FR 2574799 A1 19860620 FR 8419065 A 19841213 La présente invention concerne une nouvelle saponine, un procédé de préparation d'extraits saponiniques de Calendula officinalis, ainsi que l'application de ladite saponine et desdits extraits saponinique.s, en tant que substance active de composition pharmaceutique et dermatocosmétique destinée en particulier au traitement des hypercholestérolémies et des hypertriglycéridémies ou encore afin d'améliorer la cicatrisation. Etant donné que les saponines ont la réputation de diminuer le taux de cholestérol, de nombreuses études ont déjà été réa isées avec des saponines stéroliques et triterpéniques, obtenues à partir d'espèces végétales variées. Il a ainsi été émis l'hypothèse d'une solubilisation du cholestérol par formation d'un complexe. Chacune de ces études a été effectuée sur un totum de saponines dont la composition et la pureté n'ont pas été véritablement prises en compte. Certains auteurs, toujours dans l'optique d'une activité hypocholestérolémiante (US-A-4.242.502) ont utilisé les saponines du Médicago sativa, comme matière première pour la préparation de sapogénines ou de prosapogénines par hydrolyse acide ménagée. II s'agit à l'évidence d'un mélange de saponines modifiées dont la composition et la structure ne sont pas données Dans le but d'une sélection de plus en plus fine d'extraits, puis de groupes chimiques et enfin de molécules susceptibles de présenter des propriétés hypocholestérolémi antes, la demanderesse a étudié des extraits de Ruscus aculeatus (L), Securidaca longepedonculata, Centella asiatica, Calendula officinalis, Quillaya, Saponaria officinalis, Polygala senega, Trigonella foenumgraecum, Sapindus, Escine, Xeromphis nilotica, Psiadia altissima, Dracaena ellenbeckiana, Arnica montana. Les différents extraits ont été administrés par voie orale à des rats, soumis à un régime hypercholestérolémique ou à des souris rendues hypercholestérolémiques par injection de TRITON WR 1339 elles taux de cholestérol hépatique et plasmatique dans le premier cas, et plasmatique dans le deuxième cas, ont été déterminés, comparativement à l'administration d'une substance de référence. De tous les extraits testés, c'est de façon surprenante, le Calendula officinalis qui s'est avéré être le plus efficace, ce qui a amené la demanderesse à poursuivre ses recherches dans cette voie. Ces recherches ont en particulier débouché sur une nouvelle saponine, objet de la présente invention, comprenant une molécule d'acide oléanolique liée à une chaîne glucidique contenant une molécule d'hexose et une molécule d'acide uronique, présentant un poids moléculaire de 794. La présente invention vise également un procédé de préparation d'un extrait saponinique de Calendula officinalis, caractérisé par les étapes successives suivantes * extraction d'un broyat de Calendula officinalis par un solvant hydroalcoolique et/ou alcoolique porté au reflux * Concentration du jus d'extraction par élimination azéo tropique de l'eau * précipitation des saponines à l'aide d'un non solvant de polarité moyenne, et * purification du précipité de saponines. Pour la mise en oeuvre d'un tel procédé, le solvant d'extraction contient avantageusement un alcanol en C1 à C6, et le non solvant de polarité moyenne utilisé pour effectuer l'étape de précipitation est constitué par une cétone, en particulier l'acétone. Selon une autre caractéristique additionnelle de la présente invention, l'étape de purification est effectuée par remise en suspension du précipité de saponines dans un non solvant de polarité moyenne, tel qu une cétone et en particulier l'acétone, suivie d'une filtration, d'un essorage et d'un séchage du totum saponinique obtenu. Selon une autre caractéristique de la présente invention, à l'issue de l'étape de purification du précipité de saponines, le totum saponinique est soumis à une hydrolyse non acide qui conduit à une modification de la composition saponinique qui s'enrichit en une saponine présentant une forte activité hypocholestérolémiante. Une telle hydrolyse non acide peut etre effectuée à l'aide d'une base alcaline ou alcalino-terreuse, telle que ia soude ou la potasse, ou encore par passage sur une résine échangeuse d'ions basiques ou enfin par voie enzyma tique. Conformément à la présente invention, l'étape de purification du précipité de saponine peut etre suivie d'une séparation chromatographique conduisant à la saponine précédemment définie, et qui s'est avérée etre le siège des propriétés hypocholestérolémiantes. Compte tenu de ces propriétés intéressantes doublées d'ailleurs de propriétés favorisant la cicatrisation, la