FR 2630115 A1 19891020 FR 8804936 A 19880414 Procédé de- stabilisation des solutions d'albumine humaine et solution obtenue. L'invention concerne un procédé de stabilisa- t. tion des solutions d'albumine humaine à usage thérapeutique en vue de leur traitement à la chaleur dans un récipient, notamment dans le récipient final. :. L'invention concerne également la solution d'albumine obtenue par le procédé conforme à l'invention. Lors de la fabrication des solutions d'albumine humaine, une étape obligatoire est la pasteurisa- tion finale du produit à 60C pendant 10 h. Cette étape de c chauffage a été introduite aux USA au début des années 1950 afin d'inactiver le virus de l'hépatite B éventuellement - virus modèles ont démontré que la pasteurisation des solu- tions protéiques pendant 10 h à 60C peut être considérée comme une méthode assez générale pour réduire le risque de transmission virale chez le receveur bien que certains virus, comme le parvovirus, soient plus résistants que d'autres à l'inactivation thermique (2-3). Aujourd'hui, l'ensemble des pharmacopées nationales et internationales impose la pasteurisation des solutions d'albumine à 60'C pendant 10 h, cette pasteurisa- tion devant s'effectuer au tout dernier stade de la fabrica- tion, à savoir dans le récipient final, généralement un fla- con de verre neutre; voir par exemple la Pharmacopée Européenne, IIème édition, de 1984, la Pharmacopée des USA, XXIème édition et la Pharmacopée Japonaise de 1986. Malgré la relative stabilité de l'albumine à la chaleur, celle-ci doit être protégée, pour éviter toute gélification lors de la pasteurisation, à l'aide de stabilisants appropriés. Les stabilisants utilisés aujourd'hui de manière quasi générale sont le caprylate de sodium et l'acétyle tryptophanate de sodium, seuls ou en combinaison. En particulier, les Pharmacopées USA XXIème édition et Japonaise 1986 imposent l'acétyle tryptophanate de sodium seul, à la dose de 0,16 millimole par gramme d'albumine, ou bien le mélange acétyle tryptophanate de sodium/caprylate de sodium chacun à la dose de 0,08 millimole par gramme d'albumine. Le mandelate de sodium peut également être utilisé seul ou en association avec le caprylate de sodium (voir la Pharmacopée Française VIIIème édition de 1965). Les stabilisants sont ajoutés en large excès par rapport à l'albumine, à savoir 10 molécules de sta- bilisant pour 1 molécule d'albumine selon les Pharmacopées USA et japonaise, et du fait de leur affinité propre pour l'albumine, ils sont capables de la protéger efficacement contre une dénaturation directe par la chaleur. En l'absence de ces stabilisants, la dénaturation de l'albumine est inévitable et conduit à une agrégation progressive des molécules d'albumine, ce qui se traduit par l'apparition d'une opalescence puis par une gélification complète de la solution. Si cette opalescence et cette gélification sont bien évitées par l'emploi des stabilisants décrits précédemment, il est connu qu'après la pasteurisation, un certain nombre de flacons d'albumine présente, lors d'une inspection visuelle, de fines particules floconneuses ou filaments ou peaux en plus ou moins grand nombre. Ce phénomène est plus accentué pour les préparations d'albumine les plus diluées, c'est-à-dire à 4 % ou 5 % de protéines, que pour les préparations les plus concentrées, c'est-à- dire à 20 % de protéines. Outre que la détection de ces particules insolubles impose le rejet des flacons concernés lors de l'inspection finale dans le cadre du contrôle de qualité, ce qui se traduit par une perte économique, l'apparition de ces particules lors de la pasteurisation traduit une certaine dénaturation du produit, ce qui peut laisser un doute sur sa bonne tolérance lors de l'administration éventuelle à l'homme. L'invention vise à remédier à cet inconvénient, en proposant un procédé de stabilisation des solutions d'albumine humaine, en vue de leur traitement à la chaleur dans un récipient, notamment le récipient final, permettant une stabilisation parfaite et aboutissant à une solution d'albumine compatible avec l'usage normal de ces solutions. L'invention a pour objet un procédé de sta- bilisation des solutions d'albumine humaine à usage thérapeutique en vue de leur traitement à la chaleur dans un récipient, notamment dans le récipient final, caractérisé en ce que l'on ajoute, en plus de la formule stabilisante habituelle, une agent surfactif choisi parmi le Tween 80 (polysorbate 80 Société Atlas - oléate de sorbitanne polyoxyéthylène), le Tween 20 (Société Atlas - laurate de sorbitanne de polyoxyéthylène), le Pluronic F68 (Société Gattefossé), le laurate de polyéthylène glycol 600 (Société Ugine Kuhlmann - copolymère de polyoxyéthylène et de polyoxypropylène) ou tout autre agent équivalent. L'agent surfactif utilisé dans le procédé. de l'invention ne joue pas le même rôle que la formule stabilisante habituelle et ne peut donc pas s'y substituer. En effet, l'apparition des particules du fait de la pasteu- risation