FR 2596048 A1 19870925 FR 8603842 A 19860318 Dérivés du hényl-(méthoxy)Dhényl-pyrénvlméthane, orocédé -d'obten- tion, intermédiaires de synthèse et apolication au marquage fluorescent de nucléosides, nucléotides et polynucléotides. La présente invention concerne des dérivés du phényl (méthoxy)phényL-pyrénylméthane, utiles pour la préparation de nouveaux (poly)nucléotides fluorescents. Il est connu que, dans la synthèse de polynucléotides, la purification des produits obtenus est effectuée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) ou,-plus particuLièrement pour des séquences de plus de vingt nucléotides, par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE). La purification par PAGE est très simple et bon marché : les bandes correspondant aux produits désirés sont identifiées soit par examen du gel à L'ultraviolet à 254 nm, soit, en général aux fins analytiques, par autoradiographie après radiomarquage. Toutefois, sur le plan pratique, la présence de matériel non complètement déprotégé et de séquences coupées rend difficile l'identification certaine du produit désiré, surtout lorsqu'il est présent en petites quantités. De plus, l'ADN et -l'ARN peuvent se détériorer lorsqu'ils sont soumis à des radiations de longueur d'onde 254 nm. On a maintenant trouvé que, par l'introduction en positon 5' terminale d'un nouveau groupe fluorescent, labile, éliminable par traitement acide, on supprime les désavantages cidessus et on dispose d'un moyen rapide et simple pour la purification d'ADN synthétiques aussi bien par HPLC que par PAGE. Après la puri-fication, le groupe protecteur fluorescent peut être facilement éliminé. Ainsi, la présente invention a pour objet, selon un de ses aspects, les dérivés du phényl-méthoxyphényl-pyrénylméthane de formule dans laquelle R représente un halogène, plus particulièrement le chlore et le brome, le chlore étant particulièrement préféré et X représente L'hydrogène ou un groupe méthoxy. Les composés de formule I ci-dessus sont préparés à partir du 1-pyrenecarboxaldéhyde. Ce composé est soit oxydé selon des méthodes connues, de préférence avec de l'oxyde de manganèse dans un alcanol inférieur en présence de KCN et d'acide acétique et transformé en l'ester d'alkyle inférieur, de préférence de méthyle ou d'éthyle, de l'acide 1-pyrènecarboxylique, soit traité avec le bromure de phénylmagnésium et transformé, après oxydation par L'oxyde de mangénèse, dans le 1-benzoylpyrène. Chacun des deux produits ainsi obtenus est traité avec le bromure d'un méthoxyphénylmagnésium et transformé en un composé de formule : dans laquelle X est OCH3 lorsqu'on a utilisé l'ester ou H à partir du benzoylpyrène. Les composés de formule II sont nouveaux et représentent, en tant qu'intermédiaires dans la préparation du réactif fluorescent, un autre aspect de la présente invention. Selon un aspect ultérieur de la présente invention, un composé de formule II ci-dessus est traité avec un halogénure d'acide et transformé en le composé correspondant de formule I. Ainsi, par réaction d'un composé de formule II avec le chlorure ou le bromure d'acétyle, on obtient respectivement les composés correspondants de formule I où R est le chlore ou le brome. Les produits préférés selon La présente invention sont ceux de formule I dans Laquelle X et OCH3 sont en position 4 et R représente un atome de chlore. La présente invention a également pour objet l'utilisation des composés de formule I en tant que réactifs fluorescents pour le marquage de