FR 2621325 A1 19890407 FR 8713611 A 19871002 Procédé perfectionné de préparation de L-carnitine. L'invention concerne un procédé perfectionné pour la préparation de la carnitine, c'est-à-dire de l'acide triméthylamino-4 hydroxy-3 butyrique, et en particulier de la L-carnitine, par voie biochimique. La carnitine est principalement employée pour des applications biologiques, notamment pharmacologiques, cosmétiques et alimentaires, en particulier comme stimulant de la sécrétion gastrique et pancréatique, ou comme antihyperlipo protéinique.Comme les méthodes chimiques de sa préparation conduisent à des mélanges racémiques, alors que seul le stéréoisomère L est biologiquement actif, c'est surtout le procédé biochimique de préparation qui est intéressant, parce qu'il fournit l'isomérie L. Il est donc important de disposer d'un procédé de préparation permettant l'obtention économique de ce composé. C'est l'avantage intéressant qu'apporte le procédé suivant l'invention ; il permet de produire, par voie biochimique, la L-carnitine avec bons rendements, pratiquement sans contamination par microorganismes. Un procédé connu de préparation de la L-carnitine consiste à réduire la déhydrocarnitine au moyen du nicotinamide adénine dinucléotide réduit, NADH, en présence de l'enzyme carnitine déshydrogénase (CDH) ; le NAD+ qui en résulte est réduit à son tour à l'état de NADH par un réducteur approprié, par exemple glucose, alcool, aldéhyde, dithionate de métal alcalin ou un formiate, en présence d'une déshydrogénase cor-e~- -Idante. Un tel procédé est notamment décrit dans I. et français publié sous le Nu 2 398 046. En particulier la préparation de la L-carnitine est effec tuée par l'action du nicotinamide adénine dinucléotide réduit, NADH, sur la déhydrocarnitine, et réduction du NAD formé, au moyen du groupe formique avec de la formiate déshydrogénase FDH comme catalyseur. Le schéma de synthèse est alors (L-carnitine) CDH = carnitine déshydrogénase La CDH utilisée provient en général d'un extrait de culture bactérienne, par exemple de Pseudomona putida. Elle est précipitée au sulfate d'ammonium a 250 g par litre d'extrait brut (55% de la saturation). Cependant la technique antérieure se prétait mal à des applications industrielles, surtout à cause de très fortes quantités d'enzymes qu'elle exigeait par mole de L-carnitine à produire, et des productivités faibles par unité de capacité des réacteurs, par heure. L'utilisation de formiate comme réducteur du NAD , tentante industriellement, a conduit jusqu'à présent à des rendements très bas, comme on peut le voir dans l'exemple 5 du brevet cité plus haut. La présente invention résulte de la constatation que le procédé biochimique susindiqué peut être réalisé avec des quantités d 'enzymes considérablement réduites, ramenées à des proportions industriellement acceptables, si le milieu réactionnel contient des sels dissous, dont la concentration dépasse un certain minimum. La présence d'une telle force ionique exerce un effet sta bilisateur sur le système enzymatique présent, évitant sa contamination et destruction au cours de la réduction de la déhydrocarnitine. Ainsi, le procédé suivant l'invention est-il caractérisé le le fait que le milieu aqueux, dans lequel a lieu la au cours ?biâconversion réaction (1), présente/une force ionique d'au moins 0,5 M et de préférence 0,6 à 3M, les forces ioniques de 0,8 à 2,5 M étant particulièrement favorables ; dans la technique antérieure citée, elles ne dépassaient pas 0,3 M. Dans la forme préférée de l'invention, où une solution de déhydrocarnitine est versée progressivement dans une solution des enzymes requises, et que - par conséquent - le volume du milieu réactionnel varie du début à la fin de 1' opération, la force ionique, variant en même temps, doit atteindre les limites sus indiquées au moins à la fin de la réaction. Quant au début, il peut n'y avoir, dans la solution des enzymes, que 0,1 à 0,4 M de sels ionisables. Malgré l'effet bénéfique, sur la stabilité des composants du milieu réactionnel, qu'exercent les