FR 2547926 A1 19841228 FR 8310595 A 19830627 Procédé de dosage des oestrogènes et des androgenes par amplification et bioluminescence. Le dosage de l'oestrone et de l'oestradiol par amplification enzymatique a été décrit par les auteurs (Brevet fran çais 2 419 519 de INSERM (1) , Perfectionnement apportés aux procédés de dosage des oestrogenes et ensemble pret à l'emploi pour la réalisation desdits dosages), et Nicolas J.C., BOUSSIOUX A.M., DESCOMPS B., CRASTES de PAULET A. : Clin. Chim. Acta, 1979, 32, 1-9 (2) mais possede une sensibilité limitée (10 pg) et nécessite un temps d'incubation relativement long de 5 à 16 heures, pour permettre l'accumulation d'une quantité suffisante de NADH qui est dosée par mesure de l'absorbance à 340 nm. L'utilisation de la bioluminescence de bactéries marines de type Beneckea harveyi (Photobacterium fischeri souche MAV) et Vibrio fischeri a fait l'objet de plusieurs revues (De Luca M. (éd.) - 1978 Methods in Enzymology Vol. 57 Academic Presse New-York (3) et whitehead T.P., Kricka L.J., Carter T.J.N. et Thorpe G. HG : "Analytical Luminescence ; its potential in Clinical Laboratory", Clin. Chem. 1979, 25 (9) p. 1531-1546) (4). Plus récemment, des dosages de stéroidesont été décrits, faisant appel soit à la bioluminescence EFord J. et De Luca . Analytical biochemistry 1981 - 110 - p. 43/48 : a new assay for picomoles levels of androsterone and testosterone using co-immobilised Luciferase, oxydoreductase and steroid deshydrogenase (52 soit à la chemiluminescence gStrasburger Ch. J., Fricke H. and Wood W.G. : Development and Optimisation of a chemiluminescent Immunoassay (CLIA) Fres. Z. Anal. Chem. 1982. 311, 351-352 (6) et Klinger W., Van Postel G., Haupt 0. and Knupper R. : Chemiluminescent Immunoassay of unconjugated Oestriol in Serum of pregnant women - Fres. Z. Anal. Chem. 1982, 311, 352-353 (7) et Kim J.B., Barnard G.J., Collins W.P. Kohen F., Lindner H.R., Eshnar Z. : Measurement of Plasma Estradiol 17 ss by solid Phase chemiluminescence immunoassay - Clin. Chem. 1982, 28/5, 1120-1124) (8 )} mais ces procédés sont peu sensibles ou doivent uti- liser une technique en phase hétérogène d'emploi peu aisé. Le procédé de dosage des oestrogenes et des androgenes selon l'invention est une combinaison du procédé d'amplification enzymatique faisant appel à une transhydrogénase spécifique (la 17} hydroxystéroide déshydrogénase) d'une part, et, d'autre part, du procédé de dosage du NADH formé par bioluminescence mettant en jeu une chaîne d'oxydoréduction du NADH et la luciférase extraite de Beneckae harveyi. La combinaison selon l'invention permet d'assurer la spécificité du système, évitant l'emploi d'un dosage en phase hétérogene et donnant une grande sensibilité qui permet d'opérer avec un temps d'incubation relativement court. Le dosage des oestrogenes (oestrone et oestradiol) utilise la réaction de transhydrogénation catalysée par la 17 B oestradiol-deshyurogenase du placenta humain qui, en présence d'oestradiol et d'uestrone, transfère l'hydrogène du NEDERau NAD, conduisant à une accumulation de NADH proportionnelle à la concentration en oestrogènes (oestrone + oestradiol). Le système de transfert de l'hydrogene est réalisé par l'interconversion de l'oestrone en oestradiol, cette réaction se faisant en moins d'une seconde, et, le substrat étant constamment recyclé, la réaction peut être réalisée pendant un temps d'incubation de quelques minutes à plusieurs heures, entraînant ainsi un facteur d'amplification compris entre 1000 et 100 000 selon le temps d'incubation. Le procédé précédemment décrit (références (1) et (2) ci-dessus) met en oeuvre comme méthode de dosage du NADH une méthode pratique mais peu sensible, utilisant l'absorbance de ce coenzyme à 340 nm, et nécessite un facteur d'amplification relativement élevé, donc un temps