FR 2595374 A1 19870911 FR 8603322 A 19860307 PROCEDE POUR EXPOSER UN EPITOPE AU SEIN D'UNE PROTEINE D'UNE STRUCTURE POLYPEPTIDTOUE DISTINCTE, SUPPORTEE OU NON. ET LES PRODUITS OBTENUS L'invention concerne une méthode génétique pour insérer un épi tope dans une protéine qui lui est normalement etrangére, dans des conditions permettant à cet epitope de manifester ses propriétés caractéristiques, par exemple immunogenes, lorque celles-ci ont été reconnues au sein de l'antigène auquel normalement cet épitope appartient dans la nature. On connaît bien le but poursuivi par les méthodes du genre en question. Elles visent par exemple a la réalisation de vaccins sélectifs, dont l'immunogénicité peut être contrôlée et qui soient exempts d'immunogénicités secondaires nuisibles, étrangères à l'effet vaccinant recherché. I1 existe dans la littérature des descriptions de nombreuses séquences peptidiques présentées comme portant les épitopes responsables de l'effet immunogene connu ou reconnu de certaines protéines, de sorte que l'on a déjà cherché à isoler ces épitopes, voire å synthétiser un peptide le contenant.Une des difficultés alors rencontrées, pour l'utilisation de tels peptides pour la constitution de vaccin, réside dans le poids moléculaire extremement faible et dans une conformation qui n'est pas toujours conforme a celle sous laquelle l'épitope concerné se pressente dans les protéines naturelles le contenant. I1 a donc ete suggéré de fixer de tels peptides synthétiques (ou fragments de protéines naturelles) sur des supports de poids moléculaires. élevés. Une autre solution déjà proposée a consisté dans la transformation de bactéries non pathogènes, par exemple certaines souches de E. coli, avec des vecteurs appropriés contenant une séquence nucléotidique codant pour une protéine normalement exposée à la surface desdites bactéries, cette séquence ayant cependant été modifiée par un fragment d'insertion codant lui-même pour le peptide contenant l'épitope recherché. Cette technique vise donc a la production de "vaccins vivants réunissant plusieurs avantages : possibilité de les produire en quantité importante, reconstitution d'un support permettant l'exposition de l'épitope dans des conditions facilitant sa reconnaissance par le système immunologique des organismes auxquels le "vaccin vivant" est destiné et, enfin, l'absence de pathogénicité dudit "vaccin vivant". Des bactéries de ce type et les vecteurs appropriés à leur production sont par exemple décrits dans le brevet français n 82 07201, déposé le 26 avril 1982 et dans le brevet français n 83 14236, déposé le 6 septembre 1983. Ces brevets décrivent des souches de micro-organismes, plus particulièrement de E. coli, transformées par des vecteurs modifiés par une partie au moins du gène lamB, celui-ci étant à son tour modifié par une séquence d'insertion constituée par un fragment nucléotidique codant pour une séquence déterminée d'amino-acides. Celle-ci pourrait naturellement être constituée par une séquence codant pour un épitope déterminé.Le but des inventions décrit dans ces brevets était effectivement l'exposition à la surface des cellules E. coli transformées d'une protéine hybride contenant l'épitope concerné, et ce dans une position permettant à l'immunogénicité de l'épitope de se manifester. Les difficultés rencontrées ont déjà été mentionnées dans le second brevet sus-mentionné, même si la technique plus perfectionnnée qui y est décrite, permettait de les réduire sensiblement. Il s'agit des difficultés rencontrées pour obtenir la transcription et la traduction complètes de la séquence insérée de nucléotides, de la toxicité plus ou moins elevée de la protéine hybride synthétisée à l'égard des bactéries porteuses, toxicité qui est alors susceptible d'entraîner une lyse d'une proportion importante des cultures cellulaires. La difficulté de produire des vaccins mixtes par recombinaison de plusieurs épitopes distincts au sein d'une même protéine est également connue dans d'autres domaines. Les problèmes de l'exposition convenable de l'épitope inséré dans une protéine qui lui est normalement étrangére se posent alors de la même façon. En outre, l'introduction de l'épitope entraîne souvent une modification de la conformation globale de ladite protéine (proteine porteuse), de sorte que ses propriétés immunogènes propres peuvent s'en trouver atfecter. La difficulté est quelquefois surmontée, dès lors que l'on est en mesure de déterminer le site plus approprié à l'insertion de l'épitope dans la séquence peptidique de la protéine réceptrice.Ces déterminations ne peuvent cependant pas être étendues à d'autres protéines, de sorte que l'on se retrouve toujours confronté à ces difficultés, dès que le probleme est posé a l'égard d'une nouvelle proteine porteuse. A la difficulté de ces déterminations s'en ajoute encore souvent une autre, au niveau de la production des vecteurs permettant la production ultérieure des protéines hybrides (du moins lorsqu'on a recours à des techniques du génie génétique pour les produire). Cette difficulté supplémentaire réside dans la mise en phase nécessaire de la séquence codant pour l'épitope avec les parties correspondantes de la séquence codant pour la protéine réceptrice. La présente invention a pour but de proposer une approche différente du problème