FR 2519553 A1 19830718 FR 8200251 A 19820108 Procédé d'obtention à partir de cultures cellulaires, notamment de cellules de lignée granulocyto-macrophagique, d'un produit apyrogène ayant des propriétés immunostimulantes, et produits obtenus. L'invention est relative à un procédé d'obtention à partir de cultures cellulaires de différentes origines, notamment de cellules de la lignée granulocytolacrophagique, d'un produit apyrogène ayant des propriétés immunostimulantesv et aux produits obtenus. I1 est coHu que certaines populations cellulaires, notamment celles appartenant aux séries monocytaires et lymphocytaires, sont susceptibles de libérer des facteurs ou cytokines, par exemple lymphokines ou monokines, lorsqu'elles sont incubées dans un milieu de culture contentant un agent immunostimulant, tel que des lectines, des produits naturels ou synthétiques notamment d'origine virale, bactérienne, fongique ou parasitaire, plus particulièrement des produits provenant de parois bactériennes tels que les produits du type lipopolysaccharide bactérien (LPS), ou de préférence tel que la N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (MDP). Ces facteurs possèdent eux-memes des propriétés immunostimulantes, en particulier une capacité à contribuer aux défenses immunitaires dans les organismes vivants. Ces facteurs, qui sont libérés dans lc milieu de culture, peuvent etre isolés à partir de celui-ci. Parmi ces facteurs, figure le "facteur d'activation des lym phocytes", souvent désigné par l'abréviation LAF (abréviation de l'expression anglaise correspondante "Lym- phocytes Activating Factor") ou Interleukine 1 (IL-1). Le LAF est connu pour sa capacité à augmenter la prolifération des lymphocytes T (circulants ou du thymus), à induire la différenciation des thymocytes, à augmenter les réponses spécifiques à des antigènes in vitro, et de façon générale à intervenir, en tant que fac'teur de régulation > de médiation et de coordination entre les différents mécanismes immunitaires mis en jeu au sein d'un organisme vivant, notamment pour réagir à des antigènes. Jusqu'à présent, le LAF (IL-1) était caractérisé, non seulement par sa capacité immunostimulante, mais également par l'induction d'une réponse fébrile chez les animaux auxquels il est administré, par exemple par voie intraveineuse. Ces effets pyrogènes paraissaient jusqu'à ce jour n'être que l'une des facettes des propriétés d'un type unique de monokine. L'invention découle de la. découverte qu'il était en fait possible d'induire la production par les mêmes cellules d'un principe actif récupérable à partir du milieu de culture, et pratiquement totalement dépourvu de propriétés pyrogènes endogènes, lorsque l'incuba- tion desdites cellules est réalisée conformément au procédé de l'invention, en présence d'homologues du MDP eux-mêmes dépourvus de propriétés pyrogènes De tels homologues du MDP sont notamment décrits dans la demande de brevet européen nO 79 400357/ 0006068, déposée le ler juin 1949. Le procédé selon l'invention pour obtenir, à partir des lignées cellulaires du type sus-indiqué, des monokines présentant les activités immunostimulantes cacaractéristiques du LAF (IL-1), mais dépourvues de pyrogenicité, est caractérisé par l'incubation de cellules appartenant aux séries déjà mentionnées, cellules de la lignée granulocyto-macrophagique, normales ou tumorales, en cultures primaires ou en lignées continues, dans un milieu de culture approprié, en présence dthomologues ou'déri- Yés du F1DP, euxmêmes dépourvus de toute pyrogénicité, et par la récupération et le cas échéant la purification du surnageant du milieu de culture recueilli après le temps d'incubation nécessaire à la production de telles cytokines. De préférence les homologues du MDP susceptibles d'être utilisés dans le cadre du procédé selon