FR 2550945 A1 19850301 FR 8413133 A 19840823 -n M Pn-TT Tn N n'ENDOTOXINES PURIFIEES ET LEUR APPLICATION PHARMACOLOGIQUE La présente invention a pour objet l'utilisation de compositions d'endotoxines purifiées et rendues non toxiques en tant qu'immunostimulants potentiels et également en tant qu'adjuvants Ces endotoxines seront ci-après dénommées PNTE Les PNTE utilisées selon la présente invention sont caractérisées par le fait qu'elles ne contiennent pas de 2-céto-3-désoxyoctanoate détectable entre environ 350 et 475 nmoles/mg 10 de phosphore et entre 1700 et 2000 nmoles/mg d'acides gras. Les extraits endotoxiques obtenus à partir de l'Enterobacteriaciae incluant des organismes apparentés et mutants sont connus dans l'art antérieur Ces extraits ont été utilisés pour l'immunothérapie de diverses tumeurs immunogènes (voir Peptides as Requirement for Immuno15 therapy of the Guinea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxins; Ribi, et al Cancer Immunol Immunother, Vol 7 pages 43-58 ( 1979) inclus ici à titre de référence) Cependant les extraits d'endotoxines sont connus pour être hautement toxiques et ainsi d'usage limité dans le traitement des tumeurs cancéreuses On a déployé des efforts pour rendre non 20 toxiques les endotoxines tout en préservant leur aptitude à faire régresser les tumeurs Comme démontré chez Ribi, et al, ci-dessus référencé, des processus chimiques sont connus pour rendre non toxiques les endotoxines tout en maintenant leur caractère d'adjuvant, tel que par exemple la succinylation et la phtalylation, ce qui se traduit à la 25 fois par une perte d'endotoxicité et de puissance de régression de tumeurs Pour cette raison, les tentatives de l'art antérieur d'obtenir des compositions d'endotoxines purifiées et rendues non toxiques ont été loin d'être des succès. Des extraits d'endotoxines, du type utilisé comme produit de 30 départ pour obtenir les PNTE utilisées selon la présente invention, sont obtenus à partir de toutes Enterobacteriaciae incluant organismes apparentés et mutants A titre d'exemple, les genres suivants sont donnés à titre illustratif des types de micro-organismes pouvant être utilisés: Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella et Serratia. Les espèces suivantes sont employées de façon caractéristique: S minnesota, S typhimurium, B pertussis, B abortus, S enteritidis, 10 E coli, S typhi, S marcescens, S typhosa, Shigella flexni, et S abortus equi. Les extraits endotoxiques utilisés comme matériaux de départ peuvent être préparés par une ou plusieurs méthodes connues (voir par exemple, Webster, M E, Sagin, J F, Landy M, et Johnson, A G, J. 15 Immunol 1955, 744, 55; Westphal, O, Luderitz, O, et Bister, F, Z Naturforsch, 76 148 ( 1952); Westphal, O Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr Second Macy Conference (George F Springer, ed), Madison, N.J Madison Printing Co, 1957, 115; Galanos, C, Luderitz, O, Westphal, O, Eur J Biochem 9, 245 ( 1969); Chen CC H, Johnson, A G, 20 Kasai, N Key, B A, Levin, J, Nowotny, A, J Infect Dis 128 543 ( 1973); Ribi, E, Haskins, W T, Landy, M Milner, K C, The Journal of Experimental Medicine 114 647 ( 1961); Leive, L Biochem Biophys Res. Comm 21 290 ( 1965); and Ribi, E Milner, K C and Perrine, T, J. Immunol 82 75 ( 1959)). Une méthode plus adéquate pour obtenir l'extrait endotoxique est celle décrit par Chen et al; à savoir, la précipitation méthanolchloroforme. Le précipité méthanol-chloroforme (PMC) est amené à réagir avec un acide organique ou minéral et ensuite lyophilisé pour obtenir un lipide 30 brut hydrolysé A à toxicité et pyrogénicité réduites par comparaison avec le matériau endotoxine de départ Le produit résultant est alors traité avec un solvant qui est susceptible de dissoudre, de façon spécifique, les acides gras et d'autres impuretés sans dissoudre le lipide brut A Un solvant adéquat dans ce but, est l'acétone La teneur 35 en phosphate du lipide A purifié et rendu non toxique est d'environ la moitié de celle observée pour la contre-partie toxique, ce qui permet de penser que la teneur en phosphate est liée aux effets toxiques des endotoxines. 