FR 2605017 A1 19880415 FR 8614294 A 19861013 Microorganismes comportant des pili comme protéines porteuses, pili isoles à partir de ces microorganismes et procede d'excrétion de peptides ou de proteines à l'aide de ces pili La presente invention concerne des microorganismes comportant des pili comme protéines porteuses de materiel peptidique heterologue ainsi que les pili isoles a partir de tels microorganismes. L'invention concerne egalement un procede d'excretion de peptides ou de proteines utilisant les mecanismes genetiques propres des microorginismes pour la production de pili. Les mecanismes de production des pili d'Escherichia coli et plus particulièrement des sous-unites fimbriales K88 et K99 appelees dans la nouvelle nomenclature respectivement F4 et F5 sont actuellement connus et ont été decrits dans la litterature par notamment - B. Oudega, F.R. Mooi et F.K. de Graaf-Antonie van Leeuwenhoek 50, 1984, 569-584 - M.R. Mooi, F.K. de Graaf-Symp. Biotechnol. Res. Neth. 1983 - M. Kehoe, R. Sellwood, R. Shipley et G. Dougan - Nature Vol. 291 du 14 mai 1981 - J. Josephsen, F. Hansen, F.K. de Graaf et W. Gaastra FEMS. Microbiology Letters 25 (1984) 301-306 - D. Newman, B. Hay et Sadowski - Federation Proceedings 1985, 44 (5), p. 1438 Dans ces documents aucune information n'est cependant fournie sur l'utilisation de ces mecanismes pour l'obtention de microorganismes comportant des pili comme proteines porteuses permettant l'expression de peptides ou de proteines heterologues. La presente invention vise à resoudre cette carence et fournit les moyens pour obtenir en pratique de tels microorganismes et pili. L'invention concerne à cet effet des microorganismes dont la membrane externe porte des pili dont la composition a été modifiée par un changement de la sequence proteique au niveau de la sous-unite. La nature des microorganismes concernes par l'invention n est pas critique en elle-meme et de pend uniquement de la possibilite que possèdent certains microorganismes de produire des pili tels que de finis ci-avant. Habituellement on opère avec des bacteries comme microorganismes. Parmi celles-ci sont mises en oeuvre de preference les bacteries des familles Enterobacteriaceae, Streptococcaceae, Neisseriaceae, Proteeae, Rhizobiaceae, Pseudomonodaceae, Corynebacteriaceae, Mycoplasmataceae, Myxococcaceae, Actinomycetaceae, Bacteroidaceae et de maniere preferee les bacteries des genres Escherichia, Neisseria, Proteus, Bordetella, Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella, Moraxella, Streptococcus, Serratia, Enterobacter, Agrobacterium, Rhizobium, Corynebacterium, Myxococcus, Actinomyces, Caulobacter, Bacteroides, Shigella, Mycoplasma et de manière particulièrement preferee les espèces Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Proteus mirabilis, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas echinoides, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae.Enfin de bons resultats ont été obtenus avec les souches d'Escherichia coli, en particulier les souches de serotype K88 et K99. L'invention concerne egalement les pili isoles de ces microorganismes par tout moyen physique, chimique ou biologique. Elle concerne également les sous-unîtes ou pilines qui, par quelque moyen que ce soit ont été liberees et separees de la structure polymerique repetitive constituant les pili. Par pili on entend également les termes tels que fibrilles et, fimbriae. Ce sont des polymères excrétés par les microorganismes et attaches a la membrane externe de ces microorganismes, constitues de la repetition de proteines appelees pilines ou encore sous-unites. Les sous-unîtes ou pilines, dont la repetition constitue le pilus, sont des proteines qui ont generalement un poids moleculaire compris entre 5 et 50 kD et qui, lorsqu'elles sont associees sous forme de pili, forment des filaments extracellulaires de 20 à 250 A de diamètre et pouvant atteindre plusieurs microns de long. Les pili décrits dans l'invention peuvent etre de tous types tels que des pili somatiques. De préférence on utilise les pili somatiques qui servent à l'adhésion des microorganismes sur un suppart et de bons résultats ont été obtenus avec les pili K88 d'Escherichia coli qui permettent à cette bactérie de coloniser l'intestin de certains mammifères. Les pili obtenus selon l'invention ont une composition différente de la composition des pili du microorganisme à lTétat sauvage suite à une modification apportée à la séquence protéique de la sous-unité ou piline. Les modifications de la sous-unité portent de préférence sur les régions non critiques pour l'assemblage et ltexcretion de la sous-unité. La protéine obtenue après modification peut être utilisée dans diverses applications. En fonction du peptide introduit dans la sous-unité elle peut notamment convenir comme enzyme, comme constituant nutritif ou encore dans le domaine de la santé animale ou humaine notamment en tant que produits pharmaceutiques à usage vétérinaire ou humain. Les pili sont des molécules fortement antigéniques. Si le peptide introduit est un épitope étranger au pilus la protéine obtenue selon l'invention peut posséder un carac tere antigénique nouveau et être utilisée dans des tests immunologiques. Elle peut également posséder un caractère immunogénique et etre utilisée comme composant d'un vaccin. L'invention permet également de rendre immunogéniques des peptides, qui ne le sont que peu ou pas par eux-memes, après leur introduction dans la séquence protéique de la piline. La modification de la séquence protéique de la sous-unité ou piline peut etre réalisée par tout moyen connu. Un moyen est de modifier la séquence d'ADN codant pour la sous-unité du pilus. Ces modifications sont réalisées par ingéniérie génétique. Le gène recombinant est ensuite traduit en protéines (hétérologues) dans un organisme hôte. Par modification on entend toute modification de 1'ADN sauvage, conduisant à une modification de la séquence protéique de la sousunité. On entend également le remplacement d'un fragment d'ADN sauvage par un fragment d'ADN étranger. L'ADN étranger peut être d'origine naturelle ou synthétique. Sa séquence en nucléotide et sa phase de lecture dans le gène déterminent la séquence native en acides aminés incorporés dans la sous-unité. L'invention concerne dès lors également tout.matériel génétique permettant l'utilisation de pili comme protéines porteuses L'invention concerne en outre les procédés permettant de réaliser des pili en tant que protéines porteuses par incorporation d'ADN hétérologue. Plus particulièrement l'invention concerne tout procédé dans lequel le gene recombinant permet d'obtenir des pili dont la structure polymérique est conservée et contenant éventuellement les sous-unités modifiées résultant de l'incorporation de 1'ADN hétérologue. L'invention concerne donc les procédés qui permettent d'obtenir des pili dont la composition a été modifiée par un changement de la séquence protéique de la sous-unite, ce changement résulte de l'introduction dans le gene codant pour la sous-unité d'un pilus, d'un fragment d'ADN codant pour un peptide ou une protéine hétérologue tel qu'un fragment d'ADN synthétique, un fragment d'ADN naturel ou un fragment obtenu a partir de la transcription reverse de mRNA. Par ADN hétérologue on entend tout matériel génétique issu d'une autre source que la souche hôte dans laquelle on réalise le procédé de l'invention. Par ADN synthétique on entend aussi bien un ADN de composition ou structure naturelle obtenu par synthèse chimique qu'un ADN dont la structure ou la composition n'existe pas tel quel dans la nature. Un des procédés est la modification d'une région de la protéine de la sous-unité formant le pilus exposée au milieu environnant, par insertion d'ADN codant pour un peptide ou une protéine hétérologue, dans une zone du gene codant pour la sous-unité d'un pilus correspondant à la zone exposée au milieu environnant de la séquence protéinique des pilines concernées. Les régions exposées comprennent notamment des regions antigéniques des pili, c'est-a-dire composées d'épitopes inducteurs de la production d'anticorps. L'invention concerne également les utilisations des pili et pilines porteurs de matériel hétérologue. Ainsi l'invention concerne notamment les vaccins obtenus avec les pili et pilines porteurs de matériel hétérologue, combines ou non avec divers additifs tels que des adjuvants et des immunostimulants. L'invention comprend également des utilisations diverses dans lesquelles les pili porteurs de protéines ou de peptides sont utilisés en tant qu'agents ayant des propriétés immunostimulantes (permettant notamment la stimulation de la réponse immunitaire à partir de vaccins déjà connus). Un procédé ayant donné de bons résultats fait appel aux techniques du génie génétique. I1 comprend les étapes suivantes (1) clonage du gene ou de l'opéron du pilus choisi comme protéine porteuse et T l'expression de ce(s) gène(s) dans un organisme hôte, (2) détermination de la séquence du gène de la piline (3) alternative de la complémentation