FR 2588006 A1 19870403 FR 8514579 A 19851001 MOYENS ET PROCEDES DE TRANSFERT DE PROTEINES ET/OU D'ACIDES NUCLEIQUES SUR UNE SURFACE RECEPTRICE SUPPORTEE L' invention concerne des moyens pour la réception et la retenue sur une surface supportée, de préférence celle d'un support poreux, de protéines et/ou d'acides nucléiques tels que des ARN ou ADN qui N sont amenées et ce notamment par des techniques de transfert à partir de solutions les contenant, et amenées au contact de cette surface. Pour la commcdité du langage, l'expression "protéines" est utilisée dans ce qui suit pour désigner non seulement les protéines selon l'acception générale de ce terme, mais également tous autres polypeptides, lipoprotéines, glyco-protéines ou des fragments de protéines. L'invention s'applique plus particullèrement à la fixation et à l'immobilisation de une ou plusieurs protéines sur la susdite surface supportée, après leur transfert à partir d'une plaque ou feuille de gel, par exemple à base de polyacrylamlie. On sait que de telles plaques ou feuilles de gel sont couramment utilisées, par exemple pour fractionner un mélange de protéines par électrophorèse. Diverses techniques ont naturellement oé3à été décrites pour réaliser de tels transferts. Ceux-ci sont souvent nécessaires, en particulier lorsque des opérations ultérieures destinées à être réalisées sur ces protéines ne peuvent l'être sur le gel lui-même. C'est notamment pour remédier à de telles difficultés que des techniques de transfert des protéines sur des surfaces plus favorables ont été mises au point au cours de ces dernières annees. Une telle surface est avantageusement celle d'une feuille de nitrocellulose dont avait été reconnue la capacité de fixer des protéines par adsorption à sa surface. D'une façon générale, ces techniques de transfert comprennent la mise en contact de la feuille ou plaque de gel contenant les protéines avec une feuille ou filtre de nitrocellulose et la réalisation d'une "élution" visant à faire passer les protéines de la feuille de gel à la feuille de nitrocellulose. Cette élution peut être réalisée par diverses tecni- ques, par exemple par diffusion ou élee roélution à l'aide d'une solution tamponnée, sous l'influence d'un champ électrique, concernant des teconiques courantes on peut, par exemple, se référer à l'article général intitulé "Protein Blotting : Principles and Applications" (Transfert par absorption de protéines principes et applications) de Jonathan M. Gershoni et al., publié dans Analytical Biochemistry 131, 1-15 (1983). Pour que ce transfert puisse s'effectuer dans de bonnes conditions, les protéines doivent en général se trouver dans un état solubilisé ou solubilisasle. Une telle condition s'avèrait naturellement déjà nécessaire à l'occasion de la séparation des protéines contenues dans un mélange, notamment par électrophorèse dans un gel du type sus-indiqué. C'est la raison pour laquelle il est courant d'avoir recours à un détergent, tel que le dodécylsulfate de sodium tS D S). Il existe d'ailleurs sur le marché des feuilles de gel de polyacrylamide déjà chargées de S D S, prêtes à l'emploi pour l'électrophorèse en présence d'un tampon approprié. Les applications de cette technique sont nombreuses. En particulier, les feuilles de nitrocellulose sur lesquelles avaient été transférées les protéines, peuvent être amenées au contact de solutions de réactifs ayant une affinité particulière pour l'une d'entre elles, la réaction résultant de cette affinité pouvant ensuite être détectée par des moyens classiques. I1 en est ainsi par exemple, dans le cas où, parmi les protéines trans-erees, il existe un antigène dont la présence dans le mélange initial de protéines était à détecter. Le réactif utilisé dans ce dernier cas peut alors être constitué par un anticorps ou une lectine. Ce réactif porte lul-même un marqueur ou peut à son tour, être aétecté par une autre molécule affine marquée. Si les feuilles de nitrocellulose sont aujourd'hui encore parmi les plus utilisées, il en existe également d'autres ; par exemple, des papiers auxquels sont couplés de façon covalente, des groupes de diazobenzyloxyméthyle, ou encore des membranes de polyhexaméthylène-adipamine (connues sous la marque NYLON) modifiées par des groupes aminés tertiaires, par exemple ceux connus sous la marque ZETABIND. La séparation des différentes protéines d'un mélange se révèle aussi souvent nécessaire dans le cas où l'on veut procéder à une analyse dela structure primaire de certaines d'entre elles : une technique couramment utilisée peut mettre en jeu les techniques de dégradation type "dégradation d'Edman", dont le principe est rappelé, par exemple, dans un article de Michael W. Ht:NKAPILLER et al. intitulé "Protein Sequence Analyses automated Microsequencingtt (Analyse de la séquence de protéines de microséquençage automatisé), Science, vol. 219, Fév. 1983. Dans ce dernier type d'application des problèmes supplémentaires se posent surtout dans les opérations de séquençage qui doivent être effectuées sur des protéines qui ont, au préalable, été séparées dans un gel de polyacrylamide, et ce, tout particulièrement en présence de dodécylsulfate de sodium. En effet, les opérations de séquençage selon le principe rappelé ci-dessus, impliquent des traitements de ces protéines par des solutions organiques ou fortement acides, par exemple avec une solution ou des vapeurs d'acide chlorhydrique 6N, à des températures de 110" nécessaires pour hydrolyser la protéine immobilisée en ses constituants amino-acides. Ces opérations ne peuvent naturellement pas être réalisées sur les parties du gel retenant la fraction protéines à étudier. Elles ne peuvent l'être davantage sur la fraction de protéines transférées sur des feuilles ou membranes du type sus-indiqué. Ces dernières sont en effet trop fragiles pour résister aux réactions chimiques mises en oeuvre dans les dégradations d'Edman. D'une façon générale, il a donc été nécessaire jusqu'à ce sur, d'extraire les protéines à séquencer de la feuille de gel les contenant et, en particulier lorsqu'on avait eu recours à un gel chargé en détergents de séparer ces derniers des protéines extraites, notamment par dialyse ou des techniques d'extraction ou de précipitation. La manipulation de quantités souvent extrêmement faibles de protéines extraites dans les conditions sus-indiquées, est souvent très difficile, même si