FR 2563533 A1 19851031 FR 8406701 A 19840427 La présente invention concerne un procédé d'amplification de l'expression d'un gène déterminé chez les Bacillus, en particulier B. subtilis. B. subtilis constitue actuellement-un hôte de choix pour l'expression de gènes étrangers par des techniques de génie génétique car il s'agit d'une bactérie non pathogène dont les conditions de fermentation au stade industriel sont connues. On sait depuis assez longtemps transformer des souches de B. subtilis par de l'ADN plasmidique en utilisant des plasmides capables de se répliquer. Cependant, il existe des difficultés qui sont liées à l'instabilité de ces plasmides hybrides dans B. subtilis. On distingue au moins deux types d'instabi- lité. - L'instabilité ségrégationnelle correspondant à la perte totale du plasmide par la cellule hôte, et - L'instabilité structurale qui correspond à des remaniements de séquences, le plus souvent des délétions. Ces phénomènes d'instabilité sont beaucoup plus fréquents chez B. subtilis que chez E. coli, ce qui explique en partie pourquoi cette dernière bactérie est beaucoup plus utilisée comme cellule hôte dans les techniques actuelles. Ce problème pourrait être résolu si le clonage des gènes étrangers pouvait être effectué dans le chromosome de B. subtilis, car, dans ce cas, la stabilité est beaucoup plus grande. Des vecteurs intégratifs ont donc été construits dans le but d'intégrer des gènes étrangers dans le chromo- some de B. subtilis. Ces vecteurs se caractérisent essentiellement par l'existence de segments homologues du chromosome de B. subtilis qui assurent l'intégration. L'intégration de ces vecteurs dans le chromosome peut s'effectuer schématiquement selon les deux processus suivants: 1 ) Par un événement de recombinaison impliquant un seul "crossing-over", décrit par Campbell (1962) (fig. 1). Ce mécanisme d'intégration ne peut se faire que si le vecteur est recircularisé dans la cellule réceptrice. Cette recircularisation peut survenir soit à la suite d'événements de recombinaison intramoléculaire si le vecteur est doté de répétitions internes (Michel et coll., 1982), soit à la suite d'événements de recombinaison intermoléculaire avec les séquences homologues résidant dans le chromosome de la cellule réceptrice (Niaudet et coll., 1982). Le vecteur peut probablement être recircularisé par réparation de la coupure (comme démontré pour les plasmides par Michel et coll., 1982, 1983), en utilisant comme matrice des séquences homologues portées par le vecteur lui-même, s'il contient des répétitions internes, ou portées par le chromosome de la cellule réceptrice. L'intégration par un mécanisme de type Campbell crée une duplication des séquences homologues, duplication qui encadre 1'ADN étranger (Haldenwang et coll., 1980; Niaudet et coll., 1982). 2 ) Par un mécanisme de double "crossing-over" (fig. 2). Le vecteur linéaire doit alors avoir deux régions d'homologie avec l'ADN chromosomal de B. subtilis, situées de part et d'autre de la séquence hétérologue (Harris-Warrick et Lederberg, 1977; Niaudet et coll., 1982). Si les deux segments chromosomaux portés par le vecteur sont non adjacents dans le chromosome, l'intégra- tion du vecteur par double"crossing-over" produit la délétion de la portion chromosomale située entre ces deux régions d'homologie (Niaudet et coll., 1982). Cette intégration chromosomique dans B. subtilis ne permet pas d'obtenir une amplification génique comme cela est le cas avec les vecteurs plasmidiques auto- réplicables. Or, l'amplification génique est l'une des conditions recherchéee actuellement dans le domaine du génie génétique pour assurer une expression importante du gène cloné et donc la production en quantité indus- trielle de la protéine correspondante. L'invention permet de remédier à ces inconvé- nients grace à un procédé de préparation d'une souche de Bacillus dans le chromosome de laquelle un gène déterminé a été amplifié, caractérisé en ce que: a) on intègre dans le chromosome de Bacillus au moins un vecteur plasmidique d'intégration portant ledit gène de façon à créer dans le chromosome: au moins une séquence d'ADN dite unité amplifiable comportant au moins ledit gène et ses éléments d'expression et à chaque extrémité deux séquences identiques dans le sens direct, l'unité amplifiable codant, en outre, pour un gène sélectionnable; b) on sélectionne ensuite les souches de Bacillus obtenues par culture sur un milieu de sélection correspon- dant au gène sélectionnable et on prélève les souches dont le phénotype correspond à la présence d'un nombre de copies dudit gêne accru par rapport à la population bactérienne avant sélection. L'unité amplifiable est constituée de préférence par une unité d'amplification comportant ledit gène et ses éléments d'expression, l'extrémité N-terminale de cette séquence étant identique à une séquence située après l'unité d'amplification, ces deux séquences identiques étant appelées ci-après "séquences dupliquées". Grâce à ce procédé, on peut sélectionner des souches de B. subtilis ayant subi une amplification génique au niveau des chromosomes tant pour le marqueur de sélection que pour le gène déterminé, comme cela apparaîtra à la lecture des exemples. De façon générale, le gène sélectionnable sera un gène de résistance à un composé chimique, en particulier un antibiotique: kanamycine, chloramphénicol, ampicilline ou tétracycline par exemple. Dans ces conditions, la sélection de la souche est aisée puisqu'il suffit de sélectionner une souche très résistante à l'antibiotique. Ainsi, on a pu obtenir avec une unité d'amplification comportant, outre la séquence dupliquée, le gène Km et à titre de gène déterminé le gène Cm, une amplification génique de Cm en sélectionnant les souches très