FR 2541308 A1 19840824 FR 8320999 A 19831229 L'invention concerne es hydrolysats de protéines dépourvus de goilt amer, obtenus par hydrolyse enzymatique de protéines dont l'hydrolyse, d'après l'expérience actuelle, donne ds produits d'hydrolyse à goût amer. Les protéines dont on dispose dans l'industrie exigent fréquemment, pour leur utilisation, une attaque par hydrolyse. L'hydrolyse conduit en général à une dégradation des molécules de protéines en peptides plus petits, et éventuellement en aminoacides. On décrira maintenant, en référence à l'exemple de la caséine, certains problèmes rencontrés dans la valorisation des protéines; en effet, la caséine est une matière première de valeur, par exemple pour l'alimentation. La caséine, protéine à l'état non modifié, est très peu soluble, par exemple dans l'intervalle de pH de 4 à 5 rencontré la plupart du temps dans les boissons et les desserts à base de fruits. Par suite, la protéine flocule, ce qui d'une part affecte l'aspect des boissons et d'autre part, en raison de la rupture des masses levées, affecte la qualité des desserts; en outre, elle provoque un gott sableux dé- sagréable. Du fait que les produits d'hydrolyse des protéines sont en général plus solubles en milieu acide, on pense évidemment à la dégradation par hydrolyse, en particulier à la dégradation enzymatique des protéines. Naturellement, les propriétés d'un hydrolysat de protéines, en dehors de la composition en aminoacides, dépendent encore du degré de dégradation. Le pourcentage de liaisons peptidiques ouvertes à l'opération de dégradation constitue par exemple une mesure de degré de dégradation (D.H.= degré d'hy- drolyse). En première approximation, pour une protéine déterminée et pour une enzyme protéolytique déterminée, les propriétés de l'hydrolysat de protéines sont déterminées par la valeur du DH, qu'on peut mesurer par la cohsommation de lessive alcaline à pH constant au cours de l'hydrolyse. L'un des plus gros obstacles rencontrés pour la valorisation des hydrolysats de protéines dans la nutrition, en particulier dans la nutrition humaine, réside dans le goût. Normalement, le goût d'une protéine pure est assez neutre (le goût associé actuellement à une protéine dgune origine déterminée est dû en général à des substances aromatiques de nature non protéique. Lorsque c'est nécessaire, on peut éliminer ces substances aromatiques pour permettre une utilisation plus générale des hydrolysats de protéines). Toutefois, les difficultés sérieuses commencent au goût amer de nombreux hydrolysats de protéines. Le goût amer intense des hydrolysats de protéines ne peut pratiquement pas être mas qué dans les produits alimentaires prévus pour le consommateur. En fait, jusqu'à maintenant, cette amertume a constitué un obstacle à une utilisation extensive de ces hydrolysats de protéines dans l'alimentation. Dans la demande de brevet de la RFA DOS 3*003.679, on indique, au sujet de ce problème, qu'il existe des indications que la cause du goût amer est en relation avec le substrat de protéine ne et non avec les enzymes utilisées. Certaines protéines comme la caséine donneraient presque exclusivement des hydrolysats à gout amer alors que,par contre, la gélatine traitée de manière analogue et avec les memes enzymes donne des hydrolysats dont le goût est au maximum légèrement amer. Dans la demande de brevet en question, on appelle "point d'amertume" ("Bitterpunkt") la teneur en hydrolysat soluble de protéine (en % de la protéine initiale) à laquelle on constate pour la première fois un goût amer à la dégustation.Jusqu a maintenant, le problème du goût amer des hydrolysats a été rencontré principalement avec la caséine et les protéines de soja, de céréales et de mals; toutefois, même après des études approfondies, on n'a pas trouvé d'autres sources de protéines. Dans la demande de brevet de la RFA précitée, on propose un procédé de préparation d'hydrolysats de substrats de protéines appropriés à la nutrition par hydrolyse à l'aide d'enzymes protéolytiques dans lequel, avec les enzymes protéolytiques, on utilise des hydrates de carbone solubles dans l'eau et/ou fortement gonflables dans l'eau. En ajoutant ces hydrates de carbone aux mélan- ges de réaction enzymatiques on peut