FR 2602792 A1 19880219 FR 8611311 A 19860805 L'application pratique de la technologie de l'ADN recombinant à la production de molécules intéressantes par des microorganismes se heurte généralement au problème de l'instabilité des plasmides recombinants. Les vecteurs de clonage et d'expression couramment utilisés en laboratoire sont généralement des plasmides multicopies et leur transmission stable à la descendance est assurée par le grand nombre de plasmides par génome cellulaire (Jones et al. 1980). Toutefois, I'introduction de gènes étrangers dans ces plasmides entraîne des degrés divers d'instabilité au cours des cycles de multiplication des bactéries. Or, des productions industrielles peuvent nécessiter des cultures de 1 000 litres, aboutissant à plus de 1016 cellules, après plus de 50 générations. Il est donc essentiel de stabiliser les plasmides dans les bactéries pour assurer leur présence et donc l'expression de la molécule étrangère, jusqu'à la fin de la culture en fermenteur. La stabilisation des plasmides par intégration d'un gène codant pour la résistance à un antibiotique est une pratique classique de laboratoire mais qui ne peut être appliquée à l'usage industriel pour diverses raisons - I'utilisation d'une souche de bactérie résistante à un antibiotique peut représenter un risque pour l'environnement - la quantité d'antibiotique nécessaire pendant la culture augmente considérablement le court de la production - l'utilisation d'antibiotique ne peut être envisagée pour la production de substances à usage thérapeutique humain ou vétérinaire. I1 est donc essentiel de mettre au point d'autres méthodes de sélection des bactéries portant un plasmide recombinant. Les quelques modèles qui ont déjà été appliqués reposent sur le même principe : la cellule hôte est mutée (mutation auxotrophe ou introduction d'un gène létal pour la bactérie) de manière à empêcher sa multiplication en l'absence d'un plasmide codant pour un caractère qui complémente la déficience de l'hôte. Par exemple, Skogman et Nilson (1984 et 1985) ont utilisé la complémentation d'une mutation thermosensible val S par le gène val S porté par un plasmide ; dans ce modèle, la stabilité du plasmide, qui porte entre l'opéron tryptophane, est totale après 200 générations à température non permissive, alors qu'on observe 1,2 % de perte du plasmide à chaque génération en conditions non sélectives (300C). Miwa et al. (1984) ont utilisé comme souche hôte un mutant de E. coli streptomycine-dépendant (Smd) et un plasmide portant un gène (rpsl d'une souche SmR) qui masque le phénotype Sm d et rend la souche indépendante de la streptomycine en assurant une stabilité du plasmide supérieure à 99 %. Herthberger et Rosteck (1984) ont rendu une bactérie lysogène pour un prophage lambda délété de son répresseur ; la cellule ne peut échapper à la lyse qu'en présence d'un plasmide portant le répresseur lambda ci. On a développé un nouveau modèle de sélection basé sur la complémentation d'une mutation chromosomique dap par un gène plasmidique dap+, ce qui assure la survie des seules cellules qui portent le plasmide. L'acide diaminopimélique (DAP) est un composant de la paroi des bactéries ; il constitue aussi un intermédiaire de la biosynthèse de la lysine à partir d'aspartate. Une souche déficiente en une enzyme de la biosynthèse du DAP ne sera pas capable de se multiplier en milieu minimum ; l'addition de lysine dans le milieu permettra la croissance mais entraînera rapidement la lyse de la cellule qui n'incorpore pas de DAP dans sa membrane (Work 1950 - Davis et al., 1973). La déficience en une enzyme de la biosynthèse du DAP peut être complémentée par l'introduction du gène correspondant sur un plasmide et, en particulier, sur le vecteur d'expression de la protéine étrangère dont on veut assurer la production. Si la bactérie perd le plasmide, elle redevient dap et ne peut plus se multiplier. Ce modèle présente l'avantage de pouvoir s'appliquer à tout milieu de culture dépourvu de DAP, c'est-à-dire tout milieu industriel de production et tout milieu riche ou minimum additionné de lysine. Le système présente aussi l'avantage de ne pas perturber la synthèse de l'ADN, de l'ARN ou des protéines. On a construit une souche dapD- (délétée d'un des 9 gènes de la voie biosynthétique de la lysine, le gène D, correspondant à la