FR 2617487 A1 19890106 FR 8709198 A 19870630 La présente invention concerne un nouveau procédé pour la modification chimique de protides. Elle comprend une réaction permettant de fixer à la molécule du protide un ou plusieurs groupements organiques, susceptibles de changer les propriétés physico-chimiques de ce protide. L'invention vise, notamment, la-modification de protéines et, en particulier, celle d'enzymes. Une application importante de l'invention réside dans le changement dela solubilité de peptides ou protéines et, spécialement, dans le fait de rendre des enzymes solubles dans des solvants organiques. L'invention comprend également les protides portant des groupements organiques, modificateurs de leurs pro priétés physico-chimiques. Elle vise en particulier les enzymes rendues solubles dans des solvants organiques, par la fixation desdits -groupements. I1 est connu de changer plus ou moins les propriétés d'une protéine par l'action d'un réactif chimique. Dans les cas d-enzymes, cela a généralement pour but de modifier leurs propriétés physiques, telles la solubilité, la mobilité, c'est-à-dire masse moléculaire, la stabilité, etc. On cherche également, par ce moyen, de rendre possible l'utilisation de ces catalyseurs remarquables dans des conditions moins drastiques que celles qu'exige l'enzyme native, notamment les pH, température, force ionique, résistance aux inhibiteurs, etc.D'autres objectifs résident dans la modification des propriétés catalytiques elles-mêmes, c'est-d-dire dans l'élargissement de l'éventail de substrats justiciables de l'enzyme donnée, ou bien - au contraire - dans l'orientation de l'activité catalytique dans le sens d'une plus grande spécificité ; il peut s'agir par exemple de rendre une protéase plus spécifique d'une certaine liaison peptidique, si elle hydrolyse, à l'état natif, un spectre trop large de peptides ou de l'emploi d'enzymes en milieu non aqueux-ou faiblement concentrés en eau r qui est suscep tible d'inverser le sens des réactions dans lesquelles l'eau intervient. La plupart des procédés connus de modification chimique de protéines consistent à mettre en oeuve des composés spécifiques, capables de réagir avec des groupements fonctionnels, portés-par les résidus des acides aminés naturels de la channe peptidique ou par la partie glucidique ou nucléique de glycoprotéines ou de nucléoprotéines. Ainsi utilise-t-on très couramment le pouvoir nucléophile du grou pement -NH2 'NHZ des résidus de lysine sur des réactifs élec- trophiles activés. Les réactifs le plus souvent utilisés, dans la technique antérieure, sont les anhydrides d'acides et l'acide trinitro benzène sulfonique. Les enzymes, modifiées par ces procédés connus, ont en général une activité sensiblement abaissée.Le choix des réactifs est très restreint, car beaucoup de réactifs éventuels altèrent trop l'activité de l'enzyme, ou bien exigent des conditions opératoires incompatibles avec la conservation de l'activité catalytique,ou réagissent avec d'autres acides aminés essentiels au maintien de la structure active de l'enzyme. Il en résulte, qu'étant donné l'intérêt de la modification appropriée de protides, en particulier d'enzymes, le besoin de réactifs adéquats continue à se faire sentir. La présente invention apporte dans ce domaine un progrès sensible : elle porte sur une classe de composés qui ont la propriété de réagir aisément avec des restes aminés de protides, pour fixer sur ceux-ci tout groupe organique voulu, en n'abaissant que relativement peu l'activité catalytique Lorsque le protide est une enzyme, et en le rendant soluble dans un solvant organique. Le procédé de l'invention est caractérisé en ce que l'on fait réagir le protide donné avec un ester dithioi- que dont le reste d'acide comporte le groupe organique que l'on désire fixer au protide, tandis que le reste