FR 2620122 A1 19890310 FR 8712260 A 19870903 PROCEDE D'OBTENTION PAR VOIE CHIMIQUE D'QLIGONUCLEOTIDES MARQUES ET APPLICATIONS BIOLOGIQUES. L'invention a pour objet un procédé de synthèse chimique d'oligonucléotides marqués et les applications biologiques de ces oligonucléotides comme sondes froides. Elle vise plus spécialement la synthèse de fragments d'ADN, complémentaires de fragments d'ADN ou d'ARN de séquences connues, utilisables commme sondes d'hybridation. Pendant de nombreuses années, on a utilisé, pour la détection de séquences de gènes, des sondes marquées avec des radioisotopes, appelées sondes chaudes. Or si l'autoradiographie constitue une méthode assez sensible, cette technique s' avère longue, coûteuse et présente les défauts et les risques liés à la manipulation de produits radioactifs. Au cours de ces cinq dernières années, on a vu se développer un intérêt croissant pour la recherche de méthodes de détection de séquences d'acides nucléiques mettant en jeu des sondes, dites sondes froides, ne comportant pas d'éléments radioactifs. Ainsi, plusieurs kits de marquage enzymatique des sondes oligonucléotidiques par des nucléotides triphosphates biotinylés sont déjà commercialisés. La détection de telles sondes biotinylées se fait par des systèmes enzymatiques, tels que la peroxidase, la phosphatase alcaline, ou la galactosidase, ou des systèmes colorimétriques par fluorescence ou chimioluminescence, couplés à de la streptavidine, protéine de très forte affinité pour la biotine. On conçoit l'intérêt de disposer, pour assurer des détections de grande sensibilité, de sondes de compositions définies, marquées de manière contrôlée, en des sites déterminés. Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont amenés à développer une stratégie permettant d'améliorer la synthèse de sondes froides. Cette stratégie est basée sur l'incorporation, au cours de la construction de la séquence oligonucléotidique, de nucléosides modifiés, à la place des bases classiques dans la séquence. Les bases modifiées permettent alors d'introduire des chaînes de substitution sur lesquelles seront fixés les marqueurs, tout en gardant les memes possibilités de liaison hydrogène que les bases usuelles. L'invention a donc pour but de fournir un procédé d'obtention d'oligonucléotides par synthèse chimique, permettant l'incorporation de motifs marqués en un ou plusieurs sites et ce, de façon déterminée. Dans la description et dans les revendications, les motifs de la séquence faisant l'objet du procédé de synthèse seront identifiés en désignant leur base. Ces motifs peuvent être aussi bien des nucléosides que des nucléotides, et comporter comme sucre un ribose et/ou un déoxy-2 ribose. D'une manière générale, il est fait référence à la synthèse d'oligodésoxynucléotides mais il va de soi que le procédé de l'invention couvre également la synthèse des oligoribonucléotides correspondants. Le procédé de synthèse par voie chimique selon l'invention est caractérisé par les étapes suivantes - on incorpore, lors de la synthèse chimique en phase solide de la séquence oligonucléotidique à construire, à la place d'une ou plusieurs cytosines prévues sur la séquence, respectivement une ou plusieurs thymines dont la position 4 est substituée par un groupe activateur, - on fait réagir la séquence oligonucléotidique construite avec un composé de formule R-A-R' dans laquelle R R et R', sont identiques et représentent un groupe -NH2, -SH ou -OH, ou R et R' sont différents, l'un représentant un groupe -NH2, SH ou -OH, l'autre un groupe -NH-X, S-X ou -O-X, dans lequel X est un groupe capable de servir de marqueur pour la molécule ; et A représente une chaine alcoyle de 4 à 20 atomes de carbone environ, comportant le cas échéant des hétéroatomes, tels que 0, N ou S ce qui conduit à l'obtention de méthyl-5-cytosine(s) avec une chaine de substitution en position 4, à la place de