FR 2634211 A1 19900119 FR 8809598 A 19880713 Procédé de marquage d'une sonde nucléique et trousse de réactifs pour la mise en oeuvre de ce procédé L'invention concerne un procédé de marquage non radioactif d'une sonde nucléique, ainsi qu'une trousse de réactifs pour la mise en oeuvre de ce procédé. Les sondes nucléiques constituent une technologie récente pour la détection et l'identification de séquences génétiques spécifiques aux êtres biologiques dans des échantillons soumis à analyse. Elles sont utilisées pour la détection des acides nucléiques en particulier ceux de micro-organismes, tels que les virus ou les bactéries dans le domaine médical, vétérinaire ou agro-alimentaire. Une sonde nucléique comprend, pour l'essentiel, une séquence nucléique ou "séquence-sonde", à savoir une séquence d'ARN ou d'ADN à simple brin qui est capable, dans des conditions expérimentales définies, de retrouver sa séquence nucléique complémentaire ou "séquence-cible, si cette dernière est présente dans l'échantillon biologique soumis à analyse et mis au contact de la sonde. En pareil cas, la séquence nucléique-sonde et la séquence nucléique-cible s'hybrident, en vertu de la complémentarité de leurs structures, pour former un système stable appelé "duplex". Pour révéler la présence de l'hybride, et par conséquent celle de la séquence nucléique-cible recherchée, il faut marquer la sonde afin d'obtenir un signal de détection sur le site même de la réaction d'hybridation. On a utilisé, pour réaliser ce marquage, des sondes ra dioactives permettant de détecter l'hybridation par comptage ou auto-radiographie. Pour éviter les inconvénients inhérents à la manipulation d'isotopes radioactifs, des sondes nucléiques dites "froides", ne comportant pas d'éléments radioactifs, ont été développées ces dernières années. I1 existe ainsi différents procédés permettant de détecter des hybrides nucléiques sans faire appel à des isotopes radioactifs. Les premiers procédés, de type non radioactif s, qui ont été développés, ont fait appel à des systèmes de détection indirecte où un nucléotide modifié a été incorporé dans la séquence nucléique-cible par synthèse enzymatique invitro. Le système le plus courant utilise des nucléotides biotinylés, c'est-à-dire des nucléotides comportant un motif biotine. Ces nucléotides sont incorporés à la séquence nucléique-sonde par la méthode enzymatique dite de "déplacement de coupure" (nick translation en anglais). La séquence nucléique-sonde biotinylée est hybridée à la séquence nucléique-cible (ADN ou ARN). L'hybride ainsi formé est ensuite reconnu par une protéine possédant une très forte affinité pour la biotine : par exemple de l'avidine, protéine isolée du jaune d'oeuf, ou encore de la streptavidine, protéine isolée de certains streptomyces. Pour donner une idée de cette affinité, on peut signaler que la constante de dissociation Kd de la streptavidine pour la biotine est égale à 10-15 M. Cette protéine (avidine ou streptavidine) peut être directement couplée à une molécule de phosphatase alcaline ou bien être ensuite elle-même reconnue par un complexe de phosphatases alcalines biotinylées. Par la suite, la phosphatase alcaline peut hydrolyser un substrat incolore et soluble en un produit coloré qui précipite in situ, ce qui permet de détecter l'hybride sur le lieu même de la réaction. Malheureusement, la sensibilité des systèmes avidinebiotidine, ou streptavidine-biotine, nratteint que difficilement celle des systèmes radioactifs. En outre, ces systèmes peuvent générer un bruit de fond important dans certaines applications et leur mise en oeuvre, assez lourde, est rédhibitoire pouX une utilisation en routine dans des laboratoires d'analyses. D'autres procédés de marquage indirect de sondes nucléiques ont été développés, dont certains font appel à une modification chimique de la séquence nucléique-sonde. La modification, de nature antigénique, apporte à la séquence-sonde des épitopes spécifiques susceptibles d'être reconnus par des anticorps. Après fixation sur l'épitope, ces anticorps, le plus souvent monoclonaux, sont ensuite reconnus par des anticorps polyclonaux liés par covalence à des enzymes de révélation, par exemple phosphatase alcaline, peroxydase, glucosidase, r;-galaÇtosi- dase, etc. Ces procédés, quoique très sensibles, sont encore d'un emploi compliqué et sont, par conséquent, réservés à des laboratoires de