FR 2516078 A1 19830513 FR 8121164 A 19811112 La présente invention concerne C-terminale de la gonadotropine chorionique humaine [HCG]. Plus particulièrement, l'invention concerne un peptide de formule où R: H ou groupe R1-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro R1 : H ou groupe R2-R3-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp R2 : H ou groupe R4-Asp-His-Pro-Leu-Thr R4 : groupe H-R5-Gly-Sly-Pro-Lye R5: groupe Cys ou Tyr, et R3: groupe Cys ou S-acétamidemethyl-Cys, ou un de ses sels. LtHCG est une hormone glycoprotéique sécrétée per le placenta lors de la grossesse, dans laquelle elle jeune un rôle important. On peut utiliser l'analyse quantitative ou qualitative de 1'HCG pour le diagnostic de la grossesse, de le grossesse extra-utérine ou du choriocarcinome. Cependent on trouve de l'hormone lutéinisante (LH), de la folliculostimuline [FSH] et de la gonadotropine chorionique CCG) dans l'hormone gonadotropique, et leur structure moléculaire se ressemble; ce sont des glycoprotéines. De plus, elles se composent de deux sous-unités, une channe oC et une cheine (3 . L'échange de la choie &alpha; d'une hormone gonadotropique n'affecte pas son activité, et la structure de leurs chaînes se ressemble donc beaucoup.La channe est spécifique de chaque gonadotropine, et les chaines de LH et Co sont assez voisines l'une de l'autre. On peut cependant distinguer la séquence d'acides aminés au voisinage de l'extrémité C-terminale de la CG, et on peut donc fournir un système précis et Fiable de dosage de la CG sans interférence de autre hormone gonadotropique, en particulier LH. L'invention a été réalisée selon l'idée exposée ci-dessus, et l'anticorps obtenu à partir de l'antigène constitué par le nouveau peptide de formule [1] témoigne d'une activité immune croisée. Le peptide (I) est utile pour la préparation d'un anticorps pour doser ltHCG ou pour un réactif marqueur. La synthèse du peptide (I) de l'invention peut s'effactuer comma suite : On fait réagir un acide aminé et/ou un peptide inférieur par condensation dans tordre de la séquence diacides aminés de Formule [I], et le groupe protecteur du groupe réactif est libéré au stade final de la réaction. La réaction de condensation peut s'effectuer par synthèse classique des peptides en répétant l'adjonction et le retrait des groupes protecteurs et en condensant. Les groupes protec teurs pour la synthèse des produits de départ ou des intermédiaires sont des groupes protecteurs clmaziques pour la synthèse des peptides et sont faciles à retirer par hydrolyse, décomposition acide, réduction, aminolyse ou hydrazinolyse. Ainsi, on peut protéger le groupe amino classiquo- ment par un groupe acyle comme un groupe Formyle, trifluora- tétyle, phtaloyle, benzènsaulfonyls, p-toluènesulfonyle, o-nitrophénylsulFonyle ou 2,4-dinitrophénylsulfonyle ; un groupe aralcoyle comme le benzoyle, le diphénylméthyle ou le triphénylméthyle Cces groupes peuvent éventuellement être substitués par un groupe alcoxy inférieur comme le o-méthoxy ou le p-méthoxy); un groupe benzyloxycarbonyle comme le benzyloxycarbonyle, o-bromobenzyloxycarbonyle, p-bromobenzyloxycarbonyle, o-chlorobenzyloxycarbonyl e, p-nitrobenzyloxycarbonyle, p-méthoxybenzyloxycarbonyle, p-phénylazobenzyloxycarbonyle ou p-(p'-méthoxyphénylazo)-benzyloxycarbonyle ; un groupe oxycarbonyle aliphatique comme le cyclopentyloxycarbonyle, le trichloroéthyloxycarbonyle, le t-amyloxycarbonyle, le t-butoxycarbonyle ou le diisopropylméthoxycarbonyle, ou un groupe arelcoyloxycarbonyle comme le 2-phénylisopropoxy carbonyle, le -tolyl i 2-tolylisopropoxycarbonyle ou le 2 -p-di phényl - isopropoxycarbonyle. Ces groupes amino peuvent être protégés en formant une énamine que l'on fait réagir avec une 1,3dicétone comme la benzoylacétone, l'acétylacétone ou la dimédone. On peut protéger le groupe carboxyle par formation d'un amide, formation d'un hydrazide ou estérification. Le groupe emide est substitué par un groupe 3,4-diméthoxybenzyle ou bis-[p-méthoxy-phényl]-méthyle. Le groupe hydre zide est substitué par un groupe benryloxycarbonyle, trichloroéthyloxyoarbonyle, trifluoroacétyle, t-butoxycarbo nyle, trityle ou 2-p-diphényl-isopropoxycarbonyle.Le groupe ester est substitué par un alcanol, comme le méthanol, 1 'éthanol, le t-butanol ou le cyanométhylalcool; un aralcanol comme le benzylalcool, le p-bromobenzylalcool, le p-chlorobenzylalcool, le p-méthoxybenzylalcool, le p-nitrobenzylmlcool, le 2,4,8-triméthylbanzylaloool, le benzhydrylaloool, le benzoylméthylalcool, le p-bromobenzoylméthylalcool ou le p-ohlorobenzoylméthylalcool ; un phénol comme le 2,4,6-trichlorophénol, le 2,4,5-trichlorophénol, le pentachlorophénol, le p-nitrophénol, le 2,4-dinitrophénol, le p-cyanophénol ou le p-méthanesulfonylphénol ; ou un thiophénol comme le thiophénol, le thiocrésol ou le p-nitrothiophénol. Le groupe hydroxy dans la sérine, la thréonine ou la tyrosine peut être éventuellement protégé par estérification ou éthérification. Un groupe protégé par estérification est, par exemple, un groupe alcanoyle inférieur comme un groupe acétyle; un groupe aroyle comme un groupe benzoyle; ou un groupe dérivé du carbonyle comme le benzyloxycarbonyle ou l'éthyloxycarbonyle. Un groupe protégé par éthérification est,- par exemple, un groupe benzyle, tétrahydropyranyle ou t-butyle. La protection du groupe hydroxy peut être effectuée par un groupe Z,2,2-trifluoro-1-t-bytyloxycarbonylaminoéthyl e OU Z,2,2-trifluoro-1-benzyloxycarbonylaminoéthyle. Cependant il ntest pas toujours nécessaire de protéger ces groupes hydroxy. Le groupe amino du groupe guanidino dans l'erginine peut être protégé par un groupe nitro, tosyle ou benzyloxy- carbonyle. Cependant, il n'est pas toujours nécessaire de protéger le groupe guanidino. Le groupe imino dans l'histidine peut être protégé par un groupe benzyle5 trityle, benzyloxycarbonyle, tosyle, admmantyloxycanbonyle, 2,2,2-trifluoro-1-t-butyloxycarbonylemincéthyle ou 2,2,2-thfluopro-1-benzyloxycarbonyleminoéthyle, bien que le groupe imino m'nit pas toujours besoin d'être protégé. Le groupe mercapto dans la cystéine peut être protégé par un groupe benzyle, p-méthoxybenzyle, p-nitrobenzyle, trityle, benzylthiométhyle, éthylcarbamoyle ou acétamideméthyle. Le peptide (I) est synthétisé par condensation d'acides aminés ou de peptides inférieurs. Ainsi, on fait réagir un acide aminé ou un peptide ayant un groupe alphaamino protégé et un groupe carboxyle terminal activé avec un acide aminé ou un peptide ayant un groupe alpha-amino libre et un groupe carboxyle terminal protégé. D'un autre c8té, on Fait réagir un acide aminé ou un peptide ayant un groupe alpha-amino activé et un groupe carboxyle terminal protégé avec un acide aminé ou un peptide ayant un groupe carboxyle terminal libre et un groupe alpha-amino protégé. Le groupe carboxyle peut être activé par, par exemple, un azide d'acide, un anhydride d'acide, un imidazolide d'acide ou un ester actiF, comme par transformation en cyanométhylester, thiophénylester, p-nitrophénylester, p-nitrothiophénylester, p-méthanesulfonylphénylester, thiodylester, 2,4-dinitro-phénylaster, 2,4,5-trichlorophénylester, 2,4,5-triohlorophénylester, pentachlorophénylester, N-hydroxy suocinimidester, N-hydroxyphtalimidoester, 8-hydroxyquinolé inester ou N-hydroxypipéridinester, carbodiimide, N,N'- carbonyl-diimidazole ou un sel d'isoxazolium comme le réactif de Woodward. Les réactions de condensation préférées sont les procédés du carbodiimide, de 1' azide , de l'ester actif et de l'anhydride d'acide. Dans la réaction de condensation il faut éviter avec soin une racémisation, et les procédés préférés sont ceux de l'azide , de l'ester actif, et le procédé de Wünsch CZ. Naturforsch., 216, 426 196 ou le procédé de Geiger (Chem. Ber., 103, 788 [1970]], avec en particulier le N-éthyl-N'-3-diméthylaminopropyl-carbodi- imide (WBCI) comme agent de condensation. Le procédé de l'invention est précédé par une réaction de condensation dans la séquence d'acides aminés de formule CI3, et il est préférable de synthétiser à partir de l'extrémité C-terminale. Il est préférable de synthétiser l'HCG protégée 127-1453 par un procédé de Geiger modifié en utilisant du WSCI avec condensation du fragment C-terminal 132-145 et du fragment N-terminal 127-131. Le fragment C-terminal 132-145 est synthétisé de préférence avec condensation du fragment 132-137 et du fragment 138-134 par le procédé de Geiger modifié utilisant le WSCI. e fragment N-terminal 1Z7-131 est synthétisé de préférence avec condensation du fragment 127-129 et du fragment 130-131 par le procédé de Geiger modifié utilisant du WSCl. On synthétise de préférence 1'HCa protégée (118-145] par condensation du fragment C-terminal 127-145, c'est-à-dire l'HCGprotégée C1Z7-1453 et le fragment N-terminal 118-126 par le procédé de Geiger modifié utilisant le WSCI. Le fragment C-terminal 118-126 est dc préférence synthétisé avec condensation du fragment 118-121 et du fragment 122-126 par le pronédé de l'azide L'HCH protégée (105-145) est ynthétisée de préférence avec condensation du fragment C-terminal 112-145 et du fragment N-terminal 105-111 par le procédé de Geiger modifié utilisant le WSCI.Le fragment C-terminal 112-145 est de préférence synthétisé avec condensation séquentielle de l'HCG protégée (118-145] at du fragment 116-117, du fragment 113-115 et du 112e soide aminé par le procédé de l'ester actif. On condense de préférence le fragment N-terminal 105-111 par le procédé de l'azide avec le fragment 110111 et le fragment 105-109. L'HCG protégée 100-1453 est de préférence condensée par le procédé de l'ester actif avec le fragment C-terminal 11a-145 et le fragment N-terminal 100-111. Le fragment Nterminal 100-111 est de préférence condensé avec le fragment 100-104 'et le fragment 105-111 par le procédé de 1'azide Le [Tyr100) -HCG [100-145] est de préférence synthétisée par condensation du fragment C-terminal 112-145 et du fragment N-terminal 100-111 par le procédé de l'ester actif. Le fragment N-terminal 100-111 est de préférence condensé avec le fragment 100-104 et-le fragment 105-111 par le procédé de l'azide. Dans la synthèse peptidique ci-dessus, le groupe carboxyle C-terminal n'a pas toujours à être protégé. Ainsi, dans la réaction de condensation par le procédé de 1,azide ou de l'ester actif, il n'est pas nécessaire de le protéger. Le groupe carboxyle peut être protégé par une estérification comme par le méthyl- , éthyl- ou benzylester. Le groupe ester comme le méthylester peut être retiré par une solution diluée dthydroxyde de sodium ou par transformation en hydrazide, et on peut retirer le groupe benzylester par de l'acide fluorhydrique anhydre ou par hydrogénation catalytique. Le groupe alpha-amino du peptide est protégé par un groupe protecteur classique, comme un groupe benzyloxycarbonyle, t-butoxycarbonyle ou t-amyloxycarbonyle. On retire le groupe benzyloxycarbonyle par hydrogénation catalytique et on retire les groupes t-butoxycarbonyle et tamyloxycarbonyle par acide trifluoracétique.Les groupes protecteurs préférés sont pour le groupe hydroxyle de la sérine et de la thréonine, un groupe benzyle; pour le groupe hydroxyle de la tyrosine, un groupe 2,6-dichlorobenzyle; pour le groupe -amino de la lysine, un groupe o-chlorobenzyloxycarbonyle; pour le groupe amino du groupe guanidino de l'arginine, un groupe tosyle;et pour le groupe mercapto de la cystéine, un groupe p-méthoxybenzyle. Ces groupes protecteurs peuvent être retirés par de l'acide fluorhydrique anhydre. Le groupe acétamide-méthyle peut être utilisé comme groupe protecteur pour le groupe mercapto de la cystéine. Comme ce groupe est stable vis-à-vis de acide fluorhydrique anhydre, on peut le retirer avec l'acétate mercurique à pH 4 au moment de 11 enlèvement dos autres groupes. On obtient ainsi l'HCG protégée C127-145), ltHCG protégée (119-145), l'HCG protégée (105-145), ltHCG protégée (100-145] et la (Tyr 100]-HCG portégés (100-145). Ces groupes protecteurs sont de préférence séparés par décomposition acide comme par un retrait en une étape avec de acide fiuorhydrique anhydre pour obtenir le composé de formule [I]. Lorsqu'on protège le groupe mercapto de la cystéine en position 110 et/ou- 100 par un groupe acétamide-méthyle, on peut le retirer par l'acétate mercurique à pH 4 après retrait des autres groupes protecteurs avec fluorhydrique anhydre. On peut purifier le composé (I) ci-dessus par des procédés connus de purification des peptides. On peut par exemple le purifier par chromatographie sur colonne en utilisant le Sephadex LH-ZO marque déposée), le Sephadex G50 Cmarque déposée), le Dowex 1 [marque déposée) et la carboxyméthylcellulose. On peut obtenir le peptide (I) sous la forme de la base ou de son sel. On peut généralement le conserver par une forme de sel avec un acide organique comme L'acide acétique. On peut doser l'HCG par une réaction immune utilisant un anticorps obtenu à partir du peptide (I) comme antigène ou le peptide (I) lui-meme comme antigène en appliquant une technique d'immuno-dosage enzymatique, de radio-immunodosage, une réaction d'inhibition d'hémagglutination, une réaction d'hémagglutination ou un test de fixation du latex. On trouvera des exemples ci-dessous. [Préparation d'antisérum). Exemple 1 On dissout 500 g de chmoune des hormones susivantes : HCG [118-145]. HCG (110-1450, (Cys[Aom)100]-HCG [110-145], (Cys[Acm]110)-HCG (105-145 et (Cys[Acm)110-HCG (100-145) dans du sel physiologique et on mélange avec une quantité-égale d'adjuvant complet de Freund pour préparer l'émulsion. On injecte chaque émulsion à 5 cobayes mâles pesant Z80-350 g, la première fois dans le gras des membres et de la croupe, et la seconde fois par voie sous-cutanée dans le cou pour chaque administration, et on recueille du sang par ponction cardiaque le dixième jour. Les anticorps ainsi obtenus sont appelés Lot A-2, Lot B-3, Lot C-2, Lot 0-1 et Lot E-1. Exemple Z On ajoute du WSCI C200 mg) dans une solution de SAB Csérum-albumine de boeuf) [30 mg) et d'HCG (127-145] (60 mg) dissoute dans un tampon phosphaté 0,1 M (pH 8,0, 1 ml) et on agite à la température ambiante pendant 30 minutes. On fait passer le mélange réactionnel à travers une colonne de Sephadex 6-50 (1,5 x 50 cm) avec de l'eau distillée pour la Filtration sur gel. On recueille la Fraction contenant le SAB-HCG (127-1450 et on lyophilise pour obtenir le SAB-HCG (127-1450 (34 mg). On injecte le produit (1 mg) dissous dans du sel physiologique [2 ml] à des cobayes de la meme manière qu'il est dit dans l'exemple 1 et on recueille le sang. L'anticorps obtenu est appelé Lot F-I. Exemple 3 On dissout de la SAB t6O mg) et de l'acide 2,2'-dithiobenzothiezy -propionique [0,2 mg] dane un tempon phosphaté 0,1 M [pH 7,5, 2 ml) et on agite à 0 C pendant 10 minutes. On y ajoute une solution de succinimidester de l'aci de 2,2'-dithiobenzothiazyl-propionique [G mg] dans le OMF [0,3 ml) et on agite à 0 C pendant 1 h. On ajuste le mélange réactionnel à pH 5 en ajoutant HCl 1 H et on Fait passer à travers une colonne de Sephadex G-50 [1,5 x 50 cm] en utilisant un tampon phosphaté 0,1 M [pH 7,5] pour la Filtration sur gel. on recueille des fractions à 27-35 ml. On en prélève 3,2 ml (contenant 20 mg de SAB), on ajoute de l'HCG [100-145] (20 mg) et on agite à 0 C pendant 1 h. Après dialyse contre l'eau distillée pendant un jour, on lyophilise le dialysat pour obtenir la SAB-HCG (100-145) [36 mg]. On injecte le produit [1 mg) dissous dans le sel physiologique [2 ml) à des cobayes comme dans l'exemple 1 et on recueille le sang. L'anticorps ainsi obtenu est appelé Lot G-1. CDiagnostic de l'urine en cas de grossesse par le test de l'inhibition de l'hémagglutination). On effectue le diagnostic de l'urine en cas de grossesse par le test d'inhibition de l'hémagglutination selon le procédé décrit dans Acta ondocrinol., 35, 261 Cl960). On obtient des résultats positifs lorsqu'on diagnostique des spécimens d'urine en cas de grossesse Egrossesse de 10 semaines) en utilisant l'un quelconque des anticorps ci-dessus. L'inhibition de l'hémagglutination négative est confirmée par le diagnostic de spécimens d'urine normaux. Les abréviations dans l'invention ont les significations suivants: BOC: t-butoxycarbonyle AOC: t-amyloxycarbonyle benzyloxycarbonyle Z-Cl : o-chlorobenzylo > rycarbonyle Bzl: benzyle Tos: tosyle Bzl-Cl2 2,6-dichlorobenzyle OMe : méthyl-estor, OEt: éthyl-ester ON?: p-nitrophényl-ester, OBzl : benzyl-ester Cys : L-cystéine, OSU: N-hydroxysuccin imide ester, Ser: L-serine, Thr: L-thréonine, MBzl: p-methoxybenzylei Acm: acétamideméthyl e Leu: L-leucine, Pro: L-proline, Asp: Acide L-aspartique Arg: L-arginine, Gly: glycine, Ala: L-alanine, Gln : L-glutamine, Lys: L-lysine, His: L-histidine, Tyr: L-tyrosine, Ile: L-isoleucine, Phe : L-phénylalanine, TEA : triéthylamine TFA:Acide triflucracétique DURA: dicyclohexylamine, CHA: cyclohexylamine, DMF : diméthylformamide, THF : tétrahydrofuranne TBA : tribenzylamine NMM : N'-méthylmorpboline HOBT ; 1-hydroxybenzotriazole, WSCI : N-éthyl-N'-diméthylaminopropyl-carbodiimide, Les exemples suivants précisent l'invention. Dans les exemples, on utilise le support et le solvant de développement suivants pour la chromatographie en couche mince (CCM). Support: gel de silice w. Solvant de développement: 1. Chloroforme- méthanol - scide acétique [95:5:3) 2. - - " - " (85 : 15 : 5) 3. chloroforme-méthanol-acide acétique t85:10:53 4. " " " [80:25:2] 5. " " " [24:6:1] 6. chloroforme-éthanol-acétate d'éthyle [5:2:5] 7. acétate d'éthyle 8. acétate d'éthyle-méthanol (10:1) 9. acétate d'éthyle-benzène (1:1). 10. butanol-acide acétique-eau [3:1:1) Support: cellulose Merck Solvant de développement: 11. butanol - pyridine - acide acétique - eau 15:10:3:12[ Exemple 1. HCG 1127 - 145): 1) P(143 - 144): BOC-Leu-Pro-OBzl [1], On ajoute du THF t300 ml] à BOC-Leu-OH.H2O (149,59 g, 0,6 M]. On y ajoute du THF (150 ml] et du OMF (100 ml3 pour préparer une solution. On ajoute encore H-Pro-OBzl [152,28 g, 0,63 M], on ajoute goutte à goutte du WSCI [120,8 ml, 0,66 M) à -10 C, et on ajoute encore du DMF [100 mi), puis on agits è la température ambiante pendant la nuit. Après avoir enlevé le solvant par distillation sous vide, on ajoute de l'acétate d'éthyle [600 ml] au résidu, et on lave trois fois avec du bicarbpnate de sodium aqueux à 5X, deux fois avec HCl 1 N et deux fois avec de l'eau. On sèche la couche d'acétate d'éthyle avec du sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide. On dissout la matière huileuse dans le benzène (1 litre) et on concentre sous vide pour obtenir une substance huileuse (1). CCM: RF = 0,89 2) P[142-144] : BOC-11a-Leu-Pro-OBzl [2] : On ajoute du TFA t300 mi) à la substance (1) [192 mM) dissoute dans le chlorure de méthylène (100 mi), et on agite à la température ambiante pendant 30 minutes. On enlève le TFA par distillation sous vide. On ajoute de l'hexane, et on l'enlève par distillation sous vide. On neutralise le résidu huileux dissous dans le THF (200 ml) par NMM (56,1 ml) jusqu'à pH 7 à D .On ajoute HOC-11e-OH.H2O (38,33 g, 159,5 mM) et HOBT [21,55 g, 159,5 mM). On dissout le mélange dans le OMF (100 mi) et on y ajoute goutte à goutte du WSCI 34,1 mi) tout en refroidissant avec de la glace, puis on agite à la température ambiante pendant la nuit. On enlève le solvant par distillation sous vide et on ajoute de l'acétate d'éthyle (500 mi) au résidu, puis on lave 3 fois avec du bicarbonate de sodium à 5, une fois avec une solution saturée de chlorure de sodium, 2 fois avec HCl 9 N, 2 fois avec une solution saturée de chlorure de sodium et 1 fois avec de l'eau, dans cet ordre. On sèche avec du sulfate de sodium anhydre la solution lavée et on concentre sous vide. On ajoute de l'hexane au résidu et on sépare le précipité par décantation. On procède à la recristallisation à partir de l'acétate d'éthyle-hexane. Lors de la filtrztion, une Faible part est dissoute et le reste est dissous dans le benzène, et lyophilisé pour donner la substance [2] [rendement ; 90,9%]. Pp : 60-64 C. [&alpha;]24D : -66,34 (c = 1, DMF) CCM : Rf1 = 0,63. 3) P[142-144] : BOC-Ile-Leu-Pro-OH [3] : (76,98 g, 145 mM) On dissout le substance [2]/dans le n-butanol (20 ml) et l'éthanol (300 ml). On y ajoute du Pd/C à 5% [15 93 et on procède à une hydrogénation catalytique pendant 3 h. Après avoir enlevé le catalyseur, on concentre la liqueur-mère sous vide. Un ajoute au résidu du diéthyléther [300 ml) et on extrait avec 500 ml et ZOO ml de bicarbonate de sodium aqueux à 5%, respectivement.On ajuste l'extrait à pH 4 en ajoutant de l'HCl 1 N en refroidissant avec de la glace pour précipiter en continu le produit, que l'on extrait avec de l'acétate d'éthyle et qu'on lave 2 Fois avec de liteau. Après séchage avec du sulfate de sodium anhydre, on concentre la solution sous vide. On solidifie le résidu en ajoutant de l'éther-haxane. La recristallisation avec de l'acétate d'éthyle-éther-hexane donne la zubstance [3] [60,33 g, rendement, 94,2%]. P@ : 114-119 C. [&alpha;]24D : -61,98 [c = 1, OMF) CCM : Rf1 = 0,53, Rf6 = 0,47. Anélyac élémentaire [C22H39O6N3] : C% H% M% trouvé: 59,82 9,42 9,56 calculé: 59,84 8,O 9,52. 4) P[142-145] : BOC-Ils-Lou-Pro-Gln-DBzl, On ajouto du TFA (150 ml) dans BOC-Gon-OBzl (38,41 g, 108 mM) dissous dans le chlorure de méthylène (100 ml) et on agite à la température ambiante pendant 30 minutes. On enlève le TFA par distillation sous vide et on dissout le résidu dans le THF (100 ml) que l'on ajuste à pH 7 en sajou tant du FNMM (40 ml) en refroidissant avec un mélange réfrigé- rant.On y ajoute une solution 100 mi) de substance t33 [47,69 g, 108 mM) dans le THF et-une solution dans le DMF de HOBT 14,50 g, 108 mM). On verse goutte à goutte du WSCI (19,76 ml 108 mM) en refroidissant avec un mélange réfrigérant pendant 10 minutes et on agite pendant la nuit. On ajoute au mélange réactionnel de l'acétate d'éthyle (500 ml) et on lave avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5X. On extrait le couche aqueuse aveo de l'acétate d'éthyle t300 ml). On combine la couche acétate d'éthyle et on lave avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5%, du chlorure de sodium saturé, HCl 1 N Cdeux Fois), du chlorure de sodium saturé (deux fois] et de l'eau, dans cet ordre. On sèche la solution avec du sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide. On solidifie le résidu en ajoutant de l'étherhexane. On effectue la recristallisation à partir de l'acéta- te d'éthyle [400 ml] pour obtenir le substence [4] [56,98 g, rendement 80,0%]. Pf : 141-143 C. Analyse élémentaire [C34H53O8N5) : GX H,' Trouvé: 61,76 8,41 10,84 Calculé: 61,89 8,10 10,61 5) P [140-141] : BOC-Thr[Bzl]-Pro-OBzl [5] : On dissout BOC-Thr-[Bzl]-OH (32,88 g, 0,15 M) dans le THF (100 ml). On y ajoute de l'HOBT (20,94 g, 0,155 M) et de l'H-Pro-OBzl.HCl (37,47 g, 0,155 M], puis on ajoute du OMF [200 ml] pour préparer une solution. On ajoute goutte à goutte du WSCI (28,37 ml, 0,155m) pendant 10 minutes tout en refroidissant avec un mélange réfrigérant, puis on agite à la température ambiante pendant la nuit. On enlève le solvant par distillation sous vide.On ajoute au résidu de l'acétate d'éthyle t500 mi), et on lave avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5X (deux fois], une solution saturée de chlorure de sodium, HCl 1 N (deux fois), du chlorure de sodium saturé (deux foid et de l'eau, dans cet ordre. Après séchage avec du mulfate de sodium anhydre, distillation et concentration sous vide, on obtient une substance huileuse t53 (57,41 g, rendement : 77,1%). COM : Rf6 = 0,65, Hf1 = 0,03. 6) P(140-141) : BOC-Thr(Bzl)-Pro-OH [6] : On dissout la substance (5] (52,78 g, 106,29 mM) dans le méthanol [300 ml]. On ajoute goutte à goutte NaOH 1 N [150 ml, excès 1,4 molaire] pendant 20 minutes au bain de glace et on gite à la température ambiante. un ajoute HCl 1 N [43,71 ml, excès 0,4 molaire) en refroidissant avec de la glace pour ajuster à pH 7 et on enlève le méthanol par. distillation sous vide. On lave la couche aqueuse avec de l'éther [150 mi) et on ajuste le pH de la couche aqueuse à 3 en ajoutant HCl 1 N [110 mi). On extrait 2 fois la solution avec de l'acétate d'éthyle [300 ml et 150 ml], et on lave deux fois avec du chlorure de sodium aqueux et une nouvelle fois à Peau. un seche l'extrait en ajoutant du sulfate de sodium anhydre, puis on concentre sous vide. On ajoute au résidu de l'éther et de l'hexane pour obtenir le précipité. On répète la même opération et on dissout le précipité dans l'acétate d'éthyle, puis on sèche sous vide pour obtenir la aubstanoe solide mousseuse [6] [32,27 g, rendement : 77,75%]. Pf : 60-55 C. [&alpha;]24D : - 36,84 (c = 1, DMF) CCM: Rf6 = 0,34. Analyse élémentaire [C21H30O5N2.H2O] : C% H% N% Trouvé: 61,02 7,6d 6,67 Calculé: 61,75 7,90 6,86 7]P[140-145] : BOC-Thr[Bzl]-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OBzl [7] : On verse la substance (b) [54,77 g, 83 mM) dans le chlorure de méthylène (80 mi). On ajoute du TFA (240 mi) en reFroidissant avec de la glace et on agite à la température ambiante pendant 25 minutes. On enlève le TFA pardistillation à 0 C sous vide et on ajoute del'éther au résidu. On sépare le précipité par filtration et on concentre sous vide la solution filtrée. On ajoute de l'éther au concentré pour précipiter la matière. On combine le précipité et on le sèche dans un dessicateur sur une base pendant la nuit. On dissout le précipité dans le OMF (200 mi) que l'on ajuste à pH 7 en ajoutant du NMM [9,5 mi) en reFroidissant avec un mélange réfrigérant. On y ajoute du HOBT (11,21 9, 63 mM] et du BOC-Thr[Bzl]-Pro-OH [32,27 g, 83 mM] et du DMF (40 ml) pour préparer une solution. On verse goutte à goutte du WSCI [15,19 ml, 83 mM) pendant 10 minutes tout en refroidissant avec un mélange réfrigérant. Au bout de 2 h d réaction, on agite le mélange réactionnel à la température ambiante pendant la nuit. On enlève le OMF par distillation sous vide. On ajoute du bicarbonate de sodium aqueux à 5% (300 ml) au résidu que l'on extrait Z fois avec de l'acétate d'éthyle t800 ml et 300 ml]. On lave Z fois la couche d'acétate d'éthyle avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5%, une solution saturée de chlorure de sodium, a fois avec MCl 1 N, 2 fois avec du chlorure de sodium sature et de l'eau, dans cet ordre. On sèche la couche acétate d'éthyle avec du sulfate de sodium anhydre, puis on concentre sous vide. On sépare la matière précipitée en ajoutant de l'éther. On effectue la recristallisation avec de l'acétate d'éthyle et on y ajoute del'éther pour obtenir la substance [7] t63,98 g, rendement 81,3%]. Pf ; 101-103 C [&alpha;]20D : -61,78 [c = 1, OMF] Analyse élémentaire (C50H73O11N7. C% H% Trouvé: 62,21 7,89 10,03 Calculé : 82,18 7,82 10,15 Analyse des acides aminés [1,330 mg/HCl U,3 ml, acide acétique 0,3 ml, anisol 0,1 ml, 1050C, 24 