posé de façon générale par l'exposition convenable d'un épitope au sein-d'une protéine porteuse, ou plus généralement d'une structure qui lui est normalement étrangére, de façon à ce que les propriétés immunogènes de cet épitope puissent effectivement se manifester sans pour autant altérer les propriétés nécessaires de la structure environnante. Cette approche sera mieux comprise si l'on réexamine les problèmes particuliers posés par l'exposition d'un épitope choisi à la surface de la bactérie Es coli, étant entendu que cet exemple ne doit pas être considéré comme ayant un caractére limitatif. Il est tout d'abord rappelé que la protéine LamB, qui dans le présent exemple sera utilisée comme transporteur d'un antigène peptidique vers la surface de souches de bacteries E. coli est normalement localisée dans la membrane externe de E. coli. C'est une protéine transmembranaire qui est impliquée dans le transport du maltose et des maltodextrines (pour revue voir : HENGGE et BOOS, 1983), et sert de récepteur pour l'adsorption de différents bacteriophages, y compris le bactériophage À (CHARBIT et HOFNUNG, 1985). La séquence de lamB, le gene de structure de cette protéine, a été déterminée (CLEMENT et HOFNUNG, 1981). Elle correspond à un précurseur de 446 acides aminés qui comporte à son extrémité N-terminale un peptide signal de 25 acides aminés. Ce peptide est clivé lors de l'exportation de la protéine vers la surface de la bactérie. Pratiquement, il s'agit d'insérer dans le gène lamB un fragment d'ADN qui détermine l'épitope retenu. Pour que l'objectif de l'invention soit atteint, cette fusion doit remplir au moins trois conditions. 1 La protéine hybride ainsi construite doit etre stable et non toxique pour la bactérie. 2 La fusion doit être telle qu'elle ne détruit pas les instructions contenues dans le gène de structure, permettant l'exportation normale de la protéine. 3 Le repliement de la protéine hybride dans la membrane externe doit être tel que l'épitope choisi soit exposé à la surface de la bactérie et bien en évidence. Un plasmide a tout d'abord été construit, dans lequel le gêne lamB a été placé sous le contrôle d'un promoteur puissant et contrôlable (tac) (AMANN et colt. 1983). Ce plasmide porte également le gène de structure du répresseur (lacl) capable de contrôler ce promoteur (BAGDASARIAN et coîl. 1983). Des vecteurs du même type ont été décrits dans le brevet français n 83 14236 sus-mentionné. La mise en oeuvre du procédé selon l'invention défini plus loin de façon générale, a permis de déterminer les sites de la protéine dans lesquels il est possible d'insérer une séquence peptidique, comportant un épitope, sans perturber ni l'exportation ni le repliement de la protéine. Pour cela le plasmide a été ouvert au hasard par une méthode déjà décrite permettant l'ouverture des différentes molécules de plasmide en des sites distribués au hasard dans leurs chaînes nucléotidiques (HEFFRON et coll. 1978). Il a ensuite été refermé en présence d'un excès d'un adaptateur (LATHE et coll. 1984) de 10 paires de bases qui détermine un site pour l'enzyme de restriction BamHI. L'intérêt d'utiliser un adaptateur est qu'il est ensuite possible d'ouvrir aisément le gène au site d'insertionde l'adaptateur et d'ajouter un insert supplémentaire. Environ 400 clones ont été analysés dans lesquels l'adaptateur avait été inséré au hasard. 4 clones dans lesquels l'insertion de l'adaptateur avait été faite en conservant la phase de traduction du gène lamB, ont été retenus. Il a été constaté après séquençage des séquences codant pour lamB, après leur modification par lesdits adaptateurs, que les insertions retenues se sont produites respectivement après les 146e, 153e, 189e, 374e acides aminés de la protéine lamB mature, à compter du premier aminoacide de la protéine mature. Dans trois cas sur les quatre (sites 146, 153, 374) la présence de l'adaptateur s'est révélée correspondre à l'insertion de 4 acides aminés. Pour le quatrième cas (site 189) il y a eu délétion de 8 acides aminés et insertion de 5 acides aminés.Dans tous ces cas, les protéines hybrides étaient stables et repérables après électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS, transfert sur filtre de nitrocellulose et détection immunologique par du sérum anti-lamB. Trois des protéines hybrides (sites 146, 153 et 374) confèrent encore à la bactérie la sensibilité vis-à-vis d'au moins un phage utilisant le récepteur de À ainsi que la capacité de croitre sur dextrines. Cela suggère fortement un repliement de la protéine hybride dans la membrane externe proche de celui de la protéine sauvage. De plus, ces trois protéines hybrides ne sont pas toxiques pour la bactérie : la croissance exponentielle des cellules n'est pas affectée en présence de 10 3 molaire isopropyl-b-thiogalactoside (IPTG).Dans le quatrième cas (insertion au site 189) la protéine hybride présente une certaine toxicité pour la bactérie (il y a inhibition de croissance en présence d'IPTG), et semblait dépourvue de sensibilité pour le phage dans CHARBIT et HOFNUNG (1985). Parmi les quatre insertions qui ont été réalisées, trois n'affectent pas de façon appréciable ni l'exportation ni le repliement de la protéine lamB (sites 146,, 153, 374). De plus, il est tout à fait remarquable de constater que dans ces trois