FR 2639558 A1 19900601 FR 8815881 A 19881130 Procédé de broyage de tissus biologiques d'origine humaine ou animale et dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé La présente invention a pour objet un procédé de broyage de tissus biologiques d'origine humaine ou animale et un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé. Ces tissus biologiques seront, de préférence, frais, ctest-à-dire, présentant moins de 72 heures depuis la mort du sujet. La présente invention sera décrite plus particulièrement pour des tissus biologiques sous la forme d'os d'origine humaine. Mais il va de soi qu'elle s'applique à toutes sortes de tissus biologiques tels que des muscles, des vaisseaux, ou encore des utérus, etc... On sait qu'à partir de la poudre d'os, il est possible d'en extraire une protéine tout à fait particulière, à savoir l'ostéocalcine. I1 s'agit d'une protéine propre au tissu osseux, circulant à faible concentration dans le sang. Sa particularité, comme marqueur du turnover osseux, est de traduire la formation de l'os. Son augmentation plasmatique permet de révéler des maladies osseuses, telles que l'hyperparathyroidie, la maladie de Paget et les métastases osseuses. L'un de ses principaux intérêts réside dans le fait qu'elle amène à distinguer trois types d'ostéoporose. Actuellement, il existe déjà un certain nombre de procédés permettant de broyer des tissus biologiques et, notamment, des os d'origine animale ou humaine. Comme procédés de broyage d'os d'origine animale, on connait celui permettant le broyage de diaphyse déshydratée de fémur de rat ainsi que celui permettant le broyage d'os bovins, en particulier l'os foetal. Mais, dans le premier, les particules obtenues après pulvérisation dans un broyeur et passage au travers d'un tamis, ne présentent qu'une granulométrie hétérogène et grossière, comprise entre 74 et 420 micromètres. Dans le second, les os d'origine bovine sont pulvérisés à l'aide d'un broyeur équipé d'un tamis d'ouverture dont les orifices présentent un diamètre de l'ordre de 8 micromètres. La quantité d'os ainsi pulvérisée ne peut pas dépasser 10 grammes. De plus, pour chaque type d'os différent, il est nécessaire de recourir à un autre type de broyeur. Ces résultats ne sont guère améliorés, même lorsque l'on épluche en copeaux les os, ce qui est le cas lorsque l'on a à faire, plus particulièrement, à l'os foetal. On a, en outre, constaté que la séquence en amino-acides des protéines d'origine animale ainsi que la proportion respective des diverses protéines au sein d'un tissu animal équivalent n'est pas strictement identique aux protéines au sein d'un tissu humain. C'est pourquoi, il est plutôt souhaitable d'avoir recours au broyage d'os d'origine humaine. Comme procédé de broyage d'os d'origine humaine, on connait celui permettant le broyage d'os lyophilisés. Après concassage grossier à l'aide d'un maillet métallique, les os sont broyés dans un broyeur, par exemple de type moulin magnétique, puis soumis à une pulvérisation liquide avant tamisage de la poudre d'os au travers d'une grille dont les orifices présentent un diamètre d'environ 150 micromètres. Ce procédé présente donc un certain nombre d'inconvénients majeurs, à savoir, notamment, le recours à un grand nombre d'opérations, le fait de ne pouvoir broyer une grande quantité d'os, et surtout, d'une part, un échauffement des os dû au broyage lui-même, ce qui dénature, tout au moins partiellement, les protéines et, notamment, l'ostéocalcine, et, d'autre part, l'obligation de broyer des os lyophilisés afin de supprimer toute élasticité des os avant broyage.Enfin, ce procédé permet seulement d'obtenir une poudre d'os dont la granulométrie est hétérogène et grossière, c'est-à-dire comprise entre 80 et 2 000 mi cromètres. Le problème général à résoudre par l'objet de la présente invention consiste, par conséquent, à réaliser un procédé de broyage supprimant l'ensemble des inconvénients décrits précédemment, à savoir, permettant le broyage de tous tissus biologiques, de préférence frais, c'est-à-dire présentant moins de 72 heures depuis la mort du sujet, en particulier d'os frais d'origine humaine, non lyophilisés, faisant appel à un nombre limité d'étapes, permettant de broyer une quantité quasiillimitée d'os, tout en obtenant une poudre d'os dont la granulométrie est homogène et fine, c'est-à-dire comprise entre 3 et 150 micromètres. Par ailleurs, ce procédé doit éviter tout échauffement des tissus biologiques à broyer, en particulier des os. Selon la