h): Thr 0,84 [1), Pro 2, Ile 0,97 [1], Leu 1,00 [1], Gln 0,98 [1], e) P[39-145] : BOC-Asp(Bzl)-Thr(Bzl)-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln OBzl [8] ; On ajoute l substance (7) (63,98 g, 87,48 mM) dissoute dans le chlorure de méthylène (150 ml) à du TFA t300 ml) en refroidissant avec de la glace, et on agite à la température ambiante pendant 30 minutes. On enlève le TFA par distillation sous vide à O0C et on ajoute de l'éther au résidu. On filtre le précipité, et on le combine avec les seconds cristaux obtenus à partir de la liqueur-mère, et on sèche sur une base dans un dessicateur pendant la nuit Crendement: 67,1 g).On dissout le précipité dans le DMF t350 mi), que l'on ajuste à pH 7 en ajoutant du NMM [7,42 mi) en refroidissant avec un mélange réfrigérant. On y ajoute du BOC-Aap [BOzl]-Oh (29,77 g, 87,72 mM) et du HOBT 11,85 g, 87,72 mM). On ajoute goutte à goutte du WSCI (16,05 ml, 87,72 mM) en refroidissant avec un mélange réFrigérant. Au bout de Z h, on maintient la température à la température ambiante puis on agite pendant la nuit. On enlève le solvant par distillation et on ajoute de l'eau au résidu, puis on sépare le précipité formé par décantation en refroidissant avec de la glace.On lave le précipité dissous dans l'acétate d'éthyle [1,5 1) avec du bicarbonate de sodium à 5X [2 fois), une solution saturée de chlorure de sodium [1 fois], de l'HCl 1 N (1 fois0, ane solsution saturée de chlorure de sodium [2 fois] et de l'esu [1 fois], dans ost ordre. Après séchage avec du sulfate de sodiun anhydre, on concentre le mélange sous vide. On laisse reposer le concentré et on filtre le précipité formé. On effectue deux recristal lisations à partir de L'éther éthylique pour obtenir la subatence [8] [rendement : 94,8%]. Pf : 99-103 C. [&alpha;]24D : -82,44 (c = 1, DMF) CCM : Rf3 = 0,62, Rf2 = 0,79. Anslyse élémentaire [C6H84O14N3] : C% H% N% Trouvé: 63,38 7,56 9,80 Calculé: 63,52 7,34 9,7z 9) P(138-145] : BOC-Ser[Bzl]-Asp[OBzl]-Thr(Bzl)-Pro-Ile-Leu Pro-Gln-OBzl C9): On ajoute du chlorure de méthylène (100 mi) à la substance (a) (73,88 g, 63,97 mM). On y ajoute du TFA t300 ml] tout en refroidissant avec de la glace et on agite à la température ambiante pendant 30 minutes. On enlève le TFA par distillation sous vide à 0 C. On ajoute de éther au résidu, et on sèche le précipité ainsi formé sur hydroxyde de potassium dans un dessicateur pendant la nuit.On ajuste le précipité dissous dans le DMF [200 ml) à pH 7 en ajoutant du NMM (5 mi) tout en refroidissant avec un mélange réfrigérant. On y ajoute BOC-Ser[Bzl]-OH [24,56 g, 83,16 mM), HOBT t11,23 9, 83,16 mM) et du OMF 50 mi). On ajoute encore goutte à goutte du WSCI [15,22 ml] en refroidissant avec un mélange réfrigérant, puis on ajoute encore du NMM (2,03 ml]pour ajuster à pH 6. Au bout de 2 h on amène la température à la température ambiante, et on agite pendant la nuit. On enlève le DMF par distillation sous vide, et on verse le résidu dans l'eau froide [2 litres.On recueille le précipité ainsi formé par flutration et on l'extrait avec CHCl3 [5 litres] et du bicarbonate de sodium aqueux à 5% 5% (2 litres). Après avoir lavé la couche de chloroforme avec du bicarbonate de sodium à 5%, du chlorure de sodium saturé, HCl 1 N, du chlorure de sodium saturé et de lleau, dans cet ordre, on sèche la couche organique en ajoutant du sulfate de sodium anhydre. On sèche la couche de solvant sous vide et on ajoute au résidu de l'acétate d'éthyle-éther-hexane. On dissout le précipité formé dans le chloroforme [300 mi), on y ajoute de l'acétate d'éthyle [1 litre), puis on enlève le chloroforme par distillation. On mélange la suspension ainsi obtenue avec de l'éther-hexene pour obtenir le précipité. On répète la recristallisation de la même fagon pour obtenir la substance 93 Crendement: 95,1%, 80,95 g). Pf : 120-122 C. CCM : Af2 = 0,70. Anaolyse élémentaire [C71H95O16N9] : C% H% N% Trouvé : 63,87 7,38 8,62 Calculé: 64,09 7,20 9,47 10] P[136-137] : BOC-Gly-Pro-OBzl[10] : On ajoute du THF [100 mi), du OMF [100 mi) et de l'HOBT [20,94 tg, 0,155 M] à du BOC-Gly-OH [26,28 g, 0,15 M]. On y ajoute une solution dans le DMF C20 ml) de H-Pro- OBzl.HCl C37,47 g, 0,155 M], on refroidit à -10 C et on ajoute du WSCI [28,37 ml, 0,155 M) pendant 10 minutes. Après avoir ajouté du OMF t30 mi), on agite le mélange à la température ambiante pendant la nuit. On enlève le solvant par distillation sous vide, on ajoute de l'acétate d'éthyle (500 mi) et on lave P fois avec du bicarbonate de sodium à 5%, une solution saturée de chlorure de sodium, 2 fois avec HCl 1 N, 2 fois avec une solution saturée de chlorure de sodium et de l'eau, dans cet ordre. On sèche la couche d'acétate d'éthyle avec du sulfate de sodium anhydre, et on concentre sous vide pour obtenir la matière huileuse [67 g] que l'on dissout dans le benzène (100 ml).On introduit la solution dans une colonne [7 x 33 cm) de gel de silice t500 g) remplie de benzène et on fait passer à travers le benzène [300 ml]. On affeotue l'élution avec du benzène-acétate d'éthyle t10 : i -+5 : 1 -+2 : 1 # 1 : 1] jusqu'à l'acétate d'éthyle. On recueille les fractions présentant Rf1 = 0,86 par CCM et on sèche sous vide pour obtenir la matière huileu se (9) [46,16 g). On conoentre sous vide les fractions res tantes et on les introduit dans une colonne [4,5 x 16 cm) de gel de silice [100 g) et on chromatographie de la même manière que ci-dessus pour obtenir la matière huileuse [10] [8,78 g]. Quantité totale : 54,84 g. CCM : Hf1 = 0,86. 11) P(134-135] : BOC-Lau-Pro-OH (11) : On dissout du BOC-Leu-Pro-OBzl [82,76 g, 0,252 mM) dans le méthanol [600 ml]. On ajoute goutte à goutte MaOH 1 i [327,6 ml, excès 1,3 molaire) en refroidissant avec de la glace, et on agite pendant 1 h à la température ambiante. On ajoute au mélange réactionnel HCl 1 N [8 ml] en refroidissant avec de la glace, puis on enlève le méthanol par distillation sous vide. Après avoir lavé la couche aqueuse avec du benzène et de l'acétate d'éthyle, on ajoute de l'HCl 1 N (260 mi) en reFroidissant avec de la glace pour Former une matière huileuse que lton extrait avec de l'acétate d'éthyle. On lave l'extrait avec une solution saturée de chlorure de sodium et de l'eau et on sèche avec du sulfate de sodium anhydre. On sèche la solution sous vide et on dissout le résidu dans le benzène et on lyophilise pour obtenir la substance [11) (58,57 g, rendement : 70,8%]. Pf : 63-67 C [&alpha;]24D : -66,42 (c = 1, DMF) Analyse élémentaire (C18H28O6N2) : C% H% N Trouvé: 58,Z9 8,87 8,59 Calculé: 58,52 8,59 8,53 12] P[234-137] : BOC-Lau-Pro-Bly-Pro-OBzl (12] : On ajoute du chlorure de méthylène (100 ml) et du TFA (200 mi) à la substance (10) t54,36 g, 0,15 ti) et on agite à la température ambiante pendant as minutes. Bn enlève le TFA par distillation sous vide et on sèche le résidu sur hydroxyde de potassium dans un dessicateur.Après avoir dissouS dans le TKF [100 ml] et avoir ajouté de la triéthylamine t48 ml pour ajuster à pH 7 en refroidissant à -10 C, on y ajoute une solution dans le THf [100 ml] de la qubstance (11) [48,26 g, 0,15 M) et du HOBT [20,27 g, 0,15 M]. On ajoute encore du THF [50 ml) et l'on verse goutte à goutte du WSCI (27,45 ml] à -10 C pendant 10 minutes. Au bout de 2 h, on amène la température à la température ambiante et on agite pendant la nuit. On enlève le solvant par distillation et on dissout le résidu dans l'acétare d'éthyle [700 ml),puis on lave avec une solution de bicarbonate de sodium à 5X [500 mi). On extrait la couche aqueuse à nouveau avec de l'acte tate d'éthyle (300 mi), on combine avec la couche acétate d'éthyle, et on lave avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5%, une solution saturée de chlorure de sodium, deux fois avec HCl 1 t4, Z fois avec une solution saturée de chlorure de sodium et de l'eau, dans cet ordre.Après séchage avec du sul Fate de sodium anhydre, on concentre sous vide. On ajoute du benzène au résidu et on concentre sous vide. On introduit le concentré dans une colonne (6,5 x 20 cm) de gel de silice t300 93 remplie de benzène et on élue avec du benzène # benzène-acétate d'éthyle (3 : 1 #2 : acétate d'éthyle. On recueille les fractions présentant un Rf1 = 0,57 et on sèche sous vide pour obtenir la substance [12] qui mousse en se solidifiant (45,73 g). On recueille les fractions restantes, on concentre sous vide et on chromatographie de la même menière que ci-dessus poor obtenir le substance [12] [18 g]. Ensuite on concentre les fractions restantes sous vide, on les introduit dans une colonne [4,5 x 15 cm) de gel de silice Clou g) et on élue de la même manière que ci-dessus pour obtenir la substance [12] C7,11 g). Quantité totale: 70,84 g Crendement: 82,64%]. Pf : 65-89 C. [&alpha;]24D : -93,64 (c = 1, DMF) CCM : Rf1 = 0,57, Rf6 = 0,54 Analyse élémentaire (C30H44)7N4] : C% H% N% Trouvé : 62,98 7,94 10,07 Calculé: 32,92 7,74 9,78 13] P[133-137] : BOC-ARg[Tos]-Leu-)Pro-Gly-Pro-OBzl [13] ; On ajoute du TFA [220 ml] à le substence [12] [88,72 g, 120 mM] dissoute dans le chlorure dem6thylène [100 ml) et on agite à la température ambiante pendant 20 minutes. On enlève le TFA par distillation à 0 C sous vide, on y ajoute de l'hexane et on sèche sous vide.On sèche le résidu sur hydroxyde de potassium dans un dessicateur, on dissout dans le DMF [200 ml] et on ajuste à pH 6 en ajoutant NMM 59,4 ml) à -10 C. On ajoute une solution dans le DMF (50 ml) de BOC-Arg(Tos-OH (53 g, 123 mM) et de HOBT (16,88 g, 125 mM) pour dissoudre et on verse goutte à goutte du WSCI [22,86 ml, 125 mM) à 10 C pendant 10 minutes. Au bout de 2 h, on agite le mélange réactionnel à la température ambiante pendant la nuit. On ajoute encore du WSCI (3,66 ml, 0,2 mM) à -10 C au mélange réactionnel et on agite à la température ambiante pendant 4 h. On enlève le DMF par distillation sous vide et on ajoute au résidu une. solution de bicarbonate de sodium à 5% (600 ml].On extrait 2 Fois le précipité avec de l'acétate d'éthyle t500 ml]. On lave l'extreit avec une solution à 5X de bicarbonate de sodium, du chlorure de sodium saturé, deux fois avec HCl 1 N, 3 fois avec du chlorure de sodium saturé et de l'eau, dans cet ordre. On sèche la solution avec du sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide. On ajoute au résidu de l'éther-hexane et on filtre la matière ainsi précipitée. On effectue la recristallisation à partir de l'acétate d'éthyle-étherhexane pour obtenir la substance (13) [100,77 g, rendement: 95, 1%]. Pf : 107-112 C [déc.]. [&alpha;]24D = 64,84 [c = 1, DMF] CCM : Rf1 = 0,19. Analyse des acides aminés [0,709 mg/HCl 0,3 ml, acide acétique 0,3 ml, anisol 0,1 ml, 1050C, 24 h); Pro [2], Gly 0,95 (10, Leu 1,01 (1) et Arg (0,90 (1). 14] P[132-137] : BOC-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Pro-Gly-Pro-OBzl (14) : On ajoute du chlorure de méthylène [100 ml] et du TFA (400 ml] à la substance [13] 100,77 g, 114 mM) et on agite à la température ambiante pendant 35 minutes. On enlève le TFA par distillation sous vide à 0 C, on ajoute de l'éther au résidu et on Filtre le précipité. On concentre la liqueur-mère sous vide pour obtenir le second précipité. On combine le précipité et on le sèche sur hydroxyde de potassium pendant la nuit, et on dissout dans le DMF (aOO mi). On ajoute du MMM [10 mi) à -10 C pour ajuster à pH 8, puis on verse goutte à goutte à pH 5 du HOBT [16,94 g, 125,4 mM) et du BOC-Ser[Bzl]-Oh C37,03 g, 125,4 mM). Au bout de 2 h on agite le mélange réactionnel à la température ambiante pendant la nuit.On enlève le DMF par distillation sous vide et on verse le résidu dans un mélange d'eau et de glace [1,5 1) pour obtenir le précipité, que lton extrait a fois avec de l'acétate d'éthyle t1 litre et 500 mi). On lave la couche d'acétate d'éthyle avec HCl 1 N, une solution saturée de chlorure de sodium, 2 fois avec NaOH 1 N, une solution saturée de chlorure de sodium et de l'eau, dans cet ordre. Après séchage avec sulfate de sodium anhydre on concentre sous vide. On ajoute de éther au résidu et on recueille le précipité par filtration. On effectue deux fois la recristallisation à partir de l'acétate d'éthyle-éther pour obtenir la substance [14] [107,34 g, rendement ; 87,0%]. Pf : 101-105 C. CCM : Rf@ = 0,71, RF3 = 0,49. Analyse des acides aminés (1,818 mg/HCl 0,3 ml, acide acétique 0,3 ml, anisol 0,1 ml, 1050C, 24 h); Ser 0,72 (1), Arg 0,95 (1), Leu 1,03 (1), Pro(2). 15] P(132-137] : BOC-Ser[Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Pro-Gly-Pro-OH [15] : On dissout la substance (14) [105,44 g, 97,43 mM) dans le méthanol [350 ml). On verse goutte à goutte NaUH 1 N (125,36 ml, excès 1,3 molaire) en refroidissant avec de la glace et on agite à la température ambiante pendant 2 h. On ajoute au mélange réactionnel NaOH 1 W [20 ml) et on agite à la température ambiante pendant 1 h %. On ajoute au mélange réactionnel de l[HCl 1 N [49 ml] pour ajuster à pH 6 et on enlève le méthanol par distillation sous vide. On ajoute de l'eau à la couche aqueuse et on lave à éther (100 ml). On verse goutte à goutte de l'HCl 1 M 50 mi) en refroidissant avec de la glace dans la couche aqueuse. Comme il devient impossible d'agiter étant donné la Formation d'un précipité de matière visqueuse, on ajoute de l'acétate d'éthyle t300 mi) et on verse goutte à goutte de l'HCl 1 M (80 ml] pour ajuster le pH de la couche aqueuse à 2. On extrait la couche aqueuse avec de l'acétate d'éthyle (1 l et 500 ml), et on lave Z fois avec une solution saturée de chlorure-de sodium et de l'eau.Après séchage avec du sulfate de sodium anhydre, on concentre la couche acétate d'éthyle sous vide pour obtenir une matière huileuse que l'on solidifie en ajoutant de l'éther. On recristallise à partir de l'acétate d'éthyle-éther pour obtenir la substance (15) C95,1 g rendement : 100%]. CCM : Rf2 = 0,10, Rf4 = 0,32. 