FR 2635113 A1 19900209 FR 8810653 A 19880805 Procédé d'obtention d'interleukine-1 ss mature à partir de ceLlules d'E. coli transformées La présente invention concerne le domaine -des inter Leucines et plus particulièrement un procédé simple de récupération de l'interleukine-1 p mature (dénommée c;-après IL-1 p mature) à partir de cellules d'E. col; transformées par le gène codant pour cette protéine. L'interleukine-1 est un facteur de croissance polypeptidique, produite principalement par des macrophages activés, qui joue un role important dans le système de défense immunitaire. Récemment, on a isolé à partir dè l'ARN de macrophages stimulés par des lipopolysaccharides deux clones de L'ADN complémentaire représentant deux formes distinctes de l'IL-1 humaine ou dè l'IL-1 bovine. Ces deux formes, dénommées IL-1 x et IL-1 p, sont décrites en détail par MARCH et al. dans NATURE, 315, 1985, pp. 641-647 pour l'IL-i humaine et par MALISZEWSKI et al. dans Molecular Immunology. 25, n0 5, 1988, pp. 429-437 pour l'IL-1 bovine. Les différentes propriétés biologiques de l'IL-1 p humaine sont décrites en détail par C.A. AINARELLO dans Immunobiol., vol. 172, pp. 301-315 (1986). Plusieurs procédés d'obtention de l'IL-1 fi par voie génétique ont déjà été proposés. Par exemple, certains auteurs ont decrit te clonage de la séquence d'ADN complémentaire codant pour l'IL-1 p L(AURON et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, (1984) 7904-7911 et MARCH et al., Nature 315, (1985), 641-647)0 et L'expression dans E. coli du gène codant pour la forme sécrétée d'IL-1 p sous le contrôle du phage PL, du promoteur lac ou du promoteur tac. Dans certains cas, la protéine recombinante est produite sous ta forme d'agrégats insolubles dans le cytoplasme et peut être extraite des cellules apres solubilisation avec du chlorhydrate de guanidine 7 M ou de L'urée 8 M (MARCH et al., NATURE, 315 (1985) 641-647). Dans d'autres cas, on a recupéré la protéine IL-1 p dans la fraction soluble des lysats bruts d'E. coli (WINGFIELD et al., Eur. J. Biochem. 160, 491-497 (1986)). On a maintenant trouvé un procédé d'obtention de l'IL-1 ss mature à partir de cellules d'E. coli transformées par le gêne codant pour ladite protéine, qui permet de la récupérer entièrement et sous forme soluble. Sous son aspect général, le procédé selon la présente invention consiste à soumettre à un choc osmotique les cellules d'E. coli transformées et à séparer, du surnageant résultant du choc osmotique, la protéine recombinante IL-1 i sous forme mature. On entend par forme mature la forme sécrétée et biologiquement active de la protéine. On sait que le choc osmotique est une technique couramment utilisée pour extraire les protéines contenues dans le périplasme des bactéries. Cette technique consiste à faire passer les bactéries d'un milieu à forte pression osmotique dans un milieu à faible pression osmotique. Par exemple NEU et al. dans J. Biol. Chem. 240 (1965) 3685-3692 préconisent l'utilisation d'une solution concentrée de saccharose contenant de l'éthylènediaminetetra- acétate (EDTA) comme-milieu à forte pression osmotique et de l'eau comme milieu à faible pression osmotique. Dans certains cas particuliers, on a pu extraire également par ce procédé des enzymes cytoplasmiques qui seraient localisées sur la face interne de la membrane cytoplasmique Evoir BEACHAM dans Int. J. Biochem. 10 (1979) 877-883. Toutefois, cette technique n'a pas permis jusqu'a présent de recueillir avec succés des protéines recombinantes sous forme mature, telles quel'IL-lB mature. On a maintenant trouvé de façon surprenante que l'on pouvait, à partir de cellules d'E. coli transformées avec un vecteur recombinant contenant un gène codant pour la forme mature de l'IL-1 p, récupérer de façon sélective l'IL-p mature, sous la forme soluble en soumettant ces cellules d'E. coli à un choc osmotique. Le gène mis en oeuvre selon l'invention est avantageusement une séquence d'ADN synthétique codant pour l'IL-1 R mature humaine ou d'origine animale et de préférence celle codant pour l'IL-1 p. mature humaine, c' est-à-dire pour les 153 