FR 2635115 A1 19900209 FR 8810615 A 19880805 La présente invention concerne un procédé microbiologique pour la préparation de la sérum albumine humaine (SAH) par culture d'une levure, particulièrement du genre Kluyveromyces modifiée par l'utilisation des techniques de PADN recombinant. La SAH est une protéine de 585 acides aminés, d'un poids moléculaire de 66.000 daltons, se présentant sous forme monomère globulaire et non glycosylée. Sa structure globulaire est maintenue par 17 ponts disulfures qui créent une série séquentielle de 9 boucles doubles 1. Les gènes codant pour la SAH sont connus pour être hautement polymorphes et plus de 30 variants génétiques apparemment différents ont été repérésparanalyse électrophorétique dans des conditions variées2. Le gène de la SAH est coupé en 15 exons par 14 séquences introniques et comprend 16961 nucléotides du site de "capping" supposé jusqu'au premier site d'addition de poly(A). L'albumine humaine est synthétisée dans les hépatocytes du foie puis sécrétée dans le flux sanguin. C'est la protéine la plus abondante du sang avec une concerlion d'environ 40 g/litre de sérum; il y a donc environ 160 g d'albumine circulante dans le corps humain à tout moment. Le rôle le plus important de lia SAH est de maintenir une osmolarité normale du flux sanguin. Elle présente également une capacité exceptionnelle de liaison pour diverses substances et joue un rôle aussi bien dans le transport endogène de molécules hydrophobes (tels que les stéroïdes et les sels biliaires) que dans celui de différentes substances thérapeutiques qui peuvent ainsi être transportées à leurs sites d'action respectifs.De plus, la SAH a été récemment indiquée dans le catabolisme des prostaglandines. La synthèse de SAH dans les hépathocytes conduit d'abord à un précurseur, la prépro-SAH, qui contient une séquence signal de 18 acides aminés dirigeant le polypeptide naissant dans la voie de la sécrétion. Cette séquence signal est coupée' probablement par un processus co-translationnel, avant que la protéine ne soit relaxée du réticulum endoplasmique. Ce premier clivage protéolytique donne le précurseur pro-SAH qui contient encore à son extrémité N-terminale, un hexapeptide (Arg-Gly-Val-Phe-Arg-Arg) qui n'est pas normalementprésent dans la forme mature de la SAH circulante. Une convertase, probablement située dans le corps de Golgi, enlève le propeptide au cours d'une deuxième étape de protéolyse en coupant le peptide lié à la partie N-terminale de l'acide aspartique de la SAH 3 4. Toutefois, la proalbumine humaine immature peut représenter la moitié de celle du flux sanguin chez de rares individus hétérozygotes qui portent une mutation héréditaire dans la séquence du propeptide, voire même de toute l'albumine chez certains homozygotes extrêmement rares 5 L'un de ces variants est désigné sous le nom de proalbumine Christchurch et commence avec la séquence Arg-Gly-Val-Phe-Arg-Gln-Asp- dans lequel la substitution Arg - > Gln empêche la coupure du propeptide ainsi muté6. D'autres variants appelés proalbumine Lille 7 et Takefli Sont respectivement les séquences N-terminales suivantes : Arg-Gly-Val-Phe-Arg-His-Asp et Arg-Gly-Val Phe-Arg-Pro-Asp. Dans chacun des cas, la mutation observée concerne la paire des acides aminés basiques Arg-Arg qui précède immédiatement l'albumine humaine mature et provient du changement d'une seule base dans le codon arginine s La coupure après une paire d'acides aminés basiques est un point essentiel dans la maturation d'autres protéines, y compris d'hormones peptidiques, de neuropeptides et des protéines du plasma autres que la SAH 9. Récemment, il a été décrit que la convertase qui coupe la proalbumine en albumine dans le foie est probablement très proche de la protéase yscF de la levure 4. Cette thiol protéase, calcium dépendante, est codée par le gène KEX2 des cerevisiae et est probablement liée à la membrane de l'appareil de Golgi. Elle est connue pour être impliquée dans la maturation de la phéromone appelé facteur alpha et dans celle de la toxine "kille?, puisque les mutants kex2 de S. cerevisiae sont incapables de couper les proprotéines respectives au niveau du couple d'acides aminés basiques Lys-Arg . De plus, on peut démontrer que l'enzyme de levure codée par le gène KEX2 reconnaît correctement et coupe la proséquence normale (Arg-Arg) de l'albumine invitro, mais ne coupe pas la proséquence mutée (Arg-Gln) de la proalbumine Christchurch4.Une convertase analogue à laprotéase yscF a été récemment décrite comme codéeparlegèneSEXI de K. lactis11 Au vu de ce résultat, la capacité de ces levures pour maturer correctement l'albumine humaine recombinante et la sécréter, a été testée. L'albumine. représente 40 % du marché mondial des protéines plasmatiques. Son intérêt commercial réside dans le fait que ce produit est largement utilisé, par exemple, dans des solutés dits de remplissage pour compenser les pertes de sang au cours d'acte chirurgical, d'accident ou d'hémorragie, et à des doses pouvant atteindre plusieurs dizaines de grammes par jour et par individu. Jusqu'à présent, la SAH est généralement produite par les techniques classiques de fractionnement du plasma provenant de dons de sang 12, la consommation mondiale annuelle de plasma étant voisine de 9,5 x 106 litres . Elle peut aussi être extraite du placenta humain selon la technique décrite par J. Liautaud et al.13 Le développement du génie génétique et des nouvelles techniques d'extraction Ct de purification a ouvert la possibilité d'obtenir des produits améliorés de plus haute pureté, de meilleure stabilité, sans contamination virale (par exemple hépatite 13 et SIDA) et àunprix de revient plus faible. Toutefois, aucun procédé assez performant basé sur le génie génétique n'est aujourd'hui connu permettant d'obtenir la SAH à réchelle industrielle dans des conditions économiquement rentables. Ceci est essentiellement dû à Pabsence d'un couple hôte/vecteur performant qui permette la production importante d'une albumine sécrétée, correctement maturée, possédant une structure tertiaire conforme et ayant les propriétés ph5sicoFchimiques de l'albumine humaine native. Même si l'utilisation de cultures de cellules de mammifères peut ap paraître comme le choix idéal pour l'expression des protéines humaines, le prix de revient d'un tel procédé serait bien supérieur au prix de vente de l'albumine pharmaceutique14. Comme ce produit est en général prescrit par dizaines de grammes et à un coût très bas, la production biotechnologique de la SAH n'apparaît réalisable qu'avec des systèmes de fermentation microbienne. Jusqu'à une époque récente, la grande majorité des expériences de génie génétique ontutiliséEcoli comme organisme hôte pour la production par voie microbienne de protéines hétérologues économiquement importantes. Même si ce type de procédé est apparu satisfaisant pour un bon nombre de protéines hétérologues, tous les efforts pour produire la SAH dans des conditions économiquement acceptables en utilisant cet organisme n'ont été que partiellement couronnés de succès. L'un des problèmes majeurs associé à l'utilisation de p coli réside dans le fait que cette bactérie est, dans la majorité des cas, incapable d'excréter les protéines hétérologues dans le milieu de culture et que celles-ci s'accumulent dans le cytoplasme, le périplasme et les membranes. La protéine recherchée doit donc être séparée des constituants cellulaires, ce qui conduit à des procédés complexes et coûteux. De plus, E. coli produit des endotoxines et des pyrogènes qui peuvent contaminer les protéines produites. Pour cette raison, la plus grande attention doit être portée pendant la purification du taux résiduel d'endotoxines dans le produit final, spécialement s'il est utilisé comme médicament. Les protéines sécrétées par leur hôte naturel perdent souvent la propriété de se replier correctement si elles sont synthétisées et accumulées dans le cytoplasme. En général, la sécrétion est requise pour permettre la formation des ponts disulfures comme ceux présents dans ia SAH. Le fait que laSAHproduite dans E. coli ne soit pas sécrétée conduit ainsi à sa précipitation intracellulaire sous forme insoluble15. En conséquence, après extraction à partir des cellules bactériennes, celle-ci doit être dénaturée puis renaturée in vitro. De plus, ijne ne possède pas la machinerie cellulaire permettant de réaliser les modifications post-transcriptionnelles et post-traductionnelles spécifi ques des organismes eucaryotes, y compris l'homme. En ce qui concerne la SAH, il semble difficile d'exprimer à un taux satisfaisant dans L coli le précurseur naturel de SAH, C'est-à-dire la prépro-SAH.D'autre part, des proalbumines artificielles dans lesquelles le gène de structure de la SAH a été fusionné à des signaux de sécrétion dérivés des gènes bactériens pac ou onze sont en général maturés de façon incomplète 15 L'expression de la SAH sans la préséquence, c'est-à-dire sous forme Met-SAH, montre que le résidu méthionine N-terminal n'est pas excisé par la méthionine aminopeptidase de (MAP)15,16. En conséquence, la SAH deE, coli ne peut pas être obtenue sous forme mature in vivo et doit être modifiée invitro. par coupure trypsique, afin d'exciser une séquence leader dérivée d'un phage et ce après dénaturation et renaturation in vitro 17 En ce qui concerne les autres hôtes bactériens, des travaux concernant la sécrétion de SAH dans Bacillus subtils ont été récemment publiésis. Bien que cette étude indique qu'un organisme procaryote tel que B. subtilis possède le potentiel pour sécréter des protéines humaines de haut poids moléculaire comme la SAUR, elle montre aussi que l'excrétion dans le milieu de culture ne peut être obtenue qu'en utilisant des protoplastes de B. subtilis, c'est-à-dire des cellules dont la paroi cellulaire normale a été digérée par traitement enzymatique.De plus, le pourcentage de la SAH modifée est inversement proportionnel au taux de protéine produite: à des niveaux d'expression élevés, la plus grande partie de SAH recombinante reste sous forme immature15. En outre, aucune donnée concernant les propriétés physico- chimiques