FR 2622456 A1 19890505 FR 8715001 A 19871029 La présente invention concerne des virus recombinants de la variole de poule, communément appelée Fowlpox, et leurs applications à la préparation de vaccins ou de protéines utiles au métabolisme de la volaille. Les virus de la famille des Poxviridae, dont le virus du Fowlpox fait partie, sont des virus à ADN double bri qui se multiplient dans le cytoplasme des cellules et codent pour une partie importante de la machinerie enzymatique néces- saire à leur réplication. L'ADN viral purifié n'est pas infectieux parce que des enzymes associées à la particule virale sont nécessaires pour amorcer son expression et sa réplication. Toutefois il peut participer à des événements de recombinaison avec 1'ADN d'un virus infectieux introduit dans la même cellule. Cette découverte (Sam et Dumbeil, 1981) est la base de a mise au point de vecteurs de clonage et d'expression de gènes étrangers, dérivés du virus de la vaccine (Mackett et al. 1982 Panicali et Paoletti, 1982).Des virus de la vaccine recombinants vivants ont permis d'exprimer des antigènes étrangers et, ainsi1 d'obtenir des immunisations contre différentes maladies virales ou parasitaires (Smith et al. 1983 , Panicali et al. 1983 ; Kieny et al. 1984 ; Chakrabarti et al. 1986 Hu et al. 1986 ; Kieny et al. 1986). Bien que des publications récentes aient évoqué l'utilisation du Fowlpox comme vecteur (Brown, 1985 et Taylor et al., 1987), aucun résultat expérimental n'a été publié à ce jour et la biologie moléculaire du virus du Fowlpox n' a pas encore fait l'objet d'études approfondies, à la différence de la biologie du virus de la vaccine qui a e' été bien étudiée (voir revue de Moss, 1985). La présente invention a pour objet l'utilisation du virus du Fowlpox à titre de vecteur d'expression de protéines hétérologues. Plus précisément, l'invention a pour objet un virus du Fowlpox recombinant qui dérive d'une souche atténuée, c'est-à-dire rendue artificiellement non pathogène, et comporte, dans une partie non essentielle de son génome, une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'une protéine hété- rologue, ainsi que les éléments assurant son expression par le virus du Fowlpox, dans une cellule appropriée. Sous un de ses aspects, l'invention vise à préparer un vaccin, en particulier un vaccin qui protège la volaille contre l'une au moins des maladies virales qui peuvent l'affecter. Dans ce cas, la protéine hétérologue est une protéine induisant une réponse immunitaire contre un virus hétérologue. Parmi les virus hétérologues intéressants, on peut citer le virus de la maladie de Newcastle, le virus de la bronchite infectieuse et le virils de la maladie de Mare. Sous un autre de ses aspects, l'invention vise à produire in vivo, dans la volaille, un facteur intervenant dans son métabolisme, tel que par exemple une hormone de croissance ou un facteur inducteur de celle-ci (comme le GRF). Dans ce cas, la protéine hétérologue est ledit facteur et le virus du Fowlpox comporte les éléments assurant son expression in vivo. Pour obtenir cette production, on administre à l'animal un virus du Fowlpox selon l'invention qui contient le gène codant pour ce facteur, le virus étant vivant. Enfin l'invention permet la préparation de protéines d'intérêt industriel ou thérapeutique en culture cellulaire, notamment dans des cellules aviaires, in vitro mais également in vivo chez l'animal. L'expression d'une séquence codant pour une protéine étrangère par un Poxvirus et notamment par le virus du Fowlpox implique nécessairement les trois étapes suivantes 1) la séquence codante doit être alignée avec un promoteur de poxvirus et être insérée dans un segment non essentiel de 1'ADN du virus du Fowlpox cloné dans un plasmide bactérien