FR 2552103 A1 19850322 FR 8414123 A 19840914 -1 La présente invention concerne un procédé pour la préparation d'un nouvel inocolum pour la production du coenzyme B 12 par fermentation anaérobie. Plus particulièrement l'invention concerne un 5 procédé pour la préparation d'un nouvel inoculum contenant une nouvelle population microbienne mixte, anaérobie, mésophile et méthanogène pour l'emploi dans la production par fermentation discontinue, semi-continue ou continue du coenzyme B 12 en conditions septiques. Le terme "coenzyme B 12 " tel qu'on l'emploie dans la présente description et les revendications, désigne non seulement le coenzyme B 12 lui-même mais également d'autres corrinoides (par exemple le facteur III) à activité biologique (Barker et coll, Biol Chem 235, 15 480 ( 1960)). belon la littérature, un inoculum est "une solution virale, une suspension de micro-organismes ou de cellules, ou un organe, un tissu ou une cellule de caractère végétal utilisés pour la production de nou20 velles cultures stériles" (Straub, F B: Biological Encyclopaedia II, p 287, Akadémiai Kiad 6 Budapest, 1978) L'inoculum selon l'invention contient une nouvelle population microbienne mixte, anaérobie septique, mésophile et méthanogène. On entend ci-après par précurseur, un composé de départ à partir duquel le rroduit fir-? désiré est préparé selon une série de réactions bic %giques (ibid. III 437) par exemple le 5,6-diméthylbenzimidazole, le chlorure de cobalt, etc. Un bouillon est un milieu de culture préparé pour être utilisé dans la culture fermentaire de microorganismes Le bouillon contient toutes les substances nutritives nécessaires aux micro-organismes au cours de la fermentation sous une forme assimilable (ibid IV, 249), par exemple le méthanol, le bicarbonate d'ammonium, 25552 i 03 -2 le chlorure de magnésium, etc Le terme "bouillon" tel qu'on l'emploie ci-après désigne un milieu de culture contenant une combinaison de substances nutritives et de précurseurs. Les substances nutritives sont des substances chimiques qui sont vitales pour la population microbienne, par exemple des sources de carbone et d'azote. Dans le procédé selon l'invention, le méthanol joue un double rôle: c'est une source de carbone dans la bio10 synthèse et il fournit en même temps l'énergie nécessaire à la formation de la population microbienne mixte. Comme on le sait, depuis environ deux décennies, le coenzvme B 12 est produit par fermentation des substances nutritives de la boue d'égout par emploi des 15 micro-organismes présents dans la boue Eventuellement, la boue d'égout est également additionnée de diverses substances nutritives Le procédé est avantageux en ce que la fermentation peut être effectuée en conditions septiques, mais, pour chaque fermentation, une quantité 20 importante de boue d'égout doit être transportée à l'usine de fermentation, la composition et la population bactériennes de la boue varient et de plus, la boue d'égout peut contenir des souches dites "sauvages" dont la présence rend impossible la formation d'une population 25 bactérienne stable. Selon le brevet HU n 153 740, le coenzyme B 12 est produit en conditions aseptiques anaérobies selon un procédé dans lequel à un bouillon contenant les substances nutritives nécessaires, on ajoute uniquement 30 de la boue d'égout et après au moins cinq ensemencements, on obtient une population microbienne mixte enrichie qui peut jouer le rôle d'un inoculum, la production de coenzyme B 12 étant d'environ 6 à 6,2 mg/l de bouillon de fermentation Ce procédé dit procédé "sans 35 boue d'égout" nécessite au moins cinq stades d'ensemen- -3 cement pour adapter les micro-organismes de la boue d'égout d'origine à la production du coenzyme B 12, ce qui rend le procédé malaisé De plus la production du coenzyme B 12 est faible, un grand nombre de substances 5 nutritives différentes sont nécessaires et par conséquent les coûts de production sont assez élevés. On connait dans l'art d'autres procédés pour la production de bouillons de fermentation ayant une teneur accrue en coenzyme B 12 (voir par exemple les brevets US n 3 954 971 et n 5 979 259) qui concernent l'intensification du procédé "sans