FR 2600077 A1 19871218 FR 8608595 A 19860613 Procédé de production de l'enzyme ligninolytique par culture du champignon Phanerochaete chrysosporium La présente invention concerne l'obtention de l'enzyme ligninolytique, qui convient pour la délignification par voie biologique des sous-produits lignocellulosiques agricoles et forestiers. Par "enzyme ligninolytique", on désigne dans la presente description l'enzyme appelée "ligninase" par TIEN et KIRK (Proc. Nath. Acad. Sci., 81, 2290, 1984) ou "lignine-peroxydase" par d'autres auteurs. La présence de lignine incrustant les polyosides de la paroi végétale est le principal facteur limitant l'hydrolyse enzymatique en sucres simples de ces polymères. Certains traitements physiques ou chimiques modifiant l'organisation des polymeres de la paroi végétale permettent une amélioration des rendements- d?hydrolyse enzyma- tique, cependant leur coût reste élevé. L'utilisation de microorganismes ou d'enzymes dégradant la lignine est actuellement étudiée dans plusieurs laboratoires en vue de la délignification des sous-produits lignocellulosiques agricoles ou forestiers préalablement a l'hydrolyse enzymatique de la cellulose et des hémicelluloses. Les microorganismes capables de dégrader la lignine et susceptibles d'être utilisés pour la délignification de sous-produits agricoles lignocellulosiques sont des champignons basidiomycetes. Les enzymes responsables de la dépolymérisation de la lignine chez ces champignons sont encore mai connues. En 1983, une ligninase a été découverte par des chercheurs américains chez le champignon Phanerochaete chrysosporium. Cette enzyme catalyse plusieurs réactions d'attaque oxydative de modèles moléculaires de type lignine ou de lignine macromoléculaire d'Epicéa ou de Bouleau. A cet effet, on peut se référer à l'article de TIEN et KIRK dans Science, 221, p. 661-663 (1983). La possibilité- d'utiliser les enzymes ligninolytiques produites par cette souche implique de pouvoir les produire a grande échelle. Actuellement, les rendements de production de ces enzymes sont très faibles (quelques mg/l). Une des raisons de ces faibles rendements réside dans les particularités de la régulation du système ligninolytique chez le champignon Phanerochaete chrysosporium. Il a été montré, en effet ce le système ligninolytique de ce champignon n'est as produit pendant la phase primaire de croissance, mais après l'arrêt de la croissance, lors que le champignon est en carence nutritionnelle. Afin d'augmenter la production d'enzyme ligninoly tique, on a déjà proposé d'ajouter au milieu de culture du champignon un détergent, par exemple du "Tween 80" (polyoxyethylène monooléate de sorbitan) du "Tween 20" ou du 3-/(3-colamidopropyl) diméthylammonio 7 1-propanesulfonate ou "CHAPES. Une telle addition de détergent aux cultures submergées et agitées permet de favoriser le développe ment d'une activité ligninase comparable a celle qui est couramment obtenue en culture stationnaire. (JAGER et al. Applied and Environmental Microbiology Nov. 85, p. 1274 1278). D'autres travaux ont permis l'isolement de souches de Phanerochaete chrssosporium altérées dans la régulation du système ligninolytique par comparaison aux souches pré cédemment décrites, a savoir les souches ME-446 (ATCC 34541) et BKM-F-1767 (ATCC 24 725). Ces nouvelles souches sont les souches déposées a la Collection Nationale de Culture deMicroorganismes (C.N.C.M.) sous les numéros I-398 et I-399 et décrites dans la demande de brevet français 84 19 028 au nom de la demanderesse. Ces souches produisent une activité ligninase considérablement plus éle vée que la souche de référence BKM-F-1767 chez laquelle l'enzyme a été découverte.Par ailleurs, l'enzyme est pro duite dans des conditions où ni l'azote ni le carbone ne sont limitants contraitement a la souche NE-446pour laquelle la lignase n'est produite que lorsque le champignon se trouve en carence