FR 2521163 A1 19830812 FR 8302276 A 19830208 -1- L'invention est relative à une nouvelle protéase alcaline API-21 et f son prac 6 dé de préparation Plus particuiièremient, elle est relative à une protéase alcaline API-21 dérivée d'une bactérie et présen- tant une activité enzymatique méme à une'température relativement basse (par exemple à une température ambiante d'environ 40 C) sous des con- ditions alcalines, et elle est également relative à un procédé de pré- paration de celle-ci à partir d'une culture d'une nouvelle espèce de NKS-21 appartenant au genre Bacillus. Les protéases alcalines sont largement utilisées dans les do- maines, par exemple, de l'industrie du cuir, de l'industrie alimentaire, de l'industrie textile et des fibres, ou de l'industrie médicale ou pharmaceutique; la raison étant qu'une protéase alcaline est plutôt stable à la chaleur comparativement à une protéase neutre De plus, la demande sur le marché en enzymes utilisés comme additif de détergent a augmenté récemment Pratiquement, les enzymes utilisés comme additif de détergent sont des protéases alcalines dérivées d'une bactérie ap- partenant au genre Bacillus, qui présentent une activité maximale pour un p H d'environ 9 à environ 10 La plupart des enzymes mentionnés pré- cedemment présententune activité maximale a une température relativement haute, notamment autour de 60 C, mais ils sont inactifs ou moins actifs à une température relativement basse, en particulier autour de la tempé- rature ambiante Cela signifie que les caractéristiques des enzymes ne sont pas pleinement utilisées dans un pays tel que le JAPON, o les vê- tements sont généralement lavés à la température ambiante De plus, le développement des enzymes ayant une activité enzymatique retenue même & une température relativement basse est nécessaire à cause de l'utili- sation croissante récente de vêtements en fibres chimiques ayant une stabilité à la chaleur relativement basse et à cause des récents mouve- ments d'économie d'énergie. En conséquence, la présente invention a pour but d'éliminer les inconvénients mentionnés ci-dessus des protéases alcalines connues en proposant une nouvelle protéase alcaline ayant une activité enzyma- tique -lev e v une température relativement basse. Un autre but de la présente invention est de proposer un pro- cédé pour préparer une nouvelle protéase alcaline ayant une haute acti- vité enzymatique à partir d'une nouvelle bactérie capable de la produire. D'autres buts et avantages de la présente invention apparaî- tront au cours de la description qui va suivre. 25211 X 3 2- Selon la prÉsente invention, on propose une protéase alcaline API-21 préseitant les propriétés physico-chimiques suivantes 1) Activité: hydrolyse de la caséine dans des conditions alcalines, avec un p H optimal compris entre 10 et 11, et une température optimale d'activité comprise entre 45 OC et 50 OC: 2) Stabilité: pas de diminution dans l'activité enzymatique observée jusqu'à 40 O C sous l'effet d'un chauffage sans substrat pendant minutes à un p H de 10, mais une diminution de 90 Z O ou plus de l'acti- vité enzymatique observée à 50 'C pour 10 minutes à un p H de 10 Une désactivation se produit à 50 'C pour 10 minutes à un p H de 8, et une complète désactivation se produit effectivement à 60 O C pendant 10 minu- tes à un p H de 8 La protéase est stable sous des conditions alcalines. en particulier pour un p H compris entre 7 et 11,5, et elle est stable à la réfrigération et au séchage par le froid 3) Molécules de l'enzyme: la protéase est une protéine ayant un poids moléculaire d'environ 22 000, comme cela a été estimé par une filtration colloidale sur un appareil de marque Sephadex G-75 à un p H de 10, un point iso-électrique de 7,4 comme cela a été estimé par un procédé d'électro-focalisation un sommet d'absorption de 275 à 282 nm dans un spectre d'absorption d'ultra-violets, des caractéristiques d'absorption des infrarouges comme cela est montré à la figure 5, et un résidu de sérine dans le site actif. Selon la présente invention, on propose également un procédé pour préparer une protéase alcaline API-21 comprenant les étapes sui- vantes: a) la culture d'une espèce de NKS-21 du genre Bacillus capable de produire la protéase alcaline API-21 dans un milieu de culture alca- lin b) la récupération de la protéase alcaline API-21 à partir du produit cultivé. La présente invention sera mieux comprise si l'on se réfère à la description ci-dessous ainsi qu'aux dessins qui l'accompagnent. La figure 1 illustre graphiquement la zone de p H optimal de. l'enzyme selon la présente invention. La figure 2 illustre graphiquement la stabilité vis-à-vis du p H, de l'enzyme sans substrat selon la présente invention. La figure 3 illustre graphiquement la zone de température acti- ve et la température optimale de l'enzyme selon la présente invention. 