boue d'égout" cidessus. Une population microbienne mixte, mésophile et méthanogène a été décrite pour la première fois dans 15 le brevet IU n 167 658 lCorymebacterium sp ( 24 A 1), Corynebacterium sp entraîne des coûts de production 1 élevés. -0 Le but de l'invention est de supprimer les inconvénients ci-dessus Pour atteindre les résultats souhaités, selon l'invention, au lieu d'adapter à un nouveau bouillon une population microbienne mixte, anaérobie, mésophile et méthanogène déjà établie et dé55 finie ci-dessus, la demanderesse a à nouveau utilisé la -4 boue d'égout et à partir de la population microbienne qui y est présente, a mis au point une nouvelle population microbienne anaérobie, mésophile et méthanogéne dans un bouillon ayant une composition nutritive totale5 ment nouvelle mais par ailleurs semblable au bouillon classique On entend par "bouillon classique" par exemple le bouillon décrit dans le brevet US n 954 971 Les souches présentes dans la nouvelle population microbienne ont été déposées à la Collection Na10 tionale Hongroise de Bactéries Médicales (OKI) de l'Institut National d'Hygiène sous les numéros 00076, 00079 et 00272 lCorynebacterium sp ( 24 A 1); Propionibacterium sp ( 259 A 1/6) et lethanococcus sp (IC-017 ?). Le nouveau procédé de l'invention pour la pré15 paration d'un inoculum permet de préparer une nouvelle population microbienne mixte de façon reproductible, grâce à un seul ensemencement En dehors de l'emploi d'un bouillon contenant moins de substances nutritives au lieu du bouillon riche en substances nutritives et 20 du traitement par la chaleur (hydrolyse) de l'infusion de mais, le procédé a pour avantage que dès le début on introduit essentiellement moins de bactéries vivantes dans le système avec le bouillon, si bien que les bactéries de la boue utilisée pour l'ensemencerent pré25 dominent Le bouillon contenant une faible quantité de substances organiques et caractérisé par la présence de méthanol comme composant organique favorise les bactéries décomposant le méthanol et produisant du méthane. De plus le procédé selon l'invention assure 30 des conditions très sûres de fermentation septique, anaérobie, mésophile et méthanogène car la population microbienne désirée peut être rapidement reproduite et chaque fois à bas prix puis être utilisée pour la production du coenzyme B 12. L'invention concerne un procédé pour la pré- -5 paration d'un nouvel inoculum contenant une nouvelle population microbienne mixte, anaérobie, mésophile et méthanogène convenant à la production par fermentation discontinue, semi-continue ou continue du coenzyme B 12 5 (coenzyme cobamide) Selon ce procédé on mélange 75 à % v/v d'un bouillon contenant un nombre moindre de substances nutritives à une concentration totale plus faible que les bouillons utilisés classiquement pour la production par fermentation septique, anaérobie et 10 mésophile du coenzyme B 12, mais ayant par ailleurs la même composition, avec 25 à 15 % v/v de boue d'égout ayant subi une digestion anaérobie, on fait fermenter le mélange pendant environ 7 jours dans des conditions septiques, anaérobies et 15 mésophiles avec des additions journalières de 0,3 à 0,5 % v/v de méthanol, on ajoute le bouillon de fermentation obtenu (première génération) ou une portion de celui-ci à un volume multiple (de préférence quadruple à sextuple) d'un bouillon ayant la même composition que celle précédemment indiquée et on poursuit la fermentation dans les mêmes conditions jusqu'à ce que le p H s'abaisse à - 5,5, on prélève une portion du bouillon de fermen25 tation obtenu (deuxième génération), de préférence 5 à % v/v et on la remplace par le même volume d'un bouillon contenant les mêmes substances nutritives mais enrichi en un ou plusieurs précurseurs et si on le désire, on poursuit la fermentation 30 pendant encore un ou deux jours pour obtenir un inoculum convenant à la production du coenzyme B 12 et contenant une nouvelle population microbienne mixte, anaérobie, mésophile et méthanogène. Pour la mise en pratique du procédé selon 35 l'invention, on prépare le bouillon en utilisant au -6 lieu de l'infusion de mais qui est un composant nutritif du commerce