FR 2555588 A1 19850531 FR 8319058 A 19831129 Nouvelle synthèse de hpGRF en phase liquide et peptides intenné- diaires. Le hpCRF (human Pancreatic Growth Hormone releasing factor) ou Somatocrinine est un peptide constitué par l'enchainement de 44 amino acides. Sa séquence est la suivante 1 5 10 H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg 15 20 Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu 25 30 35 Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn 40 44 Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 Il a été récemment découvert par A. GUILLEMIN et COLT. (Science, 218, 585-587 (1982) à partir d'extraits d'une tumeur pancréatique humaine. Ce peptide est particulièrement actif sur la stimulation de la libération de l'hormone de croissance (H) aussi bien in vitro qu'in vivo. In vitro, en particulier son efficacité se manifeste à des doses de quelques fento moles/ml (ErSO 15 fento moles/ml). L'intérêt thérapeutique en médecine humaine de cette substance va donc se situer au niveau du traitement du nanisme et des retards à la croissance en pédiatrie. D'autres applications sont possibles dans les cas de déficience anabolique pro téique (ulcères de stress, réparation de fractures ou d'atteintes du cartilage, brtlures étendues (pendant la phase anabolique), réparations cutanées, ostéoporoses. Dans le domaine vétérinaire, ce composé présente un intérêt évident au niveau de la croissance pondérale des animaux d'élevage (bovins, ovins, etc). Le développement industriel de ce composé polypeptidique nécessite la synthèse de quantités importantes de cette substance. Les procédés classiques de la synthèse en phase solide permettent la préparation en des temps courts de faibles quantités de ce principe actif (Science, 218, 585-587 (1982)) à des colts très élevés et incompatibles avec un développement pharmaceutique à grande échelle. Nous décrivons un procédé de synthèse en phase liquide pouvant etre transposé à l'échelle industrielle permettant un accès au principe actif avec un rendement et un taux de pureté excellents. Ce procédé est basé sur le principe d'une synthèse faisant intervenir les fragments - 20-44 (25 acides alpha aminés) peptide K - 5-19 (15 acides alpha aminés) peptide J - 1-4 (4 acides alpha aminés) peptide I que l'on couple selon l'ordre 5-19 + 20-44 5-44 (40 acides alpha aminés) puis : 1-4 + 5-44 1-44 (séquence complète) Le procédé de la présente invention est caractérise, en outre, en. ce que les peptides 20-44 et 5-9 sont synthétisés à leur tour par un procédé par fragments. Le peptide, couvrant la synthèse 5-19 du GRF, est synthétisé d partir de 3 fragments et le peptide 20-44 à partir de 7 fragments. Les points de coupure ont été déterminés sur la base de considérations chimiques (risques minimtsrn deracémisation pendant les phases de couplage des fragments). Un avantage évident d'un procédé par fragments par rapport à une stratégie pas à pas ("Step Wise") est qu'il est possible de synthétiser ces fragments en parallèle, ce qui se traduit par un gain de temps notable. Le procédé de la présente invention est caractérisé,en outre, en ce que - au niveau du couplage des fragments a) les fonctions acides latérales des acides aspartique et glutamique et la fonction amine latérale de la lysine sont pro tétées par des groupes protecteurs stables dans les conditions de déprotection du groupement Boc, (tertiobutyloxycarbonyl) b) la fonction guanidine de l'arginine est protégée par protonation et c) on élimine sélectivement le groupement Boc de l'amine N-terminale du peptide en phase d'élongation par hydrolyse à l'acide trifluoroacétique, ledit couplage étant effectué dans un solvant polaire aprotique. - au niveau de la dé protection terminale en fin de séquence tous les groupes protecteurs sont éliminés- par hydrolyse à l'aide d'une solution 0,1 à 1M d'acide methane sulfonique ou trifluoro méthane sulfonique dans l'acide trifluoroacétique. Le procédé de la présente invention peut aussi s'appl@- quer à la synthèse du hpGRF-1-40, produit naturel isolé également par R. GUILLEMIN, presque aussi actif que le hpGRF 1-44 et utilisable dans les mêmes indications thérapeutiques. Le procédé selon l'invention a pour objet la préparation du hpGRF selon un procédé de synthèse par fragments an phase liquide selon une stratégie résumée dans les schemes suivants ( Sch. I à III) a propos du hpGRF 1-44. Le procédé de synthèse du GRF se caractérise en outre par les aspects suivants Application du principe de la protection minimale au niveau des chaînes latérales fonctionnalisées. - Protection temporaire de la fonction guanidine latérale de l'arginine par le groupement nitro. L'arginine est introduite en séquence sous forme nitro guanidine. La fonction nitro est ensuite éliminée le plus tôt possible (voir synthèse des fragments) par hydrogénation catalytique à l'aide de Pd/charbon, ou bien en utili- sant à la place de l'hydrogène gaz un générateur d'hydrogène comme l'acide formique ou le formiate d'ammonium. Ainsi, tous les fragments synthétisés possédant de l'arginine dans leur séquence ont en fin de synthèse les fonctions guanidine, simplement protégées par protonation à l'aide d'un acide fort (acide chlorhydrique par exemple). -. Les fonctions acide carboxyliques des chaînes latérales de l'acide glutamique et aspartique sont protégées par des groupements clivables par hydrogénation catalytique (H2/Pd/charbon) ou bien en milieu acide fort comme les mélanges acide méthane sulfonique (Q,5 M) - acide trifluoroacétique; ou acide trifluorométhane sulfonique (0,5 M) - acide trifluoroacétique Nous préconisons comme protecteurs l'ester benzylique (0 Bzl) ou 2,6-dichlorobenzylique. Ces groupements protecteurs sont stables dans les conditions des déprotections intermittences des amines en alpha (élimination des groupements t.butyloxycarbonyl : Boc par l'acide trifluoroacétique). - Les fonctions amine des chaînes latérales des lysines sont protégées par des groupements clivables dans les memes conditions que précédemment. Nous préconisons les groupements benzyloxycarbonyl (Z), 2-chloro ou 2-bromo benzyloxycarbonyl (2 - C1 ou 2 - Br Z) stables dans les conditions de déprotection intermittente par l'acide trifluoroacétique. Les fonctions hydroxyl présentes dans la thréonine, la sérine et la tyrosine, ne sont pas protégées. L'élongation du peptide d partir des fragments synthétisés est réalisée en utilisant comme agent de couplage l'hexafluorophosphate de benzotriazolyloxyphosphonium (BOP), ou la dicyclohexylcarbodiimide en présence dlhydroxy-l benzotrazole, ou selon la méthode aux carboxyazides (Curtius), dans un solvant approprié comme le diméthylformamide ou le diméthylsulfoxyde. L'isolement du produit du milieu réactionnel est effectué par introduction d'un tiers solvant apolaire insolubilisant (éther acétate d'éthyle, etc.) qui précipite le peptide. On se limite pendant les tapes de couplage à des purifications sommaires du type lavagesen phase solide a l'aide de solvants appropriés afin d'éliminer le léger excès du dernier fragment couplé, ainsi que les impuretés apportées par les agents de couplage. Chaque opération de couplage d'un fragment est suivie d'une phase de déprotection intermittente du groupement protecteur Boc (tertiobutyloxycarbonyl), au niveau de l'amine sur laquelle va etre effectué le couplage suivant. Cette déprotection est assurée par l'acide trifluoroacétique dans le chlorure de méthylène (50/50 en volume). Les déprotections des chaînes latérales en fin d'élongation du peptide peuvent être effectuées par hydrogénation en présence d'un catalyseur (comme le Pd/C) a l'aide d'hydrogène gazeux sous légère pression (1 a 5 kg) ou bien avec un générateur d'hydrogène comme l'acide formique ou le formiate d'ammonium. Il est également possible d'éliminer ce type de groupements protecteurs par un acide fort comme les mélanges d'acide méthane sulfonique dans l'acide trifluoroacétique (0,5 M) ou bien d'acide trifluorométhanesulfonique dans l'acide trifluoroacétique (0,5 M). Le produit, après les déprotections terminales, est purifié par filtration sur gel de Séphadex G 50 à l'aide de l'acide acétique à 30 %. Les fractions enrichies en CRF 1-44 sont réunies et soumises à une chromatographie sur échangeurs d'ions (cations) du type carboxy et à l'aide d'un gradient à force ionique croissante adapté au type de résine echangeurs d'ions utilisée. Les fractions de plus haute pureté sont réunies et purifiées, soit par chromatographie de partition sur un support approprié du type Séphadex G 50 ou Biogel P 10, soit par la distribution d contre-couran Les fractions dont le titre de pureté est jugé satisfaisant par HPLC analytique sont réunies. Les autres sont recyclées. Une variante du procédé consiste à remplacer la chromatographie de partition ou la distribution a contre-courant par la HPLC préparative. Les différents fragments (I, J, K) et sous-fragments (A à H) intervenant dans la presente synthèse du GRF ont été synthétisés selon une stratégie adaptée a chaque cas. Les différentes stratégies utilises pour la synthèse de ces fragments et sous-fragments sont reportées sur les tableaux uivants (I a IX)- Elles relevent toutes du procédé "Step Wise" en phase liquide. Dans le cas où l'on souhaite synthétiser le hpGRF 1-40, le fragment A est réduit à l'analine amide (H-Ala-NH2). Les exemples suivants permettront de mieux comprendre la portée de l'invention. Les abréviations suivantes seront utilisées. Les acides aminés sont représentés par les symboles recommandés par la commission de nomenclature de 1'IUPAC-IUB section biochimie. Ala : Alanine Arg : Arginine Asn : Asparagine Asp : Acide aspartique Gln : Glutamine Glu : Acide glutamique Gly : Glycine Ile : Isoleucine Leu : Leucine Lys : Lysine Met : Méthionine Phe : Phénylalanine Ser : Sérine Thr : Thréonine Tyr : Tyrosine Val : Valine Ils ont tous la configuration Lj HPLC : chromatographie liquide haute performance CCM : chromatographie sur couches minces OBzl : ester benzylique Z : benzyloxycarbonyl (carbamate) Boc : tertiobutyloxycarbonyl (carbamate) DMF : diméthylformamide NEM :N-éthylmorpholine TFA- : acide trifluoroacétique MA : méthode de couplage aux anhydrides mixtes ONSU : ester activé avec la N-hydroxy succinimide ONp : ester activé avec l'ortho nitrophénol Troc : trichloroéthoxycarbonyl (carbamate) OBut : ester avec le tertiobutanol OTcp : ester activé avec le 2,3,5 trichloropkènoî OHBT :N-hydroxybenzorriazole ONb : ester active avec le N-hydroxy norbornène-5 dicarboximide-2,3 BOP : hexafluorophosphate de benzo triazolyloxyphosphonium DCU : dicyclohexylurée DCC ou : dicyclohexylcarbodiimide DCCi TA : température ambiante DIPEA : diisopropyléthylamine EPP : pureté polypeptidique TFMSA : acide trifluorométhane sulfonique analyse d'amino acides Milieu de chrcmatographie exprimés en volumes BEW1 : butanol, AcOH, H2O 72/7/21 BEW2 : butanol, AcOH, H2O 67/10/23 BPEW1 : butanol, pyridine, AcOH, H2O 50/12/12/25 EPAW : AcOEt, pyridine, HCO2H, H2O 63/21/10/6 BPEW2 : butanol, pyridine, AcOH, H20 42/24/4/30 Exemple I Synthèse