FR 2557457 A1 19850705 FR 8320912 A 19831228 La présente invention est relative a un nouveau procédé de préparation de i'Antigène tuberculinique L. La tuberculine est comme on le sait un agent ae diagnostic permettant de déceler la sensibilisation d'un su 3et aux bacilles tuberculeux qu'il s'agisse de bacilles de Koch virulents ou du vaccin BCG. La sensibilité à la tuberculine se manifeste par un phénomène allergique qui se traduit par une réaction oedémo-érythémateuse consécutive à une application cutanée (par cuti-réaction ou injection intradermique) de tuberculine ; cette réaction se manifeste par l'apparition d'un érythème ou d'une papule de torme sensiblement circulaire dont le diamètre est lié à la dose injectée et à la sensibilité du sujet. Depuis les filtrats concentrés de cultures de bacilles tuberculeux préparés par KOCH, on a cherché à purifier la tuberculine de façon de plus en plus poussée, pour en améliorer l'activité et la spécificité soit vis à-vis de lespe- ce bacillaire, et de son état (vivant ou inactivé), soit visà-vis de la mesure du degré de résistance du sujet. Formulant l'hypothèse que la partie active de la tuberculine est constituée par des substances protidiques. les Chercheurs ont, conformément à l'Art antérieur, essentiellement visé à isoler ces substances protidiques sous le forme la plus pure possible, dans le but d'obtenir un produit hautement actif et éviter les réactions non spécifiques de la tuberculine. C'est ainsi que les travaux de LONG et SEIBERT BCf ANN- REV OF TUBERC , 59, 1949 p 86g ont permis dtiso- ler un produit de haute activité connu sous le nom de tuberculine PPD (purified protein derivative) qui constitue enoutre, un étalon de référence. Toutefois comme le procédé d'isolement des protéines proposé par LONG et SEIBERT présentait l'inconvénient de donner des produits présentant des caractères chimiques et une activité biologique variables, J. BRETEY et A. LAMENSANS Cf. C.R ACAD SC PARIS, 16 Mai 1951 p 1880-1882 propo sèrent un autre procédé qui permettait d'extraire des cultures de bacilles tuberculeux pratiquement la totalité des substances protidiques douées de propriétés tuberculiniques. Cependant, F. ROMAIN, S. AUGIER-GIBORY, E. VERS MISSE et J. AUGIER ont observé récemment SCf. C.R. ACAD SC. PARIS, 293, 23 Novembre 1981, p. 631-6333 que certaines tuberculines présentent une activité 5 à 10 fois plus forte que d'autres, selon la méthode de sensibilisation des animaux utilisés pour le titrage. L'évaluation de l'activité d'une tuberculine est habituellement réalisée par la mesure du diamètre de la réaction oedémo-érythémateuse provoquée par son injection intradermique chez le cobaye sensibilisé, comparativement à la mesure du diamètre de la réaction obtenue par l'injection d'une tuberculine standard servant de référence. Or au cours de leurs travaux, F. ROMAIN et Al., ont constaté que certaines tuberculines ont une activité beaucoup plus grande - exprimée par son titre en unités TU/mg - en hypersensibilité retardée chez les cobayes sensibilisés avec des bacilles vivants tels que le bacille BCG, que chez les cobayes sensibilisés par des bacilles inactivés et que l'activité de ces tuberculines peut être 5 à 6 fois supérieure dans le premier cas que ce qu'elle est dans le second cas.Ils ont pu attribuer cette différence d'activité à la présence d'un antigène, dénommé Antigène L, qu'ils ont isolé à partir de tuberculine IP 48 purifiée selon le procédé de J. BRETEY et A. LAMENSANS mentionné plus haut, par chromatographie sur DEAE-Cellulose et traitement de la fraction passant avec le volume mort de la colonne, par concentration précipitation par l'acétone dissolution dans l'eau, précipitation par l'acide trichloracétique, séparation du surnageant qui est précipité par l'acétone, puis a nouveau précipité par l'acide trichloracétique, le surnageant obtenu