FR 2574089 A1 19860606 FR 8418393 A 19841203 PROCÉDÉ DE PRODUCTION D'ACIDES GRAS, EN PARTICULIER D'ACIDE T-LINOLÉNIQUE À PARTIR DE TETRAHYMENA, PRODUITS OBTENUS ET PRiPARATION MÉDICAMENTEUSE OU ALIMENTAIRE CONTENANT DE L'ACIDE T-LINOLÉNIQUE OU SES DÉRIVÉS EN TANT QU'AGENT ANTI-AGREGATION PLAQUETTAIRE. La présente invention repose sur une étude approfondie de la biochimie et du métabolisme des postaglandines chez les vertébres supérieurs-dont l'Homme-qui a conduit à admettre la possibilité du caractère non physiologiques des prostaglandines. Celles-ci semblent n'avoir aucun rôle spécifique; elles agiraient principalement par un mimétisme inutile des hormones protidiques et certaines d'entre elles sont même dangereuses pour l'organisme, notamment la plupart de celles issues de l'acide arachidonique, dont surtout les endoperoxydes PGG2 et PGH2 et la thromboxane TxA2, un de leurs métabolites, responsable d'une agrégation plaquettaire irréversible. Or, les prostaglandines ont des précurseurs essentiellement alimentaires et donc fortuits. On peut, en principe, régler leur présence qualitative et quantitative dans l'organisme par la seule alimentation. L'absence d'acide arachidonique dans l'alimentation pourrait ainsi, théoriquement, empêcher la présence des prostaglandines dangereuses, et de leurs produits d'accompagnement. Cependant, l'on observe que l'acide linoléique ou cis-9,12-octadécadiènoSque est lui-même transforme par l'organisme en acide arachidonique. Or, quel que soit le régime alimentaire envisagé, il est pratiquement impossible d'en éliminer toute trace d'acide linoléique, qui est d'ailleurs un acide gras "essentiel". Le but poursuivi par la présente invention est donc de chercher un moyen de neutraliser les dangereux effets de l'acide arachidonique, dont un excès peut être responsable d'agrégations plaquettaires irréversibles et donc de tromboses vasculaires et d'infarctus. Les expériences de WILLIS et coll. - Prostaglandins, VIII, 509, 1974, avaient montré, chez le rat Wistar et chez le lapin New Zealand (mais non chez l'Homme), qu'un régime exempt d'acide arachidonique et riche en acide dihomo-z-linolénique ou cis-8,11,14-eicosatriè osque empêche l'agrégation plaquettaire. Malheureusement, ce dernier acide gras est extrêmement rare dans la nature et sa synthèse elle-même est difficile et très coûteuse (Samuelsson, dans Lipid Metabolism, ev. Wakil, S.J., Acad. Press, New York, London, p.131,1970). Il est apparu que le but visé par l'invention peut être atteint par un procédé caractérisé en ce qu'il comporte au moins les étapes de culture en masse de protozoaires ciliés Tetrahymena dans un milieu adéquat et l'extraction des acides gras totaux desdits Tetrahymena. Ces acides gras ne contiennent aucun individu toxique et peuvent être facilement identifiés et dosés. Les acides gras de Tetrahymena sont caractérisés par leur richesse en acide 7-linolénique ou cis-6,9,12octadécatriénoïque qui constitue, selon les souches et les conditions de culture 20 à 45% en poids des acides gras totaux et par la présence, entre autres, des acides oléique et ciliénique qui constituent, respectivement et selon les souches et les conditions de culture, 1 à 15% et 1 à 10% en poids des acides gras totaux. L'hydrolyse acide des cellules de Tetrahymena, suivie d'une saponification, d'un élimination des l'insaponifiable et d'un acidification, permet d'obtenir une huile légèrement jaunâtre qualifiée de "huile de Tetrahymena" dont les propriétés d'anti-agrégation plaquettaire ont été testées et quantifiées sur une série de plasmas humains de sujets jeunes (de 25 à 35 ans) du sexe masculin. Les résultats ont montré que cette "huile de Tetrahymena" est effectivement un agent d'anti-agrégation plaquettaire très actif. De même, l'acide T -linolénique, seul, presente un effet d'anti-agrégation plaquettaire relativement moins puissant que celui du "l'huile de Tetrahymena" dont il constitue l'élément principal sur le plan quantatif. Le mécanisme de cet effet anti-agrégant de l'acide 7-linolénique, n'a pas encore été élucidé. A titre d'hypothèse, l'acide7 -linolénique agit en se transformant instantanément en acide dihomo-C-linolénique, dont l'effet antiagrégant est connu. Ou bien il intervient lui-même directement dans les synthèses de protaglondines. D'autre part, un certain effet de synergie est probablement obtenu par l'utilisation de l'acide &gamma;-linolénique avec d'autres acides gras contenus dans l'huile de Tetrahymena, vraisemblablement, l'acide oléique et/ou ciliénique. Ceci expliquerait l'effet anti-agrégant plus puissant de l'huile de Tetrahymena. I1 reste à souligner que l'huile de Tetrahymena est inoffensive: cette huile peut constituer un aliment ou un additif alimentaire dont l'action anti-agrégante s'oppose ainsi à celle, toujours dangereuse à la longue, des anti-agrégants "médicamenteux", comme l'aspirine et les corticoïdes. Parmi les souches de Tetrahymena, dont on disposait celle de T.rostrata a été préférée du fait qu'elle présente, dans le