de H - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2 (fragment A) NO 1.H-Arg-Leu-NH2 Dissoudre à la température ambiance 130 g de leucine amide (H-Leu-NH2) dans 1,5 1 de DWMF. Ajouter 333 g de Boc-Arg (N02)-OH puis 500 g de BQP. Ajuster le pH à 7 au papier pH (sur de petits prélèvements dilués a l'eau) et a l'aide de N-éthylmorpholine (NEM). Le milieu est agité et on suit l'évolution de la réaction par CCM. La réaction est terminée au bout de 4 h. Le milieu est évaporé a sec sous vide à 25 . Le résidu est repris par l litre d'eau et on obtient un solide qui est lavé a l'eau, puis avec une solution aqueuse de NaHC03 å 5 7. a l'eau, à l'acétate d'éthyle et, finalement on sèche le solide à l'air. On contrôle par CCM. Le solide précédent est introduit dans 2 1 d'un mélange 50-50 en volume d'acide trifluoroacétique-chlorure de méthylène. le milieu est agité lOrin à la température ambiante et évaporé à sec sous vide a la température ambiante. Le résidu d'évaporation est repris dans l'éther, essoré, séché et contrôlé par CCM et RMN. Rendement : 339 g (90 %) en trifluoroacétate d'un solide blanc 2. H-Ala-Arg (NO2)Leu-NH 443 g de trifluoroacétate de H-Arg(NO2)Leu-NH2 sont dissous dans 2 1 de DMF. On ajoute 200 g de Boc-Ala-OH et ensuite 500 g de BOP. On ajuste le pH à 7 au papier pH (sur de petits prélèvements du milieu réactionnel) a l'aide de NEM. Le milieu est agité et l'évolution de la réaction est suivie par CCM. La réaction est terminée au bout de 4 h. Le milieu est évaporé à sec sous vide à 250 . Le résidu est repris par 2 1 d'eau et 2 1 d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par une solution aqueuse de NaHC03 à 5 %, à l'eua, séchée et évaporée. Le tripeptide est recristallisé dans l'acétate d'éthyléther, et finalement séché sous vide. Il est contrôlé par CCM et RMN. Le précédent produit séché est traité par un mélange 50-50 (volume) de TFA-CH2C12 dans les conditions de l'exemple précédent (I-1). L'isolement est effectué également dans les mêmes conditions. Rendement : 412 g (80 %) exprimé en trifluoroacétate d'un produit pulvérulent blanc (contrôlé en CC et RMN). 3. Arg(No2)-Ala-Arg(NO2)-Leu-NH2 A partir de 515 g de H-Ala-Arg (NO2)Leu-NH2 dans 2,5 1 de DMF et 333 g de Boc-Arg(N02)-0E et 500 g de BOP, on obtient en utilisant les conditions opératoires décrites dans l'exemple I,1, après traitement au mélange TFA-CH2C12, 607 g (85 %) d'un solide blanc contré par CCM et RMN. 4. Z-Ala-Arg(NO2)-Ala-Arg-Leu-NH2 A partir de 715 g de trifluoroacétate de H-Arg(N02)Ala Arg(N02)-Leu-NH2 en solution dans 4 1 de DMF et 233 g de Z-Ala-OH et 500 g de BOP en utilisant la même technique que celle décrite en I-2 (et sans traitement dans ce cas par TFA-CH2Cl2), on obtient après recristallisation dans le mélange DMF-éther, 612 g de Z-Ala Arg(NO2)-Ala-Arg(NO2)Leu-NH2 (76 %) sous forme d'un solide pulvdru- lent blanc, contrôlé par CCM et RMN. 5. Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, 3HCl 200 g de Z-Ala-Arg(NO2)Ala-Arg(NO2)-Leu-NH2 (0,25 mole) sont mis en suspension dans 2 l de méthanol contenant 0,8 mole de HC1. On ajoute 40 g de Pd/C à 10 % de Pd, et le milieu est agité sous atmosphère d'hydrogène sous 1,2 bar de pression, pendant 24 h. Après cet intervalle de temps, on contrôle la fin de la réaction par CCM. Le catalyseur est éliminé par filtration et le solvant évaporé sous vide à la température ambiante. Le résidu solide est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme milieu d'solution le mélange butanol, pyridine, HO2CCH3,OH2 (50-12-12-25 en olume). Les fractions contenant-le produit pur sont réunies, évaporées et lyophilisées. Rendement : 119 g (69 %) d'un solide pulvérulent blanc) Contrôles : RMN, CCM. Analyse d'aminoacides : Leu 1,03 (1) Arg 1,92 (2) Ala 1,95 (2) Exemple II : synthèse de Boc-Clu(OBzl)-Arg-Gly-OH, NCl (B 1) 1 ) Z-Arg(NO2)-Gly-OBzl On dissout 3,37 g (0,01 mole) de tosylate de H-Gly-OBzl dans 15 ml de DMF, puis on ajoute 1 équivalent de NEM (1,3 ml). Cette solution est ajoutée a une solution de 3,53 g (0,01 mole) de Z-Arg(N02)-OH dans 15 ml de DMF contenant un équivalent de NEM (1,3 ml).On ajoute alors 4,5 g (0,01 mole) de BOP au mélange réactionnel dont le pH est ensuite amené a 7 par addition de NEM et qui est agité à TA pendant 2 h 30 (la fin de la réaction est déterminée par CCM : chloroforme-methanol C3/1)). Le mélange réactionnel est évaporé A sec sous pression réduite (O,l mm de mercure) à température inférieure a 30 C. Le résidu est repris dans 100 ml d'acétate d'éthyle. Cette solution est versée dans 120 ml d'eau glacée vigoureusement agitée. Après quelques instants d'agitation, un précipité se forme qui est abandonné une nuit au réfrigérateur. Le solide est essoré et lavé successivement a l'état solide avec - 2 x 100 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de soude - 2 x 100 ml d'une solution aqueuse de SO4HK-SO4K2 a 5 % - 2 x 100 ml d'eau - 2 x 100 ml d'éther puis séché sous vide (0,1 mm de mercure) jusqu'à poids constant. Rendement : 4 g (80 %). Point de fusion Koffler : 1490C CCM : chloroforme-méthanol (3/1) Rf : 0,73 Contrôle : RMN 2 ) HCl-H-Arg-Gly-OH On met en suspension 100 g (0,2 mole) de Z-Arg(N02)-Gly OBzl dans un mélange de 600 ml d'eau, 600 ml d'acide chlorhydrique N et 100 ml de tétrahydrofuranne. On ajoute 60 g de Pd/C à 10 X contenant 50 % d'humidité. Ce mélange est hydrogéné pendant 48 h à température ambiante et sous une pression de 15 mm de mercure. Le catalyseur est ensuite filtré et la solution aqueuse est amenée à pH 6,5 par addition de résine Amberlite IR 45 (forme OH). La résine est essorée. La solution est ensuite amenée à pH 8,5 par addition d'une nouvelle quantité de résine et l'ensemble est agité pendant 20 min au rotavapor sous vide (25 mm de mercure). On essore la résine et on vérifie l'absence de chlorure d'ammonium dans la solution aqueuse par le test de Nesler, puis on évapore à sec cette solution sous pression réduite (0,1 mm de mercure) à température inférieure à 300 C. On obtient un résidu gommeux qui est séché une nuit dans un dessicateur avec de l'anhydride phosphorique. Rendement : 43,19 g (80,6 %). CCM : acétate d'éthyle-pyridine-acide formique-eau 40-21-10-6 Rf : 0,1 test de Salaguchi positif (spot rouge) Contrôle RMN 3 ) Boc-Glu(OBzl)-Arg(HCl)-Gly-OH On dissout 41,5 g de HCl-H-Arg-Gly-OH (0,155 mole) dans un mélange de 400 ml de DMF et de 130 ml d'eau. Le pH est ajusté à 7 par addition d'acide chlohydrique N.A cette solution, on ajoute simultanément - une solution de 68,8 g de Boc-Glu(OBzl)-ONP (0,150 ml) dans un mélange de 100 ml de DMF et de 40 nil d'eau - une solution de 22,7 g d'hydroxybenzothiazole (0,150mole) dans un mélange de 100 ml de DES et de 40 ml d'eau une solution de 37,8 ml de NEM (2 x 0,150 mole) dans 100 ml de DMF. Le mélange réactionnel est agité à TA et la réaction est suivie en CCM (chloroforme-méthanol-acide acétique 95-5-9 et pyridine acétate d'éthyle-acide formique-eau 21-40-10-6). Au bout de 1 h de réaction, on rajoute 13,76 g de Boc-Glu(OBzl)-ONP. Au bout de 2 h de réaction, on rajoute 13,76 g de Boc-Glu(OBzl)-ONP. Au bout de 3 h de réaction, on rajoute 7 g de Boc-Glu(OBzl)-ONP et on poursuit la réaction pendant 1 h Le mélange réactionnel est alors évaporé à sec sous pression réduite (0,1 m de mercure) et à température inférieure à 30 C. On obtient une huile épaisse qui est dissoute dans 50O ml d'acétate d'éthyle. Par addition de 1 litre d'éther, une huile épaisse se forme. On abandonne au repos 24 h an réfrigérateur, puis on décante la phase liquide. L'huile résiduelle est reprise dans 500 ml de méthanol. A cette solution on ajoute 500 g de silice (70-230 mesh) et on évapore le solvant au rotavapor.La poudre obtenue est mélangée avec un mélange chloroforme-méthanol 80-20 et le gel formé est introduit au sommet d'une colonne de gel de silice (hauteur 200 cm, diamètre 85 mm) montée dans le mélange chloroforme-méthanol 80-20. Le produit est élué avec - mélange de chloroforme-méthanol 80-20 : 25 litres - mélange de chloroforme-methanol (50-50) : 10 litres - méthanol : 30 litres. La purification est suivie par CCM (pyridine-acetate d'éthyle-acide formique-eau 21-40-10-6). On recueille 2 fractions - fraction A 29,80 g CCM : pyridine-acétate d'éthyle-acide formique-eau 21-40-10-6 Rf : 0,75 Contrôle ; RMN HPLC - EPP : 96,98 % Glu 1,01-Gly 1,01-Arg 0,98 - fraction B 36,82 g CCM : pyridine-acétate d'éthyle-acide formique-eau 21-40-10-6 Rf : 0,75 1H RMN spectre conforme Contrôle : HPLC - EPP : 99,61 X AAA : Glu 0,93-Gly 0,99-Arg 1,08, Exemple III : synthèse de Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-OH (fragment Bl) 1 ) Boc-Asn-Gln-OBzl On dissout TFA, H-Gln-OBzl (0,445 mole) dans 500 ml de DMF. A cette solution, on ajoute successivement - 103,3 g de Boc-Asn-OH 10,445 mole) - 623 ml dc NEM - 217,8 g de BOP (0,5 mole) puis le pH de la solution est ramené a 7 par addition de NEM. Le mélange est agité à TA, on maintient le pH à 7 par addition de NEM si nécessaire. La réaction est suivie en CCM (chloroforme-méthanol3-l). Au bout de 1 h, la réaction est terminée et on fait précipiter le produit par addition de 1,5 1 d'acétate d'éthyle. On laisse 1 h sous agitation puis on abandonne une nuit au refrigarateur. Le solide est essoré, lavé à l'acétate d'éthyle (3 x 500 ml), à l'éther (1 litre), puis séché. Rendement : 108,13 g (53,9 %) CCM : chloroforme-méthanol 3-1 Rf : 0,63. 20) TFA H-Asn-Gln-OBzl On dissout 102 g de Boc-Asn-Gln-OBzl (0,226 mole) dans 500 ml de TFA refroidis dans un bain de glace. On enlève le bain de glace et on poursuit l'agitation à TA pendant 15 min. On essore un léger insoluble et on poursuit l'agitation pendant 15 min. Le milieu réactionnel est concentré au 1/4 sous pression réduite (25 mm de mercure) et on reprend dans 300 ml d'éther. Cette opération est répétée 2 fois (2 x 300 ml d'éther) et le solvant restant éliminé sous vide (25 mm de mercure). On obtient un solide blanc hygroscopique. Rendement : 107 g CCM : chloroforme-méthanol 3-1 Rf : 0,08. 30) Boc-Ser-Asn-Cln-OBzl On dissout 0,226 mole de TFA, H-Asn-Gln-OBzl dans 1,5 1 de DMF. A cette solution on ajoute successivement - 48,4 g de Boc-Ser-OH, 1/2 H20 (0,226 mole) - 34,8 ml de NEM (0,27 27 mole) - 111 g de BOP (0,25 mole) puis le pH de la solution est ramené a 7 par addition de NEM. Le mélange est agité à TA en maintenant le pH à 7 par addition de NEM s nécessaire. L'évolution de la réaction est suivie en CC (chloro- forme-méthanol-acide acétique 9-2-0,5). Au bout de 2 h, la réaction est terminée. On filtre un léger insoluble et le milieu réactionnel est évaporé à sec sous pression réduite (0,1 mn de mercure) à température inférieure ou égale à 30 C.L'huile résiduelle est reprise dans 800 ml d'acétate d'éthyle. On laisse 1 h sous agitation puis on abandonne une nuit au repos au réfrigérateur. Le solide est essoré, lavé à l'acétate d'éthyle (2 x 200 ml) puis a l'éther (200 ml) et séché sous vide. Rendement : 108,32 g (89 %3 CCM : chloroforme-méthanol-acide acétique 9-2-0,5 Rf : 0,42. 