FR 2550203 A1 19850208 FR 8312659 A 19830801 Peptides synthétiques immu.0ogènes porteurs d'un épitope caractéristique de l'antigène de surface du virus de l'hépatite B et compositions les contenant L'invention concerne un nouveau peptide synthétique immunogène porteur d'un épitope de l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (antigène HBs) susceptible d'être utilisé dans la production de compositions vaccinantes, notamment à l'égard du virus de l'hépatite B. Parmi les compositions de l'invention sont également envisagés les produits résultant du couplage covalent du peptide qui sera défini ci-après avec des protéines support de poids moléculaire relativement élevé, par exemple supérieur à 20 000, ainsi que des oligomères hydrosolubles de ce peptide. On sait que les séquences nucléotidiques des génomes d'un certain nombre de sous-types du virus de l'hépatite B ont été entièrement déterminées. De même on a localisé avec précision la position, dans le génome du virus de l'hépatite B , de la séquence nucléotidique (gène S) qui code pour la protéine naturelle considérée comme portant les sites antigéniaues ou épitopes responsables de l'immunogénicité caractéristique de l'antigène de surface (HBgAg ou HBs) du virus de l'hépatite B. On connaît des vaccins mettant en jeu les propriétés immunogènes de l'antigène HBs naturel, isolé à partir de plasmas provenant de personnes qui avaient déjà été exposées au virus de l'hépatite B.La protéine naturelle susdite comprend 226 acides aminés formant un enchaînement dont la structure a aussi entièrement été élucidée à partir de la séquence nucléotidique du gène qui l'exprime, du moins en ce qui concerne un certain nombre de sous-types du virus. De nombreux peptides de plus petite taille, dont cependant les sequences coïncident avec celles de parties correspondantes de la protéine naturelle, ont déjà été svnthétisées et testés, pour ce qui est de leur capacité à être reconnus par des anticorps préala- blement forgés dans un organisme vivant à l'égard du virus de l'hépatite B entier. Les enchalnements d'aminoacide synthétisés ont été choisis en fonction des emplacements présumés dans la protéine naturelle des épitopes susceptibles de jouer un rôle essentiel dans la nature de l'immunité susceptible d'être acquise par un hotte vacciné par l'antigène HBs contre l'hépatite virale B.Ces peptides sont souvent désignés par les-numéros (I à 226) de leurs aminoacides d'extrémité, selon les positions que ceux-ci occupent dans l'enchaînement d'aminoacides de la protéine naturelle. On peut se référer par exemple aux peptides décrits dans la demande de brevet européen NO 44 710 de la SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION (invention Lerner et coll). On peut également encore mentionner la publication toute récente de John L.GERIN et coll.(Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. vol.80 pp.2 365 2 369 Avr. 1983), en ce qui concerne les peptides éventuellement porteurs d'un épitope caractéristique de l'antigène HBs. De façon très significative, il apparaît que la plupart des peptides synthétisés jusqu'à ce jour se situent principalement dans deux régions, de part et d'autre de l'acide aminé 110. Le peptide selon la présente invention, qui témoigne d'une immunogénicité remarquable, peut en première approximation, être considéré comme appartenant aux deux régions susdites si l'on fait abstraction des modifications possibles par substitution de certains des acides aminés contenus dans le peptide selon l'invention par des acides aminés distincts, lorsque ces substitutions n'entraînent pas une altération fondamentale de l'immunogénicité du peptide modifié . Dans une telle optique le peptide selon l'invention peut être considéré comme contenant essentiellement la séquence 99-121, voire 99125 de la protéine naturelle. Le peptide selon l'invention, qui contient au plus 30 résidus aminoacyle, est caractérisé en ce qu'il contient la séquence Asp - Tyr - Gln - Gly - Met - Leu - Pro - Val - X - Pro Leu - Ile - Pro - Gly - Ser - Y - Thr - Thr - Ser - Thr