FR 2528866 A1 19831223 FR 8210636 A 19820618 INOCULUM D'AGROBACTERIUM RADIOBACTER VAR RADIOBACTER INCLUSES DANS UN BIOPOLYMERE POUR LA LUTTE BIOLOGIQUE CONTRE LA GALLE DU COLLET La présente invention a pour objet un nouveau type d'inoculum pour la lutte biologique contre la galle du collet (Crown Gall) sous forme de bactéries d'Agrobacter radiobacter var radiobacter incluses dans un biopolymère. Elle a trait plus particulièrement à un procédé d'inclusion de micro-organismes du genre Agrobacterium radiobacter dans une matrice de gel de polymère, à des fins agronomiques. La maladie de la galle du collet provoquée par Agrobacterium tumefaclens cause des pertes très importantes en agriculture à travers le monde. De très nombreuses dicotylédones sont concernées mais les pertes les plus graves sont occasionnées aux arbres à noyaux et à pépins et aux plantes ornementales (Avertissements Agricoles, 18 novembre 1981, Bulletin NO 173). Le problème économique est d'autant plus grave dans certaines régions produisant des fruits ou de jeunes plantules qu'il n'existe aucun moyen de lutte chimique réellement efficace contre cette ) maladie(Acta 1981, Guide de Défense des cultures page 44 ). De plus l'exportation des fruits ou de plants atteints vers certains pays est sévèrement réglementée. On a estimé les pertes occasionnées pour les fruits à noyau en 1974 à 138 millions de dollars U.S. (F.I. FIKI and K.L. GILES, International Review of cytology, supplément 13, Acad. Press, 1981, p. 47-58). Ceci souligne l'importance qu'il faut accorder aux autres mesures, notamment au moyen de lutte biologique existant. Les travaux de KERR (J. Appl. Bact. 35, 493-497, 1972) ont montré qu'il est possible d'utiliser à titre préventif une souche d'Agrobactérium radiobacter var. radiobacter biotype 2, dénommée souche 84 (ou K 84) pour lutter efficacement contre la galle du collet (KERR, Departement of Plant Pathology, Waite Agricultural Research Institue, University of Adelaide, Gen Osmond, South Australia 5064). Cette souche est commercialisée soit sous forme de culture liquide (KERR, A. 1975, Waite Agricultural Research Instute, Biennial Report, U. Adelaide, P. 4), soit sous forme de culture absorbée sur de la tourbe (DYE D.W. 1975, Commercial Hort. 7, 5-7), soit sous forme d'un emballage unitaire constitué par une bolte de Pétri (Phytom. Défenses des Cultures, janvier 1982, P. 43). Dans tous les cas, le concept général suivi pour préparer ces inoculums d'Agrobacterium radiobacter, consiste à considérer que pour assurer la survie de la bactérie, il faut conserver dans les inoculums une certaine humidité. De cette manière, les icoculums décrits dans l'art antérieur contiennent, outre le micro-organisme, une teneur en eau importante et des éléments nutritifs issus de la culture de la bactérie. C'est pour cela que ces inoculums demeurent fragiles vis-à-vis des contaminants et résistent mal au-delà d'une quarantaine de degrés. I1 est nécessaire de les conserver à basses températures et leur durée de vie est limitée. Du fait de leur présentation, au moment de l'utilisation, ces inoculums doivent être mis en suspension dans l'eau et l'application sur les plantes ou les semences à traiter se fait au moment du semis ou de la plantation par trempage des semences ou des racines des plants. Ces moyens se sont avérés limités et des travaux de l'art antérieur pour obtenir des produits déshydratés ont montré qu'une dessiccation excessive réduit la viabilité de la bactérie (MOORE L.W., 1979, in : Soil Borne Plant pathogens, SCUIPPERS B. and GAMS W. Eds, Acad. Press. chapter 48, P. 558). L'objet de la présente invention est un inoculum d'Agrobacterium radiobacter, inclus dans un biopolymère, stable au cours du temps en les rendant aptes à un stockage prolongé, ne nécessitant ni traitement de stérilisation particulière, ni réfrigération ni agent de conservation. L'invention a également pour objet la préparation d'inoculums présentant une résistance très améliorée à l'effet