FR 2560890 A1 19850913 FR 8403564 A 19840307 Composition utile pour la fabrication de vaccins conte- nant des particules portant l'antiqgène de surface du vi- rus de l'hépatite B et le récepteur de l'albumine sé- rique humaine polymérisée, cellules animales capables de produire de telles oarticules et procédé pour leur ob- tention. L'invention concerne une composition utile pour la fabrication de vaccins, contenant ou formée par des particules polypeptidiques sensiblement sphériques, au moins en ce qui concerne la pupart d'entre elles, ces particules ayant les propriétés immunogéniques et immunologiques caractéristiques de l'antigène de surface du virus de l'hépatite virale B. Cet antigène est souvent désigné par l'abréviation HBsAg ou encore plus simple- ment HBs. Elle concerne également des lignées cellu- laires eucaryotes, de préférence animales, capables d'excréter dans leur milieu de culture des particules polypeptidiques du genre sus-indiqué avec des rendements de production élevés et des moyens, notamment des vec- teurs modifies, permettant d'obtenir de telles lignées cellulaires. On rappellera tout d'abord que le sérum des por- teurs chroniques du virus de l'hépatite B (HBV) contient des enveloppes virales vides sous forme de particules ou filaments de 22 nm de diamètre et parfois des virions complets infectieux, particules sphériques de 42 nm. L'enveloppe virale porte l'antigène de surface (HBsAg) et la présence de virions infectieux s'accompagne géné- ralement d'un antigène soluble appelé antigène (HBeAg). La composition polypeptidique de l'enveloppe virale a été très étudiée (Robinson W.S. (1977) Ann. Rev. Microbiol. 31, 357-377). Elle comprend un polypep- tide majeur présent sous forme glycosylée (GP29) et non glycosylée (P25) et au moins trois polypeptides mineurs appelés GP33, GP36 et P41. Les polypeptides GP33 et GP36 auraient la même séquence en acides aminés. GP36 possé- derait seulement un résidu glucidique supplémentaire (Stibbe W. et Gerlich W.H. (1983) J. Virology 46, 626- 628). La quantité relative des protéines mineures par rapport au polypeptide majeur varie d'un plasma à l'au- tre. Elle est très supérieure dans les sérums HBeAg po- sitifs riches en particules virales. Les polypeptides GP33 et GP36 peuvent alors représenter plusieurs % des protéines de l'enveloppe alors qu'ils représentent moins de 1 % dans les sérums non infectieux HBeAg négatifs (Stibbe W. et Gerlich W.H. (1982) Virology 123, 436- 442). Le polypeptide majeur de l'enveloppe est cons- titué de 226 acides aminés et est codé par le gène S. La séquence polypeptidique de GP33 et GP36 serait codée par le gène S et une partie de la région pré-S. Dans cette hypothèse, cette séquence polypeptidique aurait la même extrémité C-terminale que le polypeptide majeur et con- tiendrait une séquence supplémentaire de 55 acides ami-, nés en position N-terminale (Stibbe W. et Gerlich W.H. (1983), J. Virology 46, 626-628). Récemment, il a été montré que les particules virales isolées d'un sérum HBeAg positif contiennent un récepteur pour l'albumine humaine polymérisée (pHSA) (Machida A. et al (1983) Gastroenterology 85, 268-274). Ce récepteur serait porté par les polypeptides GP33 et GP36. Grâce à ce récepteur, la pHSA formerait un pont entre la particule virale et l'hépatocyte, permettant ainsi l'attachement du virus et sa pénétration dans la cellule hépatique. L'apparition des anticorps anti-ré- cepteurs serait essentielle dans le processus d'élimi- nation ("clearance") du virus. En effet, la séro-con- version HBeAg/anti-HBe, étape initiale de la guérison, s'accompagne de l'apparition de ces anticorps, alors que ceux-ci sont absents au cours de l'évolution vers la chronicité (Pontisso P. et al (1983) J. of Virological Methods 6, 151-159). Parallèlement, on observe la disparition des an- tigènes correspondants au récepteur de la pHSA, ce qui paraît témoigner de ce que l'expression du gène corres- pondant n'intervient normalement que dans des situations biologiques précises (notamment au cours de l'étape de réplication du virus). C'est ce que corrobore encore l'analyse des enveloppes vides naturelles du virus de l'hépatite B, telles qu'elles sont contenues dans des préparations de vaccins actuellement commercialisées et obtenues à partir du sérum sanguin de donneurs qui, dans le passé, ont été exposés au virus de l'hépatite B. En effet, l'analyse par électrophorèse en gel de polyacry- lamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS) des polypeptides obtenus après dissociation des particules naturelles à 100 C pendant 5 minutes, en présence de dithiothréitol (DTT), ne révèle pas la présence de poly- peptides ayant des poids moléculaires élevés, notamment de l'ordre de 34.000. De même, la présence de tels poly- peptides à poids moléculaires élevés n'a pas été obser- vée dans les compositions de particules possédant les propriétés immunologiques et immunogéniques de l'anti- gène HBs, telles qu'elles ont été obtenues par transfor- mation de cellules animales transformées par les techni- ques du génie génétiques au moyen des vecteurs qui ont été décrits par exemple dans la demande de brevet euro- péen n0 38.365. L'invention a pour but de fournir des composi- tions de vaccins ayant des propriétés de protection ren- forcées à l'égard du virus de l'hépatite B. Elle a en- core pour but de fournir des lignées cellulaires trans- formées par les techniques du génie génétique, qui peu- vent être maintenues en culture et qui sont aptes à ex- créter les principes actifs de ces