dégrader les protéines en hydrolysats qui, jusqu'à un fort degré de dégradation hydrolytique, n'ont pas le goût amer ou n'ont au maximum qu'un goût amer négligeable. Le procédé de la technique antérieure exige donc l'addition de substances non protéiques, ce qui n'est pas toujours désirable. Il existe donc un besoin en un procédé de préparation d'hydrolysats de protéines sans goût amer à partir des protéines qui, soumises à une hydrolyse enzymatique non.modifiée, donnent des produits à goût amer. Ce but a été atteint dans le procédé selon l'invention pour l'hydrolyse enzymatique modifiée des substrats de protéines dont la dégradation enzymatique non modifiée à un degré de degré dation dépassant 3% des liaisons peptidiques delamolécule donne des produits d'hydrolyse à goût amer, jusqu'à un degré de dégradation hydrolytique d'au moins 5% des liaisons peptidiques de la molécule sans formation de produits d'hydrolyse à goût amer, ce procédé se caractérisant en ce que l'on effectue l'hydrolyse enzymatique des substrats de protéines à l'aide de protéases fixées sur des supports. On peut considérer comme particulièrement surprenant que des protéases fixées sur supports permettent de dégrader les substrats de protéines à un degré d'hydrolyse (degré de dégradation) dépassant le point d'amertume rencontré à la dégradation enzymatique normale éventuellement avec la même enzyme mais non fixée sur support, sans trouver, dans les produits d'hydrolyse obtenus le goût amer attendu.Le "point d'amertume" dans le cadre de la présente demande est défini par la teneur en hydrolysat soluble de protéine, en % de la protéine initiale, à laquelle on constate pour la première fois à la dégustation le goût amer Bien que, lors d'une dégustation indivi-luelle, il puisse se produire des variations dans la sensation d'amertume, l'expérience a montré que lorsqu'on opérait avec un groupe comportant un nombre suffi- sant d'individus (par exemple plus de 5 dégustateurs) on arrivait à une valeur moyenne tout à fait fiable de la sensation d'amertume. La dégustation dans des buts de comparaison doit être effectuée par les mêmes individus, autant que possible dans une situation comparable. On utilise comme mesure du degré de dégradation le pour- centage des liaisons peptidiques coupes à l'opération de dégradation (DH = degré d'hydrolyse). En première approximation, pour une protéine déterminée et une protéase déterminée, les proprio tés de llhydrolysat de protéine sont déterminées par la valeur de DH, laquelle peut être mesurée par la consommation de lessive de soude au cours de l'hydrolyse à pH constant.Naturellement, on peut déterminer le degré d'hydrolyse et ses résultats concer- nant la composition et le poids moléculaire des produits formés par les diverses techniques d'analyse mises au point dans la chimie des protéines (en particulier les techniques chromatographi ques, l'électrophorèse, l'ultracentrifugation entre autres)* Parmi les substrats de protéines qui, dans une dEgradae tion par hydrolyse profonde, donnent des hydrolysats à goût amer, on mentionnera en premier lieu la caséine mais également les pro téines de soja, de céréales et de mais (des études approfondies ont fait apparaître la même situation pour d'autres protéines d'autres origines)O Le procédé selon l'invention permet par exemple de porter le degré de dégl^adation de la caséine à plus de 3%, par exemple à plus de 5% (par rapport à toutes les liaisons peptidiques ou liaisons amides existant dans la protéine initiale) sans apparition de goût amer dans les produits En général, mEme à un de gré de dégradation de 15% par rapport aux liaisons peptidiques de la protéine initiale, les produits obtenus n'ont pas le goût amer. Le succès auquel on est parvenu par le procédé selon l'invention semble avoir pour cause l'utilisation de protéases fixées sur des supports, en particulier des enzymes fixées par des liaisons covaléntes. On utilise de préférence des protéases fongiques dans des conditions correspondant à leurs propriétés (connues) d'activité et de stabilité On apprécie tout particulièrement les protéases fongiques du genre Aspergillus. Les enzymes ayant les désignations caractéristiques E.C. 3.4.21.15. et 3.4.24.4. conviennent; les enzymes semblent