FR 2545100 A1 19841102 FR 8307148 A 19830429 "Procédé d'obtention de cultures d'hépatocytes humains, les cultures obtenus et leurs applications biologiques et biochimiques" L'invention a pour objet un procédé d'obtention de cultures d'hépatocytes humains, les cultures obtenues et leurs applicatibnsbiologiques et biochimiques. On sait que le foie constitue le siège de multiples fonctions. On conçoit donc l'intérêt de cultures d'hépatocytes humains, en particulier pour des études pharmacologiques concernant,par exemple, la toxicité, la caractérisation des voies métaboliques d'une nouvelle moléculepuen virologie pour l'étude par exemple de I'hépatite virale. A cet égard, il est important de pouvoir disposer de populations homogènes. De même, on mesurera l'intérêt de pouvoir disposer cultures de cellules normales ayant un caryotype normal. Or, les travaux, peu nombreux, effectues à ce jour sur les cultures de foie humain ont été réalisées le plus souvent à partir de fragments tissulaires, provenant principalement de foies pathologiques ou de lignées d'hépatomes et conduisant à des populations hétérogènes. Selon des techniques récentes, des hépatocytes viables ont été obtenus par perfusion enzymatique de fragments hépatiques provenant le plus souvent de foies subnormaux ou pathologiques. Cependant, les hépatocytes mis en suspension ne peuvent survivre plus de quelques heures et ne permettent donc pas des études de longue durée. En culture, on a pu constater que les hépatocytes de petits mammifères ne conservent un phénotype stable que durant quelques jours au plus. L'addition au milieu de culture de substances nutritives appropriées et l'utilisation de ~~~~~~~~ substrats organiques permettehtde prolonger la survie mais sans le maintien, quantitativement, des fonctions spécifiques du foie. Dans des travaux récents, les inventeurs ont obtenu une survie prolongée de cultures d'hépatocytes de rat, avec maintien de leur intégrité fonctionnelle pendant plusieurs semaines, en associant les hépatocytes de rat avec une cellule hépatique d'origine Probablement biliaire, de même espèce. L'état d'avancement des recherches des inventeurs dans ce domaine, qui ont par ailleurs mis au point un procédé d'isolement d'hépatocytes humains normaux en quantité importante, les a conduit à étudier de nouveaux moyens d'obtention de cultures d'hépatocytes humains répondant de manière plus satisfaisante aux exigences de la technique. I1 s'est ainsi avéré de manière surprenante que l'utilisation d'un environnement sné- cifiaue visà-àvis d'héDatocytes humains pouvait conférer à ces cultures dthépatocytes des propriétés nettement supérieures à celles obtenues jusqu'alors. L'invention a donc pour but de fournir un procédé de culture à long terme d'hépatocytes humains. Elle a également pour but de fournir des cultures d'hépatocytes humains capables de maintenir des fonctions hépatocytaiNes spécifiques à un niveau élevé. Elle vise également à fournir des cultures utilisables comme modèles pour l'étude des fonctions du foie dans des applications biologiques et biochimiques. Le procédé de culture d'hépatocytes humains de l'invention est caractérisé en ce qu'on associe, à une culture d'hépatocytes, des cellules d'origine hépatique, différentes des hé patocytes, du type de celles assurant in vivo des interactions cellulaires spécifiques avec les hépatocytes. Dans un tel système de co-culture, il s'avère que les cellules d'origine hépatique mises en oeuvre se multiplient et viennent en confluence avec les hépatocytes, assurant ainsi l'établissement de nombreux contacts entre les deux types de cellules. De manière inattendue compte-tenu des nombreux paramètres intervenant in vivo dans les relations intercellulaires, on constate qu'il résulte des interactions in vitro entre ces deux types de cellules, 'une survie prolongée des hépatocytes et un maintien à un niveau élevé de leurs fonctions spécifiques pendant cette survie. Ces résultats constituent un avantage considérable par rapport à l'état de la technique. On mesurera, en effet, l'intérêt d'une telle stabilité fonctionnelle à long terme, qui permet, en particulier d'apprécier les effets sur une longue période de médicaments, de carcinogènes potentiels et l'étude de diverses affections. Les cellules d'origine hépatique sont avantageusement choisies parmi t cellules coopérant in vivo avec les hépatocytes. Des cellules préférées de ce type sont constituées par des cellules de même nature que les hépatocytes, à savoir, des cellules épithéliales. Des cellules d'origine hépat;gD définies ci-dessus provienrent plus particulièrement de lignées obtenues à partir d'animaux, spécialement de petits mammifères