3 2550945 Des acides minéraux adéquats utilisés pour réagir avec le PMC sont l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique et les acides organiques adéquats sont l'acide toluénesulfonique et l'acide trichloroacétique La réaction peut être menée de façon adéquate à une 5 température comprise entre environ 90 et 130 C pendant un temps suffisant pour parvenir à une hydrolyse complète, généralement sur une durée d'environ 15 à 60 minutes. La préparation des endotoxines brutes rendues non toxiques peut également être effectuée en faisant réagir le matériau de départ avec 10 l'acide choisi en présence d'un solvant organique tel que chloroforme, méthanol et éthanol ou leur combinaison. Le lipide brut résultant A est dissous dans l'acétone qui convient particulièrement à l'extraction des composants acides gras Le solvant est-alors éliminé pour obtenir les endotoxines brutes rendues non 15 toxiques. Les endotoxines brutes rendues non toxiques sont alors dissoutes dans un solvant et passées dans une colonne chromatographique adéquate telle que, par exemple, une colonne chromatographique d'exclusion moléculaire pour séparer les fractions de PNTE qui sont alors combinées 20 après extraction du solvant Selon un mode de réalisation, la solution d'endotoxines brutes rendues non toxiques passe dans une colonne Sephadex en présence d'un solvant tel que chloroforme, méthanol, acetone, pyrridine, éther ou acide acétique ou leur combinaison La pression de la colonne peut varier mais est, de façon caractéristique, dans la gamme 25 comprise entre environ la pression atmosphérique et 690 k P et le débit est compris entre environ 0,1 et 10 ml/min. En variante, la solution d'endotoxines brutes rendues non toxiques passe à travers une colonne DEAE-cellulose dans les mêmes conditions de pression que mentionnées ci-dessus pour la colonne Sephadex Le débit 30 peut être maintenu entre environ 2 et 15 ml/min Les solvants utilisés sont également les mêmes que ceux utilisés pour la colonne Sephadex bien que l'eau et/ou la diéthylamine puissent être ajoutés à tous les mélanges à une concentration pouvant aller jusqu'à environ 1 %. D'autres méthodes de production des PNTE à partir des endotoxines 35 brutes rendues non toxiques comprennent le passage de la solution dans une colonne 60 basse pression à gel de silice, ayant une dimension particulaire comprise environ entre 15 et 63 microns et utilisant un solvant adéquat tel que chloroforme, méthanol, eau ou hydroxyde d'ammo- nium Le rapport de volume préféré du mélange solvant ci-dessus mentionné est d'environ 50/25/4/2. Un objet de la présente invention est donc l'emploi de compositions d'endotoxines purifiées et rendues non toxiques qui peuvent être utilisées de façon efficace pour stimuler le système immunologique d'un animal à sang chaud Plus particulièrement, les PNTE peuvent être utilisées comme des cellules B-mitogènes pour stimuler la production de lymphokines, stimuler les macrophages et comme adjuvant renforçant la réponse immunologique chez les animaux à sang chaud. La présente invention est orientée vers l'usage des endotoxines purifiées rendues non toxiques (PNTE) comme stimulant du système immunologique Les PNTE utilisées selon l'invention ne présentent pas de 2-céto-3désoxyoctanoate détectable d'environ 350 à environ 475 nmoles/mg de phosphore et d'entre environ 1700 à 2000 nmoles/mg d'acides gras. 15 Les PNTE conformes à la présente invention peuvent être utilisés comme stimulants de la réponse immunologique chez les animaux à sang chaud contre des antigènes tels que des cellules microbactériennes ou fongiques, des fragments de cellules microbactériennes, des virus, des peptides synthétiques de sous unités ou éléments viraux qui immitent des 20 sous unités ou éléments cellulaires et viraux Des antigènes spécifiques qui sont affectés par