FR 2521146 A1 19830812 FR 8301607 A 19830202 Dérivés thioliques de L'érythromycine à activité thérapeutique, procédé de préparation, et produits pharmaceutiques dans lesquels ils apparaissent. La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés thioliques de l'érythromycine et de l'ester propionique de l'érythromycine, notamment des sels de l'érythromycine avec des acides contenant dans leur molécule un atome de soufre sous forme de thio-alcool ou de thioéther ou encore de thio-ester. Les composés de la présente invention trouvent une application thérapeutique dans les cas où l'on utilise déjà l'érythromycine ou son propionylester, et se caractérisent en général par une très faible toxicité et par une concentration sanguine élevée; ce sont là des aspects très importants du point de vue thérapeutique. Les dérivés suivant la présente invention répondent à la formule générale suivante: R - COO - X (1) où R représente le radical thEhoy1m-mercaptopropionyl- glycine et X représente le radical de l'érythromycine ou du propionylester de l'érythromycine ayant pour formule: où R1 représente H ou CH3 - CH2 - CO. Les composés suivant la présente invention se présentent tous comme des poudres blanches, microcristallines. En général, les sels contenant de l'érythromycine monopropionylester sont moins solubles que les sels correspondants contenant de l'érythromycine base; pour tous les dérivés, en outre, la solubilité augmente dans des mélanges de solvants, tels que eau-éthanol (1-5%), et eau-glycol-éthylénique (1-5%). Leur emploi est de toute façon prévu sous toutes les formes pharmaceutiques: capsules, solutions, injections, aérosols, pommades, poudres et suspensions, aussi bienpourl'homme que pour les applications vétérinaires. Pour les sels de l'érythromycine base en particulier, on prévoit des formules pharmaceutiques de type injectable ou administrable par aérosol, tandis que pour les dérivés de propionyl érythromycine, on préfère des formes pharmaceutiques à administrer par voie orale en particulier, et des suspensions. Presque tous les composés craignent la lumière solaire, l'humidité et la chaleur, et sont de véritables sels, chimiquement et physiquement bien définis.La méthode de préparation des dérivés thioliques de l'érythromycine ou du propionylester de l'érythromycine, suivant la présente invention, prévoit de faire réagir de l'érythromycine base ou l'ester propionique de l'érythromycine base avec l'acide, dans une proportion stoechiométrique ou en présence d'un léger excès du noyau de l'antibiotique et est caractérisée en ce que la réaction s'effectue dans un solvant organique, à une température comprise entre 20 et 400C et en présence d'eau en quantité non supérieure à 20%. On a en effet trouvé, et cela est surprenant, que la présence de l'eau, de préférence en quantité de l'ordre de 4 à 5% en volume par rapport au solvant de réaction, permet de compléter la réaction avec d'excellents rendements. En revanche, les quantités d'eau supérieures à 20% comportent le risque d'une redissolution du produit de réaction dans le mélange aqueux/organique. Les composés de la présente invention ont fait l'objet d'essais toxicologiques, pharmacologiques et pharmacodynamiques ayant pour but de vérifier la toxicité (et donc leur possibilité d'emploi dans le domaine thérapeutique) et les propriétés thérapeutiques. Dans les résultats indiqués ci-après, les composés de l'invention ont été référencés par les symboles