FR 2637083 A1 19900330 FR 8812657 A 19880928 PROCEDE ET DISPOSITIF DE DETERMINATION DU pH ET DE LA CONCENTRATION CELLULAIRE DANS UN MILIEU DE CULTURE DE CELLULES L'invention concerne essentiellement un procédé et un dispositif permettant de déterminer le pH et la concentration de cellules dans un milieu de culture de cellules, par exemple dans un réacteur biologique, dans une cuve de fermentation, etc. On sait que la surveillance et le contrôle des processus biotechnologiques nécessitent la vérification systématique de certains paramètres, tels que le pH du milieu et la concentration ou densité de cellules dans le milieu. Les divers capteurs ou sondes pH-métriques que l'on utilise Jusqu'à présent pour obtenir ces informations en continu doivent présenter une fiabilité élevée pendant des périodes relativement longues. I1 est toutefois néces saire de les recalibrer systématiquement, ce qui oblige à les démonter, à les retirer et à les tester avec des milieux ou des solutions de référence. En outre, ces capteurs ou sondes doivent pouvoir être stérilisés à la vapeur. Par ailleurs, le dénombrement cellulaire est obtenu de façon discontinue, par échantillonnage r ce qui interdit en pratique un contrôle continu des processus biologiques. La présente invention a pour objet un procédé et un dispositif qui permettent d'éviter ces inconvénients de la technique antérieure connue. Elle propose, à cet effet, un procédé de détermination du pH et de la concentration cellulaire dans un milieu de culture de cellules, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre le milieu de culture en contact avec un indicateur coloré dont la coloration varie en fonction du pH du milieu, à éclairer le milieu coloré au moyen d'une source de lumière polychromatique, à capter les flux lumineux transmis et diffusés respectivement par le milieu, à déterminer les coordonnées chromatiques du milieu dans un espace chroinatique uniforme tel que l'espace L*, a*, b*, et à en déduire, par comparaison à des valeurs d'étalonnage, au moins le pH et/ou la concentration cellulaire du milieu. L'invention permet donc, par une mesure de colorimétrie, de déterminer le pH et/ou la concentration de cellules dans un milieu de culture donné. Une telle mesure peut être réalisée en continu, et sans qu'il soit néces saire que le capteur ou la sonde soient en contact direct avec le milieu de culture. Selon une autre caractéristique de l'invention, ce procédé consiste à réfléchir sur un miroir le flux lumineux transmis par le milieu et à le capteur, après une nouvelle traversée du milieu, en même temps que le flux diffusé par le milieu. On peut ainsi utiliser un seul moyen optique de captation de lumière, pour transmettre simultanément à des moyens d'analyse le flux lumineux transmis par le milieu et le flux lumineux diffusé par ce milieu. De façon plus préclse, le. procédé selon l'invention consiste à mesurer la réponse spectrale du milieu éclairé en lumière polychromatique, à déterminer les composantes trichromatiques X, Y, Z, du milieu, a en dé duire les coordonnées chromatiques L*, a*, b* du milieu, à comparer les coordonnées chromatiques a*, b*, mesurées à celles de trois points prédéterminés A, B, C, le point A correspondant à une concentration infinie de cellules dans le milieu, et les points B et C correspondant respectivement à un milieu dépourvu de cellules et comprenant la forme acide de l'indicateur coloré, et à un milieu dépourvu de cellules et comprenant la forme basique de l'indicateur coloré. Le pH du milieu peut être déterminé par calcul de l'écart chromatique entre un point de référence R se trouvant dans l'espace a*, b* sur la droite joignant les points B et C, et le point I d'intersection de cette droite avec la droite passant par le point de mesure M et le point A de concentration infinie de cellules. La position du point de mesure M sur le segment de droite AI, I étant l'intersection des droites AM et BC, permet de déterminer la concentration de cellules dans le milieu de culture. Selon les modes d'exécution de ce procédé, le milieu de culture peut être à concentration constante et prédéterminée en indicateur coloré, ou bien l'indicateur coloré peut être contenu dans une capsule à paroi semi-perméable, retenant l'indicateur coloré et laissant pénétrer l'acidité du milieu de culture, cette capsule étant montée à l'extrémité de fibres optiques d'éclairage et de captation de lumière, ce qui permet de déterminer le pH du milieu par mesure de la couleur de l'indicateur coloré