milieu lait écrémé-levure ou extrait de levure utilisé, la croissance la plus rapide. Selon l'invention, la production de Tetrahymena s'effectue en fermenteur. Le milieu de culture préféré est constitué de lait écrémé et de levure ou d'extrait de-levure Les conditions opératoires préférées pour une transposition à l'échelle industrielle sont - pH = 5.5 à 7.0 - Température : fixée ou variable entre 25 et 300C, avec chute éventuelle à des températurés plus basses au début de la phase stationnaire de croissance. - Concentration initiale en poudre de lait écrémé : 1 à 3% (poids/volume) - Concentration initiale en levure : 1 å 2,58 (poids/volume) - Concentration initiale en extrait de levure : 0,5 à 18 - Debit d'air stérile : i-volume/minute/volume de milieu - Vitesses périphériques des turbines variables selon la concentration en 02 dissous. Cette vitesse est augmentée si la concentration en 02 dissous devient inférieure à 40% de sa valeur à la saturation ( fixée en absence de Tetrahymena). L'invention concerne donc également les produits résultant du procédé précité et des préparations médicamenteuses ou alimentaires, notamment à usage diététique, contenant au moins de l'acide z -linolénique sous forme d'acide libre ou sous forme d'un dérivé notamment sous forme d'un ester, de préférence sous forme d'un ester méthylique. Lesdites préparations médicamenteuses ou alimentaires peuvent contenir soit directement le produit d'extraction qualifié d'huile de Tetrahymena, soit un ou plusieurs des constituants de cette huile, à savoir au moins l'acide 7 -linolénique ou un dérivé de celui-ci et éventuellement d'autres constituants exerctant un effet antiagrégation plaquettaire ou d'autres effets. On entend par dérivé de l'acide 7-linolénique également l'acide dihomo-z-linolénique et ses esters. L'intégralité des différents acides gras peuvent être utilisés sous forme de dérivés, tels que des esters d'acides gras, en particulier les esters méthyliques. La préparation des dérivés d'acides gras s'effectue par les procédés classiques de synthèse organique et, dans le cas particulier de la formation d'un ester par les techniques classiques d'esterification. Les préparations médicamenteuses ou - alimentaires peuvent bien entendu contenir d'autres constituants, notamment des adjuvants utiles pour l'activité souhaitée tels que la vitamine E (acétate d'a-tocophérol). Lorsque les préparations médicamenteuses selon l'invention sont présentées sous forme de compositions pharmaceutiques elles peuvent aussi contenir d'autres substances actives utilisables dans les compositions pharmaceutiques pour la prévention ou le traitement des affections résultant des phénomènes d'agrégation plaquettaire. Habituellement, elles contiennent également des additifs de formulation permettant de les administrer commodément. Ces additifs peuvent être des supports ou des agents auxiliaires pharmaceutiques, solides ou liquides, organiques ou inorganiques, appropriés tels que l'eau, les solvants organiques de type paraffinique, la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, des graisses et huiles végétales et animales adéquates, la gomme, les polyalkylèneglycols ou des liants et autres agents habituels. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention contiennent en général au moins 30% en poids d'aci de7-linolénique ou l'équivalent de ses dérivés et éventuellement des substances adjuvantes. Parmi les modes d'administration pouvant convenir, l'administration par voie orale, est préférée. Du fait que les acides gras utilisés, constituent des aliments, il n'existe pas, en dehors de considérations diétetiques, de doses maximales. Dans les proportions habituelles d'un régime alimentaire, on n'observe pas de toxicité. Dans une thérapie faisant appel à un traitement continu, les gélules ou capsules peuvents être la forme appropriée de préparation pharmaceutique en raison des effets de longue durée ou d'effet retard obtenus lorsque le médicament est administré par voie orale. Les dites compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être administrées en médecine humaine par voie orale en unités de dosage contenant plus de 20% en poids d'acide 7-linolénique ou l'équivalent de ses dérivés, avec un support non toxique acceptable en pharmacie. -Par "unité de dosage", on entend une dose unitaire qui peut être administrée à un patient et peut facilement être manipulée et conditionnée, en restant sous forme d'une dose unitaire physiquement stable, comprenant l'ingrédient actif soit seule, soit en mélange avec des diluants ou supports pharmaceutiques solides ou liquides. Sous la forme d'unités de dosage, les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être administrées une à plusieurs fois par jour, à intervalles appropriés, mais toujours selon l'état du patient et en fonction des prescriptions du médecin. La dose journalière appropriée des compositions selon l'invention varie en général de 20 mg a 150 mg par kg de poids corporel. À titre d'illustration sans caractère