FR 2599844 A1 19871211 FR 8608267 A 19860609 Phase solide conductrice Dour dosage immunoenzvmatiaue, son Procédé de PréParation et son utilisation dans des procédés de dosaae immunoenzvmatique. La présente invention concerne une phase solide conductrice pour dosage immunoenzymatique, son procédé de préparation et son utilisation dans des procédés de dosage immunoenzymatique. Elle concerne plus particulièrement la mise en oeuvre de dosages immunoenzymatiques en phase hétérogène utilisant comme phase solide la surface conductrice d'une électrode. On sait que le dosage de substances présentes en faible concentration dans les liquides biologiques industriels soulève un grand intérêt dans les milieux scientifiques, enraison des tres nombreuses applications de ces dosages dans divers domaines techniques. Les techniques récentes utilisent l'activité enzymatique comme moyen de marquage et d'amplification des molécules assurant les processus de reconnaissance moléculaire qui interviennent dans les procédés d'analyse irtununologique. On a ainsi envisagé de marquer des antigènes ou desanticorps avec des enzymes telles que la peroxydase ou la glucose oxydase, dont il est possible de doser facilement l'activité par spectrophotométrie. On distingue, dans ces techniques, les dosages en phase homogène et les dosages en phase hétérogène - dans les dosages en phase homogène, l'activité enzymatique est fonction de la réaction anticorps-antigène et il n'est pas nécessaire de séparer la "fraction liée", c'est-à-dire l'immunoréactant (conjugué antigène-enzyme ou anticorps-enzyme), qui a réagi dans la réaction immunologique, de la "fraction libre", qui représente l'immuno- réactant qui n'a pas réagi t - Dans les dosages en phase hétérogène, l'activité enzymatique n'est pas modifiée par la réaction antigène anticorps et une séparation de la fraction liée et de la fraction libre s'avère nécessaire. C'est à ces dosages en phase hétérogène que s'intéresse la présente invention et l'on commencera par rappeler les principes de ces différents dosages, qu'il est usuel de classer en méthodes compétitives et non-compétitives. Dans les méthodes dites compétitives, le conjugué enzyme-ligand (antigène ou anticorps) est mélangé avec un échantillon du milieubiologique à doser (ou avec un échantillon d'un milieu standard) contenant le ligand libre, en vue d'entrer en compétition avec ce dernier pour se combiner à des antiligands fixés en quantité limitée sur un support solide. En variante (dosage par inhibition), le ligand peut être immobilisé sur un support et entrer en compétition avec le ligand à doser, lorsqu'ils sont mis simultanément en présence d'une quantité limitée d'antiligand en solution. Dans ces méthodes, l'activité enzymatique est inversement proportionnelle à la concentration en ligand à doser. Parmi les méthodes non compétitives, la méthode dite "sandwich" est la plus connue et elle s'applique au dosage de ligands ayant au moins deux sites antigéniques. Le ligand à doser est mis en contact avec un support solide sur lequel sont fixés des anticorps. Le ligand se combine avec les anticorps et, après lavage du support, on met celui-ci en contact avec un excès déterminé des mêmes anticorps marqués par une enzyme. Ceux-ci se fixent à leur tour sur les ligands, qui sont ainsi pris en sandwich entre les anticorps fixés sur le support et ceux marqués par l'enzyme, d'où le nom de la méthode. Dans ce cas, 11 activité enzymatique est directement proportionnelle à la concentration en ligand à doser. L'utilisation d'une phase solide dans un dosage immunoenzymatique est une technique relativement récente, qui présente l'avantage de permettre une séparation de la fraction libre sans avoir recours à des procédés physicochimiques qui compliquent les dosages. Toutes ces méthodes en phase hétérogène nécessitent la détection aunaie de l'activité enzymatique, qui est réalisée en général en phase homogène (par des méthodes spectrophotométriques, fluorimétriques ou par bioluminescence) ou pseudo-homogène (par