FR 2548901 A1 19850118 FR 8316421 A 19831014 Nouveaux déterminants antigéniques apparentés à l'adénocarcinome et anticorps qui leur sont spécifiques, procédés pour les préparer et combinaisons de réactifs s'y rapportant La présente invention concerne de nouveaux déterminants antigéniques apparentés à l'adénocarcinome, des anticorps gui leur sont spécifiques, et es procédés de diagnostic des adénocarcinomes humains bases sur la mise en évidence desdit. déterminants antigéniques dans des fluides biologiques, dans des extraits ou des coupes de tissus et in vivo sur les cellules ou les masses tumorales. L'invention concerne également l'emploi d'anticorps spécifiques dans la thérapie des adénocarcinomes pour faire atteindre les cellules ou les masses tumorales par des médicaments antitumoraux ou d'autres agents cytotoxiques. On saint que dans le cas des pathologies tumorales il est possible d'isoler, des masses tumorales elles-mm.es ou bien des fluides biologiques, des substances associées auxdites pathologies.Nombre de ces substances ont des propriétés antigéniques plus marquées chez l'animal que chez l'homme certaines d'entre elles, généralement appelées "marqueurs tumoraux", sont des antigènes oncofoetaux. La présence d'un antigène qui est dit etre principalement associe aux adénocarcinomes, et surtout avec leurs métastases, a été démontrée par Gold et al, J. Expt. Med. 121 : 439-462 (1965). Cet antigène, connu sous le nom d'antigène carcinoembryonnaire (CEA) peut être dosé aussi bien dans des fluides biologiques que dans des extraits ou des coupes de tissus par diverses méthodologies connues, par exemple celles qui sont rapportées dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique Nos 3.663.684 et 3.697.638 ; Ann. of Clin. and Lab. Science 4, 5, 357, 1974 ; Clin. Chem. 19, 10, 1973 ; Cancer 34:15041509, 1974 ; Clin. Res. 19:143, 1971 ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 64:161-167, 1969 ; Cancer 37:62-81, 1976 ; Scand. J. Immunol., Vol. 7 Snppl. 6, 1978 ; Cancer 45:1243-1247, 1980 et J. Natl. Cancer Inst. 57, 1, 1976. Les nombreuses études qui ont été faites en la matière, y compris par exemple les références ci-dessus, ont cependant révélé la très faible spécificité du CEA, car celle-ci a été mise en évidence non seulement dans le cas des pathologies tumorales mais aussi en présence de pathologies différentes, c'est-à-dire non tumorales, telles que par exemple de nombreux processus de dégénérescence inflammatoire, et même chez des donneurs sains. Par ailleurs, des études biochimiques [Urba R.; Alpert E., Isselbacher K.J., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 4602-6 (1975)] ont révélé des différences entre les CEA obtenus de laboratoires différents, avec pour conséquence l'obtention de resultats cliniques différents quand les mêmes techniques sont utilisées avec des substances d'origine différente. Il a maintenant été découvert qu'il était possible 1btenir à partir des métastases d'adénocarcinome humain, ainsi que de tous les adénocarcinomes humains, par exemple des adénocarcinomes gastriques, mammaires et thyroidaux, des déterminants antigéniques (K) qui sont "spécifiques" aux adénocarcinomes, et des déterminants antigéniques (pk) qui sont "associés" aux déterminants K sur- les adénocarcinomes. Alors que les déterminants antigéniques pk font apparaître une réaction croisée très forte avec les déterminants antigènes (Pn) qui se trouvent dans le plasma ou le sérum des donneurs normaux, les déterminants antigéniques K ne font apparaître aucune réaction croisée avec les déterminants antigéniques Pn. C'est le mélange desdits déterminants antigéniques K et R et peut-être, de certains autres antigènes inconnus, qui étaient auparavant connus sous le nom de CEA. En utilisant les déterminants antigéniques K et les déterminants antigéniques Pk et Pn susmentionnés, on obtient des anticorps spécifiques anti-K, anti- Pk et anti-Pn, selon 1' invention. L'emploi des déterminants antigéniques K et Pk et des anticorps anti-K et anti-Pk Pk qui leur sont spécifiques dans les procédés immunologiques connus, tels que, par exemple, le dosage radio-immunologique le dosage enzymoimmunologique, l'immunofluorescence, l'immunoluminescence, et bien d'autres, permet de détecter et de quantifier exclusivement les déterminants antigéniques K qui sont spécifiques aux adénocarcinomes, sans interférence dérivant des déterminants antigéniques pn du plasma ou du sérum normal, ou, le cas échéant, les déterminants antigéniques pk qui sont associés aux déterminants K sur les adénocarcinomes. La détermination ci-dessus peut se faire soit qualitativement soit quantitativement, soit encore semi-quantitativement. La présente invention a donc pour objet un procédé amélioré de diagnostic des adénocarcinomes humains par détermination de la substance antigène apparentée à l'adénocarcinome, soit dans un échantillon prélevé d'un patient humain, par exemple in vitro sur des fluides biologiques ou des extraits ou des coupes de tissus, ou in vivo sur les cellules ou les masses tumorales, l'amélioration consistant à déterminer, au moyen d'anticorps anti-K ou anti-pk spécifiques, exclusivement les déterminants antigènes K qui sont spécifiques aux adénocarcinomes sans révéler les déterminants antigènes Pn des cellules normales, ou, respectivement, les déterminants antigènes Pk qui sont associés aux déterminants K sur les adénocarcinomes. Le pourcentage de résultats positifs erronés est ainsi réduit. L'expression "déterminants antigènes K désigne des déterminants antigènes qui, comme on l'a déjà dit, sont spécifiques aux adénocarcinomes et qui, ne faisant pas apparaître de réaction croisée avec les déterminants antigènes pn des cellules normales, ne sont reconnus que par les anticorps qui leur sont spécifiques, c'est-à-dire les anticorps anti-K : cette définition inclut tout mélange antigène CEA dans lequel les déterminants antigènes autres que les déterminants K ont été éliminés totalement ou quasitotalement. L'expression "déterminants antigènes k" désigne des déterminants antigènes qui sont présents sur les cellules d'adénocarcinome en "association" avec, c'est-à-dire en compagnie des déterminants antigènes K qui sont spécifiques aux adénocarcinomes, lesdits déterminants antigènes pk faisant apparaître, comme on l'a déjà dit, une réaction croisée avec les déterminants antigènes pn des cellules normales : cette définition inclut tout mélange antigène CEA dans lequel les déterminants antigènes autres que les déterminants pk ont été éliminés en totalité ou en quasitotalité. Les déterminants antigènes pn sont, comme on l'a déjà dit, des déterminants antigènes présents dans le plasma ou le sérum normal et donnant une réaction croisée avec les déterminants antigènes pk Un anticorps anti- est soit un anticorps obtenu en immunisant des animaux avec les déterminants antigènes K précités, soit tout anticorps anti-CEA (c'est-à-dire l'anticorps produit en immunisant es animaux avec le CEA" modifié, de telle sorte que les sites d'anticorps autres que les sites anti-K y ont été saturés en totalité ou en quasitotalité par des déterminants antigènes qui leur sont spécifiques. De même, un anticorps anti-Pk est soit un anticorps obtenu en immunisant des animaux assc les déterminants antigènes pk précités, soit tout anticorps ani-CEA modifié de telle sorte que les su sites d'anticorps autres que les sites anti pk y ont été saturés en totalité OU en quasi-totalité par des déterminants antigènes quI eur sont spécifiques Dans l'ensemble du présent mémoire descriptif, le terme "anticorps" désigne aussi bien des immunoglobulines que des fragments d'immunoglobulines et peut également signifier l'antisérum correspondant. Par ailleurs, sauf indication contraire, le terme "anticorps" signifie un anticorps polyclonal ; lorsqu'il s'agit d'un anticorps monoclonal, cela est précisé. Deux procédés différents sont fournis par la présente invention pour la préparation d'anticorps anti-17 spécifiques aux déterminants antigènes K. Selon le premier de ces procédés, on obtient des anticorps anti-K en absorbant des anticorps produits contre un mélange de déterminants antigènes K et avec des déterminants antigènes pn ou pk de manière à saturer les sites de fixation immunologiques pk sur lesdits anticorps. Selon le second procédé, on cbtient des anticorps anti-K en 1) immunisant des animaux avec des déterminants antigènes Pn ou Pk pour produire des anticorps anti-Pn ou anti-Pk 2) purifiant un mélange de déterminants antigènes K et Pk au moyen des anticorps anti-Pn ou anti-Pk produits selon 1), de manière à obtenir des déterminants antigènes R ; et 3) immunisant des animaux avec des déterminants antigènes K obtenus selon 2). Le champ d'application de l'invention inclut, en plus des anticorps spécifiques anti-K obtenus par les deux procédés différents ci-dessus, également les déterminants antigènesKproduits selon l'étape 2) du second procédé décrit ci-dessus, et, en outre, les déterminants antigènes pk et et les anticorps anti-Dk et anti-pn qui leur sont spécifiques, qui sont mis en jeu dans les deux procédés ci-dessus. Les formes marquées, par exemple les formes radiomarquées, les formes marquées par enzymes, ou les formes marquées par fluorescence, des déterminants antigènes.K, pk et pn précités et des anticorps anti-K, anti-pk et anti-Pn correspondants, sont également incluses dans le champ d'application de la présente invention. Conformément au premier procédé décrit ci-dessus pour la préparation des anticorps anti-K, on injecte le mélange de déterminants antigènesKet à à un animal, à une chèvre, un mouton ou un lapin par exemple, en suivant les modes opératoires habituels et connus d'immunisation, par exemple sous la forme d'une émulsion dans l'adjuvant de Freund, pour donner naissance à un antisérum anti-K/Pk. On récupère ce dernier en prélevant du sang de