2521 1 63 Les figures 4 A et 4 B L-1 ustrent graphiquement les stabilités, vis-àvis des températures, de l'enzyme sans substrat selon la présente invention respectivement à des p H de 10 et de 8. La figure 5 illustre le spectre infrarouge de la transforma- tion de Fourier de l'enzyme selon la présente invention. Les inventeurs ont étudié les bactéries qui peuvent produire une protéase alcaline ayant une haute activité à une température relati- vement basse Comme résultat de la classifification et de recherche sur de nombreuses souches de bactéries isolées à partir de milieux naturels, la nouvelle bactérie appartenant au genre Bacillus sp nov NKS-21 (appelée dans la suite NKS-21) qui peut produire une protéase alcaline ayant une haute activité à une température relativement basse, fût isolée à partir de milieux naturels à Fuchu-shi, Tokyo (JAPON) Il a été trouvé à partir des propriétés microbiologiques qu'une souche NKS-21 capable de produire une protéase alcaline API-21 selon la présente in- vention est une nouvelle bactérie de sporange aérobique appartenant au genre Bacillus. Cette bactérie NKS-21 a été déposée le 3 Février 1982 au Fermentation Research Institute" (FRI) au JAPON comme étant Bacillus sp FERM BP-93 selon le Traité de BUDAPEST sur la reconnaissance inter- nationale des dépôts de micro-organismes en vue des procédures de brevets. Les propriétés microbiologiques de cette bactérie sont expli- quées ci-dessous Les réactifs et les procédés d'isolation utilisés pour la détermination des propriétés microbiologiques de la bactérie NKS-21 furent conformes à la description de "BERGEY'S MANUAL OF DETERMINATIVE BACTERIOLOGY" ( 8 ème édition 1974) L'isolation de la bactérie à partir demilieux fût réalisée de la manière suivante: une petite quantité de la masse du milieu fû t additionnée d'un milieu de peptone et la culture fût réalisée en utilisant un incubateur agitateur sous les conditions d'un p H de 7 à 10, et une température de 10 à 40 C pendant à 150 heures Une proportion du produit cultivé fût étendue sur un plateau de gélose et la souche fût isolée par un procédé d'isolement usuel. Propriétés microbiologiques de NKS-21 a) Caractéristiques morphologiques 1) Taille des cellules végétatives: 0,6-0,8 ' m x 2,5-3,5 p m 2) Pléomorphisme cellulaire: -4 - Parfois des cellules dilatent jusqu'à une taille de 0,6-1,0 1 Jm x 4,5 p m. 3) Coloration de Gram Positive mais décoloration facile. 4) Mobilité: Doué de mouvement avec des flagelles réparties uniformé- ment. ) Spores: Ovale à elliptique, presque elliptique 0,8 m x 1,2 m. 6) Sprangia Légérement gonflé. 7) Résistance à l'acide Négative. b) Caractéristiques culturales en divers milieux 1) Bouillon de Peptone: i) p H 9,5: bonne croissance à la fois à 20 O C e 30 O C p H 7,2: croissance limitée à 20 OC et bonne croissan- ce à 30 OC ii) Température de croissance à un p H de 9,5 Croissance entre 14 OC et 41 OC Pas de croissance au-dessus de 43 O C ou en dessous de 12 OC 2) Autres milieux: Extrait d'aliments gélose de peptone inclinée Bonne croissance Extrait d'aliments bouillon de peptone contenant 7 de chlorure de sodium Bonne croissance Extrait d'aliments bouillon de peptone Bonne croissance Caséine extrait d'aliments gélose inclinée de peptone: Bonne croissance Caséine extrait d'aliments bouillon de peptone Bonne croissance Amidon bouillon de peptone Bonne croissance Glucose bouillon de peptone Bonne croissance 2521 1 63 -5- Tripton extrait de levure sur plateau de gélose: Bonne croissance Amidon bouillon d'extrait de levure: Croissance Extrait d'aliment piquage de gélatine: i) p H 10,0, 30 C Croissance et liquéfaction ii) p H 10,0 à 20 CC Faible croissance de surface et faible liqué- faction iii) p H 7,2 à 30 'C Croissance et liquéfaction iv) p H 7,2 à 20 C Faible croissance de surface et faible liqué- faction 3) Croissance dans des conditions anaérobies: pas de croissance dans des conditions anaérobies, mais croissance dans des conditions aérobies c) Caractéristiques physiologiques 1) Réduction de nitrate en nitrite: pas de réduction 2) Production anaérobie de gaz à partir de nitrate: négative 3) Test de rouge de méthyle (MR) négatif 4) Test de Voges-Proskauer (VP): négatif ) Production d'indole: aucune 6) Production de H 25: aucune 7) Hydrolyse d'amidon: positive 8) Utilisation de citrate: positive 9) Utilisation d'une source non organique d'azote: utilise nitrates et sels d'ammonium ) Production de pigment: 2521 163 -6- aucune 11) Test d'urée: négatif 12) Test d'oxydase cytochrome: positif 13) Test de catalase: positif 14) Test 0-F (milieu de Hugh et Leifson's) faible fermentation ) Production d'acide et génération de gaz carbonates: Production d'acide à partir d'hydro- Génération de gaz L-Arabinose D-Xylose D-Gl ucose D-Mannose D-Fructose DGalactose Maltose Sucrose Lactose Trehalose D-Sorbitol D-Mannito-l Inositol Glycerol Amidon. Ribose Raffinose Cellobiose (Remarques) +: positif, 16) Autres i) Déamination