FR 2601020 A1 19880108 FR 8609682 A 19860703 SORBINE PURIFIEE, NOUVEAUX PEPTIDES AYANT DES SEQUENCES PEPTIDIQUES EN COMMUN AVEC LA SORBINE ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LES CONTENANT L'invention est relative à un peptide sensiblement pur, isolable à partir de la muqueuse intestinale du porc, ce peptide présentant des propriétés consistant plus particulièrement dans la capacité de provoquer un accroissement de l'absorption de l'eau et du sodium par une anse duodénale de rat in vivo et d'une vésicule biliaire isolée de cobaye, in vitro. Des fractions biologiques obtenues à partir de muqueuses intestinales de porc présentant les susditcs p opviétés onL déjà Wté obtenues. C.es fractions contiennent cependant un nombre considérable d'autres constituants dont la présence masque ce que peut être la constitution réelle du principe actif. La présente invention avait pour but de fournir un principe hautement purifié et caractérisable dont l'utilisation comme réactif et comme principe actif de médicament puisse être,envisagée. Elle avait encore plus particulièrement pour but la production de polypeptides ayant les mêmes activités dont la taille soit cependant suffisamment réduite pour être accessible à la synthèse chimique en mettant en oeuvre les techniques classiques de synthèse des protéines. Le peptide hautement purifié présente la composition en acides aminés qui est indiquée plus loin. I1 est en outre caractérisé par une pureté biologique complète en tant qu'il n'est isolable qu'en une bande unique dans des opérations d'électrophorèse et de chromatographie liquide sous haute pression. D'autres caractéristiques du peptide biologiquement pur apparaîtront encore dans le cours de la description qui suit du procédé qui a été mis en oeuvre pour sa préparation et des caractéristiques particulières du produit biologiquement pur qui a été obtenu. PREPARATION DE LA SORBINE La première partie de la préparation correspond à un procédé qui est décrit dans la littérature V. MUTT, Clin. Endocri. 1976, 5, supp. 175S-1835. Des intestins de porc correspondant aux 1/3 supérieurs de tout l'intestin, sont prélevés à l'abattoir et portés à l'ébullition dans de l'eau puis conservés congelés. Ils sont ensuite coupés en morceaux et ils sont extraits par macération dans de l'acide acétique 0,5 M pendant 12 heures. Le macérat est filtré, adsorbé sur de l'acide alginique, élué par de l'acide chlorhydrique (cl)0,2 M. Les peptides sont précipités de l'éluat par du chlorure de sodium à saturation (1-tonne d'intestins donne 1 kg de précipité). Le précipité est dissous dans de. l'eau à raison de 20 g pour 100 ml. Deux volumes d'éthanol à 95 sont ajoutés. le pH de la solution est ajusté à 7,2 par l'intermédiaire d'une électrode en verre et d'un pHmètre avec de la soude (NaOH). Le précipité qui se forme est filtré et écarté. un volume d'éthanol à 95%, à la température de -20'C, est alors ajouté au filtrat clarifié. Le mélange est stocké à -20- C pendant 48 heures. Le précipité est recueilli par filtration à -20 C. Le précipité est dissous dans du tampon phosphate 0,03 M à pH 6,4 et adsorbé sur de la carboxyméthylcellulose (CMC) et élué avec le même tampon renfermant du chlorure de sodium à une concentration de 0,3 M. Le produit est précipité de cette solution par du chlorure de sodium à saturation. Le rendement de cette étape est 22,5 g pour 1 kg de l'extrait précédent. Le produit est alors séparé en plusieurs fractions par chromatographie sur Séphadex G 25 en tampon acide acétique (CH3COOH) 0,2 M. Le produit est précipité par du chlorure de sodium à saturation. La quantité récupérée dans la fraction active est environ de 9 g. A paroir de ce stade, le procédé de purification est original puisqu'il a été mis au point pour permettre une augmentation sélective de l'activité