FR 2569721 A1 19860307 FR 8413724 A 19840906 La présente invention concerne des souches mutantes marquéesde Listeria monocytogenessleur procédé d'obtention et les compositions vaccinales contenant de ces souches. La listériose, maladie provoquée par Listeria monocytoqenes, affecte particulièrement les petits ruminants chez qui elle provoque des avortements et des encéphalites. La maladie est le plus souvent sporadique mais elle revêt parfois une forme enzootique,particulièrement dans les troupeaux consommant des ensilages et jusqu'à 30% des animaux de certains troupeaux ont été affectés. Aucune prophylaxie sanitaire ou médicale n'est actuellement connue. Osebold et coll dans Am. 3. Vet. Res. 20 966-972 puis Mackaness et colt. dans Symp. SQC . Genre. Microbiol. 14, 213-240 (1964) ont mentionné qu'une primo-infection par Listeria monocytogenes protège contre une nouvelle infection par le meme germe,une immunité de nature essentiellement cellulaire étant apparue lors de la première infection.Par ailleurs,Osebold et coll.(l959) puis Von Koenig et Finger dans Nature, 297,p 233-234 (1982) indiquent que la vaccination avec le microorganisme tué est inefficace,et Von Koenig et coll. dans Inf. Immun. 40(3), p.1170-1177(1983) démontrent que la vaccination avec Listeria innocua vivante, germe non pathogène présent dans la nature,est très peu efficace,la protection étant de très courte durée. I1 est donc particulièrement souhaitable d'avoir une souche de Listeria monocytogenes qui convienne à la préparation d'un vaccin vivant,c'est-à-dire une souche -qui ne déclenche pas la maladie lorsqu'elle est administrée aux animaux,mais présente un pouvoir immunogénique certain; -qui possède un marqueur héréditaire qui la différencie des souches virulentes naturelles et permette l'identification aisée de la souche; -qui se développe facilement en milieux artificiels -et qui soit stable. P.Pardon et coll. ont décrit dans le brevet FR-A-246300 la préparation de souches vaccinales de Salmonella abortus ovis par la mutation de souches sauvages virulentes induite par la streptomycine,suivie de l'isolement de mutants reverses,indépendants de la streptomycine. Les mutants ainsi obtenus étaient moins virulents que les souches de départ tout en conservant un pouvoir immunogène certain. Ces auteurs indiquent que si la double mutation: dépendance puis réversion à l'indépendance vis-à-vis d'un antibiotique est une méthode connue pour faire apparaltre des souches ayant une virulence atténuée,cependant les résultats obtenus sont très variables, imprévisibles et qu'une telle méthode n'est pas d'application générale. Et si elle a été utilisée pour quelques autres germes,tous des Gram , on ne pouvait prévoit qu'une telle méthode donnerait des résultats comparables en étant appliquée à des germes Gram + comme les Listeria monocytoqenes Si les mutants obtenus ainsi sont hypovirulents et immunogéniques,ils sont cependant difficiles à utiliser comme composants d'un vaccin vivant atténué.L'absence d'un marqueur spécifique, c'est-à-dire qui les différencie nettement des souches sauves1ne permet pas de les utiliser en toute sécurité, au stade industriel. C'est un avantage de I1 invention de fournir des souches ayant un marqueur spécifique particulièr qui différencie nettement toute souche mutante selon llinvention,de toutes les souches sauvages analogues. Les Listeria monocytogenes selon l'invention sont des bactéries mutantes reverses pour un premier antibiotique et résistantes à un second antibiotique. Par bactérie "mutante reverse" pour un antibiotique, on entend une bactérie ayant subi deux mutations successives, la première l'ayant rendu résistante et dépendante de l'antibiotique,la seconde indépendante de ce même antibiotique. Parmi ces bactéries, on préfère pour la préparation des vaccins vivants atténués contre la listériose,autres objets de l'invention,celles peu virulentes et fortement immunogéniques. Parmi les antibiotiques susceptibles d'induire des mutations chez les Listeria monocytogenes on préfère ceux qui donnent des mutants stables, a' croissance normale, même