approprie' 2) les séquences d'ADN du virus du Fowlpox situées de part et d'autre de la séquence codante doivent permettre des recom binaisons homologues entre le plasmide et le génome viral dans une cellule réceptrice ; une double recombinaison conduit à un transfert de l'insert d'ADN du plasmide dans le génome viral dans lequel il sera propagé et exprimé 3) la séquence d'ADN intégrée dans le génome du Fowlpox recom- binant doit être exprimée dans une cellule appropriée, supportant la multiplication du virus. On a indiqué précédemment que l'insertion de 1'ADN étranger doit se faire dans .une partie non essentielle du génome du virus du Fowlpox c'est-à-dire une partie qui n'empê- che pas sa réplication. On aurait pu envisager, comme dans les virus de la vaccine recombinants, d'introduire le gène etran- ger dans le gène TK. Toutefois, comme la souche de départ est une souche atténuée, on peut craindre que l'altération d'une fonction utile à sa réplication ne constitue un handicap trop important et ne diminue fortement son pouvoir immunogène et, par là, celui de l'antigène étranger exprimé par le virus recombinant.C'est pourquoi, suivant une caractéristique de a pressente invention, la séquence d'ADN étranger est introduite dans une zone intergénique non codant du virus du Fowlpox. Cette zone intergénique est de préférence, située entre les ORF 7 et 9 du fragment HindIII de 1.3 K pb du génome, selon Drillien et al. (1987). L'invention concerne également les cultures de cellules eucaryotes que l'on infecte avec le virus recombinant selon l'invention et qui permettent sa réplication. Parmi les cellules envisageables, on peut citer notamment les cellules aviaires. L'invention a aussi pour objet des vaccins obtenus à partir de ces virus recombinants, sous forme de virus vivants ou inactivés. Les méthodes de préparation des vaccins sont connues de l'homme de métier et ne seront pas rappelées ici. L'invention concerne aussi des virus recombinants vivants dont l'administration peut permettre la production in vivo, pendant la multiplication virale, d'un facteur utile au métabolisme de la volaille. Enfin l'invention concerne des séquences d'ADN comportant au moins un gène hétérologue au virus du Fowlpox, sous le contrôle d'un promoteur de poxvirus, flanqué de part et d'autre de l'extrémité 3' de 1'ORF 7 et de l'extrémité 5' de 1'ORF 9, ainsi que des plasmides portant ces séquences d'ADN. Ces plasmides sont utiles notamment dans le cadre d'un procédé d'obtention d'un virus recombinant selon l'invention, caractérisé en ce qu'on transfecte une culture de cellu- les compétentes avec 1'AD d'un plasmide selon l'invention, ladite culture ayant e été préalablement infectée par un virus du Fowlpox comportant éventuellement un élément de sélection. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la description détaillée suivante. Les 2 figures suivantes illustrent les exemples Figure 1 : représentation schématique du plasmide pTG1170 et de l'insert portant le promoteur 7.5 Kd qui a été introduit dans le "polylinker", pour donner le pTG1171. Figure 2 : photographie d'une boîte de culture de fibroblastes de poulet montrant les plages de virus du Fowlpox recombinant exprimant la -galactosidase et qui apparaissent colorées en bleu en présence de X Gal. Exemple 1 Sélection et caractérisation de mutants thermo sensibles (ts) du virus du Fowlpox. On utilise une souche vaccinale du virus de la variole des poules, ou Fowlpox, par exemple le vaccin produit par les laboratoires Salsbury (PoxineR, Laboratoire Salsbury, 56 Rue Delprier, 37000 TOURS, France). La multiplication du virus est mesurée å 3 températures titre après 6 jours 330C 4,1.105 ufp/ml 37 C 4,1.105 ufp/ml 39,5"C 4,2.105 ufp/ml Le virus non muté se multiplie aussi