FR 2594294 A1 19870821 FR 8513178 A 19850903 La présente invention est le résultat d'une association de 3 microorganismes sélectionnés pour obtenir un effet rhizosphère équilibré supplémentaire permettant avec des milieux de culture spéciaux, une action végétative plus ébalorée des rendements supérieurs à ceux obtenus actuellement dans les domaines suivants agriculture, arboriculture, viticulture, horticulture, maraichage. Apport dans le sol tant pour la rhizosphère éloignée ou proche de souches bactériennes pures et sélectionnées en association sans antagonisme. Apport dans le sol d'éléments contre la sécheresse permettant un taux d'humidité nécessaire aux intéractions de la rhizosphère, d'où effet protecteur Activation de la rhizosphère éloignée permettant ainsi une synergie et un rapprochement avec la rhizosphère proche. Parfait équilibre de la flore microbienne sans dominance. Augmentation triplée de la croissance par facteurs de croissance équilibrés. Solubilité des composés minéraux pour complète utilisation du phosphore sans perte énergétique. Pas d'immobilisation de l'azote, celui-ci est entièrement utilisé par la plante. Association de souches pour éviter l'intéraction microbienne. Denitrification employée totalement. Résistance supérieure au parasitisme. Diminution de l'apport d'engrais de 35 %. Par cet équilibre dans les apports, la régulation, l'effet rhizosphère complet, possibilité pour plusieurs variétés de 2 récoltes par année, sans tenir compte des dates normales des semis ou plantations, enfin développement des épis, organes divers, fleurs, fruits, très largement augmentés ou améliorés dans leurs valeurs propres, soit couleur, volume,rendement énergétique. Ces micro-organismes font partis pour une part du sous embranchement des Eubactéria, famille des Pseudomonadaceae. Les cellules de ces bactéries sont allongées en batonnets droits ou légère ment s incurvés ; asporulés ; gram-négatif ; pigmentés ou non ; mobiles par cils polaires ou immobiles et aciliés. Aérobies facultatifs croissant bien à la surface des milieux organiques habituels ; hétérotrophes en général avec quelques espèces chimiohétérotrophes ; formes libres, aquatiques, ou telluriques formes saprophytiques et formes parasitaires des plantes et des animaux. Genre Pseudomonas non pathogène pour les plantes. Pseudomonas Insolita Référence de souche (STAFF 1940) Prévost 1960 Habitat : sol Morphologie : bâtonnet de 1,2 à 1,8 sur 0,6 , forme coccoides, mobiles par l a 3 cils polaires, gram négatifs. Physiologie : Aérobie, température optimum 25 à 30 C, températures extrêmes 7 C et 48 C, tué à 60 C. PH 3,3 à 9,5. Cultures Cèlose inclinée, colonies plates, brillantes, blanchâtres à bords nets, légèrement fluorescentes. Gélatine non liquéfiée. Glucides glucose, galactose, lébrulose, maltose, mannose, saccharose, raffinose, rhamnose, lactose, arabinose, xylose, adonital, glycérol, énositol, mannitol, sorbitol, dextrine, amidon, salicine, fermentés avec gaz, l'amidon est hydrolisé. Biochimie S H2 ; nitrates réduits en nitrites, les sels d'ammonium sont utilisés ; l'azote atmosphérique est fixée. Non Pathogène. Pseudomonas Proteus référence de la souche (HUMM 1946) Brisou 1954. Isolé de sédiments marins et eau de mer Baronnet de 1,4 sur 0,3 Mobile, gram négatif. Aérobie ; catalase positif ; température optimum 30 C. Sur gèlose inclinée, colonies grisâtres, lisses, la gélatine est rapidement liquéfiée. I1 fermente : glucose, lévrulose, galactose, mannose, maltose, saccharose, raffinose, arabinose, rhamnose, cellobiose, salicine, glycérol, inositol, mannitol, méthanol, propylène glycol, il hydrolise les graisses, il utilise l'acide hippurique et la glucosamine, comme source de C et N, de même que alanine, arginine, acide aspartique, créatine, cystine, glycine, acide glutamique, leucène, glucomique, lactique, malique, malonique, mucique, oxalique, succinique et tartrique. L'acide alginique est lentement hydrolisé. Il produit NH3, SH2, urée et réduit les nitrates en nitrites. Non pathogène. Achromobacter Thalassius (référence Z obell et upham 1944) Isolé de sédiments marins. Batonnets de 0,8 a 2,3 sur 0,6 à 0,7 Isolé en paires et courtes chaînettes. Mobiles par cils péritriches. Gram-négatif. Aérobie facultatif ; température optimum 20 à 25 C croit mieux sur milieux salés. Cultures : sur gélose inclinée : colonies punetiformes, rugueuses, translucides, surélevées. La gélatine est liquéfiée. Les glucides ne sont pas fermentés. N H4 C L et 19 acides aminés peuvent servir de source d'azote et de carbone. Les nitrates sont réduits en nitrites. I1 produit N H3 à partir de la peptone. Le soufre minéral peut servir de source de soufre. Non pathogène. L'intérêt de cette association de bactéries non pathogènes, hétérotrophes et chimiotrophes exige des métabolites complexes et des facteurs de croissance. Les bactéries hétérotrophes synthétisent tous leurs constituants cellulaires à partir d'éléments carbonés minéraux, lesquels apportent des métabolites essentiels, il est nécessaire de respecter l'ensemble des caracteres tirés de leur écologie et de bien connaître leur physiologie nutritionnelle et métabolique. Les glucides, pour ces bactéries sélectionnées donc issues de souche pure apportent des sources énergétiques, elles sont donc exigeantes pour des composés organiques. Ces bacteries peuvent utiliser une grande variété de composés, en exemple de sucres, ce qui est notre cas, comme également l'azote