FR 2601964 A1 19880129 FR 8610703 A 19860723 PROCEDE DE PRODUCTION IN VITRO D'UN POLYPEPTIDE DETERMINE DANS DES CELLULES DE MAMMIFERES OU DES HYBRIDES DE CELLES-CI, ET COMPORTANT INTEGREE DANS LEUR GENOME LA SEQUENCE CODANTE POUR LE POLYPEPTIDE DETERMINE. L'invention concerne un procédé de production in vitro d'un polypeptide déterminé dans des cellules de mammifères ou des hybrides de celles-ci. L'expression "polypeptide" telle qu'utilisée plus haut et dans ce qui suit, doit être considérée dans son acceptation la plus large, et désignera par exemple, et non limitativement, une protéine, un antigène, un anticorps, une hormone, voire même un ensemble plus complexe de molécules, parmi lesquelles certaines auront néanmoins toujours une ossature polypeptidique. A titre d'exemple, on mentionnera l'antigène particulaire HBsAg correspondant à l'enveloppe du virus de l'hépatite B. La mise en culture de cellules de mammifères pour leur faire produire ceux des polypeptides qu'elles synthétisent normalement in vivo n'est souvent guère possible dans la pratique. Des raisons essentielles des difficultés rencontrées résident, soit au niveau de la division cellulaire, difficile à induire in vitro, ce qui voue ces cultures primaires à une mort à plus ou moins brève échéance, soit au non maintien de l'expression du programme de différenciation in vitro. Or, d'une façon générale, la capacité de synthèse par des cellules de mammifères de leurs "polypeptides normaux" est en général liée à leur "état différencié", à tout le moins à leur aptitude à se différencier. Certes, il est connu qu'un certain nombre de substances ont la propriété d'induire un certain niveau de re-différenciation cellulaire. C'est le cas notamment du diméthylsulfoxyde, ci-après désigné pour la commodité du langage par l'abréviation DMSO. Cette propriété du DMSO a d'abord été démontrée dans l'érythroleucémie aviaire dans laquelle le virus de Friend bloque le processus normal de la différenciation cellulaire (réf. 1). Le DMSO a été également étudié dans d'autres systèmes biologiques où son action sur la différenciation de cellules tumorales a été mise en évidence (réf.2), (réf.3), (réf.4), (réf.5), (réf.6). Cette induction de la différenciation cellulaire par le DMSO s'accompagne dans ces systèmes d'un arrêt de la division cellulaire. Cette action inductrice de la différenciation cellulaire notamment dans le cas des cellules cancéreuses, a ét démontrée pour un fibrosarcome en culture (Réf. 7), un neuro-blastome (Réf. 8), un cancer du colon humain (Réf. 9), un melanome (Réf. 10), un cancer du poumon humain (Réf. 11), dans des lignées cellulaires murines de carcinome embryonnaire (Réf. 12), (Réf. 13). L'addition de DMSO à des cellules dé-différenciées provoque alors une reprise de la synthese des protéines caractéristiques de ces cellules. Mais, en l'état actuel, cette technique ne peut tout au plus autoriser que l'obtention de niveaux de production du polypeptide recherché proches du niveau normal de production. A côté de son rôle d'inducteur de la différenciation cellulaire dans des cellules tumorales, le DMSO exerce également une action sur le maintien de la différenciation de cellules normales, en particulier d'hépatocytes après leur mise en culture in vitro (réf. 14). Il a été notamment observé que l'addition de DMSO dans le milieu de culture d'hépatocytes normaux a permis la conservation de l'état différencié des cellules pendant 43 jours. Pendant cette période, la sécrétion de la sérum-albumine a été maintenue à un niveau proche du niveau normal de sécrétion des cellules hépatocytaires, alors qu'en l'absence de DMSO, la capacité de synthèse de la sérum-albumine par des hépacocytes maintenus dans un milieu de culture tend à diminuer rapidement. Mais la culture de cellules de mammifères en présence de DMSO en vue de leur faire synthétiser des quantités substantielles d'un polypeptide déterminé ne peut être sérieusement envisagée dans la pratique. D'autres molécules sont également connues pour leur propriété inductrice de la différenciation cellulaire dans des conditions analcgues à celles connues pour le DMSO. Par exemple, 1 publication faite par Reuben R. et al, (Réf. 15) met en évidence une telle propriété inductrice pour l'hexaméthylène bisacétamide, ci-après désigné pour la commodité du langage, par l'abréviation HMBA. Les auteurs de cet article ont en particulier montré que le HMBA induisait la différenciation de cellules murines érythroleucémiques. L'induction de la différenciation cellulaire par le HMBA a été également démontrée dans d'autres systèmes biologiques, notamment dans des neuroblastomes (Réf. 16). Pour intéressant qu'ils soient, les effets du DMSO ou d'autres substances ayant comme lui une capacité de maintenir ou de réinduire une différenciation dans des cultures cellulaires, ne pouvaient guère être utilement mis à contribution dans des procédés de production de polypeptides par des cultures de cellules de mammifères dont on connait normalement leur capacité à les synthétiser.Ainsi s'est-on tourné vers les nouvelles techniques, récemment développées, de transformation de cultures cellulaires par les techniques du génie génétique, techniques qui permettent aujourd'hui d'introduire dans des cultures cellulaires des séquences d'ADN correspondant à des gènes normalement étrangers à ces cultures cellulaires, dans des conditions telles que les cultures cellulaires ainsi transformées deviennent alors