FR 2578267 A1 19860905 FR 8418369 A 19841130 Sondes à papillomavirus et Drocédé de diagnostic in vitro d'infections à DaDillomavirus L'invention concerne des ADNs de papillomavirus, et plus particulièrement des sondes dérivées de ces papillomavirus, ainsi que des procédés les mettant en oeuvre pour le diagnostic in vitro d'infections à papillomavirus. L'expression "papillomavirus" recouvre un grand nombre de virus ayant en commun d'être tenus pour responsables de plusieurs formes d'infections virales s'étageant entre les verrues cutanées ou de muqueuses relativement bénignes et des hyperplasies susceptibles de dégénérer en néoplasies intra-épithéliales et en cancers cutanés. Parmi des infections à papillomavirus, on mentionnera également plus particulièrement les épidermodysplasies verruciformes. qui seront quelquefois ci-après désignées sous l'expression "EV". Un certain nombre de types de papillomavirus a déjà été décrit. Dans le cadre de la présente demande de brevet seront décrits de nombreux types et sous-types nouveaux de papillomavirus qui ont été isolés à partir de verrues ou lésions maculaires disséminées, susceptibles de donner lieu au développement précoce de cancers de la peau chez d'importantes proportions des malades qui en sont affectés. Des études récentes ont révélé l'importance de facteurs immunitaires et le rôle majeur de divers types de virus de papillomes humains (HPV > . ces facteurs s'ajoutant au rôle déjà décrit dans la litérature de facteurs géné- tiques divers et des rayonnements actiniques dans la pathogénèse des infections aux papillomavirus. L'invention découle des observations qui ont pu être faites quant aux comportements relatifs d'un grand nombre de papillomavirus nouvellement isolés, dont les caractéristiques génomiques essentielles seront définies ci-après. L'étude d'un petit nombre de cas d'EV avait déjà conduit à la caractérisation de six types d'HPV après clonage moléculaire de leurs génomes (KREMSDORF, D. et al, 1982, J. Virol. 43:436-447 et KREMSDORF et ai, 1983, J. Virol. 48:340-351). Ces HPV ont été divisés en trois groupes en fonction de l'absence d'hybridation croisée ou d'une hybridation croisée très faible entre les génomes appartenant à des groupes différents. Le premier groupe comprenait les HPV3a et 10 qui sont associés aux verrues planes observées chez certains malades atteints d'EV et dans la population générale modes des séquences d'ADN apparen- tées à celles de l'HPV3a ont été trouvées dans un cancer de malade atteint d'EV. Le second groupe comprenait les HPV5, 8 et 12, les génomes des HPV5 et 8 ayant été dé- tectés dans des cancers de malades atteints d'EV.Le troisième groupe est constitué à ce jour d'un seul virus, l'HPV9. A l'exception d'un receveur d'une allogreffe rénale présentant une immunosuppression, qui s'était révélé être infecté par I l'HPV5, les virus des deux derniers groupes n'avaient été détectés que chez des malades atteints d'EV. la plupart d'entre eux étant infectés par plusieurs virus. Il faut noter que parmi les 14 types d'HPV actuellement mentionnés dans la littérature (références bibliographiques 1-5, 8,9, 13, 14. 16, 18-20 indiquées plus loin), quatre se sont révélés associés spécifiquement à l'EV qui est une maladie rare. Les travaux qui ont conduit à l'invention et qui ont permis d'isoler un nombre important de nouveaux types et sous-types de papillomavirus permettent désormais d'envisager des techniques de diagnostic in vitro plus affinées. Plus particulièrement, l'invention fournit des techniques perfectionnées d'identification de papillomavirus, par exemple obtenus à partir de lésions ou de coupes de biopsies et permet de faire des diagnostics plus précis. dont pourront également résulter des pronostics améliorés quant à l'évolution possible des lésions en cause. D'une façon générale, il sera remarqué que les papillomavirus, bien que très différents entre eux, ont des tailles de l'ordre de 7000-8000 paires de bases, En outre leurs génomes peuvent neanmoins présenter certains degrés d'homologie. Dans ce qui suit, on fera référence à des évaluations des pourcentages d'homologies entre types et sous-types de papillomavirus, ces pourcentages d'homologies résultant d'essais d'hybridation réalisés dans des conditions dites non stringentes ou non strictes oU encore dans des conditions d'hybridation stringente ou stricte. Parmi les papillomavirus, on distinguera plusieurs types de papillomavirus, ceux-ci se distinguent par leurs pourcentages d'homologies mesurés dans des conditions strictes ou stringentes. Il sera dit que les papillomavirus qui, dans ces dernières conditions, présentent des pourcentages d'homologie inférieurs à 50 Z appartiennent à des types différents. On notera à cet égard que les pourcentages d'homologie entre des virus de types différents peuvent meme tomber à zéro dans lesdites conditions strictes ou stringentes. Les virus pour lesquels on observe, dans ces conditions strictes ou stringentes, des pourcentages d'homologie supérieurs à 50 7, sont considérés comme appartenant au meme type et former des sous-types différents au sein de ce même type. Les essais d'hybridation dans les conditions non strictes ou non stringentes impliquent la mise en contact mutuelle d'ADNs provenant de deux isolats de virus dans les conditions suivantes décrites par HEILMAN C.A. et al, 1980, J. Virol. , 36, 395-407, et CROISSANT et al, 1982, C.R. Acad. Sc. Paris, 294, 581-586 (molécules hétéroduplexes). Les essais -d'hybridation dans les conditions strictes ou stringentes impliquent la mise en contact mutuelle d'ADNs provenant de deux isolats de virus dans les conditions décrites par KREMSDORF, D. et al. t(1982), J. Virol. 