FR 2615527 A1 19881125 FR 8707225 A 19870522 PROCEDE D'INTEGRATION D'UNE SEOUENCE CONNUE D'ADN DANS LES LEVURES ASCOSPOROGENES. VECTEURS MIS EN OEUVRE ET NOUVELLES SOUCHES DE LEVURES L'invention concerne la construction de souches nouvelles de levures industrielles pour la production de produits de panification, d'alcool ou de boissons fermentées ou pour l'expression et la production de protéines étrangères par recombinaison d'ADN in vitro. Plus précisément, l'invention a pour objet un procédé d'intégration d'une séquence connue d'ADN dans les levures ascosporogènes, les vecteurs ou plasmides mis en oeuvre dans ce procédé et de nouvelles souches de levures. Il est rappelé que, grâce aux techniques du génie génétique, une levure peut acquérir des activités nouvelles, notamment enzymatiques - soit au moyen de plasmides réplicatifs (instables sans pression de sélection), - soit au moyen de systèmes intégratifs dans les chromosomes. Sur des souches de laboratoire portant une auxotrophie, deux types d'intégration sont possibles - intégration au moyen d'un vecteur comprenant un gène de levure et du plasmide bactérien sans origine de réplication levure ; cette intégration a l'inconvénient de laisser de 1'ADN bactérien dans la levure et de conduire à une duplication du gène et donc à une certaine instabilité; elle a en général été décrite en relation avec des souches de laboratoire qui sont soumises à un criblage en vue d'identifier Les clones présentant la reversion d'une auxotrophie, - intégration par substitution de gène ou "gene replacement", décrite par Hans RUDOLF, Isabelle KERNIG RAUSEO et Albert HINNEN dans GENE (1985) 36, 87-95. Le génome des levures est très condensé et relativement peu de gènes ont été séquencés. Une des difficultés de l'intégration dans les levures est donc de définir un site d'intégration permettant des intégrations stables, sans interférence avec le métabolisme des levures. On a déjà proposé de modifier des levures par intégration de fragments d'ADN dans le locus de certains gènes, tels que notamment le gêne PH05 qui est le gène de structure de la phosphatase acide (voir l'article de GENE cité plus haut) ou le gène HO, ou gène de l'homothallisme, qui ne sert que dans la reproduction sexuée mais n'intervient pas dans la vie végétative (voir la demande de brevet EP-A-O 163 491). Le choix de ces sites d'intégration n'est pas entièrement satisfaisant. La Demanderesse a donc cherché à définir des sites d'intégration stable, sans interférence avec le métabolisme des levures. Les travaux qu'elle a effectués dans ce sens lui ont permis d'établir qu'il était en effet possible d'obtenir une intégration stable d'un fragment d'ADN dans une levure ascosporogéne en utilisant, d'une part, comme site d'intégration le locus d'un gène cryptique et, d'autre part, un vecteur de structure particulière incluant le fragment d'ADN & intégrer. Au sens de la présente invention, un gène cryptique est un gène qui ne s'exprime pas ou peu lors de la vie cellulaire et notamment dont l'expression n'est nécessaire ni à la multiplication végétative, ni à la reproduction sexuée. Cette définition étant donnée, l'invention a pour objet, selon l'un de ses aspects, un procédé pour la construction d'une nouvelle souche de levure par intégration, dans une levure ascosporogène, d'un vecteur portant un gène codant pour une protéine spécifique et capable de s'exprimer dans la levure, caractérisé en ce que le vecteur intégratif a comme fragments extrêmes tout ou partie des fragments 5' et 3' d'un gène cryptique de la levure ascosporogène hôte, si l'on définit le côté 5' de l'ÂDN comme étant la partie amont du gène par rapport au sens de transcription, le côté 3' étant la partie aval, ces fragments extrêmes du gène cryptique encadrant le gène codant pour la protéine spécifique, et caractérisé en ce que, par recombinaison homologue, ledit vecteur intégratif s'intègre au locus du gène cryptique et s'y substitue. Ce procédé permet d'obtenir des intégrations stables, avec de plus une forte fréquence d'intégration. Il a été observé que l'intégration était d'autant plus stable que le vecteur intégratif conduit à la substitution d'un certain nombre de paires de bases du locus d'un gène cryptique par un nombre de paires de bases sensiblement équivalent