l'invention sont caractérisés par la formule générale dans laquelle les substituants R1, R4, R6, X et R7 ont respectivement les significations suivantes - R1 est -NH2, -OH, -NY ou -OY, Y représentant un groupe substitué ou non par un groupe amino, ce groupe étant choisi parmi alcoyle, aryle ou alcoyl-aryle portant un maximum de 10 atomes de carbone ; - R4 est hydroxyle, acyloxy ou alcoxy ayant au plus 4 atomes de carbone, ou monosuccinyle ;; - R6 est -NH2, -OH, -NHZ ou -OZ, Z étant un radical li néaire ou ramifié formé par acyle ou alkyle conte nant de 1 à 90 atomes de carbone et portant, le cas échéant, des substituants hydroxyle, carboxyle, car- bonyle, amino, cyclopropyle ou méthoxyle ; - X est un résidu aminoacyle du groupe comprenant L-alanyle, L-arginyle, L-asparagyle, L-aspartyle, L-cystéinyle, L-glutaminyle, L-glutamyle, glycyle, L-histidyle, L-hydroxy-propyle, L-isoleucyle, L leucyle, L-lysyle, L-méthionyle, L-phénylalanyle, L-propyle, L-séryle, L-thréonyle, L-tryptophanyle, L-tyrosyle et L-valyle,N-méthyl-L-aBine, et leurs foiTi)es D;; - R7 est un groupe alcoyle linéaire ou ramifié, aryle ou alcoyl-aryle comprenant au plus 10 atomes de carbone, - RB est NH2 ou un groupe alcoyle comprenant de i à 4 atomes de carbone. Avantageusement, on choisit parmi les classes de produits répondant à la formule générale sus-indiquée ceux des composés qui sont dépourvus de pyrogénicité, à des doses de 10 mg par kg chez le lapin, c'est-à-dire n'induisant pas un accroissement de température à 0,60C à ces doses, dans les conditions décrites dans la Pharmacopée Européeenne, volume II, pages 58-6O, 197i. Parmi ces substances préférées figurent ceux des composés dans lesquels R1, R4, R6 sont simulta- nément un groupe hydroxyle, R7 est un groupe alcoyle, lånéaire ou ramifié comprenant au plus 10 atomes de carbone, X est un résidu L-alanyle. De préférence encore parmi la classe de composés pré fériés qui vient d'être définie, on choisit ceux dans lesquels R7 est un groupe alcoyle linéaire comprenant de 4 à 10 atomes de carbone. Un composé particulièrement représentatif des homologues du MDP envisagés est constitué par l'ester n-butylique de la N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamine, désignée plus loin sous l'abréviation MDP-(Gln)-O-nBu. Ces homologues du MDP présentent de plus l'avantage de pouvoir être éliminés facilement par dialyse au cours de la purification et de pouvoir induire la production de cytokines sans addition de sérum sanguin dans le milieu de culture. Le procédé selon l'invention permet par-con séquent.de produire un facteur possédant l'activité im nunostimulante caractéristique du LAF (IL-1). En effet, le facteur selon l'invention présente les propriétés caractéristiques du LAF (IL-1) pour ce qui est de sa capacité d'activer les lymphocytes et est reconnaissable par le test d'OPPENHEIM basé sur la capacité qu'a le produit selon l'invention d'accroître l'incorporation de thymidine tritiée par des thymocytes de souris, cultivés en présence de ce produit et de phytohémagglutinîne (PHA). Mais le facteur selon l'invention, ou les surnageants qui le contiennent, se distinguent des LAF (IL-1) de l'état de la technique, en ce qu'ils sont dépourvus d'activité pyrogène, notamment de facteur pyrogène endogène (PE). Par conséquent, dans la mesure où le produit selon l'invention sera visé dans ce qui suit, sous l'ex- pression LAF (IL-1), il devra être tenu compte de ce qui précède. La signification de cette désignation sera alors limitée au fait que les facteurs selon l'invention ont en commun avec les LAF (IL-1) antérieurement connus, les activités immunostimulantes caractéristiques de ces derniers. En ce qui concerne les lignées cellulaires susceptibles d'être mises en oeuvre dans le procédé selon l'invention, on peut avoir recours à toute lignée