FR 2612640 A1 19880923 FR 8703822 A 19870319 APPAREIL DE DETECTION DE LUMINESCENCE RETARDEE, POUR MILIEU LIQUIDE DESCRIPTION La présente invention concerne un appareil de détection de luminescence retardée, pour milieu liquide. ELle s'applique notamment à ta détection de phytoplancton dans l'eau, et en particulier à l'évaluation des ressources en phytoplancton dans une installation d'ostréiculture ou de pisciculture, ainsi qu 'à la détection d'un risque de pollution aqueuse. On connaTt déjà par le brevet allemand DE 3 027 317C2 et par l'article de W. GEBHARDT publie dans Physik in unserer Zeit, 15 Jahrg. 1984, n06, p.182 à 190, un appareil de détection de luminescence pour milieu liquide, destiné à l'étude d'un milieu liquide susceptible d'émettre à retardement un rayonnement de luminescence, après excitation de ce milieu liquide par un rayonnement excitateur approprié. Cet appareil connu, qui est utilisable pour la détection de phytoplancton en milieu aqueux, comprend notamment un dispositif d'excitation du milieu liquide par le rayonnement excitateur, ce dispositif étant traversé par le milieu liquide, ainsi qu'un autre dispositif prévu pour la détection du rayonnement de luminescence, ces deux dispositifs étant reliés par une canalisation dans laquelle circule le milieu liquide et qui est munie d'un piège à lumière. Il s'agit en fait d'un appareil à structure complexe. La presente invention concerne un appareil plus simple qui remédie donc à cet inconvénient de complexité. Elle a pour objet un appareil de détection de Luminescence pour milieu liquide, destiné à l'étude d'un milieu liquide susceptible d'émettre à retardement un rayonnement de Luminescence, après excitation de ce milieu liquide par un rayonnement excitateur approprié, cet appareil étant caractérisé en ce qu'il comprend : - un recipient destiné à recevoir une quantité déterminée du milieu liquide, - des moyens d'excitation de ladite quantité de milieu liquide dans Le récipient, par le rayonnement excitateur, et - des moyens de détection du rayonnement de Luminescence émis à retardement par ladite quantité de milieu liquide dans le recipient. Dans L'appareil objet de l'invention, la détection de luminescence du milieu liquide est donc réalisée de manière "discontinue" en ce sens que l'on est amené à remplir le recipient de la quantité déterminée de milieu liquide, puis à effectuer ladite détection et ensuite à vider le récipient. L'excitation du milieu liquide et la détection du rayonnement de luminescence sont effectuées dans le meme récipient. Il en résulte que l'appareil objet de l'invention est plus simple que L'appareil connu mentionné plus haut. Selon un mode de réalisation préféré de l'appareil objet de l'invention, en vue de ne pas perturber ladite détection, le récipient est opaque excepté en deux zones respectivement prévues pour l'entrée du rayonnement excitateur et la sortie du rayonnement de luminescence. De préférence, le récipient, les moyens d'excitation et les moyens de détection sont places à l'intérieur d'une enceinte opaque, ce qui contribue à éviter toute perturbation de ladite détection par une lumière parasite. Selon un mode de réalisation particulier de l'appareil objet de l'invention, cet appareil comprend en outre trois conduits opaques traversant l'enceinte dont deux sont respectivement munis d'électrovannes fixees contre la paroi interne de l'enceinte, ces deux conduits étant respectivement prévus pour remplir et vider le récipient du milieu liquide ; le troisième conduit est un évent muni de moyens de piégeage de lumière. Ceci contribue à l'obtention d'une bonne opacité à la lumière extérieure à l'enceinte. Le conduit évent, dont les moyens de piégeage de lumière (parasite) peuvent comprendre une chicane optique, évite toute communication entre l'intérieur du récipient et l'intérieur de l'enceinte, ce qui assure la protection de l'intérieur de L'enceinte contre le Liquide éventuellement corrosif de L'intérieur du récipient, liquide qui peut être de l'eau de mer. De préférence, Les moyens d'excitation sont placés à l'extérieur du récipient et munis de moyens d'obturation prévus pour isoler optiquement les moyens d'excitation de L'intérieur du récipient après ladite