FR 2569406 A1 19860228 FR 8413096 A 19840822 Sonde mixte et ses applications, son précurseur, leur. préparation et dérivés comportant une base modifiée pour cette préparation. L'invention concerne des séquences d'oligonucléoti- des pouvant remplacer les sondes mixtes pour la détection et l'isolement de séquences de nucléotides, notamment d'ARN messagers ou d'ADN complémentaires, leurs précurseurs et leur préparation, ainsi que leurs utilisations. Plus précisément, l'invention a pour objet des sé- quences d'oligonucléotides du type susindiqué comprenant des bases modifiées, leur préparation à partir de précur- seurs comprenant des bases qui, par dismutation, conduisent aux bases modifiées en question, la préparation de ces précurseurs, ainsi que l'utilisation des sondes obtenues. Il est maintenant bien connu des spécialistes d'avoir recours pour certaines analyses, notamment pour la détection de séquences nu- cléotidiques particulières, telles que des séquences d'ADN ou d'ARN et l'isolement de telles séquences,à des techniques basées sur l'hy- bridation entre une séquence déterminée de nucléotides utilisée en tant que sonde et une séquence de nucléotides complémentaires de ceux de la sonde, éventuellement contenue dans une composition renfermant des acides nucléiques. La mise en oeuvre de ces techniques, en parti- culier l'obtention de sondes sensibles et s'hybridant de façon stable avec les séquences complémentaires, pose encore des problèmes, notam- ment au niveau de leur synthèse. Ainsi. l'un des problèmes les plus fréquents posés en génie génétique est celui de la "pêche" d'ARN messagers par des oligodésoxy- nucléotides synthétiques, c'est-à-dire la détection, l'isolement et l'analyse de séquences d'ARN messagers par hybridation avec des frag- ments d'ADN complémentaires (cADN). Cette technique est basée sur l'appariement des paires A-T (2 liaisons hydrogène) et G-C (3 liaisons hydrogène). La conception et la synthèse de ces sondes sont ren- dues compliquées par la dégénérescence du code génétique: 32 à part la méthionine (AUG) et le tryptophane (UGG) -2- qui nécessitent un seul codon, tous les autres acides ami- nés sont traduits à partir de 2 à 6 codons. Jusqu'à maintenant. à partir d'une séquence protéi- que déterminée, pour obtenir des sondes, on a utilisé plusieurs stratégies: a) choisir dans une séquence G de préférence à A.et T de préférence à C. ce qui donne à l'hybridation soit une paire stable, soit un mauvais appariement G-T appelé de façon générale et dans ce qui suit "mismatch" G-T. Cette méthode a été appliquée avec succès pour la synthèse de cADN codant la relaxine de rat [P.Hudson et coll.,. Nature. (1981). 291.127] mais est difficilement gé- néralisable en raison de son manque de sensibilité notam- ment. b) préparer toutes les séquences possibles avec les ambiguités correspondantes [B.E. Noyes et coll., Proc. Natl. Acad. Sci., USA. (1979), 76, 1770 et M. Mevarech et coll... J. Biol. Chem.. (1979),254. 7472], ce qui peut né- cessiter un énorme travail de synthèse. c) synthétiser des "sondes mixtes" ("mixed probes") avec toutes les ambiguités sur la même séquence. Cette technique a donné de bons résultats pour la e-globine[R.B. Wallace et coll.. Nucleic Acids Research, (1981). 9.879], par exemple, mais représente pour le chimiste organicien un côté "frustrant" vu la complexité du mélange obtenu et le nombre de trimères mis en jeu et au surplus ne donne pas toujours des résultats satisfaisants en raison notamment des réactivités différentes des différents trimères mis en jeu au niveau de chaque ambiguité, ce qui a pour conséquen- ce pratique que l'on n'a pas de certitude quant à la com- position exacte du mélange obtenu. L'invention remédie. au moins en partie. aux incon- vénients des techniques antérieures en fournissant une sonde qui: -3- tout en ayant les caractères d'une sonde mixte, constituée d'un mélange complexe, est synthétisée comme une sonde unique, ce qui correspond à un important gain de temps et d'argent; - présente, par rapport notamment aux sondes défi- nies sous a) ci-dessus, une meilleure sensibilité dans la détection