FR 2520753 A1 19830805 FR 8201574 A 19820201 La présente invention concerne de façon générale le clonage et l'expression du gène codant pour la catéchol 2,3-oxygénase dans différents microorganismes, notamment des bactéries gram + telles que Bacillus subtilis et le phage M 13. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux vecteurs, et en particulier des plasmides vecteurs, de clonage et d'expression, ainsi que leurs applications. Enfin, la présente invention concerne l'application dans différents domaines de l'enzyme obtenue, a savoir la catéchol 2,3-oxygénase. Il est déjà connu que certaines souches de Pseudomonas ont la propriété de dégrader le toluène. Ces souches possèdent, en effet, un plasmide appelé TOL ou plif O ( 117 kb) codant pour une série d'enzymes qui transforment progressivement le toluène en dérivé directement assimilable par la cellule selon un schéma rappelé ci-après + HOODOJ úHa ale Anxxd 0113 z H 3 H apxqgple ajeouaquad oxo Z alexele Aoxo-z go v anbluoanm qa 9 lej apxqgpleiulas HOZ m HO u a 1:,Kx j-1,Kx Og: * HSWH HOO HO HO HO asr-qrapàçq HOOD HOOZ)-Iry 0 O D' - )a) v A ( 1-l,Kx (ajenjo-,) a 4 eozu Dq D 1 "X ( 1 swil(-Lou,:?) (O-1; aleuol OX 3012 xo HOO HOO HO HOO (a UQIAX) au Qn Joi enbîlxzuaq 7 lOOZ)le ap iqep 12 zuaq V-Eàçx ox E Ha El À c w + 'i Il V 9 z DIAX IIGZúl " 003 Vk MI 135 Z úSZOZSZ aselople La catéchol 2,3-oxygénase (C 2,3-0) est l'une de-ces enzymes (EC n 1 13 11 2) Elle transforme le catéchol en semi-aldéhyde muconique selon la réaction suivante: OH OH OH 02 OOH CHO L'activité d'une telle enzyme peut être facilement mise en évidence par un test coloré puisque le catéchol se présente sous forme incolore, alors que le produit de dégradation, à savoir le semialdéhyde muconique, présente une couleur jaune. On appellera ci-après et par abréviation la catéchol 2,3-oxygénase: C 2,30, et le gène codant pour la synthèse de cette enzyme: xyl E ou bien gène C 2,3-0. Compte tenu du fait que, comme cela a été indiqué précédemment, cette enzyme dégrade le catéchol incolore pour le transformer en semialdéhyde jaune, il y a 1 l une possibilité d'obtenir un test coloré permettant de trier facilement un grand nombre de colonies bactériennes pour déterminer lesquelles ont été transformées par un plasmide déterminé portant le gène xyl E ou bien dans lesquelles, au contraire, le gène xyl E a été inactive. Certains auteurs (réf 6,9,27) ont réussi à faire exprimer le gène xyl E dans Escherichia coli. Il était donc intéressant de mettre au point des plasmides comportant le gène xyl E qui s'exprime dans des bactéries gram + car il est à noter qu'il n'existe actuellement aucun test coloré chez Bacillus -subtilis par exemple qui est une bactérie de grande importance industrielle. Dans le cas des phages, en particulier du phage M 13, lequel est utilisé couramment sous forme notamment de phage M 13 mp 7 à titre de moyen pour séquencer des ADN, le remplacement du test coloré utilisant le colorant X-gal ( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D- galactoside) par un test coloré mettant en oeuvre le catéchol constituerait certainement un avantage considérable, tant sur le plan de l'efficacité que sur le plan du prix, le catéchol étant environ 1 000 fois moins cher que le colorant X-gal. Enfin, l'enzyme catéchol 2,3-oxygénase ainsi préparée présente un intérêt industriel important, tant par son action sur le catéchol lui-même que sur les dérivés dudit catéchol. Les applications selon la présent 9 invention de l'enzyme catéchol 2,3oxygénase peuvent être regroupées autour de deux centres d'intérêt essentiels: Tout d'abord l'industrie alimentaire; en effetl les fruits contiennent une quantité importante de catéchols qui, sous l'action de la lumière et de l'oxygène, sont transformés par les polyphénoloxydases en composés colorés qui sont responsables du brunissement des fruits. L'utilisation de la C 2,3-0 pour transformer le catéchol des fruits en aldéhyde en empêchant ainsi l'action des polyphénoloxydases peut donc permettre d'éviter le brunissement des fruits. Pour cette utilisation, il est bien entendu possible d'utiliser l'enzyme purifiée, mais on peut envisager également d'utiliser directement la bactérie contenant ladite enzyme, en particulier lorsqu'il s'agit déjà de bactéries d'intérêt alimentaire telles que Lactobacillus ou Streptococcus lactis. L'enzyme C 2,3-0 est également utilisable dans l'industrie pharmaceutique et cosmétique En effet, il est bien connu que le catéchol et certains dérivés du catéchol constituent des allergènes puissants, le plus connu, le 3-pentadécylcatéchol de formule: H _OH (CH 2)14-CH 3 étant présent dans différentes espèces de Toxicodendron tels que le "poison ivy" et le "poison oak" ou "arbre poison"lesquels sont responsables d'une allergie de contact touchant presque 50 % des américains. Or, on a constaté que la C 2,3-0 dégradait le cycle aromatique de dérivés apparentés et devait ainsi en diminuer très fortement l'allerginicité. On peut envisager également dans le domaine pharma- ceutique d'utiliser le C 2,3-0 pour modifier la structure des catécholamines (adrénaline, noradrenaline, DOPA, DOPAMINE,). Dans le domaine cosmétique, la C 2,3-0 peut également être utilisée pour limiter la présence de composés de type catéchol qui apparait lors de la dégradation de certaines bases cosmétiques. Pour ces deux types d'application alimentaire et cosméto-pharmaceutique, il est particulièrement intéressant de pouvoir préparer la C 2,3-0 à partir de Bacillus subtilis. L'intérêt de Bacillus subtilis comme souche hôte est qu'il s'agit, à la différence d'Escherichia coli, d'un organisme non pathogène qui n'est relié en aucune manière à une affection quelconque humaine ou animale. C'est pourquoi