FR 2640998 A1 19900629 FR 8817008 A 19881222 La présente invention concerne, d'une manière qénérale. un procédé de détermination de l'activité biologique d'un scl. A l'heure actuelle, lorsque l'on désire estimer l'activité biologique d'un sol, on doit mettre en oeuvre des méthodes longues et complexes, telles que les méthodes biocidales (Jenkinsson et Ladd, 1981) ou les méthodes de mesure du dégagement de gaz carbonique ou de la teneur en adénosine tri-phosphate (Maire, 1987). Il s'ensuit que l'on se heurte à un coût d'analyse trop élevé ou à un durée excessive des opérations pour pouvoir appliquer ces méthodes à des déterminations de routine. Or, il serait souhaitable de pouvoir dispcser d'un procédé gui pellette de mesurer l'activité biologique ou microbienne d'un sol, qui soit suffisamment simple, rapide et écono^.ique pour cue les agriculteurs puissent y avoir recours b titre ordinaire. Ce but est atteint selon l'invention e. ce sens qu'elle propose un procédé qui consiste - à établir une corrélation entre, d'une part, la teneur en phosphatase alcaline d'une série de sols de référence dont l'activité biologique est jugée satisfaisante et, d'autre part, une autre caractéristique physique et/ou chimique de cette série de sols de référence, - * mesurer la teneur en phosphatase alcaline et ladite autre caractéristique du sol objet de la détermination, et - à comparer les résultats desdites esures à la corrélation établie à partir des sols de réfárence. La teneur en phosphatase alcaline peut être déterminée indirectement par la mesure de son activité enzymatique, laquelle peut être mise en évidence, par exemple, par la dégradation du phcsphate de p-nitrophény'le an p-nitrophénol. Le choix s'est porté sur la phosphatase alcaline plutôt que sur une autre enzyme car cette enzyme répond à quatre critères importants - elle intervient dans une vcie métabolique fondamentale (cycle de l'ATP) et, donc, elle existe chez tous les microorganismes : - elle n'existe pas dans les racines des plantes, - son activité ne dépend pas de la teneur en phosphore des sols (la phosphatase acide est, elle, inhibée par les fortes teneurs en phosphore), et - sa technique de dosage est simple et peu coûteuse. Par suite, le dosage de l'activité de cette enzyme dans un échantillon de sol reflète bien, et de maniere économique, l'activité biologique microbienne du sol en question. Il est toutefois nécessaire de corréler cette mesure avec une autre caractéristique du sol. Dans un premier node de mise en oeuvre de l'invention, certe autre caractéristique est la surface interne du sol, c'est-à-dire la surface déployée par un quantité donnée de scl étalée en couche éle-entaire. Dans un second riode de mise en oeuvre de l'invention, la caractéristique avec laquelle est corrélée la mesure de la phosphatase alcaline est la teneur en carbone organique du sol. Dans un troisième ode de mise en oeuvre de l'invention, la caractéristique avec laquelle est corrélée la mesure de la phosphatase alcaline est la capacité d'échange cationique du sol. Les esures faites sur les sols de référence per-ettent de tirer de la représentation graphique de leur corrélation une droite de régression et l'ensemble axes/droite de régression forte un abaque que l'on utilise ensuite pour estimer l'activité biologique d sol sou=is à la détermination. Plus préciseent, on a déter-iné expérimentalement, dans Le cadre du premier mode de rise en oeuvre évoqué plus haut. que la droite de régression obtenue a partir des couples de mesures . @ctivité enzymatique de la phosphatase alcaline exprimée en g de p-nitrophénol produit à partir de phosphate de p-nitrophényle /g de sol sec/heure, portée en ordonnée . surface interne du sol exprimée en m2/g de sol, portee en a@sclsse, fait apparaître un facteur de régression r de l'ordre de 0,95. Dans le cadre