ne résulte pas des mêmes causes qui sont à l'origine de l'emploi des stabilisants habituels, comme cela sera illustré plus loin, mais d'interactions de la solution avec la paroi du récipient lors du traitement thermique. Ce phénomène s'observe dans les flacons de verre neutre classiques, par exemple verre de type I boro- silicaté ou verre de type II neutralisé en surface par traitement à l'anhydride sulfureux ou sulfate d'ammonium tels que décrits dans les Pharmacopées Européennes et USA (Société SAINT-GOBAIN DESJONQUERES), mais aussi dans des flacons de matière plastique, par exemple en polystyrène (Société CORNING). Ce phénomène fait donc vraisemblablement intervenir des interactions hydrophobes dénaturantes entre le produit et la paroi du flacon. Par solution stabilisante habituelle, on entend notamment le caprylate de sodium, l'acétyle trypto- phanate de sodium, le mandelate de sodium ou un mélange de deux ou trois de ceux-ci. Par agents équivalents, on entend tout agent, notamment surfactif non ionique, qui empêche, de préférence à concentration faible, la dénaturation de l'albumine sur la paroi du récipient et ainsi la formation des particules insolubles lors de la pasteurisation des solutions d'albumine et dont la présence dans la solution finale ne soit pas incompatible avec l'usage normal de la solution. Les agents surfactifs, notamment non ioniques, et équivalents selon l'invention doivent de préférence être efficaces à faibles concentrations Selon l'invention, les concentrations sont avantageusement comprises entre 5 et 50 mg/l de solution à stabiliser. Il suffit d'environ 0,25 à 1 molécule d'un agent surfactif approprié pour 100 molécules d'albumine respectivement en solution de 200 à 50 g/l, pour empêcher la dénaturation -et l'apparition de particules insolubles après pasteurisation, en présence de la formule stabilisante habi- tuelle. L'agent surfactif préféré est le Tween 80 de poids moléculaire moyen de 1320 Dalton. Il doit être utilisé à une concentration supérieure à 5 mg/1 et de préférence entre 10 et 20 mg/l. Une concentration de Tween 80 de 10 mg/1 de solution à stabiliser, pour une solution d'albumine à 50 g/l, correspond à 1 molécule de ce stabilisant pour 100 molécules d'albumine. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'agent surfactif est ajouté à un stade précoce de la fabrication de l'albumine. En pareil cas, la concen- tration initiale en agent surfactif doit être telle que le taux résiduel de ce dernier, au moment de la pasteurisation, soit suffisant pour assurer l'effet protecteur désiré. Les solutions d'albumine humaine concernées par l'invention sont notamment toutes les -solutions protéiques dont l'albumine est le composant protéique majoritaire, c'est-à-dire représente plus de 80 % de l'ensemble des protéines, et qui sont destinées à être utilisées en clinique humaine. Elles sont définies, en par- ticulier, dans la Pharmacopée Européenne IIème édition de 1984 sous l'appellation "Albumini humani solutio" et dans le Code of Federal Regulations des USA, édition du 1er avril 1986, sous l'appellation "Albumin tihuman)" et "Plasma pro- tein fraction (human)". L'albumine humaine concernée par l'invention est notamment obtenue par extraction et purification selon tout procédé convenable à partir d'une source d'albumine humaine ou même, culture de cellules animales, végétales, de bactéries ou de levures transformées pour produire de l'albumine humaine à l'aide des techniques de génie génétique. Parmi les procédés convenables pour l'extraction et la purification de l'albumine humaine, on peut citer en particulier le fractionnement du plasma à l'aide d'alcool décrit par COHN et al. (4) ou le fractionnement du sang pla- centaire à l'aide d'alcool et de zinc décrit par TAYLOR et al. (5) ou le fractionnement du sang placentaire à l'aide d'alcool, de caprylate de sodium et de gel d'alumine décrit par LIAUTAUD et al. (6) ou le fractionnement du sang placen- taire à l'aide d'alcool et par chromatographie tel que décrit par TAYOT et al. (7) ou le fractionnement du plasma par chromatographie tel que décrit dans le brevet USA n' 4.675.384. L'invention va maintenant être illustrée à l'aide d'exemples non limitatifs. EXEMPLE 1 On a essayé d'améliorer la stabilité d'une solution d'albumine à 50 g/l, obtenue par fractionnement de sang placentaire à l'aide d'alcool et par chromatographie comme décrit par TAYOT et al. (4). L'albumine obtenue a une pureté protéique de 100 % en analyse par électrophorèse sur acétate de cellulose et en immuno-électrophorèse bidimen- sionnelle (présence d'un pic unique). L'essai a consisté à augmenter les quantités de stabilisants classiques caprylate de sodium et acétyle tryptophanate de sodium par rapport aux quantités imposées par la Pharmacopée USA tout en maintenant un taux de sodium de 145 meq/l et un pH de 7,0. L'albumine a été filtrée puis répartie en flacons, de verre de type I de 100 ml et pasteurisée 10 h à 60'C en bain-marie. Les flacons ont été inspectés avant et après pasteurisation et refroidissement spontané à l'air. Aucun flacon ne présentait de particule visible avant la pasteurisation. TABLEAU: I Presence de particules ,aprylate de sodium Acétyl tryptophanate visibles aorès nmole/q prot. die sodium mmole/q prot pasteurisation Formule standard 0,08 0,08 ++ (PharmacoDée USA) formule 2 0,08 0,32 +++ formule 3 0 0,64.