FR 2518570 A1 19830624 FR 8221454 A 19821221 Enzyme destinée à la décomposition d'un hydrate de carbone à poids moléculaire élevé, hydrate de carbone ainsi Cbaud procédé de sélection d'un microorganisme produisant ladite nyme et procédé de production d'une telle enzyme. La présente invention concerne une enzyme destinée à la décomposition d'un hydrate de carbone à poids moléculaire élevé, l'hydrate de carbone à poids moléculaire élevé isolé ainsi obtenu, un procédé de sélection d'un microorganisme produisant cette enzyme ainsi qu'un procédé de production d'une telle enzyme. Un procédé de préparation d'une protéine végétale purifiée (pvp) par élimination enzymatique-de la rémanence, sans dissolution et reprécipitation de la protéine, est décrit dans le brevet BE 882 769 La pureté de la pvp pouvant être obtenue par ce procédé connu n'est pas satisfaisante et demande donc à être améliorée Dans les exemples, on a mis en évidence une pureté de la pvp d'environ 85 % Même s'il est possible d'obtenir une pvp présentant une pureté d'environ 90 % suivant le procédé connu, ceci n'est possible qu'en utilisant certaines sub- stances de départ prétraitées, par exemple un concentré de protéines de soja Il serait souhaitable d'obtenir une pureté de pvp supérieure ou proche de 90 % avec une gamrne de substances de départ beaucoup plus large, particulière;-ent de la farine de soja décortiquée et dégraissée. La présente invention repose sur la découverte surprenante qu'une certaine partie du produit de la décom- position de la rémanence,tel qu'il apparaît pendant le traitement enzymatique précité, à savoir un hydrate de carbone à poids moléculaire élevé soluble dans l'eau, se fixe lui-rême sur une partie de la protéine végétale ccmme il sera expliqué plus en détail ci-après Il en résulte, bien entendu, une pureté moins bonne de la protéine Il est également apparu que l'hydrate de carbone à poids moléculaire élevé est capable de se fixer à des protéines -22518570 d'origine animale. L'invention vise donc tout particulièrement à fournir une enzyme pour la décomposition des hydrates de carbone à poids moléculaire élevé précités et qui ouvrent la possibilité de produire une pvp de pureté améliorée, ainsi qu'un procédé pour la production d'une telle enzyme. Le principe de l'invention peut être décrit de la manière suivante en référence à la figure 1 qui n'indique que les substances existant en tant que solides non dissous alors que tous les surnageants sont omis Une charge de farine de soja a été divisée en deux parties égales,partie I et partie Il (colonne a dans la figure 1). La partie I a été décomposée par voie protéolytique à un p H d'environ 8 au moyen d'ALCALASE (nom cm-mercial pour une- enzyme protéolyticue produite au noven de B lichenformis et vendue Dar NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsvoe rd, Danemark) et a été ensuite lavée à p H d'environ 8 afin d'éliminer la quantité totale de protéine et la rémanence a été séparée du surnageant et a été lavée (voir partie I, colonne a et b. figure 1) De cette manière, on a isolé une rémanence pure (désignée par rémanence I) (colonne b à la figure) La partie II de la farine de soja n'a pas été traitée; pour plus de concision, la rémanence de la partie II a été dénommée rémanence II (colonne b à la figure 1) Ensuite, la rémanence I et la partie II sont décomposées au moyen d'une pectinase commerciale, par exemple PECTINEX (nom c OM Ier- cial Dour une enzyme pectolytique produite par Schweizerische Ferment A/G Bâle, Suisse) (voir colonnes b et c à la figure 1) On a découvert de manière inattendue que la partie non dissoute de la rémanence I est beaucoup plus faible que la partie non dissoute de la rémanence II, sur base des bilans d'azote et de la masse de matières sèches (voir figure 1 dans laquelle les surfaces hachurées de la colonne c correspon- dent aux substances insolubles différentes des protéines dans l'étape indiquée ci-dessus) En outre, si le 18570 surnageant de la rémanence I traitée à la pectinase est est ajouté à la suspension de protéine de soja