du second mode de mise en oeuvre de l'invention, la droite de régression obtenue à partir des ouples de mesures . activité enzymatique de la phosphatase alcaline exprimée en g de p-nitrophénol produit à partir de phosphate de p-nitrophényle /g de sol sec/heure, portée en ordonnée, . teneur en carbone organique du sol exprimé en /@@ parté@ en abscisse, fait apparaître un facteur de régression r de l'ordre de 0,75. Dans le cadre du troisième mode de mise en oeuvre de l'invention, la droite de régression obtenue à partir des couples de mesures l . . activité enzymatique de la phosphatase alcaline exprimée en ug de p-nitrophénol produit à partir de phosphate de p-nitrophényle /g de sol sec/heure, portée en ordonnée, . capacité d'échange cationique du sol exprimée en milliéquivalents/g de sol sec portée en abscisse, fait apparatre un facteur de régression r de l'ordre de 0,65. Quel que soit le mode de mise en oeuvre choisi, on compare les valeurs de l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline données, d'une part, par la courbe de r@çression et. d'autre part. par la mesure effectuée sur le sol soumis à la détermination, pour la même valeur de l'autre caractéristique - surface interne du sol. teneur carbone organique du sol ou capacité d'échange cationique du sol - et l'on interprète le résultat à partir des hyperboles de confiance comme suit - valeur dans les hyperboles à 95 % : bon - valeur dans les hyperboles * 90 % : insuffisant ou fort - valeur hors des hyperboles à 90t : mauvais ou excessif Il a été vérifié sur plus deux cents sols agricoles des zones tempérées et tropicales que le procédé selon l'invention donne des résultats parfaitement corrélés avec ex des méthodes complexes évoquées plus haut. Le protccole opératoire des trois variantes du procédé selon l'invention est décrit ci-après, étant toutefois entendu que les techniques de dosage sont en elles-mêmes connues et que l'invention réside dans la corrélation des mesures. Pour les sols de référence, dans ces exemples, on a utilisé des prélèvements sur des parcelles d'essais de longue durée (Déhérain, Versailles, Dijon, ITCF) dont on connaît bien les fonctionnements et les - rendements des cultures. EXEMPLE 1 Corrélation entre la mesure de l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline et celle la surface interne du sol. 1) mesure de l'activité enzymatique de la phosphatase acide On utilise la méthode de TABATABAI et DRENNER, 1982, In. Methods cf Soil Analhysis, Part 2 by A.L. PAGE et al. American Society of Agronomy, modifiée par Claude BCURGUIGNON, 1987. Le scl est tamisé à 2.-.-.. Une partie est exposée pendant @ jours à l'air libre et une autre parie est utilisée iomédiatement. Dans les deux cas (sol frais et sol séché à @@air). le protocole est le même : a -Mesure de l'humidité On pèse un échantillon de 50 g de sol séché à l'air ou frais, on le met à sécher pendabt 24 heures dans une éturve à 105 C et on le pèse de nouveau après refroidissement dans un dessicateur. La différence donne la teneur en humidité @@primée en grammes, teneur dont il faudra tenir compte pour l'expression des résultats (point c4. ci-dessous). b -Incubation enzymatique On introduit une prise d'essai de 1 g de sol (frais ou seché à l'air) dans une fiole Erlenmeyer de 50 ml et on a@oute 0,2 ml de toluène, 4 ml d'une solution tampon à p@ 10,8 (Diluer dans 800 ml d'eau, 200 ml d'une solution more contenant 12,1 g de tampon Tris (hydroxyméthylaminométhane), 11,6 g d'acide malique, 14 g d'acide 4 trique et 6,2 g d'acide borique dans 488 mi de NaOH, 1H. Diluer avec H2O et ramener à 1 litre) et 1 ml d'une solution de phosphate de p-nitrophényle. On agite, on bouche la fiole et on incube dans un agitateur fonctionnant à 50 révolutions/mn (50 rpm) à 37 C pendant 1 heure. Sous 1'action de la phosphatase acide contenue dans