un capteur enzymatique). Seule une méthode optique très complexe, l'éllipsométrie, permet de détecter directement sur la phase solide la présence, par exemple, de l'anticorps utilisé pour le dosage. Mais, cette méthode n'est pas envisageable pour des mesures de routine. La présente invention vise à utiliser la phase solide elle-même comme détecteur de la présence de l'enzyme, ce qui rend le processus totalement hétérogène et facilite sa mise en oeuvre. I1 a été en effet établi que, lorsqu'une enzyme qui produit une espèce électroactive se trouve immobilisée en situation de proximité moléculaire sur une surface conductrice, la cinétique électrochimique et la cinétique enzyma tiaue sont interdépendantes, ce qui permet de quantifier la présence de l'enzyme par le courant électrique de détection électrochimique de cette espèce électroactiveo Selon l'invention,cet état de proximité moléculaire peut être obtenu par l'une quelconque des méthodes immunologiques précédemment décrites, l'anticorps étant immobilisé directement sur la surface conductrice. Une conséquence importante de l'utilisation de ce procédé de dosage, que l'on désignera par l'expression "électrocatalyse enzymatique", est que la quantité d'enzyme détectable dans cette situation est extrêmement faible, ce qui, dans son application à un dosage immunoenzymatique, en phase hétérogène1 conduit à une sensibilité supérieure à celle des moyens de détection antérieurs. A cet effet, l'invention a pour premier objet une phase solide conductrice pour dosages immunoenzymatiques, caractérisée en ce que, sur une partie au moins de sa surface appelée à être en contact avec le milieu à doser, est fixé directement, sans interposition d'un support intermédiaire, un anticorps ou un antigène spécifique de la molécule à doser. Cette phase solide pourra être, par exemple, en carbone, en platine ou en or et pourra prendre n'importe quelle forme en fonction des contraintes d'introduction de l'échantillon à doser (électrode plane, poreuse ou à solution percolante). Les anticorps ou les antigènes peuvent être fixés sur l'électrode par tout moyen connu dans la technique, par exemple par liaison covalenteou par adsorption physique, en formant une unique couche moléculaire. Dans le cas d'une fixation par liaison covalente, on fera subir à l'électrode un prétraitement comprenant, de façon connue en soi, une phase de création de sites réactifs à la surface de l'électrode par oxydation électro-chimique de celle-ci et une phase d'activation de ces sites par un agent de couplage approprié à la nature de l'électrode et à celle de l'anticorps ou de l'antigène à fixer, par exemple une activation par un carbodiimide dans le cas d'une électrode en carbone Dans le cas d'une immobilisation des anticorps ou des antigènes sur l'électrode par adsorption physique, on procèdera également à un prétraitement électrochimique de la surface de l'électrode avant de la mettre en contact avec lesdits anticorps ou antigènes. Dans chaque cas d'espèce, on peut optimiser la quantité d'anticorps ou d'antigène à mettre en contact avec l'électrode en vue d'obtenir, au plus, une monocouche à la surface de l'électrode. L'épaisseur de cette couche étant réduite, elle ne fera pas "écran" devant la phase solide lors de la détection électrochimique ultérieure du produit de catalyse enzymatique. L'utilisation d'une telle phase solide comme électrode dans les dosages immunoenzymologiques constitue un autre objet de la présente invention. Les dessins schématiques annexés illustrent différentes variantes. Sur ces dessins Les figures 1 à 4 illustrent la préparation d'une électrode électroenzymatique conforme à l'invention et son utilisation dans un procédé de dosage par une méthode non compétitive du type "sandwich", Les figures 5 et 6 illustrent la préparation d'une électrode selon l'invention et son application dans une méthode compétitive ;; Les figures 7 et 8 sont des schémas, respectivement, d'une cellule électrochimique et d'un système de dosage utilisables dans les