FR 2605408 A1 19880422 FR 8614564 A 19861020 Procédé de dosage d'oligo-éléments, notamment de métaux, dans des échantillons capillaires. L'invention concerne un procédé pour le dosage d'oligoéléments, notamment de métaux,dans des échantillons capillaires. C'est un fait reconnu que les oligo-éléments, notamment les métaux, rouent un rôle prépondérant dans le fonctionnement de l'organisme, en particulier chez l'homme. Parmi les métaux, certains sont utiles au fonctionnement de l'organisme dans lequel ils agissent essentiellement comme catalyseur, alors que d'autres sont au contraire nuisibles, voire même toxiques à l'égard de l'organisme. I1 existe donc un besoin de disposer d'un procédé permettant de doser avec précision ces oligo-éléments, à partir d'échantillons pouvant être facilement prélevés chez les patients. Les teneurs en oligo-éléments, ainsi obtenues par le procédé de dosage, permettent de déterminer d'éventuels excès ou carences en certains oligo-éléments, par comparaison avec des valeurs moyennes considérées comme normales. Les informations obtenues permettent de guider le praticien dans son diagnostic et dans le choix du traitement le plus approprié pour corriger ces éventuels excès ou carences. Par ailleurs, un tel procédé de dosage doit pouvoir être répété à intervalles sur un même patient afin de permettre de suivre l'évolution du traitement. I1 a été proposé récemment de doser les oligo-éléments sur des échantillons de cheveux, car ceux-ci ont l'avantage de stocker les métaux et également d'être faciles à prélever, par comparaison à d'autres échantillons, par exemple des échantillons de foie, dont le prélèvement ne peut être effectué que par une opération. L'invention a essentiellement pour objet un procédé de dosage d'oligo-éléments, notamment de métaux, dans des échantillons capillaires, qui présentent un certain nombre d'avantages par rapport au procédé existant. Un des buts de l'invention est de procurer un tel procédé de dosage qui soit facile à mettre en oeuvre et qui permette d'obtenir avec précision les teneurs en oligo-éléments recherchées. Un autre but de l'invention est de procurer un tel procédé de dosage qui peut être facilement automatisé. Un autre but de l'invention est de procurer un tel procédé de dosage qui permette d'obtenir rapidement les teneurs respectives d'un grand nombre d'oligo-éléments, notamment de métaux, considérés comme utiles ou bien toxiques à l'égard de l'organisme. Le procédé de l'invention comprend, pour l'essentiel, les opérations suivantes : - prélèvement des échantillons capillaires, - lavage des échantillons pour les débarrasser des contaminations extérieures, - séchage des échantillons lavés, - pesée des échantillons secs, - traitement des échantillons par une solution acide d'extraction pour obtenir des solutions d'échantillons contenant les oligo-éléments à l'état dissous, et - passage des solutions d'échantillons dans un spectrophotomètre d'émission plasma pour déterminer les teneurs en oligo-éléments des échantillons respectifs. Selon une autre caractéristique de l'invention, chaque échantillon capillaire comprend trois mèches de cheveux prélevées à l'arrière de la tête, entre les oreilles et au ras du crâne, respectivement à droite, au centre et à gauche. I1 est important que le prélèvement se fasse au niveau de la nuque car il s'agit de la zone la plus vascularisée du crâne et qui est la moins hormono-dépendante. Selon une autre caractéristique de l'invention, l'opération de lavage des échantillons comprend d'abord le lavage, puis le rinçage de chaque échantillon avec des solvants successifs, chaque échantillon étant placé dans un creuset filtrant raccordé à une trompe à vide. On obtient ainsi des échantillons parfaitement propres, c'est-à-dire débarrassés de toute contamination extérieure, qui sont ensuite séchés puis pesés, par exemple au moyen d'une balance électronique. L'invention prévoit en outre que le traitement des échantillons par la solution acide d'extraction s'effectue au moyen d'une solution acide purifiée comprenant un mélange d'acide nitrique, d'acide chlorhydrique et d'acide sulfurique dont les teneurs en oligo-éléments, notamment en métaux, sont connues. I1 est en effet indispensable de tenir compte des teneurs en oligo-éléments de la solution d'extraction pour pouvoir doser exactement la teneur en oligo-éléments des solutions d'échantillons. Selon l'invention, la détermination des teneurs en oligoélément s dans les différents échantillons à analyser est effectuée par un spectrophotomètre d'émission à plasma dans lequel le passage.des solutions d'échantillons est précédé par le passage d'une solution étalon et d'une solution blanc. La description détaillée qui suit constitue un exemple de mise en oeuvre de l'invention, donné seulement à titre illustratif. 