FR 2581654 A1 19861114 FR 8501069 A 19850125 PROCEDE DE RECUPERATION DU TRYPTOPHANE OU DE L'UN DE SES DERIVES ET SON UTILISATION DANS UN PROCEDE DE SYNTHESE ENZYMATIQUE DU TRYPTOPHANE La présente invention a pour objet un procédé de récupération du tryptophane ou de L'un de ses dérivés à partir d'une solution et son utiLisation dans un procédé de synthèse enzymatique du tryptophane ou de l'un de ses dérivés. La synthèse des acides aminés tels que le tryptophane présente un grand intéret pour l'alimenta- tion humaine car ceux-ci sont utilisés comme additifs alimentaires. Il en est de meme en ce qui concerne L'alimentation animale et l'on utilise actuellement, dans ce secteur, 15 000 t/an d'acides aminés. Parmi les procédés de synthèse d'acides aminés, ceux faisant appel aux biotechnologies présentent un grand intéret, car ils permettent ta production de ces acides à des prix compétitifs par rapport aux procédés de synthèse classiques. Dans le cas du tryptophane, on connaît des procédés de synthèse directe du tryptophane par des microorganismes tels que C. Glutamicum, B. Subtilis et des procédés de bioconversion à partir de cellules contenant une enzyme telle que la tryptophane synthétase ou la tryptophanase qui sont capables de catalyser La synthèse du tryptophane, soit à partir d'indole et de L-sérine, soit à partir de pyruvate et d'ammoniaque. Les procédés de fermentation directe posent des problèmes. Ces procédés se heurtent en particulier au problème de rétrocontrole provoqué par l'accumulation de l'acide aminé et nécessitent L'emploi de mutans souvent complexes. De plus, la production du tryptophane dans un milieu "polLué" par de nombreux métabolites présente l'inconvénient de rendre diffi cile son isolement. Les procédés de production par bioconverson ne présentent pas tes mêmes problèmes et leur mise en oeuvre semble en être facilitée. Deux voies sont possibles - ta bioconversion d'indole et de L-sérine par action de la tryptophane synthétase, - la bioconversion indole, de pyruvate (en excès) et d'ammoniac (en excès) par la tryptophanase. La tryptophane synthétase présente lfincon- vénient de n'être naturellement synthétisée qu'en faible quantité et il est donc nécessaire de faire appel à des souches mutées. De plus, elle utilise comme substrat la L-sérine qui est un acide aminé coûteux (environ 1000 F/kg). La tryptophanase est produite naturellement par de nombreux microorganismes. C'est un avantage par rapport à la tryptophane synthétase. De pLus, elle met en oeuvre l'acide pyruvique et l'ammoniac, qui sont des composés moins couteux que la L-serine. Cependant, les procédés de synthèse par bioconversion présentent l'inconvénient de nécessiter une étape de séparation des celLules cultivées, puis Lfimmobilisation de ces cellules ou de L'enzyme qu'elles contiennent sur un support. Par ailleurs, La séparation du tryptophane obtenu est difficite à réaliser avec un rendement et un degré de pureté élevé. La présente invention a précisément pour objet un procédé de récupération du tryptophane ou de L'un de ses dérivés de substitution sur le noyau indole, qui permet de résoudre ce problème de séparation notamment dans un procédé de synthèse enzymatique utilisant des cellules contenant de ta tryptophanase immobiLisées sur un support. Le procédé selon l'invention de récupéra tion d'un composé choisi parmi le tryptophane et ses dérivés de substitution sur le noyau indole, à partir d'une solution contenant ledit composé, se caractérise en ce qu'il consiste a) à précipiter ledit composé par addition d'inosine à la solution, b) à dissoudre le précipité ainsi obtenu dans une 50 lution acide, c) à mettre en contact la solution acide ainsi obtenue avec une résine échangeuse de cations pour fixer le tryptophane ou le dérivé de tryptophane sur ladite résine, d) à éluer la résine par une base, et e) à séparer le tryptophane ou le dérivé de tryptopha ne de l'éluat ainsi obtenu. Ce procédé présente en particulier l'avantage de conduire à du tryptophane ayant un degré de pureté supérieur à 99,9% et de permettre l'obtention d'un rendement en tryptophane supérieur à 85%. En effet, l'inosine présente la propriété d'être très spécifique du tryptophane et de ne précipiter que le tryptophane ou ses dérivés à partir des solutions contenant différents composés comme par exemple l'acide p-indolyl acétique, l'acide ss-indolyl propionique, l'acide p-indolyl butyrique, la tryptamine, le tryptophol, l'acétyl L-tryptophane, des nucléosides tels que l'adénosine, la quanosine, la cytosine, le ribose et l'hypoxanthine. Le taux de précipitation dépend en particulier du pH et de la température de la solution. De préférence, on opère à des pH allant de 6 à 9 car la réaction est maximale à pH neutre, le complexe inosine-tryptophane devenant de plus en plus soluble soit vers les pH basiques, soit vers les pH acides. La solubilité du complexe augmente égale ment avec la température. Aussi, il est préférable d'opérer à des températures faibles, par exemple à des températures de O à ZOOC. Le rendement de précipitation dépend égale- ment des concentrations en tryptophane et en inosine. Pour une concentration donnée en inosine, il augmente avec la concentration en tryptophane de La solution. De même, pour une concentration donnée en tryptophane, il augmente avec la concentration en inosine. Aussi, il est préférable de précipiter une solution concentrée en tryptophane par de I'inosine en excès. Cependant, lorsqu'on associe ce mode de récupération du tryptophane a un procédé de synthèse enzymatique, on doit tenir compte d'autres paramètres, et généralement on réalise la précipitation avec un excès de tryptophane. Après la réaction de précipitation, on sépare le précipité de La solution par exemple