nutritionnelle. Bien que l'enzyme soit produite avec ces nouvelles souches dans des conditions non limitantes en azote et en carbone, les rendements obtenus sont assez faibles aussi bien sur milieu de culture de base que sur milieu de milieu additionné de détergent. On a maintenant trouvé de fa,on surprenante que lton pouvait obtenir l'enzyme lig-inolytique avec des rendements élevés en cultivant le champignon Phanerochaete chrysosporium sur un milieu de culture de base supplémenté avec un agent stimulant choisi parmi les acides gras insaturés, les acides aminés naturels et leurs mélanges. Par milieu de culture de base on désigne dans la présente description les milieux de culture contenant une source d'azote, de carbone, et de sels minéraux assimilables. Ces milieux peuvent être carencés ou non en source d'azote ou de carbone selon la nature de la souche utilisée. Comme source de carbone assimilable, on utilise par exemple le glucose, le mannose, l'amidon, le melibiose, le mannitol, le xylose, le maltose, l'adonitol, l'arabitol, le fructose, le sorbitol, le raffinose, le xylitol, le D(+)trehalose ou le glycérol. La source d'azote assimilable peut être par exemple l'asparagine, le nitrate d'ammonium ou le tartrate d'ammonium. Quant aux sels minéraux ceux-ci peuvent être par exemple le citrate de fer, KH2P04,ZnS04, Mins04, CaCl2, CuSO4, NaCl, FeS04, CoCO4, ZnS04, AlK(S04)2, H3B03, Na2MoO4, MgS04 Le glycérol constitue la source de carbone préférée selon l'invention. L'agent stimulant mis en oeuvre selon 1' invention est soit un acide gras insaturé soit un acide aminé. On a en effet trouvé que l'addition d'un tel agent stimulant au milieu de culture de base permet d'accroître considé rablement la production en enzyme ligninolytique. Des exemples d'acides gras insaturés qui conviennent aux fins de l'invention sont l'acide oléique, l'acide linoléique, l'acide palmitoléique, l'acide arachidonique. Parmi les acides aminés naturels, la sérine, la thréonine, l'isoleucine, la glycine, la valine et la tyrosine conviennent aux fins de l'invention. Les acides aminés particulièrement préférés sont l'isoleucine, la sérine, la thréonine, là glycine. Il est avantageux d'Emulsifier les acides gras insaturés pour permettre leur meilleure répartition au sein du milieu de culture. La quantité d'agent stimulant à mettre en oeuvre varie en fonction de la nature de celui-ci et doit être de préférence au voisinage de la concentration produisant le maximum d'enzyme. La détermination de cette concentration maximale peut être aisément effectuée par le test qui consiste à suivre la production d'enzyme ligninolytique dans le milieu extracellulaire de culture de Phanerochaete chrysosporium en fonction du temps et à différentes con centrations de l'agent stimulant. Par ce test, on a déterminé que la concentration maximale était d'environ 400 mg/l pour l'acide oléique émulsifié, d'environ 800 mg/l pour l'acide oléique seul et d'environ 6,5 mg/l pour l'isoleucine. Les conditions de culture sont les mêmes que celles décrites dans le brevet FR 84 19 028. On prépare d'abord un inoculum végétatif en ense mençant une petite quantité du milieu de culture avec une suspension conidiale du champignon. On cultive alors ce champignon sous conditions d' aérobiose ou de préférence sous conditions d'oxygène, à une température comprise entre 280C et 400C de préférence à 37 C et sur différents milieux nutritifs contenant une source d'azote, une source de carbone et des sels minéraux. Les cultures peuvent être agitées ou statiques. Avant l'inoculation par le microorganisme, il est souhaitable d'ajuster le pH du milieu de culture à 4,5-5. On utilise, à cet effet un tampon diméthyl-2,2' succinate de sodium ajusté avec un hydroxyde de métal alcalin par exemple l'hydroxyde de potassium. En général, une production significative d'enzyme ligninolytique au sein du surnageant a lieu du 3ème au 8ème