présente invention, ce problème général est résolu, grâce au procédé de broyage consistant essentiellement à refroidir le corps d'un broyeurtamiseur 1 par un courant continu d'azote liquide, de façon à éviter, d'une part, tout échauffement des tissus biologiques, et donc, toute dénaturation des protéines, et, d'autre part, tout traitement préalable, physique ou chimique, desdits tissus biologiques, puis à introduire une certaine quantité de tissus biologiques frais dans le corps du broyeur-tamisur 1, à opérer simultanément, en continu, en une seule étape, un broyage et un tamisage de cette quantité de tissus biologiques frais, à récupérer ainsi une poudre de tissus biologiques frais, de granulométrie fine et homogène, donc de surface spécifique importante, ce qui augmente la quantité de protéines extractibles et enfin, le cas échéant, à réintroduire à nouveau, une nouvelle quantité de tissus biologiques frais dans le corps du broyeur-tamiseur 1, la quantité de tissus biologiques frais pouvant être broyés sans mise à l'arrêt du broyeur-tamiseur 1 dépendant exclusivement de la durée de vie de ce dernier. L'invention sera mieux comprise, grâce à la description ci-après, qui se rapporte à un mode de réalisation préféré, donné à titre d'exemple non limitatif, et expliqué avec référence au dessin schématique annexé, dont la figure unique est une vue de face en perspective du dispositif de broyage pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention. Conformément à l'invention, le procédé de broyage consiste essentiellement à refroidir le corps d'un broyeur-tamiseur 1 par un courant continu d'azote liquide, de façon à éviter, d'une part, tout échauffement des tissus biologiques, et donc, toute dénaturation des protéines, et, d'autre part, tout traitement préa- lable, physique ou chimique, desdits tissus biologiques, puis à introduire une certaine quantité de tissus biologiques frais dans le corps du broyeur-tamiseur 1, à opérer simultanément, en continu, en une seule étape, un broyage et un tamisage de cette quantité de tissus biologiques frais, à récupérer ainsi une poudre de tissus biologiques frais, de granulométrie fine et homogène, donc de surface spécifique importante, ce qui augmente la quantité de protéines extractibles et enfin, le cas échéant, à réintroduire à nouveau, une nouvelle quantité de tissus biologiques frais dans le corps du broyeurtamiseur 1, la quantité de tissus biologiques frais pouvant être broyés sans mise à l'arrêt du broyeur-tamiseur 1 dépendant exclusivement de la durée de vie de ce dernier. Le procédé de broyage se déroule principalement de la manière décrite ci-après. En premier lieu, le moteur d'entrainement 2 du broyeur-tamiseur 1 est mis en route, la vitesse de rotation dudit moteur étant comprise entre 6 000 et 9 000 tours/mn, préférentiellement 7 500 tours/mn. Puis, l'azote liquide est porté à une pression comprise entre 1 et 2 bars, ce qui provoque son introduction dans le corps du broyeur-tamiseur 1 et ainsi le refroidissement dudit corps à une température voisine de - 196"C après 30 à 180 secondes, normalement 120 secondes. Le débit d'azote liquide est d'environ 10 litres pour 100 grammes de tissus biologiques frais, notamment d'os humains frais, préalablement débarassés des muscles et de la moelle, ce débit pouvant être varié en fonction, d'une part1 du débit d'alimentation en tissus biologiques du broyeur-tamiseur 1 et, d'autre part, de sa vitesse de broyage. En ce qui concerne les os frais d'origine humaine, on les découpe alors en rondelles d'environ 3 mm d'épaisseur et 3 cm de diamètre et présentant chacune un poids de l'ordre de 1 à 1,5 grammes. A ce stade du procédé, il est possible de plonger lesdites rondelles d'os frais d'origine humaine dans un volume compris, pour un poids de 100 grammes d'os, entre 200 et 300 ml d'azote liquide à une température liquide de - 196"C, préférentiellement 250 ml, durant 10 à 30 secondes, avantageusement 20 secondes, de manière à préserver toutes les molécules biologiques contenues dans les os. Ensuite, on introduit simultanément dans le corps du broyeur-tamiseur 1, par l'intermédiaire de la trémie d'alimentation 12 et à l'aide d'un entonnoir 22, par exemple, au moyen d'une spatule en acier inoxydable, une certaine quantité de tissus biologiques frais, en l'occurrence, une dizaine de rondelles d'os, puis on broie et on pulvérise simultanément en continu cette quantité de tissus biologiques frais, en ce qui concerne les os, pendant environ 30 secondes, afin d'obtenir