FR 2622450 A1 19890505 FR 8715227 A 19871103 ASSOCIATION HEPARINE/DERMATANE SULFATE La présente invention concerne une association à base de glucosaminoglycanes essentiellement formée d'un mélange d'héparine ou de dérivés de l'héparine présentant une activité anti-facteur IIa au moins égale à celle de l'héparine, et de dermatane sulfate, les compositions pharmaceutiques la contenant ainsi que leur application en tant que médicament, notamment à activité antithrombotique. L'héparine est un glycosaminoglycane, bien connu dans la littérature, qui exerce une activité anticoagulante en inhibant diverses sérine protéases de la coagulation, en particulier en potentialisant l'activité inhibitrice d'une protéine plasmatique, l'antithrombine III. De nombreux travaux ont été effectués sur l'héparine tant en ce qui concerne sa structure que son activité. En particulier, de nombreux travaux de fractionnement de l'héparine ont été effectués pour des études de structure/activité. L'héparine est constituée de chaines polysaccharidiques composées en alternance de D-glucosamines et d'acides uroniques (acide D-glucuronique et acide L-iduronique) substitués par divers groupements fonctionnels, en particulier des groupes sulfate, et plus particulièrement N-sulfate et O-sulfate. L'héparine présente également une activité antithrombotique, mais à doses susceptibles d'entrainer un certain risque hémorragique. L'utilisation de fractions et fragments d'héparine de faible masse moléculaire dépourvus d'activité sur la coagulation globale a partiellement pallié cet inconvénient, mais leur utilisation dans certaines chirurgies à haut risque reste encore délicate. Le dermatane sulfate appartient également à la famille des glycosaminoglycanes. Il est constitué de chaînes polysaccharidiques dans lesquelles alternent des D-galactosamines et des acides L-iduroniques, substitués par divers groupements fonctionnels, en particulier des groupes sulfate. Il est souvent présent en très faible proportion (env. 1 à 5) dans l'héparine pharmaceutique. Son activité vis-à-vis de la coagulation s'exerce par l'intermédiaire d'une autre protéine plasmatique, le cofacteur II de l'héparine. Divers travaux ont montré que le dermatane sulfate, comme l'héparine, possède une activité antithrombotique, mais cette activité s'exerce à des doses environ cinq fois plus élevées que celles de l'héparine. Sur la base des données de la littérature, un traitement antithrombotique éventuel à base uniquement de dermatane sulfate nécessiterait l'emploi de grandes quantités de produit, ce qui rendrait le traitement difficile et d'un coût élevé. L'intérêt est donc grand d'avoir un produit permettant de diminuer, voire de faire totalement disparaître le risque hémorragique, notamment pour le traitement des malades à haut risque, tout en étant d'un emploi facile. De façon inattendue, on a trouvé qu'en associant de l'héparine à dose faiblement active, voire inactive, d'un point de vue antithrombotique et du dermatane sulfate à dose sensiblement dépourvue d'activité antithrombotique, donc en utilisant une quantité relativement faible de dermatane sulfate, il est possible d'obtenir une forte activité antithrombotique, ce qui démontre un effet synergique des deux composés de l'association. Cette association à effet synergique présente l'avantage de diminuer, voire de faire disparaître tout risque hémorragique, ce qui permet son emploi dans des cas où des effets hémorragiques sont à craindre. On a également pu constater que des fractions ou des fragments d'héparine de faible masse moléculaire, tels que décrits dans la littérature fractions ou fragments qui n'ont que peu ou pas d'activité anti-facteur IIa, ne possèdent pas cette activité synergique en association avec le dermatane sulfate. Des travaux complémentaires ont permis de découvrir que l'activité synergique de l'héparine vis-à-vis du dermatane sulfate est due à la présence d'une majorité d'espèces moléculaires présentant une activité antifacteur IIa, c'est-à-dire possédant