de la SAH recombinante de. subttlis n'a été mentionnée. D'autre part, le niveau d'excrétion de SAH obtenu par ce microorganisme est très faible au vue des quantités de SAH détectées par utilisation de méthodes immunologiques dans les surnageants de culture. L'utilisation de systèmes microbiens eucaryotes tels que les levures ou les cbampignons représente une alternative intéressante d'utilisation d'hôtes bactériens pour la préparation de protéines hétérologues. En effet, ces orgarusmes pos- sèdent toutes les caractéristiques de structure et d'organisation cellulaire des organismes eucaryotes plus complexes, telles que les cellules de mammifère. En particulier, les levures sont capables de réaliser les modifications post-transcription nelles et post-transductionnelles importantes pour l'activité de nombreuses protéi nes.En outre, les levures sontbien connues à l'échelle industrielle : elles peuvent être cultivées à haute densité cellulaire, elles ne sont pas pathogènes, ne produisent pas d'endotoxines et sont utilisées dans l'industrie alimentaire depuis très longtemps. Enfin, contrairement aux cellules de mammifères, les manipulations génétiques sur les levures sont faciles à réaliser et les données de la génétique classique et moléculaire sont nombreuses. Le terme levure est fréquemment employé pour Saccharomvces cerevisiae. ou levure du boulanger, qui constitue l'une des espèces les plus communes et les mieux connues. fl est entendu dans ce qui suit que le terme levure s'applique à d'autres genres et n'est pas restreint à l'espèce S. cerevisiae. La sécrétion de la SAH dirigée par son propre peptide signal sous le contrôle du promoteur de la chélatine a pu être mise en évidence dans S. cerevisiae à des taux maximaux d'environ 1 to des protéines totales 20. Toutefois, le matériel reconnu par les anticorps anti-SAH décrit dans cette étude reste associé à la cellule et n'est pas exporté dans le surnageant de culture. De plus, aucune caractérisation détaillée de la protéine recombinante n'est rapportée. La production de la SAH dans la levure de brasserie en utilisant un procédé post-fermentaire lors de la fabrication de la bière a également été mentionnée 21. De nouveau aucune donnée quantitative ou qualitative concernant le produit obtenu n'a été décrite. De plus, ce procédé conduit à l'expression de Met SAH, c'est-à-dire d'un allèle de la SAH démarrant par l'acide aminé méthionine juste en amont de la séquence de l'albumine mature. L'absence d' une séquence signal empêche la sécrétion et la maturation de la SAH recombinante et provoque l'accumulation d'une albumine intracellulaire dont la structure tertiaire n'a pas été caractérisée. De plus, I'absence de méthionine N-terminale dans le produit final n'a pas été montrée. La présente invention décrit l'obtention de souches de levures modifées par génie génétique pouvant être cultivées en masse et capable de produire et d'excréter efficacement dans le milieu de culture la SAH dans sa conformation naturelle. Un système d'expression préféré implique des levures du genre Kluvveromyces comme hôte et utilise des vecteurs dérivés du plasmide naturel pKD1 de L marxianus var. drosophilarum. Les levures du genre Kluvveromvces et en particulier K marxianus (incluant les variétés lactis et marxianus qui dans ce qui suit, vont être appelées K lactis etK fragilis) sont des organismes importants et d'un intérêt commercial considérable dans l'industrie biotechnologique. K lactis et K fragilis sont utilisées, par exemple, pour la production commerciale de l'enzyme lactase (-galactosidase). Ces levures sont capables de croltre sur lactoserum, un sous-produit majeur de l'industrie laitière.Plusieurs souches de Nuvveromvces sont utilisées pour la production à grande échelle de protéines d'origines unicellulaire" (P.O.U.) qui jouent un rôle important dans l'alimentation du bétail Enfin, les organismes du genre Kluyveromy- msontmentionnés surlaliste G.RAS. (Generally Recognized As Safe), ce qui représente un facteur important en vue de la production de produits de qualité pharmaceutique. Contrairement aux progrès importants réalisés dans le domaine de la génétique moléculaire de S, cerevisiae, les techniques de manipulation génetique n'ont été développées que récemment chez Kluyveromyces. Trois types de vecteurs de clonage ont été décrits chez cet organisme: i) des vecteurs intégratifs contenant des séquences homologues de régions du gé de Kluyveromyces et qui, aprés introducton dans les cellules, s'intègrent dans les chromosomes de Kluvveromvcesparrecombinaison L"in- tégration, bien qu'étant un évènement très rare nécessitant la présence d'un marqueur de sélection efficace, est obtenue lorsque ces vecteurs ne contiennent pas de séquence permettant une réplication autonome dans la cellule.L'avantage de ce système est la stabilité des souches transformées, c'est-à-dire le fait qu'elles puissent être cultivées dans un support nutritif normal sans le besoin d'une pression de sélection pour le maintien des séquences intégrées. L'inconvénient est toutefois que les gènes intégrés sont seulement présents à une ou, au mieux, à un petit nombre de copies par cellule. Le faible dosage des gènes résulte souvent en un faible niveau de production d'une protéine hétérologue. ii) des vecteurs réplicatifs contenant des séquences de réplication autonome (ARS) dérivées de PADN génomique de Kluyveromyces sp. 22t2324 (KARS). De tels vecteurs ne semblent pas très intéressants puisque leur ségrégation lors de la mitose est très peu homogène, ce qui résulte en leur perte à un taux élevé, même lorsque celles-ci sont cultivées sous pression de sélection. iii) des vecteurs réplicatifs contenant des ARS dérivés de plasmides naturels de levure, soit du plasmide linéaire n killer "pGKl-1 isolé de K. lactis 25 soit du plasmide circulaire pKD1 isolé de K drosophilarum27. Les vecteurs contenant des séquences ARS dérivées du plasmide linéaire " killer n n'ont pas d'utilité pratique en vue de la production en masse de protéines hétérologues puisqu' un milieu nutritif particulier est nécessaire à leur maintien et puisqu'ils sont perdues à un taux de 40-99 go dans une population donnée après seulement 15 générations, même sous pression de sélection 2 . Le système vecteur le plus efficace pour la transformation du genre Kluvveromyces décrit jusqu'alors est dérivé du plasmide endogène pKD1: des constructions contenant la séquence entière de pKD1 peuvent être transformées à haute fréquence, sont présentes dans la cellule à 70-100 copies, et, ce qui est le plus important, ont une stabilité assez élevée en conditions non sélectives. Néanmoins, l'efficacité des vecteurs décrits dans la demande EP 0241435 demeure limitée à des applications de recherche dans la mesure où des fermentations à l'échelle industrielle requièrent une stabilité du plasmide pendant au moins 40 générations.Même le vecteur le plus performant (P3) décrit dans la demande EP 0241 435 est perdu par environ 70 % des cellules d'une population donnée après seulement six générations en milieu non sélectif 27. Bien qu'il soit techniquement possible de maintenir une pression de sélection à grande échelle, l'utilisation d'un milieu sélectif résulte souvent en une densité cellulaire fortement diminuée, et nécessite le recours à des souches bien définies ce qui rend cette approche moins attrayante et plus onéreuse. De plus, la demande EP 0241435 ne contient pas un seul exemple d'expression de protéine hétérologue d'intérêt commercial.En fait, le seul gène "hétérologue"dont l'expression est démontrée à partir de vecteurs dérivés de pKD1 est le gène URA3 de la levure X. cerevisiae. n reste donc à prouver que l'introduction dans pKDR d'un gène non issu d'une levure, par exemple un gène d'origine mammifère, et sa surexpression dans kluyveromyces n'entraînent pas une instabilité accrue du plasmide. Un objet de la présente invention est l'obtention de nouveaux vecteurs d'expression capables de transformer des levures du genre Kluvveromvces etpossèdant des caractéristiques de stabilité nettement supérieures à celles mentionnées dans la demande EP 0 241 435 . II sera démontré que les nouvelles constructions sont maintenues à haut nombre de copies dans 85 90 % des cellules après 50 générations de croissance en milieu non sélectif. n est ainsi possible de produire des protéines hétérologues à partir de vecteurs multicopies stables en utilisant des souches industielles du genre Kluyveromyces. qui ont été utilisées pendant de nombreuses années en raison de leurs propriétés optimales de croissance et à des densités cellulaires élevées. La stabilité élevée des vecteurs décrits dans la présente invention a été obtenue en exploitant pleinement les caractéristiques du plasmide pKD1. Les vecteurs dérivés de pKD1 différent de tous les autres vecteurs connus de Kluyvero- muses en ce qu'ils sont caractérisés par un système spécialisé de réplication responsable de leur maintien stable à haut nombre de copies. En plus d'une ongine de réplication (ARS), ce système comprend deux séquences répétées-inversées, cha aine de 346 nucléotides de long, et trois phases ouvertes de lecture (gènes A.B h et 2 qui font partie intégrante du plasmide 30. Par analogie avec le système plus étudié du plasmide 2 u de 2. cerevisiae qui est structurellement proche, les protéines codées par deux de Ces gènes a et C ) sont vraisembiablement impliquées dans la partition du plasmide lors de la mitose et pourraient jouer un rôle dans la régulation négative du gène A codant pour une recombinase à site spécifique () in n a été montré que la recombinaison FLP-dépendante entre les séquences répétées inversées de l'ADN de 2 fait passer le plasmide d'un mode de réplication régulier (un doublement des plasmides 2 par division cellulaire) à un mode de réplication du type n rolling circle" (amplification du nombre de copies à environ 50 copies par cellule)28.Cette altération du mode normal de réplication est induite aussitôt que le nombre de copies du plasmide devient trop bas pour permettre la production de quantités suffisantes des produits des gènes B et Ç qui agissent