FR 2550093 A1 19850208 FR 8312849 A 19830804 Compositions pharmaceutiques contenant de la quinine. La présente invention concerne des compositions pharmaceutiques à base de quinine. La quinine est connue pour son activité antimalarique La Demanderesse a trouvé que des compositions pharmaceutiques contenant une association de quinine et de tanin extrait d'Annona senegalensis étaient particulièrement actives pour le traitement de la malaria (ou paludisme). Les compositions de l'invention contiennent de la quinine, 10 éventuellement sous forme de sel, en association avec le tanin pur extrait d'Annona senegalensis ou un extrait à 60 % de tanins, et éventuellement en association avec de la cinchonine. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont 15 beaucoup plus actives que la quinine elle-même. La quinine et la cinchonine, extraites d'écorces de quinquina, sont connues dans la littérature pour leur activité antimalarique Toutefois la cinchonine, légèrement plus toxique, ne peut être utilisée seule en thérapeutique. Le tanin pur extrait d'Annona senegalensis et l'extrait à % de tanins condensés sont obtenus à partir de l'écorce de la tige de cette plante. L'extrait renferme 60 % de tanins condensés accompagnés de glucose, d'acides aminés et de peptides. Le tanin pur a été isolé par chromatographie liquide préparative en utilisant comme support de la silice greffée RP 8 (Merck) et comme éluant du méthanol contenant 70 % d'eau, après élution successive par de l'eau distillée et de l'eau contenant 10 % de méthanol. Les dosages réalisés par la méthode utilisant le réactif de Stiasny montrent la seule présence de tanins condensés. On prépare l'extrait purifié d'Annona senegalensis de la manière suivante: On soumet l'écorce de la tige d'Annona senegalensis sèche et réduite en poudre à une lixiviation par 5 fois son poids d'un mélange méthanol 55/ eau 45 (en poids). Le liquide obtenu est concentré sous pression réduite jusqu'à évaporation du méthanol. La solution aqueuse résiduelle est extraite à deux reprises par un volume identique d'acétate d'éthyle. Les fractions solubles dans l'acétate d'éthyle sont éliminées. La phase aqueuse résiduelle est ensuite séchée par 15 atomisation ou lyophilisation. Le résidu est extrait à chaud et à deux reprises par dix fois son poids d'un mélange acétone/acétate d'éthyle ( 1/1 en volume). L'insoluble est solubilisé dans l'eau et séché par 20 atomisation ou lyophilisation. L'extrait d'Annona senegalensis obtenu est une poudre marron clair, très soluble dans l'eau, partiellement soluble dans le méthanol et l'éthanol et insoluble dans l'acétone et l'éther. Les tanins condensés contenus dans l'extrait ont été caractérisés par plusieurs tests et réactifs: 1 Le chauffage à l'ébullition de quelques mg de l'extrait dans 5 ml d'H Cl 5 N a conduit à la formation d'une 3 2550093 coloration rouge intense Après refroidissement, il y a précipitation d'un phlobaphène insoluble Cette réaction est caractéristique des tanins condensés dérivés des flavane-diols. 2 Par addition de 50 ml du réactif de Stiasny ( 25 ml de formol à 40 % et 25 ml d'acide chlorhydrique) à une solution de 100 mg de l'extrait dans 100 ml d'eau, il se forme un précipité marron, caractéristique des tanins condensés. 3 L'addition de 0, 5 ml d'une solution de Fe C 13 à 2 % à 5 ml d'une solution aqueuse à 0,5 % d'extrait conduit à une coloration verte, caractéristique de la présence de phénols. 4 L'addition à 2 ml d'une solution à 2 % d'extrait d'l ml d'H 2 SO 4 0,1 N et de 3 ml d'une solution aqueuse de molybdate d'ammonium à 10 % conduit à une coloration jaune orangée caractéristique des orthodiphénols. On dissout 0,2 g d'extrait dans 10 ml d'H Cl 5 N puis on porte la solution au bain marie pendant 2 minutes. Après refroidissement, on extrait l'anthocyanidine formée par 1 ml d'alcool isoamylique On identifie l'anthocyanidine par chromatographie. Extrait Cyanidine témoin Papier whatman N O 1 Solvant Forestal * Rf 0,17 0,17 CCM Cellulose Merck HC O OH-HC 1-H 20 ( 10-1-3) Rf 0,42 0,42 2 04 CCM Cellulose Merck Alcool amylique Rf 0,46 0,46 CH 3 COOH-H 20 ( 2-1-1) Forestal * CH 3 COOH-HC 1 Conc -H 20 ( 5-3-10) Après chromatographie sur papier, les taches sont éluées par du méthanol Merck. L'essai et le témoin présentent un maximum d'absorption à 537 nm en spectroscopie. Ces 2 essais permettent de caractériser la cyanidine après 15 hydrolyse acide du tanin. 