FR 2599756 A1 19871211 FR 8608408 A 19860610 "MITOGENES STREPTOCOCCIQUES SPECIFIQUES DES LYMPHOCYTES T4, LEUR APPLICATION A LA STIMULATION DE LA PRODUCTION DE VIRUS LAV" L'invention concerne l'application de mitogènes streptococciques à la stimulation de lymphocytes T4 infectés ou infectables par le virus LAV considéré comme étant l'un des agents étiologiques des syndromes de lymphadénopathie (SLA) et du syndrome d'immunodéficience acquise ou encore SIDA, ou encore à la stimulation de lignées cellulaires permanentes dérivées de ces lymphocytes T4. En d'autres termes, l'invention concerne plus particulièrement l'application de ces mitogènes streptococciques à la stimulation de l'éventuelle production de virus LAV par ces lymphocytes T4 ou ces lignées cellulaires, dès lors qu'ils sont infectés par ce virus. On savait déjà, depuis quelques années, que des liquides surnageant de culture de streptocoques du groupe A possédaient des propriétés mitogéniques sur les lymphocytes sanguins de l'homme, du lapin, du cochon d'inde et de la souris, ainsi que sur les thymocytes et les splénocytes de ces animaux. (J. Lab. Clin. Immunol. 2 155-163 (1979)). La purification des liquides surnageants de milieux de cultures de Streptococcus pyogenes (notamment souche de Streptococcus pyogenes S 84 Griffith référencé sous le numéro 9994 du catalogue de la N.C.T.C (National Collection of Type Cultures, Central Public Pealth Laboratory, Colindale Avenue London, NW9 sHT3)a permis d'isoler trois fractions nommées Y , , correspondant à des protéines caractérisées par leur poids moleculaires de l'ordre de 72 000, 30 000 et 17 000 respectivement et leurs points isoélectriques, qui sont respectivement 4,2 - 4,8 et 10,3 mesurés dans les conditions décrites dans l'article de CAVAILLON et al, Immunology Letters, 5 : 317-322 (1982). En outre ces fractions mitogènes n'interagissent pas avec les positions F C des IgG, egalement dans les conditions décrites dans ce dernier article. Ces trois fractions pos sèdent des propriétés mitogéniques sur les lymphocytes T humains à de très faibles doses(nJ0,1 à 2 pg), et sont connues pour être douées de certaines propriétés immunologiques qui les rendent capables d'induire l'interféron (Immunol. Letters 5 : 323-326 (1982)) ou de permettre une immunomodulation et une activation polyclonale de la réponse immunitaire in vitro (Cell. Immunol, 76 : 200-206 (1983)). La fraction mitogene la plus efficace correspond a la fraction X (PN-30 K Dal) qui a été identifiée comme étant la toxine erythrogénique (ou pyrogenique) responsable de la scarlatine toxine qui sera ci-apres appelée toxine scarlatineuse pour la commodité du langage. L'invention découle d'abord de la découverte que ces mitogènes streptococciques stimulent préférentiel lement la division des lymphocytes T4, dont on sait qu'ils constituent la cible principale du virus LAV. Certes il est connu que d'autres substances douées de propriétés mitogènes à l'égard des lymphocytes T, parmi lesquelles figurent essentiellement les lectines d'origine végétale, telles que la concanavaline A, la phytohemagglutine (PHA), pouvaient exercer une action de stimulation de la production in vitro de virus LAV par des lymphocytes T4, (aussi connus sous la désignation "cellule Leu-3+" > .îl s'agit plus particulièrement des lymphocytes qui possèdent une glycoprotéine de surface (appelée "antigène T4" ou encore "protéine T4" ) de 62 k Dal, spécifiquement reconnue par des anticorps mono clonaux, par exemple ceux commercialisés par la firme ORTHO Pharmaceutical Corporation, sous la désignation OKT4.Cette protéine T4 forme la cible principale du virus LAV (BARRE SINOUSSI et al ; Science 225 : 59-63 (1984) et KLATZMAN -et al,Nature (London) 317 : 395-403 (1984). L'application de la PHA pour la stimulation de lymphocytes T4 in vitro utilisés pour la production de virus LAV a été décrite par ces auteurs. La production du virus