++ formule 4 0,3 0,08 +++ formule 5 0,64 0 ++* On constate (Voir tableau I) que les stabilisants classiques, malgré des doses fortement augmentées, ne permettent pas d'éviter la présence de parti- cules dans les flacons pasteurisés. Ce constat confirme le fait que la gélification empêchée par les stabilisants classiques et la formation de particules sont deux phénomènes physiques indépendants. EXEMPLE 2 A partir d'une albumine placentaire préparée comme dans l'exemple 1, on a préparé des solutions à 200 g/l, 50 g/l et 10 g/l de protéines stabilisées avec une for- mule stabilisante standard, soit 0,08 mmole de caprylate de - 15 sodium/g de protéine et 0,08 mmole d'acétyle tryptophanate de sodium/g de protéine. Le sodium a été ajusté à 145 meq/l avec du chlorure de sodium et le pH a été ajusté à 7,0. Les solutions ont été ensuite additionnées de O ou 5 ou 10 mg/I de Tween 80, puis filtrées et réparties en flacons de verre de type I de 100 ml, puis pasteurisées 10 h à 60'C en bain- marie. Aucun flacon ne présentait de particule visible avant pasteurisation. TABLEAU II Concentration en albumine(g/i 10 | 50 200 TauxdeTween80 (mq/1) 0 1 5 lO O 5 l0 01 j5 l0 Présence de particules O++l+ O +0 aDrès Dasteurisation. . I On constate (Voir tableau II) que le Tween 80 empêche totalement la formation de particules visibles à la dose de 10 mg/l quelle que soit la concentration en albumine dans la solution. EXEMPLE 3 On a essayé d'améliorer la stabilité d'une solution d'albumine à 50 g/l obtenue par fractionnement de plasma par la méthode de COHN. L'albumine a été fournie sous forme lyophilisée par la société HYLAND. La poudre a été remise en solution et ajustée à 50 g/l de protéines et stabilisée avec une formule stabilisante standard, soit 0,08 mmole de caprylate de sodium/g de protéine et 0,08 mmole d'acétyle tryptophanate de sodium/g de protéine. Le sodium a été ajusté à 145 meq/l avec du chlorure de sodium et le pH a été ajusté à 7,0. Une partie de cette solution a été additionnée de 10 mg/l de Tween 80. Les deux solutions obte- nues ont été filtrées et réparties en flacons de verre de type I de 100 ml puis pasteurisées à 60'C pendant 10 h en bain-marie. Aucun flacon ne présentait de particule visible avant pasteurisation. TABLEAU III Taux deTween 80 (mag/l) 0 Présence de particules visibles aDrès pasteurisation 0 On constate (voir tableau III) que le Tween à la dose de 10 mg/l empêche totalement la formation de particules visibles dans l'albumine de COHN à 50 g/l soumise à une pasteurisation de 10 h à 60'C. BIBLIOGRAPHIE 1. GERETY RJ, ARONSON DL. Plasma derivatives and viral hepatitis. 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Proceeding of the 13 th International Congress of the International Association of Biological Standardization, Budapest 1973 - Part A: purification of proteins. Develop. Biol. Standard. 1974; 27: 107-14. 7. TAYOT JL et al. Chromatographie indus- trielle, production et qualité de l'albumine humaine d'origine placentaire. Réunion Coopération internationale et Dérivés Sanguins, Talloires 1981-ED. Fondation Marcel MERIEUX 1982: 47-59. 2630 1 15 REVENDICATIONS 1. Procédé de stabilisation des solutions d'albumine humaine à usage thérapeutique en vue de leur traitement à la chaleur dans un récipient, notamment dans le récipient final, caractérisé en ce que l'on ajoute, en plus de la formule stabilisante habituelle, un agent surfactif choisi parmi le Tween 80, le Tween 20, le Pluronic F68, le laurate de polyéthylène glycol 600 ou tout autre agent équivalent. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent surfactif est utilisé à une concentration allant-de 5 à 50 mg/l. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le Tween 80 est utilisé à une concen- tration supérieure à 5 mg/l et notamment comprise entre 10 et 20 mg/l. 4. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on ajoute, à la solution d'albumine humaine à stabiliser, la formule sta- bilisante habituelle, on ajuste le sodium à 145 meq/l avec du chlorure de sodium et le pH à 7,0, on ajoute l'agent surfactif, on filtre puis on répartit la solution dans des flacons et l'on pasteurise à 60*C pendant 10 h. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la formule stabilisante habituelle se compose de 0,08 mmole de caprylate de sodium et 0,08 mmole d'acétyle tryptophanate de sodium par gramme d'albumine. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute l'agent surfactif à un stade précoce de la fabrication de l'albumine. 7. Solution d'albumine humaine obtenue par le procédé décrit dans l'une des revendications précédentes.