FR 2605496 A1 19880429 FR 8614918 A 19861027 FRACTIONS DU PLASMA SEMINAL FAVORABLE A LA CONSRRVATION OwS SPERMATOZOIDES D'OISEAUX DOMESTIOUES. LEUR PROCEDE D'OBTENTION. BILTEU DF CONSERVATION DES SPEREATOZOIDES LES CONTENANT ET PROCEDE DE CONSERVATION CORRESPONDANT La prése-nte invention concerne la conservation du pouvoir fécondant des spermAtozoïdes d'oiseaux domestiques, et, notamment de coq, pendant au moins 24 heures invitro. On sait que le sperme de coq, maintenu invttro a l'état pur et à la température ambiante, perd une part importante de sa fécondance en une heure, et la totalité, en quatre heures. I1 doit donc outre utilisé dans les 30 å 45 minutes qui suivent sa récolte. Or, il peut etre souhaitable de prolonger ce délai dans différentes situations - si l'on veut obtenir les taux de fécondation les plus élevés, il faut éviter d'inséminer les poules dans les 5 heures qui précèdent ou qui suivent l'oviposition. I1 est donc préférable d'effectuer la récolte du sperme pendant cette période, pour pouvoir se consacrer uniquement à sa mise en place en dehors de cette période, de manière a inséminer le plus possible de poules au moment le plus favorable. - Les reproducteurs miles et femelles peuvent loger à distance les uns des autres, soit dans le même estiment, soit dans des bâtiments différents, placés de quelques dizaines de mètres d plusieurs kilomètres les uns des autres. Si le délai d'utilisation du sperme est trop court, il y a, dans le meilleur des cas, perte de temps en allées et venues entre les batiments des mules et des femelles, rupture dans le rythme de travail, et, dans le pire des cas, impossibilité d'obtenir des taux de fécondation élevés. - Enfin, sur le plan scientifique, l'étude in vitro de la biologie du spermatozoïde est plus riche d'enseignement s'il reste fécondant, mobile et vivant, que s'il s'agit d'une cellule moribonde. Jusqu'à maintenant, la mise au point de la conservation de la fécondante des spermatozoïdes in vitro était entreprise essentiellement via la préparation de dilueurs, soit totalement synthétiques, soit additionnés de lait et de blanc d'oeuf. La methodologie se résume alors a une dilution du sperme (1/2 à 1/5), au refroidissement du mélange obtenu et à son son stockage en aérobiose à 2-4 C. Les résultats publies pouvaient conduire à l'optimisme, puisqu'après 24 heures de stockage du sperme, Lake P. E. et Ravie O., ZJ. Reprod. Fert., S, 143-155, 1979" déclarent obtenir 87Z d'oeufs fécondés, tandis que-Vishart G. J., "Br. Poult. Sci., 22, 445-450, 1981" fait état de 50 & 92% d'oeufs fécondés s'il y a aération du sperme pendant le stockage. Enfin, Van Wambeke F., tBr. Fouît. Sci., 25, 583587, 1984" a publié les résultats de fécondation les plus élevés de la littérature, soit 95, après 24 heures de conservation du sperme, qu'il soit utilisé à raison de 100, 200 ou 300 millions de spermatozoïdes par insémination, doses égales å celles habituellement recommandées pour l'insémination artificielle avec du sperme frais. L'objectif fixé parait être atteint. Cependant, la reprise au laboratoire de ces travaux montre que, dans la réalité, ces bons résultats supposent une méthode particulière de récolte du sperme, (caractérisée par les techniques de Lake P.E. "J. Agaric. Sci., 49, 120, 1957" et Van Vambeke "5ème European Poultry Conference, Exalta, 1230-1240")difficile à mettre en oeuvre chez les coqs de type chair, et à faible rendement, rendant de ce fait obligatoire l'élevage d'un effectif élevé de coqs. Les taux de fécondation obtenus passent éventuellement par le tri préalable des reproducteurs ayant les meilleures performances de fertilité et utilisés pendant la période d' & e la plus favorable à ces performances.Il