suivants: RV/06 - érythromycine-thénoyl-rmercaptopro- pionylglycinate RV/16 - érythromycine propionate thenoyl-z- mercaptopropionylglycinate. A) Toxicité aiguë La toxicité aiguë a été déterminée sur des souris blanches Swiss par voie orale et intraveineuse. Les DL50 ont été calculées par les méthodes des Probits, à partir de la mortalité enregistrée 10 jours après le traitement. COMPOSE VOIE D'ADMINISTRATION LIMITE DE CONFIANCE DL50 mg/kg (l.f.) Erythromycine Voie orale > 3000 Chlorhydrate d'êrythromycine Voie intraveineuse 376,58 (478,78-296,20) Rv 06 Voie orale > 3000 Kv 06 Voie intraveineuse 426,43 (526,55-345,34) Rv 16 Voie orale 3000 B) Activité anti-bactérienne in vitro oOn a évalué l'activité anti-bactérienne des composés suivant l'invention en comparant les différentes concentrations minimales d'inhibition (MIC) avec celles de l'érythromycine base et de l'estolate d'érythromycine sur des souches gram-positives et gram-négatives cultivées sur Brain Heart Infusion (Difco). Les échantillons examinés d'estolate d'érythromycine RV 06 ont été soumis à une hydrolyse préventive suivant description contenue dans 1'U.S.P. (pharmacopée américaine), XXe édition, page 1347. Les MIC/ml qui correspondent à la concentration la plus faible susceptible de provoquer une inhibition complète du développement bactérien, sont indiquées dans le tableau I suivant. érythro- érythro SOUCHE mycine mycine RV 06 RV 16 estolate 1) Staph.albus SS 03 0,05 0,05 0,5 0,05 2) SS 04 0,05 0,05 0,025 0,05 3) Staph-aureus SS 07 0,025 0,205 0,025 0,025 4) SS 08 0,025 0,025 0,025 0,025 5) SS 09 0,1 0,05 0,1 0,1 6) SS 10 0,1 0,2 0,1 0,05 7) Strept. haémolyticus SS 17 3 3 3 1,5 8) SS 18 1,5 3 1,5 1,5 9) Strep. faecalis SS 19 0,1 0,1 0,1 0,1 10) S.lutea ATCC 9341 0,01 0,01 0,01 0,01 11) B.subtilis ATCC 6633 0,025 0,01 0,01 0,01 12) SS 127 0,05 0,025 0,025 0,025 13) B.cereus ATCC 11778 0,4 0,8 0,4 0,4 14) B.anthranis SS 08 0,4 0,4 0,4 0,4 14bis) SS 09 0,4 0,4 0,4 0,4 15) Br.melitensis SS 19 3 3 3 3 16) Br.abortus SS 7 12 6 6 12 17) Citrobacter SS 05 > 200 > 200 > 200 > 200 18) - SS 09 > 200 > 200 > 200 > 200 19) S.infantis SS 08 100 100 100 100 20) S.heidelberg SS 18 100 100 100 100 21) E.cloacae SS 07 > 200 > 200 > 200 > 200 SOUCHE érythro- érythro mycine mycine Kv 06 RV 16 estolate 22) E.aerogenes SS 011 100 50 50 100 23) Ps.aeruginosa SS 10 100 100 200 100 24) SS 12 > 200 200 200 200 25) E.coli SS 04 100 100 50 50 26) SS 05 50 100 100 100 27) SS 06 100 50 100 25 28) SS 07 50 50 50 50 29) Pr.mirabilis SS 09 > 200 > 200 > 200 > 200 30) Pr.vuîgaris SS 10 > 200 > 200 > 200 > 200 31) Kl.aerogenes SS 71 50 100 100 100 32) Rl.pneumoniae SS 04 100 100 100 100 33) Sr.marcescens SS 03 200 > 200 200 > 200 34) C.diphteriae SS 19 0,01 0,025 0,02 0,02 35) D.pneumoniae SS 23 0,05 0,05 0,05 0,05 36) N.gonorreae SS 27 0,8 0,8 0,8 0,8 37) N.meningitidis SS 04 0,8 1,5 0,8 0,8 38) H.influentiae SS 02 1,5 1,5 0,8 1,5 39) R.pertussis SS 03 0,4 0,4 0,4 0,2 40) R.Tubercolosis SS 03 50 50 50 50 41) C.albicans SS 04 100 200 100 200 42) CÏ.tetani SS 17 0,4 0,2 0,2 0,8 C) Activité anti-bactérienne in vitro Infection expérimentale par Staph.aureus et D. pneumoniae On a utilisé des souris blanches Swiss de 20 g infectées par introduction parentérale avec une quantité de gènes pathogènes de Staph. aureus SS 07 et D. pneumoniae SS 23 en quantité léthale. On a évalué l'activité protectrice exprimée par ED50 (mg/kg) d'érythromycine base, d'estolate d'érythromycine, RV 06, RV 