FR 2546179 A1 19841123 FR 8308292 A 19830519 La présente invention concerne la-production de l'enzyme catéchol 2,3-oxygénase (ci-après dénommée C 2,3-0) de Pseudomonas par une levure telle que Saccharomyces cerevisiae, ainsi que les applications qui en découlent, notamment la réalisation de marqueurs colorés. Les marqueurs colorés ont été utilisés en génétique dès le début de cette science pour suivre facilement la ségrégation des gènes chez les plantes, les animaux et les microorganismes. La biologie moléculaire des bactéries s'est largement développée autour du système lactose d'Escherichia coli, en utilisant différents analogues chromogènes du lactose (o-nitrophényl-ss-D-galactoside jaune, 5-bromo, 4-chloro, 3-indolyl-s-D-galactoside, nommé Xgal, bleu). L'utilisation de ces substrats chromogènes permet une quantification aisée des activités enzymatiques in vitro. In vivo, le halo coloré développé par les clones contenant une activité ss-galactosidase permet le tri extrèmement rapide des colonies positives ou négatives quant à ce caractère.Le système a également été adapté dans de nombreuses constructions, notamment pour cloner des morceaux d'ADN dans le bactériophage M13 ou pour étudier l'expression des gènes. Toutefois, il existe peu de marqueurs colorés dans le domaine de la génétique des levures. Classiquement, les mutations (ade 1) et (ade 2) confèrent aux clones une couleur rouge. Cette particularité a été largement exploitée. Par contre, si on considère le champ d'étude utilisant le clonage et l'expression des genes, aucun marqueur réellement pratique n'a été développée jusqu'à présent. Le couple B-galactosidase/ Xgal bleu précédemment décrit a été introduit chez les levures (Rose et coll., 1981). Mais ce système souffre du fait que, normalement, la levure ne possède pas de perméase pour les 13-galactosides, contraignant les expérimentateurs à utiliser de grandes quantités (40 pg/ml) de substrat Xgal qui est extrèmement cher.Dans le domaine de la transformation et du marquage des souches, la mise en évidence de l'activité ss-lactamase a été développée (Reipen et coll., 1982), mais le test est trop complexe pour être utilisé de manière routinière. Un marqueur coloré en jaune a été récemment décrit dans E. coli, le phage M13 et des bactéries gram-positives de type Bacillus (Zukowski et coll., 1983). La présente invention concerne l'adaptation spécifique de ce système mettant en oeuvre la catéchol 2,3-oxygénase codée par le gène xylE, à la levure et les développements qui y sont liés. Le gène xylE est normalement porté par le plasmide TOL de quelques espèces de Pseudomonas qui dégradent le toluène (Franklin, 1981). Ce gène a été cloné dans E. coli (Franklin, 1981), dans le bactériophage M13 et dans Bacillus subtilis (Zukowski et coll., 1983). Ce gène code pour l'enzyme catéchol 2,3-oxygénase qui oxyde le catéchol en semialdéhyde 2-OH muconique suivant la réaction OH OH 4 COOH f O | 4 CHO catéchol-2,3-oxygénase semialdéhyde 20H catéchol semialdéhyde 20H incolore muconique jaune Comme indiqué ci-dessus, le substrat (catéchol) est incolore et le produit d'oxydation est jaune. Un tel système de marquage jaune, mettant en oeuvre la C 2,3-0 codée par le gène xylE, dans la levure offrirait les avantages demandés pour ce type de test, en particulier prix de revient très bas, non destruction des clones, réaction claire et rapide, en outre il n'est pas nécessaire d'utiliser un milieu spécial. De plus, l'enzyme elle-même a été proposée pour des utilisations industrielles variées (brevet français nO 82 01574 au nom de la Demanderesse) à partir de cultures bactériennes. Ici aussi, la levure peut etre un organisme très intéressant pour produire l'enzyme en grande quantité, compte tenu du savoir faire industriel concernant la production de cet organisme et du fait qu'il est reconnu comme non pathogène pour l'homme et les animaux. La présente invention concerne un bloc d'expression de la catéchol 2,3-oxygénase dans une levure, caractérisé en ce qu'il comporte selon le sens de lecture, et avec l'orientation correcte, au moins un promoteur de levure, le gène xylE, un terminateur de levure. La terminologie "bloc d'expression" de la catéchol 2,3-oxygénase dans une levure ne signifie pas nécessairement que le gène xylE est exprimé. En effet, comme on le verra ci-après, il est possible d'utiliser ce bloc d'expression à titre d'élément d'un marqueur coloré, dans ce cas on utilisera soit l'apparition d'une coloration (expression de la C 2,3-0) ou, au contraire, disparition d'une coloration (blocage de l'expression de la C 2,3-0), dans ce cas, bien que le "bloc d'expression soit présent, la C 2,3-0 ne s'exprime pas car un fragment d'ADN exogène est, par exemple, présent au sein du gène xylE, dans ce second cas on