libre ou mieux l'azote des composés minéraux indiqués dans le présent dossier et réduisent ainsi les nitrates en nitrites qui sont alors réduits en ammonium. Les bactéries du présent produit assimilent l'azote par suite de la transformation ammoniacale produite par substrats sur lesquels elles sont cultivées. Une part supplémentaire d'azote est fournie par la présence des acides aminés dans les milieux de culture. Ces derniers apportent également le phosphore nécessaire à la constitution des acides nucleiques, des phospholipides, des substances énergétiques de la série de 1'ATP, ce qui permet l'accumulation et la distribution de l'énergie dans la cellule. Cet apport de phosphore peut être organique en regard de nos milieux. Les milieux comprennent des éléments minéraux - voir le détail de ceux-ci dans le dossier - lesquels vont constituer les enzymes et ceci crée l'activation de réactions enzymatiques, la constitution de facteurs de croissance. Les bactéries du présent produit se développent aux températures indiquées, dans ce dossier lesquelles sont respectées strictement et le tout mis en étuve ventilée pour que celles-ci puissent prendre l'oxygène de l'air, le tout exécuté dans une pièce dite stérile à renouvellement d'air contrôlé par flux laminaire et climatisation régulée. En général les bactéries du genre sélectionnées peuvent subir des variations de PH de 6 à 9. Dans notre cas le PH de 7 - 7,5 doit être respecté absolument d1où contrôle strict, et ceci afin d'éviter une sensibilité trop souvent due aux variations. Aucun apport particulier de NACL à 2 % pour inhiber la croissance. Nos bactéries sont aérobies strictes, elles ont besoin d'air et d'oxygène pendant leur développement et leur activité métabolique, d'où l'exigence de cultures dans une pièce stérile, les cultures en ballon à fond plat et col large, boîtes de pétri doivent se faire non bouchés pour les premiers pour les seconds sans le couvercle mais retournées sur un support, laisser passer l'air par le dessous. Les éléments ou aliments sont de grosses molécules lesquels dans un premier temps seront fragmentés en plus petites molécules par les enzymes, enzymes qui secrètent nos cellules bactériennes (enzymes exocellulaires). Elles seront ensuite transformées à l'intérieur de la cellule par des enzymes intracellulaires. N'importe quel substrat ne peut franchir la membrane cytoplasmique, d'où intérêt de nos sélections de milieux. Notre premier ensemencement (voir technique de fabrication) s'effectue sur milieu solide pour faciliter la multiplication des bactéries. Tous les autres se font en bouillon nutritif donc en milieu liquide, dans lesquels sont ajoutés toutes les solutions spécifiées et précisées dans la liste des milieux et de la technique de fabrication. Cette condition, parce que, la membrane plastique perméable à l'eau et à certains milieux organiques. C'est d'ailleurs à ce stade que sera incorporé l'organe végétal comprenant tige, feuilles, racines broyées finement. Cette membrane plasmique empêche la pénétration anarchique des constituants se trouvant dans le milieu exocellulaire d'où la sélection des substances utiles. Les milieux qui sont utilisés pour le produit tiennent compte de ces facteurs. Cette membrane joue donc un rôle physiologique capital en équilibrant l'échange entre le milieu endocellulaire et exocellulaire. Ces substances pénètreront dans la cellule selon une certaine vitesse et d'une façon proportionnelle à la concentration extracellulaire lorsque la concentration intracellulaire est faible, et cette pénétration s'arrêtera lorsque l'é- quilibre sera égal de part et d'autre de la membrane cellulaire. En résumé la concentration endocellulaire ne peut donc dépasser la concentration exocellulaire. La cellule bactérienne peut accumuler une certaine quantité de substrats, c'est en tenant compte de cette possibilité que nos concentrations par nos milieux ou substrats sont très importants, dans notre cas sous un contrôle et dosage (technique indiquée dans le dossier) nous arrivons 9 stabiliser ou augmenter le pouvoir de concentration en enzymes de notre produit. Pour les acides aminés extérieurs par exemple, nous les concentrons à 500 fois, ce qui est un concentré de haute valeur. Les milieux de culture ou substrats que nous utilisons sont synthétiques, ils répondent mieux aux exigences nutritionnelles par suite de l'apport d'éléments nécessaires A la croissance, à la multiplication de nos bactéries sélectionnées et ceci dans des conditions physicochimiques définies. Nous utilisons (voir liste au dossier) des milieux complexes de produits naturels avec comme cités ci-dessus des extraits de tissus ou autres organes de végétaux et animaux. Ces bactéries utilisées ayant pour origine des souches pures, nous n'avons pas besoin de milieu d'isolement. Les glucides présents dans le contenu intracellulaire, donc dans le substrat sont dégradés par les bactéries. Certaines molécules avant de pénétrer dans la cellule doivent être préalablement brisées en fragments de faible poids moléculaire par des enzymes hydrolytiques excrétées par les bactéries dans le milieu. I1 s'agit d'exoenzymes, les endoenzymes restant à l'intérieur de la cellule. Les produits, produits ainsi peuvent alors diffuser lentement par osmose à travers la membrane semi-perméable. Toutefois il se produit une certaine activation de la pénétration par l'action d'enzymes également appelées perméases qui ont pour rôle