capables d'exprimer le gène ainsi introduit dans leur génome en synthétisant le polypeptide correspondant. On peut en particulier mettre en oeuvre dans ces transformations toutes cultures à partir de cellules eucaryotes établies, c'est-à-dire pouvant se cultiver in vitro et capables de se multiplier pendant plusieurs générations. Les cellules établies utilisables sont, de préférence, dérive-s de mammifères. Il s'agit par exemple de cellules tumorales ou non, de cellules dérivées par mutation ou non de cellules naturelles ou primaires, mais ayant acquis une capacité de multiplication, cette propriété pouvant être naturelle ou induite. Il s'agit encore de toute catégorie de cellules pouvant être maintenues en culture, telle que des lignées cellulaires dépourvues de caractère tumorigène, comme par exemple des lignées cellulaires Vero de primates non humains. D'autres types de cellules utilisables sont par exemple les cellules L ou CHO (Chinese Hamster Ovary cell). Une autre technique efficace met en jeu des cultures de cellules eucaryotes hybrides. Ces cellules hybrides sont obtenues à partir desdites cellules établies et de cellules eucaryotes, de préférence de mam mifères,- connues pour être le siège de la production du polypeptide dont on souhaite l'expression, de préférence des hépatocytes, dans le cas préféré envisagé dans les exemples qui suivent où l'on recherche la production d'un polypeptide possédant des propriétés immunologiques à l'égard du virus de l'hépatite B. A cet égard, les hépatocytes constituent des cellules particulièrement préférées pour l'expression des séquences d'ADN issues du génome du virus de l'hépatite B. En effet, les hépatocytes, notamment humains ou de certaines lignées de chimpanzés, constituent des cibles préférées du virus de l'hépatite B. Des constructions de différentes lignées cellulaires de ce type ont été décrites dans les demandes des brevets France n 8403565 et 8506706 déposées par la Demanderesse les 07 mars 1984 et 02 mai 1985 respectivement. Il est en effet décrit dans ces deux demandes des cellules hybrides tranformées ou transformables par une séquence d'ADN cloné contenant la séquence codant pour un polypeptide déterminé, par exemple un polypeptide immunogène présentant des propriétés vaccinantes à l'égard de l'hépatite B. Ces cellules hybrides contiennent, d'une part, une partie du patrimoine génétique d'une lignée de cellules primaires favorables à l'expression de la susdite séquence d'ADN et, d'autre part, un marqueur génétique leur permettant de pousser dans un milieu sélectif, marqueur génétique normalement absent de la lignée cellulaire utilisée. D'une façon plus générale, on peut mettre en oeuvre pour la production d'hybrides, toutes cellules dont est connue la capacité d'exprimer le polypeptide recherché, notamment à la suite d'une transformation, par exemple par un virus. On peut, par exemple, mettre en oeuvre pour la production des hybrides, des cellules d'hypophyse lorsque la protéine, dont la production est recherchée, est l'hormone de croissance, ou des lignées de lymphocytes lorsque la protéine est constituée par l'interféron lymphocytaire. Dans le cas où la séquence codant pour le polypeptide recherché ne fait pas partie du patrimoine génétique des cellules établies ou primaires entrant dans la constitution des hybrides du genre en question, elle peut être intégrée au génome des cellules établies soit avant hybridation, soit dans les hybrides préalablement formés. Bien que ces techniques permettent désormais des productions substantielles du polypeptide souhaite, les rendements de production notamment d'HBsAg par les hybrides décrits dans les demandes de brevets 8403565 et 8506706 sont à cet égard déjà remarquables, il est encore très souhaitable d'accroître ces rendements de production pour que l'utilisation de ces techniques puisse être efficacement envisagée pour des productions industrielles. L'invention résulte de la découverte que la réalisation des cultures des cellules permanentes, de mammifères, génétiquement transformées par une séquence d'ADN codant pour le polypeptide recherché, en présence de produits inducteurs de la différenciation cellulaire permettait une importante amplification des rendements en polypeptide synthétisé. Le procédé selon l'invention, de production in vitro d'un polypeptide déterminé comprend la culture de cellules établies, dérivées de cellules de mammifères, transformées par un acide nucléique, de préférence un ADN, un ADN complémentaire ou un ARN, contenant une séquence codant pour le polypeptide recherché, ce procédé étant plus particulièrement caractérisé en ce que la culture est réalisée en présence d'une ou plusieurs substances inductrices de la différenciation cellulaire. Il est à cet égard remarquable que les substances qui, au mieux, favorisent la différenciation cellulaire de cellules normales de mammifères, ou plus exactement, freinent la dédifférenciation de ces cellules lorsque celles-ci sont maintenues dans un milieu qui leur est défavorable ou qui, au mieux encore, permettent un certain niveau de redifférenciation de cellules tumorales, se soient révélées capables, lorsqu'elles sont mises au contact de cellules établies transformées en culture, d'amplifier la production d'un polypeptide qui leur est normalement étranger en tant que cette production est liée à l'incorporation d'un ADN normalement étranger au patrimoine génétique des cellules établies. Par "cellules