FR 2532178 A1 19840302 FR 8313971 A 19830831 1 2-532178 La présente invention concerne un procédé pour la stabilisation du Facteur de nécrose tumorale et une solution aqueuse ou une poudre stables contenant ce facteur. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour stabiliser le Facteur de nécrose tumorale dans lequel on ajoute un agent stabilisant choisi parmi un agent tensio-actif non ionique, un sucre particulier ou un composé apparenté aux sucres et leurs mélanges à une solution aqueuse ou à une poudre contenant le Facteur de nécrose tumorale L'invention concerne également une solution aqueuse ou une poudre stables contenant le facteur de nécrose tumorale et une quantité efficace de l'agent stabilisant choisi parmi un agent tensio-actif non ionique, un sucre particulier, un composé apparenté aux sucres et leurs mélanges - Carswell et coll ont découvert un Facteur de nécrose tumorale (désigné ci-après pour simplifier par l'abréviation "FNT"). Ils ont signalé que le FNT est une substance présente dans le sérum des souris, des rats ou des lapins traités par une endotoxine que l'on a sensibilisés avec un immunopotentiateur tel que le bacille de Calmette et Guérin (BCG), une corynébactérie ou le Zymosan, et que le FNT provoque une nécrose de diverses tumeurs transplantées à la souris sans effet toxique sur le receveur portant la tumeur lvoir Proc Nat. Acad Sci USA, 72 ( 9), 3 666-3 670 ( 1975)l. Ensuite, de nombreux articles ont été publiés relative- ment aux propriétés biochimiques et physiologiques du FNT de souris et du FNT de lapin lvoir par exemple, Proc, Nat Acad Sci USA, 73 ( 2), 381-385 ( 1976); Expl Cell Biol, -_ 53-60 ( 1979); Br J, Cancer, 38, 302-309 ( 1978); et ibid, 42, 416-422 ( 1980)l Il faut noter qu'un facteur cytotoxique, qui est une substance que l'on a suggéré être identique au FNT, a également été mentionné par certains chercheurs lvoir par exemple Infect Immun, 28 ( 1), 204-211 ( 1980)l. La production in vitro de FNT a également été mention- née Parexemple Matthews a déterminé et indiqué les conditions opti- males dans lesquelles le FNT est produit in vitro par les phagocytes mononucléaires provenant de divers tissus de lapins normaux ou ayant reçu une injection de BCG lvoir Br J Cancer, 44 418-424 ( 1981)l. Selon sa publication, les quantités optimales de FNT sont produites par des phagocytes mononucléaires en présence d'une endotoxine et les 25321 78 macrophages alvéolaires et péritonéaux sont les producteurs les plus puissants du FNT De plus, selon cette publication, les macrophages des lapins ayant reçu une injection de BCG produisent nettement plus de FNT que ceux des animaux normaux Entre temps, Mfnnel et coll. ont signalé que les cellules d'un exsudat péritonéal enrichi en macrophages libèrent un facteur cytotoxique lorsqu'elles sont sti- mulées in vitro avec un lipopolysaccharide (endotoxine) lvoir Infect Immun, 30 ( 2), 523-530 ( 1980); et ibid, 33 ( 1), 156-164 ( 1981)l. En ce qui concerne les propriétés caractéristiques du FNT, on sait que le FNT, en plus de son activité d'induction d'une nécrose dans diverses tumeurs, exerce une activité non spécifique de l'espèce animale Par exemple, le FNT de lapin peut provoquer une nécrose des tumeurs de la souris, De plus, on sait que le FNT in vitro, n'exerce pas d'effet cytotoxique notable sur les cellules normales et a un effet cytotoxique sur certains types de lignées cellulaires néoplasiques (par exemple les cellules L-M et Meth-A). Comme précédemment indiqué, le FNT a une activité antitumorale, exerce une activité non spécifique de l'espèce animale et ne provoque aucun effet nuisible notable sur les cellules normales Donc, on a beaucoup attendu de l'application clinique du FNT comme médicament antitumoral. On sait également que seule une très petite quantité de FNT est produite chez un mammifère ou dans un système de culture tissulaire Par conséquent, pour assurer une application clinique étendue et sans danger du FNT comme médicament antitumoral, il est absolument indispensable d'isoler et de purifier fortement le FNT brut produit chez un mammifère ou dans un système de culture tissu- laire De plus, lorsqu'on effectue la production à grande échelle de FNT destiné à l'emploi comme médicament antitumoral, il est généra- lement nécessaire de stocker le FNT très purifié sous forme d'une solution ou d'une masse congelée pendant une période prolongée et de lyophiliser la solution de FNT Cependant, la demanderesse a découvert que l'activité du FNT très purifié diminue fortement lorsdu stockage, de la congélation, de la décongélation et de la lyophili- sation. Pour autant que le sache la demanderesse, aucune publication ne mentionne l'étude de la stabilité du FNT très purifié. Dans ces conditions, on ne peut pas assurer une fourniture efficace et régulière de FNT très purifié, en particulier à l'échelle commer- ciale, bien que l'on sache que le FNT est unmédicament antitumoral efficace. Pour résoudre la difficulté exposée ci-dessus, rela- tive à la stabilité du FNT, la demanderesse a effectué des études importantes et poussées Ces études ont débouché sur la découverte très surprenante que l'addition d'une quantité efficace d'un agent tensio-actif non ionique, d'un sucre particulier, d'un composé appa- renté aux sucres ou de leurs mélanges comme agent stabilisant à une solution aqueuse ou à une poudre contenant du FNT, permet de conserver le FNT pendant une période prolongée sans qu'il perde son activité et rend le FNT stable à la congélation, la décongélation, la lyophi- lisation, le traitement par la chaleur ou similaires A partir de cette nouvelle découverte, la demanderesse a réalisé l'invention. L'invention a donc pour objet de fournir un procédé pour stabiliser le FNT et également de fournir une solution ou une poudre stables conservant son activité pendant une période prolongée et qui est stable à la congélation, la décongélation, la lyophilisa- tion, le traitement par la chaleur ou similaires. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description qui suit faite en regard des dessins annexés sur lesquels la figure 1 est un graphique montrant l'effet de la concentration du polyoxyéthylène ( 20) monooléate de sorbitane (Tween 80) sur l'activité résiduelle du FNT après 7 jours de stockage à 40 C; la figure 2 est un graphique montrant l'effet de la concentration du polyoxyéthylène ( 6) stéarate (Nissan Nonion S-6) sur l'activité résiduelle du FNT après 7 jours de stockage à 4 VC la figure 3 est un graphique montrant l'effet de la concentration du polyoxyéthylène ( 23) éther laurylique (Brij 35) sur l'activité résiduelle du FNT après stockage pendant 7 jours à 4 *C;. la figure 4 est un graphique montrant l'effet de la concentration du polyoxydthylène ( 60) huile de ricin hydrogénée 2532 '178 (NIKKOL HCO-60) sur l'activité résiduelle du FNT après 7 jours de stockage à 4 C; - la figure 5 est un graphique montrant l'effet de la concentration d'un polymère séquencé polyoxyéthylène-polyoxypropylène (Pluronic F 68) sur l'activité résiduelle du FNT après 7 jours de stockage à 4 C; et la figure 6 est un graphique montrant l'effet de la concentration du tréhalose sur l'activité résiduelle du FN Taprès 7 jours de stockage à 4 C. On trouvera une description plus détaillée des figures dans l'exemple 3. Selon un de ses aspects, l'invention concerne un pro- cédé pour stabiliser le FNT qui comprend l'addition à une solution aqueuse ou une poudre contenant du FNT d'une quantité efficace d'un agent stabilisant choisi parmi un agent tensio-actif non ionique, au moins une substance choisie parmi le groupe constitué par le D-glu- cose, le D-galactose, le D-xylose, l'acide D-glucuronique, un sel d'acide D-glucuronique, le tréhalose, un dextrane et un hydroxyéthyl- amidon, et leurs mélanges. Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne une solution aqueuse ou une poudre stables contenant du FNT et une quantité efficace d'un agent stabilisant choisi parmi un agent tensio- actif non ionique, au moins une substance choisie parmi le groupe constitué par le D-glucose, le D-galactose, le D-xylose, l'acide Dglucuronique, un sel d'acide D-glucuronique, le-tréhalose, un dextrane et un hydroxyéthylamidon et leurs mélanges. Le terme "FNT" tel qu'on l'emploie ici désigne une substance à activité physiologique dont la production est-induite par l'administration à un mammifère d'au moins une substance capa- ble de stimuler le système réticulo-endothéiial puis l'injection au mammifère d'une endotoxine d'une bactérie à gram négatif ou par l'addition d'une endotoxine d'une bactérie à gram négatif à un système de culture tissulaire contenant des macrophages activés d'un mammifère, cette substance provoquant la nécrose de certaines tumeurs lorsqu'elle est transférée passivement à des mammifères porteurs de tumeur, ou une substance produite selon un procédé quel- 25321 78 conque et ayant des propriétés semblables à celles de la substance à activité physiologique ci-dessus. Le FNT qu'on emploie dans l'invention est produit selon plusieurs procédés connus dans l'art, y compris le procédé de Matthews et coll lvoir Br J Cancer, 42, 416-422 ( 1980)l et le procédé de Green et coll lvoir J Natl Cancer Inst, 59 ( 5), 1519-1522 ( 1977)l. Les modes opératoires typiques pour préparer le FNT que l'on emploie dans la présente invention sont les suivants: Tout d'abord, on injecte par voie intraveineuse ou par voie intrapéritonéale à un mammifère (par exemple la souris, le lapin, le cobaye, etc) au moins une substance capable de stimuler le système réticulo-endothélial Comme substances capables de stimuler le système réticulo-endothélial, on emploie généralement des bactéries à gram positif, des protozoaires ou des levures, qu'on administre au mammifère sous forme de micro-organismes vivants, de micro-orga- nismes morts (par exemple après traitement par la chaleur ou trai- tement par la formaline) ou d'extraits cellulaires de micro-organismes. Des exemples de bactéries à gram positif comprennent des propioni- bactéries telles que Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum) et Propionibacterium granulosum (Corynebacterium granulosum), des mycobactéries telles que le bacille de Calmette et Guérin (BCG) et Mycobacterium smegmatis, et des nocardias telles que Nocardia ery- thropolis et Nocardia gardneri Comme protozoaires appropriés, on peut employer par exemple Plasmodium ou Toxoplasma Comme levure appropriée, on emploie généralement le Zymosan extrait de Saccharomyces cerevisiae ou d'autres On peut également employer des composés synthétiques de poids moléculaire élevé tels qu'un copoly- mère de pyranne Ensuite, 7 à 14 jours après 1 ' administration de la substance précitée capable de stimuler le système réticulo-endothé- lial, on injecte par voie intraveineuse audit mammifère une endo- toxine d'une bactérie à gram négatif, par exemple un lipopolysac- charide dérivé d'Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, ou Salmonella typhosa Ensuite, 1,5 à 2 h après l'injection, on prélève des humeurs de l'organisme (par exemple le liquide d'ascite, la lymphe, etc) et/ou du sérum ou du plasma dudit mammifère ou on homo- généise des viscères tels que le foie, la rate, etc et on les extrait avec une solution salée physiologique On peut employer ces humeurs de l'organisme, sérum, plasma et/ou extraits de viscères comme solutions brutes de FNT Cependant, parmi eux, on emploie généralement le sérum ou le plasma. Comme précédemment mentionné, le procédé de prépara- tion du FNT destiné à être employé dans l'invention n'est pas limité au procédé ci-dessus Le procédé reposant sur le génie génétique et le procédé de culture tissulaire dans lesquels on emploie des cellules ayant une capacité de production du FNT peuvent également être utili- sés efficacement Il convient de noter que ces procédés s'appliquent également à la production de PNT humain. Le FNT brut produit selon l'un quelconque des procédés précédemment indiqués peut être purifié par emploi des techniques biochimiques classiques mentionnées ci-après isolément ou en combi- naison pour fournir une solution aqueuse purifiée de FNT qu'on lyo- philise y obtenir une poudre de FNT purifié Comme technique bio- chimique appropriée de purification du FNT, on peut mentionner par exemple une technique de relargage dans laquelle on emploie le sulfate d'ammonium, une chromatographie d'échange d'ions dans laquelle on emploie une résine échangeuse d'anions, une technique de filtration sur gel et une technique d'électrophorèse Lorsque la pureté du FNT est accrue par l'emploi des techniques de purification précitées, on sait que le FNT devient progressivement instable Par exemple, un échantil- lon de FNT purifié pour qu'il ait une activité spécifique de 500 000 unités/mg (l'activité spécifique est exprimée en unités d'ac- tivité de FNT par mg de protéines; l'unité d'activité de FNT est définie ci-après) est très instable comme l'indiquent les valeurs figurant dans les exemples Même des échantillons de FNT ayant une activité spécifique inférieure à 500 000 unités/mg présentent égale- ment une baisse de l'activité respective dans une certaine mesure lorsqu'on les stocke ou qu'on les soumet à une congélation, une décon- gélation, une lyophilisation ou à d'autres opérations. Par conséquent, l'invention concerne la stabilisation du FNT que l'on a fortement purifié et que l'on a rendu instable Le FNT à stabiliser selon l'invention peut être sous forme d'une solution 2532 1 78 ou d'ur poudre Cependant, on préfère que le FNIT à stabiliser soit sous forme d'une solution. On préfère que la solution de FNT à stabiliser selon l'invention ait normalement un p H de 5 à 10, et, de plus, on préfère que le solvant de la solution de FNT à stabiliser soit un tampon approprié Comme tampon approprié, on peut mentionner par exemple un tampon phosphate et un tampon tris(hydroxméthyl)aminométhane-HCL. A la demande, on ajoute un sel tel que le chlorure de sodium ou le chlorure de potassium à la solution de FNT Par exemple, on ajoute un sel à la solution de FNT afin de préparer une solution isotonique lorsque la solution de FNT est destinée à être injectée Le but de l'addition du sel n'est pas limité à celui précité La concentration d'un tel sel dans la solution de FPNT peut Otre déterminée selon la raison de l'addition du sel Par exemple, lorsque la solution finale de FNT est utilisée pour l'injection, on prépare une solution iso- tonique à partir de la solution de FNT par addition de chlorure de sodium jusqu'à une concentration de 0,15 M. Selon le procédé de l'invention, on ajoute à une solution aqueuse ou à une poudre contenant du FNT une quantité efficace d'un agent stabilisant choisi parmi un agent tensioactif non ionique, au moins une substance choisie parmi