FR 2583430 A1 19861219 FR 8608264 A 19860609 PROCEDE MICROBIOLOGIQUE DE PRODUCTION D'ACIDE CITRIQUE La présente invention concerne l'industrie microbiologique et, plus précisément, un procédé de production d'acide citrique qui est applicable dans l'industrie alimentaire pour la fabrication des confiseries, des boissons non alcoolisées, pour la conservation, dans l'industrie pharmaceutique et la parfumerie. On connaît divers procédés microbiologiques de production d'acide citrique, par exemple un.procede utilisant pour cette production une souche d'Aspergillus niger R-3. Le procéde consiste a conduire la fermentation superficielle de la souche indiquee sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote, des sels minéraux, des stimulateurs de croissance. On réalise la fermentation sur un milieu nutritif contenant, comme source de carbone, de la mélasse de betterave. On effectue la fermentation a la température de 32"C pendant 9 a 10 jours (SU-A-939 549). Ce procédé assure un rendement élevé en acide citrique en utilisant, comme source de carbone, de la mélasse de betterave mais il ne peut pas être realise avec de la mélasse de canne a sucre, car le générateur d'acide citrique utilisé, a savoir la souche d'Aspergillus niger R-3, se développe tres lentement sur un milieu nutritif a base de melasse de canne, ce qui risque d'entratner le développement d'une microflore étrangère. La melasse de canne, par comparaison a la melasse de betterave, renferme une plus grande quantité d'inhibiteurs de la croissance et de l'activité biochimique des producteurs de souche, c'est pourquoi les souches connues soit ne croissent pas du tout, soit manifestent une faible activité biochimique sur les milieux prépares a base de mélasse de canne. On connaît également un procédé microbiologique de production de l'acide citrique par une fermentation superficielle du générateur de l'acide citrique, a savoir la souche d'Aspergillus niger T-55 sur un milieu nutritif contenant comme source de carbone de la mélasse de canne a sucre. Avant la preparation du milieu nutritif, on soumet la mélasse de canne a un traitement prolongé (cuisson réitérée, centrifugation, passage a l'autoclave, fractionnement). On prepare la semence du générateur d'acide citrique sous la forme d'une suspension de spores. Après un traitement complexe du milieu de la mélasse de canne, ce générateur assure un rendement en acide citrique de 65X en poids par rapport au sucre du milieu nutritif de depart (Biotechnology and Bioengineering, vol. XXVI, pp. 1114-1121, 1984). Le procede mentionné ci-dessus est applicable uniquement dans les conditions du laboratoire. Il exige une technologie compliquée étant donné qu'on réalise un traitement préalable prolongé de la mélasse de canne lors de la préparation du milieu nutritif. En outre, l'utilisation de la semence sous la forme d'une suspension de spores fait qu'elle est distribuée de façon irrégulière sur la surface du milieu de fermentation. Le procéde mentionné a un faible rendement en acide citrique (jusqu'a 65X en poids par rapport au sucre du milieu nutritif de depart). On s'est donc proposé, en utilisant une nouvelle souche productrice, de mettre au point un procedé permettant d'employer une matière premiere relativement bon marché pour le milieu nutritif, notamment la melasse de canne a sucre, d'augmenter le rendement en acide citrique et de rendre plus simple sa technique de préparation. La solution consiste en ce que, dans le procedé microbiologique proposé de production de l'acide citrique par fermentation superficielle d'un micro-organisme producteur d'acide citrique de l'espèce Aspergillus niger sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote, de sels mitraux et des stimulateurs de croissance, avec une séparation subséquente de la biomasse et l'isolement du produit obtenu dans le liquide de culture, on utilise comme micro-organisme producteur de l'acide citrique la souche Aspergillus niger R-4, sélectionnée a partir de la souche d'Aspergillus niger R-3 par son adaptation aux milieux à