l'animal selon des techniques habituelles puis on l'absorbe par incubation par exemple, avec des déterminants antigènes pn ou L'incubation se fait généralement entre la température ambiante et 500C environ, de préférence à 370C environ, pendant un temps variant de 1 à 5 jours, de préférence pendant trois jours environ.On peut utiliser du plasma humain normal au lieu des déterminants antigènes Pn puisque, comme on l'a déjà dit, le plasma humain normal contient des déterminants antigènes pn. A titre indicatif, par exemple, on peut faire incuber 0,1 ml de sérum de chèvre à 37 C pendant trois jours avec 324 ml d'une solution de PBS contenant des déterminants antigènes p n ou R à une concentration d'environ 50 y/ml, ou bien avec environ 50 ml de plasma humain normal. A la fin de 17 incubation, on centrifuge la substance et on utilise le surnageant tel quel, ou, éventuellement, après des traitements complémentaires de dilution, de purification et/ou de stabilisation, en tant qu'anticorps spécifique anti-K.Conformément au second procédé décrit ci-dessus pour la préparation des anticorps ou des antisérums anti-K, on injecte des déterminants antigènes Pn ou Pk, par exemple sous la forme d'une émulsion dans l'adjuvant de reund, à un animal, à une chèvre, un mouton ou un lapin par exemple, en suivant un mode opératoire classique d'immunisation, pour donne naissance à un antisérum anti-Pn ou anti-Pk, que l'on récupère Ici encore on prélevant le sang de l'animal dlune manière habituelle. On extrait les immunoglobulines de l'antisérum, le cas échéant, par des modes opératoires connus, La purification du mélange de déterminants antigènes K et Pk au moyen d'anticorps anti-Pn ou anti-Pk pour obtenir les déterminants antigènes K, peut se faire selon des procédés connus. Une technique utilisable peut être, à titre d'exemple, la chromatographie d'immuno-affinité ou de bio-absorption, qui est basée sur la réaction immunologique entre un antigène et un anticorps lié à un support inerte. C'est ainsi, par exemple, que l'on élue une solution, par exemple une solution dans le PBS, du mélange d'antigènes K et pk, à travers une résine, par exemple la "Sepharose 4B, portant des anticorps anti-Pn ou anti-Pk qui lui sont liés. On récupère ainsi les déterminants antigenes K dans la fraction non liée. On produit ensuite l'antisérum anti-K en injectant les déterminants antigènes K ainsi obtenus à un animal, par exemple de l'espèce indiquée ci-dessus, selon des modes opératoires classiques, par exemple ceux qui ont déjà été décrits dans le présent mémoire descriptif. Le mélange des déterminants antigènes K et pk utilisé selon les procédés décrits ci-dessus pour la préparation des anticorps anti-K est obtenu par extraction de tissus d'adénocarcinome primaire ou métastatique, par exemple de métastases hépatiques, ou bien de fluides biologiques de patients atteints d'adénocarcinome. On peut procéder à l'extraction en suivant des modes opératoires connus et, si des tissus d'adénocarcinome sont utilisés, ceux-ci demandent à être homogénéisés au préalable : l'homogénéisation se fait généralement avec une "X Press" (LKB). On peut ensuite procéder à l'extraction à l'aide d'un solvant approprié quelconque, de préférence un solvant de glycoprotéines, qui peut être, à titre d'exemple, l;acide perchlorique, l'acide trichloracétique, l'acIde phosphotungstique, un halogénure de métal alcalin, le chlorure de potassium par exemple, un mélange de phénol et d'éthanol, un détergent neutre, cationique ou anionique tel que, par exemple, le SDS, le DOC, le CPC, le "Triton X 100", le "Nonidet P40", etc. On utilise de préférence le solvant d'extraction en volume égal à celui de l'homogénéisat ou du fluide biologique, et c'est de préférence un acide concentre, ayant par exemple une concentration d'environ 0,5 N à environ 2 N ; 11 acide perchiorique 2 N est un solvant d'extraction que l'on préfère tout particulièrement. Toute température inférieure à la température ambiante convient pour le procédé d'extraction, mais on préfère généralement une température de 4 C environ par exemple Les temps d'extraction varient habituellement de 10 minutes environ à une heure environ Après l'extraction, on sépare le précipité par filtration ou centrifugation et on peut dialyser et purifier le surnageant. On peut utiliser de nombreux moyens de purification connus basés sur des principes différents. C'est ainsi, par exemple, que l'on peut, sur la base des différences de charge électrique, utiliser pour la purification des résines échangeuses d'ions telles que, par exemple, "Sephadex" (marque déposée) DEAE, "Sephacel" (marque déposée) ou - . oge -5 , ou "Sephadex1, QAE ou SP. Sur la base des différences de poids moléculaire et de volume hydrodynamique, on peut faire appel à des techniques de chromatographie, telles que, par exemple, la filtration sur gel et la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). On peut obtenir un degré de purification plus élevé sur la base des différences de migration électrophorétique et de point isoélectrioue : c'est ainsi que l1on peut utiliser des techniques d'électrophorèse telles que, par exemple, 1 'électrophorèse de préparation sur support inerte, par exemple sur "Sephadex" marque poser, sur gel de p. olyacryl- amide, etc., ou l' "isoélectrofocalisation" sur plaques ou sur colonne. Sur la base de la teneur glycidique, on peut obtenir un degré. de purification plus poussé, le cas échéant, en utilisant différentes lectines fixées à des résines, par exemple la "Sepharose" (marque déposée) 4B. Les déterminants antigènes Pn à utiliser dans les procédés décrits ci-dessus pour la production des anticorps anti-K peuvent être obtenus à partir de plasma humain normal selon des modes opératoires classiques d'extraction et de purification. C'est ainsi, par exemple, que l'on peut extraire du plasma humain normal avec, par exemple, un volume égal d'acide perchlorique ou avec tout autre solvant approprié tel que, par exemple, l'un de ceux qu ont été indiqués ci- dessus pour l'extraction du mélange antigène K/Pk de tissus d'adénocarclnome ; on peut également utilise des températures et des temps d'extraction similaires.On peut ensuite dialyser le produit de l'extraction d'une manière classique et le purifier par des techniques connues, par exemple par imuno-affinité avec des anticorps spécifiques aux déterminants pn, par exemple par chromatographie d'immuno- affinité contre des anticorps anti-K/Pk ou contre des anticorps anti-Pk ou encore contre des anticorps anti-Pn. Les déterminants antigènes pn se fixent ainsi aux anticorps et on les en détache par des méthodes connues, par exemple en utilisant un thiocyanate,- l'urée ou l'acide propionique, selon des modes opératoires classiques [J.W. Eveleigh, D.E. Levy, J. of Solid Phase Biochemistry, 2, 45, 1977]. Les déterminants antigènes pk qui, le cas échéant, peuvent être également mis en jeu dans les procédés ci-dessus pour la préparation des anticorps anti-K peuvent être obtenus, par exemple, à partir du mélange des déterminants antigènes K et pk, On peut faire subir à ce mélange, extrait par exemple de tissus d'adénocarcinome comme décrit ci-dessus, par exemple, une chromatographie de bio-absorption, en éluant, par exemple, une solution de ces mélanges, par exemple une solution dans le PBS, à travers une résine, la "Sepharose" 4B par exemple, portant des anticorps anti-Pn qui lui sont fixés. Les déterminants antigéniques pk, par suite de leur réaction croisée avec les déterminants antigéniques Pn, se lient à la résine qui porte les anticorps anti-pn, et on les en détache d'une manière classigue, par exemple au moyen de thiocyanate ou d'urée selon des modes opératoires classiques, comme rapporté ci-dessus. Le contenu ou le degré de purification de la substance antigénique, c'est-à-dire des déterminants antigéniques K, Pk k et P n et des mélanges antigêniques K/P k est contrôlé, soit par voie radio-immunologique soit par voie immunochimique, à partir de leur activité-immunologique K et pk ou pn, selon des procédés classiques. C'est ainsi, par exemple, qu'un contrôle radio-immunologique de la teneur en déterminants K d'une substance antigénique peut être effectué par mesure de l'inhibition produite par ladite substance visà-vis de la capacité de fixation d'un système RIA 1 gI-K # anti-K. Un contrôle analogue d'un système RIA 125I-Pk#anti Pk ou, respectivement, d'un système RIA 125I-Pn#anti-Pn, permet d'évaluer la teneur en Pk ou, respectivement, en Pn d'une substance antigénique. Les anticorps anti-P n et les anticorps a t. pk sont obtenus par les techniques d'immunisation connues, par exemple par les mêmes que celles décrites ci-avant pour obtenir de l'antisérum et des anticorps anti-K/P k Selon l'invention, on peut produire des anticorps anti-K, anti-Pk et anti Pn monoclonaux contre un seul déterminant antigénique K, Pk ou Pn en suivant les modes opératoires connus qui sont généralement utilisés pour preparer des anticorps monoclonaux par exemple la technique connue de l'hybridome telle qu'elle est rapportée, par exemple, par Kohler C. et Milstein C. dans Nature 256, 495-497, 1975. Selon l'invention, n'importe quelle méthode connue pour la détermination d'un antigène, par exemple n'importe quelle méthode de dosage immunologique par exemple le dosage radio- immunologique (RIA), ou le dosage enzymo-immunologique (EIA) ou l'immunofluorescence ou l'immunoluminescence, ou encore l'immunodiffusion ou l'immuno-électrophorèse, peut être utilisée pour révéler ou quantîf 1er les déterminants antigéniques K qui sont spécifiques aux adénocarcinomes ou, le cas échéant, les déterminants antigéniques Pk qui sont associes aux déterminants K sur les adénocarcinomes L'emploi d'un ou de plusieurs des déterminaits antigéniques K, Pk et K/Pk en mélange, que ce soit sous leur forme non maruée ou sous leur forme marquée, et des anticorps correspondants marqués ou non marqués, dans l'une quelconque desdites méthodes connues ci-dessus, permet de poser un diagnostic précoce des pathologies tumorales humaines qui sont connues sous le nom d'adénocarcinomes Un antigène, ou un déterminant antigénique ou un mélange antigénique ou un anticorpsmarquésest, respectivement, un antigène ou un déterminant antigénique ou un mélange antigénique ou un anticorps qui a été marqué au moyen de n'importe quel type possible de moyen de marquage : il peut s'agir, par exemple, d'un radio-isotope, d'une enzyme, ou d'une substance fluorescente ou luminescente.Pour le marquage, on peut suivre n'importe quel mode opératoire connu et usuel, par exemple pour marquer les antigènes. Pour marquer, par exemple, avec les radio-isotopes 125I ou 131l on peut suivre les techniques de la Chloramine T ou de la Lactoperoxydase (LPO) [Nature 194, 495, 1962 et, respectlvement, Bioch. Bioph. Acta 251, 363, 19713 ou des variantes de ces techniques ; ou bien on peut utiliser le réactif de Bolton et Hunter [Biochem. J. 133, 529, 19731. Pour marquer, par exemple, avec une enzyme, on peut suivre les techniques rapportées dans FEBS Letter 95, 311, 1978 ou dans J. Histochem. Cytochem. 