étant précipité par l'acétone pour donner une fraction Aac II contenant l'Antigène L, dont l'activité est 5,57 fois supérieure à celle de la fraction B qui est passée entre 0 005 M et 0,1 M dans la colonne de DEAE-Cellulose et a été concentrée et extraite par entraînement par un précipité d'acide benzoïque. Le titre de la fraction Aac il est de 82 500 TU/mg, et celui de la fraction B est de 14 800 TU/mg ; cependant, le rendement en fraction Aac II n'est que de 8 e environ. Ce faible rendement, ajouté à la complexité du procédé, a amené les Inventeurs à rechercher un nouveau procédé d'isolement de l'Antigène L qui permette de réaliser une purification plus poussée encore de la tuberculine de départ et d'obtenir une fraction pratiquement uniquement constituée par de l'Antigène L, présentant un titre plus élevé que précédemment qui permette d'obtenir des rendements plus élevés en fraction riche en Antigène L et qui soit d'une mise en oeuvre relativement simple et rapide. La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'antigène tuberculinique L à partir d'une cultu- re de bacilles tuberculeux, caractérisé en ce qu'on isole une fraction riche en Antigène L. dénommée fraction TP-G-DEAE dont le titre est supérieur à 100 000 U/mg sur des cobayes sensibilisés par du BCG vivant, à partir d'un filtrat de culture de BCG non inactivé soumis à un fractionnement préparatif qui comprend une étape de précipitation dudit filtrat par de l'acide trichloracétique à 2 % concentration finale, une étape de précipitation du surnageant recueilli, par de l'acide trichloracétique à 10 % concentration finale, reprécipita- tion du précipité ainsi obtenu préalablement dissous dans un faible volume d'eau, par de l'acide trichloracétique à 10 % concentration finale pour obtenir une fraction dite TP-G-TCA 10 qui, après dissolution dans un faible volume d'acide acé- tique et élimination du léger précipité formé, est fractionnée sur une colonne de résine échangeuse d'ions faiblement acide, pour recueillir la fraction correspondant au pic le plus actif sur cobayes sensibilisés par du BCG vivant, passant en fin de volume mort dénommée fraction TP-G-CM, laquelle fraction est elle-même soumise à un fractionnement sur une colonne de résine échangeuse d'ions basique, pour recueillir la fraction correspondant au pic le plus actif sur cobayes sensibilisés par du BCG vivant, passant en fin de volume mort, dite fraction TP-G-DEAE dont le titre est supérieur à 100 000 U/mg. Selon un mode de réalisation préféré du procédé objet de la présente invention. la fraction TP-G-DEAE est elle-même soumise à une chromatographie de gel-filtration, par tri moléculaire, pour recueillir la fraction qui passe à la fin du volume mort jusqu'au début de l'inclusion, laquelle fraction est soumise à un dessalage par chromatographie sur tamis moléculaire, pour obtenir une fraction dénommée TP-G GF05, dont le titre est supérieur à 600 000 U/mg. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé objet de la présente invention, la colonne de résine échangeuse d'ions faiblement acide utilisée pour l'obtention de la fraction TP-G-CM, est équilibrée par une solution d'acide acétique 50 mM pH 3. Selon un autre mode de mise en oeuvre préférée du procédé objet de la présente invention la colonne de résine échangeuse d'ions basique utilisée pour l'obtention de la fraction TP-G-DEAE est équilibrée par du tampon TRIS-HCl 50 mM, pH 7. Par unité "U" on entend le 1/40 000 de mg de la fraction BR6 décrite sous le nom de "B" dans le C.R. Acad. Sci 1981, 293, 631-633. La fraction BR6 a elle-même été titrée en fonction l'étalon international de PPD humain (PPDM de Copenhague Staten Serum Institute). Pour la mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, on opère avantageusement comme décrit ci-après PREPARATION DE L'ANTIGENE L Le procédé de préparation de l'Antigène L conforme à l'invention, combine un processus de purification par pré- cipitation par l'acide trichloracétique, avec un processus de fractionnement sur colonnes de chromatographie. 