diverses concentrations de mélasse de canne a sucre, par l'action de facteurs mutagènes tels que la nitrosomethyl-urEe et les rayons ultraviolets et, par sélection naturelle des cultures actives, ladite souche étant déposée en collection au Muséum Central des micro-organismes industriels Vsesojuznogo nauchnoissledovatelskogo instituta genetiki i selektsii promyshlennykh microorganizmov et enregistrée sous le numéro IIMIIM F-307. Le procéda revendiqué, gracie a l'utilisation d'une nouvelle souche productrice d'Aspergillus niger R-4, permet d'employer une matière premiere bon marché, 3 savoir la mélasse de canne et d'augmenter le rendement en acide citrique jusqu'3 75% en poids par rapport au sucre du milieu nutritif de depart. Le procédé revendique permet également de simplifier la technique de production de l'acide citrique, car il ne nécessite pas un traitement préalable prolonge de la mélasse de canne pour la préparation du milieu nutritif. De plus, l'utilisation de la semence sous la forme de spores secs permet de la distribuer uniformément sur la surface du milieu nutritif, ce qui favorise un developpement normal et rapide du mycélium du micro-organisme. Le procédé revendiqué est mis en oeuvre de la manière suivante. Pour la production de l'acide citrique, on utilise la nouvelle souche Aspergillus niger R-4. La souche Aspergillus niger R-4 est obtenue par sélection. Comme souche de départ, on utilise un generateur industriel de l'acide citrique, notamment la souche Aspergillus niger R-3. La souche Aspergillus niger R-3 a ete adaptee a des milieux a diverses concentrations en mélasse de canne. Les cultures résultant de l'adaptation sont soumises a l'action de facteurs mutagènes tels que la nitrosométhyl-urée et les rayons ultraviolets, puis on realise la sélection naturelle des cultures actives. Le nouveau producteur Aspergillus niger R-4 est déposé sous le nO IIMIIM F-307 en collection au Museum Central des micro-organismes industriels Vsesojuznogo nauchno-issledovatelskogo instituta genetiki i selektsii promyshlennykh microorganizmov. La souche Aspergillus niger R-4 présente les caractéristiques suivantes. Caractères morphologiques La culture agee de 5 jours sur le milieu de Czapek-Dox comporte des tetes conidiennes rondes de 120-200 pm de diamètre. Les vésicules sont d'une forme légèrement allongee de 18 a 25 x 30 a 3S pm. Les pédoncules sont a deux couches: la longueur des pédoncules du premier ordre est de 9 a 16 um, celle du deuxième ordre de 5 a 9 Um. Deux pédoncules du deuxieme ordre se forment sur chaque sterigme du premier ordre. Les conidies sont de couleur noir-grisâtre, rondes et presentent un diamètre de 4 a 5 iim. Les conidiophores sont droits, incolores, leur longueur est de 1,5 3 2,5 mm et leur diamètre de 6,0 a 6,5 pm. Propriétés de la culture La colonie géante sur le milieu de Czapek-Dox au 5eme jour, a la température de 32"C a une forme ronde de 52 a 55 mm de diamètre. La coloration de la colonie est noir-grisdtre. La zone asporogène est de 14 mm. Les têtes conidiennes dans le centre de la colonie sont de dimensions moyennes, elles sont disposees de façon non compacte et forment une petite élévation. La dimension des tètes conidiennes vers le bord de la colonie diminue, les têtes acquièrent une nuance jaune-verdatre. Les colonies sur le moût-agar (5 jours, température 320C) ont une forme ronde, de couleur noire-grisatre, et un diametre de 40 mm . Le mycélium aérien est d'un developpement moyen, les têtes conidiennes au centre de la colonie sont rares, elles diminuent du centre vers le bord de la colonie. Au bord de la colonie, dans un rayon de 10 mm, existe une zone claire avec des têtes conidiennes blanches, immatures, serres étroitement contre le mycélium du substrat. Le revers de la colonie est plisse radialement et blanc. Propretés biochimiques Elle fermente bien la melasse de canne. Dans les conditions du laboratoire après la fermentation superficielle (hauteur de la couche 9 cm) au 9ème jour, le rendement en acide citrique est de 70 a 75X en poids par rapport au