FR 2561523 A1 19850927 FR 8404544 A 19840323 La présente invention est relative à de nouvelles préparations d'allergènes inactivés par leur couplage à un agent immunostimulant et à leur procédé d'obtention. Comme on le sait, les allergènes sont des substances capables de provoquer une reponse immunologique spécifique responsable de l'hypersensibilité et dont le support biochimique est formé par des anticorps. La therapeutique optimale des manifestations allergiques est représentée par les traitements de désensibilisation, qui sont réalisés, après identification de l'allergène, par administration de celui-ci en injections répétées à doses progressivement croissantes afin de susciter la production d'anticorps bloquants à un taux suffisant pour fixer la totalité de l'allergène. Les allergènes utilisés dans les traitements de désensibilisation sont soit sous la forme fluide, soit adsor bés sur un composé mineral ou organique, soit encore polyme- risés. La Demanderesse a proposé (cf. Brevet français n" 79 24948) des compositions allergènes débarrassées des enzymes qu'elles contenaient, dans lesquelles les allergènes sont adsorbés sur des composés minéraux tels que l'alumine ou le phosphate d'alumine ou de calcium, et qui sont utilisées à doses cumulatives pour réaliser la désensibilisation; Cependant, le principal obstacle de la désensibilisation à doses cumulatives, est constitué par le risque de réactions locales de plus en plus importantes lors de l'augmentation progressive de la concentration en allergènes.Ce risque n'est pas totalement évité avec les préparations d'allergènes adsorbés sur un composé minéral, puisque dans ces préparations, les allergènes ne sont pas inactivés au départ et que les fortes concentrations sont susceptibles de provoquer chez certains sujets des indurations sous-cutanées persistantes. Une préparation d'allergènes connue sous le nom de "POLLINEX", commercialisée par BEECHAM, est constituée par un extrait de pollens de graminées modifié par du glutaraldéhyde et adsorbé sur un composé organique, la L-tyrosine, d'où il est libéré lentement, ce qui diminue le nombre d'injections nécessaires à l'obtention d'un effet immunologique protecteur. Toutefois, des réactions - ou accidents - secondaires (réaction locale au point d'injection, réapparition des signes cliniques de l'allergie, choc anaphylactique) peuvent survenir et des précautions d'emploi doivent être respectées pour en réduire le risque. D'autres Auteurs (L.C. GRAMMER, M.A. SHAUGHNESSY, I.M. SUSZKO, J.J. SHAUGHNESSY et R. PATTERSON dans J. ALLERGY CLIN. IMMUNOL. Novembre 1983) ont proposé des allergènes polymérisés pour les traitements immunothérapiques. Ces allergènes polymérisés sont obtenus à partir de six pollens de graminées (fausse ivraie, fléole des prés, agrostis, dactyle pelotonné, pâturin des prés et cynodon) soumis chacun à des traitements de délipidation à l'éther, extraction à l'acétate d'ammonium, précipitation par le sulfate d'ammonium et fractionnement par chromatographie sur colonne de "SEPHADEX G-15", pour obtenir six monomères qui sont polymérisés à 25"C pendant 4 heures, par addition de glutaraldéhyde ; les six graminées polymérisées ont été obtenues par chromatographie par gel filtration sur "SEPHAROSE 4B" et "SEPHADEX G-200". Les Auteurs ont constaté que la polymérisation des allergènes, tout en préservant leur immunogénicité, les rend capables d'absorber des IgG spécifiques contenues dans les sérums de patients non traités, sensibles aux graminées et les IgG spécifiques présents dans les sérums de patients traités. Ces allergènes polymérisés n'induisent pas d'effets systémiques secondaires, meme lorsqu'ils sont administrés à des doses aussi importantes que 48 000 P.N.U. en l'espace de 12 semaines et ils ne provoquent pas de choc anaphylactique. Cependant les Auteurs ont observé des réactions tardives provoquées par les fortes concentrations de ces produits polymé risés Ccf. R. PATTERSON, J. of ALLERGY, Août 19816. La présente invention s'est donné pour but de pourvoir à une nouvelle préparation d'allergènes qui répond mieux encore aux nécessités de la pratique que les préparations d'allergènes proposées dans l'Art antérieur, notamment en ce qu'elle permet de réaliser la désensibilisation à des doses, d'emblée maximales (donc comparables à celles du "POLLIMEX6'), mais sans les inconvénients d'une réaction secondaire imprévisible. Ce