FR 2607147 A1 19880527 FR 8616318 A 19861124 La présente invention concerne des autolysats de levure à usage oenologique ainsi qu'un procédé de préparation de tels autolysats. Le viellissement des vins mousseux sur levures, en particulier élaborés selon la méthode champenoise, est considéré comme une phase primordiale pour le développement des qualités sensorielles et gustatives, plus particulièrement des qualités aromatiques du produit fini. Certaines législations imposent même une durée minimale de conservation sur levures de ces vins. Ainsi pour le vin de champagne, par exemple, 12 mois sont imposés, 3 ans pour les mêmes vins millésimés, et 9 mois pour les crémants. On reconnaît également un rôle bénéfique de la conservation sur levures pour de grands vins blancs de bourgogne du type "Meursault". Ceux-ci sont séparés des lies après 8 à 9 mois d'élevage en fûts. Cependant ces procédés de vinification impliquent un coût élevé de production, notamment compte tenu de la durée de stockage. La tendance actuelle préconise l'utilisation de levures incluses pour la prise de mousse ce qui a pour conséquence un raccourcissement de la durée de stockage des vins sur levures, mais consécutivement des risques d'abaissement de la qualité. Pour les vins effervescents comme pour les vins tranquilles, au cours du vieillissement sur lies, ont lieu des phénomères d'échange entre les levures et le vin. Ces phénomènes sont connus sous le nom d'autolyse des levures et correspondent à une autodestruction enzymatique des constituants cellulaires des levures qui passent à l'état soluble dans le vin. Pour suivre l'évolution de l'autolyse dans les vins, compte tenu de l'abondance des protéines dans la cellule de levures et compte tenu du fait que 75 % d'entre elles sont hydrolysables par les protéases intracellulaires, l'dvolution des composés azotés et plus particulièrement des acides aminés est le phénomène le plus couramment utilisé. On a pu ainsi mettre en évidence que selon la méthode champenoise, l'évolution des acides aminés dans -le vin comprend trois phasés principales - l'assimilation pendant la prise de mousse, qui dure environ un mois et demi, - l'exsorption en fin de prise de mousse par les cellules encore vivantes alors que le milieu est épuisé en sucre, - une phase de stabilité plus ou moins longue (6 à 9 mois) suivie d'un nouvel enrichissement en azote aminé qui a pour origine une hydrolyse enzymatique des protéines levuriennes et qui est une manifestation de l'autolyse. De même, en étudiant l'évolution des activités protéolytiques intracellulaires des levures, on constate que ces activités diminuent fortement pendant la prise de mousse, restent faibles pendant les premiers mois qui suivent, puis augmentent de nouveau après six à neuf mois de vieillissement. On retrouve des activités importantes dans des dépôts de levures prélevés dans des vins qui ont cinq ans d'âge ou plus, ce qui prouve que le phénomène d'autolyse se déroule sur une période très longue. Afin de raccourcir la durée de stockage des vins sur levures,et pour abaisser le coût des procédés de vinification, on peut introduire dans les vins des autolysats de levures.Cependant l'addition au vin d'autolysats de levures du commerce à usage alimentaire communique de faux godets de "ferments". Ces autolysats sont en effet fortement protéolyses. Afin de prévenir cet inconvénient, la Demanderesse a mis au point des autolysats de levures destinés à être ajoutés au vin sans entraîner de défauts aromatiques ou gustatifs. Ainsi la présente invention concerne des autolysats de levuresà usage oenologique, caractérisés a) en ce quwils proviennent d'une souche de Saccharornyces bayanus, fortement protéolytique, b) en ce que leur teneur en azote total est comprise entre 7 et 13 % en poids de substance sèche, et c) en ce que leur pourcentage d'azote aminé, par rapport à l'azote total, est compris entre 20 et 40 %. La présente invention concerne également un procédé de préparation de tels autolysats de levures à usage oenologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes a) les levures sont mises à incuber dans un milieu appro prié, à une température comprise entre 25 et 550C durant une durée appropriée, pour obtenir un autolysat entier, b) éventuellement, on centrifuge l'autolysat entier poursépa rer le surnageant des écorces de levure, c) on lyophilise ou on sèche l'autolysat entier ou le surnageant pour obtenir un autolysat partiellement ou totalement deshydraté. Selon l'invention, les autolysats peuvent être préparés à partir de levures sèches simplement réhydratées ou au contraire remises en culture sur milieu synthétique avant la mise en autolyse. Dans ce dernier cas, le milieu synthétique utilisé peut être le suivant - Saccharose : 200 g, - Acide tartrique : 4 g, - Yeast Nitrogen Base : 6,5 g, - Eau distillée q.s.p. : 1000 ml. Bien que d'autres conditions d'incubation soient possibles, l'incubation des levures sèches ou remises en culture est de préférence réalisée dans un tampon hydroalcoolique de pH acide, de préférence de pH 3. Ainsi, la Demanderesse a mis en évidence qu'un tampon hydroalcoolique convenable selon l'invention a la composition suivante - Ethanol : 10 % (vol/vol), - Acidetartrique : 4 g/l, - Acide malique : 3 g/l, - Acide acétique : 0,1 g/l, - Sulfate de potassium : 0,1 g/l, - Sulfate de magnesium : 0,025 g/l, - pH ajusté à 3 avec NaOH 3 N, - Eau distillée q.s.p. : 1000 ml. Comme cela apparaîtra dans les exemples, il est possible selon l'invention de préparer des autolysats de naturesdifférentes selon la température d'incubation. Ainsi, les autolysats provenant d'une incubation de levures à des températures relativement basses, c'est-à-dire environ 300C sont constitués de surnageants moins riches en azote mais qui renferment des cellules présentant de fortes activités protéasiques intracellulaires et conservent de ce fait une forte capacité autolytique résiduelle. Les autolysats provenant d'une incubation similaire mais A des températures plus fortes, de l'ordre de 500C sont constitués de surnageants plus riches en azote mais dont les activités prostéasiques intracellulaires des levures ont été détruites par la chaleur, et dont en conséquence la capacité autolytique résiduelle est plus faible. Après l'incubation, pour obtenir des autolysats, deux variantes sont également possibles. Dans un premier cas, on peut sécher le mélange du surnageant et de la biomasse en vue d'obtenir un autolysat entier. Le séchage peut alors se faire par lyophilisation en vue de conserver les activités enzymatiques liées aux écorces cellulaires. Dans un second cas, on sèche seulement le surnageant, le séchage peut se faire alors par la chaleur. Les autolysats selon l'invention sont ajoutés dans le vin tranquille au moment du tirage en vue de la prise de mousse, ou en début d'élevage en fûts. Comme cela apparaîtra dans les exemples, l'addition des autolysats selon l'invention ou des autolysats préparés selon l'invention a permis d'améliorer leus caractéristiques biochimiqueset organoleptiques.Il peut s'agir aussi bien de vins effervescents élaborés selon la méthode traditionnelle que de vins tranquilles élevés sur lies, par exemple des vins blancs. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparattront à la lecture des exemples ci-après. F:XEMPLE 1 Préparation de deux autolysats à deux températures différentes : 30 C et 50 C 12U g de biomasse sèche provenant de levures sèches actives ou de culot de centrifugation séché d'une culture liquide sont mis à incuber dans 950 ml de tampon de composition suivante Ethanol : 10 % (vol/vol) Acide tartrique : 4 g/l Acide malique : 3 g/l Acide acétique : 0,1 g/l Sulfate de potassium : 0,1 g/l sulfate de magnesium : 0,025 g/l pH ajusté à 3 avec NaOH 3 N Eau distillée q.s.p. : 1000 ml. Le pH du tampon hydroalcoolique est 3. L'incubation est réalisée pendant 45 heures à 300C ou à 50 C. Les propriétés des autolysats obtenus apparaissent au tableau suivant Azote totel Activité protéasique Capacité eutolytique du surnageant intracelluleire résiduelle* (g N/ml) (p9 N/ml/6h) ( g N/ml) Levures svant 1 569 1 116 autolyse Levures