limitatif, l'invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent. Exemple 1 : Production d'acides gras au départ de Tetrahymena. - Souche : La souche de Tetrahymena rostrata a été fournie par Mme Fryd-Versavel (Université de Paris XI, Orsay, France). - Milieu de culture : Composé (poids/volume) de 0,5% d'extrait de levure (Difco) et de 1% de lait écrémé en poudre (Régilait) dans de l'eau. L'addition d'un supplément de lait (fed batch) est effectuée s'il y a lieu, à partir d'une boîte stérile de lait écrémé en poudre. A. Description et principes de fonctionnement des fermenteurs On dispose de fermenteurs (Biolafitte de 20 et de 100 litres en acier inoxydable dont les caractéristiques dimensionnelles sont les suivants - fermenteur de 20 litres : fond plat ; cuve 22 cm de diamètre et de 55 cm de hauteur ; quatre chicanes (contrepales) perpendiculaires de 49 cm-de hauteur et de 3,2 cm de largeur t deux turbines à disque à 4 pales radiales : élévation du centre du disque de la première turbine par rapport au fond de la cuve 4,5 cm, hauteur séparant les deux turbines 11 cm, largeur des pales 2 cm, longueur des pales 2 cm, diamètre des disques 5,9 cm, diamètre des turbines 8 cm - fermenteur de 100 litres : fond plat ; cuve de 43 cm de diamètre et de 78 cm de hauteur ; deux chicanes perpendiculaires de 58,5 cm de longueur et de 5,8 cm de largeur t deux turbines à disque à 4 pales radiales élévation du centre du disque de la première turbine par rapport au fond de la cuve 4,2 cm, hauteur séparant les deux turbines 17 cm, largeur des pales 2,5 cm, longueur des pales 3,5 cm, diamètre des disques 8,9 cm, diamètre des turbines 12,9 cm La partie active des filtres d'air est une cartouche en acier inoxydable fritté d'une épaisseur de 2 mm. L'air stérile est introduit à la base des fermenteurs par l'intermédiaire d'un sparger rotatif solidaire de l'arbre d'agitation (figure 32).Les fermenteurs sont munis de systèmes automatiques de régulation, d'enregistrement et d1affichage digital du pH, de la température et de la vitesse d'agitation (en fonctionne la concentration en 02 dissous). Un ordinateur (Hewlett-Packard 9826 ; imprimante : Hewlett-Packard 2671G , Interface Hewlett-Packard 6942A Multiprogramme) permet aussi la régulation, l'enregistrement et l'affichage de ces différents paramètres. - La mesure du pH se fait par un pH-mètre (Tacussel) relié à une sonde stérilisable (Ingold) pressurisée à l'air comprimé. Des tampons, à pH 4 et 7, servent à l'étonnage. Pour le réglage du pH, à la valeur désirée, des solutions de H2S042N reliée aux fermenteurs par l'intermédiaire de pompes péristaltiques à vitesse variable. - l'02 dissous est mesuré par l'intermédiaire d'une sonde galvanique stérilisable (Biolafitte, modèle G2L). L'O2 dissous est exprimé en pour cent : le 100% correspond à un milieu saturé en 02 en l'absence du Tetrahymena. - La mesure de la température se fait par une sonde en platine (Biolafitte). La régulation de la température est assurée par une circulation d'eau thermostatée dans un échangeur formé par un tube aplati en acier inoxydable immergé dans le milieu de culture. Un récipient de liquide anti-mousse (Antifoam Emulsion, Sigma- n" A.5758) est relié au fermenteur de 100 litres par l'intermédiaire d'une pompe péristaltique qui se met en fonctionnement dès que la mousse entre en contact avec un électrode réglable en hauteur. Pour le fermenteur de 20 litres, le liquide anti-mousse est ajouté mécaniquement. D'autre part, un appareil (Funda), fixé sur la platine supérieure du fermenteur de 20 litres, assure le pompage et la cassure des mousses grâce à ses disques tournants. B. Stérilisation : La stérilisation des fermenteurs contenant les milieux de culture est effectuée à 110-1150C pendant 30 minutes sous agitation. La stérilisation se fait à la vapeur, d'une façon indirecte jusqu'à 1000C, puis au-delà, avec une légère admission de vapeur par le diffuseur d'air pour compenser l'évaporation et stériliser le dispositif d'étanchéité de l'arbre d'agitation et le circuit d'arrivée a d'air stérile. Tou- tes les canalisations de raccordement sont stérilisées en laissant fuser la vapeur par les purgeurs. La vapeur est introduite directement a contre-courant dans les filtres à air; Pour les cultures en Erlenmeyer, les milieux sont stérilisés par autoclavage à 110-1150C pendant 30 minutes. La solution aqueuse d'H2S042n (voir plus -loin) contenue dans un Erlenmeyer est sterilisé par autoclava ge à 120-1250C pendant 20 minutes. C. Cultures en Erlenmeyer : ces cultures sont effectuées à 28 i 10C dans le milieu base ; le volume occupé par le milieu étant inférieur à 15% du volume total de l'étalonnage. E. Extraction des acides gras et analyse par GLC: Un culot sec de Tetrahymena est soumis à une hydrolyse acide puis à une saponification en milieu hydroalcooli- que. On extrait les insaponifiables, on acidifie et on extrait les acides gras libres. Un échantillon de ceux-ci est méthyle avec une solution de BF3 à 20% (poids/volume) dans le méthanol. Les