FR 2604905 A1 19880415 FR 8613955 A 19860925 PROCEDE D'OBTENTION D'UN EPITHELIUM GINGIVAL EQUIVALENT A PARTIR DE CELLULES HUMAINES CULTIVEES IN VITRO AINSI QUE LES APPLICATIONS DE CET EPITHELIUM EN ODONTOLOGIE-STOMATOLOGIE La présente invention concerne un procédé d'obtention d'un épithélium gingival équivalent à partir de cellules humaines cultivées in vitro, ainsi que les applications de cet épithélium en odonto-stomatologie. La chirurgie mucco-gingivale se définit comme l'ensemble des techniques de chirurgie plastique destinées à corriger ou modifier des défauts de morphologie, de position et de qualité du tissu gingival entourant la dent. Les paradontologistes ont porté, au cours des dernières années, une attention toute particulière à la quantitéset à l'importance de la hauteur du tissu gingival pour maintenir une santé paradontale et surtout pour éviter la perte du système d'attache ou épithélium de jonction avec la dent. Le volume et la forme de l'os alvéolaire et de la gencive sont en relation étroite avec la pathologie et modifient par là-même les données du traitement. Le clinicien odonto-stomatologiste distingue habituellement le parodonte épais et plat et le parodonte fin et festonné. Une classification établie en 1980 par Maynard et Wilson individualise quatre types 1- Os alvéolaire épais et gencive kératinisée épaisse et étendue sur une hauteur de 3 à 5 mm (idéale) 2- Os alvéolaire épais et gencive kératinée peu étendue et mince, 3- Os alvéolaire d'épaisseur réduite et gencive "idéale", 4- Os alvéolaire d'épaisseur réduite et gencive peu étendue et mince. Les différents tissus du parodonte sont, en fait, concernés par la chirurgie mucco-gingivale, mais c'est à la gencive attachée et à son étendue que ce type de chirurgie fait habituellement référence. La gencive attachée est une partie de la gencive kératinisée elle-même délimitée du côté coronaire par le bord gingival libre et apicalement par la ligne de jonction mucco-gingivale. Au-delà, la muqueuse alvéolaire apparaît plus foncée et facilement mobilisable avec un épithélium mince non kératinisé. Par contre, I'épithélium gingival est épais et est sous-tendu par un tissu conjonctif dense. L'évolution clinique de la gencive attachée est superposée à l'évolution de la profondeur du sillon gingivo-dentaire en l'absence d'inflammation. La gencive attachée ainsi délimitée présente en surface un aspect uniforme, propre au revêtement épithélial kératinisé. Le clinicien, lui, n'observe qu'une seule et même structure, qu'elle soit attachée à l'os sous-jacent ou à la dent. Or, en profondeur, la fixation de la gencive provient de deux réseaux distincts de fibres conjonctives - les fibres gingivo-osseuses de la gencive attachée proprement dite, - les fibres gingivo-cémentaires de l'attache conjonctive coronairement à la crête osseuse. La figure unique du dessin schématique annnexé permettra de mieux comprendre le mécanisme de l'attache épithélio-conjonctive. Sur la figure, L'attache épithéliale est désignée, de façon générale, par 1 et la dent par 2. On voit en 3 la jonction épithéliale bordée par la membrane'basale interne 6 au contact de l'émail 9 et la membrane basale externe 7 du côté du tissu conjonctif 5 ; l'épithélium gingival est désigné par 4 et 8 désigne les cellules granulocytaires et lymphocytaires infiltrant la jonction épithéliale 3 et le tissu conjonctif 5. 12 désigne le cément recouvrant la dentine 10 au niveau de la racine et 11 la jonction amélo-cémentaire. Cette attache épithélio-conjonctive est le véritable garant de l'intégrité paradontale et constitue la préoccupation essentielle du thérapeute qui peut se trouver en présence de trois situations - étendue suffisante voire importante de la gencive attachée et du système d'attache avec présence de fibres gingivo-osseuses et de fibres gingivo-cémentaires ; - brièveté de la gencive attachée avec exiguité du système d'attache réduit à quelques fibres gingivo-osseuses et gingivo-cémentaires. A l'extrême, on