représenté par la séquence à intégrer dans le chromosome contenant ledit locus. Un gène cryptique peut être un vestige de l'évolution. Le clonage d'un gène cryptique peut s'effectuer soit par son expression dans un autre organisme (cas par exemple de la -glucosidase), soit par le fait que sa séquence présente une homologie avec la séquence d'un gène fonctionnel d'une espèce voisine. Un exemple de gène cryptique des levures est par exemple le gène SGA de la glucamylase décrit par YAMASHITA et FUKUI dans Mol. Cell. Biol. (195) 5, 3069-3073 qui ne s'exprime que lors de la sporulation, mais dont l'expression n'est pas indispensable à la sporulation, car des diploides dont les deux gènes SGA ont été disruptés sont toujours capables de sporuler et donnent quatre spores viables.Un autre exemple de gène cryptique dans Saccharo mvces cerevisiae tel que décrit dans The Yeasts, a taxonomic study, LODDER, 2e éd. (1970), au sens donné à ce terme dans la présente demande est le gène STA1 de Saccharomvces diastaticus, dont Saccharomvces cerevisiae possède des séquences homologues en 5', mais pas en 3', ce qui fait que ledit gène n'est pas fonctionnel dans Saccha romyces cerevisiae [voir YAMASHITA et FUKUI, J. Bactériol. (1985) 161, 574-582]. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le gène cryptique utilisé comme locus d'intégration est le gène de la 6-glucosidase et la levure appartient au genre Saccharomvces tel que décrit par N.J.W. KREGER VAN RIJ dans The Yeasts, a taxonomic study, 3ème édition, (1984), publié par ELSEVIER SCIENCE PUBLI SHERS, B.V. Amsterdam. De préférence, la levure appartient à l'espèce Saccharomvces cerevisiae. Quel que soit le gène cryptique utilisé, on peut avoir recours à tout ou partie des fragments 5' et 3'. On peut ainsi utiliser des portions relativement courtes de ces fragments (comportant par exemple 300 pb). Dans le cas particulier où le gène cryptique utilisé est le gène de la 8-glucosidase de Saccharomvces cerevisiae, le locus d'intégration est situé dans le génome des levures dans la partie - qui commence par un segment 5' EcoRI BamHI de 1895 pb ayant la séquence donnée aux figures la, lb et lc, - qui se termine par un segment 3' SalI PstI dont une partie de la séquence est donnée à la figure 2a, et - qui présente entre ces deux segments la configuration suivante un segment BamHI III d'environ 1200 pb (paires de bases), suivi d'un segment HindIII HindIII d'environ 210 pb, suivi d'un segment HindIII EcoRI de 39 pb, puis d'un segment EcoRI EcoRI d'environ 1250 pb et d'un segment EcoRI liii d'environ 400 pb. L'ensemble du locus d'intégration défini ci-dessus peut être représenté par le schéma donné & la figure 3 qui donne la carte de restriction de la 8-glucosidase cryptique de Saccharomvces cerevisiae. Cette carte de restriction est comprise dans un fragment PstI PstI d'environ 12000 pb. Dans le cas particulier de l'intégration d'un fragment d'ADN dans le gène de la -glucosidase, le vec teur d'intégration contiendra à ses extrémités tout ou partie du fragment décrit dans les figures la, lb et lc, d'une part et une partie du segment BamHI PstI de la figure 3, segment dont une partie de la séquence est donnée à la figure 2a, d'autre part. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un vecteur intégratif, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement une partie au moins du fragment 5' d'un gène cryptique. Pour la construction du vecteur et sa propagation dans E. coli, l'extrémité 5' dudit fragment 5' et l'extrémité 3' dudit fragment 3'sont reliées par l'ADN appartenant au plasmide, comme par exemple le plasmide pBR 322, utilisé pour la construction du vecteur. Selon un mode avantageux de réalisation, le vecteur intégratif est caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement une partie au moins du fragment 5' du gène de la 6-glucosidase, suivi du gène codant pour une protéine spécifique, lui-même suivi d'une partie au moins du fragment 3' du gène de la P-glucosidase. Pour la construction du vecteur et sa propogation dans E. coli, l'extré- mité 5' dudit fragment 5' et l'extrémité 3' dudit fragment 3' sont reliées par l'ADN appartenant au plasmide utilisé pour la construction du vecteur.Saccharomvces peut être transformé en vue de l'intégration d'un gène codant pour