résistantes à Km. Cette expérience montre bien l'intérêt de la présente invention si l'on remplace Cm par un gène codant pour une protéine intéressante. On peut obtenir une souche hyper-productrice de cette protêine,qui est stable sans qu'il soit nécessaire de maintenir une pression de sélection. La figure 3 représente, en bas, la structure schématique d'un gène amplifié par le procédé de l'invention à partir d'une structure amplifiable en haut comportant une unité d'amplification U.A. constituée d'une séquence dupliquée D et d'une séquence M amplifiée qui comporte le gène marqueur et le gène codant pour la protéine intéressante. Sur le plan technique, les vecteurs d'intégration sont connus dans leurs principes et leurs réalisations particulières. Comme cela a été indiqué précédemment, il est nécessaire pour que l'intégration puisse se faire que le vecteur présente une séquence d'ADN identique à celle du chromosome de la souche de Bacillus. Dans certains cas, on utilise des vecteurs portant des fragments du chromosome de Bacillus sauvage, par exemple tout ou partie du gène thy B, ou d'un gène qui sera nommé X.Dans d'autres cas, on introduit préalablement dans le chromosome une séquence déterminée provenant, par exemple, d'un plasmide bactérien tel que pBR322, dans ce cas il suffira d'utiliser un vecteur d'intégration portant la même séquence. Cette dernière technique est particulièrement simple à mettre en oeuvre. De façon générale, le vecteur d'intégration comportera une unité d'amplification constituée d'une séquence dupliquée, d'un gène marqueur et du gène déterminé, le chromosome de Bacillus comportant, avant l'intégration, une séquence dupliquée. La présente invention concerne également les souches de Bacillus, en particulier B. subtilis, obtenues par la mise en oeuvre du procédé de l'invention, ainsi qu'un procédé de culture des souches obtenues afin de préparer le produit codé par le gène déterminé. De façon tout à fait surprenante, on a constaté lors de la mise en oeuvre des souches selon l'invention que la structure amplifiée était très stable alors qu'il est couramment admis qu'une telle structure est particulièrement instable, quelle que soit l'espèce bactérienne dans laquelle elle a été obtenue et sa localisation (chromosomale ou plasmidique). Le procédé de l'invention permet donc d'obtenir des souches stables industriellement exploitables. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront dans les exemples de réalisation ci-après qui seront décrits en se référant aux figures sur lesquelles: la figure 1 représente le schéma d'un simple événement de recombinaison, la figure 2 représente le schéma d'un double événement de recombinaison, la figure 3 représente le schéma de l'ampli- fication génique, 20. la figure 4 représente la construction des souches eCet A, la figure 5 représente la structure de la souche A, la figure 6 représente la courbe du nombre de copie du gène/résistance à la kanamycine la figure 7 représente la courbe du nombre de copie du gène/l'activité 4'ANT, la figure 8 représente la construction et la structure des souches Bt, Bx et C, 30. la figure 9 représente la structure de la souche D, la figure 10 représente la structure de la souche E. Sauf indication contraire, les différentes enzymes sont mises en oeuvre selon les techniques préconisées par le fournisseur. 1.) Etude de l'amplification du gène de résistance à la Kanamycine dans la souche A. 1.1) Construction de la souche A: Afin d'étudier l'amplification génique, on introduit dans le chromosome de B. subtilis une structure composée d'un gène de résistance à la kanamycine flanqué de deux séquences identiques, en répétition directe, dérivées de séquences de pBR322. La souche contenant cette structure (nommée souche A) a été construite en deux étapes: a) Insertion d'une première copie de pBR322 dans le chromosome de B. subtilis, par un événement de double crossing-over (Niaudet et coll., 1982) (obtention de la souchec); b) Insertion de la deuxième copie de pBR322 et du gène Km, par un mécanisme de type Campbell (obtention de la souche A); les différentes étapes de cette construction sont schématisées sur la figure 4. a) Insertion de la première copie de pBR322 (sbuche o) Pour insérer la première copie de pBR322 dans le chromosome de B. subtilis, on utilise le vecteur intégratif pHV452. Il est composé de deux segments du chromosome de B. subtilis, l'un portant le gène thy B (segment appelé Thy B), l'autre ne contenant pas de fonction connue (segment appelé X) et du plasmide de E. coli pHV33&81 (Dagert et coll., 1984). pHV33&81 est composé du gène de résistance au chloramphénicol de pC194 (Iordanescu, 1975) et de pBR322 délété d'une partie du gène TcR. Grâce à ces deux segments chromosomaux, pHV452 peut s'intégrer dans le chromosome de B. subtilis et conférer à la bactérie hôte la résistance au chlor- amphénicol. On a utilisé pHV452 linéarisé par l'endonucléase Bg1II pour transformer des cellules compétentes de la souche SB202 de B. subtilis. 