16 par voie orale ainsi que l'éry- thromycine éthylsuccinate, RV 06 par voie sous-cutanée. Les antibiotiques ont-été administrés au moment de l'injection du germe infectant et après 6 à 24 heures. Sur la base de la survie après 7 jours, on a déterminé les ED50 , indiquées dans les tableaux II et III suivants où figurent entre parenthèses les limites de fiabilité. Tableau II Infection expérimentale par Staph. aureus SS 07 (ED50) mg/kg d'érythromycine COMPOSE VOIE D'ADMINISTRATION LIMITE DE CONFIANCE ED50 mg/kg Etylsuccinate d'érythromycine Sous-cutanée 1,03 (1,34-0,79) RV 06 Sous-cutanée 1,13 (1,53-0,83) Erythromycine Orale 2,09 (2,36-1,86) Estolate d'érythromycine Orale 2,20 (2,44-1,99) RV 06 Orale 2,02 (2,32-1,75) RV 16 Orale 2,29 (2,58-2,04) Tableau III Infection expérimentale par D-pneumoniae SS 23 (EDsn) mg/kg d'érythromycine VOIE VOIE D'ADMINISTRATION LIMITE DE CONFIANCE ED50 m g/kg Etylsuccinage d'érythromycine Sous-cutanée 54,23 (69,76-42,16) RV 06 Sous-cutanée @ 59,65 (75,02-47,43) Erythromycine Orale 113,53 (147,33-87,48) Estolate d'érytrhomycine Orale 127,89 (156,42-104,57) RV 06 Orale 121,65 (150,91-98,06) KV 16 Orale 113,88 (144,73-89,60) D) Pharmacodynamie a) Chez le rat L'absorption par voie orale des différents sels d'érythromycine est étudiée chez les rats mâles Sprague-Dawley auxquels on a administré, par lot de 6 animaux à jeun depuis 12 heures, de l'érythromycine, de l'estolate d'érythromycine, RV 06, RV 16 à la dose de, 100 mg/kg (exprimée en érythromycine) par voie orale (sondage gastrique). Les échantillons de sang ont été prélevés 0,30 - 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 heures après l'absorption. Pour le dosage, on a utilisé la méthode microbiologique et comme, micro-organisme test, le B. subtilis. Les résultats expérimentaux sont indiqués dans le tableau IV suivant: Tableau IV Niveaux hématiques chez le rat (Moyennes + E.S.) Nombre mcg/ml après ......... heures COMPOSE Animaux 0,30 1 2 3 4 5 6 Erythromycine 6 0,71 1,03 1,15 1,05 0,37 0,26 0,03 0,19 0,23 0,24 0,22 0,10 0,08 - Estolate d'é rythromycine 6 0,68 1,74 2,49 1,49 0,61 0,37 0,04 0,07 0,14 0,35 0,22 0,10 0,05 0,01 RV 06 6 0,37 0,80 1,23 0,80 0,60 0,33 0,07 0,10 0,19 0,36 0,21 0,17 0,11 0,03 RV 16 . 6 0,73 1,97 2,82 1,28 0,58 0,35 0,05 0,09 0,09 0,14 0,11 0,08 0,05 0,01 b) Chez le volontaire en bonne santé A A des groupes de 5 volontaires en bonne santé à jeun depuis 24 heures, on a administré par voie orale de l'estolate d'érythromycine, RV 16 à une dose de 500 mg d'érythromycine. Les échantillons de sang ont été pré le vés 0,30 - 1 - 2 - 3 - 4 heures après l'absorption. Pour le dosage, on a appliqué la méthode micro-biologique en utilisant une souche de B.subtilis. Les résultats sont indiqués dans le tableau V suivant: Tableau V Niveaux hématiques chez le volontaire en bonne santé (moyennes + E.S.) COMPOSE Nombre mcg/ml après ........... heures sujets 0,30 1 2 3 4 5 6 Estolate d'é rythromycine 5 0,27 0,58 2,10 1,41 1,31 - - 0,05 0,09 0,17 0,07 0,08 - - RV 16 5 1,23 1,51 2,26 1,66 1,24 - - 0,10 0,11 0,11 0,06 0,08 - - E) Action mucolytique On a utilisé la méthode décrite par Quevauviler et COM. (Thérapie 22, 485, 196?) qui consiste à provoquer une hypersécrétion bronchique après exposition de l'animal à une séance d'aérosol de S02. Cette étude a été effectuée sur des rats mâles de race Sprague Dawley. Tous les rats ont été soumis quotidiennement à des inhalations de S02 d'une concentration de 0,03%. Après 