à p H 4,5, un polysaccharide du surnageant est lié à la protéine de soja. Ce polysaccharide du surnageant de la rémanence 1, qui est une partie du produit de décomposition de la, rémanence et qui est nettement soluble dans l'eau en l'absence de protéine de soja mais qui est lié à la protéine de soja au point isoélectrique de la protéine de soja ou autour de ce point, si la protéine de soja est présente, est désigné par SPS (nolvsaccha- ride soluble; voir figure 1 Le SPS présente une dis- tribution de poids moléculaire comprise entre 5 x 10 et 4,9 x 104 La préparation de SPS isolé apparaît dans le diagramme synoptique représenté à la figure 2 qui recouvre également certains des procédés indiqués à la figure 1 Le problème consiste donc à trouver une enzyme qui est capable de décomposer la SPS de telle manière que les produits de décomposition de SPS ne lient pas la protéine de soja ou lient celle-ci dans une mesure beaucoup moindre que le SPS ne lie la protéine de soja. Bien que la description concerne principalement la décomposition d'une protéine de soja, l'invention n'est pas limitée à une telle protéine mais concerne toutes les espèces de protéines végétales, notamment par exemple les protéines citées dans le brevet BE 992 769, page 1. Suivant la présente invention, on a à piésent. trouvé qu'en examinant l'aptitude à décomposer du SPS de soja, il est possible de sélectionner des microorganismes qui sont aptes à produire un composé qui présente une acti- vité enzymatique,en decoiposant effectivement le SPS de soja, composé désigné ci-dessous, pour plus de concision, SPS-ase. Par conséquent, sous un premier aspect, l'inven- tion concerne une SPA-ase, une carbohydrase sous une forme utilisable et capable de décomposer le SPS de soja dans des 18570 condit-ions appropriées pour donner des produits de décompo- sition qui se fixent eux-mêmes sur une protéine en milieu aqueux, à un degré moindre que celui auquel le SPS de soja se.serait fixé lui-même, avant-décomposition, sur la même. protéine dans des conditions correspondantes. En outre, on a trouvé que cette SPS-ase permettant de dégrader le SPS de soja est capable de dégrader des polysaccharides similaires au SPS et provenant de légumes. et de fruits, de manière plus complète que ne le font les pectinases commerciales et les cellulases commerciales. L'expression "forme utilisable" indiquée ci-dessus, vise à exclure de l'invention par exemple une préparation contenant une SPS-ase qui contient des substances toxiques ou qui présente une activité de SPS-ase si basse qu'elle nécessite l'utilisation de plus de 10 % d'une préparation contenant la SPS-ase, par rapport au poids du SPS dans le substrat dans une réaction effectuée pendant 24 heures, à 500 C et au p H optimal de la SPS-ase en question, pour obte- nir la décomposition du SPS présentant une importance pratique. La pureté de la protéine végétale finale est néces- sairement améliorée par une élimination totale ou partielle du SPS de la protéine végétale finale par rapport à la pureté de la protéine végétale finale obtenue suivant le procédé du brevet BE' 882 769 du fait que' cette protéine végétale connue était contaminée avec du SPS. On ne sait pas à présent, si la SPS-ase particulière décrite ci-après développe son activité enzymatique à partir d'une seule enzyme ou à partir d'un complexe d'enzymes com- prenant au moins deux enzymes Certaines recherches semblent indiquer qu'au moins deux enzymes sont responsables de l'effet de décomposition de la SPS-ase,-une de ces enzymes étant capable de n'effectuer qu'une légère décomposition du SPS, après quoi une ou plusieurs-enzymes sont capables d'effectuer une décomposition plus importante du-SPS Une telle-hypothèse ou des hypothèses semblables 18570 ne doivent cependant pas limiter la portée de l'invention. Suivant une forme d'exécution particulièrement préférée de l'invention, la SPS-ase est caractérisée en ce qu'elle est capable de décomposer du SPS de soja, en milieu aqueux, pour donner des produits de décomposition qui se fixent eux-mêmes sur une protéine