FR 2616069 A1 19881209 FR 8707921 A 19870605 Facteur inhibiteur in vivo de la prolifération tumorale et matières le contenant, en Particulier suscePtibles d'être obtenus à Partir de moelle osseuse. L'invention concerne un facteur inhibiteur in vivo de la prolifération tumorale et des matières le contenant, en particulier susceptibles d'être obtenus à partir de moelle osseuse. Elle concerne plus particulièrement un facteur inhibiteur de la prolifération tumorale in vivo, non spécifique d'espèce, qui est susceptible d'être obtenu à partir d'un surnageant de moelle osseuse , et d'être extrait de ce surnageant en même temps que la sérumalbuminé contenue dans ce surnageant de moelle et, le cas echéant, en même temps qu'avec des substances protéiques contenues dans la moelle, dont les poids moléculaires sont contenus dans une plage d'environ 60.000 à environ 68.000 daltons. I1 est à remarquer que l'expression "substances protéiques", telle qu'elle est utilisée dans le présent texte, se rapporte à des peptides, polypeptides et protéines, sans qu'il y ait lieu de distinguer entre eux. L'expression "surnageant de moelle" se rapporte au liquide acellulaire dans lequel baigne normalement la moelle osseuse et qui est séparé des constituants cellulaires, après le prélèvement de la moelle dans les os qui normalement la retiennent. I1 peut encore être envisagé comme constituant l'environnement naturel des cellules de moelle osseuse contenant les produits d'excrétion de ces cellules au moment où ladite séparation, notamment par filtration et/ou centrifugation, est effectuée. Le facteur selon l'invention comporte notamment un ou plusieurs polypeptides ou peptides thermostables (en ce que l'activité inhibitrice de la croissance tumorale n'est pas affectée, voire même est accrue, par un traitement thermique à une température de 80*C pendant 30 minutes), ces polypeptides ou peptides présentant des points isoélectriques apparents compris entre 4,5 et 6,0, lorsque ceux-ci sont déterminés par des essais de focalisation isoélectrique effectués avec ledit facteur sur un gel comportant un gradient de pH, en présence de ladite sérum-albumine et, le cas échéant, des substances protéiques initialement contenues dans le surnageant de moelle dans les plages de poids moléculaires d'environ 60.000 à environ 68.000 et séparables par gel-filtration à partir d'un surnageant de moelle osseuse. Lorsque ces essais de focalisation sont réalisés, par exemple dans les conditions qui sont décrites plus loin, ils font apparaitre au moins une bande de migration, distincte de la bande de migration caractéristique de la sérum-albumine (point isoélectrique de lrordre de 4,9) et caractéristique du susdit facteur (point isoélectrique entre 5 à 6,0). Endparticulier, on observe dans les essais décrits plus loin trois bandes de migration correspondant à des points isoélectriques contenus dans la région 5,0 à 6,0. L'invention concerne encore une matière inhibitrice de la prolifération tumorale in vivo, susceptible d'etre obtenue à partir d'un surnageant de moelle osseuse, cette matière étant caractérisée : - en ce qu'elle contient un facteur thermostable, responsable de la susdite acivité non spécifique d'espèce, distinct de la sérum-albumine, séparable par gel-filtration à partir de ce surnageant, avec la sérum-albumine que celuici peut contenir, - en ce qu'elle est essentiellement constituée d'une ou de plusieurs substances protéiques, - en ce qu'elle présente un caractère essentiellement anionique, un ou plusieurs points isoélectriques dans la région 4,5-6,0, - en ce qu'elle est essentiellement dépourvue d'hexoses et de substances protéiques séparables par gel-filtration à partir d'un surnageant de moelle et ayant des poids moléculaires inférieurs à 60.000 et supérieurs à 68.000 et de substances protéiques ayant des points isoélectriques supérieurs à 6,0, en particulier des substances protéiques qui répondent à cette condition lorsque la détermination de ces points isoélectriques est effectuée par des essais de focalisation isoélectrique effectués sur cette matière, lorsque celle-ci contient d'autres substances protéiques, notamment de la sérum-albumine de moelle osseuse. Cette matière peut également contenir de la sérum-albumine et des substances protéiques séparables par gel-filtration à partir d'un surnageant de moelle et contenues dans une plage de poids moléculaires d'environ 60.000 à environ 68 000. En d'autres termes, l'invention concerne aussi une matière, caractérisée en ce que la totalité des substances protéiques qu'elle contient est contenue dans une plage de poids moléculaires apparents s'étendant d'environ 60.000 à environ 68.000 I1 est à remarquer que les valeurs de poids moléculaires sus-indiqués, pour significatives qu'elles soient, ne sauraient être considérées comme ayant un caractère nécessairement limitatif -en ce qui concerne le facteur inhibiteur susceptible d'etre davantage purifié, dès lors que l'on ne peut exclure que dans les étapes d purification qui seront décrites plus loin, ce