FR 2608160 A1 19880617 FR 8617507 A 19861215 La présente invention concerne de nouveaux dérivés peptidiques ayant une activité antiagrégante, leur procédé de préparation et leurs applications en thérapeutique et comme agents de diagnostic. De façon plus précise, elle concerne des analogues pentidiques d'une séquerce du fibrinogène utilisables notamment comma antagonistes du fibrinogène vis à vis des plaquettes sanguines. On saint qu'au cours de l'hémostase les plaquettes sanguines adhèrent au sous-endothélium du vaisseau lésé. secrètent leur contenu granulaire après stimulation et agrègent les unes aux autres pour former un thrombus plaquettaire. L agrégation dépend des contacts qui s'établissent entre membranes de plaquettes adjacentes. Cette réaction est nécessaire pour l'arret d'un saignement. Elle a cependant de nombreuses déviations pathologiques, notamment dans les cas de thromboses veineuses ou artérielles, au cours du développement d une plaque d'athérome, ou de la formation de microthrombi qui peuvent obstruer la microcirculation périphérique ou cérébrale.Le contrôle et la régulation de l'agrégation plaquettaire sont donc un objectif majeur dans la prévention de la thrombose et de l'athérosclérose et de nombreuses études sont consacrées à la recherche et au développement de molécules aux propriétés antiagrégantes. Dans ce phénomène. le fibrinogène a un rôle important. Ainsi dans le plasma de malades atteints d afibrinogénémie congénitale. l'agrégation plaquettaire est fortement diminuée ou absente et ce défaut est corrigé par l'injection de fibrinogène. De meme en 1 absence de fibrinogène. des plaquettes lavées n'agrégent pas à 1'ADP ou à l'épinéphrine. La présence de fibrinogène est donc une nécessité pour le dévelop pement normal d'un thrombus plaquettaire. La participation du fibrinogène à l'agrégation est due à l'in- duction d'un récepteur spécifique pour cette protéine sur la membrane de la plaquette activée.Tous les stimuli physiologiques de la plaquette induisent une classe unique de récepteur et l'interaction du fibri nogène avec ce récepteur régule l'agrégation plaquettaire. I1 existe donc un mécanisme de 1 agrégation plaquettaire. commun à tous les inducteurs, qui dépend de i interaction entre le fibrogéne et son récepteur. L'importance physiologique de cette voie de l'agréga- tion plaquettaire dépendante du fibrinogène est attestée par l'étude des thrombasthénies de Glanzmann dont es plaquettes ne fixent pas le fibrinogène et n'agrègent pas en réponse à tous les stimuli physiologiques de la cellule. En résumé, le récepteur du fibrinogène n'est pas exprimé sur la plaquette circulante. il est induit des que la cellule est stimulée. Cette induction peut être dépendante ou indépendante de la réaction de sécrétion. Tous les stimul expriment le meme récepteur et l'interaction entre le fibrinogène et le récepteur conduit directement à l'agrégation. La dissociation du fibrinogène lié à la plaquette a pour conséquence la désagrégation des plaquettes. Dars ce contexte il est clair que si l'inte- raction entre le fibrinogène et son récepteur plaquettaire pouvait être régulée. ceci constituerait un moyen pour contrôler l'agrégation in vitre et in vivo. La présente invention vise précisément à fournir de nouveaux agents qui permettent d'inhiber, de réguler ou de mesurer sélectivement la voie de l'agrégation dépendante du fibrinogène. Des séquences peptidiques issues de la molécule de fibrinogène ont déjà été identifiées comme inhibant la fixation de cette protéine sur les plaquettes et bloquant ainsi leur agrégation. Ainsi E. Plow et coll. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 8057. 1985) ont décrit l'activité de la séquence Arg-Gly Asp-Ser (RGDS)* présente dans la chaine alpha du fibrinogéne. La présente invention a pour objet des analogues peptidiques de l'extrémité C-terminale de la chaine alpha du fibrinogène qui présentent un effet inhibiteur de la liaison fibrinogène-plaquette et de l'agrégation plaquettaire. Ces dérivés peptidiques répondent à la formule générale suivante X1 ~ X2 - Gly - Asp - X3 - X4 (I) dans laquelle xl représente l'hydrogène. un résidu L-Arg. D-Arg ou Cys ou un groupe N-protecteur X2 représente un résidu L-Arg ou D-Arg X3 représente un résidu L-Trp.D-Trp.L-Leu.D -Leu,L-Ile,D-Ile,L-Phe,D-Phe ou un enchainement de 2 ou 3 de ces résidus X4 représente un groupe -OH.