FR 2561101 A1 19850920 FR 8403842 A 19840313 La présente invention concerne un procédé dé préparation de liposomes. Les liposomes sont de petites vésicules sphériques normalement dispersées dans une phase aqueuse et renfermant en leur sein au moins une autre phase aqueuse. Ces phases aqueuses sont séparées par une paroi qui est formée d'une double couche de molécules comportant une fraction lipophile et une fraction hydrophile, généralement des phospholipides. La frac- tion hydrophile de chaque molécule est orientée vers une phase aqueuse, tandis que la fraction lipophile est orientée vers l'intérieur de la paroi. l'es liposomes peuvent être unilamellairesX c'est-à-dire ne comporter qu'une seule paroi à double couche de molécules à fractionslipophile et hydrophile, ou être plurilamellairs, c'est-à-dire comporter plusieurs parois concentriques isolant entre elles di f-- férentes phases aqueuses. Les liposomes ont des tailles très variables (de 25 à 10.000 nm). Les liposomes unilamellaires ont généralement une taille inférieure à 500 nm, tandis que les liposomes plurilamellaires peuvent avoir des tailles supérieures. Les liposomes se sont avérés être des véhicules très intéressants en biologie et en médecine.-. Ils sont, en effet, capables de contenir diverses substances. C'est ainsi qu'ils peuvent contenir des substances hydrophiles dans la phase aqueuse interne, des substances lipophiles dans la paroi lipidique ou même des substances amphiphiles dont la partie hydrophile est dans la phase aqueuse interne ou externe et dont la partie lipophile est dans la paroi lipidique. En outre, les liposomes présentent l'avantage de pouvoir être formés de molécules naturelles ou analogues à des molécules naturelles et métabolisables dans l'organisme. Ce sont, de ce fait, des véhicules biodégradables peu ou pas toxiques. Enfin, les liposomes, lors d'une administration chez l'homme ou l'animal par voie intraveineuse, présentent la particularité de se concentrer dans certains organes, notamment le foie et la rate. Ils constituent donc des véhicules particulièrement intéressants pour amener au foie, à la rate ou à d'autres organes des principes actifs ou des agents de diagnostic (par exemple des produits opacifiants en vue de la visualisation de ces organes). Il est donc fortement souhaitable de disposer d'un procédé de préparation industriel de liposomes permettant d'encapsuler diverses substances. On connais déjà divers procédés de préparation de liposomes. On trouvera une étude des procédés classiques dans un article de F. Puisieux, Les Liposomes, classification et obtention l'abo. Pharma. Problèmes et Techniques 281, 899-904 (1978). Ces procédés classiques conduisent à des taux d'encapsulation qui ne dépassent guère 10 % et à des structures qui sont souvent hétérogènes. De tels procédés ne sont pas utilisables à l'échelle industrielle. Plus récemment, on a proposé plusieurs procédés qui comprennent la même première étape. Cette étape consiste à former une émulsion très fine de type eau dans l'huile par dispersion d'une phase aqueuse contenant une substance à encapsuler dans un solvant organique non miscible à l'eau en présence de phospholipides. Les vési- cules microscopiques obtenues à l'issue de la première étape qui ont été appelées "précurseurs de liposomes" comprennent une seule couche de phospholipides (couche monomoleculaire). La formation d'une seconde couche de phospholipides dans une étape ultérieure conduit à l'obtention des li posqmes. Dans certains procédés de ce type (S. Matsumotoet coll. J. of Colloid Interface Scie I vol. 62, 1, 149-157, (1977) et F. Szoka et colt. Proc Nat. Acad. Sci., vol. 75, 9, 4194-4198 (19781) la phase organique est totalement éliminée de l'émulsion par évaporation avant realisation de la structure liposomiale. Ce procédé qui est envisagé également dans l'une des variantes du procédé de préparation décrit dans le brevet FR 2 399 242 conduit à une destruction partielle des précurseurs de liposomes engendrant une très grande hétérogénéité dans la structure des liposomes et un rendement d'encapsulation faible. Le brevet FR 2 399 242 propose toutefois un autre procédé qui est considéré comme préférable. Ce procédé consiste à émulsifier l'émulsion obtenue à la première étape et comprenant les précurseurs de liposomes,avec une phase aqueuse de dispersion en présence d'un excès de phospholipides, de façon à obtenir une émulsion H/E et à éliminer ensuite de cette émulsion le solvant organique par évaporation. S'il constitue un progrès par rapport aux procédés déjà connus, ce procédé ne permet pas d'obtenir une structure totalement homogène. De plus, il est difficilement transposable au niveau industriel. La présente invention vise à remédier à ces divers inconvénients et à fournir un procédé de préparation des liposomes permettant d'obtenir des structures homogènes avec un rendement élevé, qui soit utilisable au niveau industriel. A cet effet, la