16] R[132-145]: BDC-Ser[Bzl]-Arg[Tos]-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser (Bzl)-Asp[OBzl]-Thr[Bzl]-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OHBzl [16] : On dissout le substanne [9] [49,68 g, 37,32 mM] dans le chlorure de méthylène [130 ml]. On y ajoute du TFA (220 mi) et on agite à la température ambiante pendant 45 minutes. On concentre le mélange réactionnel sous vide et on ajoute de l'éther au résidu. On recueille le précipité et on sèche sur hydroxyde de potassium pendant la nuit, et on dissout dans le DMF [220 ml]. Après avoir ajusté à pH 7 en ajoutant du NMM [4,10 mi) à -100C, on ajoute la substance (15) [43,72 g, 44,79 mM] et du HOBT [8,58 g, 48,52 mM].Après dissolution, on ajoute du WSCI [8,88 ml, 48,52 mM) goutte à goutte à -10 C et on agite à la température ambiante pendant Z jours. On enlève le OMF par distillation sous vide, et on verse le résidu dans de l'eau glacée [2 i). On filtre le précipité, on le met en suspension dans l'eau, on le lave et on filtre. On répète cette opération 5 Fois à pH , et on sèche dans un dessicateur sous vide pour obtenir le solide t109 9], que l'on dissout dans le méthanol, que l'on concentre sous vide et que l'on distille de fagon azéotropique en ajoutent du benzène pour enlever le reste d'eau. On répète cette opération 3 fois.On effectue la recristallisation à partir de l'acétate d'éthyle-éther pour obtenir la matière t90,09 g] que l'on dissout dans le chloroforme [270 mi) et que l'on introduit dans une colonne de gel de silice [600 g) remplie de chloroforme, puis on élue avec du chloroforme-méthanol (20:1). On recueille les fractions présentant une tache dans la CCM et on les sèche sous vide pour obtenir la substance C153. On concentre sous vide les fractions restantes et on les introduit dans une colonne de gel de silice [220 g) et on élue de la même manière que ci-dessus. On recueille les fractions présentant une tache à la 0CM et cn sèche sous vide. On répète 4 fois l'opération de chromatographie ci-dessus pour obtenir la substance [16] [quantité totele : 64,26, g, rendement : 78,9%]. CCM : Rf3 = 0,40, Rf2 = 0,60 Pf : 120-125 C Analyse élémentaire: C% H% N% Trouvé : 60,65 7,20 11,50 Celculé : 60,63 7,09 11,38 [&alpha;]24D = -63,3 (c = 1, DMF) 17] P[130-131] : COC-Ser[Bzl]-Pro-OBzl [17] : On ajoute du THF [100 ml], du H-Pro-OBzl.HCl [31,5 g, 0,3 M] et du HOBT [17,5 g, 0,13 M] dns du BOC-Ser[Bzl]-OH (35,4 g, 0,12 M], et ony ajoute encore du OMF (50 ml] pour préparer la solution.On verse goutte à goutte du WSCI [24,8 ml] et on agite à 0 C pendant 1 h et à la température ambiante pendant la nuit On enlève le solvant par distillation sous vide et on ajoute du benzène au résidu, puis on lave trois fois avec une solution de bicarbonate de sodium à 5%, trois fois avec HCl 1 N et trois fois avec de l'eau. Après séchage avec du sulfate de sodium anhydre, on sèche la solution sous vide pour obtenir la qubstance (17) sous la forme d'une matière huileuse [58 g, rendement 100%]. CCM: RF1 = 0,68 18] P[127-129] : BOC-Ser[Dzl]-Leu-Pro-OBzl [18] : On ajoute du chlorure de méthylène [30 ml] à du BOC-Leu-Pro-OBzl (71,27 g, 156 mM). On ajoute du TFA [350 ml] à 0 C et on agite à la température ambiante pendant 30 minutes. On enlève le TFA par distillation sous vide pour obtenir une matière huileuse que l'on sèche sur hydroxyde de potassium pendant 3 h. On dissout la matière huileuse dans le DMF [170 ml), que l'on neutralise à 0 C en ajoutant du NMM [60 ml]. On y ajoute du BOC-Ser[Bzl]-OH [46,0 g, 156 mM] et du HOBT [21,1 g, 156 mM) pour préparer une solution.On verse goutte à goutte du WSCI Cas, ml, 156 mM) à 0 C, et on agite à 0 C pendant 1 h et à la température ambiante pendant la nuit. On enlève le OMF par distillation et on ajoute au résidu de l'acétate d'éthyle [500 mi), et on lave avec du bicarbonate de sodium à 5% (3 fois), HCl 1 N [3 fois] et de l'eau [3 Foie), dans cet ordre. Après avoir séché la couche d'acétate d'éthyle avec du sulfate de sodium anhydre, on concentre la couche organique sous vide. On dissout la matière huileuse dans une faible quantité de benzène que l'on introduit dans une colonne de gel de silice [500 g) remplie de benzène, puis on élue avec du benzène (1 litre), du benzène-acétate d'éthyle [10:1] [2 litres] ; du benzèneacétate d'éthyle [5:1] [1 litre) et du benzène-acétate d'éthyle (1:1) [2 litres), dans cet ordre. On recueille les fractions correspondantes vérifiées par CCM et on concentre sous vide. On dissout le résidu dans le benzène et on lyophilise pour obtenir la substance [18] [81 g, rendement: 87,0%]. CCM: Rf1 = 0,81. Analyse élémentaire (C33H4507N3): C% H% N% Trouvé: 5X,34 7,81 6,80 Calculé: 66,53 7,81 7,05 19) P[127-129] : BOC-Ser[Bzl]-Leu-Pro-OH [19] : -On dissout la substance [18] [81 g, 135,5 mM) dans méthanol [300 ml]. On verse goutte-à goutte du NaOH 1 N [178,15 ml, excès 1,3 molaire) à OOC pendant 30 minutes et on agite à la température ambiante pendant 3 h. On neutralise le mélange réactionnel en ajoutant de l'HCl 1 N à 0 C et on enlève méthanol par distillation sous vide. On ajoute de l'eau (300 ml] à le couche aqueuse, on lave 2 Fois avec de l'éther, en ajoutant HCl 1 N [150 ml] à 0 C et on extrait avec de l'acétate d'éthyle [400 ml].On lave le couohe d'acétate d'éthyle avec de l'eau, on sèche avec du sulfate de magnésium anhydre et on concentre sous vide. On sèche sous vide la matière huileuse ainsi obtenue. On repréopipts le poudre avec de l'éther-hexane pour obtenir la substance [19] [65,0 g, rendement : 94,5%]. Pf : 56-63 C COM : Rf1 = 0,58 [&alpha;]22D : -47,1 (o = 1, DMF) Analyse élémenteire [C28H39O7N3]: C% H% N% Trouvé: 61,5 7,71 8,50 Calculé: 61,76 7,78 8,31 20] P[127-131] : BOC-Ser[Bzl]-Leu-Pro-Ser[Bzl]-Pro-OBzl [20] : On ajoute du chlorure de methylène [30 ml] à la substancs [17] [58 g, 0,12 M]. On y ajoute du TFA [350 ml) à 0 C et on agite à la température ambiante pendant 30 minutes. On retire le TFA par distillation sous vide, on dissout le résidu dans le DMF [150 ml]. On y sjoute du NMM (50 ml) pour neutraliser à 0 C.On y ajoute la substance (19) (61,6 g, 0,12 X) et du HOBT [16,2 g, 0,12 M) et ajoute youtte à goutte du WSCI (22 ml, 0,12 M) à 0 C, puis on agite à 0 C pendant 1 h et à la température ambiante pendant la nuit. On enlève le OMF par distillation sous vide et on ajoute au résidu de éther éthylique (400 ml). Après avoir lavé 3 fois avec une solution à 5 de bicarbonate de sodium, 3 Fois avec HCl 1 N et 3 bois avec de l'eau et séché avec du eulfate de magnésium anhydre, on concentre la solution sous vide. On dissout la matière huileuse ainsi obtenue dans une Faible quantité de benzène et on l'introduit dans une colonne de gel de silice (500 g) remplie de benzène. On procède à l'élution avec du benzène (500 mi), du benzèneaoétate d'éthyle [10:1] [2 1], du benzène-acétate d'éthyle (10:1) [2 1], du benzène-acétate d'éthyle [3:1] [2 litres], du benzène-acétate d'éthyle (1:1) C4 litres) et de l'acétate d'éthyle t3 litres), et on recueille les fractions correspondantes vérifiées par CCM, puis on sèche sous vide pour obtenir le substance [20] [84,07 g, rendement ; 80,8%]. Pf : 58-65 C CCM : Rf1 = 0,51 [&alpha;]D : -63,7 (c = 1, DMF] Analyse élémentaire [C48H63O10N5] : C% H% N% Trouvé: 60,31 7,aS 8,09 Calculé : 68,26 7,30 8,05 Analyse des acides aminés : Ser 1,42 [2], Pro [2], Leu 1,01 (1). 21) P[127-131] : BOC-Ser[Bzl]-Leu-Pro-Ser[Bzl]-Pro-OH [21) : On dissout la substance [20] C74,4 g, 85,4 mM) dans le méthanol C300 mi), on verse goutte à goutte du NaOH 1 N [110 ml, excès 1,3 molaire) à 0 C, et on agite à la température ambiante pendant 3 h. Après neutralisation à 0 C en ajoutant HCl 1 N, on enlève le méthanol par distillation sous vide. On lave 2 fois la couche aqueuse avec de l'éther, on ajoute de l'HCl 1 N C8 ml] à 0 C et on extrait avec de l'acétate d'éthyle. On lave deux fois la couche d'acétate d'éthyle avec de l'eau, on sèche avec du sulfate de magnésium anhydre et on concentre sous vide. On ajoute de l'hexane au résidu et on filtre le précipité ainsi formé. On dissout le précipité dans une faible quantité de chloroforme et on l'introduit dans une colonne de gel de silice remplie de chloroforme. On procède à l'élution avec du chloroforme, du chloroforme-acétate d'éthyle [1:1] et du chloroforme-éthanol-acétate d'éthyle [5:1:5]. On recueille les fractions correspondant à la substance vérifiées par CCM et on sèche sous vide pour obtenir la substance (21) C53,75 g, rendement: 81X3. CCM: Rf1 = 0,34 [&alpha;]D : -66,4 (c = 1, DMF] Analyse élémentaire [C41H57O10N10] : C% H% trouvé 63,11 7,65 8,85 calculé 63,14 7,37 8,98 Analyse des acides aminés [0,77 mg/GN-HCl 0,3 ml, 105 C 20 Reures] : Ser 1,84 [2], Pro 2,06 [2], Leu (1). 22) P[127-145] : BOC-Ser[Bzl]-leu-Pro-Ber[Bzl]-Pro-Ser[Bzl] Arg(Tos)-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Thr[Bzl] Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OBzl [22] : On ajoute du chlorure de méthylène à la substance [16] [63,66 g, 29,17 mM], On y ajoute du TFA [260 ml] à 0 C et on agite à la température ambiante pendant 40 minutes. On enlève le TFA par distillation sous vide et on ajoute de l'éther au résidu. On filtre le précipité ainsi formé et on le sèche sur hydroxyde de potassium pendant la nuit [87,6 g) et on dissout dans le DMF [200 mi) [pH 43. On y ajoute du NMM [4,21 mi) pour ajuster à pH 7 à -10UC. On verse goutte à goutte à -10 C du HOBT [4,73 g, 35 mM), substance [21] [27,30 g, 35 mM] et du DMF [100 ml] et du WSCI [6,41 ml,35 mM], puis on agite à -10 C pendent 2 h et à la température ambiante pendant la nuit. On enlève le solvant par distillation sous vide et on verse le résidu dans un mélange d'eau et de glace C1,5 litre). On met le précipité ainsi formé en suspension dans l'eau et on filtre. Cette opération de mise en suspension et de filtration est répétée cinq fois à pH S. On sèche le précipité pendant 2 jours sous vide, on le dissout dans le méthanol et on concentre sous vide. On ajoute du benzène dans le résidu et on concentre. On répète deux fois le traitement au benzène. On ajoute de l'éther au concentré et on filtre le précipité ainsi formé. On répète 8 fois les opérations allant du traitement au méthanol au traitement à l'éther ci-dessus pour obtenir la substance [22] [79,85 g, rendement : 96,2%]. Pf : 127-130 C. CCM : Rf2 = 0,61 [&alpha;]22D : -67,58 [c = 1, DMF] Analyse élémentaire [C148H207D36N23S] : C% H% N% Trouvé: 1,05 8,96 11,03 Calculé: 60,95 7,15 11,05 Analyse des acides aminés [1,893 mg/6 N-HCl 0,5 ml, 105 C, 21 heures] : Asp 0,89 [1], Thr 0,96 [1], Ser 3,74 [4], Gln 1,04 [1], Pro 6,00 [6], Ile 0,95 CI), Leu 3), 'Arg 0,94 Ci), Gly 0,S8 C1). 23] HCG [127-145] : On aoute de l'anisol t5 ml) à la substance [22] C1 g, 0,34 mM). On y ajoute de l'acide fluorhydrique anhydre (HF) C30 ml) à 0 C et on agite pendent 1 h. On retire rapidement l'HF sous vide. On ajoute au résidu de l'éther C100 ml] et de l'acide acétique (0,1 N C50 ml) et on agite. On introduit le couche aqueuse dans une colonne [3,3 x 18 cm) de Dowex-1 (Forme acétate) et on élue avec l'acide acétique 0,1 N. Oncombine l'éluat et la solution de lavage et on lyophilise pour obtenir le produit brut [SGO mg].On dissout ce produit brut dans l'urée aqueuse 8 M C30 ml), on ajuste à pH 9 en ajoutant de l'ammoniaque, on introduit dans une colonne [4,5 x 120 cm) de Sephadex LH-20 et on élue avec l'acide acétique 0,1 N. On divise ltéluat en fractions de 10 ml, on recueille les fractions n 58-64 et on lyophilise pour obtenir le produit C540 mg). On dissout le produit dans l'acide acétique 0,1 N [30 ml], on introduit dans une colonne C5X13 cm) de carboxyméthylcellulose, on lave avec un tampon-à l'acétate d'ammonium 0,01 M [pH 4,53 et on élue selon un gradient avec un tampon d'acétate d'ammonium de 0,01 M à 0,1 M CpH 4,53 (Fractions de 400 ml].On divise l'étluat en en fractions de s ml, on recueille les fractions n 79-86 et on lyophilise pour obtenir la matière [180 mg). On dissout celle-ci dans l'acide acétique 0,1 N, on l'introduit dans une colonne [3 x 17 cm) de Sephadex LH-20 et on élue avec l'acide acétique 0,1 N. On répartit l'éluat en fractions de 10,5 ml et on recueille les fractions n 25-30 et on lyophilise pour obtenir l'HCG [127-145] 135,4 mg). Pf : 215-225 C [&alpha;]28D : # 55 [ c = 0,1 , acide acétique 0,1 N] CCM : Rf11 = 0,71 Analyse des acides aminés: Asp 1,05 [1], Thr 0,97 [1] Ser 3,44 [4], Gln 1,10 [1], Pro 6,50 [G], Gly 1,04 [1], Ile 0,89 [1], Leu 3 [3], Arg 1,02 [1]. Exemple 2 HCg [118 - 145] : 1) P(125 - 126); BOC-Pro-Pro-OBzl [23] : On ajoute du THF (180 ml), du H-Pro-OBzl. HCl 43,5 g, o,ie M) et du HOBT (24,3 g, 0,18 M) 3 du BOC-Pro-OH (38,b g, 0,17 M), on ajoute du DMF Clou ml) et on verse goutte à goutte du WSCI [33,0 ml, 0,18 M) à 0 C./ Après avoir agité à 0 C pendant i h et à la température ambiante pendant la nuit, on enlève le solvant par distillation sous vide. On ajoute du benzène [500 ml] au résidu et on lave 3 Fois avec du bicarbonate de sodium à 5%, 3 fois avec HCl 1 N et 3 fois avec de l'eau. Après séchage avec du sulfate de sodium