employé classiquement, une infusion de mais traitée par la chaleur (hydrolysat) ou des résidus de distillation du mais. Les résidus de distillation du mais sont des matières résiduaires obtenues par évaporation de la combinaison de l'infusion de mais et du résidu de colonne de distillation. Avant le traitement par la chaleur, on soumet 10 l'infusion de mais à un essai microbiologique et on n'effectue le traitement par la chaleur (hydrolyse) que sur une infusion de mais de qualité satisfaisante Pour l'essai microbiologique, on utilise essentiellement la fermentation décrite dans l'exemple 1 Si au quatrième 15 jour de l'essai, la production du biogaz est de 0,3 à 0,6 1/1 de bouillon de fermentation jour, l'infusion de mais convient à la préraration du nouvel inoculum selon l'invention Dans ce cas on a Joute à l'infusion de mais dont la qualité biologique est confirmée, un 20 volume égal d'eau et on fait bouillir le mélange pendant 15 minutes pour obtenir l'infusion de mais traitée par la chaleur désirée (hydrolysat). Le bouillon utilisé dans la préparation du nouvel inoculum est préparé de façon connue en soi 25 (voir par exemple l'exemple 1). Le bouillon utilisé dans le procédé selon l'invention présente par rapport aux bouillons utilisés classiquement les différences suivantes: il a une faible teneur en matières orga30 niques et contient de façon caractéristique du méthanol comme matière organicue, au lieu de l'infusion de mais du commerce, il contient de l'infusion de mais traitée par la chaleur (hydrolysat) ou des résidus de distillation du 35 mais. -? En raison dé la composition du nouveau bouillon, la composition et les propriétés de production de la population microbienne mixte enrichie lors de la préparation de l'inoculum sont modifiées et au lieu de six à sept ensemencements, un ensemencement et plusieurs jours de fermentation ( 1 à 2 jours) suffisent. On ajoute au nouveau bouillon qui contient du méthanol, de l'hydrolysat d'infusion de mais, du bicarbonate d'ammonium, du chlorure de magnésium, du chlorure de cobalt, du 5,6diméthylbenzimidazole et du bisulfite de sodium, 15 à 25 % v/v de boue d'égout ayant subi une digestion La boue d'égout est de préférence de la boue fraîchement prélevée dans le postdigesteur anaérobie d'une installation communale de traite15 ment de la boue d'égout Après une homogénéisation soigneuse, on commence la fermentation à 30-320 O et on la poursuit pendant environ une semaine (jusqu'à ce que le p H s'abaisse à 5,0-5,5) en ajoutant du méthanol et en prélevant chaque jour des échantillons du bouillon de 20 fermentation On détermine sur les échantillons le p H et la teneur en méthanol du bouillon de fermentation ainsi que la vitesse de production du biogaz Ces trois données constituent des informations d'importance capitale sur l'avancement de la fermentation On sait en particulier que pour la formation d'une population microbienne mixte, anaérobie, et mésophile, un milieu légèrement acide (p H = 5 à 6) est favorable La concentration en méthanol du bouillon de fermentation est également importante car une concentration trop élevée 30 ou trop faible en méthanol ralentit l'adaptation Enfin les vitesses de production du biogaz et d'assimilation du méthanol sont des paramètres importants car il existe une corrélation directe entre la concentration du méthanol et la vitesse de production du biogaz. Selon un mode de réalisation préféré de l'in- vention on poursuit la fermentation pendant environ une semaine comme précédemment décrit Ensuite, on utilise le bouillon de fermentation obtenu appelé première génération ou une portion de celui-ci comme inoculum 5 (éventuellement à une échelle plus grande), c'est-àdire qu'on l'ajoute à un volume plus important de bouillon La composition de ce bouillon est identique à celle du bouillon de départ On poursuit la fermentation pendant environ 7 jours essentiellement dans les conditions décrites ci-dessus Le bouillon de fermentation obtenu après cette seconde période de fermentation est appelé deuxième génération Ensuite on remplace environ 10 % v/v de la deuxième génération par un volume égal d'un bouillon de culture qui contient les mêmes substances nutritives mais, & l'exception du méthanol, du 5,6-diméthylbenzimidazole et du chlorure de cobalt, a une concentration dix fois inférieure. Le bouillon de fermentation additionné du bouillon frais ci-dessus est maintenu à 33-34 O C pendant 20 encore I ou 2 jours. On obtient ainsi un inoculum approprié au démarrage de la production par fermentation du coenzyme B 12 L'inoculum contient une nouvelle population microbienne mixte, anaérobie, mésophile et méthanogène. 