une longueur suffisante, comme décrit dans l'article Oosta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, 829-833 : Multiple functional domains of the heparin molecule: "The smallest complex carbohydrate fragment that accelerated the inactivation of thrombin by antithrombin had 14 residues"(cf. Abstract, p. 829). L'invention concerne une association à base de glycosaminoglycanes, à activité notamment antithrombotique, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement formée d'un mélange a) d'héparine ou d'un de ses dérivés possédant une activité anti-facteur lia au moins égale à celle de l'héparine, et b) de dermatane sulfate, dans laquelle chacun des composants est présent dans une quantité faiblement active, voire inactive en elle-même, en tant qu'antithrombotique, ladite association ayant un effet synergique. On entend par "dérivé d'héparine possédant une activitéanti-facteur IIa au moins égale à celle de l'héparine" tout glycosaminoglycane de type héparinique quel que soit son mode d'obtention, dont la majorité d'espèces moléculaires possède une longueur suffisante pour entraîner une forte activité anti-facteur IIa. Une association préférée est constituée d'un mélange des composants a) et b). D'une manière avantageuse, on utilise dans l'association une quantité des composants a) et b) dans un rapport pondéral composant a)/composant b) de 1/1 à 1/25, de préférence de 1/10 ; en particulier, on utilise de préférence des quantités d'héparine et de dermatane sulfate dans un rapport de i du composant a) pour 2,5 du composant b). Ce dernier rapport est susceptible de varier en fonction des caractéristiques des produits utilisés, en particulier en ce qui concerne le dermatane sulfate. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles renferment en tant que principe actif une association telle que définie ci-dessus, dans un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention se présentent de préférence sous forme injectable stériles ou stérilisables dans un excipient pharmaceutiquement acceptable pour l'administration par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intra-musculaire. Elles peuvent se présenter également sous une forme appropriée pour l'administration par voie orale, avantageusement sous forme de gélules gastro résistantes, de comprimés, tablettes ou pilules. D'une manière avantageuse, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent par unité de prise une quantité de 2,5 à 25 mg, de préférence de 5 à 15 mg d'héparine ou d'un de ses dérivés, et de 2,5 à 50 mg, de préférence de 10 à 35 mg de dermatane sulfate, et sont présentées soit sous forme d'ampoules, flacons ou seringues stérilisées, dans des solutés injectables, soit associés à des excipients appropriés pour l'administration par voie orale sous forme de gélules, comprimés, tablettes, pilules. L'invention concerne également l'utilisation d'une telle association en tant que médicament à activité antithrombotique. De manière avantageuse pour la préparation de l'association selon l'invention, on met en oeuvre une héparine de qualité pharmaceutique injectable classique, de préférence sous forme de sel de sodium, possédant un poids moléculaire de 2.000 à 50.000 daltons (poids moléculaire moyen 13.000 da.), et ayant des spécifications conformes à celles indiquées dans la Pharmacopée Européenne (1984, monographie 333). Un tel produit est disponible dans le commerce. On peut également utiliser un dérivé d'héparine possédant une masse moléculaire moyenne égale ou supérieure à 6.000-7.000 daltons. Le dermatane sulfate utilisé peut être du dermatane sulfate du commerce. On peut également le préparer en mettant en oeuvre, par exemple, une matière première telle qu'un tissu animal le contenant, notamment mucus ou intestin, poumon ou peau de mammifère, de préférence boeuf ou porc, en utilisant par exemple un procédé tel que celui décrit par L. Roden, J.R. Baker, J.C. Cifonelli et M.Bo. Mathews, Methods in enzymology, 26 (1972), 73-140. Le dermatane sulfate possède