FR 2622700 A1 19890505 FR 8715060 A 19871030 La présente invention-est relative à l'identi fication de la séquence de la protéine pS2 qui correspond à un ARNm dont la synthèse est induite par un oestrogène dans les cellules cancéreuses de sein humain, ainsi qu'à des fragments peptidiques ae cerze protéine ; la présente invention est également relative à -des anticorps polyclonaux et monoclonaux anti-pS2 et anti - fragments peptidiques de la proté ine pS2, et aux applications de ces protéine, peptides et anticorps pour le diagnostic et la détection de cancers du sein hormono-dépendants. L'hormono-dépendance du cancer du sein est un fait connu depuis 1896 lorsque Beatson ILancet (1896) 2, 104-107] rapportait deux observations de régression de tumeurs inopérables après ovariectomie chez des femmes en core réglées. Il est maintenant bien établi qu'environ un tiers des cancers mammaires répondent à des hormones et régressent à la suite de manipulations hormonales variées. Jusqu'à ces dernières années il n'existait pas de test biochimique pour identifier les femmes atteintes de cancer hormono-dépendant et qui pouvaient donc bénéficier d'une thérapeutique endDcrinienne. En 1971t Jensen et coll. rNATL CANCER INSTI. MONOGR. (1971) 34, 55-701 ont, les premiers, montré que la - mesure des récepteurs oestrogéniques dans un prélèvement tumoral pouvait être utile pour prédire la réponse à une surrénalectomie. Cette observation a depuis lors été amplement confirmée puisque 50 à 65 % des femmes dont les tumeurs contiennent des récepteurs oestrogéniques (RE) répondent à une thérapeutique endocrinienne, alors que celles dont les tiuneurs en sont dépour-maes n'ont, au mieux, que 10 % de chances d'être améliorées par le traitement hor- En effet, si les cellules cancéreuses possè dent des sites ayant une forte affinité pour une hormone West-à-dire un récepteur), sites normalement présents dans la glande mammaire, leur croissance, comme celle des cellu les normales, peut être régulée par l'environnement hormonal. Au contraire, si les cellules cancéreuses perdent leurs récepteurs au cours de la transformation maligne, elles ne sont plus reconnues comme cellules cibles. Cependant le résultat du dosage des récepteurs oestrogéniques (RE) ne permet pas de prédire parfaitement la réponse à une hormono thérapie puisque 55 % seulement des femmes dont les tumeurs possèdent ces récepteurs répondent favorablement à un trai tement hormonal. Une des explications réside dans le fait, qu'au cours de la dédifférentiation, certaines tumeurs peu vent perdre leurs récepteurs oestrogéniques. Si ceux-ci per sistent elles peuvent conserver la capacité de lier l'estra- diol mais sont incapables de poursuivre les étapes ultérieu res de l'action oestrogénique Il s'agit dans les deux cas de tumeurs qui sont hormonalement autonomes ou hormono- résistantes. Pour vérifier cette dernière hypothèse on est allé au-delà de l'étape initiale, c'est-à-dire de la liai son au récepteur cytosolique et on a recherché les produits terminaux de l'action intracellulaire des oestrogènes. C'est le cas, par exemple, du récepteur de la progestérone (RP) puisque sa synthèse est sous la dépendance des oestrogènes dans les cellules MCF-7 (lignéecellulaîre dérivée d'un can cer du sein humain) et probablement dans les cellules cancé reuses mammaires humaines in vivo. Effectivement, si l'on tient compte du taux des récepteurs progestéroniques, les taux de rémission des cancers sous traitement hormonal sont de l'ordre de 65 %. De nombreux essais cliniques ont établi que 80 % des femmes dont les tumeurs possédaient les deux récepteurs répondent à une hormonothérapie. Par contre si la tumeur contient des récepteurs oestrogéniques mais pas de récepteurs progestéroniques, ja probabilité de réponse ne dépasse pas un tiers des cas. Les récepteurs progestéroniques (RP) ajoutent donc une information supplémentaire sur la prédiction de la réponse thérapeutique. Les oestrogènes stimulent la synthèse d'un grand nombre de protéines qui sont libérées dans le milieu d'incubation de lignées cellulaires telles que les MCF-7. La plupart des protéines sécrétées sont détectées dans le mi-lieu d' incubation avec ou sans oestradiol mais leur activité est très nettement augmentée en présence de cette hormone. Elles correspondent à des poids moléculaires de 37 000, 46 000, 54 000, 60 000 M ZMAIRESSE et al. in PrCENr RESULTS IN CANCER RESEARCH , G. LECLERCQ, S. TOMA, R. PARIDAENS, J.C. HEUSEN, Vol. 91, (1984) 301--;3061. Certaines d'-entre elles .j (46 000, 54 000 et 60 000 M) sont identiques aux protéines cytosoliques. Une protéine de 50 000 M est plus abondante dans le milieu d'incubation traité par oestradiol mais les travaux de MAIRESSE démontrent qu'il s 1 agit d ' une stimula tion de la sécrétion de cette -rotéine sous l'action d'une hormone, plutôt qu'une induction. Par ailleurs, ces protéi nes stimulées existent également dans le milieu d'incubation des cellules MCF-7 et sont présentes également dans le milieu d'incubation des cellules Evsa-T oestrogéno-indépen- dantes, mais l'oestradioldans ce dernier milieu n'a aucun effet sur leur synthèse et/ou leur sécrétion. Il ne s'agit donc pas de l'induction d'un nouveau produit sous influence hormonale mais seulement de l'augmentation de la concentra tion d'un produit existant. ROCHEFORT (même publication que ci-dessus p. 289-294) a mis en évidence un taux élevé de protéine 52 K dans le milieu d'incubation et a montré que l'induction de cette protéine était spécifique de l'action de 1,oestra- diol à des concentrations physiologiques alors que la progestérone et la- dexaméthasone étaient inactives. Le tamoxifène qui inhibe la croissance cellulaire n'induit pas la sécrétion de la protéine 52 K et prévient l'action de l'oestradioldans un rapport molaire de 10. L'un de ses méta bolites, le mono-hydroxy-tamoxifène-est 200 fois plus actif que le tamoxifène pour bloque4.la croissance cellulaire et la sécrétion de 52 K dans les cellules MCF-7. Plus récem ment, cette même équipe a pÛ constater que dans une va riante des cellules MCF-7, les cellules R-27 qui possèdent des RE et RP mais dont la croissance échappe à l'action des anti- oestrogènesila protéine 52 K continue à être sécrétée en présence de tamoxifène ou de mono-hydroxy-tamoxifène. Une équipe de chercheurs comprenant certains des Inventeurs de la présente Demande a visé à l'expression de gènes spécifiques. A partir d'une librairie de cDNA construite à partir de cellules MCF-7 induites par 1, oestre- diol, il a été possible de procéder à un clonage différen tiel des cDNA correspondant au mRNA synthétisé en présence de cette hormone. A l'aide d'une sonde de cDNA fabriqué à partir de cellules poussant en présence et en l'absence d'hormone, un clone cDNA correspondant à un mRNA qui n'est présent que dans les cellules MCF-7 cultivées en présence d 'oestradiol, a pu être isolé -Il a été dénommé pS2 . Les Auteurs ont déduit de la détermination de la séquence nucléotidique du cDNA cloné qu'il slag-it d'une protéine de faible poids moléculaire constituée de 84 acides aminés rJAKOWLEW et Al. nUCI,,EIC ACIDS RES j (1984) 12, 2861-28781 . 