FR 2575474 A1 19860704 FR 8419958 A 19841228 La présente invention a pour objet de nouveaux composés polypeptidiques répondant â la formule genérale (Peptide I) et contenant l'acide a-aminosuberique (Asu) dont l'#-carboxyle est fixé au groupe aminé de A1 ou : A1 = Ser; Gly, Ala A7 = Val, Leu A10 = Lys, Thr A1l = Leu, Tyr A12 = Ser, Thr A13 = Glu, Asp A15 = Leu, Phe A16 = His, Asn A18 = Leu, Phe A19 = Gln, His A21 = Tyr, Phe A23 ' Arg, Gln A25 = Asp, Asn5 Ala A26 = Val, Thr, île A28 = Ala, Ser, Val A30 = Thr, Val, Ala Ces sont des analogues structuraux de peptides naturels, comme K. Jost et J. Rudinger les ont réalisés dans le cas des hormones neurohypophysaires (Collect. Czech. Chem. Comm., 1967, 32, 1229).Ces polypeptides abaissent la calcémte et la phosphatémie ; ils inhibent la destruction osseuse, accelèrent la formation d'os nouveau, augmentent l'absorption intestinale du calcium et diminuent la calciurie. Ils fixent le calcium a l'intérieur des cellules. Ils conservent le calcium de l'organisme. ils possèdent un effet anti-inflammatoire et antalgique majeur. Leurs indications principales sont représentées par la maladie de Paget, les ostéoporoses de diverses etiologies (commune,poro-malacique, cortisonique, post-traumatique, d'immobilisation et idiopathique), l'ostéodystrophie rénale, les fractures, les hypercalcémies, les douleurs osteoarticulaires, en particulier celles consécuritves aux métastases osseuses, la spasmophilie et la tétanie normocalcémique. La synthèse de ces peptides a été effectuee en associant la technique en phase solide au procédé classique en milieu liquide. Obtention de la séquence 10-31 La synthese en phase solide est utilisée. Elle met en jeu la résine benzylhydrylaminee (P.G. Piette et G.R. Marshall, Chem. Commun. 1970, 650), dont la préparatiôn et l'utilisation ont été décrites (P. Rivaille, A. Robinson, M. Kamen et G. Milhaud, Helv., 1971, 54, 2772). Le groupe N-a-butyl-oxycarbonyle (t-Boc) protège la fonction a-aminée des aminoacides. Les fonctions latérales des aminoacides sont bloquées sous forme 1/ d'ester benzylique pour la chaîne carboxylique des acides aspartique et glu tamique. 2/ d'éther benzylique pour les hydroxyles des sérine, threonine et d'éther 2,4-dichlerobenzyle pour la tyrosine. 3/ de tosyle ;tir le guanfdinium de l'arginine et l'imidazole de l'histidine. 4/ de groupe 2-chlorobenzocarboxyle pour la fonction #-aminée de la lysine. Les différents acides amines sont incorporés dans la chaîne peptidique a l'aide de dicyclohexylcarbodiimide (DCCI)-hydroxybenzytriazole (HOBT) en mélange équimoléculaire en faisant réagir successivement des aminoacides protégés en excès par rapport a la proline fixée en premier sur la résine. On laisse la réaction se poursuivre pendant deux heures. Le contrdle du couplage est effectué par le test 9 la ninhydrine suivant la méthode de Kaiser et Colescott. Même si ce test est négatif (pas de coloration bleue), chaque couplage est systematiquement répété deux fois.Les t-Boc sont éliminés par l'acide trifluoroacétique en solution dans le chlorure de méthylène ; apres lavage au chlorure de méthylène, la neutralisation est effectuee par de la diisopropyléthylamine (DIEA) dans le même solvant. L'asparagine et la glutamine