FR 2631451 A1 19891117 FR 8806487 A 19880513 PROCEDE DE CARACTERISATION DE L'EPITOPE INTERVENANT DANS UNE REACTION ANTIGENE ANTICORPS, KIT OU NECESSAIRE POUR LA MISE EN OEUVRE DU PROCEDE. L'invention concerne un procédé de caractérisation de l'épitope intervenant dans la réaction entre un antigène et un anticorps monospécifique reconnaisant tous le même site dans l'antigène susdit, notamment un anticorps monoclonal, en d'autres termes le site d'interaction mutuel de cet antigène et de cet anticorps. Dans ce qui suit, il sera généralement fait référence à des anticorps monoclonaux, étant néanmoins entendu que cette expression doit être considérée comme englobant aussi d'autres formes monospécifiques. L'invention concerne également un kit ou nécessaire pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, ainsi que ses différentes applications biologiques. L'expression "protéine" telle qu'utilisée dans ce qui suit, doit être considérée dans son acceptation la plus large et désignera par exemple, et non limitativement, un polypeptide, un antigène ou un fragment de celui-ci. On désignera par ADNc principalement, l'ADN résultant normalement de la transcription reverse d'un ARN messager (ARNm) suivie de celle de l'ADN a brin unique obtenu, en l'ADN double brin correspondant, en l'occurence l'ADNc correspondant. Ces ADNc peuvent alors être clonés dans des vecteurs appropriés (14 > , par exemple aux fins d'induire la production de la protéine correspondante dans un hôte cellulaire compétent. Les ARNs messagers correspondant à toute protéine étudiée, donc aussi les ADNc, sont en général accessibles. Il sont particulièrem-nt utiles, lorsque la séquence d'acide nucléique de de l'hôte cellulaire naturel qui contient les éléments codant pour la protéine étudiée comporte aussi des introns rendant impossible le transfert tel que dans un hôte de cette séquence cellulaire étranger, par exemple une bactérie, dans des conditions permettant l'expression desdits éléments codants. Néanmoins, pour les besoins de la description qui suit, il sera entendu que l'expression ADNc doit être comprise comme devant également s'étendre à ces séquences d'acides aminés codants qui, même dans les hôtes naturels, sont dépourvues d'introns. Sont alors encore couverts par l'expression ADNc, les ADNs synthétiques formés d'enchainements nucléotides distincts, néanmoins dans les limites autorisées par la dégénérescence du code génétique, pour être à même de coder pour les mêmes polypeptides. L'expression épitope" telle qu'utilisé dans ce qui précède et dans ce qui suit, doit être considérée comme désignant un épitope continu et ne s'applique par conséquent pas aux épitopes discontinus dont certains acides aminés constitutifs jouxtent d'autres dans la structure tértiaire de la protéine alors qu'il sont situés à distance les uns des autres dans la structure primaire de la protéine, (réf. 31). On parlera aussi dans ce qui suit de "région épitopique" de l'antigène pour désigner une région de l'antigène qui contient cet épitope. La localisation précise des régions épitopiques contenues dans un antigène reconnues par des anticorps, notamment des anticorps monoclonaux, est importante à déterminer dans de nombreux cas, notamment pour définir les domaines immunogéniques et fonctionnels des protéines (réf. 1, réf. 2), pour l'étude de vaccins (réf. 3), pour les expériences de mutagénèse invitro (réf. 4), etc.. ou pour réaliser une "cartographie" de diverses molécules biologiques, par exemple des récepteurs (réf. 5), des protéines de régulation variées (réf. 6), des hormones (réf. 7), des antigènes viraux bactériens et parasitaires (réf. 8, 9 et 10), etc... Cependant, ces techniques sont à ce jour complexes. Elles comprennent généralement la proteolyse de la protéine par l'identification des positions relatives des séquences peptidiques reconnues par les anticorps (réf. 11), par rapport à l'ensemble de la chaine polypeptidique de la protéine, le séquençage récurrent aminoacide par aminoacide de ces segments peptidiques, le cas échéant, la modification des acides aminés impliqués dans les réactions antigène-anticorps (réf. 12), la synthèse des peptides et l'étude de leur reconnaissance immunologique (réf. 13). L'invention vise à remédier en grande partie aux inconvénients ci-dessus, en particulier à fournir un procédé beaucoup plus simple de localisation des épitopes d'un antigène, ne nécessitant donc qu'un nombre réduit d'étapes. Un autre objet de l'invention concerne un kit ou nécessaire pour la mise en oeuvre du nouveau procédé. Le procédé de l'invention pour la localisation du site d'interaction mutuelle entre une protéine déterminée et reconnue par au moins un anticorps monoclonal reconnaissant la protéine entière, est caractérisé en ce que - partant d' un acide nucléique contenant un ADNc codant pour la protéine déterminée placé sous le contrôle d'un promoteur susceptible d'autoriser la transcription de l'ÂDNc et les éléments nécessaires à la traduction in vitro de l'ARN correspondant ou partant d'un mélange de fragments de cet acide nucléique contenant des séquences de tailles différentes de cet ADNc, parmi lesquelles celles placées sous le contrôle de ce même promoteur, - il comprend successivement la transcription de cet ADNc ou de séquences de cet ADNc sous le contrôle dudit promoteur, puis la traduction In vitzo des ARNs ainsi produits en les polypeptides correspondants dans un milieu acellulaire contenant les différents ingrédients nécessaires aux susdites transcription et traduction, la mise en contact des polypeptides résultant de cette traduction avec l'anticorps monoclonal déterminé, dans des conditions permettant une réaction immunologique entre l'anticorps monoclonal et les polypeptides que peut reconnaître l'anticorps monoclonal la séparation des polypeptides produits ln vitro les uns des autres, selon leurs tailles, avant ou après la réaction avec l'anticorps monoclonal la détection du plus petit de ceux des polypeptides qui sont reconnus et du plus grand de ceux qui ne sont plus reconnus par l'anticorps monoclonal, et l'identification d'un élément essentiel de l'épitope spécifique de l'anticorps monoclonal dans le plus petit de ceux des épitopes qui sont reconnus, cet élément essentiel consistant en la séquence C-terminale de un ou plusieurs aminoacide(s) encore contenu(s) dans le plus petit des polypeptides reconnu mais perduepar le plus grand des polypeptides qui n'a plus été reconnu par l'anticorps monoclonal. De nombreux milieux acellulaires dans lesquels ces transcription et traduction d'un ADN peuvent être effectuées sont bien connus de l'homme du métier. parmi les éléments essentiels pour la réalisation de ces opérations, on mentionne les acides aminés nécessaires à la production in vitro des polypeptides concernés. Comme