FR 2586689 A1 19870306 FR 8513046 A 19850902 MOYENS ET PROCEDES DE TRANSFERT DE PROTEINES SUR UNE SVRFACE RECEPTRICE SUPPORTEE L'invention concerne des moyens pour la réception et la retenue sur une surface de protéines qui y sont amenées et notamment par des techniques de transfert à partir de solutions les contenant, et amenées au contact de cette surface. Pour la commodité du langage, l'expression "protéines" est ùtilisée dans ce qui suit pour désigner non seulement les protéines selon l'acception générale de ce terme, mais également toutes formes de polypeptides, glyco-protéines, ou des fragments de ceux-ci. L'invention s'applique plus particulièrement à-la fixation et à l'immobilisation de protéines transférées sur cette surface à partir d'un gel, par exemple à base de polyacrylamide, dans lequel elles avaient été séparées par électrophorèse. Diverses techniques ont naturellement déjà été décrites pour réaliser ce transfert. Ce dernier est souvent nécessaire dans la mesure où les opérations destinées à être réalisées sur ces protéines ne peuvent l'être sur le gel lui-même. C'est notamment pour remédier à de telles difficultés que des techniques de transfert des protéines sur une surface plus favorable ont été mises au point au cours de ces dernières années. Une telle surface est avantageusement celle d'une feuille de nitrocellulose dont avait été reconnue la capacité de fixer des protéines par adsorption à sa surface. D'une façon générale, ces techniques de transfert comprennent la mise en contact de la feuille de gel contenant les protéines avec une feuille de nitrocellulose et la réalisation d'une "élution" visant à faire passer les protéines de la feuille de gel à la feuille de nitrocellulose. Cette élution peut être réalisée par diverses techniques y inclus la technique dite "d'électroélution" consistant à faire passer un tampon à travers les deux feuilles accolées l'une à l'autre sous l'influence d'un champ électrique. On peut, par exemple, se référer à l'article général intitulé "Protein Blotting : Principles and Applications" (Transfert par absorption de protéines , principes et applications) de Jonathan M. Gershoni et al., publié dans Analytical Biochemistry 131, 1-15 (1983). Pour que ce transfert puisse s'effectuer dans de bonnes conditions, les protéines doivent en général se trouver dans un état solubilisé ou solubilisable. Une telle condition s'avérait naturellement déjà nécessaire à l'occasion de la séparation des protéines contenues dans un mélange, notamment par électrophorèse dans un gel du type sus-indiqué. C'est la raison pour laquelle il est courant d'avoir recours à un détergent, tel que le dodécylsulfate de sodium (SDS). I1 existe d'ailleurs sur le marché des feuilles de gel de polyacrylamide déjà chargées de SDS, prêtes à l'emploi pour l'électrophorèse en présence d'un tampon approprié. Les applications de cette technique sont nombreuses. En particulier, les feuilles de itrocellulose sur lesquelles avaient été transférées les protéines peuvent être amenées au contact de solutions de réactifs ayant une affinité particulière pour l'une d'entre elles, la réaction résultant de cette affinité pouvant ensuite être détectée par des moyens classiques. Il en est ainsi, par exemple, dans le cas où parmi les protéines transférées il existe un antigène dont la présence dans le mélange initial de protéines était à détecter. Le réactif utilisé dans ce dernier cas peut alors être constitué par un anticorps ou une lectine. Ce réactif porte lui-même un marqueur ou peut à son tour être détecté par une autre molécule affine marquée. Si les feuilles de nitrocellulose sont aujourd'hui encore parmi les plus utilisées. il en existe également d'autres ; par exemple des papiers auxquels sont couplés de façon covalente des groupes de diazobenzyloxyméthyle ou encore des membranes de polyhexaméthylène adipamine (connues sous la marque NYLON), modifiées par des groupes aminés tertiaires, par exemple ceux connus sous la marque ZETABIND. La séparation des différentes protéines d'un mélange se révèle aussi souvent nécessaire dans le cas où l'on veut procéder à une analyse de structure de certaines d'entre elles : une technique couramment utilisée peut mettre en jeu les techniques de dégradation type "dégradation d'Edman", dont le principe est rappelé, par exemple, dans un article de Michael W. Hunkapiller et al. intitulé "Protein Sequence Analysis automated Microsequencing" (Analyse de la séquence de protéines de microséquençage automatisé), Science, vol. 219, Fév. 1983. Dans ce dernier type d'application, des problèmes supplémentaires se posent surtout dans les opérations de séquençage qui doivent être effectuées sur des protéines qui ont, au préalable, été séparées dans un gel de polyacrylamide et ce tout particulièrement en présence de dodécylsulfate-de sodium. En effet, les opérations de séquençage selon le principe rappelé ci-dessus impliquent des traitement de ces protéines par des solutions fortement acides, par exemple avec une solution d'acide chlorhydrique 6 N, à des températures qui peuvent dépasser 100toc. Ces opérations ne peuvent naturellement pas être réalisées sur les parties du gel retenant la fraction de protéines à