efficacement aux 3 températures. Un stock de virus cloné et amplifié à 39,5 C est traité à la nitrosoguanidine à 10 ou 20 p;g/ml. Après ce traitement mutagène, le virus est étalé, à une dilution appropriée pour obtenir des plages bien is?lées, sur cultures de fibroblastes d'embryons de poulets. Les cultures sont incubées à 33 C (température permissive) pendant 6 ou 7 jours puis colorées au rouge neutre pour faire apparaître les plages de virus. Les cultures sont ensuite incubées à 39,5 C (température restrictive) pendant 2 jours. Les plages dont la taille n'a pas augmenté sont considérées comme thermosensibles. Les virus de quelques plages sont prélevés et amplifiés à 33"C puis retitrés à 33 et 39,5 C pour confirmer leur caractère ts. Le tableau suivant présente les titres obtenus aux 2 tem;péra- tures. Titrage à : 330C 39,5'C Virus Fowlpox témoin 1.105 1.105 ufp/ml mutant tsl 2.105 10 ufp/ml mutant tsll 2.i05 ufp/ml mutant ts24 2.105 10 ufp/ml Exemple 2 Mise au point des conditions de recombinaison entre virus mutés ts et ADN purifié de virus nos muté. Dans les conditions restrictives, les mutants ts ne se multiplient plus. L'ADN purifié des virus de la famille des poxviridae n'est pas infectieux. Si l'introduction dans une même cellule d'un virus ts et d'us ADN purifié donne lieu à une multiplication de virus, ceux-ci résultent d'une complementation ou d'une recombinaison in vivo entre les 2 génomes. On infecte des tapis de fibroblastes d'embryons de poulets avec les virus ts (4.104 ufp/106 cellules). Après 1 heure d'adsorption on renouvelle les cultures en milieu frais et on les incube pendant 2 heures à température permissive (33-370C). Ensuite on élimine le milieu et on adsorbe 1'ADN purifié du virus non muté, sous forme de précipité de phosphate de caicium (1 p9 d'ADN dans 5 p1 de tampon, pour 4 boites de cultu- res). Après 1 heure d'adsorption on renouvelle en milieu frais et on incube pendant 2 heures à température non permissive (39,5"2: puis on effectue un choc au glycérol (10 %). Ensuite les cultures sont remises à incuber pendant 5 jours à 39, 50C. Les plages de virus sont comptées, pour la moitié, directement sur les boites où la manipulation a e' été effectuée, et pour la moitié, après amplification (c'est-à-dire après congélation des premières boites suivie d'un deuxième cycle de multiplication). Nombre de plages de virus sans amplification après amplification sans ADN + ADN sans ADN + ADN tsl 0 15 10 3.104 tsll 0 2 10 1.104 ts24 0 3 10 1.1ou L'expérience montre que 1'ADN purifié du virus du Fowlpox sauvage peut être réactivé par les mutants -ts polir donner une progénie infectieuse. Le mutant tsl a été retenu pour les expériences suivantes, Exemple 3 Construction d'un vecteur destiné au transfert d'ADN hétérologue dans le virus du Fowlpox. Pour transférer une séquence d'ADN étranger dans le génome d'un virus, cette séquence doit être intégrée au milieu de séquences intactes du virus de façon à permettre une double recombinaison homologue. L'ADN étranger doit être inséré dans une zone non essentielle du virus de manière à ne pas empêcher sa multiplication. Un vecteur a été construit pour favoriser l'insertion d'un ADN étranger dans une zone intergénique non codante du virus du Fowlpox. a) Insertion d'un fragment d'ADN du Fowlpox dans un plasmide bactérien : construction du pTG1170. Un fragment d'ADN du Fowlpox présentant une importante homologie avec 1'ADN du virus de la vaccine a été décrit par Drillien et al. (1987). Ce fragment (homologue au fragment Hindili J du virus de 1 vaccine) porte 5 séquences ouvertes de lecture (ORF) et se distingue de la vaccine par l'absence du gène F8 qui est remplacé par une zone intergénique non codante de 32 paires de bases. Vac e Fcs Cette zone intergnique