22, 1084, 1974. Quand on utilise une méthode de dosage radioimmunologique (RIA) pour le diagnostic des adénocarcinomes, on peut utiliser n'importe quelle technique de RIA connue avoir par exemple Clin. Chem. 19 : 146, 19737. C'est ainsi, par exemple, que les déterminants antigéniques K qui sont spécifiques aux adénocarcinomes QU les déterminants antigéniques pk qui sont associés à ceux-ci sur les adénocarcinomes peuvent, à titre d'exemple, être quantifiés dans, par exemple, un fluide biologique ou un extrait de tissu, en les mettant en concurrence avec une quantité connue de radio-isotopes marqués, par exemple des déterminants antigéniques K ou, respectivement pk ou un mélange antigénique K/pk radiomarqués à l'iode 125 ou l'iode 131 pour la réaction avec une quantité limitée d'anticorps anti-K ou, respectivement, anti-pk. La réaction de mise en concurrence peut se faire d'une manière conventionnelle, par exemple par incubation à une température de 4"C environ à 400C environ, de préférence à la température ambiante, pendant un temps variant approximativement de 6 à 90 heures, de préférence pendant 15 à 16 heures environ. On sépare ensuite de la fraction non fixée la fraction antigénique fixée aux anticorps, et on mesure la radio-activité dans la fraction fixée et/ou non fixée. La séparation de la fraction antigénique fixée d'avec la fraction non fixée peut se faire par des procédés connus, par exemple en utilisant des anticorps spécifiques aux immunoglobulines de l'espèce dans laquelle il a été donné naissance aux premiers anticorps, c'est-à-dire aux anticorps anti-K ou anti-Pk.La radio-activité dans la fraction fixée et dans la fraction non fixée peut être évaluée au moyen d'une courbe étalon, tracée par exemple avec un K étalon ou un pk étalon, ou bien en mesurant directement la chute possible de la capacité de fixation du K ou du Pk ou du K/Pk radiomarqué avec les anticorps anti-K ou anti-Pk, et ainsi, par exemple, une diminution de la radio-activité mesurée sur la fraction fixée est proportionnelle à la concentration de l'échantillon en K ou en pk Lorsqu'on utilise une méthode de dosage enzymoimmunologique pour le diagnostic des adénocarcinomes, on peut utiliser n'importe quel procédé immunologique connu faisant appel à un marquage par enzyme par exemple aux procédés qui sont décrits dans J. Immunclogy 109, 129, 1972.Bien que de nombreuses enzymes puissent être utilisées avec succès comme parqueurs, des enzymes que l'on préfère tout particulièrement sont, par exemple, la peroxydase, la ss-galactosidase, 5 phosphatase alcaline et la glucose-oxydase. C'est ainsi par exemple, que selon une méthode possible de dosage enzymo-immunologique, on peut quantifier les déterminants antigéniques K ou pk d'un échantillon de fluides biologiques ou d'extraits de tissu par un mode opératoire EIA du type sandwich, selon lequel on fait réagir l'échantillon, par incubation par exemple, avec des anticorps anti-K ou, respectivement, anti-Pk qui sont soit liés chimiquement sot absorbés passivement sur un support solide, sur des perles de polystyrène par exemple. Après avoir éliminé l'excès de réactif par des lavages, on ajoute les anticorps anti-K ou, respectivement1 anti-P marqués par enzyme, tels que, par exemple, les anticorps marqués par la ss-galactosidase, obtenus selon le mode opératoire décrit dans FEBS Letters 95, 311-313, 1978. Après d'autres lavages, on ajoute le substrat enzymatique approprié par exemple de l'ortho-nitrophényl-galactopyranoside si c'est la ss-galactosidase que l'on utilise comme marqueur, et on mesure la couleur développée, son intensité étant proportionnelle à la concentration des déterminants antigéniques R ou, respectivement, pk dans l'échantillon. Pour l'application histochimique, on peut utiliser n'importe quel procédé immunohistochimique connu [Human Pathology 12, 590-596, 1981] pour repérer la présence de déterminants antigéniques K ou Pk sur les préparations histologiques, au moyen d'anticorps spécifiques anti-K ou anti-Pk, selon l'invention.La détermination histologique peut se faire sur des coupes de tissu congelées ou fixées et enveloppées de manière routinière, selon des modes opératoires classiques. C'est ainsi, par exemple, que l'on peut faire incuber des coupes de tissu à la température ambiante dans un tampon aqueux avec des anticorps anti-K ou, respectivement, anti-Pk, de telle sorte que les anticorps anti-K ou anti-pk Pk se fixent sur les sites où les déterminants antigéniques K ou pk respectifs sont présents. On met ensuite en évidence les anticorps fixés par réaction ultérieure, par incubation par exemple, avec des anticorps marqués spécifiques aux immunoglobulines de l'espèce dans laquelle les premiers anticorps anti-K ou anti-Pk ont pris naissance. On peut préparer lesdits anticorps marqués selon des modes opératoires connus en utilisant des marqueurs connus tels que, par exemple, des enzymes, par exemple la peroxydase, la B-galactosidase, la phosphatase alcaline, la glucoseoxydase, les complexes enzyme-anti-enzyme, par exemple le complexe peroxydase-antiperoxydase (PAP) ; des molécules fluorescentes, par exemple la fluorescéine ou la Xodamine ou des combinaisons IBiotinmAvidiX dans lesquelles 1' "Avidine" est elle-meme fixée à une enzyme ou à une substance fluorescente, par exemple du type susmentionné. L'analyse microscopique finale de-la préparation histologique révèlera les sites où les déterminants antigéniques K ou pk recherchés sont présents : on observera des sites fluorescents lorsqu'un marqueur fluorescent sera utilisé, tandis que l'on observera des sites colorés lorsqu'on aura utilisé pour la détermination une enzyme marqueur et un substrat chromogène qui lui est spécifique. Une combinaison particulièrement utile pour la mise en évidence histochimique des déterminants antigéniques K ou pk sur des coupes de tissu met en jeu l'enzyme ss-galacto- sidase en tant que marqueur et un indolyl-galactoside, par exemple le 5-bromo-4-chloro-indolyl-galactoside, en tant que substrat chromogène enzymatique : on peut suivre, par exemple, pour une telle détermination, la technique de l'immuno- qalactosidase qui est décrite, par exemple, dans Histochemis- try 76, 153-158, 1982. Mais, comme on l'a déjà dit, outre les méthodes de dosage immunologique exposées ci-dessus, on peut utiliser n'importe quelle autre méthode immunologique, selon 'invention, pour mettre en evidence la présence de déterminants antigéniques K spécifiques aux adénocarcinomes ou de déterminants antigéniques Pk associés, dans des fluides biologiques ou dans des extraits ou des coupes de tissus Commue on l'a déjà dit également, en plus des procédés de diagnostIc des adénocarcinomes humains 7 invention procure également des combinaisons de réactifs permettant de mettre en oeuvre lesdits procédés. Bien que différentes combinaisons de réactifs soient prévues pour des méthodes analytiques différentes, une combinaison de réactifs permettant la mise en évidence des déterminants antigéniques K contient toujours, à titre de constituant essentiel, un anticorps spécifique anti-K, et une combinaison de réactif s permettant la mise en évidence des déterminants antigéniques Pk contient, à titre de constituant essentiel, un anticorps anti-Pk.Chacune desdites combinaisons de réactifs contient, de plus, d'autres constituants qui sont éventuellement différents dBune combinaison de réactifs l'autre, suivant la méthode analytique à laquelle la combinaison de réactifs est destinée, et ces constituants supplémentaires peuvent être, par exemple, choisis parmi les déterminants antigéniques K ou Pk marqués, les mélanges antigéniques K/Pk marqués, les anticorps anti-K ou anti-Pk marqués ou les anticorps marqués spécifiques aux immunoglobulines de l'espèces dans laquelle lesdits anticorps anti-K ou anti-Pk ont pris naissance. En outre, d'autres constituants, facultatifs ou non, peuvent éventuellement se trouver dans les combinaisons de réactifs faisant l'objet de l'invention, tels que, par exemple, un système de séparation exempt de liaison, des témoins, des étalons, des tampons, des stabilisateurs, des agents antimicrobiens, des substances tensio-actives, des substrats enzymatiques et des activateurs. C'est ainsi, par exemple, que pour une méthode de dosage radio-immunologique permettant la détection des déterminants antigéniques K ou pk dans des fluides biologiques ou dans des extraits de tissus selon la méthode RIA décrite ci-dessus dans le présent mémoire descriptif, une combinaison de réactifs utilisable peut consister en une "trousse" contenant essentiellement 1) un anticorps anti-K ou, respectivement, anti-Pk ; 2) les déterminants