par filtration, puis on le redissout dans une solution acide, ayant par exemple un pH de 1 à 2, en opérant de préférence à la température ambiante car la solubilité du précipité augmente avec la température et diminue avec te pH. Cependant, à des pH inférieurs à 1, Le tryptophane est détruit par hydrolyse. Des solutions aqueuses d'acide sulfurique ou d'acide chlorhydrique peuvent être utilisées, par exemple de l'acide sulfurique 0,5N qui dissout 52 g/l d'un précipité équimolaire de tryptophane et d'inosine. Le tryptophane est ensuite extrait de cette solution acide par fixation sur une résine échangeuse de cations, qui est de préférence une résine polystyrénique ayant un taux de divinylbenzène au plus égal à 5%. En effet, la rétention des molécules organiques sur des résines échangeuses d'ions dépend de la taille des mailles de la résine et il est important pour obtenir un bon taux de fixation du tryptophane d'utiliser une résine peu réticulée pour favoriser la diffusion des grosses molécuLes. A titre d'exemple, on peut utiliser la résine commercialisée sous la marque Duolite C 201 qui présente une capacité d'échange de 0,4 éq./l. Dans ces conditions, on obtient un bon taux de fixation du tryptophane et La résine ne retient que très peu d'inosine. Le tryptophane est ensuite récupéré par élution au moyen d'une base telle que l'ammoniaque. De préférence, on réalise cette élution à chaud, par exemple à 600C pour éviter une précipitation du tryptophane dans la colonne d'échange de cations. De préférence, pour obtenir un degré de pureté élevé de l'ordre de 99,9, on soumet la résine échangeuse de cations à un rinçage à l'eau avant de réaliser l'élution En effet, bien que l'inosine soit très peu fixée par la résine échangeuse d-e cations, il est préférable d'éliminer celle-ci par rinçage à l'eau avant de réaliser I'élution du tryptophane. Le tryptophane peut etre ensuite récupéré à partir de la solution d'élution par cristallisation. L'invention a également pour objet un procédé de synthèse enzymatique du tryptophane ou de l'un de ses dérivés de substitution sur le noyau indole, qui consiste 1) à mettre en contact une solution contenant de l'indole ou l'un de ses dérivés de substitution, un sel d'acide pyruvique et un sel d'ammonium avec des cellules d'Escherichia Coli immobilisées contenant de la tryptophanase, et 2) à récupérer le tryptophane ou l'un de ses dérivés de substitution à partir de la solution, et qui se caractérise en ce que l'on récupère le tryptophane ou l'un de ses dérivés par mise en oeuvre du procédé ci-dessus de récupération du tryptophane ou de ses derives de substitution. Dans ce procédé de synthèse enzymatique, on utilise des cellules d'Escherichia Coli qui ont été cultivées dans un fermenteur dans des conditions permettant la synthèse d'une quantité élevée de tryptophanase, en utilisant comme souche de départ, une souche d'Escherichia Coli auxotrophe pour la vitamine B1, par exemple La souche référencée Escherichia Coli K 12, Hfr 3000 provenant de L1înstitut Pasteur. Cette souche peut synthétiser une quantité élevée de tryptophanase en raison de ta locaLisation de L'opéron tryptophane qui est situé très près du point dtinitiation de la réplication de llADN. Pour obtenir a partir d'une teLle souche une quantité élevée de tryptophanase, on réalise de préférence la culture dans un milieu contenant de 0,2 à 0,5 g/l de tryptophane car celui-ci a un effet d'indiction de l'activité tryptophanase. Par ailleurs, on réalise la culture en phase exponentielle de croissance et on l'arrête lorsque l'activité en tryptophanase est maximale. Cet arrêt peut être obtenu en amenant le pH du milieu de culture à 9. De préférence, ta pression d'oxygène lors de la culture est de 10 à 50X, par exemple de 20X. Les milieux de culture utilisées sont des milieux classiques ne contenant pratiquement pas d'hydrates de carbone, par exemple des milieux à base de bactotryptone et d'extrait de levures. Après arret de la culture, on sépare les cellules par des techniques classiques, de préférence par ultrafiltration, puis on les fixe sur un support approprié. Dans ce but, on met en suspension les cellules cultivées ainsi obtenues dans un milieu liquide contenant au plus 0,30 g d'acide éthylénediamine tétracétique par g de cellules et on met en contact la suspension ainsi obtenue avec un support en matériau inorganique à base d'oxyde et/ou d'hydroxyde simple ou mixte. La présence d'acide éthylène diamine tétra cétique permet d'obtenir des rendements élevés de fixation des cellules sur le support, par exemple des rendements de l'ordre de 90%. Généralement, la concentration en acide méthylène diamine tétracétique de la suspension est telle que l'on ait 0,20 à 0,25 gramme d'EDTA par gramme de cellules. Le support utilisé peut être en particulier un silicoaluminate obtenu par exemple par calcination d'un mélange talc-argile kaoîinique. Généralement, on L'utilise sous la forme de poudre ayant une granulométrie de 100 à 200 pm. L'ut i- lisation d'un tel support est particulièrement avantageuse car il permet l'obtention de bons rendements de fixation, tout en étant d'un faible court. Par ailleurs, les cellules immobilisées sur ce support ont une bonne stabilité réactionnelle. Le milieu liquide utilisé pour préparer la suspension est de préférence un milieu à pH de 6 à 8 contenant éventuellement en plus de l'EDTA du pyridoxal 5'phosphate (PLP) qui est le cofacteur de la tryptophanase, et un agent protecteur des groupements SH présents au niveau du site actif de l'enzyme, tel que le dithioérythritol (DTE). Pour réaliser l'immobilisation des cellules d'Escherichia Coli, on opère à une température supé rieure à 309C car la fixation des cellules augmente avec la température. Toutefois, il