le groupe consti- tué par le D-glucose, le D-galactose, le D-xylose, l'acide D-glu- curonique, un sel d'acide D-glucuronique, le tréhalose, un dextrane, et un hydroxyéthylamidon, et leurs mélanges. La substance chbisie parmi le groupe constitué par le D-glucose, le Dgalactose, le D-xylose, l'acide D-glucuronique, un sel d'acide D-glucuronique, le tréhalose, un dextrane et un hydroxy- éthylamidon est appelée fréquemment ci-après "le sucre ou les composés apparentés aux sucres". Comme agent tensio-actif non ionique approprié A employer dans l'invention, on peut mentionner un polyoxyéthylène- ester d'acide gras, un polyoxyéthylène-éther alkylique, un poly- oxyéthylène-éther alkylphénylique, un polyoxyéthylène-ester d'acide gras du sorbitane, un polyoxyéthylène-ester d'acide gras de la gly- cérine, un polyoxyéthylène-huile de ricin hydrogénée, un polyoxy- éthylène-huile de ricin, un polyoxyéthylène-polyoxypropylène-éther Q alkylique, un polymère séquencé de polyoxyéthylène-polyoxy Propylène, un ester d'acide gras du sorbitane, un ester d'acide gras du sac- charose, un ester d'acide gras de la glycérine et similaires, Du point de vue de la dispersibilité ou de la solubilité, on emploie de préférence un agent tensio-actif non ionique ayant un coefficient HLB (équilibre hydrophile-lipophile) de 9 à 20 et on préfère parti- culièrement employer dans l'invention un agent tensio-actif non ionique ayant un coefficient =LB de 13 à 18. Le coefficient HLB de l'agent tensio-actif non ionique que l'on emploie dans l'invention peut 9 tre mesuré selon divers procédés bien connus, par exemple le procédé décrit dans J Soc Cosmetic Chemists, 5, 249 ( 1954). Comme polyoxyéthylène-ester d'acide gras, on préfère un polyoxyéthylèneester d'acide gras ayant un reste d'acide gras saturé ou insaturé avec 8 à 20 atomes de carbone dans lequel le nombre des moles d'oxyde d'éthylène ajouté (désigné ci-après par "OE") est d'environ 4 à 50 Comme tel polyoxyéthy 11 ne-ester d'acide gras, on peut mentionner par exemple un polyoxyéthylène-stéarate, un polyoxyéthylène-laurate et un polyoxyéthylène-oléate ayant chacun un nombre de moles d'OE ajouté de 4 à 50. Comme polyoxyéthylène-éther alkylique, on préfère un polyoxyéthylèneéther alkylique ayant un groupe alkyle saturé ou insaturé avec 8 à 20 atomes de carbone dans lequel le nombre de moles d'OE ajouté est d'environ 5 à 55 Comme tel polyoxyéthylène-éther alkylique, on peut mentionner par exemple un polyoxyéthylène-éther laurylique, un polyoxyéthylène-éther cétylique, un polyoxyéthylène- éther stéarylique et un polyoxyéthylène-éther oléylique dans chacun desquels le nombre des moles d'OE ajouté est de 5 à 55. Comme polyoxyéthylène-éther alkylphénylique, on pré- fère un polyoxyéthylène-éther alkylphénylique ayant un groupe alkyle saturé ou insaturé avec 5 à 10 atomes de carbone dans lequel le nom- bre des moles d'OE ajouté est d'environ 5 à 55 Comme tel polyoxy- éthylène-éther alkylphénylique, on peut mentionner par exemple un polyoxyéthylène-éther octylphénylique et un polyoxyéthylène-éther nonylphénylique dans chacun desquels le nombre des moles d'OE ajouté est d'environ 5 à 55. 25321 78 Comme polyoxyéthylène-ester d'acide gras de sorbi- tane, on préfère un polyoxyéthylène-ester d'acide gras de sorbitane ayant un reste d'acide gras saturé ou insaturé avec 8 à 20 atomes de carbone dans lequel le nombre des moles d'OE ajouté est d'environ 5 à 50 Comme tel polyoxyéthylène-ester d'acide gras de sorbitane, on peut mentionner par exemple un polyoxyéthylène-monolaurate de sorbitane, un polyoxyéthylène-monopalmitate de sorbitane, un poly- oxyéthylène-monostéarate de sorbitane, un polyoxyéthylène-monooléate de sorbitane, et un poly Qxyéthylène-tristéarate de sorbitane ayant chacun un nombre de moles d'OE ajouté d'environ 5 à 50. Comme polyoxyéthylène-ester d'acide gras de la glycérine, on préfère un polyoxyéthylène-ester gras de la glycérine ayant un reste d'acide gras saturé ou insaturé avec 8 à 20 atomes de carbone dans lequel le nombre des moles d'OE ajouté est d'environ 5 à 50 Comme tel polyoxyéthylène- ester d'acide gras de la glycérine, on peut mentionner par exemple un polyoxyéthylèneomonostéarate de glycéryle et un polyoxyéthylènemonooléate de glycéryle dans chacun desquels le nombre des moles-d'OE ajouté est d'environ 5 a 50. Comme polyoxyéthylène-huile de ricin hydrogénée et polyoxyéthylène-huile de ricin, on préfère un polyoxyéthylène-huile de ricin hydrogénée et un polyoxyéthylêne-huile de ricin ayant chacun un nombre de moles d'OE ajouté d'environ 20 à 150 o Comme polyoxyéthylène-polyoxypropylène-éther alkylique on préfère un polyoxyéthylêne-polyoxypropylène-éther alkylique ayant un groupe alkyle saturé ou insaturé avec 12 à 18 atomes de carbone et une teneur en OE d'environ 65 à 85 % en poids Comme tel poly- oxyéthylène-polyoxypropylène-éther alkylique, on peut mentionner par exemple un polyoxyéthylène-polyoxypropylène-éther cêtylique ayant une teneur en OE d'environ 65 à 85 % en poids. Comme polymère séquence de polyoxyéthylène-polyoxy- propylène, on préfère un polymère séquencé de polyoxyéthylène-polyoxy- propylène ayant une moyenne numérique du poids moléculaire d'environ 3 000 à 15 000 et ayant une teneur en OE d'environ 65 à 85 % en poids. Comme ester d'acide gras du sorbitane, onpréfère un monoester ou sesquiester de sorbitane formé avec un acide gras saturé ou insaturé ayant 8 à 20 atomes de carbone Comme tel ester d'acide gras du sorbitane, on peut mentionner par exemple un monolaurate de sorbitane, un monopalmitate de sorbitane et un sesquioléate de sor- bitane. Comme ester d'acide gras du saccharose, on préfère un monoester du saccharose formé avec un acide gras saturé ou insaturé ayant 8 à 20 atomes de carbone Comme tel ester d'acide gras du saccharose, on peut mentionner par exemple un monopalmitate de sac- charose et un monostéarate de saccharose. Comme ester d'acide gras de la glycérine, on préfère un monoester de la glycérine formé avec un acide gras saturé ou insa- turé ayant 8 à 20 atomes de carbone Comme tel ester d'acide gras de la glycérine, on peut mentionner par exemple un monostéarate de glycéryle et un monooléate de glycéryle. Parmi les agents tensio-actifs non ioniques précités, on préfère tout particulièrement employer un polyoxyéthylène-ester d'acide gras du sorbitane, un polyoxyéthylène-huile de ricin hydro- génée, un polyoxyéthylène-huile de ricin et un polymère séquencé de polyoxyéthylène-polyoxypropylène comme défini ci-dessus car leur toxicité est relativement faible On préfère tout particulièrement un polyoxyéthylène-monooléate de sorbitane (le nombre des moles d'OE ajouté est de 20) lappelé ci-après "polyoxyéthylène ( 20) monooléate de sorbitane" et les autres agents tensio-actifs non ioniques sont indiqués ci-après de la même façonl, un polyo Nyéthylène ( 60) huile de ricin hydrogénée et un polymère séquencé de polyoxyéthylêne-poly- oxypropylène ayant une moyenne numérique du poids moléculaire d'environ 8 350 et une teneur en OE de 80 % en poids. Les agents tensio-actifs non ioniques précités peuvent être employés isolément ou en combinaison. Comme précédemment mentionné, comme sucre ou composé apparenté aux sucres, on peut mentionner au moins une substance choisie parmi le groupe constitué par le D-glucose, le D-galactose, le D-xylose, l'acide Dglucuronique, un sel d'acide D-glucuronique, le tréhalose, un dextrane