40) TFA H-Ser-Asn-Gln-OBzl On dissout 108 g de Boc-Ser-Asn-Gln-OBzl (0,2 mole) dans 520 ml de TFA refroidis dans un bain de glace. On enlève le bain de glace et on agite 30 min h TA. On filtre un léger insoluble, puis on évapore à sec sous pression réduite à température inférieure à 300C. Le résidu est repris dans l'éther, le solide essoré, lavé plusieurs fois à l'éther et séché. Rendement : 139 g CCM : tétrahydrofuranne-pyridine-acide formique-esu 60-20-10-6 Rf. : 0,81. 5 ) TFA, H-Ser-Asn-Gln-OH On dissout 0,2 mole de TFA, H-Ser-Asn-Gln-OBzl dans 1 litre d'eau. On ajoute a la solution 22,4 g de Pd/C a 10 Z contenant 50 Z d'humidité. Le mélange est hydrogéné à TA et sous pression de 15 un de mercure pendant 24 h sous agitation. On filtre le catalyseur puis on évapore a sec sous pression réduite (0,1 mm de mercure) et a température inférieure à 30 C. Le résidu est mis à sécher une nuit dans un dessicateur avec de l'anhydride phosphorique. Rendement : 93,66 g CCM : tétrahydrofuranne-pyridine-aeide formique-eau 60-20-10-6 Rf : 0,45 6 ) Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-OH On dissout 0,2 mole de TFA, H-Ser-Asn-Gln-OH dans un mélange de 100 ml d'eau et de 600 nil de DMF. On amène le pH de la solution à 7 par addition-de NEM et ajoute une solution de 87,11 g de Boc-Glu(OBzl)-ONP (0,19 mole dans 600 ml de DMF puis 29,5 g de HOBT (0,19 mole). Le pH du mélange est ramené à 7 par addition de NEM et on agite à TA. Au bout de 1 h d'agitation on rajoute 2,7 g de Boc-Glu(OBzl)-ONP. La réaction est suivie en CCM (tétra hydrofuranne-pyridine-acide formique-eau 60-20-10-6 et chloroformeméthanol-acide acétique 95-5-3).Une 1/2 h après la dernière addi ion on filtre un léger insoluble, puis on évapore à sec sous pression réduite (0,1 mm de nercure) à température inférieure à 300 C. L'huile obtenue est reprise dans 800 ml d'acétate d'éthyle, un précipité légèrement gélatineux se forme. Il est essoré et lavé à l'acétate d'éthyle (2 x 400 ml), puis à l'éther et séché. Rendement : 114,3 g (90 %) Ce produit doit être relavé par de l'acétate d'éthyle (1,2 1) sous agitation pendant 4 h à TA. Le solide est essoré lavé à l'éther, séché. Rendement : 95,85 g (71,9 %) CCM : tétrahydrofuranne-pyridine-acide formique-eau 60-20-10-6 RE : 0,62 : n butanol-pyridine-acide acétique-eau 50-12-12-25 Rf : 0,46 1H RMN conforme flPLC - EPP 87,81 AAA : Asn (asp) : 1,01 - Ser : 0,89 - Glu(gln) : 2,05 Point de fusion Koffler : 134 C (décomposition). Exemple IV : synthèse de Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH, HCl (fragment C) 1 ) Z-Gln-Gly-OMe Une suspension refroidie sur bain de glace de 75,36 g de HCl, H-Gly-OMe (0,6 M) dans l litre de DMF est additionnée de 168,2 g de Z-Gln-OH (0,6 M), de 256,41 g de BOP (0,7 M) et de 165,4 ml de N-éthylmorpholine (1,3 M). Après 20 h de réaction à TA, la solution est concentrée sous pression réduite et le résidu repris avec de l'acétate d'éthyle La solution organique est lavée par - une solution de bicarbonate de sodium - une solution de chlorure de sodium - une solution de KHSO4/K2SO4 - une solution de chlorure de sodium La solution organique est séchage sur MgSO4 et filtrée. Après 20 h de repos, 1 y a cristallisation dans chacune de solutions. Après filtration, les fractions provenant d'une cristallisation en milieu aqueux sont regroupées et lavées dans AcOEt sature en eau pour donner après filtration et séchage sous vide 7,78 g de produit (F. 158-159 C). La fraction provenant de la cristallisation dans AcOEt est lavée dans AcOEt saturé en eau pour donneur, apres filtration et séchage sous vide 61,8 g de produit (F. 150-1540C). La phase aqueuse et la phase organique donnent une cristallisation supplémentaire.Ces deux derniers produits sont regroupés et levés comme précédemment pour fournir 38,05 g supplémentaires de qualité comparable. Rendement global :107,63 g Contrôles RMN et CCM 2 ) HCl, H-Gln-Gly-OMe Une solution de 61,8 g de Z-Gln-Gly-OMe (175,9 mM) dans 7G4 ml de DMF, 880 ml de méthanol est additionnée sous refroidisse- ment par bain de glace de 176 ml d'une solution d'HGl N, puis de 3,1 g de Pd/C à 10 %. Après 3 h 30 d'hydrogénation sous surpression de 35 cm de mercure, le catalyseur est filtré sur célite et la solution est concentre sous pression réduite Le résidu est utilisé directement dans l'étape suivante. 30) Boc-Gln-Cln-Gly-OMe Une solution du résidu obtenu a l'étape précédente (théoriquement 175 > 9 mM) dans 500 nil de DMF, refroidie sur bain de glace est additionnée de 77,6 g de Boc-Gln-ONp (211, 1 mM), 26,4 g'hydroxy benzotiazole (211, 1 mM) et de N-éthylmorpholine jusqu'à obtenir un pH de 7. Après 20 h de réaction à TA la solution est prise en masse. Par addition d'acétate d'éthyle on obtient un précipité qui est essoré, lavé à AcOEt et séché sous vide. On obtient 64,27 g de produit, soit un rendement de 82 %. Contrôles RMN et CCM 4 ) TFA, H-Gln-Gln-Gly-OMe Une suspension refroidie sur bain de glace de 98,83 g de Boc-Gln-Gln-Gly-OMe (221,8 mM) dans 300 ml de dichlorométhane est additionnée de 400 ml de TFA. Après 30 min de réaction sur bain de glace et 1 h a TA, la solution est concentrée sous pression réduite jusqu'à la moitié de son volume initial et le résidu est versé sur de l'éther en agitation. Après filtration, lavage et séchage sous vide, on obtient 119 g de produit. 5 ) Boc-Arg(NO2)-Gln-Gln-Gly-OMe Une solution des 119 g du produit -précédent dans 1190 ml de DMF refroidie sur bain de glace est additionnée de 77,91 g de Boc-Arg(NO2)-OH (244 mM), de 97,51 g de BOP (266,2 mM) et de N-éthylmorpholine jusqu'à obtention de pH 7. Après 20 h de réaction a TA, la solution est versée sur 8 1 d'acétate d'éthyle. Le précipité obtenu est filtré, lavé à AcOEt, puis séché sous vide. On obtient 153,7 g de produit. Contrôle RMN et CCM. 6 ) TFA, H-Arg(NO2)-Gln-Gln-Gly-OMe Une suspension refroidie sur bain de glace de 153,7 g de Boc-Arg(NO2)-Gln-Gln-Gly-OMe (théoriquement 221,8 mM) dans 600 ml de dichlorométhane est additionnée de 750 ml de TFA. Après 1 h à TA, on ajoute encore 250 ml de TFA et, 30 min plus tard, 250 ml de TFA. - Après 1 h supplémentaire de réaction, on concentre la solution jusqu'au tiers du volume initial et verse le résidu sur 3 1 d'éther en agitation. Le précipité formé est essoré, lavé à l'éther et séché sous vide. On obtient 167 g de produit. 7 ) Boc-Ser-Arg(NO2)-Gln-Gln-Gly-OMe Une solution refroidie sur bain de glace de 167 g de TFA, H-Arg(NO2)-Gln-Gln-Gly-OMe (théoriquemenet 221,8 mM) dans 1,5 1 de DMF est additionnée de 97,52 g de Boc-Ser-ONb (266,2 mM), 33,31 g d'hydroxybenzotriazole (266,2 mM) et de N-éthylmorpholine jusqu'à obtenir un pH de 7. Après 3 h de réaction à TA, on évapore une partie du DMF et l'on verse la solution résiduelle sur de l'acétate d'éthyle sous agitation. Le précipité est filtré, lavé à l'acétate d'éthyle et séché sous vide. On obtient 153,3 g de produit, soit un rendement de 94,2 Z sur 4 étapes. Contrôle RMN et CCM. 8 )Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Glv-OMe, AcOH Une solution de 153,3 g de Boc-Ser-Arg(NO2)-Gln-Gln Gly-OMe (208,9 mM) dans 1 litre de méthanol, 1 litre d'eau et 500 ml d'acide acétique est hydrogénée pendant 20 h en présence de 10 g de Pd/C a 10 %. Après filtration du catalyseur et concentration de la solution le résidu repris a l'eau est lyophilisé. On obtient 153 g de produit, soit 97,8 Z de rendement. 9 ) Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH, HCl Une solution de 104,4 g de Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OMe (139,4 mM) dans 2 1 de DMF est additionnée sous refroidissement par bain de glace de 1 litre d'eau, puis de 27,88 g de NaOH (697 mM) dans 50 ml d'eau. Après 15 min de réaction à température voisine de 15 C, on neutralise par une solution d'acide chlorhydrique N jusqu'à obtenir un pH de 6,5. Après évaporation, on triture le résidu dans le l'acétate d'éthyle. Le précipité formé est essoré, lavé à AcOEt et séché sous vide, puis a l'air. On obtient 132,7 g de produit. Purification : 109 g de Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH, HCl sont purifies par distribution à contre-courant dans le mélange n-butanolméthanol-eau (4-1-5). Apres 700 transferts, on fractionne en trois parties qui, apres évaporation et lyophilisation, donnent : - une fraction de 27,5 g et - deux fractions d repurifier de 23,79 g et 16,90 g Contrôles RMN et CCM AAA : Ser : 0,91 Arg : ,97 Gln(Glu) : 2,05 Gly : 1,01 Exemple V : Synthèse de Bcc-Asp (OBzl) -Ile-Met-NH-NH2 (fragment D) 1 ) Boc-Met-NH-NH-Troc 4,31 g (10 mM) de boc-Met-OH, DCHa en solution dans 50 ml acétate d'éthyle sont traites en presence de 20 ml d'eau par une solution saturez de bisulfate de potassium jusqu'à pH = 3 ; la phase aqueuse est extraite plusieurs fois à l'acetate d'éthyle et les extraits seches sur sulfate de magnésium.A cette solution, on ajoute 2,28 g (11mM) de H2N-NH-Troc (Troc = trichloro-2,2,2, éthoxycarbonyle, ce reactif etant prepare selon YAJIMA, Chem. Pharm. Bull. 1971, 19, 420). Après refroidissement au bain de glace, on ajoute 2,37 g (11mM) de DCC à 97 % an solution dans 10 ml d'acétate d'ethyle Après une nuit pendant laquelle le produit revient progressivement à TA, la dicyclohexylursse est filtre et séchée (2,04 g) et la solution organique est lavée successivement par les solutions aqueuses suivantes sulfate-bisulfate 5 % 2 fois ClNa 2 M 2X bicarbonate de sodium 5 %, 2 fois ClNa "M 2 fois et enfin à l'eau 2 fois. Après séchage sur sul- fate de magnésium et concentration du solvant presque à sec, on ajoute de l'hexane jusqu'à début de trouble et garde à ' 40 une nuit après quoi le pré forme est filtre, lave par un mélange d'hexane et d'acétate d'ethyle 4/1 et seche sous vide, on obtient ainsi 3,46 g (79 %) Fc = 92-4 alpha D 25 = -32 - C = 1, dioxane. CCM dans chloroforme-méthanol-AcOH 95/5/3 - Rf = 0,45 2 ) TFA, H-Met-NH-NH-Troc 4359 g (O, lM) de Boc-Met-NH-NH-Troc en solution dans 200 ml de dichloromethane et 20 ml d'ethanedithiol sont traitês au bien de glace sous acote et avec agitation par 200 ml d'acide trifluo- roacétique on ôte te bain froid et laisse sous agitation pendant une heure. Le produit est isolè par élimination des rêactifs volatils d'abord sous 20 mm puis 0)1 mm de pression, I'huile residualle est reprise 2 fois par 75 ml d'isopropanol en êvaporant sous vide puis lave 2 fois par 75 ml d'hexane par decantation après quoi elle est séchée sons vide en présence de potasse une nuit, après quoi elle commence d se solidifier et est utilisée telle quelle dans l'operatioe suivante. 3 ) Boc-Ile-Met-NH-NH-Troc L'huile ci-dessus (environ 0,1 M) de TFA, H-Met-NH-NH-Troc en solution dans 6500 ml d'acetate d'éthyle et refroidie au bain de glace esttraitee par 12,, ml (O,l M) de N-ethylmorpholine puis 14,85 g (0,1 M) d'HOBt, lh2O puis par 34,35 g (0,08 M) de Boc-Ile-OSu suivis de 12,7 ml (O,1M) de N-ethylmorpholine (NEM). Après 1/2 h, le bain froid est ôte et par la suite de la NEM est ajoutee periodiquement de manière à maintenir le pH apparent vers 7. Apres 20 h, la reaction est complète et l'isolement se fait par lavages successifs par les solutions aqueuses suivantes sulfate-bisulfate de potassium 5 / 3 fois, de l'eau 3 fois, du bicarbonate de sodium 5 % 3 fois et enfIn, à l'eau jusqu neutralite. Après séchage sur sulfate de magnesium et evaporation du solvant sous vide, on obtient 64 g de gomme qui est cbromatographiee sur une colonne de silice avec du dichlorométhane contenant de O a 1,5 % de methanol. On obtient ainsi 30 g (68 %) de produit ayant une purete HPLC de 98,9 Z et un spectre RMN en accord avec la structure attendue. Fc : 88-920. 