43:436-447 et 1983, J. Virol. 48:340-351) et DAVIS R.W. et al., 1971, Methods Enzymol., li 413-428 (molécules hétéroduplexes). Schématiquement, on remarquera que les papillomavirus appartenant à un même type présentent des séquences hybridables ayant des séquences nucléotidiques sensiblement identiques sur 80 à 100 g. de la totalité de leurs longueurs respectives, ces séquences homologues peuvent être réduites à 60 Z, voire moins chez des papillomavirus de types différents. Le degré d'identité ou d'analogie des séquences de papillomavirus de types différents qui s'hybrident mutuellement dans des conditions non strictes ou non stringentes, peut évidemment être plus faible que dans le cas de papillomavirus appartenant au meme type. L'étude à laquelle les inventeurs ont procédé a montré à la fois que le degré d'hétérogénéité génétique entre papillomavirus de divers types était plus important que ce qui était apprécié auparavant et en meme temps que les différents types se trouvaient souvent associés à des formes ou variantes d'infections présentant un certain degré de spécificité. L'invention concerne par conséquent non seulement les ADNs susceptibles d être isolés à partir des différents papillomavirus nouveaux qui ont été isolés et les sondes qui peuvent être constituées de tout ou partie de ces ADNs, mais encore des mélanges ou *cocktails" de types de papillomavirus susceptibles d'etre mis en oeuvre plus efficacement pour le diagnostic de diverses catégories d'infection, voire des niveaux de risques qu'accompagnent la découverte chez un patient de papillomavirus déterminés. Le nombre des sondes à papillomavirus décrites dans la présente demande, auxquelles s'ajoutent, le cas échéant, celles constituées à partir des ADNs génomiques de papillomavirus déjà isolés précédemment et leurs associations dans des mélanges déterminés, permettrait donc la réalisation de diagnostics plus affinés, notamment une plus grande discrimination des diverses catégories d'infections imputables aux divers types de papillomavirus ou susceptibles de se développer sous l'effet de ces derniers types et, au sein d'une catégorie d'infections déterminées, de mieux pronostiquer le degré de risque que ces dernières se transforment en des maladies plus redoutables.Par exemple l'invention a pour but de fournir des moyens permettant, dans le cas des infections se manifestant par des épidermodysplasies verruciformes, de mieux apprécier le degré de risque que ces dernières évoluent vers des cancers cutanés. D une façon générale et dans le but de simplifier l'exposé qui suit, les génomes entiers des papillomavirus seront désignés par l'abréviation "ADN-HPV". Dans le même but de simplification, il est fait référence dans ce qui suit aux dessins, dans lesquels les figures consistent en des cartes physiques de restriction d'ADN-HPVs, parmi lesquelles d'ailleurs des ADN-HPVs de papillomavirus déjà connus. Les cartes physiques donnent la position de sites de coupure par diverses endonucléases de restriction. L'origine des cartes est généralement constituée par un site unique de coupure. Les distances à l'origine sont exprimées en pourcentage de longueur de génome. Une unité de carte représente 1 Z de longueur de génome. L'invention concerne tout d'abord plus spécifique- ment chacun des ADN-HPVs choisis parmi l'ensemble des ADNs qui présentent des tailles qui s'étagent entre 7000 et 8000 paires de bases et sont caractérisés par les cartes de restriction qui apparaissent dans les dessins en ce qui concerne plus particulièrement les ADN-HPVs obtenus à partir des papillomavirus et qui répondent aux désignations HPV-2d, HPV-10b, HPV-14a, HPV-14b, HPV-15, HPV-17a, HPV-17b, HPV-19, HPV-20, HPV-21 , HPV-22, HPV-23, HPV-24, HPV-28, HPV-29, HPV-31 et HPV-32. Il va de soi que l'invention étend également ses effets aux ADN-HPVs qui peuvent être considérés comme appartenant aux mêmes types que ceux qui viennent d'être énoncés. Les cartes physiques correspondant aux ADN-HPVs des virus nouvellement caractérisés sont indiquées par un cercle noir. L'invention concerne également des fragments des ADN HPVs précédents ou capables de s'hybrider avec ceuxci, notamment dans des conditions strictes. De meme, elle concerne les ADNs recombinants contenant tout ou partie de chacun des ADN-HPVs sus-indiqués, et plus particulièrement des ADNs recombinants contenant des fragments correspondant aux gènes E1, E6-E7, L1 et L2 respectivement ou encore des fragments contenant des séquences correspondant aux régions intergéniques desdits ADN-HPVs. Elle concerne enfin les sondes qui peuvent être constituées à partir de ces ADN-HPVs respectifs ou à partir des fragments correspondants et les procédés de diagnostic in vitro mettant en jeu lesdites sondes. Les préparations d'ADN viral ont été extraites sélectivement (LUTZNER, M.A. et al., 1983, Lancet ii:422424) à partir de produits de grattage de lésions bénignes de six malades européens atteints d'EV et de deux malades sud-américains atteints d'EV. Les ADNs d'HPV ont été purifiés par centrifugation en équilibre dans des gradients de chlorure de césium etlou sédimentation dans des gradients de saccharose en présence de bromure d'éthidium, selon des modes opératoires précédemment décrits (articles de KREMSDORF, D. et al. déjà décrits et ORTH, G. et al., 1980, Cold Spring Hazrbor Conf. Cell Proliferation 7:259-282). Les préparations d'ADN ont été traitées avec des endonucléases de restriction et les produits de digestion ont été séparés par électrophorèse sur des gels d'agarose (articles de KREMSDORF et al. déjà mentionnés). En plus des HPVS, 8 et 12 (articles de KREMSDORF. et al. déjà mentionnés) et de l'HPV2 (HEILMAN, C.A. et al., 1980. 