FR 2606413 A1 19880513 FR 8611150 A 19860731 Chaîne A de la ricine modifiée par oxydation à l'aide d'ions periodate. La présente demande qui est une division de la demande FR 84.09.702, a pour objet, la chaîne A de la ricine modifiée par oxydation à l'aide d'ions perio@ate. Le brevet US 4 340 535 decrit la préparation de produits anticancSreux, dits conjugues ou encore imnunotoxines, obtenus par couplage par liaison covalente de la chaine A de la ricine à une structure protéique telle ou'un anticorps, une immunoglobuline ou un fragment d'immunoglobuline,capable de reconnaître selectivement un antigène donné à la surface des cellules porteuses de cet antigène que l'on veut atteindre, telles que les cellules cancéreuses. La propriété principale de ces conjugues est d'etre des agents cytotoxiques spécifiques des cellules cibles vises. L'utilisation d'anticorps dirigés, soit contre des haptènes, soit contre des antigènes de différentiation, soit contre des antigènes associés aux cellules cancéreuses avait déjà permis d'obtenir des conjugués présentant une spécificité remarquable vis-à-vis des cellules cibles et un pouvoir cytotoxique très élevé visà-vis de ces memes cellules, comme cela apparaît dans le brevet ci-dessus. Les conjugués possédant ces propriétés étaient toujours des molécules mixtes artificielles dans lesquelles la chaîne A de la ricine était associée par une liaison covalente de type disulfure à un anticorps, une immunoglobuline ou un fragment d'immunoglobuline capable de reconnaltre sélectivement un antigène porté par les cellules cibles visées. Les conjugués decrits dans le brevet ci-dessus sont caractérisés par la présence en même temps des trois propriétés suivantes - la liaison covalente entre la chaîne A de la ricine et l'anticorps contient un radical disulfure, - l'un des atomes de soufre constituent la liaison disu-lfure est toujours l'atome de soufre appartenant au résidu de cysteine en position 257 de la chaîne A de ricine, - le bras de liaison réunissant la chaîne A de ricine et l'anticorps est fixé sur ce dernier au niveau de groupements NE2 latéraux ou terminaux d'une chaîne peptidique. Il a été maintenant troué ou'il n'est pas nécessaire que les trois conditions indiquées ci-dessus soient simu-ltanément satisfaites pour que l'on puisse obtenir des conjugues possédant à un niveau satisfaisant la propriété de cytotoxicité sélective qui caractérise cette classe de produits anticancéreux. La présente invention a pour objet des produits, appartenant à la classe des Immunotoxines, obtenus par couplage covalent entre, d'une part la chaîne A de ricine telle quelle ou convenablement modifiée (ci-apres désignée par le symbole A) et, d'au-tre part un anticorps ou fragment d'anticorps, utilisé sous sa forme naturelle ou correctement modifié (ci-après désigné par le symbole P > possédant la capacité de reconnaître sélectivement un antigène porté par les cellules cibles visées. Le couplage entre les 2 protéines peut être réalisé soit par l'intermédiaire d'une liaison disulfure soit par l'intermédiaire d'une liaison thioéther. Ainsi, la présente invention a pour objet, selon un de ses aspects, une immunotoxine formée par couplage d'un anticorps P avec la sous-unité A de la ricine, ayant la formule statistique suivante P'-W-A' I dans laquelle P' représente le radical d'une protéine qui est un anticorps ou un fragment d'anticorps tel quel ou chimiquement convenablement modifié, privé d'au moins l'une de ses fonctions propres et dans lequel les autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués, A' représente le radical d'une protéine qui est la sousunité A de la ricine telle quelle ou chimiquement convenablement modifiée et dans lequel les autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués et W représente une structure covalente bivalente contenant un groupe thioéther ou un groupe disulfure dont les atomes de soufre sont soit ceux des cystéines de P et A soit sont liés aux fonctions propres de P et/ou- de A par des structures d'espacement portant un groupe fonctionnel lié auxdltes fonctions propres de P et/ou- de A; avec la limitation que, dans le cas où W contient un groupe disulfure, lorsqu'un des atomes de soufre dudit disulfure est celui de l'une des cystéines de A, l'autre soufre est lié à la protéine P par une structure d'espacement portant un groupe fonctionnel lié à une fonction de la protéine P autre une fonction amine. Par liaison thioéther entre deux protéines on entend une liaison du type: dans laquelle Z, Y et E sont tels que définis ci-dessous. D'une façon préférentielle, la présente invention concerne une immunotoxine de formule statistique P'-W'-A' II dans laquelle P' et A' sont tels que définis ci-dessus et W' représente une structure covalente choisie parmi: (a) un groupement de formule (b) un groupement de formule (c) un groupement de formule -Z"-Y-E-S-S-(E'-Y'-Z')n- (d) un groupement de formule -(SH-Y'-E')n-S-S-E-Y-Z- où - Z et Z' représentent les fonctions propres des protéines A et P, choisies parmi l'atome d'oxygène provenant de l'hydroxyle de l'un d-es résidus de tyrosine; le groupe carbonyle provenant de l'un des carboxyles terminaux ou des carboxyles libres des acides aspartiques et/ou glutamiques de A et de P; le groupe provenant de la structure dialdéhydique obtenue après oxydation d'une des structures glucidiquesde A etde P par l'acide periodique; et le groupe -WH- provenant de l'une des amines terminales de A et de P ou de l'une des amines en position epsilon de l'un des résidus de lysine - Z" est tel que défini ci-dessus pour Z et Z' mais ne peut pas être -NH-; - Y et Y' représentent des groupes fonctionnels capables de se lier d'une façon covalente avec l'une quelconque des fonctions Z, Z' et Z" des protéines A et P; - E et E' représentent des structures d'espacement inertes; et - n représente zéro ou- 1. Les immunotoxines de la présente invention sont représentées par les formules I et II ci-dessus en forme simplifiée, mais il est entendu que la structure covalente bivalente -W; ou - est liée à au moins une molécule P et au moins à une molécule A. Le nombre de liaisons avec les protéines P et A dépend du nombre des fonctions propres desdites protéines intervenant dans l'opération de couplage. Par exemple, si une immunotoxine est formée par couplage de la sous-unité A de la ricine native avec l'anticorps P (par exemple l'anticorps T101) par l'intermédiaire d'une structure covalente bivalente ayant un groupe du sulfure dont un soufre est celui de la cystéine 257 de la chaîne A de la ricine et l'autre est lié aux oxygènes phénoliques des tyrosines de l'anticorps P par un groupe oxopropylique, elle aura la formule statistique P' SA')t dans laquelle t représente le nombre des tyrosines de l'anticorps (par exemple de l'anticorps T101) intervenues dans le couplage. L'immunotoxine ainsi obtenue corresponc ainsi à un produit de formule II, où: - P' est