4 ) TFA, H-Ile-Met-NH-NH-Troc 27,6 g (50 mM) de Boc-Ile-Met-NH-NH-Troc en solution dans 140 ml de dichloromethane et 14 ml d'ethanedithiol sont refroidis au bain de glace et agites sous azote puis on leur ajoute en 5-6 min, 140 ml d'acide trifluoroacetique. Le bain froid est ôte et, après 45 min, le produit est isole par evaporation au maximum des reactifs, reprise de l'huile residuelle par 2 x 60 ml d'isopropanol suivie d'evaporation et enfin par 2 lavages par 60 ml de pentane. Après séchage une nuit sur potasse sous vide, on obtient une huile d'aspect vitreux qui est utilisee dans l'opération suivante (30 g). 5 ) Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH-Troc Les 30 g d'huile precedente en solution dans 250 ml de THF sont traites par 6,4 ml t50 mM) de NEM et 18,9 (45mM) de Boc-Asp (OBzl)O Su. Le pH apparent est ajuste entre 6 et 7 par additions successives de NEM. Après 4 , le produit est isole par evaporation du THF, reprise dans 400 ml d'acétate d'éthyle, suivie des mêmes lavages que l'homologue precedent (3). Le residu, apres sechage et evaporation (36,5 g), est purifie par chromatographie sur une colonne de silice avec du dichloromethane comme solvant contenant de O à 1,5 % de methanol. On obtient ainsi 25 g (66 %) de produit presentant un spectre RMN conforme à la structure attendue.Fc = 96-100 . 6 ) Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH2 7,57 g (10 zM) de Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH-Troc en solution dans 80 ml du mélange DMF-AcOH 80/20 sont traites à TA par 6,54 g de zinc en poudre fine sous agitation pendant 30 min. Le produit est isole par filtration du zinc, traitement du filtrat par 800 g de glace, puis filtration après fusion de la glace suivie de lavages à l'eau repetes. Le solide blanc est d'abord seche à l'air puis sous vide pousse en présence de potasse et d'anhydride phospho rique.On obtient ainsi 5,60 g (96 %) de produit à environ 95 Z de purete d'après la CCM et la RMN Fc = 180-185 . -Contrôles CCM et HPLC Exemple VI : Boc-Arg-Lys (Z)-Leu-Leu-OH (fragment E) 1 ) Boc-Leu-Leu-OMe Dans 500 ml de dioxane contenant 18,4 g de NEM (0,16 M), on ajoute successivement 9,OS S de H-Leu-OMe, HC1 (0,05 M), 7,4 g de HOBt (0,055 M) et 18 g de Boc-Leu-ONSu (0,055 M). Agiter à TA durant 18 h et ajuster le pH à 6-7 par NEM, au papier pH, si necessaire en cours de la reaction. Evaporer le solvant, dissoudre le résidu dans AcOEt et laver la solution organique successivement 2 fois par KHSO4 - K2S04 5 %, ClNa/eau, NaHC03 5 %, ClNa/eau. Secher sur MgSO4 et evaporer le solvant.Dissoudre le residu dans le minimum d'ether et precipiter le produit par le pentane. Essorer. Secher. RENDEMENT : 15 g (83 %) CCM chloroforme-mGthanol-acide acétique 95-5-3 AcOET-hexane 25/75 -Fc : 131-136 Possibilite de purification sur gel de silice 60 Merck (70-230 mesh) dans le chloroforme, avec elution par le même solvant. 2 ) H-Leu-Leu-OMe, TFA 27, 5 g de Boc-Leu-Leu-Leu-OMe (0,076 M) sont recouverts de 180 ml de TFA à TA : un leger echauffement se produit. Après 30 min, évaporer le solvant, reprendre l'huile résiduelle dans Itéther et gratter : un précipité blanc se forme ; ajouter du pentane, essorer, secher. RENDEMENT : 28,2 g (100 %) CCM : chloroforme-methanol-acide acétique 95/5/3 chloroforme-méthanol-acide acétique 80/15/5 3 ) Boc-Lys(Z)-Leu-Leu-OMe Dans 600 ml AcOEt refroidis au bain de glace, on ajoute successivement - 28,2 g de H-Leu-Leu-OMe, TFA (0,076 N) - 26,22 g de NEM (0,0228 M) - 11,23 g HOBt (0,083 M) - 46,4 g de Boc-Lys(Z)OTcp (0,083 M Agiter, puis retirer le bain froid. Ajuster le pH à 6-7 par NEM si nécessaire. Après 18 h, laver la solution organique successivement par KHSO4 -MgSO4 5 %, ClNa/eau, NaH CO3,5 %, ClNa/eau. Sécher sur MgSO4. Evaporer le solvant. Dissoudre l'huile residuelle dans le chloroforme et déposer en tête d'une colonne (L : 90 cm - diamètre 5 cm) de gel de silice 60 Merck (70-230 mesh) dans le chloroforme. Eluer avec du chloroforme, fractionner. Evaporer les fractions contenant le produit pur ; redissoudre dans l'éther la mousse obtenue et evaporer à sec. Triturer le résidu dans le pentane, essorer et sécher. RENDEMENT : 42,2 g (91 %) CCM AcOEt/hexane 1/1 chloroforme -MeOH-AcOH 95/5/3 Contrôle RMN-HPLC-EPP : 98,7 %. 4 ) Boc-Arg-Lys(Z)Leu-Leu-OMe 15,5 g de Boc-Lys(Z)Leu-Leu-OMe (0,025 M) sont recouverts de 100 ml de TFA à TA. Après 30 min avec agitation occasionnelle, evaporer le solvant à fond. Dissoudre l'huile residuelle dans 150 ml de dioxane et amener à pH 6-7 par DIPEA, au papier pH. Refroidir au bain de glace et ajouter 7,21 g de Boc-Arg-OH, H2O, HC1 (0,025 M), 13,44 g de BOP (0,03 M) et 10,32 g de DIPEA (0,08 M). Agiter, puis retirer le bain froid et ajuster le pH à 6-7 par DIPEA si necessaire. Après 18 h, evaporer le dioxane, dissoudre l'huile résiduelle dans AcOEt et laver successivement par NaHCO3 5 %, ClNa/eau. Sécher sur MgSO4. Evaporer le solvant et dissoudre l'huile dans MeOH-chloroforme 5-95, saturé d'eau puis deposer en tête d'une colonne (L : 85 cm diamètre : 4 cm) de gel de silice 60 Merck (70-230 mesh) dans le même mélange. Eluer avec - 1,5 1 de MeOH-chloroforme 5-95 saturé d'eau - 1 1 de " " 7,5-92,5 - 2,5 1 de Fractionner et évaporer les fractions pures. Reprendre dans l'éther, evaporer et tirer à fDnd sous vide. RENDEMENT : 16,8 g (87 %) CCM chloroforme-MeOH-AcOH 95/5/3 chloroforme-MeOH-AcOH 80/15/5 Contrôle RMN - HPLC-EPP 91,8 %. 5 ) Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-OH 13,98 g de Boc-Arg-Lys(Z)Leu-Leu-OMe (0,018 M) sont solubilisés dans 250 ml de MeOH ; ajouter 40 ml d'eau, puis à TA 5,67 b de baryte (0,018 M), finement pulvérisée Agiter 2h30 à TA. On contrôle la fin de la réaction par CCM. Faire barboter C02 jusqu'à pH 6, filtrer. Evaporer le filtrait, le résidu est solubilise dans l'alcool isopropylique et filtrê, Concentrer l'alcool et précipiter le produit par l'éther. RENDEMENT : 12,31 g (89 /) CCM chloroforme-MeOH-AcOH 90/15/5 2 -butanol -AcOH-eau 72/7/21 Contrôle RMN-HPLC - EPP 95,88 Exemple VII : Boc-Gln-Leu-Ser-Ala-OMe (fragment F) 1 ) Boc-Ser-Ala-OMe Dissoudre 25 g de H-Ala-OMe, HCl et 66 g de Boc-Ser-ONb dans 500 ml de DMF. Refroidir au bain de glace et ajouter sous agi tation magnétique 25 ml de NEM, 24 g de N-hydroxybenzotriazole et maintenir le pH à 6,5 ou 7 par addition de NEM. Agiter 18 h à TA. Après contrôle CCM, évaporer le milieu à 90 % (0,1 mm Hg - 35 C). l'huile obtenue est dissoute dans 1 500 ml de chloroforme, Laver avec une solution de chlorure de sodium saturée (2 fois), solution sulfate/bisulfate de potassium 5 % 3 fois bicarbonate de sodium saturée 5 fois. La solution est séchée sur Na2SO4 et évaporée à sec. On obtient une huile qui est séchée à poids constant (30 -0,1 mm/Hg). RENDEMENT : 53,78 g - Contrôle CCM 2 ) H-Ser-Ala-OMe, TFA Dissoudre 52,8 g de Boc-Ser-Ala-OMe dans 100 ml de chlorure de méthylène sous agitation magnétique en refroidissant au bain de glace. Ajouter 250 ml de TFA refroidi et agiter 20 min à TA. Filtrer. Evaporer le filtrat à sec (350 trompe a eau). Par addition de 2 1 d'ether, un solide blanc precipite. Il est essore, lave à l'éther 3 fois. Sécher à poids constant (30 -0,1 mm Hg) RENDEMENT : 40,82 g 3 ) Boc-Leu-Ser-Ala-OMe Dissoudre 40 g de H-Ser-Ala-ONe, TFA et 32,9 g de Boc Leu-OH, H2O dans 400 ml de DMF. Refroidir au bain de glace sous agitation magnétique et ajouter 14,4 ml de NEM puis 65,8 g de BOP et assez de NEM pour maintenir le pH à 5,5-7. Agiter 2h à TA. Après contrôle CCM, evaporer à sec (0,1 mm-35 ) et dissoudre l'huile obtenue dans 1 500 ml de chloroforme.Laver 2 fois avec une solution NaCl saturée, 3 fois avec sulfate/bisulfate de potassium 5 %,3 fcis au bicarbonate de sodium saturé. Sécher/Na2SO4. Evaporer à sec (30 trompe à eau). L'huile obtenue est solidifiée dans l'éther : Fraction A = 29 g. Un deuxième jet B est obtenu par addition d'hexane, identique en CCM : B = 13,7 g. RENDEMENT : 42,7 g - Contrôles RMN et CCM. 40) H-Leu-Ser-Ala-OMe, TFA Mettre en suspension 29 g de Boc-Leu-Ser-Ala-OMe dans 50 ml de chlorure de méthylène sous agitation magne tique en refroidissant au bain de glace. Ajouter 100 ml de TFA refroidi et, après dissolution, agiter 30 min à TA. Filtrer. Evaporer le filtrat à sec (350 - trompe à eau). L'huile obtenue est solidifiée dans l'éther (changer le solvant plusieurs fois). Secher a poids constant (30 0,1 mm Hg) RENDEMENT : 30,2 g. 5 ) Boc-Gln-Leu-Ser-Ala-OMe Dissoudre sous agitation magnetique 30 g de H-Leu-Ser Ala-ie, TFA et 25,5 g de Boc-Gln-ONp dans 300 ml de DMF. Neutraliser par 9,7 ml de NEM. Ajouter 10 g d'OHBt et agiter 2 h a TA en maintenant le pH à 6,5-7 par addition de NEM. Après contrôle CCM, le milieu est concentré à 90 Z (0,1 mm Hg - 35 ), repris dans 1 000 ml de chloroforme : un produit précipite en gel. Essorer. Laver en reprenant dans 500 ml de chloroforme 2 fois, puis dans l'éther 3 fois.Sécher à poids constant (0,1 mm Hg - 300) RENDEMENT : 32,1 g CCM : chloroforme/MeOH/AcOH : 9/2/0,5 - Rf = 0,81 HPLC-EPP = 91 % Ser : Ser : 0,86 - Glu : 1,02 - Ala : 0,99 -Leu : 0,99 Exemple VIII : Boc-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OH, HCl (fragment G) 1 ) z-Leu-Gly-OCH3 On dissout 0,22 mole de Z-Leu-OH dans 500 ml de DMF. A cette solution, on ajoute successivement - 25, 11 g de HCl-H-Gly-OCH3 (0,2 mole) - 28 ml de NEM - 96 g de Bop (0,22 mole) puis on ajuste le pH à 7 par addition de NEM. On agite le mélange réactionnel à TA en maintenant le @ 7 par addition de NEM si nécessaire. La réaction est suivie en CCM (chloro@orme-méthanol-acide acétique 95/5/9). Au bout de 2 h, la réaction est terminee. Le mélange réactionnel est évaporé à sec sous pression réduite (0,2 mm de mercure) et à température inférieure à 300C. Le résidu est repris dans l'acétate d'éthyle (1 litre). La solution est lavee successivement avec - solution aqueuse de bicarbonate (4 x 200 ml) - solution aqueuse de SO4HK-SO4K2 (4 x 200 mi) - solution aqueuse saturée de chlorure de sodium (2 x 200 ml) puis, elle est séchée sur sulfate de magnésium et évaporée à sec sous pression réduite.Le résidu est repris dans de l'éther (500 ml), triture, essore, séché. RENDEMENT : 56,7 g (84,28 %) CCM chloroforme-methanol-acide acétique 95/5/3 - Rf : Q,44 2 ) HCl-H-Leu-Gly-OCH3 On dissout 56 g (0,166 mole) de Z-Leu*Gly-OCH3 dans 900 ml de méthanol chlorhydrique 0,23 N. A cette solution, on ajoute 6 g de Pd/C à 10 % contenant 50 % d'humidité. On hydrogène pendant 24 h, à TA et sous pression atmospherique. On filtre le catalyseur et la solution est évaporée à sec sous pression resuite à température inférieure à 30 C. On reprend le résidu par de l'éther (2 x 50 ml), on