FR 2593394 A1 19870731 FR 8601298 A 19860130 Les liposomes sont des formes pharmaceutiques capables de convoyer la substance active jusqu'à certaines cellules cibles dans l'organisme et d'accroître ainsi saspéci Licité en réduisant les effets indésirables ; ce système vecteur conduit même le principe actif jusqu'à l'intérieur de certaines cellules cibles, comme les macrophages. L'intérêt thérapeutique évident de ces vecteurs intracellulaires a conduit à l'exploration de très nombreux domaines d'application possibles. Mais cette exploration s'est heurtée et se heurte encore à d'importantes difficultés techniques. Les recherches à la base de la présente invention étaient, à l'origine, axées sur l'application des liposomes unilamellaires à la chimiothérapie anticancéreuse à l'aide de composés lipophiles. Parmi les malades, certains étaient atteints d'infections à champignons nécessitant un traitement par l'amphotéricine B ; or, la seule forme pharmaceutique disponible de l'amphotéricine B, la Fungizone (un complexe d'amphotéricine B et de désoxycholate), provoquait chez ces malades des réactions secondaires néfastes. La Demanderesse a eu, alors, l'idée d'incorporer l'amphotéricine B dans les liposomes unilamellaires initialement utilisés comme vecteurs d'agents antimitotiques. Etudiant la technique antérieure, il s'est avéré que l'incorporation liposomiale d'amphotéricine B avait déjà fait l'objet d'études approfondies ; en particulier, dans "Liposomal Amphotericin B for the Treatment of Systemic Fungal Infections in Patients with Cancer : A Preliminary Study. The Journal of Infectious Diseases, vol. 151, nO 4 avril 1985". Les auteurs relatent la préparation de liposomes contenant de l'amphotéricine B. Cependant, l'incorporation de principes actifs hydrophobes dans des liposomes pose de nombreuses difficultés techniques qui ne semblent pas avoir été surmontées dans l'art antérieur. De façon générale, la méthode classique préconisée par de nombreux auteurs pour incorporer un principe actif hydrophobe dans des liposomes,comporte une étape de dissolution dudit principe actif hydrophobe dans un mélange chloroforme/méthanol dans lequel ont été dissous, préalablement, les composants liposomiaux. L'article susmentionné, par exemple, propose de dissoudre le principe actif hydrophobe, en l'occurrence l'amphotéricine B, dans du méthanol, avant son incorporation dans la solution liposomiale. Or, ceci constitue une étape longue (l'amphotéricine B étant peu soluble dans les solvants organiques), chère et surtout dangereuse pour la santé des préyarateurs. Ainsi, dans le but d'améliorer les procédés de préparation de liposomes contenant une substance active liphophile, la présente invention concerne un procédé de préparation de liposomes unilamellaires de composition lipidique déterminée contenant une substance active liphophile, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes susoessives suintantes : a) la fabrication de liposomes vides, ces liposomes étant multilamellaires, b) la mise en présence des liposomes vides et de la substance active lipophile pulvérulente, c) la sonication du mélange liposomes/substance active lipophile pulvérulente pour permettre l'incorporation de ladite substance dans les liposomes, et d) éventuellement, l'isolement des liposomes chargés. Ce procédé est plus particulièrement destiné à la réalisation de liposomes contenant de l'amphotéricine B ou des dérivés apparentés de l'amphotéricine B. La composition lipidique des liposomes selon la présente invention est, de préférence, ternaire, les trois composants étant respectivement la phosphatidyl-choline de jaune d'oeuf (egg PC), le cholestérol (ch) et la stéarylamine (SA), ces trois composants étant, de préférence, dans un rapport de 4:3:1. La concentration en lipides de cette composition peut être de 10 mg/ml, elle est de préférence de 20 mgXml. De façon classique, ces divers lipides sont dissous dans un mélange chloroforme/méthanol de proportion 2:1 (v/v). Mais,contrairement à la technique antérieure, la substance hydrophobe peu soluble dans les solvants organiques n'y est pas ajoutée ; ceci constitue un gain de temps et une utilisation d'un moindre volume de solvant. Ce sont donc des liposomes multilamellaires vides qui sont obtenus après évaporation complète de la solution lipidique, adjonction de tampon Tris contenant 150 mM de NaCl et agitation manuelle du récipient porteur du film lipidique en présence de ce tampon. Ces liposomes sont alors mis au contact de la substance hydrophobe pulvérulente à incorporer et sont soumis, en présence de celle-ci, à la sonication. Cette sonication se fait sous atmosphère inerte, en particulier d'azote, de préférence à la puissance de 180 W et dure environ 15 minutes. Cette méthode permet un taux d'incorporation important du principe actif lipophile ; il est selon les cas de 40 à 90 %. Cette phase de sonication