intergénique, (4) identification des sites antigéniques du pilus, (5) comparaison des séquences de différents sérotypes, (6) isolement (ou synthèse) d'un fragment d'ADN codant pour un peptide ou un épitope intéressant, caractéristique de l'orga- nisme contre lequel on veut dresser des anticorps, (7) clonage de 1'ADN obtenu en (6) en phase dans le gène de la sous-unité du pilus dans des sites préférentiels identifiés en (4) et (5), (8) introduction du gène recombinant dans un organisme et son expression en tant que pilus porteur de peptide ou de protéine hétérologues. Ces étapes sont explicitées ci-après 1 Clonage Le clonage de l'opéron ou du gène du pilus choisi comme molécule porteuse est realisé par les techniques maintenant classiques du génie génétique. Le clonage in vitro implique la préparation de 11ADN de l'orga- nisme qui produit le pilus, et le clonage de fragments de restriction (banque génomique) dans des plasmides, des phages ou des cosmides. L'emploi de vecteurs dits d'expression, contenant des signaux de transcription forts, pourra pallier l'absence de promoteur sur le fragment de DNA cloné. Le clonage in vivo peut se faire chez certaines bactéries par I'intermédiaire d'un phage transducteur ou de plasmides mobilisables ou transférables associés a des transposons. Les vecteurs de clonage sont introduits dans un organisme hôte par transformation (plasmides) ou transfection (cosmides et phages) ou conjugaison (plasmides conjugatifs). L'expression des pili est' recherchée dans un organisme hôte ne produisant pas ce type de pili : soit un mutant de l'organisme, muté dans cette fonction ou, mieux, dans un organisme de laboratoire, tel E. coli K12 pour les procaryotes. te criblage des recombinants se fera sur base des propriétés propres aux pili (telles que l'bemagglutination, l'immunoprécipitation, ou la reconnaissance immunologique sur colonie). La présence des pili est confirmée de visu par microscopie électronique, ou par la purification des pili d'une culture du recombinant et leur analyse sur gel d'électrophorèse par exemple. 2. Séguencage du gène Une carte de restriction du fragment cloné est établie pour quelques enzymes courants. On utilise pour cela les techniques de restriction partielle et de restrictions multiples. Le séquençage de 1'ADN cloné est réalisé soit par là technique dite du didéoxyribose développée par Sanger, soit la technique de modification des bases mise au point par Maxam et Gilbert. On positionne le gène de la sous-unité sur la carte de restriction par des techniques de mutagenèse. Un exemple d'exécution particulière de cetté technique fait appel aux minicellules. Ces minicellules permettent de mettre en évidence les protéines codées par le fragment cloné sur un plasmide. I1 est possible d'induire des mutations dans ce fragment, par exemple via l'intégration d'un transposon, ou in vitro par restriction, suivie de digestion par une exonucléase. Les mutations qui entraînent l'absence de synthèse de pili sont analysées a leur tour dans les minicellules : on associe ainsi l'absence d'une protéine produite avec la localisation de la mutation. L'absence de sous-unités positionne, sans équivoque, le gène de la sous-unité sur le fragment.Cette portion du fragment peut être seule séquencée. La séquence est analysée par ordinateur, via des programmes d'analyse qui fournissent les données essentielles de - début et fin du (des) gène(s) - traduction du gène en protéine - position des sites de restriction. 3. Complémentation intergénique La plupart des pili dont la génétique a été décrite à ce jour sont structurés en opéron, constitué de plusieurs gènes en plus du gène de la sous-unité. Ces gènes codent par exemple pour des protéines jouant un rôle dans l'ancrage, l'assemblage ou la protection. On peut fractionner 1' opéron en clonant le seul gène de la sous-unité sur un plasmide et le reste sur un autre plasmide. Les deux plasmides vecteurs doivent être compatibles et porter des marqueurs de sélection différents. Les pili seront synthétisés seulement lorsque les deux plasmides seront présents dans l'organisme hôte, par complémentation intergénique. Le fragment portant l'opéron délété du gène de la sous-unité peut également être introduit dans le chromosome de l'organisme hôte. La complémentation intergénique a plusieurs avantages techniques fort intéressants. Le plasmide contenant le gène de la sous-unité - est seul a devoir être manipulé, - est d'une taille réduite par rapport a celle du plasmide porteur de l'opéron complet, - contient un nombre plus limité de sites de restriction, - a été complètement séquencé, ce qui n'est pas toujours le cas pour l'entièreté de 1' opéron. 4. Sites antigéniques En disposant d'anticorps polyclonaux ou d'une batterie d'anticorps monoclonaux spécifiques aux pili, on recherche la position des antigènes par différentes techniques : par exemple a - partir de peptides synthétiques du pilus, qui sont reconnus par des anticorps antipili, ou qui induisent, après injection a un animal, la synthèse d'anticorps antipili. b - par fragmentation de la protéine par des composés comme le bromure de cyanogène ou des enzymes (trypsine, ...) qui clivent les sites spécifiques de la protéine. On cherche ensuite la présence d'antigènes sur les différents fragments. c - par clonage de fragments du gène pilus en phase dans le gène de la bêta-galactosidase. Si le fragment cloné détermine un peptide antigénique, il sera reconnu sur la protéine hybride, par les anticorps antipili. Précisons que ces techniques identifient des épitopes continus de la protéine. Des données prédictives sont souvent utilisées pour localiser des épitopes : a - La structure tridimensionnelle de la protéine, si elle est connue, identifie les régions exposées. b - Des algorithmes peuvent être utilisés pour - rechercher les régions hydrophiles et les régions hydro phobes d'une protéine : algorithmes de Roop & Wood, de Doolittle. Les régions hydrophiles, exposées au solvant, sont autant de lieux pour des épitopes potentiels. - prédire la structure secondaire (hélice, feuillet et tours) d'une protéine à partir de sa seule séquence primaire : algorithmes de Chou & Fasman, de Garnier. Les épitopes sont souvent associés a des tours dans la protéine. D'autres indices peuvent être relevés, comme la présence de résidus proline, un acide aminé qui provoque des "coudes", et donc des régions protubérantes dans la protéine. 5 - Comparaison des séquences de différents sérotypes Certains pili présentent des variations antigéniques naturelles plus ou moins importantes, permettant sans doute a ltorga- nisme qui les porte d'échapper partiellement du moins, a l'immunité acquise par l'hotte lors d'une infection antérieure. En comparant les séquences en nucléotides et en acides aminés des differents variants, on peut reconnaître a - des régions invariables, communes a tous les sérotypes, qui seront considérées comme essentielles a la structure ou la polymérisation de la pilîne. La présence de mutations conser vatrices est un indice supplémentaire qui accentue l'importance de ces régions pour la structure pili; - des régions variables, en composition en acides aminés et/ou en longueur. Ces régions seront considérées comme n'inter venant pas - ou peu - dans l'assemblage et la structure du pilus. Cette première analyse peut être plus fouillée, tenant compte notamment des propriétés chimiques des résidus variables, de leur indice d'hydrophilicité ou encore de la taille du radical. L'importance des variations entre les pili peut ainsi être pondérée. Les epitopes positionnés comme décrit au point ci-avant en 4) peuvent être caractérisés gracie a la comparaison de sérotypes, comme communs ou variables. Cette donnée n'est pas indispensable pour la bonne réalisation de notre invention, mais est cependant fort intéressante. En effet, elle définit sur la protéine des regions à la fois antigéniques et susceptibles de modifications, qui seront autant de régions cibles pour l'introduction de peptides étrangers. 6 Epitope I1 faut disposer d'un fragment d'ADN qui détermine la synthèse d'un épitope particulier de l'organisme contre lequel on désire développer une réponse immunologique. Ce fragment est soit un fragment de restriction, soit un ADN synthétique. Cette seconde solution offre évidemment beaucoup plus de souplesse pour le clonage (cf. point 7). 