10) On part d'un filtrat d'une culture de 12 semaines de BCG non inactivé, que 1 on précipite par de l'acide trichloracétique à 2 % concentration finale ; le précipité est écarté et on recueille le surnageant, que l'on précipite par de l'acide trichloracétique à 10 % concentration finale. Le précipité obtenu est redissous dans un petit volume d'eau et à nouveau précipité par de l'acide trichloracétique à 10 % concentration finale. Le précipité obtenu est désigné comme étant la fraction "TP-G-TCA 10". 2") On dissout la fraction TP-G-TCA 10 dans une faible quantité d'acide acétique, de préférence 50 mM, pH 3, on élimine par centrifugation le léger précipité qui se forme et on fait passer le surnageant sur une colonne de résine échangeuse d'ions faiblement acide telle que CM-Trisacryl-M équilibrée par une solution d'acide acétique à pH 3, de pré référence identique à celle qui a servi à dissoudre la fraction TP-G-TCA 10. Le pic passant en fin de volume mort, désigné comme étant la fraction TP-G-CM est la fraction la plus active sur cobayes sensibilisés par du BCG vivant. 3 ) ) On dissout alors cette fraction TP-G-CM dans une faible quantité de tampon TRIS-HCl 50 mM, pH 7 et on fait passer la solution obtenue sur une colonne de résine échangeuse a'ions basique telle que DEAE-Trisacryl-M, équilibrée par le même tampon pH 7 Le pic passant en fin de volume mort, désigné comme étant la fraction TP-G-DEAE, est la fraction la plus active sur cobayes sensibilisés par du BCG vivant. Le procédé combiné d'isolement par précipitation et par fractionnement sur colonne permet d'obtenir la fraction TP-G-DEAE avec un rendement qui est d'au moins 20 % par rapport à la fraction TP-G-TCA 10. 4 ) Le fractionnement est poursuivi en chromato graphiant la fraction TP-G-DEAE sur une colonne de tri moléculaire par gel-filtration, telle qu'une colonne d'agarose (type "SEPHADEX") ou .d 'acrylamide-agarose (type "ULTROGEL") . La fraction qui passe à la fin du volume mort jusqu'au début de l'inclusion et qui contient l'antigène L, est recueillie et dessalée par chromatographie sur tamis moléculaire (par exemple sur "TRISACRYL" GF05). La fraction TP-G-GFO5 obtenue présente une activité très élevée très supérieure à celle de la fraction TP-G-DEAE, sur cobayes sensibilisés par du BCG vivant et le rendement en fraction TP-G-GF05 est d'au moins 10 % par rapport au TP-G-TCA 10 mis en oeuvre en tant que matière première. PREPARATION DE LA SUBSTANCE DE REFERENCE POUR LE TITRAGE DE L'ACTIVITE DE L'ANTIGENE L On a recherché, parmi les très nombreuses fractions qui avaient été isolées au cours de recherches antérieures sur la purification des PPD, une substance de référence qui soit à peu près indépendante du mode de sensibilisation, que les cobayes soient sensibilisés par des bacilles vivants ou non. Dans ce but, on a comparé pour ces diverses fractions, les diamètres des réactions d'hypersensibilité retardée (HSR) obtenues sur cobayes sensibilisés depuis environ 3 mois, par du BCG vivant ou inactivé. La substance retenue donne, pour une même dose injectée sensiblement (à 8 0,5 mm) les mêmes diamètres pour les deux modes de sensibilisation.Il s'agit d'une fraction obtenue par fractionnement sur DEAE-Cellulose, d'une tuberculine humaine purifiée par fractionnement alcoolique d'une solution phénolique de tuberculine IP48 r lequel fractionnement donne deux fractions, à savoir une fraction qui traverse la colonne avec le volume mort, dénommée AR6, une autre fraction qui est retenue sur la colonne, dont elle est éluable par un tampon phosphate 0,2 M, pH 7, et qui est dénommée BR6. La traction AR6 donne des réactions beaucoup plus importantes avec les