est préférable de ne pas dépasser une température de 42"C car la tryptophanase perdrait son activité. De préférence, on opère à 37"C, ce qui correspond à un bon rendement de fixation et à une stabilité satisfaisante de la tryptophanase. Pour obtenir un bon rendement d'immobilisation, il est préférable que la suspension de cellules soit diluée et que le débit d'atimentation soit faible afin de favoriser le contact avec Le support et les cellules, et de limiter la compétition entre les microorganismes vis-å-vis des sites de fixation. Les cellules ainsi immobilisées peuvent être ensuite utilisées pour réaliser la biosynthèse du tryptophane ou de l'un de ses dérivés en les mettant en contact avec un milieu liquide contenant du tryptophane ou l'un de ses dérivés de substitution sur le noyau indole, un sel de l'acide pyruvique et un sel d'ammonium. La biosynthèse est réalisée de préférence à un pH élevé, par exemple à un pH de 8,5 à 9,5, à une température supérieure à la température ambiante, mais inférieure à 420C, car on observe une perte d'activité irréversible à cette température en 24 h. Les concentrations en réactifs doivent être optimisées pour obtenir La vitesse de bioconversion la plus élevée. A titre d'exemple, on peut obtenir de bons résultats en opérant avec des concentrations en pyruvate de 0,2 mol/l et des concentrations en ions ammonium de 0,6 mol/l. La concentration en indole doit être choisie en fonction des concentrations en pyruvate et en ions ammonium de façon à ne pas avoir d'excès d'indo le, car celui-ci exerce une forte inhibition sur la réaction de conversion. De préférence, on ajoute à la solution jusqu'à 10% d'éthanol pour permettre la solubilisation de l'indole qui est peu soluble dans l'eau. En effet, la présence d'éthanol a un effet bénéfique sur la réac tion de biosynthèse car elle favorise l'association enzyme-substrat et accroit ainsi t'efficacité de la réaction. Par ailleurs, la présence d'alcool qui se traduit par une diminution de la concentration en eau du milieu ralentit la réaction de dégradation du tryptophane en indole, pyruvate et ammoniaque par hydroLy- se. La présence d'alcool permet aussi d'éviter toute contamination microbienne des réacteurs. De préférence, . cette solution contient aussi de l'inosine car on a trouvé que la présence d'inosine avait un effet favorable sur la réaction de bioconversion en supprimant l'effet inhibiteur du au tryptophane produit. Selon un mode préféré de mise en oeuvre du procédé de l'invention, on réalise la biosynthèse en continu. Dans ce cas, on utilise un réacteur contenant les cellules d'Escherichia Coli immobilisées contenant la tryptophanase, on met en circulation dans ledit réacteur la solution contenant l'indole ou l'un de ses dérivés, le sel d'acide pyruvique et le sel d'ammonium, on traite la solution sortant du réacteur pour précipiter le tryptophane ou son dérivé au moyen d'inosine, et on recycle dans le réacteur la solution séparée du précipité. Dans un tel procédé, la solution recyclée contient du tryptophane et il est préférable de lui ajouter de l'inosine avant de la recycler dans le réacteur. En effet, la présence d'inosine a un effet favorable sur la biosynthèse du tryptophane car elle atténue l'effet inhibiteur dû à la présence de tryptophane dans la solution. Dans un procédé de ce type, les apports d'indole ou de son dérivé de substitution, de sel d'acide pyruvique et de sel d'ammonium sont réalisés en introduisant en amont dudit réacteur de l'indole, de l'ammoniaque et une base capable de se combiner avec l'acide pyruvique pour donner le sel d'acide pyruvique, et on introduit dans la solution qui va être soumise à la séparation du tryptophane par précipitation l'acide pyruvique, l'acide capable de se combiner avec L'ammoniaque pour donner Le sel d'ammonium et de l'acide phosphorique pour diminuer te pH de la solution avant précipitation. Ainsi, on forme directement dans la solution Le sel d'acide pyruvique et le set d'ammonium. Ce mode d'introduction des réactifs permet en particulier d'obtenir Le pH opt-imal dans Le réacteur de bioconversion et de diminuer ce pH dans le réacteur de précipitation, ce qui a une influence favorable sur te rendement de précipitation. Dans ce mode de réalisation, on introduit l'inosine dans La solution soumise à la précipitation de façon à recycler dans Le réacteur une soLution contenant l'inosine. Lorsqu'on utilise de l'alcool, on introduit celui-ci dans la solution soumise à la précipitation. D'autres caractéristiques et avantages de L'invention apparartront mieux à la lecture de la description qui suit, donnée bien entendu à titre illustratif et non limitatif en référence au dessin annexe sur lequel - la figure 1 qui est un diagramme représentant les différentes étapes du procédé de biosynthèse du tryptophane, - la figure 2 est un diagramme montrant l'influence de la concentration initiale en tryptophane sur L'activité spécifique de cellules cultivées, - la figure 3 est un diagramme représentant l'évolution de l'activité spécifique des cellules et de La concentration en tryptophane en fonction de la durée de culture, - la figure 4 est un diagramme représentant l'influence de l'addition d'acide éthylénediamine tétracétique sur la quantité de cellules fixées sur un support inorganique, - la figure 5 est un diagramme représentant de façon schématique une installation de biosynthèse en continu du tryptophane, - la figure 6 est un diagramme représentant l'évolution des concentrations en tryptophane et en inosine à la sortie de la colonne échangeuse de cations lors de la phase de fixation du tryptophane, - la figure 7 est un diagramme représentant l'évolution des concentrations en tryptophane et en inosine à la sortie de la colonne