FR 2626285 A1 19890728 FR 8800673 A 19880122 PROCEDE DE RAJEUNISSEMENT COMPLET IN VITRO PREALABLE A LA MICROPROPAGATION D'ARBRES ADULTES OU TRES AGES SELECTIONNES L'invention concerne un procédé de rajeunissement complet in vitro. prealable a la mlcropropagatlon arbres adultes ou aqes selectionnes Le procede consiste en une sequence de manipulations (dissection, isolement d organes, repiquage sur divers milieux, ) conduisant au raieunissemenz complet hou réactivation du matériel). puis à la propagation intense de olantes vigoureuses et orthotropes a partir de materiel adulte nu age (en particulier d'explants preleves sur des arbres selectionnés) Actuellement, la destruction des forêts s'accentue rapidement et la demande en bois et produits dérivés s'accroit.En vue du reboisement et pour mieux connaître la physiologie de l'arbre, il est necessaire ce produire en masse des arbres, a partir de sujets selectionnés pour un phénotype interessant. Ceri implique de multiplier des arbres adultes- voire très ages. Or, pour la plupart dC5 especes, le bouturage d'arbres adultes - et plus encore d'arbres âaés- est généralement beaucoup plus lent et plus difficile que le bouturage d'arbress leunes En outre, lorsque les boutures d'arbres âgés s'enracinent, le système racinaire est peu développé; la croissance des tiges est peu vigoureuse et parfois plagiotrope.Il apparaît donc nécessaire de rajeunir le matériel ligneux avant de procéder à sa multiplication intensive Certes 11 est possible de rajeunir in situ par ces manipulations ces pieds-meres (taille, greffages et/ou bouturages en cascade, pulvérisations de régulateurs de croissance,...).Mais la réactivation du matériel ou rajeunissement n'est que partielle et les nouvelles plantes ne présentent pas toute les caracteristiques de juvenilite (notament d'orthotropie; Ainsi, pour atteindre le double objectif -rajeunissement du maternel et multiplication intensive, il est nécessaire d'utiliser la technique de culture in vitro En effet, les différences de comportement entre matériels jeune et âgé s'observent aussi en culture in vitro Mais, selon les especes, la seule introduction in vitro induit un certain degré de rajeunissement. De pius, plusieurs auteurs ont déjà remarque que les subcultures, lors de la multiplication du matériel in vitro, induisent un certain degré de rajeunissement.En outre, cette technique permet d'assurer une propagation rapide et intense ciu matériel reactive. C'est pourquoi nous avons utilisé cette technique comme un outil pour l'étude des processus de rajeunissement Il était alors impératif pour les forestiers d'obtenir un procede in vitrode rajeunissement complet du matériel ligneux sélectionnés adultes ou âges. C'est pourquoi nous nous sommes attachés à mettre au point un traitement de rajeunissement complet du matériel in vitro chez deux clones de Sequoia sempervirens Issus d'arbres selectionnes âges de 50 ans (clone 1) et 500 ans (clone II). Voici, concrètement, les moyens pour atteindre ce résultat. Le procede selon l'invention permet d'atteindre le double objectif par la technique de culture in vitro rajeunissement complet du matériel et mlcropropagatlon intensive. Il est caractérisé par la séquence des manipulations suivantes. (a) des rameaux de l'annexe sont introduits en culture m vitro et des tiges sont obtenues (O) des explants de ces tiges, comportant 3 feuilles, subissent un traitement de repiquage sur milieu avec régulateurs de croissance, ce qui est appelé le traitement inducteur du rajeunissement (c) puis, les explants sont repiqués chaque semaine et, à chaque repiquage. la base des explants est rafraîchie (d) silmultanément à certain repiquages de l'étape (c), la taille (ou élagage) de rameaux axillaires est effectuee (e) a partir des tiges obtenues aux étapes (c) et/ou (d), les feuilles isolées sont repiquées sur milieu d'induction au bourgeonnement epiphylle Les traitements ont été effectués sur les milieux dits de repiquage MM (milieu de multiplication contenant des regulateurs de croissance; et MO (milieu ne