d'accumuler dans la cellule et assurer l'entrée auparavant. Le catabolisme cellulaire est alors créé. Les pseudomonas sélectionnés dans le produit ont une action très importante, celle d'être protéolytique et cette action est en rapport du niveau d'aération et de la concentration de nos substrats. Pour rappel - Les protéines, composés organiques de haut poids moléculaire sont constituées d'acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques. Définition de l'action associative de micro organismes du produit Pour combattre les troubles physiologiques, Stimuler la croissance dans un rapport multiplié par 2, -Augmenter la valeur énergétique sans nécessiter d'apports en amendements et traitements, au contraire les réduire, des plantes cultivées. L'action de cette association n'a aucun effet sur la foudre, le gel, la grêle, la taille, la mauvaise exécution des travaux du sol par les instruments de travail, sont tous des accidents dus à des causes physiques et météoriques. Sachant que les maladies de la nutrition sont complexes, qu'elles peuvent résulter d'une absence effective, d'un ou de plusieurs éléments dans le 801, que plus souvent la carence est provoquée par l'action antagoniste d'un autre élément qui empêche le premier de pénétrer dans les racines ou le bloc dans le sol sous une forme inassimilable, enfin que les conditons physiques et chimiques du sol et du sous-sol peuvent également provoquer une insolubilisation ou une fixation des éléments. Notre association de microorganismes de souches pures cultivée sur des milieux spéciaux, parfaitement adaptés à-ces maladies de la nutrition, va pallier par un apport supplémentaire d'acides aminés, vitamines, micro-éléments élaborés par les microorganismes, à ces inconvénients majeurs, mais encore par la pulvérisation au niveau des feuilles et du sol, va permettre de rétablir immédiatement le cycle biologique et de plus le stimuler par les facteurs de croissance présents dans les contenus intra-cellulaires. Notre association de micro-organismes formera un tout assimilable directement. D'où une relance de l'activité biologique et de l'effet rhyzophère par cette suplémentation. I1 faut noter de plus que les troubles de nutrition, prédisposent défavorablement les plantes aux attaques de divers parasites. L'action de cette supplémentation par le produit faisant l'objet de la présente invention va contrarier l'attaque de ces parasites en conférant aux plantes cultivées une résistance nette et marquée. La présente invention n'a pas pour but de décrire les symptômes de déficience, de carence rencontrés dans les cultures, mais d'expliquer l'action du produit au niveau d'une plante normale, d'une plante déficiente, ou carencée, pour rétablir l'équilibre d'une part danc ces deux cas et stimuler la croissance , d'autre part pour la plante normale l'action apportée par l'invention. Action des micro-organismes associés, de souches pures, cultivés sur milieux de culture spécifiques pour plantes cultivées. Apport d'azote. Au niveau radiculaire, d'où parties aériennes se développant mieux, d'où stimulation de la vitalité, la floraison, la fructification, même s'il y a eu lessivage des nitrates du sol et destruction de la matière organique, ou encore un excès d'humidité abaissant l'activité des bactéries qui ne peuvent plus assurer la décomposition des matières organiques et la nitrification de l'azote. L'association outre cet apport d'azote assimilable va également par sa concentration bactérienne réensemencer la rhizosphère, assurer la nitrification et la décomposition des matières organiques présentes par les bactéries spécialisées du produit dont les caractères physico-chimiques répondent à la demande de ces besoins, y compris l'urée. Apport de phosphore. I1 y a une certaine analogie avec l'azote, le produit a été étudié en rapport de celle-ci, il favorisera plus rapidement l'ouverture des bourgeons et de ce fait une floraison plus avancée. Le produit agira également au niveau radiculaire. Avantage particulier de l'association dans le produit, ne pas tenir compte de la réaction du sol. Apport en potassium. Le métabolisme végétal a un besoin de potassium, lorsque la plante a atteint un certain degré de développement, c'est le seul élément nutritif qui n'entre pas dans la compositon des constituants principaux des plantes (protides, lipides, glucides, chlorophylles) mais par contre la sensibilité est accentuée aux maladies, ainsi que la qualité des produits. Compte tenu de ces conditions afin que le potassium puisse être assimilé directement par la plante, les milieux spécifiques de culture transformés par notre association de micro-organismes contiennent du potassium ; la plante pourra donc l'assimiler à deux niveaux, soit à celui de la feuille. soit ra diculaire par suite de la pulvérisation, car cet élément est tres mobile, il émigre facilement d'un point à un autre dans la plante. Apport de magnésium. Le dosage du potassium par l'activité des micro-organismes du produit, évite l'excès relatif de potassium. Il y a souvent antagonisme entre le magnésium et le potassium, le produit a tenu compte de cet etat, ce risque n existe donc pas, de plus l'azote fourni par l'association de micro-organismes ne peut provoquer le déséquilibre du magnésium. De plus le PH est neutre. L'apport de magnésium par notre produit est calcule dans des conditons analogues au calcium. Le lessivage est aussi comblé. Par contre la pulvérisation du