échangeuse de cations lors du rinçage à l'eau, et - la figure 8 est un diagramme représentant l'évolution des concentrations en tryptophane et en inosine à la sortie de la colonne échangeuse de cations, lors de L'elution du tryptophane. Sur la figure 1, on voit que le procédé de synthèse enzymatique du tryptophane comprend 4 étapes principales qui sont : 1") la culture des cellules d'Escherichia Coli (1), 2 ) l'immobilisation des cellules cultivées sur un support, (2) 30) la biosynthèse du tryptophane en utilisant comme biocatalyseur les cellules immobilisées (3), et 40) la séparation du tryptophane ainsi obtenu (4). On décrit, ci-après, ces différentes étapes. I. CULTURE Pour cette culture, on utilise une souche qui est une entérobactérie, Escherichia Coli K 12, Hf r 3000 auxotrophe pour la vitamine B1 provenant de l'Institut Pasteur. Cette souche est conservée à l'état congelé à -200C. Avant congélation les bactéries sont cultivées à 370C pendant 48 h sur le milieu minimal synthétique qui comprend : KH2P04 13,6 g MgS04, 7H2O 7H20................. 0,2 g (NH4)2S04 .. ......... 2,0 g FeSO4, 7H20 7H2O................. 0,005 g Vitamine B1.................SI 0,0002% Glycérol 0,4 % H20. qsp 1 l pH(KOH) .. 7,2 La souche est entretenue par repiquages mensuels sur tubes de gélose inclinée (Bactotryptic SOY AGAR 40 g/l) et stockage au réfrigérateur à 40C. Pour réaliser la préculture et la culture en fermenteur, on utilise le milieu LENNOX ayant la composition suivante : Bactotryptone 10 g Extrait de levures 5 g NaCl 5 g H20 qsp 1 I pH(KOH) 7,4 Ce milieu a ainsi une très faible teneur en hydrates de carbone. Pour réaliser la fermentation, on utilise un fermenteur BIOLAFITTE de 20 l, stérilisable sur place et relié à une armoire de régulation qui permet de contrôler et de mesurer l'agitati-on, la température, le pH, la pression d'oxygène p02 et l'injection d'antimousse. l'inocuîum (1l) est préparé en erlens de 2 l contenant 500 ml de milieu LENNOX stérilisé par autoclavage (1200C-20 min), ensemencé à partir de tubes gélosés et incubés à 37 C pendant 16 h. Pour la cultu re on adopte les conditions suivantes Volume 13 l Agitation 320 Tr/min Température ; 370C pH 7,4 (régulé par KOH 4N et H2S04 4N) pO2 --- 20% Duree de 2 à 3 heures. Par ailleurs, on ajoute au début de la culture du tryptophane au milieu de culture à raison de 0,4 g/l car il a un effet bénéfique sur l'activité enzymatique. En effet, comme on peut le voir sur la figure 2, qui représente l'activité spécifique maximale en mmol de SOPC/min.g cellules en fonction de la concentration initiale en tryptophane du milieu de culture (en g/l), on voit que des concentrations de 0,3 à 0,5 g/l ont un effet favorable sur l'activité. On précise que SOPC est la S-orthonitrophe- nyl-l-cystéine q; peut être transformée par la tryptophanase en orthonitrothiophénolate et en pyruvate. Comme il est possible de suivre par spectrophotométrie la formation de l'orthonitrothiophénolate, on a utilisé cette méthode pour quantifier l'activité de l'enzyme. Pour obtenir la meilleure activité, on réalise de plus la culture en restant dans la phase exponentielle et en arrêtant la culture lorsque l'activité spécifique de l'enzyme est maximale. Sur la figure 3, on a représenté l'évolution de l'activité spécifique des cellules exprimée comme précédemment en mmol de SOPC par minute et par gramme de cellules en fonction de la durée de culture Cen heures). Sur cette figure, on voit que l'activité spécifique présente un maximum au bout de 2h30 de cul ture et qu'ensuite elle décroît. Aussi, on interrompt de préférence la culture au niveau maximum en arrêtant celle-ci par modification du pH qui est amené à 9 par addition de KOH. On sépare alors les cellules du milieu de culture par ultrafiltration, on les lave, puis on les centrifuge à 2800 g à 40C pendant 25 min et on les stocke à 4 C dans une solution permettant de maintenir leur niveau d'activité tryptophanase. Cette so solution est constituée par un tampon phosphate de potassium 0,1 m (pH7) contenant 10-4 mol/t de PLP qui est te cofacteur de ta tryptophanase et 2 mmot/L de dithioérythrîtoî (DTE).Dans ces conditions, l'acti- vité des cellules reste stable pendant une période d'au moins 10 jours. La teneur en tryptophanase des cellules représente environ 16X des protéines de la biomasse obtenue. II. IMMOBILISATION DES CELLULES SUR UN SUPPORT Pour cette étape, on utilise comme support te produit commercialisé sous le nom Biogrog A qui est un siticoatuminate obtenu par calcination vers 13000C d'un mélange talc-argile kaolinique (en proportion 30/70). D'un point de vue cristallographique, c'est un matériau du type cordiérite synthétique dont ta structure minéralogique est ta suivante - cordiérite 80%, - mullite 8X, - verre 12X. Sa composition chimique est ta suivante : SiO2 : 55,7X A1203 : 30,8% Fe2O3 1,6X TiO2 ; 1,1% K20 : 0,6X Na2O 0,6% MgO : 9,6% Ses propriétés physiques sont les suivantes Densité apparente : 1,1 Densité réelle : 2,4 Surface accessible : 0,04 (m/g) Porosité ouverte : 16 (% vol) Granulométrie : 0,1 - 0,2 (mm) Sa granulométrie est de 100 à 200 ,um, ce qui correspond à une surface accessible de 0,04 m2 /g et une porosité ouverte de 16Z en volume. On soumet tout d'abord le support à un prétraitement effectué de la façon suivante pour éviter des interférences lors de la synthèse enzymatique par relargage de métaux. Le support est lavé plusieurs fois à Ileau distillée de manière à éliminer les "fines". Il est ensuite placé dans une solution d'HCl3N(2 I/kg), sous agitation, pendant 3 heures. Après un abondant rinçage à l'eau distillée (jusqu'a l'obtention d'un pH neutre), le support est séché 1 heure à 100"C puis une nuit à 400C. Ce traitement ne semble pas provoquer d'importantes modifications