105 transformants CmR /pg d'ADN ont été obtenus. Tous les transformants étaient Ile, ce qui indique que pHV452 linéarisé a été intégré dans le chromosome de B. subtilis à la suite d'un double événement de recombinaison entre les segments plasmidiques et chromosomaux Thy B et X (fig.4) (Niaudet et coll., 1982). La région chromosomale originale située entre ces segments, contenant le gène ilvA, est alors délétée et remplacée par pHV33/81, la perte du gène ilvA conférant à la souche le phénotype Ile (Barat et coll., 1965). L'analyse chromosomique d'un transformant CmR Ile montre que celui-ci a la structure représentée sur la figure 4. La souche ainsi construite contient donc une séquence dérivée de pBR322 insérée entre les régions chromosomales Thy B et X. b) Insertion de la deuxième copie de pBR322 et du gène KmR (souche A) Pour construire une souche contenant une dupli- cation des séquences de pBR322 autour du gène de résistance à la kanamycine, on a intégré dans la région pBR322 de la souche o du gène de résistance à la kanamycine. Le plasmide utilisé, pHV457, comprend les séquences de pBR322 et les segments Sau3A I et IV et pUBllO (plasmide de Staphylococcus aureus (Gryczan et Dubnau, 1978). Ces segments, insérés dans le site BamHI de pBR322, contiennent un gène de résistance à la kanamycine, et un site pour l'enzyme de restriction BglII (Michel et coll., 1982) (fig.4). Comme on a constaté qu'il était impossible de sélectionner l'intégration d'une seule copie de pHV457 dans le chromosome de B. subtilis, on a introduit ce plasmide dans des cellules compétentes de la souche SB202 (Trp-), en congression avec l'ADN chromosomal de la souche HVS246 (Trp). Parmi les transformants Trp obtenus, % des clones étaient résistants à la kanamycine. L'ADN chromosomal d'un transformant KmR Trp a été extrait et analysé selon la technique d'hybridation de Southern, après restriction par BglII ou EcoRI, en utilisant pHV33/81 comme sonde. L'autoradiogramme obtenu montre que le transformant analysé a la structure représentée sur les figures 4 et 5. La souche A ainsi construite contient donc dans son chromosome une structure amplifiable o le gène de résistance à la kanamycine est flanqué de deux séquences homologues dérivées de pBR322. L'unité d'amplification de la souche A, telle qu'elle a été définie dans la description, est pHV457. Il est important de noter que cette souche n'a jamais été en contact direct avec la kanamycine, le phénotype de résistance à la kanamycine ayant été détecté à l'aide d'une sous-culture de cette souche. 1.2) Détection de bactéries résistantes à des concentrations subinhibitrices de kanamycine Pour rechercher dans la souche A des sous- populations bactériennes résistantes à des concentrations de kanamycine supérieures à celles tolérées par la popu- lation globale (concentrations sub-inhibitrices), on a étalé des aliquots d'une culture de la souche A sur milieu solide contenant des concentrations croissantes de kanamycine. Les résultats montrent: - - qu'une copie du gène Km confère la résistance à 1 pg/ml de cet antibiotique (la souche parentale SB202, qui ne contient pas ce gène, est résistante à 0,5 pg/ml de kanamycine); - qu'il existe dans la souche A des bactéries résistantes à des concentrations de kanamycine supérieures à 1 pg/ml; la fréquence de ces bactéries varie de 10-4 à 5.107. 1.3) Enrichissement des bactéries résistantes à des concentrations de 2 à 10 pg/ml de kanamycine La souche A a été ensemencée en milieu liquide (la concentration initiale étant de 106 cellules/ml) contenant des concentrations croissantes de kanamycine (1 à 10 ug/ml). Toutes les heures, la densité optique de ces cultures a été mesurée à 600 nM. Les résultats de cette expérience montrent: - l'existence d'une souspopulation spontanée résistante à 10 pg/ml de kanamycine (appelée A KmR1o) , -7-pplto dont la fréquence est de 5.10. Cette sous-population croit avec un temps de génération d'environ 20 mn. Après 8 heures de culture, elle devient majoritaire. Par des cultures successives de la souche A (représentant 30 générations cellulaires), en milieu liquide contenant des concentrations de kanamycine échelonnées de 2 à 10 pg/ml, nous avons enrichi et purifié des souches résistantes à 2; 2,5; 3; 4; 5; 8 et 10 pg/ml de kanamycine. 1.4) Détection de l'amplification du gène KmR dans les souches de type A On peut détecter une amplification génique dans un chromosome bactérien par la technique suivante: 1'ADN chromosomal extrait d'une souche contenant une structure amplifiée est restreint par une endonucléase ayant un site unique de coupure dans l'unité d'amplification (U.A.). Cette restriction produit, outre les différents segments chromosomaux, un segment correspondant à l'unité d'ampli- fication. Si le degré d'amplification est suffisant, l'analyse par électrophorèse en gel d'agarose de cette restriction permettra de visualiser une bande qui n'existe pas dans l'ADN chromosomal extrait de la souche parentale "non amplifiée" et qui correspond à 1'U.A. On a utilisé cette technique pour détecter l'amplification de pHV457 dans le chromosome des différentes souches résistantes à la kanamycine. Leur ADN chromosomal et celui de la souche A, ont été extraits puis restreints par l'endonucléase ClaI. Cette enzyme possède un seul site de coupure dans pHV457. Les produits de cette restriction ont été analysés par électrophorèse en gel d'agarose. Une bande, qui n'existe pas dans l'ADN chromosomal de la souche A, apparaît dans l'ADN des différentes souches. Son poids moléculaire est identique à celui de pHV457 et elle hybride avec des séquences de pBR322. Ces résultats suggèrent que cette bande correspond à pHV457. Sa forte intensité observée aussi bien par la technique d'électro- phorèse que par celle d'hybridation indique que la structure amplifiée est composée de plusieurs copies de pHV457 disposées en répétition directes. On a, en outre, vérifié que l'ADN total extrait des souches résistantes à la kanamycine ne contenait pas de forme extra-chromosomale, de deux façons: par électro- phorèse en gel d'agarose et par hybridation selon la technique de Southern. 