25 Le nouvel inoculum selon l'invention peut être utilisé pour la production par fermentation du coenzyme B 12 comme décrit dans la demande de brevet N 8414124 Le procédé de l'invention est exposé en dé30 tail dans les exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 Dans un fermenteur de verre de laboratoire ayant une capacité utile de 10 litres, on introduit 6 000 ml d'eau du robinet préchauffée entre 30 et 32 C 35 puis on ajoute les substances nutritives suivantes: -9 ml de méthanol ml d'un hydrolysat obtenu à partir de 50 g d'infusion de mais, g de bicarbonate d'ammonium 1,0 g de chlorure de magnésium, 0,05 g de chlorure de cobalt, 0,03 g de 5,6-diméthylbenzimidazole et 0,30 g de bisulfite de sodium. Le bouillon de culture est ensuite soigneuse10 ment homogénéisé et porté à 8 000 ml avec de l'eau du robinet à 30-32 C On ajoute au bouillon 2 000 ml d'une boue d'égout ayant subi une postdigestion récente provenant d'une installation comnunale de traitement des boues d'égout On mélange, on couvre le fermenteur de verre avec une plaque de caoutchouc et on place dans un thermostat à 32-34 C. Au cours de la période suivante de fermentation, on prélève chaque jour des échantillons de 50 ml (après homogénéisation) et on ajoute 35 ml de méthanol 20 au fermenteur puis on prélève à nouveau un échantillon de 200 ml, -on couvre le fermenteur avec une plaque de caoutchouc et on poursuit la fermentation anaérobie pendant encore 7 jours à la même température. Le bouillon de farmentation obtenu après les 25 sept premiers jours est appelé première génération. On détermine le p H et la concentration en méthanol du bouillon de fermentation dans l'échantillon prélevé avant l'addition du mêthanol On introduit dans un gazomètre les 200 ml de bouillon de fermentation prélevés après l'addition du méthanol et on détermine la vitesse de production du biogaz On évacue l'échantillon du gazomètre et on le réintroduit dans le fermenteur en même temps que l'on ajoute la portion de méthanol suivante. Le septième jour de fermentation, on augmente -10 l'échelle de fermentation d'un facteur 5:on remplit un fermenteur ayant une capacité utile de 50 litres de litres d'eau du robinet à 50-32 C puis on ajoute les substances nutritives suivantes: 175 ml de méthanol, 500 ml d'un hydrolysat obtenu à partir de 250 g d'infusion de mais, g de bicarbonate d'ammonium, g de chlorure de magnésium, 10 0,25 g de chlorure de cobalt, 0,15 g de 5,6-diméthylbenzimidazole, 1,5 g de bisulfite de sodium. Lorsque l'addition des substances nutritives est achevée, on porte le volume du bouillon à 40 litres 15 avec de l'eau du robinet à 30-32 C. Ensuite, on ajoute la quantité totale ( 10 litres) du bouillon de fermentation du septième jour (première génération) au bouillon fraîchement préparé (ensemencemrent) et après homogénéisation intensive, on 20 ferme le fermenteur et on poursuit la fermentation anaérobie à 32-34 C pendant encore 7 jours. Pendant la seconde période de sert jours, on pr'lève des échantillons de 50 ml, on ajoute au fermenteur 175 ml de méthanol puis on prélève chaque jour des 25 échantillons de 200 ml On ferme le fermenteur et on poursuit la fermentation à 32-34 C On détermine à partir des échantillons prélevés avant et après l'addition du méthanol respectivement le p H et la concentration du méthanol et la vitesse de production du biogaz. Le bouillon de fermentation obtenu après la seconde période de sept jours est appelé seconde génération On prélève 10 % ( 5,0 litres) de la seconde génération homogénéisée et on ajoute un volume égal d'un bouillon ayant la composition suivante: -11 000 ml d'eau du robinet à 50-32 C, ml-de méthanol, ml d'un hydrolysat obtenu à partir