Gly - Z - X dans laquelle - X est cystéyle, aminobutyryle, alanyle ou séryle - Y est séryle ou thréonyle et - Z est prolyle ou séryle. Avantageusement X est un groupe cystéyle. Des peptides particulièrement préférés de l'invention sont ceux qui présentent les structures indiquées ci-dessous, notamment en rapport avec trois sérotypes différents. S ei -o type I Asp - Tyr - Gln - Gly - Met - Leu - Pro - Val - Cys - Pro - Leu - Ile 100 105 110 Pro - Gly - Ser - Ser - Thr - Thr - Ser - Thr - Gly - Pro - Cys 115 I20 Sérotype 2 Asp - Tyr - Gln - Gly - Net - Leu - Pro - Val - Cys - Pro - Leu - Ile 100 105 Pro - Gly-Ser-Thr-Thr - Thr - Ser - Thr - Gly - Pro - Cys 115 120 Séotype 3 Asp - T > 'r - Gln - Gly - Met - Leu - Pro - Val - Cys - Pro - Leu - Ile 100 105 110 Pro - Gly - Ser - Ser - Thr - Thr - Ser - Thr - Gly - Scr - Cys II5 I20 Ces trois peptides se distinguent les uns des autres au niveau des acides aminés soulignés en traits interrompus. Le cas échéant la séquence de 23 aminoacides contenus dans le peptide, tel qu'il a été défini plus haut ou dans les peptides préférés qui ont été identifiés cidessus, est allongée du côté C -terminal par addition des séquences d'acides aminés suivants serotyne 1 = Arg - Tbr - Cys - Met - Thr sérotype 2 = LVs - Thr - Cys - Thr - Tkr sérotype 3 = Arg - Thr - Cys - Thr - Thr I1 va de soi que les fonctions réactives libres que sont susceptibles de posséder les différents résidus aminoacides entrant dans la constitution du peptide selon l'invention, peuvent être modifiées, dès lors que cette modification n'entraîne pas une modification des propriétés immunogènes de ltensemble du peptide. Les peptides ainsi modifiés entrent naturellement dans le cadre de la protection donnée à l'invention par les revendications. Par exemple des groupes -sH des résidus cystéïne dans les positions 107 et/ou 121 (et/ou 124) peuvent être à l'état thiol libre, disulfure, (par exemple dans le cas de peptides dimérisés) protégés. par un groupe de protection, par exemple acétamidométhyle. De même les fonctions carboxyle peuvent éventuellement être acylées ou estérifies et les groupes amines éventuellement alcoylés. Les peptides selon l'invention peuvent être préparés par les techniaues classiques, dans le domaine de la synthèse des peptides. Cette synthèse peut être réalisée en solution homogène ou en phase solide. Par exemple on aura recours à la technique de synthèse en solution homogène décrit par HOUBENWEYL dans l'ouvrage intitulé 'Methode der Organischen Chemie" (Méthode de la chimie organique) édité tar E. Wünsch., vol. 15-I et II, THIEME, Stuttgart 1974. Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement deux à deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou à condenser des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs résidus aminoacyles dans l'ordre approprie, ou Encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protégei au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments à l'exception des fonctions amine de l'un et carboxyle de l'autre ou vice versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des peptides.En variante, on pourra avoir recours à des réactions de couplage mettant en jeu des réactifs de couplage classique, du type carbodiimide, tels que par exemple la l-éthyl-3-(3-diméthy1- aminopropyl)-carbodiimide. Lorsque l'aminoacyle mis-en oeuvre possède une fonction amine supplémentaire (cas de la lysine par exemple) ou une autre fonction acide (cas par exemple de l'acide glutamique), ces fonctions seront par exemple protégées, par des groupes carbobenzoxy ou --butyloxycarbonyle, en ce qui concerne les fonctions amine,' ou par des groupes t-butylester, en ce qui concerne les fonctions carboxyliques. I1 en ira de même de la protection de toute autre fonction réactive.Par exemple, lorsque l'un des aminoacyles considérés contient une fonction SH (par exemple le cystéine), on pourra avoir recours à un groupe acétamidométhyle ou paraméthoxybenzyle. Dans le cas de la syntnèse progressive, acide aminé par acide aminé, la synthèse débute de