FR 2636646 A1 19900323 FR 8812166 A 19880919 PROCEDE DE DETECTION SPECIFIQUE ET DE DENOMBREMENT DES MI CRO-ORGANISMES DANS DES PRODUITS FILTRABLES L'invention concerne essentiellement un procede de détection specifique et de dénombrement des mlcro-orga- nismes dans des produits filtrables, notamment en vue de leur identification. Par produits filtrables, on entend des produits dont 11 est possible de filtrer un volume necessaire à une analyse, au moyen d'une membrane de filtration. Ces produits peuvent autre des liquides, ou bien des produits visqueux, piteux ou solides qui ont eté rendus filtrables par un traitement mécanique, physique, chimique, et/ou enzymatique L'analyse quantitative et qualitative des micro-organismes présents dans un produit, quel que soit le type de ce produit, permet de déterminer son état hygié- nique et sanitaire. Les methodes les plus couramment utilisées pour effectuer ce type de contrôle consistent à préparer un ee,.antlllon de produit filtrable, en le concentrant éventuellement Si les niveaux de contamination recherchés sont très bas. La détection spécifique et le dénombrement des micro-organismes présents se font en incubant la totalise ou une fraction de l'echantillon sur un miiieu de culture fac:l;tant théoriquement, la croissance et le developpement de tous les micro-organismes. Le dénombrement est réal;se par comptage des colonies formes au bout d'un certain temps d'incubation à une température optimale permettant en théorie le développement des micro-organismes recherchés. Les inconvenients de ces techniques sont essentiellement leur lenteur (de 2 à 8 Jours selon les types de germes recherchés), leur manque de spécificité (le milieu et les conditions de culture empêchent le développement de tous les germes vivants présents, et il y a nécessairement sélection des cellules les plus vivaces et les plus adap- tées a l'environnement propose), et leur manque de sensib; lité (on n'obtient qu'un dénombrement en terme d'unités formant des colonies, et non un nombre de germes). On a déJà proposé des techniques de dénombrement basées sur des colorations différentes des cellules vivantes et des cellules mortes. Selon ces techniques, un échantillon de produit est filtré sur une membrane de porosité déterminée, et les micro-organismes retenus sont colorés directement sur la membrane au moyen d'un colorant fluorescent, puis comptés par observation au moyen d'un microscope à épifluorescence, les micro-organismes prenant des colorations différentes en fonction de leur degré de viabilité. En règle générale, les colorants fluorescents utilisés sont des "lntercalants" c est-à-dire des molécules chimiques planes (bromure d'éth.alum, iodure de propidium, acridine orange par exemple) qui s'intercalent, sans liaisons covalentes, entre les tours de spire de 1'ADN (acide désoxyribonucléique), molécule bicaténaire. Parmi toutes ces molécules fluorescentes, l'acridine orange est la plus utilisée en raison de son comportement particulier. En effet, Si cette molécule agit bien comme intercalant vis-à-vis de 1'ADN lui conférant ainsi une fluorescence verte, elle peut aussi s'associer de manière covalente avec les extrémités libres des bases puriques et pyrimidiques des acides nucléiques monocatnaires tels 1'ARN (acide ribonucléque), provoquant ainsi une fluorescence orange. De plus, dans ce dernier cas, la fluorescence obtenue sera beaucoup plus intense car les acides nu cléiques monocaténaires peuvent fixer., en moyenne, trois fois plus de molécules d'acridine que les bicaténaires. La coloration finale d'une cellule est fonction du rapport ARN/ADN. S1 la cellule est morte, l'A)RN se dégrade très vite et l'on observe une fluorescence verte due uniquement à llADN. S1 la cellule est en période active de synthese, le taux d'ARN est important, et la coloration orange masque la coloration verte de 1'ADN. Cette méthode présente cependant un certain nombre d'inconvénients, notamment quant à l'interprétation des résultats d'observation. En effet, état physiologique des cellules influe fortement sur l'intensité de la colora tison obtenue, qui va du jaune-verdâtre pour les cellules en "dormance" a l'orange vif pour les cellules très actives métaboliquement. De pius, la façon dont les cellules meurent influe sur leur coloration. Une cellule morte de vieillesse sera colorée en vert, tandis qu'une cellule tuée rapidement