FR 2564857 A1 19851129 FR 8407959 A 19840522 La présente invention concerne la construction de lignées cellulaires produisant du facteur IX humain ou des molécules analogues. Le facteur IX est une protéine intervenant au cours de la coagulation du sang. I1 est synthétisé sous forme d'un zymogene et modifié post-traductionnellement par l'addition de chaine hydrocarbonée, l'hydroxylation d'un acide aspartique et la conversion des 12 acides glutamiques en acides w -carboxyglutamiques. Cette dernière modification dépend de la vitamine K (Bertina et coll., 1981) Le foie est le site de synthèse du facteur IX. Le facteur IX ppssede une activité réduite ou est absent dans le sang des hémophiles B. L'hémophilie B se manifeste par un temps de saignement tres prolongé, comme la forme la plus fréquente de l'hémophilie, l'hémophilie A, et elle est transmise sous forme d'un caractère récessif lié au sexe (Hedner et coll., 1982). Le facteur IX, lorsqu'il est fourni à des hémophiles B, restaure des temps de saignements normaux. Pour l'instant, la seule source disponible de facteur IX est le plasma-humain, bien que dans certains cas la protéine bovine correspondante puisse être utilisée. Les préparations de facteur IX peuvent etre pyrogènes (provoquer des fievres) et comportent aussi des risques de contamination des agents pathogènes ou des virus tels que le virus de l'hépatite et les agents vecteurs du S.I.D.A. C'est pourquoi il est intéressant de développer un procédé permettant la préparation du facteur IX de très haute pureté par la technique des ADN recombinants. Toutefois, cette technique se heurte à certaines difficultés. Le facteur IX est une protéine hautement modifiee, ainsi que cela a été mentionné au deuxième paragraphe. L'importance de ces modifications pour la stabilité ou l'activité du facteur IX est mal connue. Par analogie avec la prothrombine, possédant aussi des acides carboxy-glutamiques, on pense que les acides glutamiques modifiés sont essentiels pour l'activation du facteur IX. C'est pourquoi la Demanderesse a mis au point un vecteur permettant d'exprimer le facteur IX sous une forme active, c'est-à-dire tenant compte des structures particulières évoquées précédemment. I1 s'agit d'un vecteur d'expression constitué par un virus de la vaccine comportant un gène codant pour le facteur IX humain ou une protéine analogue du facteur IX, ce gène étant sous la dXpendance d'un promoteur d'un gène de la vaccine, par exemple le promoteur du gène codant pour la protéine 7,5K. Lorsque l'on indique que le vecteur d'expression est constitué par un virus de la vaccine, il est bien entendu que ce virus peut être incomplet, c'est-à-dire que lors de l'élaboration du vecteur certaines parties peuvent avoir été délétées, dans la mesure où ces délétions ne modifient pas les propriétés essentielles du virus. De façon générale, on entendra désigner dans la présente description par "protéine analogue au facteur IX" une protéine ayant le même type d'activité biologique in vivo ou une activité apparentée, en particulier il peut s'agir d'une protéine ayant la même structure que le facteur IX a certains amino-acides près, ou bien des fragments du facteur IX ayant l'activité essentielle de la molécule complète. L'expression d'une séquence codante pour une protéine exogène telle que le facteur IX par le virus de la vaccine (W) implique nécessairement deux étapes 10) La séquence codante doit être alignée avec un promoteur de W et être insérée dans une région non essentielle de 14ADN de W, clouée dans un plasmide bacté rlen approprié. 20) Les séquences d'ADN de W situées de part et d'autre doivent permettre des recombinaisons homologues in vivo entre le plasmide et le génome viral. Une double recombinaison réciproque conduit à un transfert de l'insert d'ADN du plasmide dans le génome viral dans lequel il est propagé et exprimé (Panicali et Paoletti, 1982 Mackett et coll., 1982 ; Smith et coll., 1983 Panicali et coll., 1983). C'est pourquoi l'ensemble promoteur/séquence codant pour le facteur IX défini précédemment sera inséré dans un gène du virus de la vaccine, par exemple le gène de thymidine kinase (TK), ce qui permet la recombinaison homologue et fournit une possibilité de sélection comme cela sera expliqué ci-après. Le virus hybride ainsi obtenu peut étre utilisé pour infecter une culture cellulaire de laquelle on pourra extraire le facteur IX ou la protéine analogue par des techniques connues à partir des broyats cellulaires ou des milieux de culture. Les cellules hottes de mammifère peuvent être variées mais adaptées au vecteur mis en oeuvre. En particuliér, ces cellules peuvent être des cellules de foie humain qui proviennent donc de l'organe produisant in vivo le facteur IX. Parmi ces cellules, il faut citer la lignée HepG2. Les procédés permettant de préparer ce type de lignées cellulaires sont décrits notamment dans le brevet WO 81 03663 au nom de The Wistar Institute of Anatomy and Biology. Ces cellules, bien qu'elles ne fabriquent pas de facteur IX, produisent des protéines de la channe de la coagulation sanguine, dont certaines possèdent des propriétés chimiques identiques au facteur IX (facteur X, protéine C, prothrombine). Ces cellules sont donc des hôtes de choix pour la mise en oeuvre de la présente invention. Les cellules transformées ou transfectées sont cultivées sur un milieu approprié assurant leur croissance Après culture, les cellules ou les milieux de culcure sont récoltés et la protéine du facteur IX peut être isolée par des techniques connues de purification des protéines et antigènes. La présente invention concerne également des procédés de transformation de cellules de mammifère, de culture de ces cellules produisant du facteur IX ou des protéines analogues, ainsi que les protéines analogues au facteur IX obtenues au moins en partie par culture de cellules de mammifère. De façon pluc générale, la présente invention concerne également un procédé de préparation de protéine fabriquée par le foie, caractérisé en ce que l'on cultive une lignée de cellule. hépatiques infectée par un virus de la vaccine dans le @énome duquel a été inséré le gène codant pour ladite piotéine sous la promotion d'un promoteur de la vaccine. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention serent mieux compris à la lecture de des exemples ci-après. La préparation du virus vecteur selon l'invention comporte notamment les étapes suivantes : 1 L'obtention d'un clone de cADN correspondant au facteur IX schératisée sur les figures 1 à 3 : . la figure 1 représente le schéma de la sonde de facteur IX avec ses homologues avec le cADN du facteur IX, . la figure 2 représente la séquence d'une partie du cADN obtenu; la figure 3 représente la stratégie de prépara tion de M13tg315. g/ La synthèse d'un mini-plasmide pTGlH à partir de pBR322 (figure 4). 3/ L'insertion dans ce mini-plasmide du fragment Hin-J portant le gène TK de W. 4/ L'insertion dans le gène TK du promoteur de la protéine 7,5K (figure 5). 2/ L'insertion sous la promotion de P7,5K du gène codant pour le facteur IX porté par M13tg315 (figure 5). 6/ Le clonage des éléments essentiels de ce dernier plasmide dans le virus de la vaccine (figure 6). Les exemples suivants illustrent les propriétés des différentes composants obtenus. Les différents matériels mis en oeuvre sont identifiés dans les exemples. Sauf indication contraire, les enzymes sont utilisées dans les conditions préconisées par le fabricant et les techniques mises en oeuvre sont connues de l'homme de métier. Les séquences d'acides aminés et les séquences de nucléotides représentées sur les figures ne sont pas reprises dans le corps de la description pour ne pas l'alourdir mais elles en constipent une partie intégrante. Obtention d'un clone de ple correspondant au facteur -IX humain L'obtention de ce clone de cADN correspondant au facteur IX humain a déjà été décrite dans le brevet français n 84 07125 au nom de la Demanderesse. Pour obtenir un clone de cADN correspondant au facteur IX humain, on utilise une sonde constituée d'un oligonucléotide synthétique unique. De façon surprenante, il a été possible d'obtenir directement le clone du facteur IX à partir d'une banque de cADN de foie humain en utilisant cet oligonucléotide synthétique, bien que seule la séquence d'acide aminé du facteur IX bovin soit connue. Matériels et méthodes (Jaye M. et coll.) I. Isolation d'ARN messagers polyadénylEs et synthèse du cADN L'ARN est préparé à partir de 5 g de foie humain en utilisant la technique d'extraction au chlorhydrate de guanidium 8 M, tel qu'il est décrit par Tolstoshev et coll., 1981. L'ARN ainsi obtenu est chromatographié sur une colonne de polyU-Sepharose (Pharmacia) comme cela est indiqué par le fabricant de façon à obtenir un extrait en ARN contenant du poly-A. Les séquences de poly-A servent de guide pour la transcription réverse en utilisant des oligo (dT) comme "amorce". Le cADN a été synthétisé en utilisant 100 pl de réactif contenant 100 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 10 mM de MgC12, 50 mM de KC1, 30 mM de mercaptoéthanol, 10 pg/ml d'oligo (dT), 50 pg/ml de poly-A-ARN, 0,5 mM de chaque de dATP, dGTP, dTTP et dCTP, 80 unités de transcriptase réverse de virus de myoblaste avien (Life Sciences Inc.,l. Après 45 minutes à 420C, la réaction est terminée et le complexe de cADN-ARN dénaturé par chauffage à 1050C pendant 3 minutes puis est transfert rapidement sur bain de glace. Pour la synthèse du second brin d'ADN, le mélange réactionnel précédent est dilué 5 fois et ajusté jusqu'd une concentration finale avec 100 mM HEPES-KOH, pH 6,9, 100 mM de KC1, -200 pM de dATP, dGTP, dTTP et P32-dCTP (activité spécifique 0,5 Ci/mmole). 10 unités de polymérase ADN de E. coli (fragment Klenow) (Boehringer Mannheim) sont ensuite ajoutées et l'incubation est effectuée à 250C pendant 2 heures. le cADN double brin (dscADN) est extrait avec un volume égal de phénol : chloroforme (50 : 50), saturé avec 10 mM de Tris-HCl, pH 8, 1 mM d'EDTA, et précipité 2 fois à l'éthanol. Approximativement 970 ng de dscADN sont obtenus à partir de 5 pg de poly-A-ARN. Les extrémités sont rendues franches par digestion avec 5 unités de nucléase S1 dans un milieu réactionnel de 0,1 ml contenant 30 mM d'acétate de sodium, pH 4,8, 300 mM de NaCl, 3 mM de ZnC12. Après 1 heure à 370C, 1'EDTA et SDS sont ajoutés jusqu'à une concentration finale-de 10 mM et 0,1 % respectivement et le mélange réactionnel est chauffé à 650C pendant 5 minutes. Le dscADN digéré par SI est alors appliqué sur un gradient de sucrose pré-établi 5-20 % contenant 100 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM d'EDTA, 100 mM de NaCl, et centrifugé à 30 000 tours par minute à 150C pendant 16 heures sur un rotor SW60 Ti. Les fractions de 0,5 ml sont collectées. Pour déterminer la taille du cADN, 1 p1 de chaque fraction est -analysé par électrophorèse sur un gel d'agarose neutre et la migration de chaque fraction est comparée avec un marqueur de poids moléculaire approprié. Les fractions contenant des cADN plus grands que 1 kilobase sont rassemblées puis précipitées avec 2 volumes d'éthanol pendant une nuit en présence de 5 pg de tARN de E. coli comme entraineur. Le précipité est remis en suspension dans 20 pl 0,1 x SSC (5 mM de NaCl, 0,5 mM de citrate de sodium, pH 7,0). 