procédés de dosage électroenzymatique conforme à l'invention Les figures 9 et 10 représentent des courbes d'étalonnage utilisées respectivement dans les dosages des Exemples 1 et 2 t La figure 11 est un schéma d'une cellule de dosage utilisée dans 1'Exemple 3 t La figure 12 est une courbe d'étalonnage utilisée dans 1'Exemple 3. Comme on le voit sur la figure 1, l'électrode 1, après avoir subi un traitement propre à permettre l'immobilisation à sa surface d'anticorps 2, par liaison covalente ou par adsorption physique, est mise en contact avec une solution contenant ces anticorps. Ceux-ci, qui sont des anticorps spécifiques de l'antigène à doser, se fixent à la surface de l'électrode en formant une monocouche, qui recouvre totalement ou partiellement la surface traitée, suivant les conditions du traitement et le résultat souhaité. L'électrode modifiée résultante est ensuite mise en contact avec une solution de l'antigène 3 à doser (figure 2) qui vient se fixer sur les anticorps 2. Les conditions de la mise en contact sont telles que les anticorps ne soient pas saturés en antigènes et qu'une partie des sites anticorps demeure vacante. Le nombre des liaisons antigène-anticorps formées dépendra de la concentration en antigène de la solution à doser. Le temps de mise en contact de la phase solide avec la solution d'antigène, ou phase d'incubation, est de l'ordre de quelques minutes, alors que, dans la plupart des méthodes de dosages immunoenzymatiques, les durées d'incubation sont de l'ordre de 1 heure. En effet, le procédé de l'invention étant beaucoup plus sensible.que les procédés usuels, pour les raisons indiquées ci-dessus, il n'est pas nécessaire de saturer tous les sites anticorps, ce qui permet de réduire de façon importante la durée de contact. L'électrode est alors exposée au conjugué anticorpsenzyme 4, qui vient se fixer sélectivement sur les antigènes 3 (figure 3)e Les conditions de la mise en contact peuvent être telles que les conjugués 4 saturent tous les sites antigènes, mais ceci n'est pas une obligation, si l'on procède par comparaison avec un étalon interne réalisé dans les mêmes conditions. Le temps d'incubation peut donc être considérablement réduit par rapport aux techniques antérieures. A l'issue de la phase illustrée par la figure 3, le conjugué antigène-enzyme 4 se trouve en situation d'électro- catalyse enzymatique à la surface de 1'électrode 1. Il suffit, en effet, d'introduire dans le milieu à doser une ou des substances 5 (ou "substrats") aptes à réagir avec l'enzyme du conjugué 4, comme on le voit sur la figure 4, pour détecter et doser à l'aide de l'électrode 1 le produit 6 de la réaction enzymatique. C'est ainsi qu'avec l'acétylcholinesterase utilisée avec un substrat artificiel du type acétylthiocholine la réaction catalysée est : acétylthiocholine thiocholine + acétate La thiocholine (R-SH) produite est électrochimiquement détectée si le potentiel de l'électrode est au moins à 0,7 V par rapport à une électrode de référence du type Ag/Ag C1 Il est possible, à partir du courant d'oxydation obtenu, de calculer le nombre de molécules enzymatiques en situation d'électrocatalyse enzymatique et de mesurer ainsi,avec l'aide d'un étalonnage interne, la concentration de l'antigène 3. Les figures 5 et 6 illustrent le même procédé de mise en condition d'électrocatalyse enzymatique pour un conjugué antigène-enzyme 7 utilisé dans une méthode par compétition. Dans cette utilisation, le conjugué enzyme-ligand 7 est mis en compétition avec le ligand libre 3 du milieu biologique à doser pour se combiner avec les anticorps 2 immobilisés en formant monocouche sur l'électrode 1, (figure 5). Comme précédemment, si l'on introduit alors dans le milieu à doser une ou des substances 5 (ou substrats) aptes à réagir avec l'enzyme E du conjugué 7, on peut, comme on le voit sur la figure 6, détecter et doser à l'aide de l'électro- de 1 le produit 6 de la réaction enzymatique. Après la phase de détection illustrée par la figure 4 ou la figure 6, il peut être souhaitable, pour