FR 2597500 A1 19871023 FR 8604215 A 19860324 Nouveau rétrovirus susceptible de Drovoauer le SIDA, antigènes obtenus à Partir de ce rétrovirus et anticorps corresoondamts et leurs ssDp7 ications au diaanostic du SIDA. L'invention est relative à une forme nouvelle de virus, ayant la capacité de provoquer des lymphadénopathies susceptibles d'être relayées ensuite par le syndrome d'immuno-déficence acquise (SIDA). L'invention concerne également des antigenes susceptibles d'etre obtenus à partir de ce virus ou ayant avec celui-ci des propriétés en commun. Elle concerne également les anticorps susceptibles d'être provoqués contre ces divers antigènes. Enfin l'invention concerne des applications de ces antigènes ou anticorps au diagnostic de certaines formes du SIDA et, en ce qui concerne certains d'entre eux, à la production de compositions immunogènes et de compositions vaccinantes contre ce rétrovirus. L'isolement d'un premier rétrovirus, dont avait été reconnue la responsabilité dans le développement du SIDA, a fait l'objet d'une description dans un article de F. BARRE-SINOUSSI et al des 1983 (Science, vol. 220, n 45-99, 20, p. 868-871. L'application au diagnostic de la présence d'anticorps contre le virus de certains extraits de ce dernier, et plus particulièrement de certaines de ses protéines, a été plus spécialement décrite dans la demande de brevet européen n 138.66?. Ce rétrovirus est connu sous la désignation LAV. Depuis d'autres souches similaires et des variants du LAV ont été isolés. On rappellera pour mémoire ceux connus sous les désignations HTLV-III et ARV.L'expression ZLAV-I couvre aussi l'ensemble de ces désignations et les souches virales correspondantes. L'ensemble des virus identiques ou proches de l'isolat initial "LAV" sera appelé dans le présent texte "LAV type I" ou "LAV-I". Le nouveau rétrovirus faisant l'objet du présent brevet et les souches de virus qui en sont proches, sont appelés LAV type Il" ou IAV-II. Chaque isolat est suivi des trois premières lettres du nom du malade dont il a été isolé. On peut définir l'ensemble "LAV" conte un ensemble de virus causant soit des polyadénopathies généralisées et persistentes, soit un SIDA et ayant in vitro un tropisme pour les cellules T4 chez lesquelles le rétrovirus induit un effet cytopathogène. Ces rétrovirus se sont révélés distincts des autres rétrovirus humains déjà connus (HTLV-I et HTLV-II). Bien qu'il y ait une assez grande variabilité génétique du virus, les différentes souches isolées à ce jour à partir des malades américains, européens, haitiens et africains ont en commun des sites antigéniques conservés sur leurs principales protéines : protéine du core p25 et glycoprotéine d'enveloppe gap110 et protéine transmembranaire gp41-43. Ceci permet à la souche prototype LAV-I déposée à la CNCM sous le n 1-232 d'être utilisée comme souche d'antigènes pour la détection d'anticorps chez tous les types de malades, quelle que soit leur origine. Cette souche, dont le virus HTLV-III isolé par R.C.GALLO et coll. ne peut être distingué, est donc utilisée actuellement pour la détection d'anticorps chez les donneurs de sang et les malades par ELISA, Immunofluorescence, les techniques dites de "Western Blot" (ou immuno-empreintes) et "RIPA" (Radio Immunoprecipitation Assay). Cependant dans une étude sérologique effectuée sur des malades natifs de Guinée-Bissau et hospitalisés au Portugal, il a été observé que certains donnaient des réactions séro-négatives ou très faiblement positives par ces tests mettant en oeuvre un lysat du LAV-I, alors qu'ils présentaient les signes cliniques et immunologiques du SIDA. A partir des lymphocytes mis en culture de l'un de ces malades1 il a été isolé un rétrovirus dont la structure en microscopie électronique et le profil des protéines en gel d'électrophorèse SDS sont, d'une manière générale, similaires à celles du LAV-I. Mais ce nouveau rétrovirus, ci-après appelé LAV-II, présente une moindre parenté, si ce n'est une parenté faible avec celui-ci, tant du point de vue de l'homologie antigénique de ses protéines que de l'homologie de son matériel génétique. Ce nouveau rétrovirus ou des rétrovirus ayant des propriétés antigéniques et immunologiques équivalentes, peuvent donc constituer des sources d'antigènes pour le diagnostic de l'infection par ce virus et des variants qui induisent un SIDA, que l'on rencontre en particulier chez les malades africains ou des personnes ayant séjourné en Afrique. Ce virus a été isolé de plusieurs malades de Guinée-Bissau et des Iles du Cap Vert, et en particulier à partir du sang, prélevé sous héparine, d'un malade de 28 ans, originaire de la Guinée-Bissau, hétérosexuel, qui n'avait jamais été transfusé et qui n'était pas toxicomane. Il présentait depuis 1983 une importante diarrhée chronique, un amaigrissement important (17 kg) avec de la fièvre par intermittence. Récemment il a présenté des infections à Candida et Serratia, dont une candidose oesophagienne, typique du SIDA. Ce patient présentait également une anémie, une anergie cutanée, une lymphopénie, un rapport lymphocytes T4/lymphocytes T8 de 0,15, avec un taux en lymphocytes T4 inférieur à 100 par de sérum. Ses lymphocytes en culture ne répondaient pas à la stimulation par la phyto-hémoglutinine et la cencanavaline A. On a également diagnostiqué chez ce malade des bactériémies récurrentes dues à S. enteriditis. des cryptosporidioses, des infections dues à AEosoora belli et des toxoplasmoses cérébrales. L'ensemble de ces signes témoignait des symptomes complexes liés au SIDA" ou "ARC" (abréviation anglaise de RAIDS Related Complex"), du type de ceux causés par le virus LAV-I. Ces différentes observations étaient également conformes aux critères apliqués par le Centre de Contrôle des Maladies (Center of Disease Control ou CDC) d'Atlanta, Etats-Unis. La mise en culture des lymphocytes