FR 2601689 A1 19880122 FR 8710142 A 19870717 Dans cette demande, plusieurs publications sont citées en références au moyen de nombres en chiffres arabes placés entre parenthèses. Les citations complètes de ces références peuvent être trouvées à la fin du mémoire descriptif, immédiatement avant les revendications. Les mentions de ces publications dans leur intégralité sont ainsi citées en référence dans cette demande afin de décrire plus en détail l'état actuel de la technique à laquelle cette invention appartient. L'apparition des techniques concernant 1'ADN recombinant a rendu possible la manipulation des séquences d'ADN naturelles dans un organisme (le génome) afin de modifier d'une certaine manière les fonctions de l'organisme par genie génétique. La présente invention concerne des organismes définis comme des virus qui infectent des animaux et contiennent comme matériel génétique de 1'ADN ; plus précisement, des virus appartenant au groupe des virus de l'herpès (herpès virus) (23). Ce groupe de virus comprend un certain nombre d'agents pathogènes qui infectent et provoquent une maladie chez un certain nombre d'espèces- cibles : les porcs, les bovins, les poulets, les chevaux, les chiens, les chats, etc.Chaque herpès virus présente une spécificité pour son espèce hôte, mais tous sont apparentés par la structure de leurs génomes, leur mode de réplication et, dans une certaine mesure, par la pathologie qu'ils provoquent dans l'animal hôte et par le mécanisme de la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection virale. Les types de manipulations génétiques qui ont été effectuées sur ces herpès virus consistent en le clonage de parties de 1'ADN viral dans des plasmides présents dans des bactéries, en la reconstruction de 1'ADN viral lors du clonage afin que 1'ADN présente des délétions de certaines séquences, et, en outre, en addition de séquence d'ADN étranger à la place des délétions ou au niveau des sites enlevés des délétions Le procédé habituel consiste à préparer des insertions de l'ADN étranger dans les séquences virales, bien que 1'ADN étranger puisse être fixé tout aussi bien à l'extrémité de l'ADN viral.Un objectif de l'addition de séquences étrangères est atteint lorsque la séquence étrangère code pour une protéine étrangère dont l'ex- pression s1 effectue au cours de l'infection viralede l'animal. Un virus présentant ces caractéristiques est désigné sous le nom de vecteur, car il devient un vecteur vivant qui véhicule et exprime la protéine étrangère dans l'animal. En effet, il devient un système élaboré de production de la protéine étrangère. L'art antérieur concernant la présente invention découle tout d'abord de l'aptitude à cloner et à analyser l'ADN lorsqu'il est dans les plasmides bactériens. Les techniques qui sont disponibles sont pour la plupart décrites en détail par Maniatis et collaborateurs (1). Cette publication présente les techniques modernes générales concernant 1'ADN recombinant. L'application des techniques d'ADN recombinant aux virus des animaux possède une histoire relativement récente, remontant à environ 1980. Les premiers virus soumis à des manipulations génétiques ont été les plus petits - les papovavirus. Ces virus contiennent 3000 à 4000 paires de bases (pb) d'ADN dans leur génome. Leur petit diamètre rend l'analyse de leurs génomes relativement aisée et, en fait, la plupart des virus étudiés (SV40, polyome, papillome bovin) ont été entièrement séquencés. Ces particules virales étant petites et ne pouvant intégrer beaucoup d'ADN étranger, et leur ADN étant constitué principalement de séquences indispensables (c'est-à-dire des séquences nécessaires à la réplication), il nta pas été possible d'utiliser en génie génétique ces virus sous forme de vecteurs vivants destinés à l'expression de gènes étrangers.Ils ont été utilises dans leur intégralité en génie génétique sous forme d'unités de réplication défectives pour l'expression de gènes étrangers dans des cellules animales en culture (approximativement analogues aux plasmides dans des systèmes bactériens), ou bien ils ont été utilisés dans des populations mixtes de virions dans lesquelles le virus de type sauvage sert d'aide pour le virus qui a remplacé un morceau essentiel d'ADN par un gène étranger. Les études sur les papopavirus ne suggèrent ni ne mentionnent le concept de vecteurs viraux vivants servant de systèmes de distribution pour des animaux hôtes. Les virus animaux les plus gros suivants contenant de l'ADN sont les adénovirus. Dans ces virus, il existe une petite quantité d'ADN non essentiel qui peut être remplacée par des séquences étrangères. Les seuls gènes étrangers qui semblent avoir été exprimés dans les adénovirus sont les gènes de l'antigène T provenant des papovavirus (2,3,4,5), et le gène thymidine-kinase du virus de l'herpes simplex (28). Il est possible, étant donné ce succes initial, d'envisager l'insertion d'autres petits gènes étrangers dans les adénovirus. Cependant, les techniques utilisées dans les adénovirus n'enseignent pas la manière d'obtenir le même résultat avec les herpès virus. En particulier, ces résultats ne permettent pas l'identification des régions non essentielles dans les herpès virus dans lesquelles de l'ADN étranger peut être inséré,pas plus qu'ils n'enseignent la manière de parvenir à l'expression des gènes étrangers dans les herpès virus, par exemple quels sont les signaux.de promoteurs et les signaux de terminaison à utiliser. Un autre groupe de virus d'animaux qui ont été soumis à des manipulations génétiques sont les poxvirus. Un représentant de ce groupe, le virus de la vaccine, a été ltobjet de recherches importantes sur l'expression de gènes etrangers. Les poxvirus sont de gros virus contenant de l'ADN dont la réplication s'effectue dans le cytoplasme des cellules infectées. Ils possèdent une structure qui est très exceptionnelle parmi les virus - ils ne contiennent aucune capside qui soit bisée sur une symétrie icosaédrique ou une symétrie hélicoidale. Dans les théories émises sur l'origine des virus, les poxvirus sont les virus les plus susceptibles d'être issus de micro-organismes analogues à des bactéries par la perte de leur fonction et dégénérescence. En partie à cause de ce caractère remarquable, les progrès effectués dans la manipulation génétique des poxvirus ne peuvent être directement extrapolés à d'autres systèmes viraux, comprenant les herpès virus. Des constructions de virus recombinants de la vaccine ont été effectuées dans un certain nombre de laboratoires, constructions qui permettent l'expression des gènes étrangers insérés suivants : gène thymidine-kinase du virus de l'herpès simplex (6,7), antigène de surface de l'hépatite B (8,9,29), gène glycoprotéine D du virus de l'herpès simplex (8,29), gène hémagglutinine de l'influenza (10, 11), gène de l'antigène de malaria (12), et gène glycoprotéine G de la stomatite vésiculaire (13). Les caractéristiques globales générales des travaux effectués sur l'ADN recombinant du virus de la vaccine sont similaires à celles des techniques utilisées pour tous les virus, notamment par le fait qu'elles s'apparentent aux techniques indiquées dans la référence (1).Cependant, dans le détail, les techniques concernant le virus de la vaccine n'ensei gnent pas la manière de soumettre les herpès virus à des manipulations génétiques. L'ADN du virus de la vaccine n'est pas infectieux, aussi l'incorporation d'ADN étranger doit comprendre une étape d'infection/ transfection qui ne soit pas appropriée aux autres virus, et le virus de la vaccine possède des caractéristiques de stabilité remarquables qui rendent sa sélection plus aisée. En outre, la séquence-signal utilisée par les promoteurs dans le virus de la vaccine est unique et ne fonctionne pas dans d'autres virus. L'utilité de la vaccine comme vecteur d'un vaccin est remise en question en raison de sa parenté étroite avec la variole humaine et de sa pathogénicité connue pour l'homme. L'utilisation d'herpes virus spécifiques d'un hôte s'annonce comme étant une meilleure solution pour la vaccination animale. L'ADN constituant le materiel génétique des herpès virus contient 100 000 à 150 000 paires de bases, et plusieurs régions du génome qui sont .facultatives pour la réplication in vitro du virus en culture de cellule ont été identifiées. On sait que des modifications de ces régions de l'ADN diminuent la pathogénicité du virus, c'est-à-dire atténuent le virus, pour une espèce animale. Par exemple, l'inactivation du gène thymidine-kinase rend le virus de l'herpès simplex humain non pathogène (45), et le virus pseudorabique du porc non pathogène (46 et 47). L'élimination d'une partie de la région de répétition rend le virus de l'herpès simplex humain non pathogène (48 et 49). Une région de répétition a été identifiée dans le virus de la maladie de Mare, qui est liée à une oncogénicité virale (50). Une corrélation a été établie de manière similaire entre une région dans le virus herpes saimiri et l'oncogénicité (51). Cependant, des modifications dans ces régions de répétition n'apportent pas d'enseignement sur la construction de virus pseudorabiques atténués présentant des délétions dans les séquences de répétition. Le degré d'atténuation d'un virus est important dans l'utilité du virus en tant que vaccin. Des délétions qui provoquent une trop grande atténuation du virus ont pour résultat un vaccin qui est incapable d'obtenir une réponse immunitaire adéquate. On sait que les herpès virus provoquent diverses infections latentes et récurrentes chez l'homme et d'autres vertébrés et infectent même un champignon et une rustre. Parmi les états associés aux infections à herpès virus se trouvent les boutons de fièvre provoqués par l'herpes simplex de type 1, l'herpès génital provoqué par l'herpes simplex de type 2, et la varicelle chez l'enfant et le zona chez l'adulte provoqués par une infection par le virus du zona. Le virus pseudorabique (VPR), un herpès virus de classe D, provoque la maladie de Aujesky, un trouble nerveux aigu et souvent fatal, chez les animaux domestiques et les animaux sauvages. Parmi les herpès virus, seul l'herpes simplex de l'homme et, à un moindre degré, l'herpes saimiri des singes ont été soumis à des manipulations génétiques pour incorporer des séquences d'ADN étranger, avant cette divulgation. Le travail le plus ancien sur la manipulation génétique du virus de l'herpes simplex comprenait la préservation de mutants du virus sensibles à la température en utilisant des fragments de restriction d'ADN purifiés (14). Ce travail ne comprenait pas le clonage des fragments d'ADN dans le génome viral. La première utilisation d'ADN recombinant pour manipuler le virus de -l'herpes simplex comprenait le clonage d'un morceau d'ADN de la région de jonction L-S dans la région longue unique de l'ADN, plus précisément dans le gène thymidine-kinase (15). Cet élément d'insertion n'était pas un morceau étranger d'ADN ; il s'agissait plutôt d'un morceau naturel d'ADN d'herpès virus qui était introduit par duplication à un autre endroit dans le génome. Ce morceau d'ADN n'était pas soumis à une manipulation génétique pour effectuer précisément l'expression d'une protéine quelconque et, ainsi, il n'apportait pas d'enseignement sur la manière d'effectuer l'expression d'une protéine dans les herpès virus. La manipulation du virus de l'herpes simplex comprenait ensuite la création de délétions dans le génome du virus par une association d'ADN recombinant et de sélection contre la thymidine-kinase. La première étape consistait à produire une délétion particulière du gène thymidine-kinase (16). L'étape suivante comprenait l'insertion du gène thymidine-kinase dans le génome à un site particulier, puis le gène thymidine-kinase et l'ADN voisin au nouveau site étaient. éliminés par délétion au moyen d'une sélection contre la thymidinekinase (17). De cette manière, le gène alpha-22 de l'herpes simplex a été éliminé par délétion (17). Dans le perfectionnement le plus récent de cette technique, une séquence d'ADN de 15 000 pb a été éliminée par délétion de la région interne de répétition du virus de l'herpès simplex (18). L'insertion de gènes qui codent pour une protéine dans des herpès virus de primates a compris sept cas : la réinsertion de la glycoprotéine C du virus de l'herpes simplex dans un mutant naturel par délétion de ce gène dans le virus de l'herpes simplex (19) ; l'insertion de la glycoprotéine D du virus de l'herpes simplex de type 2 dans le virus de herpes simplex de type 1 (20), toujours sans aucune manipulation de promoteurs puisque le gène n'est pas réellement "étranger" ; l'insertion de l'antigène de surface du virus de l'hépatite B dans le virus de l'herpès simplex sous le contrôle du promoteur ICP4 du virus de l'herpès simplex (21) ; et l'insertion de l'hormone de croissance bovine dans le virus herpès saimiri avec un promoteur SV40 qui, en fait, n'intervenait pas dans ce système (un promoteur endogène en amont servait à la transcription du gène) (22). Deux cas supplémentaires de gènes étrangers (gène de l'ovalbumine du poulet et antigène nucléaire du virus d'Epstein-Barr) ont été insérés dans le virus de l'herpès simplex (30), et la glycoprotéine X du virus pseudorabique a été insérée dans le virus de l'herpès simplex (31). Ces cas limités de délétion et d'insertion de gènes dans les herpès virus démontrent qu'il est possible de soumettre à des manipulations génétiques des génomes d'herpès virus par des techniques d'ADN recombinant. Les procédés qui. ont été utilisés pour insérer les gènes comprennent une recombinaison homologue entre l'ADN viral cloné sur des plasmides et l'ADN viral purifié introduit par transfection dans la mème cellule animale. Dans l'ensemble, cela est désigné sous le nom de la technique de recombinaison homologue. Cette technique, avec des modifications mineures, a pu être adaptée à d'autres herpès virus que l'on a soumis à des manipulations génétiques. Cependant, le degré auquel on peut généraliser l'emplacement de la délétion et les sites d'insertion de gènes étrangers n'est pas évident d'après ces études antérieures. De plus, il n'est également pas évident que des herpès virus d'animaux autres que des primates soient susceptibles d'être soumis aux mêmes techniques que les herpès virus de primates, et que l'on puisse établir une voie déterminée pour la délétion, l'insertion et l'expression de gènes étrangers. Le virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine (RIB), un herpès virus alpha ayant un génome de classe D, est un agent pathogène important des bovins. Il a été associé à des maladies respiratoires, oculaires, de l'appareil reproducteur, du système nerveux central, entériques, néonatales et cutanées (37). Les bovins sont les hôtes habituels du virus RIB; cependant, celui-ci infecte également les chèvres, les porcs, les buffles kérabau , les gnous, les visons et les furets. Des infections expérimentales ont été effectuées chez les cerfs à queue noire, les chèvres, les porcs, les furets et les lapins (38). Des vaccins à virus vivant modifiés classiques ont été largement utilisés pour lutter contre des maladies provoquées par le RIB. Ces virus des vaccins peuvent présenter, cependant, une réversion de virulence. Plus récemment, des vaccins à virus RIB tué ont été utilisés, mais leur efficacité se révèle marginale. Le RIB a été analysé au niveau moléculaire de la manière étudiée dans (39). Une carte de restriction du génome est disponible dans cette référence, qui facilitera la manipulation génétique du RIB suivant les procédés proposés par la présente invention. Il n'a été présenté aucune preuve que le RIB a été soumis à une manipulation génétique afin de contenir une délétion ou une insertion d'ADN étranger. Le virus de la maladie de Marek (VMM) provoque une paralysie de la volaille, une maladie lymphoproliférative courante chez les poulets. La maladie survient le plus souvent chez de jeunes poulets âgés de 2 à 5 mois. Les signes cliniques caractéristiques sont une paralysie progressive d'une ou plusieurs des extrémités, une incoordination due à une paralysie des pattes, un affaissement des membres dt à une atteinte des ailes, et un affaissement de la tête dû à une atteinte des muscles du cou. Dans les cas aigus, des affaissements graves peuvent survenir. Dans le cas des souches extrêmement oncogènes, il existe une atrophie caractéristique des bourses et du thymus. En outre, il existe des tumeurs lymphoides affectant les gonades, les poumons, le foie, la rate, les reins et le thymus (37). Tous les poussins sont vaccinés contre le VMM à l'âge d'un jour afin de les protéger leur vie durant contre le VMM. Une méthode de vaccination contre le VMN comprend l'utilisation d'herpès virus de dindon (HVD). Il sera.it avantageux d'incorporer d'autres antigènes à cette vaccination à l'âge d'un jour, mais les efforts pour associer des vaccins n'ont pas donné de résultats satisfaisants à ce jour en raison d'une compétition et d'une immunosuppression entre les agents pathogènes. Les vaccins multivalents produits par génie génétique dans la présente invention constituent une voie nouvelle pour la vaccination simultanée contre un certain nombre d'agents pathogènes différents. Une carte de restriction du VMM (43) et du HVD (34) est disponible dans la littérature. Il n'existe aucune preuve suggérant que quelqu'un a provoqué avec succès une délétion ou une insertion d'ADN étranger dans un VMM ou un HVD avant cette description. D'autres herpès virus considérés comme convenant pour ces modes opératoires sont l'herpès virus félin (HVF), l'herpès virus équin (HVE), et l'herpès virus canin (HVC). Ces agents pathogènes provoquent une maladie chez chacun de leurs hôtes- respectifs. L'herpès virus félin provoque une rhinotrachéite féline, une infection aiguë du tractus respiratoire supérieur caractérisée par une fièvre, des éternuements prononcés, des sécrétions nasales et lacrymales et une dépression. Le virus peut provoquer une ulcération de la cornée et un avortement. Les voies et les cornets du nez présentent des foyers de nécrose, et les amygdales sont hypertrophiées et hémorragiques. L'herpès virus équin provoque une rhinopneumonie, un avortement, un exanthème des organes génitaux et, occasionnellement, des troubles neurologiques. La maladie aiguë est caractérisée par une fièvre, une anorexie et un écoulement nasal séreux abondant. Les symptômes neurologiques, lorsqu'ils sont présents, consistent en une ataxie, une faiblesse et une paralysie. L'herpès virus canin provoque une maladie grave chez les chiots, chez lesquels la mortalité peut atteindre 80 %. La maladie est caractérisée par une virémie, une anorexie, des troubles respiratoires, des douleurs abdominales, des vomissements et des cris incessants.En général, il n'y a pas de fievre. Les lésions principales sont une nécrose disséminée et des hémorragies dans les reins, le foie et les poumons. La biologie moléculaire concernant les herpès virus félin, équin et canin est dans sa phase initiale. Des cartes de restriction partielles sont disponibles pour l'herpès virus équin, et des progrès sont eff-ectués dans au moins un laboratoire pour l'herpès virus félin. Au-delà de ce type d'analyse de génome, aucune preuve de la délétion ou de l'insertion de gènes étrangers dans ces virus n'est disponible. La présente invention comprend l'utilisation d'herpès virus soumis à des manipulations génétiques afin de protéger des animaux contre une maladie. La nature des délétions dans les herpès virus servant à atténuer le virus au degré convenable n'est pas évidente. Même l'essai de canditats-vaccins chez des modèles animaux, par exemple la souris, ne constitue pas une prédiction convenable de l'inocuité et de l'efficacite du vaccin chez l'espèce animale servant de cible, par exemple le porc Un autre objectif de la présente invention est un vaccin contre la maladie à virus pseudorabique du porc (herpes virus suis, herpes virus 1 suid ou virus de la maladie de Aujesky). Le porc est l'hotte naturel du virus pseudorabique, l'infection étant fréquemment inapparente chez les animaux âgés mais pouvant être caractérisée par une fièvre, des convulsions et la mort, en particulier chez les animaux plus jeunes. Le virus pseudorabique infecte également les bovins, les moutons, les chiens, les chats, les furets, les renards et les rats (37), chez lesquels l'infection provoque habituellement la mort. La mort est habituellement précédée par un prurit intense, une folie, une encéphalite, une paralysie et un coma. Des vaccins vivants traditionnels sont disponibles pour l'utilisation chez le porc, mais ils sont létaux pour les autres animaux. Un vaccin amélioré pour la pseudorage induirait une réponse immunitaire plus fiable chez le porc, serait atténué de manière précise afin d.'être incapable d'une réversion de virulence, et ne provoquerait pas de maladie chez d'autres hôtes. Le virus pseudorabique, un herpès virus alpha du porc, possède un gène de classe D (23) ; c'est å-dire qu'il contient deux copies d'une seule région de répétition. une située entre la région d'ADN longue unique et la région d'ADN courte unique et une au niveau de l'extrémité de la région courte unique (voir figure 1). Le virus de l'herpès simplex est un herpès virus alpha ayant un génome de classe E (23) ; c'est-à-dire qu'il contient deux copies de chacun des éléments de répétition. L'herpès saimiri est un herpès virus gamma ayant un génome de classe B ; c'est-à-dire qu'il contient de nombreuses répétitions de la même séquence aux deux extrémités (23).Ces différentes classes d'herpès virus présentant des différences importantes dans la structure du génome, et les différents virus attaquant différentes cellules dans leurs hôtes et provoquant des pathologies différentes, il est nécessaire dans chaque cas d'établir quelles régions particulières peuvent être éliminées afin d'obtenir une atténuation et quelles régions peuvent être modifiées pour obtenir l'expression de gènes étrangers. Le virus pseudorabique a été étudié en utilisant les outils de la-biologie moléculaire, comprenant l'utilisation des techniques d'ADN recombinant. Des cartes de restriction BamHI, KpnI et BgIII du génome viral ont été publiées (24, 27). Des procédés de transfection d'ADN ont été utilisés pour préserver des mutants du virus par délétion et sensibles à la température par le procédé de recombinaison homologue (24). Il existe deux exemples de délétions qui ont été produites dans le génome du virus pseudorabique - l'une est une délétion du gène thymidine-kinase (25), décrite également dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N" 4 514 497 intitulé "Modified Live Pseudorabies Viruses". Ce brevet apporte des enseignements seulement sur des délétions concernant la thymidine-kinase et ne suggère pas d'autres délétions d'atténuation, pas plus qu'il ne suggère l'insertion de séquences d'ADN étranger.L'autre référence concerne la délétion d'une petite séquence d'ADN aux environs d'un site de restriction HindîlI dans la région de répétition (26), sur laquelle est basé le brevet européen publié sous le N" 0141458, correspondant â la demande de brevet européen N" 84 201475.8, déposée le 12 Octobre 1984. Cette demande de brevet ne fait connaftre ni ne suggère des délétions d'atténuation, pas plus qu'il ne fait connaf- tre ou nesuggère l'insertion de séquences d'ADN dans le virus pseudorabique. La présente invention concerne des délétions qui ont été introduites dans le génome du virus pseudorabique à des sites précédemment non décrits. Des séquences d'ADN étranger ont été également introduites dans le génome du virus pseudorabique atténué et exprimées sous forme de protéines. Une forme de réalisation de la présente invention concerne un vaccin utile pour la prévention de la pseudorage et d'autres maladies porcines avec un seul inoculum. Le reste de la littérature concernant la pseudorage, mentionnée dans le présent mémoire, concerne la présence de délétions naturelles dans le génome de deux souches vaccinales de virus pseudorabiques (27). Ces délétions sont responsables, au moins en partie, de la nature atténuée de ces vaccins ; cependant, elles n'apparaissent pas dans une séquence de répétition et ne suggèrent pas l'atténuation du virus pseudorabique par délétion d'une portion d'une séquence de répétition. Ces délétions naturelles n'apportent pas d'enseignement sur des procédés de production de ces délétions en partant d'ADN de virus pseudorabique de type sauvage, pas plus qu'elles ne suggèrent d'autres endroits où produire des délétions d'atténuation. Il n' existe aucun exemple d'insertions naturelles d'ADN étranger dans des herpès virus. L'hôte naturel du virus pseudorabique est le porc, chez lequel l'infection est souvent inapparente mais peut être caractérisée par une fièvre, des convulsions et une paralysie. Le virus pseudorabique infecte également les bovins, les moutons, les chiens, les chats, les renards et les visons, chez lesquels l'infection entraîne habituellement la mort de l'hôte La caractéristique visible prédominante d'une infection virale pseudorabique est un prurit intense, ayant généralement pour résultat une mutilation de la région concernée de l'hôte Une excitation violente, des attaques et une paralysie, tous les symptômes de l'encéphalomyélite, précedent la mort qui survient habituellement quelques jours après l'apparition des signes cliniques. La maladie à virus pseudorabique chez le porc est un sujet de préoccupation grave pour les instances gouvernementales dans le monde entier. Aux Etats-Unis, les porcs provenant de troupeaux infectés ne peuvent être vendus, sauf aux abattoirs. Plusieurs états ont ordonné séparément des pratiques de contrôle d'éradication contre la pseudorage. Actuellement, tout animal vacciné contre la maladie pseudorabique est traité comme s'il était infecté par le virus pseudorabique et est soumis aux mêmes contraintes réglementaires. Cela est dt principalement à l'absence. d'un test de diagnostic pour différencier les animaux vaccinés des animaux infectés. La direction des recherches et des développements, chez les producteurs de vaccins classiques, a généralement mis l'accent sur des recherches conduisant à des vaccins qui sont basés sur des sous-unités virales plutôt que sur des virus vivants. Cette défiance vis-à-vis des vaccins à virus vivants est due en partie à l'aspect de sécurité reconnue des vaccins à base de sous-unités, et l'improbabilité qu'ils contiennent des virus vivants infectieux. Une autre raison pour la mise au point d'un vaccin à base de sous-unités a été de permettre la mise au point d'un test de diagnostic