facteur reste associé de façon relativement intime à l'une des substances protéiques distinctes dont le poids moléculaire apparent serait contenu dans la gamme sus-indiquée.En variante, le poids moléculaire apparent du facteur inhibiteur pourrait être dû aussi à la somme des poids moléculaires du facteur inhibiteur de la prolifération tumorale, à l'état isolé, et d'un autre constituant protéique, jouant éventuellement le rôle de porteur à l'égard de ce facteur. L'invention concerne enfin un procédé d'obtention d'une matière contenant le facteur inhibiteur de l'invention, ce procédé étant caractérisé en ce que, partant d'une moelle osseuse préalablement prélevée chez un animal, notamment le boeuf ou le lapin, on recueille le milieu acellulaire dans lequel baigne normalement les cellules de la moelle et, le cas échéant, après dilution dans une solution physiologique appropriée, on procède à une séparation, notamment par gel-filtration et fractionnement des fractions éluées, des substances protéiques ayant des poids moléculaires inférieurs à environ 60:000 et supérieurs à environ 68.000, ainsi que des substances protéiques ayant des points isoélectriques supérieurs à 6; pour ne retenir que les fractions constituées par des substances protéiques ayant des poids moléculaires apparents compris entre environ 60.000 et 68.000 et des points isoélectriques inférieurs à 6,0, en particulier lorsque la détermination de ces points isoélectriques est effectuée par des essais de focalisation isoélectrique effectuée sur l'ensemble de cette fraction. Des caractéristiques supplémentaires de l'inven- tion apparaîtront encore au cours de la description qui suit des conditions dans lesquelles des produits selon l'invention peuvent être isolés et dans lesquels les propriétés évoquées ci-dessus ont été mises en évidence, notamment par référence aux dessins, dans lesquels - la fig. 1 est une réplique du chxomatogramme de la première opération de filtration sur gel d'un surnageant de moelle osseuse de boeuf, et de fractionnement de l'éluat en plusieurs fractions ayant des gammes de poids moléculaires principaux respectivement. décroissants - la fig. 2 est une réplique du chromatogramme de la deuxième opération de filtration, appliqué à l'une des fractions purifiées au terme de la première filtration (fraction C), pour obtenir la "fraction FIT" (Facteur inhibiteur de la prolifération tumorale) qui fera ensuite l'objet des analyses en vue de la détermination des caractéristiques principales des matières et du facteur Selon l'invention - les fig. 3A et 3B sont respectivement représentatives des profils d'élution (appréciés par les variations des absorbances A mesurées à 280 nm en fonction du volume élué) de la fraction FIT et, à titre comparatif, d'une sérum-albumine bovine pure, sur gel commercialisé sous la désignation SUPEROSE 12 (marque de la Société PHARMACIA) - les fig. 4A et 4B sont respectivement représentatives des profils de migration électrophorétique d'une sérumalbumine bovine utilisée à titre de comparaison et de la fraction FIT, sur une bande d'acétate de cellulose; les pourcentages de chaque population séparée par électrophorèse sont également indiqués sur les axes des abscisses - la fig. 5 est une réplique des comportements électrophorétiques comparatifs sur gel de SDS-PAGE de la fraction FIT et de constituants utilisés à titre de comparaison, et - la fig. 6 est une réplique des comportements électrophorétiques, dans un gradient de pH sur gel, de la fraction FIT et des diverses substances utilisées à titre de comparaison. Les chromatogrammes ou profils d'élution des fig. 1, 2 et 3 font apparaitre la variation de l'absorbance A (mesurée à 280 nm sur l'axè des ordonnées) des fractions collectées en fonction des volumes élués (en ml sur l'axe des abscisses) A. OBTENTION DE LA MOELLE OSSEUSE A PARTIR DES OS D'UN MAMMIFERE - NOTAMMENT D'UN LAPIN OU BOEUF - VENANT D'ETRE SACRIFIE 1) PréParation d'une moelle osseuse de laPin On indique ci-après le protocole pour la préparation d'un extrait de moelle de lapin à partir de 10 lapins "néozélandais" de poids compris entre 1,5 kg et 2 kg. Les opérations suivantes sont effectuées le plus stérilement possible. Elles sont toutes effectuées à +4-C. Les lapins sont sacrifiés par rupture au bulbe rachidien, puis dépecés. Les os de l'animal : fémur, tibia, péroné, humérus, radius, cubitus sont prélevés avec le moins de chair possible. Après extraction et "nettoyage", l'os est immergé dans une solution biologique consistant en une solution de chlorure de sodium 0,15M-pH7,0 stérile. Les os sont lavés à trois reprises, chaque fois avec 1,5 litres de solution biologique. Les os ainsi lavés sont conservés dans une solution biologique fraîche jusqu'à usage. Pour l'extraction de la moelle, les épiphyses des os sont coupées au-dessus d'un récipient contenant de 150 à 200 ml de solution biologique. La moelle est ensuite extraite à l'aide d'une seringue, par injection d'un peu de solution le long des parois internes des os, afin de l'expulser hors des os. La moelle extraite .est alors dispersée dans la solution. A cette fin, les deux phases moelle-solution biologique sont homogénéisées à l'aide de la seringue en aspirant, puis en expulsant plusieurs fois de suite le mélange. La dispersion obtenue est centrifugée pendant 30 minutes à 10.000 tours/minute. On filtre le surnageant sur gaze stérile pour éliminer les graisses. Les culots sont mis de côté. Le surnageant, filtré, est immédiatement congelé. 