FR 2550802 A1 19850222 FR 8313399 A 19830817 Procédé de Sroduction d'interleukine 1 humaine et médicaments cor r pond an t s. L'invention a pour objet un procédé de production d'interleukine 1 humaine ; elle vise également les médicaments ou compositions médicamenteuses dont la substance active comporte de l'interleukine 1 humaine. L'interleukine 1 humaine est une hormone protéique d'importance fondamentale dans le déclenchement de le réponse immunitaire ; son poids moléculaire est voisin de 20.000 à 25.030 et elle est représentée par trois formes biochimiques dont les points isoélectriques se situent respectivement à des pH d'environ 5,7, 6,6 et 7. Ltinterleukine 1 constitue l'un des deux signaux --l'autre étant apporté par l'antigene ou le mitogène-qui déclenchent la sécrétion, par les lymphocytes T, de t'interleukine 2 qui amplifie la phase effectrice de l'immunité en provoquant la multiplication des lymphocytes T Helper et T cytotoxiques. On sait produire l'interleukine 1 humaine en in disant sa sécrétion par les macrophages/monocytes (ciaprès on retiendra le terme monocytes) normaux du sang périphérique en ayant recours en tant qu'inducteur au muramyl dipeptide. Les principaux inconvénients de ce procédé connu sont notamment celui d'être d'un rendement faible et celui de conduire å un produit relativement impur ; en effet, ce procédé implique le recours à de multiples donneurs de sang et sous-entensl le recours a' des procédés complexes de séparation des monocytes ; il conduit à des surnageants contenant non seulement de l'interleukine 1 mais également de l'interleukine 2 et d'autres facteurs tels que l'interféron, le BFD (ou B cellgrowth factor) et le CSF (ou colony stimulqting factor). L'invention a donc pour but, surtout, de remé dier à ces inconvénients et de fournir des moyens propres à permettre la fabrication d'interleukine 1 humaine la plus pure possible et en des quantités permettant d'envisager son application en tant que médicament. Or, les Inventeurs ont eu le mérite de trouver qu'il était possible d'induire, de façon inattendue, la sécrétion d' interleukine 1 très pure, c'est-à-dire non accompagnée des facteurs énumérés ci-dessus, à partir de lignées leucémiques humaines, lymphomateuses, d'origine hématopoiétique et lymphoïde, qui ne secrétent normalement pas l'interleukine 1, ces lignées étant établies en culture continue, de préférence en milieu liquide ; ces lignées comprennent notamment celles identifiées par les codes HL-60 et K562 ; l'inducteur est un agent du groupe comprenant, d'une part, ceux qui possèdent les propriétés d'induction de la différentiation cellulaire, notamment les phorbols et les phorbol-esters, en particulier le l2-O-tétra-docaroyl-phcrbol13-acétate (ou TPA) et, d'autre part, ceux appartenant à d'autres familles telles que celle de la téléocydine. Il s'ensuit que le procédé conforme à l'invention de production d'interleukine 1 humaine est caractérisé par le fait que, successivement, - on établit en phase liquide une concentration efficace, c'est-à-dire suffisante pour obtenir une production d'interleukine industriellement exploitable, en cellules appartenant à au moins l'une des lignées leucémiques humaines définies ci-dessus, - on induit la sécrétion d'interleukine 1 par les cellules en question en introduisant dans le milieu une quantité efficace, c'est-à-dire suffisante pour dB- clencher la secrétion d'interleukine, en au moins un inducteur choisi dans le groupe également défini ci-dessus, - on maintient pendant un laps de temps suffisant, c'est-à-dire tel que la quantité dtinterleukine 1 produite permette d'envisager une exploitation industrielle, les conditions nécessaires à la sécrétion d'i-nterleukine 1, - on sépare l'interleukine 1 du milieu, c'està-dire de la phase liquide, et - éventuellement, on la purifie et on la conditionne en vue de son utilisation future, Dans un mode de réalisation avantageux du susdit procédé, la phase liquide est constituée par le milieu de culture dans lequel sont normalement propagées les cellules de la lignée leucémique humaine sélectionnée ce milieu