compositions de vac- cins renforcées dans leur milieu de culture, et ce avec des rendements de production beaucoup plus élevés que ceux que permettent la plupart des cultures génétique- ment transformées dont on dispose à ce jour. Enfin elle a pour but de fournir des moyens (vecteurs et procédé) permettant l'obtention de telles lignées cellulaires à partir de lignées de cellules eucaryotes, notamment de mammifères, du genre de celles qui sont capables d'être maintenues en culture. L'invention résulte de la constatation qui a été faite qu'il était possible d'induire l'expression des séquences génétiques qui, dans le génome du virus de lPhépatite B codent pour le récepteur de la pHSA, dans des conditions pourtant très éloignées de celles qui prévalent dans les situations biologiques précises qui ont été évoquées plus haut. Enfin, il a été constaté que l'association dans la même composition de vaccin de l'antigène HBs avec des fragments polypeptidiques por- tant un déterminant antigènique paraissant correspondre à ce récepteur, conduisait aux compositions de vaccin renforcées dont il a été question plus haut. La composition utile pour la fabrication de vac- cins selon I'invention qui contient des particules poly- peptidiques sensiblement sphériques (ou qui est formée par ces particules), au moins en ce qui concerne la plu- part d'entre elles (sinon toutes), qui ont les proprié- tés immunogéniques et immunologiques caractéristiques de l'antigène HBsAg, qui ont des tailles de 18 à 25 nm, no- tamment de 20 à 22 nm, et des densités permettant leur isolement dans une zone de densité de 1,20-1,22 g/ml dans un gradient de densité à base de CsCl, et un niveau de pureté totale pour ce qui est de l'absence de toute particule de Dane et d'antigène HBe, y inclus HBc, est plus particulièrement caractérisée par le fait que les- dites particules sphériques contiennent également unré- cepteur pour l'albumine humaine polymérisée. Plus parti- culièbrement, les particules polypeptidiques de l'inven- tion se révèlent contenir des proportions substantielles de polypeptides ayant des poids moléculaires de l'ordre de 34.000 daltons, ces polypeptides constituant de pré- férence une proportion supérieure à 10 %, et de préfé- rence supérieure à 20 % de la quantité totale du poly- peptide constitutif des susdites particules. De préfé- rence encore, la composition selon l'invention est exempte de tout composant d'origine humaine, tel qu'on en trouve dans les sérums sanguins humains. Il s'agit essentiellement de compositions de particules ayant les propriétés immunogéniques de l'antigène HBsAg et du ré- cepteur de la pHSA qui sont excrétés dans leur milieu de culture par des lignées cellulaires maintenues en cul- ture et qui ont au préalable été transformées par un vecteur contenant les séquences codantes appropriées, la transformation ayant été réalisée dans des conditions permettant l'expression effective des séquences pepti- diques portant les sites immunogbnes aussi bien de l'an- tigène IBs que du récepteur de la pHSA. L'invention concerne également les vecteurs ap- propriés à la transformation des lignées cellulaires eucaryotes, plus particulièrement de cellules humaines ou animales en culture pour rendre celles-ci aptes è produire les particules immunogéniques sus-indiquées. Ces vecteurs, qui contiennent une séquence d'ADN codant pour les régions S et pré-S du génome du virus de l'hé- patite virale B, sont caractérisés en ce que ladite sé- quence d'ADN est, à l'intérieur de ce vecteur, placé sous le contrôle direct d'un promoteur exogbne dont est connue la capacité de permettre l'initiation efficace de la transcription des gènes directement sous son contrôle dans les cellules eucaryotes, notamment humaines ou ani- males, auxquelles lesdits vecteurs sont destinés. On se reportera par exemple à l'article de Galibert et Col., 1979, Nature, vol. 281, p. 646650, pour ce qui est de ladite séquence d'ADN. Elle comprend notamment le gène S proprement dit précédé de la séquence pré-S comportant approximativement 165 triplets et dont les premiers nu- cléotides apparaissent dans la formulation partielle desdites séquences indiquée ci-dessous: preS S Met Met ATCTACAGCATGGG -- ACATGGAG-- 2848 155 Le promoteur exogène mis en oeuvre est distinct ou étranger vis-à-vis du promoteur "endogène", normale- ment associé aux gènes S et pré-S dans le génome du vi- rus de l'hépatite B. Lorsque ces cellules sont origi- naires du singe, il est avantageux d'avoir recours à un promoteur issu du virus SV40, dont est connue la capa- cité de permettre l'initiation efficace de la transcrip- tion de gènes adjacents dans des cellules de singe. Avantageusement, ce promoteur correspond au promoteur "précoce" du virus SV40, lequel contrôle normalement l'expression de l'antigène "petit T" ("small T antigen") et également de l'antigène "grand T" ("large T anti- gen"). L'invention ne se limite cependant pas à l'uti- lisation de ce promoteur particulier, bien que celui-ci ait donné des résultats particulièrement favorables eu égard à la production par les cellules transformées de polypeptides portant les déterminants immunogéniques caractéristiques de l'antigène HBs et d'un récepteur de la pHSA, et à leur excrétion dans le milieu de culture utilisé. On peut également avoir recours par exemple au promoteur tardif de SV40 (qui contrôle l'expression des protéines VP1, VP2 et VP3). On peut se reporter à la carte de restriction du virus SV40 (J. Tooze, Ed. DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1980, chaps. 