la prise d'essai, une quantité plus ou moins grande de phosphate de p-nitrophényle est convertie en p-nitrophénol. c -Mesure spectrophotométrique Elle consiste à mesurer la quantité de p-nitrophénol p duice, 1 laquelle est fonction de l'activité de la phosphatase alcaline. c1. Témoin : On met 1g de sol à incuber comme précédemment, mais s@ns adjonction de phosphate de p-nitrophényle. Après incubation, on ajoute 1 ml d'une solution aqueuse de CaC1s.H2O, la concentration de 73,5c/litre et 4 mi d'une aqueuse de NaOH 0,5 Molaire. On agite, puis on filtre sur papier Whatman n 40 et lit au spectrophotomètre sous 410um. c2. Courbe d'étalonnage /solution standard colorée) : On dilue 1 ml d'une solutio standard de p-nitrophénol (1g/1) dans 100 mi d'eau et l'on distribue la dilution résultante dans des fioles Erlenmeyer, à raison respectivement de O, 1, 2, 3, 4 et 5 ml. On ajuste à 5 ml avec de l'eau, ce qui donne une gamme de concentrations allant de O à 50 g de p-nitrophénol. On mesure l'absorption de cette gamme à 410 m et on trace la courbe correspondante. c3.prise d'essai A l'issue de la période d'incubation enzymatique, on ajoute, comme pour le témoin, 1 ml d'une solution aqueuse de CaCl2.H2O, à la concentration de 73,5g/litre et.4 ml d'une solution aqueuse de NaOH 0,5 Molaire. On agite puis on filtre sur papier Whatman n 40. Le spectrophomètre étant cale en fonction de l'erreur introduite par le témoin, on mesure l'absorption à 410 m. c4. expression des résultats A partir de cette absorption et de la courbe d'étalonnage obtenue sous c2, on détermine la concentration en p-nitrophénol de la prise d'essai et donc, indirectement, l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline. Cette activité est exprimée en g de p-nitrophénol produit en une heure par 1g de sol sec, c'est-à-dire en tenant conpte de la mesure de l'humidité effectuée sous 2 ci-dessus. 2 - Mesure de la surface interne du scl La mesure utilisée est celle de la technique dite "au bleu de méthylène" du Laboratoire Central des Ponts et Chaussées. Le dosace consiste à faire des ajouts de bleu de méthylène (10 g/1) dans une suspension contenant la prise d'essai jusqu'au recouvrement des particules du sol par une couche monomoléculaire de ce colorant. a - Préparation de l'échantillon de scl Un prélèvement de sol est tamisé à 2mm et une prise d'essai de 1 g est prélevée et mise dans 100 ml d'eau permutée. On y ajoute 10 ml d'une solution aqueuse d'hexamétaphosphate de sodium à 100 g/l. On -et ensuite au mixeur pendant 30 secondes. b b - Fixation du bleu de méthylène @ On fait des ajouts de 2 ml de solution de bleu de mêthylène (10g/1) jusqu'à ce qu'une goutte du mélange t pension de sol/bleu de méthylène, déposee sur du papier titre, laisse apparaitre une auréole bleu clair autour de la tache résultante. c c - Expression des résultats La surface interne est exprimée en m/g de sol de la f*:;on suivante Surface interne = (x.s) (1/y) -formule dans laquelle x = volume en ml de solution de bleu de méthylène nécessire pour recouvrir 1g de sol s = surface en m déployée par 1g de bleu de méthylène, ea l'occurence 19,85 2 y r pourcentage pondérai d'argile dans le soi. 3 - Corréla: on Une série de esures a été faite sur des échantillons de sols de référence considérés comme satisfaisants sur le plan de leur activité biologique. Les résultats sont exprimés graphiquement à la figure 1 du dessin annexé. A partir de ces résultats, on a pu établir une droite de régression dont le coefficient de régression r est de 0,955. On obtient ainsi un abaque de corrélation. 4 - Exploitation En procédant aux mêmes mesures de l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline et de la surface interne sur un échantillon de sol dont on veut déterminer l'activité biologique et en comparant les résultats obtenus avec l'abaque issue de l'étape 3, on peut juger de cette activité biologique. EXEMPLE 2 Corrélation entre la resure de l'activité enzymatique de la phosphatase al-aline et celle de la teneur en carbone organique. 