nucléosides, nucléotides et polynucléotides. Pour cette utilisation, les composés de formule I peuvent être condensés sur un nucléoside ou un nucléotide, tel que La thymidine ou un de ses dérivés phosphorylés pour obtenir l'éther phényl-méthoxyphényl-pyrénylméthylique ou L'éther ai(méthoxyphényl)- pyrénylméthylique en 5' dudit nucléoside ou nucléotide qui donne des spectres d'émission fluorescents à une Longueur d'onde bien Loin de La région de dommage potentiel pour L'ADN. Le nucléotide ou nucléoside ainsi obtenu peut être à son tour condensé sur un oligo- ou polynucléotide pour donner un oligo- ou polynucléotide fluorescent. Les composés de formule I peuvent être également utilisés comme réactifs fLuorescents par condensation directe sur un polynucléotide. Après purification, Le groupe fluorescent protecteur est facilement éliminé par simple traitement par un acide, tel que l'acide acétique, avec libération, d'une part, du polynucléotide purifié et, d'autre part, du composé de formule II. Les exemples suivants, non limitatifs, illustrent l'invention. Les déterminations ont été effectuées avec les appareils suivants Spectre de RMN : BRUCKER WP 80 (solvant CDC 13 référence TMS) Spectre de masse : AEI MS 50 Spectre UV : BAUSCH and LOMB Fluorimètre : JOBIN et YVON EXEMPLE 1 a) 1- pyrènecarboxylate de méthyle A une solution méthanolique (600 ml) contenant 7,5 g de KCN, 10 g de 1-pyrènecarboxaldéhyde et 7,5 ml d'acide acétique, on ajoute 51 g d'oxyde de manganèse. Le mélange est agité pendant 48 h à température ambiante, puis filtré sur Celite. Le résidu obtenu après évaporation du méthanol est repris par du chlorure de méthylène.La phase organique est lavée à l'eau, séchée et évaporée pour fournir, après cristallisation dans l'éthanol, 10,6 g de 1-pyrènecarboxylate de méthyle (952); p.f. 84-850C. Spectre de masse : m/z 260 (M+). RMN : 8,5-7,8 (m, 9H, Ar); 3,92 (s, 6H, OMe). b) di-(p-méthoxyphényl)pyrén-1-ylméthanol A une solution de p-méthoxyphénylbromure de magnésium (préparé en ajoutant 6 ml de p-méthoxyphénylbromure à 1,152 g de magnésium) dans 18 ml de tétrahycirofuranne (THF), on ajoute goutte à goutte, à température ordinaire, une solution dans le THF de 1-pyrènecartoxylate de méthyle (2,86 g). Le mélange est porté à reflux pendant 1 h. Il est ensuite versé dans une solution aqueuse saturée de NH4Cl (100 ml). Cette dernière est extraite par de L'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée à l'eau, sécnée et évaporée pour donner un résidu qui est chromatographié sur gel de silice pour fournir 4,184 g (86%) de di-(p-méthoxyphényl)-pyrén- 1-ylmethanol (élution dichlorométhane); p.f. 111-115tC. Spectre de masse : m/z 444 (M+); 427 (M-17). RMN : 6 8,5-6,5 Cm, 17H, Ar); 3,72 (S, 6H, OMe). UV : Amax (dx10-4) (EtOH 95) 245 (6); 268 (2,28); 278 (3,66); 328 (2,52); 346 (4,98). EXEMPLE 2 A une suspension de di-(p-méthoxyphényl)-pyrén-1- ylméthanol (1,523 g) dans le cyclohexane (10 ml), on ajoute dJ chlorure d'acétyle (2 ml). Le mélange se dissout après 10 min de reflux. La solution est alors refroidie; il se forme un précipité qui est essoré pour fournir le di-(p-méthoxyphenyl)-pyrén-1-yl- chlorométhane (1,210 g, 76%); p.f. 162-164"C. EXEMPLE 3 a) l-benzoylpyrène A une solution de 1-pyrenecarboxaldéhyde (4,6 g) dans le THF (20 ml) est ajoutée goutte à goutte une solution de bromure de phénylmagnèsium (1,3 éq.) dans le THF (10 ml). Après l'addition, le mélange réactionnel est porté à reflux pendant 3 h. On le verse ensuite sur une solution de chlorure