comme répresseurs du gène A codant pour la recombinase Fl P Par ce mécanisme, le nombre de copies du 2)1 (et très probablement de plasmides structurellement semblables tels que pKD1) est maintenu à des niveaux élevés de façon autorégulée et est indépendant de la présence d'un marqueur de sélection. Les vecteurs précédemment publiés dans la demande EP 0 241 435 soit contiennent seulement une partie de pKD 1 (A15) soit un gène A interrompu (P 1 et P3 pour lesquels le site de clonage PstI est situé dans la séquence codante du gène e 27), détruisant ainsi le système de réplication autorégulé qui est une des caractéristiques du plasmide résidant pKD1. Au contraire, les constructions plasmidiques dérivées de pKD1 décrites dans la présente invention respectent l'intégralité fonctionnelle de toutes les phases ouvertes importantes de pKD1. En conséquence, la stabilité des plasmides décrits ci-après est considérablement renforcée par rapport aux plasmides PI et P3 et le nombre de copies des nouveaux vecteurs est maintenu à un niveau élevé dans toute la population cellulaire. Dans la présente invention, le terme SAH sera utilisé pour désigner toute albumine du sérum d'origine humaine ou pour toute protéine isolée à partir de cellules de levure et présentant la même séquence d'acides aminés, la même structure tertiaire et les mêmes propriétés physico-chimiques que la SAH naturelle d'origine humaine. La présente invention concerne la création par génie génétique de nouveaux vecteurs permettant la production de SAH sous une forme facilement purifiable en utilisant des cellules de levure comme hôte eucaryote microbien Le procédé de production est caractérisé par une excrétion efficace de SAH mature, native dans le milieu de culture des dites levures, ce qui facilite considérablement la purification de la protéine recombinante. La production de SAH est obtenue en cultivant des levures transformées par un plasmide recombinant comprenant une région de démarrage de la transcription et de la traduction fonctionnant efficacement dans l'hôte et une phase ouverte de lecture codant pour la SAH précédée d'un peptide signal dirigeant la protéine recombinante dans la voie de sécrétion desdites levures. Selon la présente invention, les nouvelles constructions incluent des cassettes d'expression contenant le gène structural de la SAH. Les constructions sont habituellement préparées de façon séquentielle en employant les vecteurs appropriés' jusq ce que les éléments indispensables à l'expression, la sécrétion, ou au maintien du plasmide soient combinés pour former un vecteur qui peut alors être introduit dans le (ou les) hôte(s) purifié (s) de façon à exprimer et excréter la protéine désirée.Les hôtes employés sont d'origine microbiologique eucaryote, en particulier des levures, plus particulièrement des genres Saccharomvees ou Kluyveromvces et de préférence de l'espèce Sluyveromvces mancianus incluant toutes ses variétés, en particulier marxianusvar. tactis. Ainsi selon la présente invention, les constructions qui sont préparées et décrites ont valeur d'exemples dans les organismes eucaryotes d'origine microbiologique, mais sont destinées de préférence à Kluyveromyces. Les hôtes particularies à employer seront préférentiellement des souches industrielles stables, atteignant des hautes densités cellulaires dans les milieux appropriés et caractérisées par un niveau élevé de production. La séquence codante pour la SAH peut être obtenue de diverses façons, la plus simple consistant à isoler des ARN messagers de foie humain et à synthétiser leurs copies sous forme d'ADN complémentaire (ADNc). Les séquences clonées peuvent ensuite être modifiées par différentes méthodes telles que la mutagenèse in vitrin. l'élongation d'amorces, la restriction, l'insertion d'adaptateurs ou la ligature avec des oligonucléotides de raccord. La séquence codante peut être adaptée, par exemple, à l'usage des codons chez la levure pour optimiser l'efficacité de la synthèse protéique (traduction). A l'extrémité N-terminale de la séquence protéique, unpeptide signal peut être introduit de façon à diriger la protéine en cours de synthèse dans la voie de sécrétion de la cellule hôte. Cette séquence-signal peut correspondre à l'extension N-terminale naturelle de l'albumine ou peut être obtenue à partir de gènes de levure tels que ceux codant pour la phéromone alpha ou la toxine n killer ". De plus, une proséquence, codant pour une autre extension peptidique, peut être intercalée entre la séquence-signal de sécrétion et la séquence codante de l'albumine mature. Cette séquence est normalementjointe à la séquence codante par l'intermédiaire d'un site de coupure d'une protéase spécifique impliquant en général au moins deux acides aminés de type basique, de préférence Lys Arg ou Arg-Arg. La cassette d'expression comprendra une région de démarrage de la transcription et de la traduction jointe à l'extrémité 5' terminale de la séquence codante, de façon à diriger et à réguler la transcription et la traduction de- la dite séquence. Le choix de ces régions promotrices peut varier en fonction de l'hôte utilisé en particulier. Généralement, ces séquences sont choisies parmi les promoteurs dérivés des gènes de levure. D'un intérêt particulier sont certaines régions issues de gènes giycolytiques de levure du type Saccharomvces ou Kluweromvces. telles que les gènes codant pour la phosphoglycérate kinase (PGK), la glycéraldehyde-3-phosphate deshydrogénase, la lactase, l'énolase, l'alcool deshydrogénase, etc. Ces régions de contrôle peuvent être modifiées, par exemple par mutagénèse III' vitro, par l'introduction d'éléments additionnels de contrôle ou de séquences synthétiques ou par des délétions. Par exemple, des éléments de régulation de la transcription, telles que les régions dites UAS ("upstream activating sequences") provenant d'un autre promoteur comme celui du gène GALlO de L cerevisiae ou LAC4 de L lactis peuvent être utilisés pour construire des promoteurs hybrides qui permettent de dissocier la phase de croissance d'une culture de levures de la phase d'expression d'un gène hétérologue en fonction de la source carbonique choisi.Une région permettant une ter minaison de la traduction et de la transcription fonctionnelle dans l'hôte envisagé sera positionnée en 3' de la séquence codante. La cassette d'expression ainsi construite sera fusionnée à un ou plusieurs marqueurs permettant de sélectionner l'hôte transformé. Les marqueurs préférés dans la levure sont des marqueurs dominants, c'est-à-dire conférant une résistance à des antibiotiques comme la généticine (G418) ou tout autre composé toxique tels que des ions cuivre, dans la mesure où ceux-ci peuvent être utilisés sans spécificité d'hôte particulière. Ces gènes de résistance seront placés sous le contrôle de signaux appropriés de transcription et de traduction dans l'hôte considéré. L'ensemble constitué par la cassette d'expression et par le marqueur de sélection peut être utilisé soit pour transformer l'hôte directement, soit peut être inséré sur un plasmide vecteur. Dans le cas d'une transformation directe, des séquences homologues à des régions présentes sur un chromosome ou sur un plasmide résidant sont fusionnées à cet ensemble. Les dites séquences seront situées de chaque côté de la cassette d'expression de façon à induire une insertion au site homologue par recombinaison invivo. Si la cassette d'expression est insérée sur un plasmide vecteur, elle devra être combinée à un système de réplication fonctionnel dans l'hôte considéré.Un système de réplication préféré pour Kluyveromyces est dérivé du plasmide pKD1, initialement isolé deL drosophilarum 2w. Un système préféré de réplication pour Saccharomvces est dérivé du plasmide de levure 2 . Le plasmide d'expression peut contenir tout ou partie desdits systèmes de réplication ou peut combiner des éléments dérivés de pKD1 aussi bien que du plasmide 2,u. Les constructions préférées sont celles qui contiennent la séquence entière du plasmide pKDl lorsque l'expression dans kluyveromyces est recherchée.Plus particulièrement, les constructions préférées sont celles où le site d'insertion des séquences étrangères dans pKD1 est localisé dans une région de 197 pb située entre le site SacI (position 4714 de la forme B de pKD1 3) et Mstll (position 154 de la forme B de pKCfl a) ou 8 I'un de ces deux sites. Pour plus de commodité, le plasmide peut être un vecteur navette: comme tel il peut être transféré à un hôte bactérien tel que E i, ou il peut être manipulé plus facilement que dans la levure à chaque étape de construction. Dans ce cas, une origine de réplication et un marqueur de sélection fonctionnant dans l'hôte bactérien sont requises. n est également possible de positionner des sites de restriction qui sont uniques sur le vecteur d'expression de façon qu'ils entourent les séquences bactériennes. Ceci permet de supprimer l'origine de réplication bactérienne par coupure et religature du vecteur avant transformation des cellules de levure ce qui peut résulter en une augmentation du nombre de copies et en une stabilité accrue du plasmide.Des sites pratiques tels que 5'-GGCCNNNNNGGCC3' (SfiI) ou 5'-GCGGCCGC-3' (NotI) peuvent par exemple être utilisés dans la mesure où ils sont extrêmement rares chez la levure et géneralement absents sur un plasmide d'expression. Ces sites peuvent être introduits sur le vecteur par mutagé- nèse dirigée par oligonucléotide ou par l'addition d'oligonucléotides de raccord spécifiques. Une fois terminée la construction du vecteur d'expression, celui-ci sera introduit dans l'hôte désiré. Divers protocoles de transformation ont été décrits dans le cas des levures31. Les transformants peuvent alors être mis en culture dans un milieu approprié en vue de la production du produit recherché. Si le produit recherché est la SAH excrétée, il peut être purifié de diverses manières à partir du surnageant de culture. n peut être cryoprécipité, extrait par chromatographie d'affinité, par électrophorèse ou par d'autres techniques conventionnelles. La récupération de la protéine sécrétée peut être faite à partir d'une culture en " batch " ou en continu. Les exemples suivants ,donnés à titre non limitatif, montrent comment l'invention peut être mise en pratique. EXEMPLES Techniques générales de clonage Les méthodes classiques de biologie moléculaire telles que la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium - bromure d'éthidium, la digestion par les enzymes de restriction, l'électrophorèse sur gel, l'électroélution des fragments d'ADN à partir de gels d'agarose, la transformation dansE. coli. etc, sont décrites dans la littérature 31,33 Les enzymes de restriction ont été fournies par New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham. Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille sur des gels d'agarose 0,7.% ou acrylamide 8 zou purifiés par électroélution, extraits au phénol, précipités à l'éthanol puis incubés dans un tampon Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, dithiothreitol 10 mM, ATP 2 mM, pH 7,4, en présence d'ADN ligase du phage T4 (Biolabs). Si nécessaire, les fragments d'ADN ayant des extrémités 5' proéminentes sont déphosphorylés par un traitement à la phosphatase alcaline d'intestin deveau(CIP,Pharmacia)à 37 C pendant 30 minutes dans le tampon suivant:glycine 100 mM, MgCl2 1 mM, ZnCl2 1 mM, pH 10,5. La même technique est utilisée pour la déphosphorylation des extrémités 3' proéminentes ou franches, mais le traitement est de 15 minutes à 37 C puis de 15 minutes à 56 C. L'enzyme est inactivée par Elle du mélange réactionnel à 68 C pendant 15 minutes en présence de SDS 1 % et de NaCI 100 mM suivi d'une extraction au phénol-chloroforme et d'une précipitation à l'éthanoL Le remplissage des extrémites 5' proéminentes est effectué par le fragment de Klenow de PADN polymérase I d'E. coli (Biolabs). La réaction est effectuée à température ambiante pendant 30 minutes dans un tampon Tris-HCl 50 mM, dNTPs 0,4 mM, MgSO4 10 mM, dithiotréitol 0,1 mM, BSA (Bovine Serum Albumine) 50 ug/mi, pH 7.2. Le remplissage des extrémités 3' proéminentes est effectué en présence de l'ADN polymérase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fabricant La digestion des extrémités proéminentes est effectuèée par traitement limité à la nucléase S1 (BRL) selon les recommandations du fabricant. La mutagénèse dirigée in vitro par oligodésoxynucléotides est effectuée selon la méthode développée par Eckstein et collez en utilisant le kit distribué par Amersham. Les ADNs ligaturés sont utilisés pour transformer la souche rendue compétente : E coli MC1060 ([lacIPOZYA],X74,gaIU, galK, strAr) ou TG1 ([lac pro A,B], supE, thi, hsdD5/FtraD36, proA+B+, lacIq, lacZ M14).L'ADN plasmidique est purifié à partir des transformants résistants à l'ampicilline ou à la tétracycline selon les cas. L'extraction de l'ADN plasmidique est faite selon le protocole décrit dans Maniatis et coll. 32 qui dérive de la méthode de lyse alcaline décrite par Birnboim et Doly 35 . Pour l'analyse rapide des plasmides, des Iysats bactériens sont préparés selon la méthode de Holmes et Quigley 34 et sont analysés par électrophorèse sur gels d'agarose sans purification préalable.Après analyse par les endonucléases de restriction, les plasmides recombinants présentant la structure désirée sont préparés à plus grande échelle selon le protocole de lyse alcaline 32 à partir de cultures de 0,5 à 1 litre et purifiés par une centrifugation isopycnique en chlorure de césium. Les transformations de K lactis avec de l'ADN étranger ainsi que les purifications d'ADN plasmidiques de K lactis sont décrites dans le texte. Exemple 1: CLONAGE D'UNE CASSETTE CONTENANT LE GENE STRUC TURAL DE LA prépro-SAH E.1.1 Isolement d'un clone d'ADN complémentaire (ADNc) codant pour la SAH La construction de plasmides recombinants permettant l'expression de la SAH dans E. coli a été décrite en détails dans la précédente demande de brevet EP 0198745 '. En résumé, l'ADNc a été obtenu à partir d'ARNm poly-A isolés de foie humain selon la technique au thiocyanate de guamdium. L'analyse de la séquence d'ADN a permis l'isolement de trois clones (pTlB11, pAA38 et p6D8 figure 1) qui contenaient des fragments chevauchant du gène structural de l'albumine et présentaient des sites de restriction communs dans les régions chevauchantes.Ces sites ont été utilisés dans la reconstruction d'un clone d'ADNc de la SAH (figure 1) qui est complet sauf pour sa séquence "pré-pro". E*12 Synthèse de la séquence signal de la SAH Dans le plasmide pXL276 (figure 2), dont la construction est décrite en détail dans la demande de brevet EP 0198745, la séquence codante de la SAH mature a été fusionnée en phase au codon ATG du site de fixation des ribosomes (RBS) du gène cII du bactériophage lambda Ceci a généré un site NdeI immédia- tement en amont du codon de démarrage de la traduction du gène de la SAH. pXL276 est utilisé pour reconstituer la région "pré-pro" de la SAH, laquelle se trouvait être tronquée dans l'ADNcjuste en amont du site TaqI au niveau de l'acide aminé "-1", La reconstitution est effectuée en insérant un fragment d'ADN correspondant à la séquence signal de la SAH sous forme de quatre oligodéoxynucléotides de 33-36 bases de long (Sq32, Sq34, Sq35 et Sq38 ; figure 2) et un fragment EcoRI- NdeI de 120 pb provenant de pXL276 portant des signaux d'expression de gènes d'E. coli entre les sites EcoRI et AccI du plasmide pUC8. Le site TaqI est ainsi reconstitué êl'une des extrémités de l'insertion dans ce plasmide appelé pXL290 (figure 2). Le petit fragment HindIII-TaqI portant le RBS et la séquence prépro en amont du site TaqI est ligaturé avec le fragment TaqI-PstI du clone d'ADNc de la SAH (plasmide plB11, contenant l'extrémité 5' de la SAH) entre les sites Hindi et PstI de pUC8 pour donner le plasmide pXL299 (figure 3).Le plasmide pXL322 est construit en ligaturant le fragment HindIII-PvuII de pXL299, portant le RBS (site de fixation de n.bosome) et la séquence prépro -SAH jusqu'au site PvuII, avec le fragment PvuII EcoRI de pXL276, portant le réplicon et l'extrémité 3' de la séquence codante de la SAH, et avec le fragment EcoRI-HindE de pXl276 contenant le promoteur (figure 4). E*13 Création d'un site HindIII en amont du codon de démarrage de la traduction de la SAH Dans le but d'obtenir une cassette prépro- SAH pouvant être facilement intégrée dans des vecteurs d'expression, le site NdeI du plasmide pXL322, décrit ci-dessus, est changé en un site Hindm par mutagénèse dirigée par oligodéoxynucléotides. A cette fin, le fragment HindIII-BgIII de pXL322 contenant l'extrémité 5' du gène de la prépro-SAH est sous-cloné dans M13mpl8 et mutagénisé par hybridation de l'oligodéoxynucléotide synthétique 5'-ATCTAAGGAAA TACAAGCl lATGAAGTGGGT-3' à la matrice simple brin (les séquences souli gnées et en caractère gras représentent respectivement le site Hindi et le site de démarrage de la traduction).On obtient ainsi le plasmide pXL855 (figure 5) dont la séquence nucléotidique de la région mutagénisée est ensuite vérifiée. La séquence codantpour la SAH complète est reconstituée eninsérant le fragment HindE-PvuII du phage mutagénisé et le fragment PvuII-HindIII, contenant l'extrémité 3' du gène structural de la SAH, dans le site HindIII de pUC8 pour donner le plasmide pXL869 (figure 6). Ce plasmide contient donc un fragment HindIII de 1,87 kb contenant le gène structural de laprépro-SAH complet ainsi qu'une région de 61 pb non-traduite à son extrémité 3'. La séquence complète du fragment Hindi ainsi que la séquence en acides aminés de la SAH recombinante sont décrites sur la figure 7.Une cassette Hindi contenant le gène structural de Met-SAH sans son signal de sécrétion est construite en suivant le même protocole sauf qu'un dérivé M13 duplasmide pXL276 est mutagénisé à l'aide de I'oligodéoxynucléotide synthétique 5'-ATCTAAGGAAA TACAAGCTTATGGATGCACACAAG-3' La reconstitution de la séquence codant pour la Met-SAH complète dans pUC8 donne le plasmide pXL868 obtenu de façon similaire au plasmide pXL869. Exemple 2: CONSTRUCTION DE VECTEURS DE CLONAGE POUR LÀ LE VURE E2.1 Isolement et purification du plasmide pKD1 Le plasmide pKD1 peut être purifié à partir d'une culture en fin de phase exponentielle de croissance de la souche de K drosophilarum UCD 51-130 (collection U.C.D., Université de Californie, Davies, CA 95616) selon le protocole suivant qui dérive de celui décrit par Fleer et coll.37. Une culture de 1 litre dans le milieu YPD (extrait de levure 1 %, Bacto-peptone (Difco) 2 %, glucose 2 %) est centrifugée, lavée et resuspendue dans une solution de sorbitol 1,2 M, et les cellules sont converties ensphéroplastes enprésence de zymolyase (300 g/ml), d'EDTA 25 mM, de phosphate 50 mM et de,-mercapto ethanol (A g/ml).Après lavage dans une solution de sorbitol 1,2 M, les sphéroplastes correspondant à 250 ml de la culture de départ par tube) sont resuspendus dans 2,5 mi de sorbitol 1,2 M et on ajoute le même volume de tampon Tris-HCl 25 mM, glucose 50 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0. Les étapes suivantes correspondent au protocole de lyse alcaline déjà décrit 32, à l'exception de laprécipitation du surnageant en acétate de potassium qui est faite à230C pendant 15 minutes en ajoutant 14 ml d'isopropanol. Le matériel obtenu est traité à la RNase (50 /ml) à 37 C pendant 20 minutes puis avec la protéinase K (150pg/ ml) dans une solution de NaCI 0,5 M, sarkosyl 0,5 % et d'EDTA 25 mM pendant 1 heure à 60 C. Après centrifugation en microcentrifugeuse Eppendorf, les surnageants sont précipités à l'éthanol pendant 10 minutes à -70 C, puis les culots sont dissous et l'ADN est purifié par centrifugation isopycnique en gradient de CsCl en présence de bromure d'6thidium. E2.2 Construction du plasmide pCXJl. L'intermédiaire de construction pUC-URA3 (figure 8) consiste en un fragment Hindi de 1,1 kb contenant le gène URA 3 de la levure S. cerevisiae inséré dans je site unique NarI du plasmide pUC19 3. Le fragment Hindi dérive du plasmide pG63 39 qui a été digéré par HindIII puis traité par le fragment de Klenow de r ADN polymérase j d'E. coli pour générer des extrémités franches. Le fragment de 1,1 kb contenant le gène URA3 est purifié puis inséré