la réponse inmmunologique améliorée par l'administration des PNTE comprennent crystococcus neoformans candida spp. chlamydia spp, legionella spp clostridia, hepatitis meningitis, streptococus spp, staphylococus spp klebsiella spp, herpes virus, brucella spp, borditella spp, salmonella spp, shigella spp, camphylobacter spp, yersinia spp, pasturella spp, francisella spp, listeria spp, et analogues. Les PNTE utilisées selon la présente invention montrent une mitogénicité des cellules B, c'est-à-dire que quand on administre des 30 PNTE à un animal à sang chaud selon une distribution de dosages adéquats, on active les B-lymphocytes qui sont les cellules responsables de la production d'anticorps. ESSAIS 1. MITOGENICITE DES CELLULES B Les PNTE sont caractérisées par leur aptitude à activer les B-lymphocytes qui sont les cellules responsables de la production d'anticorps dans les conditions suivantes: 2550 o 945 Activité mitogène des endotoxines purifiées rendues non toxiques dose incorporation de 3 H-thymidine pg/ml CPM* IS** BALB/c nu/+ 10 34 500 5,0 BALB/c nu/nu 10 38 693 5,6 Protocole 1 X 10 06 cellules/ml de chaque souche cultivée avec ou sans motigène dans 0,2 mg de RPM 1-1640 ( 5 % de SFV***) dans des plaques de microtitration à 96 cupules 1 ucl de H-thymidine est ajouté à chaque cupule aux dernières 18 heures d'une incubation de 48 heures et l'incorporation de H est mesurée par des techniques de scintillation classiques. 15 *CPM = comptage par minute **IS = indice de stimulation ***SFV = sérum de foetus de veau 2. PRODUCTION D'INTERLEUKINE I Les PNTE peuvent être utilisées pour stimuler la production de lymphokines sécrétées par les macrophages L'interleukine I est un immuno- régulateur soluble sécrété par les macrophages qui est responsable de l'activation des lymphocytes sur le site d'une infection L'interleukine I joue un rôle critique comme amplifica25 teur de la réponse immunologique. Les macrophages de la souris adhèrent aux plaques de microtitrage ( 1 X 106 par cupule) chaque détermination étant faite en trois exemplaires Les premières cupules reçoivent 1 ml d'une solution à 50 ug/ml d'endotoxines de référence produites selon le 30 procédé décrit dans la demande de brevet ci-dessus mentionnée. 1 ml d'une solution à 50 pg/ml de PNTE conformément à la présente invention sont ajoutés dans une seconde série de cupules Chaque agent est dissous dans le milieu M 199 à 5 % de sérum de foetus de veau (SFV) 1 ml de milieu M 199 à 5 % de SFV est ajouté à une troisième série de cupules pour servir de contrôle Les plaques sont incubées à 37 C pendant vingt heures Ce qui surnage est enlevé et dilué pour obtenir une solution ayant une teneur de 1/10 de ce qui surnage dans l'eau distillée Ce qui surnage est essayé 15 20 25 30 35 pour la production d'interleukine I par la méthode Geryl, et al. Cellular Inmun 64, 293 ( 1981). Les cellules restant après enlèvement de ce qui surnage sont lysées en utilisant 0,1 % de Triton X-100 La solution résultante est diluée avec un milieu RPMI 1640 à 5 % de sérum de foetus de veau à un taux de dilution de 1/10. La solution diluée est testée pour la production d'interleukine I en mesurant une augmentation de teneur en H 3-thymidine des macrophages PHA induits comme décrit chez Gery et al ci-dessus mentionné Les résultats sont montrés au tableau I. TABLEAU I matériau d'essai réponse en surnageant réponse en lysat ( 50 Pug/ml) (dilution à 1/10 é) (dilution à 1/10 é) endotoxines de référence 31 137 + 1 721 51 695 + 2797 PNTE 16 782 + 1 295 66 178 2332 contrôle 3 323 t 31 12 153 + 497 Comme on le voit sur le tableau I, la production d'interleukine I à partir des PNTE selon la présente invention dans les cellules lysées dépasse largement la production d'interleukine I à partir d'extraits d'endotoxines de référence. Les mêmes essais ont été menés en utilisant des monocytes humains au lieu de macrophages de souris. Les résultats sont les suivants: TABLEAU IA matériau d'essai réponse en surnageant réponse en lysat ( 10 pg/ml) (dilution à 1/50 è) (dilution à 1/50 è) endotoxines de référence 42 418 * 1 763 51 821 + 1348 PNTE 17 910 + 1 983 50 626 813 contrôle 1 693 + 289 15 173 + 1292 3. ACTIVATION DES MACROPHAGES Les PNTE, selon la présente invention, stimulent également les macrophages conmme le montrent les mesures d'aptitude des macrophages à phagocyter (engloutir) des particules fluorescentes. 