utilisera, néanmoins, les termes "bloc d'expression". Le sens de lecture retenu dans cette définition est celui de la lecture de 1'ADN du bloc d'expression par 1'ARN polymérase ; quant à l'orientation correcte, elle s'entend par rapport au sens défini précédemment. Le promoteur de levure est un fragment d'ADN généralement originaire de la levure elle-même et qui permet le démarrage spécifique de la synthèse du mARN. Afin d'assurer l'expression de la catéchol oxygénase, il est important qu'il n'existe entre ce promoteur et le codon initiateur ATG du gène xylE aucun autre codon initiateur ATG. Le terminateur de levure est un fragment d'ADN qui arrête la synthèse et qui assure le modelage correct du mARN afin d'obtenir un rendement en protéine important. Parmi les promoteurs de levure utilisables, il faut citer plus particulièrement le promoteur du gène URA3, mais il est possible d'utiliser d'autres promoteurs, notamment ceux des gènes codant pour les enzymes de la glycolyse (Dobson et coll., 1982 ; Hitzeman et coll., 1983). Parmi les terminateurs de levure utilisables, il faut citer plus particulièrement le terminateur du gène URA3+, mais il est bien entendu possible d'utiliser d'autres terminateurs de gènes codant pour des protéines exprimées par des levures. Le gène xylE a été décrit dans divers documents et sa structure est connue ; toutefois, dans le cadre de la pré sente invention, on entend désigner par "gène xylE" non seule ment le gène lui-même, mais également ses dérivés dont l'expression conduit également à une activité de catéchol 2,3-oxygénase. Ainsi, la structure du gène xylE "nu" peut être changée quant à la nature précise de son extrémité proximale. Le nombre et la séquence des paires de bases présentes juste avant le codon initiateur ATG peuvent varier. En particulier, l'introduction de la base A en position -3, la position O étant le A du codon ATG, peut être intéressante. En effet, cette caractéristique est commune à la plupart des gènes de levure (Dobson et coll., 1982). Les modifications peuvent être utilisées dans des études concernant la transcription et la traduction des gènes (recherche) et dans l'optimisation d'expression du gène afin d'obtenir de meilleurs rendements en enzyme (industrie). Ce "bloc d'expression" peut être utilisé de différentes façons, il peut être intégré dans un vecteur à réplication autonome, ou bien être intégré dans le chromosome d'une levure. Dans le cas d'un vecteur à réplication autonome, il faut prévoir un fragment supplémentaire assurant l'autoréplication dans les levures, notamment tout ou partie du plasmide 2 P . L'utilisation de ce fragment d'ADN présente de nombreux avantages, en particulier celui d'assurer une haute fréquence de transformation et celui de permettre un grand nombre de copies par cellule, donc potentiellement une production importante de C 2,3-0. Mais il existe également d'autres vecteurs possédant la même propriété de réplication autonome. Par exemple, l'utilisation des "séquences à réplication autonome" (Beggs, 1981) issues des chromosomes de la levure ou d'autres eucaryotes, couplées ou non avec des séquences de centromères (Beggs, 1981), est possible. L'utilisation de dérivés de 1'ADN "killer" de Kluyveromyces lactis est également envisageable (De Louvencourt et coll., 1982). Ces variations permettent l'étude et l'optimisation des paramètres essentiels intervenant dans la production d'une protéine par la levure, en particulier la stabilité, la pression sélective, les milieux, les paramètres de fermentation et la nature des souches de base. Le vecteur peut, en outre, comporter d'autres éléments assurant son bon fonctionnement dans les levures, mais également sa réplication dans des bactéries. Ainsi, il est possible de prévoir un système de réplication dans les bactéries telles que E. coli ou B.subtilis, ainsi qu'un ou plusieurs marqueurs sélectifs tels que des résistances à certains antibiotiques, ampicilline ou tétracycline. On obtient ainsi un vecteur polyvalent pour les cellules de levure et procaryotes. Dans le cas ou l'on désire assurer une intégration du bloc d'expression dans les chromosomes de levure, un ADN exogène au bloc d'expression peut se recombiner avec son homologue du chromosome de la levure réceptrice. I1 est ainsi possible d'utiliser un "bloc d'expression" complémenté par un fragment "d'ADN porteur". Ainsi, il sera démontré que l'intégration du bloc d'expression est dirigée dans les chromosomes de la levure par les extrémité des séquences d'ADN présentes dans le fragment à intégrer. Ce type de résultats a été obtenu pour d'autres systèmes (Orr-Weaver et coll., 1981). I1 est ainsi possible d'intégrer la séquence xylE dans n'importe quel point précis des 17 chromosomes de la levure, pourvu qu'on dispose d'un fragment