sont introduites sous forme d'ester Daranitrophénylique en solution dans le diméthylformamide (DMF). Si le couplage n est pas total après une répétition (glutamine en position 24), on acétyle la threonine qui n'a pas réagi par l'acide acétique et le DCCI. Obtention de la séquence 1-9 La synthèse en milieu liquide est utilisée. Le fragment ., ou A1 a la signification ci-dessus et R = ester, après cyclisation est condensé avec le tripeptide A7-Leu-Gly. On a recours aux groupes protecteurs généralement utilisés pour la synthèse des peptides. Obtention du Peptide-T Le nonapeptide protégé ci-dessus est converti en ester N-hvdro- xysuccinimide puis couplé avec le fragment 10 31 fixé sur la résine en milieu DMF a 30C. Le pepti-de est séparé de la résine par traitement a l'acide fluorhydrique liquide en présence de diméthylsulfure et de p-crésol (J.P. Tam, W.H. Heathand et R.B. Merrifield, J.A.C.S., 1983, 105, 6442). Tous les groupes protecteurs sont éliminés au cours de cette opération. Les peptides sont purifiés par filtration sur gel. Les fractions, correspondant aux pics principaux,sont rassemblées, lyophylisées. Le pic possédant l'activité biologique recherchez est purifié a nouveau sur résine échangeuse d'ions CMC 52 par élution a l'aide d'un gradient de conductivité. Le peptide obtenu après lyophylisation apparaît homogène en électrophorèse sur papier et en chromatographie sur cellulose. L'exemple suivant (Peptide II) illustre la présente invention sans pour autant en limiter la portée telle que définie dans les revendi- cations énonces ci-dessous : -YS10 -Leu-Gly-Lys10-Leu Ser-GlnvGlu-Leu15-His-Lys-Leu-Gln-Thr20-Tyr-Pro-Arg-Thr Asp25-Va -Gly-Al a-Gly-Thr30-Proami de Exemple : Les t-Boc-aminoacides portant des fonctions latérales proviennent de BACHEM(Dubendorf, Suisse) ou sont préparés au laboratoire par la technique de Schnapel (E. Schnabel, Liebigs Ann. Chem., 1967, 702, 188) dans un autotitrateur. Leur pureté est déterminée par polarimétrie, F. et chromatographie sur couche mince de silice. L'hydrolyse du peptide purifié est réalisée en tube scellé sous vide en milieu HCl 6 N (110 , 24 h.). 1/ SYNTHESE DE LA SEQUENCE 10-31 DU PEPTIDE il 1-a/ Préparation de la résine (P. Rivaille, A. Robinson, M. Kamen et G. Milhaud, Helv., 1971, 54, 2772) Benzyl-cétonésine. Dans un ballon tricol de 21, muni d'un agitateur, on laisse gonfler pendant 2 h., 50 g de polystyrène a 1 % de divi nylbenzène 3io-rad SX1 (200-400 mesh) dans 350 ml de nitrobenzène. Dans un autre ballon. on dissout 66 g de AlCl3 dans 300 ml de nitrobenzène auxquels on ajoute 80 ml de chlorure de benzoyle. Le mélange est versé dans le premier ballon sous bonne agitation, maintenue pendant 2 h. a température ambiante. Si la résine gonfle trop, on ajoute du nitrobenzène t100 ml environ). On filtre, lave avec du dioxanne (3 xj, de l'acide acétique (3 x), du méthanol (3 x) et enfin, alternativement, avec CH2C12 et CH3OH pour faire gonfler et contracter la résine en laissant chaque fois un temps de contact suffisant. On sèche dans un dessîcateur sous vide toute la nuit (rendement 75 95. Benzylhydnylamine nésine. Dans un ballon de Il, muni de "Dean Stark" et d'un agitateur, on chauffe 500 g de formiate d'ammonium a 120-130 C, pendant 1 a 2 h. On ajoute la resine (50 g) en une seule fois et laisse la temperature monter a 160-165 , en une demi-heure, sous agitation efficace qui est maintenue pendant 6 heures. On-filtre, lave a l'eau, puis on traite comme ci dessus pour la benzylcétorésine. La résine séchée sous vide est chauffée a reflux et agitée pendant 8 h. dans HCl 6N.