tétrahydropicolinate-N-succinyl transférase) et introduit le gène dapD sur un plasmide d'expression couramment utilisé (portant le gène à exprimer sous le contrôle du promoteur PL). En condition de sélection, on peut montrer que le plasmide est stable pendant au moins 150 générations. Le clonage d'un autre gène (dapA) codant pour une enzyme de la biosynthèse de la lysine sur un plasmide a déjà été réalisé, dans le but d'augmenter la production de lysine (Dauce-Le Reverend et al. 1982) mais ces auteurs ne maîtrisent pas la stabilité de leur plasmide. Le gène dapD de E. coli a déjà été cloné dans le plasmide pBR322 et sa séquence nucléotidique a été publiée par Richaud et al. (1984) mais le but de ce travail est seulement l'étude de la régulation de ce gène. C'est pourquoi, la présente invention concerne un procédé de stabilisation d'un vecteur plasmidique contenu dans une bactérie, caractérisé en ce que la bactérie comporte une mutation chromosomique dap et en ce que le vecteur plasmidique porte un gène dap+. Parmi les mutations chromosomiques dap, on utilisera, de préférence dapD mais d'autres gènes codant pour une enzyme de la biosynthèse du DAP pourraîent être utilisés à condition de prévoir un plasmide vecteur portant le gène correspondant ; dans le cas d'une souche dapD, le gène à insérer dans le plasmide sera dapD. Les plasmides sont plus particulièrement utilisables pour l'expression de protéines d'intérêt industriel, par exemple l'hirudine ou l'interféron gamma comme cela sera décrit ci-après, mais le système de stabilisation dap n'interfère pas avec l'expression de la protéine, il peut donc être utilisé avec un vecteur d'expression quelconque. Dans ce qui suit, le système d'expression comprend le promoteur de gauche du phage lambda, mais il pourraît s'agir d'un autre promoteur actif dans la bactérie en cause. Ceci explique pourquoi il ne sera pas procédé à une description complète des éléments d'expression de la protéine hétérologue, ce type de plasmide étant maintenant largement connu. il conviendra simplement d'insérer le gène dapD ou autre dans un site non essentiel du vecteur plasmidique. Les plasmides en cause peuvent être utilisés pour transformer n importe quelle souche E. coli rendue dapD. Grâce au procédé selon l'invention, on obtient des souches bactériennes dans lesquelles les plasmides d'expression sont stables en milieu complet sans besoin d'une pression sélective par un antibiotique ou d'un milieu particulier dépourvu d'un acide aminé par exemple. De plus, le procédé selon l'invention exerce une contre-sélection contre les bactéries qui ont perdu le plasmide. L'invention concerne donc égalementles souches bactériennes, en particulier de E. coli dap, transformées par un vecteur plasmidique portant un gène dap+ et les éléments assurant l'expression d'une protéine d'intérêt industriel portée par ce plasmide. L'invention concerne également un procédé pour la préparation d'une protéine d'intérêt industriel à partir d' une bactérie, dans lequel on cultive sur un milieu complet une bactérie transformée par un plasmide selon l'invention, ledit plasmide comportant en outre le gène de ladite protéine et les signaux de contrôle de l'expression de cette protéine dans la bactérie hôte. Les exemples ci-après ont pour but de démontrer la stabilité de plasmides portant le gène dapD dans des bactéries dap en comparaison avec des plasmides portant le gène Ampr. Ces plasmides portant le gène dapD ont en outre été utilisés pour exprimer les gènes codant pour l'hirudine et l'interféron gamma. Ces deux gènes sont placés sous le contrôle du promoteur PL du phage lambda et les souches hôtes de E. coli contiennent le répresseur thermosensible C1857 ; ce système permet d'induire l'expression du gène contrôlé par PL par élévation de la température. La souche de E. coli TGE 900 qui comporte le répresseur Cl857 a été modifiée pour devenir dapD en donnant la souche TGE 7615. Les plasmides suivants ont ensuite été préparés selon les schémas ci-annexés Amp r dapD Protéine étrangère Figure 1 - pTG764 + + 0 Figure 2 - pTG720 + 0 Hirudine Figure 2 - pTG771 + + Hirudine Figure 3 - pTG775 0 + Hirudine Figure 3 - pTG776 0 + Hirudine Figure 4 - pTG766 0 + 0 Figure 4 - pTG767 0 + 0 Figure 5 - pTG7671 0 + IFN gamma Figure 5 - pTG7672 0 + IFN gamma METHODES Les différentes enzymes sont, sauf indication