pouvoir réutiliser l'électrode, de la ramener à son état de départ, avant la fixation des anticorps. Dans ce cas, on procèdera à un décapage électrochimique dans des conditions analogues à celles du prétraitement de l'électrode mentionné ci-dessus, ce qui constitue un autre avantage du procédé de l'invention. Dans le cas d'une électrode en carbone vitreux, par exemple, il suffira de porter l'électrode à un potentiel d'environ 2 volts par rapport à une électrode de référence Ag/Ag Cl dans une solution oxydante, pendant quelques secondes. Il se peut aussi qu'après la phase de dosage, on veuille simplement réutiliser les anticorps fixés. Dans ce cas, les anticorps utilisés (par exemple monoclonaux) auront été sélectionnés pour qu'un rinçage,dans des conditions physicochimiques différentes de la mesure, assure la rupture des liaisons antigène-anticorps, sans dénaturation de l'anticorps immobilisé sur la phase solide. Naturellement,l'électrode modifiée conforme à l'invention peut être utilisée dans tous les procédés usuels de dosage immunoenzymatique en phase hétérogène, que ce soit les méthodes compétitives, sandwich ou par inhibition. Toute molécule permettant une reconnaissance immunolo gique (protéine, enzyme, hormone, haptène, etc.,,) est donc dosable par le procédé conforme a' 1'invention, moyennant l'utilisation d'un milieu et de conditions de dosage appropriées. On remarquera que, si la molécule à doser est une enzyme catalysant une réaction électrochimique détectable, le dosage est notablement simplifié et ne nécessite au'un anticorps de cette enzyme. C'est ce qui ressortira notamment de l'Exemple 4 qui sera décrit ci-après. Pour la préparation des conjugués, l'enzyme utilisée est nécessairement une enzyme possédant comme substrat ou produit de la catalyse un couple redox électroactif. Ce couple redox, qui peut être physiologique ou artificiel, est choisi de telle sorte qu'il présente une bonne réactivité électrochimique sur l'électrode employée, afin d'obtenir une sensibilité optimale. Les enzymes correspondantes sont en général des oxydoréductases, mais peuvent être aussi des enzymes d'une autre classe, répondant à la condition précédente, par exemple des hydrolases. Le tableau ci-après rassemble quelques enzymes utilisables pour la préparation des conjugués détectables par électrocatalyse enzymatique. TABLEAU : ( Enzymes Réactions catalysées : Molécules) électro actives détectables ( s s ) Hydrolases Ex. Acétyl- acétylthiocholine# thiocholine + thiocholine (choline estérase: acétate ex. Phosphata- phényl phosphate+H2O#acide phosphénol se alcaline phorique + phénol Oxydoréduct ases glucose +cosubstrat#acide gluconique cosubstrat Ex. : glucose +cosubstrat réduit réduit oxydase Le cosubstrat peut être O2 ou des H2O2 accepteurs artificiels comme par hydroquiexemple la benzoquinone none (Ex.: péroxydase:H202 + substrat H20 + substrat substrat oxydé : oxydé De très nombreux substratspossibles, ex. 3.3' ( :par exemple orthométhoxy phénol sdiméthoxy ) diphénoqui :none ) La sensibilité globale des procédures de dosage dépend de trois facteurs : - la sensibilité intrinsèque de la détection en phase solide - le temps de contact entre l'échantillon à doser et la phase solide, - la qualité du matériel immunologique utilisé. Pour le premier facteur, la sensibilité de détection est liée à l'activité catalytique moléculaire de l'enzyme utilisée pour l'amplification (par exemple,environ 10 000 pour un conjugué obtenu-avec l'acétylcholinestérase de Electricus Electrophorus > . Dans ce cas, l'électrocatalyse enzymatique est capable de détecter la présence d'un minimum de 1O 16 mole de conjugué par cm de surface réelle de la phase solide. Cette exceptionnelle sensibilité s'explique par la proximité moléculaire entre site enzymatique et site électrochimique, ce qui réduit à quelques nanomètres la distance que doit parcourir le produit pour être détecté. I1 est important de noter, à ce propos, que, contrairement à toute autre méthode de détection, la sensibilité de détection