- Elle est ensuite filtrée et lavée comme précédemment. La capacité de fixation varie, selon la nature de l'acide amine, entre 0,3 et 0,5 mMole/g. 1-b/Préparation de la séquence 10-31 du Peptide II L'appareil utilisé permet d'agiter mecaniquement un tube en Pyrex de 25 ml dont le compartiment central contient la résine (2 g). Aux extrémités du tube, 2 filtres dé verre fritté sont destinés a l'introduction puis a l'élimination des réactifs (environ 15 ml). Le couplage des acides aminés comporte les temps suivants Libération du groupe aminé. On traite la résine par le mélange CF3COOH-CH2Cl2 (3:7 v/v) pendant 1 mn., on filtre et on répète l'opération en laissant 30 mn. au contact. - On lave la résine avec CH2Cl2 (3 x, 1 mn.). - On élimine CF3COOH en traitant deux fois la résine par le melange DIEA/CH2Cl2 (1:9 v/v) (temps de contact : 1 mn., puis 10 mn.). On lave alternativement avec CH2Cl2 et MeOH (8 x). . Pour chaque mMole de proline fixée initialement sur la résine, on fait réagir 4 mMoles d'acides aminés protégés, dissous dans CH2Cl2, DMF (1:1 v/v). Dans le cas présent, la résine avait fixé 0,5 mMole de proline/g. 4 mMoles de DCCI et 4 mMoles de HOBt sont ajoutés au milieu réactionnel. Le temps de couplage est fixé a 2 heures. . Le couplage de la glutamine doit être prolongé jusqu'a 12 heures. . Lavages successifs avec CH2Cl2, puis CH30H absolu (3 x). . Réaction a la ninhydrine sur un échantillon de la résine. Paur négativer la réaction a la ninhydrine, il faut coupler . 2 fois la Thr en position 24 (2 x 24 h.) . 2 fois la Pro-en position 22 (2 x 2 h.) . Lavage avec CH2Cl2 (3 x) avant le clivage décrit ci-dessus (CF3COOH). 2/ SYNTHESE DE LA SEQUENCE 1-9 DU PEPTIDE II 2-a/ Séquence partielle BOC-Thr (Bzl)-Asu OMe (A) On introduit Z-Asu OMe (11,2 g) dans MeOH-H20 (2:1, v/v) et on hydrogène en presence de charbon palladié (14) h.). Le catalyseur éliminé, on concentre sous vide. On ajoute du dioxanne (40 ml), puis la triéthylamine (4,2 ml) en refroidissant puis le BOC-Thr (Bzl) OSu (16 g). Aprês agitation (72 h.), on introduit de la N,N-diméthylamino-1,3-propane diamine, agité (4 h.), concentré au tiers. Extraction avec acétate d'éthyle (AcOEt). Lavage de AcOEt avec HCl- (1 N) puis H2Q. Distillation sous vide.Reprise du résidu huileux dans l'ether, extraction avec NaHC03 (5 %). Reextraction avec AcOEt et lavages successifs avec H20, Mcl (1 N), H20. Séchage sur sulfate de sodium anhydre. AcQEt est chassé. On obtent A sous forme de produit huileux (10 g). 2-b/ Séquence partielle BQC-Ser (Bzl)-Thr (Bzl) Asu OMe.CHA (B) A (5 g) est dissous en refroidissant dans TFA (15 ml). A tempe rature ambiante, TFA est chasse sous vide et le résidu séché sous vide. Il est dissous dans DMF (10 ml) etle pH amené a 6 a l'aide de triéthylamine (4 ml) en refroidissant. On ajoute alors HOBT (5 g) et BOC-Ser (Bzl) OSu et on agite (3 j.) a température ambiante, :pH 6. On ajoute de la N,N-diméthylamino-1,3-propanediamine, agite (1 h.), ajoute H20, extrait par AcOEt comme décrit en c-1. La cyclohexylamine (CHA) est ajoutée a AcOEt séché. Distillation sous pression réduite, On obtient le produit huileux B (4 g). 