de phénylalanin positive ii)'Hydrolyse de caséine: positive iii) Décomposition de tyrosine: + f f + f + + - + +f- f- + ngatif -:nêgati f - e: -7- positive Comme il est montré ci-dessus, la souche NKS-21 selon la pré- sente invention est une bactérie de sporange aérobie, que 1 'on croit clairement appartenir au genre Bacillus Les traits caractéristiques de cette souche sont que cette souche croît dans un milieu neutre à alcalin, et que la gamme de p H optimale pour la croissance est de 8 à 10. Ces propriétés microbiologiques sont similaires à celles des souches connues Bacillus pasteurii et Bacillus alcalophilus Cependant, la souche NKS-21 selon la présente invention se distingue nettement des deux souches mentionnées ci-dessus dans certaines propriétés micro- biologiques, bien que certaines propriétés microbiologiques de la sou- che NKS-21 soient les mêmes que celles des souches connues mentionnées cidessus Par exemple, à la fois les souches de Bacillus pasteurii et Bacillus alcalophilus croissent dans une zone à p H alcalin mais la dernière ne peut pas croitre à un p H de 7 Contrairement à cela, NKS-21 croît aussi bien dans une zone à p H alcalin, mais croît encore tien dans un p H neutre Par conséquent, NKS-21 est différent de Bacillus alcalophilus sur ce point De plus, Bacillus pasteurii n'hydrolyse pas l'amidon, mais h KS-21 hydrolyse l'amidon En outre, NKS-21 se distingue de Bacillus pasteurii sur les points suivants: 1) Bacillus pasteurii réduit les nitrates, tandis que NKS-21 ne réduit pas les nitrates; 2) Bacillus pasteurii présente des endospores ayant la forme d'une sphère ou presque d'un ovale, tandis que les endospores de NKS-21 sont ovales ou elliptiques; et 3) Bacillus pasteurii décompose l'urée, tandis que NKS-21 ne décompose pas l'urée. Des différences mentionnées précédemment dans les propriétés microbiologiques, il apparaît clairement que NKS-21 est différent de Bacillus pasteurii. Les donnees de classification de Bacillus alcalophilus ne sont pas décrites en détail dans le "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" mentionné précédemment Comme la souche standard de Bacillus alcalophilus n'est pas disponible, les propriétés microbiolo- giques de NKS-21 furent comparées expérimentalement avec celles des souches originales Bacillus alcalophilus NCIB 10436 et NCIB 10438 citées dans le "Bergey's Manuel of Determinative Bacteriology" NCIB 10436 et NCIB 10438 sont à la fois légèrement positives dans la réaction de colo- 8- ration de Gram et sont légèrement décolorées Ces propriétés sont similaires à celles de NKS-21 Si l'on regarde les caractéristiques mor- phologiques des cellules végétatives, de courts bâtonnets ayant une taille de 0,7 m x 2,0 N met de longs bâtonnets ayant une taille de 0,8 P 4 m x 4,6 P m furent observés au moyen d'un microscope électronique dans NCIB 10436, et des cellules végétatives ayant une taille de 0,7 p m x 1,5 p m furent observées dans NCIV 10438 Contrairement à cela, la taille des cellules végétatives de NKS-21 étaient de 0,6 à 0,8 I m x 2,5 à 3,5 m selon les observations à l'aide d'un microscope électroni- que, et les endospores avaient une forme ovale à elliptique ayant une taille de 0,8 ' m x 1,2 J m Il ne fût pas observé de mobilité dans NCEB 10436 et 10438, tandis que NKS-21 est mobile De plus, les propriétés physiologiques de NKS-21 sont clairement différentes de celles de NCIB 10436 et de NCIB 10438 sur les points suivants: 1) Bacillus alcalophilus NCIB 10436 et NCIB 10438 ne croissent pas dans un milieu de mannitol, tandis que NKS-21 croit; et 2) NCIB 10436 ne croît pas dans un extrait d'aliments bouillon de peptone contenant 7 % de chlorure de sodium, tandis que NCIB 10438 et NKS-21 y croissent. Des différences mentionnées ci-dessus, NKS-21 se distingue de Bacillus alcalophilus NCIB 10436 et NCIB 10438, bien que certaines des propriétés microbiologiques de NKS-21 soient similaires à celles de Bacillus alcalophilus. De plus, NKS-21 est similaire à Bacillus subtilis en ce que la taille des cellules végétatives de Bacillus subtilis est de 0,7 à 0,8 m en largeur et de 2 à 31 m en longueur et que Bacillus subtilis décompose l'amidon Cependant, NKS-21 se distingue de Bacillus subtilis sur les points suivants: 1) Bacillus subtilis croît bien à un p H de 5,5 à 8,5, mais ne croit pas à un p H de 9 à 10, auquel NKS-21 croît bien, et 2) la température de croissance maximale de Bacillus subtilis est de 45 C à 55 C, tandis que NKS-21 ne croît pas au-dessus de 43 C. Par conséquent, NKS-21 se distingue clairement de Bacillus subtil i s. Aussi, NKS-21 se distingue clairement du point de vue des pro- priétés microbiologiques des Bacillus pasteurii, Bacillus alcalophilus et Bacillus subtilis et une souche ayant les mémes propriétés micro- biologiques que NKS-21 n'est pas décrite dans le "Bergey's Manual of -9Determinative Bacteriology" Par conséquent, NKS-21 est identifie