3. Virol. 36:395-407 et ORTH, G. et al., 1980. Cold Spring Harbor Conf. Cell Proliferation 7: 259-282) trouvés dans les verrues vulgaires d'un des malades, ont été identifiés onze souches fournissant des modèles majeurs de clivage par des enzymes de restriction d'ADN, différents de ceux des types précédemment caractérisés . Les nouveaux types d'HPV ont reçu un numéro et les sous-types d'un type ont reçu le même numéro suivi d'une lettre, selon l'ordre chronologique de leur identification (COGGIN, 3.R. et al., Cancer Res. 39:545-546). Les génomes des 11 nouveaux HPVs ont été clonés dans Escherichia coli K12, souche C600 larticle de KREMSDORF, D. et.al. (1983) déjà mentionné). Les ADNs ont été insérés sous forme de molécules de longueur unitaire à l'exception de deux fragments d'ADN d'HPV24 produits par l'endonucléase BamHI. Ils ont été insérés soit dans le plasmide pBR322 (SUTCLIFFE, 3,G., 1978, Nucleic Acids Res. 5:2721-2728), en utilisant les sites de clivage uniques de AvaI, de BamHI et de HindlII, soit dans un plasmide recombinant ayant intégré le fragment HindIII 8 de l'ADN d'HPV5 (article de KREMSDORF, D. et al. , 1982, déjà mentionné), qui contient un site SacI unique. Plus partipulièrement les HPV17b et 22 ont été insérés sous forme de molécules d'ADN de longueur unitaire après clivage avec une enzyme (SacI) qui ne clive qu'une fois l'ADN d'HPV et le plasmide recombinant pBR322 contenant le fragment HindIII B de l'DN d'HPV5. L'ADN d'HPV14a a été inséré dans le plasmide pBR322 sous forme d'une molécule d'ADN de longueur unitaire après digestion incomplète de la préparation d'ADN viral avec HindIII, une enzyme qui produit deux fragments de 96,1 et 3,9 7. de la longueur du génome.Les fragments BamHI A et 8 d'HPV24 (ayant des tailles correspondant à respectivement 83,1 et 16,9 Z de la longueur du génome) ont été insérés séparément dans le plasmide pBR322. Les clones isolés et les sources des HPV correspondants résultent du tableau I ci-après TABLEAU 1. ORIGINE DES ADNs d'HPV CLONES Type d'ADN d'HPV Autres types Maladea Nationalité Enzynec d'HPV trouvés Sourceb oloné Enzymec chez les de clonage maladesd 1 #olonaise verrues ; genoux 14a Hind III 5 15 Bam HI 2 française verrues ; mains 14b Bam HI 3 colombienne macules ; tronc 17a Bam HI 5 4 italienne macules ; poitrine 17b Sac I 5 22 Sac I 5 hollandaise macules ; dos 19 Bam HI 5,8,17a macules ; poitrine 24 Bam HI 6 colombienne verrues ; mains 20 Ava I. 5,8,24 7 polonaise verrues ; genoux 21 Bam HI 2,12,17a,20 8 polonaise macules ; avant- 23 Bam HI 5,8,20 bras Pour identifier les plasmides recombinants, les mobilités électrophorétiques des produits de digestion des ADNs recombinants et des ADNs d'HPV non clonés ont été comparées après traitement avec un mélange de deux endonucléases de restriction comprenant l'endonuclease utilisée pour l'insertion des sequences virales dans le plasmide. Le nombre et la taille des fragments isolés ont indiqué que dans chaque cas les génomes viraux entiers ont été intégrés. Une hétérogénéité des tailles des ADNs a été observée lorsque les ADNs des HPVs, non clonés ou excisés des séquences plasmidiques, ont été analysés par électro phorése sur gel d'agarose (données non présentées). Les ADNs d'HPV14b, 19, 20 et 21 ont des tailles semblables à ceux des HPV3a, 5, 8 et 12 (environ 7700 paires de nucléotides (articles de KREMSDORF, D. déjà mentionnés), tandis que les ADNs d'HPV15, 17a, 17b, 22 et 23 ont des tailles plus faibles semblables à celle d'HPV9 (environ 7200 paires de nucléotides) (articles de KREMSDORF, D., 1982) et ORTH, G., 1980, déjà mentionnes). La sensibilité des génomes viraux clonés à 14 endonucléases de restriction a été analysée et les cartes physiques ont été établies (figures 1 à 8). Les cartes de restriction de certains des ADN-HPVs sont répétées dans certaines des figures pour les motifs exposés plus loin. Entre 22 et 33 sites de clivage ont été localisés selon les méthodes précédemment décrites (9). Aucune analogie évidente n'a été détectée entre ces cartes, à l'exception de celles des HPV14a et 14b, d'une part (figs.4a et 4b) et entre celles des HPV17a et 17b, d'autre part (figure 5). Parmi les 21 et 31 sites localisés respectivement sur les ADNs des HPV14a et 14b, 15 se sont révélés communs lorsque l'un des deux sites de clivage BamHI de l'ADN d'HPVî4a a été aligné avec le site de clivage BamHI unique de l'ADN d'HPV14b. De façon semblable, 21 des 29 sites de clivage situés sur l'ADN d'HPVl7a ont également été trouvés sur l'ADN d'HPV17b (avec 26 sites), lorsque les sites de clivage BamHI uniques ont été alignés. Aucune analogie évidente n'a été détectée entre ces cartes et celles précédemment établies pour les HPV associés à l'EV (HPV3a, 5, 8, 9, 10 et 12) (8,9, 16, 18, 20), aux verrues cutanées (HPV1, 2, 4 et 7), et aux lésions des membranes mucocutanées ou muqueuses (HPV6b, lia, 13 et 16) (1, 33, 19), à l'exception de la carte d'HPV14a qui est étroitement apparentée à la carte d'un HPV isolé d'un malade japonais atteint d'EV (24). Ce dernier isolat diffère de l'HPV14a par un site 8amHI et un site HindII additionnels, alors que les localisations des sites Aval, BamHI, BglI, EcoRI, Hindi et HindIII sont