FR 2620231 A1 19890310 FR 8712403 A 19870904 Procédé de calibration de l'activité lipasique d'origine pancréatique d'un échantillon biologique, mesurée par une méthode indirecte La présente invention concerne un procédé de calibration de l'activité lipasique d'origine pancréatique d'un échantillon biologique, mesurée par une méthode indirecte, c'est-à-dire dont le dosage n'est pas basé sur la mesure des acides gras non estérifiés libérés lors de la réaction lipasique. Toutes les méthodes de dosage d'une activité enzymatique nécessitent la mesure d'une vitesse de la réaction catalysée par l'enzyme considérée. I1 faut donc pouvoir mesurer la quantité de substrat transformé ou de produit de réaction formé par unité de temps. Le procédé conforme à la présente invention, a pour objet de transformer un signal physique de l'activité lipasique en données chimiques (concentration d'acides gras). Pour doser l'activité lipasique, on connaît des méthodes directes mesurant les produits de réaction libérés par l'action de la lipase sur une émulsion de triglycérides. Ces méthodes sont très peu praticables et ont été récemment remplacées par des méthodes indirectes basées sur la mesure de la vitesse d'éclaircissement d'une émulsion de triglycérides. Cette activité est proportionnelle à la concentration d'activité lipasique contenue dans l'échantillon. Un étalon d'activité lipasique est toujours nécessaire pour la calibration de l'activité lipasique d'un échantillon mesurée par de telles méthodes indirectes, telles que celles, par exemple, néphélémétriques ou turbidimétriques. La détermination turbidimétrique ou néphélémétrique de l'activité lipasique est un exemple unique d'utilisation d'un étalon en enzymologie clinique. Cette pratique est imposée par le fait que le signal physique de l'activité lipasique mesuré, par exemple sous la forme d'une variation de voltage du mélange réactif/échantillon à doser, lorsque l'activité lipasique de l'échantillon est mesurée par néphélémétrie, ou sous la forme d'une variation d'absorbance du mélange réactif/échantillon à doser, lorsque l'activité lipasique de l'échantillon est mesurée par turbidimétrie, n'est pas directement transformable en nombre de molécules de produit (acide gras) libérées par unité de temps. Les réactifs utilisés dans les méthodes turbidimétriques ou néphélémétriques font actuellement appel à un étalon de lipase d'origine porcine pour la quantification de la lipase pancréatique humaine. L'emploi d'un étalon d'activité lipasique impose, pour le dosage de lipase dans les échantillons, l'utilisation des mêmes conditions opératoires que celles qui ont servi à titrer l'étalon (concentration de substrat, concentrations des substances nécessaires à la dégradation du triglycéride par la lipase, température de mesure). Par ailleurs, l'emploi d'un tel étalon sous-entend que ses propriétés soient identiques dans le milieu réactionnel et à la température de mesure, à celles de l'enzyme dont on souhaite mesurer l'activité lipasique. On sait que des différences de propriétés des enzymes peuvent provenir - de différences d'espèce (l'étalon est souvent d'origi ne animale alors que l'enzyme à doser est d'origine humaine) - de la présence d'isoenzymes dans la même espèce (ceci a été montré pour la lipase dans les plasmas humains); - des traitements utilisés pour la purification ou la stablisation de l'étalon - de l'instabilité de ces solutions étalons. Enfin, il n'existe actuellement aucun étalon d'activité lipasique d'origine pancréatique humaine. Or, la lipase pancréatique du plasma de sujets atteints de pancréatite aiguë a des propriétés différentes (thermodépendance, sensibilité à la force ionique...) de celles de l'étalon porcin. L'utilisation d'un tel étalon a, de ce fait, entre autres, deux conséquences particulièrement néfastes, à savoir fournir des ré- sultats d'activité lipasique dans des unités arbitraires, voire même des résultats inexacts, les propriétés catalytiques de l'enzyme humaine