FR 2556008 A1 19850607 FR 8319494 A 19831206 La présente invention concerne, de façon générale, des vecteurs plasmidiques de clonage et d'expression d'une protéine dans un microorganisme, et en particulier dans les levures, les micro-organismes transformés par lesdits vec- teurs plasmidiques, un procédé de fermentation et les enzymes obtenues par la mise en oeuvre dudit procédé. Plus particulièrement, la présente invention concer- ne des vecteurs plasmidiques de clonage et d'expression du gène de la p-glucosidase dans les levures, ainsi que-son appli- cation à la dégradation enzymatique des matières cellulosiques. La dégradation des matières cellulosiques corres- pond, en effet, à une préoccupation économique actuelle de pre- mier ordre. La cellulose est un des constituants principaux du bois, des céréales et de toute substance végétale en général. La valorisation des sources naturelles et renouvelables que constituent les sous-produits de la sylviculture, l'agricul- ture, l'élevage et des industries agro-alimentaires entre- autres, par la dégradation de la cellulose en glucose, est une voie importante de production d'énergie, mais également de synthèse de produits tels que: des protéines, des enzymes, des antibiotiques et des intermédiaires de chimie organique (solvants, acides organiques). Le récent développement de la technologie des enzy- mes a conduit à s'intéresser à l'hydrolyse enzymatique de la cellulose qui pourrait se révéler plus rentable que les pro- cédés chimiques utilisés jusqu'alors. On sait que la /-gluco- sidase (EC3-2-1-21) intervient dans la dernière étape de la dégradation de la cellulose. Elle permet de scinder le cello- biose en deux molécules de glucose. Nombre de bactéries et de champignons produisent des cellulases utilisées industriellement. Toutefois, l'hydro- lyse de la cellulase par le complexe cellulosique se traduit par une accumulation de cellobiose qui inhibe l'activité cellulosique. La vitesse d'hydrolyse de la cellulose pourrait donc être largement augmentée en complétant l'action des cel- lulases par des/-glucosidases immobilisées. Cette enzyme immobilisée montre une grande stabilité. De plus elle peut être réutilisée. Un autre intérêt serait de se doter d'un organisme capable directement de fermenter le cellobiose. Dans cette optique, la levure semble être un organisme de choix. En effet, la levure est cultivée industriellement sur des milieux à bas prix de revient pour la production de levure de panifi- cation de bière. Elle est consommée par l'homme depuis des millénaires, elle ne peut se multiplier chez l'homme et ne possède aucun pouvoir pathogène. C'est donc un hôte très inté- ressant pour les recombinaisons génétiques in vitro, en vue de la sélection de nouvelles souches industrielles ou la produc- tion d'enzymes, ou de protéines par exemple. Le clonage d'un gène de structure de la P-glucosi- dase dans Saccharomyces cerevisiae a permis d'obtenir des transformants de S. cerevisiae produisant la P-glucosidase à un taux élevé. L'étude de la structure du gène cloné a révélé que ce gène est transcrit à partir d'un promoteur fort, c'est- à-dire que le promoteur d'expression de la p-glucosidase dans les levures, peut être utilisé à la production à un taux élevé de protéines - autres que la P-glucosidase - par fusion entre ce promoteur et le gène de structure correspondant ou le cDNA synthétisé à partir de l'ADN messager mature, que l'on désire cloner. Un autre avantage de la présente invention réside donc dans l'isolement et le sous-clonage du fragment d'ADN portant ce promoteur fort. C'est pourquoi la présente invention concerne des vecteurs plasmidiques de clonage et d'expression d'une protéi- ne dans un micro-organisme, caractérisésen ce qu'ils compor- 255600 C tent au moins le gène de structure codant pour la synthèse de ladite protéine et les éléments assurant l'expression dudit gène de structure dans un micro-organisme, et en ce que la promotion du gêne de structure est assurée par le promoteur d'expression du gène de la P-glucosidase dans le.- levures. Selon un mode de réalisation de l'invention, le promoteur d'expression du gène de la /-glucosidase dans le d'une levure, notamment d'une souche de Kluyveromyces fragilis. Il s'agiraen particulier, de tout ou partie du fragment de restriction BamHl-BamHl de 2,2 Kb sous-cloné à partir d'un vecteur plasmidique selon l'invention. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le gène de structure de la protéine que l'on désire clone: est, de préférence, un gène eucaryote, en particulier -- codant pour la synthèse de P-glucosidase. Ce gène prove -:;- notamment, de l'ADN chromosomique d'une souche de K. fraIi produisant une /-glucosidase de manière constitutive et cons- tituant ainsi l'organisme donneur. On entend par "éléments assurant l'expression du gène de structure" toutes les séquences d'ADN nécessaires cette expression dans un micro-organisme, excepté le geè -- structure lui-même de la protéine que l'on désire cloner. - ste à-dire outre le promoteur, un élément de terminaison lor- cela est nécessaire et/ou leur codon de départ en phase exemple. Selon un mode de réalisation préféré de l'ir lesdits plasmides comprennent au moins: - une origine de réplication dans les levuz notamment l'origine de réplication d'un plasmide 2 Levure, - un gène de levure permettant une sélectiol_ les levures. Les vecteurs plasmidiques selon l'invention peuvent comprendre en outre des éléments permettant leur transfert dans les bactéries lorsqu'il s'agit d'un plasmide 'navette', notamment: - une origine de réplication dans les bactéries, par exemple dans Escherichia coli, - et des gènes codant pour la résistance à certains antibiotiques, notamment à l'Ampicilline et à la Tétracycline. L'ADN du plasmide 2 pm portant l'origine de répli- cation dans les levures permet, aux vecteurs plasmidiques selon l'invention, d'être amplifiés dans une levure qui constitue, comme il a été indiqué ci-avant, l'hôte de choix pour les recombinaisons génétiques qui font l'objet de la présente invention. L'intérêtdi gène ura3 réside dans le fait qu'il permet la sélection des micro-organismes transformants. Apres transformation d'une souche de phénotype ura3, seuls les micro-organismes ayant intégré un vecteur plasmidique selon l'invention se développeront sur un milieu minimum sans uracile. La présence d'une origine de réplication dans les bactéries se justifie car on utilise une bactérie, en particu- lier Escherichia coli, comme hôte intermédiaire au cours du processus de construction desdits vecteurs tel qu'il sera décrit ci-après. De même, la présence de gênes codant pour une résistance à certains antibiotiques, Ampicilline et Tétra- cycline entre autres, permet une sélection des bactéries transformées au cours du processus de construction des vecteurs plasmidiques. Indépendamment des vecteurs plasmidiques décrits précédemment, la présente invention concerne également les micro-organismes transformés par les vecteurs selon la pré- sente invention. Compte-tenu d'une part, que l'application princi- pale de l'invention consiste en la préparation de micro- organismes capables de fermenter directement le cellobiose, et que, d'autre part et comme il a été indiqué en introduc- tion, les levures et plus particulièrement celles appartenant au genre Saccharomyces, semblent être les micro-organismes s'adaptant au mieux à la réalisation de cet objectif, l'in- vention protège les levures transbrmées par lesdits vecteurs plasmidiques, et de manière plus spécifique une souche trans- formée de S. cerevisiae. Enfin, la présente invention concerne un procédé de production de protéines,en particulier de P-glucosidase, consistant à faire fermenter un milieu approprié par un micro- organisme,en particulier une levure,comme décrit ci-avant et à isoler la protéine obtenue. En outre, la présente invention concerne la protéine (la A-glucosidase) obtenue par la mise en oeuvre dudit procédé. La composition des milieux de fermentation est connue de l'homme de métier, en particulier pour ce qui concerne les fermentation par S. cerevisiae, mais dans certains cas il sera intéressant de pouvoir fermenter directement la cellu- lose soit en utilisant une souche portant les gènes assurant cette fermentation, et en particulier le gène codant pour la f-glucosidase selon l'invention, soit en utilisant diverses souches dont celles selon l'invention. L'isolement de la P-glucosidase produite peut être effectué par tout procédé après éclatement éventuel des cel- lules lorsque l'enzyme n'est pas excrétée. Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la pré- sente invention. L'utilisation des enzymes de restriction et des ligases est connue de l'homme de métier et afin d'alléger la description, sauf indication contraire, les enzymes en cause seront mises en oeuvre conformément aux prescriptions du fabricant. Ces enzymes sont commercialisées notamment par la Société BIOLABS, la Société MILES LABORATORIES INC. et la Société BOEHRINGER. Les figures ci-annexées permettront de mieux com- prendre certains aspects de la présente invention. Sur ces figures: - la figure 1 représente une carte de restriction du plasmide KF1, - la figure 2 représente une carte de restriction du plasmide KF4, - et la figure 3 représente une carte de restric- tion du plasmide PR1. EXEMPLE 1 Construction d'une banque de gène de Kluyveromyces fragilis dans Escherichia coli. A - Organisme donneur: L'organisme donneur est une levure Kluyveromyces fragilis (Y610) déposée à 1'ATCC sous le n 12424. Cette souche produit de manière constitutive une A-glucosidase carac- térisée par L.W. FLEMING et J.D. DUERKSEN: Purification and characterization of Yeast fl-glucosidase; Journal of Bacte- riology (1967) vol. 93 pp. 135-141. L'ADN de K. fragilis est purifié par centrifugation à l'équilibre en gradient de CsCl. Après lyse des cellules de levure, on ajoute au lysat une solution de CsCl saturée dans les proportions 1/3 et 2/3 respectivement. Le mélange est cen- trifugé 48 heures à 40 K rpm dans un rotor TFT65 Kontron. Le contenu du tube est collecté par perçage du fond du tube, la présence de l'ADN est révélée par l'écoulement de liquide très visqueux. Après dialyse de l'ADN collecté contre du TE (10mM tris, lmM EDTA pH 7,5) pendant 24 heures, l'ADN est analysé par électrophorèse en gel d'agarose. Par électrophorèse sur gel a 0,3 % avec comme étalon de taille l'ADN du phage > (49 kb), on peut estimer la taille de l'ADN purifié à environ 150 Kb au moins. B - Vecteur de clonaqe: Le vecteur de clonage utilisé est le cosmide pHCG3 décrit par C. GERBAUD et collaborateurs: construction of new yeast vectors and cloning of the nif (Nitrogen Fixation) gene cluster of Klebsiella pneumoniae in yeast; Current Genetics (1981) vol. 3 pp. 173-180. Ce vecteur est constitué d'une par- tie du plasmide de 2 m isolé de S. cerevisiae, portant l'origine de réplication de ce plasmide, et d'un gène de levure ura3+. L'autre partie de ce vecteur est le cosmide pHC79 décrit par B. HOHN et J. COLLINS: A small cosmid for effi- cient cloning of large DNA fragments; Gene (1980) volo 10 pp. 291-298. Le cosmidepHCG3 est un vecteur dit "navette"'g c'est-à-dire qu'il peut se répliquer et être sélectionné à la Lois dans S. cerevisiae et dans E. coli, il est décrit notam- ment dans le brevet français n0 80 18754. Il possède en outre des propriétés de cosmide, ce qui permet le clonage de fragments d'ADN de grande taille. C - Clonage du _ ne de._-qlucosidase dans pHCG3 L'ADN de K. fra ilis est digéré partiellement par l'enzyme de restriction Sau3A, permettant de couper l'ADN chromosomique de manière "pseudo aléatoire"'. Après digestion des fragments de 20 à 40 Kb sont purifiés par centrifugation en gradient de saccharose (10 à 40 %) tourné 20 heures à 25 K rpm dans un rotor SW41 Beckman Parallèlement, le cosmide pHCG3 est totalement digéré par l'enzyme de restriction BainHlo Les fragments purifiés de IeADN de K. fraiis sont ligaturés, par action de la T4 DNA-ligase en présence d'ATP et de dithiottreitol pendant une nuit à 13 C, au cos- mide pHCG3 digéré. Les ensymes Sau3A etBamHl donnent après digestion des extrémités compatibles. D - Préparation du piasmide KF1 Le mélange de ligation issu de l'étape C est ensuite encapsidé dans des coques vides de bactériophages Lambda selon le protocole de B. HOHN et J. COLLINS. Cosmids: A type of plasmid gene cloning vector that is packageable in vitro in bacteriophage Lambda Heads; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1978) vol. 75 n 9 pp. 4242-4246. Le mélange d'encapsidation préparé précédenmment est utilisé pour infecter une souche d'E. coli HBIQI qui est notamment sensible à l'Ampicilline et à la Tétracycline. Le vecteur utilisé portant les gènes bactériens de résistance à ces deux antibiotiques, on pourra sélectionner les bact6- ries infectées qui seront résistantes à l'Ampicilline (50 pg/ml). Les insertions d'ADN de K. fragilis sont faites au site BamHl du vecteur, situé dans le gène de résistance à la Tétracycline. De ce fait, les bactéries ayant reçu un plasmide recombinant portant de 1'ADN de K. fragilis seront Ampicilline résistance (AmpR) et Tétracycline sensible (TcS. 1800 clones bactériens Amp Tcs ont ainsi été isolés. Ce chiffre est en théorie suffisant pour être snr à 98 % d'avoir cloné un gène donné de K. fragilis. Le plasmide recombinant ainsi préparé est appelé plasmide KF1. Sa structure a été ensuite étudiée (figure 1). Le plasmide KF1 est constitué d'une seule copie du