antigéniques K ou Pk respectifs radio marqués, ou encore un mélange antigénique K/Pk radio marqué 3) des témoins ; et 4) des tampons. La trousse ci-dessus peut contenir en outre un second anticorps spécifique aux immunoglobulines de l'espèce dans laquelle l'anticorps anti-K ou anti-Pk respectif du constituant 1) a été développé, et, facultativement, des substances tensio-actives et/ou des agents stabilisateurs ou antimicrobiens. Le K ou le Pk ou le K/Pk radiomarqué du constituant 2) de la trousse peut être, par exemple, K ou Pk ou K/Pk marqué avec le radio-isotope 125I ou 1311. Les témoins 3) comprennent au moins un témoin négatif et un témoin positif, et les tampons 4) peuvent comprendre n'importe quel tampon ayant, par exemple, un pH compris entre 6,5 environ et 8 environ, égal de préférence à 7,2 environ. Les substances tensio-actives peuvent être, par exemple, le "Tween" 20 ou 80, le "Nonidet P40, le "Triton X100", etc. Les agents de stabilisation peuvent être, par exemple, la sérum albumine de boeuf, la gélatine, etc. Un agent antimicrobien peut être, par exemple, l'azoture de sodium (NaN3). Les tampons peuvent être, par exemple, des tampons de phosphate, éventuellement mélangés à des sels minéraux els que, par exemple, le chlorure de sodium Dans une forme d réalisation tout particulièrement préférée, une trousse permettant la détection RIA des déterminants antigéniques K ou Pk contient : 1) un anticorps anti-K ou anti-Pk provenant d'une chèvre, correctement dilué dans un mélange de : - tampon de phosphate dont le pH est compris entre o,5 environ eL 8 environ, de préférence egal à 7,2 environ, et dont la concentration molaire est comprise entre 20 mmoles environ et 130 mmoles environ, de préférence égale à 70 mmolec environ - chlorure de sodium dont la concentration molaire est comprise entre 20 mmoles environ et 150 mmoles environ1 de préférence égale à 70 mmoles environ , - sel dîsodique d'EDTA dont la concentration molaire est comprise entre 25 mmoles environ et 50 mmoles environ, de préférence égale à 33 mmoles environ - azoture de sodium dont la concentration molaire est comprise entre 15 mmoles environ et 50 mmoles environ, de préférence égale à 31 mmoles environ, et - sérum normal de chèvre dont la concentration volume/ volume est comprise entre 0,0 % environ et 0,5% environ de préférence égale à 0,1 % environ 2) Un tampon de référence (à utiliser pour déterminer la capacité de fixation maximale du système anticorps ++ antigène radiomarqué) comprenant - un tampon de phosphate dont le pH est compris entre 6,5 environ et 8 environ, de préférence égal à 7,2 environ, et dont la concentration molaire est comprise entre 20 mmoles environ et 150 mmoles environ, de préférence égale à 70 mmoles environ - du chlorure de sodium dont la concentration molaire est comprise entre 20 mmoles environ et 150 mmoles environ, de préférence égale à 70 mmoles environ - de l'azoture de sodium dont la concentration molaire est comprise entre 15 mmoles environ et 50 mmoles environ, de préférence égale à 31 mmoles environ ; et - de la sérum albumine de boeuf dont la concentration poids/volume est comprise entre 0,1 % environ et 1 % environ, de préférence égale à 0,4 % environ 3) Un marqueur comprenant : des déterminants antigéniques K ou Pk ou un mélange antigénique K/Pk radiomarqués à l'iode 125, dilués dans le tampon de référence 2) de manière à avoir une concentra tion de 1,5 ng/ml avec une activité spécifique d'environ 60 mCi/mg ; 4) un antisérum anti-immunoglobulines de chèvre précipitant, correctement dilué dans le tampon de référence 2) 5) un témoin négatif : plasma humain négatif à l'essai, c'est-à-dire plasma humain normal ; et 6) un témoin positif : plasma humain positif à essai, c'est-à-dire plasma humain provenant d'un patient atteint d'adénocarcinome ou plasma humain normal auquel une quantité connue de déterminants antigéniques K ou Pk ou d'un mélange antigénique K/P k a été ajoutée. Pour une méthode de dosage enzymo-immunologique permettant la détection des déterminants antigéniques K ou pk dans des fluides biologiques ou dans des extraits de tissus selon la méthode EIA du type sandwich décrite ci-dessus dans le présent mémoire descriptif, on peut utiliser une combinaison de réactifs contenant essentiellement, par exemple 1) les anticorps anti-K ou respectivement antipk fixés à une phase solide ; 2) les anticorps anti-K ou anti-Pk respectifs conjugués à une enzyme 3) un substrat enzymatique ; 4) des témoins ; et 5) des tampons. La combinaison de réactifs ci-dessus peut contenir en outre d'autres constituants tels que, par exemple, un agent de blocage de la réaction enzymatique et, en outre, ainsi qu'on l'a déjà di, des substances tensio-actives, des stabilisateurs, des agents antimicrobiens, des activateurs enzymatiques, etc. Les anticorps anti-K ou anti-P du constituant a) peuvent outre, par exemple absorbés sur des perles de polystyrène. Te constituant 2) conjugué à une enzyme peut hêtre, par exemple, des anticorps anti-K ou anti-Pk conjugués avec l'enzyme ss-galactosidase, selon des méthodes connues déjà exposées dans le présent mémoire descriptif. Le constituant 3), substrat enzymatique, peut être, par exemple, n' importe quel substrat chromogène qui est spécifique à 'enzyme d constituant 2) g si c'est la X- galactosidase qui est utilisée comme enzyme, un substrat chromogène approprié peut être, par exemple, 1' ortho-nitro- phénylgalactopyranoside. Les témoins 4) et les tampons 5) peuvent être ceux qui ont déjà été spécifies pour la trousse RIA. L'agent de blocage éventuel de la réaction enzymatique peut être, par exemple, lorsque c'est la S- galactosidase qui est utilisée comme enzyme, un carbonate de métal alcalin, le carbonate de sodium par exemple. Dans une forme de réalisation particulièrement préférée, une trousse permettant la détection par la méthode précitée EIA de type sandwich, des déterminants antigéniques K ou Pk comprend 1) des anticorps anti-K ou respectìvement anti-Pk absorbés sur des perles de polystyrène 2) un tampon diluant contenant - un tampon de phosphate dont le pH est compris entre 6,5 environ et 8 environ, de préférence égal à 7,2 environ, et dont la concentration molaire est comprise entre 50 mmoles environ et 150 mmoles environ, de préférence égale à 70 mmoles environ - du chlorure de sodium dont la concentration molaire est comprise entre 50 mmoles environ et 150 mmoles environ, de préférence égale à 70 mmoles environ - de l'azoture de sodium dont la concentration molaire est comprise entre 15 mmoles environ et 50 mmoles environ, de préférence égale à 31 mmoles environ ; et - de la sérum albumine de boeuf dont la concentration poidsjvolume est comprise entre 0,5 % environ et 3 z environ, de préférence égale à 1 % environ ; 3) les anticorps anti-K ouanti-pk respectifs conjugués à de la -galactosidase, correctement dilués dans le tampon 2) ; 4) un substrat enzymatique contenant - de l'ortho-nitrophénylgalactopyranoslde dont la concentration molaire est comprise entre 2 mmoles environ et 4 mmoles environ, de préférence égale à 2,3 mmoles environ ; et - un tampon de phosphate dont le pH est compris entre 6,5 environ et 8 environ, de préférence égal à 7,2 environ, et dont la concentration molaire est comprise entre 10 mmoles environ et 30 mmoles environ, de préférence égale à 15 mmoles environ ; 5) un agent de blocage de la réaction enzymatique, qui contient du carbonate de sodium à une concentration molaire comprise entre 0,25M environ et 2 M environ, de préférence égale à 1 M environ 6) un témoin négatif : plasma humain négatif à l'essai, c'est-à-dire plasma humain normal ; et 7) un témoin positif : plasma humain positif à essai, c'est-à-dire plasma humain provenant d'un patient atteint d'adénocarcinome, ou plasma humain normal auquel on a ajouté une quantité connue de déterminants antigéniques K ou pk ou d'un mélange antigénique K/pk Pour le dosage histochimique des déterminants antigéniques K ou pk sur des coupes de tissus selon le mode opératoire déjà décrit dans le présent mémoire descriptif, une combinaison de réactifs utilisables peut être, par exemple, une trousse contenant essentiellement 1) des anticorps anti-K ou respectivement anti-Pk 2) des anticorps marqués par enzyme qui sont spécifiques aux immunoglobulines de l'espèce dans laquelle les anticorps anti-K ou anti-Pk respectifs du constituant 1) ont pris naissance 3) un substrat enzymatique ; et 4) des tampons. D'autres constituants peuvent être inclus dans la trousse ci-dessus tels que par exemple un agent de blocage servant à éliminer les interactions aspécifiques éventuellement gênantes, un agent colorant de contraste (pour les noyaux) et, en outre, ainsi qu'on l'a déjà dit, des substances tensic-actives, des stabilisateurs, des agents antimicrobiens, des activateur s d'enzyme, etc Dans la combinaison de réactifs ci-dessus, on peut donner naissance, par exemple, aux anticorps anti-K ou antipk chez la chèvre, puis les anticorps du constituant 2) seront des anticorps anti-immunoglobulines de chèvre et seront cultivés, par exemple, chez l'âne. les anticorps marqués r)ar enzyme du constituant 2) peuvent être, par exemple, des anticorps marqués par la ss-galactosidase, obtenus par des techniques connues ainsi qu'on l'a déjà dit. Le constituant substrat enzymatique 3) peut être toute substance qui est spécifique à l'enzyme du constituant 2) et qui est capable de donner un produit cooré et insoluble par l'action de l'enzyme : si c'est la 6-galacto- sidase qui est utilisée comme enzyme, un substrat chromogène utile peut être, par exemple, un indolylgalactoside, en particulier le 5-bromo-4-chloro-indolyl- galactoside. Les tampons peuvent être, par exemple, des tampons de phosphate ou "Tris" dont le pH est compris entre 6,5 , 5 environ et 8 environ et est de préférence égal å 7,3 environ. L'agent de blocage qui est