FR 2631971 A1 19891201 FR 8806914 A 19880525 L'invention se rapporte au greffage de thioacides sur des protides, c'est-à-dire à la fixation d'un ou de plusieurs thiocarbonyles à une chaîne protidique. Elle comprend un procédé perfectionné pour la réalisation de cette fixation, ainsi que son application à l'amélioration de diverses enzymes. La fixation de différents groupes organiques sur des peptides ou protéines présente un intérêt industriel en raison des avantages qu'elle peut procurer ; ainsi, par un choix approprié de ces groupes on arrive à rendre les protides solubles dans des solvants organiques, permettant d'effectuer des opérations qui ne se font pas en milieu aqueux. Dans le cas particulièrement important des enzymes, il est possible - par ce moyen d'élargir le domaine d'action enzymatique, d'améliorer la stabilité de l'enzyme ou d'augmenter son activité. De tels résultats ont pu être obtenus, selon la demande de brevet français n087 09198, par l'action d'esters dithioiques sur des protides ; le reste d'acide des esters employé comporte le groupe organique à fixer sur le protide, tandis que son reste thiol est un groupe partant. Ce principe est réalisé à l'aide d'un réactif pouvant être représenté d'une façon générale par un composé où R est le groupe organique à fixer sur le protide, par l'intermédiaire de alors que -S-X est éliminé par la réaction avec un -NH- ou -NH2 du protide. En désignant par NH2-E la' molécule de ce dernier, la réaction de greffage de R sur celle-ci peut être schématisée comme suit Bien entendu,plusieurs groupes RC=S peuvent être fixés à E, suivant le nombre de NH2 disponibles et selon les con ditions opératoires. La demande de brevet précitée indique différentes formes possibles de R et de X ; elle préconise, en tant que pH, préférés pour la réalisation du greffage, les valeurs comprises entre le point isoélectrique du protide et 11,5. La présente invention apporte un perfectionnement à cette technique par la constatation inattendue que, lorsque R est un groupe hydrocarboné, éventuellement sub stitué, X étant H ou un cation de base faible, on peut obtenir des résultats optimaux de greffage, en opérant à des pH compris entre 3 et 7, même si le point isoélectrique du protide traité est supérieur à 7. Ce fait, qui paraît surprenant par rapport à l'expérience antérieure, susnentionnée, peut s'expliquer par l'influence particulière qu'exercent certains composés RCSSX, qui - contrairement à d'autres - exigent des pH ne dépassant pas 7, pour donner les meilleurs résultats. Il s'en suit une conséquence fort favorable pour le greffage des protides qui supportent mal le milieu basique. Ainsi la présente invention contribue-t-elle à l'élargissement du domaine des applications optimales de la technique en question. Le procédé de l'invention, qui consiste à modifier chimiquement un protide, en le faisant réagir avec un composé organique dithiolque, est caractérisé en ce que ce composé est un dithioacide ou un sel de base faible d'un tel acide, et que la réaction a lieu dans un milieu de pH compris entre 3 et 7. De préférence, le pH est de 3,5 à 6,5 ou mieux encore de 4 à 6. Ces pH sont applicables quel que soit le point isoélectrique du protide traité. La base faible, dont le sel de dithioacide R-CSS-X est utilisable suivant l'invention, peut être telle qu'ammoniaque, hydrazine, hydroxylamine, pipéridine, amine, di- ou tri-amine,primaire, secondaire ou tertiaire, pyridine, tétra-alkyl ammonium, di- ou tri-alkyl respectivement di- ou mono aryl ammonium, hydroxyde de Zn, Al, Mn, Pb, etc., et-d'une façon générale - une base dont la constante de dissociation ionique dans l'eau, à la température ordinaire, est de préférence de l'ordre de 10 à 10 et surtout de 10 à 10 4.Ainsi peut-on utilisera titre d'exemples non limitatifs des sels dont le X est le cation de l'ammonium, de tétra méthyl-ammonium, phényl-triéthyl ammonium, triméthyl-hexadécyl ammonium, mono-éthanolamine,di-éthanol amine, dipropylamine, di-isopropylamine, pipérazine, tri-isobutyl