d'ammonium (7 g) dans l'eau (20 ml) contenant de la glace. La phase aqueuse est extraite avec du chlorure de méthylène. Le produit brut de réaction, obtenu après séchage et évaporation de la phase organique, est immédiatement oxydé en 1-benzoylpyrène.Pour cela, le phénylpyrénylméthanol (5,5 g) est dissous dans le chlorure de méthylène (250 ml) et la solution, à laquelle on ajoute du bioxyde de manganèse (12 g), est agitée durant 24 h. On filtre sur Celite, le filtrat est rincé avec du chlorure de méthylène et la phase organique est évaporée. Le résidu est déposé sur une colonne de gel de silice. On élue le 1-benzoylpyrène (5,125 g). Le rendement global est de 80%; p.f. 128-129"C (éthanol). b) ohényl-(4-méthoxyphényl)-oyrén-1-vlméthanol A une solution dans le THF (5 ml) de bromure de (p-méthoxy)phénylmagnésium (préparé à partir de 273 mg de magnésium) et de 1,4 g de p-bromoanisole, on ajoute lentement une solution dans le THF (6,5 ml) de 1-benzoylpyrene (1,894 g). On chauffe ensuite à reflux pendant 3 h 30 min. Le produit de la réaction est isolé comme précédemment, puis chromatographié sur gel de silice. On élue avec le chlorure de méthylène le phényl-(p-méthoxyphényl)pyrén-1-ylméthanol (2,095 g) avec un rendement de 80%; p.f. 120-124"C (éthanol); 116-118 C (benzène/cyclohexane). Spectre de masse : m/z 414 (M+). RMN (CDCl3, 80 MHz) b : 3,56 (OHe), 3,80 (OMe); 6,6-9 (H arom.). EXEMPLE 4 Dans un mélange de cyclohexane (5 ml) et de chlorure d'acétyle (0,5 ml), on dissout le phényl-p-méthoxyphénylpyrén-1-ylméthanol (306 mg). La solution est maintenue à reflux pendant 15 min, puis abandonnée 2 h à la température ambiante. On obtient des cristaux (208 mg) de phényl-(4-méthoxy)phényl-pyrén-1- ylchlorométhane; p.f. 174-1750C. EXEMPLE 5 - A une solution de thymidine (nom usuel pour la désoxythymidine) (240 mg) dans la pyridine (5 ml) maintenue à 0 C, on ajoute du di(p-méthoxyphényl)-pyrén-1-ylchlorométhane (500 mg). Après 1 h d'agitation, la solution est concentrée, puis diluée avec du dichlorométhane. La phase organique est ensuite lavée successivement avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 5% et une solution aqueuse saturée en NaCl, puis séchée et évaporée Le résidu est chromatographié sur gel de silice pour fournir (élution dichlorométhane:méthanol 9:1) le 5'-di (p-méthoxyphényl)-pyrén- 1-ylmethylthymidine (448 mg, 67%) sour forme de mousse. RMN : 8,5-6,6 (m, 18 H, Ar + H-6); 6,35 (t, 1H, H-1'); 4,55 (m, 1H, H-3'); 3,97 (m, 1H, H-4'); 3,70 (s, 6H, OMe); 3,45 (m, 2H, H-5'); 2,57 (n, 2H, H-3'); 1,40 (s, 3H, Me). UV : N. max (xîO-4) (éthanol 95) 245 (4); 267 (2); 278 (2,7); 331 (1,9);348 (2,6). Fluorescence (excitation X 346 nm) émission max à X 376, 386 et 396 nm (éthanol 95.). Pour la comparaison, le dérivé diphényl correspondant a été également préparé à partir du diphényl-pyrén-1-ylchlorométhane (Chem. Abs., 1942, Jh, 87). EXEMPLE 6 A une solution de (2-chloro)phenyl-(2-cyano)ethyl- thymidine-3' phosphate (115 mg) dans la pyridine (3 ml) maintenue à 0 C, on ajoute du [di-(p-méthoxyphényl)-pyrén-1-yl]chlorométhane (102 mg). Comme précédemment, on isole le 5'-Ldi(4-mèthoxyphényi)- pyrén-1-yl-méthyl-thymidine-3'(2-chloro)phényL-(2-cyano)étnyL phosphate (140 mg, 65%) solution dichlorométhane:méthanol 98:2). RMN : 8,5-6,62 (m, 22H, 21 Ar + H-6); 6,42 (t, 1H, H-l'); 5,37 (m, 1H, H-3'); 4,5-3,12 (m, 6H, H-5'+H-4' +CH20); 3,72 (s, 6H, OMe); 2,72-2,25 (m, 4H, H-3'+CH2CN); 1,45 (s, 3H, Me). EXEMPLE 7 A une suspension de thymidine (242 mg) dans