indiqué dans ce qui précède, l'ADNc utilisé comme matière première est placé sous le contrôle du promoteur approprié. Celui-ci peut consister en un promoteur du vecteur dans lequel l'ADNc aura auparavant été cloné. Le plus souvent, ce vecteur ou une partie de ce vecteur, contenant ce promoteur et l'ADNc placé sous le contrôle de ce promoteur, constitue l'acide nucléique mis en oeuvre dans le susdit milieu acellulaire. Le promoteur correspond soit à un promoteur endogène, soit en un promoteur exogène vis-à-vis de la séquence d'ADN initiale dont l'ADNc initial est dérivé. Les fragments de tailles différentes de cet ADNc peuvent être obtenus par tout procédé de fragmentation adéquat mettant en oeuvre des endonucléases spécifiques ou non spécifiques, ou par une enzyme exonucléolytique, telle que Bal31 qui digère de façon progressive les deux extrémités d'un acide nucléique. La fragmentation préalable de l'ADNc n'est pas toujours nécessaire dans la mesure où il est souvent observé des interruptions spontanées de la transcription et la traduction d'un ADNc in vitro, ces interruptions se manifestent alors comme dans le cas où l'ADNc aura fait l'objet d'une pré-fragmentation sous l'effet d'enzymes appropriés, par la production d'une série de polypeptides dérivés de la protéine antigénique et présentant les tailles différentes déterminées correspondantes. Il apparaitra immédiatement à l'homme du métier que seuls peuvent être transcrits les fragments d'ADNc non préalablement séparés du promoteur sous le contrôle duquel s'effectue la transcription. Tout fragment produit au cours des opérations de pré-fragmentation ne peut plus être transcrit, encore moins traduit, dans le milieu -acellulaire. En d'autres termes, les fragments polypeptidiques produits ont naturellement la même extrémité N-terminale en commun, mais se distinguent par des extrémités C-terminales distinctes et par des delétions plus ou moins importantes des parties de la protéine. antigénique entière à partir de l'extrémité C-terminale, d'où l'expression protéines tronquées" qui est utilisée dans la suite de cet exposé pour les désigner. Il est rappelé qu'une étape supplémentaire du procédé selon l'invention, comprend la mise en contact des produits d'expression de ces fragments d'ADNc, dites "protéines tronquées", avec au moins un anticorps déterminé dans les conditions permettant l'obtention d'une réaction immunologique entre cet anticorps et les protéines tronquées, dans la mesure où celles-ci contiennent encore les éléments essentiels de l'épitope caractéristique de l'anticorps dans la protéine entière. La séparation des protéines tronquées les unes des autres selon leurs tailles respectives avant ou après l'interaction avec l'anticorps monoclonal rend possible la détection de la plus petite des protéines tronquées reconnues par l'anticorps monoclonal, et par voie de conséquence, de la plus grande des protéines tronquées qui n'est pas reconnu par l'anticorps en question. Il apparaitra alors de façon immédiate que la différence ne peut que résulter de ce que la plus petite des protéines tronquées encore reconnue par l'anticorps monoclonal, contenait à proximité de son extrémité C-terminale, un élément essentiel de l'épitope spécifiquement reconnu par l'anticorps monoclonal, cet élément essentiel n'étant pas contenu dans la plus grande des protéines tronquées, qui n'est plus reconnu par l'anticorps monoclonal. Le procédé selon l'invention fournit donc la possibilité, à partir d'un même ADNc placé sous le contrôle d'un même promoteur, de rapidement localiser la région épitopique correspondante (en tout cas l'un des éléments essentiel de l'épitope) spécifiquement reconnu par cet anticorps monoclonal. Si l'on ne dispose que d'un nombre réduit de protéines tronquées, la région épitopique identifiée dans les conditions qui précèdent, peut encore contenir des séquences d'acides aminés n'intervenant pas dans l'interaction entre l'anticorps monoclonal et l'épitope proprement dit. La sensibilité du procédé est cependant d'autant plus grande que l'on a auparavant produit d'avantage de protéines tronquées se distinguant les unes des autres par des longueurs distinctes à partir de la protéine entière. La sensibilité du procédé de l'invention dépend donc en général du choix des conditions dans lesquelles les différentes protéines tronquées sont produites, de préférence des conditions dans lesquelles les fragments de l'ADNc initialement mis en oeuvre, sont obtenus. Si la fragmentation apparait déjà à ce dernier niveau, on apprécie que le nombre de fragments susceptibles d'être transcrits et traduits in vitro, peut dépendre du choix des endonucléases mis en oeuvre, par exemple un "cocktail" d'enzyme de restriction de façon à induire un grand nombre de clivages dans l'ADNc, notamment mis en oeuvre.Avantageusement --surtout lorsque l'on ignore complètement la position de l'épitope recherché dans la protéine complète-- les conditions de la fragmentation sont réglées de façon telle que l'on soit à même d'induire toute une batterie de polypeptides des plus courts aux plus longs de la protéine étudiée, à partir de l'extrémité N-terminale de cette dernière. Les opérations de séparation des produits d'expression, en particulier des protéines tronquées, produites à l'issue des étapes sus-indiquées du procédé de l'invention, peut faire appel à nombre de techniques bien connues de l'homme du métier, en particulier à des techniques de migrations différentielles, fonctions de leurs masses moléculaires, des protéines tronquées formées sur ou dans un support approprié, par exemple par électrophorèse sur gel. Cette opération de séparation peut être effectuée sur les complexes immunologiques préalablement formés entre les protéines tronquées et l'anticorps mis en oeuvre, ou antérieurement à la réaction immunologique, celle-ci étant alors obtenue postérieurement par mise en contact de l'ensemble de ces protéines tronquées avec l'anticorps à étudier. Tout moyen approprié pour révéler celles des protéines tronquées qui ont réagi, ou sont susceptibles de réagir, et celles qui n'ont pas réagi, ou qui ne sont pas susceptibles de le faire, peut être mis en oeuvre. Avantageusement, on a recours à un marquage des protéines tronquées, ce marquage résultant avantageusement de l'utilisation d'un acide aminé lui-même marqué (par exemple radioactivement) parmi les acides aminés mis en oeuvre dans le milieu acellulaire. On peut avoir recours au marquage direct ou indirect des anticorps eux-mêmes mis en oeuvre dans la réaction immunologique. Dans ce qui précède, il n'a été envisagé que l'hypothèse de la localisation au sein d'une protéine déterminée de l'épitope reconnu par un anticorps monospécifique ou monoclonal particulier. Cette situation se présente naturellement dans l'hypothèse