après hybridation avec des séquences complémen- taires et une meilleure stabilité de l'hybride ainsi formé (température de fusion plus élevée); et au surplus, comme il sera vu plus loin, - offre la possibilité d'être utilisée avec des méthodes d'identification faisant intervenir des réactions immunologiques voire immuno-enzymatiques à la place des détec-- tions radioactives relativement peu sensibles et présentant les inconvénients bien connus, utilisées jusqu'à présent. La présente invention repose sur la découverte selon laquelle il est possible d'obtenir, par dismutation d'une séquence unique d'oligonucléotide, dans des condi- tions bien particulières, une séquence mixte comportant, à chaque fois que se pose une ambiguité au niveau d'une pyrimidine, une quantité équimoléculaire de méthyl-5 cyto- Me sine ( C) et de thymine (T) ou u n e quantité équimoléculaire d'uracile (U) et de cytosine (C), et à chaque fois que se pose une ambiguité au niveau d'une purine, une quantité équimolé- culaire de guanine (G) et d'amino-2 adénine (NH2A). La séquence mixte ainsi obtenue qui contient certaines bases modifiées MeC et/ou NH2A présente tou- tes les caractéristiques des séquences mixtes préparées par les moyens conventionnels exposés plus haut. On avait déjà proposé [W.L. Sung, Nucleic Acids Research, (1981), 9,6139] d'introduire un groupe méthyl-5 cytosine dans une séquence d'ADN en traitant par l'ammo- niaque une séquence d'ADN contenant le groupe triazolo-4 thymine, selon la réaction: -4- NH4OH 12 CH3 43 Groupe triazolo-4 thymine Groupe Mec Cette réaction fournit, de manière quasi-quantitative, une séquence contenant uniquement des groupes méthyl-5 cytosine à la place des groupes triazolo-4 thymine. On a maintenant établi que l'on pouvait, en tra- vaillant dans des conditions bien déterminées qui seront explicitées plus loin, dismuter, en quantités équimolécu- laires, dans une séquence d'oligonucléotide, un groupe triazolo-4 uracile en groupes uracile et cytosine, un groupe triazolo-4 thymine en groupes thymine et méthyl-5 cytosine et un groupe triazolo-4 guanine en groupes guanine et amino-2 adénine, selon les schémas respectifs 1 et 2 sui- vants: 1. R PR ) + I I I R= H U + C R- CU3 T + Mc 3 -MC -5- 2. N NH NHR' t[N "N.NNH 1G NH H2A R' étant un groupe protecteur du groupe amino. Selon un premier aspect, l'invention a pour objet un précurseur de sonde constitué d'un fragment d'oligo- nucléotide de structure prédéterminée par l'application envisagée, dont les fonctions réactives sont éventuelle- ment protégées et qui est éventuellement fixé à un support, caractérisé en ce qu'une partie au moins des bases pyrimidiques y est remplacée par des groupes X et/ou une partie au moins des bases puriques y est rem- placée par des groupes Y, les groupes X et Y répondant respectivement aux formules et R H2 X Y R représentant un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle. -6- Après dismutation selon l'invention, séparation éventuelle du support et élimination des groupes protec- teurs, ce précurseur conduit à une sondecomportant, à la place des groupes X, en parties égales, soit des groupes U et C (R=H), soit des groupes T et MeC (R=CH3) et à la place des groupes Y, en parties égales, des groupes G et NH2A. Il est particulièrement intéressant d'utiliser un précurseur de ce type pour préparer des sondes mixtes con- tenant des ambiguités au niveau d'une base pyrimidique et/ou au niveau d'une base purique, c'est-à-dire des son- des mixtes contenant les ambiguités U/C ou T/C et/ou G/A. Selon un mode préféré de réalisation, l'invention a pour objet un précurseur de sonde constitué d'un frag- ment d'oligonucléotide de structureprédéterminée par l'application envisagée, dont les fonctions réactives sont éventuellement protégées et qui est éventuellement fixé à un support, caractérisé en ce que chaque ambiguité au niveau d'une base pyrimidique y est remplacée par un grou- pe X et chaque ambiguité au niveau d'une base purique y est remplacée par un groupe Y, les groupes X et Y étant tels que définis plus haut. Le précurseur selon l'invention peut être préparé selon