tel que defini ci-dessus, notamment le radical de l'anticorps T101 privé de t fonctions phénoliques de ses tyrosines; - A' est tel que défini ci-dessus, notamment le radical de la chaîne A de la ricine prive de la fonction thiol de sa cystéine 257; - ' est le groupement (c): -Z"-Y-E-S-S-(E'-Y'-Z')n- où Zn est l'oxygène des hydroxyles phénoliques intervenus dans le couplage, Y est -CC- ; E est la structure d'espacement inerte -CH2-CH2- et n est zéro. Particulièrement préférées sont les immunotoxines formées par une ou plusieurs structures contenant la sousunité A de la ricine et un seul anticorps P, représentées par la formule statistique P'('-A')m III dans laquelle P', W' et A' sont tels que définis ci-dessus et m représente le nombre de fonctions propres de la protéine P intervenues dans le couplagc. Le nombre m varie de 0,3 å 12, de préférence de 0,5 à 10. L'expression "m varie de 0,3 à 12, de préférence de 0,5 à 10" signifie que la valeur de rn est statistique car dans la population des molécules d'anticorps le couplage ne se produit pas d'une façon homogène. Le nombre m peut donc ne pas être entier. La valeur de n dépend notamment des anticorps utilisés, plus particulièrement de leur poids moléculaire. Ainsi, si comme anticorps P de départ on utilise un fragment Fab ou Fab', la valeur de m pourra varier entre 0,3 et environ 2; si l'on utilise un fragment F(ab')2, m pourra varier entre 0,5 et environ 4; pour un anticorps du type IgG, la valeur de m sera entre 0,5 et 6; enfin, pour un anticorps IgM, la valeur de m pourra varier entre 1 et 12. Il est cependant préférable que le décri de substitution sur l'anticorps P soit tel qu'il conduise à une valeur de m non inférieure à 0,5 et non su?erieure à 1G. Plus généralement, les structures I et II ci-dessus représentent des formules statistiques écrites de façon simplifiée, comme il a été spécifié ci-dessus. D'une façon analogue, les formules 1V, V et IX cidessous sont également statistiques - lorsque, le cas échéant, n est 1 - car les réactifs de couplage sont préparés à partir de populations de protéines PI et P2 qui ont toutes exactement les mêmes propriétés que celles prises en compte ci-dessus pour l'anticorps P, que ces protéi nes P7 et P2 soient'elles-mêmes l'anticorps P ou la carne A de ia ricine. Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne un procédé pour la préparation d'une immunotoxine axant la structure I ci-dessus, caractérisé en ce qu'on fait réacir en solution laqueuse et à la température ambiante une protéine P1, qui est indifféremment soit la sous-unité A de la ricine éventuellement modifiée soit un anticorps ou fragment d'anticorps, porteuse d'au moins u-n groupe thiol libre attaché à ladite protéine P1 directement ou par l'intermédiaire d'une structure d'espacement, avec une protéine P.2, différente de P1, qui est indifféremment soit la sous-unité A de la ricine soit un anticorps ou fragment d'anticorps, porteuse d'un groupement capable de couplage avec le thiol libre de la protéine P1, de façon à former une liaison thioéther ou dis ifure; avec la limitation que, dans le cas de la formation de la liaison disulfure, lorsque la protéine P1 est la sousunité A de la ricine, la liaison avec la protéine P2 est effectuée sur une fonction de ladite protéine P2 autre ote les fonctions amine Selon un aspect préférentiel, la présente invention concerne un procédé pour la préparation d'une immunotoxine ayant a structure II, dans laquelle P', 'K' et A' sont tels que définis ci-dessus, caractérise en ce qu'on fait réagir en solution aqueuse et à la température ambiante une protéine de formule P1'-(Z-Y-E) n- SH IV avec une protéine de formu-le statistique P2'-Z'-Y'-E'-G V ovi Pl'et P2' représentent les radicaux des protéines P1 et P2 liés aux fonctions propres desdites protéines ou les radicaux des protéines P1 et P2 provenant de l'ouverture des structures glucidiques par action de l'acide periodique, Z, Z', Y, Y', E et E' sont tels que définis ci-dessus et G représente un groupe ou un groupe -S-S-X, où X est un groupe activateur, étant entendu que lorsque G est un groupe -S- çX et P1' est la sous-unité A de la ricine, n est 1 ou bien n peut être zéro, mais, dans ce cas, Z' est autre que -NH-. Autant P que A sont donc des protéines qui présentent indifféremment (1) la ou les fonctions thiol qui participent au couplage et (2) un ou plusieurs groupements fonctionnels capables de réagir avec les fonctions thiol ci-dessus pour former une liaison disulfure ou thioéther. Selon la présente invention lesdites fonctions thiol et groupements fonctionnels sont ceux des protéines P ou A natives, ou bien ils y sont introduits artificiellement. Pour des raisons de clarté on précise ci-après la signification des symboles utilisés pour désigner les protéines ci-dessus ou leurs radicaux et des expressions utilisées pour désigner les différents symboles. Le symbole P représente une protéine choisie cari tout anticorps ou fragment d'anticorps, ou toute imr:rnoglobuline ou fragment d'immunoglobuline ou toute molécule dérivant des précédentes par modification artificielle de l'un quelconque de leurs groupements fonctionnels, y compris des structures glucidiques qu'elles portent, sous réserve que la protéine ainsi choisie reste capable de reconnaître sélectivement un antigène donne à la surface des cellules porteuses de cet antigène et notamment des cellules cancéreuses. Le symbole A représente une protéine qui est la sousunité dite chaîne A de la toxine végétale ricine telle qu'elle peut etre directement obtenue à partir de la ricine naturelle ou toute molécule dérivant de cette chaîne A par modification artificielle de tout groupement fonctionnel port par cette protéine, y compris la structure glucidique qu'elle porte naturellement, sous réserve que la protéine ainsi choisie présente encore a propriété d'inhiber la synthèse protéique ribosomale des cellules eucaryotes,telle que l'on peut la mettre en évidence dans un modèle d'étudie acellulaire. Le symbole P' représente un radical dérivé de la protéine P ci-dessus telle quelle ou chimiquement convenablement modifiée, privée d'une ou plusieurs fonctions propres et dont d'autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués. Le symbole A' représente un radical dérivé de la protéine A ci-dessus telle quelle ou chimiquement convenablement modifiée, privée d'une ou plusieurs fonctions propres et dont d'autres groupes fonctionnels sont éventuellement blocus. Le symbole P1 représente une des protéines A et P tel les que définies ci-dessus qui porte des fonctions thiol libres, attachées à ladite protéine directement ou par l'intermédiaire d'une structure d'espacement. Le symbole P2, différent de P1, représente une des protéines A et P telles que définies ci-dessus, qui porte un ou plusieurs groupements fonctionnels capables de réagir avec les thiols libres. Le symbole P1' représente le radical de la protéine P1 