a été choisie comme site d'insertion de 1'ADN étranger. Un large fragment d'ADN qui entoure cette zone a été récupéré pour servir de séquence homologue permettant la recombinaison et l'intégration dans le génome viral du Fowlpox. Ce fragment a été obtenu après digestion par EcoRI et PstI. Le site EcoRI est situé en amont de 1'ORF6 et le site PstI est situé dans I'ORF9 (voir schéma ci-dessus). Le fragment EcoRI-PstI a été intégré dans un vecteur M13TG131 (Kieny et al. 1983), pour donner le M13TG188. L'introduction dans M13 permet d'effectuer une mutagénèse localisée, afin d'introduire des sites de reconnaissance pour des enzymes de restriction qui permettront l'insertion d'ADN étranger. On a créé 3 sites : XhoI, BamHI et EcoRI, dans la région intergénique de 32 pb, à l'aide de l'oligonucléotide de synthèse suivant 5' TTAAAAAGGAATTGACTCGAGGGATCCGAATTCAAGAAAATATTTAT 3' La construction portant l'insert synthétique est appelée M13TG195. La présence des sites de restriction a été véri fiée avec les enzymes correspondants. La séquence d'ADN du Fowlpox mutée a été récupérée à partir du M13TG195 sous forme de fragment BglII-PstI (le site BglII est situé au début de 1'ORF6, Drillien et al. 1987) et introduite dans un vecteur de clonage dérivé du pML2 portant un adaptateur synthétique comportant plusieurs sites de restriction, le POLYII décrit par Lathe et al. (1987). L'insertion du fragment BglII-PstI du Fowlpox dans le vec teur POLYII ouvert par BamHI et PstI donne le plasmide pTG1170, qui est schématisé dans la figure I. b) insertion d'un promoteur de poxvirus dans le vecteur pTG1170. Pour obtenir l'expression d'un gène étranger par un poxvi rus il est nécessaire de placer ce gène sous le contrôle d'un promoteur de poxvirus. Dans un premier temps, on a utilisé un promoteur bien caractérisé du virus de la vaccine, le promoteur du gène de la protéine 7.5 K, appelé en abrégé "promoteur 7.5 K". On a introduit, dans le vecteur pTG1170, le promoteur 7.5 K du virus de la vaccine, récupéré sous forme de fragment SalI EcoRI à partir d'un vecteur M13TG7.5K décrit par Kieny et al. (1984). Cette séquence promoteur a été introduite entre les sites XhoI et EcoRI de l'adaptateur synthétique du pTG1170 (voir figure 1). La construction résultante, pTG1171 porte donc le promoteur 7.5 K inséré entre les ORF6-7 et l'ORF9 du Fowlpox, avec un site BamHI (apporté par la séquence P7.5K) et EcoRI immé diatement en aval. Exemple 4 insertion d'un gène étranger dans le vecteur pTG1171. Un gène modèle a été utilisé pour démontrer l'utilité du vecteur et du système de sélection de recombinants du virus du Fowlpox : le gène de la ss-galactosidase de E. coli. Ce gène a été choisi parce que son expression efficace peut aisément être détectée par l'addition de X-Gal (5-bromo 4chloro-3-indolyl- D galactopyranoside) qui engendre une coloration bleue sous l'action de la B-galactosidase. Le gène lacZ codant pour la p-galactosidase de E. coli peut être récupéré, par exemple, à partir du plasmide pCH110 (Hall et al. 1983). Le gène lacZ a été excisé par Bam-HI et HindIII et inséré dans le vecteur de clonage POLYII (cité plus haut) puis repris sous forme de fragment BgîlI-BamHi pour être inséré dans le pTG1171 ouvert par BamHI et traité à la phosphatase. La construction portant le gène lacez en aval du promoteur 7.5 K est appelée pTG1177. Exemple 5 Expression d'un gène étranger par un virus re combinant du Fowlpox. L'ADN du plasmide pTG1177 (100 ng/106 cellules) a été transfecté dans des cellules d'embryons de poulet préalablement infectées par le virus Fowlpox tsl, selon le protocole décrit dans l'exemple 2. Après 5 jours d'incubation à 39,50Con récolte les virus recombinants après avoir lysé les cellules par congé la tion. Les virus sont titrés