10 Prélèvement des échantillons. On prélève 500 milligrammes à 1 gramme de cheveux à l'arrière de la tête et entre les oreilles au moyen d'une paire de ciseaux. Pour cela, on coupe trois mèches au ras du crâne, une à droite, une au centre et une à gauche de la nuque. Les trois mèches de cheveux ainsi recueillies, qui constituent un échantillon capillaire, sont alors placées dans un récipient, par exemple un sachet en matière plastique qui est envoyé au laboratoire à des fins d'analyse. 20 Préparation des échantillons. On recoupe si nécessaire les cheveux de chaque échantillon afin de conserver au maximum une longueur de 3 à 4 centimètres de cheveux à partir de la section. I1 est en effet préférable que l'analyse porte sur des cheveux d'âge récent, c'est-à-dire sur la partie des cheveux la plus proche de la racine. Les différents prélèvements ou échantillons sont ensuite numérotés de manière à les identifier en vue des opérations d 'analyse ultérieure. On prépare ensuite autant de creusets filtrants de 10 millilitres que d'échantillons à doser, en plaçant ces creusets filtrants dans un dessicateur pendant une durée d'environ 15 à 20 minutes. On numérote ensuite les creusets, puis on place chaque prélèvement dans un creuset numéroté. 30 - Lavage des échantillons. Le but de cette opération est de débarrasser les échantillons des contaminations extérieures- qui seraient susceptibles d'interférer avec les résultats des mesures. Le procédé de dosage doit en effet porter seulement sur les oligoéléments retenus dans la structure même du cheveu. Cette opération de lavage comprend d'abord le lavage proprement dit, puis le rinçage de chaque échantillon avec des solvants successifs, le creuset filtrant contenant l'échantillon à analyser étant raccordé à une trompe à vide. Dans l'exemple,le lavage proprement dit est effectué successivement avec de l'acétone, de l'éther, de l'acétone et enfin une solution de laurylsulfate de sodium. Pour cela, on procède comme suit : on recouvre tout d'abord chaque prélèvement avec environ 10 millilitres d'acétone pendant 10 minutes puis on aspire l'acétone à travers le creuset filtrant. On recouvre ensuite chaque prélèvement avec environ 10 millilitres d'éther pendant une durée de 10 minutes, puis on aspire l'éther. On recouvre ensuite le prélèvement avec environ 10 millilitres d'acétone pendant 10 minutes, puis on aspire l'acétone. Enfin, on recouvre chaque prélèvement avec environ 10 millilitres d'une solution laurylsulfate de sodium à 1% pendant 10 minutes, puis on aspire le solvant. Après le lavage proprement dit, chaque échantillon est rincé en utilisant successivement de l'eau distillée, de l'acétone et enfin de l'éther. Cette opération de rin çage comprend les phases suivantes : trois lavages successifs avec à chaque fois 10 millilitres d'eau distillée pour effectuer un rinçage complet, un rinçage avec environ 10 millilitres d'acétone pour retirer les traces d'eau et un lavage avec 10 millilitres d'éther pour retirer les traces d'acétone. I1 est important que, entre chacune des phases de lavage et de rinçage, le solvant soit aspiré complètement à l'aide de la trompe à vide. I1 faut veiller également à ce que les cheveux soient bien recouverts par le solvant au cours des différentes phases de lavage ou de rinçage. 40 - Séchage des échantillons. Les creusets filtrants contenant les échantillons respectifs sont ensuite séchés. Pour cela, on les met à l'étuve à 600C pendant environ 45 minutes puis on les laisse environ 18 heures dans un dessicateur. A l'issue de cette opération, chaque creuset filtrant contient un échantillon de cheveux propre et sec, prêt pour l'opération suivante de pesée. 