FR 2543158 A1 19840928 FR 8304843 A 19830324 MILIEU DE CULTURE DE CELLULES ANIMALES SANS SERUM SANS HORMONES ET SANS FACTEURS DE CROISSANCE ET PROCEDES DE CULTURE PRIMAIRE ET D'OBTENTION DE LIGNEES CELLULAIRES UTILISANT CE MILIEU. L'invention concerne les milieux de culture de cel- lules animales. Elle a plus particulièrement pour objet un milieu synthétique de culture de cellules animales, notamment de cellules épithéliales de foie, ne renfermant ni sérum, ni hormones, ni facteurs de croissance et convenant tant à la culture primaire de cellules animales, qu'à l'obtention de lignées cellulaires à partir de cette culture primaire Elle a également pour objet un procédé de culture primaire et un procédé d'obtention,à partir de ladite culture prinaired'une lignée de cellules animales, nota ont de cellules épithéliales de foie, utilisant un tel milieu. Depuis un certain nombre d'années, des recherches intensives ont été effectuées afin de mettre au point un milieu de culture permettant d'obtenir des lignées de cellules hépatiques présentant les caractéristiques des hépatocytes parenchymateuxafin notamment d'élucider les mécanismes régulateurs qui contrôlent la prolifération et la différenciation des cellules hépatiques. Jusqu'à présent deux types de cultur E de cellules hépatiques ont été largement développés à partir de cellu- les obtenues par dissociation du tissu hépatique au moyen de collagénase ou de trypsine. On savait que la digestion du foie par la collagé- nase fournit des hépatocytes-parenchymateux non prolifé- rants qui peuvent être maintenus plusieurs jours, voire plusieurs semaines, soit dans un milieu de culture addi- tionné de sérum (Serum Supplemented Medium SSM), soit dans un milieu de culture sans sérum (Serum Free Medium: SFM) Ces cellules parenchymateuses manifestent différentes fonctions du foie et remplacent par conséquent avantageu- sement les homogénats ou coupes tissulaires de foie. Toutefois, la sénescence inévitable de ces hépatocytes ne permet pas des études de longue durée, ce qui a incité les chercheurs à mettre au point des cultures prolifé- rantes de cellules hépatiques épithéliales De telles cultures ont été, dans un premier temps, obtenues dans des milieux additionnés de sérum (SSM), après digestion du tissu hépatique par la trypsine ou à partir de cultures primaires initiées par la collagénase Bien que la crois- sance de cellules hépatiques épithéliales normales pré- sente en général des difficultés, notamment en raison d'un développement trop important de cellules fibro- blastiques, on a pu montrer que les cultures proliférantes de cellules hépatiques épithéliales possèdent des carac- téristiques des cellules hépatiques parenchymateuses. Toutefois, l'addition de sérum au milieu de culture intro- duit dans celui-ci un très grand nombre de composants dont notamment des produits finals-et des effecteurs, c'est-à-dire régulateurs, des métabolismes du foie qui compliquent, voire même rendent impossible, l'utilisation de lignées cellulaires obtenues dans des milieux addition- nés de sérum, en particulier dans le cas de certaines études telles que celles relatives à la biosynthèse du cholestérol, des stérols biliaires neutres et des acides biliaires. Pour remédier, au moins en partielaux différents in- convénients présentés par les lignées cellulaires obte- nues dans des milieux de culture additionnés de sérum, différents auteurs ont proposé de remplacer le sérum Dar des hormo- nes et des facteurs de croissance tels qu'en particulier l'insuline et 1 '"epidermal growth factor", dont la présence était jusqu'à présent considérée coîsu indispensable au dévelopoement de lignées cellulaires. Or la dépendance de nombreux processus métaboliques du foie vis-à-vis des hormones est bien connue En consé- quence, la présence d'hormones dans le milieu de culture conduit également à des modifications ou à des perturbations, voire meoe dans certains cas à l'impossibilité d'effectuer des études fiables sur des lignées de cellules hépatiques obtenues dans des milieux de culture additionnés d'hormones. Le but de l'invention est donc de fournir un milieu de culture de cellules animales, notamment de