recherche fondamentale ou à d'importants laboratoires de recherche appliquée. Leur mise en oeuvre est encore trop longue et trop contraignante pour les laboratoires de routine diagnostique. En dehors des procédés de marquage indirect, des procédés de marquage direct ont été réalisés récemment. Le marquage se fait alors par incorporation chimique d'un nucléotide modifié sur lequel on a greffé une enzyme de révélation telle que la phosphatase alcaline. L'incorporation du nucléotide modifié ' se fait à l'aide d'un synthétiseur d'oligo-nucléotides et par couplage chimique. L'un des inconvénients de ces procédés de marquage direct réside dans le fait que cette synthèse nécessite obligatoirement de connaitre la séquence ' de 1'ADN cible que l'on recherche. Au surplus, le prix et la complexité de la séquence ne permettent d'obtenir que de courtes séquences nucléiques (oligc-nucléotides) sur lesquelles il n'est possible de greffer qu'une seule molécule d'enzyme par molécule d'oligo-nucléotide sous peine de déstabiliser l'hybride formé.Ce rapport mole à mole diminue la sensibilité de ce type de sonde. Enfin, avec ces procédés de marquage direct, il n'est guère possible d'envisager un marquage sans possèder un synthétiseur d 'ADN. Les différentes contraintes énoncées plus haut pour ce dernier procédé limitent d'autant: - la possibilité d'utiliser des sondes longues pour les études de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ce qui signifie : polymorphisme de longueur des fragments de restriction , - la possibilité d'utiliser des sondes dont la séquence nucléique-sonde n'est pas connue ou seulement partiellement connue - la possibilité d'utiliser directement un acide nucléique naturel ou un acide nucléique cloné. C'est, en conséquence, l'un des buts de l'invention de procurer un procédé de marquage non radioactif d'une sonde nucléique qui permet d'éviter les inconvénients des procédés de marquage connus dans la technique antérieure. C'est, en particulier, un but de l'invention de procurer un procédé de marquage permettant l'utilisation de sondes courtes ou longues, de séquences connues ou inconnues, sans nécessiter l'utilisation d'un synthétiseur à ADN. C'est aussi un but de l'invention de procurer un tel procédé de marquage qui soit adapté à la détection d'acides nucléiques, comme les acides nucléiques viraux ou bactériens ou plus généralement ceux des micro-organismes dont la détection est importante dans le domaine médical, vétérinaire ou agro-alimentaire. C'est encore un but de l'invention de procurer un tel procédé de marquage qui soit utilisable pour la détection de maladies génétiques ou l'analyse de cellules tumorales dans un but diagnostique, pronostique ou thérapeutique. C'est également un but de l'invention de procurer un tel procédé de marquage qui soit propice à la fabrication de trousses de réactifs diagnostiques ou "kits" ccmme à une utilisation propre à la recherche fondamentale dans laquelle le chercheur marque lui-même ses sondes, quel qu'en soit le type. C'est encore un but de l'invention de procurer un tel procédé de marquage qui permet une amplification du signal de détection par rapport aux procédés et systèmes connus jusqu'à présent. Selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé de marquage d'un acide nucléique dans une sonde nucléique comportant une séquence nucléique sonde propre à s'hybrider avec une séquence nucléique cible complémentaire. Conformément à l'invention, on réalise le marquage dudit acide nucléique par pontage chimique direct d'un système de révélation, en particulier d'une enzyme de révélation, au moyen d'un composé hétérobifonctionnel. Ce composé hétérobifonctionnel est capable de réagir à la fois avec -le ou les acides nucléiques à marquer et un système de révélation qui peut être notamment une protéine, ce qui permet d'établir un pontage entre les deux types de molécules. Ce pontage permet ainsi de lier le système de détection, par exemple une enzyme ou tout autre composé, directement sur la sonde nucléique, et cela quelle que soit la longueur et quelle que soit la nature (ADN ou ARN) de la sonde proprement dite, c'est-à-dire de sa séquence nucléique-sonde. Comme on pourra le constater plus loin, l'un des intérêts du procédé de l'invention est que le pontage chimique du système de révélation ne s'effectue pas sur la séquence nucléique-sonde proprement dite. Le procédé de