si la fréquence de mutation est basse. Des aminosides, des tétracyclines, des sulfamides peuvent convenir mais on préfère tout particulièrement la streptomycine,qui donne des mutants stables,dont la concentration minimale inhibitrice est fortement augmentee. Le second antib,iotique doit avoir ces memes propriétés; en outre, pour que le caractere de résistance à ce dernier soit utile comme marqueur spécifique, il est nécessaire que les Listeria monocytogenes nty soient pas naturellement résistantes et même qu'une telle résistance n'apparaisse qu'avec une faible fréquence; l'érythromycine est un antibiotique qui convient tout particulièrement. Le procédé d'obtention des souches de Listeria monocytogenes, selon 1' invention,consiste: 1. à cultiver une souche de Listeria monocytogenes, sur un milieu contenant un antibiotique à forte concentration et à isoler les mutants résistants à cet antibiotique et dépendants de celui-ci. 2. à cultiver ces mutants sur un milieu dépourvu de l'antibiotique et à isoler les mutants "reverses",c'est-àdire les souches redevenues indépendantes de l'antibiotique. 3. a' cultiver les mutants reverses sur un milieu classique et contenant un autre antibiotique, et à isoler les mutants reverses pour le premier antibiotique et résistants au second. La quantité d'antibiotique utilisée dépend de la nature de celui-ci; elle doit être suffisante pour induire une mutation stable de nature chromosomique. Dans une forme de réalisation préférée, on utilise comme premier antibiotique la streptomycine à une concentration dans le milieu supérieur à lOOg/ml, et de préférence de 500 ,ut / mi environ. Le premier milieu de culture lui-même est un milieu classique,convenant au développement de ces microorganismes,comme le milieu trypticase soyJagar,commercialisé par Bio-tlérieux (Lyon-France). Les souches- mères , auxquelles peuvent être appliquées le procédé de l'invention pour obtenir des bactéries mutantes à propriétés vaccinantes, sont des souches immunogéniques dont la croissance en milieu artificiel est suffisante. Les souches de Listeria monocytogenes immunogéniques,actuellement connues,sont toutes virulentes et ne peuvent être utilisées telles quelles pour la vaccinat;ion; le procédé de l'invention permet de diminuer leur virulence, jusqu'à un niveau acceptable pour la vaccination, tout en leur fixant un marqueur spécifique. La sélection,l'isolement et la culture des souches mutantes sont réalisées selon les techniques usuelles de bactériologie quelle que soit l'étape considérée. Des prélèvements des colonies résistantes à l'antibiotique sont ensuite ensemencées simultanément sur un milieu contenant ce même antibiotique et sur un milieu qui en est dépourvu, afin de déterminer celles qui sont dépendantes de l'antibiotique. Après clonage,les souches dépendantes sont ensemencéesdans un milieu liquide ne contenant plus d'antibiotique,d'où on isole de nouvelles souches mutantes, dites "reverses" dont la croissance ne dépend plus de la présence de l'antibiotique dans le milieu. Dans la troisième étape du procédé de l'invention, on cultive une souche reverse ainsi isolée, dans un milieu liquide usuel mais contenant un antibiotique connu pour ne pas induire de résistance naturelle chez les Listeria,par exemple de type macrolide, tel que lterythromycine,en quantité suffisante pour éviter toute éventuelle resistance d'origine plasmidique. Dans le cas de l'érythromycine , il faut dans le milieu plus de 10 g/ml et de préférence près de 100 g/ml d'antibiotique .Dans ces conditions très peu de souches mutantes résistantes apparaîssent;mais on a trouvé que pour favoriser les mutations,il est possible d'appliquer une pression de sélection particulière,c'est-à-dire de travailler dans un grand volune de culture,supérieur à 20ml pour loio bactéries et de préférence 100 ml d'un milieu très favorable à la multiplication intense et rapide des Listeria, tel que le milieu BHI (brain heart infusion) commercialisé par DIFCO (USA). Les souches mutantes finalement isolées au bout de quelques jours sont reverses au premier antibiotique et résistantes