FR 2601141 A1 19880108 FR 8609628 A 19860702 PRODUIT DE COUPLAGE A BASE D'HAPTENE, UTILE NOTAMMENT COMME SUBSTANCE IMMUNOGENE. ANTICORPS CORRESPONDANTS ET APPLICATIONS La présente invention concerne un produit de couplage à base d'haptene, l'application de ce produit de couplage comme substance immunogène, laquelle est destinée à être mise en oeuvre dans un procedé d'obtention de lignées cellulaires hybrides murines anti-hapténes.L'invention concerne également les anticorps anti-haptenes produits par ces lignées cellulaires hybrides, ainsi que les applications biologiques de ces anticorps, notamment au dosage de ces haptènes On sera amené à utiliser, dans la présente description, l'expression "haptènes AES" qui désigne des haptènes dont le squelette comporte un ou plusieurs cycles et présente au moins un groupement amino exocyclique substitué, lesdits haptènes répondant à la formule Z-(reste amino exocyclique substitué > ou Z représente le squelette desdits haptènes, lequel peut comporter d'autres substituants. On sera également amené à utiliser, dans la présente description, l'expression "haptène AENS", qui signifie "haptène à groupe exocyclique amine non substitué", autrement dit des haptenes dont le squelette correspond å celui des haptènes ABS, mais portant un groupement NW à la place du groupement exocyclique amino substitué. Conformément à la présente invention, les haptènes AES sont notamment constitués par des médicaments lipophiles, porteurs de groupes aminés substitués, en particulier par un reste alkyle. Un exemple particulièrement intéressant est fourni par les médicaments antipaludéens, dont la serie la plus importante est représentée par les drivés de l'amino-4 quinoléine. L'intérêt des anticorps polyclonaux ou monoclonaux anti-médicaments est manifeste à plusieurs niveaux. Ils représentent le moyen le plus fiable pour effectuer des dosages spécifiques de ces médicaments : de nombreuses méthodes utilisent désormais ces réactifs immunologiques. Dans certains cas, ces anticorps peuvent étre utilise en tant que thérapeutique antidotique. Enfin, la reconnaissance de ces molécules par des anticorps spécifiques apporte de nouvelles informations sur le mode d'interaction ligandmacromolecule. La limitation de l'emploi d'anticorps antimédicaments tient à leur difficulté d'obtention et a leur faible affinité pour les inédicaments, qui sont géneralement des molécules de petite taille (KA = 105 à 107 M-1). Dans le cas des médicaments à activité antipaludéenne précités, la chloroquine, qui est le principal composé du groupe, présente une importante toxicite. Une toxicité à long terme conduit à des syndromes cérébraux, dermatologiques, myopathiques et psychiatriques, mais les complications le plus sérieuses sont représentées par la rétinopathie et la maculopathie. D'autre part, la toxicité aiguë de la chloroquine est maintenant bien connue, en liaison avec la fréquence élevée des tentatives de suicide réalisées avec ce médicament. L'intoxication est observée après absorption de doses supérieures à 30 mg/kg, responsable d'arrêts cardiaques. Le décès a lieu pour approximativement 12% des cas dans lesquels les individus ont pris des doses importantes.Ainsi, la toxicité a entrai né la synthèse de différents dérivés, dans le but d'obtenir des médicaments antipaludéens non toxiques. Malgré les informations importantes recueillies au sujet de ce médicament durant ces trente dernières années, aucune méthode analytique simple, spécifique et sensible n'a été proposée. Les dosages de routine de la chloroquine sont réalises par des techniques fluorimétriques, qui nécessitent une étape d'extractIon. Le coefficient de variation considérable entre les differentes méthodes a suggère l'obtention d'anticorps anti-médicaments spécifiques du médicament, de façon à obtenir une méthode immunologique simple. Cependant, comme indiqué ci-dessus, les anticorps anti-médicaments présentent l'inconvénient de posséder une faible affinité pour les médicaments. C'est pourquoi, dans la présente invention, il a été