établies", on entend dans le contexte de la présente demande, des cellules dérivées de cellules de mammifères rendues permanentes et dans lesquelles on a incorporé au patrimoine génétique la séquence nucléotidique codant pour le polypeptide recherché, cette séquence ayant été apportée soit par une technique de transformation par génie génétique (notamment par l'intermédiaire d'un vecteur approprié), soit par hybridation avec des cellules primaires de mammifères, notamment dans les conditions qui ont été décrites dans les demandes de brevets français sus-mentionnées. Des formes préférées du procédé selon l'invention pour la production in vitro d'un polypeptide déterminé comprennent la culture en présence de l'agent inducteur de la différenciation - soit de cellules établies, non hybrides de mammifères, cultivables in vitro et capables de se multiplier pendant plusieurs générations, lesdites cellules établies ayant également été rendues capables d'exprimer la séquence codant pour le polypeptide dont l'expression est recherchée, - soit des cellules hybrides obtenues à partir des dites cellules établies et de cellules eucaryotes primaires, plus particulièrement de mammifères, connues pour être le siège de la production du polypeptide dont la production est recherchée. Selon une première forme de réalisation préférée du procédé de l'invention, le produit de différenciation ajouté au milieu de culture desdites cellules est le DMSO. Selon une seconde forme de réalisation préférée de l'invention, le produit ajouté est un polyméthylène bisacétamide comportant de 2 à 8 groupes méthylène. Avantage~--sement, le polyméthylène bisacétamide est le HMBA. Les produits ci-dessus ne constituent que des exemples préféréslentrant dans le cadre de formes de réalisation préférées du procédé selon l'invention. D'autres produits peuvent être en effet utilisés pour la mise en oeuvre de l'invention. Parmi ceux-ci figurent des composés polaires notamment le 1-méthyl-2 pipéridone, le triéthylène glycol, l'acétamide ; des antibiotiques et des agents anti-tumoraux notamment la bléomycine, l'actinomycine C ou D ; des dérivés puriques notamment l'hypoxanthine des acides gras tels que la butyrylcholine, l'acide butyrique. La compréhension des définitions qui précèdent se trouvera facilitée par l'exposé immédiat, à titre d'exemple, des conditions danslesquelles des hybrides cellulaires préférés sont capables, ou ont été rendus capables, de produire des quantités importantes d'un polypeptide vaccinant contre l'hépatite virale B.Dans le cadre de cet exemple préféré, le procédé de l'invention peut se définir comme un procédé de production in vitro de l'antigène HBs du virus de l'hépatite B dans des cultures de cellules eucaryotes, les cellules eucaryotes consistant - soit en des cellules établies (non hybrides) de mammifères, pouvant être cultivées in vitro et capables de se multiplier pendant plusieurs générations, soit en des cellules hybrides obtenues à partir desdites cellules établies et dthépatocytes, comprenant les étapes suivantes - la transformation desdites cellules par un plasmide comportant la séquence nucléotidique du gène codant pour l'antigène HBs, - la sélection des clones produits ayant intégré dans leur génome le gène étranger et l'exprimant, caractérisé en ce que la culture est réalisée en présence de DMSO ou de HMBA. Dans le cadre de cet exemple préféré, et selon une première variante du procédé de l'invention, on intègre le gène dont le produit d'expression est l'antigène HBs dans une lignée de cellules Vero HGPRT , qui ne sont pas naturellement productrices de l'antigène HBs. L'intégration du gène étranger est réalisée par transfection avec un plasmide approprié. Selon une autre forme de réalisation, on cultive des cellules LMTK , préalablement transfectées avec un plasmide contenant la partie du génome de l'HBV dont le produit d'expression est l'antigène HBs. Selon une seconde variante de réalisation du procédé de l'invention, on réalise une culture de cellules hybrides Vero-hépatocytes obtenues à partir de cellules Vero HGPRT préalablement transfectées avec un plasmide contenant le gène responsable de la synthese d'antigène HBs d'une part, et d'hépatocytes de singe, d'autre part. On choisit de préférence des hépatocytes, soit de singe Vervet, soit de singe Babouin. Les cellules hybrides obtenues à partir d'hépatocytes de singe Vervet sont nommées dans ce qui suit cellules b32e. Une souche de cette lignée cellulaire a été déposée à la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes (C.N.C.M) le 25 avril 1985 sous le numéro I-438. Les cellules hybrides obtenues à partir d'hépatocytes de singe Babouin sont nommées dans ce qui suit cellules C 2303. Le clone C 2303 a été déposé à la Collection Nationale de Culture des Micro-organismes (C.N.C.M) le 09 avril 1986 sous le numéro I-542. Pour réaliser la transformation ou la transfection des cellules établies (cellules Vero ou cellules L), des cellules hépatocytaires, avant hybridation de celles-ci, ou encore des hybrides préalablement formés, on peut avoir recours à tout vecteur approprié, notamment un plasmide. Les conditions auxquelles ce vecteur doit satisfaire sont uniquement qu'il permette la transformation effective et l'expression de la séquence d'ADN clonée dans les cellules utilisées. L'homme du métier sera parfaitement à même de choisir les types de plasmides à utiliser, compte tenu de la nature des cellules à mettre