apparaîtra colorée en orange1 comme une cellule vivante. Cet effet est particulièrement gênant dans le cas de contrôles de produits ayant subi une pasteurisation. Un autre inconvénient de cette méthode connue est que la membrane de filtration contient, au moment de l'observation, une quantité relativement importante de co lorant qui réémet une fluorescence verte au moment de l'observation et qui gène beaucoup la visualisation des cellules colorées. Il faut encore noter que les différents auteurs ayant travaillé sur cette méthode ne sont pas du tout d'accord sur l'interprétation à donner aux résultats d'observa tison. Certains pensent que l'acridine orange permet de colorer en orange les cellules métaboliquement actives et en vert les cellules métaboliquement inactives, d'autres arrivent à une interprétation totalement contraire, et d'autres pensent que la coloration n'est pas un indice de viabilité mais est simplement fonction des conditions opératoires (concentration du colorant, temps de contact, tampons utilisés, etc...). La présente invention a notamment pour obJet un procédé de détection spécifique et de dénombrement de micro-organismes présents dans des produits filtrables, par coloration différente des cellules vivantes et des cellules mortes, qui ne presente aucun des inconvénients de la technique antérieure citée. L'invention a également pour objet un procédé de ce type qui permet un classement morphologique et un dénombrement très fins et très précis des micro-organismes présents dans un produit filtrable. L'invention a encore pour obJet un procédé de ce type, qui permet un classement morphologique et un dénombrement très rapides des micro-organismes présents dans un produit filtrable. Elle propose, à cet effet, un procédé consistant à filtrer le produit sur un membrane propre à retenir des micro-organismes, et à colorer les micro-organismes retenus pour les dénombrer par comptage et les différencier, caractérisé en ce qu'il consiste - a) à effectuer une première coloration des micro-organismes au moyen d'un premier colorant agissant uniquement sur les cellules mortes, - b) à effectuer la fusion de 1'ADN des cellules non colorées dans l'étape précédente, - c) pu;s à effectuer une seconde coloration des cellules au moyen d'un second colorant agissant sur 1'ARN et sur 1'ADN désapparié des cellules traitées dans l'étape b). L'invention permet donc, de façon simple, d'obtenir des coloratlons différentes des cellules mortes et des cellules vivantes, tout en garantissant que toutes les cellules mortes seront colorées d'une certaine façon, et que toutes les cellules vivantes seront colorées d'une autre façon. Pour cela, il suffit d'utiliser un premier colorant qui se fixe uniquement sur les cellules mortes comme un intercalant entre les spires de la double hélice de 1'ADN et qui a pour effet de colorer et de stabiliser la structure de l'ADN et de la rendre insensible au phénomène de fusion, qui consiste à séparer, par action de la cha leur, les deux brins de la molécule d'ADN en formant aInsi de 1'ADN monocatenaire. Ainsi, l'étape. de fusion aglt seulement sur 'ADN des cellules qui n'a pas été stabilise, ce qui permet, au cours de l'étape suivante, de fixer le second colorant sur 1'ADN désapparié et 1'ARN éventuellement présent, de façon covalente en empêchant tout réappariement ultérieur de 1'ADN. L'AtN monocaténaire est alors traité comme 1'ARN et donne la même coloration. Selon une autre caractéristique de l'invention, la fusion de l'ADN est réalisée par un traitement thermique à une température déterminée, par exemple par contact avec l'eau à une température comprise entre 65 C et 100C environ. Selon encore une autre caractéristique de l'in- vention, le colorant utilisé dans l'étape a) pour ia coloration des cellules mortes est le sulfate de berbérine. Le sulfate de berbérine est un alcaloide extrait de diverses plantes, qui se fixe sur 1'ADN en s'intercalant entre les sp;res de la double hélice et provoque une fluorescence verte lorsqu'on l'excite par une lumière bieue. Selon une autre caractéristique de l'invention, le second colorant utilisé dans l'étape c), est l'acridine orange. L'acridine orange se fixe de façon covalente sur 1'ARN et sur 1'ADN monocaténaire pour donner une coloration orange en réponse à une excitation par de la lumière bleue. Selon une autre caractéristique de l'invention, le