étudier. Elles ne peuvent l'être davantage sur la fraction de protéines transférées sur des feuilles ou membranes du type sus-indiqué. Ces dernières sont en effet trop fragiles pour résister aux réactions chimiques mises en oeuvre dans les dégradations d'Edman. D'une façon générale, il a donc été nécessaire jusqu'à ce jour d'extraire les protéines à séquencer de la feuille de gel les contenant et, en particulier lorsqu'on avait eu recours à un gel chargé en détergent, d'éliminer ces derniers par dialyse. La manipulation de quantités souvent extrêmement faibles de protéines extraites dans les conditions sus-indiquées est souvent très difficile, même si les techniques et les appareillages utilisés à cet effet (voir, par exemple, l'article de Michael W. hunkapiller et al. déjà mentionné ci-dessus) ont été l'objet de perfectionnements constants. En particulier, il a déjà été proposé, pour éviter les adsorptions parasites de protéines, par exemple sur les parois de verre des récipients utilisés dans les séquenceurs, d'introduire ces protéines à l'état préalablement solubilisé dans une solution de sels d'ammonium quaternaire polymérique, dénommé polyméthobromure de 1,5 diméthyl - 1,5 diazaundécaméthylène. Ce composé, également connu sous la marque POLYBRENE, est alors capable de former sur les surfaces en verre du récipient une pellicule à laquelle le polypeptide s'incorpore, de sorte qu'il est ensuite protégé de l'action mécanique de lavage des flux de solvants. La pellicule est aisément pénétrable par les réactifs d'Edman. Les réactions de dégradations nécessaires à la réalisation du séquençage peuvent être alors aisément réalisées. Ce produit, dont l'utilisation aux fins qui précèdent, a pour la première fois été décrit par G.E. Taar et al. Anal. Biochem 75.621 (1976), sera par la suite désigné par la marque sous laquelle il est commercialisé, à savoir POLYBRENE pour de simples raisons de commodité de langage. I1 va naturellement de soi que l'utilisation de ce terme, dans le cadre de cette demande de brevet, n'a pas vocation à porter atteinte aux droits des marques. Si ce produit a permis le séquençage de quantités encore plus faibles qu'auparavant de protéines, notamment de l'ordre de 200 nmoles, les problèmes relatifs aux difficultés d'obtention des protéines séparées sur gel, dans un état tel que l'on puisse ensuite envisager les opérations de séquençage, n'ont toujours pas encore reçu de solution pratique. Le but de l'invention est de remédier en grande partie à ces divers inconvénients, particulièrement de fournir des moyens permettant le transfert directement et 1' immobilisation de protéines, par exemple à partir d'un gel de polyacrylamide, sur une surface libre formée d'un support. ces protéines immobilisées pouvant alors être directement étudiées ou analysées dans un séquenceur. Le procédé, selon l'invention de transfert et d'immobilisation de protéines sur une surface libre formée sur un support chimiquement inerte, de préférence poreux, à partir d'un milieu susceptible de les fournir, amené en contact avec cette surface, se caractérise en ce que ladite surface initialement exempte de protéines a un caractère généralement hydrophobe, tout en portant des charges d'un signe déterminé et-en ce que les protéines sont amenées à l'état solubilisé au contact de ladite surface, en présence d'un détergent portant des charges de signe opposé au signe déterminé, la concentration du détergent étant suffisante pour, sl besoin, maintenir la solubilité desdites protéines dans le milieu, mais ne dépassant pas celle qui entrainerait une fixation trop sélective du détergent à ladite surface au détriment des protéines. L'lnvention découle en effet de la découverte qu'en opérant dans les conditions qui précèdent, le détergent mis en oeuvre paraissait agir comme véhicule de transfert de la protéine sur la surface libre ainsi formée, l'excès de détergent pouvant ensuite être aisément lavé sans que les protéines transférées soient détachées de la surface libre. Dans la définition qui précède du procédé selon l'invention, il importe de préciser quelques unes des notions évoquées. L'expression "chimiquement inerte" se rapporte à tout support capable de résister aux solvants aqueux et organiques couramment utilisés dans les techniques de séquençage rappelées plus haut et également aux températures couramment utilisées. En particulier, on peut avoir recours pour la constitution de ce support à tout matériau résistant à des solutions d'acide chlorhydrique à 6 N, à une température de llO"C pendant vingt quatre heures. De façon non limitative, le support sera constitué de fibre de verre. De même, l'expression "surface du support" n'exclut pas, surtout lorsqu'il est poreux, que les protéines puissent pénétrer à l'intérieur de ce support. En fait, une telle pénétration permet la fixation, s'il y a lieu, de quantités plus importantes de protéines et leur meilleure immobilisation. I1 est cependant clair que, macroscopiquement, l'on se trouve en présence d'une surface, surtout lorsque ce support est lui-même formé d'une feuille ou d'une membrane. I1 n'est guère nécessaire d'expliciter le terme "hydrophobe", dont l'acception générale ne pose pas de problème aux chimistes, un