11. Clonaqe du cADN Des éléments d'extrémités homopolymères (approximativement 15 dCMP) sont ajoutés à l'extrémité 3' du cADN en utilisant la deoxynucléotidyl terminale transférase (Deng et coll., 1981). De manière similaire, des éléments d'extrémités homopolymères poly-dGMP (approximativement 10 dGMP) sont ajoutés aux extrémités 3' du plasmide pBR322 préalablement digéré avec l'enzyme de restriction PstI. 60 ng de cADN possédant des extrémités de poly-C-dCMP et 1 pg du vecteur préparé dans les conditions du paragraphe précédent sont chauffés pendant 2 heures à 42 C dans 10 mM de Tria-HCl, pH 7,5, 100 mM de NaCl. Les plasmides rocombinants sont utilisés pour transformer la souche E. coli 8739 (Murray et coll., 1977) et les transformants sont sélectionnés sur plaque d'agar-LB contenant 15 g/ml de tétracycline. On obtient 30 000 transformants dont inviron 50 % comportent un insert de cAND supérieur à 1 kb, Tous les transformants sont prélevés des plaques dans un volume minimum de LB et après addition d'un volume égal de glycérol, la banque obtenue est stockée @0 C III. Sélection et synthèse de la sonde oligonucléotide pour le facteur IX 1755 nucléotides de séquences de genes codant pour des protéines bovines synthétisées par le foie sont analysés (Mac Gillivray et coll., 1980 et Chung et coll., 1981) de façon à mettre en évidence les codons utilisés préférentiellement. On a sélectionné une séquence de 52 bases Cette oligonucléotide est cons- truit de la façon suivante : L'oligonucléotide A : d(CTCACACTGATCACCATCCACATACT) l'oligonucléotide B : d(GCTTCCAGAACTCTGTAGTCTTCTCA) et le fragment complémentaire C : d(GGAAGCAGTATGT) sont synthétisés chimiquement par la méthods phosphotriester sur un support solide inorganique comme cela a été décrit précédemment par Kohli et coll.., 1982 et purifiés par HPLC comme décrit par Fritz , 1978. 0,5 nmole d'oligonucléotide B est mis en incubation pendant 30 minutes a 370C dans un milieu réac- tionnel de 10 l contenant 60 mM de Tris-HCl, pH 7,8, 6 mM de MgCl2, 6 mM de dithiothreitol, 0,1 mM d'ATP, 6 pmoles P32-ATP (3000 Ci/mmole), 2 unités de kinase T4 polynucléotide. L'oligomère B 5'phosphorylé est mélangé avec 0,5 nmole d'oligonucéotide A et C dans 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM d'EDTA, chauffé à 1000C et le mélange est refroidi lentement jusqu'à 40C.Le mélange réactionnel des oligonucléotides A et B est ligué dans 50 pl de mélange réactionnel contenant 66 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 7,5 mM de MgCl2, 2 mM de dithiothréitol, 0,5 mM de spermidine, 0,2 mM d'EDTA, 4 unités de ligase DNA T4 à 40C pendant une nuit. Le 52mer résultant est alors purifié du mélange de ligation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 20 %. IV Analyse de la banque de cADN de foie humain 10 000 colonies environ sont mises en croissance pendant une nuit sur plusieurs boites d'agar LB contenant 10 g/ml de têtracycline. Le jour suivant les colonies bactériennes sont transférées sur filtres de nitrocellulose et les filtres sont préparés pour l'hybridation sur des colonies,essentiellement comme cela a été décrit par Grunstein et coll., 1979. Les bactéries restantes, sur les boites à la tétracycline d'origine, sont remises en croissance pendant auelques heures à 37 C La sonde d'hybridation est préparée par kination de 100 ng du 52mer avec 50-pCi de P32-ATP.L'hybridation est effectuée à 480C pendant une nuit dans 40 ml de 6 x SSC et 1 X de solution de Denhardt, 0,1 % de SDS, 50 pg/ml d'E. coli tARN. Le jour suivant, les filtres sont lavés à 420C plusieurs fois avec une solution de 6 x SSC, 0,1 % de SDS. Les filtres sont séchés puis autoradiographiés pendant une nuit. Résultats La séquence d'acides aminés du facteur IX bovin (Katayama et coll., 1au9) est analysée pour trouver une séquence longue composée d'acides aminés déterminés par des codons faiblement dégénérés. La sonde a ainsi été réalisée pour correspondre aux acides aminés 36 à 52 du facteur IX bovin, qui correspond à 4 acides aminés codés par 4 codons (thr, val, gly), 12 acides aminés codés par 2 codons (glu, lys, phe, gln, tyr, asp, cys) et 1 acide aminé codé par 1 codon (trp) (figure 1). Ensuite, l'analyse de 585 codons de la prothrombine bovine et du fibrinogène bovin ont révélé que le codon valine GTG est utilisé 21 fois sur 38. De même TTC et TGT sont utilisés 2 fois plus fréquemment que les autres codons des -acides amines phe et cys, respectivement. Aucune autre préférence très nette ne se détache à l'analyse, toutefois, certains nucléotides sont trouvés peu fréquemment en 3ème position pour certains codons, par exemple G dans le cas de la glycine et de la thréonine. En outre, l'appariement G:T, bien que moins stable que la paire de bases G:C, contribuera au moins à la stabilisation de l'hybridation du 52mer durant l'hybridation de la colonie, tandis que l'appariement A:C ne le fera pas. Ainsi, G a été choisi pour chacun des acides aminés (glu, lys, gln) dans lesquels le choix en 3ème position du codon dégénéré était soit G soit A ; de même T a été choisi par rapport à A dans le cas des acides aminés tyr et asp. Compte tenu de ces considérations, le choix s'est limité à T ou G comme nucléotide en 3eme position pour la thréonine et la glycine ; toutefois, comme cela a été indiqué précédemment, G se trouve peu fréquemment en 3ème position des codons de la thréonine. Ainsi on a choisi T pour l'un des codons de la thréonine et de façon à écarter un problème possible d'une structure secondaire à l'intérieur du 52mer, choisi T en position 3 pour la glycine et A en position 3 pour le second codon de la thréonine. Sélection de la banque de cADN humain et identification du clone de facteur IX La stratégie d'origine était d'utiliser le 52mer pour sélectionner la banque de cADN de foie de bovin et ensuite utiliser ce clone de cADN de facteur IX bovin sous forme d'une sonde pour une banque de cADN de foie humain. Cette stratégie reposait sur une hypothèse de généralisation de l'homologie connue dans les séquences d'acides aminés à l'extrémité N des protéines bovines et humaines (voir Di Scipio et col., 1977). En s'appuyant sur cette homologie interspécifique dans les séquences diacides aminés, on a effectué une sélection parallèle d'une banque de foie de bovin et de foie