et un hydroxyéthylamidon. Comme sel de l'acide D-glucuronique, on peut mention- ner un sel de métal alcalin tel que le sel de sodium et le sel de potassium et un sel de métal alcalino-terreux tel que le sel de calcium et le sel de magnésium. Comme hydroxyéthylamidon, on peut employer un hydroxy- éthylamidon ayant un poids moléculaire moyen de 30 000 à 400 000, de préférence de 200 000. Comme dextrane, on préfère un dextrane ayant un poids moléculaire moyen de 10 000 à 80 000 Comme tel dextrane, on peut mentionner le Dextran 10, le Dextran 40 et le Dextran 70 qui ont respectivement des poids moléculairesmoyens de 10 000, 40 000 et 70 000. Parmi les sucres ou les composés apparentés aux sucres, on préfère particulièrement le tréhalose. Les sucres ou composés apparentés aux sucres précités peuvent être employés isolément ou en combinaison. De plus, dans l'invention, on peut également employer des dérivés du Dglucose, du D-galactose, du D-xylose, de l'acide D-glucuronique et du tréhalose tels qu'un ester phosphorique ou son sel, un éther méthylique et un méthylglucoside car ils ont un effet de stabilisation du FNT. L'agent tensio-actif non ionique que l'on emploie dans l'inventionwest ajouté en une quantité d'environ ljug à 1 mg, de préférence d'environ 5 ug à 100 Fg et mieux d'environ 10 Fg à 100/ug par ml de la solution de FNT ayant une activité de FNT de 102 à unités/ml (l'unité d'activité est définie ci-après) Le mode d'addition de l'agent tensio-actif non ionique n'a pas d'importance, Par exemple, l'agent tensio-actif non ionique peut être ajouté direc- tement à la solution de FNT Sinon, l'agent tensio-actif non ionique peut être dissous préalablement dans l'eau ou dans un tampon appro- prié ou un solvant organique tel que l'éthanol et ajouté à la solu- tion de FNT L'addition de l'agent tensio-actif non ionique peut être effectuée en un moment quelconque du stade de purification ou du stade de fabrication des préparations pharmaceutiques. Lorsqu'on emploie deux ou plusieurs types différents d'agents tensioactifs non ioniques, on les ajoute en une quantité telle que leur quantité totale soit comprise dans la gamme des quan- tités précédemment définie. -J Les sucres ou les composés apparentés aux sucres que l'on emploie dans l'invention sont ajoutés en une quantité d'environ mg ou plus, de préférence de 100 mg ou plus par ml de la solu- tion de FNT ayant une activité de FNT de 10 à 109 unités/ml La limite supérieure de la quantité de sucre ou de composés apparentés aux sucres est généralement déterminée par la solubilité du sucre ou des composés apparentés aux sucres, la viscosité de la solution obtenue et du point de vue économique La limite supérieure de la quantité de sucre ou de composés apparentés aux sucres est générale- ment de 500 mg par ml de la solution de FNT Lorsque le FNT à sta- biliser est sous forme d'une poudre, on ajoute le sucre ou les composés apparentés aux sucres en une quantité telle qu'une solu- tion aqueuse obtenue par dissolution du FNT en poudre pour que l'ac- tivité soit de 102 à 109 unités/ml ait les concentrations précitées du sucre ou des composés apparentés aux sucres. Le mode d'addition du sucre ou des composés apparentés aux sucres n'a pas d'importance Par exemple, on peut ajouter direc- tement le sucre ou les composés apparentés aux sucres sous une forme pulvérulente à la solution de FNT Sinon, on peut dissoudre préala- blement la poudre du sucre ou des composés apparentés aux sucres dans de l'eau ou un tampon approprié et ajouter la solution à la solution de FNT De plus, on peut sinon mélanger la poudre du sucre ou des composés apparentés aux sucres avec la poudre de FNT L'addi- tion du sucre ou des composés apparentés aux sucres peut être effec- tuée en un moment quelconque du stade de purification ou du stade de fabrication des préparations pharmaceutiques. Lorsqu'on emploie deux ou plusieurs types différents de sucre ou decomposés apparentés aux sucres, on les ajoute en une quantité telle que leur quantité totale soit comprise dans la gamme des quantités précédemment définie. L'agent tensio-actif non ionique et le sucre ou les composés apparentés aux sucres que l'on emploie dans l'invention peuvent être employés en combinaison Dans ce cas, on peut ajouter l'agent tensio actif non ionique et le sucre ou les composés appa- rentés aux sucres en des quantités comprises respectivement dans les gammes des quantités précédemment définies. On préfère que le stockage et la purification de la solution de FNT à laquelle on incorpore un agent stabilisant employé selon l'invention, si on la maintient sous forme d'une solution,-de même que la fabrication de préparations pharmaceutiques à partir de cette solution, soient effectués à une température de O à 30 C et mieux de O à 10 C Lorsqu'on conserve la solution de FNT sous une forme congelée, on préfère que la température de stockage soit main- tenue en dessous de O C et mieux en dessous de -20 OC. La solution de FNT à laquelle est incorporée une quan- tité efficace d'au moins un agent stabilisant selon l'invention doit conserver son activité de FNT pendant le stockage, qu'elle soit sous forme d'une solution ou sous une forme congelée, et pendant les stades de purification et de fabrication des préparations pharmaceutiques. De plus, le procédé de stabilisation du FNT selon l'invention s'applique également à la lyophilisation Lorsqu'on soumet à une lyophilisation des solutions de FNT (en particulier dans le cas de FNT très purifié), leurs activités diminuent généralement nette- * ment Cependant, les solutions de FNT contenant une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant selon l'invention sont lyophilisées avec rétention d'environ 50 % ou plus de leurs activités pour former une poudre de FNT La poudre de FNT peut être dissoute pour former une solution aqueuse stable de FNT dans laquelle les concentrations de l'agent stabilisant et du FNT sont comprises dans la gamme précé- demment définie, L'agent stabilisant comme défini dans l'invention peut sinon être incorporé aux préparations lyophilisées de FNT. Lorsque le FNT est stocké sous une forme pulvérulente, on préfère que la température de stockage soit maintenue à 25 C ou en dessous. Pour déterminer l'activité du FNT, on emploie géné- ralement deux procédés, le procédé in vivo dans lequel on mesure in vivo l'effet de nécrose tumorale et le procédé in vitro dans lequel on mesure in vitro l'effet cytotoxique sur des cellules néoplasiques. Comme procédé in vivo, on peut mentionner par exemple le procédé de Carswell et coll lvoir Proc Nat Acad Sci, USA, 72 ( 9), 3 666-3 670 ( 1975)lJ Selon ce procédé, on transplante par voie intradermique des cellules sarcomateuses Meth-A de BALB/c ( 2 x 105 cel- lules) dans l'aisselle de souris (BALB/c x C 57 BL/6)F 1 et, 7 jours après, on choisit pour l'évaluation les souris porteuses de tumeurs de 7 à 8 mm de diamètre présentant une bonne vascularisation sans nécrose centrale spontanée On injecte dans la veine de la queue de chaque souris un échantillon ( 0,5 ml) de FNT dilué avec une solution salée physiologique On évalue l'activité de l'échantillon de FNT après 24 h selon les critères suivants: (-): pas de changement (+): légère nécrose hémorragique (+):nécrose hémorragique modérée (nécrose centrale occupant environ 50 % de la surface de la tumeur) (L+): nécrose hémorragique nette (nécrose massive