FR 2546755 A1 19841207 FR 8309099 A 19830601 Procedé pour la conservation de sperme notamment des chevaux La présente invention concerne un procédé pour la conservation du sperme des espèces animales et notamment du sperme des chevaux. Dépuis de nombreuses années les spécialistes ont mis au point divers procédés permettant la conservation de sperme de certaines espèces animales en vue de réaliser des inséminations artificielles. Le succès de cette opération de conservation, donc le succès de I'insémination artificielle à l'aide du produit conservé, dépend,d'une part,de la méthode utilisée pour réaliser ladite conservation et,d'autre part, de la race animale choisie. C1 est ainsi que si pour la race bovine par exemple il existe des procédés de conservation qui sont considérés comme satisfaisants, on constate que pour la race chevaline les procédés actuellement connus sont encore très aléatoires. La présente invention vise à résoudre les problèmes posés par la conservation du sperme en vue d'une insémination artificielle; elle parait améliorer les résultats obtenus en mettant en oeuvre les procédés actuels connus, quelle que soit la race à laquelle lesdits procédés sont appliqués,mais elle est parmi culièrement intéressante pour améliorer les résultats actuellement obtenus ave-c la race chevaline. Le procédé de base à partir duquel la présente invention a été réalisée consiste dans une congélation des spermatozoxdas à très basse tempéra11lre, plus précisément à la température de l'air (ou l';lzotc) liquide. Ce procédé est connu et peut etre schématiquement décrit comme suit - le sperme de l'animal prélevé dans des conditions optimales est tout d'abord dilué puis soumis à une centrifugation afin de séparer le liquide de l'ensemble des spermatozoldes - lesdits spermatozoides sont alors; admis dans un liquide de congélation, et la suspension obtenue, après avoir été admise dans des paillettes, est conge lée puis conservée dans l'azote liquide. - enfin lors de l'utilisation1 les paillettes sont ré chauffées, ouvertes et leur contenu est dilué dans un milieu liquide convenable. I1 a été trouvé,et cela constitue la base de l'invention, que la composition des milieux dans lesquels on effectue la première dilution du sperme frais (en vue de sa centrifugation) et surtout dans lesquels on réalise la suspension des spermatozoides en vue de leur congélation et de leur conservation, joue un rôle très important pour le succès de cette con- servation. I1 a été trouvé également de façon subsidiaire - que le liquide de dilution que lton utilise après décongélation des paillettes avait une certaine importance pour améliorer la vitalité et la vélocité des spermatozoldes. - et que certaines précautions devaient être prises lors de la réfrigération (ou congélation) des spermatozodes de façon à optimiser les résultats obtenus - L'invention de base se situe donc au niveau de la composition du liquide, ajouté au centrifugeat de sperme, avant la congélation du produit. Dans les techniques actuellement utilisées ce liquide comporte essentiellement, outre de l'eau distillée, des sucres,à savoir un mélange de glucose, lactose et raffinoseX un produit connu sous le nom de Tris et contenant du trihydroxyméthylaminoéthane et de l'acide citrique, du glycérol et une certaine quantité de jaune d'oeuf. I1 a été trouvé que lorsque le liquide ajouté au centrifugeat du sperme avant l'opération de congélation, contenait entre 1,5 et 3,5,0 en volume d'un composé choisi parmi-la méthylfor- mamide et la méthylacétamide, on obtenait une conservation optimale de vitalité et de la vélocité des spermatozoides soumis à la congélation et à la conservation à froid. Le liquide utilisé est constitué de préférence, comme coimu : - d'un dilueur de base constitué, pour 100cc, de 68cc d'un mélangesucré, de 27 cc de tris et de 5 cc de glycérol, et de 2cc de jaune d'oeuf. Le mélange sucré connu est très généralement composé de glucose 2,4 g lactose 3,2 g raffinose' 5,4 g l'ensemble étant dissout dans 100 cc d'eau distillée. Le tris également connu est composé de trishydroxyméthylaminoéthane 3 g acide citrique 1,67 g l'ensemble étant dissout dans 100 cc d'eau distillée - et d'un liquide cryoprotecteur qui est constitué pour 100 cc, de 90 cc du dilueur de base décrit ci-dessus, de 5 cc de glycérol, de 2 cc de jaune d'oeuf et d'un produit selon l'invention, à savoir de méthylformamide ou de méthylacétamide. L'opération de dilution du sperme centrifugé à l'aide du liquide selon l'invention consiste - tout d'abord à