LAV est appréciée par l'apparition de transcriptase inverse qui est alors secrétée dans le milieu de culture des lymphocytes. Les auteurs de la présente invention se sont aperçus que non seulement les mitogènes streptococciques stimulaient préférentiellement la transformation des lymphocytes T4, mais encore, qu'à cette action de stimulation sélective, s' ajoutait une amplification importante. de la production de virus LAV, lorsque ces lymphocytes T4 étaient le siège d'une activité virale. Alors que les fractions streptococciques se sont révélées exercer une activité stimulant la mitogénicité des lymphocytes T4 du même ordre de grandeur que celle de la PHA, il a été constaté que. le rendement en virus LAV produit était de l'ordre de trois à six fois supérieur à celui résultant de la stimulation induite par la PHA. En outre, le début de l'expression virale, détectée par l'intermédiaire de l'activité de transcriptase inverse dans le milieu de culture, se manifeste beaucoup plus rapidement que dans les systèmes antérieurs mettant en jeu des lymphocytes humains.Alors que l'on ne constate une apparition d'activité de transcriptase inverse qu'au bout de six jours, dans les conditions décrites dans l'article de BARRE SINOUSSI et al déjà mentionné, l'activité de transcriptase inverse s'observe dès le troisième jour lorsque la préparation mitogène utilisée est à base d'une fraction streptococcique, plus particulièrement de "toxine scalatineuse". L'invention concerne donc un procédé de stimulation de lymphocytes ou lignées cellulaires, porteur de récepteurs T4,infectés ou susceptibles d'être infectés avec le virus LAV, par mise en culture de ces lymphocytes ou lignées cellulaires dans des conditions permettant leur développement, et ce en présence de fractions mitogènes d'origine streptococcique, et par la détection de l'activité de transcriptase inverse observée et, le cas échéant,la récupération du virus LAV produit dans le milieu de culture. Dans l'un de ces premiers mode d'application, l'invention s'applique à une production de virus LAV avec des rendements accrus. Elle s'applique à la production de virus LAV, tant sur des cultures de lymphocytes frais non immortalisés, cultures qui doivent alors être périodiquement renouvelées, que dans des lignées cellulaires immortalisées ou permanentes portant les susdits récepteurs T4, par exemple des lignées du type CEM, HT, HUT, MOLT, etc. On mentionnera également d'autres types de lignées cellulaires infectables, teIs que ceux constitués de lymphocytes B transformés par le virus EPSTEIN-BARR, par exemple les lignées décrites dans la demande de brevet européen n" 165.120 I1 apparaîtra clairement à l'homme de métier que les conditions de culture peuvent dans chaque cas être conformes à celles décrites dans la littérature antérieure, si ce n'est que dansle cadre de la présente invention, l'agent mitogène utilisé consiste en une fraction streptococcique. D'une façon générale, l'invention est applicable à tout virus ayant un tropisme pour les lymphocytes T4, qui normalement tendent à les détruire et auxquels peut être attribué le développement sur l'homme de SLA ou de SIDA. En conséquence, l'expression LAV ne s'étend pas seulement à la culture de ceux des virus qui ont été désignés par cette abréviation par les équipes de recherche de l'Institut Pasteur, sous la direction du Professeur MONTAGNIER, mais également à la production des virus désignés par les abréviations HTLV III, tels qu'isolés par R.C. GALLO et al ; Science, 224, 500 (1984) ou par M.G. SARNGADHARAN et al ; Science, 224, 506 (1984), ou encore aux virus isolés par M. JAY LEVY et al ; Science, 225, 840-842 (1984), ce dernier type de virus ayant été désigné sous l'abréviation ARV. On peut également se référer à la demande de brevet europeen n" 138.667. déposée le 14.09.1984 pour ce qui est de la définition générale des virus concernés. Il doit être clair que dans