connue pour sa capacité à produire du LAF (IL-i). Il s'agit principalement de monocytes, macrophages, susceptibles d'être obtenus notamment à partir du sang périphérique, de la rate, du poumon, du péritoine et de la moelle osseuse. Il peut être fait appel à des cellules de toutes origines, notamment des cellules humaines, de souris, de rat, de cobaye, de singe, de lapin ou de chien, en cultures primaires ou en lignées continues. Une source de cellules activables est aussi constituée par les cellules susmentionnées, dont ont été séparés auparavant les éléments non adhérents aux flacons de culture du type de ceux commercialisés sous la marque NUNCLON ou FALCON. On peut notamment,pour les sources de cellules activables, se référer encore à l'article de I. GERY et B.H. WAKSMAN, intitulé 'tPotentiation of the T-lymphocyte Response to Mitogens", publié dans "The Journal of Experimental Medicine, volume 136, 1972, p. 143-155, et à l'ouvrage édité par E. PICK avec la collaboration de M. LANDY, intitulé 'tLymphokine Reports i", Academic Press, Inc. Pour ce qui est des conditions de mise en oeuvre du procédé, on aura avantageusement recours à des cultures cellulaires contenant de 105 à 107 cellules/ml dans tout milieu de culture approprié, en présence de 0,01 à 100 microgrammes par millilitre de l'homologue du MDP choisi. De toute évidence, les concentrations les plus efficaces peuvent être dans chaque cas déterminées expérimentalement. L'invention concerne également les surnageants desdites cultures, de prférence préalablement purifiées par dialyse, pour en éliminer le contenu en sels minéraux et en petites molécules, par exemple celles ayant un poids moléculaire inférieur à 12.000, y inclus par conséquent l'homologue non pyrogène du MDP utilisé comme inducteur. Des purifications supplé mentairesdu produit actif peuvent être obtenues par des techniques de purification complémentaires, notamment en ayant recours à des méthodes complémentaires de diafiltration, d'ultrafiltration et de gel-filtration, notamment dans les conditions décrites par L.B.LACHMAN, S.O.PAGE et R.S. METZGAR, dans l'article intitulé t'Purification of Humain Interlukin i" > publié dans "J. of Supramolecular Structure", 13, p. 457-466 (1980). D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront encore dans les compléments de description qui suivent et qui sont relatifs à des conditions de culture préférées dc cellules productrices de la monokine selon l'invention, dépourvue de facteur PE, et des tests comparatifs ainsi que des résultats obtenus avec les produits selon l'invention et ceux obtenus par induction en présence de MDP ou d'autres substances. Il sera également fait référence dans ce qui suit aux dessins, dans lesquels t la fig. 1 fournit des barogrammes représentatifs des réponses fébriles moyennes observées chez le lapin avec des surnageants de culture cellulaires,obtenus par le procédé selon l'invention et par des surna geants obtenus à l'aide de substances de comparaison les résultats affectés de la lettre T sur l'axe des abscisses,dans cette figure colmme dans les suivantes, désignent les surnageants obtenus à partir de "té moins";; - la fig. 2 représente des variations des réponses fé briles de lapins en fonction des doses, administrées par voie intracérébroventriculaire de surnageants obtenus par le procédé selon l'invention et de surna geants obtenus par culture des mêmes cellules dans des conditions semblables, soit en présence du MDP, soit en présence de son homologue MDP-(Gln)-O-nBu ; - la fig. 3 fournit des barogrammes représentatifs des degrés de prolifération de thymocytes en présence de PHA et de surnageants dialysés de cellules de lapin obtenus par le procédé selon l'invention et par des procédés mettant en jeu les mêmes conditions d'induc tion, mais en présence d'inducteurs