eutolysées 473 1 842 678 à 30 C Levures autolyses no D 15 à 50 C * Quantité d'azote libérée par les levures lors d'une deuxième incubation de 48 heures à 300C dans le tampon hydroalcoolique pH 3. Dans les deux cas, la souche de levure utilisée est une souche de vinification Saccharomyces bayanus moyenne- ment protéolytique désignée souche C". EXEMPLE 2 Composition azotée des autolysats de levures On a comparé la composition azotée des autolysats préparée comme ci-dessus avec des autolysats connus désignés par "F1", "F2" et "F3". Nature des Azote total Part des fractions azotées ( N total > des solutions autolysats (mg/l) I Il lv Fi 4 500 23 69 5 3 F2 6 625 12 80 4 4 F3 4 725 6 82 7 5 30 4 325 40 36 - 24 - 50 5 250 42 49 9 0 Fraction séparées sur colonne Sephadex G25 I : Protéines et polypeptides PM # 5 000 II: Peptides courts et acides aminés PM III et IV :Acides aminés aliphatiques et aromatiques en fin d'élution. On constate donc que les autolysats selon l'invention sont moins protéolysés que les autolysats usuels ; ils ont en effet un plus faible pourcentage de peptides et d'acides aminés et une plus forte proportion de macromolécules azotés. On remarque de plus que les autolysats F1, F2 et F3 sont particulièrement riches en acides aminés basiques. Les autolysats selon l'invention sont plus pauvres en acides aminés et renferment principalement de l'histidine, de de l'acide glutamique et de l' a-alanine. EXEMPLE 3 Addition d'autolysats de levures à des vins de champagne On a réalisé sur deux vins de champagne, des essais avec pour chacun d'eux la constitution de trois lots un lot témoin, un lot enrichi à 1 g/l en autolysat préparé à 300C, un lot enrichi à 1 g/l en autolysat préparé à 500C. Chaque lot comportait 100 bouteilles. Métabolisme azoté L'enrichissement en azote total des vins additonnés d'autolysat préparé à 300C ou d'autolysat préparé à 500C n'est pas significatif, compte tenu des teneurs initiales des vins qui sont de l'ordre de 350 à 400 mg/l N. L'évolution des composés azotés au cours de la prise de mousse et des premiers mois qui suivent celle-ci est semblable dans les trois lots. A partir de un an de vieillissement sur levures il n'y a toujours pas de différences significatives de teneur en azote total et en acides aminés entre les trois lots. Ainsi, les autolysats étudiés et aux doses d'utilisation indiquées, n'ont pas d'incidence significative sur le métabolisme azoté des levures. En particulier, ils n'entrainent pas d'enrichissement significatif en azote total ni en acides aminés après un an ou plus d'élevage sur levures. Toutefois, quelques différences apparaissent à l'analyse sensorielle. Analyse sensorieale Nous rendons compte ci - après des résultats d'une dégustation effectuée à la même date pour l'un et l'autre des deux essais, mais le premier vin avait vieilli 24 mois sur levures, alors que le second vin n'avait vieilli que 15 mois. Note moyenne / 20 Essai nO 1 : Essai nO 2 (Vin témoin 14,72 : 9,94 (Vin + autolysat préparé à 300C : 11,17 : 12,06 (Vin + autolysat préparé à 500C : 12,55 : 12,44 La première remarque qui peut être fate est que le vin témoin du premier essai est d'un meilleur niveau qualitatif que celui du deuxième essai. Rappelons que les vins ont été jugés le même jour par le même jury.L'analyse de la somme des rangs par le test de KRAMER permet de dire que dans le premier essai le vin témoin a été jugé significativement meilleur au seuil de 5 % que les deux vins additionnés d'autolysat de levures. Par contre, si l'on procède à la même analyse et si l'on retient également le seuil de 5 % pour le 2ème essai, la différence n'est pas significative entre le vin témoin et les deux vins enrichis en autolysats, bien que ceux-ci soient légèrement mieux notés. Ainsi, d'après ces essais, les autolysats entiers qu'ils soient préparés à 30 Ou i 500C à partir d'une souche moyennement protéolytique sellent avoir plutôt un effet défavorable lorsqu'ils sont ajoutés à un vin d'un bon niveau de qualité, mais un effet favorable lorsqu'ils sont ajoutés à un vin de qualité moindre. EXEMPLE 4 