FR 2538702 A1 19840706 FR 8300114 A 19830105 PREPARATION A ACTIVITE COLLAGENOLYTIQUE AYANT UNE ACTIVITE ELEVEE ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LÂ CONTENANT. L'invention est relative à une préparation à activité collagénolytique, plus particulièrement à des compositions pharmaceutiques renfermant cette préparation, en association avec un véhicule pharmaceutiques notamment pour l'utilisation dans le traitement de pathologies se manifestant par une altération incontrôlée des structures riches en collagène, chez 1' homme ou l'animal. Plusieurs types de micro-organismes producteurs d'une enzyme collagénolytique ou collagénase" ont déjà été décrits dans la littérature. Il est cependant souvent difficile de contrôler les teneurs de ces préparations en constituants actifs, ces préparations pouvant d'ailleurs n'être pas exemptes d'un certain nombre de constituants toxiques, par exemple des neurotoxines, qui les rendent impropres à ltusage dans des compositions à destination pharmaceutique. .L'invention a pour but de fournir.une composition pharmaceutique permettant une détersion enzymatique sélective à l'égard de structures collagéniques pathogènes, lorsqu'elle est appliquée à des lésions se manifes- tant par une altération incontrlée de collagène. Elle a encore pour but 1n réalisation de compositions dans les quelles les proportions relatives des principaux constituants de la préparation collagénolytique sont équilibrées selon des proportions prédéterminées en fonction de la qualité du résultat thérapeutique recherché. La composition pharmaceutique selon l'invention est caractérisée par une dose efficace d'une collagénase de haute activité spécifique reconnaissant spécifiquement une séquence peptidique X-glycyl-L-prolyl, dans laquelle X est un résidu d'acide aminé naturel lié à l'extrémité N-terminale du résidu glycyle, séquence qu'elle coupe spécifiquement au niveau de la liaison X-glycyl et en ce qu'en outre elle est inhibée au moins partiellement par la myosine. Une collagénase préférée entrant dans la compo sition pharmaceutique selon l'invention est constituée par celle qui peut être obtenue à partir de cultures de Vibrio alginolyticus chemovar iophagus, dont les caractéristiques taxonomiques principales seront rappelées plus loin, ou de tous micro-organismes dérivés de celui-ci ou capables comme celui-ci de produire une telle collagénase.Plus généralement encore font partie des collagénases susceptibles d'être mises en oeuvre dans les compositions pharmaceutiques selon l'invention, celles qui sont capables de réagir avec des anticorps selectifs préparés contre la collagénase dite "collagénase d'Achromobacter" répertoriée sous le n EC. 3.4.24.8 dans "Enzyme Nomenclature Edition IUPAC-IUB (1S78). Cette collagénase est obtenue à partir de la souche de Vibrio alginolyticus chemovar iophagus qui a été déposée à la Collection Nationale de Culture de Micro-Organismes de l'INSTITUT PASTEUR (C.N.C.M.) sous le n I-029. Cette collagénase se distingue d'autres collagénases connues par sa haute activité spécifique. Celle-ci peut atteindre 2 unités microkatal/mg (ukat/mg) de protéine. Elle a été décrite, par exemple, dans l'article intitulé "Subunit structure of Achromobacter Collagenase", de V. KEIL-DLOUHA et B. KEIL, paru dans Biochim. Biophys. Acta 522, 218-228 (1978). On pourra encore se référer, en ce qui concerne la caractérisation chimique de cette enzyme ainsi que du micro-organisme producteur, aux articles intitulés "Chemical characterization and study of the autodigestio of pure collagenase from Achromobacter iophagus" de Vera KEIL-DLOUHA, paru dans Biochimica et Biophysica Acta, 429 (1976) 239-251, et "Some newly characterized collagenases from procaryotes and lower eucaryotes de Borivoj KEIL, paru dans Molecular & Cellular Biochemistry, January 26, 1979, volume 23, nr. 2. -L'invention concerne plus particulièrement des compositions pharmaceutiques contenant des doses exprimées par l'activité de la collagénase, rapportées au poids total de la composition, au moins égales - à 0,05. kat/g de la composition pharma ceutique pour les émulsions, pommades, poudres ou toutes compositions non vraiment liquides, au sens habituelle- ment donné à cette expression, et à à 0,05 kat/ml de la composition pharmaceutique pour les solutions constituées en vue de l'usage topique. Des pommades préférées selon 19 invention contiennent notamment de 0,1 à 29 de préférence de 0,5 à 1 ukat de collagénase par gramme de pommade. Des solutions pour applications topiques préférées conformes à