FR 2566911 A1 19860103 FR 8410408 A 19840629 Sonde et procédé pour le diagnostic du sexe d'un embryon humain L'invention concerne une sonde comportant une séquence d'acide nucléique spécifique du chromosome Y humain et un procédé pour le diagnostic du sexe d'un embryon humain. On sait l'importance que peut revêtir la détermination aussi précoce que possible du sexe d'un foetus humain, notamment dans des épreuves de diagnostic prénatal de certaines maladies récessives liées aux chromosomes X. Les méthodes actuelles sont essentiellement basées sur les techniques d'amniocentèse réalisées à partir de la dixhui tième semaine de la gestation et sur le diagnostic réalisé sur les cellules amniotiques. Ce diagnostic,est couramment effectué en mettant en oeuvre des techniques de fluorescence. Il a été récemment proposé des méthodes mettant en jeu des hybridations de 1'ADN de ces cellules amniotiques avec des sondes contenant des séquences répétitives d'ADN considérées comme spécifiques du chromosome y (LAU Y.F.et coll ij984J Lancet.; i:14-16). Ces méthodes certes efficaces présentent cependant l'inconvénient de n' être sas suffisamment précoces. Plus récemment il a été proposé de réaliser ces épreuves de diagnostic sur des biopsies de trophoblast, ces épreuves comprenant alors un caryotype direct effectué sur les villosités chorionales (SIMONI G. et coll gl983g Hum. Genet.; 63:349 - 57) ou au niveau moléculaire avec des sondes d'ADN présentées comme spécifiques du chromosome Y. La réalisation de caryotypes directs sur les villosités chorionales peut cependant être perturbée par un nombre réduit de mitoses, dont le développement peut être difficile à analyser. C'est pourquoi GOSDEN et coll.fI982JLancet.;i i 1416 - 1419) ont récemment développé une méthode pour la détection prénatale rapide du sexe qui met en oeuvre une préparation d'acides nucléiques extraite des villosités chorionales par hydrolyse de restriction,transfert sur filtre de nitrocellulose ou analogue et hybridation selon la méthode de SOUTHERN avec un ADN de satellite III de mâle. Cette méthode est d'une mise en oeuvre plus rapide. Ceci étant, lo traitement de l'ADN extrait des villosités chorionales par des enzymes de restriction constitue toujours encore un facteur de ralentissement de la mise en oeuvre du procédé. En outre la sonde utilisée, qui détedte plus particulièrement une région du chromosome contenant un fragment HaeIII de 3,4(kb)reconnait également d'autres séquences présentes aussi bien dans des ADN mâles que femelles. Cette méthode de diagnostic in vitro ne présente donc pas encore une fiabilité absolue. Elle n'est pas encore non plus suffisamment rapide et commode pour la réalisation de diagonstics vraiment précoces et aisés du sexe d'un foetus. L'invention a pour but de fournir une sonde plus spécifique encore du chromosome Y et un procédé de diagnostic in vitro susceptibles d'être mis en oeuvre sur un ADN génomique total, sans séparation préalable d'aucun de ses constituants. L'invention a donc pour but d'allier la précocité du diagnostic, la rapidité et la fiabilité de sa mise en oeuvre. L'invention découle d'un proiet de recherches dont certains résultats ont fait 1' objet de premières publications. I1 s'agit plus particulièrement de l'article de C.E.BISHOP et coll. intitulé "Single-Copy DNA Sequences Specific for the Human Y Chromosome" (Séquences d'ADN à copie unique spécifiques Four le chromosome Y humain), ( Nature Vol. 303, NO 5 920, pn. 831 - 832, 30 juin 1983) et de l'article de C. BISHOp et coll.intitulé "Fxtensive Sequence Homologies Between Y And Other Human Chromosomes" (homologies importantes de séquences entre le chromosome Y et d'autres chromosomes humains) (J. Mol. Biol. ss 984 173,403-417). Ces auteurs orénarèrent en effet une banque de fragments d'ADN appartenant à un chromosome Y humain (et obtenus à partir d'une cellule somatique hybride contenant exclusivement le chromosome Y humain associé avec d'autres acides nucléiques tous originaires de la souris).L'ADN de cet hybride a été soumis à une restriction partielle avec l'enzyme de restriction MboI dans des conditions permettant d'obtenir des fragments de 35 - 50 kb , lesquels ont été clonés dans Escherichia coli par l'intermédiaire du cosmide pJB 8.Le second article décrit plus particulièrement les conditions dans lesquelles les cosmides amplifiés contenant exclusivement des insérats d'origine humaine ont été obtenus, comment ces derniers ont été encore triés, par digestion avec l'enzyme