FR 2618782 A1 19890203 FR 8710917 A 19870731 Le domaine technique de la présente invention est celui des sondes constituées par des séquences d'acides nucléiques, ADN mono-brin ou ARN, marquées. De telles sondes sont bien connues dans l'état de la technique et peuvent être obtenues par diverses voies, notamment par génie génétique ou par synthèse directe manuelle ou automatique. Ces séquences d'acides nucléiques ont la propriété de s'apparier et de former des hybrides avec les séquences complémentaires d'ADN, le cas échéant préalablement dénaturé, si ceux-ci étaient initialement bicaténaires. Cette dénaturation peut se faire après incubation dans un milieu de haute force ionique et à température élevée ou dans un milieu basique. Ces hybrides sont ensuite détectables. La détection des hybrides peut se faire par différentes méthodes. La sonde peut etre marquée par l'un des procédés connus pour le marquage des sondes d'acides nucléiques. Il peut s'agir d'un marquage radioactif, par exemple avec le phosphore 32, ou bien dans le cas d'une sonde froide d'un marquage non radioactif, par exemple enzymatique, comme cela est également connu. Dans certains cas, la sonde n'est pas marquée lors de son utilisation proprement dite, mais modifiée chimiquement pour pouvoir être repérée après l'hybridation, par exemple -avec la biotine. Plus précisément, la présente invention concerne des sondes d'acides nucléiques permettant de détecter les différents types de virus de papillomes humains par hybridation avec l'ADN du virus. I1 s'agit, notamment, des huit types de virus de papillomes humains (HPV) dont les totalités des séquences ADN sont à ce jour connues1 à savoir les types HPVla, HPV5, HPV6b, HPV8, HPVll, HPV16, HPV18 et HPV33. Un but de la présente invention est de proposer des sondes caractéristiques de l'ensemble des différents types de virus HPV notamment cités ci-dessus qui soient efficaces, c'est-à-dire des sondes présentant des séquences d'acides nucléiques les plus longues possibles et qui soient communes aux différents types de virus HPV. Un autre but de la présente invention est également de proposer des sondes spécifiques de chacun des différents types de virus HPV et qui soient, la' encore, les plus longues possibles pour assurer un appariement le plus stable possible. La présente invention a donc pour objet une sonde d'acides nucléiques utile pour détecter indifféremment les différents types de virus de papillomes humains, notamment HPVla, HPV5, HPV6b, HPV8, HPV11, HPV16, HPV18 et HPV33, caractérisée en ce qu'elle comporte l'oligomère X-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-X ou son complémentaire en interchangeant A et X d'une part, C et G d'autre part, dans le cas où l'ADN cible du virus était initialement bicaténaire et a été dénaturé avant d'être sondé, avec X = T ou U. A, T, C, G, LI représentent les nucléotides correspondant aux bases adénine, thymine, cytosine, guanine et uracile respectivement. La séquence T-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-T est la seule qui se retrouve en effet, notamment, dans l'ADN de chacun des huit types de virus HPV parmi des séquences d'au moins 10 bases de long. Cette séquence correspond aux séquences situées aux positions suivantes dans les différents types de virus pour HPVla : position 5302 pour HPV5 : position 1190 pour HPV6b : position 1076 pour HPV8 : position 1174 pour HPVl l : position 1076 pour HPV16 : position 1121 pour HPV18 : position 1167 pour HPV33 : position 1132 La présente invention a également pour objet une sonde d'acides nucléiques commune aux différents types de virus HPV, caractérisée en ce qu'elle comprend le mélange de six oligomères comportant chacun la séquence