où l'expérimentateur ayant au préalable produit un anticorps monoclonal particulier à l'égard d'une protéine déterminée, souhaite rapidement détermi- ner un épitope particulier reconnu par l'anticorps au sein de l'épitope. Le procédé selon l'invention peut naturellement être répété avec d'autres anticorps monoclonaux formés contre la meme protéine, d'où la possibilité de rapidement classer les différent anticorps monoclonaux éve tuellement obtenus à partir d'un mélange d'hybridomes préalablement formés contre la protéine entière, selon les différentes régions épitopiques de la protéine qu'ils reconnaissent. Les autres possibilités d'application du procédé selon l'invention sont multiples. Pour n'en mentionner que quelques unes on cite par exemple - la production d'une "batterie d'anticorps monoclonaux reconnaissant des régions épitopiques successives au sein de la séquence en acides aminés d'une protéine déterminée et le classement de ces anticorps monoclonux selon les régions épitopiques reconnues, - l'utilisation de ces différents anticorps monoclonaux pour rechercher l'existence Qu non, de régions épitopiques homologues dans d'autres protéines ayant des propriétés en commun avec la protéine initiale, par exemple dans des protéines homologues issues de cultures cellulaires issues d'autres espèces vivantes, par exemple de de mammifères différents, etc.. L'invention concerne plus particulièrement encore des supports, par exemple des gels, comportant des protéines tronquées marquées selon l'ordre de leurs tailles, ces protéines tronquées ayant été fixées de manière connue de l'homme du métier sur ce support dans des conditions permettant néanmoins leur mise en contact avec un anticorps monoclonal préalablement obtenu et réputé reconnaitre la protéine entière ( ou une protéine homologue) dans des conditions autorisant l'éventuelle réaction immunologique. Les exemples qui suivent n'ont d'autre but que d'éclairer les -conditions dans lesquelles l'invention peut être mise en oeuvre. Dans l'exemple envisagé, l'invention a été appliquée à la réalisation de la-cartographie d'un rêce- teur de la progestérone de lapin (PR) en mettant en oeuvre une batterie d'anticorps monoclonaux disponibles et ayant tous en commun la propriété de reconnaitre ce récepteur de la progestérone. Il va sans dire que la technique qui pourrait être mise en oeuvre avec tout autre type de protéine sous réserve, dès lors que l'on dispose, ou peut disposer, des anticorps correspondants. La description qui suit fera encore référence au dessins dans lesquels les figures dans lesquelles sont illustré les résultats d'essais de détection d'épitopes actifs reconnus par divers anticorps monoclonaux dans la protéine utilisée à titre d'exemple (figures 1, 2, 3, 4 et 6) et d'une cartographie de cette protéine (figure 5). Une description plus détaillée de ces figures apparaît ci-après. Fiaure 1 - la figure 1 montre les résultats de la réaction entre divers anticorps monoclonaux et divers fragments du récepteur de la progestérone de lapin (PR). Après protéolyse partielle du récepteur contenu dans un échantillon de cytosol utérin de lapin, et analyse par immunoblot en utilisant les anticorps monoclonaux ci-dessous (20 ijg de protéine /colonne, la concentration du récepteur dans le cytosol étant de 3 pmol/mg de protéine). Les poids moléculaires (x des marqueurs protéiques (SIGMA) sont indiqués par des flèches. On remarquera que l'anticorps monoclonal Let 595 reconnaissant le fragment de 110 kDA du PR (colonne 3), que l'anticorps monoclonal Let 548 reconnait les fragments de 110 kDA et 79 kDA du PR (colonne 2) et l'anticorps monoclonal Mi60-10 reconnait les trois fragments (110 kDA, 79 kDA et 65 kDA) (colonne 1) du PR. Dans la colonne 4, est montré le résultat obtenu avec un anticorps monoclonal (IDA 10) n'ayant aucune affinité pour le PR. Figure 2 - Dans la figure 2, sont montrées les localisations des épitopes reconnus par les anticorps monoclonaux Let 548(A) et Let 595 (B, colonnes 1 à 6), après traitement d'un acide nucléique contenant une séquence nucléique codant pour le récepteur du PR avec des enzymes de restriction générant des fragments tronqués à leur extrémités C-terminales. L'ADN du vecteur d'expression du PR avait été digéré par XbaI (site après le dernier acide aminé) (colonne 1), MluI (site à l'acide aminé 370) (colonne 2), BalI (site à l'acide aminé 295) (colonne 3), NaeI (site à l'acide aminé 106) (colonne 4), BglII (site à l'acide aminé 142) (colonne 5) et XhoI (site à l'acide aminé 101) (colonnes 6 à 8). Après la transcription, l'ARNm a été traduit en présence soit de L-[35S] méthionine (A, colonnes 1 à 3 ; B, colonnes 1 à 4), soit de L-[ H]leucine (B, colonnes 5 à 8). Les protéines ayant précipité ont été identifiées par fluorographie à -80ZC. Les poids moléculaires (x103) des marqueurs protéiques (SIGMA) sont indiquées par des flèches. Les marqueurs de 116-14 kDA correspondent aux parties A et B (colonnes 1 à 4), les marqueurs de 66-14 kDA correspondant à la partie B (colonnes 5 à 8). Les protéines radio-actives ont été immmunoprécipitées avec Let 548 (1), Let 595 (B, colonnes 1 à 6), un anticorps monoclonal n'ayant aucune affinité pour le PR (B, colonne 8) L'électrophorèse a été réalisée avec un gel de polyacrylamide à 11 8 (A, colonnes 1 à 3 ; B, colonnes 1 à 4) ou à 15 % (B, colonnes 5 à 8). On note l'absence de précipitation du récepteur tronqué par les anticorps Let 548 (A, colonne 3) et Let 595 (B; colonne 6), lorsque la délétion se situe après les acides aminés 295 et 101 respectivement. Figure 3 - La figure 3 montre la localisation des épitopes reconnus, par l'anticorps monoclonal Let 548 dans un essai ayant mis en oeuvre des interruptions de traduction de l'ARNm et la production de récepteurs tronqués à leurs extrémités C-terminales. L'ADN du vecteur d'expression du PR a été digéré par XbaI. L'ARNm transcrit a été traduit en présence de L-[ H]leucine. Les protéines ont été immunoprécipitées et analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 11 . Les protéines radioactives ont été identifiées par fluorographie à -80*C. Les résultats observés au niveau de chacune des colonnes qui suivent ont été identifiées dans les conditions suivantes. Les flèches indiquent les numéros des acides aminés C-terminaux des formes tronquées du PR obtenues par digestion du vecteur d'expression avec XbaI, MluI, BalI, NaeI, BglI, XhoI) et utilisés comme protéines de marquage. Colonne t : traduction par le lysat de réticulocyte en l'absence d'ARNm. Il n'y a pas d'immunoprécipitation. Colonne 2 : traduction par le lysat de réticulocyte en présence de l'ARNm du récepteur. Il n'y a pas d'immunoprécipitation. Colonne 3 : mêmes conditions que dans la colonne 2 mais les protéines ont été immunoprécipitées par Let 417. Colonne 4 : mêmes