FR 2582103 A1 19861121 FR 8504013 A 19850319 La présente invention concerne un procédé d'identification et de dosage de substances biologiques. Les procédés existants pour détecter des substances biologiques sont nombreux. Parmi ces procédés, les plus courants sont l'hémagglutination, les immunoessais fluorescents, enzymatiques ou radioactifs. Les immunoessais mentionnés précédemment nécessitent la mise en oeuvre de produits de couplage artificiels tels que des conjugués anticorps-enzyme ou un marquage radioactif. La présente invention a pour objet un procédé n'ayant pas recours à des produits de couplage artificiels ou à des produits radioactifs et qui puisse entre mis en oeuvre en phase solide, à la différence de l'hémagglutination. Ce procédé présente, en particulier, l'avantage d'être simple, rapide et de pouvoir être automatisé tout en étant très sensible et spécifique. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de détermination d'une substance biologique dans un échantillon, caractérisé en ce que a) on immobilise sur une phase solide un ligand ayant une affinité de fixation pour ladite substance biologique b) on met à incuber l'échantillon en présence de ladite phase solide sur laquelle est immobilisé le ligand c) on révèle la présence de ladite substance biologique, fixée sur la phase solide par ISintermédiaire du ligand, à l'aide c'une propriété inhérente à ladite substance biologique La présente invention, dénommée "Auto Revelation Immur Assay" (ARIA), apporte,en plus d'une technologie nouvelle permettant de se libérer de la contrainte de la préparation et de l'utilisation de conjugué ou produit maraudé, une innovation de concept. Ce concept nouveau apporte par essence neme une amplification du niveau de spécificité et de sensibilité de détection. Selon le principe de la présente invention, l'affinité propre du ligand vis-à-vis de la substance biologique à doser1 se conjugue à la spécificité du signal colorimétrique, enzymatique, physique ou chimique propre à la substance biologique à doser. La résultante de ces deux niveaux indépendants de spécificité est un gain global de la spécificité de réaction. La sensibilité est également accrue dans nombre d'applications par un phénomène d'amplification propre à la substance biologique à doser. C'est le cas, par exemple, de la détection de microorganismes ou de cellules, où ceux-ci, dans un prerier temps, concentrés par l'affinité propre du ligand, donnent après lyse un signal de réaction de nature enzymatique par exemple, très amplifié, en se comportant en quelque sorte comme des vésicules naturelles remplies d'enzymes. Le procédé selon la présente invention permet de lettre en eid-nce toutes les substances biologiques ui seront nommées ci-après "autorévélables", c'est-d-dire tout produit biologique qui possède une propriété nIérente qui peut être rise directement ou indirectement en évidence pour l'horde ou la machine. Les substances autorévélables sont, en particulier, es substances présentant une coloration naturelle, par exemples les globules rouges, ou bien présentant une apparence particulièrement sous un rayonnement artificiel, ou encore les substances capables, directement lorsqu'il s'agit d'une macromolécule, ou grâce à certains éléments c'elles contiennent, enzyme endogène ou composant chimique par exemple, de se colorer ou de colorer un substrat ou de générer une fluorescence ou une luminescence. Bien entendu, les substances autorévélables peuvent être révélées par de nombreuses autres propriétés chimiques ou physiques. De façon générale, le procédé selon la présente invention peut être destiné à la détection ou l'ìdentifica- tion de substances biologiques directement visualisables en lumière naturelle ou artificielle. Dans ce cas, il s'agit en général de substances colorées ou pigmentées. Ce procédé est, en outre, particulièrement intéressant pour la détection de substances biologiques révélables indirectement par une coloration ou une réaction enzvratique endogène, en présence d'un substrat et éventellement après activation enzymatique ou lyse cellulaire s'il s'agit de cellules, libérant des enzymes endogènes notamment peroxydase, phosphatase, galactosidase, glucose- oxydase, transaminase par exemple. Les substances biologiques autorévélables peuvent être 70j Des cellules, en particulier - des