groupe hydrophobe étant celui qui présente un caractère répulsif vis-à-vis de l'eau. De même, il ne faut pas nécessairement prendre à la lettre l'expression faisant apparaître : "les protéines sont amenées à l'état solubilisé au contact de ladite surface en présence d'un détergent ..." Là encore, il s'agit d'un phénomène apparent. I1 ne peut être exclu que, surtout dans les conditions envisagées plus loin, les protéines transférées forment avec le détergent choisi un complexe susceptible de "précipiter" au contact de la surface libre. De même, l'Homme du Métier est à même de régler les intervalles de concentration de détergents utilisables pour répondre à la condition correspondante exprimée dans la définition générale sus-indiquée dans l'invention. Ces concentrations relatives seront à fixer selon la nature du détergent utilisé. Lorsque le transfert s'effectuera à partir d'un gel, comme dans les cas préférés qui seront évoqués plus loin, il sera fréquent que la teneur même du gel en détergent nécessaire à la solubilisation des protéines soumises àl 'électrophorèse soit suffisante à assurer le transfert et l'immobilisation sus-indiqués. Dans une première variante de l'invention, et surtout lorsque le détergent utilisé sera constitué par du SDS, la surface libre du support devra comporter des groupements porteurs de charges positives. Dans ce cas, l'invention mettra généralement en oeuvre le produit nouveau que représentent les pellicules immo bilisées, formées à la surface du support chimiquement inerte par l'intermédiaire de liaisons assurant leur insolubilisation vis-à-vis de solutions aqueuses et organiques, ladite pellicule étant formée d'un produit initialement dépourvu de protéines et comportant à la fois des groupes hydrophobes et des groupes chargés positivement affleurant à sa surface libre. Dans le cas où le support est formé en verre, la matière dont est constituée la pellicule est avantageusement formée par un polymère hydrophobe, comprenant des chaines hydrocarbonées, dans lesquelles sont intercalés des groupements fournissant des charges positives, notamment des groupes d'ammonium quaternaire dont une partie au moins affleure à la surface libre, et l'autre partie coagit avec les groupes silanols existant à la surface du support de verre. Ce produit est avantageusement formé par le POLYBRENE. L'invention met donc à profit la capacité de cette ma-tière à former des liaisons ioniques avec des groupes silanols négativement chargés affleurant à la surface du verre poreux. La réalisation de ces liaisons ioniques suffit à insolubiliser une pellicule au moins monomoléculaire de POLY BRENE à la surface de verre vis-à-vis des solutions aqueuses (le POLYBRENE est soluble dans l'eau) tout en préservant sa capacité à absorber des protéines même en présence de détergents. Tout autre détergent porteur de charges négatives peut être utilisé en lieu et place du SDS. A titre d'exemple, l'on mentionnera l'acide stéacique, l'acide palmitique. D'une façon générale, on a recours à des détergents formés de chaînes hydrophobes, notamment de nature aliphatique ou aromatique, porteurs de groupements suffisamment hydrophiles pour les rendre hydrosolubles. En ce qui concerne les matières nécessaires à la formation de la pellicule, on peut avoir recours à tout autre type de molécules comportant à la fois des régions hydrophobes, en particulier portés par des éléments de chaînes aliphatiques ou aromatiques, et des régions porteuses de charges positives. On peut mentionner, à titre d'autres exemples de matières utilisables, le polyéthyléneimine. Dune façon générale, on peut avoir recours à des poly mètres dont la structure se distingue de celle du POLYBRENE ci-après rappelé. Structure du POLYBRENE ans laquelle n peut varier dans de grandes proportions et où les groupes triméthylène et hexaméthylène peuvent etre remplacés par des chaînes plus courtes ou plus longues. Une des conditions à prendre en considération pour le choix de ces polymères sera le nombre d'atomes d'azote intercalés dans les chaînes pour que tous ne soient pas engagés dans les liaisons ioniques formées entre les groupes -O-S-O3 du verre et les groupes -CH2-N (CH3)2-CH2- du POLYBRENE. Quel que soit le polymère utilisé comportant les groupes ammonium quaternaire nécessaires à la fixation d'une mince pellicule à la surface du support chimiquement inerte, on obtient en définitive une pellicule caractérisée par des ponts polyéthylène (hexaméthylène et triméthylène respectivement dans le cas du POLYBRENE) comprenant un excès d'ions ammonium quaternaire intercalés entre les ponts. La surface ainsi produite fonctionne à la façon d'un échangeur d'anions forts ayant un caractère hydrophobe. Avantageusement le milieu à partir duquel les protéines sont transérées à la surface libre de la pellicule est lui-même formé d'un gel de polyacrylamide contenant luimême du SDS. Le transfert peut alors être réalisé par contact intime entre la feuille de gel et le support portant la susdite pellicule, le transfert étant alors effectué de toute façon appropriée (diffusion, convection, électro-élution, etc.). Lorsque l'on a recours à un solvant tamponné extérieur pour favoriser cette élution, on peut