FR 2547500 A1 19841221 FR 8408312 A 19840528 La présente invention concerne une préparation pharmaceutique pour le traitement des ulcères du tube digestif, qui renferme comme constituant actif de l'acide désoxyribonucléique ou ses sels. Le nombre de personnes qui souffrent d'ulcères du tube digestif est en très nette augmentation du fait de la tension nerveuse accrue,provoquée par les complications de la vie sociale Une grande partie du mécanisme et de la pathophysiologie des ulcères des voies digestives n'est pas connue à ce jour, et il n'existe pas actuellement de procédé thérapeutique concluant pour le traitement de cette maladie. L'ulcère des voies digestives est présentement traité principalement par des moyens pharmacothérapeuti15 ques pour lesquels on utilise anti acides, agents antiseptiques, ou agents anticholinergiques, contre les facteurs attaquant le tube digestif, représentés par l'acide gastrique et la pepsine. D'autre part, il est admis que, dans un organis20 me vivant, le commencement de l'ulcère digestif peut être accompagné de la mise en jeu d'un mécanisme thérapeutique anti-ulcère, qui est considéré être une des facultés de protection attribuées aux organismes vivants L'idée de cette faculté de protection des organismes vivants est con25 sidérée maintenant avec intérêt, et quelques essais ont été menés pour stimuler cette faculté, et accélérer ainsi la thérapie de l'ulcère Des extraits de tissus animaux ou végétaux et des produits synthétiques ont été utilisés dans cette direction de travail Récemment, les espoirs se sont 30 particulièrement accrus pour les médicaments de ce domaine. Comme on utilise habituellement des préparations pharmaceutiques en combinaison pour le traitement des ulcères des voies digestives, il est souhaitable de rechercher un tel médicament ayant des caractéristiques d'action et des propriétés physiques différentes de celles des produits classiquement utilisés. En outre, se pose le problème des effets secondaires lorsque les médicaments sont administrés de manière prolongée afin d'empêcher la réapparition de l'ulcère digestif, qui présente un taux élevé de rechute. La plupart des effets pharmacologiques de l'acide nucléique, utilisé selon l'invention, sont inconnus, et presque rien n'a été tenté en ce qui concerne ses applications médicales La demanderesse s'est intéressée à ces ap10 plications médicales et a fait des recherches poussées qui ont confirmé que l'acide nucléique, et en particulier l'acide désoxyribonucléique, montrait un effet remarquable antitumeur du milieu hôte, ainsi qu'une excellente inocuité (demande de brevet japonais n 139096/1982). La présente invention est la conséquence d'une étude approfondie de la demanderesse sur la répartition, dans le corps, d'acide nucléique administré à un organisme vivant Il a été notamment constaté que l'acide nucléique se retrouvait à des concentrations relativement élevées 20 dans le tube digestif à proximité de l'estomac En outre, on a remarqué que l'acide nucléique accélère de façon remarquable la guérison de l'ulcère digestif Ces effets n'avaient pas été mentionnés dans l'art antérieur. La nouvelle préparation pharmaceutique selon l'in25 vention, destinée au traitement de l'ulcère du tube digestif, renferme comme constituant actif de l'acide nucléique ou ses sels, et en particulier de l'acide désoxy ribonucléique ou ses sels Dans une forme de réalisation préférée de l'invention, ces produits sont obtenus à partir de BCG. La nouvelle préparation pharmaceutique selon l'invention peut également renfermer comme constituant actif un