esters méthyliques sont analysés par chromatographie en phase gazeuse avec, comme standard interne le nonadécanoate de méthyle et des mélanges étalons et avec une colonne de polyéthylène glycol succinate. C. - cultures en fermenteurs : des cultures en Erlenmeyer en phase logarithmique de croissance dans le milieu de base sont utilisées pour l'inoculation. Leur volume est de 5% à 10% du volume total du milieu dans le fermenteur et la population initiale est de 5-10 x 103 cellules/ml. Pour toutes les cultures en fermenteur, on a gardé un débit d'air stérile constant et égal à 1 volume/minute/volume de milieu de culture et une température de 28 i 0,20C. On a effectué les cultures dans les conditions d'agitation suivantes : la vitesse périphérique des turbines possède, pour chaque fermenteur, une valeur minimum qui s'élève à 0.94 mètre/seconde pour le fermenteur de 20 litres et à 1.69 mètres/secone pour le fermenteur de 100 litres. Lors des cultures, la vitesse est réglée de telle sorte qu'elle garde se valeur minimum jusqu'à ce que la concentration en 02 dissous devient inférieure à 40%. Dans ce cas, elle augmente proportionnellement à l'écart. D. Temps de génération et poids sec - La densité cellulaire est suivie par numération électronique à l'aide d'un coulter counter modèle Z2 (orifice de l'électrode 200 m) après fixation à l'aldéhyde glutarique et le temps de génération est déterminé par regression linéaire. - Le poids sec en Tetrahymena est mesuré après centrifugation à 800 g et à 20C pendant 10 minutes d'un volume déterminé du milieu de culture suivie d'une lyophilisation du culot humide. Ces mesures du poids sec sont effectuées au début de la phase stationnaire de croissance. Exemple de culture effectuée et résultats obtenus. Fermenteur de 20 litres - volume utilisé : 15 litres - pH initial = 5.5 on le laisse évoluer librement lors de la culture sans qu'il dépasse la valeur 7.0 $ 0.1. - deux ajouts de poudre de lait écrémé de 1% (p/v) chacun. Le pH de départ est fixé à environ 5,5 par du H2SO4, il diminue d'abord légèrement probablement par suite de l'augmentation de la concentration en CO2 au début de la croissance puis augmente rapidement pour atteindre la valeur 7 où il sera fixé par le pompage automatique d'H2S042N. Le temps moyenne de génération en minutes pour onze essais (n=lltQ=7) est 118. L'ordre de grandeur de la densité cellulaire en phase stationnaire (cellules par/ml) est de 6,9 (n=ll;o=0,24). Le rendement par rapport au lactose en considerant que le poudre de lait contient 50% de lactose est de 40,1%. L'analyse des acides gras figure au Tableau 1. Exemple 2 : Action des acides gras de Tetrahymena sur l'agrégation plaquettaire in vitro. Le principe de la méthode de mesure L'exploration de l'agrégation plaquettaire a été effec tuée par une méthode photométrique. Elle consiste a ajouter, à du plasma enrichi en plaquettes,un inducteur d'agrégation dont les plus communs sont 1'ADP, l'adréna- line (ou épinéphrine) et le collagène. Lorsqu'un agent agrégant est ajouté au plasme, la transmission optique augmente avec la formation des agrégats plaquettaires et diminue lorsque survient la désagrégation. Cette méthode photométrique permet une observation qualitative et quantitative du phénomène d'agrégation et permet de dé- celer certaines anomalies plasmatiques ou plaquettaires qui se traduisent par une absence d'agrégation (thrombopathies) ou par une hyperagrégation (thrombophilies). Les deux vagues d'agrégation (la réversible) et l'irréversible) peuvent être suivies avec un appareil photométrique, l'agrégomètre Selon l'agent agrégant ajouté au plasma riche en plaquettes, l'une des deux phases peut manquer. Avec une-préparation de collagène, par exemple, la première phase ou phase réversible est absente et la réponse est caractérisée par un temps de latence suivi directement de la phase d'agrégation irréversible. Avec 1'ADP, les deux phases sont généralement présentes et la réponse à l'agrfgometre est donc biphasique. Mais, selon la concentration en ADP ou selon le donneur de sang, la première phase d'agrégation peut ne pas être suivie de la deuxième.Enfin, les deux phases peuvent ne pas être séparées dans le temps et ne sont alors pas distinguées à l'agrégomètre. L'incubation d'un plasma enrichi en plaquettes, avec un inhibiteur de l'une et/ou de l'autre des deux phases d'agrégation, modifie la réponse plaquettaire à l'agent agrégant : le fait est décelé à l'agrégomètre. Un anti-agrégant inhibitant la deuxième phase d'agrégation, par exemple, atténue ou diminue, lors d'un test in vitro, la réponse au collagène et la deuxième courbe de la réponse à 1'ADP. Matériel et méthodes Agrégomètre : l'agrégation plaquettaire est suivie, à 25 i 2-C, avec un appareil Born Aggregometer MK.III (du Pharmacological Research, Department of Pharmacology, Royal College of Surgeons, London - England) auquel est raccordé un enregistreur Perkin-Elmer Recorder 56. Un rayon lumineux monochromatique de 640 nm traverse une cuvette en verre siliconé (10 x 