de 25 g d'infusion de mais, 15 g de bicarbonate d'ammonium, 0,5 g de chlorure de magnésium, 0,25 g de chlorure de cobalt, 0,15 g de 5,6-diméthylbenzimidazole et 0,1 g de bisulfite de sodium. Après l'addition du bouillon, on mélange soigneusement le bouillon de fermentation, on ferme le fermenteur et on poursuit la fermentation à 32340 C pendant encore I jour. Au cours des opérations précédentes, il se forme une nouvelle population microbienne mixte, anaérobie, mésophile et méthanogène contenant les souches déposées à la Collection Nationale Hongroise de Bactéries Médicales (OKI) Institut National d'Hygiène, sous les numéros 00076, 00079 et 00272 lles souches suivant 20 l'ordre des numéros de dép 8 t: Corynebacterium sp. ( 24 A 1), Propionibacterium sp ( 239 A 1/6) et Methanococcus sp (MO-017) l L'inoculum est caractérisé par un p H de 5,4 à 5,8 et une production de biogaz de 0,5 à 0,8 litre de biogaz/jour litre de bouillon de fermenta25 tion. L'inoculum obtenu convient à la production du coenzyme B 12. La concentration en ingrédient actif du bouillon de fermentation déterminée à partir d'un échan30 tillon prélevé le premier jour du fonctionnement semicontinu selon le procédé décrit dans le brevet HU n 167 658 est de 7,3 mg/1. On prépare les composants nutritifs comme suit: traitement par la chaleur de l'infusion de mais: 35 on dilue de l'infusion de mais ayant une teneur en -12 substance sèche d'environ 45 % avec un volume égal d'eau du robinet, on porte le mélange à ébullition et on fait bouillir pendant 15 minutes On refroidit ensuite la solution et on ramène au volume d'origine avec de 5 l'eau du robinet La solution fraîche obtenue est ce qu'on appelle l'infusion de mais traitée par la chaleur (hydrolysat). On détermine avant l'emploi que l'infusion de mais utilisée pour la préparation de l'inoculum pour la 10 production de l'ingrédient actif convient selon le procédé microbiologique suivant: dans un fermenteur de laboratoire en verre ayant une capacité utile de 10 litres, on introduit 9 litres d'eau du robinet à 30-32 C puis les substances nutritives suivantes: 15 50 ml de méthanol g d'infusion de mais non traitée (non hydrolysée), contenant 45 % de substances sèches, à étudier, g de bicarbonate d'ammonium I g de chlorure de magnésium,0 0,05 g de chlorure de cobalt, 0,05 g de 5,6-diméthylbenzimidazole et 0,20 g de bisulfite de sodium. après homogénéisation, on ajoute au bouillon 300 ml du bouillon de fermentation du fermenteur de -5 production du coenzyme B 12 puis on porte à 10 litres avec de l'eau du robinet à 30-'2 C On recouvre le fermenteur d'une plaque de caoutchouc et on le place dans un thermostat à 32-34 C Chaque jour on ajoute ml de méthanol au mélange après homogénéisation en 50 prélevant 200 ml de bouillon de fermentation pour déterminer la vitesse de production du biogaz, on couvre le fermenteur et on poursuit la fermentation à 32-34 C. bi le quatrième jour de fermentation la production du biogaz est de 0,3 à 0,6 1/1 de bouillon de fermentation. 55 jour, l'infusion de mais, après le traitement par la -135 chaleur décrit ci-dessus, convient à la préparation de 1 ' inoculum. On ajoute le 5,6-diméthylbenzimidazole au bouillon aorès dissolution dans la quantité appropriée de méthanol. Les autres substances nutritives sont ajoutées directement au bouillon et y sont dissoutes. Exemple 2 Cet exemple illustre la préparation d'un ino10 culum sans accroissement de l'échelle Cette technique est généralement utilisée lorsqu'une petite quantité d' inoculum suffit. Selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, on prépare la première génération d'inoculum dans un fermenteur de verre ayant une capacité utile de litres. Le septième jour de fermentation (première génération) on effectue l'ensemencement par prélèvement de deux litres du bouillon de fermentation soigneusement 20 mélangés que l'on verse dans un autre fermenteur de verre ayant une capacité utile de 10 litres Ensuite on ajoute dans ce dernier fermenteur 6 litres d'eau du robinet à 50-32 C puis les substances nutritives suivantes: 355 ml de méthanol, ml d'un hydrolysat obtenu à partir de 50 g d'infusion de mais, g de bicarbonate