lié aux fonctions propres de la protéine P1 notamment les fonctions SH (de la cystéine), NH2 (terminal de la protéine ou dans la position epsilon des lysines), OH (des tyrosines), COOH (des acides aspartiques et glutamiques) ou le radical de la protéine P1, provenant de l'ouverture des structures glucidiques par action de l'acide périodique. Le symbole P2' représente le radical de la protéine P2 lie aux groupes fonctionnels caractéristiques NH2 (terminal de la protéine ou dans la position epsilon des lysines), , OH (des tyrosines), COOH (des acides aspartiques et glutamiques). Par exemple, P1'-SH représente la protéine P1 (qui peut être indifféremment l'anticorps ou fragment d'anticorps P ou la sous-unité A de la ricine) dans laquelle les groupes des cystéines sont libres et les autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués. De la même façon, P1'-CO- représente la protéine Pl, dans laquelle son groupe carboxylique terminal ou les groupes carboxyliques de ses acides glutamiques et aspartiques sont couples avec un groupement qui apporte un groupe D' introduit artificiellement. Encore, P2'-NH- représente la protéine P2 (qui peut être indifféremment l'anticorps ou fragment d'anticorps P ou la sous-unité A de la ricine) dans laquelle son groupe amino terminal ou les groupes amino de ses lysines sont attachés à un groupement susceptible de couplas avec le thiol de la protéine Pl Le terme "structure d'espacement inerte" tel qu'utilisé ici pour E et E' désigne un radical organique bivalent inerte vis-à-vis des réactifs utilises dans le procédé, tel qu'un groupe alkylène à chaine droite ou ramifiée contenant de 1 à 15 atomes de carbone, qui peut contenir une ou plusieurs doubles liaisons ou cÜi peut être interrompu par des atomes d'oxygène ou qui peut être substitue par un ou plusieurs groupes fonctionnels inertes, tels que des groupes methoxy, des groupes carboxyles libres ou estérifiés, des groupes dialkylamino, des groupes carbamates. Le même terme désigne également un groupe arylène contenant de 6 à 15 atomes de carbone qui peut être substitué par un ou plusieurs groupes fonctionnels inertes comme indiqué ci-dessus pou le groupe alkylène. L'expression "groupe fonctionnel capable de se lier d'une façon covalente" telle qu'utilisée ici pour Y et Y' désigne tous les groupes susceptibles de réagir avec les fonctions propres des protéines P1 et P2 pour donner une liaison covalente. Ainsi, les groupes -CC- et -(C=NH)- sont des groupes fonctionnels convenaWles susceptibles de se lier aux amines libres, aux thiols et aux hydroxyles phénoliques des protéines. De même, le groupe -h'H- est un groupe fonctionnel convenable susceptible de se lier aux groupes carboxyliques libres des protéines.Le groupe =Nest un groupe fonctionnel convenable, susceptible de se lier aux deux atomes de carbone des structures glucidiques des protéines P1 et P2 après oxydation avec les ions periodate. L'expression "fonction propre des protéines" telle qu'utilisée ici pour Z, Z' et Z", désigne les radicaux provenant des groupes caractéristiques des acides aminés forant les protéines ' P1 et P2, telles que l'atone c oxygène provenant des hydroxyles des acides amines tyrosine et éventuellement sérine, le groupe carbonyle provenant du carboxyle terminal ou ces carboxyles libres des acides asparticue et glutamique, le groupe -r.n- provenant de l'amine terminale des protéines ou des lysines; l'atone de soufre provenant du thiol de la cystéine.La même expression desione également le groupe provenant de la structure dialdéhydique obtenue après oxydation d'une des structures glucldioeJes des protéines P1 et P2 par traitement avec les ions periodate. Le terme "radical activateur", tel qu'utilisé ici pour X, désigne un groupement lie à un pont - -S-S- capable de réagir avec un thiol libre pour former un disulfure avec libération de X-SH. Des radicaux activateurs convenables sont les groupes pyridyl-2 et pyridyl-4, non substitués ou substitués par un ou des halogènes ou des radicaux alkyle, carboxyle, alkoxycarbonyle; le groupe phényle non substitué ou, de prEférence, substitué par un ou des halogènes ou des groupes nitro, alkoxy, carboxyle ou alko > :ycarbon;le; ou un groupe alkoxycarbonyle tel que méthoxycarbonyle. Les termes "alkyle" et "alkoxy" désignent des groupes contenant jusqu'à 5 atomes de carbone. Le terme "alkylène" désigne des groupements aliphatiques saturés, à chaîne droite ou ramifiée, contenant jusqu'à 10 atomes de carbone pouvant être substituespar un ou plusieurs groupes fonctionnels inertes tels que les groupes alkoxycarbonyle. L'obtention de la chaîne A de ricine pu-re, nécessaire à la réalisation des produits-de la présente invention, a eté décrite dans le brevet US 4 340 535. La préparation d'anticorps monoclonaux diriges contre des cellules cancéreuses humaines a été largement mentionnée dans la littérature scientificue et beaucoup de ces anticorps sont maintenant disponibles commercialement. Le couplage chimicue entre la chaîne A de ricine et l'anticorps (ou fragment d'anticorps) peut etre réalise selon le procédé de la présente invention par des modes opératoires 'i: - préservent les activités biologiques respectives des deux composants du- conjugué : l'anticorps et la chaîne A de ricine, - assurent au procédé une reproductibilite satisfaisante et un bon rendement de couplage, - permettent de maitriser la valeur du rapport chaîne A de ricine/anticorps dans le conjugué obtenu, - conduisent à un produit stable et soluble dans l'eau-. Parmi les modes opératoires répondant à ces caractéristiques, il faut privilégier ceux oui mettent en oeuvre une ou plusieurs fonctions thiol pour l'établissement de la liaison entre les 2 protéines. En effet, ces fonctions thiol se prêtent particulièrement bien à l'établissement, soit de liaisons disulfu-re, soit de liaisons thioéther qui satisfont les unes comme les autres au-x conditions générales ci-dessus. D'une façon générale, pour la bonne conduite des réactions de couplage entre protéines et en vue d'éliminer notamment les rêticulations anarchiques, il importe que l'une des protéines à coupler et elle seule porte la ou les fonctions thiol à mettre en oeuvre, alors que l'autre protéine et elle seule porte une ou plusieurs fonctions susceptibles de réagir avec les thiols en milieu aqueux de pH compris entre 5 et 9 et à une température ne dépassant pas 30 C, pour fournir une liaison covalente stable et céfinie. Les caractéristiques des protéines P1 et P2 utilisées comme produits de départ sont illustrées en détail ciaprès. La structure d'espacement E peut être remplacée par les structurespréferentielles R à R8 qu ne sont données qu'à titre d'exemple. I - CAS DE LA PROTEINE P1 Cette protéine étant dans tous les cas celle qui carte la ou les fonctions thiol qui participeront au couplage, la situ-ation se présente de façon diverse selon la nature de cette protéine P1. A) La protéine Pi