FR 2528853 A1 19831223 FR 8210891 A 19820622 "Nouveaux trisaccharides à structure D-glucosamine, acide L-iduronique, D-glucosamine et leur préparation" L'invention a pour objet de nouveaux trisaccharides formés d'un enchainement de motifs respectivement à structure D-glucosamine, acide L-iduronique, D-glucosamine. Les trisaccharides'de l'invention répondent plus spécialement à la formule I dans laquelle - R1, R3, R4 et R8 représentent un atome d'hydrogène, un groupe sulfate, ou un groupe protecteur, - R2, R5, R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur, - R représente un groupe alcoyle, notamment de 1 à 3 atomes de carbone, en particulier le groupe méthyle, ou un cation métallique tel que le sodium, ou organique tel qu'un dérivé de base organique azotée, - les radicaux Z, identiques ou différents, représentent un groupe fonctionnel azoté, ou un groupe azide, ou amine ou -NHS03 . Une famille préférée de trisaccharides de l'invention renferme avantageusement au moins un motif, de préférence les deux motifs D-glucosamine, comportant un groupe N-sulfate en position 2. Dans un groupe préféré de cette famille, R1 représente un groupe -S03-. Des trisaccharides préférés parmi ceux évoqués ci-dessus sont en outre avantageusement substitués en position 6 par un groupe -O-sulfate, c'est-à-dire qu'au moins l'un des substituants R3 ou R8, avantageusement les deux, représentent un goure 503 Dans une autre famille préférée, les trisaccharides ci-desss renferment en outre un motif acide L-iduronique comportant un groupe -O-sulfate en position 2. Les positions restantes de ces trisaccharides sont libres ou protégées par. des groupements de bloquage dont la nature est choisie selon l'application envisagée pour ces produits. D'une manière avantageuse, la séquence trisaccharidique de l'invention se retrouve dans des fragments ou des fractions d'héparine ou dthéparan-sulfate possédant notamment une activité spécifique anti-Xa (Yin et Wessler) plus élevée que celle de l'héparine et une activité anticoagulante globale, mesurée selon le titre USP,plus faible. On rappelle que les titres Yin et Wessler et USP sont définis notamment dans la demande de brevet FR No 78 31857 du 6 novembre 1978 au nom de la Demanderesse. Les produits de l'invention sont donc particulièrement intéressants en tant qu'intermédiaires de synthèse pour l'obtention de produits doués du activait dans des tests de coagulation spécifiques de certains facteurs et plus spécialement du facteur Xa. Ils sont également avantageusement utilisables comme produits de référence pour l'étude de ce type de structure. On mesure, en outre, l'intérêt de leur obtention par voie de synthèse, selon un processus de mise en oeuvre aisée. Le procédé de préparation de trisaccharides de l'invention comprend : la condensation de dérivés réactifs d'un monosaccharide à structure D-glucosamine et d'un disaccharide formé d'un enchainement demotifs à structure acide L-iduronique/-D-glucosamine/ répondant aux caractéristiques suivantes. Dans ces composés de départ, toutes les positions sont bloquées exceptées celles devant intervenir pour l'établissement d la liaison glycosidique entre le monosaccharide et le disaccharide. Pour l'établissement d'une liaison de type 1,41jC, on a recours à un monosaccharide possédant un groupe réactif en position 1 et à un disaccharide possédant en position 4 un groupe capable de réagir avec le groupe réactif du monosaccharide. Les halogénures du monosaccharide étant aisément accessibleson base avantageusement la condensation sur une réaction entre un halogénure du monosaccharide et un alcool du disaccharide. Comme déjà souligné, les autres positions de ces composés doivent etre bloquées et ce, par des groupements de bloquage n'intervenant pas dans la réaction due condensation, compatibles entre eux et éliminables soit à la fois soit par séquence pour introduire des groupements fonctionnel désirés ou libérer certains groupements -OH. Les positions des motifs de la chaine tri sec charidique destinées à etre occupéespar des groupements N-sulfate sont substituées par des groupements azotés precurseurs, inertes vis-à-vis de la réaction de glycosyla- tion et permettant l'introduction des groupements souhaités sur les motifs de la chaine trisaccharidique en particulier l'introduction de groupes -O-sulfate. Pour permettre l'introduction de ces groupes Sulfate, selon un mode préféré de réalisation del'invention, on utilise, comme groupes de bloquage dans les produits de départ, des groupes -O-CO-CH3. A partir de ces groupes-O-CO-CH3, on peut libérer les radicaux hydroxyle, puis les soumettre à une réaction de sulfatation, tandis que les positions destinées à ètre occupées par des groupes -OH, sont avantageusement substituées par des radicaux inertes durant la réaction de sulfatation, tels que les radicaux benzyle. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on fait réagir, dans une première étape un monosaccharide et un disaccharide répondant respectivement aux formules I et Il dans lesquelles - X et Y représentent deux groupements réactifs capables de donner lieu à l'établissement d'une liaison glycosidique, en particulier, X représente un halogène, plus spécialement du brome et Y un groupe -OH -R1 à R8 représentent desgroupements de bloquage des radicaux -OH et plus spécialement R1, R3,R4 et R8 représentent des groupes -COCH3 et R2,R5,R6 et R7 représentent des groupes benzyle - z représente des groupements fonctionnels azotés capables de conduire au groupe N-sulfate désiré tout en permettant la réalisation du processus de synthèse de l'invention, et en particulier, un groupe azide pour le monosaccharide et un groupe -NHA pour le disaccharide, dans lequel A représente un groupe benzyloxyearbonyle et - R représente un groupe de bloquage du radical carboxyle, notamment un groupe alcoyle,tel que le radical méthyle. Le disaccharide de formule III est avantageuse ment obtenu selon le procédé de la demande de brevet FR 82 01575 du 1.02.1982 au nom de la Demanderesse. Après avoir constitué la channe trisaccharidique selon l'enchainement souhaité, on procède au cours d'une deuxième étape, à l'introduction des groupes -O-sulfate par acétolyse des groupes O-acétyle, notamment à l'aide de soude puis à une réaction de sulfatation, par exemple, à l'aide d'un complexe du type triméthylamine/SO3: Au cours d'une étape supplémentaire, on procède ensuite à l'élimination des différents groupements bsnzyle afin de libérer les radicaux -OH qui les protègent, avantageusement par hydrogénation à l'aide d'hydrogène en présence de catalyseur, puis on soumet les groupes amine desmotifs glucosamine à une réaction de sulfatation, pour obtenir les dérivés -NHS03 correspondants. Les produits intermédiaires mis en oeuvre dans ce procédé sont nouveaux et, en tant que tels, entrent dans le cadre de l'invention. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans les exemples qui suivent, Les formules des composés dont question dans ces exemples sont représentées sur la figure unique. Les numéros indiqués correspondent à ceux utilisés dans les exemples pour désigner les mornes composés.Les symboles utilisés dans la figure ont les significations suivantes : Ac : acétyle, Bn : benzyle, S : SO3- , Me : méthyle, A : benzyloxycarbonyle, TMA : triméthylamine. EXEMPLE 1 - Synthèse du trisaccharide 3 Une solution du bromure 1 (préparé selon H.PAULSEN et W. STENZEL, Chem. Ber 111 (1978) 2334-2347, 110 mg, 0,25 mt4) et de l'alcool 2 (préparé selon la demande de brevet FR, No 82.01575 au nom de la Demanderesse, 113 mg, 0,13 ntt) dans du dichlorométhane anhydre (2,5 ml) est agitée à l'abri de la lumière sous atmosphère d'argon sec en présence de tamis moléculaire 4 A (poudre, 100 mg) pendant 30 mn. Après refroidissement à 200C, de la symcollidine (70 p1,055mM) et du triflate d'argent (78mg,0,30 mM) sont ajoutés successivement et l'agitation est maintenue dans ces conditions pendant 2 heures.Le mélange réactionnel est alors dilué avec du dichîorométhane (50 ml), les solides sont essorés, et le filtrat est lavé avec une solution 0,1 M d'acide chlorhydrique glacée, avec de l'eau, avec une solution aqueuse saturée d'hydrogénocarbonate de sodium, avec de l'eau, séché (sulfate de sodium), filtré et évaporé. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (18 g). L'élution par le mélange hexane acétate d'éthyle (4:3,v/v) donne le trisaccharide 3 sous forme d'un verre incolore qu'il n'a pas été possible de cristalliser (139 mg, 88X) ; [&alpha;]D =+ 830 (cl, chloroforme) Spectre RMN (90 MHz,CDCl3) : : 7,25 (m,25H, 5Ph.); 5,44 (d. de d.,,, 1H, H3,é J 2", 3" : 10,5 Hz,J3", 4" : 9 Hz) 5.26 (d, 1H, Hia l"3 2" : 3,5 Hz) ; 3,59 (s, 3H,COOMe) ; 3,06 (d. de d. 1H, H", J1 ,2 3,5 Hz, 2,,,3h 10,5 Hz) 2,12, 2,08, 2.01 et 1,97 (4s, 1-2H, 4 OAc,'. EXEMPLE 2 - Synthèse du trisaccharide 4 Une solution de trisaccharide 3 (122 mg) dans un mélange de 1,2-diméthoxyéthane (6ml) et de méthanol (2ml) est agitée à OOC. Une solution aqueuse 1 M de soude (2ml) est ajoutée goutte à goutte en 10 mn, et le mélange réactionncl est agité 6 heures à OOC. De l'acide chlorhydrique 1 M est alors ajouté goutte à goutte jusqu'à pH = O (apparition d'un précipité blanc). Le mélange est versé dans de l'eau glacée (100 ml) et extrait avec du chloroforme (5 fois 10 ml). Les phases organiques sont lavées avec de l'eau glacée, séchées (sulfate desodium), filtrées et évaporées. Le résidu sirupeux est dissous dans du méthanol (2 ml) et traité par une solution éthérée de diazométhane jusqu'à persistance de la coloration jaune. Après 30 mn., le mélange réactionnel est évaporé à sec. Le résidu est chromatogra phié sur une colonne de gel de silice (10 g). L'élution par le mélange acétate d'éthyle/hexane (2:1,v/v) donne le trisaccharide 4 sous forme d'une mousse incolore qu'il n'a pas été possible de cristalliser (85 mg, 81%) ; D = + 77 (cl,chloroforme), spectre RMN (90 MHz, CDC13) : absence de signaux OAc" (vers # = 2 ppm). Analyse élémentaire : en accord avec la structure recherche. EXEMPLE 3 - Synthèse du trisaccharide 5 A une solution du derivé 4 (41 mg) dans le DMF (2 ml) on ajoute du complexe triméthylamine/trioxyde de soufre (TMA/S03 : 60 mg ; 2,5 équivalents par OH). Après une nuit à 500C, la réaction est complète. Du méthanol (0,5ml) est ajouté puis la solution est déposée sur une colonne de Séphadex LH-20 (1,5 x 25 cm) équilibrée dans un mélange chloroforme/méthanol (1:1 ; v/v). L'élution par le meme mélange permet de séparer le produit de la réaction de l'excès de réactif et du solvant de réaction. Le résidu obtenu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (10 g), élué par un mélange acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/ eau (98 : 56 : 13 : 32 ; v/v/v/v). Le produit pur obtenu est dissous dans du méthanol, puis passé à travers une colonne de résine Dowex 50W x 4, Na (5ml). Après évaporation et séchage, on obtient le dérivé 5 (58 mg,100%).Il est homogène en c.c.m. (acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/ eau : 5 : 5 : 1 : 3 ; v/v/v/v et acétate d'éthyle/méthanol/ acide acétique ; 7 : 3 : 0,1 : v/v/v). 20 = + 55 (méthanol). Le spectre de RMN est compatible avec la structure recherchée. EXEMPLE 4 - Synthèse du trisaccharide 6 Une solution du composé 5 (20 mg) dans un mélange de méthanol (2ml) et d'eau (0,5ml) est agitée pendant 96 heures sous une pression d'hydrogène de 0,2 bar, en présence de Pd/C à sw (20 mg). Le catalyseur est alors éliminé par filtra tion. L'analyse en ultra-violet confirme l'absence de noyaux aromatiques. Après évaporation, le produit est engagé dans la synthèse du trisaccharide 7. EXEMPLE 5 : Synthèse du trisaccharide 7 Le dérivé 6 obtenu précédenunent est dissous dans l'eau (2 ml). Le pH de la solution est ajusté à 9,5 puis il est maintenu à cette valeur au moyen d'un pH-stat. On ajoute alors le complexe TMA/SO3 (14 mg , 5 éq./NH2) . Après une nuit, la meme quantité de complexé est ajoutée. Après 48 heures, le pH est amené à 12 au moyen de. soude 2M, puis il est maintenu à cette valeur pendant 2 heures. Après neutralisation par l'acide chlo rhydrique, le mélange réactionnel est chromatographié sur une colonne de Séphadex G-25, éluée avec del'eau. Le compose 7 est détecté par une réaction colorée au carbazole, caractéristique des acides uroniques (Bitter et Muir, Anal. Biochem. 4 (1962) 330-334). Ces fractions contenant 7 sont regroupées et passées au travers d'une colonne de résine Dowex 50W x 4,Na+ éluée avec de l'eau. Après lyophilisation, on obtient 7 (4,5 mg). L'analyse colorimétrique des constituants glucidiques donne 2,55 moles d'acide uronique pour 5,15 moles de gluc) samine (rapport 1/2). Le spectre de RMN de ce produit confirme la structure (séquenef anomérie des liaisons, substitutions par les sulfates). REVENDICATION Trisaccharides caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule dans laquelle - R1, R , R4 et R8 représentent un atome d'hydrogène, un groupe sulfate, ou un groupe protecteur, - R2, R5, R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur, - R représente un groupe alcoyle, notamment de 1 a 3 atomes de carbone, en particulier le groupe méthyle, ou un cation métallique tel que le sodium, ou organique tel qu'un dérivé de base organique azoté - les radicaux Z, identiques ou différents, représentent un groupe fonctionnel azoté, ou un groupe azide, ou amine ou -NtlS03 .