d'ADN correspondant. Avec la même technologie, il est possible d'intégrer plusieurs copies du bloc d'expression en répétant l'expérience avec différents fragments d'ADN"porteurs". Ceci aboutira à une meilleure expression du gène xylE sans instabilité appréciable. La présente invention concerne également les souches de levures transformées par les vecteurs décrits ou comportant un ou plusieurs "blocs d'expression" intégrés dans leurs chromosomes. Parmi les souches utilisables, en particulier avec les éléments du gène URA3+, il faut citer les souches de Saccharomyces telles que S. cerevisiae, S. uvarum, S. carlsbergensis, S.diastaticus, mais également Schizosaccharomyces pombe (Chevallier et coll., 1982). Les souches ainsi obtenues peuvent être utilisées pour la préparation de la catéchol oxygénase. Une optimisation de tous les paramètres décrits précédemment doit permettre d'atteindre des rendements en enzyme compatibles avec les impératifs commerciaux. Les cellules de levure peuvent être cultivées aisément en grande quantité sur des substrats bon marché (moûts, mélasses). Les cellules sont facilement extractibles du milieu par simple décantation. l'enzyme peut être extraite des cellules en broyant les cellules avec des techniques connues. Les utilisations de la catéchol 2,3-oxygénase dans les procédés chimiques, alimentaires, agriculturaux et pharma cologiques ont été décrites notamment dans le brevet français nO 82 01574. Les points essentiels spécifiques de la levure pour cette production restent le savoir faire industriel lié aux levures et la non pathogénicité des souches. Mais, la présente invention permet également le marquage de souches de levures grâce au changement de coloration du catéchol en présence de la C 2,3-0 produite. Comme cela sera démontré, la vaporisation d'une sous tion 0,5 M de catéchol sur des colonies exprimant le gène xylE aboutit au développement d'une couleur jaune intense sur celles-ci. Cette propriété peut être utilisée pour détecter les clones de levures ayant été transformées par le gène xylE. Cette technique peut avantageusement remplacer le test de la ss-lactamase (Reipen, 1982) à cause de sa manipulation beaucoup plus aisée. Avec l'intégration de gènes xylE dans les chromosomes de la levure, un marquage permanent peut être obtenu. Il est intéressant de noter que le caractère étant dominant, ce marqueur peut être utilisé dans les souches industrielles polyploldes, voire même celles dont on ignore tout de la structure génétique. Il est également important de noter que la. colora- tion n'est pas létale pour les colonies et que celles-ci peuvent être normalement repiquées après le test. Ce type de marquage des souches peut être exploité dans le contexte de fermentation mixte. Une des souches peut être ainsi marquée et suivie aisément dans la population complexe des cuves de fermentation. Ce type d'étude trouvera une application majeure dans l'étude de la vinification où la population levurienne et son évolution est encore très mal connue. Son intérêt en génétique des populations au niveau de la recherche est également évident. Les propriétés chromogènes de la C 2,3-0 peuvent, en outre, trouver des applications dans le clonage et l'expres- sion de gènes autres que le gène xylE. Ainsi, on peut couper le gène à l'intérieur de la séquence codante, après le codon initiateur ATG. Ceci fournit un fragment qui peut être fusionné avec n'importe quel autre gène. Cette fusion peut également être réalisée avec le fragment contenant quelques paires de bases avant l'ATG initiateur. La création d'une protéine hybride ayant des propriétés chromogènes peut aboutir à une méthode rapide et efficace de mesure de la production de l'autre part de la protéine. En effet, de nombreuses molécules produites par le génie génétique sont très difficilement dosables (interférons, facteurs de coagulation, molécules antigéniques, etc.). La substitution de ces tests couteux en argent et en temps par le simple test coloré ou enzymatique de l'enzyme décrit peut être un net avantage dans de nombreux cas. Une autre modification déjà proposée pour les systèmes viraux et bactériens (brevet français nO 82 01574) consiste à introduire dans la région codante du gène xylE un petit fragment d'ADN comportant quelques sites de clonage. L'introduction d'un nouveau fragment, assez important, d'ADN dans ces sites détruira le gène xylE, aboutissant à la perte du marqueur jaune. Ce système permet de reconnaitre immédiatement les molécules recombinantes et évite les recherches fastidieuses chez la levure des structures d'ADN particulières. En fait, on utilisera dans ce cas de préférence un plasmide comportant au moins un site unique de restriction situé de façon telle que l'insertion d'un fragment d'ADN dans ce site inhibe