constructions, les sites d'insertions correspondent à des régions de la protéine qui, selon le modèle qui a été proposé par CHARBIT et coll., 1984, sont localisées à l'extérieur de la membrane et à la surface de la bactérie. Le quatrième site (position 189) est, toujours d'après ce modèle, situé à l'intérieur de la membrane externe. Ce -sont les trois premiers sites qui ont été choisis pour l'insertion d'un peptide supplémentaire, en vue d'obtenir de nouvelles protéines hybrides exposant le peptide inséré à la surface de la bactérie. Ces constructions et leurs propriétés sont décrites ci-après. Un peptide de 11 acides aminés qui correspond à l'épitope 93-103 de la protéine VP1 du poliovirus de type 1 (HOGLE et coll. 1985) a été choisi comme peptide supplémentaire. Ce choix a été dicté par les considérations suivantes. Ce peptide est de taille réduite. Il est hydrophile et ne devait pas fonctionner comme séquence d'arrêt pour l'exportaiton de la protéine hybride. On dispose d'anticorps polyclonaux contre des peptides synthétiques correspondant à cette région (anti VP1) et d'un anticorps monoclonal dirigé contre cette même région sur le virus (anti C3). En outre, l'anticorps anti C3 a des propriétés neutralisantes (VAN DER WERF et coll. 1983) ; WYCHOWSKI et coll. 1983). La construction ainsi envisagee est donc susceptible d'avoir un intérêt médical. Un oligonucléotide déterminant ce peptide et terminé par des extramiés cohésives BamHI a été synthétisé. La synthèse a été faite de telle façon que l'insertion de cet oligonucléotide dans les séquences BamHI des sites 146, 153, 374, conserve la phase de traduction des protéines hybrides. Les trois insertions ont été réalisées par utilisation du même oligonucléotide car les trois adaptateurs insérés initialement étaient dans la même phase. Après insertion de l'oligonucléotide, trois nouvelles protéines hybrides 146VP1, 153VP1 et 374VP1 ont été obtenues. Ces trois protéines sont stables. ces trois protéines hybrides ne sont pas non plus toxiques pour la bactérie : la croissance exponentielle des cellules n'est pas affectée en présente d'IPTG 10 3 molaire. Elles réagissent après électrophorèse puis transfert sur filtre de nitrocellulose avec un sérum polyclonal anti-lamB dans des conditions dénaturantes et par immunoprécipitation dans des conditions non dénaturantes. Cette dernière propriété permet de mettre en évidence le fait que-les hybrides sont capables d'ados ter une forme trimérique tout comme la protéine lamB sauvage. Il est intéressant de noter également que les protéines hybrides 153VP1 et 374VP1 sont capables de conférer aux bactéries la sensibilité à au moins un phage utilisant le récepteur de x, et la capacité d'utiliser des dextrines comme source de carbone. Elles ont donc conservé, malgré l'insertion, la plupart des fonctions de la protéine lamB sauvage. Il a alors été examiné si ces protéines hybrides étaient capables de réagir avec le sérum anti VPî (polyclonal) et le sérum anti C3 (monoclonal). Trois conditions ont été utilisées : électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS des extraits bactériens dénaturés, suivie de transfert sur filtre de nitrocellulose et détection immunologique (nommé ci-après immuno-empreinte), immunoprécipitation suivie d'électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS dans des conditions non dénaturantes (nommé ci-après immunoprécipitation), détection immunologique in situ sur colonies après transfert des colonies sur filtre de nitrocellulose (nommé détection in situl (GUESDON et coll. 1985). Les résultats principaux sont les suivants. Les protéines hybrides 146VP1, 153VP1 et 374VP1 réagissent toutes les trois par immuno-empreinte avec le sérum anti VP1 (dans des conditions dénaturantes). Les protéines 153VP1 et 374VP1 réagissent toutes deux avec les sérums antiVP1 et antiC3 (par immunoprécipitation dans des conditions non dénaturantes). Dans les mêmes conditions la protéine hybride 146VP1 réagit faiblement avec le sérum antiVP1 et ne réagit pas de façon détectable avec le sérum antiC3. La protéine hybride 153VP1 réagit par détection in situ avec le sérum antiC3 sans lyse (et donc a fortiori apres lyse au chloroforme). C'est également vrai pour la protéine hybride 374VP1, mais dans ce cas la détection est meilleure apres lyse au chloroforme. L'épitope est ainsi dans ces deux cas reconnu par l'anticorps antiC3 et accessible à lui en surface des cellules. Ce résultat a été confirmé dans le cas de 153VP1 par immunofluorescence sous microscope optique et par microscopie électronique au moyen de protéine A couplée avec des billes d'or. Dans le cas de 374VP1 la confirmation a été faite uniquement par immunofluorescence. Le sérum antiVP1 réagit par détection in situ avec les bactéries porteuses de la protéine 153VP1 mais pas avec la protéine 374VP1 Des bactéries produisant l'autre protéine hybride 146VP1 ne sont reconnues par aucun des deux immunsérums par détection in situ (sans ou avec lyse). Les caractéristiques des différents hybrides (protéines hybrides de lamB et de VP1, d'une part, et des séquences codantes correspondantes, d'autre part) résultent du tableau ci-après. TABLEAU I CARACTERISTIOUES DES HYBRIDES LAMB-VP1 Nom des mutants AJC352 AJC352 AJC264 AJC264 AJC73 AJC73 AJC178 AJC178 AC1 VP1 VP1 VR1 VP1 Site d'insertion 146 - 