excitation. Ceci permet encore d'éviter toute perturbation de la détection de luminescence. Le milieu liquide peut être susceptible de contenir une substance capable d'émettre à retardement ledit rayonnement de luminescence, après excitation par le rayonnement excitateur approprié. Dans ce cas, les moyens de détection peuvent être prévus pour fournir des informations relatives à ta concentration du milieu liquide en ladite substance. L'appareil peut alors comprendre en outre des moyens de traitement des informations, prévus pour déterminer ladite concentration. Le milieu liquide peut être de l'eau (eau douce ou eau de mer) et ladite substance du phytoplancton à photosynthèse oxygénique. Dans ce dernier cas, le récipient est de préférence en silice qui est notamment préférable au verre ordinaire, ce dernier étant susceptible de produire une Luminescence du même ordre de grandeur que celle dudit phytoplancton. De préférence également, afin d'assurer la meilleure collection de la luminescence et de rendre le récipient en silice opaque à toute lumière parasite susceptible de perturber la détection, la paroi externe de ce récipient en silice est sablée et métallisée, excepté en deux zones respectivement prévues pour L'entrée du rayonnement excitateur dans Le récipient et la sortie du rayonnement de luminescence de ce récipient. Enfin, les moyens d'excitation peuvent comprendre une lampe à incandescence sous-alimentée en énergie électrique, ce qui permet d'accrottre sa longévité et de déplacer son spectre d'émission vers le rouge, ceci favorisant l'absorption de la lumière émise par la chlorophylle du phytoplancton. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de La description qui suit, d'un exemple de réalisation donné à titre purement indicatif et nullement Limitatif, en référence à la figure unique annexée. L'appareil conforme à l'invention, représenté schematiquement sur cette figure, est utilisable pour la detection, dans un échantillon d'eau douce ou d'eau de mer, du phytoplancton à photosynthèse oxygénique. On rappelle à ce propos que le phytoplancton à photosynthèse oxygénique est la fraction principale du phytoplancton, comprenant les micro-algues (chlorophycées, cyanobacteries...) dont L'appareil photosynthétique comporte les deux photosystèmes PSI et PSII et est capable d'oxyder l'eau et de dégager de l'oxygène. Dans la présente invention, on détecte ainsi uniquement la partie vivante de la biomasse phytoplanctonique. Il s'agit d'une détection quantitative pour une population phytoplanctonique donnée, l'appareil conforme à L'invention devant être réétalonné pour une autre population phytoplanctonique. On sait que dans une cellule végétale, la photolyse de l'eau est réalisee par un complexe protéique membranaire à manganese, appele système d'émission d'oxygène (SEO), etroitement associe à un autre complexe à chlorophylle, à savoir le centre réactionnel PSII. Ce dernier convertit L'énergie lumineuse absorbée par la chlorophylle et autres pigments accessoires en énergie chimique d'oxydo-réduction. Cette énergie sert en particulier à extraire successivement quatre électrons du SEO, ce qui permet l'oxydation de L'eau avec émission d'une molecule d'oxygène. Il s'agit d'un mecanisme séquentiel. Le SEO peut se trouver dans L'un des cinq états d'oxydation appelés SO, S1, S2, S3, S4, correspondant respectivement à l'état fondamental réduit (SO) et au stockage de 1 à 4 équivalents oxydés (S1 à S4). Les étants oxydés sont métastables : à L'obscurité, ils se convertissent spontanément en Les états inférieurs avec une demivie comprise entre quelques secondes et environ 1 minute. Ce phénomène, qu'on appelle désactivation, s'accompagne d'une luminescence chlorophyllienne "lente" (en fait, une fluorescence retardée à très longue durée de vie) émise dans le rouge, à des longueurs d'onde comprises entre 670 et 750 nanomètres environ, résultant d'une recombinaison de charges au niveau du centre réactionnel PSII. Ainsi, dans la présente invention, on détecte la luminescence "lente" (LL) pendant un temps déterminé, de préférence au moins une minute, à la suite dtune préillumination des cellules qui peut être de l'ordre de 10 secondes, la détection commençant quelques secondes, de