FR 2615203 A1 19881118 FR 8706667 A 19870512 TNOCULUM DANS LEOUEL LES MICRO-ORGANISMES SONT CONDITIONNES SOUS LA FORME DE GRANULES BIODEGRADABLES. SON PROCèDE DE PREPARATION ET SES APPLICATIONS La présente invention se rapporte d un inoculum dans lequel les micro-organismes sont conditionnés dans une formulation permettant leur très bonne conservation en milieu sec et leur libération en milieu humide.Celui-ci trouve son application notamment dans les domaines de l'agriculture, comme engrais microbiologiques et indirectement pour l'enrobage microbiologique des semences ; de l'horti- culture et du maraîchage, par incorporation dans des substrats naturels et artificiels et en cultures hors-sol de l'élevage, pour reconstituer la flore de l'appareil digestif des animaux ; et en alimentation animale, dans la fabrication des ensilages Les inoculums constitués par des micro-organismes peuvent être conditionnés sous diverses formulations. Cependant, dans la plupart des cas, le type de formulation choisi détermine en grande partie l'efficacité de l'inoculum: - Les formulations liquides sont les plus faciles à réaliser, mais elles ne donnent pas toujours satisfac tion. En effet, dans les milieux liquides, les micro organismes se présentent nus et en ordre dispersé lors de l'inoculation dans le sol ou dans les substrats. Dans ces conditions, le rapport de force est souvent en faveur de la flore résidente et les résultats de l'inoculation peuvent etre d'autant plus décevants que l'antagonisme de la flore nutochtone est puissant. On sait que du reste que dans un gramme de sol fertile, on peut trouver plus d'un milliard de bactéries. - Les formulations solides, se présentant sous la forme de poudres, donnent parfois de meilleurs résultats. Dans ce cas, les micro-organismes sont plus ou moins déshydratés, parfois même lyophilisés. L'adJonction d'un support protecteur inerte mais hydrophile, du type argile, est nécessaire pour obtenir une bonne efficacité L'un des problèmes est que les micro-organismes, avant d'entrer en activité, doivent etre réhydratés, ce qui provoque généralement une perte de viabilité par choc osmotique. De plus, les particules d'argile ne semblent pas offrir un rempart protecteur suffisant vis-à-vis de la multitude d'agresseurs telluriques résidents. Afin d'éviter ces problèmes, on a utilisé des formulations gélifiées sous forme solide, dans lesquelles les micro-organismes sont immobilises et qui presentent l'intérêt de pouvoir être hydratées selon ce que l'on veut obtenir. Certains gels, constitués par des polymères tels que le polyuréthanne, les polysaccharides, comme le xanthane et les dérivés cellulosiques, ou encore les polyacrylamides, ont été proposés. Toutefois, les techniques d'inclusion des microorganismes dans les gels de polymère apparaissent comme étant délicates. Ainsi, dans le brevet français n 2 501 229, on propose par exemple d'apporter un milieu de culture ensemencé avec le micro-organisme ou une suspension de micro-organismes obtenue par centrifugation ou filtration dudit milieu, dans une solution chauffée de polysaccharide, et de former le gel par refroidissement. Ce traitement thermique assurant la réticulation du gel peut être remplacé par l'action d'un sel métallique ou par traitement de synergie par un autre polymère. Dans le brevet français n 2 519 022, on préconise d'abaisser l'activité de l'eau dans l'inoculum en-dessous de sa valeur critique à une valeur inférieure a 0,5.A cet effet, on réalise un séchage par atomisation par flux d'air chaud et sec ou encore on utilise une solution saturée en un composé présentant l'activité de l'eau requise évoluant vers l'équilibre avec l'inoculum. Par ailleurs, on peut souligner que les polyacrylamides ne sont pas biodégra dables et jouissent d'une très mauvaise réputation concernant la toxicité. La présente invention vise à remédier à l'ensemble de ces inconvenients. On a en effet recherché-å 8 assurer une bonne conservation de l'inoculum sélectionné dans des structures stables, faciles à fabriquer, à commercialiser et à utiliser dans les domaines précités, également à assurer une multiplication immédiate des micro-organismes et une libération progressive de l'inoculum dès les premiers contacts avec un milieu hydraté, et enfin à obtenir une bonne colonisation de la cible et, en conséquence, les effets bénéfiques attendus. L'inoculum selon l'invention, qui est formé de micro-organismes inclus dans un support et qui se présente sous la forme de granulés, répond à l'ensemble de ces objectifs. Cet inoculum est caractérisé par le fait que