-NH2. -OR avec R1 représentant un radical alkyle en C1 à C4 NHR2 avec R2 représentant un radical alkyle en C1 à C4 ou un résidu Cys. Dans le cas où X1 = X4 = Cys le dérivé peptidique peut être cyclisé par un pont disulfure en un * La signification des symboles et abréviations utilisées est donnée en annexe. composé de formule Les groupes N-protecteurs physiologiquement acceptables sont notamment les groupes protecteurs de l'attaque en N-terminal des enzymes exopeptidases. Comme exemples de tels groupes on peut citer les groupes acyles tels que les groupes t-butyloxycarbonyle (Boc), tert-amyl-oxycarbonyle (+Aoc) . benzyloxycarbonyle, benzoyle. acétyle. formyle propanoyle. butanoyle, phénylacétyle, phenylpropanoyle, cyclo pentylcarbonyle. La présente invention englobe également les équivalents des dérivés peptidiques de formule I dans lesquels chaque liaison peptidique (-CO-NH-) entre deux résidus d'acide aminé de la formule générale I est remplacée par les structures suivantes - CO-N(CH3)- ; -CO-O- ; -CH2-NH- ; -CS-NH - CO-CH2 ; CH2-S- ; -CHOH-CH2- ; -HN-CO- ; - CH=CH- ; - CH2-CH2-. ou dans lesquels le squelette peptidique présente un ou plusieurs groupes intercalés tels que des groupes -CH2-. -NH-. -O-. Un dérivé peptidique préféré est un dérivé de formule H - Arg - Gly - Asp - Trp - OH La présente invention a également pour objet - une composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif un dérivé peptidique de formule I - un agent de diagnostic comprenant un dérivé de peptidique de formule I Les dérivés peptidiques de formule I peuvent être préparés de manière classique par synthèse peptidique en phase liquide ou solide par couplages successifs des différents résidus d'acides aminés à incorporer (de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale en phase liquide ou de l'extrémité C-terminale vers l'extrémité N-terminale en phase solide) et dont les extrémités N-terminales et les chaines latérales réactives sont préalablement bloquées par des groupements tels que ceux mentionnés ci-dessous 1) Extrémité N-terminale protégée par : Boc Spoc Fmoc 2) Groupement bloquant Résidu la chaine latérale Arginyle tosyle Asparagyle H,xanthyle Cystéyle acétamidométhyle(Acm) ' 4-méthylbenzyle (Meb) 4-méthoxybenzyle(Mob). S-ben zyle Isoleucyle H Leucyle H Phénylalanyle H Propyle H On peut utiliser différentes méthodes de couplage 1. Couplage des résidus par un carbodiimide (ex : DCC. EDC) avec ou sans catalyse (ex : HOBT) ou autre agent couplant (ex : EEDQ) 2. Utilisation des acides aminés sous forme d'anhydrides symétriques préformés 3. Utilisation des acides aminés sous forme d'esters activés (ex : p-nitrophénylester, HOBT ester) et couplage par l'intermédiaire de DCC. En synthèse en phase solide (SPPS) le tableau I ci-dessous mentionne les différents types de résine utilisable ainsi que les protections et méthodes adéquates pour les différentes étapes. Tableau I Système SPPS Liaison protection réactif de protection réactif de utilisé peptide-resine en alpha déprotection chaine latérale clivage Classique Benzyl ester Boc TFA HCl Benzyl HF, HBr Stable (longue chaîne Pam Boc TFA. HCl Benzyl HF, HBr - Benzyl ester Bpoc TFA dilué Benzyl HF - Benzyl ester Bpoc TFA dilué t-Butyl HF Labile Ether résine Bpoc TFA dilué t-Butyl TFA Orthogonal Ether résine Fmoc Pipéridine t-Butyl TFA Synthèse de Ether résine Fmoc Piperidine Benzyl TFA segment t-Butyl résine Fmoc Piperidine Benzyl TFA Nydrazide résine Fmoc Piperidine - Benzyl TFA Assemblement Benzyl ester Fmoc Pipéridine Benzyl HF de segments Peptides amides MBHA, BHA Boc TFA, Hcl Benzyl HF Peptides alcools Benzyl ester Boc TFA, HCl Benzyl LiBH4 En synthèse en phase solide le 1er acide aminé (extrémité C-terminale) à fixer sur la résine peut être soit acquis commercialement déjà attaché au support soit fixé par l'intermédiaire de sel de césium (méthode de Gisin), d'un sel de tétraméthylammonium méthode de Loffet) ou d'un carbodiimide. L'exemple suivant illustre la préparation des dérivés