physiologique sur l'absorption de l'eau et du sodium. Le gâteau de sel obtenu à l'étape précédente est dissous dans de l'eau à la concentration de 10 g pour 100 ml. Deux volumes d'éthanol à 95% sont ajoutés et le pH est porté à 7,2 à l'aide d'une solution renfermant 1 volume de NaOH 1 M et 2 volumes d'éthanol 95%. Un volume identique au nouveau volume total obtenu, a'éthanol à So, amené à la température de -20 C, est ajouté au mélange qui est placé 48 heures à - 20 C. Le précipité est recueilli par filtration puis séché par lavage par ltéthanol pur, puis l'éther et enfin séché sous vide pendant plusieurs heures. Son poids est de 5 g environ. Cette étape a permis de sécher le produit et de se débarrasser d'une partie du sel. Le produit est alors soumis à une chromatographie sur carboxyméthylcellulose (CMC) après dissolution dans du bicarbonate d'ammonium 0,02 M. Il est adsorbé puis élué par du bicarbonate d'ammonium 0,04 M. La fraction active ainsi éluée représente 335 mg. La fraction ainsi obtenue est dissoute à nouveau dans du bicarbonate d'ammonium 0,03 M et soumise à une nouvelle chromatographie sur CMC et l'activité est repérée dans les fractions éluées entre 25 et 35 fois le volume total de la colonne. Le poids de la fraction active ne représente plus que 19,2 mg environ. L'étape suivante est réalisée par chromatographie liquide haute pression (HPLC) utilisant un solvant A constitué par de l'eau avec 0,18 d'acide trifluoracétique (TFA) et un solvant B constitué par de l'acétonitrile contenant 0,1% de TFA. Sur une colonne micro-Bondapak C 18 Waters (7,8 x 300 mm), un gradient du solvant B de O à 20% en 10 minutes puis de 20 à 40 en 40 minutes et un débit de 3 ml/minute, le produit actif est élué avec un temps de rétention de 37 à 39 minutes. L'étape suivante consiste en une nouvelle HPLC, sur colonne microbondapak CN Waters (3,9 x 300 mm) un débit de 1,5 ml/minute et un solvant A constitué par eau + 0,1% TFA et un solvant B comprenant acétonitrile + 0,1 s TFA. Le solvant B est ajouté en gradient à raison de O à 20% en 10 minutes, puis 20 à 40% en 40 minutes. La fraction active est éluée avec un temps de rétention de 37 à 41 minutes. L'étape finale a consisté en une autre HPLC, sur colonne microbondapak C18, Waters (3,9 x 300 mm), débit 1,5 ml/minute, solvant A : méthanol 40% + TFA 0,1% solvant B : méthanol 80% + TFA 0,1%. Le gradient de B est de O à 75% en 30 minutes. Le temps de rétention de la sorbine est alors de 20 à 22 minutes. Le contrôle de pureté réalisé sur la même colonne avec le même système de solvant et un gradient de O à 100%'en 20 minutes, montre qu'un seul pic est obtenu dont le temps de rétention est de 15 à 16 minutes. La quantité de produit récupérée à la fin de la purification portant sur une tonne d'intestins a été de 0,462 mg de sorbine. Il est possible que des quantités plus importantes de sorbine soient extractables par tonne d'intestin, car la méthode d'estimation de l'activité biologique a pu nous donner des résultats par défaut. CARACTERISATION DE LA SORBINE La pureté de la sorbine a été mise en évidence par l'obtention d'un seul pic en HPLC et une seule bande en électrophorèse sur gel d'acrylamide. En élec trophorèses sur gel d'acrylamide en tube, la migration de la sorbine a été de 2,7 mm (moyenne de 10 électro phoeèse3) tandis que dans les mêmes conditions, la sécrétine qui est parfaitement connue a migré de 4,4 mm (moyenne de 3 électrophorèses). Pour un Rf de 1,0 pour la sécrétine, le Rf de 1,0 pour la sécrétine, le Rf de la sorbine est de 0,61 en moyenne. La détermination du poids moléculaire de la sorbine a été faite par électrophorèse sur plaque de polyacrylamide en présence de SDS (laurylsulfate de sodium). Dans ces conditions, la migration est inversement proportionnelle au log. du poids moléculaire de la