électrolytes, il est préférable que la concentration de ceux-ci ne déprisse pas certaines limites, notamment la valeur d'environ 3M. La force ionique adéquate peut etre obtenue par la dissolution dans les liquides du milieu réactionnel de différents sels d'acides et bases organiques ou inorganiques. Le choix en est conditionné par le pH du milieu, qui doit être compris entre 6 et 8 et, de préférence, entre 6,8 et 7,8. A titre d'exemples non limitatifs de sels utilisables, on peut citer les chlorures, sulfates et phosphates de métaux alcalins, d'- rium ou d'amines, ou bien des sels de tels cations avec efférents acides organiques, comme formiates, tartrates, alkyl-sulfonates, aryl-sulfonates, phtalates, citrates, maléates, malonates ou autres. L'introduction de l'électrolyte dans le milieu réaction nel peut avoir lieu de différentes manières : au départ, dans la solution des enzymes ; dans la solution de dXhydro- carnitine que l'on verse progressivement dans la précédente; directement dans le milieu réactionnel, séparement de la solution de déhydrocarnitine. Deux de ces iodes ou les trois à la fois peuvent étre pratiqués conjointement. Comme il est commode d'employer la déhydrocarnitine sous la forme d'un sel, notamment de chlorhydrate, la réalisation de la force ionique appropriée peut s'opérer par l'introduction d'une solution de base, dans le milieu réactionnel, simultanément avec celle de la solution de déhydrocarnitine,ce qui conne lieu à la formation d'un sel, chlorure par exemple. Il est & noter a ce propos que la concentration en ions dans le milieu réactionnel dépend naturellement de celle du chlorhydrateou autre sel de déhydrocarnitine dans la solution de cette dernière. Ainsi peut-on agir sur la force ionique par l'ajustement-de cette concentration. Le résultat remarquable du réglage adéquat de la force ionique, suivant l'invention, est d'abord la possibilité de diminuer considérablement la proportion d'enzymes ; ainsi, au lieu de 3200 à 8700 unités de carnitine déshydrogénase (CDH) utilisée par mole de dehydrocarnxtine traitée, dans les exemples du brevet français cité plus haut, il suffit de 200 à 1000 unités, et le plus souvent de 400 a 900 U, donc environ 5 a 10 fois moins, ce qui constitue un progrès technique-très important. En outre, grâce à la stabilité des enzymes assurée par la force ionique, on peut prolonger de beaucoup le temps de la reaction et arriver ainsi à des rendements beaucoup plus élevés que ne le permettrait la technique antérieure. La production horaire, par unité de volume de réacteur, est ainsi très fortement accrue. Alors qu'il n'était guère possible de laisser la réaction se poursuivre plus de 40 heures, la présente invention permet de dépasser largement 48 heures et atteindre par exemple une centaine d'heures. On peut en général travailler durant 45 à 80 heures. Un autre résultat intéressant est que les enzymes employées conservent encore la majeure partie de leur activité initiale, après une préparation de L-carnitine ; elles peuvent ainsi être réutilisées pour une nouvelle opération. De préférence, la température ne dépasse pas 3O0C , elle peut varier entre 10" et 3O0C. Les enzymes, employées dans le procédé de l'invention, sont bien connues dans l'art, il n'y a donc pas lieu de décrire ici leur préparation. On notera seulement que la carnitine déshydrogénase (CDH) peut etre obtenue à partir de l extrait des cultures bactériennes de Pseudomona des groupes fluorescens, seruginosa et surtout putida (collection de l'institut Pasteur nO CIP 52191). La formiate déshydrogénase (FDH) peut etre obtenue à partir de divers micro-organismes, de la façon connue, et en particulier à partir des levures des genres Candida, Kloeckera, Pichia, Torulopsis etc. et surtout à partir de Candida bodiini. Etant donné la fragilité des solutions aqueuses de déhydrocarnitine (DHC) aux températures supérieures à 100C, il ntest pas recommandable de mettre d'emblée la totalité de DHC dans le réacteur contenant une solution d'enzyme CDH. Le mode opératoire préféré consiste à conserver la