ce qui suit l'expression LAV concerne tous ces types de virus. En ce qui concerne les fractions streptococciques susceptibles d'être mises en oeuvre, on peut avoir recours à des fractions mitogànes extractibles à partir des surnage Qn t s de streptocoques. A cet égard, on mentionnera, outre les fractions mitogènes des streptocoques du type Streptococcus pyogenes groupe A, visées dans l'article de CAVAILLON et al ; Immunology letters, 5 (1982) 317-322, d'autres souches de streptocoques du groupe A, par exemple ceux cités sous les abréviations NY 5 Dochez par Y. ABE et al, Infection and Immunity ; 29 : 814-818 (1980) > C 203S et C 203U, Richards 814, 594 par J.E Alouf (1980), et plus gé néralement toutes les souches de streptocoques des groupes A, C et G.Ces fractions mitogenes peuvent être utilises à différents niveaux de séparation. On peut mettre en oeuvre, soit des produits bruts, -snitdes produits semi-purifiés ou purifiés. On mentionnera au titre des produits bruts les produits extra-cellulaires libérés dans les milieux de cultures, dans lesquels avaient auparavant été culivées les souches de streptocoques mises en oeuvre. De préférence on aura recours à des produits mitogènes davantage purifiés, plus particulièrement à la toxine scarlatineuse. On peut également avoir recours à des mélanges de différents mitogenes, par exemple les fractions , , mentionnées plus haut, etc. De bonnes conditions de production sont obtenues lorsque la concentration en un mit ogene streptococciqu-e varie de 0,1 à 2 llg/2.10 cellules, par ml de milieu de culture. En outre, il est avantageux d'opérer en présence de cellules auxiliaires non-T, étant entendu que l'on désigne sous cette expression des monocytes du sang périphérique humain ou d'autres tissus et organes. De préférence, l'infection des lymphocytes est également faite en présence, non seulement de l'un au moins des susdits mitogènes streptococciques, mais aussi de 5 à 7 % de cellules auxiliaires non-T par 2. îo6 lymphocytes T4. L'efficacité de la stimulation de l'activité virale par les fractions streptococciques leur ouvre un domaine d'application supplémentaire, celui du diagnostic in vitro de la présence effective du virus LAV dans les lymphocytes d'un porteur d'anticorps anti-LAV, même si ce n'est qu'à l'état "latent" ou du premier stade de son incubation chez le porteur, lorsque la maladie ne se manifeste pas encore par des symptômes cliniques. En particulier, on sait que les malades atteints du SIDA ou d'un pré-SIDA évolutif ne constituent vraisemblablement qu'une proportion minoritaire des personnes chez lesquelles des anticorps anti-LAV ont été détectés. Or il n'est pas à cé jour possible de distinguer parmi les porteurs asymptomatiquestceux dont les lymphocytes s'avèrent en fait être totalement débarrassés du virus, voire même de séquences d'ADN lysogénisées correspondant à 1'ARN viral,et ceux dont les lymphocytes sont infectés et/ou vraisemblablement infectés et qui pourraient, au bout d'une certaine durée d'incubation, développer un SLA ou un SIDA. On ne peut même pas distinguer dans la dernière catégorie de porteurs, ceux chez qui le virus a commencé à se multiplier. Un des buts de la présente invention est donc de fournir les moyens permettant de déterminer le niveau d'activité virale dans lequel se trouve levirus LAV chez des individus atteints de pré-SIDA et permettant ainsi la discrimination, parmi les individus susmentionnés, entre ceux qui risquent à plus ou moins court terme de développer la maladie SIDA et ceux qui ne sont pas toujours menacés à brève échéance, voire même pas menacés du tout. On conçoit qu'une telle discrimination aura pour conséquence un meilleur suivi de la surveillance et du traitement chez les premiers et la suppression d'un facteur d'angoisse important chez les seconds. C'est dans le cadre de cette application que l'invention tend à mettre à profit le pouvoir hautement