l'utilisation de B subtilis ou des produits de son métabolisme au stade industriel est autorisée, à la différence d'E coli. En outre B subtilis est parmi les bactéries gram + celle qui est la plus connue et qui a été le plus largement étudiée. Enfin, B subtilis est une bactérie largement utilisée dans l'industrie pour la production d'enzymes, notamment d'amylases et de prbtéases dont les conditions de culture industrielles sont bien connues. Pour ce faire, la présente invention concerne des plasmides vecteurs caractérisés en ce qu'ils comportent au moins: le gêne xyl E codant pour la synthèse de la catéchol 2,3-oxygénase, et un promoteur assurant l'expression fonction- nelle du gène xy E dans une bactérie gram +. Le promoteur de l'expression fonctionnelle du gène xyl E est, de préférence, obtenu à partir d'une séquence d'ADN chromosomique d'une bactérie gram + Il est évident que les promoteurs envisages dans le cadre de la présente invention peuvent être divers et s'adapter à chaque type particulier de souche gram +. Comme cela a été indiqué précédemment, l'intérêt de ces plasmides vecteurs étant en priorité de pouvoir cloner des gènes déterminés dans Bacillus subtilis, ou bien d'obtenir l'enzyme C 2,3-0 par culture de B subtilis, on recherchera de préférence un promoteur de l'expression fonctionnelle du gène xyl E dans une séquence d'ADN chromosomique de Bacillus et plus particulièrement de Bacillus subtilis. Lorsque le plasmide vecteur selon la présente invention doit servir de vecteur de clonage, il est particulièrement intéressant qu'il comporte au moins un site unique de restriction situé à un endroit tel que l'insertion d'une séquence d'ADN dans ce site conduise à l'inactivation du gène xyl E Ainsi ce site peut être situé, soit dans le gène xyl E, ou bien en aval du promoteur et en amont du gène xyl E Une telle inactivation peut facilement être mise en évidence par une pulvérisation de catéchol sur l'ensemble des colonies et sélection des colonies qui, bien que transformées, ne se colorent pas en jaune du fait que le gène xyl E n'est pas exprimé. Parmi les sites de restriction uniques présentant un intérêt, il faut citer plus particulière- ment un site de restriction Bam Hl qui peut être aisément introduit, comme cela sera démontré dans les exemples pour les plasmides dérivés de p TG 402 tels que p TG 403, p TG 4044 p TG 405,p TG 406, p TG 407, p TG 408,p TG 409 et p TG 410. La présente invention concerne également des souches de Bactéries gram +, en particulier les souches de Bacillus subtilis, transformées par les plasmides selon la présente invention Parmi les gènes de bactéries gram + utilisables, il faut citer également les genres Lactobacillus, Streptococcus et Staphylococcus. La présente invention concerne également un autre type de vecteur qui est un phage dérivé du phage M 13, caractérisé en ce que son ADN comporte au moins le gène xyl E codant pour la synthèse de la catéchol 2,3-oxygénase. De préférence, l'ADN de ce phage comportera au moins un site unique de restriction placé de façon que l'insertion d'une séquence ADN dans ce site inactive l'expression du gène xyl E De préférence, il existera plusieurs sites uniques de restriction (appelés sites "de clonage multiple") qui joueront la même fonction. L'intérêt du phage M 13 est le suivant; un dérivé de ce coliphage filamenteux est utilisé pour cloner et séquencer les ADN, il s'agit en particulier du phage M 13 mp 7 développé par le Dr J Messing et qui est distribué par Bethesda Research Laboratories et PL Labs sous forme d'ensemble pour cloner et séquencer les ADN. Ce phage comporte un site de clonage multiple dans lequel il est possible d'insérer de nombreux fragments de restriction tels que des fragments Eco Rl, Bam Hl, Acc I, Hindll, Pst I et Sall. Ainsi, lorsque l'on introduit dans le milieu de croissance d'une souche et du phage M 13 mp 7 de l'isopropyl-0-D-galactoside et du 5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-e-D-galactoside, 1 'isopropel-e-D-galactoside induit une partie du gène lac Z sur le phage M 13 qui, lorsqu'il est complémenté par la partie finale du gène porté sur le facteur F' dans la même cellule, conduit à un phênotype 0-galactosidase positif Ceci a pour effet de faire virer l'indicateur 5-bromno-4-clchloro- 3-indolyl-0-D-galactoside (colorant X-gal) au bleu. L'insertion de fragment d'ADN au niveau du site de clonage multiple cornduit à l'linactivation de la complémentation a de la g-galactosidase, dans ces conditions l'indicateur coloré ne change pas de couleur. Toutefois, il faut remarquer que cet indicateur est très cher, en effet, il faut compter environ 3 francs d'indicateur par boite de Pétri, et comme dans chaque expérience on est obligé d'utiliser un grand nombre de boites, ceci conduit parfois à des dépenses très importantes. L'utilisation du phage selon la présente invention permet d'avoir recours à un indicateur beaucoup moins onéreux, le catéchol, et, en outre, de pouvoir utiliser le phage M 13 dans différentes souches sans être dépendants d'une complémentation et donc de souches particulières contenant le gène lac ZA M 15 comme dans le cas du phage M 13 mp 7. Rappelons que pour son utilisation dans le séquençage, il faut hybrider avec le DNA du phage un oligonucléotide d'une quinzaine de bases complémentaires à la région du DNA très proche du site d'insertion. Indépendamment des vecteurs décrits précédemment en eux-mêmes, la présente invention concerne également leur application au clonage de gènes dans des bactéries ainsi que les bactéries transformées par ces plasmides et leur utilisation à la préparation de la catéchol 2,3- oxygénase Enfin, la présente invention concerne l'application de la catéchol 2,3-oxygénase obtenue, notamment