de ces malades et l'isolement du rétrovirus ont été effectués selon la technique déjà décrite pour l'isolement du LAV-I (1) dans l'article de BARRE-SINOUSSI et Coll. et la demande de brevet européen n- 84 401834/0 138 667. On les rappelle brièvement ci-après. Des lymphocytes stimulés pendant 3 jours par de la phytohémagglutinine (PHA) ont été cultivés en milieu de culture RPM1-16-40 additionné de 10 O de sérum de veau foetal et de 10 5M B-mercaptoéthanol, d'interleukine 2 et de sérum anti-interféron humain. La production de virus a été suivie par son activité transcriptase inverse. Dans le surnageant de culture, le pic d'activité virale est apparu entre le 14éme et le 22ème jour, puis a diminué. Le déclin et la mort de la culture cellulaire ont suivi. Comme avec le LAV-I, des sections de lymphocytes infectés par LAV-II révelent des virions matures et des particules virales bourgeonnant à la surface des cellules infectées. Le virus a ensuite été propagé sur des cultures de lymphocytes de donneurs de sang, puis sur des lignées continues d'origine leucémique, telles que HUT 78. Il a été caractérisé comme étant sensiblement distinct du LAV-I par ses antigènes et son acide nucléique. Le virus a été purifié comme décrit dans les documents antérieurs déjà mentionnés. Il a été déposé à la "Collection Nationale des Cultures de Micro-organismesw (C.N.C.M) à l'INSTITUT PASTEUR, le 19 décembre 1985, sous le nv I-502. D'une façon générale l'invention concerne tout virus équivalent contenant des protéines de structure qui présentent les mêmes propriétés immunologiques que celles du virus LAV-II déposé à la CNCM sous le numéro I-502. Quelques caractéristiques des antigènes et des acides nucléiques, entrant dans la constitution de LAV-II, résultent des essais réalisés dans les conditions indiquées ci-après. I - ANTIGENES. NOTAMMENT PROTEINES ET GLYCOPRO TEINES Le virus a été marqué métaboliquement par la 35 cystéine et la 355-méthionine, les cellules infectées étant incubées en présence de ces acides aminés radioactifs en milieu de culture dépourvu de l'acide aminé non marqué correspondant, pour une période de 14 à 16 heures (en particulier selon la technique décrite dans l'article répertorié en (21) dans la bibliographie présentée à la fin de la description, pour ce qui est du marquage à la 35 S- cystéine. Le surnageant est ensuite clarifié, puis le virus ultracentrifugé une heure à 100 000 g sur un coussin de 20 s de saccharose.Les principaux antigènes du virus sont séparés par électrophorèse dans un gel de polyacrylamide (12,5 5) dans des conditions dénaturantes (SDS) ou dans un gel de polyacrylamide (10 5) + bis acrylamide (0,13 -.) avec SDS (0,1 's en concentration finale). On utilise comme poids moléculaire de référence les marqueurs colorés suivants commercialisés par la société BRL myosine : 200 Kd phosphorylase B : 97,4 Kd BSA : 68 Kd ovalbumine : 43 Kd chymotrypsine : 25,7 Kd 8 lactoglobuline : 18,4 Kd lysozyme : 14,3 Kd D'autres marqueurs de poids moléculaires ont été utilisés dans d'autres essais. Il est en particulier fait référence aux figures la, lb et lc qui renvoient a d'autres marqueurs de poids moléculaires connus sous la lettre M.Les antigènes sont encore mieux distingués après immunoprécipitation (RIPA) ou par immunoempreintes (Western blot) en utilisant les anticorps présents dans le sérum du malade : leurs poids moléculaires déterminés par leurs migrations apparentes sont très proches de ceux des antigènes du r'AV-I. Ces poids moléculaires sont exprimés en kilodaltons après les lettres Zp ou ZgpW correspondantes, mème si dans certains cas, alors précisés, ces poids moléculaires peuvent varier dans une certaine mesure autour de la valeur indiquée. La répétition des essais a permis de mieux cerner les poids moléculaires des antigènes de LAV-ii. Ainsi on a constaté que les poids moléculaires des trois protéines du noyau (core), auxquelles on avait initialement attribué des poids moléculaires de l'ordre de 13.000, 18.000 et 25.000 respectivement, avaient en fait des poids moléculaires plus proches des valeurs suivantes : 12.000, 16.000 et 18.000, respectivement. Ces protéines sont ci-après respectivement désignées par les abréviations p12, p16 et p26. De même l'existence d'une glycoprotéine trans aembranaire a rapidement été reconnue, son poids moléculaire ayant été apprécié à des valeurs qui pouvaient s étager de 32.000 à 42.000. La répétition des mesures a finalement permis de préciser le poids moléculaire de cette glycoprotéine transmembranaire : 36.000.Dans ce qui suit, cette glycoprotéine est désignée par l'abréviation gp36. Une glycoprotéine majeure d'enveloppe ayant un poids moléculaire de l'ordre de 130-140 Kd est constamment observée : cette glycoprotéine est ci-après désignée par l'expression gp140. Ceci étant, il convient de noter que, d'une façon générale, les poids moléculaires sont appréciés avec une précision de plus ou moins 5 , cette précision pouvant meme devenir un peu moindre pour les antigènes de haut poids moléculaire comme on l'aura déjà constaté pour la gap140 ou encore pour une protéine qui parait consister en un précurseur de la gp140, ci-après désignée gp160 (poids moléculaire de 160 Kd + 10 a). L'ensemble de ces antigènes ont été peu ou pas reconnus (lorsqu'ils sont marqués) par la 355-cystéine par des sérums de malades contenant des anticorps anti-LAV-I dans les systèmes de détection utilisés au laboratoire ou par utilisation des tests mettant en oeuvre des lysats de LAV-i, tels que ceux commercialisés par Diagnostics Pasteur sous la marque "ELAVIA". Seule la protéine p26 a été faiblement immunoprécipitée par de tels sérums. La protéine d'enveloppe ne l'a pas été. Le sérum du malade infecté par le nouveau virus (LAV-II) reconnaît faiblement une protéine p34 du LAV-i. Dans le système de détection utilisé, les autres protéines du LAV-I