FR 2572080 A1 19860425 FR 8415978 A 19841018 "Procédé de préparation de compositions de mucopoly saccharides dotées d'une activité antithrombotique élevée les compositions obtenues et leur application en tant que médicaments" L'invention a pour objet un procédé de préparation de compositions de mucopolysaccharides dotées d'une activité antithrombotique élevée, les compositions obtenues et leur utilisation en tant que principe actif de médicament. On sait que des compositions de ce type ont té obtenues à partir de l'héparine par extraction alcoolique, ou encore, par dépolymérisation par voie chimique ou enzymatique. D'une manière générale, ces procédés permettent d'obtenir des compositions ou des fractions formées de mucopolysaccharides ou MPS dont les chaînes renferment environ 25 à 30 motifs au plus et possèdent une activité anti-Xa mesurée par le titre Yin Wessler (YW) supérieure à celle de l'héparine et une activité anticoagulante globale, exprimée par le titre USP, inférieure à celle de l'héparine, ce titre pouvant même présenter une valeur très faible à pratiquement nulle. Ces produits présentent l'intérêt d'exercer une activité plus spécifique que l'héparine sur certaines étapes mises en jeu dans le processus de coagulation. Selon les conditions opératoires utilisées pour leur obtention, ces produits présentent des rapports YW/USP et des valeurs des titres YW dans un intervalle donné, ce qui permet de disposer du produit apparaissant le plus approprié pour un traitement donné. L'obtention aisée de ces produits revêt naturellement un intérêt essentiel. En recherchant des moyens permettant d'obtenir aisément des compositions répondant à un profil donné en ce qui concerne, en particulier, leur titre yW et leur rapport des titres YW à USP, les inventeurs ont constaté qu'en opérant dans des conditions déterminées, il est possible d'isoler de tels produits à partir d'autres compositions de MPS. Ces travaux ont, en outre, abouti à l'élaboration d'une nouvelle famille de MPS possédant des activités biologiques de grand intérêt. L'invention a donc pour but de fournir un nouveau procédé de préparation de compositions de MPS à activité antithrombotiqueélevée dont la mise en oeuvre simple permet de disposer aisément de produits de grande utilité.. Elle vise également à fournir les compositions de MPS possédant notamment une activité biologique dans le domaine de la coagulation. Selon un autre but, l'invention vise à fournir des médicaments dotés d'une activité antithrombotique élevée, utilisables pour la prévention et/ou le traitement de thromboses. Le procédé de l'invention est caractérisé en ce qu'on soumet des compositions formées d'une majorité de chaînes de MPS dotées d'une activité antithrombotique élevée et possédant un rapport des titres YW/USP supérieur à celui de l'héparine à au moins une étape de fractionnement, afin de séparersélectivement celles des chaînes de MPS qui possèdent environ moins de 6 motifs. Les composi-.. tions résultantes présentant un rapport des titres YW à USP plus faible ceux des compositions de départ mais supérieurs à ceux de l'héparine. De préférence, l'étape de fractionnement est effectuée à l'aide d'un mélange d'eau renfermant un sel minéral et de solvant organique, ce solvant étant choisi parmi ceux dans lesquels au moins la majorité des produits recherchés est sélectivement insoluble. Les proportions relatives de sel minéral et de solvant sont ajustées et ce en fonction du pH du milieu pour obtenir la précipitation souhaitée. Selon une disposition préférée de l'invention, le solvant organique est avantageusement un solvant alcoolique, plus spécialement l'éthanol. Selon une autre disposition préférée , le sel minéral utilisé est constitué, notamment, par le chlorure de sodium, de potassium ou tout autre sel miscible dans le solvant organique utilisé. Selon une autre disposition préférée, le pH du mélange réactionnel est ajusté à une valeur correspondant à un pH acide, plus spécialement à un pH inférieur à 4. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les compositions de MPS mises en oeuvre pour le fractionnement possèdent un rapport des titres YW à USP d'au moins environ 10 et un titre YW d'environ 200 à 250 u/mg. Le fractionnement est effectué à l'aide d'un solvant organique permettant de précipiter sélectivement les MPS possédant les plus hauts poids molécualires et, par conséquent, un rapport des titres YW à USP inférieur à 10, notamment à 6, de préférence à 5, et plus spécialement voisin de 4. De préférence, le solvant organique est un-solvant alcoolique, plus spécialement de ltéthanol. La mise en oeuvre des dispositions qui suivent permet d'obtenir d'une manière satisfaisante plus specialement des MPS possédant un rapport des titres YW à USP inférieur à 10, de préférence de 6 à 3 environ, plus spécialement de l'ordre de 4 et un titre YW supérieur à celui de l'héparine et d'au moins environ 180 à 200 u/mg. Les compositions de MPS répondant aux caractéristiques de titres YW et USP données ci-dessus sont mises en solution à raison de 5% p/v dans de l'eau-renfermant 10g/l de NaCl. Après ajustement du pH à 3,8, le fractionnement de ces MPS est effectué à l'aide d'un volume d'éthanol. Le précipité formé qui renferme les produits recherchés étant alors récupéré. D'une manière préférée, les compositions de MPS mises en oeuvre possèdent à l'extrémité réductrice un motif. de structure 2,5-anhydromanno, de préférence choisi parmi les groupes 2,5-anhydromanhose, 2,5-anhydromannitol ou acide 2,5-anhydromannonique. Ces compositions sont avantageusement obtenues selon un procédé de dépolymérisation partielle de l'héparine sous l'action d'un agent chimique tel que l'acide nitreux. On a recours, notamment, au procédé décrit par la Demanderesse dans la deuxième demande de certificat d'addition No 80 06282 du 20.03.1980 au brevet FR 78 31357 du 6.11.1978 ou encore à un procédé de dépolymérisation de ce typeXbasé sur l'auto réqulI on J Un procédé de ce genre est décrit dans la demande de brevet FR 81 07283 du 10.04.1981 au nom de la Demanderesse. Les compositions de MPS récupérées lors de la précipitation sont caractérisées en ce qu'elles sont essentiellement formées de chaînes (1) d'un poids moléculaire moyen de 3000 à 6000 daltons, notamment de 4000 à 5000 environ, (2) possédant un titre YW d'environ au moins 180 à 200 u/mg et un rapport du titre YW/USP, inférieur à 10, notamment d'environ 6 à 3, (3) terminées des motifs de structure 2,5-anhydromanno. Ces compositions sont dotées d'activités biologiques leur permettant en particulier de contrôler de manière spécifique certaines étapes de la coagulation sanguine. Leur activité biologique élevée permet de les utiliser à faibles doses ce qui les rend particulièrement appropriées pout la prévention de thromboses. L'étude de ces produits montre qu'ils sont capables d'exercer une activité antithrombotique puissante. En outre, des dérivés selon l'invention présentent un grand intérêt pour lutter contre les troubles de la paroi vasculaire, (athéroscléroses et artérioscléroses) et le vieillissement des tissus. De plus, ils présentent l'avantage de ne pas avoir d'effet d'activation sur l'aggrégation plaquettaire et de ne pas entrainer de thrombocytopénie. Ils présentent également l'avantage d'etre pratiquement dénués d'effet sur le temps de saignement, ce qui élimine les risques d'hémorragie. Ces deux propriétés sont extrêmement importantes pour les applications médicales. En outre, on observe notamment par voie souscutanée une pharmacocinétique allongée, ce qui procure également à ces produits un grand intéret. Les compositions de l'invention sont, en outre, avantageusement dépourvues de toxicité. Ces produits sont donc particulièrement précieux pour l'élaboration de médicaments utilisables,notamment, pour la prévention et le traitement des thromboses et du vieillissement des tissus. L'invention est donc relative également à des préparations pharmaceutiques qui renferment