1.5) Détermination du nombre d'unité d'amplification/ chromosome dans les souches résistantes à la kanamycine Pour déterminer le degré d'amplification (nombre d'U.A./chromosome) dans ces souches, on a analysé par électrophorèse en gel d'agarose leurs ADN restreints par ClaI et l'ADN chromosomal de la souche A, mélangé ou non à une quantité connue de pHV457 linéarisé. En compa- rant par densitométrie l'intensité de la bande observée dans l'ADN de ces différentes souches à celle observée avec une quantité connue de pHV457 on a déterminé le nombre d'U.A./chromosome qu'elles contiennent. Les résultats sont représentés sur la figure 6. De 2 à 5 pg/ml de kanamycine, le nombre d'U.A./chromosome croît propor- tionnellement à la concentration de l'antibiotique. A 2 pg/ml de kanamycine, les bactéries contiennent 7 copies de pHV457 par chromosome, à partir de 5 "g/ml elles en contiennent 30. La taille globale de l'amplification représente environ 5 % du génome bactérien, en admettant que le poids moléculaire du chromosome est de 2,5.109 D, celui de pHV457 étant de 4.106 D (30 x 4.106 / 2,5.109 = 0,05). 1.6) Accroissement du degré d'amplification On a utilisé deux approches pour tenter d'isoler des bactéries ayant un degré d'amplification plus élevé: a) obtention de bactéries hyper-résistantes à la kanamycine (résistantes à des concentrations supérieures a 10 pg/ml de kanamycine); b) obtention de bactéries résistantes à l'amikacine (Amk). En effet, des tests d'inhibition de croissance autour d'un disque d'antibiotique montraient que la souche A kmR1 était plus sensible à l'amikacine qu'à la kanamycine. - Les souches résistantes de 10 à 320 pg/ml de kanamycine contiennent toutes environ 30 U.A./chromosome. Ces résultats indiquent: - qu'il n'existe pas de bactéries ayant des degrés d'amplification supérieurs, ou que la kanamycine ne permet pas de les sélectionner; - que l'hyper-rêsistance n'est pas liée à une R augmentation du degré d'amplification du gène KmR. Bactéries résistantes à l'amikacine En étalant une culture de la souche A KmR sur milieu solide contenant des concentrations croissantes d'amikacine, on a constaté que son efficacité d'étalement était de 50 % sur un milieu solide contenant 2,5 pg/ml d'amikacine. Pour obtenir des bactéries résistantes à des concentrations d'amikacine supérieures à 2,5 pg/ml, on a ensemencé la souche A KmR1o en milieu liquide contenant des concentrations croissantes d'amikacine, et réalisé des cycles successifs. On a ainsi isolé des souches résistantes à 4; 8; 16; 32 et 64 pg/ml d'amikacine (souches AR AmR6 (souches AmK à AmKR4). Leur ADN a été extrait, restreint par ClaI. L'isolation de souches résistantes à l'amikacine (jusqu'à 64 ug/ml) et l'analyse de l'ADN de ces souches montrent que ces souches contiennent environ 50 U.A./chromo- some, la taille globale de l'amplification représentant 7,5 % du chromosome bactérien. L'amikacine permet donc de sélectionner des bactéries ayant un degré d'amplification supérieur à ceux obtenus avec la kanamycine. Comme avec la kanamycine, il est possible d'isoler des souches résistantes à des con- centrations croissantes d'amikacine, bien que leur degré d'amplification reste constant. On peut expliquer cette limitation du degré d'amplification en supposant que des bactéries contenant plus de 50 U.A. /chromosome n'existent pas ou que l'amikacine ne permet pas de les sélectionner. 1.7) Activité de la 4'-adénosylnucléotidyl transférase (4'ANT) La 4'-adénosylnucléotidyl transférase est une enzyme codée par le gène de résistance à la kanamycine de pUB110. On a mesuré l'activité de cette enzyme dans les extraits bruts de la souche A et des différentes souches résistantes à des concentrations sub-inhibitrices de kanamycine. Les résultats obtenus (fig. 7)montrent que cette activité croit proportionnellement au nombre de gènes existants dans la bactérie avec une pente voisine de 1. Ceci indique que chaque copie du gêne de résistance à la kanamycine contribue de la même façon à la production de la 4'ANT. L'activité de cette enzyme a été également mesurée dans les extraits bruts des souches hyper-résistantes à la kanamycine (concentration >10 pg/ml). L'activité 4'ANT qu'elles contiennent est identique à celle existant dans la souche A KmR. L'ensemble de ces résultats démontre que le phénotype d'hyper-résistance de ces souches n'est pas dR à une augmentation de l'activité 4'ANT ni à l'augmentation du degré d'amplification. D'autres phénomènes en sont responsables. 1.8) Stabilité de la structure amplifiée dans la A Km 10 (30 U.A./chromosome) Pour étudier la stabilité de la structure amplifiée, 1010 cellules issues d'une culture fraîche de la souche A KmR10 ont été ensemencées en milieu liquide (100 ml) sans antibiotique. Après 3 générations, un 2ème cycle de culture en milieu non sélectif a été ensemencé avec 108 cellules. 5 cultures successives de ce type correspondant à 16 générations cellulaires ont été réalisées. A l'issu de chaque culture, des aliquots ont été prélevés et étalés sur milieu solide contenant O ou 7,5 pg/ml de kanamycine. La quantité de bactéries viables et de bactéries résistantes à 7,5 pg/ml de kanamycine existant dans ces cultures a été déterminée par numération {à chaque mesure environ 1 000 colonies ont été comptées). Après 16 générations en milieu non sélectif, la proportion de bactéries Km nR est supérieure à 90 % 7,5 (cette valeur est la limite de fiabilité des numérations). Comme les efficacités d'étalement des souches A ayant , 20 ou 15 copies de pHV457 sont de 100, 25 et 0,1 % respectivement sur un milieu contenant 7,5 pg/ml de kanamycine, on peut conclure que les bactéries issues des 16 générations effectuées en milieu non sélectif ont conservé en moyenne plus de 20 U.A./chromosome. En outre, on a calculé que la probabilité de R -4 perte du phénotype KmR7 5/génération est- 28 U.A./chromosome dans l'autre cas. Les analyses phéno- typiques et biochimiques montrent donc une grande stabilité de la structure amplifiée. 