FR 2532758 A1 19840309 FR 8215098 A 19820903 La présente invention concerne un procédé de mesure en continu des flux de sodium-de cellules biologiques en suspension. Elle concerne également L'application de ce procédé de mesure au dépistage des hypertensions artérielles et à L'investigation clinique de L'obésité familiale et des psychoses maniaco-dépressives. Les membranes des cellules biologiques présentent, étant donné leur structure lipidique,une perméabilité relative aux ions il existe par exemple plusieurs systèmes de transport de l'ion sodium Na dans les cellules biologi ques. A cet effet on peut se référer a l'article de Ph.MEYER et R.P. GARAY dans" La nouvelle Presse Médicale",13 Février 1982, 11, no 7. Ces systèmes sont principalement la pompe à Na le co-transport Na±K+ et le contre-transport Na±Na+.La pompe à Na utilise l'énergie métabolique contenue dans la molécule d'ATP pour échanger du Na+ intracellulaire contre du K+ extracellulire. Le co-transport Na±K+ utilise L'énergie tiée au gradient transmembranaire du K@ pour expulser dans le milieu extracellulaire un ion Na et un ion K+.Le contre-transport Na±Na+ échange un ion Na+ intracellu Laire contre un ion Na extracellulaires; il ne participe donc pas à la création du gradient transmembranaire Na On a récemment trouvé des anomalies spécifiques des transports du Na dans trois maladies,qui sont l'hypertension artérielle essentielle, la psychose maniaco-dépressive et L'obésité familiale Des travaux de laboratoire ont montré en effet que Le co-transport Na - k+ érythrocytaire est plus faible chez environ 80X des hypertandus essentiels que chez les sujets normotendus nés des parents normotendus [Dagher et al a Na+ - k+ cotransport assay for essential hypertension Canad. J. Biochem.1980, 58,1069]. De même,des études ont montré que dans les dépressions endogènes unipolaires et bipolaires L'activité de la Na+, k+ ATFase est souvent diminuée Hesketh. et al Membrane ATPase activities in depressive illness J. Neuro chem. 1977, 28,1401]. Par ailleurs on a constaté chez de nombreux sujets obèses une diminution importante de l'activité de la pompe à Na+ @ 1 De Wise et al"Reduced activities of the red cell sodium-potassium pump in humain obesity". N. Engl. J.Med. 1980, 303,1017]. La mise en évidence d'anomalies dans les transports transmembranaires de Na est un moyen de dépister les personnes susceptibles d'être atteintes des maladies cidessus et de permettre ainsi la prévention de ces maladies par des moyens appropriés. Jusqu'a présent Les flux de sodium des cellules biologiques sont mesurés au photomètre de flamme,par absorption atomique ou à L'aide de traceurs radioactifs. Ces techniques de mesure impliquent l'utilisation de nombreux échantilLons et dilutions et ne peuvent pas être réalisées en continu. On a maintenant trouvé un procédé de mesure en continu des flux de sodium de cellules bioLogiques qui consiste à déterminer la concentration extracellulaire en Na d'une suspension de cellules dans un milieu d'incubation approprié à l'aide d'une électrode spécifique de l'ion sodium,ladite électrode étant couplée avec des moyens électroniques agencés de manière à obtenir une lecture linéaire directe de la concentration en Na en fonction du temps. Etant donné que certains systèmes de transport de l'ion Na sont inhibes par, ou sensibles à , des substances spécifiques,on peut déterminer l'un de ces systèmes en suivant i'évolution du potentiel d'une électrode spécifique de l'ion sodium dans une suspension de cellules contenue dans un milieu d'incubation dans-lequel on ajoute lesdites substances spécifiques. Par "cellules biologiques on désigne selon l'inven- tion les cellules des êtres vivants. Les érythrocytes sont des cellules biologiques faciles à-utiliser et sont donc préférés aux fins de l'invention En conséquence le procédé de l'invention va être décrit ci-après en détail en référence aux érythrocytes, sans pour autant en limiter la porte à ce seul type de cellules Sous sa forme préférée le procédé de l'invention est un procédé de détermination de flux de l'ion sodium des érythrocytes, qui consiste:: -à préparer une suspension d'érythrocytes dans un milieu d'incubation approprie, -à mesurer la concentration en Na d cette suspension à l'aide dune électrode spécifique du sodiumeladite électrode étant couplée avec des moyens- électroniques de lecture linéaire directe de la concentration en Na et, -éventuellement à suivre la variation de la concentration en Na dans le temps à L'aide de ladite électrode aprés