laissant une petite bordure vivante sur le pourtour de la tumeur). Comme procédé in vitro de détermination de l'activité du FNT, on peut mentionner par exemple le procédé de Ruff et coll. lvoir Lymphokines, vol 2, édité par E Pick, Academic Press, N Y, 245-248 ( 1980)l et le procédé de Kull et coll lvoir J Immunol, 126 ( 4), 1 279-1 283 ( 1981)l. Le procédé in vitro que la demanderesse a employé pour le dosage de l'activité du FNT a été mis au point par amélio- ration des procédés classiques précités Le procédé in vitro de la demanderesse dans lequel l'activité cytotoxique du FNT vis-à-vis de cellules L-M (American Type Culture Collection CCL 1 2) est mesurée et réalisée comme suit Comme récipient de culture, on emploie des plaques de microtitrage à 86 godets produites par Flow Laborato- ries, Inc (USA) et on cultive des cellules L-M dans du milieu essen- tiel minimum de Eagle lvoir Science, 130, 432-437 ( 1959)l contenant % en volume de sérum de veau fétal inactivé par la chaleur On mélange dans chaque godet des plaques un échantillon ( 0,1 ml) de FNT dilué en série avec le milieu et la suspension de cellules L-M ( 0,1 ml; 1 x 10 cellules) et on incube les plaques à 370 C pendant 48 h dans de l'air contenant 5 % de dioxyde de carbone A la fin,de la période de culture, on ajoute 20 oul d'une solution aqueuse de gluta- raldéhyde à 20 % pour fixer les cellules Après fixation, on lave les plaques avec de l'eau distillée et on laisse sécher puis on ajoute 0,1 ml de bleu de méthylène à 0,05 % pour colorer les cel- lules vivantes On lave soigneusement les plaques avec de l'eau distillée pour chasser l'excès de colorant et on laisse sécher. On ajoute 0,2 ml d'acide chlorhydrique à 3 Z dans chaque cupule pour extraire le colorant des cellules colorées On mesure l'absor- 2532178 ' bance de chaque cupule à 665 nm avec un Titertek Multiskan pro- duit par Flow Laboratories, Inc L'absorbance est proportionnelle au nombre des cellules vivantes L'activité du FNT, unités (U)/ml, est définie comme l'inverse de la dilution du FNT provoquant une cytotpxicité de 50 % et on peut l'obtenir en traçant un graphique de la dilution en fonction de l'absorbance Toutes les activités de FNT déterminées selon le procédé in vitro qu'on emploie ci-après sont exprimées en les unités définies ci-dessus. Le procédé de l'invention permet d'assurer une four- niture efficace et régulière, à l'échelle commerciale, de FNT très purifié qui semble âtre un médicament antitumoral efficace appli- cable en clinique car le procédé de l'invention-permet de maintenir l'activité du FNT pendant le stockage, que le FNT soit sous forme d'une solution, d'une masse congelée ou d'une préparation lyophilisée, ainsi que pendant les stades de purification et de fabrication des préparations pharmaceutiques On a également découvert que la solu- tion ou la poudre de FNT à laquelle est incorporé un agent stabili- sant choisi parmi un agent tensio-actif non ionique, au moins une substance choisie parmi le groupe constitué par le D glucose, le Dgalactose, le D-xylose, l'acide D-glucuronique, un sel d'acide Dglucuronique, le tréhalose, un dextrane et un hydroxyêthylamidon et leurs mélanges,peut être administrée sans danger à l'organisme humain car le présent agent stabilisant est dépourvu d'antigénicité pour l'homme, si bien que la nouvelle composition de l'invention est particulièrement utile lorsqu'on emploie cliniquement le FNT comme médicament antitumoral. De plus, il convient de noter que l'agent stabilisant employé dans l'invention ne gêne pas la mesure de la pureté du FNT et que, par conséquent, lorsqu'on incorpore l'agent stabilisant employé dans l'invention à une solution aqueuse ou une poudre contenant du FNT, on peut déterminer exactement la pureté du FNT dans la solu- tion aqueuse ou dans la poudre. De plus, l'agent stabilisant employé dans l'invention peut être obtenu avec une très grande qualité à un coût raisonnable. L'invention va maintenant être décrite de façon plus détaillée dans l'exemple de référence, les exemples pratiques et les exemples comparatifs suivants qui ne limitent en rien la portée de l'inventi on. i Exemple de référence On injecte par voie intraveineuse à des lapines pesant chacune 2 à 3 kg 75 mg de cellules de Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum; Wellcome Research Laboratories, Angleterre) tuées par la formaline Huit jours après, on injecte par voie intra- veineuse à chaque lapine 100,ig d'endotoxine (lipopolysaccharide d'Escherichia coli 026: B 6, produit par Difco Laboratories, USA). On prélève le sang de chaque lapine par ponction cardiaque 2 h après l'injection de l'endotoxine et on mélange le sang obtenu avec une petite quantité d'héparine On centrifuge lesang à 3 000 tr/min pendant 15 min On obtient ainsi un plasma ayant une activité de FNT de 25 000 U/ml. On dilue le plasma contenant du FNT ainsi obtenu ( 10 1) avec 5 1 de tampon phosphate 0,03 M (p H 7,8) On applique le plasma dilué à une colonne ( 10 x 42 cm) de DEAE-Sepharose CL-6 B (fabriqué et vendu par Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède) équilibré avec du tampon phosphate 0, 03 M-(p H 7,8) 0,13 M en chlorure de sodium On lave la colonne avec 2,5 1 de tampon phosphate 0,03 M (p H 7,8) 0,13 M en chlorure de sodium et on élue le FNT adsorbé avec un gradient linéaire de chlorure de sodium obtenu avec 5,0 1 de tampon phosphate 0,03 M (p H 7,8) 0,15 M en chlorure de sodium et 5,0 i de tampon phosphate 0,03 M (p Hli 7,8) 0,3 M en chlorure de sodium Le débit est de 230 ml/h et on recueille des fractions de 45 ml L'activité du FNT est présente dans les fractions éluées avec le chlorure de sodium 0,20 à 0,24 M On regroupe les fractions ayant une activité de FNT et on les dialyse pendant une nuit contre du tampon Tris- HCI 0,03 M (p H 7,2) 0,13 M en Na Cl. On chromatographie à nouveau la solution de FNT dialysée sur une colonne ( 3,0 x 30 cm) de DEAE-Sepharose CL-6 B équilibré avec du tampon Tris-HC 1 0,03 M (p H 7,2 > 0,15 M en Na Cl On élue le FNT adsorbé avec un gradient linéaire de chlorure de sodium obtenu avec 500 ml de tampon d'équilibrage et 500 ml de tampon Tris-H Cl 0,03 M (p H 7,8) 0,3 M en chlorure de sodium Le débit est de 40 ml/h et on recueille des fractions de 10 ml On regroupe les fractions ayant une activité de FNT et on concentre. On soumet le concentré à une filtration sur gel avec une colonne ( 5 x 100 cm) de Sephacryl S-200 (fabriqué et vendu par 25321 78 Pharmacia) équilibré avec du tampon phosphate 5 m Mp H 7,0) 0,15 M en Na Cl On élue avec le tampon d'équilibrage Le débit est de ml/h et on recueille des fractions de 13 ml On regroupe les fractions ayant une activité de FNT et on concentre par ultra- filtration La solution de FNT ainsi obtenue a une activité spécifique de 5,0 x 105 U/mg de protéines et une pureté 10 000 fois supérieure à celle observée dans le plasma. On soumet la solution de FNT ainsi obtenue à une nouvelle chromatographie sur la même colonne (Sephacryl S-200) en employant le même tampon pour obtenir une solution de FNT ayant une activité spécifique de 1,0 x 106 U/mg de protéines. Exemple 1 On dilue du FNT de lapin ayant une activité spéci- fique de 5,0 x 105 U/mg obtenu selon les modes opératoires décrits dans l'exemple de référence avec du tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0) 0,15 M en chlorure de sodium pour obtenir une solution de FNT ayant