FR 2538252 A1 19840629 FR 8221817 A 19821227 Fraction polypeptidique de poids moléculaire moyen 100.000 inductrice d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme et compositions immunogènes les contenant. L'invention concerne des fractions polypeptidiques inductrices d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme, ainsi que des compositions immunogènes les contentant, susceptibles de conduire à la production de vaccins pour l'homme et l'animal. Ellé est également relative aux anticorps spécifiques induits in vivo par ces fractions. Les fractions polypeptidiques selon l'invention présentent les caractéristiques suivantes celles possèdent une masse moléculaire moyenne de l'ordre de 100.000 (mesurable dans un système de migra tion électrophorétique et par comparaison aux migra tions dans des conditions semblables de peptides mar qués, notamment à lsisothyocyanate de fluorescéine, et de poids moléculaires connus, plus particulièrement des IgG humaines, la sérumalbumine bovine (BSA) et l'oval bumine de poulet) ; - elles sont reconnues par des anticorps actifs à l'égard de Plasmodium falciparum et par des anticorps monoclo naux ou polyclonaux formés contre elles-memes ;; - elles peuvent etre mises en évidence par l'ineorpora tion métabolique d'acides aminés marqués, par exemple la méthionine 35S ; - elles sont inductrices notamment chez le singe, et plus particulièrement le singe SAIMIRI SCIUREUS, d'anti corps actifs contre des parasites du paludisme, plus particulièrement de Plasmodium falciparum ou des para sites qui présentent les mêmes caractéristiques biolo giques essentielles. En particulier les fractions polypeptidiques selon l'invention sont reconnues par des sérums ou des fractions immunoglobulines provenant d'animaux, notamment de singes SAIMIRI SCIUREUS, résistants au parasite et susceptibles de rendre résistants des animaux sensibles au parasite. Plasmodium falciparum est bien connu des spécialistes. Les schizontes et les mérozoltes de ce parasite ont déjà été utilisés pour réaliser des vaccins expérimentaux contre la malaria, notamment chez le singe (MITCHELL et als (1977) Lancent, i, 1335 et SIDDIQUI, W.A. (lu77) Science. 197, 388 (1977)). Ce dernier article intitulé "An effective immunization of experimental monkeys against the human malaria parasite, Plasmodium falciparum" peut être considéré comme témoignant un caractère si Snificatif vis-à-vis de l'homme des résultats biologiques susceptibles d'etre observés chez le singe. Il en est de meme des résultats susceptibles d'etre observés avec les fractions polypeptidiques de l'invention. Celles-ci ont été obtenues à partir d'une souche de Plasmodium falciparum qui a fait l'objet d'un dépôt à la Collection Nationale des Cultures de Micro Organismes de l'INSTITUT PASTEUR de Paris (C.N.C.M.) sous le nO FUPC I-212 le 23 décembre 1982. Par'l'expression 'gpolypeptide", il faut entendre tout constituant peptidique ou protéique, notamment du type protéine ou glycoprotéine, tels que ceux susceptibles de provenir de Plasmodium falciparum ou de parasites qui en sont dérivés. L'invention concerne encore des préparations immunogènes contenant lesdites fractions en association avec un véhicule du type de ceux qui sont utilisés dans les compositions de vaccins, ces préparations immunogènes étant aptes à conduire à la production de vaccins effi caces contre le paludisme, plus particulièrement du type de celui qui est induit par Plasmodium falciparum ou de parasites apparentés. L'invention concerne encore un procédé d'obten tion de telles fractions immunogènes. Ge procédé consis te à traiter une préparation préalablement obtenue de Plasmodium falciparum avec une solution d'un détergent, tel que le Sodium Dodenyl Sulfate (SDS) celui connu sous la désignation commerciale TRITON XlOO,ou analogue, suscep tible d'induire la dissolution de la majeure partie des structures cellulaires et des constituants protéiques du parasite, de récupérer et de séparer à partir de ce milieu ceux des polypeptides qui