envisagé d'améliorer cette affinité par l'emploi d'un couplage judicieux entre un analogue du médicament et une protéine porteuse. On sait que de nombreux médicaments sont des haptènes ABS au sens de l'invention, autrement dit qu'ils sont porteurs d'au moins une chaîne latérale comportant un groupement amino exocyclique substitué. Dans ce cas, cette chaîne latérale peut être remplacée par un lien réalisé par un agent de pontage. Ce lien mime alors une liaison entre deux atomes d'azote par une chaîne carbonée.Les anticorps obtenus présentent une affinité médiocre pour le dérivé non substitué et une affinité élevée pour le dérivé substitué, representé par le médicament a doser. De nombreuses autres classes thérapeutiques peuvent bénéficier de cette approche originale, à condition que l'on puisse obtenir la molécule aminée non substituée La présente invention a donc d'abord pour objet un produit de couplage, å l'aide d'un agent de pontage, entre une molécule porteuse et un haptène, dont le squelette comporte un ou plusieurs cycles et présente au moins un groupement amino exocyclique non substitué, ledit haptène, appelé haptène AENS, répondant à la formule Z-(reste amino exocyclique non substitué > , où Z représente le squelette dudit haptene, lequel peut comporter d'autres substituants. L'agent de pontage est notamment un dialdehyde, par exemple un dialdéhyde représenté par la formule OCH- A- CHQ dans laquelle A représente une chai ne hydrocarbonée pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes . Cet agent de pontage pourra etre choisi parmi le glutaraldéhyde, le glyoxal et l'aldéhyde malonique. La molécule porteuse sera notamment une protéine. On indiquera ci-après le schéma genéral de cette réaction de couplage OCH-A-CHO ZNH ---------# Z-N=C-A-C=N-P (Haptène AENS) PNH2 (Immunogène) Dans ce schéma, Z et A sont tels que définis cidessus, et PNH2 est notamment une protéine porteuse. La présente invention a également pour objet une substance immunogène permettant d'obtenir des anticorps dirigés contre des haptènes AES tels que définis ci-dessus, cette substance immunogène étant caractérisée par le fait qu'elle est constituée par le produit de couplage tel que défini ci-dessus.. Conformément à une caractéristique intéressante de la présente invention, l'agent de pontage, qui est utilise pour la préparation de produit de couplage, est choisi pour que le pont formé entre la molécule porteuse et l'haptène AENS mime la chaîne latérale formée par le groupement amino exocyclique substitué des haptènes AES. Par conséquent, on choisira, de préférence, l'agent de pontage de manière que la longueur de chaîne qu'il introduit dans le produit de couplage soit similaire à celle des haptènes AES en question.. De la sorte, on obtiendra une meilleure reconnaissance dudit haptène AES par l'anticorps. On mentionnera particulièrement les substances immunogênes destinées à l'obtention d'anticorps dirigés contre des médicaments lipophiles de petite taille, la substitution sur le groupe amino tel que défini ci-dessus étant notamment une substitution par un reste alkyle. En particulier, on mentionnera les substances immunogènes destinées à l'obtention d'anticorps dirigés contre les médicaments antipaludéens, dérivés de l'amino-4 quinoléine, de telles substances étant caractérisées par le fait qu'elles résultent du couplage de l'amino-4 chloro-7 quinoléine, comme haptène AENS, et d'une molécule porteuse par l'action du glutaraldêhyde. La molécule porteuse peut entre, entre autres, l'hémocyanine de patelle. Si l'on compare le groupement exocyclique aminé substitué de la chloroquine par exemple (dont la formule développée est indiquée dans le tableau I ci-après): avec le pont formé par une molécule de glutaraldéhyde dans l'immunogène correspondant on constate que ce pont mime la chaîne précitée. Dans cet exemple, on constatera ainsi qu'une forme de polymérisation du glutaraldéhyde mime la chaîne latérale d'un autre médicament de cette série, à savoir l'amodiaquine (dont la formule développée est également