dans le plasmide pUC19 lui-même coupé par NarI et traité par le fragment de Klenow de PADN polymérase I d'E coli.Le plasmide pUC-URA3 contient donc: une origine de réplication pour la maintenance du plasmide dans E coli, le marqueur de résistance à l'ampicilline pour les transformations dans E. coli. le gène les contenant un poly-site de clonage (EcoRI, sacI KpnI,BamHI, XbaI, SalI, SphI, HindIII comme sites u7niques) et le gène IRA3 de fi. cerevisiae servant de marqueur de sélection dans les mutants uraA de E Jactis. Le plasmide pCXL1 (figure 9) contient la séquence complète du plasmide pKD1 insérée dans le site unique AatII de pUC-URA3. Cette construction a été obtenue en linéarisant pKD1 au site EcoRI puis en traitant ce plasmide par le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli. Ce fragment d'ADN est ligaturé avec pUC-URA3 précédemment coupé par Aatfl et traité à la T4 DNA polymérase. La ligature de ces deux fragments permet la reconstitution de sites de restriction EcoRI. L'insertion de l'ADN de pUC-URA3 au site EcoRI du plasmide pKD1 n'inactive aucun gène nécessaire pour maintenir la stabilité et le nombre de copies du plasmide (le site EcoRI étant situé à 205 nucléotides (nt) en amont du codon ATG du gène B30).Par conséquent, le plasmide pCXL1 qui transforme les cellules de K-lactis uraA ciro à haute fréquence, est amplifié à environ 70-100 copies par cellule et est maintenu de façon stable même en l'absence de pression de sélection. Grâce à l'origine de réplication apportée par pUC-URA3, Ie plasmide pCXJ1 peut également se répliquer dans E. coli ce qui facilite les étapes de construction et de purification de plasmides. Les sites uniques de pCXJi sont les sites Hindi et SalI du polysite de clonage de pUC19. E2.3 Construction d'une fusion entre le promoteur pkl de K lactis et le gène de la 3'-aminoglycoside phosphotransférase de IhE L'utilisation de pCXJ1 en tant que vecteur pour la transformation de K. lactis et d'autres espèces de Kluweromvces reste limitée aux souches portant la mutation uraA chromosomique en tant que marqueur d'auxotrophie. Afin de pouvoir transformer des souches sauvages industrielles de Kluweromvces nous avons choisi le gène de la 3'-aminoglycoside phosphotransférase (aph [3']-I) du transposon bactérien Tn903 comme marqueur dominant de résistance aux antibiotiques que nous avons inséré dans pCXL1.Le gène de l'aph confère la résistance à la kanamycine chez coli et rend les souches sauvages de levure résistantes à l'antibiotique G418 (généticine), lequel est un inhibiteur puissant de la croissance cellulaire Pour permettre une expression suffisamment forte du gène de l'piipour avoir un marqueur de sélection dans les transformations de K. lactis. les signaux de transcription bactériens du gène aph sont remplacés par le promoteur pkl isolé à partir du plasmide killer pGkI-i ou kl de K lactis. La construction de la fusion pkl- est effectuée en plusieurs étapes (figures 10 à 12).Tout d'abord un fragment ScaI-PstI de 1,5 kb du plasmide kl est sous-cloné entre les sites uniques Scal et PstI de pBR322, le plasmide recombinant sensible à l'ampicilline et résistant à la tétracydine est appelé pk1-PS1535-6 (figure 10). Le fragment sous-cloné de 1,5 kb provient d'une extrémité du plasmide #killer# linéaire et contient la moitié 5' de la première phase de lecture ouverte (ORF1) portée par le plasmide kl et environ 220 paires de bases en amont. Comme le site ScaI est situé seulement 22 paires de bases de l'extrémité gauche de k1 (figure 10), le fragment ScaI-PstI purifié à partir de gel d'agarose contient vraisemblablement la région promoteur entière de ORF1. La digestion de pk1-PS1535-6 avec DdeI donne un fragment de 266 pb contenant 17 pb provenant de pBR322 à une de ses extrémités (proche de Scal) et les 11 premiers codons de ORF1 à I'autre extrémité. Après untraitement par le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E coli, le fragment purifié est inséré dans le site Xhol unique du plasmide pUC-kan1 (figure 11).Ce dernier plasmide a été obtenu en insérant un fragment EcoRI de 1,25 kb contenant le gène aph provenant de TnX (Kanamycin Resistance Gene Block TN(, Pharmacia) dans le site unique EcoRI de pUC19. Le plasmide pUC-kan202 est obtenu en effectuant une digestion de pUCkan1 par XhoI suivie d'une digestion brève par la nucléase S1 rendant les extrémités franches puis d'une ligature avec le fragment DdeI de pk1-PS1535-6 rendu franc avec le fragment de Klenow de PADN polymérase I d' I3 coli (figure 11). Cette construction permet d'obtenir une fusion en phase entre les 11 premiers acides aminés du gène ORG1 du plasmide linéaire k1 et de l'extrémité tronquée en 5' du gène aph de Tn903,. En fait, la jonction entre ORF1 et aph restore le douzième codon de aph (AGG) de sorte que ce sont les onze premiers acides aminés de aph qui sont remplacés par les onze premiers. acides aminés de ORF1 de kl. La séquence complète du promoteur pkl utilisé pour la fusion pk1-'aph ensemble avec le début du gène structural codant pour la aph est indiquée sur la figure 12. L2A Construction du plasmide pKan707 Le plasmide pKan707 (figure 13) est un dérivé du plasmide pCXJ1 décrit ci-dessus. Il est construit en coupant pCXJ1 par HindIII puis en traitant par le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E coli. Le plasmide linéarisé à extrémités franches est ensuite ligaturé avec un fragment ScaI-Hincll de 1,2 kb provenant du plasmide pUC-Kan202 portant la fusion pkl-'aph (figure 13). La digestion de pUC-Kan202 par ScaI et Hincîl donne une cassette de résistance à la kanamycine à extrémités franches ne contenant plus le promoteur bactérien d'origine.Le plasmide obtenu, pKan707, confère la résistance à de très hauts niveaux de G418 ( > 2,5 g/l) dans les souches de L lactis. Comme dans le cas de pCXJ1, le plasmide pKan707 peut être transformé dans les souches de K, lactis cir" à haute fréquence, amplifié à 70-100 copies par cellule et maintenu de façon stable en l'absence de pression de sélection (figure 14). Sa grande stabilité conjuguée avec la présence d'un marqueur dominant efficace permettant la transformation de souches industrielles de Kluweromvces font de pKan707 un vecteur de clonage très performant pour les levures du genre Kluweromvces. Exemple 3: CONSTRUCTION DE VECTEURS D'EXPRESSION CONTENANT DES CASSETTES D'EXPRESSION ET/OU DE SECRETION DE L' ALBUMINE DANS LA LEVURE E3.1. Construction de cassettes d'expression de la Met-SAH et de la prépro-SAH sous contrôle du promoteur PGK de & cerevisiae. Le plasmide pYG12 (figure 15) contient un fragment de restriction SalI-BamHI d'une taille de 1,8 kb constitué des régions promotrices et terminatrices du gène PGK de S. cerevisiae. Ce fragment provient d'un fragment génomique Hindi délété d'un fragment de 1,2 kb correspondant au gène structural et comprenantune région comprise entre l'ATG d'initiation de la traduction et le site BglII localisé 30 codons en amont du codon TAA spécifiantlafin de traduction42. Les sites HindIII encadrant le fragment de 1,8 kb ainsi obtenus sont ensuite détruits et remplacés par un site SalI et un site BamHI, respectivement en amont de la région promotrice et en aval du terminateur PGK de transcription.Un site HindIII est introduit à la jonction entre régions promotrices et terminatrices ; le site étant unique, il permet d'introduire facilement des gènes hétérologues. La séquence nucléotidique de cette région est indiquée sur la figure 15. Le fragment Hind m de 1,8 kbprovenant du plasmide pXL868 (voir E. 13) et codant pour le gène de laMet-SAH est ensuite introduit dans le site Hindis du plasmide pYG12 pour donner le plasmide recombinant pYG10. De façon analogue, le plasmide pYG11 (figure 15) est généré par insertion dans le plasmide pYG12 d'un fragment HindIII provenant du plasmide pXL869 (voir E13) et codant pour la prépro-SAH.En conséquence, deux cassettes d'expression SalI-BamHI d'une taille d'environ 3,6 kb sont ainsi cons truites, comprenant le promoteur du gène PGK de S. cerevisae (PPGK), suivi du gène codant soit pour la Met-SAH soit pour la prépro-SAH et enfin la région correspondant au terminateur de transcription du gène PGK(TPGK), région incluant le site de polyadénylation du ARNm. E32 Construcfion des plasmides d'expression pYG19 et pYG23. Dans le but d'introduire les cassettes d'expressions détaillées cidessus, dans le vecteur pKan707 réplicatif chez Kluyveromvces. les fragments SalI BamHI de 3,6kb et provenant des plasmides pYG10 et pYG11 sont dans un premier temps sous-clônes dans les sites correspondants du plasmide pIC-20 43, pour donner ainsi les constructions plasmidiques pYG18 (prépro-SAH) (figure 16) et pYG22 (Met-SAH). Ces constructions intermédiaires permettent de disposer des cassettes d'expression PPGK/Met-SAH/TPGK et PPGK/prépro-SAH/TPGK sous forme de fragments de restriction SalI-SacI directement insérables dans les sites correspondants de pKan707 (figure 17).La digestion de ce dernier par les enymes SalI# et SacI conduit à la suppression du marqueur URA 3 ainsi que d'un fragment de 35 pb situé en amont du gène B de pKD1. Les constructions ainsi obtenues appelées pYG19 (prépro-SAH) et pYG23 (Met-SAH) (figure 18) comprennent les cassettes d'expression PPGK/HSA/TPGK' la séquence quasiment complète du plasmide pKD1 de K drosophilarum, les séquences permettant la replication autonome chez E. coli, ainsi que les gènes codant pour latlactamase et la 3'-aminoglycoside phosphotransférase (sous contrôle dupromoteurpkl), permettant respectivement de sélectionner coli en présence d'ampicilline et K lactis en présence de G418. Exemple 4: TRANSFORMATION DE LA SOCCHE MW98-8C DE K lactis PAR LES PLASMIDES EXPRIMANT LA Met-SAH ET LA prépro-SAH E.4.1 Protocole de transformation Les plasmides pYG19 et pYG23 sont utilisés pour transformer la souche MW98-8C (alpha uraA argA lysA K+ pKD1 ) de K. lactis 46. Un échantillon de cette souche a été déposé au Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) à Baarn aux Pays Bas selon les dispositions du traité de Budapest où il a été enregistré le / / sous le numéro CBS 88. La transformation s'effectue soit