2-5) , pour apprécier les positions relatives de ces promoteurs et des gènes codant pour les différents antigènes qui leur sont as- sociés. Il va de soi que l'on peut substituer aux pro- moteurs de SV40 tout autre type de promoteur connu comme possédant ou dont pourrait être- découverte la capacité de promouvoir la transcription dans les lignées cellu- laires mises en oeuvre desdites séquences codant pour les susdites régions S et pré-S, dès lors qu'elles se- raient placées sous leur contrôle, avec pour résultat l'incorporation de ces séquences avec ce promoteur dans le génome des cellules réceptrices et/ou la capacité conférée aux cellules réceptrices ainsi transformées de synthétiser et d'excréter des quantités substantielles de polypeptides ayant les propriétés immunogéniques de HBsAg et du récepteur de la pHSA, la capacité ainsi acquise étant ensuite transmissible aux générations successives issues de ces cellules. Lesdites lignées transformées seront dites "stables" lorsque le caractère acquis par les lignées cellulaires selon l'invention de synthétiser les susdits polypeptides se transmet d'une génération de cellules à l'autres, sur au moins 10 générations. A titre d'autres promoteurs susceptibles d'être utilisés, on mentionnera par exemple le promoteur pré- coce du polyome ou des promoteurs LTR de différents ré- trovirus ou encore le promoteur EA de l'adénovirus. Comme il est bien connu, les promoteurs prélevés sur les génomes des virus dont ils sont originaires sont de préférence accompagnés des "séquences" activatrices qui normalement les précèdent (par rapport au sens de la transcription des séquences géniques normalement placées sous leur contrôle). A titre d'exemple de séquences ac- tivatrices, on peut se référer à l'article de Science, 1983, vol. 219, pages 626 à 631, et Nature, 1982, vol. 295, pages 568 à 572. Avantageusement, la susdite séquence d'ADN co- dant pour les susdites régions pré-S et S est placée, immédiatement derrière un fragment d'ADN constitué par le promoteur et la séquence activatrice permettant la transcription normale de la séquence pré-S ou S. Le susdit fragment comprend notamment de 300 à 400 paires de bases selon le type de promoteur et de séquences activatrices utilisées. De préférence encore, le vecteur selon l'inven- tion contient en outre une séquence d'ADN ou un mar- queur, tel qu'une enzyme, ce marqueur étant lui-même sous le contrôle d'un promoteur distinct plus faible que le premier promoteur mentionné cidessus. Ce marqueur est de préférence constitué par un gène ou séquence d'ADN codant pour la dihydrofolate réductase (dhfr). Il est à noter que ce marqueur se prête avec un avantage particulier à l'amplification du nombre de copies de ce vecteur dans les cellules qu'il est capable de transfor- mer, dans les conditions qui seront indiquées plus loin. Le second promoteur est dans la plupart des cas également un promoteur exogène. Il peut cependant égale- ment être constitué par l'un des promoteurs naturels contenus dans le génome de l'hépatite virale B. Un pro- moteur particulièrement préféré est celui qui provient de la LTR (séquence appelée "Long Terminal Repeat" dé- crite dans Nature, 1981, 294, 228-232) du virus de la tumeur mammaire de la souris (MMTV). L'invention concerne encore les lignées cellu- laires transformées par des vecteurs tels qu'ils ont été définis cidessus et qui sont aptes à excréter dans leur milieu de culture les particules immunogènes également définies ci-dessus. En particulier, elle concerne des lignées cellulaires ayant une capacité de production d'au moins 1 microgramme, et de préférence d'au moins 10 microgrammes d'antigène HBsAg par 106 cellules et par 24 heures. L'invention concerne en particulier des lignées caractérisées par des AIRN-HBV-spécifiques qui ont des tailles supérieures à 2,1 kb, notamment de l'ordre de 2,2 à 2,8 kb, de préférence 2,6 kb, que l'on peut y détecter lorsque s'effectue la transcription des régions S et pré-S, normalement initiée dans la région pré-S. I0 Des lign es préférées sont celles dans lesquelles on peut également détecter des ARN-HBV-spécifiques ayant des tailles supérieures à 2,1 lcb, notamment de l'ordre da 2,2 à 2,8 kib, et de préférence encore de l'ordre de 2,4-2,6 kb. En ginéral, on déltectera simultanément des ARN-HBVspécifiques ayant des tailles de l'ordre de 2,1 kb, tel que celui qui résulte de la transcription des régions S et pré-S, normalement initiés dans la région pré-S sous le contrôle de promoteur endogène, dans les conditions biologiques particulières auxquelles il était fait référence plus haut (notamment au cours de la ré- plication du virus de l'hépatite B) et des ARN-HiBV-spé- cif.ques ayant des tailles correspondant aux valeurs plus élevées qui ont été indiquées. De préférence, les lignées selon l'invention sont fopmées de cellules de mammifères, notamment de cellules CHO, L'invention concerne encore un procédé de pro- duction de telles lignées cellulaires susceptibles d'être maintenus en culturece procédé comportant la transformation de ces lignées avec un vecteur tel que défini ci-dessus et l'isolement de celles des cultures qui expriment simultanément les séquences codant pour les régions D et pré-S du génome du virus de l'hépatite B. De préférence, on a recours au vecteur complété qui comprend le marqueur sous le contrôle d'un second promoteur, la culture des lignées transformées étant alors réalisée en présence d'un inhibiteur du marqueur, la teneur de cet inhibiteur dans le milieu de culture étant réglée à une concentration suffisante pour pro- voquer une amplification du nombre de copies du gène codant pour le marqueur dans certaines au moins des co- lonies mises en culture, amplification qui permet à la fois la sélection de colonies résistantes et l'obtention de clones cellulaires secréteurs de quantités accrues des particules présentant des activités immunogènes ca- ractéristiques de HBsAg et d'un récepteur de la pHSAo Avantageusement, le marqueur est constitué par une séquence d'ADN (ou gène) codant pour la dhfr et l'inhibiteur est constitué par le méthotrexate. 