contenu dans ladite capsule. L'invention propose également un dispositif de détermination du pH et de la concentration de cellules dans un milieu de culture de cellules, au moyen d'un indicateur coloré dont la teinte varie en fonction du pH, caractérisé en ce qu'il comprend une source de lumière polychromatique, des moyens d'éclairage d'une couche d'épaisseur déterminée du milieu, des moyens de captation, d'analyse spectrale et d'enregistrement de la lumière transmise et de la lumière diffusée par ladite couche du milieu, et des moyens de calcul des coordonnées chromatiques dans un espace chromatique uniforme tel que l'espace L*, a*, b* et de calcul du pH et/ou de la concentration cellulaire par comparaison des coordonnées chromatiques a*, b* à des valeurs d'étalonnage. Avantageusement, les moyens d'éclairage et de captation sont des fibres optiques. Le dispositif comprend également des moyens de mesure du flux lumineux émis par la source et des moyens de prise en compte de la valeur mesurée de ce flux dans le calcul des coordonnées chromatiques précitées. Cette mesure du flux lumineux de la source permet de s'affranchir des variations des caractéristiques de la source. Le dispositif comprend également un miroir de réflexion de la lumière transmise par la couche du milieu de culture et une fibre optique commune de captation dé la lumière transmise par le milieu et réfléchie par le miroir et de la lumière diffusée par le milieu. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les moyens d'analyse spectrale comprennent un spectromètre, un ensemble de photodétecteurs, et des circuits électroniques de traitement comprenant notamment des circuits de préamplification, d'échantillonnage et de conversion analogique-numérique, reliés aux moyens de calcul précités. Lorsque l'on souhaite ne pas introduire d'indicateur coloré dans le milieu de culture, cet indicateur peut être contenu dans une capsule à paroi semi-perméable, qui retient l'indicateur coloré et qui laisse pénétrer le milieu de culture, cette capsule étant montée entre les moyens d'éclairage et les moyens de captation, pour la détermination du pH du milieu de culture. Dans la description qui sult, faite à titre d'exemple, on se réfère aux dessins annexés, dans lesquels: la figure 1 est une vue schématique d'un dispositif de détermination de pH et de concentration cellulaire selon 1' invention; la figure 2 est une vue partielle d'une variante de réalisation de ce dispositif; la figure 3 est un graphe, dans l'espace a*, b* illustrant le principe de l'invention; la figure 4 est un diagramme, dans l'espace a*, b*, représentant les courbes de variation de pH à concentration cellulaire constante, et les courbes de variation de concentration cellulaire à pH constant. Le dispositif selon l'invention, représenté schématiquement en figure 1, comprend essentiellement une source 10 de lumière polychromatique, de préférence sensiblement équi-énergétique, telle qu'une lampe à arc xénon, qui est associée à une fibre 12 d'éclairage d'une couche 14 d'un milieu de culture ou de fermentation dont l'on veut mesurer le pH et/ou la concentration de cellules. La couche 14 de milieu de culture, dont l'épaisseur est typiquement de l'ordre de 5 mm, est délimitée entre deux parois transparentes 16. Une lentille 18 placée à la sortie de la fibre optique 12 permet de diriger sur la couche 14 un faisceau de rayons lumineux sensiblement parallèles qui traversent une paroi transparente 16, la couche 14, l'autre paroi transparente 16, sont réfléchis par un miroir ou analogue 20 placé à l'extérieur de la couche 14 et renvoyés vers la lentille 18 qui focalise le faisceau lumineux sur l'extrémité d'une fibre optique 22 de captation, reliée à l'entrée de moyens 24 d'analyse spectrale de la lumière captée. La sortie de ces moyens 24 est reliée à un micro-processeur 26 propre à effectuer les calculs nécessaires à la détermination du pH et/ou de la concentration cellulaire de la couche 14 du milieu de culture. Plus précisément, les moyens 24 d'analyse spectrale comprennent un spectromètre 28 à la sortie duquel est placé un ensemble 30 de photodétecteurs qui sont reliés par un circuit de préamplification 32 à un circuit d'échantillonnage 34. Un convertisseur analogique/numérique 36 relie le circuit d'échantillonnage 34 au microprocesseur 26. Ce dispositif fonctionne de la façon suivante le milieu de culture 14 contient un indicateur coloré, dont la teinte varie en fonction du pH du milieu de culture. Cet indicateur