une activité de FNT de 1 000 U/ml A des portions de la solution de FNT ainsi obtenue, on ajoute séparément les divers agents tension actifs non ioniques indiqués dans le tableau 1 comme agents stabi- lisants en une quantité telle que la concentration dans la solution obtenue soit de 10,ug/m 11 Pour chacune des solutions obtenues, on détermine l'activité résiduelle relativement à i) les échantillons stockés pendant 2 jours, 7 jours ou 30 jours à 4 C, ii) les échantillons soumis à 1 et 3 cycles de congélation (= 70 C) et de décongélation et iii) les échantillons soumis à une congélation à o 70 OC, une lyophi- lisation et un stockage de 7 jours a 250 Co Pour effectuer l'essai cidessus, on emploie comme témoin la solution de FNT à laquelle on n'a pas incorporé d'agent stabilisant En ce qui concerne la prépa- e ration lyophilisée lvoir iii ci-dessusl, on la dissout dans de l'eau distillée stérile puis on la soumet à la détermination de l'ac- tivité du FNT. Pour déterminer l'activité résiduelle, on dose in vitro ou in vivo l'activité de chaque échantillon selon les procédés précédemment décrits Dans le procédé ih vitro, on calcule l'activité 18 2532178 résiduelle (%) à partir de la valeur de la détermination selon l'équation suivante: A Activité résiduelle (%) = x 100 B dans laquelle A est l'activité de FNT de l'échantillon après le stockage ou le traitement physique et B est l'activité de FNT de l'échantillon avant le stockage ou le traitement physique. Dans le procédé in vivo, on concentre chaque échantil- lon de solution à 30 fois la valeur de départ au moyen d'un Mini- Module NM-3 (marque du commerce de l'appareillage d'ultrafiltration fabriqué et vendu par Asahi Chemical Industry Co Ltd, Japon) On injecte ensuite 0,5 ml de chacune des solutions de FNT ainsi concen- trées, dans la veine de la queue, à un groupe de 5 souris porteuses de tumeur On détermine l'activité de FNT 24 h après selon le critère précédemment décrit Les résultats obtenus figurent dans le tableau 1 ciaprès. Exemple 2 A des portions de solution de FNT ayant la même activité de FNT que celle employée dans l'exemple 1, on ajoute sépa- rément divers sucres et composés apparentés aux sucres indiqués dans le tableau 2 ci-après comme agent stabilisant pour former 2 solutions différentes ayant une concentration de 100 mg/ml et une concentration de 300 mg/ml On évalue l'effet stabilisant des sucres et des composés apparentés aux sucres de la même façon que dans l'exemple 1 Cependant, la solution d'échantillon à laquelle on ajoute le dextrane ou l'hydroxyéthylamidon ne-peut pas tre concentrée à 30 fois son volume' d'origine et, par conséquent, on ne détermine pas son activité de FNT selon le procédé in vivo Les résultats obtenus figurent dans le tableau 2 ci-après. Exemple 3 A des portions de solution de FNT ayant la même acti- vité de FNT que celle employée dans l'exemple 1, on ajoute séparé- ment du polyoxyéthylène ( 20) monooléate de sorbitane (Tween 80, produit de Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Japon), du poly- oxyéthylène ( 6) stéarate (Nissan Nonion S-6, produit de Nippon Oil And Fats Co, Ltd, Japon), du polyoxyéthylène ( 23) éther laurylique (Brij 35, produit de Wako Pure Chemical Industries, Ltd), du poly- oxyéthylène ( 60) huile de ricin hydrogénée (NIKKOL HCO-60, produit de Nikko Chemicals Co, Ltd, Japon), un polymère séquencé de poly- oxyéthylène-polyoxypropylène (moyenne numérique du poids moléculaire: environ 8 350, teneur en OE: 80 %) (Pluronic F 68, produit de Asahi Denka Kogyo K K, Japon) et du tréhalose comme agent stabilisant à diverses concentrations, On conserve chacune des solutions obtenues à 4 C pendant 7 jours puis on les soumet à une détermination de l'activité du FNT selon le procédé in vitro On calcule l'activité résiduelle du FNT (%) de la même façon que dans l'exemple 1 Les résultats obtenus sont illustrés par les figures 1 à 6. Exemple 4 On dilue du FNT de lapin, ayant une activité spéci- fique de 1,0 x 10 U/mg obtenu selon les modes opératoires décrits dans l'exemple de référence, avec du tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0) 0,15 M en chlorure de sodium, pour préparer des solutions de FNT ayant respectivement des activités de FNT de 100 U/ml, 1 000 U/ml, 000 U/ml et 100 000 U/ml A une portion de chacune des solutions de FNT ainsi préparées, on ajoute séparément du NIKIKOL HCO-60 et du tréhalose-en une quantité telle que les solutions obtenues aient respectivement une concentration de 10 g/ml et 100 mg/ml On conserve chacune des solutions de FNT obtenues à 4 C pendant 7 jours et on détermine l'activité du FNT selon le procédé de détermination in vitro On calcule l'activité résiduelle de FNT (%) de la même façon que dans l'exemple 1 Comme témoin, on soumet également à la déter- mination de l'activité de FNT une autre portion de chacune des solu- tions de FNT à laquelle on a incorporé ni NIIQ(OL HCO-60 ni tréhalose. Les résultats obtenus figurant dans le tableau 3 ci-après. Exemple commaratif 1 On examine l'effet de stabilisation du FNT et l'acti- vité cytotoxique de divers agents tensio-actifs et alcools Comme agents tensio-actifs non ioniques, on emploie le polyoxyéthylène ( 20) monooléate de sorbitane (Tween 80), le polyoxyéthyle ( 60) huile de ricin hydrogénée (NIKKOL HCO-60) et un polymère séquencé de polyoxy- éthyle-polyoxypropylêne (Pluronie F 68) Comme additifs comparatifs, on emploie le dodécylsulfate de sodium (un agent tensio-actif anio- nique), le bromure de cétyltriméthylammonium (un agent tensio-actif cationique) et divers alcools comme indiqué dans le tableau 4 ci- après (qui sont des agents stabilisants bien connus des solutions de substances à activité physiologique courantes). On examine l'effet de stabilisation du FNT et l'acti- vité cytotoxique des additifs mentionnés ci-dessus selon les procédés suivants. i) Effet stabilisant A des portions de la même solution de FNT que celle employée dans l'exemple 1, on ajoute les agents tensio-actifs et alcools précités respectivement à des concentrations diverses ( 0,05 mg/ml et 0,5 mg/ml dans le cas des agents tensio-actifs; mg/ml dans le cas de l'éthanol; et 100 mg/ml dans le cas des autres alcools) On détermine ensuite l'activité résiduelle de FNT (%.) de chaque solution de la même façon que dans l'exemple 1. ii) Activité cytotoxique On prépare des solutions de FNT contenant les mêmes concentrations en additifs que celles indiquées en i) ci-dessus puis on dilue au 1/100 avec du milieu minimum essentiel d'Eagle comme précédemment mentionné Ensuite, on détermine l'activité cytotoxique de chacune des solutions diluées comme précédemeent décrit pour la détermination de l'activité du FNT selon la méthode de détermination in vitro Dans la détermination ci-dessus, on évalue l'activité cyto- toxique selon le critère suivant. + (cytotoxique): létalité de 50 % ou plus des cellules L-M (non cytotoxique) létalité inférieure à 50 % des cellules L-M Les résultats obtenus figurent dans le tableau 4 ci-après. Exemple comparatif 2 Comme sucre et composés apparentés aux sucres utiles dans l'invention, on emploie le D-glucose, le D-glucuronate de sodium, le tréhalose et un hydroxyéthylamidon (poids moléculaire moyen: environ 200 000) Comme additifs comparatifs, on emploie divers sucres et composés apparentés aux sucres qui sont des agents stabi- lisants bien connus des solutions des substances à activité physio- logique courantes. 