de l'état de surface du support. Il est apparu, en effet, que l'immobilisation des cellules était sensiblement équivalente, avec ou sans traitement du support. On met ensuite le support ainsi traité en suspension dans de l'eau distillée pour assurer son dégazage, puis on l'introduit dans un réacteur et on le tasse de manière homogène. Sa densité apparente dans le réacteur est alors de 1,5. Les cellules d'Escherichia Coli stockées à 4OC sont alors mises en suspension dans la meme solution que celle utilisée pour le stockage à laquelle on ajoute de l'acide éthylènediamine tétracétique à raison de 0,24 9/9 de cellule. En effet, comme on peut le voir sur la figure 4, la quantité de cellules fixées sur le support est beaucoup plus importante lorsque l'on utilise une suspension contenant de l'acide éthylènediamine tétracétique. Sur cette figure 4, on a représenté la quantité de cellules fixées (en mg) en fonction de la quantité de cellules envoyées (en mg) en utilisant un réacteur d'un diamètre de 2,5 cm, contenant 229 de support, un débit de la suspension de 30 ml/h et une concentration en cellules de la suspension de 1 g/l. Sur cette figure la courbe 5 représente les résultats obtenus avec une suspension contenant 0,24 g d'EDTA par g de cellules et la courbe 6 illustre les résultats obtenus sans EDTA. Ainsi, on constate que le rendement d'immobilisation est très supérieur, de l'ordre de 90X, en présence d'EDTA, ce qui permet d'immobiliser près de 50 mg de cellules par gramme de support. Pour cette opération, on met en circulation la suspension de cellules au moyen d'une pompe péristaltique dans un réacteur à lit fixe contenant le support. On réalise l'opération de façon à immobiliser au plus 10 mg de cellules par gramme de support. En effet, des taux de fixation plus élevés n'ont pas d'intérêt pour la synthèse enzymatique car les contraintes diffusionnelles sont trop importantes et l'activité de la tryptophanase dans le réacteur de synthèse n'augmente plus. III. BIOSYNTHESE DU TRYPTOPHANE OU DE L'UN DE SES DERIVES DE SUBSTITUTION SUR LE NOYAU INDOLE Cette étape est réalisée en continu dans un réacteur de biosynthèse contenant les cellules d'Escherichia Coli immobilisées sur le support en Biogrog A obtenues précédemment. Sur la figure 5, on a représenté une instal lation de fabrication en continu du tryptophane qui comprend un réacteur de biosynthèse 11, un reacteur de précipitation 13 et un dispositif de filtration 15. Sur cette figure, on voit que le réacteur 11 est parcouru de façon continue par une solution introduite par la conduite 17 ; la solution sortant du réacteur par la conduite 19 est introduite dans le réacteur de précipitation 13, ou l'on ajoute différents réactifs. Après précipitation, on effectue une séparation du précipité par filtration en 15, la solution étant évacuée par la conduite 21 puis recyclée dans le réacteur de biosynthèse 11 par la conduite 17. Dans ce schéma de circulation, on introduit les réactifs basiques, soit L'indole, ta potasse et l'ammoniaque en amont du réacteur de biosynthèse 11 et on introduit les réactifs acides constitués par l'aci- de pyruvique, l'acide acétique, l'acide phosphorique ainsi que l'éthanol, l'eau et du PLP en amont du réacteu-r de précipitation 13. Ainsi, par réaction entre les réactifs acides et basiques, on forme directement dans la solution le pyruvate et le sel d'ammonium nécessaires pour la biosynthèse. Par aiLleurs, on obtient directement dans le réacteur de précipitation l'abaissement de pH nécessaire pour précipiter le tryptophane par L'inosine. L'inosine nécessaire à la précipitation est introduite dans le dispositif de précipitation 13 par la conduite 23. Cette inosine a été solubilisée en 24 par une partie de la solution sortant du dispositif de filtration par la conduite 21 qui est dérivée par la conduite 22 dans le réacteur de soLubilisation de l'inosine 24. L'inosine introduite en 24 est constituée par I'inosine récupérée en 26 Lors du traitement du précipité inosine-tryptophane séparé dans le dispositif de filtration 15. Dans le réacteur de biosynthèse, le tryptophane ou l'un de ses dérivés est synthétisé selon te schéma réactionnel suivant : On rappelle que la synthèse du tryptophane ou de l'un de ses dérivés- correspond au Indole Acide pyruvique Ammoniac Tryptophanase (enzyme) PLP* (cofacteur) L-tryptophane dans Lequel R représente le substituant du noyau indole qui peut être notamment un- radical alkyle, par exemple CH3, un radical hydroxyle ou un radical NH2. Pour obtenir la réaction dans les meilleures conditions, le pH est réglé à 8,9 et la température est de 370C. En effet, le pH et la température sont des paramètres importants car Is conditionnent la bioconversion et la vitesse de la réaction parasite entre le pyruvate et les ions ammonium. De même, les concentrations des différents réactifs sont choisies de façon à obtenir un bon rendement de La réaction de synthèse. Sur la figure 5, on a indiqué les débits des différents produits introduits dans l'installation. De même, les concentrations en tryptophane et en inosine des solutions circulant dans le circuit sont ajustées à des valeurs appropriées. Dans le tableau 1 ci-dessous, on a regroupé les valeurs optimales des différents paramètres qui agissent sur la biosynthèse du tryptophane. TABLEAU 1 Ethanol 10% PLP 0,1mmol.l 1 K2HPO4 75 Pyruvate 200 NH4 600 Indole 10 Tryptophane 15 Inosine 15,55" pH 8,9 Température 37"C La présence d'inosine dans la solution entrant dans le réacteur de biosynthèse 11 permet de travailler à des concentrations élevées en tryptophane. Les concentrations retenues pour l'inosine (15,55 mmol/l) et en tryptophane (15 mmol/l) résultent de la prise en compte - de la nécessité d'une équimolarité en tryptophane