2.) Etude de l'amplification du gène de résistance à la kanamycine dans les souches B et C La structure contenue dans la souche A - permet l'amplification du gène de résistance à la kanamycine. Cette amplification est-elle due à des propriétés parti- culières des séquences de pBR322 ou à l'existence d'une duplication ? On a testé ces deux hypothèses en étudiant l'amplification du gène de résistance à la kanamycine: - quand il est flanqué de deux séquences - identiques autre que celles de pBR322; - quand il n'est pas encadré de duplication. 2.1) Construction des souches B et C Ces souches ont été construites en insérant dans le chromosome de B. subtilis un vecteur intégratif, soit par un mécanisme de type Campbell nécessitant un seul événement de recombinaison entre le vecteur cir- culaire et le chromosome, soit par un double évènement de recombinaison entre le vecteur linéaire et le chromo- some (Niaudet et coll., 1982). Le vecteur intégratif utilisé est pHV458. Il est composé de pHV457 et de deux segments chromosomaux, Thy B et X (2 kb et 3,3 kb respectivement) provenant de pHV438 (Niaudet et coll., 1982) (fig. 8). Il est non réplicatif chez B. subtilis et contient le gène de résistance à la kanamycine de pUBllO. Grâce à ses deux segments chromosomaux, il peut s'intégrer dans le chromo- some de B. subtilis de deux façons: a) Par un mécanisme de type Campbell dans les régions Thy B ou X créant une duplication du segment correspondant au site d'intégration, autour du gène de résistance à la kanamycine. Les deux souches ainsi construites seront appelées souches Bt et Bx (fig.8). b) Par un double événement de recombinaison provoquant la délétion du segment chromosomal portant le gène ilvA situé entre les régions Thy B et X, ce segment étant remplacé par pHV457 (fig. 8). La souche ainsi construite sera appelée souche C. Comme il est impossible de sélectionner directe- ment l'intégration d'une seule copie du gène de résistance à la kanamycine dans le chromosome de B. subtilis, pour construire ces trois souches on a transformé des cellules compétentes de la souche SB202 (Trp-) par pHV458 en con- gression avec l'ADN chromosomal de la souche HVS246 (Trp +). Parmi les transformants Trp+ obtenus, on a détecté 10 % de clones KmR dont 75 % étaient Ile+ et 25 % Ile-. 2.1.1) Transformants KmR Ile (souche Ci Pour vérifier que ces transformants avaient une structure de type C (fig. 8) on a extrait l'ADN chromosomal de deux transformants KmR Ile-. Après restric- tion par EcoRI ou BgIII, l'ADN a été analysé selon la technique de Southern en utilisant pHV458 comme sonde.- Les résultats obtenus après autoradiographie correspondent à ceux attendus lors de l'intégration d'un monomère de pHV458 dans la région Thy B-X du chromosome de B. subtilis par un double événement de recombinaison. Ce résultat a pu être confirmé en démontrant d'une part que ces transformants contiennent une région d'homologie avec les séquences de pBR322, d'autre part qu'ils ont perdu le gène ilvA. 2.1.2) Transformants KmR Ile+ (souches Bt et Bx) Six transformants KmR Ile+ ont été analysés par la technique d'hybridation de Southern. Leurs ADN chromosomaux ont été extraits puis, après restriction par EcoRI ouBglII, hybridés avec pHV458. Les résultats obtenus indiquent que quatre transformants contiennent un monomère de pHV458 intégré dans leur chromosome par un mécanisme de type Campbell, les deux autres,contenant plusieurs copies de pHV458, proviennent de l'intégration d'un polymère de pHV458 dans le chromosome de B. subtilis. Les résultats obtenus ci-dessus ne permettaient pas de connaître le site d'intégration de pHV458 dans le chromosome de la souche SB202 (Thy B ou X). Pour le déter- miner, on a restraint l'ADN chromosomal des transformants contenant un monomère de pHV458, ainsi que celui de la souche C, par l'endonucléase BamHI. Cette enzyme reconnaît un site unique dans pHV458 (fig. 8). Ces ADN restreints ont ensuite été hybridés avec pHV458 selon la technique de Southern. L'ADN de la souche C présentait une bande d'hybridation correspondant à un segment d'environ 6 kb. Or, la restriction de l'ADN chromosomal de la souche C par BamHI produit deux segments pouvant être hybridés avec pHV458 (fig. 8) dont la taille dépend de la position des prochains sites BamHI dans l'ADN chromosomal. Il s'en suit que le segment contenant le gène thyB doit avoir une taille supérieure à 2,4 kb, tandis que celui correspondant à X doit avoir une taille supérieure à 9 kb. Le segment de 6 kb détecté par hybridation correspond donc à celui contenant le gène thyB, l'autre contenant le segment X, dont la taille est supérieure à 9 kb, n'a pas été détecté, probablement parce qu'il était trop grand pour être efficacement transféré sur le filtre de nitrocellulose. Les ADN de 2 des 4 transformants contenant un monomère de pHV458 présentent une bande analogue à celle observée dans la souche C. L'analyse des structures attendues des souches Bt et Bx (fig. 8) montre que seulsles ADN contenant une structure de type Bt peuvent générer cette bande. Les deux transformants ayant une bande de 6 kb commune avec la souche C proviennent donc de l'intégration de pHV458 par un mécanisme de type Campbell dans la'région chromosomale ThyB. La souche ainsi construite contient donc une duplication des segments ThyB encadrant le gène de résistance à la kanamycine (souche Bt). Les 2 autres transformants proviennent de l'intégration de pHV458 dans la région chromosomale X. Les souches contiennent une duplication des segments X encadrant le gène de résistance à la kanamycine (souche Bx) (fig. 8). Comme pour les souches A et C, ces deux souches (Bt et Bx) n'ont jamais été en contact direct avec la kanamycine. 