les granulés comprennent les micro-organismes a inoculer, ladite matrice nourricière étant composée organismes dans lequel ceux-ci sont enrobés ; et une enveloppe protectrice poreuse entourant ledit noyau une dégradation biologique ; et De préférence, les granulés.de l'inoculum comportent selon l'invention en outre une pellicule hydrophile protectrice entourant l'enveloppe Les micro-organismes sont apportes dans le noyau (a) de préférence sous la forme d'une suspension plus ou moins concentrée. La matrice nourricière peut constituer un milieu de culture desdits micro-organismes avant la formation des granulés, auquel cas l'inoculum résultant présente une concentration trés élevée en micro-organismes, par exemple, pour les bactéries, pouvant aller jusqu'a 3 x 1010 bactéries par ml. L'extrait nutritif complet Les agents hydrorétenteurs Quant aux agents filmogènes Conformément a. une autre caractéristique intéressante de l'invention, l'enveloppe (b) peut renfermer en outre au moins une substance phytostimulanté choisie notamment parmi les nitrates, les substances de croissance, les sels minéraux divers, etc, et/ou une substance phytosanitaire, choisie notamment parmi les fongicides, les insecticides et les herbicides compatibles avec les microorganismes enrobés. Comme substances phytostimulantes, on peut mentionner l'acide indol acétique et la Cytokinine. A propos des substances phytosanitaires, on utilisera les fongicides et les insecticides dans le cas où les microorganismes enrobés sont des bactéries, et des bactéricides et insecticides lorsque les micro-organismes enrobés sont des champignons. En ce qui concerne la pellicule Concernant les proportions des différents composants des granulés qui constituent l'inoculum selon l'invention peut comprendre de 5 a 10 g de l'extrait (a1) et de 1 à 5 g du (ou des) agents hydrorêtenteur(s) Ca2), pour 10 à 15 ml d'eau, et que l'enveloppe filmogène , pour 10 à 15 ml d'eau.Ceci correspond A la formulation initiale suivante - pour la matrice nourricière , 5 & 10 g de l'extrait (a1) et de l a 5 g du (ou des) agents hydro rétenteur(s) organisme exemple a une concentration de l'ordre de 107 a. 1010 bactéries par ml d'eau pour les bactéries, et de l'ordre de 10 à 106 propagules par ml d'eau pour les champignons - pour l'enveloppe (b), 1 à 5 g du (ou des) agent filmogène(s) (bol) et s à 20 g du (ou des) agent(s) hydrorétenteur(s) (b2) pour 100 ml d'eau. En particulier, les granulés peuvent se présenter sous la forme d'éléments parasphériques dont le noyau (a) présente un diamètre moyen compris entre 2 et 6 mm et dont l'épaisseur de l'enveloppe il n'y a pas de limitation particulière quant aux micro-organismes que l'on peut introduire dans le noyau. On peut citer les bactéries comme les Rhizobactéries, et les champignons comme les Xycorhizes. Des exemples particuliers de ces bactéries seront donnés ci-après en référence aux applications de l'inoculum selon l'invention. La présente invention concerne également un procédé de préparation de l'inoculum qui vient d'être défini, dans lequel on utilise un agent filmogéne capable de passer de l'état soluble å ltétat insoluble, caractérisé par le fait que composant du noyau (a) des granulés de façon a obtenir un premier système de consistance pateuse composants de l'enveloppe tb), de façon à obtenir un second système de consistance piteuse, dans lequel l'agent filmogéne est à l'état soluble tC > on fait passer les premier et second système précités dans deux ajutages coaxiaux, le premier système, dans l'ajutage central, et le second système, dans l'espace annulaire délimité par les deux ajutages précités, de façon qu'a la sortie de ce double ajutage, on obtienne des gouttes de la matière de noyau entourée de la matière d'enveloppe (D > on fait tomber ces gouttes dans un second milieu aqueux dans lequel l'agent filmogène passe a l'état insoluble, de façon à obtenir, par suite du durcissement dudit agent filmogène, des granulés dispersés dans ledit milieu (E) on recueille lesdits granulés et, le cas échéant, on les sèche ; et matière de pellicule. En particulier, à l'étape (B), on utilise comme agent filmogène, un alginate sous forme d'alginate de sodium dans de l'eau pure, et qu'a l'étape Les applications envisagées pour les inoculume selon l'invention sont les suivantes Introduction dans les substrats et dans les sols de populations bénéfiques pour les plantes telles que des bactéries (RhizobactEries, Rhizobium, Agrobacterfum "K84", etc.) ou des champignons (Hycorhizes, Trichoderma, etc.), entre autres pour régénérer des sols "fatigués" et, corrélativement, constituer des sols ou substrats résistant aux agents pathogènes. - Inoculation de sols et de substrats à l'aide de bactéries pathogènes (Pseudomona solanacearum, Agrobacterlum tumefaciens, Erwlnia carotova .) ou de champignons pathogènes (Fusarium, Phytophthora, Verticillium, Fytium > utiles dans les études de résistance variétale par exemple. - Inoculation de bactéries fermentatives dans les ensilages afind'accélêrer les processus de fermentation. - Introduction de bactéries et/ou de levures dans différents types de milieux agro-alimentaires reconstitution de microflores des appareils digestifs par incorporation dans les aliments (très bonne compatibilité et facile biodégradabilité) ou par ingestion directe, les inoculums de l'invention ayant, par un choix judicieux de ses composants, une très bonne compatibilité avec les aliments et étant facilement biodégradables. Conformément à une autre application de l'invention, l'extrait nutritif,dans lequel les.microorganismes sont enrobés, peut également servir d'enrobage h des semences. Pour mieux illustrer l'objet de la présente invention, on décrira ci-après, de façon plus détaillée, la préparation d'un inoculum selon l'invention. I - Préparation de la matrice nourricière chargée de micro organismes. A l'aide d'eau distillée stérile, on prépare une p & e à base de crème stérilisée d'algues Selon les algues utilisées, on obtient des crèmes- possédant des propriétés différentes. On peut également utiliser des poudres d'algues existant déjà dans le commerce. On ajuste le pH à 7 par de l'oxyde de magnésium. Parallèlement, on prépare une suspension concentrée de micro-organismes, à laquelle on ajoute un peu de bentonite stérile. On mélange ces deux préparations durant plusieurs heures dans les proportions suivantes - crème d'algues à pH 7 . ........................ 90 g - bentonite . . ...... .................. 10 g - suspension concentrée de micro-organismes ....... 1000 ml A l'état hydraté, ce milieu assure une excellente multiplication des micro-organismes. A l'état déshydraté (10 à 20% d'humidité résiduelle > , il permet une très bonne survie des micro-organismes. De plus, il se rèhydrate facilement et, lors de la rèhydratation, les microorganismes y trouvent.tous les ingrédients nécessaires à leur multiplication.Si l'on veut obtenir une matrice très concentrée en micro-organismes, il est possible de cultiver ceux-ci dans ce milieu en agitation et à une température optimale (25 à 28 C par exemple pour les bactéries du sol). Il - Préparation de l'enveloppe protectrice On prépare par ailleurs un mélange stérile d'alginate de sodium et de kaolin dans les proportions suivantes - alginate de sodium .............................. 15 g - kaolin , 100 g - eau distillée ................................. 1000 ml III - Obtention des granulés frais On utilise le dispositif représenté sur la figure 1. Ce dispositif comprend deux récipients 1, 2 destinés à renfermer respectivement la matière de noyau et la matière d'enveloppe.Chacun de ces récipients l et 2, doté d'un dispositif d'agitation magnétlque, respectivement lç et 2p, est relié par une canalisation, respectivement 3 et 4, d un dispositif d'injection 5 qui sera décrit ci-apres et qui pénètre dans le col d'un récipient 6 destiné à recevoir les granulés formés. Sur chacune des canalisation 3 et 4 sont disposées des pompes péristaltiques respectivement 7 et 8 qui amènent les matières correspondantes dans le dispositif d'injection 5.Celui-ci est constitué par un double ajutage, le premier ajutage En fonctionnement, la matière de noyau et la matière d'enveloppe parviennent dans le dispositif d'injection 5, de façon que la première soit entourée par la seconde. L'ensemble sort à la base du dispositif d'injection 5 sous la forme de gouttes 9, lesquelles tombent dans un bain 10 de succinate ou de gluconate de calcium (concentration 0, in) contenu dans le récipient 6. L'alginate de sodium entrant dans la formulation de la matière d'enveloppe, qui est une substance soluble dans l'eau, est alors transformé en alginate de calcium, insoluble dans l'eau, constituant, avec le kaolin qui compose également l'enveloppe, une couche résistante. Plus le temps de séjour des billes obtenues dans le sel de calcium est long, plus l'enveloppe est chargée en ions Ca++ et sera solide. IV - Pelliculage des granulés A la sortie du bain, on laisse ressuyer quelques heures les granulés a la température ambiante. Puis, on les roule dans une argile très hydrophile comme la bentonite, de manière a former une pellicule autour