2-c/ Séquence partielle BOC-Ala-Ser (Bzl)-Leu-Ser (Bzl)-Thr(Bzl)-Asu OMe (C) B (2 g) est introduit dans AcOEt en présence de HCl (1 N); séchage sur sulfate de sodium anhydre et concentration sous vide. Addition a froid de TFA '6 ml), agitation a température ambiante (0,5 h.), élimination du TFA sous vide, séchage du résidu sous vide. Dissolution du résidu dans DMF (2 ml), neutralisation avec triéthylamine puis introduction lente a -400C dans une solution de |OC-Ala-Ser(Bzl)Leu-NH-NH2 (1,7 g) dans DMF (6 ml), a laquelle on a préalablement ajoute djoxanne (2,8 ml) en présence HCl (1 N) et nitrite d'isoamyle (0,6 ml) Ajustement du pH a 7 avec triétylamine ; réaction a 5 C (72 h.). Introduction lente du mélange réactionnel a - 50C dans HCl 0,5 N (60 ml). Lavage du précipité par H2O. Extraction par CHCl3 (100 ml) ; lavages successifs avec HCl- (1 N) NaCl aqueux. Elimination du CHCl3. Precipitation par le mélange CHCl3-n hexane (2 g). 2-d/ Cyclisation Al-Ser (Bzl)-Leu-Ser (Bzl)-Thr (Bzl) Asu1,7-NH-NH2 (D) Dissolution de C (1,6 g) dans pyridine anhydre (15 ml). Addition de TFA-ONP (2,5 g). Agitation a 45 C (3 h.). Concentration sous vide. Précipitation par éther éthylique. Traitement par TFA comme ci-dessus. Cyclisation dans la pyridine anhydre a 50 pendant 5 h. Extraction par CHCl3 et lavage comme decrit en c-3. Concentration sous vide et précipitation par n-hexane. Dissolution du précipité (2 g) dans DMF (5 ml) et CM30H (25 ml). Addition de 15 ml d'hydrazine (80 ,0). Agitation a température ambiante (14 h.). Addition de H20. Filtration du-précipité. Lavage a H20. Addition de CH30M (50 ml) et chauffage a reflux. Precipitation de D (0,8 g). 2-e/ Préparation de la séquence 1-9 : Al-Ser(Bzl)-Leu- Ser(Bzl)-Thr (Bzl) Asu1,7 - Val-leu-Gly OH (E) D (1 g) est en suspension dans DMF /4 ml), additionné de dioxanne HCl 4 N (1,7 ml) à-5 C. Ajout de nitrite d'isoamyle (0,3 ml) à -10 C sous agitation. Addition de H-Val-Leu-Gly (0,9 g) à-5 C, le pH étant amené a 7 par triéthylamine. Agitation en bain glace (48 h.). Préci-- pitation par HCl 0,5 N (150 ml) de E (1 g). 3/ PREPARATION DU PEPTIDE il 3-a/ E (500 mg) dissous dans DMF (2 ml) est additionné de HOBT (111 mg) et DCCT (150 mg). Agitation pendant 72 h. en présence du peptidyl résine 10-31 (300 mg) après avoir éliminé le t-BOC de Lys10. 3-b/ Cliyage du peptide selon Tam et al. (1983) Les quantités sont rapportés a 1 g de pepttdyl résine. 1) On distille HF (2,5 ml) dans le mélange résine-peptide (1 g), diméthylsulfure (6,5 ml), p-crésol (250 mg). Agitation (1 h.) à 0 C. On chasse l'acide et le diméthylsulfure sous vide et on reprend le résidu par 3 fois 5 ml d'AcOEt. 2) Le peptidyl résine séché, suspendu dans le diméthyl-sulfure (1 ml) est traité par HF liquide (10 ml-) a 0 C (1 h.). Apres élimination de HF et du diméthylsulfure sous vide, la résine est lavée a l'éther (3 fois 10 ml) ; le peptide est repris a l'acide acétique et précipite a l'éther éthylique. On centrifuge a froid, on lave plusieurs fois le précipité a l'éther, on sèche sous vide. Le précipité est repris par de l'eau et le résidu insoluble éliminé par centrifugation. La solution lyophylisée fournit 500 mg de produit. 