sucre du milieu nutritif de depart (teneur initiale en sucre du milieu nutritif : 13 à 15X en poids). L'acide citrique constitue 95 à 98X en poids, l'acide oxalique 0,5 a 1,0X en poids de la quantité totale d'acides synthétisés. Comportement vis-a-vls des sources de carbone Elle assimile le saccharose, le glucose, le fructose, le maltose, l'hydrolysat de la tourbe. Elle n'assimile pas l'acide acétique. Coportement vis-A-vis des sources d'azote Elle assimile l'azote organique et l'azote mineral. L'activite de la biosynthèse de l'acide citrique sur les milieux prépares a base de mélasses de betterave et de canne, a été doterminTe pour la souche Aspergillus niger R-3 de départ et pour la nouvelle souche productrice Aspergillus niger R-4. Les résultats comparatifs sont résumées dans le tableau. TABLEAU Rendement en acide citrique par rapport au sucre, % en poids SOUCHE de mélasse de de mélasse de betterave canne Aspergillus niger R-3 jusqu' 100 45 a 50 Aspergillus niger R-4 80 à 85 70 a 75 La souche Aspergillus niger R-4 forme un mycélium développé 24 heures après la culture sur un milieu a base de mélasse de canne. La souche Aspergillus niger R-3 ne commence 9 former le mycélium qu'au 3ème jour de la culture. Dans les conditions industrielles, plus lent est le développement du mycélium, plus grand est de risque du développement d'une microflore étrangère. On obtient la semence de la souche Aspergillus niger R-4 au cours de sa culture sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux. Comme source de carbone et d'azote, on peut utiliser un extrait de malt ou du moût de bière (5 3 9% de sucre par rapport 3 la substance sèche). On conduit la culture dans des conditions superficielles, en réglant la température (32"C) et l'humidité. La duree de la culture est de 9 a 10 jours. On obtient 0,5 a 0,7 g de spores par dm2 de surface de la semence. On récolte les spores par aspiration au vide. On prepare la semence en mélangeant les spores secs avec du charbon actif dans le rapport 1/1, le mélange étant soigneusement malaxe. On réalise ensuite la fermentation. Pour préparer le milieu de fermentation, on utilise comme source de carbone de la mélasse de canne de diverses origines avec des teneurs en sucre différentes, par exemple de la mélasse indienne, brssil!enne, cubaine. On prepare le milieu de fermentation a une teneur en sucre atteignant de préférence de 13 a 15% en poids. De plus, on introduit de l'azote si la teneur de la mélasse est insuffisante en azote et en sels minéraux. On ensemence la surface d'un milieu de fermentation avec la semence. La durée de fermentation est de 9 3 10 jours a la température de 320C. La fermentation terminée, on sépare la biomasse et on isole l'acide citrique du liquide de culture suivant la technique habituelle. Le rendement en acide citrique est de 70 à 75X en poids, par rapport au sucre du milieu de départ nutritif. Le procédé proposé permet, comparativement au procédé connu, d'utili- ser une matière première bon marché pour préparer le milieu nutritif, notamment la melasse de canne à sucre, ce qui simplifie la technique du processus de préparation de l'acide citrique et augmente son rendement. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris a la lecture de la description qui va suivre d'exemples de réalisa- tion concrets. EXEMPLE 1 On utilise la souche Aspergillus niger R-4 pour obtenir la semence. On prépare le milieu nutritif a base de moût de biere, contenant 7X de sucre en poids par rapport a la substance sèche, et on ajoute les constituants suivants, en X en poids: . urée ................. 0,5 . NaCl ................. 1,5 CuSO4.5 H20 .................... 