d'incubation de plusieurs heures. L'utilisation d'enzymes bioluminescentespermet de doser des quantités de NADH de l'ordre de la picomole et donc, associée au système de transhydrogénase, de réduire considérablement le temps d'amplification et d'augmenter la sensibilité du dosage. Le réactif de dosage de NADH par bioluminescence comprend une NADH - FMN oxydoréductase (FMN = flavine mononucléotide) qui catalyse la réaction NADH + FMN + H @ NAD + FMNH2 et une luciférase qui utilise le FMNH2 produit , en presence d'une aldéhyde à longue chaîne (RCHO) et d'oxygène, pour produire de la lu- mière selon la réaction suivante, couplée avec la précédente FMNH2 + RCHO + O2 # FMN + RCOOH + H2O + h # On mesure au photomètre l'intensité de lumière produite, qui est proportionnelle à la concentration de NADH. I - Dosage des oestrogènes (oestrone + oestradiol) dans le plasma ou l'urine Le procédé selon l'invention utilise, d'une part, un tampon transhydrogénase contenant les constituants suivants : -glucose-6-phosphate = 10-2 à 10-5 mol./l, de préférence 10-3 mol./l -glucose-6-phosphate déshydrogénase = 10 à 1 000 unités/l et de pre- férence 100 unités/l -NAD = 10-2 à 10-5 mol./l, de préférence 2.10-4 mol./l -NADP = 10-5 à 10-10 mol./l, de préférence 2,10-7 mol./l d'autre part un réactif de bioluminescence contenant -FMN = = 0,5 à 10 mg/l, de préférence 5 mg/l -aldéhyde aliphatique = 0,2 à 20Sug/l, de préférence 10 g/l de décanal -NADH/FMN oxydoréductase = 2 à 50 U.I./l et, de préférence 20 U.I./l -luciférase extraite de Beneckea harveyi = 1 à 30 mg/l, de préférence 20 mg/l Le protocole de dosage est le suivant On utilise 3 tubes (désignés 1,2 et 3) contenant chacun - 10 à 1 000 l, de préférence 200jil de tampon transhydrogénase - et l'échantillon à doser : soit 1 à 5 l d'urine ou 10 à 30 l de plasma. Les tubes 2 et 3 reçoivent 10 à 500 l, et de préférence 100 l, (soit environ 10 milliunités/l) de 17 u - hydroxystéroïde déshydrogénase. Le tube 3 reçoit une surcharge connue, de 5 à 50 pg (de préférence 10 pg) d'oestradiol. Les 3 tubes sont incubés de 10 min. à 2 heures, chacun selon la sensibilité requise (de préférence 15 à 30 minutes). Puis, on ajoute séquentiellement à chaque tube le réactif de bioluminescence et on mesure la luminescence (variation de l'intensité de la lumière) sur 30 secondes ou 1 minute. Le calcul de la quantité d'oestrone + oestradiol présente dans l'échantillon est réalisée comparant les résultats obtenus pour ltechantillon (tube 2 - tube 1) aux résultats obtenus pour la surcharge (tube 3 - tube 2) de concentration connue. Il faut noter qu'il est nécessaire, immédiatement avant de mesurer la luminescence du tube témoin (1) d'injecter 100 l de 17 ss - hydroxystéroïde déshydrogénase, puis le réactif de bioluminescence. Du fait de la grande sensibilité de la méthode (de l'ordre de la femtomole) l'utilisation d'anticorps anti-stéroïde peut être envisagée pour augmenter la spécificité de la méthode de dosage et ainsi peut etre appliquée au dosage spécifique de l'oestrone, de l'oestradiol et des différents androgènes. TI - Dosage spécifique de l'oestradiol dans le seruin ou dans l'urine. Le principe du dosage repose sur l'absorption spécifique du stéroïde à doser par un anticorps spécifique. Dans le cas de l'oestradiol - le dosage est réalisé sur trois tubes le témoin contient l'échantillon à doser (oestradiol + oestrone) préalablement traité pendant 30 mn, par un immunoabsorbant spécifique du stéroïde à doser. Les tubes 2 et 3 contiennent l'échantillon normal et le troisième tube une surcharge connue en stéroïde à doser Le dosage spécifique de l'oestrone ou de l'oestradiol peut ainsi être realisé directement par addition du réactif complet de transhydrogénase, incubation 15 à 30 minutes et dosage du NADH par bioluminescence (selon le I). Une autre voie plus simple pour