n'ont pas été reconnues. Par contre le LAV-II possède certaines protéines présentant une certaine parenté immunologique avec des protéines ou glycoprotéines structurales semblables séparables dans des conditions analogues à partir dEun rétrovirus récemment isolé à partir de singes macaques captifs, alors que cette parenté immunologique tend à s' effacer pour d'autres protéines ou glycoprotéines.Ce dernier rétrovirus, qui est présumé etre l'agent étiologique de SIDAs chez les singes, a été désigné par les chercheurs qui l'ont isolé (références bibliqgraphiques (16-18) ci-après) sous l'appellation ZSTLV-IIImac". il a été déposé le 7 février 1986 à la Collection Nationale de Culture de Micro-Organismes (C.N.C.M.) de l'Institut Pasteur de Paris sous le numéro I-521. Pour la commodité du langage, il ne sera plus désigné dans ce qui suit que par l'expression "STLV-III". En mettant en oeuvre les memes techniques que celles rappelées plus haut, il a été constaté que l'on pouvait également obtenir à partir de 5TLV-III : - une protéine principale du noyau p27, ayant un poids moléculaire de l'ordre de 27 kilodaltons, - une glycoprotéine majeure d'enveloppe, gp140, - une protéine transmembranaire p32, qui n'est pas observée en RIPA lorsque le virus a au préalable été marqué par la 355-cystéine, mais qui peut être observée dans les essais d'immunoempreintes (Western blots), sous forme de bandes larges. La glycoprotéine majeure d'enveloppe de LAV-II s'est révélée etre plus proche de la glycoprotéine majeure d'enveloppe de STLV-III que de la glycoprotéine majeure d'enveloppe de lav-I. Ces constatations s'imposent non seulement au niveau des poids moléculaires : 130-140 kilodaltons pour les glycoproteines majeures de LAV-II et de STLV-III, contre environ 110 pour la glycoprotéine majeure d'enveloppe de LAVIr mais aussi au niveau des propriétés immunologiques puisque des sérums prélevés à partir de malades infectés par LAV-II, et plus particulièrement des anticorps formés contre la gp140 de LAV-II reconnaissent la gp140 de STLV-III, alors que dans des essais semblables les mêmes sérums et les mêmes anticorps de LAV-II ne reconnaissent pas la gel 10 de LAV-I.Mais les sérums anti-LAV-I qui n'ont jamais réagi avec la gp140 de LAV-II précipitent une protéine de 26 Kdal marquée par la 32S-cysteine, contenue dans les extraits de LAV-Ii. La protéine majeure du noyau (core) de LAV-II semble présenter un poids moléculaire moyen (environ 26.000) intermédiaire entre celui de la p25 de LAV-I et la p27 de STLV-III. De meme une protéine transmembranaire majeure de LAV-Ii possède un poids moléculaire moyen, environ 36.000, comprise entre le poids moléculaire de la protéine transmembranaire correspondante (environ 41.000 pour la p41) et celui de la protéine correspondante, p32, de STLV-III. Ces observations résultent des essais réalisés avec des extraits viraux obtenus à partir du LA-II isolé à partir de l'un des patients susmentionnés. Des résultats similaires ont été obtenus avec des extraits viraux du LAV-II isolé à partir du second patient. Dans ce qui suit il sera fait référence au dessin dans lequel - les figures la, lb et 1c se rapportent à des essais d'immunoprécipitation croisée entre des sérums de patients respectivement infectés par LAV-I et LAV-II et de macaques infectés avec STLV-III, d'une part, et d'extraits viraux de LAV-f, d'autre part - les figures 2a et 2b présentent des résultats comparatifs quant aux mobilités électrophorétiques des protéines de LAV-I, LAV-II et STLV-III, dans des gels de polyacrylamide-SDS - la figure 3 présente des résultats d'hybridation croisée entre des séquences génomiques de LAV-I, LAV-II et STLV-III, d'une part1 et des sondes contenant différentes séquences subgénomiques du virus LAV-I, d'autre part. D'une façon générale, les antigènes et les séquences d'ADN dérivés de l'ADN génomique de LAV-I utilisés dans les tests comparatifs dont la description suit sont issus de la souche de LAV-I déposée à la C.N.C.M. sous le n I-232 le 15 juillet 1983. Des cellules infectées respectivement avec LAV-I, LAV-II et STLV-III ont été incubées dans un milieu conte 35 nant 200 uCi/ml de cystéine dans un milieu exempt de cystéine non marquée pendant 16 heures. Les surnageants clarifiés ont été centrifugés à 60.000 g pendant 90 minutes. Les culots ont été lysés dans un tampon RIPA(1), immunoprécipités avec différents sérums, puis soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide chargé en dodécylsulfate de sodium (SDS-PACE). Les résultats observés sont illustrés par les figures la, lb et lc. Dans la figure la, sont présentés les résultats d'immunoprécipitation observés entre un extrait viral de LAV-I obtenu à partir d'une lignée cellulaire CEM C1.13 et les sérums respectifs suivants - sérum positif anti-LAV (bande 1), - sérum obtenu du premier patient mentionné plus haut (bande 2), - sérum d'un porteur africain sain d'anticorps anti-LAV (bande 3), - sérum obtenu à partir d'un macaque infecté avec STLV-III (bande 4) et - sérum du deuxième patient susmentionné (bande 5). Dans la figure lb, sont rapportés les résultats d'immunoprécipitation observés entre les antigènes de LAV Xi obtenus à partir du premier patient, après culture préalable sur des cellules HUT-78 et différents sérums, plus particulièrement le sérum du premier patient susmentionné (bande 1), le sérum positif anti-LAV (bande 2), le sérum du macaque infecté par STLV-III (bande 3), le sérum du second patient susdit (bande 4). Enfin, la figure lc illustre les résultats d'immunoprécipitation observés entre les antigènes d'un isolat de STLV-III otenu à partir d'un macaque présentant un SIDA de singe. Les sérums utilisés et auxquelles se réfèrent les bandes 1 à 5 sont les mêmes que ceux rappelés plus haut en rapport avec la figure la. M se réfère aux marqueurs myosine (200 Kd) galactosidase (130 Kd), sérum