préférence 3 secondes, après cessation de cette illumination. Cette luminescence "lente" est le témoin de l'évolution spontanée des états oxydés du SEO. Sa présence dépend de manière absolue du bon état fonctionnel, et donc de l'intégrité, du SEO. La corrélation entre LL et SEO est bien établie. On considère donc dans la présente invention que lorsqu'une cellule de micro-algue meurt, la fonction du SEO disparaît très rapidement. La mesure de LL est donc bien spécifique de l'état vivant du phytoplancton à photosynthèse oxygéni que. L'appareil schématiquement représenté sur la figure comprend un récipient 2 destiné å recevoir L'échantillon d'eau à analyser. Ce récipient a par exemple la forme d'un ballon sphérique. Ce baLlon est en silice fondue. Il est raccordé à sa base à une tubulure en T en silice. Cette tubulure est prévue pour Le remplissage et la vidange du récipient. L'appareil comprend également, à l'extérieur du ballon 2, des moyens 6 d'excitation de la luminescence du phytoplancton à photosynthèse oxygénique susceptible d'être contenu dans l'eau analysee. L'appareil comprend aussi, à L'extérieur du ballon 2, des moyens de détection 8 de ladite luminescence. Les moyens d'excitation 6 comprennent, dans un bottier 10, une lampe à incandescence 12 associee à un condenseur (optique) 14 ainsi qu'à un obturateur électromécanique 16 destine à l'ouverture ou la fermeture, sur commande, d'une fenêtre 17 prévue, dans la paroi du bottier 10, pour la sortie de la lumière émise par la lampe. Cette Lampe, qui peut avoir une puissance de l'ordre de quelques watts, est de préférence sous-alimentee, afin de déplacer son spectre d'émission vers le rouge, ce qui favorise l'absorption de lumière par la chlorophylle et accroît en même temps la longévité de la lampe. Les moyens de detection 8 comprennent un photomultiplicateur 18 associé à un obturateur électromécanique 20 prévu pour obturer ou laisser apparaStre sur commande, ta fenêtre d'entrée du photomultiplicateur 18. Sur la figure, les moyens d'excitation 6 et les moyens de détection 8 sont situés en regard l'un de l'autre, ce qui facilite d'ailleurs la compréhension de La figure, mais dans un mode de réalisation préféré non représenté, les "axes" respectifs des moyens d'excitation 6 et des moyens de détection 8 sont orthogonaux. Afin de ne pas perturber la detection, le ballon 2 muni de sa tubulure 4, Les moyens d'excitation 6 et les moyens de détection 8 sont placés dans une enceinte 22 opaque et métallique (pour constituer un blindage electrique). L'introduction et l'évacuation des échantillons sont effectuees par gravité au moyen de canalisations pénétrant dans l'enceinte par des traversées (par exemple des presse-étoupe) egalement opaques à la lumière. Plus précisément, une canalisation 24, prévue pour L'introduction de l'échantillon dans le ballon 2, pénètre dans L'enceinte 22 par le haut de celle-ci et se raccorde à l'une des deux branches de la tubulure 4. Une canalisation 26, prévue pour t'évacuation de L'échantillon, est raccordée à l'autre branche de la tubulure 4 et traverse L'enceinte 22 à la partie inférieure de cette dernière. La canalisation 24 est munie d'une électrovanne 28 et la canalisation 26 d'une électrovanne 30. Les électrovannes 28 et 30 sont montées en traversée de paroi de l'enceinte 22 (c'est-à- dire contre la paroi interne de cette dernière), afin d'obtenir des traversées opaques pour les canalisations 24 et 26. L'appareil représenté sur la figure comprend également une tubulure 32 opaque qui sert d'évent et qui traverse la partie supérieure de l'enceinte (cette traversée étant bien entendu opaque) pour se raccorder, au moyen d'un manchon 34 électriquement isolant, par exemple en polytetrafluorethylène, à une tubulure en silice 36 raccordée au ballon 2, à la partie supérieure de ce dernier. Deux électrodes 38, 40 prévues-pour la détection de la fin du remplissage du ballon 2, sont montées sur le manchon 34 et ont des extrémités en regard l'une de l'autre à l'intérieur de ce dernier. Ces électrodes peuvent être en platine. En outre, à l'intérieur de l'enceinte 22, un piège à lumière 42, par exemple constitué par une chicane optique, est prévu sur la tubulure 32. On empêche ainsi la pénétration de toute