végétale, en mi- lieu aqueux, à un degré moindre que celui auquel le SPS de soja se serait fixé lui-même, avant décomposition, sur la même protéine végétale, en milieu aqueux. Suivant une forme d'exécution préférée de la pré- sente invention, la SPS-ase est caractérisée en ce qu'elle permet de décomposer du SPS de soja en milieu aqueux à un p H ne s'écartant pas de plus de 1,5 unités de la valeur 4,5, pour donner des produits de décomposition qui se fixent eux-mêmes sur une protéine de soja, en milieu aqueux, à un dégré moindre que celui auquel le SPS de soja se serait fixé lui-même, avant décomposition, sur la pro- téine de soja, en milieu aqueux. Suivant une forme particulièrement préférée de la présente invention la SPS-ase est caractérisée en ce que les produits de décomposition du SPS de soja, après dégra- dation complète, se fixent eux-mêmes sur la protéine végé- tale à un degré représentant une valeur inférieure à 50 %, en particulier inférieure à 20 %, que celui auquel le SPS- de soja se serait fixé lui-même, avant décomposition, sur la protéine végétale, en milieu aqueux. Suivant une forme particulièrement préférée de la présente invention la SPS-ase est caractérisée en ce qu'elle réagit positivement au test de la SPS-ase, lors- qu'il est exécuté suivant le procédé de détermination qualitative et quantitative de la SPS-ase décrite dans cette description. Suivant une forme d'exécution particulièrement pré- féré de la présente invention, la SPS-ase est produite au moyen d'un microorganisme appartenant au genre d'Aspergillus, de préférence appartenant au groupe Aspergillus niger. Suivant une autre forme d'exécution particulière- ment préféré de la présente invention, la SPS-ase est dérivée des enzymes pouvant être obtenue au moyen de Asp aculeatus CBS 101 -43 La mêime SPS-ase peut être obte- nue par A Sp japonicus IFO 4408 On a trouvé que Asp. aculeatus CBS 101 43 produit également des rémanases, des cellulases, des pectinases et des hémicellulases très effi- caces En outre, on a trouvé que toutes les souches appar- tenant aux souches Asp aculeatus ou As japonicus ne con- viennent pas pour produire une SPS-ase nécessaire dans le cadre de l'invention Ainsi, comme il apparaît dans un paragraphe ultérieur de la présente description (partie 5), on a prouvé que Asp japonicus ATCC 20236 ne produit pas suffisamment de SPS-ase pour que celle-ci puisse être détectée par la détermination enzymatique de la SPS-ase décrite dans le présent mémoire descriptif. Suivant une autre forme d'exécution particulière- ment préférée de l'invention, la SPS-ase est identique au point de vue de l'immunoélectrophorèse à la SPS-ase produi- te au moyen de Asp aculeatus CBS 101 43 et peut être iden- tifiée au moyen de la technique de recouvrement électropho- rétique (cfr parties 6 et 7). Lorsque la SPS-ase est produite par voie microbio- logique, elle est obtenue en mélange avec différentes substances accompagnantes, particulièrement d'autres enzymes. Si on le désire, la SPS-ase en question peut être purifiée, par exemple au moyen des procédés de séparation chromatogra- phique, comme on le verra plus tard dans ce mémoire (partie 8). Dans Agr Biol Chem 40 ( 1), 87-92, 1976, on décrit qu'une souche de Asp japonicus, ATCC 20236 produit un complexe d'enzymes qui-est capable d'effectuer une décom- position partielle d'un polysaccharide acide dans une sauce de soja, nommée APS, dont une fraction est désignée par APS-1 Ce polysaccharide acide n'est pas identique au SPS, ce qui sera montré plus loin et plus en détail dans ce mémoire des- criptif à la partie 3 Ainsi les chromatooramnes de chromatographie li- quide de haute performance (HPLC)de filtration sur gel du SPS et de -À - "- 2518570 l'APS sont nettement différents, et,en outre, les chromratooramnes de filtration sur gel de l'APS décomposée par la pectinase commerciale Pectolyaseet d'un SPS traité avec la pectinase commerciale Pectolyase sont nettement différents En outre, il n'apparait pas dans cet article que le polysaccharide acide est lié à la protéine de soja et que le