FR 2561129 A1 19850920 FR 8403845 A 19840313 La présente invention concerne un procédé et un dispositif de séparation de bactéries à partir d'une phase liquide en vue notamment d'un contrôle bactériologique. Le contrôle bactériologique des eaux est une nécessité pour la protection sanitaire des populations, notariment en ce qui concerne - les eaux destinées à la consommation humaine neaux potables) et animale, - les eaux destinées a des usages alimentaires directs ou indirects (utilisées dans les industries alimentaires), - les eaux des milieux aquatiques utilisées pour la la conchyliculture (élevage des coquillages) ou l'aqua culture, - les eaux de piscines, - les eaux du milieu aquatique naturel consacrées aux loisirs, baignade, ... - les rejets d'eaux usées plus ou moins épurées, notamment dans les zones sensibles à la pollution. Le contrôle est d'autant plus nécessaire que les aux superricielles (rivières, lacs, étangs) sont de plus en plus utilisées pour la préparation d'eau potable, et que ces eaux superficielles sont très vulnérables aux rejets contaitiinés bactériolog#quement (rejets domestiques et urbains, rejets d'abattoirs, ...). Devant la dif ficulté d'isoler et de dénombrer les bactéries pathogènes, susceptibles de provoquer des ma ladies humaines ou animales, on recherche classiquement des bactéries dites "germes-tests de contamination ~4- cale" dont la présence permet de suspecter celle de germes pathogènes u sont de meme origine matières fé cales, et les accompagnerit généralement. Ces germes-tests ont été choisis également en fonction de leur facilité de détermination par les méthodes de la bactériologie classique. Les bactéries coliformes répondent au critère de définition des germes-tests et sont utilisées classiquement en tant que tels. Par ailleurs, certaines bactéries de ce type, de l'espèce Escherichia coli sont#potentiel- lement pathogènes et leur identification apporte une présomption supplémentaire de non-potabilité. D'autres bactéries sont également utilisables comme germes-tests de contamination fécale (Streptocoques fécaux, ...). Le problème posé par l'application des méthodes classiques de la bactdriologie à l'évaluation du degré de contamination bactérien des eaux est la longueur des déterminations en laboratoire. Cette durée est et effet incompressible du fait que ces méthodes comportent des cultures bactériennes, sur milieux nutritifs appropriés, nécessitant des incubations de longue durée avant lecture du résultat. A titre indicatif, les méthodes classiques de dénombrement des bactéries coliformes ou Escherichia coli, nécessitent au moins 24 heures (méthode avec concentration sur membrane) dans le cas de l'analyse des eaux peu contaminées (type eaux potables ou eaux traitées) tandis que la méthode utilisée sur les eaux contaminées (type eaux de rivière) nécessite deux incubations successives de 48 heures pour déterminer les bactéries co- liformes et Escherichia coli. (Méthode en milieu liquide, dite du "nombre le plus probable"). Ce temps de réponse élevé constitue un handicap certain lorsque le contrôle de qualité de l'eau est ef fectud en vue d'une action preventave ou curative (interdiction de l'usage de l'eau contaminée, modiflcai;ioal des conditions de fonctionnement d'une installation de traitement). En effet, une atteinte irréparable a la santé publique peut être causée entre le début de la pollution bactérienne de l'eau et la connaissance du résultat de l'analyse de contrôle Un autre inconvénient de ces méthodes est d'être purement manuelles et de ne pas pouvoir se prêter à une automatisation complète (réalisation d'analyses en continu ou de façon séquentille à fréquence rapide sans aucune intervention humaine). Le but recherché lors de la conception de l'invention était - de permettre une réduction très importante du temps de réponse des analyses de contrôle bactériologique des eaux par identification et comptage des bactéries, notamment coliformes et/ou Escherichia coli et, si possible, de réduire ce temps de plusieurs jours à une durée de quelques heures, - de permettre une automatisation complète rendant possible un contrôle pratiquement continu. Au niveau du laboratoire, la seule manière actuellement connue de raccourcir le temps de réponse. des méthodes de la bactériologie classique consiste à réaliser une filtration de l'échantillon liquide sur une membrane dont la taille des pores est inférieure à celle des bactéries (en général des pores de diamètre 0,4 microns), à concentrer ainsi la totalité des bactéries présentes sur la surface de la membrane et à réaliser sur celleci, par apport de milieu nitritif adéquat, une culture qui, après incubation