75 mm) contenant 1 ml de plasme sanguin enrichi en plaquettes (PRP). Un petit barreau magnétique, recouvert de polyéthylène et effectuant 1150 tours/minute, assure l'agitation du plasma dans la cuvette. Le PRP représente le 0% de transmission optique et un plasma pauvre en plaquettes (PPP) représente le 1008 de transmission.L'addition d'un agent agrégant (ADP ou collagène) au PRP est suivie d'une variation de la transmission optique. Cette variation est enregistrée pendant 6 minutes, conformément au mode opératoire classique. Donneurs de sang : Sept donneurs de sang du sexe masculin, âgés de moins de 35 ans, à jeûn depuis au moins 9 heures et sans aucun traitement médical. PRP et PPP : tous les ustensiles utilisés sont en verre siliconé ouen plastique. Le sang est prélevé sur citrate : 1 volume de citrate à 3,8% (poids/volume) dans de l'eau distillée pour 9 volumes de sang. Le PRP est obtenu par centrifugation du sang à 300 g pendant 9 minutes. Les plaquettes du surnageant sont comptées à l'aide d'un coulter counter (modèle ZF, orifice de l'électrode 70 microns) et si le nombre est supérieur à 300.000 plaquettes/mm3, il est ajusté à cette valeur par dilution avec du PPP. Le PPP est obtenu par centrifugation du sang à 2000 g pendant 10 minutes. Les PRP et PPP -sont conservés à la température du laboratoire durant l'analyse. Agents agrégants : De 1'ADP (Boehringer) est dilué avec un tampon Michaëlis (Stago, pH = 7,3) jusqu'a une concentration de 5 Pg/ml. Du collagène (Stago) est dilué avec le tampon Michaëlis jusqu'à une concentration de 400 g/ml. On incube au bain-marie à 37 C pendant 10 minutes pour polymériser le collagène. Les solutions d'ADP et de collagène sont conservées dans la glace fondante pendant l'analyse. Produits testés : les produits sont dissous dans le benzène (Merck, pour analyse) et conservés sous azote jusqu'a utilisation; - &gamma;-linolénate de méthyle ou 18:3 #6,9,12 (Sigma, n = 5377) - mélanges de T-linolénate de methyle et d'acétate de méthyle et d'acétate d'a-tocophérol (Rocae-vitami- ne E). - mélange d'acides gras de Tetrahymena rostrata dont la composition est donnée à l'exemple 1, tableau 1 (pH - Les tests d'agrégation plaquettaire sont effectués dans les quatre heures qui suivent le prélèvement du sang. Pour un test à blanc, om procède comme suit - 1 ml de PPP = 100% de transmission optique - 1 ml de PRP = 0% de transmission optique - addition au PRP de 50 e1 de la solution d'ADP (0,25 kg d'ADP/ml de PRP) ou de 100 iil de la solution de collagène (# 40 g de collagène/ml de PRP) et on enregistre la réponse pendant 6 minutes. Pour chaque agent agrégant, ce test est répéte à intervalles réguliers (2 à 4 fois) durant l'analyse. Les tests de l'action d'un produit sur l'agrégation. Le même procédé est utilisé, mais, dans ce cas, le ml de PRP est préalablement incubé, pendant 30 minutes et sous agitation, avec la quantité désirée du produit à tester. Le benzène dans lequel était dissous le produit, est soigneusement éliminé de la cuvette et avant incubation, par un flux d'azote. Pour chaque donneur de sang, un test est effectué, au préalable, avec le résidu de l'évaporation à sec de 1 ml de benzène : les réponses obtenues sont analogues à celles obtenues avec les tests à blanc. Expressions des résultats - Les résultats de l'agrégation au collagène sont exprimés par l'agrégation à 6 minutes de la vague d'agrégation unique B obtenue; Les tests à blanc, avec 0,25 pg d'ADP/ml, ont présenté, pour tous les donneurs, à l'exception du donneur 2, les deux vagues d'agrégation : la réversible A et l'irréversible B. Les résultats seront exprimés par l'agrégation maximum de la première vague A et par l'agrégation à 6 minutes de la deuxième vague B. Pour le donneur 2, les deux vagues ne sont pas séparées dans le temps et les résultats ont été exprimés par l'intensité de l'agrégation à 6 minutes. Dans tous les cas, l'agrégation en première ou en deuxième phase, exprimée en %, représente la différence de transmission optique entre le PRP (0%) et respectivement le point le plus élevé de la vague A et le point atteint à la 6ème minute pour la vague B. - Réponses normales et % d'inhibition de l'agré- gation On entend par "réponses normales", les résultats enrégistrés én présence d'un agrégant, mais en l'absence de la substance à tester. Pour chaque agent agrégant, les tests "à blanc", effectués à intervalles réguliers durant l'analyse, nous permettent de calculer la réponse "normale" de chaque donneur de sang. L'agrégation obtenue avec le même agent agrégant, mais en présence de l'un des produits testés, est comparée à celle de la réponse normale L'exemple suivant illustre notre méthode de calcul : pour le premier donneur du sang, deux tests "à blanc" avec 40 Fg de collagène/ml de PRP ont fourni des agrégations à 6 minutes1 respectivement de 81,7% (fig.44) et de 71,7% (fig.47). La "réponse normale" au collagène est caractérisée par une agrégation de 76,7% (moyenne x des deux résultats) avec un écart-type o de q 100 7,1% ce qui