but est atteint, conformément à l'invention, en couplant des allergènes avec une fraction particulaire active isolée d'une corynébactérie, en particulier d'une corynébactérie présentant une activité immunostimulante ; la fraction particulaire P40, est un support approprié dans le cadre de la présente invention. Cette fraction P40 est isolée de Corynebacterium granulosum, qui est une corynébactérie anaérobie, et elle est connue pour son activité antitumorale chez la souris et chez l'homme fcf. INTERNATIONAL SURGERY, 1982, Vol. 67, pages 17-24 et pour son action de stimulation de la capacité immunogénique de synthèse d'anticorps anti-hématies de mouton chez la souris, ainsi que pour son pouvoir stimulant sur le système réticulo-endothélial aussi bien chez l'homme que chez l'animal. L'association d'un allergène inactivé à cèt adjuvant a pour but d'effectuer un recrutement cellulaire particulièrement important en ce qui concerne les éléments mononucléés susceptibles d'induire une tolérance immunitaire. La présente invention a, en conséquence, pour objet une préparation d'allergène comprenant au moins un allergène couplé à un support approprié constitué par une fraction active isolée d'une corynébactérie. Selon un mode de réalisation avantageux de la préparation d'allergène conforme à la présente invention, ladite fraction est une fraction particulaire. Selon un autre mode de réalisation avantageux de la préparation d'allergène conforme à l'invention, l'allergène est couplé par liaison de covalence à ladite fraction parti- culaire. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de la préparation d'allergène conforme à l'invention, ladite fraction particulaire provient d'une corynébactérie anaérobie. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite traction particulaire est la fraction P40 isolée de Corynebacterium granulosum. Selon un autre mode de réalisation avantageux de la préparation d'allergène conforme à l'invention, ladite fraction particulaire provient d'une corynébactérie aérobie. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite fraction particulaire est la fraction CBAp40 isolée de Corynebacterium catarrhalis. Selon un autre mode de réalisation avantageux des préparations d'allergène conformes à l'invention, la fraction particulaire est un analogue de la fraction particulaire P40, notamment une mycobactérie telle, notamment, que le bacille de Koch entier ou le MDP. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux des préparations d'allergène conformes à la présente invention, l'allergène est couplé à la fraction particulaire active qui en constitue le support, par l'intermédiaire d'agents de couplage tels que le glutaraldéhyde, le carbodiimide ou les dialdéhydes par exemple, dithio bis-(succinimidyl propionate) ou le méta-maléïmidobenzoyl N-hydroxysuccinimide ester ou la 4-4' difluoro 3-3' dinitrodiphényl sulfone. Conformément à la présente invention, l'allergène couplé à la fraction particulaire active dans les pré par tions d'allergènes conformes à la présente invention est n'importe quel allergène impliqué dans une thérapeutique de désensibilisation d'un sujet allergique. Parmi les allergènes pouvant être couplés à une fraction particulaire active conformément à l'invention, l'on peut citer, par exemple, les allergènes suivants : pollen de dactyle, poils et squames de chat, poils et squames de chien, squames humaines, D. farinas purifié, graminées, Dermatophagoïdes pteronyssinus, ovaîbu- mine, pollens d'arbres, moutarde, pollens dçorigine africaine, etc... présents isolément ou en divers mélanges entre eux. Selon un mode de réalisation avantageux des préparations d'allergène conformes à 1 ' invention le rapport pondéral allergènes/support dans les préparationse est de l'or- dre de 50/1 jusqu'à 5/1. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention des préparations d'allergènes conformes à la présente invention, qui est caractérisé en ce guipon couple les allergènes avec une fraction particulaire isolée d'une corynébactérie ou analogue, en mettant en contact lesdits al lergènes avec ladite fraction, en présence de glutaraldéhyde, dans des conditions réactionnelles et pendant un temps propres à entraîner ledit couplage par covalence. Le couplage entre la fraction particulaire P40 et l'allergène est réalisé au moyen de différents agents de couplage bi-fonctionnels. Dans le cas du glutaraldéhyde, plusieurs méthodes peuvent etre utilisées. A titre d'exemple, l'une consiste à faire agir directement le glutaraldéhyde sur le mélange fraction particulaire P40-allergène, une autre consiste à activer la fraction particulaire P40 par le glutaraldéhyde et ensuite à ajouter l'allergène à coupler à la fraction particulaire P40 activée. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. La présente invention vise des préparations d'allergènes et leur procédé de préparation, conformes aux dispositions qui précèdent, ainsi que les moyens propres à leur préparation et à leur utilisation pour la désensibilisation spécifique. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que cet exemple de mise en oeuvre, est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont il ne constitue en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : OBTENTION D'UNE PRÉPARATION D'ALLERGÈNE CONFORME A L'INVENTION. Du pollen de dactyle à 100 mg/ml est mis en contact avec une suspension aqueuse à 2 mg/ml de fraction P40 isolée de Corynebacterium granulosum, en présence de glutaraldéhyde, dans les proportions suivantes Pollen de dactyle au 1/100è (10 mg/ml) 5 ml (50 mg) Fraction P40 (suspension à 2 mg/ml) 5 ml (10 mg) Glutaraldéhyde (solution à 25 t) 1,25 ml (0,027 %) Les réactifs ci-dessus sont tout d'abord mélangés, puis on les laisse en contact pendant 15 minutes, au bout desquelles on centrifuge (dans des pots en plastique rincés à l'alcool puis à l'eau physiologique stérile) pendant 5 minutes à 12 000 tours/minute, à + 4"C. Le culot de centrifugation est remis en suspension dans 15 ml d'eau physiologique stérile, puis la suspension est centrifugée pendant 5 minutes à 12 000 tours/minute à + 4"C. Le nouveau culot obtenu est remis en suspension, puis lavé par centrifugation comme décrit ci-dessus. Le culot obtenu est mis dans 5 ml de soluté glycériné à 5 %, phénolé à 5 %O La préparation d'allergène ainsi obtenue contient du pollen de dactyle au 1/1où et de la fraction P40 à 2 mg/ml. Le couplage d'allergènes à la fraction P40 décrit ci-dessus a été répété avec les allergènes suivants - poils et squames de chat - poils et squames de chien - squames humaines - D. farinae purifié - graminées (pollens) - Dermatophagoides pteronyssinus - ovalbumine - pollens d'arbres - moutarde - pollens d'origine africaine, - etc... Expérîmention clinique L'activité des préparations d'allergènes conformes à la présente invention a été vérifiée chez des malades allergiques dans le but de determiner d'une part, leur efficacité dans la désensibilisation spécifique, meme avec un nombre réduit d'injections, et d'autre part l'absence d'effets secondaires. 38 malades allergiques, 22 pollinoses, 16 allergies diverses (dont 3 eczémas atopiques), ont été traités au cours de l'expérimentation clinique. Les tests ont été effectués parallèlement avec les allergènes actifs "A et les composés conjugués inactivés "B" provenant du même lot, préparé par le Service des Allergènes de l'Institut Pasteur. Tous ces allergènes sont titrés en unités P.N.U. (Protein Nitrogen Unit). Il est rappelé qu'1 unité P.N.U. exprime l'activité d'une dilution d'allergène contenant 0,01 X 1 on6 g d'azote protéique par ml. a) Pour les allergènes divers suivants 1 poils de chat 1 poils de chien 2 D. farinae 3 squames humaines 9 D. pteronyssinus, les tests avec les (B) ont été négatifs dans tous les cas - 6 fois par rapport à un test positif effectué avec l'al lergène (A) à la même concentration - 1 fois à une concentration double de celle de l'allergène (A) - 5 fois à une concentration dix fois supérieure à celle de l'allergène (A) - 3 fois à une concentration cent fois supérieure à celle de l'allergène (A). lia concentration maximale de l'allergène (B) était équivalente à 10 000 P.N.U. de la préparation (AJ. b) Pour les pollens, les prick-tests à une concentration ma xima effectués avec (B) ont tous été négatifs. Les intradermoréactions effectuées avec (B) au 1/1000 (é quivalent à 10 000 P.N.U.) ont toutes été négatives par rapport à la préparation (A) toujours fortement positive à une dilution cent fois plus faible (1/100 000 = 100 P.N.U.), ainsi que cela ressort du Tableau I ci-après. Ce pendant, certaines réactions cutanées quoique faibles, se sont révélées tardivement positives ; cette notion d'acti vité de la préparation est d'ailleurs correlée avec la présence d'IgE spécifiques positives quoiqu'à un taux peu élevé. 