FR 2530472 A1 19840127 FR 8305540 A 19830405 La présente invention concerne un procédé pour stabiliser un Facteur de Nécrose Tumorale et une solution aqueuse ou une poudre stables contenant ce facteur. Plus particulièrement, l'invention concerne un pro- cédé pour stabiliser un Facteur de Nécrose Tumorale, dans lequel on ajoute une protéine spécifique à une solution aqueuse ou à une poudre contenant un Facteur de Nécrose Tumorale ainsi qu'une solu- tion aqueuse ou une poudre contenant un Facteur de Nécrose Tumorale et une quantité efficace d'une telle protéine spécifique. Carswell et coll ont découvert un Facteur de Nécrose Tumorale (Tumor Necrosis Factor désigné ci-après pour sim- plifier par l'abréviation "TNF") Ils ont indiqué que le TNF est une substance présente dans le sérum des souris, des rats ou des lapins traités par une endotoxine, qui ont été sensibilisés avec un immunopotentiateur tel que le bacille de Calmette et Guérin (BCG), des corynébactéries ou du Zymosan, et que le TNF provoque une nécrose de diverses tumeurs transplantées à la souris sans effet toxique surle receveur portant la tumeur lvoir Proc Nat Sci. Etats-Unis d'Amérique, 72 ( 9), 3666-3670 ( 1975)l. Ensuite, de nombreux articles ont été publiés rela- tivement aux propriétés biochimiques et physiologiques du TNF de souris et du TNF de lapin lvoir par exemple Proc Nat Acad Sci, Etats-Unis d'Amérique, 73 ( 2), 381-385 ( 1976); Expl Cell Biol, 47, 53-60 ( 1979); Br J Cancer, 38, 302-309 ( 1978) et ibid, 42, 416-422 ( 1980)l Il convient de noter qu'un facteur cytotoxique qui est une substance suggérée comme étant identique au TNF a été également mentionné par certains chercheurs lvoir par exemple Infect Immun, 28 ( 1), 204-211 ( 1980)l. La production in vitro de TNF a également été men- tionnée Par exemple, Matthews a déterminé et indiqué les condi- tions optimales dans lesquelles le TNF est produit in vitro par les phagocytes mononucléaires à partir de divers tissus de lapins nor- maux et de lapins ayant reçu une injection de BCG (voir Br J Cancer, 44, 418-424 ( 1981)l Selon cette publication, les quantité optimales de TNF sont produites par les phagocytes mononucléaires en présence d'une endotoxine et les macrophages alvéolaires et péritonéaux sont les producteurs les plus puissants de TNF De plus, selon cette publication, les macrophages de lapins ayant reçu une injection de BCG produisent nettement plus de TNF que ceux des animaux normaux Entre temps, Ndnnel et coll ont indiqué que les cellules d'exsudat péritonéal enrichi en macrophages de souris ayant reçu une injection de BCG libèrent un facteur cytotoxique lorsqu'on les stimule in vitro avec un lipopolysaccharide (endotoxine) lvoir Infect Immun, 30 ( 2), 523-530 ( 1980); et ibid, 33 ( 1), 156-164 ( 1981)l. En ce qui concerne les propriétés caractéristiques du TNF, on sait que le TNP, en plus de son activité d'induction de la nécrose de diverses tumeurs, exerce une activité non spécifique de l'espèce des animaux Par exemple, le TNF de lapin peut provo- quer la nécrose des tumeurs de la souris De plus, on sait que le TNF in vitro n'exerce aucun effet cytotoxique notable sur les cel- lules normales et a un effet cytotoxique sur certains types de lignées cellulaires néoplasiques (par exemple les cellules L-M et Meth-A) Comme indiqué ci-dessus, le TNF a une activité antitumo- rale, exerce une activité non spécifique de l'espèce des animaux et n'exerce aucun effet nuisible notable sur les cellules normales. Donc, les espérances des applications cliniques du TNF-comme médi- cament antitumoral ont été grandes dans l'art. On sait également que seule une très petite quantité de TNF est induit chez un mammifère ou un système de culture tissu- laire -Par conséquent, pour assurer une application clinique éten- due et sans danger du TNF comme médicament antitumoral, il est absolument nécessaire d'isoler et de purifier fortement le TNF brut produit chez un mammifère ou dans un système de culture tissulaire. De plus, lorsqu'on effectue une production à grande échelle de TNF destiné a l'emploi comme médicament antitumoral, il est générale- ment nécessaire de stocker le TNF fortement purif Lé sous forme d'une solution ou d'une masse congelée pendant une période prolongée et de lyophiliser la solution de TNF Cependant, les demanderesses ont découvert que l'activité du TNF fortement purifié diminue nette- ment lors de son stockage, de sa congélation, de sa décongélation et de sa lyophilisation. Pour autant que les présents inventeurs Ie sachent, il n'existe pas de publication dans lequelle la stabilité du TNF fortement purifié ait été étudiée Dans ces circonstances, une fourniture efficace et régulière de TNF fortement purifié, en parti- culier à l'échelle industrielle, ne peut pas être assurée, bien que l'on sache que le TNF est un médicament antitumoral efficace. Pour résoudre la difficulté exposée ci-dessus rela- tive à la stabilité du TNF, les demanderesses ont effectué des études importantes et poussées Elles ont débouché sur la découverte très surprenante que l'addition d'une quantité efficace d'une pro- téine spécifique comme agent stabilisant à une solution aqueuse ou à une poudre contenant du TNF permet de conserver le TNF pendant une période prolongée sans qu'il perde son activité et rend le TNF stable à la congélation, la décongélation, la-lyophilisation et similaires L'invention repose sur cette découverte. L'invention a donc pour objets: de fournir un procédé pour stabiliser le TNF; et de fournir une solution ou une poudre stables de TNF conservant leur activité pendant une période prolongée et stables à la congélation, la décongélation, la lyophilisation et similaires. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit, faite en regard des dessins annexés, dans lesquels la figure l est un graphique montrant l'effet de la concentration de la sérum-albumine humaine sur l'activité résiduelle du TNF après 7 jours de conservation à 4 OC; la figure 2 est un graphique montrant l'effet de la concentration de la gélatine partiellement hydrolysée sur l'activité résiduelle du TNP après 7 jours de conservation à 4 OC; la figure 3 est un graphique montrant l'effet de la concentration de la y-globuline humaine sur l'activité résiduelle du TNF après 7 jours de conservation à 4 C; et la figure 4 est un graphique montrant l'effet de la concentration du sulfate de protamine de saumon sur l'activité rési- duelle du TNF après 7 jours de conservation à 40 C. Une explication détaillée complémentaire des figures est exposée ci-après relativement à l'exemple 2. = 4 Selon un de ses aspects, l'invention fournit un procédé pour stabiliser un TNF qui comprend-l'addition à une solu- tion aqueuse ou à une poudre contenant du TNF d'une quantité effi- cace d'au moins un agent stabilisant choisi parmi le groupe cons- titué par une albumine, une gélatine,-une globuline, une protamine et un sel de protamine Selon un autre de ses aspects, l'invention fournit une solution aqueuse ou une poudre stables contenant du TNF et une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant choisi parmi le-groupe constitué par une albumine, une gélatine, une glo- buline, une protamine et un sel de protamine. Le terme "TNF" tel qu'on l'emploie ici désigne une substance à adtivité physiologique qui est produite par l'adminis- tration d'au moins une substance capable de stimuler le système réticulo-endothélial d'un mammifère, puis injection d'une endo- toxine d'une bactérie à gram négatif au mammifère ou par addition d'une endotoxine d'une bactérie à gram négatif à un système de culture tissulaire contenant des macrophages activés d'un mammifère, cette substance provoquant la nécrose de certaines tumeurs lors- qu'elle est transférée de façon passive à des mammifères porteurs de tumeur, ou une substance produite selon un procédé quelconque et ayant des propriétés semblables à celles de la substance à activité physiologique ci-dessus. Le TNF que l'on emploie dans l'invention est produit selon plusieurs procédés connus dans l'art, y compris les procédés de Matthews et coll lvoir Br J Cancer, 42, 416-422 ( 1980)l et le procédé de Green et coll lvoir J Natl Cancer Inst, 59 ( 5), 1519-1522 ( 1977)l. Des procédés typiques pour préparer le TNF que l'on emploie dans la présente invention sont les suivants. Tout d'abord, on injecte par voie intraveineuse ou intrapéritonéale à un mammifère (par exemple souris, lapin, cobaye, etc) -au moins une substance ayant la capacité de stimuler le système réticulo-endothélial Comme substances ayant la capacité de stimuler le système réticulo- endothélial, on emplpie généralement des bactéries à gram positif, des protozoaires ou des levures, que l'on administre au mammifère à l'état soit de micro-organismes vivants, soit de micro- organismes-morts (par exemple après trftement par la chaleur ou traitement avec la formaline), soit un extrait de cellules de micro-organismes. Des exemples des bactéries à gram positif comprennent les propioni- bactéries telles que Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum) et Propionibacterium granulosum (Corynebacterium granulosum), des mycobactéries telles que le bacille de Calmette et Guérin (BCG) et Mycobacterium smegmatis, et des nocardias telles que Nocardia erythropolis et Nocardia gardneri Comme protozoaires appropriés, on peut par exemple employer des plasmodiums ou des toxoplasmes Comme levure appropriée, on emploie généralement le Zymosan extrait de Saccharomyces cerevisiae ou autres On peut aussi employer des composés synthétiques de poids moléculaire élevé tels qu'un copolymère de pyranne Ensuite, 7 à 8 jours après l'administration de la substance précitée ayant la capacité de stimuler le système réticulo-endothélial, on injecte par voie intraveineuse audit mammifère une endotoxine d'une bactérie à gram négatif, par exemple un lipopolysaccharide dérivé d'Escherichia coli, de Pseudomonas aeruginosa ou de Salmonella typhosa Enfin, 1,5 à 2 h après l'injection, on prélève des liquides de l'organisme (par exemple le liquide d'ascite, la lymphe, etc) et/ou du sérum ou du plasma desdits mammifères ou on homogénéise des viscères tels que le fois, la rate, etc et on les extrait avec une solution salée physiologique On peut employer ces liquides de l'orga- nisme, sérum, plasma et/ou extrait de viscères comme solution brute de TNF Cependant, on emploie généralement parmi eux le sérum ou le plasma. Comme indiqué ci-dessus, le procédé pour préparer le TNF à employer dans l'invention n'est pas limité au procédé ci- dessus On peut également employer de façon efficace le procédé repo- sant sur le génie génétique et le procédé de culture tiss Ulaire o on emploie des cellules capables de produire du TNF Il convient de noter que ces procédés peuvent également être appliqués à la produc- tion de TNF humain. Le TNF brut produit selon l'un quelconque des pro- cédés indiqués ci-dessus peut être purifié selon les techniques bio- chimiques classiques indiquées ci-dessous isolément ou en combinai- son, pour fournir une solution aqueuse purifiée de TNF que l'on lyophilise pour obtenir une poudre purifiée de TNF Comme techniques biochimiques appropriées de purification du TNF, on peut mentionner par exemple une technique de relargage dans laquelle on emploie du sulfate d'ammonium, une chromatographie