mélange d'une proportion majeure d'acide désoxyribonucléique, ou d'un de ses sels, et d'une proportion mineure d'acide ribonucléique, ou d'un de ses sels,de préférence obtenu 35 à partir de BCG. L'acide nucléique,utilisable conformément à l'invention,comprend les acides préparés à partir de thymus de veau, de testicules de saumon, de microorganismes, ou d'autres produits naturels, parmi lesquels on préfère, pour leur inocuité, ceux qui ont déjà été utilisés pour les aliments ou les médicaments On peut également utiliser des acides nucléiques dits préparés artificiellement, qui sont obtenus par un procédé chimique ou biochimique Ils sont représentés par l'acide désoxyribonucléique, l'acide ribo10 nucléique, leurs mélanges, ou des fractions les renfermant. Il convient que les propriétés pharmacologiques et physicochimiques de chaque acide nucléique soient compatibles avec l'objet de la présente invention, et que la quantité d'impuretés qui peuvent entraîner de la fièvre ou d'autres ef15 fets secondaires, renfermées dans cet acide nucléique, soit aussi faible que possible Ces acides nucléiques peuvent âtre ensuite soumis à un chauffage, un traitement alcalin ou autres traitements physicochimiques, à un traitement par nucléase ou à d'autres traitements biochimiques, les rendant 20 plus aptes à entrer dans une préparation pharmaceutique Le traitement par la chaleur est particulièrement préféré en raison de la facilité de l'opération L'objet de ces traitements est d'améliorer l'action de l'acide nucléique en tant que constituant actif de la préparation pharmaceuti25 que selon l'invention, de faciliter la préparation, et de plus d'élever la solubilité de l'acide nucléique en vue de son administration. Ces traitements, toutefois, ne sont pas indispensables pour réaliser l'objet de la présente invention. Le procédé de préparation de l'acide nucléique est décrit dans les exemples de référence suivants. EXEMPLE DE REFERENCE 1 Préparation d'acide nucléique dérivé du BCG On cultive pendant 3 semaines à 370 C, de manière statique, sur un milieu glycérine d'extrait de viande, Myco- bacterium boris BCG, ATCC 19015, et l'on centrifuge le milieu de culture pour obtenir des bacilles contenant de l'eau 3,3 kg de ces bacilles sont mis en suspension dans une quantité 7 fois plus élevée de solution tampon de phos5 phate 10 m M (p H 7), et sont dilacérés, sous refroidissement, par de la glace avec un DINO-MILL (nom de marque), avant d'être centrifugés à 20 000 x g pendant 20 minutes, ce qui donne 21 litres d'extrait cellulaire. On ajoute à cet extrait 63-g de sulfate de streptomycine, on mélange par une agitation suffisante, et on abandonne le tout une nuit durant à 4 C; on sépare alors le précipité formé par centrifugation, et on le met en suspension dans un tampon phosphate 10 m 4 (p H 7) renfermant 0,5 M de Na Cl. On dialyse cette suspension contre le même tampon, puis con15 tre de l'eau distillée, pour obtenir 8 litres de suspension contenant de l'acide nucléique. A 1 litre de cette suspension est ajoutée une quantité égale de Na Cl à-1, 8 %, et le mélange est réalisé sous agitation et chauffé à 100 C pendant 60 minutes Après refroidissement, 20 cette suspension est centrifugée à 10 000 x g pendant 20 minutes, et l'on sépare la partie surnageante, à laquelle on ajoute du Na Cl,de manière à ce que sa concentration finale soit de 0,4 M, on agite, et l'on ajoute en outre à la solution du bromure de céthyl triméthyl ammonium (fabriqué par Tokyo Kasei Kogyo) en quantité telle que sa concentration finale soit de 0,2 % (poids/volume), on mélange par