au second . Leur virulence et leur immunogénicité ont pu varier ,en plus ou en moins,par rapport à celles des souches reverses isolées à la fin de la seconde étape du procédé de l'invention,et ces propriétés seront déterminées, selon des techniques usuelles,pour sélectionner les souches pouvant convenir comme agent de vaccination, c'est-à-dire présentant simultanément l'immunogénicité la plus élevée avec la virulence la plus faible. Bien qu'ayant subi trois mutations successives, les souches obtenues ont, contre toute attente un taux de croissance en culture comparable à celui des souches sauvages et sont utilisables pour la préparation industrielle d'un vaccin contre la listeriose. Parmi les souches vaccinantes objets de l'invention,on préfère tout particulièrement la souche dénommée Aer, et déposée à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) de l'institut Pasteur (France), le 29 Août 1984 sous le n I - 335 ;cette souche est peu virulente , a un pouvoir immunogénique important et ces deux propriétés sont stables. On admet généralement qu'unie souche est stable lorsque ses caractères n'ont pas été modifiés après 10 passages successifs sur animaux.Aussi Pour étudier la stabilité d'une souche,on l'a inoculée par voie intracranienne,à des souris, au bout d'un certain a temps, oniprélève les cerveaux des animaux et on les a broyés dans du tampon phosphate isotonique (dilution au 1/10 poids/volume). les broyats ont été réinjectés par voie intra- cranienne à de nouvelles souris.Cette méthode évite l'utilisation de milieu artificiel entre deux passages successifs . On répète 10 fois l'opération et7détermine alors la virulence de la souche résultant du poème passage et sa résistance à l!érythromycine. Les vaccins contenant les microorganismes de l'invention vivants , immunogéniqueset de faible virulence, sont un autre objet de l'invention et particulièrement les vaccins qui comprennent des germes de souche CNCM N I - 335 ,associés aux excipients usuels. Les vaccins seront administrés à titre préventif aux animaux susceptibles de faire une listériose et notamment les moutons et les chèvres à des doses comprises entre 107 et @ @@@ lO9 P/ianimal par voie sous-cutanée. Une injection de rappel à la même dose permet d'augmenter sensiblement la durée et le niveau de la protection. La mesure du pouvoir vaccinant comme de la virulence et de l'immunogénicité des souches mutantes selon l'invention peut être effectuée chez la souris. de souche OFl commercialisée par IFFA CREDO (St Cermain sur l'Arbres le-France),particulièrement sensible aux infections par Listeria. Pour déterminer la virulence,on administre aux animaux , par la voie sous-cutanée plantaire,une la suspension de bactéries de/souche à étudier. Les souris sont sacrifiées trois jours après,pour prélever leurs rates. Celles-ci sont broyées et diluées au 1/10 (poids/vol.), dans une solution tamponnée isotonique. Les broyats sont ensemencés sur gélose (trypticase/soyZagar) après dilutions successives au 1/10 et les colonies de Listeria comptées après 24 et 48 heures d'incubation, à 370C. La virulence est exprimée par le logarithme de la moyenne du nombre de bactéries présentes dans les rates de souris,détermine pour six souris ayant reçu 105 bactéries de la souche à étudier. Le pouvoir vaccinant ou immunogénicité, a été étudié en déterminant l'importance de l'infection splénique des animaux après une injection sous-cutanée de bactéries de la souche vaccinante à étudier,suivie au bout d'un mois d'une injection d'épreuve avec des bactéries de souche naturelle virulente. Les résultats ont été expri més en logarithme du nombre de bactéries présentes dans les rates infectées. Dans ce qui suit,on décrit un exemple de mise en oeuvre du procédé selon l'invention et les caractéristiques des souches obtenues. EXEMPLE a)isolement de mutants,dépendants de la streptomycine. Un clone de bactéries de la souche Lm 5 a été mis en culture dans 10 tubes de bouillon trypticasesoja. La souche Lm 65,isolée d'un cerveau de brebis malade, a été déposée à la CNCM(Franse) sous le n I-336 le 29 Août 1984. Après 18 heures d'incubation à 370C, 0,5 ml de bouillon de chaque tube, soit 3,5 x 108 bactéries par ml, a été ensemencé sur des botes de gélose trypticase-soja contenant 500 g/ml de streptomycine. Les 100 bottes obtenues ont été incubées à 370C pendant cinq jours,puis 53 souches de mutants résistants apparus isolés. On a alors recherché quelles étaient les colonies dépendantes de la streptomycine en ensemençant deux séries de botes de gélose trypticase-soja contenant,ou non, 500 tg/ml d'antibiotique. 