cobayes sensibilisés par du BCG vivant, tandis que la fraction BR6 donne sensiblement les mêmes diamètres pour les deux modes de sensibilisation (vivant et inactivé). C'est la raison pour laquelle cette fraction BR6 a été choisie comme substance de référence. MESURE DE L'ACTIVITE DES FRACTIONS ISOLEES L'évaluation de l'activité des fractions isolées, et notamment des fractions TP-G-DEAE et TP-G-GF05, a été mesurée par la détermination du titre de ces fractions par la méthode mise au point par J. AUGIER G. GAYOT, G. GRANGE, C. DENISE, S. AUGIER-GIBORY et C. POUJEOL, décrite dans DEVELOP. BIOL. STAND., 29 1975, page 331. Les titres des fractions ont été mesurés par rapport au titre de la fraction DR6, respectivement sur des cobayes sensibilisés par du bacille BCG vivant et sur des cobayes sensibilisés par du bacille BCG inactivé. Les résultats obtenus sont réunis dans le Tableau qui va suivre TABLEAU TITRE en HSR TITRE en HSR RAPPBEZT T6TREL FRACTION avec BCG avec BCG VIVANT/ vivant inactivé Filtrat de cul ture (de départ) 15 800 U/ml 7 100 U/ml 2,2 . ~ ... TP-G-TCA 10 176 000 U/mg 21 900 U/mg 8 TP-G-CM 192 000 U/mg 11 850 U/mg 16,2 TP-G-DEAE 378 U00 U/mg 10 430 U/mg 36 TP-G-GF05 630 000 U/mg 19 000 U/mg 33 Les fractions TP-G-DEAE et TP-G-GF05 sont celles qui ont le meilleur rapport d'activité, puisqu'elles sont plus de 30 fois plus actives en HSR sur des cobayes sensibilisés par du BCG vivant que sur ceux sensibilisés par du BCG inactivé. Ces fractions TP-G-DEAE et TP-G-GFO5 sont donc très riches en Antigène L, la fraction la plus active étant la fraction TP-G-GF05. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit etre bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 18 litres de milieu de Sauton neutralisés par NH40H (pH = 6,9) sont répartis dans 45 boîtes de Roux à raison de 0,4 litre chacune. Ces boîtes de Roux sont ensemencées par des fragments de voile de cultures de BCG de 7 à 8 jours cultivées en ballon. Après 12 semaines de culture à 36-37"C, on mesure le pH de toutes les fioles, et sont retenues celles dont le pH est voisin de 5 ' 0,5. On filtre les bacilles sur papier et on obtient 13 litres de filtrat. Les résidus bacillaires sont éliminés par filtration sur SAM 20. On peut également filtrer sur membrane d'ultra-filtration calibrée à 106 Daltons. Le filtrat est concentré 5 fois par évaporation sous vide et on obtient 2,6 litres auxquels on ajoute 2 % TCA concentration finale puis l'on centrifuge (1 heure à 15 000 g). Le surnageant recueilli est refroidi à 4"C, on ajoute du TCA de manière que la concentration finale soit 10 % compte-tenu des 2 %- antérieurs. Le précipité est recueilli par ultra-filtration et centrifugation, repris dans 15 ml d'H20 distillée, amené à pH 7 par NaOH, clarifié par centrifugation, puis précipité par TCA 10 % concentration finale. Le culot est lavé 2 fois par au moins 10 fois le volume du culot, de TCA 10 % concentration finale. Il est lavé 3 fois par de l'acétone et est séché sous vide : poids obtenu : 330 mg ; il s'agit de la fraction TP-G-TCA 10. 100 mg de ce produit sont dissous dans 4 ml de CH3COOH 50 mM pH 3 (on élimine l'insoluble par centrifugation) et on dépose le surnageant sur une colonne de CM-Trisacryl-M de 12 cm X 1,6 cm, après équilibrage par la même solution de CH3COOH. Le débit est de 5 ml/heure. On recueille le premier pic qui s'élue à la fin du volume mort et le produit est obtenu à l'état sec par lyophilisation (62 mg) ; il s'agit de la fraction TP-G-CM. 40 mg de ce produit sont dissous dans 3 ml de tampon Tris-HCl 50 mM pH 7 et introduits sur une colonne de DEAE Trisacryl-M de même dimension que la précédente et au même débit ; on recueille également le premier pic qui passe avec le volume mort ; le produit est lavé 3 fois par ultrafiltration sur membrane UM2 de porosité 1 000 Daltons, puis recueilli par lyophilisation. On