la synthèse de la C 2,3-0. Enfin, la mise en évidence des propriétés fluorescentes de la C 2,3-0 ouvre des perspectives considérables au niveau industriel pour automatiser les applications précédentes. Avec une optimisation appropriée, les cellules contenant ou pas le gène xylE pourraient être comptées directement sous le microscope à fluorescence sans devoir attendre le développement de colonies. Ceci peut amener à une technique d'analyse en "temps réel" des fermentations complexes, l'observation des cellules au microscope à fluorescence ne prenant que quelques minutes. Pour des études automatisées, l'utilisation de "cell counters" équipés pour la fluorescence (Falaiya et coll., 1979) peut permettre des études extrèmement précises sur des populations importantes. En recherche fondamentale, l'étude des phénomènes génétiques liés aux plasmides peut être abordée directement sur les cellules elles-mêmes et non sur les clones dérivés de celles-ci, ce qui jusqu'à présent n'était pas réalisable par les marqueurs connus. Bien entendu, la présente invention peut être utilisée à des fins de recherches plus fondamentales ou à titre didactique. Ainsi, ce système peut être utilisé comme "sonde" pour les fonctions de terminaison et de promotion. Ou bien, si on couple les mutations rouges mendeliennes (ade-) avec la ségrégation typiquement non mendelienne du système xylE sur un vecteur autoreplicatif, il est aisé et spectaculaire de démontrer les deux types de ségrégation dans une même expérience. Un tel système répond en outre aux impératifs particuliers de l'enseignement : simplicité, prix de revient peu élevé, reproductibilité, clarté. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparattront dans les exemples ci-après qui se réfèrent, en tant que de besoin; aux figures annexées sur lesquelles la figure 1 schématise une stratégie de clonage du gène xylE "nu" la figure 2 schématise la construction d'un bloc d'expression la figure 3 schématise la stratégie permettant d'obtenir un vecteur autoréplicatif portant le gène xylE la figure 4 schématise la construction d'une levure contenant un bloc d'expression intégré dans le chromosome la figure 5 représente le dosage de l'activité de C 2,3-0 dans un extrait brut de levure . la figure 6 représente la cinétique d'action de C 2,3-0 produite par la levure . la figure 7 représente une comparaison des activités de la C 2,3-0 de levure et de E. coli en fonction du pH. EXEMPLE 1 Construction du bloc d'expression nécessaire au fonctionnement du gène dans la levure a) Clonage du gène xylE "nu" (figure 1) Le point de départ de cette construction est le phage M13mp9 (commercialisé par la société N.E. Biolabs - U.S.A.) dans lequel le gène xylE est cloné sous forme d'un fragment SalI/SalI. Ces sites ont été décrits dans le brevet français nO 82 01574. Comme il est décrit dans la figure 1, ce phage contient un site PstI unique situé en aval de la séquence codante du gène xylE. Ce site sera utilisé comme point terminal du gène "nu". Si on considère à présent le début du gène, on doit, comme cela a été précisé précédemment, enlever la plus grande partie de l'ADN située en amont du codon initiateur ATG. A cette fin, les 4 sites HgiDI présents sur la structure sont à analyser. Le premier à gauche (HgiDI (O)) se trouve sur l'ADN du phage lui-même. Pour une raison inconnue, ce site n'est pas coupé par l'enzyme HgiDI dans les conditions de travail. Les 3 autres sites sont situés dans les séquences d'ADN provenant de Pseudomonas. Le premier, loin en amont du départ de traduction (ATG) ne présente pas d'intérêt. Le second (HgiDI (2)) est situé juste avant l'ATG du gène XylE (en fait 4 paires de bases en amont). I1 peut donc être utilisé comme extrémité proximale du gène xylE "nu" car aucun ATG n'est présent dans ces 4 paires de bases. Le dernier site (HgiDI (3)) se trouve à l'intérieur du gène et, s'il est coupé, va détruire la structure du gène. Dans le but de produire un fragment HgiDI (2)/PstI contenant en entier le gène xylE "nu", on fait une digestion partielle de 30 Wg du clone M13xylE décrit ici (1 unité d'enzyme par pg d 'ADN dans 60 p1 de tampon contenant 5 pg/ml de bromure d'éthidium à 370C pendant environ 2 heures). Le mélange obtenu est extrait au phénol puis avec un mélange de chloroforme-alcool isoamylique (24:1) (mélange dit "Sevag"), précipité à l'alcool et resuspendu dans un tampon approprié. Une digestion totale par l'enzyme PstI est effectuée sur cette solution. Le mélange de digestion est ensuite analysé par électrophorèse sur gel d'agarose 1 % et résolu en ses différents fragments. la taille de ces fragments d'ADN peut toujours être expliquée par la double digestion décrite ci-dessus. Parmi eux, le fragment de 1,1 kilobase (kb), théoriquement limité par les sites HgiDI (2) et PstI, est isolé du gel grâce à la technique de Girvitz (1980). Afin d'obtenir ce fragment plus facilement et en grande quantité, si cela est nécessaire, il est cloné de la manière décrite ci-dessous Le plasmide pRG5 (Loison et coll., 1981) est un dérivé de PBR322 qui contient une insertion de 2,5 kb dans son site HindIII. Ce fragment permet l'expression de la résistance à la tétracycline portée par pBR322. pRG5 est coupé par PstI et Clan, puis le gros fragment ainsi généré est isolé comme précédemment d'un gel d'agarose. Ce fragment est mélangé avec le gène xylE "nu" dont l'isolement vient d'être décrit, et le mélange est incubé une nuit à 15 C en présence de ligase du phage T4. Le mélange est utilisé pour transformer une souche d'E. coli suivant la technique au chlorure de calcium (Maniatis et coll., 1982). La population bactérienne est étalée sur un milieu contenant de la tétracycline. Les clones tétracycline résistants obtenus ont été analysés quant à leur contenu en plasmide et le plasmide pTG820 en a été extrait. Le fait que les extrémités générées par HgiDI et ClaI sont complémentaires sur l'ADN permet la formation du plasmide pTG820. Si on coupe celui-ci par les enzymes PstI et HindIII, on libère un fragment de 1,1 kb contenant le gène xylE "nu" contenant 9 paires de bases entre le codon initiateur ATG et l'extrémité HindIII. Ces 9 paires de bases ne contiennent aucun codon ATG. b) Construction du "bloc d'expression" (figure 2) Cette structure doit contenir, comme cela a été précédemment indiqué, un promoteur de levure en amont du gène xylE et un terminateur derrière ce gène. Le plasmide de base dans cette construction est le plasmide pTG802. I1 consiste en un plasmide dérivé de pBR322 sans site PstI, et dans le site HindIII duquel a été cloné le gène URA3 de levure. Le seul site PstI de pTG802 se situe dans la séquence d'ADN de levure, exactement 20 paires de bases avant le codon initiateur ATG du gène URA3. Ce plasmide est coupé par PstI et traité avec le fragment "Klenow" de l'ADN polymérase I, ce qui génère des extrémités franches à chaque bout du fragment. Le gène xylE "nu" est préparé comme décrit à l'exemple 1 par une digestion PstI et HindIII de pTG820. Le fragment de 1,1 kb est isolé d'un gel, traité également avec le fragment "Klenow" de la polymérase I et coprécipité avec pTG802 traité comme décrit précédemment. Le mélange est resuspendu dans le tampon ad'hoc et ligué comme décrit précédemment. La transformation d'E. coli et la sélection sur milieu contenant de l'ampicilline fournit des milliers de colonies. Le promoteur du gène URA3 fonctionne dans la bactérie E. coli. Comme la construction peut aboutir à une fusion entre le gène xylE et le promoteur, des clones bactériens produisant de la catéchol 2,3-oxygénase sont recherchés parmi les colonies résistantes à l'ampicilline. A cette fin, une solution de catéchol (0,5 M) est vaporisée sur les boites et quelques clones jaunes apparaissent. Des plasmides provenant de ces clones sont extraits et analysés. On peut démontrer que l'orientation du gène xylE est "correcte" dans ces plasmides, par rapport au promoteur de levure. Le plasmide pTG821 ainsi obtenu peut libérer par une simple coupure par HindIII un fragment de 2,2 kb qui contient dans l'ordre le promoteur du gène de levure URA3, . le gène xylE, et . le gène URA3 de levure qui a les fonctions de terminaison dans sa partie distale. Ce fragment H III/HindIII regroupe donc toutes les fonctions nécessaires à l'expression du gène xylE dans la levure et sera dénommé "bloc d'expression" par la suite. EXEMPLE 2 Construction d'une souche de levure portant le bloc d'expression sur un plasmide à réplication autonome (figure 3) L'introduction d'ADN étranger et l'utilisation des plasmides à réplication autonome dans les levures sont connues (Beggs, 1981), en particulier en utilisant des plasmides dérivés du "plasmide 2 pm" de levure. L'utilisation de structures dérivées du plasmide naturel de la levure, appelé "2 îim" présente comme avantages d'assurer une haute fréquence de transformation et un grand nombre de copies par cellule. Si le bloc d'expression est couplé avec ce type de plasmide, le grand nombre de copies du gène xylE peut permettre à la levure de produire une quantité notable de catéchol 2,3-oxygénase. Comme élément de base dans cette construction on utilise le plasmide pJDB207 (Beggs, 1981). Après coupure par l'enzyme HindIII, le grand fragment est isolé et mélangéavec le bloc d'expression lui-même sorti de pTG821 par coupure HindIII. Le mélange est ligué et utilisé pour transformer E. coli. On obtient des clones résistants à l'ampicilline et parmi eux de nombreux clones jaunes apparaissent au contact du catéchol comme décrit précédemment. L'un d'eux est cultivé et le