rongeurs, notamment, compte-tenu de leur disponibilité aisée, de rat. Des cellules épithéliales de rat spécialement mises en oeuvre sont formées de cellules épithéliales telles que décrites par GUGUEN-GUILLOUZO et al dans S t-. Cell Research 143 (1983) 47-54. Ces cellules épithéliales sont probablement d'origine biliaire. On mesurera l'originalité de tels modèles de co-cultures de cellules provenant d'espèces différentes, On connait, en effet les nombreux problèmes de spécificités d'espèces et même de spécificités tissulaires rencontrés dans les systèmes de cultures. Or, conformément à l'invention, il s'avère que les hépatocytes humains, associés aux cellules hépatiques d'origine animale et plus spécialement,comme montré dans les exemples aux cellules hépatiques de rat, survivent au moins 6 à 8 semaines et maintiennent plusieurs fonctions différenciées telles que la sécrétion d'albumine et la conjugaison de médicaments. Selon une autre disposition de l'invention, après l'agrégation des deux types de cellules on ajoute dans le milieu de culture mis en oeuvre une hormone plus spécialement du type corticostéroide telle que l'hémisuccinate de l'hydrocortisone. Cette hormone a avantageusement pour effet de participer aux interac tions cellulaires. I1 en résulte une stabilisation des hépatocytes en culture, plus spécialementleurs fonctions spécifiques. Selon encore une autre disposition supplémentaire de l'invention, on sépare les hépatocytes des cocultures ainsi obtenues. A cet effet, on soumet les co-cultures à l'action d'une enzyme protéolytique d type de la collagènase, en l'absence de son co-facteur, le calcium. On opère avantageusement dans des conditions permettant une action lente de l'enzyme, en particulier, à une température de l'ordre de 37"C. Alors que de nombreux travaux ont montré les difficultés de séparation des différents types cellulaires dans une culture cellulaire hétérogène, l'invention fournit donc des moyens permettant de séparer sélectivement les hépatocytes dola co-culture. On dispos ainsi d'une population purifiée d'hépatocytes, stabilisée par la co-culture, de grand intérêt pour de nombreuses applications en biochimie et biologie moléculaire, en particulier, pour l'étude de l'expression des gènes. Apres lavage, les hépatocytes séparés des co-cultures peuvent être, soit congelés et conservés à moins-80 C environ pour utilisation ultérieure, soit réensemencés avec de nouvelles cellules hépatiques, ce qui augmente encore leur durée de vie. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, on ajoute les cellules d t origine hépatique aux hépatocytes après l'attachement de ces dernièrs -aux supports utilisés. Pour l'ensemencement des hépatocytes, on cpère avantageusement selon les conditions habituelles, en utilisant des supports en un matériau organique tel que du polystyrène. Les hépatocytes humains utilisés proviennent de foies adultes ou foetaux, normaux ou pathologiques, ce qui permet de disposer de plusieurs modèles pour des études en pharmacologie ou pathologie. I1 est également intéressant de noter qu'avec des hépa,to- cytes provenant de foies foetaux, on obtient au bout de quelques semaines de co-culture, une maturation du type de celle qui se produit in vivo, ce qui représente un moyen d'étude de la différenciation hépati- que. Les cellules d'origine hépatique mises en oeuvre sont avantageusement constituées comme indiqué cidessus par des cellules épithéliales de rat probablement d'origine biliaire. Pour des études concernant le métabolisme d'un foie normal, on a plus particulièrement recours à des cellules non transformées. Mais, on sait que ces cellules se transformetit spontanément au bout de plusieurs mois. Elles modifient alors le signal donné à l'hépatocyte pour le stabiliser. L'utilisation de telles cellules transformées présentent un intérêt comme modèle pour étudier des altérations très précoces notamment en hépatocarcinogénèse. Le milieu de culture renferme les substances nutritives utilisées généralement pour les cultures d 'hépatocytes. I1 apparaît, en outre, approprié d'y. incorporer de l'insuline porcine ce qui permet de favoriser l'expression des fonctions hépatocytaires. On utilise également avantageusement de l'albumine qui a pour effet, notamment de stabiliser les membranes ainsi que l'étalement des cellules qui s'adaptent mieux alors aux conditions de culture. Un autre additif convenant dans ces milieux de culture est constitué par du sérum de veau. Ce milieu est avantageusement renouvelé pendant la co-culture.En particulier, il est approprié de renouveller ce milieu, notammert tous les jours ou tous les deux jours. Ce milieu peut contenir du senm. Mais d'une manière avantageuse, on utilise