éventuellement requis pour éliminer les interférences résultant d'interactions aspécifiques, peut être, par exemple, du sérum d'âne normal pour le cas où il est donné naissance aux anticorps du constituant 2) chez l' ne. L'agent colorant de contraste peut contenir, par exemple, de l'acide carminique. Selon une forme de réalisation particulièrement préférée, une trousse permettant la démonstration histochimique des déterminants antigéniques K ou pk sur des coupes de tissus contient 1) un tampon de lavage comprenant - un tampon "Tris" ou de phosphate dont le pH est compris entre 6,5 environ et 8 environ et est de préférence égal à 7,3 environ, et dont la concentration molaire est comprise entre 5 mmoles et 100 mmoles environ et est de préférence égale à 10 mmoles environ ; et - du chlorure de sodium dont la concentration molaire est comprise entre 50 mmoles environ et 200 mmoles environ et est de préférence égale à 150 mmoles environ 2) un tampon de blocage comprenant les mêmes constituants que le tampon de lavage 1) ci-dessus et, de plus, du sérum d'âne normal à une concentration volume/volume comprise entre 1 % environ et 5 % environ et de préférence égale à 3 % environ 3) des anticorps anti-K ou anti- respectifs, cultivés chez la chèvre, correctement dilués dans le tampon 1) ci dessus ; 4) des anticorps anti-immunoglobulines de chèvre conjugués à la (3-galactosidase, cultivés chez l'âne et correctement dilués dans le tampon 1) ci-dessus 5) un substrat enzymatique contenant un tampon de phosphate dont le pH est compris entre 7 environ et 8 environ et est de préférence égal à 7,4 environ, et dont la concentration molaire est comprise entre 5 mmoles environ et 50 mmoles environ et est de préférence égale à 10 mmoles environ - du chlorure de sodium dont la concentration molaire est comprise entre 5 mmoles environ et 50 mmoles environ et est de préférence égale à 10 mmoles environ - du chlorure de magnésium dont la concentration molaire est comprise entre 0,1 mmole environ et 2 mmoles environ et est de préférence égale à 1 mmole environ - du 5-bromo-4-chloro-indolylgalactoside dont la concentration molaire est comprise entre 0,5 mmole environ et 5 irmoles environ et est de préférence égale à 1 mmole environ - du ferrocyanure da potassium dont la concentration molaire est comprise entre 3 mmoles environ et 10 mmoles environ et est de préférence égale à 6 mmoles environ ; et - du ferricyanure de potassium dont la concentratIon molaire est comprise entre 3 mmoles environ et 10 mmoles environ et est de préférence égale à 6 ntmcles environ ; 6) un agent colorant de contraste contenant - de l'acide carminique dont la concentration poids/ volume est comprise entre 1 gXl et 10 g/l environ et et est de préférence égale à 2,5 g/l environ ; et - du sulfate de potassium et dealuminium dont la concentration molaire est comprise entre 25 mmoles environ et 150 mmoles environ et est de préférence égale à 50 mmoles environ. Dans les formes de réalisation préférées décrites ci-dessus pour les combinaisons de réactifs selon l'invention, les concentrations indiquées sont les concentrations par litre auxquelles chaque constituant est présent dans la solution ou dans le mélange utilisé pour effectuer l'essai. L'utilisation des combinaisons de réactifs qui font l'objet de la présente invention dans les méthodes analytiques connues permettant la détermination des antigènes, y compris les méthodes de dosage immunologique en phase liquide et les méthodes de dosage immunologique en phase solide et des déterminations histochimiques, permet d'améliorer d'une manière significative la possibilité de poser le diagnostic des adnocarcinomes humains. La possibilité de détecter, selon l'invention, uniquement les déterminants antigéniques (K) qui sont spécifiques aux adénocarcinomes sans interférence découlant de la présence des déterminants antigéniques pn ou bien les déterminants antigéniques (P k) qui sont associés aux déterminants K sur les adénocarcinomes, permet de parvenir à de meilleurs diagnostics que ceux obtenus avec les trousses connues, disponibles dans le commerce, pour le dosage CEA en erfet, avec les procédés et les réactifs selon l'invention, on observe un nombre nettement réduit de faux résultats positifs. Les résultats obtenus à partir d'expériences menées avec les procédés et les réactif s selon l'invention sur de nombreux cas de pathologies non néoplastiques, y compris de nombreuses pathologies de dégénérescence inflammatoire, et aussi de pathologies néoplastiques, ont été caractérisés par des pourcentages de faux résultats positifs et, respectivement, de faux résultats négatifs, plus faibles que ceux observés dans les cas où on utilise les trousses connues pour le dosage CEA, utilisant des anticorps anti-CEA (par exemple l'essai CEA de Roche etla trousse CEA de Liso-phase). Lorsque, en particulier, on a procédé à des expériences comparatives par analyse de préparations histologiques avec les réactifs selon la présénte invention, d'une part, et avec des trousses disponibles dans le commerce, d'autre part, par exemple ',DAKO PAP KIT" et 'IIMMULOR HISTO SET", on a observé que, alors que les trousses connues donnent une réaction positive même sur certaines cellules normales, avec un pourcentage d'erreur particulièrement élevé, par exemple dans le cas de l'analyse des tissus de la moelle des os, les réactifs selon l'invention révèlent exclusivement les cellules métastatiques d'adénocarcinome, sans aucun faux résultat positif, c'est-à-dire sans aucune coloration positive des cellules normales, des granulocytes par exemple, ce qui n'est pas du tout le cas avec les trousses disponibles dans le commerce auxquelles ils ont été comparés. Les nouveaux anticorps anti-K, polyclonaux ou monoclonaux, ou bien les anticorps anti-Pk, faisant l'objet de la présente invention, ainsi que les fragments d'anticorps anti-K ou anti-Pk, par exemple les fragments Fab' ou F(ab')2, peuvent etre utilises comme marqueurs, par exemple, en médecine nucléaire et en chue radioimmunologique. C'est ainsi, par exemple, que l'on peut marquer lesdits anticorps ou fragments d'anticorps avec des radio-isotopes, par exemple i31 I, et injecter les radiomarqueurs ainsi obtenus dans le corps humain pour visualIser et localiser les éventuelles cellules ou masses d'sdéno- carcinome. La visualisation du marqueur peut se faire par des méthodes connues à l'aide d'instruments spéciaux, par exemple à l'aide d'une &gamma;-caméra. Une autre application das nouveaux anticorps anti-K, polyclonaux ou monoclonaux, ou ou des nouveaux anticorps anti Pk, ou de fragments de ceux-ci, faisant l'objet de la présente invention est la thérapie des adénocarcinomes humains La possibilité utiliser des anticorps anti-K ou anti-pk respec-tifs spécifiques qui sont capables de reconnaître exclusivement les cellules d'adénocarcinome sans reconnaître les cellules normales, permet de réaliser une chimiothèrapie des tumeurs qui est spécifiquement et exclusivement dirigée sur les masses tumorales. Pour cette application, on peut conjuguer lesdits nouveaux anticorps ou fragments d'anticorps précités avec des médicaments antitumoraux ou avec d'autres agents cytotoxiques, et injecter le produit résultant au patient de telle sorte que le médicament ou l'agent cytotoxique ne soit spécifiquement transporté par le porteur d'anticorps que vers les cellules ou les masses tumorales. Les médicamentsantitumoraux peuvent être, par exemple, la daunorubicine, la doxorubicine, l'épirubicine et le méthotrexate. Un agent cytotoxique peut être, par exemple la ricine. La conjugaison du médicament antitumoral ou de 1'agent cytotoxique, par exemple l'un de ceux qui ont été mentionnés ci-dessus, avec un anticorps anti-K ou anti-pK polyclonal ou monoclonal selon l'invention peut se faire selon des modes opératoires connus, par exemple ceux qui sont décrits dans J. Immun. Methods 59, 129-143 (1983). Les conjugués formés entre un médicament antitumoral ou un agent cytotoxique, par exemple l'un de ceux déjà indiqués, et un anticorps anti-K ou anti-Pk polyclonal ou monoclonal, constituent un autre objet de l'invention. La présente invention procure par conséquent également un procédé amélioré de chimiothérapie spécifique et focalisée des adénocarcinomes humains, dans lequel on fait en sorte que l'effet du médicament se développe exclusivement sur les cellules tumorales et que les cellules normales ne soient nullement affectées par le médicament. Dans le présent mémoire descriptif, les abréviations EDTA, "Tris", PBS, PEG, HPLC, IgG, mCi, mM, P/V, V/V, DEAE, SDS, DOC, CPC désignent respectivement l'acide éthylènediamine-tétra-acétique, le tris-(hydroxyméthyl)aminométhane, une solution saline tamponnée par phosphate, le polyéthylèneglycol, la chromatographie liquide à haute performance, une ou des immunoglobulines, le milli Curie, le nombre de millimoles, le rapport poids/volume, le rapport volume/volume, la diéthylaminoéthyl cellulose, le dodécyl sulfate de sodium, le désoxycholate de sodium, et le chlorure de cétyl pyridinium Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter en aucune manière. EXEMPLE 1 On a congelé à - 80"C pendant 24 heures 100 g de métastases hépatiques d'adénocarcinome du côlon, puis on les a homogénéisées sous haute pression à l'aide d'un instrument "X-press" de LKB. On a repris lthomogenéisat avec trois volumes d'une solution aqueuse 0,025 M de saccharose, puis on lui a ajouté un volume égal de HCl04 2 N. Après centrifugation (10.000 g pendant 20 minutes à 40C) et dialyse du surnageant avec de l'eau distillé, on a effectué une precipitation avec du KCl 3 M pendant 24 heures à 40C sous agitation. On a à nouveau centrifugé le mélange (100.000 g pendant une heures à 40C), puis on a dialysé le surnageant avec un tampon de phosphate-0,005 M à pH 6,75. On a contrôlé l'extrait par RIA à partir de l'inhibition