amine, triéthylamine, benzylamine, phényl-éthyl amines, etc. Le groupe organique R est un radical hydrocarboné, aliphatique ou/et arylique. Cela peut être notamment un alkyle en C1 à C20, cycloalkyle en C4 à C8 et principalement en C5 ou C6, ou un alcényle en C2 à C20. Lorsque R est ou contient un groupe aryle, il est en général tel que phényle ou homologue, phénylène, naphtyle ou naphtylényle, pouvant porter des substituants aliphatiques, c'est-à-dire qu'il peut être constitué par un arylalkyle ou alkyl-aryle. Conviennent particulièrement bien à la réalisation de l'invention les acides R-CSSH et leurs sels d'amine ou d'ammonium quaternaire, dontle groupe R est un alkyle en C4 à C18, comvne par exemple n-C4Hg- ou n-C11H23-, ou un phényle ou tolyle C6H5, CH3-C6H4 etc. Dans les composés dithiolques R-C-S-S-X, utilisés selon l'invention, le groupe hydrocarboné R peut porter un ou plusieurs substituants fonctionnels, par exemple carboxyles, hydroxyles, halogènes,sulfinyles, sulfonyles, phosphoryles, phosphonyles, sulfhydryles, amido ammonium, phosphonium ou autres. Le greffage suivant l'invention est effectué par la mise en contact du protide choisi avec un composé dithiolque au sein d'une solution tampon de pH approprié, c'est-à-dire entre 3 et 7. Il est bon d'employer un large excès de ce composé par rapport au protide, de préférence 10 à 100 équivalents de R-C-S-S-X par groupe NH2 disponible dans le protide. Cet excès est éliminé de la solution finale, notamment par dialyse. Il convient de prolonger ce contact durant quelques heures, le plus souvent et selon la température et la nature des réactifs en présence, pendant 1 à 20 heures, bien que cette indication ne soit nullement limitative. Bien entendu, compte doit être tenu de la stabilité du protide dansles conditions opératoires, pour ne pas prolonger la réaction au delà du temps de stabilité du produit. Xe procédé peut être conduit à des températures d'environ 0 à 600C, de préférence entre 100 et 400, les températures voisines de l'ambiante étant les plus favorables. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs qui suivent. EXEMPLE 1 Modification d'une hémoprotéine par de l'acide dithio pentanoigue La protéine traitée est la peroxydase de raifort de point isoélectrique 7,2. Dans 5 ml de tampon phosphate 0,2 M pH 6,0, on dissout 25 mg de peroxydase de raifort (Sigma Type II) et 2 mg de dithioacide pur CH3(CH2)3CSSH, ce qui correspond à des concentrations de 0,05 mM d'enzyme pour 3 mM de dithioacide. On laisse agiter 16 heures à température ambiante. La solution est ensuite dialysée pendant 16 heures contre du tampon citrate 5 mM pH 6,5. Le dialysat est ensuite récupéré et analysé Le rendement chimique global est calculé par la comparaison du nombre de moles d'hémoprotéine (déterminé par l'ab sorbance à 402 nm où t =102 mM t.cm ) utilisé au dé- part, avec celui de moles récupérées après modification. Le rendement est de 100%.Concernant l'activité, on détermine pour chaque solution de peroxydase le rapport de l'activité de la solution (en U/ml) par la concentration en hémoprotéine (en nmole/ml) ce qui conduit à l'activité spécifique,en U par nmole thème. L'activité enzymatique de la solution est mesurée à 300C dans une cuve en plastique remplie par 1,5 ml de tampon citrate 0,1 M pH 3,5, 20 l d'eau oxygénée 0,2 M, 20 l d'o-dianisidine 13 mM et 20 l de solution enzymatique préalablement diluée 20 fois. Le produit d'oxydat.ion de l'o-dianisidine est suivi à 444 nm avec E=30 mM cm Dans le présent exemple, on passe d'une activité spécifique de 125 U/nmole d'hème pour l'enzyme native à 67 U/ nmole thème pour l'enzyme modifiée soit 54% de rendement: puisque le rendement chimique est 100%, le rendement global en activité est aussi de 548.Mais en revanche, l'enzyme modifiée présente l'avantage de présenter une activité ligninase de 1,4 U/plmol d'heme, alors que enzyme native ne la possède pas. Le nombre de groupes lysine est déterminé par la méthode au TNBS (acide trinitrobenzène-sulfonique ) : on trouve que 3 lysines sur 6 