2.2) Amplification dans les souches B 2.2.1) Détection de bactéries de tyEeB résistantes à des concentrations sub-inhibitrices de kanamycine , Des aliquots des cultures des souches Bt et Bx ont été étalés sur des milieux solides contenant des con- contrations croissantes de kanamycine pour déterminer leurs efficacités d'étalement sur différentes concentra- tions. Les résultats mettent en évidence: a) que la souche Bx se comporte comme la souche A, elle résiste à 1 pg/ml de kanamycine et contient des bac- téries capables de résister à des concentrations de kanamycine subinhibitrices (2 à 8 pg/ml); la fréquence de ces bactéries varie de 1O04 à 106.; b) la souche Bt est plus résistante à la kanamycine que les souches A et Bx, puisque son efficacité d'étalement sur 2 pg/ml de kanamycine est de 5.10-1 (au lieu de 10-4), elle contient également des bactéries capables de croître sur 4; 8 et 16 pg/ml de kanamycine. Il est possible que la résistance élevée à la kanamycine de cette souche provienne d'une transcription accrue du gène KmR due à un promoteur d'origine chromosomale. 2.2.2) Enrichissement de bactéries résistantes àO gal ide kanamycine Pour enrichir les bactéries résistantes à 10 pg/ml de kanamycine, les souches Bt et Bx ont été cultivées en milieu liquide contenant 10 pg/ml de kanamycine comme pour la souche A. Comme pour la souche A, on a pu mettre en évidence dans une-culture de la souche Bx en milieu sélectif un enrichissement d'une sous-population résistante à la kanamycine. En milieu non sélectif cette sous-population n'est pas enrichie. 2.2.3) Obtention de bactéries de tye Bx, hyper:résistantes à la kanamycine A l'aide de cycles successifs en milieu liquide contenant des concentrations croissantes de kanamycine, des souches issues de la souche Bx, résistantes de 10 pg/ml à 0,1 g/ml de kanamycine, ont été obtenues. 2.2.4) Détermination du degré d'amElification des souches de tye B Le nombre de copies de pHV458 contenues dans les souches Bx résistantes de 10 pg à 20 mg/ml de kanamycine a été déterminé par densitométrie. Ces souches contiennent toutes environ 20 U.A./chromosome. Comme pour la souche A, l'augmentation de la résistance à la kanamycine des souches de type Bx n'est pas associée à l'augmentation de leur degré d'amplification. L'hyper-résistance de ces souches est donc due à d'autres phénomènes que l'amplification génique. Par densitométrie, nous avons constaté que la souche de type Bt résistante à 10 pg/ml de kanamycine contenait environ 5 U.A./chromosome. On suppose que l'utilisation de la kanamycine comme agent sélectif ne peut permettre d'isoler des souches de type Bt ayant un degré d'amplification supérieur puisque les souches de type A et Bx résistantes à 10 pg/ml de kanamycine con-- tiennent un degré d'amplification maximal. On peut probablement expliquer le faible degré d'amplification de la souche Bt KmR1 en supposant que le promoteur d'origine chromosomal provoquant la sur-expression de ce gène est contenu dans l'unité d'amplification. Sachant que le gène de résistance à la kanamycine est orienté dans le sens du petit segment BgII - BamHI de pHV457 (J.E. Davis, communication personnelle) et connais- sant les structures des souches A, Bt et Bx, ainsi que leur degré de résistance à la kanamycine, on peut conclure que ce promoteur d'origine chromosomal est situé dans le segment Thy B. 2.2.5) Stabilité de la structure amplifiée dans la souche BxRo (_2OU.A.chromosome) -_--10 La stabilité de la structure amplifiée a été étudiée dans la souche Bx Km 1 de la mnme façon que pour la souche A KmR1. ' La stabilité de la structure amplifiée dans la souche Bx KmR10 (20 U.A. /chromosome) est similaire à celle observée dans la souche A KmR 1. La probabilité pour qu'une cellule KmR 5 devienne KmS7 5 par génération est 47,57, également La stabilité de la structure amplifiée dans la souche Bx étant identique à celle existant dans la souche A KmR1, on peut conclure que la région chromosomale délétée dans la souche A,mais présente dans la souche Bx, ne con- tient pas de fonctions particulières pouvant modifier la stabilité de la structure amplifiée. 2.3) Souche C 2.3.1) Obtention de souches de tye C h_ er- résistantes à la kanamycine et déter- mination de leur degré d'amplification A partir de la souche C, résistantes à 1 pg/ml de kanamycine, on a obtenu des souches résistantes à - 20... 320 pg/ml de kanamycine. Aucune amplification du gène de résistance à la kanamycine n'a été détectée dans mes souches. Ces résultats suggèrent que dans la souche C il n'y a pas de sous-population contenant une structure amplifiée. Il apparait donc qu'une duplication autour de ce gène est indispensable pour qu'il puisse être amplifié. L'hyper-résistance des souches de type C obtenue ci-dessus serait due à une modification de la sensibilité de la souche vis-à-vis de la kanamycine. 3.) Etude de l'amplification du gène de résistance au chloramphénicol (Cm) dans les souchese et D Les études effectuées avec les souches de type A, Bx, Bt et C montrent que le gène de résistance à la kanamycine peut être amplifié uniquement s'il est inséré entre deux séquences identiques. Pour généraliser ces observations et montrer que l'amplification observée n'est pas due à des propriétés particulières du fragment d'ADN contenant le gène de résistance à la kanamycine, on a étudié l'amplification du gène de résistance au chlor- amphénicol lorsqu'il est encadré ou non de séquences identiques. 3.1) Constructions 3.1.1) Souche o La construction de la souche est décrite dans le paragraphe 1.1.a). Cette souche contient dans son chromosome des séquences dérivées de pBR322, portant le gène de résistance au chloramphénicol de pC194 (pHV33/ 81), non encadrées de séquences identiques (fig. 4). 