commune de douze nucléotides visée précédemment, prolongée en amont comme en aval par les nucléotides correspondant aux huit types de virus HPV.Ces prolongements sont constitués par les nucléotides s'appariant aux nucléotides entourant immédiatement ~ la séquence commune aux hult types de virus HP\' T-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-T. Parmi ces oligomères; quatre sont associés chacun à un type de virus différent, le cinquième est commun aux virus 6b et 11, un autre est commun aux virus 5 et 8. Par exemple, on peut prolonger la séquence commune de douze nucléotides de part et d'autre de l à 10 des nucléotides correspondants pour chaque type de virus. En prolongeant jusqu'à six ou sept nucléotides de part et d'autre de la séquence commune, on obtient les six oligomères suivants ou leurs complémentaires: pour HPV I a A-X-G-C-X-X-X-A-A-A-A-C-G-A-A-4(;-X-X-A-C-X-X-X pour HP\'6b A-G-C-C-C-X-A-A-A-A-C-G-A-A-A-C-X-A-X-X-X-A-G et HPV J 1 pour HPV8 C-A-A-A-.4-A-C-X-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-X-A-X-C-X-X-A et HPV5 pour HPV 16 A-G-G-X-X-C-X-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-X-A-X-X-X-G-G pour HPV 18 A-X-G-X-X-X-X-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-X-X-X-G-C-A-G pour HPV3 3 G-X-G-C-A-C-X-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-X-X-X-G-C-C-G Ces oligomères correspondent à des séquences cibles d'ADN des virus aux positions suivantes pour chaque type de virus HPV pour HPVla : position 5296 pour HPV5 : position 1183 pour HPV6b : position 107G pour HPV8 : position 1167 pour HPVl l : position 1070 pour HPV16 : position 1115 pour HPV18 : position 1161 pour HPV33 : position 1126 Un prolongement de quatre bases de chaque côté de la séquence commune ne fournit que des séquences donnant des températures de demi-hybridation de l'ordre de 50 à 52"C. En revanche, à partir de six bases, tant vers l'amont que vers l'aval, correspondant donc aux séquences exactes présentes dans les virus, on obtient des températures de demihybridation de l'ordre de 6G à 700C. Ainsi, pour la séquence cible de HPVla (en position 5296) la sonde a une température de demi-hybridation prévisible de 60"C, pour HPV5 (position 1183) T = 62 C pour HPV6b (position 1070) T = 64 C pour HPV8 (position 1168) T = 62 C pour HPVI I (position 107G) T = 64 C pour HPV 16 (position 1115) T = 640C pour HPV18 (position 1161) T = 620C pour HPV33 (position 1126) T = 7ODC Ces sondes oligonucléotidiques communes à tous les virus de papillomes humains connus permettent le diagnostic rapide des affections à base de virus de papillome. Un autre objet de la présente invention est également une série de huit sondes d'acides nucléiques chacune spécifique d'un type de virus de papillome humain par rapport aux autres types, à savoir les bligomères suivants ou leurs complémentaires pour HPVl a : l'oligomère C-C-X-C-A-G-G-C-G-A-G-A-A-G-C-G-C-G-G-A-C pour HPV5 : l'oligomère X-G-X-A-X-G-G-G-A-X-C-G-G-G-G-G-C-G-X.-X-X-A pour HPV6b : l'oligomère C-A-X-X-A-A-C-G-C-A-G-G-G-G-C-G-C-C-X-G-A-A pour HPV8 : l'oligomère A-C-A-C-C-G-C-C-G-C-C-A-A-G-A-C-C-C-C-C-A pour HPV11: l'oligomère G-G-C-G-X-G-X-C-G-G-C-G-C-C-G-C-C-X-A-G pour HPV16: I'oligomère C-A-G-A-A-C-C-G-G-A-C-A-G-A-G-C-C-C-A-X pour HPV 18 :1 'oligomère C-G-G-X-A-X-C-C-G-C-X-A-C-X-C-A-G-C-X-X-G pour HPV 33 :1 'oligomère C-G-X-C-C-X-C-C-G-G-X-X-A-C-X-G-X-A-G-A-C-A avec X = T ou U. On peut envisager d'utiliser les oligomères complémentaires lorsque l'ADN à sonder était initialement bicaténaire et a été dénaturé pour pouvoir s'hybrider. L'oligomère sélectif pour HPVla comprend 21 monomères, cette séquence correspond à la position 5325 de l'ADN du virus et présente une température de demi-hybridation