une granulométrie de la poudre d'os comprise entre 3 et 150 micromètres. Après récupération de la poudre ainsi obtenue, on réintroduit, le cas échéant, à nouveau, une certaine quantité de tissus biologiques frais dans le corps du broyeur-tamiseur 1, et on poursuit les opérations jusqu'à la récupération de la poudre obtenue de la dernière quantité de tissus biologiques frais introduits. Enfin, on coupe l'alimentation du corps du broyeur-tamiseur 1 en azote liquide et on coupe le moteur d'entraînement 2 du broyeur-tamiseur 1. La présente invention a également pour objet un dispositif de broyage pour la mise en oeuvre du procédé décrit précédemment, dispositif comportant, notamment, comme représenté à la figure unique du dessin schématique annexé, un broyeur-tamiseur 1 principalement pourvu d'un moteur 2 entraînant en rotation un plateau 3 situé dans une chambre de pulvérisation 4 alimentée grâce à une trémie 12 et munie de marteaux de forme spé civique susceptibles de projeter la matière à broyer contre une couronne dentée fixe 5 et un moyen de recueil 15 de la matière à broyer, ledit dispositif étant caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, un moyen de ré- glage 6 de la vitesse de rotation du moteur d'entraînement 2 et un moyen de soutirage 7 d'azote liquide assurant le transfert de l'azote liquide du réservoir d'azote gazeux 8 jusqu'au broyeur-tamiseur 1. On pourra, par exemple, prendre un broyeurtamiseur 1 à couronne du type FORPLEX F 00 fabriqué par la société LES ATELIERS REUNIS - BROYEURS FORPLEX. Un tel broyeur 1 présente dans son corps un plateau 3 entraîné en rotation par le moteur 2. La matière à broyer est introduite dans l'axe de l'appareil par une trémie d'alimentation 12 et est acheminée sur la première rangée de marteaux fixés sur le plateau 3. Ces marteaux, de forme spécifique, la projette alors contre une couronne dentée fixe 5, de manière à la désagréger par chocs successifs. Puis, la matière est reprise par les marteaux extérieurs, projetée sous l'effet de la force centrifuge contre une couronne tamisante d'ouverture de maille variable, et se dégage ainsi sur toute la périphérie. Le passage de la matière à broyer au travers du tamis est facilité par la ventilation créée par la rotation du plateau 3. Conformément à l'invention, le dispositif de broyage présente un moyen de réglage 6 sous la forme d'un rhéostat intercalé entre la prise d'alimentation 9 du moteur 2 et le disjoncteur du broyeur-tamiseur 1. En effet, sur les broyeurs-tamiseurs connus tels que celui du type FORPLEX F 00, la vitesse de rotation est de l'ordre de 10 000 à 15 000 tours/mn. Le rhéostat 6 permet ainsi de réduire cette vitesse. Selon une autre caractéristique de l'invention, le moyen de soutirage 7 d'azote liquide comporte une arrivée d'azote liquide 10 sous la forme d'une conduite qui plonge, à l'une de ses deux extrémités 10', dans un réservoir d'azote liquide 11 et, à son autre extrémité 10", dans la trémie d'alimentation 12, un robinet 13 à trois voies étant situé sur cette conduite 10, de manière à la mettre en liaison avec le réservoir d'azote gazeux 8 par l'intermédiaire d'un détenteur de gaz 14, ce robinet 13 permettant, par conséquent, la mise sous pression de l'azote liquide et le réglage du débit d'azote liquide en fonction du débit d'alimentation en tissus biologiques frais du broyeur-tamiseur 1 et de la vitesse de broyage.La conduite 10 est maintenue à son extémité 10" dans la trémie d'alimentation 12 par une plaque 19 présentant deux orifices 20 et 21, l'un 20 permettant précisément le passage et le maintien de l'extrémité 10" de la conduite 10, et l'autre 21 autorisant l'alimentation de la trémie 12 en tissus biologiques frais, par exemple, par l'intermédiaire d'un entonnoir 22. Par ailleurs, le moyen de recueil 15 est sous la forme d'un cyclone, de préférence en polypropylène armé, maintenu grâce à un support 16, et dont le fond 17 est perforé et présente une grille fine 18 autorisant l'évacuation du volume important d'azote gazeux dégagé lors de l'opération de broyage / tamisage. A titre d'exemple, le moyen de recueil du broyeur de type FORPLEX F 00 est sous la forme d'un sac en toile. Or, le broyage des tissus biologiques néces site la présence d'azote liquide qui dégage 22,4 fois son volume en gaz (un litre d'azote liquide équivaut à 22,4 litres d'azote gazeux à 00C et sous une pression de 760 mm de mercure). Le cyclone 15 utilisé permet ainsi l'évacuation du volume important d'azote gazeux dégagé lors du broyage tout