convenir spéciale ment lorsque les activités âptimales se situent en milieux neutre et alcalin. Les représentants de l'espèce Aspergillus flavusoryzae ont un intérêt spécial.Dans une position intermé- diaire, on trouve la protéase fongique obtenue à partir du sous- groupe Aspergillus sojae, groupe A. Oryzae, par exemple l'enzyme existant dans le commerce sous la marque Corolase PN , ou des préparations obtenues à partir de cultures d'Aspergillus melleus. Les renseignements suivants peuvent servir à une caractérisa- tion plus précise. La Corolase PN est un produit contenant une unité d'enzyme active en pu neutre et une unité d'enzyme active en pH alcalin. L'activité optimale de l'enzyme a l'égard de la caséine servant de substrat se situe à pH 7 à 9; à l'égard de lthemoglobine, elle est à pH 6, optimum secondaire 8. On a trouvé 500C pour la température d'activité optimale de l'enzyme libre. La stabilité optimale est entre pH 6 et 8. Le point isoélectrique de l'enzyme est à pH 4,5-5. L'enzyme peut être inhibée, en partie au moins, par les agents complexants tels que 1'EDTA, des produits réactifs avec les groupes OH comme le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) ou des substances tensio-actives comme le laurylsulfate de sodium entre autres Pour une caractérisation plus complète, on peut exploiter le cas échéant les activités secondaires consistant en l'activité amyliasique, eellulasique, pentosanasique ee galactomannanasique. Pour les enzymes particulièrement intéressantes conformoment à l'invention, on trouve en général un rapport de 0,5:1 à 1,5:1 entre "l'activité à pH 5 et l'activité à pH 8 (avec l'hé- moglobine comme substrat)". Conformément à l'invention, les protéases à utiliser conformément à l'invention, et en particulier la Corolase PN, sont des enzymes fixées sur des supports. On peut utiliser en tant que matières de support les types de supports connus pour les enzymes immobilisées (cftO. Zaborsky 11Immobilzed Enzymes11, Chemical Rubber Corporation Press, Cleveland, Ohio, 1973). On mentionnera d'une part les matières de support minérales fortement poreuses, par exemple le verre, la bentonite entre autres, et les supports organiques polymères poreux. A cet égard, on peut utiliser comme supports aussi bien des polymères purement synthétiques comme le polyacrylamide réticulé et ses dérivés, le polystyrène, les acrylates et méthacryo lates polymères, les copolymères éthylène-anhydride maléique, des polypeptides, le Nylon, que des polymères semi-synthétiques, des substances naturelles et substances naturelles modifiées comme la cellulose, la chitine, l'acide alginique, le collodion, le dextrane, l'agarose, l'amidon, le produit du commerce Sephadex, la kératine, le collagène. Parmi les groupes réactifs pouvant servir à l'immobilisation, on signalera ceux qui sont cités dans Ullmanns Enzyklopä- die der Technischen Chemie, 4eme édition, volume 10, Chemie, page 540. On préfère les groupes oxirannes. On préfère tout particulièrement les supports polymères à base d'acrylates, en particulier les perles de résines acryllques. On pourra trouver des renseignements sur la préparation et les manipulations des perles de résines acryliques utilisables conformément à l'invention dans le brevet britannique n" 1.329.062, la demande de brevet de la RFA DOS 2.237.316, le brevet des Etats-Unis n - 4.070.348 et le brevet de la RFA n" 2.722.751. On mentionnera en particulier les enzymes fixées sur les produits du commerce Eupergit C et Plexazym O (de la firme Rohm GmbH, Darmstadt), et spécialement la Corolase PN fixée sur ces produits. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre selon les modes opératoires usuels pour les réactions d'hydrolyse effectuées avec des enzymes fixées sur supports. Ainsi, on utilise avantageusement la matière de support en association avec une colonne : la solution du substrat à hydrolyser est jetée sur la colonne garnie du support polymère. Les solutions de substrats contiennent en général de 5 à 15% en poids de substrat. On mentionnera par exemple à titre de directive une solution à 5% en poids, par exemple une solution de caséinate. En première approximation, le pH dépend des caractéistiques de 1'enzyme et on peut admettre une certaine