FR 2574185 A1 19860606 FR 8418268 A 19841130 La présente invention concerne de nouveaux polymères de lysine destinés à être utilisés comme supports pour la préparation de réactifs pour diagnostics des allergies hapténiques. Il a été décrit, dans la Demande de Brevet Européen déposée le 6 août 1981 snus le n 81401267.0 par le Demandeur, des polymères de lysine utilisables comme supports pour la préparation de produits de diagnostic, répondant à l'une des formules suivantes H - Lys, OH et dans lesquelles n est un nombre entier compris entre 8 et 20, et de préférence compris entre 8 et 12 et n' est un nombre entier compris entre 4 et 10 et Lys représente le radical de la L-lysine. Ces polymères de lysine se sont montrés être très utiles comme supports pour la préparation de produits de diagnostic dans les tests cutanés destinés à deceler une allergie à la pénicilline ou à tout autre antibiotique du type ss - lactame. Ces polymères de lysine se sont avérés toutefois mal adaptés à la préparation de réactifs pour diagnostics des allergies hapténiques, lorsque les haptènes qui doivent être couplés sur ces polymères, sont hydrophobes. Les polymères en question qui sont totalement substitués par les groupes hapténiques sont, en effet, insolubles en milieu aqueux, lorsque l'on couple à ces polymères des haptènes hydrophobes, et conviennent donc difficilement à des tests cutanés. La présente invention vise à surmonter cette difficulté en proposant de nouveaux supports de polylysine partieilement substitués par des substituants hydrophiles et sur lesquels sont couplés les haptènes hydrophobes La présente invention propose donc de nouveaux polymères de lysine qui, après couplage avec les haptènes hydrophobes, comportent en alternance des groupes hydrophiles et des groupes hydrophobes. La présente invention concerne également les produits de couplage des polymères de lysine avec les haptènes. Elle a également pour objet l'application de ces produits de couplage à la préparation de réactifs pour diagnostics des allergies hapténiques. La présence combinée de substituants hydrophiles et de substituants hydrophobes sur la chaine d'oligolysine permet de notablement améliorer la solubilité du support de polylysine dans l'eau et rend ledit support particulièrement approprié pour déceler les allergies hapténiques dans les tests cutanés. Si l'utilisation des nouveaux polymères de lysine substitués conformes à l'invention présente un intérêt tout particulier pour la détection des allergies hapténiques dans les tests cutanés, leur utilisation n'est pas limitée à ces seuls tests. De récentes études effectuées par Le Demandeur a pu constater que la présence des groupes hydrophiles sur le polymère de lysine n'affectait en rien l'efficacité du polymère à déceler les allergies hapténiques et que les polymères conformes à la présente invention se comparaient avantageusement aux polymères de lysine décrits dans la Demande de Brevet Européen précitée. Les substituants hydrophiles utilisés sont avantageusement constitués par des substituants du type carboxylatoalkyle ou par des oligohyd roxy. La préparation des oligolysines conformes à l'invention qui doivent être substituées par des groupes polaires et plus particulièrement par des restes du type carboxylatoalkyle ou des oligohydroxy et des groupes hapténiques hydrophobes, nécessite que soient protégées les chaines latérales de la chaîne d'oligolysine par des groupes protecteurs différents susceptibles d'être éliminés sélectivement. Après élimination du premier type de groupes protecteurs, les haptènes (par exemple) peuvent être fixés sur les groupes amino libérés. Dans une étape subséquente du procédé, les groupes amino encore protégés sont débloqués pour permettre la fixation des groupes polaires. On utilise avantageusement comme groupes protecteurs des chaines latérales les groupes tert-butyloxycarbonyle Boc- et le groupe benzyloxycarbonyle Z-.Le groupe Boc peut être éliminé par acidolyse par exemple par l'acide trifluoroacétique, tandis que le groupe Z- peut être éliminé par hydrogénolyse catalytique. Dans le cas où l'on utilise des substituants hydrophiles du type oligohydroxy, il est en général avantageux d'introduire ces substituants en dernier, c'est-à-dire après couplage de la chaîne d'oligolysine avec les haptènes. Ceci peut être illustré par exemple sur le modèle monomère N1 - Boc - N6 - phénylacétyl - diaminohexane (1): Dans cet exemple, le phénylacétyle représente l'haptène à fixer et le diaminohexane représente ie monomère lysine. Après élimination du groupe protecteur Boc, on fait réagir la lactone de l'acide gluconique pour obtenir le N1 -gluconyl -N6-phénylacétyl diaminohexane. Dans le cas des substituants hydrophiles du type carboxylatoalkyle, il est avantageux d'introduire la lysine comportant le reste carboxylatoalkyle convenablement protégé dans la chaine d'oligolysine. La polylysine. comportant les groupes hydrophiles obtenue à l'étape finale du procédé, et qui est totalement protégée, est débloquée de telle sorte que les fonctions carboxylique et amino soient libérées simultanément. Le support de polymère de lysine totalement déprotégé peut alors être substitué par les groupes hapténiques hydrophobes en couplant audit support les haptènes préalablement activés en les mettant sous forme d'ester, éventuellement en présence d'un agent de condensation. Le procédé de préparation des polymères de lysine conformes à l'invention comportant des groupes carboxylatoalkyle comme substituants hydrophiles comprend la série d'étapes suivantes - dans une première étape, on couple un dérivé de la lysine dont la fonction carboxylique est protégée, avec un dérivé de la lysine dont l'azote terminal est protégé et dont- la fonction carboxylique est activée, ledit dérivé comportant le reste carboxylatoalkyle convenablement protégé que l'on désire introduire dans la chaîne d'oligolysine, - dans chacune des étapes successives suivantes, on couple la chaine d'oligolysine obtenue dans l'étape précédente et après déprotection de l'azote terminal, alternativement avec un dérivé de la lysine convenablermernt protégé et activé tel que celui utilisé dans la première étape, mais ne comportant pas de reste carboxylatoalkyle, et avec un dérivé de la lysine tel que celui utilisé dans la première étape comportant un reste carboxylatoalkyle, - dans une étape finale, et avant couplage avec les haptènes. on déprotége simultanément les fonctions amino et ca rboxyl tique Il sera décrit. ci-après, à titre d'exemple, la synthèse de l'héterornère déca-L-lysine (PAL 5+5) constitué de deux chaînes pentalysine reliées ensemble par l'intermédiaire de leur azote terminal par un pont acide adipique, substitué par des restes carboxylatopentanoyle sur quatre des groupes amino de la chaîne d'oligolysine (II), et répondant à la formule où Ad désigne le reste acide adipique -CO-(CH2)4-CO-. Comme exemple de fixation d'un haptène hydrophobe sur le PAL 5+5, on décrira le couplage de l'acide o-méthoxybenz & que (ici) L'acide o-méthoxybenzotque est un analogue de l'acide acétylsalicylique, mais présente une plus grande stabilité que l'haptène acétylsalicylique. L'acide o-méthoxybenzoTque a été transformé en l'ester de N-hydroxysuccinimide par une méthode connue en sol et a été ajouté sous forme de solution de tétrahydrofuranne avec environ deux fois la quantité stoechfométrique au support PAL 5+5 dans une solution aqueuse de carbonate de potassium.Le couplage s'est effectué en phase homogène et le produit de couplage qui avait une réaction négative avec la ninhydrine, a présenté les propriétés spectrales attendues. te produit était totalement substitué sur les six restes de la L-lysine non substitués par l'acide adipique et présentait une solubilité dans l'eau appropriée pour les test cutanés. Comme autres exemples de fixation d'un haptène hydrophobe sur le PAL 5+5. on décrira également le couplage de la carboxylatovaléroyl-arninoantipyrine de fornule et le couplage de la D- a - phénylglycine (désignée dans la suite du texte par l'abréviation D-a-Phg). La carboxylatovaléroyl-aminoantipyrine (IV) et la D- - phénylglycine (V) ont été activées préalablement à la réaction avec PAL 5+5, par transformation en ester de 4-hydroxysuccinimide, et ont été ajoutées sous forme de solution de tétrahydrofuranne au support PAL 5+5 dans une solution aqueuse de carbonate de potassium. La synthèse du PAL 5+5 a été réalisée en utilisant le procédé de purification à deux phases, tel que décrit par Schneider et al. dans J. Peptide Protein Res. 15, 411-419 (1980) et par Rolli et Schneider dans Chimia 35, 403-405 11982). Les extractions ont été effectuées en utilisant la technique décrite par Schneider et al. dans Int. J. Peptide Protein Res. 15, 411-419 (1980). Le contrôle analytique des produits a été effectué par chromatographie sur couche mince (TLC) (Rolli et al., int. J. Peptide Protein Res. 15, 339-410 (1980)). Le système A est un mélange chloroformelméthanol 9:1. Ltélectrophorèse sous haute tension sur couche mince (HVTLE) a été réalisée à l'aide d'un Phérographe Francfort. Mini 68 ou d'un appareil Camag. Les abréviations utilisées dans la suite du texte sont celles recommandées par la Commission IUPAC-IUB sur la nomenclature Biochimique publiée dans Biochemistry 11, 1726-1732 (1972) Lys = L-lysine