ne rencontre qu'une ligne d'attache osseuse avec quelques fibres gingivo-cémentaires. Un tel complexe peut être stable ou, au contraire, qualifié d'insuffisant dans le cas de pathologie persistante ou de récession évolutive ou de thérapeutique agressive - rupture-du système d'attache associée à une pathologie parodontale profonde. La chirurgie mucco-gingivale est une chirurgie essentiellement reconstructrice, c'est une chirurgie additive ou l'apport tissulaire conjontif modifie, de façon prévisible, un environnement défavorable au maintien de la santé parodontale et à la fonction protectrice et esthétique de la dent. Les protocoles opératoires rigoureux exigent une manipulation attentive de ces tissus fragiles et la stabilité de ces tissus à l'aide de sutures ancrées sur la dent ou le périoste. L'observation de principes biologiques est indispensable, non seulement pour assurer le succès de l'intervention, mais surtout pour éviter la perte du système d'attache et une alvéolyse au niveau du site donneur choisi. Il faut, par ailleurs, noter que, dans la chirurgie mucco-gingivale, le tissu conjonctif joue un rôle important dans les processus de réparation. Les caractéristiques gingivales ne sont pas le résultat d'une adaptation fonctionnelle. La gencive est génétiquement déterminée et la différenciation de l'épithélium gingival en tissu kératinisé se fait par l'intermédiaire de la matrice extracellulaire en grande partie élaborée par les cellules du tissu conjonctif sous-jacent. Ainsi, le succès ou l'échec des interventions de chirurgie parodontale dépende aussi de la qualité de cette matrice conjonctive. Cette chirurgie est mise en oeuvre, par exemple, dans les cas suivants - rupture du système d'attache (pathologie parodontale profonde), - insuffisance gingivale et du système d'attache, - chirurgie pré-prothétique, - aménagement tissulaire chez l'enfant en rapport avec un traitement orthodontique, - récessions gingivales, La chirurgie mucco-gingivale utilise habituellement les techniques suivantes - frenotomies et frenectomies, - approfondissement vestibulaire - greffes gingivales libres, - lambeaux positionnés coronaire ment, - lambeaux positionnés latéralement, - lambeaux positionnés apicalement. Ces techniques présentent de nombreux inconvénients, parmi lesquels on peut citer les douleurs occasionnées et la durée des interventions, les temps de cicatrisation et de réparation, la difficulté d'obtention de sites donneurs acceptables qualitativement et surtout quantitativement, et enfin la nécessité de protection des sites donneurs, de recouvrement des sites receveurs et d'hémostase. La présente invention s'est donné pour but de remédier à ces inconvénients en fournissant aux paradontologistes un nouveau moyen d'éviter la perte du système d'attache gencive-dent par apport d'un épithélium gingival équivalent obtenu à partir de cellules humaines cultivées in vitro. Les Inventeurs ont, en effet, découvert, de façon surprenante, qu'il était possible d'appliquer à la réalisation d'un épithélium gingival équivalent certaines méthodes de culture in vitro de cellules humaines utilisées pour la préparation de greffes de peau, notamment dans le traitement des brûlures. Les problèmes importants qui se posent lors de l'application de ces méthodes au domaine bucco-dentaire étaient, en effet, tels qu'il n'était pas évident, pour l'homme du métier, d'envisager une simple extrapolation des méthodes classiques. Il faut, en effet, rappeler que la bouche constitue un milieu éminemment septique et que les prélèvements que l'on y effectue se heurtent à des problèmes de contamination que l'on ne rencontre pas lors dés prélèvements effectués sur la peau. On sait, d'autre part, que les prélèvements effectués sur la peau sont de dimensions relativement importantes pouvant atteindre plusieurs cm2 ; or, il est impensable d'envisager des prélèvements de cette taille sur la gencive, pour des raisons évidentes de protection du site et