50 - Pesée des échantillons. Cette opération s'effectue en pesant chaque échantillon dans un flacon, par exemple dans un erlenmeyer, préalablement lavé et séché, le poids de l'échantillon étant obtenu par différence entre le poids du flacon contenant l'échantillon et le poids du flacon vide. Avantageusement, on utilise des erlenmeyers en matière plastique, ayant une capacité de 125 millilitres chacun, et comportant une fermeture à bouchon. Chaque flacon est préalablement lavé afin d'être débarrassé de toute contamination ionique et est ensuite séché. On pèse chaque flacon avec son bouchon en utilisant une balance électronique donnant des valeurs de pesée au l/lOème de milligramme. On introduit ensuite dans chaque flacon un échantillon capillaire provenant d'un des creusets filtrants puis on pèse le flacon renfermant l'échantillon capillaire ainsi que son bouchon, au moyen de la même balance. On obtient par différence la masse M de l'échantillon qui servira de référence pour l'expression des résultats. 60 - Extraction des oligo-éléments Cette opération a pour but d'extraire les oligo-éléments présents dans l'échantillon capillaire à analyser. Cette opération s'effectue au moyen d'une solution acide d'extraction qui est mise en contact avec l'échantillon pendant une durée suffisante pour dissoudre complètement les cheveux et mettre ainsi en solution les oligo-éléments à doser. La solution acide d'extraction est une solution acide purifiée comprenant un mélange d'acide nitrique, d'acide chlorhydrique et d'acide sulfurique dont les teneurs en oligo-éléments, notamment en métaux, sont connues. Ces teneurs sont indiquées habituellement par le fabricant sur le flacon du produit. Dans l'exemple, on utilise une solution d'extraction comprenant 10 millilitres d'acide nitrique, 2 millilitres d'acide chlorhydrique et 6 gouttes, soit 0,03 millilitre, d'acide sulfurique. L'acide sulfurique est concentré à 95-97%, l'acide chlorhydrique à 37% au moins et l'acide nitrique à 65%. Dans chaque erlenm?yer contenant un échantillon de produit à doser, on introduit successivement l'acide nitrique, l'acide chlorhy drique et l'acide sulfurique, ce qui représente en tout 12,03 millilitres de solution. On laisse agir cette solution pendant une durée d'environ 6 à 12 heures. Pendant la première heure, on effectue plusieurs agitations pour recouvrir les cheveux de la solution d'acide. L'agitation s'effectue par exemple au moyen d'un agitateur magnétique avec une vitesse de rotation de 2800 tours par minute. Au bout de cette période de 6 à 12 heures, les cheveux et les oligo-éléments qu'ils contiennent sont complètement dissous au sein de la solution d'extraction. Cette solution constitue ainsi une solution d'échantillon qu'il convient de diluer avant de la soumettre à analyse. 70 - Dilution de la solution pour l'analyse. La concentration de la solution à analyser doit avoir une teneur inférieure à 20% pour pouvoir être correctement analysée. On ajoute alors 36 millilitres d'eau bidistillée dans chaque erlenmeyer contenant déjà 12,03 millilitres de solution à analyser. 8" - Préparation de la solution étalon et de la solution à blanc. Le passage des solutions d'échantillons dans le spectrophotometre d'émission à plasma doit être précédé par le passage d'une solution étalon et d'une solution à blanc. La solution étalon contient une concentration connue des différents oligo-éléments à doser, tandis que la solution à blanc ne contient aucun de ces oligo-éléments. Pour préparer une solution étalon, on introduit dans un ballon gradué de 100 millilitres 1 millilitre des solutions standards des différents métaux à doser, chaque solution standard contenant 1 milligramme de métal par millilitre. Dans cet exemple où l'on dose 23 métaux, on ajoute 23 solutions standard de 1 millilitre chacune, soit 23 millilitres en tout. La concentration finale de chaque métal sera de 10 microgrammes par millilitre ou 10 000 microgrammes par litre, lorsque le contenu du ballon gradué aura été complété à 100 millilitres. Pour réaliser ce complément, on ajoute de la solution acide d'extraction et de l'eau distillée dans les mêmes proportions que pour les échantillons. La solution étalon comprend ainsi une concentration connue des différents oligo-éléments à doser, ainsi que la solution acide d'extraction et de l'eau distillée, la solution acide d'extraction et l'eau distillée étant présentes dans les mêmes proportions que dans les solutions d'échantillons. Pour préparer la solution à blanc, on introduit dans un ballon gradué de 100 millilitres uniquement de la solution acide d'extraction et de l'eau distillée, cela toujours dans les mêmes proportions que dans les solutions d'échantillons. 