peptidiques de formule I Exemple Synthèse du peptide H-Arg-Gly-Asp-Trp-OH (ou R G D W) Ce peptide a été synthétisé en phase solide à partir d'une résine de type PAM (4-(oxyméthyl)-phénylacétamidométhyl) présubstituée Boc-Trp(CHO)-PAMrésine dont la substitution est de 0,34 mmol Trp/g. Les acides aminés protégés utilisés et leur milieu de solubilisation ont été les suivants Dérivés Solvants Boc-Asp (O Bzl) DMC Boc-Gly DMC Boc-Arg (Tos) DMF Chaque couplage a été réalisé en 2 heures par le dicyclohexylcarbodiimide (DCC) catalysé par l'hydroxy benzotriazole (OHBT) et suivi par une acétylation de 30 minutes par l'anhydride acétique. En cours de synthèse les déprotections par l'acide trifluoroacétique (TFA) et les couplages ont été contrôlés par un test de Kaiser. Le clivage final a été réalisé par HF (10 ml HF/g) en présence d'éthanedithiol (1 ml/10 ml HF) pour protéger le tryptophane pendant 1 heure à O-C. Après lavage à l'éther, le peptide a été extrait par de l'a- cide acétique 45Z puis 10 Cependant le groupement formyl (-CHO) utilisé comme protecteur du Trp pendant la synthèse est résistant à l'acide fluorhydrique (HF?. Pour l élimi- ner un 2ème traitement du peptide est nécessaire A cet effet on traite le peptide RGDW (For) par 75 ml d'hydroxylamine 0,03 M (H2N-OH,HCl) basifiée à pH 9 par de l'ammoniaque pendant plusieurs heures, en suivant par spectre d'absorption optique la disparition du groupement formyl à 300 mn et l'apparition du Tryptophane libre à 280 mn. Après filtration sur Millex SR-0,5 p le peptide obtenu a été purifié sur colonne de Sephadex G 10 éluée par de l acide acétique à 25 puis lyophilisé 2 fois. L'analyse d'acides aminés et le spectre d'absorption du RGDW montrent, ainsi que les chromatographies en couche mince et l'HPLC, un produit pur au point de vue peptidique et organique, mais révélant la présence d'une grande quantité de sel. Ceci s'explique par le traitement préalable de déprotection du Tryptophane par H2N-OH HCl en présence de NH40H qui entraine la formation de chlorure d ammonium non lyophilisable. Les chlorures ont donc du être retenus par échange d anion sur une colonne AG 1 -X2 (forme acétate) et le peptide élué par de l'acide acétique à 0,1% (pH 3,5). L'acétate d'ammonium obtenu est lyophilisable. Controle de Dureté 1 . Chromatooraphie sur couche mince de silice avec détection par - ninhydrine (NH2) - TDM (NH) - réactif d'Ehrlich (paradiméthylaminobenzaldéhyde) (spécifique du Trp) Solvants de migration Rf. Butanol-1/Acide Acétique/Eau 0,1 4 1 1 Méthanol/chloroforme/ammoniaque 25 0,42 60 40 20 2.HPLC sur colonne analytique Spherisorb OD5.2 5 Eluant : gradient d'Acétonitrile (TFA 0.1Z) dans H20 (TFA 0.1 Détection : Densité optique à 205-215 mn (liaison peptidique) et à 270-290 mn (Trp) T Rétention RGDW : 15 mn soit 48% d'acétonitrile (TFA 0,1 3. Analvse d'acides aminés Après hydrolyse à 110 C pendant 27 heures par HCl/Acide propionique (50/50) en présence de mercaptoéthanol (0, 1%). Equivalent molaire Trp ND Asp 1 Cly 0,92 Arg 0.95 On donnera ci-après des résultats des études pharmacologiques mettant en évidence les propriétés des dérivés peptidiques de formule I 1. Inhibition de la liaison plaquette-fibrinogène Préparation des plaquettes Les plaquettes sont isolées à partir de 60 ml de sang humain prélevé sur un tampon anticoagulant, l'ACD, à raison d 1 volume d'ACD pour 6 volumes de sang. L'ACD a la composition suivante Citrate trisodique 5 H20 5,95 g Acide citrique 3,41 g Dextrose 5 g H20 qsp 250 ml Le sang est ensuite centrifugé 20 mn à 1000 t/mn (centrifugeuse JOUAN E 96) à température ambiante. Le PRP (plasma riche en plaquettes) est décanté et additionné de PGE 0,1 1.10-6M puis centrifugé 15 mn à 2000 t/mn. Les plaquettes obtenues dans le culot sont alors reprises par 1 ml de tampon Tyrode-albumine pH 7,2 préparé selon la composition suivante Tampon Tyrode (solution mère) : NaCl 1,3 M KC-l 0, 026 M NaHC03 0. 