2) Préparation d'une moelle osseuse de boeuf Les côtes d'une génisse fraîchement abattue d'un an ayant un poids d'environ 1000 kg ont été séparées à partir de sa carcasse. Le tissu mou en a été séparé et chaque côte a été sciée en quatre parties. Les os ont été rincés à plusieurs reprises avec une solution isotonique stérile à -4iC, avant d'être montés dans un étau. La moelle osseuse a été extraite à partir de la matière spongieuse avec un instrument de forage à main et entraîné à faible vitesse. La matière obtenue a été immédiatement suspendue dans une solution isotonique saline et stérile et les molécules ont été dissociées par agitation douce. La suspension des cellules de moelle osseuse dans la solution saline isotonique a ensuite été soumise à une première centrifugation à 15.000 g, pour éliminer les matières particulaires telles que les cellules et les fragments d'os. Le surnageant a été filtré sur gaze naturelle dans le but de retenir toute matière grasse encore présente. Le précipité a été mis de côté et le surnageant immédiatement congelé. 4 litres de surnageant acellulaire de moelle osseuse ont été obtenus à partir de la totalité des côtes d'une génisse. Elles ont été réunies et congelées (sous forme -d'aliquots) à -30iC. Toutes les opérations qui précèdent, à commencer par le rinçage sus-indiqué des côtes, ont été effectuées dans des conditions stériles et à +4-C. C'est le dernier surnageant ci-après désigné "moelle osseuse", qui a constitué le matériel de départ pour les purifications ultérieures. Il est entendu que le surnageant de lapin susdit aurait pu être mis en oeuvre dans.des conditions identiques. B. PREPARATION ET PURIFICATION DU FACTEUR INHIBITEUR DE LA CROISSANCE DES TUMEURS (FIT) A PARTIR DE LA MOELLE OSSEUSE. 1) PréParation du surnaaeant. On met en oeuvre un matériel stérile et des solutions stériles, préparés à partir d'eau fraîchement distillée, puis stérilisés par passage en autoclave 20 minutes à 120*C. Deux flacons contenant chacun environ 200 ml de moelle osseuse sont décongelés par incubation sous agitation dans un bain-marie préalablement équilibré à la température de 37-C. La solution décongelée est répartie dans des godets à centrifuger de 100 ml, puis centrifugée 30 minutes à 38.000 g à +4-C. Le surnageant est récupéré puis filtré sur gaze stérile. Son volume est mesuré. Dans une expérience type,- ce volume est d'environ 400 ml. Pour des raisons pratiques, ce volume est divisé en quatre fractions identiques (volume = 100 ml) correspondant chacune à un échantillon destiné à être chromatographié. On ajoute à chaque fraction 1 ml d'une solution d'azoture de sodium (NaN3) à 2 % (p/v) en eau distillée stérile. Dans l'attente de la chromatographie ultérieure, les fractions sont stockées à +4-C. Les boyaux utilisés pour les dialyses sont éprouvés avec de l'eau fraîchement distillée, puis répartis par groupes de cinq dans des flacons "plasma" stériles contenant environ 100 ml d'eau fraîchement distillée. Les flacons sont alors stérilisés par passage en autoclave, 20 minutes à 120'C. 2) Première étaPe de Purification : Obtention d'une fraction active Purifiée par filtration sur ael. Le gel mis en oeuvre consiste en une matrice mixte d'un polyacrylamide à haute résolution et d'un agarose stabilisant en suspension aqueuse, possédant une zone préférentielle de fractionnement comprise entre environ 20.0po et environ 350.000. C'est plus particulièrement un gel de polyacrylamide (3 %)-agarose (4 %), commercialisé sous la désignation ULTROGEL ACA34 (marque LOB), qui a été utilisé dans l'essai dont la description suit. On utilise des colonnes d'ULTROGEL AcA34 (5x90 cm) préalablement équilibrées par environ 5 litres d'une solution de chlorure de sodium 0,9 % contenant NaN3 0,02 %, à l'aide d'une pompe péristaltique. Une partie du surnageant (100 ml) est déposée sur la colonne (débit : 60 ml/h). L'élution est réalisée avec une solution de chlorure de sodium 0,9 % contenant NaN3 0,02 % (débit : 60 ml/h). Des fractions de 10 ml sont collectées et le déroulement de la chromatographie est suivi, par l'utilisation d'un détecteur U.V. (A=280 nm) branché en sortie de colonne et couplé à un enregistreur. Les fractions collectées sont laissées quelques heures à température ambiante, puis leur absorption à 280 nm est mesurée au specrophotomètre. Après lecture, les fractions sont stockées à +4in. Le chromatogramme d'absorption (à 280 nm), en fonction du volume d'élution (en ml), est tracé (figure 1). On détermine les limites de chaque fraction et les tubes sont réunis pour fournir six fractions, respectivement