3-c/ Purification du peptide Deux cents milligrammes de peptide brut sont placés au sommet d'une colonne (diamètre 2,5 cm, longueur 90 cm) de Biogel P6, 50 100 mesh. On élue à l'aide d'acide acétique 0,1 M et on recueille des fractions de 12 ml en suivant l'élution à l'aide d'un enregis treur 280 nm. Le peptide purifié est recueilli dans les fractions 23-28. Ces fractions sont lyophylisées et le résidu purifié sur colonne CMC 52 Whatman par gradient d-'acetate d'ammonium de mho 0,6 à mho 7, pH 4, avec un appareil LKB Ultrograd 11300. Après hydrolyse acide, la composition en acides aminés est la suivante, rapportée à la proline = 2 (entre parenthèses les chiffres théoriques Ala (2) 2,1 ; Arg (1), 0,85 ; Asp (1) 1,1 ; Glu (3) 3,20 ; Gly (3) 3,2 ; His (1) 0,80 ; Leu (5) 5,2 ; Lys (2) 1,90 ; Pro (2) 2,0 ; Ser !3) 3,10 ; Thr (4)4,20 ; Tyr (1) 0,85 ; Val (2) 2,1 ; Asu (1) 0,95 ; 3-d/ Activité biologique Elle est déterminée chez le Rat mâle pesant de 100 a 120 g et soumis à un jeune de 16 heures. L'activite est exprimée en unité MRC a partir de la baisse de la calcémie, mesuree une heure après l'injection intraveineuse du peptide II convenablement dilué en tampon acétate de sodium 0,1 n pH 6 et 0,1 % d'albumine, par comparaison avec l'activité du "Research Standard B" convena blement dilue. L'activité biologique du peptide II est supérieure a 1000 unités MRC par mg. -Abreviations AcOEt = Acetate d'éthyle Asu = Acide &alpha;-aminosubérique Bzl = Benzyle CHA = Cyclohexyl ami ne DCHA = Dicyclohexylamine ONP = Ester p-nitrophenylique OSu = Ester N-hydroxysuccinimide. Z = Benzyloxycarbonyl REVENDICATIONS 1. Nouveaux polypeptides répondant à la formule générale I, caracté risés par -la présence de sérine en position 2 où : A1 = Ser, Gly, Ala A7 = Val, Leu A10 = Lys, Thr A11 = Leu, Tyr A12 = Ser, Thr A14 = Glu, Asp A15 = Leu, Phe A16 = His, Asn A18 = Leu, Phe A19 = Gin, His A21 = Tyr, Phe A23 = Arg, Gln A25 = As, Asn, Ala A26 = Val, Thr, tie 28 = Ala, Ser Val A30 = Thr, Val, Ala 2. En particuliers les polypeptides de Pormule t qut contiennent une valine en position 7. 3. A titre d'exemple, le polypeptide Formule Il 7-(CH2 ) CO-Ala-Ser-Leu a-Ser-Leu-Ser-Thr5-NH-H-CO-Val -Leu-Gly-Lys-Leu Se r-Gi n-GI u-Leu15-Mi s-Lys-Leu-Gl n-Thr20-Tyr-Pro-Arg Thr-Asp25-Val-Gly-Ala-Gly-Thr30-ProamiXde. 4. Procédé de préparation des nouveaux polypeptides spécifiés dans les revendications 1, 2, 3, caractérisé par le fait de soumettre des acides aminés, des peptides ou leurs comibnaisons a des réactions de condensation dans l'ordre de la séquence des acides aminés de la formule I, par exemple en associant la technique en phase solide pour l'obtention de la séquence 10-31 et la technique classique pour l'obtention de la séquence 1-9. 5. A titre de médicament, les polypeptides mentionnés dans les revendi cations 1, 2, 3. 6. Les préparations pharmaceutiques contenant comme principe actif un -ou plusieurs polypeptides mentionnes dans la revendication 1, 2, 3, ainsi que les véhicules adéquats destinés a l'administration paren tépale, lave sous forme de liposome et nasale sous forme de pulvé- risation.