préférence par la condensation de l'amino-acide C-terminal avec l'amino-acide qui correspond à l'aminoacyle voisin dans la séquence désirée et ainsi de suite, de proche en proche, jusiju'à l'acide aminé N-terminal. Selon une autre technique préférée de l'invention, on a recours à celle décrite nar R.D. MERRIFIELD dans l'article intitulé "Sol id phase peptide synthesis" (J. Am. Chem. Soc., 45, 2149-2154). Pour fabriquer une chaine peptidique selon le procédé de MERRIFIELD, on a -recours à une résine polymère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier aminoacide C-terminal de la chaine. Cet amino-acide est fixé sur la résine par l'intermédiaire de son groupe carboxylique et sa fonction amine est protégée, par exemple par le groupe t-butyloxycarbonyle. Lorsque le premier amino-acide C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on enlève le groupe protecteur de la fonction amine en lavant la résine avec un acide. Dans le cas où le groupe protecteur de la fonction amine est le groupe t-butyloxycarbonyle, il peut etre éliminé par traitement de la résine à l'aide d'acide trifluoroacétique. On couple ensuite le deuxième amino-acide qui fournit le second amino-acyle de la séquence recherchée, à partir du résidu amino-acyle C-terminal sur la fonction amine déprotégée du Dremier amino-acide C-terminal fixé sur la chaine. De préférence, la fonction carboxyle de ce deuxième amino-acide est activée, par exemple par la dicyclohexylcarbodiimide, et la fonction amine est pro tégée, par exemple par le t-butyloxycarbonyle. On obtient ainsi la première partie de la chaine peptidique recherchée, qui comporte deux aminoacides, et dont la fonction amine terminale est proté aée. Comme précédemment, on déprotège la fonction amine et on peut ensuite procéder à la fixation du troisième aminoacyle, dans les conditions analogues à celles de l'addition du deuxième aminoacide C-terminal On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés; qui vont constituer la-chaine peptidique sur le groupe amine chaque fois déprotégé au préalable de la portion de la chaine peptidique déjà formée, et qui est rattachée à la résine. Lorsque la totalité de la chaine peptidique désirée est forme, on élimine les groupes protecteurs des différents aminoacides constituant la chaine peptide dique et on détache le peptide de la résine par exemple à l'aide d'acide fluorhydrique. L'invention concerne également les oligomères hydrosolubles des peptides monomères sus indiqués. L'olinomèrisation peut résulter en accroîs sement de l'immunogénicité des neDtides selon l'invention. Sans qu'une telle indication chiffrée puisse être considérée comme limitative, on mentionnera néanmoins que ces oligomères peuvent éventuellement contenir de 2 à 10 unités monomères. On peut avoir recours1 pour réaliser l1oli- gomérisation, à toute technique de polymérisation couremment utilisée dans le domaine des peptides, cette polymérisation étant conduite jusqu'à l'obtention d'un oligomère ou polymère contenant le nombre de motifs monomères requis pour l'acquisition de I 'immunogénicité désirée. Une méthode préférée de l'oligomérisation ou de polymérisation du monomere consiste dans la réaction de celui-ci avec un agent de réticulation tel que le glutaraldéhyde. On peut également avoir recours à d'autres méthodes d'oligomérisation ou de couplage, par exemple à celle mettant en jeu des couplages successifs d'unités monomères, par l'intermédiaire de leurs fonctions terminales carboxyle et amine ou d'autres groupes réactifs, par exemple -SH en présence d'agents de couplage homoou hétéro- bifonctionnels. L'invention concerne encore les conjugués obtenus par couplage covalent des peptides selon l'invention (ou des susdits oligomères) à des molécules porteuses (naturelles ou synthétiques), physiologique- ment acceptables et non toxiques, par l'intermédiaire de groupements réactifs complémentaires respectivement portées par la molécule porteuse et le peptide. Des exemples de groupements appropriés sont illustrés dans ce qui suit: A titre d'exemples de molécules