acides aminés de la partie carboxy terminale de l'IL-1 p humaine. La séquence d'ADN codant pour l'IL-1 p humaine est decrite par LOMEDICO et al. dans NATURE, vol. 312, nov. 1984, p.458-462 et celle codant pour l'IL-1 p bovine est decrite notamment par MALISZEWSKI et al. cite précédemment. Le gene codant pour la forme mature de l'IL-1 ss doit être placé, dans le vecteur recombinant, sous le contrôle d'un promoteur approprié, tel que par exemple le promoteur tac ou le promoteur du gène e 10 du bactériophage T7 décrit par STUDIER et al. CJ. Mol. Biol. 189 (1986) 113-1303 et dénommé ci-apres promoteur e 10. L'invention va être maintenant décrite plus en détail en référence à t'IL-î p humaine sans pour autant Limiter la portée de la présente demande à L'obtention de cette seule protéine. La séquence d'ADN synthétique codant pour l'IL-1 p humaine decrite ci-après, placée dans un vecteur recombinant ou plasmide sous le contrôle du promoteur du gène e 10 du bactériophage T7 ou du promoteur tac, a été clonée dans des cellules d'E. coli selon les techniques classiques de clonage. Les cellules, d'E. coli résultantes ont été mises en culture, puis soumises à un choc osmotique. Le choc osmotique a été réalisé selon la technique de NEU et al. décrite précédemment. On a donc mis en suspension les cellules d'E. coli dans une solution concentrée de saccharose contenant de l'EDTA et on a transféré rapidement la suspension obtenue dans un milieu de faible pression osmotique, par exemple de l'eau glacée. Dans les deux cas, on a pu récupérer entièrement la proteine recombinante par ce choc osmotique, laquelle peut être aisément séparée en une seule étape à partir du surnageant par des techniques classiques de séparation, telles que par exemple par chromatographie haute performance (HPLC). La caractérisation partielle de la protéine recombinante obtenue a montré que 50X des molécules ont perdu La methionine Nterminale, tandis que les autres 50X ont perdu le dipeptide Nterminal méthionine-aîanine. On a trouvé que la protéine recombinante obtenue avait la même activité que l'IL-1 ss mature sur la prolifération des cellules T. I- Synthèse de la séquence d'ADN codant pour la forme mature de L'IL-1 p humaine Les oligonucléotides ont été synthétisés dans un synthétiseur "Biosearch 4600" en utilisant des nucléosides diiosopropylphosphoramidites et purifiés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 12% - urée 8 M. Le gène synthétique de l'IL-1 p humaine précédé du codon d'initiation ATG est représenté sur la figure 1 annexée ; il a été obtenu par assemblage de 19 fragments d'oligonucléotides contenant de 35 à 58 nucléotides ; ces fragments d'oligonucléotides sont indiqués par des flèches sur la figure 1 et la longueur de chaque fragment est précisée entre parenthèses. Cette séquence synthétique diffère de la séquence naturelle par quelques nucléotides ; on a note au-dessus de la séquence synthétique les bases de la séquence naturelle qui ont été modifiées. D'autre part, on a noté également sur la figure 1 les sites de restriction introduits dans cette séquence. Les fragments Cl g), à ltexception des fragments I et 11, ont été phosphorylés soit en paires complémentaires soit en un groupe de 3 oligonucléatides(fragments 4, 5 et 16) dans un mélange standard de ligation contenant les ingrédients suivants : Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 ; MgCl2 10 mM ; dithiothréitol 10 mM ; spermidine 1 mM , ATP 1 mM , 1 mg/ml de sérum albumine bovine et 10 unités de Tq-polynucléotide kinase (1 pL) dans un volume total due 11 luL. Après 30 minutes à 37 C, Les mélanges sont pLacés dans un bain-marie à 65 0C et maintenus pendant 10 minutes à cette température. Les solutions ont été rassemblées, Les fragments 1 et 11 ont été ajoutés et le mélange résultant a été chauffé pendant 10 minutes à 650C. On a ensuite Laissé le mélange refroidir jusqu'à 220C, puis on a ajouté l'ADN Ligase du bactériophage T4 (1 uL - 5 unités) et Le mélange ainsi traité a été maintenu pendant 10 minutes à 220C. Le gène synthétique (représenté sur la figure 1) a été purifié par électrophorèse