FR 2641792 A1 19900720 FR 8817349 A 19881228 SEQUENCES DE NUCLEOTIDES CODANT POUR LA CALMODULINE CHEZ L'HOMME ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES L'invention concerne des séquences de nucléotides codant pour la calmoduline chez l'homme et leurs applications biologiques. La calmoduline est une protéine ubiquiste, de structure hautement conservée au cours de l'évolution, et qui lie le calcium. Elle sert de médiateur intracellulaire aux effets du calcium et se trouve impliquée dans le contrôle de la prolifération cellulaire, la réparation de l'ADN ou l'expression génétique. On sait que la calmoduline joue un rôle d'activation vis-à-vis de l'adényl cyclase excrétée par B,Dertussis (bactérie à Gram négatif) et B.anthracis (bactérie à Gram positif), agents, respectivement, de la coqueluche et du charbon, ce qui se trad.;lt par une forte production d'AMP cyclique (cAMP). L'interaction entre l'adényl cyclase et- la calmoduline -est mise à profit dans le procédé de clonage de gênes décrit dans les demandes FR 87/10614 du 24.7.87 et 88/93952 du 25.10.88 au nom de la demanderesse. Selon ce procédé, on réalise le clonage de gènes codant pour l'adényl cyclase respectivement de B.Dertussis et de B.anthracis dans une souche réceptrice déficiente en adényl cyclase portant un plasmide renfermant un gène synthétique de calmoduline et exprimant de hauts niveaux de calmoduline. La détection microbiologique de la présence du cAMP permet le clonage des gênes exprimant l'adényl cyclase. La technique symétrique s'est révélée utilisable pour cloner l'ADN complémentaire (ADNc) de l'ars messager (ARN-m) de la calmoduline chez l'homme. L'invention a donc pour bit de fournir des séquences portant les séquences codantes pour la calmoduline chez l'homme et plus spécialement l'AD.Nc de l'ARN-m de la calmoduline humaine. La séquence de nucléotides selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comrrend tout ou partie des séquences codant pour la calmoduline humaine. Cette séquence de l'invention est capable de s'hybrider avec un brin d'ADN des exons d'un gêne codant pour la calmoduline chez l'homme ou l'ADSc de leur ARN-m. Selon une autre disposition de l'invention, la séquence de nucléotides ci-dessus est caractérisée en ce qu'elle porte l'inFormatior, pour l'expression de la calmoduline humaine. L'invention concerne également une séquence de nucléotides telle que définie ci-dessus, ou des fragments de cette dernière, codant respectivement pour la calmoduline humaine ou des fragments de cette dernière, la calmoduline ou ses fragments étant capables de former un complexe immunologique avec des anticorps dirigés respectivement contre la calmoduline humaine ou de mammifère en général ou des fragments de calmoduline humaine. Selon un autre aspect, l'invention vise une séquence de nucléotides recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence telle que définie cidessus, le cas échéant, associée à un promoteur capable de controler la transcription de la séquence et, éventuellement, une séquence d'ADN codant pour des signaux de terminaison de la transcription. La séquence de nucléotides recombinante de l'invention peut être associée à un promoteur et à un opérateur permettant de controler la transcription, et éventuellement à une séquence signal permettant la sécrétion de la protéine dans l'espace périplasmique ou dans le milieu extérieur. Plus spécialement, l'invention vise une séquence de nucléotides capable de s'hybrider avec une sonde formée à partir de la séquence présentant l'enchaînement de nucléotides (I) suivant, ou l'enchainement complémentaire de cette séquence 10 20 30 40 50 60 ATTAGTCCGA GTGGAGAGAG CGAGCTGAGT