FR 2577140 A1 19860814 FR 8501892 A 19850211 Antigènes Drotecteurs de Leishmania. comnositions les contenant et procédé Dour les obtenir. L'invention concerne des antigènes protecteurs de Leishmania utiles pour la production de compositions vaccinantes contre les leishmanioses. Elle concerne également es compositions d anticorps dont la production peut etre induite in vivo à l'aide des antigènes protecteurs susindiqués. anticorps qui sont eux-memes capables de neutraliser aQ vivo les parasites responsables des leishmanioses. On a décrit dans le brevet n" 84 15079 des anticorps monoclonaux capables de reconnaitre des déterminants antigéniques communs à des espèces variées de Leishmania et d'exercer un effet protecteur in vivo contre diverses espuces de Leishmania. Ces anticorps monoclonaux sont caractérisés par leur capacité à inhiber l'infection de cellules sarcomateuses par les formes promastigotes de une ou plusieurs espèces de Leishmania. lorsque ces cellules sarcomateuses sont mises en contact avec lesdites formes promastigotes pré-incubées avec ces anticorps monoclonaux dans des conditions qui. en 1 absence desdits anticorps monoclonaux, conduiraient à une parasitémie élevée dans lesdites cellules. Le procédé d obtention et d'isolement d hybridomes secréteurs de tels anticorps monoclonaux anti-Leishmania et possédant les propriétés sus-indiquées a également été décrit. Ce procédé est caractérisé en ce que l'on met en contact les formes promastigotes infectieuses avec, d'une part, des anticorps monoclonaux reconnaissant des antigènes d'une ou plusieurs espèces de Leishmania et secrétés parmi des hybridomes préalablement formés de façon en soi connue entre des cellules de myélome et des cellules spléniques d un animal. notamment la souris. préalablement immunisé contre une ou plusieurs souches de leishmanies et, d'autre part, avec des cellules sarcomateuses dans des conditions qui, en l'absence desdits anticorps, conduiraient à une infection parasitaire desdites cellules sarcomateuses. et en ce que l'on sélectionne ceux de ces anticorps monoclonaux qui. dans l opération précédente, protègent complètement in vive les cellules sarcomateuses vis-å-vis de l'infection par lesdites Leishmania. après leur injection dans le péritoine dune souris sensible auxdites cellules sarcomateuses, plus particulièrement d'une souris Balb/c. De préférence -mais non nécessairement- les formes promastigotes mises en oeuvre sont prétraitées avec les anticorps monoclonaux avant l'injection dans la souris Balb/c. Ce prétraitement consiste de préférence en un contact maintenu à 37-C, pendant 30 minutes.L'infection éventuelle desdites cellules sarcomateuses peut être appréciée par prélèvement de l ascite, lorsque celle-ci s'est formée dans la cavité péritonéale de la souris. mise en culture des cellules sarcomateuses de l'ascite dans un milieu approprié, par exemple le milieu NNN, et détection éventuelle des promastigotes formés dans le milieu. Il va sans dire que la sélection des hybridomes secréteurs est en rapport direct avec celle des anticorps monoclonaux protecteurs. Les anticorps monoclonaux ou des mélanges de ces anticorps monoclonaux ont permis la reconnaissance d an- tigènes de poids moléculaire déterminés communs à diverses espèces de Leishmania. notamment L infantum. L. troDica, L. mexicana amazonensîs, L. brasiliensis quvanensis. En particulier, il a été remarqué que trois antigènes ayant des poids moléculaires de l'ordre de 40 kD. 70 kD et 113 kD étaient constamment reconnus dans la panoplie des Leishmania de l'Ancien et du Nouveau Monde. La présente invention vise à caractériser davantage encore des antigènes protecteurs apparentés à ceux décrits dans le brevet principal et susceptibles d'être mis en oeuvre pour la production de compositions de vaccins. Elle a également encore pour but l'isolement d'autres antigènes. notamment de poids moléculaires plus petits, qui présentent des propriétés immunogènes et pro tectrices semblables. Les résultats des essais dont la description suit démontrent, s'il en était encore besoin, que des espèces de Leishmania aussi variées que celles qui ont été rappelées plus haut avaient toutes en commun la capacité d'être neutralisées par des anticorps préalablement formés contre un antigène ayant un poids moléculaire de l'ordre de 70.000 et obtenus à partir de l'une d'entre elles. Les essais du genre en question ont d'autre part fait apparaitre que l'on pouvait isoler à partir de lysats de ces diverses espèces