humain. Les conditions d'hybridation et de lavage employées furent peu sévères car l'homologie actuelle entre la sonde 52mer et le cADN de facteur IX était inconnue. Différentes colonies dans la banque de cADN bovin donnèrent des signaux positifs par sélection avec la sonde 52mer. Dans la banque de cADN de foie humain, une colonie a été obtenue, qui donne un signal dans les conditions mises en oeuvre. Compte tenu du fait que la présente recherche a été effectuée dans le but d'isoler un cADN de facteur IX humain, il n'a pas été effectué d'autres analyses sur les clones bovins et tous les efforts se sont portes sur le clone humain. Pour. à établir que cette colonie correspond au facteur IX humain, le plasmide recombinant est digéré avec PstI, puis - l'insert de cADN excisé est transféré dans le phage M13mp8 (Messing et coîl.3 1982) et séquence en utilisant des didéoxynucléotides comme terminateurs de channe (Sanger et coll., 1977). La séquence obtenue correspond aux nucléotides 1-180 de la figure 2, la séquence d'acides aminés déduite confirme que le clone est un clone de cADN de facteur IX humain. La séquence plus complète de l'insert de cADN de ce clone, pTG397, est déterminée en combinant les méthodes de Maxam et de Gilbert, 1980, ou de Sanger, à partir de segments de restriction sous clonés dans M12mp9. La séquence obtenue est indiquée dans la figure 2. Discussion du résultat En employant une sonde oligonucléotide unique, il a été possible d'isoler un clone de facteur IX humain contenant un insert de 2,1 kb. Lorsque l'insert de 2,1 kb est utilisé comme sonde pour trier une seconde banque de cADN de foie humain, un autre clone spécifique de facteur IX, pTG398, contenant un insert de 2,6 kb est isolé. L'extrémité 5' de pTG398 est située au nucléotide 480 de la figure 2. Ceci suggère que l'extrémité non traduite 3' de pTG397 est incomplète et que l'extrémité complete 3' non traduite a une longueur d'environ 1,7 kb. On observe une différence entre la séquence de nucléotide obtenue et la séquence donnée par Kurachi et Davie. Cette différence comporte une transition au nucléotide 581 (G- > A), transformant l'alanine en thréonine. La détermination de la séquence d'acides aminés du peptide de connexion du facteur IX confirme la présence de thréonine dans cette position. Ces données suggèrent que comme pour d'autres protéines sériques le facteur IX est polymorphe (Cooper, 1978). En considérant l'utilisation des codons de substitution G:T et l'élimination de la structure secondaire possible dans la sonde de nucléotide, on a pu obtenir un 52mer unique qui s'est révélé être utile de façon satisfaisante comme sonde pour le séquençage d'un clone unique. Le 52mer choisi est homologue avec la séquence clonée pour 43/52 nucléotides tandis que deux appariements erronés sont des paires G:T. Ceci reflète une homologie à 85 % dans les séquences de nucléotides interspécifiques observées précédemment. Structure géné-rale du ADN -de facteur IX La connaissance des séquences de nucléotide du cADN de facteur IX permet de déduire la séquence d'acides aminés codée de la protéine correspondante. L'insert de cADN de pTG397 révèle les caractéristiques suivantes du facteur IX humain a. Le facteur IX est une protéine contenant 415 acides aminés. Dans la figure 3, les nucléotides.140-1384 codent pour le facteur IX humain. b. Le facteur IX humain est synthétisé sous forme d'un précurseur avec une séquence signal attachée et une séquence de pré protéine. Ceci est une caractéristique commune à toutes les protéines qui sont destinées à être sécrétées. Dans le cas du facteur IX, il y a une séquence signal classique d'environ 25 acides aminés codés par les nucléotides 2-76, inclus. L'extension hydrophobe des acides aminés est normalement éliminée pendant la sécrétion de la protéine à l'extérieur de la cellule. Les nucléotides 77-139 inclus codent pour une séquence de préprotéine qui probablement rapidement après la sécrétion est éliminée de la forme mature du facteur IX (commençant avec la tyrosine au nucléotide 140). Comme cela est souvent trouvé à la fin de la séquence de préprotéine, la structure d'acides aminés dibasiques lys-arg est trouvée à la jonction entre la séquence de préprotéine et le premier acide aminé du facteur IX mature. d. La forme activée du facteur IX (IXa) est pro duite à partir de la forme inactive ou zymogène du facteur IX par hydrolyse de deux liaisons peptides par le facteur XI activé (XIa). Ces liaisons peptides sont trouvées entre les acides aminés arg-ala (nucléotides 572-577) et val-val (nucléotides 677-682). Le peptide le plus long de 35 acides aminés libéré pendant l'activation du facteur IX est appelé le peptide d'activation. Le facteur IXa est ainsi composé de deux channes polypeptidiques : une chaise légère de 145 acides aminés (nucléotides 140-574) et une chaine lourde de 235 acides aminés (nucléotides 680-1384). Les chaînes légères et lourdes du facteur IXa sont maintenues ensemble par des ponts disulfures. La chaise lourde comprend un site actif typique de la sérine-protéase (met-phe-cys-ala-gly, nucléotides 1181-1195) de même que d'autres résidus importants dans l'activité catalytique de la sérine-protéase typique. La channe légère contient 12 unités d'acide glutamique qui sont ?r-carboxylées pour produire l'acide &gamma;-carboxy-glutamique par un -processus qui dépend de la vitamine K. Ceci est important dans la fixation du facteur IXa au Ca++, à la membrane phospho lipidique membranaire et au facteur VII la dans le cycle de coagulation. d. Au contraire du facteur IX bovin qui a 4 sites pour la fixation d'hydrate de carbone, le facteur IX humain a 2 sites potentiels pour l'attachement des hydrates de carbone. Ces sites sont tous situés dans le peptide d'activation, aux nucléotides 608-616 et 638-646, et contiennent la séquence typique asn-x-thr/ser. Par contraste, le facteur