l'invention peut s'appliquer à la fois au diagnostic de routine par la réalisation de trousses de réactifs (kits) de détection d'acides nucléiques de microorganismes, au diagnostic de certaines maladies génétiques et à une utilisation à des fins de recherche fondamentale où le chercheur possède ses propres sondes qu'il peut marquer lui-même. Comme .déjà indiqué plus haut, l'une des caractéristiques essentielles du procédé de l'invention consiste dans l'utilisation d'un composé hétérobifonctionnel propre à établir un pontage entre, d'une part, l'acide nucléique à marquer et, d'autre part, le système de révélation choisi, qui peut être une enzyme de révélation. De façon générale, on peut utiliser, pour la mise en oeu vre du procédé de l'invention, tout composé hétérobifonc- tionnel capable d'effectuer un tel pontage, c'est-à-dire un composé chimique possédant d'une part une fonction propre à établir une liaison avec l'acide nucléique à marquer et, d'autre part, une fonction propre à établir une liaison avec le système de révélation choisi. Certains des composés hétérobifonctionnels pouvant être utilisés dans l'invention sont déjà connus et ont été utilisés pour des applications totalement différentes. Dans une première forme de réalisation de l'invention, le composé hétérobifonctionnel est du type comportant une fonction dicarbonyle à une extrémité et une fonction phényl-azide à son autre extrémité. I1 peut s'agir, par exemple, du 4-azidophényl-glyoxal (APG) répondant à la formule générale ou encore du kéthoxal répondant à la formule générale ou de leurs dérivés. Le kéthoxal et le 4-azidophényl-glyoxal (APG) ont été décrits dès 1969 cottirne capables de se fixer spécifiquement sur les résidus Guanine non appariés des ARN de trans fert conférant à ces derniers une résistance aux attaques par la ARNase T1. Dans une autre forme de réalisation de l'invention, le composé hétérobifonctionnel est du type comportant une fonction imido-ester ou N-hydroxysuccinimide ester et une fonction phényl-azide. A cet égard, il peut s'agir, par exemple, du P-azidophénylacétique imido ester (APAI) répondant à la formule ou de l'un de ses dérivés. Les composés tels que 1'APAI sont des composés connus capables de se fixer à 1'ARN après photolyse de son groupe azide. Ces composés hétébifonctionnels ont été utilisés dans la littérature pour réaliser des pontages entre protéines et ARN ribosomiques des particules 30S des ribosomes d'E. Coli et pour étudier ainsi les sites de contact entre les protéines et L'ART qui constitue les ribosomes. Par conséquent, les composés hétérobifonctionnels utilisés dans la mise en oeuvre du procédé de l'invention ont une fonction et permettent d'aboutir à des résultats totalement différents de ceux qu'ils avaient rempli jusqu'à présent. En effet, conformément à l'invention, la fonction du composé hétérobifonctionnel est de réaliser un-couplage entre un système de révélation, notamment une enzyme, et l'acide nucléique à marquer qui fait partie de la sonde. Dans le cas où le composé hétérobifonctionnel utilisé dans l'invention est du type comportant une fonction dicarbonyle et une fonction phényl-azide, on fait d'abord réagir le composé hétérobifonctionnel, dans l'obscurité, avec l'acide nucléique à ponter, de manière à former une liaison covalente entre le composé hétérobifonctionnel et les groupements Guanine de l'acide nucléique. Ensuite, on fait réagir l'ensemble sous photo-activation, avec un système de révélation propre à former une liaison avec le nitrène qui résulte de la photo-activation de la fonction azide. Dans le cas où le composé hétérobifonctionnel est du type comportant une fonction imido ester ou N-hydroxysuccinimide ester et une fonction phényl-azide, on commence d'abord par faire réagir le composé hétérobifonctionnel avec un système de révélation comportant des groupements Lysine, par exemple une enzyme de révélation, pour obtenir une réaction entre le groupe ester du composé hétérobifonctionnel et les fonctions Epsilon-NH2 des groupements Lysine. Ensuite, on fait réagir l'ensemble sous photd- activation avec l'acide nucléique à ponter. Dans une première variante de réalisation de l'invention, on réalise le pontage du système de révélation sur un acide nucléique de la sonde elle-même, à condition toutefois que cet acide nucléique soit différent de l'acide nucléique qui forme la séquence sonde, faute de quoi