qui accompagnerait le vaccin et permettrait de différencier les animaux vaccinés des animaux infectés, permettant ainsi de se soustraire aux contraintes réglementaires suivant l'utilisation d'autres vaccins. Les vaccins à base de sous-unités possèdent également des limitations. Ils contiennent un nombre limité d'antigènes viraux, comparativement à ceux produits par des virus vivants. Ce manque d'antigènes produit une réponse immunitaire faible de courte durée chez l'animal vacciné, à un cott considérablement supérieur à celui d'une vaccination par virus vivant. Cependant, le spectre antigénique limité dans le. vaccin à base de sous-unités permet de distinguer les porcs vaccinés des porcs qui ont été infectés par le virus de type sauvage. L'aptitude à distinguer les porcs vaccinés des porcs infectés est une propriété cruciale d'un vaccin pseudorabique car aucun des vaccins nouveaux ne permet d'éviter une surinfection des animaux vaccinés par le virus de type sauvage.Bien que les animaux vaccinés ne deviennent pas malades par surinfection, il existe de fortes présomptions qu'ils puissent devenir des porteurs du virus de type sauvage et transmettent- le virus de type sauvage à d'autres porcs. Dans n'importe quel programme d'éradication ayant pour but l'élimination du virus pseudorabique, un vaccin muni des caractéristiques qui permettraient de distinguer les animaux vaccinés des animaux infectés par le virus de type sauvage serait avantageux. Les vaccins à base de sous-unités sont d'un coût élevé et possèdent une efficacité faible, mais un animal vacciné avec ce type de vaccin produit seulement des anticorps contre le spectre limite d'antigènes présents dans le vaccin. Par prélèvement d'un échantillon du sérum des porcs, il est possible de montrer que l'animal vacciné possède seulement des anticorps contre les antigènes présents dans le vaccin, tandis qu'un animal infecté par le virus de type sauvage posséderait des anticorps contre une gamme plus large d'antigènes. Un vaccin à base de sous-unités utilisé de cette manière pour différencier les animaux vaccinés des animaux infectés par le virus pseudorabique a été décrit dans la demande de brevet européen N" 85 40074.4, déposée le 4 Septembre 1985, publiée le 27 Novembre 1985 sous le numéro de publication européenne N" 0162738 et intitulée "Production of Pseudorabies Virus Subunit Vaccines". Cette demande de brevet publiée n'apporte pas d'enseignements ni ne suggère l'élaboration ou l'utilisation d'un test de diagnostic similaire, conjointement avec un vaccin à virus vivant. La vaccination d'un animal avec un virus vivant qui aurait pour résultat une réponse immunitaire pouvant être distinguée d'une infection à virus de type sauvage, aurait également les avantages supplémentaires de faible coût et de forte efficacité associés aux vaccins à virus vivants. Des délétions dans les gènes codant pour des antigènes viraux ont été décrites précédemment. Une délétion spontanée dans le gène glycoproteine C du virus de l'herpès simplex (52), une délétion spontanée dans le gène glycoprotéine A du virus de la maladie de Marek (53), une délétion spontanée dans le gène glycoprotéine A (appelée également glycoprotéine gI) du VPR (27,55) et l'absence ou la présence d'une quantité fortement réduite de glycoprotéine gIII dans certains mutants de VPR (54) sont connues. Cependant, toutes ces délétions sont survenues spontanément dans un procédé non contrôlé. En conséquence, il n'a pas été possible d'orienter des délétions vers l'ADN codant pour des antigènes particuliers afin d'ajuster le procédé de délétion et de diriger les délétions vers des antigènes convenant particulièrement comme marqueurs de diagnostic. La présence ou l'absence d'antigènes particuliers dans une maladie infectieuse quelconque peut être exploitée comme test de diagnostic de l'agent responsable de la maladie infectieuse. Cette présence ou cette absence constitue la base de tous les tests de diagnostics immunologiques, qui diffèrent seulement par les détails de leur investigation immunologique particulière. Les publications concernant la présente invention comprennent Wathan et Wathan (54) qui ont indiqué que le gène gI ou le gène gIII pourrait être éliminé du VPR par délétion- et ont suggéré que le virus résultant pourrait être utilisé pour distinguer les porcs vaccinés des porcs infectés.Cependant, ils n'ont pas décrits la méthodologie nécessaire pour produire le vaccin, ils n'ont pas démontré l'utilité d'un tel vaccin dans des tests sérologiques et ils n'ont en aucune manière trouvé la possibilité de produire un tel vaccin. Van Oirschot et collaborateurs (56) ont utilisé un système de détection immunologique particulier à base d'anticorps monoclonaux pour l'antigène gI du VPR et ont montré que des porcs auxquels ont été inoculées des souches vaccinales naturelles auxquelles manque au moins une portion du gène gI peuvent être différenciés des porcs infectés par le VPR de type sauvage. Cependant, ce test de diagnostic peut être utilisé pour n'importe lequel de plusieurs vaccins contre le VPR qui existent déjà en Europe et aux Etats Unis, sans différencier le vaccin qui a été utilisé. Cela limite l'utilité de ce diagnostic, puisque les vaccins qui peuvent être détectés possèdent des propriétés biologiques et de virulence différentes. La voie d'investigation concernant la délétion d'un gène afin d'atténuer un virus associé à un diagnostic pour ce gène permet d'obtenir un vaccin qui peut être différencié de n'importe lequel des vaccins couramment utilisés contre le VPR et du VPR de type sauvage. Il est important de pouvoir différencier un vaccin nouveau,, plus sûr, de ceux couramment utilisés car les porcs auxquels sont administrés les vaccins classiques sont tous soumis à la même réglementation au cours des programmes d'éradication que ceux infectés par le VPR de type sauvage. Les antigènes de choix en vue d'un marqueur de diagnostic auraient les caractéristiques suivantes: 1) les antigènes et leurs gènes ne seraient pas essentiels pour la production de virus infectieux dans une culture de tissu ; et 2) l'antigène produirait une réponse sérologique importante chez l'animal, mais ne serait de préférence pas un agent neutralisant important. En conséquence, la présente invention comprend l'aptitude à atténuer le virus pseudorabique du porc pour produire un vaccin à virus vivant et l'apti- tude à distinguer si un animal a été soumis à la vaccination ou si l'animal a été infecté par le virus pseudorabique de type sauvage. La présente invention propose un herpes virus hybride, d'animal n'appartenant pas aux primates, comprenant de l'ADN qui contient une séquence essentielle pour la réplication virale de l'herpès virus hybride, d'animal n'appartenant pas aux primates, dont au moins une partie est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un herpès virus naturel, d'animal n'appartenant pas aux primates, et au moins une séquence d'ADN étranger. Il est également proposé un herpès virus atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, comprenant de l'ADN qui contient une séquence essentielle pour la réplication virale de l'herpès virus atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, dont au moins une portion est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un herpès virus naturel, d'animal n'appartenant pas aux primates, de laquelle au moins une portion d'une séquence de répétition a été éliminée par délétion. La présente invention propose en outre un herpès virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates. Ce virus comprend de l'ADN qui contient une séquence essentielle pour la réplication virale de l'herpès virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, dont au moins une partie est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un herpès virus naturel, d'animal n'appartenant pas aux primates, et au moins une séquence d'ADN étranger. Il est également poroposé des virus pseudorabiques atténués qui sont formés d'ADN comprenant une séquence essentielle pour la réplication du virus atténué, dont au moins une partie est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un virus pseudorabique naturel, et au moins une séquence d'ADN étranger apte à l'expression dans un hôte et codant pour une séquence d'amino-acides qui est antigénique chez l'hôte Les vaccins comprenant une quantité immunisante efficace d'un virus de la présente invention et un support convenable sont utiles pour l'immunisation d'animaux contre la maladie à virus pseudorabique. Les vaccins multivalents, comprenant également une quantité immunisante d'un virus de la présente invention et un support convenable, sont utiles pour l'immunisation d'animaux contre la maladie à virus pseudorabique et au moins un autre agent pathogène. La presente invention propose en outre des procédés de préparation de virus pseudorabiques atténués, comprenant au moins une séquence d'ADN étranger, -et des procédés d'immunisation d'animaux avec des vaccins comprenant ces virus. La présente invention propose en outre une molécule d'acide nucléique isolée qui code pour la glycoprotéine 38 du rotavirus du porc et une molécule d'acide nucléique isolée qui code pour la protéine de la capside du-parvovirus B du porc. Il est également proposé un virus pseudorabique atténué comprenant de l'ADN qui contient une séquence essentielle pour la réplication du virus pseudorabique atténué, dont au moins une portion est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un virus pseudorabique naturel. Cet ADN code, chez un animal infecté par le virus pseudorabique atténué, pour des ARNm qui sont traduits en des produits géniques antigéniques de virus pseudorabique qui suscitent chez l'animal infecté une réponse immunologique pouvant être distinguée d'une réponse immunologique suscitée chez un animal infecte par un virus pseudorabique naturel. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre, faite en regard des dessins annexés sur lesquels FIGURE 1 Détails de la souche S-62 A Iowa de type sauvage A. Diagramme de l'ADN génomique de VPR montrant la région longue unique ('LU), la région courte unique (CU), la région de répétition interne (RI) et la région de répétition terminale (RT). B. Carte de 11 enzyme de restriction BamHI du VPR. Les fragments sont numérotés dans l'or dre des dimensions décroissantes. FIGURE 2 Détails de 11 élaboration du S-PRV-004 et résultats cartographiques A. Carte détaillée de BamHI NO 8' et N 8. L'emplacement de la region de répétition interne (RI) est indiqué. B. Carte détaillée du fragment BamHI N 8' TK-8 présent finalement dans le virus recom binant. C. Diagramme du génome d'ADN de S-PRV-004 montrant l'emplacement du gene VHS-1 TK inséré dans la région de jonction entre les régions LU et RI. Légendes des enzymes de restriction B = BamHI ; K = XpnI ; N = NdeI ; P = PvuII; S = StuI. FIGURE 3 Détails de ltélaboration de S-PRV-005 et résultats cartographiques A. Carte détaillée de BamHI N 5. Le gène VHS 1 TK fusionné au promoteur ICP4 de VSH 1 est indiqué sur un fragment PvuII. B. Carte détaillée de BamHI N 5 après l'inser tion de l'élément comprenant le gène TK. C. Diagramme du génome d'ADN de S-PRV-005 mon trant l'emplacement du gène TK inséré dans les deux copies de BamHI N 5 dans la région de répétition du génome et la création de nouvelles délétions. Légendes des enzymes de restriction B = BamHI ; H = HindîlI ; Hp = HpaI K = KpnI ; P = PvuII ; X = Xba. FIGURE 4 Elaboration de l'élément d'insertion d'ADN étranger utilisé dans S-PRV-010. A. Diagramme de la portion correspondante de pJF751 qui contient le gène lac Z (bêta galactosidase). La position du codon de terminaison TAA pour le polypeptide est indiquée. B. Diagramme de la séquence du promoteur dans le gène VSH-1 TK. C. Diagramme du fragment RsaI du gène TK ayant à présent des extrémités modifiées par BamHI. D. Diagramme du plasmide final qui contenait le gène lac Z fusionné au promoteur VSH 1 TK. Légendes des enzymes de restriction : B = BamHI ; Ba = BaII ; Bc = BclI Bg = BglII ; H = HindIII ; Ha = HaeIII N = NdeI ; R = RsaI ; X = XbaI. FIGURE 5 Détails de l'élaboration de S-PRV-010 et résultats cartographiques A. Carte détaillée de BamHI N 5. Le gène lac Z (bêta-galatosidase) fusionné au promoteur VSH-1 TK est indiqué sur un fragment XbaI (voir figure 4). La position de la délétion dans S-PRV-002 est indiquée. B. Carte détaillée de BamHI N 5 après l'inser tion de l'élément contenant le gène lac Z. C. Diagramme de l'ADN du génome de S-PRV.-010 montrant l'emplacement du gène lac Z dans les deux copies de BamHI N 5 dans la région de répétition du génome. Légendes des enzymes de restriction B = BamHI ; Bc = BclI ; H : Hindîli Hp = HpaI ; K = KpnI ; N = NdeI ; X = XbaI. FIGURE 6 Détails de l'élaboration de S-PRV-O07 et résultats cartographiques A. Carte détaillée de BamHI N 5 dans S-VPR 005. B. Carte détaillée de BamHI N 5 après le rem placement du gène TK par le gène gp38 du rotavirus du porc. C. Diagramme du génome d'ADN de S-PRV-007 mon trant l'emplacement du gêne gp38 inséré dans les deux copies de BamHI N 5 dans les régions de répétition du génome. Légendes des enzymes de restriction : B = BamHI ; H = HindIII ; K = KpnI. FIGURE 7 Elaboration de l'élément d'insertion d'ADN étranger utilisé dans S9RV-007, FIGURE 8 Détails de l'élaboration de S-VPR-012 et résultats cartographiques A. Carte détaillée du VPR allant de BamHI B 10 à BamHI N 7. B. Carte détaillée du VPR allant de BamHI N 10 à BamHI N 7 après l'insertion du gène TK dans le virus recombinant. C. Diagramme du génome d'ADN de S-PRV-012 mon trant l'emplacement du gène TK inséré dans la région gpX et la création d'une délétion qui élimine la plus grande partie de la région de codage du gène gpX et rend le virus incapable de synthétiser le polypeptide gpX. Légendes des enzymes de restriction B = BamHI ; K = KpnI ; N = NdeI ; P = PvuII; Ps = PstI ; S = StuI. FIGURE 9 Détails de l'élaboration de S-PRV-013, S VPR-014 et S-PRv-016 et résultats carto graphiques A. Carte détaillée du VPR allant de BamHI N010 à BamHI N 7. B. Carte détaillée du VPR allant de BamHI N 10 à BamHI N 7 après l'insertion du gène lac Z dans le virus recombinant. C. Diagramme du génome d'ADN de S-PRVO13 mon trant l'emplacement du gene lac Z inséré dans la région gpX et la création d'une délétion qui a éliminé la plus grande partie de la région de codage du gène gpX et a rendu le virus incapable de synthétiser le polypeptide gpX. D'autres délétions dans la région TK et les régions de répétion sont indiquées par (). D. Diagramme du génome d'ADN de S-PRV-014 mon trant l'emplacement du gène lac Z inséré dans la région gpX et la création d'une délétion qui a éliminé la plus grande partie de la région de codage du gène gpX et a rendu le virus incapable de synthétiser le polypeptide gpX. Il n'existe aucune autre délétion dans ce virus. E. Diagramme du génome d'ADN de S-PRV-016 mon trant l'emplacement du gène lac Z inséré dans la région gpX et la création d'une délétion qui a éliminé la plus grande partie de la région de codage du gène gpX et a rendu le virus incapable de synthétiser le polypeptide gpX. D'autres délétions dans les régions de répétition sont indiquées par (). Légendes des enzymes de restriction B = BamHI ; Ba = BalI ; K = KpnI ; N = NdeI ; Ps = PstI ; S = StuI. FIGURES 1OA et 10B Séquences du gene gp38 du rotavirus du porc dans pSY565. FIGURES 11A et 11B Séquence du gène du parvovirus B du porc dans pSY875. FIGURE 12 Elaboration du gène du parvovirus B du porc avec une séquence-signal A. pSY864 qui contient le gène B de AccI au nucléotide N 391,au site RsaI au nucléotide N 2051, cloné entre le site BamHI dans BamHI N 10 et le site NdeI dans BamHI N 7. B. pSY957 qui contient le fragment SalI de pSY864 cloné dans une molécule polyvalente de jonction dans pSP65, de sorte que les sites XbaI entourent l'élément d'insertion. Légende : pSP = plasmide de E. coli ; VPR = ADN de virus pseudorabique ; PVP = ADN de parvo virus de porc ; Pv = PvuII ; RV = EcoRV; Ps = PstI ; B = BamHI ; A = AccI -; R = RsaI; N = NdeI ; Sa - SalI ; Sm = SmaI ; S = StuI; X = XbaI ; gpX pro = promoteur de glyco protéine X ; gpX pA = séquences-signaux de polyadénylation de glycoprotéine X. FIGURE 13 Détails de l'élaboration de S-PRV-020 et résultats cartographiques A. Carte détaillée du VPR allant de BamHI N 10 à BamHI N 7, montrant le gène du parvo virus B qui remplace le gène gpX. B. Carte détaillée du VPR allant de BamHI N 10 à BamHI N 7 après l'insertion du gène du parvovirus B du porc à la place du gène gpX. C. Diagramme du génome de S-PRS020 montrant l'emplacement du gène du parvovirus B du porc inséré dans la region gpX du VPR. Légendes des enzymes de restriction B=BamHI ; Ps=PstI ; Sa=SalI ; N=NdeI S=StuI ; A=AccI ; R=RsaI. FIGURE 14 Détails de l'élaboration de S- PRV-025 et résultats cartographiques A. Région du virus de départ S-PRV-002 montrant le fragment BamHI N 5. Le fragment XbaI du gène du parvovirus B de pSY957 est repré senté schématiquement en dessous, montrant comment il est inséré dans le site XbaI par ligation directe. B. Région de BamHI N 5 après insertion du gène du parvovirus B. C. Emplacement du gène du parvovirus B inséré dans les deux copies de la région de répéti tion dans S-PRV-025. Légende : B = BamHI ; H : HindIII ; X = XbaI S = SalI ; pA = séquences-signaux de poly adénylation de glycoprotéine X ; UL = région longue unique ; SU = région courte unique; RI = région de répétition interne RT = région de répétition terminale. FIGURE 15 Détails de ltélaboration de S-PRW029 et résultats cartographiques A. Carte détaillée du VPR allant de BamHI N 10 à BamHI N 7, montrant le gène lac Z qui remplace le gène gpX. B. Carte détaillée du VPR allant de BamHI N"8' à BamHI N 8 à la jonction de la région longue unique et de la région de répétition interne (RI). Le gène lac Z sous forme d'un fragment SalI remplace l'ADN entre les sites StuI encadrant la jonction. C. Diagramme du génome de S-PRV-o29 montrant les emplacements des gènes lac Z dans la région gpX et la région de jonction. Légendes des enzymes de restriction B=BamHI ; Ps=PstI ; Sa=SalI ; N=NdeI ; S=StuI ; Ba=BalI; K=KpnI. FIGURE 16 Carte de restriction du fragment EcoRI B et du fragment EcoRI F de S-IBR-002 éliminés par délétion. Une delétion de 800 pb comprenant les sites de restriction EcoRV et BglII a été carto graphiée dans les deux fragments de répéti tion. FIGURE 17 Elaboration du virus S-IBR-004 recombinant. Le S-. IBR-004 est un virus RIB recombinant portant un gène étranger inséré (NEO) sous le contrôle du promoteur gpX de VPR. Un nouveau site XbaI a été créé au niveau de la petite région unique et le site SacI initial a été éliminé par délétion. FIGURE 18 Elaboration du virus S-IBR-008 recombinant. Le S-. IBR-008 est un virus RIB recombinant qui possède un gène de glycoprotéine rota bovine et le vecteur plasmidique inséré dans le site XbaI sur la région longue uni que. Une délétion spécifique du site a été créée au site tSacI, , due à la perte du gène NEO dans la petite région unique. FIGURE 19 Détails de l'élaboration de l'HVD et résul- tats cartographiques A. Carte du fragment de restriction BamHI de HVD. Les fragments sont numérotés dans l'or dre des dimensions décroissantes ; les let tres désignent de petits fragments dont les dimensions comparatives n'ont pas été déterminées. B. Fragment BamHI N 16 montrant l'emplacement de l'insertion du gène bêta-galactosidase dans S-HVT-001. C. Fragment BamHI N 19 montrant l'emplacement de l'insertion du gêne bêta-galactosidase. Légende : B = BamHI ; X = XhoI ; H : HindIII ; P = PstI ; S = SalI ; N = NdeI ; R = EcoRI. FIGURE 20 Analyse des taches selon laméthode de Western des protéines libérées dans le milieu des cellules infec tées par le VPR, montrant l'absence de gpX dans s-PRV-012 et S-PRV±o13 mais sa présence dans le PRV,000 de type sauvage. Voies (A) marqueurs de poids moléculaires déter minés, (B) cellulès Vero non infectées, (C) VPR de type sauvage, (D) S-PRV-012, (E) S-PRV-013 FIGURE 21 Test de diagnostic de la présence d'anti corps contre gpX dans le sérum d'un porc vacciné avec S-PRV.-013 au jour 0 et soumis au contact avec le virus pseudorabique de type sauvage au jour 28. La présente invention propose un herpès virus hybride, d'animal n'appartenant pas aux primates, comprenant de l'ADN qui contient une séquence essentielle pour la réplication virale de l'herpès virus hybride, d'animal n'appartenant pas aux primates, dont au moins une portion est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un herpès virus naturel, d'animal n'appartenant aux primates, et au moins une séquence d'ADN étranger. La séquence essentielle pour la réplication virale de l'herpès virus hybride, d'animal n'appartenant pas aux primates, peut être synthétique ou dérivée d'un herpès virus naturel, d'animal n'appartenant pas aux primates. La séquence d'ADN étranger peut être adaptée pour l'expression dans un hôte et code pour une séquence d'amino-acides. Dans une forme de réalisation de la présente invention, la séquence d'ADN étranger est adaptée pour l'expression par un promoteur d'herpès virus. Le promoteur d'herpès virus peut être un promo teur d'herpès virus en amont endogène ou un promoteur d'herpès virus en amont inséré. Des exemples de ces promoteurs d'herpès virus comprennent, mais à titre non limitatif, le promoteur de la protéine de l'herpès simplex de type ICP4, le promoteur de la thymidinekinase de l'herpès simplex de type I, le promoteur de la thymidine-kinase du virus pseudorabique, le promoteur du gène immédiatement antérieur du virus pseudorabique, le promoteur de la glycoprotéine X du virus pseudorabique ou le promoteur de la glycoprotéine 92 du virus pseudorabique. La séquence d'aimino-acides codée par la séquence d'ADN étranger peut être un polypeptide. De plus, le polypeptide peut être une protéine. Dans une forme de réalisation de la présente invention, la protéine, lorsqu'elle est exprimée dans 1' hôte, est antigénique. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, la protéine est la glycoprotéine 38 du rotavirus du porc. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, la protéine est la glycoprotéine 38 du rotavirus bovin. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, la protéine est la protéine de la capside du parvovirus B du porc. L'herpès virus hybride, d'animal n'appartenant pas aux primates, peut comprendre de l'ADN dont au moins une portion est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un herpès virus alpha naturel. L'herpès virus alpha peut être un virus pseudorabique, un virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine, un herpès virus I équin, un herpès virus I félin ou un herpès virus I canin. En outre, l'herpès virus alpha peut être un herpes virus de classe D. L'herpès virus de classe D peut être un virus pseudorabique, un virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine, un herpès virus I équin, un herpès virus I félin ou un herpès virus I canin. Dans une forme de réalisation de la présente invention, l'herpès virus alpha est un virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine et l'ADN étranger code pour le gène de résistance à la néomycine de Escherichia coli. Cette séquence d'ADN étranger peut également être sous le contrôle d'un promoteur de glycoprotéine X insérée de virus pseudorabique. Un tel virus a été élaboré, désigné sous le nom de S-IBR-O04 et déposé dans l'American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, sous le numéro de dépôt VR 2134. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, l'herpès virus alpha est un virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine ayant une délétion dans la séquence courte unique. De plus, la séquence d'ADN étranger peut coder pour le gène de la glycoprotéine 38 du rotavirus bovin. Ce virus, désigné sous le nom de S-:IBR-008, a été élaboré et déposé dans l'ATCC sous le numéro de dépôt VR 2141. En outre, l'herpès virus hybride, d'animal n'appartenant pas aux primates, peut comprendre de l'ADN dont au moins une portion est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un herpès virus gamma naturel. L'herpès virus gamma peut être un virus de la maladie de Marek ou un herpès virus du dindon. De plus, l'herpès virus gamma peut être un herpès virus de classe E. L'herpès virus de classe E peut être un virus de la maladie de Marek ou un herpès virus du dindon. Il est également proposé un herpès virus atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, comprenant de l'ADN qui contient une séquence essentielle pour la réplication virale de l'herpès virus atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, dont au moins une portion est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un herpès virus naturel, d'animal n'appartenant pas aux primates, dont au moins une portion d'une séquence de répétition a été éliminée par délétion. La séquence essentielle pour la réplication virale de l'herpès virus atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, peut être obtenue à partir d'un herpès virus naturel, d'animal n'appartenant pas aux primates. La portion éliminée par délétion de la séquence de répétition peut comprendre une portion d'une séquence de répétition autre qu'une région de jonction ou peut comprendre une région de jonction. En outre, la portion éliminée par délétion de la séquence de répétition peut comprendre une séquence non essentielle d'une séquence de répétition ou les deux séquences de répétition. De plus, au moins une portion de la séquence essentielle d'une séquence de répétition peut être éliminée par délétion. Dans une forme de réalisation de la présente invention, une séquence de répétition entière peut être éliminée par délétion. De plus, une séquence non située dans une séquence de répétition peut être de plus éliminée par délétion. Dans une forme de réalisation de la présente invention, la séquence éliminée par délétion non située dans une séquence de répétition est au moins une portion d'un gène. L'herpès virus atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, peut comprendre de l'ADN, dont au moins une portion est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un herpès virus alpha naturel. L'herpès virus alpha peut être un virus pseudorabique, un virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine, un herpès virus I équin, un herpès virus I félin ou un herpès virus I canin. En outre, l'herpès virus alpha peut être un herpès virus de classe D. L'herpès virus de classe D peut être un virus pseudo rabique, un virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine, un herpès virus I équin, un herpès virus I félin ou un harpés virus I canin. Dans une forme de réalisation de la présente invention, herpès virus alpha est un virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, l'herpès virus atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, comprend un virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine, duquel a été éliminée par délétion au moins une portion des deux séquences de répétition. Ce virus a été élaboré, appelé S-IBR002 et déposé dans l'ATCC sous le numéro de dépôt VR 2140. Il est de plus proposé un herpès virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, comprenant de l'ADN qui contient une séquence essentielle pour la réplication virale de l'herpès virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, dont au moins une portion est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un herpès virus naturel, d'animal n'appartenant pas aux primates, et au moins une séquence d'ADN étranger. La séquence essentielle pour la réplication virale du virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, peut être obtenue à partir d'un herpès virus naturel, d'animal n'appartenant pas aux primates. De plus, au moins une portion d'une séquence de répétition de l'herpès virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, peut être éliminée par délétion. La séquence d'ADN étranger peut être adaptée pour l'expression dans un hôte et code pour une séquence d'amino-acides. En outre, la séquence d'ADN étranger peut être adaptée pour l'expression par un promoteur d'herpès virus. Le promoteur d'herpès virus peut être un promoteur en amont, endogène, ou un promoteur d'herpès virus en amont, inséré. Le promoteur d'herpès virus peut être le promoteur de la protéine de l'herpès simplex de type ICP4, le promoteur de la thymidine-kinase de l'herpès simplex de type I, le promoteur du gène immédiatement antérieur du virus pseudorabique, le promoteur de la glycoprotéine X du virus pseudorabique ou le promoteur de la glycoprotéine 92 du virus pseudorabique. La séquenced'amino-acides codée par la séquence d'ADN étranger peut être un polypeptide. En outre, le polypeptide peut être une protéine. De plus, la protéine, lorsqu'elle est exprimée dans un hôte, peut être antigénique. Dans une forme de réalisation de la présente invention, la protéine est la glycoprotéine 38 du rotavirus du porc. Dans une autre forme de réalisation, la protéine est la glycoprotéine 38 du rotavirus bovin. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, la protéine est la protéine de la capside du parvovirus B du porc. L'herpès virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, peut comprendre de l'ADN, dont au moins une portion est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un herpès virus alpha naturel. L'herpès virus alpha peut être un virus pseudorabique, un virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine, un herpès virus I équin, un herpès virus .1 félin ou un herpès virus I canin. En outre, l'herpès virus alpha peut être un herpès virus de classe D.L'herpès virus de classe D peut être un virus pseudorabique, un virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine, un herpès virus I équin, un herpès virus I félin ou un herpès virus I canin.; De plus, l'herpès virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, peut comprendre de l'ADN, dont au moins une portion est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un herpès virus gamma naturel. L'herpès virus gamma peut être un virus de la maladie de Marek ou un virus du dindon. En outre, l'herpès virus gamma peut être un herpès virus de classe A. L'herpès virus de classe E peut être un virus de la maladie de Marek ou un herpès virus du dindon. La présente invention propose également un vaccin utile pour l'immunisation d'un animal contre une maladie à herpès virus. Ce vaccin comprend une quantité immunisante efficace d'un herpès virus hybride, d'animal n'appartenant pas aux primates, de la présente invention et un support convenable, par exemple un milieu de culture physiologiquement équilibré contenant des conservateurs. Il est également proposé un vaccin multivalent utile pour l'immunisation d'un animal contre au moins un agent pathogène. Ce vaccin comprend une quantité immunisante efficace d'un herpès virus hybride, d'animal naturel n'appartenant pas aux primates, de la présente invention qui comprend une séquence d'ADN étranger codant pour une protéine qui, lorsqu'elle est exprimée dans l'hôte est antigénique, et un véhicule convenable. De plus, la présente invention propose un vaccin utile pour l'immunisation d'un animal contre une maladie à herpès virus, qui comprend une quantité immunisante efficace d'un herpès virus atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, faisant l'objet de la présente invention, et un véhicule convenable. Un autre vaccin utile pour i'immunisation d'un animal contre une maladie à herpès virus est également proposé. Ce vaccin comprend une quantité immunisante efficace d'un herpès virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, de la présente invention, et un véhicule convenable. En outre, un vaccin multivaient utile pour l'immunisation d'un animal contre au moins un agent pathogène est proposé. Ce vaccin comprend une quantité immunisante efficace d'un herpès virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, qui contient au moins une séquence d'ADN étranger codant pour une protéine qui, lorsqu'elle est exprimée dans l'hôte est antigénique, et un véhicule convenable. Des méthodes d'immunisation d'animaux contre des maladies à herpès virus et des méthodes d'immunisation d'un animal contre au moins un agent pathogène sont proposées. Ces méthodes consistent à administrer à l'animal une dose convenable d'un vaccin de la présente invention. Les animaux qui peuvent être immunisés comprennent, mais à titre non limitatif, les porcs, les bovins, les moutons, les chèvres, les chiens et les chats. Le vaccin peut être administré par injection intramusculaire, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse. Le vaccin peut également être administré par voie intranasale ou orale. Des procédés d'identification des herpès virus hybrides, d'animaux n'appartenant pas aux primates, sont proposés. Dans une forme de réalisation de la présente invention, la séquence d'ADN étranger dans virus est détectée. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, la présence du polypeptide exprimé dans l'animal hôte ou la cellule hôte est détectée. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, la présence de la protéine exprimée dans l'animal hôte ou la cellule hôte est détectée. De plus, des procédés d'identification d'un herpès virus hybride atténué, d'animal n1 appartenant pas aux primates, de la présente invention sont proposés. Dans une forme de réalisation de la présente invention, la séquence d'ADN étranger est détectée. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, la présence du polypeptide exprimé dans l'animal hôte ou la cellule hôte est détectée. Dans une troisième forme de réalisation de la présente invention, la présence de la protéine exprimée dans l'animal hôte ou la cellule hôte est détectée. La présente invention propose de plus un procédé de production chez un animal d'un produit genique à des fins autres qu'une immunisation. Ce procédé consiste à administrer à l'animal une quantité convenable d'un herpès virus hybride, d'animal n'appartenant pas aux primates, de la présente invention qui comprend une séquence d'ADN étranger apte à l'expression chez un hôte, séquence d'ADN étranger qui effectue l'expression du produit génique. En outre, un produit génique peut être produit chez un animal à des fins autres qu'une immunisation par administration à l'animal d'une quantité convenable d'un herpès virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, qui comprend une séquence d'ADN étranger apte à l'expression chez un hôte, séquence d'ADN étranger qui effectue l'expression du produit génique. Des procédés de préparation dtun herpès virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, de la présente invention sont également proposés. Un procédé consiste à isoler de l'ADN viral d'her pès virus naturel, d'animal n'appartenant pas aux primates, et à utiliser une digestion par un enzyme de restriction afin de produire des fragments de restriction d'ADN. Ces fragments de restriction sont purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose afin d'obtenir des fragments d'ÂDN particuliers qui sont traités avec des enzymes appropriés, connus de l'homme de l'art, afin de produire des fragments d'ADN viral modifié. Ces fragments d'ADN modifié sont capables de se lier à des séquences d'ADN plasmidique bactérien. Des plasmides bactériens convenables sont traités séparément avec des enzymes de restriction appropriés, connus de l'homme de l'art, afin de produire des séquences d'ADN plasmidique bactérien capables de se lier à des fragments d'ADN viral modifié. Ces séquences plasmidiques bactériennes sont ensuite associées aux fragments d'ADN viral modifié dans des conditions convenables pour permettre à l'ADN viral de se lier à l'ADN bactérien et de former un plasmide viral-bactérien. Le plasmide d'ADN viral-bactérien est ensuite cartographié au moyen d'enzymes de restriction pour produire une carte de restriction de l'élément d'insertion d'ADN viral. Le plasmide d'ADN viral-bactérien est ensuite traité avec un enzyme de restriction connu dans la pratique pour provoquer au moins une délétion dans la séquence d'ADN viral du plasmide d'ADN viralbactérien. Ce plasmide, contenant au moins une délétion dans la séquence d'ADN viral, est transfecté avec de l'ADN viral d'herpes naturel, d'animal n'appartenant pas aux primates, dans des cellules animales.Les cellules animales sont maintenues dans des conditions convenables afin de permettre à l'ADN d'herpès virus naturel, d'animal n'appartenant pas aux primates, de produire à nouveau des herpès virus et un petit pourcentage de virus qui ont subi une recombinaison avec la séquence d'ADN étranger viral du plasmide d'ADN étranger viralbactérien. Une partie de ces virus recombinés possède des délétions dans leur génome, en résultat de délétions dans l'élément d'insertion d'ADN viral du plasmide. Les virus sont identifiés, puis débarrassés par purification sur plaque des virus indésirables. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, de l'ADN d'herpès virus naturel, d'animal n'appartenant pas aux primates, est isolé et digéré avec des enzymes de restriction appropriés pour produire -des fragments de restriction viraux. Séparément, de l'ADN étranger est digéré avec des enzymes appropriés pour produire des fragments de restriction d'ADN étranger. Les fragments de restriction d'ADN étranger sont mélangés aux fragments de restriction d'ADN viral dans des conditions convenables de manière à permettre la jonction des fragments les uns aux autres afin de produire des fragments d'ADN viral-étranger. Des cellules animales sont transfectées avec les fragments d'ADN viral-étranger et maintenues dans des conditions convenables de manière à permettre aux fragments d'ADN étranger de produire à nouveau des herpès virus et un petit pourcentage de virus qui ont incorporé des fragments d'ADN étranger dans leur génome. Les herpès virus qui ont incorporé des fragments d'ADN etranger désirés dans leur génome sont identifiés et débarrassés par purification sur plaque des herpès virus indésirables. La présente invention concerne également un virus pseudorabique atténué comprenant de l'ADN qui contient une séquence essentielle pour la réplication du virus atténué, dont au moins une portion est essentielle pour la réplication d'un virus pseudorabique naturel, et au moins une séquence d'ADN étranger apte à l'expression dans un hôte et codant pour une séquence d'amino-acides qui est antigénique dans l'h8te. Dans une forme de réalisation de la présente invention, la séquence d'amino-acides codée par la séquence d'ADN étranger est exprimée dans l'hôte cette expression ayant pour résultat la production d'anticorps dirigés contre la séquence d'amino-acides, et ces anticorps conférant à l'hôte une protection contre une infection ultérieure par un agent pathogène autre qu'un virus pseudorabique. La séquence d'ADN qui est essentielle pour la réplication du virus atténué peut être synthétique, ou bien elle peut être obtenue à partir d'un virus pseudorabique naturel. La séquence d'amino-acides codée par la séquence d'ADN étranger peut être un polypeptide. Dans une forme de réalisation de la présente invention, le polypeptide est une protéine. De plus, la séquence d'ADN étranger peut être adaptée pour l'expression par un promoteur de virus pseudorabique en amont, endogène, ou par un promoteur d'herpès virus en amont, inséré. Dans une forme de réalisation de la présente invention, le promoteur d'herpès virus est un promoteur de virus pseudorabique. Le virus pseudorabique atténué peut comprendre un virus pseudorabique duquel une séquence non essentielle a été éliminée par délétion . La séquence non essentielle éliminée par délétion peut être au moins une portion d'un gène. Dans une forme de réalisation de la présente invention, la séquence non essentielle éliminée par délétion comprend au moins une portion du gène de la glycoprotéine X pseudorabique. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, la séquence d'ADN étranger est insérée dans I'ADN où la délétion dans le gène de la glycoprotéine X s'est produite. Dans une forme de réalisation particulière de la présente invention, la séquence d'ADN étranger est adaptée pour l'expression par le promoteur du gène de la glycoprotéine X pseudorabique et les séquences-signaux de polyadénylation de la glycoprotéine X pseudorabique, et code pour la bêta-galactosidase de E. coli. Ce virus a été appelé S-PRV-014 et est déposé dans l'ATCC sous le numéro de dépôt VR 2135. Encore dans une autre forme de réalisation de la présente invention, le virus pseudorabique atténué comprend un virus pseudorabique duquel a été élimi née par délétion au moins une portion du gène de la glycoprotéine X et au moins une portion d'une séquence de répétition, et dans lequel a été insérée, à l'endroit où la délétion dans le gène de la glycoprotéine X s'est produite, une séquence d'ADN étranger codant pour la bêta-galactosidase de E. coli adaptée pour l'expres sion par le promoteur du gène de la glycoprotéine X et des séquences-signaux de polyadénylation. Dans une forme de réalisation particulière de la présente invention, une portion des deux séquences de répétition est éliminée par délétion. Ce virus est appelé S-PRV016 et a été déposé dans l'ATCC sous le numéro de dépôt VR 2136. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, le virus pseudorabique atténué comprend un virus pseudorabique duquel au moins une portion d'un gène et duquel au moins une portion d'une séquence de répétition ont été éliminés par délétion. Dans une forme de réalisation de la présente invention, le gène code pour la thymidine-kinase pseudorabique. De plus, la séquence éliminée par délétion, qui comprend au moins une portion d'une séquence de répétition, peut contenir une portion d'une séquence unique. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, la séquence éliminée par délétion, qui comprend au moins une portion d'une séquence de répétition, contient une portion de la région de jonction ou de la séquence de répétition interne et la séquence longue unique. De plus, la séquence d'ADN étranger peut être insérée dans l'ADN où la délétion dans la séquence de répétition s'est produite. Dans une forme de réalisation de la présente invention, le virus présente une délétion dans le gène de la thymidine-kinase pseudorabique, une délétion d'au moins une portion d'une séquence de répétition comprenant une portion de la région de jonction de la séquence de répétition interne et une portion de la séquence longue unique, et une séquence d'ADN étranger insérée à l'endroit où la délétion dans la région de jonction s'est produite. Dans une forme de réalisation particulière de la présente invention, la séquence d'ADN étranger est adaptée pour l'expression par le promoteur du gène ICP4- de l'herpes simplex du type I et code pour la thymidine-kinase du virus de l'herpes simplex de type I.Ce virus est appelé S-PRW004. La présente invention concerne également des virus pseudorabiques atténués desquels a été éliminée par délétion au moins une portion du gène de la thymidine-kinase et au moins une portion des deux séquences de répétition. Dans une forme de réalisation de la présente invention, une séquence d'ADN étranger est insérée dans le virus à l'endroit où les délétions dans les deux séquences de répétition se sont produites. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, le virus présente une délétion dans le gène de la thymidine-kinase pseudorabique, une délétion dans les deux séquences de répétition et une insertion d'une séquence d'ADN étranger dans les- deux séquences de répétition. Dans une forme de réalisation particulière de la présente invention, la séquence d'ADN étranger est adaptée pour l'expression par le promoteur du gène ICP4 du virus de l'herpes simplex de type I et code pour la thymidine-kinase du virus de l'herpes simplex de type I. Ce virus est appelé S-PRV-005 et a été déposé dans l'ATCC sous le numéro de dépôt VR 2109. Dans une autre forme de réalisation particulière de la présente invention, la séquence d'ADN étranger est adaptée pour l'expression par le promoteur du gène ICP4 du virus de l'herpes simplex de type I et code pour la glycoprotéine 38 du rotavirus du porc.Ce virus est appelé S-PRW007 et déposé dans l'ATCC sous le numéro de dépôt VR 2118. Encore dans une autre forme de réalisation particulière de la présente invention, l'ADN étranger est adapté pour l'expression par le promoteur du gène de la thymidine-kinasé du virus de l'herpes simplex de type I et code pour la beta-galacto- sidase de E, coli (le gène lacZ). Ce virus est appelé S-PRV-010 et a été déposé dans l'ATCC sous le numéro de dépôt VR 2110. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, au moins une portion de chaque séquence de répétition, le gène codant pour la thymidinekinase pseudorabique et le gène codant pour la glycoprotéine X pseudorabique ont été éliminés par délétion. De plus, la séquence d'ADN étranger peut être insérée dans la séquence d'ADN à l'endroit où la délétion dans le gène de la glycoprotéine X pseudorabique s'est produite. Dans une forme de réalisation particulière de la présente invention, la séquence d'ADN étranger code pour une portion antigénique de la protéine de la capside du parvovirus B du porc et est adaptée pour l'expression par le promoteur du gène de la glycoprotéine X pseudorabique et les séquences-signaux de polyadénylation de la glycoprotéine X pseudorabique. Ce virus, appelé S-PRV-020, a été déposé dans ltATCC sous le numéro de dép8t VR 2137. Encore dans une autre forme de réalisation de la présente invention, le virus présente une délétion dans le gène de la thymidine-kinase pseudorabique, une délétion dans les deux séquences de répétition et des insertions de séquenc-es d'ADN étranger qui codent pour une portion antigénique de la protéine de la capside du parvovirus B du porc dans les deux séquences de répétition. Les séquences d'ADN étranger sont adaptées pour l'expression par le promoteur du gène de la glycoprotéine X pseudorabique et les séquencessignaux de polyadénylation de la glycoprotéine X pseudorabique. Ce virus, appelé S-.PRV-025, a été déposé dans l'ATCC sous le numéro de dépôt VR 2138. Encore dans une autre forme de réalisation de la présente invention, au moins une portion d'une séquence de répétition a été éliminée par délétion d'un virus pseudorabique et au moins une portion du gène de la glycoprotéine X pseudorabique a été éliminée par délétion. La séquence élimine par délétion, qui comprend au moins une Portion d'une séquence de répétition, peut comprendre une portion d'une séquence unique. Dans une forme de réalisation de la présente invention, la séquence éliminée par délétion, qui comprend au moins une portion d'une séquence de répétition et une portion d'une séquence unique, comprend une portion de la région de jonction de la séquence de répétition interne et de la séquence longue unique. De plus, la séquence d'ADN étranger peut être insérée dans la séquence d'ADN à l'endroit où la délétion dans le gène de la glycoprotéine X s'est produite. Dans une forme de réalisation particulière de la présente invention, la séquence d'ADN étranger est adaptée pour l'expres- sion par le promoteur de la glycoprotéine X pseudorabique et les séquences-signaux de polyadénylation de la glycoprotéine pseudorabique, et code pour la bêtagalactosidase de E. coli. Ce virus, appelé S-PRV-029, a été déposé dans l'ATCC sous le numéro de dépôt VR 2139. Des vaccins utiles pour l'immunisation d'un animal contre la maladie à virus pseudorabique sont également proposés. Ces vaccins comprennent une quantité immunisante efficace d'un virus pseudorabique atténué de la présente invention et un véhicule convenable, par exemple un milieu de culture physiologiquement équilibré qui contient des conservateurs. La présente invention concerne en outre des vaccins multivalents utiles pour l'immunisation d'un animal contre la maladie à virus pseudorabique et au moins un autre agent pathogène. L'animal hôte est immunisé contre d'autres agents pathogènes par la production dans l'animal d'antigènes étrangers codés par la séquence d'ADN étranger du virus pseudorabique atténué. Les animaux peuvent être immunisés contre le virus pseudorabique et d'autres agents pathogènes en leur administrant une dose convenable d'un vaccin de la présente invention. Ces animaux comprennent les porcs, les chiens, les chats, les moutons ou les bovins. Le vaccin peut être administré par injection intramusculaire, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse. Le vaccin peut être également administré par voie intranasale ou orale. La présente invention propose également des procédés de préparation de virus pseudorabiques atténués qui comprennent une séquence d'ADN étranger. Un procédé consiste à isoler de l'ADN de virus pseudorabique naturel et à utiliser une digestion par des enzymes de restriction pour produire des fragments de restriction d'ADN. Ces fragments de restriction sont purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose afin d'obtenir des fragments d'ADN particuliers qui sont traités avec des enzymes appropriés, connus de l'homme de l'art, afin de produire des fragments d'ADN viral modifiés. Ces fragments d'ADN viral modifiés sont capables de se lier à des séquences d'ADN--plasmidique bactérien. Les plasmides bactériens convenables sont traités séparément avec des enzymes de restriction appropriés, connus de l'homme de l'art, afin de produire des séquences d'ADN plasmidique bactérien capables de se lier à des fragments d'ADN viral modifiés.Ces séquences d'ADN plasmidique bactérien sont ensuite associées aux fragments d'ADN viral modifiés dans des conditions convenables pour permettre à l'ADN viral de se lier à l'ADN bactérien et de former un plasmide viral-bactérien. Le plasmide d'ADN viral-bactérien est ensuite cartographié au moyen d'enzymes de restriction pour produire une carte de restriction de l'élément d'insertion d'ADN viral. Le plasmide d'ADN viral-bactérien est ensuite traité avec des enzymes de restriction connus dans la pratique pour couper la séquence d'ADN viral du plasmide d'ADN viral-bactérien. L'ADN étranger est digéré séparément avec des enzymes de restriction appropriés afin de produire des fragments de restriction d'ADN étranger. Les fragments comprenant les gènes désirés sont mélangés aux séquences plasmidiques d'ADN viral-bactérien dans des conditions convenables afin de permettre la formation d'un plasmide d'ADN viralbactérien-étranger. Ce plasmide, contenant la séquence d'ADN étranger, est transfecté dans des cellules animales avec des virus pseudorabiques naturels intacts. Les cellules animales sont maintenues dans des conditions convenables afin de permettre à l'ADN viral pseudorabique naturel de produire à nouveau le virus naturel et un petit pourcentage de virus qui présente une recombinaison avec la séquence d'ADN étranger du plasmide. Une partie de ces virus recombinés présente des délétions dans leur génome en résultat de délétions dans l'élément d'insertion d'ADN viral du plasmide. Les virus comprenant la séquence d'ADN étranger sont identifiés, puis séparés du virusde type sauvage par purification sur plaque. La séquence d'ADN étranger incorporée au génome du virus pseudorabique peut coder pour la thymidine-kinase du virus de l'herpès simplex de type I, la bêta-galactosidase de E. coli, la glycoprotéine 38 du rotavirus du porc ou la protéine de la capside du parvovirus B du porc. Un autre procédé de préparation de virus pseudorabiques atténués qui comprennent une séquence d'ADN étranger est proposé. Ce procédé de ligation directe consiste à isoler et digérer de l1ADN viral pseudorabique avec des enzymes de restriction appropriés pour produire des fragments de restriction d'ADN viral. L'ADN étranger est digéré séparément avec des enzymes de restriction pour produire des fragments de restriction d'ADN étranger. On fait réagir dans des conditions convenables les fragments de restriction d'ADN viral afin de permettre la formation de fragments d'ADN viralétranger. Des cellules animales sont ensuite transfectées avec les fragments d'ADN viral-étranger et maintenues dans des conditions convenables pour permettre aux fragments d'ADN viral-étranger de produire à nouveau des virus pseudorabiques. Les virus qui comprennent les séquences d'ADN étranger désires sont identifiées et debarrassées par purification sur plaque des autres virus. Dans une forme de réalisation de la présente invention, le procédé de ligation directe comprend l'incorporation au génome du virus pseudorabique d'une séquence d'ADN étranger codant pour la bêta-galactosidase de E. coli. La présente invention propose en outre des procédés de préparation de vaccins comprenant des virus pseudorabiques qui contiennent une séquence d'ADN étranger. Ces procédés comprennent la culture du virus dans des flacons munis d'un dispositif d'agitation à rouleaux ou dans une suspension de perles servant de microsupports. Les vaccins peuvent également être préparés en cultivant le virus par fermentation discontinue. La présente invention propose également une molécule d'acide nucléique isolée ayant la séquence d'acides nucléiques indiquée sur la figure 10 et codant pour la glycoprotéine 38 du rotavirus du porc. Cette molécule d'acide nucléique peut être une molécule d'ADNc. La présente invention concerne en outre une molécule d'ARNm qui est complémentaire de la molécule d'acide nucléique indiquée sur la figure 10. Un vecteur recombinant de clonage bactérien qui comprend l'ADN plasmidique et l'ADNc de la présente invention est également proposé. Dans une forme de réalisation particulière de la présente invention, l'ADN plasmidique comprend de l'ADN de pBR322. Ce vecteur de clonage est appelé pSY565. Une cellule hôte bactérienne qui comprend ce vecteur de clonage est en outre proposée. Dans une forme de réalisation particulière, la cellule hôte est une cellule de E. coli appelée DH-1/pSY565 déposée dans l'ATCC sous le numéro de dépôt 53 340. Il est de plus proposé une molécule d'acide nucléique isolée ayant la séquence d'acides nucléiques indiquée sur la figure 11 et codant pour la protéine de la capside du parvovirus B du porc. Cette molécule d'acide nucléique peut être une molécule d'ADNc. La présente invention propose également une molécule d'ARNm qui est complémentaire de la molécule d'acide nucléique indiquée sur la figure 11. De plus, un vecteur recombinant de clonage bactérien qui comprend l'ADN plasmidique et l'ADN de la figure 11 est également proposé. Dans une forme de réalisation particulière de la présente invention, l'ADN plasmidique comprend de l'ADN de pSP64. Ce vecteur de clonage est appelé pSY875. Une cellule hôte bactérienne qui comprend le vecteur de clonage est en outre proposée. Dans une forme de réalisation particulière, la cellule hôte est une cellule de E. coli appelée HB1O1/pSY875, déposée dans l'ATCC sous le numéro de dépôt 67 146. La présente invention propose en outre un virus pseudorabique atténué comprenant de l'ADN qui contient une séquence essentielle pour la réplication du virus pseudorabique atténué, dont au moins une portion est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un virus pseudorabique naturel. Cet ADN code pour des ARNm qui, chez un animal infecté avec le virus pseudorabique atténué, sont traduits en des produits géniques antigéniques de virus pseudorabique qui produisent chez l'animal infecté une réponse immunologique pouvant être distinguée d'une réponse immunologique provoquée chez un animal infecté par un virus pseudorabique naturel.Dans cette demande, l'expression "virus pseudorabique naturel" signifie un virus pseudorabique qui n' a pas été soumis à une manipulation génétique et comprend, mais à titre non limitatif, des virus pseudorabiques de type sauvage et des virus pseudorabiques choisis parmi les virus pseudorabiques qui existent dans la nature et présentent des délétions spontanées. La séquence essentielle pour la réplication du virus pseudorabique atténué peut être obtenue à partir d'un virus pseudorabique naturel. En outre, l'ADN peut comprendre de l'ADN de virus pseudorabique de type sauvage duquel au moins une portion d'un gène non essentiel a été éliminée par délétion. Dans cette demande, l'expression "gène non essentiel" signifie un gène qui n'est pas essentiel pour la réplication virale. Dans une forme de réalisation de la présente invention, le gène non essentiel dont au moins une portion a été éliminée par délétion est le gène gpX. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, pratiquement la totalité de la région de codage du gène gpX, une portion d'une séquence de répétition et le gène de la thymidine-kinase sont éliminés par délétion. Encore dans une autre forme de réalisation de la présente invention, pratiquement la totalité de la région de codage du gène gpX, une portion d'une séquence de répétition et le gène de la thymidinekinase sont éliminés par délétion et le gène de la thymidine-kinase du virus de l'herpes simplex de type 1 (VHS-1), sous le contrôle du promoteur ICP4, est inséré à la place de la région de codage du gene gpX éliminée par délétion. Ce virus, appelé S-PRV-012, a été déposé dans l'ATCC sous le numéro de dépôt VR 2119. Encore dans une autre forme de réalisation de la présente invention, la région de codage du gène gpX, une portion d'une séquence de répétition et le gène de la thymidine-kinase sont éliminés par délétion et le gène de la bêta-galactosidase de E. coli est inséré à la place de la région de codage du gène gpX éliminée par délétion. Le gène de la bêta-galactosidase inséré est sous le contrôle du promoteur gpX endogène. Ce virus, appelé S-PRV-013, a été déposé dans l'ATCC sous le numéro de dépôt VR 2120. La présente invention propose en outre un vaccin contre la maladie à virus pseudorabique qui comprend une quantité immunisante efficace d'un virus pseudorabique atténué de la présente invention et un véhicule convenable. Le véhicule convenable peut être un milieu de culture physiologiquement équilibré contenant des conservateurs. En outre, la quantité immunisante efficace, c'est-à-dire une quantité nécessaire pour provoquer la production d'anticorps par l'animal qui confèrent à celui-ci une protection contre une infection ultérieure par le virus pseudorabique de type sauvage, peut être comprise entre environ 103 et environ 106 unités de formation de plaques (UFP)/dose. De plus, la quantité immunisante efficace peut être comprise entre environ 10 et environ 105 UFP/dose. Dans une forme de réalisation de la presente invention, le vaccin comprend une quantité immunisante efficace du virus pseudorabique atténué appelé S-VPR012 et un véhicule convenable. Encore dans une autre forme de réalisation, le vaccin comprend une quantité immunisante efficace du virus pseudorabique atténué appelé S-PRV013 et un véhicule convenable. La présente invention propose également une méthode d'immunisation d'un animal contre une maladie à virus pseudorabique. Cette méthode consiste à administrer à l'animal une dose convenable d'un vaccin de la présente invention. Dans une forme de réalisation de la présente invention, la quantité immunisante efficace du virus pseudorabique atténué du vaccin est com prise entre environ 103 et environ 106 UFP/dose. De plus, l'animal peut être un porc. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, la quantité immunisante efficace du virus pseudorabique atténué du vaccin est comprise entre environ 104 et environ 105 UFP/dose. L'animal immunisé par cette méthode peut être un porc, un chien, un chat, un mouton ou un bovin. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, un animal peut être immunisé contre une maladie à virus pseudorabique par l'administration à celui-ci d'une dose convenable d'un vaccin de la présente invention, qui comprend le virus pseudorabique atténué S-PRV-012. L'animal immunisé peut être un porc. Une autre méthode d'immunisation d'un animal contre une maladie à virus pseudorabique consiste à administrer à l'animal une dose convenable du vaccin de la présente invention, qui comprend le virus pseudorabique atténué S-PRV-013. De plus, l'animal immunisé peut être un porc. La présente invention propose également une méthode pour différencier un animal vacciné avec un vaccin de la présente invention d'un animal infecté par un virus pseudorabique naturel. Cette méthode consiste à analyser un liquide biologique de l'animal pour déterminer la présence d'antigènes exprimée normalement chez un animal infecté par un virus pseudorabique naturel, à identifier les antigènes qui sont présents dans le liquide biologique et les antigènes qui ne sont pas présents dans le liquide biologique, et à effectuer une corrélation entre les antigènes qui ne sont pas présents dans le liquide biologique et les antigènes qui ne sont pas exprimés chez un animal infecté par le virus pseudorabique atténué du vaccin.La présence dans le liquide biologique d'antigènes qui sont exprimés normalement chez l'animal par un virus pseudorabique naturel, sauf pour les antigènes qui ne sont pas exprimés chez l'animal par le virus pseudorabique atténué du vaccin, est révélatriced'un animal vacciné avec le vaccin et non infecté par un virus pseudorabique naturel. Dans une forme de réalisation de la présente invention, la présence d'antigènes dans le liquide biologique est déterminée par la détection dans le liquide biologique d'anticorps spécifiques des antigènes. Il est également proposé une méthode pour différencier un animal vacciné avec un vaccin comprenant le virus pseudorabique atténué S-PRV-012 d'un animal infecté par un virus pseudorabique naturel. Suivant cette méthode, un liquide biologique de l'animal est analysé pour déterminer la présence de la glyco protéine X et d'au moins un autre antigène exprimé normalement chez l'animal par un virus pseudorabique naturel. Les antigènes qui sont présents dans le liquide biologique sont identifiés et la présence ou l'absence de la glycoprotéine X dans le liquide biologique est déterminée. La présence d'antigènes qui sont exprimés normalement chez l'animal par un virus pseudorabique naturel et l'absence de la glycoprotéine X dans le liquide biologique sont révélatrices d'un animal vacciné avec le vaccin et non infecté par un virus pseudorabique naturel.Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, la présence d'antigènes et de la glycoprotéine X dans le liquide biologique est déterminée par la détection dans le liquide biologique d'anticorps spécifiques des antigènes et la glycoprotéine X. La présente invention propose en outre une méthode pour différencier un animal vacciné avec un vaccin qui comprend le virus pseudorabique atténué S- Pro013 d'un animal infecté par un virus pseudorabique naturel. Cette méthode consiste à analyser un liquide biologique de l'animal pour déterminer la présence de la glycoprotéine X et d'au moins un autre antigène exprimé normalement chez un animal par un virus pseudorabique naturel. Les antigènes qui sont présents dans le liquide biologique sont identifiés et la présence ou l'absence de la glycoprotéine X dans le liquide biologique est déterminée. La présence des antigènes qui sont exprimés normalement chez un animal par un virus pseudorabique naturel -et l'absence de la glycoprotéine X dans le liquide biologique sont révélatrices d'un animal vacciné avec le vaccin et non infecté par un virus pseudorabique naturel. La présence des antigènes et de la glycoprotéine X peut être déterminée par la détection dans le liquide biologique d'anti corps spécifiques des antigènes et de la glycoprotéine X. De plus, la présente invention propose un procédé de préparation d'un vaccin à virus pseudorabique de la présente invention. Dans une. forme de réalisation de la présente invention, le virus pseudorabique atténué est cultivé dans des flacons munis d'un dispositif d'agitation à rouleaux. Dans une autre forme de realisation de la présente invention, le virus pseudorabique atténué est cultivé dans une suspension de perles servant de microsupports. Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, le virus pseudorabique atténué est cultivé par fermentation discontinue.Les procédés d'élaboration, de sélection et de purification des herpès virus de la présente invention, ainsi que les techniques analytiques destinées à déterminer le statut immunitaire des porcs après vaccination et mise à l'épreuve avec des virus pseudorabiques de type sauvage, sont décrits en détail dans les paragraphes "matériels" et "méthodes" et "exemples" suivants, qui illustrent, mais en aucune manière ne limitent, le cadre de la présente invention, qui est defini par les revendications. MATERIELS ET METHODES CROISSANCE D'HERPES VIRUS EN CULTURE DE TISSU. La croissance de tous les herpès virus examinés a été effectuée dans des cellules de tissus en culture. Sauf spécification contraire, les cellules utilisées étaient : des cellules Vero pour le VPR ; des cellules HDBK pour le RIB ; des cellules de CEF pour l'HVD ; des cellules de reins de chat Crandall pour l'HVF. Les cellules Vero conviennent pour le HVE et les cellules de MDCK conviennent pour l'HVC. PREPARATION D'ECHANTILLONS DE RESERVE D'HERPES VIRUS. Des échantillons de réserve d'herpès virus ont été préparés en infectant des cellules de tissus en culture à un facteur multiplicatif d'infection de 0,01 UFP/cellule dans du milieu de Eagle modifié de Dulbecco (MEMD) contenant 2 mM de glutamine, 100 unités/ ml de pénicilline, 100 unités/ml de streptomycine (ces constituants ont été obtenus auprès de Irvine Scientific ou d'un fournisseur équivalent, et sont désignés ciaprès sous le nom de milieu de EMD complet), plus 1% de sérum de bovin foetal. Une fois l'effet cytopatho gène terminé, le milieu et les cellules ont été recueillis et les cellules ont été rassemblées en un culot à 3000 tr/min pendant 5 minutes dans une centrifugeuse médicale.Pour tous les herpès virus, sauf le HVD, les cellules ont été remises en suspension dans 1/10 du volume initial de milieu, et un volume égal de lait écrémé soumis à deux reprises à un traitement en autoclave (poudre de lait écrémé dans l'eau à 9 % en poids/volume) a été ajouté. L'échantillon de virus a été congelé et décongelé à deux reprises, porté à un volume aliquote et entreposé à l'état congelé à -70 C. Le titre était habituellement égal à environ 10 unités formant des plaques par ml. Pour l'HVD, les cellules infectées ont été remises en suspension dans du milieu complet contenant 20 % de sérum de bovin foetal, 10 X de DHSO, et entreposées à l'état congelé à -70 C. PREPARATION D'ADN D'HERPES VIRUS. Pour la préparation d'ADN d'herpès virus, une monocouche confluente de cellules de tissus en culture dans un flacon de 25 cm2 ou une boite de Pétri de 60 mm a été infectée avec 100 microlitres d'échantillon de virus dans 1 ml de milieu. L'adsorption s'est effectuée pendant 1 à 2 heures à 37"C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de C02 dans l'air. Après adsorption, 4 mol de milieu de EMD complet plus 1 % de sérum de bovin foetal ont été ajoutés. Apres incubation pendant une nuit, ou bien lorsque les cellules ont présenté un effet cytopathogène de 100 %, les cellules ont été grattees dans le milieu avec un racloir de cellules (de marque Costar).Les cellules et le milieu ont été centrifugés à 3000 tr/min pendant 5 minutes dans une centrifugeuse médicale. Le milieu a été décanté, et le culot de cellules a été remis doucement en suspension dans 0,5 ml de solution contenant 0,01 M de tris à pH 7,5, 1 mM d'EDTA et 0,5 % de Nonidet P-40 (NP40, un détergent ionique comprenant un produit de condensation d'octylphénol et d'oxyde d'éthylene, contenant en moyenne 9 moles d'oxyde d'éthylène par molécule, acheté chez Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.). L'échantillon a été mis à incuber à temperature ambiante pendant 10 minutes. Dix microlitres d'une solution de réserve de RNase A (Sigma) ont été ajoutés (la solution de réserve, à 10 mg/ml, a été soumise à une ébullition pendant 10 minutes pour activer la DNAase).L'échantillon a été centrifugé pendant 5 minutes à 3000 tr/min dans une centrifugeuse médicale pour rassembler les noyaux en un culot. Le culot d'ADN a été enlevé avec une pipette pasteur ou une baguette de bois et a été rejeté. Le liquide surnageant a été décanté dans un tube d'Eppendorf de 1,5ml contenant 25 microlitres de dodécylsulfate de sodium à 20 % (Sigma) et 25 microlitres de protéinase-K (10 mg/ml ; fournisseur Boehringer Mannheim). L'échantillon a été mélangé et mis à incuber à 37"C pendant 30 à 60 minutes. Un volume égal de phénol saturé d'eau a été ajouté et l'échantillon a été mélangé sur un mélangeur tourbillonnaire pendant 1 minute. L'échantillon a été centrifugé dans une minicentrifugeuse d'Eppendorf pendant 5 minutes à la vitesse maximale.La phase aqueuse supérieure a été transférée dans un nouveau tube d'Eppendorf, et deux volumes d'éthanol absolu à -20 C ont été ajoutés et le tube placé $ -200C pendant 30 minutes pour obtenir la précipitation de l'acide nucléique. L'échantillon a eté centrifugé dans une centrifugeuse d'Eppendorf à 4"C pendant 5 minutes. Le surnageant a été décanté, et le culot a été lavé une fois avec de l'éthanol froid à 80 X. Le culot a eté déshydraté dans un lyophiliseur, et réhydraté dans 17 microlitres de H20. Pour la préparation de quantités supérieures d'ADN, le mode operatoire a été développé, en commençant avec un flacon muni d'un dispositif d'agitation à rouleaux de 850 cm2 de cellules Vero.L'ADN a été entreposé dans H20 ou dans 0,01 M de tris à pH 7,5, 1 mM d'EDTA à -20 C ou 44 C. EXTRACTION PAR LE PHENOL Une extraction par le phénol a été effectuee sur un volume convenable quelconque d'échantillon d'ADN, compris normalement entre 100 microlitres et 1 ml. L'échantillon d'ADN a été dilué dans 0,01 M de tris à pH 7,5, 1 mM d'EDTA et un volume égal de phénol saturé d'eau a eté ajouté. L'échantillon a été brièvement mélangé sur un mélangeur tourbillonnaire et placé sur de la glace pendant 3 minutes. Après centrifugation pendant 3 minutes dans une microcentrifugeuse, la phase aqueuse a été transférée dans un nouveau tube et a été précipitée par l'éthanol. PRECIPITATION PAR L'ETHANOL. L'ADN dans un échantillon a été concentré par précipitation par l'éthanol. On a ajouté à ltéchan- tillon d'ADN 1/10 de volume d'acétate de sodium 3M, à pH 7,5, et 3 volumes d'éthanol froid. L'ADN a été précipité pendant 30 minutes à -700C ou pendant une nuit à -20 C, puis rassemblé en un culot par centrifuga tion pendant 15 minutes à 4"C dans la microcentrifugeuse. Le culot a été lavé une fois avec 200 microlitres d'éthanol froid à 80 % et mis de nouveau sous forme de culot pendant 10 minutes à 4"C. Après séchage à l'air ou lyophilisation, les culots ont été remis en suspension dans le tampon approprie ou H20. DIGESTION PAR DES ENZYMES DE RESTRICTION. L'ADN a été coupé par des enzymes de restriction en utilisant le tampon recommandé par le fabricant (International Biotechnologies Inc., New Haven, CT. (IBI), Bethesda Research Laboratories, Bethesda, -MD. (BRL) et New England Biolabs, Beverly, MA). Chaque fois que cela était possible, la concentration d'ADN a été maintenue en dessous de 1 microgramme/50 microlitres. L'incubation a été effectuée à 37"C pendant 1 à 4 heures. ELECTROPHORESE DE L'ADN SUR GEL D'AGAROSE. Pour visualiser le diagramme de restriction de l'ADN, 5 microlitres de tampon de fixation (tampon d'électrophorèse 5X, 0,01 % de colorant du type bleu de bromophénol, 50 mM d'EDTA et 50 % de glycérol) ont été ajoutés. L'échantillon a été introduit dans une voie dans une unité d'électrophorèse sous-marine horizontale contenant un gel d'agarose à 0,6 %. Le tampon d'électrophorèse comprenait 40 mM de tris, 10 mM d'EDTA, ajusté à pH 7,8 avec de l'acide acétique, et contenait ou non 0,5 microgramme/ml de bromure d'éthidium. Le gel a été mis en service à 40-50 V pendant 18 heures, et le gel a été enlevé et coloré avec 0,5 microgramme/ml de bromure d'éthidium pendant 30 minutes. Les bandes d'ADN ont été visualisées sur un appareil d'éclairage par transparence à UV de grandes longeurs d'ondes. TRAITEMENT DE L'ADN PAR UNE PHOSPHATASE. Un traitement de l'ADN par une phosphatase a été effectué en ajoutant 1 microlitre (25 unités) de phosphatase intestinale de veau (Boehringer Mannheim) directement après les réactions de digestion par des enzymes de restriction et en poursuivant l'incubation pendant 30 minutes à 37ex. La phosphatase a été inactivée pendant 60 minutes à 65"C avant l'extraction par un phénol. REACTION DE COMBLEMENT DE BRECHES PAR UNE POLYMERASE. L'ADN a été remis en suspension dans un tampon contenant 50 mM de tris à pH 7,4, 50 mM de KCl, 5 mM de MgCl2 et 400 micromoles de chacun des quatre désoxynucléotides. On a ajouté 10 unités d'ADN-polymérase de Klenow (BRL) et on a laissé la réaction s'effectuer pendant 15 minutes à température ambiante. L'ADN a été ensuite extrait par un phénol et précipité par l'éthanol de la manière indiquée ci-dessus. REACTION DE RESECTION PAR UNE EXONUCLEASE. L'ADN a été remis en suspension dans 100 microlitres de 60 mM de tris à pH 8,0, 0,66 mM de MgCl2, 1 mM de bêta-mercapto-éthanol. L'échantillon a été chauffe à 30"C pendant 5 minutes, et 10 unités d'exonucléase lambda III (BRL) ont été ajoutées. A des intervalles de temps rapprochés (par exemple toutes les 2,5 minutes), des portions aliquotes de 10 microlitres ont été diluées dans 100 microlitres d'acétate de sodium 30 mM à pH 4,5, NaCl 250 mM, ZnSO4 1 mM, 4 microgrammes/100 microlitres d'ARNt de levure, 30 unités/100 microlitres de nucléase S1. Au bout de 45 minutes à 30"C, 15 microlitres de tampon d'arrêt comprenant 625 mM de tris à pH 9,0, 150 mM d'EDTA, 1 X de DSS, ont été ajoutés.Les échantillons ont été ensuite extraits par un phénol et précipites à l'éthanol de la manière indiquée ci-dessus. Les produits de diges tion de l'ADN ont été ensuite analysés et purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose. EXTRACTION PAR LE PHENOL DE L'ADN DE L'AGAROSE. Des bandes d'ADN séparées par découpage de gels d'agarose de bas points de fusion ont été diluées à une concentration d'agarose inférieure à 0,5 X jusqu'à une concentration finale de 0,3 M d'acétate de sodium. Les échantillons ont été chauffés à 65"C pour faire fondre l'agarose, puis ont été refroidis à 37"C pendant 5 minutes. Un volume égal de phénol a été ajouté et l'échantillon a été extrait par le phénol à trois reprises (voir EXTRACTION PAR LE PHENOL). L'ADN a été ensuite précipité par ltéthanol et le culot remis en suspension à une concentration de 3 à 6 fmoles d'ADN/microlitre. LIGATION. La jonction de l'ADN a été effectuée par l'action de l'enzyme appelé ADN-ligase T4 (BRL). Les réactions de ligation faisaient intervenir 10 fmoles d'ADN, 20 mM de tris à pH 7,5, 10 mM de MgCl2, 10 mM de dithiolthréitol (DTT), de l'ATP 200 micromolaire et 20 unités d'ADN-ligase T4 dans un volume de réaction final de 10 microlitres. On a laissé la ligation s'effectuer pendant 3 à 16 heures à 15"C. Normalement, les fragments d'ADN devant être reliés les uns aux autres par ligation ont été ajoutés à un rapport molaire égal. Normalement, deux fragments d'ADN différents ont été reliés au cours de la ligation, mais la jonction de trois ou quatre ADN différents à la fois était également possible. CARTOGRAPHIE DE RESTRICTION DE L'ADN. Une cartographie de restriction de l'ADN a été effectuée de la manière décrite en détail par Maniais et collaborateurs (1). Une fois cloné, l'ADN a été digéré avec un certain nombre d'enzymes de restric tion différents et les ADN ont été analysés sur des gels d'agarose et les dimensions des fragments résultants ont été mesurées. Une double digestion avec deux enzymes de restriction différents a été effectuée sur le même échantillon d'ADN pour faciliter l'interprétation des cartes.Une autre voie utilisée a consisté à couper l'ADN avec un enzyme de restriction possédant un seul site unique dans l'ADN, a marqué l'extrémité de l'ADN avec le 32P en utilisant de l'ADN-kinase l'ADN-kinase de T4 ou de l'ADN-polymérase de Klenow (voir REACTION DE COMBLEMENT DE BRECHES PAR UNE POLYMERASE), puis à couper l'ADN avec d'autres enzymes de restriction à basse température ou pendant de courtes durées afin que se produise seulement une digestion partielle. L'analyse ultérieure des fragments de digestion partielle sur des gels d'agarose a servi à classer les sites de restriction sur la carte. Tous ces procédés de cartographie sont bien connus de l'homme de l'art et sont décrits en détail par Maniatis et collaborateurs (1). Les cartes de restriction les plus complètes peuvent seulement être constituées une fois que l'ADN a été séquencé, et la séquence est ensuite analysée au moyen d'un calculateur recherchant tous les sites d'enzymes de restriction connus. Certaines des cartes de la présente invention ont été produites par informations successives. ANALYSE DE L'ADN PAR LA METHODE DE SOUTHERN. Le procédé général de la méthode d'analyse de Southern a été extrait de Maniatis et collaborateurs (1). L'ADN a été déposé sur des filtres de nitrocellulose (S & BA85) dans 20X SSC (1X SSC = 0,15 N NaCl, 0,015 H citrate de sodium, pH 7,0), et préhybridé dans une solution d'hybridation comprenant 30 % de formamide, 1X solution de Denhardt (0,02 % de polyvinylvinylpyrrolidone (PVP), 0,02 % de sérum-albumine bovine (SAB), 0,02 % de Ficoll), 6X SSC, 50 mM de NaH2P04, à pH 6,8, 200 microgrammes/ml d'ADN de sperme de saumon pendant 4 à 24 heures à 55"C. Une sonde d'ADN marquée a été ajoutée, qui a été marquée par coupure-substitution en utilisant un kit provenant de Bethesda Research 32 Laboratories (BRL) et un nucléotide marqué au P.La sonde d'ADN a été séparée des nucléotides non incorporés au moyen d'une colonne de NACS (BRL) ou sur une colonne de Sephadex G50 (Pharmacia). Après hybridation pendant une nuit à 55"C, le filtre a été lavé une fois avec 2X SSC à température ambiante, puis lavé à deux reprises avec 0,1X SSC, 0,1 % de dodécylsulfate de sodium (DSS) pendant 30 minutes à 55"C. Le filtre a été séché et autoradiographié. TRANSFECTION D'ADN POUR LA PRODUCTION D'UN VIRUS RECOM BINANT. Le procédé est basé sur le procédé de précipitation d'ADN par le phosphate de calcium de Graham et Van der Eb (32), avet les modifications suivantes. Pour la transfection dans des cellules animales, 0,1 à 0,2 microgramme d'ADN plasmidique contenant l'ADN étranger entouré par des séquences clonées d'herpès virus appropriées (l'homovecteur) a été mélangé à 0,3 microgramme d'ADN intact. Les deux ADN ont été entreposés dans H20 ou 0,01 M de tris à pH 7,5, 1 mM d'EDTA, le volume final devant être inférieur à 0,25 ml. On a ajouté au mélange un volume égal de 2X de solution de sel tamponnée par de L'HEPES (10 g d'acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N' -2-éthanesulfonique (HEPES), 16 g de NaCl, 0,74 g de KCl, 0,25 g de Na2HPO4. 