indiquée dans le tableau I ci-apresA. Le procéde conforme a la présente invention, pour l'obtention de lignées cellulaires hybrides mutines antihaptènes AES est caractérisé par le fait qu'il consiste a effectuer la fusion de splénocytes de souris immunisées a l'aide de la substance immunogène telle que définie ci -dessus, et de cellules de myélome de souris. En particulier, ce procédé comprend les étapes consistant à : (a) immuniser des souris avec la substance immunogène telle que définie ci-dessus (b) prélever la rate des souris immunisées et séparer les splénocytes ; (c) réaliser la fusion des splénocytes ainsi obtenus avec des cellules de myélome de souris en présence d'un promoteur de fusion (d > cultiver les cellules hybrides obtenues dans un milieu sélectif sur lequel ne se développent pas les cellules de myélomes non fusionnées et en présence d'éléments nutritifs appropriés (e) sélectionner les cellules produisant l'anticorps désiré et réaliser,le cas échéant, le clonage de ces cellules. En particulier, à l'étape (a) sus-indiquee, on peut réaliser l'immunisation des souris par une première injection de l'immunogène par voie sous-cutanee, par deux injections de rappel par voie intrapéritonéale respectivement deux et quatre semaines après la première injection, et par une dernière injection, par voie intraveineuse, six semaines après la premiere injection. A l'étape (c,, on réalise avantageusement la fusion en utilisant environ une cellule de myelome pour quatre cellules de splénocyte en présence de polyéthylene- glycol d'un poids moléculaire d'environ 1000. A l'étape (e), on sélectionne les souches hybrides par une méthode immunologique appropriée à la détection d'anticorps dirigés contre les haptènes AES (par exemple, par une methode ELISA, puis par une méthode radioimmunologique). La présente invention porte également sur les lignées de cellules hybrides murines produisant des anticorps anti-haptènes AES, obtenues par le procédé qui vient d'étre défini. De même, l'invention porte sur ces anticorps qu'ils soient polyclonaux ou monoclonaux,en particulier sur les anticorps monoclonaux anti-médicaments antipaludéens dérivés de l'amino-4 quinoléine produits par la lignée cellulaire clonée déposée le ler juillet 1986 å la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes de l'institut PASTEUR - PARIS, sous le n I-577. Les anticorps selon l'invention sont appliqués notamment au dosage des haptènes AES. L'invention va être maintenant décrite plus en détail par les exemples illustratifs mais non limitatifs ci apyres. On a indiqué, dans le tableau I ci-dessous, la liste des dérivés de la quinoléine mis en oeuvre dans cette partie expérimentale, ainsi que leurs formules structurales respectives et les abreviations utilisées ci-apres pour ces dérives. TABLEAU I M C.S t I I Ey[:PPtE I I I Amino-4 chloro-7 I I quinoléine I - I I . I Nz I Chloroquine I I Hydroxy- N I I HGI > I chloroquîne 1HN t chloroquine I ho CH / ZCH2OIl C I N-desthyl- C I I îÀÇ 1 I chloroquine I SN Y \~' \ NoC'r I I r3 N N I Ainodiaquine I'JNowNNcÉlÏ\î I- AD I Propylamino-4 CÉ\r$; i Ce I I I I pC I chloro-7 quinoléine M6floquine I X I M F Q CI,C H 0s,/H $ I Quinine I pO. $Q I 62NE i "ir I I I Méthyl-7 C 1 7 - M I I quinoléine I I I I I I I I Hydroxy-8 I I I I I I 8-H I I quinoléine I Par ailleurs, les abréviations "KLH", "CMECDI", "BSA" et "BBS" signifient respectivement:: -l'hémocyanine de patelle; -le N-cyclohexyl-N'-(2-morpholino-éthyl)-carbodiimide méthyl-p-toluène sulfonate; -la sérum albumine bovine;et -une solution saline tamponnée de bicarbonate. PREPARATION DE L'IMMUNOGENE Cet immunogène est constitué par le conjugué ACQ XLH (agent de pontage : glutaraldéhyde). KLH (5 mg) a été dissous dans 800 l de BBS 0,1 M, pH 9,5. ACQ (4,5 mg) a été dissous dans 40 l de dioxanne, avant de compléter à 200 l avec BES 0,1 M. 40 l de la solution de ACQ ont été combinés avec la solution de KLH, et 100 l d'une solution de glutaraldéhyde à 25% ont été ajoutés a ce mélange sous agitation douce. Le mélange reactionnel a été