souplesse à l'égard du pH. Lorsqu'on utilise l'enzyme Corolase PN, un intervalle de pH de 6 à 9 convient. A l'égard des températures également, et selon les caractéristiques de l'enzyme, on peut se permettre des variations dans un certain intervalle, par exemple l'intervalle allant de la température ambiante à 600C. Ainsi, la Corolase PN fixée sur support peut être utilisée dans l'intervalle de 20 à 600C. Lorsqu'on utilise des colonnes, on a une certaine possibilité d'action sur le déroulement de l'hydrolyse en agissant sur le débit d'écoulement (durée de passage). Ainsi par exemple, on peut sans grande difficultés poursuivre l'hydrolyse tant qu'il ne se forme pas de produits à goût amer. Avec une solution de caséinate-en tant que substrat et de la Corolase PN fixée sur support en tant que protéase, on obtient encore des hydrolysats de caséine sans goût amer à des degrés d'hydrolyse allant jus qu'à 15% par exemple. Ce résultat est tout-à-fait surprenant car lorsqu'on utilise 19 Corolase PN libre dans des conditions par ailleurs identiques, on obtient des peptides à goût amer à partir d'un degré d'hydrolyse de 320 On ne connait pas exactement les raisons de ces résultats. Toutefois, on pourrait trouver une indication dans le fait, confirmé par l'expérience, que les produits d'hydrolyse préparés par le procédé selon l'invention à l'aide de protéases fixées sur supports ne contiennent pas ou ne contiennent que des petites proportions de peptides ayant des poids moléculaires de 1.000 à 6.000 Dalton. Par suite, toute la question est de diriger les conditions de réaction de manière à réduire au minimum la proportion des peptides dans cet intervalle de poids molécu- laire. Pour charger le support de l'enzyme active selon l'invention, on peut opérer de manière connue en soi, par exemple en faisant réagir avec les parles de verre acrylique (portant des groupes oxiranne) par exemple du type Eupergit C de la firme Röhm GmbH. On lave ensuite de manière connue en soi, par exemple à l'aide d'eau distillées puis avec une solution dQelectro- lyte (inerte), par exemple une solution de chlorure de sodium a 5%. Les enzymes sur supports ainsi obtenues sont utilisables directement. En général, on utilise une solution de substrat à une teneur de 1 à 20% en poids, par exemple une solution aqueuse de caséinate. La durée de passage moyenne de la solution de substrat peut aller de 1 à 100 mn, de préférence de 5 à 10 mn Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans tou- tefois en limiter la portée; dans ces exemples, les indications de parties et de % s'éntendent en poids sauf mention contraire. EXEMPLE 1. On dissout 100 g de protéase fongique dDA EXEMPLE 2. Dans une colonne à double paroi (60 C), on hydrolyse une solution de caséinate de sodium à 5% pompée en continu dans la colonne par 5 g de protéase fongique immobiliseeO Le débit est de 24 ml/h. Le degré d'hydrolyse est de 16%. On ne trouve pas de goût amer. EXEMPLE 3 On hydrolyse une solution de caséinate de sodium à 5% à un débit de 18 ml/h, comme décrit ci-dessus, par 10 g de protéase fongique immobilisée. Le degré d'hydrolyse est de 37%. On constate un goût amer. EXEMPLE 4. (exemple comparatif, avec enzyme libre) On soumet 300 ml d'une solution de caséinate de sodium à 5% à incubation de 30 mn avec 300 mg de Corolase PN (cf,ex.l) (température t 60oc). Qn arrête la réaction par une ébullition de 10 mn de la solution de substrat au bain-marie, Le degré d'hydrolyse est de16%, Le goût amer est très marqué, EXEMPLE 5. Une séparation des hydrolysats des exemples 2 et 4 sur Sephadex G15, G 25 et G 50 fait apparaître des différences Lm- portantes dans la taille moléculaire des fragments entre l'hydro- lysat obtenu avec l'enzyme libre et l'hydrolysat obtenu avec l'enzyme immobilisée.Dans l'hydrolysat dépourvu de goût amer, il n'y a pas de fragments de poids moléculaire 1.000 à 6,000 environ. Le degré d'hydrolyse a été déterminé par titrage au formol, mode opératoire modifié d'après "Methods in Enzyrology'2 yolume III, 457 (Academic Press Inc, New-York 1957). Ce mode opératoire est le suivant On pipette un échantillon de 5 ml dans un bécher de 100 ml et on règle à pH 7,4. Après addition de 5 ml de solution de formaldéhyde à 408 neutralisée, on