plasmide qu'il contient est décrit dans la figure 3 (pJDB207-:lE). Ce plasmide comporte un marqueur de sélection pour la levure (gène LEU2), un système de réplication autonome pour la levure (2 pm), R R . un marqueur sélectif pour E. coli (Amp ou où Tet ), . un système de réplication autonome pour E. coli (oRi), le bloc d'expression xylE. Ce plasmide pJDB207-xylE est utilisé pour transformer une souche de levure (leu ). Les cellules ayant reçu le plasmide sont sélectionnées sur un milieu sans leucine. Des milliers de colonies sont obtenues ainsi et pratiquement toutes expriment le gène xylE en produisant de la catéchol 2,3-oxygénase. EXEMPLE 3 Construction d'une souche de levure contenant le bloc d'expression intégré dans le chromosome V (figure 4) Si on transforme la levure avec un fragment d'ADN ne portant aucun système de réplication autonome, 1'ADN exogène peut se recombiner avec son homologue du chromosome de la levure réceptrice (Hinnen et coll., 1978). Cet évènement est cependant très rare. Il a été montré récemment que de l'ADN linéaire et non circulaire comme dans le cas des plasmides a la propriété de recombiner beaucoup plus fréquemment avec le chromosome. D'un autre côté, pendant l'évènement de transformation, chaque cellule "prend" dans le milieu un grand nombre de molécules d'ADN (Beggs, 1981). Ces deux éléments ont permis de mettre au point la stratégie décrite ci-dessous afin d'intégrer le bloc d'expression dans le chromosome V de la levure. 30 in du plasmide pTG820 sont traités par HindIII pour libérer le bloc d'expression, puis traités avec le fragment "Klenow" de la polymérise I pour éviter toute reconstitution de la molécule. A ce mélange on ajoute 5 pg de plasmide pJDB207 intact. Ce mélange est utilisé pour transformer une levure (leu2 ), en sélectionnant sur 2 milieu sans leucine, mais contenant de l'uracile. En effet, si le bloc d'expression s'intègre à la place du gène URA3 endogène de la levure, celle-ci va devenir auxotrophe pour l'uracile et aura besoin de ce composé dans le milieu de culture pour se développer. La transformation aboutit à des milliers de clones. 200 d'entre eux sont analysés pour voir s'ils sont devenus (ure ) pour la raison décrite ci-dessus. Des analyses génétiques ultérieures ont montré que pour l'une de ces souches elle était bien (ure) comme prévu. Une recherche de l'enzyme catéchol 2,3-oxygénase dans cette souche particulière s' avère toutefois négative. On sélectionne alors un grand nombre de souches (ura ) parmi la population obtenue précédemment. Pour ce faire, on utilise une sélection positive des cellules recher chées en les étalant sur un milieu contenant de l'uracile et du 5-fluoro-orotate (10'2 M). Les colonies qui croissent sur ce milieu sont génétiquement (ure) (cette technique a été transmise par F. Lacroute à Strasbourg). De cette façon, on isole une centaine de souches (ure). Parmi celles-ci 4 produisent une très faible quantité de catéchol 2,3-oxygénase. EXEMPLE 4 Test coloré sur les colonies et les cellules La souche précédemment décrite dans l'exemple 2, qui contient le gène xylE sur un plasmide à réplication autonome, est analysée dans l'optique de la coloration in situ. Premièrement, une population cellulaire de cette souche est étalée sur un milieu permettant le maintient du plasmide, c'est-à-dire un milieu dépourvu de leucine. Après croissance des colonies (3 jours à 280C), les bottes de Pétri sont vaporisées avec une solution de catéchol (0,5 M dans l'eau). Après quelques minutes à température ambiante ou à 280C, les colonies deviennent jaunes foncés. La coloration persiste sur la colonie même après plusieurs jours à température ambiante. Aucune diffusion appréciable de la couleur n'apparatt. Le pH bas (environ 5) du milieu évite le brunissement de la botte de Pétri, ce qui se passe pour des pH voisins de 7. De la même manière, une population mixte contenant des cellules contenant le plasmide pJDB207-xylE et des cellules ne le contenant pas est étalée, après croissance des colonies, le même test de coloration (vaporisation de catéchol) est réalisé. on observe que les deux sortes de colonies (avec et sans gène xylE) sont très nettement différenciées par la couleur. Il est connu (Beggs, 1981) que le type de plasmide utilisé n'est pas stable dans la levure en condition non sélective, c'est-à-dire en présence de leucine dans le milieu. La souche originale contenant le plasmide pJDB2O7-xylE est cultivée 3 jours dans des conditions non sélectives puis étalée sur milieu également non sélectif. Après croissance des colonies, on effectue le test de coloration. On peut observer, malgré la non sélectivité du milieu, une majorité de clones jaunes contenant encore le plasmide et des clones blancs l'ayant perdu. De plus, un examen attentif des colonies