FR 2550942 A1 19850301 FR 8313709 A 19830825 Vaccin contre le paludisme et procédé de préparation de ce vaccin. La présente invention a trait å un vaccin contre le paludisme, et notamment le paludisme induit:par Plasmodium falciparum, ainsi qu'a un procédé de fabrication de ce vaccin. Le paludisme, notamment à Plasmodium falciparum, est une infection majeure particulièrement invalidante et qui,si elle a pu être éradiquée dans un certain nombre de zones dépaludées, reste endémique dans de vastes secteurs géograp;iiques dans lesquels la dépaludation ou d'-autres mesures d'éradication ne paraissent pas possibles. Le besoin d'une vaccination contre le paludisme s'est donc fait sentir depuis longtemps, sans que l'on ait pu, jusqu'à présent, aboutir à des préparations susceptibles d'être mises en oeuvre de façon systématique et répondant donc simultanément aux critères d'efficacité, d'innocuité et de prix de revient économique. La présente invention se propose de remédier à ces inconvénients et de fournir un vaccin contre le paludisme qui soit efficace, facile à mettre en oeuvre, dépourvu de risques et économique. L'invention a également pour objectif de fournir un procédé de préparation économique de ce vaccin, permettant sa fabrication massive et à bon marché. On sait aéja cultive Plasmodium falciparum in vitro sur des hématies humaines, par la technique mise au point par TRAGER & JENSEN (1976). Voir Human Malaria Parasites in Continuous Culture, Science, 193, p. 673-675. Voir également, W. TRAGER, Médecine et Maladies infectieuses, 1981 - 11 - n0 6 - p. 339-341 ; W. CHIN, Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, Vol. 73 n" 3, 1979 et T. SCOTT - FINNIGAN et ai. Vol. 75 n" 2, 1981. On a cherché, grâce aux facilités produites par ces procédés de culture in vitro, à trouver des antig*- nes susceptibles d'être utilisés pour la préparation d'un vaccin contre le paludisme. Malheureusement, il existe un très grand nombre d'antigènes de Plasmodium falciparum parmi lesquels on peut citer des antigènes parasitaires, des antigènes érythrocytaires et des exo-antigènes isolés par immuno-adsorption, ces différents antigènes étant relatifs aux nombreux stades appartenant au cycle complexe que suit le parasite. Cette situation complexe explique la difficulté de mettre au point- des vaccins anti-paludiques qui ne soient pas extrêmement spécifiques ainsi que cela ressort des articles de/W.H. WERNSDORFER, Bulletin de l'Organisation Mondiale de la Santé, 59/6/1981 p. 837-844 ou W. TRAGER, Médecine et Maladies Infectieuses, 1981-11 nv 6 bis p. 408-409. Ces difficultés se trouvaient encore augmentées par l'absence de techniques permettant une purification industrielle à grande échelle des antigènes, malgré la possibilité récente offerte par le développement de la technique de culture in vitro des parasites sur hématies. De façon surprenante, le vaccin selon l'invention permet l'acquisition d'une immunité de spectre extrêmement large tant au point de vue du stade de développement des parasites infectants qu'au point de vue des espèces et souches des parasites. L'invention a pour objet un vaccin contre le paludisme, caractérisé en ce qu'il comporte, dans un véhicule convenable, certains au moins des exo-antigènes provenant de surnageants de culture de Plasmodium falciparum à une concentration thérapeutiquement active. De préférence, la concentration en exo-antigènes est au moins égale à 0,75 mg/ml et de préférence de l'ordre de 1,25 mg/ml. Le vaccin peut être conservé sous forme de préparations liquides injectables ou bien sous forme lyophilisée mise en oeuvre par redissolution par exemple dans un sérum physiologique. La dose de vaccin est de préférence de l'ordre de 1 ml. Le vaccin peut comporter des adjuvants usuels tels que par exemple de l'hydroxyde d'alumine. Le protocole de vaccination comporte de préf é- 45 rence 3 injections sous-cutanées à 30 à / jours d'intervalle. L'invention a également pour objet un procédé de fabrication d'un vaccin à base d'exo-antigènes de surnageants de culture de Plasmodium falciparum, caractérisé en ce que l'on cultive, par exemple de façon connue, une souche convenable, par exemple une souche humaine, de Plasmodium falciparum sur des. hématies humaines, de préfé- rence du groupe A+,- par exemple selon les modalités décrites en 1976 par TRAGER & JANSEN ou par une variante de cette méthode décrite en 1982 par JANSEN, que l'on prélève le surnageant de culture, que l'on filtre ce surnageant de façon à éliminer tous parasites ou gros débris de parasites ainsi que toutes hématies ou gros débris d'hématies, que l'on effectue, s 'il est nécessaire d'abaisser le pH, une dialyse à froid du surnageant filtré concentré, que l'on élimine le précipité obtenu, que l'on soumet le surnageant à une chromatographie par échange d'ions, et que l'on concentre l'éluat collecté jusqu'à obtention du degré de concentration voulu en exo-antigènes pour former le vaccin. L'invention sera maintenant décrite a propos d'une forme de réalisation particulière, faite à titre d'exemple non limitatif. 