2H20, 2 g de dextrose par litre de H20 et tamponnée avec NaOH à pH 7,4).Le mélange a été ensuite dilué à 0,5 ml par addition du volume approprié de 1X solution de sel tamponnée par de l'HEPES (préparée par dilution de la solution ci-dessus dans le rapport 1:1 avec H20). Après mélange, 35 microlitres de Caca2 2,2 M ont été ajoutés au mélange d'ADN et le mélange a été effectué. Le mélange a été mis à incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Le milieu a été séparé d'une monocouche confluente à 80 X de cellules d'épiderme de lapin, de cellules Vero ou de cellules de CEF croissant dans un flacon de 25 cm2, et le mélange d'ADN a été introduit dans le flacon et réparti sur les cellules.Après une incubation de 30 minutes à température ambiante, 5 ml de milieu EMD complet plus 10 X de sérum de bovin foetal ont eté ajoutés. Les cellules ont été mises à incuber pendant 5 heures à 37"C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de C02 dans l'air. Le milieu a été changé au bout de 5 heures avec ou sans un choc au glycérol. Lorsqu'il a été utilisé, le choç au glycérol consistait à enlever le milieu et à ajouter de l'EMD contenant 20 % de glycérol pendant 3 minutes à température ambiante, puis à effectuer un lavage avec 10 % de glycérol dans le l'EMD, et un lavage dans 5 % de glycérol dans l'EDM, puis à ajouter du milieu d'EMD complet frais plus 10% de sérum de bovin foetal.Les cellules ont été mises à incuber à 37"C de la manière indiquée ci-dessus pendant 3 à 4 jours, jusqu'à production par le virus d'un effet cytopathogène de 50 à 100 %. Le virus a été recueilli de la manière décrite ci-dessus pour la préparation des réserves de virus. Cette réserve a été désignée sous le nom de réserve de transfection et elle a été ensuite soumise à un examen pour déterminer la présence de virus recombinants, avec ou sans un système de sélection destiné a enrichir des plaques en recombinants de la manière décrite ci-dessous. PROCEDE DE LIGATION DIRECTE DESTINE A LA PRODUCTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANTS. Plutôt que d'utiliser des homovecteurs et de s'appuyer sur la recombinaison homologue pour produire un virus recombinant, la technique de ligation directe a été- mise au point pour insérer des gènes étrangers dans des herpès virus. Dans ce cas, le gène étranger cloné ne nécessite pas de séquences voisines d'ADN d'herpès virus mais necessite seulement la présence de sites de restriction disponibles pour éliminer par coupure le fragment de gènes étrangers du vecteur plasmidique. Un enzyme de restriction compatible a été utilisé pour couper l'ADN d'herpès virus. Un impératif de la technique était la nécessité que l'enzyme de restriction utilisé pour couper l1ADN d'herpès virus puisse effectuer une coupure à un nombre limité de sites, de préférence inférieur à 3 sites.Pour l'ADN de VPR, on a utilisé xbaI, qui coupe l'ADN de VPR à deux endroits, et l'utilisation de HindIII (2 coupures), EcoRV (2 ou 3 coupures) ou NdeI (3 à 5 coupures) est envisagée. L'ADN d'herpès virus a été mélangé à un excès molaire de 30 fois d'ADN plasmidique, et le mélange a été coupé avec l'enzyme de restriction approprié. Le mélange d'ADN a été extrait par le phénol et précipité par l'éthanol pour éliminer les enzymes de restriction, et les ADN ont été fixés les uns aux autres par ligation suivant le procédé de ligation décrit en détail ci-dessus. Le mélange d'ADN soumis à une ligation a été ensuite extrait par le phénol, précipité par l1étha- nol et remis en suspension dans 298 microlitres de tris 0,01 M à pH 7,5, l'EDTA 1 mM. Quarante-deux microlitres de CaCl2 2M ont été ajoutés, suivis par un volume égal de 1X solution de sel tamponnée par de l'HEPES (voir ci-dessus), et l'échantillon a été utilisé pour transfecter des cellules animales de la manière décrite ci-dessus. Le virus dans la souche de transfection a été ensuite soumis à un examen pour déterminer la présence d'éléments d'insertion d'ADN étranger de la manière décrite ci-dessous. L'avantage de la technique de ligation directe consistait en la nécessité d'une élaboration moindre de sous-clones à l'état de plasmides, et la présence du virus recombinant dans la souche de transfection à une fréquence bien supérieure à celle obtenue avec une recombinaison homologue. SELECTIONPARHAT D'HERPES VIRUS RECOMBINANT EFFECTUANT L'EXPRESSION DE THYMIDINE-KINASE. Des mutants par délétion d'herpès virus présentant des délétions dans le gène de la thymidinekinase (TK) ont été élaborés. Ces souches de VPR ont été appelées S-'PRV,002 et S-PR > -003 et ont été déposées dans l'ATCC respectivement sous les numéros de dépôt VR 2107 et VR 2108. Ces virus TK moins (TK-) ont été utilisés comme récepteurs pour l'insertion du gène TK étranger du virus de l'herpès simplex de type 1 (VHS-1). Un gène TK de VHS -1 qui a été utilisé contient le promoteur ICP4 de VHS-1 et provenait de B. Roizman (16). Il a été sous-cloné pour se placer entre deux régions voisines d'ADN de VPR, par exemple par insertion du gène TK dans le fragment BamHI N 5 de VPR entre les sites XbaI et HpaI. L'élément plasmidique construit a été ensuite transfecté avec l'ADN TK- de VPR, donnant un virus recombinant. La souche de transfection a été enrichie en virus contenant TK par le procédé de sélection par HAT décrit en (35). La souche de transfection a été utilisée pour infecter des monocouches de 143 cellules TK- dans des bortes- de culture de 60 mm qui ont été soumises à une incubation préalable dans du milieu HAT pendant 16 heures à 37 C (milieu HAT : milieu 199 contenant 2 mM de glutamine, 100 unités/ml de pénicilline, 100 unités/ml de streptomycine, 10 % de sérum de bovin foetal, 5 x 10 5 M d'hypoxanthine, 10 5 M de thymidine, 5 x 10 6 M d'aminoptérine).Des échantillons du virus de la souche de transfection ont été infectés dans les 143 cellules TK- en utilisant des dilutions de virus comprises entre 10 3 à 10 7 Au bout d'un ou deux jours à 37"C, les boîtes ensemencées avec la plus forte dilution de virus et présentant encore des plaques de virus ont été recueillies pour constituer des souches de virus, et la sélection a été répétée une seconde fois. La souche de virus recueillie par la seconde sélection par HAT a été utilisée dans un essai sur plaque et des plaques distinctes ont été prélevées et essayées en ce qui concerne la présence d'éléments d'insertion d'ADN étranger de la manière décrite cidessus. SELECTION PAR LA BROMODESOXYURIDINE D'HERPES VIRUS RECOMBINANT. Afin d'insérer un gène étranger à la place d'un gène TK déjà présent dans le génome de l'herpes virus, le gène étranger a été cloné dans des plasmides afin de contenir les mêmes régions homologues voisines que pour les gènes TK. Ces régions voisines pouvaient être une partie du gène TK proprement dit, ou bien des parties de l'herpès virus qui entourent le gène TK. Dans tous les cas, l'ADN plasmidique contenant le gène étranger a été transfecté avec de l'ADN génomique d'herpès virus intact contenant le gène TK de VHS1. La souche de transfection de virus recombinant a été cultivée pour deux sélections dans 143 cellules TK- en présence de 40 microgrammes/ml de bromodésoxyuridine (BUDR, Sigma) dans du milieu d'EMD complet plus 10 % de sérum de bovin foetal.Le médicament appelé BUDR est un analogue de la thymidine qui est reconnu par l'enzyme viral appelé thymidine-kinase (TK) et est finalement incorporé à l'ADN. Lorsqu'il est incor poré à l'ADN, le BUDR est mutagène et létal et une sélection est ainsi effectuee contre des virus qui possèdent un gène TK actif. Par cette méthode de sélection, la population était enrichie en virus qui avaient échange leur gène TK contre un gène étranger par recombinaison homologue. La sélection des virus recombinants a été ensuite effectuee par une des techniques décrites en detail ci-dessous. SELECTION PAR HYBRIDATION D ' HERPES VIRUS RECOMBINANT Un mode opératoire utilisé est décrit en (36). La technique consistait à effectuer une analyse de VPR sur plaque sous agarose, à éliminer l'agarose une fois les plaques formées, à arracher la monocouche cellulaire de la boîte et à la placer sur un filtre à membrane de nitrocellulose. Le filtre était ensuite traité par la méthode d'analyse de Southern pour l'hybridation de l'ADN de la manière décrite en détail cidessus. La sonde d'ADN utilisée dans le mode opératoire était préparée à partir du gène étranger qui a été inséré dans le virus. Ainsi, des plaques contenant le gène étranger ont été identifiées, et elles ont été prélevées de la couche supérieure d'agarose qui a été conservée. SELECTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT AU MOYEN DU BLUO GAL. Lorsque le gène étranger a codé pour l'enzyme appelé bêta-galactosidase, les plaques qui contenaient le gène ont été visualisées plus aisément. La substance chimique appelée Bluogal (BRL) a été incorporée à la teneur de 200-300 microgrammes/ml à la couche supérieure d'agarose au cours de l'analyse sur plaque, et les plaques qui ont effectuées l'expression de bêtagalactosidase active ont viré au bleu. Les plaques de couleur bleue ont été ensuite prélevées et purifiées par d'autres isolements de plaques bleues. D'autres gènes étrangers ont été insérés par recombinaison homologue de manière à remplacer le gène de la bêta-galactosidase ; dans ce cas, des plaques ne présentant pas la couleur bleue ont été prélevées afin d'effectuer une purification du virus recombinant. SELECTION PAR DES ANTICORPS D?-HERPES VIRUS RECOMBINANT Une troisième méthode de sélection de la souche de virus recombinant consistait à rechercher directement l'expression du gène étranger avec des anticorps. Des plaques d'herpès virus ont été repérées et prélevées par insertion d'un cure-dents à travers l'agarose au-dessus de la plaque et grattage de la région de la plaque sur la boîte. Les virus ont été ensuite enlevés du cure-dents par rinçage par insertion du cure-dents dans un puits d'une boîte de microtitration de 96 puits (Falcon Plastics) contenant une monocouche confluente de cellules de tissus en culture qui a été lavée à trois reprises dans du milieu d'EMD dépourvu de sérum. Il était important que la croissance du virus s'effectue en l'absence de sérum à cette étape afin de permettre la mise en oeuvre du procédé immunologique.Une fois- l'effet cytopathogène total, les plaques ont été placées à -70 C pour obtenir la congélation et la lyse des cellules. Le milieu a été décongelé, et le procédé de congélation/décongélation a été répété une seconde fois. Puis, 50 à 100 microlitres de milieu ont été prélevés dans chaque puits et filtrés sous vide à travers une membrane de nitrocellulose (S & BA85) en utilisant un appareil DotBlotTM (BRL). Les taches du filtre ont été trempées dans une solution de fixation de 0,01 M de tris à pH 7,5, 0,1 M de NaCl, 3 % de sérum-albumine bovine à température ambiante pendant 2 heures sous agitation. Les taches du filtre ont été ensuite placées dans un sac pouvant être scellé (Sears Seal-A-Meal ou équivalent), et 10 ml de la solution de fixation qui contenait 10 microlitres d'anticorps spécifiques de la protéine étrangère ont été ajoutés. Après incubation sous agitation pendant une nuit à température ambiante, la tache a été lavée à trois reprises avec 100 ml de tris 0,01 M, à pH 7,5, NaCl 0,1 M, détergent Tween 20 à 0,05 % (Sigma). La tache a été placée dans un autre sac pouvant être scellé et 10 ml de solution de fixation contenant 106 coups par minute de protéine A- 5 I (New England Nuclear) ont été ajoutés.Après avoir laissé la protéine A se lier à l'anticorps pendant 2 heures à température ambiante sous agitation, on a lavé la tache de la manière indiquée ci-dessus, on l'a séchée et recouverte d'un film sensible aux rayons X et d'un écran renforçateur (Dupont) et autoradiographiée pendant 1 à 3 jours à -70 C. Le film a été développé par des procédés classiques. Le virus dans les puits positifs qui contenaient le virus recombinant a été purifié davantage. ANALYSE SUIVANT LA METHODE DE WESTERN Des échantillons de lysats cellulaires, des témoins positifs et des échantillons de protéines de référence ont été placés sur un gel de polyacrylamide suivant le mode opératoire de Laemmli (42). Après électrophorèse, le gel a été trempé dans un tampon de transfert (0,025 M de base Tris, 0,192 M de glycine, 20 % de méthanol) plus 0,1 X de DSS pendant 20 minutes. La portion de gel accumulé a été enlevée et le gel de séparation a été placé sur du papier Whatman- de 3 mm. Un morceau -de filtre de nitrocellulose de dimensions comparables a été imprégné préalablement par le tampon de transfert et placé sur le gel de polyacrylamide afin de recouvrir complètement le gel et réaliser un contact intime. Un morceau de papier Whatman de 3 mm imprégné préalablement a été placé au-dessus du filtre de nitrocellulose pour créer un "sandwich", et le sandwicha été placédans un dispositif de transfert électrophorétique (Biorad). Le sandwich a été cômplètement immergé dans le tampon de transfert. Le transfert électrophorétique a été effectué pendant 3 heures à 250 milliampères.Après transfert, le filtre de nitrocellulose a été enlevé du dispositif et placé dans une boite contenant 50 ml de tampon de fixation (50 mg/ml de sérum-albumine bovine, 10 mM de chlorure de magnésium, 100 mM de chlorure de potassium, 1 mM de chlorure de calcium, 10 mM d'imidazole à pH 7,0, 0,3 % de Tween 20, 0,02% d'azoture de sodium). La tache sur nitrocellulose a été mise à incuber pendant 1 à 2 heures dans le tampon de fixation à température ambiante sur un dispositif d'agitation. La tache a été ensuite placée dans un Sc'C pouvant être scellé contenant 15 ml du tampon de fixation plus l'anti-sérum spécifique servant de sonde et mise à incuber pendant une nuit à 37"C sur un dispositif d'agitation.La tache a été ensuite enlevée de la solution de sonde et rincée à 5 ou 6 reprises avec de la solution de sel tamponnée par un phosphate pendant une durée de 1 heure. La solution de sel tamponnée par un phosphate a été enlevée et 50 ml de tampon de fixation contenant 125 5 x 105 cpm de protéine A marquée au I (Amersham) ont été ajoutés. La tache a été mise à incuber pendant 1 heure avec la solution de protéine A marquée, la solution de protéine A marquée a été enlevée et la tache a été rincée à 5 ou 6 reprises avec de la solution de sel tamponnée par un phosphate contenant 0,3 de Tween 20. La tache a été séchée à l'air et autoradio graphiée pendant une nuit avec un écran renforçateur. METHODE DE CLONAGE EN ADNc DU GENE gp38 DU ROTAVIRUS DU PORC Croissance du virus. La multiplication de la souche OSU du rotavirus porcin (ATCC VR-892) a été effectuée sur des cellules MA-104 (cellules de reins de singe Rhésus provenant de MA Bioproducts). Des monocouches confluentes ont été infectées à un facteur multiplicatif d'infection supérieur à 10 dans du MEMD contenant 5 microgrammes/ml de trypsine. Les cellules ont été mises à incuber avec le virus pendant 48 heures ou jusqu'à obtention d'un effet cytopathogène Les milieux et les débris cellulaires ont été recueillis et centrifugés à 10 000 g pendant 20 minutes à 4"C. Le surnageant contenant le rotavirus a été ensuite centrifugé à 10 000 g dans un rotor préparatif Beckman Ti45 à 4"C. Les culots de virus ont été remis en suspension dans du milieu SM (50 mM de tris HCl à pH 7,5, 100 mM de KCl, 10 mM de MgCl2) et homogénéisés légèrement dans un homogénéiseur de type Dounce. Le virus remis en suspension a été centrifugé à 10 000 G pendant 10 minutes, puis chargé sur des gradients de CsCl à 25-50% dans du tampon SM. Les gradients ont été centrifugés à 100 000 G pendant 4 heures à 20"C. Les deux bandes de couleur bleu-blanc représentant les virions intacts et les parties centrales des rotavirus ont été recueillies, diluées, et le procédé en gradient de CSl a été répété une seconde fois. Le virus obtenu à partir du second gradient a été dialysé pendant une nuit contre du tampon SM à 4"C. Isolement de l'ARN viral. Le rotavirus de porc dialysé a été extrait à deux reprises avec un volume égal de SDS/phénol, puis de nouveau à deux reprises avec un mélange chloroforme:alcool iso-amylique (24:1). L'ARN bicaténaire a été précipité avec de l'éthanol en présence d'acétate de sodium 0,2 M, centrifugé et remis en suspension dans l'eau. La quantité obtenue était normalement égale à 100 microgrammes à partir de 1000 cm2 de cellules infectées. Synthèse et clonage d'ADNc gp38. 160 microgrammes d'ARN bicaténaire de rotavirus de porc obtenus par le méthode opératoire cidessus ont été mélangés à 1 microgramme de chacune des deux amorces oligonucléotidiques synthétiques dans un volume de 160 microlitres (les séquences des amorces étaient 5' -GGGAATTCTGCAGGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-3' et 5' -GGGAATTCTGCAGGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTTTGGCTA-3') obtenues à partir de la séquence publiée du rotavirus bovin (24). Le mélange -ARN-amorce a été soumis à une ébullition pendant 3 minutes dans un bain d'eau, puis a été refroidi sur de la glace.Des additions de 25 microlitres de tris HCl 1 M à pH 8,3, 35 microlitres de KCl 1 M, 10 microlitres de MgCl2 0,25 M, 7 microlitres de 2-mercapto-éthanol 0,7 M, 7 microlitres de dNTP 20 mM et 6 microlitres de transcriptase inverse (100 unités) ont été effectuées successivement. Le milieu réactionnel a été mis à incuber à 42"C pendant 1,5 heure, puis 10 microlitres d'EDTA 0,5 M à pH 8,0 ont été ajoutés et la solution a été extraite une fois avec un mélange chloroforme:phénol (1:1). La phase aqueuse a été enlevée et 250 microlitres d'acétate d'ammonium 4 M et 1,0 ml d'éthanol à 95 % y ont été ajoutés, le mélange a été congelé dans de la neige carbonique et centrifugé au froid. Le culot résultant a été remis en- suspension dans 100 microlitres de tris HCl 10 mM à pH 7,5 et le procédé de précipitation par l'acétate d'ammonium a été repété.Le culot a été remis en suspension dans 100 microlitres de KOH 0,3 M et mis à incuber à température ambiante pendant une nuit, puis à 37"C pendant 2 heures. Le pH de la solution a été amené à la neutralité par addition de 10 microlitres de HCl 3,0 M et 25 microlitres de tris HC1 1,OM à pH 7,5. L'ADNc monocaténaire resultant a été ensuite précipité à deux reprises par le procédé à l'acétate d'ammonium-éthanol décrit ci-dessus. Le culot obtenu a été remis en suspension dans 50 microlitres de tris HCl 10 mM à pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, soumis à une ébullition dans un bain d'eau pendant 2 minutes, puis mis à incuber b 59"C pendant 16 heures.La solution a été lyophilisée à un volume de 15 microlitres et l'ADNc bicaténaire résultant a été placé sur un gel d'agarose à 1,0 % (agarose Sigma de type II). L'ADN coloré au bromure d'éthidium migrant à une longueur correspondant à 1000-1100 paires de bases a été excisé du gel et soumis à une électro-elution dans undisposi- tif d'electro-élution CBS. La solution a été lyophilisée, et l'ADNc a été remis en suspension dans 25 microlitres d'eau. Deux microlitres de tris HCl 1,0 M à pH 7,5, 2 microlitres de KCl 1 M, 1 microlitre de MgCl2 0,25 M, 1 microlitre de dNTP 20 mM et 5 unités d'ADN-polymérase I de E. coli ont été ajoutés à cette solution. Le milieu réactionnel a été mis à incuber à température ambiante pendant 15 minutes, puis extrait par un mélange chloroforme/phénol et précipité par un mélange acétate d'ammonium-éthanol de la manière décrite ci-dessus. L'ADNc résultant a été caudé avec de la dCTP en utilisant de la désoxynucléotlde-transférase terminale (tampon et enzyme BRL utilisés). La réaction a été arrêtée avec 2 microlitres d'EDTA 0,5 M, une extraction a été effectuée avec un mélange chloroforme/phénol et une précipitation avec de l'acétate de sodium en présence de 10 microgrammes d'ARNt servant de support.L'ADNc remis en suspension a été mélangé à 200 ng de pBR322 coupé par Pst I caudépar dMGP (catalogue BRL N" 5355SA) dans 200 microlitres de tris HCl 10 mM à pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, chauffé 9 65"C pendant 5 minutes, puis à 57"C pendant 2 heures. Le pBR322 vecteur d'ADNc reconstitué a été transformé sur des cellules de E. coli DH-1 préparées en vue d'une transformation extrêmement efficace. Les colonies qui ont présenté une sensibilité à l'ampicilline et une résistance à la tétracycline ont été cultivées et l'ADN a été préparé et coupé avec Pst I pour déterminer les dimensions de l'élément d'insertion d'ADNc. Plusieurs clones possédant des éléments d'insertion Pst I de 1050 à 1100 paires de bases ont été analysés et se sont révélé posséder des modèles identiques de digestion par enzymes de restriction. Le plus grand clone a été appelé pSY565 et a été déposé dans l1ATCC sous le numéro de dépôt 53 340. Pour un de ces clones, l'élément d'insertion Pst I de 1100 paires de bases a été sous-cloné dans un vecteur de séquençage de phage M13. La séquence d'ADN entière de ce clone a été déterminée et est représentée sur les figures 10A et lOB.L'emplacement du cadre de lecture ouvert gp38 a été déterminé d'après l'homologie d'amino-acides aux séquences humaine et bovine déjà publiées (44). METHODE DE CLONAGE EN ADNc DU GENE gp38 DU ROTAVIRUS BOVIN. Croissance du virus La multiplication de la souche Calf Nebraska du rotavirus bovin (USDA) a été effectuée sur des cellules de MA-104 (cellules de reins de singes rhésus provenant de MA Bioproducts). Des monocouches confluentes ont été infectées à un facteur multiplicatif d'infection supérieur à 10 dans du MEMD contenant 5 microgrammes/ml de trypsine. Les cellules ont été mises à incuber avec le virus pendant 48 heures ou jusqu'à obtention d'un effet cytopathogène. Les milieux et les débris cellulaires ont été recueillis et centrifugés à 10 000 g pendant 20 minutes à 4 C. Le surnageant contenant le rotavirus a été ensuite centrifugé à 10 000 g dans un rotor préparatif Beckman Ti45 à 40C. Les culots de virus ont été remis en suspens ion dans du milieu SM (Tris-HCl 50 mM à pH 7,5, KCl 100 mM, MgCl2 10 mM) et homogénéisés légèrement dans un homogénéiseur de type Dounce. Le virus remis en suspension a été centrifugé à 10 000 g pendant 10 minutes, puis chargé sur des gradients de CsCl à 25-50 % dans du tampon SM. Les gradients ont été centrifugés à 100 000 g pendant 4 heures à 200C. Les deux bandes de couleur bleu -blanc représentant les virions intacts et les masses centrales de rotavirus ont été recueillies, diluées et le procédé au qradient de CsCl a été répété une seconde fois. Le virus obtenu au moyen du second gradient a été dialysé pendant une nuit contre du tampon SM à 40C. Isolement de l'ARN viral Le rotavirus bovin dialysé a été extrait à deux reprises avec un volume égal d1un mélange DSS/phénol, puis également à deux reprises avec un mélange chloroforme:alcool isoamylique (24:1). L'ARN bicaténaire a été précipité avec de l'éthanol en présence d'acétate de sodium 0,2 M, centrifugé et remis en suspension dans l'eau. La quantité obtenue était normalement égale à 100 mi.crogrammes à partir de 2 1000 cm de cellules infectées. Synthèse et cLonage d'ADNc gp38 160 microgrammes d'ARN bicaténaire de rotavirus bovin obtenus par le mode opératoire ci-dessus ont été mélangés à 1 microgramme de chacune des deux amorces oligo-nucldotidiques synthétiques dans un volume de 160 microlitres (les séquences des amorces étaient 5'-GGGAATTCTGCAGGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-3' et 5' -GGGAATTCTGCAGGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTTTGGCTA-3') obtenues d'après la séquence publiée du rotavirus bovin (24). Le mélange ARN-amorce a été soumis à une ébullition pendant 3 minutes dans un bain d'eau, puis refroidi sur de la glace. Des additions de 25 microlitres de Tris-HCl 1 M à pH 8,3, 35 microlitres de KCl 1M, 10 microlitres de MgCl2 0,25 M, 7 microlitres de 2-mercaptoéthanol 0,7 M, 7 microlitres de dNTP 20 mM et 6 microlitres de transcriptase inverse (100 unités) ont été effectuées successivement. Le milieu réactionnel a été mis à incuberà 420C pendant 1,5 heure, puis 10 microlitres d'EDTA 0,5 M à pH 8,0 ont été ajoutés et la solution a été extraite une fois avec un mélange chloroforme:phénol (1:1). La phase aqueuse a été enlevée et 250 microlitres d'acétate d'ammonium 4 M et 1,0 ml d'éthanol à 95 % y ont été ajoutés, le mélange a été congelé dans de la neige carbonique et centrifugé au froid. Le culot résultant a été remis en suspension dans 100 microlitres de Tris-HCl 10 mM à pH 7,5 et le procédé de précipitation par l'acétate d'ammonium a été répété.Le culot a été remis en suspension dans 100 microlitres de KOH 0,3 M et mis à incuber à température ambiante pendant une nuit, puis à 370C pendant 2 heures. Le pH de la solution a été porté à la neutralité par addition de 10 microlitres d'HCl 3,0 M et 25 microlitres de Tris-HCl 1,0 M à pH 7,5. L'ADNc monocaténaire résultant a été ensuite précipité à deux reprises par le procédé à l'acétate d'ammonium-éthanol décrit ci-dessus. Le culot obtenu a été remis en suspension dans 50 microlitres de Tris-HCl 10 mM à pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, soumis à une ébullition dans un bain d'eau pendant 2 minutes, puis mis à incuber à 590C pendant 16 heures.La solution a été lyophilisée à un volume de 15 microlitres et l'ADNc bicaténaire résultant a été placé sur un gel d'agarose à 1,0 % (agarose Sigma de type II). L'ADN coloré au bromure d'éthidium migrant à une longueur correspondant à 1000-1100 paires de bases a été excisé du gel et soumis à une électroélution dans un dispositif d'électro-élution CBS. La solution a été lyophilisée , et l'ADNc a été remis en suspension dans 25 microlitres d'eau. 2 microlitres de Tris-HCl 1,0 M à pH 7,5, 2 microlitres de KCl 1 M, 1 microlitre de MgCl2 0,25 M, 1 microlitre de dNTP 20 mM et 5 unités d'ADN polymérase I de E. coli ont été ajoutés à cette solution. Le milieu réactionnel a été mis à incuber à température ambiante pendant 15 minutes, puis extrait au moyen d'un mélange chloroforme/phénol et précipité par un mélange acétate d'ammonium-éthanol de la manière décrite ci-dessus. L'ADNc résultant a été caudé avec de la dCTP en utilisant de la désoxynucléotide-transférase terminale (utilisation de tampon et d'enzyme BRL). La réaction a été arrêtée avec 2 microlitres d'EDTA 0,5 M, une extraction a été effectuée avec un mélange chloroforme/phénol et une précipitation a été effectuée avec de l'acétate de sodium en présence de 10 microgrammes d'ARNt servant de support. L'ADNc remis en suspension a été mélangé à 200 ng de pBR322 coupé par Pst I etnmfRavec dGMP (catalogue BRL NO 5355SA) dans 200 microlitres de Tris-HCl 10 mM à pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, chauffé à 650C pendant 5 minutes, puis à 570C pendant 2 heures. Le pBR322 vecteur d'ADNc reconstitué a été transformé sur des cellules de E. coli DH-1 préparées en vue d'une transformation extrêmement efficace. Les colonies qui ont présenté une sensibilité à l'ampicilline et une résistance à la tétracycline ont été cultivées et l'ADN a été préparé et coupé avec Pst I pour déterminer les dimensions de l'élément d'insertion d'ADNc. Plusieurs clones possédant des éléments d'insertion Pst I de 1050 à 1100 paires de bases ont été analysés et se sont révélé. posséder des modèles identiques de digestion par des enzymes de restriction.Pour un de ces clones, l'élément d'insertion Pst I de 1100 paires de bases a été sous-cloné dans un vecteur de séquence de phage M13. Une partie de la séquence d'ADN de ce clone a été déterminée et s'est révélé être identique à la séquence publiée (24). SELECTION D'UN HERPESVIRUS RESISTAXJT AU G418 