FR 2640143 A1 19900615 FR 8816407 A 19881213 ANTICORPS POLYMERISES. DIRIGES CONTRE DES IMMUNOGLO BULINES - LEUR UTILISATION DANS DES TESTS DE DIAGNOSTIC. Des anticorps circulant contre plusieurs antigènes de parasites sont produits pendant la durée d'une infection. De tels anticorps peuvent être mis en évidence dans le sang total, le plasma ou le serum par des tests d'agglutination directs ouspécifiques. Ces tests spécifiques qui comprennent l'utilisation d'antigènes spécifiques permettent la détection d'agglutinines spécifiques. Leur utilité est cependant limitée par un manque de sensibilité. Ainsi, certaines infections ne sont pas détectables si l'antigène utilisé dans le test est exprime seulement dans une phase tardive de l'infection ou si cet antigène n'est pas suffisamment immunogène. Par ailleurs, certains parasites ne possèdent pas le gène codant pour l'antigène utilisé peuvent échapper à la détection. Le défaut de sensibilité peut être attribué également à des anticorps dits "incomplets et bloquants qui, lorsqu'ils sont seuls ne s'agglutinent pas. L'utilisation d'anticorps anti-immunoglobulines du type Ig (anticorps anti-Ig) en tant que réactif de Coomb, améliore considérablement la sensibilité. Cependant, dans ces conditions, la lecture des résultats du test est rendue plus difficile à cause de la petite taille des agrégats formés après la réaction immunologique ou d'un phénomène de prozone bien connu en immunologie qui se manifeste en présence de faibles dilutions de sérum (par exemple des dilutions de l'ordre de 1/2 ou 1/10). Dans ce cas, lorsque les anticorps à doser sont présents à haute concentration, l'agglutination avec les anti-Ig est inhibée et le signal de présence des anticorps recherchés disparait. La mise en oeuvre de test de détection d'infection due à un parasite nécessite des manipulations supplémentaires telles que des dilutions préalables de l'échantillon à tester. Les inventeurs ont mis en évidence qu'une quantité appropriée d'anticorps anti-Ig sous forme polymérisée ajoutée à un antigène, entraine un accroissement de la sensibilité lors d'un test de détection immunologique impliquant des réactions d'agglutination, et la réduction, sinon l'abolition de phénomène de prozone. De plus, aucune manipulation supplémentaire n'est requise préalablement à la mise en oeuvre des réactions, comme par exemple des dilutions préalables de l'échantillon à doser. La présente invention se rapporte à des anticorps-Ig polymérisés. L'invention vise également l'utilisation de ces anticorps en tant que réactif dans des tests immunologiques de détection par exemple de parasites ou de virus. La présente Invention vise également des tests rapides d'anticorps déterminés par exemple dus à des maladies infectieuses chez l'homme ou l'animal grâce à la mise en oeuvre des anticorps anti-Ig polymérisés. Cette application comprend toute sorte de tests qui permettent la détection d'agrégats de particules (constituées par des multicomplexes du type anti-Ig, anticorps recherché, antigène spécifique dudit anticorps recherché) de taille suffisante pour être visibles à l'oeil.nu, compte tenu des conditions de révélation de ces agrégats. L'invention met à profit la capacité conservée par des anticorps-Ig sous forme polymérisée à fixer de façon non sélective d'autres anticorps et les complexes immunologiques les contenant, parmi lesquels les complexes formés entre des anticorps spécifiques contenus dans un échantillon biologique et des antigènes correspondants. Les échantillons biologiques peuvent être constitués par des fluides biologiques tels que le sang complet, le sérum, ou le plasma. Des anticorps anti-Ig polymérisés de l'invention sont encore caractérisés par un taux de polymérisation suffisant pour permettre la formation d'agrégats visibles à l'oeil nu, lorsque ceux-ci sont formés à l'occasion de la mise en contact d'un échantillon biologique contenant des anticorps. Les anticorps anti-Ig polymérisés