la ou des thymines activées, et lorsque le composé R-A-R' ne renferme pas de groupe marqueur, - on introduit un groupement marqueur sur la chaîne de substitution des méthyl-cytosines. On observera que le remplacement d'une cytidine par une thymidine activée permet de mettre en place, dans la séquence en construction, le motif destiné à être marqué. Les produits obtenus sont donc parfaitement définis en ce qui concerne leur structure et leurs substitutions et ce, contrairement aux oligonucléotides marqués obtenus par les synthèses enzymatiques classiques dans lesquels les nucléotides sont incorporés de façon non contrôlable à partir d'un primer. De plus, le motif incorporé peut être substitué avec une grande souplesse par des chaines de structures variées, ce qui permet de fixer divers marqueurs et d'obtenir à partir d'une seule séquence activée plusieurs sondes comportant des chaines différentes ou des marqueurs différents. Le procédé de synthèse selon l'invention présente également l'intérêt de conduire à des oligonucléotides dans lesquels les extrémités 5'OH et 3'OH restent libres. Il est ainsi possible, par exemple, de les insérer dans des vecteurs biologiques. Un autre avantage de ce procédé réside dans la possibilité de son automatisation permettant une construction rapide, à faible coût, de grandes quantités de fragments d'ADN. L'étape d'incorporation des motifs thymine activés en position 4 est effectuée au cours de la construction de la séquence oligonucléotidique. Cette séquence est construite en couplant successivement, à partir d'un premier nucléotide, ou nucléoside, fixé sur un support solide, les motifs de la séquence recherchée et en remplaçant, comme souhaité, un motif cytosine par un motif thymine activé en position 4. L'expression "support solide" recouvre tout support qui peut rester insoluble dans au moins un milieu déterminé susceptible de contenir des acides nucléiques en solution. De nombreux supports peuvent être utilisés. Il s'agit par exemple de polymères organiques de silice ou de billes de verre. Ces supports sont avantageusement traités au préalable (fonctionnalisation) afin de leur conférer des groupements fonctionnels susceptibles d'etre mis en jeu dans une réaction de fixation d'une molécule distincte, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un bras. Des supports de ce type sont disponibles dans le commerce. Il s'agit par exemple des gels de type polyacrylmorpholide, par exemple ceux commercialisés sous la désignation "ENZACRYL K-2". On citera également les polyacrylamides, polystyrènes ou cellulose. Le couplage des nucléosides, ou des nucléotides, est effectué motif par motif, ou par groupes de nucléotides. Pour la constitution de la séquence, on a avantageusement recours aux méthodes connues d'allongement de chaines de nucléotides en phase solide, en particulier les méthodes dites aux phosphotriesters ou aux phophoramidites. Des techniques de ce type sont décrites par exemple dans les références bibliographiques (1) à (6), données en fin de description. La condensation est effectuée en présence d'un agent de couplage, de préference utilisé en excès. L'étude des rendements de couplage montre que la condensation de motifs thymidine activés ne s'accompagne pas d'une baisse sigificative de ces derniers. L'activation de la position 4 de la thymine comprend la fixation, sur ce sommet, d'un dérivé hétérocyclique du type triazole, nitro-triazole ou tétrazole, imidazole. Un groupe activateur préféré, permettant de disposer aisément d'une thymine activée comme souhaité, est constitué par le groupe 1,2,4-triazolyle. Sa fixation sur la thymine est réalisée en opérant, par exemple, selon l'une des techiques décrites dans (7), (8) ou (9). D'autres modes d'activation du sommet 4 des thymines peuvent être utilisés, par exemple à l'aide d'un chlorure d'acide, selon les techniques décrites dans (10) et (11). Dans