1. Culture de Plasmodium falciparum. La multiplication des parasites a lieu sur des hématies humaines du groupe A+. La phase liquide est cons tituée de milieu RPMI 1640 vendu par exemple par la société britannique GIBCO BIO-CULT Ltd à Paisley, Ecosse, le milieu étant enrichi de 2 à 20 %, par exemple 10 t de sérum A+. La concentration en hématies est de 5 t . L'infection est effectuée selon un rapport de 2 å 5 parasites par 1000 hématies. La culture est effectuée à 370C sous atmos phère enrichie en C02 (7 t}. Les milieux de culture sont soigneusement renouvelés tous les jours. De préférence, mais non obligatoirement, la culture est précédée d'une synchronisation de la souche. Les surnageants sont prélevés lorsque la parasi témie atteint 4 à 10% (par rapport aux hématies), ce qui se produit environ après 48 heures. Le surnageant de culture est prélevé après decan- tation des hématies 'par simple gravité. Le surnageant contient les exo-antigènes. Le surnageant concentré peut être conservé pendant une longue durée, par exemple au moins une année, Si on le souhaite, dans l'azote liquide. 2. Extraction et purification du surnageant contenant les exo-antigènes. Le surnageant prélevé est tout d'abord filtré. sur membrane de type MILLIPORE de 0,45 . Le surnageant filtré est ensuite concentré envi ron 10 fois à l'aide d'un concentrateur à fibres creuses H1 PlO AMICON de 10000 Daltons. Un tel concentrateur est vendu par la société AMICON S.A.R.L. demeurant a Paris. Selon les caractéristiques du gel échangeur d'ions (anionique ou cationique),le surnageant concentré est ensuite éventuellement soumis à une dialyse contre une solution tampon-acétate 10 mM à pH acide (par exemple 3,7) à 4"C pendant 15 heures environ. La dialyse s'effectue par exemple dans la proportion de 5 1 de tampon, renouvelé au moins une fois, pour 200 ml de milieu concentré placé dans des sacs à dialyse. Le précipité formé est éliminé par filtration sur membrane de type NUCLEOPORE ayant un diamètre de pores de 5 6 . De tels filtres sont vendus par la société américaine NUCLEOPORE Corporation à Pleasanton, Californie. Le filtrat est ensuite purifié par chromatographie échangeuse d'ions cationiques ou anioniques. Le support de chromatographie peut être par exemple le support vendu sous la dénomination SULFOPROPYL TRISA CRYL M par la Société Réactif IBF (Industrie Biologique Française) Société Chimique POINTET GIRARD à Villeneuve-la Garenne ou QAE Sephadex A 50 (Pharmacia, Uppsala, Suède). La chromatographie peut être réalisée dans des colonnes de capacités différentes en fonction des volumes traités. Cependant, de préférence, il faut respecter les rapports diamètre/hauteur et volume de dépôt/volume de la colonne approximativement dans les proportions suivantes: rapport diambtre/hauteur compris entre 0,3 et 0,8, rapport volume de dépôt/volume de la colonne compris entre 0,05 et 0,6. Par exemple, le diamètre interne peut être de 6 cm, la hauteur de 10 cm, le volume de la colonne de 280 ml. La colonne de gel est équilibrée par au moins trois fois son volume de tampon d'élution, c'est-a-aire tampon acétate 10 mM pH 3,7 pour les gels cationiques et TriHCl, par exemple, 50 mM pH 7,6 pour les gels anioniques. L'équilibrage est réalisé lorsque le pH de 1 ' lut atteint 2 le pH du tampon initial. Le débit maximum est de 20 ml/cm / heure. Le dépôt est effectué en tête de colonne, c'est-àdire par chromatographie descendante à raison de 30 à 80 de gel mg de protéine/ml/pour les gels cationiques (et 4 à 8 mg/ml pour les gels anioniques). On peut vérifier que cette proportion est respectée avec le SP TRISACRYL Si le milieu concentré dialysé, qui est'coloré en brun, colore la moitié supérieure de la colonne en en saturant les sites. L'élutîon de la colonne se fait alors par un gradient croissant de chlorure de sodium dans du tampon d'élution. Ce gradient peut être effectué de façon continue jusqu'à une molarité maximum de 0,5 M pour les gels anioniques et 0,3 M pour les gels cationiques, ou par paliers discontinus, par exemple 0,1 puis 0,2 puis 0,3 M en Nazi. Par exemple pour une colonne ayant un diamètre interne de 6 cm, une hauteur de 10 cm, un volume de 280 ml, la colonne est élude par 3 paliers de molarité croissante ayant chacun un volume de l 300 ml. Le débit d'6lu- 2 tion est de 20 ml/cm /heure. On recueille l'élut par fractions telles que le rapport volume d'une fraction/volume de colonne soit compris entre 0,07 et 0,7. 