par échange d'ions,- dans laquelle on emploie une résine échangeuse d'ions, une technique de filtration sur gel et une technique d'électrophorèse Lorsque la pureté du TNF s'accroît par la mise en pratique des techniques ci- dessus de purification, on constate que le TNF devient progressive- ment instable Par exemple, un échantillon de TNF purifié pour qu'il ait une activité spécifique de 500 000 unités/mg (l'activité spéci- fique est exprimée en unités d'activité de TNF par mg de protéine; l'unité d'activité du TNF est définie ci-après) est très instable comme le montrent les valeurs indiquées dans les exemples Même les échantillons de TNF ayant une activité spécifique inférieure à 500 000 unités/mg présentent également un certain degré de baisse de l'activité lorsqu'on les stocke ou les soumet à une congélation, une décongélation, une lyophilisation ou d'autres opérations. Par conséquent, l'invention concerne la stabilisa- tion du TNF que l'on a purifié à un degré élevé et que l'on a rendu instable Le TNF à stabiliser selon l'invention peut être soit sous forme d'une solution, soit sous forme d'une poudre Cependant, on préfère que le TNF stabilisé soit sous forme d'une solution. On préfère que la solution de TNF à stabiliser selon l'invention ait constamment un p H de 5 à 10 et, de plus, on préfère que le solvant de la solution de TNF soit stabilisé par un tampon approprié Comme tampon approprié, on peut mentionner par exemple un tampon phosphate et un tampon tris(hydroxyméthyl)- aminométhane-H Cl A la demande, on ajoute à la solution de TNP un sel tel que le chlorure de sodium et le chlorure de potassium Par exemple, on ajoute un sel à la solution de TNF pour préparer une solution isotonique lorsque la solution de TNP est utilisée pour l'injection Ce n'est pas le seul but de l'addition d'un sel La concentration d'un tel sel dans la solution de TNF peut être déter- minée selon le but de l'addition du sel Par exemple, lorsque la finale de TNF est utilisée pour l'injection, on prépare une solution isotonique à partir de la solution de TNF par addition -de chlorure de sodium jusqu'à une concentration de 0,15 M. Selon le procédé de l'invention, on ajoute une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant choisi parmi le groupe constitué par une albumine, une -gélatine, une globuline, une protamine et un sel de protamine à une solution aqueuse ou ar une poudre contenant du TNP. Comme albumine appropriée, on peut mentionner les albumines de divers animiaux, tels que les bovins, les chevaux, les moutons, les chèvres, les poulets et l'homme Comme exemples spécifiques d'albumine appropriée, on peut mentionner la sérum- albumine bovine, la sérum-albumine humaine, l'albumine d'oeuf de poule, la lactalbumine bovine et la lactalbumine humaine On n'observe pas de différence significative en ce qui concerne la capa- cité de stabiliser le TNF entre les albumines précitées Cependant, comme agent de stabilisation des préparations injectables, on préfère tout particulièrement la sérum-albumine humaine. Comme gélatine appropriée, on peut mentionner une gélatine ordinaire produite selon des procédés courants et une géla- tine partiellement hydrolysée Le poids moléculaire de la gélatine n'a pas d'importance stricte Cependant, comme agent stabilisant pour les préparations injectables, on préfère particulièrement une gélatine partiellement hydrolysée soluble dans l'eau La gélatine partiellement hydrolysée est obtenue par hydrolyse enzymatique d'une gélatine au moyen d'une enzyme protéolytique, telle que la papaïne ou par hydrolyse catalysée par un acide ou un alcali d'une gélatine. Comme globuline appropriée, on peut mentionner les globulines sériques de divers mammifères, tels que les bovins, les chevaux, les moutons, les chèvres et l'homme et leurs dérivés On n'observe pas de différence notable en ce qui concerne la capacité de stabiliser le TNF entre les globulines précitées Cependant, parmi elles, on préfère tout particulièrement une y-globuline et un dérivé correspondant obtenu par traitement enzymatique ou modi- fication chimique de la globuline de départ Comme agent stabilisant pour les préparations injectables, on préfère tout-particulièrement une yeglobuline humaine et ses dérivés tels qu'une y-globuline humaine traitée par la fibrinolysine ou traitée par la pepsine et une y-globuline humaine sulfonée. Comme protamine appropriée, on peut mentionner les protamines provenant d'espèces de poissons appropriées, telles que le saumon, le hareng et le maquereau Comme sel de pro tamine appro- prié on peut mentionner les chlorhydrates, sulfates et phosphates de protamines On n'observe pas de différence notable en ce qui- concerne la capacité de stabiliser le TNF entre les protamines et leurs sels précités. Les agents stabilisants que l'on emploie dans l'in- vention peuvent être utilisés isolément ou en mélange. -10 L'agent stabilisant que l'on emploie dans l'inven- tion est ajouté à raison d'environ 11 g ou plus, de préférence-de l Opg ou plus, en particulier de i Oog *ou plus par ml de la solu- 2 9 - tion de TNF ayant une activité de TNF de 10 à 10 unités/ml (l'unité d'activité est 4 éfinie plus loin) La limite supérieure de la quantité d'agent stabilisant est généralement déterminée du point de vue de la solubilité de l'agent stabilisant et de la visco- sité de 1 a solution obtenue et du point de vue économique La limite supérieure de la quantité d'agent stabilisant est généralement de mg, de préférence de 10 mg par ml de la solution de TNF Lorsque le TNF est stabilisé sous forme d'une poudre, on ajoute l'agent stabilisant en une quantité telle que la solution aqueuse obtenue par