contraire, utilisées selon les techniques connues. Transformation Les cellules compétentes ont été préparées selon la méthode de Hanahan (1983). Leur compétence s'élève à 104 à 105 transformants/g 6 nN pour la souche RL58 (Bollen et ai. 1979) et 105 à 106 transformantstpg DN pour la souche TGE 7615. De manière générale, on ajoute à 0,2 ml d'un stock de cellules compétentes 1 à 10 pI d'une solution ayant la dilution appropriée, d'une préparation d'ADN contenant le plasmide que l'on veut introduire dans la souche. On laisse réagir les cellules avec l'ADN pendant 15 minutes à 0 C puis on les incube à 370C pendant 90 secondes. On les remet à OOC pendant 5 minutes puis on y ajoute 0,8 ml de milieu LB. Pour la souche RL58 ou pour la souche TGE 7615, ce milieu doit contenir du DAP à raison de 8 gamma /ml. Ceci est nécessaire à la croissance des cellules dapD, même celles qui contiennent le plasmide portant le gène dapD.On incube les cellules de manière générale à 30"C avec une forte agitation (toutefois, on peut les mettre à 37"C si le plasmide ne contient pas le promoteur PL). Le temps d'incubation est de 60 minutes, mais il peut être prolongé à 90 minutes pour une croissance à 300C pour la souche TGE 7615. Ensuite, des volumes fixes (0,1 ml) sont étalés sur du milieu LB solide. Pour les plasmides contenant le gène de résistance à l'ampicilline, on sélectionne les clones par addition de 100 gamma/ml d'ampicilline ; les clones contenant le gène dapD sont sélectionnés, à partir d'une culture qui est dapD dans son ensemble, est dapD dans son ensemble, sur le milieu LB sans autres additions. Les boîtes sont incubées pendant 24 heures à 30"C. Les colonies sont ensuite repiquées au cure-dents dans 3 ml de milieu LB et après une nuit de croissance à 30"C le plasmide est isolé et sa structure confirmée sur gel d'agarose, après digestion par les enzymes de restriction appropriées. Les plasmides contenant le gène dapD peuvent être transformés dans n'importe quel E. coli qui porte la mutation dapD (par exemple RL58, TGE7615) ; si, en outre, ils contiennent le promoteur PL du bactériophage lambda, ils doivent nécessairement être transformés dans des souches de E. coli dapD qui expriment le répresseur C1857 du bactériophage lambda, soit sur un plasmide2 soit dans le chromosome, ou le Cl et une mutation Rec (par exemple RecA441). EXEMPLE I Introduction d'un Rène muté dapD dans la souche E. coli TGE900 La souche hôte E. coli TGE900 a été rendue dap par une conjugaison avec un mutant dapD connu, RL58. La souche TGE900 est un dérivé de la souche N4830 décrite par Gottesman et al. (1980) dont les caractéristiques sont : su F- his ilv bio (acul857 a Bam ÔHI) Smr. Elle est couramment utilisée comme hôte pour les vecteurs d'expression dans lesquels le gène étranger est placé sous le contrôle du promoteur PL de lambda parce qu'elle permet d'induire l'expression à volonté par une augmentation de la température (supérieure à 370C) ce qui inactive le répresseur thermosensible (lambda c1857) porté par la bactérie. La souche dap RL58 (met B dapD2 met D279 Hfr P4 X) a été décrite par Bollen et al. (1979). A partir de'cette souche, on a sélectionné un mutant spontané résistant au triméthoprim (après étalement de la souche sur une boîte contenant 2 gamma/ml de triméthoprim et confirmation du caractère résistant d'une colonie choisie en milieu contenant 4 gamma/ml de triméthoprim). En effet, le gène codant pour cette résistance est suffisamment proche de la mutation dapD pour que si la souche réceptrice après conjugaison, devient résistante au triméthoprim elle soit également devenue dapD. La souche résistante a été appelée TGE755 ; ses caractéristiques utiles sont Hfr dapD Temps. Après conjugaison des souches TGE900 oe SmreS dap+) et TGE755, interrompue après 15 minutes, par étalement sur milieu minimum contenant du DAP, de la streptomycine et du triméthoprim, on sélectionne des colonies Sm r Tmp r on vérifie ensuite le caractère dap des souches sélectionnées sur milieu LB et la présence des mutations auxotrophes de la souche parentale (his ilv val) sur milieu minimum + DAP. Une souche (his ilv dap-) a été retenue : Tue7615. EXEMPLE 2 Construction d'un plasmide vecteur portant le gène dapD de E. coli (figure 1) a) Construction d'un plasmide de clonage à usage multiple comprenant un polylinker à 12 sites de