peut comprendre environ 10 y de sérum de veau foetal et environ 90 S de la composition désignée par le code RPMI-1640 et dont les constituants sont indiqués dans la publication "In vitro" 9,6 (1974). Dans un autre mode de réalisation avantageux du susdit procédé, la lignée sélectionnée est celle connue sous le code HL-60 et la concentration de la phase liquide en cellules constitutives de cette lignée est de à à 108 eellules/ml; de préférence voisine de 4.106 cellules par ml de phase liquide. Dans un autre mode de réalisation avantageux du susdit procédé, la lignée sélectionnée est celle connue sous le code K562 et la concentration de la phase liquide en cellules constitutives de cette lignée est de lû5 à 108 cellules/ml, de préférence voisine de 3.106 cellules par ml de phase liquide. Dans un autre mode de réalisation avantageux du susdit procédé, la concentration de la phase liquide en inducteur constitué par le TPA est de 1 ng à 100 og/ml, de préférence de 0,5 à 2 pgiml de phase liquide. Dans un autre mode de Irealisation avantageux du susdit procédé, la température de la phase liquide est de 34 à 380 C, de préférence de 370C et le milieu ainsi défini est maintenu aux conations en question de secrétion d'interleukine 1 pendait une durée suffisante pour que sa concentration en interleukine 1 atteigne une valeur palier à partir de laquelle elle n'augmente pratiquement plus, cette durée étant avantageusement de 2 à 10, de préférence de 3 .l 5 jours. Dans un autre mode de réalisation avantageux du susdit procédé, le milieu do culture contenant I' inter- leukine 1 humaine formée est- traité par un procédé de concentration, de préférence précipitation au sulfate d'ammonium, centrifugation et remise en solution dans le minimum de volume d'eau distillée. Dans un autre mode de réalisation avantageux du susdit procédé, on sépare l'interleukîne 1 humaine formée en soumettant la phase liquide concentrée à une chromatographie en phase solide, de préférence sur colonne du type Ultragel AcA 54 (IBF, France), l'éluant étant choi-si dans le groupe comprenant les tampons salins, de préférence NaCl 0,5 I1, phosphate de sodium pH 7,2 additionné d'une molécule stabilisante, de préférence polyéthylène glycol 60(10 (MERCK). Dans un autre mode de réalisation avantageux du susdit procédé, on purifie l'interleukine 1 séparée de la phase liquide contenant les cellules, en. ayant recours à une immunoabsorption spécifique par anticorps mettant en cause les enseignements généraux des techniques d'immunoabsorption par anticorps ; ces enseignements généraux sont. décrits en rapport avec d'autres produits biologiques, dont l'interleukine 2 et les interférons, dans Robb et al. lmmunobiology 161:21 (1982). L'invention vise églement l'extraction à partir des susdites lignées de 1''ERN messager codant pour la molécule d'interleukine 1, a fabrication d'un cADN à partir de cet ARN messager r l'introduction par mise en oeuvre des techniques du géie génétique de ce cADN dans un microorganisme approprié, puis la fabrication de l'interleukine 1 par extraction à partir du surnageant recueilli à l'issue de tout procédé comportant la culture dudit microorganisme. D'autres caractéristiques du procédé conforme à l'invention de production dtinterleukine 1 humaine apparaissent dans la suite de la description. Pour illustrer les indications qui précèdent, on décrit un ensemble d'essais qui ont permis la mise au point des susdites conditions préparatoires, les lignées étudiées dans le cadre de ces essais étant les lignées K562 et HL-60. Ces lignées K562 et HL-60 sont conservées sous ces noms au C.I.R.C. (O.M.S.) à Lyon. Parallèlement et à titre de référence, on conduit une expérience de préparation d'interleukine 1 humaine par le procédé connu à partir de monocytes de sang périphérique. Dans une première série d'expériences, on étudie pour la lignée HL-60, - l'influence de la concentration de la phase liquide contenant les cellules en inducteur, en l'occur rence le tPA, - l'influence de la durée de l'expérience pour une température de la phase liquide dont l'optimum se situe