GGTTGTGTGG TCGCGTCTCG GAAACCGGTA 70 80 90 100 110 120 GCGCTTGCAG CATGGCTGAC CAAC TGAC TG AAG AGCAGAT TGCAGAATTC AAAGAAGCTT 130 140 150 160 170 180 TTTCACTATT TGACAAAGAT GGTGATGGAA CTATAACAAC AAAGGAATTG GGAACTGTAA 190 200 210 220 230 240 TGAGATCTCT TGGGCAGAAT CCCACAGAAG CAGAGTTACA GGACATGATT AATGAAGTAG 250 260 270 280 290 300 ATGCTGATGG TAATGGCACA ATTGACTTCC CTGAATTTCT GACAATGATG GCAAGAAAAA 310 320 330 340 350 360 TGAAAGACAC AGACAGTGAA GAAGAAATTA GAGAAGCATT CCGTGTGTTT GATAAGGATG 370 380 390 400 410 420 GCAATGGCTA TATTAGTGCT GCAGAACTTC GCCATGTGAT GACAAACCTT GGAGAGAAGT 430 440 450 460 470 480 TAACAGATGA AGAAGTTGAT GAAATGATCA GGGAAGCAGA TATTGATGGT GATGGTCAAG 490 500 510 520 530 540 TAAACTATGA AGAGTTTGTA CAAATGATGA CAGCAAAGTG AAGACCTTGT ACAGAATGTG 550 560 570 580 590 600 TTAAATTTCT TGTACAAAAT TGTTTATTTG CCTTTTCTTT GTTTGTAACT TATCTGTAAA 610 620 630 640 650 660 AGGTTTCTCC CTACTGTCAA AAAAATATGC ATGTATAGTA ATTAGGACTT CATTCCTCCA 670 680 690 700 710 720 TGTTTTCTTC CCTTATCTTA CTGTCATTGT CCTAAAACCT TATTTTAGAA AATTGATCAA 730 740 750 760 770 780 GTAACATGTT GCATGTGGCT TACTCTGGAT ATATCTAAGC CCTTCTGCAC ATCTAAACTT 790 800 810 820 830 840 AGATGGAGTT GG TCAAATGA GGGAACATCT GGGTTATGCC TTTTTTAAAG TAGTTTTCTT 850 860 870 880 890 900 TAGGAACTGT CAGCATGTTG TTGTTGAAGT GTGGAGTTGT AACTCTGCGT GGACTATGGA 910 920 930 940 950 960 CAGTCAACAA TATGTACTTA AAAGTTGCAC TATTGCAAAA CGGGTGTATT ATCCAGGTAC 970 980 990 1000 1010 1020 TCGTACACTA TTTTTTTGTA CTGCTGGTCC TGTACCAGAA ACATTTTCTT TTATTGTTAC 1030 1040 1050 1060 1070 1080 TTGCTTTTTA AACTTTGTTT AGCCACTTAA AATCTGCTTA TGGCACAATT TGCCTCAAAA 1090 1100 1110 1120 1130 1140 TCCATTCCAA GTTGTATATT TGTTTTCCAA TAAAAAAATT ACAATTTACC C.(terminaison poly A) Des séquences selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles comprennent l'enchaînement (I) défini ci-dessus ou sont constituées par tout ou partie de cet enchaînement, l'enchaînement total correspondant à l'ADNc de l'ARN-m d'un gêne de la calmoduline humaine. Dans cet enchainement, le début de la phrase codante est en position 72 et la fin en position 519. Il va de soi que les bases de la séquence de nucléotides considérée peuvent être dans un ordre différent de celui trouvé dans l'enchaînement ci-dessus et/ou que ces bases peuvent être, le cas échéant, substituées, dès lors qu'une sonde élaborée à partir d'une telle séquence donne une réponse caractéristique et non équivoque quant à la capacité de reconnaître la présence des séquences codantes vis-å-vis de la calmoduline humaine. Les séquences de nucléotides selon l'invention sont obtenues avantageusement selon le procédé de clonage des demandeurs évoqué plus haut. Selon un mode de réalisation du procédé de l'invention, un dérivé cva défectif de la bactérie E.coli, restriction moins de manière à accepter l'ADN étranger, est d'abord transformé par un plasmide porteur du gêne de l'adényl cyclase de B.pertussis. Les bactéries résultantes restent phénotypiquement cyclase-, et sont blanches sur milieu Mc Conkey supplémenté en maltose à 1%. Toute activation de l'adényl cyclase se reflète par la formation d'une colonie rouge sur le même milieu. Une banque d'ADN complémentaire humain est transférée dans cette souche et plusieurs clones rouges sont obtenus. L'ADN plasmidique correspondant est isolé, purifie, et l'ADNc séquencé (enchaînement I). L'utilisation du code génétique universel montre la présence d'une séquence polypeptidique identique à celle des calmodulines de mammifères (conservées sans changement au cours de l'évolution chez la plupart) On remarquera qu'il s'agit d'un clonage de gènes eucaryotes effectué après complémentation d'une fonction déficiente d'un procaryote, ce qui n'a été effectué que très rarement.Ainsi