porte naturellement un ou- plusieurs radicaux thiol utilisables pour permettre le couplage à la protéine P2 : c'est notamment le cas si la protéine P1 est le fragment d'anticorps connu sous la denomination de F(ab)', ', tel qu'il est classiquement obtenu par protéolyse limitée de l'anticorps en présence de pepsine, suivie d'une réduction du- (ou des ) ponts disulfure entre chaines lourdes. C'est également. le cas si la protéine P1 est la chaîne A de la ricine, ou un dérivé de cette chaîne A où l'un au moins des groupements thiol portés par les résidus de cystéine 171 et 257 de la chaîne A de ricine native est libre et accessible au couplage chimique. Dans tous ces cas, la protéine P1 porteuse dc son tou ses) groupement(s)thiol natureli!peut être utilisée dans cet état pour l'étape de couplace. E) La protéine P1 ne porte pas naturellement de radicaux thiol utilisables pou-r permettre le couplage à la protéine P2 : - c'est notamment le cas si la protéine P1 est une immunoglobuline native, un anticorps entier ou un fragment d'anticorps et notamment l'un des fragments couramment dénommés F(ab)'2 '2 ou F(ab), - un autre cas ou la protéine Pl ne porte pas naturellement de fonction thiol utilisable pour le couplage est celui où cette proteine P1 est la chaise A de ricine où chacun des deux résidus de cystéine est soit blo que par alkylation, soit inaccessible à la modification chimique. Dans tous les cas, il conviendra alors d'introduire artificiellement sur de telles molécules une ou plusieurs fonctions thiol aptes à permettre le couplage. Trois types de réaction peuvent être utilisés de préférence pour l'introduction de fonctions thiol: 1 - Le premier type de réaction est l'action de l'anhydride S-acétylmercapto succinique qui est capable d'acyler des fonctions amines de ia protéine. On pourra ensuite libérer les fonctions thiol par élimination du radical acétyl protecteur, par action de l'hydroxylamine, ainsi que cela a été décrit (Archives of Biochemistry and Biophysics, 119, r1-49, 1967). On pourra même, dans le cas où la (ou les) fonction(s) thiol ainsi introduiteg sous forme protégée doivent réagir ultérieurement avec un radical d sulfure mixte activé, se dispenser de la déprotection préalable par l'hydroxylamine ; en effet, la réaction de formation de la liaison disulfure utilisant les réactifs objet de la présente invention se produit aussi bien avec le radical S-acétyl qu'avec le thiol libre. D'autres méthodes décrite dans la littérature scientifique peuvent aussi être utilisées pour l'introduction de fonctions thiol su-r la protéine à modifier. 2 - Le deuxième type de réaction consiste à faire réagir la protéine par ses groupements carboxylicues avec une molécule diamine asymétrique présentant un pont disulfure, dc formule: H2N-Rl-S-S-R1-NH2 dans laquelle R1 est un groupe aliphatique comportant de 2 à 5 atomes de carbone. La réaction se fait de préférence avec la cystamine [R1=-(CH2)2-]en présence d'un agent de couplage, tel qu'un carbodiimide et notamment un dérivé soluble dans l'eau comme ltéthyl-1 (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide, et conduit à la formation, selon les stoechiométries mises en oeuvre, de l'un des dérivés suivants ou du mélange des deux: P1'-CO-NH-R1-S-S-R1-NH2 (Ia) P1-CO-NH-R1-S-S-R1-NH-CO-P1 (Ib). Un tel produit de réaction peut être alors utilise de deux manières: a) Si dans les formules la ou Ib, la protéine P1 est la chaîne A de ricine ou l'un de ses dérivés le milieu- réactionnel obtenu est soumis sans fractionnement à l'action d'un réducteur,tel que le mercapto-2-éthanol, ce qui conduit à l'obtention d'un dérivé protéique unique de formule générale: P1'-CONH-R1-SH Le produit ainsi obtenu est alors purifié par dialyse ou filtration sur gel. b) Si dans les formules Ia et Ib, le radical P'lest le radical de la protéine P1 constitué par un anticorps ou l'un de ses fragments, le milieu réactionnel obtenu sera utilisé tel quel pour le couplage en utilisant alors une méthode d'échange thiol/disulfure par exemple celle décrite par Gilliland et Collier (Cancer Research, 40, 3564, 1980). 3 - Le troisième type de réaction consiste à utiliser des motifs glucidiques naturellement présents soit sur la chaîne A de ricine, soit sur les anticorps pour fixer le radical porteur du- thiol que l'on se propose d'introduire. La protéine est alors soumise à une oxydation par les ions periodate afin de faire apparaître des fonctions aldehyde sur les motifs glucidiques. Après arrêt de la réaction par addition d'un excès d'ethylène glycol et élimination des sous-produits et exces de réactifs par dialyse, le produit obtenu est traité par une molécule du aminée asymétrique présentant un pont disulfure, de formule générale: H2N-Rl-S S-R1-SH2 dans laquelle R1 est un groupe aliphatique comportant de 2 à 5 atomes de carbone. Les produits d'addition formés sont alors réduits en amines secondaires ou tertiaires par action d'un hydrure métallique convenable, notamment le borohydrure de sodium.La réaction se fait de préférence avec la cystamine LR1 = - (CH 2) 2-J et condu-it à la formation, selon les stoechiomêtries mises en oeuvre ae l'un des dérivés suivants ou du mélange des deux: Selon que, dans les formules IIa ou IIb, le radical P'1 est le radical de la protéine P1 constituée. par la chaîne A de la ricine éventuellement modifie ou un anticorps ou fragment d'anticorps, le milieu rcactionnel obtenu pourra alors être traité exactement comme indicuf ci-dessus pour les produits caractérisés par les structure s la ou Ib. Dans les deux derniers types de réaction d'introduction artificielle de groupements thiols dccrits ci-dessus (ceux utilisant un réactif disulfure diaminé symétrioue), il est préférable que la protéine P1 mise en oeuvre ne possède ni groupes SH libres, ni groupes aminés libres. Dans le cas de la chaîne A et de ses derivés cela peut toujours etre réalise par alkylation du ou des 5H naturels obtenue par reaction avec un reactif usuel des thiols tel que le N-éthylmaléiimide ou l'acide iodacétique ou l'un de ses dérivés et par mc-thylation des NH2 naturels selon le procédé de méthylation réductive décrit par M,':S et FEENEY (Piochemistry 7, 2192 (1968)). On peut introduire ainsi dans la chaîne A de ricine native jusqu'à 6 radicaux méthyle par mole.La protéine ainsi modifiée conserve l'intégralité de ses propriétés biologiques et notamment sa capacité à inhiber la synthèse protéique ribosomale dans les cellules eucaryotes. Dans les cas des anticorps ou fragments d'anticorps et plus généralement de toutes les substances du premier groupe tel que défini précédemment qui ne possèdent pas de groupenents Su naturellement libres, il conviendra de procéder à une méthylation rductive, par exemple selon la méthode de MEANS et FEENEY : on peut ainsi habituellement introduire plusieurs dizaines de radicaux méthyle par mole d'anticorps sans modifier sa capacité à reconnaître sélectivement un antigène à la surface des cellules porteuses de cet antigène. II - CAS DE LA PROTEINE.P2 Cette protéine est dans tous les cas celle qui porte un ou plusieurs groupements fonctionnels capables de réagir avec les thiols de la protéine P1 pour former une liaison soit disulfure soit thioéther. Ces groupements fonctionnels, toujours artificiellement introduits sur la protéine P2, différent selon que l'on cherche à obtenir un couplage par liaison disu-lfu-re ou par liaison thioéther et sont choisis comme indiqués ci-après. 