IX bovin a 4 hydrates de carbone attachés dont la structure a été récemment déterminée par Nizurochi et coll., 1983. Préparation du cADN de facteur IX cloné nécessaire pour l'expression (voir figure 3) pTG397 a été mis en digestion avec l'enzyme de restriction PstI. Comme la banque de cADN a été clonée par des extrémités G/C dans le site PstI de pBR322 et, en outre, que le facteur IX de pTG397 ne contient pas un site interne de reconnaissance PstI, ee traitement libère un cADN intact de 2,1 kb correspondant au facteur IX, avec des extrémités susceptibles d'être clones dans les sites PstI. Le fragment de cADN facteur IX est transféré par des procédures standards dans le phage Mî3mp8 qui a été précédemment mis en digestion avec PstI et traité avec la phosphatase alcaline. Les phages recombinants sont utilisés pour transfecter une souche de E. coli JM103. Le phage recombinant M13tg397B est utilisé comme source de cADN de facteur IX comme cela sera décrit ci-après. Le cADN de facteur IX contient un site de reconnaissance unique pour l'enzyme FnuDII qui reconnaît la séquence de tétranucléotide CGCG située sur les nucléotides 7-10. Par digestion de M13tg397B avec PstI et FnuDII, on obtient un grand fragment et de nombreux petits fragments, correspondant à 19 sites de reconnaissance pour FnuDII dans M13mp8. Le fragment le plus grand correspondant au fragment FnuDII:PstI. Ce fragment écarte 9 nucléotides et les extrémités G/C de l'extrémité 5' du cADN de facteur IX. I1 a été considéré comme important d'écarter les extrémités G/C de l'extrémité 5' de façon à augmenter l'expression et la stabilité du cADN de facteur IX dans le vecteur d'expression. En éliminant ces 9 nucléotides, on élimine un ATG de la séquence signal. I1 n'est pas str toutefois que cet ATG soit 1'ATG qui initie la traduction. La portion du facteur IX éliminée par digestion avec FnuDII est dans la séquence signal et en conséquence n'est pas importante pour l'activité du facteur IX. La séquence signal, si la traduction débute normalement à 1'ATG eliminé lors de la digestion par FnuDII, est écourtée de 5 acides aminés. De façon à déterminer si ces 5 acides aminés additionnels sont importants pour la sécrétion et/ou pour l'utilisation du facteur IX, la séquence de nucléotide éliminée par digestion avec FnuDII est restaurée en utilisant deux oligonucléotides synthétiques A) S' GATCCATGCAGCG 3' B) 5' CGCTGCATG 3' La séquence soulignée dans l'oligonucléotide A correspond à la séquence écartée, moins le premier nucléotide T, du phage M13tg397B par digestion avec FnuDII. L'oligonucléotide B est complémentaire de l'oligo- nucléotide A. L'hybridation des oligonucléotides A et B donne la structure à double brin suivante qui possède des extrémités BamHI cohésives 5' GATCCATGCAGCG 3' 3' GTACGTCGC 5' Les oligonucléotides A et B sont ligués avec le fragment de cADN de facteur IX EcoRI/FnuDII qui a été purifié à partir de M13tg397B. Le phage M13mp701 traité par le phosphatase-alkaline et soumis à la restriction par BamHI est alors ajouté pour la ligation et la ligation est effectuée pendant toute une nuit. Un aliquote du mélange de ligation final est transformé dans une cellule JM103. La séquence de nucléotide du phage recombinant Mi3tg315 qui a donné une plage blanche confirme que la construction est correcte.La digestion de M13tg315 avec BamHI libère un fragment de cADN de facteur IX dont la séquence 5' est la suivante 1 10 20 5' G GATCCATGCAGCGCGTGAACATG/////////FIX////////////G GATCC 3' / ........... ---------------- / BamHI BamHI La séquence correspondant à l'oligonucléotide A été indiquée ci-dessus en traits pointillés. La séquence soulignée correspondant aux 15 nucléotides qui codent pour les 5 acides aminés absents de la séquence signal du fragment de cADN de facteur IX BamHI/BglII de M13tg311. Construction des plasmides hybrides Les tailles combinées des différents eléments necessaires pour le transfert de la séquence codant pour le facteur IX Z . dans le génome de W et son expression subséquente sont de l'ordre de plusieurs kb. Il a donc été jugé nécessaire de minimiser la taille du plasmide de réplication dans E. coli utilisé pour le travail de construction de façon à faciliter les manipulations nécessaires. Le fragment flindilî (Hin-J) du gnome de W contient le gène complet de la thymidine kinase (TK) qui a déjà été utilisé précédemment pour permettre l'échange et la recombinaison de 1'ADN à insérer dans le génome de W (Mackett et al., 1982). I1 est important de noter que le transfert d'un insert dans le gène TK dans le génome de W crée un virus TK déficient qui peut être reconnu en utilisant une simple sélection. I1 a tout d'abord été nécessaire de produire un plasmide de petite taille portant site unique HindIII utilisable pour l'intégration du fragment Hin-J W. En outre, il était important d'éliminer les séquences de restriction non nécessaire du plasmide de façon à permettre les manipulations suivantes. 3/ La construction a été amorcée & partir du plasmide pML2 (Lusky et Botchan, 1981) qui est un vecteur dérivé du plasmide pBR322 par délétion spontanée du segment entre le nucléotide 1089 et 249-1 (figure 4). D'abord la séquence de PstI a été .éliminée par insertion du fragment AhaIII-AhaIII de pUC8 (Vie ira et Messing, 1982) entre deux sites AhaIII de pML2 en éliminant 19 paires de bases. On a utilisé la méthode de "linker-tailing" (Lathe et al., 1984) pour insérer un linker HindIII entre les sites NruI et EcoRI traite par la nucléase S1 . en éliminant le site BamHI. Ceci conduit à un plasmide de 2049 paires de bases portant le gène t-lactamase fonctionnel (conférant la résistante à l'ampicilline)et comportant en outre une origine de réplication active dans E. coli et un site de restriction unique HindIII. Cette construction a été appelée pTGlH. 