FR 2617501 A1 19890106 FR 8709366 A 19870702 L'invention concerne un procédé permettant la réalisation de réactions enzymatiques entre des matières prises en solution dans un solvant organique. Elle est particulièrement utile dans le domaine des corps gras, où la transfor- mation est effectuée au moyen d'une hydrolase. Alors qu'à l'origine les réactions enzymatiques avaient toujours lieu en milieu aqueux, depuis quelques années on cherche à les effectuer dans des solvants organiques, éventuellement additionnés d'eau, afin de solubiliser, et. ainsi mieux soumettre à l'action de l'enzyme, les substrats non hydrosolubles à traiter. C'est, notamment, le cas des différentes opérations sur les corps gras qui, étant insolubles dans l'eau, devaient être traités en milieu hétérogène, dont on connaît les inconvénients. Cependant, la recherche en ce domaine comporte beaucoup de difficultés, surtout à cause de la désactivation des enzymes par la plupart des solvants usuels. Un certain progrès fut réalisé par l'emploi de CO2 supercritique comme milieu de la réaction enzymatique, mais cela complique le travail ne serait-ce que par l'obliga- tion d'opérer sous pression.Un perfectionnement marqué a été obtenu par l'utilisation d'un solvant organique, notamment pour des matières grasses à hydrolyser, accompagné d'un tiers solvant ou d'un agent tensioactif,de façon à homogénéiser l'eau avec ce solvant organique tenant en solution la matière grasse ; ce procédé, décrit dans FR 2 585 365, a donné d'excellents résultats dans l'hydrolyse de différents glycérides en vue de l'obtention des acides gras correspondants. I1 exige, cependant, l'emploi d'un solvant tiers ou d'un agent tensioactif, en plus du solvant organique de la matière grasse ; il est, en outre, quelque peu limité à l'hydrolyse. Un autre procédé récent, objet de FR 86 04352 apporte des nouvelles possibilités, fort intéressantes pour la chimie enzymatique, par l'utilisation d'hydrocarbures .fluorés comme solvants des matières à traiter ; il permet les opérations telles qu'estérification, thioestérification, transestérification, amidation, etc. avec bons rendements diverses matières grasses peuvent ainsi être traitées en solution organique, en discontinu ou en continu. En particulier, l'estérification d'acides gras se fait rapidement, avec différents alcools, à des taux très élevés ; cependant l'estérification avec du glycérol est assez lente et conduit à un mélange de mono- et di-glycéride en proportions du même ordre, ne permettant pas l'obtention sélective de monoglycéride. Or, dans.le cadre de la présente invention, on a trouvé qu'en travaillant avec certains solvants organiques spéciaux, il devient possible d'obtenir des résultats que ne donnent pas les procédés précités. En effet, l'invention permet-elle de travailler plus aisément en continu. Dans le cas des estérifications aux polyols, en particulier au glycérol, elle rend possible l'obtention sélective de monoester, fait tout à fait nouveau. Ce résultat est sans doute lié à ce que cette invention comporte la solubilisation si- multanée de l'acide gras et du polyol dans le milieu réactionnel. Le procédé suivant l'invention, qui consiste à effectuer une réaction enzymatique au sein d'un solvant organique du substrat à traiter, est caractérisé en ce que le solvant comprend ou est constitué par un ou plusieurs alcools tertiaires. Lorsque ce solvant n'est pas intégralement formé par un alcool tertiaire, il est généralement constitué par un mélange d'un ou de plusieurs de tels alcools avec de l'eau ou/et avec d'autres liquides, tels que par exemple les éthers d'alkyles en C1 à C6, compatibles avec l'enzyme utilisée. Les alcools tertiaires, liquides aux températures inférieures à environ 60"C, c'est-à-dire à celles auxquelles ont lieu les réactions enzymatiques, sont peu nombreux ; pra tiquement comptent seulement les tertio-alcanols en C4 et C5 fondant au-dessous de 260C, mais il peut néanmoins être avantageux d'en employer d'autres,de points de fusion plus élevés, à condition de les mélanger avec des solvants avec lesquels ils