stimulant des fractions streptococciques. En conséquence, l'invention concerne un procédé de diagnostic in vitro de la présence dans les lymphocytes d'une activité virale potentielle ou au contraire de l'absence de cette activité potentielle. Le procédé selon l'invention comprend donc des étapes de cultures de lymphocytes et plus particulièrement des lymphocytes T4 obtenus à partir d'uln fluide biologique, notamment du sang obtenu à partir du patient soumis à diagnostic avec une fraction streptococcique du type sus-indiqué et, après un temps d'incubation suffisant à induire la manifestation d'une activité transcriptase inverse (ou de toute autre manifestation témoignant de l'activation ou de la production par lesdits lymphocytes de virus LAV), à détecter ladite activité inverse transcriptase ou l'autre manifestation appropriée correspondante. Comme dans le cas de la production du virus, la mise en oeuvre de ce procédé de diagnostic implique de préférence la présence de 1 a 5 pg/ml de fractions streptococciques, notamment de toxine scarlatineuse par ml de milieux de culture. . L'invention met donc à profit le pouvoir sti mulant particulièrement élevé des fractions streptococ ciques pour activer ion vitro les virus latents éventuel lement présents dans les lymphocytes étudiés, ou pour provoquer la "délyzogénisation" des éventuels acides nucléiques dérivés du génome du virus LAV. S'il y a lieu, il conviendra de vérifier que le virus produit appartient bien à la famille du LAV. Le cas échéant il peut être cultivé et lysé Les extraits peuvent alors être mis à réagir avec des anticorps anti-LAV de référence. La détection d'une réaction immunologique signera alors l'appartenance du virus produit à la famille des virus LAV. La production d'une activité transcriptase inverse témoigne donc d'une infection déjà évolutive ou au contraire du caractère latent d'une infection virale potentielle. L'absence de détection d'activité de transcriptase inverse ou de toute autre manifestation corrélable à la présence du virus ou de toute autre manifestation analogue, peut alors être corrélable vraisemblablement à l'absence de virus et par conséquent conduire à un pronostic favorable. I1 va de soi que la détection peut reposer sur toute autre prcFriété ou manifestation biologique du virus produit. Comme déjà indiqué p3us haut, des lysats de ces virus pourront éventuellement être déposés et fixés de façon en soi connue sur des membranes ou filtres, notamment de cellulose, puis mis au contact d'anticorps marqués spécifiques des protéines ou glycoprotéines du LAV. La rétention de l'anticorps marqué sur le filtre permet alors de conclure È un diagnostic positif, quant à la possibilité que le patient dont provenaient les lymphocytes étudiés soit menacé d'un SIDA. Les possibilités de l'invention pourront encore mieux être déduites de la description qui suit des conditions dans lesquelles l'effet de stimulation et d'amplification de la production de virus LAV a été mise en évidence, dans des cultures de lymphocytes infectées par le virus LAV. Au cours de cette descrption, il sera fait référence au dessin dans lequel :: - la figure 1 est représentative des résultats obtenus dans des essais de micro-culture de LAV sur différents types de lymphocytes et en présence de diverses préparations mitogènes, - la figure 2 fournit des courbes permettant la compa- raison des effets stimulants d'une préparation de SM d'une part et de PHA d'autre part à l'égard de la production de virus LAV par une suspension de cellules mononucléaires de sang non fractionnées et infectées avec le LAV, - la figure 3 représente de même les effets stimulants des mitogènes streptococciques sur la production de LAV par différents types de lymphocytes et - la figure 4 montre llinfluence sur la production de LAV des différentes fractions streptococciques et de leur mélange. Les mitogènes streptococciques utilisés dans ce qui suit ont été purifiés à partir de la souche de Streptococcus pyogenes, comme décrit dans J. Lab. Clin. Immunol. 