de chaque granulé. Cette opération permet de conserver une humidité résiduelle et amortit l'écrasement à l'intérieur de la matrice, lequel pourrait être provoqué par une brutale déshydratation. La figure 2 illustre la libération des microorganismes dans le milieu inoculé. On introduit les granulés secs . Au contact de ce milieu, la pellicule P des granulés absorbe l'eau disponible, laquelle passe ensuite à travers l'enveloppe poreuse E. La réhydratation de la matrice, puis des micra-organismes du noyau N se fait alors lentement et progressivement. Ensuite, l'enveloppe E se déchire sous la pression de la matrice et le contenu du granulé est libéré dans le milieu . Dans un premier temps, les micro-organismes réhydratés absorbent les éléments nutritifs de la matrice qui sont à proximité, puis ils acquièrent leur autonomie et se dispersent dans le milieu. Pour illustrer la bonne conservation dé l'inoculum selon l'invention, on a fabriqué, par le procédé qui vient d'être décrit ci-dessus, des granulés bactériens à base de Pseudomonas f2 uorescens. Durant la fabrication, la viabilité des cellules de Fseudomonas fluorescens descend Jusqu'à environ 50 000 a 100 000 cellules viables par granulé sec lorsque l'on utilise une concentration de départ de l09 bactéries par millilitre . C'est ce qui est illustré par la figure 3 qui est la courbe de viabilité a 25*Ci2-C de ces cellules (souche L 26-l), les granulés ayant été dissous d +4*C dans du tampon phosphate 0,02M ; pH 6,4. Légende de la figure 3 A : avant mélange B : après mélange C . après formation des billes (noyau + enveloppe > ; et D : après pelliculage et séchage. Par la suite, la conservation de l'inoculum apparaît être satisfaisante puisqu'au 60ème jour, à la température du laboratoire 25-Cf2*C, le nombre de bactéries par granulé étant encore de 5000 à 10 000, suivant ce qui est illustré par la figure 4, les granulés étant dans les mêmes conditions que dans le cas de la figure 3. Certaines souches de Rhizobactéries (groupe Pseudomonas fluorescens - P. putida > ont un effet stimulateur de la croissance et de la protection des plantes. Lorsque l'on bactérie le système racinaire de la laitue par exemple, on peut obtenir un gain important de croissance et de rendement.L'ensemble des résultats obtenus pour diverses plantes expérimentées est indiqué dans le tableau TABLEAU BACTERISATION DES SUBSTRATS Amélloration des rendements en fonction de l'age de la plante PLANTE SUBSTRAT* % GAIN AGE MAX./TEMOIN (jours) PELARGONIUM Poids frais de la plante T66% + S33 16,0 100 Nombre de boutures id 31,4 100 Nombre de boutures T20'h + E60 t HF20% 47,4 100 LAITUE Poids frais de la feuille T100% 21,0 45 Poids frais de la feuille Te 50h + Tr 50% 19,0 53 Précocité de la pommaison id 113,0 53 CHRYSANTHEXE Hauteur de la plante E45% + t 35% + T20% 30,4 36 Nombre de feuilles étalées id 26,9 36 POMMIER (Malus x 'Evereste' > Hauteur de la plante T 75% + S 25% 44,0 45 Hauteur de la plante id 73,0 102 Hauteur de la plante id 12,0 480 Nombre de ramifications 20,4 480 POMMIER 'Golden Smothee' Poids de fruits sol naturel 11,5 1460 t LEGENDE : T : Tourbe brune E : Ecorce de pin S : Sable de Loire t : Tourbe blonde Te : Terreau maraicher HF : Fibre de bois ("Hortifibre") Tr : Terre franche. REVENDICATIONS 1 - Inoculum qui est formé de micro-organismes inclus dans un support et qui se présente sous la forme de granulés, caractérisé par le fait que les granulés comprennent les micro-organismes a inoculer, ladite matrice nourricière étant composée organismes dans lequel ceux-ci sont enrobés ; et une dégradation biologique ; et (2 > d'au moins un agent hydrorétenteur. 2 - Inoculum selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les granulés comportent en outre (c > une pellicule hydrophile protectrice entourant l'enveloppe . 3 - Inoculum selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que les micro-organismes sont apportés dans le noyau sous la forme d'une suspension. 4 - Inoculum selon l'une des revendications l à 3 présentant une concentration très élevée en microorganismes, caractérisé par le fait que la matricenourricière a constitué un milieu de culture desdites micro-organismes avant la formation des granulés. 5 - Inoculum selon l'une des revendications l a 4, caractérisé par le fait que l'extrait nutritif complet 6 - Inoculum selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l'extrait nutritif complet est un extrait à base d'algues, lesquelles sont choisies notamment parmi les espèces Fucus, Laminarla et Ascopbyllum, ledit extrait étant amené å pH 7. 