donnent du liquide ; c'est le cas des alcools tertiaires en C6 à C12 aliphatiques ou porteurs de groupes aryliques. Ainsi, les plus importants parmi les alcools ter tiares utiles selon l'invention. sont le méthyl-2 OH propanol-2 CH3-C-CH3 tertio-butylique) CH3 fondant à 250C (ou alcool bouillant à 82,90C entièrement miscible à l'eau et à l'éthanol le méthyl-2 butanol-2(ou alcool tertio-amylique) fondant à -11,90C, bouillant à 1020C soluble dans l'eau à raison- de 14% à 300C et intégralement dans l'éthanol. Comme mentionné plus haut, ces alcools présentent l'intéressante propriété de dissoudre à la fois les matières grasses, acides et esters, comme les polyols, notamment le glycérol. Toutefois, des alcools tertiaires plus lourds peuvent constituer des systèmes solvants fort utiles, lorsqu'ils sont pris en mélanges avec les deux précédents ou/et avec des composés tels comme par exemple diéthyl éther, di-isopropyl éther, méthyl t.butyl éther, di-isobutyl éther, di-n. butyl éther, di-méthoxypropane, phényl éthyl éther, di-éthoxy-1,2 éthane, diglyme, acétone, méthyl-éthyl cétone, glycérol-formal, etc., choisis - bien entendu - parmi ceux qui ne désactivent pas l'enzyme donnée. A titre d'exemples non limitatifs, voici quelques uns des alcools tertiaires fondant au-dessus de 45 cl, qui peuvent être employés dans les conditions sus indiquées tertio-hexanols méthyl éthyl isopropyl carbinol (tertio-heptanol) tertio-octanol diphényl-l,l éthanol fondant à 800C Les alcools tertiaires suivant l'invention non seulement sont parfaitement compatibles avec le fonctionnement des lipases,estérases et protéases, dont ils n'affectent en rien l'activité, mais - de plus - ont un comportement inattendu : leur fonction alcool ne réagit pas avec des acides gras, en présence de l'enzyme, alors que les alcools primaires réagissent bien pour donner de l'ester. Le solvant à base de tert.alcool, suivant l'invention, reste donc inaltéré et récupérable, tout au long des opérations portant sur les matières grasses. Le procédé de l'invention peut en général être réalisé à des températures de 100 à 600C, et surtout entre 300 et 400C, la concentration du substrat à traiter par l'enzyme étant de 1 à 60% en poids dans le solvant employé. L'application de l'invention aux corps gras, particulièrement importante, peut être réalisée sous les différentes formes suivantes. Le corps gras est hydrolysé après sa mise en solution dans le tert.alcool, accompagné de la quantité adéquate d'eau et de l'hydrolase appropriée. La synthèse directe d'un ester est effectuée par dissolution d'un acide gras et d'un polyol dans du tert.alcool, au contact de l'enzyme nécessaire. Cette opération peut avoir lieu en discontinu, auquel cas il est indiqué d'introduire dans le milieu réactionnel un adsorbant de l'eau,par exemple un tamis moléculaire, afin d'éliminer l'eau de la réaction. Pour conduire cette synthèse directe en continu, on fait passer la solution des réactifs à travers un lit catalytique supportant l'enzyme ;des éléments absorbant l'eau sont prévus sur le parcours de la solution. La synthèse a lieu suivant l'équation. -OH lipase RCOO HO OH + R COOH W HO + RCOO- tertio-alcool HO HO R étant en alkyle en C2 à C30. Cette équation illustre le résultat inattendu de l'invention, mentionné plus haut : au sein d'un alcool tertiaire on obtient du mono-glycéride avec forte sélectivité, alors qué dans la technique antérieure les mono- et di-glycérides sont formés en proportions du même ordre. La synthèse indirecte d'un ester s'obtient, suivant l'invention, par l'alcoolyse d'un ester donné, au sein d'une solution dans le tert.alcool, en présence de l'enzyme appropriée. On opère ainsi en milieu anhydre, et il est recommandable de déshydrater convenablement les matières en présence. C'est le cas notamment où l'on fait réagir du glycérol avec un triglycéride, en solution dans l'alcool tertiaire, en présence d'une lipase ; sous peine d'hydrolyse indésirable on doit déshydrater préalablement le milieu réactionnel ; de préférence il ne doit plus y rester que moins de 50 ppm d'eau. Dans les exemples non limitatifs, donnés plus loin, on relate différents essais effectués avec la lipase du champignon Rhizopus arrhizus (ATCC 24563) ; ce catalyseur était préparé selon FUKUMOTO et coll. (J. Gen. Appl. Microbiol. 