jour avec un maximum au 3ème ou 7ème jour. L'enzyme ligninolytique contenue dans les surnageants des cultures des microorganismes de l'invention peut être isolée notamment par centrifugation, dialyse et chromatographie par exemple sur colonne de gel d'aragose. L'enzyme ainsi obtenue peut être alors conservée après lyophilisation. L'invention va être maintenant décrite en détail par les exemples non limitatifs ci-après EXEMPLE 1 Preparation de l'enzyme ligninolytique ,Dar culture de Phanerochaete chrysosporium sur milleu supplémenté en acide oléigue a) Surnageant de culture contenant ltenzyme ligninolytique On a maintenu P. chrysosporium C.N.C.M. 1-398 à 40C sur des plaques d'agar à 2% de malt. D'autre part, on a préparé un inoculum, consistant en suspensions conidiales filtrées sur laine de verre, en utilisant le milieu de sporulation décrit dans Applied and Environmental Microbiology, Vol. 35, No.6 Dp. 1223 1225 (1978). On a réalisé ensuite des cultures (1% de glycérol et 26 mM en azote) dans des flacons Erlenmeyer de 150 ml contenant 10 ml du milieu de base ayant la composition ci-après gil Source de carbone Glycérol 10 Source d'azote Asparagine 1 4 0,5 Sels minéraux WH2P04 0,2 MgS04, 7H20 0,05 CaCl2, 2H2 O 0,0132 MnS04, H20 0,035 Citrate de fer - 0,084 ZnSO4, 2 0,0462 CuSO4, 5H20 0,007 CoCl2, 6H20 0,007 Vitamine Thiamine 0,0025 Extrait de levure 0,2 Tampon Diméthyl-2,2' succinate de sodium 1,46 Alcool veratrylique 0,4 mmole/l et on a ajusté à pH 4,5-5 avec de l'hydroxyde de potassium. Ce milieu a été supplémenté avec des quantités variables d'acide oléique émulsifié avec un détergent (Tween 80). L'émulsification de l'acide oléique a été réalisée en mélangeant sous agitation 0,003 g/l d'acide oléique dans 3ml d'eau distillée avec 0,001 g/l de Tween 80. On a inoculé les cultures avec approximativement 2,3.10 spores, on a balayé avec de l'oxygène pendant 2 min. Après inoculation-et on a bouché les flacons hermétiquement. Les cultures ont ensuite été incubées à 370Cet on a obtenu 3 à.4 jours après inoculation un surnageant contenant l'enzyme ligninolytique, l'activité enzymatique maximale se situant vers 4 à 5 jours. b) Mesure de l'activite enzymatigue dans les surnageants de culture On a déterminé l'activité ligninase des surnageants de cultures obtenus ci-dessus en mesurant à 35"C l'augmentation de l'absorbance à 310 nm due à l'oxydation de l'alcool vératrylique (ou diméthyoxy-3,4 benzylique) en vératraldéhyde, selon la méthode décrite dans Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , Vol. 81, pp. 2280-2284 (1984). A cet effet, on a employé le même mélange reactionnel que celui de la référence en question à ltexception du peroxyde d'hydrogène que 1 on a utilisé à raison de 0,27mM. On a défini l'activité enzymatique en unités katal (kat.) (correspondant à 1 mole de veratraldéhyde formé par seconde). Les rés.ultats obtenus avec l'acide oléique émulsifié sont reportés sur la figure 1 annexée sur laquelle on a porté en ordonnées l'activité ligninase en nkat./ml et en abscisses la concentration en acide oléique (courbe 1). On a repété le même essai en utilisant de l'acide oléique seul à la place de l'acide oléique émulsifié. Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 1 (courbe 2). A titre de comparaison, on a effectué le même essai en utilisant du "Tween 80" à la place de l'acide oléique. On notera que le Tween 80 est un détergent qui contient 99 mg/l d'acide oléique. Les résultats obtenus sont également reportés sur la figure 1 (courbe 3). Ces résultats montrent que la supplémentation du milieu de culture en acide oléique éventuellement émulsifié permet d'obtenir une production importante d'enzyme. On notera par contre que l'addition de détergent au milieu de culture produit des rendements moins élevés, et qu'à des concentrations supérieures à 700 mg/l le Tween 80 a un effet inhibiteur sur la production d'enzyme. Bien que le Tween 