L'addition dans ledit milieu d'incubation de substances spécifiques modifiant les flux de sodium, Ainsi par exemple le procédé de l'invention convient particulièrement bien pour déterminer les flux de sodium, qui peuvent être individualisés par t'action successive d'inhibiteurs spécifiques,lesquels ont une signification pathogénique importante dans les maladies citées ci-dessus, qui sont l'hypertension artérielle, l'obésité familiale et les psychoses maniaco-dépressives.Par exemple, La pompe à sodium est inhibée par L'ouabaine alors que le co-trans- port Na+ - K+ l'est par le furosémide ou par le bumétanide. Ainsi en ajoutant successivement de l'ouabaïne puis un inhibiteur du co-transport Na±K+ dans le milieu d'incubation contenant la suspension de cellules à tester on peut determiner par différence le flux de sodium sensible au bumetani- de ou au furosémide, c'est-à-dire le co-transport Na "Furosemide " et" Bumétanide" sont les dénominations communes internationales des composés chimiques ci-après:: -acide 3-(aminosulfonyl)-5-butylamino-4-phénoxybenzoique (Bumétan ide) -acide 4-chloro-N-furfuryl-5-sulfamoyl-anthranilique (furosémide) D'autre par ce procédé permet également de suivre l'action de médicaments,tels que les diurétiques , les -bîoquants, Les hormones etc sur les transports de Na La détermination en continu et successive des flux de sodium résistants à l'ouabaïne et au bumétanide selon t'invention comprend les étapes suivantes qui consistent:: 1)à préparer une suspension d'érythrocytes, 2)à ajouter Ladite suspension dans un milieu d'incubataon spécifique contenant de l'ouabaine, 3)à mesurer la concentration en Na dudit milieu en fonction du temps à L'aide dBune électrode spécitique du sodium,coupiée a des moyens électroniques de lecture linéaire directe, 4)à ajouter du bémétanide dans ledit milieu et à mesurer la concentration en Na du milieu en fonction du temps à l'aide de ladite électrode.Le flux de sodium sensibLe au bumétanide étant obtenu directement par soustraction des pentes des droits donnant Le potentiel de L'électrode en fonction du temps, enregistrées en l'absence et en présence de bumétanide et corrigées par le coefficient d'étalonnage de l'électro- de Les érythrocytes mis en oeuvre dans le procédé de l'invention sont soit ceux préparés selon un procédé classique, tel que celui décrit par GARAY et al /J. Membrane Biol. 1981, 62, 169-174] soit des cellules fraîches, c'est-à- dire des érythrocytes dont on n'a pas modifié les concentrations intracellulaires Na et K Les érythrocytes ainsi préparés sont ensuite mis en suspension apres les lavages dans une solution appropriée, par exemple une solution à base de chlorure de magnésium. Avantageusement les érythrocytes sont lavés six fois avec une solution de chlorure de magnésium 110 mM, puis remis en suspension dans la même solution pour L'obtention d'une hématocrite donnée. On utilise selon l'invention un milieu d'incubation spécitique pour les cellules biplogiques. Un exemple d'un tel milieu est une solution aqueuse contenant: 75 mM de NgCl2 85 m de saccharose 5 mM de glucose 10 mM Tris MOPS ipH 7,2 > A ce milieu d'incubation on ajoute de l'ouabaine (0,1 mM) L'électrode utilisée dans le procédé de l'invention est une électrode de verre spécifique de L'ion sodium sensibLe à très basses concentrations Une telle électrode est commercialisée par la Société EIL (Grande Bretagne) sous la référence 1048.,4. Le procédé de mesure selon L'invention est avantageusement réalisé à pH neutre à la température de 37&commat; C et sous agitation continue pour éviter les réponses lentes ou les décalages de l'électrode Cette électrode répond selon l'équation logarithmique de Nernst à des concentrations de sodium supérieures à 25 M Na + pour des mesures normales de Laboratoire Pour la mise en oeuvre dans le procédé de l'invention, L'électrode spécifique de L'ion sodium est utilisée avec une électrode de référence et est couplée avec des moyens électroniques agencés de manière à fournir une réponse lineai- re du potentiel de l'électrode en fonction de la concentra @@@@ @@ @@+ tion en Na Ce système représenté schématiquement sur la figure 1 comprend essentiellement une électrode spécifique de Na (1) et une électrode de référence (2) éventuellement connectées entre elles par l'intermédiaire deux pont ionique (3),un amplificateur a haute impédance d'entrée (4) connecté à un amplificateur exponentiel (5),un réglage de décalage de tension (6),un dispositif d'affichage-enregistrement (7),et éventuellement un système de