la deuxième étape du procédé de l'invention, on fait réagir la séquence oligonucléotidique synthétisée, qui renferme, au(x) site(s) souhaité(s), un motif thymine activé, avec un composé de formule R-A-R'. On utilise avantageusement un composé bifonctionnel tel qu'un diaminoalcane, un glycol ou un a, w-aminoalcool. Des diaminoalcanes appropriés comprennent l'éthylène-diamine, le diamino 1-6 hexane, le diamino 1-10 décane ou la spermine. La substitution des thymines activées par un diaminoalcane est réalisée dans un solvant organique tel que la pyridine, de préférence avec un excès diamine. Les séquences oligonucléotidiques obtenues, renfermant les motifs méthyl-cytosine substitués sont décrochées du support sur lequel elles étaient fixées durant leur construction et sont débloquées. On utilise avantageusement les méthodes classiques d'élimination des groupes protecteurs des bases et des phosphates mises en oeuvre en synthèse en phase solide. Les groupes phosphates sont plus spécialement débloqués en utilisant par exemple du TMGPAO, puis de l'ammoniaque concentré, En opérant à température ambiante, on laisse agir le TMGPAO durant environ 14 heures. L'action de l'ammoniaque concentrée est réalisée avantageusement à une température supérieure à l'ambiante, de préférence de l'ordre de 50'C durant 2 à 7 heures environ, notamment 5 heures environ. Les fragments d'ADN sont ensuite purifiés par passage sur une ou plusieurs colonnes échangeuses d'ions, puis déprotégés, par exemple à l'aide d'acide acétique et, de préférence, à nouveau purifiés. Lorsque la chaîne de substitution ne comporte pas de groupe marqueur, on fait réagir la séquence oligonucléotidique, comportant le ou les motifs méthylcytosine substitués par une chaîne en position 4, avec un groupe capable de servir de marqueur pour la molécule. Parmi les groupes habituellement utilisés, on citera les peptides, les haptènes, des groupement colorés ou fluorescents tels que la rhodamine, le fluorescéine ou le dansyl, ou encore des enzymes telles que la phosphatase ou la peroxydase. Des marqueurs préférés sont constitués par des peptides, et sont couplés avec des oligonucléotides comportant des chaînes -de substitution à terminaison amino. La biotine est plus spécialement utilisée sous forme activée, par exemple sous forme d'ester de biotinyl-N-hydroxysuccinimide. La biotinylation des oligonucléotides aminés est réalisée, de préférence, en soumettant ces oligonucléotides, en milieu basique, à l'action de la biotine sous forme activée, dans un solvant organique du type DMF. Les oligonucléotides sont ainsi plus spécialement en solution dans un tampon de pH de 8 à 10 environ, de préférence de 9. La réaction est réalisée avantageusement avec un excès de biotine activée. La concentration en oligonucléotide est dans un rapport de 10-3/1 environ par rapport à celle de la biotine activée. La température de la réaction ne dépasse pas l'ambiante et peut varier d'environ O'C à 25 C. des résultats satisfaisants sont obtenus en maintenant le mélange réactionnel de 3 à 8 heures, de préférence environ 6 heures, à une température voisine de l'ambiante, puis de 8 à 20 heures, de préférence environ de 12 à 14 heures à une température voisine de O'C. Les fragments d'ADN marqués obtenus selon l'invention sont purifiés en vue de leurs applications biologiques. L'élimination des sels formés lors de la synthèse est avantageusement réalisée à l'aide d'une ou plusieurs colonnes de résines échangeuse d'ions ou de Séphadex ou Biogel. D'autres caractéristiques et avantages de 1 'in- vention sont donnés dans les exemples qui suivent relatifs à la préparation de sondes d'ADN biotinylées utilisées pour la détection du gène cloné de l'antithrombine III. Les abréviations utilisées dans les exemples présentent les significations suivantes tT : 2'-désoxythymidine substituée par un groupe 1,2,4-triazole en position 4, DMTr : diméthoxytrityle, DMTrTP : thymine protégée en 5' par un groupe diméthoxytrityle et substituée en 3' par un groupe &commat; de formule TPSNT : triisopropyl -2,4,6 benzène sulfonyl nitro-3 triazole -1,2,4, TMGPAO : pyridine-aldoximate-tétraméthyl guanidine DCCI : dicyclohexyl carbodiimide DCU : dicyclohexyl urée BNHS : biotinyl N hydroxysuccinimide TEAB : bicarbonate de triéthyl ammnonium Exemple 1 Synthèse de sondes biotinylées complémentaires d'un fragment d'ADN-c de l'antithrombine III humaine (ou AT III). Des expériences précédentes des inventeurs ont permis d'isoler, à l'aide de sondes marquées enzymatiquement en 5' au 32p, de l'ADN-c de l'AT III inséré dans des plasmides. Ces ADN-c ont été séquencés et la séquence de l'ARN-m correspondant à été décrite. Connaissant cette séquence, les trois sondes biotinylées suivantes ont été synthétisées manuellement, en phase solide, par la méthode au phosphotriester * sonde 1 3' TAC TAC ATG GTC CTT C (B)5, (5'Biot) sonde sonde 2 3 TAC TAC (B) ATG GTC CTT C (3'Biot) sonde sonde 3 3 TAC TAC (B) ATO GTC CTT C (B)5' (5',3' Biot) C = 5 méthyl, 2'-déoxycytidine Biot = biotinyle B = (NH -(CH2)10-NH-Biot) en position 4 de C Cette synthèse comprend trois étapes 1) La synthèse chimique d'une séquence d'ADN triazolée, 2) la substitution des groupements 1,2,4-triazolyl des tT pas de la décanediamine, 3) la biotinylation des séquences d'ADN aminées. Ces étapes sont réalisées comme suit pour synthétiser la sonde 1 1) Svnthèse chimique d'une séquences d'ADN triazolée On utilise comme support une résine du type polyacrylamide telle que celle commercialisée sous la marque Enzacryl K2 dont le taux de substitution en thymidine est de 130 pmoles par gramme de support. Le tauxde substitution du support, c'est-à-dire la quantité du premier nucléoside fixé au support, est évalué par dosage en UV à 507 nm du cation DMT libéré par traitement acide (acide benzène sulfonique à 2 %) dans un mélange CH2Cl2/CH30H : 70-30 Synthèse des motifs t T selon le schéma 1 Schéma I 4g de thymidine entièrement protégée DMTr (5,07 mmoles) sont coévaporés dans la pyridine avec (20,3 mmoles) de 1,2,4-triazole. Le résidu est dissous dans 25 ml de pyridine distillée et le ballon est placé dans un bain de glace. 2,5g (10,14 mmoles) d'o-chlorophényl phosphodichloridate sont ajoutés et le milieu réactionnel est soumis à agitation pendant 10 minutes à 0iC,puis 48 heures à température ambiante. Après évaporation à sec, le résidu est repris par du CH2Cl2, lavé au NaHC03 concentré, rincé à l'H20 jusqu'à pH neutre, séché sur Na2S04, filtré puis évaporé. Le produit est dissous dans un minimum de CH2Cl2 et reprécipité trois fois dans l'éther de pétrole. Après plusieurs purifications sur colonnes de silice et sur colonne de Séphadex LH20R, on obtient 1,7g de DMTr(t)TP (Rdt mince (CH2Cl = MeOH:95-5) 40 %). Chromatographie en couche mince (CH2Cl2, MeOH:95-5) Rf = 0,48. Synthèse de la séquence d'ADN triazolée DMTr 120 mg de support soit 15,5 moles sont détritylés par de l'acide benzène sulfonique (ABS) à 2 %. Le nucléoside DMTrCAP (6 éq) est décyanoéthylé par un mélange de triéthylamine-pyridine-H20:1-3-1 (TPE) pendant 20 minutes, puis activé par 18 éq. de TPSNT et couplé sur la fonction 5'OH de la thymidine fixée sur le support. Le rendement du couplage a été évalué par dosage en UV à 507 nm du cation DMT+ libéré par traitement avec l'acide benzène sulfonique. Il est de 100 % pour ce premier couplage. Les rendements des couplages des nucléosides suivants sont : DMTrCAT (59 ) ; DMTrGTA (65 ') DMTrCTG (86 %) ; DMTrTTC (93 %). 