FR 2542012 A1 19840907 FR 8403415 A 19840302 25420 1 2 La présente invention concerne un nouveau lipbpolysac- charide, un procédé pour sa préparation, et ses applications notamment en médecine humaine Plus spécialement, elle vise un lipopolysaccharide possédant des activités physiologiques, et notamment une action antitumorale, une action immunisante, une action juvénilisante sur les cellules, une action activante pha- gocytaire et une action anti-infectieuse, ainsi qu'un procédé pour l'obtention de ce lipopolysaccharide à partir des actino- mycetes et des bactéries apparentées - On a déjà utilisé des bactéries, et en particulier le bacille de la tuberculose bovine, les corps cellulaires du BCG et les corps cellulaires du Corynebacterium anaérobie comme agents anti-tumoraux ou agents immunisants, et on a démontré leur efficacité Par contre ces bactéries possèdent apparemment d'importants effets secondaires. On a tenté de trouver des bactéries ayant une effica- cité élevée sans effets secondaires, et on les a soumises à des épreuves sévères pour éliminer des cellules efficaces les compo- sants responsables des effets secondaires, et pour isoler et purifier les composants efficaces. Des recherches ont été menées sur les activités de composants du corps cellulaire de bactéries appartenant aux gen- res Mycobacterium, Propionibacterium, Nocardia, etc et divers composants possédant des activités physiologiques ont été iso- lés et purifiés, et on s'est efforcé de préparer des substances à activités encore supérieures en modifiant ces composants Par exemple, on a décrit un composant du squelette de paroi cellu- laire (par exemple demande de brevet japonais publiée N' 28813/79) un muramyl-dipeptide (par exemple demande-de brevet japonais publiée N'156812/77), un produit de modification de ce dipep- tide (par exemple demande de brevet japonais publiée No 98922/78) un glycolipide contenant un acide gras à longue chaîne (par exem- ple demande de brevet japonais publiée N O 28830/79), et un extrai à l'eau chaude (demandes de brevets japonais publiées No 6393/61 et 43842/73) Au surplus on a récemment décrit un lipopolysac- charide obtenu par purification d'un extrait à l'eau chaude d'un corps cellulaire du bacille tuberculeux humain et un lipopolysaccharide obtenu en couplant ce lipopolysaccharide avec un acide gras par l'intermédiaire d'une liaison ester (demande de brevet japonais publiée No 8320/81). l Les déposants ont procédé à des recherches en vue de mettre au point des composants efficaces possédant une action immunisante, une action anti-tumorale et une action juvénilisan- te sur les cellules, sans effets secondaires à partir de bacté- ries telles que la souche Aoyama B du Mycobacterium tuberculosis (un bacille tuberculeux humain), le Mycobacterium bovis (un bacille tuberculeux bovin) et le propionibacterium acnes ( un bacille anaerobie non pathogène) Il en est résulté la décou- verte que si on utilise un agent tensio-actif non-ionique dans un traitement d'extraction des cellules de ces bactéries, on peut très aisément séparer les substances provoquant les effets secondaires sans les opérations compliquées telles que celles adoptées dans les procédés classiques, et on peut obtenir effi- cacement un lipopolysaccharide ayant une action anti-tumorale élevée, une action immunisante élevée ainsi que d'autres actions physiologiques La présente invention repose donc sur cette découverte. On va maintenant décrire en détail le procédé selon l'invention pour la préparation d'un nouveau lipopolysaccharide. On recueille par filtration sur un filtre pour élimi- nation de cellules ou par séparation centrifuge des corps cel- lulaires obtenus par culture aérobie ou anaerobie d'actinomyces et/ou de bactéries apparentées dans un milieu de culture approprié, et on remet en suspension dans l'eau distillée les cellules recueillies La suspension est stérilisée par chauffa- ge et les cellules mortes sont à nouveau recueillies par filtra- tion ou séparation centrifuge Les cellules mortes ainsi re- cueillies sont agitées dans une solution aqueuse d'un agent tensio-actif non-ionique, tel que le TRITON X-100 (polyoxyethy- lène-ter -octyl-phényl-ether) à température ambiante, et on obtient un extrait