et inosine à l'entrée du réacteur, - de l'alimentation du réacteur par de l'indole à 10 mmol/l, et - du produit de solubilité tryptophane-inosine dans les conditions du réacteur de biosynthèse 11. La concentration en tryptophane à la sortie du réacteur 11 est dans ces conditions de 25 mmol!L, ce qui permet un rendement de précipitation très satisfaisant dans le dispositif 13, par exemple un rendement de 77,6X à pH 8,6 et à 50C. La concentration résiduelle en tryptophane de la solution recyclée par les conduites 21 et 17 est alors de 5,6 mmoL/l. Etant donné que l'on recycle les solutions dans le réacteur de biosynthèse 11, L'augmentation de volume due à l'introduction des réactifs en amont du réacteur de biosynthèse 11 et en amont du réacteur de précipitation 13, doit être minimale. Elle ne doit pas excéder le niveau de purge correspondant au volume du précipité tryptophane-inosine séparé dans le dispositif de filtration 15, la densité du précipité étant voisine de 1 et sa teneur en humidité étant de 50X. Aussi, on introduit les réactifs sous forme de solutions très concentrées et le tableau 2 ci-dessous indique les concentrations retenues pour chacun des réactifs introduits TABLEAU 2 Ethanol 17,1 mol.l 1 KOH 13,4 NH4OH 15,7 H3PO4 5,1 Acide acétique 17,5 Acide pyruvique 13,8 Indole (dans l'éthanol) 7 Pour l'introduction de l'inosine recyclée par la conduite 25, on réalise la solubilisation de l'inosine dans le réacteur 24 en opérant à un pH de 8,6 et à 25"C, ce qui correspond à une solubilité de 130 mmol/l. La quantité d'inosine nécessaire à la pré cipitation du tryptophane étant de 19,4 mmol/l/h, le débit dans la boucle de solubilisation 22, 23 est de 0,164 I/h. Dans les conditions données ci-dessus, le taux de bioconversion de l'indole est de 100%. On précise que le réacteur de biosynthèse 11 a une section d'entrée de 410 cm2, une hauteur de tit de 3cm, soit un volume de réacteur de 1,23 t et it contient 1840 g de support et 18,4 g de cellules, puisque le taux de fixation des cellules sur te support est de 10 mg/g de support. -IV. SEPARATION ET RECUPERATION DU TRYPTOPHANE Comme on l'a vu plus haut L'étape de précipitation est réalisée dans le réacteur 13 à une temperature de 50C après avoir modifié le pH au moyen de l'addition d'acide phosphorique, ce qui L'amène à une valeur de 8,6. Dans ces conditions, le produit de so lubilité tryptophane-inosine est de 87.10 mol2l 2 et les concentrations en tryptophane et en inosine dans la solution recyclée sont donc respectivement de 5,6 mmol.l 1 et de 15,5 mmol.l Le précipité obtenu est ensuite séparé de la solution par filtration en 15 puis traité dans l'ins- tallation représentée à la partie inférieure de la figure 5. On soumet tout d'abord le précipite à un rinçage en 31, par de l'eau introduite par la canalisation 33 qui est évacuée ensuite par la conduite 34. Le précipité est dissous en 35 par une solution d'acide sulfurique 0,3N. La solution obtenue est introduite par la conduite 37 dans une colonne échangeuse de cations 39 sur laquelle se fixe le tryptophane. La solution sortant de la colonne 39 par ta conduite 41 qui ne contient pratiquement que de l'inosine est concentrée en 43 pour séparer l'inosine qui est stockée en 26 avant d'être réintroduite par la conduite 25dans le réacteur de solubilisation de l'inosine 24. Après fixation du tryptophane sur la coLonne échangeuse de cations, on soumet celle-ci à un rinçage par de L'eau introduite par la conduite 45, l'eau de rinçage étant ensuite recyclée par la conduite 33 à l'étape de rinçage 31 du précipité d'inosine et de tryptophane. On réalise ensuite L'élution de La colonne échangeuse de cations par une solution d'ammoniaque ,1 N à une température de 60"C, ce qui permet d'éluer la totalité du tryptophane qui est évacué en solution par la conduite 47 et séparé de celle-ci par cristallisation en 43. On récupère ainsi le tryptophane en 49 avec un rendement d'environ 88,3%. L'eau qui a servi au rinçage de La résine échangeuse de cations en 39 et du précipité en 31 est évacuée par La conduite 34, puis traitée en 43 pour etre concentrée. Elle est ensuite recyclée par La conduite 36 à l'étape de dissolution du précipité de tryptophane-inosine. Sur La figure 5, on a indiqué Les voLumes utilisés pour Le traitement de 230 g de précipité tryptophane-inosine ayant entraîne 230 ml de Liquide, ce qui conduit à L'obtention de 1QOg de tryptophane. Le procédé de l'invention conduit ainsi à de bons taux de productivité, puisque dans Les conditions décrites précédemment, on peut obtenir 4,29 de tryptophane par heure et par litre de réacteur, soit 0,289 de tryptophane par heure et par g de cellules. De plus, on a vérifié que les cellules immobilisées présentaient une bonne stabilité car on n'a observe aucune perte d'activité après 25 jours de fonctionne ment en continu du réacteur. En se reportant maintenant aux figures 6 à 8, on peut voir tes résultats obtenus pour la séparation du tryptophane lorsqu'on utilise 49 cm de résine échangeuse de cations Duolite C 201, sous forme NH4+, introduites dans une colonne de 2,5 cm de diamètre et de 10 cm de hauteur, et une solution de tryptophane et d'inosine ayant un volume de 740 ml contenant 26,36 mmol/l de tryptophane et 25,1 mmol d'inosine, à pH 1,5 en milieu chlorhydrique, le débit d'alimentation du réacteur étant de 172 ml/h, ce qui correspond à une vitesse linéaire de 35 cm/h. Sur la figure 6, on a représenté l'éyolution des concentrations en tryptophane et en inosine à la sortie de la colonne échangeuse de cations lors de la phase de fixation. La concentration en tryptophane et en inosine des fractions successives qui ont chacune un volume de 20 ml a été portée en ordonnée et Les numéros des fractions ont été portés en abscisse. Ainsi, on voit que les 32 premières fractions de 20 ml contiennent uniquement de I'inosine et que le tryptophane appariait seulement dans les 5 der nières fractions. Ainsi, le tryptophane est totaLement etenu sur la résine en début d'opération et il n'apparait en sortie de colonne qu'après un volume de percolation de 640 ml. En revanche, l'inosine n'est que peu retenue. Sa concentration à la sortie de la colonne augmente progressivement. ELle dépasse même sa valeur initiale, traduisant ainsi l'entraînement de I'inosine fixée par la solution de percolation. Le bilan de cette étape (avant l'apparition du tryptophane en sortie de colonne) est le suivant Tryptophane fixé = 26,36 mol.l 1x0,64 I = 16,87 mMces Rendement = 100% (% du tryptophane envoyé) Rendement = 16,87 mec les = 86X (% du nombre d'équivalents 0,4m.