présentent un poids molé culaire moyen de l'ordre de 100.000daltons, qui sont suscepti bles de réagir avec des anticorps (sérums ou fractions d'immunoglobulines) originaires d'animaux résistants à Plasmodium falciparum et, le cas échéant, d'être marqués par la méthionine 3 Des caractéristiques supplémentaires de l'inven tion apparaitront encore au cours de la description qui suit d'un exemple de production de fractions polypepti diques selon l'invention, à partir d'une culture de para sites, et des propriétés biologiques de ces fractions. Culture des parasites et préparation. Les parasites sont cultives sur globules rouges humains de groupe Ads dans du milieu RPMI 1640 (FLOBIO) additionné de 10 % de sérum humain du même groupe, sous une atmosphère contenant 1 % p2, 3 % CO2, 96 % N2 (% en volumes). Les cultures sont synchronisées au stade "anneaux", tel que défini dans l'article de Science 1976, 193, 673S par traitement au sorbitol (LA?4BROS 1979, vol. 55,p. 418 J. oî Parasitology). Elles sbnt récoltées 40 heures plus tard, lorsque les parasites atteignent le stade de schizontes mûrs, à 8 noyaux en moyenne. Les globules rouges sont lavés par centrifugation en RPMI 1640 et lysés par action de la Saponine à 0,025 % -en RP1NLI (% en poids), en présence d'inhibiteurs de protéases 'tPXSF', 1,TLCK" (SIGMA) 10 10-j M, pendant 10 minutes à 370C. Les parasites libres sont purifiés par centrifugation dans un gradient discontinu en PBS comportant 40 à 70 % de PERCOLL (PHARMACIA)g pendant 30 minutes à 4 C. L'interface 40-70 % est récoltée par pipettage et lavée deux à trois fois en PBS. Préparation des protéines semi-purifiées Les parasites sont traités par 5 à 10 volumes de tampon pour électrophorèse, contenant 6 % en poids de SDS et 10 % de ss-mercapto-éthanol (ou d'un agent analogue susceptible de couper les ponts du sulfure des protéines et de linéariser les chaînes polypeptidiques), deux fois pendant 5 minutes à 1000 C. Les extraits sont centrifugés 5 minutes à 15.000 g, les surnageants (contenant plus de 90 % des protéines totales initialement contenues dans les parasites) sont soumis à une électrophorèse (pendant 4 heures sous 200 V) en gel contenant 10 % en poids/volume d'acrylamide au sein d'un tampon Tris aqueux (d pH 8-9) contenant 0,2 % de SDS (en poids/volume). Après électrophorèse, des bandes de gels sont coupées aux niveaux-correspondants aux poids moléculai- res 100.000 - 10.000 daltons repérés sur le gel par électrophorèse simultanée de peptides marqués à l'isothyocyanate de fluorescéine (IgG humaines, BSA et ovalbumine). Les polypeptides sont élués à partir des bandes de gel par électrophorèse dans un tampon sans SDS, et récoltés dans un sac à dialyse. La concentration en protéines est déterminée par dosage colorimétrique des protéines ("Biorad assay",test commercialisé par BIORAD et décrit par SPECTOR, Analytical Biochemistry, 1978 > 86, 142). Les préparations sont analysées par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS et révélées par coloration au nitrate d'argent. On peut ainsi séparer encore - 6 bandes majeures dans les zones de poids moléculaires 40.000, 45.000, 100.000, 110.000, 115.000 et 130.000, parmi un ensemble complexe étendu s'étageant entre 83.000 à 14D.OOO. Des produits de dégradation mineurs de cette bande de 100.000 sont vus dans les zonès 33.000 et 45.000 daltons. Les propriétés biologiques de cette fraction, qu'il s'agisse de l'ensemble de-la fraction de poids moléculaire moyen 100.000 (ou 100.000 tri0.000) ou des fractions protéiques davantage purifiées qui peuvent être isolées à partir des dernières bandes susmentionnées, peu-vent être mises en évidence comme décrit ciaprès en rapport avec la fraction globale. Essai d'immunisation de singes SAIMIRI SCIUREUS Les résultats d'immunisation susceptibles d'être observés dans ces primates sont particulièrement représentatifs de ce qui pourrait être obtenu de façon semblable chez l'homme. Ces animaux peuvent être davantage encore rendus sensibles à l'infection parasitaire par