1-a régulation hormonale qui s'exerce sur le gène pS2 est située au niveau transcriptionnel. Le gène n'est pas trans crit en l'absence d1oestradiol,alors que l'accumulation de mRNA est nette huit heures après l'addition de l'hormone au milieu de culture. Les Auteurs n'avaient cependant pas encore isolé la protéine pS2. Le criblage de la librairie de cDNA construite à partir de cellules MCF-7, induit par l'oestradiol,a per mis d'isoler ègalement deux autres clones 36 B4 et 3 A5. Aucune régulation hormonale ne s'exerce au niveau transcriptionnel de leur gène correspondant. Ces deux clones ont été appelés clones "constants". Les sondes 36 B4 et 3 A5 peuvent donc être utilisées pour apprécier la quantité de mRNA totaux présents,alors que la sonde pS2 correspond à un RNA spécifique, oestrogeno-induit,des cellu, les MCF-7. Le pS2 RNA n'est pas présent dans le RNA extrait des cellules de cancer du sein humain T 47 D, qui contien nent à la fois les récepteurs oestrogéniques et progestéro- niques, mais dans lesquelles la présence dé ce dernier ré cepteur est constitutive. A l'inverse, le RNA-36 B4 est présent dans les cellules T 47 D. L'obiervation que le pS2 RNA est exprimé dans la lignée cellulaire MCF-7 dérivée d'un cancer du sein humain, mais ne l'est pas dans la lignée cellulaire T 47D, indique une voie d'identification de cancers du sein hor- mono-dépendants. C'est la raison pour laquelle les Inven teurs ont cherché à vérifier si l'expression du gène pS2 peut constituer un marqueur supplémentaire pour le dépis tage des cancers du sein hormono-dépendants. Selon la ré férence JAKOWLEh et Al. citée plus haut,le pS2 mRNA code rait pour une protéine comprenant 84 amino-acides et dont le poids moléculaire est de 9140 Daltons. La poursuite des recherches par les Inventeurs leur a permis d'isoler la pr*otéine pS2 et de la synthéti ser au moins en partie et leur a égalen-ent permis d'élaborer des anti corps à partir de ladite protau"le et clé fragments de celle-ci. La présente invention a pour objet une protéine dénommée pS2, qui est caractérisée en ce qu'elle comprend 84 amino-acides, en ce que son amiino-acide N-terminal est une méthionine et en ce que son poids moléculaire est de l'or dre de 9140 Daltons. L'invention englobe également tous fragments de ladite protéine. Dans cette perspective, la présente invention a notamment pour objet un peptide caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment de la protéine sus dite, en ce qu'il comprend 58 amino-acides et en ce que son poids moléculaire est de 6450 Daltons environ. La présente invention a aussi pour objet un pel5tide caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment de la protéine susdite, en ce qu'il comprend 63 amino-acides et en ce que son poids moléculaire est d'en viron 6970 Daltons. La présente invention a également pour objet un peptide caractérisé en ce qu'il est constitué par un frag ment de la protéine susdite, en ce qu'il comprend 31 amino- acides, en ce que ces 31 amino-acides correspondent aux 31 amino-acides terminaux à l'extrémité COOH-terminale de ladite protéine et en ce que son poids moléculaire est d'environ 3450 Daltons. La présente invention a, de plus, pour objet un polypeptide caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment de la protéine susdite, lequel comprend 60 amino-acides et en ce que son poids moléculaire est d'en viron 6660 Daltons. La présente invention a également pour objet un peptide caractérisé en ce qu'il est constitué par un frag ment de la protéine susdite, lequel comprend 30 amino-aci- des qui correspondent aux 30 amino-acides qui se trouvent à l'extrémité NH 2-terminale de ladite protéine et en ce que son poids moléculaire est d'environ 3330 Daltons. La Présente invention a aussi pour objet un peptide caractérisé en ce qu'il est constitué par un frag ment de la protéine susdite, lequel comprend 28 amino- acides qui correspondent aux 28 amino-acides qui se trou vent à l'extrémité C-terminalede ladite protéine et en ce que son poids moléculaire est d'environ 310ODaltons. La séquence en amino-acides de la protéine pS2 (I), telle que décrite en tant que séquence potentielle dans la référence JAKOVUEW citee plus haut, est la suivante telle que confirmée par les Inventeurs. 1 10 MET ALA THR MET GLU ASN LYS VAL ILE CYS ALA LEU VAL LEU 20 VAL SER MET LEU ALA LEU GLY THR LEU ALA GLU ALA GLN THR 30 i 40 GLU THR CYS THR VAL ALA PRO ARG GLU ARG GLN ASN CYS GLY 50 PHE PRO GLY VAL THR PRO SER GLN CYS ALA ASN LYS GLY CYS 60 70 CYS PHE ASP ASP THR VAL ARG GLY VAL PRO TRP CYS PHE TYR 80 PRO ASN THR ASP VAL PRO PRO GLU GLU GLU CYS GLU PHE (I) - Conformément à l'invention, la composition (A) en amino-acides du peptide qui comprend 63 amino-acides est la suivante 30 THR LEU ALA GLU ALA GLN THR GLU THR CYS TER VAL ALA PRO ARG 40 50 GLU ARG GLN ASN CYS GLY PHE PRO GLY VAL TER PRO SER GLN CYS 60 ALA ASN LYS GLY CYS CYS PHE ASP ASP THR VAL ARG GLY- PRO 70 80 TRP CYS PHE TYR PRO ASN THR ILE ASP VAL PRO PRO GLU GLII GLU CYS GLU PHE (A) Egalement conformément à l'invention, la sition (B) en amino-acides du peptide qui comprend 58 amino-acides est la suivante 30 40 GLN THR GLU THR CYS THR VAL ALA PRO ARG GLU ARG GLN ASN CYS 50 GLY PHE PRO GLY VAL THR PRO SEP, GLN CYS ALA ASN LYS GLY CYS 60 70 CYS PHE ASP ASP THR VAL ARG GLY VAL PRO TRP CYS PHE TYR PRO 80 ASN THR ILE ASP VAL PRO PRO GLU GLUGLU CYS GLU PHE (B) Conformément à l'invention, la composition (C) en amino-acides du peptide qui comprend 31 amino-acides est la suivante : (C) 60 LYS GLY CYS CYS PHE ASP ASP THR VAL ARG VAL PRO TRP 70 80 CYS PHE TYR PRO ASN THR ILE ASP VAL PRO PRO GLU GLU GLU -CYS GLU PHE Conformément à l'invention, la composition (D) en amino-acides du peptide qui comprend 60 amino-aci- des est la suivante : 30 GLU ALA GLN THR GLU THR CYS THR VAL ALA PRO ARG GLU ARG 40 50 GLN ASN CYS GLY