par la mise en oeuvre de bactéries selon l'invention, à titre d'additif alimentaire, en parti- culier d'agent de conservation dans l'industrie alimentaire et comme conservateur en cosmétique, et à titre de principe actif en thérapeutique pour le traitement et la prévention des allergies provoquées notamment par le catéchol et des composés dérivés du catéchol. Les propriétés de la catéchol 2,3-oxygénase ont été étudiées sur des extraits bruts bactériens. L'extrait bactérien s'est révélé capable d'oxyder, outre le catéchol, le 4-méthylcatéchol, avec l'apparition d'un produit jaune présentant 2 pics d'absorption: 326 et 278 nm. Pour mesurer l'activité enzymatique des souches obtenues on utilise une technique spectrophoto- métrique en mesurant l'accroissement d'absorbance à 375 mm dû à l'accumulation dans le miliéu réactionnel du semialdéhyde. Protocole Dans une cuve spectro: 2,9 ml de tampon phosphate 0,1 M, p H 6, 8, 0,1 ml d'extrait bactérien, pl d'une solution de catéchol 0,02 M. cinétique effectuée à 30 C et mesurée sur une minute. L'appareil (Uvikon 810/820) est doté d'une unité de calcul qui fournit par l'intermédiaire d'une imprimante les résultats suivants: DO pour chaque mesure effectuée, à DO entre chaque mesure, vitesse exprimée en DO/min, calcul du coefficient de corrélation qui permet de vérifier la bonne linéarité de la courbe. Une mesure est effectuée toutes les 6 secondes pendant une minute ( 10 points). L'activité enzymatique est exprimée en m U/mg de protéines. Une m U correspond a une nanomole de produit formé en une minute à 300 C dans les conditions précédemment décrites. Stabilité de l'enzyme en fonction de la température L'extrait est traité 10 minutes à différentes températures et l'activité est mesurée dans les conditions décrites précédemment. Température 300 C 550 C 60 C 650 C Activité de la 100 84 18 3 C 2,3-O (%)1 L'extrait est traité, cette fois, à 550 C pendant différents temps. Durée (minutes) O 10 20 30 Activité de la 100 84 39 24 C 2,3-O (%) D'après ces résultats, l'enzyme montre une bonne résistance vis-à-vis de la température et les résultats ci-dessous vont confirmer sa bonne stabilité. L'extrait est placé à température ambiante, dilué dans différents tampons à une concentration en protéines de 0,32 mg/ml. O 19 h 2,5 jours 6 fjours Activité (%) Après stockage dansl'eau 100 O Phosphate 0,1 M p H 6,8 Phosphate 0,1 M p H 7,5 10 % acétone 84 93 81 Ces résultats montrent l'effet stabilisant de l'acétone qui est d'ailleurs utilisée dans la technique d'extraction par plusieurs auteurs (réf 28, 29) Activité en fonction du p H Des essais enzymatiques effectués dans du phosphate 0,1 M à des p H variables ont montré un optimum d'activité à 6,75. ,6 6 6,5 6,75 7 7,5 Activité (%) 10 8 8,5 8,9 78 100 93 80 61 52 49 Température optimale En outre, il a été démontré que l'activité maximum se situe à 45 C. Température d'incubation ( C) Activité (%) 27 30 35 40 45 50 53 100 125 162 200 131 119 On remarquera que l'activité à la température de référence ( 30 C) représente la moitié de l'activité maximum Ql = 1,6 Durée p H Parmi les compositions selon la présente invention incorporant la catechol 2,3-oxyg 6 nase, il faut citer plus particulièrement les compositions pour application topique externe dans le domaine cosmétique et médicamenteux Les bases utilisables dans ce type de compositions sont connues de l'homme de l'art et ne constituent pas des caractéristiques de la présente invention Toutefois, on pourra tenir compte de l'effet stabilisant de l'acétone pour la C 2,3-0 et du p H optimum d'activité situé entre 6,5 et 7,5, pour la réalisation des compositions selon l'invention. Lorsque la C 2,3-0 est utilisée comme conservateur dans l'industrie alimentaire, en particulier pour éviter le brunissement des fruits, il est possible d'utiliser l'enzyme purifiée ou un extrait bactérien, mais il est possible d'envisager dans certains cas d'utiliser la bactérie elle- mnme, en particulier lorsque le produit alimentaire contenant les fruits est déjà un produit de fermentation bactérienne. Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention De façon générale, les références bibliographiques sont rassemblées en fin de description et ne sont rappelées que par leurs numéros dans le corps de la description. Dans un premier temps, le gène xyl E, qui est entièrement compris dans un des fragments Xho I du plasmide p WWO, a été cloné sur de petits plasmides de façon à disposer d'une source d'ADN de xyl E facile à recloner pour la suite des expériences sans avoir à sélectionner tous les fragments de restriction de ph O qui est un très grand plasmide. En outre, ces petits plasmides ont permis de préparer de grandes quantités de catéchol 2,3-oxygénase pour l'étude de cette enzyme. EXEMPLE 1 Clonage et expression du gène codant pour la catéchol 2,3oxygénase dans Escherichia coli la) Souches et plasmides Le plasmide pl O O a été extrait d'une souche de Pseudomonas putida. Le plasmide vecteur est le plasmide p KT 230 (réf 6) qui code pour la résistance à la kanamycine et à la streptomycine Ce plasmide possède un site Xho I unique dans le gène de résistance à la kanamycine. A titre de plasmide vecteur, on a également utilisé les plasmides p B Xh 12 et p B Xh 3, construits comme décrits ci-dessous par Vince Pirotta (European Molecular Biology Laboratories, Heidelberg), dans lesquels les gènes clonés sont exprimés à partir du promoteur du phage XPR qui a été cloné dans p BR 322. Le plasmide p B Xh 3 a été préparé de la façon suivante: On découpe p BR 322 avec l'enzyme de restriction Hindl II, on le traite avec la nucléase 51 et les extrémités franches sont ligaturées avec un fragment Hae III de de 890 paires de base qui contient tous les aminoacides