pouvant être différentes de celles de l'enzyme porcine en fonction des conditions de mesure, et imposer certaines conditions opératoires (en particulier des conditions de température, de force ionique, de concentration de substrat...), à savoir celles qui ont été retenues pour la détermination de l'activité lipasique de l'étalon. Ceci réduit donc la praticabilité des méthodes indirectes, par exemple, turbidimétriques ou néphélémétriques, et empêche notamment toute modification des conditions opératoires, en particulier dans un but d'optimisation de la mesure de l'activité de l'enzyme humaine. Le problème général à résoudre par l'objet de la présente invention est donc de réaliser un procédé permettant de quantifier l'activité de l'enzyme quelles que soient les conditions utilisées pour la détermination de l'activité lipasique par une méthode indirecte, par exemple,turbidimétrique, néphélémétrique ou autres, afin de réaliser les mesures sans aucune contrainte, concernant notamment la température de mesure et l'adjonction éventuelle de toute substance nécessaire à la dégradation du triglycéride par la lipase et permettant d'améliorer l'efficacité de cette détermination. Un autre avantage du procédé de calibration, objet de la présente invention, est de permettre l'obtention de résultats cohérents entre les différents lieux d'utilisation et leur expression en unités internationales (nombre de micromoles d'acides gras libérés par minute). L'invention a pour objet un procédé de cali bration de l'activité lipasique d'origine pancréatique d'un échantillon biologique, mesurée par une méthode indirecte, c'est-à-dire dont le dosage n'est pas basé sur la mesure des acides gras non estérifiés libérés lors de la réaction lipasique, procédé caractérisé en ce qu'il consiste, après addition de l'échantillon biologique à un réactif contenant notamment un substrat et des substances nécessaires à la dégradation du triglycéride par la lipase, à bloquer toute activité lipasique d'origine pancréatique à des intervalles de temps définis, de manière à connaître exactement le temps d'action de la lipase sur son substrat et à mesurer la variation d'un signal physique de l'activité lipasique durant chaque intervalle de temps, à doser les acides gras non estérifiés libérés dans le milieu réactionnel lors 'de la réaction lipasique, de manière à déterminer la concentration d'acides gras non estérifiés pour chaque intervalle de temps, puis à établir un facteur de conversion en effectuant le rapport entre la quantité d'acides gras libérés pendant un intervalle de temps et la variation du signal physique mesuré par laméthode indirecte dans le même intervalle de temps. L'invention sera mieux comprise, grâce à la description ci-après, qui se rapporte à un mode de réalisation préféré, donné à titre d'exemple non limitatif, et expliqué avec référence aux dessins schématiques annexés, dans lesquels la figure 1 représente un diagramme dans lequel est portée, pour un exemple de mesure, d'une part, la variation du voltage mesuré en néphélémétrie en fonction du temps et, d'autre part, la concentration d'acides gras non estérifiés (AGNE) en fonction du temps, et la figure 2 représente le diagramme avec en abscisse les différentes variations du voltage mesurées et en ordonnée la concentration correspondante d'acides gras non estérifiés déterminée (AGNE). Conformément à l'invention, le procédé de calibration consiste, après addition de l'échantillon bio logique à un réactif contenant notamment un substrat et des substances nécessaires à la dégradation du triglycéride par la lipase, à bloquer toute activité lipasique d'origine pancréatique à des intervalles de temps définis, de manière à connaître exactement le temps d'action de la lipase sur son substrat et à mesurer la variation d'un signal physique de l'activité lipasique durant chaque intervalle de temps, à doser les acides gras non estérifiés libérés dans le milieu réactionnel lors de la réaction lipasique, de