désignées A,B,C,D,E,F, qui sont ensuite stockées à +4-C. Les six fractions A,B,C,D,E,F, correspondent respectivement aux volumes d'élutions qui sont indiquées dans la figure 1 (abscisses). On voit que la répartition initiale a été effectuée plus particulièrement dans le but de récueillir chacun des principaux pics d'élutions (fractions A,C,D et F) et les volumes intermédiaires (fractions B et E). Les fractions éluées se caractérisent également par des plages des poids moléculaires apparents (PM) qui sont approximativement les suivantes Fraction A : PM supérieur à 300-350.000, Fraction B : environ 300.000 PM > environ 150.000, Fraction C : environ 68.000 > PM > environ 60.000, Fraction D : environ 50.000 > PM environ 25.000, Fraction E : environ 25.000 > PM environ 10.000, Fraction F : PM inférieur à Les mêmes chromatographies sont répétées trois fois dans les mêmes conditions, chaque fois sur 100 ml de surnageant. Entre chaque chromatographie, la colonne est lavée avec environ 3 litres de solution de chlorure de sodium 0,9 % contenant NaN3 0,2 % (débit : 60 ml/h). Après chaque chromatographie, les fractions A,B,C,D,E, et F obtenues sont réunies, respectivement avec les fractions A,B,C,D,E et F homologues des chromatographies précédentes. Après la dernière chromatographie, chaque fraction est répartie en boyaux de dialyse (par exemple ceux commercialisés sous la désignation NOJAX) stériles (excepté la fraction F pour laquelle on utilise des boyaux de marque SPECTRAPOR de seuil de coupure moléculaire 1 x puis dialysée contre plusieurs volumes d'eau fraîchement distillée. La fin de la dialyse est déterminée par l'absence d'ion chlorure (réaction négative en présence de nitrate d'argent 0,1M) dans l'eau de dialyse. Les différentes fractions dialysées (rétentats) A,B,C,D,E et F sont récupérées, congelées à -30-C, puis lyophilisées stérilement durant 48 heures. Les lyophilisats sont conservés à +4-C. Dans une expérience type, mettant en oeuvre 400 ml, les poids respectifs de matière dans les fractions A,B,C,D,E et F ont été les suivants Fraction A : 114 mg Fraction B : 79 mg Fraction C : 489 mg Fraction D : 827 mg Fraction E : 109 mg Fraction F : 30 mg. L'activité antitumoraie in vivo, est associée à la fraction C poids moléculaires compris entre environ 60000 et environ 68000). 3) Deuxième étage de Purification La fraction active (fraction C) est soumise à une seconde filtration sur gel, en utilisant le même gel que dans la première opération (opération de recyclage)mais en opérant dans les conditions qui suivent. La même colonne d'ULTROGEL AcA34 (5x90 cm) a préalablement été équilibrée par environ 5 litres de tampon PBS-pH7,40 contenant NaN3 0,02 % (débit 60 ml/h). La préparation de l'échantillon s'effectue sous une hotte à flux laminaire, dans du matériel stérile, de la manière suivante : Dans une expérience type, 470 mg de la fraction C, exactement pesés sont dissous dans 20 ml de tampon PBS pH7,40 contenant NaN3 0,02 % La solution obtenue est soumise à une agitation magnétique durant 30 minutes, puis centrifugée 30 minutes à 38.000 g à +4C. Le surnageant obtenu est déposé sur la colonne (débit : 60 ml/h) et l'élution est réalisée avec du tampon PBS à pH7,40 contenant NaN3 0,02 % (débit : 60 ml/h). Des fractions de 10 ml sont collectées et le déroulement de la chromatographie est suivi, par l'utilisation d'un détecteur U.V. (A=280 nm) branché en sortie de colonne, et couplé à un enregistreur, comme dans le cas précédent Les fractions collectées sont laissées quelques heures à température ambiante, puis leur absorption à 280 nm est mesurée au spectrophotomètre. Après lecture, les fractions sont conservées à + 4'C. On trace le chromatogramme absorption (à 280 nmb en fonction du volume d'élution (en ml). Le chromatogramme obtenu est représenté à la figure 2. Les tubes collectés sont transférés sous la hotte à flux laminaire, répartis en trois groupes A', B et C', dans le but de séparer la fraction correspondant au pic d'absorption (fraction B'), des fractions d'élution antérieure (fraction A') et postérieure (fraction C'). Les contenus des tubes dans chacun de ces groupes sont ensuite réunis. La fraction B' contient à nouveau des constituants dont les poids moléculaires apparents s'étendent d'environ 60.000 à environ 68.000, avec des proportions de poids moléculaires inférieurs à 60.000 et supérieurs à 68.000 maintenant devenues négligeables. Chaque fraction est répartie en boyaux de dialyse stériles, puis dialysée contre plusieurs volumes d'eau fraîchement distillée. Comme précédemment, la fin de la dialyse est déterminée par l'absence d'ion chlorure (réaction négative en présence de nitrate d'argent 0,1M) dans l'eau de dialyse. Chaque rétentat (correspondant chacun à une fraction) est congelé à -30*C, puis lyophilisé stérilement durant 48 heures. Le lyophilisat est conservé à +4in. Dans une expérience type, pour 470 mg de produit engagé, le poids de chaque fraction A',B',C', est le suivant: Fraction A' : 47 mg Fraction B' : 253 mg Fraction C' : 61 mg. L'activité antitumorale, déterminée in vivo, se trouve dans la fraction B'. C'est cette fraction qui constitue la "fraction FIT" qui fera l'objet des essais biologiques dont il est question plus loin, et dont l'activité doit être imputée à son contenu en facteur FIT. C. ELEMENTS DE CARACTERISATION DE LA "FRACTION FIT". 