thiol a une structure de groupe partant. L'ester dithioique employé peut être représenté par la formule où R désigne le groupe organique à fixer, par l'intermédiaire de C=S, sur le protide, alors que X est un groupement choisi de telle manière que X-S soit un bon groupe partant. En désignant par E la molécule de ce dernier, on peut schématiser comme suit la réaction suivant l'invention: Ainsi, HSX étant éliminé, la molécule de protide est modifiée par la fixation d'un ou de plusieurs groupes Ce groupe modificateur est choisi, naturellement, selon les nouvelles propriétés que l'on désire faire acquérir au protide, par exemple solubilité dans des hydrocarbures, réactivité avec des b > ses, résistance à la chaleur,etc. Il peut donc comprendre un R qui est un radical hydrocarboné, aliphatique ou arylique, donc hydrophobe, en particulier alkyle en C1 à C20 ou alcényle en C2 à C20, phényle,phénylényle, naphtyle ou naphtylényle, ou bien un alkylaryle ou aryl-alkyle correspondant. R peut également être un groupe organique hydrophile, polaire, négatif, positif ou neutre il peut, par exemple, comporter un groupe carboxyle, hydro xyie, halogène, sulfinyle, sulfonyle, phosphoryle, phosphonyle, sulfhydryle, amide, ammonium, phosphonium, etc. Dans une forme d'exécution particulière, R est une chatne polymère ou oligomère, par exemple de polyéthylène, polypropylène, polyacrylique, polyéthylène glycol ou similaire. En outre, R peut être constitué, lui-même, par un reste de dithioester du type dans lequel R' désigne un groupe hydrocarboné divalent, notamment alkylène, cycloalkylène, arylène ou alkyl-arylène, le premier comportant de préférence 1 à 20 atomes de C, les autres 6 à 16. Y est un groupement du même type que X mais non forcément identique à celui-ci. Dans cette variante, le réactif est un bis-dithioester L'utilisation d'un bis-dithioester permet de former un protide modifié, spécial, porteur d'une chaine polymère, en particulier polyacrylique, d'alcool polyvinylique, polyalkylène-glycol ou autre oligomère ou polymère susceptible d'être aminé au moins en bout de chaine.En désignant par Q-NH2 un tel polymère aminé, on peut le combiner au bis-dithioester par une réaction Ensuite, en faisant réagir le composé de Q obtenu en (4) [e p-5 ] NOTA Dans une variante X ou/et Y, semblables ou différents, sont constitués par une partie hydrocarbonée (-CH2-)n , où n est 1 à 6, portant une fonction halogène, carboxyle, sulfinique, sulfonique, phosphoreuse, phosphoneuse, phosphorique, phosphonique, H actif, SH, amide ou hydroxy. Un protide suivant l'invention, en particulier protéase ou peroxydase, soluble dans du benzène, toluène, éther, éthanol, chloroforme ou /et diméthyl sulfoxyde, comprend plusieurs motifs lysine qui portent, par l'intermédiaire d'un -ç=S-, un groupe R constitué par un radical aliphatique en C1 à C20, un radical arylique en C6 à C16 ou une chaine polymère, en particulier de polyéthylène glycol. avec un protide S NH2, aboutit à c 'est-à-dire un bis-thioamide à la fois du polymère Q et du protide E. A titre d'illustration non limitative, on donne ci-après les formules de quelques uns des dithioesters et bis-dithioesters utilisables dans la réalisation de la présente invention. Selon la nature du protide à traiter et celle du dithioester employé ,le procédé suivant l'invention est réalisé en solution aqueuse, organique ou hydro-organique, généralement à une température comprise entre 0 et 700C. Dans les cas des enzymes les températures préférées s'échelonnent de 100 à 500C et surtout entre 200 et 450C. Les proportions des réactifs sont calculées à partir du nombre de groupes -NH- ou -NH2 du protide qu'il s'agit de combiner avec le dithioester. Il est en général bon d'utiliser un excès de fonctions dithioesters par groupe -NH- ou -NH2 libre du protide sur lequel on veut fixer le groupe