porteuses ou supports macromoléculaires entrant dans la constitution des conjugués selon lin- vention, on mentionnera des protéines naturelles, telles que l'anatoxine tétanique, l'ovalloumine, des sérums alloumines, des bémocyemines, etc.. A titre de supports macromoléculaires synthétiques, on mentionnera par exemple des poiylysinesiou des poly(D-L-alanine)-poly(L-lysine). La littérature mentionne d'autres types de supports macromoléculaires susceptibles d'etre utilisés, lesquels présentent en général un poids moléculaire supérieur à 20.000. Pour synthétiser les conjugués selon l'invention, on peut avoir recours à des procédés connus en soi, tel que celui décrit par FRANTZ et ROBERTSON dans Infect. and Immunity, 33, 193-198 (1981), ou celui décrit dans Applied and Environmental Microbiology, octobre 1981, vol. 42, nO 4, 611-614 par P. E. KAUFFMAN en utilisant le peptide et la molécule porteuse appropriée. Dans la pratique, on utilisera avantageusement comme agent de couplage-les composés suivants, cités à titre non limitatif : aldéhyde glutarique, chloroformiate d'éthyle, carbodiimides hydrosolubles S-éthyl-N'(3-di- méthylamino-propyl) carbodiimide, Hot7, diisocyanates, bis-diazobenzidine, di- et trichloro-s-triazines, bromures de cyanogène, benzoquinone, ainsi que les agents de couplage mentionnés dans Scand. J. Immunol., 1978, vol. 8, p. 7'23 (AVRAMEAS, TERNYNCK, GUESDON). On peut avoir recours à tout procédé de cou Dlage faisant intervenir d'une part une ou plusieurs fonctions réactives du peptide et d'autre part, une ou plusieurs fonctions réactives des molécules supports. Avantageusement, il s'agit des fonctions carboxyle et amine, lesquelles peuvent donner lieu à une réaction de couplage en présence d'un agent de couplage du genre de ceux utilisés dans la synthèse des protéines, par exemple, le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)-carbodii- mide, le N-hydroxybenzotriazole, etc. On peut encore avoir recours àlaglutaraldéhyde, notamment lorsqu'il s'agit de relier entre eux des groupes aminés respectivement portés par le peptide et la molécule support. D'autres caractéristiques de l'invention apparaitront encore au cours de la description qui suit d'exemples de mise en oeuvre de l'invention, étant naturellement bien entendu que ces exemples ne revêtent en eux-mêmes aucun caractère limitatif. Le peptide synthétisé est le suivant Sgérot)pc I Asp - Tyr - Gln - Gly - Met - Leu - Pro - Val - Cys - Pro - Leu - Ile îoe 105 110 Pro - Gly - Ser - Ser - Thr - Thr - Ser - Thr - Gly - Pro - Cys II5 I20 La synthèse est réalisée selon la technique en phase solide de Merrifield au moyen d'un synthétiseur automatisé de type BECKMANN 990 B. La chalne peptidique est préparée à partir du premier acide aminé-C-terminal, fixé de manière covalente sur un polymère de styrène et divinylbenzène (pouvant également être de type polyamide) par une liaison de type ester benzylique (résine chlorométhylée) ou amide (résine benzhydrylamine). Les acides aminés suivants, vers la partie N- terminale, sont ajoutés successivement par répétition du cycle d'opérations figurant au tableau 1.Les étapes principales en sont: I) - une déprotection du groupe Boc (tertio butyloxycarbonyle, utilisé pour protéger les fonctions -aminées) au moyen d'acide trifluoroacétique (TFA) en solution dans CH2 Cl2; 2) - une neutralisation des fonctions -aminées au moyen de diisopropylamine (D I E A) en solution dans CH2 C1 3) - un couplage réalisé par activation des fonctions carboxyliques des acides aminés à intro duire au moyen de dicyclohexyl-carbodiimide ou en préparant des esters activés (d'rthonitrophénol, par exemple). Les différents réactifs de couplage sont ajoutés en excès (3 à 6 fois) par rapport à la charge de résine. En fin de couplage, on vérifie l'absence de fonction amine libre sur la résine au moyen du test à la ninhydrine. En cas de réaction positive, le couplage est répété. Au cours de la synthèse les fonctions réactives portées par les chaînes latérales des aminoacide s sont protégées au moyen des groupes figurant