du gène Ic I, sauf les six derniers acides aminés de l'extrémité COOH, avec ts 857 qui contient également ORPR et 110 paires de base du gène cro. A 80 paires de base en aval de PR, se trouve un site Bgl II qui est unique dans le plasmide. Le promoteur est dans une orientation qui permet de transcrire le gène de la tétracycline de p BR 322 Le plasmide p B Xh 12 est identique à la seule différence que le plasmide p BR 322 est coupé à la fois avec les endonucléases Eco R 1 et Hind III, avant d'être ligaturé avec le fragment c I. Le promoteur EL peut également être utilisé (réf 22) Les promoteurs Xp L et XR sont réprimés par le produit du gène c I et il existe des mutants sensibles à la température qui répriment la transcription de chacun des promoteurs à basse température (réf 23) Cette régulation a pour avantage de permettre la croissance à basse température pour augmenter la masse cellulaire avec un système simple d'induction pour, en quelque sorte, "allumer" le gène clone. Le plasmide p BR 322 a également été utilisé comme vecteur de clonage. Le plasmide p ED 5-1, "le vecteur d'expression tr_" (réf 24), a également été utilisé. Les souches hôtes sont toutes des dérivés d'E coli K 12 SK 1592 est gai thi sbc B 15 end A hsd R 4 hsd M+ (réf 25) B Z 18 rk mk+ gal lac y Su II (réf 19). W 3110 trp OE met (réf 26). lb) Procédé Afin de cloner le gène xy E dans p KT 230, i'ADN de p WWO a été coupé avec l'enzyme de restriction Xhol et ligaturé avec un fragment Xho I de l'ADN du vecteur phosphaté. Des études précédentes ont démontré que ce gène xay E est entièrement situé dans le fragment de restriction I (Xho I)_ du plasmide p WWO et dans un sous-fragment Bam Hl-Xho X de ce fragment ( 6,9) La souche SK 1592 a été transformée à l'aide des plasmides obtenus et les colonies résistant à la streptomycine ont été triées grâce à une pulvérisation de catéchol. En effet, les souches contenant l'enzyme catéchol 2,3-oxygénase virent au jaune lorsqu'elles sont mises en présence de catéchol, compte tenu de la production du semialdéhyde 2-hydroxymuconique (réf 14). Les recombinants contenant l'ensemble du gène xyl E mais qui ont perdu une portion de l'ADN du plasmide vecteur sont isolés La carte de restriction du plasmide p TG 200 est représentée sur la figure 1, en traits doubles on a représenté le fragment ADN de p WWO. Ce plasmide p TG 200 est utilisé comme source d'ADN codant pour le gène xl E dans les expériences suivantes: Le fragment Bam HI-Xhol du plasmide p TG 200 a été cloné dans les sites Bam HI-Sall des plasmides p Blh 3 et p B Xh 12 et également dans les sites Bgl II-Sal I de p B Xh 3 et p B Xhl 2. Le fragment Bam HI-Xhol de p TG 200 a également été cloné dans les sites Bam HT et Sal T des plasmides p ED 5-1 et p BR 322 Les plasmides dérivés sont décrits dans le tableau I. TABLEAU 1 PLASM IDES PORTANT LE GENE xy IE BZ 18 / p TG 2 Oi BZI 8 / p TG 2 02 BZ 18 / p TG 2 03 BZ 18 / p TG 2 04 W 3110 I p TG 2 05 BZ 18 / p TG 2 06 SK 1592/p TG 200 p B)Xh 3 coupé avec pglll-Sall et intégration du fragment Bam HI-Xho I de p TG 200 (Ap R Tc S p B Xh 3 coupé avec Bam Hl I-Sal I et intégration du fragment Bam HI-Xho I de p TG 200 R S (Ap Tc) p B>Xh 12 coupé avec PUIII-Sal I et intégration du fragment Bam HI-Xho I de p TG 200 (Ap R Tc S) p B Xh 12 coupé avec Bam HI-Sall et intégration du fragment Bamn HI-Xho I de p TG 200 R S (Ap Tc) ptrp ED-51 coupé avec Bam HI-Sal I et intégra- tion du fragment Barn HI-Xhol de p TG 200 R S (Ap Tc> p BR 322 coupé avec Bam HI-Sall et intégration du fragmwent Bam HI-Xhol de p TG 200 (Ap R Tcs) plif O coupé avec Xho I et cloné dans p KT 23 O aussi coupé par Xho I Délétion d'une partie de l'ADN p KT 23 O proche du site Xho I : Résistance à l'ampicil Jline : Sensibilité à la tétracycline Ap R Tc 5 Le niveau d'expression de la catéchol 2,3- oxygénase dans chacune des souches contenant les plasmides recombinants obtenus ont 6 galement été compares. La concentration en protéines est déterminée par la technique de Lowry (réf 11) Les résultats mesurés sont rassemblés dans le tableau 2. TABLEAU 2 ACTIVITE Sp ElCf I IUE EN CATECHOL 213-OXYGENASE DANS DIFFERENTES SOUCHES EN PIIASE EXPONENTIELLE (activité en m U/mg) Comme cela ressort du tableau 2, la plupart des souches obtenues présentent un degré élevé de catéchol 2,3-oxyg 6 nase et ainsi peuvent être considérées comme utilisables pour la synthèse de cette enzyme. La souche donnant les rendements maximums est celle contenant le plasmide p TG 201, toutefois, pour des considérations industrielles, il est possible que la souche la plus intéressante soit en fait la souche p TG 206, laquelle dérive d'un plasmide maintenant bien connu: p BR 322. On a, ainsi, obtenu un ensemble de plasmides de petite taille grâce auxquels le gène xyl E peut s'exprimer dans E coli. Dans un deuxième temps, à partir de ces "wsources' de gène xyl E, on va construire des plasmides grâce auxquels le gène xyl E pourra s'exprimer dans B subtilis. Cette construction est effectuée en deux étapes, tout d'abord le clonage du gène xyl E sur un plasmide capable de se répliquer dans B subtilis, puis la sélection d'un promoteur assurant l'expression du gène xyl E dans B subtilis. EXEMPLE 2 Clonage et expression du gène codant pour la catéchol 2,3oxygénase dans Bacillus subtilis 2 a) Souches et plasmides Les souches de Bacillus subtilis qui ont été utilisées sont dérivées de la souche Marburg 168. Une souche BZ 2 ys B 3 rec E 4 a été construite en transformant à l'aide d'un ADN donneur BD 224 thr 5 trp C 2 rec E 4 dans une souche K 527 his A 1 cys B 3 La sélection a été effectuée pour des colonies his+ sensibles à la mitomycine C (MMC) à une concentration finale de 0,10 pg/ml La sensibilité à des niveaux faibles de MMC constitue une