50 heures d'inhalation, les animaux ont été regroupés en lots de 10 éléments chacun. Un lot n'a reçu aucun traitement (animaux de contrôle), tandis que les autres ont été soumis 2 heures par jour, pendant 15 jours consécutifs à des inhalations de SO2 et traités respectivement avec l'estolate d'érythromycine, RV 16 par voie orale à la dose de 500 mg/kg et avec de l'érythromycine éthylsuccinate, RV 06 par voie intra-musculaire à la dose de 250 mg/kg. Le jour suivant le dernier traitement, les animaux anesthésiés ont été sacrifiés, on a prélevé et préparé les poumons pour l'examen microscopique et macroscopique. Les résultats sont indiqués dans le tableau suivant. Tableau VI Estimation qualitative et quantitative de l'obstruction de l'arbre bronchique (% d'incidence) TRAITEMENT VOIE OBSTRUC D'ADMINIS- TION TRATION Bouchon Amas Amas PARTIELLE compact nodulaire bulleux S02 (contr.) ----- 40 13,33 6,66 26,66 S02+estolate d'érythromycine 500 mg/kg orale 46,66 20 6,66 20 S02+ RV 16 500 mg/kg orale 26,66 6,66 6,66 6,66 S02 +érythromy- intra cine éthylsuc- muscu- 53,33 26,66 13,33 20 cinate 250 mg/kg laire S02+ RV 06 250 mg/kg .. 25,66 6,66 6,66 13,33 On a ensuite procédé à un examen histologique sur les animaux de contrôle et sur les animaux traités. 1) Animaux de contrôle soumis à une inhalation de 502 Les obstructions bronchiques macroscopiques relevées à l'examen histologique correspondent à un amas de mucus mêlé de fibrine et infiltré d'éléments polynucléaires. L'hypersécrétion concerne également les bronchioles périphériques et les alvéoles. En ce qui concerne l'épithélium bronchique, on constate une prolifération des cellules caliciformes. L'hyperplasie de la bronche principale se traduit par une stratification de 7 à 8 couches, associée à une hypertrophie des bronches. 2) Animaux traités à l'estolate d'érythromycine à la dose de 500 mg/kg par voie orale et à l'érythromycine éthylsuccinate à la dose de 250 mg/kg par voie intra-musculaire De l'examen histologique, il ressort que l'obstruction bronchique est formée par un abondant mucus méloé de fibrine. Sous l'effet irritant du SO2, l'épithélium bronchique réagit par une prolifération de cellules, notamment de cellules caliciformes. L'hyperplasie est associée dans de nombreux cas à une hypertrophie des bronches. Dans quelques cas, il y a apparition dans les bronchioles périphériques de cellules sécrétant du mucus. 3) Animaux traités au RV 16 à la dose de 500 mg/kg par voie orale Chez les animaux qui à l'examen macroscopique présentaient un arbre bronchique libre non obstrué, l'examen histologique a révélé la présence de bronches à l'aspect presque normal. On a constaté une hyperplasie Fpithéliale avec de nombreuses cellules caliciformes et des amas muco-purulents intra-bronchiaux réduits. L'aspect histologique des arbres bronchiques obstrués est tout à fait semblable à celui des animaux de contrôle. 4) Animaux traités au RV 06 à la dose de 250 mg/kg par voie intra-musculaire L'examen histologique effectué sur les animaux qui à l'examen macroscopique présentaient un arbre bronchique libre d'obstructions, a mis en évidence un aspect pratiquement normal. Chez certains animaux, on a constaté la présence d'une hyperplasie épithéliale avec cellules caliciformes associées à des amas mucopurulents intra-bronchiques. L'examen histologique effectué chez les animaux qui présentaient un arbre bronchique obstrué, a mis en évidence un aspect semblable à celui des animaux