0,0001 agar 2,0 le pH du milieu est maintenu à 5,6 On stérilise le milieu préparé de cette façon dans un autoclave a la température de 12O0C pendant 20 a 30 minutes. On fait développer la culture dans des cuvettes jusqu'a une hauteur de la couche de 1 cm. On place les cuvettes dans une chambre thermique qui est aérée avec de l'air stérile. La température est maintenue a 320C. La durée de culture est de 10 jours.On récolte les spores par aspiration au vide. On obtient 0,68 g de spores par dm2 de milieu. On mélange les spores sèches et le charbon actif dans un rapport de 1/1. On prépare le milieu pour la fermentation base de mélasse de canne indienne. Cette mélasse est caractérisée par une teneur de 49,2X en poids de sucre, 82X de substances sèches et 14,4X de cendres. On prend 300 g de mélasse, on dilue avec de l'eau chaude dans la proportion de 1/1, on ajoute 19 ml d'une solution a 10X de carbonate de sodium, on porte a l'ébullition, on introduit 60 ml d'une solution a 10X de ferrocyanure de potassium et on fait bouillir pendant 20 minutes pour la sterilisation. On ajoute 19 ml d'une solution à 1X de phosphate de potas sini monosubstitué dans a saluti,en refroidie jusqu'! 750C, on refroidit jusqu'a 50"C et on introduit 0,4 ml d'une solution a 1% de sulfate de zinc. On additionne de l'eau stérile pour atteindre un volume d'un litre. Le pH du milieu final est de 6,1. La teneur en sucre du milieu est de 14,7% en poids. On coule le milieu préparé de cette façon dans des béchers ayant une surface de fond de 0,48 dm2, en versant 440 ml dans chacun, la hauteur de la couche étant de 9 cm. La semence de la souche Aspergillus niger R-4, sous la forme d'un mélange de spores et de charbon actif, est ensemencée sur la surface du milieu. La duree de la fermentation est de 9 jours a la température de 32"C. Le rendement en acide citrique est de 72,3% en poids par rapport au sucre du milieu de départ nutritif. Dans la totalité des acides synthétisés, l'acide citrique constitue 95,7% en poids et l'acide oxalique repr- sente 0,6X en poids. EXEMPLE 2 On prépare la semence de la souche Aspergillus niger R-4 selon une technique analogue S celle décrite dans l'exemple 1. On prépare le milieu de fermentation à base de mêlasse de canne brésilienne, caractérisée par une teneur en sucre de 54,0X en poids, en substances sèches de 78,5X en poids et en cendres de 19,08%. On prend 250 g de meulasse, on dilue avec de l'eau chaude dans la proportion de 1/1, on ajoute 12,5 ml d'une solution a 10% de carbonate de sodium, on porte à ébullition, on introduit 50 ml d'une solution a 10% de ferrocyanure de potassium et on fait bouillir pendant 20 minutes pour la stérilisation.On ajoute 25 ml d'une solution t 1% de phosphate de potassium monosubstitué et 20 ml d'une solution à 10X de nitrate d'ammonium dans la solution refroidie jusqu'a 75"C. On refroidit la solution jusqu'a la température de 50"C et on introduit 1,25 ml d'une solution a 1% de sulfate de zinc, on additionne de l'eau stérile jusqu'a atteindre un volume d'un litre. Le pH du milieu final est de 5,8. La teneur en sucre est de 13,5X en poids. On réalise la fermentation de façon analogue à celle décrite dans l'exemple 1. Le rendement en acide citrique est de 74,5X en poids par rapport au sucre du milieu de départ nutritif. Dans la totalite des acides synthétises, l'acide citrique constitue 96,2X en poids et l'acide oxalique 0,5X en poids. REVENDICATIONS 1.- Procéde microbiologique de production de l'acide citrique par fermentation superficielle d'un micro-organisme producteur d'acide citrique de l'espèce Aspergillus niger sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote, des sels minéraux et des stimulateurs de croissance, avec séparation subséquente de la biomasse et isolement du produit obtenu dans le liquide de culture, caractérisé en ce qu'on utilise comme microorganisme producteur de l'acide citrique une souche Aspergillus niger R-4, sélectionnée a partir de la souche Aspergillus niger R-3 par son adaptation aux milieux a diverses concentrations en mélasse de canne 3 sucre, par l'action de facteurs mutagènes tels que la nitrosométhyl-uree et les rayons ultraviolets et par sélection naturelle des cultures actives, ladite souche etant déposée en collection au Museum Central des micro-organismes industriels Vsesojuznogo nauchno-issledovatelskogo instituta genetiki i selektsii promyshlennykh microorganizmov et enregistrée sous le numero IIMIIM F-307.