manière à déterminer la concentration d'acides gras non estérifiés pour chaque intervalle de temps, puis à établir un facteur (F) de conversion en effectuant le rapport entre la quantité d'acides gras libérés pendant un intervalle de temps et la variation du signal physique mesuré par la méthode indirecte dans le même intervalle de temps. Ce procédé permet donc de quantifier les acides gras libérés, pendant des intervalles de temps définis, lors de la réaction lipasique car il bloque instantanément et totalement l'activité lipasique. La comparaison du nombre d'acides gras libérés à la variation du signal physique mesuré, par exemple, en turbidimétrie ou en néphélémétrie, permet d'établir un facteur. Celui-ci est utilisable pour transformer les variations des signaux physiques mesurées par unité de temps (variation de l'absorbance en fonction du temps, variation du voltage en fonction du temps) en unités internationales d'activité lipasique. Le blocage de l'activité lipasique à des temps définis est essentiel car il permet de définir avec exactitude le temps d'action de la lipase sur son substrat. Comme substrat, on peut utiliser une émulsion d'un triglycéride, par exemple, de trioléine et éventuellement des substances nécessaires à la dégradation du triglycéride par la lipase dans des conditions optimales. Selon une caractéristique de l'invention, pour bloquer toute activité lipasique, le procédé consiste à prélever, à des intervalles de temps définis, une certaine quantité du milieu réactionnel de la lipase que l'on met immédiatement dans une solution A. Cette solution A pourra avantageusement présenter un pH de 6,8 à 7, de préférence 6,9, être maintenue à une température comprise entre 00C et 5"C et être de la composition suivante - 40 à 60 mmol/l d'un tampon phosphate, de préférence 50 mmol/l - 0,25 à 0,35 kU/l d'acyl-coenzyme A synthétase, de préférence 0,3 kU/1; - 4 à 6 mmol/l d'adénosine triphosphate, de préférence 5 mmol/l; - 1,2 à 1,7 kU/l d'acide ascorbique oxydase, de préférence 1,5 kU/l;; - 1,2 à 1,7 mmol/l d'amino 4-antipyrine, de préférence 1,5 mmol/l; - 0,55 à 0,85 g/l de coenzyme A, de préférence 0,7 g/l; - 2,5 à 3,5 mmol/l de chlorure de magnésium, de préférence 3 mmol/l, et - 0,5 à 2,5 g/l d'éther d'octylphénol-polyéthylèneglycol, de préférence 2 g/l. L'éther d' octylphénol-polyéthylèneglycol pourra être celui connu sous la dénomination commerciale Triton X-100 fabriqué par la société Rohm et Haas. Par ailleurs, le procédé est adapté à une mesure d'acides gras contenus ou libérés dans une émulsion de triglycérides utilisée comme substrat de la lipase. Les acides gras peuvent être dosés de manière spectrophotométrique selon le principe suivant Acide gras + adénosine triphosphate (ATP) + coenzyme A Acyl-Coenzyme A Acyl-Coenzyme A synthétase + adénosine monophosphate (AMP) + Pyrophosphate Acyl-Coenzyme A + O2 -Acyl-Coenzyme A oxydase 2,3 trans-énoyl Coenzyme A + peroxyde d'hydrogène 2 peroxyde d'hydrogène (H202) + Amino4-antipyrine + 3-méthyl-N éthyl-N (6 hydroxyéthyl) aniline Peroxydase, Chromogène rouge + 4H20 Selon une autre caractéristique de l'invention, pour doser les acides gras libérés à partir du substrat pendant un intervalle de temps défini, le procédé consiste à porter le mélange milieu réactionnel de la lipase/solution A, à une température constante, puis à y ajouter la solution B et enfin à mesurer l'absorbance qui est proportionnelle à la concentration d'acides gras non estérifiés. Cette solution B pourra avantageusement être de la composition suivante - 5,3 à 8 kU/l d'acyl-coenzyme A oxydase, de préférence 6,6 kU/l ; - 6 à 9 kU/l de peroxydase, de préférence 7,5 kU/l - 0,8 à 1,2 mmol/l de 3-méthyl-N éthyl-N (6 hydroxy éthyl) aniline, de préférence 1 mmol/l - 2,5 à 3,5 g/l de polyoxyéthanol, de préférence 3 g/l, et - 0,8 à 1,2 g/l d'éther d'octylphénol-polyéthylèneglycol, de préférence 1 g/l. L'éther d'octylphénol-polyéthylèneglycol pourra également être le Triton X-100. Pour le blocage de