de traitements thermiques à l'inverse des inoculums préparés jusqu'à ce jour. Elle a encore pour objet des inoculums qui peuvent être appliqués par des techniques avantageuses telles que la pulvérisation à sec sur les semences et/ ou les parties des plantes à traiter. Le moyen selon l'invention pour préparer ces inoculums d'Agrobactérium radiobacter consiste à l'inclure dans les polymères et à modifier la disponibilité de l'eau dans le biopolymère, exprimée en terme d'activité de l'eau, dans des zones où le pouvoir de solvation et calorique de l'eau est fortement diminuée. De cette manière, la culture d'Agrobacterium radiobacter est apportée dans la matrice d'un biopolymère. Un moyen pour conserver les cellules bactériennes consiste à abaisser l'activité de l'eau dans l'inoculum à des valeurs très faibles, en dessous de sa valeur critique, à une valeur inférieure à 0,5. I1 est donc possible de soustraire les Agrobacterium radiobacter à la réactivité de l'eau. Le concept de l'invention consiste à extraire du produit la fraction d'eau la plus disponible et à utiliser les caractéristiques du mélange biopolymère et substances solubles associées, agissant comme des solutés et à placer l'inoculum dans le domaine des activités de l'eau les plus faibles. Les valeurs optimales de l'activité de l'eau des inoculums de bactéries incluses sont préférentiellement inférieures à 0,1. On peut admettre que, d'une manière générale, pour les valeurs minimales de l'activité de l'eau, on conserve un nombre maximum de cellules viables au cours du stockage. Ces valeurs dépendent des conditions de milieu de culture et de la température La connaissance de la vitesse de destruction de l'Agrobacterium radiobacter en fonction de la température est un paramètre nécessaire pour la mise au point de procédés de préparation très sûrs pour les inoculums d'Agrobacterium radiobacter. Les travaux de la demanderesse ont montré que la résistance de la bactérie est maximale dans les inoculums aux températures élevées (50"C) pour les valeurs de l'activité de l'eau (aw) les plus faibles et que la perte de la survie intervient rapidement quand ces valeurs sont vers 0,5. Le procédé selon l'invention se caractérise par le fait que le séchage est suffisant pour abaisser l'activité de l'eau de l'inoculum en dessous des valeurs critiques où la survie des bactéries est possible. Les valeurs de l'activité de l'eau sont déterminées par la méthode dite des solutions aqueuses saturées (MULTON, 1981, Techniques d'analyse et de contrôle dans les industries agro-alimentaires, APRIA) ou par leur mesure directe à l'aide d'un hygromètre (Hygroscop) ROTRONIC BT, J. RICHARD et PEKLY. Pour maintenir l'activité de l'eau à une valeur optimale, on fait appel à un mode d'emballage étanche limitant les transferts d'eau entre l'atmosphère environnante et l'atmosphère interne des inoculums lors du stockage. Lorsque ces conditions sont réalisées, la survie de la bactérie Agrobacterium radiobacter est possible pendant plusieurs mois à la température du laboratoire. Selon l'invention, le milieu de culture d'Agrobacterium radiobacter renferme au moins un composé hydrocarboné, celui-ci peut être un composé usuel du groupe des sucres, et alcools, notamment di-ou-polyosides, polysaccharides. Le milieu de culture renferme également une source azotée usuelle, minérale et/ou organique telle que glutamate ou extrait de levure, par exemple. Le milieu de culture renferme également au moins un sel minéral de type macro ou oligoélément. Le choix de ces composés est important pour la survie des Agrobacterium radiobacter dans les polymères. Au-delà de certaines valeurs de l'activité de l'eau, l'eau peut devenir capable d'agir comme un solvant pour un plusieurs de ces composés solubles ou partiellement solubles : la mobilisation des substances réactives sur l'Agrobacterium radiobacter entraine l'altération des inoculums. De façon simple, selon l'invention, on prépare d'abord un milieu de culture que l'on ensemence