permet de voir une hétérogénéité dans l'intensité de la couleur. Certaines sont claires3 d'autres plus foncées. Une analyse rapide de chacune des classes de couleur montre que plus une colonie est intensément colorée3 plus le pourcentage de cellules (à l'intérieur de cette colonie) contenant le plasmide est élevé. EXEMPLE 5 Dans une seconde-étude, il faut considérer précisément la technique de transformation des levures (Hinnen et coll., 1978). La dernière étape consiste à envelopper les protoplastes de levure dans une couche d'un gel d'agarose. Ces protoplastes régénèrent en cellules qui donnent naissance à de très petits clones inclus à l'intérieur de la gélose. Si du catéchol est vaporisé sur de telles boites, il diffuse rapidement dans la couche de gélose et les petites colonies lenticulaires deviennent jaunes. L'examen de telles bottes sous une loupe binoculaire (grossissement 100 fois) permet une claire reconnaissance des micro-colonies jaunes. Enfin, la même préparation peut être examinée grâce à un microscope à fluorescence. Dans ce cas la différenciation est encore plus nette car les clones exprimant le gène xylE fluorescent nettement sous le rayonnement ultraviolet, alors que ceux qui ne l'expriment pas restent noirs et donc invisibles sur le champ d'observation. Une recherche extrème ment -efficace peut ainsi être effectuée sur des colonies très peu développées. On peut également utiliser un grossissement supérieur (400 fois) et observer que les cellules elles-mêmes sont fluorescentes. Une autre propriété intéressante des cellules a pu être mise en évidence.Les souches normales de levure ne sont intoxiquées par le catéchol qu'à des doses très importantes, supérieures à 10 mM ; or, les souches décrites ici, qui expriment le gène xylE, montrent une hypersensibilité au substrat, aucune croissance n'apparaissant au delà de 1 mM. Ainsi, il est possible de coupler un test de développement avec le test coloré, comme c'est le cas pour les souches (ade) précédemment citées. EXEMPLE 6 Les essais suivants sont effectués avec les souches décrites à l'exemple 3 qui contiennent le bloc d'expression du gène xylE intégré dans le chromosome V. La différence essentielle avec la souche contenant ce bloc sur un plasmide à réplication autonome est que le gène est ici présent en une seule copie, contre 30 à 50 sur Ie plasmide. On attend donc une activité enzymatique par cellule 30 à 50 fois plus faible. La vaporisation de catéchol sur ce type de souches, ne contenant qu'une seule copie du gène, ne permet pas de voir apparaître une coloration jaune directement. Ceci est sans doute du à la trop faible activité enzymatique des cellules. Par contre, un traitement détruisant les cellules grâce à l'action (1 heure, ?70C, 1 mg/ml) de l'enzyme Zymolase 60 000OR (Miles Laboratory) suivi d'une incubation in situ des colonies dans du tampon approprié (phosphate, pH 7, 0,1 M) contenant 0,1 M de catéchol permet de révéler une coloration jaune des colonies exprimant ce gène. Afin d'aboutir à une plus forte expression, on peut envisager la modification du bloc d'expression qui permettra sans aucun doute la réalisation du test simple sur les colonies intactes. Une autre solution peut être de chercher des mutants exprimant xylE suffisamment par la simple recherche de clones jaunes après mutagénèse. Enfin, un enrichissement de ce type de souches peut être effectué grâce à la nystatine, comme on peut s'en rendre compte au vu du phénotype de sensibilité au catéchol mis en évidence à l'exemple 5. EXEMPLE 7 Afin de quantifier le phénomène macroscopique de coloration, des tests biochimiques ont été effectués. Environ 3 g de cellules cultivées en milieu sans leucine sont récoltées, lavées dans du tampon phosphate, 0,1 M, pH 7, contenant 10 % d'acétone (Zukowski et coll., 1983) puis broyées grâce à des billes de verre dans ce même tampon. Après centrifugation (40 000 g, 30 minutes) l'extrait cellulaire est testé quant à son activité enzymatique catéchol 2,3-oxygénase dans les conditions standards (Zukowski et coll., 1983). Les résultats de ce dosage sont donnés dans la figure 5 qui donne l'activité, une cinétique typique est présentée par la figure 6. Le calcul de l'activité spécifique de l'enzyme aboutit à une activité de 25 mUnités/min/mg de protéines. Ce chiffre est extrèmement faible comparé à ceux obtenus d'autres organismes : E.coli ou B. subtilis. Il est remarquable que si peu d'activité mène à-un test macroscopique sur colonie si prononcé. On effectue ensuite une étude de la cinétique de l'enzyme issue de la levure en fonction du pH pour la comparer à celle issue de E.coli. Les résultats (figure 7) montrent que les deux enzymes se comportent de manière identique, indiquant par là que la catéchol 2,3-oxygénase fabriquée par la levure a essentiellement les mêmes propriétés que celle fabriquée par les autres organismes. Références Beggs J. (1981) in Genetic Engineering, vol. 2, P.175-203 Ed. R. Williamson - Academic Press. Chevallier M.R., Lacroute J.F. (1982), The Embo Jl 1, 3, p.375-377. De Louvencourt L., Wesolowski M., Fukuhara H., Heslot H. (1982) in The proceeding of the XI International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, p.48. Dobson M.J., Tuite M.F., Roberts N.A., Kingsman A.J. and Kingsman S.M. 