sur du gel de polyacrylamide non dénaturant (SZ) et le fragment d'ADN souhaité a été électroélué pendant 16 heures dans un tampon composé de Tris-acétate 20 mM, pH 7,9 EDTA 500 mM et 0,1% de dodécylsulfate de sodium (SDS). Le fragment d'ADN a été ensuite purifié par chromatographie sur coLonne de DE-52 (Pharmacia) en éluant avec NaCl 1,5 M, Tris-HCL 50 mM pH 7,6 et EDTA 5 mM et précipité par de L'éthanol. Il- Construction des vecteurs d'expression Le plasmide 338,1 contenant La séquence d'ADN synthétique fabriquée ci-dessus a été construit à partir des plasmides 212,6 et 163,1 décrits dans La demande de brevet européen nO 245 138 citée dans la présente demande de brevet à titre de référence. Ces plasmides sont représentés respectivement sur Les figures 2 et 3 de cette demande européenne. Le plasmide 212,6 a été digéré par Les enzymes de restriction XhoI et HindîlI. Le grand fragment XhoI-HindIII de ce plasmide 212,6 a été ligature avec le petit fragment XhoI-EcoRI du plasmide 163,1 et avec la séquence d'ADN synthétique représentée sur La figure 1 annexée à la présente demande, c'est-à-dire avec Le fragment EooRI-HindIII correspondant aux 153 acides aminés de la partie carboxy terminale de L'IL-1 p mature humaine. Le plasmide 338,1 obtenu est représenté sur la figure 2a annexée à la présente demande ; il contient en plus du fragment EcoRI-HindîlI codant pour L'IL-1 p mature humaine - 1) le promoteur tac et le terminateur principal fd pour la transcription de L'IL-1 p (T. fd), - 2) Le répresseur lac i. La séquence d'ADN synthétique codant pour L'IL-1 F mature humaine a aussi été placée sous le contrôle du promoteur e 10. On a opéré selon te mode opératoire ci-apres en utilisant le plasmide 338,1 prépare précédemment. Le fragment BglII - HindîlI de 450 paires de bases du plasmide 338,1 a été cloné avec L'oligonucléotide de formule TATGGCACCTGTAA ACCGTGGACATTCTAG dans le plasmide pUC 18 décrit par Y. PERRON et al. Gene 33 (1985) : 103-119 cité dans la présente demande à titre de référence, ledit plasmide pUC 18 ayant été préalablement digéré par les enzymes de restrictions NdeI et BamHI. On a ainsi obtenu le plasmide 346 représenté sur la figure 2b. On a ensuite isolé le fragment NdeI - BamHI de 490 paires de bases du plasmide 346 et on l'a inséré dans le plasmide pET - 3a (contenant le promoteur e 10) préalablement digéré par les enzymes de restrictions BamHI et NdeI pour former le plasmide 353,1 représenté sur la figure 2c. On notera que le plasmide pET - 3a est décrit en détail par Rosenberg et al dans Gene 56 (1987) 125-135, cité dans la présente description à titre de référence, et est également dénommé pAR3040 par Studier et al. dans J. Mol. Biol. 189 (1986) 113-130. Les plasmides p338,1 et p353,1 ont été clonés, respectivement dans des cellules d'E. coli qui ont été cultivées sur du milieu L supplémenté avec 100 pg/ml d'ampicilline. III. Expression, isolation et caractérisation partielle de la pro téine recombinante Le plasmide p353,1 a été utilisé pour l'expression de la protéine recombinante sous Le contrôle du promoteur e 10. L'induction de L'ARN polymérase du bactériophage T7 a permis La transcription du gène de la protéine recombinante et la production de celle-ci avec Le poids moléculaire attendu, à savoir 17500 daltons. L'analyse densitométrique du profil électrophorétique de protéines totales de La cellule est représentée sur La figure 3. L'intégration des pics de cette figure a indiqué que La protéine recombinante représentait 20X des protéines cellulaires totales. Le choc osmotique, réalisé selon le mode opératoire défini ci-dessus sur Les cellules d'E. coli en fin de Leur phase de croissance exponentielle, a libéré 60X de La protéine recombinante produite comme te montrent les résultats de l'analyse densitométrique du profil électrophorétique des protéines- du choc osmotique (figure 4) et L'intégration des pics de celle-ci. Le surnageant du choc osmotique a été chromatographie en phase liquide haute performance sur une colonne HPLC phase inverse o C4 de Nucléosil 300 A (4,6 x 75 mm, SFCC, France) et élué avec un gradient Linéaire