Préparation d'autolysats à partir de deux souches de levures différentes et avec ou sans écorces cellulaires On a prépar des autolysats à partir de deux souches de Saccharomvces bayanus notées ci-après "D" (souche de vinification fortement protéolytique) et "F" (souche de boulangerie). Après une culture sur milieu synthétique, an a réalisé l'autolyse des cellules dans un tapon hydroalcoolique à pH 3, à X)OC pendant 48 heures. Après l'autolyse, une partie a été centrifugée, afin d'éliminer les écorces de levures et les surnageants ont été séchés par la chaleur à 5O0C.On a donc recueilli les autolysats notés SDS et SFS (souchesD surnageants, souchesF surnageants). La seconde partie a été recueillie et lyophilisée sous forme d'autolysats entiers lyophilisés SDE et SFE (souchesD entiers, souches F entiers). On a réalisé une analyse des autolysats et les compositions sont les suivantes (SDE SDS SFE SFS) (Azote total (mg/g de produit sec) ( 73 83 78 119) Acides aminés totaux (mg/l21)* (157 208 130 223) * solution à 1 g/l N On constate que les surnageants sont plus riches en acides aminés que les autolysats entiers. EXEMPLE 5 : Utilisation des autolysats dans des vins de champagne et dans des vins mousseux élaborés selon la méthode champenoise Essai n 1 L'essai est conduit dans un vin de champagne riche en azote total (450 mg/l N) pendant 3 ans. Essai nO 2 L'essai est conduit dans un vin mousseux pauvre en azote total (120 mg/i N) pendant 18 mois. Chaque essai comporte 5 lots de 100 bouteilles dont un lot témoin et 4 lots additionnés de l'un ou l'autre des autolysats SDE, SFE, SFE, SDS, SFS à la dose de 1 g/l (poids sec). Remargue concernant l'évolution de la Srise de mousse etle métabolisme azoté L'addition d'autolysat a un effet stimulant beaucoup plus marqué vis-à-vis de la vitesse de la prise de mousse dans le vin mousseux pauvre en azote que dans le vin de Champagne qui est riche en ce constituant. Cet effet se traduit par une plus forte multiplication levurienne. Ainsi dans le vin mousseux, les populations maximales de levures vivantes atteintes sont de l'ordre de 5,5.106 cellules par ml pour le témoin, de 8.106 cellules par ml pour les vins enrichis en autolysats entiers et de 6,5.106 cellules par ml pour les vins enrichis en surnageant d'autolyse. Les vins additionnés d'autolysats de levures renferment plus d'azote total en fin de prise de mousse et restent plus riches pendant toute la durée du vieillissement. La même remarque peut être faite concernant les acides aminés. La mesure des activités protéasiaues intracellulaires réalisée dans les dépôts de levures aux différentes étapes du vieillissement du vin de Champagne montre que les activités sont toujours plus faibles dans les dépôts provenant des vins enrichis en autolysats entiers que dans les dépôts provenant des vins enrichis en surnageants et du vin témoin. On peut supposer que les autolysats entiers apportent des inhibiteurs enzymatiques qui freinent l'autolyse. Les mêmes écarts en azote total entre le lot témoin et les lots additionnés d'autolysat restent vrais pour les vins mousseux mais ceux-ci restent pauvres (175 à 200 mg/l au maximum). Pour ces derniers vins, il ne reste pratiquement plus d'acides aminés en fin de prise de mousse pendant le vieillissement dans le lot témoin (3 b 4 mg/l N), alors que l'addition d'autolysats maintient les vins ainsi enrichis à une teneur légèrement supérieure à celle du vin de base (25 à 30 mg/l N). Analyse sensorielle a) Vin de Champagne : des dégustations ont été effectuées à 12, 24 et 36 mois. Pour chacune de ces dégustations, les remarques suivantes peuvent être faites - Les autolysats préparés avec la levure de boulangerie (souche "F") communiquent au vin des caractères aromatiques et gustatifs moins agréables que les autolysats préparés à partir de la levure de vinification (souche "D"). Les écarts entre les deux souches s'accentuent au cours du vieillissement, des faux goûts apparaissent avec la souche "F". - L'autolysat entier provenant d'une souche de levure donnée communique au vin des arômes et des