les techniques et les appareillages utilisés à cet effet (voir par exemple l'article de Michael W. HUNKAPILLER et al. déjà mentionné ci-dessus) ont été l'objet de perfectionnements constants. En particulier, il a déjà été proposé, pour éviter les extractions parasites de protéines dans les séquençeurs, d'introduire ces protéines à l'état préalablement solubilisées dans une solution de sels d'ammonium quaternaire polymériques dénommés polyméthobromure de 1,5 diméthyl - 1,5 diazaundécaméthylène. Ce composé également connu sous la marque POLYBRENE est alors capable de former sur les surfaces en verre du récipient une pellicule à laquelle le polypeptide s'incorpore de sorte qu'il est ensuite protégé de l'action mécanique, des flux de solvants utilisés pour les lavages. Sa pellicule est aisément pénétrable par les réactifs d'Edman. Les réactions de dégradation nécessaires à ia réalisation du séquençage peuvent être alors aisément réalisées. Ce produit dont l'utilisation aux fins qui précèdent, a pour la première fois été décrit par G.E. TARR et al. anal. Biochem 75.621 tel976) sera par la suite aésigné par la marque sous laquelle il est commer cialisé, à savoir POLYBRENE pour de simples raisons de commodité de langage. =1 va naturellement de soi, que llutilisation de ce terme dans le cadre de cette demande de brevet, n'a pas vocation à porter atteinte aux droits du ou des titulaires de la marque POLYBRENE. Si ce produit a permis le séquençage de quantités encore plus faibles qu'auparavant de protéines, notamment de l'ordre de 200 pmoles, les problèmes relatifs aux difficultés d'obtention des protéines séparées sur gel dans un état tel que l'on puisse ensuite envisager les opérations de séquençage, n'ont toujours pas encore reçu de solution pratique. Le but de l'invention est de remédier en grande partie à ces divers inconvénients, particulièrement de fournir des moyens permettant le transfert directement et l'immobilisation de protéines, par exemple à partir d'un gel de polyacrylamide, sur une surface libre formée sur un support, ces prqtéines immobilisées pouvant alors être directement étudiées ou analysées dans les séquençeurs à phase gazeuse, par exemple comme décrit par HEWICK, R.M. HUNKAPILLER, M.W. HOOD, L.E. et DREYER, W.J. (1981) J. BIOL. CHEM. 256, 7990-7997. Le procédé selon l'invention de transfert et d'immobilisation de protéines sur une surface libre formée sur un support chimiquement inerte, de préférence poreux, à partir d'un milieu susceptible de les fournir, amené en contact avec cette surface, se caractérise en ce que ladite surface, de préférence initialement exempte de protéines, et/ou d'acides nucléiques, a un caractère généralement hydrophobe tout en portant des charges d'un signe déterminé et en ce que les protéines sont amenées à l'état solubilisé au contact de ladite surface, en présence d'un détergent portant des charges de signe opposé au signe déterminé, la concentration du détergent étant suffisante pour, si besoin, maintenir la solubilité desdites protéines dans le milieu, mais ne dépassant pas celle qui entraînerait une fixation trop sélective du détergent à ladite surface au détriment des protéines. L'invention découle en effet de la découverte qu'en opérant dans les conditions qui précèdent le déter- gent mis en oeuvre paraissait agir comme véhicule de transfert de la protéine sur la surface libre ainsi formée, l'excès de détergent pouvant ensuite être aisément lavé sans que les protéines transférées soient détachées de la surface libre. Dans la définition qui précède, du procédé selon l'invention, il importe de préciser quelques unes des notions évoquées. L'expression "chimiquement inerte" se rapporte à tout support capable de résister aux solvants aqueux et organiques couramment utilisés dans les techniques de séquençage et d'hydrolyse acide rappelées plus haut, et également aux températures couramment utilisées. n particulier, on peut avoir recours pour la-consti- tution de ce support à tout matériau résistant à des solutions d'acide chlorhydrique 6N, à une température de llO"C. pendant 24 heures. Un matériau-approprié, répondant à cette condition, est constitué par le verre. De façon non limitative, le support sera constitué de fibre de verre. De même l'expression "surface du support" n'exclut pas, surtout lorsque le support est poreux, que les protéines puissent pénétrer à l'intérieur de ce support. En fait, une telle pénétration permet la fixation, s'il y a lieu, de quantités plus importantes de protéines que ne le permettrait une surface lisse et leur meilleure immobilisation. Il est cependant clair que "macroscopiquement", l'on se trouve toujours en présence d'une surface, surtout lorsque ce support se présente sous la forme d'une feuille ou d'une membrane. I1 n'est guère nécessaire d'expliciter le terme "hydrophobe" dont l'acception générale ne pose pas de problème aux chimistes. D'une façon générale, une surface ou un groupe hydrophobe présentent un caractère répulsif vis-à-vis de l'eau. De même, il ne faut pas nécessairement prendre à la lettre l'expression faisant apparaître : "les protéines sont amenées à 1|état solubilisé au contact de ladite surface en présence d'un détergent..." Là encore, il s'agit d'un phénomène apparent. I1 ne peut être exclu qu'il ne se produise au contact immédiat de la surface libre, une précipitation de complexes entre le détergent et les protéines, au moment même de leur transfert. On ne peut en particulier a exciure l'intervention de ces complexes dans l'effet d1immo- bilisation observé desdites protéines. De même, l'Homme du Métier est à même de régler les intervalles de concentration de détergents utilisaDles pour répondre à la condition correspondante exprimée dans la définition générale sus-indiquée de l'invention. Ces concentrations relatives peuvent dépendre de la nature du détergent utilisé. Lorsque le transfert est effectué à partir d'un gel, à la suite d'une opération de fractionnement de protéines par électrophorèse, comme dans les cas préférés qui seront évoqués plus loin, la teneur initiale en détergent du gel luimême sera également généralement suffisante pour assurer le transfert et l'immobilisation de ces protéines à la surface libre du support. Dans une première variante de llinvention, et surtout lorsque le détergent utilisé sera constitué par du SDS, la surface libre du support devra comporter des groupements