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Speck D., Kruffmann M., Findeli A., Wisecup A., Lecocq J.P. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, p.1101-1105. REVENDICATIONS 1) Bloc d'expression de la catéchol 2,3-oxygenase dans une levure, caractérisé en ce qu'il comporte selon le sens de lecture et avec l'orientation correcte, au moins . un promoteur de levure, le gène xylE, et . un terminateur de levure. 2) Bloc d'expression selon la revendication 1, caractérisé en ce que le promoteur et le terminateur sont le promoteur et le terminateur du gène URA3+ dans Saccharomyces cerevisiae. 3) Bloc d'expression selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le gène xylE est inséré dans le site PstI du gène URA3. 4) Bloc d'expression selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est limité par deux sites HindIII. 5) Plasmide caractérisé en ce qu'il comporte un bloc d'expression selon l'une des revendications 1 à 4 et un système de réplication autonome pour la levure. 6) Plasmide selon la revendication 5, caractérisé en ce que le système de réplication autonome est celui du plasmide 2 pm de levure. 7) Plasmide selon l'une des revendications 5 et 6, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, un marqueur de sélection pour la levure. 8) Plasmide selon la revendication 7, caractérisé en ce que le marqueur de sélection est le gène LEU2. 9) Plasmide selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, un système de réplication autonome pour une bactérie. 10) Plasmide selon la revendication 9, caractérisé en ce que le système de replication autonome dans une bactérie est celui du plasmide pBR322.. 11) Plasmide selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisé en ce qu'il comporte un marqueur sélectif pour une bactérie. 12) Plasmide selon la revendication 11, caractérisé en ce que le marqueur sélectif pour une bactérie est un gène de résistance à un antibiotique. 13) Plasmide selon l'une des revendications 7 à 12, caractérisé en ce qu'il comporte au moins . le promoteur du gène URA3, . le gène xylE, . le terminateur du gène URAS, . l'origine de replication de pBR322, . le gène de résistance à l'ampicilline, . le gène LEU2, tout ou partie du plasmidé 2 pm. 14) Plasmide selon l'une des revendications 7 à 13, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un site unique de restriction situé de façon telle que l'insertion d'un fragment d'ADN dans ce site inhibe la synthèse de la catéchol oxygénase. 15) Plasmide selon la revendication 14, caractérisé en ce que ce site unique de restriction est situé dans le gène xylE. 16) Plasmide selon l'une des revendications 14 et 15, caractérisé en ce qu'il comporte dans le site unique de restrition l'ADN codant pour une protéine. 17) Souche de levure transformée par un plasmide selon l'une des revendications 5 à 16. 18) Souche de levure caractérisée en ce qu'elle comporte un bloc d'expression selon l'une des revendications 1 à 4 incorporé sur son chromosome. 19) Souche selon l'une des revendications 17 et 18, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de Saccharomyces ou de Schizosaccharomyces. 20) Souche selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de Saccharomyces cerevisiae. 21) Catéchol 2,3-oxygénase obtenue par fermentation d'une souche selon l'une des revendications 17 à 20. 22) Application des blocs d'expression selon l'une des revendications 1 à 4 et des plasmides selon l'une des revendications 5 à 16 à titre de marqueurs colorés dans les levures par intégration des blocs d'expression sur les chromosomes desdites levures ou par transformation desdites levures par les plasmides et detection de la catéchol2,3-oxygénase produite. 23) Application selon la revendication 22, caractérisée en ce que la souche de levure marquée est une souche de levure utilisée en vinification. 24) Application selon l'une des revendications 22 et 23, caractérisée en ce que la détection est effectuée par mesure de la fluorescence des souches produisant la catéchol 2,3-oxygénase. 25) Application selon l'une des revendications 22 et 23, caractérisée en ce que la détection est effectuée par pulvérisation des souches par du catéchol et observation d'une coloration jaune pour les souches produisant de la catéchol oxygénase.