16 malades ont été traités avec succès pour des allergies diverses par la composition d'allergènes (B) conforme à l'invention. La totalité de la dose injectée par voie sous-cutanée pour chaque malade allait de 1000 à 40 000 PNU. Il n'y a eu aucune réaction locale ou systémique ni immédiate ni retardée. 22 malades polliniques ont reçu : 11 d'entre eux 2 séries de 4 injections de pollen (B) de dactyle au 1/1000 soit 2 fois 25 000 PNU et les 11 autres malades 1 série de 4 injections de pollen (B) de dactyle soit 25 000 PNU. Il n'a été observé aucune réaction ni locale ni systémique, immédiate ou retardée. Ainsi que cela ressort du tableau II ci-après; 4 malades ont été partiellement améliorés (score entre 20 et 49 %) et 8 malades ont été très favorablement améliorés (score supérieur à 50 %) sans prise de médicaments durant la saison pollinique. TABLEAU I RESULTATS OBTENUS CHEZ 23 MALADES AYANT SUBI DES "PRICK-TESTS" ET DES INTRA DERMO-REACTIONS COMPOSITION ALLERGENE A COMMERCIALISE PAR COMPOSITION CONFORME L'INSTITUT PASTEUR A L'INVENTION MALADE INTRA DERMO-REACTIONS PRICKS I.D. PRICKS 1/100 000 lilo 000 1/100 1/1 000 1/100 N 1 AS ++++ +++ 0 0 N02 FO +++ +++ + 0 1/10000=0 N03 Z ++++ +++ O O 0,05 ml 0,05 ml * N04 BE +++ +++ + ; O O N05 L +++;+ ++++;+ +++ O O N06 COL + ++++++;++++ +++ + O N 7 CA +++ 3 jrs +++ + O N 8 CM ++++ +++ + 0 1/10000=+ N09 FE +++ +++++;;+++++ +++++ + 0 3 jrs 1/10000=0 N010 AL +++ ++++ +++ O nod O pendant 48 heures N011 W +++ +++ O 0 N 12 T + +++ ++ + 0 N013 DI ++ +++ 0 O N014 K +++ +++++ + O N015 SE +++ ++++ O O N016 SOT O X 48 h ++++ 0 0 N017 G + ++++ pseud 0;;++±-24 h O N018 DU ++ +++ O O N019 SOB +++ +++ + O N020 J + +++ +O 0 N021 COR +++++ ++++ + O N022 BO +++ ++ O 0 N023 M + ++;++++ +++ +;+ 0 48 h . 48 h * Reviviscence au 25ème jour. TABLEAU II TRAITEMENT DE 22 MALADES POLLINIQUES P I \ Amélioration score % 0 - 20 % 20 t-49 z + 50 % Traitement 1 2 X 4 injections * 5 2 4 1 X 4 injections ** 5 2 4 Total 10 4 8 *) Pollen dactyle inactivé au 1/1000 - 4 injections hebdoma daires X 2 **) Doses croissantes de 0U25 mlU 0,50 ml, 0,75 ml, 1 mlO Ainsi que cela ressort de ce qui précède aucune réaction secondaire ne se manifester meme chez des malades ayant reçu jusqu'à 40 000 unités P.N.U., ce qui rend les nouvelles préparations d'allergènes conformes à la présente in- vention d'un emploi fiable, sur et facile, d'autant plus que leur titre élevé et le couplage des allergènes sur la fraction particulaire active permettent un recrutement cellulaire suffisamment important et varié pour induire une tolérance immunitaire. EXEMPLE 2 : PRPARATION D'ALLERGÈNES SELON L'INVENTION Des essais de couplage entre la fraction particulaire P40 et des allergènes ont été réalisés avec du carbodiimide dans les conditions suivantes Pollen de dactyle au 1/10è (100 mg/ml) 1 ml (100 mg) Fraction P40 (suspension à 10 mg/ml) 2 ml (20 mg) Carbodiimide (concentration finale dans le milieu réactionnel : 166 mg/ml) 16,6 % Pour réaliser le couplage, il faut ajuster le pH du mélange pollen de dactyle-fraction P40 à 4,5. Le démarrage de la réaction a lieu par addition au mélange ci-dessus, de 500 mg de 1-éthyl 3-(3 diméthylaminopropyl) carbodiimide, HCl (commercialisé par SIGMA) finement pulvérisé. On agite pour dissoudre l'agent de couplage dans le mélange. Après 30 minutes, le pH est réajusté à 4,5 par addition de soude NaOH (0,1 N). On laisse la réaction se poursuivre pendant 90 minutes à la température du laboratoire, puis on centrifuge (dans des pots en plastique rincés à l'alcool puis à l'eau physiologique stérile) pendant 5 minutes à 12 000 tours/ minute, à + 4"C. Le culot de centrifugation est remis en suspens ion dans 15 ml d'eau physiologique stérile, puis la suspension est centrifugée pendant 5 minutes à 12 000 tours/minute à + 4"C. Le nouveau culot obtenu est remis en suspension, puis lavé par centrifugation comme décrit ci-dessus. Le culot obtenu est mis dans 10 ml de soluté glycériné à 5 %, phénolé à 5 %O . La préparation d'allergène ainsi obtenue contient du pollen de dactyle au 1/iOè et de la fraction P40 à 2 mg/ ml. EXEMPLE 3 : COUPLAGE D'UN ALLERGENE A LA FRACTION PARTICULAIRE P40 1") Activation 20 mg de fraction particulaire P40 sont lavés par centrifugation avec 2 fois 10 ml d'eau "Volvic" -stérile, la fraction P40 lavée est reprise dans le mélange suivant eau "Volvic" stérile 0,5 ml tampon phosphate de potassium (K/K2) 1 molaire, pH 7,4 0,1 ml On ajoute ensuite du glutaraldéhyde à 25 %, 0,15 ml, concentration finale 0,5 %. Le mélange est agité pendant 18 heures à la température ambiante du laboratoire. Il est ensuite centrifugé. Le culot de fraction P40 activée est lavé 3 fois avec 10 ml d'eau de "Volvic" stérile et 2 fois avec 10 ml de tampon phosphate de potassium (K/K2), 0,1 mol, pH 7,4, stérile. 