153 - 189 - 374 - du peptide VPl Longueur de la 438 425 438 425 431 418 438 425 421 protéine (en aminoacides) Immunoempreinte @47K 47K > 47K 47K 47K > 47K 47K 47K avec un sérum antilamB (condition dénaturante) Immunoprécipitation + + + + + - + + + avec un sérum antilamB (condition non dénaturante) Immunoempreinte > 47K - > 47K - - - > 47K - avec un sérum anti VP1 (condition dénaturante) Immunoprécipitation avec sérum anti-VP1 . ± - + - + - + - sérum anti-C3 - - +++ - - - + - - (conditions non dénatu- rantes) Détection in situ avec sérum anti-VP1 - - + - - - - - - sérum anti-C3 - - + - - - + Sensibilité à IPIG R R R S S R R R Sensibilité aux phages h+ R R R I R R R R S -ho R R S S R R R I S -hh+ R S S S R R S S K10 R R R R R R R Couleur de McConkey dextrines rouge rouge rouge rouge rouge rose rouge rouge rose Signification des lettres, en ce qui concerne - la sensibilité au phage R = résistant S = sensible - la sensibilité à l'IPTG : R = non toxique S = toxique (voir texte) Le modele de CHARBIT et Coll. mentionne'plus haut est illustré dans la figure 1 jointe.On y a représenté de façon schématique la paroi bactérienne et, repliée au travers de cette membrane, la protéine lamB Des parties de cette protéine affleurant à l'extérieur de la membrane y sont représentées. Les nombres indiqués correspondent aux numérotations des acides aminés de lamB à compter du premier aminoacide de la protéine mature. Les carrés noirs représentent schématiquement les sites d'insertion de la séquence issue de VPI dans le lamB. Les indications 352-VPî, 264-VP1, 73-VPI, et 78-VPI, correspondent aux quatre clones qui ont été retenus (AJC 352, AJC 264, AJC 73, AJC 178). Dans la figure 2 sont indiqués - la séquence d'aminoacides de l'épitope 93-103 VPI, dans la partie supérieure de la figure, - les éléments séparés de l'adaptateur qui avait été réalisé par synthèse et inséré dans les sites 146, 153, 189 et 374 de la protéine lamB, après clivage par l'enzyme BamHI et - dans le milieu de la figure est indiquée la séquence nucléotidique réalisée par synthèse contenant l'épitope 93-103 VPI entouré des extrémités cohésives résiduelles de l'adaptateur après traitement avec l'enzyme bamHI. Enfin dans la figure 3 sont indiquées- les séquences à la fois nucléotidiques et peptidiques de la région des trois plasmides sus-indiqués, cependant avant introduction dans ces sites de la séquence d'insertion contenant 1' épitope. Il apparaitra immédiatement à l'homme du métier que le type de construction qui précède est applicable à toute autre forme de protéine, d'une part, et de séquences d'insertion, d'autre part. En particulier, il sera observé que l'on peut utiliser tout autre épitope que celui issu de la protéine VP1 du poliovirus, également que l'insertion de l'épitope choisi peut être envisagée dans tout autre type de protéine dans laquelle il pourrait être souhaitable d'insérer l'épitope du genre en question. En conséquence l'invention est applicable à la production de tout acide nucléique circulaire, notamment vecteur, contenant initialement une séquence nucléotidique codant pour une protéine déterminée sous le contrôle d'un promoteur adéquat.Il est également clair que la technique d'insertion qui vient d'être exposée concernant l'incorporation de l'épitope de la protéine VP1 du poliovirus dans un plasmide contenant une séquence codant pour la protéine lamB est transposable à la modification par une séquence insérable codant pour un épitope de tout autre acide nucléique circulaire contenant initialement une séquence nucléotidique codant pour une protéine déterminée, dès lors que l'on souhaite produire une protéine hybride capable de manifester au moins celle des propriétés biologiques de la protéine réceptrice que l'on souhaite conserver et les propriétés caractéristiques de l'épitope. Le procédé selon l'invention peut donc d'une façon générale être défini comme suit. Le procédé de modification selon l'invention d'acides nucléiques circulaires contenant initialement une séquence nucléotidique codant pour une protéine déterminée, par l'insertion dans cette séquence nucléotidique d'un fragment nucléotidique insérable distinct codant pour un peptide portant un pitope, dans des conditions qui permettent, lorsque l'un au moins de ces acides nucléiques modifiés aura été incorporé dans des cellules compétentes, la production d'une protéine hybride capable de manifester simultanément au moins celles des propriétés biologiques de la protéine que l'on souhaite conserver et les propriétés caractéristiques de l'épitope, est caractérisé par la combinaison d'étapes que représentent - l'ouverture de ces acides nucléiques circulaires en des sites répartis -selon le hasard par une endonucléase non spécifique pour produire une pluralité d'acides nucléiques linéarisés, - la recircularisation in vitro de cette pluralité d'acides nucléiques linéarisés et la ligation, simultanée ou postérieure, dudit fragment inserable dans au moins certains de ces acides nucléiques, pour obtenir un ensemble d'acides nucléiques recircularisés, parmi lesquels des acides nucléiques contenant le fragment insérable, inséré en des sites répartis au hasard de ces acides nucléiques - la transformation de cellules compétentes avec ledit ensemble et la culture des cellules compétentes ainsi transformées, - la