distincts,à des fins de comparaison ;; - les fig.4a à 4d illustrent les activités LAF(IL-1) in vitre, et les niveaux de pyrogénicité respectivement mesu rables de surnageants obtenus dans les conditions sus indiquées,à partir de cellules mononucléaires humaines. Tout le matériel utilisé, c'est-à-dire aiguilles, seringues, objets en verre et en plastique, milieux et solutions sont stériles et exempts de pyrogénicité. Les réactifs suivants ont été utilisés. Leurs noms chimiques sont accompagnés des abréviations utilisées pour les désigner dans ce qui suit - N-Acétylmuramyl-L-Alanyl-D-glutamine-a-n butyl-ester : -MDP-(Gln)-O-nBu, - N-Acétylmuramyl-L-Alanyl-D-isoglutamine : MDP, - le MDP conjugué à un support synthétique, multipoly(DL-Alanine)--poly(L-lysine)l ci après appelé MDP-A--L, obtenu par la technique décrite dans le brevet français nO 79 00819 déposé le 12 janvier 1979. Préparation des cellules. Des exsudats de péritoine sont induits chez le lapin, avec 50 ml d'huile minérale stérile par voie intrapéritonéale. Après 72 heures, les lapins sont sacrifiés au moyen d'une dose mortelle intraveineuse de pentobarbital. Les cellules sont recueillies à partir de la cavité périto néale,au moyen de 300 ml de solution saline héparinée 5 ui/ml) dénuée de pyrogénicité. Les cellules sont lavées deux fois et remises en suspension à la densité de 107 cellules/ml dans un milieu RPMI 1640 (FLOW LABS, Ecosse) auquel on a ajouté des antibiotiques (solution de pénicilline/streptomycine) et un tampon de HEPES 0,01 M, pH 7, 1-7, 3. La population de cellules contient au moins 90 % de macrophages, ce qui résulte d'une mise en évidence d'estérases non spécifiques (méthode d'histoenzymologie). Le sang provient d'un sujet volontaire en bonne santé et est recueilli sur un anticoagulant. Après centrifugation des échantillons de sang, on recueille le produit contenu dans la zone intermédiaire ou interface entre le dépôt sédimenté et le plasma surnageant et on le dilue au 1/3 (v/v) dans le milieu MEM-199 (INSTITUT PASTEUR PRODUCTION, PARIS) auquel on a ajouté 1/100ème d'héparine (v/v). La couche cellulaire mononucléaire est recueillie après centrifugation sur un milieu connu sous la désignation"FICOLL TRIOSIL" (de PHARMACIA, UPPSALA, Suède) ou 'LYMPHOPREP" (de NYEGAARD & Co., OSLO, Norvège) et lavée trois fois suivant la méthode de Boyüm (Scand. J. Lab. lnvest., 21. suppl. 97, 77-109). Les cellules mononucléaires (10-15 % de monocytes) sont diluées à 5 x106 cellules/ml dans un milieu de culture (RPMI 1640) exempt de sérum complété avec des antibiotiques et de l'HEPES. L'indométacine, lorsqu'elle est utilisée, est introduite sous forme de solution dans I'éthanol, pour obtenir une dilution finale dans le milieu de culture de 10 vM d'indométacine et de 0,1 fi d'éthanol. Préparation des surnageants. Les deux types de cellules, c'est-à-dire les cellules d'exsudat péritonéal de lapin PEC (107/ml) et les cellules mononucléaires humaines (PBMC) (5 x 10 6/ml) sont incubées (5ml) dans des flacons de 25 cm de cul ture tissulaire (FALCON NO 3013) pendant au moins 18 heures à 370C dans un incubateur sous atmosphère de CO2. Les cultures sont incubées avec ou sans immunostimulants auxquels a été ajoutée dans certains cas de l'indométacine (10 uM) (sous forme d'une solution dans l'éthanol).Après le temps d'incubation, tous les surnageants exempts de cellules sont dialysés pendant là nuit contre 200 volumes de solution de chlorure de sodium physiologique apyrogène et filtrés au travers d'une membrane de 0,45 vM. Ils sont conservés sous forme d'aliquotes de 1 ml à -20 C. Dans la plupart des expériences, le même surnageant est utilisé pour mesurer la production de LAF (IT,-î) (facteur d'activité lymphocytaire) ou de PE, selon les procédés ci-dessous. Test LAF (IL-i). On. prélève aseptiquement le