d'ammonium, I g de chlorure de magnésium, 30 0,05 g de chlorure de cobalt, 0,03 g de 5,6-diméthylbenzimidazole et 0,30 g de bisulfite de sodium. Lorsque l'addition des composants est achevée, on homogénéise soigneusement le mélange, on porte le 35 volume à 10 litres avec de l'eau du robinet à 30-32 C, -14 on homogénéise à nouveau et on recouvre le fermenteur de verre d'une plaque de caoutchouc puis on le place dans un thermostat à 32-34 C. Ensuite on prélève un échantillon de 50 ml, 5 on prélève 35 ml de méthanol et on prélève encore un échantillon de 200 ml chaque jour, on recouvre lefermenteur d'une placque de caoutchouc et on poursuit la fermentation anaérobie à la même température pendant encore 7 jours. Le bouillon de fermentation obtenu arrès cette seconde période de sept jours est appelé deuxième g 5 énration. On prélève 10 % v/v de bouillon de fermentation homogénéisé dans la deuxième génération et on in15 troduit un volume égal d'un bouillon ayant la composition suivante: Dans 1,0 1 d'eau du robinet à 50-32 C, on a 4 oute les substarnces nutritives suivantes: ml de méthanol, ml d'hydrolysat obtenu à partir de 5,0 g d'in20 fusion de mals, 3,0 g de bicarbonate d'ammonium, 0,1 g de chlorure de magnésium, 0,05 g de chlorure de cobalt, 0,03 g de 5,6-diméthylbenzimidazole et 25 0,02 g de bisulfite de sodium. Après l'addition du bouillon, on mélange soigneusement le bouillon de fermentation, on recouvre le fermenteur d'une plaque de caoutchouc et on poursuit la fermentation pendant encore 24 heures à 32-34 C Le 50 bouillon de fermentation (inoculum) obtenu après la fermentation de 24 heures convient à l'emploi dans la production du coenzyme B 12. Exemple 3 Cet exemple montre que le procédé selon l'in35 vention peut être également utilisé à l'échelle indus- -15 trielle. Dans un fermenteur ayant une capacité utile de 2,0 m 3, on pompe I 000 I d'eau du robinet chauffée à -32 C puis on ajoute les substances nutritives sui5 vantes après préparation comme décrit dans l'exemple 1: 7,0 1 de méthanol, ,0 1 d'hydrolysat obtenu à partir de 10 kg d'infusion de maîs, 6,0 kg de bicarbonate d'ammonium, 10 0,2 kg de chlorure de magnésium, 0,01 kg de chlorure de cobalt, 0,006 kg de 5,6diméthylbenzimidazole et 0,06 kg de bisulfite de sodium. On homogénéise soigneusement le bouillon contenant les substances nutritives ci-dessus puis on ajoute 400 1 de boue d'égout anaérobie décrite dans l'exemple 1 On porte le mélange à 2 m 3 avec de l'eau du robinet à 30-32 C, on homogénéise, on ferme le fermenteur et on débute la fermentation anaérobie à 3020 32 C. Ensuite, on prélève chaque jour un échantillon du bouillon de fermentation (après 20 minutes d'agitation), on ajoute 7,0 1 de méthanol, on poursuit l'agitation pendant 20 minutes, on prélève un rouvel 25 échantillon et on poursuit la fermentation pendant 24 heures A partir de l'échantillon prélevé avant l'addition du méthanol, on détermine la concentration en méthanol du bouillon de fermentation et le p H tandis qu'on utilise l'échantillon prélevé après l'addition du méthanol pour déterminer la vitesse de production du biogaz. Le septième jour de fermentation (première génération) on ensemence avec la culture un bouillon frais en accroissant l'échelle d'un facteur 5 Dans 35 un fermenteur ayant une capacité utile de 10 m 3, on -16 pompe 6 m 3 d'eau du robinet chauffée à 30-32 C, puis on introduit les substances nutritives suivantes: ,0 1 de méthanol, ,0 1 d'un hydrolysat obtenu à partir de 50 kg d'infusion de mais, ,0 kg de bicarbonate d'ammonium, 1,0 kg de chlorure de magnésium, 0,05 kg de chlorure de cobalt, 0,03 kg de 5,6-diméthylbenzimidazole et 10 0,30 kg de bisulfite de sodium. Après avoir soigneusement homogénéisé, on pompe 2 m 3 du bouillon de fermentation du septième jour dans le bouillon puis on porte le volume à 10 m avec de l'eau du robinet à 30-32 C et, après homogénéisation, 15 on débute la fermentation anaérobie à 30-32 C. De plus, chaque jour on agite le bouillon de fermentation pendant 30 minutes, on prélève un échantillon, on introduit 35 litres de méthanol, on poursuit l'agitation pendant encore 30 minutes et on prélève un 20 nouvel échantillon. On analyse régulièrement