avec la souche d'Agrobacterium radiobacter. Après quelques jours d'incubation, de préférence au moins deux, la culture est apportée à un gel de polymère puis le gel est déshydraté jusqu'au dessous d'un seuil d'hydratation à partir duquel l'eau devient incapable d'agir comme up solvant vis-à-vis d'un ou de plusieurs composés particuliers. Lorsque l'eau dans le polymère n' est plus capable de supporter la mobilité des -molécules réactives, on considère que l'inoculum est suffisamment déshydraté. Ce taux de déshydratation n'est pas une valeur absolue mais dépend de multiples facteurs tels que la température, la nature des composés, de leur taille et de leur stéréochimie, de leur interaction entre eux et avec le biopolymère. On doit choisir des composés du milieu de culture non réactifs vis-à-vis de l'Agrobacterium radiobacter. Le séchage peut se faire de plusieurs manières, en une ou plusieurs étapes. Toutefois, l'on doit éviter de faire appel à une technique qui entraîne la destruction des micro-organismes. Selon l'invention, un simple contact à l'air dans les conditions habituelles de température et d'humidité relative n'est pas suffisant. L'on doit faire appel à des techniques qui permettent d'obtenir une dessiccation plus poussée, telles que - solutions saturées en un composé présentant l'activité de l'eau requise évoluant vers l'équilibre avec l'inoculum, - substances déshydratantes, - séchage par air chaud. Avantageusement, pour obtenir la meilleure capacité d'élimination d'eau, on peut utiliser un procédé par atomisation. Le rendement d'un processus d'élimination d'eau par atomisation sera optimum pour une température d'air la plus élevée à l'entrée du séchoir, cette température doit être compatible avec la survie de la bactérie Agrobacterium radiobacter et pour une température d'air la plus basse possible à la sortie du séchoir. L'élimination de la dernière fraction d'eau dans les inoculums atomisés peut être réalisée par l'utilisation d'un lit fluidisé. Par ailleurs, on peut apporter l'inoculum sur un support (charge inerte) présentant l'activité de l'eau requise telle qu'à base de silice, notamment silice précipitée. Le polymère utilisé est avantageusement du groupe des polysaccharides bactérien ou végétal auquel on fait subir un traitement de réticulation au moins partiel. Par traitement de réticulation au moins partiel, on entend un traitement susceptible de modifier la structure du polysaccharide tel que tra tement thermique, traitement par un complexant ou par synergie ave un autre polysaccharide, le traitement de réticulation peut être réalisé aussi au cours de l'opération de déshydratatlon. Comme dit précédemment, on ajoute la culture dans une matrice de biopolymère. Cet apport est realisé en mélangeant la culture à une solution de polysaccharide dissous ou en dissolvant le polysaccharide dans la culture. Les inoculums se présentent sous forme de particules, à structure souple, facile à mettre en oeuvre : on peut utiliser avantageusement pour leur application la pulvérisation, la remise en suspension dans de l'eau ou dans une solution, l'apport direct de l'inoculum seul ou associé à une charge inerte. Comme déjà dit, avantageusement, on fait appel à des polymères de base de polysaccharides qui vont influer le devenir d'Agrobacterium radicbacter suite à l'inoculation - la taille des particules de polysaccharide permet la meilleure dissémination sur les semences ou le végétal à protéger et permet d'appliquer des quantités d'inoculums minimales - la poudre de polysaccharide se réhumidifie rapidement - le polysaccharide se lie facilement aux particules de sols, aux semences, aux parties de la plante à traiter telles que racines, collet, parties aériennes - le polysaccharide est rapidement dégradé, les Agrobacterium radiobacter sont libérés de leur matrice de polymère et assurent la protection recherchée contre l'agent de la galle" du collet. Dans le cas d'une dégradation lente du polymère, les molécules antagonistes (agropine) produites par la souche d'Agrobacterium radiobacter peuvent diffuser à travers la matrice du polymère. Mais la présente invention sera plus aisément comprise à l'aide des exemples suivants, donnés à titre indicatif, mais nullement limitatif. On utilise la souche K84 (Environmental Protection Agency - USA - 38087-2) 10) Préparation d'un inoculum polymère xanthane-farine de graines de caroube On prépare deux solutions (les valeurs sont données pour la préparation de 300 g d'inoculum). a) Solution de polysaccharide de type anionique résultant de la fermentation d'hydrates de carbone par un micro-organisme de genre Xanthomonas de PM > 2.106, que l'on désignera par produit 1. On amène 100 ml d'eau distillée à 70-800C, on ajoute 1,5 g du produit 1, on maintient cette température 20 à 30 minutes, sous agitation puis on le ramène entre 40 et 50 C. b) Solution de farine de graine de caroube = polysaccharide constitué d'unités- D - manno pyranosyl (liaisons 1 - 4) une sur quatre ou cinq étant substituée en C6 par un i - D - galacto-pyranosyl PM = 3,1 10 que l'on désignera par la suite par produit 2. On procède de la mye façon en remplaçant le produit 1 par 1,5 g de farine de graine de caroube (produit 2). Lorsque les deux solutions sont à 40-45 C, on ajoute sous agitation, à chacune d'elle, 50 ml de la culture d'Agrobacterium radiobacter. On verse alors, en agitant vigoureusement le mélange culture + polysaccharide dans le mélange culture + farine de graine de caroube. L'obtention d'un gel consistant est instantanée. On obtient deux types d'inoculums avec les milieux de culture suivants Inoculum A en g/l : mannitol 10, extrait de levure DIFCO 1, K2HPO4 0,5, NaCl 0,2, MgS047H20 0,2, FeC13 0,004. (milieu YEM : VINCENT - A manual for practical study of root nodule bacteria IBP - Handbook 215 Blackwell Scientific Publication Oxfort, page 169). Inoculum B en gil : saccharose 10, Nutrient Broth DIFCO 8, extrait de levure 1. (Anand et Heverlein - American Journal of Botany 64 (2) Pages 153-158, 1977). Le pH des milieux est ajusté à 6,8. 20) Préparation d'un inoculum polymère alginate CaS0, Deux étapes sont nécessaires a) Préparation de la suspension d'Agrobacterium radiobacter dans un alginate de viscosité comprise entre 150 10 3 et 1000 10-3 Pa/S. On dissout dans 80 ml de culture bactérienne 1 g d'alginate. Pour cela, on disperse la poudre en pluie fine sur la culture en l'agitant continuellement jusqu'à solubilisation complète de l'alginate. b) Gélification d'Agrobacterium radiobacter On ajoute à la suspension d'Agrobacterium radiobacter dans l'alginate 20 ml d'une solution de CaS042H20 à 6 g/l. La prise en masse du gel est instantanée On obtient un inoculum C avec les composés du milieu de culture suivants en g/l : mannitol 10, extrait de levure DIFCO 1, K2HPO4 0,5, NaCl 0,2, MgSO4 4H20 0,2, FeCl3 0,004. (milieu YEM). Le pH du milieu est ajusté à 6,8. Comme dit précédemment, le séchage est un point important puisque les modes de séchage utilises dans l'art antérieur pour la survie des micro-organismes tels qu'Agrobacterium radiobacter conduisaient à la destruction des bactéries. Dans les exemples suivants, on règle l'activité de l'eau au moyen de solutions saturées dont les valeurs des activités de l'eau à une température de 250C sont exposées dans le tableau 1. : SOLUTES (solutions saturées) : Activité de l'eau à 250C : Actigel (composé déshydratant) : 0,04 : NaOH 0,0695 KC2H302 - 1,5 H20 . 