polysacchari- de acide décomposé n'est pas lié à la protéine de soja ou y est lié à un degré nettement inférieur à celui d'un poly- saccharide acide non décomposé On a également prouvé que cette souche ne forme pas de SPS-ase en une quantité suffi- sante pour une détection au moyen d'une détermination enzy- matique de la SPS-ase décrite dans cette description Ceci créait un préjugé à l'égard de toute souche de Asp Japonicus en tant que producteur de SPS-ase;^cependant, suivant - l'invention, on a trouvé de manière inattendue quecertaines souches de Asp japonicus-sont des producteurs de SPS-ase. Suivant un deuxième aspect, la présente invention concerne le SPS isolé, produit à partir d'une protéine végétale brute servant de substance de départ. Un mode d'exécution préféré du SPS isolé suivant la présente invention est caractérisé en ce que la protéine végétale brute consiste en une farine de soja dégraissée. La préparation de ce SPS isolé est décrite dans ce-qui précède, en référence à la figure 2. Suivant un troisième aspect, la présente inven- tion concerne un procédé de sélection d'un microorga- nisme produisant une SPS-ase permettant de produire la SPS- ase suivant l'invention, dans lequel le microoraanisme à tester est cultivé S u r u N milieu de fermentation dont la source principale de carbone est le SPS, après quoi un échantillon du milieu de fermentation est analysé Dour la détermination de la SPS-ase et le microorganisme en question est choisi en tant que microorganisme produisant une SPS-ase si l'analyse de détermination de la SPS-ase est positive. CBS 101 43 produit également des enzymes solubilisant la rémanence,des cellulases, des pectinases et des hémicellu- lases très efficaces en plus de la SPS-ase et que le com- plexe d'enzymes produit au moyen de la souche Asp aculeatus CBS 101 43 convient extrêmement bien en tant qu'agent des- tiné à la désintégration de parois cellulaires des substan- ces végétales Ainsi, le complexe d'enzymes produit par Asp aculeatus 101 43 peut être utilisé dans l'industrie alimentaire avec d'excellents résultats, pour le traite- ment de purées de fruits et de légumes et-pour clarifier et réduire la viscosité lors de la production de jus et de vins; on peut également l'utiliser comme agent de déshydra- tation (à savoir un agent de décomposition de polysaccha- rides et par conséquent de libération de l'eau liée à l'intérieur de la structure polymère des polysaccharides) dans le traitement de végétaux. Un cinquième aspect de la présente invention concer- ne l'utilisation d'une SPS-ase ou un procédé de décomposi- tion de polysaccharides, de préférence des polysaccharides de parois cellulaires de plantes, au moyen d'une carbohy- drase, procédé dans lequel on met une préparation de SPS- ase suivant la présente invention en contact avec un sub- strat pour ladite préparation de SPS-ase, en un milieu aqueux, exception faite des décompositions déjà décrites dans la demande de brevet danois n 5691/81. Ainsi, on a trouvé, suivant la présente invention, que les préparations de SPS-ase sont des préparations d'enzymes efficaces pour la liquéfaction ou la décomposi- tion partielle ou totale de différentes substances, de préférence des substances végétales, par exemple des fruits et des déchets de plantes, contenant des protéines, de la cellulose, de l'hémicellulose,(par exemple des glucannes, du xylane, des galactanes et de l'arabanne), des gommes, de la pectine, des lipides, de l'inuline, des polyphénols, de l'amidon et des alginates; elles peuvent également être utilisées pour des applications qui y sont apparentées, Suivant un quatrième aspect, la présente inven- tion concerne un procédé de production de SPS-ase, suivant lequel une souche choisie suivant le procédé ci-dessus de sélection d'un microorganisme produisant une SPS-ase est cultivée dans un milieu nutritif La culture peut être effectuée e N fermentation noyée (basse) ou en fermentation en surface (haute>. Un mode d'exécution préféré du procédé suivant l'invention est caractérisé en ce que la souche s. aculeatus CBS 101 43 ou