est éventuellement suivie d'une phase de centrifugation permettant d'isoler les liposomes unilamellaires chargés obtenus. Les avantages obtenus par ce nouveau procédé sont énormes. Ainsi par exemple, dans le cas d'un mode de réalisation préférentiel de l'invention décrit dans les exemples ci-après, la substance active lipophile incorporée dans les liposomes est de l'amphotéricine B dans ce cas, la méthode selon la présente invention entrainant la suppression de la mise en solution de l'amphotéricine B dans le méthanol, permet, pour un volume de 300 ml de liposomes, une épargne de 3 1 de méthanol. De meme, le gain de temps qui résulte de l'emploi de cette nouvelle méthode de préparation est très important puisqu'il est de l'ordre de 9 heures pour l'obtention d'un volume de 300 ml de liposomes.Ce gain de 9 heures résulte de la suppression de la mise en solution dans le méthanol (3 heures) et de l'évaporation du solvant organique (3 heures) et ainsi que du très net raccourcissement de la phase manuelle d'agitation nécessaire pour obtenir le détachement du film de la paroi du récipient (3 heures). En outre, grace à ce procédé, la préparation des liposomes chargés peut être effectuée extemporanément. La présente invention concerne, en outre, plus particulièrement des compositions injectables de liposomes unilamellaires contenant de l'amphotéricine B notamment obtenues par le procédé selon la présente invention. Les exemples suivants illustrent d'autres avantages du procédé selon la présente invention lorsqu'il s'applique à la préparation de liposomes contenant de 1 'amphotéricine B. EXEMPLE 1 Préparation des liposomes contenant de l'amphotéricine B et taux d'incorporation de ce principe actif lipophile On prépare des liposomes Egg PC - ch - SA dans un rapport molaire de 4:3:1. Pour ce faire, on dissout ces lipides dans un melange chloroforme/méthanol de proportion 2:1 (v/v), à raison de 20 mg de lipides pour 1 ml de préparation liposomiale. On évapore cette solution sous pression réduite dans un récipient connecté à un évaporateur rotatif. Dès que l'évaporation complète est obtenue, 1 ml de tampon Tris contenant 150 mM de NaCl (à pH 7,4) est ajouté par fraction de 20 mg de lipides. Une agitation manuelle du récipient porteur du film lipidique en présence du tampon permet d'obtenir des liposomes multilamellaires vides. Ces liposomes sont alors mis au contact de la poudre d'amphotéricine B, à raison d'une concentration de départ en amphotéricine B de 500 mcg pour 1 ml de solution liposomiale. On procède alors à une sonication sous atmosphère d'azote, à la puissance de 180 W et pendant 15 minutes. Ces conditions permettent d'aboutir à un taux d'incorporation de l'amphotéricine B de l'ordre de 60 %. EXEMPLE 2 Caractéristiques des liposomes obtenus 2.1) Dimensions a) Le diamètre des liposomes contenant de l'amphotéricine B obtenus par le procédé selon la présente invention a été mesuré par une technique de spectroscopie à corrélation de photons (dif frac- tion de la lumière). Cette technique donne une valeur moyenne des liposomes de 101 nm. b) Des expériences complémentaires ont été réalisées dans le but de mieux définir certaines propriétés des préparations de liposomes contenant de l'amphotéricine B, obtenues par le procédé selon la présente invention. .hae-ilae Les liposomes constitués de phosphatidylcholine de jaune d'oeuf, de cholestérol et de stéarylamine ont été marqués en additionnant, avant la phase d'évaporation, 14 une faible quantité de C-DPPC(dipalmitoylphosphatidyl- chloline) au mélange lipidique. La préparation de liposomes a été filtrée sur une colonne de sépharose C1-4B. La mesure de la radioactivité a permis de mettre en évidence les fractions d'élution contenant les liposomes. La concentration en amphotéricine B de chacune des fractions a été déterminée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Les diamètres des liposomes ont été mesurés dans les fractions d'élution à l'aide d'une méthode de spectroscopie à corrélation de photons en utilisant un appareil Nicomp. Cette technique permet une mesure de diamètre des particules dont la population est bimodale. . Re~uL a Le profil d'élution donne 2 pics de liposomes, le premier ayant son sommet dans la fraction 42 de la filtration, le second dans la fraction 55. Les dosages d'amphotéricine Montrent que le premier pic de liposomes contient 5 fois plus de substance incluse que le second pic, alors que le contenu en lipides des deux pics est très voisin. Les mesures du diamètre des liposomes montrent que le premier pic contient deux sous-populations de liposomes d'égale importance ; dans l'une, les liposomes les plus nombreux ont un diamètre de 84 nm et dans l'autre, les liposomes les plus nombreux ont un diamètre de 300 nm. Le deuxième pic est constitué d'une seule population de liposomes dont le diamètre moyen est de 50 nm. 2.2.) Profil d'elution Une