semblables dans les deux virus. Des expériences d'hybridation croisée ont confirmé que ces deux virus étaient très étroitement apparentés. On remarquera encore que quelques sites (ceux indiqués par les flèches) n'ont pas été localisés. Les sites de clivage différant de moins de 2 Z de la longueur du génome par leur localisation sont considérés comme conservés (*). Les enzymes ne produisant pas de coupure ont été PvuI, Sal I et 5maI pour les ADNs d'HPV14a et 23 PvuI, SacI, SalI et SmaI pour l'ADN d'HPV14b BglI, PvuI, SalI et SmaI pour les ADNs d'HPV15, 17a et 17b ; BglI, SacI, SalI et SmaI pour l'ADN de HPV19 ; EcoRI, PvuI, SacI et SmaI pour l'ADN d'HPV20 ; Sac I et SmaI pour l'ADN d'HPV21 ; BamHI, BglI, PvuI, PvuII et SalI pour l'ADN d'HPV22 ; BglI, EcoRI, PvuI, SacI, SalI et SmaI pour l'ADN d ' HPV24. L'existence d'homologies de séquence entre les ADNs des ADNs d'HPV nouvellement caractérisés ainsi qu'entre ces derniers et les ADNs d'HPV d'EV précédemment caractérisés (HPV3a, 5, 8, 9, 10 et 12) d'HPV associés aux verrues cutanées (HPV1, 2, 4 et 7), et d'HPV associés à des lésions des membranes muqueuses (HPV6b, lia, 13 et 16) a été étudiée. Des expériences d'hybridation par fixation sur un papier-filtre et d'hybridation ADN-ADN en phase liquide à saturation suivie d'une digestion par la nucléase S1 ont été effectuées dans des conditions strictes ou stringentes précédemment décrites (8, 9).En particulier les ADNs d'HPV ont été marques par translation de coupure ("nick-translation") et fractionnés par sédimentation dans des gradients de saccharose alcalins (5 à 20 7.) comme précédemment décrit (13). Les ADNs d'HPV marqués (4000 cpm) ont été incubés dans du NaCl 0,48 M-EDTA 1 mM (pH 6,8) à 68-C, en présence soit d'ADN de thymus de veau (20 g), soit d'ADN d'HPV non marqué (0,20 pg) comme précédemment décrit (8, 9). Les activités spécifiques des sondes d'ADN d'HPV ont varié entre 5,3 x 107 et 2 x 108 cpm/ g.Le pourcentage d'hybridation a été déterminé par mesure des fractions résistant à la nucléase S1 Les nombres représentent les valeurs corrigées pour l'autorenaturation spontanée des sondes (4 à 15 Z) et normalisées à 100 % pour l'hybridation homologue (75 à 95 Z). L'abréviation ND signifie : non déterminé. Les importances relatives des hybridations croisées entre les ADN-HPV dans les conditions sus-indiquées sont exprimées en % d'hybridation entre un ADN HPV marqué et un ADN HPV non marqué. TABLEAU 2. DEGRE D'HYBRIDATION CROISEE ENTRE LES ADNs d'HPV DETERMINEE PAR HYBRIDATION EN PHASE LIQUIDE ADN d'HPV non % d'hybridation avec de l'ADN d'HPV marqué au 32P marqué 3a 5 14a 14b 19 20 21 22 23 9 15 17a 17b 24 1a 0,1 0,3 0,2 0,3 0 0,8 2,9 0 0 1,0 0,4 0,2 0 0 11a 1,6 1,0 1,3 0 0,3 0,1 0,7 3,7 0 0,1 0,1 0,6 3,3 0 3a 100 1,8 1,0 0 1,5 0,1 1,5 0 1,9 0,1 1,7 1,2 1,8 3,0 10 32,3 ND ND 0,1 0 0,1 1,9 3,0 ND 0 1,6 0,1 2,0 ND 5 0,2 100 12,1 12,4 5,8 9,3 9,4 10,1 5,8 4,3 0,7 3,6 0 2,4 8 1,1 15,7 9,9 13,4 8,5 5,6 5,0 7,1 5,8 3,5 1,5 3,2 3,8 0,1 12 0,1 19,3 9,2 12,5 5,3 8,6 9,3 11,7 4,0 3,6 1,2 0,1 1,9 0 14a 0,2 13,2 100 88,8 14,6 32,4 32,9 10,1 24,6 3,0 2,2 2,4 4,1 ND 14b ND 10,5 94,1 100 9,3 28,4 35,4 9,5 28,2 0 0 0 0 0 19 ND 7,2 21,4 20,6 100 7,6 8,8 15,5 27,7 0 0 0 2,2 1,0 20 ND 9,9 28,8 37,9 6,2 100 25,4 13,7 14,1 0 0 2,1 0 3,6 21 ND 10,5 38,7 40,5 6,4 37,5 100 9,8 18,6 0,1 0 2,5 0,3 0 22 ND 7,2 7,4 ND 17,3 7,2 10,8 100 17,9 0 0 0,1 0,1 0 23 ND ND ND ND ND ND ND 21,2 100 0 0,5 0 0 0,1 9 0,4 3,1 0,5 1,2 0 2,0 1,0 0 0 100 5,5 6,3 5,4 0 15 0,4 3,3 2,1 3,3 0 0,1 0,8 0 0 7,8 100 22,5 21,6 0 17a 0,7 1,2 1,4 2,8 0 0,1 0,1 0,8 1,4 7,6 19,5 100 92,7 0 17b ND ND ND 1,4 0 0,3 3,4 ND ND ND ND 86,3 100 ND 24 ND ND 0,1 2,6 ND ND ND 0,8 0 0,2 0 1,1 1,1 100 On constate 1 absence ou la quasi-absence d'hybridation croisée entre les génomes des HPV1, 2, 4, 6b, 7 et îîa et d'ADNs d'HPV d'EV nouvellement clonés marqués au 32P ou entre les ADNs d'HPV d'EV non marqués et des sondes specifiques des HPV13, 16 et 18. De façon semblable, on n a pas ou quasiment pas détecté d'hybridation croisée entre les ADNs des HPV14a, 14b, 15, 17a, 17b, 19, 20, 21, 22, 23 et 24 et les ADNs des HPV1a et lia par réassociation à saturation (tableau 2). Les ADNs d'HPV nouvellement clonés n'ont pas ou quasiment pas présenté d'hybridation croisée ou ont présenté une hybridation croisée inférieure à 50 Z entre eux et avec les génomes des autres HPV associés à l'EV (HPV3a, 5, 8, 9, 10 et 12), à l'exception des HPV14a et 14b, d'une part, et des HPV17a et 17b, d'autre part, qui ont présenté une forte hybridation croisée.Ces observations justifient le classement des nouveaux virus en neuf nouveaux types (HPV14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23 et 24) plus deux sous-types des types 14 (HPVî4a et b) et 17 (HPV17a et b). De même les différents HPVs ont été classés en groupes, sur la base de leurs homologies (ou absence d'homologies) de séquences dans des conditions strictes d'hybridation moléculaire. Ces groupes, désignés par les lettres A à H, sont répertoriés dans le tableau III qui suit. Ce tableau mentionne les maladies qui ont été diagnostiquées chez les porteurs de ces HPVs (isolés ou en combinaison entre eux) et les potentiels oncogènes qui leur ont été reconnus. TABLEAU III CLASSIFICATION DES HPV FAISANT L'OBJET DE LA DEMANDE DE BREVET, EN FONCTION DE LEUR DEGRE D'HOMOLOGIE DE SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DETERMINE PAR HYBRIDATION MOLECULAIRE DANS DES CONDITIONS STRICTES Groupe) Types) Homologies Mélange d'HPV au sein Maladies associées Potentiel