90 - Dosage des oligo-éléments Pour réaliser ce dosage, on utilise un spectrophotomètre d'émission à plasma de type ICP 6500 commercialisé par la firme Perkin-Elmer. I1 s'agit d'un appareil programmable capable d'effectuer des dosages de métaux en série et cela sur une multiplicité d'échantillons qui passent dans l'appareil après la solution étalon et la solution à blanc. Cet appareil comprend un dispositif capillaire qui est prévu pour prélever les solutions à analyser. On introduit donc ce dispositif capillaire successivement dans la solution étalon, la solution à blanc et enfin les différentes solutions d'échantillons à analyser. I1 est à noter que cette opération pourrait être remplacée par l'utilisation d'un passeur automatique d'échantillons. 100 - Programmation du spectrophotomètre d'émission à plasma. Le spectrophotomètre d'émission à plasma ICP 6500 de la firme Perkin-Elmer est un appareil programmable qui présente plusieurs modes de fonctionnement, notamment un mode "méthode" permettant de sélectionner les séquences de métaux à analyser. On sélectionne les séquences des métaux choisis pour le.mode "méthode. Pour chacun des métaux sélectionnés, on détermine au préalable la longueur d'onde la plus sensible ainsi que l'intervalle de mesure et la correction du bruit de fond ou "fond" pour le mode "graphique" à partir d'une solution standard à 10 000 microgrammes par litre préparée dans la solution d'analyse. On intègre ensuite ces informations ainsi que l'unité de concentration du standard (microgramme par litre) pour le mode "élément". On donne un code personnalisé à chacun des éléments standard ainsi définis et on rappelle, au niveau du mode "méthode", les codes des différents éléments sélectionnés. La méthode de programmation ainsi définie par l'appareil sera déterminée par une succession de longueurs d'ondes et d'intervalles de mesure spécifiques à chaque méthode mesurée. La programmation du spectrophotomètre d'émission à plasma s'effectue conformément au manuel d'instruction de l'appareil et il n'apparait pas utile de donner ici plus de détails sur la programmation de l'appareil qui ne fait pas partie de l'invention. 11" - Analyse des échantillons Lors de l'analyse, le monochromateur du spectrophotomètre s'arrêtera sur chacune des longueurs d'ondes présélectionnées et mesurera la variation d'intensité lumineuse correspondant à chaque métal sélectionné. Cette mesure s'effectuera successivement pour la solution étalon, la solution à blanc et les solutions d'échantillons. Avec un tel appareil, il est possible de doser, dans chaque échantillon, et de façon simultanée, un grand nombre de métaux préselec- tionnés, ce qui n'est pas possible avec un spectrophotomètre à absorption. 120 - Résultat de l'analyse Le spectrophotomètre comprend une imprimante sur laquelle seront donnés les résultats bruts en microgrammes par litre de solution pour chaque métal. Si x désigne cette concentration en microgramme par litre, V le volume de solution soumis à l'analyse, exprimé en litres, M la masse de l'échantillon capillaire en grammes, la quantité de métal q en microgrammes par gramme de cheveux sera donnée par la formule : q = x(V/M). On pourra ainsi exprimer pour chaque échantillon les quantités de métaux dosées, ces quantités étant exprimées à chaque fois en microgrammes par gramme d'échantillon capillaire. A titre d'exemple, le spectrophotomètre peut être programmé pour doser simultanément 23 oligo-éléments - 15 oligo-éléments "utiles" : calcium, cobalt, chrome, cuivre, fer, magnésium, manganèse, molybdène, nickel, or, phosphore, sélénium, silicium, vanadium et zinc; - 8 oligo-éléments "toxiques" : aluminium, antimoine, arsenic, baryum, cadmium, mercure, plomb et tungstène. Ces résultats pourront être exprimés sur une même feuille indiquant en regard de l'identification de l'oligo-élément considéré - les valeurs normales ou normes de concentration de cet oligo-élément exprimées en microgrammes par gramme de cheveux, ces valeurs normales étant le plus souvent indiquées sous forme d'un intervalle, - la valeur mesurée exprimée en microgrammes par gramme de cheveux, - l'écart entre la valeur mesurée et la valeur normale, cet écart étant exprimé en valeur positive ou négative. En outre, il pourra être intéressant de faire figurer sur cette feuille de résultats les rapports en différents oligo-éléments avec, en regard,les valeurs normales, les valeurs mesurées et les écarts correspondants. A titre d'exemple, il peut être utile de considérer les rapports calcium/magnésium, calcium/zinc, calcium/fer, calcium/ manganèse, zinc/cuivre, cuivre/fer et fer/manganèse. Le cas échéant, les résultats pourront être présentés également sous forme de tableaux graphiques faisant appa raître les carences et excès éventuels de tel ou tel oligoélément par rapport à la valeur moyenne correspondante. Ces résultats pourront être présentés, le cas échéant, avec un calcul d'erreur. Ce calcul d'erreur tiendra compte de la qualité de la précision de la balance utilisée et de la sensibilité du spectrophotomètre, étant à noter que cette sensibilité est différente pour chaque métal. Revendications. 