Ala = alanine Boc = tert-butyloxycarbonyle -ONBzl = nitrobenzyloxy - ester de p-nitrobenzyle OBzl = ester de benzyle OSu = ester de N-hydroxysuccinimide Z- = benzyloxycarbonyle Nps = p-nitrophénylsulfényle DOC = dicyclohexylcarbodiimide HOBt = 1-hydroxybenzotriazole DMF = diméthylformamide TllF = tétrahydrofuranne TFA = acide trifluoroacétique DCHA = dicyclohexylamine DMSO = diméthylsulfoxyde Appliqués à la détection des allergies hapténiques dans les tests cutanés, les polymères de lysine substitués conformes à l'invention, après couplage avec les haptènes, sont utilisés tels quels, généralement sous forme de solutions ou suspensions réalisées dans une phase aqueuse, de préférence saline. Lorsqu'on utilise les polymères de lysine conformes à l'invention pour la détection des allergies hapténiques dans les tests sérologiques, ces polymères sont couplés à un support solide, généralement un polymère insoluble, tel que cellulose, sépharose et se présentant sous la forme de billes, de disque ou de tube. On utilise avantageusefrSent comme support solide insoluble un gel d'agarose préalablement activé par mise sous la forme ester, tel que l'ester succinimide et auquel on lie de façon covalente le polymère de lysine conforme à l'invention, par f'intermédiaire d'un groupe amino libre que comporte ledit polymère. La présence combinée de groupes hydrophiles et de yroupes hydrophobes, outre ie fait qu'elle permet d'accroitre la solubilité dans l'eau du conjugué haptène-polymère de lysine, confère à celui-ci un certain nombre de particularités mises à profit dans les tests sérologiques. Cette alternance de groupes hydrophiles et de groupes hydrophobes, tout en favorisant le caractère hydrophile du polymère de lysine, est également favorable à une bonne interaction antigène-anticorps en milieu aqueux. La molécule haptène-polylysine substituée a une charge neutre qui prévient les réactions non spécifiques entre immunoglobulines et support fixe, ce qui a pour effet de diminuer le bruit de fond non spécifique lors d'un dosage radioimmunologique. Le fait, enfin, de disposer d'un antigène plurivalent présentant plusieurs déterminants antigéniques dont la structure moléculaire n'est pas modifiée par le milieu réactionnel, permet une totale interaction entre les antigènes et les anticorps à détecter. ce qui est d'un grand intérêt du point de vue sérologique. Les exemples I et Il donnés, d-aprês, à titre non limitatif, illustrent respectivemernt la préparation d'un dérivé monomère substitué par un groupe oligohydroxy et la préparation du PAL 5+5 et son couplage avec divers haptènes. L'ensemble des opérations que comporte la préparation du support PAL 5+5 et son couplage avec un haptène est schématisé à la page 7. L'exemple III- illustre l'utilisation d'un conjugué benzylpenicilloyl-PAL 5+5 couplé à un support solide pour la détection d'anticorps anti-benzylpenicilloyl (BPO) dans les tests sérologiques. EXEMPLE I N1 -Boc-N6-phénylacétyl-1 6-diaminohexane On a mélangé 545 mg (4 mmoles) d'acide phénylacétique et 600 mg (4 mmoles) de 1-hydroxybenzotriazole (90%) dissous dans 15 ml de THF avec 908 rng (4,4 mmoles) de DOC à 50C et on a agité à cette température pendant 1 heure. On a ajouté à cette solution 1 ,01 g (4 mmoles) de chlorhydrate de N1-Boc-1 ,6-diaminohexane et de la triéthylamine jusqu'à pH 7. Après 1 heure, on a séparé le précipité par filtration et on a repris le filtrat à sec sous vide à 40 C.On a dissous le résidu (2,7 g) dans 100 ml d'acétate d'éthyle et extrait six fois avec des portions de 50 ml de K2CO3 2M puis HC1 0,1 M et on a finalement lavé à l'eau jusqu'à neutralité. On a séché la solution sur du Na2SO4 et on a éliminé le solvant sous vide : on a obtenu 24 g de résidu amorphe. TLC : Rf 0,94, homogène (1,4-dioxannelH2O 5:1), Rf 0,47, homogène (CHCl3/CH3OH 9:1). N1 -Gluconyl-N6-phénylacétyl-1,6-diaminohexane On a maintenu 636 mg (1,9 mmole) de N1-Boc-N6-phénylacétyl- -1,6-diaminohexane dans 10 mi d'acide trifluoroacétique refroidi dans de la glace pendant 1 heure. Après élimination de l'acide sous vide, on a dissous l'huile résiduelle dans 3 ml de THF/H2O (1:2) et neutralisé à froid avec de la triéthylamine. On a ajouté à cette solution 400 rng (2,2 mmoles) de lactone de l'acide D(+)-gluconique (Fluka, Buchs) dissous dans 1 ml d'eau et on a ajusté le pH à 9 avec de la triéthylamine.Après 12 heures, on a ajouté une portion supplémentaire de 400 mg de la lactone de l'acide gluconique et on a recueilli, après 24 heures, le produit par filtration après acidification de la solution réactionnelle à pH 2 avec HCI 2M. Le produit brut (265 mg) a été recristallisé dans le rnélange éthanol/isopropanol (1:1) pour donner 160 mg, p. f. 180-1830C. TLC : Rf 0,81, homogène (1,4-dioxanne/H2O, 5:1). IR (KBr) 3 300 br. (OH), 2 920 (CH, -CH2-) 2 850 (CH, -CH2-) 1 635 (C=O, amide), 1 545 (NH, O=C-N), 1 445 (aromatique), 1 430 (OH, alcool Schéma de la synthèse du PAL 5+5 (II) Produits Lye Lys Lys Lys Lys 1 2 3 4 5 OBzl I-- + I-l Boc > Ad H Boc- OSu OBzl P-2 Boc ONBzl OBzl Boc OSu H Ad ONBzl OBzl P-3 Bo Ad 0NBzl ?Bzl 0Bzl Ad Z Ad Z -ONBzl floc-OSu H Ad ONBzl OIBzl OBzl P-4 Boc Ad z Ad ONBzl OIBz OBzl Boc OSu f Ad z Ad ONBzl OBzl OBzl P-5 Z Ad Z Ad Z ^NBzl OBzl OBzl P-5d H d ld Z Ad ONBzl 2 P-5d + acide adipique dicyclohexylcarbodiimide > PAL 5+5 l-hydroxybenzotriazole protégé PAL 5+5 hydrogenolyse / Pd sur C primaire), 1 210 (OH, alcool secondaire). Analyse élémentaire C20H32N2O7 (412,48), calculé C 58,24 H 7,82 N 6,79 % trouvé C 58,41 H 7,54 N 6,72 9 EXEMPLE Il Synthèse du PAL 5+5 H-Lys (Z) -ONBzl (1-1) On a agité 7,4 g (12 mmoles) du sel Nps-Lys-- Z) DCHA et 2,6 g (12 mmoles) de bromure de 4-nitrobenzyle dissous dans 50 ml de DMF à la température ambiante, après addition de 1,3 mi (12 mmoles) de N-méthylmorpholine. On a dilué la solution réactionnelle avec un excès de CH2Cl2et extrait avec HCI 0,1 M, H20, K2 C03 0,3 M et à nouveau avec de l'eau.L'évaporation du solvant sous vide à laissé une huile jaune qui a été reprise dans 160 ml de méthanol et agitée, pour éliminer Nps, dans l'obscurité pendant 30 min avec 20 ml d'acide acétique glacial et 200 ml de Na2S203 1 M. On a séparé par filtration le précipité jaune de Nps-disulfure, et on a dilué le filtrat jusqu'à 400 ml avec CH2CI2 pour extraction avec de l'eau, K2CO3 0,15 M et H2 O. L'élimination du solvant et le séchage sous vide ont laissé 3,9 g (9,3 mmoles) d'une masse cristalline jaunâtre TLC : Rf 0,38, tache principale, traces à Rf 0,27 et 0,81 (Nps-disulfure) (système A). Ester de 1-benzyl-6-N-hydroxysuccinimide de l'acide adipique On a dissous 14,6 g (100 mmoles) d'acide adipique et 5,4 g (50 mmoles) d'alcool benzylique dans 70 ml de DMF, puis on a agité pendant 90 min à la température ambiante avec 11,3 g (55 mmoles) de DCC et 150 mg de 4-diméthylaminopyridine. On a séparé par filtration le précipité d'urée et on a dilué le filtrat jusqu'à 400 ml avec CH2C12 pour l'extraction avec HCl 0,1 M et H2O. On a éliminé le solvant sous vide et on a repris le résidu dans 300 ml d'acétate d'éthyle et extrait 3 fois avec 100 mi de K2C03 0,15 M.On a lavé les extraits réunis avec de l'acétate d'éthyle et acidifié avec HCl 2M à pH 3,5. On a extrait l'émulsion résultante 3 fois avec 150 ml de CH2CI2. On a repris l'extrait à sec sous vide et on a chromatographié ie résidu brut (8,6 g) sur une colonne de gel de silice (100 g de gel de silice 60) avec CHCl3/méthanol (9:1). Rendement: 7,0 g (30 mmoles) de 11ester monobenzylique de l'acide adipique sous forme d'une huile. TLC : Rf 0,50, homogène (A). On a mélangé ce produit dissous dans 50 ml de DMF avec 3,7 g (32 mmoles) de DCC et agité à la température ambiante pendant 22 heures. On a obtenu par extraction 10,0 g (30 mmoles) d'une huile légèrement jaune.TLC : Rf 0,84, tache principale, trace à Rf 0,93 (A). Boc-Lys(Ad(OBzl))-OSu (1-2) On a agité 10 g d'ester de 1-benzyl-6N-hydroxy-succinimide et 7,4 g (30 mmoles) de Boc-Lys dissous dans 50 ml de DMF, à la température ambiante pendant 18 heures après avoir ajusté le pH à 8 avec de la N-méthylmorphotine. II s'est - formé un léger trouble qui a pu être dissipé en ajoutant 10 ml de DMSO. On a filtré le mélange réactionnel, dilué le filtrat avec CH2Cl2 jusqu'à 400 ml et extrait avec HCl 0,1 M et H2O. On a éliminé sous vide -la phase organique et on a repris le résidu dans 300 ml d'acétate d'éthyle et extrait 3 fois avec 100 ml de K2CO3 0,15 M. On a acidifié l'extrait à pH 3,5 avec HCl 2M et on a extrait le produit avec du CH2Cl2 (3 fois 100 ml). On a finalement lavé la solution de CH2C12 avec HC1 0,1 M et H2O. L'élimination du solvant et le séchage sous vide ont laissé 10,8 g (23 mmoles) de Boc-Lys (Ad(OBzl)) sous la forme d'une huile jaunâtre. On a dissous celle-ci dans 100 mi de DMF et mélangé à froid à 2,6 g (23 mmoles) de HOBt et 5,2 g (excès de 10 %) de DCC. Après avoir laissé la solution 1 heure à 0 C et 16 heures à la température ambiante, on a filtré celle-ci et, après dilution avec CH2Q2, on a isolé le produit par extraction : on a obtenu 12,6 g (22 mmoles) d'une masse incolore, visqueuse. TLC : Rf 0,59, tache principale, traces de produits secondaires (A). Boc-Lys(Z-Lys(Ad(OBzl)-Lys(Z)Lys(Ad(OBzl))Lys(Z)ONBzl (P-5) Partant de 3,9 g (9,3 mmoles) de H-Lys tZ)-ONBzl on a obtenu le peptide P-5 en couplant étape par étape, à la température ambiante