du conjugué est entièrement indépendante de la surface de la phase solide. La taille et la forme de l'électrode utilisée peut donc être adaptée à la quantité d'antigène que l'on souhaite doser. Ce point sera illustré dans les exemples proposés. Pour ce qui est du temps de contact entre la phase solide et l'échantillon, ce temps de contact détermine un taux de capture" T, qui peut être inférieur à 1, si tous les antigènes n1 ont pas été captés , le taux de capture étant défini comme le rapport entre le nombre de molécules antigèniques capturées par la phase solide et leur nombre total dans l'échantillon. Le taux T est également sensible au rapport entre le volume de l'échantillon et la surface de la phase solide. Une des caractéristiques de l'invention est que la détection est suffisamment sensible pour qu'il soit possible d'accepter des taux de capture faibles (par exemple T = 0,03 dans l'exemple 1 > . Enfin, la sensibilité pratique du procédé de dosage est fonction, comme pour toute méthode immunologique,de la qualité des anticorps utilisés ainsi que des adsorptions non spécifiques parasites sur la phase solide. Les rinçages dans des tampons appropriés, connus de l'homme de l'art, limitent ces adsorptions non spécifiques. Mais on notera que le temps d'incubation très court permis par la procédure proposée réduit considérablement ces adsorptions non spécifiques. La sensibilité globale obtenue est finalement un paramètre modulable en fonction du problème analytique traité, Les exemples présentés ci-après illustrent des sensibilités effectives pouvant atteindre 2. -12 mole par litre ou 2,1o21 mole dans la prise d'essai. Ceci marque un progrès appréciable par rapport aux méthodes usuelles, dont la sensibilité est en général de l'ordre de 10-10 mole par litre. Les exemples suivants illustrent diverses formes de mise en oeuvre de ltinvention. EXEMPLE 1 Cet exemple illustre le dosage d'une immunoglobine G par la méthode "sandwich" sur une phase solide de surface moyenne (électrode plane de-carbone vitreux de surface d'environ 0,1 cm2). 1) PréDaration des réactifs L'anticorps anti lgG de lapin a été fourni par les laboratoires BYOSIS, de Compiègne (France). Il a été obtenu chez le mouton et puririé selon les procédures connues. Le conjugué glucose oxydase-anti lgG est préparé par la méthode au glutaraldéhyde d'AVRA4EAS et al (Immunochemistry, Pergamon press 6, 43-52 (1969). Après purification, le conjugué est enzymatiquement actif à 95 % et immunologiquement actif à 60 %. 2) AsDareillaqe. La mesure pourra, par exemple, être effectuée dans une cellule électrochimique 9 à circulation, du type illustré par la figure 7. Dans cette cellule, le liquide arrive par une canalisation 10, circule en lame mince délimitée par une pellicule 11 de matière plastique, par exemple de P T F E, et est évacué par une canalisation 12. La cellule comprend, par ailleurs, une électrode de travail 13, par exemple en carbone vitreux, une contre-électrode 14, par exemple du type Ag/Ag C1, et une électrode de décapage 15, par exemple en carbone vitreux. Les électrodes sont gainées sur toute leur surface latérale par une matière isolante et ne sont en contact avec le liquide à doser que par leur face d'extrémité. Bien entendu, une telle cellule n'a qu'une valeur d'exemple et l'on pourrait utiliser tout autre système conçu par 1'homme de l'art. La cellule 9 s'incorpore dans un système entièrement automatisé du type de celui de la figure 8, qui permet un étalonnage interne assurant la précision du dosage. La cellule électrochimique 9 est alimentée par la canalisation 10 à partir d'un circuit fluidique 16, lui-même alimenté en réactifs par le conduit 17, avec prise d'échantillon éventuelle par le conduit 18. Les électrodes 13, 14 et 15 sont connectées à un système d'alimentation électrique 19, qui sert en même temps d'interface électronique de contrôle et d'acquisition, couplée à un microordinateur 20. 