l'inveùtion contiennent de 0,1 à 2, de préférence 0,5 à 1 kat de collagénase par ml de solution. Des compositions avantageuses selon l'invention contiennent en outre, d'une part, des protéases neutres et, d'autre part., des endonucléases. -De préférence, les proportions de protéases et d'endonucléases rapportées à 0,350 pkat de collagénase ne dépassent pas 200 unités caséinolytiques pour les proté- ases et 500 unités nucléasiques pour les endonucléases. Des compositions appropriées à la mise en oeuvre de l'invention contiennent les trois types de constituants, de préférence dans des proportions relatives correspondant - à au moins 0,350 kat de collagénase, - à de 20 à 200 unités caséinolytiques pour ce qui est de leur teneur en protéasesneutreset - à 30 à 500 unités nucléasiques, en ce qui concerne les endonucléases. Dans des compositions davantage préférées encore, les proportions relatives les unes vis-à-vis des autres des susdits constituants correspondent respectivement à des ac- tivités d'au moins 0,350 ukat en ce qui concerne la collagénase, - de 20 à 50 unités caséinolytiques en ee qui concerne les protéases neutres et - de 30 à 60 unites nucléasiquesD en ce qui concerne les endonucléases. L'utilisation des compositions selon l'invention dans le traitement de lésions du genre sus-indiqué (par exemple des brûlures, ulcères, escarres, escarres dures ou blanches à base de collagène chéloïdes, telles que celles produites après des interventions chirurgicales) se révèle particulièrement bénéfique. Dans son action thérapeutique, la composition selon l'invention, ci-après dénommée "Achromase" décompose préférentiellement le collagène du tissu conjonctif Elle ne s'attaque pas à la masse musculaires en particulier aux myofibrilles des muscles, son composé collagénolytique étant inhibé par la myosine du muscle. Simultanément, l'action de 1'Aehromase est caractérisée par la production, à partir de substrats macromoléculaires de la nécrose, de fragments qui ont une action chémo tactique sur les éléments du sang ; c ' est par cette action chémotactique qu'en particulier les macrophages et les leucocytes s'accumulent à la périphérie de la zone d'action de ltAchromase. Cette accumulation des éléments du sang est favorable au processus de régénération tissulaire (par exemple, dans les ulcères, dans les tissus endommagés par des brûlures). Une autre caractéristique de l'action de l'Achro- mase à l'égard de tissus- altérés à caractère nécrotique est qu'elle s'arrête au niveau des tissus vivants. L'action de l'Achromase s'arrente après avoir décomposé les tissus morts à la limite des tissus vivants. Elle ne provoque pas, par l'action de ses composés protéolytiques,de lésions du tissu vivant.Ces effets se produisent particulièrement grâce aux systèmes d'inhibition qui existent dans les tissus vivants, notamment aux trois systèmes mettant enjeu 10) des inhibiteurs de la collagénase de nature polypep tidique, présents dans le tissu non endommagé, 20) la myosine présente dans les tissus musculaires, et 30) des inhibiteurs non spécifiques de la collagénase et des protéases, en particulier de la a2-macroglobu- line, -présents dans la circulation sanguine. I1 est à cet égard important de souligner que pour être efficaces les compositions pharmaceutiques doivent avoir une activité collaténolytlque élevée, présentant notamment les ordres de grandeurs qui ont été indiqués plus haut. Il s'est en fait avéré que, contrairement à ce que l'on pouvait craindre, la sélectivité de l'action de la préparation collagénolytique de l'inven- tion à l'égard des seuls tissus nécrosés ou, d'une façon plus générale, de tout tissu non sain, n'était pas affectée même à des doses élevées de collagénase En effet les barrières naturelles que présentent les tissus sains contre l'action de la collagénase ou les régulateurs de l'activité de celle-ci qu ils contiennent se révèlent parfaitement efficaces contre ce qui pouvait a priori être considéré comme un "surdosage" de l'enzyme. Les protéases neutres, qui forment le second constituant actif de lvAchromase, complètent l'action de la collagénase en dégradant davantage encore les fragments du substrat moléculaire collagénolytique initial. Lorsque la préparation mise en oeuvre dans la composition pharmaceutique selon l'invention est originaire de Vibrio alginolyticus chemovar iophagus, lesdites protéases sont dépourvues de constituants indésirables. Enfin le troisième constituant de l'Achromase, essentiellement formé d'endonucléases, contribue à la destruction de 1'ADN susceptible