oncogène de du groupe sondes A 1 Myrcémies très faible 1 B 2 Verrues vulgaires faible 1 C 3,10,28*,29* 14 à 38 % Verrues planes modéré ; 2 Verrues intermédiaires un virus apparenté, associé Kératoses séniles à des néoplasies intraépi Maladie de Bowen théliales et des cancers cu tanés, en cours de caracté risation D 4 Verrues vulgaires très faible 1 E 5,8,12 14* 4 à 38% Epidermodysplasie verruciforme HPV5,8 et 14 associés aux 3,4,7 19* 20* 21*, Kératoses séniles ou actiniques carcinomes d'EV; un virus ap 22*,23* Maladie de Bowen parenté, associé à des né Carcinomes cutanés plasies intraépithéliales et des cancers cutanés, en cours de caractérisation F 9,15*,17* 6 à 23 % Epidermodysplasie verruciforme 5 G 24* Epidermodysplasie verruciforme 6 H 13,31* Hyperplasie épithéliale focale 8 orale. Leucoplasies orales I 32* Maladie de Bowen Néoplasies intraépithéliales 7,9 cutanées 1) Les génomes des types d'HPV appartenant à des groupes différents ne présentent généralement des d'ho mologie de séquence décelable dans des conditions strictes d'hybridation moléculaire. Les génomes des types d'HPV appartenant au même groupe présentent une homologie de séquence inférieure à 50 %. 2) Les nouveaux types d'HPV sont indiqués par un astérisque. Les ADNs des HPV5, 8, 12, 14. 19, 20, 21, 22 et 23 présentent entre eux des taux d'hybridation croisée (homologies de groupes) variant de 5 à 38 Z, et ne présentent une hybridation croisée notable (4 à 13 Z.) qu'avec les ADNs des HPV5, , 8 et 12. Ces virus font donc partie d'un groupe d'HPV d'EV précédemment défini (9). De même les ADNs des HPV9, 15 et 17 qui présentent entre eux une hybridation croisée d'environ 20 Z et une hybridation croisée d'environ 6 Z avec l'ADN d'HPV9, appartiennent également à un groupe d'HPV d'EV déjà décrits (9). Les HPVs de types 13 et 31 peuvent être considérés comme appartenant à un même groupe. Enfin les HPVs de types 1, 2, 4, 24 et 32 qui ne présentent presque pas d'homologie avec les génomes des autres HPV sont considérés comme formant les premiers membres d'autres groupes distincts entre eux et des groupes précédents. L'invention concerne encore plus particulièrement des fragments d'ADN, issus des ADN-HPVs sus-décrits, et plus particulièrement ceux correspondant respectivement aux gènes ES-E7 ; El , L2 ; L1 et à leurs régions intergéniques. Les positions et longueurs relatives de ces divers fragments, vis-à-vis des sites pris comme origines (figures 1 à 9) sont indiquées dans le tableau IV qui suit. TABLEAU IV LOCALISATION PUTATIVE DES PRINCIPAUX GENES ET DE LA REGION INTERGENIQUE SUR LES CARTES PHYSIQUES DES GENOMES D'HPV Type Coordonnées des extrêmités 5' et 3' des fragments correspondant d'HPV aux gènes à la région E6 - E7 E1 L2. L1 intergénique 1 44 - 34,5 35 - 11 95 - 75,5 76,5 - 56 56 - 44,5 3 18,5 - 9 9,5 - 85,5 69,5 - 50 51 - 30,5 30,5 - 19 5 6,5 - 97 97,5 - 73,5 57,5 - 38 39 - 18,5 18,5 - 7 8 63 - 53,5 54 - 30 14 - 94,5 95,5 - 75 75 - 63,5 9 42 - 32,5 33 - 9 93 - 73,5 74,5 - 54 54 - 42,5 10a 49 - 39,5 40 - 16 0 - 80,5 81,5 - 61 61 - 49,5 10b 93 - 83,5 84 - 60 44 - 24,5 25,5 - 5 5 - 93,5 12 23,5 - 14 14,5 - 90,5 74,5 - 55 56 - 35,5 35,5 - 24 14 8,5 - 99 99,5 - 75,5 59,5 - 40 41 - 20,5 20,5 - 9 15 39,5 - 30 30,5 - 6,5 90,5 - 71 72 - 51,5 51,5 - 40 17 46 - 36,5 37 - 13 97 - 77,5 78,5 - 58 58 - 46,5 24 24,5 - 15 15,5 - 91,5 75,5 - 56 57 - 36,5 36,5 - 25 28 47,5 - 38 38,5 - 14,5 98,5 - 79 80 - 59,5 59,5 - 48 29 89,5 - 80 80,5 - 56,5 40,5 - 21 22 - L 5 L 5 - 90 31 89 - 78,5 80 - 53,5 33,5 - 15,5 17,5 - 96,5 96,5 - 92,5 La localisation des génes sur le génome du HPV1 a été déduite de la séquence nucléotidique de ce génome (Brevet O. Danos, M. Katinka et M. Yaniv). Les cartes physiques des génomes des HPV3, 5, 8,, 9, 1Oa, 12, 14, 15, 17 et 24 ont été alignées par rapport à la carte physique et à la carte génétique du HPV1, et celle du HPV31, par rapport à la carte physique et à la carte génétique du HPV6b (E. Schwarz et al, EMBO J., 1983, 2, 2341-2348), après analyse au microscope électronique de molécules hétéroduplexes formées dans des conditions strictes (Tm -29'C) ou moins strictes (Tm -40'C) d'hybridation.Les cartes physiques des HPVlOb, 28 et 29 ont été alignées par rapport aux. cartes physiques des HPV3a et 1Oa après juxtaposition des sites d'enzymes de restriction conservés. Les valeurs des coordonnées portées dans le Tableau IV indiquent la position, sur les cartes physiques présentées dans les figs. 1-9, des extrémités 5' et 3' des segments des.génomes homologues des gènes E6 et E7, El, L2 et L1 et de la région intergénique par rapport au génome du HPV1a ou, dans le cas du HPV31, par rapport au génome du HPV6b. La région intergénique (comportant des éléments de régulation) et les gènes adjacents E6 et E7 (correspondant vraisemblablement aux gènes de transformation majeurs exprimés dans les tumeurs) ne présentent pas d'homologie de séquence décelable par analyse au microscope électronique de molécules hétéroduplexes formées, dans des conditions non strictes d'hybridation, entre des génomes de types d'HPV appartenant à des groupes différents, ou formées, dans des conditions strictes d'hybridation, entre les génomes de la plupart des types d'HPV appartenant au même groupe.Le gène El (impliqué principalement dans la réplication de l'ADN viral) et le gène L1 (codant pour la protéine majeure de la capside virale portant les principaux déterminants antigéniques des virions) présentent des homologies de séquence décelables par analyse d'hétérodu plex formés, dans des conditions