en résulte que les données précitées de la littérature ne paraissent pas généralisables & l'ensemble des reproducteurs d'un élevage travaillant dans les conditions habituelles, D'ailleurs, ces différents procédés n'ont pas donné lieu à des applications industrielles durables d grande échelle. L'objectif qui a été fixé reste donc & atteindre, impliquant la recherche d'un milieu de conservation in vitro le plus approprié possible aux spermatozoïdes d'oiseaux domestiques, notamment de coqs. Comme on vient de l'exposer, d'un point de vue appliqué, l'existence d'un milieu de conservation permettant le maintien intégral du pouvoir fécondant des spermatozoïdes pendant plusieurs heures de stockage in vitro contribuerait fortement & la rationalisation du travail des éleveurs. Recherchant ainsi un milieu de conservation des spermatozoïdes permettant le maintien de leur fécondance ix vitro pour des conditions d'animaux et de collecte du sperme les plus proches possible de ce qui est réalisable chez les éleveurs, une étude a été effectuée sur le plasma séminal. Il paraît en effet assez bien établi que la présence de ce plasma, favorable & la fécondance des spermatozoïdes & l'état frais, est au contraire défavorable au maintien de cette fécondante in vitro. L' idée est donc venue de rechercher si ce plasma comportait un de cette situation défavorable. Il est apparu alors important de séparer le plasma séminal en fractions de différents poids moléculaires et d'incuber les spermatozoïdes en présence de ces fractions, afin de rechercher les molécules responsables des effets observés. Il a pu ainsi etre mis en évidence que les particules du plasma séminal de poids moléculaires inférieurs & 1000 daltons sont néfastes & la conservation in vitra des spermatozoïdes d'oiseaux domestiques, et que les particules du plasma séminal de poids moléculaires supérieurs à 50 000 daltons sont, au contraire, bénéfiques à la conservation de la fécondance des spermatozoïdes de volaille. Ces oiseaux domestiques sont notamment le Coq Gallus gallus et ceux appartenant aux autres espèces avicoles, notamment les Canards, la Pintade et le Dindon. Ainsi, les fractions de plasma séminal qui contiennent des molécules de poids moléculaires supérieurs a 1000 daltons et, de préférence, supérieurs à 50 000 daltons, constituent un premier objet de la présente invention, en tant qu'agents favorables au maintien du pouvoir fécondant des spermatozoïdes d'oiseaux domestiques conservés in vitro. Le terme "9molécule' englobe les complexes cromoléculaires, comme les lipoprotéines et les vésicules multienzymatiques. La présente invention porte également sur le procédé de préparation de l'une ou l'autre des fractions de plasma séminal telles que définies ci-dessus, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant d : - prélever le plasma séminal & partir du sperme complet par des centrifugations successives ; et - dialyser ledit plasma séminal contre de l'eau afin d'éliminer, dans le milieu de dialyse, les fractions qui contiennent les molécules de poids inférieurs à respectivement 1000 et 50 000 daltons. Conformément a un mode de réalisation particulier de ce procédé, on effectue la dialyse sur une durée de 24 heures environ, å une température de 4 C environ, le bain d'eau étant changé en cours de dialyse, l'osmolarité du plasma séminal dialysé, au bout de ces 24 heures, étant proche de celle de l'eau. La présente invention concerne également un milieu destiné & la conservation des spermatozoïdes d'oiseaux domestiques in vitro à une température de 2-5-C, sans perte du pouvoir fécondant de ces spermatozoïdes, caractérisé par le fait qu'il est constitué par le mélange - d'une fraction du plasma séminal