modificateur. Le milieu réactionnel peut éventuellement être hétérogène,pouvant par exemple être constitué par une dispersion du protide dans une.solution organique du dithioester ; c'est en particulier le cas où la réaction suivant l'invention solubilise le protide dans le solvant organique du dithioester ; ainsi, le protide, ayant subi la réaction, passe en solution dans ce solvant. Les pH préférés du milieu réactionnel sont compris entre le point isoélectrique du protide et 11,5,dans le cas des enzymes, les pH les plus favorables se situent entre environ 7,5 et 11,5, et surtout entre 8 et 11. Les exemples qui suivent apportent, sans aucune limitation, des détails à la mise en oeuvre de l'invention. EXEMPLE 1 Les opérations décrites ici servent à montrer (I) qu'il f ét possible de préparer un dithioester à partir d'un autre, par simple changement de nucléofuge, et - ensuite (II) comment le -NH2 d'un amino-acide réagit avec un.dithioester. I- Préparation de S-dithiobenzoyl N-acétyl cystéine (DTAC) A 1,632 g de N-acétyl cystéine et 2,123 g d'acide thiobenzoyl mercapto acétique (ou dithiobenzoate de carboxyméthyle), dissous dans 50 ml d'éthanol, on ajoute 2 ml de solution aqueuse de NaOH M. Le mélange est agité à 200C, pendant 2 heures et ensuite concentré, par évaporation d'éthanol, et acidifié avec de l'HCl 6N. Par chromatographie sur silice, avec comme éluant un mélange hexane/chloroforme, 2,45 g de S-thiobenzoyl N-acétyl cys téine sont isolés, ce qui représente un rendement de 86,5%, par rapport à l'acétyl cystéine de départ, de la réaction II- Préparation de la N-thiobenzoyl lysine à partir de dithiobenzoyl acétyl-cystéine (DTAC) 0,425 g soit 1,5mmole de DTAC, préparée suivant I, et 0,220g de lysine, également 1,5 mmole, sont dissous dans 10 ml de solution aqueuse de NaOH 0,25 N. La solubilisation du mélange est facilitée par l'addition d'une goutte d'éthanol. Après 5 heures de réaction à la température ambiante, le milieu est acidifié et libère la N-thiobenzoyl lysine N-thiobenzoyl lysine EXEMPLE 2 Modification de la peroxydase de raifort au moyen de l'acide tridécyl thiomercaptoacétique C12H25CS-S-CH2COOH (c'est-à-dire carboxyméthyle) Dans 3 ml de tampon phosphate 0,1 M pH = 8,5 sont dissous 6 mg de peroxydase de raifort commerciale (Sigma type II) soit 0,15 immole (d'après absorption à 402 nm avec 3= 102 mM1.-cm1) et 1,6 mg d'acide tridécyl thiomercaptoacétique soit 5 immoles (préalablement dissous dans 0,1 ml d'éthanol). Le mélange est agité 18 heures à température am biante. La solution est ensuite dialysée 18 heures à 40C contre de l'eau distillée puis lyophilisée. L'enzyme obtenue a été analysée.Elle présente les caractéristiques suivantes. Spectre W : apparition d'une bande à 277 nm due aux fonctions thioamide formées. Nombre de lysines touchées ; les lysines libres sont dosées par la méthode classique au TNBS (acide trinitrobenzènesulfonique), on trouve ainsi que 3 à 4 lysines ont été touchées. Solubilités : alors que l'enzyme native n'est soluble que dans l'eau, la nouvelle enzyme est soluble à plus de 5 mg/ml dans l'éthanol, le chloroforme, le toluène, l'éther et l'eau. Activité spécifique : il s'agit de l'activité mesurée sur l'oxydation de l'orthodianisidine par l'eau oxy génée. Un dimère est formé qui absorbe à 444 nm (avec -1 = 30 mu~1. cl ). L'activité spécifique obtenue est 850 U par mg de protéine soit 97% de l'activité spécifique de l'enzyme native. Activité en solvant organique : la peroxydase de raifort est connue pour catalyser la réaction d'oxydation de la 9-méthoxy.