1. Spectre d'absorption U.V. Ce spectre se caractérise par un maximum d'absorption à 278 nm. 2. Dosage de protéines. Ce dosage est effectué selon la méthode de Lowry (selon une modification de Miller ; réf. Anal. Chem. 1959, 31, page 964). Ce dosage indique une teneur en protéines pratiquement de 100 S pour la fraction active. 3. Dosages des hexoses. Ce dosage est effectué par une méthode à l'anthrone-sulfurique (réf. Methods Enzymol., 1957, III, 84). Le dosage indique l'absence d'hexoses (teneur inférieure à 0,5 %). 4. Etude du comportement de la fraction active (FIT) dans divers systèmes de chromatographie. 4.1. Essais de filtration sur le gel commercialisé sous la marque "SUPEROSE 12" (PHARMACIA). Ce gel est constitué par un gel à base d'agarose, formé de particules calibrées avec une haute précision, pour autoriser une forte résolution de séparation de molécules biologiques selon leurs poids moléculaires respectifs, dans des opérations de chromatographie liquide sous haute pression et dans les conditions préconisées par son fabricant, la Société PHARMACIA, et désignées par elle sous l'expression "FAST PROTEIN LIQUID CHROMATOGRAPHY" (chromatographie liquide rapide de protéines). La fraction FIT a été chromatographiée sur ce support dans les conditions suivantes : 100 ijl d'une solution à 1,6 mg/ml de la fraction FIT en tampon Tris-HCl 0,1 M pH 7,0 NaCl1M-NaN3 0,02 eó sont injectés dans une colonne (1x30 cm) de SUPEROSE 12 équilibrée et éluée avec le même tampon ; vitesse d'élution 0,5 ml/minute ; température ambiante. A titre de comparaison, 100 pl d'une solution à 1,2 mg/ml de sérum-albumine bovine du même tampon Tris-HCl 0,1M pH 7,0-NaCl1M NaN3 0,02 % sont chromatographiés dans des conditions identiques. La sérum-albumine bovine utilisée était celle commercialisée par la Société SIGMA sous la référence A4378. Le profil obtenu pour la fraction FIT est indiqué à la figure 3A. Deux pics principaux sont respectivement élués à un volume de 11,69 + 0,03 ml et 12,95 + 0,01 ml. Le profil obtenu dans des conditions expérimentales identiques pour la sérum-albumine bovine est indiqué à la figure 3B. Les deux pics principaux sont respectivement élués à 11,66 ml et 13,03 ml. L'examen comparatif des figures 3A et 3B révèle la présence de proportions importantes d'un constituant qui est élué comme la sérum-albumine, dans la fraction FIT. La présence du facteur actif selon l'invention altère dans une certaine mesure le spectre dû à la sérumalbumine. L'existence dans la fraction FIT de constituants autres que l'albumine est ainsi mise en évidence. Les constituants ctifs se retrouvent néanmoins dans des volumes d'élution très voisins. Lé -poids moléculaire apparent du pic principal découlant de cet essai pour la fraction FIT est de l'ordre de 65.000. 4.2. Chromatographie sur résines échangeuse de cations du type MONO-S, HR 5/5. Plusieurs essais ont été réalisés sur différentes résines cationiques, plus particulièrement sur les résines commercialisées sous les désignations - MONO-S, HR 5/5, qui est une résine échangeuse de cations, portant des groupes chargés CH2S03 , - CM SEPHADEX C-50, qui est une résine échangeuse de cations, portant des groupes chargés CH2COO Ces essais ont été effectués en mettant en oeuvre des tampons appropriés à pH 7. L'activité d'inhibition de la croissance tumorale, dans les conditions décrites plus loin, s'est retrouvée dans les toutes premières fractions d'élution, attestant -ainsi du caractère anionique de la fraction FIT (absence de fixation, à pH 7, sur une résine cationique). 5. Etude du comportement électrophorétique de la fraction active (FIT). Les électrophorèses - ont été effectuées dans deux systèmes différents - sur support acétate de cellulose, - en gel de polyacrylamide en présence de SDS (PAGE-SDS). 5.1. Electrophorèse sur bande d'acétate de cellulose. On a de nouveau procédé à des électrophorèses comparatives de la fraction FIT et de la sérum-albumine bovine de SIGMA. Les essais ont été réalisés dans les conditions suivantes sur bande d'acétate de cellulose, dans le système PHOROSLIDE-MILLIPORE, dans les conditions décrites par la Société MILLIPORE : a) 1,2 ijl d'une solution de sérum-albumine bovine (SIGMA réf. A4-378) à 11 mg/ml en eau bidistillée sont soumis à une séparation d'une durée de 20 minutes sous une tension de 100 V en tampon Véronal-pH 8,6. La bande est revélée par incubation 10 minutes dans une solution de colorant PONCEAU-S, rincée par plusieurs bains d;une solution d'acide acétique à 5 %, puis diaphanisée pour lecture au densitomère à 520 nm. b) 0,9 ijl d'une solution de la fraction FIT (10 mg/ml) en eau bidistillée sont soumis à une séparation d'une durée de 30 minutes sous une tension de 