1 X 106 cellules exsudées par le péritoine sont mélangées à pl d'une solution de matériau d'essai contenant des endotoxines de référence des PNTE conformes à la présente invention et du sérum physiologique comme contrôle et ceci respectivement pour former trois solutions d'essai Chacune des solutions contient 10 1 pg de matériau d'essai et 20 pl d'une suspension de particules fluorescentes Les solutions d'essai sont placées sur des plaquettes individuelles pour microscope et ensuite incubées pendant minutes à 37 C. Apres incubation, les plaquettes sont observées sous micros15 cope à fluorescence Par observation visuelle, on détermine le nombre des cellules qui ont phagocyté les particules fluorescentes ainsi que le nombre de particules par cellule. L'indice de phagocytage est calculé selon la formule: indice de phagocytage = % des cellules phagocytantes X le nombre de particules pour 100 cellules et les résultats des deux expériences sont représentés au tableau II. TABLEAU II indice de phagocytage* expérience 1 expérience 2 endotoxines de référence 5,0 3,6 PNTE 5,4 4,1 Contrôle 1,0 0,5 Comme le montre le tableau II, l'indice de phagocytage pour les PNTE selon la présente invention sont largement supérieures à ceux des endotoxines de référence, ce qui montre que les PNTE sont des stimulants de macrophage remarquablement supérieurs. 4. ACTIVITE COMME ADJUVANT Pour démontrer plus avant l'utilisation des PNTE comme stimulants du système immunologique des animaux à sang chaud, on a testé leur caractère adjuvant en déterminant leur aptitude à augmenter la réponse immunologique sur les globules rouges du mouton (GRM) en mesurant l'aptitude des anticorps à lyser ces globules du mouton Trois compositions de test ont été préparées. Chacune contenait une quantité de 1 X 107 de GRM La composition n 2 contenait, de plus, 20 m Icg d'endotoxines de référence plus les 10 GRM, tandis que la composition n 3 contenait 20 mcg de PNTE conformes à la présente invention plus les GRM. Les compositions d'essai ont été injectées par voie interpéritonéale sur des souris de souche BALB/C Apres 4 ou 5 jours, les animaux testés ont été sacrifiés, les rates extraites et 15 broyées dans un broyeur à tissu Une suspension de cellules de référence de chaque rate est faite en utilisant un hématocytomètre et chacune des suspensions ci-dessus a été placée sur des plaquettes ainsi que les GRM ? du milieu de culture et de l'agaragar. Les plaquettes ont été incubées pendant deux heures à 37 C et du sérum de cochon d'inde a été ajouté à titre de source complémentaire sur chacune des plaquettes ce qui a été suivi par une incubation pendant 30 minutes à 37 C. Ensuite, les plaquettes ont été examinées pour déterminer la 25 quantité de cellules formant plaques qui sont des surfaces dans lesquelles les anticorps ont détruit les globules rouges à l'aide du complément trouvé dans le sérum de cochon dinde. Les résultats sont montrés au tableau III. TABLEAU III Composition d'essai PFC/2 X 105 cellules de rates GRM 88 GRM + endotoxine de référence 165 GRM + PNTE 219 Comme on le voit sur le tableau III, le nombre de cellule formant plaques résultant de l'utilisation des PNTE par rapport aux endotoxines de référence est notablement plus élevé, ce qui montre que les PNTE sont un adjuvant puissant. Les PNTE, telles qu'utilisées conformément à la présente invention, peuvent être administrées en combinaison avec un vecteur pharma5 ceutiquement acceptable tel que du sérum physiologique ou une émulsion de gouttelettes d'huile La composition ci-dessus indiquée peut être stabilisée par