2") Couplage La fraction P40 activée est reprise dans 1 ml de tampon phosphate de potassium (K/K2) 0,1 M, pH 7,4, stérile. Après addition d'1 ml de pollen de dactyle au 1/10è (100 mg par ml), le mélange est agité pendant 18 heures à + 4QC. Le mélange est alors lavé par centrifugation 3 fois avec 10 ml de solution saline isotonique stérile. Le culot du dernier lavage est remis en suspension dans 10 ml de soluté glycériné à 5 % et phénolé à 5 to. Il contient l'allergène à la dilution 1/100 (10 mg par ml) et la fraction particulaire P40 à la concentration de 2 mg par ml. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'etre décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir-à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1") Préparation d'allergènes comprenant au moins un allergène couplé à un support approprié constitué par une fraction active isolée d'une corynébactérie. 2") Préparation d'allergènes selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite fraction est une fraction particulaire. 3 ) Préparation d'allergènes selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que l'allergène ou les allergènes est ou sont couplé(s) par liaison de covalence à ladite fraction particulaire. 4 ) Préparation d'allergènes selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite fraction particulaire provient d'une corynébactérie anaérobie. 5 ) Préparation d'allergènes selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite fraction particulaire est la fraction P40 isolée de Corynebacterium granulosum. 6 ) Préparation d'allergènes selon l'une quelconque des revendications 7 à 3, caractérisée en ce que ladite fraction particulaire provient d'une corynébactérie aérobie. 7 ) Préparation d'allergènes selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite fraction particulaire est la fraction CBAp40 isolée de Corynebacterium catarrhalis. 8 ) Préparation d'allergènes selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la fraction particulaire est un analogue de la fraction particulaire P40, notamment une mycobactérie telle, notamment, que le bacille de Koch entier ou le MDP. 9 ) Préparation d'allergènes selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'allergène est couplé à la fraction particulaire active qui en constitue le support, par l'intermédiaire d'un agent de couplage bifonctionnel 10 ) Préparation d'allergènes selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'allergène est couplé à la frac tion particulaire active qui en constitue le support, par l'intermédiaire du glutaraldéhyde 11") Préparation d'allergènes selon la revendication 9, caractérisée en ce que en ce que l'allergène est couplé à la fraction particulaire active qui en constitue le support, par l'intermédiaire du carbodiimide. 12") Préparation d'allergènes selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que le rapport pondéral allergènes/support dans les préparations, est de l'ordre de 50/1 jusqu'à 5/1. 13 ) Procédé d'obtention des préparations d'allergène nes selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'on couple les allergènes avec une fraction particulaire isolée d'une corynébactérie ou analogue, en mettant en contact lesdits allergènes avec ladite fraction, en présence d'un agent de couplage bi-fonctionnel tel que le glutaraldéhyde ou le carbodiimide, dans des conditions réactionnelles et pendant un temps propres à entraîner ledit couplage par covalence. 14") Procédé d'obtention des préparations d'allergène nes selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'on active d'abord une fraction particulaire isolée d'une corynébactérie ou analogue, par addition d'un agent de couplage bi-fonctionnel, puis l'on ajoute l'allergène à coupler à la fraction particulaire préalablement activée, dans des conditions réactionnelles appropriées. 15 & Application des préparations d'allergènes selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, en tant qu'agents de désensibilisation dans des traitements de désensibilisation spécifique.