100 V, en tampon Véronal-pH 8,6. La bande est révélée par incubation 10 minutes dans une solution de colorant PONCEAU-S, rincée par plusieurs bains d'une solution d'acide acétique à 5 %, puis diaphanisée pour lecture au densîtomètre à 520 nm. Le profil electrophorétique de la fraction FIT (fig. 4B) présente des caractères à la fois communs avec celui de la préparation de sérum-albumine bovine (fig. 4A) et des caractères qui distinguent les constituants actifs de la fraction FIT de la sérum-albumine. Les résultats indiquent que FIT contient une proportion importante (évaluée à 40 %) d'un constituant qui migre comme la sérum-albumine. Ceci confirme ce qui avait été observé lors des expériences de filtration sur gel de SUPEROSE 12, à savoir des volumes d'élution très voisins pour l'albumine et pour FIT. 5.2. Electrophorèse sur PAGE-SDS. Le comportement de la fraction FIT en électrophorèse est comparé à celui de plusieurs molécules de référence identifiées ci-après. L'expérience est réalisée en tampon phosphate de sodium 0,1 M-pH 7,1 contenant 1 % de SDS, avec un gel à 10 % en acrylamide, dans les conditions décrites par LKB (Notice d'emploi 306). Chaque échantillon est dissous en tampon phosphate de sodium O,1M-pH 7,1 contenant 1 0 de SDS, 1 % de ss-mercaptoéthanol et de l'urée 6M, puis incubé au bain marie à ébullition (concentration en protéine comprise entre 2 et 11 mg/ml). Durée de l'expérience : 4,5 heures. Coloration : bleu de Coomassie. Dépôt : 10 ijl. A : Ovalbumine (Worthington), PM 43.000 B : Sérum-albumine bovine (SIGMA), PM 68.000 C : Lysozyme (Sigma), PM 14.000 D : Sous-unité alcool déshydrogénase (Bohringer), PM 37.000 E : Sous-unité catalase (Serva), PM 60.000 F : Fraction B de première gel-filtration (fraction B, fig. 1) G : Fraction FIT (fraction B de deuxième gel-filtration voir fig. 2) H : Fraction D de première gel-filtration (fraction D, fig. 1). Cet essai confirme, par comparaison des distances de migration (fig. 5) des constituants de FIT avec les distances de migration des substances de poids moléculaires connus, que l'essentiel des constituants de la fraction FIT, est contenu dans une plage de poids moléculaires apparents 60.000-68.000, avec une prédominance à environ 65.000. Focalisation isoélectrisue sur Plaques de ael commercialisées par la Société LKB sous la marque AMPHOLINE (PAG). Ces plaques fines, décrites dans le brevet français n' 1.554.045 ou le brevet américain n 3.485.736, sont formées d'un gel à base d'acrylamide en couche mince contenant des ampholytes (mélanges de polyacides et de polybases) qui, lorsque les constituants de la plaque sont soumis à l'action d'un champ électrique, se répartissent en un gradient stationnaire de pH. L'expérience est réalisée avec les dépôts des matières identifiées ci-après, sur une plaque permettant la formation d'un gradient de pH3,5-9,5, dans les conditions décrites par le fabricant (LKB) dans le mode d'emploi accompagnant les plaques PAG. A : dépôt de 15 ijg de sérum-albumine-bovine (SIGMA réf. A4378). B : dépôt de 75 pg de la fraction FIT. C : dépôt de 30 pg d'inhibiteur de trypsine (SIGMA), marqueur de pI = 4,55. D : dépôt de 30 pg d'anhydrase carbonique B (SIGMA), marqueur de PI=6,57. E : dépôt de 75 ijg de la fraction D obtenue à l'issue de la première purification sur ULTROGEL AcA34 du surnageant de la moelle osseuse mise en oeuvre. La fig. 6 montre les distances comparées de migrations de ces différentes substances dans le gradient de pH. Les bandes de migration sont révélées par coloration avec le bleu de Coomassie. Cette expérience permet les observations sui vantes - La sérum-albumine est caractérisée par un point isoélectrique (pI) de 4,9. - Les distances de migration des substances connues (C pI 4,55 ; A : pI 4,9 ; D : pI 6,57 ) permettent par comparaison de préciser les points isoélectriques de certaines des substances contenues dans la fraction FIT. - La fraction FIT comprend une bande importante de pI 4,9, attribuable à la sérum-albumine, et trois bandes mineures à des valeurs de pI dans une fourchette de pI entre 5 et 6,0. - La fraction FIT est essentiellement exempte de constituants nettement distincts de la bande correspondant apparemment à de la sérum-albumine et ayant des points isoélectriques compris entre 7 et 8, que l'on retrouve dans la piste E de la fig. 6 (correspondant à la fraction D obtenue au terme de la première purification sur ULTROGEL AcA44). Plus généralement, la fraction FIT est exempte de constituants ayant des points isoélectriques supérieurs à 6,0. ACTIVITE BIOLOGIOUE DES FRACTIONS FIT. Les essais dont la description suit ont été réalisés avec des lots de fractions FIT obtenues à partir de préparations différentes de moelle osseuse. 