maintenu à la température ambiante pendant 2 heures. On a fait passer le conjugué résultant sur une colonne PD10 de Sephadex-G-25M, préalablement équilibré avec BES 0,01M, pH 7,4. Les fractions combinées contenant le conjugué ont été divisées en fractions de 0,5 ml et stockées à -80 C. Préparation d'un conjugué : hémisuccinate de ECLO- BSA. L'hémisuccinate de HCLQ a été préparé comme suit 400 mg d'anhydride succinique ont été dissous dans 40 ml de dioxanne et 2 nil de triéthylamine ont été ajoutés. Ensuite, on a introduit dans le récipient de réaction, .335 mg de HCLQ, dissous dans 1O ml de dioxanne. On a agité doucement la solution résultante, à la température ambiante, pendant deux heures. On a estimé que la succinylation etait achevée par chromatographie sur couche mince sur gel de silice fluorescent a l'aide de CHCl@/MeOH/NH4OH (V/V/V: 15/2/0,2) comme solvant. Les valeurs de référence frontale trouvées pour HCLQ et HCLQ succinylé étaient respectivement de 0,5 et de 0,19.Ensuite, le milieu réactionnel a eté séché, redissous dans 10 ml de méthanol et passé sur une colonne remplie de gel de silice et équilibree par du méthanol (200 x 15 mm). Les fractions, contenant l'hémisuccinate de HCLQ, ont été détectées par absorption UV (absorption à 280 nm) et identifiées par chromatographie sur couche mince. Le résidu sec a été utilisé pour la préparation du conjugué Une solution d'hémisuccinate de HCLQ (0,6 mg), BSA (3 mg) et CMECDI (0,7 mg) dans du PBS 0,01M, pH 7,4 ont été combinés et amenés à un volume final de 1 ml. On a fait incuber pendant toute une nuit å 4 C. Le conjugué résultant a été purifié sur une colonne Sephadex G-25M, puis stocke à -80 C. PROTOCOLE D'IMMUNISATION Trois souris Biozzi hautement répondeuses âgées de six semaines, ont été immunisées par le conjugué ACQ-KLH. Le mode opératoire suivant a été utilisé - 20 g (exprimés en hapténe) ont été injectés par voie sous-cutanée dans l'adjuvant complet de Freund (1:1) - 2 et 4 semaines plus tard, la même quantité d'immunogène a été injectée par voie intrapéritonéale dans l'adjuvant incomplet de Freund - un rappel final a été effectué six semaines aprés la première injection, en utilisant 15 g de l'haptène conjugué dans une solution physiologique, par voie intraveineuse. La fusion cellulaire somatique a été réalisée trois jours après l'injection intraveineuse. FUSION CELLULAIRE SOMATIQUE Environ 150 x 10@ cellules de rate ont été fusionnées avec 40 x 10 cellules de myélome NS-1, en présence de polyéthylèneglycol (poids moléculaire 1000), à l'aide des modes opératoires classiques décrits dans la littérature. Les cellules sont développées sur des plaques de culture à 96 puits. Au bout de deux semaines, les surnageants ont été repris, de façon à sélectionner les hybridomes sécrétant les anticorps. Cette sélection a été réalisée par la méthode ELISA, puis par la méthode radioimmunologique, comme décrit ci-dessous. METHODE ELISA Des plaques de microdosage ont été revêtues avec 0,5 pg du conjugué hémisuccinate de HCLQ-BSA par puits dans 0,15 ml de tampon de revêtement, pendant 24 heures à 4 C. Les jours suivants, le conjugué non adsorbé a été éliminé et 0,2 ml de ESA à 1% dans le tampon de revêtement ont été ajoutés à chaque puits et mis à incuber dans les mêmes conditions que ci-dessus. Après un lavage abondant, 0,2 ml des surnageants de culture dilués 200 fois ont été mis à incuber, à 37 C, pendant une heure. Après une etape dé lavage, une incubation avec un anticorps lapin-anti-souris, marqué avec la peroxydase de raifort, a été réalisée pendant une heure supplémentaire à 37 C. Après rinçage, 0,2 ml d'une solution à 0,05% d'ortho-phénylènediamine, activée par H2O2, a été ajoutée à l'abri de la lumière.La réaction a été arrêtée par 0,05 ml de H@SO4 12,5M, au bout de 30 minutes, et la coloration a été lue par un appareil a balayage multiple Titertek à une longueur d'onde de 492 nm. METHODE DE DOSAGE RADIOIMMUNOLOGIOUE (RIA) Chaque surnageant de culture positif a la méthode ELISA a été testé par la technique RIA décrite ci-dessous. D'abord, 