7 Clonage d'ADN L'ADN codant pour l'épitope est cloné, en phase, dans le gène de la sous-unité, dans une des régions antigeniques et variables établies en (4) et (5) ci-avant. Cet ADN est soit ajouté au gène, soit cloné en lieu et place d'un fragment existant. Dans ce dernier cas, la taille totale de la sous-unité pourra être maintenue. La stratégie de clonage dépend de la disponibilité de sites de restriction dans la région choisie. En cas d'absence d'une telle séquence, un site est créé parmutagenèse in vitro, ou éventuellement 1'ADN est cloné par des techniques de mutagenèse in vitro. L'introduction d'un site de restriction unique présente le grand avantage de créer un vecteur universel. En effet, n'importe quel ADN synthétique possédant des extrémités cohésives avec la séquence restreinte pourra être dorénavant cloné dans ce site. 8. Expression du gène recombinant Le vecteur portant le gène recombinant est introduit dans l'organisme hôte capable de produire le pilus modifié, notamment l'organisme porteur du système de complémentation décrit en 3. La présence de pili est mise en évidence comme lors du criblage décrit en (1), alors que des anticorps spécifiques a l'épitope cloné peuvent en prouver la présence. Exemple 1 Un exemple de réalisation particulière de l'invention est décrit ci-après, il illustre l'invention sans en limiter la portée. Cet exemple est réalisé avec les pili K88 d'Escherichia coli. Les pili K88 sont des pili somatiques produits par des Escherichia coli entérotoxigéniques. Ils leur permettent d'adhérer aux cellules épithéliales de l'intestin et de coloniser ce milieu. K88 existe sous trois variations sérotypiques : chaque variant possède un type antigénique commun, noté a, et un type variable, noté respectivement b, c et d. Le procédé suivi dans cet exemple peut être décrit de la façon générale suivante a - La cartographie des épitopes du pilus d'une part et la compa raison des séquences des trois sérotypes ab, ac et ad d'autre part permettent de localiser des régions antigéniques et variables du pili. L'analyse des séquences de 1'ADN fait apparaître des sites de restriction utilisables pour les clonages. b - le fragment d'ADN déterminant un peptide antigenique reconnu par un anticorps donné est introduit par manipulation génétique dans le gène de la sous-unité du pilus K88. Le site d'inser tion est choisi de façon a ce que le peptide hétérologue conserve les propriétés d'excrétion et d'assemblage du pilus. c - Le peptide antigénique est fusionné a la sous-unité et donc multiplié sur le pilus. d - Les pili sont ensuite purifiés. Ils sont décrochés des mem branes par l'agitation d'une suspension de bactéries piliées dans un mixer. Pili et bactéries sont séparé s par centri fugation. Résultats expérimentaux A - Matériels et méthodes 1 - Souches bactériennes et plasmides Les souches bactériennes utilisées sont EC294 : End 1-, hsd (rk, mk), sup E JM103 : 4(Lac, Pro), Thi, strA, endA, sbcB1S, hsdRt supE, recA/F', traD36, proAB, Lac Iq, LacZMl5. K88abNL - souche E. coli K88+, sérotype ab, reçue du Dr. Van Zijderveld (CDI, Lelystad, NL) K88abUS - idem, reçue de Salsbury Laboratories, USA 1476 [pK88ac] souche E. coli K88+, sérotype ac, reçue de Salsbury Lab. K88adNL - sérotype ad, reçue du Dr. Van Zijderveld. K88adUS - idem, reçue de Salsbury Lab. Les plasmides utilisés et construits durant ce travail sont décrits dans le tableau I. Les cultures sont réalisées en milieu Furia broth (LB), addi tionné des antibiotiques appropriés aux concentrations de 100 l/ml pour l'ampicilline, 25 g/ml pour la tétracycline et le chloramphenicol. Le caractère F de JM103 est testé par sa sensibilité au phage M13 comme décrit par Miller (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972). Les auxotrophies sont testées par la croissance sur milieu minimal, additionné des acides aminés (aa) adéquats. La production de bêta-galactosidase, phénotype tac, est mise en évidence par la coloration bleue des colonies sur un milieu LB contenant de 1'IPTG (425 g/ml final) et du X gal (409 g/ml final). Tableau 1 : Liste des plasmides Nom Description Vecteurs : pBR322 ApRTcR (1) pBR322E = pBR322 dépourvu du site EcoRl pACYC184 CmRTcR (2) pUR222 ApRLac alpha (3) pUC8 ApRLac alpha pUC18 ApRLac alpha pUCtgl30 polylinker du M13 tg130 remplace le polylinker du pUC18 K88ac : pIX102 pBR322 ::K88ac clonage d'un fragment HindIII de 12 kb du plasmide pK88ac pIX105 restriction EcoRl partielle du pIX102. Insert de 7kb pIX115 idem pIX105 mais l'insert K88 est flanqué de deux sites HindIII pIX120 Fragment DraI de K88, contenant le gène de la sous-unité, cloné dans le site HindIII/klenow du pBR322; délétion BamHl-aval pIX126 =pIX120 dont le fragment SacI/BssHII est remplacé par le linker du pUCtgl30 pIX128 =pIX120 dont le fragment SacI/BssHII est remplacé par un adaptateur synthétique pIX130 pIX126 contenant un épitope de l'hémagglutinine du virus de l'influenza dans le linker tgl30. pIX131 =pIX130 avec la partie SacI-KpnI du linker du pUC18 pIX134 pIX120 dont le fragment Bg11-Bg11 porteur de l'extrémité 3' du gène de la piline ac est remplacé par le fragment Bgll-Bgll équivalent du pAD120. Nom Description pIX135 pAD120 dont le fragment Bg11-Bg11 porteur de l'extrémité 3' du gène de la piline ad est remplacé par le fragment Bgll-Bgll équivalent du pIX120. pIX136 =pIX128 contenant un épitope de l'hémagglutinine du virus de l'Influenza. pIX139 =pIX136 avec la partie SacI-kpnI du pUC18. pIX211 =pACYC184 contenant l'opéron R88ac, dé lé té du gène de la sous-unité, cloné dans le site EindIII K88ad : pAD102 pBR322::K88ad - clonage de l'opéron K88ad pAD120 id pIX120, mais la sous-unité appartient au. sérotype K88ad pUC81 Délétion HindII/RindIII du pUC8 pUC82 =pUC81 contenant le fragment ECOR1 Xh02 du gène piline de pAD120 pUC83 = pUC82 dont le fragment Hind II-BamEl a été remplacé par un adaptateur synthétique pUC84 le fragment Xh02 contenant la partie 3' du gène de la sous-unité K88ad du pADdl20 est cloné dans le site BamHl du pUC83. pAD121 =pAD120 dont le fragment HindII-BamHl a été remplacé par un adaptateur synthétique pAD122 =pAD121 contenant l'ADN codant pour l'épitope de l'Influenza Les références sont (1) Bolivar et al, 1977, Gene ,2 95-113 (2) Chang A.C.Y. et Cohen S.N., 1978, J. Bacteriol. 134, 1141-1156 (3) Rütter et al, 1981, Nucl. Acids Res., 9, 4087-4098 2. Enzymes Les enzymes de restriction, phosphatase (CIP), T4-polymerase et le fragment Klenow sont utilisés selon les recommandations des manufacturiers. La T4-ligase est employée à 10 u/ g/ d'ADN pour la ligation des bouts cohésifs et à 1 u/ g d'ADN pour la ligation d' extrémités aveugles. Bal 31 à la concentration de 5.10-2 uss g d'ADN enlève 600 bp par min. La RNase est à 20 g/ml finale. Les conditions de digestion parla DNase sont de 10 g DNase/ g DNA linéaire pendant 15 min. 3. Préparation d'ADN Les plasmides sont purifiés par la méthode du lysat alcalin sur 5 ml de culture (mini préparation). La technique du lysat clarifié suivie d'un gradient de CsCl est utilisée pour la purification de plasmides à partir d'un litre de culture (cf. Maniatis et al, 1982, Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory). Hormis pACYCî84 et ses dérivés, les plasmides sont amplifiés au chloramphenicol (75 Sg/nl final), qui est ajouté lorsque la culture atteint la densité optique de 0,7. 4. Transformation La technique au CaC12 est utilisée pour la transformation d'E. coli (cf. Maniatis et al, 1982). 5. Electrophorèses Pour l'analyse de 1'ADN, les électrophorèses d'agarose sont réalisées sur des appareils horizontaux, tampon tris-acetate (Tris 40 iM, acétate 20mM, EDTA 1 m M pH 8.0), ou tris-borate (Tris 90 mM, acide borique 90 mM, EDTA 2 mM, pH 8.0) en présence de bromure d'éthidium. Le standard de taille est l'ADN du phage lambda restreint par HindIII. Les gels d'acrylamide-bisacrylamide (38:2) sont réalisés dans du tampon tris-borate. Pour l'analyse des protéines, les gels SDS-PAGE sont à la concentration de 15 % en polyacrylamide. Les électrophorèses sont réalisées selon la technique classique décrite par Laemmli (1970 Nature, 227, 680-685). 6. Sequencage Les fragments d'ADN marqués en 5' à une extrémité sont séparés sur gel d'agarose ou sur gel d'acrylamide et les fragments nécessaires au séquençage sont élués. La procédure de séquençage décrite par Maxam et Gilbert (1980, Methods in Enzymology, 65, 499-560) leur est appliquée. 7. Techniques immunologiques La présence de pili K88 sur des bactéries adsorbées sur un filtre de nitrocellulose est révélée par une méthode immunologique en utilisant un antisérum polyclonal antiK88 et des immunoglobulines IgG anti-lapins couplés à la peroxydase. Le substrat est le 4-chloronaphtol. La détection de peptides antigéniques de K88, fusionnés à la bêta-galactosidase suit la méthode immunologique sur colonie décrite par Stahl et al (1984, Proc. Nath. Acad. Sci., 81, 2456-2460). Les protéines séparées sur gel SDS-PAGE sont transférées sur une membrane de nitrocellulose (appareillage Transblot de BioRad); qui est ensuite soumise à un test immunologique avec divers anticorps spécifiques (technique dite du "Western Blot"). L'ELISA sandwich est réalisé selon la technique décrite par Engvall (1980, Methods in Enzymology, vol. 70, 419-439), en utilisant des anticorps anti-K88 mono- ou polyclonaux. 8. Constructions génétiques Les techniques utilisées pour les diverses constructions génétiques sont décrites par Maniatis et al, 1982. 