par séparation par filtration ou centrifuga- tion On ajoute un solvant organique approprié à L'extrait pour précipiter un polysaccharide brut Ce polysaccharide brut est dissout dans une solution aqueuse d'un agent tensio-actif non ionique tel que le TRITON X100, on fait passer la solution à travers une colonne d'une résine d'échange d'anions appropriée pour éliminer les composants acides et une fraction d'un lipo- polysaccharide sous forme d'une substance à haut poids molécu- laire est récupérée par une colonne de tamis moléculaires tels que le BIOGEL A-5 m La fraction récupérée est dialysée à travers une membrane dialysante, le liquidé interne est traité par l'al- pha-amylase, de l'amylo-glucosidase ou une protéinase, puis chauffée pour précipiter l'enzyme, à la suite de quoi le surna- geant est dialysé, déssalé et lyophilisé pour obtenir le lipo- polysaccharide. On peut utiliser comme bactérie de départ dans la présente invention n'importe lequel des micro-organismes réper- toriés dans la partie 17 du Manuel de Bergey "Actinomycetes and Related Organisms", Nouvelle Edition ( 1974) Les cellules utili- sées dans le présent procédé peuvent être celles pulvérisées par un procédé mécanique utilisant un générateur d'ondes ultra- soniques ou une presse telle que celle connue sous la désigna- tion "French Press", ou bien des cellules ayant-été dégraissées par un solvant organique. Le lipopolysaccharide selon l'invention se présente sous forme d'une poudre blanche ou blanc-grisâtre On le dis- sout dans de l'eau distillée ou une solution saline physiolo- gique pour former une solution blanc laiteux, mais il est insolu- ble dans les solvants organiques Le lipopolysaccharide se com- pose d'un polysaccharide contenant des unités D-arabinose et D-mannose comme constituants saccharidiques et d'un acide gras de 14 à 19 atomes de carbone couplé à ce polysaccharide par l'intermédiaire d'une liaison ester On estime que ce lipopolysai charide possède une structure micellaire hydrophobe, et il se comporte comme si c'était une substance à poids moléculaire très élevé dans les diverses méthodes de mesure du poids moléculaire. Le lipopolysaccharide selon l'invention peut égale- ment être obtenu par extraction au moyen d'une solution alca- line aqueuse ou d'une solution tampon alcaline. On va maintenant décrire en détail les résultats d'es- sais sur les activités physiologiques, telles que l'action anti- tumorale, l'action juvénilisante sur les cellules, l'action de relèvement de la production d'anti-corps et l'action d'activa- tion phagocytaire Dans ces essais, on utilise les lipopolysac- charides tels que préparés aux exemples 1, 2 et 3 ci-après et une solution saline physiologique comme témoin selon les besoins On va en premier lieu décrire les résultats de l'essai d'activité anti-tumorale utilisant comme indice l'action de pro- longation de la vie d'une souris cancéreuse. On utilise comme animaux d'essais des souris mâles BALB/c âgées de 8 semaines, pesant 24,5 + 1,0 g, auxquelles on inocule par voie intra péritonéale 105 cellules d'une tumeur ascitique Meth A Les souris sont divisées en 2 groupes de 10 souris chacun A partir du jour suivant les substances d'essai sont inoculées par voie intra-pgritongale, une fois par jour pendant 7 jours. L'indice T/C est calculé à partir de la date moyenne de survie, selon l'équation suivante T/C (%) = date de survig moyepgi dans le groupe traité X 100 date de survie moyenne dans le groupe témoin C Dans le groupe témoin, on a inoculé 0,2 ml de solution saline physiologique par voie intra-péritonéale, selon le même schéma que précédemment. On interrompt l'essai le'60 iàme jour Les résultats sont réunis au Tableau I, qui confirme que le lipopolysaccharide selon l'invention possède une action de prolongation de la vie sur les souris cancéreuses ayant la tumeur précitée. Tableau I Action anti-tumorale par prolongation de la vie de souris cancéreuse. Substance Dose (pg/}lb d'animaux Date de survi E Nb souris T/C (% essayée 0,2 ml/souris) + E V survivan- tes après jours Témoin 10 27,1 + 1,2 0 100 Produit Ex 1 100 10 50,2 10 40,1 1 10 32,8 + 2,1 O 121,0 Produit Ex 2 100 10 44,7 10 36,9 + 2,0 '" O 136,1 1 10 29,7 + 1,2 O 109,6 Produit Ex 3 100 10 49,8 10 