agitation suffisante, et on abandonne à température ambiante pendant 30 minutes Le précipité formé est recueilli par centrifugation, et il est dissous dans 400 ml de Na Cl 1 M. On ajoute à cette solution une quantité égale d'un mélange (dans la proportion de 24/1) de chloroforme et d'alcool isoamylique, on secoue, et centrifuge afin de séparer la phase aqueuse On répète cette opération à deux reprises, puis on ajoute à la phase aqueuse ainsi obtenue, trois fois sa quan35 tité d'éthanol à 99,5 %, on mélange par agitation et abandon- ne une nuit durant à 4 C Les précipités formés sont recueillis par centrifugation, dissous dans de l'eau distillée, dialysés contre de l'eau distillée et séchés par congélation, pour donner 1,04 g d'acide nucléique dérivé du 5 BCG L'acide nucléique ainsi obtenu comprend 70 % d'acide désoxyribonucléique, 28 % d'acide ribonucléique, et des traces d'autres constituants Après fractionnement de ces acides, (voir W C Schneider J Biol Chem 164, 747 ( 1946), on les soumet à un dosage quantitatif L'acide désoxyribo10 nucléique est dosé par le procédé à la diphényl amine lvoir K Burton, Biochem J 62, 3, 5 ( 1956)l avec comme étalon de l'acide désoxyribonucléique de thymus de veau, et l'acide ribonucléique est dosé par le procédé à l'orcinol lvoir W. Mejbaum, Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem 258, 117 ( 1939)l 15 avec comme étalon de l'acide ribonucléique de levure. Les dosages sont réalisés de manière identique dans les exemples suivants. EXEMPLE DE REFERENCE 2 Préparation d'acide nucléique dérivé de Bacillus Le Bacillus subtilis, ATCC 6633, est cultivé sous agitation, pendant 6 heures à 37 C, sur un milieu de peptone, puis le milieu de culture est centrifugé pour donner des bacilles contenant de l'eau 98 g de ces bacilles sont mis en suspension dans 100 ml d'un tampon phosphate (p H 7), 25 et l'on prépare une solution d'acide nucléique dérivé de Bacillus, de manière identique à celle qui est décrite dans l'exemple de référence 1 La solution ainsi obtenue est neutralisée avec Na OH 1 N, et séchée par congélation, pour donner 158 mg d'échantillon sec On en dissout 90 mg dans 10 30 ml de tampon acétate 0,05 M (p H 4,5), auxquels on ajoute U de ribonucléase T 2 (fabriquée par Sankyo) dissoutes dans 2 ml de ce tampon, et l'on met à incuber à 37 C pendant 22 heures. Une quantité égale de mélange (dans la proportion de 24/1) 35 de chloroforme et d'alcool isoamylique, est ajoutée au li- quide réactionnel, et le tout est secoué et centrifugé afin de séparer la phase aqueuse Après répétition de cette opération, on charge la totalité de la couche aqueuse sur une colonne ( 2,5 x 90 cm) de Sephadex G-100 (fabriqué par Phar5 macia Fine Chemicals, Inc) préalablement mise en équilibre avec un bicarbonate d'ammonium 0,5 M, et on élue avec cette solution La fraction renfermant l'acide désoxyribonucléique, qui est éluée en premier, est dialysée contre de l'eau distillée Le dialysat est neutralisé avec Na OH 1 N, 10 et séché par congélation, ce qui donne 72 mg de sel de sodium d'acide nucléique dérivé du Bacillus L'acide nucléique,ainsi obtenu, renferme principalement de l'acide désoxyribonucléique. EXEMPLE DE REFERENCE 3 L'acide nucléique dérivé du BCG, obtenu dans l'exemple de référence 1, est digéré avec de la ribonucléase (fabriquée par Sigma Corp), puis avec de la pronase, et est alors secoué avec du chloroforme, afin de le déprotéiner La phase aqueuse de cet acide nucléique déprotéiné est 20 purifiée par fractionnement à l'aide d'une colonne de Sepharose CL 6 B (fabriqué par Pharmacia Fine Chemicals, Inc) en vue de son utilisation dans les essais La teneur en acide désoxyribonucléique, de l'acide nucléique ainsi obtenu, n'est pas inférieure à 98 %. 