FR 2536087 A1 19840518 FR 8318042 A 19831114 La présente invention se rapporte à un procédé de production par fermentation en utilisant des cellules microbiennes immobilisées ou une enzyme immobilisée, dont la densité est réglée, On saint que de l'éthanol, de l'acé- tone-butanol, etc. sont produits par des procédés de fermentation avec des cellules microbiennes immobilisées. (Ici, les cellules microbiennes signifient les cellules microbiennes de bactérie, de levure, etc.). En ce qui concerne I'éthanol, on se réfèrera à European J. Appl Microbiol. Biotechnol. 10, 275-287 (1980), et en ce qui concerne l'acétone-butanol, on se réfèrera à Biotechnology Letters Vol. 2 (nO 5) 241-246 (1980) Comme système d'alimentation du milieu de culture des procédés de fermentation en continu, en utilisant des cellules microbiennes immobilisées, il y a un systeme à courant ascendant et un système à courant descendant, mais le système à courant descendant pose un problème pour induire la -fermeture et le cheminement facilement dus aux cellules microbiennes qui se sont propagées durant la fermentation, Ces problèmes se produisent facilement dans le cas ou les particules des cellules microbiennes immobilisées sont petites, Dans le cas où le procédé est réalisé par un sys tème à courant ascendant, il est souhaitable que toutes les cellules microbiennes immobilisées soient dans l'état fluide, mais dans une relation entre les propriétés physiques telles que la dimension de particules, la densité de cellules microbiennes immobilisées, la vitesse d'alimentation du milieu de culture ou le gaz produit, il y a un cas dans lequel l'efficacité est diminuée, parce qutil existe certaines cellules microbiennes immobilisées qui ne participent pas à la réaction due à une flottation ou au fait quelles descendent. La flottation ou la descente des cellules microbiennes immobilisées entraine l'abaissement du rendement en produits de fermentation, Si la vitesse d'alimentation du milieu de culture est abaissée, le taux de flottation peut etre abaisse, mais, si ceci est réalisé, cela n'est pas préférable, parce que la productivité est réduite. Ensuite, afin de prévoir qu'il n'y ait pas de flottation sans abaissement de la vitesse d'alimentation, le dispositif de fermentation dot être amélioré. En général, dans le cas où l'on conduit la fermentation en continu avec des cellules microbiennes immobi- lisées, la condition de fonctionnement doit être conçue afin d'obtenir un fort rendement autant que possible en utilisant le même dispositif et aussi en changeant la condition opératoire de fermentation, parce que l'établis- sement du dispositif pour chaque produit entraîne une augmentation du prix de revient. Rependant, la densité de cellules microbiennes immobilisées est généralement rendue approximativement égale à celle du milieu de culture, et les cellules microbiennes immobilisées sont amenees à flotter par adhérence aux particules avec un gaz produit et flottent sur la mousse de la surface de l'eau et il y a de nombreux cas ou les cellules microbiennes immobilisées ne participent pas å la production du produit recherché L'état le plus efficace des cellules microbiennes immobilisees dans un procédé de fermentation existe dans un état fluidisable de toutes les cellules microbiennes immobilisées dans le fluide, Il n'est pas nécessaire pour renforcer l'efficacité que les particules des cellules microbiennes immobi lisées soient rendues aussi petites que possible,parce que les cellules microbiennes s'assemblent à la surface des particules et se propagent facilement, Ensuite, quelle que soit la condition opératoire ou quel que soit le gaz produit qui serait modifié selon les genres de produit recherché, on a étudié comment les cellules microbiennes immobilisées pourraient être maintenues dans un état préférable , et,par suite, on a trouvé que les particules- à densité préférable paurraient être prepa- rées en ajoutant lyingredient, afin de ne pas influenoer,pour le pire, les cellules microbiennes dans l'étape d'immobilisation des cellules microbiennes, et également on a trouvé que le rendement en produit pourrait être augmenté en utilisant ces particules a densité préférable et en diminuant le taux de flottation de cellules microbiennes immobilisées La présente invention peut être appliquée de manie re tout à fait semblable aussi dans les cas d'enzymes immo bilisées sans se limiterauxcellules microbiennes immobilisées