en oeuvre dans l'hybridation et, le cas échéant, de la séquence d'ADN à cloner. Selon une forme de réalisation particulièrement préférée de l'invention, le vecteur utilisé est un plasmide contenant la séquence nucléotidique correspondant au gène S et aux régions pré-S1 et pré-S2 du génome du virus de l'hépatite B (HBV). Les régions pré-S1 et pré-S2 répondent à la définition qui en a été donnée par P.Tiollais, P. Charnay, G.N. Vyas (Science (1982) 213, 406). Dans une forme particulièrement préférée de I'invention, le plasmide utilisé (lui-même nouveau et susceptible d'être utilisé dans un environnement distinct de celui du procédé décrit à titre principal dans la présente demande de brevet) contient en outre, inséré entre la séquence nucléotidique dont l'expression est recherchée, notamment une partie du génome de l'HBV et le promoteur sous le contrôle duquel la transformation s'effectue, notamment un promoteur issu du virus SV40, une séquence nucléotidique contenant le promoteur de la sérum-albumine d'un mammifère, tel que le rat (pASA). Avantageusement, ce promoteur est inséré en orientation inverse (pASA4). Si le promoteur de la sérum-albumine de rat, inséré en orientation inverse, permet d'aboutir à un meilleur rendement en HBs synthétisé, il n'en reste pas moins vrai que le plasmide portant ledit promoteur dans la bonne orientation (pASA 7), permet lui-aussi d'obtenir des rendements améliorés en HBs synthétisé. La construction et les caractéristiques de ces différents plasmides seront décrites plus loin. Les recherches réalisées par la Demanderesse ont permis de montrer que la quantité de HBs recueillie dépend de la concentration finale en substance inductrice de la différenciation cellulaire, et dépend également du type de cellules utilisé. Ainsi, dans le cas où le procédé de l'invention est mis en oeuvre avec des cellules Vero HGPRT , la concentration finale en DMSO varie avantageusement entre 0,5 et 2 % en volume, de préférence 1,5 %. Dans le cas où le procédé de l'invention est mis en oeuvre avec des cellules'hybrides Vero-Hépatocytes, la concentration finale en DMSO varie avantageusement entre 0,5 et 4 % en volume. Il existe de la même façon une concentration finale optimale en HMBA ajouté , variant entre 4 et 6 mM. En effet, au-delà de 6 mM, les cellules s'altèrent ou se détachent du support plastique. Il n'est pas besoin de souligner que les intervalles de concentration appropriées pourront chaque fois être déterminés par des essais de routine. Ils peuvent naturellement varier selon la nature des cellules établies utilisées, du produit inducteur de différenciation mis en oeuvre, ou les deux à la fois. La concentration relative à utiliser doit être suffisante pour avoir l'effet amplificateur recherché. Elle ne doit pas dépasser la valeur pour laquelle elle est susceptible d'induire des effets toxiques à l'égard de la culture choisie. D'autres avantages et caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront à la lumière de la description plus détaillée qui suit, de modes de réalisation préférés de l'invention, ainsi que des figures qui s'y rattachent dans lesquelles - la figure 1 est une représentation schématique du plasmide pAESV qui porte la partie du génome du virus de l'hépatite B (HBV) comprenant les régions S et pré-S placées sous le contrôle du promoteur fort du virus simien SV40, - la figure 2 représente schématiquement le plasmide pASA, comportant la séquence nucléotidique correspondant aux régions S et pré-S du génome du virus de l'hépatite B et portant, insérée entre le promoteur du virus SV40 et la partie du génome de l'HBV, la séquence nucléotidique codant pour le promoteur de la sérum-albumine de rat dans la bonne orientation (pASA7) ou dans l'orientation inverse (pASA4): : - La figure 3 est une courbe représentant l'augmentation de la production d'HBsAg dans différents clones de cellules Vero-hépatocytes en fonction de la concentration en DMSO. - La figure 4 est une courbe représentant l'augmentation de la production d'HBsAg dans les cellules Vero-hépatocytes b32e en fonction de la concentration en HMBA. La préparation et les caractéristiques de ces plasmides sont décrites ci-après. 1. Matériel et méthodes Obtention de clones hybrides Vero-hépatocytes porteurs d'une Partie du génome du virus de l'hépatite B (HBV) et l'exDrimant à un niveau élevé On utilise dans les expériences décrites ciaprès des cellules Vero HGPRT (cellules de singe dérivées de cellules déficientes en hypoxanthine guanine phosphoribosyl transférase), obtenues par Lee Cl. Y. et al, (1983) et des hépatocytes (HA) de singe Babouin et Vervet. Origine des ADN transfectés Le plasmide PASV est dérivé du plasmide PAC2 (Pourcel et al, 1982), et porte le gène codant pour la région S du virus HBV (fragment Stu 43 Bal II 1984), l'origine de réplication du virus SV40 ainsi que le promoteur précoce (fragment Pvu II 253 HindIII 5154). Le fragment pBR322 est délété entre 1120 et 2490 (EcoR1 4360 - Sal I 650) (lusky et al, 1981) Le plasmide pAESV porte le gène codant pour les régions S, pré-S1 et pré-S2 du virus HBV (fragment ABal II 2837-1984), inséré au site BamHI du plasmide pSKS107 (Shapira S.L, et al, Gene. (1983), 25, 71-82) ainsi que le fragment HindîlI EcoR1) d'un plasmide pML2 (Lusky M., et Botchan M., Nature (1981) 293, 79-81) contenant le promoteur précoce du virus SV40. (figure 1). Les plasmides pASA4 et pASA7 portent en outre, inséré au site HindIII de pAESV, le promoteur