35,4 + 1,99 O 130,6 1 10 29,9 + 1,8 O 110,3 2542012. : Examen visuel p On va maintenant décrire les résultats de l'essai d'acti- vité anti-tumorale utilisant comme indice l'action inhibitrice sur la propagation de la tumeur. On utilise comme animaux d'essai des souris femelles C 57 BL/6 âgées de 8 semaines et pesant 20,1 + 1,1 g On inocule par voie sous cutanée dans la région inguinale de chaque souris 105 cellules de tumeur MC-1 induite au méthylcholanthrène Les souris sont divisées en groupes de IO souris chacun A partir du 10 ième jour après l'inoculation, on administre la substance d'essai par voie intrapéritonéale, une fois par jour tous les 4 jours Le 21 ième jour on mesure la taille (longueur x largeur, mm 2) de la tumeur au moyen d'un calibre à cadran et on évalue l'action inhibitrice sur la propagation de la tumeur à partir de la valeur T/C calculée selon l'équation suivante: T/C (%) = Taille moyenne de la tumeur dans le groupe traité 100 Taille moyenne de la tumeur dans le groupe témoin Chaque substance d'essai est administrée stérilement en solution dans 0,2 ml de solution saline physiologique Dans le groupe témoin, la solution saline physiologique est adminis- trée à raison de 0,2 ml par souris suivant la même procédure. Les résultats obtenus sont réunis au tableau II, qui confirme que le lipopolysaccharide selon l'invention possède une action inhibitrice élevée sur la propagation de la tumeur précitée chez la souris. Tableau II Action anti-tumorale par inhibition de la propagation d'une tumeur. Examen visuel Substance Dose(pg/ Taille moyenne 2 deNb de souris T/C (%) essayée 02 ml/souris) tumeur (Lxl,mm) survivantes à + E V la mesure Témoin 394:1 + 18,6 9 100 Produit Ex 1 100 170,4 + 31,7 e 10 4392 Produit Ex 2 100 209,6 + 19,8 & 10 53,2 Produit Ex 3 100 202,1 + 21,4 t 10 51,3 __ _ _ _ _ _ __ _ _ __ _ _ __ __ _ _ _ _ _ ___ _ _ _ _ p On va maintenant décrire les résultats de l'essai d'ac- tivité juvénilisante sur les cellules. On recueille des cellules normales de rate de souris femelles C 57 BL/6 âgées de 8 semaines et on les cultive ensemble avec 100 pg du lipopolysaccharide de l'exemple 1, 2 ou 3 Le degré d'absorption de 3 Hthymidine par les cellules est mesuré et l'action activatrice sur les cellules du lipopolysaccharide est évaluée Chez les témoins, les cellules sont cultivées avec la quantité correspondante de solution saline physiologique Dans chaque groupe d'essai, l'essai est réalisé sur des cellules prélevées sur un animal, et l'essai est répété sur cinq animaux. Les résultats sont réunis au Tableau III, qui confirme que le lipopolysaccharide selon l'invention augmente de manière frappante le degré d'absorbtion de la thymidine par les cellules de rate de souris, et possède donc des actions activatrices et juvénilisantes. Tableau III Action juvénilisante sur la cellule. On va maintenant décrire les résultats de l'essai d'activité sur l'accroissement de la production d'anti-corps. On administre la substance d'essai ( 100 Fig) de l'exem- ple 1, 2 ou 3 en même temps que 108 globules rouges de mouton (GRM) dans la veine de la queue de souris femelles C 57 BL-6 âgées de 8 semaines en groupes de 5 souris,et on prélève la rate au bout de 4 jours Le nombre de cellules plaquettogènes anti-GRM (CP) est compté selon la méthode de Cunningham et Sjenberg, et comparé h celui du groupe témoin L'indice de réponse est cal- culé selon l'équation suivante: indie de rnponse ombre de CP dans le groupe traité nombre de CP dans le groupe témoin. Le résultats obtenus sont réunis au Tableau IV, qui Substance essayée Degré d'absorbtion de la 3 H-dmidine (c p S) Témoin 8298 + 201 Produit Ex 1 66139 + 5379 Produit Ex 2 43271 + 2110 Produit Ex 3 76045 4 + 4998 confirme que le lipopolysaccharide de la présente invention est une substance qui accroît de manière significative la production d'un anti-corps vis à vis des GRM, et qui participe à l'instal- lation de l'immunité. Tableau IV Influences sur la production d'anticorps vis à vis des cellules rouges du mouton. Substances essayées Nombre moyen CP + E V Indice de réponse (%) On va maintenant décrire les résultats de l'essai d'action sur l'activation phagocytaire. On administre la substance d'essai obtenue aux exem- ples 1,2 