au tableau 2. En fin de synthèse, le peptide est libéré de la résine et de ses groupes protecteurs par traitement durant l heure au moyen d'acide fluorhydrique anhydre contenant 10 % d'anisole (V/V/). Seul le groupe acétamidométhyle (acm) protégeant la cystéine reste intact à l'issue de ce traitement. Le peptide est alors réduit au moyen de dithiothréitol dans un tampon àpH8,puis purifié par gel filtration et chromatographie de partition en phase inversée. Son identité est contrôlée par analyse d'acides aminés après hydrolyse acide et son homogénéité par chromatographie sur couche mince de silice dans 3 systemes solvants différents ainsi que par chromatographie liquide haute pression en phase inverse. Protocole de synthèse Volume pour Nombre Temps Réactif 1 g de Momore résine d'opérations Temps CH2Cl2 15 ml x 3 2 mn TFA - CH2Cl2 (4/6) 13 ml xl 1 mn TFA - CH2Cl2 (2/3) 13 ml xl 30 mn CH2Cl2 13 ml x5 2 mn DIEA - CH2Cl2 (1/2) 15 ml x3 2 mn CH2Cl2 15 ml x5 2 mn couplage 15 ml xl 90 mn CH2Cl2 15 ml x5 2 mn TABLEAU Il Groupes Drotecteurs des chaines latérales Acide aminé Position Groupe protecteur Asp 99 Ester benzylique Tyr ioe O -dichlorobenzyle Cys I07 S -acétamidométhyle Ser 113 - 114 - 117 O benzyle Thr 115 - 116 - 118 O benzyle Cys 121 S-p Méthoxybenzyle A partir du peptide ainsi obtenu, on neut obtenir un oligomère ayant des propriétés immunogènes renforcées, en procédant comme suit 15 mg du susdit peptide dissous dans une solution de bicarbonate de sodium 0,1 M sont mélangés avec une solution aqueuse de 250 gr de glutaraldéhyde /litre pour obtenir une concentration finale en peptides de 0,1 %. La réaction s'effectue à température ambiante, à l'obscurité et sous agitation On laisse la réaction se poursuivre pendant 3 jours. L'oligomère formé peut ensuite être dialysé contre un tampon approprié, tel que le PBS. Pour coupler le peptide selon l'invention à une molécule porteuse appropriée, telle que la toxine tétanique, en vue de renforcer son immunogénicité, on peut avoir recours à une des méthodes décrites ci-après, en présence des agents homo- bifonctionnels ou hétérobifonctionnels également identifiés ci-après I - Agent homo-bifonctionnel tel que la glutaraldéhyde Les conditions expérimentales peuvent être résumées comme suit. 25 mg d'une macromolécule (protéine ou polymère synthétique) dissoute dans 2,5 ml de bicarbonate de sodium 0,1M sont mélangés à 21 mg de peptide. Après une heure de contact, sous agitation et à température ambiante, on ajoute en deux étapes de la glutaraldéhyde de manière à obtenir une solution finale à 0,1 % de l'agent couplant. Le contact est maintenu, à l'obscurité et à la température ambiante pendant 3 jours. On recueille le conjugué formé après dialyse de la solution contre du PBS. Dans l'exemple envisagé plus loin, la macromolécule utilisée a consisté en l'anatoxine diphtérique. II - Agent hétéro-bifonctionnel liant les fonctions suivantes 1. aminé et carboxyl méthode aux anhydrides mixtes : Les conditions expérimentales suivies correspondent au procédé général décrit par M.L. Tilak dans Tetrahedron Letters, 1979, 11, 849-854 2. carboxylet amine ou alcool - méthode utilisant une carbodiimide hydrosoluble Les conditions expérimentales ont été décrites par Goodfriend T.L. et al dans Science, 1964, 144, 1344. 3. amine et sulfhydryl De nombreux agents sont utilisés, cependant les plus usuels sont a) le 6-maléimido-caproïque-acyl-N-hydroxy-succinimide ester (MCS). Les procédés de couplage faisant intervenir ce réactif sont décrits par Lee et al. dans Molec. Immunol., 1980, 17, 749-756. b) le N-succinimidyl-3(2-pyridyl-dithio)propio (SPDP). La méthode employée a été décrite par Carlsson et al, dans Biochem. J., 1978, 173, 723-727 Propriétés biologiques des peptides selon l'invention 1) Propriétés immunogènes du peptide 99-121 Des essais d'immunisation de la souris sont effectués dans les conditions indiquées ci-après Ils démontrent le pouvoir immunogène du peptide synthétique lui-même, en présence d'un adjuvant. Cette activité immunogène se manifeste surtout en immunisation