conditions que dans la colonne 3 mais les protéines ont été immunoprécipitées par Let 458. Colonne 5 : mêmes conditions que dans la colonne 3, mais les protéines ont été immunoprécipitées par l'anticorps IDA 10. On remarquera que ces polypeptides de tailles inférieures à 325 aminoacides ne sont pas immunoprécipités par Let 548 (cf. 4). Figure 4 - La figure 4 montre la localisation de l'épitope reconnu par l'anticorps monoclonal Let 595, lorsque l'on a utilisé l'enzyme Bal31 pour générer des récepteurs tronqués à leurs extrémités C-terminales. On a procédé comme suit L'ADN du vecteur d'expression a été digéré avec ApaI (acide aminé 233). Une digestion progressive avec Ba131 a ensuite été réalisée. L'ARN transcrit a été traduit en présence de L-[ H]eucine. L'électrophorèse a été réalisée sur un gel de polyacrylamide à 15 %. Les protéines radioactives ont été identifiées par fluorographie à -80-C. Les flèches indiquent les numéros des acides C-terminaux aminés des formes tronquées du récepteur obtenues par la digestion du vecteur avec ApaI, HaeI, BglII et XhoI utilisés à titre de marqueurs protéiques. Les protéines radioactives ont été immunoprécipitées avec l'anticorps polyclonal P2 (colonne 2), l'anticorps monoclonal Let 595 (colonne 3) et l'anticorps monoclonal IDA 10, (colonne 4). La colonne 1 montre l'immunoprécipitation par un anticorps polyclonal P2 des protéines obtenues à partir de l'ADN digéré avec ApaI, mais pas avec Bal31. Il n'y a pas eu d'immunoprécipitation du PR tronqué par l'anticorps Let 595 lorsque la délétion Cterminale se situe au delà de l'acide aminé 110. Fiaure 5 - La figure 5 représente les domaines immunologiques du PR respectivement reconnues par les divers anticorps, tels qu'ils ont été obtenus à partir d'un vecteur ArPR1 qui est un clone agit11 contenant une séquence peptide codant pour le récepteur de PR. En A, on note les positions des sites-de coupure dans l'ADN du vecteur d'expression du PR (le site XbaI étant situé dans le polylinker) en B, on montre les positions des épitopes reconnus par les anticorps monoclonaux en C, les prédiction d'hydrophilices de régions du PR selon la méthode décrite par HOPP et WOODS (réf. 28). Seuls des segments sélectionnés sont montrés. bp : paires de bases, a.a. : acides aminés. Frisure 6 - La figure 6 représente la fixation additionnelle d'anticorps au PR marqué avec 125I. A : Le PR marqué avec 125I (bande 110 KDA électroéluée) a été incubé avec des concentrations variables des anticorps monclonaux Let 595 (ss), Let 548 (e), Let 417 () et Let 126 (fil). Des billes de polystyrène ayant adsorbé Let 126 ont été ajoutées. Après lavage, la radioactivité liée a été mesurée et la fixation non spécifique évaluée avec des billes ayant adsorbé l'anticorps non spécifique, qui n'a pas de parenté immunologique avec le récepteur. B : radioactivité spécifique liée en présence d'anticorps compétiteurs. Bo : radioactivité spécifique liée en l'absence d'anticorps compétiteurs. représente une série d'expériences réalisées selon la méthode de la figure A. Les différents anticorps monoclonaux utilisés ont été adsorbés sur des billes de polystyrène et la fixation du RP marqué avec E 1251) étudiée en présence d'anticorps compétiteurs (10 pg/ml). Les traits en pointillé représentent une compétition de 50 . MATERIELS ET METHODES L'exemple qui suit de mise en oeuvre du procédé de l'invention est appliqué à l'étude d'un groupe d'anticorps monoclonaux préparés contre le récepteur de la progestérone de lapin (PR). Quatre domaines immunogéniques ont été identifiés, se situant entre les acides aminés 1 à 60, 101 à 110, 295 à 325 et 370 à 396. Il n'a pas été trouvé d'anticorps dirigés contre les régions de fixation du récepteur à l'ADN ou à des stéroïdes. Ceci est probablement du au degré de conservation de la séquence en amino-acides de ces régions, que l'on observe dans les récepteurs provenant de différentes espèces, les anticorps qui présentent l'affinité la plus élevée avec le récepteur humain, réagissent également avec le premier domaine immunogénique (acides aminés 1 à 60). La- séquence de 79 kDA (sous-unité A) du récepteur est dépourvue des deux domaines immunogéniques situés vers l'extrémité N-terminale (acides aminés 1 à 60 et 101 à 110). La séquence à 65 kDA est dépourvue du domaine situé entre les acides aminés 295 à 325. Ces deux séquences du récepteur correspondent ainsi à des délétions de la partie N-terminale de la protéine. La mise en oeuvre du procédé de l'invention a permis la définition des domaines immunogéniques et la carthographie des différentes formes du RP. Une attention particulière a été portée à l'étude de la, forme A du récepteur (poids moléculaire 79 kDA). Le récepteur de la progestérone a été purifié par chromatographie d'affinité (réf. 15) à partir de cytosol utérin de lapin et a été utilisé pour immuniser des souris BALB/c tel que décrit dans la publication de LOGEAT et al, (réf. 16). A) dr6paration et caractérisation des anticorps La fusion cellulaire, le clonage et la sélection d'hybridomes avec la méthode ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) et la double immunoprécipitation des complexes récepteurs-progestine E3H] ont été réalisés selon la méthode référencée ci-dessus. Les classes d'immunoglobulines ont été déterminées en utilisant des immunoglobulines de lapin anti-souris (MILES, NAPER VILLE, IL). Les anticorps ont été préparés à partir de liquide d'ascites, après précipitation par du sulfate d'ammmonium (50 . de saturation).Les anticorps Ig2a ont été purifiés sur un gel de A sépharose C1-4B (PHARMACIA UPSALA - SUEDE) (réf. 15), tandis que les anticorps IgG1 ont été purifiés en utilisant une colonne DEAE-TRISACRYL (IBF - VILLENEUVE LA GARENNE - FRANCE). L'anticorps monoclonal Mi60-10 anti-récepteur et l'anticorps de contrôle négatif IDA10 ont été utilisés tel que décrit dans les publications ci-après (réf. 16 et Ref. 17), ainsi que les anticorps polyclonaux antirécepteur obtenus à partir de chèvres. B) Spécificité des anticorPs monoclonaux Les cytosols ont été préparés tel que décrit dans LOGEAT et al (réf. 15) à partir d'utérus de lapin, de rats WISTAR, de fragments d'utérus humain obtenus au cours d'une hystérectomie et d'oviductes de poule. Les cytosols sont incubés pendant 2 heures à OXC avec 10 nM de E3H)oRG. 2058 (E3H]-16-éthyl-21-hydroxy-19-norpregn- 4-ène-3.20-dione) (activité spécifique 47Ci/mmol, AMERSHAM - GRANDE BRETAGNE). La fixation non spécifique est mesurée par des incubations parallèles des mêmes constituants en présence d'une micromole de ORG. 2058 non marqué. La mesure des complexes récepteur-stéroides a été effectuée par la méthode au charbon recouvert de dextran (réf. 18).La concentration moyenne du complexe récepteur-stérolde étant de 30 pmol/ml pour le lapin, 5 pmol/ml pour le rat, 