com e une nouvelle souche appartenant au genre Bacillus. Selon la présente invention, une nouvelle protéase alcaline API-21 ayant une haute activité à une température relativement basse est préparée par la culture de la nouvelle NKS-21 dans un milieu de cul- ture alcalin, suivi de la récupération à partir du produit cultivé Les micro-organismes utilisés pour la culture ne sont pas limités à NKS-21 mais les microorganismes incluant les mutants naturels ou artificiels de NKS-21 peuvent aussi être utilisés aussi longtemps qu'ils peuvent pro- duire une protéase alcaline API-21 Ces micro-organismes sont inclus dans le champ de la présente invention. La nouvelle protéase alcaline API-21 obtenue à partir de la culture de NKS-21 selon la présente invention sera expliquée maintenant en détail. NKS-21 peut être cultivé d'une manière aérobie, par exemple, dans un bouillon de culture de peptone ayant un p H de 8 à 10 au moyen d'une culture agitée ou d'une culture agitée aérobie après l'inoculation de NKS21 dans le milieu de culture à une température de 10 C à 40 C pendant 40 à 150 heures Après l'achèvement de la culture, les cellules microbiennes cultivées sont séparées facilement du produit de culture et lasolution limpidesurnageante cultivée peut être Obtenue La protéase alcaline API-21 est facilement précipitée au moyen de l'addition d'un solvant organique tel que l'éthanol en une solution surnageante La protéase alcaline précipitée API-21 fait l'objet d'une séparation par centrifugation et d'un séchage refroidissant dans un dispositif produisan; t le vide Ainsi, l'enzyme désiré, la protéase alcaline API-21 peut être obtenue. L'activité de la protéase alcaline API-21 ainsi obtenue est déterminée comme suit. La solution limpide cultivée ou la solution d'enzyme est diluée d'une manière appropriée avec 0,1 mole de carbonate de sodium, 0,1 mole d'acide borique, 1 solution tampon de chlorure de potassium (p H 10,0). A 0,5 ml de la solution résultante, on additionne 0,5 ml d'une solution à 2 %J de caséine de lait ayant un p H de 10,0 et alors, il se produit une réaction enzymatique à 30 C pendant 10 minutes Après l'achèvement de la réaction, 2 ml de 0,1 mole d'acide trichloroacétique contenant 0,2 mole d'acide acétique, 0,2 mole d'acétate de sodium est ajouté au mélange de réaction pour termine la réaction Le mélange peut être - maintenu pendant 10 minutes ou plus à 30 C, et alors, il est filtré au moyen d'un papier fjltre 5 mi de 0,4 mole ae carbonate de sodium et 1 ml d'un réactif du phénol dilué 5 fois sont ajoutés à 1 ml du filtrait obtenu ci-dessus et le mélange peut rester à 30 û pendant 20 minutes pour développer la coloration Ensuite, le pouvoir d'absorption du mélange coloré est mesuré à 660 nm L'unité d'enzyme est déterminée selon "Commission on Biochemical Nomenclature" (Comprehensive Biochemistry Vol 13, Pages 26 27, 1973), dans laquelle la quantité de protéase alcaline qui libère des substances d'acide soluble trichloroacétique montrant le développement de la coloration à 660 nm correspondant à une mole de tyrosine à partir d'un substrat de caséine à 1 ayant un p H de ,0 à 30 C pendant une seconde, est définie comme " 1 Katal". Les propriétés physicochimiques de la protéase-alcaline API-21 (mentionnées comme étant le présent enzyme dans la suite) seront décrites maintenant en détail. 1) Activité Hydrolyse de protéine telles que la caséine, l'hémoglobine, l'albumine, la globuline, les protéines animales, les protéines de pois- son et les protéines de soja. 2) Effet du p H sur l'activité enzymatique Comme il est montré à la figure 1, le p H optimal est d'en- viron 10 à environ 11 L'activité relative fût déterminée de la manière suivante. Chaque solution tampon ( 0,5 ml) mentionnée ci-dessous con- tenant 2 ' de caséine de lait fût ajoutée à 50 ml de la solution du pré- sent enzyme pour préparer une solution test. p H Solution tampon 6-9 0,1 mole de phosphate de potassium 0,05 mole de borate de sodium 9-11 0,1 mole de carbonate de sodium 0,1 mole d'a- cide borique chlorure de potassium 11-12 0,1 mole d'hydrogenphosphate disodique - hydroxyde de sodium L'activité enzymatique de la solution test fût déterminée de la manière décrite ci-dessus L'activité relative (en %) fût calculée, dans laquelle l'activité enzymatique a un p H de 10,0 fût définie comme étant 100 %. 