une.protéine étrangère, soit avec le vecteur d'intégration natif contenant de l'ADN plasmidique bactérien, soit de préférence avec le vecteur linéarisé obtenu par digestion enzymatique à l'aide d'enzymes de restriction appropriées, de manière à éliminer l'ADN plasmidique bactérien. Selon un autre mode avantageux de réalisation de l'invention, le gène-codant pour une protéine spécifique est le gène MELI. Quel que soit le vecteur intégratif envisagé, on peut avoir recours, pour le construire, à des procédés classiques dans ce domaine, en utilisant notamment des cosmides disponibles dans le commerce ou décrits dans la littérature et des enzymes, en particulier des enzymes de restriction, couramment utilisées dans le domaine du génie génétique et disponibles dans le commerce. La construction du vecteur intégratif, après clonage du gène cryptique, d'une part et du gène codant pour la protéine spécifique, d'autre part, comprend au moins une étape de sous-clonage du gène cryptique en deux fragments, avec éventuellement une ou plusieurs autres étapes de sous-clonage et différentes digestions et religations. D'autres caractéristiques, aspects et avantages de l'invention apparaitront à la lecture de l'exemple non limitatif qui suit. EXEMPLE Construction d'un vecteur intégratif comportant le gène MEL1 de Saccharomvces uvarum recombiné in vitro avec des fragments 5' et 3' du gène cryptique de la P-glucosidase de Saccharomvces et obtention d'une nouvelle souche de levure de panification mélibiase+ (c'est-à-dire présentant l'activité a-galactosidase), indépendamment de la présence de galactose. De façon générale, dans cet exemple, on emploie la classification de The Yeasts, a Taxonomic Study, LODDER, 2e éd. tuf970). Le gène MEL1 code pour l'a-galactosidase appelée aussi mélibiase, enzyme qui hydrolyse le mélibiose (galac tose-al-4-glucose). Les souches de Saccharomvces cerevisiae utilisées pour la production de levures de panification ne possèdent pas le gène MELI, contrairement aux souches de Saccharomvces uvarum (en fait, S. cerevisiae race uvarum) utilisées en brasserie. Ce gène fait partie du système galactose qui comprend les gènes GAL2, GAL1, GAL7, GALlO, qui sont des gènes de structure et les gènes GAL3, GAL4 et GAL80 qui sont les gènes de régulation. La figure 4 annexée explique la "régulation galactose". Dans cette figure, les signes + indiquent une action positive, les signes - une action négative. "UAS" (Upstream Activating Sequencies) signifie : séquences activant en amont. Le gène MEL1 s'exprime et reste soumis au susdit système de régulation dans les souches industrielles, qu'il soit intégré dans le chromosome ou dans un vecteur réplicatif, sauf si la souche est modifiée de manière à exprimer constitutivement le système galactose. Ce gène produit une enzyme qui est excrétée dans le milieu de culture grâce à un peptide signal ("leader") de 18 acides aminés qui est clivé après le passage de la membrane. I. Structure du vecteur intéaratif Le vecteur intégratif est un vecteur qui, pour être transformant, doit s'intégrer au locus du gène de la B-glucosidase, gène cryptique de Saccharomvces cerevisiae. Ce gène ss-glu ne s'exprime pas ou très peu dans la levure. La présence de ce gène a été vérifiée par analyse Southern blot comme décrite dans J. Mol. Biol. (1975) 98, 503-517, dans plusieurs souches de Saccharomvces cerevisiae (S.c.) (des souches de laboratoire et des souches industrielles utilisées pour la production de levures de panification). Ce vecteur comprend: - un fragment EcoRI BamHI de 1895 pb (paires de bases) qui contient la partie 5' du gène~ss-glu 1131 pb après le site EcoRI, on trouve l'ATG initiateur du gène de structure de la 8-glucosidase cryptique (fig. la, lb et tic). - un fragment-X, qui est le gène ou le fragment de l'ADN comportant le gène que l'on veut introduire dans la souche Saccharomvces, c'est-à-dire dans le cadre de cet exemple le fragment BamHI SalI de 2812 pb qui contient le gène MELI. La phase de lecture du gène MEL1 débute à 461 nucléotides du site SalI. Cette phase de lecture comporte 1413 pb orientées de SalI vers BamHI. - un fragment SalI EcoRI de 261 pb qui fait partiè de la région 3' du gène de la P-glucosidase de S.c. (fig. 2). La séquence complète du vecteur contenant le gène MEL1 est