25 EXEMPLE DE REFERENCE 4 On fait digérer l'acide nucléique obtenu dans l'exemple de référence 1, par de la désoxyribonucléase 1 (fabriquée par Worthington Corp), et l'on secoue avec du chloroforme afin de réaliser la déprotéination La phase aqueu30 se de l'acide nucléique déprotéiné est utilisée dans les essais, après avoir été soumise à une purification par fractionnement à l'aide d'une colonne de Sephadex G-50 (fabriqué par Pharmacia Corp) La teneur en acide ribonucléique, de l'acide nucléique ainsi obtenu, n'est pas inférieure 35 à 98 %. Ainsi qu'il ressort des résultats des essais reportés ci-dessous, l'accélération du traitement de l'ulcère passe pour être l'un des effets pharmacologiques de l'acide nucléique De plus, comme indiqué dans les essais 1 et 3, cette accélération du traitement de l'ulcère,grâce à l'acide nucléique, est redevable principalement à l'acide désoxyribonucléique, car,lorsqu'on administre seul l'acide ribonucléique, les effets obtenus sont moins remarquables que lorsqu'on administre uniquement de l'acide désoxyribo10 nucléique Toutefois, il est à remarquer que l'incorporation d'une quantité appropriée d'acide ribonucléique à l'acide désoxyribonucléique entraîne un effet légèrement supérieur à celui que l'on obtient lors de l'utilisation de l'un de ces deux produits. La préparation pharmaceutique selon la présente invention exerce un effet remarquable lors du traitement de l'ulcère provoqué par l'acide acétique, chez le rat, ulcère considéré comme étant de structure morphologiquement similaire à celle de l'ulcère humain De plus, il est compris 20 que la dose efficace de préparation s'étend sur un large intervalle. La préparation pharmaceutique pour ulcère du tube digestif, selon la présente invention, présente une toxicité aiguë extrêmement faible, et est sans risque du point de 25 vue antigène Les résultats des essais ont confirmé que l'effet pyrogène, la douleur, les propriétés prophlogistiques ou d'autres troubles sont si légers que l'on peut les négliger lors d'une application ordinaire comme médicament. Ainsi qu'il est décrit plus haut, comme la prépa30 ration pharmaceutique selon la présente invention agit également comme tumoricide, elle convient pour le traitement des cas d'ulcère digestif, par exemple d'ulcère gastrique qui se développe en précancer ou ultérieurement en cancer gastrique. La préparation pharmaceutique pour ulcère du tube $ digestif, selon l'invention, peut être appliquée isolément ou en combinaison avec des excipients ou additifs habituellement utilisés Le dosage, le procédé et la voie d'administration sont choisis selon les cas En général, il est judicieux d'administrer 0,001 à 100 mg de produit à la fois, à un intervalle de 1 à 7 jours La voie d'administration peut être intradermique, hypodermique, intramusculaire, intraveineuse, orale, ou bien administration directe au siège de la maladie. La présente invention sera mieux comprise grâce aux exemples non limitatifs suivants, et son caractère général est expliqué par les résultats des essais reportés cidessous. EXEMPLE 1 Préparations liquides mg d'acide nucléique dérivé de BCG, obtenu dans l'exemple de référence 1, sont dissous dans 100 ml de solution saline tamponnée de phosphate (fabriquée par Nissui Seiyaku Co.), et l'on filtre dans des conditions stériles, au moyen 20 d'un filtre Nuclepore ( 0,2 Hm; fabriqué par Nuclepore Corp) Des fractions de 1,5 ml du filtrat obtenu sont