selon l'invention, on démontre qu'il est possible de cloner l'ADNc de cerveau humain codant pour la synthèse de la calmoduline bien que la souche hote ne comporte pas normalement de fonction calmoduline. Le clonage à plusieurs partenaires est effectué de préférence avec des plasmides ayant des groupes d'incompatibilité différents, de façon à ce qu'ils restent stables, en présence l'un de l'autre dans la même cellule. Les vecteurs recombinants d'expression et de clonage capables de transformer une cellule hôte appropriée entrent également dans le cadre de l'invention. Ces vecteurs comportent au moins une partie d'une séquence de nucléotides de l'invention sous le contrôle d'éléments de régulation permettant son expression. Les souches de microorganismes transformées font également partie de l'invention. Ces souches comportent l'une des séquences de nucléotides définies ci-dessus ou encore un vecteur recombinant tel que défini précédemment. L'invention vise egalement les applications biologiques des séquences de nucléotides, des protéines correspondantes et des anticorps monoclonaux ou polyclonaux. Ces applications comprennent la production à haut niveau de calmoduline humaine, ce qui constitue une ultrastructure à l'usage de gênes synthétiques. Elles comprennent également l'élaboration, a partir de fragments de l'enchaînement (I), de sondes pour la détection de séquences complémentaires dans les gènes produisant de la calmoduline. Cette élaboration comprend, notamment, la dénaturation des séquences double brin pour obtenir une séquence monobrin utilisable en tant que sonde. L'invention vise donc des sondes de détection caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une partie d'une séquence de nucléotides définie ci-dessus, plus spécialement un fragment intragénique de la séquence codant pour la calmoduline chez l'homme. Le fragment d'ADN utilisé comme sonde comporte un nombre de nucléotides suffisant pour obtenir la spécificité requise et la formation d'un hybride stable. Des sondes appropriées pour ce type de détection sont avantageusement marquées par un élément radio-actif (sondes chaudes) ou tout autre groupe non radio-actif (sondes froides) permettant la recgnnaissance de la sonde à l'état hybridé avec la préparation renfermant 1'ADN à étudier. Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec un échantillon biologique renfermant des bactéries, ou directement avec ces bactéries ou leurs acides nucléiques, dans des conditions autorisant l'hybridation éventuelle de la séquence de nucléotides de la sonde avec une séquence complémentaire, éventuellement contenue dans le produit testé. On peut, par exemple, mettre en oeuvre la méthode d'hybridation sur taches. Cette méthode comporte après dénaturation de l'ADN préalablement obtenu à partir de cellules exprimant de l'adényl cyclase, le dépôt d'une quantité aliquote de cet ADN sur des membranes de nitrocellulose, l'hybridation de chaque membrane dans les conditions usuelles avec la sonde et la detection, de manière classique, de l'hybride formé. On peut aussi utiliser une méthode d'hybridation sur réplique, selon la technique de Southern. Cette méthode comprend la séparation électrophorétique en gel d'agarose des fragments d'ADNs engendrés après traitement de l'ADSs par des enzymes de restriction, le transfert après dénaturation alcaline sur des membranes appropriées et leur hybridation avec la sonde dans les conditions usuelles. Il n'est pas toujours nécessaire de procéder à l'expression préalable de l'ADN. Il suffit que l'ADN soit rendu accessible à la sonde. Pour la mise en oeuvre des méthodes de détection considérées ci-dessus basées sur l'utilisation de