thymus de souris C3H/He Orl (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTI FIQUE, Orléans, France) âgées de 6 à 9 semaines. La suspension de thymocytes isolés est diluée à une densité de 1,5 x 107 cellules/ml dans du RPMI 1640 contenant 5 % de sérum de veau foetal décomplémenté (FLOW LAPS.) des antibiotiques et du 2-mercaptoéthanol, 5 x 10 5M, et incubée 72 heures à raison de 1,5 x 106 cellules dans 0,1 ml, dans les cupules à fond plat d'une plaque pour la microculture de tissus (NUNCLON), en présence ou en l'absence de 1 ug/ml de phytohémagglutinine (PHA).Les surnageants à tester sont dilués et ajoutés dans un volume de 0,1 ml. Les cu]tures sont traites pendant les 4 dernières heures avec 1 uCi (méthyl-3H) thymidine (iCi/mM, C.E.A., SACLAY, France). Les cellules sont recueillies sur des filtres en fibre de verre avec un collecteur semi-automatique (SKATRON, FLOW LABS.) ; les filtres sont lavés à liteau distillée et séchés à l'air. La radioactivité est déterminée par spectrométrie en scintillation liquide au moyen d'un compteur de particules ss (INTERTECHNIQUE). Les résultats sont exprimés en incréments moyens des nombres d'impulsions par minute, mesurés sur des cultures de thymocytes (en triple) vis-à-vis de thymocytes témoins non stimulés (toujours moins de 1000 impulsions par minute : ipm). Test de pyrogénicité sur les lapins. On utilise des lapins blancs mâles Néo Zélandais pesant 2 à 3 kg. L'injection est effectuée soit par voie intraveineuse (i.v.), soit par voie in tracérébroventriculaire (i.c.v.). Dans ce dernier cas, on implante une canule dans le ventricule cérébral droit, afin d'effectuer une injection i.c.v. aseptiquement et sous anesthésie (pentobarbital) (25 mgtkg i.v.). On utilise les animaux seulement 8 jours plus tard, Des injections de surnageant sont effectuées (20 p1/kg) à travers le diaphragme de caoutchouc du couvercle de la canule.Dans plusieurs cas, les mêmes lapins reçoivent alternativement des surnageants de cellules témoins, des surnageants de cellules traitées par du MDP ou du MDP-(Gln)-O-nBu, ces expériences étant cependant effectuée; à des intervalles de temps d'au moins une semaine. On a toujours observé une bonne côrrélation des résultats dans les cas de présence et d'absence de pyrogénicité, tant lorsque l'administration a été faite par voie i.c.v. que lorsqu'elle a été faite par voie i.v.. Dans le cas d'injections intraveineuses, on administre 0,5 mlikg de surnagent non dilué. La température rectale est prise toutes les 15 minutes pendant 5 heures après l'injection, au moyen de sondes (Thermistor) reliées à un téléthermomètre (modèle YSI 47, YELLOW SPRING, Ohio). Les différences de température sont exprimées par les différences visà-vis des températures mesurées au moment de l'injection (h TO C t déviation standard). La dose pyrogène minimale représente la quantité capable d'induire une augmentation de 0,60C de la température du lapin. I - ESSAIS DE PYROGENICITE. Production in vitre de substances pyrogènes endogènes et/ou de substances ayant une activité LAF (IL-l) induite dans des cellules d'exsudat péritonéaux de lapins, mises en culture en présence de MDP-(Gln) O-nBu, de MDP et de MDP-A--L. Les e3sais ont été effectués dans les conditions sus-indiquées avec des surnageant s obtenus par incubation des susdites cellules en présence - de MDP-(Gln)-O-nBu à des doses de 10 et 100 ug par ml respectivement, - de MDP, à des doses de 0 > 1 > O,i, 10 ou 100 pg respectivement et - de MDP-A--L à des doses exprimées en MDP, de 0,01 et O,1 pg par ml. Les mesures de pyrogénicité ont été effectuées sur des lapins auxquels avaient.aIparavant été injectés les surnageants obtenus, soit par voie intraveineuse, soit par voie intracerébroventriculaire, dans les conditions sus-indiquées. ar Injections par voie intraveineuse. La fig. I