doser spécifiquement l'oestradiol consiste à faire réagir l'oestrone avec un réactif des cétones tel que l'hydrazine. Le procédé est le suivant - le tube "oestradiol + oestrone" contient de 100 à 1 000 l, de préférence 500 l, de sérum ou d'urine et 100 à de préférence 120 l, d'eau distillée. Le tube "oestradiol't contient les mêmes quantités de sérum ou d'urine, mais l'eau distillée est rem- placée par un volume égal de chlorhydrate d'hydrazine 6mol/l pH 7,4. Après rédaction, le contenu de chaque tube est extrait par 1 à 5ji1 d'éther qui est lavé par un égal volume de tris HCY 0,1 mol/l. La phase éthérée séparée est évaporée, le résidu repris par 250 l de tampon transhydrogénase est dosé selon le protocole décrit au 3 I. III-Dosage des androgènes. Le dosage des androgènes nécessite l'utilisation d'une enzyme capable de convertir les androgènes en oestrogènes, enzyme membranaire contenue dans le placenta. Cette enzyme doit être débarrassée de son contenu en stéroïde. La purification est conduite selon le procédé ci-dessous. La préparation contient les activités suivantes : une sulfatase, une 3 p - hydroxystéroïde - déshydrogénase, une a5, #4 - cétostéroide - isomérase et une aromatase. Elle est désignée ci-après par le terme "aromatase". 1. Procédé de préparation de l'aromatase 1/1. Préparation des microsomes : Les cotylédons de 2 placentas sont homogénéisés dans 1 litre de tampon phosphate 30mmol/l, pH 7,2, 20 z de glycérol. L'homogénat est centrifugé à 10 000 g pendant 30 mn. Le surnageant est centrifugé à nouveau 60 mn à 105 000 g. Le culot correspondant à la fraction microsomiale est lavé 2 fois par 500ml de tampon. Le lavage a lieu par homogénéisation puis centrifugation. 1/2. Solubilisation des microsomes La solubilisation des microsomes doit être effectuée rapidement afin d'éviter toute perte d'activité enzymatique durant cette étape. Le culot de microsomes précédemment obtenu est remis en suspension dans 50 ml de tampon phosphate (30 mmol/l, pH 7,2, 25 z de glycérol), puis on ajoute 50 ml de ce même tampon contenant 8 7 de Triton X100. La suspension est homogénéisée à 40C dans un Potter (verre téflon) pendant 30 mn. La suspension est ensuite centrifugée 60 mn à 105 000 g. Le Triton X100 est éliminé de ce surnageant par chromatographie sur résine hydrophobe de type XAD2(R).La solution est passée sur une colonne (0 2,5 cm x 15 cm) de résine équilibrée contre le tampon phosphate. La solution d'aromatase est éluée grâce à ce même tampon et les fractions colorées sont rassemblées. 1/3. Mesure de l'activité aromatase La mesure est réalisée dans 350 zip de tampon 200 mmol/l -5 @@@@@@@@ Tris HCl, pH 8 contenant 10 mol NADP, 10 mol glucose-6-phosphate, mol dithiothreitol, 0,1 unité glucose-6-phosphate déshydrogénase ~R et 10 5 mol de substrat stéroide (androstènedione ou testostérone ou déhydroépiandrostérone). La solution d'aromatase est ajoutée et l'in cubation poursuivie pendant 15, 30 et 60 mn. Les oestrogènes formés sont dosés selon le procédé usuel sur 100 l du milieu. 2. Dosage du sulfate de déhydroépîandrostérone plasma tique (SDHEA) Le dosage est réalisé sur une quantité de 0,5 à 1 l de sérum. Le tampon de transformation de la déhydroépiandrostérone (DHEA) en oestradiol est le même que celui décrit précédemment pour la mesure de l'activité aromatase, c'est-à-dire, un tampon 200 mmol/l Tris-HCl, pH8. A 60yul de tampon contenant l'aromatase, on ajoute 40 l d'eau pour constituer le tube (1) correspondant au témoin aromatase. Comme la quantité de sérum utilisée est très faible, le dosage ne néces site pas de tube correspondant au témoin sérum. Les densités optiques du tube (2) dosage - sérum (auquel on ajoute 20 l d'une dilution de sérum + 20jil d'eau) et du tube (3) dosage + surcharge (auquel on-ajou- te 20 > il d'une dilution de sérum + 20 l de tampon contenant 2p moles