L'antibiotique G418 (GIBCO) possède une large plage d'activité inhibitrice sur la synthèse des protéines. Cependant, le virus recombinant a effectué l'expression de l'aminoglycoside appelé 3'-phosphotransférase, codé par le gène NEO, par acquisition du gène étranger, et est devenu résistant au G418. Les souches de transfection de virus recombinants ont été cultivées sur du MDBK (pour le virus RIB), des cellules Vero (pour le VPR) ou QT35 (pour l'HvD) en présence de 500 microgrammes/ml de G418 dans du milieu EMD complet plus 1 % de sérum de bovin foetal. Au bout d'un ou deux jours à 370C, des plaques provenant des boîtes ensemencées avec la plus forte dilution de virus ont été prélevées pour constituer des souches de virus. La sélection a été répétée une seconde ou une troisième fois.Les souches de virus produites par la sélection par G418 ont été essayées en ce qui concerne l'insertion du gène NEO par le procédé d'Iwbfldat.ion, par l'ANALYSE DE L'ADN PAR LA METHODE DE SOUTHERN décrite cidessus. PURIFICATION DE gpX gpX a été purifié dans le milieu de culture de tissu de cellules Vero infectées cultivées dans de 1'EMD complet plus 1 % de sérum de bovin foetal. Les cellules Vero confluentes ont été infectées à un facteur multiplicatif d'infection égal à 5, avec la souche Iowa S-62 de virus pseudo rabique de type sauvage. Les protéines virales ont été radiomarquées avec de la 14C-glucosamine et/ou de la 35S- méthionine par introduction du marqueur approprié dans le flacon huit heures après l'infection. Les cellules et les milieux ont été recueillis vingt heures après l'infection, les cellules présentant un effet cytophathogène considérable et les liquides ont été centrifugés. Le liquide surnageant a été concentré d'un facteur 10 et dialysé contre un tampon sulfate de sodium 0,02 M/ phosphate de sodium 0,01 M, à pH 7,2 (16 heures, OOC), puis contre du tampon au phosphate de sodium 0,01 M à pH 7,2 renouvelé deux fois (24 heures, 0 C). Le dialysat a été traité pendant 30 minutes à OOC avec de l'acide perchlorique à 70 % à une concentration finale d'acide perchlorique de 0,02 M, puis centrifugé à 10 000 tr/min pendant 25 minutes. Le liquide surnageant a été ensuite dialysé contre du Tris 0,02 M à pH 8,5. Une purification a été effectuée par chromatographie en phase liquide à haute performance sur un appareil de CLHP Beckman modèle 334. Les protéines acido-solubles ont été séparées sur une colonne Biogel TSK DEAE 5-PW (75 x 75 mm) en utilisant un gradient linéaire de 60 minutes, un débit de 0,8 ml/ minute. Le tampon de départ était du Tris 0,02 M, à pH 8,5. Le tampon limitatif était du Tris 0,02 M à pH 7,0 contenant du NaCl 0,75 M. Le gpX a été élué sous forme d'un pic radioactif principal à 64 * du tampon limitatif. La matière recueillie représentait 25 % de la radioactivité introduite. ESSAI ELISA Un protocole d'essai classique utilisant un immunosorbant lié à un enzyme (ELISA) a été utilisé pour déterminer le statut immunitaire des porcs après vaccination et mise à l'épreuve. On a laissé l'absorption d'une solution d'antigène gpX purifiée (40 microlitres) s'effectuer dans les puits de boites de microtitration- en polycarbonate pendant deux heures à température ambiante. L'antigène se trouvait dans un tampon au carbonate (0,015 M)-bicarbonate (0,04 M), à pH 9,6. Les puits revêtus ont été rincés à trois reprises avec une solution de lavage ELISA (0,05 % de détergent non ionique Tween 20 dans une solution physiologique de sel tamponnée par un phosphate, à pH 7,5). Quarante microLitres de sérum contenant de l'anticorps contre gpX (dilués dans un rapport de 1 à 10 dans du tampon Tris contenant 1 % de sérum-albumine bovine et 0,05 % de Tween 20) ont été introduits dans les puits et mis à incuber pendant une heure à 37 0C. L'antisérum a été enlevé et les puits ont été lavés à trois reprises avec une solution de lavage ELISA. Une solution contenant de la protéine A staphylococcique associée à de la peroxydase de raifort (Bio-Rad) (diluée à 1:10 000 and le tampon Tris/SAB/Tween décrit ci-dessus) a été ajoutée (50 microlitres) pour visualiser les puits contenant l'anticorps contre l'antigène spécifique. La solution a été mise à incuber pendant une heure à 37 0C, puis enlevée et les puits ont été lavés à trois reprises avec une solution de lavage ELISA. On a introduit dans chaque puits 100 microlitres de solution de substrat (volumes égaux de peroxyde d'hydrogène et de tampon ATBS (Bio-Rad) et on a laissé la coloration se développer pendant 20 minutes. La réaction a été arrêtée par addition de 50 microlitres d'acide oxalique 0,01 M. La coloration a été lue à une absorbance (A) de 4t0 nm sur un appareil de lecture automatique de plaques. ETUDES DE VACCINATION CHEZ LE PORC. Des porcs sevrés (âgés de 4 à 6 semaines) et des truies gravides ont été obtenus à partir de troupeaux de porcs connus pour être dépourvus de maladies pseudo-rabique. La sensibilité des animaux d'essai à la pseudo-rage a été de plus vérifiée en vérifiant dans le sérum de porc l'absence d'anticorps neutralisant contre le virus pseuso-rabique (VPR). Les porcs sevrés et des porcelets agés de 3 à 4 jours ont été traités par inoculation intramusculaire de 1 ml de liquide viral contenant environ 104 à 1 o6 unités infectieuses (DICT50). Les animaux ont été observés chaque jour après la vaccination en ce qui concerne des réactions néfastes (signes cliniques d'une maladie à VPR) et les températures corporelles ont été notées.Des échantillons de sécrétions amygdaliennes ont été obtenues et cultivées pour déterminer si le virus vaccinal était capable de se répandre et de s'étendre à d'autres animaux. L'immunité a été déterminée en mesurant les teneurs en anticorps sériques contre le VPR à des intervalles d'une semaine et, dans certains cas, en mettant à l'épreuve les porcs vaccinés par contact avec le virus virulent. Dans ce dernier cas, les animaux vaccinés et un groupe de porcs non vaccinés ont été soumis à une inoculation de souche Iowa S-62 de VPR virulent, en utilisant une quantité de virus provoquant une maladie à VPR chez au moins 80 % du groupe de porcs non vaccinés. Cela a été effectué environ 28 jours après vaccination. Les animaux mis à l'épreuve ont été observés chaque jour en ce qui concerne des signes de maladie et des températures corporelles accrues. Une autopsie a été effectuée sur les animaux qui sont morts et des tissus sélectionnés ont été examinés et cultivés pour déterminer la présence de VPR. EXEMPLES EXEMPLE 1 S-PRV-004 On a produit un virus qui présente une délétion dans la région de jonction entre l'ADN long unique et la séquence de répétition interne du VPR, et une délétion dans le gène thymidine-kinase endogène du VPR dans la région longue unique. Dans la délétion de la région de jonction, on a effectué un clonage du gène thymidine-kinase (TK) du virus herpes simplex de type 1 (VSH-1) sous le contrôle du promoteur ICP4. Ce virus est appelé S-FRV-004. Pour produire ce virus, on a tout d'abord cloné le fragment SalI NO 1 du VPR. L'ADN du VPR a été préparé, puis coupé avec l'enzyme de restriction SalI. L'ADN coupé a été soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose et la bande SalI la plus grande (15 kb) a été purifiée par séparation du gel (voir EXTRACTION PAR LE PHENOL DE L'ADN DE L'AGAROSE). L'ADN purifié a été introduit par ligation dans le plasmide pSP64 (voir LIGATION) et le mélange d'ADN a été utilisé pour transformer E. coli HB101 suivant Maniatis et collaborateurs (1). Les sites de restriction du clone SalI NO 1 ont été cartographiés. Le procédé de recombinaison homologue a été utilisé pour produire S-PRV:-004 (voir figure 2). La position exacte de la région de jonction a été déterminée par séquence de l'ADN du fragment SalI N 1. Il a été trouvé que la région de jonction était placée entre deux sites StuI (figure 2A). Deux fragments d'ADN provenant du clone SalI ont été utilisés pour produire le vecteur d'homologie en vue d'une recombinaison. L'un était un fragment provenant de BamHI N 8', de StuI à BamHI, et l'autre était un fragment provenant de BamHI N 8, de BamHI à StuI (voir figures 1B et 2A). Ces fragments ont été clonés dans le site BamHI de psP64. Ce plasmide a été coupé avec StuI, et un fragment PvuII de 3,8 kb, obtenu auprès de B.Roizman (16), The University of Chicago, et contenant le promoteur ICP4 sur le fragment BamHI-N et le gène TK de VSH-1 sur le fragment BamHI-Q, fusionnés au niveau des sites BamHI/BglII, a été introduit par ligation dans le site Stuc. Le résultat final de cette série de clonages était un plasmide qui présentait une délétion de 3 kb entre les sites StuI, et dans lequel 3,8 kb du gène TK étranger ont été incorporés (voir figure 2B). Le gène TK a été ainsi entouré de séquences d'ADN du VPR afin de permettre l'insertion du gène étranger dans le génome du VPR par recombinaison homologue. L'ADN plasmidique a été transfecté dans des cellules d'épiderme de lapin avec l'ADN du VPR intact provenant de S-RS -003, qui est un virus pseudo-rabique qui présente une délétion dans le gène TK endogène.La souche de transfection de virus a été choisie dans du milieu HAT et le virus a été identifié et sélectionné par analyse du schéma de restriction d'ADN isolé des cellules infectées. S-PRV-004 contenait le gène TK de VSH-1 et effectuait l'expression de ce gène, comme l'ont démontré l'incorporation de 14C-thymidine dans une analyse sur plaque décrite dans Tenser et collaborateurs (40) et l'analyse directe d'activité de TK dans des extraits cellulaires infectés, suivant le mode opératoire de Cheng et collaborateurs (41). L'emplacement de ce gène dans le génome du VPR est indiqué sur la figure 2C.- Six porcs en âge d'être sevrés ont été vaccinés avec 105'0 unités infectieuses de S-PRV-004 et mis à l'épreuve par contact avec du VPR virulent 28 jours plus tard, suivant le mode opératoire des ETUDES DE VACCINATION CHEZ LE PORC. Les porcs vaccinés sont restés sains après vaccination et ont produit un anticorps sérique neutralisant contre le VPR (voir le tableau I ci-dessous).Le virus vaccinal n'a pas été recueilli dans les sécrétions nasales ou amygdaliennes.Après exposition au VPR virulent, 83 % des porcs vaccinés étaient protégés contre la maladie à VPR. TABLEAU I REPONSES DE PORCS SEVRES VACCINES AVEC S-PRV-004 ET MIS A L'EPREUVE PAR CONTACT AVEC DU VPR VIRULENT Après vaccination Après mise à l'épreuve Anticorps Anticorps Teneur en Porc Jour Jour Jour Signes Isolement Jour Jour Signes Isolement antigène N 14 21 28 cliniques du virus 7 14 clinquesa du virus 1 32 32 16 Aucun Aucun > 64 > 64 F Ecouvillons 2 16 32 8 Aucun Aucun > 64 > 64 F Ecouvillons 105,0 3 8 16 4 Aucun Aucun > 64 > 64 F Ecouvillons 4 4 16 8 Aucun Aucun > 64 > 64 F,C Ecouvillons 5 16 16 8 Aucun Aucun > 64 > 64 F Ecouvillons 6 8 8 4 Aucun Aucun > 64 > 64 F Ecouvillons a Légende des signes cliniques :C = Système nerveux central, F = fébrile EXEMPLE 2 S-PRV-005 S-PRV-005 est un virus pseudorabique qui présente une délétion dans la région de répétition et dans le gène TK endogène de VPR dans la région longue unique, et présente une insertion du gène TK de VHS -1 sous le contrôle du promoteur ICP4 incorporé aux deux copies de la région de répétition entre le site XbaI et le site HpaI dans le fragment BamHI NO 5 (voir figure 3). Pour produire ce virus, on a tout d'abord obtenu un clone de fragment BamHI NO 5 provenant dtu VPR (figure 1B). Le fragment BamHI NO 5 a été cloné dans le plasmide pACYC184 au niveau du site BamHI (voir LIGATION ci-dessus). Une carte du fragment BamHI NO 5 est présentée sur la figure 3A. Le plasmide contenant le fragment BamHI NO 5 a été coupé avec XbaI et HpaI et le plasmide linéarisé a été purifié (voir EXTRACTION PAR LE PHENOL DE L'ADN DE L'AGAROSE). Le fragment PvuII de 3,8 kb décrit dans l'exemple 1 et contenant le gène TK et le promoteur ICP4 a été purifié de manière similaire. Le site XbaI a été comblé pour obtenir une extrémité franche (voir REACTION DE COMBLEMENT DE BRECHES PAR UNE POLYMERASE), et les deux ADN ont été mélangés et réunis par ligation. Le plasmide résultant qui avait incorporé le gène TX dans la délétion XbaI-HpaI a été sélectionné et analysé par cartographie de restriction (figure 3B). Le plasmide contenant le gène TK entouré par les séquences BamHI NO 5 du VPR a été utilisé pour transfecter des cellules d'épiderme de lapin avec de l'ADN purifié provenant de S-PRV-003, un virus pseudorabique qui présentait une délétion dans le gène TK endogène. Le VPR recombinant résultant qui avait incorporé le gène TK de VHS-1 dans la délétion dans les séquences de répétition a été sélectionné et purifié à partir de la souche de transfection par le mode opératoire intitulé SELECTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT'PAR HYBRIDATION sans aucune sélection antérieure. Il a été montré que le. VPR recombinant appelé S-PRV-005 effectuait l'expression du gène TK de. VHS-1 par incorporation de 14C-thymidine dans un essai sur plaque (40), par analyse de l'activité de TK dans des lysats de cellules infectées (41), et par immunodétection de la protéine TK de VHS-1 suivant le mode opératoire intitulé SELECTION PAR DES ANTICORPS D'HERPES VIRUS RECOMBINANT indiqué ci-dessus. L'emplacement de ce gène dans le génome de VPR est indiqué sur la figure 3C. EXEMPLE 3 S-PRU-010 S-PRV-010 est virus pseudorabique qui présente une délétion dans le gène TIC du VPR dans la région longue unique, une délétion dans la région de répétition, et l'insertion du gène de la bêta-galactosidase de E. coli (gène lacZ) incorporé dans les deux copies des séquences de répétition au niveau du site XbaI dans le fragment BamHI NO 5 (voir figure 5 Al. Le gène de la bêta-galactosidase a été élaboré afin d'être exprimé en utilisant le promoteur du gène TK de VHS-1 dont on a montré l'activité dans cet élément de construction dans VPR. Le procédé utilisé pour insérer le gène de la bêtagalactosidase dans S-PRV-010 était une ligation directe (voir PROCEDE DE LIGATION DIRECTE POUR LA PRODUCTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT). Le gène bêta-galactosidase était un plasmide mJF751, obtenu auprès de Jim Hoch, Scripps Clinic and Research Foundation. Ce gène est tronqué à l'extrémité 5' avec un site BamHI qui a enlevé le codon d'initiation AGT, et le site AvaI dans pBR322 a été utilisé à l'autre extrémité (voir figure 4A). Le promoteur de TK de VHS-i (figure 4B) a été prélevé dans le gène TK McKnight sous forme d'un fragment RsaI, purifié sur gel, et fixé par ligation à un morceau synthétique d'ADN qui contenait un site BamHI dans la séquence CGGATCCG (figure 4C). Après digestion avec BamHI, le fragment a été cloné dans le site BamHI au début du gène de la bêta galactosidase (figure 4B).Le plasmide a été élaboré avec les plasmides de E. coli pSP64 et pSP65 de manière que les sites XbaI dans les molécules polyvalentes de jonction puissent être utilisées pour exciser du plasmide l'éliment entier. Le mélange de ligation a été utilisé pour transfecter E. coli HB101 suivant des modes opératoires publiés (Maniatis et collaborateurs (1)). Cet élément a été concu de manière que les trois premiers amino-acides de la protéine soient situés dans le gène TK de VHS-1, les trois suivants dans la molécule synthétique de jonction, et le reste dans le gène de la bêta-galactosidase. Le gène contenait la séquence suivante à la fusion entre TK et lacZ 5' CGT ATG GCT TCG TCG GAT CCC GTC GTT TTA 3' MET ala ser ser asp pro val val leu...... gène TK lac Z molécule de jonction BamHI Une construction de virus pseudorabique appelée S-PRV-OO2 qui présente une délétion dans le gène TK du VPR dans la région longue unique et une délétion dans la région de répétition a été utilisée comme récepteur pour le gène de la bêta-galactosidase. L'ADN de S-VPR-002 intact a été mélangé avec un excès molaire de 30 fois d'ADN de plasmide contenant le gène de la bêta-galactosidase sous le contrôle du promoteur TK de VHS-1, et ce mélange a été digéré avec l'enzyme de restriction XbaI. L'ADN fixé par ligation a été utilisé pour transfecter des cellules animales, et la souche de transfection a été analysée en ce qui concerne la présence de VPR recombinant.Tout d'abord, l'ADN de VPR a été préparé à partir de cellules infectées avec le virus de la souche de transfection et cet ADN a été coupé avec des enzymes de transfection et analysé sur un gel d'agarose. Cette analyse a montré que le,virus recombinant était présent comme espèce principale dans la souche de transfection, et il a été ensuite séparé des autres espèces virales par purification au moyen d'une analyse sur plaque associée à la SELECTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT AU MOYEN DU BLUOGAL. La bêtagalactosidase ayant réagi avec le médicament appelé BluogalTM pour donner un produit de couleur bleue, il était possible de purifier sur plaque le recombinant en prélevant les plaques bleues. Le résultat final de la purification était le VPR recombinant appelé S-PRV-o1o. Il a été montré qu'il effectuait l'expression de l'enzyme appelé bêta-galactosidase par la formation de plaques bleues, comme indiqué ci-dessus, et par la détection de l'enzyme dans des extraits cellulaires infectés en utilisant le substrat appelé O-nitrophényl-bêta- D-galactopyranoside (Sigma) suivant le mode opératoire de Norton et Coffin (33). L'emplacement de ce gène dans le génome de VPR est indiqué sur la figure 5C. Des études préalables ont démontré que des porcs vaccinés avec S-PRV-OO2 ont produit un anticorps contre le VPR et ont été totalement protégés contre une maladie clinique après exposition au virus VPR virulent. Des études sur animaux ont été effectuées avec le S-PRV-o1O pour déterminer l'utilité d'un virus pseudorabique recombinant comme vaccin contre la maladie pseudorabique. Un groupe de porcs sevrés et une portée de porcelets âgés de 4 jours ont été vaccinés avec S-PRV-010 et mis à l'épreuve trois à quatre semaines plus tard, suivant les ETUDES DE VACCINATION CHEZ LE PORC. Les réponses des porcs sevrés vaccinés avec S9RV.-010 sont indiquées sur le tableau Il. L'administration de ce virus n'a pas provoqué de réactions néfastes chez les porcs. Les animaux vaccinés ont produit un anticorps neutralisant le VPR. Deux animaux témoins non vaccinés (NO 75 et NO 91) placés en contact avec- les sujets vaccinés n'ont pas produit d'anti corps contre le VPR avant mise à l'épreuve, indiquant que le virus vaccinal n'était pas répandu par les sujets vaccinés. Après mise à l'épreuve, tous les dix animaux vaccinés sont restés cliniquement normaux et dépourvus de maladie à VPR.A l'opposé, les deux animaux témoins en contact et trois animaux témoins non vaccinés sur cinq ont contracté une maladie à VPR et un de ces porcs est mort de maladie à VPR. Pour tester davantage l'utilité du S-PRV-Oio comme vaccin, le virus a été inoculé à des porcelets âgés de 4 jours. Les résultats, présentés sur le tableau III, ont démontré que le virus provoquait une réponse par anticorps chez des porcelets vaccinés et ne provoquait pas de réactions néfastes. Apparemment, le virus n'a pas été répandu par les sujets vaccinés, puisque un (NO 67) des deux porcelets témoins non vaccinés en contact a produit un anticorps contre le VPR au jour 24. Après mise à l'épreuve, tous les animaux vaccinés et l'animal témoin séro-positif en contact sont restés dépourvus de maladie à VPR. Par comparaison, les trois porcs témoins non vaccinés et le second porc témoin en contact ont présenté des signes cliniques de VPR et sont morts. La conclusion de cette étude est que le S-PRV-010 administré à une posologie de 104,0 ou in6,0, provoque une réponse protectrice chez des porcelets vaccinés ou des porcs sevrés, capable de prévenir l'infection par un virus virulent. TABLEAU II REPONSES SEROLOGIQUES ET CLINIQUES DE PORCS SEVRES APRES VACCINATION AVEC S-PRV-010 ET MISE A L'EPREUVE AVEC UN VPR DE TYPE SAUVAGE Titres de l'anticorpsa Après mise à l'épreuve Groupe Porc Après Après mise à Signes cliniques de N vaocination l'épreuve vaccin Jour Jour Jour Jour Jour 0 14 24 .7 14 70 6t0 71 72 par 73 75b signes SNCc 76 par 78 80 81b signes SNC 82 NT NT 83 NT NT 84 NT NT Témoins dyspnée 85 NT NT 86 NT NT incoordination, un déplacement en rond, une position couchée sur le coté NT Non testé TABLEAU III REPONSES SEROLOGIQUES ET CLINIQUES DE PORCELETS AGES DE 4 JOURS APRES VACCINATION AVEC S-PRV-010 ET MISE A L'EPREUVE PAR CONTACT AVEC DU VPR DE TYPE SAUVAGE Titres de l'anticorpsa Après mise à l'épreuve Groupe Porc Après Après mise à Signes cliniques de N vaccination l'épreuve vaccin Jour Jour Jour Jour Jour 0 14 24 .7 14 106,0 60 par 61 par 64 Témoins 66 c -- Etat comateux, mort en 67 87 NT NT Témoins 88 Nr NT SNNd, mort 89 NT NT c -- Mort a Déterminés par RIDEA b Mort 8 jours après vaccination par rupture de l'estomac c Mort au ou avant le jour 7 après mise à l'épreuve d Les signes affectant le SNC comprennent une ataxie, une incoordination, un déplacement en cercle, une position couchée sur le caté NT Non testé EXEMPLE 4 S-PRV -007 S-PRV-007 est un virus pseudorabique qui présente une délétion dans le gène TK du VPR dans la région longue unique, une délétion dans la région de répétition, et le gène de la glycoprotéine 38 du rotavirus du porc sous le contrôle du promoteur ICP4 de VHS-1 inséré dans la région de répétition. Le virus S-PRV.-005 décrit dans l'exemple 2 ci-dessus a été soumis à une autre manipulation génétique afin qu'il contienne l'antigène du rotavirus (voir figure 6) de la manière suivante. Le gène gp38 du rotavirus du porc a été cloné dans le plasmide pBR322 au niveau des sites PstI pardes modes opératoires décrits précédemment dans le présent mémoire. Le plasmide résultant a été appelé pSY565 (voir figure 7). Le fragment PstI de 1090 pb contenant le gène gp38 a été cloné dans le vecteur pUC4K au niveau du site PstI de manière à être entouré par les sites BamHI dans un plasmide appelé pSY762. Le plasmide pSY590 possédait une origine complexe comme le diagramme opératoire a permis de le déduire. Ces clonages ont été de nature courante et présentent un intérêt historique mais ne sont pas strictement nécessaires pour la mise en pratique de la présente invention. Brièvement, cet historique est le suivant (1) Le gène TK McKnight était le fragment BamHI Q de VHS-1 de HaeIII à -178 par rapport au site CAP à BamHI à +2700, qui a été cloné entre HindIII et BamHI dans pBR327. (2) pSY491.. La région entière de codage de TK du site BglII à +55 (par rapport au site CAP) au site BamHI à +2700 a été clonée dans le site BamHI en pSP65 et appelée pSY491. (3) pSY481.. La séquence-signal polyA (pA) sur un fragment SmaI de 800 pb provenant de TK a été sous-clonée dans le site SmaI dans pSP65 et a été appelée pSY487. (4) pSY583.. Le fragment pA-SmaI de 800 pb provenant de pSY481 a été cloné dans le site Hindi dans pSP65 et appelé pSY583. (5) pSY429.. Le fragment BamHI N de VHS-i a été obtenu auprès du Dr. B. Roizman, cloné dans le site BamHI de pBR322 et a été appelé pSY429. (6) pSY584.. Le fragment de 2,2 kb de BamHI de PvuII à BamHI (réf. 16) dans pSY420 a été sous-cloné dans pSP65 entre HincII et BamHI dans l'élément polyvalent de jonction et a été appelé pSY584. (7) pSY479.. Un plasmide contenant une séquence polyvalente de jonction fusionnée, a été élaboré à partir de pSP64 et pSP65. Les deux plasmides ont été coupés avec PstI dans l'élément polyvalent de jonction et PvuI dans le corps du plasmide. L'effet final de cette construction était la création d'un plasmide de fusion appelé pSP66 qui présente une séquence polyvalente symétrique de jonction centrée sur le site PstI. pSY479 est le nom de ce plasmide et il contenait également un fragment PstI cloné dans le site PstI qui est sans intérêt pour les manipulations suivantes. Le plasmide pSY590 a été créé à partir de pSY583, pSY584 et pSY479 dans une ligation en trois fragments des éléments suivants : les séquences plasmidiques de 3kb de pSY479 (pSP66) coupées avec PstI, le fragment pA-SmaI de 800 pb enlevé de l'élément polyvalent de jonction par coupure dans pSY583 avec PstI et BamHI, et le fragment BamHI N de 2200 pb enlevé par coupure de pSY583 avec PstI et BamHI. La figure 7 montre la configuration finale de tous ces fragments d'ADN dans pSY590. Il existe un seul site BamHI dans le plasmide entre le promoteur dans BamHI N et le signal pA TK qui a été utilisé pour insérer la région de codage du gène gp38. Pour la création du vecteur d'homologie utilisé dans la formation de S-PRV-007, le plasmide pSY590 a été ouvert avec BamHI, et le gène gp38 de 1090 pb a été enlevé de pSY762 par coupure avec BamHI, et ces deux fragments ont été fixés l'un à l'autre par'ligation pour former pSY596. L'orientation correcte du gène gp38 a été confirmée par un diagnostic au moyen d'une digestion par des enzymes de restriction en utilisant des sites avec gp38 (voir figures 10A et lOB). Dans pSY596 décrit ci-dessus, le gène gp38 se situait entre deux fragments d'ADN voisins de VHS-1. Ces deux régions étaient ainsi homologues à des régions similaires sur le gène TK de VHS-i dans S-PRV-005, et ces régions ont été utilisées pour la recombinaison homologue afin de créer S-PRV.