tout procédé classique de préparation de fragments d'oligonucléotides en remplaçant une partie au moins des bases pyrimidiques par des groupes X et/ou une partie au moins des bases puriques par des groupes Y. Avantageusement, la préparation est effectuée en phase solide, essentiellement par fixation. d'un monomère, dimère ou trimère par son extrémité 3' sur l'extrémité 5' du nucléotide terminal 3' de la séquence désirée, fixé sur un support solide, puis fixations successives de monomères, --7- dimères et/ou trimères, à chaque fois sur le nucléotide terminal 5'de la chaîne obtenue, jusqu'à obtention de la fraction d'oligonucléotide désirée. Une telle préparation peut être effectuée selon les indications données par B.L. Gaffney et coll. dans Nucleic Acids Research, (1982), 10, 435 et Tetrahedron, (1984),40, 3. On entend ici par "monomère", "dimère", ou "trimère" des groupes constitués respectivement de 1,2 ou 3 acides nucléiques, identiques ou différents, devant entrer dans la constitution de la sonde. Il va de soi qu'au moment de la synthèse, les fonc- tions réactives de ces groupes dont la participation à la réaction envisagée n'est pas souhaitée, doivent être proté- gées au moyen de groupes protecteurs pouvant être ensuite éliminés dans des conditions non dégradantes pour la sonde que l'on souhaite préparer. A titre d'exemples non limitatifs, la préparation de monomères, dimères et trimères portant des groupes protec- teurs de ce type peut être effectuée selon les indications de K. Itakura et coll. dans Nucleic Acids Research, (1980), 8, 5507. Les groupes acide nucléique modifié contenant, en tant que base, la base X ou la base Y, utilisables en tant que mo- nomères dans la synthèse du précurseur de sonde selon l'invention ou entrant dans la préparation des dimères ou trimères utilisables dans cette synthèse peuvent être pré- parés selon les méthodes connues de préparation de monomè- res habituellement utilisées dans de telles synthèses.en remplaçant les bases usuelles pour un groupe X ou Y selon le cas. A titre d'exemples non limitatifs, il est indiqué que pour la préparation d'un fragment d'ADN: -8- - le monomère contenant la base modifiée X (avec R = CH3) peut être la 0-diméthoxytrityl-5' 0-(chloro-2 phényl cyanoéthyl) phosphate-3' triazolo-4 thymidine, de formule CH3 DMT=diméthoxytrityle DMT-OQ O-OCe 6H4Cl OCH2CH2CN qui peut être préparée, comme décrit plus en détail dans l'exemple préliminaire 1 qui suit, par réaction de la diméthoxytrityl-5' thymidine (qui est un produit com- mercial) avec le triazole puis le 2-chlorophényl phospho- rodichloridate et enfin le cyanoéthanol et - le monomère contenant la base modifiée Y peut être la N-isobutyryl-2 0-diméthoxytrityl-5' 0-(chloro- 2 phényl cyanoéthyl) phosphate-3' triazolo-4 désoxy-2' guanosine, de formule - DM10ON HR;u R tyisobuyryle _ 6CH2fH4CN -9 - qui peut être préparée, comme décrit plus en détail dans les exemples préliminaires 2a et 2b qui suivent, par réaction de la N-isobutyryl-2 O-diméthoxy-trityl5' désoxy-2' guanosine ou du phosphate correspondant avec le triazole, puis le 2-chlorophényl phosphorodichlo- ridate et enfin le cyanoéthanol. Les monomères contenant la base X ou la base Y et destinés à la préparation de fragments d'ARN peuvent être préparés en analogie à ce qui est décrit ci-dessus. Selon un secohd aspect, l'invention vise les son- des mixtes telles qu'obtenues par déblocage des précur- seurs décrits ci-dessus, avec dismutation, de préférence en proportions égales, des nucléotides contenant des groupes X et/ou Y tels que définis plus haut qu'ils con- tiennent. Selon l'invention, on a entre autres établi, et cela est surprenant, qu'en débloquant les groupes pro- tecteurs dans des conditions bien déterminées, non seu- lement on pouvait obtenir, en proportions égales, d'une part les produits de dismutation du groupe X et d'autre part les produits de dismutation du groupe Y, mais encore que ces conditions étaient les mêmes dans les deux cas. Ces conditions consistent essentiellement à, successivement: a) traiter le précurseur selon l'invention par un mélange molaire de pyridine aldoxime (PAO) t dans la té- traméthyl guanidine (TMG), additionné d'ammoniaque concentrée (à % au moins) dans la proportion de 1 volume de mélange PAO-TMG pour volumes d'ammoniaque, à la température ambiante, pendant une nuit; b) traiter le mélange obtenu sous a),évaporé à sec>par l'ammoniaque concentrée, pendant environ 5 heu- res à environ 50 C; et -10- c) traiter le mélange obtenu sous b), évaporé à sec, par l'éthylène diamine, pendant environ 72 heures à la température ambiante. Il est intéressant de noter que ce traitement "débloque" également le groupe NH2 de l'adénine. Cela ne pouvait être déduit des essais de "débloca- ge" effectués d'une part avec 1 mg de nucléotide renfer- mant la base X et d'autre part avec 1 mg de nucléotide renfermant la base Y et qui sont résumés dans le tableau suivant dans lequel les abréviations sont les mêmes que précédemment, NH4OH représentant l'ammoniaque concentrée {c'est-à-dire à 20 % au moins)et t.a. la température ambiante. X -1. 100 P1 TMG-PAO 0,3 M, 15h, t.a.; 2. 500 1pl NH40H 5 h, 50oC - T(99 %). -1. 1 ml dioxanne-NH4OH (3-1),3h, t.a. 2. 500 p1 NH4OH h, 500C- Me C (99 %). -1. 300 pl TMG-PAO 0,3 M + 3 ml NH4OH, 24 h, 40 C--)35 % T + 65 % MeC -1. 300 p1 TMG-PAO 0,3 M, 4 h, t.a.3 2. 3 ml NH4OH 15 h, C - 93 % T + 6% MeC. Y y _1. 100 pi TMG-PAO 0,3 M, 15 h, t.a.; 2. 500 lu NH4OH h, 50 C-. 100 % G -1. 400 pl dioxanne-NH4OH(3-1) 3 h, t.a.' 2. 500 l NH40H 48 h, 50 C.-. 100 % A NHiBu -1. 400 pl dioxanne-NH4OH(3-1) 3 h, t.a.' 2. 500 1 NH4OH 48 h, 50 C; 3. 1 ml éthylène diamine, 72 h, t.a.- 100 % ANH2 -1. 100 pl TMGPAO 0,3 M + 1 ml NH OH 16 h, t.a -11- 2. 500 p1 NH4OH 98 h, 65 C --55 % G + 31 % ANHiBu + 13 % A NH2 Pour la plupart des applications, la sonde selon l'invention comporte moins de 20 nucléotides par frag- ment. Toutefois, pour certaines applications particuliè- res, il peut être souhaitable de disposer de fragments plus "longs" d'oligonucléotides. Compte tenu de l'absen- ce d'ambiguité. au moment de la préparation du précurseur, il n'exite en principe aucune limitation "technique" à la préparation de fragments plus longs. Ainsi, on a montré qu'il était possible d'obtenir des séquences comportant plus de 40 nucléotides,ce qui permet d'obtenir une meilleure sensibilité. Bien qu'il soit préférable, comme indiqué plus haut, que toutes les ambiguités sur des bases pyrimidi- ques soient remplacées par les produits de dismutation de nucléotides contenant la base X et que toutes les ambiguités sur des bases puriques soient remplacées par les produits de dismutation de nucléotides contenant la base Y, l'invention comprend également les sondes dans lesquelles unepartie des ambiguités ont été remplacées par l'un des nucléotides de 1'ambiguité, notamment par un nucléotide contenant G dans le cas d'une ambiguité G/A et par un nucléotide contenant T pour une ambiguité T/C. Il faut rappeler toutefois que ce choix est suscep- tible d'introduire des "mismatchs"- L'invention comprend également les précurseurs et les sondes mixtes comprenant, outre les groupes amino- 2 adénine éventuellement introduits par dismutation du groupe Y, des groupes adénine modifiés de telle sorte qu'ils soient capables de donner trois liaisons hydro- gène avec la thymine ou l'uracilenotamment des groupes amino-2 adé- nine remplaçant soit un groupe adénine sur lequel il n'y a pas d'ambiguité, soit une ambiguité G/A, comme cela est expliqué plus en détail dans la demande de brevet -12- français déposée le même jour, par les mêmes déposants, sous le titre "sondes comportant des groupements adénine modifiée, leur préparation et leurs utili- sations. Quel que soit leur mode d'introduction dans la fraction nucléotidique, les groupes adénine modifiée confèrent à l'hybride formé par la sonde ainsi obtenue une meilleure stabilité en raison de l'augmentation de son point de fusion. On sait en effet que lorsqu'on rem- place dans une séquence nucléotidique une désoxy-2' adénosine (A) par une amino-2 désoxy-2' adénosine (A*), cela conduit, dans l'hybride formé par cette séquence, à la transformation d'une paire AT présentant deux liai- sons hydrogène, en une paire