de l'oiseau domestique considéré, telle que définie ci-dessus ; et - d'un dilueur de conservation des spermatozoïdes, modifié pour hêtre hypertonique par rapport au plasma séminal d'origine. En particulier, la proportion de la fraction de plasma séminal correspond, dans le mélange, à la quantité normale du plasma séminal du sperme complet, dont on a extrait les spermatozoïdes a conserver, et la proportion du dilueur hypertonique correspond au volume du sperme complet au moment de la collecte. En particulier, le mélange fraction de plasma séminal-dilueur modifié présente une osmolarité comprise entre 330 et 420 mosm, ce qui correspond a une osmolarité compatible avec la conservation de la fécondance des spermatozoïdes. En particulier, cette osmolarité est de l'ordre de 370 mosm. Le pH du milieu de conservation selon l'invention est avantageusement compris entre 6,8 et 7,4, et il est, notamment, de l'ordre de 7,2. Par ailleurs l'hypertonicité du dilueur est ajustée par exemple par addition d'acide F-trisChydroxy- methylZméthyl-2-amino éthane-sulfonique (TES > . Le dilueur est notamment le BPSE I, tel qu'il est décrit par Sexton T.J. dans zPoultry Science 56, 1443-1446, 1977". Ce milieu présente la formule suivante Constituant Poids Diphosphate de potassium, 3H20 12,70 Glutamate de sodium ' 8,67 Fructose Acétate de sodium, 3H2O 4,30 TES 1,95 Citrate de potassium 0,64 Xonophosphate de potassium 0,65 Chlorure de magnésium, 6H20 0,34 Dans le cas où l'on utilise ce dilueur, il est, selon la présente invention, modifié pour que sa concentration en TES soit respectivement de 30 g/l ou de 35 g/l suivant que le mélange ultérieur est réalisé avec la fraction de plasma séminal contenant les molécules de poids moléculaires supérieurs à respectivement 50 000 et 1000 daltons. La présente invention concerne également le milieu que l'on vient de décrire mélangé avec des spermatozoïdes vivants, préalablement séparés de leur plasma séminal homologue. La présente invention porte également sur le procédé de conservation correspondant, suivant lequel on stocke des spermatozoïdes vivants dans un mélange comprenant: - un volume de la fraction de plasma séminal telle que définie ci-dessus, un tel volume correspondant a celui du plasma séminal homologue préalablement élimine ; et - un volume de dilueur modifié comme cela a été indiqué ci-dessus, ce volume correspondant au volume du sperme complet initial, et que l'on conserve l'ensemble en atmosphère d'oxygène, c'est--dire sous aération, pendant au moins 24 heures. Les expériences qui ont été conduites montrent qu'en éliminant du plasma séminal, la fraction contenant les molécules de poids inférieurs & 1000, et mieux encore celle contenant les molécules de poids inférieurs a 50 000, on obtient finalement des résultats au moins égaux à ceux enregistrés avec l'insémination à l'aide de sperme pur frais. Pour illustrer la présente invention, on décrira ci-après un mode de réalisation préféré de la conservationdes spermatozoïdes selon la présente invention. COLLECTE DU SPERME : Les éjaculats de 48 coqs Cornish I99, tous adultes & és de 30 à 40 semaines, ont été collectés quotidiennement par massage dorso-abdominal, selon la méthode décrite par Burrows W.H. et Quint J.P., "Fouît. Sci., 1E, 19-24, 1936". On a constitué différents "pools" de sperme, chacun étant formé par le mélange, dans un meme tube de collecte, du sperme de 8 & 10 coqs. Pour chaque pool de sperme, la concentration en spermatozoïdes a été mesurée par absorption de la lumière d 530 nm à l'aide d'un photomesre. PREPARATION DU PLÀSxÂ SEXINÂL DIALYSE A partir d'un pool de sperme, du plasma séminal dialysé a été préparé par trois centrifugations à 20'C, les traitements