de 72 C. L'oligomère sélectif pour HPV5 comprend 22 monomères, cette séquence correspond à la position 1801 de l'ADIK du virus et présente une température de demi-hybridation de 68"C. L'oligomère sélectif pour HPV6b comprend 22 monomères, cette séquence correspond à la position 4761 de 1'ADN du virus et présente une température de demi-hybridation de 70"C. L'oligomère sélectif pour HPV8 comprend 21 monomères, cette séquence correspond à la position 3344 de l'ADN du virus et présente une température de demi-hybridation de 72"C. L'oligomère sélectif pour HPI11 1 comprend 20 monomères, cette séquence correspond à la position 3416 de l'ADIN' du virus et présente une température de demi-hybridation de 72 C L'oligomère sélectif pour HPV16 comprend 20 monomères, cette séquence correspond à la position 695 de 1'ADN du virus et présente une température de demi-hybridation de 64 C. L'oligomère sélectif pour HPV18 comprend 21 monomères, cette séquence correspond à la position 3448 de l'ADN du virus et présente une température de demi-hybridation de 64"C. L'oligomère sélectif pour HPV33 comprend 22 monomères, cette séquence correspond à la position 4474 de L'ADOS du virus et présente une température de demi-hybridation de 68"C. La finalité de cette seconde série de sondes spécifiques de l'un ou l'autre des huits virus de papillomes humains est d'être utilisée comme éléments sélectifs pour des tests diagnostics d'infections par ces virus. La présente invention a également pour objet un procédé de détection et d'identification sélective des virus de papillomes humains HPVla, HPV5 HPV6b, HPV8,HPV11,HPV16,HPV18 et HPV33, caractérisé en ce qu on hybride une sonde conforme à la présente invention avec une séquence d'ADN des virus HPV complémentaire, le cas échéant préalablement dénaturé, si elle était initialement bicaténaire. D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumières de la description qui va suivre. Sur les figures annexées, la figure I représente un gel correspondant à l'hybridation sélective des sondes synthétiques HP\' aux ADN des virus HPV 1. fragments d'ADN radioactifs lambda EcoRi-Hindlll - standards de taille, 2. ADN du virus HPV6b, digéré par BamHI, 3. ADN du virus HPV 11, digéré par BamH1, 4. ADN du virus HPV16, digéré par BamHI, 5.ADN du virus HPV18, digéré par EcoR1, A. sonde spécifique de HPV6b, B. sonde spécifique de HPVl 1, C. sonde spécifique de HPV16, D. sonde spécifique de HPV18 la figure 2 représente un gel correspondant à l'hybridation de l'ADE génomique avec les sondes HPV: 1. lambda EcoRl-Hindllî - standards de taille radioactifs, 2. rien, 3. ADN génomique humain (10 pg) digéré par EcoRI, 4. rien, 5. ADN du virus HPV (6b, Il, 16 ou 18) hybridé avec sonde spécifique HPV (6b, 11, 16 ou 18) . la figure 3 représente un gel correspondant à l'hybridation des clones HPV aux sondes communes à tous les types de virus. EXEMPLE 1 Détermination de sondes oligonucléotidiques communes à tous les virus de papillomes humains connus En vue de la préparation d'une sonde permettant le diagnostic rapide des affections à base de virus de papillome, il a été procédé à la recherche des séquences les plus longues qui soient communes à tous les virus dont la séquence est aujourd'hui connue, à savoir à ce jour des séquences des virus suivants : HPVla, HPV5, HPV6b, HPV8, HPVll, HPV16, HPV18 et HPV33. Un programme FORTRAN a été développé spécifiquement en vue du travail considéré, les algorithmes usuels étant impropres à Ja manipulation de plusieurs séquences aussi étendues. Le programme explore chacune des séquences qui lui sont soumises au moyen de tous les blocs possibles extraits de la première d'entre elles, ces blocs prenant successivement toutes