1) Cas de la liaison disu-lfure La preparation du conjugué peut alors être représentée par le schéma P1'-(Z-Y-E)n-SH + P2'- Z'-Y'-E'- S-S-X P1'-(Z-Y-E)n-S-S-E'-Y'-Z'-P2' + X-gH La protéine P2 substituée par un atome de soufre activé est obtenue à partir de la protéine P2 elle-même ou de la protéine P2 correctement protégée, par substitution à l'aide d'un réactif lui-même porteur d'un atome de soufre activé selon le schéma P2 + L,Y'-R-S-S-X, P2'-Z'-Y'-R'-S-S-X dans lequel : P2 désigne la protéine à substituer . L,Y' représente une fonction permettant la fixation covalente du réactif su-r la protéine. Le groupement fonctionnel L,Y' est une fonction capable de se lier de façon covalente avec l'une quelconque des fonctions portées par les chaînes latérales des aminoacides constitutifs de la protéine à substituer. Parmi celles-ci, on retiendra particulièrement a) Les fonctions aminées terminales des chaînes peptidiques ou les fonctions aminées latérales des radicaux lysyle contenus dans la protéine. Dans ce cas, L- Y' pourra notamment représenter un groupe carboxylique qui pourra se lier aux fonctions aminées de la protéine en présence d'un agent de couplage tel qu-'un carbodiimide et notamment un dérivé soluble dans l'eau comme l'éthyl-1 (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide;; un chlorure d'acide carboxylique qui est susceptible de réagir directement avec les fonctions aminées pour les acyle un ester dit "activé" tel qu'un ester d'ortho- ou para-, nitro- ou dinitro-phényle ou encore un ester de Nhydroxy succinimide qui peut réagir directement avec les fonctions aminées pour les acyler;; un anhvdride interne d'un diacide carboxylique tel, par exemple, l'anhydrique succinique oui réagit spontanément avec les fonctions amines pour créer des liaisons amides un groupement imidoester (L = OR2, Y'= -(C=NH)-) où R est un groupe alkyle, réagissant avec les groupes aminés de la protéine P2 selon la réaction où R3 représente le groupe -R-S-SX; b) les fonctions phénol des radicaux tyrosyle contenus dans la protéine. Dans ce cas L,Y' pourra notamment représenter un groupement imidazolyl-l- carbonyl, réagissant avec les groupes phénol de la protéine selon la réaction où le 1-imidazolyle est L, le groupe CO est Y' et R4 est le groupe -R-S-S-X. Le radical - ç S-X désigne un disulfure mixte activé capable de réagir avec un radical thiol libre. En parti culier, dans ce disulfure mixte, X pourra désigner un groupe pyridyl-2 ou pyridyl-4, Cventuellement substitué par un ou des radicaux alkyle, halogène ou carboxylivue. X peut aussi désigner un groupe phényle de préférence substitué par un ou des groupes nitro- ou carboxylique. X peut encore représenter un groupe alcoxycarbonyle,tel que le groupe méthoycarbonyle. Le radical R désigne la structure d'espacement (indique comme E dans la formule générale II ci-dessus) capable de porter simultanément les substituants Y' et S - S - X. Il devra être choisi de façon à ne pas comporter de fonctions susceptibles d'interférer au cours des réactions ultérieures avec les réactifs utilisés et les produits synthétisés. En particulier, le groupe R peut être ur. groupe - -(CH2)n- avec n compris entre 1 et 10, ou encore un groupe dans lequel R6 désicne l'hydrogène ou un groupe alkyle ayant de 1 à 8 atomes de carbone et RS désigne un substituant inerte vis-à-vis des réactifs utilisés ultérieurement,tel tel qu'un groupe carbamate où R7 désigne un groupe alkyle droit ou ramifié ayant de I à 5 atomes de carbone et notamment le groupe tertiobutyle. La réaction du composé L,Y'-R-S-S-X avec la protéine P2 est effectuée en phase liquide homogène le plus souvent dans l'eau- ou une solution tampon. Lorsque la solubilité des réactifs l'exige, il est possible d'ajouter au milieu réactionnel un solvant organique miscible à l'eau à une concentration finale pouvant atteindre 20 % en volume lorsqu'il s'agit d'un alcool tertiaire tel que le butanol tertiaire ou 10 % en volume lorsqu'il s'agit du diméthylformamide ou du tétrahydrofuranne. La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps variant de quelques minutes à quelques heures. Après quoi, une dialyse ou une filtration sur gel permet d'éliminer les produits de faible masse moléculaire et, en particulier, les excès de réactifs. Ce procédé permet d'introduire un nombre de groupements substituants par mole de protéine habituellement compris entre 1 et 15. En utilisant de tels composés, le couplage avec la protéine P1 est réalisé par mise en présence des deux protéines en solution aqueuse de pH compris entre 6 et 8, à une température ne dépassant pas 30 C, pendant un temps variant de 1 heure à 24 heures. La solution aqueuse obtenue est éventuellement dialysée pour éliminer les produits de faible masse moîCculaire, puis le conjugue peut être purifié par diverses méthodes connues. 2) Cas de la liaison thioéther La préparation du conjugue consiste alors à faire réagir P1'-(Z-Y-E)n-SH avec la protéine P2 sur laquelle aura préalablement été introduit un ou plusieurs radicaux maleiimide. La réaction est alors représentée par le schéma suivant cité cote exemple: dans lequel: . R8 représente une structure d'espacement, aliphatique ou aromatique comportant de 1 à 15 atomes de carbone, inerte vis-à-vis des réactifs utilisés ultErieurement . Z représente des groupes variables selon le te de groupement fone tionnel de la protéine P2 intervenant dans le couplage. Ainsi Z = oxygène dans le cas d'un ester sur le phénol d'un résidu tyrosyle; Z = Nn dans le cas du couplage d'un groupement carboxylique activé sur un groupement aminé de la protéine; Z = NH-CH2 dans le cas de la réaction d'une chlorométhylcétone sur un groupement aminé de la protéine. La protéine P2 substituée par le ou les groupes maléìimide est obtenue à partir de la protéine P2 elle-meme ou de la protéine P2 correctement protégée, par substitution de fonctions convenables de la protéine à l'aide d'un réactif lui-meme porteu-r du- groupement malélimide. Parmi ces fonctions convenables, on retiendra particulièrement a) Les fonctions aminées terminales des chaînes peptidiques ou les fonctions aminées latérales des résidus lysyle contenus dans la protéine. Dans ce cas, le réactif porteu-r du radical malélimide pourra être - soit un réactif de formule générale L-CO-RE dans laquelle t-CC- represente . soit un groupe carboxylicue, la réaction étant alors effectuée après activation