ladite séquence spnde ne pourrait s'hybrider à la séquence cible. Dans une autre variante, on réalise le pontage du système de révélation sur un acide nucléique ne faisant pas partie de la sonde et on accroche ensuite l'acide nucléique ponté à la sonde. Dans ce cas, l'acide nucléique sur lequel le pontage a été réalisé est ensuite lui-même lié à l'acide nucléique sonde, c'est-à-dire à la séquence sonde, par une liaison phospho-ester faisant intervenir une ligase ou bien par un procédé de couplage chimique. Conformément à l'invention, on préfère cette deuxième variante de marquage, dans laquelle l'acide nucléique préalablement ponté est ensuite accroché à la séquence sonde étant donné qu'elle confère une excellente sensibilité au procédai. En effet, les composés hétércbifonctionnels utilisés, notamment 1'APG et 1'APAI, réagissent avec les bases aromatiques des acides nucléiques. L'APG, par exemple, réagit avec les groupements aminés qui permettent aux liaisons hydrogènes de s'établir entre la Guanine et la Cytosine dans les duplex d'acides nucléiques. -Ainsi, lorsque 1'APG est fixé sur une Guanine, celle-ci ne peut plus établir ensuite de liaison hydrogène avec une Cytosine. Par ailleurs, après couplage avec le système de révélation, par exemple une molécule de phosphatase alcaline, dont la masse moléculaire est de l'ordre de su.000 daltons, l'er.-- cambrement stérique apporté par la protéine ccnduit à un non-appariement sur une longueur moyenne de 250 nucléotides environ par molécule d'enzyme fixée. Toujours dans cette variante préférentielle, l'acide nucléique accroché à la sonde est un acide nucléique non ccdant, naturel ou synthétique, choisi parmi de 1'ADN, df 1'ARN, du poly-A-G (formé uniquement de bases Adénine et Guanine) et de poly-dA-dG,'ou bien un acide nucléique naturel dont la séquence est choisie de manière à ne pas interférer avec la séquence nucléique-cible pendant l'hybridation. On Fréfère tout particulièrement utiliser des séquences statistiques ou "randomisées" d'acide nucléique simple brin comme le poly-A-G ou le poly-dA-dG et de longueur variable, ce qui donne tout loisir pour fixer un grand nombre de molécules du système de révélation, notamment d'une enzyme de révélation. La sensibilité de la détection s'e trouve améliorée et il n'y a pas à craindre de fixation non spécifique de ces séquences. Conformément à l'invention, la réaction de pontage doit s'effectuer sur un acide nucléique préalablement dénaturé, c'est-à-dire du type monobrin. L'accrochage de l'acide nucléique ponté à la sonde, c'està-dire à la séquence nucléique-sonde, s'effectue avanta geusément au moyen d'une ligation faisant intervenir une ARN ligase à laquelle on ajoute éventuellement de 1'ADN ligase. Toutefois, en variante, on peut envisager d'accrocher l'acide nucléique ponté à la sonde par voie chimique. Le système de révélation est de préférence une protéine choisie notamment parmi des enzymes, en particulier la phosphatase alcaline, des anticorps, etc. Si le système de révélation est constitué par une protéine, on peut former ensuite sur cette protéine un complexe protéique, enzymatique ou multi-enzymatique propre à amplifier le signal de détection. La formation du complexe peut s'effectuer par des méthodes connues, en particulier en utilisant du glutaraldéhyde ou encore du Néthoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ) pour former des liaisons covalentes protéine-protéine. On obtient ainsi une amplification élevée de la détection, étant donné que, d'une part, plusieurs moles de système de'détection sont liés à 1a sonde par mole de cette dernière et que, d'autre part, on peut greffer ensuite des complexes générant des signaux amplifiés. Dans une autre variante, le système de révélation est de nature non protéique et choisi notamment parmi des composés fluorescents. Ainsi, conformément à l'invention, la partie propre de la sonde, c'est-à-dire la séquence nucléique-sonde complémentaire de la séquence nucléique-cible recherchée dans le milieu biologique ou dans l'analyse, peut ainsi avoir une longueur importante ou, au contraire, être très courte au gré de l'expérimentateur. Cette souplesse permet une utilisation universelle de ce type de marquage. En effet, les séquences longues pourront être utilisées pour réaliser des hybridations utilisant des acides nucléiques clonés de séquences généralement importantes. Ces acides