de l'invention sont encore définis par leur capacité à se fixer de façon non spécifique aux parties constantes d'anticorps déterminé spécifiques présents dans un échantillon biologique, ces anticorps déterminé étant eux-mêmes reconnu par un antigène spécifique. Entrent en particulier dans le cadre de l'invention, des anticorps anti-Ig polymérisés composés d'oligomères comportant au moins 2 motifs, notamment 2 à 25 anticorps anti-Ig couplés entre eux de façon covalente. Il est remarquable que les polymères ainsi obtenus, conservent les capacités des anticorps dans leur forme non polymérisée de former des complexes non spécifiques avec d'autres anticorps parmi lesquels les anticorps déterminés ou choisis éventuellement présents dans l'échantillon testé, ces anticorps étant eux-mêmes reconnus immunologiquement par un antigène marqué, spécifique. Le taux de polymérisation des anticorps anti-Ig polymérisés ne dépasse pas celui qui entrai- nerait l'insolubilisation du polymère. Ce taux de polymérisation est cependant suffisant pour que, en présence d'anticorps distincts, les anticorps anti-Ig polymérisés soient capables de produire par agglutination avec d'autres anticorps des agrégats visibles à l'oeil nu, le cas échéant après concentration du milieu dans lequel l'opération est réalisée. Les anticorps polymérisés sont capables de se fixer sur la partie constante des anticorps présents dans le milieu par exemple à la suite d'une infection, pour former les susdits agrégats, ceux de ces agrégats dans lesquel interviennent les anticorps recherchés étant alors eux-mêmes reconnus par les antigènes homologues marqués par exemple par coloration, normalement aptes à sélectiivement former avec l'anticorps recherché un complexe du type antigène-anticorps ; ce grâce à quoi ceux des agrégats formés qui comprennent des antigènes marqués, peuvent être repérés aisément grâce au marqueur, parmi les agrégats faisant intervenir les anti-Ig polymérisés et d'autres anticorps, hétérologues vis-à-vis de l'antigène marqué. L'invention vise également un test de diagnostic de la présence d'anticorps déterminés dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes - la mise en contact de l'échantillon biologique avec un cïigène marqué spécifique de l'anticorps recherché en présence d'anticorps anti-Ig polymérisés tels que définis plus haut, - la détection de ceux des agrégats d'anti-Ig qui portent également l'antigène marqué. Il est à remarquer que les immunoglobulines Ig utilisées pour la production des anticorps anti-Ig doivent provenir du même hôte mammifère que celui fournissant le milieu biologique, notamment le sérum ou le plasma., dans lequel l'anticorps recherché est à doser. Si l'hôte est humain les anticorps anti-Ig sont obtenus par immunisation d'un animal non humain avec des immunoglobulines G obtenues à partir d'un sérum humain. Il est aisément concevable que le taux de polymérisation préféré pour les anticorps anti-Ig est à choisir selon les natures des échantillons biologiques et des anticorps recherchés. Ce taux de polymérisation doit être suffisant pour que les agrégats soient susceptibles de se former et de retenir individuellement un taux maximum des anticorps recherchés. Ce taux ne dépassera pas celui qui pourrait entrainer une agglutination trop massive en présence d'autres anticorps. D'une façon générale, on se placera dans des conditions permettant la production d'agglutinats multiples. Du fait de l'affinité spécifique de l'antigène utilisé pour la détection avec l'anticorps recherché, on est encore amené à faire les constatations suivantes selon que l'échantillon biologique contenait ou ne contenait pas l'anticorps recherché - cas où l'échantillon contenait l'anticorps recherché attraction sélective de l'antigène marqué vers les complexes que forment entre eux les anticorps anti-Ig et l'anticorps recherché : d'où l'individualisation et par conséquent visualisation des particules retenant le