3.1.2) Souche D Dans le chromosome de la souche D existe une duplication identique à celle contenue dans la souche A (duplication de séquences dérivées de pBR322) encadrant le gène de résistance au chloramphénicol de pC194. Pour construire cette souche, on a transformé des cellules compétentes de la souche C par un plasmide non réplicatif * chez B. subtilis, pHV33/A81 (Dagert et coll., 1983). La préparation du plasmide pHV33 L 81 était fortement polymérisée, afin d'éviter l'intégration de polymères de pHV33/\ 81 dans le chromosome de la souche C, on a transformé des cellules compétentes de cette souche par l'ADN de la préparation plasmidique de pHV33/L81 préalablement linéarisé par PstI. Ainsi linéarisé, ce plasmide conserve une partie de son pouvoir transformant car la coupure qu'il porte peut être réparée par des interactions entre le plasmide linéarisé et les séquences homologues existant-dans la cellule réceptrice (Contente 3R et Dubnau, 1979). 2.10 transformants CmR/Pg d'ADN ont été obtenus. L'ADN total extrait d'un transformant, coupé par EcoRI et BglII a été hybridé avec pHV457. Sa structure correspondait à celle de la souche D recherchée (fig. 9). 3.2) Amplification du gène de résistance au chloramphénicol 3.2.1) Souche D A partir de cultures successives de la souche D (résistante à 5 pg/ml de chloramphénicol) effectuées en milieu liquide contenant des concentrations croissantes de chloramphénicol, on a obtenu des souches résistantes de 10 à 50 pg/ml de chloramphénicol. A partir d'une culture de la souche D, il est possible d'isoler des souches ayant des degrés d'ampli- fication différents et contenant 2,5 et 7 U.A./chromosome. L'amplification du gène de résistance à la kanamycine observée dans les souches A, Bx et Bt n'est donc pas due à des propriétés particulières des séquences portant le gène Km. Dans les conditions expérimentales, il n'a donc pas été possible d'isoler des souches contenant plus de 7 U.A./chromosome. Deux hypothèses peuvent expliquer -63533 ce résultat: soit le chloramphénicol ne permet pas de les sélectionner, soit elles n'existent pas. 3.2.2) Souche La souche " résiste à 5 pg/ml de chloramphé- nicol. A partir de cette souche il n'a pas été possible d'obtenir de bactéries résistantes à des concentrations supérieures à 5 pg/ml de chloramphénicol. L'ADN total de la souche résistante à 5 pg/ml de chloramphénicol a été extrait et analysé par densitométrie. Aucune structure amplifiée n'a été détectée. Ces études effectuées sur les souches D et D démontrent que le gène de résistance au chloramphénicol peut être amplifié s'il est inséré entre deux séquences identiques. 4.) Co-amplification de deux gènes Pour démontrer qu'il est possible de co-amplifier deux gènes, on a construit la souche E. Dans son chromo- some ont été insérés pHV33/S-81, qui contient le gène de résistance au chloramphénicol, et pHV458, qui contient le gène de résistance à la kanamycine. Ces deux plasmides encadrés de deux séquences X constituent l'U.A. n 2 (fig. 10). Avec cette structure, l'amplification de pHV458 entraîne obligatoirement celle de pHV33/A81. La souche E contient également une duplication des séquences de pBR322 encadrant le gène de résistance au chloramphénicol, pHV33 / 81 constituant l'U.A. n 1 (fig. 10). L'amplification de pHV33 s 81 peut être indépendante de celle de pHV458. 4.1) Construction de la souche E Des cellules compétentes de la souche Bx ont été transformées pour la résistance au chloramphénicol par le plasmide pHV33/A 81 préalablement linéarisé par par PstI (voir paragraphe 3.1.2). 102 transformants/"g d'ADN résistants à 3 pg/ml de chloramphénicol ont été obtenus. Un clone a été choisi, dont on suppose qu'il contient la structure indiquée sur la figure 10. 4.2) Amplification de pHV458 et pHV33Z 81 Les cellules de la souche E ont été ensemencées en milieu liquide contenant 10 pg/ml de kanamycine ou des concentrations croissantes de chloramphénicol (de 0 à 40 pg/ml). Apres 18 heures d'incubation, la proportion de cellules résistantes à 10 pg/ml de kanamycine et 25 pg/ml de chloramphénicol a été déterminée par étalement sur milieu solide. A l'issue d'une culture de la souche E en milieu non sélectif, la proportion de cellules résistantes à 10 pg/ml de kanamycine est de 2,5.105 (valeur proche de celles déterminées pour les souches A et Bx). La proportion de cellules résistantes à 25 pg/ml de chloramphénicol est de 3, 3.10. Comme attendu, les bactéries résistantes à pg/ml de kanamycine ont été enrichies pendant la culture en milieu liquide contenant 10 pg/ml de kanamycine (efficacité d'étalement de 1 sur milieu solide Km10o). Cet enrichissement est accompagné d'une augmentation de la quantité de bactéries résistantes à 25 pg/ml de chloramphénicol, efficacité d'éta- lement de 0,1 sur milieu solide Cm25. La non induction du gène de résistance au chloramphénicol pendant la culture en présence de 10 pg/ml de kanamycine doit être la cause de la moins bonne efficacité d'étalement sur Cm25 que sur Kmlo(1/10). Ces résultats montrent que l'amplification d'un gène (gène KmR) entraîne celle d'un autre gène (gène CmR) présent dans la même unité d'amplification. Pour les cultures effectuées en faibles concen- trations de chloramphénicol (jusqu'à 15 pg/ml), la co- amplification des gènes de résistance au chloramphénicol et à la kanamycine semble faible. Ceci peut être dé soit à une amplification indépendante de pHV33 A 81 (il fait partie de 1'U.A. n 1, (fig. 10), soit à une co-amplification insuffisante du gène de résistance à la kanamycine (le degré d'amplification serait trop faible pour conférer la résistance à 10 pg/ml de kanamycine). Il est intéressant de noter qu'aux concentrations de chloramphénicol supérieures à 15 pg/ml, l'enrichissement des bactéries résistantes au chloramphénicol est accom- pagné de celui de bactéries résistantes à 10 ng/ml de kanamycine (la proportion de cellules KmR O par rapport aux cellules CmR25 croit de 50 % à 90 %). Ceci indique que l'amplification de 1'U.A. n 2 se fait préférentielle- ment