anhydre, on concentre la solution sous vide pour obtenir une matière huilleuse [23] [74 g, rendement : 100%]. Après qu'on l'ait gardée au réfrigérateur, la matière se cristallise partieliement et on la recristallise à partir du benzène-hexane. Cependant, il reste une matière presque huileuse, que l'on utilise pour la réaction suivante; Pf : 73-74 C. [&alpha;]D ; -85,7 [c - 1, DMF] Analyse élémentaire [C22H30O5N2] : C% H% N% Trouvé : 85,98 7,81 6,83 Claculé : 65,85 7,51 6,96 CCM : RF9 = 0,71 2] P[123-124] : BOC-Ala-Pro-OBzl [24] : On ajoute du THF [200 ml), du H-Pro-OBzl. HCl [48,3 g, 0,2 M] et du HOBT [27,0 g, 02 M] à du BC-Als-OH [37,8 g, 0,2 M], on ajoute du DMF [100 ml] et on verse goutte à goutte du WSCI [38,6 ml, 0,2 M] à 0 C. Après avoir git6 à OoC pendant 1 h et à la température ambiante pendant la nuit, on enlève le solvant par distillation sous vide.On dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle [500 ml], on le lave trois fois avec une solution de bicarbonate de sodium à 5, 3 fois avec de l'HCl 1 N et 3 fois avec de l'eau, on sèche avec du sulfate de magnésium anhydre et on concentre sous vide. On dissout le résidu dans une faible quantité de benzène et on l'introduit dans une colonne de el de silice [250 g) remplie de benzène. On procède à l'élution avec du benzène [1 l], du benzène-scétate d'éthyle [10:1] (1 litre) et du benzène-acétate d'éthyle [1:1] 1 litre), on recueille les Fractions correspondantes vérifiées par CCM et on concentre sous vide pour obtenir le substance huileuse [24] [75,55 g, rendement : 100%]. CCM : RF1 = 0,87 3] P[123-124] : BOC-Ala-Pro-OH [25] : On diseout la substance [24] dans l'éthanol [200 ml]. On verse goutte à goutte du NaOH 1 N [240 ml, excès 1,2 molaire) à O0C et on agite à la température ambiante. Au bout de 2 h, on ajoute du iQaOH 1 N [20 ml] et on agite encore pendant 30 minutes. On neutralise le mélange réactionnel avec HCl 1 N [60 ml] à ODC, on enlève l'éthanol par distillation sous vide. Après avoir lavé Z fois la couche aqueuse avec de l'éther 100 mi), de l'HCl 1 N CdOO ml] y est ajouté à OtC. On filtre le précipité ainsi formé, on le lave complètement et on sèche sous vide. On procède à la recristallisation à partir de l'acétate d'éthyle [45 ml)- hexane pour cristalliser la substance [25] [47,92 3, rendement: 83,8%]. Pf 159-160 C. [&alpha;]D : -72,9 [c = 1, DMF] CCM : AF1 = 0,18 Analyse élémentaire [C13H22O5N2,2/3 H2O] : C% H% N% Trosuvé : 52,74 8,13 9,58 Calculé : 52,34 7,81 9,38 4] P[123-126] : BOC-Ala-Pro-Pro-Pro-OBzl [26] : On ajoute du chlorure de méthlène [30 ml] à la substance [23] [74 g, 0,17 M]. On y ajoute du TFA [500 g] à 0 C et on agite à la température ambiante pendant 30 minutes. On enlève le TPA sous vide et on dissout le résidu dans le OMF [150 ml], et on neutralise en ajoutant du NMM (60 ml] à OOC. Après avoir ajouté la substance Ces3 [47,9 g, 0,16 M] et du HOBT [23 g, 0,17 M), on ajoute du WSCI [33 ml, 0,17 M) à 0 C et on agite pendant 1 h et à la température ambiante pendant la nuit. On enlève du OMF à raison d'environ 80 ml. On ajoute au résidu de l'acétate d'éthyle CSOO mi), puis on lave avec une solution de bicarbonate de sodium à 5%, de l'HCl 1 N et de l'eau, en répétant 3 Fois chaque opération de lavage, dans cet ordre. Après avoir séche la couche d'acétate d'éthyle avec du sulfate de magnésium anhydre, on concentre la solution sous vide.On ajoute de l'hexane au résidu, on filtre le précipité et on recristallise Z Fois à partir de l'acétate d'éthyle-hexane pour obtenir la substance [26] 80,08 g, rendement : 88,5%]./ Pf : 116-1170C CCM: Af2 = 0,89 Anaolyse élémentaire [C30H42O7N4] : C% H% N% Trouvé: 63,12 7,73 9,97 Calculé : 63,14 7,42 9,82 5] P[122-126] : BOC-Lys[Z-Cl]-Ala-Pro-Pro-Pro-OBzl [27] : On ajoute du chlorure de méthylène [40 ml] à la substance [26] [77,84 g, 136 mM], on ajoute du TFA [350 ml] à 0 C et on agite à la température ambiante pendant 30 minutes. On enlève le TFA sous vide et on dissout le résidu dans le OMF [200 ml], puis on neutralise en ajoutant du NMM [80 ml] à 0 C. On y ajoute du BOC-Lys [Z-Cl]-OH préparé à partir de BOC-Lys[Z-Cl]-OH.TBA [80 g, 163 mM) et du HOBT [220 g, 163 mM), on ajoute goutte à goutte du WSCI (29,8 ml, 163 mM), et on agite à ODC pendant i h et à la température ambiante pendant la nuit. On enlève le OMF sous vide, on ajoute detl'acétate d'éthyle [600 ml] au résidu et on lave avec une solution à 5X de bicarbonate de sodium, du HCl 1 N et de liteau, en répétant 3 fois chaque opération de lavage, dans cet ordre. On sèche la couche d'acétate d'éthyle avec du sulfate de magnésium anhydre et on concentre sous vide.On dissout la matière huileuse ainsi obtenue dans la plus faible quantité possible de chloroforme, et on l'introduit dans une colonne de gel de silice [500 g), remplie de chloroForme. On procède à l'élution avec du chloroforme [1,5 1) et du chloroforme-acétate d'éthyle (1:1) [2 litres). On recueille les fractions correspondantes véri Fiées par CCM et on concentre sous vide pour obtenir la substance [27] [90,27 g, rendement : 79,0%]. CCm : TF6 = 0,69, Rf2 = 0,95. [&alpha;]D : - 100,8 ( c = 1, DMF]. Analyse élémentaire [C44H58O15N6Cl.H2O] : C% H% Trouvé: 59,62 7,07 9,39 Calculé: 59,68 6,94 9,49 Analyse des acides aminés: Ala 0,94 [1], Lys 0,99 [1], Pro[3]. 6] P[120-121] : BOC-Ser[Bzl]-Ser[Bzl]-OMe [28] : On ajoute du THF [700 ml] et du BOC-Ser[Bzl]-OH [23,6 g, 0,8 M) et du HOBT t108 g, 0,5 M) à du H-Ser[Bzl]- OMe.HCl [196,57 g, 0,8 M) et on ajoute du OMF [200 mi) pour préparer une solution. On verse goutte à goutte du WSCI t146 ml, 0,8 M) à 0 C et on agite à 0 C pendant 1 h et à la température ambiante pendant la nuit.On concentre le mélange réactionnel sous vide, on ajoute de l'acétate d'éthyle (1 litre] au résidu, puis on lave avec une solution de bicarbonate de sodium à 5, de l'HCl 1 N et de l'eau, en répétant 3 fois chaque opération de lavage, dans cet ordre. On ajoute de l'hexane au produit huileux que l'on cristallise en ajoutant un germe cristallin. On recristallise à partir de l'éther-hexane pour obtenir la substance [23] [340,4 g, rendement : 87,5%]. Pf : 55-55 C. [&alpha;]D: + B, 1 [c = 1, DMF] CCM : HF = 0,96 Analyse élémentaire [C26H34O7N2] : C% H% N% Trouvé : 84,08 7,21 5,43 Calculé : 84,18 7,04 5,75 7] P(118-119) : BOC-Ser[Bzl]-Ser[Bzl]-NHNH2 [25] : On dissout la substance [28] (191 g, 0,393 M] dans le DMF [500 ml]. On verse goutte à goutte de l'hydrazine hydratée [100%] [200 ml] et on agite à la température ambiante pendant 3 h. On enlève le DMF sous vide et on y ajoute de l'eau. On filtre le précipité ainsi Formé, on sèche, on recristallise Z fois à partir de l'acétate d'éthyle-hexane pour obtenir la substance Cas3 [183,6 g, rendement: 96,0%]. Pf : 123-124 C [&alpha;]D : +9,3 [c = 1, DMF] CCM : Rf9 = 0,30 [substance [28] Rf9 = 0.73] Analyse élémentaire [C26H34O7N2] : C% H% N% Trouvé : 64,60 7,34 5,87 Calculé : 64,18 7,04 5,65, 8] P[118-121] : BOC-Ser[Bzl]-Ser[Bzl]-Ser[Bzl]-Ser[Bzl]-Me [30] : On dissout la substance [29] [146 g, 0,3 M] dans le OMF (500 ml). On verse goutte à goutte une solution de HCl 4,49 N/dioxanne [202 ml, 0,9 M) à -60 C et de l'isoamylnitrile [48 ml, 0,33 M], puis on gite à -20 C pendant 20 mintues. On ajouts du TBA [125 ml, 0,9 M] à -20 C pour obtenir une solution azidée. @'un autre côté, on ajoute à du TFA à 0 C [350 ml] le substance [28] [122 g, 0,25 M], on agite à la température ambiante pendant 30 minutes et on enlève le TFA sous vide.On ajoute de l'hexane au résidu, on Filtre le précipité ainsi formé, puis on dissout dans le OMF [300 ml) et on neutralise en ajoutant du TwA à OOC. On ajoute la solution neutralisée à la solution d'azide ci-dessus et on agite à 0 C pendant la nuit. On filtre le TEA. HCl et on concentre le filtrat. On ajoute au résidu de la glace et de l'HCl 1 N, on recueille le précipité par filtration et on lave avec du bicarbonate de sodium à 5% et de l'eau. Après séchage sous vide, on procède à une recristallisation à partir du méthanol pour obtenir la substance trans [223g, rendement 88,4%]. D : +9,6% (c = 1, DMF) Analyse élémentaire [C46H56O11N4] : C% H% N% Trouvé 65,81 6,89 6,73 Calculé 65,70 6,71 6,66 9) P(118 - 121) : BOC-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-NHNH2 [31] : On dissout la substance [30] [98,4 g, 117 mM) dans le DMF [300 ml]. On y verse goutte à goutte de l-'hydrazine hydratée [100%] [117 mi) et on agite à la température pendant 3 h. On enlève le OMF par distillation sous vide et on ajoute au résidu un mélange d'eau et de glace. On Filtre le précipité ainsi Formé et on sèche. On recristallise à partir de l'acétone pour obtenir la substance t313 [97,44 g, rendement : 99%]. Pf : 176 - 177 c. [&alpha;]D : +9,8 (c = 1, DMF) CCM : Rf7 = 0,49 10) P (118 - 126) ; BOC-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala- Pro-Pro-Pro-OBzl [32] : on dissout la substance [30] [60,6 g, 72 mM] dans le DMF [300 ml] et on verse goutte à goutte une solution d'HCl 4,32 N/dioxanne [50 ml, 216 mM] à -50 C. Après avoir versé goutte à goutte de l'isoemylnitrile [11,5 ml, 80 mM], on agite à -20 C pendant 30 minutes. On ajoute du TEA [30 ml, 216 mM) à -50 C pour préparer une solution d'azide. D'un autre côté, on ajoute la substance [27] t53 g, 60 mM) à du TEA (180 ml) à 0 C, on agite à la température ambiante pendant 30 minutes et on enlève le TFA sous vide. On ajoute de l'éther au résidu, on filtre le précipité formé, on le dissout dans le OMF [100 ml] et on nautralise par NMM [15 ml] à 0 C. On ajoute oatte solution neutralisée à la solution d'azide ci-dessus et on agite à 0 C pendant la nuit. On enlève le solvant par distillation sous vide et on ajoute au résidu un mélange d'eau et de glace. On recueille le précipité par filtration et on le lave avec HCl 1 N, du bicarbonate de sodium à 5% et de l'eau. On recristallise à partir du méthanol-DMF après séchage sous vide pour obtenir la substance [32]. [Rendement : 95,9%]. Pf : 210 - 211 C (décomp.) Analyse élémentaire CRo HZ NAo Trouvé 6 3 4 2 6 | > ?, 5 6 Calculé 6 3 ,) s i,7 83 Analyse des acides aminés j 11) P(llS - 126) : On dissout la substance C3a) [88,51 g, 46,2 mM) dans le chloroforme [600 ml], on ajoute de l'hydroxyde de potassium [20 g, 360 mM) dans le méthanol à 90X [500 ml) à 5 C, et on agite à le température ambiante pendant 4 h. On neutralise le mélange réactionnel en ajoutant de l'HCl 1 N [70 ml], on retire le solvant sous vide et on verse le résidu dans l'HCl 1 N [1,5 1) froid (5 C]. On filtre le précipité ainsi formé, on ajoute de l'acétate d'éthyle [600 mi) et on lave avec HCl 1 N et de l'eau [3 fois3. On sèche le couche d'acétate d'éthyle avec du sulfate de magnésium anhydre et on concentre sous vide. On ajoute de l'éther au résidu et on filtre le précipité , que l'on lave avec de l'acétate d'éthyle pour obtenir la substance [33] (55 g ; 80,1%]. Pf : 125 - 135 C. [&alpha;]D : -56,4 (c = 1, DMF) CCX : Rf6 =autour de la ligne de départ, Rf5 = 0,45 Analyse des acides aminés Ser 3,23 (4), Pro 3 (3), Ala 0,98 (1), Lys 0,97 (1). 12 P(118 - 145): On ajoute du chlorure de méthylène [200 mi) à la substance [22] [78 9, as mM] de l'exemple 1. On y ajoute du TFA C400 ml] à 0 C et on agite à la température ambiante pendant 50 minutes. On enlève le TFA sous vide, on ajoute de l'éther au résidut on filtre le précipité et on sèche sur hydroxyde de potassium pendant la nuit sous vide [85,35 g). On dissout ceci dans le DMF [270 ml, pH 3], et on ajuste à pH 6 en ajoutant du NMM [4,58 ml] à -10 C. On ajoute la substance [33] (49,93 g, 33,6 mM) et on ajoute encore du DF [100 ml] pour préparer la solution, Un verse goutte à gou6tte du WSCI [6,20 ml] à -10 C [pH 5], puis on gite à -10 C pendant 2 h et à la température ambiante pendant 2 jours. On enlève le solvant sous vide, et on verse le résidu dans l'eau glacée (1,5 litre). Un recueille le précipité formé , on le met en suspension dans l'eau et on procède à des lavages répétés puis on sèche pendent jours [130 g). On y ajoute du méthanol, on concentre sous vide, et on ajoute du benzène au résidu puis on concentre sous vide.On recristallise en ajoutant de éther au résidu, et on répète 12 fois l'opération. Après avoir ajouté du méthanol, on concentre la solution sous vide et on recristal lise à partir du méthanol pour obtenir le produit [34] [108, 43 g, rendement 91,9%]. Pf : 129 - 1310C. [&alpha;]24D : -72,76 (c - 1, DMF) CCM : Rf2 = 0,56 Anaolyse élémentaire [C220H294O51N33SCII : C% H% N% Trouvé 61,49 7,07 11,02 Calculé 61,67 6 > 92 10,79 Analyse des acides aminés 10,978 mg/6 N-HC1 0,5 ml, 105 C, 21 h 3 Asp 1,00 (1), Thr 0,96 (1), Ser 6 > 87 (7), Gln 1,05 (1), Pro 9,63 (9), Gly 1,03 (1), kla 1,09 (i), Ile 0,94 (1), Leu 3 (3), Lys 1,09 (1),Arg 0,97 (1). 