coloré peut être par exemple le rouge de phénol dont la coloration est jaune en milieu acide et violette en milieu basique. Plus précisément, la forme acide du rouge de phénol est caractérisée par une bande d'absorption centrée sur 430 nm (d'où résulte la couleur jaune) et sa forme basique est caractérisée par une bande d'absorption centrée sur 556 nm (d'où la couleur violette). La lumière transmise par le milieu de culture 14 va donc être modifiée par la teinte de ce milieu, résultant de la teinte de l'indicateur coloré correspondant au pH du milieu de culture. Lorsque le milieu de culture contient des cellules, il se produit une diffusion quasi-achromatique et multi-directionnelle de la lumière incidente. Lorsque la concentration de cellules dans le milieu de culture tend vers une valeur infinie, toute la lumière incidente est diffusée et aucun flux lumineux n'est transmis par le milieu de culture. La présence de cellules dans le milieu de culture se traduit donc par la diffusion d'une lumière blanche qui modifie la coloration due au pH du milieu de culture. En conséquence, une mesure colorimétrique permet, Si on le souhaite, de déterminer simultanément le pH et la concentration cellulaire du milieu de culture. Le dispositif de la figure 1 permet de capter par la fibre optique 22 une lumière qui est le mélange de la lumière transmise par le milieu de culture 14 et de la lumière diffusée par les cellules présentes dans ce milieu. La lumière captée est transmise au spectromètre 28, qui est par exemple du type à réseau par diffusion, et les signaux des photodétecteurs 30 placés en sortie du spectromètre sont traités par les circuits de préamplification, d'échantillonnage et de conversion analogique/numérique avant d'être transmis au microprocesseur 26 qui effectue des calculs qui seront expliqués dans ce qui suit. Dans le mode de réalisation qui vient d'être décrit, l'indicateur coloré est contenu dans le milieu de culture 14, qui est en général livré directement avec une concentration déterminée d'indicateur coloré. Il est cepen dant possible de faire des mesures sur un milieu de culture 14 qui ne comprend pas d'indicateur coloré. Pour cela, on utilise la variante du dispositif qui est représentée partiellement en figure 2 et qui comprend une capsule 40 montée entre les extrémités des fibres optiques 12 d'éclairage et 22 de captation, et dans laquelle est contenu l'indicateur coloré. La capsule 40 est à paroi semi-perméable, qui retient l'indicateur coloré et qui laisse pénétrer l'acidité du milieu de culture.La couleur de l'indicateur va donc être modifiée par le pH du milieu de culture et la lumière transmise par le liquide contenu dans la capsule et captée par la fibre optique 22, va permettre de déterminer, par une mesure colorimétrique, le pH du milieu de culture. La fibre optique de captation 22 peut être alignée avec la fibre d'éclairage 12 et -avec la capsule 40 comme représenté lorsque l'on veut également déterminer la concentration cellulaire du milieu de culture. De façon générale, la détermination du pH et de la concentration cellulaire se font par comparaison de coordonnées chromatiques de la lumière captée à des valeurs d'étalonnage, comme cela va être expliqué en référence à la figure 3. La réponse spectrale du milieu de culture 14 éclairé par la source 10 est analysée, échantillonnée et enregistrée numériquement. A partir de ces valeurs numériques enregistrées, on peut calculer les composantes trichromatiques X, Y, Z, de la lumière captée, puis ses composantes chromatiques dans un espace chromatique uniforme tel que L2, a*, b*. Il suffit, dans cette application de l'invention, de considérer les coordonnées chromatiques at, bt dont le plan est représenté en figure 3. Dans ce plan, le point A correspond au cas où la concentration dans le milieu de culture 14 tend vers l'infini, c'est-à-dire lorsque toute la lumière incidente est diffusée et qu'aucune lumière n'est transmise par le milieu de culture. La lumière captée est donc uniquement de la lumière blanche diffusée. Les points B et C sont définis par les coordonnées chromatiques a*, b* du milieu de culture 14 ne contenant aucune cellule, pour la forme acide et pour la forme basique respectivement de l'indicateur coloré. On constate que la droite BC est sensiblement le lieu des points représentant le milieu de culture 14 ne comprenant aucune cellule et dont le pH varie entre des valeurs acides et basiques. La droite BC peut être appelée, par exemple, droite de limpidité ou