A*T présentant trois liai- sons hydrogènes et qui a une stabilité équivalente à celle d'une paire CG [R.C. Comtor et P.R. Schimmel, Biophysical Chemistry, W.H. Freeman,. San Francisco, (1980)]. Par ailleurs, et c'est là un des avantages parti- culiers des sondes selon l'invention qui contiennent des groupes adênine modifiée, les demandeurs ont établi que la présence de tels groupes modifiés, notamment par des groupes -NH2 sur le sommet C-2 du cycle pyrimidine favo- rise la configuration gauche, appelée configuration Z, des hybrides formés à partir des séquences de ce type, par rapport à la configuration usuelle B et que dans la configuration Z, les groupes adénine modifiée sont plus accessibles à des réactifs extérieurs. -13- Ceci permet leur repérage, notamment par des anticorps spécifiques de ces bases, de préférence monoclonaux, alors que la configuration B ne permet que difficilement, voire même empêche, l'accession des réactifs aux bases. La sonde selon l'invention, lorsqu'elle comporte des groupes adénine modifiée, notamment amino-2 adénine, introduits par dismutaiton des groupes Y de son précur- seur et/ou en remplacement d'une partie au moins des groupes adénine peut donc êtreavantageusement utilisée dans des techniques d'analyse ou d'extraction, notamment d'ARN messagers ou d'ADN complémentaires, faisant appel à des mises en évidence comportant la formation de complexes immuns et mettant éventuellement en jeu des réactions immunoenzymatiques. Pour son utilisation, la sonde obtenue selon l'in- vention est avantageusement marquée, en vue de son repé- rage après hybridation, selon un technique usuelle dans le domaine des analyses biologiques. Ainsi, elle peut être marquée radioactivement notam- ment au 3 P au moyen de [ yr- 32P]ATP en présence de poly- nucléotide kinase, comme décrit dans les exemples qui suivent. L'invention vise également une sonde telle que définie plus haut, marquée radioactivement, notamment par 32p L'invention vise enfin l'utilisation de la sonde définie précédemment sous ses différents aspects dans le domaine des analyses et extractions biologiques,notamment de détection et d'extraction d'ARN messagers et d'ADN com- plémentaires, au moyen d'une hybridation. -14- I1 sera décrit ci-après, à titre d'exemple, l'appli- cation de l'invention à la résolution du problème posé par l'isolement de l'ADN complémentaire (cADN) de l'anti- thrombine III. La séquence d'aminoacides prise en considération est: 251 256 Met - Met - Tyr -Gln- Glu - Gly ce qui correspond à la séquence de mRNA: OH A ' AUG AUG UAU CAA GAG GG 3 OH C G G U La sonde mixte correspondante s'écrit: A T T O 3 OHTAC TAC ATG GTC CTC C 5 O La séquence de cADN de l'antithrombine III déterminée après séquençage s'est révélée être: ' OHATG ATG TAC CAG GAA G 3' OH On a préparé deux sondes destinées à s'hybrider avec le cADN de l'antithrombine III, à savoir: 1 la sonde mixte comportant les trois ambiguités 2O (mélange de 8 hexadécamères) a été construite à partir de triplets en phase solide, selon la technique de R.B. Wallace et coll. dans Nucleic Acids Research, (1981),9, 879, suivant le schéma. CTT CTT JGAT - g Support AC CTsolide CCT CCT GGT ACA TCA T solide ce qui a nécessité l'emploi de 8 trimères 2 la sonde modifiée selon l'invention qui a été obtenue à partir du précurseur selon l'invention, lui-même synthétisé, selon la méthode de H. Ito et coll., Nucleic Acids Research (1982), 10, 1755. à l'aide de monomères et de dimères suivant le. schéma: CI XITCIXITG|YITAICA TCIAIT,_.