15.L'utilisation d'un second promoteur plus faible que le premier favorise l'amplification du nombre des copies de la séquence d'ADN codant pour HBsAg et le ré- cepteur de la pHSA. En effet ce sont en général les clones qui contiennent le plus grand nombre de copies de la séquence codant pour le marqueur et, par consequent, dans les lignées.cellulaires préférées de l'invention le plus grand nombre des séquences codant pour les régions pré-S et S, qui sont à même de survivre dans le milieu de culture contenant l'inhibiteur. Les clones efficaces sont avantageusement sélec- tionnés dans les milieux de culture contenant de 0,5 à microgrammes de méthotrexate, notamment de 1 à 25 mi- crogrammes. Il est souhaitable de réaliser une pré-am- plification dans des milieux plus pauvres en inhibiteur, notamment de 5 à 150 nM en méthotrexate, les clones sé- lectionnés au terme de cette première étape étant en- suite mis en culture dans des milieux contenant les te- neurs plus élevées sus-indiquées en méthotrexate. Des caractéristiques complémentaires de l'in- vention apparaîtront encore au cours de la description qui suit de la construction préférée des vecteurs mis en oeuvre pour la transformation de lignées cellulaires d'origine animale, de production de lignées cellulaires ayant un haut rendement d'excrétion des particules selon l'invention et des résultats susceptibles d'être obte- nus. On se reportera également aux dessins dans les- quels: - les fig. 1 et 2 présentent les étapes successives es- sentielles de la production d'un plasmide conforme à l'invention, particulièrement appropriées à la trans- formation efficace de cellules animales, telles que la lignée CHO; - la fig. 3 est une représentation schématique des opé- rations d'amplification des séquences d'ADN codant pour le polypeptide immunogène selon l'invention dans des cellules CHO; - les fig. 4 et 5 font apparaître les résultats de l'am- plification génique des cellules précédemment transfor- mées dans les conditions du procédé selon l'invention. - la fig. 6 contient une courbe représentative de la va- riation de la quantité d'antigène HBsAg produite en fonction des teneurs en ARN-HBV-spécifiques observables dans les cellules productrices; - la fig. 7 rapporte de façon schématique les résultats des récoltes successives effectuées sur des cellules en phase stationnaire. I - CONSTRUCTION DES VECTEURS A - Construction du plasmide pSVS (fiqg. 1) Il permet l'expression de la région S (région pré-S + gène S) sous contrôle du promoteur précoce du virus SV40. Le fragment BglII de 2,3 kb a été excisé du plasmide pcPlO décrit dans la demande de brevet européen n0 81 400634. Le plasmide pCPO10 est schématisé dans la fig. 1. Les parties épaisses et hachurées sont origi- naires de DNA-HBV et la partie en trait plus mince pro- vient du plasmide pBR322. La partie au regard de l'arc a correspond au susdit fragment de 2,3 kb. pCP10 contient un dimère en tandemn tête à queue du génome HBV. Ce fragment commence dix nucléotides avant 1'ATG de la ré- gion pré-S et se termine 1,1 kb après le codon stop TAA du gène S. I1 contient le site putatif de polyadényla- tion de l'ARNm de l'HBsAg, et le site d'initiation de transcription du gène S. On utilise le promoteur précoce de SV40 contenu dans le plasmide pSV2 gpt (ATCC 37145) dans lequel le gène de la gpt de E. coli est fusionné à un fragment PvuII HindII de 348 bp de la région précoce de 5V40. Ce fragment comprend, outre l'origine de réplication de SV40 (SV40 ori), les promoteurs précoces et tardifs, le site d'initiation de transcription des messagers préco- ces et les 72 bp répétées en tandem. pSV2 gpt est sché- matisé dans la fig. 1. Les parties épaisses noires sont originaires de SV40, les parties en traits plus minces de pBR322. Les parties épaisses blanches contiennent les régions pré-S et S. Les parties hachurées correspondent aux séquences de 1'HBV non utilisé. Le fragment BglII de 2,3 kb, issu de pCP10, a été inséré dans le site unique HindII du plasmide pSV2 gpt par ligature des extrémités des fragments d'ADN, rendues franches par l'ADN polymérase (Klenow). Après étude des plasmides recombinants un clone a été sélec- tionné (pSVH4) dans lequel la région codante pour l'HBS était orientée par rapport au promoteur SV40, de façon à permettre son expression. La construction a été vérifiée par cartes de restriction et la séquence nucléotidique à la jonction des deux fragments SV40 et HBV a été déter- minée. Le plasmide pSVS-a été construit par ligature de trois fragments issus de trois plasmides: 1 ) le fragment de 2,5 kb, PvuI-XhoI issu de pSVH4 (arc b), 2 ) le fragment de l19 kb, XhoI BglII, issu de pcPlO (arc c), 3 ) le fragment de 1,0 kb, bamHI PvuI, de pBR322 (arc d). Le plasmide résultant, pSVS (5,4 kb) diffère de pSVH4 par l'absence de la région gpt et des séquences d'ADN SV40 adjacentes en aval de cette séquence gpt, et par la présence du fragment EcoRI-BamHI de pBR322. B - Construction du plasmide pSVS dhfr (fige 2) On procède par recombinaison génétique des frag- ments définis sous a) et b) ci-après. a) Le fraqment contenant la dhfr Le plasmide pMTV dhfr décrit par G. Ringold et Coll. (1981) J. of Molecular and Applied.Genetics 1 165-170 (déposé à la C.N.C.M. le 7.03.84 sous le n0 I-286),aprês linéarisation par l'enzyme PvuI! a été en- suite digéré partiellement par l'enzyme HindlII, libé- rant plusieurs fragments dont un de 4400 bp (arc e) con- tenant: - la LTR du MMTV, - l'ADNc de le dhfr, - l'intron du tAg de SV40, - le site de polysdênylation des gènes précoces de SV40, - un fragment EcoRI-PvuI du pBR322. b) Le fragment de DNA HBV Le plasmide pSVS a été digéré par PvuI puis HindIII, libérant ainsi un fragment de 4676 bp (arc f) contenant: le fragment PvuI-PvuII contenant l'origine de réplica- tion de pBR322; - l'origine de réplication et le promoteur précoce du virus SV40; - le fragment BglII 2,3 kb de 1'HBV contenant les par- ties codant pour le pré-S et le gène S, ainsi que le signal de polyadénylation de ce gène; - le fragment BamHI-HindIII du pBR 322. c) Liqature des fragments Apres purification, ces deux fragments sont joints par les sites homologues PvuI et HindIII, ré- * tablissant ainsi la résistance à l'ampicilline du pBR322. Dans le vecteur recombinant, les unités de transcription de la région S et du gène dhfr sont orien- tées dans le même sens et séparées par environ 300 bp de pBR322. Le cADN codant pour la dhfr peut aussi être ob- tenu à partir de pSV2 dhfr (ATCC 37146), pSV3 dhfr (ATCC 37147) ou pSV5 dhfr (ATCC 31148). Le placement du gène de la dhfr sous le contrôle d'un promoteur faible (LTR du MMTV) et du gène HBV sous le contrôle d'un promoteur fort (promoteur précoce du SV40) augmente l'efficacité de l'amplification génique. La séquence nucléotidique de la jonction entre la région pré-S et le promoteur précoce du SV40 a été vérifiée (fig. 2). II - TRANSFECTION DES CELLULES ANIMALES 1 ) Transfert et expression du plasmide pSVS dhfr dans des cellules CHO dhfr.: Des cellules CHO dhfr- (Urlaub G. et Chasin L.A. (1980) P.N.A.S. 77, 4216-4220) (déposées à la C.N.C.M. le 7.03.84 et sous le n 1-287) ont été transfectées se- lon la technique de Craham et Van der Eb (1973, Virology 52, 456-467) modifiée par Parker et Stark (1979, J. Vi- rology, 31, 360-369). La production d'HBsAg par les clo- nes CHO dhfr+ a été testée par radioimmunoessai (RIA) dans le surnageant des cultures cellulaires. 60 % des clones dhfr+ étaient HBsAg+. Le taux de production d'HBsAg était relativement faible compris entre 1 à 20 ng/106 cellules par 24 heures. 2 ) Ampiification des séquences HBV: Elle a été obtenue en propageant les clones CHO HBsAg+ en présence de méthotrexate (MTX), analogue de l'acide folique et inhibiteur de la dhfr. En effet, la résistance au MTX est due principalement à une amplifi- cation du nombre de copies du gène dhfr, ce qui conduit à une augmentation de la quantité de l'enzyme dhfr. Les séquences HBV et le gène dhfr étant portés par le même plasmide et donc intégrées ensemble dans le DNA de la cellule-hôte, celles-ci sont co-amplifiées avec les sé- quences dhfr dans les clones résistant au MTX. Comme pour la dhfr, l'augmentation du nombre de copies de la séquence HBV s'accompagne d'une augmentation de synthèse d'HBsAg par la cellule. L'amplification génique a été effectuée en deux étapes selon la stratégie décrite sur la fig. 3. La fig. 4 représente les résultats de la première étape d'ampli- fication et la fig. 5 les résultats de la deuxième éta- pe. Celle-ci a été effectuée à partir des clones les plus producteurs, issus de la première étape. Dans les fig. 4 et 5, les barres en pointillés représentent le taux de synthèse d'HBsAg avant amplification et les barres en traits pleins après amplification. Les concen- trations en MTX sont rapportées sur ces figures. Elles étaient de 50, 100 ou 140 nM dans la première étape et de 1,5, 10 ou 25 micro-M dans la deuxième. Au total, environ 150 clones résistant au MTX ont été criblés pour la production d'HBsAg. Comme le montrent les fig. 4 et , l'amplification de production d'HBsAg était très va- riable d'un clone à l'autre, aussi bien dans la première que dans la seconde étape. Le nombre de copies par cellule de la séquence HBV présentes dans différents clones a été évalué selon la technique d'hybridation sur filtre de cellulose ou analogue, selon la technique dite du "dot blot", en uti- lisant comme sonde le DNA-HBV cloné marqué au 32p. Pour une même dose de MTX, ce nombre était extrêmement va- riable d'un clone à l'autre, allant de 100 à 500. L'organistion des séquences HBV dans les clones cellulaires a été analysée selon la technique de Sou- thern. Les séquences HBV étaient présentes sous forme intégrée; les profils électrophorétiques étaient assez comparables d'un clone b l'autre. Les différences ob- servées entre des clones sélectionnés à une même dose de MTX ne permettaient pas d'expliquer la discordance entre le nombre de copies de DNA-HBV et le niveau de synthèse d'HBsAg (résultats non rapportés). Une analyse compara- ble a ét-é effectuée pour le gène dhfr. Pour une même dose de MTX, le nombre de copies par cellule était éga- lement très variable d'un clone à l'autre (résultats non rapportés). Pour un clone donné, il y avait une amplifi- cation parallèle des séquences HBV et dhfr. La quantité de RNA spécifiques de 1'HBV a été également analysée par hybridation moléculaire. Contrai- rement aux résultats obtenus pour le DNA, la quantité de RNA-HBVspécifiques était proportionnelle au taux de