globules rouges pour la détermination des groupes sanguins des systimes A3E, Lewis, P, Lutheran, Rhésus (D, C, c, E, e), Kell, Duffy, Kidd et bESs ou autres, révélables par leur coloration ou après lyse par l'activité peroxydasique de l'hémoglobine ou tout autre activité enzymatique sur un substrat ou tout autre propriété physique ou chimique; - des leucocytes : polynucléaires, lymphocytes, monocytes; - des plaquettes sanguines; - des cellules d'origine epithéliale, endothéliale, parenchymateuses ou conjonctives normales ou patholociques (par exemple tumorales) présentes dans le liquide de prélèvement ou prélevées par cytoponction ou biopsie et resuspendues dans un tampon artificiel. 20) Des microorganismes : bactéries, parasites, virus, les bactéries étant, par exemple, révélables après lyse par l'activité d'enzymes endogènes comme la ss-galactosidase ou la glucose-oxydase. La détermination de l'activité enzymatique selon le procédé de l'invention peut être une application en soit, comme par exemple la recherche d'une activité ss-lactaminase et de son niveau d'induction dans le cadre d'une recherche de sensibilité aux antibiotiques et, dans ce cas précis, de sensibilité aux ss-lactamines. 3 ) Des macromolécules biologiques et en particulier les enzymes ou molécules douées d'activité enzymatique comme l'hémoglobine, les transaminases, les phosphatases, les protéases, les facteurs de la coagulation par exemple. Le produit autorévélé peut être directement sous forme active ou être secondairement activé par lyse cellulaire et libération dans le milieu réactif ou par activation secondaire dans une cascade enzymatique, comme c'est le cas pour les enzymes de la coagulation. La phase solide peut être n'importe quel support haLituellement utilisé pour les immunoessais, qu'il s'agisse de support en forme de bille, de puits sur des plaques de microtitration, de bandelettes réactives ou autres. Ce support peut être en n'importe quel polymère d'origine naturelle ou synthétique ou en substance amorphe tel le verre. On utilise avantageusement pour les bandelettes réactives les membranes de nitrocellulose ou de nylon, pour les billes ou microplaques, les matières plastiques polyvinyl, polypropylène, polystyrène ou autre. On peut encore utiliser des gels ou des particules à base d'agarose, d'acrylamide ou de latex. La sensibilisation de la phase solide par le ligand ayant une affinité vis-à-vis de la substance à doser est faite soit par adsorption passive, soit par couplage covalent selon la nature du support et des impératifs du test. La phase solide, après adsorption du ligand, peut être saturée par des protéines ou macromolécules telles que l'albumine bovine, le sérum de veau foetal, la gélatine, ou chimiquement modifiée par des agents chimiques comme le Tween, pour empêcher les interactions non spécifiques. Cette phase solide peut être modifiée pour être conservée sous forme desséchée ou lyophilisée. Le ligand mis en oeuvre dépend de la nature de la substance à déterminer, il peut s'agir, par exemple, d'une lectine, d'un antigène ou le plus souvent d'un anticorps. Suivant la nature du test envisage, il peut être nécessaire de disposer d'un ligand très spécifique tel qu'un anticorps monoclonal, mais,aans certains cas, le ligand peut très bien n'être spécifique que dans les conditions opératoires ou pour les besoins du test, ainsi il est possible d'utiliser comte ligand un anticorps polyclonal ou bien, éventuellement, un mélange de ligands. Dans un mode de mise er. oeuvre particulièrement intéressant de l'invention, la phase solide est constituée par une bandelette réactive ou une plaque sensibilisée par au reins ns deux ligands distincts, spécifiques de différentes substances biologiques susceptibles d'être présentes dans l'échantillon à tester, par exemple un ligand pour les globules rouges de groupe A et un ligand pour les globules rouges du groupe B. Dans ce cas, une mise en contact de cette bandelette ou de cette plaque avec un échantillon de sang permet une détermination immédiate du groupe sanguin, la plage correspondante ou le puits de microtitration apparaissant colorés. Chaque plage comportant un ligand peut comporter une indication permettant pour l'homme ou la machine d'identifier la nature du résultat, code alphanumérique ou code à barres par exemple. Afin de faciliter