traitement des mesures en temps réeL (8) pour le calcul des flux Na Le dispositif d'affichage-enregistrement peut être incorporé dans le système de traitement (8). L'amplificateur à haute impédance d'entrée (1012 #) est un amplificateur classique utilisé couramment en potentiométrie pour la mesure des potentiels d'électrode à courant nul L'amplificateur exponentiel est adapté pour fournir, à partir du signal reçu-de l'amplificateur à haute impédance d'entrée,lequel est une fonction Logarithmique de la concentration en Na une réponse linéaire directe de la concentration en Na + en fonction du temps,par exemple pour des concentrations en Na - dans la gamme allant de 25AM à 500 m. -Ces valeurs de concentration en Na encadrent la concentration en Na extraceilulaire des suspensions d'érythrocytes utilisées pour mesurer les flux de sodium. En effet,ces concentrations en Na en m/h pour une hématocrite à 5% sont généralement de; -300 à 400 pour le flux en Na Na+ total - 40 à 60 pour le flux résistant à l'ouabaïne - 10 à 30 pour le flux résistant à l'ouabaïne et au bumétanide. Les moyens électroniques pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention comprennent également un réglage de décaiage de tension qui permet d'augmenter la sensibilité du système de mesure et de déterminer les pentes des droites enregistres, par exemple en l'absence et en présence de bumétanide. En variante,les moyens selon l'invention peuvent également comporter un systeme de traitement des mesures.en temps réel approprié pour fournir directement la valeur du flux de Na en micromoles par litre de cellules et par heure. L'électrode de référence utilisée est une électrode au calomei,par exemple l'électrode au calbmeL 1370.210 vendue par la Société EIl. L'invention va être maintenant décrite en référence aux dessins annexés (figures 2 à 5),sur lesquels: Fig.2 représente la courbe d'étalonnage dynamique de l'électrode pour des variations Linéaires continues des concentrations de Na ; Fig.3 représente la courbe d'étalonnage de l'électrode;; Fig.4 représente l'enregistrement continu selon l'invention des flux résistants à L'ouabaïne et des flux résistants à l'ouabaine et aubumétanide dans une suspension unique d'érythrocytes Fig.S représente la corrélation entre la méthode de mesure du flux de Na + avec un photomètre de flamme et le procédé selon 1' invention Etalonnage de l'électrode de verre spécifique de Na+ Des solutions de référence ont été préparées par dilution en série d'une solution-mère de référence de chlorure de sodium 1M dans le milieu d'incubation défini précédemment. Les solutions à des concentrations intérieures à 10-4 ont été préparées immédiatement avant utilisation Pour chaque concentration en Na D ia mesure a été effectuée 20 minutes après le changement de concentration. en effet, le temps de. réponse de l'électrode dépend des conditions opératoires utilisées Généralement,l'électro- de met environ 7 minutes pour atteindre 90% du potentiel final et 20 minutes pour atteindre l'équitibre,lorsqu'elle est retirée d'une solution à 25 M M Na erincee et immergée dans une solution à 100 M Na . Lorsque la concentration en Na+ augmente de 25 à 75 M Na+,l'électrode met environ 3 minutes pour atteindre 90% du potentiel final et environ 15 minutes pour atteindre L'équilibre. Pour des variations continues de la concentration de Na, le temps de réponse de l'électrode est beaucoup plus rapide. Pour des variations continues de concentrations de Na étaion (33,83, 400 M/h),réalisées par l'adjonction continue avec une micropompe dans le mi lieu de mesure,d'une solution standard, il faut au maximum 12 à 15 minutes-pour que l'électrode atteigne son équilibre dynamique,c'est-à- dire que la tension de sortie après L'amplificateur exponentiel soit linéaire en fonction du temps avec la même pente que celle que l'on obtiendrait avec une variation de concentration étalon en fonction du temps si l'électrode avait un temps de réponse égai à zéro. Un exemple est représenté sur la figu-re 2 pour un flux de sodium étalon de 83 M/h O Sur cette figure 2 on a porté en abscisses le temps en minutes et en ordonnées la tension de sortie en volts la courbe obtenue est la courbe en traits pleins,la courbe en pointillés est celle représentant l'addition de Na en fonction du temps (flux étalon Na ) Ces mesures linéaires de flux de sodium,mesurées dans le milieu extracellulaire d'une suspension de cellules en prenant soin d'attendre que l'enregistrement de la tension de sortie, soit linéaire;soit dans le cas présent 