production d'HBsAg (fig. 6). D'autre part, pour une même dose de MTX (50 nano-M), la quantité de RNA dhfr-spéci- fiques était constante dans les différents clones analy- sés (fig. 6). Les RNA-HBV-spécifiques ont été analysés selon la technique du Northern. Deux RNA, l'un majeur de 2,1 kb, l'autre mineur de 2,5 kb, ont été mis en évi- dence. L'étude de ces RNA par cartographie à la nucléase SI a montré l'existence d'une initiation majeure dans la région pré-S à la position 3157 correspondant au RNA 2,1 kb, l'autre mineure dans le promoteur du 5V40 corres- pondant au RNA 2,5 kb. 30) Analyse des particules HBsAq: L'analyse a été effectuée sur les particules produites par le clone 37BA5. Des surnageants corres- pondant à plusieurs récoltes de 24 heures obtenues en phase stationnaire ont été rassemblés. Les particules HBsAg ont été purifiées par deux ultracentrifugations successives en gradient de densité de CsCl suivies d'une ultracentrifugation de vélocité en gradient de saccha- rose. Les particules HBsAg avaient une densité de 1,20. Observées au microscope électronique, elles apparais- saient comme des particules sphériques d'un diamètre moyen de 22 nm, morphologiquement semblables aux par- ticules d'origine humaine. Aucune forme tubulaire n'a été observée. Après dissociation des particules à 1000 pendant 5 minutes en présence de DTT, les polypeptides ont été analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS. Le gel a été révélé par coloration aux sels d'argent. Trois bandes ont été observées, corres- pondant à des polypeptides de 22.300, 26.100 et 34.000 daltons. L'intensité relative de la coloration de ces trois bandes a permis d'évaluer à 54 %, 19 % et 27 % les proportions de ces trois protéines. Après marquage in vivo par la 35S méthionine, les particules purifiées ont été immunoprécipitées par un sérum anti-HBs, puis les protéines ont été analysées par électrophorbse. Les trois polypeptides décrits ci- dessus étaient détectés sur l'autoradiogramme et dans les mêmes proportions. La présence du récepteur pour la pHSA h la sur- face des particules a été testée par radioimmunoessai en phase solide selon la technique de Hansson et Purcell ((1979), Infect. Immun. 26, 125), modifiée par Pontisso et al (J. of Virological Methods 6, 151-159). La détec- tion de ce récepteur s'est révélée positive aussi bien dans le surnageant cellulaire que sur des particules purifiées (tableau 1): TABLEAU I Surnageant de culture 2.805 cpm (13 microgrammes/ml). Particules purifiées 1.564 cpm (12 microgrammes/ml) Témoin positif 2.536 cpm sérum HBe positif Témoin négatif 678 cpm sérum HBsAg négatif On peut également utiliser la technique décrite par Machida et al (1983, Gastroenterology 85, 268-274. III - ESSAIS D'IMMUNISATION Après addition d'hydroxyde d'aluminium AI(OH)3 à -la concentration de 0,1 %, une préparation de particules a été utilisée pour immuniser des souris Balb/c. Comme le montre le tableau II, le pouvoir immunogène des par- ticules cellulaires est identique à celui du vaccin contre l'hépatite B, commercialisé sous la marque HEVAC B (et obtenu à partir de donneurs humains de sérums ayant des teneurs en HBsAg naturel). La dose efficace 50 % est de 0,04 microgramme pour les particules cellu- laires et de 0,03 microgramme pour i'HEVAC B (marque Institut Pasteur). TABLEAU II Vaccin HEVAC B Particules HBsAg CHO HBsAg Séroconversion Anticorps Séroconversion Antico.rps Doses injectées > 50 uRIA anti-HBs > 50 uRIA anti-HBs Nombre de Moyenne Nombre de Moyenne souris géométrique souris géométrique uRIA uRIA 0,312 microgrammes 20/20 > 388 20/20 > 505 0,078 microgrammes 19/20 > 212 14/20 > 87 O 0,019 microgrammes 6/20 > 24 6/20 > 24 0 témoins 4/20 DE500,04 microgrammes DE500,03 microgrammes uRIA unités définies dans le test AUSAB commeroialisé par ABBOTT r> Uw. O, oe o 1%0 1 C> Il résulte donc de ce qui précède que le vecteur pSVS dhfr permet, après intégration dans le DNA cellu- laire, la synthèse et l'excrétion d'enveloppes vides du virus HBV sous forme de particules de 22 nm. L'élimina- tion d'une grande partie du génome de 1'HBV et en parti- culier du gène codant pour la protéine de la capside exclut la production de particules virales complètes infectieuses. Ce vecteur porte également une unité de transcription du gène de la dhfr murine qui, après introduction dans des cellules dhfr-, leur permet de se multiplier en présence de MTX par un phénomène d'amplification génique. La technique d'amplification par la résistance au MTX utilisée ici a permis d'obtenir des clones de cellules CHO produisant des particules HBsAg à un niveau élevé. Cette amplification était variable d'un clone à l'autre. Dans certains cas, le taux de synthèse a été multiplié par 1500. Pour le clone concerné, le taux de production était de 15 microgrammes/106 cellules par 24 heures. Plusieurs clones produisant de 1 à 10 micro- grammes d'HBsAg/106 cellules par 24 heures ont été obte- nus. Le taux de production d'HBsAg exprimé par ml et par 24 heures dépend des conditions de culture. Des valeurs de 10 à 20 microgrammes/ml/24 heures ont pu être obte- nues couramment, valeurs comparables à la concentration d'HBsAg dans le sérum des porteurs chroniques. Une étude cinétique de la production d'HBsAg a montré que cette synthèse reste constante en phase stationnaire pendant plusieurs semaines. La fig. 7 rapporte les résultats de récoltes successives effectuées sur des cellules en phase stationnaire, par renouvellement périodique du milieu de culture pendant 3 semaines. Du milieu sans sérum peut