éllipticine Cette réaction est intéressante car la 9-oxoellipticine est aisément réduite en 9-hydroxyellipticine par l'acide ascorbique. Le seul inconvénient réside dans la faible solubilité de la 9-méthoxyellipticine dans l'eau. La faible concentration en substrat, qui en résulte pour l'enzyme, limite la vitesse de la réaction d'oxydation. Or, on a pu mettre en oeuvre cette réaction dansltéther avec la peroxydase modifiée suivant l'invention. Dans'une cuve de spectrophotomètre on mélange 0,5 ml de 9-m6ihoxy- ellipticine 1mM dans l'éther, 0,5 ml de peroxydase modifiée 1 mg/ml dans l'éther, 10 à 50 Fl de solution aqueuse d'eau oxygénée 200 mM et on complète avec de l'éther jusqu'à un volume final de 2 ml.On suit alors à 20qC l'adsorbance à 486 nm, longueur d'onde d'absorption de la 9-oxoellipticine formée ( = 9,2 mM 1.cm 1). Plusieurs essais, effectués avec différentes quantités d'eau oxygénée, ont permis de montrer que la cinétique d'oxydation est michaelienne avec KH2O2 = 2 mM m vm = 0,25 mol/mn par mg de lyophilisat de peroxydase modifiée. EXEMPLE 3 Fixation de groupes thiobenzofques sur la papaïne la rendant soluble et active dans du diméthyl sulfoxyde Dans 40 ml de tampon phosphate 0,1 M pH = 8,5 sont dissous 0,32 g de papaine commerciale (Sigma Type IV) et 100 mg d'acide thiobenzoyl-mercapto-acétique, préalablement dissous dans 3 ml d'éthanol. Le mélange est laissé 2 heures à 400C puis dialysé 16 heures à 40C contre de l'eau, puis lyophilisé. On récupère 0,26 g soit 81% de rendement chimique. L'enzyme obtenue présente les caractéristiques suivantes. Spectre W : déplacement de la bande d'absorption de 278 nom à 280 nm. Nombre de lysines touchées : 2 sur les 10 que comprend la papaïne. Solubilité : soluble dans le benzène, le DMSO et l'eau à raison de 10 mg/ml, tandis que l'enzyme native n'est pas soluble dans le benzène, seulement dans l'eau et le DMSO. Activité amidase : c'est celle de l'hydrolyse, à pH = 7,5 et à 500C en tampon tris et en présence de cystéine et d'EDTA, de la N-benzoyl D, L arginine para-nitroanilide (BAPA) qui libère la para-nitroaniline absorbant à 410 nm (avec = 8,8 mu 1. . cm 1). Alors que l'enzyme native a une activité de 28 mU par mg de lyophilisat, l'enzyme modifiée a 11 mU par mg de lyophilisat, soit 32% de l'activité initiale ; malgré cela l'enzyme modifiée est très intéressante, parce qu'elle présente une activité en solvant organique ; on peut donc l'utiliser dans du DMSO, en l'absence d'eau, pour de la synthèse peptidique Le DMSO convient particulièrement bien pour solubiliser de nombreux peptides, mais l'enzyme native n'a aucune activité dans ce solvant : par contre, l'enzyme modifiée présente une activité de 1,2 mU par mg de lyophilisat. EXEMPLE 4 Modification de la papaine par la fixation de groupes thiopropionate d'éthyle sur sa molécule On fait réagir, en milieu aqueux le dithioester carboxyméthyl sulfure-3 dithiopropionate d'éthyle sur la papaine Pour cela, dans 4,5 ml de tampon phosphate 0,1 M pH = 8,5 on mélange 36 mg de papaïne commerciale (Sigma Type IV) avec 23 mg de dithioester préalablement dissous dans 0,1 ml d'éthanol. Le mélange est porté à 400C pendant 2 heures, puis dialysé 16 heures à 40C contre du tampon phosphate 0,1 M pH = 7,2. La solution protéique obtenue est analysée et l'on trouve Spectre UV : déplacement maximum d'absorption. de 278 nm à 270 nm Nombre de lysines touchées : 4,5 sur 10 Activité enzymatique dans l'eau, perte de 50%. Les sites de la molécule modifiés peuvent être représentés, conformément à la formule (2),par Cet exemple montre que l'on peut remplacer un groupement -tH3par un groupement -COO ce qui permet de changer le point isoélectrique et le domaine optimum de pH de l'enzyme modifiée. EXEMPLE 5 Fixation d'un polyéthylène glycol bis-dithioester (PEGdithioester) sur la peroxydase de raifort On prépare un polymère fonctionnalisé de la façon suivante. Dans 10 ml d'eau distillée, on dissout 0,25g de PEG 20000 bis-aminé, commercial (Sigma), correspondant à 25 moles de fonctions-NH2 libres ; on ajoute 0,4 ml de triéthylamine et 44 mg de tétrathiooctanedioate de carboxyméthyl, préalablement dissous dans 