PHE PRO GLY VAL THR PRO GLN CYS ALA 60 ASN LYS GLY CYS CYS PHE ASP ASP THR VAL ARG GLY VAL PRO 70 80 TRP CYS PHE TYR PRO ASN THR ILE ASP VAL PRO PRO GLU GLU GLU CYS GLU PHE (D) Egalement conformément à l'invention, la compo sition (E) en amino-acides du peptide qui comprend 30 amino-acides est la suivante 30 GLU ALA GLN THR GLU THR CYS THR VAL ALA PRO ARG GLU ARG 40 50 GLN ASN CYS GLY PHE PRO GLY VAL THR PRO SER GLN CYS ALA ASN LYS (E) Egalement conformément à l'invention, la compo sition (F) en amino-acides du peptide qui comprend 28 amino-acides est la suivante : 60 70 CYS PHE ASP ASP THR VAL ARG GLY VAL PRO TRP CYS TYR 80 PRO ASN THR ILE ASP VAL PRO PRO GLU GLU GLU CYS GLU PHE (F) La présente invention a également pour objet des anticorps polyclonaux anti-pS2 caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par immunisation de lapins ou autres animaux appropriés contre la protéine pS2 susdite et ses fragments, notamment contre l'un quelconque des peptides de formules (A) à (F). La présente invention a en outre pour objet des anticorps monoclonaux anti-pS2 caractéri.sés en ce qu'ils sont obtenus par clonage d'hybridomes résultant de la fusion de cellules de rates de mammifères immunisés par des injections convenables de protéine pS2 ou d'un de ses frag#ntsr- notannent d'un peptite de formules (A) à (F), tels qu'identifiés plus haut, avec des cellules d'un nyé1cim approprié. Bien entendu, tous autres procédés d'obtention d'anticorps monoclonaux, entrent dans le cadre de la pré sente invention, dans la mesure oÙ ils permettent d'obte nir les anticorps monoclonaux anti-pS2 qui sont protégés dans le cadre de la présente invention. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de la protéine pS2 purifiée, à partir de cellules MCF-7, caractérisé en-ce que l'on recueille le surnageant de cellules MCF-7 mises en culture en pré sence d'oestradiol, en ce qu'on purifie ce surnageant en en éliminant par précipitation les protéines de haut poids moléculaire d'ùne part, et les protéines insolubles à pH de l'ordre de 1, d'autre part, en ce qu'on purifie en suite le surnageant recueilli, qui contient le pS2, par centrifugation, le culot renfermant le pS2 étant ensuite purifié par chromatographie, pour récupérer les fractions contenant le pS2, qui sont éventuellement congelées et/ou concentrées. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé d'obtention de la protéine pS2, cette dernière est isolée par immuno-précipitation soit d'extraits de cellules MCF-7, soit/et de milieu de culture de ces cel lules, à l'aide d'anticorps dirigés contre la protéine pS2 et/ou contre des fragments de celle-ci, tels que, notamment, les peptides de formules (A) à (F) ci-dessus. La présente invention a, de plus, pour objet un procédé de préparation de la protéine pS2 et de ses fraqnLants, notamnent des peptides de formule (A) à (F) par voie de synthèse, no- tarm-ent par voie de synthèse chimique ou par biosynthèse. On peut utiliser .0 en particulier, la méthode en phase solide mise au point par MERRIFIELD. (La méthode de MERRIFIELD est décrite dans "Spécial Methods in peptide synthesis" publié en 1980 par E. GROSS et J. MEIENHOPER dans "THE PEPTIDES : Analysis, synthesis, biology", vol. 2, Partie A, p. 1-254, Academic Press, New-York), ou toute autre méthode de synthèse (biosynthèse, par génie généti que, notamment). La présente invention a également pour objet une méthode de dépistage et de diagnostic de cancers du sein hormono-dépendants, qui est caractérisée en ce que l'expression du gène pS2 (protéine pS2) est déterminée par méthode immunologique dans des prélèvements biologi ques effectués chez des sujets soumis au dépistage. Selon un mode de réalisation avantageux de la méthode de dépistage et de diagnostic conforme à l'inven tion, l'expression du gène pS2 est déterminée par immu- nocytochimie. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite méthode de détection, l'expression du gène pS2 est déterminée dans des prélèvements de tumeurs. Selon encore un autre mode de réalisation avan tageux de la méthode de détection et de diagnostic confor- rm à l'invention, les prélèvezient de turmurs mis en oeuvre peuvent être, entre autres, des coupes histologiques ou des cytosols. Selon une dispos ition avantageuse de ce mode de réalisation, les prélèvements de'tumeurs mis en oeuvre sont des coupes histologiques conservées et stabilisées par enrobage dans de la.paraffine et fixées à la forma- line, qui confèrent à la méthode de diagnostic une sensi bilité très grande, un faible bruit de fond et préservent la structure histopathologique. Selon un mode de réalisation avantageux de la rAthode de détection et de diagnostic conforme à l'inventi nn Y donné # ti tre ple, la méthode immunocytochimique est mise en oeuvre par incubation desdits prélevemenrs avec des anticorps de lapin, ou autre animal approprié, poly- ou.monoclonaux anti-pS2 ou anti- fragments de pS2, précédée d'une in cubation avec du sérum de mouton (ou d'un autre animal approprié) pour réduire les colorations non-spécifiques, et suivie d'une pluralité d'incubations successivement avec de-s IgG de mouton anti-lapin et avec un système de marquage et de révélation approprié-de l'anticorps. Selon une disposition avantageuse de l'invention ledit système de marquage et de révélation de 1'--.iticorps peut comprendre un système PAP (peroxydase-antiperoxydase) de lapin, avec lequel lesdits prélèvements sont alors in cubés, après quoi ils sont incubés avec du DAB (tétrachlor- hydrate de 3,3'-diamino-benzl;dine), ces opérations étant éventuellement suivies d'une coloration de la coupe par de l'hématoxyline ou analogue, la coloration obtenue étant estimée sur une échelle d'intensité de coloration et la proportion de cellules tumorales colorées déterminée en pourcentage des cellules tumorales totales (1-100 %), tan dis que l'indice de coloration est obtenu en multipliant le pourcentage-de cellules colorées par le score de colo ration (1-300). On peut, bien entendu, mettre en oeuvre tout autre système de marquage et de révélation approprié de l'anticorps, par une méthode directe ou indirecte (notam ment par la méthode sandwich, par les systèmes de marquage à l'avidine et à la biotine, par fluorescence, phospho rescence, protéinat, RIA, ELISA, etc .... Etc.) Bien que l'hormono-dépendance de certains can cers du sein soit bien connue, la plupart des-patientes présentant des tumeurs contenant des RE (récepteurs d'oes- trogènes), mais pas toutes, peuvent tirer bénéfice d'un traitement hormonal. D'un autre cÔté, le fait que 30 à 40 % des patientes présentant des cancers riches en RE ré pondent négativement à un traitement hormonal a été attri bué soit.