saveurs moins bien notés que le surnageant d'autolyse correspondant. Ceci est particulièrement vrai pour les autolysats préparés à partir de la souche "F". - Le vin témoin est toujours classé comme très proche du vin enrichi en autolysat SDS, ce dernier étant même mieux noté après 36 mois de vieillissement à cause notamment d'une meilleure persistance de mousse et de qualités aromatiques et gustatives supérieures. Ainsi, le tableau ci-après rapporte les résultats d'un test préférentiel effectué par 13 jurés à 36 mois de vieillissement et portant sur les trois échantillons "SDS", "témoin", "SFE". Selon l'analyse de KRAMER, les différences observées d'un échantillon à l'autre sont significatifs au seuil de 5 4 pour tous les caractères sauf pour la couleur. Evaluation sensorielle du vin de Champagne après 36 mois de vieillissement sur lies chentillons 5D5 lXmoln SFE Caractères Couleur 39,5 35,5 37,5 Per6istence de le 36,5 28,5 20 mousse Arome 51 35,5 19 Seveur 49 36,5 24 Total des points 176 136 100,5 b) Vin mousseux Les mêmes remarques que pour le Champagne concernant la nature de la souche : souches "D" ou "F" et le mode de préparation de l'autolysat : autolysats entiers ou surnageants peuvent être faites. Toutefois ce vin vieillissant beaucoup plus vite que le Champagne, c'est lors de la première dégustation, soit après 7 mois de vieillissement, que l'effet bénéfique d'un enrichissement en autolysat "SDS" apparaît, en particulier en ce qui concerne une amélioration de la persistance de mousse. Aux dégustations suivantes, soit respectivement après 12 et 18 mois de vieillissement, le vin enrichi en autolysat "SDS" est jugé comme plus vieux que le témoin qui lui-même a perdu de ses qualités. DEPOT DE SOUCHE La souche de Saccharomyces bayanus D utilisée dans les exemples a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur, 28 rue du Docteur-Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, sous le numéro suivant - Saccharomyces bayanus souche D : nO I-625 le 21 novembre 1986 REVENDICATIONS 1. Autolysat de levures b usage oenologique, caractérisé : a) en ce qu'il provient d'une souche Saccharomyces bayanus à caractère fortement protéolytique, b) en ce que sa teneur en azote total est comprise entre 7 et 13 % en poids de substance sèche, et c) en ce que son pourcentage d'azote aminé par rapport à l'azote total est compris entre 20 et 40 %. 2. Procédé de préparation d'autolysat de levures à usage oenologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes a) les levures sont mises à incuber dans un milieu appro prié, à une température comprise entre 25 et 550C durant une durée appropriée, pour obtenir un autolysat entier, b) éventuellement, on traite l'autolysat entier pour sépa rer le surnageant des écorces de levure, c) on lyophilise ou on sèche l'autolysat entier ou le sur nageant pour obtenir un autolysat partiellement ou totalement deshydraté. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'incubation est réalisée dans un tampon hydroalcoolique. 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que l'incubation est réalisée dans un tampon hydroalcoolique d'une valeur de pH environ égale à 3. 5. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le tampon a pour composition - Ethanol : 10 % (vol/vol), - Acide tartrique : 4 g/l, - Acide malique : 3 g/l, - Acide acétique : 0,1 g/l - Sulfate de potassium : 0,1 g/l, - Sulfate de magnesium : 0,025 g/l, - pH ajusté à 3 avec NaOH 3 N, - Eau distillée q.s.p. : 1.000 ml. 6. Procédé selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que la durée d'incubation est de 48 heures environ. 7. Procédé selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que la température d'incubation est comprise entre 30 et 500. 8. Procédé selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que la levure est une levure sèche réhydratée et/ou la levure provient d'un milieu de culture liquide. 9. Procédé selon l'une des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que l'on sépare et/ou sèche le surnageant par lyophilisation ou par la chaleur à environ 50"C.