sondes nucléotidiques, on a recours avantageusement à des nécessaires ou kits comprenant - une quantité déterminée d'une sonde nucléotidique selon l'invention, - avantageusement, un milieu approprié respectivement à la formation d'une réaction d'hybridation entre la séquence à détecter et la sonde, - avantageusement des réactifs permettant la detection des complexes d'hybridation formés entre la séquence de nucléotides et la sonde lors de la réaction d hybridation. Les séquences de nucléotides de l'invention permettent également, entre autres - l'évaluation du niveau d'ARN messager de la calmoduline des divers types cellulaires, en particulier des cellules tumorales, et ainsi le repérage de cellules d'une classe particulière, par exemple tumorales - le marquage de chromosomes, - la fabrication de kits liés à ces méthodes, et - le clonage du gène complet de la calmoduline humaine. - la fabrication d'antimessagers de la calmoduline, qu'ils soient sous forme d'ARN, d'ADN ou de polynucléotides modifiés. Une autre application des séquences de nucléotides conformes a l'invention concerne l'identification d'empreintes génétiques du gêne de la calmoduline et la recherche du polymorphisme génétique humain. Par recherche du polymorphisme génétique humain, on entend à la fois l'identification génétique d'un individu et la détection de certaines pathologies liées à des modifications génétiques concernant un gène de la calmoduline ou un gène lié génétiquement. L'identification d'un individu peut comprendre l'analyse des fragments de restriction contenant tout ou partie d'un gène de la calmoduline humaine. Dans le cadre de cette application, les séquences de nucléotides définies précédemment sont utilisées à titre de sondes. Ces sondes sont mises en oeuvre sur un échantillon biologique par exemple un tissu ou un fluide préparé pour être accessible à ces sondes. On opère avantageusement selon la demande de brevet européen 0 186 271 dont le contenu est incorporé dans la présente description. La mise en évidence spécifique de la présence de séquences codant pour la calmoduline chez l'homme peut également être réalisée selon des procédés mettant en oeuvre des techniques d'amplification de l'ADN (PCR). Ces techniques sont décrites en particulier dans les brevets US 4 683 202 et 4 683 195. Dans ces techniques, on utilise deux amorces, avantageusement d'environ une vingtaine de nucléotides, mais distantes l'une de l'autre et comprises dans l'une des séquences de nucléotides définies ci-dessus. L'une des séquences est capable de se lier à une séquence de nucléotides d'un des brins du fragment d'ADN à amplifier, cette séquence étant située au niveau d'une extrémité de ce fragment (par exemple l'extrémité 5') l'autre séquence est capable de se lier à une séquence de nucléotides du deuxième brin du fragment d'ADN à amplifier, cette dernière séquence étant située au niveau de l'extrémité de ce fragment opposée à celle sus-mentionnée (cette dernière extrémité étant encore désignée par extrémité 3' dans l'exemple proposé). On indique ci-après, à titre d'exemple non limitatif, les matériels et les méthodes utilisés pour cloner et sequencer l'ADNc de l'ARN-m d'un gène de la calmoduline humaine. Souches bactériennes et milieux de culture On utilise un dérivé cva TP610 (1) de la souche d'E.coli restriction moins C600SF8 (2) et comme milieux de croissance le milieu riche LB ou le milieu minimal (3). On effectue un tri des bactéries au regard de leur capacité à produire la fermentation de sucres sur des plaques d'agar Nc Conkey contenant 1% du sucre testé. Les concentrations en chloramphénicol et en ampicilline sont respectivement de 30 pg/ml et de 100 ug/ml. La