produite sur la capacité de fixation d'un système 125I-K # anti-K ou 125I-K/Pk # anti-K, puis on lui a fait subir une chromatographie dans une colonne de DEAE cellulose (1,6x 5 cm) préalablement équilibrée avec un tampon de phosphate 0,005 X à PH 6,75. On a procédé à des élutions successives avec 40 ml d'un tampon de phosphate 0,025 M à pH 6,75, avec 40 m d'un tampon de phosphate 0,05 M à pH 6,75, puis avec 40 ml d'un tampon de phosphate 0,1 M à pH 6,75.On a contrôlé chaque fraction éluée par RIA comme indiqué ci-dessus, puis on a concentre à 5 ml. On a encore purifié les fractions 0,025 M et 0,05 M par filtration sur gel (4 ml/heure) dans une colonne de "Sephadex" (marque déposée) G 200 (~ 1,6 cm ; hauteur 100 cm) tamponnée à pH 4,65 avec une solution aqueuse contenant du NaH2PO4 0,05 M et du NaCl à 0,9 %. On a ainsi élué deux pics et on a à nouveau contrôlé chacun d'eux par RIA, comme indiqué ci-dessus, et également avec un système 125I-Pk # anti-Pk afin de connaître sa teneur en activité antigénique K et Pk. Il a été confirmé que les deux pics correspondaient à un mélange de déterminants antigéniques K et pk avec une concentration en K plus grande dans le premier pic que dans le second. EXEMPLE 2 On a centrifuge 5 litres de plasma humain normal à 5.000 g pendant 15 minutes à 4 C, puis on a extrait le surnageant avec un volume égal de HClO4 1,2 M. On a dialysé l'extrait avec de l'eau courante pendant 24 heures puis à nouveau avec de l'eau bidistillée pendant encore 24 heures. Après avoir concentré de 10 à 20 fois à l'aide d'une cellule "Amicon" et par dialyse avec du PBS à pH 7,2, on a ajouté à l'extrait du "Tween" 80 à 0,5 % (pour éviter des interactions non spécifiques), puis on lui a fait subir une chromatographie dans une colonne de bic- absorption de "Sepharose" (marque déposée) 4B portant les anticorps anti-Pn liés à la résine. La fraction s'est liée à la résine pendant le processus d'élution (déterminants antigéniques Pn), puis on l'a détachée de la résine elle-même au moyen d'une solution de thiocyanate d'ammonium dans du PBS 3 M, selon le mode opératoire décrit dans J. of Solid-Phase Biochemistry 2, 45, 1977. On a dialysé le produit obtenu avec de l'eau distillée et avec du PBS à pH 7,2, puis on l'a contrôlé par RIA en mesurant l'inhibition de la capacité de fixation d'un système 125I-Pn # anti-Pn. Il a été ainsi confirmé que le contenu correspondait à des déterminants antigéniques p n à une concentration de 50 /ml, déterminée par la méthode de Lowry. EXEMPLE 3 On a fait subir à une solution de PBS à pH 7,2, contenant du Tween 80 (0,5 %)- et le mélange antigénique K/Pk (1 mg/ml) obtenu dans l'Exemple 1 (premier pic d'élution), une chromatographie dans une colonne de bio-absorption de "Sepharose" 4 B fixant des anticorps antipk. On a concentré à un petit volume la fraction non fixée contenant les déterminants antigéniques K, et on l'a contrôlée par RIA en mesurant l'inhibition de la capacité de fixation d'un système RIA 125I-K # anti-K. Il a été ainsi confirmé que la fraction non fixée contenait des déterminants antigéniques K à une concentration de O,1 mg/ml dans le mélange de PBS et de Tween. On a détache la fraction fixée, c'est-à-dire la fraction qui s'était liée aux anticorps anti-Pk de la colonne, par élution avec une solution de thiocyanate d'ammonium dans du PBS 3 M, selon le mode opératoire indiqué à l'Exemple 2. On a ensuite dialysé l'éluat avec de l'eau bidistillée puis avec du PBS, et on a contrôlé son contenu par RIA à partir de l'inhibition de la capacité de fixation d'un système RIA 125I-Pk # anti-Pk. Il a été ainsi confirmé que la fraction éludée contenait des déterminants antigéniques pk à une concentration de 0,15 mg/ml. On a répété le même mode opératoire ci-dessus en utilisant une colonne de bio-absorption de "Sepharose" 4B fixant les anticorps antiP. Pendant l'élution du mélange antigénique k, les déterminants antigéniques pk se sont lies par réaction croisée avec les anticorps anti-Pn de la colonne, et cela a été prouve par le fait que des déterminants antigénlques P k, à une concentration de 0,1 5 mg/ml, ont été récupérés de la fraction fixée.Le contrôle du contenu en Pk a été à nouveau effectué par RIA, comme indiqué ci-dessus a l'aide d'un système RIA 125I-Pk # anti Pk EXEMPLE 4 On a émulsifié une solution dans le PBS du mélange antigénique K/P obtenu selon 1 Exemple 1, à une concentration de 1 mg/ml, avec un volume égal d1une suspension complète d'adj@vant de eursd. On a utilisé le mélange obtenu pour faire quatre inJectioes sous-cutanées en quatre endroits différents dans le dos d'une chèvre du Thibet. On a répété les injections trois fois a intervalles de quinze jours, Après la troisième injection, on a contrôlé la réponse immunologique : on a prélevé du sang de l'animal et on a contrôlé le titre du sérum de la manière suivante.On a fait incuber des dilutions en série du sérum pendant une nuit à 37 C avec 100 1 d'une solution de PBS contenant 1,5 ng/ml de déterminants antigéniques K radiomarqués à l'iode 125 ou bien, selon une autre méthode, d'un mélange antigénique K/Pk radiomarqué à l'iode 125. après incubation, on a ajouté 0,1 ml d'un solution PBS à 1/10 d'anti-immunoglobulines de chèvre cultivées chez le lapin et 0,1 ml d'une solution de PBS à 1/1000 d'un sérum normal de chèvre. On a ensuite centrifugé le mélange à 5000 g pendant 15 minutes à 4 C, on a enlevé le surnageant et on a mesuré la radio-activité à l'aide d'un compteur gamma sur le précipité. On a calculé le titre de l'antisérum sous la forme de a dilution d'anticorps capable de fixer 50 0 de l'antigène marqué total. On a constaté que l'antisérum K/Pk obtenu avait un titre moyen de 1/50.000. En suivant un mode opératoire analogue mais en utilisant, à la place du mélange antigénique K/Pk, des déterminants antigeniques K ou des déterminants antigéniques pk obtenus selon l'Exemple 3, ou des déterminants antigéniques Pn obtenus selon l'Exemple 2, on a obtenu respectivement de l'antisérum anti-K, de l'antisérum antipk et de l'antisérum anti-P. EXEMPLE 5 On a traité 1 ml de l'antisérum anti-K/Pk obtenu à l'Exemple 4, par une solution de PEG 6.000 à 14 % dans 9 ml d'un tampon de "Veronal" 0,1 M à pH 8,6. On a repris le précipité obtenu avec la plus petite quantité possible d'un tampon de phosphate 0,02 M ayant un pH de 8, et on l'a purifié sur DEAE cellulose. On a fait à nouveau précipiter les protéines éluées dans le tampon de départ (5 ml) avec une solution de PEG 6.000 à 20 % dans un tampon de Veronal 0,1 M à pH 8,6 (45 ml). On a repris le précipité avec du PBS et avec 1 ml de Tween 80 à 0,5 %, puis on l'a à nouveau purifié dans une colonne de bio-absorption de "Sephadex" 4B portant des antigènes K/Pk fixés. On a ensuite éliminé les immunoglobulines anti K/Pk qui étaient restées fixées à la colonne, par élution avec du thiocyanate d'ammonium selon le mode opératoire indiqué à l'Exemple 2, pour obtenir des anticorps anti-K/Pk. Par un mode opératoire analogue, en partant des antisérums anti-K, anti-Pk et anti-Pn obtenus à l'Exemple k 4, on a obtenu respectivement des anticorps anti-K, anti-k et anti-Pn. EXEMPLE 6 On a fait incuber pendant 24 heures à 370C, avec 8 ml de plasma humain normal, l'antisérum anti-K/Pk obtenu selon le mode opératoire de l'Exemple 4 (0,1 ml), et on a centrifugé le mélange à 5.000 g pendant 5 minutes à 40C. On a fait incuber à nouveau chaque fraction de 0,1 ml du surnageant pendant 24 heures à 370C avec 4 ml de plasma humain normal, et on l'a à nouveau centrifugée dans les mêmes conditions que celles indiquées ci-dessus. On a séparé le surnageant et on a contrôlé son activité immunologique à partir de sa capacité à fixer dans la même mesure un mélange antigénique K/Pk radiomarqué à l'iode 125, d'une part en présence et d'autre part en l'absence de plasma humain normal L'absence de réaction croisée avec le plasma humain normal, c'est-à-dire avec des déterminants antigéniques Pn, a prouvé que l'antisérum obtenu était de l'antisérum anti-K. On a porté le sérum obtenu aux dilutions appropriées et on l'a utilisé pour les déterminations immunologiques des déterminants antigéniques K sur du plasma humain ou sur d'autres fluides biologiques ou extraits de tissus EXEMPLE 7 On a fait incuber pendant 24 heures à 370C I anti- sérum anti-K/Pk obtenu selon le mode opératoire de l'Exemple 4 (0,1 ml), avec une solution dans le PBS à 50 y/n1 de déterminants antigéniques Pn obtenus selon le mode opératoire de l'Exemple 2 (1,8 ml).Après incubation, on a centrifugé le mélange à 5.000 g pendant 15 minutes à 4 C On a à nouveau fait incuber chaque fraction de 0,1 ml du surnageant pendant 24 heures à 370C avec la solution de PBS à 50 &gamma;/ml de déterminants antigéniques Pn (1,8 ml). Après centrifugation dans les mêmes conditions que ci-dessus, on a porté le surnageant aux dilutions appropriées et on l'a utilisé comme antisérum anti-K pour les déterminations immunohistochimiques. On a contrôlé l'activité immunologique anti-K e l'antisérum à partir de sa capacité à révéler les cellules d'adénocarcinome mais pas les cellules normales, sur des coupes histologiques : pour cet essai, on a suivi la méthode de coloration par la peroxydase, telle qu'elle est décrite par Sternberger L.A. dans Immunocytochemistry - 2 Edition John Wiley and Sons - New York, 1979. EXEMPLE 8 On a immunisé des souris BALB/c âgées de 8 semaines, par injection intrapéritonéale de l'émulsion obtenue en mélangeant des déterminants antigéniques K, préparés selon le mode opératoire de l'Exemple 3 (100 g) avec un volume égal d'un adjuvant de Freund complet Au bout de 30 jours, on a répété les injections intrapéritonéales, avec des quantités moindres de déterminants antigéniques K. On a procédé à un contrôle de la réponse immunologique sur les animaux, comme indiqué à l'Exemple 4. En utilisant ensuite les animaux positifs au contrôle, on a procédé