4/ Le fragment Hin-J de 1'ADN de W portant le gène TK a préalablement été cloné dans un vecteur provenant de pBR327 (Drillien et Spehner, 1983). Ce fragment de 4,6 kb a été recloné dans le site HindIII de pTG1H. Un clone a étX sélectionné dans lequel le gène TK est situé distalement par rapport au gène codant pour la résistance à l'ampicilline. Cette construction pTGlH-TK a été utilisée comme porteur dans l'expérience suivante. 5/ L'étape suivante a été d'isoler un promoteur de W utilisable pour commander l'expression de la séquence codant pour le docteur IX inséré. Le promoteur d'un gène précoce codant pour une protéine de 7 500 daltons (7,5K) a déjà été utilisé avec succès dans un but identique (Smith et all., 1983) et on a donc procédé à son isolement. . . Le gene 7,5K est situé sur l'un des plus petits fragments SalI (fragment Sal-S) du génome de W type WR (Venkatasan et al., 1981). Comme les petits fragments sont clones de façon préférentielle, une grande proportion des clones obtenus par clonage direct de 1'ADN de W type WR coup par SalI dans le plasmide pBR322 porte le fragment Sal-S. Ce fragment est transféré sur le bactériophage vecteur M13mp701 (voir Kieny et al., 1983), par digestion SalI et religation, en conduisant ainsi au phage M13tgSal-S. Dans ce clone, un site ScaI se trouve immEdiate- ment à proximité de 1'ATG d'initiation du gène 7,5K. En aval du gène 7,5K se trouvent situés des sites uniques BamHI et EcoRI provenant du vecteur. Les sites BamHI et ScaI sont fusionnés par l'intermédiaire d'un linker BglII 5'-CAGATCTG-3' par la technique des "linker" après avoir complété les extrémités générées par digestion BamHI avec le fragment Klenow de la polymérase. Ce procédé élimine le site ScaI mais reconstitue le site BamHI et place le.site-unique EcoRI immédiatement en aval du site BamHI. En même temps, le site SalI(AccI) en aval est éliminé, le site en amont devient donc unique. Cette construction est appelée M13tg7,5R. A l'intérieur du fragment Hind-J de 1'ADN de W se thobvent situés des sites Clal et EcoRI qui sont séparés par environ 30 paires de bases (Weir et Moss, 1983). Le fragment promoteur de 7,5K présent dans M13tg7,5K est excisé par AccI et EcoRI et cloné entre les sites ClaI et EcoRI de pTGlH-TK pour générer pTGlH-TK-P7,5K dont la synthèse est schématisée figure 5. Cette construction conduit au transfert du site BamHI unique du vecteur N13 immédiatement en aval de la séquence du promoteur 7,5K. Ce site unique BamHI est utilisé dans les constructions suivantes. 6/ pTGlH-TK-P7,5K est mis en digestion avec BamHI et ligué avecM13tgll5 digéré par BamHI (figure 5). Après transformation de E. coli l1un des plasmides recombinants isolé par cette procédure, pTG393, est sélectionné car il porte le cADN du facteur IX dans l'orientation correcte pour l'expression à partir du promoteur de 7,5K. Clonage dans le virus de la vaccine (figure 6) 7/ La stratégie décrite par Smith et al. (1983) repose sur l'échange in vivo entre un plasmide portant un insert dans le gene W TL et le génome viral de type sauvage de façon a inactiver le gène TK porté par le virus. Les virus TK peuvent être sélectionnés par étalement sur une lignée cellulaire TK-négative en présence de 5-bromodéoxyuridine (5BUDR) tMackett et al., 1982). La thymidine kihase phosphoryle le5BUDR en 5'-monophosphate, qui est ensuite converti en triphosphate. Ce composé est un analogue de dTTP et son incorporation dans 1'ADN bloque le développement correct du virus. Un virus 32L peut néanmoins répliquer son ADN normalement et il conduit à des plaques virales visibles dans une couche cellulaire également Tek . Le virus de la vaccine se propage dans le cytoplasme des cellules infectées plutôt que dans leur noyau. C'est pourquoi il n'est pas possible de tirer avantage de la machinerie de réplication et de transcription de 1'ADN de l'hôte et il est nécessaire que le virion possède les composants pour l'expression du gène viral. L'ADN de W purifié est non-infectieux. Afin de générer les recombinants, il est nécessaire d'effectuer simultanément l'infection cellulaire avec un W et une transfection avec le segment d'ADN cloné qui présente de l'intérêt. Toutefois, la génération des recombinants est limitée à une petite proportion des cellules compétentes pour la transfection à l'ADN. C'est pour cette raison qu'il a été nécessaire de mettre en oeuvre une stratégie de "congruence" indirecte pour réduire le bruit de fond des virus parentaux non-recombinants. Ceci a été effectué en utilisant comme virus infectieux vivant un mutant thermosensible (ts) de la vaccine qui n'est pas capable de se propager à une température non permissiblede 39,50C (Drillien et Spehner, 1983). Lorsque les cellules sont infectées avec un mutant ts dans des conditions non permissibles et transfectées avec l'ADN d'un virus de type sauvage, la multiplication virale interviendra seulement dans les cellules qui sont compétentes pour la transfection ; aucun résultat ne sera obtenu dans les autres cellules, en dépit du fait qu'elles ont été infectées. Si un plasmide recombinant contenant un fragment de 1'ADN de vaccine tel que pTG393 est inclus dans le mélange de transfection à la concentration appropriée avec 1'ADN du type sauvage, il est également possible d'obtenir qu'il participe à la recombinaison homologue avec 1'ADN de la vaccine dans les cellules compétentes. Clonage des recombinants W-FIX Des fibroplastes d'embryons de poulets primaires (CEF) établis à partir d'embryons agés de 11 jours sont mis en croissance jusqu'à confluence (2 x 106 cellules/bofte de 2 cm de diamètre) dans un milieu de base de Eagle (MBE/ Eurobio) supplémenté avec du sérum de veau nouveau-né (SNV) (Drillien et Spehner, 1983). Les cellules sont infectées à raison de 0,01 à 0,1 pfu par cellule avec un mutant du virus de la vaccine thermosensible N7 dérivé du virus de type sauvage Copenhague (Drillien et colt., 1981). Après absorption du virus, les