souche TP610 a été transformée selon (4) à l'aide du plasmide pDI5 (5), plasmide dérivé de pACYC184. Cette souche transformée est incapable de synthétiser le cAMP et est utilisée comme réceptrice pour cloner des fragments d'ADNc de cerveau humain. Constructions de bibliothèques d'ADNc La banque d'ADNc est construite dans le plasmide pUC9, qui est un dérivé de pBR322 (compatible avec pACYC184) et la résistance utilisée est la résistance à l'ampicilline. La construction de la bibliothèque d'ADNc a été faite selon la méthode de Cathala et al (6) pour l'extraction de l'ARN messager. Ensuite, la bibliotheque a été construite sur une amorce d'oligo dT a partir des ARN messagers terminés par du poly A selon la méthode de Caput (7) : brièvement, le plasmide pUC9 a été linéarisé par coupure par PstI et une extension de dG a été ajoutée par la terminal transférase. Les molécules ainsi allongées ont été digérées par BamHI et le petit fragment engendré par la coupure BamHI a été éliminé par élution au travers de petites colonnes de Sépharose CL6B2. L'ADNc est produit à partir de 1 g de matrice d'ARN-m en utilisant la transcriptase inverse et une amorce synthétique pour s'hybrider aux extrémités poly A des messagers (5' GATCCGGGCCCTl23'). L'ARN-m résiduel est éliminé par hydrolyse alcaline et on ajoute les extrémités dC de l'ADNc à l'aide de terminal transférase. L'extrémité 5' de l'ADNc est modifiée en une extrémité cohésive BamHI par hybridation avec un adaptateur constitué par un oligonucléotide synthétique (5'Ai2GGGCCCG3') complémentaire de l'amorce. L'ADNc monobrin est joint au vecteur par ligation pour produire des molécules circulaires. La réparation de la région monobrin est réalisée en utilisant l'extrémité dG du vecteur comme amorce et 1'ADS T4 polymérase. Analvse de la séquence d 'ADN La séquence d'ADN a été analysée en utilisant des sous-clones dans le phage M13tgl31 (8). Des délétions unidirectionnelles sont engendrées en utilisant le système Cyclone (IBI). La séquence d'ADN est déterminée par la méthode de terminaison de chaîne didéoxynucléotide de Sanger et al (9) en utilisant l'alpha S3 5 dATP (Amersham) et le 7-déaza-dGTP (Boehringer) à la place de dGTP. REFERENCES BIBLIOGRAPHIOUES 1. STRUHL, R. et al: Functional genetic expression of eukaryotic DNA in Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73 (1976), 1471-1475. 2. HEDEGAARD, L. DANCHIN A., The cya gene region of Erwinia chrvsanthemi B374: organisation and gene products, Mol. Gen. Genet. (1985) 201: 38-42. 3. MILLER, J.H: Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1972. 4. MANIATIS, T. et al: Molecular cloning: a laboratorymanual. VCold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982. 5. GLASER, P. et al: Mol. Microbiol. 2 (1988) 19-30. 6. CATHALA, G. et al: DNA 2 (1983) 329-335. 7. McKEON, F.D. et al: Nature 319 (1986) 463-468. 8. KIENY, M.P. et al: New versatile cloning and sequencing vecteurs based on bacteriophage M13. Gene 26 (1983), 91-99. 9. SANGER, F et al: DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natal. Acad. Sci. USA 74 (19770 5463-5467. REVENDICATIONS 1. Séquence de nucléotides, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie des séquences codant pour la calmoduline chez l'homme. 2. Séquence de nucléotides, caractérisée en ce qu'elle est capable de s'hybrider avec un brin d'ADN des exons d'un gène codant pour la calmoduline chez l'homme ou l'ADNc de leur ARN-m. 3. Séquence selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle porte l'information pour l'expression de la calmoduline chez l'homme. 