entre 36 et 380C et - l'influence de la concentration de la phase liquide en cellules de la lignée HL-60. On réalise trois expériences pour l'étude de l'influence de chacun de ces paramètres. La phase liquide dans laquelle se trouvent les cellules de la lignée HL-60 est constituée par la composition RPt-1I 1640 susdéfinie, additionnée d'antibiotiques, de L-glutamine et 1n 10 m sérum de veau foetal (svF). Les expériences sont effectues dans des étuves de préférence thermostatéer et les quantités de phase liquide utilisées dans chaque expérience sont de 5-10 ml par point de l'expérience. L'apparition des molécules portant l'activité d'interleukine 1 dans la phase liquide et l'augmentation de la concentration de ces molécules est suivie par titration de parties aliquotes de la phase liquide, ces parties aliquotes étant prlzlevees à intervalles de 24 heures, puis soumises au test dit "Costimulator assay" décrit en détail par t4ELTZER M.S. et OPPENHEIM J.J. dans J. Immunol. 118, pages 77-82 (1977). Dans le cadre de ce test, des thymocytes de souris, placés à une concentration de 1,5 x 107 cellules/ml dans un milieu constitué par la composition RPMI 1640 et 1 y de sérum de veau foetal, sont mis en présence d'une dose suboptimale (c'est-à-dire à une dose quarante fois inférieure à la dose optimale, elle-même égale à 100 pg/ml de milieu) de phytohémagglutinine-A ou PHA ; dans ces conditions, les thymocytes en question sont incapables de se multiplier. Par contre, l'addition d'interleukine 1 induit leur prolifération. La mesure de la prolifération des thymocytes traduit donc l'intensité de l'activité d'interleukine 1 de la phase liquide, par exemple du milieu de culture contenant la lignée étudiée. En vue de cette mesure, chaque partie aliquote prélevée de la phase liquide est donc introduite dans un volume connu du milieu contenant les thymocytes en présence de PHA. La mesure proprement dite de la prolifération est effectuée 48 heures plus tard par l'incorporation d'une quantité de 0,1 à 50 urbi, de préférence de 0,5 à 2 pCi de thymidine tritiée qui est normalement incorporée par le D.N.A. ; la valeur ainsi déterminée de l'activité en interleukine 1 à un mament donné de la phase liquide contenant les cellules de la lignée étudiée est exprimée en coups par minuit' (c.p.m.). Un deuxième ensemtie d'expériences identiques est réalisé en remplaçant J Les résultas des mures ainsi effectuées sont réunis dans les tableaux suivants I, II et III, illus t rés respectivement par les graphiques des figures 1, 2 et 3. TABLEAU I Variation de l'activité dtinterleukine 1 de la phase liquide en fonction de sa concentration en TPA Concentration Activité d'interleukine 1 (en c.p.m.) en TPA de la phase liquide contenant en ng/ml des cellules des cellules de HL-60 de 1 1 O 0 10 0 1 200 100 20 000 25 000 1 000 50 000 58 000 Sur le graphique de la figure 1, la variation de l'activité d'interleukine 1 en fonction de la concentration en TPA est représentée pour la lignée HL-60 par la courbe A, pour la lignée K562 par la courbe B. I1 résulte du tableau I et du graphique correspondant de la figure 1 que la concentration optimale en TPA est voisine de 1 Ig/ml. TABLEAU Il Variation de l'activité d'interleukine 1 de la phase liquide an fonction de la durée de l'expérience exprimée en jours Durée de Activité d'interleukine 1 (en c.p.m.) l'expérience de la phase liquide contenant en jours des cellules des cellules N N de HL-60 de K562 1 2-' 000 32 000 2 23 000 40 000 3 30 000 56 000 4 36 000 66 000 5 35 000 62 000 6 31 000 60 000 Sur le graphique de la figure 2, la variation de l'activité d'interleukine 1 en fonction de la durée de l'expérience est représenté par la courbe C pour la lignée HL-60 et par la courbe D pour la lignée K562. Il résulte de ce tableau II et du graphique cor respondant de la figure 2 qu'il n'y a pas d'intérêt à poursuivre l'expérience apr-s 4 jours ; l'activité décroît dès le cinquième jour. TABLE;\U III Variation de l'activité d'interleukine 1 du milieu de culture en fonction de la concentration en cellules leucémiques exprimée en trillions de cellules/ml de milieu Concentration m Activité d'interleukine 1 (en c.p.m.) en cellules de la tase liquide contenant des cellules des -cellules x106 ml de HL-60 de K562 0.1 20 000 9 000 0.5 29 000 18 000 1 28 O0o 22 000 2 36 000 43 000 3 ~ 49 000 64 000 - 4 . 