donnée aux fig. 5a, 5b, 5c, 5d, 5e et 5f anne xées. II. Construction Pour construire le vecteur d'intégration défini ci-dessus, plusieurs étapes ont été nécessaires: 1) Clonage du gène cryptique en vue de sa caractéri sation. Le gène cryptique de la P-glucosidase a été cloné par expression dans E. coli à partir d'une banque génomique de la levure S.c. DRI 8T décrite par GUERINEAU M et coll, Biochem. Biophys. Res. Com. (1974) il, 462-469. Le gène de la ss-glucosidase ne s'exprime pratiquement pas dans S.c.Par contre, son expression est suffisante dans E. coli pour pouvoir le repérer grâce à l'hydrolyse du PNPG P-glu (4-nitrophényl P-D-glucopyranoside) disponible par exemple au catalogue de BOEHRINGER MANNHEIM, les clones transformés qui contiennent un cos-mide comportant le gène cryptique de la p-glucosidase. Donc des ensembles de bactéries transformées par la banque génomique de la souche DRI 8T ont été testés pour leur capacité à hydrolyser le PNPG P-glu. D'un ensemble de clones de bactéries présentant une activité ss-glucosidasique a té isolé un clone renfermant un cosmide qui contenait, dans un insert de 7 kb (1 kb = 1000 paires de bases), le gène cryptique de la P-glucosidase de Saccharomvces. 2) Clonage du gène MELI. Le gène MEL1 a été cloné à partir de la souche Saccharômvces uvarum ATCC 42 367. Une banque génomique a été construite dans un cosmide tel que le cosmide pHCG3 décrit par GERBAUD et coll dans. Current genetics (1980) i, 173-180 et dans le brevet FR 80 18755 (2.489.364). Une souche de S.c. Ura3-, par exemple la souche S.c. OL1 (Leu2- His3- Ura3-) construite et décrite par BOY-MARCOTTE et JACQUET dans Gene (1982) 20, 433-446, a été transformée par la banque génomique et les clones Ura+ ont été repiqués sur milieu mélibiose. D'un clone Ura+ Mel+ a été isolé le cosmide pSU1 (pHCG3 + un insert de 18 kb contenant le gène MEL1). A partir de ce cosmide, plusieurs plasmides ont été créés dont p3R SU112 qui comprend un fragment BamHI SalI du plasmide pBR322, disponible par exemple au catalogue de BOEHRINGER MANNHEIM, et tout le gène de structure MELI. Le gène MEL1 s'exprime dans la souche transformée Saccharomvces cerevisiae, mais il reste soumis au système de régulation galactose (voir figure 4) et son expression est très réprimée par le glucose. 3) Construction du vecteur intégratif. Ce vecteur est construit en plusieurs étapes. il comporte une partie au moins du fragment 5' du gène cryptique puis le gène X utile à insérer, enfin une partie au moins du fragment 3' du gène cryptique. Les phases de lecture du gène cryptique et du gène X ne sont pas en phase ; de ce fait, la phase de lecture du gène cryptique est interrompue par des codons stop. Dans le cas particulier de l'exemple décrit ici, on a eu recours aux 9 étapes suivantes. - 1ère étape : Sous-clonage de deux fragments du gène cryptique. Un fragment BamHI PstI de 5,5 kb est sous-cloné dans le plasmide pUCl2 disponible par exemple au catalogue de BOEHRINGER MANNHEIM, ce qui donne le plasmide pUC 6-glu 5,5. Un fragment BamHI Psti de 3,7 kb est sous-cloné dans pUC12, ce qui donne le plasmide pUC B-glu 3,7. - 2ème étape : Sous-clonage du fragment BamHI EcoRI de 1895 pb dé pUC 6-glu 5,5 dans pUC12, ce qui donne le plasmide pUC ss-glu 1,8. - 3ème étape Digestion de pUC p-glu 3,7 par les.enzymes de restric tion BamHI et SalI, ce qui a pour effet de libérer un fragment de 2,7 kb issu du gène cryptique de la ss-gluco-- sidase. - 4ème étape Religation du vecteur pUC p-glu 3,7 (sans le fragment BamHI SalI de la ss-glu) avec le fragment BamHI SalI de 2812 pb du gène MEL1, pour obtenir le plasmide pUC 3,8 ss-glu Mel. - 5ème étape - Digestion de ce plasmide par les enzymes de restriction BamHI ho et EcoRI et insertion du fragment BamHI EcoRI du plasmide pUC ss-glu 1,8, ce qui conduit à l'obtention du plasmide pMeli-2 (plasmide Melibiase Intégratif -2). - 6ème étape - pMelI-2 est digéré par l'enzyme de restriction PstI qui ne coupe qu'une fois dans pMelI-2 (dans le gène URA3). Le résultat obtenu est schématisé à la figure 6 annexée. - 7ème étape - Le plasmide est ensuite digéré par l'enzyme Bal 31 qui est une exodésoxyribonucléase qui digère l'ADN double et simple brin à partir d'une extrémité libre. Le résultat obtenu est schématisé à la figure 7 annexée. - 8me~elape Le