decante et on séche le produit au dessiccateur en presence d'anhydride phosphorique. On obtient une poudre blanche. RENDEMENT : 33,53 g (84,4 %) CCM chloroforme-mthanol-acide acétique 90/20/9 - Rf : 0,15 Contrôle RMN 3 ) Boc-Val-Leu-Gly-OCH3 28,24 g de Boc-Val-OH (0,13 mole) sont dissous dans 400 ml de tetrahydrofuranne refroidi à -10 C. On ajoute ensuite 14,45 ml (0,13 mole) de chloroformiate d'isobutyle. Le mélange est vigoureusement agité à -10 C pendant 15 min. A ce mélange, on ajoute une solution tétrahydrofurannique refroidie à -10 C contenant 31,5 g du chlorhydrate de H-Leu-Gly-OCH3 (C,13 mole) préalablement neutralisé par 14,45 ml de N-méthylmorpholine. On poursuit l'agitation en refroidissant le mélange réactionnel dans un bain de glace (2 h) puis à TA pendant 2 h.Le mélange réactionnel est évaporé a sec sous pression réduite à température inférieure à 30 C. Le résidu est repris dans un mélange acétate d'éthyle-eau (500 ml-500 ml). La phase aqueuse est décantée et la phase organique lavée successivement avec - une solution aqueuse de bicarbonate de soude (2 x 50 ml) - une solution aqueuse de SO4HK-S04K2 (pH 2) (2 x 50 ml) - une solution aqueuse de chlorure de sodium (50 ml), puis séchée sur sulfate de magnésium et évaporée à sec sous pression reduite à température inferieure a 30 C. Le résidu est repris avec le pentane (50 ml), essore et séché sous vide (0,1 mm de mercure). RENDEMENT : 39,7 g (76 %) CCM chloroforme-acetone 75j25 - Rf : 0,46 Contrôle RMN 4 ) TFA H-Val-Leu-Gly-OCH3 On dissout 39 g de Boc-Val-Leu-GIy-OCH3 (0,097 mole) dans 190 ml de TFA refroidi dans un bain de glace. Après dissolution, on enlève le bain de glace et on agite le mélange pendant 30 min à TA. On evapore à sec sous pression réduite et le résidu est repris dans l'éther (100 ml), triture et l'éther decante. Cette opération est réputée 2 fois et les dernières traces de solvants sont éliminées sous pression réduite (0,1 mm de mercure). RENDEMENT : 44,8 g CCM chloroforme-méthanol-acide acétique 90/20/3 - Rf : 0,36. 5 ) Boc-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 On dissout 25,55 g de TFA H-Val-Leu-Gly-OCH3 (0,0615 mole) dans 200 ml de DMF. La solution est amenee à pH 7 par addition de NEM. On ajoute alors à cette solution 32,47 g de Boc-Lys(Z)-OTCP (0,058 mole) et 9 g de HOBT (0,059 mole). Le pH du mélange réaction nel est ramene à 7 par addition de NEM. On agite à TA en maintenant le pH à 7 par addition de NEM Si nécessaire. La réaction est suivie en CCM : chloroforme-mèthanol 90/10 ; chloroforme-méthanol-acide acétique 90/20/3 (2 milieux). Au bout de 1 heure, on rajoute 1,96 g de Boc-Lys(Z) OTCP (0,0035 mole) et 0,61 g de HOBT. Le pH de la solution est ramené à 7 par addition de NEM. 2 h après, la réaction est terminée en CCM. Le mélange réactionnel est alors évapore à sec sous pression réduite (0,1 mm de mercure) à température inférieure à 30 C. Le résidu est repris avec 500 ml d'eau, trituré. Le solide forme est essore puis lavé avec - 500 ml de solution aqueuse de HKSO4-K2SO4 (pH 2) - 500 ml d'une solution aqueuse saturée de bicarbonate de soude - 200 mi d'eau puis à l'éther (200 mL x 2) et séché. Le produit impur est chromatographie sur une colonne de gel de silice (5cm x 150 cm). Il est éluè avec le mêlange chloroformeacétate d'éthyle 80/20 (dêit 600 ml/h). Les bonnes fractions deter- minées en CCM sont réunies, évaporées à sec sous pression réduite. Le résidu est repris dans l'éther, triture et le solide obtenu essoré. Poudre blanche 35,14 g (86 %) CCM chloroforme-méthanol 90/10 - Rf : 0,62 Chloroforme-méthanol-acide acétique 87,7-9,4-2,8 Rf : 0,52 Contrôle RN : AC Gly 1,00-Val 0,96-Leu 1,06-Lys 0,98. 6 ) TFA H-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 On dissout 15 g de Boc-L5s(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 (22,6 nM) dans un mélange de TFA-chlorure de méthylène (75 ml/75 ml). On agite 40 min à TA, puis on évapore à sec sous pression reduite à temperature inférieure à 300C. Le résidu est repris par de l'éther contenant 20 % d'hexane (100 ml). Le solide forme est essore et séché. On obtient un solide blanc de 14,51 g. RENDEMENT : 94,7 % CI chloroforme/méthanol/acide acétique 95/5/3 - Rf : 0,12 7 ) Boc-Arg(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 On dissout 14,1 g de TFA H-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 (21 mM) dans 5G ml de DMF. La solution est amenée à pH par addition de NEM. On ajoute alors à cette solution 6,57 g de Boc-Arg (HCl)-OH.l H20 (20 mM) et 10,6 g de BOP (24 mM). Le pH du melange réactionnel est ramené à 6-7 par addition de NEM, On agite i TA en maintenant Le pH à 6-7 par addition de NEM si nécessaire. La reaction est suivie en CCM : chloroforme/méthanol (80/20). Au bout de 5 h, la réaction est terminée. On evapore à sec le melange réactionnel sous pression reduite (0,1 mm de mercure) et à température inférieure à 30 C. L'huile obtenue est reprise dans 300 ml d'acétate d'éthyle. Le solide formé est essore et levé à l'éther (ler jet). On rajoute de l'éther au filtrat précédent ; un solide precipite qui est essoré (2ème jet) : les 2 jets sont indentiques en CCM. Ils sont laves à l'état solide par agitation pendant 1 h avec un mélange de 200 ml d'eau saturée en acétate d'éthyle et 60 ml d'eau. Le solide est essoré puis lavé avec 60 ml d'eau et 300 ml d'éther et séché. RENDEMENT : 78,7 % (13,49 g) CCM chloroforme/methanol 20/20 - Rf = 0,32 Contrôle RMN 8 ) TFA H-Arg(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 13,3 g de Boc-Arg(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 (15,5 mM) sont dissous dans un mélange TFA-chlorure de méthylène (60 ml/60 ml). On agite 40 min à TA, puis on évapore à sec sous pression reduite à température inferieure à 300C. Le résidu est repris par un melange ether-hexane (80/20 : 100 ml). Le solide forme est essore, lavé à l'hexane et séché (poids : 15,13 g). CCM : chloroforme/ méthanol (3/1) - Rf : 0,35 9 ) Boc-Tyr-Arg(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 On dissout 15,5 mM de TFA H-Arg (HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly OCH3 dans 50 ml de DES. La solution est amenée à pH 6 par addition de NEM. On ajoute alors à cette solution 8,20 g de Boc-Tyr-OTCP (15,5 x 10 mM) et 2,41 g de HOBT (15,5 x 10 mM), On ramène le pH à 6 par addition de NEM. Le mélange reactionnel est agite à TA en maintenant le pH à 6 par addition de NEM si necessaire. La réaction est suivie en CCM : chloroforme/methanol (3/1). Au bout de 3 h, la reaction est terminée. On évapore à sec le mélange réactionnel sous pression reduite (0,1 mm de mercure) et à température inférieure à 300C. l'huile residuelle est reprise dans de l'acétate d'éthyle (300 ml).Le solide gélatineux forme est essoré, lave avec de l'acé- tate d'éthyle (100 ml), avec de l'acétate d'éthyle-êther (1/1 ; 100 ml), puis à ltether (100 ml), enfin à l'hexane (100 mi). Le produit est séché sous pression réduite jusqu'à poids constant. RENDEMENT : 96 % (15,14 g) CCM chloroforme/méthanol (3/1) - Rf : 0,47 Contrôle RMN AAA : AC : Gly : 0,95 - Val : 0,98 - Leu : 1,02 - Lys : 1,01 Arg : 1,01 - Tyr : 1,05 HPLC : 93,81 % EPP. 10 ) Boc-Tyr-Arg(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OH 7 g de Boc-Tyr-Art(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 (6,86 mM) sont dissous dans un melange de 70 ml de dioxane et 35 ml d'eau. On ajoute à cette solution 6,4 ml de soude 4N (25,6 mM) : 3,7 équivalents) et on agite pendant 30 min à TA. On dilue avec 200 ml d'eau et 800 ml d'acétate d'éthyle. Le mélange est alors acidifié à pH 3 par addition de HCl (N). On décante l'acétate d'éthyle et on essore le solide (1er jet). L'acetate d'éthyle est évaporé à sec ; on obtient un 2ème jet Les 2 jets identiques en CCM sont réunis, lavés à l'éther et séchés. RENDEMENT : 74,7 % (5,16 g) CCM : chloroforme/méthanol (2/1) - Rf : 0,45 1H Contrôle RMN AAA : Ac : Gly : 1,00 - Val : 0,97 - Leu : 1,04 - Tyr : 0,95 Lys : 0,99 -Arg : 1,05 HPLC - EPP 91,52 %. Exemple IX : Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-NH-NH2 (fragment H) 1 ) Boc-Asn-Ser-OMe Une solution de 23,32 g de Boc-Asn-OH (0,1 M) et 19,7 g de NbOH (0,11 M) dans 250 ml de DMF, refroidie sur bain de glace est additionnée de 22,69 g de DCC. Après 3 h de réaction a TA, on filtre la DCU, on refroidit sur bain de glace et ajoute 15,56 g de HC1, H Ser-OMe (chlorhydrate de H-Ser-OMe). Le pH est amené, puis maintenu à 7 par addition de NEM. Après 4 h à TA et 20 h à +40, la solution est concentrée sous pression réduite. Le résidu est repris par le melange AcOEt/n-butanol (50/50).La solution organique est lavee successivement par - une solution saturée de bicarbonate de sodium - une solution saturee de chlorure de sodium - une solution de KHSO4 /R2S04 à 5 % - une solution saturée de chlorure de sodium. Après séchage sur MgSO4 et évaporation sous pression réduite, le résidu est cristallise dans le melange ether-hexane Filtration, lavage à ether/hexane et sechage sous vide donnent 26,9 g de produit. RENDEMENT : 80,8 % Contrôle RMN et CCM 20) TFA H-Asn-Ser-OMe Une solution refroidie sur bain de glace de 13,5 g de Boc Asn-Ser-OMe (40,5 mM) dans 54 ml de dichlorométhane est additionnée de 81 ml de TFA. Après 1 h de réaction à TA, la solution est concentree sous pression réduite, le résidu est repris à l'éther. On obtient une huile épaisse qui est utilisée dans la réaction suivante. 3 ) Boc-Thr-Asn-Ser-OMe Une solution refroidie sur bain de glace du produit brut précédemment obtenu dans 300 ml de DMF est additionnée de 14,09 g de Boc-THr-ONSu (44,55 mM) 5,58 g d'HOBt (41,3 mM) et de NEM jusqu'à obtenir un pH de 7. Après 20 h de réaction à TA, la solution est concentrée sous pression reduite et le résidu est repris dans le mélange AcOEt/n butanol. La solution organique est lavée successivement par - une solution saturée de bicarbonate de sodium - une solution saturée de chlorure de sodium - une solution de KHSO4/K2SO4 à 5 % - une solution saturée de chlorure de sodium. Après séchage sur MgSO4, la solution est concentrée sous pression reduite et le résidu cristallise dans le melange éther/hexane. On obtient 8,28 g de produit. RENDEMENT : 47 % Contrôle RMN et CCM 4 )TFA, H-Thr-Asn-Ser-OMe Une solution refroidie sur bain de glace 8 g de Boc-Thr Asn-Ser-OMe dans 32 mi de dichlorométhane est additionnée de 54 ml de TFA. Après 1 h de réaction à TA, la solution est concentrée sous pression réduite et le résidu précipité à l'éther. Après filtration, il est utilisé tel quel dans la réaction suivante. 