Lumière parasite d'origine extérieure dans le ballon 2. La tubulure 32 permet également de protéger les organes de l'appareil contenus dans l'enceinte 22, d'une corrosion par te milieu liquide analysé, qui peut être le milieu marin. Compte tenu de l'extrême sensibilité de la détection de luminescence utilisée dans la présente invention, ce qui permet d'ailleurs d'exploiter des signaux de très faible niveau, on cherche à optimiser la réponse du photomultiplicateur 18. A cet effet, les concentrations de phytoplancton étant très faibles, couramment de l'ordre du microgramme par litre, on peut chercher à utiliser un ballon de volume le plus grand possible pour obtenir une grande sensibilité, mais on choisit avantageusement d'analyser un échantillon de volume egal à 100 millilitres, ce qui permet une bonne détection aux concentrations indiquées cidessus tout en ayant un volume assez faible pour permettre une opération rapide de détection. Afin d'assurer l'opacité du ballon à toute lumière parasite et d'obtenir un bon rendement de collection de lumière et de conversion photoélectrique, la surface externe du ballon 2 est finement sablée et métallisée, par exemple au moyen d'une couche d'aluminium 43, afin de collecter au mieux la luminescence par diffusion multiple. Bien entendu, deux zones 44 et 46 du ballon 2 respectivement prévues pour la pénétration, dans le ballon 2, du rayonnement d'excitation et la sortie du rayonnement de luminescence de ce ballon 2, ne sont ni sablées ni aluminisées. Ces deux zones ou fenêtres peuvent être prévues au niveau du plan équatorial du ballon 2 et en regard l'une de l'autre comme on l'a représenté sur la figure annexée. Dans un mode de réalisation preféré non représenté auquel il a déjà été fait allusion plus haut, les deux fenêtres sont à 900 l'une de l'autre au niveau dudit plan equatorial. La fenêtre 17 du bottier 10, munie de son obturateur 16, est placée en regard de la fenêtre 44, une pièce d'interface 48 opaque étant prévue entre le bottier 10 et le ballon 2 pour empêcher toute pénétration de lumière pouvant emaner de l'intérieur de L'enceinte 22, par la fenêtre 44. De même, la fenêtre d'entrée du photomultiplicateur 18 munie de son obturateur 20, est située en face de La fenêtre 46, une pièce d'interface opaque 50 étant prevue entre le bottier du photomultiplicateur et le ballon 2 pour empêcher la pénetration de toute lumière pouvant emaner de l'intérieur de l'enceinte 22, par la fenêtre 46. En outre pour ne pas perturber la détection de luminescence, cette détection n'est déclenchée qu'après extinction de La lampe 12 et fermeture de l'obturateur 16 afin d'empêcher toute émission luminescente parasite. Bien entendu, l'obturateur 20 du photomultiplicateur 18 n'est ouvert qu'au moment de la détection, cet obturateur 20 étant fermé lorsque L'échantillon contenu dans le ballon est excité par la lampe 12. A titre purement indicatif et nullement limitatif, Le tube (non représenté) du photomultiplicateur est protégé par une enveloppe en mu-metal et en vue de placer la fenêtre d'entrée du photomultiplicateur aussi près que possible de la fenêtre 46 associée, on peut utiliser l'enveloppe en mu-métal comme obturateur, cette enveloppe tant actionnée selon son axe au moyen d'un électro-actuateur rotatif du type moteur pas-à-pas. Le principe de la méthode de détection utilisée avec l'appareil représenté sur la figure est le suivant : un échantillon d'eau à analyser, de 100 millilitres, placé dans le ballon 2, est illuminé pendant 10 secondes (ce qui établit un peuplement stationnaire des états S du système SEO). Quelques secondes (de préférence 3 secondes) après cessation de l'illumination, la luminescence est mesurée pendant 1 minute. Le signal alors fourni par le photomultiplicateur permet de mettre en évidence le phytoplancton à photosynthèse oxygénique présent dans l'eau contenue dans le ballon. L'intégration du signal fourni par le photomultiplicateur permet de déterminer la quantité de phytoplancton à photosynthèse oxygénique contenue dans l'échantillon placé dans le ballon (après étalonnage de L'appareil). A cet effet, l'appareil représenté sur la figure comprend des moyens électroniques de traitement 52 qui comportent un amplificateur