1. Procédé de dosage d'oligo-éléments, notamment de métaux, dans des échantillons capillaires, caractérisé en ce qu'il comprend les opérations suivantes - prélèvement des échantillons capillaires, - lavage des échantillons pour les débarrasser des contaminations extérieures, - séchage des échantillons lavés, - pesée des échantillons secs, - traitement des échantillons par une solution acide d'extraction pour obtenir des solutions d'échantillons contenant les oligo-éléments à l'état dissous, - passage des solutions d'échantillons dans un spectrophotomètre d'émission à plasma pour déterminer les teneurs en oligo-éléments des échantillons respectifs. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que chaque échantillon capillaire comprend trois mèches de cheveux prélevées à l'arrière de la tête, entre les oreilles et au ras du crâne, respectivement à droite, au centre et à gauche. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'opération de lavage des échantillons comprend d'abord le lavage puis le rinçage de chaque échantillon avec des solvants successifs, chaque échantillon étant placé dans un creuset filtrant raccordé à une trompe à vide. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le lavage proprement dit est effectué successivement avec de l'acétone, de l'éther, de l'acétone et une solution de laurylsulfate de sodium. 5. Procédé selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que le rinçage est effectué successivement avec de l'eau distillée, de l'acétone et de l'éther. 6. Procédé selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que les creusets filtrants, contenant les échantillons respectifs, sont ensuite mis à l'étuve et conservés en dessicateur pour réaliser le séchage des échantillons. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que chaque échantillon est pesé dans un flacon, par exemple dans un erlenmeyer préalablement lavé et séché, le poids de l'échantillon étant obtenu par différence entre le poids du flacon contenant l'échantillon et le poids du flacon vide. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la solution acide d'extraction est une solution acide purifiée comprenant un mélange d'acide nitrique, d'acide chlorhydrique, et d'acide sulfurique dont les teneurs en oligo-éléments, notamment en métaux, sont connues. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la solution comprend 10 millilitres d'acide nitrique à 65%, 2 millilitres d'acide chlorhydrique à 37% au moins et 0,03 millilitre d'acide sulfurique à 95-97%. 10. Procédé selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que chaque échantillon est recouvert de la solution d'extraction pendant une durée d'environ 6 à 12 heures, avec agitation pendant la première heure. 11. Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que la solution d'échantillon obtenue après extraction est ensuite diluée à l'eau distillée pour que la concentration de la solution à analyser ait une teneur inférieure à 20%. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le passage des solutions d'échantillons dans le spectrophotomètre d'émission à plasma est précédé par le passage d'une solution étalon et d'une solution à blanc. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la solution étalon comprend une concentration connue des différents oligo-éléments à doser, ainsi que la solution acide d'extraction et de l'eau distillée, la solution acide d'extraction et l'eau distillée étant présentes dans les mêmes proportions que dans les solutions d'échantillons. 14. Procédé selon l'une des revendications 12 et 13, caractérisé en ce que la solution à blanc comprend la solution acide d'extraction et l'eau distillée dans les mêmes proportions que dans les solutions d'échantillons. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le spectrophotomètre est programmé pour doser des oligo-éléments utiles tels que calcium, cobalt, chrome, cuivre, fer, magnésium, manganèse, molybdène, nickel, or, phosphore, sélénium, silicium, vanadium et zinc et des oligo-éléments toxiques tels que : aluminium, antimoine, arsenic, baryum, cadmium, mercure, plomb et tungstène.