plasmide obtenu à la 7ème étape est traité par le fragment de Klenow qui est une enzyme que l'on peut obtenir chez BOEHRINGER MANNHEIM ou auprès de GENOFIT (Genève). Dans les conditions décrites par le fabricant et avec le tampon qu'il préconise, cette enzyme trans forme les extrémités monocaténaires de l'ADN en extrémi tés bicaténaires à bout franc. Une ligation est effectuée avec un linker EcoRI d(GGAATTCC) (séquence d'ADN répétée qui contient la séquence reconnue par l'enzyme de restriction EcoRI) disponible par exemple au catalogue BOEHRINGER MANNHEIM. La figure 8 annexée montre les positions relatives des divers fragments. - 9me tape : On obtient alors le plasmide pMelI-3 (plasmide Mélibiase Intégratif -3) qui, s'il est digéré par l'enzyme de res triction EcoRI, présente le gène MEL1 borné à gauche par 1895 pb du gène ss-glu et à droite par 261 pb du gène p-glu, comme le montre la figure 9 annexée. Sur les figures 5c et 5f annexées sont notés respectivement les sites BamHI (position 1890 en 5') et SalI (position 4700 en 3') correspondant à l'insertion du gène de l'a-galactosidase dans le gène de la p-glucosidase. Le plasmide pMelI-3 peut servir de vecteur de base pour la création de nouveux vecteurs intégratifs. Deux cas peuvent se présenter - le gène à intégrer donne un phénotype repérable, dans ce cas le gène MEL1 est délété par une double diges tion à l'aide des enzymes de restriction BamHI et liii et remplacé par le fragment d'ADN à insérer. - le gène à intégrer ne donne pas un phénotype repéra ble, dans ce cas le vecteur est digéré soit par SalI soit par BamHI et le fragment à insérer est alors intégré par ligation. Ce système peut servir de révé lateur d'intégration grâce à l'enzyme produite par le gène MELI. En effet les clones intégrants présentent l'activité a-galactosidasique qui pourra être révélée grâce au colorant u-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl a-D-galactopyranoside) disponible chez BOEHRINGER MANNHEIM. III. Intéaration 1) Création de souches industrielles marquées. Pour l'étude du vecteur intégratif, on a construit des souches marquées par croisement entre une souche de laboratoire haploide (OL1) et un haploide industriel, comme les haploïdes déposés au N.C.Y.C. et décrits dans le brevet US N 4.318.929. 2) Transformation des souches marquées. Ces souches portent la mutation leu2-. On peut donc les transformer par le plasmide YEP13 décrit par BEGGS J.D. dans Nature (1978) 275, p. 104, plasmide réplicatif, qui porte le gène LEU2. Ces souches sont transformées par YEP13 + le fragment EcoRI EcoRI de pMel I-3. Les clones Leu+ sont repiqués sur milieu mélibiose. 30es des clones Leu+ sont Mel+. Le plasmide YEP13 est perdu par ségrégation au cours de la multiplication végétative sans pression de sélection. Le gène MEL1 est quant à lui intégré de manière stable et ne ségrège pas au cours de la multiplication végétative. Cette fréquence de co-transformation de 30% correspond à une fréquence élevée, eu égard aux chiffres cités par la littérature (1 - 5%) et illustre le fait que le vecteur construit a une forte fréquence d'intégration. 3) Transformation des souches industrielles. 31) Transformation avec un vecteur comportant le gène de la résistance à la phléomycine. La phléomycine disponible auprès de la Société CAYLA, à Toulouse, France, est un antibiotique qui inhibe la croissance des eucaryotes. L'introduction du-gène de résistance à la phléomycine permet de sélectionner des transformants à partir de levures industrielles ne possédant aucun marqueur. La souche NCYC 995 décrite dans le brevet US N 4.396.632 est donc transformée par un vecteur comportant le gène de résistance à la phléomycine, à savoir le plasmide pUT305 de la Société CAYLA, et par le fragment EcoRI EcoRI de pMelI-3. Comme dans le cas d'YEPî3, 30 des transformants ont intégré le gène Mel-1 de manière stable. De la même manière que précédemment, le plasmide pUT305 est perdu par ségrégation au cours de la multipli cation végétative sans pression de sélection. 