présente invention a pour objet un procédé de préparation de liposomes consistant à former dans une première étape une émulsion de type E/H par dispersion d'une première phase aqueuse dans un solvant organique non miscible à l'eau en présence de molécules comportant une fraction lipophile et une fraction hydrophile, caractérisé en ce que, dans une seconde étape, on élimine la majeure partie du solvant organique de cette émulsion par une méthode douce,obtenant ainsi une émulsion È/H concentrée,puis, dans une troisième étape, on ajoute progressivement à cette émulsion E/H concentrée, sous agitation, une seconde phase aqueuse contenant des molécules comprenant une fraction lipophile et une fraction hydrophile et si- multanément on élimine le solvant organique résiduel par évaporation. -Dans la présente invention, on désigne par molécule comportant une fraction lipophile et une fraction hydrophile ou, plus simplement, molécule à fractions lipophile et hydrophile toute molécule capable de participer à la constitution de la paroi des liposomes. Ces molécules sont notamment des phospholipides, mais peuvent être également d'autres lipides, certaines protéines, des polymères, des anticorps (ou immunoglobulines), des stérols et même certains principes actifs qui peuvent ainsi participer à la constitution de la paroi des liposomes. Comme exemples de phospholipides, on peut citer la phosphatidylcholine (lécithine) d'oeuf ou de soja, la phosphatidylsérine, le phosphatidylinositol, la dipaîmitoyîphosphatidyîchoîine, la dimyristorylphosphatidylcholine et la sphingomyéline. Comme autres lipides, on peut utiliser des lipoldes ioniques. Les lipoïdes ioniques peuvent être de type anionique, par exemple l'acide phosphatidique et le phosphate de dicétyle, ou de type cationique, par exemple la stéarylamine. On peut, en outre, avantageusement ajouter à ces lipides des stérols (tels que le cholestérol) ou le tocophérol, qui diminuent la porosité des liposomes. On utilise de préférence des lécithines de soja ou d'oeuf, éventuellement en mélange avec du cholestérol. On peut, en outre, ajouter diverses substances qui permettent d'améliorer la migration vers les cellules cibles et notamment des immunoglobulines ou des anticorps monochlonaux. Les molécules à fractions lipophile et hydrophile sont genéralement utilisées dans la première étape à raison de 0,5 à 5 parties en poids pour 100 parties en poids de solvant organique. Le solvant organique utilisé dans la présente invention peut être tout solvant organique pratiquement insoluble dans l'eau. On préfère toutefois le dichlorométhane en raison notamment de sa faible toxicité, de son caractere pratiquement inexplosif et ininElam- mable et de son point d'ébullition très bas. Comme exemples d'autres solvants, on peut citer l'éther diéthylique et le chloroforme. La phase aqueuse que l'on disperse représente avantageusement de 20 à 50 parties en poids pour 100 parties en poids de solvant organique, cette quantité pouvant varier avec la teneur en molécules à fractions lipophile et hydrophile. La dispersion de 1a première phase aqueuse dans le solvant organique peut être effectuée par agitation, notamment à l'aide d'ultrasons. Cette dispersion est toutefois effectuée de préférence sous l'action d'une turbine tournant à une vites-se relativement élevée. En pratique, pour réaliser la dispersion, on dissout les molécules à fractions lipophile et hydrophile dans le solvant organique, on soumet la solution organique à une agitation et on ajoute progressivement la première phase aqueuse. Il se forme une émulsion E/H comprenant des précurseurs de liposomes. Cette émulsion est ensuite concentrée par éli mination de la majeure partie du solvant organique. Cette élimination du solvant organique doit être ef secouée par des méthodes douces, c'estçà-dire des méthodes ne détruisant pas la structure des précurseurs de liposomes. En pratique, il suffit de laisser décanter l'émulsion E/H. Une émulsion E/H concentrée se sépare au bout de quelques heures. On peut accélérer la décantation par centrifugation à faible vitesse. L'émulsion concentrée ainsi obtenue est ensuite soumise simultanément à deux opérations - d'une part, on ajoute progressivement à l'émulsion sous agitation une seconde phase aqueuse contenant des molécules à fractions lipophile et hydrophile, - d'autre part, on soumet l'ensemble à une évaporation du solvant organique pour éliminer le solvant résiduel. Les molécules à fractions lipophile et hydrophile destinées à former la paroi des liposomes, peuvent être presentes dans la seconde phase aqueuse sous forme de dispersion très fine, mais sont de préférence sous forme de solution ou de pseudo solution. Compte tenu du fait que ces molécules sont relativement peu solubles dans l'eau, on utilise de préférence des phases aqueuses qui contiennent ces molécules à une concentration voisine de la saturation, de façon à obtenir des compositions ayant des teneurs