un milieu ne renfermant pas de sérum, donc micux définiquant à sa composition et les effets qui en résultent. Dans ce milieu de culture utilisé, après la confluence des cellules hépatiques, on ajoute un corticostérolde. avantageusement de l'hémisuccinate d'hydrocortisone, en particulier å des doses de 7X10-5 M à 7 x 10-7 7 M correspondant à un intervalle déterminé par la toxicité qui pourrait apparaître vià- vis des cultures et de la concentration physiologique. Lorsqu'on désire isoler les hépatocytes de la co-culture, on soumet cette dernière à l'action de collagénase en l'absence de calcium. L'absence de ce cation est connue pour entraîner des modifications dans l'adhésivité et la forme de nombreux types cellulaires. les conditions mises en oeuvre dans l'inven- tion sont telles que son absence est sans effet uniquement sur les cellules épithéliales de rat. La collagénase ayant une activité réduite agit préférentiellement sur le collagène facilement accessible, c'est-à-dire sur le collagène localisé entre les deux types cellulaires, ce qui entraîne le détachement préférentiel des groupes d'hépatocytes. On réalise avantageusement cette étape en opérant une incubation de la co-culture préalablement lavée avec un tampon afin d'éliminer toute trace de calcium. On utilise environ une concentration de 0,020 à 0,030% de collagénase en solution tamponnée dépourvue d calcium et on maintient le milieu réactionnel à environ 37"C pendant 15mn. Les hépatocytes sont récupérés en soumettant le milieu à agitation mécanique puis centrifugation et sont avantageusement lavés pour éliminer l'enzyme. Dans un autre mode préféré de réalisation de l'invention, les cellules d'origine hépatique définies ci-dessus sont ajoutées aux populations pures d'hépatocytes après plusieurs jours de culture. Cette disposition permet de moduler les fonctions des hépatocytes, c'est-à-dire de réactiver les gènes. Il est ainsi possible de modifier l'activité observée avec une culture d'hépatocytes classique, où l'hépatocyte est en culture seul, par addition tardive de cellules épithéliales et de faire remonter, par exemple, la production d'albumine qui avait pratiquement complétement disparue. La co-culture est ensuite avantageusement poursuivie dans les conditions ci-dessus. L'invention vise également les co-cultures d'hépatocytes humains en tant que produits nouveaux. Ces co-cultures sont caractérssées par la présence de nombreuses fibres de réticuline dès 24 heures environ après la confluence des cellules d'origine hépatique. Elles sont également caractérisées par une stabilité fonctionnelle des hépatocytes, au regard de leurs fonctions spécifiques, d'au moins 6 à 8 semaines. Dans un mode préféré: de réalisation de l'invention, les co-cultures comprennent des hépatocytes humains en association avec des cellules hépatiques provenant de petits mammifères. I1 s'agit notamment de cellules hépatiques de petits mammifères rongeurs, en particulier,de rats. De telles cultures sont caractérisées par la présence d'un matériau extracellulaire autour des hépatocytes et entre les hépatocytes et les cellules hépatiques. I1 s'aqit d'un matériau hétérogène formé essentiellement de fibronectine et de collagènes. Dans les co-cultures comprenant des hépatocytes proovwenant de foies normaux le collagène précipite et forme des fibres réticulées comme in vivo (alors qu'il reste pratiquement totalement soluble dans le milieu dans le cas de cultures pures d'hépatocytes de l'art antérieur). Ce collagène est alors formé principalement de collaqène III et comprend en moindre quantité du collagène I, ce qu traduit un bon fonctionnement des cellules. Parallèlement, cesco-cultures sont caractérisées par le maintien à un niveau élevé de leurs fonctions hépatocytaires. En particulier, les cellules hépatocytaires de ces co-cultures sont capables de produire de l'albumine pendant au moins quatre semaines. La mise en évidence de cette production d'albumine par immunoperoxydase a permis de constater une polarité de l'albumine comme in vivo, c'est-à-dire une concentration des vésicules golgiennes contenant l'albumine vers un pôle de la cellule. L'étude de la oie de glucuronidation montre par ailleurs une activité de cette dernière pendant au moins 3 semaines. On observe, au contraire, dans le matériau extra-cellulaire une prédominance de collagène .1 et de faibles quantités de collagène III lorsque la secrétion d'albumine est elle-même diminuée au-delà notamment de 6 à 8 semaines de culture. Cette évolution peut refléter le comportement cc-nu in vivo de foies pathologiques. Le maintien à long terme des fonctions hépatocytaires spécifiques dans les hépatocytes humains cultivés en co-culture permet