13) HCG 1118 - 1451: On ajoute de l'anisol [10 ml] à la substance [34] [30 g, 0,17 mM]. On introduit du HF [80 ml] et on gite à 0 C pendant 1 h. On retire le HF sous vide. On ajoute de l'éther au résidu, et on Filtre le précipité formé. On introduit cette poudre dissoute dans l'cide acétique 0,1 N [50 ml] dans une colonne [3,5 x 35 cm) de Dowex-1 Cforme acétate) on lave avec de l'acide acétique 0,1 N.On combine l'éluat et la solution de lavage et on lyophilise pour obtenir le produit [1,46 g], que l'on dissout dans une solution d'urée 8 M (30 mi), on ajuste à pH 9 en ajoutant de ltammoniaque à OOC, puis on introduit dans une colonne [4,5 x 120 cm) de Sephadex LH-20 et on élue avec de 1-' acide acétique 0,1 N. On divise l'éluat en fractions de 7 ml et on recueille les fractions n 55-83, puis on lyophilise pour obtenir la poudre [990 mg). On dissout la poudre dans l'acide acétique 0,1 N t30 ml] et on l'introduit dans une colonne [5 x 14 cm) de CMC. Après avoir lavé avec un tampon d'acétate d'ammonium 0,01 M [pH 4,5, 200 ml], on ohromatographie par élution à gradient linéaire avec un tampon d'acétate [0,01 M à 0,1 M, par 400 ml, pH 4,5). On combine les fractions n 85-115 (une Fraction: 6 mi), puis on lyophilise pour obtenir la poudre (850 mg). On introduit la poudre dissoute dans l'acide acétique 0,1 N dans une colonne [4 x 120 cm) de Sephadex LH-20, et on élue avec de l'acide acétique 0,1 N. On recueille les fractions n 35-43 (une Fraction : 10,5 mi) et on lyophilise pour donner la poudre [650 mg). On dissout ceci dans l'acide acétique 0,1 N C30 ml] et on introduit à nouveau dans une colonne [5 x 15 cm) de CMC, que l'on lave avec un tempon d'acétate d'ammonium 0,01 M [pH 4,5, 200 ml]. On élue par un gradient linéaire de tampon d'.acétate d'ammo- nium 0,01 M [400 ml] à 0,1 m [400 ml] [pH 4,5]. On reoueille les frections n 100-111 (une fraotion : ,5 ml) et on lyophilise pour obtenir la poudre t480 mg). On introduit la poudre dissoute dans l'acide acétique 0,1 N dans une colonne [3 x 117 cm) de Sephadex LH-20 et on élue avec l'acide acétique 0,1 N. On combine les fractions n 24-30 Cune frection : 10,5 ml) et on lyophilise pour obtenir l'HCG [118-14] [320 mg]. Pf : > 2200C (décomp.) CCM : Rf11 = 0,57 Analyse des acides aminés: Asp 1,07 (1), Thr 0,97 (1), Ser 8,23 (8), Gln 1,13 (1), Pro 9,98 (9), Gly 1,07 (1), Ala 1,06 (1), lie 0,89 (1), Leu 3 (3), Lys 1,08 (1), Arg 1,07 (1). Exemple 3 [Cys(Acm)110]-HCG [110 - 145] : 1) P(116 - 117); BOC-G1n-Asp(OBz1)-OH [35] : On met en suspension du H-Asp [OBzl]-OH C33,4e g, 150 mM) dans le DMF C400 ml). On y ajoute du HOBT [2,03 g, 15 mM], du BOC-Gln-ONP [55,10 g, 150 mM] et du DMF [100 ml]. On ajuste le mélange réactionnel à pH 7 en ajoutant du NMM [2 ml] à 100 C et on agite à la température ambiante pendant la nuit. On ajuste 3 fois le pH du mélange à pH 7 en ajoutant du NMM t16 ml]. Après la réaction CpH G], on enlève le DMF sous vide. On ajoute une solution d'acide citrique C300 ml] et de chloroforme t300 ml] et on agite. On extrait la couche aqueuse avec du chloroforme C300 ml.et 10U ml]. On combine les couches de chloroforme et on les lave 4 fois avec du chlorure de sodium saturé, de l'eau acide pH 33 et de l'eau acide CpH 4]. On sèche la couche aqueuse avec du sulFate de sodium anhydre et on concentre sous vide. On ajoute de l'éther au résidu et on recueille par Filtration le précipité Formé. On y ajoute du méthanol et on concentre sous vide, puis on recristallise 2 Fois à partir du chloroForme-éther pour donner la substance [35] [32,31 g, rendement: 7,7). On concentre le liqueur-mère sous vide et on recristallise a Fois à partir du chloroForme-éther pour obtenir la substance [35] (6,3 g). On introduit ensuite la liqueur-mère dans une colonne de gel de silice [100 g) et on élue avec du chloroforme-éthanol-acétate d'éthyle [5:1:5]. On sèche sous vide les Fractions correspondantes vérifiées par CCM pour obtenir la substance [35] CZ,98 g). Rendement total: 44,12 g [65,1%]. Pf : 92 - 15 C [&alpha;]24D : -4,9 [c = 1, DMF) CCM : Rf4 = 0 > 27, Rf2 = 0,56 Anlayse élémentaire [C21H29O8N3] : C% H% N% Trouvé 55,86 6,50 9,61 Calculé 55,86 6,47 9,31 2) P(116 - 145): On dissout le subswtence [34] de l'exemple 2 [101,10 g, 24 mM] dans le chlorure deméthylène [150 ml]. On y ajoute du TFA C350 ml] à 0 C, et on agite à la température ambiante pendant 1 h. On enlève le TFA par distillation sous vide, on ajoute de l'éther au résidu, on Filtre le précipité ainsi formé, et on sèche sur hydroxyde de potassium pendant la nuit [114,14 g). On dissout la poudre dans le DMF C300 ml] CpH 3], on ajuste à pH o en ajoutant du I4MM [8,64 mi) à 0 C et on ajoute de la substance [35] [13,00 g, 28,8 mM] et du HOBT [3,89 g, 28,8 mM] pour préparer la solution. On y ajoute du PCP C7,7 g, 28,8 mM] et on ajoute encore du DMF [50 ml] et du THF [50 ml]. On ajoute du NMM [3,17 ml] à la solution à 0 C CpH 5], on ajoute goutte à goutte du WSCI [5,27 ml] CpH 5) et on agite à la température ambiante pendant la nuit. On enlève le solvant sous vide et on verse le résidu dans de l'eau glacée CI,s 1) pour obtenir le précipité CpH 4), que l'on met en suspension dans l'eau et que l'on lave 3 Fois, respectivement CpH 5). On sèche la poudre sous vide, et on la dissout dans le méthanol, on concentre sous vide, et on distille de Fanon azéotropique en en ajoutant du benzène. On ajoute de l'éther et on sépare par décantation la matière visqueuse précipitée. On ajoute encore de l'éther pour obtenir une poudre brunatre pâle. On dissout la poudre dans le méthanol, on ajoute du benzène et on concentre sous vide. On ajoute de l'éther au résidu pour cristalliser la substance. On répète cette opé- ration 7 fois pour donner la substance [38] [101,2 g, rendement : 93,5%]. Pf : 134 - 139 C. [&alpha;]24D : -68,72 (c = 1, DMF) CC : Rf2 = 0,40, Rf4 = 0,93 Analyse élémentaire [C236H315C57N36SCl5.H2O] : C% H% N% Trouvé 60,87 6,70 11,00 Calculé 61,15 6,85 10,88 Analyse des acides aminés : Asp 2,00 (2), Thr 1 > 03 (1), Ser 7,16 (8), Gln 2,02 (2), Pro 10,20 (9), Gly 1,09 (1), Ala 1,13 (1), Ile 0 > 87 (1), Leu 3 (3), Lys 1,16 (1), Arg 1,05 (1). 3) P(114 - 115): AOC-Arg(Tos)-Phe-OEt (37), On dissout de i'AOC-ArgCTos)-OH C63,83 g, 150 mM] dans le DMF C0O mi). On y ajoute du H-Phe-OEt.HCl [36,18 g, 157,5 mM] et du HOBT [21,28 g, 157,5 mM]. On verse goutte à goutte du WSCI [28,82 ml, 157,5 mM) à -10 C et on agite à la température ambiante pendant la nuit. On enlève le DMF sous vide et on ajoute au résidu une solution de bicarbonate de sodium à 5% [500 ml]. On extrait a fois le précipité ainsi formé avec de l'acétate d'éthyle C500 ml-300 ml). On lave la couche d'acétate d'éthyle avec du bicarbonate de sodium -à 5% , avec de l'eau, 2 fois avec HCl 1 N, 3 fois avec du chlorure de sodium saturé et avec de l'eau, dans cet ordre. Après avoir séché avec du sulfate de sodium anhydre, on concentre la solution sous vide. On ajoute de l'hexane au résidu et on redistallise le précipité à partir de l'acétate d'éthyle-benzène-hexane pour obtenir la substance [37] [85,52 g, rendement : 92,3%]. Pf : 70 - 73 C. [&alpha;]D = -5,12 (c = 1, DMF) CCM : Rfl = 0,69 4) P(113 - 115): BOC-Pro-Arg(Tos)-Phe-OEt [38] : On dissout la substance [37] (85,0 g, 138 mM] dans le chlorure de méthylène [150 ml]. On y ajoute du TFA C350 mi) à OOC, et. on agite à la température ambiante pendant as minutes. On enlève le TFA et on ajoute de l'éther au résidu, on filtre le précipité, puis on sèche sur hydroxyde de potas- sium pendant la nuit. On dissout la poudre dans le DMF CtsO mi) et le THF C300 ml).On ajuste la solution à pH 7 en ajoutant du NMM [15,17 mi) à -10 C. On y ajoute du BIOC-Pro-OH [29,70 g, 138 mM] et du HOBT [18,64 g, 138 mM). On y ajoute du WSCI [25,25 mi) à -10 C, on agite à -10 C pendant 2 h et à la température ambiante pendant la nuit. On enlève le solvant sous vide et on verse le résidu dans du bicarbonate de sodium à 5% [GOO mi), on extrait deux fois avec de l'acétate d'éthyle C300 ml). On lave 2 fois la couche d'acétate d'éthyle avec du bicarbonate de sodium à 5X, une solution saturée de chlorure de sodium, Z fois avec HCl 1 N, 3 fois avec une solution saturée de chlorure de sodium et de lteau, dans cet ordre, on sèche en ajoutant du sulfate de sodium anhydre, puis on concentre sous vide. On ajoute de l'hexane au résidu, on recueille le précipité par décantation et on concentre sous vide après avoir ajouté de l'acétate d'éthyle.Un ajoute de lthexane au résidu aux fins de recristallisation pour obtenir la substance [38] [98,25 g, rendement : 99,5%] P : 99 - 1010C. [&alpha;]22D : -31,8 (c = 1, DMF) CCM : Rf1 = 0,52, Rf6 = 0,54 Analyse élémentire [C34H48N6S] : C% H% N% Trouvé 58,40 7,22 11,71 Calculé 58,27 6,90 11,99 5) P(113 - 115): BOC-Pro-Arg(Tos)-Phe-OH 1391: On dissout la substance [38] C35,04g, 50 mM) dans le méthanol [200 mi). On verse goutte à goutte du Ln-HCl [60 ml, BO mM) pendant 20 minutes à 0 C et on agite à le température ambiante pendant 90 minutes. On ajoute au mélange réactionnel à 0 C de l'HCl 1 N (10 mi), on enlève le méthanol sous vide et on y ajoute de l'HCl I N [55 ml] à 0 C CpH 23. On filtre le précipité et on sèche sous vide [27,85 93. On extrait le filtrat avec du chloroforme. On lave 3 fois la couche de chloroforme avec du chlorure de sodium saturé et de l'eau et on déshydrate avec du sulfate de sodium anhydre, puis on concentre sous vide. On combine le résidu avec ce qui précède, et on recristallise 2 fois pour obtenir la substance [39] [29,22 g, rendement : 86,9%]. Pf : 118 - 1200C. [&alpha;]24D : -27,04 (c = 1, DMF) CCM : Rf6 = 0,14, Rf. = 0.25 6) P(113 - 145): On ejoute du chlorure de méthylène [100 ml] et du TFA [350 ml] à la substance [36] [102,01 g, 22,44 mM) et on agite à la température ambiante pendant 1 h. On enlève le TFA, on y ajoute de éther, on filtre le précipité et on sèche sur hydroxyde de potassium sous vide pendant la nuit [120,7 g] puis on dissout dans le DMF [300 ml] [pH 3]. On y ajoute du NMM [11,47 ml] à 0 C (pH 3). On ajoute du HOBT [3,84 g, 29,17 mM], une solution de PCP [7,77 g, 29,17 mM] dans un mélange de DMF [50 mi) et de THF [20 ml] et une solution dans le DMF [40 ml] de substance [39] [19,63 g, 29,17 mM].On verse encore goutte à goutte du WSCI (16,02 ml] CpH 3), on ejoute du NMM [5 ml], on ajuste à pH 5 en ajoutent du NMM [5 ml) et on agite à 0 C pendant 2 h et à la tempére- ture ambiante pendant 5 h. On ajoute pendent 2 jours du WSCI [5,34 ml, exoès 1,3 molaire], [2,67 ml, excès 0,65 molaire) et [2,67 ml,-excès 0,65 molaire), dans cet ordre, puis on continue dtagiter. On enlève le sol vent sous vide, on verse le résidu dans l'eau Froide et on recueille par filtration la matière ainsi précipitée.On met en suspension le précipite dans l'eau et on lave de fagon répétée 3 Fois, puis on sèche sous vide pendant 3 jours pour obtenir le pro- duit brut [148,49 g). On dissout le produit dans le méthanol chloroforme (1:1), on concentre sous vide, puis on recristal lise à partir de l'éther Con répète 10 Fois l'opération) pour donner le produit [40] C105,94 g, rendement: 92,65%]. Pf : 148 - 1520C. [&alpha;]24D : -67,38 (c = 1, DMF) CC : Rf2 = 0,42 [gal de silice Merok 5715] Rf2 = 0,58 (gel de silice Merck 5721] Rf4 = 0,89 Cgel de silice Merck 57153 Analyse élémentaire [C263H351O63N42S2Cl6H2O] : C% H% N% Trouvé 60,52 6,78 11,41 Calculé 60,65 6,79 11,29 Analyse des acides aminés [5,422 mg/6NHC1 0,5 ml, 105 C 24 h ]: Asp 1,88 (2), Thr 0,97 (1), Ser 6,83 (8), Gln 1,93 (2), Pro 10,68 (10), Gly 1,02 (1), Ala 1,08 (1), Ile 0,94 (1), Leu 3 (3), Phe 0,75 (1), Lys 1,09 (1), Arg 1,81 (2). 7) P(112 - 145): On ajoute du chlorure de méthylène [150 ml] et du TFA [450 ml] à la substance [40] (104,56 g, 20,5 mM] et on agite à la température ambiante pendant 1 h. On enlève le TPA sous vide, on ajoute de l'éther au résidu et on recueille le précipité par filtretion et on sèche sur hydroxyde de potassium pendant la nuit (125,4 g). On dissout la poudre dans le DMF (300 ml] CpH 2], et on ajuste à pH 7 en ajoutant du NMM [20,25 ml] à -10 C. On y ejoute du HOBT [3,60 g, 26,65 mM], du BOC-Asn-[OBzl]-OH [8,62 g, 26,65 mM] et une solution dens le THF Cao ml] de PCP [7,10 g, 26,65 mM], dans cet ordre, pour préparer une solution.On verse goutte à goutte du WSCI [8,63 ml, 47,15 mM) CpH 7) à -10 C et on agite à la température ambiante pendant le nuit. On enlève le solvant sous vide et on verse le résidu dans l'eau froide [1,5 litre). On filtre la matière précipi- tée, on la met en suspension dans l'eau et on lave, 3 fois, puis on sèche sous vide. On concentre sous vide la matière séchée dissoute dans le chloroforme-méthanol [1:1]. On répète 6 fois la recristallisation en ajoutant de l'éther au résidu pour obtenir la substance [41] [102,37 g, rendement 94,1%]. Pf : 145-150 C. [&alpha;]22D : -67,6 (c = 1, DMF) CCM : Rf2 = 0,29, Rf4 = 0,87 Analyse élémentaire [C274H366O68N45S2Cl.8H2O] : C% H% N% Trouvé 60,28 6,69 11,18 Calculé 60,39 6,77 11,05 Analyse des scides aminés [0,529 mg/6 N-HCl 0,5 mlo, 105 C, 24 h ] : Asp 2,63 (3), Thr 0,97 (1), Ser 6,75 (8), Gln 1,92 (2), Pro 10,65 (10), Gly 1,03 (1), Ala 1,08 (1), Ile 0,93 (1), Leu 3 (3), Phe 0,77 (1), Lys 1,09 (1), Arg 1,72 (2). 