protéine. La mesure de a distance de a sorJine a permis de calculer son Rf ainsi que celui des autres protéines de référence (phosphorylase b : 94.000; albumine 67.000; ovalbumine : 43.000; anhydrase carbonique 30.000; inhibiteur de la trypsine : 20.100; myoglobine 17.000 et alpha lactalbumine : 14.400) qui ont migré simultanément et dont le poids moléculaire est connu.On a porté sur un graphique les Rf en fonction du logarithme des poids moléculaires et le Rf de 0,38 de la sorbine a permis de calculer sur la droite le poids moléculaire de 3a sorbine égal à 22.500, encadré par les Rf de 0,41 pour l'inhibiteur de la trypsine (poids moléculaire PM = 20.100 et de 0,27 pour l'anhydrase carbonique de PM = 30.000). La composition en aminoacides a été déterminée après hydrolyse de la molécule par de l'acide chlorhydrique (HC1) 6 N + 0,5% de phénol à 106 C pendant 24 heures et le dosage sur un analyseur Beckman; le nombre indiqué représente le rapport entre les aminoacides lysine 1,55 histidine 0,77 arginine 1,27 acide aspartique et asparagine 2,17 thréonine 1,45 sérine 1,79 acide glutamique et glutamine 1,42 proline 2,45 glycocolle 0,47 alanine 1,1 valine 0,81 méthionine O., 46 isoleucine 0,27 leucine 0,60 tyrosine 0,93 phénylalanine 0,47 Si on donne la valeur de 1 au rapport le plus faible, soit celui de l'isoleucine = 0,27, le nombre des acides aminés devient donc égal à un ou un multiple des valeurs suivantes; ces valeurs multipliées par le poids moléculaire de chacun des aminoacides donnent le poids moléculaire du peptide renfermant une seule isoleucine, soit Nombre d'acides Poids moléculaire Total aminés ly 5,74 128,1 73F,3 his 2,85 137,2 391,0 arg 4,7 156,2 734,1 asp 8,03 115,1 924,2 thr 5,37 101,1 542,9 ser 6,62 87,1 576,6 glu 5,25 128,6 675,2 pro 9,07 97,1 880,7 gly 1,74 57,1 99,4 ala 4,07 71,1 289,4 ral 3 99,1 297v9 met 1,7 131,2 223,0 ile 1 113,2 113,2 leu 2,22 113,2 251,3 tyr 3,44 163,2 561,4 phe 1,74 147,2 256,1 TOTAL 66,54 7551,7 Cette unité a un poids moléculaire de 7551,7 alors que la molécule entière a un poids moléculaire de 22.500, soit 2,98 fois plus grande.Le nombre total des aminoacides de la molécule correspond donc à 66,54 x 2,98 = 198 aminoacides. La composition de la molécule totale devient donc la suivante lys 17,1 his 8,5 arg 14,0 asp 23,9 thr 16,0 ser 19,7 glu 15,6 pro 27,0 gly 5,2 ala 12,1 val 8,9 met 4 ou 5 ile 3,0 leu 6,6 tyr 10,1 phe 5,2 La détermination du N terminal par la méthode de dansylation classiquement utilisée n'a pas permis de mettre en évidence aucun groupement terminal indiquant que le groupement est bloqué soit par un groupement N acétyle, soit N formyle ou par un groupement moins classiquement rencontré. Par contre, la présence de epsilon lysine et de o tyrosine contenues dans la molécule témoigne que la réaction se soit déroulée convenablement puisque ces deux aminoacides prennent la dansylation à leur groupement NH2 ou NH libres et non en position terminale. L'invention porte sur le peptide constitué d'un certain nombres de fragments qui ont été déterminés mais qui n'ont pas encore pu être reliés les uns aux autres. L'ordre le plus probable a été représenté en commençant par la partie N terminale, comportant un groupement NH2 qui est substitué (comme on l'a dit précédemment) par un radical non encore identifié ( > ) et en terminant par le groupement C terminal acide qui lui aussi est substitué par une fonction amide (comme on le décrira plus bas). Pour gagner de la place une représentation à une iettre a été utilisée pour les amino- & idcs avec le code suivant Alamine=ala=A/ arginine=arg=R/ asparagine=asn=N/ acide aspartique=asp=D/ acide glutamique=glu=E/ glutamine=gln =Q/ glycine=gly=G/ histidine=his=H/ isoleucine=ile=I/ leucine=leu=L/ lysine=lys=K/ methionine=met=M/ phenylalanine=phe=F/ proline=pro=P serine=ser=S/ threonine=thr=T/ trytophane=trp=W/ tyrosine=tyr=Y/ valine=val=V/. 