avoir recours à une solution tamponnée classique. Dans le cas où la concentration en SDS est suffisante à assurer la solubilisation des protéines, il est en général inutile de travailler avec une solution tamponnée contenant elle-même encore une certaine teneur en détergent.La teneur en détergent du gel est en général suffisante pour promouvoir le transfert dans les conditions qui ont été indiquées. Il en est ainsi en particulier lorsque la teneur du gel de polyacrylamide en SDS utilisé, pour réaliser l'électrophorèse préalable d'un mélange de protéines, contenait 0,1% de SDS. I1 est significatif que l'invention tire profit des propriétés qui pourraient a priori être contradictoires des différents constituants mis en jeu. Il est en effet rappelé que le POLYBRENE est insoluble dans l'eau. Sa fixation sur le support inerte le protège cependant de cette propriété qui autrement pourrait être nuisible, particulièrement si les quantités de solution tamponnée mises en oeuvre pour réaliser l'élution étaient relativement importantes. C'est la raison pour laquelle il n'est pas avantageux d'utiliser des supports pourvus à sa surface de POLYBRENE non fixé. Celui-ci pourrait alors à l'occasion du susdit contact capter des protéines qui seraient ensuite perdues, par exemple dans le cas de lavages répétés de la surface libre supportée. La présence de POLYBRENE non "fixé" pourrait encore être nuisible pour une raison supplémentaire. En effet, le POLYBRENE et le SDS forment des complexes insolubles dans l'eau. Leur formation éventuelle serait alors un obstacle au transfert complet des protéines à partir du gel vers la pellicule supportée. Enfin, la fixation du POLYBRENE, sous forme d'une fine pellicule à la surface du support inerte, ne fait pas obstacle au lavage de la surface libre retenant les protéines avec des solvants organiques, y compris ceux réputés dissolvant aisément le POLYBRENE ou des polymères déchargés analogues. Bien entendu, dans la technique qui précède, le gel de polyacrylamide peut être remplacé par tout autre gel, par exemple des gels à base d'agarose, de carboxyméthylcellulose, etc. L'invention concerne également un procédé particulièrement simple de fabrication de pellicules supportées répondant aux conditions sus-indiquées. En particulier, le procédé de formation d'une pellicule insolubilisée vis-à-vis de solvants aqueux ou organiques sur un support chimiquement inerte, notamment en verre, est caractérisé par la mise en contact de la surface de ce support avec une solution de préférence aqueuse d'une matière dont la structure moléculaire comporte à la fois des régions hydrophobes et des groupes chargés positivement permettant sa solubilisation dans l'eau, le nombre de groupes chargés positivement et la concentration de la matière dans la solution étant suffisante pour permettre la neutralisation des charges négatives portées par le support de verre, ainsi que la formation et la rétention d'une pellicule au moins monomoléculaire hydrophobe portantun excédent de charge positive à sa surface, après rinçage et séchage dudit support revêtu de la pellicule insolubilisée alors formée. L'invention concerne également la variante opposée du procédé de transfert et d'immobilisation de protéines qui peut être conçu. Dans cette variante opposée, la surface libre sur laquelle les protéines sont transférées porte alors des groupes chargés négativement et le détergent mis en oeuvre dans l'opération de transfert porte alors des groupes chargés positivement. On peut se retrouver placés dans cette situation lorsque, partant d'une feuille de gel de polyacrylamide initialement chargé en SDS et dans laquelle différentes protéines ont été séparées sous forme de bandes, le gel polyacrylamide-SDS est lavé de façon extensive avec une solution contenant 0,5% d'acide acétique et 0,1% de bromure de cétyltriléthyl-ammonium (commercialisé sous la marque CETAVLON).Ce lavage substitue alors au SDS le CETAVLON positivement chargé et transforme le complexe protéinesdétergent en des micelles positivement chargées. Le complexe protéines-détergent ainsi formé peut alors être fixé sur un support chimiquement inerte, présentant une surface libre hydrophobe, mais portant cette fois-ci des charges négatives. Ces charges négatives peuvent être fournies par une surface de verre, en l'absence de toute pellicule intermédiaire. Les groupes silanols fournissent alors les charges négatives permettant de fixer les groupes triméthyl-ammonium du CETAVLON tandis que les parties cétyl-aliphatiques interviennent au niveau de l'interaction entre le détergent et les régions hydrophobes de la surface de verre. Ceci étant, la surface de verre peut également être pourvue d'une pellicule fixée de façon ionique, covalente ou non covalente (selon des principes analogues à ceux applicables dans le cas précédent), notamment lorsque l'on souhaitera renforcer le nombre de charges négatives affleurant à la surface du verre. Dans ce qui précède, il a surtout été fait référence au transfert des protéines contenues dans une feuille de gel à la surface libre d'un support chimiquement inerte. I1 va de soi que le milieu fournissant les protéines peut être de toute autre nature, par exemple consister en