produit est parfaitement indiquée au niveau des feuilles, ce qui permet une très nette assimilation de cet apport de magnésium, d'ou un équilibre qui évite l'antagonisme. Apport de calcium. L'excès de calcium où la déficience crée des troubles importants au niveau cellulaire et méristématique pour la formation des tissus. Notre produit apporte par pulvérisation et aussi au niveau du sol un rétablissement des fonctions dans le cas de troubles, mais encore par la supplémentation élaborée par les micro-organismes de notre association, la quantite stimulante nécessaire et utile pour renforcer les parois cellulaires dont la lamelle moyenne est formée principalement de pectate de calcium, mais encore au développement plus rapide des tissus méristématiques, et aussi une solubilisation totale pour mise à disposition de la plante. Notre produit comble le lessivage. Apport de bore. Ce micro-élément est présent dans notre produit élaboré par notre association de micro-organismes. La pulvérisation au niveau des feuilles donne des résultats très satisfaisants, ainsi qu'au niveau du scl. Le bore sera assimilé directement par les feuilles et les racines par n ntim- porte quelle qualité du sol, sauf s'il y a un chaulage trop important ce qui n'incombe pas au produit, mais aux accidents cités au début du développement de l'activité de notre produit, accidents par causes physiques ou météoriques. Apport en cuivre. Cet élément se trouve dans le produit, son action dans cette composition est de renforcer l'activité du potassium pour lutter contre les maladies parasitares, ainsi apporter à la plante une meilleure résistance au parasitisme. Apport en fer. Elément indispensable à la formation du pigment, de la chlorophylle. L'apport du produit au niveau des racines, va résoudre le grave problème de la non assimilation du fer dans certains sols, également de son insolubilisation. Avantage aussi dans le cas de chaulage trop important. L'équilibre de l'élaboration du produit par les micro-organismes tient compte également de la déficience du potassium qui aggrave la chlorose levrique, qui ne se manifeste pas par suite du PH du produit et de l'apport en calcium comme les sels de fer s'insolubilisent rapidement, comme le fer naturellement présent dans le sol, la pulvérisation du produit est mieux indiquée au niveau des feuilles, que des racines, sans toutefois abandonné le traitement au sol. Apport en manganèse Intérêt du produit par pulvérisation sur les feuilles. Comme cet apport est élaboré par des micro-organismes vectorises, il y a un dosage étudié aux différentes cultures de micro-organismes de l'association apportant de l'ammoniaque au niveau radiculaire, intérêt dans l'effet qui est très souvent limité par les sols et les engrais. Apport en molybdène. Le molybdène intervient en qualité de co-facteur dans le processus de réduc tion des nitrates en ammoniaque. L'association de micro-organismes par ses propriétés et la qualité de ceux-ci répond parfaitement dans la réduction des nitrates, l'ajout de molybdène augmente le potentiel de co-facteur, ce qui permet de renforcer l'azote produit par notre produit et de le fixer par l'association des micro-organismes présents. Il n'y a aucun risque d'insolubilisation, car le produit ne subit pas la réaction des sols. Apport en Zinc Dans l'association du produit, le zine joue un rôle de facteur de croissance, de stimulateur. Les milieux de culture utilisés et leurs propriétés. Leur provenance. Avant de situer en détails les lieux de culture pour la multiplication microbienne des espèces que nous avons choisies, il est nécéssaire de signaler que tous ces milieux de culture comportent Un support inerte de gel de silice imprégné d'un liquide nutritif de composition déterminée, en ajoutant à ce liquide un composant aliment consommable de préférence par la bactérie en présence ce qui permet sur le plan du contrôle de determiner le groupe physiologique qui le consomme. Nous arrivons ainsi à une condition naturelle d'existence de la bactérie. On obtient ainsi, ayant au départ une souche microbienne pure, avec des milieux spécifiques de culture, une flore microbienne dominante. pour revenir au gel de silice, celui utilisé doit être de prise immédiate. Nous allons donc créer des cultures de bactéries au pouvoir "ammonifiant", nitrique, nitreux, cellulolytique, glucidolytique, fixatrice, d'azote, démitrificateur etc... Nous utiliserons également des milieux avec suspension dilution de terre. Technique de préparation des plaques de silico-gel, dans le cas d'une difficulte å trouver celles-ci dans le commerce. Mélanger en parties égales Une solution de silicate de soude diluée à 7 Baumé et une solution d'acide chlorhydrique dilué à 13 Baumé, en versant l'acide dans le silicate et en agitant. I1 ne faut d'apparition de grumeaux sinon l'acide n'est pas assez dilué. Verser ensuite 30 ml dans les boîtes de pétri de 10 cm de diamètre. Laisser sur la paillasse les boites ouvertes jusqu'a prise du gel (environ 30 Heures). Constater que le gel est bien vibrant, pour cela il faut frapper sur le bord de la boite. Mettre ensuite ces boîtes dans un très grand cristallisoir et procéder au lavage des boîtes à l'eau courante (par robinet) jusqu'à élimination de l'excès d'acide. Le PH contrôlé au papier doit être neutre. Avant d'utiliser ces boîtes il faut les plonger dans l'eau bouillante. Ensuite faire bouillir dans un tube à essais la solution suivante sur laquelle on