5 ) Boc-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe Une solution du précipité obtenu a l'étape précédente dans 100 ml de DMF est additionnée sous refroidissement par bain de glace de 7,82 g de Boc-Phe-ONp (20,24 mM), 2,53 g d'HOBt (18,71 mM) et de la N-éthylmorpholine jusqu'à obtenir un pH de 7. Après 4 h, la solution est concentrée sous pression reduite et le résidu est repris dans AcOEt. La solution organique est lavée par - une solution saturée de bicarbonate de sodium - une solution saturée de chlorure de sodium - une solution de KHSO4/K2SO4 à 5 % - une solution sature de chlorure de sodium. Après séchage sur MgSO4, concentration de la phase organique le résidu est cristallisé dans l'éther. On obtient 10 g de produit. RENDEMENT : 93,5 % Contrôle CCM et RMN 6 ) TFA, H-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe Une solution de 10 g de Boc-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe (17,19 nM) dans 40 ml de dichlorométhane est additionnée sous refroidissement par bain de glace de 60 ml de TFA. Après 1 h de réaction à TA, le produit est précipité à l'éther. La gomme obtenue après séchage s'organise pour donner 5,14 g de produit. RENDEMENT : 48,5 % 7 ) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe Une solution refroidie sur bain de glace de 5,14 g de TFA, H-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe (8,78 mM) dans 100 ml de DMF est additionée de 3,17 g de Boc-Ile-OSu (9,66 mM), 1,30 g d'HOBt (9,62 mM) et de N-ethylmorpholine jusqu'à obtenir un pH de 7. Apres 20 h de reaction à TA, la solution est concentre sous pression réduite et le résidu repris à l'éther donne un précipité qui est filtre et seche sous vide. On obtient 5,24 g de produit. RENDEMENT : 85,9 % Contrôle RMN et HPLC. 8 ) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-NH-NH2 Une solution de 5 g de Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe (7,2 mM) dans 40 ml de DMF et 200 ml de methanol refroidie sur bain de glace est additionnee de 3,6 ml d'une solution à 80 % d'hydrate d'hydrazine. Après 21 h de reaction à TA, on ajoute 0,9 ml de la même solution d'hydrate d'hydrazine. Après 3 h supplementaires) le gel obtenu est filtré, lave au methanol et séché sous vide. On obtient 3,94 g de produit. RENDEMENT : 78,8 % Contrôles RMN et CCM. Exemple X : Boc-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH (fragment I) 1 ) Boc-Asp(OBzl)-Ala-OBut 3,62 g (0,02 mole) de chlorhydrate d'alaninate de tertiobutyle sont mis en suspension dans 30 ml d'acètonitrile. 2,52 ml de NEM sont ajoutés puis 8,4 g (0,02 mole) de Boc-Asp(OBzl) ONSU. Le pH est maintenu à 6-6,5 par addition de NEM. L'agitation est poursuivie 18 h. Après contrôle CCM le milieu est évaporé à sec; l'huile est reprise dans 50 mi AcOET, la solution lavee 2 fois par une solution KHSO4/K2SO4' puis à l'eau salée, sechee sur Wa2S04 et évaporée à sec. L'huile obtenue est dissoute dans l'hexane, un peu de solide est filtre et le filtrat est évaporé à sec. L'huile obtenue est utilisée telle quelle. CCM : CHCl3/Acétone/ACOH 80/15/5 - Rf = 0,8 2 ) Boc-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH L'huile brute obtenue précédemment est dissoute dans 50 ml TFA glace et agitee lh30 à TA. Le TFA est évapore au maximum et l'huile résiduelle est reprise 3 fois dans l'éther anhydre et décantée. Elle est ensuite séchée au dessiccateur sous vide en pré- sence de pentane. Il se forme une mousse solide qui-est écrasée et remise à secher. On obtient 9,4 g de produit brut utilise tel quel pour le couplage. Le sel de TFA ci-dessus est dissous dans un mélange de 20 ml D et 18 ml d'eau distillée. Le NEM est ajoutée jusqu'à pH i (utilisation du pEmetre). 4 g (0,014 mole) de Boc-Ala-ONSu en solution dans 16 ml de DMF sont introduits. Le pH est maintenu à 6,5-7 par addition de NEM. Après 5h30, la réaction est terminée (contrôle CCM). Le solvant est évapore au maximum et le résidu est repris dans un mélange d'eau et d'acetate d'ethyle. La phase organique est lavée par une solution de NaHC03, à l'eau salée, séchée sur NA2SO4 et évaporée sec. Le résidu est dissous dans l'éther et précipité par l'hexane pour donner une gomme qui cristallise après triturage. Le solide est essoré et séché à l'air. RENDEMENT : 5,05 g. CCM CHCl3-acétone-ACOH 80/15/5 - Rf = 0,28 30) Z-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OR 1 g (2mmoles) de Boc-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH est introduit dans 10 ml TFA glace agite. Après 30 min d'agitation à TA, le TFA est evapore au maximum, le résidu repris 2 fois dans l'éther anhydre et décanté, puis seche au dessiccateur sous vide en presence de potasse. Il se forme une mousse solide. Le produit brut est mis en solution dans un mélange de 4 ml DMF et 2 ml d'eau distillée. NEM est ajouté jusqu's pH 7-7,5. 1 g (2,4 mmoles) de Z-Tyr-ONSu est alors ajoute et le pli est maintenu a 7-7,5 par NEM (plimètre) Au bout de 2h30, apres contrôle CCM, le solvant est évaporé au maximum à 40 C. Le résidu est repris dans l'acétate d'éthyle et lave à l'eau, un peu de solide est éliminé et l'acétate d'ethyle est lavé au melange sulfate/bisulfate et à l'eau salée. Après abandon quelques heures, il se forme un precipite qui est essoré, lavé à l'éther et seche à l'air. 500 mg sont ainsi obtenus.Un 2ème jet de 350 mg legerement moins pur est obtenu par concentration de l'acétate d'éthyle. CCM chloroforme-ACOH 3/1 Rf : 0,4 butanol-ACOII-H20 72/7/2 Rf : 0,85 chloroforme-acetone-ACOH 80/15/5 Rf : HPLC 90,9 % purete polypeptidique Contrôle RMN Exemple XI : synthèse de H-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(Bzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu (OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2(peptide K) 1 ) Boc-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 3 HCl 34,47 g de H-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCl (57 mM) sont dissous dans 230 ml de DMF. On ajoute 28 g de BOP (63 mM), puis en 1 h 33,5 g (57 sM) de Boc-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH en solution dans 190 mi de DMF. Le pH du milieu réactionnel est maintenu autour de 6 par addition de NEM. Après 4 h, le milieu réactionnel est concentré sous vide de moitie et le résidu versé sur 800 ml d'acétate d'acétate d'éthyle. Le précipité obtenu est filtre, lavé à l'acétate d'éthyle, à l'éther et seché sous vide. On obtient 56,8 g de produit avec un rendement de 80 %. Identification : 1H RMN et AAA : Glu : 0,98 - Gly : 1,01 - Ala : 1,97 Leu : 1,05 - Arg : 2,97 HPLC phase reverse EPP 95 % CCM dans EPAW 40/20/10/6 Rf = 0,55 2 ) H-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, TFA, HCl 55,3 g du produit ci-dessus sont agités 30 min dans 250 mi de CH2C12 + 250 ml de TFA. Puis le milieu réactionnel est concentré sous vide de moitie et versé sur 1200 ml d'ether glace. te precipite obtenu est filtre, lavé à l'éther, séché sous vide sur potasse. RENDEMENT : 100 % 30) Boc-Glu(OBzl-)-Ser-Asn-Gla-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg- Ala-Arg-Leu-NH2, HCl Au précédent sel de TFA (45 mM) dissous dans 400 ml de DMF et neutralisé par de.la NEM, on ajoute 22,2 g de BOP (50mM) puis, en 1 h, 30 g (45 sel) de Boc-Glu(OBzl)Ser-Asn-Gln-OH en solution dans 300 ml de DMF. Le pH du milieu réactionnel est maintenu à 6. Après 6 h, le milieu est concentré de moitîé sous vide à 30 C puis versé sur 1 200 ml d'acétate d'éthyle. Le précipité forme est filtré, lave à l'acétate d'éthyle, puis à L'éther et finalement séché sous vide. RENDEMENT : 60,5 g (75 %) Produit identifie par RMN et AAA : Asp : 1,00 - Ser : 0,81 Glu : 2,71 - Gly : 0,89 - Ala : 1,82 - Leu : 0,96 - Arg : 3,02 IIPLC phase réverse EPP 70 % CCM : EPAW 30/20/10/6 Rf = 0,35 4 ) H-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg Ala-Arg-Leu-NH2, TFA HCl 53,3 g (30 mM) du produit ci-dessus sont agités 35 min dans 250 mi de dichlorométhane plu 250 ml de TFA. Après concentration sous vide de moitie, le résidu est versé sur 1 300 ml d'éther glacé ; le précipité formé est ìltre, lavé à l'éther, puis séché sous vide sur potasse. 5 ) Boc-Ser-Arg-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu (OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCl Le precedent sel de TFA est dissous dans 300 ml de DMF et neutralisé par la NEM. On ajoute 14,8 g de BOP (33 mM) puis par petites portions en 1 h 21,4 g (30 sel) de Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH. Le pH du milieu réactionnel est maintenu autour de 6 par la NEM. A Apres 7 heures, le milieu est verse sur 2 1 d'ACOEt. Le précipité obtenu est filtré, lavé à l'acétate d'éthyle, puis à l'éther et enfin séché sous vide. RENDEMENT 57 g (80 %) Produit indentifie par RMN, AAA - Ser : 1,7 - Arg : 4,1 - Glu : 4,7 Gly : 2,05 - Asp . 1,00 - Ala : 1,91 - Leu : 0,97 - CCM BPW1 - Rf : 0,35 6 ) H-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl) Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, TFA, HCl 14,21 g (6 sel) du produit précédent en suspension dans 80 ml de dichloromélhane sont traités en 10 min sous azote par 120 mi d'acide trifluoroacétique. Après 45 enfin à TA sous agitation, on concentre sous vide au 1/3 du volume initial et coule sur 750 ml d'éther froid (+4) agité. Le precipite est filtre et lave à l'éther puis seche sous vide sur potasse puis anhydride phosphorique.On obtient ainsi 13,9 g (97 %) de produit utilisé tel quel dans la réaction suivante. 7 ) Boc-Asp-(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl) Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu NH2,HCl 5,82 g (10 mM) de Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH2 en solution dans 76,6 ml de DMF sont traites entre -20 et -25 par 6,56 ml (40 mM) d'HCl gaz 6,0 N/dioxane, puis par 1,45 ml (12 mM) de nitrite de tertiobutyle en solution dans 5 ml de DMF.Après 1 h entre -20 et -25 on neutralise à pH apparent de 6-7 par addition d'environ 8 ml de diisopropylé thylamine (DIPEA) et ajuste le volume total à 100 ml par un peu de DMF, ce qui conduit à une solution d'azide à 0,1 molaire (qui est toujours conservée vers -20 ). 13,84 g (environ 5,8 mM) du sel de TFA précédent dissous dans 58 ml de DMSO et 87 ml de DNF sont neutralises à pH apparent de 6,7 par I ml de DIPEA et la solution ainsi obtenue est additionnee en 10 min environ 72,5 ml (soit environ 1,25 équivalent) de la solution d'azide ci-dessus à température comprise entre -20 et -25 . Le pH est ajusté à 6-7 par un peu de DIPEA et la solution conservée à -15 .Après 16 h, 14,5 ml (0,25 équivalent) supplémentaires de la solution d'azide sont ajoutes. Un contrôle en CCM montre une réaction complète après 24 h, cependant la reaction n'est stoppee qu'après 40 heures par coulee de la solution sur 750 ml d'acétate d'éthyle glacé, agité. Le précipité ainsi formé est filtré et lavé abondamment par le même solvant et séché sous vide en présence d'anhydride phosphorique. On obtient ainsi 14,35 g utilisés tels quels dans l'étape suivante. 