de la fonction carboxylique en présence d'un agent de couplage, tel qu'un carbodiimide et notamment un dérivé soluble dans l'eau > tel que l'éthyl-l (dimEthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide, . soit un ester dit "activé" tel qu'un ester d'ortho- ou para- nitro ou dinitrophényle, ou encore un ester de Nhydroxysuccinimide qui réagit directement avec les fonctions amines pour les acyler. La préparation de tels réactifs est notamment décrite dans Helvetica Chimica Acta 58, 531-541 (1975). D'autres réac- tifs de la même classe sont commercialement disponibles. - soit un réactif de formule capable de réagir avec les groupements aminés de la protéine P2 selon le schéma b) les fonctions phénol des radicaux tyrosyle contenus dans la protéine. Dans ce cars, le réactif porteur du radical male imlise pourra être un réactif de formule génCrale réagissant avec les groupes phénol de la protéine selon la réaction La réaction des réactifs porteurs de malélimide avec la protéine P2 est effectuée en phase liquide homogène le plus souvent dans l'eau ou une solution tampon.Lorsque la solubilité des réactifs l'exige, il est possible d'ajouter au milieu- réactionnel un solvant organique miscible à l'eau à une concentration finale pouvant atteindre 20 % en volume lorsqu'il s'agit d'un alcool tertiaire tel que le butanol tertiaire ou 10 t en volume lorsqu'il s'agit du diméthylformamide ou du tétrahydrofuranne. La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps variant de quelques minutes à quelques heures. Après quoi, une dialyse ou une filtration sur gel permet d'éliminer les produits de faible masse moléculaire et, en particulier, les excès de réactifs. Ce procédé. permet d'introduire un nombre de groupements substituants par mole de protéine habituellement compris entre l'et 15. En utilisant de tels composés, le couplage avec la protéine P1 est réalisé par mise en présence des deux protéines en solution aqueuse de pH compris entre 6 et 8, à une température ne dépassant pas 30C C, pendant un temps variant de 1 heure à 24 heures. La solution obtenue est éventuellement dialysée pour éliminer les produits de faible masse moldwculaire, puis le conjugue peut être purifié par diverses méthodes connues. Parmi les composés de la présente invention, sont particulièrement convenables ceux de formule II dans laquelle W'représente un des groupements (a), (b), (cj et (c) ci-cessus, où E et E' représentent un groupe -teH2)p-, p étant un nombre entier de 2 à 7 ou un groupe Ies exemples qui suivent permettent de mieux comprendre l'invention sans en limiter la portée. Dans tous ces exemples, la préparation des conjugues sera décrite à partir de la chaîne A de ricine sous sa forme native, telle qu'elle est obtenue par le procédé décrit dans le brevet US 4 340 535. Les anticorps utilises dans ces exemples sont - soit l'anticorps monoclonal T101 dirigé contre l'antigène T65 présent sur les lymphocytes T humains et de nombreuses lignées de cellules de leucémies T humaines. Cet anticorps est celui décrit dans Journal of lmmunology 125 (2), 725-7 (1980r Il est commercialement disponible auprès de HYDRITECH Inc. SN DIEGO, California, USh - soit l'anticorps monoclonal AT1SE, dirigé contre l'antigène Thy 1.2 des lymphocytes murins. Cet anticorps est celui décrit dans Journal of Immunology 122, 2491-9 (1979) et a été obtenu à partir de l'hybridome décrit dans Hybridome 1 (1) 13-17 (1981) - soit un anticorps monoclonal anti-DNP. I - EXEMPLE 1 P1 = chaîne A de ricine portant un SH introduit par l'interrnédiaire des carboxyles. P2 = anticorps T101 sur lequel on a introduit u-n groupement disulfure activé par l'intermédiaire des amines. A) Préparation de la channe A de ricine correctement fonctionnalisée 1) Blocage du thiol naturel Par le N-éthvlmalélimide 15 ml de solution aqueuse de chaîne A de ricine à 8 mg/ml (soit 4,1 micromoles de chaîne A) sont additionnés d'une solution aqueuse de mercapto-2-éthanol de telle sorte que la concentration finale de ce dernier soit de 1 pour cent. La solution est laisse au repos une heure puis dialysée en continu contre du tampon phosphate 125 mM pH 7 renouvelé pendant 40 heures à raison de 300 ml/heure. Selon la méthode d'ELLMAN (Methods in Enzymology 25, 457, 1972), on a dose 0,9 équivalent 5H par mole de chaîne A de ricine. On procède au blocage de cette fonction SH par le Néthylmaléiimide selon la méthode décrite dans Methods in Enzymology 11, 541, (1967). Pour cela, la chaîne A de ricine obtenue à l'étape précédente est incubée pendant 2 heures à 30 C en présence de 20 équivalents de li- éthylmaleìimide par mole de chaîne A. On élimine l'excès de réactif par dialyse en continu contre du tarpon phosphate 125 mM pH 7 renouvelé pendant 20 heures à raison de 500 ml/heure. On obtient ainsi 13 ml d'une solution de channe A de ricine z 7 mg/ml, ne présentant plus de groupements thiol dosables par le réactif d'ELLMAN.Le produit ainsi obtenu est désigné ultérieurement sous l'appellation chaine A (N:). 2) Modification des carboxvles A 40 mg, soit 1,33 micromoles de chaîne A (NEM) dans du tampon phosphate 125 m.! sont ajoutés 1,95 mmoles de chlorhydrate de cystamine et 390 microlitres d'une solution aqueuse 1 M d'éthyl-l(diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide. Le pH de la solution est ramené à 5,4 par de l'acide chlorhydrique 1 N. On laisse la réaction évoluer 2 heures à 20 C puis elle est arrêtée par addition de 750 microlitres de solution aqueuse 1 M d'acétate de sodium et le milieu réactionnel est purifié par dialyse en continu contre du tampon phosphate 125 mu pH 7 (20 1 à 300 ml/h). Le pont du sulfure de la cystamine fixée à la protéine est ensuite réduit par le mercapto- 2-éthanol (à la concentration finale de 3 pour cent pendant 1 heure à 30 C). On poursuit ensuite la dialyse contre le tampon phosphate 125 m." pH 7 comme precédemment. Après centrifugation on obtient 14 rnl de solution de chaîne A (NEM) modifiée, à 1,75 mg/ml. Sur ce produit, la méthode d'ELLMAN permet de doser 0,7 groupement- SH libre par mole de protéine. Examinée par électrophorèse en gradient de polyacrylamide, cette chaîne A (NEM) modifiée présente une seule bande de poids moléculaire voisin de 30 000. B) Préparation de l'anticorps modifié A 25 ml d'une solution d'anticorps T101 à 10 mg/ml (soit 1,68 micromoles d'anticorps; est ajoutée une solution aqueuse contenant 11 mg d'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique préalablement dissous dans le butanoi tertiaire et 6,5 mg d'éthyl-l (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide. Le mélange est agité 15 minutes à 30C C puis dialysé en continu contre du tampon phosphate 125 mM pu 7 C) Préparation de l'immunotoxine A 1,75 ml de la solution d'anticorps activé précédemment obtenue (soit 0,12 micromole) , on ajoute 7,5 ml de la solution de chaîne A (NEM) modifiée précédemment obtenue (soit 0,44 micromole) et on incube 5 heures