1) Mesure de l'activité enzymatique de la phosphatase acide On procède comme à l'exemple 1 et le résultat obtenu est exprimé de la même façon. 2) Mesure de la teneur en carbone organique La méthode utilisée est celle de ANNE, P. 1945; Ann. Agron. 15:161-172, modifiée par la norme AFNOR d'analyse des sols. Elle consiste à oxyder le carbone organique par une solution sulfo-chromique à l'ébullition et à doser les ions Cr*** par spectrocolorimétrie à 625 m. a - Mode opératoire On opère sur une prise d'essai de sol pesant de 200 mg à 5 g selon que 12 sol est suppose contenir de 20 à 1 % de carbone. On introduit cette prise d'essai dans un ballon à col rodé, on ajoute 50 ml de mélange sulfo-chromique (30 g de CrO3 dissous dans 540 ml d'eau distillée + 500 ml d'acide sulfurique concentré) et 15 ml c'acide sulfurique concentré. Après avoir adaptè au col rodé du ballon un réfrigérant à reflux, on porte le contenu du ballon à l'ébullition pendant 5 mn. On laisse refroidir pendant 30 mn, puis on transvase quantitativement dans une ficle jaugée de 200 nl. On laisse reposer une heure. après quoi on decante le liquide clair de la fiole. Après un nouveau repos, de 12 heures cette fois, on décante dans un pilulier à bouchon hermétique. b - Mesure spectrocolorimètrique bl. Gamme étalon On prépare, à partir d'une solution mère de glucose à 10 g/1 (donc à 4 g de carbone par litre), une gamme de dilutions titrant respectivement 0, 10, 20, 6C, 100, 200, 300, 400, 500 et 600 g de carbone/ml. On mesure -l abscrption de cette --- sous 625 m et on trace la courbe d'étalonnage correspondante. b2. Mesure L'appareil étant calé pour tenir compte de l'absorption d'un témoin préparé selon le principe classique rappelé sous l'exemple 1, on mesure l'absorption de la prise d'essai préparée comme indiqué sous a (suspension de liquide d'incubation), et l'on s'en rapporte à la courbe d'étalonnage pour en tirer la concentration en carbone exprimée en g de carbone par cm de suspension (valeur qui peut directement être rapportée au poids de sol sec). c - Expression des résultats La teneur en carbone organique est exprimée comme suit Teneur en carbone (%) = (z)(1/50p)(100)(1/100-h) formule dans laquelle z r concentration en carbone en ug/g p = poids de la prise d'essai (en g) h = humidité de la terre (en g) mesurée comme à l'exemple 1. 3 3 Corrélation Une série de mesures a été faite sur des échantillons d sols -de référence considérés comme satisfaisants sur le plan de leur activité biologique. Les résultats sont exprimes graphiquement à la figure 2 du dessin annexé. A @ partir de ces. résultats, on a pu établir une droite de régression dont le coefficient de régression r est de 0,7502. On obtient ainsi un abaque de corrélation. 4 - Exploitation En procédant aux mêmes mesures de l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline et de la teneur en carbone organique sur un échantillon de sol dont on veut déterminer l'activité biologique et en comparant les résultats obtanus avec l'abaque issu de l'étape 3, on peut juger de cette acticité biologique. EXEMPLE 3 Corrélation entre la mesure de l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline et celle de la capacité d'échange cationique. 1) Mesure de l'activité enzymatique de la phosphatase acide On procède comme à l'exemple 1 et le résultat obtenu est exprimé de la même façon. 2) Mesure de la capacité d'échange cationique On utilise la méthode de RROADES, J.D. 1982. In : Methods of soil analysis, Part 2 by PaGE, A.L. ; MILLER, R.H. and KEENEY, D.R. American Society of Agronomy,Madison, U.S.A. Cette méthode distingue les sols contenant des carbonates et les sols acides. 