Asp japonicus IFO 4408 est cultivé dans un milieu nutritif. Suivant un mode d'exécution préféré de l'inven- tion, le procédé est caractérisé en ce que la culture. est effectuée e N culture noyée à un p H compris dans l'intervalle de 3 à 7, de préférence de 4 à 6, à une température comprise dans l'intervalle de 20 à 40 OC, de préférence de 25 à 35 OC et en ce que le milieu nutritif contient des sources de carbone et d'azote et des sels inorganiques. Suivant un autre mode d'exécution particulière- ment préféré de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que le milieu nutritif contient de la farine desoja, de préférence grillée. Suivant un autre mode d'exécution particulière- ment préféré de la présente invention, le procédé est caractérisé en ce que la farine de soja est traitée par une enzyme protéolytique avant d'être utilisée comme composant du substrat, l'enzyme protéolytique étant, de préférence, produite par voie microbiologique au moyen du B licheniformis. Suivant un autre mode d'exécution préféré de l'invention, le procédé est caractérisé en ce qu'on ajoute une solution de pectine de manière aseptique au bouillon de fermentation pendant la culture. On a trouvé que la souche Asp aculeatus voir le tableau ci-dessous dans la description A titre d'exemple pour de telles applications onpeut citer toutes les applications pour lesquelles les pectinases et cellu- lases commerciales sont utilisées-de nos jours Différents exemples seront donnés plus loin dans cette description. En ce qui concerne le procédé d'extraction (d'isolation) décrit dans l'exemple 2, par exemple, il faut noter que la préparation de SPS-ase est essentiellement exempte de protéinase, étant donné que le produit final désiré, à savoir la protéine, serait décomposé dans le cas contraire De même, si l'on désire extraire (isoler), d'une substance biologique brute, des substances biologi- ques différentes de la protéine, la préparation de SPS-ase utilisée sera essentiellement exempte de toute-enzyme dégradant cette autre substance biologique Une telle préparation de SPS-ase modifiée peut être produite par inactivation sélective-de l'enzyme indésirée, par fraction- nement ou par-un autre procédé connu en soi. Ainsi, un mode d'exécution préféré de la présente invention est caractérisé en ce que la composition est accompagnée par l'isolation ou l'extraction d'une substance biologique différente d'une protéine de soja et de protéines végé- tales apparentées d'une substance biologique brui 2 e, la préparation de SPS-ase étant essentiellement exempte de toute enzyme capable de décomposer ladite substance biolo- gique. Suivant la présente invention, on a donc trouvé que les préparations modifiées de SPS-ase (modifiées dans le sens qu'elles sont essentiellement exemptes d'enzymes capables de décomposer la substance biologique à extraire ou à isoler) sont des préparations d'enzymes efficaces pour l'extraction (isolation) de-substances biologiques spéci- fiques, par exemple l'amidon, les lipides, les arômes, les pigments et les essences de substances biologiques brutes. Plusieurs exemples seront donnés plus tard dans cette des- cription. Suivant un m Dde particulièrement préféré de la présente invention, l'utilisation suivant l'invention est caractérisée en ce que l'un ou plusieurs des produits de réaction (sans distinguer s'ils sont des produits finals recherchés ou des déchets) sont traités ulté- rieurement en même temps que le traitement par enzyme ou après celui-ci. Ceci fournit une utilisation plus flexible et pouvant être mieuxadaptée. Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré de la présente invention, l'utilisation est caractérisée en ce que le traitement ultérieur consiste en une fermentation alcoolique dans le cas o le produit de réaction est un sucre fermentable Ainsi on fournit un procédé simple et bon marché pour la production d'alcool. Afin de mieux expliciter la nature de la présente invention, on se référera à la description qui suit et qui est divisée en diffé- rentes parties numérotées de 1 à 10 décrivant chacune les détails spé- cifiques relatifs à la présente invention Les différentes parties sont comne suit: 1 Préparation du SPS. 2 Caractérisation du SPS, en particulier la distribution du poids moléculaire de celui-ci. 3 Essais prouvant la différence entre SPS et APS. 4 Sélection de microorganismes produisant de la SPS-ase. Caractérisation de certains microorganismes formant de la SPS-ase. 6 Description générale de la technique de recouvrement associée à des imnunoélectrophorèses. 