secondaire (donc après une injection de rappel). L'essai immunogène obtenu s'exerce à l'égard de l'antigène HBs naturel. Obtention d'une réponse secondaire après immunisation par le peptide 99-121 (Tableau I) Les souris (15 par lot) ont reçu par la voie souscutanée au jour 1, l'antigène naturel avec ou sans adju vants. Après 1 mois, chaque lot initial est divisé en trois (a) 5 souris ne reçoivent rien, (b) 5 souris reçoivent un rappel d'antigene naturel et (c) 5 autres l'antigène synthétique. Les sérums sont recueillis après 8 jours. Les sérums sont titrés par hémagglutination passive. Les chiffres indiquent la-plus grande dilution de sérum capable d'agglutiner les globules humains sensibilisés à l'antigène HBs (Centre National de Transfusion sanguine). Les résultats montrent que le peptide synthétique injecté seul à des souris pré-immunisées par l'antigène naturel avec un adjuvant, a permis d'obtenir un effet de rappel par rapport aux souris n'ayant pas reçu de rappel. TABLEAU Immunisation- Titres anticorps Primaire secondaire anti-HBs J1 J30 au jour 38 HBS 1 g (a) - 2 (b) HBS 1 g 2 (c) (99-121) 100 g 2 HBs 1 g + Al (OH)3 40 g (a) - 512 (b) HBS 1 g 8192 (c) (99-121) 100 g 2048 HBS 1 g + Al(OH)340 g + (a) - 500 murabutide (b) HBS 1 g 524254 100 g (c) (99-121) 100 g 8192 Propriétés immunogènes. d'un conjugué résultant du couplage covalent du peptide 99-121 et d'une molécule porteuse, en particulier l'anatoxine diphtérique Le peptide 99-121 a etc couplé à l'anatoxine diphtérique par le alutaraldéhyde, dans les conditions qui ont été indiquées plus haut. Le conjugué contient de 25 à 50 pg de peptide par 150 pg de produit. Des souris BALB/c (groupe de 8) reçoivent une première injection sous-cutanée de 150 g du conjugué, désigné dans le tableau sous l'abréviation "pep(99-121)AnaD) en l'absence ou en présence des doses indiquées dans le tableau,d'un adjuvant, notamment l'adjuvant complet de FREUND (FCA) le murabutide (N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-glutamique-n-butylester et l'hydroxyde d'aluminium. Au jour 44 après la première immunisation, les animaux reçoivent une seconde injection du conjugué, en l'absence de l'adjuvant. La réponse primaire a été mesurée au jour 35 et les reponses secondaires au jour 51 et au jour 58 suivant la première immunisation. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau Il ci-après. Il comporte deux types de résultats, exprimés par les titres anti-peptides et les titres anti-HBsAg. Les titres anti-peptide ont été mesurés par une méthode dérivée de la méthode ELISA réalisée dans les conditions expérimentales décrites parAUDIBERT F. et Coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5042-5046. En particulier 2 pg du peptide 99-121 ont été déposés dans chacun des puits d'une plaque de micro-titrage NUNC. La plaque a été mise en incubation pendant 2 h. à 370C. Après deux lavages de la plaque de microtitrage, des dilutions de 10 en 10 du sérum étudié ont été introduites dans les puits successifs des rangées de cavités de la plaque de microtitrage à raison de 200 g de solution par puits. La plaque a de nouveau eté incubée pendant heure à 37 C. Après 5 lavages avec une solution tampon,les plaaues ont été remises à incuber pendant une heure avec un. sérum contenant des immunoglobulines de chèvre anti-mouton marcruées à la péroxydase.Après lavage poussé des plaques, on a ajouté dans les puits une solution de substrat (O-phénylène-diamine) dans un tampon citrate 0,05 M/phosphate, pH5 (50 mg de substrat/ 100 ml de tampon) et 20 1 d'une solution d'eau oxygénée à 130 volumes. On a laissé la réaction se produire pendant 20 minutes . Elle a éte interrompue par addition d'acide sulfurique à 12,58. Les absorbances d'une radiation à 492 nm-ont ensuite été lues dans un lecteur ELISA du type "Titerteck multiskan", commercialisé par "Flow Laboratories". Des essais semblables ont été réalisés avec un sérum de souris normal à titre de témoin négatif. Les titres individuels mesurés ont été exprimés par la dilution maximum à laquelle était encore observée une