splenec- tanlie l'infection se développe rapidement chez des singes splénectomisés. Elle se manifeste par des parasitémies importantes (50 % environ de leurs globules rouges pouvant être parasités). Les animaux splénectomisés et impaludés meurent au bout d'une duré de l'ordre de 10 jours. Les essais qui suivent ont été réalisés chez des animaux splénectomisés répartis respectivement en deux groupes de 5 et 10 singes. Les animaux du premier groupe sont inoculés trois fois avec chaque fois une dose de 100 pg de la préparation diluée dans 0,5 ml de PBS émulsionnée avec un volume égal d'adjuvant de Freund,complet pour la première inocu lation, incomplet pou, les deux suivantes. Ces inoculations se font à trois semaines d'intervalle, sous la forme d'injections sous-cutanées. Les singes du deuxième groupe (témoins) ne re çoivent qe les adjuvants. Trois semaines après la troisième immunisation, les animaux sont infectés avec 50 x 106 globules rouges parasités,par voie intraveineuse. La parasitémie est ensuite contrlée chaque jour pendant trois semaines. On observe tout de suite un important retard de la multiplication parasitaire chez ceux des animaux qui ont été immunisés. 15 jours plus tard, la proportion de~globules rouges parasités chez les animaux immunisés est inférieure à 10 %, alors que chez le groupe témoin 5 jours après la dernière injection la parasitémie est de plus de 25 %. Ces resultats sont hautement significatifs, compte tenu du caractère splénectomisé des animaux. Des résultats semblables peuvent être obtenus avec des fractions davantage purifiées encore; Les fractions peptidiques selon l'invention constituent tout d'abord des réactifs biologiques particulièrement intéressants en ce qu'ils sont actifs in vivo. Ils peuvent être utilisés comme référence de mesure de l'acti- vité in vivo d'autres préparations immunogènes obtenues à partir de parasites responsables des diverses formes de paludisme. L'invention concerne encore plus particulièrement les compositions vaccinantes contenant lesdites fractions polypeptidiques en association, comme on l'a déjà indiqué, avec les divers véhicules pharmaceutiques et/ou agents adjuvants couramment utilisés dans les compositions de vaccins. De préférence, lfinvention concerne des solutions injectables desdites fractions polypeptidiques. Les fractions polypeptidiques selon l'invention peuvent encore être utilisées pour la fabrication d'anticorps plus spécifiques à l'égard de Plasmodium-falciparum que les sérums ou fractions purifiés d'immunoglobulines susceptibles d'être obtenus à partir d'animaux devenus résistants. Avantageusement, on aura recours pour la fabrication de ces anticorps plus spécifiques à la technique de fabrication des hybrides cellulaires ou hybridomes,comportant alors les étapes essentielles suivantes (susceptibles d'être mises en oeuvre selon des techniques aujourd'hui connues ) : ) - fusion de cellules myélomateuses et de cellules splé niques de souris ou de rat, voire de singe, ayant au préalable été immunisées avec les fractions peptidiques sus-définies - sélection parmi les hybridomes formés de ceux qui sécrè- tent des anticorps monoclonaux actifs contre les susdites fractions polypeptidiques. Ces anticorps plus spécifiques, particulièrement ces anticorps monoclonaux, peuvent alors être à leur tour utilisés, par exemple pour constituer des colonnes de chromatographie d'affinité. Une telle colonne est par exemple obtenue par fixation de ces anticorps monoclonaux sur la résine commercialisée par PHARMACIA sous la marque SEPHARO SE par la méthode bien connue au bromure de cyanogène. Ces colonnes de chromatographie d'affinité peuvent alors à leur tour être utilisées pour réaliser la séparation de fractions polypeptidiques immunogènes, que ce soit à partir-de solutions obtenues à partir de préparations de par rasites traités avec des agents dissolvants, du genre-de ceux qui ont été mentionnés plus haut, ou à partir de fractions déjà concentrées et dont un état de plus grande pureté est recherché. Comme