de la sérum-albumine de rat dans le bon sens (pASA 7), et dans le sens inverse (pASA 4) (figure 2). Le plasmide pASA 4 a été déposé à la Collection Nationale de Culture des Micro-organismes (C.N.C.M) le 02 avril 1986 sous le numéro I - 538. Les cellules Véro ont été co-transfectées selon la méthode décrite par Graham R. et Van der Eb A., Virology (1973) 52, 456-467) par de l'ADN provenant de deux vecteurs, l'un (plasmide pW) portant le gène de l'aminoglycoside-3'-phospho-transférase (APH3'), l'autre portant une partie du génome de virus HBV (plasmides pAESV, pASV, pASA4, ou pASA7). On donn ci-après la partie du génome de l'HBV contenue dans chaque plasmide utilisé, le clone correspondant et la production en antigène HBs (HBsAg), expri 2 mée en ng/24h/25 cm2, des cellules transfectées expri- mant l'enzyme APH3', après sélection par addition de 400 pg/ml d'aminoglycoside G418 selon la méthode décrite par Colbère - Garapin F. et al (J. Mol.Biol. (1981), 150, 1-14). ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ clone Plasmide Production cellules Vero de HBs Ag 2 (ng/24h/25 cm du clone Vero 273 c20 PAESV : promoteur SV40 et séquence S + pré-S 15 284 16 PAESV : " " 40 285 5 PASA 4 : promoteur SV40 + séquence S + pré-S + promoteur de sérum albumine en orientation inverse. 50 285 6 PASA 4 : " " 26 286 6 PASA 7 : promoteur SV40 + séquence S + pré-S + promoteur de sérum albumine bien orienté 10 V3 PASV : promoteur SV 40 + séquence du gène S 80 - Isolement des cellules héPatocvtaires. fusion avec les cellules Vero HGPRT Les Hépatocytes (HA) de Singe Babouin et Vervet ont été isolés du foie en présence de Collagénase selon la méthode décrite par SEGLEN (1973), avec quelques modifications : Guguen, Guillouzo et al (1980, in Vitro 16), J.F. Houssais et N. Chenciner (1983, C.R. Acad. Sci. Paris, tome 297, série III, 497-500), et mis en culture dans le milieu HAM F12 , (contenant Sérum-albumine, insuline et hydrocortisone, ainsi que 10 % de Sérum de veau foeial). Après l'attachement des hépatocytes sur le support plastique, on ajoute dans le milieu les cellules Vero HGPRT dont les numéros de clones ont été indiqués ci- dessus. Le processus de fusion intercellulaire est induit 15 heures plus tard par le polyéthylène glycol selon la méthode décrite par Davidson R.L et Gerald P.S.(1976, Somatic Cell Genetics Vol. 2, n-2, 165-176). les cellules sont passées dans le milieu sélectif HAT tLittlefield, 1964) le jour suivant, puis repiques au 1/5 en milieu HAT. Dans ces expériences, deux cultures d'hépatocytes ont été utilisées pour chaque clone de cellules Vero. Chaque série a donc donné lieu après le repiquage au 1/5 en HAT à 10 cultures. Après sélection, environ 20 à 25 clones se développaient dans chaque culture. Il s'ensuit que dans cette expérience environ 200 à 250 clones Véro-hépatocytes étaient théoriquement utilisables. La présence d'HBsAg est détectée à l'aide de tests radioimmunologiques (RIA) (AUSRIA, Abbott), en utilisant les clones à confluence ayant un ratio élevé et par rapport à une courbe étalon établie par dilution du standard d'HBsAg de Abbott. 2-.Niveau d'expression obtenu du gène S seul. et du crène S avec la région pré-S dans les clones hvbrides Véro-hépatocytes a) RaPPel concernant la cellule b32e. - Hybride hépatocyte de Singe Vervet/cellules Véro HGPRT préalablement transfectées par le plasmide PASV (clone V3) déposé à la C.N.C.M le 25 avril 1985 sous le numéro I-438. - Cette lignée, actuellement à son 39è passage, a un niveau de production de l'antigène HBs extrêmement stable, aux environs de 700-900 ng/24h/ pour 25 cm2. Elle a subi, par exemple, les tests suivants maintenue en culte "roller" pendant 4 mois (sans repiquage) la production journalière de l'antigène HBs a été en moyenne de 24 pg/24h. pour 875 cm2, maintenue à confluence pendant 7 jours, sans changement de milieu la production de HBsAg est linéaire, au rythme constant de 880 ng/24h/25 cm2. b) Cas des hybrides Vero-héPatocvtes obtenus à Partir des cellules Vero 285.5 et 285.6 Les tableaux I et II ci-après montrent les résultats du dosage de l'HBsAg produit par les clones des séries C et D ayant des ratios élevés (entre 60 et 90), par rapport aux cellules Vero de départ. La série C correspond aux lignées cellulaires résultant de l'hybridation entre les cellules Vero HGPRT 285.5 et les hépatocytes HA de singe Babouin. Le tableau Ia ci-après montre la quantité d'antigène HBs produit par les clones de la série C, le coefficient multiplicateur étant exprimé par rapport à la surface. Le tableau Ib ci-après montre la quantité d'antigène HBs produit par les clones de la série C, le coëfficient multiplicateur étant exprimé par rapport à 106 cellules. TABLEAU Ia Série C : 8 clones isolés N clone dosages Moyenne coeff. (en ng/24h/25 cm2) (ng/24h/25cm2) multipli (dans exp. indépendantes) cateur Cell .285.5 (50ng/24h/ 25cm2) C 1101 648,616,800,621,680,720 680 x 13 C 1102 285 285 x 5,7 C 1103 1309,903,1059,640,608,960 913 x 18 C 2204 468,584 526 x 10 C 2205 606,588,680,715,700 657 x 13 C 2302 243 243 x 4,8 C 2303 878,740,956,784,680 807 x 16 C 2304 462,600 531 x 10 TABLEAU Ib N N du clone ng HBs Ag/ coefficient du repiquage 24h/106 multiplicateur cellules /106 cellules* 24 ième C 1101 736 46 22 ième C 1103 1119 70 21 ième C 2205 1382 86 22 ième C 2303 1447 90 6 * Cellules 285.5 = 16 ng HBs Ag/106 cellules. la série D correspond aux lignées cellulaires résultant de l'hybridation entre les cellules Vero