successifs étant effectués sur les surnageants. La première des centrifugations est de 10 mn a 500 g. le surnageant est récupéré, puis recentrifugé 10 mn à 500 g; le surnageant résultant est à nouveau centrifugé, mais cette fois-ci une demi-heure à 1500 g. Les surnageants résultants de la troisième centrifugation constituent le plasma séminal à dialyser. Ce plasma séminal est alors dialysé 24 heures à 4 C contre de l'eau bi-distillée, afin d'éliminer la fraction contenant les molécules de faible poids moléculaire. Cette dialyse est effectuée dans des tubes de dialyse, préalablement soigneusement nettoyés de toute trace de métaux. Deux membranes de dialyse Au bout des 24 heures de dialyse, l'osmolarité du plasma séminal était pratiquement nulle. Celle-ci nécessitait un réajustement avec un dilueur hypertonique au plasma séminal afin d'assurer la survie des spermatozoïdes, c'est- & dire une pression osmotique du milieu de conservation comprise entre 330 et 420 mosm. PREPARATION DU DILUEUR HYPERTONIQUE Le BPSE I, qui a été défini ci-dessus, sert de dilueur de base. Pour augmenter son osmolarité sans altérer ses autres propriétés, le contenu de ce BPSE I en une substance non métabolisable par les spermatozoïdes, à savoir le TES, a été porté à 30 g/l ou 35 g/l selon que le dilueur devait autre mélangé ulterieurement avec du plasma séminal dialysé à 50 000 daltons ou & 1000 daltons. La pression osmotique du mélange plasma séminal dialysé-dilueur hypertonique résultant était de 370 mosm dans les deux cas, le pH étant proche de 7,2. XELANGE PLASMA SEXINAL DIALYSE-DILUEUR HYPERTONIQUE Ce mélange a été réalisé dans les proportions indiquées dans le préambule de la présente description; on constate & ce propos que les proportions respectives des deux solutions (plasma séminal dialysé dilueur hypertonique > dans le mélange final sont susceptibles de varier en fonction notamment de la concentration initiale du sperme en spermatozoïdes. Dans la présente expérience, le mélange était constitué par 1/3 de plasma séminal dialysé et de 2/3 de dilueur hypertonique. PROCEDE DE CONSERVATION DES SPERXATOZOIDES DANS LE MELANGE PLASMA SEXINAL DIALYSE-DILUEUR HYPERTONIQUE A partir d'un pool de sperme fraîchement collecté, les spermatozoïdes ont d'abord été séparés de leur plasma séminal, puis mis 9 conserver dans le mélange ci-dessus. Pour séparer les spermatozoïdes de leur plasma séminal homologue, le sperme a été centrifugé 10 mn & 500 g et 20-C. Le "surnageant" résultant a été éliminé et le "culot" contenant les spermatozoïdes remis avec précaution en suspension dans le mélange plasma séminal dialysé-dllueur. Le volume final correspondait au double du volume du sperme complet initial. Il se répartissait dans la présente expérience de la façon suivante : 1/4 de spermatozoïdes provenant du "culot" de centrifugation; 1/4 de plasma séminal dialysé ; 1/2 de dilueur hypertonique. La concentration en spermatozoïdes initiale du sperme complet était de 5,5 milliards/mi. Les spermatozoïdes ainsi préparés ont ensuite été conservés 24 heures & 4-C, sous une pression partielle d' 2 dans le mélange sperme+plasm séminal+dilueur d'environ 400 nmoles 02/ml s ans perte potable du pouvoir fécondant. TEST DE LA MéTHODE : PROTOCOLE EXPERIXENTAL ET TAUX DE FECONDATION Pour tester l'efficacité de la méthode, 300 poules chair nanifiées par le gène dw (Vedettes), toutes adultes âgées de 30 & 40 semaines, réparties en lots de 48, ont été inséminées avec du sperme provenant de coqs Cornish I99 i raison de 200 millions de spermatozoïdes inséminés par poule. Un des lots était inséminé avec du sperme fraîchement récolté. Les quatre autres lots étaient inséminés avec des spermatozoïdes centrifugés 10 mn à 