opérationnel 54 prévu pour convertir en tension le courant fourni par t'anode du photomultiplicateur. La sortie de cet amplificateur opérationnel est reliée à l'entrée d'un convertisseur tension/fréquence 56, ce qui permet d'effectuer l'intégration dans le temps du signal fourni par le photomultiplicateur (c'est-à-dire d'obtenir le total des impulsions de conversion pendant le temps de mesure). A titre purement indicatif et nullement limitatif, le photomultiplicateur est du type R928 commercialisé par la société HAMAnATSU, l'amplificateur opérationnel est du type AD 515-KH(100 mV na) commercialisé par la société ANALOG DEVICES et le convertisseur tension-fréquence est du type AD 537-KH également commercialisé par La société ANALOG DEVICES. La sortie du convertisseur tension-fréquence 56 est reliée à L'entrée d'un système 58 à microprocesseur, prévu pour La commande des divers organes de l'appareil et le calcul et l'affichage numérique des résultats de la mesure. A cet effet, le système 58 est relié à un clavier de commande 60 et à des moyens d'affichage 52. Le clavier 60 est prévu pour déclencher diverses opérations associées à la mesure : remplissage du ballon, vidange de ce ballon, mesure de la luminescence, prise en compte de la correction de zéro (expliquée par la suite) et remise à zéro de L'appareil. On précise que le système à microprocesseur 58, realisable par l'homme du métier, est prévu pour gérer directement les organes mécaniques (électrovannes, obturateurs) et la lampe d'excitation 12, assurer différents contr8les de sécurité (état de la lampe, extinction de celle-ci au moment de la mesure), recevoir et traiter les signaux du photomultiplicateur intégrés et effectuer la correction de zéro (voir plus loin) et les conversions nécessaires à l'affichage numérique. Le microprocesseur (non represente) du système 58 est, à titre purement indicatif et nullement limitatif, du type EF68705P3 commercialisé par la société THOMSON-EFCIS et associé à une memoire morte intégree, programmable et effaçable par un rayonnement ultraviolet. Le système 58 commande les électrovannes 28 et 30, les obturateurs 16 et 20 et la lampe 12 par l'intermédiaire d'un etage de puissance 64. Un opto-isolateur 66 permet par ailleurs au système 58 de surveiller cette lampe 12. En outre, les électrodes 40 sont reliées à des entrées appropriées du système 58 qui est ainsi averti de La fin du remplissage du ballon 2 et commande alors la fermeture de L'électrovanne de remplissage 28. En effet, lorsque le niveau de remplissage est atteint, un contact électrolytique s'étabit entre les deux électrodes, ce qui permet de commander par L'intermédiaire du système 58, la fermeture de l'électrovanne 28. Bien entendu, des traversées opaques sont prévues sur l'enceinte 22 pour les différents connecteurs ou cables électriques devant pénétrer à L'intérieur de cette enceinte. La méthode d'analyse d'un échantillon comprend les étapes suivantes - remplissage- du ballon (un volume d'échantillon suffisant à la mesure pouvant être placé dans une ampoule 68 reliée à la portion de canalisation 24 sortant de l'enceinte 22, le remplissage se faisant par gravité et s'arrêtant automatiquement au niveau de consigne), - prise en compte du zéro, ce qui signifie que l'échantillon à analyser subit une adaptation à l'obscurité d'une minute par exemple, après quoi un cycle de mesure est déclenché ; cette étape de prise en compte du zéro est identique à l'étape suivante indiquée ci-dessous, excepté que L'illumination par la lampe 12 n'a pas lieu, et que le résultat de la prise en compte du zéro est mémorisée dans le système 58 ; il est entendu que dans une série de mesures, L'appareil ayant atteint sa température de régime, cette étape de prise en compte du zéro n'est normalement pas réalisée plus d'une fois, - mesure proprement dite (illumination de l'échantillon pendant 10 secondes - attente pendant 3 secondes - mesure de la luminescence pendant 1 minute), traitement des informations, - affichage des résultants, - vidange du ballon 2, qui se fait également par gravite par exemple dans un récipient de décharge non représenté. Au cours ' du traitement des informations relatif à La mesure proprement dite, le total des impulsions