marqueur, en particulier lorsque celui-ci est coloré, - cas de qu'absence de l'anticorps recherché : absence d'individualisation et par conséquent de visualisation d'agrégats particuliers parmi d'autres. Selon un mode de realisation avantageux du procédé de diagnostic réalisé sur un échantillon biologique en solution contenant éventuellement les anticorps à doser, on met celui-ci en contact avec les antigènes marqués et les anticorps anti-Ig polymérisés et l'on. concentre le milieu jusqu'à provoquer l'insolubilisation des agrégats formés. Avantageusement de petites quantités du milieu sont déposées en tâches sur un support, notamment un papier et on provoque l'évaporation. Dans le cas où le marqueur est coloré, la présence de l'anticorps recherché se manifeste par des points de coloration au niveau des agrégats alors individualisables (concentration de la coloration en plusieurs points de l'échantillon) Au contraire, une coloration uniforme de l'échantillon montre que les anticorps recherchés sont absents. Les anticorps déterminés recherchés peuvent être des anticorps formés à la suite d'une infection par un parasite ou par un virus. A titre d'exemple on citera le trypanosome, le vecteur de la brucellose, le virus HIV. La détection des agrégats formés peut être réalisée grâce à une étape de détection de la coloration de ces agrégats, dès lors que l'antigène spécifique incorporé dans le milieu a été marqué. Ce marquage peut être obtenu grâce à un colorant tel que le bleu de Coomassie ou le rose de Bengale ou encore grâce à un agent fluorescent. Des marqueurs enzymatiques sont aussi utilisables. La révélation des agrégats est dans ce cas effectuée grâce à un révélateur d'activité enzymatique. Un marquage radioactif des antigènes peut également être effectué. Dans ce cas, l'étape de détection des agrégats est précédée d'une étape de séparation physique des complexes non agrégés et des complexes agrégés recherchés. La susdite séparation peut avoir lieu par centrifugation ou par filtration. L'invention vise en outre un kit de diagnostic de la présence anticorps déterminés comprenant - des anticorps polymérisés, - des antigènes marqués spécifiques. De façon avantageuse, ce kit de diagnostic est utilisable pour détecter des anticorps spécifiques dus à une infection par un parasite ou un virus. Dans ce cas les antigènes du kit sont spécifiques de ce parasite ou de ce virus. Les antigènes de ce kit peuvent etre marqués de la façon définie précédemment. L'invention concerne aussi un procédé pour la préparation d'anticorps anti-Ig polymérisés, comprenant la polymérisation d'anticorps anti-Ig en présence d'un agent de polymérisation, notamment dans les conditions standard utilisées pour les réactions de couplage de protéines. Des agents de polymérisation adaptés sont ceux habituellement utilisés pour polymériser ou coupler les protéines. On peut par exemple faire réagir les anticorps en solution avec le chloroformiate d'éthyle, la glutaraldéhyde ou tout réactif polyfonctionnel de couplage entre des fonctions actives respectivement portées par les protéines que représentent ces anticorps anti-g. De telles fonctions actives consistent par exemple en des fonctions amine, carboxyle ou les deux à la fois. Par ajustement des proportions relatives des anticorps et du réactif polyfonctionnel on peut régler de façon en soi connue le taux de polymérisation. L'invention concerne aussi en tant que réactifs nouveaux des compositions contenant à la fois l'anticorps anti-Ig polymérisé et l'antigène marqué dans des proportions relatives de préférence ajustées en fonction des concentrations possibles en les anticorps recherchés dans les échantillons à tester. Des proportions appropriées doivent dans chaque cas être établies -expérimentalement, en mettant en oeuvre des proportions variables des deux constituants et en les mettant à réagir avec des échantillons contenant des concentrations type de l'anticorps immunologiquement