d'hémorragie. Par ailleurs, les seules méthodes de culture d'épithélium gingival connues se limitent à des cultures d'explants, comportant donc à la fois tissu conjonctif et épithélium, qui ne permettent donc pas de fabriquer d'épithélium seul (BUCHNER,A. et MLINEK,A. (1975) J. Periodontal Res. 10 : 346-356). Les Inventeurs se sont donc appliqués à apporter une solution à ces différents problèmes, ce qui les a conduit à adapter tant les conditions de prélèvement du greffon que les conditions mêmes de culture, de façon à obtenir des cultures stratifiées de cellules épithéliales buccales d'origine humaine. Le procédé d'obtention d'épithélium gingival équivalent selon l'invention est caractérisé en ce que l'on effectue un microprélèvement gingival superficiel, de quelques dizièmes de millimètres d'épaisseur, essentiellement limité à la couche épithéliale, ledit prélèvement étant ensuite cultivé et traité de façon classique, afin d'éliminer microorganismes et bactéries, trypsinisé de façon classique et la suspension cellulaire obtenue déposée sur une culture-support de type 3T3 irradiée jusqu'à obtention de cultures primaires confluentes qui sont à nouveau dissociées par trypsinisa tion, ensemencées et cultivées jusqu'à obtention de cultures secondaires confluentes stratifiées avec formation de couches pluristratifiées, et en ce que l'épithélium en culture secondaire une fois confluent est ensuite détaché du support de culture par voie enzymatique puis déposé sur un support avant utilisation. Selon l'invention, le prélèvement superficiel d'épithélium buccal est effectué à l'aide d'un dispositif type rasoir, ce qui permet de limiter essentiellement le prélèvement à la couche épithéliale ; on dispose, de ce fait, d'un maximum de cellules exploitables, avec peu de pertes dues au conjonctif. On applique ensuite à cet épithélium buccal le procédé d'iso lement et de culture des cellules épidermiques décrit par O'CONNOR, N.E., CALLICO,G., COMPTON,C., KEHINDE,O. et GREEN,H., dans "HUNT,T.K., HEPPENSTALL,K.B., PINES,E. et ROVER,D., eds. "Soft and hard tissue repair : Biological and Clinical aspects". (New York : Praeger Scientific Vol.2: 283-29, 1984). C'est ce procédé, qui sera décrit plus en détail ci-après, qui permet d'obtenir des couches de cellules épithéliales pluristratifiées. La présente invention sera mieux comprise et ses avantages ressortiront bien de la description qui suit du procédé d'obtention de l'épithélium gingival équivalent selon l'invention, ainsi que de ses applica tions en odonto-stomatologie. Après anesthésie du site et nettoyage au merfène, on effectue, sur un palais de 4 à 5/10ème de mm d'épaisseur, un prélèvement d'environ 0,4 x 0,4 cm d'épithélium buccal à l'aide d'un bistouri à lames interchangeables, d'un épitome de Klewanski ou d'un mucotome. Cette biopsie, essentielle ment constituée de tissu épithélial, est immédiatement placée dans du DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) additionné de 100U/ml de penicilline et de 100 pg/ml de penicilline streptomycine (P/S). Le prélèvement est rincé successivement dans dix bains de tampon phosphate à pH 7,2 (PBS) avec antibiotiques (P/S). La biopsie est coupee aussi finement que possible et incubée avec un mélange (V-V) trypsine 0,1 % (dans du Hanks' sans calcium ni magnésium)-EDTA (Acide Ethylénediamino tétracétique) 0,02 g/100 ml(dans du PBS sans Ca ni Mg + P/S) dans un flacon à trypsinisation (CELSTIR 25 ml) sous agitation à 370C pendant trente minutes. Le surnageant est prélevé, additionné d'un volume égal de milieu de culture dépourvu de facteur de croissance épidermique (EGF) et contenant du sérum de veau foetal (SVF) qui arrête l'action de l'enzyme. Ce surnageant est remplacé dans le CELSTIR par un volume égal de mélange trypsine-EDTA, le flacon est à nouveau placé sous agitation à 37"C pendant trente minutes. Le surnageant est traité comme pour la première trypsinisation. Ces deux suspensions cellulaires sont centrifugées à 1200 r.p.m. pendant