par la technique de formation de sphéroplastes initialement décrite par Hinnen et coll. et adaptée en conséquence, soit en traitant les cellules entières par l'acétate de lithium, ce qui favorise l'incorporation d'ADN en présence de polyethylène glycol (PEG) 45. Les modifications concernant la formation de sphéroplastes sont déjà décrites 46. Lorsque la méthode faisant intervenir l'acétate de lithium est utilisée, la croissance des cellules se fait à 28 C dans 50 ml de milieu YPD, avec agitation et jusqu'à une densité optique à 600 nm (OD6 ) comprise entre 0,6 et Q8. Les cellules sont récoltées par centrifugation à faible vitesse, lavées dans une solution stérile de TE (10 mM Tris HCl pH7,4,1 mM EDTA), resuspendues dans 34 ml d'une solution d'acétate de lithium (0, 1 M dans du TE) pour donner une densité cellulaire d'environ 2 x 108 c/ml, puis incubées à 30 C pendant 1 heure sous agitation modérée. Des parties aliquotes de 0,1 ml de la suspension résultante de cellules compétentes sont incubées à 30 C pendant 1 heure en présence d'ADN et à une concentration finale de 35 Go de PEG4000. Après un choc thermique de 5 minutes à 42 C, les cellules sont lavées 2 fois par de l'eau stérile, resuspendues dans 0,2 ml d'eau stérile et transférées dans des tubes de 10 ml. Une solution d'YPD contenant 0,7 % d'agar et maintenue en surfusion à 46 C (5ml) est ensuite ajoutée et immédiatement coulée sur boîtes YPD. Après modification, une surcouche additionnelle de S ml de "top-agar" est ajoutée et les boîtes sont incubées à 28 C.Après 18 à 24 heures d'incubation, 0,16 ml d'une solution de G418 (Geneticin 50 mg/ml, GIBCO, Grand Island, N.Y.) est étalée sur les boites et des transformants sont comptés après 4-5 jours d'incubation additionnelle à 28 C. L'étalement direct des cellules sur boîtes YPD + G418 (c'est-à-dire sans utiliser une surcouche additionnelle de top-agar) résulte en l'apparition de clones de taille plus importante pour les cellules transformées de X, lactis. Cepen dant, une concentration plus basse de G 418 (50 g/ml) est alors nécessaire pour observer des colonies, ce qui entraîne la sélection de mutants partiellement résistants au G418 et provenant de cellules non transformées. De plus, l'efficacité de transformation est au minimum 10 fois plus faible que l'efficacité observée après expression phéflotypique pendant 18 à 24 heures. EA2 Stabilité mitotique des plasmides d'expression de la SAH La stabilité mitotique des plasmides pYG19 et pYG23 est mesurée au cours du temps après croissance en milieu non sélectif; elle est déterminée comme étant le rapport entre les pourcentages finaux et initiaux de cellules croissant sur boites YPD contenant 250pg/ml de G41 & Comme l'indique la figure 19, les deux plasmides sont remarquablement stables malgré l'expression à haut niveau d'un gène hétérologue : 40 à 45 % des cellules ont maintenu ces plasmides après 40 générations cellulaires en milieu non sélectif E.4.3 Niveaux d'expression et d'excrétion de l'albumine Les niveaux d'expression et d'excrétion des cellules de L lactis MW98-8C contenant les plasmides pYG19 (prépro-SAH) et pYG23 (Met-SAH) sont déterminés en fonction du temps après croissance à 28 C en milieu YPD et sous agitation constante. Les surnageants de culture sont obtenus par deux centrifugations oensécutives (5 minutes à 4000 puis 10 minutes à 12000 tours/minute) pour éliminer toute contamination éventuelle par des cellules.Un échantillon du second surnageant (0,5 ml) est chauffé à 95 C pendant 15 minutes puis mélangé àun volume égal de tampon d'application contenant 0,125 M Tris HCI, 20 % glycerol, 10 % 2mercaptoéthanol (ss-ME), 4,6 % sodium dodecyl sulfate (SDS) et 0,4 % bleu de bromophénol. Quand une concentration des protéines présentes dans le surnageant est souhaitée, 0,4 ml d'une solution à 100% p/v d'acide trichloracétique (TCA) est ajoutée à 8 ml de surnageant et les protéines sont précipitées sur glace pendant 1 heure. Le matériel précipité est récupéré par centrifugation (20 minutes, 15 000 tours/minute) puis resolubilisé par chauffage à 95 C pendant 15 minutes dans 0,5 ml de tampon d'application contenant 63 mM Tris HCI, 10 % glycérol, 5 %-ME, 2,3 % SDS et 0,2 % bleu de bromophénol. L'expression intracellulaire d'albumine est détectée àpartir d'extraits cellulaires préparés comme suit: 0,25 ml équivalent d'un culot cellulaire (lavé une fois en tampon salin) est resuspendu dans le même volume de tampon de lyse maintenu sur glace et contenant 67 mM de phosphate à pH 7, 5 mMss-ME, 1 mM phénylméthylsulfonyl fluoride (PMSF), 2,uM de Ieupeptine, et 2pM de pepstatine A (Sigma). Après addition de 0,5 mlde billes de zirconium (diamètre 0,45 mm), stockés en tampon phosphate (67 mM, pH 7) à 4 C, les cellules sont cassées par 7 périodes de 30 secondes avec un broyeur de cellules (Biospec Mini Bead-Beater, Biospec Products) entrecoupées par des périodes de refroidissement de 2 minutes surglace.L'efficacité de broyage des cellules est supérieure à 90 % si on enjuge par comptage des cellules sous microscope à contraste de phase. La fraction liquide dépourvue de billes de zirconium est transférée dans un tube Eppendorf et les billes sont lavées 3 fois avec 0,2 ml de tampon de lyse, puis rassemblées dans le même tube Eppendorf. Par centrifugation du tube pendant 15 minutes à 40C à 12000 g, on définit ainsi une fraction des protéines solubles (surnageant) et une fraction de protéines insolubles (culot).Ces deux fractions sont individualisées et reprises dans le même volume final d'une solution de tampon d'application après dilution Ces échantillons sont chauffés pendant 15 minutes à 95 C, et appliqués sur un gel de polyacrylamide SDS à 8,5 % précédé d'un gel de concentration à S % 47, puis soumis à une intensité de 25 niA jusqu'à ce que le bleu de bromophénol atteigne le bas du gel. La figure 20 montre le résultat d'une expérience typique qui permet d'évaluer l'expression et l'excrétion d'albumine obtenue avec la souche de E; lactis MW 98-8C transformée avec les plasmides pYG19 (prépro-SAH), pYG23(Met SAH), et pYG 25 (vecreur dépourvu de cassette d'expression), après croissance dans 50 ml de milieu YPD sans G418 à 28 C pendant 68 heures. Chaque échantillon correspond à 100 l de culture originale et permet de comparer les fractions solubles, les fractions insolubles, et le surnageant de culture, après migration en gel de polyacrylamide à 85 % et coloration au bleu de coomassie.Une bande protéique qui comigre avec de l'albumine humaine commerciale (Sigma) servant de référence de poids moléculaire est détectable dans les échantillons provenant des cellules transformées avec les plasmides pY19 ou pYG23 mais pas avec les cellules contenant le vecteur pYG25 qui ne contient pas le gène de la SAH. On remarquera que, alors que la quasi-totalité de l'albumine exprimée à partir de pYG19 (prépro-SAH) est exportée dans le surnageant de culture, toute l'albumine produite à partir du plasmide pYG23 (Met-SAH) est présente dans la fraction des protéines cytoplasmiques non solubles.De plus, les résultats de la figure 20 indiquent que l'albumine excrétée par les cellules contenant le plasmide pYG19 est la seule protéine excellulaire présente en quantités significatives. Dans le surnageant d'une culture de MW98-8C transformée avec le plasmide pYG19, la concentration d'albumine peut atteindre 12 mg SAH/g biomasse. L4A Détection immunologique de l'albumine produite par K. lactis L'identité des protéines qui cl migrent avec l'albumine extraite du plasma humain peut être testé par immuno-détection. A ce but, un gel de polyacrylamide est transféré sur filtre de nitrocellulose (Schleicher et Schuell, 0,45 m) en utilisant un appareil de transfert semi-sec (Biométra) dans un tampon de transfert contenant 25 mMTris base, 150 mMglycine, et 10 % méthanol. Le temps de transfert est de 30 minutes en utilisant un courant d'environ 0,85 mA/cm2 de surface de gel. Après transfert, le filtre est incubé trois fois 5 minutes avec 50 ml de tampon A (5% poudre de lait écrémé, 0,2 % Tween20 en tampon PBS [137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 4,3 mM Na2 HPO4]), suivi d'une incubation de 30 minutes dans 40 ml de tampon A contenant des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre la SAH et dilués au 1/ 1000.Après 3 rinçages du filtre par du tampon A, un anticorps secondaire biotinylé reconnaissant les anticorps de lapin (Vectastain ABC - Immuno Peroxidase Kit, Vector Laboratories), est ajouté à raison d'une goutte pour 50 ml de tampon A Après incubation du filtre pendant 30 minutes, le filtre est rincé 3 fois par du tampon B (0,2 to Tween 20 dans PBS) puis incubé en présence d'un complexe avidine DH/ péroxidase H biotinylée. Le complexe avidine/ péroxidase biotinylée est préparé extemporanément en diluant 1 goutte de chacun des réactifs A et B du kit dans 5 ml de tampon B, après incubation à 23"C pendant 30 minutes. Le filtre est incubé dans une dilution au 1/10 du complexe dans du tampon B (50 ml au total) pendant 30 minutes.Le filtre est rincé de nouveau par du tampon B pendant 3 périodes de 5 minutes et mis à développerpendant 2-3 minutes dans une solution de 10 ml à 0,02% H202 et 10 ml d'une solution contenant 1 mg/ml de diaminobenzidine et 0,4 mg/ NiC1, en 0,1 M Tris HCl pH 7,4. Le résultat de cette expérience (figure 21) démontre que K lactis MW98-8C exprime (pYG23) et excrète (pYG19) une protéine reconnue par des anticorps polyclonaux anti-SAH. Ce matériel antigénique est spécifiquement associé à la présence d'une cassette d'expression de l'albumine ; il n'est pas détecté dans des extraits cellulaires ou des surnageants de culture des levures transformées avec le vecteur sans cassette d'expression. E.45 Cinétique d'excrétion de la SAH Comme le montre la figure 22A (chaque échantillon correspondant àl'équivalent de 160;21de surnageant de culture), la sécrétion de l'albumine humaine se fait avec une cinétique relativement lente en erlenmeyer. Les niveaux maximums d'excrétion semblent avoir lieu après 70 à 100 heures d'incubation d'une culture inoculée initialement à 105 cellules/ml (Fig 22B, échantillons déposés correspondant