de contrôle. CONCLUSIONS I1 résulte des essais de toxicité que les sels d'érythromycine sont dép-ourvus de toxicité lorsqu'ils sont administrés par voie orale. Injectés, ils peuvent être légèrement toxiques et présentent de toute façon une DL50 tout à fait comparable à celle de l'érythromycine. I1 résulte des essais des activités antibactériennes in vitro que les sels d'érythromycine sont actifs dans une proportion analogue à l'érythromycine base. I1 résulte des essais d'activité antibactérienne in vivo et des essais de pharmacodynamie, que les composés RV 06 sont faiblement absorbés par voie orale et dans la même mesure que l'érythromycine base. Les dérivés propioniques (RV 16) sont absorbés par voie orale dans une proportion pratiquement analogue à l'estolate d'érythromycine. Contrairement à l'érythromycine estolate, les médicaments suivant la présente invention sont dotés d'une bonne activité mucolytique que l'on constate chez les animaux soumis à une inhalation de S02. REVENDICATIONS 1. Dérivés thioliques de l'érythromycine et de l'ester propionique de l'érythromycine ayant pour formule: R - COO - X (I) où R représente un radical thénoyl-a-mercaptopropionyl- glycine et X représente le radical de l'érythromycine ou du propionylester de l'érythromycine, ayant pour formule: où R1 représente H, ou CH3- CH2- CO 2. Sel d'érythromycine avec thénoyl-a-propionylglycine suivant la revendication 1. 3. Sel d'ester propionique d'érythromycine avec thénoyl-a-mercaptopropionylglycine suivant la revendication 1. 4. Procédé de préparation des dérivés thioliques d'érythromycine et de l'ester propionique d'érythromycine dans lesquels l'érythromycine base ou son ester propionique réagit avec l'acide souhaité, caractérisé en ce que la réaction s'effectue dans un solvant organique, à une température comprise entre 20 et 400C et en présence d'eau. 5. Procédé de préparation suivant la revendication 4, caractérisé en ce que l'eau présente dans le solvant de réaction n'est pas supérieure à 20% en volume du solvant de réaction. 6. Procédé de préparation suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le volume d'eau est de 4 à 5% de celui du solvant de réaction. 7. Procédé de préparation suivant la revendication 4, caractérisé en ce que ledit solvant organique est de l'acétone ou du méthylisobutylcétone. 8. Préparation pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient pour ingrédient actif, un dérivé thiolique suivant la revendication 1, ainsi que des véhicules et des supports de type usuel, et acceptables d'un point de vue pharmaceutique. 9. Préparation pharmaceutique à activité antibactérienné et mucolytique, caractérisée en ce qu'elle contient pour ingrédient actif un dérivé suivant la revendication 1. 10. Préparation pharmaceutique suivant l'une des revendications 8 et 9, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme qui lui permet d'être administrée par voie orale en particulier sous forme de capsules et de suspensions, et en ce qu'elle contient pour ingrédient actif un dérivé de l'érythromycine suivant la revendication 1, ainsi que les excipients et véhicules usuels. 11. Préparation pharmaceutique suivant les revendications 8 et 9, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme qui lui permet d'être administrée par voie parentérale et par aérosols et en ce qu'elle contient pour ingrédient actif, un dérivé de l'ester propionique d'érythromycine ainsi que les excipients et véhicules usuels.