à la séquence dont l'azote terminal a été préalablement débloqué, respectivement 9,3 mmoles de 1-2 (volume réactionnel 100 mi, CH2CI2) 6,3 mmoles de Boc-Lys(Z)-OSu (50 mi, CH2CI2) 5,8 mmoles de l-2 (50 ml, DMF), 5,2 mmoles de Boc-Lys(Z)-OSu (50 ml, DMF). Ces quantités étaient équimoléculaires ou en excès de 5% par rapport au peptide.Les durées réactionnelles étaient respectivement de 2, 20, 20 et 60 heures, le pH était de 8, et était ajiste pour chaque réaction avec la triéthylamine. Les esters d'hydroxysuccinimide n'ayant pas réagi restant à la fin des réactions, étaient transformés en dérivés extractibles avec les acides, par réaction avec la 2-diéthylaminoéthylamine. Le traitement des intermédiaires protégés P-2, P-3, P-4 s'est effectué par dilution des solutions réactionnelles avec un excès de CH2CI2 et extraction avec HCI 0,1 M, H 20, K2CO3 0,3 M et H2O. On a effectué les déprotections de l'azote terminal des intermédiaires P-2, P-3 et P-4 en dissolvant les peptides dans 50 ml d'acide trifluoroacétique aqueux à la température ambiante.Après 40 min, on a éliminé l'acide sous vide et on a dissous les huiles résiduelles dans 400 ml de CH2CI2 et extrait avec H 20, K2CO3O, 15 M et H2O dans une colonne d'extraction. On a alors éliminé sous vide les solvants. On a suivi toutes les étapes réactionnelles par TLC suivant la technique décrite par Rolli et al. dans Int. J. Peptide Protein Res. 15, 339-410 (1980). Le traitement de l'intermédiaire P-5 a dû être modifié, car il s'est formé une émulsion relativement stable de la phase aqueuse lors de l'extraction basique. On a pu éliminer en partie la phase organique et on a soumis l'émulsion à une évaporation sous vide à 400C, ce qui a fourni un précipité du produit.On a repris celui-ci et le résidu provenant de ia phase organique, après élimination du solvant sous vide, dans 100 ml de DMF. On a filtré et on a ajouté goutte à goutte au filtrat 1,5 litre d'eau sous agitation. On a recueilli le précipité de P-5 par filtration. on l'a lavé à l'eau et séché sous vide : on a obtenu 8,3 g (4,8 mmoles), d'une poudre pratiquement blanche. TLC : Rf 0,57 tache principale, traces de produits secondaires (A). H-Lys(Z)-Lys(Ad(OBzl))-Lys(Z)-Lys(Ad(OBzl)-Lys(Z)-ONBzl (P-5d) On a débloqué 8,3 g de P-S dans le TFA. comme il a été décrit pour P-2-4. Lors de l'extraction de la solution de CH2CI2 avec de l'eau, il s'est formé un gel et une émulsion. On a concentré le mélange sous vide jusqu'à ce que la majeure partie du produit ait précipité. II a été recueilli par filtration, lavé à l'eau et séché sous vide : on a obtenu un résidu de 7,8 g. TLC : Rf 0,71, tache principale, des traces de produits secondaires (1,4-dioxanne/H2O,9:1). On a mélangé 7,8 g (4,8 mmoles) de peptide P-5d et 330 mg (2,3 mmoles) d'acide adipique dans 30 ml de DMF avec 750 mg (5 mmoles) de HOBt et 1,0 g (10 % d'excès) de chlorhydrate de N-éthyl-N'-(3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide. Le pH a été amené à 8 avec la N-méthylmorpholine. Après agitation pendant 20 heures à la température ambiante, on a dilué la pâte avec 20 ml de DMF et on l'a ajoutée à 1 litre de HCI 0,01 M sous agitation. On a recueilli le précipité par filtration, on Ifa lavé à l'eau et séché sous vide : on a obtenu 7,8 g (2,3 mmoles, 96 %) de PAL 5+5 protégé, sous la forme d'un granulé légèrement jaunâtre.Celui-ci a été hydrogéné pendant 5 heures 112 dans 100 ml d'acide acétique glacial en présence de 700 mg de Pd sur du carbone (10 % Pd). On a séparé le catalyseur par filtration et le filtrat a été évaporé sous vide. On a dissous le résidu dans 100 ml H 20, on l'a extrait avec de ltéther et concentré sous vide jusqu'à 15 ml et on l'a passé au travers d'une colonne de Sephadex G-10 de 2,5 x 44 cm avec de l'eau.On a réuni les fractions contenant le produit désalifié et on a passé une portion aliquote de 50 % de l'ensemble (40 ml) au travers d'une colonne de Sephadex CM-C-25 sous forme Na+ de 2,5 x 29 cm à une vitesse de 60 ml/heure, des fractions de 3,5 mi étant recueill.es. L'éluant était de l'eau jusqu'à la fraction 35 puis un gradient d'une solution NaCI 0-0,3 M. Les fractions 81 à 110 ont été réunies, concentrées sous vide jusqu'à 15 ml et désalifiées sur une colonne de Sephadex G-10 de 2,5 x 73 cm.On a réuni les fractions 60 à 80 provenant de la colonne échangeuse d'ions, comme on l'a indiqué ci-dessus, et à nouveau chromatooraphié sur une colonne de Sephadex-CM, comme indiqué plus haut, avec cette différence que l'on a utilisé comme é!uant un gradient NaCI o-o-,15 M. Une désalification et une lyophilisation comme pour la fraction I ont donné 0,45 g de fraction II. Les fractions I et II se sont montrées