à l'equivalent de 25)11 de surnageant de culture). Aucune augmentation, ni di minution, significative n'est détectable entre 100 et 240 heures de culture, démontrant une remarquable stabilité de la SAH dans ces conditions de culture et de température.Puisqu'il n'y a pas d'açcumulation de matériel protéolysé durant cette période, il peut être conclu qu'aucune protéase extracellulaire n'est présente qui pourrait dégrader l'albumine excrétée. Une représentation graphique de la cinétique d'excrétion (A), de même que la courbe de croissance de la souche MW98-8C transformée avec le plasmide pYG (B)est montrée en figure 23 ; ces résultats montrent que l'excrétion de l'albumine humaine continue après que les cellules ont atteint la phase station mire de croissance. Cette observation est en accord avec des observations antérieures concernant d'autres systèmes d'expression chez la levure . Exemple 5: PURIFICATION DE LA SAH SECRETEE DANS LE MILIEU DE CULTURE Dans une expérience typique de purification, la souche MW98=8C transformée avec le plasmide pYG19 est cultivée en milieu YPD pendant 72 heures dans les conditions standards déjà décrites. Un surnageant de culture (0,5 litre) est débarrassé de toute contamination cellulaire par centrifugation et incubé à 4 C pendant 15 minutes en présence de 60 % d'éthanol (V/V). Le précipité est récupéré par centrifugation, redissous dans 10 rnl d'une solution 50 mM Tris HCl pH 8,0, puis charge sur une colonne de bleu Trisacryl. L'albumine humaine est éluée de cette colonne par une solution de NaCI 3M.Après dialyse des fractions contenant la SAH contre 50 M Tris, celles-ci sont purifiées sur colonne MONO Q (Pharmacia), et éluées e une concentration de NaCl û,25 M. Dans une dernière étape une chromatographie Superose '2(Pharmacia) permet d'obtenir de la SAH pure à plus de 99% après les résultats d'électrophorèse PAGE-SDS et coloration du gel aux sels d'argent). Exemple 6: CARACI ERISATION DE LXALBUMINE SECRETEE ET PURIFIEE L'absence d'un test permettant de mesurer in vitro les propriétés biologiques de l'albumine ne simplifie pas la procédure permettant dejuger de la qualité de l'albumine recombinante. Pour cette raison, après purification, l'albumine excrétée par L lactis est donc caractérisée par plusieurs tests physico-chimiques et immunologiques. Ces tests démontrent que l'albumine recombinante est sécrétée par K lactis sous forme mature et dans sa configuration native : elle est indistinguable de la sérum albumine humaine extraite du plasma pour tous les critères. E.6.1 PAGE SDS : Coloration au bleu de coomassie et aux sels d'argent L'électrophorèse est effectuée en gel de polyacrylamide (7,5 %) dénaturant (figure 24 C) comme décrit précédemment, ou grâce à l'utilisation d'un "Phast gel" (Pharmacia, Figure 24 A). Différentes quantités d'albumine recombinante ont été comparées à une préparation commerciale de l'albumine standard (Sigma) extraite de plasma humain. La coloration du gel au bleu de coomassie (Figure 24 C), ou aux sels d'argent (Figure 24 A ), montre l'homogénéité totale des échantillons d'albumine de levure. E.6.2 Isoélectrofocalisation Des focalisations isoélectriques sont effectuées entre pH 4,5 et 6,0 (Phast gel, Pharmacia, figure 24 B), et pH 4,0 et 7,0 (Immobiline, LKB). Le point isoélectrique de la SAH recombinante est identique à celui de la SAH humaine référence (pI = 4,8). E6.3 PAGE en conditions non dénaturantes: révélation immunologique L'électrophorèse de la SAH recombinante dans un gel de polyacrylamide (10 %) non dénaturant, suivi d'un transfert sur filtre de nitrocellulose et révélation immunologique dans les conditions décrites en section E.4.4 révèlent une co-migration avec l'albumine standard extraite du plasma humain. Ceci suggère très fortement que la maturation correcte de la prépro-SAH recombinante a lieu lors du prouesse, de sécrétion inhérent aux cellules de K4 lactis. Aucune contamination avec de la SAH non maturée n'est détectable ce qui implique que le clivage de la séquence signal et de la région pro de la SAH s'effectue avec efficacité dans cette levure. E6A Aromatograyhie d'exclusion moléculaire Une chromatographie d'exclusion moléculaire est effectuée avec une Superose 12 (Pharmacia). Le débit du tampon d'élution (50 mM Tris HCI pH 8,0) est maintenu à 1 ml/minute. Les concentrations en albumine recombinante et en albumine référence issue du plasma humain sont de 0,4 et 1 mg/ml respectivement. Après dépôt d'un volume de 100pl, l'élution de l'albumine est détectée par mesure de l'absorption à 280 nm. Dans les deux cas le volume d'élution est identique (11,5 ml). LU Chromatograhie d'échange d'anion L'albumine recombinante est éluée d'une colonne Mono Q HR 5/5 (Pharmacia) à une concentration de 0,31 M NaCl2 comme l'albumine référence issue duplasma humain. La figure 25 montre les profils chromatographiques obtenus pour des injections de 100 l de SAH recombinante (0,4 mg/ml) et de SAH plasmatique (0,5 mg/ml) utilisant une colonne équilibrée en Tris-HCl 50 mM pH 8,0 et à un débit constant de 1 ml/minute. E,6,6 Chromatographie en phase inverse Le comportement de l'albumine de levure en phase inverse est analysé sur une colonne Nucleosil (C4) avec les tampons A (eau à 0,1 % TFA) et B (acétonitrile à 0,1 to TFA). La figure 26 représente l'élution, par un gradient de 20 à 80% de H dans A, de l'albumine de levure qui possède le même temps de rétention que l'albumine plasmatique. E.6.7 Composition en acides aminés La composition en acides aminés de la SAH recombinante est détenninée par chromatographie en phase inverse après hydrolyse acide (HCl) et dérivatisation au PlTC. Les résultats obtenus par cette méthode indiquent clairement une composition identique à celle de l'albumine référence issue du plasma humain E.6.8 Séquence N-terminale L'utilisation d'un appareil automatisé permettant la dégradation d'Edman (Applied Biosystems) indique que la séquence N-terniinale de la SAH sécrétée par K. lactis est Asp-Ala-His-Lys-Ser-Glu-Vai-Ala-His-Mg-Phe-Lys-Asp- Leu-Gly.La détermination de cette séquence confirme donc les résultats provenant des expériences d'électrophorèse en gels natifs de polyacrylamide, et démontre la maturation correcte et complète de l'albumine secrétée par la levure K lactis. E.69 Fluorescence du tryptophane Avecune excitation à295 nm,l'émission de fluorescence de runique tryptophane possède le même maximum pour la SAH recombinante et l'albumine plasmati que (337 nm) indiquant un environnement hydrophobe identique au niveau de cet acide aminé (figure 27). E.6.10 Stabilité thermique L'albumine référence (Sigma) et l'albumine sécrétée par la levure ont une cinétique identique de dégradation à 75"C (figure 28) ce qui suggère que les liaisons de stabilisation de la structure protéique (interactions hydrophobes et ponts disulfures) sont identiques dans les deux cas. E.6.11 Affinités vis-à-vis de différentes anticorps monoclonaux L'antigénicité de l'albumine recombinante a été étudiée avec différents anticorps monoclonaux dirigés contre l'albumine humaine. La figure 29 montre leur spécificité : les anticorps HAiO, HA11 et HA13 correspondent à des épitopes dont la conservation nécessite l'intégrité de l'ensemble de la molécule.Les anticorps HA21, HA6, HA4, HA3, HA8 et HA1 correspondent à des épitopes localisés le long de la chaîne peptidique de l'extrémité N à l'extrémité C terminale SL Le test utilisé est un test d'inhibition d'ELISk Les différents anticorps sont adsorbés sur des plaques de polystyrène et une courbe de fixation d'albumine marquée avec la phosphatase alcaline est établie pour chaque anticorps. Les courbes de saturation de chaque anticorps ont une allure sigmoïde et la quantité d'albumine marquée correspondant à 50 % de fixation a été choisie pour étudier l'inhibition de chacun des anticorps L'inhibition a été réalisée avec l'échantillon d'albumine recombinante et comparée à celle obtenue avec un échantillon d'albumine plasmatique (Sigma).La figure 30 montre que pour les 9 anticorps testés, l'albumine recombinante est aussi inhibitrice que l'albumine native. Etant donné l'extrême sensibilité du test' les différences observées sont minimes. DESCRIPTION DES FIGURES Les représentations des plasmides indiqués dans les figures ne sont pas traçées à l'échelle et seuls les sites de restriction importants pour les constructions sont indiqués. Figure 1: Construction du plasmide pXL276 contenant la séquence complète codant pour la Met-SAH obtenu à partir de trois clones d'ADNc (voir texte) dérivés d'ARNm poly-A isolés de foie humain. Figure 2: Reconstitution de la séquence signal "prépro" de l'albumine à partir de quatre oligonudéotides synthétiques : Construction du plasmide pXL290. Figure 3: Construction du plasmide pXL299. Figure 4: Construction du plasmide pXL322. Figure 5: Construction du plasmide pXL855. Figure 6: Construction du plasmide pXL869. Figure 7: Séquence nucléotidique et en acides aminés du fragment Hindi prove nant du plasmide pXL869 et contenant le gène de structure de la prépro SAH. Les flèches noires indiquent la fin des régions "pré" et pro. Figure 8: Construction du plasmide pUC-URA3. Figure 9: Construction du plasmide pCXJi. Figure 10 :Construction du plasmide pkl-PS1535-6. Figure 11 :Construction du plasmide pUC-kan202. Figure 12 : Séquence nucléotidique du promoteur pkl à partir du site de restriction ScaI et incluant lajonction entre ORF1 et pkl et la région 5' du gène bac térien codant pour l'aminoglycoside phosphotransférase provenant de Tn 903. Figure 13 : Construction du plasmide pKan707. Figure 14 : Courbe de stabilité du plasmide pKan707 dans la souche MW98-8C dans des conditions de croissance non-sélectives. Figure 15 : Construction du plasmide pYG11. Figure 16 : Construction du plasmide pYG18. Figure 17: Construction du plasmide pYG19. Figure 18 :Représentation des plasmides pYG19 (prépro-SAH) et pYG23 (Met SAH). La séquence nucléotidique fournie en dessous de chaque plas mide indique la jonction entre le promoteur du gène PGK et les gènes de structure des différentes formes de SAH. Figure 19 : Courbes de stabilité des plasmides pYG19 et pYG23 dans la souche MW98-8C dans des conditions de croissance non-sélectives. Figure 20 : Gel de polyacrylamide-SDS à 8,5 % après coloration au bleu de coo massie démontrant l'expression et l'excrétion de la SAH à partir de la souche MW98-8C. Pistes 1 - 4: albumine extrait du plasma humain (Sigma) déposée à des concentrations croissantes; 0,2 g, 0,6 g, 2 g et 6)1gparpiste.pYG19 (prépro-SAH), pYG23 (Met-SAH) et pYG25 (vec teur): chaque piste correspond à une quantité de protéine équivalent à 100)11 de la culture originale (approx. 