les caractéristi ques suivantes - il est formé d'un mélange de chaînes ayant une masse moléculaire allant de 10.000 à 60.000 daltons, la masse moléculaire moyenne étant d'environ 25.000 da. - activités . anti-facteur Xa : anti-facteur IIa : APTT : taux de carboxyle (C) : compris entre 1,60 et 2,00 S/C : compris entre 0,95 et 1,40 La masse moléculaire moyenne a été déterminée par GPC (gel permeation chromatography) sur colonne TSK 3000 SW en utilisant comme étalons les produits suivants : acide hyaluronique (230.000 da.), dermatane sulfate (45.000 da.), chondroitine-6-sulfate (29.000 da.), chondroîtine-4-sulfate (15.000 da.), héparine (16.000 da., 13.000 da. et 7.700 da.), oligpsaccharides de préférence préparés à partir de l'héparine par dégradation à l'héparinase (di-, tétra-, hexa-, octa- et décasaccharides).Les activités anti-facteur xa et anti-facteur IIa ont été mesurées par une méthode chromogénique (Stago, France) en utilisant l'héparine standard comme étalon. L'activité APTT (Actin FS, Dade, USA) a été mesurée à l'aide d'un appareil KC4 (AHS, Dade, USA). Les taux de sulfate et de carboxyle ont été dosés par conductimétrie. On peut également utiliser un dermatane sulfate du commerce, tel que celui vendu par Sigma, USA (Catalog n" C4259 from porcine pin). Aux doses administrées, les compositions pharmaceutiques selon l'invention n'ont provoqué aucun effet toxique et on n'a observé aucun allongement du temps de saignement chez les animaux traités. L'invention ne se limite pas aux aspects particuliers qui viennent d'être décrits, elle en englobe au contraire toutes les variantes et elle sera plus facile à comprendre à l'aide des exemples d'application qui vont suivre. EXEMPLE 1 : Activité des Produits dans un modèle de thrombose expérimentale Les produits testés ont été les suivants - dermatane sulfate (DS) ayant les caracté ristiques décrites ci-dessus, - héparine standard (SH) du commerce sous forme de sel de sodium, conforme à la Pharmacopée Européenne. Les doses de produits à injecter ont été déterminées par une étude de relation dose-effet en choisissant des doses de chacun des produits n'exerçant qu'une action antithrombotique faible ou non significative lorsqu'ils sont administrés séparément. Les produits ont été administrés seuls ou en association. - Modèle expérimental Des lapins New-Zealand mâles (2 à 2,5 kg) sont anesthésiés au pentobarbital de sodium (30 mg/kg) administré par voie intrapéritonéale. Puis chaque veine jugulaire est isolée entre deux sutures lâches. On injecte ensuite 10 curie de fibrinogène marqué à 1,125Il puis la dose voulue des glycosaminoglycanes à tester seuls ou en association, par l'intermédiaire d'un cathéter introduit dans l'artère carotide. Tois minutes après, on injecte dans l'artère carotide de la thromboplastine de-cerveau humain (National Reference Laboratory for Anticoagulant Reagents, Manchester), à la dose de 1 mg/kg en 30 secondes.Trente secondes plus tard, on serre les sutures proximales et distales de manière à occlure les deux segments de veines jugulaires. 15 minutes après, on ouvre ces segments et on mesure la taille des thrombi en comparant leur radioactivité à celle d'un ml de sang. Pour chaque produit ou association de produits, on utilise des groupes de 5 à 11 animaux par dose afin de calculer le pourcentage de réduction de la taille du thrombus par rapport aux valeurs obtenues chez des animaux-témoins auxquels on a injecté du sérum physiologique. (Pour plus de détails, cf. Carter et al.. Thromb. Res., 21, 1981, 169). La signification statistique des différences entre animaux témoins et animaux traités a été calculée en utilisant le test de Wilcoxon (elle est représentée par la valeur P). Les résultats sont donnés dans le tableau suivant Dose Equivalence n Prévention P administrée anti-Xa u/kg du thrombus ug/kg DS 25 0 10 17 + 12 N S DS 35 0 7 32 + 14 SH 10 1,6 Il 12 + 11 N S SH 25 4 9 49 t 13 DS 25 + SH 10 1,6 11 54 + 7 DS 25 + SH 25 4 7 76 + 10 DS 35 + SH 10 1,6 7 73 + 8 DS 35 + SH 25 4 7 78 + 5 