procedé consiste également à exposer la membrane à une rayonnement ultra-violet de longueur d'onde déterminée, pendant une durée déterminée, pour annuler l'émissivité lumineuse des molécules de colorant retenues par la membrane de filtrat;on, dans la plage de longueurs d'onde d'observa tions. L'acridine orange qui est retenue dans l'épais- seur de la membrane de filtration peut être éteinte très rapidement, par exposition à un rayonnement ultra-violet pendant quelques secondes, sans que le même phénomène se produise pour l'acr1dlne fixée sur 1'ADN et 1'ARN, qui est aavantage protégée et stabilisée que l'acridine libre retenue par la membrane. On peut ainsi éliminer, en observation, un fond vert très brillant, et donc observer uniquement des celluies oranges et des cellules vertes, sur fond noir. L'observation est réalisée au moyen d'un microscope à épifluorescence. Le procédé selon l'invention prévoit également de balayer la surface de la membrane de filtration au moyen d'un faisceau lumineux, d'enregistrer des images des lignes ou des zones de balayage au moyen d'une caméra vldéc, et d'utiliser des moyens d'analyse d'image pour identifier et dénombrer les micro-organismes retenus par la membrane. Un tel procédé est très facilement automatisable, et permet dans un temps très court (quelques minutes) de classer morphologiquement et de dénombrer les micro-organismes presents dans un échantillon de produit. Le procédé selon l'invention est applicable a toutes scrtes de produits, notamment à des échantillons de produits alimentaires ou agro-alimentaires, de produits cosmétiques, de produits pharmaceutiques, de produits ln- dustriels, de produits naturels tels que l'air, le sol, l'eau ; ou de produits ou liquides biologiques tels que le sang, l'urine, etc... Pour mieux faire comprendre l'invention, on va maintenant décrire de façon détaillée, à titre d'exemple, une mise en oeuvre particulière du procédé selon l'inven tion. Un échantillon de produit est filtré par dépression sur une membrane dont la porosité et le diametre sont choisis en fonction de la taille de l'échantillon a analyser et des germes que l'on veut identifier et déom- brer. On peut notamment utiliser une membrane ayant un diamètre de l'ordre de 45 mm ou moins, et une porosité lnfé- rieure ou égale à 0,5 pm environ. Les cellules retenues sur la membrane sont ensuite mises en contact pendant une minute avec 5 ml de sulfate de berbérine à 1 g/l préparé en solution de Ringer à un pH 7. Le sulfate de berbérine est ensuite évacué par aspiration. Les cellules retenues par la membrane sont ensuite mises en contact pendant une minute avec 25 ml d'ea distillée stérile à une température de l'ordre de 85 C, pour réaliser la fusion de 1'ADN des cellules non colorées par le sulfate de berbérine, après quci l'eau est évacuee par aspiration. Simultanément, ou immédiatement après la fu- sion, les cellules retenues sur la membrane de f;ltraticn sont mises en contact pendant une minute avec 5 ml d'une solution à 0,1 g/l d'acriaine orange1 préparée dans un tampon citrate/phosphate à un pH de 7. La solut;on d'acrîdine orange est ensuite évacuee par aspiration, puis la membrane est rincée avec 10 ml d'eau distillée stérile et est déposée sur une lame de verre et recouverte d'huile à immersion pour microscope et d'une lamelle couvre-obet. Cette préparation est alors exposée pendant 30 secondes à un rayonnement ultra-violet ayant une longueur d'onde d'environ 255 nm. L'observation est faite ensuite au moyen d'un microscope à épifluorescence, avec une longueur d'onde d'excitation lumineuse de 400-450 nm et un filtre d'arrêt à 480 nm, pour une identification et un dénombrement des m1- cro-organismes dans les longueurs d'onde visibles supérieures à 480 nm. Toute la surface de la membrane de filtration doit être examinée Si l'on veut pouvoir atteindre la sensibilité maximale de détection, qui est d'une cellule par échantillon. Le grossissement utilisé du microscope est de 500, ce qui correspond à un minimum acceptable pour distinguer la morphologie cellulaire. Les avantages du procédé selon l'invention sont les suivants - les cellules mortes sont colorées en vert fluorescent, et les cellules vivantes en orange vif, ce qui évite tous les problèmes d'interprétation des résultats liés à l'utilisation de l'acridine orange dans la technique antérieure, - la morphologie cellulaire est