8) P(110 - 111) : BOC-Cys(Acm)-Asp(OBzl)-OH [42] : On dissout du BOC-Cys(Acm)-OSu (77,5 g, 19B mM) dans du THF t400 ml). On y ajoute du H-Asp(OBzl)-OH C44,64 g, ZOO mM), on ajuste à pH 7 en ajoutant du NMM C18 ml] à OOC, on ajoute du DMF t300 ml] et on agite pendant la nuit en ajustant le pH à 7 en ajoutant du NMM (18 ml]. On enlève le DMF sous vide, on ajoute du bicarbonate de sodium à 5X (150 ml) au résidu et on lave a Bois avec de l'éther. On ajuste la couche aqueuse à pH 3 en ajoutant de l'HCl 1 N C200 ml] pour précipiter la matière huileuse, que l'on extrait 3 Fois avec de l'acétate d'éthyle [300 ml] et on lave 3 fois la couche d'acétate d'éthyle avec du chlorure de sodium aqueux et de l'eau. Après séchage avec du sulfate de sodium anhydre, on concentre la solution sous vide. On ajoute de l'éther et de hexane au résidu pour obtenir le précipité.On recristallise à partir de l'acétate d'éthyle éther pour donner la substance C4a) [51,98 g, rendement: 62,9%] Pf : 132 - 134 C [&alpha;]24D : - 9,76 (c = 1, DMF) CLX : Rf2 = 0,27, Rf4 = 0,30 Analyse élémentaire [C22H31O8N3S] : C% H% N% Trouvé 52,95 6,35 8,25 Calculé 53,11 6,28 8,45 P(110 - 145) : On ajoute du chlorure de méthylène C40 ml] et du TFA [80 ml] à la substance [41] [15,82 g, 3 mM] et on agite à la température ambiante pendant 90 minutes. On enlève le TFA sous vide, et on ajoute de l'éther au résidu. On filtre le précipité et on le sèche sur hydroxyde de potassium [17,47 g].On dissout la poudre dans le OMF [50 ml]. [pH 3], on ajuste à pH 7 en ajoutant du NMM [1,32 ml) à -10 C, puis du HOBT (0,53 g, 3,9 mM), une solution dans le DMF [20 ml] de la substance [42] [1,94 g, 3,9 mM], et une solution dans le THF (20 ml) de PCP (1,04 g, 3,9 mM), dans cet ordre. On verse goutte à goutte du WSCI 0,71 ml, 3,9 mM) à -10 C et on agite à -100C pendant 2 h et à la température ambiante pendant 3 h. On y ajoute encore du WSCI (0,71 mi) à -100C et on agite à le température ambiante pendant la nuit. On enlève le solvant par distillation et on verse le résidu dans l'eau froide [500 ml] pour recueillir le préoipité. On met le précipita en suspension dans l'eau et on lave trois fois, puis on sèche sous vide pendant 2 jours [18,01 93. On y ajoute du chloroforme-méthanol (1:1), on concentre sous vide, et on ajoute de l'éther au résidu pour cristalliser le matière. On répète ces opérations 6 fois pour obtenir la substance [43] [15,59 g, rendement : 91,35%]. P : 146 - 1480C. [&alpha;]22D : -66,72 (c = 1, DMF) CCM : Rf2 = 0,62, Rf4 = 0,62 Analyse élémentaire [C291H391O75N46S Cl-10 H2O] : C% H% N% Trouvé 59,71 6,43 10,70 Calculé 59,59 6,72 10,99 Analyse des soides aminés [0,542 mg/6 N-HCl, 0,5 ml, 105 C, 22 h Asp, 3,38 (4), Thr 0,97 (1), Ser 6,51 (8), Gln 1,97 (2), Pro 10,00 (10), Gly 1,03 (1), Ala 1,10 (l), le 0,94 (1), Leu 3 (3), Phe 0,81 (1), Lys 1,11 (1), Arg 1,71 (2), Cys-Cys 0,34 (0,5). 10) [Cys(Acm)110]-HCG [110 - 145] : On ajoute de l'enisol [20 ml] à la substance [43] (5,89 g, 1 mM). On y ajoute du HF anhydre [100 ml) à 0 C et on agite pendant 1 h. On enlève rapidament al HF. sous vide. On ajoute de éther au résidu. On filtre le précipité ainsi formé pour obtenir le poudre C5,07 g), que l'on dissout dans l'acide acétique 0,1 N [200 ml], on ajoute de l'éther [200 ml), et on agite. On fait passer la couche aqueuse à travers une colonne [3 x 44 cm) de Dowex-1 Cforme acétate) et on lyophilise l.'éluat pour obtenir la poudre [4,08 g). On dissout la poudre dans une solution d'urée 8 M [350 ml], on ajuste à pH 9,5 en ajoutant de l'ammoniaque, on enlève et on l'introduit dans une colonne [4,5 x 14 cm) de CMC. On fait passer un tampon d'acétate d'ammonium 0,01 M pH 4,5, 500 ml), puis on élue avec un gradient linéaire de tampon acétate d'ammonium CpH 4,53 de 0,01 M [1,5 litre) à 0,2 M C1,5 litre). On recueille les fractions n 48-59 Cune fractions 11,8 ml) et on lyophilise pour donner la poudre C800 mg]. On dissout la poudre dans l'acide acétique 0,1 N et on l'introduit dans une colonne [3,5 x 122 cm) de Sephadex LH-20, puis on élue avec une solution 0,1 N d'acide acétique. On recueille les fractions n 96-100 (une fraotion : 64 ml] et on lyophilise pour donner la [Gye[Acm]110]-HCG [110-145] [2,6 mg]. Pf : > 230 C (décomp.) [&alpha;]28D : -81,2 (c = 0,1. acide acétique 0,1 N) CCM : Rf11 = 0,43 Analyse des acides aminés : Asp 3,83 (4), Thr 0 > 95 (l), Ser 6,82 (8), Gln 2 > 05 (2), Pro 10,43 (30), Gly 1,01 (1) Ala 0,96 (1), Cys 0,47 (0.5), Ile 0,97 (1), Leu 3 (3), Phe 1,00 (1), Lys 1,00 11), Arg 2,02 (2). Exemple 4 HCG (110 - 145): On diseout la [Cys[Acm)110]-HCG [110-145] [50 mg] de l'exemple 3 dans l'acide acétique 0,1 N [3 ml]. On y ajoute une solution dans l'acide acétique 0,1 N [1 ml] d'acétate mercurique (50 mg) et on agite à la température ambiante pendent 4 h. On y ajoute du 2-mercapto-éthanol 91 ml) et on agite pendant la nuit. On introduit la solution dans une colonne [2,0 x 35 cm] de Sephadex G-25 et on élue avec l'acide acétique 0,1 N. On recueille les fractions n 20-30 Cune fraction: 5 ml] et on lyophilise pour obtenir l'HCG [110-145] $47,56 mg, rendement : 95%] Dans cet échantillon, on détecte 51,35% des groupes mercapto par le procédé OTNB. Pf : supérieur à 240 C. + 106 C (c = 0,1, acide acétique 0,1 N) Analyse des acides aminés Asp 3,33 (4), Thr 0,89 (1), Se5r 5,65 (8). Gln, 1,77 (2). Pro 9,80 (10), Gly 0,99 (1), Ala 0,99 (1), Cys-Cys 0,29 (0,5), Ile 0,9E (1), Leu 3'(3), Phe 0,98 (1), Lys 0,98 (1), Arg 1,68 (2). Groupes mercapto libres: on détecte 53,15X par le procédé de "dosage colorimétrique de la cystéine selon Ellman". Exemple 5 1) P(108-109) : BOC-Leu-Thr(Bzl)-Obzl) [44] : On dissout H-Thr[Bzl]-OBzl. [COOH]2 [68,88 g, 0,2 M) dans le OMF t300 ml], on neutralise en ajoutant du TEA (28 ml, 0,2 M] et on ajoute du HOBT [27,0 g, 0,2 M] et du BOC-Leu-OM.M2O [49,85 g, 0,2 M]. On verse goutte à goutte du WSCI [36,5 ml, 0,2 M) à 0 C et on agite à la température ambiante pendant la nuit. On ajoute encore du WSCI [15 ml) et on agite pendant la nuit. On enlève le DMF par distillation sous vide et on dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle [1,2 litre).On lave la couche d'acétate d'éthyle avec du bicarbonate de sodium à 5X, de l'eau, de l'HCl 1 N et de l'eau, dans cet ordre, on sèche en ajoutant du sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide. Un laisse reposer pendant longtemps aux fins de cristallisation la substance huileuse ainsi obtenue [99,24 g, rendement: 94,2%] pour obtenir la substance [44]. Pf 62 - 640C [&alpha;]21,5D : = 15,22 (c = 1, DMF) CCM : Rf1 = 0,91, Rf6 = 0,87 2) P(107 - 109): BOC-Pro-Leu-Thr(Bzl)-OBzl [45]: On ajoute du chlorure de méthylène [150 ml) à la substance [44] [97,9 g, 191 mM]. On y ajoute du TFA [300 ml] et de l'anisol t6 ml) à 0 C et on agite à la température ambiante pendant 60 minutes. Un enlève le TFA par distillation sous vide et on y ajoute de l'éther. On neutralise la matière huileuse dissoute dans le OMF [600 ml] en ajoutant du NMM à OOC. On ajoute du BOC-Pro-OH 41,11 g, 191 mM] et du HOBT (25,80 g, 191 mM], et oh verse goutte à goutte du WSCI [35,0 ml) à OOC. On neutralise le mélange réactionnelon ajoutant du NMM à pH 7, puis on agite à la température ambiant pendant la nuit. On enlève le OMF sous vide, et on dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle 1,5 litre], que l'on lave avec du bicarbonate de sodium à 5X, de l'HCl 1 N et une solution saturée de chlorure de sodium, dans cet ordre, et on déshydrate avec du sulfate de sodium anhydre. On concentre la solution sous vide pour obtenir une substance huileuse [44] (111,16 g, rendement : 95,4%]. CCM : Rf1 = 0,78, Rf6 = 0,82 3) P(106 - 109): BOC-His-Pro-Leu-Thr(Bzl)-OBzl I45]: On ajoute du chlorure de méthylène [240 ml], du TFA [400 ml] et de l'enisol [8 ml] à la substance [44] [106,67 g, 175 mM) et on agite à la température ambiante pendant 1 h. On enlève le TFA et le chlorure de méthylène sous vide, et on ajoute de l'éther au résidu. On dissout la matière ainsi précipitée dans le DMF [800 mi), on ajuste à pH 7 en ajoutant du NMM, puis on ajoute du HOBT [23,64 g, 175 mM) et du BOC-His(Tos)-OH buileux [BOC-His[Tos]-OH.OCHA [124,1 g, 210 mM) dissous dans le chloroforme [900 ml] et lavé avec de l'acide nitrique 1 N et de l'eau, déshydraté avec du sulfate de sodium anhydre, et concentré sous vide]. On verse encore goutte à goutte du WSCI 35,23 ml, 192,5 mM) et on agite à la température ambiante pendant la nuit. On enlève le DMF sous vide, et on dissout le résidu dans l'acé- tate d'éthyle [900 il). On lave la solution d'acétate d'éthyle avec du bicarbonate de sodium à 5,' et de l'eau, et on sèche avec du sulfate de sodium anhydre , puis on concentre sous vide pour obtenir une matière huileuse. On dissout la matière huileuse dans le DMF t900 mi), on ajoute du HOBT [90 g) et on agite à la température ambiante pendant Z jours. On enlève le DMF par distillation sous vide et on dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle [900 ml).On lave la solution avec du bicarbonate de sodium à 5X et de l'eau, on sèche avec du sulfate de sodium anhydre, puis on concentre sous vide. On introduit le concentré dans une colonne (6 x 25 cm) de gel de silice et on élue avec de l'acétate d'éthyle et de l'acétate d'éthyle-méthenol (10:1). On recueille les fractions correspondantes vérifiées par CCM et on sèche sous vide pour obtenir la poudre t453 [69,2 9 rendement ; 52,9%]. CCM : Rf8 = 0,35 4) P(106 - 109): BOC-His-Pro-Leu-Thr(Bzl)-NHNH2 146]: Un dissout la substance [45] C67,aa g, 90 mM) dans le DMF t300 ml], on ajoute de l'hydrazine hydratée C45,b ml, 0,95 M) et on agite à la température ambiante pendant la nui t. On enlève le OMF et on dissout le résidu dans l'acétate te d'éthyle [800 ml]. On lave la solution avec de l'eau, on déshydrate avec du sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide pour obtenir la substance [46] en poudre t55 g, rendement: 91,1%]. 5] P[106-111] : BOC-His-Pro-Leu-Thr[Bzl]-Cysw[Acm]-Asp[OBzl]-OH [47] ; On ajoute du TFA [180 ml] et de l'anisol [3 ml] à la substance [42] [46,69 g, 93,63 mM] et on agite à la température ambiante pendant bo minutes. On enlève le TFA et on y ajoute de l'éther. On sépare le précipité et on le dissout dans le OMF (300 ml] et on ajuste à pH 7 en ajoutant du TEA [26,04 ml, 187,29 mM] pour obtenir une solsution de de-BUC. On dissout la substance [46] [52,44 g, 78,03 mM] dans le DMF t300 ml). On y ajoute une solution d'HCl 4,32 N/ dioxanne [54,18 ml, 234,09 mM), puis on ajoute de l'isoamyl- nitrile [11,55 ml, 85,83 mM), puis on agite à -20 C pendent 25 minutes. Après avoir ajouté du TEA [32,52 ml, 234,03 mM] à -60 C, on y ajoute la solution de de-BOC ci-dessus, et on agite à 10 C pendant 3 jours. On enlève le DMF sous vide et on dissout le résidu dans le chloroforme (800 ml]. On lave la solution avec une solution d'acide citrique à 5% et avec de l'eau, on sèche avec du sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide. On introduit le résidu dans une colonne de gel de silice et on élue avec du chlorofrome-méthanol [5:1].On recueille les fractions correspondantes vérifiées par CCM et on sèche sous vide. On recristallise à partir du méthanol-éther pour obtenir la substance C473 [52,79 g, rendement ; 77,7%]. Pf : 117 - 120 C. [&alpha;]23D : -242, (c = 1, DMF) CCM : Rf4 = 0,50 Analyse élémentaire [C50H69O13N9S-CF3COOH] C% H% N% Trouvé 54,21 6,29 11,33 Calculé 54,30 6,13 10,96 6) P1105 - 111): BOC-Asp(OBzl)-His-Pro'Leu-Thr(Bzl)-Cys(Acm)-Asp(OBzl)-OH 148]: On ajoute du chlorure de méthylène (200 ml), du TFA (300 ml] et de l'anisol t4 ml) à la substance [47] [52,17 g, 60 mM) et on agite à la température ambiante pendent 60 minutes. On enlève le TFA et on ajoute de l'éther au résidu.On dissout le précipité dans le DMF [500 ml), on ajuste à pH 7 en ajoutant du NMM et du HOBT [8,11 g, 60 mM] et du 2,4-dinitrophénol [11,05 g, 60 mM], puis on ajoute du BOC-Asp[OBzl]-OSu (30,27 g, 72 mM) à OOC. en réglant le pH à 7-8, on agite le mélange à la température ambiante pendant 2 jours. On enlève le uMF par distillation, on dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle 600 mi), on lave à l'eau et on sèche avec du sulfate de sodium anhydre. On concentre la solution sous vide et on y ajoute de l'éther pour cristalliser.On purifie les cristaux précipités par chromatographie sur colonne de gel de silice [6 x 5 cm) éluée avec du chloroforme-méthanol (4:1), gel de silice élué avec du chloroforme-méthanol-acide acétique [80:25:2] et gel de silice élué avec du chloroforme-méthanol-acide acétique (95:15:5), dans cet ordre, respectivement. On recueille les fractions correspondantes vérifiées par CCM et on concentre sous vide aux fins de cristallisation en ajoutant de l'éther pour obtenir la substance [48] (65,05 g, rendement: 72,8%]. Pf : 122 - 1250C [&alpha;]23D : -33,22 (c = 1, DMF) CCM : Rf2 = 0,19, Rf4 = 0,53 Analyse élémentaire [C61H80O16N10S.CF3COOH] : C% H% N% Trouvé 56,05 6,06 10,36 Calculé 55o70 6,23 10,31 7) P(105 - 145): On ajoute du chlorure de méthylène t50 ml) à la substance (41) [15,92 g, 3 mM) de l'exemple 3, et on laisse gonfler à la température ambiante pendant 1 h. On ajoute du TFA (100 ml) et on agite à la température ambiante pendant 1 h %. On enlève le TFA sous vide, on ajoute de l'éther au résidu.On sèche le précipité- sur hydroxyde de potassium sous vide pendant la nuit [17,81 g). On dissout la poudre dans le OMF t60 ml], on ajuste à pH 7 en ajoutant du NMM t1,98 ml] à -10 C, puis du HOBT [0,53 g, 3,9 mM), la substance t483 [4,84 g, 3,9 mM] et du DMF (20 ml). On y ajoute une solution dans le THF (20 ml) de PCP [1,04 g, 3,9 mM] (pH G] et on verse goutte à goutte du WSOI [0,71 ml, 3,9 mM] à -10 C [pH 6]. Après avoir agité à -10 C pendant 1 h et à la température ambiante pendant Z h, on ajoute encore goutte à goutte du WSCI (0,71 ml, 3,9 mM) (pH 73 à -10 C, puis on agite à la température ambiante pendant la nuit.On concentre le mélange sous vide et on verse le résidu dans l'eau froide t600 ml). On met le précipité en suspension dans l'eau et on lave Con répète 3 fois cette opération) et on sèche sous vide [20,79 g). Un dissout la poudre dens le chlorofomme-méthanol (1:1), on concentre sous vide et on dissout le résidu dans le benzène, puis on concentre à nouveau sous vide aux fins de cristallisation en ajoutant de l'éther au résidu. (On répète 6 fois cette opération). On répète 3 fois la Filtration sur gel en utilisant une colonne de Sephades LH-SO [3,5 x 125 om) éluée avec du ohloroformeméthanol [1:1] et on concentre l'éluat sous vide pour obtenir la substance[48] [16,07 g, rendement ; 83,32%]. CCM: Rf4 = 0,86, Rf2 = 0 > 55 Analyse élémentaire [C330H420O73N53S3Cl.8 H2O] C% H% N% Trouvé 60,10 6,48 11,40 Calculé 60,30 6,69 11,29 Analyse des acides aminés: Asp 4,20 (5), Thr 1,50 (2), Ser 7,05 (8), Gln 2,04 (2), Pro 10,47 (11), Gly 1,07 (1), Ile 1,00 (1), Leu 4 (4), Phe 0,83 (l), Ala 1,14 (1), Cys-Cys 0 > 49 (0,5), Lys 1,16 (1), His 0,64 I1). 