nouvelle saponine selon l'invention ainsi que les extraits obtenus par le procédé précédemment défini, peuvent être incorporés dans des compositions pharmaceutique et dermatocosmétique en association avec un support acceptable. Extraction des saponines On indiquera ci-apres à titre indicatif un exemple particulier de mise en oeuvre du procédé de préparation selon l'invention, conduisant à un précipité de saponine de Calendula officinalis. Dans un exemple type, 1 kg de fleurs sèches broyées est extrait au reflux pendant 1 heure par 10 I de n-propanol à 80 puis filtré chaud. Le marc est lavé sur filtre par 2 I de propanol à 80 % préalablement chauffé (environ 500C), puis essoré. Les jus d'extraction groupés sont concentrés sous vide à 3,5 1 environ, de façon à éliminer la totalité de l'eau par azéotropié ; puis le concentrat est additionné lentement et sous agitation de 5 I d'acétone, de façon à précipiter la totalité des saponines. Le précipité formé est décanté et remis en suspension dans 500 ml d'acétone sous agitation énergique, puis filtré et essoré sur filtre à l'abri de l'air, enfin séché à l'étuve à 400C sous vide. On obtient ainsi 80 g environ d'une poudre brunâtre de saponines de Calendula officinalis. Bien entendu, le Totum Saponinique (T.S.) ainsi obtenu peut être préparé de façon analogue, en remplaçant le propanol par du méthanol, de L'méthanol ou du butanol. Les différentes poudres de T.S. obtenues sont solubles dans l'eau et les mélanges hydroalcooliques, insolubles dans le chloroforme, le chlorure de méthylène, l'hexane, le cyclohexane et le benzène. Par chromatographie en couche mince sur silice dans le système CHC13 - MeOH - eau (65-35-10) et révélation par -une solution à 1 % de vanilline dans l'acide sulfurique, on observe principalement 3 tâches violettes de Rf : 0,03 0,13 et 0,22, correspondant à des fractions saponiniques nommées respectivement 51 ' 52 et 53. Isolement des saponines Parmi les nombreuses techniques envisagées- par la demanderesse pour isoler les fractions saponiniques 51 ' et 53 > ce sont principalement les méthodes de séparation chromatographiques qui ont pu être retenues. En particulier, la chromatographie à contre-courant (D.C.C.C.) avec le mélange CHCl3-MeOH-n PrOH-eau (9-12-1-8) ainsi que la chromatographie en phase inverse sur colonne de silice greffée C ont permis de conduire aux meilleurs résultats. Enrichissement en saponines Au cours des diverses études effectuées par la demanderesse sur l'activité hypocholestérolémi ante des sapon i nes de Calendula officinalis, il a été constaté de façon surprenante que l'activité du totum saponinique (T.S.) était plus que doublée, lorsqu'on le soumettait à une hydrolyse non acide. En revanche, une hydrolyse acide de ce totum saponinique entraidait une perte d'activité. Par chromatographie comparativè du totum saponinique et, avant et après l'hydrolyse alcaline, on constate que cette hydrolyse alcaline fait disparaître la fraction saponinique S1 et génère la fraction saponinique S3. Bien que plusieurs techniques d'hydrolyse alcaline permettent d'augmenter de façon significative le titre en 53, on indiquera ci-après à titre d'exemple un mode de mise en oeuvre particulier de cette hydrolyse. 1009 de totum saponinique (T.S.) titrant S1 = 30 % ; 52 = 31 % ; 53 = 15 %, sont solubilisés dans 1 litre de soude 0,5 N et portés à ébullition pendant 30 minutes. Après refroidissement, la solution est neutralisée par passage sur résines Amberlite IRC 50 et concentrée à 250 ml. Puis, la phase aqueuse contenant les saponines est épuisée par du n-butanol 100 ml + 50 ml. Le solvant évaporé laisse un résidu blanc poudreux de saponines purifiées, enrichies en 53. Poids = 50 à 60 g, titre = 51 = O % ; S2 = 50 % ; S3 = 50 %. 2 % ; S3 = 50 %. Dosage Le dosage a été effectué par C.L.H.P dans le système - Colonne C8 10 microns 30 cm - méthanol-eau (60-40) 0,1 % AcONH4 - Détection à 210 nm - Débit 1,5 ml/min. Les temps de rétention sont de : 51 = 7 min.; 52 = 9 min.; S3 = 15 min. Les calculs sont effectués en considérant les rapports des densités optiques comparativement aux saponines S1' S2 et 53 pures obtenues par C.L.H.P. préparatives dans le même système. Structure des saponines L'analyse des saponines isolées des fleurs de Calendula officinalis a été effectuée par spectrographie de masse selon la technique dite "F.A.B." (Fast Atom Bombardment) qui a conduit aux résultats suivants MH+ 1119, 957 (MH+ - hexose) MH 1117, 955 (MH - hexose), 939 (MH - hexose - ester), 909, 793 (MH - 2 hexoses), 631 (MH - 3 hexoses), 455 (Génine) = MH - 3 hexoses - Ac.glucuronique. S2 = MH 957 MH 955, 793 (MH - hexose), 631 (MH 2 hexoses), 455 (MH - 2 hexoses - Ac.uronique), 439 (MH - 2 hexoses - Ac.uronique - H20)-. S3 = M Na+ 817 ; MH+ 795, 457 + Ac.uronique + hexose. Propriétés pharmacologiques D'importantes propriétés pharmacologiques essentiellement dans le domaine de la cicatrisation et de l 'hypocholestérolémie ont pu être mises en évidence au cours des expérimentations effectuées par la demanderesse. 