cellules sont incubées à une température permise pour le virus (330C) pendant 2 heures dans MBE/SCN 5 %. Les cellules sont alors transfectées avec un mélange d'ADN virus de type sauvage (Wt) Copenhague purifié 30 ng par boîte) et 1'ADN du plasmide chimérique contenant le gène étranger (30 ng/botte) en utilisant la méthode de coprécipitation au calcium-phosphate. Après 1 heure d'absorption, les cellules sont incubées pendant 2 heures à 39,50C en présence de MBE/2 % SCN. Le précipité calcium est lavé 3 fois avec PBS et les cellules sont mises en croissance pendant 2 jours à une température non permise (39,50C) avec 2 ml de MBE supplémenté avec 5 % SNV. Ce procédé permet un enrichissement en virus de génome sauvage (Wt) ou recombinant. Dans une seconde étape, les virus TK (recombinants) peuvent être sélectionnés comme indiqué précédemment en présence de 5BUdR à 370C. Dans ces conditions, les virus recombinants tk sont capables de se répliquer mais la croissance des virus Wt est empêchée par incorporation dans leur ADN d'analogue de dTTP. Les virus sont clonés dans une premier étape en utilisant un milieu solide contenant 1 % d'agar, des cellules LMTK-, 5 % de SNV (Drillien et coll., 1982) et reclonés à nouveau sur des cellules TK en présence de 5BUdR. Pou vérifier la recombinaison correcte du facteur IX dans le gène tk de W, 1'ADN total des cellules CEF infectées avec le virus recombinant est isolé et digéré avec diverses endo- nucléases. Après fractionnement, 1'ADN est transféré sur filtres de nitrocellulose et hybridé avec un cADN de facteur IX marqué au phosphore radioactif.avec 1'ADN polymérise de E. coli (fig. 8). On sélectionne ainsi un virus VVRTG2 utilisé dans les expériences ci-après. Le virus isolé est ensuite cultivé sur des tapis de cellules CEF pour obtenir une grande quantité de virus en vue des expériences suivantes. Infection des cellules -de la lignée HepG2 par le virus de la vaccine Les cellules HepG2 sont cultivées jusqu'à confluence dans des bouteilles à fond plat contenant un milieu composé de MEM (MEM,GIBCO) et de 5 z de sérum de veau foetal (SVF) (GIBCO) et supplémenté avec de la vitamine K (50 g/ml). Ces boîtes contiennent environ 107 cellules. Elles sont infectées soit avec le virus de la vaccine recombinant, soit avec le virus sauvage. Pratiquement le milieu de culture des cellules est retiré et 500 l d'un extrait contenant le virus de la vaccine sont déposés sur les cellules (soit environ 5 pfu/cellule). Les bottes sont agitées à la température de la pièce pendant 1 heure, puis 10 ml de MEM additionne de SVF (5 t) et de vitamine K (50 pg/ml) sont ajoutés. Les bottes sont placées dans un incubateur à 970C pendant différents temps (4 heures, 8 heures, 22 heures). Analyse de milieux de culture des cellules infectées On a étudié les surnageants de cellules hépatiques infectées par le virus de la vaccine sauvage et le virus recombinant. Cette analyse a été accomplie par l'étude des milieux 4 heures, 8 heures et 22 heures après l'infection. Les milieux ont été fractionnes par adsorption du facteur IX sur le citrate de barium selon un procédé classique (dérivé de Miletrich et coll.) : le facteur IX peut s'adsorber sur ce sel insoluble quand les acides carboxylés sont présents sur la molécule. Pratiquement à un volume de surnageant de cellules infectées (7 ml de surnageant de cellules infectées par le virus de la vaccine recombinant ou normal) on ajoute du citrate de sodium (30 mM final) puis on introduit au goutte à goutte 1/10 de volume d'une solution de chlorure de barium 1 M tout en agitant continuellement. On laisse agiter pendant une heure le mélange. Le précipité est centrifugé à 8 000 g pendant 20 minutes. Le surnageant est récolté et subit un fractionnement de 30 à 70 % de sulfate d'ammonium. La fraction précipitée avec 70 8 de NH2S04 est reprise par addition de 200 pl de Tris 20 mM NaCl 150 mM, pH 7,5, et est dialysé contre ce même tampon. Le volume final est alors de 800 pl environ. Le précipité de barium est resuspendu dans 0,3 volume de BaC12 10 mM, NaCl 100 mM, puis recentrifugé à 8 000 g pendant 10 minutes. Cette opération de lavage du culot est répétée encore deux fois. Ensuite, le culot est repris dans 0,3 volume de Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5, puis on ajoute au goutte à goutte 0,075 volume de sulfate d'ammonium 2 M. Le mélange est agité pendant 1 heure puis centrifugé à 8 000 g 10'. Les protéines du surnageant sont précipitées du sulfate d'ammonium (concentration 70 %) pendant 1 heure. Les protéines précipitées sont centrifugées 10' à 8 000 g. Le culot est dissous dans 200 ul de Tris 20 mM NaCl 150 mM, pH 7,5 et est dialysé contre le même tampon. L'ensemble de ces opérations est accompli à OOC. Les fractions obtenues sont ensuite conservées à - 200C. Elles sont ensuite testées de deux façons a) La quantité d'antigène facteur IX est estimée avec un test ELISA (commercialise par Diagnostica - Stago). b) L'activité du facteur est calculée en mesurant le temps de coagulation d'un plasma d'hémophile supplémenté avec les extraits. Ces mesures sont comparées avec celles obtenues en utilisant un mélange de plasmas humains normaux. Les résultats s'expriment en pourcentage. Pratiquement 100 % correspond à la quantité de facteur présent dans 1 ml de sang humain normal. Les résultats sont fournis sur le tableau joint. Dans ce tableau sont indiquées les concentrations en facteur IX par ml d'échantillon. Dans les surnageants des cellules hépatiques infectées avec les virus de la vaccine sauvage, aussi bien dans la fraction adsorbée sur le citrate de barium que sur la fraction non adsorbée, la quantité d'antigène du facteur IX est inférieure à 1 %, l'activité coagulante reste inférieure à 2 %. En revanche dans les surnageants des cellules infectées par le virus recombinant, la quantité de facteur IX dans la fraction adsorbable