la pyridine (3 ml), on ajoute le chlorure de (p-méthoxyphényl)phénylpyrénylméthane (552 mg). Le milieu devient immédiatement homogène. Après 1 h, on ajoute du méthanol (0,5 ml) et le produit de la réaction est isolé de la manière habituelle. Il est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice, avec du chlorure de méthylène contenant 3% de méthanol on élue le 5'-(p-méthoxyphényl-phényl-pyrényl)méthy thymidine (452 mg) sous forme de mousse incolore. RMN (CDCl3, 80 MHz) ô : 1,45 (MeC-5); 2,30 (H-2'); 3,50 (H-5'); 3,74 (OMe); 4,05 (H-4'); 4,62 (H-3'); 6,37 (H-1'); 6,65-9 (H arom.). EXEMPLE 8 Un petit oligonucléotide a été synthétisé pour mesurer la limite de détection lorsqu'on utilise le nouveau groupe fluorescent provenant du réactif selon la présente invention. Par traitement avec la triéthylamine, le tri este phosphorique obtenu selon l'exemple 6 a donné le du ester correspondant et Le sel de triéthylamine du 5'-LdiC4-mèthoxyphényl)-pyrén-3- yllméthylthymidine-3' phosphate; on a ensuite fait réagir le sel avec Le dinucléotide d(GC) convenablement protégé en présence de 1-Cmésitylène-2-sulfonyl)-3-nitro-1,2,4-triazole (MSNT), pour fixer en position 5' du d(GC), le 5'-Edi-C4-méthoxyphényl)-pyrényl-1-yL]- méthylthymidine-3' phosphate. Le tridésoxyribonucléosidediphosphate complètement protégé ainsi obtenu a été purifié sur une colonne de gel de silice et les groupes protecteurs sensibles aux bases ont été éliminés par traitement avec L'oximate (Tetrahedron Lett. 1978, 2727) et l'ammoniac. La chromatographie en couche mince en phase inverse a montré La présence d'un produit fluorescent et absorbant à l'UV, constitué par le proauit de condensation du 5'-EdiC4-méthoxyphényL)pyrén-1-yl- méthylthymidine-3'-phosphate sur Le d(GC), ci-après désigné ppm-d(TGC). Différentes parties aliquotes d'une solution standard du ppm-d(TGC) ont été séparées par PAGE à 20%.Une seule bande fluorescente a été obtenue et la limite de la détection par simple examen visuel a été estimée à 2,25 nmol, ce qui est largement infé- rieur aux quantités manipulées lors de la synthèse chimique conventionnelle. EXEMPLE 9 Pour évaluer l'utilité du procédé de marquage fluorescent transitoire pour la synthèse en phase solide, on a effectué l'essai suivant : Le tridécamère complètement protégé d(CTCTGGACCTGGT) est synthétisé sur gel Enzacryl K2 (K. Miyoshi et al., Nucleic Acids Res., 1980, , 5473) utilisant les unités digères protégés par le diméthoxytrityle (C. Broka et al., Nucleic Acids Res., 1980, 8, 5461) et, en tant qu'agent de condensation, le MSNT Après chaque condensation, les groupes 5'-OH qui n'ont pas réagi sont acétylés (H.Ho et al., Nucleic Acids Res., 1982, 10, 1755). Pour une réaction finale de condensation, on utilise l'éther/ester fluorescent 51-Edi (4-mèthoxyphényl)pyrèn-1-yl3méthylthymidine-3' phosphate.Le produit est détaché du support solide et les groupes protecteurs sensibles aux bases sont éliminés comme indiqué dans L'exemple 8. L'examen par HPLC du produit brut (Lichrosorb RP-18, 10 nm, 250 x 4 mm, gradient linéaire de L'acétate d'ammonium 100 mt à l'acétonitrile à 100% en 45 min, débit de 1,5 ml/min; détecteur UV LC-75, détecteur fluorescent LS-5 en série) montre un pic important d'absorption à l'UV et de fluorescence (temps de rétention 14,39 min). Le produit est séparé aussi par PAGE à 20%. On observe que la bande fluorescente majoritaire migre de façon relativement plus lente que dans Le gel. L'examen d'un gel surchargé à 254 nm montre que cette