3) Dosage On utilise, dans ce cas, le principe de la méthode "sandwich" décrite en référence aux figures 1 à 4. L'introduction et la circulation des réactifs est assurée par le circuit fluidique 16 de la manière suivante L'électrode de travail est oxydée 5 secondes dans un mélange nitrochromique (10 % en poids de HN03 + 2% en poids de K2Cr2O7 + eau) par passage d'un courant de 5 mA. L'électrode 15 est utilisée comme cathode. Cette phase de décapage de l'électrode régénère la surface de la phase solide et facilite l'adsorption de l'anticorps. Après rinçage au tampon (phosphate 0,01 M, pH 7,4RNaCl 0,15 M), une solution d'anticorps (300g/ml dans le même tampon) est mise en contact 5 minutes avec la phase solide. Un rinçage pendant 2 minutes au tampon bloquant (phosphate 0,01 M, pH 7,4 + gélatine 0,25 % + Tween 20,0,1% (monolaurate de polyoxyéthylènesorbitane commercialisé sous cette appelation et utilisé commetensio-atif ) + NaCl 0,15 M) permet d'éliminer l'anticorps én excès. On introduit 0,2 cm3 de la solution contenant l'antigène 3 à doser avec un débit de 0,1 cm par minute. Cette phase est suivie par 2 minutes de rinçage au tampon bloquant. Le conjugué (100 g/cm3 dans le tampon bloquant) est introduit pendant 1 minute, puis rincé par une solution de benzoquinone (10 M dans du tampon acétate 0,1 M,pH 5,6 + NaCl 0,15 M). Le courant de l'électrode, portée à 350 mV par rapport à l'électrode 14, est alors échantillonné pendant 1 minute par le système d'acquisition de données 19 et 20. L'introduction de glucose 0,2 M dans la même solution provoque un saut de courant , dû à la détection de l'hydroquinone enzymatiquement formée. Ce saut de courant, pratiquement instantané, est directement proportionnel à la quantité de conjugué en position d'électrocatalyse enzymatique. I1 est relié par une courbe d'étalonnage (figure 9) à la concentration en IgG dans l'échantillon. Le taux de capture calculé est ici de l'ordre de 0,03 et la sensibilité de l'ordre de 2.1O11 mole/l en antigène, soit 4.10 mole d'antigène dans la prise d'essai. Le cycle de mesure peut alors recommencer par le décapage de la phase solide. L'ensemble du cycle dure ici 20 minutes y compris l'adsorption de l'anticorps sur la phase solide. EXEMPLE 2 Cet exemple concerne le dosage d'un stéroïde, le 17ss oestradiol,par une méthode dite "compétitive ",sur une phase solide de surface moyenne (électrode plane de carbone vitreux de 0,1 cm de surface). 1) Réactifs L'anticorps de lapin anti-oestradiol a été obtenu d'un laboratoire spécialisé. Le conjugué oestradiol-acétylcholi nestérase a été préparé selon la méthode de ERLANGER et al (Methods in immunology and immunochemistry, Academic Press, vol 1 144, (1967). 2) Anpareillave On utilise le même appareillage que dans 1'Exemple 1. 3) Dosage On utilise le principe de la méthode par compétition de l'antigène vis-à-vis de l'antigène marqué pour la phase solide , décrite en référence aux figures 5 et 6. L'introduction et la circulation des réactifs est assurée automatiquement par le circuit fluidique 16 selon la chronologie suivante t Les phases de décapage puis d'adsorption de l'anticorps anti-oestradiol sont identiques aux deux premières phases de l'Exemple 1. Pendant la phase de compétition, une solution de conjugue antigène-enzyme de concentration appropriée est introduite aveclasolution à doser. Le débit de ce mélange 3 échantillon/conjugué est de 0,1 cm /min et cette phase dure 3 minutes. Après un rinçage d'une minute au tampon phosphate (0,01 M pH 7,5 + NaCl 0,15 M), la solution d'acétylthio. choline (5.10 M dans le même tampon) est introduite. Le saut de courant mesuré par l'électrode 13 préala blement portée à + 700 mV par rapport à l'électrode 14 correspond à l'oxydation de la thiocholine produitepar le conjugué en position d'électrocatalyse enzymatique. Dans ce cas, le courant mesuré est inversement proportionnel à la concentration en antigène dans l'échantillon à doser. La figure 10 représente une courbe d'étalonnage. EXEMPLE 3 Cet exemple concerne le dosage d'une immunoglobine G par la méthode "sandwich", à l'aide d'une phase solide de grande surface (électrode en feutre de carbone de surface réelle 50 cm2) 1) Réactifs Les anticorps - ont la même provenance que ceux de l'Exemple 1. Le conjugué est ici obtenu par couplage de l'acétylcholinestérase de Electricus electrophorus sur l'anticorps par la méthode au carbodiimide décrite par Goodfriend T.L. et al., Science 1964, 144, 1344 - 46. 