les valeurs entre 20 et 1G bases de long. Au cours de cette recherche, le programme annonce les occurrences des blocs intégralement conservés au travers de l'ensemble des séquences qui lui sont soumises. La plus longue séquence commune trouvée, à savoir le fragment de douze bases (T-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-T) est située aux positions suivantes dans les diverses séquences HPVla 5302 HPV5 1190 HPV6b 1076 HPV8 1174 HPVl1 1076 HPX 16 1121 HPV18 1167 HPV33 1132 Comme douze bases constituent un fragment trop court pour pouvoir servir aisément dans certaines conditions expérimentales, on a rallongé cette séquence vers l'amont comme vers l'aval. Un prolongement de quatre bases de chaque côté ne fournit que des séquences donnant des températures de demi-hybridation de l'ordre de 55-52 C. On a donc prolongé de six ou sept bases tant vers l'amont que vers l'aval? chaque fois par les séquences exactes présentes dans les virus pour donner ce qui suit Séquence cible Position Température HPV I a : ATGCTTTAAAACGAAAGTTACTTT 5296 60 C HPV5 : CAAAAACTAAAACGAAAGTATCTTA 1183 62 C HPV6b: AGGACCTAAAACGAAAGTATTTAG 1070 64 C HPV8 : CAAAAACTAAAACGAAAGTATCTTA 1167 620C HPVl l : AGGACCTAAAACGAAAGTATTTAG 1070 64 C HPV16 6 AGGTTCTAAAACGAAAGTATTTGG 1115 64 C HPV18 : ATGTTTTAAAACGAAAGTTTGCAG -1161 62 C HPV33 : GTGCACTAAAACGAAAGTTTGCCG 1126 70 C Certaines de ces sondes peuvent être quelque peu raccourcies et ( elle spécifique du HPV8 peut encore éventuellement être rallongée pour obt'nir des températures de demi-dénaturation quasi identiques. Il est à noter que les séquences obtenues pour HPV6b et HPVl I sont identiques, de même que pour HPV5 et HPV8. Le mélange d'oligo nucléotides ne comporte donc que six molécules différentes. Le mélange de ces six oligonucléotides permet d'obtenir, pout tout système comportant de l'ADN d'un des virus de papillomes humains un signal d'hybridation bien caractéristiaue. EXEMPLE 2 Détermination de sondes spécifiques de chacun des types de HPV connus Le travail a consisté en la recherche de sondes oligonucléoti diques de longueur avoisinant vingt bases, et choisies de telle sorte qu'elles soient chacune spécifiques de l'un ou l'autre des huit virus de papillomes humains dont les séquences complètes sont aujourd'hui connues. Leur finalité est d'être utilisées comme éléments sélectifs pour des tests diagnostics d'infections par ces virus. A cette fin a été développé un logiciel spécifique, comportant des programmes FORTRAN, et destiné à la comparaison de plusieurs séquences de grande taille, en vue de la détection des régions les moins conservées. Ce programme fonctionne comme un filtre progressif, marquant à chacune de ses exécutions successives les régions d'une séquence qui se retrouvent exactement dans chacune des autres séquences considérées. Après chaque passage, la longueur de l'homologie recherchée est décrémentée d'une unité, entre la valeur initiale de 25 et une valeur finale de 8. Chacune des versions de la séquence de référence, marquée lors de chacun des passages successifs avec chacune des séquences cibles, est stockée séparément. Un second programme détermine alors entre les diverses séquences marquées, les régions non marquées, et ceci pour chacun des stades successifs du filtrage. A la sortie, on obtient une liste des régions potentiellement utilisables. Le choix parmi ces régions s opère par un examen de l'environnement de la région lors des passages précédents du filtre, de telle sorte que ltoligomère choisi présente un minimum d'homologies avec les séquences d'ADN des autres virus. On est arrivé ainsi, par exemple, aux oligomères suivants, chacun dénommé en fonction du virus pour lequel il est sélectif Virus