6 Après hydrolyse simple et oxydative de l'extrait en présence de Fe C 13, on sature la phase aqueuse avec du chlorure de sodium et on extrait par de l'éther. La phase éthérée agitée avec une solution aqueuse de 20 Fe C 13 à 0,5 % ne donne pas de coloration bleue caractéristique d'acide gallique, l'extrait ne contient donc pas de tanins hydrolysables de type gallique. 7 La recherche d'alcaloides et de saponosides est négative, contrairement à ce qui est décrit dans la littérature. 25 8 Spectrocopie dans l'ultraviolet: Le tanin pur en solution dans de l'eau distillée à la -2550093 dilution de 25 pg/ml présente un maximum d'absorption à 279-280 nm A 280 nm la DO doit être comprise entre 0,30 et 0,33. L'extrait purifié à 60 % en solution dans de l'eau distillée à la dilution de 25 lg/ml présente un maximum d'absorption à 279-280 nm, la DO doit être comprise entre 0,18 et 0,20. La caractérisation du glucose a été effectuée par réaction positive à la bandelette à la glucose-oxydase et par chromatographie en couche mince sur gel de silice GF 254 Merck. Le solvant de développement est un mélange isopropanol/acide borique M/30 ( 85/15 en volume). La révélation est effectuée par pulvérisation de phtalate d'aniline et chauffage à l'étuve à 105 C pendant 5 minutes. L'essai et le témoin glucose présentent une tache de couleur marron, de Rf identique voisin de 0,5. La caractérisation des acides aminés totaux est réalisée au moyen de l'amino-acide analyseur Carlo-Erba type 3 A 27 8 suivant la technique décrite par P Molla, thèse de doctorat de spécialité, Marseille, 1975. Après hydrolyse acide par HC 1 5 N ont été identifiés: amino-acides basiques: acide gamma-aminobutyrique; 25 ornithine, lysine, histidine, arginine. 12 amino-acides neutres: acide aspartique, thréonine, sérine, proline, acide glutamique, glycine, alanine, valine, 6 2550093 isoleucine, leucine, tyrosine, phénylalanine. Le dosage en tanins condensés de l'extrait a été effectué par rapport au tanin pur isolé au moyen de la chromatographie liquide préparative. Les deux méthodes utilisées: méthode utilisant le réactif de Stiasny, méthode par spectroscopie en UV à 280 nm, donnent un titre de 60 + 3 % L'activité antimalarique des compositions de l'invention a été étudiée in vivo sur des souris blanches infestées avec le Plasmodium berghei. Le Plasmodium berghei est le premier hématozoaire découvert chez les rongeurs Muridés Sa relative facilité d'entretien 15 et de multiplication chez les animaux courants de laboratoire: souris et rat blancs, hamsters font de ce parasite un matériel de choix pour la recherche des nouvelles drogues antipaludiques. Une substance a une activité antipaludique in vivo lorsqu'en 20 même temps: elle provoque une réduction de la parasitémie et une prolongation de la survie des souris traitées. Si la plupart des auteurs utilisent le test en quatre jours ( 4 days test) qui permet de rechercher les DE 50 et DE 90 au bout de 4 jours de traitement des souris parasitées, nous 25 suivrons l'évolution de la parasitémie des souris traitées jusqu'à leur mort ou guérison éventuelle Cette méthodologie qui a été utilisée par Peters pour l'étude de la résistance du Plasmodium berghei à la chloroquine, permet d'établir une relation étroite entre l'évolution de la parasitémie et la 30 survie des souris traitées. Les souris blanches pesant 20 + 2 g sont infestées par voie intrapéritonéale avec 0,05 ml de sang contenant environ 2.10 globules rouges parasités. Chaque lot comprend 10 souris et un lot