équivalents X 49 ml de la résine). Inosine fixée = (25,1 mMx0,64 I) - 11 mM=5,06mc Rendement = 31,5X (% de l';nosine envoyée) Cette première phase permet donc d'obtenir une soLution d'inosine, dépourvue de tryptophane, contenant 68,52 de la quantité initiale d'inosine. Sur la figure 7, on a représenté l'évolution des concentrations en tryptophane et inosine à la sortie de la colonne échangeuse de cations, Lors du rin çage à l'eau distillée. Comme sur la figure 6, on a porté en ordonnée les concentrations en tryptophane et en inosine de chaque fraction de 20 ml et en abscisse le numéro de fraction. On remarque ainsi que le rinçage de la résine par de l'eau distillée se traduit par l'eLution de l'inosine. Elle est progressive, mais devient difficile en fin de rinçage. L'élimination totale de L'inosine est obtenue pour un volume d'eau distillee égal à 16 volumes de colonne mais elle s'accompagne d'une élution parallèle de tryptophane. La perte en tryptophane est à peu près constante et représente environ 0,73% de la quantité fixée par volume de rinçage de La colonne. Ainsi, l'elution totale de l'inosine se traduit par une perte en tryptophane de 11,7X. Pour éviter ces pertes en tryptophane, on effectue le rinçage par 9 volumes d'eau distillée et la quantité d'inosine résiduelle représente 7% de la quantité fixée. La quantité de tryptophane restant sur la résine est de 16,87 mmol-0,11 mmol, soit 16,76 mmol, ce qui correspond à un rendement global de 99,3% par rapport à la quantité envoyée. La solution de rinçage, d'un volume de 440 ml (9 volumes de résine) contient 9,5 mmol/l d'inosine et 0,25 mmol de tryptophane. Sur la figure 8, on a représenté l'évolution des concentrations en tryptophane et en inosine à ta sortie de la colonne échangeuse de cations, tors de l'eLution par de L'ammoniaque 0,1M à 60 C. Comme sur les figures 6 et 7, on a porté en ordonnée, Les concentrations de chaque fraction en tryptophane et en inosine, et en abscisse le nO de fraction, chaque fraction ayant un volume de 20 ml. Sur cette figure, on voit que La totalité du tryptophane est recueilLie dans un volume de 380 ml (8 volumes de résine). La concentration du tryptophane dans cette soLution est alors de 44 mmol/L, soit 9 g/l. La mise en oeuvre dans une installation de fabrication en continu du tryptophane par synthèse enzymatique, du procédé selon l'invention de récupération du tryptophane par précipitation au moyen d'inosine, dissolution du précipité dans une solution acide et récupération du tryptophane sur une colonne échangeuse de cations est particulièrement avantag-eu- se. En effet, elle est simple à mettre en oeuvre et conduit à une très grande efficacité puisqu'on obtient le tryptophane avec un degré de pureté de 99,9% sans aucun problème. La séparation du tryptophane à partir du milieu de bioconversion dans lequel il est produit est délicate car la nécessité de recycler les réactifs en excès, impose un procédé de séparation très spécifique n'entraînant pas de modifications dans la composition du miLieu. La précipitation du tryptophane par de l'inosine (ribonucléoside purique) est très avanta geuse car elle permet le recyclage des réactifs. Le tryptophane et l'inosine forment un complexe spécifique, peu soluble dans certaines conditions de pH et de température. La présence d'inosine résiduelle, dans le mi lieu réactionnel recyclé ne gêne pas la bioconversion. A L'inverse elle Lève l'effet inhibiteur exercé par Le tryptophane sur la réaction de biosynthèse et permet ainsi d'augmenter la concentration de ce dernier avant L'étape de séparation.Le précipité tryptophane-inosine peut être aisément fiLtré et remis en solution à pH acide. Par traitement sur résine échangeuse de cations (Duolite C201), il est alors possibLe de récupérer 88,3X du tryptophane dans une solution dépourvue d' inosine. Cette opération de précipitation par l'ino- sine, permet ainsi d'intégrer l'étape de séparation du tryptophane et Le recyclage des réactifs en excès dans un procédé fonctionnant en continu. De même l'utilisation dans le procédé de l'invention d'une souche sauvage d'Escherichia Coli est interessante car pour une efficacité pratiquement du même ordre, ces ceLLuLes présentent une meilleure résistance que celtes de mutants. Par ailleurs, Les cellules immobilisées sur le support en siLicoaLumi- natte ont une bonne stabiLité réactionneLle et Leur immobiLisation peut être obtenue avec un très bon rendement. Enfin, Le fait de réaliser ta synthèse en continu dans une installation telle que celLe représentée sur la figure 5, permet de maintenir à un niveau très faible La consommation des réactifs onéreux tels que le PLP et l'inosine. REVENDICATIONS 1. Procédé de récupération d'un composé choisi parmi Le tryptophane et ses dérivés de substitution sur le noyau indole à partir d'une solution contenant ledit composé, caractérisé en ce qu'il consiste a) à précipiter ledit composé par addition d'inosine à la solution, b) à dissoudre le précipité ainsi obtenu dans une so lution acide, c) à mettre en contact la solution acide ainsi obtenue avec une résine échangeuse de cations pour fixer le tryptophane ou le dérivé de tryptophane sur ladite résine, d)à éluer la résine par une base, et e) à séparer le tryptophane ou le dérivé de tryptopha ne de I'éluat ainsi obtenu. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on réalise la précipitation à un pH de 8 à 9 et à une température de O à 200 C. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la solution acide est une solution aqueuse d'acide sulfurique ou d'acide chlorhydrique ayant un pH de 1 à 2. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la résine échangeuse de cations est une résine polystyrénique dont le taux de divinylbenzène est au plus égal à 5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on réalise l'élution de la résine à chaud au moyen d'ammoniaque. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'après l'étape c) on soumet la résine échangeuse de cations à un rinçage à l'eau avant de réaliser l'élution. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on récupère le tryptophane ou le dérivé de tryptophane de la solution d'élution par cristallisation. 8. Procédé de synthèse enzymatique du tryptophane ou de l'un de ses dérivés de substitution sur le noyau indole, consistant 1) à mettre en contact une solution contenant de l'indole ou l'un de ses dérivés de substitution, un sel d'acide pyruvique et un sel d'ammonium avec des cellules d'Escherichia CoLi immobitisées contenant de la tryptophanase, et 2 > à recu- pérer le tryptophane ou son dérivé de substitution à partir de la soLution, caractérisé en ce que l'on récupère le tryptophane ou l'un de ses dérivés de ladite solution par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Procédé selon la revendication 8, carac térisé en ce que les cellules d'Escherichia CoLi contenant de la tryptophanase immobilistes ont été obtenues à partir de cellules d'Escherichia Coti cultivées dans un fermenteur, par mise en suspension desdites cellules dans un milieu liquide contenant au plus 0,30g d'acide éthyîènediamine tétracétique par g de cellules et mise en contact de la suspension ainsi obtenue avec un support en matériau inorganique à base d'oxyde et/ou d'hydroxyde simpLe ou mixte. 10. Procédé selon la revendication 9, carac térise en ce que la concentration en acide éthylène- diamine tétracétique de la suspension est tel Le que l'on ait 0,20 à 0,25 gramme d'EDTA par gramme de ceLlules. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que Le support est un silicoaluminate. 12. Procédé selon l'une quelconque des re vendi cations 9 à 11, caractérisé en ce que les cellu les d'Escherichia Coli ont été cultivées dans un milieu de culture contenant de 0,2 à 0,5 g/l de tryptophane. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que les cellules d'Escherichia Coli ont été produites en réalisant la culture en phase exponentielle de croissance et en arrêtant cette culture lorsque l'activité en tryptophanase des cellules est maximale. 14. Procédé selon La revendication 13, ca ractérisé en ce que l'on arrête la culture en amenant le pH du milieu de culture à 9. 15. Procédé selon t'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que la pression d'oxygène lors de la culture est de 10 à 50% 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que Le milieu de culture est un milieu à base de bactotryptone et d'extrait de levures ne contenant pratiquement pas d'hydrate de carbone. 17. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la solution contenant l'indoLe ou l'un de ses dérivés de substitution, un sel d'acide pyruvique et un sel d'ammonium utilisé dans l'étape 1), contient de plus de I'inosine. 18. Procédé selon L'une quelconque des revendications 8 et 17, caractérisé en ce que- la solution contenant t'indole ou l'un de ses dérivés, le sel d'acide pyruvique et le sel d'ammonium contient de plus jusqu'à 10% d'éthanol. 19. Procédé seLon la revendication 8, carac térisé en ce que dans L'étape 1) on utilise un reac- teur contenant les cellules d'Escherichia Coli immobi lisées contenant la tryptophanase, on met en circula tion dans ledit réacteur la solution contenant l'indole ou l'un de ses dérivés, le sel d'acide pyruvique et le sel d'ammonium, on traite la solution sortant du réacteur pour précipiter le tryptophane ou son dérivé au moyen d'inosine et on recycle dans Ledit réacteur La soLution séparée du précipité. 20. Procédé selon La revendication 19, ca ractérisé en ce que tes apports d'indole ou de son dérivé de substitution, de selo d'acide pyruvique et de sel d'ammonium sont réalisés en introduisant en amont dudit réacteur de l'indole, de L'ammoniaque et une base capable de se combiner avec L'acide pyruvique pour donner Le set d'acide pyruvique, et en ce que L'on introduit dans la solution qui va être soumise à ta séparation du tryptophane par précipitation, l'aci- de pyruvique, l'acide capable de se combiner avec L'-ammoniaque pour donner te sel d'ammonium et de L'acide phosphorique afin de diminuer le pH de cette solution avant précipitation. 21 Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 et 20, caractérisé en ce que l'on in tr-odwit Egatement jusqu'a 10X d'éthanol dans la soLu- tion qui va être soumise à La précipitation. 22. Procédé selon L'une quelconque des revendications 19 à 21, caractérisé en ce que l'on intraduit de L'inosine dans ta solution soumise à la précipitation de façon à recycler dans te réacteur une solution contenant de l'inosine. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 22, caractérisé en ce que l'on utilise des cellules d'Escherichia Coli auxotrophe pour la vitamine B1.