Oligomère Longueur Position Température bases HPVla CCTCAGGCGAGAAGCGCGGAC 21 5325 72 C HPV5 TGTATGGGATCGGGGGCGTTTA 22 18û1 68 C HPV6b CATTAACGCAGGGGCGCCTGAA 22 4761 70"C HPV8 AÇACCGCCGCCAAGACCCCCA 21 3344 72 C HPV11 GGCGTGTCGGCGCCGCCTAG 20 3416 72 C HPV16 CAG4ACCGGACAGAGCCCAT 20 695 64 C HPVl8 CGGTATCCGCTACTCAGCTTG 21 3448 64 C HPV33 CGTCCTCCGGTTACTGTAGACA 22 4474 68 C Chacune des sondes proposées ci-dessus a ensuite été comparée à chacune des séquences HPV par l'algorithme de Sellers et Goad, qui cote les "mismatches"l et les "gaps"2. Les résultats de ce traitement montrent que les sondes choisies n'ont jamais plus de 75 % d'homologies avec les séquences non homologues. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau I ci-après. Dans chaque case sont repris - le nombre de bases appariables - le nombre de mismatches - le nombre de gaps 1 mismatch : appariement de bases impropre à la formation de liens hydrogènes; cet appariement ne contribue donc pas à la stabilisation de la région hybridée et aura par contre fréquemment un effet déstabilisant. 2 gap : lors de la tentative d'appariement de deux régions d'acides nucléiques, il peut arriver qu'afin de maximiser la stabilité globale de la région hybridée, il soit nécessaire de prévoir dans une des séquences l'existence d'une ou plusieurs bases non appariées ; ce genre de "saut" détermine généralement une contribution négative à la stabilité globale de l'hybride. TABLEAU I Séquence : HPVla HPV5 HPV6b HPV8 HPV11 HPV16 HPV18 HPV33 cible de Sonde de HPVla 21/0/0 -de 8 15/1/2 10/0/1 13/1/2 9/0/1 -de 8 13/1/2 HPV5 -de 8 22/0/0 -de 8 14/1/1 -de 8 12/3/0 -de 8 10/0/1 HPV6b 11/210 15/2/1 22/0/0 12/3/0 -de 8 10/0/1 -de 8 -de 8 HPV8 9/0/1 17/4/0 9/1/0 21/0/0 12/1/1 9/1/0 -de 8 8/0/0 HPV11 -de 8 l l/2/0 12/1/0 l l/1/0 22/0/0 11/2/0 10/1/0 10/1/Q HPV16 13/1/2 12/2/0 15/3/1 11/2/0 -de 8 20/0/0 15/5/0 12/1/1 HPV18 10/0/1 13/1/2 12/2/0 10/0/1 13/3/0 1313/O 21/0/0 10/1/0 HPV33 IO/1/G 11/0/2 11/2/0 12/3/0 10/1/0 -de 8 11/2/G 22/0/0 Dans cet ensemble, la sonde HPV8 apparaît comme légèrement moins satisfaisante que les autres. Elle pourrait être relativement moins sélective contre les séquences 6b et Il (respectivement 17 similitudes et seulement 4 mismatch, et 16 similitudes avec 4 mismatch). Les autres situations garantissent toutes des hybridations hautement spécifiques, sans risque de signaux erronés ou de bruits de fond gênants. EXEMPLE 3 Hybridation des sondes HPV avec 1'ADN des différents virus Les génomes de l'HPV6b, 11, 16 et 18 ont été reçus clonés dans pBR322. Quand on digère les clones 6b, Il, 16 par BamHI et le clone 18 par EcoRI, on sépare le génome du virus (environ 8 kb) du pBR322. a) Amplification des clones La présence des génomes d'HPV dans les clones a été confirmée par restriction. Les clones ont ensuite été amplifiés et l'ADN a été purifié sur gradient de chlorure de césium. b) Séparation de l'ADN des virus HPV sur gel d'agarose 2 ug de chaque ADN ont été digérés soit par BamHI -pour les clones 6b, 11 et 16, soit par EcoRI pour le clone 18. Les 2 ug de chaque ADN ont été répartis en adjacence et parallèlement sur quatre gels d'agarose 0,8 %(500 ng ADN/clone/gel) à proximité d'un marqueur de taille marqué radioactîvement (lambda HindIII-EcoRI). Après 3 heures de migration à 80 Volts dans du TBEIX (Tris 90 mM, EDTA 2,5 mM, acide borique 90 mM, pH 8), les gels ont été dénaturés (NaOH 0,5 M, NaCI 0,5 M) pendant 30 minutes, rincés à l'eau puis neutralisés (NaCI 1,5 M, Tris HCI pH 8, 0,5 M) pendant 30 minutes à température ambiante.Les gels ont ensuite été déposés sur du papier Whatman 3 MM, recouverts de saranwrap et mis à sécher sous vide pendant 1 heure à température ambiante et 1 heure à 60 C. c) Marquage