d'être libéré par les cellules à l'occasion du processus infectieux, donc du pus dont l'ADN libéré forme une partie importante. La composition pharmaceutique selon l'invention joue donc un rôle essentiel au niveau de la destruction des déchets tissulaires qui tendent à s'accumuler dans la région des lésions du genre en question, cette destruction (détersinon devant nécessairement précéder le début de la cieatri- sation naturelle ou induite, par exemple par greffe. L'invention concerne encore un procédé de production d'une préparation active conforme à l'invention, contenant plus particulièrement les trois types de constituants qui ont été envisagés ci-dessus. Ce procédé met plus particulièrement en oeuvre la bactérie aérobie Vibrio alginolyticus chemovar iophagus.Ce procédé consiste à cultiver ce micro-organisme dans des conditions en soi connues et à induire également de façon en soi connue la production de collagénase par l'addition au milieu de culture d'un inducteur approprié, plus particulièrement de collagène ou de fragments de collagène ayant un poids moléculaire encore suffisant pour former une structure secondaire caractéristique des chaînes hélicoldales de collagène, à poursuivre cette culture jusqu'après induction dans le milieu de cul ture d'une production desdites protéases neutres, la culture pouvant être interrompue quand les proportions relatives de collagénase et de protéinase ont atteint des valeurs désirées comprises dans les intervalles respectifs susindiqués, la préparation active pouvant ensuite étre récupérée par des techniques en soi connues à partir du milieu de culture. En particulier, on peut, après élimination des cellules, précipiter les protéines hors du surnageant avec une concentration suffisante de sulfate d'ammonium pouvant par exemple atteindre 60 % du taux de saturation en ce sel de la solution. Le précipité remis en suspension peut être dialysé contre de l'eau distillée pour éliminer les ions entraînés au cours de la précipitation9 avant d'être finalement lyophilisé. En variante9 le principe actif peut être purifié par ultrafiltration. Pour doser les différents constituants de la composition, on peut avoir recours aux techniques décrites ci-après qui mettent en oeuvre les substrats, les réactifs et les méthodes de calcul également mentionnés ciapres. I DOSAGE DE LA.COLLAGENASE (wünsch E. et Heidrich H. G. (1963) Z. für Physiol. Chem. 333, 149-151) SUBSTRAT Le substrat utilisé est du 4-phénylazo-benzyloxy- carbonyl-L-Pro-Leu-Gly-L-Pro-D-Arg. HCl (PZ-PLGPR), comercialisé par la Société Fluka. REACTIFS Les réactifs mis en oeuvre sont les suivants A Tampon le tampon est constitué à partir des trois solutions suivantes - solution Al u effectuée à l'aide de 160 mM de véronal (sel de sodium de l'acide 5,5-diéthylbarbiturique) et 143 mM d'acétate de sodium, 3 H2O - solution A2 : HCl 1W - solution A3 :: NaCl à 8,5 % le tampon est obtenu en mélangeant 200 mi de solution Al avec 80 ml de solution A3 et en ajustant le pH à 8,5 avec la solution A2 ;on complète à 1 1 en ajoutant de l'eau et on additionne CaCl2, 2 H2O pour obtenir une concentration finale de 4 mM. - B. Solution de substrat elle est obtenue en dissolvant 10 mg de-PZ PLGPR dans 100 l de méthanol ; on ajoute du tampon pour compléter à 10 ml et la solution de substrat ainsi obtenue reste stable une semaine. C. Echantillon de collagénase l'échantillon de collagénase. est obtenu en conservant 1 mg de solution dans l ml de tampon ; à l'aide d'échantillons d'activite spécifique inconnue, on dilue selon les lectures préliminaires ; les dilutions optimales doivent donner les valeurs colorimétriques de la densité optique à 320 nm (voir ci-dessous-) dans la gamme de 0,1 à 1,0. D. Acide citrique il s'agit d'une solution à 0,-5 % dans l'eau. E. Acétate d'éthyle. TECHNIQUE DE DOSAGE Elle se déroule comme suit 1 on préchauffe la solution B à 37 C 2 on mélange 0,1 ml de solution de collagénase [correctement diluée) avec 0,4 ml de solution B préchauffée et on laisse incuber pendant 15 mn à 37 C 3 on additionne 1 m de solution D et on mélan- ge 4 on additionne 5 ml d'acétate d'éthyle et on mélange vigoureusement 5 on enlève ensuite la couche organique supérieure et on sèche en additionnant Na2SO4 anhydre 6 on mesure la densité optique à 320 nm par rapport à celle d'un témoin obtenu dans les mêmes conditions que l'échantillon étudié, selon la procédure indiquée sous les points l à 5, si ce n'est qu'on utilise du tampon à la place du substrat (solution B). METHODE DE CALCUL 1 unité Wünsch-Heidrich = @@@@@@@ @@@@@@ @ @@@ @@ @@@@@@@@ @ @@@ @@ @@@@@@@@@@@@@ 0,044 Activité spécifique de l'échantillon exprimée en katals = @@@@@@ @ @@@@@@@ @@@@@@ @ @@@ @@ en nkat/mb 1,0 kat = 90 000 unités de WH Le coefficient est déduit de la courbe d'étalon nates obtenue avec le produit qui découpe le peptide (PZ Pro-Leu) (composé B commercialisé par Fluka). II DOSAGE DES PROTEASES (Laskowski M. (1955) Methods in enzymology II, 32 ; Kunitz M. (1947) J. Gen. Physiol. 