2a- Sols contenant des carbonates 2al -Mode opératoire On pèse 4 à 5 g de sol sec que l'on met dans un tube à centrifuger. On ajoute 33 ml d'une solution saturante de NaOAc, 0,4N et de NaCl 0,1N avec 60 % d'éthanol et ajustée à pH 8,2 avec une solution de NaOH 6N. Or. agite pendant 5 mn et on centrifuge à 1000 tours/mn pendant 5 mn. On élimine le surnageant et on repète d'opération quatre fois. On ajoute ensuite 33 zl d'une solution de MgNO3 à 0,5 N, on agite pendant 5mn et on centrifuge jusqu' éclaircissement du surnageant que l'on verse dans une fiole de 100 ml. On répète l'opération deux fois et on ramène à 100 ml exactement. On dose, dans des aliquots du contenu de la fiole, le sodium et le chlore présents dans la solution par rapport à des solutions standard (Méthode de RHOADES, section 10-3.4 du même ouvrage). 2a2 - Expression des résultats La capacité d'échange cationique (C.E.C.), en m@lliéquivalents pour 100 g de sol sec, est exprimée comme suit : C.E.C. = (100/p sol)[(cNa)(100/v al)-(cCl)(100/v al)(cNaCl)] dans laquelle : - p sol est le poids en grammes de l'échantillon de sol - cNa est la concentratio en Na, exprimée en milliéquivalents par litre, de la solution saturante - v al est le volume de l'aliquot en ml - cCl est la concentration en Cl, exprimée en milliéquivalents par litre, de la solution saturante - cNaCl est la concentration en NaCl, exprimée en milliéquivalens par litre, de la solution saturante 2b- Sols acides 2b1 -Mode opératoire On pèse 2 g de sol sec que l'on place dans un tube à cehtrifugation. On ajoute 20 ml d'une solution de BaCl2 0,1M. On agite pendant 2 heures et on centrifuge.On jette le surnageant et on répète l'opération deux fois avec 20 ml de BaCl2 0,002M. On ajoute 10 ml d'une solution de MgSO4 0,005M. et on agite pendant 1 heure. On ajuste la capacité d'échange a celle d'une solution de référence de MgSO4 0,0015M par ajouts successifs d'une solution de MgSO4 0,005M d'eau distillée. On agite doucement pendant ne nuit. On p@se le tube et on centrifuge. On détermine le pH et la c entration en Mg du surnageant. 2b2 Expression des résultats La capacité d'échange cationique (C.E.C.), en milliéquivalents pour 100 g de sol sec, est exprimée comme suit - si l'on n'a ajouté que de l'eau distillée : CEC - 100(0,1-C1V3)/p sol - si l'on a ajouté du MgSO4 CEC = 100(0,01V1 -C1V3)/p sol formules dans lesquelles : - p sol = poids en grammes de l'échantillon de sol sec - Cl = concentration en Mg dans le surnageant en milliéquivalents/ ml - VI = volume en ml de la solution de MgSO4 ajoutée - V, = volume en ml de la solution finale de surnageant. 3 - Corrélation Une série de mesures a été faite sur des échantillons de sols de référence considérés comme satisfaisants sur le plac de leur activité biologique. Les résultats sont exprimés graphiquement à la figure 3 du dessin annexé. A partir de ces résultats, on a pu établir une droite de régression dont le coefficient de régression r est de 0.6482. On obtint ainsi un abaque de corrélation. 4 - Exploitation En procédant aux mêmes mesures de l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline et de la capacité d'échange cationique sur un échantillon de sol dont on veut déterminer l'activité biologique et en comparant les résultats obtenus avec l'abaque issu de l'étape 3. on peut juger de cette acticité biologique. Que l'on ait recours à l'un ou l'autre mode de mise en ceuvre du procédé selon l'invention, on n'a à effectuer que des opérations simples, rapides et peu cossteuses. On peut, par suite. les appliquer couramment aux sols agricoles en tue d'aboutir à une "analyse conseil". Cela est d'autant plus utile que l'intensification de l'agriculture a conduit à une perte de matière organique dans les sols avec une baisse consécutive de leur activité microbienne. Le procédé selon l'invention permet