indication d'une déficience au niveau de la recomnbinaison associée avec la présence d'une mutation rec E 4 (réf 4, 5). La souche TGB 1 tr/C 2 rec E 4 spo 331 a été obtenue par transformation de cellules réceptrices RUB 331 thy Al thy B 1 trp C 2 spo 331 à l'aide d'un ADN donneur dérivé de BD 224 MI 112 leu A 8 arg 115 thr 5 rec E 4 r M m M (Tanaka 1979 La sélection a été effectuée pour des + cellules thy sensibles à la MMC. Les souches d'E coli utilisées sont dérivées de BZ 18 rk mk+ xn al _ac Y Su II et de C 600 rk mk+ et CSR 603 (réf 19). Le plasmide p TG 206 a déjà été mentionné dans l'exemple 1. Le plasmide p HV 33 est décrit dans les références 16 et 18 Ce plasmide est capable de se répliquer dans E coli en rendant les cellules hôtes résistantes à l'ampicilline ( 50 pg/ml), à ia tétracycline ( 15 pg/mlyet au chloramphénicol ( 20 pg/ml) Ce plasmide se réplique également dans Bacillus subtilis, toutefois, dans ce dernier hôte, la résistance au chloramphénicol ( 5 2 b) Milieu de croissance et conditions de culture Toutes les souches de B subtilis ont été maintenues sur un milieu gélose-sang-tryptose (TBAB, Difco Laboratories) auquel on ajoute 0,3 % (poids/volume) de gélose, de thymine et d'uracile, chacun à une concentration finale de 20 pg/ml Du chloramphénlcol (Sigma Chemical Corporation) est ajouté au TBAB à pg/ml pour maintenir les souches contenant les plasmides. La croissance des cultures cellulaires dans des milieux liquides riches est effectuée dans un bouillon de Penassay (PAB, Difco Labordtories) auquel on ajoute 20 pg/ml de thymine Du chloramphénicol est ajouté lorsque cela est nécessaire. Toutes les souches d'Escherichia coli sont maintenues sur L-agar Les cultures liquides sont effectuées en bouillon L Des antibiotiques sont ajoutés lorsque cela est nécessaire. Toutes les cultures sont effectuées à 37 C et l'aération desdites cultures est effectuée par agitation. Les cultures de Bacillus subtilis, une fois qu lles sont établies, sont maintenues sur TBAB à la température de la pièce ( 20-22 C) Les cultures d'E coli sont maintenues sur L-agar à 40 C. 2 c) Transformation bactérienne La transformation des ADN de plasmide dans les cellules réceptrices d'E coli est effectuée par la méthode de Ledeberg et Cohen (réf 10) tel que cela est décrit dans l'article de Morrison (réf 13). Les cellules compétentes sont préservées par cryogénie avant leur transformation. La transformation conventionnelle de B subtilis (réf 20) est suivie par la mise en oeuvre de la méthode de Boylan (réf 2) Il est également possible d'effectuer la transformation des protoplastes en utilisant les ADN plasmidiques (réf 3) La sélection des souches portant les plasmides est effectuée sur milieu TBAB supplmnenté avec 5 pg/ml de chloramph Gnicol dans le cas de transformations conventionnelles et sur un milieu de régénération DM 3 supplémenté avec 20 pg/ml de chloramphénicol dans le cas d'une transformation de protoplastes. L'expression fonctionnelle du gène codant pour la C 2,3-0 est observée et mesurée comme cela a été décrit à l'exemple 1. 2 d) Construction du plasmide p TG 402 Le plasmide p HV 33 est mis à digérer avec l'endonucléase de restriction Bam Hl dans une solution comportant 6 m M tris (hydroxyméthyle) aminométhane (Tris) p Hli 7,9, 6 mM Mg C 12, l O Om M Na Cl, 1 pg ADN et 6 unités d'enzyme. La réaction est conduite pendant 1 heure à 37 "C avant ad'tre stoppée par chauffage pendant 10 minutes à 650 C Les conditions de tampon sont ajustées à l'aide de 100 m M Tris, p H 7,4, 5 m M Mg C 12 et 5 Om M Na Cl, puis l'on ajoute 3 unités d'endonucléase de restriction Eco Rl. L'incubation est poursuivie pendant 1 heure à 37 e C La réaction est de nouveau stoppée par chauffage. Le plasmide p TG 206 est traité de la même façon que le plasmide p HV 33. Les fragments plasmidiques de 0,5 pg chacun sont ligaturés dans 50 pl de tampon qui contient 66 r M tris H Cl, p H 7,9, 6,6 m M Mg C 12, 10 m M dithiothréitol (DTT), 0,5 m M adénosine triphosphate (ATP) et 0,1 unité ADN ligase T 4 (Boehringer Mannheim) La réaction est effectuée à 10-12 C pendant approximativement 18 heures, puis stoppée par chauffage de la solution pendant minutes à 65 C. Les produits obtenus sont stockes à 4 C ou bien sont utilisés directement pour la transformation. Ces produits de ligation sont utilisés pour transformer E coli BZ 18 Les souches réceptrices sont sélectionnées pour leur résistance à l'ampicilline et au chloramphénicol et leur sensibilité à la tétracycline. On obtient ainsi 7,6 x 104 transformants par pg ADN plasmidique. Ces transformants sont pulvérisés avec une solution de catéchol et les colonies qui virent au jaune sont transférées sur des plaques de sélection contenant de l'ampicilline. Parmi ces colonies chez lesquelles le gène xyl E s'exprime fonctionnellement on en prélève 14 chacun dans 1 ml de culture et l'ADN plasmidique en est extrait puis résolu sur gel d'agarose. La majorité des plasmides extraits sont plus grands que p TG 206 et présentent un site de restriction Bam Hl et 4 sites de restriction Cla I. L'un de ces plasmides appelé p TG 402 a été purifié à partir d'un litre de culture et analysé avec *diverses enzymes de restriction. Ce nouveau plasmide p TG 402 porte le gène C 2,3-0 sur l'ADN d'un plasmide vecteur qui est capable de se répliquer à la fois dans E coli et dans B subtilis Dans ce dernier hôte toutefois, le produit du gène C 2,3- 0 codé par p TG 402 n'est pas exprimé fonctionnellement, en effet tous les transformants de Bacillus subtilis TGB 1 résistant au chloramphénicol demeurent blancs lorsqu'on les pulvérise avec du cat 6 chol Ceci suggère que le gène C 2,3 O n'a pas été transcrit ou traduit dans B subtilis, ou bien a été rearrangé dans les processus de transformation ou de croissance. Le plasmide a été extrait de B subtilis pour être ensuite réintroduit dans E co i Toutes les souches d'E coli transformées deviennent jaunes lorsqu'on les pulvérise avec du catéchol. Dans ces conditions, le gène C 2,3-0 est demeuré intact sur le plasmide vecteur dans B subtilis mais celui-ci ne s'exprimait pas Ainsi, on peut conclure à une absence d'expression du gène C 2,3-0 dans les souches gram + 2 e) Analyse par restriction de p TG 402 En utilisant diverses enzymes de restriction pour digérer p TG 402, on obtient la carte de restriction partielle représentée figure 2 Le tableau 3 rassemble cette analyse de restriction de p TG 402. 