en ralentissant la vitesse des particules recueillies. I1 est conseillé qu'un dispositif d'aspiration soit situé dans le local où se trouve le dispositif de broyage, afin d'assurer l'évacuation des gaz. Enfin, afin d'obtenir une poudre dont la granulométrie est comprise entre 3 et 150 micromètres, la couronne dentée fixe 5 est perforée par de multiples orifices présentant un diamètre de l'ordre de 100 micromètres. De plus, cette couronne dentée fixe 5 est réalisée dans un métal susceptible de résister durant plusieurs heures à une température proche de - 196"C, tel que préférentiellement de l'aluminium, ou encore de l'argent, de l'or, du bronze, du platine, etc... En effet, par exemple, sur le broyeur FORPLEX F 00, la couronne dentée fixe présente un diamètre moyen des trous de l'ordre de 150 micromètres. Par ailleurs, cette couronne, en acier inoxydable, se fragiliserait rapidement sous l'effet du froid intense (- 196"C). Bien entendu, l'invention n'est pas limitée au mode de réalisation décrit et représenté aux dessins an nexés. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers éléments ou par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de broyage de tissus biologiques frais d'origine humaine ou animale, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à refroidir le corps d'un broyeur-tamiseur (1) par un courant continu d'azote liquide, de façon à éviter, d'une part, tout échauffement des tissus biologiques, et donc, toute dénaturation des protéines, et, d'autre part, tout traitement préalable, physique ou chimique, desdits tissus biologiques, puis à introduire une certaine quantité de tissus biologiques frais dans le corps du broyeur-tamiseur (1), à opérer simultanément, en continu, en une seule étape, un broyage et un tamisage de cette quantité de tissus biologiques frais, à récupérer ainsi une poudre de tissus biologiques frais, de granulométrie fine et homogène, donc de surface spécifique importante, ce qui augmente la quantité de protéines extractibles et enfin, le cas échéant, à réintroduire à nouveau, une nouvelle quantité de tissus biologiques frais dans le corps du broyeurtamiseur (1), la quantité de tissus biologiques frais pouvant être broyés sans mise à l'arrêt du broyeurtamiseur (1) dépendant exclusivement de la durée de vie de ce dernier. 2. Procédé de broyage, selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à réaliser principalement les opérations suivantes - mise en route du moteur d'entraînement (2) du broyeur-tamiseur (1) - mise sous pression de l'azote liquide qui est intro duit dans dans le corps du broyeur-tamiseur (1) afin de provoquer son refroidissement - introduction d'une certaine quantité de tissus biolo giques frais dans le corps du broyeur-tamiseur (1) ;; - broyage et tamisage si-multanés en continu de cette quantité de tissus biologiques frais - récupération de la poudre de tissus biologiques frais ainsi obtenue - réintroduction, le cas échéant, d'une certaine quan tité de tissus biologiques frais dans le corps du broyeur-tamiseur (1) - poursuite des opérations jusqu'à la récupération de la poudre obtenue de la dernière quantité de tissus bio logiques frais introduits - arrêt de l'alimentation du corps du broyeur-tamiseur (1) en azote liquide - arrêt du moteur d'entraînement (2) du broyeur-tamiseur (1). 3. Procédé de broyage, selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la vitesse de rotation du moteur d'entraînement (2) du broyeur-tamiseur (1), est comprise entre 6 000 et 9 000 tours/mn, préférentiellement 7 500 tours/mn. 4. Procédé de broyage, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'azote liquide est mis sous une pression comprise entre 1 et 2 bars, ce qui provoque son introduction dans le corps du broyeur-tamiseur (1) et ainsi le refroidissement dudit corps à une température voisine de - 196"C après 30 à 180 secondes, normalement 120 secondes. 5. Procédé de broyage, selon la revendication 4, caractérisé en ce que le débit d'azote liquide est d'environ 10 litres pour 100 grammes de tissus biologiques frais, ce débit pouvant être varié en fonction, d'une part, du débit d'alimentation en tissus biologiques du broyeur-tamiseur 1 et, d'autre part, de sa vitesse de broyage. 6. Procédé de broyage, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les tissus biologiques frais sont, préalablement à leur introduction dans le corps du broyeur-tamiseur (1) et, le cas échéant, après leur découpage ou morcellement, plongés dans de l'azote liquide à une température de - 196"C du rant 10 à 30 secondes, avantageusement 20 secondes, de manière à préserver toutes les molécules biologiques contenues en eux. 7. Procédé de broyage, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les tissus biologiques frais sont avantageusement des os d'origine humaine. 