sur cultures de fibroblastes d'embryons de poulet, sous milieu gélosé. Après 5 jours, les plages du virus sont révélées au X-Gal (solution à 30 mg/ml diluée à 1/100 en milieu PBS + agarose 1 %). Les plages de virus se colorent en bleu, ce qui indique la présence de F-galactosidase fonctionnelle. Exemple 6 Construction d'un deuxième vecteur destiné au transfert d'ADN hétérologue dans le virus du Fowlpox. a) Un autre vecteur permettant le transfert d'ADN hétérologue dans le virus Fowlpox a été construit en conservant une région intergénique plus importante entre les ORF F7 et F9. Pour réaliser cet objectif une première mutagénèse locali sée a été effectuée sur le phage M13TG188 (décrit dans l'exemple 3) avec l'oligonucléotide de synthèse suivant 5' AACAACCTAATATCACTATAGGATCCTTGTTAAAAAGGAAT 3' Ceci donne le phage M13TG2123 et a pour résultat d'intro duire un site BamHI dans la partie 3' codante de 1'ORF F7. Une deuxième mutagénèse a ensuite été effectuée sur M13TG2123 avec l'oligonucléotide suivant 5' CCTAATATCACTACTGAAGCGCAACTAGGATCCTTGTTAA 3' Dans le phage résultant, M13TG2125, la distance intergéni que entre 1'ORF F7 et 1'ORF F9 est augmentée d'une quinzai ne de nucléotides et les codons situés en 3' de 1'ORF F7 sont remplacés par des codons équivalents, codant pour les mêmes acides aminés. La séquence d'ADN du Fowlpox muté a été récupérée à partir du M13TG2125 sous forme de fragment BglII-PstI et introduit dans le vecteur POLYII comme dans l'exemple 3 pour générer le plasmide pTG2l34. b) insertion d'un promoteur de poxvirus dans le vecteur pTG2134. Le promoteur du gène de la protéine 7,5 K du virus de la vaccine récupéré sous forme de fragment 8glII-BamHI d'un vecteur M13TG2119 (dérivé du M13TG7.5K décrit dans l'exem ple 3) a été inséré dans le site BamHI du plasmide pTG2134. Ceci a donné naissance à deux vecteurs pTG2135 et pTG2136 qui se distinguent entre eux par l'orientation du promo teur. Dans le plasmide pTG2135 le promoteur est orienté dans le même sens que les ORF F7 et F9 tandis que dans le plasmide pTG2136 l'orientation est inversée. Exemple 7 insertion d'un gène étranger dans les vecteurs pTG2135 et pTG2136. Comme dans l'exemple 4 le gène de la ss-galactosida- se, sous forme d'un fragment BglII-BamHI, a été inséré dans les vecteurs pTG2135 et pTG2136 préalablement ouverts par BamHI et traités par la phosphatase. Ces manipulations ont donné naissance au vecteur pTG2137 où le gène de la F-galacto- sidase est orienté dans le même sens que les gènes des ORFs F7 et F9 et au vecteur pTG2138 dans lequel l'orientation du gène de la B-galactosidase est inversée. L'ADN du pTG2137 a été transfecté dans des cellules d'embryons de poulet infectées par le virus du Fowlpox tsl, comme dans l'exemple 5. Des plages de virus recombinants sont observées après 5 jours et elles se colorent en bleu après addition de X-Gal. REFERENCES Brown, T.D.K. Span 28, 68-70 (1985). Chakrabarti, S., Robert-uroff, M., Wong-Staal, F., Gallo, R.C. and Moss, B. Nature 320, 535-540 (1986). Drillien, R., Spehner, D., Villeval, D. and Lecocq, J.P. Virology 160, in press (1987). Hall, C.V., Jacob, P.E., Ringold, G.M. and Lee, F. J. Mol. Appl. Gen. 2, 101-109 (1983).. Hu, S.L., Kosowsi, S.G. and Dabrymple, J.M. Nature 320, 537 549 (1986). Kieny, M.P., Lathe, R. and Lecocq, J.P. Gene 26, 91-99 (19831. Kieny, M.P., Lathe, R., Drillien, R., Spehner, D., Skory, S., Schmitt, D., Wiktor, T., Koprowski, H. and Lecocq, J.P. Nature 312, 163-166 (1984). Kieny, M.P., Rautmann, G., Schmitt, D., Dott, K., Wain-Hobson, S., Alizon, M., Girard, M., Chamaret, S., Laurent, A., Montagnier, L. and Lecocq, J.P. Biotechnology 4, 790-795 (1986). Lathe, R., Vilotte, J.L. and Clark, A.J. Gene in press (1987). 