30, 291) SUBSTRAT Le substrat utilisé est de la caséine pour usage biochimique (commercialisé par Merck, sous le n 2 244). REACTIFS Les réactifs utilisés sont les suivants - solution A elle est constituée par Aa : acide borique 0,2 M (12,4 g/l 000 ml) Ab : borax 0,05 M (19,05 g/l 000 ml) pour obtenir la solution A, on ajuste 100 ml de solution Aa à pH 7,6 à l'aide de solution Ab (environ 4 ml) - solution B on met en suspension 1 g de caséine dans 100 ml de solution A ; on chauffe dans un bain d'eau à 1000C jusqu'à dissolution totale (environ 15-mn) ; la solution opalescente ainsi obtenue peut être conservée pendant une semaine à 4 C. - solution C acide trichloroacétique à 5 % dans l'eau. ECHANTILLON DE PROTEINASE La dilution des échantillons contenant la protéinase doit être ajustée selon le dosage préliminaire jusqu'à un équivalent de 2-10 g de trypsine/ml. TECHNIQUE DE DOSAGE Elle se déroule comme suit 1 on prépare les tubes (tubes de plastique Vidal 11 x 70), en nombre correspondant au double du nombre d'échantillons, afin qu'à chaque échantillon corresponde son propre témoin 2 on fait pré-incuber 0,5 ml de solution B dans chaque tube, pendant 5 mn, à 37 C 3 à chaque tube "d'échantillon", on ajoute 0,5 ml d'échantillon ; on fait incuber 20 mn à 370C sous agitation ; on additionne 1,5 mi de solution C 4 à chaque tube témoin, on additionne 1,5 ml de solution C ; on fait incuber 5 mn à 37 C et on ajoute 5 ml d'échantillon 5 on laisse tous les tubes à 4 C. toute la nuit 6 on centrifuge pendant 10 mn à 8 000 tr/mn à température ambiante 7 on lit la densité optique à 280 (DO280) du surnageant de l'échantillon vis-à-vis du témoin correspondant. CALCUL 1 Courbe d'étalonnages on dilue une solution stockée de trypsine pure (0,1 mg/ml d'HCl 10- M) pour obtenir des concentrations finales de 1,2,4,6,8 g de trypsine par ml ; on effectue ensuite les étapes 1 à 7 mentionnées dans le paragraphe précédent. 2 Une unité d'activité correspond à 1 g de trypsine ; une unité d'activité spécifique correspond à 1 g de trypsine par mg de protéine. III DOSAGE DE LA DEOXYRIBONUCLEASE (Kunitz M. (1950) J Gen. Physiol. 33, 349-363) REACTIFS Les réactifs utilisés sont les suivants - déoxyribonucléase I (commercialisée par BOEHRINGER3 de qualité Il (2 000 U/mg) - acide déoxyribonucléique {commercialisée par BOEHRINGER) à 3 ml/10 mg. TAMPON Le tampon est constitué. comme suit 100 mM de Tris. HCl ; 4 mM de MgSO4; 7 H20 ; 1,8 mM de CaCl2. 2 H20 ; on ajuste à pH 7,5 avec de l'acide chlorhydrique. SOLUTIONS - Enzyme standard : on dissout 1 mg de déoxyribonucléase I dans 1 ml de tampon. - Substrat ; on dilue 150 l dans 50 ml de tampon. TECHNIQUE DE DOSAGE Elle se déroule comme suit 1 on ajuste au 0 l'absorbance à 260 nm de 3 ml de solution de substrat 2 on ajoute 100 l de l'enzyme standard et on mélange 3 on enregistre la variation d'absorbance pendant 10 mn 4 on détermine le rapport #A260 (variation d'absorbance à 260 nm)/mn 5 on recommence les étapes 1 à 4 avec une solution de substrat frais et un échantillon d'enzyme inconnu et on détermine la valeur #A260/mn. CALCUL mgSml = densité optique à 280 mn (D0280) x 0,9 Unités par mg de protéine = ## ######## ######## IV DOSAGE DES PROTEINES (Lowry H. O., Roseborough N. J. et Randall R. J. (1951), J. Biol. Chem. 193, 265) REACTIFS Les réactifs utilisés sont les suivants - solution A : Na2CO3 à 2 % dans NaOH 0,1 M - solution B : Na à 2 %, tartrate de potassium - solution C e CuSO4 à 1 % - solution D : 1 mi de solution B + 1 ml de solution C ; on dilue à 100 ml avec la solution A - solution E : réactif de foline dilué à 1/1. COURBE D'ETALONNAGES 1 On prépare la solution de protéine de référence de 1 mg de sérum albumine bovine (BSA, commercialisée par Sigma) dans 2 ml d'eau 2 on prépare une série de dilutions de solution de référence de 10 à 80 l à un volume final de 400 l dans l'eau 3 on ajoute 2 ml de solution D, on mélange et on laisse 10 mn à la température du laboratoire 4 on additionne 200 l de solution E ; on laisse incuber à 1obscurité à 50 C pendant 10 mn 5 on lit la densité optique à 750 nM vis-à-vis du témoin (eau au lieu de la solution de BSA utilisée dans l'étape 20) ; on construit ainsi la courbe d'étalonnages. DOSAGE On traite l'échantillon inconnu à différentes dilutions (volume final 400 su, étape 20). CALCULS On exprime le contenu protéique de l'échantillon inconnu comme équivalent en poids de sérum albumine bovine (BSA) de référence. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit des conditions de culture de Vibrio alginolyticus chemovar iophagus. Référence sera faite aux figures dans lesquelles - la fig. i contient des courbes représentatives des con centrations relatives de différentes enzymes dont les productions sont induites à l'occasion de la culture de la susdite bactérie en fonction du temps -; - la fig. 2 comprend des courbes comparatives visantà mettre en évidence le caractère inhibIteur de la myosine vis-à-vis de la collagénase. La souche Vibrio alginolyticus chemovar iophagus (1-029) est aérobie - anaérobie facultatif - et se présente sous forme de bâtonnets gram négatif de2-2,5 um de long et de 1-1,5 um de large, mobiles au moyen de flagelles polaires simples. Elle forme des colonies rondes et jaunes de 2-3 mm de diamètre, après incubation à 300C pendant une nuit sur un milieu de thiosulfate-citrate-bile-sucrose (TCBS). Elle présente une réponse positive dans les tests suivants : oxydase de cytochrome, réaction de Voges- Proskauer, production d'indole, décarboxylase de lysine, gélatinase (test de pellicule), estérase de l'agent mouillant commercialisé sous la désignation TWEEN 80, réductase de tétrathionate, réduction de nitrate, production d'acide à partir de glucose, maltose, mannitol, sucrose, tréhalose, mannose et glycérol, utilisation de citrate (Simmons). Elle est sensible à l'action des antibiotiques aminoglycosidiques, au chloramphénicol, aux tétracyclines, à la colistine, à la rifampicine, aux sulfonamides, à l'acide nalixide, à la nitrofurantolne et à l'agent vibriostatique 0/129 dans le test du disque, mais elle résiste à la triméthoprime. Elle donne une réponse négative dans les tests suivants : réaction au rouge de méthyle, dihydrolase d'arginine, uréase, phénylalanine déaminase, test ONPG, production d'H2S (agar fer Kligler), production de gaz de glucose, production d'acide à partir de xylose, d'arabinose, d'adonitol, de rhamnose, de sorbose, de sorbitol, de dulcitol, de lactose, d'inositol, de salicine, de raffinose, de mellibiose, d'a-méthylglucoside, de mucate. Elle n'utilise pas le malonate. La souche I-029 est très halophile avec une croissance optimale qui se produit dans du chlorure de sodium à 13 % et une tolérance apparente an chlorure de sodium à 15 %. Elle est également pleinement résistante à l'am picilline, à la carbénicilline, en partie à la céphalotine. Elle présente des réactions positives dans les tests à la décarboxylase ornithine et dans les tests de fermentation de cellobiose. CONDITIONS DE CULTURE Les cellules sont cultivées sous agitation et aération forcée (1,4 atmosphères) à 300C dans un milieu contenant Tris.HCl O,P M, NaCl O,ZI N, 2 mM de CaCl2, à pH 7, contenant soit des acides casaminés à 2,5 % (Difco Labs., Detroit, Mich.). Deux heures après le début de la culture, on ajoute au milieu la composition commercialisée sous la désignation ASF (fragments de peptide de collagène de peau de veau ; poids moléculaire moyen 7000, ROUSSELOT S.A., France) pour obtenir une concentration de 1,5 % en poids.Pour les contrôles de croissance, la turbidité est mesurée par leabsorbance par cm 1 600 nm dans des échantillons extraits à une heure d'intervalle. PRODUCTION DE COLLAGENASE, DE PROTEINASE ET DE NUCLEASE La souche produit de la protéines caséinolytique de la nucléase extra-cellulaire et, dès que l'ASP a été ajouté, de la collagénase. Le niveau d'activité de la collagénase s'élève alors jusqu'à atteindre 60 nkat/ml. Les courbes de la fig. 1 sont représentatives en ce qui concerne - la courbe a, de la croissance cellulaire, - la courbe b, de l'activité de la éôllagénase, - la courbe c, de l'activité de la protéinase caséino lytique et - la courbe d, de activité de la nucléase, en fonction du temps. La culture est de préférence interrompue, lorsque l'activité de la collaténase passe par un maximum, notamment au bout de 5 heures dans le cas représenté. La collagénase est concentrée et récupérée à partir de ce milieu. Elle peut être davantage purifiée comme décrit dans les ouvrages de KEIL-DLOUHA, y. 1976, "Chemical characterization and study of the autodigestion of pure collagenase from Achromobacter iophagus, Biochem. Biophys. Acta, 429, 239-305 et de