versées dans des fioles, dans des conditions stériles, afin de produire la préparation liquide selon l'invention. EXEMPLE 2 Préparations lyophilisées On dissout dans 100 ml d'eau distillée pour injection, 100 mg d'acide nucléique dérivé de BCG, et on y ajoute 5 g de mannitol qui s'y dissolvent, puis on filtre dans des conditions stériles au moyen d'un filtre Nucleopore ( 0,2 gm). Après avoir versé des fractions de 1 ml du filtrat obtenu, dans des fioles, dans des conditions stériles, on sèche par congélation la solution, ce qui donne la préparation lyophilisée selon l'invention. ESSAI 1 Effet de l'acide nucléique sur l'ulcère à l'acide acétique L'ulcère à l'acide acétique, qui est le type de l'ulcère chronique du rat, est provoqué dans les estomacs de rats Wistar mâles, conformément au procédé de Okabe et coll. Z Amer J Dig Dis Vol 16, 277 ( 1971)l, afin d'examiner l'efficacité de divers acides nucléiques Les acides nucléiques, dissous dans une solution physiologique, sont administrés par voie hypodermique dans les dos des rats, à 6 repri10 ses, un jour sur deux, à partir du jour qui suit l'opération Les estomacs sont prélevés le jour qui suit la dernière administration (le douzième jour après l'opération) et sont légèrement fixés avec de la formaline, et l'on mesure les diamètres les plus grands et les plus petits des surfa15 ces ulcérées L'indice d'ulcération et le taux de guérison sont calculés à partir des formules suivantes: Indice d'ulcération (mm 2) = diamètre le plus grand (mm) x diamètre le plus petit (mm) Taux de guérison (%) Indice d'ulcération des Indice d'ulcération des animaux témoins animaux traités x 100 Indice d'ulcération des animaux témoins Les résultats sont indiqués dans le Tableau 1 à la page 12. ESSAI 2 A Effet de l'acide nucléique dérivé de BCG sur l'ulcère à l'acide acétique (première partie) On examine, comme dans l'essai 1, l'effet de l'acide nucléi30 que dérivé de BCG, obtenu dans l'exemple de référence 1 Les résultats sont reportés dans le Tableau 2 à la page 13. ESSAI 2 B Effet de l'acide nucléique dérivé de BCG sur l'ulcère à l'acide acétique (seconde partie) On opère comme dans l'essai 1 pour déterminer l'effet de l'a- cide nucléique dérivé de BCG, obtenu dans l'exemple de référence 1, et l'effet de l'acide désoxyribonucléique et celui de l'acide ribonucléique, séparés de cet acide nucléique dérivé de BCG Les résultats sont reportés dans le Tableau 3 à la page 14. ESSAI 3 A Toxicité aiguë de l'acide nucléique dérivé du BCG L'acide nucléique dérivé de BCG, dissous dans une solution de sérum physiologique, est administré par voie intravei10 neuse à raison de 1 g/kg de poids du corps, à des souris mâles dd Y âgées de 5 semaines, et divisées en groupes de animaux chaque (poids moyen 23 g) Au cours de la période d'une semaine qui suit l'administration, on n'observe pas d'empêchement à l'augmentation de poids, ni de décès. Il ressort de ces résultats que la dose léthale à 50 % (DL 50) de la présente substance administrée par voie intraveineuse, n'est pas inférieure à 1 g/kg. ESSAI 3 B Toxicité aigu de l'acide désoxyribonucléique dérivé de BCG 20 La toxicité aigue de l'acide désoxyribonucléique dérivé de BCG, utilisé dans l'essai 2 B, est examinée selon le mode opératoire de l'essai 3 A I 1 ressort du résultat de cet essai que la DL 50 de la présente substance administrée par voie intraveineuse, n'est pas inférieure à 1 kg/kg. 25 ESSAI 4 A Essai de capacité antigène de l'acide nucléique dérivé de BCG L'acide nucléique dérivé de BCG obtenu dans l'exemple de référence 1, dissous dans du sérum physiologique, est