détection et le tri de celles des colonies dont les produits d'expression manifestent ou ont été rendus capables de manifester simultanément les propriétés biologiques que l'on souhaitait conserver de la protéine et du polypeptide susdits, - le cas échéant, la récupération à partir des colonies ainsi isolées, des acides nucléiques modifiés correspondants contenant les séquences nucléotidiques codant pour la protéine, cependant modifiées, par insertion dans les sites appropriés de la susdite séquence insérable. Vue sous un autre aspect, l'invention peut être considérée comme consistant en un procédé d'insertion d'un peptide contenant un épitope déterminé dans une protéine présentant des propriétés biologiques déterminées et susceptible d'être produite dans des cellules compétentes transformées avec un acide nucléique circulaire contenant initialement une séquence nucléotidique codant pour ladite protéine, sans que soient pour autant perdues les propriétés biologiques essentielles que l'on souhaite préserver tant de la protéine que de l'epitope, ce procédé étant caractérisé par la combinaison d'étapes que représentent - l'ouverture de ces acides nucléiques circulaires en des sites répartis selon le hasard par une endonucléase non spécifique pour produire une pluralité d'acides nucléiques linéarisés, - la recircularisation in vitro de cette pluralité d'acides nucléiques linéarisés et la ligation, simultanée ou postérieure, d'un fragment insérable codant pour le susdit peptide, dans au moins certains de ces acides nucléiques recircularisés, pour obtenir un ensemble d'acides nucléiques recircularisés, parmi lesquels des acides nucléiques contenant le fragment insérable, inséré en des sites de ces derniers répartis au hasard, - la transformation de cellules compétentes avec ledit ensemble et la culture des cellules compétentes ainsi transformées, - la détection et le tri de celles des colonies dont les produits d'expression manifestent ou ont été rendus capables de manifester simultanément les propriétés biologiques que l'on souhaitait conserver de la protéine et du polypeptide susdits, - la récupération des colonies ainsi isolées comportant ou produisant la susdite protéine modifiée par un peptide contenant le susdit épitope, inséré en des sites de la protéine initiale, compatibles avec la préservation des propriétés que cette dernière possédait initialement et que l'on souhaitait conserver et, simultanément, l'acquisition des propriétés caractéristiques de l'épitope et, - le cas échéant, la récupération de la protéine modifiée. Dans ce qui précede, on a essentiellement évoqué le cas où les acides nucléiques contenant la séquence nucléotidique codant pour la protéine sont des ADNs circulaires, notamment des vecteurs plasmides, phages ou cosmides. L'invention n'y est cependant pas limitée. Elle est également applicable à des acides nucléiques répondant aux mêmes conditions, si ce n'est qu'ils ne sont pas circularisés. Dans ce cas l'endonucléase les coupe en fragments en des sites répartis au hasard dans leur séquence nucléotidique, la précédente recircularisatin étant alors remplacée par une recombinaison conduisant à une reconstitution d'un ensemble d'acides nucléiques modifiés, comme il a été dit plus haut, parmi lesquels des acides nucléiques contenant le fragment insérable, inséré en des sites répartis au hasard dans la chaine nucléique. De tels acides nucléiques sont, par exemple, constitués par certains phages qui, par nature, ne sont pas circularisés et qui sont modifiés par une séquence nucléotidique codant pour la susdite protéine, notamment dans une de leurs régions non essentielles. De même l'endonucléase non- spécifique, bien que préférée, peut être remplacée par une enzyme de restriction, voire même par un "cocktail" d'enzymes de restrictions. Les coupures - à l'occasion d'une digestion partielle - ne se font alors plus tout à fait au hasard dans la chaîne nucléotidique. Elles peuvent cependant, le cas échéant, être réalisées en des points suffisamment nombreux dans la chaîne nucléotidique de l'acide nucléique pour induire, certes moins parfaitement, des insertions dans certains cas en un nombre de sites suffisant pour permettre la sélection de séquences hybrides susceptibles de fournir des résultats semblables au terme des variantes du procédé défini ci-dessus. En ce qui concerne les "propriétés biologiques" dont il est question plus haut, il y a lieu d'observer qu'elles ne sont pas limitées à celles qui interviennent dans des réactions immunologiques. Il peut s'agit tout aussi bien d'autres propriétés : capacité de réactions avec des molecules affines, action sur un substrat spécifique, capacité de bactéries modifiées par la protéine formée de croître dans certains milieux sélectifs, etc.. Il apparaîtra clairement à l'homme de métier que des modifications peuvent être apportées à la technique en cause, selon la nature des constituants nucléiques intervenant dans la production d'une protéine hybride déterminée. De préférence, on a certes recours à la recircularisation des plasmides linearisés dans les conditions indiquées plus haut (le cas échéant après réparation des extrémités des plasmides linéarisés à l'aide d'une polymérase pour obtenir des extrémités franches), afin de faciliter l'insertion ultérieure d'une séquence