0,1 ml d'éthanol ; cela représente 250 moles de fonction dithioester Le pH se fixe à 10,8. On laisse agiter 48 heures à la température ambiante. La solution est ensuite dialysée 16 heures à température ambiante contre de l'eau distillée. On récupère alors 13 ml d'une solution de pH = 6,6 qui est analysée. Le spectre UV permet de doser à 308 nm les fonctions dithioester greffées (avec =12,2 mM 1.cm 1) et à 263nm les fonctions thioamide formées ( =12,8 mM 1.cm 1). Ayant travaillé avec un excès de fonctions dithioesters, on peut admettre qu'il ne reste plus de fonctions -NH2 libres.On a donc un produit de formule le rapport des concentrations en fonction thioamide (1,31 mM) et dithioester (0,18 mu) permet de calculer le degré de polymérisation n ; ce rapport vaut 2n + 2 r = ~~~~~~ = n+ 1 2 expérimentalement : r = 1,31 = 7,3 soit n = 6,3 on obtient 0w18 6 mg de peroxydase de raifort commerciale (Sigma Type II) sont dissous dans la solution précédemment préparée (0,15 mole de peroxydase et 2,3 mole de dithioester) et le pH est porté à 8,5 par dissolution de Na2HPO4 dans le mélange. On laisse agiter 18 heures à la température ambiante,puis la solution est dialysée et enfin lyophilisée. L'enzyme obtenue présente les caractéristiques suivantes. Spectre W : apparition d'une bande à 287 nm due aux - fonctions thioamide. Nombre de lysines touchées : 2 Solubilité : l'enzyme est soluble à plus de 5 mg/ ml dans les solvants : acétone, chloroforme, dioxanne, toluène, diméthylformamide, eau Activité spécifique : 780 U par mg de protéines soit 89% de l'activité spécifique de l'enzyme native. Activité dans le chloroforme : pour l'oxydation de la 9-méthoxyellipticine, l'activité est satisfaisante. Dans une cuve de spectrophotomètre, on mélange : 0,5 ml de 9méthoxyellipticine 1 mM dans le chloroforme, 0,3 ml de peroxydase modifiée à 1 mg/ml dans le chloroforme, 10 à 40 ssl d'eau oxygénée 200 mM (en solution aqueuse) et le volume est porté à 1,5 ml avec du chloroforme. Pour diffé- rentes quantités d'eau oxygénée, on observe une cinétique michaelienne avec K 2 2 : 6,25 mM m Vm = 83 nmoles/minute par mg de lyophilisat de peroxydase modifiée. EXEMPLE 6 Modification de la papaïne à l'aide d'un polyéthylène glycol bis-dithioester Le polymère fonctionnalisé a été préparé comme à l'exemple 5, mais dans des conditions de plus grande dilution. Les mêmes quantités de -produit ont été utilisées dans 100 ml d'eau distillée au lieu des 10 ml à l'exemple 5. On a obtenu alors un polymère moins lourd, puisque le dosage W conduit à n = 0. On- était donc en présence de 1,9 mg de papaïne commerciale (Sigma type IV) et 89 mg de Na2HPO4 sont dissous dans 23 ml de la solution susindiquée de polymère fonctionnalisé. Le volume est porté à 50 ml avec de l'eau distillée. Le pH obtenu est 8,5.La solution est portée à 400C pendant 2 heures puis dialysée 16 heures à 40C contre de l'eau distillée. La solution dialysée a un pH = 6,6 et un volume de 58 ml. Après lyophilisation on ré récupère 45 mg, soit un rendement chimique de 76%. L'analyse de l'enzyme ainsi modifiée donne les résultats que voici. Spectre W : la bande à 278 nm est déplacée à 269 nm avec un épaulement à 308 nm montrant que toutes les fonctions dithioesters n'ont pas réagi. Nombre de lysines touchées : 5 lysines sur 10. Solubilité : l'enzyme est soluble à 10 mg/ml dans le chloroforme, le DMSO et l'eau. Activité amidase : 1,5 mU par mg de lyophilisat soit un rendement en activité : 45 x 1,5 = 125 % 1N9 x 28 Activité dans le -DMSO par le même test que dans l'exemple 3 : 3,0 mU par mg de lyophilisat. Dans le chloroforme, la solution de substrat est préparée dans un mélange de 80% de chloroforme avec 208 de DMSO pour solubiliser les ingrédients nécessaires au test. On trouve une activité de 4,2 mU par mg de lyophilisat. Par contre, l'enzyme native, mise en suspension (car