9. Préparation des pili Les pili sont extraits selon deux techniques l'une préparative qui emploie l'omnimixer, l'autre analytique qui fait intervenir un traitement A la chaleur. A. Méthode préparative Un litre de culture liquide de bactéries piliées est centri fugée 10 min à 10 krpm (rotor JAlO - Beckman) et le culot est repris dans 1/40 du volume initial de solution PBS urée (25 mM NaH2P04, 5 mM Na2HP04, 25 nM NaCl, 2M urea, pH 7.4). L'extraction est effectuée par une agitation 30 min dans un omnimixer Sorvall, en position 5. Le produit d'extraction est centrifugé pendant 10 min à 10 krpm (rotor JA20 - Beckman). Le surnageant constitue le rasat brut. Les pili peuvent être purifiés par une précipitation acide (acide acétique 1M, pH4.5, 1 h à température ambiante) suivie d'une chromatographie sur gel de perméation (gel de séphacryl, Pharmacia S200). Cette solution constitue le rasat purifié. b. Méthode analytique 100 ml de culture sont centrifugés et le culot est remis doucement en suspension dans 10 ml de PBS préchauffe à 600C. Les bactéries sont maintenues dans un bain à 600 C, sans agitation, pendant 20 min. puis centrifugees pendant 10 min à 10 krpm. Le surnageant constitue le rasat brut. Cette méthode d'extraction sera employée pour la première analyse et la quantification des pili produits par les différents recombinants. B. RESULTATS Les pili excrétés par les souches E. coli K88 sauvages, appartenant aux trois sérotypes ab, ac et ad, et provenant soit de Hollande (notation NL) ou des Etats-Unis (notation US) ont été extraits et sépares sur gel SDS-PAGE. ta figure la montre un tel gel coloré au bleu de Coomassie. Les sous-unités pilines forment une bande électrophorétique dont la migration est celle d'une protéine de 28 kD environ. La figure lb présente un western blot du gel de la figure la. Les anticorps polyclonaux dressés contre les pili du sérotype ac reconnaissent sans équivoque les pilines des trois sérotypes. Les protéines appliquées dans les autres puits seront décrites par la suite. 1. Clonage de K88 a. Sérotype K88ac Le plasmide pK88ac de 80 kb, transféré dans la souche d'E. coli 1476 NalR, a été purifié, puis restreint par l'endonuclease HindIII. Les fragments HindIII sont clonés dans le vecteur pBR322, restreint par HindIII et traités à la phosphatase, de manière à limiter sa recircularisation. L'insertion d'un fragment dans le site HindIII inactive la résistance à la tétracycline. Trois cents recombinants résistants à l'ampiciline et sensibles à la tetracycline (ApRTcS) ont été testés pour la présence de pili K88 par agglutination sur une plaque de verre provoquée par un antisérum K88. Neuf donnent une réaction positive, dont cinq présentent une agglutination rapide, comparable à celle provoquée par la souche sauvage, et quatre présentent une agglutination lente. Les neuf clones possèdent un plasmide contenant un fragment derestriction d'une taille de 12 kb. L'orientation de l'insert est antihorlogique pour les 5 clones nettement positifs et horlogique pour les 4 autres. La dépendance de l'expression de K88ac vis-à-vis de l'orientation peut s'expliquer par la présence du promoteur cryptique P1, situé en aval du site Hindili, connu pour déterminer une transcription dans le sens antihorlogique (S tuber et Bujard, 1981, Proc. Natl, Acad. Sci, 78, 167-171). L'expression de l'opéron K88 dépend donc d'un promoteur externe au fragment HindIII cloné. L'un des plasmides des 5 clones nettement positifs a été choisi, noté pIX102, et manipulé plus avant. La taille de l'insert a été réduite à 7kb par restriction partielle EcoR1 (plasmide pIX105). Le site EcoR1 a été remplacé par un site HindIII dans le plasmide pIX11S, de telle sorte que l'opéron K88 soit sur un fragment HindIII. Les figures l.a et l.b, piste 5, montre les protéines extraites par rasage d'une culture d'E. coli porteuse du pIX115. -La sousunité a la même migration que celle produite par la souche ac sauvage, et est clairement reconnue par les anticorps anti-ac. Une carte de restriction sommaire du pIX 115 est présentée à la figure 2, ainsi que la carte génétique de l'opéron K88ac. La position relative des différents gènes est deduite essentiellementdes données de la littérature (Dougan et al, 1983, J. Bacteriol., 153, 364-370) pour le sérotype K88ac et, par analogie avec K88ac pour le serotype K88ab (Mooi et al, 1983, J. Bacteriol., 154, 41-49). Le poids moléculaire de différentes protéines produites par l'opéron K88 est de 80, 31, 21 kD, et 26 kD pour la sous-unité. Une protéine de 25 ko pourrait être codée par le dernier gène de 1 'opéron. La production d'une protéine de 17.6 kD n'a pas été prouvée par des expériences in vivo, mais déduite des analyses de séquences. Le gène de la sous-unité K88ac est situé sur un fragment DraI, de 1 kb environ. Le fragment a été cloné dans le site HindIII du pBR322, dans les deux orientations. Le plasmide possédant le gène sous le contrôle de P1, soit l'orientation antihorlogique, est noté pIX120. D'autre part, le gène de résistance à la tétracycline a été délété après restriction par BamH1 et AvaI, suivie d'un traitement à la DNA polymérase en présence des quatres dNTP et ligation. Cette délétion maintient un site Aval dans le plasmide pLY120. b. K88ad L'ensemble des plasmides de la souche K88ad US ont été purifiés et restreints par HindIII. Les fragments ont été séparés sur gel d'agarose 0.7 Z et les fragments de 10 à 15 kb ont été électroélués et clonés dans le vecteur pBR322 restreint par Hindili et déphosphorylé à la phosphatase CIP. La production de K88ad par des clones E. coli transformés est recherchée par un test immunologique sur colonie (cf. Méthode). Les clones K88+ possèdent un insert de 12 kb dans l'orientation antihorlogique et le plasmide est noté pAD102. La production de pili K88ad par la souche E. coli (pAD102) est confirmée par un gel d'électrophorèse et Western blot d'un rasat brut d'une culture liquide (cf. figure 1, piste 9). Le fragment de 1 kb BstEII-DraI du pAD102 a été cloné dans les sites BstEII-EcoR1 Klenow du pIX120, générant ainsi le plasmide pAD120. De la meme manière que pIX120, le pAD120 contient le gène de structure de la sous-unité piline du sérotype K88ad. L'insertion antihorlogique de l'insert dans le site Hindi il place le gène sous le contrôle du promoteur fort PI. 2. Séquenage Les gènes des sous-unités K88ac (pIX120) et K88ad (pAD120) ont été séquencés sur les deux brins, par la technique de Maxam et Gilbert. Les sites de restriction marqués par la Klenow ont été les sites HinfI, DdeI et EcoR1 notamment. La séquence complète de l'insert du pIX120, tel qu'il est clone dans le site HindIII du pBR322 est donnée à la figure 3. Cette figure montre qu'il existe une phase de lecture ouverte en -63, codant pour un ATG initiateur, terminée en 710 par un codon stop TAA. Cette phase de lecture code pour la sous-unité piline. Celle-ci est synthétisée sous la forme d'un precurseur portant une séquence signal de 21 acides aminés à l'extrémité amine de la protéine. Cette séquence permet au précurseur de traverser la membrane interne de la bactérie, et serait ensuite clivée. La sous-unité est composée de 262 acides aminés formant une protéine d'un poids moléculaire (PM) déduit de 27.337, proche des 26 kD détermines expérimentalement. Les séquences N et C terminales déduites de la séquence du gène sont identiques aux séquences de la proteine du sérotype K88ab. Une séquence complémentaire au RNA 16S est présente 14 paires de bases en amont de l'ATG et devrait constituer une séquence efficace d'attachement au ribosome (RBS). Le promoteur P1 du pBR322 est souligné sur la figure 3. Aucune autre séquence qui puisse correspondre à un promoteur n'est observée en amont du RBS du fragment K88. La position de quelques sites de restriction est également donnée. Epinglons des sites de restriction uniques tels EcoRV, Pstl, EcoR1, ScaI, Nsil, Sacl, Bgll, BssHII, HindII et Aat2. La figure 4 montre la carte de restriction du pIX120. La séquence complète du gène de la sous-unité K88ad est donnée à la figure 5. Cette sous-unité est composée de 264 résidus, pour un PM déduit de 27.535. Le gène de la sous-unite K88ad US contient des sites de restriction différents de ceux observés dans le gène ac. Nous retiendrons la présence des sites AvaI, HpaI, et XhoII, l'absence des sites ScaI et Sacl et l'existence de deux sites EcoR1. La carte de restriction du pAD120 est donnée à la figure 6. 