correspond, d'après l'équitation E= x 7,1 x 100 E= ~~~~~~~~ = 9,2% 76.7 Pour le même donneur de sang et avec 1 mg d'acide oléique/ml de PRP, on obtient, et pour la même concentration en agent agrégant, une agrégation de 33,7%.Le % d'inhibition de l'agrégation au collagène est donc de (76,7 - 33,7) x 100 = 56,1% 76,7 Cette valeur est supérieure à E -et est donc significative. Résultats et discussions Le tableau 2 fournit, pour chaque donneur de sang, la concentration des plaquettes dans le PRP et les "réponses normales" (avec les valeurs de E) au collagène (40 Pg/ml) et à 1'ADP (0,25 Yg/ml). Chacun des tableaux suivants donne, par produit testé, et sur la base des figures précédentes, les % d'inhibition des agrégations induites respectivement par le collagène et par 1'ADP. Notons que ceux-ci varient souvent considérablement, pour le même produit et pour la même concentration, d'un PRP à un autre. 1) &gamma;-linolénate de méthyle (tableau 3) I1 a été constaté que le z -linolénate de méthyle est un inhibiteur de l'agrégation plaquettaire et inhibe préférentiellement la deuxième vague d'agrégation à 1'ADP ou la vague d'agrégation unique B au collagène. - Avec une concentration de 1 mg/ml, l'inhibition de l'agrégation au collagène est variable d'un sujet à un autre. Mais, à cette concentration l'inhibition est significative (et assez importante) chez quatre PRP (des cinq testés). L'inhibition moyenne (sur les cinq) est d'environ 42%. Pour la même concentration, l'inhibition -de la deuxième vague d'agrégation à 1'ADP est présente chez quatre PRP (sur les cinq testés) et la moyenne se situe à environ 558. L'inhibition de la première vague d'agrégation est présente, mais faiblement, chez deux PRP, et est non significative chez les deux autres. Elle nla pas pu être mesurée chez le cinquième (donneur 2). La moyenne (chez quatre PRP) est très peu significative et se situe à environ 10%. - Pour une concentration de 6 mg/ml, l'inhibition de l'agregation au collagène se situe, en moyenne, à environ 528 et seule l'agrégation d'un PRP sur quatre n'a pas été inhibée d'une manière significative. A cette même concentration, les tests d'agrégation à 1'ADP montrent que la deuxième vague d'agrégation est inhibée, en moyenne (pour les deux PRP testés) d'environ 65% et la première vague est inhibée d'environ 29%. On constate que l'inhibition de la vague B ne varie pas d'une manière significative en augmentant la concentration de 1 à 6 mg/ml et que , même à ces concentrations élévées, l'inhibition n'est pas totale. Pour expliquer ces effets, l'hypothèse suivante peut être avancée : le -linolénate n'est, en lui-même, ni un substrat de la cyclooxygénase, ni un inhibiteur de celle-ci ; son action antiagrégante serait due à l'augmentation, dans les plaquettes sanguines, de la proportion d'acide dihomo-t -linolénique (antiagrégant) par rapport à l'arachidonique (agrégant), deux acides dont il est le précurseur biologique.Sur la base de cette hypothèse, on peut supposer que la biosynthèse du dihomo-r -linolenique La concentration en acide &gamma; -linolénique et le temps nécessaires pour atteindre cet équilibre varient d'un sujet à l'autre. I1 est possible que cette concentration puisse être inférieure à 1 mg/ml, ce qui expliquerait les réponses analogues observées avec les concentrations de 1 et de 6 mg/ml. De même, l'équilibre en question, qui suppose une réduction importante de la quantité d'acide arachidonique présente dans les plaquettes, n'élimine toutefois pas complètement cet acide. Ceci empêcherait une inhibition totale de l'agrégation. Selon les résultats obtenus et le mode d'action proposé, on peut conclure que l'introduction, dans la nourriture, d'une source riche en acide -linolénique, ou l'acide lui même, doit prévenir les maladies thrombotiques en augmentant la proportion du dihomo-y-linolénique par rapport à l'arachidonique et en réduisant ainsi la phase d'agrégation iréversible des plaquettes face aux différents agents agrégants. 2) Mélanges de -linolénate et d'acétate d'a-tocophérol (tableau 4) En mélangeant, dans la nourriture, une source riche en acide &gamma;-linolénique (ou l'acide -linolénique lui-même) avec de la vitamine E, le pouvoir antiagrégant de cette source est augmenté. La vitamine E a aussi, dans le mélange, un autre rôle : empêcher comme antioxydant, la dégradation des acides insaturés dont, surtout, le y -linolénique. 