30 35 40 45 G.K.S.S.I.L.Q.H.E.R.P.V.T.K.P.Q.A-NH2 La fonction amide de l'alanine terminal a été déterminée par la technique décrite par TAYEMOTO K. & V. MUTT (Proc.Natl), Acad. Sci. USA 1978,75 : 4115. Le fragment peptidique contenant les 40 derniers amino-acides et qui renferme l'activité de la molécule entière sur l'absorption d'eau et des electrolytes a pu être obtenu par clivage non spécifique par l'acide formique 70% après 72 heures de séjour à la température du laboratoire et être produit de façon non spécifique au cours du clivage par le bromure de cyanogène. Le reste de la molécule peut posséder d'autres activités qui n'ont pas encore été mises en évidence. La formule du peptide actif est la suivante 1 5 10 15 20 25 P.P.D.R.K.V.D.T.R.K.F.R.S.E.P.R.S.I.F.E.Y.E.P.G.K.S.S.I. 30 35 40 2 L.Q.H.E.R.P.V.T.K.P.Q.A-NH Il va de soi que l'invention concerne plus particulièrement tout peptide qui aurait, par ailleurs, les mêmes séquences 1-12 et 14-40 dès lors qu'il possé- - derait les mêmes activités biologiques. Ce peptide de 40 acides aminés peut être obtenu à partir de la sorbine purifiée par traitement de celle-ci avec le bromure de cyanogène connu pour sa capacité à couper les liaisons methionyl-alanine de façon spécifique et à couper de façon moins spécifique, certaines autres liaison et, en particulier, à cause de l'acide formique 70% qui sert de véhicule, la liaison acide aspartique-proline. Plus particulièrement, on récupère celui des fragments pressentant le poids moléculaire correspondant à 40 acides aminés environ. En outre, le peptide purifié en question se distingue des autres fragments résultant des coupures par le bromure de cyanogène par l'absence d'un groupement méthionine, transformé en homosérine au cours de la réaction, mais d'un groupe alanyle terminal. Surtout ce peptide de 40 acides aminés présente des propriétés semblables à celles de la sorbine pure et ce, dans les essais biologiques dont la description suit. Les conditions dans lesquelles on réalise la coupure de la orjne par le bromure de cyanogène et dans lesquelles on isole le peptide actif sont indiquées ci-après. On réalise la coupure par le bromure de cyanogène, dans un flacon en forme de poire de 100 ml, muni d'un rodage s'adaptant sur un rotavapor (ballon muni d'un réfrigérant sur lequel on applique le vide). Quand l'échantillon a été réparti sur toute la paroi, puis séché complètement on ouvre le système et on ajoute 700 pl d'acide formique, 300 l d'eau et 0,2 g de bromure de cyanogène. On agite et on laisse en contact pendant 24 heures à la température ordinaire. Le lendemain, l'échantillon est séché comme auparavant à l'aide du rotavapor. Lorsque l'échantillon est sec on reprend par 0,5 ml d'acide formique, 0,5 ml d'eau et on sèche de nouveau. Les produits coupés par le bromure de cyanogène sont ensuite séparés par HPLC (chromatographie liquide haute pression) sur une colonne C18 avec un gradient comprenant - solvant A, eau + acide trifluoroacétique 0,1%, - solvant B, acétonitrile + acide trifluoroacétique O, 18. Avec un gradient du solvant B de O à 40% en 40 minutes, le peptide actif a été séparé au temps de rétention de 38 à 40 minutes, il répond à la séquence donnée plus haut (page 10, lignes Il à 14) et possède les teneurs suivantes en les acides aminés ci-après - lysine 0,61 nanomoles, - histidine 0,18, - arginine 0,72, - acide aspartique 0,36, - sérine 0,72, - acide glutamique 0,92, - prolyne 0,95, - valine 0,32, - isoleucine 0,18, - leucine 0,20, - tyrosine 0,25, - phénylalanine 0,29. Le peptide actif obtenu peut être produit par synthèse chimique, en mettant en oeuvre les techniques classiques dans le domaine de la synthèse des peptides. Cette synthèse peut être réalisée en solution homogène ou en phase solide. Par exemple, on aura recours à la technique de synthèse en solution homogène décrite par HOUBENWEYL dans l'ouvrage intitulé NMethode der organischen Chemie" (Méthode de la chimie organique) édité par E. Wènsch., vol. 15-I et II, THIEME, Stuttgart 1974. Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement deux à deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou à condenser des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs résidus aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments à l'exception des fonctions amine de l'un et carboxyle de l'autre ou vice versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des peptides.En variante, on pourra avoir recours à des réactions de couplage mettant en jeu des réactifs de couplage classique, du type carbodiimide, tels que par exemple la 1-éthyl-3 (3-diméthyl-aminopropyl)-carbodiimide. Lorsque 1 'ami- noacyle mis en oeuvre possède une fonction amine supplémentaire (cas de la lysine par exemple) ou une autre fonction acide (cas par exemple de l'acide glutamique), ces fonctions seront par exemple prot gées, par des groupes carbobenzoxy ou t-butyloxycarbonyle, en ce qui concerne les fonctions amine, ou par des groupes t-butylester, en ce qui concerne les fonctions carboxyliques. Il en ira de même de la protection de toute autre fonction réactive.Par exemple, lorsque l'un des aminoacyles considérés contient une fonction SH (par exemple la cystéine), on pourra avoir recours àvun groupe acétamidométhyle ou paraméthoxybenzyle. Dans le cas de la synthèse progressive, acide aminé par acide aminé, la synthèse débute de préférence Fils la condensatIon dt l'amino-acide-C-terminal avec l'aminoacide qui correspond à l'aminoacyle voisin dans la séquence désirée et ainsi de suite, de proche en proche, jusqu'à l'acide aminé N-terminal. Selon une autre technique préférée de l'invention, on a recours à celle décrite par R.D. MERRIFIELD dans l'article intitulé "Solid phase peptide synthesis" (J. Am. Chem. Soc., 45, 2149-2154). Pour fabriquer une chaîne peptidique selon le procédé de MERRIFIELD, on a recours à une résine polymère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier aminoacide C-terminal de la chaîne. Cet aminoacide est fixé sur la résine par l'intermédiaire de son groupe carboxylique et sa fonction amine est protégée, par exemple par le groupe t-butyloxycarbonyle. Lorsque le premier aminoacide C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on enlève le groupe protecteur de la fonction amine en lavant la résine avec un acide. Dans le cas où le groupe protecteur de la fonction amine est le groupe t-butyloxycarbonyle, il peut etre éliminé par traitement de la résine à l'aide d'acide trifluoroacétique. On couple ensuite le deuxième aminoacide qui fournit le second aminoacyle de la séquence recherchée, à partir du résidu aminoacyle C-terminal sur la fonction amine déprotégée du premier aminoacide C-terminal fixé sur la chaîne. De préférence, la fonction carboxyle de ce deuxième aminoacide est activée, par exemple par le dicyclohexylcarbodiimide, et la fonction amine est protégée, par exemple par le t-butyloxycarbonyle. On obtient ainsi la première partie de la chaîne peptidique recherchée, qui comporte deux aminoacides, et dont la fonction amine terminale est protégée. Comme précédemment, on déprotège la fonction amine et on peut ensuite procéder à la fixation du troisième aminoacyle, dans les conditions analogues à celles de l'addition du deuxième aminoacide C-terminal. On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés, qui vont constituer la chaine peptidique sur le groupe amine chaque fois déprotégé au préalable de la portion de la chaine peptidique déjà formée, et qui est rattachée à la résine. Lorsque la totalité de la chaine peptidique désirée est