au 32p des sondes HPV spécifiques Les oligomères synthétiques caractéristiques des HPV6b, 11, 16 et 18 ont été synthétisés. Taille Température HPV6b : CATTAACGCAGGGGCGCCTGAA 22 mer 7G C HPX11 : GGCGTGTCGGCGCCGCCTAG 20 mer 72 C HPV16 : CAGAACCCGACAGAGCCCAT 2G mer 64 C HPV18 : CGGTATCCGCTACTCAGCTT 20 mer 60 C Ces séquences sont complémentaires à la fibre non codante des HPV. Les quatre oligomères ont été marqués au 32P par kination selon le protocole suivant : 1 pg de chaque oligomère a été mélangé, dans un volume final de 30 ul, à 30 uCi de gamma 32P ATP (3 000 Ci/mmole), 5 unités T4 polynucléotide kinase, 67- mM Tris HCl pH 8, 10 mM MgC12, 10 mM dithiothréitol et incubé 45 minutes à 37 C. Les oligomères marqués ont été séparés des nucléotides libres par chromatographie sur Sephadex G50. L'activité spécifique obtenue s'élève à 65.106 cpm/ g d'oligomère engagé dans la réaction. d) Hybridation sur gel avec les sondes marquées Les gels d'agarose ont été décollés du papier Whatman en les plongeant quelques minutes dans de l'eau. Chaque gel a été hybridé avec l'un des quatre oligomères marqués radioactivement, dans un volume de 5 ml de mélange d'hybridation comprenant 2.106 cpm/ml d'oligomères radioactifs, C,1 % SDS, 100 g/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé 10 minutes à 100"C, 5 x SSPE (NaCI 0,9 M, NaH2P04, EDTA pH 8, 5 mM). L'incubation s'effectue dans des sacs en plastique scellés et dans un bain agitant à 60 C pendant 14 heures. e) Lavage et exposition Les gels ont été lavés deux fois 15 minutes, puis 1 heure à température ambiante, 10 minutes à 60 C et enfin I heure à température ambiante dans du 6XSSC (0,9 M NaCI, 90mM citrate trisodique, pH 7). Après avoir été déposés sur une feuille de papier Whatman et recouverts de saranwrap, les gels ont été mis à exposer entre deux écrans renforçateurs à -70 C pendant 14 heures (Film Kodak X-OmatS). f) Résultats Quatre duplicata d'un gel contenant l'ADN des clones HPV6b, Il, 16 et 18 ont été chacun hybridés à l'un des quatre oligomères. On voit que sur le gel A seul l'HP\'6b est reconnu par la sonde 6b ; sur le gel B, seul l'Hp\'l I est reconnu par la sonde 11 ; sur le gel C, seul l'HPV16 est reconnu par la sonde 16 et enfin sur le gel D, seul l'HPVl8 est reconnu par la sonde 18. Il en résulte que chaque sonde reconnaît exclusivement l'HPV correspondant à l'exclusion des autres types d'HPV (figure 1). Hybridation des sondes HPV sur I'ADN génomique humain Par ailleurs, on a déposé sur 4 gels, 4 x 10 tjg d'ADN génomique isolé de lymphocytes, digérés par EcoRI, et 200 ng d'ADN d'un des 4 clones d'HPV. Chaque gel a été hybridé à la sonde correspondant au type d'HPV présent sur le gel (témoin positif) et lavé comme décrit précédemment. Après 70 heures d'exposition, on ne décèle absolument aucune trace d'hybridation aspécifique des quatre types de sondes testées sur I'ADN génomique humain (figure 2). EXEMPLE 4 Hybridation des clones HPV aux sondes communes à tous les types d'HPV connus a) Préparation des gels Les clones des HPV 6b, 11, 16 et 18 ont été digérés par BamHI ou EcoRI. 600 ng de chaque clone ont été répartis parallèlement sur quatre gels et en adjacence aux autres clones, et à proximité du marqueur de taille radioactif, le lambda HindIII-EcoRI (150 ng ADN/clone/ gel). Après 3 heures de migration à 8D Volts, les gels ont été dénaturés, neutralisés et séchés sous vide. b) Kination des sondes communes (marquage au 32p) On a déterminé, par voie informatique, la séquence la plus longue qui est commune à tous les types de virus dont la séquence est connue. Cette séquence commune est un fragment de 12 bases. Ce fragment étant trop court, les sondes ont été prolongées de 6 bases (7 bases pour la