illustre les résultats obtenus sous forme de barogrammes faisant apparaître les réponses fébriles maxima mesurées dans les conditions susindiquées B T (OC) sur l'axe des ordonnées) en fonction des inducteurs et des doses respectives -de ceux-ci,en pg/ml, respectivement indiquées en abscisses. Les chiffres qui surmontent les barres verticales indiquent le nombre des animaux utilisés dans chaque essai. Le petit trait surmontant chacune des barres est représentatif de la demi-déviation standard calculée d'après les résultats obtenus chez les animaux appartenant à un même groupe et soumis aux mêmes essais. La réponse fébrile maximum est en général observée 50 minutes après l'injection intraveineuse. On constate que 0,1 ug de MDP-A--L induit dans la culture sensiblement le même effet que 10 pg de MDP libre. Par contre, on n'observe aucune réaction pyrogène avec les surnageants préparés en présence de doses allant jusqu'à 100 pg/ml de MDP-(Gln)-0-nBu. b) Injections par voie intracérébroventriculaire. L'absence de réaction pyrogène dans les surnageants obtenus par culture des cellules en question, en présence de MDP-(Gln)-O-nBu, a été confirmée par la technique très sensible mettant en oeuvre l'injection intracérébroventriculaire des substances étudiées. La dose minimale pyrogène, pour des surnageant s obtenus en présence de MDP, passe d'environ 0,4 ml/kg pour les surnageants administrés par voie. intraveineuse, à environ i g lorsqu'ils sont administrés par la voie. intra- cérébroventriculaire. La fig. 2 est représentative des variations de la réponse fébrile maximum chez le lapin (E T (OC) sur l'aèdes ordonnées), d'une part, en fonction de volumes croissants (exprimés en pl/kg sur l'axe des abscisses) d'un surnageant obtenu à partir des cellules de l'exsudat péritonéal de lapins (107 cellules par ml) stimulés en présence de 10 ug/ml de MDP et, d'autre part, pour un volume de 20 pl/kg de surnageant obtenu par incubation des mêmes cellules en présence de 100 pg/ml de MDP-(Gln)-0-nBu. La fig. 2 illustre le fait que la dose minimale pyrogène du surnageant préparé avec le MDP est beaucoup plus. faible dans le cas de l'injection intracérébroven triculaire, que dans le cas de l'injection intraveineuse : environ 1 pl/kg. Mais dans les mêmes conditions d'administration, on n'observe aucune réaction pyrogène chez le lapin ayant reçu 20 pl/kg du surnageant non dilué obtenu après incubation de la même quantité de cellules en présence de 100 vg/ml de MDP-(Gln)-O-nBu. On observera que les surnageants ont été soumis à une dialyse, avant l'administration au lapin ; que l'on avait également eu soin d'utiliser des MDP et homologues de MDP marqués radioactivement, compte tenu des doses très faibles du MDP,lui-même susceptibles d'induire par cette voie une action pyrogène. Les surnageants utilisés avaient en particulier été débarras sés de plus de 99 % 'de leur radioactivité initiale, ce qui montre bien que la dialyse permet de se débarrasser de l'inducteur. Par contre l'on a obtenu des réactions pyrogènes encore plus intenses chez des lapins auxquels ont été administrés les surnageants obtenus dans les mêmes conditions, mais en présence de doses inférieures de MDP-A--L, exprimées en MDP. Il - L'ACTIVITE LAF (IL-1) DES SURNAGEANTS OBTENUS. a) Surnageant de cellules de lapin. Les surnageants obtenus par incubation en présence de MDP-(Gln)-O-nBu présentent cependant une activité LAF (IL-1) au moins égale,sinon supérieure, à celle susceptible d'être induite par le MDP luimême. C'est ce qui résulte de l'examen de la fig. 3 qui illustre les variations des proliférations (b ipm x 10 3sur i03sur l'axe des ordonnées) de thymocytes en réponse à la PHA (1 vg/ml) en présence de surnageants dialysés (dilution finale au 1/8ème), obtenus à partir de cellules de lapins (107 cellules/ml) incubées