62 000 56 000 5 63 000 1 51 000 Sur le graphique de la figure 3, la variation de l'activité d'interleukine 1 en fonction de la concentration en cellules productrices dans le milieu est représentée par la courbe E pour la lignée HL-60 et par la courbe F pour la lignée K562. Il résulte de ce tableau III et du graphique correspondant de la figure 3 que la concentration optimale se situe vers 3.106 c-llules/ml de milieu pour la lignée K562 et vers 4.106 cellules/ml pour la lignée HL-60. Pour identifier les molécules portant l'activité interleukine 1 produites pal les lignées K562 et HL-6û, on les compare à l'interleukine secrétée par les monocytes activés par le muramyl tipeptide. Les monocytes sont extraits du sang par les techniques décrites dans CHOUAIB et al.; Journal of Immunology (1982) 129:2463 et mis en suspension à la concentration de 106 cellules/ml dans un milieu constitué par la composition RPMI 1640 et 1 % SVF ; on introduit dans ce milieu du muramyl dipeptide à une concentration de 10 Pg!ml et on maintient l'ensemble à une température de 370C pendant 48 heures. Pnrallèlement, on conduit respectivement pour les lignées HL-60 et K562 : - une expérience de production d'interleukine 1 à partir de cellules de la lignée HL-60 mises en suspension à la concentration de 4.106 cellules par ml de la phase liquide définie plus haut et on maintient cette suspension à 370C pendant 4 jours en présence de 1 pg de TPA par ml, - une expérience de production d'interleukine 1 à partir de cellules de la lignée K562 mises en suspension à la concentration de 3.106 cellules par ml de la phase liquide définie plus haut et on maintient cette suspension à 370C pendant 4 jours en présence de 1 pg de TPA par ml. On élimine, par exemple par centrifugation, respectivement les monocytes ou cellules des lignées étu diées, on concentre les trois surnageants ainsi recueillis par précipitation au sulfate d'ammonium et on isole les molécules d'interleukine 1 par chromatographie sur colonne de AcA 54 (IBF, rance) ; l'éluant utilisé est le phosphate de Na pH 7,3, NaCl 0,5 M, additionné d'une molécule stabilisante, à savoir PEG 6000 à 0,1 0/00. On détermine par le test dit "Costimulator assay" les "activités interleukine 1" des fractions d'élution successives. Dans le tableau IV, on a réuni les valeurs mesurées de cette activité, toujours exprimée en c.p.m., pour chacune des fractions recueillies, les étapes de chromatographie et d'élution étant réalisées pour les trois cultures dans les mêmes conditions. TABLEAU IV Activité d'intPrleukine 1 (en c.p.m.) N de de la phase liquide contenant fraction des cellules des cellules des monocytes n de HL-60 de K562 12 1 000 1 1 500 1 000 14 5 500 2 000 750 16 200 000 24 000 10 000 18 200 000 23 000 19 000 20 4 000 2 500 8 000 22 1 000 500 3 500 24 1 500 i 500 1 500 26 2 500 500 1 000 28 4 000 1 000 500 30 7 500 3 000 2 000 32 16 000 9 000 9 500 34 25 000 14 500 10 000 36 15 000 8 500 12 000 38 6 500 1 500 7 500 40 a 4 000 2 000 l 500 42 3 000 1 750 l 000 44 3 000 1 500 1 000 46 2 000 1 000 1 000 48 2 000 500 500 50 1 500 500 500 La variation de l'activité d'interleukine 1 en fonction du n de la fraction chromatographique étudiée est représentée respectivement par les courbes G et H pour les lignées HL-60 et K562 et par la courbe K pour les monocytes. L'examen des chiffres réunis dans ce tableau IV et plus encore celui des courbes du graphique de la figure 4 font apparaître l'identité entre les interleukines 1 produites par les cellules des lignées HL-60 et K562 d'une part, et celle produite par les monocytes d'autre part. Ces interleukines 1 sont en fait concentrées à deux niveaux du profil d'élution, c'est-à-dire dans deux groupes de fractions, respectivement 16 à 20 et 32 9 38. On a mesuré par la méthode de L. FISHER, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Vol