dissolution du TNF en poudre, présentant une activité de 102 à 109 unités/ml, présente les concentrations précitées de l'agent stabilisant La façon dont on ajoute l'agent stabilisant n'a pas d'importance stricte Par exemple, l'agent stabilisant sous forme d'une poudre peut être ajouté directement à la solution de TNF. Sinon, la poudre de l'agent stabilisant peut être préalablement dissoute dans de l'eau ou un tampon approprié et ajoutée à la solu- tion de TNIF De plus, on peut également mélanger la poudre de l'agent stabilisant avec la poudre de TNF L'addition de l'agent stabilisant peut être effectuée en un moment quelconque du stade de purification ou du stade de fabrication des préparations pharmaceutiques. Lorsqu'on emploie deux ou-plusieurs types différents d'agets stabilisants, on les ajoute en une quantité telle que leur quantité totale soit comprise dans -la gamme des quantités définie ci-dessus. 9. On préfère que la conservation, la purification et la fabrication de préparations pharmaceutiques à partir de la solution de TNF à laquelle est incorporé un agent stabilisant selon l'invention, lorsqu'on la maintient sous forme d'une solution, soient effectuées à une température de O à 30 C et mieux de O à 100 C. Lorsque la solution de TNF est conservée à l'état congelé, on préfère que la température de conservation soit maintenue en dessous de 00 C et mieux en dessous de -20 'C. La solution de TNF à laquelle est incorporée une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant selon l'invention conserve son activité de TNF pendant la conservation, qu'elle soit sous forme d'une solution ou sous une forme congelée et également pendant les stades de purification et de fabrication des prépara- tions pharmaceutiques. De plus, le procédé pour stabiliser le TNF selon l'invention s'applique également à la lyophilisation Généralement, lorsqu'on lyophilise des solutions de TNF (en particulier dans le cas de TNF très purifié), leur activité diminue nettement Cependant, les solutions de TNF contenant une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant selon l'invention peuvent être lyophilisées sans perte de l'activité pour fournir une poudre de TNF La poudre de TNF peut être dissoute pour former une solution aqueuse stable de TNP dans laquelle les concentrations de l'agent stabilisant et du TMP sont comprises dans les gammes définies ci-dessus L'agent stabili- sant comme défini dans l'invention peut sinon être incorporé-aux préparations lyophilisées de TNF Lorsque le TNF est conservé sous forme d'une poudre, on préfère que la température de conservation soit maintenue à 25 C ou moins. Pour déterminer l'activité du TNF, on emploie géné- ralement deux procédés, le procédé in vivo dans lequel on mesure in vivo l'effet de nécrose tumorale et le procédé in vitro dans lequel on mesure in vitro l'effet cytotoxique sur des cellules néo- plasiques. Comme procédé in vivo, on peut mentionner par exemple le procédé de Carswell et coll lvoir Proc Nat Acad Sci Etats- Unis d'Amérique, 72 ( 9), 3666-3670 ( 1975)l Selon ce procédé, on transplante des cellules Meth A de sarcome de BALB/c ( 2 x 105 cellules) par voie intradermique dans l'aissel e de souris (BALB/c x-C 57 BL/6)F 1 et, 7 jours plus tard, on choisit pour l'éva- luation des souris porteuses de tumeurs de 7 à 8 mm de diamètre bien vascularisées-et sans nécrose centrale spontanée On injecte dans la veine de la queue de chacune des souris un échantillon de TNF ( 0,5 ml) dilué avec une solution salée physiologique On évalue l'activité de l'échantillon de TNF après 24 h selon les critères suivants. (-): pas de changement (+): légère nécrose hémorragique (++): nécrose hémorragique modérée (nécrose centrale atteignant environ 50 % de la surface tumorale) (±1-): nécrose hémorragique nette (nécrose massive laissant un petit anneau viable sur le pourtour de la tumeur). Comme procédé in vitro de détermination de l'activité du TNF, on peut mentionner par exemple le procédé de Ruff et coll. lvoir Lymphokines, vol 2, édité par E Pick, Academic Press N Y, 245-248 ( 1980)l et le procédé de Kul et coll lvoir J Immunol, 126 ( 4), 1279-1283 ( 1981)l. Le procédé in vitro que les demanderesses ont employé pour la détermination de l'activité du TNF a été mis au point par amélioration des procédés classiques précités Dans le procédé in vitro des demanderesses o on mesure l'activité cytotoxique du TNF vis-à-vis de- cellules L-M (American Type Culture Collection CCL 1 2), on opère comme suit Comme récipient de culture, on emploie des plaques de microtitrage à 96 cupules produites par Flow Laboratorieg, Inc (Etats-Unis d'Amérique) et on cultive les cellules L-M dans du milieu essentiel minimal de Eagle lvoir Science, 130 432-437 ( 1959)l contenant 10 % v/v de sérum de veau foetal inactivé par chauffage On dilue en série un échantillon de 0,1 ml de TNF et on mélange la suspension de cellules L-M ( 0,1 ml; 1 x 10 cellules) dans chaque cupule des plaques et on incube les plaques à 370 C pendant 48 h dans de l'air contenant 5 % de gaz carbonique A la fin de la période de culture, on ajoute 2011 d'une solution aqueuse à 20 % de glutaraldéhyde pour fixer les cellules Après la fixation, on lave les plaques avec de l'eau distillée et on laisse sécher, puis on ajoute 0,1 ml de bleu de méthylène à 0,05 % pour colorer les cellules vivantes On lave à fond les plaques avec de l'eau distillée pour éliminer l'excès de colorant et on laisse sacher. On ajoute 0,2 ml d'acide chlorhydrique à 3 % dans chaque cupule pour extraire le colorant des cellules colorées On mesure l'absor- bance de chaque cupule à 665 nm avec un-Titertek Multiskan produit par Flow