être identiques par HVTLE et ont été ultérieurement réunies. HVTLE : 16,5 mm vers la cathode, homogène (50 volts/cm, pyridine/acide acétique/H2O, 1:9:90, pH 3,6, 10 min, plaque KG 60 F 254 Merck) ; 49,5 mm vers la cathode, homogène (50 Volts/cm, pyridine/acide acétique/H2O, 1:9:90, pH 3,6, 20 min, plaque de cellulose F, Merck). Analyse des aminoacides après réaction d'une portion aliquote (100 mg) avec un excès de Boc-Aia-OSu (280 mg) dans 4 ml de K2CO3 0,25 M contenant 50 % de THF pendant 6 heures et élimination du groupe protecteur Boc avec TFA. Lys10Ala6 trouvé Analyse élémentaire: CgoH162N20026 (1 940,4) calculé C 55,71 H 8,41 N 14,44 % trouvé C 55,41 H 8,21 N 14,26 % (corrigé pour 0,81 % cendres) Hexa-(o-méthoxybenzoyl )-PAL 5+5 On a mélangé 65 mg (33,5 mmoles) de PAL 5+5 dans 1 ml de K2CO3 1 M avec 100 mg (0,4 mmole) de l'ester de N-hydroxysuccinimide de l'acide 2-méthoxybenzoïque dans 1 ml de THF, préparé à partir de l'acide 2-méthoxybenzoïque et de N-hydroxysuccinimide avec le chlorhydrate de N-éthyl-N'-(3-dimêthylami- nopropyl)-carbodiimide. On a agité la solution qui était légèrement trouble, à la température ambiante pendant 16 heures, on a neutralisé avec HCl 1 M et on a repris à sec sous vide. On a dissous le résidu dans approximativement 4 mi d'eau et on a passé la solution au travers d'une colonne de Sephadex-G-25 de 2,8 x 50 cm avec de l'eau On a réuni les fractions contenant le produit du pic de tête et on a concentré et lyophilisé l'ensemble: on a obtenu 55,5 mg (60,5 t) de produit. Extinction molaire E280 ( (H2O) : 14 500, par groupe m (H2O) o-méthoxybenzoyle seul : 2 420 - Littér. (Handbook of Chemistry @ Physics, R.C. Weast # M.J. Astle, ed., page C-195, CRC Press, West Palm Beach, Fl., 1974) acide o-méthoxybenzoique : 2 510. Phénazone - PAL 5+5 On a agité 1 ,5 g (4,5 mmoles) de carboxytatovaléroyl- aminoantipyrine (IV) et 0,575 g (5 mmoles) de N-hydroxysuccinimide dans 30 ml de DMF avec 5 mmoles de chlorhydrate de N-éthyl-N' (3-diméthylaminopropyl)carbodiimide pendant 16 h à la température ambiante, en maintenant le pH légèrement alcalin avec de la triéthylamine. On a dilué la suspension avec 100 ml CH 2C12 et extrait avec HCI 0,1 M, H2 O, 2 % K2CO3 et à nouveau avec H2O, en utilisant pour chaque extraction un volume de 300 mi. On a séché la phase organique (Na2SO4) et on l'a évaporée sous vide. On a obtenu un résidu qui a été recristallisé dans CH2C12 : 1,2 g (62 %), p.f. 197-1990C. TLC (CHC13/MeOH, 9:1), Rf : 0,30 ; (dioxanelH2), Rf 0,64, homogène. 300 mg (70 mmoles) de l'ester d'hydroxysuccinimide de (IV) ont été mis en suspension dans 4 ml de THF ; la suspension a été ajoutée à 200 mg PAL 5+5 dans 4 ml 1 t K2CO3 puis le -pH a été ajusté à 10 avec NaOH 1 N. Après 1 h, on a ajouté à nouveau 150 mg d'ester activé sous forme de poudre. Après 17 h à la température ambiante, on a éliminé sous vide THF et on a neutralisé la solution aqueuse avec HCI 1 N.On a fait passer la solution au travers d'une colonne 2,5 x 70 cm de Sephadex G25 avec une solution salée 0,01 M tamponnée au phosphate ayant un pH de 7,4 et l'élut qui contenait le produit de couplage a été à nouveau passé sur une colonne de Sephadex G25 avec de l'eau. Les fractions contenant le produit de couplage, repérées à 260 nm, ont été réunies et lyophilisées : on a obtenu 270 mg (66 %) du produit de couplage. TLC (n-butanol/H2O/HAc/triéthylamine 1û:10:9:1) Rif: 0,80; (CHCl3/MeOH/17 % NH3, 5:5:2), Rf : 0,69, homogène . Analyse élémentaire de l'acide libre, obtenu après précipitation avec HCI 0,5 N et séchage C192H276N38044 (3 820,6) calculé C 60,36 H 7,28 N 13,93 % trouvé C 60,23 H 7,51 N 13,87 % D - a - Phénylglycyl - glycyl - PAL 5+5 (chaîne latérale de l'ampicilline) 23 mg (57 umoles) de Boc -D -a - Phg - Gly - OSu dans 0,5 ml de THF ont été ajoutés à 40 mg PAL 5+5 dans 1,0 ml K2CO3 1 M. Le mélange à deux phases a été agité pendant 48 h à la température ambiante. Après la première heure, on a ajouté à nouveau 35 mg de l'ester activé. On a éliminé les solvants sous vide, et on a laissé le résidu dans l'acide trifluoroacétique à la température ambiante pendant 40 min. Après avoir éliminé l'acide sous vide, on a trituré le résidu et on l'a lavé avec de l'éther.On l'a dissous ensuite dans un faible volume d'eau et on l'a fait passer au travers d'uné colonne 2,5 x 70 cm de Sephadex G25 avec une solution salée 0,01 M tamponnée au phosphate. On a fait à nouveau passer le produit de couplage, repéré à 257 nm, au travers d'une colonne de Sephadex G10 avec de l'eau. On a réuni les fractions contenant le produit de couplage et on les a lyophilisées : on a obtenu 55 mg (80 %) de produit de couplage TLC (n- butanol/H2O/HAc/pyridine, 10:10:9:1), Rf: 0,83, homogène. Electrophorèse (cellulose F, Merck ; tampon pyridine-acétate pH 3,6 ; 50 volts : cm ; 30 min) : 49 mm vers la cathode, homogène. Analyse par spectrométrie UV : nombre de groupes D-&alpha;-Phg: calculé: 6,0; trouvé: 5,9; extinction molaire Em257nm = 210mol-1 cm-1 pour D - a - Phg - OH. EXEMPLE lil Préparation du coniugué benzylpénicilloyl - PAL 5+5 Dans un premier temps, on a préparé le conjugué benzylpenicilloyl - PAL 5+5. Le conjugué benzylpénicilloyl - PAL 5+5 comportait un groupe amino primaire libre, de manière à permettre la fixation par une liaison covalente au support en phase solide. Fixation du conjugué benzylpénicilloyi - PAL 5+5 sur le CH-Sépharose 4 B Le support était constitué par du CH-Sépharose 4 B (gel d'agarose commercialisé par PHARMACIA) que l'on a activé par mise sous la forme d'ester succinimide. Le conjugué benzylpénicilloyl - PAL 5+5 a été couplé aux particules de Sépharose, de telle manière qu'il y ait équivalence entre groupes BPO et unité de phase solide. Les groupes esters actifs n'ayant pas réagi ont été bloqués avec de l'éthanolamine et les billes de Sépharose ont été conservées dans une solution tampon phosphate contenant de l'albumine de sérum de boeuf. Tests sérologiques On a utilisé un mélange de sérums cordonaux et de sérums AB comme témoins négatifs, et trois sérums ayant réagi positivement aux tests sérologiques, provenant de patients allergiques à la pénicilline. Les tests ont été réalisés dans les conditions suivantes : - lavage et remise en suspension des billes de Sépharose dans 0,01 h1 - NaHC03 - répartition en fractions aliquotes de 100 lJ1 dans des tubes à essais en plastique - incubation avec 50 ul de sérum pendant une nuit - lavage et centrifugation (quatre fois) 125 - incubation avec 50 l d'anti-lgE marquée à I (environ 50 000 coupsiminute) pendant une nuit - lavage et centrifugation (quatre fois) - mesure au compteur gamma. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau ci-dessous. Bruit de Sérum cordonal 355 fond AB 498 Coups/minute R.E. 13 498 Patients S.D. il 053 M G 7 526 Bruit de Sérum cordonal 0,63 Coups/minute fond Serum AB 0,88 Z du total coups/minute R.E. 24,00 (total coups/ Patients S.D. 19,60 minute) M.G. 13,40 56 285 Ces résultats montrent que le conjugué benzylpénicilloyl PAL 5+5 couplé à un support solide permet, par un test radioimmunoíogique, de détecter immédiatement une allergie è la pénicilline. Les coups/minute élevés obtenus avec les sérums de patients allergiques (13 500) montrent qu'il y a totale réaction entre les anticorps anti-benzylpénicilloyl (BPO) contenus dans le sérum des patients et les antigènes. On constate, par ailleurs, un brùit de fond très faible avec les sérums témoins négatifs. ce qui montre l'absence de réactions non spécifiques entre immunoglobulines et support. REVENDICATIONS 1. Nouveaux polymères de lysine, destinés à servir de supports pour la préparation de réactifs pour diagnostics des allergies hapténiques, dans lesquels les molécules présentent le même nombre de radicaux de L-lysine compris entre 8 et 20, caractérisés en ce que lesdits polymères, après couplage avec les haptènes, comportent des substituants hydrophiles alternant avec les substituants hapténiques hydrophobes. 2. Nouveaux polymères de lysine selon la revendication 1, caractérisés en ce que les substituants hydrophiles sont constitués par des restes carboxylatoalkyle. 3. Nouveaux polymères de lysine selon la revendication 1, caractérisés en ce que les substituants hydrophiles sont constitués par des restes oligohydroxy. 4. Nouveaux polymères de lysine selon la revendication 2, caractérisés en ce que le substituant hydrophile est le reste acide adipique. 5. Nouveaux polymères de lysine selon la revendication 3, caractérisés en ce que le substituant hydrophile est le reste acide gluconique. 6. Produits de diagnostic pour les tests cutanés destinés à déceler les allergies hapténiques, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les produits de couplage des polymeres selon l'une des revendications 1 à 5 avec les haptènes. 7. Produits de diagnostic pour les tests sérologiques destinés à déceler les allergies hapténiques, caractérisés en ce qu'ils sont constitués d'un support solide sur lequel ont été fixés les produits de couplage des polymères selon l'une des revendications 1 à 5 avec les haptènes. 