l,part.,II, North Holland Publishing Company - Amsterdam - (cité dans "Gel filtration Theory and Practice" édité par Pharmacia), les poids moléculaires des interleukines 1 correspondant respectivement aux fractions 16 à 20 et 32 à 38. On a trouvé : - une valeur voisine de 70.000 pour celle contenue dans les fractions 16 à 20 et on pense qu'il s agit ici d'interleukine 1 complexée avec des protéines, - une valeur voisine de 17.000 pour les fractions 32 à 38. On a procédé à une deuxième identification par la détermination du point isoélectrique des molécules d'interleukine 1 secrétées par la lignée HL-60 et on a procédé de même pour celle produite par les monocytes Pour ce faire, on a utilisé la méthode de B.T. RADOLA, décrite dans Biochemicai Biophysical Acte; 386, p 181 (1975). On a pu déterminer ainsi que, tant pour l'interleukine produite par la lignée HL-60, que pour celle produite par les monocytes, il s'agit en fait de trois formes biochimiques de même poids moléculaire focalisant respectivement aux pH d'environ 5,7, d'environ 6,6 et d'environ 7. Les courbes L et M apparaissant respectivement sur les figures 5 et 6 et représentant la variation de l'activité d'interleukine en fonction du numéro de fraction d'un gradient de pH, respectivement pour les monocytes et pour la lignée HL-60, montrent en effet des valeurs de focalisation extrêmement proches. Il résulte de ce qui précède qu'il est possible, à l'aide du procédé conforme à l'invention, de fabriquer de l'interleukine 1 très semblable à celle classiquement obtenue à partir de monocytes. On peut prévoir que cette interleukine est toutefois plus pure, c'est-à-dire accompagnée de moins de facteurs du type interféron, BCGFD ou CSF, étant donné l'absence d'autres types cellulaires contaminants, en partitulier lymphocytes T, toujours présents dans les préparations de monocytes et qui sont les cellules productrices de ces facteurs. De plus, la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention permet de produire 1'interleukine 1 humaine en des quantités permettant son application en tant que médicament. En effet, cette production n'est plus tributaire d'un plus ou moins grand nombre de donneurs de sang. Bien au contraire, les possibilités de culture offertes par les lignées sélectionnées autorisent le recours à des quantités de cellules illimitées, donc permettent d'envisager une production industrielle. Celle-ci pourrait être réalisée comme suit - croissance des lignées cellulaires an fermenteur, - induction de la production d'interleukine 1 en grands volumes, - concentration des surnageants (par exemple par ultrafiltration), - purification de la molécule en plusieurs étapes comprenant une étape de filtration sur gel, une étape dtisoelectrofocalisation, etc. Une telle production peut également être mise en oeuvre en cultivant les microorganismes dans lesquels a été introduit Le cADN fabriqué à partir du ARN messager extrait des lignées sélectionnées. Les compositions pharmaceutiques à base de l'interleukine ainsi produite se présentent sous la forme de préparations injectables, préparations pour applications externes et préparations pour administration orale et rectale. Ces compositions comportent une quantité d'interleukine 1 efficace, c'est-d-dire suffisante pour déclencher la réponse immunitaire ; elles comportent également un véhicule non toxique et pharmaceutique acceptable L'application thérapeutique essentielle de ces compositions pharmaceutiques est celle de médicament coopérant au déclenchement de la réponse immunitaire, ce qui ouvre un immense champ d'utilisations cliniques potentielles comparable à celui de l'interleukine 2. quoi qu'il en soit et quel que soit le mode de réalisation adopté, on dispose ainsi d'un procédé de production d'interleukine 1 humaine dont les caractéristiques et avantages par rapport à l'art antérieur résultent suffisamment de ce qui précède pour qu'il soit inutile d'insister à ce sujet et qui est donc propre à fournir en quantités industriellement exploitables et sous une forme très pure, ladite interleukine 1 dont les propriétés rappelées plus haut en font un principe thérapeutique très intéressant. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus particulièrement envisagés elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'interleukine 1 humaine est caractérisé par le fait que, successivement, - on établit en phase liquide une concentration efficace en cellules appartenant à au moins une lignée leucémique humaine, lymphomateuse, d'origine hématopoiétique et lympholde ne secrétant pas normalement 1'in- terleukine 1, cette lignée étant établie en culture continue, de préférence en milieu liquide, - on induit la sécrétion d'înterleukine 1 par les cellules de la susdite lignée en introduisant dans le milieu une quantité efficace en au moins un inducteur choisi dans le groupe comprenant, d'une part, ceux qui possèdent les propriétés d'induction de la différentiation cellulaire, notamment les phorbols et les phorbol-estars et, d'autre part; ceux appartenant à d'autres familles telles que celle de la téléocydine, - on maintient pendant un laps de temps suffisant les conditions nécessaires à la sécrétion d'inter- leukine 1, - on sépare l'intarleukine 1 du milieu, c'està-dire de la phase liquide, et - éventuellement, on la purifie et on la conditionne en vue de son utilisation future. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la phase liquide dans laquelle sont suspendues les cellules de la lignée leucémique sélec tionnée est constituée par le milieu de culture dans lequel ces cellules sont normalement propagées. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que la lignée sélectionnée est celle connue sous le code HL-60, la concentration de la phase liquide en cellules constitutives de cette lignée étant de 105 à 108 cellules/ml, de préférence voisine de 4.106 cellules/ml de phase liquide. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que la lignée sélectionnée est celle connue sous le code K562, la concentration de la phase liquide en cellules constitutives de cette lignée étant de 105 à 108 cellules/ml, de préférence voisine de 3.106 cellules/ml de phase liquide. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'inducteur sélectionné est le 12-0-tétra-decaroyl-phorbol-13-acétate (ou TPA), la concentration de la phase liquide en TPA étant de 1 ng/ml à 100 ug/ml, de préférence de 0,5 à 2 pg/ml. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que les conditions de secrétion d'interleukine 1 sont maintenues jusqu'au moment à partir duquel la concentration de la phase liquide en interleukine 1 n'augmente plus. 7. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4 et selon les revendications 5 et 6, caractérisé par le fait que les conditions de secrétion de l'interleukine 1 sont maintenues pendant 2 å 10, de préférence pendant 3 à 5 jours. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que l'interlaukine 1 est séparée de la phase liquide, après avoir retiré de celleci les cellules de la lignée sélectionnée, en soumettant ladite phase liquide à une chromatographie en phase solide, de préférence sur colonne de AcA 54, l'éluant étant choisi dans le groupe comprenant les tampons salins. 9. Procédé selon les revendications 1 et 8, caractérisé par le fait que l'on purifie 1'interleukine 1 séparée de la phase liquide en ayant recours à une immunoabsorption spécifique par anticorps. 10. Procédé de production d'interleukine 1 ca ractérisé par le fait qu'on extrait cette interleukine 1 du surnageant recueilli à l'issue de tout procédé comportant la culture d'un microorganisme dans lequel a été introduit préalablement, par mise en oeuvre des techniques du génie génétique; le cADN fabriqué å partir de 1'ARN mess-ager codant pour la molécule d'interleukine 1 extrait des lignées HL-60 ou K562. 11. Composition pharmaceutique comportant, d';ne part, à titre de médicament coopérant au déclenchement de la réponse immunitaire, une quantité efficace d'interleukine 1 humaine notamment préparée par mise en oeuvre de l'un des procédés selon les revendications 1 à 10 et, d'autre part, tout véhicule non toxique et physiologiquement acceptable.