témoin est constitué pour chaque série de test. Les produits sont mis en suspension dans de l'eau distillée stérile L'administration se fait par voie orale; le traitement des souris commence le jour de l'infestation et se poursuit pendant 5 jours par l'administration d'une dose 1 O quotidienne à chaque souris L'examen des frottis se fait à partir du troisième ou quatrième jour On détermine en fin d'expérience le pourcentage d'hématies parasitées. Dans un premier temps on a déterminé la dose minimale de chlorhydrate de quinine capable de réduire la parasitémie et 15 de provoquer une prolongation de la survie des souris traitées par rapport aux témoins. Cette dose est d'environ 80 mg/kg A cette dose, le chlorhydrate de quinine provoque une diminution de la parasitémie pendant la durée du traitement Les souris 20 traitées survivent quelque temps par rapport aux souris témoins. Aux doses de 120 et 150 mg/kg de chlorhydrate de quinine, les pourcentages de parasitémie des souris traitées diminuent Les souris survivantes ne présentent pas de 25 parasites après 30 jours de contrôle. Le chlorhydrate de cinchonine, à la dose de 120 mg/kg, a la même activité que le chlorhydrate de quinine à la même dose. A titre d'exemples, deux compositions de l'invention, contenant du chlorhydrate de quinine et du tanin pur ( 100 30 mg/kg) ont été étudiées Les produits sont administrés à raison de 120 mg/kg et 150 mg/kg de chlorhydrate de quinine et de 100 mg/kg de tanin. 8 2550093 Les taux de mortalité des souris diminuent très fortement lorsque les souris sont traitées avec les compositions de l'invention. Le tableau suivant (I) donne les résultats comparatifs obtenus avec les compositions de l'invention et avec le chlorhydrate de quinine seul. TABLEAU I Pourcentage de parasitémie des souris traitées (groupes de 10 souris) I)é lai de Chlorhiydrate de Chlorhydrate de Chlorhydrate de Chlorhydrate de contrôle quinine ( 120 mg/kg) quinine ( 120 mg/kg) quinine ( 150 mg/kg) quinine ( 150 nmg/kg) et tanin ( 100 mg/kg) et tanin ( 100 mg/kg) To + 3 jours 0,5 % 0,8 % 0,J % O To + 7 jours 0 % O % O % O % lo + 9 jours 0,3 % O % 0,1 % O % To + 10 jours 1,6 % 1 % 0,4 % O % Tu + 11 jours 9 % 1,5 % 2 % O % lo + 12 jours 28 % 3,5 % 5,8 % 0,2 % Io + 14 jours 34 % 8 % 16,5 % 0,3 % lo + 15 jo Jlurs 52 % 16,5 % 24 % 1,5 % Io + 16 jours 62 % 18 % 25 % 3,5 % lo + 17 jours 18,5 % 19 % 7,5 % lo + 18 jours 19 % 16 % 11 % lu + 21 jours 21 % O % 12 % To + 25 jours 12, O % 8 % lo + 26 jouru O % O O % lo + 28 jours O % O % O % Io + 3 U jours O % O % O % i\ Pourcentage O %u 30 % 30 % 50 % d'animaux guéris (D ri Un Vld o 0 I J 2550093 A titre d'exemple une composition de l'invention, contenant du chlorhydrate de quinine administré à raison de 80 mg/kg), du chlorhydrate de cinchonine (administré à raison de 40 mg/kg) et du tanin pur (administré a raison de 100 mg/kg) a été étudiée comparativement au mélange des chlorhydrates de quinine et de cinchonine. Les résultats sont donnés dans le tableau suivant (II). ep il 2550093 TABLEAU II Pourcentage de parasitemie des souris traitées (groupe de 10 souris) Délai de Chl quinine:80 mg/kg Chl quinine:80 mg/kg contrôle Chl cinchonine:40 mg/kg Chl cinchonine:40 mg/kg Tanin: 100 mg/kg 15 20 25 30 To + 3 jours 0,4 % 0,2 To + 4 jours 0,1 % 0,1 To + 5 jours O % O % To + 7 jours 0 % O % To + 8 jours 0 % O % To + 9 jours 0 % O % To + 10 jours 0 % O % To + i 1 jours 0,1 % O % To + 12 jours 0,2 % 0,1 To + 13 jours 1 % 0, 1 To + 14 jours 6 % O % To + 15 jours 1 % O % To + 17 jours 12 % O % To + 18 jours 16 % O % To + 19 jours 20 % O % To + 21 jours 26 % O % To + 23 jours 18 % O % To + 24 jours 0 % O % To + 25 jours 0 % O % To + 27 jours 0 % O % To + 29 jours O % O % To + 30 jours I O % O % Pourcentage i 30 % 100 % d'animaux guéris I 1 2 2550093 Il ressort de ces résultats que le tanin d'Annona senegalensis, lui-même non actif potentialise l'activité de la quinine et l'activité de la quinine et de la cinchonine. La synergie