__ Au déblocage, dans des conditions bien définies, ce pré- -15- curseur a donné une sonde composée des huit séquences: T T G C TC TG TACATCAT MeC MeC NH2A Ces deux sondes on été marquées au P et ont servi à analyser une "banque" contenant du cADN de l'antithrom- bine III. L'une et l'autre ont permis d'isoler le çADN dont la structure a été prouvée par séquençage. PARTIE EXPERIMENTALE Exemples préliminaires: préparation des nucléotides contenant les bases X et Y 1. Synthèse de la O-diméthoxyltrityl-5' O-(chloro-2 phénylcyanoéthyl) phosphate-3' triazolo-4 thymidine DMT tT (nucléotide contenant la base X) -p 5 g, (9,2 mmoles) de diméthoxytrityl-5' thymidine sont coévaporés 2 fois avec de la pyridine. On ajoute 43 ml de pyridine puis 3,872 g (56 mmoles) de triazole. Le mé- * lange est refroidi à 0 C et on ajoute 6,72 g (27,4 mmoles) de 2-chlorophényl phosphorodichloridate. Un léger préci- pité se forme. On laisse sous agitation à température ambiante pendant 40 heures. Ensuite 15,08 g (212,4 mmoles) de cyanoéthanol sont ajoutés. Après une heure trente, on ajoute 150 ml d'eau distillée et on extrait deux fois avec du dichlorométhane. La phase organique est lavée une fois au bicarbonate de sodium à 0,2 % puis à l'eau jus- qu'à ce que le pH de la phase aqueuse soit neutre. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium, évapo- rée à sec puis précipitée à l'éther de pétrole. Le produit obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de si- lice éluée au dichlorométhane enrichi progressivement en méthanol. On obtient 1,54 g de DMT tTp (rendement 20 %). CCM: Système (dichlorométhane/méthanol: 90/10) Rf: 0,54. Le produit est fluorescent à 310 nm 2569406 - -16- Spectre UV: (ETOH 96 ) max 328 nm ( = 6 600) Xmin 292 nm (e = 2 800) A 234 nm (e = 26 400) Spectre de masse: (spectre réalisé avec un appareil commercialisé sous la dénomination VG Micromass 305, en DCI NH à 200 C) - 3 303 (72,0) DMT; 245 (1,O) phosphate protégé; 178 (2,5) thymine triazolée. 2. Synthèse de la N-isobutyryl-2 0-diméthoxytrityl-5' 0-(chloro-2 phényl cyanoéthyl)phosphate-3' triazolo-4 t lb désoxy-2' guanosine ou DMT G.p (nucléotide contenant la base Y) a) A partir de N-isobutyryl-2 0-diméthoxytrityl-5' désoxy- 2' guanosine (DMT GIb). 2 g (3,13 mmoles) de N-isobutyryl-2 0-diméthoxytrityl-5' désoxy2'guanosine sont traités de la même façon que la diméthoxytrityl5tthymidine,.avec 1,386 g (20 mmoles) de triazole, 2,464 g (10 mmoles) de 2-chlorophényl phospho- rodichloridate dans 16 ml de pyridine. La réaction est totale au bout de 17 heures. On ajoute 5,4 g (76 mmoles) de cyanoéthanol. Deux heures après, le mélange réactionnel est dilué dans du dichlorométhane, lavé deux foix au bi- carbonate-de sodium à 5 % et une fois à l'eau distillée. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium et évaporée à sec. Le produit obtenu est purifié par chroma- tographie sur colonne de silice. On obtient 1,11 g de DMTtGpIb (rendement 38 %). p b) A partir de N-isobutyryl-2 0-diméthoxytrityl-5' phos- phate-3' -désoxy-2' guanosine (DMT Gb) -- - - - _-_ _ __--- - p À 0,5 g (0,566 mmole) de DMT GIb est traité par 251 mg p (3,635 mmoles) de triazole et 0,44 g (1,79 mmoles) de 2- chlorophényl phosphorodichloridate dans 5 ml de pyridine. -17- Au bout de 5 heures, on traite de la même façon que pré- cédemment et on obtient 360 mg de DMT- tG Ib (rendement p 68,2 %). CCM:(système dichlorométhane/méthanol: 80/20) Rf: 0,575. Le produit est fluorescent à 31Onm. Spectre UV: (EtOH 96 %) Xmax 338 nm (E = 4 200) min 300 nm (E = 3 100) 252 nm (t = 16 800) 231 nm (E = 32 000) Spectre de masse: spectromètre de type VG Micro- mass 305, EI 70 eV 303 (100) DMT; 273 (32,5) gua- nine triazolée et isobutyrylée; 200 (1,6) guanine triazolée; 132 (1,4) guanine; Exemple 1: Synthèse de la sonde mixte n 1: La sonde mixte a été "montée" à partir de 19 mg de résine T [résine portant le nucléotide T et préparée selon la technique de K. Itakura et coll. décrite dans Nucleic Acids Research (1980),8, 5473] avec les trimères suivants: CTT CCT GAT + + + ACA TCA T CCT CCT GGT Rendements: 86% 83% 79% 50% Après le dernier couplage, la résine est traitée par 500 p1 d'un mélange molaire de pyridine aldoxime(PAO) dans la tétraméthyl guanidine (TMG) additionné, de 500 pl de TMG pendant une nuit. Après évaporation à sec et chauffage avec de l'ammoniaque concentrée à 50 C pendant 3 heures, le milieu réactionnel est purifié par chromatographie sur une colonne de Sephadex G-10 (dénomination commerciale de la société Pharmacia pour une colonne de polysaccha- -18- ride réticulé),suivie d'une chromatographie liquide haute performance (HPLC) sur colonne en phase inverse. Le mélan- ge d'oligonucléotides est ensuite détritylé avec l'acide acétique