3) Acides gras totaux de Tetrahymena (tableau 5) Ce mélange d'acides gras est, parmi toutes les substances testées, l'antiagrégant le plus puissant. - Pour le test au collagène, l'inhibition de l'agrégation demeure significative à une concentration de 57 gg/ml où elle atteint une moyenne d'environ 23%. À cette concentration seuls deux PRP (sur les cinq testés) n'ont pas présenté une influence significative, tandis que l'inhibition de l'agrégation d'un PRP (donneur 6, figure 59) atteignait environ 67%. En doublant cette concentration, on a, a peu près, doublé l'inhibition : celle-ci atteignait en moyenne et pour les cinq PRP testés, environ 41%. A une concentration de 230 pg/ml, l'inhibition a atteint une moyenne de 54%, mais pour deux PRP (donneurs 5 et 6), elle était supérieure à 80% (voir les figures) à des concentrations supérieures à 575 yg/ml, l'inhibition est, en moyenne, supérieure à 70%. - Pour le test à 1'ADP, l'inhibition de la première vague de l'agrégation n'est, en moyenne, significative qu'à partir des concentrations supérieures à 230 yg/ml où elle atteint environ 15%. L'inhibition de la deuxième vague d'agrégation à 1'ADP atteint environ 30% à 57,5 gg/ml, environ 50% à 115 g/ml et devient supé- rieure à 70% à partir de 575 yg/ml. On constate que l'inhibition affecte principalement la vague B (irréversible) et qu'il faut dépasser une concentration en acides gras supérieure à 230 Fg/ml pour déceler une inhibitation significative de la première vague d'agrégation. Le mélange d'acides gras de T. rostrata contient (en poids) environ 30% d'acide- 7-linolénique et environ 10% d'acide oléique. Ces deux acides, pris séparément, ne présentent que des inhibitions très faibles comparativement au mélange d'acides gras de Tetrahymena et la simple sommation de ces trois inhibitions par paires (en tenant compte, par exemple, des teneurs respectives et des résultats des tableaux 2 et 3) ne peut, en tout cas, pas expliquer le puissant pouvoir antiagrégant du mélan ge. Pour tenter d'expliquer ce pouvoir, plusieurs hypothèses peuvent être avancées 1. Une "synergie" existe entre l'action du -linolénique et celle de l'oléique et/ou du ciliénique. 2. La présence de l'acide ciliénique (* 7% du poids des acides gras totaux) dont l'action n'est pas connue. 3. Action d'autres acides (ou de mélanges d'acides) présents dans ce mélange (voir tableau 1; pH De ces hypothèses, la première paralt la plus plausible. On sait que l'acide oléique est un inhibiteur de la cyclooxygénase : il se fixe sur l'enzyme sans pour autant être un substrat de celui-ci. Les acides dihomo-&gamma;-linolénique et arachidonique en sont, par contre, des substrats. En présence des trois acides, il y a compétition. La concentration de chacun d'eux ainsi que les affinités respectives de l'enzyme déterminent l'acide qui sera préférentiellement fixé. On peut supposer que l'affinité de la cyclooxygénase pour le dihomo-7-li- nolénique est la plus importante et que la compétition, en présence des trois acides, se fait principalement entre l'arachidonique et l'oléique. Dans ce cas, l'effet antiagrégant dû à l'augmentation de l'acide dihomo-7-li- nolénique serait augmenté d'un autre effet antiagrégant: celui dû à l'inhibition par l'acide oléique de la fixation de l'acide arachidonique sur la cyclooxygénase. L'intervention éventuelle de l'acide ciliénique aurait une explication identique ou analogue. L'inhibition de la première vague d'agrégation à 1'ADP, observée pour des concentrations de mélange supérieures à 230 g /ml, est probablement due, comme on l'a souligné pour le cas duz -linoléique, à une formation de PGE1 avant l'addition de l'agent agrégant. Ainsi donc, le mélange des acides gras de Tetrahymena constitue en lui-même un puissant agent antiagré gant. Son pouvoir dépasse, de loin, ceux des acides r-linolénique et oléique pris séparément. Aucune huile ou mélange d'acides gras connu ne présente, à la connaissance des Demanderesses, un effet aussi puissant sur l'agrégation plaquettaire in vitro. Tableau 1 : Composition en acides gras des Tetrahymena par GLC (% en poids par rapport aux acides gras totaux). Moyennes des résultats obtenus avec trois cultures (n = 3). Acides gras T.rostrata Structure 12:0 3,1% acide laurique # =0,9% 14:0 5,8% acide myristique # =1,4% 16:0 5,7% acide palmitique # =0,8% 16:1#9 6,3% acide palmitoléique # =0,6% 16:2#6,9 6,1% # =0,4% 16:2#9,12 0,9% # = 0,2% 18::0 3,8% acide stéarique # =0,5% 18:1#9 11,2% acide oléique # =0,8% 18:2#6,11 7,7% acide ciliénique # =0,7% 18:2#9,12 11,6% acide linolénique # =0,7% Suite du Tableau 1 18:3#6,9,12 29,8% acide 7 -linolénique o =1,8% 20::1#11 3,8% o =0,3% Tableau 2 : Concentration des plaquettes dans les PRP et réponses normales des différents donneurs de sang. Concentration Collagène (40 g/ml) des plaquettes (b) ADP (0,25 g/ml) dans le PRP (b) Donneur (plaquettes / Nombre Agrégation à 6 Nombre Agrégation maximum Agrégation à 6 de mm ) de minutes (vague de en % de la première minutes vague sang (a) tests B) en % et (E) tests vague et (E) B en % et (E) 1 270 x 10 2 76,7 (9,2) - - 2 365 x 10 - - 4 -(c) 58,4(10,6) 3 450 x 10 4 83,4 (8,4) 4 43,1(9,3) 62,8(12,1) 4 496 x 10 2 72,2 (4,8) 4 58,4(5,5) 56,7(15,3) 5 372 x 10 3 84,1 (12,0) 3 67,6(10,7) 73,1(11,6) 6 370 x 10 4 72,9 (8,9) 4 47,7(8,3) 76,8(8,7) 7 460 x 10 4 75,6 (10,2) 4 57,3(7,2) 66,9(12,0) (a) Le PRP qui présentet des concentration supérieures à 300.000 plaquettes/mm seront ajustés à cette valeur, pour les différents tests, par dilution avec du PRP (b) Ce tableau donne, pour chaque facteur, la moyenne des valeurs obtenues dans les tests à blanc et E = ################## (c) Pour le donneur 