et ces cas sont aussi inclus dans le domaine de protection de la présente invention, mais, en prenant pour exemple les cas de cellules microbiennes immobilisées, la présente invention est décrite après avec plus de détails. L'immobilisation de cellules microbiennes peut être conduite par les procédés généraux, par exemple, un procédé de liaison sur support, un procédé de réticulation, un procédé d'emprisonnement sur gel, etc,, peuvent être appliqués.armi ces procédés, le procédé d'emprisonnement sur gel avec lequel on peut obtenir une activité stable avec une immobilisation plus facile est utilisé de préférence, Comme procédés d'emprisonnement, il y a de nombreux procédés pour l'utilisation de gel d'alginate de calcium, de gel de polyacrylami.de, de collagène, de fibrine, d'agar-agar, de caraghénan, de cellulosetetcn te fonctionneiment pour les procédés d'emprisonnement avec ces gels peut être conduit par l'opérationoennue en soi, mais, pour fournir un exemple concret, le fonctionnement est comme suit Ainsi, des cellules microbiennes vivantes ou le liquide de culture pour l'emprisonnement sont ajoutés dans une solution aqueuse d'alginate de sodium pour produire le mélange, et, quand on laisse tomber ce mélange dans une so- lution aqueuse de chlorure de calcium comme agent de géli-- fication, on peut obtenl'r les cellules microbiennes immobilisées.Selon le procédé d'emprisonnement avec un gel de polyacrylamide, de l'acrylamlde monomère, de la N,N'-mé thylènebisacrylamide cone agent de réticulation et des cellules microbiennes vivantes (il peut y avoir un liquide de culture également), sont mises en suspension dans une solution tampon, et, à cette solution de suspension, on ajoute du persulfate d'ammonium comme initiateur de polymérisation et de la N,N,N',N'-tétraméthyléthylènediamine comme promoteur de polymérisation, et, quand on a fait réagir ces produits entre 15 et 23 C-pendant environ lO minutes pour la polymérisation, on obtient des cellules microbiennes immobilisées. Le réglage de la densité des cellules microbiennes immobilisées de la présente invention peut être obtenu en ajoutant l'ingrédient afin de rendre la densité grande ou faible pour la solution de matière de support (par exemple une solution aqueuse d'alginate de sodium, une suspension d'acrylamide monomère) ou le mélange de solution de matière de support et de cellules microbiennes vivantes ou le liquide de culture dans l'étape d'immobilisation. Comme ingrédient,pour rendre plus importante la densité de cellules microbiennes immobilisées, on peut utiliser du sulfate de baryum, du blanc de baryte-titane, des acides siliciques, de la poudre de verre et,comme ingrédaent pour rendre la densité plus petite, on peut utiliser du polyéthylène, du polypropylène, du polystyrène, du polyuré thane etc, Pour obtenir les particules à densité réglée en ajoutant ces ingredients, l'augmentation de plus de 3 % de la densité, ordinairement une augmentation de 5r20 %, est nécessaire pour former le courant de fluide préférable par comparaison avec le cas où il n'y a pas d'ingrédient contenu, mais, bien sùr, les genres et la quantité d'ingrédient que l'on doit ajouter dans le gel pour régler la densité afin de pouvoir former le courant de fluide préférable peuvent être déterminés d'après les conditions opératoires de fermentationfla composition de milieu de culture et de genres de matière de gel immobilisé, etc. En général, même si les conditions du courant de fluide préférable étaient obtenues, il y a une partie de particules flottantes due à la distribution des particules. Le taux de particules flottantes dans un état préférable est environ 3 -- 20 %, La fermentation continue de la présente invention peut être conduite en remplissant des cellules microbiennes immobilisées dans le réacteur et en fournissant continuellement le milieu de culture. Avant la fermentation continue, la culture par fournée (culture discontinue) peut être réalisée, et, spécialement, dans le cas de fermentation pour l'acétone-butanol, il est préférable de renforcer au préalable la propagation des cellules microbiennes par fermentation par fournée. Les conditions opératoires de la culture par fournée telles que la température, le pH, la concentration de source de carbone peuvent être semblables à celles de la fermentation en continu. Les conditions opératoires de la fermentation en continu dépendent des genres de fermentation (par exemple, fermentation