porteurs de charges positives. Dans ce cas, l'invention mettra généralement en oeuvre le produit nouveau que représentent les pellicules immobilisées, formées à la surface du support chimiquement inerte par l'intermédiaire de liaisons assurant leur insolubilisation vis-à-vis de solutions aqueuses et organiques, ladite pellicule étant formée d'un produit initialement dépourvu de protéines, et comportant à la fois des groupes hydrophobes et des groupes chargés positivement affleurant à sa surface libre. Dans le cas où le support est formé en verre a la matière dont est constituée la pellicule est avantageusement formée par un polymère hydrophobe, ou des mélanges de différentes polybases comprenant des chaînes hydrocarbonées, dans lesquelles sont intercalés des groupements fournissant des charges positives, notamment des groupes d'ammonium quaternaire dont une partie au moins affleure à la surface libre, et l'autre partie coagit avec les groupes silanol existants à la surface du support de verre pour assurer la fixation par liaisons ioniques de la pellicule à la surface du verre. Ce polymère est avantageusement formé par le POLYBRENE. L'invention met donc à profit la capacité d'une pellicule continue à la surface du verre à former des liaisons ioniques avec des groupes silanols négativement chargés affleurant à la surface du verre poreux, et le cas échéant, à masquer des groupes silanols n'intervenant pas dans la réaction de fixation. La réalisation de ces liaisons ioniques suffit à insolubiliser une pellicule au moins monomoléculaire de POLYBRENE à la surface de verre vis-à-vis des solutions aqueuses (le POLYBRENE est soluble dans l'eau) tout en préservant sa capacite à absorber des protéines même en présence d'un détergent, de charge négative, en particulier de SDS. On rappelle que le POLYBRENE est un polymère dont la structure peut être représentée par la formule dans laquelle on peut varier dans de grandes proportions. On appréciera que la pellicule peut également être constituée à partir de polymères semblables, dans lesquels les groupes triméthylène et hexaméthylène séparant les groupes ammonium quaternaire, peuvent être remplacés par des chaînes plus courtes ou plus longues, comprenant par exemple de 2 à 10 motifs méthylène. Une des conditions à prendre en considération pour le choix de ces polymères sera le nombre d'atomes d'azote intercalés dans les chaînes pour que tous ne soient pas engagés dans les liaisons ioniques formées entre les groupes -O-S-O3 du verre et les groupes -CH2-N+(CH3)2-CH2-du polymère. L e s indications qui précèdent ne sont pas limitatives en ce qui concerne les types de polymères utiirisables pour la constitution des pellicules chargées positivement. On peut mentionner le polyéthylénimine, le polyvinyl pyridine à titre d'autres exemples de matières utilisables. D'une façon générale, la pellicule peut être formée à partir de toute molécule comportant au niveau moléculaire, à la fois des régions hydrophobes, an particulier portées par des éléments de chaînes aliphatiques ou aromatiques, et des régions porteuses de charges positives. Quel que soit le polymère utilisé comportant les groupes ammonium quaternaires nécessaires à la fixation d'une mince pellicule à la surface du support himiquement inerte, on obtient en définitive une pellicule caractérisée par des ponts hydrophobiques (hexaméthylène et triméthylène respectivement dans le cas de POLYBRENE) comprenant un excès d'ions ammonium quaternaires intercalés entre les ponts. La surface ainsi produite fonctionne à lafaçon d'un échangeur d'anions forts ayant un caractère hydrophobe. Dans les réalisations qui précèdent on peut naturellement utiliser des détergents autres que le SDS. D'une façon générale, on peut avoir recours à tout détergent formé de chaînes hydrophobes notamment de nature aliphatique ou aromatique, ces chaînes portant en outre des groupements suffisamment hydrophiles pour les rendre hydrosolubles. Ces détergents doivent en outre, être aptes à favoriser la solubilisation des protéines dans des milieux aqueux. A titre d'exemples d'autres détergents, on mentionnera l'acide stéarique, l'acide palmitique, le dioxycholate. Avantageusement le milieu à partir duquel des protéines sont transférées à la surface libre de la pellicule est lui-même formé d'un gel de polyacrylamide contenant lui-même du SDS. Le transfert peut alors être réalisé par contact intime entre la feuille de gel et le support portant la susdite pellicule, le transfert étant alors effectué de toute façon appropriée (diffusion, convection, électro-élution,etc). Lorsque l'on a recours à un solvant tamponné extérieur pour favoriser cette élution, on peut avoir recours à une solution tamponnée classique. Dans le cas où la concentration en SDS du gel est suffisante à assurer la solubilisation des protéines, il est en général inutile de travailler avec une solution tamponnée contenant ellemême encore une certaine teneur en détergent. La teneur en détergent du gel est en général suffisante pour promouvoir le transfert dans les conditions qui ont été indiquées. I1 en est ainsi,en particulier lorsque la teneur du gel de polyacrylamide en SDS utilisé, pour réaliser l'électrophorèse préalable d'un mélange de protéines, contenait 0,1 % de SDS. il est significatif que l'invention tire profit des propriétés a priori contradictoires des différents constituants mis en jeu. Il est en effet rappelé que le POLYBRENE est soluble dans l'eau. Sa fixation sur le support inerte le protège cependant de cette propriété qui autrement pourrait être nuisible, particulibrement si les quantités de solution tamponnée mises en oeuvre pour réaliser lélution étaient relativement importantes. C'est la raison pour laquelle il n'est pas avantageux d'utiliser un support pourvu à sa surface de POLYBRENE non fixé. Celui-ci pourrait alors à l'occasion du susdit contact capter des protéines qui seraient ensuite perdues, par exemple dans le cas lavages répétés de la surface libre supportée. La présence de POLYBRENE non "fixé" pourrait encore être nuisible pour une raison supplémentaire. En effet le POLYBRENE et le SDS forment des complexes insolubles dans l'eau. Leur formation éventuelle serait alors un obstacle au transfert complet des protéines à partir du gel vers la pellicule supportée. Enfin la fixation du POLYBRENE, sous forme d'une fine pellicule à la surface du support