obtient 21 mg du produit recherché, qui est très riche en Antigène L (fraction TP-G DEAE). Rendement : 33 % par rapport à la fraction TP-G-TCA 10. Titrage Sur cobayes sensibilisés par des bacilles vivants 378 000 U/mg, et sur cobayes sensibilisés par des bacilles tués et injectés dans de l'antigène de Freund incomplet 10 430 U/mg. Le rapport vivants/inactivés est de 36. Analyse chimique teneur en protéines titrées par la méthode du microbiuret 95 % teneur en polyosides libres titrés par la réaction à l'anthrone (Morris) : inférieure à 1 % teneur en ADN titrés par la méthode de Burton : 0 teneur en ARN titrés par la méthode à l'orcinol : inférieu re à 1 % poids moléculaire mesuré en gel de polyacrylamide en pré- sence de SDS : au maximum 15 000 Daltons point isoélectrique mesuré en gel de polyacrylamide en pré- sence de Servalyt 2-11 : s'échelonnant de 4 à 6. EXEMPLE 2 Le processus de fractionnement sur colonnes de chromatographie est poursuivi en soumettant la fraction TP-G-DEAE obtenue à l'Exemple 1 à une chromatographie sur une colonne de tri moléculaire par gel-filtration, par exemple sur une colonne d'"ULTROGEL" AcA 202 (IBF) de 95 cm de hauteur et de 16 mm de diamètre, avec un débit de 3,55 ml/heure/ cm2. La fraction qui passe à la fin du volume mort (55 ml) à partir du tube 181 jusqu'au tube 214, c'est-à-dire jusqu'au début de l'inclusion, est recueillie et contient l'antigène L (13,3 ml). La fraction fortement incluse (tubes 215-244 ; 12,2 ml) est peu active et est éliminée. La fraction recueillie est dessalée d'une manière connue en elle-même, par chromatographie sur tamis moléculaire, par exemple sur "TRISACRYL" GFO5, dont le poids d'exclusion est de 3 000, sur une colonne de 1 mètre de hauteur et de 16 mm de diamètre. La fraction TP-G-GF05 obtenue (40 mg) est lyophilisée. Le rendement en fraction TP-G-GF05 par rapport au TP-G-TCA 10 utilisé comme matière première à l'Exemple 1, est de 15 %. Titrage sur cobayes sensibilisés par des bacilles vivants : 630 000 U/mg sur cobayes sensibilisés par des bacilles tués et injectés dans de l'antigène de Freund incomplet : 19 000 U/mg Rapport vivants/inactivés : 33 Caractérisation de la fraction TP-G-GF05 riche en antigène L Elle est très soluble, que ce soit dans l'eau, les milieux basiques ou les milieux acides Son poids moléculaire, mesuré sur gel de polyacrylamide à 18 %, contenant 0,1 % de SDS, est de 15 000 Daltons au ma ximum ; Elle est essentiellement constituée par des protéines : 98% par la méthode du biuret Elle ne contient pratiquement pas d'acides aminés aromati ques, comme le montre son spectre d'absorption en UoV. une très faible absorption àK280 nm Elle ne se fixe pratiquement pas sur les résines échangeu ses d'ions faiblement acides et basiques, ce qui permet de la séparer par simple filtration Elle migre par électrophorèse . Son point isoélectrique, mesuré sur gel de polyacrylamide en présence de SERVALYT 2-11 fait apparaître plusieurs bandes s'échelonnant entre 4 et 6 . Sa chromatographie HPLC montre qu'elle se compose de plu sieurs substances actives. La fraction TP-G-DEAE présente un titre qui est de très loin supérieur aux titres indiqués dans la littérature pour les fractions actives de la tuberculine et notamment pour les fractions riches en Antigène L, dont le titre est au maximum de 82 500 U/mg, alors que celui de la fraction TP-G-DEAE est supérieur à 100 000 et peut être aussi élevé que 378 000. La fraction TP-G-GF05 présente, cependant, un titre encore plus élevé que la fraction TP-G-DEAE, puisqu'il peut être environ 1 ,6 fois supérieur au titre de la fraction TP-G-DEAE, pour un rapport vivants/inactivés sensiblement du même ordre. Ceci permet d'envisager son utilisation en tant qu'agent de diagnostic à des doses très inférieures à celles utilisées actuellement dans le cas de la tuberculine, tout en obtenant une activité