d'envisager de nombreuses applications biologiques et biochimiques. Les modèles constitués par ces co-cultures sont utilisables, notamment en cancérologie pour des tests de mutagén-ése et de cancérogénése; en pharmacologie pour des tests d'hépatotoxicité aigüe ou chronique des médicaments, de biotransformation hépatique d'une molécule nouvelle (au cours de la période de recherche et de développement d'un principe pharmacologiquement actif), également en biotechnologie pour la production de métabolites de-médicaments, de protéines plasmatiques humaines (en particulier l'albumine et les facteurs de coagulation), de facteurs de suppléance hépatique, utilisables en cas de grande insuffisance hépatique cellulaire, production d'antigènes viraux (en particulier ceux du virus de l'hépatite B). D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent et en se reportant aux figures 1 à 6. La figure la représente une photo au microscope optique (grossissement 120) montrant le matériau extracellulaire après coloration de réticuline (a), et les figures lb et lc, les photos obtenues par immunofluorescences après 22 jours de culture, montrant respectivement la fibronectine (lb) et le collagène III (lc), les figures 2a et 2b représentent des photos prises au microscope à contraste de phase, respectivement de cultures d'hépatocytes seuls et de co-cultures selon l'invention, - la figure 3 représente une photo prise au microscope électronique de co-cultures de l'invention montrant des fibres de collagène entre deux types cellulaires, - la figure 4 -représente une courbe de la variation de la concentration d'albumine en fonction du temps avec des cultures conventionnelles d'une part et avec des co-cultures de l'invention d'autre part, la figure 5 représente les formules du kétotifène et' de ses métabolites, et, - les figures 6a à 6c représentent des photos au microscope montrant respectivement des celles d'hépatocytes se détachant d'une coculture, des hépatocytes isolés et les plages laissées libres dans la co-culture après séparation des hépatocytes. EXEMPLE 1 - Procédé de co-culture d'hépatocytes humains et de cellules KépatiqLec de rat. On rapporte sous a) les moyens utilisés pour prélever les hépatocytes humains et sous b) les conditions mises en oeuvre pour la co-culture. a) prélèvement des hépatocytes. On opère au terme de binephrectomie pour transplantation rénale selon la technique décrite par GUGUEN GUILLOUZO et al dans Cell. Biol. Int. Rep. 1982, 6, 625-628 "High yield preparation of isolated human adult hepatocytes by enzymatic perfusion of the liver" Les hépatocytes humains sont obtenus à partir soit de fragments de tissu hépatique (5-10 g) soit d'une partie du foie entier (lobe gauches. Le tissu est dissocié par perfusion d'une solution de collagénase via la veine porte . Les hépatocytes fraîchement isolés présentent les caractéristiques d'ultrastructure des cellules du parenchyme in vivo. Le procédé d'isolement ci-dessus. n'entraîne aucune altération nucléairé ou cytoplasmique évidente. Le rendement cellulaire est de l'ordre de hépatocytes et la viabilité des cellules de l'ordre de 85%. Les hépatocytes isolés sont lavés et purifiés avant leur mise en culture. b) co-culture Les hépatocytes sont alors ensemencés dans des flacons de polystyrène comportant ou non un revêtement de fibronactine purifiée à partir de plasma humain. L'ensemencement est réalisé à raison de 0,5 x 106 cellules par ml de milieu de culture. On utilise un milieu HamF12 contenant 10 pg/ml d'insuline porcine, 0,2% d'albumine bovine et 10 de sérum de veau foetal. Environ 3 heures plus tard, le temps nécessaire pour des hépatocytes au substrat, le milieu nutritif est enlevé et remplacé par un milieu nutritif identique frais contenant 0,8 x 106 cellules épithéliales hépaIqjes de rat par ml.Ces cellules proviennent de lignées obtenues par dissociation à l'aide d'une solution de trypsine de foie de rat âgé de 10 jours.Elles sont utilisées avant leur transformation spontanée in vitro, facilement reconnaissable selon divers critères comme rapporté par MOREL-CHANY E. et al dans "Spontaneous neoplastic transformation in vitro of epithelial cell strains of rat liver : cytology, growth and enzymatic activities." Europ.3. Cancer, 1978, 14 1341-1352. Au cours des heures suivantes, les hépatocytes s'étalent pour constituer des travées de cellules épithéliales granulaires. Les cellules épithéliales hépatiques de rat prolifèrent et occupent rapidement tous les espaces libres. Après 24-30 h. une confluence cellulaire est atteinte. Le milieu nutritif est renouvelé tous les jours ou tous les 2 jours. Lorsque la confluence cellulaire est atteinte, on ajoute"dans ce milieu 3,6 xlO