FR 2601692 A1 19880122 FR 8710047 A 19870716 L'invention concerne un procédé pour la préparation de la bacitracine par fermentation de souches modifiées de Bacillus. Parmi les souches appartenant aux espèces Bacillus subtilis et Bacillus licheniformis, on en connait plusieurs qui produisent la bacitracine en quantités abondantes. Dans le brevet des Etats-Unis n" 2 813 061, on décrit une souche qui produit 323 U/cm3 (unités par cm3 de milieu de culture) (dans toute la présente demande, les unités de bacitracine sont celles utilisées dans le brevet des Etats-Unis n" 2 498 165, à savoir 1 U = 23,8 microgrammes). La souche décrite dans le brevet tchécoslovaque n" 206 910 produit 580 U/cm , la souche décrite dans le brevet hongrois 3 n" 173 315 produit 570 à 590 U/cm et la souche décrite dans le brevet japonais n" 74.46 079,500 U/cm3.Dans le brevet tchécoslovaque n" 173 450, on décrit une souche de Bacillus licheniformis qui, même à l'état contaminé par des phages virulents, produit encore 240 à 280 U/cm3. Dans certains brevets, on donne également des indications sur la production de bacitracine par des mutants défectueux ou des souches résistantes aux antimétabolites et des souches à métabolisme perturbé. Ainsi par exemple, la souche du brevet japonais n" 74. 46 079 est auxotrophe à la méthionine, la souche du brevet hongrois n" 173 315 est résistante à l'hydroxamate d'isoleucine et la souche du brevet polonais n" 120 267 est incapable de valoriser l'isoleucine. Une comparaison des chiffres de production publiés montre que les souches résistantes aux phages virulents et par conséquent bien aptes à la fermentation n'ont pas une production particulièrement forte, alors que les cultures de souches bonnes productrices sont toujours exposées au risque d'une contamination par les phages. Jusqu'à maintenant, on n'a jamais décrit de souches productrices de bacitracine à haute activité et simultanément résistantes aux phages. La demanderesse a cherché à préparer des souches de Bacillus dont la capacité de production atteigne ou dépasse les capacités de production indiquées dans la littérature scientifique mais dont la fermentation ne serait pas perturbée par les phages virulents. La demanderesse: a également étudié des paramètres nouveaux exploitables à la fermentation des souches recherchées. On sait que l'addition d'ornithine à des milieux nutritifs chimiquement définis conduit à une augmentation de la production de bacitracine (FEMS Microbiol. Letters 10(2), 111-114/1981/). On sait également que les souches bonnes productrices ont une caractéristique commune un catabolisme de l'ornithine qui est inhibé (Acta Biochim. Pol. 21 (2), 213-214/1974/). Dans certains cas, une résistance à l'arséniate, produite artificiellement, diminue le transport du phosphate à l'intérieur de la cellule (J. Bacteriol. 137 (1), 69-72/1979/). Finalement, on sait que la fusion de protoplastes convient pour le transfert de propriétés po2ygènes (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 2147-50 et 73, 2151-55, /1976/) et également qu'une recombinaison est possible entre Bacillus substilis et Bacillus licheniformis (Arch. Microbiol. 134 (4), 303-308/1983/). On a maintenant trouvé que le catabolisme inhibé de l'ornithine, caractéristique des souches bonnes productrices, pouvait également se produire chez des mutants défectueux. On a en outre trouvé que le trans port amoindri des phosphates permettait également un haut rendement en antibiotique lorsque la concentration en phosphate minéral était supérieure à la concentration optimale. Finalement, on a trouvé que l'on pouvait préparer des souches bonnes productrices et résistantes aux phages virulents par fusion interspécifique des protoplastes de souches mauvaises productrices ou même non productrices de bacitracine mais résistantes aux phages virulents. A l'étude des conditions de la fermentation, on a trouvé que, pour une multiplication de la souche productrice, la température optimale était différente de celle qui est optimale pour la biosynthèse de la bacitracine. On a encore trouvé que les ions ammonium formés en tant que produits de décomposition