à 30 C. La solution est centrifugée puis purifiée par filtration sur colonne de Sephadex C100 avec mesure de la densité optique de l'effluent à 280 nm. Le reoroupement des fractions contenant à la fois l'anticorps et la chaîne A conduit à 31 mi de solution d'immunotoxine à 0,51 mg/ml (soit 15,8 mg). Cette solution contient 0,125 mg de chaîne A (NEM) modifiée couplée à l'anticorps par ml. te taux de couplage moyen dans cette préparation est donc de 1,6 channe A (NEM) par gnole d'anticorps. On obtient ainsi une immunotoxine de formule Il ci-dessus, où - A' est le radical de la sous-unité A de la ricine dont les groupes S sont bloqués par la N-éthylmaléiniide - P' est le radical de l'anticorps T101 - W' est un groupement de formule -Z#-Y-E-S-S- (E'-Y'-Z')n- dans laquelle . Z" est -CC- . Y est -NH . E est -CH2CH2 . E' est -CH2CH2- . Y' est -CO- . Z' est -NH . n est 1. D) Test d'activité des immunotoxines La propriété biologique fondamentale de la chaîne A de ricine est d'inhiber la synthèse protéique dans les cellules eucaryotes par altération de la sous-unité ribosomale 60S. Les tests réalisés sont donc des tests d'inhibition de la synthèse protéique soit sur un modèle acellulaire (est n 1) soit sur un modèle cellulaire (test n 2) 1) Le modèle acellulaire (test no 1) Le protocole in vitro utilise des fractions subcellu-laires de foie de rat convenablement complémentées et capables d'incorporer la 14Cphénylalanine en présence d'un AR messager artificiel : l'acide polyuridylique. te mode opératoire employé pour préparer les fractions subcellulaires et pour mesurer l'incorporation de 14Cphénylalanine est une adaptation de la méthode décrite dans Biochemica Biophysica Acta 312, 608-615 (1973), mettant en oeuvre à la fois une fraction microsomale et une fraction de cytosol des hépatocytes de rat. L'échantillon contenant la chaîne A est introduit sous la forme d'une solution convenablement dilue dans un tampon Tris HCl 50 mM, pH 7,6 contenant du mercapto-2 éthanol à 0,2 e et de la sacrum albumine bovine à 15 microgrammes/ml. A partir des données de comptage, on calcule par rapport à un milieu témoin sans inhibiteur le pourcentage d'inhibition d'incorporation de 14C-phénylalanine dans les protéines pour chaque milieu réactionnel contenant de la chaise A de ricine. L'ensable de ces valeurs peur et de déterminer la concentration de chaîne A de ricine (ou C.50) oi inhIbe 50 8 d'incorporation de la 14C- phenylalanine dans les conditions de l'essai. 2) Le modèle cellulaire (test n 2) Ce test mesure l'effet des substances étudies sur l'incorporation de 140-leucine dans des cellules cancéreuses en culture. Les cellules utilisées dépendent de la spécificité de l'anticorps choisi pour la fabrication de l'immunotoxinc. Dans cet exemple, il s'agit de cellules de la lignée lymphoblastoìide humaine CEM portant naturellement l'antigène T65. Ces cellules sont incubées en présence de préparations des substances à étudier puis soumises en fin d'incubatIon à une mesure de leur taux d'incorporation de 14C-leucine. Cette mesure est effectuée selon une technique adaptée de la technique décrite dans Journal of Biological Chemistry 249 (11), 3557-3562 (1974) utilisant le traceur 14Cleucine pour la détermination du- taux de synthèse protéique. La détermination de la radioactivité incorpore est effectuée ici sur les cellules entières isolées par filtration. A partir de ces déterminations, on peut tracer les courbes effets/doses présentant en abscisse la concentration des substances étudiées et en ordonnée l'incorporation de 14Cleucine exprimée en pourcentage de l'incorporation par des cellules témoins en l'absence de la substance à étudier. On peut ainsi déterminer pour chaque substance étudiée la concentration qui inhibe de 50 pour cent l'incorporation de 14C-leuclne dans les cellu-les ou "concentration inhibitrice 50" (CI50). On a vérifié que la mesure d'incorporation de la 14C-leucine dans les cellu-les entières conduit à la détermination de CI50 identiques à celles obtenues par la méthode classique de mesure de la synthèse protéique. 3) Re-sultats a - Test n l (modèle acellulaire) L'activité inhibitrice de la chaine A modifiée a été déterminée. On observe une CI 50 égale à 2,18.10**-10 mole/l. La CI50 de la chaîne A témoin de l'expérience est 1,03.10**-10 mole/l : la modification n'entraîne donc pas de perte d'activité significative de la chaîne A. b - Test n0 2 modèle cellulaire) Le test est réalisé sur cellules CE.' portant naturellement l'antigène T65. Le conjugué présente une activité cytotoxique significative (CI50 environ égale à lO##-9 mole/1) 50 fois supérieure à celle de la chalne A de ricine (CI50 = 5 lO-8 mole/l dans les memes conditions opératoires). En présence de chlorure d'ammonium 10 m l'activité cytotoxique du conjugue augmente de façon très importante (CI50 = 2.10**-12. mole/l). L'activité cytotoxique est alors 25000 fois plus élevée que celle de la chaîne A. II - EXEMPLE 2 P1 = chaîne A de ricine portant un SH introduit par l'intermédiaire des carboxyles P2 = anticorps T101 sur lequel on a introduit un groupement malElimide sur les amines. A) Préparation de la chaîne A correctement fonctionnali sée: identique à celle de l'exemple 1 B) Prétaration de l'anticorps modifié: A 10 nil d'une solution d'anticorps T101 à 10 mo/nl, soit 0,67 micromoles, est ajoutée une solution aqueuse contenant 8,8 mg d'éthyl-l (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide et ll mg d'acide maléiimidocaproiique, prealablement incubez 15 minutes à 25 C. Le mélange est agité 3 heures à 300 C puis dialysé en continu à 4 C contre du tampon phosphate 125 mM pH 7 pendant 40 heures (500 ml/h). On obtient ainsi 18,5 nil d'une solution à 5,2t mg d'anticorps modifié par ml.Par dosage du groupement malélimide à l'aide de la 14C cystéine, on constate que l'on a obtenu un anticorps portant 2,8 groupements activateurs par mole d'anticorps. C) Préparation de l'immunotoxine. A 3 ml de la solution d'anticorps activé précédemment obtenue (soit 0,11 micromoles), on ajoute 7,5 nil de la solution de chaîne A de ricine modifiée, soit 0,4 micromoles). On laisse le mélange évoluer 1 h à 30 C. Les groupements maléiimide résiduels sont bloqués par addition de 5,8 micromoles de cystéine. L'incubation dure 1 h à 300 C. Le milieu réactionnel est purifié par filtration sur une colonne de Sephadex G100 comme décrit dans l'exemple 1. On obtient 39 ml de solution d'immunotoxine à 0,35 mg/ml Le taux de couplage moyen dans cette préparation est acnc de 2,1 chaîne A (NEM) par mole d'anticorps. On obtient ainsi une immunotoxine de formule II ci-dessu-s, ou - A' est le radical de la sous-unité A de la ricine dont les groupes SH sont bloqués par le N-éthylmaléimîde - P' est le radical de l'anticorps T101 - W' est un groupement de formule . Z' est -CO- . Y' est -NH- . E' est -CH2CH2 . E est - (CH2) 6- Y Y est -CC- Z Z est -NH- . n est 1. D) Tests d'activité: a - Test