21 2532178 A des portions de la même solution de FNT que celle employée dans l'exemple 1, on ajoute respectivement les sucres et com- posés apparentés aux sucres précités Dans ce cas, pour chaque type de solution, on prépare deux solutions ayant des concentrations différentes, c'est-à-dire 10 mg/ml et 200 mg/ml On conserve chacune des solutions de FNT obtenues à 40 C pendant 7 jours et on détermine l'activité de FNT selon le procédé in vitro comme précédemment men- tionné On calcule l'activité résiduelle de FNT (%) de la même façon que dans l'exemple 1 à partir de la valeur de l'activité de FNT obtenue. Les résultats figurent dans le tableau 5 ci-après. Il ressort des exemples et exemples comparatifs pré- cédemment décrits que le procédé de stabilisation du FNT de l Vinvenr tion permet de maintenir stable l'activité du FNT pendant le stockage du FNT sous forme d'une solution et pendant des opérations telles que la congélation, la décongélation, la lyophilisation, un traitement par la chaleur ou similaires. Bien entendu, diverses modifications peuvent âtre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. TABLEAU 1 Effet stabilisant d'agents tensio-actifs non ioniques Tibin cngaatonstckgeà 5- Condition stockage ou traite Stockage à 40 C -dcongélainsokaeà 2 Me It phiysique) (slto)-éo (préparation _____________________ ______ (oluton)la ti on lyophi 1 iséç) Méthode de déterinati__ de l'a-c-ti 7 vitéin vitrain vivo in vitra in viv in vitro in vitra Agent stabiisant (marque du commerce ours jours répétition jours ou nom trivial) 17 30 7 i 3 7 Témoin (dans agent stabilisant) 100 i-++ 4,++ 1 5 43 -à. (suite) Temoin (avant Congélation Stockage à 25 C Condition stockage ou traite Stockage à 4 C écongéla (préparation ment physique) (solution) tion lyophilisée) Méthode de détermination de l'activité in vitro in vivo in vitro in vivo in vitro in vitro Agent stabilisant (marque du commerce jours jours répétition jours ou nom trivial) 2 7 30 7 1 3 7 POE ( 20)monostéarate de sorbitane 100 +±f 4,++ 1 97 96 95 +++ 2,++ 2,+ 1 66 70 61 (Tween 60) POE ( 20)monooléate de sorbitane (M Tem 80)100 +++ 3,++ 2 99 98 100 +++ 4,++ 1 88 74 68 POE ( 20)tristéarate de sorbitane 100 +++ 4,++l 95 92 90 +++ 2,++ 2,+l 78 82 57 (Tween 85) POE ( 60)huile de ricin hydrogénée 100 ++ 4-4,++ 11 92 97 98 +++ 5 70 62 69 (Nt IKKOL IICO-60) POE ( 40)huile de ricin (N If OL CO-40 T 100 ++ 3 ++ 2 90 100 92 +++ 3,++ 2 60 65 63 Polym Are séquencé POE-polyouypropylène 100 +++ 4 ++ 1 99 98 95 +++ 5 75 53 69 (Pluronic F 68) Nota: Les valeurs des colonnes marquées "in vitro"' représentent l'activité résiduelle comme précédemment défini. Lee valeurs des colonnes marquées "in vivo" représentent le nombre de souris Les significations des sym- boles (-, +, ++, etc) ont été précédemment indiquées. POE abréviation de "polyoxyéthylène" Nissan Nonion marque de commerce des agents tensio-actifs non ioniques produits par Nippon Oil And Fats Co., Ltd, Japon. NIKKOL: marque de commerce des agents tensio-actifs produits par Nikko Chemicals Co, Ltd,Japon. Brij, Tween, Triton et Pluronic O noms triviaux des agents tensio-actifs non ioniques. Les agents tensio-actifs non ioniques du tableau qui portent les noms triviaux Brij ou Tween sont des pro- duits de Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Japono Le Triton X-100 du tableau est le produit de Rohm R Haas Co, USA. Le Pluronic F 68 du tableau est le produit de Asahi Denka Kogyo Ko K, Japon. w t. Ma %) -"N Co I TABLEAU 2 Effet stabilisant de sucres et de composés apparentés aux sucres u Temoi-n Cv-tconge lation Stockage à 7 condition stockage ou traite Stockafe à 40 C décongéla 25 *C (prépara ment physique) ( 50 iution) jtion tiai lyophîiie Y Méthodede détermination de l'activité in vitro in vivo in vitro in vivo in vitro in vivo Agent stbilisant Concentration jours jours répétition jo 2 u-rs Agent stabilisant(mg/ml) 2 _____ 727 30 - 7 1 3 7 Témoin (sans agent stabi 100 + 4 + + 4,++l5 300 100 -100 83 53 65 83 67 Dextran 70 100 100 -62 50 15 69 46 62 300 100 -73 65 27 71 69 64 I Hydroxyéthylamidon 100 100 -96 58 42 75 49 54 300 100 -861 69 43 70 57 61 Nota Les valeurs des colonnes marquees -In v tro" représentent 1 Vactivice res Les valeurs des colonnes marquées "in vivo" représentent le nombre de soi boles (-, +, + 1-, etc) ont été précédemment indiquées. Le poids moléculaire moyen de l'hydroxyéthylamidon est d'environ 200 000. idcue lle comme précédemment défini. uris Les significations des sym- 4.- r-J t A La r-J 1 % 4 cn TABLE Ai U 3 Effet stabilisant du NIKKOL 11 C 0-60 et du tréhalose L Mi lLes valeurs représentent l'activité résiduelle de FNT (MIl. L-n 1 \> -'J Concentration du O (témoin) NIKKOL 11 C 0-60 Tréhalose FNT, U/ml 10,ug/ml 100 mg/MI ,0 3 86 79 1000 5 99 96 000 43 ' 98 101 000 47 101 98 TABLEAU 4 Condition Stockage à 40 C Méthode de détermination de l'activité in vitro in vivo Additifs Concentration Activité Jours Jours (marque du commerce ou (mg/ml) cytotoxique O 2 7 30 O 7 nomtrivial)__ _ __ _ _ _ _ _ Témoin (sans agent stabilisant) 100 5 05 100 100 96 95 +±t 4,++l 3,2 sorbitane (Tween 80) __ __ ____ -00 00 100 98 5 ___ 4 __l POE ( 60) huile de ricin 0,05 100 97 100 98 + 3,++ 2 4-3,++ 2 hydrogénée (NIKKOL IICO-60) 0,5 100 98 96 98 +++ 14,+ 4-1 3,++ 2 I Polymère èquencé POE-poly 0,05 100 99 91 85 +++ 4,+'+ 1 propylène (Pluronic F 63) 0,5 ______ 100 97 100 95 +++ 5 3,2 Dodéy 1 sufatede sdium 0,05 100 60 8 6000 100 100 52 Sorbitol 100 100 5 Glycérine 100 100 10 - Ethanol 5 100 Note: * L'activité de FNT selon le procédé in vitro ne peut pas cytotoxique de l'additif vis-à-vis des cellules L-M. être déterminée par suite de l'activité Ln 1 -.4 oe TABLEAU 5 Concentration ActivitéA Concentration Activité Additif (mg/ml) résiuelle Addtf (mg/ml) résiduelle ) (%) Témoin (sans agent 2532 178 R E V E N D I C A T I ON S 1 Procédé pour stabiliser le Facteur de nécrose tumorale caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter à une solution aqueuse ou une poudre contenant le Facteur de nécrose tumorale une quantité efficace d'un agent stabilisant choisi parmi un agent tensio-actif non ionique, au moins une substance choisie parmi le groupe constitué par le D-glucose, le D- galactose, le D-xylose, l'acide D-glucuronique, un sel d'acide D- glucuronique, le tréhalose, un dextrane et un hydroxyéthylamidon et leurs mélanges 2 Procédé selon la revendication l, caractérisé en ce que ledit agent stabilisant est un agent tensio-actif non ionique. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit agent tensio-actif non ionique a un coefficient HLB de 9 à 20. 4 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit agent tensio-actif non ionique a un coefficient HLB de 13 à 18. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit agent tensio-actif non ionique est choisi parmi un polyoxyéthylène-ester d'acide gras, un polyoxyéthylène-éther alkylique, un polyoxyéthylène-éther alkylphénylique, un polyoxy- éthylène-ester d'acide gras du sorbitane, un polyoxyéthylne-ester d'acide gras de la glycérine, un polyoxyéthylène-huile de ricin hydrogénée, un polyoxyéthylène-huile de ricin, un polyoxy-:ithylène- polyoxypropylène-éther alkylique, un polymère séquence de polyoxy- éthylène-polyoxypropylène, un ester d'acide gras du sorbitane, un ester d'acide gras du saccharose, un ester d'acide gras de la glycérine et leurs mêélnges. 