à une hybridation somatique avec des cellules de myélome de murine, selon le mode opératoire décrit dans Nature 256, 495-497, 1975. On a évalue la spécificité des produits obtenus par essai RIA en mesurant la capacité de fixation d'un antigène 125I-K. On a ensuite isolé et cloné les hybrides qui se sont avérées positives à l'essai. On a obtenu de grandes quantités d'anticorps monoclonal anti-K par injection intrapéritonéale à des souris BALB/c de cellules secrétant l'anticorps anti-K monoclonal. La croissance de la tumeur due aux cellules injectées s'est manifestée par la production d'un liquide ascitique contenant jusqu'à 20 mg/ml d'anticorps anti-K monoclonaux. En opérant d'une manière analogue mais en utilisant pour l'immunisation des déterminants antigéniques Pk ou Pn, au lieu des déterminants antigéniques K, dn a obtenu respectivement des anticorps monoclonaux anti-Pk et des anticorps monoclonaux antip n EXEMPLE 9 On a traité pendant 5 minutes, dans un bain de glace, une solution de déterminants antigéniques K préparés selon le mode opératoire de l'Exemple 3 (10 ssg) dans 20 l d'une solution de PBS à pH 7,2, avec une solution de Na125I (1 mCi) dans 10 jil de PBS, et 20 l d'une solution contenant de la chloramine T dans du PBS à une concentration de 0,5 mg/ml. On a ensuite ajouté au mélange 20 l d'une solution contenant du métabisulfite de sodium dans du PBS à une concentration de 2 mg/ml, et 20 iil d'une solution contenant de l'ioduré de potassium dans du PBS à une concentration de 20 mg/ml. On a purifié le produit de la réaction par HPLC afin d'éliminer l'iode 125 libre, et on a ainsi obtenu quantitativement des déterminants antigéniques K (125I-K) radiomarqués par l'iode 125. Par un mode opératoire analogue, on a prépare des déterminants antigéniques Pk radiomarqués (125I-Pk) et des mélanges antigéniques K/Pk radiomarqués (125I-K/Pk). EXEMPLE 10 Gn a essaye, au moyen de l'antisérum anti-K obtenu à l'Exemple 6, des échantillons de sérum humain provenant de 335 patients hospitalisés atteints de maladies non néoplastiques, en utilisant les réactifs et la méthode analytique indiqués ci-dessous. Réactifs (1) Tampon de éférence contenant - 70 mmoles de tampon de phosphate à pH 7,2 ; - 70 mmoles de chlorure de sodium , - 31 mmoles d'azoture de sodium ; et - sérum albumine de boeuf à 0,4 t P/V. (2) Antisérum anti-K obtenu comme à l'Exemple 6, correctement dilué au 50/1000 dans - 70 mmoles de tampon de phosphate à pH 7,2 ; - 70 mmoles de chlorure de sodium ; - 33 mmoles de sel disodique d'EDTA ; - 31 mmoles d'azoture de sodium ; et - sérum de chèvre normal à 0,1 % V/V. (3) Marqueur radio-iodé contenant un mélange antigénique 125I-K/Pk dilué dans le tampon (1) de façon à avoir une concentration de 1 5 ng/ml et une activité spécifique de 60 mCi/mg. (4) Second antisérum : antisérum précipitant les immuno- globulines de chèvre, ayant pris naissance chez le lapin et correctement diluées dans le tampon (1). (5) Témoin négatif e plasma humain normal. (6) Témoin positif : plasma humain normal auguel a été ajoutée une quantité connue de mélange antigénique K/Pk Méthode analytique "Zéro" Témoin Témoin Echan négatif positif tillon Tampon de référence (1) 0,5 ml - - Témoin négatif (5) - 0,5 ml - Témoin positif (6) - - 0,5 ml Echantillon - - - 0,5 ml Antisérum anti-K (2) 0,2 mi 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml Mélanger, faire incuber pendant 5 heures à la température ambiante Marqueur radio-iodé (3) 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml Faire incuber pendant une nuit à la température ambiante Second antisérum (4) 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml Faire incuber pendant 1 heure à la température ambiante, centrifuger pendant 30 minutes à 4000 tours par minute, décanter et mesurer la radio-activité dans le précipité à l'aide d'un compteur gamma. Calcul : on a calculé l'indice de positivité P.I. en évaluant la radio-activité des échantillons et, respectivement, des témoins, par rapport à la radio-activité du zéro" selon les expressions suivantes activité de l'échantillon P.I. (échantillon) = 100 - x 100 activité du "zéro" P.I. (témoin) = 100 - x 100 activité du "zéro" Une valeur de l'indice P.I. supérieure à 15 était considérée comme indiquant la présence d'adénocarcinome, tandis qu'une valeur de l'indice P.I. inférieure à 15 était considérée comme indiquant l'absence d'adénocarcinome. On a également examiné en parallèle les 335 échantillons précités en utilisant deux trousses disponibles dans le commerce pour la détection du CEA humain, à savoir l'essai de CEA de Roche, et la trousse CEA de Liso-phase de Lepetit. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau suivant : Faux r6sultats positifs Nombre Pathologies Essai de Essai de Notre de cas Roche Lepetit essai 30 Cirrhose du foie 4 (13,2 %) 3 (19 %) 2 (6,6 %) 17 Maladies inflamma- 4 (23,5 %) 5 (23,5 %) 2 (11,7 %) toires pulmonaires 18 Broncho-pneumopa- 3 (16,6 %) 3 (16,6 %) 1 (5,5 %) thies obstructives 270 Autres maladies non 4 (1,5 %) 4 (1,8 %) 1 (0,3 %) néoplastiques 335 Total 15 (4,5 %) 15 (4,5 %) 6 (1,8 %) EXEMPLE 11 On a analysé des échantillons de sérum humain provenant de 84 patients atteints d'adénocarcinomes identifiés, en utilisant les réactif s et la méthode analytique qui sont décrits dans l'Exemple 10, et en utilisant en parallèle les deux trousses commerciales également mentionnées à l'Exemple 10. Les résultats sont résumés dans le tableau suivant. Faux résultats négatifs Nombre Pathologies Essai de Essai de Notre de cas Roche Lapetit essai 60 Adénocarcinomes 5 (8,3 %) 7 (11,6 %) 2 (3,3 %) gastro- intestinaux i 24 Adénocarcinomes 2 (8,3 %) 2 (8,3 %) 0 (0 %) du poumon 84 Total 7 (8,3 %) 9 (10,7 %) 2 (2,4 %) EXEMPLE 12 On a également examiné les mêmes échantillons de plasma humain que dans les Exemples 10 et 11, en utilisant les réactifs et l'autre méthode analytique qui sont indiqués ci-dessous. Réactifs (1) Anticorps anti-K obtenus selon le mode opératoire décrit aux Exemples 5 et 6, absorbés sur des perles de poly styrène (2) Tampons de diluant contenant - 70 mmoles de tampon de phosphate à pH 7,2 - 70 mmoles de chlorure de sodium ; - 31 mmoles d'azoture de sodium ; et - sérum albumine de boeuf à 1 % (P/V) (3) Conjugué enzymatique contenant les mêmes anticorps anti-K que ceux du réactif (1) ci-dessus, conjugués à de la 2-galactosidase (selon le mode opératoire décrit dans FEBS Letters 95, 311, 1978) et correctement dilués dans le tampon (2). (4) Substrat enzymatique contenant - 15 mmoles de tampon de phosphate à pH 7,0 ; et - 2,3 mmoles d'ortho-nitrophénylgalactoside. (5) Agent de blocage : carbonate de sodium 1 M. (6) Témoin négatif : plasma humain normal. (7) Témoin positif : plasma humain normal auquel a été ajoutée une quantité connue des mélanges antigéniques K/P k Méthode analytique "Zéro" Témoin Témoin Echantillon négatif positif Tampon de diluant (2) 0,2 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml Témoin négatif (6) - 0,1 ml - Témoin positif (7) - - O,i ml Echantilion - - - 0,1 ml Anticorps anti-K (1) 1 perle 1 perle 1 perle 1 perle Faire incuber en secouant pendant 5 heures à la température ambiante. Jeter la phase liquide. Laver 2 fois avec 2 ml d'une solution saline Conjugué enzymatique (3) 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml Faire incuber en secouant pendant 2 heures à la température ambiante. Jeter la phase liquide. Laver 2 fois avec 2 mi d'une solution saline Substrat enzymatique (4) 1 mi 1 ml 1 ml I ml Faire incuber pendant une heure à 37 C. Agent de blocage (5) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Mesurer l'absorbance à 420 nm à l'aide d'un spectrophotomètre. Calcul On a calcul l'indice de positivité P.I. par rapport à la densité optique (O.D.) du "zéro" selon l'expression: O.D. de l'échantillon P.I. = O.D. du "zéro" Une valeur de l'indice de positivité supérieure à 3 était considérée comme une indication de la présence d'adénocarcinome, tandis qu'une valeur de l'indice de positiovité inférieure à 3 était considérée comme une indication d'absence d'adénccarcinome. On a observé des résultats similaires a ceux qui sont rapportés dans les Exemples 10 et 11. EXEMPLE 13 On a examiné des coupes de tissus, fixées dans du formol et enveloppées dans de la paraffine, provenant d'un adénocarcinome de côlon humain, d'un adénocarcinome de mammifère humain et de la moelle d'os de patients atteints d'adénocarcinome de la poitrine, en utilisant les réactif s et la méftiode analytique qui sont indiqués ci-dessous : Réactifs (1) Tampon de lavage contenant : - 10 mmoles d'un tampon de phosphate à pH 7,3 1 et - 150 mmoles de chlorure de sodium. (2) Tampon de blocage contenant - 10 mmoles d'un tampon de phosphate à pH 7,3 - 150 mmoles de chlorure de sodium ; et - sérum d'âne normal à 3 % (V/V). (3) Conjugué enzymatique contenant des anticorps d'anti immunoglobulines de chèvre cultivés chez l'âne, marqués avec de la 8-galactosidase (selon la méthode décrite dans FEBS Letters 95, 311, 1978, et correctement dilués dans le tampon (1). (4) Substrat enzymatique contenant - 10 mmoles d'un tampon de phosphate à pH 7,4 ; - 10 mmoles de chlorure de sodium ; - 1 mmole de chlorure de magnésium ; - 1 mmole de 5-bromo-4-chloro-indolyl galactoside ; - 6 mmoles de ferrocyanure de potassium ; et - 6 mmoles de ferricyanure de potassium. (5) Agent colorant de contraste contenant - bisulfate de potassium et d'aluminium ; et - de l'acide carminique. (6) Anticorps anti-K cultivés chez la chèvre, obtenus selon le mode opératoire de 11 Exemple 7, et correctement dilués dans le tampon (1) ci-dessus. Méthode analytique On a déparaffiné les coupes dans du xylol, dans la série d'alcools éthyliques de 100 % à 50 %, puis dans le tampon de lavage (1). On a ajouté le réactif éventuel en quantité telle que l'ensemble de la coupe était recouvert. Tampon de blocage (2). Faire