12 M Tampon Tyrode-albumine solution mère 1/10 M D-glucose 0,0055 M albumine 2% HCl 1M qsp pH 7,2 Les plaquettes sont lavées sur une colonne de Sépharose CL 2B par du tampon tyrode-albumine pH 7,2 puis les plaquettes recueillies sont diluées à la concentration de 2.108 pl./ml. Les essais sont réalisés sur 4.107 plaquettes en présence de CaCl2 (0,5 mM), de 125I-fibrinogène (0,1.10 M) et de différentes concentrations de peptide, et la stimulation des plaquettes est provoquée par de l'ADP (5.10-6M). Après 15 mn d'incubation et dépôt sur une solution de saccharose à 15Z le complexe 1251-fibrinogène-plaquette est isolé par centrifugation à 12000 t/mn pendant 2 mn. Les résultats sont donnés sous forme de CI50 dans le tableau Il. Ce tableau donne également la séquence du peptide. 2. Inhibition de l'agrégation plaquettaire L'effet des peptides synthétiques sur l'agrégation plaquettaire a été étudié sur des plaquettes isolées comme précédemment pour l'étude de la liaison au fibrinogène. La stimulation des plaquettes est également obtenue par l'ADP 5.10-6M et l'essai réalisé en présence de fibrinogène 1.i.îD M et de CaCl2 0,5.10-6M. Les résultats sont donnés dans le tableau II et mettent en évidence une activité inhibitrice sur l'agrégation plaquettaire des peptides de formule I. Tableau II Inhibition IC50 ( M) Peptide Nomenclature Liaison plaquettaire Agrégation Fibrinogène Arg - Gly - Asp - Trp RGDW 3,6 10 Les dérivés peptidiques de formule I peuvent être utilisés notamment pour le traitement et la prévention des thromboses, en particulier dans les états préthrombotiques pour bloquer l'agrégation plaquettaire. Ils peuvent également exercer un effet inhibiteur sur - l'adhésion des plaquettes sanguines aux cellules endothéliales des parois vasculaires ou du sous endothélium. - l'athérogénèse - le développement de métastases - la réponse inflammatoire Les compositions thérapeutiques selon l'in- vention peuvent etre administrées à l'homme ou aux animaux par voie orale ou parentérale. Elles peuvent être sous la forme de préparation solides, semi-solides ou liquides. Comme exemples, on peut citer les comprimés, les gélules, les solutions ou les suspensions injectables. Dans ces compositions le principe actif est généralement mélangé avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables habituels bien connus de l'homme de l'art. Les compositions thérapeutiques peuvent contenir notamment de 1 à 60Z en poids de principe actif. La quantité de principe actif administrée dépend évidemment du patient qui est traité, de la voie d'administration et de la sévérité de la maladie. Elle est généralement de 1 à 500 mg. ANNEXE Abréviations usuelles de la chimie des peptides 6HA : benzylhydrylamine (résine) Boc : tert-butyloxycarbonyle Bpoc : 2-(4-biphénylyl)propyl(-2)oxycarbonyle Bzl : benzyle Clz : 2-chlorobenzyloxycarbonyle DCC : dicyclohexylcarbodiimide DCM : dichlorométhane DMF : diméthylformamide EDC : N-ethyl-N'-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide EEDQ : N-ethyloxycarbonyl-2-ethyloxy-1 2- dihydroquinoline Fmoc : 9-fluorénylméthyloxycarbonyle HOBT : l-hydroxybenzotriazole MBHA : 4-méthylbenzhydrylamine (résine) TDM : N,N,N',N',tétraméthyl-4,4'-diaminodiphé- nylméthane TFA : acide trifluoroacétique Tos : tosyle Xan : xanthyle Svmboles des acides aminés A Ala alanine C Cys cystéine D Asp acide aspartique E Glu acide glutamique F Phe phénylalanine G Gly glycine H His histidine I Ile isoleucine K Lys lysine L Leu leucine M Met méthionine N Asn asparagine P Pro proline Q Glu2 glutamine R Arg arginine S Ser serine T Thr thréonine V Val valine W Trp tryptophane Y Tyr Tyrosine REVENDICATIONS 1. Dérivés peptidiques de formule X1 - X2 - Gly - Asp - X3 - X4 (I) dans laquelle X1 représente l'hydrogène, un résidu L-Arg, D-Arg ou Cys ou un groupe N-protecteur X2 représente un résidu L-Arg ou D-Arg X3 représente un résidu L-Trp,D-Trp,L-Leu,D -Leu,L-Ile,D-Ile,L-Phe,D-Phe ou un enchainement de 2 ou 3 de ces résidus X4 représente un groupe -OH,-NH2, -OR1 avec R1 représentant un radical alkyle en C1 à C4, NHR2 avec R2 représentant un radical alkyle en C1 à C4, ou un résidu Cys. 2. Peptide de formule H - Arg - Gly - Asp - Trp - OH 3. Composition thérapeutique, caractérisé en ce qu'elle contient à titre de principe actif un dérivé peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2. 4. Agent de diagnostic. caractérisé en ce qu'il contient un dérivé peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2.