d'insertion codant pour un peptide contenant l'épitope choisi. Cette méthode assure également un meilleur contrôle de la séquence etudiée. Cependant l'utilisation de tels adaptateurs ne sera pas toujours nécessaire.La recircularisation de plasmides préalablement linéarisés au hasard, dont les extrémités auront au préalable été réparées, peut être faite en présence directe de la séquence peptidique insérable1 elle-même pourvue d'extrémités franches, en présence de la ligase appropriée. D'une façon genérale, l'invention est donc applicable à la fabrication d'autres types de vaccins vivants, mettant en jeu toute souche bactérienne non pathogène et susceptible d'être transformée par un vecteur comportant une séquence hybride telle que définie plus haut et codant pour une protéine apte à être transportée à la surface desdites cellules, dans les conditions définies ci-dessus. L'invention concerne donc églement les compositions de vaccins formées avec de tels "vaccins vivants", dès lors que ceux-ci sont associés avec un véhicule pharmaceutique aproprié à l'administration in vivo du vaccin, notamment par voie orale ou parentérale. Les bactéries porteuses utilisables ne sont pas limitées à des E. coli non pathogènes. A cet égard, et à titre d'exemples seulement, on mentionnera les souches vaccinales Salmonella tvDhi. non pathogènes et invasives, par exemple des mutants Ty21 A pour l'homme, ou des souches Salmonella tvphvmurium, non pathogènes et invasives, par exemple des mutants aro B pour l'animal. Au titre de séquences codant pour d'autres protéines porteuses, on mentionnera à titre d'exemples les protéines connues sous les désignations OmpS, OmpC, OmpA, BtuB, Pho, etc.. Plus particulièrement l'invention concerne le vecteur particulièrement avantageux que représente celui qui contient une séquence codant la protéine lamB sous le contrôle d'un promoteur permettant la transcription et la traduction essentiellement de la totalité de cette séquence dans une souche de E. coli préalablement transformée avec ce vecteur, caractérisé par l'insertion de la séquence peptidique portant un épitope distinct dans un site situé dans région codant pour les acides aminés de 140 à 160 de la protéine lamB mature ou dans une région codant pour les acides aminés de 370 à 380. Des sites d'insertion préférés dans la protéine LamB se situent au niveau des acides aminés 153 et 374 respectivement. Sans que les chiffres qui suivent présentent le moindre caractère limitatif, il peut être indiqué que la séquence insérée comporte normalement 4 à 35, notamment de 4 à 27 acides aminés. En conséquence, l'invention concerne encore les souches de bactéries E. coli résultant de la transformation des E. coli par le vecteur sus-défini, ces souches de bactéries E. coli portant à leur surface externe des récepteurs modifiés du phage À contenant, exposée à la surface, plus particulièrement une séquence peptidique comportant un épitope caractéristique intercalé entre les acides aminés entourant notamment les acides aminés 150 à 160 et plus particulièrement 153 de la protéine lamB. L'invention est également applicable à la synthèse de protéines hybrides contenant plusieurs épitopes. Avantageusement, le système cellulaire et les vecteurs utilisés sont choisis de façon à ce que la protéine hybride finale recherchée soit excrétée dans le milieu de cultures. Un tel cas pourrait se présenter à l'occasion de l'insertion d'un peptide contenant un épitope choisi dans une séquence d'ADN dérivé du génome du virus de l'hépatite B et contenant les régions S et pré S de ce virus. Le système cellulaire peut alors lui-même être constitué par des cellules eucaryotes transformées par ce vecteur. Là encore l'invention doit permettre de déterminer les régions de la séquence contenant lesdites régions S et pré-S dans lesquelles pourrait être insérée la séquence d'insertion codant pour l'épitope choisi de façon à ce que les propriétés immunogènes de l'antigène HBs soient préservées et que l'épitope soit convenablement exposé à la surface des particules d'antigène HBs, pour que ses propriétés immunogénes puissent se manifester lorque l'antigène hybride éventuellement formé serait administré in vivo. De façon générale, l'invention fournit donc également une technique d'analyse des sites d'une protéine dans lesquels un épitope déterminé peut être introduit. Le procédé selon l'invention fournit donc des moyens nouveaux d'étudier la topologie et la structure de protéines déterminées, par insertion de séquences insérables en différents sites de ces protéines, d'apprécier les contraintes s'exerçant dans les régions de la protéine où les insertions sont effectuées. Ayant déterminé une telle région, il est également possible de vérifier si des peptides plus importants que ceux ayant été utilisés pour l'insertion pourraient être insérés dans la région de la protéine tout en assurant la préservation des propriétés essentielles choisies de la protéine et l'éventuelle manifestation des propriétés biologiques propres aux peptides plus grands. A l'inverse, le procédé selon l'invention est applicable à l'identification dans une protéine déterminée de celles de ces régions qui contiennent des épitopes caractéristiques. La variante de procédé selon l'invention consiste alors à fragmenter la séquence d'ADN codant pour la