36 souches dépendantes ont été ainsi isolées. b)Isolement des mutants reverses Parmi ces 36 souches, 9 souches avaient une croissance compatible avec la production industrielle d'un vaccin. Elles ont été clonées quatre fois puis mises en culture dans des tubes contenant du bouillon trypticase-soJa et 500 g/ml de streptomycine. Après une in cubation de 18 heures à 370C, 4 ml de chaque culture,contenant en moyenne 5,4 x 108 bactéries par ml ,ont été introduits dans des fioles contenant 100 ml de bouillon trypticase-soja,en l'absence d'antibiotique. Après 24 heures d'incubation,une a anse de chaque bouillon/été ensemencée sur des botes de gélosans antibiotique se crypticase-soja@et chaque colonie de bacteries qui s'est developpee a /clonée quatre fois comme précédemment. On a isolé ainsi neuf souches reverses appelées A, B I, provenant chacune d'une des 9 souches précédemment sélectionnées. Leur virulence et leur immunogénicité ont été étudiées chez la souris. Les résultats obtenus figurent dans le tableau I ci-dessous. TABLEAU I Souche log(nombre de bactéries par rate # écart-type virulence immunogénicité ** rates (souris normales) (souris vaccinées) infectées/total A 3,20 + 0,29 1,86 + 0,39 8/9 B 3,57 + 0,32 2,23 + 0,43 8/9 C 2,36 + 0,63 2,41 + 0,21 919 D 3,68 + 0,10 2,47 + 0,26 9/9 E 2,64 + 0,61 2,60 + 0,21 9/9 F 4,03 + 0,22 1,85 + 0,26 8/9 G 3,59 + 0,29 2,05 + 0,46 7/9 H 2,21 + 0,48 2,74 + 0,38 8/9 I 4,32 + 0,17 2,55 + 0,17 9/9 Lm 65 4,57 + 0,11 1,70 + 0,31 8/9 (témoins) 4,90 + 0,13 10/10 * injection sous-cutanée de 1,5 x 105 bactéries à six souris. ** injection sous-cutanée de 6 x 105 bactéries de souches vaccinantes et un mois après de 1,5 x 106 Lm. 65 par la même voie c)isolement des souches reverses résistantes à l'érythromycine. Chacune des neuf souches précédemment obtenues est mise en culture dans un tube contenant 10 mi d'infusion coeur cerveau (BHI) commercialisée par DIFCO-Detroit,USA. Après 18 heures à 370C, 10 ml de chacune des cultures, contenant environ 1,2 x 109 bactéries par ml, ont été introduits dans des fioles contenant 100 ml d'infusion BHI et 100 g/ml d'érythromycine. Les fioles ont été incubées à 370C pendant deux semaines, période au bout de laquelle seulement cinq souches résistantes ont été isolées. Elles sont dénommées Aer, Ber, Der, Fer, Cer et proviennent respectivement des souches A, B, D, F et G. Leursoaractéristiques de virulence et d'immunogénicité figurent dans le tableau II ci-après; les trois souches reverses les plus immunogéniques, A, F et G, sont indiquées à titre de référence. TABLEAU II Virulence* (sour is normales) Immunogénicité** (souris vaccinées) Souche Voie sous-cutanée voie IV Voie orale A 3,41 # 0,18 1,95 # 0,32 (9) 1,65 # 0,46 (6) 1,21 # 0,36 (7) F 4,36 # 0,12 1,42 # 0,34 (7) 0,42 # 0,23 (3) 1,15 # 0,28 (9) G 4,22 # 0,19 1,83 # 0,33 (8) 0,92 ~ 0,42 (4) 1,01 # 0,36 (6) Aer 3,75 # 0,27 2,00 # 0,47 (7) 1,98 # 0,42 (8) 1,21 # 0,36 (7) Ber 4,18 # 0,15 2,47 # 0,23 (10) 1,42 # 0,44 (6) 0,89 # 0,24 (7) Der 3,56 # 0,20 1,90 # 0,29 (9) 2,17 # 0,50 (7) 1,65 # 0,29 (10) Fer 2,58 # 0,13 3,19 # 0,21 (10) 2,36 # 0,44 (9) 1,21 # 0,36 (7) Ger 3,78 # 0,16 2,61 # 0,28 (10) 2,47 # 0,30 (9) 1,41 # 0,36 (7) Lm 65 4,95 # 0,11 0,95 # 0,42 (4) 0,64 # 0,31 (4) 0,62 # 0.26 (5) (témoins) 4,80 # 0,12 (10) 5,17 # 0,11 (10) 3,43 # 0,22 (10) résultats exprimés en logarithme du nombre de listeria par rate # écart-type, suivi du nombre de rates infectées sur 10 * Injection sous-cutanée de 6,6 x 105 bactéries à 10 souris. ** Injectin de 6,6 x 105 bactéries vaccinantes à 10 souris, suivie d'une injection,un mois après de bactéries Lm 65 (1,6 x 106 bac. par voie sous-cutanée ; 6,5 x 10 par voie IV; 1,5 x 109 par voie orale) Parmi les souches obtenues,on préfère tout particulièrement la souche Aer, déposée à la CNCM sous le n0 . Cette souche de Listeria monocytogenes est de serovar 4b ,hémolytique et sensible aux phages 2671, 3551. 