restriction La construction a été amorcée à partir du plasmide pML2 (Lusky et Botchan, 1981), dérivé du pBR322 par délétion des nucléotides 1089 à 2491. Ce plasmide a conservé l'origine de réplication de pBR322 et le gène de la beta lactamase (résistance à l'ampicilline). La séquence de reconnaissance de l'enzyme psti a été éliminée par insertion d'un fragment Ahalll-Ahalll de pUC8 qui porte une mutation Pstl induite à l'éthane-sulfonate (Vieira et Messing, 1982), entre deux sites AhalII de pML2, ce qui délète 19 paires de bases du pML2. Le plasmide résultant, pTGr90, porte la mutation PstI de pUC8. Un linker BglII (5'-dCAGATCTG-3' ; Collaborative Research) a été inséré dans le site unique Nrul, par la technique de "linker tailing" décrite par Lathe et al., 1984. La construction résultante est le pTGl9l. Le pTGl9l a été ouvert par EcoRI et Bglll (ce qui délète le gène de résistance à la tétracycline) et religué avec le segment EcoRI-BgllI du phage M13TG131 (Kieny et al., 1983) qui comprend un polylinker à 12 séquences de reconnaissance d'enzymes de restriction. le plasmide résultant est le pTG192. b) Clonage d'un gène dapD dans le plasmide pTG192 Le gène chromosomique dapD de E. coli a été inséré dans le plasmide pACYC184 pour donner le pDB6 (Bendiak et Friesen, 1981). Ce gène dapD a été récupéré à partir de pDB6 sous forme d'un fragment Alul de 1,3 kb et inséré dans le site EcoRI de pTG192 (les extrémités EcoRI ayant préalablement été réparées par traitement avec le fragment Klenow de l'ADN polymérase 1). Parmi les plasmides résultants, on choisit le pTG764 dans lequel un seul site EcoRI est reconstitué. pTG764 porte donc le gène dapD et le gène de résistance à l'ampicilline du pTG192 (originellement du pUC8). EXEMPLE 3 Plasmide d'expression de l'hirudine contenant les gènes dapD et Amp r (figure 2) Le plasmide pTG720 décrit dans le brevet n" 84 04755 comporte essentiellement le gène de l'hirudine sous le contrôle du promoteur PL de lambda. Le plasmide pTG720 digéré par BgllI et Bgll donne un fragment de 2,74 kb qui porte le gène de l'hirudine et une partie du gène amer. Ce fragment, traité à la phosphatase, est religué au fragment Bglll-BglI du plasmide pTG764 qui porte le gène dapD et un autre fragment du gène ampr. Le plasmide résultant, pTG771, porte le gène amp complet reconstitué, le gène dapD et le gène codant pour l'hirudine. Les colonies de TGE7615 transformées par ce plasmide peuvent être sélectionnées soit sur milieu LB (sélection pour le caractère dap+) soit sur milieu LB + ampicillines Après induction, la souche transformée produit de J'hirudine. EXEMPLE 4 Plasmide d'expression de l'hirudine contenant le gène dapD et ne contenant plus Vamp' (figure 3) Le plasmide de départ est pTG771. On effectue une digestion avec Ahalil pour éliminer le petit fragment comportant l'extrémité 3' du gène codant pour Amp et on referme le plasmide par une ligation en présence d'un "linker" EcoRI: CCGAATTCGG On obtient le plasmide pTG775. Une digestion EcoRI suivie d'une ligation permet d'éliminer entièrement le gène codant pour Ampr. On obtient le plasmide pTG776. Les bactéries TGE7615 transformées par ce plasmide peuvent être sélectionnées en milieu LB, sans addition (sélection pour le caractère dap+). Après induction, la souche transformée produit de l'hirudine. EXEMPLE 5 Construction de plasmides portant le gène dapD et ne comportant pas le gène Vamp' (figure 4) Le plasmide de départ est le plasmide pTG192. Après digestion par Semai et Ahalil, puis traitement à la phosphatase, le fragment du vecteur de 0,95 kb est isolé et ligué avec le fragment AluI de 1,3 kb de pDB6 qui porte le gène dapD. Le gène amp r a donc été complètement délété. On transforme la souche TGE7615 avec ce nouveau plasmide et on sélectionne sur milieu LB pour obtenir des clones qui portent le gène dapD. On obtient des plasmides qui portent le gène dap dans les deux orientations ; I'orientation de l'insert peut être déterminée par digestion avec Pstl. Pour deux candidats choisis . pTG766 libère des fragments de 1,34 kb et 0,9 kb . pTG767 libère des fragments de 1,85 kb et 0,4 kb. EXEMPLE 6 Plasmide d'expression de l'interféron gamma portant le gène dapD (Figure 5) Le plasmide pTG40 (PED) porte sur un fragment Hindi1 de 1,2 kb le gène de l'interféron gamma sous le contrôle du promoteur PL. Après digestion par Hindîli, ce