insoluble dans le chloroforme) ,dans un test identique, ne donne aucune activité. Les deux exemples 5 et 6 montrent que la modification avec PEG-dithioesters permet d'avoir de bonnes activités dans le chloroforme, ce qui apporte un progrès technique appréciable. REVENDICATIONS 1. Procédé de modification d'un protide par fixation d'un groupe organique sur sa molécule, caractérisé en ce que l'on fait réagir le protide avec un ester dithiol- que dont le reste d'acide comporte le groupe organique à fixer, tandis que le reste thiol a une structure de groupe partantlde sorte que le dithioester réagit avec des -NH2 ou -NH- de la molécule protidique. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'ester dithiolque répond à la formule où R désigne le groupe organique àfixer, par llintermédiaire de C=S, sur le protide, tandis que X est un groupement éliminable par la réaction de -S-X avec un reste d'amine du protide. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que R est un radical hydrocarboné, aliphatique ou arylique, notamment alkyle en C1 à C20, alcényle en C2 à C20, phényle, phénylényle, naphtyle, naphtylényle, alkylaryle ou aryl-alkyle. 4. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que R est un groupe organique, hydrophile, polaire, négatif, positif ou neutre, en particulier porteur d'un carboxyle, hydroxyle, halogène, sulfinyle, sulfonyle, phosphoryle, phosphonyle, sulfhydryle ou amide. 5. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que R est une channe polymère ou oligomère, en particulier polyéthylène, polypropylène, polyacrylique polyéthylène glycol ou alcool polyvinylique. 6 Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que R est du type R' désignant un groupe hydrocarboné divalent, en particulier un alkylène en C1 à C20, ou un cycloalkylène, arylène ou alkyl-arylène en C6 à C16, tandis que Y est un groupement éliminable par la réaction de -S-Y avec un reste d'amine du protide. 7. Procédé suivant une des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que X ou/et Y, semblables ou différents, sont constitués par une partie hydrocarbonée (-CH2-)n , où n est 1 à 6, portant une fonction halogène, carboxyle, sulfinique, sulfonique, phosphoreuse, phosphoneuse, phosphorique, phosphonique, H actif, SH, amide ou hydroxy. 8. Procédé suivant une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est réalisé au sein d'un solvant aqueux, organique ou hydro-organique, ou bien en milieu hétérogène, entre 0 et 700C, de préférence 200-450C, le pH du milieu étant compris entre le point isoélectrique du protide et 11,5, de préférence entre 8 et 11 notamment dans le cas d'enzymes. 9. Protide modifié chimiquement, caractérisé en ce qu'au moins un de ses atomes d'azote porte un groupe où R est un radical organique, notamment hydrocarpouvant comprendre une partie polaire, positive, négative ou neutre, ou bien est constitué par une chaîne polymère. 10. Protide suivant la revendication 9, constitué par une enzyme caractérisée en ce qu'elle est soluble dans des solvants organiques. 11. Protide suivant la revendication 10, en particulier protéase ou peroxydase, soluble dans du benzène, toluène, éther, éthanol, chloroforme ou/et diméthyl sulfoxyde, dont plusieurs motifs lysine portent, par l'intermédiaire d'un un groupe R constitué par un radical aliphatique en C1 à C20, un radical arylique en C6 à C16 ou une chaine polymère, en particulier de polyéthylène glycol. 12. Protide suivant la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est constitué par une enzyme dont le point isoélectrique et le domaine de pH optimum sont modifiés. 13. Protide suivant la revendication 10, caracté risé en ce qu'il est constitué par une enzyme, notamment hydrolase, susceptible de catalyser une réaction inverse, en particulier synthèse d'esters, d'amides, de thioamides et peptides.