à l'hétérogénéité de la tumeur, soit au fait que les RE pouvaient ne pas être fonctionnels. Il a été, en outre, suggéré que la détermination de la teneur en RP (récepteurs de progestérone), dont l'expression est connue comme étant oestrogène-dépendante dans les tissus reproducteurs normaux et dans la lignée cellulaire MCF-7 dérivée d'un cancer du sein, pourrait permettre l'identi fication de tumeurs présentant des récepteurs fonctionnels. En fait, tous les cancers du sein RE(+) et RP(+) ne répon dent pas à l'hormono-thérapie (seulement 80 % le font), ce qui montre la nécessité de disposer de marqueurs addi tionnels de réponse à l'hormonothérapie pour permettre une identification plus aisée des cancers du sein qui pourraient bénéficier d'une hormonothérapie. Selon un mode de réalisation avantageux de la méthode de détection et de diagnostic conforme à l'inven tion, des prélèvements d'une tumeur du sein so nt soumis à une détection immunocytochimique simultanée des RE, des RP et de la protéine pS2, faisant apparaitre d'une part, une hétérogénéité fonctionnelle additionnelle dans les cancers du sein RE(+) (avec 60 % environ seulement de tu meurs RE(+) également positives pour les RP et l'expres sion de pS2), et d'autre part, une grande homogénéité des cancers (RE(-) en ce qui concerne les RP et l'expression du gène pS2 (avec environ 96 % d'absence d'expression de ces deux gènes inductibles par des oestrogènes). Selon une disD position avantageuse de ce mode réalisation, les tests de detection immunocytochimique des RE et des RP soht réalisés sur des coupes histologiques congelées à -180'C, de préférence dans l'isopentane. Les techniques mises en oeuvre pour la détection immunocytochimique des RE et des RP sont connues et décrites dans la littérature. Outre les dispositions qui précèdent, l'in vention comprend encore d'autres dispositions, qui res sortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de réalisation des objets de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de réalisation sont donnés uniquement à titre d'illustration des objets de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1- Purification de la protéine pS2 produite par les cellules MCF-7. .On cultive des cellules MCF-7 en présence d'oestradiol 10- 9 M pendant 4 jours. On recueille le surnageant de culture enrichi en pS2 sécrété dans le milieu de culture par lesdites cel lules et on le soumet successivement à l'action : - de l'acétone (IV) à -20*C pour précipiter des protéines de haut poids moléculaire, - de l'HCl 12N (à pH 1 environ) pour précipiter les pro téines insolubles à ce pH. On centrifuge successivement les deux précipi tés pour éliminer les culots et ne conserver que les sur nageants renfermant le pS2. Ce surnageant est traité par 4V d'acétone à -20'C pour précipiter les autres protéines présentes dont la protéine pS2. on centrifuge ; on élimine le surnageant ; on recueille le culot qui renferme la protéine pS2. Le culot est lyophilisé ; on ajoute au lyophi- lisat 3 ml de tampon KC1, 50 mM EDTA ; on le soumet à une chronatoara,,Dhie en IIPLC sur G 3000 et phase inverse successive-ment. On récupère 120 fractions de 1,5 ml chacune q ui sont soumises à un Western blotting (immuno-empreinte). Les fractions contenant la protéine pS2 sont identifiées à l'aide d'anticorps polyclonal de lapin dirigé contre un peptide de synthèse correspondant aux 31 amino-acides ter minaux de la protéine pS2. Les fractions positives sont réunies et soumi ses à une deuxième chromatographie en HPLC phase inverse de type BROWNzLEE-AQUAPORE RP 300, puis congelées à -20'C ou concentrées par centrifugation sous vide. L'échantillon est contrôlé sur gel SDS-PAGE, ré vélé par coloration des protéines au nitrate d'argent. On isole la protéine pS2 pure à 80 %. Exemple 2 - Synthèse de la protéine de formule I et de ses fragments, notamment des peptides de formules (A), (B), (C), (D), (E), (F). La synthèse de chacune de ces substances est réalisée en mettant en oeuvre la méthode en phase solide de MERRIFIELD. Après lyophilisation, la protéine ou les peptides synthétisés sont respectivement réduits en pré sence d'un mélange dIurée/#-mercaptoéthanol, relargués pour en éliminerles sels, relyophilisés et leur composi tion en amino-acides est vérifiée. Exemple 3 - Préparation d'anticorps polyclonaux à l'aide du peptide de formule (C) Le peptide (C) composé des 31 ami'no-acides à l'extrémité carboxy-terminale de la protéine (J), synthé tisé conformément à l'Exemple 2, est injecté par voie sous- cutanée à des lapins, 3 fois à 2 semaines d'intervalle, à raison de 200 gg, mélangé à de l'adjuvant complet de Freund pour les deux premières injections. Le sérum a été collecté deux semaines après la dernière injection et utilisé à une dilution appropriée. Selon la même méthode, on prépare des anticorps polyclonaux à partir de tous les fragments de la protéine' (Il et notamment à partir des peptides de formules (A), (B) (D), (E), (F). Exemple 4 - Préparation d'anticorps monoclonaux spécifi ques. Des souris Balb C ont été utilisées. Le schéma de l'immunisation a été le-suivant : t injections sous-cutanées dorsales en présence d'adjuvant complet de Freund de 5 gg de protéine pS2 puri fiée. t jours t 45 jours injections sous-cutanées dorsales en pré- _.sence d'adjuvant incomplet de Freund de 5 gg de protéine pS2 purifiée. t 52 jours prélèvement de sang à l'oeil et recherche des anticorps spécifiques dans le sérum par la technique Elisa contre le peptide de synthèse et la protéine native. Réinjection si nécessaire jusqu'à positivation de ce contrÔle tous les 15 jours. Les rates des souris immunisées ont été fusion nées comme suit, après avoir effectué avant la fusion, pour avoir la meilleure production d'anticorps possible, trois injections de 2.gg de protéine, chacune par voie intra- péritonéale, respesticement à j. (-15), j. (-10) et j. (-5). La fusion a été réalisée en présence de PEG avec des cellules de myélome X63, à raison de deux cellules de rate pour une cellule myélome. Les hybridomes obtenus ont été distribués en 11 plaques de 96 puits. L'addition de RAT dans le milieu de culture quatre heures après la fusion permet de sélectionner les hybridomes. Les cultures ont été poursuivies en présence de macrophages. Les premiers tests de surnageant de culture ont été entrepris environ 8 jours après la fusion. Ces derniers sont identiques à ceux effectués sur les sérums, à savoir technique Elisa contre les peptides de synthèse et notamment le peptide de formule (C), par exemple, contre la protéine native et détection immunohistochimique sur coupe de tissus. La classe des anticorps produits a également été déterminée. 