homologue de l'antigène, notamment à des concentrations souvent rencontrées chez des sujets cliniquement suspects. EXEMPLE 1 : Test d'aaalutination sur carte de Trvpanozoma evansi. Dans la trypanosomiase chronique humaine, des recherches concernant le mécanisme de la variation antigénique et la réponse immune, ont conduit à la mise au point d'un diagnostic basé sur un simple test d'agglutination sur carte. Le principe d'un tel test est fondé sur la détection des anticorps circulants dirigés contre plusieurs antigènes du parasite infectieux en utilisant un type d'antigène variable de T aambiense apparaissant de façon précoce lors de l'infection. Lorsque ce test est employé dans les conditions connues pour le diagnostic de la trypanosomiase du chameau (5) et de l'infection par T.evansi du buffle (2), on observe une sensibilité faible. Des modifications ont été réalisées sur ce test dans le cadre de l'invention de façon à ce que la sensibilité soit portée à un niveau plus élevé par l'addition à l'antigène d'un anticorps anti-Ig polymérisé. Ce nouveau test est original en ce qu'il est fondé sur l'utilisation d'un antigène variable exprimé de façon précoce lors d'une infection, à savoir l'antigène (VAT) RoTat 1.2 (abréviation anglaise de Rode Trypanozoma antigèn type) de T evansi qui est présent chez tous les parasites T evansi, en combinaison avec un anticorps anti-Ig polymérisé. Ce test détecte l'agglutination des anticorps apparus dès les deux premières semaines de l'infection. - PréParation des anticorPs Polvmérisés anti-I. On désignera parfois dans la suite les anticorps anti-Ig polymérisés par le terme "adsorbant anti-Ig". Des antisérums spécifiques des immunoglobulines du buffle, du chameau, du porc ont été obtenus par immunisation de lapins avec des immunoglobulines spécifiques ci-dessus, de chacune des espèces animales ci-dessus et respectivement obtenues à partir des sérums de ces animaux et isolées sur protéine A par complexation avec une protéine A immobilisée sur un support approprié, notamment celui connu sous la marque SEPHAROSE 4B. La technique utilisée est celle décrite dans (3). Les anti-immunoglobulines obtenues ont ensuite été polymérisées par du chloroformiate d'éthyle et conservées à 4C dans un tampon phosphate (PBS) contenant 1% de sérum albumine bovine avec 0,1% d'azides tel que décrit dans (4). - Exécution du test. Ce test est réalisé comme suit - 45p litres de sérum dilué dans le tampon phosphate à pH 7,4 et 45p litres de l'antigène fixé RoTat 1.2 coloré par un colorant bleu et contenant 10% d'anticorps anti-Ig polymérisés sont déposés sur la surface de réaction -constituée par une carte d'agglutination recouverte d'une matière plastique blanche (Bruster) qui peut être substituée par un papier photographique RC. La suspension est étalée et soumise à réaction pendant 1Omn dans un évaporateur rotatif. Les résultats sont indiqués comme suit +++ (très fortement positif), ++ (fortement positif), -+ (positif), +/- (faiblement positif) - (négatif). La plus forte dilution de sérum donnant un résultat positif (+) est considérée comme le titre limite de détection - SDécificité du test Le test est significatif pour les dilutions suivantes du sérum avec ou sans l'utilisation d'anticorps polymérisés anti-immunoglobulines - buffle (water-buffalo): > 1/4 - bétail : 1/2 - porc : 1/2 - chameau : 1/2 Ce test est en très bonne corrélation avec la parasitémie et il est complémentaire des tests Elisa mettant en oeuvre des antigènes (voir le tableau I) basés sur des anticorps monoclonaux produits contre le T aambiense ou le T evansi. - Sensibilité du test La sensibilité du test a été mise en évidence par titration de 43 antisérums produits chez le lapin chez des bovins et des buffles expérimentalement infectés avec Tevansi (voir la figure 1) et la titration de sérums obtenus à partir de 4 chameaux infectés et de deux chameaux non infectés, de 139 échantillons collectés sur des porcs, du bétail