une feuille de nitrocellulose ou de NYLON poreux contenant des protéines à l'état adsorbé et qui peuvent en être éluées dans toutes conditions appropriées. Des caractéristiques supplémentaires de 1' invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit des conditions dans lesquelles a été réalisé le transfert de protéines diverses à partir de milieux appropriés vers une surface libre supportée par un support inerte répondant aux conditions qui ont été précisées plus haut, ainsi qu'à la lecture des figures qui s'y rattachent dans lesquelles - la figure 1 représente le transfert de différentes protéines d'un gel de polyacrylamide contenant du SDS sur une fibre de verre recouverte de POLYBRENE. Le mélange standard-contient de la phosphorylase b (a) de la sérumabumine bovine (b) , ; de l'ovalbumine (c) de l'anhydrase carbonique (d) ; un inhibiteur de la trypsine du soja (e) ; du lysozyme (f). A représente le modèle après coloration du gel par le bleu de Coomassie , B et C, respectivement les taches sur la fibre de ve-rre de la première couche (B) et de la seconde (C) colorées avec la fluorescamine ; D une coloration avec le bleu de Coomassie des protéines restantes dans le gel - après lélectrotransfert ;E et F respectivement, les taches de protéines après lsélectrotrans- fert sur la première (E) et la seconde (F) feuille des protéines colorées auparavant au bleu de Coomassie G les taches de protéines colorées au bleu de Coomassie restantes dans le gel après élimination des taches de transfert colorées au bleu de Coomassie - la figure ? représente le transfert à deux dimensions de protéines issues de muscle embryonnaire d'un poussin âgé de 18 jours sur une fibre de verre recouverte de POLYBRENE où A représente le gel à deux dimensions coloré avec le bleu de Coomassie ; B la tache correspondante sur le verre recouvert de POLYBRENE. Les protéines dans B représentent la moitié de la quan tité utilisée dans A où A1, A2 et Tm représentent respectivement la bêta-actine, l'alpha-actine et la tropomyosine. H+ et OH indiquent le côté acide et basique du gel. Le point isoélectrique (IEF) est monté horizontalement, le gel de polyacrylamide contenant du SDS est monté verticalement - la figure 3 est un exemple de transfert de protéines variées où A, B, C, D, E, F représentent la myoglobine, la phosvitine, l'actine, le chymotrypsinogène, la sérumalbumine humaine et la DNase I immobilisés sur la première feuille et colorés avec la fluorescamine. A+, B+, C+, D+, E+, F+ représentent les mêmes taches sur la seconde couche. G, H, I, J, K, L représentent les mêmes protéines, dans le même ordre, transférées après une coloration dans le gel avec le bleu de Coomassie. Seule la première couche est montrée ici. Les taches ont été utilisées pour déterminer la capacité de fixation du verre recouvert de POLYBRENE (voir tableau I) et pour comparer leur composition avec celles dérivées de leur séquence connue - la figure 4 représente la détermination de la sensibilité de l'opération de transfert sur fibre de verre où des quantités variées (10, 50, 100, 500 et 1000 ng) de sérum-albumine humaine ont été utilisées sur un gel de polyacrylamide à 12,5% et détectées dans le gel avec le bleu de Coomassie (A), la coloration à l'argent (C), la fluorescamine après la fixation sur le POLYBRENE (B. On indique ci-après les natures des matériels et des méthodes qui ont été utilisés au cours du transfert des protéines. Le mélange standard de protéines à bas poids moléculaire a été fourni par Bio Rad Laboratories. La Sérumalbumine humaine, la DNase pancréatique bovine et la myoglobine de muscle squelettique de cachalot ont été obtenues par Sigma Chemicals. L'ovalbumine et le chymotrypsinogène traité au diisopropylfluorophosphate sont des produits Worthington. La phosvitine d'oeuf de poulet a été fournie par le Docteur S. de Boeck, State University of Ghent, Belgique. 'actinie du muscle squelettique de lapin a été préparée à partir de poudres d'acétone selon Spudich et Watt (2). =es feuilles de fibre de verre (47 x 56 cm) sont des produits Whatman, Royaume-Uni. =e POLYBRENE (polyméthobromure de 1,5 diméthyl - 1,5 iazaundicaméthylène) et la fluorescamine sont des pro inuits de Janssen Chimica, et Fluka A.G. respectivement. Les produits chimiques dans le procédé de transfert ont été utilisés sans autre purification. es réactifs et les solvants utilisés dans le séquençage en phase gazeuse ont été fournis par Applied Biosystems Inc. Les solvants dans l'analyse HPLC des dérivés de l'acide aminé -PTH- ont été mesurés par chromatographie liquide à haute performance. PREPARATION DES FEUILLES DE FIBRE DE VERRE RECOUVERTES DE POLYBRENE Des feuilles de papier de microfibre de verre ont été coupées à la taille du gel de polyacrylamide et imprégnées avec une solution de POLYBRENE dans l'eau à 3 mg/ml. Les feuilles imprégnées ont été séchées à l'air et l'excès de POLYBRENE a été enlevé par lavage avec 100 ml d'eau distillée pendant 10 minutes. Les feuilles ainsi lavées ont été ensuite utilisées immédiatement, ou stockées dans un milieu sec. ELECTROPHORESE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE CONTENANT DU S D S - TRANSFERT ET DETECTION DES PROTEINES IMMOBILISEES Les échantillons