l'utilisation de tels supports, il est également possible de déposer les différents ligands sur la bandelette selon un schéma propre, par exemple sous la forme d'une ou plusieurs lettres ou d'un ou plusieurs signes en relation, ou non, avec le phénotype en cause. Ainsi, on peut prévoir des bandelettes sur lesquelles les anticorps anti-A sont sous la forme d'un A, les anticorps anti-B sous la forme d'un B et les anticorps anti-A5 sous la forme de ÀB. De cette façon, l'attachement des globules rouges à l'anticorps spécifique permet de lire directement le phénotype qui apparaît sous forme d'une lettre rouge. Ce système permet un groupage sanguin en environ 5 minutes, ce qui correspond aux impératifs de l'urgence. Les substances biologiques autorévélables sont mises à incuber en présence de la phase solide en milieu aqueux. Ce milieu peut être un liquide biologique normal ou pathologique, tel le sang, le sérum, le plasma, l'urine, le liquide cephalorachidien, un liquide d'épanchement pleural,péritonéal, synovial ou autre, ou un milieu artificiel isotonique comportant éventuellement des substances d'optimisation (protéines, sels, macromolécules, agents chimiques tel le Tween) dans lequel le prélèvement est resuspendu. L'incubation se fait à température ambiante ou modifiée avec ou sans agitation pendant un temps qui dépendra de la nature de la substance et de sa capacité à se fixer sur le ligand.Après incubation, la phase liquide est, de préférence, éliminée par séparation de phase ou lavage par exemple dans une solution telle un tampon PBS Tween à 0,05 %, mais, dans certains cas, cette séparation de phase ou lavage n'est pas indispensable pour la révélation de la substance. Le procédé selon la présente invention est plus particulièrement utilisable pour la mise en évidence de phénotypes de globules rouges correspondant à des antigènes de surface en utilisant, à titre de ligand, les anticorps monoclonaux correspondants ou des anticorps polyclonaux immuns ou naturels. La révélation de la fixation des globules rouges peut être directe grâce à la coloration rouge apparaissant, ou bien, pour rendre le procédé plus sensible, plus objectif et automatisable, les cellules fixées après lavage sont lysées par un acrent d'hémolyse et l'on dose une activité enzymatique, en particulier l'activité de la peroxydase, du lysat. e dosage de la peroxydase est cornu, il peut mettre en oeuvre un substrat chromogène comme l'orthophénylène-diamine (OPD) ou le TMB. L'intérêt d'utiliser l'activité peroxydasique de l'hémoglobine provient du fait que, bien qu'il existe de nombreuses autres enzymes dans les globules rouges, des déficits sont toujours possibles, alors qu'un déficit total ou très important en hémoglobine serait léthal. Les exemples ci-après sont destinés à illustrer d'autres caractéristiques et avantaces du procédé selon la présente invention. EXEMPLE 1 DETERMINATION DU GROUPE SANGUIN DANS LE SYSTEME ABH Des anticorps monoclonaux purifiés anti-A, anti-B, sont adsorbés passivement sur une plaque de microtitration type plaque Microelisa, fond en U rigide en immulon de référence M 124 B du Laboratoire Dynatech, ou plaque de microtitration souple, PVC, à fond en U de référence M 24 du même laboratoire. Des anticorps anti-A+B peuvent également être utilisés. Pour ce faire, les anticorps monoclonaux purifiés sont mis à incuber à la concentration de 4 /gml dans du tampon bicarbonate 0,1 M pH 9,6, 3 heures à 37 CC, à raison de 100 1 par puits, la plaque étant recouverte d'un film adhésif. La plaque est saturée pendant 30 minutes par une solution de sérum de veau foetal à 10 %. Des échantillons de sang total prélevé sur tube EDTA, citrate ou héparine des groupes A, B, AB ou 0, ainsi que des suspensions globulaires à 1 9 de groupes faibles A2, A3, AXt Aend' B3 A1Bx, cis AB, sont répartis à raison de 100 l par cupule et mis à incuber à terpérature ambiante pendant 30 minutes La plaque est lavée par lavage automatique Multiwash Dynatech pendant 4 cycles par du tampon PBS 0,15 M pH 7,4 contenant du Tween 20 à 0,05 5. La réaction peut être spontanément lue pour les globules rouges des groupes A et A3 avec les anticorps anti-A pour les globules rouges des groupes B et AB avec les anticorps anti-B. Cette réaction positive se matérialise par une adsorption macroscopique des globules rouges, sur la surface des