inerte, ne fait pas obstacle au lavage de la surface libre retenant les protéines avec des solvants organiques, y compris ceux qui dissolvent aisément le POLYBRENE ou des polymères chargés analogues. Bien entendu, dans la technique qui précède, le gel de polyacrylamide peut être remplacé par tout autre gel, par exemple des gels à base d'agarose, de séphadux, de cellulose, etc... L'invention concerne également un procédé particulie- rement simple de fabrication de pellicules supportes répondant aux conditions sus-indiquées. En particulier, le procédé de formation d'une pellicule insolubilisée vis-à-vis de solvants aqueux ou organiques sur un support chimiquement inerte, notamment en verre et poreux de préférence, e s t caractérisé par la mise en contact de la surface de ce support avec une solution, de préférence aqueuses, d'une matière dont la structure moléculaire comporte à la fois des régions hydrophobes et des groupes chargés positivement permettant sa solubilisation dans l'eau, le nombre de groupes chargés positivement et la concentration de la matière dans la solution étantsuffisante pour permettre la neutralisation des charges négatives portées par le support de verre, ainsi que la formation et la rétention d'une pellicule hydrophobe portant un excédent de charges positives à sa surface, au moins monomoléculaire, après rinçage et séchage dudit support revêtu de la pellicule insolubilisée alors formée. L'invention concerne également la variante opposée du procédé de transfert et d'immobilisation de protéines qui peut être conçu. Dans cette variante opposée, la surface libre sur laquelle les protéines sont transférées porte alors des groupes chargés négativement et le détergent mis en oeuvre dans l'opération de transfert porte alors des groupes chargés positivement. On peut se retrouver placés dans cette situation lorsque, partant d'une feuille de gel de polyacrylamide dans lequel les protéines sont séparées en la présence d'un détergent inverse (un détergent contenant des charges positives, par exemple le bromure de cétyltriméthylammonium, commercialisé sous la marque CETAVLON) ou d'une feuille de gel de polyacrylamide initialement chargé en SDS et dans laquelle différentes protéines ont été séparées sous forme de bandes, le gel polyacrylamide SDS est lavé de façon extensive avec une solution contenant 0,5% d'acide acétique et 0,1% de bromure de cétyltriméthylammonium.Ce lavage substitue alors au SDS le CETAVLON positivement chargé et transforme le complexe protéines-détergent en des micelles positivement chargées ; le complexe protéinesdétergent ainsi formé peut alors être fixé sur un support chimiquement inerte présentant une surface libre hydrophobe, mais portant cette fois-ci des charges négatives. Ces charges négatives peuvent être fournies par une surface de verre a en l'absence de toute pellicule intermédiaire. Les groupes silanol présents à la surface du verre fournissent alors les charges négatives permettant de fixer les groupes triméthylammonium du CETAVLON, tandis que les parties cétylaliphatiques interviennent au niveau de l'interaction entre le détergent et les régions hydrophobes de la surface de verre. Ceci étant, la surface de verre peut également être pourvue d'une pellicule fixée de façon ionique, covalente ou non covalente (selon des principes analogues à ceux applicables dans le cas précédent), notamment lorsque l'on souhaite renforcer le nombre de charges négatives affleurant à la surface du verre. Dans ce qui précède, il a surtout été fait référence au transfert des protéines contenues dans une feuille de gel à la surface libre d'un support chimiquement inerte. I1 va de soi que le milieu fournissant les protéines peut être de toute autre nature, par exemple consister en une feuille de nitrocellulose ou de NYLON poreux contenant des protéines à l'état adsorbé et qui peuvent en être éluées dans toutes conditions appropriées I1 va de soi que le principe de la présente invention peut également etre utilisé pour adsorber toutes sortes de particules présentes dans des micelles de détergent chargé, par exemple des gouttes d'huile, des lipides, sur du verre ou des supports inertes possédant les propriétés décrites ci-dessus. Il peut également être utilisé pour purifier des détergents contenant des suspensions d'une manière très simple. Une fois saturés, des matériaux absorbés peuvent ensuite être éliminés par des solvants organiques et le support filtrant peut être rechargé en le faisant passer dans une solution d'une polybase. MATERIELS ET METHODES On indique ci-après, les natures des matériels et des méthodes qui ont été utilisés au cours du transfert des protéines. Le mélange de protéines de référence a bas poids moléculaire a été fourni par Bio Rad Laboratories. La Sérumalbumine humaine, la DNase pancréatique bovine et la myoglobine de muscle de squelette de Cachalot ont été obtenus de Sigma Chemicals. L'ovalbumine et le chymotrypsinogène traité au diisopropylfluorophosphate sont des produits WORTHINGTON. La phosvitine d'oeuf de poulet a également été utilisée comme l'une des protéines de référence. L'actine du muscle squelettique de lapin a été préparée à partir de poudres d'acétone selon Spudich et Watt (12). La protéase de Staphylococcus aureus V8 est de MILES, Angleterre. Les feuilles de fibre de verre (47 x 56 cm) sont des produits WHATMAN, Royaume-Uni. Le POLYBRENE et la fluorescamine sont des produits de JANSSEN CHIMICA et FLUA A.G. respectivement. Les produits chimiques utilisés dans le procédé de transfert et les amino-acides ont été utilisés sans autre purification. Les réactifs et les solvants utilisés dans le séquen çage en phase gazeuse ont été fournis par APPLIED BIOSYSTEMS INC. Les solvants utilisés étaient appropriés à l'analyse en chromatographie liquide haute performance des dérivés phénylhydantoine des acides aminés PTH. PREPARATION DES FEUILLES DE FIBRE DE VERRE RECOUVERTES DF POLYBRENE Des feuilles de papier de microfibres de verre (GF/C) ont été coupées à la taille du gel de polyacrylamide et imprégnées avec une solution de POLYBRENE dans l'eau à 3 mg/ml. Les feuilles imprégnées ont été séchées & l'air et l'excès de POLYBRENE a été enlevé par lavage avec 10O ml d'eau distillée pendant 10 minutes. Les feuilles ainsi lavées ont été ensuite utilisées immédiatement, ou stockées dans un milieu sec. ELECTROPHORESE SUR GEL DE POLYSCRYLAMIDE CONTENANT DU S