10, 1964, 257-65), de la façon suivante. Le microorganisme est cultivé dans un fermenteur sur le milieu composé de - huile de colza 20 g/l - "Corn Steep Liquor" 50 KH2Po4 2 -KCl 0,5 -NaNO3 0,5 -MgSO4.7H2O 0,5 Le pH initial est de 4,6. La croissance a lieu pendant 3-5 jours à 25-300C. Le mycélium est alors essoré, lavé à l'eau distillée et séché soit à l'étuve sous vide à température modérée, soit par lyophilisation. Le mycélium sec est dégraissé par extraction, puis broyé, tamisé et conservé au sec. L'activité lipasique du mycélium ainsi préparé se situe entre 0,9 et 4 unités/mg (sur trioléine en émulsion. EXEMPLE 1 Hydrolyse en discontinu Le mélange réactionnel est constitué de 88,9g d'alcool tertio-amylique contenant 10g d'huile végétale raffinée et 1,5g d'eau. Chaque opération est réalisée sur 10 mu de ce mélange mis en contact avec 100 mg de mycélium de R.arrhizus préparé comme indiqué plus haut. Après 2 heures de réaction, la conversion, c'est-à-dire la proportion des acides gras libérés par rapport au total des acides gras présents est de 12,8%. EXEMPLE 2 Hydrolyse en continu On fait passer en continu, à travers un réacteur, le mélange constitué de la façon suivante, en g pour 100g de mélange Huile végétale 12 Eau 1,8 Alcool t.amylique 86,2 La colonne du réacteur contient 5,5g de mycélium pour 1Oml de silice, soit un volume total d'environ 35 ml. Le volume mort est de l'ordre de 15 ml pour un débit de l'ordre de 12 ml/h, ce qui correspond à un temps de séjour de l'ordre de 75 mn. La réaction a lieu en continu avec un taux de conversion de 39% (proportion d'acide gras libérés par rapport aux acides gras présents). EXEMPLES 3 à 5 Estérification en discontinu Le mélange réactionnel est constitué par 9,2 g de glycérol (0,1 M) et de 14,1g d'acide oléique (0,05 M) pour 100 ml de solvant qui varie d'un exemple à l'autre. Après ajout de 2g de mycélium de R-arrhizus et 10 g de tamis moléculaire, on laisse sous agitation à TOC pendant e h puis on procède à l'analyse des produits de la réaction par chromatographie en phase gazeuse des dérivés triméthylsilyl de l'acide gras libre, ainsi que de mono- et diglycéride présents. Les résultats sont réunis dans le tableau ci-après, où la composition du mélange obtenu est exprimée en moles % Exemple NO 3 4 5 Solvant alcool tert. trichloro-tri- C02/77 bars amylique fluoro-éthane TOC 400C 400C 32 "C Durée e h 18 18 5 Etat du milieu 1- phase plusieurs homogène phases Composition % mol acide oléique 82,9 32,4 32,2 monoglycéride 17,9 37,1 -44,1 diglycéride 0 30,5 23,7 Bien que, dans l'exemple 3 correspondant à l'emploi d'un alcool tertiaire, l'estérification soit allée moins loin que dans les exemples comparatifs 4 et 5 représentant l'art antérieur, le résultant est néanmoins très intéressant, puisqu'il démontre la possibilité d'obtention de monoglycé ride seul. EXEMPLE 6 Estérification en continu dans un réacteur segmenté Le réacteur proprement dit est constitué de une ou plusieurs colonnes en cascade avec stockage intermédiaire. Chaque colonne (résistanteau milieu solvant) est thermostatée par double enveloppe, et alimentée par une pompe volumétrique à débit constant. Le garnissage de chaque segment est fait à sec avec un mélange de mycélium broyé sec et de silice de granulométrie 300 , à raison de.0,54 g de silice pour 1 g de mycélium (soit environ 0,4 volume de silice pour 1 volume de mycélium). Le mélange initial est préparé dans un premier bac de stockage. La teneur en eau du mélange est ajustée dans chaque stockage intermédiaire. Le temps de séjour sur chaque étape est de l'ordre de 75 mn pour un volume parcouru voisin de la moitié du volume total. Le mélange réactionnel est constitué d'acide oléique (1 mole) et de glycérol (3 moles) pour 1000 ml d'alcool tertio-amylique. Le débit est choisi de façon à assurer en continu un temps de séjour de l'ordre d'une heure par