53 puits renfermant 1 ou plusieurs hybridomes ont ainsi été sélectionnés, dont certains d'entre eux ont été clonés, notamment le puits 9H4 qui donne deux types de clones : les uns réagissant uniquement avec la protéine native, les autres également avec les peptides de syn thèse et notamment, le peptide de formule (C) utilisé dans le présent Exemple et étant dirigés contre l'extrémité -COOH de la protéine. Certains des clones obtenus permet tent une excellente détection immunohistochimique de la protéine pS2 sur les coupes de biopsies de cancers du sein, en tous points identiques à celle précédemment obte nue avec les anticorps polyclonaux dirigés contre les peptides de synthèse et notamment le peptide (C). Exemple 5 - Caractérisation de la protéine pS2. 70 à 90 % de monocouches confluentes de cellules MCF-7 cultivées en présence d'oestradiol ont été marqués par de la 35 S-cystéine (cf. figure 1 annexée) ou de la 35 S-méthionine (cf. figure 2 annexée) et le milieu ainsi que des extraits cellulaires ont été collectés à des intervalles déterminés. Des aliquots ont été immunoprécipités par de l'anti-sérum pS2 et analysés sur un gradient-de 15 à 25 % de gel de SDS-PAGE. Le déroulement dans le temps relatif à la 35 S-cystéine (figure 2, A et B) montre la présence d'une seule bande située à environ 7 KD, ce qui est en accord avec le poids moléculaire déduit de la séquence d'ADNc. Dans l'extrait cellulaire (partie B de la figure 1) le signal est déjà visible au bout de 15 minutes de marquage. ùorsque les échantillons de milieu correspondant à des aliquots identiques du milieu de culture total ont été analysés (partie A de la figure 1), le signal est devenu irisible au bout d'une heure de marquage, ce qui suggère un certain retard dans le processus de secrétion. Dans la figu re 1 C, l'immunoprécipitation de la protéine pS2 dans le milieu (colonne 2) est montrée comme étant spécifique atten du que la bande de la protéine pS2 est en compétition avec le peptide synthétique C (colonne 1). Contrairement à cela, aucune bande de la dimension attendue pour la protéine pS2 n'a pu être détectée à aucun moment du déroulement dans le temps, aussi bien dans le -milieu que dans l'extrait cellulaire après marquage par la 35 S-méthionine et immunoprécipitation par l'anti-sérum (cf. figure 2,partie (A). Le schéma de bande présent dans la partie- supérieure du gel a persisté après utilisation d'un sérum témoin non-immun (colonnes 7 et 15) et il n'est pas entré en compétition par l'addition du peptide synthétique (C) à la réaction d'immunoprécipitation (colonnes 8 et 16), ce qui indique qu'il correspond à une adsorption non spécifique. Le milieu de culture et les extraits cellulaires ont également été analysés sans immunopurifica'tion posté rieure au marquage par la 35 S-cystéine (cf. figure 2b, colon nes 1 et 4) ou par la 35 S-méthionine (colonne 5). Une-bande (fléchée), marquée avec de la cystéine (colonne 1) mais pas par de la méthionine (colonne 2) était clairement visible dans le milieu de culture et elle migrait au même niveau que la protéine pS2 immunoprécipitée (colonne 3). Contrai rement à cela, il n'y a pas eu de marquage différentiel dans l'extrait cellulaire total, ce qui indique que la masse des protéines qui migre à ce niveau ne correspond pas à la protéine pS2. Les résultats qui viennent d'être mentionnés fon dent l'hypothèse selon laquelle les trois résidus méthio- nine placés à l'extrémité amino-terminale de la séquence de la protéine pS2 déduite de l'ADNc, appartiennent à un peptide signal qui est rapidement clivé. L'hypothèse de départ a été que le clivage par la peptidase peut se produire en deux sites possibles, le peptide ayant une longueur de 58 ou de 63 amino-acides. Dans le dernier cas, un résidu leucine devrait Atre présent dans la protéine secré- tée. Pour distinguer entre ces deux possibilités, des cellu les MCF-7 ont été marquées par de la . 14 C-Jeuciee (cf. figu re 1C). Aucune bande de protéine n'a été v# dans la rosi- tion de la protéine pS2 (cf. colonne 1, flèche), ce qui indique que la peptidase coupe probablement après l'alanine p2acée en position 26 et que la protéine pS2 secrétée a dans le cas présent, une lonqueur de 58 amino-acides. La figure 1 représente le déroulement d-3ns le temps du marquage de la protéine pS2 par la 35 S-cystéine. Les parties (A) et (B) montrent respectivement des cellules MCF-7 cultivées en présence d'oestradiol et de rouy 5 de phénol marquées pour des durées différentes par la S_ cystéine : 15 minutes, 30 minutes, 1 heure, 2 heures, 4 heures et 6 heures, dans les colonnes 1 à 6 respective ment. Des aliquots du milieu (200 pl) (partie A) et des extraits cellulaires (25 pl) (partie B) correspondant à des fractions identiques de la culture totale ont été immunoprécipités puis analysés sur un gradient de 15 à 25% de gel de SDS-PACE et par fluorographie. M désigne des marqueurs de poids moléculaire. La partie C représente un marquage de 16 heures par la 35 S-cystéîne ; colonne 2 ltimunoyDréci,Dité d'un aliquot de milieu ; colonne 1 : même chose que colonne 2 mais en présence du peptide synthé tique compétiteur (C..) Figure 2, partie A, tentative.de marquage de la protéine pS2 par de la 35 S_rléthionine dans le milieu (colonnes 1 à 8) et l' extrait cellulaire -(colonnes 9 à 16). Même expérience que dans la Figure 1, mais en présence de 35S_méthionine. La colonne 0 est identique à la colonne-5 de la figure 1 A, la durée du marquage a été de 15 minutes, 30 minutes, 1 heure, 2 heures, 3 heures, 4 heures et 6 heurps comme indiqué. L'immunoprécipitation a été effectuée avec du sérum non-immun (colonnes 7 pour le milieu et 15 pour l'extrait cellulaire) ou en présence de sérum immun et du peptide synthétique compétiteur (C) (colonnes 8 pour le milieu et 16 polir l'extrait cellulaire). M désigne des marqueurs de poids moléculaire. Partie B : la protéine pS2 peut être détectée direc tement dans le milieu. La synthèse de la protéine par les cellules MCF-7 a été réalisée en présence de 35 S-cystéine (colonnes 1 et 4) ou de 35 S-in#-#thionine (colonnes 2 et 5) . Les cellules ont été cultivées en nrésence de rouqe de