de restricion EcoRI et sous-clonage des fragments obtenus dans pBR 322, pour finalement obtenir 45 sondes contenant des insérats originaires du chromosome Y humain et vraisemblablement non- apparentés entre eux.Ces sondes ont été davantage encore caractérisées grâce à des expériences d'hybridation dans des conditions déterminées strictes avec des séries de fragments obtenus à partir d'ADN génomique traité par digestion complète avec l'enzyme de restriction EcoRI, puis séparés par électrophorèse dans des gels d'agarose, avant dtêtre transférés sur filtre de nitro-cellulose ou un papier analogue, connu sous les initiales DBM (ALWINE, J.C 9777 Proc.Nat.Acad. SCi. USA 74, 5 350 - 5354).Ces ensembles de fragments transférés sur filtres de nitrocellulose ou analogues étaient désignés par l'expression anglaise "Genomic Blots". Ces auteurs devaient ainsi isoler 9 sondes hybridables avec le chromosome Y humain , mais non-hybridables avec chromosome X humain ou avec d'autres chromosomes (autosomes) humains. L'invention découle de la découverte que l'un de ces fragments EcoRI, dénommé "Sonde 49 F" était capable non seulement de donner lieu à une hybridation sélective avec un fragment particulier'ADN obtenu à partir de séries de fragments EcoRI transférés comme indiqué plus haut et obtenus à partir de chromosomes Y, mais encore de donner lieu à une hybridation toute aussi sélective lorsque celleci est réalisée sur une tache unique d'un ADN originaire d'embryon masculin humain, le cas échéant fragmenté au préalable, cette tache ayant été obtenue par exemple par filtration d'une solution de 1'ADN génomique total à travers une pastille de filtre de nitrocellulose, selon la technique dite du "Dot-Blot".La susdite fragmentation préalable peut étre réalisée par simple traitement aux ultrasons (sonication) de la préparation d'ADN à tester. L'invention concerne plus généralement tout ADN contenant un fragment hybridable dans les conditions strictes rappelées ci-après, avec le fragment EcoRI de 2,8 kb obtenu à partir de la région euchromatique située entre le centromère et l'hétérochromatine (lorsque celle-ci est présente) du grand bras d'un chromosome Y, ce fragment ayant été déposé le 29/06/1984 à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes de 1'INSTITUT PASTEUR de Paris (C.N.C.M) sous le NO I-312 . En particulier doit être considéré comme faisant partie de l'invention tout fragment de chromosome Y qui forme des hybrides stables avec le susdit fragment EcoRI déposé à la C.N.C.M. en présence d'une solution de 0,1 SSC à 65-680C, plus particulièrement à 680C.Cette condition de stabilité de l'hybride peut être vérifiée notamment à l'occasion du lavage de l'hybride préalablement formé sur un support approprié, tel que filtre de nitrocellulose ou analogue, avec une solution de 0,1 x SSC (SSC étant une solution de NaCI 0,5 M; citrate de sodium 0,15 M à pH 7,0 à 65 - 680C, plus particulièrement 680C). En particulier l'invention concerne tout plasmide ou autre vecteur contenant un insérat répondant à la susdite définition. On remarquera que les conditions de stabilité d'hybridation qui ont étédéfinies ci-dessus sont strictes eu égard à la sélectivité de l'hybridation. En effet la teneur en ions de la solution 0,1 SSC étant faible, l'hybridation ne reste stable que dans la mesure où les deux chaînes intervenant dans la constitution de l'hybride présentent un très haut degré de complémentarité.La sélectivité de cette sonde même à l'égard du génome total de cellules obtenues à partir d'embryons est d'autant plus remarquable que des essais extensifs ont montré aue cette sonde hybridait avec des chromosomes "mini Y",c'est à dire des chromosomes v humains pratiquement dépourvus d'hétérochromatine (anomalie qui se rencontre chez un certain nombre d'individus mas culins) ou avec des chromosomes Y dont avaient au préalable été délétés l'hétérochromatine et qu'elle n'hybridait jamais avec des chromosomes X contenant des fragments d'hétérochro matine Y résultant d'une translocation du type de celles que l'on rencontre chez 1 femme sur 3.000.La préparation d'ADN requise pour la mise en oeuvre du diagnostic selon l'invention peut être constituée par toutes cellules de l'embryon susceptibles d'être obtenus à un stade très precoce de la gestation, notamment entre la 6ème et la 8ème semaine, par exemple à partir de trophoblastes (c'est à dire de cellules chorioniques) ou de villosités chorionales. Des exemples de mise en oeuvre du procédé selon l'invention