une quantité efficace de ces compositions en association avec des excipients pharmaceutiques et plus spécialement les préparations pharmaceutiques dépourvues de substances pyrogènes. Elle concerne éga?ement'les composltldns-dans lesquelles le véhicule pharmaceutique est approprié pour l'administration par voie orale. Des formes d'administration de l'invention appropriées pour l'administration par voie orale peuvent etre avantageusement des gélules gastrorésistantes, des comprimés ou tablettes, des pilules, ou encore présentées sous forme de liposomes. D'autres compositions pharmaceutiques comprennent ces oligosaccharides en association avec les excipients appropriés pour l'administration par voie rectale. Des formes d'administration correspondantes sont constituées par des suppositoires. D'autres formes d'administration de l'invention sont constituées par des aérosols ou des pommades. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques injectables, stériles ou stérilisables pour l'administration tant par voie intraveineuse qu'intramusculaire ou sous-cutanée. Ces solutions renferment avantageusement 1000 à 100 OOO u (Yin-Wessler)/ml ede t.PS de préférence de 5000 à 50 000, par exemple de 25 000 u/ml, lorsque ces solutions sont destinées à l'injection par voie sous-cutanée. Elles peuvent contenir, par exemple, de 500 à 10 000, notamment 5000 u/ml de MPS lorsqu'elles sont destinées à l'injection par voie intraveineuse ou par perfusion. Avantageusement, de telles préparations pharmaceutiques sont présentées sous la forme de seringues non récupérables, pretes à l'emploi. L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques contenant les compositions de MPS définies ci-dessus en association avec un autre produit actif, utilisable en particulier pour la prophylaxie et le traitement de thromboses, tel qu'un agent veinotonique comme la dihydroergotamine, un sel d'acide nicotinique ou un agent thrombolytique comme l'urokinase. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont particulièrement adaptées pour le contrôle (préventif ou curatif) de certaines étapes de la coagulation du sang chez l'homme ou l'animal), notamment dans le cas où le patient est soumis à des risques dsshypercoagulabilité résultant notamment d'opérations chirurgicales, de processus athéromateux, de développement de tumeurs et de troubles de la coagulation par des activateurs bactériens ou enzymatiques, etc. Certaines compositions sont plus spcialement- appropriées pour lutter contre le vieillissement des tissus ou des manifestations de type dégénératif telles que les alopécies. Afin d'illustrer l'invention, on indique, ci après, un exemple de posologie utilisable chez l'homme : cette posologie comprend, par exemple, l'administration au patient de lOOO à 25 OOO u (Yin et Wessler) par y oie sous-cutanée, une à trois fois par jour, selon le niveau des risques d'hypercoagulabilité ou la condition thrombotique du patient, ou de 1000 à 25000 u/24 heures, par voie intraveineuse, en administrations discontinues à intervalles réguliers, ou continues par perfusion, ou encore de 1000 à 25000 u (trois fois par semaine) par voie intramusculaire ou sous-cutanée (ces titres sont exprimés en unités Yin Wessler).Ces doses peuvent etre naturellement ajustées pour chaque patient en fonction des résultats et des analyses de sang effectuées auparavant, la nature des affections dont il souffre et, d'une manière générale, son état de santé. Outre les compositions pharmaceutiques renfermant les compositions de MPS telles quelles, l'invention vise également les préparations pharmaceutiques renfermant au moins une oppitin de Mus telle que définie ci-dessus, conjugu, par liaison covalente, à un support soluble ou à un support insoluble,' avantageusement au moyen du sucre terminal réducteur. Des conjugués fixés à des supports solubles préférés sont constitués par des oligosaccharides conjugués à 1'AT III. Un conjugué de ce type comportant le pentasaccharide 49 est