a prélevé 1 ml à laquelle on a ajouté 1 ml de la substance énergétique qui va donner une production. Formule de la solution de Winogradsky. Phosphate bi potassique 5 gr Sulfate de magnésie 2 gr 5 Chlorure de sodium 2 gr 5 Sulfate ferrique 0 gr 05 Sulfate de manganèse 0 gr 05 Dissoudre ces sels dans 1.000 ml d'eau normale mais ne renfermant pas d'antiseptiques (attention à l'eau du robinet), prendre alors une eau genre Vittel. Contrôler le PH qui doit être de 7 - 7,5. Indicateur : utiliser du bleu de Bromothymol en solution à 0,02 %. Teinte bleue à PH 7 - 7,5. Si le PH de la solution est acide (le Bromothymol bleu vire au vert ou au jaune). Ajouter alors le PH avec une solution de KOH. Répartir cette solution en tube ou flacon de 100 à 1.000 ml. Boucher au coton. Stériliser à 110 C pendant 20 minutes. La solution présente un précipité surmonté d'un liquide clair. Avant l'utilisation, agiter pour homogénéiser la solution. Verser le contenu des tules sur les plaques (1 tube par plaque). Porter le tout à l'étuve à 45 - 50 pendant 2 heures jusqu a évaporation complète de l'eau en évitant bien entendu la dessication du gel. Ensuite déposer à la surface de de terre la boîte ainsi imprégnée des graines/débacterisée à l'aide d'un agitateur étiré et boutonné dont l'extrémité est humidifiée.Disposer les plaques ensemensées, le milieu de culture au plafond, (ce qui veut dire la culture en haut) milieu de culture couvercle Dans une chambre humide et porter le tout à l'étuve. Vous avez ici un milieu de culture pure et sélectionné qui va permettre la première multiplication des bactéries sélectionnées pour nos produits. Formule "extrait de terre" nécessaire comme composant dans les milieux de culture en plaques de silico-gel. Choisir une terre de PH neutre ou très peu alcaline 7,5 par exemple. Prélever cette terre a 10 ou 25 cm de profondeur (10 kgs de terre donnent 7 litres d'extraits). Mélanger à froid égal terre et eau de source de PH neutre, ou encore Vittelourobinet si celle-ci ne contient pas d'antiseptiques. Autoclaver pendant 1 heure à 130 C. Dès que la température de l'autoclave (après 1 H à 130'C) s'abaisse à 105 -100 C, laisser échapper doucement la vapeur pour éviter le brunissement de l'extrait de terre. Filtrer le mélange décanté sur filtre par exemple Laurent n 7 à chaud, pour éliminer d'une façon certaine l'apparition possible d'un trouble colloidal, filtrer sur rondelle filtrante (amiante-cellulose), sous vide. Vérifier le PH, il doit être voisin de la neutralité. Répartir en tubes de 22 pour l'utilisation immédiate ou en flacons. Boucher au coton . Stériliser à l'autoclave pendant 30 minutes à 115 C. Milieu de culture pour bactérie ammomifiante. Prendre 2 plaques de silico-gel, les imprègner avec 2 ml du milieu Whinogradsky et 0,5 gr de Peptonebactériologique (source d'azote organique). Ensemencer les plaques avec la souche bactérienne provenant des plaques de silico-gel, ajouter la technique des graines de terre. Porter à l'étuve à 30 C. Après 24 H : développement envahissant des colonies. Examen au microscope, vous devez avoir une culture pure. Chercher le gram en regard des bactéries qui la composent que vous connaissez (moyen de contrôle). Vous décelez l'amoniaque par le réactif de Nessler (ce réactif se trouve dans le commerce (moyen de contrôle). Mise en évidence des bactéries nitrifiantes Ferments nitreux. (moyen de contrôle) Prendre deux plaques (boites de Pétri) imprégner celles-ci avec 2 ml du milieu de Winogradsky + 0,1 gr de chlorure d'ammonium (source d'azote ammoniacal). Ensemencer les plaques par la technique des graines de terre. Porter a l'étu- ve å 30'C. Après 24 H : examiner les plaques : Autour des graines~de-terre on distingue un halo plus cu moins brun. Rechercher les nitrites par le réactif de griess suivant cette technique (découper à l'aide d'un petit tube servant d'emporte pièce, une rondelle de silico-gel autour d'un grain de terre, pousser la rondelle au fond du tube et rechercher les nitrites). Coloration rose caractérise la présence des nitrites. Ce réactif se trouve dans le commerce en 2 parties qu'il faudra mélan ger, pour cette recherche des nitrites, il faut prélever 1 ml du mélange. Sur une deuxième rondelle, rechercher l'ammoniaque par le réactif de Nessler. Ce réactif se trouve dans le commerce. En raison de la fonction de la durée d'incubation , celle de l'ammoniaque est encore positive ou négative. Ferments nitriques. (moyen de contrôle) Prendre 2 plaques (boîtes de pétri) les imprégner de 2 ml de milieu de Winogradsky et 0,1 gr de nitrite de Potassium (source d'azote nitreux). Ensemencer les plaques par la technique des grains de terre. Porter à étuve à 30'C. Après 24 Heures examiner les plaques. Autour des grains de terre on distingue un halo plus ou moins brun. Faire la recherche des nitrates et constater la disparition plus ou moins poussée des nitrites. Pour cela : opérer suivant la technique appliquée aux ferments nitreux. Rechercher les nitrates par la diphénylanine et les nitrites par le réactif de griefs. La réaction des nitrates doit être positive, tandis qu'en fonction de la durée d'incubation celle des nitrites est encore positive ou négative. Mise en évidence des bactéries fixatrices de l'azote de l"air. (moyen de contrôle). Imprégner deux plaques chacune avec 2 ml de milieu Winogradsky + 0,1 de glucose et 0,3 de carbonate de calcium (ce qui émaille la surface). Ce milieu ne contient pas d'azote. Imprègner