FR 2574413 A1 19860613 FR 8418838 A 19841210 La présente invention a pour objet de nouveaux composés polypeptidiques répondant à la formule générale (Peptide I) : Cys - A2 - Ser3 - Leu - Ser - Thr - Cys - A8 - Leu - Gly - A11 - A12 A13 - Gln - A15 - A16 - A17 - Lys - A19 - A20 - Thr - A22 - Pro - A24 Thr - A26 - A27 - Gly - A29 - Gly - A31 - Pro NH2 où ; :A2 = Ser, Gly, Ala A8 = Val, Leu A11 = Lys, Thr A12 = Leu, Tyr A13 = Ser, Thr A15 = Glu, Asp A16 = Leu, Phe A17 = His, Asn A19 = Leu, Phe A20 = Gln, His A22 = Tyr, Phe A24 Arg, Gln A26 = Asp, Asn, Ala A27 = Val, Thr, tle A29 = Ala, Ser, Val A31 = Thr, Val, Ala Ces polypeptides abaissent la calcémie et la phosphatemie ils inhibent la destruction osseuse; accélèrent la formation d'os nouveau augmentent l'absorption intestinale du calcium et diminuent la calciurie. Ils fixent le calcium a l'intérieur des cellules. Ils possèdent un effet anti-inflammatoire et antalgique majeur Leurs indications principales sont représentées par la maladie de Paget, les osteoporoses de diverses étiologies (commune, poro-malacique, cortisonique, post-traumatique, d'immobilisation et idiopathique), l'ostéodystrophie rénale, les fractures, les hypercaqlcémies, les douleurs ostéoarticulaires, en particulier celles consécutives aux metastases osseuses, la spasmophilie et la tétanie normocalcémique, La synthèse de ces peptides a été effectuée par la technique en phase solide avec la résine benzylhydrylaminée (P.G. et G.R. Marshall, Chem. Commun,. 1970, 650), dont la préparation et l'utilisation ont été décrites (P. Rivaille, A. Robinson, M. Kamen et G. MUhoed, Hetv., 197t, S4, 2772). Le groupe N-a-butyl- oxycarbonyle (t-Boc) protège la fonction a-aminée des aminoacides. Les fonctions latérales des aminoacides sont bloquees sous forme : 1) d'ester benzylique pour la channe carboxylique de l'acide aspartique. 2) d'éther benzylique pour l'hydroxyle des sérine, thréonine et tyrosine. 3) d'ether méthoxybenzylique pour le groupe sulfhydryle de la cystéine. 4) de dinitro-2,4-phényle pour l'imidazole de l'histidine. 5) de groupe benzoxycarbonyle pour la fonction #-aminée de la lysine. Les différents acides aminés sont incorporés dans la channe peptidique à l'aide de dicyclohexylcarbodiimide (DCCT) en faisant réagir successivement des aminoacides protégés en excès par rapport a la proline fixée en premier sur la resine.On laisse la réaction se poursuivre pendant deux heures, Les t-Boc sont éliminés par l'acide trifluoroacétique en solution dans le chlorure de méthylène ; après lavage au chlorure de méthylène, la neutralisation est effectuée par de la triéthylamine dans ce meme solvant L'asparagine et la glutamine sont introduites sous forme de leurs esters paranitrophénylques, en solution dans le diméthylformamide (DMF) additionné de 1 X d'acide acétique. St l'essai de contrôle du couplage a la ninhydrine est négatif, on remplace l'acide acétique par de l'acide pivalique (1 %) ; st la coloration bleue persiste- encore dans cet essart, on sature le DMF/l % AcOH avec de l'urée.Si le couplage n'est pas total au bout de 48 h. de réaction, comme c'est le cas pour la glutamine en position 24, on acétyle la thréonine qui n'a pas reagt, par l'acétylimidazole dans le chlorure de méthylène. A la fin, on élimine le groupe protecteur de l'imidazole de l'histine, alors que le peptide est encore lie a la résine, a pH 8, avec du mercapto-ethanol en solution dans le DMF. Le peptide est séparé de la résine par traitement a l'acide fluorhydrique liquide en presence d'ani-sole et de méthionine, Tous les groupes protecteurs sont éliminés au cours de cette opération, Les peptides sont purifiés par filtration sur gel Les fractions, correspondant aux pics prtncfpaux, sont rassemblées, lyo- phyltsees, reprises dans un tampon a pH 8 et oxydées durant 24 h. par un courant d'air pour former le pont disulfure entre les deux résidus çysteiniques. Le pic possédant l'activité biologique recherchée est purifie a nouveau sur résine échangeuse d'ions CMC 52 à l'aide d'un gradient acide d'élution. Le peptide obtenu est homogene à l'electrophorèse sur papier et a la chromatographie sur cellulose. L'exemple