nucléiques clonés peuvent être obtenus facilement et en grande quantité par les techniques d'amplification plasmidique. De plus, il n'est pas nécessaire d'en connaître la séquence pour les utiliser. Ce type de sonde est particulièrement utile pour les études de RFLP. D'autre part, les séquences courtes ou oligo-nucleoti- diques, c'est-à-dire comprises entre 15 et 50 nucléotides, peuvent être employées de la même manière en utilisant ce type de marquage. L'intérêt des sondes oligo-nucléo- tides réside dans la vitesse à laquelle l'hybridation peut être réalisée. Ainsi, le temps (t ) au bout duquel la moitié d'un ADN est renaturée est égal à 2,5 minutes avec une sonde de 15 nucléotides de longueur à une concentration de l'ordre de 10 nM. Dans les mêmes conditions, il faudrait entre 6 et 24 heures pour une sonde de longueur classique, c'est-à-dire de l.0C0 à 5.0C0 nucléotides.Cet important gain de temps est vital pour permettre à la technologie des sondes non-radioactives d'être utilisées en routine dans les laboratoires d'analyses diagnostiques privés ou publics. Sous un autre aspect, l'invention concerne un ensemble de réactifs ou "kit" pour la mise en oeuvre du procédé défini plus haut. Cet ensemble comprend, pour l'essentiel - un flacon d'acides nucléiques pontés avec un système de détection, par exemple une enzyme de détection - un flacon d'un système de ligation, par exemple une enzyme de ligation - un flacon d'un mélange réactionnel tamponné, propre à être mélangé aux substrats (acide nucléique-sonde et acide nucléique-ponté au système de détection); - un flacon d'une solution tampon, propre à être mélangée à au moins un substrat chromogène, propre à réagir avec le système de révélation ; et - un flacon d'au moins un substrat chromogène. L'invention sera maintenant décrite en référence au dessin annexé qui représente schématiquement une sonde conforme à l'invention. Sur le dessin annexé, on a représenté schématiquement une séquence nucléique-cible SNC fixée sur un support solide approprié, par exemple sur une membrane M de nylon ou de nitrocellulose. La séquence nucléique-cible, qui peut être par exemple un ADN monobrin, est propre à s'hybrider avec une séquence nucléique-sonde SNS monobrin et de structure complémentaire pour former un hybride. La séquence nucléique-sonde SNS fai.t partie d'une sonde conformément à l'invention. A chaque extrémité de la sé quence SNS est accroché un acide nucléique marqué ANM, le marquage étant effectué conformément à l'invention. Ainsi, des molécules d'un composé hétérobifonctionnel CHB sont liées, d'une part, à l'acide nucléique marqué et, d'autre part, à un système de révélation, dans l'exem- ple une molécule de phosphatase alcaline PA jouant le rôle de système de détection. La phosphatase alcaline est cap ~le de réagir avec un substrat chromogénique SC incolore et de catalyser sa transformation en un produit coloré et insoluble qui précipite in situ, c'est-à-dire sur le lieu même de la réaction A titre d'exemple, on utilise 1'APG en tant que composé hétérobifonctionnel pour réaliser le pontage chimique direct du système de révélation sur l'acide nucléique à marquer. Cet acide nucléique est dénaturé s'il est à dcuble-brin par chauffage à 1000C pendant 7 minutes, puis refroidi brutalement dans la glace à OOC pour éviter toute renaturation. L'APG est un alpha-dicarbonyle qui est propre à réagir avec les groupements Guanidinium de l'acide nucléique devant être marqué. La réaction est plus spécifique des résidus Guanine à pH neutre et en présence de borate. Cette première réaction doit nécessairement être réalisée à l'obscurité pour éviter la photolyse de la fonction azide. La première réaction qui conduit à la liaison covalente APG-Guanine a lieu dans un tampon : 0,1 M acide 3-(Nmorpholino)2-propanesulfonique ou MOPS, pH : 7,0, 0,02 M borate de sodium., 0,01 M MgC12. Pour 10 à 20 microgrammes d'acide nucléique simple brin en solution dans ce tampon, on ajoute de 1'APG à l'obscurité à partir d'une solution stock ccngelée à 200 mg par ml dans le dioxanne de manière que la concentration finale en APG soit de 1,5 mg par ml. La réaction a lieu à l'obscurité pendant 30 minutes à 37"C. Les acides nucléiques sont ensuite précipités à l'obscurité avec de l'méthanol absolu à -200C. Le précipité est ensuite centrifugé et remis en suspension dans le même tampon MOPS sans APG. La deuxième réaction consiste à