3552. 1317 et l84.et résistante aux nhaoes 1967.2685.4477. 575, 1652, 1209, 1806, 1090 et 1807 selon la classification d'Audurier et coll.dans Ann. Microbiol. (Institut Pasteur)130 B,179-189(1979). Cette souche est stable; elle se développe bien sur milieu de culture artificiel,en formant des colonies irrégulières. Elle peut cotre dans un milieu de culture contenant 16 ug/ml de streptomycine, lOOO/ig/ml d'érythromycine, ou un mélange de 8 ug/ml de streptomycine et 100 fg/ml d'érythromycine, alors que les souches naturelles ne peuvent se développer en présence de plus de plus de 8 g/ml de streptomycine ou 0,25 g/ml d'érythromycine ou ce qui montre que le second marqueur de la souche Aer est particulièrement sélectif. La DL50 pour la souris OF1 est pour les bactéries de cette souche supérieure à 1,6 x 1010 alors que pour la souche-mère, Lm 65s elle est de 3,2 x 108. La DI.50 (dose infectante 50%) par voie sous-cutanée chez le même animal est de 34 pour la souche-mère et de 342 pour les bactéries de souche Aer. La dose vaccinale pour la souris,pour administration par voie sous cutanée, est de 106 environ bactéries de souche Aer par animal. L'fnnocuité de cette souche a été vérifiée sur 229 brebis gravides ou non,auxquelles on a injecté par voie sous cutanée 107 à 109 bactéries par animal. Aucun animal ainsi vacciné n'a présenté de symptomes de la maladie pendant l'année qui a suivi. REVENDICATIONS 1. Listeria monocytogenes ccaractérisées en ce qu'elles appartiennent à des souches mutantes reverses pour un premier antibiotique et résistantes à un second antibiotique. 2. Listeria monocytogenes selon la revendication l,caractérisées en ce qu'elles sont hypovirulentes et immunogéniques. 3. Listeria monocytogenes selon l'une des revendications 1 ou 2,caractérisées en ce quelles sont reverses à la streptomycine et résistantes à l'erythromycine. 4. Listeria monocytogenes selon la revendication 3 ayant Les caractéristiques de la souche déposée à la Collection Nationale de Microorganismes CNCM(France), sous le nO 1-335. 5. Procédé d'obtention de souches mutantes, portant un marqueur,de Listeria monocytogenes selon l'une des revendications 1 ou 2 ,caractérisé en ce qu'il consiste : a) à cultiver une souche de Listeria monocytogenes sur un milieu contenant un antibiotique et isoler des mutants résistants et dépendants de l'antibiotique, b)à cultiver les mutants sur un milieu dépourvu de l'antibiotique et isoler les mutants devenus indépendants de l'antibiotique, c)à cultiver ces mutants reverses sur un milieu contenant un autre antibiotique et à isoler les souches résistantes apparues. 6.Procédé selon la revendication 5 pour l'obten- tion de souches vaccinantes,portant un marqueur ,caractérisé en ce que la souche de départ est immunogénique. 7;Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que le premier antibiotique utilisé est la streptomycine et en ce que le second antibiotique est l'érythromycine. 8 Procédé selon la revendication 7,caractérisé en ce que la concentration en streptomycine du premier milieu de culture est supérieure à 100 fgfml et la concentration en érythromycine du troisième milIeu de culture est supérieure à 10 Tg/ml. 9.Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le troisième milieu de culture est un bouillon d'un volume supérieur à 100 ml pour 1010 bactéries et que la culture est poursuivie pendant au moins 15 jours. 10 Vaccin atténué vivant contre la listeriose animale ,caractérisé en ce qu'il comprend des Listeria monocytogenes selon l'une quelconque des revendications 2 à 4,aux caractéristiques stables. ll.Vaccin selon la revendication 10 pour le traitement prophylactique des petits ruminants,caractérisé en ce que la dose unitaireypour injection sous-cutanée comporte de 10 à 109 bactéries mutants