8 pmol/ml pour le poulet et 10 pmol/ml pour l'homme. Après une incubation pendant la nuit à OC avec l'anticorps anti-récepteur (0,4 mg de protéine/ml ), les complexes ont été précipités par des immunoglobulines anti-souris (SIGNA, SAINT-LOUIS - MO) (réf. 16). Les anticorps ont eté considérés comme réagissant avec les récepteurs d'une espèce donnée lorsqu'ils ont induit des immunoprécipitations mesurées par la radioactivité des immunoprécipités trois fois plus intenses que les anticorps ne présentant pas d'affinité pour le récepteur. C) Reconnaissance de différentes formes du récepteur de la vroaesterone de laDin Dar les anticorps monoclonaux. Le récepteur de la progestérone de lapin purifié par chromatographie d'immunoaffinite (réf. 15) a été soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodecyl sulfate de sodium (réf. 19). Le récepteur de 110 kDA, les fragments de 79 kDA et 65 kDA ont été électroélués après une coloration avec le Bleu de Coomassie (réf. 20). La concentration du récepteur a été déterminée par la méthode dot-blot en utilisant l'anticorps Mi 60-10 et le récepteur purifié (réf. 21) en tant que témoins. La réactivité des anticorps monoclonaux avec les trois formes de récepteur a été étudiée par la méthode ELISA (réf. 16). D) Méthodes immunocytochimipues Les anticorps ont été testes, comme décrit dans la publication de PERROT-APPLANAT et al (réf. 22) sur des coupes dans la paraffine d'utérus de lapin injecté aux oestrogènes et sur des coupes congelées d'échantillons de carcinome primaire du sein (réf. 23). Les méthodes d'immuno-blot utilisant soit des cytosols utérins à l'état brut, soit un récepteur purifié, ont été réalisées selon la méthode décrite dans la publication de lOGEAT (réf.15). E) Construction d'un vecteur d'exPression. transcription et traduction L'ADN complémentaire du récepteur de la progestérone de lapin contenant la totalité de la séquence codante (3036 nucléotides, numérotés de -142 à +2894, le nucléotide n1 étant constitué par le début du cadre de lecture ouverte) est dérivé des clones ArPR5 et ArPR6 (réf. 24). La fusion intervient au niveau du site BamH1 (nucléotide +73). L'ADN complémentaire (ADNc) a été inséré dans le site EcoR1 du vecteur pGEM-4 (OMEGA BIOTEC, MADISON, WI). L'ADN plasmidique a été linéarisé et la transcription réalisée en utilisant la polymérase Sp6 selon les indications du fabricant.En moyenne la synthèse d'ARN a été de 1 g/ g d'ADN. Les produits de la transcription ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose et par fluorographie. L'ARN messager (ARNm) a été traduit dans un lysat de réticulocyte de lapin (PROMEGA BIOTEC) (25 pg d'ARN/ml de lysat) en utilisant les acides aminés radioactifs L-E35 S) méthionine (AMERSHAM) à une activité spéficique de 1445 Ci/mmol ; 1,5 pCi/pl d'incubation) ou la L-E4,5-3H]leu- cine à une activité spécifique de 167 Ci/mmol ; 0,5 Ci/ l d'incubation. Ce dernier acide aminé a été utilisé pour les polypeptides de faible poids moléculaire ne contenant qu'une faible proportion de méthionine. La biosynthèse du récepteur de la progestérone est estimée par précipitation à l'acide trichloacétique. Dans la plupart des cas, la concentration du récepteur était supérieure ou égale à une pmol/ml de milieu d'incubation. F) Localisation d'énitones en utilisant les enzymes de restriction aénérant un récepteur tronqué L'ADN du vecteur d'expression de la progestérone a été digéré avec XbaI (site de restriction dans le polylinker), MluI (site de restriction + 1112), BalI (site de restriction + 886), NaeI (site de restriction + 620), Bgl; (site de restriction + 431) ou Xhoî (site de restriction + 303), puis a ensuite été transcrit dans le milieu acellulaire. L'ARN messager résultant a été traduit en présence de méthionine [35S] ou de leucine [ H] dans le cas d'une digestion avec BglI ou XhoI. Pour l'immunoprécipitation 30 ijl du mélange de lysat de réticulocyte ont été incubés pendant la nuit à OC avec 20 g d'anticorps monoclonal dans un tampon Tris 10 mM, pH 7,6 EDTA 1,5 mM NaCl 150 mM. Le milieu d'incubation a été ajusté à Tris 50 mM, pH 7,6 ; NaCl 150 mM ; NP-40 (détergent connu par la marque NONIDET P-40) 0,5 % ; PMSF (fluorure de phénylméthanesulfonyle) 0,1 mM ; méthionine 10 mM (ou leucine 10 mM) (tampon de T-méthionine ou T-leucine), (volume final de 50 l). Des IgG non-spécifique de souris (5 pg,SIGMA) et des immunoglobulines anti-souris de lapin (SIGMA)(1 mg/incubation) ont été ajoutées. Après une incubation de quatre heures à OC, le précipité a été récupéré par centrifugation (12 000 g, 20 minutes) à travers une solution de 500 Lil de sucrose à 0,85 M (dans un tampon T-méthionine ou T-leucine, contenant 0,1 % de sérumalbumine bovine). Le précipité a été lavé six fois avec un tampon T-méthionine ou T-leucine (contenant de la sérum-albumine bovine à 0,1 %) et dissous dans 50 l de solution tampon de LAEMMLI (réf. 19). Des anticorps polyclonaux anti-récepteur obtenus à partir de chèvre (P2) ont été utilisés comme témoin positif et un sérum préimmun de chèvre (Po) ou un anticorps monoclonal IDA10 ne présentent pas d'affinité pour le récepteur, comme témoins négatifs. L'électrophorèse a été realisée comme décrit par LAEMMLI (réf. 19), en gels de polyacrylamide à 11 % ou 15 %. Les gels ont été fixés pendant 45 minutes dans de l'acide acétique à 10 %, du méthanol à 30 a, du glycérol à 5 %, puis trempés pendant 45 minutes dans un milieu connu sous la désignation EN3 HANCE (NEW ENGLAND NUCLEAR, BOSTON, MA) et rincés pendant trente minutes avec de l'eau distillée contenant du glycérol à 5 . UN film HS-90 (ORWO, RDA) a été exposé aux gels préalablement séchés à 60'C pendant une durée variant de 10 heures à 7 jours. G) Localisation d'épitopes en mettant en oeuvre les arrêts spontanés aDParaissant de traduction des lors d'un ARN messaaers L'ADN du vecteur d'expression du récepteur de la progestérone a été digéré avec XbaI, transcrit et traduit en présence de leucine E3H]. Un aliquot (30 pl) du mélange de lysat. de réticulocyte a été incubé avec 50 g d' anticorps monoclonal. L ' immuno-précipitation, 1 'élec- trophorèse et l'autoradiographie ont été effectuées dans les mêmes conditions que ci-dessus. H) Localisation d'épitopes en utilisant l'enzYme Ba131. L'ADN du vecteur d'expression du PR a été incubé avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I, puis avec la protéinase K (réf. 25). L'ADN plasmidique a été digéré par l'endonucléase ApaI (site de restriction + 700) et incubé avec l'enzyme Bal31 (BOERINGHER MANNHEIM- RFA) L'activité de l'enzyme correspond à l'élimination de 100 paires de bases par minute. Un aliquot (1 g d'ADN) a été prélevé toutes les quinze secondes de O à 2,15 minutes. Après addition d'EDTA (concentration finale 20 mM > les aliquots ont été rassemblés. La transcription, la traduction et