bande est bien séparée du matériel absorbant à l'UV et non fluorescent; une telle rétention ayant déjà été reportée pour un oligodésoxynucléotide tritylé (A.B. Studencki and R.B. Wallace, DNA, 1984, Z 7). La bande fluorescente est séparée et le produit élué avec une solution aqueuse d'acétate d'ammonium (100 mM). L'analyse HPLC montre, à côté d'impuretés du gel, un seul pic fluorescent absorbant à L'UV (temps de rétention 14,25 min). Le produit est traité avec L'acide acétique aqueux à 80% pendant 20 min pour séparer Le groupe protecteur, ensuite on élimine l'acide par évaporation. Le résidu est dissous dans l'eau et la solution est extraite plusieurs fois avec de l'éther. Après le marquage de la position 5' avec P en utilisant le gamma P ATP et la polynucléotide kinase T4, le produit donne une seule tache qui, par analyse PAGE, correspond à un tétradécamère. Le contrôle de la séquence dTCTCTGGACCTGGT est effectué selon la méthode de Maxam et Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1977, ii, 560). EXEMPLE 10 Déprotection des dérivés de la thymidine. Quatre échantillons (5 mg) de 5'-0-dimethoxytrityl- thymidine, de 5'-[di(p-méthoxyphényl)-pyrényl]méthylthymidine, de 5'-E(p-mèthoxyphényl)-phényl-pyrényl)méthylthymîdine et de 5'-Cdi Cphényl)-pyrényl]méthylthymidine sont dissous dans un mélange d'acide acétique et d'eau 8:2 (0,1 ml). A intervalle régulier, une aliquote des quatre réactions est examinée sur une plaque de chromatographie en couche mince analytique : absorbant : (gel de silice). Première élution à L'éther éthylique et ensuite avec de l'acétate d'éthyle contenant 3% de méthanol. De cette manière, on estime que 90% de la thymidine sont Libérés en 10-20 min dans le premier cas, 30-60 min dans le deuxième et 1 h 30 min dans le troisième. Les vitesses de déprotection relatives sont donc de 1 pour la 5' (diméthoxy)tritylthymidine, 1/3 pour la 5'-(di-p-méthoxyphényl)- pyrénylméthylthymidine, et 1/10 pour la a 5'-(p-méthoxyphényl)-phényl- pyrénylméthylthymidine. La 5'-diphénylpyrénylmèthylthymidine n'est pas significativement hydrolysée dans Les conditions ci-dessus. REVENDICATIONS 1 - Dérivés du phényl-(méthoxy)phényl-pyrénylméthane répondant à la formule dans laquelle X représente L'hydrogène ou un groupe mèthoxy et R représente un atome d'halogène. 2 - Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans la formule, les substituants X et OCH3 sont dans la position 4 du groupe phenyle. 3 - Dérivé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le substituant X est un groupe méthoxy. 4 - (4-méthoxy)phényl-phényl-pyrén-1-ylchloro- métnane. 5 - di(4-méthoxypnényl)-pyrén-1-yl-chlorométhane. 6 - Procédé pour La préparation d'un dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on traite un composé de formule dans laquelle X est tel que défini dans la revendication 1, avec un halogénure d'acide. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'halogénure d'acide est choisi parmi le chlorure ou le bromure d'acétyle. 8 - Composé de formule : dans Laquelle X est l'hydrogène ou un groupe méthoxy. 9 - C4-méthoxy)phényl-phényl-pyrén-1-yLméthanol. 10 - di (4-méthoxyphényl)pyrèn-I-ylméthanol. 11 - Réactif pour le marquage fluorescent de nucléosides, nucléotides ou polynucléotides, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un composé selon L'une des revendications 1 à 5. 12 - Nucléosides, nucléotides ou polynucléotides marqués par éthérification en position 5' avec un composé selon L'une quelconque des revendications 1 à 5.