cellules épithéliales de foie, ne présentant pas les inconvénients des milieux de culture connus addtionnés de sérum ou d'hormones et de facteurs de croissance. Or, on a constaté que de façon surprenante et contre toute attente, il est possible d'effectuer tant des cultu- res primaires que des cultures secondaires dans un milieu ne comportant ni sérum, ni hormones, ni facteurs de crois- sance, en l'additionnant en des proportions bien définies, de certains acides gras ou de leurs esters en présence d'un biopolymère lipophile en une quantité capable de permettre la dissolution des acides gras ou de leurs esters ajoutés. L'un des objets de l'invention est donc un milieu de culture du type susindiqué ne comprenant ni sérum, ni hor- mones, ni facteurs de croissance,caractérisé en ce qu'il est additionné, en des proportions bien définies, de cer- tains acides gras ou de leurs esters, en présence de bicpolymere li- pophile en une quantité capable de permettre la dissolution de la quantité d'acides gras ou de leurs esters ajoutée. Dans son esprit le plus général l'invention fournit donc un milieu de culture de cellules animales dépourvu de sérum, caractérisé par l'utilisation d'un milieu de base contenant les nutriments indis- pensables à la croissance des oellules animales et d'acides gras déterminés ou leurs esters, à des concentrations relatives et à une concentration globale propres à assurer la croissance desdites oellu- les, oes concentrations ne devant pas dépasser un seuil au delà duquel ès acides gras ou leurs esters deviendraient toxiques à l'égard des cultures cellulaires, le milieu de culture étant en outre essentiel- lement caractérisé par l'absence d'hormones et de facteurs de croissan- oe Il va par ailleurs de soi que les acides gras utilisésou leurs esters, doivent avoir une concentration supérieure à un seuil minimum pour autoriser la croissance des cellules animales. L'invention a plus particulièrement pour objet un milieu de culture de cellules animales, notamment de cellules épithéliales de foie, sans sérum, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué a) d'un milieu synthétique de base conçu pour la culture de cellules animales; b) de 2 à 30 peq/l d'acides gras constitués par un mélange de composés choisisparmi l'acide palmitique, l'a- cide cis-palmitoléique, l'acide stéarique, l'acide cis- oléique, l'acide cis-linoléique et l'acide cis-linolèniqué et leurs esters, présents dans les proportions suivantes, rapportées à l'acide gras libre: de O à 24,0 pmole/l d'acide palmitique de 0,6 à 9,0 imole/l d'acide cis-palmitoléique; de 0 à 2,0 Pmole/l d'acide stéarique; de 0,5 à 10,0 Vmole/1 d'acide cis-oléique; de 1,2 à 27,0 pmole/t d'acide cislinoléique; et de 0,3 à 4,0 Vmole/l d'acide cis-linolènique, adsorbés sur c) au moins un biopolymère lipophile présent en une quantité capable d'assurer la dissolution des acides gras ou de leurs esters présents dans le milieu, oe milieui étant essenú it &d ' hou et de factbrs de caaroe. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu comprend en outre une concentration non cyto- toxique, pour toute la durée de passage de la culture, d'un antibiotique, de préférence à large spectre De préférence on utilise, en tant qu'antibiotique, de la gentamycine à raison de 25 à 100 mg/lo. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'in- vention, on utilise de préférence des acides gras libres. Selon encore un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le mélange d'acides gras comprend outre de l'acide cis-palmitoléique, de l'acide cis-oléique, de l'acide cis-linoléique et de l'acide cis-linolènique, éga- lement de l'acide palmitique. Selon un mode tout particulièrement préféré de réali- sation de l'invention, le mélange d'acides gras comprend les six acides mentionnés, à l'état d'acides libres. Le biopolymère lipophile est de préférence consituté par de l'albumine délipidée ou non, de préférence en une quantité de 2 à 6 g/l de milieu de culture. Des résultats équivalents étant obtenus avec l'albumi- ne délipidée d'une part et avec l'albumine non délipidée d'autre part, il semble que les lipides contenus au dé- part dans l'albumine n'interviennent