80 soit un composé contenant une forte proportion d'acide oléique, les résultats reportés sur la figure ! - re que la supplémentation en acide oléique seul n'était pas évidente compte tenu des résultats obtenus avec le Tween 80. EXEMPLE 2 Production d'enzyme ligninolytigue par culture de Phanerochaete chrysosporium sur milieu de base supplementé en acide linoléique On a répété le mode opératoire de l'exemple 1 en supplémentant le milieu de base avec de l'acide linoléique à la place de l'acide oléique. On a obtenu une production de 18,2 nkat/ml pour une concentration en acide linoléique de 400 mg/l. EXEMPLE 3 Production d'enzyme ligninolytigue par culture de Phanerochaete chrysosporium sur milieu de base supplementé en acide aminé On a répété le mode opératoire décrit à l'exemple 1 en utilisant le milieu de culture ci-après et en le supplé- mentant avec un acide aminé choisi parmi l'isoleucine, la sérine, la thréonine ou la glycine. Composition du milieu de culture gil Source de carbone Glycérol 10 Source d'azote Asparagine 1 NH4N03 0,5 Sels minéraux KH2P04 0,2 MgS04, 7H20 0,05 CaCl2, 2H20 0,0132 MnS04, H20 0,005 Citrate de fer 0,012 ZnSO4, 7H20 0,0066 CuS04, 5H20 0,001 CoC12, 5H20 0,001 Vitamine Thiamine 0,0025 Tampon Diméthyl-2,2' succinate de sodium 1,46 L'activité ligninase a été déterminée selon le mode opératoire décrit à l'exemple 1 en fonction du temps en jours. Les résultats obtenus sont reportés sur les figures 2a, 2b, 2c, 2d, sur lesquelles on a porté en ordonnées l'activité ligninase par mg de mycelium (nkat/mg) et en abscisses le nombres de jours de culture. Les figures 2a à2d correspondent respectivement aux cultures sur milieu de base supplémenté en isoleucine figure 2a sérine figure 2b thréonine figure 2c glycine figure 2d. Pour chaque figure, les courbes 1 à 4 sont spécifiques des concentrations ci-après courbe 1 10 lu M courbe 2 50 M M courbe 3 200 lu M courbe 4 1 mM Comme le montrent ces résultats, on obtient une augmentation de la production d'enzyme ligninolytique pour des concentrations spécifiques en un acide aminé donné, la production ayant lieu en général au bout de a jours de culture. A titre de comparaison on a effectué la culture de la souche CNCM I-398 sur le même milieu sans addition d'acide aminé. Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 2e. La comparaison des courbes 2a à 2d et 2e montrent que la production d'enzyme ligninolytique sur un milieu de culture supplémenté en acide aminé est considérablement augmentée. L'isoleucine est l'acide aminé qui donne la meilleure production. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la production d'enzyme ligninolytique par culture de Phanerochaete chrysosporium, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver ledit champignon sur un milieu de culture de base contenant une source d'azote, de carbone et de sels minéraux assimilables, ledit milieu de culture étant supplémenté avec un agent stimulant choisi parmi les acides gras insaturés et les acides aminé nés naturels et à isoler l'enzyme contenue dans le surnageant de culture. 2. Procédé selon la revendicatoon 1, caractérisé en ce que la souche Phanerochaete crsosporium est l'une des souches Phanerochaete chrvsosnorium d-éposées sous les N0 1-398 et I-399 à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'agent stimulant est l'acide oléique, l'acide linoléique, l'acide arachidonique, l'acide pal-Icoléique. 4. PrOcédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent stimulant est l'acide oléiqu-e et en ce que sa concentration dans le milieu de culture est d'environ 400 mg/l. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'agent stimulant est un acide aminé choisi parmi l'isoleucine, la sérine, la thréonine, la glycine. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'agent stimulant est l'isoleucine et en ce que sa concentration dans le milieu de culture est d'environ 6,5 mg/l.