solution de DRC dans un réservoir à part, à température suffi sament basse, par exemple' entre O et 4iC, et n'en introduire progressivement, dans le réacteur, qu'un certain courant compatible avec la vitesse de réaction, de façon à ce que la DHC soit pratiquement.convertie en L-carnitine au fur et à mesure de son arrivée dans le réacteur. Cela conduit à la forme préférée du procédé de l'invention suivante. Dans un réacteur, muni de moyens d'agitation et de réglage de la température, on introduit un volume déterminé d'une solution de NADH et des deux enzymes, CDR et FDH, convenablement tamponnée à un pH voisin de 7. On y ajoute également, selon l'invention, un sel de manière à ce que la force ionique de la solution d'enzymes soit d'au moins 0,2 M. A cette solution maintenue entre 10 et 30 OC, en particulier à 200C, on ajoute progressivement, sous agitation, une solution aqueuse de déhydrocarnitine, venant d'un réservoir spécial où cette solution de DRC est stockée à basse température.Connaissant, au moins approximativement, la vitesse de la réaction (2) DRC + NADH L-carnitine + NAD on règle le débit de la solution de telle manière que la DRC soit, au moins en majeure partie, convertie au fur et à mesure de son arrivée dans la solution De préférence, la DRC étant sous la forme de son chlorhydrate DHC.HCl, soit on fait couler simultanément, dans le réacteur, un débit de solution basique, juste pour neutraliserl'acidité de la DRC introduite ; la solution basique peut etre par exemple de NaOH, KOH, CH3COONa etc. et, plus particulièrement de l'ammoniaque qui donne du NR4Cl bien favorable à la force ionique du milieu. La concentration en DHC de la solution aqueuse,utilisée, peut varier entre les larges limites, maiselle est le plus souvent de l'ordre de 0,2 à 2 M ; une des incidences de ce facteur est expliquée plus haut au sujet du réglage de la force ionique. Lorsque la totalité de DRC a été introduite dans le réacteur, on détermine la teneur du milieu en la L-carnitine formée ; on procéde ensuite à la séparation et la purification de celle-ci selon la technique connue. L'invention est illutrée par les exemples non limitatifs qui suivent. EXEMPLE 1 Dans un réacteur de 250 ml de capacité on a placé 50 ml d'une solution aqueuse renfermant les composants suivants 40 U d'enzyme carnitine déshydrogénase CDR présentant une activité spécifique de 55U/my provenant du Pseudomona putida 2mM de NAD+ ; 40 U de formiate déshydrogénase, FDH, provenant de la levure Candida bodiini (EC 1.2.1.2. ; ven due par BOEHRINGER MANNHEIM) 50mM de phosphates HNa2P04/KH2P04 (pH 7,5) 150mM de formiate d'ammonium HCOONH4 6mg de chloramphénicol Dans cette solution de départ on a fait couler, sous agitation, à raison de 1,2 ml/h, une solution aqueuse 0,8 M de chlorhydrate de DRC et 0,8 M d'acide formique provenant d'un réservoir dans lequel cette solution était stockée à 40C. La température dans le réacteur était réglée à 300C. Simultanément avec l'introduction de la solution de DHC, on ajustait le pH du milieu réactionnel à la valeur de 7, par l'injection d'un solution 2N de NH4OH Après 70 heures, le volume de solution dans le réacteur est de 150 ml et sa concentration en L-carnitine 428 mM. Le bilan de l'opération se présente donc comme suit 0,0672 mole de DRC mis en oeuvre, 0,0642 " de L-carnitine formée (10,3g) soit rendement de 96 X Ce résultat est obtenu avec force ionique au départ 0,20M I' Il à la fin 0,96M nombre d'unités CDR par mole de DRC 595 EXEMPLE 2 Cherchant à limiter l'augmentation de volume au cours de la bioconversion, on a mis en oeuvre des réactifs en solutions plus concentrées en déhydrocarnitine, acide formique et ammoniaque. D'autre part, on a réduit la concentration en NAD+. Ainsi a-t-on chargé dans le réacteur 50 ml de solution contenant HNa2PO4/KH2PO4 50 mM pH : 7,5 NAD + 0,2 mM HCOONH4 150mM 6 mg chloramphénicol 40 U de CDR sommairement purifiée comme décrit ci-après 25U de FDH BOEHRINGER-tiANNHEIM provenant de la Candida bodiini . La CDH, extraite de P. Putida, avait été précipitée au sulfate d'ammonium (55 