protéine étudiée pour autant qu'elle soit disponible et à insérer les différents fragments dans la région préalablement identifiée de la séquence codant pour la protéine réceptrice en vue d'étudier les expressions des divers fragments après que la séquence hybride ait été introduite dans des bactéries compétentes et exprimées dans celles-ci. Ce procédé permettra par exemple la détermination de celles des régions de la protéine à l'étude qui sont plus particulièrement reconnues par des anticorps préalablement obtenus à l'égard de l'ensemble de la protéine.En particulier, cette approche permet (par exemple par insertion dans le site 153 du gène lamB décrit ci-dessus) d'identifier un ou plusieurs épitopes de la protéine étudiée et d'obtenir du même coup des clones qui les exposent. En utilisant un immunsérum spécifique de la protéine à l'étude, il est possible de rechercher, voire de sélectionner, des colonies perdues d'épitope. Cette approche est par exemple applicable à la recherche des épitopes d'une protéine de virus à partir de sérum d'un malade. Il est bien entendu que les publications antérieures auxquelles il est fait référence dans le cadre de cette description et qui sont encore identifiées ci-après, doivent être considérées comme faisant partie de la description des techniques utilisées à l'occasion de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention pour autant qu'elle sera nécessaire à la bonne intelligence du texte. En figure 4 sont montrées les structures schématiques de deux plasmides qui ont été utilisés pour la mise en oeuvre de l'invention. Ils consistent notamment en des plasmides dérivés de pBR322 dans lesquels a été insérée une séquence de lamB sous le contrôle d'un promoteur tac12. Les lettres P/B concernent les jonctions réalisées au niveau des anciens sites pvuII/BamHI des deux fragments sus-indiqués (partie proximale de lamB), les lettres S/P les jonctions réalisées au niveau des anciens sites StuI/PvuII de lamB (partie distale) et de pBR322. Le plasmide pAGI diffère du plasmide pBBo, par la présence dans le premier d'une séquence laciez contenant le répresseur de l'opéron lactose de ptacl2. REFERENCES - Amann, E., Brosius, J. et Ptashne M. (1983) Gene, 25, 167-178. - Bagdasarian, M.M.,,Amann, E., Lurtz, R., Ruckert, B. et Bagdadsarian, M. (1983) Gene, 26, 273-282. - Charbit, A., Clément, J. M. et Hofnung, M. (1984) J. Mol. Biol., 175, 395-401. - Charbit, A. et Hofnung, M. (1985) Journal of Virology, 53, 667-671. - Clément, J. M. et Hofnung, M. (1981) Cell, 27, 507 514. - Guesdon, J. L., Bouges-Bocquet, B., Débarbouillé, M. et Hofnung, M. (1985) J. Immunolo. Methods, sous presse. - Heffron, F. So, M. et Mc Carthy,B.J. (1978) P.N.A.S. (USA), 75, 6012-6016. - Hengge, R. et Boos, W. (1983) Biochim. Biophy. Acta 737, 443-478. - Hogle, J.M., Chow,M. et Filman, D.J. (1985) Science, 229, 1358-1365. - Lathe, R., Xierry, M.P., Skory, S. et Lecocq, J.P. (1984) DNA, 3 N 2, 173-182. - Van der Werf, S., Wychowski, C. Bruneau, P., Blondel, B., Crainic, R., Horodniceanu, F. et Girard, M. (1983). P.N.A.S. (USA) 5080-5084. - Wychowski, C., Van der Werf, S., Siffert, O, Crainic, R., Bruneau, P. et Girard, M. (1983) Embo Journal, 2 N 11, 2019-2024. REVENDICATIONS 1 - Procédé de modification d'acides nucléiques contenant initialement une séquence nucléotidique codant pour une protéine déterminée, par l'insertion dans cette séquence nucléotidique d'un fragment nucléotidique insérable distinct codant pour un peptide portant un épitope, dans des conditions qui permettent, lorsque l'un au moins de ces acides nucléiques modifiés aura été incorporé dans des cellules compétentes, la production d'une protéine hybride capable de manifester simultanément au moins celles des propriétés biologiques de la protéine que l'on souhaite conserver et les propriétés caractéristiques de l'épitope, caractérisé par la combinaison d'étapes que représentent:: - la coupure de ces acides nucléiques en des sites répartis selon le hasard par une ou plusieurs endonucléases pour produire une pluralité d'acides nucléiques linéarisés, - la recombinaison in vitro de cette pluralité d'acides nucléiques et la ligation, simultanée ou postérieure, dudit fragment insérable dans au moins certains de ces acides nucléiques, pour obtenir un ensemble d'acides nucléiques reconstitués, parmi lesquels des acides nucléiques contenant le fragment insérable, inséré en des sites répartis au hasard de ces acides nucléiques - la transformation de cellules compétentes avec ledit ensemble et la culture des cellules compétentes ainsi transformées, - la détection et le tri de celles des colonies dont les produits d'expression manifestent ou ont été rendus capables de manifester simultanément les propriétés biologiques que l'on souhaitait conserver de la protéine et du polypeptide susdits, - le cas échéant, la récupération à partir des colonies ainsi isolées, des acides nucléiques modifiés correspondants contenant les séquences nucléotidiques codant pour la protéine - cependant modifiées, par insertion dans les sites appropriés de la susdite séquence insérable. 