pour 1 ' acétone-butanol, fermentation pour un alcool(éthanol)). Les conditions opératoires des cellules microbiennes qui doivent être utilisées pour la fermentation pour dè l'acétone-butanol sont illustrées comme suit. Cela ne signifie pas que la presente invention soit limitée seulement à la fermentation pour de l'acétone-butanol. Comme cellules microbiennes de production d'acétone-butanol à utìliser par la présente invention, on peut utiliser des cellules microbiennes connues. Par exemple, diverses cellules microbiennes appartenant au genre, c'est à-dire des microorganismes producteurs d'acétone-butanol appartenant au Clostridium acetobutylicum, au Clos tri- dium saccharoperbutylacetonicum, au Clostridium saccha robutylîcum, au Clostridium saccharobutyloacetonicum, au Clostridium saccharoacétobutylicum sont utilisés.Des exemples de souche comprennent le Clostridium acetobutylicum ATCC 824, 425su, 10132, IFO 3854, le Clostridium sac charobutyiacetonicum ATCC 27022 etc, Comme milieu de culture pour a fermentation par fournée et la fermentation continue, un milieu de culture semblable qui est utilisé pour la culture de ces cellules microbiennes peut être employé, Ainsi, on peut utiliser n 'importe quel milieu de culture de synthèse ou milieu de culture naturel, n'importe que2 milieu de culture contenant une source d'azote appropriée, une substance minérale et des produits nutritifs ainsi qu'une source de carbone. Comme source de carbone, on peut employer divers hydrates de carbone tels que le glucose, le saccharose, le fructose,le mannose, l'amidon, des hydrolysats d'amidon, des mélasses de liqueur noire. Comme source d'azote, on peut utiliser divers sels d'ammonium organiques et minéraux tels que l'ammoniac, le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le carbonate d'ammonium, l'acétate d'ammonium ou l'urée et d'autres composés contenant de l'azote tels que la peptone, un extrait de viande, un extrait de levure, de la liqueur de mas macérée, un hydrolysat de caséine, de la farine de poisson ou son produit digéré, un gâteau de soja dégraissé ou son produit digéré, et de l'hydrolysat de chrysalides. En outre, comme substance minérale, on peut employer du phosphate de potassium, du sulfate de magnésium, du chlorure de sodium, du sulfate ferreux, du sulfate de manganèse, du carbonate de calcium, etc, Comme milieu de culture, on peut employer un liquide contenant beaucoup de substance de flottation qui peut être préparé à partir de biomasse.L'exemple d'un tel liquide est décrit dans la demande de brevet japonais publiée sans examen n 53 > 136585 (136585/1978), La température, le pH, la source de carbone, etc. de la culture par fournée et de la culture continue ne sont pas limités specialement pour autant que la pro lifération des cellules microbiennes et la production d'acétone et de butanol soient réalisées régulièrement, mais, en général, il est préférable de les réaliser dans des conditions- de température de 28-380C,un pH de 6,5 ou à peu près et une concentration de source de carbone de 4-10 % (en poids/volume) . L'achèvement de la culture par fournée ou le passage à la fermentation en continu est ordinairement conduit au moment où commence le bouillonnement (barbotage par un gaz de fermentation tel quede l'hydrogene gazeux, de l'anhydride carBonique gazeux qui sont formés en même temps que se forme le produit de fermentation) ou après ce temps. La fermentation en continu peut être réalisée par un système de courant ascendant ou par un système de courant descendant, La vitesse de l'alimentation du milieu de culture n'est pas spécialement limitée, mais il est convenable de la fixer à une vitesse de 0,1-0,4 l/h par litre de cellules microbiennes immobilisees remplies 9 On a expliqué cindessus dans les cas de cellules microbiennes immobilisées, mais aussi,dans le cas d'enzymes immobilisés,la présente invention peut être réalisée de manière semblable à ce qu'on a indiqué ci-dessus en employant l'enzyme iu'obllisée qui est préparée par des procédés connus. EXEMPLE (1) Procédé de préparation de cellules microbiennes immobi lisées Une petite quantité de sol stocké contenant du Clostridium saccharoperbutylacetonicum ATCC 27022 a été placée dans 10 ml de milieu active contenant la composition mentionnée ci-dessous dans une éprouvette et le milieu a été traité dans le bain à l'ébullition avec de la chaleur pendant 8 minutes (ce qu'on appelle le choc thermique a