élément. Chaque élément de réacteur est suivi d'un élément de tamis moléculaire où le temps de séjour est du même ordre. Résultats Temps de séjour 1 heure Conversion du mélange obtenu (% molaires) acide oléique monoglycéride diglycéride libre 1er passage 72,39 27,1 0,0 2ème " 53,3 44,7 2,0 En rapprochant ces résultats de ceux de l'exemple 3, on constate qu'il est bien possible, avec le procédé de l'invention, de pousser la formation de monoglycéride assez loin (44,7%) en n'obtenant qu'une très faible proportion de diglycéride (2%). Cet exemple est donc à comparer avec les exemples 4 et 5. EXEMPLE 7 Glycérolyse du suif en continu dans l'alcool tertio-amylique Le mélange réactionnel est constitué de 50g de glycérol (0,54 mole) et de 50g de suif (0,05 mole) pour 1000 ml d'alcool tertio-amylique. Le mélange est passé sur colonne à un débit assurant un temps de séjour de l'ordre de 75 mn au contact du mycélium. L'analyse est faite par chromatographie en phase gazeuse des dérivés triméthyl-silyl, et rendue quantitative par utilisation d'un étalon interne (acide laurique). te rendement observé en monoglycérides par rapport au suif est de 17,2g de monoglycérides pour 100g de suif. EXEMPLE 8 Glycérolyse suif en continu dans l'alcool tertio-butylique Le mélange réactionnel est constitué de 10g de glycérol et de 10g de suif pour 100g d'alcool tertio-butylique. Le mélange est préalablement déshydraté sur tamis moléculaire puis passé sur colonne à un débit assurant un temps de séjour de l'ordre de 75 mn au contact du mycélium. L'analyse est faite comme dans l'exemple 7. Le rendement obtenu est de 38,8 g de monoglycérides pour 100g de suif. EXEMPLE 9 Glycérolyse du suif hydrogéné en continu dans l'alcool tertioamylique Le mélange réactionnel est constitué de 5g de suif hydrogéné et de 5g de glycérol pour 85g d'alcool tertio-amylique, et est laissé en contact de 10g de tamis moléculaire pendant 20 heures avant réaction. Le mélange est passé sur colonne à un débit correspondant à un temps de séjour de 75 mn au contact du mycélium. L'analyse est faite par chromatographie en phase gazeuse comme en 5a. Le rendement observé est de 27,7g de monoglycérides pour 100g de suif hydrogéné. Revendications 1. Procédé pour effectuer une réaction enzymatique au sein d'un solvant organique du substrat à traiter, caractérisé en ce que le solvant comprend ou est constitué par un ou plusieurs alcools tertiaires. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les alcools tertiaires sont en C4 ou/et en C5, notamment alcools tertio-butylique ou/et tertio-amylique. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le ou les alcools tertiaires sont mélangés à d'autres solvants. 4. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que des alcools tertiaires en C6 à C12 sont employés en mélange liquide avec des alcools tertiaires en C4 ou/et C5, ou/et avec des solvants, en particulier éthers. 5. Application du procédé, suivant une des revendications 1 à 4, à l'hydrolyse enzymatique de corps gras, en continu ou en discontinu. 6. Application du procédé, suivant une des revendications 1 à 4, à l'estérification d'un acide gras, en continu ou en discontinu. 7.Application suivant la revendication 6, caractérisée en ce qu'un absorbant de l'eau, en particulier un tamis moléculaire, est placé dans le milieu réactionnel. 8. Application du procédé suivant une des revendications 1 à 4, à l'estérification indirecte, par la réaction d'un glycéride avec un mono- ou polyol , caractérisé en ce que le milieu réactionnel est préalablement déshydraté, de préférence jusqu'à moins de 50 ppm d'eau. 9. Application du procédé suivant une des revendications 1 à 4 à la production exclusive d'un monoglycéride. 10.-Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les composés traités sont dissous dans l'alcool tertiaire à raison de 1 à 60% en poids. 11. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est réalisé à une température de 10 à 600C, et de préférence entre 300 et 400C. 12. Procédé suivant une des revendications précédentes, mis en oeuvre avec la lipase du Rhizopus arrhizus.