leu Ala Asn Asn Ala His Thr Thr Asn Tyr Tyr UCA GCC UUC GAU GAA GAU UUT GAA AGC AAG UAC CUC CGA ACC AAU GAG 6862 Ser Ala Phe Asp Glu Asp Phe Glu Ser Lys Tyr Leu Arg Thr Asn Glu CAC AAU GAA UGG GUC AAG UCU UGG GUU UAU AAU CCA GAC ACA GUG UUG 6910 His Asn Gly Trp Val Lys Ser Trp Val Tyr Asn Pro Asp Thr Val Leu UGG GGC CCG UUG AAA CUU AAA GAC AGC ACU CCC AAA GGG UUA UUC AAA 6958 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AUA GGG UUA UCA UCU ACC UGC AAU GUG CAC GGC UUC AAG AAG UGU 7342 Ser Ile Gly Leu Ser Ser Thr Cys Asn Val His Gly Phe Lys Lys Cys GCA UAU GUC ACU GAU GAG CAA GAA AUU UUC AAA GCG CUC AAC AUG AAA 7390 Ala Tyr Val Thr Asp Glu Gln Glu Ile Phe Lys Ala Leu Asn Met Lys GCU GCA GUC GGA GCC AGU UAU GGG UGC AAA AAG AAA GAC UAU UUT GAG 7438 Ala Ala Val Gly Ala Ser Tyr Gly Cys Lys Lys Lys Asp Tyr Phe Glu CAU UUC ACU GAU GCA GAU AAG GAA GAA AUA GUC AUG CAA AGC UGU CUG 7486 His Pha Thr Asp Ala Asp Lys Glu Glu Ile Val Met Gln Ser Cys Leu CGA UUG UAU AAA GGU UUG CUU GGC AUU UGG AAC GGA UCA UUO AAG GCA 7534 Arg Leu Tyr Lys Gly Leu Leu Gly Ile Trp Asn Gly Ser Leu Lys Ala GAG CUC CGG UGU AAG GAG AAG AUA CUU GCA AAU AAG ACG AGG ACG UUC 7582 Glu Leu Arg Cys Lys Glu Lys Ile Leu Ala Asn Lys Thr Arg Thr Phe ACU GCU GCA CCU CUA GAC ACU UUG CUG GGU GGU AAA GUG UGU GUU GAU 7630 Thr Ala Ala Pro Leu Asp Thr Leu Leu Gly Gly Lys Val Cys Val Asp GAC UUC AAU AAU CAA UUT UAU UCA AAG AAU AUU GAA UGC UGU UGG ACA 7678 Asp 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GUU GAG UUT GAA GAA AUC GAC AGG ACG UGU GUA UUC UUT GUU 8062 Glu Cys Val Glu Phe Glu Glu Ile Asp Ser Thr Cys Val Phe Phe Val AAU GGU GAU GAC UUA UUG AUU GCU GUG AAU CCG GAG AAA GAG AGC AUU 8110 Asn Gly Asp Asp Leu Leu Ile Ala Val Asn Pao Glu Lys Glu Ser Ile CUC GAU AGA AUG UCA CAA CAU UUC UCA GAU CUU GGU UUG AAC UAU GAU 8158 Leu Asp Arg Het Ser Gln His Phe Ser Asp Leu Gly Leu Asn Tyr Asp UUT UCG UCG AGA ACA AGA AGG AAG GAG GAA UUG UGG UUC AUG UCC CAU 8206 Phe Ser Ser Arg Thr Arg Arg Lys Glu Glu Leu Trp Phe Met Ser His AGA GGC CUG CUA AUC GAG GGU AUG UAC GUG CCA AAG CUU GAA GAA GAG 8254 Arg Gly Leu Leu Ile Glu Gly Met Tyr Val Pro Lys Leu Glu Glu Glu AGA AUU GUA UCC AUU CUG CAA UGG GAU AGA GCU GAU CUG CCA GAG CAC 8302 Arg Ile Val Ser Ile Leu Gln Trp Asp Arg Ala Asp Leu Pro Glu His AGA UUA GAA GCG AUU UGC GCA GCU AUG AUA GAG UCC UGG GGU UAU UCU 8350 Arg Leu Glu Ala Ile Cys Ala Ala Met Ile Glu Ser Trp Gly Tyr Ser GAA CUA ACA CAC CAA AUC AGG AGA UUC UAC UCA UGG UUA UUG CAA CAG 8398 Glu Leu Thr His Gln Ile Arg Arg Phe Tyr Ser Trp Leu Leu Gln Gln CAA CCU UUT GCA ACA AUA GCG CAG GAA GGG AAG GCU CCU UAU AUA GCA 8446 Gln Pro Phe Ala Thr Ile Ala Gln Glu Gly Lys Ala Pro Tyr Ile Ala AGC AUG GCA CUA AGG AAA CUG UAU AUG GAU AGG GCU GUG GAU GAG GAA 8494 Ser Met Ala Leu Arg Lys Leu tyr Met Asp Arg Ala Val Asp Glu Glu GAG CUA AGA GCC UUC ACU GAA AUG AUG GUC GCA UUA GAU GAU GAG UUT 8542 Glu Leu Arg Ala Phe Thr Glu Met Met Val Ala Leu Asp Asp Glu Phe GAG CUU GAC UCU UAU GAA GUA CAC CAU GAA GCA AAU GAC ACA AUU GAU 8590 Glu Leu Asp Ser Tyr Glu Val His His Gln