cinq minutes ; le culot est repris dans du milieu de culture sans EGF. Les cellules épithéliales (CE) dissociées, peuvent alors être ensemencées dans des flacons (FALCON F25) à raison de 5.105 cellules/25 cm2 sur 5.10 fibroblastes 3T3 (souche 32) irradiés à 6000 Rads. Les cultures sont maintenues à 37"C en atmosphère humide à 10 Sb de dioxyde de carbone (CO2). Après 48 heures, le milieu sans EGF est remplacé par du milieu complet de composition donnée par O'CONNOR et Al. soit D.M.EM. 3 volumes (Gibco), HAM's F12 1 volume (Gibco), + 10 ,ó Sérum de veau foetal (Boerhinger) (décomplémenté:: 30 minutes à 56"C), + 100 U/ml Pénicilline (Gibco) + 100 pg/ml Streptomycine (Gibco), 4 0,4 pg/ml Hydrocortisone (France Biochem), + 10 10M Toxine cholérique (Sigma), + 5 llg/ml Insuline (Sigma), + 8.10 4M Adénine (Boerhinger), + 5 pg/ml Transferrine (France Biochem), + 2.10-9M Triiodothyronine (Rhône-Alpes Chimie), + 10ng/ml E.G.F. = Facteur de croissance épidermique (ou Epidermal Growth Factor) (Sigma) (ajouter après 48 heures de culture primaire). Au bout de quatorze à vingt jours, les cultures primaires confluentes sont dissociées avec le mélange trypsine-E.D.T.A. (cinq minutes à 379C). Comme précédemment, la trypsine est inhibée par addition de milieu complet, la suspension est centrifugée et le culot repris dans du milieu complet. On isole environ 3.105 à i06 cellules. Les cellules épithéliales dissociées sont cultivées en présence de fibroblastes 3T3 irradiées. Cette fois, les kératinocytes sont ensemencées à des densités comprises entre 0,7 et 5.105 cellules pour 25 cm2. Les cultures sont maintenues dans les mêmes conditions que les cultures primaires. Au fur et à mesure du développement des colonies épithéliales, les fibroblastes murins sont repoussés puis se détachent et sont éliminés des flacons lors des changements de milieu. Les cellules épithéliales après adhésion sur le support présentent un aspect polygonal et sont très jointives. Après 14 à 16 jours, les cultures primaires parviennent à confluence. Les cultures secondaires (subcultures) parviennent à confluence plus rapidement, 6 5 à 6 jours pour une densité d'ensemencement de 5.106 CE pour 25 cm2. L'épithélium en culture secondaire, une fois confluent, est détaché du support par voie enzymatique (dispase 11) et déposé sur une gaze vaselinee qui sert de support de la culture-greffon avant utilisation chirurgicale. La miniaturisation de la méthode rendant impossible l'élimination du tissu conjonctif de la biopsie, on aurait pu craindre la prolifération de fibroblastes humains. Mais les prélèvements étant très minces, ce problème est peu fréquent. De plus, il est possible de détacher les fibroblastes adhérant au support de culture par traitement à l'EDTA (0,02 % dans du PBS) pendant 3 minutes. L'étude en microscopie optique permet de déterminer que, à confluence, la culture présente une seule assise cellulaire et se stratifie par la suite. Après traitement à la dispase des cultures stratifiées, il est possible de distinguer une couche de cellules basales et une série de couches suprabasales, constituées de cellules plus aplaties. L'étudie en microscopie électronique permet de déterminer que l'épithélium buccal de culture pluristratifié ne possède pas de couche cornée mais seulement une couche basale surmontée de six à huit couches de cellules suprabasales. Les cellules én culture présentent un aspect polyhédrique ; en coupe les différentes couches apparaissent cuboïdes ou aplaties, c'est-à-dire analogues à ce qui est observé in vivo au niveau des premières couches de l'épithélium buccal. On a, par ailleurs, détaché l'épithélium de son support de culture et on l'a mis au contact d'une section d'émail dentaire humain selon le processus suivant Des dents saines extraites pour convenances orthodontiques sont soigneusement nettoyées (par grattage), passées à l'alcool à 90" puis coupées en section comprenant exclusivement la couronne (Isomet BUEHLER). Avant utilisation, ces