1) Activité in vivo. Le produit actif IC 86 1773 (FIT) a été testé pour son activité antitumorale in vivo sur un modèle expérimental réputé significatif, utilisant un carcinome du colon CL 26 transplanté chez la souris (souris BALB:c). L'activité inhibitrice in vivo de la croissance des tumeurs, que possède le facteur FIT, est appréciée par la réduction de l'importance des tumeurs induites dans l'animal, lorsque celui-ci a reçu l'injection de FIT, par rapport au développement de la tumorisation dans des animaux témoins. Le protocole expérimental qui suit a été mis en oeuvre. Les souris, des femelles BALB/c reçoivent aux jours JO une injection tumorisante de 400.000 cellules de carcinome dans 0,2 ml de solution physiologique, par voie sous-cutanée. Les cellules avaient été préparées peu de temps auparavant dans des conditions stériles. Immédiatement après. l'injection tumorisante, les souris reçoivent par voie intrapéritonéale, 109 pg par animal du produit à tester dans 0,5 ml d'une solution de tampon phosphate. Le traitement est poursuivi pendant 8 à 10 jours. Les animaux sont ensuite sacrifiés, les tumeurs prélevées et pesées. Les résultats sont exprimés en pourcentage du poids des tumeurs des animaux traités par rapport aux animaux contrôle ayant reçu dans un volume équivalent 100 ug de sérum-albumine bovine. Les résultats sont rapportés dans le tableau suivant qui porte sur 4 lots différents, numérotés de (1) à (4), de la fraction IC 86 1773. TABLEAU 1 Résultats Lot testé Contrôle Traité Inhibition p (1) 664 + 197 411 t 174 38 % 0,01 (2) 92 t 38 28 + 16 70 % 0,01 (3) 125 + 65 39 t 19 69 % 0,01 (4) 215 + 78 92 + 73 57 Ct 0,005 Ces résultats témoignent dont de la présence dans le facteur FIT de propriétés très significatives d'inhibi- tion in vivo du développement tumoral puisque celui-ci s'exprime par une réduction du poids des tumeurs, s'étageant de 38 à 70 %, selon les expérimentations par rapport au poids des tumeurs chez des animaux témoins. 2) Absence d'activité in vitro. Le test utilisé, réputé signlficatif, consiste à évaluer l'influence in vitro sur le développement de cellules tumorales en culture, au contact de la substance étudiée introduite dans le milieu de culture. Le lot FIT 3 a été testé sur des lignées cellulaires de carcinome mammaire, lignées BR 3 et MCF 7, en mettant en oeuvre le protocole expérimental qui suit. Les cellules sont incubées dans des boites de pétri, à raison de 104 cellules par boite dans un milieu composé de méthylcellulose dans le milieu de DUL BECCO modifié par ISCOVE (IMDM) + 20 % sérum de veau foetal + insuline. Les produits à tester sont introduits dans le milieu aux dilutions suivantes : O, 5, 25 et 100 pg/ml. Les résultats sont exprimés en nombre de colonies après 7 jours de culture. Les lectures ont été effectuées en double. TABLEAU 2 TABLEAU 2 Lignée Dilution Nombre de colonies BR 3 0 pg/ml 296 + 35 5 pg/ml 267 t 19 25 pg/ml 256 + 23 100 pg/ml 294 + 28 MCF 7 0 pg/ml 159 + 12 5 pg/ml 159 + 12 25 pg/ml 126 t 14 100 pg/ml 138 t 27 Ces résultats témoignent de l'absence d'activité significative in vitro induite par le facteur FIT. Une expérimentation semblable a également été effectuée avec le lot (4), mais à l'égard d'une souche KB, d'un cancer humain -du nasopharynx. Le lot (4) a été introduit dans la culture à raison de 200 pg/ml. Sur cette souche très sensible et à la dose très élevée testée, aucune activité cytotoxique n'a été observée, confirmant les résultats du tableau ci-dessus. 3. Activité du Produit aPrès chaufface. Un lot (5) du produit IC 86 1773, qui presentait une activité modérée, a été chauffé pendant 30 minutes à la température de 80-C. Le produit, après chauffage, a montré une importante augmentation de son activité Les résultats sont rapportés dans le tableau ci-dessous : TABLEAU 3 AVANT CHAUFFAGE Inhibition APRES CHAUFFAGE Inhibition contrôle traité Ó contrôle traité 206+81 141t108 32 224+102 93+42 58 4. Etudes histooatholoaiues des tumeurs témoin et contrôle Prélevées, après administration à l'animal du lot (3) du produit IC 86 1773 dans les conditions décrites plus. haut. Chez les animaux témoins, les tumeurs sont plus grosses que chez les animaux traités. Elles présentent des surfaces nécrosées et le tissu conjonctif n'est composé que de fibroblastes orientés de façon à encapsuler la tumeur et la capsule est épaisse. Beaucoup de mitoses sont visibles dans la masse tumorale. Le carcinome est en effet connu comme présentant un caractère fortement malin. Chez les animaux traités, quelques tumeurs présentent des surfaces nécrosées massives infiltrées.de tissu inflammatoire marqué par la présence de granulocytes, macrophages, lymphocytes. Tautes les tumeurs sont totalement entourées d'un tissu granulomateux nouvellement formé qui a nettement remplacé la tumeur. En fait les capillaires sont visibles ; ils sont orientés perpendiculairement à la masse tumorale comme si le tissu granulomateux avait remplacé les surfaces tumorales après leur nécrose. Toutefois l'on observe encore des mitoses dans le tissu tumoral restant. Il résulte de ce qui précède que l'invention fournit donc un principe actif capable d'inhiber la prolifération ou la croissance tumorale. A ce titre, l'invention concerne toute préparation pharmaceutique utilisable en thérapeutique humaine ou vétérinaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable approprié au mode d'administration choisi, notamment par voie parentérale. Il appartiendra au clinicien de déterminer chaque fois, à la lumière de l'état d'avancement de la maladie tumorale à traiter, les doses efficaces qui devront être administrées au patient ou à l'animal, aux fins d'inhiber le processus tumoral en cours, par exemple en doses unitaires de 100 mg à 2.000 mg. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes, notamment celles consistant en des compositions et des facteurs inhibiteurs de la croissance tumorale susceptibles d'être obtenus dans des conditions semblables à partir de surnageants de cellules ayant en commun avec la moelle osseuse de contenir des cellules lymphoîdes, par exemple à partir de surnageants de cellules de rates. REVENDICATIONS 1. Matière inhibitrice de la prolifération tumorale in vivo, susceptible d'être obtenue à partir d'un surnageant de moelle osseuse, caractérisée - en ce quelle contient un facteur thermostable responsable de la susdite activité non spécifique d'espèce, distinct de la sérum-albumine, séparable par gel-filtration à partir de ce surnageant avec la sérum-albumine que celui-ci peut contenir, - en ce qu'elle est essentiellement constituée d'une ou de plusieurs substances protéiques, - en ce qu'elle présente un caractère essentiellement anionique, un ou plusieurs points isoélectriques dans la région 5-6,0, - en ce qu'elle est essentiellement dépourvue d'hexoses et de substances protéiques séparables par gel-filtration à partir d'un surnageant de moelle et ayant des poids moléculaires inférieurs à 60.000 et supérieurs à 68.000 et de substances protéiques ayant des points isoélectriques supérieurs à 6, en particulier des substances protéiques qui répondent à cette condition lorsque la détermination de ces points isoélectriques est effectuée par- des essais de focalisation ioélectrique effectuée sur cette matière, lorsque celle-ci contient d'autres substances protéiques. 2. Matière selon la revendication 1, caractérisée par l'absence d'activité inhibitrice de la prolifération tumorale in vitro, lorsque cette matière contient aussi de la sérum-albumine et des substances protéiques de poids moléculaires séparables par gel-filtration à partir d'un surnageant de moelle et contenues dans une plage de poids moléculaires d'environ 60.000 à environ 68.000. 3. Matière selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que la totalité des substances protéiques de cette matière est contenue dans' une plage de poids moléculaires apparents s'étendant d'environ 60.000 à environ 68.000. 4. Matière selon la revendication 1, caractérisée par un poids moléculaire apparent de l'ordre de 65.000. 5. Facteur inhibiteur de la prolifération tumorale in vivo, non spécifique d'espèce, susceptible d'être obtenu à partir d'un surnageant de moelle bosseuse, et d'être séparé de celui-ci avec la sérum-albumine contenue dans ce surnageant de moelle. 6. Facteur selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est séparable dudit surnageant de moelle avec son contenu en substances protéiques, dont les poids moléculaires sont contenus dans une plage d'environ 60.000 à environ 68.000. 7. Facteur selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, caractérisé en ce qu'il comporte un ou plusieurs peptides thermostables, présentant des points isoélectriques apparents compris entre 5 et 6,0, lorsque ceux-ci sont déterminés par des essais de focalisation électrique effectués avec ledit facteur sur gel comportant un gradient de pH, en présence de ladite sérum-albumine et, le cas échéant, des substances protéiques initialement contenues dans le surnageant de moelle dans les plages de poids moléculaires d'environ 69.000 à environ 68.000 et séparables par gel-filtration à partir d'un surnageant de moelle osseuse. 8. Facteur selon la revendication 7, caractérisé en ce que les susdits essais de focalisation font apparaître au moins une bande de migration, distincte de la bande de migration caractéristique de la sérum-albumine (point isoélectrique de l'ordre- de 4,9) et caractéristique du susdit facteur (point isoélectrique entre 5 et 6). 9. Facteur selon la revendication 8, caractérisé par trois bandes de migration distincts dans la région de points isoélectriques de 5 à 6. 10. Facteur selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce qu'il consiste en un peptide. 11. Facteur selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérise en ce qu'il peut également être séparé par gel-filtration, à partir de surnageants de cellules de rate. 12. Composition pharmaceutique ou vétérinaire, caractérisée par l'association d'une dose efficace de la matière inhibitrice de la prolifération tumorale in vivo selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 13. Composition pharmaceutique ou vétérinaire, caractérisée par l'association d'une dose efficace du facteur inhibiteur de la prolifération tumorale in vivo selon l'une quelconque des revendications 5 à 11, avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.