Phénol et d'oestradiol et marquées pour une durée de 6 heures. Des aliquots de milieu et d'extraits cellulaires contenant -le n*m nontre de coup- tages précipitables de TCA ont été analysés directement sur un gradient de 15 à 25 % de gel de-SDS-PAGE. Colonnes 1 et 2' milieu de culture ; colonnes 4 et 5 : extraits cellulaires. Colonne 3 et la flèche : protéine pS2 immuno-précipitée, marquée in vivo par de la 35 S-cystéine. Partie C : tentative de marquer la protéine pS2 14 par de la C-leucine. Des cellules MCF-7 cultivées en pré sence d'oestradiol et de rouge de phénol ont été marquées pour une durée de 6 heures par de la 14 C-leucine. Des ali- quots de 200 gl de milieu de culture (colonne 2) ou d'ex traits cellulaires (colonne 3) ont été immuno-précipités comme dans les figures 1 et 2a. La colonne 1 et la flèche donnent la position de la protéine pS2 immuno-précipitée 35È_c# marquée in vivo par de la #7sté ine. Exposition du film; deux mois, Exemple 6 - Détection immunocytochimique de la protéine 1) Préparation de coupes histologiques. Un échantillon chirurgical a été découpé en fines lamelles qui ont été utilisées pour la détection immunocytochimique des RE, des RP et de la protéine pS2. Les echantillons prévus pour la détection -immunocytochimique des RE et des RP ont été congelés dans de l'isopentane à -1800C, tandis que les échantillons prévus pour la détection immunocytochimique de la protéine pS2 ont été enrobés dans de la paraffine et fixés par de la formaline à 10 % pendant 2A heures. 2) Coloration immunocytochimique de la protéine pS2. Les échantillons enrobés de paraffine et fixés à la formaline ont été découpés, débarrassés de la paraf fine à l'aide de toluène et rincés parfaitement à l'éthanol absolu. Après lavage à l'eau et ai-, PBS, les coupes ont été incubées avec du sérum de mouton (2,5 % dans du PBS conte nant 0,5 % de y- globulines bovines) pour réduire les colora tions non spécifiques. Après incubation avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-peptide pS2 (à une concentra tion de 1:640) les coupes ont été incubées successivement avec des IgG de mouton anti-lapin, puis avec un systène peroxy- dase anti-peroxydase de lapin à une concentration del:10 pour les IgG,etdel:50 pour le système péroxydase anti- peroxydase. Chaque incubation a été suivie d'un lavage au PBS . Après un rinçage final en PBS, les coupes ont été incubées avec du DAB et colorées à l'hématoxyline à une concentration de 1:10. Les déterminations immunocytochimi- ques des RE et des RP ont été réalisées sur des coupes congelées en utilisant des kitsd'anticorps monoclonaux four nis par Abbott#EtTransbio respectivement, conformément à la procédure recommandée par ces fournisseurs. L'intensité de la coloration a été estimée sur une échelle à 4 points (0 à 3+) et la proportion de cellules tumorales colorées positivement a été déterminée en pourcentage des cellules tumorales totales (l à 100%); l'indice de coloration a été obtenu en multipliant le pourcentage de cellules colorées par le score de coloration (l à 300). 3) Le test de coloration de la protéine pS2 s'est avéré être cytoplasmique aussi bien sur des coupes de cellules-cancéreuses de sein que sur des coupes de nodules métastasiques (cf. figure 3, partiesA, E. F) . Toutefois la répartition cytoplasmique de la coloration n'était pas uniforme avec, fréquemment, une condensation périnucléaire (cf. flèche à la figure 3, partie F) qui peut correspon dre à l'appareil de GOLGI, car, comme on le sait, la pro téine pS2 est sécrétée. En outre,l'intensité de la colora tion s'egt avérée variable d'une cellule à une autre, même ê à l'intérieur d'une surface donnée d'une coupe (cf. figure 3a et F). Il en a également été de mCme pour la coloration nucleaire spécifique des RE (figure 3B). Toutefois, tous les carcinomes de sein ne se sont pas avérés positifs vis- à-vis de la coloration spécifique de la protéine pS2 (fi gure 3D). La coloration s'est avérée spécifique pour la protéine pS2 comme l'a démontré sa suppression lorsqu'on l'a mise en compétition avec l'un des peptides synthéti ques utilisé pour réaliser les anticorps qui, dans le cas présent.a été le peptide (C) comprenant 31 acides aminés (figure 3, partie C). En outre, des cellules d'épithélium ductulaire normal ("N" à la figure 3) et des tumeurs bé- nignes de sein n'ont pas été colorées. Une bonne corrélation a été-observée entre l'in dice de coloration de la protéine pS2 et le score d'in tensité de PARNm pS2 déterminé à partir de l'analyse par NORTHERN-blot d'ARN décrite précédemment dans la littéra ture, ce qui indique que la présence de la protéine pS2 reflète très probablement une transcription augmentéer ainsi qu'il a déjà été démontré précédemment dans la lit térature en utilisant la lignée cellulaire de cancer du sein MCF-7. Le fait que cette induction soit RE-dépendante est fortement supporté par la bonne corrélation qui existe entre l'indice de coloration de la protéine pS2 et l'indice de coloration des RE (cf. figure 4 et Ta bleau I annexés). On peut en conclure que l'expression du gène pS2 dans les cancers du sein est très probable ment oestrogène-dépendante comme c'est le cas dans la lignée cellulaire MDF-7, Exemple 7 - Expression comparative du gène pS2 avec ceux des récepteurs d'oestrogène et de progestérone et l'oncogène erbB-2. Le Tableau I annexé constitue un résumé des résultats qui ont été obtenus pour 180 échantillons de cancer du sein pour lesquels sous les paramètres ont été déterminés de façon non équivoque à peu d'exceptions près en ce qui concerne l'expression des RE(récepteurs d'oes- trogène), des RP (récepteurs de progestérone), du gène pS2 (pS2) et de l'oncogène etbB-2. Les taux de RE et de RP ont été déterminés en utilisant à la fois les tests RE-DCC, RP-DCC, RE-ICA et RP-ICA sauf pour 2 des 7 cas "RE(+), (RP(-) et pS2(+)" pour lesquels les RP n'ont été testés que par le test RP-DCC EDCC "dextran-coated charcoal stéroide binding assay" (test de fixation des stéroîdes par le charon dextran) ; ICA test immunocy- tochimique7. L'expression du gène pS2 a été déterminée en utilisant aussi bien l'analyse à l'aide d'ARNm ps2 que le test pS2-ICA. L'excès d'expression (positvité) et les taux d'expression non détectables ou très faibles (négativité) du gène erbB-2 ont été déterminés par analyse à l'aide d'ARNm. La répartition des métastases des nodu les lymphatiques axillaires (ALN) est indiquée dans la dernière colonne de droite du Tableau I. RE(+) et RP(+) correspondent à des échantillons qui se sont avérés po sitifs en utilisant au moins l'un des tests RE et RP ; pS2(+) correspond à des échantillons positifs pour des tests utilisant l'ARNm pS2 et/ou le test immunocytochi- TABLEAU I ------------------------------------------------------------------- EXPRESSION DE pS2, erbB-2, RE et RP dans 180 BIOPSIES DE CANCER DU SEIN -RB B -72 FPS2 rE r2l7(+)1(26%) 116(+), 4( 8: (4 114(+) (44z) L ba l 1 4 1 7+) 87 (63%)[88%] -7( ±)#( 21%) 2(+) E-) 53 E34(1-)3 F-15(+) (19%)[26ZI El 2# 9(+) 1 (727.) E F7( J,) 28%) 4(-) (727 M) V-) -6(--#) 7 5 M 2(-) (4%)[6%] +) (28%) 50(-) m 49(-) z 41(-) (847.) 