en présence de doses variables (en pg/ml) de MDP et de MDP-(Gln)-O-nBu. Les doses utilisées sont indiquées sous les barres correspondantes de la fig.3. A titre de témoin, on a utilisé des surnageants de cultures cellulaires non stimulées, la culture étant faite avec ou sans addition, au moment de l'emploi, de MDP bu de MDP-(Gln)-O-nBu. L'examen de la fig. 3 fait apparaître une activi- té LAF (IL-1) importante des surnageants obtenus en présence de MDP-(Gln)-O-nBu, alors même que ces derniers surnageants ntont aucune activité pyrogène. Ces effets ne peuvent être attribués aux glycopeptides résiduels contenus éventuellement dans les surnageants, puisque lton ne constate aucun accroissement particulier de l'incorporation de thymidine dans ceux des thymocytes qui ont été incubés en présence de PHA et de surnageant té moin, même lorsqu'il est additionné de MDP ou du MDP-(Gln)-O-nBu. Comme dans ie cas du MDP, on a constaté que l'incubation des cellules en présence à la fois de MDP-(Gln)-O-nBu et d'indométacine avait pour effet d'accroître l'effet LAF (IL-9) mesurable dans les surnageants obtenus, bien que le médicament antipyrétique lui-même soit sans effet. Les mêmes essais réalisés avec des surnageants obtenus en présence de MDP-A--L, à des doses de 0,01 et 0,1 ug/ml, qui se sont avérées pyrogènes, ont produit des surnageants dépourvus d'activité LAF (IL-1) pour la dose la plus faible de MDP-A--L ou n'ayant qu'une très faible activité LAF (IL-1), lorsqu'incubés en présence de la dose dix fois plus élevée. L'addition d'indométacine au milieu d'incubation n'a résulté en aucun accroissement de l'activité LAF (IL-1) mesurable. I1 résulte de ce qui précède que les activités LAF (IL-1) et les activités pyrogènes devraient en fait être attribuées à des monokines distinctes, la monokine responsable de l'activité pyrogène n' étant pas induite en présence des homologues non pyrogènes du MDP, dont le MDP-(Gln)-O-nBu est l'un des représentants préférés. b) Induction d'une activité LAF (IL-1) et, le cas échéant d'une activité pyrogène endogène in vitro par incubation de cellules sanguines humaines périphériques, en présence de MDP et de MDP-(Gln)-O-nBu. Des résultats semblables ont été obtenus avec des surnageants produits par incubation de cellules humaines mononucléaires en présence de MDP et de MDP-(Gln)-O-nBu respectivement. Les résultats obtenus avec des cellules provenant de deux donneurs-humains différents (a et b) sont indiqués dans les fig. 4a et 4c (pour le donneur (a)) et les fig. 4b et 4d (pour le donneur (b)). Dans les fig. 4a et 4b sont indiquées les variations de température rectale maximum (A T (OC)) des lapins, en fonction des doses variables de surnageant de cultures incubées avec du MDP et du MDP-(Gln)-O-nBu (10 et 100 pgZml). Au-dessus des barogrammes des fig.4a et 4b sontégalement indiqués les nombres de lapins traités dans chaque essai. Dans les figures 4c et 4d sont indiquées les activités LAF (IL-1), appréciées par le nombre d'impulsions par minute : b ipm (E ipm x 1-0 3 sur l'axe des ordonnées) évaluées avec les mêmes surnageants. Les deux donneurs, a et b, auxquels correspondent les résultats indiqués dans les fig. 4c et 4d sont caractérisés au niveau des témoins,par une activité spontanée différente, ces bruits de fond étant cependant dans les deux cas inférieurs à 10.000 impulsions par minute. Dans les deux cas, on observe néanmoins, surtout en ce qui concerne le MDP-(Gln)-O-nBu, des différences significatives au niveau de l'incorporation de thymidine tritiée. Ces résultats montrent le caractère général de-la capacité d'induction par le MDP-(Gln)-O-nBu de la production d'une monokine dépourvue d'activité pyrogène, mais douée des propriétés immunostimulantes caractéristiques du LAF (IL-1). Les surnageants obtenus par le procédé selon l'invention, ainsi que les produits résultant de leur purification, constituent-, par conséquent, des réactifs particulièrement précieux, notamment en tant que références de comparaison, chaque fois qu'il s'agit de détecter les capacités que peuvent avoir d'autres substances de stimuler des cellules mononucléaires à produire des monokincs ayant une activité LAF dépourvue d'activité PE et à permettre une mesure relative de l'intensité de l'activité LAF (IL-1) ainsi induite par ces autres substances. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention s'étend naturellement aussi à tous procédés équivalents mettant en jeu également des homologues apyrogènes de MDP et équivalents dans leurs fonctions. REVENDICATIONS 1 - Procédé pour obtenir des monokines présentant les activités immunostimulantes caractéristiques du LAF (IL-1), mais dépourvues.de pyrogénicité, à partir de lignées cellulaires susceptibles de libérer des cytokines, telles que des lymphokines ou monokines > caractérisé par l'incubation desdites cellules, notamment de cellules de la lignée granulocyto-macrophagique, normales ou tumorales, en cultures primaires ou en lignées continues, dans un milieu de culture approprié, en présence d'homologues ou dérivés du MDP, eux-mêmes dépourvus de toute pyrogénicité, et par la récupération et le cas échéant la purification du surnageant du milieu de culture recueilli après le temps d'incubation nécessaire à la production de telles cytokines. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'incubation susdite est réalisée en présence d'un homologue de MDP appartenant à la classe de composés de formule dans laquelle les substituants R1, Rq, R6, X et R7 ont respectivement les significations suivantes - R1 est -NH2 > -OH, -NY ou -OY, Y représentant un groupe substitué ou non par un groupe amino, ce groupe étant choisi parmi alcoyle, aryle ou alcoyl-aryle portant un maximum de 10 atomes de carbone ; - R4 est hydroxyle, acyloxy ou alcoxy ayant au plus 4 atomes de carbone, ou monosuccinyle ;; - R6 est -NH2 > -OH, -NHZ ou -OZ, Z étant un radical li néaire ou ramifié formé par acyle ou alkyle conte nant de 1 à 90 atomes de carbone et pourtant, le cas échéant, des substituants hydroxyle, carboxyle, car bonyle, amino, cyclopropyle ou méthoxyle - X est un résidu aminoacyle du groupe comprenant L-alanyle, L-arginyle, L-asparagyle, L-aspartyle, L-cystéinyle, L-glutaminyle, L-glutamyle, glycyle, L-histidyle, L-hydroxy-propyle, L-isoleucyle, L leucyle, L-lysyle, L-méthionyle, L-phénylalanyle, L-propyle, L-séryle, L-thréonyle, L-tryptophanyle, L-tyrosyle et L-valyle,N-méthyl-L-alanine, et leurs fon1ies D;; - R7 est un groupe alcoyle linéaire ou ramifié, aryle ou alcoyl-aryle comprenant au plus 10 atomes de carbone, - RB est NH2 ou un groupe alcoyle comprenant de 1 à 4 atomes de carbone. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la susdite incubation est réalisée en présence d'un homologue du MDP dépourvu de pyrogénicité à des doses de 10 mg/kg chez le lapin. 4 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la susdite incubation est réalisée en présence d'un composé répondant à la susdite formule dans laquelle R1, Rq, R6 sont simultanément un groupe hydroxyle, R7 est un groupe acyle, linéaire ou ramifié comprenant au plus 10 atomes de carbone, X est un résidu L-alanyle. 5 - Procédé selon la revendication 3, ca caractérisé en ce que le groupe R du composé considéré comprend de 4 à 10 atomes de carbone. 6 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'incubation susdite est réalisée en présence d'ester n-butylique de la N-acétyl-muramyl-L- alanyl-D-glutamine. 7 - Composition contenant un facteur ayant les propriétés caractéristiques du LAF (IL-1) tout en étant dépourvue de facteur pyrogène endogène, obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6