7 - Inoculum selon l'une des revendications 1 a 4, caractérisé par le fait que l'extrait nutritif complet est un extrait d'origine animale. 8 - Inoculum selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que les agents hydrorétenteurs (a2) et sont constitué par des argiles, comme la bentonite, le kaolin, le talc et la vermiculite. 9 - Inoculum selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait que les agents filmogènes (b1) sont choisis parmi les alginates, le chitosan et d'autres biopolyméries. 10 - Inoculum selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que l'enveloppe 11 - Inoculum selon l'une des revendications 2 à 10, caractérisé par le fait que la pellicule (c > est constituée par une argile très hydrophile, comme la bentonite. 12 - Inoculum selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé par le fait que dans les granulés, après déshydratation, la matrice nourricière comprend de 5 à 10 g de l'extrait (a1) et de 1 à 5 g du (ou des) agent hydrorétenteur(s) (a2), pour 10 à 15 ml d'eau, et que l'enveloppe (b1) et de 5 à 20 g du 13 - Inoculum selon la revendication 12, caractérisé par le fait que sa formulation initiale est la suivante - pour la matrice nourricière (a1) et 1 à 5 g du (ou des) agent(s) hydrorétenteur(s) (a2) pour 100 ml d'eau, les micro-organismes étant présents dans ladite matrice notamment à une concentration de l'ordre de 107 à 1010 bactéries par ml d'veau pour les bactéries, et de l'ordre de 103 S 106 propagules par ml d'eau pour les champignons - pour l'enveloppe , 1-à 5 g du (ou des) agent (s) filmogène(s) (b1) et 5 à 20 g du (ou des > agent(s) hydrorétenteur(s) 14 - Inoculum selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé par le fait que les granulés se présentent sous forme d'éléments parasphériques dont le diamètre moyen du noyau est compris entre 2 et 6 mm et dont l'épaisseur de l'enveloppe 15 - Inoculum selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé par le fait que les micro-organismes sont choisis parmi les bactéries, comme Rhizobactéries, et les champignons,comme les Mycorhizes. 16 - Inoculum selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé par le fait que l'extrait nutritif dans lequel les micro-organismes sont enrobés, sert également d' enrobage à des semences. 17 - Procédé de préparation de l'inoculum tel que défini à l'une des revendications 1 à 16, dans lequel on utilise un agent filmogene capable de passer de l'état soluble a l'état insoluble, caractérisé par le fait que (A) on associe entre eux, dans un milieux aqueux, les composants du noyau des granulés de façon & obtenir un premier système de consistance pateuse on associe entre eux, dans un milieu aqueux, les composants de l'enveloppe , de façon å obtenir un second système de consistance pâteuse, dans lequel l'agent filmogène est å l'état soluble (C) on fait passer les premier et second système précités dans deux ajutages coaxiaux, le premier système, dans l'ajutage central, et le second système, dans l'espace annulaire délimité par les deux ajutages précités, de façon qu'à la sortie de ce double ajutage, on obtienne des gouttes de la matière de noyau entourée de la matière d'enveloppe CD > on fait tomber ces gouttes dans un milieu aqueux dans lequel l'agent filmogène passe à l'état insoluble, de façon à obtenir, par suite du durcissement dudit agent filmogène, des granulés dispersés dans ledit milieu si on le souhaite, on enrobe ces granulés dans de la matière de pellicule. 18 - Procédé selon la revendications 17, caractérisé par le fait qu'à l'étape 19 - Procédé selon l'une des revendications 17 et 18, caractérisé par le fait qu'avant de réaliser l'association de l'étape 20 - Utilisation de l'inoculum tel que défini à l'une des revendications 1 à 15, pour introduire dans les substrats et dans les sols, notamment pour les régénérer, des bactéries et champignons bénéfiques pour les plantes. 21 - Utilisation de l'inoculum tel que défini à l'une des revendications 1 à 15, pour inoculer des sols et des substrats à l'aide de bactéries ou de champignons pathogènes, par exemple pour étudier la résistance variétale. 22 - Utilisation de l'inoculum tel que défini a l'une des revendications 1 à 15, pour inoculer des bactéries fermentatives dans les ensilages afin d'accélérer les processus de fermentation. 23 - Utilisation de l'inoculum tel que défini a l'une des revendications 1 à 15, pour introduire des bactéries ou des levures dans des milieux agro-alimentaires ou pour reconstituer des microflores des appareils digestifs par incorporation dans les aliments ou par ingestion directe.