l'immunoprécipitation ont été réalisées de la même façon que décrite ci-dessus. I) Vérification de la localisation d'un épitope bar l'étude de la fixation additionnelle des anticorps au récepteur Le récepteur de la progestérone sous la forme 110 kDA marqué à l'iode 125 (activité spécifique 30 pCi/pg 5 fmole/incubation) a été incubé pendant la nuit à OvC avec des concentrations variées de l'anticorps monoclonal (de Q,1 à 15 ijg de protéine/ml) dans 0,2 ml d'un tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) contenant de la sérum-albumine bovine à 0,5 . Des billes de polystyrène (PRECISION PLASTIC BALL CO, CHICAGO, IL) sur lesquelles était fixé l'anticorps monoclonal antirécepteur (3 tjg de protéine par bille) (réf. 27) ont été ajoutées. l'incubation a été réalisée à O'C pendant 48 heures. Les billes ont été isolées et lavées une première fois avec 1 ml du tampon PBS contenant de la sérum-albumine bovine à 0,1 %, et une seconde fois avec 1 ml de la même solution tampon contenant en outre de un agent mouillant connu sous la marque TWEEN-20 à 0,1 \ (SIGMA). La radioactivité associée aux billes a été mesurée. La fixation non spécifique a été déterminée en utilisant des billes sur lesquelles était adsorbé un anticorps ne présentant pas d'affinité pour le récepteur. RESULTATS 1) PréDaration et caractérisation d'une série d'anticorps monoclonaux dirigées contre le récepteur de la Droaestérone de laDin Au cours de trois fusions successives, 59 anticorps monoclonaux ont été obtenus. Le tableau 1 ci-après indique les classes, les réactions entières avec des récepteurs . obtenus à partir de différentes espèces (humaine, de rat, de poulet) et les propriétés immunocytologiques de 16 anticorps monoclonaux sélectionnés. TABLEAU 1 CARACTERISTIQUES DE QUELQUES ANTICORPS MONOCLONAUX DIRIGES CONTRE LE RECEPTEUR DE LA PROGESTERONE DE LAPIN reconnaissance des ditté- réactivité en foncjtion des Détecteur par la méthode dite rentes formes RP de lapin espèces. (methode par l'im- de "Westem blot" sur cytosol Immunocoloration de Anticorps Classe (méthode ELISA) munopreécipitation). utérin * coupes d'un tis coupes d'utérus su cancéreux de 100KDA 79KDA 65KDA humain rat poulet lapin humain de lapin. sein humain Mi60-10 IgG2a + + + + + - +(3) - + Mo482 IgG1 + + + + - - +(3) - + Let27 IgG1 + + - - Let64 IgG1 + - - + - - +(1) +(1) + + Let81 IgG1 + + - + + + +(2) - + + Let126 IgG1 + - - + - - +(1) +(1) + + Let223 IgG1 + + - + + + +(2) + Let382 IgG1 + - - + - - +(1) - Let411 IgG1 + + - + + +(2) Let417 IgG1 + - - + - Let456 IgG1 + + - + - - + + Let500 IgG1 + - - - - +(2) Let548 IgG1 + + - + + +(2) - + + Let595 IgG1 + - - - - - +(1) - + Let661 IgM + + - + + +(2) +(2) Let868 IgG1 + + - + + +(2) P2 Polcylonal + + + + +(3) +(2) + + Le tableau montre une sélection de 16 anticorps parmi les 59 anticorps monocionaux obtenus. Pour comparaison, les caractéristiques d'un sérum polyclonal de chèvre sont également montrées. * : le chiffre entre parenthèse indique. le nombre de bandes de récepteur. déterté par immunoblot du cytosol :(1) : 1 bande (110KDA) ; (2) : 2 bandes (110 et 79 KDa) ; (3) : 3 bandes (110,79 et 65 KDA) RP: Récepteur de la progest érone. Les expériences d'immuno-blot ou les tests selon la méthode ELISA avec des formes purifiées du récepteur de la progestérone (forme B de 1 kDA, forme A de 79 kDA et forme de 65 kDA) ont permis la classification des anticorps en trois catégories, ceux reconnaissant les trois formes, ceux reconnaissant les formes A et B, et ceux reconnaissant seulement la forme B. Aucun anticorps ne reconnaissant seulement la forme A ou seulement le fragment de 65 kDA n'a été mis en évidence. Tous les anticorps n'ont pas été détectés le récepteur par la méthode de WESTERN dans un cytosol utérin brut ou par immunocytochimie. Ceci est dû au fait que l'affinité des anticorps doit être très élevée pour reconnaitre cet antigène très rare lorsqu'il est présent in situ. Cette observation est particulièrement importante lorsque des anticorps anti-récepteur de progestérone anti-lapin sont utilisés pour l'étude ,du récepteur chez d'autres espèces. Seuls quelques anticorps ont été capables de détecter le récepteur humain in situ par immuno-blot ou immunocytochimie. La figure 1 montre les différentes réactivités de certains des anticorps monoclonaux avec le récepteur de la progestérone. 2) Localisation d'épitoges en utilisant des ro- téines tronauées à leurs extrémités C-terminales obtenues Par transcriPtion et traduction d'un ADNc cloné L'ADNc codant pour le PR complet a été introduit dans le vecteur d'expression pGEM-4. La transcription avec la polymérase Sp6 et la traduction par un lysat de réticulocyte en présence soit de méthionine E35 S] soit de leucine E3Hl a permis la préparation d'un récepteur de progestérone radio-actif.Les protéines tronquées ont été obtenues par trois méthodes différentes : - soit par une digestion de l'ADNc avec une endonucléase de restriction, - soit en mettant en oeuvre des interruptions spontanées multiples de la traduction, - soit par une digestion progressive de l'ADN complémentaire avec l'enzyme Bal31. Dans tous les cas1 l'échantillonage ou le mélange obtenu de protéines tronquées à leurs extrémités C-terminales ont été précipitées par l'anticorps étudié. Les immuno-précipitations ont été observées par électrophorèse et fluorographie pour les polypeptides de plus grand poids moléculaire. L'immunoprécipitation n'a plus été possible lorsque la délétion a atteint l'épitope reconnu par l'anticorps. Ainsi la détermination du plus petit polypeptide pouvant être immunoprécipité a permis la localisation de la région de la protéine reconnue par l'anticorps. Utilisation 'd'endonucléases Dour aénérer des protéines tronquées. L'ADN complémentaire a été digéré soit par XhoI (acide aminé 101), BglI (acide aminé 142), NaeI (acide aminé 106), Bail (acide aminé 295), MluI (acide aminé 370), Xba1 (dans le polylinker, après le dernier acide aminé. Les expériences d'immunoprécipitation réalisées ont montré que les anticorps Let 126 et Let 417 ont précipité mêmes les plus petits polypeptides, montrant que leurs épitopes respectifs étaient situés en amont de l'acide aminé 101. L'anticorps Let 595 (figure 2b) a immunoprécipité le polypeptide 1-142 mais pas le polypeptide 1-loi, l'épitope correspondant a pu être ainsi localisé entre les acides aminés 101 et 142. L'épitope reconnu par l'anticorps Let 548 (figure 2a) a été localisé par la même méthode entre les acides aminés 295 et 370, tandis que les épitopes Mi60 et Mo482 ont été localisés en aval (par rapport à l'extrémité C-terminale) de l'acide aminé 370 (non montré). Protéines tronquées aénérÉes par les arrêts spontanés de traduction. L'analyse par électrophorèse des protéines obtenues par la méthode de transcription-traduction décrite ci-dessus