correspondant à La prise en compte du zero est soustrait du total des impulsions correspondant à la mesure proprement dite. La méthode de mesure utilisée avec l'appareil représenté peut etre étalonnée avec des cultures pures d'espèces représentatives du phytoplancton dont on veut connattre la concentration. La méthode utilisée est simplifiée par le fait qu'il est inutile de maintenir à température constante l'échantillon contenu dans le ballon 2 compte tenu de la marge d'erreur due notamment à l'hétérogénéité des populations de phytoplancton, à l'état physiologique variable de ces populations.... La présente invention permet de détecter rapidement, dans des échantillons de petit volume, la presence de phytoplancton à photosynthèse oxygénique, biologiquement actif, et d'en quantifier la concentration. L'appareil de l'invention est d'une conception simple, fonctionne "en discontinu" et peut être réalisé avec un prix de revient modéré. En outre, il est facile à utiliser. Si nécessaire, on pourrait l'adapter en ayant recours au comptage de photons, en vue de gagner plusieurs ordres de grandeur en sensibilité. Enfin, on pourrait adapter cet appateil en vue de réaliser un système d'alarme pour la surveillance des eaux risquant d'être polluées. REVENDICATIONS 1. Appareil de détection de luminescence pour milieu liquide, destiné -à l'étude d'un milieu liquide susceptible d'émettre à retardement un rayonnement de luminescence, après excitation de ce milieu liquide par un rayonnement excitateur approprié, cet appareil étant caractérisé en ce qu'il comprend : - un récipient (2) destiné à recevoir une quantité déterminée du milieu liquide, - des moyens (6) d'excitation de ladite quantité de milieu liquide dans le récipient, par le rayonnement excitateur, et - des moyens (8) de détection du rayonnement de luminescence émis à retardement par ladite quantité de milieu liquide dans le récipient. 2. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que le récipient (2) est opaque excepté en deux zones (44, 46) respectivement prévues pour l'entrée du rayonnement excitateur et la sortie du rayonnement de luminescence. 3. Appareil selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le récipient (2), les moyens d'excitation (6) et les moyens de détection (8) sont placés à l'intérieur d'une enceinte opaque (22). 4. Appareil selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre trois conduits (24, 26, 32) opaques traversant l'enceinte (22), dont deux sont respectivement munis d'électrovannes (28, 30) fixées contre la paroi interne de L'enceinte (22), ces deux conduits étant respectivement prévus pour remplir et vider le récipient du milieu liquide, le troisième conduit (32) étant un évent muni de moyens de piégeage de lumière (42). 5. Appareil selon L'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les moyens d'excitation (6) sont placés à l'extérieur du récipient (2) et munis de moyens d'obturation (16) prévus pour isoler optiquement les moyens d'excitation (6) de l'intérieur du récipient (2) après ladite excitation. 6. Appareil selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu liquide est susceptible de contenir une substance capable d'émettre à retardement ledit rayonnement de luminescence, apres excitation par le rayonnement excitateur approprié. 7. Appareil selon la revendication 6, caractérisé en ce que Les moyens de détection (8) sont prévus pour fournir des informations relatives à la concentration du milieu liquide en ladite substance. 8. Appareil selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens (52) de traitement des informations, prévus pour déterminer ladite concentration. 9. Appareil selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le milieu liquide est L'eau et en ce que Ladite substance est du phytoplancton à photosynthèse oxygénique. 10. Appareil selon la revendication 9, caractérisé en ce que le récipient (2) est en silice. 11. Appareil selon la revendication 10, caractérisé en ce que la paroi externe du récipient (2) en silice est sablée et métal tisée, excepté en deux zones (44, 46) respectivement prévues pour l'entrée du rayonnement excitateur dans le récipient (2) et la sortie du rayonnement de luminescence de ce récipient.