252 o 753 TABLEAU 3 ANALYSE DES Si TES D'ENZYI-I,S DE PY-STRICTION DE pl'G 402 Nombre total de sites Nombre de sites dans la région F,5 -11 2 O 1 1 1-Enz Vme Ava I Bamlil lq LI'I Clal Eco R'f ljpal lRn-ll Pst'I Sacl Sa IT Sm.a'I phj Xbal Xhol Xmal Ce plasmide de 8,90 kb comprend un ADN dérivé de p BR 322 (moins la petite région située entre Bam Hl et Sal I), p C 194, et le fragment Bam HI A Xho I de pl WO qui contient le gène C 2,3-0. p BR 322 et p C 194 ont déjà été séquences. La région de p TG 402 qui contient le gène C 2,3-0 a été partiellement sequencée Cette région est reliée au site du plasmide par un site Bam HI et un site hybride Xhol/Sal I Dans cette région il existe des sites uniques pour Hpa I, Ava I, Cla I et Kpn I et 3 sites pour Sal I Il n'existe pas de site Bgl II, Eco RI, Hindll, Sac I, Sma I, Sphl, Xbal, Xho I ou Xmal Le sites Hpa I et pn I sont uniques pour l'ensemble du plasmide p TG 402 Le site Ava I se situe probablement a l'intérieur du gène C 2,3-0 car lorsque l'on découpe p TG 402 avec Ave I et lorsque l'on effectue le ligature des fragments résultats dans une orientation opposée a l'orientation d'origine, ceci supprime l'activité du gène. 2 f) Sélection des promoteurs permettant la transcription du gqne C 213-O dans Bacillus subtilis L'ADN chromosomique est isolé de la souche de Bacillus subtilis BZ 2 L'ADN obtenu est mis à digérer avec l'endonucléase de restriction Sau 3 A dans un tampon constitué de 6 m M tris, HC 1, p H 7,4, 6 m M Mg C 12, m M Na Cl et 2 à 3 unités d'enzyme Sau 3 A pour 1 pg d'ADN On obtient ainsi plusieurs centaines de petits fragments d'ADN avec des extrémités 5 ' GATC 3 ' a monobrin cohésives Ces fragments sont ligaturés avec p TG 402 qui a été lin 6 arisé à l'aide de Bamn HI (Cette linéarisation produit des terminaisons monobrin identiques à celles produites par Sau 3 A) Les produits de ligature sont introduits directement dans les protoplastes de Bacillus subtilis TGB 1 par transformation D'autre part, les produits de ligature sont introduits par transformation dans Escherichia coli C 600 rk mk+. Les transformants d'E coli sont sélectionnes par incubation pendant une nuit dans un bouillon L supplémenté avec 50 pg/ml d'ampicilline La population cellulaire mixte est traitée par la méthode des lysats clarifies (réf 7, 12) de façon à isoler les ADN plasmidiques Une petite proportion d'ADN ainsi obtenu est utilisée comme ADN donneur pour la transformation par des méthodes classiques de B subtilis TGB 1 ou M 1112 devenu cellule réceptrice La sélection est effectuée pour la résistance au chloramphénicol des cellules comportant un plasmide. Tous les transformants TGB 1 ou M I 12 qu'ils soient obtenus par les méthodes classiques ou bien par transfor- mation protoplastique, sont soumis à une-pulvérisation d'une solution de catéchol de façon à détecter l'expression du gène C 2,3-0 La coloration jaune des colonies est utilisée comme une indication pour sélectionner les promoteurs qui autorisent la transcription du gène C 2,3-0. La transformation directe dans les protoplastes conduit à isoler sept colonies qui deviennent jaunes lorsqu'on les pulvérise avec du catéchol Les ADN plasmidiques qui se trouvent à l'intérieur de ces cellules sont appelés p TG 411, p TG 423; p TG 424, p TG 425, p TG 426, p TG 427 et p TG 428. Le passage Jcls ple 5 nidcs à Lrivers l'intermediaire d'l:sclierichia coli condluit à iso( ler 18 colonies SUFJ Plcmenrltailes (le B su j Ailis (lui deviennent jaunes lorsqu'on les pulviérise avuc du catéchol Les plasmirdes ainsi otnsn é p TCAO 03, p TG 404, p'1 G 405, p Tc 11; 406, p T'G 407, L 3 TC 4 o 08, p TG 4 009, p TG 41 O, p'TG 412, p TG 4 l 3, p TCG 4 l 4, p TG 415, p 1 YG 416, p 1 'l G 417, p Tl G 4 l 8, p TG 4191 p'TG 420 et pi G 421, de-neurent associes avec une activité du gène C 2,3- 0, sous réserve que la sélection pour la résistance au chloramph Cnicol soit rnaintenue. Les origines de ces différents plasmides sont rassemblées dans le tableau 4. O TA B J,) ' 4 U, 4 SELECTION DES DANS 13 JACILLUS S Uli'1 '31,lS Mr tli -)(le de Plasmide transformation B subtilis TGB 1 p'IG 4 1 1 pi otoplaste E COI-i BZ 18 B subtilis TGB 1 p TC 403 classique Exl:)r rienc-e AIJN donneur BZ 2 + pr G 402 ( 3:1) 3 i(ja tu re L 4 Z 2 + p'I'G 4 O 2 ( 3:1) ligature lysats clarifiés je exp 2 BZ 2 + p TG 402 ( 4:1) ligature lysats clarifiés de exp 4 E coli BZ 18 B subtilis TGBI classique p'l'G 404 r'j'G 4 1 2 1)'IG 4 1 3 BZ 2 + p TG 402 E coli ( 2: 1) ligature C 6 È-O- lysats clarifiés de exp 6 BZ 2 + p TC-402 1 ( 2:1) ligature B subtilis M 1112 c la S S i q é- B subtilis MI 112 prit-6-p Tà -Ste p î'G 405 p'2 G 406 p;i G 407 p-.r G 408 p'l'G 409 p'PG 410 p TG 414 PTG 415 p TG 416 p TG 417 p TG 418 p TC 419 p TG 420 p TG 421 p TG 422 p TG 423 pl-C 424 p TG 42 5 p TG 426 p TG 427 2 g) Purification des ADN plasmidiues, digestion par les enzymes de restriction et 6 lectroph Lorèse Les ADN plasmidiques sont isolés à partir des lysats d'un bouillon de culture de 1 litre dans un milieu liquide riche. La purification des ADN plasmidiques est effectuée par