à celle de i'U.A. n 1 seule. Les caractéristiques et les origines des souches et des plasmides utilisés dans les exemples de réalisation seront résumées dans les tableaux ci-après. SOUCHES BACTERIENNES MARQUEURS GENETIQUES ORIGINE E. coZi HVC45 thrAl teu-6 thi-1 ZacYl tonA21 R. Davis supEAE hedR rpaL B. ubtilies SB202 trpC2 tyrAl aroB2 hieH2 P. Schaeffer a (a) trpC2 typAl aroB2 hiel2 ce travail ins [pHV452] deZ [ilvA2] A (a) tyrA1 aroB2 hisH2 ins [pHV452I ce travail deZ tilvA2l ins [pHV457' dup IQR322A81] BT (a) tyrAl aroB2 hisE2 ce travail ins tpHV458, ThyBl dup ThyBh dp txj BX (a) tyrAl aroB2 hiaH2 ce travail ins HV458, X) dup ej dkp UThyB] C (a) tyrAl aroB2 hieH2 ce travail ins rpHV458J deZ BlvA2) D (a) tyrAl aroB2 hieR2 ce travail ins HV4,58)- deZ tilvA2] ins tpHV33A80 dup [pBR322à813 E (a) tyrAl aroB2 hisH2 ce travail ine [pHV458, X] dup iX] dup [ThyB] ins IpHV33A813 dup [pBR3226813 (a) modifications génétiques dues à des insertions de plasmides dans le chromosome de B. eubtiZis: 1) ins suivi d'un nom de plasmide entre crochets signifie que le plasmide est inséré dans le chromosome 2) deZ oudup suivi d'un nom de gène, de séquence ou d'un nom de plasmide signifie qu'après l'insertion du plasmide il y a eu délétion ou duplication respectivement de ce gène, séquence ou plasmide. 3) Quand un plasmide peut être inséré dans plusieurs endroits, son site d'intégration est indiqué derrière le nom du plasmide. PLASMIDES CONSTRUCTION REFERENCE pBR322 vecteur de clonage Bolivar et col., 1977 pC194 1solat naturel lordanescu, 1975 pUB110 isolat naturel Gryczan et col., 1978 pHV32 revertant TcR obtenu Primrose et Ehrlich, 1981 in vtivo de pHV33 pHV33 hybride entre pC194 et " pBR322 pHV33681 pHV33 coupé par BamlI Dagert et col., 1984 érodE par BAL31 pHV438 hybride entre pHV32 Niaudet et col., 1982 et les segments ThyB et X du chromosome de B. Mebtitis pHV452 hybride entre pHV33A81 ce travail et les séquences du chiomosome de B. aubtiZis ThyB et X pHV457 segments Sau3A I et IV ce travail de pUB110 inséré dans site BafH1 de pBR322 pHV458 hybride entre pHV457 et ce travail les segments du chromosome de B. subtilis ThyB et X REFERENCES Barat M., Anagnostopoulos C. et Schneider A.M. (1965) J. Bacteriol. 90:351-369 Campbell A. (1962) Advances Genet. 11:101-145 Contente S. et Dubnau D. (1979) Plasmid 2:555-571 Dagert M., Jones I.M., Goze A., Romac S., Niaudet B. et Ehrlich S.D. (1984) EMBO J. 3:81-86 Gryczan T.J. et Dubnau D. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:1428-1432 Haldenwang S. Banner C.D.B., Ollington J.F., Losick R., Hoch J.A., O'Connor M.B. et Sonensheim B.L. (1980) J. Bacteriol. 142:90-98 Harris-Warwick R.M. et Lederberg J. (1977) J. Bacteriol. 133:1246-1253 Iordanescu S. (1975) J. Bacteriol. 124:597-601 Michel B., Niaudet B. et Ehrlich S.D. (1982) EMBO J. 1: 1565-1571 Michel B., Niaudet B. et Ehrlich S.D. (1983) Plasmid 10: 1-10 Niaudet B., Goze A. et Ehrlich S.D. (1982) Gene 19:277-284 REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation d'une souche de Bacillus dans le chromosome de laquelle un gène déterminé a été amplifié, caractérisé en ce que: (a) on intègre dans le chromosome de Bacillus au moins un vecteur plasmidique d'intégration portant ledit gène de façon à créer dans le chromosome: au moins une séquence d'ADN dite unité amplifiable comportant au moins ledit gène et ses éléments d'expression et à chaque extrémité deux séquences identiques dans le sens direct, l'unité amplifiable codant, en outre, pour un gène sélectionnable; (b) on sélectionne ensuite les souches de Bacillus- obtenues par culture sur un milieu de sélection correspondant au gène sélectionnable et on prélève les souches dont le phénotype correspond à la présence d'un nombre de copies dudit gène accru par rapport à la population bactérienne avant sélection. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le marqueur de sélection est un gène de résistance à un composé chimique et en ce que à l'étape b) on sélectionne les souches présentant la résistance la plus élevée à ce composé chimique. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le composé chimique est un antibiotique. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le marqueur de sélection est le gène Km ou Cm ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les séquences idehtiques dites séquences dupliquées proviennent d'un plasmide bactérien. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les séquences dupliquées proviennent de pBR322. 7) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les séquences dupliquées sont constituées par tout ou partie d'une séquence d'ADN du chromosome de B. subtilis sauvage. 8) Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que les séquences dupliquées sont constituées par tout ou partie du gène thy B. 9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que dans l'étape a) le vecteur plasmi- dique d'intégration comporte au moins: une unité d'amplification constituée d'une séquence dupliquée, d'un gène marqueur et du gêne déterminé, le chromosome du Bacillus comportant, avant l'intégration, une séquence dupliquée. ) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la séquence dupliquée présente dans le chromosome de Bacillus a été introduite par intégration à l'aide d'un vecteur plasmidique d'intégration. 11) Souche de Bacillus obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 10. 12) Souche selon la revendication 11, caracté- risée en ce qu'il s'agit de B. subtilis. 13) Procédé de préparation d'une protéine déterminée, caractérisé en ce qu'on cultive une souche selon l'une des revendications 11 et 12 dans laquelle le gène déterminé code pour ladite protéine, dans un milieu de culture, et en ce que l'on sépare ensuite la protéine exprimée.