à 80 % pendant 5 mn, évaporé à sec (9D.O.; 1 D.O. = une unité de densité optique, correspondant à -40 pg de séquence) et purifié par électrophorèse préparative sur gel d'acryl- amide. Exemple 2: Synthèse de la sonde modifiée n 2: Le précurseur de la séquence n 2 est synthétisé à partir de 40 mg de résine T/selon le schéma suivant: C X TC X TG Y TAC AT CA T,,__ Rende- t ments: 86% 499% 92% 64%699% 56% 95% 83% Après couplage du dernier monomère, 20 mg de résine sont traités par 375 p1 de mélange molaire de pyridine aldoximeMPAO) dans la tétraméthyl guanidine (TMG), additionné de 3,75 ml d'ammoniaque concentrée à la température ambiante pendant une nuit. On évapore à sec, ajoute 5 ml d'ammoniaque con- centrée et chauffe 5 heures à 50 C. Après évaporation à sec, on laisse 72 heures à la température ambiante dans 2,5 ml d'éthylène diamine. Le filtrat est chromatographié sur une colonne de Sephadex G-10, purifié par HPLC sur colonne de phase inverse, et détritylé avec l'acide acéti- que à 80% pendant 20 mn. Le mélange brut est purifié parélectrophorèse préparative. Exemple 3: Marquage des sondes au 32p On ajoute 50 pCi de [-32 P]ATP sur 100 pmolesde la sonde dans un volume de 4 1 + 0,5 1l de mix et 0,5 p1 de poly- nucléotide kinase [activité 5-20 10 unités/ml Boehringer Mannheim]. On laisse une demi-heure à 37 C [T.Maniatis et coll. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1982)]. -19- La réaction est stoppée par addition de 1,3 p1 de tampon au bleu de bromophénol 100 mM EDTA, 50% glycérol. Le pro- duit marqué est purifié sur gel (0,4 x 30 X 40 cm) conte- nant 19 g de bisacrylamide, 19 g d'acrylamide et 10 ml de tris borate 1 M pour un volume total de 100 ml. L'électrophorèse sous programmation: 2 000 V, 43 W, 40 mA, est arrêtée quand le bleu de bromophénol atteint le tiers de la longueur de la plaque. La bande radioactive est dé- coupée et extraite pendant une nuit dans 2 ml d'eau. Exemple 4: Hybridation 3 colonies contenant un cADN de l'ATIII et 3 colonies con- tenant un cADN non relaté à i'ATIII ont été repiquées en 2 exemplaires sur boîtes de milieu complet avec 50,ug/ml d'ampicilline. Les colonies ont été transférées sur 2 fil- tres de type Whatman 541, amplifiées 20 heures sur boîtes contenant 250 pg/ml de chloramphénicol et préparées pour l'hybridation, selon la technique décrite par J.0. Gergen et coll. dans Nucleic Acids Research, (1979),7,2115. Les filtres ont été préhybridés 2 heures à 42 C en 6 NET (1 NET = 0,15 M NaCl, 0,015 M tris HCJ, pH = 7,5, 0,001 M EDTA), 0,5 % Monidet P40 (dénomination commerciale pour un détergent), 100 pg/ml de tRNA de levure et 100 pg/ml d'ADN soniqué de sperme de saumon [technique de T. Maniatris et coll. dans l'article cité plus haut]. L'hybridation a été effectuée à 42 C pendant 20 heures dans la même solution 1 6 1 en présence de 106 cpm d'oligonucléotide marqué en 5' au [e-32P]ATP, chaque filtre ayant été hybridé avec une des deux sondes. Les filtres ont été lavés 4 fois 15 minutes à C en 6 SSC (1 SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M citrate de so- dium, pH - 7,2), 0,1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS). Les filtres ont été soumis à une autoradiographie. L'hybridation est visible sur la sonde mixte 1 (1 séquence sur 8 est complémentaire du cADN) et sur la sonde modifiée 2. 256940O -20- I1 est rappelé que le "mix" est un mélange de: - tris(hydroxyméthyl) aminométhane (500 mM, pH 8); - MgCl2 (100 mM); et - dithiotréitol (50 mM). o o o Les nucléosides et nucléotides comportant la base Y, utilisables dans la synthèse des précurseurs selon l'invention, sont nouveaux. Ces composés répondent à la formule générale: R1 HR' R20 R3 dans laquelle: R' représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur du groupe amino, notamment le groupe isobuty- ryle, R1 représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur du groupe hydroxyle, notamment le groupe dimé- thoxytrityle, -21- R2 représente un atome d'hydrogène, un groupe pro- tecteur du groupe hydroxyle ou un groupe phosphoryle éven- tuellement modifié, notamment le groupe O-(chloro-2 phényl cyanoéthyl) phosphate; et