formée, on élimine les groupes protecteurs des différents aminoacides constituant la chaine peptidique et on détache le peptide de la résine par exemple à l'aide d'acide fluorhydrique. Il va naturellement de soi que l'invention couvre également tout peptide ayant en commun une séquence avec le peptide 40 et ayant de surcroit les propriétés d'accroissement de l'absorption de l'eau et du sodium par les organes dont question plus haut, et ce notamment dans les conditions expérimentales qui sont décrites ci-après. Sont en particulier inclus dans le cadre de l'invention, tous peptides plus petits que le peptide 40 mais qui s'avèveraient également présenter les propriétés biologiques du type de celles qui sont indiquées ci-après. Une première approche pour l'étude des peptides actifs plus petits peut consister dans la fragmentation du peptide 40 en peptides plus petits en utilisant des enzymes capables de couper ces peptides en des sites spécifiques et en l'étude de leurs propriétés biologiques en mettant en oeuvre le test dont la description suit. On mentionnera par exemple la glu-protéase qui coupe les peptides après les résidus acide glutamique, la trypsine qui coupe les peptides après les résidus lysine ou arginine, etc... Une autre approche de l'étude des peptides actifs plus petits peut s'appuyer sur la synthèse chirni que, par exemple dans les conditions qui ont été rappelées ci-dessus, puis l'étude des propriétés biologiques des fragments synthétiques. Il va également de soi que l'invention concerne également tous peptides équivalents à ceux qui précèdent. On entend par peptide équivalent, tout peptide qui se distingue de ceux qui sont plus particulièrement décrits par la substitution d'un ou plusieurs acides aminés par un ou plusieurs autres acides aminés, dès lors que cette substitution n'entrain pas une disparition, à tout le moins une réduction importante des propriétés biologiques sus-indiquées. MISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVITE PHYSIOLOGIQUE L'action qui a servi à suivre la purification de la sorbine à chaque étape est représentée par son effet sur l'absorption de l'eau et du sodium soit au niveau d'une anse duodénale isolée chez le rat anesthésié, soit au niveau d'une vésicule biliaire isolée de cobaye in vitro. I - Action sur l'absortion duodénale Chez le rat à jeun depuis 45 heures avec de l'eau à volonté, une anesthésie avec du nembutal est pratiquée. Une anse duodénale est préparée en plaçant une ligature sur le pylore et une autre à 7 cm au-dessous avec une ligature supplémentaire sur le canal bilio-pancréatique. Un millilitre de la solution test contenant 138 micromoles de chlorure de sodium, 0,1 microcuries de polyéthylène glycol marqué au carbone c 14 et 0,01 microcuries de sodium 22. La sorbine à différents stades de purification a été administrée en injection intracardiaque rapide; les animaux témoins ont recu dans les mêmes conditions un meme volume de sérum physiologique isotonique. Le contenu des anses isolées a été recueilli une heure après. Le sodium a été déterminé par photométrie de flamme tandis que les activités du sodium 22 et du polyéthylène-glycol marqué au carbone 14 ont' été mesurées dans un compteur spectromètre bêta -et gamma. La relation linéaire entre la contribution bêta et gamma du sodium 22 a permis de soustraire la part du sodium de l'activité bêta totale afin de déterminer l'activité réelle due au PEG c 14 utilisé comme marqueur non absorbable. L'absorption de l'eau qui représente la différence entre le volume initial et le volume final recueilli dans l'anse a été calculé en déterminant le volume final comme étant égal au rapport entre l'activité du PEG initial sur le PEG final.L'absorption du sodium a été calculée en soustrayant le débit final (concentration en sodium multipliée par