24(-) (217.) [267.1 mique pour le pS2 ou le charbon dextran (et habituelle ment pour les deux) et un excès d'expression pour erbB- a été déterminé par analyse à l'aide d'ARNm. ALN(+) indique la présence d'au moins un nodule métastasé. Les pourcentages indiqués entre parenthèses se réfèrent au nombre total de tumeurs (180 cas), tandis que les pourcentages entre crochets se réfèrent soit à des tumeurs RE(+) (129 cas, partie supérieure du Tableau I), soit à des tumeurs RE(-) (51 cas, partie inférieure du Tableau I). Tous les cancers du sein peuvent être classés en six sous-classes d'importance inégale, comme le montre le Tableau 1. 72 % des tumeurs sont RE(+), dont 88 % sont RP(+) et 12 % (RP(-). Cependant, tous les cancers RP(+) ne sont pas pS2(+) et tous les cancers RP(-) ne sont pas pS2(-). En fait, seulement 62 % des tumeurs RE(+) se sont avérées également positives pour l'expression de RP et de pS2, alors que 26 % des tumeurs RE(+) se sont avé rées RP(+) et pS2(-). Il s'est également avéré que quel ques tumeurs "RE(+), RP(-)" étaient soit pS2(+), soit pS2(-). Ces observations présentent un grand intérêt attendu que la transcription aussi bien du gène RP que du gène pS2 peut être induite par un oestrogène dans les cellules MCF-7. Ainsi, la détermination simultanée de l'expression des gènes RE, RP et pS2 fait apparaitre une hétérogénéité fonctionnelle additionnelle dans les cancers du sein RE(+). Ceci peut refléter soit une hété rogénéité des RE eux-mêmes, qui serait apte à induire aussi bien les gènes RP que le gène pS2, ou aucun d'en tre eux, ou bien une hétérogénéité dans l'aptitude à la réponse aux oestrogènes, des gènes RP et pS2. D'autre part, les cancers RE(-) apparaissent très homogènes en ce qui concerne l'expression de RP et de pS2, attendu que 96 % d'entre eux n'expriment aucun de ces deux gènes inductibles par un oestrogène. L'excès d'expression erbB-2 a été également réparti entre les diverses sous- classes, Il est à souligner que la détermination par voie cytoimmunochimique des RE, des RP et de la protéine pS2 présente une grande utilité pour l'examen de l'hété rogénéité des tumeurs en ce qui concerne leur réponse vis-à-vis des oestrogènes et, par voie de conséquence, l'aptitude au traitement des cancers du sein par hormono thérapie. Exemple 8 - Dosage de la protéine pS2 sur du cytosol. Le cytosol est préparé à partir de prélèvements effectués sur des tumeurs mammaires, par bioponction ou par broyage de tissus, les prélèvements étant congelés dans du tampon Tris 10 mmoles contenant 1,5 mmole d'EDTA, 10 mmoles de mono- thioglycérol, 10 mmoles de molybdate de sodium, pH 7,4,tel que décrit pour les dosages de ré cepteurs hormonaux, ce qui évite une préparation spécifi que du cytosol, et permet de doser le pS2 en plus des récepteurs déjà dosés en routine. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'in vention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écar ter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1.- Protéine dénommée pS2 / caractérisée en ce qu'elle est obtenue par synthèse ou par isolement à par tir de cultures de cellules MCF-7, en ce qu'elle est iden tifiée comme comprenant 84 amino-acides, en ce que son amino-acide N-terminal est une méthionine, en ce que son poids moléculaire est de l'ordre de 9140 Daltons et en ce que sa composition en amino-acides est la suivante (I) 1 10 MET ALA THR MET GLU ASN LYS VAL ILE CYS ALA LEU VAL LEU 20 VAL SER MET LEU ALA LEU GLY THR LEU ALA GLU ALA GLN THR 30 40 GLU THR CYS THR VAL ALA PRO ARG GLU ARG GLN ASN CYS GLY 50 PHE PRO GLY VAL THR PRO SER GLN CYS ALA ASN LYS GLY CYS 60 70 CYS PHE ASP ASP THR VAL ARG GLY VAL PRO TRP CYS PHE TYR 80 PRO ASN THR ILE ASP VAL PRO PRO GLU GLU GLU CYS GLU PHE (I) 2.- Peptide, caractérisé en ce qu'il est consti tué par un fragment de la protéine selon la revendication 1, en ce qu'il comprend 58 amino-acides et en ce que son poids moléculaire est de 6450 Daltons environ. 3.- Peptide caractérisé en ce qu'il est consti tué par un fragment de la protéine selon la revendication 1, en ce qu'il comprend 63 amino-acides et en ce que son poids moléculaire est d'environ 6970 Daltons. 4.- Peptide caractèrisé en ce qu'il est consti tué par un fragment de la protéine selon la revendica tion 1, en ce qu'il comprend 31 amino-acides, en ce que ces 31 amino-acides correspondent aux 31 amino-acides ter minaux de ladite protéine et en ce que son poids molécu laire est d'environ 345ODaltons. 5.- Peptide caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment de la protéine selon la reven dication 1, lequel comprend 60 amino-acides et en ce que son poids moléculaire est d'environ 6660 Daltons. 6.- Peptide caractérisé en ce qu'il est consti tué par un fragment de la protéine selon la revendication 1, lequel comprend 30 amino-acides qui correspondent aux 30 amino-acides qui se trouvent à lvextrémité NH 2- termi nale de ladite protéine et en ce que son poids molécu laire est d'environ 3330 Daltons. 7.- Peptide caractérisé en ce qu'il est consti tué par un fragment de la protéine selon la revendication 1, lequel comprend 28 amino-acides qui correspondent aux 28 amino-acides qui se trouvent à l'extrémité C-termi- nale de ladite protéine et en ce que son poids moléculai re est d'environ 3100 Daltons. 8.- Peptide selon la revendication 3, carac térisA en ce que sa composition (A) en amino-acides, qui comprend 63 amino-acides est la suivante . 