incuber pendant 20 minutes à 370C en chambre humide. Eliminer l'excès de réactif par secouage. Ajouter les anticorps anti-K (6). Faire incuber pendant 2 heures à 370C en chambre humide. Ajouter le conjugué enzymatique (3). Faire incuber pendant 30 minutes à 370C en chambre humide. Laver la coupe avec le tampon (1) pendant 5 minutes. Ajouter le substrat enzymatique (4). Faire incuber pendant 30 minutes à 370C. Eliminer l'excès de réactif par lavage. Ajouter l'agent colorant de contraste (5) Au bout d'une minute, laver la coupe à l'eau courante et observer au microscope éclairé. Selon une autre méthode, on a suivi le mode opératoire analytique ci-dessus en effectuant les incubations pendant une nuit à la température ambiante en chambre humide, excepté l'incubation avec le substrat enzymatique (4), que l'on a effectuée pendant une heure à la température ambiante en chambre humide. Toujours en variante du mode operatoire ci-dessus, après le lavage final à l'eau courante et avant l'examen au microscope, on a d'abord éclairci les coupes en les faisant tasser dans le tampon de lavage (1), dans la série des alcools éthyliques de 50 % à 100 %, et dans du xylol, puis on les a montées dans un"Eukitt" (marque déposée). L'analyse microscopique des coupes a révélé une coloration bleue intense exclusivement localisée au cytoplasme et à la membrane des cellules tumorales, sans aucune reaction de coloration positive dans les cellules des tissus normaux voisins, telles que les granulocytes par exemple. Ces résultats se sont révélés très différents de ceux obtenus en analysant les mêmes préparations à l'aide des trousses disponibles dans le commerce pour la détection histochimique du complexe CEA par l'intermédiaire d'anticorps anti-CEA, à savoir le "DAKO PAP KIT" et le "IMMUNOLOK HISTOSET KIT". Lesdits réactif s commerciaux ont fait preuve, en fait, d'une spécificité bien moindre, en ce sens qu'on a constaté qu'ils coloraient non seulement les cellules tumorales mais aussi, à un degré variable, les cellules des tissus normaux, l'erreur étant particulièrement importante dans le cas de l'analyse des tissus de moelle d'os. On a suivi le meme mode opératoire que ci-dessus pour l'analyse de coupes de tissus congelées et on a obtenu des résultats analogues. EXEMPLE 14 On a conjugué la doxorubicine aux anticorps anti-K par une méthode de liaison covalente. On a mélangé une solution de doxorubicine (40 mg/ml) dans une solution saline tamponnée par un phosphate 0,015 M à pH 7,2, avec un léger excès molaire de Nais4 0,1 M, et on l'a fait incuber pendant une heure à la température ambiante dans l'obscurité. A la fin de cette incubation, on a ajouté du glycérol 1 M jusqu'à une concentration finale 0,05 M. On a mélangé la solution de doxorubicine oxydée avec 1 ml d'une solution d'anticorps anti-K (20 mg/ml) dans un tampon de carbonate de potassium 0,15 M à pH 9,5, et on l'a fait incuber pendant une heure à la température ambiante. A la fin de l'incubation, on a ajouté du NaBH4 jusqu'à une concentration finale de 0,3 mg/ml et on a laissé la réaction se faire pendant deux heures à 370C, A la fin de la réaction, on a fait subir au mélange une chromatographie dans une colonne de filtration sur gel (15 x 1,5 cm) de "Bio-gel" (marque déposée) P 100, équilibrée dans du PBS. Les fractions du volume exclu contenaient le médicament lié aux anticorps exempts du médicament non conjugué. REVENDICATIONS 1. Procédé approprié destiné à être utilisé dans le diagnostic d'un adénocarcinome humain en déterminant la matière antigénîque se rapportant à l'adénocarcinome dans un échantillon prélevé chez un malade,caractérisé par le fait qu'en utilisant (a) un anticorps anti-K monoclonal ou polyclonal ou (b) un anticorps anti-Pk onoclonal ou plolyclonal, la matière qui est déterminée dans 'échantillon possède respectivement (a') exclusivement ceux des déterminants antigéniques K spécifiques pour les adénocarcinomes ou (b') ceux des déterminants antigéniques Pk associés avec des déterminants K sur les adénocarcinomes. 2. Anticorps choisisparmi les anti-corps anti-K spécifiques pour les déterminants antigéniques K, les anti-corps anti-Pk spécifiques pour les déterminants antigéniques Pk et les anti-corps anti-Pn spécifiques pour les déterminants antigéniques Pn. 3. Procédé pour la préparation des anti-corps anti-K selon la revendication 2, ledit procédé consistant a) à absorber les anti-corps produits contre un mélange de déterminants antigéni- ques K et Pk avec les déterminants antigéniques pn ou pk afin de saturer les sites de fixation immunologiques k sur lesdits anti-corps ou (b , 1) à à immuniser des animaux avec les déterminants antigéniques Pn ou Pk pour produire des anti-corps anti Pn ou anti-Pk ; 2) à purifier un mélange de déterminants antigéniques K et pk au moyen des anti-corps anti-Pn ou anti-pk produits selon ) obtenant ainsi des déterminants antigéniques K et, 3) à immuniser des animaux avec des déterminants antigéniques K obtenus selon 2). 4. Procédé pour la préparation des anti-corps anti-Pk selon la revendication 2 > ledit procédé consistant à immuniser des animaux avec des déterminants antigéniques Pk. 5. Procédé pour la préparation des anti-corps anti-Pn selon la revendication 2, ledit procédé consistant à immuniser des animaux avec des déterminants antigéniques Pn. 6. Déterminants antigéniques choisis parmi les déterminants antigéniques K spécifiques pour les adénocarcinomes humains, déterminants antigéniques Pk, lesdits déterminants antigéniques pk étant les déterminants antigéniques associés avec les déterminants antignéiques K sur les adénocarcinomes humains, et déterminants antigeniques pn, lesdits déterminants antigéniques pn étant les déterminants antigéniques présents dans le plasma ou le sérum normal et donnant une réaction croisée avec les déterminants antigéniques pk. 7. Procédé pour la préparation des déterminants antigéniques K selon la revendication 6, ledit procédé consistant à purifier un mélange de déterminants antigéniques K et pk au moyen des anti-corps anti-Pn ou anti-Pk. 8. Procédé pour la préparation des déterminants antigéniques Pk selon la revendication 6, ledit procédé consistant à purifier un mélange de déterminants antigéniques K et Pk au moyen d'anti-corps anti-Pn. 9. Procédé pour la préparation des déterminants antigéniques pP selon la revendication 6, ledit procédé comprenant l'extraction à partir de plasma ou de sérum normal puis la purification par immunoaffinité avec des anti-coprs qui leur sont spécifiques. 10. Anti-corps monoclonals choisis parmi les anti-corps anti-K monoclonalsspécifiques pour les déterminants antigéniquesK seuls, les anti-corps antl- k monoclonals spécifiques pour les déterminants antigéniques pk seuls et les anti-corps anti-Pn monoclonals spécifiques pour les déterminants antigéniques pn seuls. 11. Procédé pour la préparation des anti-corps monoclonals selon la revendication 10, caractérisé par le fait que lesdits anti-corps monoclonals sont obtenus par la technique de l'hybridome. 12. Système réactif destiné à être utilisé dans un procédé pour le diagnostic des adénocarcinomes humains selon la revendication 1,comprenant comme constituant essentiel des anti-corps anti-K monoclonals ou polyclonals spécifiques pour les déterminants antigéniques K ou des anti-corps anti-Pk monoclonals ou polyclonals spécifiques pour les déterminants antigéniques Pk. 13. Système réactif destiné à être utilisé dans une méthode de dosage radio-immunologique destinée au diagnostic des adénocarcinomes humains selon la revendication 1 contenant essentiellement 1) un anti-corps anti-K ou respectivement anti-PK 2) des déterminants antigeniques K ou, respectivement; des déter pk minants antigeniques @ ; maiques pai un pi@@@@@@ @@@@@@@@@@ @@ en variante uh mélange antigénique k marqué par un produit radioactif, de préférence 125I-K ou 125I-Pk ou 125I-K/Pk 3) des témoins et 4) des tampons. 14. Système réactif selon la revendication 13,contenant comme autre constituant un second anti-corps spécifique pour les immunoglobulines des espèces dans lesquelles l'anti-corps anti-K ou, respectivement, anti-Pk du constituant 1) a été développé. 15. Système réactif destiné à être utilisé dans un procédé de dosage immunologique avec des enzymes pour le diagnos- tic des adénocarcinomes humains selon la revendication 7 contenant essentiellement 1) des anti-corps anti-K ou, respectivement, anti-Pk fixés sur une phase solide 2) des anti-corps anti-K ou, respectivement, anti-Pk conjugués à une enzyme, de préférence à la ss-galactosidase 3) un substrat enzymatique, de préférence 1 l'orthonitrophényl- galactopyranoside 4) des témoins et 5) des tampons. 16. Système réactif destiné à être utilisé dans un procedé immunohistochimique destiné au diagnostic des adénocarcinomes humains selon la revendication 11 contenant essentiellement 1) des anti-corps anti-K ou, respectivement, anti-Pk 2) des anti-corps marqués par une enzyme, spécifiques pour les immunoglobulines des espèces dans lesquelles les anti-corps anti-K ou, re1pectivement, anti-Pk du constituant 1) ont été développés, le marqueur enzymatique étant de préférence la ss-galactosidase 3) un support enzymatique de préférence le 5-bromo-4-chloroindolyl-galactoside 4) des tampons. 17. Déterminants antigéniques K, pk et pn marqués de préférence marqués avec un isotope ou marqués avec une enzyme ou anti-corps polyclonals ou monoclonals anti-K, anti-P et anti-P marqués. 44 18. Anti-corps anti-K ou anti-Pk polyclonals ou monoclonals destinés à être utilisés comme excipients de médicaments antitumoraux ou d'agents cytotoxiques dans la thérapie des adénocarcinomes humains. 19. Conjugués entre un anti-corps anti-K ou anti-P A polyclonal ou monoclonal,et un médicament anti-tumoral ou un agent cytotoxique;de préférence la daunorubicine, la doxorubi chine, l'épirubicine, le méthotrexate ou la ricine.