des protéines inhibaient, à une concentration de 70 à 80 mM, la biosynthèse de la bacitracine et que, par conséquent, il fallait régler en conséquence le rapport entre les sources d'azote organique et les sources d'azote minéral, de même que le rapport entre les sources de carbone et les sources d'azote.Finalement, on a trouvé que la farine de soja pouvait être remplacée avantageusement par de la farine de pois ou de la farine de luzerne lorsque l'indice d'amidon du milieu nutritif était considéré comme une constante et que la concentration des composants naturels du milieu nutritif était choisie en tenant compte de cette constante et du rapport carbone/azote (l'indice d'amidon est calculé selon mode opératoire de la norme hongroise MSZ 6830-53). L'invention a en conséquence pour objet un procédé de préparation de la bacitracine par fermentation de souches modifiées de Bacillus, procédé dans lequel la fermentation est effectuée dans des conditions aérobies, avec contrôle de la température, en culture submergée dans un milieu nutritif contenant des sources de carbone, des sources organiques et minérales d'azote, des oligoéléments et, en tant que tampon, du carbonate de calcium.Le procédé selon l'invention se caractérise en ce que l'on utilise en tant que souche productrice - un mutant défectueux, ou bien - une souche de Bacillus résistante à 1'arse- niate, ou bien - une souche de Bacillus bonne productrice de bacitracine, résistante aux phages virulents, préparée par fusion des protoplastes de sou ches différentes de Bacillus, on procède à la culture à 37-45"C, on procède à la production à 35-37"C et on utilise un milieu nutritif dont l'indice d'amidon est de 60 à 85 par litre, qui contient la source de carbone et la source organique d'azote dans un rapport de 0,30 à 0,95:1 et qui, avant l'ensemencement, présente une concentration en ions NH4 de 16 mM au maximum et une concentration en ions phosphate de 5 mM au maximum. On décrit ci-après la préparation de quelques souches de Bacillus appréciées. Les propriétés des souches de départ sont rapportées dans le tableau ci-dessous. Tableau I Propriété S o u c h e s MNG 00110 MNG 101012 MNG 101013 Phylaxia ATCC 9800 NCTC 6816 production de bacitracine bonne mauvaise néant Résistance aux phages virulents sensible résistante résistante Résistance aux antibiotiques oxytétracycline résistante sensible résistante érythromycine résistante sensible résistante bacitracine résistante sensible résistante Préparation des mutants à l'aide de la N-méthyl-N'-nitro-N-nitroso-guanadine On cultive la souche Bacillus MNG 00110 pendant une nuit dans un milieu nutritif à la composition suivante extrait de levure 5 g tryptone 10 g NaC1 5g MgSO4 10-4 4 M -5 CaCl2 5 x 10 M eau 1 litre (en abrégé ci-après : solution nutritive YT). La suspension de bactéries est diluée 50 fois et soumise à culture pendant encore 2 h. On centrifuge ensuite les cellules et on les met en suspension dans du tampon au phosphate 1/15 M (pH 6,0). On ajoute à la suspension 20 microgrammes de N-méthyl-N'-nitro-N-nitroso-guanadine par ml et on abandonne le mélange au repos pendant 1 h. On centrifuge les cellules, on les lave avec le tampon, on centrifuge à nouveau puis on met en suspension dans le milieu nutritif à la composition cidessus. On aère les cellules traitées pendant 2 h à 30"C puis on isole pour l'obtention de monocolonies (description du mode opératoire : cf. Sherrat et Collins, J. Gen. Microbiol. 76, 217-230/1973/). Après l'isolement, on obtient une souche dont la production de bacitracine est supérieure de 20% à celle de la souche de départ. La nouvelle souche a été appelée PP-188. Par irradiation aux UV On lave la suspension de spores de la souche PP-188 à deux reprises avec de l'eau distillée stérile puis on l'irradie par une lampe à UV (Philips Germicid, 30 W) d'une distance de 30 cm pendant 1,5 mn puis on isole sur milieu nutritif YTA (le milieu nutritif YTA a la même composition que la solution nutritive YT mais avec en plus 1,8% de gélose). Après le traitement aux UV, on isole une souche de mutants défectueux en ornithine/arginine. Cette souche a été appelée