fragment est récupéré et inséré dans le site Hindlil de pTG767 préalablement traité à la phosphatase. Après ligation, on transforme TGE7615 et on sélectionne pour la présence du gène dapD sur milieu LB. On retient deux plasmides qui portent l'insert dans des orientations opposées . pTG7671 (qui a le PL proximal de l'origine de réplication et dans la même orientation) et . pTG7672. Les bactéries TGE7615 transformées par ces plasmides peuvent être sélectionnées en milieu LB, sans addition (sélection pour le caractère dap+). Après induction, la souche transformée produit de l'interféron gamma. Les exemples suivants sont destinés à mettre en évidence les caractéristiques des souches transformées selon la présente invention. Tous les plasmides portant le gène dapD se trouvent dans la souche Tue7615, les autres sont dans la souche TGE900. La stabilité des différents plasmides a été testée sur les milieux appropriés - on appellera milieu sélectif le milieu LB pour les plasmides selon l'invention et le milieu LB + ampicilline pour les plasmides pTG720 et pTG740 - on appellera milieu non sélectif le milieu LB + DAP pour les plasmides selon l'invention et le milieu LB pour les autres plasmides. On effectue une étude de stabilité sur 110 générations, par plusieurs cycles successifs de dilution et multiplication des bactéries. A la fin de cette phase de multiplication, on mesure la stabilité du plasmide de la manière suivante - on mesure le nombre de cellules viables dans la culture, par dilution appropriée et comptage des cellules en milieu non sélectif gélosé ; - un échantillonnage significatif de ces colonies est repiqué en parallèle sur milieux sélectif et non sélectif gélosés et le pourcentage de colonies ayant perdu le plasmide et donc la capacité de croître sur milieu sélectif est déterminé. Les résultats obtenus avec les plasmides portant le gène de l'interféron sont présentés dans le tableau 1: TABLEAU 1 Evaluation de la perte du plasmide par les bactéries après 110 générations Souche TGE900 TGE7615 TGE7615 TGE7615 Plasmide pTG40 pTG766 pTG767 pTG7671 Sélection Amp dapD dapD dapD Milieu LB 2.10-3 2.10-3 Milieu LB + DAP 2.1o-3 C p- = cellules ayant perdu le plasmide p-/c/génération = (nombre de p-/nombre de c testées) x nombre de générations Des essais équivalents réalisés avec les plasmides portant le gène de l'hirudine et avec le vecteur de clonage pTG766, après multiplication des bactéries pendant 170 générations en milieu LB, donnent les résultats suivants TABLEAU 2 Evaluation de la perte du plasmide par les bactéries après 170 générations en milieu LB Souche TGE900 TGE7615 TGE7615 TGE7615 Plasmide pTG720 pTG771 pTG776 pTG766 p+ (%) 96 98 100 100 p-/c/génération 2.1 2.10-4 1,5.10-4 Les résultats représentés dans les tableaux I et 2 montrent 10) que la stabilité des vecteurs dap est améliorée d'un facteur 10 par rapport au plasmide portant le gène ampr 20) que la différence entre le milieu sélectif et non-sélectif est minime 30) que les vecteurs de clonage pTG766 et pTG767 ont une perte inférieure à 5.10-5 p-/c/génération ;; 4 ) que la stabilité du pTG40 est nettement inférieure à celle des vecteurs dap+ mais il convient de préciser que le phénomène se marque surtout après 50 générations ; au début de la culture, la perte n'est que de 2,5.10-4 p-/c/génération 5 ) que la perte des plasmides témoins ampr, pTG40 et pTG720, portant respectivement les gènes de l'interféron et de l'hirudine, est du même ordre de grandeur ; cette perte des plasmides au cours du temps est réduite quand ils portent le gène dapD (pTG766, 767, 7671 et 776). I1 faut toutefois remarquer que la stabilité dû plasmide portant le gène dapD et le gène de la résistance à l'ampicilline (pTC771) est moins bonne et reste comparable à celle de pTC720. On interprète ce résultat par l'analyse du contenu plasmidique sur gel d'agarose ; celle-ci montre que pTC771 se tétramérise, phénomène qui se répercute sur la partition des plasmides et qui rend leur perte plus élevée (Summers et Sherratt, 1984). I1 faut ajouter que sur un nombre réduit de générations (30) ce phénomène de multimérisation ne se produit pas et que sur un total de 70 générations la perte de pTG771 reste inférieure à 2,8.10 4 p-/c/génération. Donc les plasmides qui contiennent le gène dapD voient leur stabilité accrue par rapport aux plasmides portant