3. Complémentation intergénique a. Pour K88ac L'opéron K88ac est composé de 5 gènes, dont le gène de la sous-unité et quatre gènes dont les produits servent à l'ancrage du pilus et à sa polymérisation (cf. figure 2). Ces 5 gènes ont été repartis sur les vecteurs de clonage pACYC184 et pBR322. Ces deux vecteurs sont compatibles, portent des marqueurs de résistance différents (au chloramphenicol pour pACYC184 et à l'ampicilline pour pBR322), et sont tous deux à grand nombre de copies par cellule. De plus, ils ont le même gène de résistance à la tétracycline, donc le même promoteur P1 localisé en amont du site HindIII. La complémentation de K88ac est schématisée à la figure 7. Elle fait intervenir les 2 plasmides pIX120 et pIX211 construits de la manière suivante (1). pIX120 Le pIX120 contient le seul gène de la sous-unité K88ac sous le contrôle de P1 dans le pBR322. Le gène TcR a été délété pour éviter la recombinaison des gènes homologues TcR entre les vecteurs pBR322 et pACYC 184 dans un environnement Rec (2). pIX2îl Le pIX211 est un plasmide pACYC184 contenant l'opéron K88ac délété du gène de la sous-unité, et cloné dans le site HindIII, donc sous le contrôle du promoteur P1. Ce plasmide a été construit en plusieurs étapes. - isolement du pBR322E, qui est un pBR322 dépourvu de site EcoR1. il a été obtenu par restriction EcoR1 du pBR322, et traitement à la Klenow. - clonage de l'operon K88 dans le site HindIII du pBR322E. Ce plasmide est l'équivalent du pIX115, portant un seul site EcoRI, localisé au premier tiers du gène de la sous-unité (cf. figure 2). - linéarisation du plasmide par EcoR1, suivie d'une digestion de 600 à 1000 paires de bases par Bal 31. Les plasmides sont ligaturés après avoir été rendus "blunt ended" par la T4 DNA polymérase. L'importance de la délétion des recombinants est estimée par restriction BstEII, PstI et DraI (Cf. position de ces sites sur la figure 2.) - Quelques recombinants ont servi à transformer une souche E. coli contenant le seul gène de la sous-unité cloné dans le site Hindili du vecteur pACYC184. La fabrication de pili par les clones Cm, ApR est testée sur colonie par méthode immunologique. - Le plasmide qui a subi la plus grande délétion, tout en permet tant la complémentation a été finalement sélectionné. Cette délétion est d'environ 1000 paires de bases; elle couvre les sites BstEII, localisé 50 bp avant le codon initiateur de la sous-unité, et le site HindII, situé 110 bp avant le codon stop. La séquence RBS et le gène complet de la sous-unité sont donc délétés, sauf peut-être les derniers codons du côté 3' du gène. - La dernière étape est le clonage du fragment HindIII de ce plasmide dans le site HindIII du pACYCl84. Ce plasmide est le pIX211. Les bactéries qui contiennent à la fois le pIX120 et le pIX211 @@@@+ sont K88 Un extrait d'un rasat brut d'une culture de EC294 (pIX211) (pIX120) est présenté à la figure 1, piste 7. b. Pour K88 ad Les souches qui contiennent le pAD120 - porteur du gène de la sous-unité K88ad - et le pIX211 - porteur du système d'assemblage de K88ac-, fabriquent du pili K88ad, comme le montre la présence de piline ad dans un rasat brut d'une culture de cette souche (figure l, piste 10). Le système de complémentation mis au point pour K88ac peut donc être utilisé pour le sérotype ad. 4. Recherche des epitopes de K88 A. Données expérimentales Le principe de la recherche d'épitopes est le clonage de fragments du gène de la sous-unité dans le gène de la bêta-galactosidase. La présence d'un peptide K88 antigénique fusionné à la bêta-galactosidase est recherchée par un test immunologique sur colonie, avec I'antisérum spécifique au pilus. Cette technique a été appliquée au sérotype K88ac de la manière suivante Le segment BstEII - Dral du pIX11S, contenant le gène de la sous-unité (cf. figure 2), est hydrolysé par la DNase, de manière à isoler des fragments de 50 à 150 paires de bases. Les fragments sont remplis à la T4-polymérase en présence des 4dNTP et clonés dans le site HindII (extrémités aveugles) du pUR222. Le site Hindi est unique et fait partie d'un polylinker, situé dans le fragment Lac alpha de la bêta-galactosidase. Les plasmides sont introduits dans la souche JM103, qui possède le plasmide F' porteur de lTopéron lactose complet, mais muté dans la région lac alpha. Le phénotype lac+ apparaît par complémentation entre les gènes portés par les deux plasmides, et est mis en évidence sur milieu contenant l'IPTG - inducteur de l'opéron lactose - et le X-gal groupe chromogène. Les plasmides pUR222 qui ont inséré un fragment K88 en phase, apparaissent bleu sur milieu Xgal-IPTG. Une réaction antigenique contre les anticorps anti-K88 a été recherchée sur 1000 clones environ, présentant une coloration bleu clair à bleu foncé sur X-gal. Douze clones réagissent de manière très positive. Le séquençage des inserts clonés dans les pUR222 révèle que les peptides aa 69 à 92 (= 23 aa) t FAT ....GAS aa 83 à 122 (= 39 aa) = IAF ....KVG aa 147 à 160 (= 13 aa) 3 LLS ....IFY aa 217 à 229 (= 12 aa) = YTD ....YAL de K88ac sont antigéniques. Les segments contiennent donc des épitopes continus. Les trois premiers et les trois derniers acides aminés de ces fragments peptidiques sont donnés dans le code à une lettre. La numérotation des acides aminés est celle de la piline ac (référence est faite à la figure 3). bl. Hydrophilicité La figure 8 présente le profil dThydrophilicité/hydrophobicité de la sous-unité K88ac, d'après l'algorithme de Doolittle. (Kyte et Doolittle, 1982, Mol. Biol., 157, 105-132). Les parties hydrophiles de la molécule sont hachurées; chacune constitue une région exposée et un site antigénique potentiels. Les peptides suivants ont été retenus aa 17-29 aa 96-107 et aa 115-123 aa 162-170 aa 209-219 et aa 235-253 Ils sont particulièrement hydrophiles et de grande taille. Pour la sous-unité K88ad,. ce sont les régions suivantes qui ont été retenues aa 16 à 29 aa 87 à 106 aa 114 à 122 aa 162 à 175 aa 211 à 222 et 245 à 255. b2. Présence de résidus proline Les acides aminés prolines sont susceptibles de former des angles dans les protéines et d'exposer ainsi les régions voisines. Des prolines sont présentes aux aa 59, 72, 81, 98, 113, 164 et 254 de la piline ac. La présence de proline aux positions 98, 113, 164 et 254 qui sont situees à proximité immédiate ou dans des zones hydrophiles, est une indication supplémentaire favorable à la présence d'un épitope. La sous-unité K88ad contient 8 résidus prolines, (aa 59, 72, 81, 98, 112, 163, 210 et 256). Ceux situés aux positions 98, 112, 163, 210 et 256 peuvent être mis en relation avec des régions hydrophiles. b3 - Structure secondaire La prédiction de structure secondaire de la piline K88ac, d'après l'algorithme de Chou et Fasman, montre que les régions hydrophiles retenues sont associées à des coudes dans la protéine. 5. Comparaison des sérotypes K88 existe sous la forme de trois serotypes : K88ab, ac et ad. Cette nomenclature signifie que ces sérotypes possèdent des antigènes communs "a" et distincts "b", "c" et "d". Chaque sérotype possède en outre des "variants". Nous comparons a) les séquences et b) les profils d'hydrophilicité de toutes ces sous-unités. a) Comparaison des séquences La figure 9 donne la séquence en acides aminés des variants ab (Dyker et al, 1985, Infection and Immunity, 50, 279-283), des variants ac (Josephsen et al, 1984, FEMS Microbiol. Letters, 25, 301-306) et celui analysé dans ce travail et des variants ad (Gaastra et al, 1983, FEMS Microbiol. Letters, 18, 177-183). Les différences entre acides aminés sont seules reprises. La relation entre les sites antigéniques et les séquences des trois sérotypes et leurs variants se base sur des postulats (1) - les sites antigéniques "a", qui sont communs aux 3 sérotypes et à leurs variants sont localisés dans des séquences invariantes. La figure 9 montre que les régions délimitées par les acides aminés là 27, 38 à 48, 50 à 59, 83 à 93, 105 à 131, 190 à 207, et 237 à 264 sont constantes dans toutes les pilines. (2) - les sérotypes b, c et d doivent se situer dans des régions variables entre les 3 sérotypes mais constantes entre leurs variants. Les régions 147 à 155 (148 à 151 pour ac) et 213 à 227 (211 à 225 pour ac) sont les deux seules régions qui répondent à ces deux contraintes. En dehors de ces régions perturbées, seule la mutation ponctuelle à l'acide aminé 94 est variable entre les sérotypes b, c et d et communs à leurs variants. (3) - les séquences 94 à 105, 133 à 136, et 163 à 173 diffèrent entre les variants et les sérotypes. Ceci est particulièrement frappant pour la séquence 163-173 dont la composition ET la longueur sont différentes. D'un point de vue antigénique, ces séquences pourraient co m cider avec des antigènes variables, qui distingueraient les variants entre eux. ta séquence 163-173 (cf. Fig. 6) est particulièrement variable dans ce sens. b. Comparaison des profils d'hydrophilicité Les variations en acides aminés peuvent modifier les propriétés chimiques locales des séquences et en particulier lshydrophilicite/ hydrophobicité de la molécule. La figure 10 compare les profils des six sous-unités dont la composition est donnée à la figure 7, selon l'algorithme de Doolittle. Les indices d'hydrophilicité des séquences hydrophiles indexées au point 3b permettent de déduire que - le fragment limité par les aa 17 à 29 est commun à toutes les sous-unités et nettement hydrophile; - les fragments 96-107 et 115-123 sont également très hydrophiles dans tous les pili; - par contre, les séquences 162-175 et 211-222 ont des indices d'hydrophilicité variable. Ainsi, pour le sérotype ab, le peptide 162-175 n'est pas hydrophile, alors que le segment 211-222 est très hydrophile. Au contraire, dans le sérotype ad, c'est l'inverse qui est observé : 162-175 est hydrophile, et 211-222 l'est moins (d'après Doolittle) sinon pas (d'après Hoop & Wood). Le sérotype ac présente une position intermédiaire. C. Conclusions des points 3 et 4 Le tableau 2 reprend la position des peptides antigéniques, hydrophiles, invariables, et variables de la sous-unité K88ac, avec, pour le dernier point, la distinction entre la variabilité Tableau 2 Séquences Séquences Séquences Séquences variables Séquences antigéniques hydrophiles invariables entre entre antigéniques + variables sérotypes variants (ac) (ac) (ac) (ac) 17-29 1-27 39-48 38-48 55-58 50-59 69-92 83-93 96-107 94-107 ?? 