ou 3, à raison de 100 ug dans 0,2 ml de solution saline physiologique, par voie intrapéritonéale chez des souris mâles BALB/c âgées de 8 semaines Au bout de 2 jours on prélève l'ascite péritonéale On ajoute alors 103 cellules d-e tumeur Meth A par 2 x 104 cellules adhérant à un disque plastique dans les cellules péritonéales, et on poursuit la culture pendant 24 heures dans un milieu de sérum d'embryon bovin On ajoute alors de la 3 Hthymidine et on poursuit la culture pendant encore 16 heures On évalue l'action du macrophage activé sur les cellules tumorales en se basant sur le degré d'absorbtion de la 3 H-thy- midine, et l'action activante sur le macrophage de la substance d'essai est chiffrée à partir de cette évalua-tion Les souris sont divisées en groupes de 10 et chez les témoins, 0,2 ml de solution saline physiologique sont administrés à la place de la substance d'essai Le taux d'action activante est calculé selon l'équation suivante: Absorbtion moyenne _ Absorption moyenne chez groupe témoin chez groupe traité Taux d'activation activante _ 100 (M) Absorption moyenne chez groupe témoin Les résultats obtenus sont réunis au Tableau V, qui confirme que le lipopolysaccharide selon l'invention est une Témoin 189 700 + 10 910 100 - Produit Ex 1 478 800 + 38 540 252 Produit Ex2 428 600 + 19 780 226 Produit Ex3 399 400 + 28 370 211 substance influençant positivement l'activation du macrophage de souris. Tableau V: effet d'inhibition de la propagation des cellules tumorales par le macrophage. Substance essayée Taux d'action activante (%) Lipopolysaccharide de l'exemple 1 82,6 Lipopolysaccharide de l'exemple 2 77,3 Lipopolysaccharide de l'exemple 3 89,4. Quand le lipopolysaccharide selon l'invention est administré par voie intrapéritonéale à des souris femelles C 57 BL/6 et à des souris mâles BALB/c à raison de 5 g/Kg/jour pendant 7 jours consécutifs, aucun changement n'intervient chez les animaux d'essai, et on a trouvé que le lipopolysaccharide selon l'invention n'est que très faiblement toxique. Le lipopolysaccharide selon l'invention est inhérent aux actinomycetes et aux bactéries apparentées et il se compose d'un polysaccharide contenant des unités D-arabinose et D-mannose comme saccharides constituants principaux et d'un acide gras comportant principalement de l'acide palmitique et de l'acide tuberculostéarique, couples avec le polysaccharide par une li- aison ester Comme il ressort des résultats d'essais précédents, le lipopolysaccharide selon l'invention est excellent par son action antitumorale, son action juvénilisante sur-les cellules, son action immunisante, etc, et ce lipopolysaccharide est précieux en ce qu'il ne présente pas d'effets secondaires inhé- rents aux cellules en soi Par suite le lipopolysaccharide selon l'invention trouve son application en médecine humaine comme agent immunothérapeutique vis à vis des tumeurs et comme agent immunisant. Au surplus, grace au procédé selon l'invention, ce lipopolysaccharide peut être obtenu efficacement par une opéra- tion simple, faisant appel à un agent tensio-actif non-ionique. Ce procédé constitue donc un excellent procédé industriel. On va maintenant illustrer l'invention grâce aux exemples suivants, ne présentant aucun caractère limitatif. Exemple 1. On cultive une souche Aoyama B de Mycobacterium tuber- culosis dans un milieu de Sauton pendant 5 semaines, et on recueille les cellules par filtration, on les lave à l'eau et on les met en suspension dans l'eau distillée La suspension est chauffée et stérilisée à 100 C pendant 20 minutes Les cel- lules mortes sont recueillies par filtration, lavées à l'eau et ajoutées à une solution aqueuse à 1,5 % de TRITON X-100 (envi- ron 5 fois le poids des cellules humides) Le mélange est agité à température ambiante pendant 24 heures On réalise une sépara- tion centrifuge sous 20 000 g pendant 20 minutes, on dialyse le surnageant par une membrane dialysante et on ajoute de l'ethanol au liquide interne à raison d'environ 9 fois le volume dudit liquide interne On agite le mélange et on réalise une séparation centrifuge sous 5000 g pendant 10 minutes Le précipité est recueilli et lavé à l'éthanol puis à l'ether éthylique pour donner un lipopolysaccharide brut Ce produit brut