-007 (figure 6A). Les ADN du plasmide et de S- PRV-005 ont été mélangés et utilisés dans le PROCEDE DE TRANSFECTION D'ADN POUR LA PRODUCTION D'UN VIRUS RECOMBINANT. Un virus ayant incorporé l'antigène de rotavirus à la place du gène TK a été sélectionné avec BUDR.Des recombinants provenant de la souche de virus choisie ayant incorporé l'ADN de rotavirus ont été sélectionnés par la SELECTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT PAR HYBRIDATION et par analyse des produits de digestion par restriction d'ADN par le mode opératoire intitulé ANALYSE DE L'ADN PAR LA METHODE DE SOUTHERN en utilisant le gène gp38 cloné de rotavirus comme sonde. Le résultat final de cette sélection était un VPR recombinant appelé S- PRV-007 possédant le gène gp38 du rotavirus incorporé dans la région de répétition entre les sites XbaI et HpaI dans le fragment BamHI N 5 du VPR représenté sur la figure 6C. La présence chez un hôte de gp38 exprimé par un S-PRV-007 n'a pas encore été détectée. EXEMPLE 5 S-PRV-ol2 S-PRV-012 est un virus pseudorabique qui présente une délétion dans la région TK du VPR dans la région longue unique, une délétion dans la région de répétition et une délétion dans la région courte unique codant pour la glyco protéine X du VPR, appelée gpX et identifiée et cartographiée par Rea et collaborateurs (23). Le gène TK de VHS-1 sous le contrôle du promoteur ICP4 a été inséré à la place du gène gpX. Le mode opératoire suivant a été utilisé pour produire la délétion de gpX et l'insertion simultanée du gène TK de VHS-1. Les régions voisines pour l'homologie au VPR étaient obtenues à partir des fragments clonés du fragment BamHI NO 10 et du fragment BamHI NO 7 allant de NdeI à BamHI (figure 8). Les sites BamHI et NdeI ont été comblés suivant la REACTION DE COMBLEMENT DE BRECHES PAR UNE POLYMERASE, et le fragment PvuII de l'ADN de VHS-1 a été inséré par LIBATION. Ce plasmide a été transfecté avec de l'ADN de S-PRV-002 intact suivant le mode opératoire intitulé TRANSFECTION D'ADN POUR LA PRODUCTION DE VIRUS RECOMBINANT. Le virus recombinant a été choisi par le mode opératoire intitulé SELECTION PAR HAT D'HERPES VIRUS RECOMBINANT, et sélectionné par le mode opératoire intitulé SELECTION PAR DES ANTICORPS D'HERPES VIRUS RECOMBI NANT , en utilisant des anticorps spécifiques de la protéine de VHS-1. Le virus recombinant sélectionné par ce mode opératoire a été appelé S-PRV-012 et a été déposé dans l'ATCC sous le NO de dépôt VR-2119 et il a été montré par CARTO GRAPHIE DE RESTRICTION DE L'ADN et ANALYSE DE L'ADN PAR LA METHODE DE SOUTHERN qu'il contenait le gène TK de VHS-1 inséré à la place du gène gpX (figure 8B). Le mode opératoire intitulé SELECTION PAR DES ANTICORPS D'HERPES VIRUS RECOM BINANT a montré que le virus effectuait l'expression du gène TK de VHS-1 inséré. La structure de ce virus est présentée sur la figure 8C. EXEMPLE 6 S-PRV-013 S-PRV-013 est un virus pseudorabique qui présente une délétion dans le gène TK dans la région longue unique, une délétion dans la région de répétion et une délétion dans la région de codage gpX. Le gène de la bêta-galactosidase de E. coli (gène lacZ) a été inséré à la place du gène gpX et est sous le contrôle du promoteur du gène gpX endogène. Les modes opératoires suivants ont été utilisés pour élaborer S-PRV-013 par recombinaison homologue. Les régions d'homologie du VPR voisines allaient du fragment BamHI NO 10 cloné qui contenait le promoteur gpX,et du fragment BamHI NO 7 cloné allant du site NdeI au site de BamHI (figure 9A). Le site NdeI a été comblé suivant la REACTION DE COMBLEMENT DE BRECHES PAR UNE POLYMERASE, et le gène de la bêta-galactosidase a été inséré entre les fragments BamHI NO 10 et BamHI NO 7. Cet élément plaçait le gène de la bêta-galactosidase entre le promoteur gpX et les séquences-signaux poly A gpX avec une délétion de presque la totalité des régions de codage de gpX.L'ADN plasmidique et l'ADN de S-PRV-002, une souche de VPR présentant une délétion dans les deux séquences de répétition et une délétion dans le gène de la thymidine-kinase, ont été mélangés et transfectés suivant le mode opératoire intitulé TRANSFECTION D'ADN POUR LA PRODUCTION D'UN VIRUS RECOMBINANT. Le virus recombinant a été sélectionné et purifié à partir de la souche de transfection par le mode opératoire intitulé SELECTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT AU MOYEN DU BLUOGAL. Le virus résultant de cette sélection a été appelé S-PRV-013 et a été déposé dans l'ATCC sous le NO de dépôt VR 2120. Il contenait le gène de la bêtagalactosidase à la place des régions de codage gpX (figures 9B et 9C), tel que déterminé par la PREPARATION D'ADN D'HERPES VIRUS, suivie par ANALYSE DE L'ADN PAR LA METHODE DE SOUTHERN. L'expression du gène de la bêta-galactosidase a été confirmée par l'essai intitulé SELECTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT AU MOYEN DU BLUOGAL, et par l'analyse de substrat au moyen d'ortho-nitrophénylgalactopyranoside (33). Pour confirmer l'élimination de la région de codage de gpX de S-PRV.-013, l'ADN extrait d'une souche de S-PRV-013 purifiée a été digéré avec BamHI et les fragments ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose et analysés par L'HYBRIDATION PAR ANALYSE SUIVANT LA METHODE DE SOUTHERN. La sonde d'hybridation était le fragment BamHI-NDE du fragment BamHI NO 7 pseudorabique provenant de la région courte unique. Ce fragment de sonde comprenait 90 % des séquences de codage de gpX. Par cette analyse, il a été montré que la région gpX était absente de S-PRV-013* Pour confirmer ces résultats, des cellules ont été infectées avec le virus pseudorabique de type sauvage, S-PRV-012 ou S-PRV-013, et des échantillons de milieux provenant des cultures infectées ont été soumis à une électrophorèse sur DSS-gel de polyacrylamide. Les cellules ont été déposées sous forme de taches et analysées en utilisant le PROCEDE D'ANALYSE SUIVANT LA METHODE DE WESTERN. L'anti-sérum utilisé était un sérum hyper-immun de lapin produit contre un peptide antigénique gpX synthétisé par voie chimique lié à de la sérum-albumine bovine. Comme le montre la figure 4, le gpX est dominant dans les milieux des cellules infectées avec le virus de type sauvage (VPR 000), mais n'est pas détecté dans les milieux des cellules infectées par S-PRV-012 ou S-PRV.-013. Ces résultats démontrent que le gène gpX est absent de S-PRV-012 et de S-PRV-013 et que la protéine, gpX, n'est pas produite dans des cellules infectées par S-PRV-012 ou S-PRV-013. Les expériences suivantes indiquent que S-PRV-013 peut être utilisé comme vaccin pour protéger des porcs contre la maladie pseudorabique et qu'il produit une réponse immune qui peut aisément être distinguée d'une infection à virus de type sauvage. Dans la première étude, des porcs sevrés sensibles et des porcelets âgés de 4 jours ont été vaccinés par voie intramusculaire avec le S-PRV-013 de la manière suivante 4 individus de chacun des groupes ont été traités par inoculation avec 106 DICT50 et 4 ont été traités par inoculation avec 100 DICT50 de virus. Les animaux ont été observés, puis mis à l'épreuve de la manière décrite dans les ETUDES DE VACCINATION CHEZ LE PORC (voir le tableau IV ci-dessous). TABLEAU IV REPONSES DES PORCELETS AGES DE 4 JOURS VACCINES AVEC S-PRV-013 ET MIS A L'EPREUVE PAR CONTACT AVEC DU VPR VIRULENT Après Après vaccination mise a I'épreuve Anticorps Anticorps Croupe Dose - Signes Isole- ~ Signes de de Porc Jour Jour Jour clini- ment Jour Jour clini porc ; vaccin NO 14 21 28 quesa Su virus 7 14 ques 106 1 4 2 2 NEC. NTb > 64 > 64 NEG 2 2 2 4 2 2 NEC. NT > 64 > 64 3 Du 50 3 2 2 2 NEC NT 64 > 64 NEC X 4 4 2 4 NEC. NT > 64 > 64 NEC 104 5 4 5 2 2 2 NEC. NT > 64 > 64 ' NEC - t2 (2 2 NM; NT 64 > 64 10 DICSO 6 c2 2 NEC NT 64 > 64 3 NEC X DICT50 7 NEC NT 64 > 64 NEC 8 NEC NT 64 > 64 NEC. 106 10 8 16 32 NEC. NEG fui64 > 64 NEC. DICT 11 8 -- 64 NEG NEC -- -- - m 13 4 8 32 NEC NEG > 64 > 64 NEC E X ' ~ ~ . 8 4 14 4 8 32 NEC NEC > 64 > 64 NEC 10 15 8 8 16 32 NEC NEC. > 64 > 64 D U DICT50 16 2 2 8 NEC NEC 64 > 64 NEC. 17 4 16 32 NEC NEG 64 64 NEC. o z '6moin en 18 NEC. NEC 2 16 F,C contact 19 -d -- -- NEC. NEC -- - - Témoin 20 -- F,C,M de mise à 21 Non applicable 2 F,C l'épreuve 22 2 F,C a Légendes des signes cliniques :: NEG = négatif, C = SNC, M = mort, F = fébrile, R = respiratoire, D = diarrhées b Non testé c Sacrifié au jour 4 après vaccination d Sacrifié au jour 7 après vaccination ; animal malingre, de comportement déficient Après vaccination, tous les animaux étaient dépourvus de réactions néfastes et tous, à l'exception de deux (porcs sevrés),ont produit des titres d'anticorps sérique neutralisant compris entre 1:2 et 1:64. Le virus n'a pas été recueilli dans les sécrétions amygdaliennes d'un porc quelconque ou dans les tissus prélevés chez le porcelet (N 11) sacrifié au jour 4. Un des deux porcelets témoins en contact (NO 19) a été sacrifié au jour 7 de l'expérience car il s'agissait d'un animal malingre, ayant un comportement déficient.Les tissus de ce porcelet étaient négatifs lorsqu'ils ont été cultivés pour déterminer la présence de VPR. L'autre témoin en contact est resté sain et n'a pas produit d'anticorps contre le VPR avant la mise à l'épreuve. Après mise à l'épreuve, tous les animaux vaccinés restaient cliniquement normaux et ont développé des réponses par anticorps secondaires. Le porcelet témoin en contact et les trois porcs témoins de mise à l'épreuve ont tous présenté des signes classiques affectant le système nerveux central dus au VPR et un témoin est mort après mise à l'épreuve. Dans une seconde étude avec S-VPR-013 utilisant de plus grands nombres d'animaux, 2 portées de porcelets sensibles âgés de 3 jours et un groupe de 15 porcs sevrés sensibles ont été vaccinés avec 104 DICT50 de virus, puis mis à l'épreuve de la manière décrite dans les ETUDES DE VACCINATION CHEZ LE PORC (voir les tableaux V et VI cidessous). TABLEAU V REPONSES DE PORCELETS AGES DE 3 JOURS VACCINES AVEC S-PRV-013 ET MIS A L'EPREUVE PAR CONTACT AVEC DU VPR VIRULENT Après vaccination Après mise à l'épreuve I Anticorps Anticorps Signes ----- Signes Isole- --I Signes Isole Porc Jour Jour Jour Jour clini- ment Jour Jour clini- ment Groupe NO 7 14 21 28 1 qeesa du virus 7 14 ques duvirus I X 2 2 4 nom; ' p NEG 32 2 2 8 8 16 F t NEG 64 > 64 NEG NEG NEC 64 2 s 8 16 F r NM; 64 > 64 NEC NEC 3 E 2 3 8 8 16 F I NEC 16 32 NEG NEC 2 ffi 2 4 8 16 16 F ' NEG 32 > 64 NEC NEC X g 6 6 8 8 16 F NEG 64 > 64 NEG NEC I Témoin 7 NEC NEC 2 2 C,F,R NEC en 8 NEC ' NEC > 64 C,F NEG .~ ~ , -, t 10 8 8 16 F ; NEC 16 > 64 NEC NEG 11 8 8 16 F NEC 32 > 64 ' NEC NEC il 12 8 32 32 F ' NEC 32 > 64 NEG NEC B X E 13 4 16 32 F NEC 64 > 64 NEC NEC fjt3 14 t2 8 16 32 NEC i NEC 64 > 64 NEG NEC ui v 2 16 4 4 16 F ! NEC 32 > 64 NEG NEC 17 8 8 32 F NEC 64 > 64 NEC NEC émoin en 18 NEC NEC 2 2 NEC NEC contact 19 2 C,F,R NEC 20 20 2 C,F,R Ecouvillon 2221 Non 2 42 C,F,R Ecouvilion applicable 22 applicable applicable 2 2 C,F,R Ecouvillon &commat; - Ecouvillon R 23 2 2 Mort C,M,F, Amygdale gz g M 24 2 2 C,F,R Ecouvillon a Signes cliniques : NEG = négatif, C = SNC, M = Mort, F = fébrile, R = respiratoire - Une augmentation de température de 0,550C a été observée au jour 1 chez ces sujets vaccinés TABLEAU VI REPONSE DE PORCS SEVRES VACCINES AVEC S-PRV-013 ET MISE A L'EPREUVE PAR CONTACT AVEC DU VPR VIRULENT Après vaccinaux Après mise .1'éprEe'e Anticorps Anticorps Signes Isole- Signes Isole Porc Jour Jour Jour clini- ment Jour Jour clini- ment Group NO O 14 21 quesa duvirus 7 14 ques du virus 35 4 NEG NEG > 64 > 64 NEC NEG 36 2 2 NEC NEC > 64 > 64 NEC NM; 37 2 2 NEC NEC > 64 > 64 NEC NEC 38 2 NEG NEC > 64 > 64 NEC NEC 39 1 2 2 NEC NEC 64 64 NEG NEC 40 40 2 4 NEG NEG > 64 > 64 NEG NEG E 41 41 ! 2 4 NEC NEC 64 > 64 NEG NEG 42 1 2 4 NEG 1 NEC > 64 > 64 F NEC M 43 2 2 NEC i NEG > 64 > 64 - F NEC 44 2 2 NEC NEC 64 > 64 F NEC 45 2 4 NEC NEC > 64 > 64 NEG NEG 46 46 2 2 NEC NEG > 64 > 64 NEC NEC 47 2 NEC NEG 32 > 64 F NEC 48 2 2 NEC NEC > 64 > 64 F NEC 49 c2 2 2 NEC NEC - 64 > 64 F NEG I 30 Wr t2 4 C,F,R NEC 31 nu 2 C,F NEG 32 NT Non 2 4 C,F,R i NEC 33 33 NT applicable Nort C,M,F, Amygdale R R SNC 34 NT 2 4 F NEC a Signes cliniques : NEG = négatif, C = SNC, M = mort, F = fébrile, R = respiratoire b Non testé Dans cette expérience, tous les animaux vaccinés sont restés sains après vaccination, ont produit un anticorps sérique neutralisant contre le VPR et n'ont pas répandu le virus vaccinal par les sécrétions amygdaliennes. Après mise à l'épreuve par contact avec le virus virulent, les sujets vaccinés des deux groupes d'âges sont restés dépourvus de maladie à VPR, tandis que les trois témoins non vaccinés en contact et 10 des 11 témoins de mise à l'épreuve ont contracté une maladie pseudorabique grave. Les échantillons de sérum recueillis chez les porcs vaccinés et les porcs mis à l'épreuve ont été analysés par l'analyse ELISA de gpX. Le gène de gpX ayant été éliminé par délétion de S-PRV-013, il est escompté que les porcs vaccinés avec S-PRV -013 soient séronégatifs dans l'essai ELISA pour cet antigène. Le virus de mise à l'épreuve porte le gène gpX. Les animaux vaccinés étaient protégés par la vaccination contre la maladie pseudorabique lorsqu'ils étaient mis à l'épreuve par contact avec le virus de type sauvage. Cependant, les animaux vaccinés étaient surinfectés de manière asymptomatique par la souche de mise à l'épreuve et, en conséquence, il fallait s'attendre à la production d'anticorps contre gpX par mise à l'épreuve. Comme le montre la figure 5, le sérum provenant d'un animal vacciné avec S-PRV-013 est resté négatif en ce qui concerne gpX après la mise à l'épreuve par contact avec le virus de type sauvage. Ces résultats indiquent que le S-PRV-013 est une souche vaccinale efficace qui permet de distinguer les sujets vaccinés des animaux infectés par un virus de type sauvage au moyen d'un essai de diagnostic sérique sur échantillon. EXEMPLE 7 S-PRV-014 S-PRV -014 est un virus pseudorabique qui présente une délétion dans la région de codage de gpX. Le gène pour la bêta-galactosidase de E. coli a été inséré à la place du gène gpX et est sous le contrôle du promoteur gpX endogène. Les modes opératoires suivants ont été utilisés pour créer S-PRV.-014 par recombinaison homologue. Les régions d'homologie de VPR voisines partaient du fragment BamHI- NO 10 cloné qui contient le promoteur gpX, et du fragment BamHI NO 7 cloné allant du site NdeI au site BamHI (figure 9). Le site NdeI a été comblé suivant la REACTION DE COMBLEMENT DE BRECHES PAR UNE POLYMERASE, et le gène de la bêta-galactosidase a été inséré entre les fragments BamHI NO 10 et BamHI NO 7. Cette construction a placé le gène de la bêta-galactosidase derrière le promoteur gpX et la séquence-signal poly A gpX avec une délétion de presque la totalité de la région de codage de gpX. L'ADN plasmidique et l'ADN du VPR de type sauvage ont été mélangés et transfectés suivant le mode opératoire intitulé TRANSFECTION D'ADN POUR LA PRODUCTION D'UN VIRUS RECOMBINANT. Le virus recombinant a été sélectionné et purifié par séparation de la souche de transfection par le mode opératoire intitulé SELECTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT AU MOYEN DU BLUOGAL. Le virus résultant de cette sélection a été appelle S-VPR-014 et a été déposé dans l'ATCC sous le NO de dépôt VR 2135. Il contient le gène de la bêta-galactosidase à la place de la région de codage de gpX, tel que déterminé par LA PREPARATION D'ADN D'HERPES VIRUS, suivie par L'ANALYSE DE L'ADN PAR LA METHODE DE SOUTHERN. L'expression du gène de la bêta-galactosidase a été confirmée par l'essai intitulé SELECTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT AU MOYEN DU BLUOGAL, et par l'analyse de substrats au moyen de ltortho-nitrophényl- galactopyranoside (33).;La structure de ce virus est indiquée sur la figure 9P. EXEMPLE 8 S-PRV-01 6 S-PRV-016 est un virus pseudorabique qui présente une délétion dans les deux séquences de répétition, et une délétion dans la région de codage de gpX. Le gène pour la bêtagalactosidase de E. coli a été inséré à la place du gène gpX et est sous le contrôle du promoteur de gène gpX endogène. Les modes opératoires suivants ont été utilisés pour élaborer S-PRV*-o16 par recombinaison homologue. Les régions d'homologie du VPR voisines partaient du fragment BamHI NO 10 cloné qui contient le promoteur gpX, et du fragment BamHI NO 7 cloné allant du site NdeI au site BamHI (figure 9). Le site Ndel a été comblé suivant LA REACTION DE COMBLEMENT DE BRECHES PAR UNE POLYMERASE, et le gène de la bêta-galactosidase a été inséré entre les fragments BamHI N 10 et BamHI N 7. La construction disposait le gène de la bêta-galactosidase derrière le promoteur gpX et la séquence-signal poly A gpX avec une délétion de presque la totalité de la région de codage de gpX.L'ADN plasmidique et l'ADN de S- PRV-001 ont été mélanaés et transfectés suivant le mode opératoire intitulé TRANSFECTION D'ADN POUR LA PRODUCTION DE VIRUS RECOMBINANT. Le virus recombinant a été sélectionné et purifié par séparation de la souche de transfection au moyen du mode opératoire intitulé SELECTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT AU MOYEN DU BLUOGAL. Le virus résultant de cette sélection a été appelé S-PRV-016 et a été déposé dans l'ATCC sous le N de dépôt VR 2136. Il contient le gène de la bêta-galactosidase à la place de la région de codage de gpX, tel que déterminé par PREPARATION D'ADN D'HERPES VIRUS, suivie par ANALYSE DE L'ADN PAR LA METHODE DE SOUTHERN. L'expression du gène de la bêta-galactosidase a été confirmée par l'essai intitulé SELECTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT AU MOYEN DU BLUOGAL, et par l'analyse de substrats au moyen d'ortho-nitrophényl gGactopyranoside (33). La structure de- ce virus est indiquée sur la figure 9E. EXEMPLE 9 s-PRV-020 S-PRV-020 est un virus pseudorabique qui contient une délétion dans le gène TK, une délétion dans les régions de répétition, et une délétion du gène a-pX, avec une insertion du gène de la protéine de la capside du virus B du porc dans la région gpX. Pour le clonage du gène du parvovirus B du porc, la forme réplicative d'ADN bicaténaire de la souche NADL-8 a été purifiée par séparation de cellules infectées par le parvovirus de porc et a été fournie par le Dr. T. Molitor, Université de Minnesota. L'ADN de la souche NABL-8 de parvovirus a été cloné dans le plasmide pSP64 de E. coli par les procédés décrits en détail dans (15). L'ADN a été partiellement séquencé pour permettre la détermination du début et de la fin du gène principal de la protéine de capside, le gène B. L'identification a été confirmée par comparaison des séquences apparentées dans le gène de la capside de parvovirus HI du rat (28, 29). La séquence du gène du parvovirus B du porc est indiquée sur les figures liA et 11B. Le promoteur du gène de la glucoprotéine X (gpX) de VPR a été utilisé pour exprimer le gène B et la séquencesignal poly A gpX a été utilisée pour terminer la transcription. Le gène du parvovirus B du site AccI au niveau du nucléotide N 391 au site RsaI au niveau du nucléotide ne2051 a été cloné entre le site BamHI et le site NdeI de gpX (voir figures 7A et B). Le plasmide pSY864 contenait ce fragment du gène du parvovirus B entouré par la séquencesignal gpX, comme le montre la figure 13. Il a été utilisé comme ADN homologue pour activer la recombinaison homologue entre l'ADN de S-PRF013 et l'ADN plasmidique afin de faciliter l'incorporation du gène B dans le génome du VPR. L'ADN plasmidique et l'ADN de S-PRM'013 ont été mélangés et transfectés ensemble suivant le mode opératoire intitulé TRANSFECTION D'ADN POUR LA PRODUCTION DE VIRUS RECOMBINANT. Le virus recombinant a été sélectionné et purifié par séparation de la souche de transfection au moyen du mode opératoire intitulé SELECTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT AU MOYEN DU BLUOGAL avec la modification suivante. Comme le S-PRV-013 parental contenait le gène de la bêta-galactosidase, il a produit des plaques bleues dans le procédé de sélection. Puisque le gène du parvovirus B remplace le gène de la bêta-galactosidase dans le virus, les plaques avec cet élément d'insertion apparaissent incolores. En conséquence, les plaques incolores ont été prélevées et analysées au cours de cette sélection. Un virus qui contenait le gène B a été isolé de cette sélection et a été appelé S-PRV-020. S-PRF020 a été déposé dans l'ATCC sous le N0 de dépôt VR 2137. L'ADN provenant de S-PRV-020 a été isolé par le mode opératoire intitulé PREPARATION D'ADN D'HERPES VIRUS et utilisé pour confirmer l'insertion du gène du parvovirus B suivant le mode opératoire intitulé ANALYSE DE L'ADN PAR LA METHODE DE SOUTHERN en utilisant le gène B comme sonde. L'essai a montré que le gène du parvovirus B a été incorporé au génome de VPR, comme cela était escompté. La structure de S-PRV-020 est présentée sur la figure 13C. EXEMPLE 10 S- PRV-025 Le clonage du gène B et l'élaboration de ces séquences-signaux sur le gène B sont décrits dans l'exemple 9 et sont présentés sur la figure 12. Le PROCEDE DE LIGATION DIRECTE POUR LA PRODUCTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT a été utilisé pour insérer le gène du parvovirus B dans le VPR. Le plasmide pSY957 contenant le gène B a été mélangé à l'ADN de S-PRV-oO2 et ils ont été coupés avec l'enzyme de restriction XbaI. Le mélange d'ADN a été fixé par ligation de la manière décrite dans le procédé et l'ADN a été transfecté dans des cellules Vero. Un virus qui contenait le gène B a été isolé de la souche de transfection de virus et a été appelé S-PRV.-025. S-PRV-025 a été déposé dans l'ATCC sous le NO de dépôt VR 2138. L'ADN provenant de S-PRV-025 a été isolé par le mode opératoire intitulé PREPARATION D'ADN D'HERPES VIRUS et utilisé pour confirmer l'insertion du gènes du parvovirus B suivant le mode opératoire intitulé ANALYSE DE L'ADN PAR LA METHODE DE SOUTHERN en utilisant le gène B comme sonde. L'essai a montré que le gène du parvovirus B a été incorporé dans le génome de VPR de la manière escomptée. La structure de S-PRV-025 est indiquée sur la figure 14. EXEMPLE 11 S-PRV-029 S-?RV-029 est un virus pseudorabique qui présente une délétion dans la région de jonction entre la région longue unique et la séquence de répétition interne de VPR, et une délétion dans le gène gpX dans la région courte unique. Le gène de la bêta-galactosidase de E. coli sous le contrôle du promoteur gpX et des signaux de polyadénylation a été inséré dans les deux délétions dans S-PRV-029. Pour élaborer ce virus, le fragment SalI NO 1 du VPR a été tout d'abord cloné. De l'ADN de VPR a été préparé, puis coupé avec l'enzyme de restriction SalI. L'ADN coupé a été soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose et la plus grande bande SalI (15 kb) a été purifiée par séparation du gel (voir EXTRACTION PAR LE PHENOL DE L'ADN DE L'AGAROSE). L'ADN purifié a été introduit par ligation dans le plasmide pSP64 (voir LIGATION) et le mélange d'ADN a été utilisé pour transformer Ho101 de E. coli suivant Maniatis et collaborateurs (1). Les sites de restriction du clone SalI NO 1 ont été cartographiés. Le procédé de recombinaison homologue a été utilisé pour produire S-PRV-029. La position exacte de la région de jonction a été déterminée par séquençage de l'ADN du fragment SalI N01. Il a été observé que la région de jonction était placée entre deux sites StuI (voir figure 15B). Deux fragments d'ADN provenant du clone SalI ont été utilisés pour produire le vecteur d'homologie pour la recombinaison. L'un était un fragment provenant de BamHI NO 8' de StuI à BamHI et l'autre était un fragment de BamHI à StuI (figure 15B). Le gène de la bêta-galactosidase de E.coli a été préalablement soumis à une manipulation génétique afin qu'il contienne le promoteur gpX et des signaux de polyadénylation de la manière décrite pour S-PRV-013. Pour placer ce gène de la bêta-galactosidase dans le clone comprenant la région de jonction, une molécule de jonction HindIII a été tout d'abord insérée dans le site StuI entre BamHI NO 8 et BamHI NO 8', et, dans ce site HindIII, un fragment HindIII contenant le gène de la bêta-galactosidase avec les signaux gpX a été cloné. Le plasmide résultant, plus de l'ADN de VPR de type sauvage, ont été transfectés dans des cellules Vero par le mode opératoire intitulé TRANSFECTION D'ADN POUR LA PRODUCTION DE VIRUS RECOMBINANT. Un virus a été isolé de la souche de transfection qui contenait le gène de la bêta-galactosidase inséré dans la délétion de jonction (figure 15B) et la délétion gpX (figure 15A) en raison de la présence d'une homologie entre ces deux régions dans le plasmide. Le virus a été purifié par le mode opératoire intitulé SELECTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT AU MOYEN DU BLUOGAL et a été appelé S-PRV-029. S-PRV-029 a été déposé dans l'ATCC sous le NO de dépôt VR 2139. Il a été montré que S-PRV-029 effectue l'expression de la bêta-galactosidase par le mode opératoire intitulé SELECTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT AU MOYEN DU BLUOGAL et par l'analyse au moyen de ltortho-nitrophénylgEactropyranoside (33). La structure de ce virus est présentée sur la figure 15C. EXEMPLE 12 S-IBR-002 S-IBR.