50 l d'une solution contenant 0,5 pg de :H-CLQ (diluée dans le PBS) (activité spécifique 82,2CiZmmol) ont été introduits dans des tubes de polypropylène. Ensuite, 50 p1, soit du tampon, soit de différentes concentrations de CLQ ou d'autres médicaments mis en compétition ont été ajout et le contenu des tubes a été mélangé. Enfin, 50 l du surnageant de culture ont été ajoutés et remélangés, avant incubation pendant une heure à la température ambiante.Ensuite, les tubes ont été refroidis dans un bain eau-glace et le médicament libre a été adsorbé par du charbon actif revêtu par du dextrane (150 l d'une solution à 1,2 %). Au bout de 5 minutes de secouage continu et de 10 minutes de centrifugation à 5000rpm, 200 1 du surnageant ont été transférés à une ampoule à scintillation, contenant 7 ml de liquide scintillant. La radioactivité a été comptée pendant 5 minutes par échantillon et corrigée pour les valeurs temoins obtenues dans les mêmes conditions. PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX Des splénocytes provenant de deux souris choisies pour leurs titres élevés en anticorps dans le sérum ont été utilisées pour la fusion cellulaire somatique. Deux semaines après la fusion, des clones de cellules stables ont été observés dans 452 parmi les 960 puits. La sélection par les méthodes ELISA (sur leur capacité a lier HCLQ-BSA) et RIA, a révélé 27 hybridomes fortement positifs. Les deux cultures montrant la liaison la plus élevée à PH-CLQ ont été sousclonées deux fois par la technique de dilution limite. Apres amplification dans le fluide ascitique de souris Nude, les deux anticorps monoclonaux, désignés ACQ-O1 et ACQ-O2, ont été purifiés par chromatographie sur protéine-A.Ces deux anticorps entrent dans les classes G1 et G2 ab respectivement. La lignée cellulaire clonée fournissant les anticorps ACQ-01 est celle dont le dépôt a été mentionné cidessus. CARACTERISTIOUES DE LIAISON DES ANTICORPS MONOCLONAUX Les études de liaison avec diverses quantités de (@H)-CLQ ont été effectuées par la dilution adéquate d'anticorps purifiés (1:1500) et ont indiqué un isotherme saturable: La figure 1 représente I1 isotherme de la liaison de saturation de ACQ-01 (#) et ACQ-02 (#) par la L'analyse des caractéristiques de liaison de ACQ-01 et ACQ02 a montré une classe unique de sites de liaison (Abt = 3,3 10- et 6,3 10-9 M, respectivement) avec des constantes d'affinité de 3,1 10@ et 5,6 107 M-1. L'affinité apparente de l'amino-4 chloro-7 quinoléine (ACQ), de la chloroquine (CLQ) et de plusieurs molécules analogues pour ACQ-01 et ACQ-02 (dilution 1:300) a été déterminée par inhibition de la liaison par (3H)-CLQ 2nM, avec une concentration du médicament mis en compétition se situant dans une gamme de 3 10-10 à 3 10--' M. A partir de la valeur de CI50 résultante pour chaque molécule, les constantes d'affinité apparente ont été calculées à l'aide de la formule suivante (CHENG Y., PRUSSOFF W.H. (1973 > . Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108.) Kapp = = KA (1 + C)/CI50, où Kapp est la constante d'affinité apparente ; KA est la constante d'association de CLQ a l'anticorps, C est la concentration de (3H)-chloroquine utilisée dans l'essai, et CI. est la concentration de l'inhibiteur donnant 50% d'inhibition comme cela est déterminé a partir de la courbe d'inhibition. Les valeurs de IC. TABLEAU II Parametres d'inhibition pour les differents composés testes ACQ-01 ACQ-02 COMPOSE CI50 Kapp CI50 Kapp ( M) (x106M-1) ( M) (x 10@ M@) ACQ 130 0,0125 110 0,01 CLQ 0,12 13,5 0,28 4 HCLQ 0,18 9 0,28 4 ADQ 0,018 90 0,074 15 PCQ 0,50 3,2 0,75 1,5 MFQ > 1000 1000 QNE > 1000 1000 7-MQ > 1000 1000 90,001 8-HQ > 1000 1000 L'amino-4 chloro-7 quinoléine, qui a été utilisée pour l'immunisation, se lie aux anticorps avec une affinité apparente 1000 fois plus faible La substitution de la chaîne latérale aliphatique par une structure aromatique (phénolique) (ADQ) augmente l'affinité apparente d'environ 10 fois. MFQ ne se lie pas aux anticorps. L'absence de liaison peut être reliée à l'absence d'atome de