et des buffles de différentes régions de Thailande. L'addition des anticorps anti-Ig polymérisé à l'antigène, a conduit à un accroissement de 10 à 100 fois de la sensibilité. Le test a permis de détecter les anticorps circulants contre des parasites dans le sang total, le sérum ou le plasma lors des deux premières semaines de l'infection (1), en l'absence de phénomènes de prozone constamment observés lorsque l'on utilise des anticorps anti-Ig non-polymérisés à la place des anticorps polymérisés. Au contraire l'utilisation des anticorps anti-Ig conduit à des résultats fiables, meme à des dilutions faibles de sérum (2). TABLEAU I : Comraraison entre 4 tests nour le diagnostic de T evansi chez le buffle. Nombre Parasité- anticorps testés par: Ag-ELISA d'animaux mie CATT CFT 1 + 320 40 0.087 2 +++ 160 40 0.193 3 ++ 320 160 0.098 5 + 640 80 0.855 7 - 640 80 0.078 9 +++ 320 80 0.262 12 + 160 160 0.198 13 - - 120 0.034 23 - 640 20 0.757 24 +++ 320 20 0.836 Controle .- 4 2 0.020 (D.0.) CATT= Test pour la recherche de Trypanosome par agglutination sur carte. CFT= Test de fixation sur le complément. D.O= Densité Optique : les valeurs supérieures ou égales à 0,050 sont considérées comme positives. EXEMPLE 2 - Test d'alutination sur carte Pour la maladie du sommeil chez l'Homme. Le test comprend l'utilisation d'un antigène conventionnel Testryp(R)CATT et d'antigène RoTat 1.2 ainsi que l'utilisation d'un anticorps anti-Ig polymérisé (anticorps dirigés contre des immunoglobulines G humaines). La préparation de l'adsorbant anti-Ig et l'exécution du test sont réalisées comme décrit dans l'exemple 1. La sensibilité du test a été mise en évidence après titration de serums connus de patients africains infectés par T aambiense et T rodesiense et après titration de serums de contrôle obtenus chez des personnes européennes saines. L'addition d'un adsorbant anti Ig a conduit à un accroissement de 10 à 100 fois de la sensibilité. EXEMPLE 3 - Test de la brucellose. Ce test est basé sur l'utilisation d'un antigène en tampon acide, coloré avec du rose Bengal et Complété avec des anticorps polymérisés anti-Ig humaines. Ce. test est réalisé sur des cartes d'agglutination .jetables et ces réactions spécifiques ont lieu dans un intervalle de 5 minutes. La sensibilité du test a été mise en évidence par la titration de sérums de patients européens ayant des anticorps bloquants pour la brucellose ainsi qu'avec des sérums obtenus chez des européens sains. L'addition d'un adsorbant anti Ig à l'antigène conventionnel coloré par le rose Bengal a permis d'obtenir un accroissement de 2 à 8 fois de la sensibilité. EXEMPLE 4. - Test d'a4alutination Pour HIV. On prépare un support solide coloré de façon appropriée et consistant en des particules d'une substance polymérisée telles qu' un plastique ou un autre polymère organique. Les particules peuvent également être constituées par des protéines insolu biliées ne réagissant pas de façon croisée avec les anticorps polymérisés. Ces particules protéiques sont préparées par couplage contrôlé. La protéine de surface de HIV est ensuite couplée à ce support par l'intermédiaire de liaisons covalentes. Une suspension de particules recouvertes d'antigènes est préparée pour mettre en oeuvre le test d'agglutination. Des anticorps dirigés contre les IgM ou les IgC sont détectés en utilisant des adsorbants spécifiques anti IgM ou anti IgG polymérisés. La réalisation -du test est conduite comme dans l'exemple 1. CONCLUSION Les tests d'agglutination mettant en oeuvre des anticorps polymérisés répondant aux définitions de l'invention, ont permis la détection des anticorps circulant dirigés contre des parasites ou des virus, à partir du sang complet, du plasma ou de sérum. De tels tests sont très rapirses (10mn), fiables, très sensibles et peuvent être adaptés pour des criblabes en grand nombre. En conséquence, le traitement des maladies infectieuses décrites dans les exemples peut être immédiatement