15 minutes après ie début des enregistrements. La réponse linéaire de l'électrode de verre spécifique de Na obtenue à partir de l'amplificateur expotentiel couplé avec l'amplificateur à haute impédance d'entrée est représentée sur la figure 3,sur Laquelle on a porté en abscisses les concentrations de Na en M M et en ordonnées ta tension de sortie en volts. La tension linéaire varie entre 500 mV et 4930 mV pour des concentrations en Na allant de 25 à 100 M. La sensibilité correspondante est alors constante et gale à 9,3 mV/ M de Na + Mesure du flux Na sensibles au bumétanide dans une suspension d'érythrocytes (co-transport Na+ - K+). Des érythrocytes humains ont été préparés selon la méthode décrite par GARAY et al. [J. Membrane Biol. 62 169 (1980)] . Les érythrocytes ont été ensui- te Lavés six fois avec une solution froide de chlorure de. magnésium (110 mM)et remis en suspension dans la même suspension jusqu'à l'obtention d'une hématocrite de 50%. On a utilisé un milieu d'incubation comprenant 75 mf'i-. de Mgcl2, 85 m de saccharose, 5 mN de glucose, 10 m Tris MOPS (pH 7,2). A ce milieu d'incubation on a ajout 0,1 m d'ouabaine. L'électrode spécifique de l'ion Na+ et l'étectrode de réfèrence au calomei ont été prèalablemet étalonnees à 37 C dans 10 ml du milieu d:incubation défini ci-dessus dans iequeC on a ajouté 25 M de Na+. Au temps t = O on a ajouté un millilitre de la suspension d'érythrocytes hématocrite à 50% et on a enregistré directement la concen tration en Na Na+ en fonction du temps. 15 à 30 minutes pius tard, on a ajouté du bumétanide (50 M) et on a enregistré la concentration en Na en fonction du temps pendant 15 à 30 minutes. Ensuite un second étalonnage a été effectué pour une concentration en Na voisine de la concentration finale atteinte.A cet effet les électrodes ont été retirées de la suspension d'érythrocytes, rincées et immergées dans une solution de référence contenant par exemple 100 M de Na On a représenté sur la figure 4 la courbe obtenue Lors de cet essai. Sur cette figure ie temps en minutes est porté en abscisses et ta tension de sortie en mV est indiquée en ordonnée avec en correspondance ia concentration Na des deux étalonnages. On a calculé Les flux de Na rèsistants à l'ouabaïne et les flux résistants a l'ouabaïne et au bumétanide sur La partie linéaire de la courbe enregistrée entre 15 et 30 minutes après les modifications du milieu d'incubation par l'addition d'ouabaïne d'une part et par addition du bu métanide d'autre part. Dans cet essai le coefficient d'étalonnage était de 8,7 mV/ M de Na+ . Les pentes S1 et S2 des flux de Na mesurées en l'absence et en présence de bumétanide sont respectivement de 36,06 m/h (S1) et de 18 M/h (S2). Le flux de Na + sensible å la bumétanide co-transport (Na+ - K+) est calculé par différence des deux pentes Laquelle est corrigée par le coefficient d'étalonnage de l'électrode. Corrigé de L'hématocrite finale qui était de -3,2X, ce flux de sodium est égal à 320 micromoles par litre de cellules et par heure, Comparaison avec la méthode de mesure au photomètre de flamme Pour la mesure au photomètre de flamme on a opéré sensiblement selon le mode operatoire décrit par GARAY et al. @ J. Membrane Bio@. 62 1969 (1980)]. Pour chaque temps de mesure (30,60,90,120 et 180 minutes) on a ajouté un millilitre de la suspension d'érythrocytes préparée comme ci-dessus dans deux tubes à essai contenant 5 ml au milieu d'incubation défini précédemment, avec ou sans bumétanide. La suspension résultante a été transferée à la pipette dans deux tubes (2,5 ml par tube )et incubée à 37 C sous agitation continue. Après chaque temps d'incubation (30, 60,90, 120,180 minutes) les deux tubes correspondants sont transférés dans une enceinte à OOC et ensuite soumis å une centrifugation à 4 C pendant 4 minutes à 1750g. La concentration en Na+ dans les surnageants a été mesurée par photométrie de flamme. Le co-transport Na - K+ en micromoles par litre de cellules et par heure est obtenu en divisant par l'hématocrite finale la différence des flux de Na extracellulaires en micromotes/ h obtenus en présence et en l'absence de bumétanide. A des fins de comparaison on a déterminé les flux de Na+ sensibles au bumétanide par photométrie de flamme et par le procédé de l'invention pour 12 patients normotendus et hypertendus Les résultats obtenus sont portés sur la figure 5,sur laquelle sont indiqués en + abscisses les flux de Na sensibles au bumétanide déterminés selon le procédé de l'invention et en ordonnées les flux de Na sensibles