32) Transformation directe. La souche NCYC 995 est transformée directement pour l'acquisition du caractère Mel+ grâce & la technique suivante Le fragment EcoRI EcoRI du vecteur intégratif pMel I-3 est purifié. Ce fragment est utilisé pour transformer des protoplastes de NCYC 995. Après transformation, les protoplastes sont placés dans un milieu YNB (Yeast Nitrogen Base) commercialisé par la Société DIFCO, contenant 2% de galactose + environ 50 iig de colorant X a-gal par ml de milieu.L'X a-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-a-D-galactopyranoside) disponible par exemple au catalogue de BOEHRINGER MANNHEIM, lorsqu'il est mis en présence de l'a-galactosidase, développe une coloration bleue insoluble, ce qui permet de révéler les clones Mel+ bleus, au milieu des clones Mel- blancs. Par cette technique, deux intégrants stables ont été obtenus. IV. Vérification et localisation de l'intégration. L'intégration dans le chromosome est démontrée de manière génétique On croise un haploïde rendu Mel+ par transformation intégrative avec pMelI-3, avec un haploïde de signe opposé, puis on fait sporuler le diplolde obtenu. Le caractère Mélibiase+ ségrège 2:2, c'est-à-dire on obtient 2 spores Mel+ et 2 spores Mel-. Par sporulation de la souche NCYC 995, rendue Mélibiase+ par transformation intégrative avec pMelI-3, on obtient également une ségrégation 2:2, ce qui prouve l'intégration dans un seul des 2 allèles. L'intégration est également démontrée dans le cas des haploldes rendus Mélibiase+, par la disparition de l'activité résiduelle 8-glucosidase. La localisation de l'intégration a été vérifiée par Southern blot. Le gène Mel-l est bien intégré au locus -glucosidase, l'intégration n'a eu lieu que sur l'un des allèles pour le diplolde étudié. Aucun autre site tinté gration n'a été révélé. L'intégration au locus du gène cryptique de la ss-glucosidase a également été démontrée par la séquence des jonctions, celle-ci étant effectuée sur de 1'ADN.chromosomique de la souche transformée. V. Stabilité La souche NCYC 995 Mel+ a été cultivée durant 100 générations, puis étalée sur un milieu permettant de rêvé- ler des clones ayant perdu le gène MELI. Aucun clone sur 10 000 n'avait perdu le gène MELI. Vi. Disrugtion du gène GAL80 Comme indiqué, le gène MEL1 intégré dans les souches transformées de Saccharomvces où il n'est pas normalement présent, comme les souches de levures de panification, est sous la dépendance de la régulation galactose. Cela veut dire que le mélibiose des mélasses de betteraves sera difficilement hydrolysé en présence de glucose, provenant de l'inversion du saccharose des mélasses coulées en continu. L'hydrolyse du mélibiose n'a lieu pour sa plus grande partie qu'après arrêt de la coulée de mélasses. Pour que le mélibiose présent dans les mélasses de betteraves soit utilisé pendant la coulée de la mélasse, il faut que la régulation galactose soit rendue inopérante. Ceci a été obtenu par disruption du gène GAL80. Le gène GAL80 code pour une protéine qui intervient négativement sur la protéine GAL4 qui est l'activateur du système galactose. Une souche Gal80- est une souche qui exprime constitutivement le système galactose. On a donc construit une souche industrielle dont les gènes GAL80 ont été disruptés. 1) Clonage du gène GALBE. Le gène GAL80 a été cloné à partir d'une banque génomique de levure Saccharomvces cerevisiae dans Escherichia coli par hybridation sur colonie grâce à une sonde moléculaire constituée d'un oligonucléotide marqué au 32p, de 33 bases de la phase codante du gène GAL80. La séquence du gène GALLO a été décrite par NOGI et FUKASAWA dans Nucleic Acids Research (1984), 12, 9287-9298. 2) Sous-clonage du gène GAL80. Le fragment XhoI HindIII du gène GAL80 a été souscloné dans le plasmide pUC12 pour donner le plasmide pUC Gal80. 3) Création du vecteur de disruption. Le plasmide pUC Gal80 est digéré par Balil puis le fragment BalII BalII est éliminé. Le vecteur est religué sur lui-même, ce qui a pour effet d'introduire une délétion dans le gène GAL80. Un autre vecteur est créé suivant le même principe: le fragment EcoRI HindIII de GAL80 est sous-cloné dans pUC12, puis digéré par les enzymes de restriction ClaI et BalII, puis religué sur lui-même. 4) Disruption du gène GAL80 et mise en évidence des levures Gal 80-. Les levures Mel+ sont cotransformées par un vecteur réplicatif à sélection positive, comme par exemple le vecteur pUT305 et par l'un des deux fragments de levure précédemment décrits comportant le gène GAL80 portant une délétion. Les transformants sont