3. Vérification. Pour chacune des fractions, on mesure le taux de protéines. Ceci peut être effectué par exemple par la méthode de Bradford ou par mesure de la densité optique à 280 nm. On peut également effectuer des contrôles immunoenzymatiques face à des sérums humains anti-P. Falciparum, à des sérums humains normaux, à des sérums expérimentaux d'animaux immunisés contre des hématies humaines et enfin contre des conjugués anti-immunoglobulines humaines. Ces contrôles permettent de déterminer la pureté de chaque fraction et de vérifier l'absence de contaminants érythrocytaires ou immuno-globuliniques. L'exo-antigène SPE obtenu est composé de trois protéines de propriétés voisines et dont le pH est compris entre 3,8 et 4,0. Le rendement constaté est approximative- ment le suivant : pour 1,9 1 de surnageant de culture dont la concentration protéique est de 7,5 mg/ml, on obtient 77 egtml d'exo-antigène SPE. 4. Production du vaccin. Les fractions mélangées d'éluat sont concentrées par exemple par lyophilisation ou par dialyse contre le polyéthylène glycol 6000 jusqu'a une concentration protEini- que finale de 1,25 mg/ml. Le vaccin peut être utilise tel quel ou être, après concentration au-delå de cette valeur, repris dans un véhicule liquide convenable. L'hydroxyde d'alumine peut être ajouté comme adjuvant, par exemple dans la proportion de 2 mg/ml Les doses à usage humain sont de 1 ml, contenant 3 à 5 mg d'exo-antigènes. Les essais ont montré que l'on obtient l'immunisation de singes Saimiris par trois injections sous-cutanées de 0,60 mg d'antigène SPE, administrées chaque fois sous un volume de 0,5 ml avec, comme adjuvant,del'hydroxyde d'alumine. Les injections ont été effectuées tous les 30 à 45 jours. L'infestation de contrôle est réalisée par injection de sang parasité, un mois après la dernière injection vaccinante. Bien entendu, l'invention peut faire l'objet de nombreuses modifications dans les étapes de préparation. REVENDICATIONS 1. Vaccin contre le paludisme, caractérisé en ce qu'il comporte, dans un véhicule convenable, certains au moins des exo-antigènes provenant de surnageants de culture de Plasmodium falciparum à une concentration thérapeutiquement active. 2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration en exo-antigènes est au moins égale à 3 a 5mg/ml. 3. Vaccin selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il est préparé sous des doses de I1 ordre de 1 ml. 4. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte un adjuvant. 5. Procédé de fabrication d'un vaccin à base d'exo-antigènes de Plasmodium falciparum, caractérisé en ce que l'on cultive une souche de Plasmodium falciparum sur des hématies humaines, que l'on prélève le surnageant de culture, que l'on filtre ce surnageant, que l'on effectue une dialyse à froid du -surnageant filtré, que l'on soumet le surnageant dialysé à une chromatographie par échange d'ions cationiques ou anioniques et que l'on concentre l'éluat collecté jusqu'a obtention du degré de concentration voulu en exo-antigènes. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on utilise pour la culture un milieu connu RPMI 1640 enrichi de 2 à 20 % de sérum. 7. Procédé selon l'une des revendications 5 et 6, caractérisé en ce que l'on prélève les surnageants lorsque la parasitémie atteint 4 a10 %. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que le surnageant filtré est concentré environ 10 fois puis soumis Si nécessaire à une dialyse contre une solution tampon acétate à pH acide à basse température, le précipité formé étant éliminé par filtration. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 9 8, caractérisé en ce que l'on effectue une chro en colonne matographiet avec des rapports diamdtre/hauteur compris entre 0,3 et 0,8 et volume de dépôt/volume de colonne compris entre 0,05 et 0,6. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce que l'on élue la colonne par un gradient croissant de chlorure de sodium dans du tampon d'élution.