tout spécialement préféré. De tels produits constituent des médicaments particulièrement intéressants dans la prévention de thromboses, en cas de déficits en AT III. D'autres conjugués, préférés avec supports solubles sont formés d'une composition de MPS fixée à un véhicule tel qu'une protéine, notamment la polylysine, ou le sérum albumine bovine. Ces produits sont utilisables comme immunogènes eux-memes sources d'anticorps circulants produits in vivo ou d'anticorps monoclonaux, clonés in vitro selon les techniques appropriées. Dans d'autres conjugués préférés, les compositions de r' invention sont conjugus à des supports insolubles. On utilisera avantageusement les supports classiques. Ces conjugués sont utilisables comme immunoabsorbants, par exemple pour une purification de haute spéci- ficité de 1'AT III et pour son dosage ou pour l'élaboration, par fixation sur des polymères biocompatibles, de nouveaux polymère s hémocompatibles athrombotiques. L'invention vise également l'application des cq,rxpositions considérées en médecine nucléaire, en tant que produits radiopharmaceutiques. -Ces produits sont alors parqués par des traceurs choisis parmi ceux couramment utilisés dans ce domaine, et notamment à l'aide de technétium 99 m. A cet effet, on transforme le technétium 99 m obtenu à partir de générateurs du commerce, sous forme de pertechnêtate de sodium de valence 7 non-réactif, en technétium réduit de valence 4 qui serait la forme la plus réactive du technétium. Cette transformation est effectuée grâce à un système réducteur réalisé à partir de sels d'étain (chlorure stanneux), de sels de fer (sulfate ferreux), de sels de titane (trichlorure de titane) ou autres sels. La plupart du temps, cette simple réduction du technétium suffit, dans des conditions de pH données, à réaliser la fixation du technétium sur la molécule considérée. On peut utiliser les produits de l'invention, qui constituent en quelque sorte un support, à des doses de l'ordre de 100 à 200 u Yin-Wessler. Pour l'élaboration de ces réactifs radiopharmaceutiques, on peut opérer conformment à la méthode de P.V. KULKARNI et al. dans The Journal of Nuclear Medecine 21, NO 2, p. 117-121. Les produits ainsi marqués sont avantageusement utilisés dans des tests in vivo pour la détection et le diagnostic d'extension des thromboses et des états,thrombo- tiques. L'invention concerne également encore l'application des mucopolysaccharides selon l'invention à la cons titution de réactifs biologiques utilisables au labora toire, notamment à titre de référence de comparaison pour l'étude d'autres produits dont est testée l'activité anticoagulante, notamment au niveau de l'inhibition du facteur Xa. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent vent. Les exemples 1 et 2 sont relatifs à la préparation de compositions de MPS possédant un rapport des titres YW à USP de l'ordre de 4. EXEMPLE 1 500 g d'héparine injectable, sous forme de sel de sodium, sont mis en solution dans 4500ml d'eau déminéralisée, à une température de 18 C. Le rapport YW/USP de l'héparine utilisée est voisin de 1, ces titres présentant une valeur de l'ordre de 160-170. La solution obtenue est mise sous agitation énergique, et son pH est abaissé à 2,5 par addition d'acide chlorhydrique concentré. On ajoute alors 15 g de nitrite de sodium dissous dans 300 ml d'eau Le pH-de la réaction est ajusté à 2,5 par de l'acide chlorhydrique concentré, et le volume total de la solution est amené à 5000 ml. On laisse la réaction s'effectuer pendant 45 minutes puis on vérifie l'absence d'ions nitreux résiduels dans la solution réactionnelle, par exemple au moyen de papier indicateur imprégné d'iodure de potassium amidonné (développement d'une coloration bleue-violacée en presence d'ions Nô2 ) On laisse la réaction sepoursuivre jusqu'à disparition totale des ions nitreux et absence de réaction au papier iodo-amidonné, en effectuant des contrôels toutes les 3 ou 4 minutes. Lorsque ces contrôles deviennent