8 ) H-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn Gln-Arg-Gly-Ala-Ala-Arg-Leu-NH2, TFA, HCl 14 g du produit ci-dessus sont agitès 35 min dans 80 ml de CH2Cl2 + 120 ml de TFA + 10 ml HS(CH2)2 SH. Après concentration sous vide de moitié, le milieu réactionnel est versé sur 800 ml d'éther glace. Le précipite obtenu est filtre, lavé à ltether, puis seche sous vide sur potasse. RENDEMENT : 100 % 90) Boc-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gly-Glu(OBzl) Ser-Asn-Gln-Glu-(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu NH2, HCl Au sel de TFA obtenu ci-dessus (4,9 mM) dissous dans 120 ml de DMF plus 30 ml de DMSO et neutralise par de la NEM, on ajoute 740 mg d'HOBt (5,5 mM) puis par petites portions 2,02 g de Boc Gln-ONp (5,5 mM), le pH du milieu réactionnel est maintenu vers 6 par addition de NEM. Après 6 h, le milieu réactionnel est versé dans 800 ml d'AcOEt. Le précipite obtenu est filtré, lave à l'acétate d'éthyle, puis à l'éther, puis seche sous vide. POIDS : 14,8 g RENDEMENT : 100 % Le produit est identifie par RMN et AAA : Asp : 1,97 - Ser : 2,0 Glu : 6,12 - Gly : 2,06 - Ala : 2,06 - Met : 0,55 - Ile : 0,93 Leu : 0,99 - Arg : 3,81 - CCM : Rf 0,45 - BPEW1 10 ) H-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl) Zer-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu NH2, TFA, HCl 14,7 g du produit ci-dessus sont agités 35 min dans 80 ml de CH2C12 + 10 ml HS(CH2)2SH + 120 ml de TFA. Après concentration sous vide de moitie, le milieu réactionnel est verse sur 600 mI d'éther glacé. Le precipite obtenu est filtré, lave à l'éther puis seche sous vide sur potasse. POIDS : 14,5 g. 11 ) Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCl Au sel de TFA obtenu ci-dessus (4,9 mM) dissous dans 120 ml de DMF + 40 ml de DMSO et neutralisé par de la NEM, on ajoute 2,44 g de BOP (5,5 mM) et 4,2 g de Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-OH, HCl (5,5 mM) par petites portions en 30 min. Le pH du milieu réactionnel est maintenu vers 6 par addition de NEM. Après 23 h, le milieu réac- tionnel est versè sur 1 litre d'AcOEt Le précipité formé est filtré, lavé par AcOEt puis Et2O, puis séché sous vide. M : 16,5 g ~RENDEMENT : 93 % - Produit identifie par RMN et AAA Asp : 2,10 -Ser : 1, 86 - Glu : 6,2 - Gly 4 2,00 - Ala : 2,00 Met : 0,55 - île : 0,80 -Leu : 2,89 - Lys : 0,87 - Arg : 4,67 - CCM Rf : 0,40 (BPEW1). Exemple XII : Synthèse de : Boc-Ile-Phe-Asn-Thr-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala OH, HCl (peptide J) 1 ) H-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3 10,3 g (18,8 mM) de Boc-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3 sont agités 35 min dans 100 ml de dichlorométhane contenant 100 ml de TFA. Le milieu réactionnel est concentre sous vide à environ 50 ml et verse sur 300 ml d'éther. 2 ) Boc-Tyr-Arg(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3, HCl Au sel de TFA obtenu ci-dessus, dissous dans 200 ml de diméthyformamide et neutralise par de la N-éthylmorpholine, on ajoute 18,9 g (18,8 mM) de Boc-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OH, HCl puis 9,2 g de BOP (21 mM) puis de la NEM pour amener le pH du milieu réactionnel vers 6. Après 4 h d'agitation, le milieu réactionnel est verse sur 1 1 d'AcOEt. Le précipite obtenu est filtre, lave 3 fois par 100 ml d'AcOEt, puis 3 fois par 100 ml d'Et20 puis il est séché sous vide. On obtient 24,16 g de produit. RENDEMENT : 90 % CCM Rf : 0,20 (BEW1) - alpha D : -17,6 - (Cc : 1 - DMF à 5 7. d'AcOH) Produit identifie par 1H RMN et AAA : Ser : 1,01 - Glu : 0,99 Gly : 1,06 - Ala : 1,01 -Val : 0,98 - Leu : 1,97 - Tyr : 1,00 Lys : 0,98 - Arg : O,99-HPLC en phase reverse (EPP : 92 %) 3 ) H-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Arg-OCH3, HCl, TFA 8,66 g (6,1 mM) du produit ci-dessus sont agites 35 min dans 37 ml de dichloromethane + 3,5 ml d'anisole + 40 ml de TFA. Apres concentration sous vide de moitie, le résidu est verse sur 300 ml d'éther glace ; le precipite blanc obtenu est filtre, lave à l'éther puis seche sous vide sur potasse. POIDS : 8,68 g RENDEMENT : 100 %. 4 ) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-N3 5,94 g (8,55 mM) de Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-NH-NH2 sont dissous dans 27 ml de DMSO + 37 ml de DMF. Après refroidissement à -250C, on ajoute 6,1 ml d'une solution HCl/dioxanne 5,6 N puis 1,23 ml de nitrite de tertiobutyle (1,2 équivalent) prêdiué dans 5 ml de DMF prérefroidi à -20 C.Après lh15 min d'agitation entre 200 et -25 C, on ajoute 6,1 ml de diisopropyléthylamine (DIPEA) pour amener le pH vers 6, puis on ajoute 3 ml de DMF pour amener le volume à 85 ml et on conserve cette solution à -25 C 5 ) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3, HCl Le sel de TFA obtenu à l'exemple XI-3 ), dissous dans 70 ml de DMF, est neutralise par de la DIPEA puis ajoute en 15 min à 70 ml de la solution d'azide obtenue ci-dessus à -20 C. Puis on ajoute de la DIPEA pour amener le pH vers 7, on agite 1 h à -200C, puis on conserve le milieu à -12 C. Après 22 h, on ajoute 5 ml de la solution d'azide et remonte le pH vers 7 par DIPEA.Après 45 h, on rajoute le restant de la solution d'azide et remonte le pH vers 7 par DIPEA. Après 74 h, le milieu réactionnel est verse sur 1 200 ml d'acetate d'éthyle. Le précipité blanc obtenu est filtré, lavé à l'acétate éthyle puis à l'éther, puis seche sous vide. POIDS : 10,46 g RENDEMENT : 86 % Par concentration des eaux mères et reprêcipitation par un mélange acétate d'éthyle-éther, on obtient un 2e jet qui permet d'avoir un rendement global de 95 %. Le produit de couplage est identifié par 1H RMN et AAA : Asp : 1,02 -Thr : 1,03 - Ser : 1,91 -Glu : : 0,97 - Cly : 1,06 - Ala: 1,06 - Val : 1,00 - île 0,94 - Leu : 1,98 Tyr : 1, 04 - Phe : 1,02 - Lys : 0,94 - Arg : 1,02 - CCM Rf : 0,20 (BEW1) - HPLC en phase reverge (EPP : 90 %). 6 C) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Gly-Gln Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OH, HCl 5,3 g (2,7 mM) du produit obtenu ci-dessus sont dissous dans 40 ml de DMSO + 6 ml d'eau ; on ajoute goutta à goutte 10 ml de soude 1N, on agite 30 min puis neutralise par 10 ml d'acide chlorhy drique lN . Le milieu réactionnel est versé sur un litre d'acétate d'éthyle. Le précipité obtenu est filtré, lavé 4 fois à l'acétate d'éthyle puis 2 fois à l'eau, puis 4 fois à l'éther, puis il est séché sous vide sur P205. Poids : 4,56 g RENDEMENT : 86 % - Produit identifié par 1H RMN et AAA - CCN : Rf 0,5 BEW1 Exemple XIII : Synthèse de Z-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu Cly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg Gln-Gln-Gly(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu NH2, HCl (CRF 1-44 protege) 1 ) H-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg Glu-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCl, TFA. 1,4 g du produit de l'exemple X-110) sont agites 35 min dans 60 ml de CH2C12, + 70 ml de TFA + 7 ml d'éthanedithiotAprès concentration sous vide de moitié, le résidu est verse sur 500 ml d'ether glace. Le precipite obtenu est filtre, lave a ltether) puis seche sous vide sur potasse. POIDS : 7,44 g. 2") Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu (OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCl A 6,6 g de sel de TFA ci-dessus (1,9 mM) dissous dans 36 ml de DMSO + 90 ml de DMF et neutralisé par de la NEM, on ajoute 1,0 g de BOP (2,3 mM) > puis 3,8 g du peptide de l'exemple XI-6 ) (1,9 mM), le pH du milieu réactionnel est amené à 6 par de la NEM. Après 19 h, on ajoute 1,15 mM de BOP. Après 26 h, le milieu réactionnel est verse sur 600 ml d'AcOEt. Le précipité obtenu est filtre, lave par AcOEt, puis filtré et seche sous vide. RENDEMENT : 88 % (9,2 g) Produit identifie par RMN et AAA. 3 ) H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln Leu-Ser- la-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-lle-llet- Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl) Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 HCl, TFA 9,1 g du produit ci-dessus sont agites 35 min dans 100 ml de TFA + 5 ml d'ethanedithiol. Puis le milieu réactionnel est verse sur 500 ml d'éther glace. Le précipite obtenu est filtré, lavé par Et2O, puis seche sous vide sur potasse. RENDEMENT : 100 %. 4 ) GRF-1-44 protégé A 9,10 g du précédent sel de TFA (1,66 mM) en solution dans 50 ml de DMF et 50 ml de DMSO et neutralise par la NEM, on ajoute 1,18 g du peptide decrit dans l'exemple IX-3 ) (1,78 mM) et 0,79 g de BOP (1,78 mM) ; le pH est maintenu vers 6 par de la NEM. Après 23 h, à TA, le milieu réactionnel est verse sur 600 ml d'AcOET. Le précipite formé est filtré, lave à l'acétate d'ethyle, puis à l'éther et finalement seche sous vide. RENDEMENT : 8,54 g (84 %) Contrôle RMN et CCM : AAA : Asp : 4,2 -Thr : 0,92 - Ser : 4,02 Glu : 7,37 (pour 7) - Gly : 3,14 (pour 3) - Ala : 5,11 - Val : 1,01 Met : 0,61 - Ile : 1,84 - Leu : 4,98 - Tyr : 1,87 - Phe : 0,95 Arg : 5,90. Exemple XIV : Deprotection du GRF-1-44 : 4,5 g du produit obtenu selon l'exemple XII-4 ) sont agités 1 h à 0 dans 180 ml de TFA contenant 19,8 ml de TFMSA, 27 ml de thioanisole et 11 ml de métacrésol. On ajoute ensuite 1 1 d'éther. Le précipité obtenu est filtré, lave à l'éther puis séché 1 h sous vide en présence de potasse. Le produit est redissous dans 200 ml d'eau et on ajoute dela résine echangeuse d'ions Amberlite IR 45 (sous forme acétate) afin de ramener le pH à 4,5. On agite le milieu 30 min à TA. La resine est filtre, lavée à l'eau et les filtrats concentrés à 50 ml puis lyophilises. RENDEMENT : 3,85 g Contrôle par RMN de la disparition des groupements protecteurs Z et OBzl. CCM (BEPW1) : tache majoritaire Rf 0,38 Exemple XV : Purification du GRF-1-44 La peptide deprotége obtenu dans l'exemple precedent (XIII) est soumis à une chromatographie sur gel de Sephadex G 50 (fine) en utilisant l'acide acétique à 30 % comme éluant. Les fractions contenant le peptide attendu sont reunies, évaporées et lyophilisées. Le lyophilisat ainsi obtenu est purifié à son tour par une chromatographie sur un echangeur de cations du type CM-32 carboxymêthyl- cellulose (Whatman) en utilisant un gradient linéaire d'acétate d'anmonium compris entre 0,1 M (pH 4,5) et 0,4 M (PH 6,5). Par exemple, pour 1 charge de 1 g de peptides à purifier, on utilisera une colonne à chromatographie ayant un volume de lit de 50 ml environ pour une hauteur de 20 cm. Les fractions contenant le peptide avec un degre de purete # à 80 % (HPLC) sont reunies et lyophilisées jusqu'à poids constant (afin d'éliminer le tampon CH3CO2NH4). Enfin, le précédent lyophilisat est soumis à une chromatographie de partition en utilisant comme support de la phase liquide stationnaire le Séphadex G 50 fine et à l'aide du système de solvants suivant : n-butanol/ethanol/pyridine/acide acétique 0,2N dans la proportion de : 4/1/1/7 (en volumes). Les fractions de chromatographie sont contrôles par HPLC et celles dont le titre de purete est # à 95 % sont réunies et lyophilisées Le produit est finalement contrôlé par analyse des amino-acides Tyr : l,91 (2) Arg : 5,89 (6) Ala : 4,88 (5) Lys : 1,98 (2) Asn, Asp : 3,86 (4) Val : 1,01 (1) Ile : 1,96 (2) Leu : 5,10 (5) Phe : 0,93 (1) Gly : ,98 2,98 (3) Thr : 1,02 (1) Gln, Glu : 6,82 (7) Ser : 3,88 (4) Met : 0,91 (1) SYNTHESE OU FRAGMENT 20-44 (25 aa) :PEPTIDE X 13az1 H H HH I J I I BO. BocGlu-Arg-Gly-oH a H-Ala-ArS-Ala-Ar~-Leu-blH2 ~ (puis H j [A] OBzl H H+ // / Hr,I u-Arg-GIy-Ai a-Arg-Ai aArgrLeu,NH 03ti BOP kc-61 u-Ser-AsnWl n-OH puis il r EBX OzI i+ M H+ H+ w / H-GI u-Ser-As n -G1 n-Si u-Arg-Si y-Ai a -Arg-AI a -Ar-Leu-fln2 HI 80P | Boc-Ser-APg-GTA-ln-ly-O puis + LC H OBZ1 Par OBzl H H+ f / f / H-Ser-Arg-Sin -r,i n-Sly-SI u-Ser-Asn-SI n-Si u -Arg-S1 y-Ai a-Ar--A a-'4r-Leu-NH2 (Curtius) OBzl puis H Boc-Asp-Ii e-Met-213 Boc-Asp-Ile-et-, Ogzl H+ Oss2i QBzl H+ H 1/ I H-As-Il e-Met-Ser-Arg-Gl n-Gi n-Gly-C1 u-Ser-Asn- > i n-G1 u-Arg-Gi y-41 a -Arp -1 a-Arg-l.eu-ttH2 Bcc Boc-Sin-ONo puis H+ OBzl t 9 OBzl ORzl H+ H I I M-61n-sp-;;1 è-Yer-Ser-Prg-rJ1 n-Si n-SI y-Si u-Ser-sn-Si n-Si u-Arg-Si y-A' a-Arq-Ai a-SrO-LÊu-l( H+ n-Asp- 11 e-Me*-Ser-Ars-51 n-,l n-Gl y-Gl u-Ser-4sn-Gl n-Gl u-Arg-Gl y-AI a H+ Z 3op puis H Eoc-Ary-1ys-Leu-Leu-OH . , r n i, 08zt H OPZ1 08zl H I , I I ~-^r S-Leu-lou-51n-:so-tie-Me±S-.