observée permet d'utiliser de moins grandes quantités de quinine pour le traitement ou la prévention de la malaria. Les compositions de l'invention peuvent être préparées de telle manière que soit administrée chez l'homme 1) pour un traitement curatif: une quantité de sel de quinine correspondant à 6 à 15 mg/kg de quinine base ou d'un mélange contenant 2/3 de sel de quinine et 1/3 de sel de cinchonine soit de 4 à 10 mg/kg de quinine et de 2 à 5 mg/kg de cinchonine et de 5 à 15 mg/kg de tanin pur d'Annona senegalensis ou une quantité de 8 à 25 mg/kg d'extrait 15 d'Annona senegalensis titré à 60 % de tanin. ) pour un traitement préventif une quantité de sel de quinine correspondant à 1 à 2,5 mg/kg/jour de quinine base ou d'un mélange contenant 2/3 de sel de quinine et 1/3 de sel de cinchonine, soit 0,66 à 1,6 mg/kg de quinine et 0,33 20 à 0,8 mg/kg de cinchonine et de 1 à 2,5 mg/kg de tanin pur d'Annona senegalensis ou une quantité de 1,5 à 4,5 mg/kg d'extrait d'Annona senegalensis titré à 60 % de tanin. Les toxicités de la quinine et de la cinchonine, testées sous forme de chlorhydrates chez la souris de 20 g + 2 g 25 sont les suivantes: Les DL 50 sont proches et de l'ordre de 820 mg/kg pour le chlorhydrate de quinine et de 720 mg/kg pour le chlorhydrate de cinchonine. Les toxicités de l'extrait d'Annona senegalensis et du tanin 30 pur sont les suivantes: la DL 50 de l'extrait à 60 % est supérieure à 4 g/kg par voie orale, la DL 50 du tanin pur est d'environ 2,5 g/kg par voie orale. 13 2550093 Les compositions de l'invention peuvent contenir de 45 à 65 % en poids de quinine ou du mélange quinine-cinchonine et de 35 % à 55 % en poids de tanin pur. Les compositions de l'invention peuvent être utilisées pour le traitement ou la prévention du paludisme. Elles peuvent être présentées en association avec tout excipient approprié pour l'administration par voie orale ou parentérale. Z 550093 Revendications 1 Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle con tient un alcaloïde ou un mélange d'alcaloides extrait de l'écorce de quinquina en association avec du tanin pur ou un extrait à 60 % de tanins d'Annona senegalensis. 2 Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'alcaloide est la quinine, éventuellement sous forme de sel. 3 Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient un mélange de quinine et de cinchonine, éventuellement sous forme de sels. 4 Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient du chlorhydrate de quinine. 5 Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient un mélange constitué par 2/3 de sel de quinine et 1/3 de sel de cinchonine. 6 Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient de 45 % à 65 % en 20 poids d'alcaloide base et de 35 % à 55 % en poids de tanin pur. 7 Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est préparée de manière à ce que soient administrés de 6 à 15 mg/kg de quinine base et 25 de 5 à 15 mg/kg de tanin pur d'Annona senegalensis ou de 8 à 25 mg/kg d'extrait à 60 % de tanins d'Annona senegalensis. 8 Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est préparée de manière à ce que soient administrés de 4 à 10 mg/kg de quinine base et de 2 à 5 mg/kg de cinchonine base et de 5 à 15 mg/kg de tanin pur d'Annona senegalensis ou de 8 à 25 mg/kg d'extrait d'Annona senegalensis titré à 60 % de tanins. 9 Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caract 6 risée en ce qu'elle est préparée de manière à ce que soient administrés de I à 2,5 mg/kg de quinine base et de 1 à 2,5 mg/kg de tanin pur d'Annona senegalensis ou de 1,5 à 4,5 mg/kg d'extrait à 60 % de tanins d'Annona senegalensis. 10.Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est préparée de manière à ce 15 que soient administrés de 0,66 à 1,6 mg/kg de quinine base et de 0,33 à 0,8 mg/kg de cinchonine base et de 1 à 2,5 mg/kg de tanin pur d'Annona senegalensis ou de 1,5 à 4,5 mg/kg d'extrait d'Annona senegalensis titré à 60 % de tanins.