30 THR LPTI ALA GLU ALA GLN THR GLU THR CYS THR VAL ALA PRO ARG 40 50 GLU ARG GLN ASN CYS GLY PHE PRO GLY VAL THR PRO SER GLN CYS 60 ALA ASN LYS GLY CYS CYS PHE ASP ASP THR VAL ARG GLY VAL PRO 10 80 TRP CYS PHE TYR PRO ASN THR ILE ASP VAL PRO PRO GLU GLU GLU CYS GLU PHE. (A) 9 - - Peptide selon la revendication 2, carac térisé en ce que sa composition (B) en amino-acidesqui comprend 58 amino-acides, est la suivante, 30 40 GLN THR GLU THR CYS THR VAL ALA PRO ARG GLU ARG GLN ASN CYS 50 '7LY PHE PRO GLY VAL THR PRO SER GLN CYS ALA ASN LYS GLY CYS 60 70 CYS PHE ASP ASP THR VAL ARG GLY VAL PRO TRP CYS TYR 80 PRO ASN THR ILE ASP VAL PRO PRO GLU GLU GLU CYS GLU PHE (B) 10.Peptide selon la revendication 4, caractérisé en ce que sa composition (C) en amino-acides, qui comprend 31 amino-acides, Pst la suivante 60 LYS GLY CYS CYS PHE ASP ASP THR VAL ARG GLY VAL PRO TRP CYS 70 80 PHE TYR PRO ASN THR ILE ASP VAL PRO PRO GLU GLU GLU CYS GLU PHE. (C) il.- Peptide selon la revendication 5, carac térisé en ce que sa composition en amino-acides est la sui vante (D) 30 GLU ALA GLN THR GLU THR CYS THR VAL ALA PRO ARG GLU ARG 40 50 GLN ASN CYS GLY PHE PRO GLY VAL THR PRO SER GLN CYS ALA 60 ASN LYS GLY CYS CYS PHE ASP ASP THR VAL ARG GLY VAL PRO 70 80 TRP CYS PHE TYR PRO ASN THR ILE ASP VAL PRO PRO GLU GLU GLU CYS GLU PHE (D) 12.- Peptide selon la revendication 60 caracté risé en ce que sa composition en amino-aoidesfest la sui vante (E) 30 GLU ALA GLN THR GLU THR CYS THR VAL ALA PRO ARG GLU ARG 40 50 GLN ASN CYS GLY PHE PRO GLY VAL THR PRO SER GLN CYS ALA ASN LYS (E) 13.- Peptide selon la revendication 7, caracté risé en ce que sa composition en amino-acides est la sui vante (F) 60 70 CYS PHE ASP ASP THR VAL ARG GLY VAL PRO TRP CYS PHE TYR 80 PRO ASN THR ILE ASP VAL PRO PRO GLU GLU GLU CYS GLU (F) 14.- Anticorps polyclonaux anti-pS2, caracté- risésen ce qu'ils sont obtenus par immunisation de lapins ou autres animaux appropries, contre la protéine pS2 et ses fragments, notamment contre l'un quelconque des pep tides de formule (A) à (F) selon l'une quelconque des revendications 8 à 13. 15.- Anticorps monoclonaux anti-pS2, caracté risés en ce qu'ils sont obtenus par clonage d'hybridomes résultant de la fusion de cellules de rates de mammifères appropriés immunisés par des injections convenables de la protéine pS2 ou de fragments de celle-ci, notamment de l'un des peptides de formules (A) à (F), selon l'une quel conque des revendications 8 à 13, avec des cellules d'un myélome approprié. 16.- Procédé d'obtention de la protéine pS2 pu rifiée, à partir de cellules MCF-7, caractérisé en ce que l'on recueille le surnageant de cellules MCF-7 mises en culture en présence d'oestradiol, en ce qu'on purifie ce surnageant en en éliminant par précipitation les protéines de haut poids moléculaire d'une part, et les protéines insolubles à pH de l'ordre de 1, d'autre part, en ce qu'on purifie ensuite le surnageant recueilli, qui contient le pS2, par centrifugation après précipitation par une cétone, le culot renfermant le pS2 étant ensuite purifié par chromatographie/pour récuper les fractions contenant le pS2, qui sont -éventuellement congelées et/ou concentrées. 17.- Procédé selon la revendication 16, carac térisé en ce que la protéine pS2 est isolée par immuno- précipitation soit d'extraits de cellules MCF-7, soit/et de milieu de culture de ces cellules, à l'aide d'anti corps dirigés contre la protéine et contre des fragments de celle-ci tels que notamment, les peptides de formules (A) à (F) selon l'une quelconque des revendications 8 à 13. 18.- Procédé de préparation de la protéine pS2 et de fragments de celle-ci, dont, notamment les peptides de formules (A) à (F) selon l'une quelconque des revendi cations 8 à 13, par voie de synthèse, notamment par syn thèse chimique ou par biosynthèse. 19.- Méthode de dépistage et de diagnostic de cancers du sein hormono-dépendants, caractérisée en ce que l'expression du gène pS2 (protéine pS2) est déter minée par méthode immunologique dans des prélèvements biologiques effectués chez des sujets soumis au dépistage, 20.- Méthode selon la revendication 19, caracté risée en ce que l'expression du gène pS2 est déterminée par immunocytochimie. 21.- Méthode selon l'une quelconque des reven dications 19 et 20, caractérisée en ce que l'expression du gène pS2 est déterminée dans des prélèvements de tu meurs. 22.- Méthode de détection et de diagnostic se lon la revendication 21, caractérisée en ce que les pré lèvements de tumeurs mis en oeuvre sont des coupes histo logiques. 23.- Méthode selon la revendication 22, carac térisée en ce que les prélèvements de tumeurs mis en oeuvre sont des coupes histologiques conservées et sta bilisées par enrobage dans de la paraffine et fixées à la formaline. 24.- Méthode selon l'une quelconque des reven dications 19 à 21, caractérisée en ce que les prélève ments de tumeurs mis en oeuvre sont des cytosols. 25.- Méthode selon l'une quelconque des reven dications 20 à 24, caractérisée en ce que la méthode immunocytochimique est misé en oeuvre par incubation des- dits prélèvements avec des anticorps de lapin, ou autre animal approprié, poly- ou monoclonaux anti-pS2.ou anti- fragments de pS2, puis avec un système de marquage et de révélation approprié de l'anticorps. 26.- Méthode selon l'une quelconque des reven dications 19 à 25, caractérisée en ce que des prélève ments biologiques utilisés pour la détection d'une tumeur du sein sont soumis à une détection immunologique simul tanée des RE, des RP et de la protéine pS2, faisant appa- raitre d'une part, une hétérogénéité fonctionnelle addi tionnelle dans les cancers du sein RE(+) (avec 60 % environ seulement de tumeurs RE(+) également positives pour les RP et l'expression du gène pS2), et d'autre part, une grande homogénéité des cancers RE(-) en ce qui concerne les RP et l'expression du gène pS2 (avec environ 96 % d'absence d'expression de ces deux gènes inductibles par des oestrogènes). 27.- Kit prêt à l'emploi pour le dépistage et le diagnostic de cancers du sein hormono-dépendants, par immunocytochimie, caractérisé en ce qu'il comprend - des doses appropriées d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre la protéine pS2 et/ou ses fragments ; - des doses appropriées de protéine pS2 et/ou de ceux de ses fragments contre iesquels sont dirigés les anticorps mis en oeuvre ; - des doses appropriées d'anticorps anti-IgG de la pin (ou d'un autre mammifère approprié) ; - un système enzymatique (tel que PAP-système peroxy- dase-antiperoxydase notamment), de révélation de la réaction anticorps-antigène ; - un substrat pour la révélation de la réaction en zymatique, tel que, notamment le DAB ; - éventuellement une substance de coloration des cellules tumorales, si le prélèvement biologique est constitué par des coupes histologiques et si la coloration de celles-ci est désirée ; - des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre du test de dépistage et de diagnos tic.