NS = non significatif Ces résultats montrent qu'en associant deux doses respectivement inactives de dermatane sulfate, 25 pg/kg, et d'héparine, 10 pg/kg, on obtient, en les associant, une forte activité antithrombotique (inhibi tion de la formation du thrombus supérieure à 50% par rapport aux témoins), ce qui démontre un effet synergi que des deux composants de l'association. Des expériences effectuées avec du dermatane sulfate d'une autre qualité (Sigma, USA) ont donné des résultats comparables en utilisant une dose plus impor tante de dermatane sulfate, c'est-à-dire 50 à 75 pg/kg pour des doses d'héparine de 10 et 25 pg/kg. EXEMPLE 2 Dans des expériences complémentaires utilisant le modèle expérimental décrit dans l'Exemple 1, on a testé l'association du dermatane sulfate avec soit des fractions, soit des fragments d'héparine préparés de façon à avoir des chaînes de plus faible masse moléculaire. Le produit CY 216 est une fraction d'héparine de faible masse moléculaire (poids moléculaire moyen 4.500 da.), préparée par dépolymérisation comme décrit dans le Brevet France 2 572 080. Le rapport d'activité anti-facteur Xa/activité anti-facteur IIa est égal à 4. Le produit PS est un pentasaccharide synthétique correspondant à la séquence minimale de fixation de l'héparine à l'antithrombine III, dont la synthèse est décrite dans la demande de brevet Européenne 0 084 999 (Produit n" 50). Ce produit est totalement dépourvu d'activité anti-facteur IIa. Les résultats sont donnés dans le tableau suivant Dose Equivalence n Prévention P administrée anti-Xa u/kg du thrombus cig/kg DS 25 0 10 17 + 12 N S DS 35 0 7 32 + 14 CY 216 50 6 7 11 t 12 N S CY 216 100 12 5 41 + 15 PS 14 4 6 1Q + 10 N S PS 34 10 6 55 t 15 DS 25 + CY 216 50 6 8 18 + 16 N S DS 25 + CY 216 100 12 8 39 + 14 DS 35 + CY 216 50 6 8 44 t 13 DS 35 + CY 216 100 12 8 32 + 16 N S DS 25 + PS 14 4 8 5 t 14 N S DS 25 + PS 34 10 5 59 t 9 Ces résultats montrent que l'association de quantités respectivement inactives de dermatane sulfate et de CY 216 ou de dermatane sulfate et de pentasaccharide ne permet pas d'obtenir une activité antithrombotique supérieure à celle obtenue avec la dose considérée de chacun des produits séparément. En outre, lorsqu'on utilise des quantités de CY 216 ou de pentasaccharide possédant une certaine activité antithrombotique lorsqu'ils sont administrés seuls, leur association avec du dermatane sulfate entraîne même une diminution de l'activité antithrombotique. Par exemple, 100 pg/kg de CY 216 montrent une diminution de l'incidence des thromboses de 41 %, alors que l'association à 35 pg/kg de dermatane sulfate n'entraîne une inhibition que de 32 %, comme le dermatane sulfate seul à la même dose. On ne constate donc pas l'effet synergique obtenu avec I'héparine. EXEMPLE 3 En utilisant le modèle expérimental décrit dans l'Exemple 1, on a testé l'activité du dermatane sulfate en association soit avec une fraction d'héparine de forte affinité pour l'AT III (HA Hep), soit avec une fraction de faible affinité (LA Hep). Ces fractions ont été obtenues par chromatographie d'affinité sur une colonne d'AT III-Sépharose, comme décrit dans Hook et al., Febs Lett., 66, 1976, 90-93. Les résultats sont donnés dans le tableau suivant Dose Equivalence n Prévention P administrée anti-Xa u/kg du thrombus ug/kg % DS 25 0 10 17 + 12 N S DS 35 0 7 32 + 14 HA Hep 5 2,8 8 25 + 14 N S LA Hep 10 0,07 8 0 + 13 N S DS 25 + HA Hep 5 2,8 8 52 t 12 DS 25 + LA Hep 10 0,07 7 9.1 + 17 N S DS 35 + HA Hep 5 2,8 7 66 t 7 DS 35 + LA Hep 10 0,07 7 52-t 12 On observe que l'association d'une quantité inactive ou faiblement active de dermatane sulfate avec une quantité inactive d'héparine de forte affinité entraîne une activité antithrombotique importante, démontrant un effet synergique de cette association, alors que cet effet n'est pas obtenu avec l'héparine de faible affinité. L'ensemble de ces résultats montre que pour l'obtention d'une forte activité antithrombotique dans le modèle décrit, résultant d'un effet synergique, la