réaliser une liaison covalente entre 1'APG liée à l'acide nucléique et une protéine ou tout composé chimique susceptible de réaliser une liaison avec un nitrène. Les aryles-azides, inactifs dans l'obscurité, forment des aryles-nitrènes lorsqu'ils sont photoactivés. Ces groupes sont très instables et réagissent avec les protéines pour donner des liaisons covalentes. A la solution précédente, on ajoute le système de détection que l'on désire coupler. Dans cet exemple, ce système de détection est une enzyme, à savoir la phosphatase alcaline, que l'on ajoute à une concentration finale de 120 microgrammes par ml. Le mélange est placé dans une cuve de quartz de 1 à 2 mm d'épaisseur et irradié pendant 15 à 45 minutes sous une lampe à ultraviolets de faible puissance. La cuve est directement placée contre la lampe avec, cependant, un couvercle de boite de- Pétri en pyrex, intercalé entre la lampe et la cuve. Le pyrex permet de filtrer les rayonnements ultraviolets de longueur d'onde inférieure à 300 nM. Après irradiation, le mélange est directement placé sur une colonne d'Ultrogel AcA-34 afin de séparer et de purifier les acides nucléiques couplés à la phosphatase alcaline qui viennent d'être préparés. Les fractions utiles récupérées sont rassemblées et précipitées avec de l'méthanol absolu à -200C. Dans un autre exemple, le composé hétérobifonctionnel utilisé est 1'APAI et le système de révélation est la phosphatase alcaline, comme dans l'exemple précédent. La première réaction fait intervenir le groupe imido-ester de 1'APAI et les fonctions Epsilon-NH2 des groupes Lysine de la phosphatase alcaline à pH 7,4 ou à pH 9. De préférence, la réaction a lieu à l'obscurité et à 370C pendant 30 minutes dans un tampon triéthanolamine-HCl à 0,1 M et à pH 9 contenant 1'APAI à 0,05 M final et la phosphatase alcaline à 120 microgrammes par ml final L'acide nucléique (ADN dénaturé ou ARN) devant être ponté est ajouté au mélange réactionnel et l'ensemble est précipité avec de l'éthanol absolu à'-200C. Le précipité est centrifugé et repris dans le même tampon sans APAI. Le mélange est ensuite placé dans une cuve en quartz de 1 à 2 mm d'épaisseur et irradié pendant 15 minutes sous une lampe à ultraviolets de faible puissance. La cuve est directement placée contre la lampe avec un couvercle de boîte de Pétri en pyrex, intercalé entre la lampe et la cuve. Après irradiation, le mélange est directement placé sur une colonne d'Ultrogel AcA-34 afin de séparer et de purifier les acides nucléiques couplés à la phosphatase alcaline qui viennent d'être préparés. Si la sonde est assez longue et si le niveau de détection requis demande une sensibilité moyenne, la sonde peut être directement utilisée après ces dernières étapes, que le pontage ait été effectué avec 1'APG ou avec 1'APAI. Cependant, la sensibilité demandée le plus souvent doit permettre la détection d'une séquence unique dans un génome où la détection d'ARN, messagers rares. L'invention se prête tout à fait à ces exigences. Dans ce cas, le pontage s'effectue sur un acide nucléique non-codant préparé, par exemple, par synthèse enzymatique ou sur un acide nucléique naturel dont la séquence n'interférera pas avec la séquence nucléique-cible au cours de l'hybridation. L'exemple qui suit illustre l'accrochage à la séquence nucléique-sonde de l'acide nucléique préalablement ponté. Dans une forme de réalisation préférée de l'invention, les acides nucléiques non-codants sont constitués de poly-A-G ou de poly-dA-dG simple brin dont la séquence est obtenue au hasard. Ces acides nucléiques peuvent être réalisés par l'utilisateur au laboratoire ou achetés facilement dans le commerce. Le pontage avec des molécules de système de révélation, par exemple de phosphatase alcaline, est réalisé à l'aide de 1'APG ou de 1'APAI. L'acide nucléique, lié de façon covalente à l'enzyme, est ensuite lui-même lié ou accroché à la sonde proprement dite, c'est-à-dire à la séquence nucléique-sonde, par une réaction de ligation faisant intervenir de 1'ARN ligase à laquelle on peut ajouter éventuellement de l'ADN ligase. I1 se produit ainsi une liaison alcool-acide qui donne un phospho-eter qui permet de relier les deux acides nucléiques. Le pontage des acides nucléiques faisant intervenir 1'APG et ses dérivés ou encore 1'APAI et ses dérivés nécessite la dénaturation préalable des acides nucléiques. Tous les acides nucléiques utilisés