rapide, permettra d'identifier la-pre- sence et de dénombrer les bactéries spécifiquement recherchées. Cette technique présente trois graves inconvénients - le diamètre des pores de la membrane nécessaire à la rétention des bactéries est si petit que ces pores peuvent se trouver très rapidement colmatés par des particules solides de petite taille, de nature non bactérienne (particules colloldales d'argile, limons, matières humiques, débris végétaux ou animaux, etc.) ce colmatage empêchant la filtration de se poursuivre et rendant donc la méthode inopérable, - le nombre de bactéries séparées par filtration et retenues par unité de surface de la membrane peut être trop élevé, rendant impossible l'identification séparée des colonies bactériennes se développant lors de l'incubation et par conséquent la numération des bactéries. - la préconcentration des bactéries sur membrane étant irréversible, celle-ci ne peut retrouver son état initial et être réutilisée. On pourrait concevoir des systèmes à renouvellement automatisé de la membrane (déroulement d'une bande de matériau), mais au prix d'une grande complexité sur le plan mécanique et avec un risque important de contamination de la membrane neuve par celle qui a déjà été utilisée. La méthode décrite ci-dessus manifeste donc des résultats insuffisants.vis-à-vis des objectifs fixés. Dans le but de résoudre le problème, des méthodes nouvelles reposant sur des principes tout à fait différents ont été mises au point. Il s'agit essentiellement de méthodes instrumentales et notamment la méthode électrochimique de détection des bactéries coliformes et E. coli mise au point par Wilkins et coll.("Microbial de tection method based on sensing molecular hydrogen". Applied Microbiology, vol. 27, n0 5, Mai 1974, p.649652. - J.R. Wilkins, E-.H. Boykin "Analytical notes. Method for early detection and monitoring of -coliforms". J.A.W.W.A. Mai 1976, p.257-262. - -3.R. Wilkins et coll. "Multichannel electrochemical microbial detection unit". Applied and Environmental Microbiology, vol. 35, n0 1, p.214-215, Janv. 1978), qui numère ces bactéries en mesurant le temps de latence au bout duquel une culture réalisée par mélange de l'échantillon étudié avec un milieu nitritif convenable produit de l'hydrogène moléculaire détectable à l'aide d'une électrode de platine dont le potentiel est comparé en permanence à celui d'une électrode de référence (par exemple électrode au calomel ou au chlorure d'argent). Du treks méthodes ont été également décrites par la littérature : méthode utilisant des radio-éléments, méthodes sérologiques, méthodes électrochimiques diverses, méthodes enzymatiques, méthodes chromatographiques, méthodes par chimiluminescence (voir A.j'#.Cundell "Rapid counting methods for collform bacteria". Advances in appliedmicrobiology, vol. 27, p.169-181# 1981). Bon nombre des méthodes instrumentales mentionnées ci.-dessus présentent la particularité d'avoir un temps de réponse d'autant plus court que l'échantillon étudié est fortement contaminé en bactéries coliformes ou E. coli. Le temps de réponse peut être court de ltor- r de quelques heures sur des échantillons très- forte- rnvnt contaminés. Il est par contre plus long lorsque l'échantillon est peu contaminé et peut atteindre ou dépasser une douzaine d'heures lorsque l'échantillon continent une seule bactérie du type recherché Ceci demeure un inconvénient dans le cas de la surveillance des eaux potables où une contamination faible peut déjà conduire à des risques sanitaires importants. Il est à signaler par ailleurs que toutes les méthodes connues, dont toutes celles qui ont été men tonnées précédemment, utilisent des volumes d1échantil- lon (eau) faible (en général de 100 ml), alors que des volumes beaucoup plus importants (quelques litres ou dizaines de litres) seraient nécessaires pour identifier des bactéries en cas de contamination très faible, mais néanmoins existante. Enfin, certaines méthodes utilisent des réactifs oûteux (par exemple molécules biochimiques complexes) ou dont l'usage pose des problèmes spécifiques (ex: radio-éléments). La présente invention n est pas en soi une méthode de détermination à réponse rapide des bactéries, maïs un procédé de séparation et donc de "concentration" rapide de celles-ci, permettant de diminuer le temps de réponse des méthodes de détermination utilisées ensuite. La présente invention a ainsi pour objet un procédé de séparation de bactéries d'une phase liquide, ca racterisé en ce que l'on met en contact la phase liquide avec au moins une électrode maintenue à un potentiel ayant une polarité opposée à la charge des bactéries à séparer de facon à obtenir une fixation