8. Procédé de broyage, selon la revendication 7, caractérisé en ce que, préalablement à son introduction dans le corps du broyeur-tamiseur (1), chaque os est morcelé en des rondelles d'environ 3 mm d'épaisseur et 3 cm de diamètre et présentant chacune un poids de l'ordre de 1 à 1,5 grammes. 9. Procédé de broyage, selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on introduit simultanément, dans le corps du broyeur-tamiseur (1), par exemple, au moyen d'une spatule, une dizaine de rondelles d'os, ces dernières étant pulvérisées en une durée d'environ 30 secondes, afin d'obtenir une granulométrie de la poudre d'os comprise entre 3 et 150 micromètres. 10. Procédé de broyage, selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que, préalablement à leur introduction dans le corps du broyeurtamiseur tel), les rondelles d'os sont plongées dans un volume compris, pour un poids de 100 grammes d'os, entre 200 et 300 ml d'azote liquide à une température de - 196"C, préférentiellement 250 ml. 11. Dispositif de broyage pour la mise en oeuvre du procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, comportant notamment un broyeur-tamiseur (1) principalement pourvu d'un moteur (2) entraînant en rotation un plateau (3) situé dans une chambre de pulvérisation (4) alimentée grâce à une trémie (12) et munie de marteaux de forme spécifique susceptibles de projeter la matière à broyer contre une couronne dentée fixe (5) et un moyen de recueil (15) de la matière à broyer, dispositif caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, un moyen de réglage (6) de la vitesse de rotation du moteur d'entraînement (2) et un moyen de soutirage (7) d'azote liquide assurant le transfert de l'azote liquide du réservoir d'azote gazeux (8) jusqu'au broyeur-tamiseur (1). 12. Dispositif de broyage, selon la revendication 11, caractérisé en ce que le moyen de réglage (6) est sous la forme d'un rhéostat intercalé entre la prise d'alimentation (9) du moteur (2) et le disjoncteur du broyeur-tamiseur (1). 13. Dispositif de broyage, selon l'une quelconque des revendications 11 et 12, caractérisé en ce que le moyen de soutirage (7) d'azote liquide comporte une arrivée d'azote liquide (10) sous la forme d'une conduite qui plonge, à l'une de ses deux extrémités (10'), dans un réservoir d'azote liquide (11) et, à son autre extrémité (10"), dans la trémie d'alimentation (12), un robinet (13) à trois voies étant situé sur cette conduite (10), de manière à la mettre en liaison avec le réservoir d'azote gazeux (8) par l'intermédiaire d'un détenteur de gaz (14), ce robinet (13) permettant, par conséquent, la mise sous pression de l'azote liquide et le réglage du débit d'azote liquide en fonction du débit d'alimentation en tissus biologiques frais du broyeur-tamiseur (1) et de la vitesse de broyage. 14. Dispositif de broyage, selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que la conduite (10) est maintenue à son extrémité (10") dans la trémie d'alimentation (12) par une plaque (19) présentant deux orifices (20 et 21), l'un (20) permettant précisément le passage et le maintien de l'extrémité (10") de la conduite (10), et l'autre (21) autorisant l'alimentation de la trémie (12) en tissus biologiques frais, par exemple, par l'intermédiaire d'un entonnoir (22). 15. Dispositif de broyage, selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que le moyen de recueil (15) est sous la forme d'un cyclone, de préférence en polypropylène armé, maintenu grâce à un support (16), et dont le fond (17) est perforé et présente une grille fine (18) autorisant l'évacuation du volume important d'azote gazeux dégagé lors de l'opération de broyage / tamisage. 16. Dispositif de broyage, selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que la couronne dentée fixe (5) est perforée par de multiples orifices présentant un diamètre de l'ordre de 100 micromètres. 17. Dispositif de broyage, selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, caractérisé en ce que la couronne dentée fixe (5) est réalisée dans un métal susceptible de résister durant plusieurs heures à une température proche de - 196"C, tel que, préférentiellement, de l'aluminium, ou encore de l'argent, de l'or, du bronze ou du platine.