1/ Cicatrisation - Deux tests ont été utilisés : perte de substance (mesure de la diminution d'une plaie) et force de rupture. -Les saponines sont testées par application de pommade à 0,25 ; 0,75 et 2 %, comparativement à l'excipient servant de témoin. Les résultats montrent une excellente efficacité se traduisant par une force de rupture de + 25 % après 4 jours. 2/ Hypocholestérolémie Cette étude a été effectuée non seulement sur le totum saponinique (T.S.), mais également sur chacune des saponines 51 ' S2 et S3 individuellement. C'est de cette façon qu 'il a été démontré que l'activité hypocholestérolémiante était essentiellement due à-la saponine S3. L'expérimentation a consisté à injecter au temps 0 par voie l.V. 600 mg/kg de TRITON WR 1339 à des souris mâles, naTves, d'un poids d'environ 30 grammes. Simultanément, res produits à étudier sont administrés par voie orale. Au temps T + 20 heures, une deuxième administration orale des produits à étudier est effectuée. Au temps T + 48 heures, les animaux sont sacrifiés et le sang prélevé sur- héparine en vue de doser le cholestérol total plasmatique selon la technique enzymatique CHOD-PAP applicable à l'autoanalyseur AA Il Technicon. Dans ces conditions expérimentales, les saponines totales T.S. administrées aux doses de 200 et 100 mg/kg ont entraîné une baisse respective du cholestérol de 30 % et 17 %. Les saponines S1 et 52 ont été trouvées inactives à 100 et 50 mg/kg. Par contre la saponine 53 a entraîné une baisse de cholestérol de 40 % et 31 % aux doses respectives de 100 et 50 mg/kg. Le CLOF IBRATE, choisi comme substance de référence, administré à 300 mg/kg a fait baisser la cholestérolémie de 28 %. Les propriétés pharmacologiques démontrées ci-dessus sont utilisables en thérapeutique, en particulier dans le traitement des hypercholestérolémies et des hypertri glycéri démies, les doses journalières étant comprises entre 200 mg et 29. REVEND I CAT I ONS 1/ Nouvelle saponine comprenant une molécule d'acide oléanolique liée à une chaîne glucidique contenant une molécule d'hexose et une molécule d'acide uronique, d'un poids moléculaire de 794. 2/ Procédé de préparation d'un extrait saponinique de Calenduta officinalis, caractérisé en ce que l'on effectue les opérations successives suivantes * extraction d'un broyat de Calendula officinalis par un solvant hydroalcoolique et/ou alcoolique porté au reflux * concentration du jus d'extraction par élimination azéotropique de l'eau * précipitation des saponines à l'aide d'un non solvant de polarité moyenne, et * purification du précipité de saponines. 3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le solvant d'extraction contient un alcanol en C1 à C6. 4/ Procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que le non solvant de polarité moyenne utilisé pour effectuer l'opération de précipitation est une cétone, en particulier l'acétone. 5/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que l'opération de purification est effectuée par remise en suspension du précipité de saponines dans un non solvant de polarité moyenne, tel qu'une cétone et en particulier l'acétone, suivie d'une filtration, d'un essorage et d'un séchage du totum saponinique obtenu. 6/ Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le totum saponinique est soumis à une hydrolyse non acide en vue de l'enrichir en saponine selon la revendication 1. 7/ Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'hydrolyse est effectuée à l'aide d'une base alcaline ou alcalino-terreuse. 8/ Procédé selon la revendication 6, caractérisé. en ce que l'hydrolyse est effectuée par passage sur une résine échangeuse d'ions basiques. 9/ Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'hydrolyse est effectuée par voTe enzymatique. 10/ Procédé selon l1une des revendications 2 à 9, caractérisé en ce que l'étape de purification est suivie d'une séparation chromatographique conduisant à la saponine selon la revendication 1. 11/ Compositions pharmaceutiques et dermatocosmétiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent, en association avec un support acceptable, une saponine et/ou un extrait saponinique obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 2 à 10.