pas dans le processus de prolifération des cellules Dans ces conditions, compte tenu du coût moindre de l'albumine non délipidée,-elle est tout particulièrement préférée. En tant que milieu synthétique de base on peut avan- tageusement avoir recours à un milieu synthétique utilisé de façon habituelle pour la culture des cellules animales, tel que notamment les milieux de Ham, le milieu Waymouth MB 752/1, les milieux RPMI 1629 et 1640, le milieu de Eagle, et les milieux de Eagle modifiés Des résultats particulièrement bons ont été obtenus avec le milieu commercialisé sous la référence "Ham F 10 medium" par la société Gibco, Grand Island, New York, EUA, dont la composition sera indiquée plus loin. Si le milieu de culture contient l'un ou plusieurs des acides gras mentionnés plus haut, ou leurs esters, il devra en être tenu compte dans le calcul de la concentra- tion globale en acides gras. Un autre objet de l'invention est constitué par un procédé de culture primaire de cellules animales, notamment de cellules épithéliales de foie, utilisant un tel milieu. Le procédé de culture primaire selon l'invention comprend essentiellement les étapes consistant à: 1) prélever le tissu renfermant les cellules à cultiver et le découper très finement, dans un nilieu de culture de base, de préfé- rence dans le milieu de base devant être utilisé mais ne contenant pas d'ions Ca 2 + et Mg 2 +, tiédi ( 30-370 C), dans des conditions aseptiques 2) après rinçage, de préférenoe dans le milieu de base devant àitre utilisé mais ne contenant pas d'ions Ca 2 + et Mg, soumettre le tissu à digestion enzymatique, 3) transférer la suspension de cellules ainsi libérées dans un milieu de base, de préférenoe celui utilisé pour la culture, èntri- fuger en poursuivant parallèlement la digestion du tissu restant, 4) mettre le culot de centrifugation en suspension (lans le milieu de culture selon l'invention puis, ) inoculer la suspension ainsi obtenue dans une boc- te ('Ce culture surfactée, G) incuber dans un incubateur étanche, saturé par la vapeur d'eau, en présence d'un mélange d'azote, d'oxygène et de gaz carbonique dans des proportions utilisables en biologie de la respiration cellulaire, en renouvelant périodiquement le milieu de culture, les étapes 3) à 6) étant répétées sur les différentes fractions de cellules désirées dissociées, obtenues suc- cessivement à l'étape 2), en utilisant à chaque fois une nouvelle boîte de culture. La digestion enzymatique est effectuée au moyen d'une enzyme protéolytique telle que la collagénase ou de préfé- rence la trypsine, éventuellement associée avec d'autres enzymes agissant sur les saccharides complexes, telles que la hyaluronidase et/ou sur les acides polynucléiques, tels que DNA-ase et RNA-ase, selon une méthode connue en soi, par exemple celle décrite par M Chessebeuf et Coll dans Biochimie, 56, 1365-1379 ( 1974). Le volume de milieu de culture ajouté à 1 ' étape 4) correspond en pratique au volume intérieur de la boîte de culture devant être utilisée à l'étape 5). Comme boîte de culture, on peut avoir recours à toute boîte habituellement utilisée pour la culture des cellules animales, telles que boite de Pétri ou, de préférence, boite de Cooper. Le surfactage du fond des boîtes semble avoir pour rôle de permettre "l'accrochage" des cellules et favo- riser ainsi leur prolifération Il est effectué selon des méthodes usuelles, connues de l'homme du métier, par exemple au moyen de sérum 1 de collagène ou de fibronectine Différents types de sérums, de préférence le sérum de veau fétal ou mieux le sérum de veau nouveau-né qui est moins coûteux, peuvent être utilisés à cet effet. Après le surfactage, la boite étant rincée à plusieurs reprises, de préférence avec le milieu de base utilisé, tiédi ( 30- 37 C), avant l'ensemencement, seuls restent dans le -fond de la boîte les éléments devant servir à "l'accrochage'' des cellules, alors que les constituants du sérum actifs dans la croissance cellulaire sont éliminés. Un autre objet de l'invention est un procédé d'obten- tion d'une lignée de cellules animales utilisant le milieu de culture selon l'invention Ce procédé est caractérisé par le fait qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à: a) soumettre à digestion enzymatique chaque boîte de culture obtenue selon le procédé de culture primaire de l'invention et ayant de préférence atteint la confluence, pour initier une ou plusieurs culture(s) secondaire(s), b) effectuer la ou les culture(s) secondaire(s) dans le milieu de culture selon l'invention, et c) répéter les étapes a) et b) autant de fois que nécessaire pour conserver la lignée cellulaire pendant le temps désiré. L'invention sera mieux comprise à l'aide de l'exemple détaillé décrit ci-dessousd'obtention d'une culture primai- re puis d'une lignée cellulaire de cellules épithéliales de foie de ratt Il và de soi que cet exemple a uniquement pour but d'illustrer et de mieux expliquer l'invention, sans en limiter acuc- nement la portée. EX Erple. Mqilieu de culture Le milieu de base est obtenu à partir du milieu de Hami en pou- dre commnercialisé sous la référence "Ham F 10 mrediumi" par la société Gibco, Grand Island, New-York, EUAX Après dissolution dans de l'eau tridistillée, il a la coeiposition suivante C Oirposants mg/i L-alanine 9, 000 L-arginine HCI 211,000 L-asparagine HO 15,010 Acide IL-aspartique 13, 000 L-cystéine 25,00 e Acide Ir-glutamique -14,700 IL-glutaxnine 146,000 Glycine 7,510 Ir-histidine H Cl H 20 23,000 L-isoleucine 2,600 L-leucine 13,000 Lr-lysioe H Cl 29,000 Ir-méthionine 4,480 Lrphénylalanine 5,000 Lproline 11,500 L-sérine 10,500 L-thréonine 3,570 L-tryptophane 0,600 Ltyrosine (sel disodique) 2,620 L-valine 3,500 Biotine 0,024 Dpantothénate de Ca 0,715 Chlorure de choline 0,698 Acide folique 1,320 C Erposants M/i L-inositol 0,541 Nicotinamide 0,615 Pyridoxine H Cl 0,206 Ri-bof lavine 0,376 r Thiamine HC 1 1,000 Vitamine B 12 1,360 Ca Cl 2 22 H 2 44,000 Cu SO 4 5 H 2 O 0,0025 Fe SO 4 7 H 20 0,8340 K Cl 285,000 M 2 po 4 83,000 Mg SO)4 7 H 20 153,000 Na Ci 7400,000 Na HPO 4 15,700 Na HOD 3 1200,000 Zn SO 4 7 H 20 0,0288 Glucose 1100,0000 Hypoxanthine 4,680 Acide lipolgue 0,200 Rouge de phénol 1,200 Pyruvate de sodium 110,000 Thymnidine 0,700 Eau tridistillée qsp 1000 mil A oe milieu sont ajoutés 50 Mg/i de gentamycine et les acides gras libres utilisés selon l'invention, coiniercialisés par la société NU CH{ECK PREP, ELYSIAN, M 4 N, sont ajoutés, à une concentration totale en acides gras de 7,6 peq/l, dans les proportions molaires suivantes: acide palmitique 31,0 % acide cis-palmitoléique 11,6 % acide stéarique 2,8 % acide cis-oléique 13,4 % acide cis-linoléique 35,4 % acide cis-linolènique 5,6 %, ces acides étant adsorbés sur 4 g/l d'albumine (n 1 4503 de la société Sigma Saint Louis, MO, EUA) Culture primaire des cellules épithéliales de foie de rat: Les foies de 8 rats nouveaux-nés, de préférence du même sexe, sont excisés et découpés finement dans des conditions aseptiques Après deux rinçages dans du milieu "Ham F 10 medium" ne contenant toutefois pas d'ions Ca 2 + et Mg 2 +, les foies finement découpés'sont transférés dans un flacon de trypsinisation de 50 ml, muni d'un agitateur magnétique On leur ajoute un volume égal d'une solution diluée 3 fois par le milieu de rinçage de tryp- sine 1:250 (c'est-à-dire de la trypsine qui hydrolyse 250 fois son poids de caséine) provenant de la société Micro- biological Associates, Bethesda, MD, EUA On agite 10 minutes à 100 t/mn,à 370 C,puis on décante la suspension de cellules dans du milieu "Ham F 10 medium" refroidi par de la glace ( 2 volumes de milieu pour un volume de cellu- les) et on centrifuge à 30 g Parallèlement, on renouvelle la solution de trypsinisation dans le flacon. On répète la digestion séquentielle par la trypsine tant que le rendement de digestion se maintient (cellules épithéliales viables identifiées au'microscope), c'est-. à-dire en général de 6 à 9 fois. Chaque culot de centrifugation comprenant environ cellules épithéliales viables est mis en suspension dans environ 4,3 ml du milieu de culture selon l'invention, décrit plus haut, et innoculé dans une boite de Cooper (n O 3 009 de la société Falcon, Oxnard, CA, EUA) surfactée par du sérum Les boîtes sont maintenues à 370 C dans un incubateur étanche de culture (Lequeux, Paris, France) saturé par la