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REVENDICATIONS 1) Virus du Fowlpox recombinant, caractérisé en ce qu'il dérive d'une souche atténuée de virus du Fowlpox et comporte, dans une partie non essentielle de son génome, une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'une protéine hétérologue au virus du Fowlpox ainsi que les éléments susceptibles d'assurer l'expression de cette protéine dans une cellule infectée par ledit virus recombinant. 2) Virus du Fowlpox selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est clonée dans une zone intergénique non codante du virus du Fowlpox. 3) Virus du Fowlpox selon la revendication 2, caractérisé en ce que la zone intergénique non codante est la zone située entre les ORF 7 et 9 du fragment HindIII de 1.3 K pb de 1'ADN viral. 4) Virus du Fowlpox selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit virus recombinant dérive d'une souche vaccinale du virus du Fowlpox. 5) Virus du Fowlpox selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit virus recombinant dérive d'une souche de virus du Fowlpox thermosensible. 6) Virus du Fowlpox selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce qu'il comporte un gène codant pour un marqueur de sélection qui s'exprime dans une cellule infectée par ledit virus recombinant. 7) Virus du Fowlpox selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour une protéine induisant une réponse immunitaire contre un virus hétérologue. 8) Virus du Fowlpox selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit virus hétérologue est choisi parmi le virus de la maladie de Newcastle, le virus de la bronchite infectieuse et le virus de la maladie de Marek. 9) Virus du Fowlpox selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la séquence d'ADS code pour un facteur intervenant dans le métabolisme de la volaille. 10) Séquence d'ADN comportant au moins un gène hétérologue au virus du Fowlpox, sous le contrôle d'un promoteur de poxvirus, flanqué de part et d'autre de l'extrémité 3' de 1'ORF 7 et de l'extrémité 5' de 1'ORF 9. 11) Séquence selon la revendication 10, caractérisée en ce que le promoteur est le promoteur de la protéine 7,5 K du virus de la vaccine. 12) Plasmide caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'ADN selon l'une des revendications 10 ou 11. 13) Procédé d'obtention d'un virus recombinant selon l'une des revendications 1à 9, caractérisé en ce qu'on transfecte une culture de cellules compétentes avec 1'ADN d'un plasmide selon la revendication 12, ladite culture ayant été préalablement infectée par un virus du Fowlpox. 14) Culture de cellules eucaryotes infectée par un virus du Fowlpox recombinant selon l'une des revendications 1à 9. 15) Culture de cellules selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'il s'agit de cellules aviaires. 16) Vaccin caractérisé en ce qu'il contient un virus du Fowlpox selon l'une des revendications 1 à 9. 17) Vaccin caractérisé en ce qu'il contient un virus du Fowlpox obtenu par réplication dans les cultures de cellules selon l'une des revendications 14 ou 15. 18) Vaccin selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que le virus du Fowlpox est vivant. 19) Vaccin selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que le virus du Fowlpox est inactivé. 20) Antisérum contenant les anticorps dressés contre le virus du Fowlpox selon l'une des revendications 1 à 9. 21) Procédé de préparation in vivo d'un facteur intervenant dans le métabolisme de la volaille, caractérisé en ce qu'on administre à la volaille un virus du Fowlpox selon la revendication 9, vivant. 22) Procédé de préparation d'une protéine d'inté rêt industriel ou thérapeutique caractérisé en ce qu'on cultive une cellule eucaryote selon les revendications 14 ou 15 et qu'on récupère la protéine obtenue.