suivant (Peptide II) illustre la présente invention, sans pour autant en limiter la portée telle que définie dans les revendications énoncées ci-dessous Cys - Ala - Ser - Leu - Ser5 - Thr - Cys - Vla - Leu - Gly10 - Lys Leu - Ser - Gln - Glu15 - Leu - His - Lys - Leu - Gln20 - Thr - Tyr Pro - Arg - Thr25 - Asp - Val - Gly - Ala - Gly30 - Thr - Proamide. Exemple : Les t-Boc-aminoacides portant des fonctions latérales proviennent de BACHEM (Dubendorf, Suisse) ou sont préparés au laboratoire par la technique de Schnabel (E. Schnabel, Liebigs Ann. Chem., 702, l88 1967) dans un autotitrateur. Leur pureté est déterminée par polarimétrie, F. et chromatographie sur couche mince de silice. L'hydrolyse du peptide purifié est réalisée entube scellé sous vide en mtlieu HCl 6 N (110 , 24 h.). r. SYNTHESE DE LA SEQUENCE DE LA FORMULE II at Préparation de la résine (P. Rivaille, A. Robinson, M. Kamen et G. Milhaud, Helv., 1971, 54, 2772) Benzyl-cétorésine. Dans un ballon tricol de 2 1, muni d'un agi tateur, on laisse gonfler pendant 2h., 50 g de polystyrène à 1 % de divinylbenzène Bio-rad SX1 (200-400 mesh) dans 350 ml de -nitrobenzene. Dans un autre ballon, on dissout 66 g de AlCl3 dans 300 ml de nitrobenzène auxquels on ajoute 80 ml de chlorure de benzoyle. Le mélange est versé dans le premter ballon sous bonne agitation, maintenue pendant 2 h. à température ambiante. St la resine gonfle trop, on ajoute du nitrobenzène (100 ml environ. On filtre, lave avec du dioxanne (3 x), de l'acide acétique (3 x), du méthanol (3 x) et enfin, alternativement, avec CH2Cl2 et CH3OH pour faire gonfler et contracter la résine en laissant chaque fois un temps de contact suffisant. On seche dans un dessicateur sous vide toute la nuit (rendement 75 g). . Benzylhydrylamine résine. Sans un ballon de 1 1 muni de "Dean Stark" et d'un agitateur, on chauffe 500 g de formiate d'ammonium a 120-130 C, pendant 1 a 2 h. On ajoute la résine (50n g) en une seule fois et laisse la température monter a 160-165 , en une demi-heure, sous agitation efficace qui est maintenue pendant 6 heures. On filtre, lave a l'eau, puis on traite comme ci- dessus pour la benzylcétorésine. La résine séchée sws vide est chauffée à reflux acitée nendant 8 h. dans HCl 6N. Elle est ensuite filtrée et lavée comme précédemment la capacité de fixation varte, selon la nature de l'acide aminé, entre 0,3 et 0,5 mMole/g. bt Préparation du peptide II L'appareil utilisé permet d'agiter mécaniquement un tube en pyrex de 25 ml dont le compartiment central contient la résine t2 g) Aux extrémités du tube, 2 filtres de verre fritté sont des ttnés a l'introduction puis a l'élimination des réactifs (environ 15 ml). Le couplage des acides aminés suivants : . Libération du groupe aminé. On traite la résine par le mélange CF3 COOH-CH2Cl2 (1:1, v/v), pendant 1 mn., on filtre et on répète l'opération en laissant 15 mn. au contact, . On laye la résine avec CH2Cl2 (3 x, 1 mn.). . On élimine CF3COOH en trattant deux fois la résine par le mélange Et3N/CH2Cl2(12,5:87,5 v/v) (temps de contact : 1 mn., puis 5 mn.). . On lave avec CH2Cl2 (8 x). . Pour chaque mMole de proline fixée initialement sur la résine, on fait réagir 4 mMoles d'acides aminés protégés, dissous dans a l'exception de la nitroarginine qut est mise en solution dans (CH3)2NCHO. Dans le cas présent, la résine avait fixé 0,5 mMole de proline/g. On laisse 5 mn. sous agitation en milieu CH2Cl2 ou CH2Cl2/(CH3)2 NCHO dans le cas de l'arginine et des acides aminés suivants. . On ajoute 2 mMoles de DCCP dissous dans CH2Cl2, puis on -reprend l'agitation pendant une heure ; on ajoute alors 2 autres mMoles de BCCI et on continue a agiter pendant une heure . Lavage successif avec CH2Cl2, puis CH3OH absolu (3 x). . Reaction a la ninhydrine sur un échantillon de la résine. Pour négativer la.réaction a la ninhydrine, il faut coupler . 2 fois la Thr en position 25 (2 x 24 h.) . 2 fois la Pro en position 23 (2 x 2 h.) . Lavage avec CH2Cl2 (3 x) avant le clivage decrit ci@dessus CCP3 COOH) Le couplage de l'arginine et des acides amines suivants est effectué en milieu (CH3)2NCHO CH2C12 (1:1, v/v). 