AH 22 et a été déposée sous le n" MNG 00343 à la collection de microorganismes hongroise. La souche croît bien sur milieu nutritif minimum à 50 microgrammes/ml d'ornithine, elle croît mal sur milieu nutritif minimum à 50 microgrammes/ml d'arginine et sa production d'antibiotique est supérieure d'environ 25% à celle de la souche initiale. Isolement de mutants résistant à l'arséniate On lave des cellules de la souche PP-188 à laide de sérum physiologique et on les met en suspen sion dans un milieu nutritif minimum Spizizen contenant, à la place des phosphates, 200 millimoles d'arséniate. On aère la culture pendant une nuit à 30"C. On centrifuge les cellules survivantes, on les lave avec la solution nutritive YT puis on les isole (mode opératoire Alfesi, Friedberg et Friedberg, J. Bacteriol. 137, (1), 69-72 /1979/). La souche PP-188 a 25 descendants résistants à l'arséniate dont les productions de bacitracine sont supérieures de 10% pour 5 d'entre elles, d'environ 25% pour deux d'entre elles et d'environ 50% pour deux d'entre elles. La souche la meilleure productrice a été appelée AS 19 et déposée à la collection de microorganismes hongroise sous n" 00344. Pour produire la quantité optimale de bacitracine, cette souche nécessite un complément de phosphate (qui n'est pas nécessaire pour les autres souches). Fusion des protoplastes La préparation des protoplastes, la fusion et la régénération ont été effectuées selon le mode opératoire de Gabor et Hotchkiss (J. Bacteriol. 137 (3), 1346-1353 /1979/). Parmi les souches utilisées pour la fusion, l'une était résistante aux phages et insensible aux antibiotiques et l'autre était sensible aux phages et résistante aux antibiotiques. On a procédé à la fusion de la souche PP-188 dans un cas avec la souche MNG 101012 et dans l'autre cas avec la souche MNG 101013. Pour la préparation des protoplastes, on a lavé les cellules se trouvant en phase exponentielle avec une solution à la composition suivante CaCl2 0,1 mM MgC12 0,15 mM K2SO4 0,05 mM gélatine 1 g saccharose 68,5 g tampon au tris-HCl 0,05 M (pu 7,4) complément à 1 litre -(en abrégé ci-après : solution BP). On a ensuite repris les cellules dans une solution BP contenant 0,1 mg/ml de lysozyme et on a soumis à une incubation de 45 mn à 37"C. On a lavé les protoplastes formés à deux reprises à l'aide de la solution BP. On a mélangé entre eux des volumes égaux des protoplastes à fusionner.A 0,2 ml du mélange de protoplastes, on a mélangé avec précautions 1,8 ml"de solution de PEG (solution de PEG : 4 g de polyéthylène-glycol 4000 dans 6 ml de solution BP). On a abandonné le mélange au repos pendant 1 mn puis on a dilué par la solution BP, isolé sur milieu nutritif YTA complété par 68,5 g/litre de saccharose puis régénéré. On a sélectionné les recombinants, après l'isolement, en présence de phages virulents et d'antibiotique afin d'exclure les souches de départ. La sélection a été réalisée en détail de la manière suivante : les colonies développées après fusion et régénération des souches PP-188 et 101013 ont été prélevées par grattage et mise en suspension dans de 8 la solution nutritive YT contenant 10 phages virulents par ml. On a agité le mélange pendant 16 h à 37"C ; pendant cette agitation, la plupart des cellules sensibles aux phages sont mortes. On a recueilli les cellules surnageantes par centrifugation et on a traité par un antisérum de phages pour inactivation des phages virulents. On a ensuite isolé les cellules sur milieu nutritif YTA. On a transféré les colonies développées à l'aide d'une anse à prélèvement sur du milieu nutritif YTA et respectivement sur du milieu nutritif YTA contenant, par cm3, environ 106 cellules de Micrococcus flavus ATCC 10240.On a soumis les plaques à incubation de 16 h à 37"C. Sur les colonies qui présentent un anneau d'inhibition sur milieu nutritif contenant Micrococcus flavus, on a étudié la production de bacitracine et la résistance aux phages. On a ainsi obtenu des souches de recombinants fusionnées bonnes productrices et résistantes aux phages. La meilleure d'entre elles donnait, même en présence de phages virulents, environ 80% de la