seront décrites ci-après. L'invention concerne donc également un procédé pour le diagnostic in vitro du sexe, procédé caractérisé nar la mise en contact d'un ADN contenant tout ou partie du fragment hybri- dable sus-défini avec 1'ADN pratiquement total provenant de cellules prélevées sur le foetus dont le sexe doit être déterminé, cet ADN total ayant au préalable été extrait desdites cellules ou simplement rendu accessible à la sonde, par exemple par lyse des cellules, et par mise en contact de l'hybride formé, que ce soit déjà au cours de l'hybridation ou postérieurement à celle-ci (notamment à l'occasion de lavages) avec une solution à faible force ioniaue . et à une température favorisant conjointement des hybridations hautement sélectives de la sonde avec une séquence d'ADN complémentaire présente dansl'euchromatine du chromosome Y humain. De préférence la susdite nise en contact est opérée avec une solution 0,1 SSC à une température de 65 - 68 OC, plus narticulièrement de 680C. Il est remarquable oue l'on puisse dans ces condi- tions, et en présence de l'ADN génomique total, obtenir des hybridations à ce point sélectives et détectables - lorsque la sonde est convenablement marouée - Dar un signal aisément décelable. Dans les essais dont la description suit les sondes sont marquées radio-activement. Bien entendu l'invention n'est pas limitée à ce mode de marquage. De façon en soi connue, les sondes peuvent être modifiées par un groupe unique permettant leur couplage, direct ou indirect, par exemple avec une enzyme dont la présence peut être révélée Ear son action à l'égard d'un substrat spécifique, de préférence un substrat chromogène, ou encore avec une molécule fluorescente ou luminescente. Les modes de couplage de ce type ont été envisagés par exemple dans les brevets français 78 10975 et 81 27631 ou dans la demande'de brevet européen-publiée 0063 879. Un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention pour la détection du sexe sur des cellules originaires d'un foetus ou embryon humain comprendra notamment - leidépôt et la fixation de l'acide nucléique des cellules à analyser (ou de ces dernières préalablement traitées de façon à permettre l'accès de leurs acides nucléiques à la sonde) sur un filtre approprié; - la mise en contact des acides nucléiques ainsi fixés ou rendus accessibles avec la sonde marquée selon l'inven tion dans des conditions permettant la réalisation d'une hybridation effective, lorsque les ADN étudiés comportent un chromosome Y; ; - l'élimination, notamment par lavages, de toute sonde non hybridée, etce, en particulier, avec une solution 0,1 SSC à une température de l'ordre de 680C et - la détection des sondes d'ADN retenues par hybridation sur le support. L'invention concerne naturellement également les nécessaires ou "kits't contenant une sonde conforme à l'invention et le cas échéant des préparations chromosomiques témoins (originaires d'embryons males et/ou femelles) et tous autres réactirs nécessaires à la réalisation d'un essai de diagnostic in vitro. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit des conditions dans lesquelles la sonde selon l'invention a été utilisée, des résultats qui ont été obtenus, ces essais étant représentatifs de ceux qui, dans la pratique, peuvent être mis en oeuvre au cours des essais de diagnostic in vitro du sexe d'un embryon. L'analyse des ADN a été effectuée sur des cellules appartenant aux villosités chorionales ou à des cellules sanguines prélevées sur les embryons étudiés. La technique dite du "Dot blot" a été utilisée. Les essais peuvent être réalisés sur des quantités d'ADN inférieures à 3 gg. Les essais ne durent que deux Jours. Les échantillons cellulaires Les échantillons sanguins ont été fournis par des hopitaux. Des échantillons de trophoblastes ont été obtenus à partir de biopsies placentaires réalisées au bout des 6 à 8 premières semaines de la gestation Dans un certain nombre de cas des biopsies ont ete effectuées chez des femmes avant avortement et après avoir obtenu leur consentement en toute connaissance de cause. Un forceps à biopsie DYONIC de 1,7 mm de diamètre a été introduit transcervicalement dans la cavité utérine en nettant en oeuvre un guide à ultrasons sous temps réel selon les méthodes décrites par SIMONI r;. et collO(Hum. Genet.