83-122 155-123 105-133 94-105 134-136 147-160 148-151 # 162-170 162-170 147-170 185-201 188-205 209-219 206-211 217-229 211-225 # 206-229 235-253 226-262 Tableau : Position des séquences antigéniques, hydrophiles, invariables et variables et variables dans la sous-unité de K88ac et en fin des séquences à la fois antigéniques, hydrophiles et variables. entre sérotypes et entre variants. La dernière colonne est la sélection des peptides à la fois antigéniques et variables, qui sont au nombre de trois. 1. peptide 94 à 107. Cette séquence reste douteuse du point de vue antigénique. En effet, les peptides antigéniques 69-92 et 83-122 pourraient contenir un épitope variable (94-105), ou commun, appartenant au sérotype a, (105-133 ou 84-90 peu hydrophile). 2. peptide 147-170 Le peptide 147-160 est antigenique. Il correspond à une séquence variable entre sérotype et pourrait donc correspondre au sérotype C. D'autre part, la séquence voisine 162-170 est extrêmement variable, en composition, longueur et hydrophilicité. 3. peptide 206-229 La séquence 206-225 diffère entre sérotypes et variants et son hydrophilicité est variable. Elle contient un épitope continu entre les acides aminés 217-229. Ces fragments contenant des séquences antigéniques propres au pilus, sont susceptibles de modifications plus ou moins importantes qui changent le caractère antigénique-de la molécule sans en altérer les propriétés d'excrétion et de polymérisation. 6. Choix d'un épitope L'épitope choisi pour cet exemple est un épitope du virus de l'Influenza. Il fait partie d'une région antigénique du virus, à la jonction entre l'hémagglutinine HA1 et HA2. La séquence peptidique 5 10 N'-P E K Q T R G I F G A est immunogène lorsqu'elle est injectée à un animal sous forme d'un peptide synthétique (Brevet PCT/US83/01291, Scripps Clinic and Research Foundation). Cette séquence existe dans la souche ViC3 75 L'ADN codant pour cet épitope est obtenu par synthèse chimique. Le choix des codons tient compte de l'usage préférentiel des codons par E. coli. La séquence est présentée à la figure 11. 7. Clonage de 1'ADN et expression du pili recombinant La possibilité de modifier le gène de la sous-unité dépend de la présence de sites de restriction. Les 2 régions définies ci-avant : de aa 147 à 170 (ac) ou 146 à 173 (ad) est notée ci-après S1 et 206 à 229 (ac) équivalent à 208 à 231 dans les sérotypes ab et ad est notée S2. En se reportant aux séquences nucléotidiques des sous-unités ac (fig. 3) et ad (fig. 5), il apparaît que la région S1 est clivée par l'enzyme SacI dans le sérotype ac et EcoR1 dans le type ad.SacI clive dans la région antigénique 147-160, et EcoR1 restreint dans le segment très variable 163-173 de ad. Deux sites intéressants, BglI et BssHII, clivent non loin de S1, aux aa 175 et 178 pour ac et 177 et 180 pour ad. La région S2 est accessible dans le gène K88ad grâce aux sites de restriction HindII/Hpa I (aa 207/208) et XhoII (222 et 223). HindII est situé au début de la séquence variable; XhoII clive une séquence antigénique. Les manipulations suivantes sont réalisées pour S1 et S2 successivement. a. Manipulation de S1 Les modifications de la région S1 sont données à la figure 11. La production de pili par les souches recombinantes est tout d'abord testée par un test immunologique sur colonie. La figure 12 montre la réaction immunologique obtenue pour les différentes constructions décrites ci-dessous. 1. Utilisation d'un polylinker Clonage Dans le but de tester la versatilité de la région S1, le fragment SacI-BssHII du gène de la piline K88ac porté par le piu120 a été remplacé par le linker synthétique du M13tgl30, cloné dans un vecteur pUC. La construction du pIX126 est réalisée en deux étapes le clonage de la partie 5' du gène de la sous-unité en amont du site SacI du pUC 130 tout d'abord est le résultat de la ligation des fragments PvuI-SacI du pUCtg 130, et Saci -Pvu I du pIX126. Le plasmide est ensuite restreint par BamH1, rendu blunt ended par la polymérase-fragment Klenow, puis restreint par PvuI.La partie C terminal du gène de la sous-unité est isolée sur le fragment BssHII/ Klenow/PvuI du pIX120. Le gène de la sous-unité est reconstitué par la ligation des fragments PvuI BamH1 et BssHII - PvuI pour générer le pIXl26. La séquence de ce plasmide a été vérifiée. La séquence du linker est donnée à la figure 11, qui montre le fragment SacI-BamHl introduit en lieu et place de S1, et sa traduction en acides aminés dans la sous-unité. Notons que la taille de la sous-unité est réduite de 262 aa à 255 acides aminés. Expression Le pIX126 est ensuite introduit, par transformation dans une souche contenant le système de complémentation (pIX211) et la présence de pili est recherchée par - agglutination : une faible agglutination est observée - test immunologique sur bactérie : l'anticorps polyclonal réagit positivement avec les bactéries, mais de manière moins intense que. sur la souche témoin. Par contre, des anticorps monoclonaux spécifiques K88ac ne reconnaissent pas les pili recombinants. Ces anticorps sont spécifiques au sérotype commun "a" parce qu'ils reconnaissent à la fois K88ab, ac et ad, et en particulier la protéine native, non dénaturée. L'absence de réaction avec les pilines produites par pIX126 laissait présager des modif i- cations de structure des pili. - purification de pili et gel d'acrylamide. La présence de pili a été recherchée par rasage d'une culture liquide de la bactérie contenant pIX126 et pIX211, dans les mêmes conditions que la bac térie témoin porteuse de pIX120 et pIX211. Les préparations sont analysées sur gel d'acrylamide. Aucune sous-unité piline n'appa ratt dans la préparation de la bactérie recombinante. - un ELISA sandwich détecte de l'ordre de O,l sg de pili par ml de rasat brut d'une culture de pIX126. Les conclusions de cette première modification pourraient être que le pilus modifié est bien excrété de la bactérie mais n'est pas assemblé en de longs filaments. 2. Clonage de l'épitope dans le polylinker L'addition de ltépitope de l'Influenza décrit au point 5 dans le polylinker augmente la taille de la sous-unité de 10 acides aminés. Clonage L'ADN synthétique codant pour l'épitope de l'Influenza possède des extrémités cohésives KpnI - XbaI. I1 a été tout d'abord cloné, en phase, dans le polylinker du pUC18; ce plasmide induit la production d'une bêta-galactosidase hybride contenant l'épitope viral. L'ADN synthétique est également cloné dans le pIX126 pour générer le pIX130. Expression Le pIX130 introduit dans la souche de complémentation induit la fabrication et l'excrétion de sous-unités reconnues par les polyclonaux, mais non par les monoclonaux anti K88. Aucune structure identifiable aux pili nTest cependant extraite d'une culture liquide de cette bactérie, comme le montre les résultats d'Elisa (cf. Tableau 3). Clonage Le site SacI a les mêmes phases de lecture dans pUC18 et le pIX126 (AGC code pour une serine). Dans le pIX126, la séquence SacI-EcoRV-Sphl-KpI a été remplacée par la séquence SacI-KpnI du PUC18. Le plasmide qui en résulte, noté pIX131, contient l'épitope de l'influenza et code pour une sous-unité de 260 résidus. Expression Le pIX131 introduit dans la souche de complémentation est reconnu par les anticorps polyclonaux anti K88 de la même manière que le pilus produit par la souche contenant le pIX126. Cette sous-unité semble être excrétée mais mal sinon pas assemblée. Une très faible quantité de pili (de l'ordre de 10 ng par ml) est détectée dans les rasats bruts (cf. Tableau 3). 3 - Utilisation d'un adaptateur synthétique La comparaison des séquences en acides aminés des diverses pilines, présentée à la figure 7, montre que, schématiquement, la région S1 est constituée de 3 séquences : six aa constants (I, F, Y, G, G, L), 8 aa variables (11 dans les sérotypes ad et ab), puis une large région invariable, qui couvre le site BssHII. Ces deux régions invariables pourraient jouer un rôle dans la production du pili et leur absence expliquerait la perte de production de pili par les recombinants pIX126 et ses dérivés pIX130 et 131. Nous avons dès lors réintroduit ces deux régions constantes dans la séquence S1 de la manière Suivante cLo=n==age Un adaptateur dont les extrémités sont cohésives avec les sites SacI et BssHII et codant pour les acides aminés invariables de la région S1 a été synthétisé. La région variable est remplacée par les sites KpnI et XbaI, qui permettront le clonage futur de l'épitope. La séquence de cet adaptateur noté Ep34 apparaît à la fig. 11. Cet ADN a été cloné dans les sites SacI-BssHII du pIX120 suivant la technique classique : restriction SacI-8ssH2 du pIX120, et ligation en présence d'un excès d'adaptateur. Ce plasmide est le pIX128. Expression La sous-unité synthétisée par le pIX128 est constituée de 258 acides aminés. Les tests immunologiques sur colonies des bactéries d'expression contenant le pIX128 sont clairement positifs, que les pili soient recherchés grâce à des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. La concentration en pili recombinants dans un rasat brut est de 3 à 6 g/ml, (Elisa sandwich dans lequel les anticorps adsorbés sont des polyclonaux, cf. tableau 3), comparés aux 16-20 g de pili sauvages/ml. Les pili sont donc toujours assemblés, mais sont en moindre quantité, de l'ordre de 5 fois moins que des pili non recombinant s. La sous-unité recombinante du pIX128 a été mise en évidence sur un gel PAGE et sur un immunoblot. 