contenant pas de régulateurs de croissance), ainsi que sur le milieu d'allongement aes tiges MA (milieu ne contenant pas ae régulateurs de croissance, mais du charDon actif), ces milieux sont décrits dans la figure 1 > le milieu de base commun à tous les milieux de culture est décrit dans la figure 2 Pour illustrer l'invention, les expérimentations sont présentées ci-apres, en référence aux dessins annexés dans lesquels - la figure 3 représente le schéma expérimental utilise, - la figure 4 représente la méthode de taille (ou élagage) in vitro des rameaux axillaires d'ordre 1, puis d'ordre 2, - la figure 5 represente la séquence des observations morphologiques, des tests physiologiques et des mesures biochimiques qui sont effectués au cours des expérimentations de rajeunissement pour caractériser l'état de jeunesse du Nous avons travaillé selon les protocoles expérimentaux décrits ci-après. Dans un premier temps, nous avons montre qui faut prendre des explants de t feuilles; ces derniers sont prélevés sur toute la longueur des tiges provenant du pool de matériel introduit puls multiplié in vitro(appelé matériel d'entretien). Dans un deuxième temps, nous avons montré que les procédés de rajeunissement reposent sur le traitement repiquage frequent ces explants sur milieux de culture Le repiquage consiste à rafraîchir la section basale de l'expiant et a le repiquer sur un milieu neuf.Les traitements sont les suivants (Fig :) * Les explants sont repiqués sur MM (Fig 1 et 2) tous les 7 jours pendant trois semaines ce que nous appellons le traitement Inducteur du raleunissement Puis lis sont repiqués sur MO tous.les 7 jours dans l'exp (4) et tous les 21 jours dans l'exp (5). * Dans l'exp (6), après l'induction au rajeunissement, les explants sont repiqués sur MO tous les 21 jours mais simultanement, les rameaux axillaires sont tailles a i cm de la tige qui les porte (Fig 4). Nous appellons cette manipulation: la taille (ou élagage) des rameaux axillaires in vitro Pour suivre l'évolution du rajeunissement. nous disposons dsur, certain nombre de criteres de l'état jeune (Fig 5) "enracinement", "reactivation des méristèmes caulinaires isolés", "hauteur des tiges "nombre cie feuilles". "rapport hormonal AIA/ABA", "bourgeonnement épiphylle" A Intervalle de temps régulier (Fig 3 et 5), nous sortons, pour chaque clone, des lots de 12 expiants qui sont repiqués sur MA (Fig 1 et 2).Trois semaines plus tard, cnaque expiant fait l'objet des observations morphologiques et des test physiologlques, cités précédement Décrivons plus en détail la technique du bourgeonnement épiphylle induit" les 10 feuilles apicales des tiges allongées sur MA sont isolées, en prenant soin de prelever la zone axillaire (fragment de tige a la base cie ia feuille ou se développe normalement le bourgeon axillaire). Les feuilles sont ensuite déposées sur Me (millieu d'induction au bourgeonnement épiphylle contenant une forte concentration en cytokinine, en particulier en BAP, Fig X, 2 et 5): le traitement inducteur sur MB dure 21 jours Les feuilles sont ensuite transférees sur milieu d'expression au bourgeonnement adventif (milieu MO dépourvu de régulateurs de croissance; Fig 1, t et 5). Les observations sont effectuées 30 jours plus tard.C'est aussi a ce moment que les bourgeons adventifs néoformés sont isolés des feuilles et déposés sur MA L'allongement des tiges est heterogene C'est pourquoi nous leur faisons subir un cycle de multiplication (repiquages selon la séquence de milieux -MM (milieu de multiplication)-MA (milieu d'allongement)). La croissance des tiges est alors vigoureuse et homogène. Des microboutures de 6 cm de hauteur peuvent être induites à l'enracinement selon le protocole général (Fig 5). Nos conditions d'éclairement et de température sont les suivantes: - 8 heures d'éclairement quotidien - lumière fournie par des tubes fluorescents Incandia Mazdafluor 4OlNC -energie lumineuse d'environ 26 W m-2 -température de 22 + 3 C Le bourgeonnement epiphylle a été effectue dans le conditions suivantes. - 16 heures d'éclairement