D S - TRANSFERT ET DETECTTON DES PROTEINES IMMOBILISEES. Les échantillons ont été préparés et séparés sur des gels de polyacrylamide contenant du S D S essentiellement selon la méthode décrite par LAEMMLI (13). Les gels étaient épais de 1,5 mm et le pourcentage d'acrylamide utilisé a été de 12,5% sauf indication contraire. Le transfert électrophorétique a été effectué pendant 20 heures à 3 V/cm et l'ensemble gel-fibre de verre a été assemblé essentiellement selon la méthode décrite pour le transfert de protéines sur de la nitrocellulose (4), la nitrocellulose étant remplacée par deux feuilles de verre recouvertes de POLYBRENE et marquées sur les bords par des encoches, afin de pouvoir réaliser une superposition parfaite après le séchage et la coloration. Le tampon de transport contenait 50 mM de borate de Sodium (pE : 8,0), 20% de méthanol et 0,02% de Bêta-mercaptoéthanol. Les feuilles de verre recouvertes de POLYBRENE ont été ensuite lavées pendant 10 minutes avec 150 ml de chlorure de sodium à 25 mM et 10 mM de borate de sodium (pH 8,0). Cette opération a été répétée 4 fois et s'est terminée par un lavage à-l'eau pendant 5 minutes. Les feuilles ont été séchées pendant la nuit et plongées dans une solution de fluorescamine dans l'acétone fraîchement préparée (de 1 mg;50 ml à 1 mgl/300 ml). Les protéines ont été visualisées après exposition à l'ultraviolet, avec une lampe à lumière minérale, (Ultraviolet Products, San Gabriel, USA) et photographiées avec un film Polaroïd type 665 P/M et un filtre Wratten n" 9, avec des temps d'exposition variant de 1 à 2 minutes. Dans certaines expériences, les protéines ont été visualisées en premier lieu dans le gel par une coloration pendant 20 minutes avec une solution de Bleu de Coomassie (0,25% de Bleu de Coomassie, 45% de méthanol, 9 d'acide acétique en volume) et décolorées pendant au moins 24 heures avec des solutions chargées plusieurs fois de 5% de méthanol, 7,5% diacide acétique. Avant l'électrotransfert, les protéines coloriées ont été redissoutes en introduisant le gel dans 0,1% de SDS, 50 mN de borate de sodium (pH 8,0), et ce tampon a été remplacé plusieurs fois jusqu'à ce que le dernier lavage montre une valeur due pH supérieure à 7,0. Le gel équilibré a été ensuite monté et électrotransféré comme il a été décrit plus haut. Etant donné que le bleu de Coomassie se lie fortement au POLYBRENE cationique, les protéines ont pu être localisées parla co-électrcélution et co-adsorption de la tAche liee à l'origine è la protéine dans le gel. La dernière procédure sera ici référencée comme l'immobilisation "indirecte" ou "colorée" par le bleu de Coomassie. HYDROLYSE ACTDE ET ANALYSE AMINO-ACIDE La portion de feuille de fibre de verre portant les protéines a eté coupée et placée dans un tube Pyrex auquel ont été ajoutés 400 l d'une solution d'HCl, 6 N contenant 0,0005 t de Bta-mercaptoéthanol (14). Les tubes ont été bouchés sous vide et mis a incuber pendant 22 heures. Les hydrolysats ont été rapidement séchés, redissous dans 400 pl d'un tampon de citrate. de sodium 0,2 M (pK : 2,2) et filtrés. Les analyses ont été effectuées avec un analyseur d'amino-acides BIOTRONIK équipé d'un détecteur de fluorescence et d'un intégrateur HEWLET PACKARD. Les acides aminés ont été dosés de façon quantitative après réaction avec du o-phtaldialdéhyde essentielle ment de la manière décrite par BENSON et HARE (15). DETERMINATION DE LA SEQUENCE AMINO-ACIDE La portion de feuille en fibre de verre portant les protéines ou les polypeptides immobilisés a été découpée afin de former un disque de 12 mm de diamètre. Les éventuelles bandes de protéines étrangères contaminantes ont été éliminées et le disque restant a été monté dans la chambre de réaction du séquençeur à phase gazeuse (Applied Bîosyst. Inc. USA). Le séquençeur a été assemblé et utilisé comme décrit par HEWICK et al (16). Les dérivés amino-acides-PTH libérés à chaque étape ont été analysés en utilisant une colonne analytique Cyano-EPLC (IBM Instruments) et le systeme d'élution décrit par HUNKAPILLER AND HOOD (17). Un système HPLC Waters comprenant 2 pompes M 6000 A, un autoinjecteur WISP 710 B, un système de contrôle M 721 et un détecteur à longueur d'onde fixe M 441 (254 mm) ont été utilisés L'obtention d'acides aminés PTH a été mesurée & BR ELECTROPHORESE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE A 2 DIMENSIONS. Du tissu embryonnaire de muscle squelettique de poussins agés de 18 jours a été dissolus dans 10% de Béta- mercaptoéthanol, 3% de dodécylsulfate de sodium, centrifugé et les parties aliquotes contenant des concentrations aporopriées de protéines ont été lyophilisées. Le matériel séché a été redissous dans un tampon lyse (18) et les protéines ont été séparées dans un système polyacrylamide à 2 dimensions, comme décrit par Garrels (18). DIGESTION DE L'ACTINE AVEC LA PROTEASE DE. STAPHYLOCOCCUS AUREUS V8. Une solution d'actine G (2 mg/ml) dans un tampon salin (2 m! Tris, 0,2 mM ATP, 0,2 M CaCl2, 0,2 mM Bêta mercaptoéthanol pH = 7,6) a été diluée avec un volume égal de 2 M tris-HC1 pH 7,0 et digérée pendant 30 minutes à 250C avec la protease V8 (ratio enzyme/ substrat : 1/30 en poids). La fragmentation a été terminée par précipitation avec 1/8 en volume d'acide trichloroacétique à 100%. Le produit obtenu après centrifugation a été redissous dans le tampon (voir ci-dessus) et des parties aliquotes appropriées ont été appliquées sur des gels de polyacrylamide à 205. En variante, l'actine -G a été diluée (dans les mêmes conditions que ci-dessus), avec un volume égal de 0,1% de dodécylsulfate de sodium, 0,175 M de tris-HCl de pH = 7,5 et digérée comme ci-dessus. La protéolyse a été terminée par l'addition de dodécylsulfate de sodium (concentration finale 2%) et de mercaptoéthanol (concentration finale 10%) (19). Les fragments ont été séparés comme ci-dessus. TRANSFERT ET IMMOBILISATION DE PROTEINES VARIES. Les résultats obtenus sont exposés dans ce qui suit, en particulier par référence aux figures dont les significations sont rappelées ci-après - la fig. 1 illustre le principe du transfert de différentes protéines d'un gel de polyacrylamide contenant du S D S sur une fibre de verre recouverte de POLYBRENE. Le mélange de protéines étalons contient de la phosphorylase b (a) ; de la sérumalbumine bovine (b); de l'ovalbumine (c) ; de ltanvdrase carbonique (d) un inhibiteur de la trypsine du soja (e) ; de