4. Addition de l'épitope dans l'adaptateur synthétique Le DNA synthétique qui code pour un épitope de l'Influenza possède des extrémités compatibles avec les séquences Kpnl et XbaI de l'adaptateur cloné dans le pIX128. L'étape suivante comporte donc le clonage de cet épitope en phase dans lep1Xl28, générant le pIX136. Clonage Le pIX128 est restreint par les endonucléases de restriction KpnI et XbaI et mis en présence d'un excès du DNA synthétique codant pour l'antigène viral. Après ligation, les plasmides sont introduits dans EC294 par transformation. Expression Le plasmide pIX136 induit dans la souche EC294 (pIX211) la production de pili reconnus par des anticorps anti-K88 poly- et monoclonaux (cf. figure 12). L'Elisa révèle la présence de pili dans les rasats bruts. La concentration en antigène est cependant assez faible, de l'ordre de 1-3 g/ml. En appliquant 1 g de pili sur un gel PAGE et sur immunoblot, on met en évidence une sous-unité d'un poids moléculaire légèrement supérieur à celui de la sous-unité native. 5. Réduction de la taille de la piline recombinante La sous-unité produite par le pIX136 a une taille équivalente à 268 acides aminés (aa), soit 6 acides aminés de plus que la sousunité naturelle ac. Nous avons délété le fragment d'ADN situé entre les sites SacI-KpnI du pIX136 (cf. figure 11.b). Ce DNA code pour 6 acides aminés invariables, situés du côté N-terminal de l'épitope du virus. il est intéressant de noter que, ce faisant, l1épitope clone est rapproché du site SacI qui est compris dans une séquence traduite antigénique : la séquence peptidique LLSIFY appartient à un antigène du pilus. Clonage Le gène pilus du pIX139 possède la partie 5' du pIX131, jusqu'au site Xba - y compris donc l'épitope de l'Influenza -, et la partie 3', à partir du site XbaI du pIX128. Les 6 premiers acides aminés (aa) constants de la région S1 ont donc été délétés. expression La bactérie qui contient à la fois le système de complémen- tation et le pIX139 est reconnue par les anticorps anti-pili K88 polyclonaux mais non par les monoclonaux. L'Elisa d'un rasat brut de cette souche détecte très'peu d'antigènes, environ 10 à 20 ng/ml, ce qui est à la limite de détection de cette méthode' dans nos conditions. Aucun antigène n'est décelé lorsque des monoclonaux sont utilisés pour l'Elisa (cf. Tableau 3). L'immunoblot d'un large extrait du rasat brut laisse apparaître une bande peu intense dont la migration correspond à celle d'une sous-unité de pilus. 6. Conclusions pour S1 Les conclusions suivantes ressortent des différentes manipulations de Sl. - La région variable de 8 acides aminés de Sl peut être délétée de la sous-unité sans supprimer sa propriété d'excrétion et d'assem blage. - Elle peut être remplacée par une autre séquence, totalement inédite et plus longue de 6 acides aminés. - Les deux séquences constantes situées de part et d'autre de la région variable sont essentielles à la fabrication du pilus - ta quantité de pili que l'on peut extraire des deux souches recombinantes est faible; en prenant comme référence la quantité de pili purifiés d'une souche sauvage, elle chute à 20 Z pour la souche contenant le pIX128 et à 6 Z pour celle porteuse du pIX136. D'une manière ou d'une autre donc ces modifications altèrent la production des pili. b. Manipulation de la région S2 Rappelons que la région S2 définie au point 4 se situe entre les acides aminés 208 et 231 de la piline K88ad. Ce qui suit decrit les diverses manipulations de cette région. 1. S2 est interchangeable entre sérotypes La région S2 a une composition et une hydrophilicité differentes entre les sérotypes ac et ad. Une première manipulation a consisté à remplacer la région S2 de ad par celle de ac et, inversément, de cloner S2 de ad dans le gène de la piline ac. Clonage Les plasmides pIX120 et pAD120 (cf. figures 4 et 6 respectivement) sont clivés par BglI. Chaque plasmide contient deux sites Bgll l'un est situé dans le gène de résistance à l'ampicilline, l'autre dans le gène de la piline, 100 nucléotides en amont de la région S2. Le fragment du pIX120 porteur du début du gène de la piline ac est ligaturé au fragment du pAD120 porteur de l'extrémité 3' du gène de la piline ad. Cette ligation reconstitue un gène de résistance à l'ampicilline, et une sous-unité piline hybride ac-ad.Ce plasmide est le pIX134. De la même manière, les deux autres fragments sont ligaturés pour reconstituer cette fois une piline ad-ac, ce second plasmide est le pIX135. Ces plasmides sont aisément distingués des molécules parentales pIX120 et pAD120 par restriction EcoRl notamment. Expression Introduits dans la souche EC294 (pIX211), ces deux plasmides induisent l'excrétion de pili que l'on peut extraire. A noter que la piline codée par le pIX134 (ac-ad) a la migration électrophorétique de la piline ac, alors que la sous-unité déterminée par le plasmide plu135 (ad-ac) migre plus lentement sur gel PAGE-SDS, comme la sous-unité du type ad. 2. Remplacement de la S2 par un adaptateur synthétique Le remplacement de la région S2 par un adaptateur synthétique permet d'introduire des sites de restriction multiple dans la région S2, et de tester sa versatilité. Comme souligné auparavant, la région du gène de la piline ad contenant S2 est accessible aux manipulations génétiques via les sites HindII et XhoII. Pas directement cependant car il existe 9 sites de restriction XhoII dans le pAD120. Le remplacement du fragment HindII-XhoII du gène piline par un DNA synthétique ne pouvait donc être réalisé dans le pAD120. Comme XhoII possède des extrémités cohésives avec BamHl, une stratégie de clonage a été adoptée dans laquelle le site multiple XhoII est remplacé par un site unique BamHl. Le clonage fait intervenir quatre intermédiaires, dérivés du vecteur pUC8. Ces intermédiaires sont présentés à la figure 13. Clonage - Dans le but d'utiliser le site-HindII du gène de structure de la piline, le site HindII du linker du pUC8 a été préalablement délété, générant le pUC81. Cette délétion est réalisée par restriction du pUC8 par les enzymes HindII et HindIII, traitement à la polymérase - fragment klenow - de E. coli et ligation. Cette délétion maintient le caractère Lac+ (fig. 13.a et 13.b). - pUC 82 est le second intermédiaire construit par le clonage en phase du fragment EcoRl-XhoII du gène ad dans les sites EcoRl-BamHl du pUC81. Cette insertion entraîne la perte du site SmaI du linker pUC81, et maintient le caractère Lac+. Le site multiple XhoII (GGATCT) est maintenant remplacé par un site unique BamH1 tGGATCC) (Fig. 13c). - L'adaptateur synthétique EP56, dont la séquence est donnée à la figure 14, est cloné en phase dans les sites HindlI-BamHl du pUC82. Ce pUC83 contient donc un fragment du gène piline ad, avec une nouvelle region S2 (Fig. 13d). I1 faut maintenant reconstituer le gène complet, ce qui est réalisé dans les deux dernières étapes. - Clonage du fragment XhoII-XhoII du pAD120, fragment porteur de l'extrémité 3' du gène piline1 en phase dans le site BamH1 du pUC83 (Fig. 13e). Ce clonage confère le caractère Lac à la souche JM103. Les deux insertions possibles du fragment sont distinguées par restriction AatII. - Enfin le remplacement du fragment BssHII-AatII du pAD120 par son homologue du pUC84 permet de reconstituer un gène piline complet, recombinant. Ce plasmide est le pAD121. Sa carte de restriction apparaît à la figure 13f. Pression La souche d'expression EC294 (pIX211)(pAD121) donne une réponse immunologique intense (cf. fig. 12) et synthétise des pili que l'on peut extraire par les techniques classiques. La figure 15 montre une photographie d'un gel PAGE-SDS d'un rasat brut des cultures productrices de pili sauvages et recombinants. La piline recombinante codée par le pAD121 a une mobilité électrophorétique un peu plus grande que la piline ad sauvage. Ceci est attendu puisque la modification de S2 reduit la taille de la sous-unite de 264 acides aminés à 258 résidus. Analysée par Western Blot, cette sous-unité est parfaitement reconnue par les anticorps polyclonaux anti-K88, comme le montre la figure 15.b. La concentration en antigène d'un rasat brut de la souche EC294 (pIX211)(pAD120) est d'environ 25 g/ml, soit identique à celle d'un rasat d'une souche ad non recombinante. Contrairement à ce que nous avons observe pour S1 (cf. 11 équivalent du pAD121, le pIX128) la délétion de la région variable ne diminue pas la quantité de pili variables. 