8) [Cys(Acm)110]-HCg (105 - 145] : On ajoute de l'anisol [20 ml] à la substance [49] t6,4 g, 1 mM). On y ajoute du HF anhydre [100 ml), on agite à 0 C pendant 1 h, puis on enlève rapidement le HF sous vide. On ajoute de l'éther au résidu. On dissout le précipité dans l'acide acétique 0,1 N (100 ml) et on agite en ajoutant de l'éther. On fait passer la couche aqueuse dans une colonne de Dowex-1 (Forme acétate, 4,5 x 17 cm) et on lyophilise l'éluat pour obtenir le produit [4,17 g). On dissout la poudre dans une solution durée 8 M (250 ml), on ajuste à pH 9,5 en ajoutant de l'ammoniaque et on verse dans une colonne (4,5 x 17,5 cm] de CMC. On lave la colonne avec un tampon d'acétate d'ammonium [0,01 M) pH 4-,5) et on élue selon un gradient avec un tempon d'acétate d'ammonium de 0,01 M [1,5 litre) à 0,1 M t1,5 litre) [pH 4,53.On recueille les fractions n 63-73 (une Fraction: 12,4 ml) et on lyophilise pour obtenir la matière [930 mg). On dissout la poudre dans l'acide acétique 0,1 N, on l'introduit dans une colonne de de Sephadex LH-20 [3,5 x 120 cm) et on élue avec de l'acide acétique 0,1 N. On recueille les fractions n 45-60 (une Fraction: 6,8 ml] et on lyophilise pour obtenir la poudre [770 mg]. On dissout cooi dans l'eau [20 ml] et on verse dans une colonne [4,5 x 17,4 cm] de CMC, que l'on lave avec un tamon d'acétate d'ammonium 0,01 M (pH 4,5, 500 ml). On élue selon un gradient linéaire de tampon d'acétate d'ammonium 0,01 M CI litre) à 0,1 M [1 litre) [pH 4,53.On recueille les fractions n 58-77 (une fraction : 9,8 ml) et on lyophilise pour obtenir la poudre (360 mg). On verse ceci sur une colonne t3,0 x 120 cm) de Sephadex LH-20 et on élue avec de l'acide acétique 0,1 N. On divise l'éluat en fractions de 9,3 ml de volume et onr ecueille les fractions 37 à 41 et on lyophilise pour obtenir la poudre [230 mg). On dissout ceci dans l'acide acétique 0,1 N et on verse dans une colonne [2,5 x 92 cm] de Sephadex G-50 et on élue avec l'acide acétique 0,1 N. On renueille les fractions n 47 à 58 [une fraction : 5,1 ml] et on lyophilise pour obtenir [Cys[Acm]110]-HCG [105-145] [200,1 mg]. Pf : > 230 C (décompl) [&alpha;]28D : +97,4 (c = 0,1, CCX Rf11 = 0,42 Analyse des acides aminés: Asp 4)44 (5), Thr 1 > 34 (2), Ser 5,55 (8), Goln 2,06 (2), Pro 11,76 (11), Gly 0,98 (1), Ala 1,00 (1), Gys-Cys 0,25 (0,5), Ile 0,97 (1), Leu 4 (4), Phe 1,00 (1), Lys 1,01 (1), His 1 > 03 (1) Arg 2,12 (2). Exemple 6 [Cys(Acm)110]-HCG [100 - 145] : 1) p(100 - 145): On dissout la substance [41] C8,44 g, 1,5 mM] de l'exemple 3 dans le DMF [35 ml] [pH 33 et on ajuste à pH 7 en ajoutant du NMM [0,48 ml) à -10tC. On y ajoute du BOC-Cys[MBzl]-Gly-Gly-Pro-Lys[z)-Asp(OBzl)-Hls-Pro-Leu-Thr [Bzl]-Cys[Acm]-Asp[OBzl]-OH (550 [3,78 g, 1,95 mM) et du HOBT (0,26 g, 1,95 mM) puis on ajoute une solution dans le THF [5 ml] de PCP [0,52 g, 1,95 mM].On verse goutte à goutte du WSCI C0,35 ml, 1,95 mM] à -100C et on agite à -10oC pendant 2 h et à la température ambiante pendant 3 h. 'On verse goutte à goutte du WSCI [0,36 ml, 1,95 mM] dans le mélange réactionnel à 10 C, et on ajoute encore de la substance t553 [0,25 g, 0,13 mM). On verse goutte à goutte du WSCI 0,11 mi, 0,6 mM] à -10 C et onagite à ba température ambiante pendant la nuit. On enlève le OMF sous vide et on verse le résidu dans l'eau froide t400 ml]. On met le précipité en suspension puis on le lave 3 fois et on sèche sous vide pendant 2 jours. On dissout la matière séchée dans le méthanol-chloroforme [1:2] et on reprécipite en ajoutant de l'éther [en répétant 6 pois] pour obtenir le substance [56]. [11,59 g, rendement : 109,9%]. Pf : 135 - 1400C. [&alpha;]20,5D : -59,16 (c = 1, DMF) CCM : Rf2 = 0,21, Rf4 = 0,80 Analyse élémentaire [C359N477O90N58S4Cl.10 H2O] C% H% N% Trouvé 59,58 6,55 11,53 Calculé 59,82 6,67 11,27 2) [Cys[Acm)110]-HCgt 1100 - 145): On ajoute du thioanisol [10 ml] et de la L-méthionine C200 mg] à la substance t563 [3,51 g, 0,5 mM). On y ajoute du HF anhydre [70 ml), on agite à 0 C pendant 1 h et on enlève rapidement le HF sous vide. On ajoute de l'éther au résidu et on sépare le précipité. On dissout la poudre dans l'acide acétique 0,1 N t150 ml) et on agite avec de l'éther. On fait passer la couche aqueuse dans une colonne (3 x 40 cm] de Oowex-1 (Forme acétate) et on lyophilise l'éluet pour obtenir la poudre [2,78 g]. On dissout ceoi dans le mercapto-éthanol à 10X dans une solution d'urée 8 M. [120 ml], on ajuste à pH 9,5 en ajoutant de l'ammoniaque et on remplace par de l'azote gazeux puis on agite pendant 30 minutes. On verse la solution dans une colonne t4,5 x 12 cm] de CMC, que l'on lave avec un tampon d'acétate d'ammonium 0,01 M [pH 4,5). On élue selon un gradient linéaire d'acétate d'ammonium de 0,01 M [1 litre) à 0,1 M [1 litre) (pH 4,53. On recueille les fractions n 27-35 Cune Fraction: 12,6 ml), on lyophilise et on verse encore la poudre dans une colonne [3 x 120 cm) de Sephadex LH-20, et on élue avec de l'acide acétique 0,1 N.On recueille les fractions n 36-47 (une fraction: 6,2 ml) et on lyophilise pour obtenir la poudre t400 mg). On dissout lapoudre dans l'acide acétique 0,1 N [30 ml) et on verse dans une colonne (2,5 x 24 om] de CMC, que l'on lave avec un tampond d'acétate d'ammonium 0,01 M [pH 4,5). On élue selon un gradient linéaire avec un tampon d'acétate d'ammonium de 0,01 M t500 ml] à 0,1 M t500 ml) [pH 4,5]. On recueille les fractions n 61-70 (une Fraction: 10,2 ml) et on lyophilise pour obtenir is poudre t270 mg). On dissout la poudre dans l'acide acétique 0,1 N, on verse dans une colonne [3 x 120 cm] de Sephadex LH-20 et on élue avec de l'acide acétique 0,1 N. On recueille les Fractions n 20-87 (une fraction : 9,5 ml] et on lyophilise pour obtenir le poudre [160 mg]. On dissout ceci dans l'acide acétique 0,1 N, on verse dans une colonne [3x192 cm] de Sephadex G-50 et on élue avec l'acide acétique 0,1 N. On recueille les fractions n 55-67 Cune fraction: 9 ml) et on lyophilise pour obtenir la poudre (10,22 mg). On en dissout 100 mg dans une solution d'urée 8 M [4 ml, que l'on Fait passer è travers une colonne de Dowex-1], on ajoute de l'EUTA [0,48 g] et un tampon Tris-HCl 3 M [pH 8,6, 1,5 ml] et du 2-mercapto-éthanol (0,1 ml), puis on gite à le température ambiante pendant 24 h sous une atmosphère d'azote. Après avoir ajusté à pH 5 en ajoutant de acide acétique, on verse la solution dans une colonne (2,5 x 34 cm) de Sephadex G-25 et on élue avec de l'acide acétique 0,1 N. on recueille les Fractions n 8-12 (une fraction: 6 ml) et on lyophilise pour obtenir le produit [92 mg]. On detecte 35X de mercapto-éthanol libre par le procédé DTNB de détection des groupes mercapto. Pf : supérieur à 220 C [déc.] [&alpha;]24D : + 127 [c = 0,1, acifde acétique 0,1 N] On recueille les fractions n 61-70 (une fraction: 10,2 ml] et on lyophilise pour obtenir la poudre [270 mg]. On dissout la poudre dans l'acide acétique 0,1 N, on verse dans une colonne [3 x 120 cm) de Sephadex LH-20 et on élue avec de l'acide acétique 0,1 N. On recueille les fractions n 20-27 (une fraction: 9,5 ml] et on lyophilise pour obtenir la poudre t160 mg). On dissout ceci dans l'acide acétique 0,1 N, on verse dans une colonne [3x192 cm] de Sephadex G-50 et on élue avec l'acide acétique 0,1 N.On recueille les fractions n 55-67 (une fraction: 9 ml] et on lyophilise pour obtenir la poudre 10,22 mg). On en dissout 100 mg dans une solution d'urée 8 M (4 ml, que l'on fait passer à travers une colonne de Dowex-1], on ajoute de l'EDTA (0,48 g) et un tempon Tris-HCl 3 M (pH 8,6, 1,6 ml) et du 2-mercapto-éthanol (0,1 ml), puis on gite à la température ambiante pendant 24 h sous une atmosphère d'azote. Après avoir ajusté à pH 5 en ajoutant de l'acide acétique, on verse la solution dans une colonne [2,5 x 34 cm] de Sephadex G-25 et on élue avec de l'acide acétique 0,1 N. On recueille les fractions n 8-12 (une fraction: 6 ml] et on lyophilise pour obtenir le produit [92 mg]. On détecte 35% de mercapto-éthanol libre par le procédé DTNB de détection des groupes mercapto. Pf : supérieur à 220 C [déc.] [&alpha;]D28 : +127 [c = 0,1, acide acétique 0,1 N] CCM : Rf11 = 0,49 Analyse des acides aminés : Asp 4,50 (5), Thr 1,29 (2), Ser 5Z43 (8), Gln 2,06 (2), Pro 12,78 (12), Gly 2,80 (3), Ala 0,95 (1), Cys-Cys 0,34 (0,50. Ile 0,96 (1), Leu 4 (4), Phe 0,96 (1), Lys 2,06 (2), His 1,07 (1), Arg 2902 (2). Exemple 7 [Tyr 100, Cys(Acm)110]-HCG [100 - 145] : 1) P(100 - 145): On dissout la substance [41] [8,44 g, 1,5 mM) de l'exemple 3 dens le DMF (35 ml] [pH 33 et on ajuste à pH 7 en ajoutant du NMM (0,48 ml] à -10 C. On ajoute du HOBT [0,26 g, 1,95 mM] et du BOC-Tyr[Bzl-Cl2]-Gly-Gly-Pro-Lys[z] Asp(OBzl)-His-Pro-Leu-Thr(Bzl)-Cys(Acm)-Asp[OBzl]-OH [59] [3,97 g, 1,95 mM), puis on ajoute une solution dans le THF (5 ml) de PCP [0,52 g, 1,95 mX). On verse goutte à goutte du WSCI [0,36 ml, 1,95 mM] à - 10 C, et on agite à -10 C pendant 2 n et à la température ambiante pendant 3 h. On verse goutte à goutte du WSCI (0,36 ml, 1,95 mM] à -10 C dans le mélange réactionnel, on agite à la température ambiante pendant la nuit, et on ajoute encore de la substance C593 (0,31 g, 0,15 mM]. On y ajoute goutte à goutte du WSCI (0,11 ml, 0,6 mM) à -10 C et on agite à la température ambiante pendant la nuit. On enlève le DMF sous vide, et on verse le résidu dans l'eau froide (400 ml). On répète 3 fois les opérations de mise en suspension du précipité dans l'eau et de lavage, et on sèche sous vide pendant 2 jours. On dissout la matière séchée dans le chloroforme-méthanol [2:1] et on reprécipite avec de l'éther. On répète cette opération 6 fois pour obtenir la substance [80] (12,03 g, rendement ; 112,5%). Pf : 139 - 1440C 20,5 CCM : Rf2 = 0,18, Rf4 = 0,89 Analyse élémentaire [C364H477O90N58S3Cl3.10 H2O] C% H% N% Trouvé 59,60 6,47 11,16 Calculé 59,83 6,58 11,12 2] (Tyr100, cys[Acm]110]-HCG [100-145] : On ajoute de l'anisol [15 ml] à la substance [60] [3,56 g, 0,5 mM]. On y sajoute de l'HF anhdyre [70 ml]. on agite à 0 C pendant 1 h et on enlève le HF rapidement sous vide. On ajoute de l'éther au résidu. On Fait passer la poudre blanche précipitée dissoute dans l'acide acétique 0,1 N [200 ml] dans une colonne [4,5 x 16 cm] de Dowex-1 [frome acétate] et on lyophilise l'éluat pour obtenir la poudre (2,42 g). On treite ensuite de la substance [60] [3,56 g) comme ci-dessus pour obtenir la poudre [2,36 g).On dissout les poudres combinées [4,80 g) dans une solution d'urée 5 M [250 ml), on ajuste à pH 9 en ajoutant de l'ammoniaque, on verse dans une colonne [3,5 x 17 cm) de CMC. On lave la colonne avec un tampon d'acétate d'ammonium 0,01 M [[H 4,5, 500 ml) et on réalise une élution à gradient linéaire avec un tampon d'acétate d'ammonium de 0,01 m [1,2 litre] à 0,1 M [1,2 litre] (pH 4,5). On recueille les fractions n 52-60 Cune Fraction: 12 ml) et on lyophilise pour obtenir la poudre [1,72 93. On dissout ceci dans l'acide acétique 0,1 N et on verse dans une colonne [3,5 x 120 cm] de Sephadex LH-20 et on élue avedc de l'acide acétique 0,1 N.On recueille les fractions n 25-31 (une Fraction: 12,4 ml) et on lyophilise pour obtenir la poudre [0,63 g). On dissout ceci dans l'acide acétique 0,05 N (20 ml) et on verse dans une colonne CZ x 32 cm) de CMC. On lave la colonne avec un tampon d'acétate d'ammonium 0,01 M [pH 4,5, 200 ml). On procède à une élution à gradient linéaire avec un tampon d'acétate d'ammonium de 0,01 M (1 litre) à 0,05 M (1 litre) (pH 4,53.On recueille les fractions n B9- 96 (une Fraction: 9,4 ml) et on lyophilise pour bbtenir le lyophiliset (350 mg). On dissout ceci dans l'acide acétique 0,1 N, on verse dans une colonne (3,5 x 120 cm) de Sephadex LH-20 et on élue avec de l'aoide acétique 0,1 N. On recueille les fractions n 24-29 [une fraction : 12,4 ml) et on lyophi lise pour obtenir le lyophilisat [180 mg). On dissout ceci dans l'acide acétique 0,1 N, on verse dans une colonne [2 x 74 cm] de Sephadex G-50 et on élue avec de l'acide acétique 0,1 N. On recueille les fractions n 18-23 (une fraction: 6 ml) et on lyophilise pour obtenir [Tyr100, Cys[Acm]100]-HCG[100-145] [141,1 mg]. Pf : > 235 C (décomp. [&alpha;]28D : -25 (c = 0,1. acide acétique 0,1 N] CCM Rf11 = 0,45 Analyse des acides aminés (dans l'état de décomposition du peptide protégé): Asp 4,96 (5), Thr 1,15 (2), Ser 6,26 (8), Gln 2,04 (2), Pro 12,14 (12), Gly 2,93 (3), Ala 0,93 (1), Cye-Cys 0,45 (0,5), Ile 0,93 (1), Leu 4 (4), Tyr 0299 (1), Phe 1,00 (1), Lys 1,98 (2), His 0,97 (1), Arg 2,05 (2) R E V E N D I C A T I O N S 1. Peptide de Formule R-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro- Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OH où R: H ou groupe R1-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Als-Pro-Pro-Pro, R1 : H ou groupe R2-R3-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp, H ou groupe R4-Asp-His-Pro-Leu-Thr, R4 : groupe H-R5-Gly-Gly-Fro-Lys, et R5 : groupe Cys ou Tyr, et 93 : groupe Cys ou 6-moétamideméthyl-Cys, ou un de ses sels.