chlore en position- 7, et de groupe amino en position 4. La figure 2 montre les courbes d'inhibition typique de liaison de ACQ-0l avec (@H)-CLQ par les différents analogues testes chloroquine (1) hydroxy-chloroquine (2) amodiaquine (3 > N-deséthyl-chloroquine amino-4 chloro-7 quinoléine (5) quinine (6) méfloquine (7) On donnera ci-après un exemple concret de dosage utilisant un anticorps monoclonal obtenu précédemment. Ce dosage est réalisé par une méthode radioimmunologique. DOSAGE RADIOIMMUNOLOGIQUE On introduit,dans des tubes de polypropylène de 7,5 cm de hauteur x 1,2 cm de diamètre, 100 l d'une solution contenant 0,25pg de > H-CLQ (25000 cpm > dans du tampon phosphate O,OlM, pH 7,4. On ajoute 300 pl de solutions étalons ou d'échantillons à doser (on utilise des solutions étalons de 20, 40, 80, 160, 320 et 480 g/l de CLQ, exprimées en base). On mélange et on ajoute 100 l de la préparation ACQ-Ol (dilution 1 : 500 > . On mélange et on fait incuber pendant 1 heure à température ambiante. Ensuite, on refroidit à 4 C, et on ajoute 300 l de charbon actif revêtu par du dextrane, maintenu à 4 C (12 g de charbon actif et 1,2 g de dextrane et de gélatine chacun dans le PBS à la mime température de 4 C). On mélange immédiatement et on réalise une centrifugation PRECISION DE LA METHODE On a calculé le coefficient de variation intraessai en comparant les moyennes de déterminations réalisées en triple à partir de cinq essais séparés. Dans la gamme des taux de plasma habituellement trouvés, le coefficient précité a varié entre 2,1 à 3,0/ (TABLEAU III ci-après). TABLEAU III Concentration en Nombre de Coefficient de chloroquine déterminations variation ( g/l) réalisées en intra-essai triple 10-100 63 2,1 100-400 66 2,5 400-700 22 3,0 Le coefficient de variation inter-essai et la récupération analytique ont également été déterminés : les solutions étalons de CLQ correspondant à la gamme des taux de plasma observés ont été testés dans respectivement 6, 13 et 17 essais séparés. Le coefficient de variation et la récupération calculée sont présentés dans le TABLEAU IV ciaprès. TABLEAU TV Chloroquine Nombre de Chloroquine Récupération coefficient ajoutée détermina- mesurée de variation pg/l tions rea- ( g/l) % inter-essai lisées en triple 20 17 19,0 95 10,1 4 17 37,5 94 9,6 80 17 87,7 110 6,0 120 6 123,3 103 4,2 160 17 181;0 113 7,7 320 13 337,4 105 2,4 480 6 471,2 98 6,2 640 13 522,3 82 7,8 On a illustré l'invention par un dosage radioimmunologique. D'autres méthodes de dosage peuvent également être utilisées, par exemple une méthode immunonéphélémétrique, une méthode ELISA ou une méthode d' hémagglutination. La description ci-dessus a été faite sur des anticorps monoclonaux, leur préparation et leur utilisation. Il va sans dire, néanmoins, que l'invention couvre également les anticorps polyclonaux dont dérivent lesdits anticorps monoclonaux. Ces anticorps polyclonaux sont utilisables d'une manière identique à celle des anticorps monoclonaux. REVENDICATIONS 1 - Produit de couplage, à l'aide d'un agent de pontage, entre une molécule porteuse et un haptène, dont le squelette comporte un ou plusieurs cycles et présente au moins un groupement amino-exocyclique non substitué, ledit haptène, appelé haptène AENS, répondant à la formule Z- (reste amino exocyclique non substitué) ou Z représente le squelette duditçhaptène, lequel peut comporter d'autres substituants. 2 - Produit de couplage selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'agent de pontage est un dialdêhyde. 3 - Produit de couplage selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'agent de pontage dialdéhydique est représenté par la formule OCH-A-CHO, dans laquelle A représente une chaîne hydrocarbonée pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes. 4 - Produit de couplage selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'agent de pontage est choisi parmi le glutaraldéhyde, le glyoxal et l'aldéhyde malonique. 