de leishmanies des antigènes pro tecteurs ayant des poids moléculaires beaucoup plus pe tits, notamment inférieurs ou égaux à 30.000 kD. Les essais dont l'exposé suit ont également fait apparaitre la nature glucidique de certains des antigènes protecteurs concernant l'invention. Ainsi a-t-il été constate que l'antigène protec teur de 70 kO, qui peut etre obtenu à partir des susdits lysats. contient des groupes glucose et mannose, et que des antigènes protecteurs présentant des poids molécu laires respectivement de 20 et 30-32 kD comportaient des groupes fucose et a-D-l-acétyl-galactosamine. Partant des résultats décrits dans le brevet n 84 15079 des expériences de vaccination chez la souris Balb/c avec des extraits de promastigotes de L. infantum ont été menés de la façon suivante Les prosmatigotes ont été lysés ainsi : le culot de parasites a été suspendu dans du tampon Tris 1OmM pH 7.5 contenant des détergents du type NP40 (0,5 +/.) et SDS (1 Z). . La suspension obtenue a ensuite été traitée par ul- trasons (s-oniquée) pendant 1 minute 30 secondes. L'homogénat a été repris dans du "tampon d'échan tillonnage" ("sample buffer") contenant 5 7. de (3-mercapto-éthanol, 3 Z de SDS, 0,065 M Tris et 10 Z de glycérol, et déposé sur un gel de polyacrylamide et de dodécylsulfate de sodium à 10 Z d'acrylamide (PAGE-SDs), Après électrophorèse, une partie du gel a été colorée afin de révéler les bandes protéiques et une autre partie, non colorée, a été découpée en 6 fractions nommées F1, F2 F6. Les fourchettes ou plages de poids moléculaires correspondant à chaque fraction ont été les suivantes (poids moléculaires appreciés d'après les distances de migration desdites protéines, comparées à celles des protéines de poids moléculaires utilisées dans les expériences décrites dans le brevet n 84 15079) Fractions Plaqes de poids moléculaire F1 > 94.000 daltons F2 entre 94.000 et 67.000 daltons F3 entre 67.000 et 43.000 daltons F4 entre 43.000 et 30.000 daltons F5 entre 30.000 et 20.000 daltons FS en dessous de 20.000 daltons. Chaque fraction a été eléctr3éluée du gel, puis dialysée. et enfin soit lyophilisée, soit conservée telle quelle à -80-C. L'activité protectrice éventuelle de chacune de ces fractions a été évaluée par la capacité de ces fractions à induire in vivo la production d'anticorps aptes à inhiber in vivo l'infection parasitaire de cellules-sarcomateuses TG180, dans des essais réalisés selon le protocole decrit dans le brevet principal. si ce n'est que des parasites ont été préincubes avec des sérums obtenus à partir des animaux (souris) immunisés avec les susdites fractions, avant d'être mis en contact avec les cellules qui ont ensuite été injectees à des souris Balb/c. On indique ci-apres les conditions dans lesquelles les deux lots de souris utilisées ont été immunisées. a) Par voie sous-cutanée (5 souris/fraction). Chaque souris a reçu 3 injections à un mois d'intervalle, de 100 mg de fraction du stock maintenu à -80-C avec 100 'jg de muramyldipeptide (MDP). Les controles ont été faits avec du NaCl 0,15 M + MDP 100 pg. b > Par vole intraveineuse (8 souris/fraction). Chaque souris a reçu 3 injections à un mois d'intervalle de 100 ijg de fraction du stock lyophilisé. Les controles ont été faits avec NaCl 0.15 M. Dans tous les cas, 3 mois après l'immunisation, les sérums des animaux immunisés ont été prélevés et le sérum de chaque animal a été décomplémente, puis utilisé dans le test de protection précédemment décrit dans le brevet n 84 15079. On a ainsi testé l'effect protecteur de chaque sérum de souris sur un mélange de 4 souches de Leishmania (L. infantum. k. mexicana amazonensis. L. trooica et L. brasiliensis auvanensis). Dans le tableau qui suit et dans lequel sont in diqués les effets protecteurs induits par les sérums obtenus chez les animaux préalablement immunisés par les fractions F1 à F6, on entend par "protection complète avec tous les sérums" , la capacité pour les sérums en cause d'inhiber l'infection parasitaire des cellules sarcomateuses de la lignée TG180 dans tous les animaux des groupes 3 concernés, lorsque 2 x 103 cellules de cette lignée sont injectées dans le péritoine des souris immunisées en mélange avec 105 promastigotes non prétraités par les sérums. Les résultats sont résumés dans le tableau ciaprès Fraction Effet Drotecteur F1 pas de protection constante F2 protection complète avec tous les serums F3 pas de protection constante F4 pas de protection constante F5 protection complète avec tous les sérums