2) A > nareillaqe L'appareillage utilisé est représente schématiquement sur la figure 11. La phase solide est un cylindre 22 de feutre de carbone (par exemple, celui portant la référence RVC 2000 commercialisé par la Société Le Carbone Lorraine) de 7 mm de long sur 5 mn de diamètre, correspondant à une surface réelle de fibre de carbone de l'ordre de 50 cm2. Le contact électrique avec cette électrode de travail est assuré par l'électrode annulaire 23 en platine. La solution, introduite par 24, percole au travers de l'électrode 22 et est évacuée par la sortie 25. L'électrode de référence 26 et la électrode de décapage 27 sont identiques à celles de la figure 7. Ce microréacteur électrochimique 21 s'incorpore à la place de la cellule électrochimique dans le système automatisé décrit dans la figure 8. Ce micro réacteur est particulièrement efficace pour les solutions très diluées qui nécessitent un taux de capture élevé. Il permet également de réduire encore les temps de contact entre solutions et phase solide du fait de l'important rapport surface/volume obtenu. 3) Dosaae Dans son principe, le processus de dosage est identique à celui de l'exemple 1, avec les différences suivantes - le temps d'adsorption de l'anticorps est réduit à 2 minutes ; - l'échantillon à doser (volume 10 cm3) est introduit avec un débit de 5 cm3/minute ; - le potentiel de l'électrode 22 pendant la phase de mesure est à + 700 mV par rapport à l'électrode 26 t le saut de courant est obtenu par introduction du substrat de l'enzyme, ici l'acétylthiocholine 510 M M dans un tampon phosphate 0,01 M,pH 7,5/NaC1 0,15 M. La procédure de décapage de la phase solide est différente à cause de sa grande surface. Dans ce cas, l'alimentation 18 impose un courant alternatif à la fréquence du secteur d'environ - 3V d'amplitude entre l'électrode de travail 22 et l'électrode 270 Cette phase, réalisée en présence du mélange nitrochromique (10 % HN03 + K2Cr207 2 %), dure 5 secondes. Elle est suivie d'une phase de rinçage au tampon phosphate 0,01 M,pH 7,4 > . L'ensemble du cycle de mesure dure 15 minutes et un exemple de courbe de calibration est donné sur la figure 12. La sensibilité est de l'ordre de 2.10 mole/1 avec un taux de capture compris entre 0,5 et 0,90 On remarquera que, Si une moins bonne sensibilité est désirée, il suffit de réduire le volume de l'échantillon. EXEMPLE 4 Cet exemple concerne la détection et la localisation d'une protéine in vivo à l'aide d'une microélectrode (fibre de carbone de diamètre 10 m). Dans cet exemple, la phase solide est utilisée pour détecter la présence d'acétylcholinestérase libre localisée à la périphérie d'une cellule nerveuse dans la moelle épinière du rat. L'anticorps anti-acétylcholinestérase est immobilisé sur la fibre de carbone, qui est introduite sous contrôle microscopique dans les tissus, selon les méthodes habituelles à l'électrophysiologie. 1) Réactifs L'anticorps monoclonal anti-acétylcholinestérase adapté à cette mesure n'est pas commercialisé et a été fourni par un laboratoire de recherches universitaire spécialisé. 2) ADareillaqe On utilise ici une méthode manuelle. La microélectrode utilisée (par exemple celle portant la référence MFC1 commercialisée par SOLEA-TACUSSEL) est sectionnée de telle sorte que la longueur utile de la fibre soit d'environ 50 m. Compte tenu du diamètre (10 pin), ceci correspond à une surface externe de la fibre de l'ordre de 1,6.10 5 cm2 Pendant la phase de contact avec l'échantillon, l'électrode est montée sur un stand de micromanipulation. Pendant la phase de mesure de l'activité enzymatique, l'électrode est placée comme électrode de travail dans un montage électrochimique classique à trois électrodes. Le courant est mesuré à l'aide d'un picoampéromètre, à cause des faibles courants débités. 