vapeur d'eau,en présence d'un mélange azote, oxygène et gaz carbonique à 76 %: 19 %: 5 % On change le milieu de culture tous les deux jours. Le surfactage des boîtes s'effectue au moyen de sérum de veau fétal ou nouveau-né par incubation une nuit à 370 C Après rejet du sérum, on rince deux fois avec du milieu "Ham F 10 medium" tiédi ( 30-370 C), avant l'inoculation. Peu après l'inoculation, les cellules épithéliales s'attachent sous forme de nombreux placards monocouches composés de 100 à 500 cellules chacun La croissance de ces plages conduit à des cultures confluentes d'une popu- lation pure en cellules épithéliales de 106 cellules par boîte en moins de 8 jours, en moyenne après 6 jours pour une surface de 20 cm Il est frappant de constater l'inaptitude du milieu de culture selon l'invention à favoriser la croissance de cellules-fibroblastoideset endothéliales Le milieu de culture selon l'invention-conduit donc à une sélection cellulaire en favorisant une croissance privilégiée de cellules épithéliales. Propagation cellulaire Lorsque les cultures primaires ont sensiblement atteint la confluence, le contenu de chaque boîte est traité par la solution de trypsine utilisée précédemment pour la digestion du foie et misen culture secondaire pour initier deux nouvelles cultures. Le milieu de culture selon l'invention permet d'ef- fectuer avec succès des cultures primaires et des cultures secondaires jusqu'à un nombre de passages élevé (des résul- tats positifs ont encore été obtenus au bout de 80 passa- ges). Etude des fonctions hépatiques des cellules épithé- liales de foie obtenues selon l'invention: Pour évaluer les qualités des cellules épithéliales de foie obtenues selon l'invention, on a étudié, sur ces. cellulesdes fonctions caractéristiques du foie vis-à-vis du métabolisme de composés endogènes, à savoir l'inducti- bilité de la L-tyrosine aminotransférase par les gluco- corticoldes, la biosynthèse des acides biliaires et le métabolisme de la progestérone. Résultats obtenus: A Activité de la L-tvrosine aminotransférase (TAT) et son induction ou inductibilité par les glucocorticoldes. L'induction bien connue de l'enzyme TAT (EC 2 6 1 5) par les glucocorticoldes in vivo a été démontrée pour la première fois en 1957; elle est souvent utilisée pour prouver le maintien d'une activité hépatique dans des systèmes de foie-en culture. L'activité de la TAT et son inductibilité par les glucocorticoldes ( 10-6 mole/l de dexaméthasone (dex) pen- dant 5 heures à 37 C) ont été étudiées dans les lignées de cellules épithéliales hépatiques obtenues selon l'in- ventionen suivant la technique décrite par T I Diamond- stone dans Anal Biochem 16, 395-401 ( 1966) et en caparant à l'induction obtenue in vivo dans du foie de rat post- natal L'étude a été faite sur cinq lignées de cellules -épithéliales de foie obtenues selon l'invention Deux lignées ( 54 Co 5 FRS et 54 C(D)o 15 FRS) ont été étudiées depuis le 8 e passage jusqu'au 28 e passage, deux autres ( 45 Ao 16 FRS et 45 A(D)o C 6 FRS) depuis le 8 e ou respec- tivement le 14 e passage, jusqu'au 30 e passage Le tableau I suivant montre l'évolution du taux d'induction en fonction de la progression du nombre de passages Les taux d'induction étaient principalement compris entre 1,5 et 2,1 dans les premiers passages pour les 2 lignées 54 C et 45 A Ces taux d'induction ont ensuite commencé à- diminuer pour revenir à l-vers le 15 e passage pour la lignée 54 C et vers le 25 e passage pour la lignée 45 A Les lignées 54 C(D) et 45 A(D) ont maintenu un taux d'induc- tion supérieur à 1 respectivement jusqu'au 25 e passage pour la première et jusqu'au 30 e passage pour la deuxième. En conclusion, les lignées obtenues selon l'inven- tion ont montré qu'elles avaient une activité basale de la TAT correspondant à 20 à 30 % de celle du foie in vivo dans le cas de rats du même âge, mais que le taux d'induction était d'environ 75 % de celui observé in vivo, dans les mêmes condi- tions. Tableau I Expression de l'inductibilité de la TAT par les glucocor- ticoldes. 