comparaison du profil d'élution sur Sépharose CL-4B des liposomes obtenus par la méthode classique et par le procédé de l'invention montre que ce dernier procédé donne une préparation plus homogène, l'amphotéricine B etant surtout contenue dans les liposomes de plus grandes dimensions. Les résultats sont identiques, que le profil lipidique soit déterminé par densité optique à 280 nm ou par radioactivité (liposomes préalablement marqués par de la DPPC porteuse de 14C.) 2.3.) Stérilité et absence d'endotoxine Toutes les préparations de liposomes administrées à l'homme (agents antimitotiques, amphotéricine B) se sont révélées pures de toute contamination microbienne et mycotique, par les tests usuels de la microbiologie.Aucune infection liée à leur injection n'a pu être mise en évidence chez les malades qui les ont reçues. Le test à la limule a été utilisé pour la détection d'une éventuelle endotoxine ; il s'est toujours révélé négatif. 2.4.) Comportement au cours de l'irradiation par 1,5 megarad Après cette irradation, le profil d'élution sur Sépharose CL-4B montre une modification, suggérant une perte de l'amphotéricine B par certains liposomes. En fait, ce point n'est pas important puisque cette étape n'est pas nécessaire, les préparations de liposomes étant stériles. 2.5) Stabilité en présence de sérum décomplémenté A la concentration de 25 %, ce sérum mis en présence des liposomes pendant 3 ou 24 heures à la température de 370C n'entraîne pas de modification du profil d'élution sur Sépharose CL-4B. 2.6) Stabilité lors du stockage Le stockage des liposomes unilamellaires contenant de l'amphotéricine B peut se faire en réfrigérateur à + 4c ou au congélateur à - 180C. Les liposomes obtenus par la méthode classique présentent au 14ème jour de stockage au réfrigérateur une perte de leur contenu en amphotéricine B de l'ordre de 20 % ; au 30ème jour on ne constate aucune perte nouvelle. Les liposomes obtenus par le procédé selon l'invention présentent une perte de 1 % au 14ème jour et une perte de 2 % au 30ème jour, quel que soit le volume stocké (5 ou 25 ml). Il n'y a pas de différence entre les liposomes gardés au réfrigérateur ou au congélateur. EXEMPLE 3 Propriétés biologiques et toxicité 3.1) Epreuves in vitro de détermination du pouvoir fongicide Il s'agit de la méthode des "killing curves" de Candida albicans. L'incubation d'amphotéricine B incorporée dans les liposomes préparés par la méthode classique, à la concentration de 1 mcg/ml,ne peut empêcher la repousse du champignon à 72 heures, alors qu'incluse dans les liposomes préparés selon le procédé de la présente invention, il n'y a pas de repousse des champignons à 72 heures. Si la concentration d'amphotéricine B est augmentée à 1,5 mcg/ml, les deux types de liposomes montrent une activité égale. 3.2) Toxicité In vitro La capacité d'induire la lyse de globules rouges a été étudiée pour les deux types de liposomes. En fait, l'amphotéricine B incluse dans les liposomes ne peut induire la lyse de ces cellules. In vivo La préparation classique de liposomes d'induit aucune toxicité apparente chez la souris après 4 injections intraveineuses d'une dose de 15 mg/kg/jour d'amphotéricine B administrée tous les 2 jours. Les souris ont été suivies pendant au moins 60 jours. La préparation selon l'invention est en voie d'évaluation chez la souris. Les résultats actuels ne montrent aucune toxicité aigue. EXEMPLE 4 Essai chez l'homme - injections intraveineuses Jusqu'à présent, on a procédé à 100injections intraveineuses de la préparation de liposomes selon l'invention, administrées à 12 malades. Une très bonne tolérance a été observée. REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation de liposomes unilamellaires de composition lipidique déterminée contenant une substance active lipophile, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes successives suivantes a) la fabrication de liposomes vides, b) la mise en présence des liposomes vides et de la substance active lipophile pulvérulente, c) la sonication du mélange liposomes/substance active lipophile pulvérulente pour permettre l'incorporation de ladite substance dans les liposomes, et d) éventuellement l'isolement des liposomes chargés. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la composition lipidique des liposomes est ternaire, les trois composants étant respectivement la phospitidylcholine de jaune d'oeuf (egg PC), le cholestérol (ch) et la stéarylamine (SA). 3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le rapport molaire des trois composants lipidiques est de 4:3:1. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la substance active lipophile est 1' amphotéricine B. 5) Liposomes unilamellaires incorporant une substance active, obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 4. 6) A titre de médicament nouveau, les liposomes selon la revendication 5 sous forme injectable.