cupules revêtues d'anticorps, en cas de réaction négative, aucun globule n'est visible (par exemple avec les globules rouges du groupe 0). Pour sensibiliser la lecture ou la rendre objective, la réaction peut être révélée après lyse des globules rouges par la réaction peroxydasique de l'hémoglobine. Pour ce faire, une solution hémolysante contenant un substrat de la peroxydase est ajoutée dans les cupules orthophénylène-diamine (OPD) à 3 mg/ml dans du tampon citrate 0,1 M à pH en présence d'H2O2 et contenant de la saponine à 0,1 % comme agent d'hémolyse. Après 10 minutes, la réaction est stoppée par l'addition de 50 1 d'H2504 à 1,5 M. Les réactions sont lues au spectrophotomètre à 490 nm. Dans cet exemple, les prélèvements des différents groupes normaux ou faibles (peu de sites antigéniques) donnent des réactions positives supérieures à 1,5 de densité optique, les groupes très faibles ayant très peu de sites antigéniques ou particuliers(Ax, Zend, A1BX, cis AB) donnent une densité optique comprise entre 0,15 et 1,5 ou dépassant 1,5. Le bruit de fond est dans cette expérience inférieur à 0,050. Le tableau I donne un exemple de résultat comparativement à la technique classique d'agglutination. Les résultats sont exprimés en DO à 490 nm pour le test ARIA et cotés en nombre de croix selon l'intensité comme il est classique pour l'agglutination. TABLEAU I Réactivité d'un panel de globules rouges de différents phénotypes en ARIA mesurée en DO (ligne supérieure) et en agglutination cotée en croix (ligne inférieure) A1 A2 A3 A3 Ax Ax Aend B B3 A1Bx CisAB O Anti-A 1,5 1,5 1,5 1,5 0,184 0,822 0,647 0,002 0,005 1,5 1,5 0,000 +++ +++ +++ +++ - (+) (+) - - +++ +++ Anti-B 0,004 0,001 0,005 0,002 0,000 0,001 0,000 1,5 1,5 0,380 1,5 0,000 - - - - - - - +++ ++ - - Ces résultats montrent une plus grande sensibilité pour la technique de l'invention qui est capable de détecter sans ambiguité les échantillons de groupes faibles ou particuliers comme Ax' Aend, aSBx ou cisAB, alors que ceux-ci sont faiblement dépistés ou négatifs en agglutination. La méthode ARIA pour la détermination des groupes ABH a été validée comparativement à la méthode d'agglutination sur 2 000 prélèvements sanguins de donneurs de sang et sur des échantillons de globules rouges rares sélectionnés pour leur faible densité en site antigénique ou particularité. EXEMPLE 2 DOSAGE DE LA PROTEINE C PLASMATIQUE La phase solide est sensibilisée avec le même protocole que dans l'exemple 1 par des anticorps monoclonaux anti-protéine C. Le plasma contenant la protéine C est mis à incuber après activation ce la protéine C par les activateurs appropriés (thrombine humaine ou bovine, trypsine ou venin serpent RVVX Sigma) ou avec les activateurs pendant 7 heure à 370C. Après lavage avec le même protocole que dans l'exemple 1, le substrat chromogène ou fluorescent de la protéine C ou des sérines protéases en général est ajouté, par exemple le substrat chromogénique S22-38 de ia société KABI, à 0,5 mt1 dans du tampon Tris 0,05 M, NaCl 0,1 M, pH 8,3. L'adsorption est lue à 405 nm. La densité optique est proportionnelle à la concentration en protéine C. EXEMPLE 3 DETERMINATION DES GROUPES SANGUINS DU SYSTEME ABH SUR MEMBRANE DE NITROCELLULOSE OU NYLON 10) Préparation des membranes Des bandelettes de membrane nylon type Biodyne TM du Laboratoire Pall sont découpées aux dimensions désirées. Si le test est fait en tube de Ahan, les bandelettes peuvent etre ddcoupFes aux dimensions intérieures du tube. La membrane est sensibilisée par des anticorps monoclonaux anti-A et anti-B qui sont déposés sous forme liquide, soit à la pipette, soit avec un tampon imbibé de la solution d'anticorps. De manière à identifier la réaction effectuée, un tampon en forme de A pour I'anti-A et en forme de B pour l'anti-B est déposé sur la membrane. es dépôts peuvent se faire également sous forme-d1autres signes d'identification ou codes-lisibles par l'opé-rateur ou par une machine. Si l'on utilise des anticorps purifiés, ceux-ci sont déposés à une concentration de 10 Fg/ml ou éventuellement une concentration différente selon les résultats expérimentaux. Des ascites diluées ou des surnageants de culture contenant l'anticorps peuvent également être utilisés. Les membranes sont séchées 2 heures d température ambiante ou 30 minutes à 370C en étuve sèche. Après séchage la membrane est lavée en tampon PBS à pH 7,4 puis saturée par une solution protéique, telle l'albumine bovine à 7 dans du tampon PBS ou en sérum de veau foetal à 10 % ou la gélatine à 1 %. A ce stade, les membranes peuvent être employées immédiatement ou conservées après dessication pour une application ultérieure. 