exemple par un processus de lyophilisation et ensuite reconstitué sans perte d'efficacité. Comme décrit ci-dessus, la composition pour le traitement des 10 animaux et à sang chaud et des humains, peut être utilisée sous forme d'une émulsion à gouttelettes d'huile La quantité d'huile utilisée est de la gamme d'environ 0,5 à 3,0 % en volume basée sur le volume total de la composition Il est préférable d'utiliser entre environ 0,75 et 1,5 % en volume de l'huile Des exemples d'huiles adéquates comprennent l'huile minérale légère, le squalane, le 7-n-hexyloctadecane, l'huile supérieure de Conoco, l'huile minérale 6 VR Drakeol (produite par la Pennreco Company, Bulter, Pennsylvanie, Etats-Unis). Le mélange homogénéisé contenant l'huile est alors combiné avec un détergent qui peut être éventuellement dissous dans une solution de 20 sérum physiologique avant mélange La quantité de détergent est, peut être de façon caractéristique, comprise entre environ 0,02 et 0,20 % en volume et, de préférence, entre environ 0,10 et 0,20 % en volume par rapport au volume total de la composition Tout produit détergent courant peut être utilisé, ce qui comprend le Tween-80 et l'Arlacel 25 (produit par la Atlas Chemical Company). Le mélange résultant de l'addition de détergent est alors homogénéisé pour former une suspension qui a un haut pourcentage de gouttelettes d'huile enrobé avec des PNTE comme le montre l'observation au microscope. La quantité de PNTE en une seule injection est entre 5 et 500 ug, de préférence, entre 10 et 100 pg (par poids total du corps de 70 kg pour un adulte humain). Une à trois injections sont administrées sur une période d'environ 2 mois La composition de PNTE utilisée selon la présente invention présente une activité pyrogène, notablement plus faible qu'une composition contenant des endotoxines de référence comme le montre l'exemple suivant. Trois lapins de Nouvelle Zélande reçoivent une injection (par voie veinale de l'oreille) d'une composition contenant des endotoxines de référence La quantité d'endotoxine de référence nécessaire pour provoquer une augmentation de température du corps d'au moins 0,46 C sur 50 % de la population testée est déterminée sur une période de 3 heures en utilisant un thermomètre rectal Trois autres lapins d'essai ont égalemnient reçu une injection avec une composition contenant les PNTE et le même test d'activité pyrogéne a été mené Les résultats sont montrés sur le tableau IV suivant. TABLEAU IV PYROGENICITE 20 ' Composition d'essai Activité sur le lapin* (en pg/kg) endotoxines de référence 0,012 PNTE 10 (c'est-à-dire pas de fièvre à des doses plus élevées = 10 pg) * La dose nécessaire pour provoquer une réponse fébrile (fièvre) plus forte que 0,46 C dans 50 % de la population testée. Comme on le voit sur le tableau IV, les endotoxines de référence produisent une réponse 1 fébrile dans 50 % des animaux testés pour un 25 dosage de 0,012 pg par kg Les PNTE, cependant, ne produisent pas de réponse fébrile à plus de 10 pg/kg, ce qui est 850 fois le niveau de dose des endotoxines de référence classiques. REVENDICATIONS 1. Une composition apte à produire une réponse efficace comme adjuvant ou une stimulation ou à stimuler la réponse immunologique chez les animaux à sang chaud comprenant une quantité efficace d'une composi5 tion comprenant des endotoxines purifiées rendues non toxiques n'ayant pas de 2-cêto-désoxyoctanoate détectable, et ayant environ de 350 à 475 nmoles/mng de phosphore et entre environ 1700 à 2000 nmoles/mg d'acides gras en combinaison avec un vecteur pharmaceutiquement acceptable. 2 Une composition selon la revendication 1, dans laquelle ladite quantité efficace est comprise entre 5 et 500 pg/kg. 3. Une composition selon la revendication 2, dans laquelle ladite quantité efficace est comprise entre 10 et 100 pg/kg. 4. Une composition selon la revendication 1, sous forme lyophili15 sée. 5. Une composition selon la revendication 1, sous forme d'une émulsion à gouttelettes d'huile.