54 Cc 5 PRS 54 C(D)c 5 FRS 45 Ad 6 FRS 45 A(D)o 6 FRS 8,7 + 3,7 7,3 + 4,3 5,6 * 3,3 6,5 + 2,8 P n I/B P n I/B P n I/B P n I/B 8 1,5 8 1,6 8 1,7 12 1,5 12 1,3 14 2,0 14 2,5 1,8 18 1,2 18 1,7 19 0,7 18 2,1 21 1,4 1,0 25 1,2 24 1,5 24 1,7 28 1,1 28 0,8 30 1,1 30 1,3 lere ligne: référence de la lignée cellulaire; 2 eme ligne: moyenne + coefficient de variation de l'activité basale de la TAT pour chaque lignée cellulaire; 3 eme ligne: P n = numéro de passage et I/B = taux d'inductibilité, c'est-à-dire activité après induction/ activité basale. L'activité spécifique de la TAT est exprimée en m U/mg de protéine Une unité est la quantité d'enzyme formant lnmole de pyruvate de phydroxyphényle par minute à 37 C Chaque valeur représente la moyenne de deux es- sais L'activité enzymatique et la teneur en protéines ont été déterminées en utilisant trois boites de culture avec monocouche de cellules soit pour le témoin soit pour l'induction par la dexaméthasone (dex) ( 10 6 mole/l pen- dant 5 heures à 37 C) Les cellules ont été récoltées après double rinçage par 2 ml de PBS (tampon salin au phosphate) froid puis grattage avec 2 ml de PBS et ont été immédiatement sépa- rées sous forme d'un culot de centrifugation avant entreposage à -30 C. Après décongélation-, les cellules ont été mises en présence d'un volume total de tampon de 1 ml (phosphate de potassium 0,1 M, p H 7,6, EDTA 1 m M, pyridoxal phosphate 0,2 m M et cétoglutarate de Na 5 n M) La suspension résul- tante a été centrifugée à 40 000 g pendant 30 minutes avant l'étude de l'activité enzymatique. B Biosynthèse des acides biliaires. L'acide chénodésoxychlolique et l'acide cholique sont les deux acides biliaires (BA) principaux, dits acides biliaires primaires synthétisés par le foie de la plupart des espèces animales, tandis que dans le foie de rat il se produit une synthèse biliaire primaire particulière, la biosynthèse de l'acide a-muricholique C'est une produc- tion spécifique des espèces murines qui correspond à une hydroxylation en position 6 e de l'acide chénodésoxycho- lique. La biosynthèse des acides biliaires libres a été re- cherchée dans des lignées cellulaires obtenues selon l'invention. 1 Biosynthèse des acide cholique et chénodésoxycho- ique. Cette étude a été effectuée sur une lignée cellulaire SEM obtenue selon l'invention, au lle passage Les acides biliaires ont été extraits du milieu de culture et analysés par chromatographie en phase gazeuse et par chromatogra- phie en phase gazeuse couplée à la spectrcmétrie de masse. Le tracé chromatographique et l'analyse des spectres de masse repérés ont montré que la lignée étudiée au lle passage synthétisait, dans les conditions de l'étude, l'acide cholique et l'acide chénodésoxycholique Les spectres de masse étaient tout-à-fait en conformité avec ceux des standards Cette méthode a permis de calculer la quantité d'acides biliaires synthétisée, exprimée en nanogrammes par 24 heures et par mg de cellules en cul- ture Ce taux de synthèse était de 11,4 nanogrammes dans le cas de l'acide chénodésoxycholique libre et de 63 nanogrammes dans le cas de l'acide cholique libre. On rappellera, pour comparaison, que dans le cas du foie de rat in vivo, il a été démontré que la synthèse totale des acides biliaires primaires (acides chénodésoxy- cholique et cholique) qu'ils soient libres ou conjugués, était de l'ordre de 280 nanogrammes par 24 heures et par mg de foie frais. 2 Biosynthèse de l'acide a-muricholigue. Une autre lignée a été étudiée au 9 e passage en incu- bant avec de l'acide ch 9 nodésciycholique radioactif marqué au carbone 14 ( 14 C) en position 24 Cet acide biliaire dihy- droxylé a été hydroxylé en position 6, dans l'isomérie 6 e, pour donner naissance à l'acide a-muricholique marqué en position 24 par le carbone 14 Le taux d'acide a-muri- cholique synthétisé était de l'ordre de 100 nanogrammes par 24 heures et par mg de cellules cultivées Cette valeur est tout-à-fait comparable à la valeur trouvée *in vivo chez le rat. Ces observations sur la biosynthèse des acides bi- liaires montrent d'une façon pertinente que les cellules épithéliales de foie de rat cultivées dans le milieu de culture selon l'invention sont capables de maintenir en activité les hidroxylases du cycle stérolde qui sont des enzymes microsomales dépendantes du cytochrome