Ala Asn Asp Thr Ile Asp GCA GGA GGA AGC AAC AAG AAA GAU GCA AAA CCA GAG CAG GGC AGC AUC 8638 Ala Gly Gly Ser Asn Lys Lys Asp Ala Lys Pro Glu Gln Gly Ser Ile CAG CCA AAC CCG AAC AAA GGA AAG GAU AAG GAU GUU AAU GCA GGC ACA 8686 Gln Pro Asn Pro Asn Lys Gly Lys Asp Lys Asp Val Asn Ala Gly Thr UCU GGG ACA CAU ACU GUG CCG AGA AUC AAG GCU AUC ACG UCC AAA AUG 8734 Ser Gly Thr His Thr Val Pro Arg Ile lys Ala Ile Thr Ser Lys Met RGR AUG CCC ACA AGC AAG GGA GCA ACC GUG CUA AAC UUA GAA CAU UUG 8782 Arg Met Pro Thr Sar Lys Gly Ala Thr Val Leu Asn leu Glu His Leu CUU GAG UAU GCU CCA CAA CAA AUU GAU AUU UCA AAU AGU CGG GCA ACU 8830 Leu Glu Tyr Ala Pro Gln Gln Ile Asp Ile Ser Asn Thr Arg Ala Thr CAA UCA CAG UUT GAU ACG UGG UAU GAG GCA GUG CGG AUG GCA UAC GAC 8878 Gln Ser Gln Phe Asp Thr Trp Tyr Glu Ala Val Arg Met Ala Tyr Asp AUA GGA GAA ACU GAG AUG CCA ACU GAG AUG AAU GGG CUU AUG GUU UGG 8926 Ile Gly Glu Thr Glu Met Pro Thr Val Met Asn Gly Leu Met Val Trp UGC AUU GAA AAU GGA ACC UCG CCA AAU GUC AAC GGA GUU UGG GUU AUG 8974 Cys Ile Glu Asn Gly Thr Ser Pro Asn Val Asn Gly Val Trp Val Met AUG GAU GGG AAU GAA CAA GUU GAG UAC CCG UUG AAA CCA AUC GUU GAG 9022 Met Asp Gly Asn Glu Gln Val Glu Tyr Pro leu Lys Pro Ile Val Glu AAU GCA AAA CCA ACC CUU AGG CAA AUC AUG GCA CAU UUC UCA GAU GUU 9070 Asn Ala Lys Pro Thr Leu Arg Gln Ile Met Ala His Phe Ser Asp Val GCA GAA GCG UAU AUA GAA AUG CGC AAC AAA AAG GAA CCA UAU AUG CCA 9118 Ala Glu Ala Tyr Ile Glu Met Arg Asn Lys Lys Glu Pro Tyr Met Pro CGA UAU GGU UUA AUU CGA AAU CUG CGG GAU AUG GGU UUA GCG CGU UAU 9166 Arg Tyr Gly Leu Ile Arg Asn Leu Arg Asp Met Gly Leu Ala Arg Tyr GCC UUT GAC UUT UAU GAG GUC ACA UCA CGA ACA CCA GUG AGG GCU AGG 9214 Ala Phe Asp Phe Tyr Glu Val Thr Ser Arg Thr Pro Val Arg Ala Arg GAA GCG CAC AUU CAA AUG AAG GCC GCA GCA UUG AAA UCA GCC CAA CCU 9262 Glu Ala His Ile Gln Met Lys Ala Ala Ala Leu lys Sar Ala Gln Pro CGA CUU UUC GGG UUG GAC GGU GGC AUC AGU ACA CAA GAG GAG AAT ACA 9310 Arg Leu Phe Gly Leu Asp Gly Gly Ile Ser Thr Gln Glu Glu Asn Thr GAG AGG CAC ACC ACC GAG GAU GUC UCU CCA AGU AUG CAU ACU CUA CUU 9358 Glu Arg His Thr Thr Glu Asp Val Ser Pro Ser Met His Thr Leu Leu GGA GUC AAG AAC AUG UGAUGUAGUGUCUCUCCGGACGAUAURURRGUAUUUACAUAUGC 9417 Gly Val Lys Asn Met AGUAAGUAUUUUGGCUUUUCCUGUACUACUUUUAUCAUAAUUAAUAAUCGUUUGAAUAUUACUG 9481 GCAGAUAGGGGUGGUAUAGCGAUUCCGUCGUUGUUAGUGACCUUAGCUGUCGGUUCUGUAUUAU 9545 UAAGUCUUAGRUAAAAAGUGCCGGGUUGUUGUUGUGUGACUGAUCUAUCGAUUAGGUGAUGCUG 9609 UGAUUCUGUCAUAGCAGUGACUAUGUCUGGAUUUAGUUACUUGGGUGAUGCUGUGAUUCUGUCA 9673 UAGCAGUGACUGUAAACUUCAAUCAGGAGACA(N) 9704 (II) 15 ) Séquence selon l'une quelconque des Revendications 13 et 14, caractérisée en ce quine la position de la séquence de la protéine de capside dans la séquence d'ARN susdite est telle que son extrémité Nterminale se si tue en position 2796 de la polyprotéine. 16 ) Séquence d'ARN selon l'une quelconque des Revendications 13 et 14, caractérisée en ce qu'elle code pour au moins huit protéines présentant des poids moléculaires resPectifs de 31, 62, 38, 71, 5,6, 55, 60 et 30 KDa.