n 1 (modèle acellulaire:identique à l'exemple 1 b - Test n 2 (modèle ceilulaire): Dans des conditions identiques à celles de l'exemple 1, la CISO en présence d'activateur (chlorure d'ammonium 10 mM) est de 2.10**-11 mole/l ce qui représente une activité cytotoxlque du conjugué 2500 fois supérieure à celle dc la chaine A (CI50 = 5.10**-8 mole/l dans la même expérience). III - EXEMPLE 3. P1 = chaîne A de ricine sur laquelle on a introduit un groupement 5.; par l'intermédiaire du motif glucidique. P2 = anticorps T101 sur lequel on a introduit un groupement disulfure activé sur les amines. A) Pré?aration de la chaîne A de ricine correctement fonctionnalisée: 1) Héxaméthylation de la chaîne A La réaction de méthylation s'effectue à 0 C sous agitation dans du tampon borate 0,2 M pH 10 selon la méthode de Means et Feeney (Biochemistry 7, 2192 (1968)).A 35 nil de chaîne A (3 mg/ml) on ajoute successivement 20 mg de borohydrure tritié (à 9,5 mCi/mmole) puis 350 microlitres de formaldéhyde à 6 % en 5 additions de 70 microlitres chacune échelonnées sur un délai de 30 min.) On élimine l'excès de réactif par dialyse en continu contre du tampon phosphate 125 mM pH 7 (40 1 à 300 ml/ h). Après dialyse la solution protéique est centrifugée. On recueille 36,5 ml de chaîne A hexamethylée à 2,6 mg/ml. 2) Blocage au N-éthyl maléiimide On procède au blocage du SH naturel de la chaîne A comme indiqué à l'exemple 1. 3) Oxydation périodique 6 ml de la solution de chaI ne A (NEM) hexamethylée précédemment obtenue, sont traités par NaIO4 (12,8 mg) en 40 minutes à l'obscurité, à pH 4,S et à 0 C. La réaction est arrentée par addition de 600 microlitres d'éthylène glycol et le milieu réactionnel est dialysé en continu cotre du tampon carbonate 0,1 M, pH 10 (20 h à 500 ml/h). 4) Couplage à la cystamine Après dialyse, 5 ml de la solution protéique sont mis à incuber avec 11,25 mg de chlorhydrate de cystamine pendant 1 heure à 250 C. Cette incubation est suivie d'une réduction par le borohydrure de sodium (200 équivalent par mole de chaîne A), soit 50 microlitres d'une solution 2 M), pendant 1 h à 250 C. On élimine l'excès de réactif par dialyse en continu contre du tampon phosphate 125 r pH 7. Le pont disulfure de la cystamine fixée est ensuite réduit par le mercapto2 éthanol à la concentration finale de 5 pour cent pendant 1 h à 30 C. On poursuit ensuite la dialyse en continu contre du tampon phosphate 125 mM pH 7 (20 1 à 300 ml/h). Après dialyse et centrifugation on a dosé selon la méthode d'Ellman 0,68 équivalent SH par mole de chaîne A. B) Préparation de l'anticorps modifié: identique à celle décrite dans l'exemple 1. C) Préparation de l'immunotoxine: A 1,3 ml de la solution d'anticorps activé à 10,32 mc/ml précédemment obtenue (0,09 micromoles), on ajoute 4 ml de la solution de chaîne A activée (soit 0,23 micromoles). On laisse le mélange évoluer 5 h à 300 C. te milieu réactionnel est purifié sur une colonne de Sephadex G100 selon la méthode précédemment décrite. On obtient 6,7 ml d'une solution d'imrnunotoxine à 0,25 mg/ml (soit 1,7 mg). Cette solution contient 0,024 mg de chaîne A (NEM) modifiée couplée à l'anticorps. Le taux de couplage moyen dans cette préparation est donc de 0,5 chaîne A (NEM) par mole d'anticorps. On obtient ainsi une immunotoxine de formule II ci-dessus, où - A' est le radical de la sous-unité A de la ricine dont les groupes thiol sont bloqués par la N-éthylmaléimide, les groupes aminés sont méthylés, et les fonctions glucidiques ont été modifiées par traitement par les ions periodate - P' est le radical de l'anticorps T101 - M;' est un groupement de formule -Z"-Y-E-S-S-(E'-Y'-Z')n dans laquelle Z" est le groupe dérivant du dialdéhyde obtenu par traitement des structures glucidiques avec l'acide periodique . Y est =N- . E est -CH 2CH 2-. . E' est -CH2CH2 . Y' est -CC- . Z' est -NH . n est 1. D) Tests d'activité: a) test n 1 (modèle acellulaire) L'activité inhibitrice de la chaîne A modifiée a été déterminée. On observe une CI50 de 2,7.10**-10 mole/l alors que la CI50 dans la même expérience de la chaîne h non momifiée est de 1,03.10**-10 mole/l. La modification n'entraîne donc pas de perte d'activité significative de la chaîne A., b) Test n 2 (modèle cellulaire): Dans des conditions exépérimentales identiques à celle de l'exemple 1, la CI50 en présence d'activateur (chlorure d'ammonium 10 mM) est de 10**-12 mole/l, ce qui représente u-ne activité cytotoxique lO**5 fois supérieure à celle de la chaîne h, (CISO = 10**-7 mole/l dans la mee expérience.) IV - EXEMPLE 4. P1 = chaîne A de ricine sur laquelle on a introduit un SH par l'intermédiaire du motif glucidime. P2 = anticorps T101 sur lequel on a introduit un grouperent maléiimide sur les amines. A) Préparation de la chaîne A correctement fonctionnalisée: identique à celle de l'exemple 3 B) Préparation de l'anticorps modifié: identique à celle de l'exemple 2 C) Préoaration de l'immunotoxine : A 1,65 ml de la solution d'anticorps activé précédemment obtenue (soit 0,058 micromole), on ajoute 2 ml de la solution de channe A (NEM) hexaméthylEe (soit 0,28 micromoles). On laisse le mélange évoluer 1 heure à 300 C. Les groupements malélimide résiduels sont bloqués par addition de 3,15 micromoles de cystéine. L'incubation dure 1 heure à 30O C. Le milieu réactionnel est purifié sur un.e colonne de Sephadex G100 selon la méthode décrite à l'exemple 1. On obtient 34 ml d'une solution d'immunotoxine à 0,25 mg/ml, soit 8,75 mg. Cette solution contient 0,040 mg de chaîne A (NEM) modifiée couplée à l'anticorps par ml. Le taux de couplage moyen dans cette préparation est de 1 chaîne A (NEM) hexamethylée par mole d'anticorps. On obtient ainsi une immunotoxine de formule II ci-dessus, où - A' est le radical de la sous-unité A de la ricine dont les groupes thiol sont bloqués par la N-éthylmaléimide, les groupes aminés sont méthyles, et les fonctions glucidiques ont été modifiées Dar traitement par les ions periodate - P' est le radical de l'anticorps T101 - W' est un groupement de formule - (Z'-Y'-E'n)-S dans lacrjelle . Z" est le groupe dérivant du dialdéhyde obtenu par traitement des structures glucidiques avec l'acide périodique . Y' est = N- . E' est -CH2CH2 . E est -CH2CH2- . Y est -CC- . Z est -NH- n n est 1. D) Tests d'activité: a) Test n 1 (modèle acellulaire): identique à l'exemple 3. b) Test n 2:(modèle cellulaire) Dans les conditions expérimentales identiques à celles de l'exemple 1, la CI50 du conjugué en présence -de chlorure d'ammonium 10 mM est de lO**-8 mole/litre. REVENDICATIONS. 1. A titre de produit nouveau, la chaine A de la ricine dont les fonctions glucidiques ont été modifiées par oxydation à l'aide d'ions périodate. 2. Chaîne A de la ricine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par traitement d'une solution aqueuse de chaîne A de ricine, dont les groupes thiol sont protégés, avec une solution aqueuse de périodate de sodium à l'obscurité.