5 - Produit de couplage selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que la molécule porteuse est une protéine. - - Substance immunogène, permettant d'obtenir des anticorps dirigés contre des haptènes, dits haptènes AES, de même squelette que l'haptène AENS tel que defini à la revendication 1, mais comportant, à la place du reste amino exocyclique non .substitué, un reste amino exocyclique substitué, aractérisée par le fait qu'elle est constituée par le produit de couplage tel que défini à l'une des revendications 1 à 5. 7 - Substance immunogene selon la revendication 6, caractérisée par le fait que l'agent de pontage est choisi pour que le pont formé entre la molécule porteuse et l'haptène AENS mime la chaîne latérale formée par le groupement amino exocyclique substitué des haptènes ABUS. 8 - Substance immunogène selon l'une des revendications 6 et 7, destinée à l'obtention d'anticorps dirigés contre des médicaments lipophiles de petite taille, la substitution sur le groupe amino exocyclique étant notamment une substitution par un reste alkyle. 9 - Substance immunogène selon la revendication 8, destinee à l'obtention d'anticorps dirigés contre les médicaments antipaludéens dérivés de l'amino-4 quinoléine, caractérisée par le fait qu'il résulte du couplage de l'amino-4 chloro-7 quinoléine, comme haptène AENS, et d'une molécule porteuse, par l'action du glutaraldéhyde. 10 - Substance immunogène selon la revendication 9, caractérisée par le fait que la molécule porteuse est l'hémocyanine de patelle. 11. Procédé pour l'obtention de lignées cellulaires hybrides murines produisant des anticorps anti hapténes AES, caractérisé par le fait qu'il consiste à effectuer la fusion de splénocytes de souris immunisées à l'aide de la substance immunogène telle que définie à l'une des revendications 6 à 10, et de cellules de myélome de souris. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à (a) immuniser des souris avec la substance-immunogene telle que définie à l'une des revendications 6 à 10 (b) prélever la rate des souris immunisées et séparer les splénocytes ;; (c) réaliser la fusion des splénocytes ainsi obtenus avec des cellules de myélome de souris en présence d'un promoteur de fusion (d) cultiver les cellules hybrides obtenues dans un milieu sélectif sur lequel ne se développent pas les cellules de myélome non fusionnées et en présence d'éléments nutritifs approprié (e) selectionner les cellules produisant l'anticorps désiré et réaliser,le cas échéant, le clonage de ces cellules. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérise par le fait qu'a l'étape (a9, on realise l'immunisation des souris par une première injection de l'immunogene par voie sous-cutanée, par deux injections de rappel par voie intrapéritonéale respectivement deux et quatre semaines après la première injection, et par une dernière injection, par voie intraveineuse six semaines après la première injection. 14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait qu'à l'étape (c), on réalise la fusion en utilisant environ une cellule de myélome pour quatre cellules de splénocyte, en présence de polyéthylèneglycol de poids moléculaire d'environ 1000. 15 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait qu'à l'étape (e), on sélectionne les souches hybrides par une méthode immunologique appropriée à la détection d'anticorps dirigés contre les haptènes AES. 16 - Lignées de cellules hybrides murines produisant des anticorps anti-haptènes AES, obtenues par le procédé tel que defini à l'une des revendications 11 à 15. 17 - Anticorps polyclononaux et monoclonaux antihaptènes AES, produits par les lignées de cellules hybrides murines anti-haptènes AES, obtenues par le procédé tel que défini à l'une des revendication:, il à 15. 18 - Anticorps monoclonaux anti-médicaments antipaludéens dérivés de l'amino-4 quinoléine produits par la lignee cellulaire clonée déposée le 1er juillet 1986 à la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes de l'Institut PASTEUR-PARIS, sous le n I-577. 19 - Application des anticorps tels que définis a l'une des revendications 17 à 18, aux dosages des haptenes AES.