sont donc simple brin. Dans une réalisation préférée de l'invention, les acides nucléiques pontés sont liés à la sonde (séquence nucléiquesonde) en utilisant de 1'ARN ligase. Cette enzyme est en effet capable de réaliser la formation d'une liaison phospho-diester entre deux acides nucléiques simple brin ADN ou ARN. Son activité est particulièrement bonne visà-vis de llARN. A titre d'exemple, la ligation est réalisée pendant la nuit à 370C en présence de 4 microgrammes de T4 ARN ligase dans un tampon contenant 0,05 M Tris HC1 pH 7,6, 0,01 M MgC12, 0,01 M adénosine-triphosphate (ATP), 0,01 M dithiothréitol, 5 % polyéthylèneglycol 8000 (PEG 8000) en concentration finale et 2 microgrammes d'acide nucléique totaux. La rapport acide nucléique-sonde/acide nucléiqueponté est généralement de 1/3 à 1/5 en termes de concentration d'extrémité. Comme indiqué, précédemment, on peut, dans certains cas, ajouter de 1'ADN ligase pour améliorer la ligation entre l'acide nucléique-ponté et l'acide nucléique-sonde. Comme indiqué plus haut, le nombre de molécules d'enzymes, ou plus généralement de molécules du système de détection, fixé par molécule de sonde, peut être augmenté de façon importante. Cette augmentation est possible car elle ne nuit pas à la stabilité future des hybrides qui se formént puisque les nucléotides pontées n'interviennent pas dans l'hybridation elle-même. L'augmentation du nombre de molécules d'enzyme (ou autre système de détection) liées par molécule de sonde est obtenue par liaison covalente protéine-protéine à l'aide de la-glutaraldéhyde ou de 1'EEDQ selon des méthodes classiques connues. Ainsi, on peut aboutir, par exemple, à des complexes de poly-phosphatases alcalines. On peut prévoir de réaliser également la fixation de complexes multi-enzymatiques à plusieurs substrats capables d'augmenter encore l'importance du signal généré par la sonde hybridée ou tout autre système propre à générer un signal intéressant et exploitable. Le procédé de l'invention trouve ainsi une application universelle, c' est-à-dire qu'il peut être utilisé pour marquer tous les types de sondes pour chaque application spécifique. Ce procédé de marquage peut être appliqué aussi bien pour le diagnostic rapide avec des oligo-nucléotides que pour des applications de recherche fondamentale ou encore pour l'étude des RFLP ou les sondes doivent nécessairement comporter des séquences longues. Le procédé de l'invention est très sensible et plus facile à mettre en oeuvre que les autres procédés existants puis qu'il ne fait pas intervenir de molécules intermédiaires, telles que protéines et leurs ligants, systèmes anticorpsantigènes, etc. La révélation de l'hybride nucléique est donc immédiate après hybridation. Le procédé permet également l'utilisation de complexes multi-enzymatiques ou de tous autres systèmes biologiques, biochimiques ou chimiques, propres à augmenter efficacement le signal de détection sans nuire à la réalisation et à la stabilité de l'hybride nucléique. La très bonne sensibilité du marquage permet l'utilisation de sondes plus courtes. Ces sondes plus courtes limitent ainsi la complexité de la renaturation et donc le temps de la réaction. Les temps d'hybridation sont ainsi considérablement réduits. I1 ne nécessite pas obligatoirement de disposer d'un synthétiseur de ADN, les sondes courtes pouvant être obtenues et amplifiées par clonage. I1 permet l'utilisation de sondes- longues, indispensables pour l'étude de RFLP. A titre d'exemple, l'ensemble de réactifs pour la mise en oeuvre du procédé peut comprendre les éléments suivants - un flacon d'acides nucléiques pontés avec la phosphatase alcaline - un flacon d'une enzyme de ligation (par exemple ARN ligase) - un flacon d'un mélange réactionnel tamponné, par exemple Tris acétate 100 mM, pH 9,4, acétate de sodium 100 mM, acétate de magnésium 10 mM - un- flacon d'une solution tampon propre à être mélangée aux substrats chromogène de l'enzyme de révélation - un flacon d'un composé chromogénique nO 1, par exemple 5-bromo-'4-chloro-3-indolyl-phosphate - un flacon d'un composé chromogénique 2, par exemple nitrobleu de tétrazolium. Revendications 1. - Procédé de marquage d'un acide nucléique dans une sonde nucléique comportant une séquence nucléique-sonde propre à s'hybrider avec une séquence nucléique-cible complémentaire, caractérisé en ce que l'on réalise le marquage de l'acide nucléique par pontage chimique direct d'un système de révélation, en particulier d'une enzyme de révélation, au moyen d'un composé hétérobifonctionnel. 2. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé hétérobifonctionnel comporte une fonction dicarbonyle à une extrémité et une fonction phényl-azide à son autre extrémité. 3. - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le composé hétérobifonctionnel est choisi parmi le 4-azidophényl-glyoxal (APG) et le kéthoxal ou leurs dérivés. 4. - Procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que l'on fait d'abordréagir le composé hétérobifonctionnel, dans l'obscurité, avec l'acide nucléique à ponter de manière à former une liaison aovalente entre le composé hétérobifonctionnel et les groupements Guanine de l'acide nucléique et en ce que l'on fait ensuite réagir l'ensemble, sous photoactivation, avec un système de révélation propre à former une liaison avec le nitrène résultant de la photoactivation de la fonction azide. 5. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé hétérobifonctionnel est du type comportant une fonction imido-ester ou N-hydroxysuccinimide ester et une fonction phényl-azide. 6. - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le composé hétérobifonctionnel est le p-azidophénylacétique imido ester (APAI) ou l'un de ses dérivés. 7. - Procédé selon l'une des revendications 5 et 6, caractérisé en ce que l'on fait d'abord réagir le composé hétérobifonctionnel avec un système de révélation comportant des groupements Lysine, notamment une enzyme de révélation, pour obtenir une réaction entre le groupe ester du composé hétérobifonctionnel et les fonctions Epsilon NH2 des groupements Lysine, et en ce que l'on fait ensuite réagir l'ensemble, sous photoactivation, avec l'acide nucléique à ponter. 8. - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on réalise le pontage du système de révélation sur un acide nucléique de la sonde elle-même. 9. - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on réalise le pontage du système de révélation sur un acide nucléique ne faisant pas partie de la sonde et en ce que l'on accroche ensuite l'acide nucléique ponté à la sonde. 10. - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'acide nucléique accroché à la sonde est un acide nucléique non codant, naturel ou synthétique, choisi parmi de 1'ADN, de 1'ARN, du poly-A-G, du polydA-dG, ou un acide nucléique naturel dont la séquence est choisie de manière à ne pas interférer avec la séquence nucléique-cible pendant l'hybridation. 11. - Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on réalise la réaction de pontage sur un acide nucléique préalablement dénaturé, du type monobrin. 12. - Procédé selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que l'on accroche l'acide nucléique ponté à la sonde (séquence nucléique-sonde) par une ligation faisant intervenir une ARN ligase à laquelle on ajoute éventuellement de 1'ADN ligase. 13. - Procédé selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que l'on accroche l'acide nucléique ponté à la sonde par voie-chimique. 14. - Procédé selon l'une des revendications 1 a 13, caractérisé en ce que le système de révélation est une protéine choisie notamment parmi des enzymes, en particulier la phosphatase alcaline, des anticorps, etc. 15. - Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'on forme ensuite sur la protéine un complexe protéique, enzymatique, ou multi-enzymatique propre à amplifier le signal de détection, la formation du complexe étant effectuée par des méthodes connues, en particulier au moyen de glutaraldehyde ou de EEDQ pour former des liaisons covalentes protéine-protéine. 16. - Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le système de révélation est de nature non protéique et choisi notamment parmi des composés fluorescents. 17. - Ensemble de réactifs pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend - un flacon d'acides nucléiques pontés avec un système de détection, par exemple, une enzyme de détection - un flacon d'un système de ligation - un flacon d'un mélange réactionnel tamponné propre à être mélangé aux substrats (acide nucléique-sondeet acide nucléique ponté au système de détection) - un flacon d'une solution tampon propre à être mélangée à au moins un substrat chromogène propre à réagir avec le système de révélation ; et - un flacon d'au moins un susbstrat chromogène.