3) Dosage La micro-électrode est prétraitée par passage de 10 A pendant 5 secondes dans le mélange nitrochromique de l'Exemple 1. Après rinçage au tampon phosphate (0.01 M, pH 7,4), l'anticorps anti-acétylcholinestérase est adsorbé par simple trempage de la fibre dans une solution à 10 pg/cm3 dans le même tampon. Après rinçage au tampon bloquant de 1'Exemple 1, l'électrode est fixée sur un micromanipulateur et la pointe de la fibre de carbone est enfoncée dans la préparation pendant 2 minutes. La localisation s'effectue sous microscope. La détection de l'acétylcholinestérase ainsi "prélevée"par les anticorps fixés sur l'électrode peut ensuite être effectuée, en différé, dans la cellule électrochimique. Les courants mesurés sont de l'ordre de 10 à 100 pico A, en fonction de la quantité d'enzyme à détecter et des temps de contact in vivo. La sensibilité, exprimée ici en quantité d'enzyme et non en concentration, est de l'ordre de 2,1O21 mole d'acétylcholinestérase. La méthode est semi quantitative, à condition de standardiser les temps de contact avec des témoins. On remarquera que la méthode peut être utilisée in vitro selon les mêmes principes, dans le cas de volumes d'échantillons très faibles (par exemple de volume inférieur à 1 1). Ceci prouve la très grande sensibilité de la méthode de détection0 REVENDICATIONS 1.- Phase solide conductrice pour dosages immunoenzymatiques, caractérisée en ce que, sur une partie au moins de sa surface appelée à être en contact avec le milieu à doser, est fixé directement, sans interposition d'un support intermédiaire, un anticorps ou un antigène assurant la reconnaissance spécifique de la molécule à doser. 2.- Phase solide selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'anticorps ou l'antigène est fixé à sa surface suivant une unique couche monomoléculaire. 3.- Phase solide selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisée en ce qu'elle est constituée de ou comprend du carbone, du platine ou de l'or. 4.- Phase solide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'anticorps ou l'antigène de dosage est fixé sur l'électrode par liaison covalente avec certains sites de celle-ci. 5.- Phase solide modifiée selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'anticorps ou l'antigène de dosage est fixé sur l'électrode par adsorption physique. 6.- Procédé de préparation d'une phase solide selon la revendication 4, caractérisé en ce que, de façon connue en soi, on fait apparattre, par oxydation électrochimique, des sites réactifs à la surface de ladite électrode, en ce que l'on active lesdits sites avec un agent de couplage approprié à la nature de l'électrode et à celle de l'anticorps ou de l'antigène à fixer, et en ce que l'on amène l'électrode ainsi prétraitée en contact avec lesdits antigènes ou anticorps. 7.- Procédé de préparation d'une phase solide selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on procède à une oxydation électrochimique de la surface de l'électrode et en ce que l'on amène la surface ainsi traitée en contact avec lesdits antigènes ou anticorps. 8.- Utilisation d'une phase solide selon--l'une des revendications 1 à 5 comme électrodedans un procédé de dosage immunoenzymatique faisant intervenir une enzyme qui possède un substrat dont le produit est électroactif sur ladite phase solide0 9.- Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que, en fin-de dosage, l'électrode est soumise à un décapage électrochimique par action d'un courant continu ou alternatif, en vue d'en séparer les anticorps ou/et les antigènes qui en sont solidaires. 10.- Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que en fin de dosage, on sépare 1'immunoréactant de l'antigène ou de l'anticorps fixé sur l'électrode sans séparer ledit antigène ou ledit anticorps de l'électrode, par rinçage de l'électrode avec un liquide dont les conditions de pH et/ou de polarité sont différentes de celles du milieu de dosage.