la lysozyme (f). A représente les bandes observées après coloration du gel par le bleu de Coomassie ; B et C, respectivement les taches sur la fibre de verre de la première feuille (B) et de la seconde (C) colorées avec la fluorescamine ; D une coloration avec le bleu de Coomassie des protéines restantes dans le gel, après l'électrotransfert ; E et F respectivement, les taches de protéines après l'électrotransfert sur les première (3) et seconde (F) feuilles des' protéines colorées auparavant au bleu de Coomassie ; G les taches de protéines colorées au bleu de Coomassie restantes dans le gel après élimination des taches de transfert -colorées au bleu de Coomassie - La fig. 2 représente les résultats d'un transfert à deux dimensions de protéines issues de muscle embryonnaire d'un poussin âgé de 18 jours sur unefeuille de fibre de verre recouverte de POLYBRENE. Dans la figure 2, A représente le gel à deux dimensions coloré avec le bleu de Coomassie. Les résultats du transfert des taches de protéines sur le verre recouvert de POLYBRENE sont représentee en B. Les-protéines dans 3 représentent la moitié ae la quantité utilisée dans A où Al, A2 et Tm représentent respectivement la 3êta-actine, l'Alpha-actine et les tropomyosines. H+ et OH indiquent le côté acide et le côté basique du gel. La séparation par focalisation isoélectrique "IEF" de lwanglais;isoelectric focussing) a été réalisée dans une direction horizontale, la séparation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide contenant du SDS dans une directlon verticale. - La fig. 3 sont des exemples de transfert de protéines variées:, B, C, D, E, F représentent la myoglobine, la phosvitine, l'actine, le chymotrypsinogène, la sérumalbumine humaine et la DNase I immobilisées sur la première feuille et colorées avec la fluorescamine. A+, C+, D.+, E+, F+ représentent les mêmes taches sur la seconde feuille. G, 'A, I, J, K, L représentent les mêmes protéines, dans le même ordre, transférées apres une coloration dans le gel avec le bleu de Coomassie. Seule la pre misère feuille est montrée ici. Les taches ont été utilisées pour déterminer la capacité de fixation du verre recouvert de POLYBRENE (voir tableau I) et pour comparer leur composition avec celles dérivées de leur séquence connue. - la fig. 4 représente la détermination de la sensibilité de l'opération de transfert sur fibre de verre Des quantités variées (10, 50, 100, 500 et 1000 ng) de sérumalbumine humaine ont été utilisées sur un gel de polyacrylamide à 12,5% et détectées dans le gel avec le bleu de Coomassie (A), la coloration à l'argent (C), la fluorescamine après-la fixation sur le POLYBRENE(3). RESULTATS La grande diversité des protéines susceptibles d'être fixées apparaît à l'examen des résultats ci-après - la fig. 1 montre les résultats des expériences de transfert effectuées avec le mélange de protéines de référence à bas poids moléculaires fourni par Blo RAD, et séparé sur un gel de polyacrylamide à 12,5i. Une des encoches du gel a été colorée avec le bleu de Coomassie (fi3. 1A) et l'autre a été électroéluée sur deux feuilles de fibre de verre superposées, recouvertes de POLYBRENE et colorée ensuite avec la fluorescamine (fig. 1 3 et 1 C). La figure 1 D montre un exemple de protéines colorées avec le bleu de Coomassie et restant encore dans le gel après l'opération de transfert. Les modèles démontrent que, hormis le cas de la phosphorylase b, toutes les protéines standard sont électroéluées quantitativement hors du gel et immobilisées sur plusieurs feuilles de verre recouvertes de POLYBRENE. an raison de son poids moléculaire élevé, la phosphorylase b n'est pas quantitativement éluée hors du gel et des périodes d'électroélution plus longues semblent nécessaires pour obtenir une élution complète. La quantité de protéines présentes dans chaque bande (environ 10;us) est suffisante pour saturer la surface correspondante sur la première feuille de verre, après quoi les protéines sont immobilisées sur la seconde feuille.Les protéines présentes seulement en de faibles quantités (qui resrésen- tent ici les produits de dégradation des protéines de référence) sont entièrement retenues sur la lère feuille. Les figures 1 E et 1 F montrent le transfert du meme mélange de protéines sur deux feuilles de verre recouvertes de POLYBRENE superposées. Elles ont été auparavant colorées avec le bleu de Coomassie (voir fig. 1 A) et ensuite redissoutes en incubant ie gel dans le tampon contenant du SDS avant l'électrotransrert. Les protéines restantes dans le gel après cette opération de transfert ont été recolorées avec le bleu de Coomassie et le résultat est montré à la fig. 1 F. Cette expérience montre que les protéines qui ont été auparavant colorées dans le gel peuvent aussi être transférées et immobilisées sur le verre. Toutefois, ce transfert "indirect" apparait être moins quantitatif et plus dépendant du type de protéines que dans le transfert direct. Non seulement les protéines à poids moléculaire élevé (phosphorylase b et sérumalbumine bovine), mas également des protéines plus petites comme la lysozyme sont retenues partiellement sur le gel original. Ici également, les protéines sont immobilisées à des niveaux de saturation sur la lère feuille et ensuite adsorbées sur les couches suivantes. Dans le but de démontrer que la technique de transfert sur verre peut être appliquée avec une large variété de protéines, un extrait de protéine d'un muscle de patte de poulet embryonnaire âgé de 18 jours a été séparé par une électrDphorèse classique à deux dimentions sur gel de polyacrylamide. La fig. 2 A montre les taches de protéines après coloration du gel avec le bleu de Coomassie. La fig. 2 B montre une coloration avec la fluorescamine des taches sur la fibre de verre effectuée à partir d'une séparation similaire et avec la moitié de l'extrait de protéines utilisé pour la fig. 2 .x. La tache sur le verre apparaît comme une copie presque exacte de la protéine visualisée dans le gel. Les taches principales sont dues à l'actine alpha et à latine beta et aux isoformes de la tropomyosine. Elles représentent environ 0,5,ag de protéines ainsi qu'il a été déterminé par l'analyse des amino-acides des taches immobilisées (voir ci-dessous). Ces quantités correspondent respectivement à 12 et 17 pmol d'actine et de tropomyosine, malgré l'extrême petitesse des quantités fixées(dans le domaine des picomoles) > les