-Ar;-G'n-Gln-Gly-Glu-Ser-4sn-aJinZ1u-Ars-G'y-Ala H A > -3-Ala-Arg-; Hz - Schéma I SYNTHESE DU FRAGMENT 5-19 (15 acides @ aminés) : PEPTIDE J H Z 1. -oc-Tjr-4rg-Lys-Val -Leu-Gly-OH + H-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3 fF BOP puis H+ ; H+ Z H- .tyr-Arg-Lys-Val -Leu-Gly-Gl n-Leu-Ser-Ala-OCH3 Curtiur Soc- Il e-Phe-sn-Thr-Ser-NH-!iH2 puis OH rH] H+ Z 1 i Soc- I'e -Phe-Asfl-Thr-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val -Leu-Gly-Gl n-Leu-Ser-Aia-OH - Schéma II PASSAGE A LA SEQUENCE DU GRF 1-44 Peptide J + peptide K BOP puis H+ H+ Z H Z 8zl J F [ 1 le- Pe-Asn-Thr-Ser-Tyr-Arg-Lys -Val -Leu-Gly-GI n-e"-Ser-;;0 a-Ara-Lys-Leu-Leu-Si n-Aso- lie 5:1 3:1 H+ Hf Ht I Il I I - Met-ser-Ar9-Gl n-Gl n-Gl y-âl u-Ser-Asn-Gl n -G1 u-Arq-Gly-Al a-}srg-Ala-Ar9-Leu-NH2 OBzl aOP puis H fcrt | Z-Tyr-Ala-Ásp-Ala-OH (peDtide I) GRF - 1-44 - Schéma III TABLEAU I (fragment A) A,)a Arg -AlaAr,3 A,a -slcL---Lse, Ara SLeuNH t t I 't l Ne 2 t t t t q t t I t I 80 OH t L t ' t NH2 I t t t t t t NO 2 i, 2 $ I I t t t t Oc t I TFA 2 t. ,N02 t t. I 5 Oh' 2 t I t t BOP j 803 f NO z t I t I t ; 0C ' ' NH 2 tN0z I NO, TFA Bac " if Off H NH 'OH ' ' 2 I BbP t I I I t t t t t t 2 1 v I ,/eN02 - Bcc L , NH2 t t t t I t t t NO z-f-CIH H wNG2 + EH 2 1 t t t t BOP t ' NO t Z 2 NH2 t w -H TE2,3 EC1 G1 u, Arg - ,Gly a a a a a a a a a : N02 a . a a a a ZCH H- OBzl . l a a a BOP a a a 0Bzl a a a a a a t t H t a a - a a I J i OBzl ' P 1 J Boc LONp H -,' OH . . . a a a OBzl . M OH Boc 1/ s ! oy Tableau II - (sous-fragment B1) Ser u . ~ Ser - Asn GIn Boc ' OH I I 1 I BOP I I I I ' Boc t OBzl 1- BocOH H -1- - - I li- OBzl swap I I I I I Boc ! I-L I 1 " 0Bzi I I I 1 I . I I I H I I I I . I . I I I I I I I i QBZ1 j t ., . . 7 80c 'zONp H~' I OH I I I I I I I I I ' OBzl l g Bac D ~~~ i ON Tableau III - (sous fragment B2) ~~~~~~~~ Ar,g Gin Cl,n Gly a a a I I a ' H ' OCH I a a a a I t I a a I a a a a a a B? a SSr 4rg Gltn Gln Gly a Z oh H a OCH a a 3 1 1 a I a H i ',NO 2 a 2 =-1- H3 H2 a 'I OH H a NO2 ,a a I I a B oc a | oh H j xN i 1 TFA : Boc -- I Boc : NO ---cc- OCR3 Boc , ' H s ~ OH Boc I I OH Boc Tableau IV - (fragment C) Asp 11e et I 1 I I I I I I f I I I Boc ' NH-NH-Troc I I I I I f I 1 I I I I BoclONSu H . t NH-NH-Troc I I . I I I I I I I I I I Boc 'I .. ., I NH-NH-Troc I I l l l . I I j ,OBzl 80cgONSu H ' I NH-NH-Troc I I I I I . I I 0Bzl I I I Boc I ' NH-NH-Troc I I I I I I I I I I OBzl , . Boc !/ , , , , ', NH-NH2 Tableau V - (fragment D) ArS Lys - Leu ~ . Leu I I I l I I I I I I Boc ' ONSu ' O-CH M3 I I I I I I I I I I I I Boc. ' , ≈ 3~CU 3 I I I TFA I z I 'Z I I I Boc, H oïcp H ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~O-CH I I I I I I I I I I i I I I I I i I I 'z 'I Boc K j 0-r}i 3 TFA j Z j 1 ! Boc OH H I Boc T oh I : O-CH3 I I I / I BOP I I I I I I I Boc I I l OH O-CH3 Boc o ' r OH Tableau VI - (fragment E) Gln -------------- Leu ------------- Ser ------------ Ala Boc -------------- ONB H ------- O-CH3 Boc ----------------------------- O-CH3 TFA # I I Boc ------- OH H -------------- O-CH3 BOP # I I Boc ------------------------------------------- O-CH3 # TFA Boc ------------- ONp H --------------------------------------------- O-CH3 I I | | Boc ------------------------------------- ' 0-CH3 Tableau VII - (fragment F) Tyr Arg --- Lys --- Val --- Leu --- Gly I I I &verbar; l I I I I I I I I l l ~~~~~~ Z | OH H : O-CH 3 BOP & BR II I a t , Z ' O-CH3 f H, L s s s {l Boc OH H , - O-CH3 3 t l l l B B oc ' - I I O-CH3 I I Z Boc OTcp H , -r-- ,- / ' O-CH 3 v : z ' I V Boc ; a ' - ' O-CH3 + t7 t I I I Boc H oh H S - --- O-CH OH ' : B I H : Z , /Z P v I I Boc 'J ::A S 0CH3 1 O-CH, f : /H TFA Boc ---1 t l Boc OTcp H , + I I - I 3 I H ss ia I I B oc- ' - 1 , O-CH3 l I I I I. Z ' NaOH I Z : I I I I s Boc I " OH Tableau VIII - (fragment G) Ile ------------- Phe -------------- Thr ---------------- Asp --------------- Ser I I Boc ---------- ONb H-------- OCH3 TFA # I I Boc ---------------------------- OCH3 I I | I I Boc --------- ONSu H ---------------------------- OCH3 I I I TFA # Boc --------------------------------------------------- OCH3 I I I I Boc -------- ONp H ------------------------------------------- OCH3 TFA # Boc -------------------------------------------------------------- OCH3 I I I I I I I I I Boc --------- ONSu H ------------------------------------------------------- OCH3 I I I I I I I Boc ------------------------------------------------------------------------------ OCH3 # NH2 -NH2,H2O Boc ------------------------------------------------------------------------------ NH-NH2 Tableau IX - (fragment H) Tyr . Asp , . Asç ^la l E 0Bz E E E E E E E E E E Boc YONSU H E E 0zi E E E E E E E Boc, E 80c Y ! OBu E E E E r I OBzl cC E E i-A E E E E 80c , OTcp H Y , E E E l E E E E E E E . E E E E Boc ≈ / HL, ;;0BZ0 TFA l' 1 I I I .1 , 08zl t E E E I E E E E ' P. Tableau X - (fragment t I) REVENDICATIONS 1 - Procédé de synthèse en phase liquide et par fragments des hpGRF 1-44 et hpGRF 1-40, caracterise en ce que l'on couple successivement et dans l'ordre de la séquence du GRF les 3 fragments pepti disques 1)H-Arg-Lys (Z)--Leu-Leu-Gln-Asp (OBzl) - Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln Gly-Glu (OBzl) -Ser-Asn-Gln-Glu- (OBz1) -Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg Leu-NH2 (séquence 20-44 du GRF dit peptide K), ou le fragment peptidique correspondant à la séquence 20-40 du GRF 2) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys (Z) - Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser Ala-OH (séquence 5-19 du GRF dit peptide j) 3) Z-Tyr-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH (sequence 1-4 du GRF dit peptide I) ; fragments dans lesquels a) les fonctions acides latérales des acides aspartiques et glutamiques et la fonction amine laterale de la lysine sont pro tégées par des groupes protecteurs stables dans les conditions de déprotection du groupement tertiobutoxycarbonyie (Boc) b) la fonction guanidine de llarginine est protégée par protonation et, c) l'acide aminé N-terminal du fragment J est protêgé sur l'amine par le groupement Boc, eliminable sélectivement en phase d'élongation du GRF par hydrolyse à l'acide trifluoroacétique, les couplages étant effectués dans un solvant polaire aprotique et, en ce qu'on élimine en fin de séquence tous les groupes protecteurs par hydrolyse à l'aide d'une solution 0,1 à 1 M d'acide méthanesulfonique ou trifluoromêthanesulfonique dans l'acide trifluo roacé tique. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'après chaque opération du couplage le produit obtenu est isolé du milieu réactionnel par precipitation à l'aide d'un solvant apolaire. 3 - A titre de produits nouveaux, les peptides intermediaires mis en oeuvre dans le procédé selon l'une des revendications 1 ou 2. 4 - Peptide intermédiaire selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est le peptide K (séquence 20-44 du -GRF) obtenu par couplage successif en phase liquide des sous-fragments ciaprès dans l'ordre de la séquence du CRF H-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 (40-44) dit fragment A Boc-Clu(OBzl)-Arg-Cly-OH (37-39) dit fragment B1 Boc-Clu(OBzl)-Ser-Asn-Cln-OH (33-36) dit fragment B2 Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH (28-32) dit fragment C Boc-Asp(OBzi)-Ile-Met-NH-NH2 (25-27) dit fragment D Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-OH (20-23) dit fragment E dans lesquels a) les fonctions acides latérales des acides aspartiques et glutamiques et la fonction amide latérale de la lysine sont protegees par des groupes protecteurs stables dans les conditions de dé protection du groupement Boc ; b) la fonction guanidine de l'arginine est protegee par la protonation et, c) l'acide amine N-terminal des fragments B1, B2, C, D, E est protège sur l'amine par le groupement Boc éliminable sélectivement en phase d'élongation du peptide par hydrolyse à l'acide trifluoroacé- tique, les couplages étant effectues dans un solvant polaire aprotique 5 - Peptide intermédiaire selon la revendication 3, caracterise en ce qu'il est le fragment peptidique ayant la séquence 20-40 du GRF, obtenu par couplage successif en phase liquide des sous-fragments ci-après dans l'ordre de la séquence du GRF H-Ala-NH2 Boc-Glu(OBzl)-Arg-C-ly-OH (37-39) dit fragment B1 Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-OH (33-36) dit fragment B2 Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH (28-32) dit fragment C Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH2 (25-27) dit fragment D Boc-Arg-Lys(Z)-Leu-Leu-OH (20-23) dit fragment E dans lesquels a) les fonctions acides laterales des acides aspartiques et glutamiques et la fonction amine laterale de la lysine sont pro tétées par des groupes protecteurs stables dans les conditions de deprotection du groupement Boc b) la fonction guanidine de l'arginine est protegee par la protonation et, c) l'acide aminé N-terminal des fragments B1, B2, C, D, E, est protégé sur l'amine par le groupement Boc éliminable sélectivement en phase d'élongation du peptide par hydrolyse à l'acide trifluoroacétique, les couplages étant effectués dans un solvant polaire aprotique. 6 - Peptide intermédiaire selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est le peptide J obtenu par couplage successif en phase liquide des sous-fragments suivants dans l'ordre de la séquence du GRF, H-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3 (16-19 dit fragment F) Boc-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OH (10-15 dit fragment G) Boc -ile-Phe-Thr-Asn-Ser-NH-NH2 (5-9 dit fragment H) dans lesquels ::' a) la fraction amine latérale de la lysine du fragment G est protégée par un groupement protecteur stable dans les conditions de deprotection du groupement Boc b) la fonction guanidine du fragment 10-15 est protégée par protonation ; c) l'acide aminé N-terminal des fragments G et H est proue sur l'amine par le groupement Boc, éliminable selectivement en phase d'élongation du peptide par l'hydrolyse à l'acide trifluoroacetique les couplages étant effectués dans un soivant polaire aprotique. 7 - Peptide intermediaire selon la revendication 3, caracterise en ce qu'il est le peptide I obtenu par synthèse en phase liquide dans laquelle a) la fonction latérale acide de 1' acide aspartique est protegee par un groupe protecteur stable dans les conditions de dépro- tection du groupement Boc b) l'acide alpha amine N-terminal est protege sur l'amine par un groupement clivacle dans les conditions de dèprotection des groupements protecteurs des chaînes latérales.