2 - Procédé d'insertion d'un peptide contenant un épitope déterminé, dans une protéine présentant des propriétés biologiques déterminées et susceptible d'être produite dans des cellules compétentes transformées avec un acide nucléique contenant initialement une séquence nucléotidique codant pour ladite protéine, sans que soient pour autant perdues des propriétés biologiques que l'on souhaite préserver tant de la protéine que de 1' épitope, caractérisé par la combinaison d'étapes que représentent - la coupure de ces acides nucléiques circulaires en des sites répartis selon le hasard par une ou plusieurs endonucléases pour produire une pluralité d'acides nucléiques linéarisés, - la recombinaison in vitro de cette pluralité d'acides nucléiques et la ligation, simultanée ou postérieure, d'un fragment insérable codant pour le susdit peptide, dans au moins certains de ces acides nucléiques reconstitués, pour obtenir un ensemble d'acides nucléiques recircularisés, parmi lesquels des acides nucléiques contenant le fragment insérable, inséré en des sites répartis au hasard de ces acides nucléiques - la transformation de cellules compétentes avec ledit ensemble et la culture des cellules compétentes ainsi transformées, - la détection et le tri de celles des colonies dont les produits d'expression manifestent ou ont été rendus capables de manifester simultanément les propriétés biologiques que l'on souhaitait conserver de la protéine et du polypeptide susdits, - la récupération des colonies ainsi isolées comportant ou produisant la susdite protéine modifiée par un peptide contenant le susdit épitope, inséré en des sites de la protéine initiale, compatibles avec la préservation des propriétés que cette dernière possédait initialement et que l'on souhaitait conserver et, simultanément, l'acquisition des propriétés caractéristiques de l'épitope et, - le cas échéant, la récupération de la protéine modifiée. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'endonucléase utilisée pour la coupure des acides nucléiques est une endonucléase non spécifique. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les acides nucléiques à modifier sont circulaires et la coupure de ces acides nucléiques pour l'endonucléase se manifeste par une linéarisation de ces acides nucléiques, la recombinaison n vitro qui suit permettant alors d'obtenir un ensemble d'acides nucléiques recircularisés, parmi lesquels des acides nucléiques contenant le fragment insérable, en des sites répartis au hasard. 5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'acide nucléique circulaire est un vecteur, que la recombinaison est faite en présence d'un adaptateur contenant un site de restriction déterminé, en ce que le fragment codant pour le peptide contenant l'épitope est porteur d'extrémités cohésives caractéristiques de ce site de restriction et en ce que le fragment insérable est inséré postérieurement dans les sites de restriction ménagés dans les vecteurs modifiés par l'adaptateur et recombinés. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la protéine pour laquelle code la susdite séquence nucléotidique est une protéine normalement transportée à la surface externe des cellules compétentes productrices ou excrétées dans le milieu de culture de ces dernières 7 - Procédé selon la revendication 4, caracterisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour la protéine déterminée est constitué par le gène lamB, à tous le moins la séquence de celui-ci codant pour la protéine lamB, et en ce que les cellules compétentes utilisée appartiennent à une souche bactérienne. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la détection et le tri des colonies susdites reposent, d'une part, sur la détection de la sensibilité des bactéries transformées à un phage utilisant le recepteur de A, ou de leur capacité de culture sur des dextrines et, d'autre part, sur la reconnaissance de l'épitope par un anticorps monoclonal le reconnaissant spécifiquement. 9 - Vecteur contenant une séquence codant pour la protéine lamB sous le contrôle d'un promoteur permettant la transcription et la traduction de la totalité de cette séquence dans une souche de E. coli ou d'une autre bactérie gram-négative préalablement transformée avec ce vecteur, caractérisé par l'insertion d'une séquence peptidique portant un épitope distinct dans un site situé dans la région codant pour les acides aminés 140 à 160 ou 370 à 380 de la protéine lamB mature. 10 - Vecteur selon la revendication 9, caractérise en ce que la séquence insérée comporte de 4 à 27 acides aminés. Il - Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce que la séquence insérée contient un peptide codant pour un épitope du poliovirus I, notamment pour le peptide asp asn pro ala ser thr thr asn lys asp lys. 12 - Souche de bactérie E. coli portant à sa surface externe des récepteurs modifiés du phage A contenant, exposée à la surface, plus particulièrement une séquence peptidique comportant un épitope caractéristique intercalé entre les acides aminés entourant notamment les acides aminés 140 à 160 ou les acides aminés 370 à 380, et plus particulièrement 153 ou 374 de la protéine lamB. 13 - Composition immunogène dirigée contre des antigènes pathogènes neutralisables par des anticorps dirigés contre un épitope déterminé, caractérisée par l'association de bactéries conformes à la revendication 12, dans laquelle I'épitope répond à la condition précisée ci-dessus, avec un véhicule pharmaceutique approprié à la production de compositions de vaccin.