ont été préparés et séparés sur des gels de polyacrylamide contenant du SDS essentiellement selon la méthode décrite par Laemmli (3). Les gels étaient épais de 1,5 mm et le pourcentage d'acrylamide utilisé a été de 12,5% sauf indication contra ire. Le transfert électrophorétique a été effectué pendant 23 heures à 3 V/cm et l'ensemble gel-fibre de verre a ete assemblé essentiellement selon la méthode décrite rouir le transfert de protéines sur de la nitrocellulose ), la nitrocellulose étant remplacée par deux feuilles e verre recouvertes de POLYBRENE et marquées sur les oDrds par des encoches, afin de pouvoir réaliser une superposition parfaite après le séchage et la coloration. Le tampon de transport contenait 50 mM de borate e Sodium (pH : 8,0), 20% de méthanol et 0,02% de Bêta rercaptoéthanol. 'es feuilles de verre recouvertes de POLYBRENE ont été ensuite lavées pendant 10 minutes avec 150 ml e chlorure de sodium à 25 mM et 10 mM de borate e sodium (pH 8,0). Cette opération a été répétée 4 fois et s'est terminée par un lavage à l'eau pendant 5 minutes. Les feuilles ont été séchées pendant la nuit et plongées dans une solution de fluorescamine dans acétone fraîchement préparée de 1 mg/50 ml à 1 mgl/300 ml). 'es protéines ont été visualisées après exposition à l'ultraviolet, avec une lampe à lumière minérale, Ultraviolet Products, San Gabriel, USA) et photographiées avec un film Polaroïd type 665 P/M er un filtre Wratten ne 9, avec des temps d'exposition variant de 1 à 2 minutes. tans certaines expériences, les protéines ont été visualisées en premier lieu dans le gel par une coloration pendant 20 minutes avec une solution de Bleu de Coomassie (0,25% de Bleu de Coomassie, 45X de méthanol, 9% d'acide acétique en volume) et décolorées pendant au moins 24 heures avec des solutions chargées plusieurs fois de 5% de méthanol, 7,5% d'acide acétique. Avant ltélectrotransrert, les protéines coloriees ont été redissoutes en introduisant le gel dans 0,1i de S D S, 50 mM de borate de sodium (pH 8,0), et ce tampon a été remplacé plusieurs fois jusqu'à ce que le dernier lavage montre une valeur de pH supé rieure à 7,0. Le gel équilibré a été ensuite monté et électrotransféré comme il a été décrit plus haut. Etant donné que le bleu de Coomassie se lie fortement au POLYBRENE cationique, les protéines ont pu être localisées par la co-électroélution et co-adsorption de la tache liée à l'origine à la protéine dans le gel. La dernière procédure sera ici référencée comme l'immobilisation "indirecte" ou "colorée" par le bleu de Coomassie. ELECTROPHORESE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE A DEUX DIMENSIONS Du tissu embryonnaire de muscle squelettique de poussins âgés de 18 jours a été dissous dans 10% de Bêtamercaptoéthanol, 3X de dodécylsulfate de sodium, centrifugé et les aliquots contenant des concentrations appropriées de protéines ont été lyophilisés. Le matériel séché a été redissous dans un tampon lyse ( 4) et les protéines ont été séparées dans un système polyacrylamide à 2 dimensions, comme décrit par Garrels {4 ). EXEMPLE I TRANSFERT ET IMMOBILISATION DE PROTEINES VARIEES La figure 1 montre les résultats des expériences de transfert effectuées avec le mélange standard de protéines à bas poids moléculaire fourni par Bio Rad, et séparé sur un gel de polyacrylamide à 12,5%. Une des encoches du gel a été colorée avec le bleu de Coomassie (fig, 1A) et l'autre a été électroéludée sur deux feuilles de fibre de verre superposées, recouvertes de POLYBRENE et colorées ensuite avec la fluorescamine (fig. 1 B et 1 C). La figure 1 D montre un exemple de protéines colorées avec le bleu de Coomassie et restant encore dans le gel après l'opération de transfert. Les modèles démontrent que, hormis le cas de la phosphorylase b, toutes les protéines standard sont électroéiudées quantitativement hors du gel et immobilisées sur plusieurs couches de verre recouvert de POLYBRENE. En raison de son poids moléculaire élevé, la phosphorylase b n'est pas quantitativement éludée hors du gel et des périodes dlélectroélution plus longues semblent nécessaires pour obtenir une élut ion complète. La quantité de protéines présentes dans chaque bande (environ 10 pg) est suffisante pour saturer la surface correspondante sur la première feuille de verre, après quoi les protéines sont immobilisées sur la seconde feuille. Les protéines présentes seulement en de faibles quantités (qui représentent ici les produits de dégradation des protéines standard) sont entièrement retenues sur la .