des bactéries sur l'électrode. Sans que cela constitue une limitation quelconque, on estime que le mécanisme de fixation est le suivant: comme toutes les particules en suspension dans l'eau, les bactéries portent une charge électrique superfin cielle qui peut résulter simultanément de phénomènes - de nature électrochimique (formation d'une double couche ionique à l'interface solide-liquide, em- magasinant une certaine quantité d'électricité), - de nature biochimique : propriétés de dissocia- tion ionique des molécules constituant la paroi cellulaire ou secrétées et adhérant à celle-ci, - de nature biologique, liés au métabolisme des bactéries : transport actif d'ions à travers les parois cellulaires. Lorsqu'on met en contact la phase liquide avec l'électrode dont le potentiel est maintenu a une polarité opposée à la charge des bactéries, les bactéries sont attirées par cette électrode et viennent y adhérer. Généralement, la charge des bactéries est négative et l'électrode est maintenue à un potentiel positif. Le mécanisme de cette adhésion importe peu, qu'il soit purement physico-chimique ou biochimiaue. Pour favoriser le processus de migration des bactéries vers l'électrode et la rétention des bactéries sur cette électrode afin d'obtenir un rendement de séparation élevé, on utilise avantageusement une électrode perforée telle qu'une grille et on fait passer la phase liquide à travers ladite électrode perforée. Selon les cas, on pourra ensuite applwquer une méthode d'identification et de dénombrement des bactéries: - soit directement à la surface de l'électrode, - soit dans un petit volume de liquide (concentrat) dans lequel on liera relarguer les bactéries précédemment fixées à la surface de l'électrode à l'aide de moyens adaptés (par exemple modification de la polarité électrique de l'électrode). La présente invention facilite l'utilisation de méthodes déjà connues d'identification et de dénombrement des bactéries et permet de réduire leur temps de réponse chaque fois qu'il ssagit de méthodes dont le temps de réponse est d'autant plus court que l'échantillon étudié est contaminé bactériologiquement. L'invention est exposée ci-après plus en détail à l'aide d'un dessin représentant seulement un mode d'exécution. Sur ce dessin la figure unique est un schéma d'un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invent ion. Comme représenté sur la figure unique, lXéchantil- lon d'eau duquel on veut séparer les bactéries est introduit dans une cellule 1 de forme cylindrique comportant à sa base un dispositif de réglage de débit 2 permettant de régler à volonté la vitesse de passage de l'eau à travers la cellule. La cellule est garnie de deux électrodes métalliques 3 et 4 qui sont superposées horizon talèrent et remplissent la section entière de la cellule. Ces électrodes sont constituées par une grille métallique de faible ouverture de maille. Le liquide qui s'écoule verticalement à travers la cellule est ainsi obligé de passer à travers les grilles métalliques. L'ensemble du dispositif est stérilisé (rinçage prolongé à l'alcool éthylique) avant réalisation de chaque analyse. L'électrode métallique inférieure 3 est placée à un potentiel électrique positif par rapport à la deuxième électrode 4 par un générateur 5 dont la nature importe peu (pile, accumulateur, alimentation stabilisée en courant ou en tension). Cette différence de potentiel peut être con trôlée par un voltmètre 6 et ajustée à l'aide d'un dispositif adéquat tel qu'un rhéostat 7.La vitesse d'écoulement du liquide est réglée à une valeur telle que toute particule bactérienne puisse séjourner un temps suffisant à proximité immédiate de l'électrode 3 chargée positivement pour que, soumise à l'attraction de l'électrode, elle ait le temps de se déplacer à travers le liquide pour atteindre cette électrode et se trouver retenue à sa surface. Cette durée est fonction de la géométrie du dispositif, du potentiel électrique appliqué à l'électrode et de la charge électrique propre de la bactérie. Après passage de tout le volume d'échantillon, les bactéries qu'il contenait se trouveront en très grande partie, sinon totalement, fixées à l'électrode 3. Une méthode d'identification et de numération de bactéries spécifiques ayant un temps de réponse d'autant plus court que le nombre de bactéries est élevé peut alors être directement appliquée sur l'électrode métallique. A titre d'exemple, on peut appliquer la méthode électrochimique de Wilkins en introduisant dans la cellule le milieu de culture des bactéries coliformes ou E.coli et en thérmostatant cette cellule à une température respectivement de 37 ou 44qu, Dans ce cas, le matériau de l'électrode 