entrepris après un diagnostic positif, BIBLIOGRAPHIE (1) - Bajyana Songa E., et al, Ann. Soc. belge Méd trop. 1987, 67, 51-57. (2) - Bajyana Songa E., et al, Ann. Soc. belge Méd. trop., 1987, 67, 137-148. (3) - Goding J.W. Journ. Imm. Meth., 1976, 13, 215-226. (4) - Van der Loo W., et al, European Journal of Immunology, 1977, 7(1), 15-22. (5) - Zweygarth E. et al, Ann. Soc. belge Méd. trop. 1984, 64, 309-313. REVENDICATIONS 1/ - Anticorps dirigés contre des immunoglobulines (anticorps anti-Ig) à l'état polymérisé, solubles capables notamment de se fixer de façon non spécifique aux parties constantes d'anticorps produits lors d4une infection due à un virus ou à un parasite tels que le trypanosome, le vecteur de la brucellose, le virus HIV. 2/ - Anticorps anti-Ig selon la revendications 1 composés d'oligomères comportant au moins 2 motifs, notamment 2 à 25 anticorps anti-Ig couplés de façon covalente. 3/ Procédé de diagnostic in vitro de la présence d'anticorps déterminés dans un échantillon biologique de mammifère comprenant les étapes suivantes - la mise en contact de l'echantillon biologique avec un antigène marqué spécifique de l'anticorps recherché, en présence d'anticorps anti-Ig polymérisés selon l'une quelconque des revendications 1 ou é, ces anticorps anti-Ig étant formés contre des Ig fournies par un mammifère de la même espèce que celui dont provient le milieu biologique testé. - la détection de ceux des agrégats d'anti-Ig qui portent également l'antigène marqué. 4/ Procédé de diagnostic in vitro selon la revendication 3, caractérisé en ce que le milieu obtenu après mise en contact de l'échantillon à doser avec les anticorps anti-Ig polymérisés selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 et avec les antigènes marqués, est concentré jusqu'à provoquer l'insolubilisatjon des agrégats formés. 5/ Procédé de diagnostic in vitro selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, caracterisé en ce que de petites quantités du milieu obtenu après mise en contact de l'échantillon à doser avec les anticorps anti-Ig polymérisés selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 avec les antigènes marqués, sont déposées en taches sur un support et soumises à évaporation préalablement à la mise en oeuvre de l'étape de détection. 6/ Procédé de diagnostic in vitro selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que la détection des agrégats formés est réalisée soit grace à une étape de détection de la coloration de ces agrégats, après marquage de l'antigène spécifique incorporé dans le milieu grace à un colorant, tel que le bleu de Coomassie ou le rose. de Bengale ou encore grâce à un agent fluorescent, soit grâce à une étape de détection d'un marqueur enzymatique lorsque l'antigène spécifique incorporé dans le milieu est marqué par un marqueur enzymatique. 7/ Kit de diagnostic de la présence anticorps déterminés comprenant - des anticorps polymérisés selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, - des antigènes marqués spécifiques des anticorps déterminés recherchés. 8/ Procédé de préparation d'anticorps anti-Ig selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, comprenant la polymérisation d'anticorps anti-Ig en présence .d'un agent de polymérisation habituellement utilisé pour polymériser ou coupler les protéines, tel que le chloroformiate d'éthyle, la glutaraldéhyde ou tout réactif polyfonctionnel de couplage entre des fonctions actives respectivement portées par les protéines que représentent ces anticorps anti-Ig. 9/ Réactif pour le diagnostic de la présence d'anticorps déterminés dans un échantillon biologique constitué par une composition contenant à la fois l'anticorps anti-Ig polymérisé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2 et un antigène marqué spécifique de l'anticorps recherché, dans des proportions relatives de préférence ajustées en fonction des concentrations possibles en anticorps recherchés dans 1' échantillon testé.