vecteur pHCG3 et d'une insertion d'ADN de K. fragilis d'environ 35 Kb, l'ensemble du plasmide ayant une taille de 45 Kb. E - Recherche de l'activité -glucosidase: L'activité,-glucosidase a été recherchée parmi ces 1800 colonies, en dosant la capacité à hydrolyser le PNPG (p-nitrophenyl /-D-glucoside). La coupure de la liaison 1-4 (-Dglucoside libère des groupementÉnitrophénol donnant une coloration jaune quantifiable en densité optique à 400 nm; 1 nM de PNPG hydrolysée produit une augmentation de Do de 0,013. Le test d'activité est fait sur des bactéries préala- blement lysées par action de lysozyme et d'un détergent doux le Triton X100. On a isolé ainsi un clone parmi les 1800 aant l'activité recherchée. L'ADN plasmidique isolé de ce clone a été utilisé pour transformer la souche HB101. Tous les transformants résultants produisaient de la /-glucosidase. On montre ainsi que l'on a cloné sur un plasmide, appelé KF1, un fragment d'ADN portant le gène de structure de la /-gluco- sidase de K. fragilis. F - PrEparation du plasmide KF4 Cette préparation consiste à réduire, par sous- clonages successifs, la taille du plasmide KF1 et plus préci- sément de réduire la taille du fragment d'ADN de K. fragilis inséré au cosmide pHCG3 de façon à ne conserver de ce frag- ment que la partie comportant le gène de structure et la région promotrice de la protéine que l'on désire cloner. Les sous-clonages consistent à chaque étape à faire des délétions dans l'insertion portée par le plasmide pHCG3. A chaque étape on recherche après transformation de la souche HB101 de E. coli des transformants iglucosidase + portant une insertion d'ADN de taille réduite. On est ainsi passé en trois étapes successives du plasmide KF1 portant une insertion de 35 Kb au plasmide KF4 pour lequel la taille de l'insertion a été réduite à 3,5 Kb (figure 2). EXEMPLE 2 Transformation d'une levure par le plasmide KF4 A - Préparation d'une souche de S. cerevisiae, transformée TYKF4: Les plasmides sélectionnés dans E. coli ont été, après purification, transférés dans la levure S. cerevisiae par transformation. La souche réceptrice utilisée pour la transformation est la souche OL1, double mutante pour le gène ura3. La souche OL1 de S. cerevisiae ainsi transformée constitue la souche TYKF4. Les plasmides utilisés portent le gène de levure ura3+, et après transformation on sélectionne des colonies de levure prototrophe sur milieu minimum sans uracile. B - Expression de la ?-glucosidase dans la levure Les clones sélectionnés ont donc reçu le plasmide et on a étudié l'expression du gène de la Iglucosidase dans les transformants TYKF4 de S. cerevisiae. Les dosages enzyma- tiques ont été effectués sur des extraits bruts de levure obtenues par broyage avec des billes de verre. Les essais ont été faits en utilisant, d'une part, le PNPG, d'autre part, le cellobiose comme substrats. Ce test permettant de déterminer le niveau d'expression du gène et de savoir si la 3-glucosidase produite était capable d'hydrolyser le cellobiose. Les résultats obtenus sont présentés dans le ta- bleau 1. On peut noter une activité spécifique, pour les levures transformées par le plasmide KF4, plus de 300 fois supérieure à celle observée pour la souche de K. fragilis. On considère:- le turn-over de la /-glucosidase de levure purifiée donnée par H.N. INAMAR et J.C. KAPLAN: 12,1 x 103 molécules de PNPG hydrolysées par minute par molécule d'enzyme. - un poids moléculaire moyen pour la -glucosidase de 300 000 daltons. - l'activité spécifique de OL1 transformée par KF4 (TYKF4) qui est de 3650 nM de PNPG hydrolysées par minute par mg de protéine. 2556008:B - et l'activité spécifique de OLI transformée par KF4 (TYKF4) qui est de 600 yg de glucose libéré par minute et par mg de protéine. On précise que ceci correspond à 1700 nM de cellobiose hydrolysées par minute et par mg de protéine. On peut estimer que dans TYKF4 la j-glucosidase produite représenterait de l'ordre de 10 % des protéines totales. Ce résultat fait apparaître que le gène de la A-glucosidase serait transcrit à partir d'un promoteur fort. EXEMPLE 3 sous-clonage de la région promotrice Après avoir déterminé à partir du plasmide KF4 la taille et le sens de la transcription du gène de la bglucosidase, il convenait, pour caractériser la région promoteur, de souscloner un fragment recouvrant le gène situé en amont du site Pstl de KF4 (figure 2). On est donc retourné au plasmide XFt pour sous-cloner le fragment rami{l - BamHl de 2,2 Xb recouvrant cette zone (figure 1) o Afin de tester si ce fragment porte le promoteur recberché, on effectue des fusions avec le gène lacZ pro- dj.u-sant la galactosidase. On utilise le plasmide pZ4C2010 construit par CASADAAN, qui porte le gène lacZ de l'opéron lactose, dépourvu de région promoteur et de codon d"initia- cion. Les souches de E, co!i et de S. cerevisiae transformées ]}ar ce plasmide ont donc un phenotype 0-galactosidase-o Si on L.nsee cdians ce plasmide un frag-ment% ADN portant un promoteur un codon d'init!ation de ia transcription on doit alors :'mettre la production de %-oaiactosidase. Le fracaent ar! - iri de %4 Yb isol! après digestion de RFi a été e..ses au i Bami de pM4C20t0l On a préparé ainsi le plasmide PRI. Après ligation en utilis% 2556008. la T4 DNA ligase et transformation d'E. coli, on a obtenu des transformants produisant la -galactosidase. Le plasmide recombiné isole de tels transformants a été, après purifi- cation, utilisé pour transformer S. cerevisiae. On a pu montrer que les transformants résultants produisaient la e-galactosidase (figure 3). Ces résultats montrent donc clairement que le fragment sous-cloné de 2,2 Kb porte bien la région promotrice. 2556008. T A B L E A U 1 Vecteur Activité spécifique plasmidique Souche testée sur PNPG Cellobiose -_ OL1 1 0,22 - K. fragilis 7,6 2,1 KP4 TYLF4 3636 600 - L'activité spécifique testée sur le PNPG s'exprime en n Moles hydrolysées /mn/mg de protéine, - L'activité spécifique testée sur le cellobiose s'exprime en Gg de glucose libéré /mn/mg de protéine. REVENDICATIONS 1. - Vecteur plasmidique de clonage et d'expres- sion d'une protéine dans un micro-organisme, caractérisé en ce qu'il comporte au moins le gène de structure codant pour la synthèse de ladite protéine et les éléments assurant l'expression dudit gène de structure dans un micro-organisme, et en ce que la promotion du gène de structure est assurée par le promoteur d'expression du gène de la 6-glucosidase dans les levures. 2. - Vecteur plasmidique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le promoteur est une séquence d'ADN chromosomique d'une levure. 3. - Vecteur plasmidique selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'ADN chromosomique est extrait d'une souche de Kluyveromyces fragilis. 4. - Vecteur plasmidique selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'ADN chromosomique est constitué de tout ou partie du fragment de restriction BamHl - BamH1 de 2,2 Kb. 5. - Vecteur plasmidique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gène de structure code pour la syn- thèse de f-glucosidase. 6. - Vecteur plasmidique selon les revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le gène de structure est un gène eucaryote. 7. - Vecteur plasmidique selon la revendication 6, caractérisé en ce que le gène eucaryote est le gène de la -glucosidase de Kluyveromyces fragilis. 8. - Vecteur plasmidique selon l'une des revendi- cations 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre: - une origine de réplication dans les levures, - et un gène assurant une sélection dans les levures. 9. Vecteur PlaiDMdique selon la raevenacatiot 3 caract6ris en ce que l'oigiine de ?Plication dans len - vures est l'origine de rOplication du plasmide de 2 p. 10. - Vecteur plasmidique selon la revendication 0, caractéris6 en ce que le gene assurant une sélecton est le gène ura3+. 11. - Vecteur plasmidique selon l'une des revendi- cations 1 à 10, caractérise en ce qu'il comprend en outre: - une origine de rêplication dans les bactéries, notamment dans Escherichia coli, - et des gènes de résistance à certains antibio- tiques, notamment à l'Ampicilline et à la Tétracycline. 12. - Micro-organisme transformé par un vecteur plasmidique selon l'une des revendications 1 a 11. 13. - Micro-organisme selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une levure. 14. - Micro-organisme selon la revendication!3, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une souche de levure appar- tenant au genre Saccharomyces. 15. - Micro-organisme selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il s'agit de SacEcharMyces cerevisiae. 16. - Procédé de production d'une protéine carac- risé en ce qu'il consiste a faire fermenter un milieu par un micro-organisme selon l'ne des revendications!2 & 15 et à isoler la protéine produite. 17. - Procédé selon la revendication 6, caracta- risé en ce que la protéine produite est le g!cosidaseo la. - -glucosdase obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication!6o