l'activité lipasique à des temps définis, il est donc nécessaire d'utiliser la solution A et pour le dosage des acides gras non estérifiés libérés dans le milieu réactionnel, les deux solutions A et B. Le procédé présente donc l'avantage d'utiliser comme agent bloquant de l'activité lipasique, une solution qui est de toute façon nécessaire au dosage des acides gras non estérifiés libérés. I1 n'entraine donc aucune dilution supplémentaire et par là, de diminution de la sensibilité du dosage des acides gras. Le facteur F est calculé en faisant le rapport du nombre d'acides gras libérés pendant un intervalle de temps sur la variation du voltage ou de l'absorbance mesurée pendant ce même intervalle de temps. En pratique, on détermine ces deux grandeurs après plusieurs temps de contact entre enzyme et substrat de manière à améliorer l'exactitude de la valeur calculée pour le facteur F. I1 est à noter que la valeur de ce facteur F change avec les conditions dans lesquelles la réaction lipasique est réalisée. Enfin et surtout, dans la quasi totalité des conditions opératoires testées, on trouve pour l'enzyme porcine et l'enzyme humaine des facteurs significativement différents. I1 est donc clair qu'il y a lieu de rejeter l'emploi d'un étalon porcin pour doser l'enzyme humaine. Dans la pratique, et à titre d'exemple purement non limitatif, le procédé peut se dérouler de la manière suivante Pour la détermination turbidimétrique ou néphélémétrique de l'activité lipasique d'un échantillon biologique, on utilise, par exemple, 2 ml de réactif contenant en particulier le substrat émulsionné et les substances nécessaires à la dégradation de triglycéride par la lipase dans des conditions optimales, mis dans une cuvette de mesure, porté à la température choisie et additionné de 50 1 d'échantillon dont on désire mesurer l'activité lipasique. Le signal physique de l'activité lipasique, en l'occurrence la variation du voltage ou de l'absorbance du mélange de réactif/échantillon à doser, en fonction du temps, est enregistré de façon continue. Le blocage de l'activité lipasique à des temps définis est réalisé par la solution A. A des intervalles de temps définis (par exem ple toutes les deux minutes) on prélève 20 à 60 P 1 du milieu réactionnel de la lipase, préférentiellement 40 rl, qui sont mis immédiatement dans 100 l de la so- lution A maintenus à une température comprise entre 0 C et 5 C. On constate que dans ces conditions, l'activité lipasique est totalement inhibée. On ajoute ensuite à ce mélange porté durant environ 4 à 10 minutes, préférentiellement 6 minutes, à une température comprise entre 20"C et 400C, de préférence 37 C, 200 1 de la solution B. Après une durée de 2 à 10 minutes, préférentiellement 3 minutes, à la température d'environ à 37"C, on mesure l'absorbance à 550 nm qui est proportionnelle à la concentration d'acides gras non estérifiés. La séquence des opérations nécessaires pour la calibration des acides gras libérés au cours d'une réaction lipasique est donc préférentiellement la suivante OPERATIONS I Mélange substrat (maintenu à température constante) + Echantillon à doser II A des temps définis, prélèvement d'aliquots du mélange précédent et mélange immédiat à la solution A mainte nue à une température comprise entre 00C et 5"C III A chaque mélange aliquots de l'opéra tion I + solution A, (après une durée de 6 min à une tempéra ture de 37"C) on ajoute la solution B IV Mesure spectrophoto métrique à 550 nm après une durée de 3 min à une tempéra ture de 37"C RESULTATS Réaction lipasique Blocage de la réaction lipasique à temps définis dans chaque aliquot, la lipase de l'échantillon est restée en contact avec le substrat pendant un temps connu Les opérations II,III et IV sont nécessaires pour le dosage des acides gras libérés à partir du substrat pendant un intervalle de temps défini (opération I). Le rapport entre la quantité d'acides gras libérés par unité de temps et la variation par unité de temps du signal mesuré en