20) Test de groupage proprement-dit Les bandelettes sensibilitées sont immergées dans un tube contenant du sang total ou une suspension globulaire pendant 3 minutes à température ambiante avec ou sans agitation. A l'issue de l'incubation, elles sont rincées par une solution de chlorure de sodium 0,15 M et immédiatement lues. Si le sang est du groupe A, la lettre A apparaît, matérialisée par la fixation des globules rouges ; si le sang est du groupe B, la lettre B apparaît si le groupe est AB, les deux lettres apparaissent ; si les globules sont de groupe 0, la bandelette reste entiEre- tent blanche (figure unique). RE.'ENDICATIONS 1) Procédé de détermination d'une substance biologique dans un échantillon, caractérisé en ce que a) on immobilise sur une phase solide un ligand ayant une affinité de fixation pour ladite substance biologique b) on met à incuber l'échantillon en présence de ladite phase solide sur laquelle est immobilisé le ligand ; c) on révèle la présence de ladite substance biologique, fixée sur la phase solide par l'intermédiaire du ligand, à l'aide d'une propriété inhérente à ladite substance biologique. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ligand ayant une affinité pour ladite substance biologique est choisi parmi les lectines, les antigènes et les anticorps. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le ligand est un anticorps monoclonal. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite substance est révélée directement par sa coloration ou son apparence sous un rayonnement naturel ou artificiel. 5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladre substance est révélée par coloration en lumière visible. 6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite substance est une cellule et qu'elle est révélée par mise en évidence d'une activité enzymatique ou chimique endogène de ladite cellule après lyse. 7) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite substance est une macro molzcule révélée par son activité enzymatique ou chimique propre. 8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que )a substance biologique à déterminer est un- globule rouge appartenant à un groupe ou système particulier et en ce que le ligand est un anticorps monoclonal du groupe ou du système à déterminer. 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le globule rouge est mis en évidence par sa coloration propre. 10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la substance biologique est mise en évidence par lyse du globule rouge et mise en évidence d'une activité enzymatique ou chimique endogène. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'activité enzymatique endogène est l'activité peroxydasique mise en évidence par un substrat chromogène. 12) Procédé de détermination d'un antigène de surace d'une cellule, caractérisé en ce que a) on immobilise sur une phase solide un anticorps correspondant à l'antigène en cause b) on met à incuber l'échantillon contenant ladite cellule en présence de ladite phase sur laquelle est i.umobilisd l'anticorps c) on lyse la cellule et on met en évidence une activité enzymatique contenue dans ladite cellule. 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la cellule est un globule rouge et que l'activité enzymatique mise en évidence est l'activité peroxydasique de l'hémoglobine. 14) Phase solide pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle comporte plusieurs ligands fixés sous forme sèche. 15) Phase solide selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle est sous forme de bandelette ou de plaque. 16) Phase solide selon la revendication 15, caractérisée en ce que chaque ligand est déposé sur la bandelette ou la plaque selon une configuration particulière telle que lettre, signe, code. 17) Phase solide selon la revendication 16, caractérisée en ce que la bandelette ou la plaque comporte un anticorps anti-A déposé sous forme d'un A, un anticorps anti-B sous forme d'un B et/ou un anticorps anti-AB sous forme AB pour le groupage sanguin.