albumine bovine (69 Kd), phosphorylase B (93 Kd), ovalbumine (46 Kd) et carbonate anhydrase (30 Kd). Les figures 2a et 2b présentent les résultats comparatifs quant aux mobilités électrophorétiques des protéines de LAV-i, LAV-II et STLV-III. La figure 2a se rapporte aux essais réalisés avec des extraits de virus marqués par la 35S-cystéine, après itsunoprécipitation sur SDS-PAGE. Les différentes bandes se rapportent aux extraits de virus suivants : virus obtenu à partir du patient 1 et immunoprécipité par le sérum provenant du même patient (bande 1), extrait du même virus iflunoprécipité avec un sérum témoin négatif provenant d'une personne ne portant pas d'anticorps anti-LAV-i ou anti-LAV-II (bande 2), extrait de virus STLV-tII immunoprécipité par un sérum provenant d'un macaque infecté par STLV-III (bande 3), immunoprécipitations observées entre des extraits du même virus et d'un sérum témoin négatif (bande 4), extrait de LAV-I immunoprécipité par un sérum d'un patient européen infecté par le SIDA. La figure lb présente les résultats obtenus dans des essais de Western-blot (immunoempreinte). Des lysats cellulaires provenant de cellules HUT-78 non infectées ou infectées ont été soumis à une électrophorèse sur SDS PAGE, puis transférés électrophorétiquement sur un filtre de nitrocellulose, avant d'etre mis à réagir avec le sérum du premier patient susmentionné (sérum dilué au 1/1COe). te filtre de nitrocellulose a ensuite été lavé et la détection des anticorps fixés révélée avec des IgG anti 125 humaines de chèvre marquées par i. Les taches observées dans des bandes 1, 2 et 3 se rapportent respectivement aux essais d 'agglutination entre le susdit sérum et des extraits de cellules HUT-78 non infectées (bande 1), des extraits de cellules HUT-78 infectées avec un virus LAV-II (bande 2) et des extraits de cellules HUT-78 infectées par STLV-III (bande 3). Les nombres qui apparaissent dans les marges de chacune des bandes correspondent aux poids moléculaires approximatifs des protéines virales les plus représentatives (poids moléculaires en kilodaltons). Il - ACIDES NUCLEIOUES L'ARN du virus, déposé sur filtre d'après la technique du "spot blot" n'a pas hybridé, dans des conditions stringentes avec l'ADN du tAV-I. Par "conditions stringentes" on entend : les conditions dans lesquelles la réaction d'hybridation est faite en mettant le RNA du LAV-II en contact avec la sonde choisie marquée radioactivement au P32 (ou marqué de façon différente), à savoir à 42"C en présence de 50 % de formamide pendant 18 heures. La membrane sur laquelle a été faite la réaction d'hybridation est lavée ensuite à 65-C dans un tampon contenant 0,1 a de SDS et 0,1 X SSC. Par "conditions non stringentes*, on entend les conditions dans lesquelles la réaction d'hybridation est faite en mettant en contact avec la sonde- choisie marquée au p32 (od marquée autrement), à savoir à 42'C dans un tampon 2 x SSC en présence de 30 0 de formamide pendant 18 heures. Le lavage de la membrane est réalisé à 50'C avec un tampon contenant 0,1 E de SDS et 2 X SSC. On a également réalisé des essais d'hybridation avec une sonde d'hybridation constituée par un plasmide recombinant pBTl obtenu par clonage de l'ADN du LAV-I provenant de AJ19 (Cell 1985, vol. 40, p.9) dans le vecteur pUC18. En conditions non stringentes, seule une très faible hybridation a été observée. D'autres sondes ont été utilisées a) Des sondes simple brin de l'ADN du LAV-I subgénomique élaborées à partir de sous-clones du génome du LAV-I et insérées dans le phage M13. Les régions clonées concernaient le gène protéase ou le gène "endonucléase". Seule une sonde de la région endonucléase de LAV-I (séquence de nucléotides comprise entre les bases n 3760 et 4130) a donné une hybridation faible en conditions non stringentes avec le tAV-II. La sonde "protéase' (séquence de nucléotides de LAV-I comprise entre les bases n' 1680 et 1804) n'a pas hybridé, meme en conditions non stringentes avec le tAV-II. b) Une sonde pRS3 constituée par la séquence codant pour la région "enveloppe" du LAV-I (sous-clonage dans pUC18) n'a pas donné d'hybridation en conditions non stringentes avec LAV-Ii. La technique du "spot blot'est appelée aussi "dot blot" (transfert par taches). Des résultats d'hybridation supplémentaires entre des ARNs génomiques de tÂV-I, LAV-II et STLV-III, d'une part, et des sondes contenant différentes séquences sub-génomiques du virus tAV-I, d'autre part, apparaissent dans la figure 3. Les surnageants des différents milieux de culture (à raison de 0,5 à 1 ml pour chaque tache) ont été centrifugés pendant 5 minutes à 45.000 tours par minute ; les culots ont été remis en suspension dans un tampon NTE contenant 0,1 % de SDS et déposés sur filtre de nitrocellulose.Celui-ci a été prétrempré dans un milieu 2 x SSC (NaCl 0,3 M, citrate de sodium 0,03 M). Aprés cuisson (pendant 2 heures à 80"C), les filtres ont été hybridés avec diverses sondes contenant des sous-fragments génomi- ques de LAV-I, dans des conditions non stringentes (30 "' de formamide, 5 x SSC, 40'C), lavés avec une solution 2 x SSC et contenant 0,1 '; de SDS, à 50 .C, puis autoradiogra phiés pendant 48 heures à -70iC avec des écrans d'amplification. Les sondes 1-4 sont des sondes à brin unique obtenues par la méthode de "coupe principalee (prime cut method) telle que décrite en (25). En bref des fragments mono-brins issus du virus M13 et portant des insérats de LAV-I subgénomiques (30) ont été ligaturés à des fragments d'oligomères (17 nucléotides) issus de M13 (BIOLABS). Le brin complémentaire a été ensuite synthétisé avec l'enzyme de Klenow dans un tampon TM (Tris 10 mM, pH 7,5, MgCl21 10 mM) en présence de dATP, dGTP, dTTP et dCTB marqués par du 32Pen alpha (Amersham, 3000 Ci/mMol).L'ADN a ensuite été digéré par les enzymes de restriction appropriés, dénaturé par la chaleur et soumis à