X de la saturation), centrifugée et le culot redissous dans le tampon phosphate 50mM pH : 7,5 ; la solution obtenue dialysée pendant 16 h contre ce meme tampon. Le réacteur était alimenté avec une solution maintenue à 40C, contenant la déhydrocarnitine et l'acide formique à la concentration, l'un et l'autre, de 1,6 M. Le débit était de 0,6 ml/h. La température du réacteur maintenue à 300C et le pH 7,5 par addition contrôlée d'ammoniaque 8N. Après 48 heures, on atteint un volume final de 90 ml et une concentration en L-Carnitine de 500 mM, soit un rendement de 98 x. La force ionique au début était de 0,20 La force ionique à la fin était de 1,13 Unités CDH/mole DRC ,, 863 EXEMPLE 3 La synthèse de L-carnitine a été effectuée avec, au départ, 1 litre de solution , dans les conditions initiales suivantes sa2HPO4/KH22o4 50 mM pH : 7,5 RCO2NR4 150 mM NAD+ 0,6 mM 120 mg de chloramphénicol CDR 800 U sommairement purifiée comme dans l'exemple 2 FDH 500 U soit 750 mg du lyophilisat commercialisé par Boehringer-Mannheim. Le réacteur était alimenté par la meme solution 0,8 M que dans l'exemple 1, avec un débit de 0,4 ml/min. Le pH était maintenu à 7,5, par un système régulateur adapté au réacteur, avec de l'ammoniaque 2 N ; la température était fixée à 300C. Une agitation mécanique assurait l'homogénéisation de l'ensemble. Après 67 h on a atteint un volume de 3.2 1 et une concentration en L-carnitine de 390 mM soit un rendement de 97 %. Dans cet exemple on a travaillé avec une force ionique initiale de 0,20 une force ionique finale de ........... 0,86 un rapport unités CDH/moles DRC 622 Le dosage de la CDH présente dans le réacteur donne 704 U soit 88 X d'activité résiduelle. Pour la FDH le dosage donne 384 U soit 80 X d'activité résiduelle. Le NAD+ a été intégralement transformé en NADH par voie enzymatique, puis dosé spectrophotométriquement à 340 mm. On obtient 0,2 mM ce qui , compte tenue de la dilution, correspond à 100 X d'activité. EXEMPLE 4 En partant d'un litre de -solution,on a effectué la synthèse de la L-carnitine avec les conditions initiales suivantes tampon phosphate 50 mM pH 7,5 HCO2NH4 0,5 M Lu NAD 0, 4 mM CDH 820 U purifiée comme dans l'exemple 2 FDH 503 U extraite d'une culture de Pichia Pastoris, précipitée au sulfate d'ammonium (50 X de la saturation), centrifugée et le cu lot redissous dans du tampon phosphate 50 mM pH 7,5 , la solution obtenue dialysée 16 h con tre ce même tampon. Le réacteur était alimenté par la même solution de DRC que dans l'exemple 2, avec un débit de 12 ml/h. Après 49 h on atteint un volume de 1,75 litres et une concentration en L-carnitine de 526 mM, soit un rendement de 98 %. Le dosage des activités résiduelles en CDH et FDH a donné respectivement 459 U et 111 U. Au cours de cette préparation la force ionique du milieu réactionnel était au départ 0,505 à la fin- 1,363 et le rapport CDH/mol DRC = 872 unités/mol La production ressort à 1,72 g de L-carnitine par heure, par litre de volume liquide final. La force ionique , imposée par les sels (formiate, phosphate, chlorure d'ammonium) s'est révelée suffisante pour retarder toute contamination bactérienne et permettre le travail sans antibactériens tels que le chloramphénicol. EXEMPLE 5 Dans le but d'atteindre une concentration finale en L-carnitine plus élevée, un réacteur a été initialement chargé de 50 ml de solution tampon phosphate 50 mM pH 7,5 NAD 0,4 mM HCO2NH4 0,5 M CDR : 80 U purifiée comme à l'exemple 2 FDH : 50 U purifiée comme à l'exemple 4 Le réacteur était alimenté par une solution aqueuse de déhydrocarnitine DRC 3,2 M, mélangée à de l'acide formique 3,2 M, avec un débit de 0,55 ml/h, le pH dans le réacteur étant maintenu à 7,5 au moyen d'ammoniaque. Après 47 h on atteint un volume final de 82 ml et une concentration en L-carnitine de 880 mM soit un rendement de 87 x. Les activités en CDR et FDH étaient respectivement de 21 U et 10 U. Les forces ioniques étaient dans cet essai : au départ 0,505 M, à la fin 2,3 M. Rapport unités CDH/moles DRC = 967 et la production 3 g/h par litre de volume final ; on