P 450. Ces hydroxylases qui permettent la synthèse de l'acide cholique et de l'acide chénodésoxycholique appartiennent à la classe du cytochrome P 450 agissant sur les composés endogènes, tandis que la 6 B-cholanoylhydroxylase qui transforme l'acide chénodésoxycholique en acide a-muri- cholique est une hydroxylase à cytochrome P 450 qui agit sur des composés exogènes, du type de celles qui inter- viennent dans la biotransformation des xénobiotiques. Ainsi, on a mis en évidence la biosynthèse des aci- des biliaires par les lignées de cellules hépatiques épi- théliales de foie obtenues grâce au milieu de culture selon l'invention Cette observation n'aurait pu être faite sur des lignées cellulaires contenant du sérum. En effet il est connu que les acides biliaires sont des inhibiteurs de leur propre biosynthèse doncdans le cas de cultures de cellules épithéliales de foie obtenues dans un milieu contenant du sérum normalement les acides biliaires qui sont présents dans le sérum inhibent la bio- synthèse des acides biliaires par les cellules de foie. Ainsi, grâce à la culture de cellules de foie dans le milieu selon l'invention on a pu mettre en évidence d'une façon pertinente la biosynthèse des acides biliaires. De plus, ces cellules de foie étant des cellules de foie de rat on a pu mettre en évidence le maintien en culture d'une caractéristique spécifique du foie de rat, à savoir la synthèse de l'acide a-muricholique. C Métabolisme de la progestérone. Le métabolisme de la progestérone représenté de façon schématique à la page 17 a été vérifié sur deux lignées de cellules hépatiques épithéliales provenant de rats impu- bères, du 4 e au 7 e passage - De la progestérone marquée au carbone 14 en position 4 a été incubée à un taux physiologique pendant 24 heures à la confluence - L'extrait stéroidien de chaque passage a été chroma- tographié en couche mince et la radioactivité des fractions séparées sur chaque plaque a été mesurée au moyen d'un compteur de radioactivité. Cette étude a montré que 87 % du précurseur avaient été métabolisés en quatre fractions contenant respective- ment des prégnanetriols, de la 20 a-dihydroprogestérone et des prégnanediols, des prégnanolones contenant de la progestérone résiduaire, et de la prégnanedione. Chaque fraction obtenue par chromatographie en couche mince a été analysée et quantifiée par chromatographie en phase gazeuse associée à la spectrométrie de masse On a ainsi pu mettre en évidence la présence des li métabolites représentés sur le schéma de la page 17. CD Ln C_ t m _e Ln CY i 1, $ O E, O 9 'let IIUD Ubtici,)b g m OH x MO 5 'S c"D pirrie O Z v C au ou 5 bid-)oç m i OH " 1 buo-oz-U Dubaid-xç Axoipk 4 ip-),Ipc d A r- 1-i Ille a uoiti 1 Aoi cioip Aylp-yo OZ IA O 9 c MD 1 )Oljlnz e MOH OH lx $MD ""\ - / me pu Cr orucu M bid O 'x xox>,Fqlp,",u E Il 40 m OH xi H OH III wo -1 -1 '1 1 % 3 3 N Od 3 15300 ? 3 d O Les caractéristiques métaboliques les plus marquantes du foie ont été trouvées dans ces cultures, à savoir réduction 20 a du groupe C 20-oxo (composés VI à XI)q production de prégnanetriol (composés X et XI) due à la 6 a-prégnanolone hydroxylase, enzyme qui est un "marqueur" spécifique du foie; présence unique de la réduction en 5 a de la double liaison A 4-5 (composés I à V et VII à XI) sans aucune réduction 56, et prééminence de l'oxydo-réduction 3 a. L'apparition de ces métabolites de la progestérone constitue l'expression phénotypique normale du métabolisme de la progestérone chez les rats impubères (et également chez les rats femelles adultes). En conclusion: la culture de cellules épithéliales de foie dans le milieu de culture selon l'invention offre un nouvel outil pour étudier l'expression et la régulation des fonctions hépatiques dans des cellules ne subissant pas les effets perturbants du sérum ou des hormones. REVENDICATIONS 1 Milieu de culture de cellules animales, notamment de cellules épithéliales de foie, sans sérum, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué: a) d'un milieu synthétique de base conçu pour la culture de cellules animales; b) de 2 à 30 peq/l d'acides gras consitutés par un mélange de composés choisis parmi l'acide palmitique, l'a- cide