3) Effet du p H sur la stabilité sans substrat 2521 1 63 il - Comme montré à la figure 2, le présent enzyme est stable pour un p H compris entre environ 7 et environ 11,5. La stabilité du présent enzyme fût évaluée de la manière suivante. Chaque solution tampon ( 0,5 ml) mentionnée ci-dessous fût ajoutée à 50 P 1 l de la solution du présent enzyme dialysée et diluée d'une manière adéquate et le mélange fût placé dans un incubateur à C pendant 10 minutes. p H Solution tampon 3-8 0,1 mole d'acide citrique 0,2 mole d'hydrogeno- phosphate de disodium 8-11 0,1 mole de carbonate de sodium 0,1 mole d'acide borique chlorure de potassium 11-12 0,15 mole d'hydrogeno-phosphate disodique - hydroxyde de sodium Après l'incubation, 9,5 ml d'une solution tampon à 0, 1 mole de carbonate contenant 2 % de caséine et ayant un p H de 10,0 fût ajouté au mélange L'activité enzymatique du mélange fût déterminée de la ma- nière décrite comme ci-dessus L'activité relative (C) fût calculée, dans laquelle l'activité enzymatique à un p H de 10,0 fût définie comme étant 100 e%. Comme montré à la figure 2, le présent enzyme est le plus stable à un p H d'environ 10 à environ 11 Dans cette zone de p H, l'acti- vité originale du présent enzyme est complètement retenue De plus, 80 ou plus de l'activité restante est fournie à un p H de 7 à 11,5. 4 L Effet de la température sur l'activité enzymatique Comme il est montré à la figure 3, le présent enzyme fût activé par de la caséine à une température de 5 à 65 C et à un p H de ,0 La température optimale fût de 45 à 50 C. 5) Effet de la température sur la stabilité sans substrat Comme il est montré aux figures 4 A et 4 B, l'activité du présent enzyme est complètement retenue jusqu'à 40 C suite à un chauffa- ge sans substrat à un p H de 10,0 pendant 10 minutes, mais la majeure partie de l'activité est perdue à 50 C De plus, l'activité du présent enzyme est retenue jusqu'à 45 C à un p H de 8 pendant 10 minutes, mais la déactivation se produit à 50 C et l'enzyme est complètement désac- tivé à 60 C. 6) Stabilité au stockage 2521 1 63 12 - Le présent enzyme est stable à l'égard de la réfrigération et d'un séchage à froid On n'observe pas de diminution substantielle dans l'activité de l'échantillon séché à froid quand l'échantillon reste à la température ambiante pendant 2 semaines Quand l'échantillon séché à froid est stocké dans une désécheuse à la température ambiante, l'activité du présent enzyme est complètement retenue. 7) Inhibition Le présent enzyme fût remarquablement paralysé par un inhi- biteur actif de résidu de sérine tel qu'un acide diisopropylfluorophos- phorique (DFP) et d'un fluorure de phenylmethanesulfonyl (PMSF) Il fût également paralysé par une cétone benzyloxycarbonyl-phenyl-alanine- chloromethyl (ZPCK) Cependant, le présent enzyme ne fût pas paralysé par une cétone tosyl-phenyllalanine-chloromethyl (TPCK), qui est un inhibiteur d'une protéase animale de serine, du chymotrypsine, et d'une cétone tosyl-lysine-chloromethyl (TLCK), qui est un inhibiteur de la trypsine. De plus, l'activité du présent enzyme ne fût pas affectée défavorablement par l'addition de benzoate de p-chloro-mercure (PCMB) et de tetraacétate ethy 11 ne diamine (EDTA) De plus, l'activité du pré- sent enzyme ne fût pas affectée défavorablement par l'addition de pepsta- tine Comme résultat des tests d'inhibition mentionnés ci-dessus, il est clair que le présent enzyme est une protéase ayant un résidu de serine dans le site activé. 8) Procédé de détermination de l'activité enzymatique Comme mentionné ci-dessus. 9) Poids moléculaire Le poids moléculaire du présent enzyme est d'environ 22; 000 comme cela a été estimé par une filtration colloïdale par Sephadex (mar- ques de fabrique) G-75 à un p H de 10. 10) Point isoélectrique Le point isoélectrique du présent enzyme est de 7, 4 comme cela a été estimé par un procédé d'électrofocalisation. 11) Absorption des ultra-violets (UV) Le sommet d'absorption est présent dans le spectre d'absor- ption des UV entre 275 et 282 N m. 12) Spectre d'absorption des infra-rouges (IR) Voir figure 5. 13) Analyse élémentaire vr 252 1 1 63 13 - Omise étant donné que les différences caractéristiques dans ces substances de haut poids moléculaire, tel que le présent enzyme, ne peuvent pas se manifester par la comparaison des teneurs des éléments tels que le carbone, l'azote ou l'hydrogène. 14) Composition d'amino acide Une composition d'amino acide calculé à titre d'essai sur la base des résultats par l'hydrolyse acide de l'enzyme excepté pour la cysteine/cystine et le tryptophane, tandis que la décomposition par l'acide performique pour l'analyse de cysteine/cystine et par une décomposition alcaline pour l'analyse d'un troptophane, selon le procédé décrit dans la littérature (Methods in Enzymology" Volume XI, 1967 Presse Académie NEW YORK) sont indiqués au tableau 1, avec les compositions des autres protéases alcalines, dont les données sont citées à partir de la littérature * 1, * 2). Comme le montre le tableau 1, il y a de grandes différences entre API-21 et d'autres enzymes cités dans des compositions amino acides telles qu'une serine, arginine, lysine, valine, alanine, trypto- phane, proline, et suivantes. o / / 14 - TABLEAU i Comparaison des compositions d'amino-acide entre API-21 et d'autres protéases alcalines Amino acide API-21 Substilisine Novo) Substi l isine Carlsberg Lys i ne Histidine Arginine Tryptophane Acide aspartique /Asparagine ThreonineÀ Serine