diluer sensiblement volume par volume le sperme centrifugé avec le dilueur de base - puis à ajouter au mélange ainsi obtenu, sensiblement volume par volume, le liquide cryoproteeteur. Ainsi, si i'on veut diluer environ 100 cc de sperme centrifugé,on ajoutera tout d'sabord environ 100 cc du dilueur de base puis, au mélange obtenue, environ 200 cc de liquide cryogénique. Ce sont ces 500 cc de liquide de dilution qui devront contenir de 1,-5 à 3,5 Qe en volume eau moins un produit choisi parmi le méthylformamide et le méthylacétamide. Si la proportion de méthylformamide et de méthylacétamide est trop faible, la protection des spermatozoides lors de la congélation et du stockage au froid sera insuffisante; lorsque au contraire la proportion desdits produits est trop importante, il semble apparaître une certaine nocivité du liquide vis-à-vis des spermatozoides. I1 a été trouvé de plus que la composition du liquide dans lequel on diluait le sperme fraichement recueilli pour soumettre le mélange obtenu à l'opération de centrifugation,pouvait avoir une taine importance pour le maintien des qualités des spermatozoîdes. On sait qu?il existe de nombreuses solutions préconisées à cet effet; la solution la plus utilisée parait être une solution commerciale contenant (solution A) glucose 6g citrate de sodium 0,375 g acétate de tétraéthylene diamine 0,370 hydrocarbonate de sodium 0,125 g eau distillée q.s.p. 100 cc. I1 a été trouvé que cette solution, qui possède une pression osmotique élevée, était très efficace pour la conservation (pendant l'opération de centrifugation) de la vélocité des spermatozoides recueillis; cependant cette solution ne permet pas de maintenir, notamment dans le cas de la race équine, la vitalié desdits spermatozoïdes à un niveau suffisant. Il a eté trouvé qu'il était souhaitable d'utiliser à la place de la solution décrite ci-dessus, un mélange sensiblement volume à volume (à + 10% près) de - ladite solution A - et d'une solution contenant, pour 100cc, de solution dans liteau environ: 1 g de bromure de potassium 0,45 g de citrate de sodium et 1,8 g de glucose. On ajoutera comme connu à la solution utilisée une faible quantité de jaune d'oeuf. Grâce à l'utilisation, lors de la dilution du sperme avant centrifugation, du mélange décrit ci-dessus, il apparaît que l'on conserve à la fois la vélocité et la vitalité desspermatozoldes. Comme autre amélioration à la technique de conservation et de réutilisation du sperme pour insémination artificielle, il a été trouvé que le liquide dans lequel le produit conservé au froid peut avantageusement être dilue lors de 1' insémination, est avantageusement constitué d'un mélange d'environ 20cc d'un mélange sucré analogue à celui décrit ci-dessus (ctest-à-dire contenant pour 100 cc, 2,4 g de glucose, 3,2 g de lactose et 5,4 g de raffinose) et d'environ 80 cc de solution tris (décrite ci-dessus), l'ensemble étant dilué dans du lait écrémé. Dans ce qui précède,les proportions des divers composés doivent être respectées avec une précision d'environ 10 ó; ctest ainsi par exemple que lorsque l'on mentionne que la solution de dilution pour le sperme décongelé, doit comporter environ 20 cc de solution sucrée pour environ 80 cc de solution tris,cela veut dire que l'on utilisera, pour 100 cc, de 18 à 22 cc de solution sucrée pour 82 à 78 cc de solution tris. Enfin, il a été trouvé que lors de la congélation des spermatozoides, la vitesse de congé- ration pouvait avoir une importance sur la qualité des produits conservés. Bien entendu, comme la température effective de la solution soumise à refroidissement dépend en partie de la forme physique (volume, état de dispersion...) dans laquelle se trouve ladite dilution, il convient de préciser que cette vitesse de congélation optimale a été déterminée pour des paillettes qui constituent une méthode très connue de conditionnement du sperme en vue de l'opération de congélation.La vitesse de congélation àla température étant mesurée dans l'enceinte refroidie dans laquelle les paillettes de sperme sont disposées, doit être la suivante - 50C/minute + 10C pour les températures allant de 0 a - 100 C. - 150Clminute + 2 C pour les températures allant de -100C à - 300C, et 60 C/minute 6 C pour les températures allant de -30 jusqu'à - 140 C. L'exemple non limitatif suivant illustre l'invention. Le sperme d'un cheval est recueilli puis filtré; le filtrat est dilué en utilisant, pour lOOcc de filtrat, un volume d'environ 100 cc d'un mélange constitué de 503o en volume dfune solution commerciale