le gène amp r et leur perte devient minime. EXEMPLE 8 Stabilité des plasmides à 37 ou 42"C L'influence de la température sur la stabilité des plasmides ne peut être étudiée, pour ceux qui contiennent un gène codant pour une protéine étrangère placé sous le contrôle du promoteur PL sans induire l'expression de cette protéine étrangère. Néanmoins, il faut remarquer que dans les conditions ou l'on travaille l'induction est suivie par une augmentation de D.O. de 0,3 à 3,6, ce qui correspond à 3,6 générations. Donc, en fait, les bactéries font le plus grand nombre de générations à 30"C, avant l'induction, avec une perte qu'on a déjà déterminée dans l'exemple précédent. Lorsqu'on induit l'expression d'une protéine étrangère (par exemple l'hirudine pour pTG720 et l'interféron gamma pour pTG40) on constate, après un certain temps (2 à 4 heures), une mortalité de la culture de E. coli à raison de 90 % à 95 %. Il s'agit de cellules contenant le plasmide (puisque la cellule hôte p- est capable de croître à 37 et 42"C). Cette mortalité augmente forcément la proportion des cellules p- par rapport aux cellules en vie d'un facteur de 10 à 20. Lorsque l'ensemble des cellules en vie a fortement diminué et que les cellules p- forment une fraction significative de la population, on mesure la multiplication des cellules p-, ce qui fait diminuer fortement le rapport p+/p- (voir, par exemple, tableau 3, les résultats obtenus après 5 h 30 et 7 heures). II est évident que le paramètre p-/cellule/génération a perdu sa signification dans de telles conditions puisque les p+ ne se multiplient plus. On propose le paramètre suivant: p-/ml/unité de densité optique, qui ne mesure que les cellules p- à chaque moment de la culture. En outre, il permet de comparer deux cultures différentes pour leur perte de plasmide. Ce paramètre est calculé selon la formule suivante p-/ml/DO = C1-(%p+/100)1 x c. viables/ml/DO. Finalement, si l'on rapporte ce paramètre au nombre total des cellules (qui est de 4.108 dans les conditions présentes) on peut obtenir le pourcentage des cellules (Fp-) dans la culture et estimer le degré de contamination de la culture par des cellules p- à chaque moment. Le Fpest calculé de la manière suivante Fp- = 4.108 c/ml/DO x 100/(p-/ml/DO). Fp- est un paramètre objectif qui permet de décider si une culture destinée à la production d'une molécule est suffisamment pure pour valoir un développement ultérieur et qui permet de comparer différents plasmides entre eux dans les conditions d'induction. On va, dans les inductions décrites dans les exemples suivants, mesurer les cellules viables, le pourcentage de p+ et ensuite calculer le p-/ml/DO et le Fp-. Ces données seront présentées sous forme de tableaux. EXEMPLE 9 induction de l'hirudine On présentera les résultats relatifs à l'induction de l'hirudine, en premier lieu, avec un vecteur contenant le gène de résistance à l'ampicilline, ensuite, avec le vecteur contenant aussi le gène dapD. 1) Stabilité des plasmides a) Induction de l'expression de l'hirudine dans un vecteur qui contient le gène de résistance à l'ampicilline (TGE900/pTG720) en LB à 37"C Des résultats typiques pour TGE900/pTG720 sont repris dans le tableau 3. TABLEAU 3 Paramètre de stabilité des plasmides durant l'expression à 42"C de l'hirudine dans TGE900/pTG720 Temps en heures c/ml/DO % p+ p-/ml/DO Fp- (%) 0 h 8,3.107 100 C1,7.106 On voit qu'après 3 heures le nombre de cellules viables par unité de DO diminue en même temps que la porportion de p+. Après 5 h 30 le Fp- (% de p- par rapport à la totalité des cellules) est de l'ordre de 2,35 %. Après 7 heures, ce nombre aura doublé et il est vraisemblable que ceci est dû à la croissance des cellules p- uniquement. b) induction de l'expression de l'hirudine dans un vecteur qui contient le gène dapD (TGE7615/pTG771) en LB à 37"C Les résultats repris dans le tableau 4 sont comparables à ceux obtenus pour pTG720. TABLEAU 4 Paramètres de stabilité des plasmides durant l'expression à 42"C de l'hirudine dans TGE7615/pTG771 Temps en heures c/ml/DO % p+ - p-/ml/DO Fp- (%) 0 h 3,4.106 99,8 7,7.105 0,2 1 h 30 2,1.107 99,2 lJ.l05 0,04 3 h 9,7.106 100 (1,0.105 On voit dans le tableau 4 que malgré une mortalité comparable à celle enregistrée pour TGE900/pTG771, la perte de plasmide (%p+) est faible (après 5 heures 98 % p+) tout comme la quantité absolue de cellules p- (p-/ml/DO). Après 5 heures le Fp- se quantifie à 0,04 %, ce qui est 10 fois moins que pour pTG720 au même moment.Ceci montre la meilleure stabilité du pTG771 par rapport au pTG720. Il faut rappeler que dans une expérience d'induction le pTG771 ne s Les résultats montrent une plus grande stabilité du plasmide pTG771 que celle de pTG720. 