2) Substitution des groupements 1.2,4 triazolvl des t T présentes dans les séquences par de la décanediamine selon le schéma 2 suivant schéma 2 /NH2 /r ( CH2), o I CH3 CH3 Aí 3 w 0 É(CH3 5 NH2-(CH2) 1ONH2 *0 eq.) À rcoJ NHI (CH2)IO NH2 (10 eq.) 1 120n Pyr id ine o o O = IP~04 =IILQU 9 61 mg de résine (7,9,umoles) sont mis en suspension dans 610 pl (10 éq) d'une solution 120 mM de décanediamine dans la pyridine. Le milieu réactionnel est conservé à température ambiante pendant au moins 2 jours. La résine est alors essorée puis rincée à la pyridine pour éliminer toute trace de diamine restante. Les séquences aminées sont alors décrochées du support et débloquées par les méthodes classiques utilisées en synthèse en phase solide. Les oligonucléotides sont débloqués par addition de 1,1 ml (1,1 mmoles) d'une solution de TMGPAO 1 M dans un mélange eau-dioxane : 1/1. On utilise 10 éq. de TMGPAO par phosphate à débloquer ; soit pour la séquence d'ADN ci-dessus 150 éq. de TMGPAO 1 M. Après une nuit à température ambiante, le milieu réactionnel est évaporé à sec. On ajoute 3 ml d'ammoniaque concentrée (20 %) et l'on chauffe à 50C pendant 5 heures. La résine est alors filtrée, rincée et le jus est concentré puis déposé sur une colonne de résine Dowex NH4+R éluée avec H20. Le produit est lyophilisé, puis purifié au stade DMTr par HPLC sur une colonne Nucléosi préparative avec un gradient de 5 à 25 % ou de 5 à 50 % d'acétonitrile dans un tampon d'acétate de triéthyl ammonium 10 2 M en 20 minutes. Les séquences sont détritylées dans de l'acide acétique à 80 % dans H20 pendant 20 minutes à température ambiante. L'acide est alors évaporé puis entraîné par 2 ou 3 coévaporations au toluène. Le résidu est dissous dans H20, lavé à l'éther éthylique puis concentré. Les Les produits, entièrement déprotégés, nouveau purifiés par HPLC sur une colonne Nucléosi préparative, puis vérifiés sur une colonne Nucléosi analytique. 3) Biotinylation des séquences d'ADN aminées Synthèse de l'ester de biotinyl , N-hydroxysuccinimide : (B.N.H.S.) Le protocole utilisé a été décrit par BAYER et WILCHEK dans Methods in Enzymol. (1974), 34, 265-7. A une solution de 250 mg de biotine (1 mmole) dans 3 ml de DMF passé sur alumine sont ajoutés 150 mg (1,3 éq.) de N-hydroxysuccinimide et 412 mg (2 éq.) de DCCI. Le milieu réactionnel se présente sous forme d'une suspension blanche qui est chauffée une demi-heure à 50'C puis gardée 20 heures sous agitation à température ambiante. Le précipité de dicyclohexyl urée formé est filtré et le filtrat est entreposé environ 14 heures à O'C. La partie insoluble de DCU formée est ensuite filtrée et le filtrat est concentré . Le BNHS est recristallisé dans un grand volume d'isopropanol. 271 mg de produit sont obtenus, soit un rendement d'estérification de 77,6 %. Biotinylation des sondes aminées selon le schéma 3 suivant Schema 3 (CH ) (CH2) 10 2 10 NH /CH 2 É CH3 I / o 5'O O '' o po0 \sÊC2)4-Co-N h Tampon 470 eq. NaHC03pH9 DMF 1 DO de sonde aminée est disssoute dans un mélange de 200 ijl d'H20 et de 100 pl de tampon NaHC03 pH 9. 1 mg (2,93 moles) d'ester de biotinyl, N-hydroxysuccinimide sont ajoutés dans 40 tjl de DMF. Après 6 heures à température ambiante et une nuit à O'C, le DMF est évaporé ete produit est déposé sur une colonne de Séphadex GIR J éluée avec un tampon de TEAB 0,05 M. Les sondes sont ensuite purifiées par HPLC sur colonne Nucléosi W analytique ou préparative. En fin de purification, les oligonucléotides sont échangé sous forme ammonium sur une colonne Dowex 50 W NH+R, puis vérifiés par HPLC sur colonne Nucléosianalytique. Les rendements de biotinylation sont de 21 % à 23 % ; 5' Biot = 3,18 DO. Exemple 2 On prépare les sondes 2 et 3 en Opérant comme indiqué ci-dessus. Sonde 2 3' NH2 = 5,23 DO 3' Biot = 1,124 DO Rdt = 21,5 Sonde 3 5'3' NH2 = 1 DO 5'3' Biot = 0,228 DO Rdt = 22,8 % Exemple 3 : Révélation de Dot Blots de sondes biotinylées. Les sondes décrites ci-dessus ont été utilisées pour éprouver l'efficacité de deux kits de détection de l'ADN biotinylé commercialisés par la société BRL 1. Products for Nucleic Acid Detection, ref. 8239 SA 2. Blu GENETM, ref. 8279 SA. La très forte affinité de la biotine pour les protéines avidine ou streptavidine est à la