2, les deux vagues d'agrégation à l'ADP ne sont pas séparées dans le temps Tableau 3 : Inhibition de l'agrégation plaquettaire par le &gamma;-linolénate de méthyle (a) (b) (c) collagène ADP 40 g/ml 0,25 g/ml yg/ml % d'inhibition % d'inhibition % d'inhibition de de l'agrégation de la vague B maximum de la la vague B (donneur) première vague (donneur) (donneur) 6000 86,0 (4) 46,7 (4) 89,4 (4) 36,4 (5) 11,6 (5) 40,6 (5) 86,0 (6) 9,1 (7) (x) M = 52,1 M = 29,1 M = 65,0 1000 42,3 (1) -(2) 42,5 (2) 76,7 (4) 24,7 (4) 88,2 (4) 24,5 (5) 8,4 (5) (x) 10,9 (5)(x) 68,2 (6) 7,3 (6) (x) 75,2 (6) 10,0 (7) (x) 15,4 (7) 67,1 M = 42,3 M = 10,0 M = 54,6 (x) % d'inhibition non significatifs (a) N.S. = valeurs non significatives sur la base des va leurs de E du tableau 1. (b) M = moyenne des valeurs (les valeurs non significati ves sont considérées comme nulles). M est non significative si elle est inférieure ou égale à la moyenne des E. (c) Pour le donneur 2, les deux vagues d'agrégation à 1'ADP ne sont pas séparées dans le temps et on mesure seulement l'inhibition de l'agrégation à 6 minutes. Tableau 4 : Inhibition de l'agrégation plaquettaire par les mélanges de &gamma;-linolénate de méthyle et d'acetate d'a-tocophérol (a) (b) (c). collagène ADP 40 g/ml 0,25 yg/ml g/ml % d'inhibition % d'inhibition % d'inhibition de la vague B de l'agréga- de la vague B (donneur) tion maximum (donneur) de la première vague (donneur) Acétate : 84,3 t4) 38,3 (4) 83,9 (4) 142 85,0 (5) 37,7 (5) 73,3 (5). &gamma;-linolé- 83,7 (6) nate : M = 84,3 M = 38 M = 78,6 1000 Acétate : 79,6 (1) - - 71 - - 59,9 (2) &gamma;-linolé- 82,1 (5) 36,3 (5) 72,3 (5) nate : 71,2 (6) 15,4 (6) 84,2 (6) 1000 9,1 (7)(x) 43,3 (7) 86,8 (7) M = 58,2 M = 31,7 M = 75,8 (x) % d'inhibition non significatifs (a) (b) (c) : voir notes tableau 3. Tableau 5 : Inhibition de l'agrégation plaquettaire par les acides gras de T.rostrata (a) (b) (c). collagène ADP 40 g/ml 0,25 g/ml yg/ml % d'inhibition % d'inhibition % d'inhibition de la vague B de l'agrégation de la vague B (donneur) maximum de la (donneur) première vague (donneur) 2300 92,5 (1) - 93,3 (2) 86,7 (4) 100 (4) 79,5 (4) M = 89,6 M = 86,4 1150 81,1 (3) 85,7 (3) 100 (3) 86,3 (4) 40,4 (4) 76,0 (4) 88,6 (5) 75,8 (5) 85,4 (5) 89,8 (6) 80,9 (6) 83,8 (6) 59,7 (7) 43,3 (7) 87,3 (7) M = 81,1 M = 65,1 M = 86,9 575 69,7 (3) 45,3 (3) 84,3 (3) 84,9 (4) 43,3 (4) 78,7 (4) 91;;0 (5) 22,8 (5) 47,9 (5) 89,8 (6) 30,5 (6) 92,1 (6) 28,6 (7) 41,5 (7) 67,5 (7) M = 72,8 M = 36,7 M = 74,1 230 28,6 (3) 11,4 (3) 44,5 (3) 55,9 (4) 13,3 (4) 81,7 (4) 88,0 (5) 6,9 (5)(x) 10,1 (5) 84,5 (6) 16,6 (6) 86,3 (6) 13,4 (7) 35,4 (7) - 55,5 (7) M = 54,1 M = 15,3 M = 53,6 Suite du Tableau 5 115 12,4 (3) - 33,0 (4) 11,2 (4) 77,7 (4) 77,6 (5) 6,0 (5)(x) 3,2 (5)(x) 83,7 (6) 2,7 (6)(x) 78,4 (6) -2,5 (7)(x) 20,6 (7) 44,3 (7) M = 41,3 M = 7,9 (x) M = 50,1 57,5 4,3 (3)(x) 8,7 (3)(x) 12,3 (3) 15,2 (4) 4,0 (4)(x) 49,0 (4) 31,9 (5) 2,8 (5)(x) 0,2 (5)(x) 67,4 (6) 1,0 (6)(x) 69,0 (6) -1,9 (7)(x) 15,8 (7) 21,9 (7) M = 22,9 M = 3,2 (x) M = 30,4 (x) % d'inhibition non significatifs (a) (b) (c) : voir notes tableau 3. REVENDICATIONS. 1. Procédé de production d'acides gras caractérisé en ce qu'il comporte au moins les étapes de - culture en masse de protozoaires ciliés Tetrahymena dans un milieu nutritif adéquat et - l'extraction des acides gras totaux de Tetrahymena. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on utilise l'espèce T.rostrata de Tetrahymena. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que la production de Tetrahymena s'effectue en fermenteur en utilisant un milieu de culture à base de lait écrémé et de levure ou d'extrait de levure. 4. Produit obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 5. Produit selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il est constitue à raison dlau moins 20% d'acide 7-linolénique ou d'acide dihomo-r-linolénique ou de ses dérivés, éventuellement mélangé avec 1 a 15% en poids d'acide oléique et 1 à 10% d'acide ciliénique. 6. Produit selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il contient l'acide r -linolénique ou l'acide dihomo-7-linolénique sous forme d'acide libre ou sous forme d'un dérivé notamment d'ester, de préférence un ester méthylique. 7. Préparation médicamenteuse ou alimentaire à action d'antiagrégation plaquettaire ou antithrombotique caractérisée en ce qu'elle contient comme constituant actif au moins de l'acide z -linolénique ou l'acide dihomo-Y-linolénique ou ses dérivés, notamment ses esters, de préférence l'ester méthylique. 8. Préparation médicamenteuse ou alimentaire caractérisée en ce qu'elle contient l'acide T-linolénique en -mélange avec de l'acide oléique et/ou de l'acide ciliénique. 9. Préparation médicamenteuse ou alimentaire selon la revendication 7 ou 8 caractérisée en ce qu'elle comporte comme adjuvant l'acétate d' a-tocophérol. 10. Préparation médicamenteuse ou alimentaire a action d'antiagrégation plaquettaire ou antithrombotique caractérisée en ce qu'elle contient le produit selon la revendication 4.