production de la souche PP-188. Cette souche a été appelée HS-124. La fusion des souches PP-188 et 101012 a été effectuée de manière analogue mais la solution YT contenait des phages virulents et 20 U/ml de bacitracine, ce qui a éliminé les deux souches de départ. On a formé de nombreuses souches bonnes productrices et résistantes aux phages. La meilleure d'entre elles avait une production identique à celle de la souche PP-188 même en présence de phages, et en l'absence de phages, sa production était supérieure de 50%. Cette souche a été appelée HS-13. La préparation des souches est illustrée schématiquement dans la figure unique des dessins annexés. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 Capacité de production des souches individuelles 1. Préparation de la matière d'ensemencement (mode opératoire général) On a ensemencé du milieu nutritif YTA par la souche concernée de Bacillus licheniformis et on a soumis à incubation, 120 h à 37"C. On a conservé la culture portant les spores à + 4"C. Sur la culture conservée sur gélose inclinée, on a prélevé la grosseur d'une tête d'épingle qu'on a transférée dans 100 ml de solution nutritive YT et on a secoué pendant 120 h. A l'expiration de cette période, la culture est porteuse de spores à 80%. On introduit 2 ml dans chaque cas de la suspension de spores dans un tube à essais portant un bouchon stérile et on conserve à + 40C jusqu'à l'utilisation.Avec 2 ml de la suspension de spores, on ensemence à chaque fois 100 ml de solution nutritive YT et on secoue pendant 16h à 30"C. Ces cultures constituent la matière d'ensemencement du stade opératoire suivant. 2. Culture productrice On ajoute 10% de la matière d'ensemencement à 50 ml de solution nutritive BTK dont la composition est la suivante (en % en poids/volume) farine de soja extraite 6,0 % en poids/volume farine de mais 2,4 " (NH4)2SO4 0,2 CaCO3 0,4 MgSO4,7H2O 0,02 MnSO4 ,4H2O 0,0015 Antihabzin A/3 1,0 dans de l'eau de ville. (L'Antihabzin A/3 est décrit dans le brevet-hongrois n 160 474). Dans un erlenmeyer de 500 ml, on introduit 50 ml de solution nutritive et on stérilise en 20 mn à 1200C -1 une table à secouer à la fréquence de 220 mn -1 pendant 48 h. Les différentes souches donnent les productions suivantes de bacitracine U/ml MNG 00110 320 PP-199 384 MNG 00343 480 MNG 576 HS-124 310 HS-13 480 Exemple 2 Efficacité d'une addition de phosphate On cultive la souche MNG 00344 comme décrit dans l'ex. 1 mais en complétant la solution nutritive par 0,02% en poids/volume de phosphate monopotassique. Le liquide de culture atteint un titre de 640 U/ml alors qu'on arrive à 576 U/ml en l'absence de phosphate (ex. 1). Exemple 3 Fermentation industrielle avec variation de température 1. Préparation de la matière d'ensemencement On utilise 100 ml d'une culture sur YT vieille 3 de 16 h pour ensemencer 4 m du milieu de culture K-3/72 dont la composition est la suivante farine de soja extraite 4,5% en poids/volume farine de mals 2,25 (NH4)2SO4 0,2 CaCO3 0,1 Antihabzin A/3 0,2% en volume dans l'eau de ville. La matière d'ensemencement est cultivée à 30"C sous une aération de 0,25 litre d'air par litre de liquide et par mn pendant 12 h. Avant l'ensemencement dans le fermenteur, le milieu de culture est stérilisé en 45 mn à 125"C et a ensuite un pH de 6,8 à 7,2. 2. Culture productrice 3 On ensemence 19 m de solution nutritive K-6 3 par 1 m d'inoculat. Composition de la solution nutritive en poids/volume farine de soja extraite 6,74 farine de mais 3,47 CaCO3 0,39 MgSO4, 7H20 0,021 MnSO4, 4H 20 0,0016 Antihabzin A/3 0,2 dans l'eau de ville. Le fermenteur est stérilisé en 60 mn à 125"C au bout desquelles le pHest de 6,8 à 7,2. La fermentation est effectuée à 300C pendant les huit premières h puis à 37"C de la trentième h jusqu'à la fin.Dans le premier stade opératoire, le taux d'aération est de 0,25 litre d'air par litre de liquide et de culture et par mn et au deuxième stade opératoire, il est de 0,5 litre d'air. La durée de fermentation est de 30 à 35 h ; à la fin de la fermentation, le pH est de 8,0 à 8,3. On détermine les activités suivantes en bacitracine : PP-188 530 U/ml HS-13 570 