électrophorèse sur un gel dénaturant de polyacrylamide (contenant 6 S d'acrylamide, de l'urée 8 M dans un tampon TDE). Le gel a ensuite été autoradiographié pendant 5 minutes. La sonde a ensuite été découpée et éluée dans un tampon de NaCl 300 mM, SDS 0,1 s. Des activités spécifiques (AS) de ces sondes à brin unique ont été estimées à S.108-10 désintégrations par minute/ microgramme (dpm/ijg). Les séquences caractéristiques contenues dans les différentes sondes étaient les suivantes sonde 1 : nucléotides 990-1070, sonde 2 : nucléotides 980-1260, sonde 3 : nucléotides 2170-2240, sonde 4 : nucléotides 3370-3640. Les numérotations des nucléotides qui précèdent sont celles envisagées dans l'article référencé en (30). Enfin la sonde 5 consiste en un plasmide pUC-18 portant le fragment EcoR1-Sacl du LAV cloné dans AJ19 (31), lequel a fait l'objet dgune translation de coupure (nick-translation) pour obtenir un AS d'approximativement 108 dpm/g. Les dispositions relatives des fragments subgé- nomiques contenus dans les sondes vis-à-vis du génome entier de LAV-I sont schématisées à la figure 5. Les différentes taches correspondent respectivement - tache A : virus obtenus à partir d'une culture de cellules CEM C1.13 infectées par LAV-I, - tache a virus obtenus à partir de cellules HUT-78 infectées par STLV-III, - taches C et D : isolats respectivement obtenus à partir des virus des deux patients africains susmentionnés, - tache E : extrait cellulaire témoin négatif obtenu à partir de cellules HUT-78 non infectées, - tache F : virus obtenu à partir d'un patient du Zabre affecté par le SIDA et ayant été cultivé sur des lymphocytes T normaux en présence de TCGF. Toutes les taches ont été obtenues avec une quantité de virus correspondant à 25.000 dpm en activité transcriptase inverse, sauf pour les taches C : 15.000 dpm. Les observations faites ont été les suivantes Les ARNs génomiques des deux isolats de LAV-II, obtenus à partir de particules virales purifiées, n'ont hybridé avec aucune des sondes dans les conditions stringentes sus-indiquées, bien que les particules virales aient été isolées et purifiées à partir de surnageants de cultures de cellules hautement infectées témoignant d'une activité transcriptase inverse élevée. Dans les conditions non stringentes sus-indiquées, les observations suivantes ont été faites. Toutes les sondes ont hybridé de façon intense avec les ARNs génomiques obtenus des préparations témoins de LAV-I et d'un autre isolat obtenu à partir d'un patient du Zaire souffrant du SIDA. Deux des sondes obtenues (nucléotides 990-1070 et 990-1260, toutes deux de la région GAG) ont hybridé légèrement avec les taches des extraits des rétrovirus LÂV-II; l'une seulement de ces deux sondes (nucléotides 990-1260) a aussi montré une légère hybridation avec la tache de STLV-III (figure 5). En ce qui concerne la sonde contenant un fragment de la région D01 (nucléotides 2170-2240), on a observé une hybridation avec STLV-III et, mais de façon beaucoup plus faible, avec l'ARN de LAV-II. L'autre sonde de la région pol (nucléotides 3370-3640) n'a donné d'hybridation avec aucune des taches de LAV-II et de STLV-III. Enfin, la sonde modifiée par translation de coupure et contenant la totalité du gène env et le LTR (nucléotides 5290-9130) n'a hybridé ni avec les ARNs de STLV-III, ni avec ceux de LAV-iI. On remarquera encore qu'une autre sonde, qui contenait l'extrémité 5' du cadre de lecture de pol (correspondant à la région protéase) n'a hybridé ni avec les ARNs de LAV-iI, ni avec les ARNs de STLV-III. il résulte donc encore de ce qui précède que le virus LAV-II parait plus éloigné, sur le plan structural, du virus LAV-I qu'il ne l'est de STLV-III, dont il diffère néanmoins de façon importante. L'invention concerne également, outre le virus LAV-II et ses variants, tout virus équivalent présentant des caractéristiques immunologiques propres au LAV-II. D'une façon générale, l'invention concerne tout virus qui, outre les propriétés que possède le LAV-II déposé à la CNCM, présente encore les caractéristiques suivantes. La cible préférentielle du rétrovirus LAV-II est constituée par les cellules Leu 3 (ou lymphocytes T4) humaines et pour des cellules "immortalisées" dérivées de ces lymphocytes T4, par exemple les cellules des lilgnées HUT-78 considérées dans le cadre de cette demande. En d'autres termes, il a un tropisme spécifique~pour ces cellules. il peut être cultivé dans des lignées permanentes du type HUT ou exprimant la protéine T4. Il n'est pas infectieux pour les lymphocytes T8. Il est cytoxique pour les lymphocytes T4 humains. Il a une activité de transcriptase inverse nécessitant la présence d'ions Mg 2+ et présentant une forte affinité pour le poly(adénylateoligodéoxy-thymidylase) (poly(A)-oligo(dT) 12-18). Il a une densité de 1,16 dans un gradient de sucrose.Il a un diamètre moyen de 140 nanomètres et un noyau ayant un diamètre moyen de 41 nanomètres. Les lysats de ce virus contiennent une protéine p26 qui ne croise pas immunologiquement avec la protéine p24 du virus HTLV-I ou du virus HTLV-II Ces lysats contiennent en outre une protéine p16 qui n'est pas reconnue immunologiquement par la protéine p19 de HTLV-I ou de HTLV-II dans des essais de radioimmunoprécipitation RIPA (abréviation de l'expression anglaise Zradioimmunoprecipitation assay"). Ils contiennent en outre une glycoprotéine d'enveloppe ayant un poids moléculaire de l'ordre de 130.000-140.000 qui ne croise pas immunologiquement avec la gap110 du LAV-I, mais qui par contre croise immunologiquement avec la glycoprotéine d'enveloppe gp140 de STLV-III.Ces lysats contiennent en outre un précurseur de cette glycoprotéine ayant un poids moléculaire de l'ordre de 160.000. Ces lysats contiennent encore une glycoprotéine transmembranaire, marquable par la 355-cystéine, ayant un poids moléculaire de l'ordre de 36.000. L'ARN