quotidien - lumiere fournie par des tubes fluorescents Sylvania Grolux WS -énergie lumineuse d'environ 25 W.m-2 -température de 22 3 C RESULTATS ET CONCLUSIONS Les résultats présentés ci-apres sont illustrés par les dessins annexes dans lesquels: - la figure 6 représente la neoformation in vitro de bourgeons epiprylles induits au cours des exp (4), (5) et t6) chez les deux clones de Sequoia: il est figuré le pourcentage de feuilles isolées portant des bourgeons épiphylles. - la figure 7 représente la néoformation in vitro de bourgeons épiphylles induits au cours des exp (4) > (5) et (6) chez les deux clones de aequoia. il est figuré le nombre de bourgeons par feuille - dans la figure 8, sont notés le pourcentage d'enracinement induit in vitro et le pourcentage de reprise e vitro lors du transfert en serre de matériels prealablement rajeunis en exp (4), (5) et (6) (clones I et II) - la figure 9 représente l'allongement en serre des plantes préalablement rajeunies en exp (4), (5) et (6), lors de la culture en serre des clones I et II - les photos (Fig 10) illustrent l'évolution, selon les traitements appliqués, du rajeunissement du materiel issu du Sequoia sempervirens âge de 500 ans (clone II) La figure 10 représente les vitroplants: - Fig 10A. le système aérien du matériel témoin (avant experimentation), après 9 mois de culture en serre - Fig 10B le systeme aerien du materiel rajeuni en exp (6) apres 5 mois de culture en serre - Fig 10C: le systeme aerien du matériel rajeuni en exp (6) puis bourgeonnement épiphylle, après 3 mois de culture en serre La figure 1 l représente la vitropiants - Fig I 1 A: le système racinaire du matériel témoin (avant experimentation), après 9 mois de culture en serre - Fig lB: le système racinaire du matériel rajeuni en exp (6); après 5 mois de culture en serre - Fig l lC: le système racinaire du matériel rajeuni en exp (6) puis bourgeonnement épiphylle, après 3 mois de culture en serre Nous avons pu observé, avant expérimentation de rajeunissement que le materiel m vitro issu de l'arbre le plus agé (clone II) presente une croissance aérienne peu active, contrairement au matériel plus jeune; l'insertion des feuilles est de type oppose decusse ou de type distique (types de matériel âge) alors que chez le clone I il est le plus souvent de type axial (type ce matériel jeune).Chez le clone II, peu ou pas d'explants s'enracinent, alors que chez le clone I, la plupart des explants s'enracinent (% d'enracinement variante chez le clone II de 0% a 60%; % d'enracinement stable chez le clone I de 75% a 90%).En outre, avant expérimentation de rajeunissement, aucune feuille ne forme de bourgeons adventifs chez le clone II, chez le clone I, des neoformations adventives fl ou 2 bourgeons) apparaissent sur quelques feuilles (Fig 6 et 7) Après expérimentations de rajeunissement, les tiges, vigoureuses, s'allongent bien et portent de nombreuses feuilles, tant chez le clone I ciue chez le clone II. Dé plus, chez le clone II, le pourcentage d'enracinement atteint 100% au cours des expérimentations (dès t2) et reste à un niveau élevé (entre 80 et 100%). Enfin, c'est à la sortie t3 (Fig 3) que le pourcentage de feuilles formant le plus grand nombre de bourgeons adventifs est observé chez les deux clones (Fig Ó et 7i. D'apres l'ensemble des criteres, ie materiel au clone II a rajeuni par les traitements appliqués. L'induction au rajeunissement est indispensable (repiquage hebdomadaire sur MM). Apres le traitement inducteur, chez le clone I, un repiquage toutes les trois semaines sur MO (exp (5)) est suffisant pour améliorer puis maintentr l'état du matériel. Par contre, chez le clone II, il est indispensable que le repiquage sur MO soit hebdomadaire (exp (4)), et mieux encore, que simultanement a certains repiquages les rameaux axillaires soient tailles çexp (6)).En conclusion, du point de vue pratique, la technique de taille in vitro des rameaux axillaires est la plus appropriée pour assurer une micropropagation intense de matériel ligneux adulte ou âge: en effet, les explants amputés