éte ajouté. q Ensuite, on a refroidi à 300C et on a soumis à l'incubation pendant 24 heures dans un état de culture anaérobie.Le milieu de culture ainsi obtenu a été ajouté à 150 ml de milieu de culture d'ensemencement contenant la composition mentionnée ci-dessous dans un ballon d'Erlenmeyer d'un volume- de 250 ml, et le milieu de culture a été soumis à l'incubation à 30OC pendant 24 heures dans des conditions anaérobies.Pendant ce temps, une solution aqueuse à 3 % d'alginate de sodium contenant une quantité définie de sulfate de baryum comme ingrédient pour régler la densité a été stérilisée à l100C pendant 10 minutes, et, après son refroidissement, on y a ajouté une quantité de 10 % (en volume/volume) du milieu de culture d'ensemencement,et on a laissé tomber le mélange dans une solution aqueuse à 1 % de chlorure de calcium, et puis les cellules microbiennes immobilisées ont été obtenues. Milieu de culture activé ï se compose de 150 g de pomme de terre, de 3 g de glucose, de 0,6 g de sulfate d'ammonium, de 1,2 g de carbonate de calcium et de 420 ml d'eaux Milieu de culture d'ensemencement I1 se compose de 6 g/dl de mélasses (sous forme de glucose), de 0,5 g/dl de sulfate d'ammonium, de 0,3 g/dl de carbonate de calcium et de 0,003 gzdl de superphospha te de calcium. 60 ml de cellules microbiennes immobilisées cidessus ont été remplis dans des réacteurs d'un volume de 100 ml, et le milieu de culture de fermentation mentionné ci-dessous a été envoyé dans les réacteurspour remplir le contenu de 100 ml, et la culture discontinue (par fournée) a été réalisée à 32QCo 20 heures après le commencement de la culture, le milieu de culture de fermentation a été fourni continuellement à une vitesse de 0,2 l/h par litre de cellules microbiennes immobilisées selon le système à courant ascendant, et la fermentation continue a été commencée, La température de fermentation a été réglée à 32QCw Le taux de flottation de cellules microbiennes immobilisées et le rendement par saccharide qui ont été obtenus le 7ème jour à partir du commencement de la fermentation continue, Oflrt été présentés dans le tableau. Milieu de culture de fermentation Il se compose de 6 g/dl de mélasses (sous forme de glucose), de 0,5 g/dl de carbonate d'ammonium, de 0,3 g/dl de carbonate de calcium et de 0,003 g/dl de superphosphate de calcium. TABLEAU Taux d'addition 51 Taux de flottation Rendement de par sulfate de baryum (%) b 0 90 16,0 1,0 10 - 17,7 2,0 5 17,5 2,8 3 16,8 4,0 0 12,5 % (en poids/volume) par solution aqueuse d'alginate de sodium. 2 Solvant (acétone + butanol + éthanol) (g) x 100 Quantité utilisée de saccharide (g) La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qu viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de variantes qui apparaîtront à l'homme de l'art. REVENDICATIONS 1 - A titre de produits industriels nouveaux, cellules microbiennes immobilisées ou enzyme immobilisée, dont la densité est réglée en ajoutant un solide afin de ne pas fournir d'influence pire lors de la fermentation, en tant que troisième ingrédient dans l'étape d'immobilisation. 2 - Cellules microbiennes immobilisées selon la revendication 1, caractérisées en ce que les cellules microbiennes sont des microorganismes capables de produire de l'acétone et du butanol, 3 - Cellules microbiennes immobilisées selon la revendication 1, caractérisées en ce que les cellules microbiennes sont emprisonnées dans un gel d'alginate de sodium. 4 - Cellules microbiennes immobilisées selon la revendication 1, caractérisées en ce que l'ingrédient est choisi dans le groupe se composant de sulfate de baryum, de blanc de baryte-titane, d'acides siliciques, de poudre de verre, de polyéthylène, de polypropylène, de polystyrène et de polyuréthane. 5 - Procédé de production continue par fermentation,caractérisé en ce qu'on utilise des cellules microbiennes immobilisées ou une enzyme immobilisée, dont la densité est réglée en ajoutant un solide afin de ne pas influencer de panière pire la fermentation, en tant que troisième ingrédient dans l'étape d'immobilisation du procédé de production par fermentation en employant les cellules microbiennes immobilisées ou l'enzyme immobilisée. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules microbiennes sont formées de microorganismes capables de produire de l'acétone et du butanol. 7 -Procédé selon la revendication 6 caracterisé en ce que le microorganisme appartient au genre Clos- tridium.