négatifs, la réaction est considérée comme étant achevée. Le pH de la solution est alors élevé à 10 à l'aide de soude concentrée, et l'on ajoute 5 g de tétrahydruroborate de sodium. La solution est maintenue sous agitation 'pendant 15 heures. Le tétrahydruroborate de sodium n'ayant pas réagi est détruit par abaissement du pH à 3,0 à l'aide d'acide chlorhydrique concentré. La solution est soumise à agiation 15 minutes, puis le pH est réajusté à 7,0 au moyen de soude concentrée. Les produits de la réaction sont récupérés par addition de 10 1 d'éthanol. Après 48 heures de repos, le produit est décanté et on élimine le surnageant. Le précipité est redissous dans 9 litres d'eau déminéralisée. On ajoute 100 g de chlorure de sodium, et on abaisse le pli de la solution à 3,8 à l'aide d'acide chlorhydrique concentré. Le volume est ajusté exactement à 10 litres à l'aide d'eau déminéralisée, et l'on ajoute sous agitation energique 10 litres d'éthanol. On laisse reposer 48 heures. On siphonne le surnageant que l'on écarte. Le précipité est récupéré, lavé à l'éthanol, broyé, séché sous vide. Or obit en 230 grammes de produit ayant les caractéristiques suivantes: Titre USP = 52 uI/mg Titre Yin et Wessler = 225 uI/mg Poids moléculaire moyen = 4000 à 5000 daltons EXEMPLE 2 5000 g d'héparine injectable sont dissous dans 45 litres d'eau déminéralisee, à 1boy. On procède de manière similaire à l'exemple 1 en multipliant les quantités de réactifs par 10, c'est-à-aire - en ajoutant 150 g de nitrite de sodium en solution dans 3 litres d'eau. - en ajustant le volume de la réaction à 50 litres - en ajoutant 50 g de tétrahydruroborate. - en précipitant à l'aide de 100 litres d'éthanol. - en redissolvant dans 90 1 d'eau. - en ajoutant 1000 g de chlorure de sodium. - en ajustant le volume final à 100 litres. - en ajoutant finalement 100 litres d'éthanol. On obtient ainsi 2230 g de produit ayant les caractéristiques suivantes: Titre USP = 54 uI/mg Titre Yin et Wessler = 232 uI/mg Poids moléculaire moyen = 4000 à 5000 daltons. Les produits de la réaction sont récupérés par addition de 10 1 d'éthanol, repos 48 heures, décantation et élimination du surnageant. Le précipité est redissous dans 9 litres d'eau déminéralisée. On ajoute 100 g de chlorure de sodium, et l'on abaisse le pli de la solution à 3,8 à l'aide d'acide chlorhydrique concentré. Le volume est ajusté exactement à 10 litres à l'aide d'eau déminéralisée, et l'on ajoute sous agitation énergique 10 litres d'éthanol. On laisse reposer 48 heures. on siphonne le surnageant que l'on écarte. Le précipité est récupéré, lavé à l'éthanol, broyé, séché sous vide. On obtient 230 grammes de produit ayant les caractéristiques suivantes: Titre USP = 52 uI/mg Titre Yin et Wessler = 225 uI/mg Poids moléculaire moyen = 4000 à 5000 daltons Dans l'exemple 3 donné ci-après, on rapporte les résultats d'essais pharmacologiques effectués avec le produit de l'exemple 1. EXEMPLE 3 Sur les figures 1 à 4, on rapporte les courbes obtenues en étudiant, in vitro, la variation des temps de coagulation induits dans -des plasmas sanguins humains par des doses croiszntes d'une héparine du commerce et du produit de l'exemple 1. Dans les essais correspondant aux résultats donnés dans les figures 3 et 4, on a utilisé des plasmas exempts de plaquettes, c'est-à-dire appauvris en facteur XI. Ces figures font apparaître les variations des temps en secondes de thrombine (figure 1), de céphaline-kaolin (figure 2), de coagulation en présence de thromboplastine concentrée (figure 3.) et de thrombo plastine diluée (figure 4), induits par les produits testés, à savoir, le produit de l'exemple 1 (courbes al, a2, a3 et a4) et l'héparine (courbes hi, b2,b3 et b4) en fonction des doses respectivement utilisées. Les temps de thrombine et les temps de céphaline-kaolin constituent tous deux des types de mesure reflétant plutôt l'action des préparations étudiées res pectivement sur l'inhibition du facteur II activé et la coagulation globale. L'étude