turbidimétrie ou en néphéléme- trie permet, par conséquent, d'établir un facteur de conversion F aisément calculable, et qui ne dépend donc que de deux paramètres, à savoir la nature du réactif utilisé et la nature biologique de l'échantillon en question. La figure 1 représente un exemple de la variation du voltage (- aV) mesuré en néphélémétrie et de la concentration d'acides gras non estérifiés (AGNE) mesuré lors d'une réaction lipasique, en fonction du temps (2ml de réactif + 50 1 d'échantillon). Le réactif contient notamment, dans ce cas, une émulsion de trioléine (0,30 mmol/l), de la colipase (3mg/l),du désoxycholate de sodium (19 mmol/l), du chlorure de sodium (140 mmol/l), du chlorure de calcium (0,1 mmol/l), du tris(hydroxyméthyl)-aminométhane (26 mmol/l, pH 9,2). L'échantillon est un plasma humain d'un sujet atteint de pancréatite aiguë. La réaction lipasique se déroule à 37"C. Les différents points 1 représentent chacun une mesure de voltage à un temps défini (de deux minutes en deux minutes). Les différents points 2 représentent chacun, quant à eux, la concentration d'acides gras non estérifiés mesurée au même temps (de deux minutes en deux minutes et exprimée en mol/l). On reporte alors ces valeurs sur le diagramme de la figure 2 (voir les différents points 3) et on obtient ainsi une droite 4 qui passe par l'origine et dont la pente donne le facteur de conversion F recherché. Le facteur obtenu par régression linéaire à partir des données expérimentales représentées à la figure 1, est, dans ce cas égal à 78, pour le type de réactif utilisé et pour le type d'échantillon en question. Donc, dans ces conditions opératoires, le calcul de la concentration d'activité lipasique dans tout plasma humain d'un sujet atteint de pancréatite aigüe est réalisé de la manière suivante à partir de la mesure physique de dégradation du substrat Unités Internationales/l = 78 x (- dv/min. ) volume total de milieu réactionnel volume d'échantillon Dans notre exemple (voir figure 1), on obtient donc Unités Internationales/l = 78 x (- AV/min) x 2050. 50 Ce procédé est donc réalisable pour la détermination d'une activité lipasique dans n'importe quelle condition opératoire (température, force ionique, concentration de substrat, concentration d'effecteurs...),à la seule condition que le produit de la réaction lipasique soit un acide gras. L'établissement du facteur F dans des conditions opératoires choisies par l'utilisateur permet une calibration du dosage en multipliant par ce facteur le signal obtenu en turbidimétrie ou en nephélémétrie pour une activité lipasique à déterminer.Le résultat est alors exprimé en unités internationales par litre, selon l'une des deux formules suivantes Unités Internationales/1 = F x (- a absorbance/min) volume total de milieu réactionnel volume d'échantillon ou Unités Internationales/l = F x (-avolt/min) X volume total de milieu réactionnel volume d'échantillon I1 est évident que ce procédé est susceptible de s'adapter à d'autres méthodes de mesures indirectes d'activité lipasique, à d'autres moyens de blocage de l'activité lipasique, à d'autres moyens de quantification des acides gras non estérifiés, ou encore à la calibration d'autres enzymes lipolytiques. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée au mode de réalisation décrit et représenté aux dessins schématiques annexés. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers éléments ou par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de calibration de l'activité lipasique d'origine pancréatique d'un échantillon biologique, mesurée par une méthode indirecte, c'est-à-dire dont le dosage n'est pas basé sur la mesure des acides gras non estérifiés libérés lors de la réaction lipasique, procédé caractérisé en ce qu'il consiste, après addition de l'échantillon biologique à un réactif contenant notamment un substrat et des substances nécessaires à la dégradation du triglycéride par la lipase, à bloquer toute activité lipasique d'origine