2 : 155-163 (1975) et Immunol. letters 5 : 317-322 (1982), si ce ntest que le tamis moléculaire choisi pour la purification de la toxine récupérable à partir du milieu de culture était différent. La fraction récupérée après précipitation des surnageants de culture par une solution de sulfate d'ammonium saturé à 50 et 80 % a été filtrée sur une colonne (0,25 x 100 cm) du gel pour filtration commercialisé sous la marque de BIOGEL P-100 (Bio-Rad), équilibrée dans un tampon de PBS à pH 6,8, plutôt que dru gel pour filtration commercialisée sous la marque SEPHADEX G-100. La fraction correspondant au volume élué entre 160 et 240 ml a été collectée et concentrée par ultrafiltration sur une membrane filtrante commercialisée sous la désignation AMICON PM 10, cette membrane autorisant le passage des molécules ayant un poids moléculaire inférieur à environ ]0 000.Les fractions non diffusiblesà travers le filtre constituent ainsi la przpa- ration des mitogènes streptococciques purifiés (MS) (20 mg de protéines par ml) qui a été utilisée dans les expériences qui ont suivi. Cette préparation a été soumise à une migration isoélectrique préparative comme décrit dans la dernière publication susmentionnée, ce qui a conduit à l'isolement de trois fractions mitogéniques , PAGE). La -propagation du virus LAV a été réalisée sur des lymphocytes T totaux ou fractionnés f à partir de sang périphérique de deux donneurs adultes sains, qui ne présentaient pas d'anticorps contre le virus et dont les lymphocytes ne relarguaient pas spontanément le virus (comme on peut le déterminer par mesure de l'activité du type transcriptase inverse (RT))ou qui n exprimaient pas de protéines virales . Les cellules mononuléaires du sang périphérique (CMP) ont été isolées par centrifugation sur un gradient de densité connue sous la désignation FICOLL-HYPAQUE, stockées et congelées à -196 C dans l'azote liquide, comme décrit dans Nature (London) 312 : 767-771.Avant utilisation, les cellules ont été décongelées dans un bain à 37"C, puis lavées et incubées à 37"C dans un milieu de culture pendant une heure, avant d'être comptées et ajustées à des concentrations appropriées (Nature (London) 312 : 767-771). Une suspension enrichie en lymphocytes T a été obtenue après des opérations comprenant un épuisement des monocytes par adhérence sur plastique, la formation de rosettes en présence d'érythrocytes de mouton traités avec l'aminoethylisothiouranium, puis une centrifugation sur gradient FICOLL HYPAQUE (Science 225 : 59-63).En.moyenne, les suspensions enrichies en cellules T contenaient plus de 90% de lymphocytes T avec 5 à 7% de cellules contaminantes alors que les préparations de cellules non-T (NT) comprenaient 5 à 6% de cellules T et un mélange de nombre sensiblement égal de cellules B et de monocytes. Les lymphocytes T4 et T8 purifiés (ou lymphocytes CD4+ et CD8+) ont été obtenus par chromatographie d'affinité cellulaire, tel que décrit dans Science 225 : 59-63. L'infection virale des cellules cibles a été réalisée comme il est décrit dans la publication citée cidessus, avec quelques modifications. 5 106 cellules ont été cultivées à 37"C dans une atmosphère contenant 5% de CO2 en présence, soit de 1% de PHA-M (DIFCO), soit de différentes concentrations de préparation SM purifiée ou des fractions Y , t et & dans un milieu RPMI 1640 (GIBCO) auquel avaient été additionnés 10% de sérum de veau foetal. Après trois jours, les cellules ayant sédimenté ont été remises en suspension dans un milieu de culture ne contenant pas de mitogènes mais de l'interleukine-2 (IL-2), du sérum anti- g interféron et du polybrène (Science 220 : 868-871).La préparation de virus LAV (titre en RT du supernageant : 50 000 cpm) a été ajoutée au milieu. Après trois jours, les cellules ont été centrifugées afin