serviraient de soucne rajeunie produisant regulierement des tiges axillaires prêtes a etre enracinées. Un essai d'aclimatation et de culture en serre a ete effectue sur le matériel rajeuni en exp (4), (5) et (6). Le pourcentage d'enracinement in vitro varie de 80 à 100% selon l'expérience et le clone (Fig 8). Le pourcentage de reprise chez le clone 11, comme d'ailleurs chez le clone I, est plus faible en exp (4) et (5i qu'en exp (6). Nous pensons que ceci est dû au fait que les tiges en exp (4) et (5) se sont beaucoup allongées sur milieu d'enracinement in vitre. Or, des vitroplants trop allongés s'adaptent difficilement aux conditions ex vitro. Pendant les mois de culture en serre qui suivent, nous remarquons que ce sont les plantes issues de l'exp (6) qui presentent, particulièrement chez le clone II, la meilleure croissance ex ISitro (Fig 9).En résumé, si nous considérons à la fois le comportement rn vitro et le comportement ex vitro du matériel, il apparaît que l'exp (6) est la plus favorable à l'obtention non seulement d'un pourcentage d'enracinement élevé ir, vitre, mais aussi d'un bon pourcentage de reprise t? > Par ailleurs, nous avens suivi le comportement en serre du materiel provenant des bourgeons épiphylles induits sur des feuilles prélevées sur des tiges rajeunies (partiellement) au cours de l'exp (6). Il faut souligner tout d'abord que, chez le clone II, c'est essentiellement le matériel provenant du test effectué à la sortie t3 (Fig 3) qui s'est bien développé sur milieu d'allongement. Les microboutures s'enracinent in vitre à I 100% chez le clone II comme chez le clone I. Nous remarquons à cette occaslon que peu ou pas de cals se développe a la base des microboutures, ce qui laisse penser que la connexion racine-tige est de bonne qualité.Le pourcentage de reprise ex vitro vitro est d'environ 60% chez les deux clones Après trois mois de culture en serre, les plantes sont toujours orthotropes, même chez le clone II (comparer Fig 10A et B avec Flg 10C). L'aspect général des tiges est semblable à celui des tiges issues d'un semis.De plus, des bourgeons axillaires se sont developpes des le premier mois de culture En outre, le système racinaire, ramifié, présente une croissance active (comparer Fig 11A avec Fig 1 s Ainsi, le bourgeonnement adventif sur feuilles isolées permet l'obtention de plantes qui présentent tous les caractéres de plantes jeunes, et ceci à partir d'un matériel issu d'un arbre de 500 ans, matériel qui a éte rajeuni par des traitements prealables in vitre. Le rajeunissement complet du matériel a été obtenu, même chez le clone issu d'un arbre de 500 ans. Du point de vue pratique et à l'heure actuelle, la technique de rajeunissement par la taille in vitro des rameaux axillaires puis induction au bourgonnement épiphylle décrite ici permet, maintenant. d'obtenir un produit de qualite: c'est le seul procédé de micropropagation pemettant d'assurer une production intensive de jeunes plants vigoureux et orthotropes, a partir d'arbres très âgés sélectionnés. Le matériel in vitro. provenant des bourgeons adventifs néoformés sur les feuilles isolées des souches rajeunies, peut ensuite etre rapidement multiplie selon la séquence -MM (milieu de multiplication)- MA (milieu d'allongement). Puis des microboutures peuvent être enracinées et transférées en serre pour fournir, à volonté, un grand nombre de jeunes plants Nous poursuivons les recherches en tentant d'apliquer ce procéde a d'autres especes ligneuses REVENDICATIONS 1) Procédé de rajeunissement complet en culture in vitrode matériels issus d'arbres sélectionnés adultes ou âges, caractérisé en ce que la sequence des manipulations est la suivante (a) des rameaux sont introduits en culture in vitro et des tiges sont obtenues (b) des expiants de ces tiges. comportant 3 feuilles, subissent un traitement de repiquage sur milieu avec regulateurs de croissance, ce qui est appelé le traitement inducteur du raleunissement (c) puis les explants sont repiqués chaque semaine et, à chaque repiquage. ia base des explants est rafraîchie (d) simultanement a certains repiquages de l'étant (c), la taille (ou élagage) des rameaux axillaires est effectuee (e) a partir des tiges obtenues aux étapes (c) et/ou (d), les feuilles isolées sont repiquees sur milieu d'induction au bourgeonnement épiphylle 2) Procédé de rajeunissement complet en culture m vitro de matériels issus d'arbres sélectionnes adultes ou âgés selon la revendication 1), caracterîse en ce que: l'induction au rajeunissement, selon l'étape (b), est effectuée en début du traitement de rajeunissement et consiste en 1 repiquage hebdomadaire (répété au moins 2 fois) sur milieu avec régulateurs de croissance (apellé MM) pour que l'effet soit optimum 3) Procédé de rajeunissement complet en culture in vitre de matériels issus d'arbres sélectionnes adultes ou âges selon la revendication 2), caractérise en ce que outre les composés classiques des milieux de culture tels que des sels mineraux et des constituants organiques (notamment le meso-inositol), le milieu MM est compose de regulateurs de croissance du type des auxines et des cytokinines 4) Procédé de rajeunissement complet en culture m vitro de matériels issus arbres selectionnes duites ou âges selon la revendication 3), caracterise en ce que on utilise l'acide Indolyl-acétique (ANA) et la benzyl-amino-purine (BAP) avec des concentrations en ANA d'environ l à 0,001 mg l-1 et en BAP d'environ 0,1 a 5 mg.l-1 et avec un rapport hormonal BAPZANA d'environ 44 (en molarité) 5) Procéde de rajeunissement complet en culture in vitro de maternels issus d'arbres sélectionnes adultes ou âgés selon la revendication 2), 3) et 4s, caractérisé en ce que: l'induction au rajeunissement (repiquage hebdomadaire sur MM) est suivi par le traitement repiquage hebdomaaaire sur MO ou bien par le traitement, simultanement à certains repiquages sur MC, taille des rameaux axillaires d'ordre successifs à au moins 1cm de la tige qui les porte et que le milieu MO est du type MM, mais ne contient pas de régulateur de croissance 6) Procedé de rajeunissement complet en culture in vitrode matériels issus d'arbres sélectionnés adultes ou âgés selon ia revendication 5), caractérise en ce que: les feuilles des tiges rajeunies sont isolees et induites au bourgeonnement adventif sur MB, a moins que le bourgeonnement soit obtenu spontanement au cours du traitement de rajeunissement 78 Procédé de rajeunissement complet en culture in vitre de matériels issus d'arbres selectionnes adultes ou ages selon la revendication 6), caracterise en ce que. outre les composés classiques des milieux de culture tels que des sels minéraux et des constituants organique's (notamment le méso-inositol), le mi lieu MB est composé de régulateurs de croissance du type des cytokinines 8) Procédé de rajeunissement complet en culture in vitro de de materiels issu;; d'arbres sélectionnes adultes ou âges selon la revendication 7), caracterise en ce que la cytokinine utilisée est la benzyl-amino-purine (BAP) et que la concentration en BAP est d'au moins 0,5 mg l-t 9) Procede de rajeunissement complet en culture in vitro de matériels issus d'arbres sélectionnés adultes ou âgés selon la revendication 8), caractérisé en ce que les bourgeons eplphylles qui se sont neoformes acres transfert sur MO des feuilles induites sur milieu MB sont ensuite - isolés et mis à allonger en tiges sur milieu d'allongement (Aj - puis la croissance de ces tiges est homogenéisée au cours d'un cycle de multiplication, > c'est-a-dire repiquage et induction au bourgeonnement axillaire sur milieu de multiplication (MM) puls repiquage et allongement en tige sur milieu d'allongement (MA)( appelé aussi cycle de multiplication -MM-MA-) - l'ensemble des tiges provenant des bourgeons épiphylles peut alors être propages a grande echelle, enracinés et transféres ex vitre 10) Procedé de rajeunissement complet en culture m vitro de matériels Issus d'arbres selectionnes adultes ou âges selon la revendication 9), caracterise en ce que. la séquence des manipulations et transferts s'applique a d'autres espèces ligneuses ou sub-ligneuses