LECROISEY A., V. KEIL-DLOUHA, D.R. WOODS, D. PERRIN et- B. KEIL, 1975, "Purification, stability and inhibition-of the collagenase from Achromobacter iophagus, FEBS Letters 59, 167-172. Une préparation type d'Achromase contient 0,312 mg de protéine (poids sec) par mg du produit total. Elle se caractérise par les activités relatives suivantes, par mg de poids sec de protéine - collagénase : 0,554 kat - protéases 145 unités caséinolytiques - endonucléases : 477 unités nucléasiques Les préparations de collagénase obtenues présentent, outre leur activité collagénolytique susindiquée, la caractéristique d'être inhibées par la myosine, laquelle joue le role d'un inhibiteur non com- pétitif pour la collagénase. Cette propriété peut être mise en oeuvre en ayant recours à la technique mettant en jeu l'étude cinétique de l'effet de la myosine sur l'ac- tivité de la collagénase vis-à-vis du collagène. La dégradation du collagène par la collagénase est suivie par le dosage de l'hydroxyproline libérée après hydrolyse des fragments de collagène solubilisés par la digestion. L'hydroxyproline étant un acide aminé spécifique du collagène, les autres protéines contenues dans le mélange réactionnel n'interfèrent pas lors du dosage. Le mélange ci dessous est incubé au sein d'un tampon Tris, HCl 0,02 M, NaCl 0,23 M, CaCl2 5.10- M, pH 7,4 pendant une heure à 370C - collagène musculaire en fibre de 5 à 30 mg, - collagénase à 0,1 mg/ml dans du CaCl2 lO @ : 1 ml, - tampon d'incubation ou - suspension de myosine à 5 mg/ml dans ce meme tampon 5 mi Après incubation le mélange réactionnel est centrifugé 5 minutes à 12.000 g. 0,5 ml de surnageant sont hydrolysés une nuit à 11000 avec 0,5 ml d'HCl 12 N. Les échantillons sont ensuite évaporés sous vide et repris par un volume d'eau tel que le dosage de l'hydroxyproline soit rendu possible. Le résultat d'un tel essai avec une collagénase titrant 0,098 pkat/ml est illustré par les courbes de la fig. 2, dans laquelle la courbe e est représentative des variations du rapport l/v (v représentant le nombre de moles de collagène digérés par heure à 370C) en fonction du rapport l/s (s représentant le nombre de moles de collagène mis en oeuvre), mis en présence de la col lagénase, en l'absence de myosine (interprétation selon LINWEAVER BURK). La courbe f est représentative de l'évolution de la digestion des mêmes préparations respectivement en présence de 5 mg de myosine. L'examen de ces courbes fait apparaltre les effets très significatifs de leinhibition de l'activité des préparations de collagenase considérés vis-à-vis du collagène. La collagénase mise en oeuvre selon l'invention est dépourvue de toute toxicité Ceci peut être montre par l'étude des doses léthales effectuée sur la sourls selon la méthode de J.T . LICHTFIELD et F.W. WILCOXON. Les DL-50 mesurées avec une préparation injectez par voie intraveineuse à activité collagénolytique selon l'invention, titrant 0,17 pkat/mg de protéine, ont été les suivantes - 8,58 mg par kg de souris, ce qui correspond à - 1,4Ç ukat par kg de souris, lorsque l'on rapporte cette dose léthale aux unités d'activité collagénoly tique de la préparation. La remarquable activité collagénolytique des préparations selon l'invention a eté démontrée dans les tests pharmacologiques in vivo indiqués ci-après. Ces tests ont consiste dans le traitement avec une préparation contenant la collagénase selon l'invention de brûlures préalablement effectuées sur la peau de porcs, par application d'eau à la température de 80 C, en plu sieurs points du dos de ces animaux pendant 15 secondes (6 lésions-sur le côté droit et 6 lésions sur le côté gauche des porcs). L'épiderme mort est alors enlevé des surfaces ébouillantées et les lésions ont été exposées à l'air pendant 48 heures. Chaque lésion avait un diamètre de tordre de 3,8 cm. Les essais effectués avec la pommade contenant la collagénase ont été doublés d'essais effectués avec une pommade analogue, mais qui était dépourvue de collagénase, cette pommade ayant été utilisée à titre de témoin. Les compositions de ces pommades étaient les suivantes Pour la pommade témoin : - alcool polyoxyéthylénique ó ç 13 g - huile de vaseline ... o 20 g - eau ............................................ 