être utilisé pour ces récoltes. Outre l'im- pact sur le prix de revient, l'utilisation d'un milieu sans sérum facilite beaucoup la purification des parti- cules à partir du surnageant cellulaire et élimine des contaminations éventuelles d'origine sérique. La syn- thèse d'HBsAg par les clones CHO s'est révélée très stable même en l'absence de ItTX. Ceci sur une période de 6 mois, soit environ 300 générations. Dans certains cas, une légère augmentation spontanée de l'HBsAg produit a même été observée. Jamais une diminution ou une perte de la production d'HBsAg n'a été observée pendant l'ampli- fication génique, ceci sur environ 150 clones testés. Ces deux dernières observations peuvent être dues à la structure du vecteur dans lequel les séquences HBV et le gène dhfr sont seulement séparés par environ 300 bp du pBR322. L'invention permet par conséquent l'obtention de clones producteurs de particules immunogènes d'une sta- bilité génétique particulièrement remarquable. Une corrélation entre le nombre de copies de sé- quences HBV et le taux de synthèse d'HBsAg n'a pas été observée. La technique utilisée (le "dot blot") permet une quantification globale, mais ne permet pas de dis- criminer les séquences fonctionnelles. Les résultats ob- tenus peuvent s'expliquer par l'apparition de délétions et de réarrangements dans Le vecteur au cours de la transfection et de l'amplification. Cette hypothèse est supportée par la complexité des profils électrophoré- tiques des séquences HBV et dhfr intégrées. Beaucoup de ces séquences sont probablement non fonctionnelles. Par contre il y a parfaite proportionnalité entre le niveau de synthèse d'HBsAg et la quantité de RNA-HBV-spéci- fiques. Ceci démontre que l'augmentation de synthèse d'HBsAg observée est bien due à une augmentation de la transcription des séquences HBV, due en partie très vraisemblablement à une augmentation du nombre de copies fonctionnelles. Ce résultat montre par ailleurs que l'évaluation du nombre de copies d'un gène amplifié, que ce soit par dot-blot ou par analyse électrophorétique n'est pas le meilleur test pour évaluer le nombre de co- pies efficaces dans un clone cellulaire. Par contre, la quantification des RNA spécifiques reflète parfaitement les copies fonctionnelles. Cette quantification prend tout son intérêt dans les systèmes o la protéine pro- duite n'est pas facilement dosable. L'invention concerne donc plus particulièrement des clones contenant une dose d'ARN-HBV d'au moins 2 x 103 cpm/106 cellules dans le système de mesure tel qu'il a été décrit plus haut pour une sonde ayant une activité spécifique de 108 cpm/microgramme (marquage au 32p). Deux RNA-HBV-spécifiques ont été mis en éviden- ce. L'initiation du transcript majeur de 2,1 kb a été localisée dans la région pré-S à la position 3157. Ceci est en accord avec les résultats de Catteneo et al (1983) Nature, vol. 305, 336-338, qui ont localisé l'initiation de transcription du gène S à cette posit- ion. Le RNA mineur de 2,5 kb est initié dans le promo- teur du SV40. Cet RNA pourrait être le mRNA du poly- peptide de 34.000 (GP34) présent dans les particules. Il est donc vraisemblable que la synthèse du GP34 en quan- tité importante (27 % des polypeptides des particules) est due à l'utilisation du promoteur précoce du SV40 in- cluant les 72 bp répétées et placé en amont de la région pré-S. L'utilisation d'un radioimmunoessai a montré que les particules synthétisées par les cellules CHO portent le récepteur de la pHSA. D'après Machida et al (1983) Gastroenterology 85, 268-274, ce récepteur serait porté par les polypeptides GP31 et GP35. Il est donc vraisem- blable que dans notre système le récepteur est porté par le GP34. L'existence observée d'un seul polypeptide, et non de deux, porteur du récepteur de la pHSA dans les particules d'origine cellulaire n'est pas expliquée. Il est possible que, contrairement aux particules sériques, la glycosylation dans les cellules CHO soit homogène. Les particules HBsAg de 22 nm -synthétisées par les cellules CHO ont la même immunogénicité que I'HEVAC B qui est une préparation de particules d'origine séri- que. Les taux de production d'HBsAg obtenus sont compa- tibles avec une utilisation industrielle. La présence du récepteur de la pHSA à la surface de ces particules est un argument supplémentaire à l'utilisation de ce système pour la fabrication d'un vaccin contre l'hépatite B. A ce titre, l'invention concerne toute composi- tion de vaccin contre l'hépatite virale B contenant une dose efficcace de particules conformes à l'invention, notamment de 3 à 6 microgrammes de protéine/ml, de pré- férence 5 microgrammes de protéine/ml (dose unitaire), en association avec un véhicule pharmaceutique approprié au mode d'administration choisi, notamment par voie parentérale. REVENDICATIONS i - Composition utile pour la fabrication de vaccins, contenant ou formée par des particules polypep- tidiques, sensiblement sphériques, au moins en ce qui concerne la plupart d'entre elles ayant les propriétés immunogéniques et immunologiques caractéristiques de l'antigène HBsAg, ayant des tailles de 18 à 25 nm, no- tamment de 20 à 22 nm, et des densités permettant leur isolement dans une zone de densité de 1,20-1,22 g/ml dans un gradient de densité à base de CsCI, et un niveau TO de pureté totale pour ce qui est de l'absence de toute particule de Dane et d'antigène HBe, y inclus HBc, ca- ractérisée par le fait que lesdites particules sphéri- ques contiennent également un récepteur pour l'albumine humaine polymérisée. 