génomique de LAV-II n'hybride pas avec 1'ARN génomique de LAV-I dans des conditions stringentes. Dans des conditions non stringentes, il n'hybride, ni avec la séquence nucléotidique dérivée de LAV-I et contenant le gene env et le LTR qui le jouxte, plus particulièrement avec la séquence de nucléotides 5290-9130 de tAV-I, ni avec des séquences de la région Pol du génome de LAV-I, en particulier avec la séquence de nucléotides 2170-2240. Dans des conditions non stringentes, il hybride faiblement avec des séquences de nucléotides de la région de LAV-I, notamment les séquences de nucléotides 990-1070 et 990-1260. La carte de restriction et la séquence de 1'ARN génomique ou des cADNs obtenus à partir de ces ARNs génomiques sont accessibles à l'homme du métier, dès lors que la souche de LAV-II déposée à la C.N.C.M. peut, après multiplication appropriée, mettre en ses mains le matériel génétique nécessaire aux déterminations de ces cartes de restriction et séquences nucléotidiques. il est à remarquer que tout virus susceptible d'induire un SIDA et dont 1'ARN génomique est susceptible de s'hybrider dans les conditions usuelles avec celui de la souche virale déposée à la C.N.C.M. (ou avec un cADN ou fragment de cADN dérivé de l'ARN génomique du LAV-II déposé à la C.N.C.M.) doit être considéré comme un équivalent de LAV-II.Il en est tout particulièrement ainsi lorsque ces virus équivalents sont caractérisés par des propriétés essentielles sensiblement analogues à celles qui ont été rappelées plus haut pour la souche de LAV-II déposée à la C.N.C.M. La susdite notion d'équivalence s'étend également aux virus dont les extraits ou lysats contiennent des antigènes du type sus-indiqué et conduisant à des ractions immunologiques croisées avec les antigènes du LAV-II déposé à la C.N.C.M. L'invention concerne encore un procédé de production du virus LAV-II dans des lignées cellulaires permanentes dérivées de lymphocytes T4, par exemple du type cellules HUT 78 (lignée déposée à la CNCM sous le n I-519 le 6 février 1986), ce procédé consistant à cultiver ces lignées préalablement infectées avec le virus tAV-ii, et à récupérer les quantités de virus libérées dans le milieu de culture. L'infection préalable peut notamment etre réalisée comme suit Les cellules HUT 78 (106/ml) sont mises en cocultures avec des lymphocytes humains normaux infectés (106/ ml). Le milieu de culture est du RPMI 1640 avec 10 % de sérum de veau foetal. Au bout de 15 à 21 jours, on observe un effet cytopathogène des cellules HUT 78.On dose la reverse transcriptase une semaine après cette observation, dans le surnageant de culture. On peut alors commencer à récupérer le virus à partir de ce surnageant. L'invention concerne encore chacun des antigènes, notamment protéines et glycoprotéines à l'état purifié, tels qu'ils peuvent etre obtenus à partir de LAV-II. On parle de protéines ou glycoprotéines *purifiées" lorsque ces protéines ou glycoprotéines ne conduisent respectivement qu'à des bandes uniques en électrophorèse sur gel de polyacrylamide, notamment dans les conditions expérimentales qui ont été indiquées plus haut. Tout procédé approprié de séparation et/ou de purification pour obtenir chacune d'entre elles peut etre utilisé. On mentionnera à titre d'exemple de technique pouvant etre mise en oeuvre celle décrite par R.C. MONTELARO et Coll., J. of Virology, juin 1982, pp. 1029-1038. D'une façon générale, l'invention concerne tous antigènes, notamment protéines, glycoprotéines ou polypeptides ayant des propriétés immunologiques équivalentes à ceux ou celles du LAV-II. Deux antigènes sont dits "équi- valents" dans le cadre de cet exposé, dès lors qu'ils sont reconnus par les mêmes anticorps, notamment d'anticorps isolables à partir d'un sérum obtenu à partir d'un patient ayant fait une infection avec un LAV-iI, ou dès lors qu'ils répondent aux conditions "d'équivalence immunologique" indiquées ci-après. Parmi les polypeptides, protéines ou glycoprotéines équivalents, doivent être rangés des fragments des antigènes qui précèdent (ou des ppeptides reconstitués par synthèse chimique), dès lors qu'ils donnent lieu à des réactions immunologiques croisées avec les antigènes dont ils sont dérivés. En d'autres termes, l'invention concerne tout polypeptide ayant, en commun avec les susdits antigènes, des épitopes identiques ou semblables, susceptibles d'être reconnus par les mêmes anticorps. Font partie de ce dernier type de polypeptides les produits d'expression de séquences correspondantes des ADNs codant pour les séquences polypeptidiques correspondantes. Le virus LAV-II s'est avéré utilisable comme source d'antigènes pour la détection d'anticorps chez toutes personnes atant été mises en contact avec le virus LAV-II. Les différents antigènes de LAV-II ont été reconnus par des sérums provenant d'autres malades de Guinée-Bissau atteints d'ARC, ou de personnes asymptomatiques dont les anticorps immunoprécipitent les protéines du LAV-II D'une façon générale, l'invention concerne toute composition utilisable pour le diagnostic de la présence dans un sérum fluide biologique, notamment de personnes ayant été mises au contact de LAV-II, d'anticorps contre l'un au moins des antigènes de LAV-II.Cette composition peut etre appliquée au diagnostic séletif de la variété correspondante du SIDA, en mettant en oeuvre les techniques de diagnostic, telles que décrites dans la demande de brevet européen citée ci-dessus, si ce n'est que l'on utilise des extraits, lysats ou encore antigènes purifiés de LAV-II au lieu de ceux de LAV-I. A cet égard, l'invention concerne plus particulièrement des compositions contenant l'une au moins des protéines p12, p16, p26, s'agissant des protéines internes, ou l'une au moins des glycoprotéines gp36, gp40 ou gap160. On mentionnera à titre d'exemples de compositions, celles qui contiennent