2 x 108 cellules/ml). a), fractions solubles ; b), fractions insolubles ; c), surnageant de culture. Figure 21 :Immunorévélation d'un gel de polyacrylamide à 7,5 to transféré sur nitrocellulose comme décrit dans le texte. Piste 1-5 5 albumine extraite du plasma humain (Sigma) qui a été dissous dans un milieu YPD à des concentrations variées et précipité avec du TCA (5 to concentration fi nale) comme décrit. Les échantillons de la gamme SAH ont donc été traités de la même façon que les surnageants de culture.Dans les deux cas, les dépôts de gel correspondent à des volumes équivalents. 1), pré cipitation à une concentration de 100 mg/I ; 2), 50 mg/i ; 3), 25 mg/I ; 4), 12,5 mg/l; 5), 0,6 mg/l. pYG19 (prépro-SAH) et pYG23 (Met-SAH): chaque piste correspond à une quantité de protéines équivalent à 20 l de la culture originale (approx. 2 x 106 cellules/ml). a), surnageant de cul ture ; b), fractions insolubles ; c), fractions solubles. Figure 22 :Gel de polyacrylamide à 8,5 % après coloration au bleu de coomassie démontrant la cinétique de l'excrétion de la SAH à partir de la souche MW98-8C A, piste a-e : albumine extraite du plasma humain (Sigma) qui a été dissous dans du milieu YPD à des concentrations variées et précipitée avec du TCA (5 % concentration final) comme décrit (voir légende de la figure 21). l), précipitation à une concentration de 6 mg/i ; 2), 12,5 mg/ 1; 3), 25 mg/l; 4), 50 mg/i ; 5), 100 mg/l. pYG19 : excrétion de la SAH à partir du plasmide pYG19 et en fonction de l'âge de la culture, 16 - 61 heures comme indiqué. Chaque échantillon correspond à l'équivalent de 160pl de surnageant de culture. B, pistes a -e : albumine extrait du plasma humain (Sigma) déposée à des concentration croissantes; 0,4 g, 0,8 g, 1,0 g et 1,2 g par piste. pYG19: excrétion de la SAH à partir du plasmide pYG19 et en fonction de l'âge de la culture, 72- 240 heures comme indiqué. Chaque échantillon correspond à l'équivalent de 25 l de surnageant de culture. Figure 23 :A, représentation graphique de la cinétique d'excrétion de la SAH à partir de la souche MW98-8C transformée avec le plasmide pYG19 et cultivée en erlenmeyer comme indiqué dans le texte. La concentration de l'albumine détectée dans le milieu de culture (mg/l) est représentée en fonction du temps (heures). Les résultats de quatre expériences indépen dantes sont représentés. B, courbe de croissance de la souche MW98-8C transformée avec le plasmide pYGî9. Figure 24: Techniques électrophorétiques (S = standard, L = albumine de levure). A - PAGE-SDS (Phast gel, Pharmacia, gradient 8-25 %) coloration aux sels d'argent. S = 1 g, L:de 0.05 à 0.25 g B - Isoélectrofocalisation (Phast gel, pH 4,5-6,0), coloration au bleu de coomassie, dépôts = i > ig. C - PAGE SDS (7,5 %), coloration au bleu de coomassie. S = 0,2-1,0 g, L = 0,25-2,5 g Figure25 :Chromatographie d'échange d'ions - Mono Q (Pharmacia). En bas: SAH levure 40 g; en haut: SAH standard 50 pg Figure 26 :Chromatographie en phase inverse = Nucleosil C4. a), SAH standard; b), SAH levure. Figure 27 : Spectrométrie d'émission de fluorescence du tryptophane. En trait plein: SAH standard ; en pointillé : SAH levure. Figure 28 Stabilité thermique à 75 C. En trait plein: SAH standard ; en pointillé: SAH levure. Figure 29 :Régions de l'albumine reconnues par les différents anticorps monoclo naux utilisés pour la caractérisation antigénique. Figure30: Courbes d'inhibition, vis-à-vis des neuf anticorps monoclonaux (voir texte) : pourcentage d'inhibition en fonction de la concentration en albumine ( g/ml): #, SAH standard; #, SAH levure. REFERENCES 1 Brown, J.R., in "Albumin Structure, Function and Uses", Rosenoer,V.M. et al. (eds.), Pergamon Press, Oxford, (1977) 27-51. 2 Weitkamp, L.R. et al., Ann. Hum. 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Sci. USA 75 (1978) 1929-1933. 45 Ito, H. et al., J. Bacteriol 153(1983) 163-168. 46 Bianchi, M. et al., Curr. Genet. 12 (1987) 185- 192. 47 Laemli, U.K., Nature 227 (1970) 680 - 685. 48 Tschopp, J.F. et al., Bio/Technology 5 (1987) 1305-1308. 49 Doyen, N. et ai., Mol. lurnun. 22 (1985) 1-10. 50 Lapresle, C., Anal. Biochem. (1988) in press. REVENDICATIONS 1- Procédé de préparation microbiologique de la sérum albumine humaine (SAH) ou de l'un de sesvariants caractérisé en ce que l'on cultive une levure capable d'assurer le maintien stable d'une cassette d'expression comportant au moins un marqueur de sélection des levures transformées, l'ADN du gène de structure de SAH fusionné à des séquences permettant son expression dans la levure et éventuellement l'excrétion de la protéine encodée par ce gène dans le milieu de la culture. 2-Procédé selon revendication 1 caractérisé en ce que la cassette d'expression est intégrée dans le génome de la levure. 3 - Procédé selon relendication 1 caractérisé en ce que la cassette d'expression fait partie d'un plasmide comportant un système de réplication fonctionnant dans la levure et assurant le maintien stable de ladite cassette dans cette levure. 4- Procédé selon l'une des revendications 1, 2 ou 3 caractérisé en ce que les levures sont choisies dans les genres Saccharomvces et Kluweromvces. 5- Procédé selon l'une des revendications 1, 2 ou 3 caractérisé en ce que la levure est choisie dans le genre Kluvveromvces. 6 - Procédé selon l'une des revendications 1, 2 ou 3 caractérisé en ce que la levure est choisie parmi toutes les variétés de Kluyveromyces marxianus. 7 - Procédé selon l'une des revendications 1, 2 ou 3 caractérisé en ce que la levure est Kluyveromvces mancianus var. lactis. 8 - Procédé selon l'une des revendications 3 à 7 caractérisé en ce que le système de réplication fonctionnant dans la levure est tout ou partie du plasmide pKD 1 isolé de Kluvveromvces marxianus var. drosophilarum ou tout ou partie du plasmide 2 > i isolé de Saccharomvces cerevisiae ou une combinaison d'éléments dérivés du plasmide pKD1 et du plasmide 2P. 9 - Procédé selon l'une des revendications 3, 6,7 ou 8 caractérisé en ce que le système de replication fonctionnant dans la levure est tout ou partie de la séquence du plasmide pKD1. 1S Procédé selon l'une des revendications 3, 5, 6, 7, 8 ou 9 caractérisé en ce qu'une cassette d'expression selon la revendication 1 ou un marqueur de sélection est inséré dans une région de 197 pb définie par les sites SacI et Mstfl de pKDi. Il - Procédé selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que les séquences permettant l'expression du gène de structure sont choisies parmi les promoteurs dérivées des gènes de levures du genre Saccharomyces ou KIuyveromy- 12-Procédé selon revendication il caractérisé en ce que ces promoteurs sont dérivés des gènes glycolytiques de levures du genre Saccharomyces ou Kluyveromyces. 13 - Procédé selon revendication 12 caractérisé en ce que les séquences permettant rexpression du gène de structure sont choisies parmi les gènes codant pour la phosphoglycerate kinase (PGK), la gly'céraidéhyde-3-phosphate deshydro génase, la lactase, l'enolase ou l'alcool deshydrogénase. 14 - Procédé selon revendication 13 caractérisé en ce que les séquences permettant l'expression du gène de structure proviennent du gène codant pour la phosphoglycérate lactase. 15 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisé en ce que les séquences permettant rexcrétion de la protéine hétérologue sont choisies parmi l'extension N-terminale naturelle "prépro" de l'albumine et les séquences obtenues à partir des gènes de levure codant pour la phéromone alpha ou la toxine "killer". 16 - Procédé selon revendication 15 caractérisé en ce que la séquence permettant l'excrétion de la SAH est l'extension terminale naturelle "prépro" de l'alburine. 17 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisé en ce que les séquences permettant la sélection des levures transformées sont choisies parmi les gènes apportant la résistance aux antibiotiques ou aux ions cuivre. 18 - Procédé selon revendication 17 caractérisé en ce que la séquence de sélection est un gène apportant la résistance à la G418. 19 - Procédé selon revendication 18 caractérisé en ce que la séquence de sélection est une fusion entre le promoteur kl du plasmide linéaire de K lactis et l'aminoglycoside phosphotransférase du transposon Tn. 20 - Le plasmide pYG19 caractérisé en ce qu'il comporte le plasmide pKD1, l'ADN de la prépro-SAH, les séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription du gène codant pour la phosphoglycérate kinase et les séquences d'une fusion entre le promoteur pkl du plasmide linéaire kl de Kluyveromyces lactis et le gène de la 3'aminoglycoside phosphotransférase de Tn 903. 21- Le plasmide pYG23 caractérisé en ce qu'il comporte le plasmide pKD1, l'ADN de la Met-SAH, les séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription du gène codant pour la phosphoglycerate kinase et les séquences d'une fusion entre le promoteur pkl du plasmide linéaire kl de K. marxianus var. lactis et le gène de la 3'-aminoglycoside phosphotransférase de Tn. 22- La levure K marxianus var. lactis MW98-8C. 23- La levure K. marxianus var. lactis MW98-8C transformée par le plasmide pYG19. 24-La levure Kluyveromyces marxianus var. lactis MW98-8C transformée par le plasmide pYG23. 25 - La sérum albumine humaine lorsqu'elle est obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 19. 26 - La sérum albumine humaine lorsqu'elle est obtenue par culture dans des conditions appropriées de la levure selon les revendications 23 et 24. 27 - Application de la sérum albumine humaine selon les revendications 25 ou 26 à titre de médicament. 28 - Le plasmide pKan-707. 29 - Le plasmide CXJ1.