des courbes des figures 1 et 2 montre que les MPS selon l'invention excercent un effet nettement plus réduit que celui de l'héparine sur l'inhibition de l'activation de la prothrombine et au niveau de la coagulation globale. Les figures 3 et 4 qui sont représentatives de phénomènes plus directement liés à la séquence des réactions enzymatiques, caracté ristiques de la coagulation extrinsèque (notamment en l'absence relative du facteur fIa), font apparaître l'effet avantageux des MPS de l'invention par rapport à l'héparine. L'exemple 4 ci-dessous concerne les résultats d'essais in vivo chez le lapin avec les MPS de l'exemple 2. EXEMPLE 4 : Etude de l'activité antithrombotique duproduit de l'exemple 2 chez le lapin. L'administration de 500 u YW au lapin provoque une activité anti-Xa importante alors que l'activité anticoagulante globale reste relativement faible. Deux heures après l'administration, l'activité YW est de l'ordre de 0,88 u/ml alors que le temps de céphaline kaolin est de 0,09 ui.ml. Les essais in vitro et in vivo montrent donc l'action nettement plus sélective des MPS de l'invention notamment au niveau de l'inhibition du facteur Xa, que celle de l'héparine. REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation de mucopo.ysaccharides ou MPS possédant une activité antithrombotique élevée, caractérisé en e qu'on soupme des compositions formées d'une majorité de chaînes de MPS dotées d'une activité antithrombotique élevée et possédant un rapport des titres YW/USP supérieur à celui de l'héparine à au moins une étape de fractionnement, afin de séparer celles des chaînes de MPS qui possèdent environ moins de f > motifs, ce qui conduit à des compositions présentant-un rapport plus faible des titres YW/USP et un titre YW plus faible que les compositions de départ. 2.- Procédé selon la revendication l,caractérisé en ce que le fractionnement est effectué à l'aide d"n mélange d'eau renfermant un sel minéral et de solvant organique, ce solvant étant choisi parmi ceux dans lesquels au moins la maJorité des produits recher- chés est sélectivement insoluble. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le solvant organique est un solvan alcoolique plus spécialement de l'éthanol. 4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le sel minéral est constitué notamment par le chlorure de sodium, de potassium ou tout autre sel miscible dans le solvant organique utilise. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendica +ions 1 à 5, caractérisé en ce que les compositions de MPS mises en oeuvre pour le fractionnement possèdent un rapport des titres YW à USP d'au moins environ 10 et un titre YW d'environ 200 à 250 u/mg. 7.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on effectue le fractionnement à l'aide d'un solvant organique permettant de précipiter sélectivement les MPS possédant un rapport des titres YW à USP inférieurs à 6, de préférence à 5, et plus spécialement voisin de 4. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on met en solution dans de l'eau 5% p/v de MPS renfermant 10 g,/l de NaCl et qu'après aus- tement du pH à 3;8, on effectue le fractionnement par addition d'an volume d'éthanol et récupération du précipité formé. 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications prcédentes, caractérisé en ce que les compositions de MPS mises en oeuvre possèdent à ltextrémité réductrice un motif de structure 2,5anhydromanno choisi de préférence parmi les grcupes 2,5-anhydromannose, 2,5-anhydromannitol ou acide 2, 5-anbydromannonique. 10.- Compositions de MPS, caractérisées en ce qu'elles sont essentiellement formées de chaînes (1) d'un poids moléculaire moyen de 3000 à 6000 daltons, notamment de 4000 a 5000 environ (2) possédant un titre Yh'/USP inférieur à 10, notamment d'environ 6 à 3, (3) terminées par des motifs de structure 2,5-anhydromanno. 11.- Médicaments caractérisés en ce qu'ils renfer- ment une proportimilefficace d'au moins une composition selon la revendication 10.