a montré une bande principale correspondant à la protéine entière et également une zone de bandes mineures correspondant à des polypeptides plus petits. Ces derniers ont été produits du fait d'interruptions spontanées de traduction, étant donné, qu'elles~sont toutes (ou presque toutes) immunoprécipitées par des anticorps reconnaissant la région N-terminale de la protéine (figure 3, colonnes 2 et 3). Il a ainsi été possible de tirer avantage de cette situation pour localiser l'épitope reconnu par l'anticorps monoclonal, en établissant la longueur minimale de la protéine que cet anticorps pouvait encore immunoprécipiter (figure 3, colonne 4). Cette méthode constitue simplement une variante de la méthode décrite ci-dessus, la localisation ayant été réalisée en utilisant une simple immunoprécipitation du produit résultant de la transcription-traduction. Cette technique a permis une localisation plus précise de l'épitope, puisqu'il a été possible d'étudier la région du polypeptide se situant entre deux sites de restriction. Les marqueurs protéiques utilisés pendant l'électrophorèse ont été produits par clivages de l'ADNc lui-même en des sites de restriction choisis, puis transcrits et traduits. Puisque la séquence de la protéine totale était connue, les poids moléculaires de ces marqueurs protéiques ainsi produits (produites d'expression des fragments d'ADNc de longueurs connues) a été estimé avec précision. De tels marqueurs "homologues" ont conduit à des estimations ie poids moléculaire plus précises que celles qui peuvent obtenues en ayant recours à des comparaisons avec des protéines hétérologues -de poids moléculaires connus. Cette méthode a été utilisée par exemple pour déterminer de façon plus précise l'épitope reconnu par l'anticorps Let 548 (figure 3). Les expériences initales en utilisant des enzymes de restriction ont montré que l'épitope reconnu par cet anticorps était situé entre les acides aminés 295 et 370. L'étude de l'immunoprécipitation des protéines tronquées produites par les interruptions spontanées de protéines apparaissant pendant la traduction a permis une meilleure définition de la région reconnue par l'anticorps Par exemple, l'anticorps Let 548 a été montré comme réagissant avec un épitope localisé entre les acides aminés 295 et 325 (figure 3). Cette méthode a été utilisée pour- localiser les épitopes reconnus par les anticorps Let 81, Let 223, et Let 868 (non montré). Protéines tronauées produites par l'utilisation de Bal31. Les interruptions spontanées de traduction sont produites à des positions déterminées. Cependant, certains anticorps monoclonaux ont réagi avec des épitopes situés dans des régions où de telles interruptions s'étaient pas produites. Pour résoudre ce probleme, l'ADNc a été ouvert en 3' de l'épitope présomptif puis digéré avec Bal31 pendant des temps variables. Ces ADN complémentaires digérés ont été mélangés et transcrits et traduits comme décrit ci-dessus. Ce traitement a produit une gamme de protéines de poids moléculaires progressivement décroissants. Il a alors été possible de déterminer la région dans laquelle l'immunoprécipitation de la protéine a été produite, du fait des éliminations de parties C-terminales de longueurs croissantes de la protéines. La figure 4 illustre une telle expérience. Aucune interruption spontanée pendant la traduction n'a été observée dans la région située entre les acides aminés 101 (site de restriction XhoI) et 160 du récepteur de la progestérone de lapin. Des protéines tronquées à leurs extrémités C-terminales dans cette région ont été obtenues après restriction de l'ADNc avec ApaI, et sa digestion avec Bal31. Le résultat de l'immunoprécipitation avec l'anticorps Let 595 a permis la localisation précise de l'épitope pour cet anticorps entre les acides aminés 101 et 110. Cette méthode a permis également de localiser l'épitope des anticorps Let 417 et Let 126 entre les acides aminés 1 et 60. 3) Domaines immunoaéniaues du récePteur de la roaestérone de latin Le procédé décrit ci-dessus a permis de définir quatre régions du PR reconnus par les anticorps monoclonaux figure 5b). Il est connu que les anticorps sont habituellement dirigés contre des régions hydrophiles des protéines (réf. 28). Il a été observé que dans chacun de ces quatre domaines immunogéniques, il existe une région hydrophile principale (figure 5C). Le domaine immunogénique situé entre les acides aminés 1 et 60 contient une région hydrophile principale (acides aminés 3 à 10) et 3 régions mineures (acides 20 à 24, 30 à 33 et 40 à 45 respectivement). Un second domaine immunogénique est situé entre les acides aminés 101 et 110 et est hydrophile dans sa totalité. Le troisième domaine (acides, aminés 295 à 325) est hydrophile entre les acides aminés 317 et 325. Le dernier domaine est limité par les acides aminés 370 et 396 et contient une région hydrophile entre les acides aminés 384 et 396. Quand la séquence du récepteur a été étudiée pour sa flexibilité par la méthode de KARPLUS-et SCHULZ (réf. 29) ou pour son caractère hydrophile en utilisant la procédure de PARKER-et al (réf. 30), les prédictions des régions immunogéniques de la protéine ont été essentiellement les memes que celles obtenues en utilisant la méthode décrite dans la réf. 28 ci-dessus. Lorsqu'on considère la réactivité avec le récepteur humain, les réactions les plus fortes ont été observées avec des anticorps reconnaissant le premier domaine (acides aminés 1 à 60), des réactions plus faibles étant observées avec le troisième domaine (acides aminés 295 à 325). 4) Vérification de la localisation des épitoges nar l'étude de l'additivité de la fixation de l'anticorPs au récepteur Le récepteur (forme 110 kDA intacte) a été marqué avec l'iode 125, un anticorps monoclonal correspondant à chaque domaine immunogénique a été immobilisé sur des billes de polystyrène et la fixation du récepteur marqué avec E 1251) a été étudiée en l'absence ou en la présence d'anticorps de compétition (figure 6). Ces expériences ont confirmé la carte des épitopes reconnus par des anticorps monoclonaux établie précédemment. Dans chaque cas, ,les anticorps réagissant avec deux domaines immunogéniques différents se sont liés au récepteur de façon additionnelle, comme cela a été montré par l'absence de compétition entre eux. Au contraire, les anticorps reconnaissant le même domaine immunogénique sont entrés fortement en compétition les uns avec les autres. Ce résultat suggère qu'à l'intérieur d'un domaine immunogénique donné, ce n'est qu'une région très limitée qui portent les sites reconnus par les acides aminés reconnues par les anticorps réagissant avec ce domaine font compétition entre eux. 5) Les fraaments de 79 kDA (sous-unité A) et de 65 kDA du récepteur de la Droaestérone anDaraissent par délétion de l'extrémité N-terminale du récepteur Les anticorps qui -ont réagi avec le récepteur intact (forme B, p.m 110 kDA) appartiennent aux deux groupes reconnaissant les épitopes situés à l'extrémité N-terminale de la protéine (en amont de l'acide aminé 110). Les anticorps qui reconnaissent les formes du récepteur de 110 kDA et 79 kDA, mais pas la forme de 65 kDA appartiennent au groupe reconnaissant l'épitope situé entre les acides aminés 295 et 325. Ces résultats montrent que l'extrémité N-terminale de 79 kDA est localisée entre les acides aminés 110 et 295 et que l'extrémité N-terminale de la forme 65 kDA est située entre les acides aminés 325 et 370. Ces formes correspondent à un récepteur délété dans celles des protéines. REFERENCES 1. JEMMERSON , R., et al, Science 232, 1001-1004 (1986). 