ï1983J;63 349-57) et WARD R.H.T.et colt. (Brit.Med. H. 1983 : 1542 - 4). Des petits échantillons de villosités de trophoblaste (c'est-à-dire de chorion) ont été prélevés sur le côté du frondosum chorionique du placenta. Les tissus ont été lavés dans une solution saline isotonique et stérile puis examinés immédiatement sous un microscope-à dissection. Toute cellule déciduale maternelle a été soigneusement séparée des villosités à l'aide de pincettes appropriées. De 10 à 50 mg de villosités de trophoblaste ont alors été utilisées pour l'analyse de leur acides nucléiques. Les produits de la conception ont été utilisés pour des études de karyotype ou de chromatine. Des villosités de trophoblaste ont également été utilisées. Dans sept cas, des petites parties de ces villosités ont eté obtenues par dissection à partir de cotylédons placentaires obtenus à l'issue de césariennes. Un certain nombre d'essais classiques de détermination de karyotypes et de chromatine ont été réalisés à des fins de comparaison. Des fibroblastes obtenus à partir des embryons ont été mis en culture in vitro selon des procédures standards (RPMI 1640 serum foetal de veau, antibiotiques, dans une atmosphère contenant 5 % de CO2). Les karyotypes ont été établis après des cultures in vitro pendant 12 - 20 jours (second ou troisième passage) en utilisant des techniques classiques Des colorations au Giemsa et des techniques de séparation par poids moléculaire (C Banding techniques: CBG) ont été utilisées. De deux à dix mitoses ont été analysées.Les chromatines des chromosomes intervenant dans la constitution-du sexe ont été étudiées sur des cellules au niveau de l'interphase fournies à partir de cultures de fibroblastes colorées au bleu de toluidine. De 100 à 200 noyaux ont été comptés. Préparation des acides nucléiques et analyse A)Prearation de 1'ADN obtenu Eart}r de cellu- les du sang : 10 ml de sang ont été collectés dans un ml d'EDTA à 5%. Le sérum a été éliminé par centrifugation. Les globules rouges ont été lysés dans NH4C1 0,17 M et les leucocytes ont été collectés par centrifugation. Ils ont été lysés dans une solution contenant de l'urée 7 M, du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 2 %, NaCl 0,2 M, Tris 10mM à pH 8 et EDTA 1 mM. La solution a été soumise à extraction deux fois avec un mélange à volumes égaux de phénol et de chloroforme, puis deux fois avec du chloroforme avant d'être précipitée avec l'éthanol. Le précipité a été repris, dissous dans une solution Tris 10 mM , EDTA 1 mM et contenant de la ribonucléase A (50 pg/ml).La solution a été incubée à 370C pendant une heure, puis complétée avec les produits qui suivent pour obtenir finalement une concentra en SDS à 1 %, EDTA 10 mM et protéinase K 100 ug/ml. La solution a ensuite été incubée pendant deux heures. La solution a été ensuite extraite une fois avec du chloroforme, dyalisée dans une solution Tris 10 mM pH 8, EDTA 1 nM pendant la nuit, avant d'être précipitée à nouveau par l'éthanol.Le précipité final a été dissous dans 200 l d'une solution Tris 10 mM pli 8, EDTA 1 mM B) Préearation d'ADN à Eartir des échantillons de trophoblastes Les échantillons ont été incubés dans une solution contenant NaCl 10 mM , Tris 10 mM pH 8, EDTA 10 mM, SDS 0,5%, protéinase K 100 10 mM, pH 8, EDTA 8,1 mM C) Analyse des ADN Les ADN ont été traités par des ultrasons, dénaturés dans une solution NaOH 0,4M et NaCl 1 M à 40C pendant une demi-heure.La solution a été neutralisée juste avant sa filtration sur un filtre de nitrocellulose dans une solution de Tris-NaCl 1,5 M, pH 7. Avant la filtration le filtre de nitrocellulose avait été lavé dans une solution 6 x SSC. Après filtration le filtre a été séché à 800C pendant deux heures, puis hybridé dans 6 x SSC,1 x DENHARDT, pendant 1 heure à 680C. L'hybridation a été rélisée pendant le nuit avec la sonde radioactive (20 x 1o6 dpm/,:g) dans 1 x DEN HARDT, 2 x SSC, SDS 0,5 %, EDTA 2 mM et NaH2PO4 25 mM à 680C. Les filtres ont ensuite été lavés deux fois à 680C dans 0,1 x SSC, SDS 0,1 % pendant une heure puis exposés pendant la nuit à -700C. Pour obtenir des résultats interprétables les taches d'ADN sur le filtre devraient en contenir au moins 0,1 pg, de préférence de l'ordre de 1 pg. La sonde selon l'invention utilisée dans ces conditions conduit à des signaux extrêmement nets permettant d'apprécier sans hésitation le caractère masculin ou féminin de l'embryon étudié. Dans le tableau qui suit figurent les résultats comparatifs réalisés au moins en partie sur des échantillons de même origine avec les techniques classiques dont question plus haut. Le tableau qui suit contient les résultats de détermination de sexe sur 12 embryons. Dans le haut