conservée et permet de distinguer les levures des bacilles et des coca, - le sulfate de berbérine qui diffuse librement dans les cellules mortes et les colore, ne pénètre pas dans les cellules vivantes, - les cellules colorées en vert par le sulfate de berbérine ne sont pas sensibles au chauffage utilisé pour la fusion de 1'ADN, - la durée totale d'une analyse (filtration, coloration, examen, comptage) réalisée par un opérateur est d'environ 30 minutes, - la sensibilité maximale et le seuil de détec tion sont de 1 cellule, - les dénombrements réalisés par ce procédé de coloration sont beaucoup plus précis que ceux réalisés par les techniques de culture, - le procédé selon l'invention est extrêmement simple et ne demande ni personnel qualifié en microbiologie, ni laboratoire spécialement équipé, - l'utilisation de membranes de diamètre plus faible et le couplage du microscope d'observation à des moyens de balayage par un faisceau lumineux de longueur d'onde appropriée, à une caméra vidéo et a un système d'analyse d'image permettent de réaliser des ldentlflca- tions et des dénombrements de micro-organismes en quelques minutes par échantillon traité. REVENDICATIONS 1 ) Procédé de détection spécifique et de dénombrement de micro-organismes dans un produit filtrable, consistant à filtrer le produit sur une membrane propre a retenir les micro-organismes, et à colorer les micro-crganismes retenus pour les dénombrer par comptage et les dif- férencier, caractérisé en ce qu'il consiste - a) à effectuer une première coloration des micro-organismes au moyen d'un premier colorant agissant uniquement sur les cellules mortes, - b) à effectuer la fusion de 1'ADN des cellules non colorées dans l'étape précédente, - c) puis à effectuer une seconde coloration des cellules au moyen d'un second colorant agissant sur 1'ARN et sur 1'ADN désapparié des cellules traitées dans l'étape b). 2-) Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce qu'il consiste à fixer le premier colorant cité comme un intercalant sur 1'ADN des cellules mortes pour le colorer et le stabiliser, puis à réaliser la fusion de 1'ADN non stabilisé des autres cellules pour le désapparier, et à fixer le second colorant cité de façon covalente sur 1'ARN ainsi que sur 1'ADN désapparié, pour empêcher son réappariement ultérieur et le colorer comme de 1'ARN. 3 ) Procédé selon la revendication 1 ou 2, ca ractérisé en ce que la fusion de 1'ADN est réalisée par traitement thermique à une température déterminée. 4') Procédé selon la revendication 3, caracté- risé en ce que le traitement thermique est réalisé par contact avec de l'eau à une température comprise entre 65 C et l00C environ. 5') Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le colorant utilisé dans l'étape a) est le sulfate de berbérine. 6 ) Procédé selon l'une des revendications 1 a 5, caractérisé en ce que le colorant utilisé dans l'étape c) est l'acridine orange. 7 ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la seconde coloration des cellules est réalisée pendant ou immédiatement après l'étape de fu sion de 1'ADN des cellules non colorées. 8 ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il consiste ensuite à exposer la membrane a un rayonnement ultra-violet de longueur d'onde déterminée, pendant une durée déterminée, pour annuler l'émissivité lumineuse des molécules de colorant retenues par la membrane de filtration, dans la plage de longueurs d'onde d'observation. 9 ) Procédé selon l'une des revendications 1 a 8, caractérisé en ce qu'il consiste à observer les cellules colorées au moyen d'un microscope à épifluorescence pour les classer morphologiquement et les dénombrer. 10 ) Procédé selon l'une des revendications i a 9, caractérisé en ce qu'il consiste a balayer la surface de la membrane au moyen d'un faisceau lumineux, à enregistrer des images des lignes ou zones de balayage au moyen d'urne caméra vidéo, et à utiliser des moyens d'analyse d'lmage pour identifier et dénombrer les micro-organismes retenus par la membrane. il ) Procédé selon l'une des revendicatIons précédentes, caractérisé en ce qu'il est appliqué à des échantillons de produits alimentaires ou agro-alimentaires, de produits cosmétiques, de produits pharmaceutiques, de produits industriels, de produits naturels tels que l'air, le sol, l'eau ; ou de produits ou liquides biologiques tels que le sang, l'urine, etc...