2. MORGAN, D.O., et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 328-332 (1986) 3. YQUNG, R.A., et al Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 2583-2587 (1985a) 4. NEUBERGER, M.S., et al, Nature, 312, 604-608 (1984) 5. TZARTOS, S.J., et al, J. Biol. Chem., 256, 8635-8645 (1981) 6. KRISTIE, T.M., et al Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 4700-4704 (1986) 7. SOOS, M.A., et al, Biochem. J., 235, 199-208 (1986) 8. COLMAN, P.M., et al Nature, 326, 358-363 (1987) 9. GUERIN-MARCHAND, C., et al Nature, 329, 164-167 (t987) 10. YOUNG, R.A., et al Nature, 316, 450-452 (1985b) 11. TAKAGAKI, Y., et al Biochemistry, 19, 2498-2505 (1980) 12. BURNENS, A., et al Science, 235, 780-783 (1987) 13.LAMB, J.R., et al EMBO J., 6, 1245-1249 (1987) -14. STANLEY, K.K., et al EMBO J., 6, 1951-1957 (1987) 15. LOGEAT, F., et al Biochemistry, 24, 1029-1035 (1985) 16. LOGEAT, F., et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 6456-6459 (1983) 17. LEGRAIN, P., et al Methods Enzymol. 92, 175-182 (1983) 18. VU HAI, M.T., et al J. Endocrinol, 76, 21-31 (1978) 19. LAEMMLI, U.K., et al Nature, 227, 680-685 (1970) 20. HUNKAPILLER, M.W., et al Methods Enzymol, 91, 227-236 (1983) 21. BAILLY, A., et al Embo. J. 5, 3235-3241 (1986) 22. PERROT-APPLANAT, M., et al Endocrinology, 116, 1473-1483 (1985) 23. PERROT-APPLANAT, M., et al Cancer Res., 47, 2652-2661 (1987) 24. LOOSFELT, H., et al Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 9045-9049 (1986) 25. MANIATIS, T., et al Clonage moléculaire : un guide de laboratoire (Molecular cloning A Laboratory Manual) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) (1982) 26. LEGERSKI, R.J., et al Nucleic Acids Res., 5, 1445-1464 (1978) 27. SOOS, M., et al J. Immunol. Methods, 73, 237-249 (1984) 28. HOPP, T.P., et al Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 78, 3824-3828 (ainsi) 29. KARPLUS, P.A., et al Naturwissenschaften, 72, 212-213 (1985) 30. PARKER, J.M.R., et al Biochemistry, 25, 5425-5432 (1986) 31. BENJAMIN D. C., et al Annu. Rev. Immunol., 2, 67-101 (1984) REVENDICATIONS 1. Procédé pour la localisation du site d'interaction mutuelle entre une protéine déterminée et reconnue par au moins un anticorps monoclonal reconnaissant la protéine entière, caractérisé en ce que: - partant d' un acide nucléique contenant un ADNc codant pour la protéine déterminée placé sous le contrôle d'un promoteur susceptible d'autoriser la transcription de l'ADNc et les éléments nécessaires à la traduction in vitro de 1'ARN correspondant ou partant d'un mélange de fragments de cet acide nucléique contenant des séquences de tailles différentes de cet ADNc, parmi lesquelles celles placées sous le contrôle de ce même promoteur, - il comprend successivement la transcription de cet ADNc ou de séquences de cet ADNc sous le contrôle dudit promoteur, puis la traduction in vitro des ARNs ainsi produits en les polypeptides correspondants dans un milieu acellulaire contenant les différents ingrédients nécessaires aux susdites transcription et traduction, la mise en contact des polypeptides résultant de cette traduction avec l'anticorps monoclonal déterminé, dans des conditions permettant une réaction immunologique entre l'anticorps monoclonal et les polypeptides que peut reconnaitre l'anticorps monoclonal . la séparation des polypeptides produits in vitro les uns des autres, selon leurs tailles, avant ou après la réaction avec l'anticorps monoclonal . la détection du plus petit de ceux des polypeptides qui sont reconnus et du plus grand de ceux qui ne sont plus reconnus par l'anticorps monoclonal, et l'identification d'un élément essentiel de l'épitope spécifique de l'anticorps monoclonal dans le plus petit de ceux des épitopes qui sont reconnus, cet élément essentiel consistant en la séquence C-terminale de un ou plusieurs aminoacide(s) encore contenu(s) dans le plus petit des polypeptides reconnu mais perdue par le plus grand des polypeptides qui n'a plus été reconnu par l'anticorps monoclonal. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, partant d'un ADNc entier placé sous le contrôle du susdit promoteur r on procède à la fragmentation de cet ADNc en mettant en oeuvre des endonucléases non spécifiques ou des enzymes exonucléolytiques. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, partant d'un ADNc entier placé sous le contrôle du susdit promoteur, on procède à la fragmentation de cet ADNc en mettant en oeuvre un "cocktail" d'enzymes de restriction reconnaissant des sites respectivement distincts au sein dudit ADNc. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séparation des po lypeptides produits in vitro les uns des autres au terme de l'opération de traduction in vitro est effectuée en leur faisant subir des migrations différentielle, fonctions de leur masses moléculaires respectives sur un support approprié. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que lesdites séparations sont effectuées par électrophorèse sur gel. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'opération de séparation des protéines tronquées est effectuée sur les complexes immunologiques préalablement formés entre les protéines tronquées et l'anticorps monoclonal mis en oeuvre ou antérieurement à la réaction immunologique. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'opération de séparation est effectuée postérieurement à la mise en contact des protéines tronquées avec l'anticorps étudié. 8. Support, notamment gel, comportant des protéines tronquées marquées, de référence selon l'ordre de leurs tailles, et toute dérivées d'une protéine déterminée initiale, ces protéines tronquées étant séparées les unes des autres et fixées sur un support dans des conditions permettant néanmoins leur mise en contact avec un ou plusieurs anticorps monoclonaux éventuellement aptes à reconnaitre la protéine entière ou une protéine homologue dans des conditions autorisant l'éventuelle réaction immunologique entre cet anticorps ou ces anticorps et une ou plusieurs desdites protéines tronquées.