d'enlever le virus non adsorbé et remises en suspension dans le milieu de culture. Tous les trpis jours, les cellules on-t été centrifugées (sédimentées) et remises en culture dans le supernageant ne contenant pas de cellules dans les conditions de la dernière publication susmentionnée. Des expériences de prolifération cellulaire en micro-culture de différentes préparations de lymphocytes, réalisées en présence de MS (fig. 1) ont montré que les lymphocytes T4 étaient préférentiellement stimulés par rapport aux lymphocytes T8. Cette stimulation nécessite la présence de cellules auxiliaires non-T. La comparaison des effets obtenus avec la préparation de MS, par rapport à ceux obtenus avec la PHA sur la producticn de virus LAV par une suspension de cellules périphériques mononucléaires du sang infectées par ce virus (fig. 2) dans les conditions rappelées ci-après, montre que l'on cbtient un rendement plus élevé en activité RT en présence de MS que de PHA. L'activité en présence des MS, ainsi que le titre optimal en RT apparaissent plus tôt que ceux obtenus avec la PHA et déclinent moins rapidement. Les rendements en RT, obtenus à partir de surnageant de milieux de culture de lymphocytes T4 et et de lymphocytes T8, sont bien supérieurs - pour les cultures de lymphocytes T4 - en présence de MS (environ 10 fois) qu'en son absence. On obtient un maximum d'activité, plus de deux fois plus élevé que dans le cas où la stimulation de ces lymphocytes est effectuée en présence de PHA. Aucun effet significatif de ces deux mitogènes sur la production du LAV à partir de lymphocytes T8 n'a été observé. L'activité RT est réduite d'environ 50% dans les mélanges de lymphocytes T4 et T8 (5.106 pour chaque classe de cellules) stimulés par la préparation MS en comparaison avec les lymphocytes T4 seuls. Les PBM, cellules périphériques mononucléaires du sang, infectées par le LAV et stimulées par les fractions purifiées X , t et i ou par leurs mélanges (fig. 4), présentent également de bons rendements en activité RT, sans différence significative entre ces trois mitogènes. Les observations qui précèdent et dont remarquent les figures 1 à 4 ont été réalisées comme suit - La figure 1 se rapporte à 1 1essai de prolifération en microculture en présence de mitogènes streptococciques. Les cellules de chaque population (2 x 106/ml) ont été incubées seules ou en combinaison (50 pl) dans les puits d'une plaque de microtitrage. avec 5 pg (dose optimale) d'une préparation de mitogènes streptococciques dans 100 pi du milieu de culture à 37 C dans une atmosphère contenant 5% de CO2 pendant six jours avant la mesure de l'incorporation de H-thymidine pCi ajoutée 8 heu res avant la récolte des cellules).Les valeurs corres pondent aux moyens (essais répétés trois fois) (A) cellules périphériques mononucléaires totales du sang, (B) cellules T enrichies, (C) cellules CD4 + T, (D) cel lules CD8+ T, (E) T + NT, (F) T + * (G) CD4+ + NT, * (H) CD4+ + NT, (I) CD8+ + NT, (J) CD8+ + NT (K) NT, (L) NT + T , (M) NT + CD4+*, (N) NT + CD8+*. (*) cellules irradiées 20-Gy. - La figure 2 témoigne de la production de LAV mesurée par détermination séquentielle de l'activité transcriptase inverse (RT) dans les surnageants de cellules mononu cléaires périphériques non fractionnées par des prépara tions de mitogènes streptococciques à une concentration optimum de 5 pg/ml (coube a) ou par une préparation de PHA-M à 1% (courbe b). - La figure 3 se rapporte à la production de LAV dans les conditions sus-indiquées par des cellules CD4+ T (cour be c), des cellules CD8+ T (courbe d) et des mélanges de cellules CD4+ + CD8+ T (courbe e),-respectivement sti mulées par des mitogènes streptococciques et par la - PHA (courbes e et f). - Enfin la figure 4 est relative à la production de LAV par les cellules mononucléaires non fractionnées, par 2.5 pg (dose optimale) en présence des fractions streptococciques &alpha; (courbe j), # (courbe k), # (courbe 1) et du mélange des trois (courbe m). Les documents dont les références suivent doivent être considérés comme contribuant, en tant que de besoin, à la description de l'invention. 