pancréatique à des intervalles de temps définis, de manière à connaître exactement le temps d'action de la lipase sur son substrat et à mesurer la variation d'un signal physique de l'activité lipasique durant chaque intervalle de temps, à doser les acides gras non estérifiés libérés dans le milieu réactionnel lors de la réaction lipasique, de manière à déterminer la concentration d'acides gras non estérifiés pour chaque intervalle de temps, puis à établir un facteur (F) de conversion en effectuant le rapport entre la quantité d'acides gras libérés pendant un intervalle de temps et la variation du signal physique mesuré par la méthode indirecte dans le même intervalle de temps. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le blocage de l'activité lipasique à des temps définis est réalisé grâce à une solution (A) identique à l'une des solutions 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on utilise comme substrat de l'activité lipasique une émulsion d'un triglycéride, par exemple, de trioléine. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le dosage des acides gras non estérifiés libérés dans le milieu réac tionnel s'effectue de manière spectrophotométrique. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que pour bloquer toute activité lipasique, on prélève, à des intervalles de temps définis, une certaine quantité du milieu réactionnel de la lipase que l'on met immédiatement dans la solution (A). 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que pour doser les acides gras libérés à partir du substrat pendant un intervalle de temps défini, on porte le mélange milieu réactionnel de la lipase/solution (A), à une température constante, puis on y ajoute la solution (B) et enfin on mesure l'absorbance qui est proportionnelle à la concentration d'acides gras non estérifiés. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il consiste - à mélanger, par exemple, 2ml de réactif avec 50 d'échantillon dont on désire mesurer l'activité lipa sique - à enregistrer de façon continue le signal physique de l'activité lipasique (variation de voltage ou d'absor bance) - à prélever, par exemple, toutes les deux minutes, 20 à 60 1 du milieu réactionnel de la lipase, préféren tiellement 40 tAl, qui sont immédiatement additionnés à 100 1 de la solution (A) maintenue à une température comprise entre 00C et 5"C - à ajouter à ce mélange porté durant environ 4 à 10 mi nutes, préférentiellement 6 minutes, à une température comprise entre 20"C et 40"C, de préférence 37"C, 200 1 de la solution (B) - à mesurer l'absorbance à 550 nm après environ une du rée de 2 à 10 minutes, préférentiellement 3 minutes, à la température d'environ 37"C ; - à effectuer le rapport entre la quantité d'acides gras libérés pendant un intervalle de temps et la variation du voltage ou de l'absorbance pendant le même inter valle de temps. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que la solution (A) présente un pH de 6,8 à 7, de préférence 6,9, et contient avantageusement - 40 à 60 mmol/l d'un tampon phosphate, de préférence 50 mmol/l - 0,25 à 0,35 kU/l d'acyl-coenzyme A synthétase, de préférence 0,3 kU/l ; - 4 à 6 mmol/l d'adénosine triphosphate, de préférence 5 mmol/l - 1,2 à 1,7 kU/l d'acide ascorbique oxydase, de préférence 1,5 kU/l - 1,2 à 1,7 mmol/l d'amino 4-antipyrine, de préférence 1,5 mmol/l - 0,55à 0,85 g/l de coenzyme A, de préférence 0,7 g/l; - 2,5 à 3,5 mmol/l de chlorure de magnésium, de préférence 3 mmol/l, et - 0,5 à 2,5 g/l d'éther d'octylphénol-polyéthylèneglycol, de préférence 2 g/l. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que la solution (B) contient avantageusement - 5,3 à 8 kU/l d'acyl-coenzyme A oxydase, de préférence 6,6 kU/l ; - 6 à 9 kU/l de peroxydase, de préférence 7,5 kU/l - 0,8 à 1,2 mmol/l de 3-méthyl-N éthyl-N (6 hydroxy éthyl) aniline, de préférence 1 mmol/l - 2,5 à 3,5 g/l de polyoxyéthanol, de préférence 3 g/l, et - 0,8 à 1,2 g/l d'éther d'octylphénol-polyéthylèneglycol, de préférence 1 g/l.