adminis30 tré par voie intradermique à raison de 1 mg par animal, à des femelles cobayes Hartley qui ont été réparties en groupes de six animaux chaque (poids moyen 350 g), à 6 reprises ( 3 fois par semaine) en vue de les sensibiliser Deux semaines après la sensibilisation finale, on administre par 35 voie intraveineuse le même acide nucléique dérivé de BCG, dissous dans du sérum physiologique, à raison de 10 mg ou 2 mg/kg de poids du corps Il ressort de l'examen de la capacité antigène de la présente substance, par l'observation du comportement des cobayes aux attaques environnan5 tes, qu'il n'induit pas de choc anaphylactique à la dose ci-dessus. ESSAI 4 B Essai de capacité antigène de l'acide désoxyribonucléique dérivé de BCG On opère comme dans l'essai 4 A, avec l'acide désoxyribonucléique utilisé dans l'essai 2 B Il ressort de cet essai que la présente substance n'induit pas de choc anaphylactique. TABLEAU 1 Echantillon Quantité Nombre Indice d'ul Taux de guérison administrée d'animaux ération (moyenen une dose ne + SE:mm 2)(%) (ig) Témoin (a) 8 19, 43,3 ADN dérivé d'E coli (b) 200 7 14,0-3,5 28 AN dérivé de Bacillus (c) 200 7 12,9 2,6 33 ADN dérivé de testicules + 19 de saumon (d) 200 7 15, 8-3,9 ADN dérivé de thymus de + veau (e) 200 7 17,1-3,1 12 ARN dérivé de levure de + boulanger (f) 200 7 16,5-3,8 15 (a) Administré seul avec une solution physiologique. (b) On utilise l'acide nucléique préparé à partir d'E Coli K-12, selon le procédé de J.Marmur lvoir J Mol Biol Vol 3, 208 ( 1961)J (c) On utilise l'acide nucléique dérivé du Bacillus, obtenu dans l'exemple de référence 2. (d) On utilise de l'ADN de testicules de saumon (Type III, fabriqué par Sigma Corp) (e) On utilise de l'ADN de thymus de veau (Type I, fabriqué par Sigma Corp) (f) On utilise de l'ARN de levure de boulanger (Type III, fabriqué par Sigma Corp). r.1 U'I Lni 0 CD TABLEAU 2 Quantité administrée en une dose (ag) Nombre d'animaux Indice d'ulcération (moyenne+ SE:mm 2 (moyenne SE:mm Taux de guérison (%) 200 2000 11 1 1 10 12 ,7 9,3 9,0 9,4 1,7 1,6 * 1,9 * + 2,4 ** 41 43 40 W * p TABLEAU 3 I.1 i Echantillon Témoin (a) AN dérivé de BCG ADN dérivé de BCG (b) ARN dérivé de BCG (c) Quantité administrée en une dose (gg) 100 100 Nombre d'animaux 12 12 12 12 ,4 T 1,8 8,9 1,3 ** 10,6 + 1,4 ** 13,2 2,5 Indice d'ulcération (moyenne SE:mm 2) Taux de guérison (%) 42 31 I a ______________________ I 'I 1 ** P (a) Administré avec 5 % de mannitol. (b) Obtenu dans l'exemple de référence 3. (c) Obtenu dans l'exemple de référence 4. Ln 4 ut o Lo Revendications 1 Préparation pharmaceutique contre l'ulcère du tube digestif, caractérisée en ce qu'elle contient, en tant qu' ingrédient actif, de l'acide désoxyribonucléique ou un sel de cet acide. 2 Préparation pharmaceutique suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient un mélange d'acides désoxyribonucléique et ribonucléique ou des sels de ces acides. 3 Préparation suivant la revendication 2, caractérisée 10 en ce que le mélange comprend en majeure partie l'acide désoxyribonucléique ou un sel de cet acide. 4 Préparation suivant une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les acides désoxyribonucléique et ribonucléique ont été obtenus à partir du BCG. 5 Préparation suivant la revendication 4, caractérisée en ce qu'avant d'y être employés les acides désoxyribonucléique et ribonucléique, obtenus à partir du BCG, ont été d'abord déprotéinés. 6 Procédé d'obtention d'une préparation suivant la re20 vendication 5, caractérisé en ce que les dits acides sont déprotéinés par agitation avec du chloroforme.