il va de soi et comme il résulte d'ail-leurs déjà de ce qui précède, lginvention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes, notamment celles dans lesquelles les factions immunogènes de poids moléculaire moyen de 100.000 sont obtenues à partir de parasites distincts de Plasmodium falciparum, mais qui en possèdent les propriétés biologiques essentielles. L'invention s'étend encore à celles des fractions polypeptidiques qui peuvent être obtenues à partir de parasites qui peuvent être eonsi- dérés comme des dérivés ou même encore des mutants de Plasmodium falciparum.Notamment sont inclus dans le cadre des revendications tous les polypeptides -immunogènes ayant un poids moléculaire moyen de l'ordre de 100.000, qui sont reconnus par des anticorps protecteurs, obtenus à partir d'animaux résistants à la souche de Plasmodium falciparum déposée à la C.N.C.M. sous le nOFUPC I-212 le 2)décembre 1984 et plus particulièrement encore les anticorps protecteurs plus spécifiques susceptibles d'être obtenus à partir des animaux immunisés avec les polypeptides de poids molécu laire moyen de l'ordre de100000 issus de cette même souche ou à partir des hybridomes formés dans les condi tions qui ont également été indiquées, en mettant en oéu vre, pour l'immunisation des animaux donneurs des celui lules spléniques requises, lesdits polypeptides issus de ladite même souche. D'une façon générale, on pourra,à partir d'une préparation donnée de parasites, déterminer ceux des constituants protéiques susceptibles d'induire in vivo la production d'anticorps protecteurs en procedant comme suit. On part d'une culture du parasite étudié préalablement réalisée au sein d'un milieu de culture contenant un marqueur radioactif spécifique des constituants protéiques des parasites en question, tel que la méthionine 355 Les constituants parasitaires sont alors recueillis et traités comme il a été décrit plus haut en ce qui concerne Plasmodium falciparum, mais en vue de dissoudre la majeure partie des constituants cellulaires et protéiques du parasite choisi, sauf que l'on utilise le détergent TRITON X100 en lieu et place du SDS. Le TRITON X100 solubilise en effet les protéines antigéniques sans altérer profondément leur structure, de sorte qu'elles peuvent toujours encore être reconnues par des anticorps. On procède alors aux séries d'opérations suivantes. Première série d'opérations a) On fait une électrophorèse d'un échantillon de l'ensemble des constituants protéiques des parasites. On obtient toute une sériede bandes visualisables par autoradiographie. Par comparaison avec des protéines dont les poids moléculaires sont connus, on détermine les successions de poids moléculaires, par rapport aux migrations réalisées de façon concommittante par des peptides de poids moléculaires connus. b)Partant d'un échantillon distinct desdits constituants protéiques (il s'agitez toujours de la préparation marquée, on le fait réagir avec les anticorps provenant d'un singe résistant au parasite ; on fait ensuite réagir l'ensemble avec la protéine A du staphylocoque doré (préparation commerciale). On sépare par centrifugation le précipité formé,qui contient un complexe protéine A - anticorps - antigène radioactif. Après lavage du précipite, on le redissout en présence de SDS. Celui-ci dissocie l'antigène de l'anticorps et de la protéine A. On resoumet l'ensemble à électrophorèse et on repère les bandes marquées, en nombre plus réduit que dans le cas précédent, ainsi que leurs poids moléculaires respectifs. Deuxième série~d'opérat~on~ : On répète l'ensemble des étapes a) et- b) cidessus, mais en utilisant cette fois-ci des anticorps provenant d'un singe sensible au parasite. Par comparaison des bandes obtenues sur les gels après les réactions avec les anticorps provenant d'animaux résistants, d'une part, etde celles obtenues après réaction avec des anticorps provenant d'animaux sensibles, d'autre part, on détermine celles -des bandes qui n'ont été obtenues qu'au terme de l'étape b) de la première