feuilles de verre revêtues selon l'invention permettent dé3à l'analyse d'au moins certains acides aminés éluant avec le premier tampon (Asp, Thr, Ser, Gly, Ala, Val). Le fait que des protéines peuvent être transférées à partir d'une feuille de gel et être immobilisées sur plusieurs feuilles superposées de verre poreux revêtues de POLYBRENE, indique que les capacités de fixation de protéines sont déterminées, pour un type donné de feuille poreuse en verre revêtu du film du matériau utilisé, ne serait-ce qu'en raison de la capacité maximum d'absorption de protéines. Les capacités de fixation par une feuille de fibre de verre de diverses protéines ont été déterminées pour plusieurs protéines en mesurant les quantités de protéines qui étaient retenues dans des régions saturées des feuilles (les régions de la 1ère feuille correspondant à celles de la 2ème feuille, etc.). Les résultats ont été ensuite normalisés enyag de protéine par cm2 et sont résumés dans le tableau 1. Les capacités maximales ont été déterminées pour la myoglobine de muscle squelettique de cachalot, la phosvitine d'oeuf de poulet 1'actine de muscle squelettique de lapin, le chymotrypsinogène bovin, la sérumalbumine humaine et la DNase I pancréatique bovine. Les protéines ont été déposées sur le gel en quantités suffisantes pour permettre une analyse amino-acide précise (de 1 nnmol à 300 pmol). Les caractéristiques de transfert de ces protéines sont montrées à la fig. 3. Les capacités de fixation ont été mesurées soit après le transfert direct et la détection avec la fluorescamine (Tableau 1, ligne 1) soit après la détection avec le bleu de Coomassie suivie du transfert (Tableau 1. ligne 2). Les valeurs données à la ligne 1 sont des moyennes de deux déterminations indépendantes, chacune d'entre elles ne diffèrant pas de la valeur moyenne de plus de 10%. Ceci indique que la capacité de transfert pour chaque protéine est relativement constante, indépendante de l'expérience. Les valeurs ont été basses pour la phosvitine (protéine phosphorylatée) (8wug/cm2) et variables pour les autres protéines entre 15 et 28 > igicm2. La capacité de fixation pour les protéines colorées avec le bleu de Coomassie (ligne 2) a été identique aux valeurs ci-dessus pour 3 protéines sur 5, mais seulement égale à la moitié pour la myoglobine et 1'actine et extrêmement basse pour la phosvitine. De plus, ces dernières valeurs ont varié d'une maniere sensible d'une expérience à l'autre (+ de 50%). Comme ci-dessus, les valeurs données à la ligne 2 du Tableau 1 représentent des moyennes de deux expériences indépendantes. Cette variabilité sensible semble être dûe à une insaturation incomplète du gel avec le tampon SDSborate avant I'électrotransfert. La fig. 4 A montre le résultat de la coloration de différentes quantités de sérumalbumine humaine (de 5 a- 500 ng) avec le bleu de Coomassie, La fig. 4 C la coloration avec l'argent (20) La fig. 4 5 avec la fluorescamine, cette dernière étant effectuée après un transfert électrophorétique sur le verre recouvert de POLYBRENE. Les résultats démontrent que pour la sérumalbumine, la détection avec la fluorescamine (en utilisant 1 mg/200 ml) présente une meilleure sensibilité que celle avec le bleu de Coomassiea mais moins bonne qu'avec l'argent. DETERMINATION DIRECTE DE LA COMPOSITION DES SEQUENCES D'ACIDES AMINES PAR UN SEQUENCAGE EN PHASE GAZEUSE. Une expérience a été réalisée avec 20 ug ( e 1,7 nnmol) de myoglobine de muscle de squelette de cachalot, lequel avait auparavant subi une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS avant d'être immobilisé sur du verre recouvert de POLYBRENE. La protéine immobilisée a été soumise à 18 cycles de la dégradation d'Edman et la quantité ainsi que la nature des acides aminés-PTH mis en évidence après chaque étape ont été déterminées par une analyse HPLC (fig. 5). Ces données ont permis de déterminer les efficacités de séquençage. Le rendement de couplage initial (30X) a été calculé en comparant la quantité de myoglobine immobilisée et transférée (1 nmole) et le rendement de l'acide aminé PTH correspondant à l'acide aminé NH2terminal (300 pmol). Les rendements répétés ont été calculés à partir des rendements de la leucine PTH en positions 2, 9 et 11 et ceux de la Valine PTH en positions 1, 10 et 13 des valeurs de 91% et 92% ont été trouvées respectivement. Un séquençage semblable en phase gazeuse a été effectué avec la même quantité de myoglobine (1 nenomole) qui avait été directement déposée sur un disque de fibre de verre recouvert auparavant avec 30 p1 diune solution de POLYBRENE (100 mg/ml). Le second séquençage a été effectué de manière classique. I1 a montré un rendement initial supérieur (55%) mais les rendements répétés ont été similaires à la 1ère expérience. Le séquençage en phase gazeuse de protéines immobilisées sur du verre recouvert de POLYBRENE ne conduit à la production que de très faibles quantités de diphénylthiourée (DPTU) et de diphénylurée (DPTJ), c'est-à-dire de produits secondaires de la dégradation d'Edman, qui sont normalement détectés en grande quantité dans les chromatogrammes HPLC des acides aminés PTH. L'absence de ces produits secondaires est un avantage spécial puisqu'elle permet une identification certaine de la PTH-Met et PTH-Ile, éluant dans le système de séparation de HUNKAPILLER et HOOD(17). Le procédé de transfert selon l'invention fournit donc des moyens permettant un séquençage "in situ" particulièrement efficace et reproductible de quantités initialement excessivement faibles de protéines. Ci-après est encore fournie la bibliographie des articles qui doivent être considérés comme faisant partie de la présente description, dans la mesure où ils seraient utiles à une meilleure compréhension de son contenu. TABLEAU 1 Capacité de transfert et d'immobilisation de différentes protéines sur des feuilles de fibres de verre recouvertes de POLYBRENE électroéluées à partir de gels de polyacrylamide - SDS ( g/cm2) Transfert direct Transfert après suivi d'une détec- coloration au bleu protéine tion à la fluores- de Coomassie dans camine : le gel myoglobine . 21 13 DNase I 21 : 20 chymotrypsinogène : 15 14 actine : 28 : 13 sérumalbumine humaine 23 24 phosvitine 8 0,5 REFERENCES 1. Burnette, W.N. (1981) Anal. Biochem. 