Laboratories, Inc L'absorbance est proportionnelle au nombre de cellules vivantes L'activité du TNF, unité(U)/ml, pst définie par l'inverse de la dilution du TNF qui provoque une cyto- toxicité de 50 % et on peut l'obtenir par établissement d'un gra- phique de la dilution en fonction de l'absorbance, Toutes les activités de TNF déterminées selon le procédé in vitro qui sont indiquées ci-après sont exprimées au moyen de l'unité déterminée ci-dessus. Le procédé de l'invention permet la fourniture efficace et régulière à l'échelle commerciale de TNF très purifié que l'on estime être un médicament antitumoral efficace applicable en clinique, grâce-au fait que l'activité du TNF est maintenue pen- dant la conservation, que le TNF soit sous forme dlune solution, d'une masse congelée ou d'une préparation lyophilisée, et pendant les stades de purification et de fabrication des préparations phar- maceutiques. Les demanderesses ont également découvert que la solution ou poudre de TNF à laquelle est incorporé au moins un agent stabilisant choisi parmi la sérum-albumine humaine, une géla- tine, une y-globuline humaine, un dérivé de y-globuline humaine, une protamine et un sel de protamine, peut être administrée sans danger à l'organisme humain et que, par conséquent, la nouvelle composition de l'invention est particulièrement utile lors de l'application clinique du TNF comme médicament antitumoral L'invention va être décrite de façon plus détaillée, par l'exemple de référence, les exemples et les exemples comparatifs suivants qui ne limitent en rien la portée de l'invention. Dans les exemples suivants, les noms des agents stabilisants sont abrégés comme suit: HSA: sérum-a Ibumine humaine BSA: sérum-albumine bovine PHG-1: gélatine partiellement hydrolysée obtenue par hydrolyse cata- lysée par un alcali de la gélatine (poids moléculaire moyen: environ 7 000) HGG: yglobuline humaine SPS: sulfate de protamine de saumon HPS: sulfate de protamine de hareng BGG y-globuline bovine CEA: albumine d'oeuf de poule BLA: a-lactalbumine bovine PHG-2: gélatine partiellement hydrolysée obtenue par hydrolyse cata- lysée par un acide de 1 a gélatine (poids moléculaire moyen: environ 7 000) PHG-3: gélatine partiellement hydrolysée ayant une faible solidité de gel PG: gélatine purifiée SPF:protamine de saumon (base libre) SPP:phosphate de protamine de saumon EDTA:acide éthylènediaminetêtraacétique. EXEMPLE DE REFERENCE On injecte par voie intraveineuse à des lapines pesant 2 à 3 kg 75 mg de cellules tuées par la formaline de Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum; Welcome Research Laboratories, Angleterre) Huit jours plus tard on injecte par voie intraveineuse à chaque lapine 100 g d'endotoxine (lipopolysaccharide d'Escherichia coli 026:B 6, produit par Difco Laboratories, Etats-Unis d'Amérique). On prélève le sang de chaque lapine par poncticn cardiaque 2 h après l'injection d'endotoxine et on mélange le sang obtenu avec une petite quantité d'héparine On centrifuge le sang à 3 000 tr/min pendant min- On obtient ainsi un plasma ayant une activité de TNF de 2500 U/ml. On dilue le plasma ainsi obtenu ( 10 1) contenant du TNF avec 5 1 de tampon phosphate 0,03 M (p H 7,8) On applique le plasma dilué àune colonne ( 10 x 42 cm) de DEAE-Sepharose CL-6 B (fabriqué et vendu par Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède) équilibrée avec du tam- pon phosphate 0,03 M (p H 7,8) 0,13 M en Na Cl On lave la colonne avec 2, 5 1 de tampon phosphate 0,03 M (p H 7,8), 0,13 M en Na CI et on élue le TNF adsorbé avec un gradient linéaire de chlorure de sodium obtenu avec 5, 0 1 de tampon phosphate 0,03 M (p H 7,8), 0,15 M en Na Cl et 5,0 1 de tampon phosphate 0,03 M (p H 7,8), 0,3 M en Na Cl Le débit est de 230 ml/h et on recueille des fractions de 45 ml On observe l'activité de TNF dansles fractions éluées avec le Na Cl 0,20-0,24 M. On regroupe les fractions à activité de TNF et on les dialyse pendant une nuit contre du tampon Tris-HC 1 0,03 M (p H 7,2) 0,13 M en Na Cl. On rechromatographie la solution dialysée de TNF sur une colonne de DEAESepharose CL-6 B ( 3,0 x 30 cm) équilibrée avec du tampon Tris-H Cl 0,03 M (p H 7,2) 0,15 M en Na Cl On élue le TNF adsorbé avec un gradient linéaire de chlorure de sodium obtenu avec 500 ml du tampon d'équilibrage et 500 ml de tampon Tris-HC 1 0,03 M (p H 7,8) 0,3 M en Na Cl Le débit est de 40 ml/h et on recueille des fractions de 10 ml On regroupe et concentre les fractions ayant une activité de TNF. On soumet le concentré à une filtration sur gel avec une colonne ( 5 x 100 cm) de Sephacryl S-200 (fabriqué et vendu par Pharmacia) équilibrée avec du tampon phosphate 5 m M (p H 7,0) 0,15 M en Na Cl On effectue l'élution avec le tampon d'équilibrage Le débit est de 80 ml/h et on recueille des fractions de 13 ml On regroupe les fractions ayant une activité de TNF et on concentre par ultrafil- tration. La solution de TNF ainsi obtenue se révèle avoir une activité spécifique de 5,0 x 105 U/mg de protéines et une pureté 000 fois supérieure à celle observée dans le plasma. On soumet la solution de TNP ainsi obtenue à une nou- velle chromatographie sur la même colonne (Sephacryl S-200) en utili- sant le même tampon pour obtenir une solution de TNF ayant une acti- vité spécifique de 1,0 x 106 U/mg de protéines. EXEMPLE 1 On dilue avec du tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0) 0,15 M en chlorure de sodium du TNF de lapin ayant une activité spé- cifique de 5,0 x 105 U/mg obtenu selon le mode opératoire décrit dans l'exemple de référence pour obtenir une solution de TNF ayant une acti- vité de TNF de 1 200 U/ml A des portions de la solution de TNF ainsi