non strictes d'hybridation. entre des génomes de types d'HPV appartenant à des groupes différents ou formés, dans des conditions strictes d'hybridation, entre des génomes d'HPV appartenant au même groupe. Des sondes préparées à partir de plasmides recombinants comportant les régions El et L1 peuvent théoriquement permettre de détecter le plus grand nombre de types d'HPV par des experiences d'hybridation moléculaire ef fectuées, selon le cas, dans des conditions strictes ou non strictes. Des sondes préparées à partir de plasmides recombinants comprenant la région intergénique et les gènes E6 et E7 permettent de detecter spécifiquement un type d'HPV ou des types d'HPV apparentés. La région L2 (codant pour un constituant mineur de la capside virale) présente un degré variable de conservation de séquences nucléotidiques parmi les différents types d'HPV. L'invention concerne plus particulièrement encore des mélanges ou cocktails de différents ADNs HPVs (ou sondes contenant ces ÀDNs HPVs ou des séquences de ces derniers), susceptibles d'être utilisés en combinaison pour réaliser des diagnostics globaux des différentes formes d'infections à papillomavirus, éventuellement aux fins de pronostiquer l'évolution possible de l'infection. Des mélanges préférés conformes à l'invention sont identifiés dans le tableau V qui suit. TABLEAU V CARACTERISTIQUES DES MELANGES D'ADN D'HPV UTILISABLES POUR LE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE D'INFECTIONS A PAPILLOMAVIRUS Désignation des mélanges Constitution) Maladies à diagnostiquer 1 1,2d*,4 Verrues cutanées ou muqueuses (en particulier, verrues vulgaires et plantaires). Diagnostic différentiel de l'épidermodysplasie verruciforme. 2 3,10a,10b*,28*,29* Verrues planes ou intermédiaires cutanées ou mu queuses. Néoplasies intraépithéliales et cancers cutanés. Diagnostic différentiel de l'épidermodys plasie verruciforme. 3 5,17a*, 24* Epidermodysplasie verruciforme. Népolasies intra épithéliales et cancers cutanés. 4 5,8,12,14a*,14b*,19*,20*,21*,22*,23* Epidermodysplasie verruciforme. 5 9,15*,17a*,17b* Epidermodysplasie verruciforme. 6 24* Epidermodysplasie verruciforme. 7 5,8,14b*,32* Cancers cutanés de l'épidermodysplasie verruciforme. Néoplasies intraépithéliales et cancers cutanés. 8 13,31* Hyperplasie épithéliale focale orale ; Diagnostic différentiel des néoplasies intraépithéliales orales. 9 32* Néoplasies intraépithéliales et cancers cutanés. 1) Les nouveaux types d'HPV entrant dans la constitution des mélanges de sondes sont indiqués par un astérisque Ce tableau indique également les natures des affections susceptibles d'être plus particulièrement diagnostiquées par l'utilisation des mélanges figurant dans la partie gauche du tableau. Il sera remarqué que les regroupements des cartes de restriction dans les figures 1 à 9 ci-jointes sont en conformité avec les regroupements qui sont indiqués dans la colonne "Constitution du tableau V. C'est également la raison pour laquelle certaines des sondes ont été reproduites à plusieurs reprises dans différentes figures des dessins ci-annexés. Chacun de ces mélanges peut encore être défini comme comprenant au moins l'une des sondes nouvelles selon l'invention. En d'autres termes les compositions de diagnostic selon l'invention peuvent être définies comme contenant 1) au moins l'ADN de l'HPV2d, 2) au moins l'un des ADNs de HPV10b, 28 et 29, 3) au moins l'un des ADNs de HPV17, 24, 4) au moins l'un des ADNS de HPV14, 15, 17, 19, 20, 21, 22 et 23, 5) au moins l'un des ADNB de HPV15 et 17. 6) l'ADN de HPV24, 7) l'ADN de HPV14, 32, 8) l'ADN de HPV31, 9) l'ADN de HPV32, étant entendu que les ADNs des neuf groupes sont choisis de façon à être en toutes circonstances différents les uns des autres. Etant donné la grande diversité des HPVs susceptibles d'être isolés à partir des différentes formes de verrues ou autres lésions cutanées ou de muqueuses, il est cependant préféré d'utiliser; pour le diagnostic de chaque type d'affection mentionné dans le tableau, des mélanges comportant plus d'un ou deux ADN-HPVs. dès lors que d'autres ADN-HPVs ont été reconnus comme pouvant également intervenir dans le développement du même type d'affection. Le diagnostic de la nature de l'infection et de son évolution possible sera d'autant plus efficace que le nombre de sondes utilisées sera plus élevé. En outre, des essais d'hybridation réalisés avec des mélanges différents de sondes permettra des diagnostics différentiels présentant un degré de probabilité également plus important de la nature du mal dont souffre le patient. Dans le tableau V, il n'a été mentionné que des sondes formées à partir d'ADN-HPVs isolés dans le laboratoire des inventeurs. Il va sans dire que, en raison de ce qui précède, les différents mélanges pourront avantageusement être complétés avec des ADNs issus des HPVs obtenus dans d'autres laboratoires, des lors qu'ils auront été retrouvés à différentes reprises chez des patients affectés par les mêmes types d'infections. Par exemple, le mélange 7 ne peut que gagner à être complété par tous autres ADN-HPVSs rencontrés dans des épidermodysplasies verruciformes à risque de transformation en néoplasies intraépithéliales et cancers cutanés. On remarquera que dans le tableau V, certains des mélanges sont présentes comme caractéristiques des mêmes maladies à diagnostiquer. Il est à remarquer cependant que les différents mélanges font une distinction entre des infections à faible risque de cancérisation et des infections à haut risque de cancérisation. Par