sur le citrate de barium augmente avec le temps d'infection. Les quantités estimées par les tests ELISA et d'activité sont semblables. Dans la fraction non adsorbée sur le citrate de barium la quantité d'antigène reste faible ( s 5 %) et l'activité reste comparable au bruit de fond détecté avec le virus sauvage. En conclusion, les cellules HepG2 infectées avec le virus de la vaccine recombinant produisent du facteur IX actif. L'absence d'antigène facteur IX dans la fraction non adsorbée sur le citrate de barium montre que le facteur IX produit dans ces conditions est &gamma; carboxyle pratiquement dans sa totalité. Analyse des milieux de culture de cellule hépatique Hep62 infectés par le virus de la vaccine de type sauvage ou recombinant avec pTG393. Virus de type sauvage Virus recombinant Temps d'infection Temps d'infection 4h 8h 22h 4h 8h 22h Fraction non adsorbée Quantité antigène 0,36 0,33 0,95 4,2 5,57 1,84 (%/ml) au citrate de Barium Activité coagulante 2,3 1,7 1,7 1,7 1,7 1,8 (%/ml) Fraction adsorbée sur Quantité antigène 0,29 0,41 0,559 1,0 4,2 89,3 (%/ml) le citrate de barium Activité coagulante 1,2 1,2 0,9 3,3 5,8 71,2 (%/ml) BIBLIOGRAPHIE BERTINA R.M. et VELTKAMP J.J. (1981) In Hemostasis and Thrombosis, Bloom A.L. et Thomas D.T. Eds. pp. 98-110, Churchill Livingstone, London. HEDNER U. et DAVIE E.W. (1982), in Hemostasis and Thrombosis, Colman R.W., Hirsh J., Marder V.J. et Salzman E.W. Eds. pp. 29-38, J.B. Lippincott Co., Philadelphia. TOLSTOSHEV Po, BERG R.A., RENNARD S.I., BRADLEY K.N. TRAPNEL B.C. et CRYSTAL R.G. (1981).J. Biol. Chem. 256, 3135-3140. DENG G. et WU R. (1981). Nucl. Acids Res. 9, 4173-4188. MURRAY N.E., BRAMMAR W.J. et MURRAY K. (1977), Mol. Gen. Genetics 150, 53-61. MacGILLIVRAY R.T.A., DEGEN S.H.F., CHANDRA T., WOO S.L.C. ET DAVIE E.W. (1980). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5153-5157. CHUNG D.W., RIXON M.W., MacGILLIVRAY R.T.A. et DAVIE E.W. (1981). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1466-1470. KOHLI V., BALLAND A., WINTZERITH M., SAUERWALD R., STAUB A. et LECOCQ J.P. (1982). Nucl. Acids Res. i0, 7439-7448. FRITZ H.J., BELAGAJE R., BROWN E.L., FRITZ R.H., JQNES R.A., LEES R.F. et KHORANA H.G. (1978). Biochemistry 17, 1257-1267. GRUNSTEIN M. et WALLIS J. (1979). Methods in Enzymology 68; 379-389. KATAYAMA K., ERICSSON L.H., ENFILED D.L., WALSH K.A., NEURATH H., DAVIE E.W. et TITANI K. (1979). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4990-4994. DI SCIPIO R.G., HERMODSON M.A., YATES S.G. et DAVIE E.W. (1977). Biochemistry 16, 698-706. MESSING J. et VIEIRA J. (1982). Gene 19, 269-276. SANGER F., NICKLEN S. et COULSON A.R. (1977.); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467. MAXAM A.M. et GILBERT W. (1980). Methods in Enzymology 65, 499-555. DI SCIPIO R.G., KURACHI R. et DAVIE E.W. (1978). J. Clin. Inves. 61, 1528-1538. COOPER D.W. (1978) in The Biochemical Genetics of Man, Brock D.J.H. et Mayo O., pp. 271-324, Eds. Academic Press London. MIZUOCHI T., TANIGUCHI T., FUJIKAWA K., TITANI K. et KOBATA A. (1983). J. Biol. Chem. 258, 6020-6024. DRILLIEN R. et SPEHNER D. (1983) Virology 131, 385-393. KIENY M.P., LATHE R. et LECOCQ J.P. (1983) Gene 26, 91-99. LATHE R., KIENY M.P., SKORY S. et LECOCQ J.P. (1984), DNA, in press. LUSKY M., BOTCHAN M. (1981). Nature 293, 79-81. MACKETT M., SMITH J.L. & MOSS B. (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-7419. PANICALI D. & PAOLETTI E. (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931. PANICALI D., DAVIS S.W., WEINBERG R.L. & PAOLETTI E. (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5364-5368. SMITH G.L., MACKETT M. et MOSS B. (1983). Nature 302, 490-495. VENKATESAN S., BAROUDY B.M. & MOSS B. (1981). Cell 125, 805-813. VIEIRA J. & MESSING J. (1982). Gene 18, 259-268. WEIR J.P. & MOSS B. (1983). J. Virol. 46, 530-537. DRILLIEN R., SPEHNER D. & KIRN A. (1982). Virology 119 372-381. DRILLIEN R., KOEHREN F. & KIRN A. (1981). Virology 111 488-499. KURACHI K., DAVIE E.W. (1982). Proc. Natl. Acad. Sci., USA 79, 6461-6464. MILETRICH J.P., BROZE G.J., MAJERUS P.W. (1981). Methods in Enzymology 80, 221-228 (Academic Press Inc.). JAYE M., de la SALLE H., SCHAMBER F., BALLAND A., KOHLI V., FINDELI A., TOLSTOSHEV P., LECOCQ J.P. (1983) Nucl. Acids Res., 11, 2325-2335. SOUTHERN E.M. (1975). J. Mol. Biol., 94, 51-69. REVENDICATIONS 1) Vecteur d'expression dans les cellules de mammifères du facteur IX ou d'une protéine analogue, caractérisé en ce qu'il est constitué du génome du virus de la vaccine dans lequel a été inséré un gène codant pour le facteur IX humain ou une protéine analogue du facteur IX. 2) Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit gène est sous la promotion d'un promoteur de la vaccine. 3) Vecteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit promoteur de la vaccine est le promoteur du gène de la protéine 7,5K. 4) Vecteur selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit gène est cloné dans le gène TK de la vaccine. 5) Cellule de mammifère infectée par un vecteur selon l'-une des revendications 1 à 4. 6) Cellule selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'il s'agit de cellule hépatique humaine. 7) Cellule selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il s'agit de la lignée HepG2. 8) Procédé de préparation du facteur IX ou d'une protéine analogue, caractérisé en ce qu'on cultive des cellules selon l'une des revendications 5 à 7 et que l'on récupère le facteur IX ou la protéine analogue formés 9) Procédé de préparation de protéine fabriquée par le foie, caractérisé en ce que l'on cultive une lignée de cellules hépatiques infectées par un virus de la vaccine dans le génome duquel a été inséré le gène codant pour ladite protéine sous la promotion d'un promoteur de la vaccine. 10) Facteur IX ou protéine analogue obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 8.