obtenue, on ajoute séparément comme agents stabilisants de la HSA (sérumalbumine humaine), de la BSA (sérum-albumine bovine), de la PHG-1 (gélatine partiellement hydrolysée, de la HGG (y-globuline humaine) et du SPS (sulfate de protamine de saumon) pour former dans chaque cas deux solutions différentes ayant une concentration de - 0,1 mg/ml ou de 1,0 mg/ml. Pour chacune des solutions obtenues, on détermine l'activité résiduelle relativement à 1) les échantillone obtenus par conservation respectivement pendant 2 jours, 7 jours et 30 jours à C, 2) les échantillons soumis respectivement à 1 cycle et 3 cycles de congélation (-70 C) et de décongélation et 3) l'échantillon soumis à une congélation à -70 C, une lyophilisation et une conservation pendant 7 jours à 25 C, Pour effectuer l'essai ci-dessus, on emploie comme témoin la solution de TNF à laquelle on n'a pas incorporé d'agent stabilisant En ce qui concerne la préparation lyophilysée lvoir 3)l, on la dissout dans de l'eau distillée stérile puis on la soumet à la détermination de l'activité du TEF. Pour déterminer l'activité résiduelle, on mesure l'activité de chaque échantillon in vitro ou in vivo selon les pro- cédés décrits précédemment Dans le procédé in vitro, on calcule l'activité résiduelle (%) à partir de la valeur de dosage selon l'équation suivante: A Activité résiduelle (%) = A x 100 B o A est l'act Lvité de TNF de l'échantillon après conservation ou traitement physique et B est l'activité de TNF de l'échantillon avant conservation ou traitement physique. Dans le procédé in vivo, on concentre chaque échan- tillon de solution pour que la concentration soit 20 fois supérieure à celle de départ au moyen du mini-module NM-3 (marque du commerce de l'appareil d'ultrafiltration fabriqué et vendu par Asahi Chemical Industry Co Ltd, Japon) On injecte ensuite 0,5 ml de chacune des solutions de TNF ainsi concentrées dans la veine de la queue à un groupe de 5 souris porteuses de tumeurs On détermine l'activité du TNF 24 h après selon le critère précédemment décrit Les résultats obtenus figurent dans le tableau 1. Effet stabiliscnt TABLEAU 1 de HSA BSA PHG-1. HGG et SI'8 Témoin avant con Conservation à 40 C Congélation Conservation à Condition servation (ou trai (solution) décongéla 250 C (prépara- tement physique) _________ ______tion Lion lyophilisée) Procédé de détermai in i io i ir ioi nation de l'activité vitro in invto vitro in vivo Concen Jours Jours Répétition Jours Jours Agent sta tratioxn bilisant mg/ml _________ 2 7 30 7 1 3 7 7 Témoin (sans agent 10 4 ++ 4, ++ I 52,26 4 + 3, -2 30 8 40 + 4, -1 stabili- USA 0,1 l100 + 4-7-4-', A 41 10 95 90 -3, 2 90 82 95 + 4-43, -I+ 2 IISA 1 > O 100 + 4-1-4, H-I100 98 92 44 ±4,-11 100 94 102 + 4-44, 441 BSA 1,0 100 F+ 44, 4 +îI99, 98 93 4, + 1 1 02 96 96 4-3, ++ 2 PUG-1 0,1 100 44, 441 96 94 88 + -3, -FI-2 95 85 97 + 4-44, ++ 1 1,0 100 4-444, + 4-1103 97 91 4441-4, + 1-1101 93 lÈ O + 4-45 01 100 + k F 4, + 4-194 90 87 + -3, -+ 2 88 80 93 +++ 3, + 4-2 IIGG l'0 O 100 444 + 4-1102 97 90 +++ 3, + 442100 90 98 -14 + 3, + 4-2 ss 0, 100 ++ 4,44 '4-l 95 9 87 4 +,+ 4-2 93 80 90 4 43 4-42 SPS 1,0 100 14 I-+ 4, lo-1 1096 ' 90 + 4-4-4,+ 1 100 92 97 ++ 4, + 4-1 Nota;Les valeurs dans les colonnes marquées précédemment défini. "in vitro" représentent l'activité résiduelle comme Les valeurs dans les col -mies marquées "invio représentent le nombre de souris La si Gni- fication des symboles (,+, etc) a été précédemment indiquée. HSA produit de -Sigma Wcmic'al Co, Etats-Unis d'Amériue - :S produit, de Armour i Pharmacieutical Co, tas-ni d Aéique- PIIG-1 produit de Nippi Co, Ltd j Japan (Iligh Grade gelatin) HQG produit de Nutritiona'l Biochemicals Corp tats-Ufnis d'Amérique SPS produit de'Si Sma Chemical Co, Etats-Unis d'Amérique j-. tji 1 % 3 Lni ul> C). -J *EXEMPLE 2 A des portions de solution de TNF ayant la même activité de TNF que celle employée dans l'exemple 1, on ajoute sépa- rément de la HSA, de la PHG-1, de la HGG et du SPS (ces protéines sont les mêmes que celles employées dans l'exemple 1) comme agent stabilisant à diverses concentrations On conserve chacune des solu- tions obtenues à 4 C pendant 7 jours, puis on les soumet aà la déter- mination de l'activité du TNF selon le procédé in vitro On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus sont illustrés-par les figures 1 à 4. EXEMPLE 3 On dilue avec du tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0) 0,15 M en chlorure de sodium, du TNF de lapin ayant une activité spé- cifique de 1,0 x 10 U/mg, obtenu selon les modes opératoires décrits dans l'exemple de référence pour obtenir une solution de 'TNF ayant une activité de TNF de 1 000 U/ml A des portions de la solution de TNF ainsiobtenue, on ajoute conjointement deux types différents d'agents stabilisants choisis parmi diverses albumines, globulines, protamines et gélatines, à diverses concentrations comme indiqué dans le tableau 2 On conserve chacune des solutions obtenues à 4 C pendant 7 jours et on les soumet à une détermination de l'activité de TNF selon le procédé d'essai in vitro On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1 Les résultats obte- nus figurent dans le tableau 2. TABLEAU 2 Effet stabilisant de divers agentsstabilisants Agent stabilisant Activité résiduelle du TNF, % (concentration, mg/ml) conservation à 4 C pendant 7 jours Néant (témoin) 5 BSA ( 0,05) + HSA ( 0,05) 96 HSA ( 0,01) + PHG-1 ( 0,05) 90 HPS ( 0,1) ±PHG-1 ( 0,05) 95 CBGG ( 1,0) + CEA ( 1,0) 9 HGG ( 0,1) + SPS ( 0,1) 94 Nota: Comme BSASA, SA, PHG-1, HGG et SPS, on utilise les mêmes matières que celles employées dans l'exemple 1. HPS: produit de Sigma Chemical Co. BGG: produit de