cis-palmitoléique, l'acide stéarique, l'acide cis- oléique, l'acide cis-linoléique et l'acide cis-linolènique et leurs esters,présents dans les proportions suivantes, rapportées à l'acide gras libre: de O à 24,0 imole/l d'acide palmitique; de 0,6 à 9,0 pmole/l d'acide cis-palmitoléique; de O à 2,0 pmole/l d'acide stéarique; de 0,5 à 10,0 pmole/l d'acide cis-oléique; de 1,2 à 27,0 pmole/l d'acide cislinoléique; et de 0,3 à 4,0 pmole/l d'acide cis-linolènique, adsorbés sur c) au moins un biopolymère lipophile présent en une quantité capable d'assurer la dissolution des acides gras ou de leurs esters présents dans le milieu, oe mlieui étant -eaitieleit dxuud'hos et ddefactars decr Eissanoe. 2 Milieu de culture selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'il comprend en outre une concentration non cytotoxique, pour toute la durée de passage de la culture, d'un antibiotique, de préférence à large spectre. 3 Milieu de culture selon la revendication 2, carac- térisé en ce qu'il comprend en tant qu'antibiotique de la gentamycine à raison de 25 à 100 mg/l - 4: milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le mélange d'acides gras est constitué par l'ensemble des acides palmitique, cis-pal- mitoléique, stéarique, cis-oléique, cis-linoléique et cis- linolènique, à l'état d'acides libres. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le biopolymère lipophile est constitué par de l'albumine délipidée ou non, de préférence en une quantité de 2 à 6 g/l de milieu de culture. 6 Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu synthétique de base est constitué par un milieu choisi parmi: les milieux de Ham, le milieu Waymouth MB 752/1, les milieux RPMI 1629 et 1640, le milieu de Eagle, et les milieux de Eagle modifiés. 7 Procédé pour la culture primaire de cellules ani- males, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à 1) prélever le tissu renfermant les cellules à cultiver et le découper très f-inement-, dans un milieu de culture de base, de préférence dans le milieu de base devant être utilisé mais ne contenant pas d'ions Ca et Mg 2, tiédi ( 3037 a C), dans des conditions aseptiques; 2) après rinçage, de préférence dans le milieu de base devant être utilisé mais ne contenant pas d'ions 2 + 2 + Ca et Mg, soumettre le tissu à digestion enzymatique, 3) transférer la suspension de cellules ainsi libé- rées dans un milieu de base 1 de préférence celui utilisé pour la culture, centrifuger en poursuivant parallèlement la digestion du tissu restant, ' 4) mettre le culot de centrifugation en suspension dans le milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 6, puis, ) inoculer la suspension ainsi obtenue dans une boite de culture surfactée, 6) incuber dans un incubateur étanche, saturé par la vapeur d'eau, en présence d'un mélange d'azote, d'oxy- gène et de gaz carbonique, dans des proportions utilisables en bio- logie de la respiration cellulaire, en renouvelant périodiquement le milieu de culture, les étapes 3) à 6) étant répétées sur les différentes fractions de cellules désirées dissociées, obtenues successivement à l'étape 2), en utilisant à chaque fois une nouvelle boîte de culture. 8 Procédé de culture primaire selon la revendication 7, caractérisé en ce que la digestion enzymatique est effectuée à l'aide de collagénase ou de trypsine, de pré- férence de trypsine. 9 Procédé de culture primaire selon la' revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que le surfactage desboîtesest effectué au moyen de sérum,de collagène ou de fibronectine, de préféren- ce de sérum de veau fétal ou de sérum de veau nouveau-né. 10 Procédé d'obtention d'une lignée cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à a) soumettre à digestion enzymatique chaque boîte de culture obtenue selon le procédé de l'une des revendica- tions 7 à 9 et ayant de préférence atteint la confluence, pour initier une ou plusieurs culture(s) secondaire(s)? b) effectuer la ou les culture(s) secondaire(s) dans le milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 6 et c) répéter les étapes a) et b) autant de fois que nécessaire pour conserver la lignée cellulaire pendant le temps désiré.