droite de concentration cellulaire nulle. On constate également que, lorsque la concentration cellulaire varie dans un milieu de culture ayant un pH prédéterminé constant, le lieu des points de mesure estun segment de droite passant par le point A (concentration cellulaire infinie) et coupant la droite BC en un point dont la position correspond au pH du milieu.Ainsi, lorsqu'une mesure colorimétrique sur un milieu de culture 14 de pH et de concentration cellulaire inconnus permet d'obtenir des coordonnées chromatiques a*l, b* correspondant à un point M dans l'espace a*, b* la position du point I d'intersection des droites AM et BC définit le pH de milieu de culture, et la position du point M sur le segment AI définit la concentration cellulaire du milieu. Dans l'espace chromatique uniforme Lt, a*, b*, la distance entre deux points correspond à l'écart chromatique NE qui est donné par la formule suivante où al, a2*, bi, b2 sont les composantes chromatiques des deux points. En général, le pH d'un milieu de culture est à une valeur de 7,2. On peut donc placer sur la droite BC le point de référence R qui correspond à un pH de 7,2 et dont les composantes chromatiques a*, b* sont connues, puis cal culer l'écart chromatique correspondant à la distance IR pour déterminer, par interpolation, le pH du point I. On peut également effectuer un calcul plus précis à partir de la formule suivante qui donne le pH en fonction de la constante de dissociation KA de l'indicateur coloré et du rapport forme basique/forme acide de cet indicateur forre basique formr acide pKA étant égal à 7,9 pour le rouge de phénol. Dans le graphe de la figure 3, cette formule correspond à PH = pKA + log IC lB Un étalonnage complet du système avec les milieux de culture et un type de cellules données, permet d'obtenir le diagramme de la figure 4, où il apparait clairement que la position d'un point dans l'espace at, b* permet de déterminer le pH et la concentration cellulaire du milieu de culture et où les concentrations sont exprimées. en nombre de cellules par millilitre. Le procédé et le dispositif selon l'invention permettent de déterminer le pH avec une précision de l'ordre du centième. Lorsque la concentration de cellules dans le milieu de culture est faible, on peut augmenter l'épaisseur de la couche 14 du milieu de culture traversée par la lumière. Par contre, lorsque la concentration de cellules est importante, on peut réduire cette épaisseur, pour privilégier la transmission de la lumière par rapport à sa diffusion, et obtenir une bonne précision sur le dénombrement cellulaire de solutions concentrées. Comme indiqué dans ce qui précède, l'invention prévoit également de réaliser une mesure, par exemple à intervalles réguliers, sur le flux lumineux émis par la source 10, qui peut donc être reliée directement aux moyens d'analyse spectrale 24. Les valeurs correspondantes sont conservées en mémoire et on utilise, dans les calculs, le rapport de ces valeurs par rapport à des valeurs initiales ou théoriques, pour s'affranchir des variations des caractéristiques de la source lumineuse. REVENDICATIONS 1) Procédé de détermination du pH et de la concentration cellulaire dans un milieu de culture de cellules ou de fermentation, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre le milieu de culture (14) en contact avec un indicateur coloré dont la coloration varie en fonction du pH du milieu, à éclairer le milieu coloré au moyen d'une source (10) de lumière polychromatique, à capter les flux lumineux transmis et diffusé respectivement par le milieu, à déterminer les coordonnées chromatiques du milieu dans un espace chromatique uniforme tel que l'espace L*, a*, b* et à en déduire, par comparaison à des valeurs A, B, C d'étalonnage, au moins le pH et/ou la concentration cellulaire du milieu. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à réfléchir sur un miroir (20) le flux lumineux transmis par le milieu (14) et à le capter, après une nouvelle traversée du milieu, en même temps que le flux diffusé par le milieu (14). 3) Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à optimiser l'épaisseur du milieu (14) traversée par le flux lumineux, en fonction de la concentration de cellules dans le milieu. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il consiste à capter le flux lumineux émis par la source (10) et à tenir compte de la mesure de ce flux pour la détermination des coordonnées chromatiques. 