présence du site de fixation à l'AT III est importante, puisque l'on n'observe pas cet effet avec l'héparine de faible affinité qui ne le possède pas. Néanmoins, la présence de ce site n'est pas suffisante puisque cet effet ne se produit ni avec le pentasaccharide, ni avec une fraction d'héparine de faible masse moléculaire comme le CY 216 qui le possèdent tous deux. Ces observations montrent que l'effet synergique est dû à la présence dans l'héparine et ses dérivés de chaînes moléculaires responsables de l'activité anti-facteur IIa. EXEMPLE 4 : Formulations Pharmaceutiaues Héparine Standard de la Pharmacopée Dermatane sulfate du commerce Formule 1 : voie sous-cutanée Héparine, sel de sodium 10 mg Dermatane sulfate 25 mg Eau pour préparation injectable ,q.s.p. 0,5 ml Formule 2 : voie sous-cutanée Héparine, sel de sodium 10 mg . Dermatane sulfate ........... 50 mg Eau pour préparation injectable q.s.p. 0,5 ml Formule 3 : voie intraveineuse Héparine, sel de sodium ..... 20 mg . Dermatane sulfate .......... 200 mg Eau pour préparation injectable q.s.p. 5 ml EXEMPLE 5 : Méthode de traitement Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être administrées en tant que médicament antithrombotique à titre préventif, par exemple dans le cas d'interventions chirurgicales lorsqu'il s'agit de malades à haut risque hémorragique. Les doses administrées sont de 1 à 3 ampoules par jour d'une des formules ci-dessus, en fonction de l'état du malade et de l'avis du médecin traitant. D'une manière générale, les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être utilisées en tant que médicament pour la prévention et le traitement de la maladie thrombo-embolique. REVENDICATIONS 1. Association à base de glycosaminoglycanes, à activité notamment antithrombotique, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement formée d'un mélange a) d'héparine ou d'un de ses dérivés possédant une activité anti-facteur lIa au moins égale'à celle de l'héparine, et b) de dermatane sulfate, dans laquelle chacun des composants est présent dans une quantité faiblement active, voire inactive en elle-même, en tant qu'antithrombotique, ladite association ayant un effet synergique. 2. Association selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un mélange des composants a) et b). 3. Association selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que le rapport pondéral composant a)/ composant b) est de 1/1 à 1/25. 4. Association selon la revendication 3, caractérisée en ce que le rapport pondéral des quantités des composants est de 1 du composant a) pour 10 du composant b). 5. Association selon la revendication 3, caractérisée en ce que le rapport pondéral des quantités des composants est de 1 du composant a) pour 2,5 du composant b). 6. Compositions pharmaceutiques renfermant en tant que principe actif une association selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable. 7. Compositions phamaceutiques selon la revendication 6, caractérisées en ce qu'elles comprennent l'association d'héparine ou d'un de ses dérivés et de dermatane sulfate dans un excipient pharmaceutiquement acceptable pour l'administration par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire. 8. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 6, caractérisées en ce qu elles comprennent l'association d'héparine ou d'un de ses dérivés et de dermatane sulfate sous une forme appropriée pour l'administration par voie orale, avantageusement sous forme de gélules gastro résistantes, de comprimés, tablettes ou pilules. 9. Compositions pharmaceutiques selon l'une quelconque des revendi-cations 6 à 8, caractérisées en ce qu'elles contiennent par unité de prise une quantité de 2,5 à 25 mg, de préférence de 5 à 20 mg d'héparine ou d'un de ses dérivés, et de 10 à 100 mg, de préférence de 10 à 35 mg de dermatane sulfate.- 10. Utilisation d'une composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 6 à 9 en tant que médicament pour la prévention et le traitement de la maladie thromboembolique.