U/ml. Exemple 4 Remplacement de la farine de soja On opère comme décrit dans l'ex. 3 mais on remplace la farine de soja extraite par 10% en poids/ volume de farine de luzerne (ou 10,53% en poids/volume de farine de pois) et 2,1% en poids/volume de farine de mais. Les résultats obtenus à la synthèse de bacitracine sont les mêmes. Exemple 5 Optimisation du profil de température On opère comme décrit dans l'ex. 3 mais avec une température de fermentation de 39 C dans les neuf premières h qu'on abaisse ensuite de 1 C à l'heure jusqu'à la douzième h. A partir de la douzième h jusqu'à la fin, la température est de 36 C. Le taux d'aération est constant, ae 0,5 litre d'air par litre de liquide de culture et par mn. La durée de fermentation tombe à 25-28 h et le rendement en bacitracine est le même. Exemple 6 Milieu nutritif optimal 3 On ensemence 4 n de milieu nutritif d'inoculat AGI par 100 ml d'une culture sur YT vieille de 16 h. La composition du milieu AGI est la suivante farine de soja extraite 4,0 % en poids/volume farine de maïs 1,0 CaCO3 0,3 I' MgSO4,H2O 0,02 'I Antihabzin A/3 0,2% en volume On stérilise le milieu nutritif en 5 mn à 125 C. Après l'ensemencement, le pH est de 6,8 à 7,2. On cultive à 37 C sous agitation, avec une aération de 0,25 litre d'air par litre de milieu et par mn pendant 3 24 h, jusqu'à formation des spores. Avec 1 m de l'ino- culat, on ensemence 19 m de milieu nutritif AG à la composition suivante farine de soja extraite 6,74 % en poids/volume farine de mais 5,7S (NE)2S 4 0,05 CaCO3 0,53 MgSO4,7H2O 0,021 kinSOS,4H2O 0,0016 Antinabzin A/3 0,2% en volume Le fermenteur a été stérilisé en 60 mn à 125"C au bout desquelles le pH était de 6,8 à 7,2. L'aération et le régime de température sont les mêmes que dans l'ex. 5. La durée de fermentation est de 28 à 30 h et à la fin de la fermentation, le pH est de 7,4 à 7,8. Titre en bacitracine PP-188 630 U/ml HS-13 817 U/ml REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de la bacitracine par fermentation de souches de Bacillus modifiées, dans lequel la fermentation est effectuée dans des conditions aérobies avec contrôle de la température, en culture submergée dans un milieu nutritif contenant des sources de carbone, des sources organiques et minérales d'azote, des oligoéléments et du carbonate de calcium en tant que tampon, le procédé se caractérise en ce que l'on utilise en tant que souches productrices - un mutant défectueux, ou bien - une souche de Bacillus résistante à l'arsé- niate, ou bien - une souche de Bacillus bonne productrice de bacitracine, résistante aux phages virulents, préparée par fusion des protoplastes de aif fé-entes souches de Bacillus, on cultive à ne température de 37 à 45"C, on produit à une température de 35 à 37"C et on utilise un milieu nutritif dont l'indice d'amidon est de 60 à 85 par litre, qui contient la source de carbone et la source organique a'azote à un rapport de 0,30 à 0,95:1 et qui présente avant l'ensemencement une concentration en ions NH4 de 16 mM au maximum et une concentration en ions phosphate de 5 mM au maximum. 2. Procédé selon la rev. 1, caractérisé en ce que l'on utilise en tant que souche productrice les mutants défectueux en ornithine/arginine déposés sous n" MNG 00343 à la collection de microorganismes hongroise. 3. Procédé selon la rev. 1, caractérisé en ce que l'on utilise en tant que souche productrice la souche de Bacillus licheniformis résistante à l'arséniate déposée sous le n" MNG 00 3a4 à la collection de microorganismes hongroise et en ce que l'on complète le milieu nutritif par du phosphate. 4. Procédé selon la rev. 1, caractérisé en ce que l'on utilise en tant nue souche productrice une souche préparée par fusion interspécifique d'une souche bonne productrice mais sensible aux phages et d'une souche mauvaise productrice ou non productrice mais résistante aux phages, de préférence la souche obtenue par fusion des souches PP-188 et 101013 ou PP-188 et 101012. 5. Procédé selon l'une des rev. 1 à 4, caractérisé en ce que, au passage de la température de culture à la température de fermentation, on diminue la tempera- ture d'environ 1"C à l'heure.