M d'hémisuccinate d'hydrocortisone. A partir de ce moment la présence de sérum n'est pas nécessaire. Dans ces conditions, les hépatocytes survivent sans perte cellulaire --------------- évidente pendant au moins 6 à 8 semaines avec maintien à un niveau élevé de diverses fonctions spécifiques. On n'observe ni prolifération évidente d'hépatocytes ou de cellules épithéliales de rat, ni détachement d'un nombre significatif d'hépatocytes. On remarque, par étude au microscope électronique, la production d'un matériel extracellulaire important Ce matériel comporte de nombreuses fibres qui apparaissent dès 24 h. après la confluence cellulaire et sont localisées entre les deux populations cellulaireS et entre les hépatocytes. On note également la présence en quantité importante de fibronectine et de collagène. de type III. En revanche, on n'observe que de faibles quantités de collagène de type I autour des hépatocytes. On trouve également du collagène de type IV et de la laminine. La figure 1 correspond à une photo prise au microscope optique (grossissement 120) sur laquelle apparaît le matériau extracellulaire en question après coloration de réticuline au bout de 6 jours de culture (a) et. où sont localisés de la fibronectine (b) et du collagène de type III (c) par immunofluorescence indirecte après 22 jours de culture. EXEMPLE COMPARATIF lA : culture d'hépatocytes humains selon selon une technique convention nelle. On recouvre des flacons de polystyrène comportant ou non un revêtement de fibronectine purifiée à partir de plasma humain à l'aide d'hépatocytes prélevés comme indiqué dans l'exemple 1. L'ensemencement est effectué à raison de 2 x 106 cellules par flacon dans 3mî du milieu de culture utilisé également pour l'ensemencement ci-dessus mais dans lequel on ajoute 5 xl05 M d'hémisuccinate d'hydrocortisone. Ce milieu est renouvellé 4 h après l'ensemencement, puis chaque jour. L'étude au microscope électronique ne revèle que peu de fibres réticulaires entre les cellules. EXEMPLE 2 : Comparaison entre les caractéristiques morphologiques et les activités fonction nelles des hépatocytes en co-culture (selon l'exemple l)-ou en culture convén tionnelle (selon l'exemple comparatif 1A) . caractéristiques morphologiques En utilisant les conditions de culture habituelle on observe un étalement rapidedes hépatocytes, en particulier lorsqu'on utilise des flacons recouverts de fibronectine Comme le montre la figure 2a, il se forme des mono-couches de cellules épithéliales granulaires avec des espaces intercellulaires réfringents correspondant- à des structures du type des canaliculesbiliaires. Cette figure correspond à une photo prise après 4 jours de culture, à un grossissement de 290 avec un microscope à contraste de phase. La survie de ces- cellules n'excède pas 2 à 3 semaines. L'examen de ces cellules au niveau de leur ultrastructure montre, après quelques jours, une diminution progressive des particules de glycogène etdu réticulum endoplasmique. granulaire accompagnée d'une augmentation rapide des éléments du, cytosquelette en particulier sous la membrane plasmatique. Au contraire, comme le montre l'examen de la figure 2b, les hépatocytes obtenus selon le procédé de co-culture de l'invention sont moins étalés que dans le cas des cultures'classiques Cette figure 2b correspond à une photo de cultures âgées de 10 jours prise au microscope à contraste de phase (grossissement 200). L'examen de cette photo permet d'observerdes structures du type canalicules biliaires. On remarque que les particules de glycogène restent abon dantes et les complexes GOLGI sont localisés près des structures du type des canaux biliaires. La photo représentée sur la figure 3, prise au microscope électronique après 30 jours de culture (grossissement 31 000),permet d'observer de nombreux contacts entre les deux populations cellulaires et des structures filamenteuses comprenant des fibres typiques de collagène apparaissant dans les espaces intracellulaires (voir flèche). . Activités fonctionnelles : secrétion d'albumine . On a étudié la secrétion d'albumine en fonction du temps avec des hépatocytes de cultures classiques (H) et des hépatocytes en coculture (HC) en milieu sans sérum. Sur la figure 4, on a rapporté les résultats, respectivement obtenus correspondant à la moyenne de deux expériences Les courbes correspondent respectivement à l'utilisation de HC et de H en l'absence de sérum de veau. Avec des conditions de culture habituelle, on constate une augmentation de la secrétion d'albumine en fonction du temps durant les 8 premiers jours, suivie. d'une diminution. Dans le cas des co-cultures, la vitesse de secrétion d'albumine s'avère plus élevai et reste à un