3 - Introduction d'un antigène dans S2 La région S2 du gène piline recombinant offre de nombreuses possibilités de clonage d'un fragment de DNA hétérologue grâce à la présence des sites de restriction unique Kpnl, HindIII et XbaI. Dans cet exemple, le DNA synthétique codant pour un épitope de l'Influenza a été cloné dans les sites KpnI et XbaI. Clonage Le vecteur pAD121, restreint par kpnI et XbaI est ligaturé en présence d'un excès du DNA synthétique Epl2. La séquence de cet ADN est donnée à la figure 14. Le plasmide recombinant est le pAD122. Expression Comme le prouve l'immunoessai sur colonie (fig. 12), la souche EC294 (pIX211) (pAD122) réagit aux anticorps anti-K88ac. Cette souche excrète des pili recombinants que lton peut extraire, comme le montrent les gels PAGE et immunoblot des figures 15a et b. Nous avons pu estimer la quantité de pili présente dans un rasat brut à 7)tg/ml, soit environ 3,5 fois moins que dans les rasats des pAD120 et 121 (cf. Tableau 3). 4. Conclusions pour S2 La région S2 apparaît très versatile, et ceci à la fois pour sa longueur globale et pour sa composition. En effet, Les résultats montrent qu'unie délétion de 6 résidus (pAD121) ou une insertion finale de 2 acides aminés (aa) (pAD122) maintiennent l'assemblage du pili. On peut remarquer que la région S2 du pAD121 contient des acides aminés (aa) identiques ou chimiquement proche de ceux présents dans le pAD120 (cf. fig. 14). C'est le cas pour la proline (P), phenylalanine (F), valine (V), sérine (S) et l'acide glutamique (E) qui sont identiques, ou l'acide aspartique (D), remplacé par l'acide glutamique (E).L'insertion de l'épitope viral dans le pAD122 change par contre complètement la composition de S2 et le maintien de la synthèse de pili prouve la grande variabilité de cette séquence. I1 faut cependant pondérer ce résultat en rappelant que la quantité de pili purifiables est diminuée d'un facteur 3. 8. Antigenicite des épitopes clonés L'épitope de l'Influenza a été fusionné à la sous-unité K88 dans deux localisations différentes. La figure 16 présente un test immunologique sur filtre sur lequel on a appliqué une goutte d'une suspens ion virale (rangée 1) et sur lequel ont poussé diverses bacteries piliées. Les témoins de cette expérience sont des souches d'expression contenant le pIX120 (rangée 2), pAD120 (rangée 5) et le pAD121 (rangée 6). Les souches productrices de pili recombinants porteurs de l'épitope viral en S1 sont le pIX136 (rangée 3), et le pIX139 (rangée 4) tandis que la souche contenant l'antigène viral cloné en S2 est dans la rangée 7. L'anticorps utilisé ici est un anticorps polyclonal anti-hemagglutinine couplé à la peroxydase. Seule la souche porteuse du pIX139 est reconnue par les anticorps antivirus. Cet épitope, fusionné en S1 pourrait donc hêtre antigénique. Nom du Concentration en % plasmide antigène.K88 ( g/ml) pIX116 16 100 pIX126 0,1 0,6 pIX130 0,01 pIX131 0,01 pIX128 3 18 pIX136 1 6 pIX139 0,01 pAD120 25 100 pAD121 25 100 pAD122 6 28 Tableau 3 : Concentration en antigène K88 dans différents rasats bruts (purification à la chaleur) déterminée par Elisa Sandwich. L'anticorps adsorbé est un polyclonal anti-K88ac. ta concentration en protéine est de 50-60 g/ml, déterminée par Coomassie. Ces valeurs sont la moyenne de trois mesures. Les références sont des pili purifiés des sérotypes ac pour la série pIX et du sérotype ad pour la série des pAD, amené à la concentration de 1 g/ml. Legende des figures figure 1 Analyse des sous-unités pilines produites par diverses souches E. coli, en gel de polyacrylamide -SDS et en Western blot. figure la Piste R : références de PM : phosphorylase b-94KD, albumine 67KD, ovalbumine 43KD, anhydrase carbonique 30kD, inhibiteur de la trypsine 20 kD, alpha-lactalbumine 14.4.kD 1. rasat purifié de K88ac 2. rasat brut de K88ab NL 3. rasat brut de K88ab US 4. rasat brut de K88ac 5. rasat brut de EC294 (pIX11S) 6. rasat brut de EC294 (pIX120)(pIX211) 7. rasat brut de K88ad NL 8. rasat brut de K88ad US 9. rasat brut de EC294 (pAD102) 10. rasat brut de EC294 (pAD120)(pIX211) figure lb Western blot du gel de la figure la. figure 2 Carte de restriction de l'opéron K88ac cloné dans le plasmide pBR322. La position des sites de restriction pour quelques enzymes courants est donnée, ainsi que la carte génétique de l'opéron. La taille des 6 protéines est donnée en kD. La protéine de 17.6 kD est putative. figure 3 Séquence du gène de la sous-unité K88ac et sa traduction en peptide, ainsi que la position de quelques sites de restriction remarquables. RBS : ribosome binding site. figure 4 Carte de restriction du pIX120. La position du gène de la sousunité K88ac (K88), du gène de résistance à l'ampicilline (AP) et de ltorigine de réplication du pBR322 (Ori) est donnée. figure 5 Séquence du gène de la sous-unite K88ad US. figure 6 Carte de restriction du pAD120 avec le gène de la sous-unité (K88), de résistance à l'ampicilline (AP) et ltorigine de réplication du plasmide (Ori). figure 7 Schéma de la complémentation intergénique pour K88ac : les gènes de lTopéron K88 (2), porté par le pIX115, ont été sous clonés sur deux vecteurs : pIX211, dérivé du pACYC184, porte les gènes des protéines d'ancrage et d'assemblage des pili et pIX120, dérivé du pBR322, contenant le seul gène de la sous unité (1). P1 est un promoteur cryptique du vecteur. figure 8 Profil d'hydrophilicité de la piline K88ac, d'après l'algorithme de Doolittle. Les zones particulièrement hydrophiles sont hachurées. figure 9 Comparaison des séquences protéiques des trois sérotypes K88 et de leurs variantes. figure 10 Comparaison des spectres d'hydrophilicité des différents sérotypes et de leurs variants suivant l'algorithme de Doolittle. figure 11 Manipulations de la région S1. Les plasmides pIX126 (2), pIX130 (3), pIX131 (4), pIX128 (5), pIX136 (6) et pIX139 (7) sont dérivés du gène K88ac du pIX120 (1) figure 12 Test immunologique sur colonies des souches recombinantes. rangée 1 - EC294 (plX211)(pIX120) souche productrice de pili K88ac, utilisée comme témoin positif. rangée 2 - EC294 (pIX120)(pACYC184) et EC294 (pUR222)(pIX211) deux témoins négatifs. rangée 3 - EC294 (pIX211)(pIX126) rangée 4 - EC294 (pIX2ll)(pIX130) rangée 5 - EC294 (pIX2ll)(pIX131) rangée 6 - EC294 (pIX211)(pIX128) rangée 7 - EC294 (pIX211)(pIX136) rangée 8 - EC294 (pAD120)(pACYC184) témoin négatif rangée 9 - EC294 (pIX2ll)(pAD120) rangée 10 - EC294 (pIX211)(pAD121) rangée Il - EC294 (pIX211)(pAD122) L'anticorps est un polyclonal anti K88ac. Cet anticorps est reconnu par un anti-lapin couplé à la peroxydase. figure 13 - Etapes de clonage permettant le remplacement de la région S2 par un adaptateur synthétique. Les cartes de restriction des différents intermédiaires qui ont permis la construction du pAD121 sont présentées aux figures (13a), pU8, (13b) pUC81, (13c) pUC82(13d) pUC83, (13e) pUC84 et enfin (13 f) pAD121. figure 14 - Manipulation de la région S2 : les plasmides pAD121 (2), et pAD122 (3) sont dérivés du plasmide pAD120 (1). figure 15a - gel de PAGE-SDS d'un rasat brut des souches 1 - EC294 (pAD120)(pIX211) 2 - EC294 (pAD12l)(pIX211) 3 - EC294 (pAD122)(pIX211) figure 15b Western blot des rasats bruts séparés sur le gel de la figure 15a. figure 16 Test immunologique sur filtre de rangée 1 : virus Influenza rangée 2 : EC294 (pIX2ll)(pIX120) rangée 3 : EC294 (pIX211)(pIX136) rangée 4 : EC294 (pIX211)(pIX139) rangée 5 : EC294 (pIX2ll)(pAD120) rangée 6 : EC294 (pIX2ll)(pAD121) rangée 7 : EC294 (pIX211)(pAD122) REVENDICATIONS 1 - Microorganismes ayant une membrane externe qui porte des pili dont la composition est modifiée par un changement de la séquence protéique de la sous-unité ou piline. 2 - Pili isolés de microorganismes dont la composition est modifiée par un changement de la séquence protéique de la sousunité ou piline. 3 - Utilisation de protéines obtenues par modification de la séquence proteique de la sous-unité ou piline de pili en tant que produits pour la santé animale. 4 - Utilisation de protéines obtenues par modification de la séquence protéique de la sous-unité ou piline de pili en tant que produits pour la santé humaine. 5 - Procédé pour obtenir des pili dont la composition a été modifiée par un changement de la séquence protéique de la sous-unité ou piline caractérisé en ce que ce changement résulte de l'introduction dans le gène codant pour la sous-unité d'un pilus, d'un fragment d'ADN codant pour un peptide ou une protéine hétérologue. 6 - Procédé selon la revendication 5 caractérise en ce que le fragment d'ADN codant pour un peptide ou une protéine hétérologue est un fragment d'ADN synthétique. 7 - Procédé selon les revendications 5 et 6 caractérisé en ce que l'ADN codant est inséré dans une zone du gène codant pour la sous-unité d'un pilus qui correspond à une zone exposée au milieu environnant de la séquence protéinique des pilines formant le pilus. 8 - Vaccins obtenus avec des microorganismes, des pili ou des pilines dont la composition est modifiée par un changement de la séquence protéique au niveau des pilines.