relativement élevées en liposomes. Pour augmenter la solubilité de ces molécules dans la phase aqueuse1 on peut ajouter à la phase aqueuse des adjuvants favorisant la dissolution, par exemple du glycérol ou de 1' alcool éthylique. La quantité de cette seconde phase aqueuse peut être ajustée de façon à ajouter la quantité de molécules à fractions lipophile et hydrophile juste nécessaire pour obtenir une structure unilamellaire. Ceci peut être contrôlé notamment au microscope électronique. L'évaporation du solvant résiduel peut etre obtenue notamment par passage au sein du mélange d'un gaz neutre tel que i'azote, à une température voisine de la température d'ébullition du solvant, cette opération pouvant être effectuée 'notamment sous un vide partiel. En pratique, on dispose-l'émulsion concentrée dans un réacteur qui est muni d'un agitateur et qui est chauffé légèrement, on introduit progressivement la phase aqueuse, tout en faisant passer un gaz neutre chauffé et on maintient le réacteur sous un vide partiel. Il est ainsi possible d'obtenir des liposomes dispersés dans une phase aqueuse, qui se caractérisent par une structure unilamellaire et une taille de particules très homogène. Ces caractéristiques sont liées à la nature déterminante des deux dernières étapes du procédé. En effet, dans la deuxième étape (élimination de la majeure partie du solvant) les techniques utilisées permettent d'éviter la destruction des précurseurs de liposomes et, dans la troisième étape, il est possible d'ajouter juste la quantité nécessaire de molécules à fractions lipophile et hydrophile pour obtenir une structure unilamellaire. De plus, le départ d'une faible quantité de solvant par évaporation a alors beaucoup moins d'effets destructifs au niveau de la paroi des liposomes que dans le cas du procédé du brevent FR. 2 399 242. En outre, contrairement au procédé décrit dans le brevet FR. 2 399 242, le procédé selon l'invention est aisément réalisable à l'échelle industrielle. En effet, l'élimination du solvant organique par évaporation ne concerne plus dans le procédé selon l'invention qu'une fraction mineure de ce solvant et non pas la totalité de ce solvant. Il en résulte en outre une dépense plus faible en énergie. De plus, les rendements d'encapsulation sont élevés (ils peuvent être supérieurs à 70 %, ce qui permet d'éviter toute opération de recyclage des substances à encapsuler. Il est à noter également que le procédé selon l'invention permet d'encapsuler des produits sensibles à la chaleur, puisque les températures peuvent être modérées. Grâce au procédé selon la présente invention, on peut encapsuler un grand nombre de substances. Ces substances peuvent être hydrophiles, lipophiles ou amphiphiles. Les substances hydrophiles'ou amphiphiles peuvent être ajoutées à la première phase aqueuse avant dispersion dans la phase organique et sont encapsulées à l'intérieur des liposomes. Les substances lipophiles ou amphiphiles peuvent être ajoutées à la phase organique, pour être encapsulées à l'intérieur des parois ou à leur périphérie après l'élimination du solvant organique. Ces substances peuvent être notamment des médicaments et des agents de diagnostic, notamment des produits opacifiants,ou des produits cosmétiques,de nature hydrophile ou lipophile. Comme exemples de médicaments, on peut citer des enzymes, des substances antitumorales, l'insuline, des agents chélatants, des stéroides. Comme exemples de produits opacifiants hydrophiles, on peut citer les sels pharmaceutiquement acceptables des acides iotalamique, ioxitalamique et ioxaglique. Comme exemple de produit opacifiant lipophile, on peut citer le monoiodostéarate d'éthyle. En outre, on peut fixer sur la paroi des liposomes, par adsorption ou tout autre type de liaison, diverses substances et notamment des principes actifs ou des produits favorisant la migration des liposomes jusqu'à la cible visée. Par le procédé selon la présente invention, on obtient une dispersion de liposomes dans une phase aqueuse. Dans les applications thérapeutiques, ou de diagnostic, cette composition peut être administrée par voie orale, parentérale ou locale. Les exemples suivants illustrent la présente invention. EXEMPLE 1 On soumet à l'action d'un appareil à turbine Ultra Turrax T45 (tournant à 4000 t/mn) une phase organique comprenant 100 ml de dichlorométhane contenant en solution 3 g de lécithine de soja et 1 g de cholestérol, refroidie entre 5 et 10"C. Au cours de la première minute d'agitation, on introduit progressivement 32 ml d'eau à titre de première phase aqueuse. La durée totale d'agitation est de 4 minutes. L'émulsion E/H ainsi obtenue est versée dans une ampoule à décanter. Deux phases se séparent : une phase surnageante de couleur blanche et une phase organique. La phase surnageante a la consistance d'un gel. Elle est constituée par une émulsion E/H (sens déterminé par la méthode des colorants) comprenant des précurseurs de liposomes