et une spécificité très supérieures à celles de la tuberculine. REVENDICATIONS 1") Procédé de préparation d'antigène tuberculinique L à partir d'une culture de bacilles BCG ou tuberculeux, caractérisé en ce qu'on isole une fraction riche en Antigène L, dénommée fraction TP-G-DEAE, dont le titre est supérieur à 100 000 U/mg, sur des cobayes sensibilisés par du BCG vivant, à partir d'un filtrat de culture de BCG non inactivé soumis à un fractionnement préparatif qui comprend une étape de précipitation dudit filtrat par de l'acide trichloracétique à 2 % concentration finale, une étape de précipitation du surnageant recueilli, par de l'acide trichloracétique à 10 % concentration finale, reprécipitation du précipité ainsi obtenu, préalablement dissous dans un faible volume d'eau, par de l'acide trichloracétique à 10 % concentration finale, pour obtenir une fraction dite TP-G-TCA 10 qui, après dissolution dans un faible volume d'acide acétique et élimination du léger précipité formé, est fractionnée sur une colonne de résine échangeuse d'ions faiblement acide, pour recueillir la fraction correspondant au pic le plus actif sur cobayes sensibilisés par du BCG vivant, passant en fin de volume mort, dénommée fraction TP-G-CM, laquelle fraction est elle-même soumise à un fractionnement sur une colonne de résine échangeuse d'ions basique, pour recueillir la fraction correspondant au pic le plus actif sur cobayes sensibilisés par du BCG vivant, passant en fin de volume mort, dite fraction TP-G DEAE, dont le titre est supérieur à 100 000 U/mg. 2") Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fraction TP-G-DEAE obtenue en mettant en oeuvre ledit procédé selon la revendication 1, est elle-même soumise à une chromatographie de gel-filtration, par tri moléculaire, pour recueillir la fraction qui passe à la fin du volume mort jusqu'au début de l'inclusion, laquelle fraction est soumise à un dessalage par chromatographie sur tamis moléculaire, pour obtenir une fraction, dénommée TP-G-GF05, dont le titre est supérieur à 600 000 U/mg. 3 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la colonne de résine échangeuse d'ions faiblement acide utilisée pour ltobtention de la fraction TP-G-CM, est équilibrée par une solution d'acide acétique 50 mM, pH 3. 4 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la colonne de résine échangeuse d'ions basique utilisée pour l'obtention de la fraction TP-G-DEAE, est équilibrée par du tampon TRIS-HCl 50 mM, pH 7. 5 ) Fraction isolée de filtrat de culture de BCG non inactivé, par le procédé selon la revendication 1, dénommée fraction TP-G-DEAE, caractérisée en ce qu'elle est riche en Antigène tuberculinique L, en ce. que son poids moléculaire est de 15 000 Daltons au maximum, en ce que son point isoélectrique est de 4 à 6 et en ce que son titre d'activité est supérieur à 100 000 U/mg sur des cobayes sensibilisés par du BCG vivant. 6 ) Fraction isolée à partir de la fraction TP-G DEAE selon la revendication 5, par le procédé selon la revendication 2, dénommée fraction TP-G-GF05, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée par de l'Antigène tuberculinique L, en ce que son poids moléculaire est de 15 Q00 Daltons au maximum, en ce que son point isoélectrique s'échelonne de 4 à 6, en ce qu'elle se compose essentiellement de protéines et présente une faible teneur en acides aminés aromatiques et en ce que son titre d'activité est supérieur à 600 000 U/mg sur des cobayes sensibilisés par du BCG vivant. 7 ) Agent de diagnostic de la sensibilisation d'un sujet aux bacilles tuberculeux, caractérisé en ce qu'il comprend en tant que constituant actif, la fraction selon la revendication 5. 8 ) Agent de diagnostic de la sensibilisation d'un sujet aux bacilles tuberculeux, caractérisé en ce qu'il comprend en tant que constituant actif, la fraction selon la revendication 6.