absorbance deux fois plus élevée que celle du témoin TABLEAU II Réponse primaire Réponse secondaire J 35 anti-HBs J 51 J 58 anti-peptide anti-peptide anti-HBs anti-peptide anti-HBs ELISA S/N ELISA S/N ELISA S/N Pep (99-121) AnaD 150 g 1,8 x 104 1,9 2,3 x 105 4,1 106 7,5 Pep (99-121) AnaD 150 g 7,7 x 105 2,2 1,4 x 106 5,8 > 106 2,7 +FCA Pep (99-121) AnaD 150 g 1,6 x 105 1,7 5 x 105 3,4 106 2,2 + Al(OH3) 200 g (généralement 0,2 O.D.). Les résultats indiqués entre parenthèses sont des moyennes arithmétiques des titres mesurés sur les différents individus. Les résultats indiqués dans le Tableau II font apparaître un accroissement relatif sensible des titres mesurés, vis-à-vis des témoins, tant en réponses primaires qu'en réponses secondaires. Les titres anti-HBsAg ont été mesurés en utilisant un nécessaire ou "kit" de radioimmunoessai AUSAB. L'index S/N indique le rapport entre les "coups par minute" (cpm) obtenus en faisant réagir une dilution donnée de sérum expérimental et les cpm obtenus en utilisant un sérum normal à la même dilution. Les sérums montrant un index S/Nl,8 sont considérés comme positifs. I1 est particulièrement intéressant de noter que la réaction croisée avec l'antigène HBs est la plus sélective sinon la plus intense en réponse secondaire, lorsque l'on a mis en oeuvre le conjugué selon l'invention en l'absence de tout adjuvant. C'est également encore dans ce cas que l'on constate la plus longue réactivité à l'égard de HBsAg. Des résultats semblables ont été observés en mettant en oeuvre un oligomère du peptide 99-121, obtenu dans les conditions qui ont été indiquées plus haut et utilisé dans les conditions suivantes Des souris BALB/c (7 par lot) ont reçu, par la voie sous-cutanée, 100,ug d'oligomère soit seul, soit avec du FCA. Après 40 jours, elles reçoivent une injection de rappel. Les sérums sont titrés par ELISA contre HBs pour les réponses anti-peptides et par AUSAB (radioimmunoessai) pour les réponses anti-HBs. Les sérums montrant un index S/N ?val,8 sont considérés comme positifs. TABLEAU III Réponse anti-HBs de souris BALB/c immunisées avec le peptide (99-121) polymérisé (poly-HBs) (99-121)) Traitement RéPonse primaire au Réponse secondaire au poly-HBs (99-121) HBs poly-HBs (99-121) HBs Poly HBs (99-121) (100 - - (300 - Poly HBs (99-121) + PCA (100.000- 4.000) 3,7 (500.000 - 40.000) 5,4 43,500 203.000 Le tableau III montre que le peptide 99-121 est capable de donner des anticorps reconnaissant HBs, même en l'absence de molécule porteuse (carrier) et sans immunisation primaire avec la protéine naturelle. L'invention concerne naturellement également les compositions préparées sous forme de vaccins contenant soit le peptide selon l'invention, soit un oligomère de ce peptide, soit encore un conjugué de ce peptide ou oligomère avec une molécule porteuse, en association avec un véhicule approprié. Des compositions pharmaceutiques avantageuses sont constituées par des solutions, suspensions ou liposomes injectables,-contenant une dose efficace d'au moins un produit selon l'invention. De préférence, ces solutions , suspensions ou liposomes sont réalisés dans une phase' aqueuse. stérilisée isotonique, de préférence saline ou glucosée. L'invention concerne plus particulièrement de telles suspensions, solutions ou forme liposome qui sont aptes à être administrées par injections intradermiques, intramusculaires ou sous-cutanées, ou encore par scarifications. Elle concerne également des compositions pharmaceutiques administrables par d'autres voies, notamment par voie orale ou rectale, ou encore sous forme d'aérosols destinés à venir en contact avec des muqueuses, notamment les muqueuses oculaires, nasales, pulmonaires ou vaginales. En conséquence, elle concerne des compositions pharmaceutiques dans lesquelles l'un au moins des produits selon l'invention se trouve associé à des excipients pharmaceutiquement acceptables, solides ou liquides, adaptés à la constitution de formes orales, oculaires ou nasales, ou avec des excipients adaptés à la constitution des formes d'administration