de taille homogène. Au bout de 24 heures, la décantation est pratiquement terminée et on élimine la phase organique. On introduit 20 ml de gel dans un reacteur en verre muni d'une arrivée d'azote au sein du gel, d'une arrivée de solution agueusie au fond du réacteur, d'une agitation mécanique de type turbine centrifuge (Microvortex) et d'un orifice permettant d'assurer un vide partiel. Le réacteur est maintenu dans un bainmarie thermostaté à 420C. De l'azote à 40"C est envoyé à travers le réacteur et évacué par l'orifice relié au dispositif de vide. h'agitation est mise en route à 140 t/mn On prépare une seconde phase aqueuse par dissolution de 2 g de lécithine de soja dans un litre d'eau contenant 0,5 g de glycérol et filtration à travers une membrane à ouverture de 0,22 ssm. On introduit dans le réacteur progressivement en 30 mn 400 ml de cette seconde phase aqueuse. L'agitation est poursuivie encore 5 minutes. Lorsque l'agitation est arrêtée, le courant d'azote est coupé et le vide est supprimé. On obtient une dispersion fine de liposomes d'un volume final d'environ 420 ml. L'étude de la granulométrie des liposomes obtenus, au Nanosizer, indique que leur taille moyenne est de 230 nm et que la dispersion est de 3. L'examen au microscope électronique à transmission confirme l'homogénéité de la taille des liposomes et montre en outre qu'ils sont unilamellaires. EXEMPLE 2 On opère comme à l'exemple 1, mais on utilise comme première phase aqueuse 32 ml d'une solution aqueuse de ioxitalamate de sodium et de méglumine à 38 % d'iode. On obtient une dispersion de liposomes ayant une taille moyenne de 237 nm avec une dispersion de 4. La mesure de la taille des particules au bout de trois mois donne une valeur de 236 nm avec une dispersion de 4, ce qui montre la stabilité des liposomes ainsi obtenus au cours du temps. EXEMPLE 3 On opère comme à l'exemple 1, mais on effectue la préparation de l'émulsion E/H en utilisant à la place de l'appareil à turbine un appareil à ultrasons (Branson). On introduit l'eau pendant la première minute et l'on soumet le mélange pendant encore une minute à l'action des ultrasons. On poursuit le traitement comme décrit à l'exemple 1. On obtient des résultats analogues. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de liposomes consistant à former dans une première étape une émulsion de type E/H par dispersion d'une première phase aqueuse dans un solvant organique non miscible à l'eau en présence de molécules comportant une fraction lipophile et une fraction hydrophile, caractérisé en ce que, dans une seconde étape, on élimine la majeure partie du solvant organique de cette émulsion par une méthode douce obtenant ainsi une émulsion E/H concentrée puis, dans une troisième étape, on ajoute progressivement à cette émulsion E/H concentrée sous aigtation une seconde phase aqueuse contenant des molécules comportant une fraction lipophile et une fraction hydrophile et simultanément on élimine le solvant organique résiduel par évaporation. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant organique est le dichlorométhane. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la première phase aqueuse représente de 20 à 50 parties en poids pour 100 parties en poids de solvant organique. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'élimination de la majeure partie du solvant organique est effectuée par décantation. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'élimination de la majeure partie du solvant organique est effectuée par centrifugation. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les molécules comportant une fraction lipophile et une fraction hydrophile sont présentes dans la seconde phase aqueuse à une concentration voisine de la saturation. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on ajuste la quantité de la seconde phase aqueuse de façon à ajouter la quantité de molécules comportant une fraction lipophile et une fraction hydrophile juste nécessaire pour obtenir une structure unilamellaire. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on effectue l'évaporation du solvant organique résiduel sous vide partiel par barbotage d'un gaz neutre alune température voisine de la température d'ébullition du solvant organique. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, dans la première étape, on ajoute progressivement la première phase aqueuse à une solution des molécules comportant une fraction lipophile et une fraction hydrophile dans le solvant organique sous agitation. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le solvant organique contient de 0,5 à 5 parties en poids de molécules comportant une fraction lipophile et une fraction hydrophile pour 190 parties en poids de solvant organique. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la première phase aqueuse contient un produit opacifiant hydrophile. 12. Liposomes obtenus par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.