est dissout dans une solution 40 m M de Na Cl et cette solution est envoyée dans une colonne à tamis moléculaire (par exemple, BIO-GEL A-Sm) équilibrée avec une solution 50 m M de Na Clo On effectue l'élu- tion avec la même solution pour recueillir une fraction blanc laiteux retenue par le tamis moléculaireo Cette fraction est dialysée dans l'eau courante en utilisant une membrane dialysan- te jusqu'au lendemain, et le liquide interne est traité par l'alphaamylase puis par de l'amyloglucosidase La solution est dialysée à nouveau, dessalée et lyophilisée pour obtenir le lipopolysaccharide Le rendement est de 0,1 % par rapport aux cellules humides D'après les résultats d'analyse, il apparaît que cette substance comprend 56 % d'un polysaccharide contenant des unités D-arabinose et D-mannose dans le rapport 1:4, et 44 % d'un composant du type acide gras comportant principalement des acides gras saturés à 16,18 et 19 atomes de carbone. Exemple 2. On cultive du BCG Mycobacterium bovis dans un milieu de Santon pendant 4 semaines et les cellules obtenues sont lavée à l'eau, séchées et dégraissées avec un mélange éther-éthanol (I:I, V/V) puis un mélange chloroforme-méthanol (I:I,V/V) Les cellules sont ensuite chauffées à 100 C pendant 20 minutes dans 2542012. l'eau distillée, et recueillies par filtration Les cellules recueillies sont traitées suivant le même processus que celui décrit à l'exemple 1, pour obtenir un lipopolysaccharide Le rendement est de 1 % par rapport aux cellules sèches D'après les résultats de l'analyse, il apparait que cette substance est un lipopolysaccharide comprenant 59 % d'un polysaccharide contenant comme saccharides constituants principaux du D-ara- binose et du D-mannose dans la proportion de 1:4, et 41 % d'un composant du type acide gras comprenant principalement des acides gras saturés à 16,18 et 19 atomes de carbone. Exemple 3. On cultive du propionibacterium acnes C-7 en conditions anaerobies dans un milieu constitué par un bouillon GAM, pendant 4 jours selon la méthode de culture stationnaire Les cellules recueillies par séparation centrifuge sont lavées avec une solution saline physiologique, pulvérisées à la presse et traitées de la même manière qu'à l'exemple 1 pour obtenir un lipopolysaccharide Le rendement est de 0,2 % par rapport au poids des cellules humides L'analyse montre que ce lipopolysac- charide se compose de 60 % d'un polysaccharide contenant des unités Darabinose et D-mannose dans la proportion de 1:3 et de % d'un constituant acide gras comprenant principalement des acides gras saturés à 15-18 atomes de carbone. Une culture de Mycobacterium tuberculosis, souche Aoyama B, a été déposée à la collection dite American Type Culture Collection, à Rockville, Maryland, USA, et enregistrée dans la collection permanente sous la référence ATCC 31726. Une culture de Mycobacterium bovis, souche BCG, a été déposée à la même collection, et enregistrée sous la réfé- rence ATCC 19015. Enfin, une culture de Propionibacterium acnes C-7, recueillie et conservée à la Faculté de Médecine de l'Universi- té de Gifu, au Japon, a été de même déposée à la même collec- tion, et enregistrée sous la référence ATCC 11827. 1 1 REVENDICATIONS. 1 Nouvelle substance du type lipopolysaccharide, carac- térisée en ce qu'elle se compose de 53 à 63 % d'un polysacchari- de contenant des unités D-arabinose et des unités D-mannose dans une proportion comprise entre 1:3 et 1:4, et de 37 à 47 % d'un composant acide gras. 2 Substance selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composant acide gras est constitué par au moins un acide gras saturé contenant de 14 à 19 atomes de carbone. 3 Procédé pour la préparation d'un lipopolysaccharide, caractérisé en ce qu'il consiste à extraire les cellules prove- nant d'une culture d'actinomyces et/ou d'une bactérie apparentée, au moyen d'un agent tensio-actif non-ionique, et à purifier l'extrait au moyen d'un tamis moléculaire. 4 Applicationdu lipopolysaccharide selon les revendica- tions 1 et 2, comme agent immunothérapeutique, possédant notam- ment une action anti-tumorale, une action immunisante, une action juvénilisante sur les cellules, une action activatrice phagocy- taire et une action prgventrice sur l'infection.