contenant, pour 100 cc, 6 g de glucose, 0,375 g de citrate de sodium, 0,370 g d'ac-étate de tétraéthylène diamine et 0,125 g d'hydrocarbonate de sodium et 50% en volume d'une solution contenant, pour 100 cc, 1 g de bromure de potassium,- 0,45 g de citrate de sodium et 1,8 g de glucose, mélange auquel on ajoute lcc de jaune d'oeuf frais. La température à laquelle cette dilution est réalisée,est d'environ 25 à 30 C. Le mélange ainsi obtenu est soumis à une centrifugation, à température ambiante la vitesse de centrifugation étant telle que le mélange soit soumis une force de 400 à 500g pendant une durée de 7 à 10 minutes environ. Le culot de centrifugation (contenant les spermatozosdes) est recueill et dilué. Cette dilution s'effectue endeux étapes,à savoir première étape : à 100 cc de sperme centrifugé on ajoute environ 100 cc d'un dilue-ur de base contenant, pour.100 cc, solution sucrée (A) 68 cc tris (B) 27 cc glycérol 5 cc jaune d'oeuf 2 cc La solution sucree contient, pour 100 cc d'eau distillée, 2,4 g de glucose, 3,3 g de lactose et 5,4 de raffinose. La solution tris contient, pour 100 cc d'eau distillée, trishydroxyméthylaminoéthane 3 g, acide citrique l,67g. deuxième étape : à 100 cc de la solution obtenue dans la première étape de dilution, on ajoute environ 100 cc d'une solution contenant, - 90Q,A0 en volume d'un mélange à 70,6 en volume de la solution sucrée A décrite ci-dessus et 30% en volume de la solution tris décrite ci-dessus - 5% en volume de glycérol - 2% en volume de jaune d'oeuf - et soit environ 3% en volume de méthylformamide soit environ 4% en volume de méthyl acétamide. Le mélange obtenu est introduit, de façon connue, dans des paillettes qui sont bouchées et lesdites paillettes sont réfrigérées vers 40C pendant environ 3 à 60 minutes. Les paillettes sont introduites dans une enceinte que l'on va refroidir avec la vitesse suivante - diminution de la température de 50C/ minute entre les températures de O et de -100C - diminution de la température de 150C/ minute entre les températures de - 100C à - 300C - diminution de la température de 600C/ minute entre les températures de - 30 C à - 1400C. Les paillettes ainsi congélées sont conservées à la température de l'air ou de l'azote liquide. Le réchauffement des paillettes s'effectue par trempage des dites paillettes dans un bain marie à environ 400C et le contenu des-paillettes est dilué. Cette dilution, réalisée en une ou plusieurs étapes, est effectuée à l'aide d'un mélange composé de Z0 cc de la solution sucrée (A) décrite ci-dessus 80 cc de la solution tris (B) décrite ci-dessus et 100 cc de lait écrémé. I1 a été trouvé que grâce à l'invention on pouvait améliorer les résultats des opérations d'insémination arçioicielle obtenus avec de nombreuses races d'animaux (bovins, ovins, porcins, caprins, volailles et surtout équidés). Dans tous les cas l'amélioration obtenu est de l'ordre de 10 à 15% environ, ce chiffre étant obtenu par des mesures comparées de la vitalité et de la mobilité des spermatozoldes au moment de leur utilisation, c'est-à-dire après conservation. 9 REVENDICATIONS I. Procédé pour la conservation de sperme, en vue d'une insémination, dans laquelle le sperme est centrifugé, puis dilué dans un liquide convenable, puis admis dans des paillettes maintenues dans l'azote liquide, puis, après réchauffement, dilué à nouveau avant utilisation.Caractérisé en ce que ledit "liquide convenable" utilise lors de la dilution après centrifugation contient entre 1,5 et 3,5 % en volume d'un composé choisi parmi la méthylformamide et la méthylacétamide. 2. Procédé selon la revendication I caractérisé en ce que ledit composé est utilisé dans un liquide cryoprotecteur constitué d'un dilueur de base qui contient lui-même, pour 100cc, 68cc d'un mélange sucré, 27cc de tris, 5cc de glycérol et 2cc de jaune d'oeuf auquel on-a ajouté, outre ledit composé, Scc de glycérol et 2cc de jaune d'oeuf pour IOOcc. 3. Procédé selon l'une des. revendications 1 et 2 caractérisé en ce que avant l'opération de centrifugation, le sperme est dilué dans une solution contenant, pour I0cc, environ 3g,9 de glucose, environ 0,187 g de cétrate de sodium, environ 0,187 g d'acétate de tétraéthylènediamine, environ 0,06 g d'hydrocarbonate de sodium, environ 0,5 g de bromure de potassium et environ 0,22 g de citrate de sodium. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la diluation du sperme, après réchauffement, est réalisée à l'aide d'un liquide contenant, pour 100cc, 20cc d'un mélange sucré et 80cc de tris.