2) Le contenu plasmidique Les plasmides pTG1'20 et pTG771 ont été isolés à différents temps durant l'induction. De manière générale, on observe au début de l'induction, en phase exponentielle, un contenu plasmidique par cellule faible et qui s'accroît de manière sensible au cours du temps. Durant cette même période, il y a production d'hirudine. II est intéressant de noter que cette augmentation du contenu plasmidique se produit dans une population où plus de 95 96 des cellules sont mortes. 3) L'activité induite Les activités d'hirudine produites à partir des pTG720 ou pTG771 ne sont pas significativement différentes. Les valeurs (en unités antithrombine, UAT) sont de 2720 UAT/1/DO pour pTG720 et de 2380 UAT/l/DO pour pic771, après 5 heures d'induction. En conclusion, on peut dire que le pTG771 montre une stabilité accrue par rapport au pTG720, tout en gardant la même capacité de production et les mêmes propriétés d'augmentation de son nombre de copies en fin de phase exponentielle que le pTG720. EXEMPLE 10 Induction de l'interféron gamma Les données concernant l'induction de l'interféron gamma sont présentées de la même manière que celles de l'hirudine. 1) Stabilité des plasmides a) Induction de l'expression de l'interféron gamma dans un vecteur contenant le gène de résistance à l'ampicilline (TGE900/pTG40) en LB à 42"C Les résultats repris dans le tableau 5 montrent que la perte des plasmides est comparable à celle du pTG720- et qu'après 5 heures le Fps'élève à 6 96. Toutefois, à la différence de pTG720, la viabilité se perd plus vite et après 3 heures déjà un nombre minimal de cellules viables est atteint (à comparer avec les 5 heures observées pour le pTG720) ; de plus, les cellules p- présentes dans la culture restent viables et se divisent déjà significativement après 3 heures et contribuent à ce Fp- de 6 96 après 5 heures. TABLEAU 5 Paramètres de stabilité des plasmides durant l'expression à 42"C de l'interféron dans TGE900/pTG40 Temps en heures c/ml/DO 96 p+ p-/ml/DO Fp- (%) (Nb de colonies testées) Oh 1 h 30 1,8.106 100 (202/202) 3 h 6,6.106 10 6,0.106 1,5 (2/20) 5 h 2,5.107 2,7 2,4.107 6 (10/366) 6 h 4,3.107 1,7 7,3.107 18 (11/645) 8 h 1,3.108 0,9 1,3.108 32 (4/465) b) Induction de l'expression de l'interféron dans un vecteur contenant le gène dapD (TGE7615/pTG7671) en LB à 42 C Dans le tablerau 6, figurent les données relatives à une induction de TGE7615/pTG7671 à 42 C en LB.On remarque que la mortalité maximale n'est atteinte qu'après 5 heures et qu'à ce moment, bien que le %p+ soit comparable à celui du pTG40 (10 %), le nombre des cellules p- (p-/ml/DO) est 5 fois inférieur à celui que l'on obtient après 3 heures pour le pTG40. En fait, après 5 heures le Fp- est de 0,3 % alors que le Fp- pour pTG40 est alors déjà de 6 %. Il y a donc une différence d'un facteur 20, qui est un reflet de la stabilité accrue du pTG7671, observation qui confirme les données de stabilité à 300C (voir tableau 1). TABLEAU 6 Paramètres de stabilité des plasmides durant l'expression à 42 C de l'interféron dans TGE7615/pTG7671 Temps en heures c/ml/DO % p+ p-/ml/DO Fp- (%) (Nb de colonies testées) 0 h 1,7.108 100 (50/50) 1 h 30 1,35.108 100 (50/50) 3 h 4,2.107 100 (50/50) 5h 1,3.106 12 1,1.106 0,3 (6/50) 6 h 2,2.106 5 2,1.106 0,5 (5/100) En conditions d'induction de TGE7615/pTG7671 à 42"C, la stabilité du plasmide est pratiquement identique en milieux sélectif et non-sélectif, la stabilité du pTG7671 étant déjà très bonne en absence de sélection.La perte du plasmide est donc réduite à un taux très satisfaisant et compatible avec une production industrielle. 2) Le contenu plasmidique L'analyse sur gel d'agarose du contenu plasmidique montre que les souches transformées par les plasmides pTG40 et pTG7671 contiennent des quantités équivalentes de matériel et que ce contenu plasmidique par cellule augmente au cours du temps pendant l'induction. 