aux agriculteurs de juger de l'état de leur sol ainsi que de vérifier l'efficacité de tel ou tel produit dans le maintien ou 1'augmentation de son activité biologique. Il est bien entendu que la présente invention n'est pas limitée aux modes opératoires décrits ci-dessus, à titre d'exemples. En partioulier, l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline pourrait être déterminée en utilisant autre substrat que le phosphate de p-nitrophényle, cu même la phosphatase alcaline pourrait être dosée directement par tout procédé approprié. De même, la teneur en carbone, la C.E.C. et la surface interne pourraient être mesurées par tôutes autres méthodes reconnues sur le plan national ou iaternational. REVENDICATIONS 1 - Procédé de dé er-i-.aticn de l'activité biologique d'un sol, caractérisé en ce qu'il consiste - à etablir une corrélation entre, d'une part, la teneur en phosphatase alcaline d'une série de sols de référence dont l'activité biologique est jugée satisfaisante et, d'autre part, une autre caractéristique physique et/ou chimique de cette série de sols de référence, - à mesurer la teneur en phosphatase alcaline et ladite autre caractéristique du sol objet de la détermination, et - à comparer les résultats desdites mesures à la corrélation établie à partir des sols de référence. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à mesurer la teneur en phosphatase alcaline de façon indirecte, par une mesure de son activité enzymatique. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite autre caractéristique est la surface interne du sol. 4 - Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que la droite de régression obtenue à partir des couples de mesures . activité enzymatique de la phosphatase alcaline exprimée en ug de p-nitrophénol produit à partir de phosphate de p-nitrcphênyle /g de sol sec/heure, portée en ordonnée, surface Interne du sol exprimée en m2/g de sol. portée en abscisse, fait apparaître un facteur de régression r de l'ordre de 0,95. 5 - Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite autre caractéristique est la teneur en carbone organique du sol. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la droite de régression obtenue 9 partir des couples de mesures . . activité enzymatique de la phosphatase alcaline exprimée en g de p-nitrophénol produit à partir du phosphate de p-nitrcphényle /g de sol sec/heure, portée en ordonnée, . teneur an carbone organique du sol exprimé en pour mille ( /..), portée en abscisse, fait apparaître un facteur de régression r de l'ordre de 0,75. 7 - Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé on ce que ladite autre caractéristique est la capacité d'échange cationique du sol. 8 - Procédé selon la revendication 2 ou 7, caractérisé en ce que la droite de régression obtenue à partir des couples de mesures activité enzymatique de la phosphatase alcaline exprimée er; g de p-nitrophenol produit à partir de phosphate de p-nitrophényle /g de sol sec/heure, portée en ordonnée, capacité d'échange cationique du sol exprimée en milliéquivalents/g de sol, portée en abscisse, faut apparaître un facteur de régression r de l'ordre de 0,65. 9 - Procédé selon l'une quelconque des revendication 4, 6 4u 8 caractérisé en ce qu'il consiste à comparer les valeurs d'activité enzymatique de la phosphatase alcaline données, d'une part, par la courbe de régression et, d'autre part, par la mesure sur le sol soumis à la détermination, la même valeur d'une autre caractéristique choisie ont; a la surface interne du sol, sa teneur en carbone organique et sa capacité d'échange cationique, et à interpréter le résultat à partir des hyperboles de confiance comme suit : - valeur dans les hyperboles à 95 % : bon - valeur dans les hyperboles à 90 % : insuffisant ou fort - valeur hors des hyperboles à 90 % : mauvais excessif.