niveau élevé pendant plusieurs semaines, même en l'absence de sérum. En utilisant la technique de l'immunoperoxydase,,on met en évidence une production d'albumine par la plupart des hépatocytes durant a'u moins'lesqùatre premiere semaines de culture. modulation de la production d'albumine On utilise des cultures d'hépatocytes humains seuls en présence ou en l'absence de sérum de veau foetal. Au bout de quatre jours de cultures, la production d'albumine est très faible, voire pratiquement nulle. En ajoutant des cellules épithéliales hépatiques de rat conformément à l'invention, on note une reprise de la production d'albumine qui atteint alors un niveau élevé. L'utilisation de co-cultures de l'invention permet donc de réactiver les fonctions spécifiques des hépatocytes. biotransformation du kétotifène Le kétotifène commercialisé sous la marque ZADITEN par les laboratoires SANDOZ est un médi cament administré par voie orale à action anaphylac tique. Ce médicament a été choisi pour cette étude en raison de sa métabolisation selon différentes.voies typiques comme décrit par M. GUERRET et al dans .Proceedings 1 st Eur. Cong. Biopharm. Clermont-Ferrand, Vol. I, p 317, Tehn. et Doc. (1981). L'étude de cette biotransformation (qui sera rapportée plus en détail dans l'exemple 3 suivant) montre que la voie de glucuronidation reste le plus active pendant au moins 3 semaines avec des hépatocytes en co-cultures alors qu'elle disparaît après 4 jours avec des cultures d'hépatocytes convéntionnelles. EXEMPLE 3 : - application des cultures d'hépatocytes tocytes humains adultes comme moWele pour l'étude du métabolisme de médi caments. Chez I'homme, le kétotifène est biotransformé selon plusieurs voies métaboliques, subissant une N-déméthylation, une N-oxydation, une N-glucuroconjugaison conduisant à un dérivé d'ammonium quaternaire et à une réduction du groupe céto suivie d'une O-glucuronidation. Cette biotransformation est décrite dans l'article de GUERET et al cité plus haut. Sur la figure 6, on a rapporté les formules du kétotifène et des métabolites obtenus. Ces formules portent les N" 1 à 6 et correspondent respectivement : 1) au kétotifène, 2) au kétotifène réduit, 3) au N-glucurokétotifène, 4) au nor kétotifène, 5) au nor-kétotifène réduit et 6) au kétotifène oxydé. A différents intervalles de temps après l'ensemencement des cellules, entre 24 h et 3 semaines, on incube les hépatocytes adultes d'une cul ture réalisée selon l'exemple 1 avec 3 Culg/ml de kétotifène - 14C ayant une activité spécifique de 107 Ci/mg et 20 yg/ml de médicament non marqué par 25 cm de flacon. On ne note aucune toxicité à cette concentration en médicament de 23 yg/ml de milieu. Quatre heures ou 24 heures après l'addition de médicament, on recueille des quantités aliquotes: de milieu qu'on congèle rapidement et qu'on stocke à -20 C jusqu'à analyse. Les métabolites du kétotifène sont analysés par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) à phase inversée. Leur structure est confirmée par spectrométrie de masse. La détection limite de radioactivité est de 400 dpm ce qui correspond à 0,13 ng del4C-kétotifène. Les temps de rétention des métabolites qui sont semblables dans les deux expériences sont comparés avec ceux obtenus avec des composés de synthèse. On recueille les métabolites aux fins d'étude par spectrométrie de masse. De même, on analyse des médicaments analogues et leurs métabolites avant ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ et après incubation deB -glucuronidase. Les expériences réalisées ont montré que quelque soit le temps de culture, on ne détecte pas de glucuronides du kétotifène avant 8 heures suivant l'addition de médicament. Entre 4 et 28 h après l'ensemencement des cellules incubées avec le kétotifène, on obtient, comme représenté sur la figure 5, les métabolites suivant dans le milieu de culture, à savoir - du nor-kétotifène : ce produit possède le temps de rétention le plus long en HP.C (74 mn) et donne union moléculaire caractéristique à m/e 295 en GLC-MS - des traces de kétotifène N-oxyde qui se décompose à l'analyse GLC-MS donnant le médica- ment non modifié, - du kétotifene réduit constituant le principal métabolite : ce produit | possède en HPLC un temps de rétention identique à celui du composé de synthèse de référence obtenu par réduction de kétotifène avec du borohydrure de sodium.A l'analyse GLC-MC, les ions moléculaires et autres caractéristiques ioniques sont observés à m/ê 311 et m/e 291 respectivement - du nor-kétotifène réduit donnant en GLC-MS un ion de fragment caractéristiqueà m,é 279 (M±18 (H2O) > ; - des glucuronides à la fois du médicament non modifié (N-glucuro-kétotifène) et de kétotifène