Acide glutamique /Gultamine Proline Glycine Alanine Valine Methionine Isoleucine Leucine Tyrosine Phenylalanine Cysteine /cystine 1 il o o * 1) J Biol Chem, 243,5296 ( 1968) 12) J Biol Chem, 243,2134 ( 1968) Comme il apparaît clairement des résultats mentionnés ci- dessus, le présent enzyme, qui a un p H optimal de 10 à 11, retient l'ac- tivité à une température relativement basse, mais il est désactivé à une température relativement haute (par exemple 50 C ou plus) Le présent enzyme ayant ses propriétés physico-chimiques sera comparé maintenant i i i 1 i i 2521 1 63 - avec des protéases alcalines similaires. Parmi les proteases alcalines extra-cellulaires dérivées de bactéries positives de Gram, sont bien connues par exemple une protéase alcaline (subtilisin carlsberg) dérivée de Bacillus licheniformis et une protease alcaline (subtilisin Novo) dérivée de Bacillus subtilis. Ces enzymes sont des proteases ayant un résidu de serine dans le site actif, un poids moléculaire d'environ 27 000 à 30 000 et un point isoélectrique de 9 à 11 La plupart des autres proteases alcalines extra-cellulaires dérivées du genre Bacillus ont un poids moléculaire de 25 000 à 30 000 et un point isoélectrique de 9 à 11 La plupart des enzymes mentionnés ci-dessus ne sont pas désactivés par la chaleur à C et un p H de 10 pendant 10 minutes Les proteases alcalines connues ayant un poids moléculaire inférieur dérivé du genre Bacillus sont des protéases alcalines E-1 et E- 2 dérivées de Bacillus No D-6, les deux ayant un poids moléculaire de 20 000, l'activité de celles-ci ne dimi- nuant pas du tout par le chauffage à 50 C et un p H de 9,0 (voir la pu- blication du brevet japonais examiné KOKOKU No 56-4236) De plus, connue comme étant une protease alcaline dérivée du genre Bacillus existe uneprotéase alcaline dérivée de Bacillus alcalophilus NCIB 10436 et une protéase alcaline dérivée de Bacillus alcalophilus NCIB 10438 Cepen- dant, ces enzymes retiennent environ 90 %O de leur activité par le chauf- fage à 50 C et un p H de 10 pendant 10 minutes comme il est indiqué au tableau 2 Comme il est également indiqué au tableau 2, des proteases alcalines dérivées de Bacillus licheniformis et Bacillus subtilis retien- nent 70 à 80 % de leur activité suite à un chauffage à 50 C et un p H de 10 pendant 10 minutes 'Ainsi, ces protéases alcalines connues dérivées de bactéries appartenant au genre Bacillus telles que Bacillus subtilis sont stables dans une zone de température relativement élevée Contrai- rement à cela, comme mentionné ci-dessus, le présent enzyme perd la plupart de ses activités sous l'effet du chauffage à 50 C et un p H de pendant 10 minutes, tandis qu'il est stable suite à un chauffage à une température jusqu'à 40 C et un p H de 10 pendant 10 minutes De plus, la désactivation du présent enzyme se produit par le chauffage à 50 C et un p H de 8 pendant 10 minutes et la plupart de ses activités sont perdues à 60 C dans les mêmes conditions Au vu des différences dans les carac- téristiques de température de stabilité, de poids moléculaire et de points isoélectriques, le présent enzyme se distingue clairement des proteases alcalines connues dérivées de bactéries appartenant au genre Bacillus ? 2521 1 63 16 - et n'a pas fait l'objet de publications Par conséquent, le présent enzyme est déterminé comme étant nouveau et il est désigné comme "alcaline protéase API-21 ". w cd c D r U r 7,4 U-1 Ln, o Ui TABLEAU 2 Protéase alcaline Poids moléculaire Protéase alcaline dérivéede Bacillus licheniformis Protéase alcaline dérivée de Bacillus subtilis Protéase alcaline dérivée de Bacillus alcalophilus NCIB 10436 Protéase alcaline dérivée de Bacillus alcalophilus N Ci B 10438 Protéase alcaline dérivée de Bacillus *NKS-21 27,287 * 3) 27,537 * 4) Point isoélectrique 9,4 * 3) 9,1 * 4) Activité restante (%) suite à un chauffage à un p H de 10 pendant minutes C C 22,000 * 3) Fette Seiten Anstrichmittel 75, p 49 ( 1973 * 4) The Enzymes vol III p 564 ( 1971) km l 1- 2521 1 63 18 - Le présent enzyme API-21 peut être utilisé avec un élément constitutif détergent, et ainsi il peut être utilisé comme un additif détergent car il est stable pour un p H compris entre 7 et 11,5 et le maximum d'activité enzymatique est obtenu avec un p H compris entre 10 et 11 comme mentionné ci-dessus Plus particulièrement, le présent enzyme fournit sa haute activité même à une température relativement basse (par exemple 20 OC à 30 OC), si on le compare avec les enzymes traditionnels utilisés pour les détergents En conséquence, le présent enzyme est un des types de protéase alcaline le plus souhaitable comme additif pour un détergent ménager dans un pays tel que le JAPON o les vêtements sont lavés à la température ambiante De plus, le présent enzyme peut également être effectivement utilisé dans un traitement résiduel et dans un traitement d'eau d'égout pour une rapide décompo- sition des