exemple, l'hybridation d'une préparation virale provenant d'un malade soumis à diagnostic avec le mélange 7 témoignera d'un risque de cancérisation cutanée plus important que dans le cas où l'hybridation se produira plutôt avec le mélange 3. De même les EV détectées par le mélange 5 temoi- gneront d'un risque de cancérisation plus important que les EV détectées par le mélange 6. Le mélange 4 détectera des EV à risque plus élevé encore que celles détectées par le mélange 5. Dans ce qui précède, on a surtout envisagé l'utilisation, à titre de sondes, des ADN-HPVs entiers clones. Ceux-ci peuvent cependant être substitués par des fragments clonés de ces différents ADNs, notamment par les gènes El ou L1 et par les gènes E6-E7. Le principe de base des détections in vitro d'ADN HPV mettra naturellement en jeu des hybridations opérées dans des conditions strictes ou moins strictes. On peut opérer par exemple comme suit. étant naturellement entendu que les essais de diagnostic décrits ne sauraient être considérés comme limitatifs des conditions d'emploi des sondes ou mélanges de sondes selon l'invention. L'objet des examens mettant en jeu des sondes préparées à. partir de mélanges d'ADNs de HPVs clonés est de mettre en évidence un HPV et d'identifier le type d'HPV dans une biopsie, dans des cellules obtenues par grattage de lésions, ou dans des coupes de biopsies fixées par le mélange de Carnoy (éthanol, chloroforme. acide acétique 6:3:1) et incluses dans la paraffine. L'examen nécessite l'extraction préalable de l'ADN des prélèvements selon des méthodes dont le principe est connu et met en jeu l'analyse de cet ADN par des expériences d'hybridation moléculaire, effectuées dans des conditions strictes ou moins strictes, à l'aide de sondes radioactives (marquées au 32P ou au S) préparées à partir de mélanges d'ADNs d'HPVs. Chaque examen requiert. en général, l'utilisation de plusieurs mélanges de sondes. Deux méthodes d'hybridation peuvent être utilisées, la méthode d'hybridation sur tache et la méthode d'hybridation sur réplique. La méthode d'hybridation sur tache comporte, après dénaturation de l'ADN. le dépôt d'une quantité aliquote d'ADN sur des membranes (nitrocellulose ou Genescreenplus), l'hybridation de chaque membrane, dans les conditions usuelles, avec un mélange de sondes et la détection des hybrides radioactifs par exposition des membranes au contact d'un film radiographique.La méthode d'hybridation sur réplique comprend la séparation électro phonétique en gel d'agarose des fragments d'ADN engendrés après traitement de l'ADN par des enzymes de restriction, le transfert des fragments, après dénaturation alcaline, sur des membranes (nitrocellulose, Genescreenplus) et leur hybridation, dans les conditions usuelles, avec différents mélanges de sondes. La formation d'hybrides radioactifs est détectée après exposition des membranes au contact d'un film radiographique. Les sondes radioactives sont constituées soit par des ADNs d'HPVs marqués par la méthode de "nick-translation", soit par des ARNs préparés par transcription d'ADNs viraux insérés dans un vecteur, par exemple de type SP6. L'utilisation de sondes radioactives présente l'avantage d'une grande sensibilité, mais ceci n'exclut pas l'utilisation de sondes non radioactives par exemple biotinylées et susceptibles d'être reconnues par des anticorps soit marqués eux-mêmes, soit eux-mêmes reconnus par des anticorps portant un marqueur enzymatique, fluorescent, etc.. Le choix des sondes dépend de la nature des prélevements. Ainsi, par exemple, dans le cas d'un malade suspect d'être atteint de EV, les mélanges 1, 2, 3, 4. 5, 6 et 7 seront utilisés. Les mélanges 1 et 2 permettront de faire le diagnostic différentiel entre l'EV et les verrues cutanées. La sonde 3, incluant le membre le plus fréquemment détecté de chacun des trois groupes d'HPVs associés à la maladie, et la sonde 7, contenant les ADNs des types d'HPV associés aux cancers d'EV, permettront le diagnostic de la majorité des cas d'EV et, en particulier, d'identifier les patients infectés par les types d'HPVs présentant un risque pour le développement de cancers. L'utilisation des mélanges 4, 5 et 6 permettront de préciser le type ou les types d'HPV infectant un même malade. L'invention concerne donc encore des nécessaires ou "kits" contenant une pluralité des sondes sus-indiquées, notamment - soit des représentants de chacun des 17 types et soustypes d'ADN-HPVs sus-indiqués, - soit des mélanges de sondes, de préférence les divers groupes ou mélanges de sondes qui ont été définis plus haut, ces kits" étant destinés à des études de diagnostic an vitro par hybridation entre des préparations virales obtenues à partir de patients et les divers groupes ou mélanges. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes ; notamment la référence dans les revendications à une désignation ADN-HPV suivie d'un nombre déterminé, -et à laquelle correspond un ADN-HPV dont la carte de restriction a été fournie dans les dessins, s'entend comme signifiant que ces revendications couvrent tous les ADN-HPVs qui ont en commun avec cet ADN-HPV particulier de pouvoir être classés dans le même type, selon la définition qui en a été donnée plus haut, et a fortiori aux ADN-HPV appartenant au même sous-type. Il est encore remarqué, en ce qui Concerne plus particulièrement l'ADN dérivé de HPV-32, qui apparait dans les dessins, n'est pas coupé par AvaI, Bail, BamHI, Clan, EcoRI, HindîlI, NdeI, NruI, PvuI, PvuII, SacI, SalI, SamI, TthIII. XmaI. On notera que les ADNs recombinants désignés ci-après ont été déposés le 30 novembre 1984 à la C.N.C.M. (Collection Nationale des Cultures de Micro-Organismes de l'INSTITUT PASTEUR de Paris), sous les numéros apparaissant ci-après pBR322/HPV2d .............. n 1-379 pBR322/HPV10bA .............. n I-380 pBR322/HPV10bB .......... n I-381 pBR322/HPV14a ............... n I-382 pBR322/HPV14b ................. n- I-383 pBR322/HPV15 .................. n I-384 pBR322/HPV17a ................. n I-385 pHPV5 HindIIIB/HPV17b . n- I-386 pBR322/HPV19 ............... n I-387 pBR322/HPV20 .............. n I-388 pBR322/HPV21 .................. n I-389 PHV5 HindIIIB/HPV22 ........... n I-390 pBR322/HPV23 .............. n I-391 pBR322/HPV24a ................. n I-392 pBR322/HPV24b ................. n I-393 pBR322/HPV28 ................. n I-394 pBR322/HPV29 ................. n I-395 pBR322/HPV31 ................. n- I-396 pSP64/HPV32 .................. n I-397 Il est enfin fait référence aux articles dont les références bibliographiques suivent, lesquels complètent en tant que de besoin la description de l'état de la technique antérieur. dans la mesure où cela pourrait s'avérer utile à la compréhension complète du texte par le lecteur. A ce titre,- le contenu de ces articles doit donc etre considéré comme faisant partie de la description. BIBLIOGRAPHIE (1) Dürst, M. et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:3812-3815. (2) Coggin, J.R., 3r. et al., 1979, Cancer Res., 39:545 546. (3) Gissmann, L. et al., 1982, 3. Virol. 44:393-400. (4) Green, M. et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:4437-4441. (5) Hejiman, C.A. et al., 1980, Virol. 36:395-407. (6) Jablonska, S. et al., 1972, Cancer Res., 32:583-589. (7) Jablonska, S. et al., 1982, Springer Semin. Immuno pathol. 5:33-62. (8) Kremsdorf, D. et al., 1982, J. Virol. 43:436-447. (9) Kremsdorf, D. et al., 1983, 3. Virol. 48:340-351. (10) Lutzner, M.A. et al., 1978, Bull. Cancer, 65:169-182. (11) Lutzner, M.A. et al., 1983, Lancet ii:422-424. (12) Migozzi, M. et al., 1965, Bull. Soc. Franc. Derm. Syph. 72:747-748. (13) Orth, G. et al., 1980, Cold Spring Harbor Conf. Cell Proliferation, 7:259-282. (14) Orth, G. et al., 1981, J. Invest. Dermatol. 76:97-102. (15) Orth, G. et al., 1979, Cancer Res. 39:1074-1082. (16) Ostrow, R.S. et al, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79:1634-1638. (17) Ostrow, R.S. et al., 1983, Ann. Acad. Dermatol. 8:398-404. (18) Pfister, H. et al., 1983, Cancer Res. 43:1436-1441. (19) Pfister, H. et al., 1983, J. Virol. 47:363-366. (20) Pfister, H. et al., 1981, Int. J. Cancer, 27:645-650. (21) Rueda, L.A. et al., 1976, Med. Cut. I.L.A. 1:113-136. (22) Ruiter, M. et al. 3. Invest. Dermatol., 47:247-252. (23) Sutcliffe, J.G., 1978, Nucleic Acids Res. 5:2721-2728. (24) Tsumori, T. et al., 1983, J. Gen. Virol. 64:967-969. REVENDICATIONS 1 - ADN-HPV ayant une taille comprise entre environ 7000 et environ 8000 paires de bases ou un fragment de cet ADN-HPV, celui-ci étant choisi parmi les ADN-HPVs obtenus à partir des papillomavirus qui répondent aux désignations HPV-2d, HPV-10b, HPV-14a, HPV-14b, HPV-15, HPV-17a, HPV-17b, HPV-19, HPV-20, HPV-21, HPV-22, HPV-23, HPV-24, HPV-28, HPV-29, HPV-31 et HPV-32. 2 - Fragment d'ADN selon la revendication 1, carac térisé en ce qu'il correspond aux gènes El, E6-E7, L1 ou L2 ou qu'il correspond encore à un fragment correspondant à une région intergénique dudit ADN-HPV. 3 - ADN recombinant contenant un ADN-HPV selon la revendication 1 ou un fragment selon la revendication 2. 4 - ADN, fragment ou ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 3 pour l'utilisation en tant que sonde de détection d'ADN-HPVs. 5 - Composition utilisable pour la détection de papillomavirus dans un milieu biologique le contenant, caractérisée en ce qu'elle contient plusieurs ADN-HPVs distincts conformes à a revendication 1 ou plusieurs fragments issus de ADN-HPVs distincts conformes à la revendication 2 ou plusieurs ADNs recombinants respectivement issus d'ADN-HPVs distincts entre eux selon la revendication 3. 6 - Nécessaire ou kit comportant une pluralité de sondes ou mélange de sondes distinctes, caractérisé par 9 groupes de sondes , chacune desquelles comporte 1) au moins l'ADN de l'HPV2d, 2) au moins l'un des ADNs de HPV 1Ob, 28 et 29, 3) au moins l'un des ADNs de HPV 17, 24, 4) au moins l'un des ADNs de HPV 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22 et 23, 5) au moins l'un des ADNs de HPV 15 et 17, 6) l'ADN de HPV 24, 7) l'ADN de HPV 14, 32, 8) l'ADN de HPV 31, 9) l'ADN de HPV 32, étant entendu que les ADNs des neuf groupes sont choisis de façon à être en toutes circonstances différents les uns des autres dans la mesure où chacun des neuf groupes serait réduit à un seul des ADNs qui le composent. 7 - Procédé de détection et d'identification de papillomavirus contenus dans un échantillon biologique comprenant la réalisation d'essais d'hybridation avec un ou plusieurs ADN-HPVs, fragments d'ADN-HPVs ou ADNs recombinants conformes à l'une quelconque des revendications t à 3 ou encore plusieurs compositions distinctes conformes à la revendication 4, et la détection de ceux des ADN-HPVs, fragments ou ADNs recombinants ou encore compositions qui donnent lieu à hybridation préférentielle avec les ADN-HPVs préalablement obtenus à partir desdits echan- tillons biologiques. 8 - Papillomavirus purifiés biologiquement purs, caracterisés en ce qu'ils appartiennent au meme type que l'un de ces papillomavirus identifiés dans la revendication 1.