au bumétanide déterminés par photométrie de flamme Le coefficient de corrélation était de 0,987. Dans l'exemple particulier décrit ci-dessus,les deux électrodes sont immergées dans la suspension à tester sans aucun pont ionique. En effet La fuite de K + a travers la membrane de l'électrode de référence a été mesurée et était voisine de 50 micromoles par heure. La concentration de potassium résultante dans le milieu de mesure est trop faible pour interférer de façon importante avec le cotransport Na - K+ dans les érythrocytes. Par contre on notera qu'un pont ionique serait nécessaire pour connecter l'électrode spécifique de Na à l'électrode de référence si l'ion K+ libéré interférait avec le processus bioiogique à mesurer (par exemple le flux de la pompe à Na ). La précision du procédé de mesure selon l'invention dépend de nombreux facteurs,qui doivent être contrôlés et stabilités: stabilité électronique, température,homogénéi sation,pré-équilibraye de L'électrode de sodium,étalonnage Lorsque l'électrode est stabilisée dans une solution à 25Hw Na9, le bruit de fond est'compris entre 2 et 3 mV ce qui représente une variation au maximum de 0,6 M Na Le procédé de l'invention simplifie considérablement la technique opératoire antérieure de mesure des concentrations de Na+ dans les cellules biologiques et réduit le temps de mesure En effetealors que de multiples échantillons de suspension de cellules sont nécessaires pour la mesure par photomètre de flamme,dans le procédé de L'invention, on utilise un seul échantillon dans lequei on plonge les électrodes. Le procédé de l'invention permet une mesure en continu des concentrations de Na en fonction du temps REVENDICATIONS 1.Procédé de mesure en continu des flux de Na de cellules biologiques en suspension,caractérisé en ce qu'il consiste à déterminer la concentration extracellulaire en Na d'une suspension de cellules dans un milieu diincubation approprié à L'aide d'une électrode spécifique de l'ion sodium, ladite électrode étant couplée avec des moyens électroniques agencés de manière à obtenir une lecture linéaire directe de La concentration en Na en fonction du temps 2.Procédé selon la revendication 1,caractérisé en ce que Les cellules biologiques sont des érythrocytes. 3.Procédé selon l'une des revendications i ou 2,caractérisé en ce quiil consiste: i) à préparer une suspension de cellules dans un milieu d'incubation approprié; 2)à mesurer la concentration en Na+ de cette suspension à itaide d'une électrode spécifique du sodium,ladite électrode étant coupiée avec des moyens électroniques de lecture linéaire directe de la concentration en Na et 3)éventuellement à suivre la variation de la concen tration en Na dans le temps à l'aide de tadite électrode apres l'addition dans le milieu d'incubation de substances spécifiques modifiant Les flux de Na 4.Procédé selon t'une quelconque des revendications 1 a 3,pour la détermination du co-transport Na±K+,caracté- rise en ce qu'ii consiste: a)à préparer une suspension d'érythrocyte-s, b)à ajouter la suspension dans un milieu d'incuba- tion spécifique contenant de l'ouabine, c)à mesurer la concentration an Na dudit milieu en fonction du temps à l'aide d'une électrode spéci fique du sodium,couplée a des moyens électroniques de lecture linéaire directe de la concentration Na d)à ajouter dans iedit milieu un inhibiteur du co transport Na+ - K et à mesurer la concentration en Na+ dans le milieu en fonction du temps à l'aide de ladite électrode,le co-transport Na±K+ étant obtenu directement par soustraction des pentes des droites donnant ie potentiel de l'électrode en fonction du temps,enregistrèes en t'absence et en présence de l'inhibiteur du co-transport Na - K+, et corrigées par le coefficient d'étalonnage de l'électrode. 5. Application du procédé de mesure selon l'une quelconque des revendications 1 à @, au dépistage de l'hy- pertension artérielle et à l'investigation clinique de lobé- sité familiale et des psychoses maniaco-dépressives 6.Système de mesure pour La mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à Scaracterisé en ce qu il comprend une électrode spécifique de Na (1) et une électrode de référence (2) éventuellement connectées entre elles par l'intermédiaire dsun pont ionique (3).un amplificateur à haute impédance d'entrée (4) connecté à un amplificateur exponentiel (5),un réglage de décalage de tension (6) ,un dispositif d'affichage enregistrement (7) et éventuellement un système de traitement en temps réel des mesures (8) pour le calcul direct des flux Na+.