8. Procédé de préparation des polymères de lysine selon les revendications 1,2 et 4 par élongation progressive d'une chaine d'oiigolysine à partir diun dérivé de la lysine dont la fonction carboxylique a été préalablement protégée. caractérisé en ce que dans une première étape, on couple le dérivé de la lysine dont la fonction carboxylique a été préalablement protégée, avec un dérivé de la lysine dont l'azote terminal a été préalablement protégé et la fonction carboxylique activée, ledit dérivé comportant le reste carboxylatoalkyle convenablement protégé à introduire dans la chaîne d 'oligomère. dans chacune des étapes successives suivantes, on couple la chaîne d'oligomère obtenue dans l'étape précédente et après déprotection de l'azote terminal, alternativement avec un dérivé de la lysine convenablement protégé et activé tel que celui utilisé dans la première étape, mais ne comportant pas de reste carboxylatoalkyle et avec un dérivé de la lysine convenablement protégé et activé comportant un groupe carboxylatoalkyle tel que celui utilisé dans la première étape. dans une étape finale. et avant couplage avec les haptènes, on libère simultanément les fonctions amino et carboxylique. 9. Procédé de préparation d'un polymère de lysine selon la revendication 8, et répondant à la formule dans laquelle Ad signifie le reste acide adipique, caractérisé en ce que dans une première étape, on couple un dérivé de la lysine dont la fonction carboxylique a été préalablement protégée par un groupe protecteur tel que ONBzl avec un dérivé de la lysine dont la fonction amine a été préalablement protégée par un groupe protecteur tel que Boc et la fonction carboxylique activée par mise sous la forme d'ester, ledit dérivé comportant ie substituant acide adipique protégé par un groupe protecteur tel que Bzl, . dans une étape suivante, on couple la chaîne obtenue dans l'étape précédente, après déprotection de l'azote terminal, avec un dérivé de la lysine dont la fonction amine a été préalablement protégée et la fonction carboxylique activée, tel que celui utilisé dans la première étape, mais ne comportant pas de reste acide adipique, .on répète les opérations effectuées dans les première et seconde étapes, . on condense deux molécules de la chaîne oligomère obtenue dans l'étape précédente avec l'acide adipique, éventuellement en présence d'un agent de condensation, . et on déprotège simultanément les fonctions amino et carboxylique. 10. Procédé de préparation des polymères selon les revendications 8 et 9, caractérisé en ce que le dérivé de lysine convenablement protégé et activé et comportant le reste acide adipique à introduire dans la chaîne d'oligolysine est préparé par réaction de la lysine dont l'azote terminal a été protégé par un groupe protecteur tel que Boc avec un ester de l'acide adipique préalablement protégé par un groupe protecteur tel que,OBzl. 11. Procédé de préparation des polymères de lysine selon les revendications 1,3 et 5 caractérisé en ce que la fixation des substituants oligohydroxy sur le polymère intervient après le couplage des haptènes avec ledit polymère. 12. Procédé de préparation des produits de diagnostic selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on couple les polymères selon les revendications 1, 2 et 4 avec les haptènes préalablement activés par mise sous la forme d'esters. 13. Procédé de préparation des produits de diagnostic selon la revendication 1?, caractérisé en ce que I'haptène avec lequel sont couplés les polymères selon les revendications 1, 2 et 4 est l'acide o-méthoxybenzolque . 14. Procédé de préparation des produits de diagnostic selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'haptène avec lequel sont couplés les polymères selon les revendications 1, 2 et 4 est la ca rboxylatovaléroyl-aminoantipyrine. 15. Procédé de préparation des produits de diagnostic selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'haptène avec lequel sont couplés les polymères selon les revendications 1, 2 et 4 est la D-phénylglycine. 16. Procédé de préparation des produits de diagnostic selon la revendication 11, caractérisé en ce que - l'haptène avec lequel sont couplés les polymères selon les revendications 1, 2 et 4 est la benzylpénicilline. 17. Procédé de préparation des produits de diagnostic selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on utilise comme support, un gel d'agarose chimiquement activé et en ce que I'on fixe de façon covalente le produit de couplage du polymère selon les revendications 1, 2 et 4 avec I'haptène, 18. Procédé de préparation des produits de diagnostic selon l'une des revendications 16 et 17, caractérisé en ce que le produit de couplage du polymère selon les revendications 1, 2 et 4 avec l'haptène est lié par llintermédiaire d'un groupe fonctionnel -NH2 libre au support et qu'il répond à la formule dans laquelle Ad signifie e reste acide adipique et BPO le groupement benzylpénicilloyl.