simultanément : - la p26 et la gp36, - la p26, les gp36, gp140 et, le cas échéant, gp160, - les p12, p16 et p26, - les p16, p26 et gp 140 .... il va de soi que ces compositions n'ont que valeur d'exemples. En particulier, l'invention concerne les extraits ou lysats viraux contenant l'ensemble de ces protéines et/ou glycoprotéines ou toutes fractions dont auront au préalable été séparées une ou plusieurs des protéines ou glycoprotéines susdites. Il doit encore être entendu que l'expression compositions contenant une protéine ou glycoprotéine de ce virus", ne doit pas être entendue comme limitée aux extraits ou lysats du virus LAV-II L'invention concerne encore des compositions associant des protéines et/ou glycoprotéines d'un tAV-II, avec des protéines et/ou glycoprotéines d'un LAV-I, par exemple - soit des protéines du 'core' de LAV-I et de tAV-Ii, notamment les p25 d'un LAV-I et p26 d'un LAV-II, ou encore soit la p18 d'un LAV-I et la p16 d'un LAV-II, - soit des glycoprotéines d'enveloppe d'un LAV-I et des glycoprotéines d'enveloppe d'un LAV-II, notamment la gp110 de LAV-I et la gp140 de LAV-Ii, ou encore la gp42 de LAV et la gp36 de LAV-iI, - soit naturellement des mélanges de protéines et/ou glycoprotéines d'un LAV-I et de protéines et/ou glycoprotéines d'un LAV-ii. De telles compositions, utilisées pour le diagnostic, permettent par conséquent des opérations de diagnostic du SIDA ou des symptômes qui lui sont associés, qui s'étendent sur un plus large spectre des agents étiologiques responsables. il va sans dire que l'utilisation pour les opérations de diagnostic de compositions qui ne contiennent que des protéines et/ou glycoprotéines de LAV-II n'en reste pas moins utile pour des diagnostics plus sélectifs de la catégorie de rétrovirus qui peut etre tenue pour responsable de la maladie. L'invention concerne encore les ADNs ou fragments d'ADNs, plus particulièrement ADNs et fragments d'ADNs clonés obtenus à partir de l'ARN ou de cADNs dérivés de l'ARN du rétrovirus LAV-II. L'invention concerne encore particulièrement tous ADNs équivalents, notamment tout ADN présentant des homologies de séquences avec l'ADN du LAV-II, en particulier avec les séquences codant pour les régions env et Dol de la souche de LAV-II déposée a la C.N.C.M., au moins égales à 70 0, de préférence à 90 D'une façon générale, on dira encore que l'invention concerne tout ADN (ou ARN) équivalent capable d'hybrider avec l'ADN ou l'ARN du LAV-II dans la technique du spot blot" dans des conditions non stringentes telles que définies ci-dessus. L'invention concerne de la meme façon les sérums susceptibles d'être produits chez l'animal par inoculation à celui-ci de LAV-ii. L'invention concerne donc plus particulièrement les anticorps polyclonaux plus spécifiquement orientés contre chacun des antigènes1 notamment protéines ou glycoprotéines du virus. Elle concerne aussi les anticorps monoclonaux qui peuvent être produits par des techniques classiques, ces anticorps monoclonaux étant orientés respectivement plus spécifiquement contre les différentes protéines du LAV-II. Ces anticorps polyclonaux ou monoclonaux sont utilisables dans différentes applications. On mentionnera essentiellement leur utilisation pour neutraliser les protéines correspondantes, voir inhiber l'infectivité du virus entier. Ils peuvent également etre utilisés, par exemple, pour mettre en évidence des antigènes viraux dans lEs préparations biologiques ou pour réaliser des opérations de purification des protéines et/ou glycoprotéines correspondantes, par exemple par leur utilisation dans des colonnes de chromatographie d'affinité. il est entendu que, d'une façon générale, la littérature technique disponible (notamment celle dont les références bibliographiques sont rappelées dans le cadre de la présente description) en ce qui concerne le LAV-I et le virus dénommé HTLV-III doit etre considérée comme faisant partie de la présente invention, dès lors que les techniques décrites par cette littérature s'appliquent dans des conditions semblables à l'isolement du virus LAV-II ou de virus équivalents, à l'obtention à partir de ces virus de leurs différents constituants (notamment protéines, glycoprotéines, polypeptides, acides nucléiques). On peut également faire appel aux enseignements de cette littérature technique pour ce qui est de l'application des différents constituants concernés, notamment à des opérations de diagnostic des formes correspondantes de SLA ou de SIDA. La présente invention concerne plus particulièrement un procédé de diagnostic in vitro du SIDA, qui comprend la mise en contact d'un sérum ou d'un autre milieu biologique provenant d'un malade faisant l'objet du diagnostic avec une composition contenant l'une au moins des protéines ou glycoprotéines du LAV-II, ou encore un extrait ou lysat du virus, et la détection de la réaction immunologique. Des exemples de telles compositions ont été indiqués plus haut. Des méthodes préférées mettent en jeu par exemple des réactions immunoenzymatiques de type ELISA ou d'immunofluoresence. Les titrages peuvent être des mesures par immunofluorescence directe ou indirecte ou des dosages immunoenzymatiques directs ou indirects. Ainsi la présente invention est également relative à des extraits de virus (soit d'un extrait d'un ou plusieurs LAV-II seulement, soit d'un mélange d'extraits originaires d'un ou plusieurs LAV-II, d'une part, et d'un ou plusieurs LAV-I, d'autre part), ces extraits étant marqués. On peut utiliser tout type de marqueur approprié : enzymatique, fluorescent, radioactif, etc.. De tels titrages comprennent par exemple - le dépôt de quantités déterminées de l'extrait ou des compositions visées conformes à la présente invention dans les puits d'une microplaque de titrage - l'introduction dans ces puits de dilutions croissantes du sérum à diagnostiquer e - l'incubation de la