sonde 8) en amont, et de 6 bases en aval de ce fragment.Les séquences sont les suivantes Sonde Taille Température HpV la ATGCTTTAss\RACG.2s.R.4GTTACTTT 24 65 C HPV65 AGGACCTAAAACGAAAGTATTTAG 24 64 C HPVII HPV8 CAAAAACTAAAACGA.RAGTATCTTA 25 6 20C HPV5 HPV 16 AGGTTCTAAAACGAAAGTATTTGG 24 64 C HPV18 ATGTTTTAAAACCAAAGTTTGCAG 24 620C HPV33 GTGCPiCTAAAACGAAAGTTTGCCG 24 7 00C Ces sondes sont complémentaires à la fibre codante. Comme les sondes 6b et 11 sont parfaitement identiques, seule une des deux a été synthétisées (sonde 6b/1 1). Ces sondes ont été marquées au 32P par kination comme décrit précédemment. c) Hybridation des gels Chaque gel a été hybridé avec un lot de sonde, dans un volume de 5 mi de mélange d'hybridation contenant 0,1 % SDS, 100 pg/ml ADN de sperme de saumon dénaturé, 5xSSPE dans un sac en plastique scellé, à 60 C pendant 15 heures. Le mélange d'hybridation A contenait 106 cpm/ml de chacune des sondes (la, 6b/11, 8/5, 16, 18 et 33). Le mélange B contenait 106 cpm/ml de chacune des sondes à l'exception de la sonde 6b/11. Le mélange C contenait 106 cpm:ml de chacune des sondes à I'exception de la sonde 16. Le mélange D contenait 106 cpm/ml de chacune des sondes à l'exception de la sonde 18. d) Lavage et exposition Les quatre gels ont été lavés dans du 6XSSC une heure à température ambiante, 10 minutes à 60"C, puis de nouveau une heure à température ambiante. Les gels ont été exposés entre deux écrans renforçateurs pendant deux heures à -80 C. e) Résultats (figure 3) Hybridation des clones HPV aux sondes communes à tous les types de virus. 1. lambda Hindlll-EcoRI, 2. HPV6b BamH1, 3. HPVI 1 BamHl, 4. HPV16 BamHI, 5. HPV18 EcoR1 A. Hybridation à l'ensemble des sondes (la, 6b/ll; 16, 18, 33), B. Hybridation à l'ensemble des sondes à l'exception de la sonde 6b/l 1, C. Hybridation à l'ensemble des sondes à l'exception de la sonde 16, D. Hybridation à l'ensemble des sondes à l'exception de la sonde 18. Ces résultats montrent clairement que les sondes communes s'hybrident avec l'ensemble des clones en expérience et que les conditions d'expérimentation permettent même de différencier les clones par la spécificité des extrémités d'extension de la séquence commune. REVENDICATIONS 1) Sonde d'acide nucléique utile pour détecter indifféremment les différents types de virus de papillomes humains, notamment HPVla, HPV5, HPV6b, HPV8, HPVl 1, HPV16, HPV18 et HPV33, comportant une séquence d'acides nucléiques marquée, caractérisée en ce qu'elle comprend l'oligomère de douze nucléotides X-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-X, avec X = T ou U, et/ou son complémentaire en interchangeant A et X d'une part, C et G d'autre part, dans le cas-où 1'ARN:: cible du virus était initialement bicaténaire, puis a été dénaturé pour être sonde 2) Sonde d'acide nucléique commune aux différents types de virus HPV selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comporte le mélange de six oligomères, lesquels comportent tous la séquence commune de douze nucléotides de la revendication 1, prolongée par les nucléotides correspondants pour chaque type de virus. 3) Sonde d'acide nucléique selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence commune de douze nucléotides est prolongée de part et d'autre par 1 à 10 nucléotide(s) correspondant(s) pour chacun des huit types de virus. 