d'acétonitrile dans de L'eau contenant 0,1% d'acide trifluoroacetique, allant de 15 à 75% pendant 10 minutes à la vitesse de 2 ml/min. Le pic principal élué à 6,65 min (40% d'acétonitrile) contenait toute L'activité IL-1 B. Le chromatogramme obtenu est représenté sur la figure 5 annexée sur laquelle on a port en ordonnées la densité optique à 220 nm et en abscisses le temps en minutes. L'analyse automatique de la séquence selon la dégradation de EDMAN de La protéine éluée dans ce pic a montré que cette protéine ne possédait pas de méthionine sur la partie N-terminale et que 50t des molécules débutaient par l'alanine, alors que les autres 50X commençaient par la proline comme le montrent les résultats du tableau I ci-joint. L'activité biologique de la protéine recombinante IL-1 a été déterminée par le test de costimulation en utilisant la lignee de cellules auxiliaires T murines clonées DO-G4-1 (KAYE et al. Lymphokine Research, 3 (1984) 175-182). Les réponses proliférantes des cellules ont été mesurées par le test colorimetrique décrit par MOSMANN (J. Immunol. Methods 65 (1983) 55-83). L'activité spécifique de la protéine recombinante IL-1 obtenue, par rapport à L'IL-1 de référence obtenue auprès du National Institute of B;ological Standards and Control, London, était de 1,3 x 108 U/ml, étant entendu que 0,75 pg/ml d'IL-1 de référence correspond à 75000 unités arbitraires. La lyse dPs cellules au cours du choc osmotique a eté déterminée par La libération de la t-galactosidase. Les résultats obtenus figurent dans le tableau II ci après dans lequel on a également noté la quantité de j3-galactosi- dase (en U/mg) libérée après traitement aux ultrasons par des cellules traitées avec du saccharose ou des cellules entières. Ces résultats montrent que cette enzyme cytoplasmique reste associée avec les cellules qui ont été soumises au choc osmotique et qu'en conséquence la protéine recombinante IL-1 p est extraite sélectivement par le choc osmotique. En utilisant le plasmide p353,1 dans des cellules E. coli on a obtenu sensiblement les mêmes résultats, c'est-à-dire que La plus grande majorité de la protéine recombinante IL-1 p mature a été recueillie sous forme soluble dans le surnageant du choc osmotique. Le procédé de l'invention permet donc d'obtenir faci Lement une protéine recombinante IL-1 B sans qu'il soit nécessaire de faire intervenir des solvants parfois dénaturants pour la récupération de la protéine. D'autre part on notera que la purification de la protéine obtenue peut se faire en une seule étape TABLEAU I No des cycles de A A pmoles A A pmoles dégradation 1 Ala 245 Pro 268 3 Val 198 Arg 273 4 Arg 266 Ser 45 5 Ser 34 Leu 273 6 Leu 260 Asn 173 7 Asn 165 N.D. 8 N.D. . Thr 45 9 Thr 43 Leu 244 10 Leu 242 Arg 178 11 Arg 193 Asp 160 12 Asp 160 Ser 18 13 Ser 20 Gln 120 14 Gln 160 - Gln 15 Gln . Lys 168 16 Lys 179 Ser 10 17 Ser 10 Leu 129 18 Leu 145 Val 74 19 Val 91 Met 97 Met 118 Ser 8 21 Ser 9 Gly 75 22 Gly 82 Pro 83 Séquence N-terninale de la protéine recombinante IL-i p. TABLEAU II Traitement ss-galactosidase U/mg Surnageant du choc osmotique 51 Extrait aux ultrasons des cellules traitées avec du 873 saccharose Extrait aux ultrasons des cellules entières 906 REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'obtention d'IL-1 p mature recombinante, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver des cellules d'E. coli transformées parun gène codant pour ladite protéine, à soumettre les cellules d'E. coli à un choc osmotique et à séparer la protéine recombinante du surnageant du choc osmotique. 2. Procédé selon la revendication 1, caracterisé en ce que les cellules d'E. coli sont transformées par un vecteur recombinant contenant une séquence d'ADN synthétique codant pour les 153 acides aminés de la partie carboxy terminale de l'IL-1 ss humaine. 3. Procédé selon L'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'oligonucléotide est placé sous le contrôle du promoteur e 10 du bactériophage T7. 4. Procédé selon L'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que L'oligonucléotide est placé sous le con trône du promoteur tac.