6 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit agent tensio-actif non ionique est choisi parmi un polyoxyéthylène-ester d'acide gras ayant un reste d'acide gras saturé ou insaturé avec 8 à 20 atomes de carbone dans lequel le nombre des moles d'oxyde d'éthylène ajouté est d'environ 4 à 50, un polyoxyéthylène-éther alkylique ayant un groupe alkyle saturé ou insaturé avec 8 à 20 atomes de carbone dans lequel le nombre des 2532 1 78 moles d'oxyde d'éthylène ajouté est d'environ 5 à 55, un poly- oxyéthylène-éther alkylphénylique ayant un groupe alkyle saturé ou insaturé avec 5 à 10 atomes de carbone dans lequel le nombre des moles d'oxyde d'éthylène ajouté est d'environ 5 à 55, un polyoxy- éthylène-ester d'acide gras du sorbitane ayant un reste d'acide gras saturé ou insaturé avec 8 à 20 atomes de carbone dans lequel le nombre des moles d'oxyde d'éthylène ajouté est d'environ 5 à 50, un polyoxyéthylène-ester d'acide gras de la glycérine ayant un reste d'acide gras saturé ou insaturé avec 8 à 20 atones de carbone dans lequel le nombre des moles d'oxyde d'éthylène ajouté est d'environ 5 a 50, un polyoxyéthylène-huile de ricin hydrogénée ou un polyoxyéthylène-huile de ricin dans lequel le nombre des moles d'oxyde d'éthylène ajouté est d'environ 20 à 150, un polyoxyéthylène- polyoxypropylène-éther alkylique ayant un groupe alkyle saturé ou insaturé avec 12 à 18 atomes de carbone et ayant une teneur en oxyde d'éthylène d'environ 65 à 85 % en poids, un polymère séquencé de polyoxyéthylène-polyoxypropylène ayant une moyenne numérique du poids moléculaire d'environ 3 000 à 15 000 et ayant une teneur en oxyde d'éthylène d'environ 65 à 85 % en poids, un ester d'acide gras du sorbitane qui est un mono ou sesquiester du sorbitane et d'un acide gras saturé ou insaturé ayant 8 a 20 atonies de carbone, un ester d'acide gras du saccharose ou un ester d'acide gras de la glycérine qui est un monoester du saccharose ou de la glycérine et d'un acide gras satura ou insatura ayant 8 à 20 atomes de carbone et leurs mélanges. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit agent tensio-actif est choisi parmi un polyoxyéthylène- ester d'acide gras du sorbitane ayant un reste d'acide gras saturé ou insaturé avec 8 à 20 atomes de carbone dans lequel le nombre des moles d'oxyde d'éthylène ajouta est d'environ 5 a 50, un polyoxy- éthylène-huile de ricin hydrogénée dans lequel le nombre des moles d'oxyde d'éthylène ajouté est d'environ 20 à 150, un polyoxyéthylène- huile de ricin dans lequel le nombre des moles d'oxyde d'éthylène ajouta est d'environ 20 & 150, un polymère séquencé de polyoxy- éthylène-polyoxypropylène ayant une moyenne numérique du poids molé- culaire d'environ 3 000 à 15 000 et ayant une teneur en oxyde d'éthy- lène d'environ 65 à 85 % en poids et leurs mélanges. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit agent tensio-actif non ionique est choisi parmi le polyoxyéthylène ( 20) monooléate de sorbitane, le polyoxyéthylène ( 60) huile de ricin hydrogénée, un polymère séquencé de polyoxyéthylène- polyoxypropylène ayant une moyenne numérique du poids moléculaire d'environ 8 350 et ayant une teneur en oxyde d'éthylène de 80 % en poids et leurs mélanges. 9 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit agent tensio-actif non ionique est ajouté en une quantité d'environ 1;ug a 1 mg/ml de la solution aqueuse contenant le Facteur de nécrose tumorale, ladite solution aqueuse ayant une activité du Facteur de nécrose tumorale de 102 109 unités/ml. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la quantité dudit agent tensio-actif non ionique est d'environ ,ug à 100 ug/ml. 11 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend de plus la lyophilisation de la solution aqueuse a laquelle on a ajouté ledit agent tensio- actif non ionique. 12 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit agent stabilisant est au moins une substance choisie parmi le groupe constitué par le D-glucose, le D-galactose, le D-xylose, l'acide D-glucuronique, un sel d'acide D-glucuronique, le tréhalose, un dextrane et un hydroxyéthylamidon. 13 Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite substance est ajoutée en une quantité d'environ mg à 500 mg/ml de la solution aqueuse contenant le Facteur de nécrose tumorale, ladite solution aqueuse ayant une activité du Facteur de nécrose tumorale de 102 à 109 unités/ml. 14 Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la quantité de ladite substance est d'environ 100 mg à 500 mg/ml. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 12 à 14, caractérisé en ce que, de plus, on lyophilise la solution aqueuse a laquelle on a ajouté ladite substance. 16 Solution aqueuse ou poudre stables, caractérisée en ce qu'elle contient le Facteur de nécrose tumorale et une quantité efficace d'un agent stabilisant choisi parmi un agent tensio-actif non ionique, au moins une substance choisie parmi le groupe constitué par le D-glucose, le D-galactose, le D-xylose, l'acide D-glucuronique, un sel d'acide D-glucuronique, le tréhalose, un dextrane et un hydroxy-. éthylamidon et leurs mélanges. 17 Solution aqueuse ou poudre stables selon la revendi- cation 16, caractérisée en ce que ledit agent stabilisant est un agent tensio-actif non ionique comme défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 8. 18 Solution aqueuse ou poudre stables selon la revendi- cation 17, caractérisée en ce que ledit-agent tensio-actif non ionique est contenu en une quantité d'environ 1 ug à 1 mg/ml de la solution elle- même contenant-le Facteur de nécrose tumorale, ladite solution aqueuse ayant une activité dû Facteur de nécrose tumorale de 10 à unités/ml, ou est contenu en une quantité d'environ 1 jug à 1 mg/ml d'une solution aqueuse ayant une activité du Facteur de nécrose tumo- rale de î 02 à 109 unités/ml, cette solution étant obtenue par disso- lution de la poudre contenant le Facteur de nécrose tumorale. 19 Solution aqueuse ou poudre stables selon la revendi- cation 18, caractérisée en ce que la quantité de l'agent tensio- actif non ionique est d'environ 5,ug à 100 ug/ml de la solution aqueuse elle-même contenant le Facteur de nécrose tumorale ou d'une solution aqueuse obtenue par dissolution de la poudre contenant le Facteur de nécrose tumorale. Solution aqueuse ou poudre stables selon la revendi- cation 16, caractérisée en ce que ledit agent stabilisant est au moins une substance comme défini dans l'une des revendications 1 ou 12. 21 Solution aqueuse ou poudre stables selon la revendi- cation 20, caractérisée en ce que ladite substance est contenue en une quantité d'environ 10 mg à 500 mg/ml de la solution aqueuse elle-même contenant le Facteur de nécrose tumorale, ladite solu- tion aqueuse ayant une activité du Facteur de nécrose tumorale de 102 à 109 unités/ml, ou est contenue en une quantité d'environ mg à 500 mg/ml d'une solution aqueuse ayant une activité du Facteur de nécrose tumorale de 10 à 109 unités/ml, cette solu- tion étant obtenue par dissolution de la poudre contenant le Facteur de nécrose tumorale. 22 Solution aqueuse ou poudre stables selon la revendication 21, caractérisée en ce que la quantité de ladite substance est d'environ 100 mg à 500 mg/ml de la solution aqueuse elle-même contenant le Facteur de nécrose tumorale ou d'une solu- tion aqueuse obtenue par dissolution de la poudre contenant le Facteur de nécrose tumorale.