3 peut être avantageusement choisi en platine et il suffira alors pour appliquer le procédé de Wilkins de suivre le potentiel pris spontanément par cette électrode par rapport à une électrode de référence 8 placée dans le milieu de culture, le dispositif imposant le potentiel entre les électrodes 3 et 4 étant alors mis hors circuit. Un essai a été effectué dans les conditions suivantes sur une eau très faiblement contaminée (2 Escherichia coli/100 ml) - diamètre de la cellule : 2,3 cm, - nature des électrodes 3 et 4 : grille de platine à ouverture de maille: de 250 microns, en double épaisseur, - distance entre ces électrodes o 1 cm, - différence de potentiel appliquée entre les électrodes 3 et 4 . 2 volts, - vitesse de passage : 240 cm3/cm2 de surface d 'électrode/heure, - température de thermostatisation pendant la phase de culture de la méthode de Wilkins : 440C. La durée de l'analyse effectuée en utilisant le procédé selon l'invention, puis en appliquant la méthode de Wilkins est de 11 heures. A titre de comparaison, la durée d'une analyse effectuée par la méthode du nombre le plus probable (méthode de la bactériologie classique) est de 96 heures et la durée de l'analyse effectuée par la méthode de Wilkins appliquée directement à l'échantillon est de 15 heures O m#nutes. On donnera ciraprès des variantes possibles de -céa3.isati.on et de fonctionnement a) Nature du matériau métallique constituant les électrodes On peut utiliser tous les métaux ou alliages non corrodables dans les conditions de fonctionnement, du graphite ou du carbone conducteur de l'électricité, ainsi lue tous les autres matériaux susceptibles de conduire le courant électrique ou d'acquérir le potentiel électrique désiré : matériaux minéraux ou organiques échan geurs d'ions, b) Forme du matériau constituant les électrodes A la place des grilles, on peut utiliser une feuille métallique perforée ou un empilement de grains (par exemple des sphères). c) Sens de circulation du fluide dans la cellule par rapport au système d'électrodes et au champ de la pesanteur L'écoulement peut être ascendant, descendant, i #élCl ou entre une combinaison de ces types d'écoule ent. d) Nature du dispositif créant le champ électrique entre électrodes ou imposant le potentiel électrique de l'électrode opérant la séparation et la rétention des bactéries En plus des générateurs électriques extérieurs, on peut utiliser deux électrodes constituées de métaux différents entre lesquelles s'établira spontanément une différence de potentiel électrique. e) Forme du signal électrique entre les électrodes Le courant peut avoir un potentiel ou une intensité constante au cours du temps. Mais, il peut également avoir un caractère discontinu se définissant par sa fréquence, la forme du signal (triangulaire, carré, sinusoidal, etc.) et son amplitude. f) Mode de réglage du potentiel entre électrodes: On peut utiliser un dispositif dtimpédance électrique réglable intercalé entre le générateur de courant et les électrodes. On peut également utiliser corme générateur de courant une alimentation électrique stabilisée en tension (réglable) ou en courant (réglable), ou un dispositif potentiostatique ou potentiocinétique réglant la tension de l'électrode en fonction de la tension d'une électrode de référence en agissant sur l'intensité du courant placé entre les deux élec troues. g) Possibilité d'utilisation des électrodes de la cellule pour réaliser ou faciliter les opérations de nettoyage et stérilisation de la cellule - par application entre les électrodes d'un potentiel électrique continu suffisant pour provoquer l'électrolyse de l'eau et nettoyer les électrodes par les effets mécaniques (génération de bulles gazeuses) et chimiques {production d'oxygène naissant à caractère oxydant et biocides, - ou encore par génération électrolytique in situ de réactifs stérilisants par passage d'une solution adéquate (par exemple génération de chlore par électrolyse d'une solution de chlorure de sodium). Le procédé selon l'invention présente les avantages suivants - Ce procédé permet de "concentrer" des bactéries à partir d'un volume d'eau pouvant être important (plusieurs litres ou dizaines de litres) comparativement aux échantillons habituellement traités, conduisant ~ à une réduction notable du temps de réponse de la méthode d'identification et de dénombrement des bactéries, ~ à une augmentation de la sensibilité de la méthode, une seule bactérie contenue dans plusieurs litres de liquide pouvant être détectée - Ce procédé peut être utilisé sur des eaux con tenant des particules en suspension et colloïdes sans risque de colmatage (contrairement aux membranes utilisées classiquement