deux autre plaques, mais remplacer le glucose par 0,1 gr de Benzoate de sodium. Ce milieu est également carancé en azote. Ensemencer les plaques préparées par la technique des graines de terre et porter celles-ci à l'étuve à 30'C. Après 24 H, noter la couleur des colonies. En milieu avec glucose : colonies blanches, bombées, crémeuses, qui brunissent par la suite. En milieu avec benzoate : colonies plus plates, noires, à reflet métallique. Dans les deux cas, il s'agit d'Azotobacter fixatrices d'azote. Bien entendu vous devez ensemencer avec des bactéries en provenance de souche achetée, cette façon de procéder vous donne la possibilité de contrôler. La valeur de votre souche dont la fonction est de fixer l'azote de l'air. I1 en est de même ce que j'ai oublié de signaler (précédemment) pour les nitrites, les nitrates l'ammoniaque, les bactéries ammonifiantes. Il s'agit la de moyens techniques de contrôle pour vous assurer de la qualité de vos souches de leurs possibilités de multiplication d'enrichissement. Milieu d'oligo-éléments. (enrichissement) Molybdate de potassium 0,10 gr Borate de sodium 0,10 gr Nitrate de Cobalt 0,10 gr Sulfate de Cadmium 0,10 gr Sulfate de cuivre 0,10 gr Sulfate de zinc 0,10 gr Sulfate de manganèse 0,10 gr Perchlorure de fer 3 gouttes Eau distillée 1.000 ml au travers de laquelle on fait passer un courant de gaz carbonique. Milieu du carbonate de calcium stérile (enrichissement) Répartir dans des tubes de 17 de carbonate de calcium en poudre S raison de 0,2 gr par tube. Boucher au coton cardé. Stériliser 20 minutes à 120'C. Vous pouvez mettre en flacon ou bien en tube. Milieu pour ammonifiants. ( moyen de contrôle) produits finis. 0,2 gr Asparagine Solution saline standard de Winogradsky 50 ml. Solution d'oligo éléments 1 ml Eau distillée 950 ml Répartir en tube de 22 (10 ml par tube) ou en flacon, boucher au coton, Stériliser à 110 C pendant 20 minutes. Milieu pou la recherche des ferments nitreux. (moyen de contrôle) produits finis. Sulfate d'ammonium 0,5 gr Carbonate de calcium 1 gr Solution Saline Standard de Winogradsky 50 ml Eau distillée 950 ml Répartir en tubes à hémolyse à raison de 1 ml par tube. Boucher au coton cardé. Stériliser 20 minutes à 110 C. Milieu pour la recherche des ferments nitriques. (moyen de contrôle) produits finis. Nitrite de sodium 1 gr Carbonate de calcium 1 gr Solution Saline Standard de Winogradsky 50 ml Eau distillée 950 ml Répartir en tubes a hémolyse à raison de 1 ml par tube ou utiliser un flacon. Boucher au coton cardé. Stériliser 20 minutes à 110 C. Milieu pour la recherche de la dénitrification. (moyen de contrôle) produit fini. Nitrate de potassium 2 gr Carbonate de calcium 5 gr Glucose 10 gr Solution Saline Standard Winogradsky 50 ml Solution d'oligo éléments 1 ml Eau distillée 950 ml Répartir en tubes de 22 i raison de 10 ml par tube ou mettre en flacon. Stériliser 20 minutes à 110 C. Milieu minéral purifié (enrichissement) Glucose purifié 20 gr Gélose lavée 20 gr Phosphate monopotassique 1,5 gr Sulfate de magnésie 0,25 gr Biotine 10 - 9 gr Thiamine 10 - 6 gr Acide nicotinique 10 - 6 gr Eau distillée 1.000 ml Milieu pour la croissance (vitamines) Miso Ynositol 300 mg litre Thiamine 1 mg litre Acide ascorbique 5 mg litre Acide citrique 50 mg litre Milieu de croissance (acides aminés) Glutamine 250 mg/litre Glycine 100 mg/litre Asparagine 100 mg/litre Proline 100 mg/litre Tyrosine 100 mg/litre Phenylalanine 100 mg/litre Méthionine 100 mg/litre Cysteine 100 mg/litre Mélanger toutes les solutions. Milieu stimulant de croissance extrait de levure 1 gr Milieu stimulant de croissance Hydrolysat de Caséine 3 gr/litre Milieu d'enrichissement en sucre Saccharose 5 % Glucose 8$ Composition minérale de micro-éléments enrichissante Sulfate de manganèse 10 mg Sulfate de zinc 10 mg Sulfate de cuivre 0,03 mg Chlorure d'aluminium 0,03 mg Chlorure de cobalt 5 mg Chlorure de Nikel 0,03 mg Chlorure de potassium 0,01 mg EDTA 0,03 mg Sulfate de fer 0,03 mg Eau distillée q S P 1.000 ml Provenance de ces milieux Tous les produits chimiques peuvent être achetés aux sociétés suivantes Merk Paris Rhône-Poulenc Paris Institut Pasteur pour certains milieux préparés à l'avance - Paris Pointet Girard - paris Ces produits doivent être vigoureusement purs, pas de produits techniques. Vous remarquerez que certains milieux ne comportent que des minéraux et des substances organiques. I1 faut les considérer comme des apports dans le développement des souches microbiennes aux propriétés enrichissantes, la solution de vitamines, des acides aminés, des sucres de l'extrait de levure, sont a ajouter aux apports de minéraux. Provenance Les mêmes sociétes que celles citées ci-dessus, avec en plus pour les vitamines, la Sté Hoffman La Roche à Paris. Compositon minérale de quelques milieux macro-éléments. Eau de-levure Autolysat de levure 50 ml Eau distillée 1.000 ml Répartir en tubes de 17 cm. Boucher avec du coton cardé. Stériliser à 120 pendant 20 minutes. Préparation de l'autolysat de levure 1 000 g de levure de boulangerie sont délayés dans 1 000 ml dans l'eau distillée. Porter la suspension au bain mari à 50 C pendant 24 H. Faire bouillir ensuite. Neutrallscr ct filtrer. Autoclaver le filtrat pendant 20 minutes à 120'C. On trouve parfois de l'autolysat de levure concentré dans le commerce, dont 1 gr correspond à environ 10 ml de la solution ci-dessus. Eau de levure gelosé gélose 20 gr Eau de levure 1 000 ml Dissoudre la gélose