centrifugation sur les gradients de densité au chlorure de césium-bromure d'éthidium (réf 17). Dans certains cas, les ADN plasmidiques sont préparés à partir de culture de 1 ml par la méthode d'extraction alcaline (réf 1). Le plasmide p TG 402 purifié est mis à digérer avec différentes enzymes de restriction dans les conditions prévues pour son utilisation Les dérivés de p TG 402 susceptibles de promouvoir l'expression du gène C 2,3- 0 sont mis à digérer avec Bam Hl de façon à rechercher des sites potentiels en aval du promoteur mais en amont du gène C 2,3-0. Ces fragments d'ADN sont résolus grâce à un appareil d'électrophorèse horizontal sur gel d'agarose 1 % (poids/volume), ou bien 0,8 % (poids/volume). On utilise pour ce faire un tampon Tris-acétate ( 40 m M Tris, p H 7,8, 20 m M acétate de sodium, 2 m M EDTA). L'électrophorèse est effectuée sous différence de potentiel constante de 35 volts pendant 14 à 18 heures à la température de la pièce ( 20-22 C). L'ADN est fixé grâce au bromure d'éthidium 0,5 pg/ml pendant 30 minutes, le gel est rincé abondammnent avec de l'eau distillée, les bandes d'ADN sont visualisées avec des rayons ultra 7 violets de grandes longueurs d'ondes provenant d'un transilluminateur UV (Ultra Violet Products, Inc) La dimension des fragments d'ADN plasmidiques est estimée en comparant la mobilité relative à celle de i'ADN de k C 185757 mis à digérer avec llind III La taille des fragments d'ADN est obtenue à partir de la publication de Philippsen et al (réf 15). Chacun des plasmides testés est plus grand que p TG 402. Ce résultat démontre que le produit du gène C 2,3-0 est exprimé fonctionnellement dans Bacillus subtilis, sous réserve de l'introduction de séquences d'ADN chromosomiquesde B subtilis qui assurent la pronmotion de la transcription du gène C 2,3-0. 2 h) Activité enzyatigue _C 2 _ 3-O dans Bacillus subtilis Des extraits de culture en phase stationnaire ont été préparés pour déterminer le niveau d'activité enzymatique C 2,3-0 dans Bacillus subtilis Ces activités sont mesurées par la méthode spectrophoto- métrique décrite précédeirment et rassemblées dans le tableau 5. TABLEAU 5 ACTIVITE DE LA CAT'ECHOL 2,3-OXYGENASE DANS BACILLUS SUBTILIS Souche et plasmide TGB 31/PTÀGt 02 TGBI/P?G 403 T'GB 1/p T 2 G 404 t:'l 1 id î/plà 2 G 405 1 111 112/p'2 G 406 4 \ 11112/p'i G 407 Mi 2112/p TG 408 MI 2112/,p 1 G 409 M 1112/p TG 4 10 O TGBI 3/p TLG 41 il âWGBI/p TG 412 TGI 31/p TG 4 33 M Ii 12/p"G 4124 Ml il 2/p TG 4, 5 II i 12/p'2 G 416 M i 112/p TCG 4 17 Ai 1112/p TG 418 Mi il 2/pt"G 4 19 MI i 112/p WG 420 M 1112/p TG 421 M 41112/p TG 422 Mil' 2/p'3 G 423 M 1112/p'2 G 425 MI 112/p'2 G 426 MI 112/p TG 427 No déterminations 3. i 1 ' 2, N T. IN T. * 1 (c) Protéinc totale (a) (mg/m ") 1,59 1,59 1,59 1,86 1 L,74 2, 22 2, 21 2,03 1,93 0, 26 2,, 10 1,46 0, 90 1,44 2,30 1,50 (c) 1,34 1,06 1, 60 (c) (c) 1,64 1, 2,4 1,60 (a) Concentrations en protéines par la méthode de Lowry (b) 1 milliunité (m U) correspond à la formation de 2, mm-ol. 2-hydroxymuconique par minute à 3 O'C (c) N T Non Testé de semialdéhyde de Remarque Il est à noter que l'activité de la C 2,3-0 dans 13 subtàlis peut être faible alors que la quantité d'enzymes peut être g-rande. (b) Acti vité (rmu/m-g) 238,0 , 5 I 702, 5 l 124,0 373, 5 ,0 169, 5 961,5 87,5 1.i 5,0 18,0 262,0 4 '67, O 2 011,0 394,0 407,0 274,O 164,0 ,0 127,0 1 3,0 VI r> C> j ui L 4 2 i) Caract rrdjtion des pl-mdcs de J Bacillus:;ubtilis (ui expriment le _g ne C 2,30 La ligation (I'i N gérnfré par SAU 3 A à un plasmide vecteur lin(arisé par P,m Hl (tel que p TG 402) prévoit avec une probabilité de 1/4 la régénération d'un site Bam Hl pour chacune des extreimités du fragment SAU 3 A Les plasmides associés avec une activité du gène C 2,3-0 dans B subtilis sont mis à digérer avec B Aim H 1 Les plaslmides p Ti(; 403, p T'G 404, p TG 405, p TG 406, p'IG 407, p TG 408, p TG 409, p TG 410, p TG 411, p 2 G 422 et p TG 425 présentent au moins un site Bamn H 1. Les plasmides purifiés sont mis à digérer par l Hind III et Bam HI pour déterminer si les sites Bam HI régénérés sont en amont ou en aval des promoteurs qui se trouvent localisés sur les fragments Sau 3 A. Un site Bam HI unique est détecté en amont du promoteur sur p TG 411, p TG 422 et p TG 425 Des sites Bam Hl uniques sont détectés en aval des promoteurs sur p TG 403, p TG 404, p TG 40 05, p TG 406, p TG 407, p TG 408, p TG 409 et p TG 410. Les dimensions approximatives du fragment Sau 3 A qui porte les promoteurs de Bacillus subtilis sont de 500 paires de base pour p TG 403, 140 paires de base pour pk G 404, 575 paires de base pour p TG 405, 950 paires de base pour p TG 406, 335 paires de base pour p TG 407, 500 paires de base pour p TG 408, 900 paires de base pour p TG 409 et 100 paires de base pour p TG 41 O. 2 j) Développcensnet des vecteurs d'expression plasmidiques dans Bacillus subtilis Les plasmides p TG 403, p TG 404, p TG 405, p TG 406, p TG 407, p TG 408, p TG 409 et p'i G 410 présentent les caractéristiques suivantes: 1 ) Ils expriment le gène C 2,3-O. ) Les cellules hôtes qui incorporent ces plasmides convertissent le catêchol en semialdéhyde 2-hydroxymuconique, comme cela peut être mis en évidence par coloration en jaune des colonies et analyse spectrophotométrique. 