pour concentrer les bactéries par filtration ou couplées à des méthodes instrumentales plus performantes,par exemple la méthode de Wîlkins. Le nettoyage du dispositif est facile et ce qui ci peut être réutilisé rapidement. - En conséquence des trois points précédents, le dispositif est facilement automatisable pour travailler de façon séquentielle sans intervention humaine. - Le dispositif ainsi automatisé peut être luimême couplé à un dispositif automatique d'identification et de numération des bactéries. - Le dispositif n'est pas sélectif vis-à-vis des types de microorganîsmes ou germes pathogènes, la sélectivité étant assurée par la méthode d'identification et de numération, le dispositif est donc d'application générale. - Bien que, par nature, le-dispositif puisse être couplé à toute méthode d'identification et de nu aération des bactéries, sa conception le rend avantageusement cou:#lable aux méthodes électrochimiques (telle que par exemple celle de Wilkins) car l'électrode de fixation et rétention des bactéries peut alors devenir électrode active dans le processus d'identification et numération. Le procédé selon l'invention trouve des applications diverses a) Applications analytiques Ce procédé trouve une application en laboratoire pour la concentration des microorganismes (bactéries, mais aussi levures, champignons, algues microscopiques, éventuellement virus) préalablement à leur identification et leur numération par des méthodes diverses en vue de diminuer les temps de réponse, notamment dans les laboratoires d'analyse des eaux potables; pour le contrôle microbiologique de toutes les eaux naturelles (superficielles et souterraines, continentales et marines); pour le contrôle de denrées alimentaires liquides aqueuses (exemple: le lait); pour les analyses biologiques et médicales sur des fluides biologiques (sang, urine,...). il trouve également une application dans des systèmes automatises de contrôle de la contamination biologique des eaux en vue d'une détection précoce des contaminations et de la prévention-des risques sanitaires, notamment - le contrôle des systèmes de captage, traitement, stockage, distribution des eaux potables, ainsi que des chaînes de production et conditionnement de liquides alimentaires; - le contrôle sanitaire des eaux à usage thérapeutique; - le contrôle des piscines et installations de loisirs utilisant l'eau; - le contrôle de la qualité sanitaire des eaux de baignade (eaux douces et marines); - le contrôle et la protection des zones de pisciculture, conchyliculture, aquaculture et toutes zones sensibles à la contamination microbiologique; - le contrôle continu d'eaux industrielles. Selon les cas, ces systèmes peuvent fonctionner en continu ou de façon séquentielle à fréquence rapide. b) Autres applications L'invention peut également être utilisée, à une échelle beaucoup plus grande pour la purification microbiologique de liquides, principalement de nature aqueuse en adaptant la configuration du système à des débits importants (substitution d'une Invention dans la masse à une rétention en surface). Cette application est notamment intéressante lorsque l'usage ultérieur du liquide ne permet pas lead -#j.ticn de réactifs chimiques sterilisants ou l'usage de doyens thermiques (pasteurisation) REVENDICATIONS 1. procédé de séparation de bactéries d'une phase liquide, caractérisé en ce que l'on met en contact la phase liquide avec au moins une électrode maintenue à un potentiel avant une polarité opposée à la charge des bactéries à séparer, de façon à obtenir une fixation des bactéries sur l'électrode. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise une électrode perforée et on fait passer la phase liquide à travers ladite électrode perforée. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'électrode est constituée par une grille. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on fait passer la phase liquide verticalement à travers une cellule comportant deux électrodes superposées constituées par des grilles. 5. Dispositif de séparation des bactéries pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend une enceinte, une électrode perforée remplissant la section entière de cette enceinte et des moyens pour faire passer de manière contrôlée une phase liquide contenant des bactéries à travers ladite électrode. 6. Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend deux électrodes perforées superposées horizontalement et des moyens pour faire passer verticalement ladite phase liquide à travers les deux électrodes. 7. Dispositif selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que la ou les électrodes sont constituées par des grilles.