0,226 : MgC12 0,3273 K2C032H20 0,438 : CuC12 0,686 : NaCl 0,7532 : KC1 : 0,8432 On a illustré dans les diverses courbes de survie l'influence d'un certain nombre de paramètres. FIGURE 1 : Elle représente les courbes de survie des inoculums A (courbe 1) et B (courbe 2) après 15 Jours de stockage à 28"C, en fonction de l'activité de l'eau. Ces courbes montrent que la survie d'Agrobacterium radobacter est maximale lorsque l'activité de l'eau de l'inoculum est la plus faible, elles montrent, en outre, l'importance de la composition du milieu de culture sur la survie de la bactérie. Les composés du milieu de culture contenus dans l'inoculum B sont plus réactifs que ceux de l'inoculum A. FIGURE 2 : Elle représente les courbes de survie de l'inoculum A à deux activités de l'eau (I aw : 0,03 et 2 aw : 0,11) au cours du stockage à 280C. La survie d'Agrobacterium radiobacter est possible dans un biopolymère déshydraté. FIGURE 3 : Elle représente les courbes de survie d'Agrobacterium radiobacter de l'inoculum A en fonction de l'activité de l'eau au cours du stockage à 550C (1 aw = 0,03 ; 2 aw = 0,07 ; 3 aw = 0,22 ; 4 aw = 0,32 et 5 aw = 0,43) Elle illustre la résistance de la bactérie dans les biopolymères et notamment lors d'un traitement thermique important. FIGURE 4 : Elle représente l'évolution de l'activité de l'eau dans l'inoculum A en fonction de la durée de stockage à 380C et à HR = 90 % ensaché dans différents matériaux d'emballage (I. emballage polypropylène (RP Films) ; 2. emballage métallisé polypropylène (RP Films) et 3. emballage métallisé en polyester-propylène (Clarylène RP Films). Le 3ème type d'emballage est totalement étanche à la vapeur d'eau, et la figure montre l'importance de l'étanchéité de l'emballage. Le tableau II illustre un essai de contrôle biologique par saupoudrage des inoculums A d'Agrobacterium radio bacter, souche 84 au niveau d'une plaie d'inoculation effectuée à la base de la tige des plants de tomate. Les plants ont été préalatlement infectés par une souche d'Agrobacterium tumefa:iens virulente (C58 p Ti C58, Phabagen Collection. Department of molecular cell biology. De Mithof 3 584 CH UTRECHT, The Netherlands). Cet essai montre que la prévention de la galle du collet causé par une souche virulente est de 100 Z lorsque l'on applique préventivement des inoculums de bactéries antagonistes inclus dans un biopolymère déshydraté. TABLEAU II Contrôle biologique de la galle du collet de plants de tomate : INOCULUMS : (Agrobacterium : POIDS DES GALLE DU COLLET (g/plant) : tumefaciens) : C 58 pTi C58 : (0,2 ml culture : 4,4 3,7 2,1 4,1 2,8 4,2 4,0 3,6 5,1 3,1 2,1: : liquide / Plant : C58 pTi C58 x : - Agrobacterium : radiobacter 84 : (culture liquide) : 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 : 0,2 ml/plant : - Agrobacterium : radiobacter 84 Inoculum A : 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 : 2 mg/plant Age des plantules : 60 j. Culture sur milieu vermiculite perlite + NPK et oligoéléments REVENDICATIONS 10) Inoculum- caractérisé par le fait qu'il est sous forme d'Agrobacterium radiobacter var radiobacter inclus dans un biopolymère. 20) Procédé de préparation d'inoculums d'Agrobacterium radiobacter à longue viabilité et à résistance à la température améliorée selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'on inclut la bactérie d'Agrobacterium radiobacter dans son milieu de culture, dans un gel de polymère, et que l'on abaisse l'activité de l'eau dans l'inoculum en dessous de sa valeur critique à une valeur inférieure à 0,5 et qu'on la maintient à cette valeur. 30) Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'on abaisse l'activité de l'eau dans l'inoculum en dessous de 0,1. 40) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'on maintient l'activité de l'eau dans l'inoculum en le conservant dans un emballage étanche. 5 ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que le milieu de culture renferme - une source hydrocarbonée du groupe des sucres, alcools, et notamment polysaccharides, di-ou-polyosides - une source azotée minérale et /ou organique - un sel minéral. 6 ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que le polymère est du groupe des polysaccharides auquel on fait subir un traitement de réticulation au moins partiel. 70) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que l'on abaisse l'activité de l'eau par séchage par atomisation. 80) Application de l'inoculum selon la revendication 1, à la pulvérisation à sec, sur les semences et les parties des plantes à traiter.