ère feuille. Les figures 1 E et 1 F montrent le transfert du même mélange de protéines sur deux feuilles de verre re -ouvertes de POLYBRENE superposées. Elles ont été auparavant colorées avec le bleu de Coomassie (voir figure 1 A) et ensuite redissoutes en incubant le gel dans le tampon contenant du SDS avant lélec- trotransfert, les protéines restantes dans le el après cette opération de transfert ont été recolorées avec le bleu de Coomassie et le résultat est montré à la fig. 1 F. Cette expérience montre que les protéines qui ont été auparavant colorées dans le gel peuvent aussi être transférées et immobilisées sur le verre. Toutefois, ce transfert "indirect" apparaît être moins quantitatif et plus dépendant du type de protéines que dans le transfert direct. Non seulement les protéines à poids moléculaire élevé (phosphorylase b et sérumalbumine bovine) mais également des protéines plus petites comme la lysozyme sont retenues partiellement sur le gel original. Ici également les protéines sont immobilisées à des niveaux de saturation sur la première feuille et ensuite adsorbées sur les couches suivantes. Dans le but de démontrer que la technique de transfert sur verre peut être appliquée avec une large variété de protéines, un extrait de protéine d'un muscle de patte de poulet embryonnaire âgé de 18 jours a été séparé par une électrophorèse classique à deux dimensions sur gel de polyacrylamide. La figure 2 A montre les taches de protéines après coloration du gel avec le bleu de Coomassie. La figure 2 B montre une coloration avec la fluorescamine des taches sur la fibre de verre, effectuée à partir d'une séparation similaire et avec la moitié de l'extrait de protéines utilisé pour la figure 2-A. La tache sur le verre apparaît comme une copie presque exacte de la protéine visualisée dans le gel. Les taches principales sont de l'actine alpha et bêta et les isoformes de la tropomyosine. Elles représentent environ 0,5 ug de protéines ainsi qu'il a été déterminé avec l'analyse amino-acide des taches immobilisées. La capacité pour la feuille de fibre de verre de retenir des protéines a été déterminée pour plusieurs protéines en mesurant la quantité de protéines qui était retenue sur des régions saturées des feuilles (ces régions sur la première couche correspondant à la tache des protéines sur la deuxième couche). Les résultats ont été ensuite normalisés en > ug de protéine par cm2 et sont résumés dans la table 1. Les capacités maximales ont été déterminées pour la myoglobine de muscle squelettique de cachalot, la phosvitine d'oeuf de poulet. latine de muscle squelettique de lapin, le chymotrypsinogène bovin, la sérumalbumine humaine et la DNase I pancréatique bovine. Les protéines ont été déposées sur le gel en quantités suffisantes pour permettre une analyse amino-acide précise (de 1 nnmol à 300 pmol). Les modèles de transfert de ces protéines sont montrés à la figure 3. Les capacités de fixation ont été mesurées soit après le transfert direct et la détection avec la fluorescamine (Table 1 ligne 1) soit après la détection avec le bleu de Coomassie suivie du transfert (Table 1, ligne 2). Les valeurs données à la ligne 1 sont des moyennes de deux déterminations indépendantes, chacune d'entreelles ne différant pas de la valeur moyenne de plus de 10%. Ceci indique que la capacité de transfert pour chaque protéine est relativement constante, indépendante de l'expérience. Les valeurs ont été basses pour la phosvitine (protéine phosphorylatée) (8 ug/cm2) et variables pour les autres protéines entre 15 et 28 Fg/cm2. La capacité de fixation pour les protéines colorées avec le bleu de Coomassie (ligne 2) a été identique aux valeurs ci-dessus pour 3 protéines sur .6, mais seulement égale à la moitié pour la myoglobine et l'actine et extrêmement basse pour la phosvitine. De plus, ces dernières valeurs ont varié d'une manière sensible d'une expérience à l'autre (+ de 50X). Comme ci-dessus, les valeurs données à la ligne 2 de la Table 1 représentent des moyennes de deux expériences indépendantes. Cette variabilité sensible semble être due à une insaturation incomplète du gel avec le tampon SDS-borate avant lélectrotransfert. La figure 4 A montre le résultat de la coloration de différentes quantités de sérumalbumine humaine (de 5 à 500 ng) avec le bleu de Coomassie, la figure 4 C la coloration avec l'argent (5), la figure 4 B avec la fluorescamine, cette dernière étant effectuée après un transfert électrophorétique sur le verre recouvert de POLYBRENE. Les résultats démontrent que pour la sérumalbumine, la détection avec la fluorescamine (en utilisant 1 mg/200 ml) présente une meilleure sensibilité que celle avec le bleu de Coomassie, mais moins bonne qu'avec l'argent. Tableau I Capacité de transfert et d'immobilisation de différentes protéines sur des feuilles de verre recouvertes de POLYBRENE électroéludées de gels de polyacrylamide-SDS ( > gicm2) Transfert direct Transfert suivi Protéine suivi d'une d'une coloration détection à la au bleu de Coomas fluorescamine sie dans le gel myoglobine 21 13 DNase I 21 20 cnymotrypsinogène 15 14 actine 28 13 sérumalbumine humaine 23 24 phosvitine 8 0,5 REFERENCES 1 - Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 2 - Spudich, J.A., and Watt, S. (1971) J. Biol. Chem. 246, 1866-1871 3 - Laemmli, U.K. (1970) Nature 277, 680-681 4 - Garrels, J.I. (1979) J. Biol. Chem. 254, 7961-7977 5 - Wray, W., Boulikas, T., Wray, V., and Hancock, R. (1981) Anal. Biochem. 118, 197-203 REVENDICATIONS 1. Procédé du transfert et d'immobilisation de protéines sur une surface libre formée sur un support chimiquement inerte, de préférence poreux, à partir d'un milieu susceptible de les fournir, amené en contact avec cette surface, caractérisé en ce que ladite surface initialement exempte de protéines a un caractère généralement hydrophobe tout en portant des charges d'un signe déterminé-et en ce que les protéines sont amenées à l'état solubilisé au contact de ladite surface, en présence d'un détergent portant des charges d'un signe opposé au signe déterminé, la concentration du détergent étant suffisant pour, si besoin, maintenir la solubilité desdites protéines dans le milieu, mais ne dépassant pas celle qui entraînerait une fixation trop sélective du détergent à ladite surface au détriment des protéines. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support chimiquement'inerte est à base de verre, notamment de fibre de verre. 3. Procédé selon-la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le milieu à partir duquel les protéines sont transférées vers ladite surface est essentiellement formé par une feuille à'un gel, notamment à base de polyacrylamide, amené au contact de la surface libre. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le gel porte plusieurs bandes de protéines et en ce que le transfert est effectué par élut ion des protéines hors du gel et vers la surface libre du support. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la surface libre est formée sur une pellicule hydrophobe immobilisée à la surface du support inerte par l'intermédiaire de liaisons assurant son insolubilisation vis-à-vis de solutions aqueuses et organiques venant à son contact. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la pellicule est formée d'un produit polymère géné ralement hydrophobe isolant le support du milieu contenant les protéines et amenée à son contact, ladite pellicule comportant des groupes chargés positivement affleurant à sa surface extérieure et en ce que le détergent utilisé comporte des charges négatives. ,. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la pellicule est formée d'un produit comportant des chaines hydrocarbonées hydrophobes, dans lesquelles sont intercalés des groupes ammonium quaternaire. e. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la pellicule est constituée de polyméthobromure de 1,5 diméthyl-l,5 dlazaundécaméthylène. 9. Procédé selon la revendication 5 prise isolément ou en zomDinaison avec l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le détergent est constitué de dodécylsulfate de sodium. O. Procédé selon la revendication 1 ou 2. caractérisé en ce que ladite surface porte des groupes chargés négavivement et en ce que le détergent porte des groupes chargés positivement. il. Procédé selon la revendication 10. caractérisé en ce que le support chimiquement inerte est constitué par du verre poreux et en ce que le détergent au contact duquel les protéines sont amenées au contact de la surface libre du support porte des groupes chargés positivement, et en ce que le transfert est fait à la surface du verre directement. 12. Procédé selon la revendication 11. caractérisé en ce que le détergent est constitué de bromure de céthyl- trlméthyl ammonium. 13. Procédé selon la revendication 3 ou 4, elle-même combinée avec l'une quelconque des revendications 5 à 12, caractérisé en ce que le gel, notamment de polyacrylamide, renfermant les protéines contient une concentration en détergent suffisante à maintenir et à assurer la solubilisation des protéines pendant l'opération de transfert. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le transfert est réalisé en mettant en oeuvre une solution éluante dépourvue de détergent. 15. Pellicule immobilisée et inslubilisée vis-à-vis de solutions aqueuses ou organiques par liaison à la surface d'un support chimiquement inerte, ladite pellicule étant formée d'un produit initialement dépourvu de protéines comportant à la fois des groupes hydrophobes et des groupes chargés positivement affleurant à sa surface libre. 16. Pellicule selon la revendication 15, caracterisée en ce qu'elle est immobilisée à la surface d'un support en verre poreux. 17. Pellicult supportée selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle est formée par un produit polymère hydrophobe comprenant des chaînes hydrocarbonées dans lesquelles sont intercaléS des groupes ammonium quaternaire formant des charges positives dont une partie au moins affleure à la surface libre de la pellicule. 18. Pellicule supportée selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle est formée de polvmétho- bromure de 1,5 diméthyl-1,5 diazaundécaméthylène ioniquement fixé au support, notamment de verre. 19. Procédé de formation d'une pellicule insolubilisée vis-à-vis de solvants aqueux ou organiques sur un support chimiquement inerte, notamment en verre, portant des groupes chargés négativement, caractérisé par la mise en contact de la surface de ce support avec une solution de préférence aqueuse d'une matière dont la structure moléculaire comporte à la fois des régions hydrophobes et des groupes chargés positivement permettant sa solubilisation dans l'eau, le nombre de groupes chargés positivement et la concentration de la matière dans la solution étant suffisants à permettre la neutralisation des charges négatives portées par le support de verre1 ainsi que la formation et la rétention d'une pellicule au moins monomoléculaire hydrophobe portant un excédent de charges positives à sa surface, après rinçage et séchage dudit support revêtu de la pellicule insolubilisée alors formée.