100 g - hydroxyle de sodium pour régler le pH à 7. La pommade contenant la collagénase contient les mêmes excipients, et 0,25 ukat de collagénase par g de pommade. La pommade contenant la collagénase a été appliquée sur les lésions du côté droit des porcs, la pommade témoin sur celles du côté gauche. Les applications de pommade ont été répétées respectivement 3 jours, LI jours, 6 jours et 13 jours après la réalisation des brûlures. On a fait les observations suivantes 6 jours et 13 jours après la réalisation des brûlures Etat des brûlures 6 jours plus tard : La profondeur de la brûlure et l'épaisseur du tissu qui a survécu sont approximativement les mêmes dans les brûlures traitées par la pommade et celles ayant reçu la composition témoin. Dans les brûlures traitées avec la pommade témoin, on constate la présence d'escarres contenant des fibres intactes de collagène sur les 6 brûlures. Les brûlures traitées avec la pommade contenant la collagenase selon l'invention n'en comportent aucune. On constate la présence de cellules inflammatoires infiltrées dans la partie supérieure du derme sur les 6 brûlures traitées par la pommade à la collagénase. La. meme observation ne peut être faite que sur 3 brûlures témoins. L'afflux de cellules-inflammatoires témoigne d'un processus de cicatrisatin plus avance que dans les brûlures où ces infiltrations ngont pas eu lieu. On ne constate cependant que peu de différences au niveau de la réparation de l'épiderme et du tissu conjonctif, entre les brûlures traites et les brûlures témoins, sauf que cette'réparation paralt un peu plus avancée dans le cas des brûlures traitées. Etat des brûlures 13 jours plus tard. On constate chez les animaux traités que les brûlures sont recouvertes d'une mince pellicule de tissu dégradé. Du tissu conjonctif nouveau s'est développé sur la totalité de la surface des brûlures, immédiatement sous cette pellicule ainsi que plus en profondeur, dans le derme. L'épiderme s'est développé sous la forme d'un tissu de granulation à partir des bords des lésions, immédiatement sous la pellicule de tissu dégradé. On constate dans les lésions traitées que la partie collagène des escarres a été dissoute par la col lagénase, de sorte que la régénération du tissu conjonctif a pu se développer en surface, dans des conditions analogues à celles qui sont observées dans le cas de blessures par coupures. L'épiderme formé peut migrer sur la surface de ce tissu de granulation. On constate au contraire que les brûlures témoins sont recouvertes d'escarres profondes de collagène compact qui adhère au tissu et le recouvre. Il s'est formé du tissu conjonctif nouveau seulement sous- la nouvelle couche d'épiderme qui s'est formée sur les seuls bords des brûlures. L'épiderme a migré à partir des bords de la lésion, à travers le derme, sous les escarres susdites, séparant ainsi celles; du tissu profond. Donc les sources d'épidermes nouveaux ne se constatent quvau bord des lésions, ce qui requérait une greffe chirurgicale d'épiderme pour assurer la cicatrisation complète de ces lésions. Ltun des avantages de la pommade contenant la collagénase réside dans le fait que le traitement enzymatique réalise automatiquement un équilibre correct entre les tissus nécrotiques et les tissus viables, e-qui- libre qu'il serait difficile de recréer par la voie ehirurgicale. Les préparations pharmaceutiques selon l'inven- tion peuvent se présenter sous toutes les formes susceptibles d'être mises en oeuvre par application externe : émulsions, notamment telles que pommade et crem?s, ou solutions ou pulvérisations (aérosols ou poudres)2 la collagénase entant dans chaque préparation associee à des excipients conformes selon le cas à chacune desdites formes. Dans le cas de solutions pour l'application topique, on aura recours avantageusement à une mise en solution de la collagénase dans un milieu isotonique, de préférence un tampon physiologiquement acceptable de pH 7-8,5, et de préférence stérile. Les préparations de collagénase sous forme de solutions au sein deun véhicule stérile injectable peuvent etre administrées par la voie sous-cutanée, à proximité des plaies à traiter ou des chéloïdes. On peut également envisager l'utilisation de ces solutions inJectables, pour les administrations profondes, notam- ment en vue de la destruction de l'accumulation pathologique du collagène dans les tissus, comme par exemple dans les disques intervertébraux. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont donc applicables à tous types de lésions se manifestant par une altération incontrôlée des structures riches en collagène. A titre d'exemple de lésions qui peuvent être traitées, on citera les brûlures, ulcères, escarres, les escarres dures ou blanches à base de collagène, chéloïdes, telles que celles produites après des interventions chirurgicales, nécroses, en particulier dans le cas des décubitus ou des ulcères. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent égaiement être appliquées à titre préventif; notamment préalablement à des interventions chirurgicales visant à réaliser des greffes plastiques ou autres, ou à des interventions de chirurgie esthétique, et d'une façon générale à toutes blessures de la peau. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce gui précède, l'invention ne se limite nullement a ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes. Les solutions de collagénase selon l'invention peuvent être appliquées au traitement des caries dentaires. On sait en effet que la pulpe dentaire est essentiellement constituée de collagène calcifié compact, la carie dentaire se manifestant par une fissuration ou un perçage de la dent,par lequel s'échssppe le calcium. La trame décalcifiée de collagène qui subsiste devient alors poreuse et risque de devenir le siège d'une infection bactérienne. Par introduction d'une solution concentrée de collagénase conforme à l'invention dans cette trame, on induit la dissolution du collagène poreux qui peut alors être éliminé par rinçage. Action de la collagénase s'interrompt d'elle-même au niveau du collagène calcifié sain. La solution de collagénase utilisée, tamponnée à pH 7-8,5, notamment au borate, contient de préférence au moins l ukat de collagénase par ml de solution. A cette concentration et a fortiori pour des concentrations plus élevées, le collagène poreux est rapidement dissous. Après rinçage et désinfectiona la dent traitée peut être refermée en mettant en oeuvre des techniques bien connues de l'homme de l'art.- Les traces résiduelles possibles de collagénase retenues dans la dent sont progressivement inhibées par le pH acide dominant qui se réinstalle au coeur de-la dent. REVENDICATIONS i - Composition pharmaceutique, notamment pour l'utilisation dans le traitement de caries dentaires ou autres altérations de la pulpe dentaire chez l'homme ou l'animal, cette composition contenant, en association avec un véhicule pharmaceutique, une collagénase de haute activité spécifique reconnaissant spécifiquement une séquence peptidique X-glycyl-L-prolyl, dans laquelle X est un résidu d'acide aminé naturel lié à ltextrémité Nterminale du résidu glycyle, séquence qu'elle coupe spécifiquement au niveau de 'la liaison X-glycyl et en ce qu'en outre elle est inhibée au moins partiellement par la myosine. 2 - Composition selon la revendication 1, carac- térisée en ce que la collagénase est issue de cultures de Vibrio alginolyticus chemovar iophagus. 3 - Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que la collagénase est issue de la souche déposée à la C.N.C.M. sous le n I-029. 4 - Composition selon l'une quelconque des revendications i à 3, caractérisée en ce qu'elle contient des doses exprimées par l'activité de la collagénase, rapportées au poids total de la compositio-n, au moins égales - à 0,05 pkat/g de la composition pharmaceutique pour les émulsions, pommades, poudres ou toutes compositions non vraiment liquides, au sens habituellement donné à cette expression, et - à 0,05 kat/ml de la composition pharmaceutique pour les solutions constituées en vue de l'usage topique. 5 - Composition selon la revendication 4, carac- térisée en ce qu'elle contient de 0,1 à 2, de préférence 0,5 à l pkat/g d'émulsions, pommades, poudres ou composi- tlons non vraiment liquides ou de 0,1 à 2, de préférence de 0,5 à l kat de collagénase par ml de solution 6 - Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications l à 5, caractérisée en ce quelle contient également des protéases et des endonucléases, les proportions de protéases et d'endonucléases rapportées à 0,350 ukat de collagénase ne dépassant pas -200 unités caséinolytiques pour les protéases et 500 unités nucléasiques pour les endonucléases 7 - Composition selon la revendication 6, carac térisée en ce qu'elle contient les trois susdits consti tuants dans des proportions relatives correspondant - à au moins 0,350 ukat de collagénase, - à de 20 à 200 unités caséinolytiques pour ce qui est de leur teneur en protéases neutres et - à 30 à 500 unités nucléasiques, en ce qui concerne les endonucléases. 8 - Composition selon la revendication 7, ca ractérisée par des proportions relatives des susdits constituants correspondant respectivement à des activités : - d'au moins 0,350 ukat entre qui concerne la collagénase, - de 20 à 50 unités caséinolytiques en ce qui concerne les protéases neutres et - de 30 à 60 unités nucléasiques, en ce qui concerne les endonucléases.