HGPRT 285.6 et les hépatocytes HA de singe Babouin. Le tableau IIa ci-après montre la quantité d'HBAg produit par les clones de la série D, le coefficient multiplicateur étant exprimé par rapport à la surface. Le tableau IIb ci-après montre la quantité d'HBAg produit par les clones de la série D, le coefficient multiplicateur étant exprimé par rapport à 106 cellules. TABLEAU IIa Série D : 10 clones isolés clone Dosages HBs Ag Moyenne Coeff. (ng/24h/25 cm2) (ng/24h/25cm2) multipli teur (cell. 285.6) 26ng/24h/ 25 cm2 D 1102 104,140 122 x 4 D 1209 263 263 x 10 D 2102 336,400 368 x 14 D 2103 415,390 402 x 15 D 2201 233,240,245 239 x 9 D 2203 449,348,355 384 x 14 D 2205 455,354 404 x 15 D 2401 310,261 285 x Il D 2502 468,468,485,396 454 x 17 D 2504 477,468,543,542 507 x 19 TABLEAU IIb N N' du clone ngHBsAg/ Coefficient du repiquage 24h/106 multiplicateur 6 * cellules /106 cellulesx 22 ième D 2103 1243 155 20 ième D 2203 214 26 18 ième D 2401 413 51 21 ième D 2504 513 64 cellules 285.6 = 8 ng HBs Ag/106 cellules. L'étude de ces tableaux montre en premier lieu que la production d'HBsAg augmente après hybridation avec les hépatocytes. D'autre part, l'orientation du promoteur de la sérum-albumine semble être un élément important, déterminant le niveau d'expression des séquences voisines (gène S + pré-S). - Dans la bonne orientation, le gène S est exprimé, mais à un niveau faible (il convient de souligner toutefois, que le niveau d'expression de la cellule Véro de départ est de 2 à 4 fois plus bas que celui des autres clones Véro utilisés), - dans l'orientation iverse, on obtient avec une fréquence élevée des clones ayant une très bonne expression du gène S. Cet effet est observé dans deux expériences indépendantes (série C et D). On note cependant un parallélisme entre le niveau d'expression des clones hybrides et celui de la cellule Véro correspondante de départ : l'expression des clones hybrides de la série C est plus élevée que dans la série D ; la cellule Véro 285.5 (Série C) synthétise également plus de HBs Ag que la cellule Véro 285.6 (série D). Au terme de cette expérience, des clones de cellules hybrides Véro-hépatocytes porteurs des régions S et pré-S produisant près de 1 pg/24h/25 cm2 ont été isolés. 3- Auamentation de la Production de HBsA9 dans les cellules Par action de substances inductrices de la différenciation cellulaire a) Action du DMSO sur le niveau d'exPression du qène S. dans les clones de cellules L et Véro, aPrès transfection et intéaration du gène. Des cellules LMTK (clone 1D) (cellules des souris dérivées du clone L 929, déficientes en thymidine kinase, poussant dans du milieu de Eagle modifié par Dubelcco supplémenté par 10 % de sérum de veau et déposées le 5 mars 1984 à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (C.N.C.M) sous le numéro I-283, ont été co-transfectées de la même façon que celle décrite ci-dessus pour les cellules Véro HGPRT-. 1. Action du DMSO sur l'expression du gène S dans les cellules LM TK (clone 1D) après transfection des plasmides PASV (cellules 12.215). pASA4 (cellules 4.15) et PASA 7 (cellules 42.15) Deux boites de cellules sont passées à la même densité pour chaque lignée cellulaire. Après 3 jours, le milieu est changé ; une boîte sert de témoin, l'autre est mise dans un milieu contenant 2 % de DMSO. La présence de HBs Ag dans le milieu surnageant, est dosée à des temps variables, par la méthode AUSRIA telle que décrite précédemment. Les résultats sont les suivants N clone Plasmide Période du Dosage de HBsAg LM TK transfecté test(jours) (ng/25cm2/24h) Cl.12.215 PASV J13 J16 témoin 736 + 2 % DMS0....570 Cl. 4.15 pASA 4 J 11 témoin 578 + 2 t0 DMSO...1078 Cl.42.15 pASA 7 J 4 J 7 témoin 680 + 2 % DMS0....640 2. Action du DMSO sur l'expression du gène S dans les cellules Véro HGPRT après transfection avec les plasmides PASV (cellules 201.3). pAESV(cellules 284.16), et PASA 4 (cellules 285.5). Deux boites de cellules sont passées à la même densité pour chaque lignée cellulaire. Après 3 jours en milieu normal, le milieu est changé : une boîte sert de témoin, l'autre est mise dans un milieu contenant 1.4 de DMSO. La présence de HBs Ag est dosée dans le milieu surnageant par AUSRIA, à des temps variables. Les résultats obtenus avec les cellules Véro sont les suivants N clone Plasmide période du dosage de HBs Ag Véro transfecté test(ours) (ng/25cm2/24h) Cl. V3 PASV J10-13 témoin 93 1,4 % DMSO : 1106 (x 11,8) Cl. 284.16 pAESV J14-18 témoin. .140 1,4 % DMS0:180 (x 1,2) Cl. 285.5 pASA 4 J4-7 témoin.:280 1,4 % DMSO : 1380 (x 4,9) 3. Action de différentes concentrations de DMSO sur la production de HBs Aa dans le clone Véro 285.5 (isolé après transfection du plasmide pASA 4) Les conditions de culture et de dosage~sont celles décrites dans le paragraphe précédent. Le DMSO a été utilisé à O % (témoin), 0,1 %, 1 % et 1,5 Les résultats des dosages de HBs Ag sont exprimés en ng/25 cm2/24h. Période du test témoin concentration en DMSO ajouté (nombre de sans DMSO) jours de culture) 0,1 % 0,5 % 1 % 1,5 % J4-8 85 184 341 624 1730(x20 J8-11 109 149 404 1066 1309(x12 J11-15 123 123 360 800 1680(x13 b- Action du DMSO sur le niveau de Production de l'antigène HBs. Par les hybrides Vero-hépatocytes. 