1. ALOUF J.E. et al (1977) Ann. Immunol. Inst. Pasteur ]28 C : 37-39. 2. ALOUF J.E. (1980) Pharmac. Therap. il : 661-717. 3. ABE, Y., et al (1980) Infect. Immun. 29 : 814-818. 4. BARRE-SINOUSSI, et al, (1983), Science 220 : 868-871. 5. BARSUMIAN E.L., et al (1978), Infect. Immun. 22 681-688. 6. CAVAILLCN, J.-M., et al (1979), J. Lab. Clin. Immunol 2 : 155-163. 7. CAVAILLON, J.-M., et al (1982), A. Immunol. Letts 5 317-322. 8. CAVAILLON, J.-M., et al (1982), Immunol. Letts 5 323-326. 9. CAVAILLON, J.-M., et al (1983), Cell Immunol. 76 200-206. 10..DALGLEISH, A.G., et al (1984), Nature (London) 312 763-767. ll: FEORINO, P.M., et al (1984), Science 225 : 69-72. 12. FOLKS, T., et al (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 4539-4543. 13. GALLO, R.C., et al (1984), Science 224 : 500-502. 14. GOTTLIEB, M.S., et al (1981), N Engl. J. Med. 305 1425-1431. 15. KLATZMANN, D., et al (1983), Transplantation 35 332-338. 16. KLATZMANN, D., et al (1984), Nature (London) 312 767-771. 17. KLATZMANN, D., et al (1984), Science 225 : 59-63. 18. KNOLL, H., et al, Zblt. Bakt. Hyg. A256 49-60. 19. LANE, H.C., et al (1985), Ann. Rev. Immunol. 3 477-500. 20. MONTAGNIER, L., et al (1984), Science 225 : 63-66. 21. MONTAGNIER, L., et al (1984), Cold Spring Harbor Laboratory, New-York. 22. PARISH, W.E., (1971), Clin. Allergy 1 : 295-309. 23. POPOVIC, N., et al (1984),- Science 224 : 497-500. 24. QUAGLIATA, F., et al (1982), Cell. Immunol. 68 146-154. 25. REGELMANN, W.E., et al (1982), J. Immunol. 128 1631-1636. 26. WEISS, A., et al (1985), Ann. Rev. Med. 35 : 545-562. 27. WONG-STAAL, F., et al (1985), Nature (London) 317 395-403. REVENDICATIONS 1. Procédé pour stimuler la production de virus LAV par des populations cellulaires contenant des cellules porteuses de récepteurs T4, lorsque ces populations sont affectées par le virus, caractérisé par la mise en culture de ces populations cellulaires dans des conditions permettant leur développement en présence de fractions mitogènes d'origine streptococcique et par la détection de l'activité de transcriptase inverse après un temps d'incubation adéquat et nécessaire à la production du virus. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration du milieu de culture en mitogènes streptococciques varie de 0,1 à 2 pg/2.106 cellules, de préférence par ml de milieu de culture. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la culture est effectuée en présence de cellules auxiliaires non-T, notamment de 5 à 7 % de cellules auxiliaires non-T par ml de milieu de culture. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'antigène streptococcique utilisé est constitué par la fraction purifiée. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la fraction mitogène streptococcique est constituée par la fraction purifiée. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la fraction mitogène streptococcique est constituée par la fraction purifiées, 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les fractions mitogènes utilisées sont formées par un mélange des fractions et X 8. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 à la production de virus LAV par des populations cellulaires infectables initialement saines, préalablement infectées avec le virus. 9. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 au diagnostic in vitro de l'existence ou non d'une menace potentielle ou du début de l'évolution d'une maladie pouvant aboutir au SIDA, comprenant la culturé de lymphocytes obtenus à partir de cette personne en présence de fractions streptococciques et la détection, après le temps nécessaire à l'incubation du virus- éventuellement présent, de l'activité reverse transcriptase qui lui serait alors liée.