les chantillons comme décrit précédemment. après 40 minutes d'agitation, on prélève % v/v du bouillon de fermentation de deuxième géné25 ration ( 1 m 3) et on introduit un volume égal de bouillon comme préparé comme décrit cidessous. Dans 0,5 mû d'eau du robinet chauffée à 3032 C, on dissout les substances nutritives suivantes: ,0 1 de méthanol, 10,0 1 d'un hydrolysat obtenu à partir de 5,0 kg d'infusion de mais, 3,0 kg de bicarbonate d'ammonium, O,1 kg de chlorure de magnésium, 0,05 kg de chlorure de cobalt, 0,03 kg de 5,6-diméthylbenzimidazole et 0,02 kg de bisulfite de sodium. On introduit le bouillon ci-dessus dans le fermenteur puis on porte le volume à 10 m 3 avec de l'eau du robinet On agite pendant 30 minutes puis on arrête l'agitation et on poursuit la fermentation anaérobie pendant encore 24 heures. Après 24 heures la préparation de l'inoculum est achevée Les propriétés caractéristiques du bouillon de fermentation sont les suivantes: p H = 5,4 à 5,8; 10 production de gaz: 0,5 à 0,8 1/1 de bouillon de fermentation jour; teneur en ingrédient actif: 8,3 mg/l. Le bouillon de fermentation obtenu convient à l'emploi dans la production du coenzyme B 12. On prépare les substances nutritives et on contrôle la qualité de l'infusion de mais comme décrit dans l'exemple 1. Note: Les souches citées ont été déposées à la collection Nationale Hongroise de Bactéries Mgdicales (OKI) sous les numéros 00076, 00077, 00078 et 00079, le 21 décembre 1971 et sous le numéro 00272, le 26 juillet 1983. -18 REVENDICATIONS I Procédé pour la préparation d'un nouvel inoculum convenant à la production par fermentation discontinue, semi-continue ou continue du coenzyme B 12 5 (coenzyvme cobamide) en conditions septiques, contenant une nouvelle population microbienne mixte, anaérobie, mésophile et méthanogène qui comprend le mélange de 75 à 85 %o v/v d'un bouillon ayant la même composition que les bouillons classiques 10 utilisés pour la production par fermentation septique, anaérobie et mésophile du coenzvme 312 si ce n'est qu'il contient moins de types de substances nutritives à une concentration totale plus faible, avec 25 à 15 %o v/v d'une boue d'égout ayant subi une digestion anaéro15 bie, la fermentation du mélange dans des conditions septiques, anaérobies et mésophiles pendant environ 7 jours avec addition de O 3 à 0,5 % v/v de méthanol chaque jour, l'addition du bouillon de fermentation obtenu (première génération'ou d'une portion de celui-ci, à un volume multiple, de préfprence quadruple à sextuple, d'un bouillon ayant la même composition, et la poursuite de la fermentation dans des conditions iden25 tiques jusqu'à ce que le p H s'abaisse à 5 à 5,5, le prélèvement de 5 à 15, en volume du bouillon de fermentation obtenu (deuxième généràtion) chaque jour et leur remplacement par un volume égal d'un bouillon plus riche en un ou plusieurs précurseurs 30 mais contenant les mêmes substances nutritives et si on le désire, la poursuite de la fermentation pendant plusieurs jours additionnels pour fournir un inoculum contenant une population microbienne mixte, anaérobie, mésophile et méthanogène convenant à l'emploi 35 dans la production du coenzyme B 12. -19 2 Procédé comme revendiqué dans la revendication 1, dans lequel comme un des composants nutritifs on utilise une solution aqueuse d'une infusion de mais dont les capacités microbiologiques ont été confirmées et qui a été traitée par la chaleur (hydrolysée). 3 Procédé comme revendiqué dans la revendication 1, dans lequel on ajoute au bouillon 15 à 25 % en volume d'une boue d'égout communale ayant subi une digestion anaérobie. 4 Procédé comme revendiqué dans la revendication I dans lequel on utilise comme boue d'égout ayant subi une digestion anaérobie, la boue d'égout fraîche de postdigestion d'une installation communale de purification des eaux d'égout. 5 Procédé selon la revendication I dans lequel le bouillon utilisé contient du méthanol, de l'hydrolysat d'infusion de mais et/ou des résidus de distillation du mais traités par la chaleur, du bicarbonate d'ammonium, du chlorure de magnésium, du chlorure de 20 cobalt, du 5,6diméthylbenzimidazole et du bisulfite de sodium.