4. Séquence de nucléotides, ou fragments de cette séquence, codant respectivement pour la calmoduline humaine ou des fragments de cette dernière, la calmoduline ou ses fragments étant capables de former un complexe immunologique avec des anticorps respectivement contre la calmoduline humaine ou des fragments de cette dernière, la calmoduline ou ses fragments étant capables de former un complexe immunologique avec des anticorps dirigés respectivement contre la calmoduline humaine, de mammifères en général, ou des fragments de calmoduline humaine. 5. Séquence de nucléotides recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, le cas échéant, associée à un promoteur capable de contrôler la transcription de la séquence et éventuellement une séquence d'ADN codant pour des signaux de terminaison de la transcription. 6. Séquence de nucléotides recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, associée à un promoteur et à un opérateur permettant de contrôler la transcription, et éventuellement à une séquence signal permettant la sécrétion de la protéine dans l'espace périplasmique ou dans le nilieu exterieur. 7. Séquence de nucléotides, caractérisée en ce qu'elle est capable de s'hybrider avec une sonde formée à partir de la séquence présentant l'enchainement de nucléotides (I) suivant 10 20 30 40 50 60 ATTAGTCCGA GTGGAGAGAG CGAGCTGAGT GGTTGTGTGG TCGCGTCTCG GAAACCGGTA 70 80 90 100 110 120 GCGCTTGCAG CATGGCTGAC CAAC TGACTG AAGAGCAGAT TGCAGAATTC AAAGAAGCTT 130 140 150 160 170 180 TTTCACTATT TGACAAAGAT GGTGATGGAA CTATAACAAC AAAGGAATTG GGAACTGTAA 190 200 210 220 230 240 TGAGATCTCT TGGGCAGAAT CCCACAGAAG CAGAGTTACA GGACATGATT AATGAAGTAG 250 260 270 280 290 300 ATGCTGATGG TAATGGCACA ATTGACTTCC CTGAATTTCT GACAATGATG GCAAGAAAAA 310 320 330 340 350 360 TGAAAGACAC AGACAGTG AA GAAGAAATTA GAGAAGCATT CCGTGTGTTT GATAAGGATG 370 380 390 400 410 420 GCAATGGCTA TATTAGTGCT GCAGAACTTC GCCATGTGAT GACAAACCTT GGAGAGAAGT 430 440 450 460 470 480 TAACAGATGA AGAAGTTGAT GAAATGATCA GGGAAGCAGA TATTGATGGT GATGGTCAAG 490 500 S10 520 530 540 TAAACTATGA AGAGTTTGTA CAAATGATGA CAGCAAAGTG AAGACCTTGT ACAGAATGTG 550 560 570 580 590 600 TTAAATTTCT TGTACAAAAT TGTTTATTTG CCTTTTCTTT GTTTGTAACT TATCTGTAAA 610 620 630 640 650 660 AGGTTTCTCC CTAC TGTCAA AAAAATATGC ATGTATAGTA ATTAGGACTT CATTCCTCCA 670 680 690 700 710 720 TGTTTTCTTC CCTTATCTTA CTGTCATTGT CCTAAAACCT TATTTTAGAA AATTGATCAA 730 740 750 760 770 780 GTAACATGTT GCATGTGGCT TACTCTGGAT ATATCTAAGC CCTTCTGCAC ATCTAAACTT 790 800 810 820 830 840 AGATGGAGTT GGTCAAATGA GGGAACATCT GGGTTATGCC TTTTTTAAAG TAGTTTTCTT 850 860 870 880 890 900 TAGGAACTGT CAGCATGTTG TTGTTGAAGT GTGGAGTTGT AACTCTGCGT GGACTATGGA 910 920 930 940 950 960 CAGTCAACAA TATGTACTTA AAAGTTGCAC TATTGCAAA CGGGTGTATT ATCCAGGTAC 970 980 990 1000 1010 1020 TCGTACACTA TTTTTTTGTA CTGCTGGTCC TGTACCAGAA ACATTTTCTT TTATTGTTAC 1030 1040 1050 1060 1070 1080 TTGCTTTTTA AACTTTGTTT AGCCACTTAA AATCTGCTTA TGGCACAATT TGCCTCAAAA 1090 1100 1110 1120 1130 1140 TCCATTCCAA GTTGTATATT TGTTTTCCAA TAAAAAAATT ACAATTTACC C (terminaison poly A) 8. Sonde de détection caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie des sequences de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Utilisation en tant qu'amorces dans des techniques d'amplification d'ADS, de type PCR, de deux séquences de nucléotides d'environ au moins 20 nucléotides, comprises dans l'une des séquences selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, l'une des séquences étant capable de se lier à l'extrémité 5' d'un brin de la séquence à amplifier et la deuxième séquence à l'extrémité 3' de l'autre brin. 10. Sonde pour la détection du polymorphisme des fragments de restriction du génome humain, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie d'une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.