ont été modifiées par l'acide dithio pentanolque. EXEMPLE 2 Modification de la peroxydase de raifort par un sel de 1' acide dithiobenzolque Dans 100 ml de tampon citrate 0,1M pH 5,0 on dissout 2,6 mg de peroxydase de raifort (Sigma Type II) et 1,2 mg de dithiobenzoate de tétraméthylammonium Les concentrations initiales sont ainsi de 0,26 ssM en enzyme et 5,3 M en sel du dithioacide. Après 2 heures d'agitation à température ambiante, la solution est dialysée pendant 16 heures, contre du tampon citrate 5 mM pH 6,0. Les analyses effectuées comme à l'exemple 1 donnent - rendement chimique 72t - rendement global en activité 110% - nombre de groupes lysine greffée : 6 On voit que le traitement suivant l'invention a accru l'activité de l'enzyme et que des thiocarbonyles se sont fixés sur tous les groupes lysine présents. EXEMPLE 3 Modification de la lignine peroxydase de Phanerochaete Chrysosporium, par de l'acide dithiopentanolque, CH,CH2'3CSSH La protéine utilisée présente un point isoélectrique de 3,9. A 80 ml de tampon phosphate 0,2 M pH 6,0 sont ajoutés 20 ml de préparation brute de lignine peroxydase issue d'une culture de Phanerochaete Chrysosporium (décrite dans : TIEN, M. et KIRK, T.K., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. US. 81, 2280-2284) et 1,5 ssl de dithioacide pur. Les concentrations en hémoprotéine et dithioacide sont ainsi de 0,52 ssM et 130 ssM respectivement. Le mélange est laissé en agitation pendant 7 heures à la température ordinaire, puis dialysé pendant 40heures contre du tampon bis-tris 1 mM pH 6,0. Les analyses sont effectuées comme dans les exemples précédents - rendement chimique, déterminé par les absorbances à 404 nm ( = 102 mM 1.cl 1), après modification, 73% par rapport à l'enzyme de départ. - rendement global en activité : 65% ; l'activité fut déterminée à 300C dans une cuvette en plastique contenant 2 ml de tampon lactate 0,1 M pH 3,0, 0,1 ml d'eau oxygénée 10 mM, 0,1 ml d'alcool vératrilique 12 mM et 0,1 ml de préparation enzymatique, l'apparition d'aldéhyde vératrilique étant suivie à 310 nm prenant ç =9,1 mM . cm La légère baisse de l'activité de l'enzyme est compensée par le fait que la protéine modifiée peut être lyophilisée, avec un rendement en activité de 23%, alors que l'enzyme native perd toute son activité par lyophilisation. Le lyophilisat de l'enzyme modifiée est soluble dans du chloroforme et dans du DMSO. EXEMPLE 4 Etude de l'effet du pH sur la modification de la lignine peroxydase On opere avec la même enzyme qu'd l'exemple 3 et avec le même acide dithiopentanoîque. A 80 ml de tampon citrate-phosphate 0,1 M de pH 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 ou 6,8 on ajoute 20 ml de préparation brute de lignine peroxydase et 2 Fl d'acide dithiopentanolque. Après 3 h1/2 d'agitation à température ambiante le mélange est dialysé contre du tampon citrate-phosphate 5 mM pH 6,0 pendant 18 h. Les résultats en fonction du pH sont donnés dans le tableau suivant pH Rendement chimique Rendement global en activité (%) (8) (%) 3,0 25 1 4,0 43 60 5,0 70 115 6,0 56 85 6,8 51 45 8,5 90 G Pour tous les essais on observe l'absence totale de grou pes lysine libres,après modification par le dithioacide. Il apparat donc que pH 5,0 est optimal pour cette modification de la lignine peroxydase. A ce pH l'activité de l'enzyme est augmentée par le greffage de groupes CH3(CH2)CS-. Il est frappant de voir que, si l'on travaille avec un pH de 8,5, comme dans la demande de brevet antérieure, citée plus haut, l'enzyme perd son activité avec le dithiocomposé employé ici. EXEMPLE 5 Modifications de la papaïne par de l'acide dithiopentanoi que. Effet du pH. Le point isoélectrique de la protéase papalne est de 8,8. Dans 4,5 ml de tampon phosphate 0,1 M pH 6,0, 6,5 ou 8,5 sont dissous 36 mg de papalne (Sigma Type IV) et 23 mg de dithioacide. Le mélange est chauffé à 400C pendant 2 heures puis dialysé à 40C pendant 16 heures contre de l'eau distillée. Les résultats en fonction du pH sont pH Rendement en activité nombre de lysines (t) touchées 6,0 100 6 6,5 92 3 8,5 113 0 Il apparait clairement que les pH plus faibles favorisent la réaction de modification. D'autre part, cet exemple est important, car la papaïne est une enzyme à cystéine active. Puisque les activités ne sont pratiquement pas affectées par la modification au dithioacide, on peut en conclure que la cystéine du site actif de la protéase n'est pas atteinte par le dithioacide dans les conditions opératoires, alors que les lysines le sont. EXEMPLE 6 Modification de la lignine peroxydase de Phanerochaete Chrysosporium par un sel de l'acide dithiobenzoîgue. La protéine est la même qu'à l'exemple 3,de point isoélectrique 3,9. On mélange 80 ml de tampon citrate 0,1 M pH 5,0 et 20 ml de préparation brute,dialysée, de lignine peroxydase. On ajoute ensuite 1,2 mg de dithiobenzoate de tétraméthylam- monium. Les concentrations initiales en hémoprotéine et sel de dithioacide sont ainsi de 0,46 ssM et 5,3 rM respectivement. Après 2 heures d'agitation à température ambiante,le mélange est dialysé à 40C pendant 16 heures contre du tampon citrate 5 XM oH 6,0. Le dialysat est analysé comme décrit à l'exemple 3, ce qui donne - rendement chimique 1008 - rendement global en activité 86R - plus aucune lysine libre après modification. Bien que l'activité soit un peu baissée, l'enzyme greffe comporte l'avantage c' être particulièrement stable ; tandis que l'enzyme native a perdu 2 à 5% de son activité par mois, conservé dans les mêmes conditions, l'enzyme modifiée a gardé 100% de son activité après 2 mois. EXEMPLE 7 Comparatif Le greffage de la papaïne (point isoélectrique 8,8) est effectué comme dans l'exemple 6 de la demande de brevet antérieure, FR 87 09 198, mais à pH 6 au lieu de 8,5 on constate alors que le dithioester employé ne se fixe pas sur la protéine. Par contre, comme vu dans l'exemple 5 ci-dessus, l'acide dithiolque s'y fixe sur tous les groupes lysine à pH6. Revendications 1. Procédé de modification chimique de protides, qui consiste à faire réagir un protide avec un composé organique dithiolque, caractérisé en ce que ce composé est un dithioacide ou un sel de base faible d'un tel acide, et que la réaction a lieu dans un milieu de pH compris entre 3 et 7, et de préférence entre 3,5 et 6,5. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le pH du milieu réactionnel est de 4 à 6. 3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que dans le dithioacide ou dans son sel, R est un radical hydrocarboné, aliphatique ou/et arylique, X étant H ou un cation de base azotée. 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que R est un alkyle en C1 à C20, cycloalkyle en C4 à C8, alcényle en C2 à C20, un phényl ou homologue, phénylène, naphtyle ou naphtylène, aryl-alkyle ou alkylaryle, chacun de ces radicaux pouvant porter un ou plusieurs substituants fonctionnels. 5. Procédé suivant la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que le cation X est celui d'une base azotée inorganique, notamment ammoniaque, flydrazine ou hydroxylamine. 6. Procédé suivant la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que le cation X provient d'une base azotée organique, en particulier amine ou ammonium quaternaire. 7. Procédé suivant la revendication 4 ou 4, caractérisé en ce que le cation X provient d'une base formée par un hydroxyde métallique, notamment hydroxyde de Zn, Al, Mn ou Pb. 8. Procédé suivant une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le sel R-C-SSX est celui d'une base dont la constante de dissociation ionique est de 10 à 10 , et de préférence de 10'6 à 9. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on fait réagir 10 à 100 équivalents de composé ditholque par équivalent de NE2 disponible dans le protide. 10. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est réalisé au sein d'une solution tampon aqueuse, à une température de 0 à 600C, de préférence entre 100 et 400C. 11. Application du procédé suivant une des revendications précédentes à la modification d'enzymes, en particulier de protéases et peroxydases.