A l'autoclave pendant 20 minutes à 120 C. Filtrer à chaud. Répartir en tubes à raison de 10 ml par tube de 17. Boucher les tubes au coton cardé. Stériliser 20 minutes a C pour éviter une précipitation éventuelle. Cette préparation est très riche et peut remplacer le milieu "eau de levure". Milieu nutritif gélosé. (gélose nutritive) gélose 20 gr Bouillon nutritif 1 000 ml Faire fondre la gélose å l'autoclave pendant 20 minutes à 120'C. Filtrer chaud. Répartir en tubes "culot" et en tube "incliné". Boucher au coton cardé. Stériliser 20 minutes à 115'C. Eau de touraillon Peptone Bactérologique 2 gr Phosphate Biammonique phosphate monopotassique Acide tartrique Sulfate d'amonium Saccharose Eau de touraillon q S Après dissolution, filtrer, répartir en tubes, boucher au coton, stériliser 20 minutes à 120'C. Préparation de l'eau de touraillon Dans un sac de toile introduire 15 g de touraillon. Plonger le sac dans l'eau et faire bouillir pendant 30 minutes. Filtrer. Ramener le volume final a 1 litre. Stériliser 20 minutes à 120'C. Le milieu ne doit pas être employé immédiatement. Touraillon : germe d'orge que l'on fait sécher dans une étuve que l'on appelle TOURAILLE. Solution saline de Winogradsky Phosphate 5 gr Sulfate de magnésie 2,5 gr Chlorure de sodium 2,5 gr Sulfate ferrique 0,05 gr Sulfate de manganèse 0,05 gr Dissoudre ces sels dans 1 000 ml d'eau, mais ne renfermant pas d'antiseptique comme le chlore dans l'eau du robinet. Le PH doit être de 7 - 7,5. Répartir en flacons ou tubes. Boucher au coton. Stériliser pendant 20 minutes. Solution d'oligo éléments Molybdate de potassium 0,05 gr Borate de sodium 0,05 gr Nitrate de cobalt 0,05 gr Sulfate de cadmium 0,05 gr Sulfate de cuivre 0,05 gr Sulfate de zinc 0,05 gr Sulfate de manganèse 0,05 gr Perchlorure de fer 1 goutte Eau distillée 1000 ml au travers de laquelle on fait passer un courant de gaz carbonique C02. Solution stériles de sucre Préparer des solutions à 30 % dans l'eau distillée neutralisée à PH 7,2 les sucres suivants glucose - saccharose - maltose - lactose - galactose. Répartir en tube de 17 à raison de 10 ml par tube. Boucher au coton. Stériliser 15 minutes à 115 - 107'C. La solution ne doit pas être jaune a la sortie de l'autoclave. Milieu de mobilité pour les bactéries afin de contrôler si elles vivent bien. Extrait de levure 3 gr Peptone 10 gr Chlorure ee sodium 5 gr Gélose 20 gr Eau distillée q SP l 000 ml QSP veut dire quantite suffisante pour.aépartir en tubes de 17. Steriliser 20 minutes à 120 C. Boucher au coton. Milieu minéral purifié Glucose purifie 20 gr Gélose lavée 20 gr Phosphate monopotassique 1,5 gr Sulfate de magnésie 0,25 gr Biotine 10 9 o gr Thiamine 10 - 6 gr Acide nicotinique 10 - 6 gr Purification du glucose Faire bouillir au moins 10 minutes une solution de glucose pur à 20 % additionné de charbon actif. Filtrer. Ramener le volume à 1 litre après y avoir fait dissoudre les différents ingrédients du milieu. La gélose coupée en petits morceaux est lavée a l'eau courante pendant 48 H à l'eau distillée et sécher à l'alcool. Préparation des suspensionn - dillution de terre matériel nécessaire (lequel doit être stérilisé) Mortier de 500 ml et pilon Fiole stérile de 500 ml graduée à 100 ml et marquée n 1 15 tubes à essais de 22 5 pipettes graduées stériles Eau distillée stérile. Mode opératoire 9 tubes de 22 sont disposés sur un portoir et marqués de 2 à 10. Introduire dans chacun 18 ml d'eau distillée stérile. Broyer à sec dans le mortier 10 grs de terre tamisée et homogeneisee. Broyer à nouveau après additon d'environ 20 ml d'eau distillée. Broyer encore une fois en ajoutant un peu d'eau distillée. Transvaser dans la fiole graduée stérile et compléter à 100 ml le volume de la suspension. Agiter la fiole qui contient la suspension de terre à la dilution 10 Prélever à l'aide d'une pipette graduée de 5 ml stérile, 2 ml et les introduire dans un tube marqué. Agiter en le roulant entre. les mains, le tube rebouché sans mouiller le coton. On obtient une sus pension à la dilution 10 Opérer de même, mais en changeant de pipette stérile entre chaque dilution, jusqu'à 10-10 N.B. : L'addition de pyrophosphate de sodium aide la dissociation des agrégats du sol et la dispersion des germes dans l'eau. Dans certains cas, on pourra utiliser pour la première suspension-dilution, une solution aqueuse à 1 pour 1000 de pyrophosphate de sodium. Utiliser immédiatement les suspensions-dilutions après préparation en ensemençant les differents milieux, en commençant par les suspensions les plus diluées. Opérer dans des conditons d'aseptie rigoureuse. Procédé de culture particulière (poudre de plante) Il est absolument nécessaire de cultiver chaque plante dans des conditions de culture particulière pour obtenir une culture pure dont la destination est d'être broyée finement (tiges, racines, feuilles) et ceci jusqu'au stade de développement 3e feuille. Les graines ou semences doivent être déposés sur un treillage très fin au dessus d'un bac d'eau contenant du lithothanne, l'eau doit affleurer la base du treillage, pluvérisé 1 ou 2 fois par jour les plantes pour activer le développement et maintenir ainsi un certain fi d'humidité. Agriculture et cultures maraichères : (même technique) Cultures viticoles : prélever des racines et branches de l'année. Cultures fruitières : idem Cultures horticoles : graines ou semences. Pour les boutures (broyer celles ci). La poudre de plante ainsi obtenue est ajoutée au milieu extrait de terre dans la fabrication de ce complexe microbien. Cette technique d'apport est un secret de fabrication. Technique de fabrication Dans un local stérile et sous flux laminaire tout le matériel utilisé pour la manipulation doit être stérile. 