2 - Composition selon la revendication 1, carac- térisée par la présence de polypeptides ayant des poids moléculaires de l'ordre de 34.000 daltons. 3 - Composition selon la revendication 1, carac- térisée par le fait que ces polypeptides de l'ordre de 34.000 daltons sont dans une proportion supérieure à 10 %, de préférence supérieure à 20 %, de la quantité to- tale des polypeptides constitutifs des susdites parti- cules. 4 - Composition selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est exempte de tout composant sérique d'origine humaine. - Vecteur approprié à la transformation de cellules eucaryotes, plus particulièrement de cellules humaines ou animales en culture et contenant une sé- quence d'ADN codant pour les régions S et pré-S du gé6- nome du virus de l'hépatite virale B, caractérisé en ce que cette séquence d'ADN est à l'intérieur de ce vec- teur, placée sous le contrôle direct d'un promoteur exo- gène dont est connue la capacité de permettre l'initia- tion efficace de la transcription des gènes directement sous son contrôle dans les susdites cellules animales auxquelles est destiné ledit vecteur. 6 - Vecteur selon la revendiction 5, caractérisé en ce que le susdit premier promoteur est issu du virus SV40, ce promoteur correspondant notamment au promoteur précoce du virus SV40. 7 - Vecteur selon la revendication 5 ou la re- vendication 6, caractérisé en ce que la susdite séquence d'ADN codant pour les susdites régions S et pré-S est placée, en phase, immédiatement derrière un fragment d'ADN contenant le promoteur et la séquence activatrice associée à ce premier promoteur. 8 - Vecteur selon la revendication 7, caractéri- sé en ce que le susdit fragment comprend de 300 à 400 paires de bases. 9 - Vecteur selon l'une quelconque des revendi- cations 5 à 8, caractérisé en ce qu'il contient en outre une séquence d'ADN codant pour un marqueur, tel qu'une enzyme, lui-même sous le contrôle d'un promoteur dis- tinct, ce second promoteur étant plus faible que le sus- dit premier promoteur. - Vecteur selon la revendication 9, caracté- risé en ce que le marqueur est constitué par un gène codant pour la dihydrofolate réductase. ll - Vecteur selon la revendication 9 ou la re- vendication 10, caractérisé en ce que le second promo- teur provient du virus de la tumeur mammaire de la sou- ris (MMTV). 12 - Lignées de cellules animales susceptibles d'être maintenues en culture, caractérisées en ce qu'elles ont été transformées par un vecteur conforme à l'une quelconque des revendications 5 à Il. 13 - Lignées selon la revendication 12, carac- térisées en ce qu'elles sont originaires de mammifères, notamment de cellules CHO. 14 - Lignées formées de cellules conformes à la revendication 12 ou à la revendication 13, caractérisées par leur capacité à excréter dans leur milieu de culture des particules telles que définies dans l'une quelconque des revendications i à 4, à raison d'au moins 1 micro- gramme, et de préférence au moins 10 microgrammes d'an- tigène HBsAg par 106 cellules et par 24 heures. - Lignées caractérisées par la présence que l'on peut y détecter d'ARNHBV-spécifiques qui ont des tailles supérieures à 2,1 kb, notamment de l'ordre de 2,2 à 2,8 kb. 16 - Lignées selon la revendication 15, carac- térisées par la présence que l'on peut y détecter, d'ARN-HBV qui ont une taille de l'ordre de 2,4-2,5 kb. 17 - Lignées selon la revendication 15 ou la revendication 16, caractérisées par la présence, détec- table simultanément, d'un ARN-HBV spécifique ayant une taille de l'ordre de 2,1 kb, tel que celui qui résulte de la transcription des régions S et pré-S, normalement initié dans la région pré-S. 18 - Lignées selon l'une quelconque des reven- dications 13 à 17, caractérisées par leur capacité à ex- créter les particules ayant les propriétés immunologi- ques et immunogéniques caractéristiques de l'antigène HBsAg et formées, en partie au moins, par des protéines de poids moléculaire de l'ordre de 34.000 et portant les sites antigéniques à la fois de HBsAg et d'un récepteur de pHSA. 19 - Procédé de production de lignées cellulai- res conformes à l'une quelconque des revendications 14 à 18, caractérisé par la transformation de lignées cellu- laires d'origine humaine ou animale susceptibles d'être maintenues en culture avec un vecteur conforme à l'une quelconque des revendications 5 à 11 et par' l'isolement des cultures exprimant les régions S et pré-S du génome du virus de l'hépatite B. - Procédé selon la revendication 19, caracté- risé en ce que le vecteur est conforme à l'une quelcon- que des revendications 9 à 11 et en ce que la culture des lignées cellulaires transformées est réalisée en présence d'un inhibiteur du marqueur dont la teneur dans le milieu de culture est réglée à une concentration suf- fisante pour provoquer une amplification du nombre de copies du gène codant pour le marqueur dans certaines au moins des colonies mises en culture, cette amplification du nombre de gènes codant pour le marqueur permettant, à la fois, la sélection de colonies résistantes et l'ob- tention de clones cellulaires secréteurs de quantités accrues des susdites particules. 21 - Procédé selon la revendication 20, caracté- risé en ce que le marqueur est constitué par une séquence ou un gène codant pour la dihydrofolate-réductase et en ce que l'inhibiteur est constitué par le méthotrexate. 22 - Vaccin contenant une dose efficace de la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, en association avec un véhicule pharmaceutique approprié au mode d'administration choisi.