4) Sonde selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend le mélange des six oligomères suivants ou leurs complémentaires pour HPV la A-X-G-C-X-X-X-A A-A-A-C-G-A-A-AG-X-X-A-C-X-X-X pour HPV6b A-G-GR-C-C-X-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-X-A-X-X-X-A-G et HPVll pour HPV8 C-A-A-A-A-A-C-X-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-X-A-X-C-X-X-A et HPV5 pour HPV 16 A-G-G-X-X-C-X-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-X-A-X-X-X-G-G pour HPV 18 A-X-G-X-X-X-X-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-X-X-X-G-C-A-G pour HPV33 G-X-G-C-A-C-X-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-X-X-X-G-C-C-G avec X = T ou U. 5) Sonde d'acide nucléique spécifique pour la détection du type de virus de papillome humain HPVla par rapport aux types de virus de papillomes humains HPV5, HPV6b, HPV8, HPVll, HPV16, HPV18 et HPV33, caractérisée en ce quelle comporte l'oligomère: C-C-X-C-A-G-G-C-G-A-G-A-A-G-C-G-C-G-G-A-C ou son complémentaire avec X = T ou U. 6) Sonde d'acide nucléique spécifique pour la détection du type de virus de papillome humain HPV6b par rapport aux types de virus de papillomes humains HPVla, HPV5, HPV8, HPVl I, HPV16, HPV18 et HPV33, caractérisée en ce qu'elle comporte ltoligomère: C-A-X-X-A-A-C-G-C-A-G-G-G-G-C-G-C-C-X-G-A-Aou son complémentaire avec X = T ou U. 7) Sonde d'acide nucléique spécifique pour la détection du type de virus de papillome humain HPV8 par rapport aux types de virus de papillomes humains HPVla, HPV5, HPV6b, HPVll, HPV16, HPV18 et HPV33, caractérisée en ce qu'elle comporte l'oligomère A-C-A-C-C-G-C-C-G-C-C-A-A-G-A-C-C-C-C-C-A ou son complementaire avec X = T ou U. 8) Sonde d'acide nucléique spécifique pour la détection du type de virus de papillome humain HPV11 par rapport aux types de virus de papillomes humains HPVla, HPV5, HPV6b, HPV8, HPV16, HPV18 et HPV33, caractérisée en ce qu'elle comporte l'oligomère G-G-C-G-X-G-X-C-G-G-C-G-C-C-G-C-C-X-A-G ou son complémentaire avec X = T ou U. 9) Sonde d'acide nucléique spécifique pour la détection du type de virus de papillome humain HPV16 par rapport aux types de virus de papillomes humains HPVla, HPV5, HPV6b, HPV8, HPVll, HPV18 et HPV33, caractérisée en ce qu'elle comporte I'oligomère C-A-G-A-A-C-C-G-G-A-C-A-G-A-G-C-C-C-A-X ou son complémentaire avec X = T ou U. 10) Sonde d'acide nucléique spécifique pour la détection du type de virus de papillome humain HPV18 par rapport aux types de virus de papillomes humains HPVla, HPV5, HPV6b, HPV8, HPVll, HPV16 et HPV33, caractérisée en ce qu'elle comporte l'olîgomère C-G-G-X-A-X-C-C-G-C-X-A-C-X'-C-A-G-C-X-XG ou son complémentaire avec X = T ou U. 11) Sonde d'acide nucléique spécifiqué pour la détection du type de virus de papillome humain HPV33 par rapport aux types de virus de papillomes humains HPVla, HPV5, HPV6b, HPV8, HPVll, HPV16 et HPV18, caractérisée en ce qu'elle comporte l'oligomère: C-G-X-C-C-X-C-C-G-G-X-X-A-C-X-G-X-A-G-A-X-A ou son complémentaire avec X = T ou U. 12) Sonde d'acide nucléique spécifique pour la détection du type de virus de papillome humain HPN15 par rapport aux types de virus de papillomes humains HPVla, HPV6b, HPV8, HPVII, HPV16, HPVI8 et HPV33, caractérisée en ce qu'elle comporte I'oligomère X-G-X-A-X-G-G-G-A-X-C-G-G-G-G-G-C-G-X-X-X-A ou son complémentaire avec X = T ou U. 13) Sonde d'acide nucléique selon I'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est marquée par l'un des procédés connus pour le marquage des sondes ADN ou ARi, choisi notamment parmi 32 les marquages radioactifs tels que P- et le-s marquages enzymatiques tels qu'avec la biotine. 14) Procédé de détection de virus de papillomes humains des types HPVîa, HPV5, HPV6b, HPV8, HPVll, HPV16, HPV18 et HPV33, à l'aide d'une sonde selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'on hybride ladite sonde à une séquence d'ADN desdits virus HPV, le cas échéant préalablement dénaturé s'il était initialement bicaténaire. 15) Application des sondes selon l'une des revendications précédentes pour la détection, le diagnostic et l'épidémiologie du virus HPV.