base de la mise au point de ces deux méthodes de détection enzymatique. Les premières révélations ont été faites sur des dot blots de sondes biotinylées. Les sondes sont déposées à différentes concentrations (de 100 pmoles à 0,5 fmole)sur de la nitrocellulose puis fixées par passage au four à 80iC pendant 1 heure. Les filtres sont bloqués par de l'albumine de sérum bovine à 3 dans un tampon 0,1 M tris-HCl (pH 7,5 ; 0,15 M NaCl à 55 C pendant 2 heures. Suivant le kit de détection employé, la révélation se fait en deux ou trois étapes. Le premier kit de détection commercialisé 1 suit un protocole en 3 étapes 1. couplage avec la streptavidine; 2. couplage avec la phosphate alcaline biotinylée; 3. réaction enzymatique colorée avec le nitroblue tetrazolium (NBT) et le 5 bromo-4-chloro-3indonyl phosphate (BCIP). Des signaux amplifiés peuvent être obtenus grâce à la propriété de la streptavidine de lier 4 molécules de biotine. Le second kit 2 se fait en deux étapes 1. couplage avec la streptavidine-phosphatase alcaline, 2. réaction enzymatique colorée avec le NBT et le BCIP. L'intensité des révélations est appréciée visuellement. Chaque révélation de sondes biotinylées synthétiques est menée en parallèle avec la révélation d'ADN biotinylé enzymatiquement, fourni par BRL, et déposé à différentes concentrations sur de la nitrocellulose, ce qui permet d'éprouver la sensibilité de chaque détection d'ADN. Des quantités de 50 fmoles d'ADN de sondes biotinylées déposées sur de la nitrocellulose ont été révélées. Hybridation des sondes avec de l'ADN immobilisé sur nitrocellulose. Préparation des filtres de nitrocellulose. De l'ADN plasmidique cible dans lequel sont insérés 1.6 kb correspondant à l'ADN-c de l'AT III et de l'ADN contrôle de pBR 322 ont été déposés sur nitrocellulose : ces ADNs préalablement linéarités par l'enzyme de restiction HindIII ont été dilués de 2 en 2 pour obtenir une gamme de concentrations variant de 10 ijg à 0,01 pg, dénaturés par chauffage 10 minutes à 100'C et additionnés de 0,5 M NaOH 20 minutes à température du laboratoire puis neutralisés dans la glace avec 0,3 M HCl, 0,3 M NaCl, 0,15 M Tris HCl pH 8, 0,1 M citrate de sodium. 7,5 ijl de chaque dilution ont été déposés sur nitrocellulose. Les filtres ont été séchés 1 heure à l'air libre, puis 2 heures au four à 80'C. Hybridation Des filtres de nitrocellulose ont été préhybridés 2 heures à 37 C en 6 x NET (1 x NET = 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris HCl, pH 7,5, 0,001 M EDTA), 5 x Denhardt's (100 Denhardt's 0,02 Ó sérum albumine bovine, 0,02 % polyvinyl pyrolidone, 0,02 Ó ficoll), 5 50 sulfate de dextran , 0,1 % SDS et 100 ijg par ml d'ADN soniqué de sperme de saumon. L'hybridation a été effectuée 20 heures à 37 C dans la même solution contenant soit 106 cpm par ml de sonde marquée en 5' au L P] par la polynucléotide kinase, soit 100 ng par ml de sonde biotinylée.Les filtres ont été lavés 3 fois 15 minutes en 6SSC à 4C et 1 fois 5 minutes à 40*C puis soumis à une autoradiographie ou à une réaction colorée. Le procédé de l'invention permet d'obtenir, par voie chimique, des oligonucléotides utilisables comme sondes de détection de séquences complémentaires d'acides nucléiques. On notera à cet égard que la limite de détection avec le kit streptavidine-phosphatase alcaline est de l'ordre de 15 fentomoles. Ces sondes revêtent également un grand intérêt pour la séparation d'un polynucléotide complémentaire contenu dans une solution amenée au contact de cette molécule supportée, la détection ou la séparation étant mise en oeuvre dans des conditions autorisant leur hybridation mutuelle. Grâce à la formation d'un double brin sur le support il est également possible de purifier des protéines donnant lieu à une interaction avec un fragment d'ADN. Les inventeurs ont constaté que lorsqu'on introduit le groupement marqueur du côté 5', on obtient un duplex plus stable à l'hybridation que lorsque ce groLpement se trouve du côté 3'. BIBLIOGRAPHIE (1) H. Koster et Coll., Tetrahedron, 40,103, 1984. (2) H. Caruthers et Coll., Tetrahedron Letters, 21 719, 1980. (3) M.J. Gait et Coll., Nucleic Acids Research, 10, 6243, 1982. 