réduit, obtenus également en quantités importantes entre 20 et 25 mn en HPLC. Ces produits conduisent à du kétotifène et à son dérivé réduit libre après incubation avec de la ii-glucuronidase. On trouve également de faibles quantités de glucuronide de nor-kétotifène réduit. Ces différents métobolites correspondent aux quatre voies métaboliques trouvées in vivo, à savoir la N-déméthylation, la N-oxydation et principalement la cétoréduction et la N-glucuronidation. Ces deux dernières voies sont utilisées afin de déterminer l'activité métabolique de cellules cultivées seules ou enassociation avec des cellules épithéliales de foie durant 24 h. ou plus. Après incubation de 4 h. de kétotifène et d'hépatocytes humains de culture, la vitesse du métabolisme apparaît faiblement modifie les 7 premiers jours dans les deux cas. Avec des hépatocytes de co-cultures, la métabolisation du kétotifène s'effectue de manière plus active. Durée de KETOTIFENE KETOTIFENE METABOLISE RAPPORT C/R + G CELLULES CULTURE non REDUIT N-GLUCURONIDE ( jours) modifié (R) (G) a b A b a b b HCPATOCYTES 0.17 67 25 33 48 0 25 0.34 " 1 68 16 32 56 0 28 0.33 " 4 63 13 37 61 0 26 0.30 " 6 93 50 7 50 0 0 0.00 HEPATUCYTES + cellules 4 58 13 42 43 0 44 0.51 épithéliales de foie " 7 51 6 49 29 0 65 0.69 " 21 83 29 17 29 0 12 0.17 Cellules épithéliales 100 100 0 0 0 0 de foie La vitesse du métabolisme se réduit considérablement avec des cultures plus âgées. Elle apparaît cependant beaucoup plus élevée au 21ème jour de co-culture qu'au 6ème jourde. culture conventionnelle. Le tableau ci-dessous comporte les résultats relatifs aux pourcentages respectifs de kétotifène non modifié, de kétotifène réduit et de kétotifène de N-glucuronide obtenus 4 h et 24 h après l'addition de médicament. Les valeurs indiquées correspondent à la moyenne de deux essais. Comme le montre l'examen de ce tableau, avec les cultures conventionnelles, le rapport du nombre de métabolite. glucuronide au nombre de métabolite5 totaux(métabolites réduits et N- glucuronide) est de 0,34 à 0,30 les 4 premiers jours. Le 6ème jour, on ne note plus d'activité de glucuronidation alors qu'on observe encore une réduction. Avec les co-cultures, le kétotifène est activement métabolisé durant la période étudiée de 21 jours. Au 7ème jour, le rapport métabolite de glucuronide: métabolites totaux est de 0,69 et au 21ème jour, ce rapport est encore de 0,17. A ce moment là , le pourcentage de réduc tion de kétotifène total est identique à celui trouvé dans des cultures conventionnelles après 24 h. Durant les 21 jours de co-culture on détecte du nor-kétotifène. Dans les cultures de cellules épithéliales utilisées comme contrôle, on ne détecte aucune biotransformation en kétotifene. Exemple 4 - Production d'antizènes viraux Des cultures d'hépatocytes humains normaux ont été infestées expérimentalement par le virus B de lthépatite. Une fois infectés, on a montré la production des antigènes viraux Hb et Hbe caractéristiques du virus. L'étude réalisée a également montré le maintien à long terme, i taux plus élevé que dans les cultures infestées de l'art antérieur, de la production de ces antigènes pendant au moins trois semaines. La production maintenue de Hbe montre une réplication du virus. Les co-cultures d'hépatocytes humains de l'invention fournissent donc des modèles précieux notamment pour l'étu- de des facteurs impliqués dans la reconnaissance par le virus de la cellule cible. Selon un autre aspect, elles constituent également des moyens de grand inérêt pour l'obtention d'antigènes viraux et d'anticorps spécifiques en quantité élevée. Exemple 5 : Séparation des hépatocytes d'une co-culture d'hépatocytes humains et de cellules épithé liales de rat On soumet une co-culture du type de l'exemple 1 à deux lavages successifs afin d'éliminer toute trace de calcium du milieu de cultures On utilise une solution saline du type PBS (tampon phosphate borate sodique), dépourvue de calcium et de magnésium. pendant 15 mp On opère une incubation à 370C/de la co-culture avec une solution aqueuse de collagénase préparée en concentration de 0,025 % dans une solution tampon elle-mme dépourvue de calcium. On soumet la co-culture à une agitation mécanique pour décoller les hépatocytes. On recueille ceux-ci par centrifugation, puis on les met en suspension et on les lave pour éliminer la collagénas. pour de nouvelles cultures Les hépatocytes isolés sont immédiatement utilisés/ou congelés pour conservation. Sur les figures 6a à 6 c , on a représente respectivement les populations d'hépatocytes se détachant sous l'action de la collagénase de la co-culture (6a), les populations séparées (6b) et la culture restante avec les plages laissées libres par l'enlèvement des hépatocytes (6c). REVENDICATIONS 1.