122, 195-203 2. Alvine, J.C., Kemp, D.J., Parker, B.A., Reiser, J., Renart, J., Stark, G.R., and Wahl, G.M. (1979) in Methods in En@ymo- logy (Wu,R., ed.), Vol 68, pp.220-242, Academic Press, New York 3. Clarke, L., Ritzeman, R., and Carbon, J. (1979) in Methods in Enzymology (Wu, R., ed.), Vol 68, pp436-442, Academic Press, New York 4.Towbin, H., Staebelin, T., and Gordon, J. (1979) Proc. natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 5. Gershoni, J.M., and Palade. G.E. (1982) Anal. 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Acta 578, 253-257 REVENDICATIONS 1: Procédé de transfert et d'immobilisation e protéines et/ou d'acides nucléiques sur une sur face libre formée sur un support chimiquement inerte, e préférence poreux, à partir d'un milieu susceptible de les fournir, amené en contact avec cette surface, caractérisé en ce que ladite surface a un caractère cenéralement hydrophobe tout en portant des charges d un signe déterminé et en ce que les protéines =./ou les acides nucléiques sont amenées à l'état solubilisé au contact de ladite surface, en présence 'un détergent portant des charges d'un signe opposé au signe déterminé, la concentration du détergent etant suffisante pour, si besoin, maintenir la soluilité desdites protéines et/ou des acides nucléiques ans le milieu, mais ne dépassant pas celle qui entraînerait une fixation trop sélective du détergent ladite surface au détriment des protéines et/ou des acides nucléiques. 2' Procédé selon la revendication 1, caractérisé r ce que le support chimiquement inerte est à base de verre, notamment ae fibres de verre. 3/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le milieu à partir duquel les protéines et/ou les acides nucléiques sont transférées vers ladite surface est essentiellement formé par une feuille d'un gel, notamment à base de polyacrylamide, amené au contact ae la surface libre. Procédé selon la revendication 3, caractéri- e en ce que le gel porte plusieurs bandes de protéines et/ou d'acides nucléiques et en ce que le transfert est effectué par élution des protéines et/ou des acides nucléiques hors du gel et vers la surface libre du support. 5/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la surface libre est formée sur une pellicule hydrophobe immo bilisée à la surface du support inerte par l'inter mdiaire de liaisons assurant son insolubilisation vis-à-vis de solutions aqueuses et organiques venant à son contact. 6/ Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la pellicule est formée d'un produit Polymère généralement hydrophobe isolant le support du milieu contenant les protéines et/ou les acides nucléiques et amenée. à son contact, ladite pellicule comportant des groupes chargés positivement affleurant à sa surface extérieure et en ce que le détergent utilisé comporte des charges négatives. 7/ Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la pellicule est formée d'un produit comportant des chaînes hydrocarbonées hydrophobes, dans lesquelles sont intercalées des groupes ammonium qua ternaire. 8/ Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la pellicule est constituée de polyméthobromure de 1,5 diméthyl-1,5 diazaundécaméthylène. 9/ Procédé selon la revendication 5 prise isolément ou en combinaison avec l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le détergent est constitué de dodécylsulfate de sodium. 10/ ' Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite surface porte des groupes chargés négativement et en ce que le détergent porte des groupes chargés positivement. 11/ Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le support chimiquement inerte est constitué par du verre poreux et en ce que le détergent au contact duquel les protéines et/ou les acides nucléiques sont amenées au contact de la surface libre du support porte des groupes chargés positivement, et en ce que le transfert est fait à la surface du verre directement. 12/ Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le détergent est constitué de bromure de céthyl-triméthyl ammonium. 13/ Procédé selon la revendication 3 ou 4, ellemême combinée avec l'une quelconque des revendications 5 à 12, caractérisé en ce que le gel, notamment de polyacrylamide, renfermant les protéines et/ou les acides nucléiques contient une concentration en détergent suffisante à maintenir et à assurer la solubilisation des protéines et/ou des acides nucléiques pendant l'opération de transfert. 14/ Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le transfert est réalisé en mettant en oeuvre une solution éluante dépourvue de détergent. 15/ Pellicule immobilisée et insolubilisée vis à-vis de solutions aqueuses ou organiques par liaison à la surface d'un support chimiquement inerte, ladite pellicule étant formée d'un produit comportant à la fois des groupes hydrophobes et des groupes chargés positivement affleurant à sa surface libre, ce produit étant de préférence dépourvu de protéines et/ou d'acides nucléiques. 16/ Pellicule selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle est immobilisée à la surface d'un support en verre poreux. 17/ Pellicule supportée selon la revendication lb, caractérisée en ce qu'elle est formée par un produit polymère hydrophobe comprenant des chaînes hydrocarbonées dans lesquelles sont intercalées des groupes ammonium quaternaire formant des charges positives dont une partie au moins affleure à la surface libre de la pellicule. 18/ Pellicule supportée selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle est formée de polyméthobromure de 1,5 diméthyl-1,5 diazaundécaméthylène ioniquement fixé au support, notamment de verre. 19/ Procédé de formation d'une pellicule insolu biliée vis-à-vis de solvants aqueux ou organiques sur un support chimiquement inerte, notamment en verre, portant des groupes chargés négativement, caractérisé par la mise en contact de la surface de ce support avec une solution de préférence aqueuse d'une matière dont la structure moléculaire comporte à la fois des régions hydrophobes et des groupes chargés positivement permettant sa solubilisation dans l'eau, le nombre de groupes chargés positivement et la concentration de la matière dans la solution étant suffisants à permettre la neutralisation des charges négatives portées par le support de verre a ainsi que la formation et la rétention dune pellicule au moins monomoléculaire hydrophobe portant un excédent de charges positives à sa surface, après rinçage et sèchage dudit support revêtu de la pellicule insolubilisée alors formée.