serie d'opérations et leurs régions de poids moléculaires. Ces bandes contiennent des constituants pro télques reconnus préférentiellement par des sérums dlani- maux résistants et, de ce fait, les antigènes reconnus spécifiquement par des anticorps protecteurs. Troisième série d'opératIons On réalise enfin une nouvelle culture du même parasite, mais en l'absence du marqueur radioactif, et on procède à une nouvelle séparation électrophorétique de ses constituants protéiques dans les mêmes conditions que dans la première et deuxième série d'opérations. On teste ensuite la capacité des constituants ayant migré aux mêmes distances que ceux qui ont été reconnus par les anticorps à l'issue de la deuxième série d'opérations, à induire in vivo la production d'anticorps protecteurs,'et l'on recueille ceuxtde ces constituants qui ont induit une réaction immunologique positive, par exemple dans les mêmes conditions que celles évoqués précédemment à propos des constituants protéiques actifs de Plasmodium falciparum. Ces dernières entrent dé ce fait dans le champ des revendications ou constituent des équivalents des constituants protéiques qui ont plus particulièrement été revendiqués. REVENDICATIONS 1 - Fraction polypeptidique inductrice d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme qui présentent les caractéristiques suivantes - elles possèdent une masse moléculaire moyenne de l'ordre de 100.000 ; - elles sont reconnues par des anticorps dirigés contre Plasmodium falciparum et par des anticorps monoclonaux ou polyclonaux formés contre elles-mêmes - elles peuvent être mises en évidence par incorporation métabolique d'acides aminés marqués, par exemple la méthionine 35S ; - elles sont inductrices notamment chez le singe, et plus particulièrement le singe SAIMIRI SCIUREUS, d'anticorps actifs contre des parasites du paludisme, plus particulièrement de Plasmodium falciparum ou des parasites qui présentent les mêmes caractéristiques biologiques essentielles. 2 - Fraction polypeptidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente un poids moléculaire de l'ordre de 100.oxo +10.000. 3 - Fraction polypeptidique telle qu'elle peut. être isolée à partir de la fraction selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée par l'un des poids moléculaires moyens suivants 90.000-, 95.000, 100.000, 110.000, 115.000 et 130.000 daltons au sein d'un ensemble complexe s' étageant de 83.000 à 140.000 daltons. 4 - Procédé pour ltobtention des fractions polypeptidiques selon la revendication 1 ou la revendication 2,' eonsistant à traiter une préparation préalablement obtenue de Plasmodium falciparum avec une solution d'un détergent tel que le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)oucelui connu sous la désignation commerciale TRIT0i' X100,ou analogue, susceptible d'induire la dissolution de la majeure partie des structures cellulaires et des constituants protéiques du parasite, de réeupérerset de séparer partir de ce milieu ceux des polypeptides qui présentent un poids moléculaire moyen de l'ordre de 100 .000, qui sont susceptibles de réagir avec des anticorps (sérums ou fractions dtimmunoglo- bulines) originaires d'animaux résistants à Plasmodium falciparum et, le cas échéant, d'être marqués par la méthionine 35S. 5 - Fraction polypeptidique selon l'une quelconque des revendications 1 a 4, caractérisée en ce qu'elle est reconnue par les anticorps spécifiques préalablement formés contre les peptides immunogènes con brumes à l'une quelconque de ces revendications et tels qu'obtenus à partir de la souche déposée à la C.N.C.M. sous le nOFUPC 1-212. 6 - Préparation immunogène associant une fraction conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 4 avec un véhicule ou un excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins. 7 - Préparation d'anticorps spécifiques à l'égard des fractions polypeptidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 8 - Application à des fins de diagnostic de -la fraction selon l'une des revendications 1 A 3.