3) Sélection des cellules p+ contenant le gène dapD Afin de mettre en évidence le pouvoir sélectif du système dapD en tenant compte de la croissance des cellules p-, qui ne seront plus générées dès que la majeure partie des cellules auront perdu leur viabilité, on effectue une induction pendant laquelle la culture est diluée d'un facteur 5 à trois reprises espacées de 2 heures, après quoi on laisse cette culture atteindre la phase stationnaire. Les résultats pour l'induction à 42"C de TGE7615/pTG7671 sont présentés dans le tableau 7 pour une croissance en milieu sélectif LB et dans le tableau 8 pour une croissance en milieu non-sélectif LB + DAP. TABLEAU 7 Paramètres de stabilité des plasmides durant l'expression à 42 C de l'interféron dans TGE76l5/pTC767l en milieu sélectif LB Temps en heures c/ml/DO % p+ p-/ml/DO Fp- (%) (Nb de colonies testées) 0 h 3,8.107 100 (50/50) 2 h 8,3.107 97 1,4.106 0,4 (60/60) TABLEAU 8 Paramètres de stabilité des plasmides durant l'expression à 42"C de l'interféron dans TGE7615/pTG7671 en milieu LB + DAP Temps en heures c/ml/DO 96 P± p-/ml/DO Fp- ( ,ó) (Nb de colonies testées) O h 5,5.107 100 z 1,2.106 ( 0,3 (50/50) 2 h 9,9.107 99 1,3.106 0,3 (74/75) 4 h (106 6 h lo6 9 h 1,7.107 5 1,6.107 4 (5/100) On remarque dans le tableau 8 qu'au bout de 9 heures d'induction les cellules viables contiennent toutes du plasmide, en milieu sélectif LB (la présence du plasmide est confirmée par minipréparationà partir de 30 colonies sur un total de 60 colonies positives sur LB et identification du plasmide par électrophorèse sur gel d'agarose). En milieu non-sélectif, par contre, la viabilité est 5 fois plus élevée, mais la culture ne contient plus que 5 % de cellules ayant retenu le plasmide. Cette viabilité plus élevée en LB + DAP qu'en LB montre la croissance des cellules p- en milieu aditionné de DAP et a fortiori la mortalité des cellules p- dans le milieu sélectif.Donc le milieu LB permet une contre-sélection efficace des cellules p-. 4) Production de l'interféron Le pTG7671 garde la même capacité de production de I'interféron gamma que le plasmide originel pTG40. Les souches et constructions représentatives de l'invention ont été déposées à la Collection Nationale de l'Institut Pasteur, le 25 juillet 1986: . TGE7615/pTG7671 sous le n 1-586 TGE76l5/pTC77l sous le n 1-585. REFERENCES 1. jones l.M., Primrose S.B., Robinson A., Ellwood D.C. (1980) Mol. Cen. Genet. 180, 579-584. 2. Nilsson J., Skogman G. (1985) European patent application n" 84850313.2. 3. Skogman G., Nilsson J. (1984) Gene 31, 117-122. 4. Miwa K. 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REVENDICATIONS 1) Procédé de stabilisation d'un vecteur plasmidique contenu dans une bactérie, caractérisé en ce que la bactérie comporte une mutation chromosomique dap et en ce que le vecteur plasmidique porte un gène dap+. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mutation chromosomique dap est une mutation du gène dapD et en ce que le plasmide vecteur porte un gène dapD intact. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le plasmide vecteur porte le gène codant pour une protéine d'intérêt industriel et les éléments assurant son expression dans la bactérie hôte. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la bactérie hôte est une souche de E. coli. 5) Procédé selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt industriel est choisie parmi l'hirudine et l'interféron gamma. 6) Souche bactérienne contenant un vecteur plasmidique d'expression stabilisé obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 5. 7) Souche bactérienne selon la revendications 6, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de E. coli présentant une mutation chromosomique dap et transformée par un vecteur plasmidique portant un gène dap+ et un gène qui code pour l'expression d'une protéine d'intérêt industriel. 8) Souche bactérienne selon la revendication 7, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt industriel est choisie parmi l'hirudine et l'interféron gamma. 9) Souche bactérienne selon la revendication 8, caractérisée en ce que le gènee de l'hirudine ou de l'interféron gamma est sous le contrôle des éléments nécessaires pour assurer son expression dans la bactérie. 10) Procédé de préparation d'une protéine d'intérêt industriel, caractérisé en ce qu'on cultive une souche selon l'une des revendications 6 à 9 sur un milieu complet et que l'on récupère la protéine en cause.