du tableau sont indiquées les natures des tests mis en oeuvre. Dans la colonne "échantillons" ,C.S fait référence à des villosités chorionales obtenues après césarienne; C.B. fait référence à une biopsie chorionale obtenue avant la fin du premier trimestre de la gestation. Les " âges" correspondent naturellement à ceux des mères. Les lettres MF se rapportent aux sexes respectivement masculin et féminin des embryons testés. PATIDE. ECH,NTILLON SEXE KARYOTYPE CHROMATINE ADN FOETAL HYBRIDATION CAS AGE FOETAL HYBATIW 1 27 C.S M - - M 2 34 C.B - M - M 3 28 C.S F - - F 4 33 C.S M - - M 5 38 C.S F - - F 6 35 C.S F - - F 7 34 C.B - - M M 8 32 C.S F - - F 9 16 C.B - F - F 10 32 C.S. M - - M 11 24 C.B - F - F 12 31 C.B - F F F I1 résulte du tableau qui précède une remarquable corrélation entre les résultats obtenus avec la sonde selon l'invention et les autres méthodes. Des essais réalisés sur des ADN obtenus à partir de différents groupes ethniques ont démontré l'universalité du système. Le sexe de l'embryon a-été prédit avec une sécurité à 100 % sur 30 échantillons de sang obtenus à partir d'embryons de parents africains, européens et asiatiques. La sonde selon l'invention (laquelle contient pour l'essentiel une séquence unique, par opposition à des sondes antérieures essentiellement constituées de séquences répétitives) discrimine parfaitement les chromosomes masculins et féminins, même lorsque ceux-ci présentent les anomalies suivantes : dans le cas de chromosomes masculins, perte d'une partie ou de la totalité de l'hétérochromatine et dans le cas de chromosomes féminins, translocation dans le chromosome X de certains fragments d'hétérochromatine normalement considérée comme appartenant à l'hétérochromatine du groupe Y des chromosomes masculins. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été spécialement envisagés; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1 - Fragment d'ADN hybridable avec le fragment EcoRI de 2,8 kb obtenu à partir de la région euchromatique du grand bras d'un chromosome Y et déposé le 29 juin 1984 à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes de 1'INSTITUT PASTEUR de Paris (C.N.C.M) sous le NO 1-312, cette hybridation étant réalisable ou maintenue en présence d'une solution 0,1 x SSC, à 65 - 680C, plus particulièrement 680C. 2 - Fragment selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un recombinant contenant le susdit fragment hybridable. 3 - Procédé pour le diagnostic in vitro du sexe, caractérisé par la mise en contact d'un ADN contenant tout ou partie du fragment conforme à la revendication 1 ou à la revendication 2 avec 1'ADN pratiquement total provenant de cellules prélevées sur le foetus dont le sexe doit étre déterminé, cet ADN total ayant au préalable été extrait desdites cellules ou simplement rendu accessible à la sonde, par exemple par lyse des cellules, et par mise en contact de l'hybride formé, que ce soit déjà au cours de l'hybrida- tion ou postérieurement à celle-ci (notamment à l'occasion de lavages) avec une solution à faible force ionique et à une température favorisant conjointement des hybridations. hautement sélectives de la sonde avec une séquence d'ADN complémentaire présente dans la chromatine des chromosomes Y humains 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la susdite mise en contact est opérée avec une solution 0,1 SSC à une température de 65 - 680C, plus particulièrement de 680C. 5 - Procédé selon la revendication 3 ou la reven dication 4, caractérisé en ce qu'il comprend notamment - le dépot et la fixation de l'acide nucléique des cellules à analyser (ou de ces dernières préalablement traitées de façon à permettre l'accès de leurs acides nucléiques à la sonde) sur un filtre approprié; - la mise en contact des acides nucléiques ainsi fixés ou rendus accessibles avec la sonde marquée selon l'invention dans des conditions permettant la réalisation d'une hybridation effective, lorsque les ADN étudiés comportent un chromosome Y; - l'élimination, notamment par lavages, de toute sonde non hybridée, et ce, en particulier, avec une solution 0,1 SSC à une température de l'ordre de 680C et - la détection des sondes d'ADN retenues par hybridation sur le support. 6 - Nécessaire ou "kit" contenant une sonde conforme à la revendication 1 ou à la revendication 2 et, le cas échéant, des préparations chromosomiques témoins (originaires d'embryons mâles et/ou femelles)et tous autres réactifs nécessaires à la réalisation d'un essai de diagnostic in vitro