F6 protection complète avec tous les sérums controle pas de protection du tout. Ces résultats sont identiques tant avec les sérums de souris immunisées par voie intraveineuse que par voie sous-cutanée. Par ailleurs on a caractérisé la nature glucidique des différentes fractions obtenues à partir de lysat de L. infantum. Pour cela, un lysat de L. infantum a été résolu sur gel de PAGE-SDS à 10 Z d'acrylamide. dans les memes conditions que précédemment. puis le profil électrophorétique a été transféré sur feuille de nitrocellulose. La feuille de nitrocellulose a été découpée en plusieurs bandes de papier comportant toutes, après transfert, le susdit profil électrophorétique. Chaque bande de papier a fait l'objet d'une révélation à l'aide de lectines conjuguées à de la péroxydase et fabriquées par la technique de J.L. GUESDON et Col. (J. of Immunological Methods 39 (1980), 1-131. Les conjugués suivants ont été fabriqués 1) Concanavaline lectine conjuguée - péroxydase 2) Ulex europaeus - péroxydase. 3) Dolichos biflorus - péroxydase, ces différentes lectines étant caractérisées par des affinités marquées respectivement pour 1) le mannose. glucose, 2) le fucose et 3) l a-D-N-acétyl-galactosamine. Le papier est incubé 30 minutes avec une dilution au 11200e de la lectine conjuguée, puis après plusieurs lavages en présence de l'agent mouillant TWEEN 20 à 0,1 X, on a révélé la présence de lectine fixée par la présence de la péroxydase associée, en ajoutant les substrats de cette dernière (eau oxygénée et diaminobenzidine). La présence d'un précipité marron sur le papier permet la localisation de l'activité enzymatique. Les résultats sont les suivants lectine bande reconnue sucre concerné x ConA-PO 70 kDaltons glucose. mannose Ulex-PO 85 kD fucose 30 kD 20 kD Dolichos-PO 85 kD -D-N-acétyl-galactosamine 60 kD 32 kD 20 kD Les poids moléculaires sont estimés à 10 Z. Les résultats marqués d'une astérique concernent des bandes qui se sont révélées être reconnues par les anticorps des animaux immunisés avec les fractions contenant les poids moléculaires correspondants. L'invention concerne par conséquent également les compositions immunogènes caractérisées par l'association de l'une au moins des fractions actives sus-indiquées avec un excipient physiologiquement acceptable permettant son administration à un hôte vivant, en vue de lui conférer une immunité à l'égard non seulement de ces fractions polypeptidiques, mais également des parasites pathogènes. On remarquera d'tailleurs que des sérums isolés à partir de 20 malades ont montré que les sérums de 2 malades seulement reconnaissaient la glycoprotéine de 70 kD. Ce fait tend à montrer que. pour être protégés contre les leishmanioses, les organismes humains doivent normalement contenir des anticorps formés contre la glycoprotéine de 70 kD. En effet, l'absence d'anticorps correspondant dans les serums de malades s'explique par la lenteur de la formation des anticorps protecteurs. A 1 inverse, les différentes fractions selon l'invention peuvent également être utilisées dans un procédé de détection de la présence d'anticorps antileishmanies, notamment dans des échantillons sanguins provenant de l'homme ou de l'animal. par exemple pour vérifier ltexistence ou non d'une protection de l'hôte contre les leishmanioses. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes, REVENDICATXONS 1 - Composition contenant des antigènes protecteurs contre des leishmanioses, caractérisée par le fait qu'elle contient des glycoproteines susceptibles d'entre obtenues à partir de lysats de leishmanies. 2 - Composition selon la revendication 1, carac térisée en ce qu'elle contient une glycoprotéine protectrice ayant un poids moléculaire de l'ordre de 70 kD et comportant des groupes glucose et mannose. 3 - Composition productrice contenant des glycoprotéines isolables à partir de lysats de leishmanies présentant des poids moléculaires de l'ordre de 20 kD et contenant des groupes fucose et a-D-N-acetyl-galacto- samine, 4 - Composition productrice contenant des glycoprotéines isolables à partir de lysats de leishmanies présentant des poids moléculaires de l'ordre de 30-32 kD et contenant des groupes fucose et a-D-N-acetyl-galacto- samine. 5 - Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, utile pour la constitution de vaccins pour l'homme ou l'animal, cette composition comportant en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour l'administration à l'homme ou à l'animal, de préférence par voie parentérale.