- Procédé de culture d'hépatocytes humans, caractérisé en ce qu'on associe, à une culture d'hépatocytes, des cellules d'origine hépatique, différentes des hépatocytes, du type de celles assurant in vivo des interactions cellulaires spécifiques avec les hépatocytes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules d'origine hépatique sont des cellules hépatiques épithéliales. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les cellules hépatiques proviennent des lignées obtenues à partir d'animaux. 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les lignées de cellules sont obtenues à partir de petits mammifères rongeurs, notamment, à partir de rats. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on ajoute dans le milieu de culture une hormone de type corticostéroide, telle que llhémisuccinate dthydrocorti- sone, avantageusement après agrégation des deux types de cellules. 6. Procédé-selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, pendant la co-culture on utilise un milieu de culture renfermant de 7 X 10-5M à 7 X 10 X -7M environ d ' hémîsuccinate d'hydrocortisone. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on utilise pendant la co-culture un milieu sans sérum. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le milieu de culture, renferme de l'insuline porcine ainsi qu'avantageusement de l'albumine bovine et lons de l'ensemencement des hépatocytes du sérum tel que du sérum foetal de veau. 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par l'étape supplémentaire de séparation des hépatocytes de la co-culture par action d'une enzyme protéolytique du type de la collagénase dans un milieu dépourvu de calcium, dans des conditions permettant une action lente de la collagénase, spécifique vis-à-vis des populations d'hépatocytes puis qu'on soumet la co-culture à un traitement mécanique pour récupérer les hépatocytes. 10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on opère l'incubation de la co-culture avec la cdlagénase à environ 37 C pendant environ 15 mn, à une concentration d'environ 0,020 à 0,030% en solution tamponnée dépourvue de calcium. 11.- Procédé selon l'uns quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les cellules d'origine hépatique sont ajoutées à la culture d'hépatocytesdès l'agrégation de ces derniers. 12.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les cellules d'origine hépatique sont ajoutées aux populations pures d'hépatocytes après plusieurs jours de culture, ce qui permet de moduler les fonctions des hépatocytes. 13.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que les hépatocytes humains proviennent de foies normaux ou pathologiques, adultes ou foetaux. 14.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cellules épithéliales d'origine hépatique sont des cellules transformées ou non transformées. 15.- Co-cultures d'hépatocytes humains, caractérisées en ce qu'elles comprennent en association des hépatocytes humains et des cellules d'origine hépatique tels que définis dans lune quelconque des revendications-l à 4, 13 ou 14 16.- Co-cultures selon la revendication 15, caractérisées par la présence de nombreuses fibres de réticuline dès 24 heures environ après la confluence des cellules d'origine hépatique. 17.- Co-cultures selon la revendicationîS ou 16, caractérisées oar une stabilité fonctionnelle des hépatocytes, au regard de leurs fonctions spécifiques, d'au moins 6 à 8 semaines. 18.- Co-cultures selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisées en ce que les cellules d'origine hépatique sont des cellules épithéliales de petits mammifères rongeurs, en particulier de rats et que les co-cultures résultantes comportent un matériau extracellulaire autour des hépatocytes et entre les hépatocytes et les cellules hépatiques, ce matériau étant hétérogène et formé essentiellement de fibronectine et de collagène. 19.- Co-cultures selon la revendication 18, caractérisées en ce,que dans les co-cultures comprenant des hépatocytes provenant de foies normaux, le collagène est formé principalement de collagène III et comprend en moindre quantité du collagène I, et que parallèlement les fonctions hépatocytaires sont maintenues à un niveau élevé et que lorsque la secrétion d'albumine est elle-même diminuée, le matériau extra-cellulaire comporte une majeure partie de collagène I et de faible quantités de collagène III. 20.- Utilisations- biologiques et biochimiques des co-cultures selon l'une quelconque des revendications 15 à 19 et des hépatocytes séparés de ces co-cultures, en particulier comme modèles pour l'étude des fonctions hépatocytaires en pharmacologie et en pathologie.