titre à pH 8,3 par de la lessive de soude 0,01 N. Hydrolyse acide on fond dans des tubes scellés 100, 300 et 500 mg de caséinate de sodium de la firme De Melkindustrie Veghel BV, Hollande, avec 10 ml d'HCl 3N et on maintient pendant 17 heures à l'étuve à 1210C. Après refroidissement à température ambiante, on titre au formaldéhyde 0,5 mî de l'hydrolysat acide, Essai à blanc on procède également à un titrage par le formaldéhyde sur 5 ml de la solution de caséinate de sodium à 5%, Calcul Hydrolyse acide Pour 0,5 ml (= 5 mg de caséinate de sodium) il a fallu 3,47 ml de NaOH O,OlN9 c'est-à-dire que 100 mg de caséinate de sodium consomment 69,40 ml. Essai à blanc Pour 5 ml (=250 mg de caséinate de sodium), il a fallu 15,00 ml de NaOH O,OlN, c'est- -dire que 100 mg de caséinate de sodium consomment 6,00 ml. Si l'on admet qu'à l'hydrolyse acide, 1 caséinate de sodium est entièrement dégradée., on trouve, auprès déduction de la valeur obtenue à 11 essai à blanc, une consommation de lessive de soude de 63,40 ml de NaOH O,O1N pour l'hydrolyse totale de 100 mg de caséinate de sodium On peut en déduire par le calcul le degré de dégradation des hydrolysats comparativement au caséinate de sodium hydrolysé à l'acide. - REVENDICATIONS 1.- Procédé pour l'hydrolyse enzymatique modifiée de substrats de protéines dont la dégradation enzymatique non modifiée à un degré de dégradation supérieur à 3% des liaisons peptidiques de la molécule donne des produits d'hydrolyse à goût amer, jusqu'à un degré de dégradation hydrolytique d'au moins 5% des liaisons peptidiques de la molécule sans formation de produits d'hydrolyse à goût amer, caractérisé-en ce que l'on procède à l'hydrolyse enzymatique des substrats de protéines à l'aide de protéases fixées sur supports 2. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on procede à l'hydrolyse enzymatique des substrats de protéines jusqu'S un degré de dégradation hydrolytique de 15% -des liaisons peptidiques de la molécule 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caracteri sé en ce que l'on utilise en tant que substrat de la caséine et/ou des caséinates 4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on utilise en tant que protéases fixées sur supports des protéases fongiques 5.- procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on utilise des protéases fongiques obtenues à partir d'espèces Aspergillus, 6.- Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que l'enzyme utilisée a son activité optimale en pH neu- tre et alcalin. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le poids moléculaire des protéases se situe dans l'intervalle de 20vOO0 à 50,000 Dalton, 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on utilise en tant que protéase fongique l'enzyme du commerce Corolase PN (protéase fongique du sous-groupe Aspergillus sojas, du groupe Aspergillus oryzae) 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on procède à l'hydrolyse enzymatique du substrat de protéine dans l'intervalle de pH de 6 à 9. 10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'on procède à l'hydrolyse enzymatique dans l'intervalle de température de 18 à 600C. 11.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en-ce que l'on utilise en tant que substrat une solution aqueuse de caséinate S une concentration de 1 à 20% en poids. 12.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'on utilise les protéases fixées sur supports dans un réacteur à colonne 13.- Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la duree de passage moyenne de la solution de substrat est de 1 à 100 mn, de préférence de 5 à 10 mn. 14.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à13, caractérisé en ce que les supports polymères consistent en perles de résines acryliques portant des groupes conférant l'adhérence. 15.- Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que les supports polymères consistent en perles de résines acryliques portant, en tant que groupes conférant l'adhérence, des groupes oxiranne. 16.- Produits d'hydrolyse préparés par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 et qui se caraco térisent en ce qu'ils contiennent un minimum de peptides de poids moléculaire situé dans l'intervalle de I x 103 à 6 x 103 Dalton