étalés sur un milieu glucose contenant le colorant X u-gal, les clones bleus sont les clones dont la régulation galactose est rendue inopérante. La même expérience est réalisée sans cotransformation en utilisant directement le repérage des clones bleus sur glucose, après transformation par un des fragments du gène GAL80 portant une délétion. En effet, seuls les clones exprimant constitutivement le système galactose présentent une coloration bleue détectable en présence de glucose. On a donc obtenu ainsi une souche de levure industrielle Mel+ Gal80- qui exprime le système galactose en présence de glucose. Cette souche, contrairement aux souches habituelles de levures de panification, ou aux souches de levures de panification croisées avec Saccha romyces uvarum de manière à être mélibiase+, utilise entièrement le raffinose des mélasses de betteraves (et donc la fraction mélibiose), au fur et à mesure de la coulée des mélasses, c'est-à-dire en présence de glucose. Cette souche utilise le mélibiose en présence de glucose, indépendamment de toute induction par le galactose. On peut remarquer qu'il est également possible d'obtenir des nouvelles souches de levures S.c. Mel+ Gal80-, c'est-â-dire des souches de Saccharomvces qui utilisent entièrement le raffinose en présence de glucose, en opérant une disruption -du gène GAL80, en insérant à l'intérieur de ce gène, le gène MELI. Par exemple, on peut cloner le fragment HindIII EcoRI du gène GAL80 dans pUCl2. Le plasmide ainsi obtenu, appelé pUCG80 EH, est digéré par les enzymes de restriction EcoRI et BalII; on insère alors le fragment BamHI EcoRI du gène MELI dans ce plasmide, ce qui donne le plasmide pUCG80 MEL EH. Le plasmide pUC12 est digéré par les enzymes de restriction HindIII et SmaI et religué avec les segments HindIII EcoRI du plasmide pUCG8O MEL EH et le segment EcoRI SmaI du gène GAL80. On obtient alors le plasmide intégratif pUCI80 MEL. Ce plasmide intégratif pUCi8O MEL, après digestion par les enzymes Hindili et SmaI, sert à transformer des souches de S.c. haploïdes et diploldes de manière à obtenir des transformants Mel+ Gal80- dont les clones sont repérés par le fait qu'ils sont bleus en milieu glucose plus colorant X&alpha;gal, selon la technique décrite ci-dessus. il est à remarquer que les constructions réalisées permettent d'intégrer un fragment d'ADN portant le gène codant pour la propriété recherchée, sans nécessité d'intégrer de l'ADN d'Escherichia coli. La construction réali sée pour obtenir des souches de levures de panification Mélibiase+ a fait appel uniquement à des gènes de Saccharomvces, la construction est restée intragenre au sens strict, et même intraespèce si on se réfère à la 3ème édition de l'ouvrage de référence The Yeasts, a taxonomic study. Il est clair que l'invention n'est pas limitée au présent exemple décrivant l'intégration du gène MELI. A côté ou en substitution du gène MEL1, il peut être intégré notamment tout gène codant pour des protéines, comme par exemple des enzymes comme les différentes amylases, la cellobiase, des protéines étrangères utiles. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la construction d'une nouvelle souche de levure par intégration, dans une levure ascosporogène, d'un vecteur portant un gène codant pour une protéine spécifique et capable de s'exprimer dans la levure, caractérisé par le fait que le vecteur intégratif a comme fragments extrêmes tout ou partie des fragments 5' et 3' d'un gène cryptique de la levure ascosporogène hôte, si l'on définit le côté 5' de l'ADN comme étant. la partie amont du gène par rapport au sens de transcription, le côté 3' étant la partie aval, ces fragments extrêmes du gène cryptique encadrant le gène codant pour la protéine spécifique, et caractérisé par le fait que, par recombinaison homologue, ledit vecteur intégratif s'intègre au locus du gène cryptique et s'y substitue. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le gène cryptique utilisé est le gène de la ss-glucosidase et que la levure hôte appartient au genre Saccharomvces. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que le locus d'intégration est situé dans le génome des levures dans le fragment commençant par un segment 5' EcoRI BamHI de 1895 pb ayant la séquence donnée aux figures la, lb et îc et se terminant par un segment 3' SalI PstI dont une partie de la séquence est donnée à la figure 2a et ayant entre ces deux segments la configuration ci-dessous: un segment BamHI Ilin9III d'environ 1200 pb, suivi d'un segment HindIII HindIIf d'environ 210 pb, suivi d'un segment HindIfI EcoRI de 39 pb, puis d'un segment EcoRI EcoRI d'environ 1250 pb et d'un segment EcoRI SalI d'environ 400 pb. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le fragment 5' du gène cryptique utilisé pour la construction du vecteur intégratif contient tout ou partie de la séquence représentée aux figures la, lb et lc. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que le fragment 3' du gène cryptique utilisé pour la construction du vecteur intégratif contient une partie du segment BamHI PstI de la figure 3, segment dont- une partie de la séquence est donnée à la figure 2a. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que le vecteur intégratif a un nombre de paires de bases sensiblement équivalent à celui du gène cryptique. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que le gène codant pour une protéine spécifique, inséré dans le vecteur intégratif, est le gène MELI. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que le vecteur intégratif correspond à la séquence représentée par l'ensemble des figures 5a, 5b, 5c, 5d, Se et 5f. 9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé par le fait qu'en plus du gène MEL1, le vecteur contient un gène codant pour une autre protéine, le gène MEL1 servant de marqueur d'intégration. 10. Souche de levure ascosporogène, caractérisée par le fait qu'elle comporte, intégré au locus de l'un de ses gènes cryptiques et substitué à celui-ci, un gène intégratif ayant comme fragments extrêmes tout ou partie des fragments 5' et 3' dudit gène cryptique, Si l'on définit le côté 5' de l'ADN comme etant la partie amont du gène par rapport au sens de transcription, le côté 3' étant la partie aval, ces fragments extrêmes encadrant un gène codant pour une protéine spécifique. 11. Souche de levure selon la revendication 10, caractérisée par le fait que le gène cryptique utilisé est le gène de la 8-glucosidase et que la levure hôte appartient au genre Saccharomvces. 12. Souche de levure selon la revendication 10 ou 11, caractérisée par le fait que le gène codant pour une protéine spécifique est le gène MELI. 13. Souche de levure selon la revendication 12, caractérisée par le fait qu'elle comporte, en tant que gène codant pour une protéine spécifique, outre le gène MEL1, un gène codant pour une autre protéine, le gène MEL1 servant de marqueur d'intégration. 14. Souche de levure selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisée par le fait qu'elle est mélibiase+ et que son activité mélibiase est indépendante du système de régulation galactose. 15. Souche de levure selon la revendication 14, caractérisée par le fait que son activité mélibiase est indépendante du système de régulation du galactose par disruption du gène GAL80. 16. Souche de levure de panification, caractérisée par le fait qu'elle utilise le mélibiose en présence de glucose, indépendamment de toute induction par le galactose. 17. Souche de levure de panification selon l'une des revendications 10 à 16, caractérisée par le fait qu'elle ne contient que du matériel génétique provenant de levures ascosporogènes et plus particulièrement de levures du genre Saccharomvces. 18. Vecteur intégratif caractérisé par -le fait qu il comprend essentiellement une partie au moins du fragment 5' d'un gène cryptique de levure ascosporogène, suivie du gène codant pour une protéine spécifique, luimême suivi d'une partie au moins du fragment 3' du même gène cryptique. 19. Vecteur intégratif selon la revendication 18, caractérisé par le fait qu'il comprend essentiellement une partie au moins du fragment 5' du gène de la 6-glucosi- dase, suivie du gène codant pour une protéine spécifique, lui-même suivi d'une partie au moins du fragment 3' du gène de la 6-glucosidase. 20. Vecteur intégratif selon la revendication 18 ou 19, caractérisé par le fait que le gène codant pour une protéine spécifique est le gène MELI. 21. Vecteur intégratif, caractérisé par le fait qu'il comprend la séquence représentée dans l'ensemble des figures 5a, 5b, 5c, 5d, 5e et 5f.