le volume final) du débit initial (concentration initiale multipliée par le volume initial). Il - Action sur 1~ vésicule biliaire isolée La vésicule biliaire de cobaye a été prélevée dès la mort des animaux par rupture cervicale. La vésicule a été remplie de solution de KREBS et placée dans un bain à base de solution de KREBS et alimenté en bulles d'un mélange oxygène 95%, gaz carbonique 5%. L'absorption a été déterminée par la courbe pondérale des vésicules pesées toutes les 5 minutes quand la swrDire est ajoutés à la solution de KREBS. Une accélé ration de la perte de poids par rapport à la période témoin représente une augmentation de l'absorption qui. se traduit par une diminution du rapport perte de poids horaire témoin sur perte de poids horaire sous traitement. Ces deux tests permettent de mesurer l'acti vité des fractions au cours de la purification et d'ob tenir la molécule purifiée douée d'une telle activité. Un contrôle réalisé avec des peptides déjà connus n a pas permis d'obtenir une activité semblable à celles qui sont observées chez les peptides selon l'invention à des doses aussi faibles de l'ordre de 0,1 à 10 picomoles par ml du bain ou par 100 g. de rat. La sorbine purifiée ou les peptides actifs plus petits peuvent être utilisés comme réactifs de référence ou de substances de comparaison pour l'étude de produits présumés posséder des propriétés tendant à accroître l'absorption de l'eau et du sodium par les 'muqueuses intestinales, particulièrement au niveau du duodénum. Ils peuvent également être utilisés pour apprécier au contraire l'activité de substances ayant des activités contraires, notamment par le degré d'inhibition de ces activités contraires par des doses déterminées des peptides selon l'invention. L'invention concerne encore les compositions pharmaceutiques associant des doses efficaces de sorbine purifiée ou des peptides actifs de plus petite taille avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. D'une façon générale, les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont utilisables pour le traitement de toute affection susceptible de se manifester sous forme de diarrhées. Les compositions selon l'invention peuvent être administrées sous forme orale ou parentérale. Il va de soi que dans chaque cas le véhicule pharmaceutique sera adapté au mode d'administration envisagé. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été spécialement envisagées; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Sorbine pure, caractérisée par un poids moléculaire de l'ordre de 22.500 possédant la propriété de provoquer un accroissement de l'absorption de l'eau et du sodium par les muqueuses intestinales ou la vésicule biliaire. 2. Sorbine pure selon la revendication 1, caractérisée par les teneurs relatives suivantes en acides aminés (nombre d'acides aminés relatif, tel que déterminé expérimentalement) : lys 17,1 his 8,5 arg 14,0 asp 23,9 thr 16,0 ser 19,7 glu 15,6 pro 27,0 gly 5,2 ala 12,1 val 8,9 met 4 ou 5 ile 3,0 leu 6,6 tyr 10,1 phe 5,2 3. Peptide constitué par les fragments suivants > M.R.Â.A.T.P.L.Q.T.V.D.R.P.K.D.T.Y.K.T.M.F.K.Q.I.H.N.V.H.K. .P.D.D.D.T.M.... M.Y.N.T.P.Y.T.Y.N.A.G.L.Y.N.S.P.Y.S.A.Q.S.H.P.A.A.K.T.Q. T.Y.R.P. L.S.(R ou K)... D.A.S.S.P.V.P.P.P.H.V.P.P.P.V.P.P.L.R. K.V.P.F.R. S.A.K.E.H.E.T.K. T.Q.L.P.R.Y.T.S.K. S.H.S.D.N.G.T.D.A.F.K. K.H.D.R.D.P.PD.R.K.V.D.T.R.K.F.R.S.E.p.R.S.I.F.E.Y.E.p. G.K.S.S.I.L.Q.H.E.R.P.V.T.K.P.Q.A-NH2 4. Peptide responsable de l'activité de la molécule entière en ce qui concerne l'absorption d'eau et des électrolytes P.P.D.R.K.V.D.T.R.K.F.R.S.E.p.R.S.I.F.E.Y.E.p.G.K.S.S.I L.Q.H.E.R.P.V.T.K.P.Q.A-NH2 5. Composition pharmaceutique contenant une dose efficace d'un peptide conforme a l'une quelconque des revendications I à 4 avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.