1) Mettre dans les flacons ou tubes des souches de micro organismes reçues, quelques mls ou gouttes pour mettre ceux-ci en suspension. 2) Répartir les suspensions obtenues en parties égales dans les boîtes de pétri de grandes dimmensions (diamètre 18 cm) ou dans des flacons de roux grande capacité qui est préférable. Faire en regard du nombre de gouttes que l'on obtient dans une souche en suspension, le calcul du nombre de flacons de roux nécessaire. 3) Couler dans les falcons de roux une gélose inclinée à l'extrait de levures, ou acheter des flacons préparés avec ce milieu. 4) Situer en parallèles le milieu avec des écarts faibles entre chaque parallèle avec fil de platine préalablement flambé au bec bunsen et ceci à chaque fois que l'on effectue ce travail dans chaque flacon qu boîte, afin d'éviter le transport d'une contamination d'urbi flacon ou boîte à l'autre par suite toujours possible malgré le flux laminaire et le local stérile d'un micro organisme présent dans l'air ambiant ayant résister à la stérilité. 5) Lorsqu'on effectue ce travail de stries, il est entendu que le fil de platine a été prealablement trempé dans le milieu des microorganismes en suspension. Il est donc très difficile malgré comme indiqué au n'2 de compter le nombre de gouttes contenues dans la suspension, car à chaque fois qu'il y aura prélèvement avec le fil de platine dans celle-ci, il n'est pas toujours dit que celui-ci prendra une goutte. I1 y a donc intérêt à prévoir un nombre important de flacons de roux. Autre observation, il est plus facile de strier dans une boite de pétri, que dans un flacon de roux. Les deux cas sont toutefois signales avec préférence aux boites de pétri. 6) Après incubation à l'étuve à température des bactéries 25 C pendant 4 jours, prélever toutes les colonies développées et les ensemencer dans de nouvelles boîtes ou flacons. L'importance du développpement obligera a doubler le nombre de boîtes. 7) Préparer les milieux bouillons pour chaque type de.souche car chaque souche mise en suspension doit être cultivée à part et non associés. 8) Prélever toutes les colonies développées, ajouter dans des boites de roux un extrait terre ou de dilution en suspension (pour extrait de terre 10 grs, pour dilution en suspension 10 ml) ensemencées toutes les colonies développées. Ajouter à ce milieu 1 gr de la plante (par boîte) qui va être traité Incuber pendant 5 jours à l'étuve chambre humide à température de 25 C. 9) Vider la totalité des boites d'une façon aseptique dans un recipient verre. Ajouter à ce mélange une solution d'oligo éléments une solution vitaminique que l'on fait développer dans un cristallisoir dans une étuve S la température de 25 C en chambre stérile humide pendant 5 jours. 10) Reprendre le tout ajouter 500 gr d'extrait de terre ou 500 ml de suspension en dilution, y ajouter le milieu micro-éléments + milieu au carbonate de calcium. Utiliser un récipient plus grand, incuber à 25'C pendant 5 jours dans étuve chambre humide. 11) Reprendre le tout, ajouter 500 grs d'extrait de terre ou de suspensiondilution. Ajouter milieu de croissance (acides aminés) incuber à 25'C à étuve chambre humide pendant 5 jours. 12) Reprendre le tout ajouter 500 grs d'extrait de terre ou de suspensiondilution dans un récipient plus grand, y ajouter le milieu stimulant de croissance à l'extrait de levure. Incuber à 25 C pendant 5 jours (étuve chambre humide). 13) Reprendre le tout, ajouter 500 grs d'extrait de terre ou de suspensiondilution dans un récipient adapté å la quantité, y ajouter la composition de micro éléments enrichissante + le milieu d'enrichissement en sucres. Incuber à 25 C à l'étuve chambre humide pendant 5 jours. Ce produit est ensuite lyophilisé (uniquement sous cette forme). Concentration au gr 50 milliards de bactéries. Provenance des souches (micro organismes) Quelques adresses achat Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, Paris 15e Centraalbureau, Voor schimmelcutures, 5 Javalaan Baarn,(Hollande) American type culture collection, 2029 M. Street, Washington (U.S.A.) Sté Biòpox, BP 177, 8 rue Barhes, 92305 Levallois-Perret. REVENDICATIONS 1) Association de bactéries de souche pure, non pathogene de la famille des Pseudomonadaceae, ordre des Bactériales constituée par une poudre végétale dans les substrats résultant d'une culture particulière dans des conditions stériles, poudre végétale comprenant tiges, racines et feuilles broyées très finement, 2) Produit selon la revendication (1) caractérisé par un substrat composé de micro-eléments, macro-éléments spécifiques, solution vitaminique, facteur de croissance, complexes d'acides aminés, en regard de la physiologie nutritionnelle des bactéries. 3) Produit lyophilisé selon les revendications (1 et 2) caractérisé par la concentt tion au grime à 50 milliards de beXS téries actives, devant tre remises en solution dans de l'eau normaie. 4) Produit selon les revendications (1 à 3) caractérisé par une technique particulire de fabrication en utilisant des extraits de terre débactérisés. 5) Produit selon l'ensemble des revendications (1 à 4) caractérisé par l'utilisation dans la formule d'extrait de levure et eau de levure comme source nutritive.