R3 représente un atome d'hydrogène, un groupe OH ou un groupe OH protégé, notamment le groupe benzoyloxy. La préparation de ces composés peut être effectuée comme indiqué plus haut, ou par analogie avec des procédés connus de préparation de composés de structure analogue. --22- REVENDICATIONS 1. Précurseur de sonde constitué d'un fragment d'oligonucléotide de structure prédéterminée par l'appli- cation envisagée, dont les fonctions réactives sont éven- tuellement protégées et qui est éventuellement fixé à un support, caractérisé en ce qu'une partie au moins des bases pyrimidiques y est remplacée par des groupes X et/ou une partie au moins des bases puriques y est remplacée par des groupes Y, les groupes X et Y répondant respec- tivement aux formules: et X Y R-représentant un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle. 2. Précurseur de sonde constitué d'un fragment d'oligonucléotide de structure prédéterminée par l'appli- cation envisagée, dont les fonctions réactives sont éven- tuellement protégées et qui est éventuellement fixé à un support, caractérisé en ce que chaque ambiguité au niveau d'une base pyrimidique y est remplacée par un groupe X et chaque ambiguité au niveau d'une base purique y est remplacée par un groupe Y, les groupes X et Y étant tels que définis à la revendication 1. 3. Précurseur de sonde selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un fragment de désoxyoligonucléotide et en ce que, dans le groupe X, R représente le groupe méthyle. 4. Sonde mixte telle qu'obtenue par déblocage du précurseur selon l'une des revendications 1 à 3 avec dis- mutation, de préférence en proportions égales, des nuclé- -23- otides contenant des groupes X et/ou Y tels que définis à la revendication 1. 5. Sonde mixte selon la revendication 4, carac- térisée en ce qu'elle est en outre marquée radioactive- ment, notamment par 32p 6. Procédé pour la préparation du précurseur selon l'une des revendicationsl à 3, caractérisé en ce qu'il est effectué en phase solide et consiste essentiellement à fixer un monomère, dimère ou trimère par son extrémité 3' sur l'extrémité 5' du nucléotide terminal 3' de la séquence désirée, fixé sur un support solide, puis à fixer successivement les monomères, dimères et/ou trimè- res suivants, à chaque fois sur le nucléotide terminal 5' de la chaîne obtenue, jusqu'à obtention de la fraction d'oligonucléotide désirée. 7. Procédé d'obtention de la sonde mixte selon la reven- dication 4, à partir du précurseur selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en cequ'il consiste essentiellementà successivement: a) traiter le précurseur par un mélange molaire de pyri- dine aldoxime(PAO) dans la tétraméthyl guanidine (TMG),additionné d'ammoniaque concentrée (à 20% au moins) dans la proportion de 1 vo- lume de mélange PAO-TMG pour 10 volumes d'ammoniaque, à la tempé- rature ambiante, pendant une nuit; b) traiter le mélange obtenu sous a), évaporé à sec, par l'ammoniaque concentrée, pendant environ 5 heures à environ 50 C; et c) traiter le mélange obtenu sous b),évaporé à sec, par l'éthylène diamine, pendant environ 72 heures à la température ambiante. 8. Utilisation de la sonde mixte selon la revendi- cation 4 ou 5 dans le domaine des analyses et extractions biologiquesnotamment de détection et d'extraction d'ARN messagers et d'ADN complémentaires, au moyen d'!une hybri- dation. -24- 9. Composés répondant à la formule générale R HR' R20 R3 dans laquelle: R' représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur du groupe amino, notamment le groupe isobu- tyryle, R1 représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur du groupe hydroxyle, notamment le groupe di- méthoxytrityle; R2 représente un atome d'hydrogène, un groupe protecteur du groupe hydroxyle ou un groupe phosphoryle éventuellement modifié, notamment le groupe O-(chloro- 2 phényl/cyanoéthyl) phosphate; et R3 représente un atome d'hydrogène, un groupe OH ou un groupe OH protégé, notamment le groupe benzoyl- oxy. 10. La N-isobutyryl-2 O-diméthoxytrityl-5' O-(chloro-2 phényl cyanoéthyl)-phosphate-3' triazolo-4 désoxy-2' guanosine.