sections sont passées à l'alcool et séchées à l'étuve. Les cultures secondaires confluentes sont traitées à la dispase, rincées avec du milieu de culture puis délicatement déposées sur le côté de la section constituant la surface de la dent. Le film cellulaire est laissé avec peu de milieu pendant deux heures à 37"C pour lui permettre d'adhérer sur l'émail, ensuite l'épithélium "reconstitué" est recouvert de milieu. Les cultures en contact avec l'émail sont maintenues dans les conditions habituelles pendant cinq jours. Après cinq jours de culture sur l'émail, les cellules prennent un aspect plus allongé ressemblant aux cellules suprabasales de l'épithélium de jonction in vivo. De plus, ces cellules déposent sur l'émail une structure comparable à la membrane basale interne de l'épithélium de jonction composée de trois feuillets : lamina lucida, lamina densa, lamina (pars) fibroreticularis. On a également pu observer des plaques denses. Ces structures d'adhésion présentent de fortes analogies avec des hémidesmosomes (filaments intracellulaires, épaississement de la membrane cytoplasmique). In vitro, sur le plan morphologique, l'adhésion des cellules épithéliales sur l'émail est tout à fait comparable à ce qui est obsevé in vivo dans l'épithélium de jonction. L'émail dentaire induit donc sur les cellules épithéliales in vitro la différenciation de structures d'adhésion qui ne sont pas observées lors de cultures sur plastique, les propriétés du substrat paraissant déterminer la nature et la structure des sites de contact. La présente invention concerne également les applications de l'épithélium gingival équivalent obtenu en odonto-stomatologie et notamment la réalisation de greffes gingivales. L'intervention de greffe se fait dans les conditions suivantes: - préparation du site receveur par réalisation d'un lit conjonctivo-periosté, voire cémento-conjonctivo-périosté dans les cas de recouvrement radiculaire imposant un rapport favorable : surfaces vasculaires / surfaces avasculaires ; - mise en place de la culture-greffon (montée sur gaze) sur le lit receveur préalablement recouvert de Tissucol pour assurer le "collage" et la fixation la plus intime possible entre le greffon et le lit receveur.Si cela est nécessaire, on réalise un ancrage de protection par réalisation de sutures passant à distance et garantissant un placage sans déplacement du greffon - protection à l'aide d'un écran non collant de la gaze supportant la greffe et mise en place d'un pansement chirurgical de type COE PACK fixé sur les dents - post-indications habituelles comportant des bains de bouche, antibiothérapie et si nécessaire antalgiques anti-inflammatoires - dépose du pansement chirurgical huit jours plus tard, nettoyage de la plaie et de ses parages, mise en place d'une protection plus légère pendant encore une semaine - quinze jours après l'intervention, on enlève les pansements et les sutures - contrôle post-opératoire à un mois, trois mois et six mois. On sait, par ailleurs, que le remplacement de l'organe dentaire par une prothèse ou implant (endo ou justa-osseux) se heurte à des difficultés d'attachement de l'épithélium de jonction au niveau du collet du matériau. Dans ces conditions, on conçoit tout l'intérêt de faire pousser des cellules épithéliales en couches pluristratifiées autour du matériau à implanter avant de réaliser la mise en place in situ chez le malade. Ainsi, I'interface implant/cellules épithéliales peut-il être préparé in vitro, ce qui permet d'éliminer les problèmes, très fréquents en implantologie, de diffusion bactérienne entre l'implant, le conjonctif et l'os sous-jacent, principale cause des échecs actuels. L'invention présente de très nombreux avantages par rapport aux procédés de la technique antérieure et notamment par rapport aux greffes gingivales libres. - Le prélèvement est toujours réalisable, car il est minime q elques mm2 au lieu de 2 à 3 cm2 pour les greffes gingivales libres - Le prélèvement est très superficiel : 4 à 5/10ème de mm d'épaisseur contre 1,5 à 2 mm pour un prélèvement épithélio-conjonctif.Il ne laisse qu'une plaie très minime qui est rapidement réparée avec peu de douleurs pour le malade, alors que les prélèvements habituels (greffons) posent le problème de la protection du site donneur toujours imparfaite et donnant en plus des suites inconfortables pendant huit à dix jours - On ne rencontre aucun problème hémorragique en raison de la taille du prélèvement et de son épaisseur - Les possibilités offertes par la culture garantissent d'avoir toujours suffisamment de matériau de recouvrement quelque soit l'étendue de la zone d'intervention à traiter et ceci en seule séquence opératoire. Outre les indications similaires à celles des greffes gingivales libres, les cultures permettent d'envisager le recouvrement immédiat: - des fenestrations conjonctives et périostées dans les approfondissements vestibulaires (suppression des suites douloureuses et accélération très importante de la réparation tissulaire) - des zones périostées et osseuses mises à nues dans les lambeaux de repositionnement latéraux ou apicaux - des zones de prélèvements obligatoires visant à assurer la fermeture gingivale des greffes osseuses de comblement dans les lambeaux type Widman modifié. Enfin, I'utilisation d'allogreffe et la mise en place de banques de culture disponibles évitera toute attente (trois semaines) et tout prélèvement avant l'intervention. - REVENDICATIONS 1- Procédé d'obtention d'épithélium gingival équivalent, caractérisé en ce que l'on effectue un microprélèvement gingival superficiel de quelque mm2 de surface et de quelques dizièmes de millimètres d'épaisseur, essentiellement limité à la couche épithéliale, ledit prélèvement étant ensuite cultivé et traité de façon classique, afin d'éliminer microorganismes et bactéries, trypsinisé de façon classique et la suspension cellulaire obtenue déposée sur une culture-support de type 3T3 irradiée jusqu'à obtention de cultures primaires confluentes qui sont à nouveau dissociées par trypsinisation, ensemencées et cultivées jussqu'à obtention de cultures secondaires confluentes stratifiées avec formation de couches pluristratifiées. 2- Procédé d'obtention d'épithélium gingival équivalent selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'épithélium en culture secondaire une fois confluent est détaché du support de culture par voie enzymatique, puis déposé sur un support avant utilisation. 3- Procédé d'obtention d'épithélium gingival équivalent selon la revendication I et la revendication 2, caractérisé en ce que le prélèvement gingival est effectué à l'aide d'un dispositif type rasoir. 4- Procédé d'obtention d'épithélium gingival équivalent selon l'une des revendications I à 3, caractérisé en ce que le prélèvement gingival est effectué sur le patient destiné à recevoir par la suite l'épithélium gingival équivalent. 5- Procédé d'obtention d'épithélium gingival équivalent selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le prélèvement gingival est effectué sur un patient quelconque et en ce que l'épithélium gingival équivalent ainsi obtenu est stocké en banque de culture pour permettre ultérieurement la réalisation d'allogreffes. 6- Procédé d'obtention d'épithélium gingival équivalent selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les cultures secondaires confluentes sont traitées à la dispase, rincées avec du milieu de culture, déposées sur une section d'émail dentaire, puis maintenues pendant environ cinq jours en condition de culture. 7- Procédé d'obtention d'épithélium gingival équivalent selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la culture des cellules épithéliales en couches pluristratifiées est effectuée autour d'un matériau à implanter ou à placer en bouche, avant mise en place de l'implant ou de la prothèse chez le patient. 8- Applications de l'épithélium gingival obtenu selon l'une quelconque des revendications I à 7 en odontologie stomatologie.