500 g, puis conservés 24 heures å 4'C. Les spermatazoides étaient conservés, soit dans le sperme total complété de BPSE I, soit dans l'un des deux mélanges plasma séminal dialysé (1000 ou 50 000 daltons) + BPSE I modifié, décrits cidessus, soit uniquement dans du BPSE -I. Le volume final de chaque échantillon conservé correspondait au double de celui du sperme pur. Les poules ont été inséminées tous les 7 jours, pendant 7 semaines consécutives. Les taux de fécondation ont été mesurés sur les oeufs des jours 2 à 8 inclus, après chaque insémination, et ont porté au total sur environ 1000 oeufs par lot. Les taux de fécondation correspondent à la proportion d'oeufs fécondés, exprimés en Z des oeufs incubés. Ils ont été mesurés par mirage 7 jours après le début de l'incubation. RESELTÂTS Les résultats rapportés dans les Tableaux I et II montrent clairement que les spermatozoïdes conservés 24 h en présence de plasma séminal dialysé donnent des taux de fécondation (93,2 et 92% comparables & ceux obtenus avec le sperme pur fraîchement c.-.llecté (93,5%). Les différences entre les trois valeurs ne sont pas significatives au seuil de probabilité 5%, et les niveaux atteints sont normaux compte-tenu du type de coqs employés. Les taux de fécondation obtenus avec les mélanges plasma séminal dialysé-dilueur hypertonique sont, en revanche, significativement supérieurs a ceux obtenus avec les spermatozoïdes conservés en absence totale de plasma séminal Enfin, bien qu'il n'y ait pas de différence significative entre les résultats obtenus avec les deux systèmes de dialyse du plasma séminal, l'un séparant à 50 000 et l'autre 9 1000 daltons, les taux de fécondation légèrement, mais presque constamment, supérieurs du premier (Tableau Il > par rapport au second pourraient avoir une signification biologique. Tableau I Effets des fractions du plasma séminal contenant les molécules de PM > 1000 et > 50 000 sur le pouvoir fécondant de spermatozoïdes de coq conserves 24 h à 4-C dans du BPSE I Xoyenne des résultats de 7 semaines d'insémination. Proportion d'oeufs Traitement "frais" fécondes incubés (X) Sombre Conservé d'oeufs 24 h à 4-C Sperme pur 93,5% Sperme dilué 77,5% c 1/2 dans BPSE I Spermatozoïdes sans plasma séminal 89% b dilués dans BPSE I Spermatozoïdes + plasma séminal 1000) + 92% a BPSE I modifié Spermatozoïdes + plasma séminal (PX > 50 000) + 93,2% a BPSE I modifié Les lettres a, b, c indiquent les différences significatives au seuil de probabilité 5% (X2 de PEARSON) Tableau II Effets des fractions du plasma séminal contenant les molécules de PX > 1000 et > 50 000 sur le pouvoir fécondant de spermatozoïdes de coq conservés 24 h å 4*C dans du dilueur BPSE I (taux de fécondation observés par semaine d'insénination) Semaine d'insémination 1 2 3 4 5 a 7 Traitenent du sperme Sperme pur frais 91Z 92 92 92 95 97 96 C Sperme dilué 1/2 BPSE I 81 75 69 78 78 73 84 o H S Spermatozoïdes sans plasma 94 89 80 85 89 94 91 E séminal dilué dans BPSE I R v E Spermatozoïdes + plasma 92 92 91 87 91 94 96 séminal dialysé, FX > 1000 24 H A Spermatozoïdes + plasma séminal dialysé, 94 92,5 92,5 92 91,5 94 96 4-C PM > 50 000 REVEDICATtOS 1 - A titre d'agent favorable au maintien du pouvoir fécondant des spermatozoïdes d'oiseaux domestiques conservés in vitra, la fraction du plasma séminal de l'oiseau domestique considéré qui contient les molécules de poids moléculaires supérieurs & 1000 daltons. 2 - A titre d'agent favorable au maintien du pouvoir fécondant des spermatozoïdes d' oiseaux domestiques conservés in vitro, la fraction du plasma séminal de l'oiseau domestique considéré qui contient les molécules de poids moléculaires supérieurs a 50 000 daltons. 