microplaque - le lavage soigneux de la microplaque avc un tampon approprié - l'introduction dans les puits de la microplaque d'anticorps marqués spécifiques d'immunoglobulines humaines, le marquage étant réalisé par une enzyme choisie parmi celles qui sont capables d'hydrolyser un substrat de telle sorte que ce dernier subit alors une modification de son absorption des radiations, au moins dans une bande de longueurs d'ondes déterminée et - la détection, de préférence de façon comparative par rapport à un témoin, de l'importance de l'hydrolyse du substrat en tant que mesure des risques potentiels ou de la présence effective de la maladie. La présente invention est également relative à des néessaires ou "kits" pour le diagnostic ci-dessus, lesquels comprennent - un extrait ou une fraction plus purifiée des types de virus indiqués ci-dessus, cet extrait ou fraction étant marqué, par exemple de façon radioactive, enzymatique ou immunofluorescence - des anti-immunoglobulines humaines ou une protéine A (fixée de façon avantageuse sur un support insoluble dans l'eau, tel que des billes d'agarose) - un extrait de lymphocytes obtenus à partir d'une personne en bonne santé - des tampons et, le cas échéant, des substrats pour la visualisation du marquage. L'invention concerne naturellement aussi l'utilisation des cADNs ou de leurs fragments (ou de recombinants les contenant) en tant que sondes, pour le diagnostic de la présence ou non de virus LAV-II dans des échantillons de sérums ou d'autres liquides ou tissus biologiques obtenus à partir de patients suspectés d'etre porteurs du virus LAV-II Ces sondes sont de préférence marquées également (marqueurs radio-actifs, enzymatiques, fluorescents, etc.). La détection peut être réalisée de toutes façons en soi connues, notamment par une mise en contact de ces sondes soit avec les acides nucléiques obtenus à partir des cellules contenues dans ces sérums ou autres milieux biologiques, par exemple liquides céphalorachidiens, salive, etc.., soit avec ces milieux eux-memes dès lors que leurs acides nucléiques auront été rendus accessibles à l'hybridation avec ces sondes, et ce dans des conditions permettant l'hybridation entre ces sondes et ces acides nucléiques et par une détection de l'hybridation éventuellement produite. Le susdit diagnostic mettant en jeu des réactions d'hybridation peut également etre réalisé à l'aide de mélanges de sondes respectivement originaires d'un LAV-I et d'un LAV-II, dès lors qu'il n'est pas nécessaire de faire une différence entre le type de virus LAV recherché. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement & ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes; en particulier celles qui sont encore indiquées dans les revendications qui suivent et qui, à ce titre, doivent etre considérées comme incorporées - ou réincorporables - à la présente description. Il est encore précisé que dans ce qui précède les noibres qui suivaient les indications p- et/ou "gap" correspondent aux poids moléculaires approximatifs des protéines et/ou glycoprotéines correspondantes divisés par 1000. Par exemple la gp36 a un poids moléculaire de l'ordre de 36 000. il est cependant entendu que ces valeurs de poids moléculaires peuvent varier dans un intervalle pouvant atteindre 5 X, selon les techniques utilisées pour les déterminations de ces poids moléculaires. il est mentionné que le caractère cytopathogène du virus LAVII à l'égard des lymphocytes est caractérisé par t'apparition de cellules multi-nucléées. Le virus LAV II peut être cultivé dans des lignées permanentes portant le phénotype T4, en particulier dans des cellules connues sous la désignation CEM. L'infection puis la culture des cellules CEM infectées peuvent être réalisées comme suit. On procède à la coculture de lymphocytes T4 préalablement infectés avec le virus LAV II et de cellules non infectées de la lignée CEM pendant le temps nécessaire à l'infection des CEM. On poursuit d'ailleurs ensuite les conditions de culture dans un milieu approprié, par exemple celui décrit ci-après et, lorsque l'activité transcriptase inverse des cellules infectées a atteint un niveau suffisant, on récupère le virus produit à partir du milieu de culture. On a notamment réalisé une co-culture dans les conditions précisées ci-après de lymphocytes T4 humains qui avaient été infectés cinq jours auparavant avec une souche de virus LAV II provenant d'un patient désigné ci-après "Rod", d'une part et de CEM, d'autre part. Les lymphocytes T4 infectés, préalablement activés par la phytoglutinine, se sont révélés posséder une activité de transcriptase inverse de 5 000 cpm/106 lymphocytes T normaux trois jours après le début de l'infection. La culture a été poursuivie jusqu'à ce que l'activité transcriptase inverse mesurée ait atteint 100 000 cpm dans le surnageant. Ces lymphocytes T4 ont alors été mis en contact avec les cellules CEM (3.106 cellules CEM par 1.106 lymphocytes T normaux infectés) dans le milieu de culture suivant : RPMI 1640 contenant 2,92 mg/ml de L glutamine, 10P de sérum de veau foetal décomplémenté, 2 pg/ml de polybrène, 0,05% de sérum anti-interféron-alpha,l00 000 u/ml de pénicilline, 10 mcg/ml de streptomycine et 10 000 mcg/ml de néomycine. Le milieu de culture a été porté à la température de 56eC pendant 30 minutes. Le milieu de culture est changé deux fois par semaine. Les mesures d'activité transcriptase inverse mesurées dans le surnageant ont été les suivantes - au jour 0 : 100 000 - au jour 15 : 20 000 - au jour 21 : 200 000 - au jour 35 : 1 000 000 La culture de CEM infectées par le virus LAV II a été déposée à la Collection Nationale de Culture de Micro- organismes de l'INSTITUT PASTEUR (C.N.C.M.) sous le n" I-537 le 24 mars 1986 BIBLIOGRAPHIE 1 - F. Barré-Sinoussi et al., Science 220, 868 (1983). 2 - L. 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