5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il consiste à mesurer la réponse spectrale du milieu (14) éclairé en lumière polychromatique, à déterminer les composantes trichromatîques X, Y, Z, du milieu, à en déduire les coordonnées chromatiques L*, a*, b* du milieu, à comparer les coordonnées chromatiques a*, b* mesurées à celles de trois points déterminés A, B, C, le point A correspondant à une concentration infinie de cellules dans le milieu, et les points B et C correspondant respectivement à un milieu dépourvu de cellules et contenant la forme acide de l'indicateur coloré, et à un milieu dépourvu de cellules et contenant la forme basique de l'indicateur coloré. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il consiste à déterminer le pH du milieu par détermination de l'écart chromatique entre un point de référence R se trouvant dans l'espace a*, b* sur la droite joignant les points B et C, et le point I d'intersection de cette droite avec la droite passant par le point de mesure M et le point A de concentration infinie de cellules. 7) Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il consiste à déterminer la concentration de cellules dans le milieu par la position du point de mesure M sur le segment de droite AI, I étant l'intersection des droites AM et BC. 8) Procédé selon l-'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que, dans l'espace a*, b* les courbes de mesure sur les milieux à pH constant et concentration de cellules variable sont des droites passant par un même point A correspondant à un milieu à concentration infinie de cellules. 9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que, dans l'espace a*, b* les courbes de mesure sur les milieux à concentration constante de cellules et à pH variable, sont des droites, au moins en première approximation. 10) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu. de culture est à concentration constante et prédéterminée en indicateur coloré. 11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'indicateur coloré est contenu dans une capsule .(40) à paroi semi-perméable, retenant l'indicateur coloré et laissant pénétrer le milieu de cul ture, cette capsule étant montée à l'extrémité de fibres optiques (12,22) d'éclairage et de captation de lumière, et en ce qu'on détermine le pH du milieu par mesure de l'indicateur coloré dans ladite capsule (40). 12) Dispositif de mesure du pH et de la concentration de cellules d'un milieu de culture de cellules ou de fermentation, au moyen d'un indicateur coloré dont la teinte varie en fonction du pH, caractérisé en ce qu'il comprend une source (10) de lumière polychromatique, des moyens (12) d'éclairage d'une couche (14) d'épaisseur déterminée dudit milieu, des moyens (22,24) de captation, d'analyse spectrale et d'enregistrement de la lumière transmise et de la lumière diffusée par ladite couche (14) du milieu, et des moyens (26) de calcul des coordonnées chromatiques dans un espace chromatique uniforme tel que l'espace L*, a* b* et de calcul du pH et/ou de la concentration cellulaire par comparaison des coordonnées chromatiques a*, b* à des valeurs d'étalonnage. 13) Dispositif selon la revendication (12), ca caractérisé en ce que les moyens d'éclairage et de captation sont des fibres optiques (12,22). 14) Dispositif selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens de mesure du flux lumineux émis par la source (10) et des moyens de prise en compte de la valeur mesurée de ce flux dans le calcul des coordonnées chromatiques précitées. 15) Dispositif selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend un miroir (20) de réflexion de la lumière transmise par la couche (14) du milieu et une fibre optique (22) commune de captation de la lumière transmise par le milieu et réfléchie par le miroir, et de la lumière diffusée par le milieu. 16) Dispositif selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que les moyens (24) d'analyse spectrale comprennent un spectromètre (28), un ensemble de photodétecteurs (30), et des circuits électroniques de traitement comprenant notamment des circuits (32) de préamplification, (34) d'échantillonnage et (36) de conversion analogique-numérique, reliés aux moyens (26) de calcul précités. 17) Dispositif selon l'une des revendications 12 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend une capsule (42) contenant l'indicateur coloré, à paroi semi-perméable retenant l'indicateur et laissant pénétrer le milieu, montée entre les moyens d'éclairage (12) et les moyens de captation (22), pour la détermination du pH du milieu.