rectale, ou encore avec des excipients gélatineux pour l'administration vaginale. Elle concerne aussi des compositions liquides isotoniques contenant l'un au moins des conjugués selon l'invention, adaptées à l'administration sur les muqueuses, notamment oculaires ou nasales Avantageusement, les compositions vaccinales selon l'invention contiennent en outre un véhicule, tel que la polyvinyl-pyrrolidone, facilitant l'administration du vaccin.A la place de la polyvinyl-pyrrolidone, on peut utiliser tout autre type d'adjuvant au sens classique que l'on donnait autrefois à cette expression, c'est-à-dire d'une substance permettant l'absorption plus aisée d'un médicament ou facilitant son action dans l'organisme. A titre d'exemples d'autres adjuvants de ce dernier type, on méntionnera encore la carboxymëthyl-cellulose, les hydroxydes et phosphates d'aluminium ou tous autres adjuvants de ce type, bien connus de l'homme de l'art. Enfin, elles contiennent si bespin un adjuvant immunologique, notamment du type muramylpeptide, tel que le murabutide. L'invention ne se limite évidemment pas aux modes de réalisation décrits ci-dessus à titre d'exemples et l'homme de l'art peut y apporter des modifications sans pour autant sortir du cadre des-revendications ci-après ; notamment certains des acides aminés intervenant dans la séquence des peptides selon l'invention peuvent être remplacés par des acides aminés isofonctionnels ou isotériques ; par exemple, une ou plusieurs des substitutions suivantes peuvent être envisagées - Gly est substitué par Ala ou vice versa, - Gln est substitué par Asp, Gln ou Glu, - Val est substitué par Ala, Leu ou Gly, - Leu est substitué par Ala ou Val. Il est naturellement bien entendu que les peptides qui résultent de telles substitutions consistent en des équivalents des peptides plus particulièrement revendiqués, dès lors qu'eux-mêmes ou des oligomères ou conjugués formés à partir de ces peptides présentent des propriétés immunogènes semblables REVENDICATIONS I - Peptide contenant au plus 30 résidus aminoacyle caractérisé en ce qu'il contient la séquence Asp - Tyr - Gln - Gly - Met - Leu - Pro - Val - X - Pro Leu - Ile - Pro - Gly - Ser - Y - Thr - Thr - Ser - Thr Gly - Z - X dans laquelle : X est cystéyle , aminobutyryle, alanyle ou séryle Y est séryle ou thréonyle et Z est prolyle ou séryle. 2 - Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est cystéyle. 3 - Peptide selon la revendication l ou la revendication 2, caractérisé en ce que Y est séryle et Z est prolyle. 4 - Peptide selon la revendication l ou la revendication 2, caractérisé en ce que Y est thréonyle et Z est prolyle. 5 - Peptide selon la revendication l ou la revendication -2, caractérisé en ce que Y est séryle et Z est séryle. 6 - Peptide selon l'une quelconque des revendications l à 5, caractérisé en ce qu'il comporte 23 résidus aminoacyle 7 - Peptide selon l'une quelconque des revendications l à 6, caractérisé en ce que la séquence est allongée du coté C-terminal par addition d'un ou plusieurs des résidus aminoacyle de llune des séquences supplémentaires suivantes Arg - Thr - Cys - Met - Thr Lys - Thr - Cys - Thr - Thr Arg - Thr - Cys - Thr - Thr 8 - Produit consistant en un oligomère hydrosoluble du peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, cet oligomère comprenant de 2 à 10 motifs monomères. 9 - Produit contenant le peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 à l'état conjugué par 11 intermédiaire d'une liaison covalente à une molécule porteuse biologiquement acceptable, ayant de préférence un poids moléculaire supérieur à 20 000. 10 - Composition pour l'utilisation comme inducteur in vivo d'anticorps contre le peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou contre l'antigène HBs ou encore le virus de l'hépatite B , carac térisée en ce qu'elle contient, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable, un principe actif immunogène consistant soit en le peptide selon l'une quelconque des revendicatiçns 1 à 7, soit le produit selon la revendication 7 ou la revendication 8.