protéines et pour une réutilisation des ressources en azote, étant donné que la teneur en protéines dans les eaux résiduelles domes- tiques et dans les eaux d'égout domestiques a augmenté récemment. De plus, l'utilisation de la présente protéase dans une industrie ali- mentaire comme procédé nutritif est avantageuse, car l'enzyme peut facilement être désactivé après son utilisation par un chauffage à une température relativement basse, par exemple comprise entre 50 et O C Ainsi, l'utilisation du présent enzyme est efficace du point de vue du contrôle de la qualité et du procédé nutritif. EXEMPLE La présente invention sera illustrée maintenant, mais d'une manière non limitative, par les exemples suivants, dans lesquels tous les pourcentages sont exprimés sur la base du poids sauf indications contraires. EXEMPLE 1 La présente nouvelle souche NKS-21 fût cultivée dans un milieu de culture inclinée Le produit cultivé fût mis en suspension dans une eau stérilisée et 0,5 ml de cette suspension fût utilisé comme un inoculent En un milieu de culture produisant l'enzyme contenant 1 5- de caséine, I c d'extrait de viande, 1 c, de polypeptone et 1 et de bicar- bonate de sodium, fut additionnée une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique pour obtenir un p H de 9,5 ou 7,2. Dans un incubateur agitateur (A) utilisant un agitateur rotatif ml, 200 mil ou 300 ml du milieu préparé ci-dessus ayant un ph de 9,5 19 - furent ajoutés dans un flacon Erlenmeyer d'un litre Après la stérili- sation, 0,5 ml de la suspension de NKS-21 préparé fût inoculé dans le milieu de culture et l'incubation fût réalisée à une température de C et sous des conditions d'agitation de 200 t/mn pendant 41, 65 ou 89 heures. D'un autre côté, dans un incubateur agitateur alternatif (B), ml du milieu de culture mentionnés ci-dessus ayant un p H de 9,5 ou 7,2 fût ajouté dans un récipient Sakaguchi 500 ml Apres la stérili- sation, 0,5 ml de la suspension de NKS-21 préparée ci-dessus fût inoculée dans le milieu de culture et l'incubation avec agitation alternative fût réalisée sous des conditions d'agitation de 110 c/mn à 30 C pen- dant 66 ou 90 heures. Après l'incubation, le produit obtenu fût centrifugé à 28 000 g pendant 15 minutes, et la solution surnageante résultante fût retirée. L'activité de la protéase alcaline de cette solution fat déterminée de la manière décrite ci-dessus. Les résultats sont indiqués dans les tableaux 3 et 4. TABLEAU 3 Résultats de l'incubateur-agitateur rotatif (A) ( 20 C, p H initial du milieu: 9,5) Activité enzymatique Quantité du mi (micro katal/litre) lieu (ml) 41 H 65 H 89 H 1,3 2,6 2,7 2,0 4,3 4,0 300 2,5 5,6 5,4 TABLEAU 4 Résultats de l'incubateur-agitateur alternatif (B) ( 30 C) p H initial du Activité enzymatique milieu (micro katal/litre) 66 H 90 H 9,6 4,5 3,0 7,2 4,9 3,4 - Lorsque la souche NKS-21 fit l'objet d'une culture à 30 OC avec agitation alternative, la taille de NKS-21 fût bonne non seulement pour un p H du milieu initial de 9,5 mais également pour un p H du milieu initial de 7,2 et la protéase alcaline désirée API-21 fût produite avec un haut rendement dans chaque cas Comme dans le cas d'un p H du milieu initial de 9,5, des résultats similaires furent obtenus quand NKS-21 fût cultivé dans un agitateur alternatif à 20 OC et avec un p H du milieu initial de 7,2. Sept litres de la solution surnageante après la séparation par centrifugation du produit cultivé NKS-21 obtenu ci-dessus, fut refroidi à 3 O C Alors, deux fois le volume d'alcool éthylique préalablement refroi- dis à 3 O C fut ajouté à la solution surnageante refroidie pour former un précipité Le précipité résultant fût séparé par centrifugation dans un séparateur centrifuge refroidi à 1 100 g et, alors, le précipité séparé fût immédiatement séché et refroidi dans un dispositif produisant le vide Ainsi, 15,7 g de la poudre d'enzyme désiré fût obtenu. L'activité spécifique de la'protéase alcaline ainsi obtenue à partir d'un kilo de la protéine fût de 0,71 micro katal ( 0,71 Vktal/ kg de protéines) et le rendement de récupération fût de 33 ,, o la protéine fût déterminée selon un procédé de Lowry. L'échantillon d'enzyme séché, refroidi ainsi obtenu fût dis- sout dans une solution tampon à 0,01 mole de carbonate de soude, acide borique, chlorure de potassium (p H 10,0) contenant 0,2 mole de chlorure de sodium La solution d'enzyme colloïdale fût filtrée à l'aide d'une colonne (diamètre 2 cm x 74 cm) remplit de Sephadex G-75 (marque de fa- brique disponible à Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède) préalablement équilibrée avec la solution tampon mentionnée ci-dessus pour fractionner 3 ml à chaque solution L'enzyme purifié fût obtenu à partir des fractions principales qui avaient une haute activité enzymatique L'enzyme ainsi obtenu avait un poids moléculaire d'environ 22 000 selon les estimations d'une filtration collo Tdale par Sephadex G-75 (marque de fabrique) à un p H de 10 et un point isoélectrique de 7,4 selon les estimations du pro- cédé d'électro-focalisation L'activité spécifique de l'enzyme ainsi obte- nue augmentait d'environ 10 fois si on la compare à celle obtenue sans filtration colloÂdale et l'activité spécifique basée sur 1 kg de protéine fût de 7,0 micro katal Le rendement de récupération fût de 70 %. EXEMPLE 2 La production de protéase alcaline dans un réservoir de fermen- 252 1 1 63 21 - tation de 500 litres et la production ultérieure de la préparation d'en- zyme fût réalisée en utilisant une souche NKS-21 produisant des protéases alcalines. A un milieu de culture produisant l'enzyme contenant 1 % de caséine, 1 % d'extrait de viande, 1 % de polypeptone et 1 % de bicarbonate de soude, on ajouta une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium de façon à obtenir un p H de 9,5 Une quantité de 300 ml du milieu préparé ci- dessus fût ajoutée dans un flacon Erlenmeyer d'un litre Après la stéri- lisation, 0,5 ml de la suspension de NKS-21 préparée de la même manière que mentionnée dans l'exemple 1 fût inoculée dans un milieu de culture et l'incubation fût réalisée à 20 C pendant 3 jours 300 ml du produit cultivé résultant fût ajouté dans un récipient stérilisé de fermentation par battement de 30 litres contenant 10 litres du milieu de culture préparé ci-dessus ayant un p H de 9,5, alors, la culture par agitation aérobie fût réalisée à 20 C pendant 3 jours sous les conditions d'une vitesse d'agitation de 400 t/mn et un taux d'aération de 12 litres/mn. Après l'incubation dans le récipient de fermentation par bat- tement de 30 litres pendant 3 jours, 10 litres du produit cultivé furent transférés dans un réservoir de fermentation stérilisé de 500 litres con- tenant 220 litres du milieu de culture préparé ci-dessus ayant un p H de 9,5 Alors, une incubation par agitation aérobie fût réalisée à 20 C pendant 4 jours sous les conditions d'une vitesse d'agitation de 400 t/mn et un taux d'aération de 200 litres/mn. Après l'incubation, le produit cultivé fût centrifugé à 11 000 g dans un séparateur centrifuge à refroidissement continu, et 200 litres de solution surnageante furent obtenus Cette solution surnageante fût refroidie à 3 C Alors, on ajouta deux fois le volume d'alcool éthylique préalablement refroidi à 3 C à la solution surnageante refroidie pour précipiter les protéases alcalines désirées Les protéases alcalines précipitées API-21 furent centrifugées séparément à environ 11 000 g dans un séparateur centrifuge à refroidissement continu, et alors, les protéases alcalines séparées API-21 furent immédiatement séchées et re- froidies dans un dispositif produisant le vide Alors, la préparation d'enzymes par la protéase alcaline séchée refroidie API-21 fût obtenue. Poids d'enzyme récupéré en g 1 230 Activité spécifique (micro katal/kg protéine) 0,52 Rendement de récupération en % 70 L'enzyme ainsi obtenu fût purifié de la même manière que men- 2521 1 63 22 - tionne dans l'exenple 1 pour obtenir une protéase aicaline ayant un poids moléculaire d'environ 22 000 et un point isoélectrique à un p H de 7,4. 23 - REVENDICATIONS 1 Protéase alcaline API-21, caractérisée par le fait qu'elle présente les propriétés physico-chimiques suivantes: ( 1) Activité: hydrolyse de la caséine dans les conditions alcalines, avec un p H optimal compris entre 10 et 11, et une tempéra- ture optimale d'activité comprise entre 45 et 50 C, ( 2) Stabilité: pas de diminution de l'activité enzymatique observée jusqu'à 40 C sous l'effet d'un chauffage sans substrat pen- dant 10 minutes et à un p H de 10, mais une diminution de l'activité enzymatique de 90 % ou plus observée à 50 C sous l'effet d'un chauffage pendant 10 minutes et un p H de 10, la désactivation se produit à 50 C sous l'effet d'un chauffage pendant 10 minutes et un p H de 8, et une complète désactivation substantielle se produisant à 60 C sous l'effet d'un chauffage pendant 10 minutes et un p H de 8 La protéase étant stable dans les conditions alcalines, spécialement avec un p H compris entre 7 et 11,5 et étant stable à l'égard d'un refroidissement ou d'un séchage à froid; ( 3) Molécule d'enzyme: la protéase est une protéine ayant un poids moléculaire d'environ 22 000, selon les estimations du procédé par filtration colloïdale, un point isoélectrique de 7,4 selon le procédé d'électro-focalisation, un sommet d'absorption de 275 à 282 nm dans un spectre d'absorption d'ultra-violets (UV), des caractéristiques d'absorp- tion des infrarouges (IR) indiquées dans la figure 5 et un résidu de sérine dans le site actif. 2 Procédé de préparation d'une protéase alcaline API-21, caractérisé en ce que: (a) l'on cultive des espèces de NKS-21 du genre Bacillus capa- ble de produire une protéase alcaline API-21 dans un milieu de culture alcalin, et (b) l'on récupère la protéase alcaline API-21 à partir du pro- duit cultivé.