-002 est un virus RIB qui présente une délétion d'approximativement 800 pb dans la région de répétition du génome. Cette délétion élimine les deux seuls sites de restriction EcoRV sur le génome viral et un site BglII adjacent(figure 16). Pour élaborer ce virus, le PROCEDE DE LIGATION DIRECTE POUR LA PRODUCTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT a été mis en oeuvre. De l'ADN de RIB purifié (souche Cooper) digéré avec l'enzyme de restriction EcoRV a été mélangé à de 1'ADN de plasmide digéré par l'enzyme de restriction DraI contenant le gène de la bêta-galactosidase sous le contrôle du promoteur TK de VHS-1. Après ligation, le mélange a été utilisé pour transfecter des cellules animales et la souche de transfection a été sélectionnée pour déterminer la présence de virus RIB recombinant par le mode opératoire intitulé SELECTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT PAR HYBRIDATION. Le résultat final de la purification était le RIB recombinant appelé S-IBR-002. Il a été montré par hybridation suivant la méthode de Southern que ce virus ne porte aucun gène étranger. L'analyse au moyen d'enzymes de restriction a montré également que les sites d'insertion (EcoRV) aux deux séquences de répétition ont été éliminés par délétion. La figure 16 montre la carte de restriction du fragment EcoRI B qui contient les sites de restriction EcoRV et la carte de S-IBR-002 qui est dépourvue des sites EcoRV. s-IBR-002 a étç déposé dans l'ATCC sous le NO de dépôt VR 2140. EXEMPLE 13 S- IBR-004 S-IBR-004 est un virus recombinant RIB portant un gène étranger inséré, le gène Tn5 NEO (aminoglycoside 3'-phosphotransférase), sous le contrôle du promoteur de la glycoprotéine X du virus pseudorabique (VPR). Pour élaborer ce virus, le fragment d'ADN HindIII K provenant du virus RIB de type sauvage a été cloné dans le plasmide pSP64 au niveau du site HindIII. Ce plasmide a été appelé pSY524. Une carte du fragment HindIII K est présentée sur la figure 17. L'ADN du site XhoI au site HindIII et contenant le site NdeI de pSY524 a été cloné dans le plasmide pSP65 et appelé pSY846. Le fragment de NdeI à EcoRI a été éliminé de pSY846 par digestion avec les enzymes de restriction NdeI et EcoRI, puis REACTION DE COMBLEMENT DE BRECHES PAR UNE POLYMERASE et LIGATION. Le plasmide résultant a été appelé pSY862. Le plasmide pNEO (P.L.Biochemicals, Inc.) contient le gène de l'aminoglycoside appelé 3'-phosphotransférase (NEO) et confère une résistance à l'ampicilline et à la néomycine à des hôtes de l'espèce E. coli. La région de codage de ce gène (fragment Bg1II-BamHI) a été isolée et clonée entre le promoteur gpX de VPR et la séquence poly A VHS-Tk dans un plasmide appelé pSY845. La construction de gène NEO dans pSY845 a été excisée avec HindIII, pourvue d'extrémités franches par la REACTION DE COMBLEMENT DE BRECHES PAR UNE POLYMERASE, et clonée dans le site SacI du plasmide pSY862. Le produit. final a été appelé pSY868. De 1'ADN de RIB de type sauvage a été mélangé à de l'ADN de pSY868 et le mélange a été transfecté dans des cellules d'épiderme de lapin pour produire le RIB recombinant. Le virus RIB recombinant portant un gène NEO fonctionnel a été ensuite isolé et purifié suivant le procédé intitulé SELECTION DE VIRUS RESISTANT AUG418. Il a été montré que le RIB recombinant appelé S-RIB-004 effectue l'expression du gène NEO par le fait que des cellules infectées avec ce virus étaient résistantes à la toxicité produite par G418. Une carte détaillée de la construction du plasmide est indiquée sur la figure 17. La structure de S-IBR-004 est également présentée sur la figure 17. S-IBR-004 a été déposé dans l'ATCC sous le NO de dépôt VR 2134. EXEMPLE 14 S-IBR-008 S-IBR-008 est un virus RIB qui présente une délétion dans la région courte unique, et une insertion du gène de la glycoprotéine 38 (gp38) du rotavirus bovin dans le site XbaI dans la région longue unique. Tout d'abord, le gène gp38 du rotavirus bovin a été soumis à une manipulation génétique afin qu'il contienne des signaux régulateurs d'herpès virus, comme le montre la figure 18. Cela a été effectué par clonage du fragment BamHI du gène gp38 présent dans pSY1053 entre les sites BamHI et Bg7II dans pSY1052. Le plasmide résultant, pSY1023, contenait le promoteur gpX de VPR en face du gène gp38, et le signal de polyadénylation TK de VHS-1 derrière le gène gap38. La construction totale a été entourée par les sites XbaI-pour permettre l'insertion du fragment XbaI dans RIB par ligation directe. S-IBR-004 était le virus de départ pour la production de S-RIB-008. L'ADN de S-IBR-004 et l'ADN de pSY1023 ont été mélangés l'un avec l'autre, coupés avec XbaI et transfectés dans des-cellules d'épiderme de lapin suivant le mode opératoire intitulé LIGATION DIRECTE POUR LA PRODUCTION D'UN HERPES VIRUS RECOMBINANT. La souche transfectée a été sélectionnée pour déterminer la présence de virus recombinant par le mode opératoire intitulé SELECTION PAR DES ANTICORPS D'HERPES VIRUS RECOMBINANT, en utilisant des anticorps préparés contre la protéine gp38 du rotavirus. Un des virus purifiés par cette sélection était S-IBR-008, qui possède les caractéristiques suivantes. Il contient le gène gp38 du rotavirus plus l'ADN de plasmide inséré dans le site XbaI dans la région longue unique du génome viral, mais ne contient plus le gène NEO du S-IBR-004 parental dans la région courte unique. En fait, une petite délétion a été produite dans la région courte unique à l'emplacement du gène NEO, comme le montre l'absence d'un site XbaI à cet emplacement dans S-:IBR-008. Il a été montré que S-IBR-008 effectue l'expression du gène gp38 du rotavirus par analyse de la transcription d'ARN dans des cellules infectées, et par le mode opératoire intitulé SELECTION PAR DES ANTICORPS D'HERPES VIRUS RECOMBI NANT, en utilisant des anticorps spécifiques du gène gp38. S- IB > 008 a été déposé dans l'ATCC sous le NO de dépôt VR 2141 et sa structure est présentée sur la figure 18. EXEMPLE 15 HERPES VIRUS DU DINDON L'herpès virus du dindon (HVD) est un autre herpès virus qui possède une organisation et une structure similaires à celles des autres exemples d'herpès virus animaux décrits ci-dessus. La carte d'enzymes de restriction de HVD a été publiée (34). Cette information a été utilisée comme point de départ pour effectuer par manipulation génétique l'insertion de gènes étrangers dans HVD. La carte de restriction de BamHI de HVD est présentée sur la figure 19A. D'après ces résultats, plusieurs régions différentes d'ADN de HVD dans lesquelles des insertions de gènes étrangers ont pu être effectuées ont été choisies comme cibles. Le gène étranger choisi pour l'insertion était le gène de la bêta-galactosidase (bêta-gal) de E. coli, qui a été utilisé dans VPR. Le promoteur était le promoteur gpX de VPR. Le gène bêta-gal a été inséré dans la région longue unique de HVD, plus précisément dans le site XhoI dans le fragment BamHI NO 16 (3300 pb), et il a montré qu'il était exprimé dans un HVD recombinant par la formation de plaques bleues en utilisant le substrat appelé Bluogal. De manière similaire, le gel bêta-gal a été inséré dans le site SalI dans la région de répétition présente dans le fragment BamHI NO 19 (900 pb). Ces expériences montrent que le HVD peut être soumis modes opératoires décrits dans la présente demande pour l'insertion et l'expression de gènes étrangers dans des herpès-virus. En particulier, deux sites pour l'insertion d'ADN étrangers ont été identifiés (figures 19B et 19C). EXEMPLE 16 Procédé d'élaboration d'un herpès virus atténué contenant un élément d'insertion d'ADN étrangers La Demanderesse envisage que les modes opératoires décrits dans le présent mémoire, qui ont été utilisés pour atténuer et insérer des séquences d'ADN étranger dans VPR, RIB et HVD,peuvent convenir pour l'élaboration d'autres herpès-virus qui sont atténués ou contiennent des séquences d'ADN étranger insérées qui sont traduites en séquences d'amino-acides dans un hôte ou les deux. L'herpès virus équin (HVE), l'herpès virus canin (HVC), l'herpès virus félin (HVF) ou n'importe quel herpès virus animal dont la structure du génome est apparentéeà celle de ces virus sont considurés comme étant susceptibles d'être soumis à ces procédés. Plus précisément, les modes opératoires suivants peuvent être suivis pour élaborer ces virus. CROISSANCE D'UN HERPES VIRUS ANIMAL EN CULTURE DE CELLULES. Des lignes cellulaires fixées ou des cellules primaires peuvent être utilisées. La méthodologie pour la croissance de ces virus se trouve dans la littérature et ne nécessite pas de nouveau développement. Le HVE se développe dans des cellules Vero, le HVC se développe dans des cellules de reirsde chien Madin Darby et le HVF se développe dans des cellules de reins de chat Crandell. PURIFICATION D'ADN D'HERPES VIRUS. Le mode opératoire décrit dans le présent mémoire pour la purification d'ADN d'herpès virus a été mis en oeuvre avec succès pour tous les herpès virus essayés, comprenant le VPR, le RIB, le HVD et le cytomégalovirus, et est un procédé général pouvant être appliqué à tous les herpès virus. CLONAGE DE FRAGMENT DE RESTRICTION. Le clonage de fragments de restriction d'herpes virus est un mode opératoire utilisant l'ADN recombinant faisant partie de l'état actuel de la technique et est décrit dans Maniatis et collaborateurs (1) . CARTE DES FRAGMENTS DE RESTRICTION DU GENOME. Il est utile de posséder une carte des enzymes de restriction du génome viral pour identifier et sélectionner des régions pour une délétion et une insertion. Ces cartes sont disponibles pour VPR et RIB, et partiellement pour HMD, Une carte existe pour HVE, mais non pour HVC ou HVF. La création de cette carte ne nécessite aucune nouvelle technologie et est décrite en détail par Maniatis et collaborateurs (1). IDENTIFICATION DES FRAGMENTS DE RESTRICTION QUI CORRESPON DENT A LA REGION DE REPETITION. L'identification des régions de répétition nécessite le mode opératoire d'ANALYSE PAR LA METHODE DE SOUTHERN, tel que décrit en détail dans le paragraphe concernant les méthodes. Des clones de la région de répétition s'hybrident à des bandes multiples dans un produit de digestion par enzyme de restriction, en raison du fait qu'ils sont répétés dans le génome viral. Cette caractéristique, associée à leur emplacement dans le génome, constitue un diagnostic des régions de répétition. PRODUCTION D'UNE DELETION DANS LE CLONE DE REGIONS DE REPETITION. L'information génétique dans la région de répétition est soumise à une duplication dans l'autre copie de la séquence de répétition dans le génome. Une copie de la région de répétition n'est donc pas essentielle pour la réplication du virus. En conséquence, la région de répétition convient pour des-délétion et insertion d'ADN étrangers. Après clonage et cartographie par des enzymes de restriction de la région de répétition, des enzymes peuvent être choisis pour soumettre à une manipulation génétique la délétion de répétition et pour insérer de l'ADN étranger. Il est évident pour l'homme de l'art que des sites d'enzymes existent dans une extension donnée d'ADN et qu'ils peuvent etre trouvés par analyse.La méthodologie comprend une DIGESTION D'ADN PAR RESTRICTION, ELECTROPHORESE D'ADN -SUR GEL D'AGAROSE, LIGATION et un clonage dans des cellules bactériennes, de la matière decrite en détail dans le paragraphe concernant les méthodes et par Maniatis et collaborateurs (1). PRODUCTION D'UNE INSERTION D'UN GENE MARQUEUR DANS LA DELETION DANS UN CLONE DE REGION DE-REPETITION. La méthodologie de cette insertion est celle décrite par Maniatis et collaborateurs (1) pour le clonage des gènes dans des bactéries. Ce qui n'est pas évident avant la présente divulgation est quels gènes marqueurs doivent être utilises qui sont actifs dans un herpès virus ni quels séquences-signaux doivent être utilisées pour l'expression des gènes étrangers dans ces herpès virus. Le gène de la bêta-galactosidase de E. Coli et le gène de la résistance à la néomycine sous le contrôle du promoteur ICP4 de VHS-1, le promoteur gpX de VPR ou le promoteur TK de VSH-1 ont été utilisés. Le promoteur gpX, en particulier, convient dans VPR, RIB et HVD. Les autres promoteurs ont également convenu dans un essai plus limité. TRANSFECTION AVEC UN CLONE DE GENE MARQUEUR + DE L'ADN D'HERPES VIRUS. Le but de ce mode opératoire consiste à placer dans la même cellule l'ADN d'herpès virus intact et le clone de régions de répétition présentant la délétion et contenant le gène marqueur. Une fois ces deux ADN présents dans la même cellule, les mécanismes normaux de recombinaison homologue permettent d'être sûr qu'une recombinaison se produit entre les régions homologues dans le clone et la même région dans l'ADN d'herpès virus, les régions éliminées par délétion dans le virus étant ainsi remplacees par le gène marqueur, avec une fréquence d'environ 1 %. La technique comprend le PROCEDE DE TRANSFECTION POUR LA PRODUCTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANTS, tel que décrit en détail dans le paragraphe concernant les méthodes. PURIFICATION D'ADN D'HERPES VIRUS. L'ADN d'herpès virus peut être purifié suivant les méthodes décrites ci-dessus. SELECTION DE PLAQUES DE RECOMBINANTS. Tous les herpès virus concernés par la présente invention forment des plaques (foyers d'infection en culture de cellules) qui permettent leur purification. Une plaque résulte d'une infection par une seule particule virale. Ainsi, le prélèvement d'une seule plaque permet de choisir ia descendance d'un seul événement ae recombinaison. Cette réussite technique nécessite un procédé pour identifier la plaque qui doit être prélevée. Les procédés utilisés dans le présent mémoire comprennent l'ANALYSE DE L'ADN PAR LA METHODE DE SOUTHERN pour prélever la plaque sur la base de la présence du gène inséré, la SELECTION PAR DES ANTICORPS D'HERPES VIRUS RECOMBINANT pour prélever la plaque sur la base de la présence d'une protéine produite à partir du gène, la SELECTION D'HERPES VIRUS RECOMBINANT AU MOYEN DU BLUOGAL pour prélever une plaque qui effectue l'expression du gène marqueur de la bêta-galactosidase, ou la SELECTION PAR G-418 POUR PURIFIER DES HERPES VIRUS RECOM BINANTS pour prélever la plaque par son aptitude à se former en présence de l'antibiotique G-418. Les deux premiers procédés peuvent s'appliquer à n'importe quel gène.; les deux derniers sont spécifiques respectivement du gène de la bêta-galactosidase et du gène de résistance à la néomycine. La biologie de ces systèmes d'examen et de sélection est telle qu'ils peuvent s'appliquer à n'importe quel herpès virus, comprenant HVE, HVC, HVF et n'importe quel herpès virus animal apparenté à ceux-ci. PURIFICATION DE VIRUS RECOMBINANT. Ce mode opératoire comprend des purifications multiples successives Ce plaques pour purifier complètement le virus recombinant par séparation du virus parental. La sélection est appliquée à chaque étape pour choisir la plaque avec laquelle on doit continuer. Les modes. opéra- toires sont connus du spécialiste du domaine de la virologie. Des vaccins multivalents pour animaux peuvent être élaborés par insertion d'un gène d'antigène étranger dans un herpès virus. Les modes opératoires et la méthodologie sont très similaires à ceux utilisés pour l'inser- tion initiale du gène marqueur dans le virus et peuvent être mis en oeuvre de la manière suivante. SUBSTITUTION D'UN GENE MARQUEUR PAR UN GENE D'ANTIGENE ETRANGER DANS UN CLONE DE SEQUENCES DE REPETITION. Il s'agit d'une expérience de clonage qui consiste à introduire le gène de l'antigène derrière le même promoteur d'herpès virus que celui utilisé avec le gène marqueur et à insérer cette construction dans une délétion identique à celle du clone de répétition. Les méthodes pour ce clonage sont décrites dans Maniatis et collaborateurs (1). TRANSFECTION AVEC UN CLONE D'ANTIGèNE + UN MARQUEUR CONTENANT DE L'ADN D'HERPES RECOMBINANT. Le gène marqueur qui est déjà présent dans le génome de l'herpès virus peut être utilisé pour faciliter la sélection du nouveau recombinant. Par exemple, il s'est révélé utile de sélectionner des plaques blanches au lieu de plaques bleues pour tester l'absence de bêta-ga1actosidase dans cette étape. Une raison pour la présence d'une plaque blanche est le remplacement du gène de la bêta-galactosidase par le gène d'antigène étranger par recombinaison homologue (le résultat désiré). Une sélection continue de ce nouveau recombinant par le MODE OPERATOIRE D'ANALYSE PAR LA METHODE DE SOUTHERN ou par la SELECTION PAR DES ANTICORPS D'HERPES VIRUS RECOMBINANT est devenue mieux définie, moins longue et permet l'identification -précise du recombinant présentant un intérêt. ISOLEMENT D'ADN D'HERPES VIRUS RECOMBINANT. Le procédé de transfection nécessite de l'ADN d'herpès virus infectieux intact. Des herpès virus recombinant s qui comprennent un gène marqueur inséré peuvent être utilisés. Le procédé d'isolement de l'ADN d'herpès virus peut s'appliquer également à ces virus recombinants. SELECTION D'UNE SOUCHE DE TRANSFECTION POUR L'INSERTION DE GENES ETRANGERS. Des méthodes de sélection ont été décrites ci-dessus. Elles consistent en une association de méthodes indirectes (sélection pour l'absence du marqueur) et de méthodes directes (ANALYSE PAR LA METHODE DE SOUTHERN pour le gène de l'antigène, et SELECTION PAR DES ANTICORPS pour la protéine exprimée). Les méthodes peuvent être appliquées successivement au cours de la purification du virus. PURIFICATION DE VIRUS RECOMBINANTS CONTENANT UN GENE D'ANTI GENE ETRANGER. Le virus recombinant contenant le gène d'antigène étranger peut être purifié suivant les modes opératoires décrits ci-dessus. Cette séquence d'étapes, avec les méthodes et exemples décrits dans le présent mémoire, permettent à tout homme de l'art de mettre en pratique avec succès la présente invention avec n importe quel herpès virus animal. EXEMPLE 17 La présente invention comprend l'utilisation d'herpès virus soumis à des manipulations génétiques afin de protéger des animaux contre une maladie. Il n'était pas évident au commencement des recnerches de savoir quelles délétions dans des herpès virus serviraient à atténuer les virus au degré convenable de manière à les rendre utiles comme vaccins. Meme l'essai de candidats-vaccins chez des modèles animaux, par exemple la souris, ne constitue pas un indicateur valide de l'innocuité et de l'efficacité du vaccin chez l'espèce animale servant de cible, par exemple le porc. Pour illustrer ce point plus clairement, le tableau VII présente un résumé des résultats d'innocuité et d'efficacité de divers virus pseudorabiques qui ont été élaborés et essayés chez le porc suivant le mode opératoire intitulé ETUDES DE VACCINATION CHEZ LE PORC. TABLEAU VII RESUME DES ETUDES ENTREPRISES CHEZ DES PORCS AVEC DIVERSES CONSTRUCTIONS DE VIRUS PSEUDORABIQUES Construction Age Après vaccination Pourcentage de (Délétions/ Nombre de des Intervalle Signes protection Insertions) porcs porcs d'anticorps cliniques contre une mise à l'épreuve S-PRV-001 9 4-6 1:32- oui aucun (A) semaines > 1:64 (22 %) S-PRV-002 12 4-6 1:4- aucun 100 (A,B) semaines 1:64 S-PRV-003 8 4-6 aucun 50 (B) semaines 1:16 S-PRV-004 6 4-6 1:4- aucun 64 (B,C) semaines 1:32 10 4-6 oui 100 S-PRV-010 semaines 1:16 (13 %) (A,B,E) 30 3-4 1:4- oui 100 jours 1:64 (13 %) 23 4-6 aucun 100 S-PRV-013 semines 1:8 (A,B,D,E) 25 3-4 1:4- aucun 100 jours 1:64 S-PRV-014 5 4-6 1:4- oui 100 (D,E) semaines 1:8 (40 %) s-PRV-016 5 4-6 1::4- aucun 100 (A,D,E) semaines 1:8 A-Séquences de répétition; B-TK ; C-jonction ; O-gpX E-élément d'insertion de bêta-galactosidase Les huit constructions qui ont été essayées présentent les délétions et insertions suivantes dans le génome de la souche Shope virulente de VPR : S-PRV-001 présente une délétion dans les deux régions de répétion S-PRV-002 presente une délétion dans les deux régions de répétition et dans le gène de la thymidine-kinase S-PRV-003 présente une délétion dans le gène de la thymidinekinase ; S-PRV-004, S-PRV-010, S-PRV-013, S-PRV-014 et SPRV-(;i6 sont décrits respectivement dans les exemples N 1, 3, 6, 7 et 8. Un produit vaccinal supérieur ne doit pas produire de signes cliniques chez des porcelets âgés de 3 à 4 jours {l'age le plus sensible), et offre une protection de 100 % chez des porcs de n'importe quel age. Il est évident d'après le tableau VII que chaque candidat-vaccin a offert un certain degré d'atténuation et de protection chez le porc, mais chaque vaccin a donné une réponse unique. Le meilleur candidat-vaccin de cette liste, à ce jour, eSt le S-PRV-Ol3, qui contient trois délétions ; une dans la région de répétition. ; une dans le gène TK et une dans le gène gpX. L'utilité de cette association de délétions était inattendue. Ces résultats sont nouveaux, imprévus et utiles dans les sélections d'un produit supérieur du type vaccin pseudorabique. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y tre apportées sans sortir de son cadre. REFERENCES 1. 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Herpes virus hybride, d'animal n'appartenant pas aux primates, caractérisé en ce qu'il comprend de l'ADN qui renferme une séquence essentielle pour la réplication virale de l'herpes virus hybride, d'animal n'appartenant pas aux primates, dont au moins une portion est présente dans une séquence sssentielle pour la réplication d'un herpès virus naturel, d'animal n'appartenant pas aux primates, et au moins une séquence d' DN étranger. 2. Herpes virus atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, caractérisé en ce quil comprend de l'ADN qui renferme une séquence essentielle pour la réplication virale de l'herpès virus atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, dont au moins une portion est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un herpes virus naturel, d'animal n'appartenant pas aux primates, duquel au moins une portion d'une séquence de répétition a été éliminée par délétion. 3. Herpès virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, caractérisé en ce qu'il comprend de l'ADN qui renferme une séquence essentielle pour la réplication virale de l'herpes virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, dont au moins une portion est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un herpes virus naturel, d'animal n'appartenant pas aux primates, et au moins une séquence d'ADN étranger. 4. Herpes virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la séquence d'ADN étranger est apte à l'expression chez un hôte et code pour une séquence d'amino-acides. 5. Herpes virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence d'amino-acides est un polypeptide, avantageusement une protéine et de préférence une protéine qui, lorsqu'elle est exprimée dans l'hôte, est antigénique. 6. Vaccin utile pour liimmunisation d'un animal contre une maladie à herpes virus, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité immunisante efficace d'un herpes virus hybride, d'animal n'appartenant pas aux primates, suivant la revendication 1, et un véhicule convenable. 7. Vaccin utile pour 1 'immunisation d'un animal contre une maladie à herpes virus, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité immunisante efficace d'un herpes virus atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, suivant la revendication 2 ou 3, et un véhicule convenable. 8. Vaccin multivalent utile pour l'immunisation d'un animal contre au moins un agent pathogène, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité immunisante efficace d'un herpes virus hybride atténué, d'animal n'appartenant pas aux primates, suivant la revendication 5, et un véhicule convenable. 9. Virus pseudorabique atténué comprenant de 1iADN, caractérisé en ce qu'il renferme une séquence essentielle pour la réplication du virus atténué, dont au moins une portion est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un virus pseudorabique naturel, et au moins une sequence d'ADN étranger apte à l'expression chez un hôte et codant pour une séquence d'amino-acides qui est antigénique chez l'hôte. 10. Vaccin utile pour l'immunisation d'un animal contre la maladie à virus pseudorabique, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité immunisante efficace du virus pseudorabique atténué suivant la revendication 9, et un véhicule convenable. 11. Virus pseudorabique atténué comprenant de l'ADN, caractérisé en ce qu'il renferme une séquence essentielle pour ia réplication du virus pseudorabique atténué, dont au moins une portion est présente dans une séquence essentielle pour la réplication d'un virus pseudorabique naturel, ledit ADN codant pour des ARNm qui, chez un animal infecté par le virus pseudorabique atténué, sont traduits en produits géniques antigéniques du virus pseudorabique qui provoque chez l'animal infecté une réponse immunologique pouvant être distinguée d'une réponse immunologique provoquée chez un animal infecte par un virus pseudorabique naturel. 12 Virus pseudorabique atténué suivant la revendication 11, caractérisé en ce que l'ADN comprend de l'ADN de virus pseudorabique de type sauvage duquel au moins une portion d'un gène non essentiel est éliminée par délétion, le gène non essentiel étant de préférence le gène gpX. 13. Virus pseudorabique atténué suivant la revendication 12, caractérisé en ce que pratiquement la totalité de la région de codage du gène gpX, une portion d'une séquence de répétition et le gène de la thymidinekinase sont éliminés par délétion. 14. Virus pseudorabique atténué suivant la revendication 13, caractérisé en ce que le gène de la thymidine-kinase du virus de l'herpes simplex i, sous le contrôle du promoteur ICP4, est inséré à la place de la région de codage du gène gpX. 15. Virus pseudorabique atténué suivant la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est appelé S-PRV-012 et déposé dans l'American Type Culture Collection sous le numéro de dépôt VR 2119. 16. Virus pseudorabique atténué suivant la revendication 13, caractérisé en ce que le gène de la bêta-galactosidase de E. coli est inséré à la place de la région de codage du gène gpX et est sous le contrôle du promoteur gpX endogène. 17. Virus pseudorabique atténué suivant la revendication 16, caractérisé en ce qu'il est appelé S-PRV-013 et déposé dans l'American Type Culture Collection sous le numéro de dépôt VR 2120. 18. Vaccin contre la maladie a virus pseudorabique, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité immunisante efficace du virus pseudorabique atténué suivant la revendication i1 et un véhicule convenable. 19. Vaccin contre la maladie à virus pseudorabique, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité immunisante efficace du virus pseudorabique atténué suivant la revendication 15 et un véhicule convenable. 20. Vaccin contre la maladie à virus pseudorabique, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité immunisante efficace du virus pseudorabique atténué suivant la revendication 17 et un véhicule convenable. 21. Méthode permettant de distinguer un animal vacciné avec le vaccin suivant la revendication 18 d'un animal infecté par. un virus pseudorabique naturel, carac térisée en ce qu'elle consiste à analyser un liquide biologique de l'animal pour déterminer la présence d'antigènes normalement exprimés chez un animal infecté par un virus pseudorabique naturel, à identifier les antigènes qui sont présents dans le liquide biologique et les antigènes qui ne le sont pas, et à effectuer une corrélation entre les antigènes qui ne sont pas présents dans le liquide biologique et les antigènes qui ne sont pas exprimés chez un animal par le virus pseudorabique atténué du vaccin, la présence dans le liquide biologique d'antigènes qui sont normalement exprimés chez l'animal par un virus pseudorabique naturel, sauf pour les antigènes qui ne sont pas exprimés chez l'animal par le virus pseudorabique atténué du vaccin, étant révélatrice d'un animal vacciné avec le vaccin et-non infecté par un virus pseudorabique naturel. 22. Méthode permettant de distinguer un animal vacciné avec le vaccin suivant la revendication 19 dun animal infecté par un virus pseudorabique naturel, caractérisé en ce qu'elle consiste à analyser un liquide biologique de l'animal pour déterminer la présence de la glycoprotéine X etc'au moins un autre antigène normalement exprimé chez un animal par un virus pseudorabique naturel, à identifier les antigènes qui sont présents dans le liquide biologique et à déterminer si la glycoprotéine X est présente dans le liquide biologique, la présence d'antigènes qui sont normalement exprimés chez un animal par un virus pseudorabique naturel et l'absence de la glycoprotéine X dans le liquide biologique étant révélatrices d'un animal vacciné avec le vaccin et non infecté par un virus pseudorabique -naturel. 23. Méthode permettant de distinguer un animal vacciné avec le vaccin suivant la revendication 20 d'un animal infecté par un virus pseudorabique naturel, caractérisée en ce qu'elle consiste à analyser un liquide biologique de l'animal pour déterminer la présence de la glycoprotéine X et d'au moins un autre antigène normalement exprimé chez un animal par un virus pseudorabique naturel, à identifier les antigènes qui sont présents dans le liquide biologique et à déterminer si la glycoprotéine X est présente dans le liquide biologique, la présence d'antigènes qui sont normalement exprimés chez un animal par un virus pseudorabique naturel et l'absence de la glycoprotéine X dans le liquide biologique étant révélatrices d'un animal vacciné avec le vaccin et non infecté par un virus pseudorabique naturel.