1- Action du DMSO sur les cellules b32e. Action du DMSO à la concentration de 2 % dans le milieu de culture. Les conditions standard ont été les suivantes les cellules étant à confluence, le DMSO est ajouté à la concentration finale de 2 % , et la culture est mise à 37-C. 24 heures plus tard, le milieu est récolté et le dosage effectué. Le résultat est comparé au contrôle. Les résultats ont été les suivants - sur 7 expériences contrôle : 730 ng/24h/25 cm2 - + 2 % de DMSO : 1444 ng/24h/25 cm2 Il y a -donc avec-cette cellule un doublement immédiat de la production de HBs Ag, dès l'addition du DMSO. Si le DMSO est laissé plusieurs jours, l'expression du gène se poursuit à ce même niveau. Il est d'autre part possible de cultiver en continu les cellules b32e en présence de 2 % de DMSO. Les cellules se multiplient, leur morphologie n'est pas modifiée. Au sixième repiquage et à confluence, elles produisent 1 545 ng/24h/25 cm2 d'antigène HBs. Action de différentes concentrations de DMSO sur la Production de l'antigène HBs excrété dans le milieu de culture Les conditions du test sont celles décrites dans le paragraphe précédent. Le test est effectué pendant 24 heures, à compter de l'addition du DMSO dans le milieu de culture. La gamme de concentration utilisée a été la suivante O %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 4 Ct, 6 Après 24 heures, les cellules ont été comptées, et l'HBs Ag est dosé dans les milieux de culture. La morphologie des cellules n'est pas modifiée, même à 4 % de DMSO. Une partie des cellules se détache du support plastique, à une concentration en DMSO de 6 %. Les résultats de cette expérience sont les suivants s DMSO ng HBs/24h/106 cellules contrôle 0 346 0,5 358 1,0 502 2,0 908 4,0 819 2- Action du DMSO sur les cellules C 1101. C 1103. C 2205. C 2303. D 2502. D 2504 Les résultats sont montrés sur la figure 3 ci-après. Il apparait que le niveau d'expression du gène S et de la région pré-S est multiplié de 2 à 2,5 fois. Le niveau maximum est obtenu avec une concentration en DMSO de 1,5 %, exprimée par rapport au volume. Le DMSO a été ajouté au milieu de culture, les cellules étant à confluence dans des flacons Falcon T25, à des concentrations finales variant de O (témoin) à 1,5 en volume, puis laissé au contact des cellules pendant 24 heures. L'augmentation de la production de HBs Ag est exprimé en % en prenant pour base la quantité de HBs Ag produite par les cellules en absence de DMSO. La numérotation des 6 clones testés est indiquée sur la figure. -Le retour au niveau de produ-ction habituel de HBsAg est obtenu en 48 heures environ lorsque leDMSO est retiré du milieu de culture, tant avec les lignées Vero, V3 et 285.5, qu'avec les hybrides Vero-hepatocytes b32e et C 2303. Les résultats expérimentaux permettent de souligner un certain nombre de points - la production de l'antigène HBs par les cellules en culture (cellules Vero, et hybrides-Vero-hépa- tocytes) peut être multipliée de 2 à plus de 10 fois, par adjonction de DMSO dans le milieu de culture, - en présence de DMSO, le clone Vero 285.5 atteint des niveaux de production similaires à celui de l'hybride Vero-hépatocyte C 2303, - toutes les cellules ne semblent pas répondre de la même façon à l'action du DMSO, par exemple, les cellules L semblent etre réfractaires, - la dose optimale de DMSO doit etre définie pour chaque type cellulaire :: 1,5 % pour les cellules Vero, 2 2 à 4 % pour les cellules hybrides Vero-hépatocytes, - la rapidité d'action du DMSO semble aussi dépendre du type cellulaire : action quasi-immédiate et maximale, dès les premières 24 heures pour les hybride b32e, C 2303, action maximale après 3 jours pour les cellules Vero, - en présence de DMSO, la morphologie cellulaire est parfois modifiée, - l'action du DMSO est proportionnelle à la dose utilisée dans les limites acceptées par la cellule cette action est réversible, - les immunoprécipitations faites sur les particules d'HBs Ag produites en présence et en absence de DMSO montrent que les peptides synthétisés ne sont pas affectés par la drogue. C Action du HMBA sur le niveau d'expression du crène S dans des clones de cellules hybrides Vero-hépato- cotes. Les cellules utilisées sont les cellules hybrides Vero-hépatocytes : b32e, C 1103, C 2303, C 2205, telles que décrites ci-dessus. Les conditions de culture sont les mêmes que précédemment milieu F12 + HAT, avec les cellules à confluence dans les flacons FALCON de 25 cm2 Le HMBA est utilisé aux concentrations finales de 2 à 10 mM dans le milieu de culture. Le mode opératoire est le même que celui utilisé avec le DMSO : addition de HMBA au milieu de culture, soit pendant 24 heures, soit pendant 3 jours. Les résultats du dosage de HBsAg dans le milieu de culture 2 sont exprimés en ng/24h/25cm Comme pour le DMSO, l'effet de HMBA est quasi immédiat et constant dans le temps : pour une concentration donnée en HMBA, la production de l'antigène HBs en 24 heures est la même après les 24 premières heures, ou après contact pendant 3 jours. Les clones issus d'une même expérience (série C) réagissent de façon similaire au DMSO et ou HMBA, dans l'ordre décroissant C 1103; C 2303 et C 2205. Comme pour le DMSO, il existe une concentration optimale au-delà de laquelle les cellules s'altèrent ou se détachent du support plastique. La concentration du DMSO se situe autour de 1,5 à 2 % (210-280 mM) selon les cellules ; pour le HMBA la concentration optimale se situe aux environs de 4 à 6 mM ; au-delà les cellules se détachent et lE test d'expression perd sa signification. Le HMBA comme le DMSO) augmente le niveau d'expression apparenre du gène S - à 6 mM, la production de HBsAg est multipliée par 3 dans les cellules b32e. - à 4 mM HMBA, la production de HBsAg est. multipliée par 1,5 à 2 dans les cellules C 1103, C 2303, C 2205.