54) K. Itakura et Coll., Nucleic Acids Research, 8, 5507 1980. (5) A. Rosenthal et Coll. Tetrahedron Letters, 24, 1691 1983. (6) C.K. Brush et Coll.Nucleic Acids Research, 10, 6295, 1982. (7) C.B. Reese et Col., Tetrahedron Letters, 21 2265,1980 (8) W.L. Sung, J.Org. Chem., 47, 3623, 1982. (9) C.B. Reese et Coll., Nucleic Acids Research, Symposium Series 7, Koster Editor, p. 5. (10)C.B. Reese et Coll., Tetrahedron Letters, 22, 4755, 1981. (11)R.A. Jones et Coll., Tetrahedron Letters, 40, 3, 1984. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention par voie chimique, d'oligonucléotidides marques, caractérisé par les étapes suivantes - on incorpore, lors de la synthèse chimique en phase solide de la séquence d'oligonucléotides à construire, à la place des cytosines prévues sur la séquence, respectivement une ou plusieurs thymines dont la position 4 est substituée par un groupe activateur, - on fait réagir la séquence oligonucléotidique construite avec un composé de formule R-A-R' dans laquelle . R et R', sont identiques et représentent un groupe -NH2, -SH ou -OH, ou R et R' sont différents, l'un représentant un groupe -NH2, -SH ou -OH, l'autre un groupe -NH-X, -SX ou -O-X, dans lequel X est un groupe capable de servir de marqueur pour la molécule ; et .A représente une chaîne alcoyle de 4 à 20 atomes de carbone environ, comportant le cas échéant des hétéroatomes, tels que 0, N ou S ce qui conduit à l'obtention de méthyl-5-cytosine(s) avec une chaîne de substitution en position 4, à la place de la ou des thymines activées, et lorsque le composé R-A-R' ne renferme pas de groupe marqueur, - on introduit un groupement marqueur sur la chaine de substitution des méthyl-cytosines. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activation de la position 4 de la thymine comprend la fixation sur ce sommet d'un dérivé hétérocyclique du type triazole, en particulier 1,2,4-triazole, nitro-triazole ou tétrazole,imidazole ou encore d'un chlorure d'acide. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le couplage des nucléosides ou des nucléotides pour la construction de la chaîne est effectuée motif par motif ou par blocs de nucléotides, après fixation d'un motif sur un support solide. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le composé R-A-R' est un diaminoalcane, en particulier le diamino 1-10 décane, un glycol ou un a, w-aminoalcool. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que en ce que la substitution des thymines activées par un diaminoalcane est réalisée dans un solvant organique tel que la pyridine, de préférence avec un excès d'amine. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les oligonucléotides comportant les motifs méthyl-cytosines avec une chaîne de substitution en position 4 sont décrochés du support, puis débloqués et soumis à une ou plusieurs types de purification. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on fait réagir la séquence d'oligonucléotide renfermant le ou les motifs méthyl-cytosines substitués avec un ou plusieurs groupes capable de servir de marqueur pour la molécule. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le groupe marqueur est choisi parmi les peptides, les haptènes, des groupement colorés ou fluorescents tels que la rhodamine, le fluoresceine ou le dansyl, ou encore des enzymes telles que la phosphatase alcaline ou la peroxydase. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le groupe marqueur est la biotine. 10. Application des oligonucléotides obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, en tant que sondes froides de détection de séquences complémentaires d'acides nucléiques.