Sigma-Chemical Co. CEA: produit de Nutritional'Biochemicals Corp. EXEMPLE 4 A des portions de solution de TNF ayant la même activité de TNF que celle employée dans l'exemple 3, on ajoute sépa- rément comme agent stabilisant diverses albumines indiquées dans le tableau 3 en une quantité telle que la solution obtenue ait une concentration de 1,0 mg/ml On conserve chacune des solutions obte- nues à 4 C Fendant 7 jours et on les soumet à une détermination de l'activité du TNF selon le procédé d'essai in vitro On calcule l'activité résiduelle (%) de la même façon que dans l'exemple 1 Les résultats obtenus figurent dans le tableau 3. TABLEAU 3 Effet stabilisant de diverses albumines Agent stabilisant Activité résiduelle du TNF, % conservation à 4 C pendant 7 jours Néant (témoin) 5 HSA 98 Fraction de HSA 97 BSA 98 Fraction de BSA 98 CEA 90 BLA 91 Nota: Comme HSA, BSA et CEA, on utilise les mêmes matières que celles employées dans les exemples 1 et 3. Fraction de HSA: fraction de sérum-albumine humaine (fraction V de Cohn), produit de Sigma Chemical Co. Fraction de BSA: fraction de sérum-albumine bovine (fralti " " de Cohn), produit de Sigma Chemical Co. BLA: produit de Sigma Chemical Co. EXEMPLE 5 A des portions de solution de TNF ayant la même activité de TNF que celle employée dans l'exemple 3, on ajoute séparément comme agent stabilisant diverses gélatines comme indiqué dans le tableau 4 en une quantité telle que la solution obtenue ait une concentration de 1,0 mg/ml On conserve chacune des solutions obtenues à 40 C pendant 7 jours et on détermine l'activité de TNF selon le procédé d'essai in vitro On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1 Les résultats obtenus figurent dans le tableau 4. TABLEAU 4 Effet stabilisant de diverses gélatines. Agent stabilisant Activité résiduelle du T 1 NF, % Conservation à 40 C pendant 7 jours Néant (témoin) 4 PRG-1 97 PHG-2 99 PHG-3 99 PG 96 Nota: Comme PHG-1, on emploie la même matière que celle utilisée dans l'exemple 1. PHG-2: produit de Nippi Co, Ltd. PHG-3: produit de Sigma Chemical Co, (Gélatine type IV: environ 60 Bloom) - PG: produit de Nakarai Chemicals Co, Ltd Japon, EXEMPLE 6 A des portions de solution de TNF ayant la même activité de TNF que celle employée dans l'exemple 3, on ajoute sépa- rément diverses globulines comme indiqué dans le tableau 5 en une quantité telle que la solution obtenue ait une concentration de 1,0 mg/ml On conserve chacune des solutions obtenues à 40 C pendant 7 jours et on les soumet à la détermination de l'activité du TNF selon le procédé d'essai in vitro On calcule l'activité résiduelle du TNF (%û) de la même façon que dans l'exemple 1 Les résultats obtenus figurent dans le tableau 5. TABLEAU 5 Effet stabilisant de diverses globulines Agent stabilisant Activité résiduelle du TNF,-% conservation à' 4 C pendant 7 jours Néant (témoin) 4 HGG 97 BGG 95 HGG traitée par la fibrino 93 lysine HGG traitée par la pepsine 94 HGG sulfonée 91 Fraction de HGG; 99 _ Nota: Comme HGG et BGG, on emploie Ies mêmes matières que celles utilisées dans les exemples 1 et 3. HGG traitée par la fibrinolysine: Venoglobulin (marque de commerce), produit de The Green Cross Corporation, Japon. HGG traitée par la pepsine: Gamma-Venin (marque du commerce), produit de Hoechst Japan Ltd, HGG sulfoné: Venilon (marque du commerce), produit de Chemo- Sero-Therapeutic Research Institute, Japon. Fraction de HGG: fraction de y-globuline humaine (fraction II de Cohn), produit de Sigma Chemical Co. EXEMPLE 7 A des portions de solution de TNF ayant la même acti- vité de TNF que celle employée dans l'exemple 3, on ajoute séparément comme agent stabilisant diverses protamines comme indiqué dans le tableau 6 en une quantité telle que la solution obtenue ait une concentration de 1,0 mg/ml On conserve chacune des solutions obtei nues à 40 C pendant 7 jours et on les soumet à la détermination de ' l'activité du TNF selon-le procédé d'essai in vitro On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 6. TABLEAU 6 Effet stabilisant de diverses protamines. Agent stabilisant Activité résiduelle du TNF, % -conservation à 49 C pendant 7 jours Néant (témoin) 6 SPS 96 SPF 93 SPP 95. HPS 93 Nota: Comme SPS et HPS, on emploie les mêmes matières que celles utilisées dans les exemples 1 et 3. SPF: produit de Sigma Chemical Co. SPP: produit de Sigma Chemical Co. EXEMPLE 8 On dilue avec du tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0) 0,15 M en chlorure de sodium, du TNF de lapin ayant une activité spécifique de 1,0 x 106 U/mg, obtenu selon les modes opératoires décrits dans l'exemple de référence pour préparer des solutions de TNF ayant respectivement des activités de TNF de 100 U/ml, 1 000 U/ml, 10 000 U/ml et 100 000 U/ml A une portion de chacune des solutions de TNF ainsi préparées, on ajoute de la HSA en une quantité telle que la solution obtenue ait une concentration de 1,0 mg/ml On conserve chacune des solutions de TNF obtenues-à 4 C pendant 7 jours et on les soumet à une détermination de l'acti- vité du TNP selon le procédé d'essai in vitro On calcule l'acti- vité résiduelle du TNF (%) de la meme façon que dans l'exemple 1. Comme témoins, on soumet une autre-portion de chacune des solutions de TNF auxquelles on-n'a pas incorporé de HSA à la détermination- de l'activité du TNF Les résultats-obtenus figurent dans le tableau 7 TABLEAU 7 Effet stabilisant de la HSA Concentration du TNF, Concentration de la HSA, mg/ml U/ml O (témoin) 1,0 3 85 1 000 5 98 000 45 101- 000 48 99 lLes valeurs représentent l'activité résiduelle du TNF (%)l. EXEMPLE COMPARATIF A des portions de solution de TNF ayant la même acti- vité de TNF que celle employée