- L'effet est proportionnel à la dose utilisée dans les limites acceptées par les cellules. La figure 4 ci-après montre les résultats expérimentaux obtenus avec les cellules Vero-hépatocytes b32e pour différentes concentrations en HMBA. Le HMBA a été ajouté au milieu de culture de cellules b32e à confluence dans des falcons Falcon T25. Les concentrations finales de HMBA sont comprises entre O (témoin) et 10 mM. Les dosages de l'antigène HBs sont effectués dans les milieux après contact des cellules avec le HMBA pendant 24heures. L'augmentation de la production HBs Ag est exprimée en %, en prenant pour base la quantité produite d'antigène dans les cultures témoins. Les points correspondants aux symboles&commat;,n ,\, représentent trois expériences indépendantes. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite Elle en embrasse au contraire toutes les variantes. Dans l'exemple préféré qui précède, la séquence d'ADN déterminée était contituée, pour l'essentiel, par le gène S et les régions pré-S1 et pré-S2 de l'HBV. Il va de soi que cette séquence peut être remplacée par d'autres séquences. Le procédé selon l'invention peut en effet être utilisé avec avantage dans tout système cellulaire, transformé ou non, portant dans son génome un ou plusieurs gènes transfectés ou non dont on cherche à optimiser le niveau d'expression. Les tableaux III et IV ci-après donnent à titre d'illustration et, d'une manière non limitative, d'autres exemples de cellules eucaryotes utilisables dans le procédé de l'invention ainsi que d 'autres exemples d'application de l'invention respectivement. Les polypeptides produits par le procédé de l'invention, notamment quand il s'agit d'antigènes, sont utilisables avec avantage dans une méthode de diagnostic pour l'homme ou l'animal. Ils sont également utilisables, quand ils sont introduits chez l'animal, pour la production d'anticorps protecteurs contre cet antigène. TABLEAU III EXEMPLES DE CELLULES EUCARYOTES UTII,ISABLES DANS LE PROCEDE DE L'INVENTION - Cellules CHO - cellules hybrides lymphocytes B-plasmocytomes, hybridomes - cellules hybrides Véro-lymphocytes B et/ou T - lymphocytes B et cellules dérivées - lymphozytes T et cellules dérivées - macrophages - fibroblastes - cellules en culture primaire (rein, hypophyse, pancréas :) hybridées ou non avec une autre cellule. TABLEAU IV EXEMPLES D'APPLICATIONS DU PROCEDE SELON L'INVENTION Production d'une Protéine à nartir d'un crène cloné - Antigène de surface de HBV, Herpès I, II.. - protéines antigéniques de Rétrovirus - Sérum albumine - facteur de coagulation : Prothrombine, Facteur VIII, IX, protéine C... - anticorps monoclonaux - insuline - hormone de croissance - interférons - interleukines 1, 2 et leurs inhibiteurs, CSF (colonies stimulating factor) - Facteur de croissance, EGF... - Facteurs antitumoraux, TNF... - Erythropoïetine - Facteur régulant la tension artérielle... REFERENCES 1. 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Procédé de production in vitro d'un polypeptide déterminé, comprenant la culture de cellules établies, dérivées de cellules de mammifères, transformées par un acide nucléique, de préférence un ADN, un ADN complémentaire ou un ARN, contenant la séquence codante pour le polypeptide recherché, caractérisé en ce que la culture est réalisée en présence d'une ou plusieurs substances inductrices de la différenciation cellulaire. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture contient du diméthylsulfoxyde. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture contient un polyméthylène bisacétamide comportant de deux à huit groupes méthylène. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le polyméthylène bisacétamide est l'hexaméthylène bisacétamide. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les cellules établies sont choisies dans le groupe comportant notamment les cellules Vero, les cellules L, les cellules CHO. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les cellules hybrides sont choisies dans le groupe comportant notamment les hybrides Vero-hépatocytes, lymphocytes B-plasmocytomes, Vero-lymphocytes. 7. Procédé de production invitro de l'antigène HBs du virus de l'hépatite B dans des cultures de cellules établies, dérivées de cellules de mammifères et consistant - soit en des cellules Vero pouvant être cultivées invitro et capables de se multiplier pendant plusieurs générations, - soit en des cellules hybrides obtenues à partir desdites cellules Vero et d'hépatocytes, comprenant les étapes suivantes - la transformation desdites cellules par un plasmide comportant la séquence D'ADN codant pour le gène dont le produit d'expression est l'antigène HBsAg, - la sélection des clones produits ayant intégré dans leur génome le gène étranger et l'exprimant, caractérisé en ce que la culture est réalisée en présence de DMSO ou du HMBA. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la concentration finale en DMSO dans une culture de cellules Vero varie d'environ- 0,5 à environ 2 % en volume, avantageusement est d'environ 1,5 %. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la concentration finale en DMSO dans une culture de cellules hybrides Vero-hépatocytes varie d'environ 0,5 % à environ 4 % en volume. 10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la concentration finale en HMBA varie d'environ 4 à environ 6 mM.