3 ) Ils présentent un site unique Bam Hl en aval du promoteur mais en amont du gène C 2,3-0. Ces plasmides sont importants, non seulement pour la conversion du catéchol, mais aussi parce qu'ils peuvent être également utilisés commre vecteurs d'expression dans Bacillus subtilis. Le clonage de gène dans le site Bam H 1, aussi bien de p TG 403, p TG 404, p TG 405, p TG 406, p TG 407, p TG 408, p TG 409 et p TG 410, aura selon toute probabilité pour effet de supprimer l'activité du gène C 2,3-0. De même, le clonage de gène dans la région de p TG 403, p TG 404, p TG 405, p TG 406, p TC 407, p TG 408, p TG 409 et p TG 410, qui se situe entre le site Bam HI et un site quelconque à l'intérieur du gêne C 2,3-0, aura probable- ment pour effet de supprimer l'activité du gène C 2,3-0. Ainsi, l'insertion de nouveaux gènes dans le vecteur d'expression peut être détectée en pulvérisant les colonies avec une solution de catéchol et en observant l'apparition ou non d'une coloration jaune. En effet, les colonies qui demeurent blanches indiquent que le gène C 2,30 n'est plus exprimé et qu'un nouveau gène a été inséré dans le plasmide Par contre, les colonies jaunes indiquent que ce nouveau gène n'a pas été Jnseré dans le plasitdde Un nouveau ygne inséréE dans le site Bam HI a une grande probabilité d'être exprimé parce qu'un promoteur de B sbtiilis est situé en amont de ce site Bamrn HI. Dans ces conditions, les plasmides ainsi obtenus présentent un très grand intérêt sur le plan industriel pour l'expression d'un gène déterminé dans Bacillus subtilis. EXEMPLE 3 Clonage et expression du gène dans le phage M 13 Le phage M 13 est un coliphage filamenteux distribué par Bethesda Research Laboratories et PL Labs. sous forme de "kit" pour le séquençage et le clonage de gènes. Le fragment Bam Hl-Xhol de p TG 200 a été clon 6 dans les sites Bamr H Il-Sal I du phage M 13. Le phage ainsi obtenu permet l'expression du gêne xyl E dans les souches d'Escherichia coli mentionnées précédemmnent. Le clonage de ce gène est mis en évidence, corme cela a été indiqué à l'exemple 1,par pulvérisation de catéchol et observation des colonies présentant un aspect jaune dû à la dégradation du catêchol. Les deux fragments Sal I (voir figure l) contenus dans le segment Bam HIXho I ont été clones dans M 13 de deux façons: en conservant leur sens et leur ordre originaux, en conservant leur ordre original mais en inversant tous les deux leur sens. Seul le phage recombinant construit selon le premier mode a pu exprimer une activité de C 2,3-0. î 7 Fil iiii 1 (GRAI, Il 1 E 1 Birnboim H C et J Doly 1979 A al Ja 1 ijie cxiy-acti cn fur plamidDNA Nucleic Pc-s 7: 1513 3520. 2 Boylan R J, N H 1-il-,pulel-son, D Brools et F E Yoiing. 1972 Regulation of the bacterial, cell; nalysis of a itutant of Pacilllis subtilis 3 ( fcctive in biosynthesis of teichoic aci-d J Racteriol 110: 281-290. 3 Chang S et S N Cohan 1 979 Hich Frequericy transformation of Pacillus subtilis proi-Oplasts by p 1 asnid DNA Molec r ',en Genet -1-6-8: 111-115. 4 Du Lnau D et C Cirigliaiio 1974 Gc-netic charactc- rization of recciabination eficient viutants of Pacillus subtilis J Bacteriol 117: 488 493. Dubnau D, R Davidoff-Albelson, B Scher et C Cirigliano 1973 Fate of transforming dec-xy- ribonucleic acid after uptal-e by competent Racillu s subtil, is hcnotypic characterizaition of radiation sensitive reroi;biriation-eieficiuiit rtutants. 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Rh VE-i) 1 i'A'I'l ONS le e gne xyl EF coi (ntj ur la yn Ii he-3 e (le la cut&lao 12,3 -xja eet -unj ol teu dei'cÄ:Az 3 onfetorl Ie du gt"ie xyl F, cd'ns Urie I tri rami+ 2) Plasmride vecteur selon la 1 re-vendication 1, criract Cirisé on ce que le promnoteur e st une S 3 éqluen Ce â'ADN chromios;ojrinue d'une bactérie yrain + 3) Plasmide vecteur selon l'une des revenrdications i et 2, caracterisé en ce que le pla 1-micle comporte au moins un site unique de restriction situ 5 en un endroit tel que l'insertion d'une sréquience d'ADI-,N dlans ce site condui se à l'inactivation du gine xyl E. 4) Plasm;ide vu*ctcur selon larl\e du -roiiioteur. ) Plasmide vecteur sel on l'une des revendical ions 3 et 4, caracté 5 risé en ce que le site unique est un site 13 ar 11. 6) lsid vecteur selon l'une des revendications 1 à 5, ç-arac t;risé en ce aue la -bactiérie gr;-,n + est un B 3.cillus, Lactebacillus, Streptococcus ou Staph 1 y ococcus. 7) Pa Hd vecteur selon la codcain 6, cari ctérisé en ce que la baspctre oréim + caest n Facillus subtilis. 8) Pl asmnide vecteur solon la rvn ctin 1 car dcttrisé c:n ce qu'ill S 'agit d'un Iasi De rivé aie p'i-C 402. 9) Plasmide vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide p TG 403 ou p TG 404. ) Souche bactérienne gram + transformée par un plasmide selon l'une des revendications 1 à 9. 11) Catéchol 2,3-oxygénase obtenue par fermentation d'une souche selon la revendication 10. 12) Application d'un plasmide selon l'une des revendications 1 à 9 au clonage d'un gène dans une bactérie gram +. 13) Phage M 13 caractérisé en ce que son ADN comporte au moins le gène xyl E codant pour la synthèse de la catéchol 2,3-oxygénase. 14) Phage selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un site unique de restriction situé en un endroit tel que l'insertion d'une séquence d'ADN dans ce site conduise à l'inactivation du gène xyl E. ) Phage selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comporte un site de clonage multiple placé de façon que l'insertion d'une séquence d'ADN dans un point de ce site inactive l'expression du gène xyl E. 16) Application du phage selon l'une des revendications 13 à 15 au clonage et au séquençage d'ADN. 17) Composition pour application topique externe, caractériséeen ce qu'elle comporte de la catéchol 2,3- oxygénase selon la revendication 11. 18) Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle comporte, en outre, une base cosmétique. 19) Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement et à la prévention des allergies. ) Application de la catéchol 2,3-oxygénase selon la revendication 11 à titre d'additif alimentaire. 21) Application de la catéchol 2,3-oxygénase dans le domaine pharmaceutique pour modifier la structure des catécholamines.