dans l'exemple 1, on ajoute séparé- ment à diverses concentrations, comme indiqué dans le tableau 8, chacun de divers aminoacides, sels métalliques et agents chélatants qui sont des agents stabilisants bien connus des solutions des subs- tances ordinaires à activité physiologique On conserve chacune des solutions obtenues à 4 C pendant 7 jours et on les soumet à une détermination de l'activité du TNF selon le procédé d'essai in vitro. On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1 Les résultats obtenus figurent dans le tableau 8. TABLEAU 8 Comparaison de l'effet stabilisant de divers agents stabilisants. Nota: Comme HSA, PHG-1, HGG et SPS, on emploie que celles utilisées dans l'exemple 1. les mêmes matières Activité résiduelle du TNF, % Agent stabilisant 'Concentration Agent stabilisant Concen N conservationà 4 C pendant 7 jours Néant (témoin) 26 HSA 1,0 (mg/ml) 98 PHG-1 1,0 (mg/ml) 97 HGG 1,0 (mg/ml) 97 SPS 1,0 (mg/ml) 90 Glycine 0,1 (M) 30 L-lysine 0,1 (M) 28 Larginine 0,1 (M) 24 Acide L-glutamique 0,1 (M) 23 Ca C 12 1 (m M) 32 Mg C 12 1 (m M) 32 EDTA 1 (MM) 26 Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limita- tifs sans sortir du cadre de l'invention. R E V END I CA TI ON S 1 Procédé pour stabiliser un Facteur de Nécrose Tumorale, caractérisé en ce qu'il comprend l'addition à une solu- tion aqueuse ou à une poudre contenant un Facteur de Nécrose Tumorale d'une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant choisi parmi le groupe constitué par une albumine, une gélatine, une globuline, une protamine et un sel de protamine. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit agent stabilisant est une albumine. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite albumine est une sérum-albumine humaine. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit agent stabilisant est une gélatine. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite gélatine est une gélatine partiellement hydrolysée soluble dans l'eau. 6 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit agent stabilisant est une globuline. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite globuline est une y-globuline humaine ou un de ses dérivés. 8 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit agent stabilisant est une protamine ou un sel de pro- tamine. 9 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit agent stabilisant est ajouté en une quantité d'environ 10/g à 50 mg/ml de la solution aqueuse con- tenant le Facteur de Nécrose Tumorale, ladite solution aqueuse ayant une activité de TNP de 10 02 à 109 unités/ml. 10 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit agent stabilisant est ajouté en une quantité d'environ 100 g à 10 mg/ml de la solution aqueuse contenant le Facteur de Nécrose Tumorale, ladite solution aqueuse ayant une activité de TNF de 102 à 10 unités/ml ' 11 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 a 10, caractérisé en ce qu'il consiste de plus à soumettre à une lyophilisation la solution aqueuse obtenue à laquelle ledit agent stabilisant est-ajouté. 12 Solution aqueuse ou poudre stables, caracté- risées en ce qu'elles contiennent un Facteur de Nécrose Tumorale et une quantité efficace'd'au moins un agent stabilisant choisi parmi le groupe constitué par une albumine, une gélatine, une globuline, une protamine et un sel de protamine. 13 Solution aqueuse ou poudre stables selon la revendication 12, caractérisées en ce que ledit agent stabilisant est une albumine. 14 Solution aqueuse ou poudre stables selon la revendication 13, caractérisées en ce que ladite albumine est une sérum-albumine humaine. Solution aqueuse ou poudre stables selon la revendication 12, caractérisées en ce que ledit agent stabilisant est une gélatine. 16 Solution aqueuse ou poudre stables selon la revendication 15, caractérisées en ce que ladite gélatine est une gélatine partiellement hydrolysée soluble dans l'eau. 17 Solution aqueuse ou poudre stable selon la revendication 12, caractérisée en ce-que ledit agent stabilisant est une globuline. 18 Solution aqueuse ou poudre stables selon la revendication 17, caractérisées en ce que ladite globuline est une y-globuline humaine ou un de ses dérivés. 19 Solution aqueuse ou poudre stables selon la revendication 12, caractérisées en ce que ledit agent stabilisant est une protamine ou un sel de protamine. Solution aqueuse ou poudre stable selon l'une quelconque des revendications 12 à 19, caractérisées en ce que ledit agent stabilisant est contenu en une quantité d'environ l Og à mg/ml de la solutionaqueuse contenant le Facteur de Nécrose Tumorale, ladite solution aqueuse ayant une activité de TNF de 2 9 102 10 unités/ml ou est contenue en une quantité d'environ lop 10/g à 50 mg/ml d'une solution aqueuse ayant une activité de TNF de 102 109 unités/ml, cette solution étant obtenue par dissolu- tion de la poudre contenant le Facteur de Nécrose Tumorale. 21 Solution aqueuse ou poudre stables selon l'une quelconque des revendications 12 à 19, caractérisées en ce que ledit agent stabilisant est contenu en une quantité d'environ 100 ?g à mg/ml de la solution aqueuse contenant le Facteur de Nécrose Tumorale, ladite solution aqueuse ayant une activité de TNF de 102 à 109 unités/ml ou est contenue en une quantité d'environ l OO 1 g à 10 mg/ml d'une solution aqueuse ayant une activité de TNF de 10 à 109 unités/ml, cette solution étant obtenue par dissolution de la poudre contenant le Facteur de Nécrose Tumorale, -10 22 Nouveau médicament antitumoral ayant une sta- bilité améliorée, caractérisé en ce qu'il consiste en une solution aqueuse ou une poudre selon l'une quelconque des revendications 12 à 21.