3 - Agent selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que l'oiseau domestique est le Coq Gallus gallus. 4 - Agent selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que l'oiseau domestique appartient à une espèce avicole autre que le coq, comme les Canards, la Pintade et le Dindon. 5 - Procédé de préparation des fractions de plasma séminal telles que définies aux revendications respectivement 1 et 2, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant a - prélever le plasma séminal à partir du sperme complet par des centrifugations successives - dialyser ledit plasma séminal contre de l'eau, afin d'éliminer, dans le milieu de dialyse, les fractions qui contiennent les molécules de poids moléculaires inférieurs à respectivement 1000 et 50 000 daltons. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'on effectue la dialyse sur une durée de 24 heures environ à une température de 4-C environ, le bain d'eau étant changé au cours de dialyse, I'osmolarité du plasma séminal dialysé, au bout de ces 24 heures, étant proche de celle de l'eau. 7 - Xi lieu destiné à la conservation des spermatozoïdes d'oiseaux domestiques in viro, à une température de 2-5-C, sans perte du pouvoir fécondant de ces spermatozoïdes, caractérisé par le fait qu'il est constitué par le mélange - d'une fraction du plasma séminal de l'oiseau domestique considéré, telle que définie à l'une des revendications 1 4 ; et - d'un dilueur de conservation des spermatozoïdes, modifié pour être hypertonique au plasma séminal d'origine. 8 - Milieu selon la revendication 7, caractérisé par le fait que la proportion de la fraction de plasma séminal correspond, dans le mélange, & la quantité normale du plasma séminal du sperme complet, dont on a extrait les spermatozoïdes d conserver, et que la proportion du dilueur hypertonique correspond au volume du sperme complet au moment de la collecte. 9 - Xilieu selon la revendication 7 ou 8, caractérisé par le fait que le mélange fraction de plasma séminal-dilueur modifié présente une osmolarité comprise entre 330 et 420 mosm. 10 - Milieu selon la revendication 9, caractérisé par le fait que l'osmolarité du mélange est de l'ordre de 370 mosm. 11 - Xilieu selon l'une des revendications 7 a 10, caractérisé par le fait que son pH est compris entre 6,8.et 7,4, et est, notamment, de l'ordre de 7,2. 12 - Xilieu selon l'une des revendications 7 a 11, caractérisé par le fait que l'hypertonicité du dilueur est ajustée par addition d'acide -trisChydroxymethylAméthyl-2- amino éthane sulfonique (TES). 13 - Milieu selon l'une des revendications 7 à 12, caractérisé par le fait que le dilueur est le BPSE I. 14 - Xilieu selon les revendications 12 et 13, prises simultanément, caractérisé par le fait que le dilueur BPSE I est modifié pour que sa concentration en TES soit respectivement de 30 g/l ou de 35 g/l, suivant que le mélange ultérieur est réalisé avec la fraction de plasma séminal contenant les molécules de poids moléculaires supérieurs à respectivement 50 000. et 1000 daltons. 15 - Xilieu selon l'une des revendications 7 a 14, mélangé avec des spermatozoïdes vivants, préalablement séparés de leur plasma séminal homologue. 16 - Procédé de conservation in vitro des spermatozoïdes d'oiseaux domestiques, caractérisé par le fait que l'on stocke les spermatozoïdes vivants dans un mélange comprenant - un volume de la fraction de plasma séminal telle que définie & l'une des revendications 1 à 4, ce volume correspondant à celui du plasma séminal homologue préalablement éliminé ; et - un volume du dilueur modifié comme indiqué à la revendication 7, ce volume correspondant au volume du sperme complet initial, et que l'on conserve l'ensemble en atmosphère d'oxygène, pendant au moins 24 heures.