de SDHEA) sont lues, en fin de dosage, contre le témoin aromatase (1). La quantité d'eromatase ajoutée sous un volame en ral de lOjAl doit être suffisante pour assurer une conversion totale de 10 ng de DHEA. Le temps d'incubation est compris entre 30 mn et 2 heures. Après aromatisation, de 0,2 à 1 ml, de préférence 0,2 ml, de tampon transhydrogénase sont ajoutés, l'incubation est poursuivie 10 à 30 mn, de préférence 10 mn, les tubes sont mesurés séquentiellement après addition de 100 l de réactif de bioluminescence, de la même façon que décrit ci-dessus pour le dosage des oestrogènes. 3. Dosage de l'ensemble DHEA, #4 - androstènédione, testostérone : Afin d'éliminer du sérum le sulfate de DKEA, il est né cessaire de procéder à une extraction par l'éther1 le sulfate de DHEA n'étant pas extractible : 0,5 ml de sérum sont extraits par 4 ml d'éther. La phase éthérée, après lavage est évaporée et le résidu repris par 0,5 ml de tampon tris 0,1 mol/l, pH 7,2. 20 l de cet extrait (échantillon) sont traités par 50 l de tampon contenant l'aromatase selon le procédé suivant - le tube témoin (1) contient l'aromatase inactivée ainsi que l'échantillon, - le tube dosage (2) contient l'aromatase non-inactivée ainsi que l'échantillon, - le tube surcharge (3) contient l'aromatase non-inac tivée, l'échantillon et la surcharge. Après incubation 30 minutes à 37 C, l'aromatase est inactivée par chauffage ou par traitement alcalin suivi de neutrali sation. On ajoute alors 200 pl de tampon transhydrogénase. Une incu bation de 15 mn à 2 heures à 20-250C, selon la sensibilité désirée, est suivie d'addition de 100 ul de réactif de bioluminescence ; la mesure de la luminescence est faite comme précédemment. 4. Dosage de testostérone + androsténédione Le dosage plasmatique nécessite l'extraction par éther de 1 ml de plasma ou l'utilisation d'une technique similaire d'extrac tion (colonne d'extrélut). Le dosage peut être réalise sur l'équivalent de 200 )11 de plasma selon le procédé précédent. Il faut toutefois uti liser, comme système d'aromatisation, une préparation dont l'activité 3 - hydroxystéroide déshydrogénase d'enzymes est inhibée par le 11&alpha;- bromoacétate de progestérone (afin de ne pas transformer la DHEA). L'inhibition est réalisée à 250C, à pH 7,9 par 10 mol/l de 11=bromoacétoxyprogestérone (ce dérivé a été synthétisé par esté- rification de la 11&alpha;-hydroxyprogestérone par le bromoacétate). La surcharge en sulfate de DHEA est remplacée par une surcharge en testostérone. La concentration en enzymes doit etre égale ou inférieure à 100vug/ml. L'inhibition est quasi complète après 2 heures d'incuba tion. L'excès de stéroïdes est enlevé par une chromatographie sur ré sine hydrophobe selon le procédé précédent. L'activité aromatase rési duelle mesurée avec la déhydroépiandrostérone doit être inférieure à 5 % de celle mesurée avec la- testostérone. 5. Dosage de la testostérone utilisant les anticorps antitestosterone : Le dosage fait appel à trois tubes, chacun contenant 50 l d'extrait sérique correspondant à 5 l de sérum. Le tube (1) correspond au témoin sérum et sera traité pendant 15 mn à 250C par 50 l d'anticorps antitestostérone. Le tube (2) recevra 50 l de tris. Le tube (3) 50 > ul de tris contenant 12 pg de testostérone. Après addition de 50 1 de tampon aromatase et 30 mn d'incubation à 37 C, on inactive l'aromatase; Puis on additionne 300 l de tampon transhydrogénase et incube 1 heure à 370C. Après addition de 100 l de réactif de bioluminescence les tubes sont lus séquentiellement. Les avantages du procédé de dosage selon l'invention sont les suivants Cette méthode, en utilisant à la fois l'amplification enzymatique et la bioluminescence, permet de réaliser des dosages spécifiques des oestrogènes et des androgènes avec une sensibilité supérieure aux méthodes radioimmunologiques (gain en sensibilité 10) et ne nécessite qu'un temps d'incubation relativement court De plus, cette méthode peut être automatisée facilement avec une instrumentation déjà existante Au niveau de la spécificité, elle permet de cumuler à la fois la spécificité de l'enzyme et-celle de l'anticorps. L'utilisation d'un standard interne évite les utilisations d'une courbe étalon et met en évidence les interférences dues aux milieux. REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage des oestrogènes et des androgènes présents dans les milieux biologiques, caractérisé en ce qu'il combine le procédé d'amplification enzymatique utilisant une réaction de transhydrogènation conduisant à l'accumulation de NADH, et le dosage du NADH formé par bioluminescence. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on associe la 17 ss - hydroxystéroïde déshydrogènase de placenta humain pour la réaction de transhydrogènation, à une NADH-FMN oxydoréductase et une luciférase extraites de microorganismes pour le dosage par bioluminescence, en présence des coenzymes et-aldéhyde nécessaires. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on utilise un réactif de transhydrogènation ou "tampon transhydrogènase" constitué par : - 10-2 à 10-5 mol/l de glucose-6-phosphate - 10 à 1000 unités/l de glucose-6-phosphate déshydrogènase - 10-2 à 10 mol/l de NAD - 10 5 à 10 10 mol/l de NADP 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à3, caractérisé en ce qu'on utilise un réactif de bioluminescence constitué par - 0,5 à 10 mg/l de FMN - 0,2 a 20iug/l d'une aldéhyde aliphatique telle que le décanal - 2 à 50 UI/l de NADH/FMN oxydoréduétase - 1 à 30 mg/l de luciférase de Beneckea Harveyi 5.Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on dose le couple oestradiol-oestrone dans le plasma sanguin ou l'urine en utilisant 3 tubes à essai contenant chacun l'Echan- tillon à doser et le tampon - transhydrogenase ; le tube 1 est le tube témoin et les tubes 2 et 3 reçoivent chacun de la 17ss-hydroxystéroïde- déshydrogènase ; le tube 3 reçoit, de plus, une surcharge connue d'oestradiol; après incubation des tubes de 10 mn à 2 heures, on ajoute à chaque tube le réactif de bioluminescence et mesure la luminescence sur 30 secondes ou 1 minute; on calcule la quantité d'oestradiol + oestrone dans l'échantillon en comparant les résultats obtenus pour l'échantillon (tube 2 - tube 1) aux résultats obtenus pour la surcharge (tube 3-tube 2) de concentration connue. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on dose spécifiquement l'oestradiol ou l'oestrone dans le plasma ou l'urine en traitant d'abord l'échantillon par un immunoadsorbant spécifique du stéroïde à doser, puis en dosant le sterolde par addition du réactif de transhydrogènase, incubation et dosage du NADH par bioluminescence. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on dose spécifiquement l'oestradiol dans le plasma ou l'urine en éliminant d'abord ltoestrone par réaction avec lthydrazine. 8. Procédé de dosage des androgènes selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'on convertit d'abord les androgè- nes en oestrogènes par action d'une enzyme extraite du placenta et qui présente des activités de sulfatase, de 3 ss-hydroxystéroïde-déshydrogè- nase, de#5, #4-cétostéroïde-isomérase et d'aromatase, et qu'on dose ensuite les oestrogènes, après avoir inactivé l'aromatase par chauffage ou traitement alcalin, par addition du réactif de transhydrogènase, incubation et dosage du NADH par bioluminescence. 9. Procédé de dosage du couple testostérone + androstèné- dione selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on utilise, pour la conversion des androgènes en oestrogènes, une préparation enzymatique dont l'activité 3 ss-hydroxystéroïde - déshydrogènase est inhibée par le 11-bromacétate de progestérone.