peut constater que cette productivité augmentée a été obtenue au prix d'une légère baisse du rendement. Comme dans l'exemple 4 l'absence d'antibactérien est justifiée par la force ionique encore plus élevée du milieu, ce qui retarde toute contamination bactérienne. EXEMPLE 6 On opère de la meme façon que dans l'exemple 3, mais la solution de mélange de DRC + acide formique n'est que 0,1 M. La force ionique du milieu passe de 0,20 M de début à 0,16 M après 67 heures de réaction, car la dilution compense largement l'ajout de sels en cours de la bioconversion. Le rendement en L-carnitine n'est plus que de 60%, et les activités résiduelles en enzymes sont nulles du fait d' une contamination du milieu. La production est de 0,07 g/h, par litre de volume final. EXEMPLE 7 La réaction est mise en route comme dans l'exemple 1, mais avec une concentration initiale de formiate de 3,0 M au lieu de 0,15 M. La solution de DRC ne contient alors pas de HCOOH. La force ionique de 3,05 M au départ passe à 3,45 M à la fin. Le rendement est de 40%. Aucune contamination ne s' est produite, mais l'activité de la CDR baisse à 15% de sa valeur initiale. La production est de 1,03 g/h x 1 de volume final. R6caritulation des exemples. Dans le tableau ci-après on a reporté les principaux résultats des exemples qui précèdent. Les abréviations suivantes sont adoptées F.i.i ..... force ionique initiale, en moles par litre F.i.f " Il " finale,en M. CDH/DHC.... nombre d'unités CDH em ployées par mole de DHC. Rdt. X rendement en L-carnitine sur la DHC consommée. Prod. ... g de L-carnitine obtenue par heure, par litre de solu tion finale. Exemple n F.i.i F.i.f CDH/DHC Rdt.% Prod. 1 0,20 0,96 595 96 0,98 2 0,20 1,13 868 98 1,67 3 0,20 0,86 622 97 0,93 4 0,50 1,36 872 98 1,72 5 0,50 2,30 967 87 3,0 6 0,20 0,16 4975 60 0,07 7 3,s5 3,45 595 40 1,03 Les exemples 1 à 5 représentent visiblement des cas optimaux, alors que les exemples 6 et 7 montrent une chute du rendement lorsque la force ionique est trop faible (ex.6) ou trop forte (ex.7). D'autre part, l'exemple 5 indique une certaine limite à la vitesse de l'opération : une production assez forte (3g/l.h.) est obtenue au prix d'une baisse de rendement (87 X). Revendications 1. Procédé de préparation de la L-carnitine par réduction de la déhydrocarnitine au moyen de nicotinamide adénine dinucléotide (NADH), en présence de carnitine déshydrogénase (CDH), le NAD+ formé étant réduit par un formiate sous l'effet d'une formiate déshydrogénase (FDH), ca- ractérisé en ce que la solution aqueuse, constituant le milieu réactionnel, présente,au cours de bioconversion, une force ionique d'au moins 0.5 M. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la force ionique du milieu réactionnel est de 0,6 à 3 M, au moins à la fin de l'opération. 3. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel une solution aqueuse de déhydrocarnitine est versée progressivement dans une solution des enzymes, caractérisé en ce que le milieu réactionnel présente une force ionique de 0,1 à 0,4 M au départ et 0,8 à 2,5 M à la fin de l'opération. 4. Procédé suivant une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la force ionique est formée principalement par du formiate d'ammonium. 5. Procédé suivant une des revendications 1 à 4, dans lequel la déhydrocarnitine est prise sous la forme de chlorhydrate, le milieu réactionnel étant neutralisé avec de l'ammoniaque, caractérisé en ce qu'une solution d'acide formique est versé dans ce milieu en même temps que la solution de déhydrocarnitine. 6. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu réactionnel contient 200 à 1000 unités d'enzyme CDR par mole de déhydrocarnitine employée au total. 7. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution de déhydrocarnitine a une concentration de 0,2 à 2 M. 8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que cette solution est versée dans la solution des enzymes avec une vitesse telle que la déhydrocarnitine soit convertie en L-carnitine au fur et à mesure de son arrivée dans la solution enzymatique.