2. ELIMINATION DU GROUPE DINITROPHENYLE DE L'HISTrDINE A 15 ml de diméthylformamide (DMF), on ajoute 2 ml de mercaptoéthanol et on ajuste le pH a 8 avec de la triéthylamine. On introduit ce reactif dans l'appareil et on agite 14 h. On filtre et on lave la résine alternativement avec du chlorure de méthylène (3 x), du méthanol (3 x). Apres séchage sous vide, le poids de la résine est de 2,85 g. 3. LIBERATION DU PEPTIDE DE LA REINE ET ELIMINATION DES GROUPES PROTECTEURS On distille 15 ml d'acide fluorhydrique dans un mélange de 1,5 g de résine-peptide , 1,5 ml d'anisole. On agite 1 h. a 0 C et 30 mn. a température ambiante. On chasse l'acide sous vide et on reprend le résidu dans 3 fois 5 ml d'acide acé tique et on précipite par de l'éther éthylique exempt de peroxyde. On centrifuge a froid, on lave plusieurs fois le précipite a l'éther, on sèche sous vide Le précipité est repris par de l'eau et le résidu insoluble,elimine par centrifugation. La soluti-on lyophylisée fournit 800 mg de produit. 4. PURIFICATION DU PEPTIDE Deux cents mut grammes de peptide brut sont placés au sommet d'une colonne (diamètre 2,5 cm, longueur 90 cm) de Biogel P6, 50-100 mesh. On élue à l'aide d'acide acétique 0,1 M et on recueille des fractions de 12 ml en suivant l'élution à l'aide d'un enregistreur 280 nm. Le peptide purifié est recueilli dans les fractions 23-28. 5. CYCLISATION Les fractions contenant le peptide purifié sont lyophylisées et le résidu est repris dans 500 ml de tampon hydrogénocarbonate d'ammonium 1M, pH 8, et soumis a un barbotage d'air a travers une plaque poreuse pendant 24 h. La solution est lyophylisée et le résidu purifié sur colonne CMC 52 Whatman par gradient d'acétate d'ammonium de mho 0,6 a mho 0,7, pH 4, avec un appareil LKB Ultrograd 11300. Après hydrolyse actee, la composition-en acides aminés est la suivante, rapportée a la proline = 2 (entre parenthèses les chiffres théoriques).: ARa (2) 2,20 ; Arg (t) O,SO ; Ap (1) 1,a4 ; Cys (2) 1,90 ; Glu (3) 3,l4 ; Gly (3) 3,3 ; His (1) 0,85 ; Lue (5) 5,0 ; Lus (2) 1,95 ; Pro (2) 2,0 ; Ser (3) 3,05 ; Thr (4) 4,26 ; Tyr (1) 0,90 ; Val (2) 2,2. 6. ACTIVITE BIOLOGIQUE Elle est déterminée chez le Rat mâle pesant de 100 à 120 g et soumis à un jeDne de 16 heures. L'activité est exprimée en unité MRC a partir de la baisse de la calcémie, mesurée une heure après l'injection intraveineuse du peptide iI convenablement dilué en tampon acétate de sodium 0.1 n DH 6 et 0,1 % d'albumine. Dar comDaraison avec l'activité du "Research Standard B" convenablement dilué. L'activité biologique du peptide II est supérieure à 1000 unités MRC par mg. REVENDICATIONS 1. Nouveaux polypeptides répondant a la formule générale I, carac térisés par la présence de sérine en position 3. Cys - A2 - Ser3 - Leu - Ser - Thr - Cys - A8 - Leu - Glu - A11 - A12 - A13 - Gln - A15 - A16 - A17 - Lys - A19 - A20 - Thr - A22 - Pro - A24 Thr - A26 - A27 - Gly - A29 - Gly - A31 - Pro NH2 où : A2 = Ser, Gly, Ala A8 = Val, Leu A11 = Lys, Thr A12 = Leu, Tyr A13 = Ser, Thr A15 - Glu, Asp A16 = Leu, Phe A17 = His, Asn A19 = Leu, Phe A20 = Gin, His A22 = Tyr, Phe A24 = Arg, Gln A26 = Asp, Asn, Ala A27 9 Val, Thr, Ile A29 = Ala, Ser, Val A31 = Thr, Val, Ala 2. En particulier les polypeptides de Formule I qui contiennent une valine en position 8. 3. A titre d'exemple, le polypeptide Formule II Cys - Ala - Ser - Leu - Ser5 - Thr - Cys - Val - Leu - Gly10 Lys - Leu - Ser - Gln - Glu15 - Leu - His - Lys - Leu - Gln20 Thr - Tyr - Pro - Arg - Thr25 - Asp - Val - Gly - Ala - Gly30 Thr - Proamide. 4. Procédé de préparation des nouveaux polypeptides spécifiés dans les revendications 1, 2, 3, caractérisé par le fait de soumettre des acides aminés, des peptides ou leurs combinaisons a des réactions de condensation dans l'ordre de la sequence des acides aminés de la formule t 5. A titre de médicament, les polypeptides mentionnés dans les reven dtcatzons 1, 2, 3. 6 Les préparations pharmaceutiques contenant comme principe acttf un ou plusteurs polypeptides mentionnés dans la revendiation 1, 2, 3, aionsi que les véhicules adéquats destinés a l'administration parenterale, orale sous forme de liposome et nasale sous forme de pulvérisation