7 Caractérisation imnnunoélectrophorétique de la SPS-ase avec un anticorps polyspécifique et recouvrement. 8 Purification d'une préparation de SPS-ase. 9 Dépendance de l'activité à l'égard du p H et de la tem- pérature et stabilité d'une SPS-ase. Détermination de l'activité enzymatique. -.251857-0 PARTIE 1. PREPARATION DU SPS. Comme déja mentionné précédemment, la substance de départ pour-la préparation du SPS peut être la rémanence de soja C'est pourquoi, on décrira d'abord la préparation d'une rémanence de soja. La rémanence de soja est une fraction d'hydrate de carbone exempte de protéines (qui, en pratique, peut contenir de faibles quantités de lignine et matières miné- rales), contenue dans la farine de soja dégraissée et décortiquée, ladite fraction d'hydrate de carbone étant insoluble dans un milieu aqueux à p H 4,5 et pouvant être préparée de la manière suivante, en référence a:u tableau synoptique n 1. La farine de soja dégraissée (Sojamel 13 de Aarhus Oliefabrik A/S) est mise en suspension dans de l'eau désionisée à 50 C dans un proportion pondérale de farine de soja à l'eau de 1:5, dans un réservoir contenant un équi- pement de stabilisation de p H et de température On règle le p H à 8,0 au moyen de Na OH 4 N ( 1 I) On effectue une hydrolyse à p H stationnaire aiu moyen d'ALCALASE 0,6 L (une enzyme protéolytique à base de B licheniformis ayant une activité de 0,6 unités Anson par gramme, l'activité'étant déterminée suivant la méthode Anson, comme décrit dans NOVO ENZYME INFOR-t ATION IB No 058 e-GB) Le rapport enzyme/ substrat correspond à 4 % de la quantité de protéines dans la farine de soja (II) Après une hydrolyse pendant une heure, la boue est séparée par centrifugation (III) et on lave (IV), cette opération étant effectuée- deux fois (V, VI, VII) La boue ainsi traitée est-ensuite hydrolysée une fois de plus pendant une heure au moyen d'ALCALASE 0,6 L (VIII, IX), de manière similaire à ce qui a été dit-ci-dessus. Ensuite la boue séparée par centrifugation (X) est lavée deux fois (XI, XII, XIII, XIV}, la boue finalement lavée ( 6) étant séchée par pulvérisation (XV) La poudre ainsi produite, séchée par pulvérisation est la rémanence de soja servant de matériau brut pour la production de SPS. Le SPS est la fraction soluble à l'eau de poly- saccharide qui est obtenue par un traitement classique de la rémanence de soja susmentionnée avec de la pectinase. Le SPS est préparé de la manière suivante au moyen des 14 étapes réactionnelles indiquées ci-dessous, en référence au tableau synoptiquen 2. 1 On détermine la teneur en matière sèche de la rémanence susmentionnée et on dilue la rémanence de soja dans de l'eau à raison de 2 % de matière sèche et ladite rémanence de soja est maintenue en suspension à 50 C dans un réservoir comportant un règlage de température. 2 On règle-lavaleur du n HE 4,50 au moyen de Na O Hi 6 N. 3 On ajoute en une quantité de 200 g/kg de matière sèche du Pectinex Super concentréL(pectinase commerciale de la Schweizerische Ferment AG, Bâle, Suisse présentant une activité en pectinase de 750 000 MOU, déterminée suivant le feuillet "Détermination of the Pectinase units of Apple Juice (MOU)" du 12 6 1981, disponible à la Schweizerische Ferment AG, Bâle, Suisse) et on ajoute égaaement en quantité de 20 g/kg de matière sèche du Celluclast 200 L (cellulase commerciale décrite dans le feuillet NOVO enzymes, information sheet B-153 e-GB 1000 juillet 1981, disponible chez NOVO INDUSTRIE A/S,Novo Alle, 2880 Bacsvaerd, Danemark) 4 Le contenu du réservoir est maintenu à 50 C pendant 24 *heures en agitant. 3 Les enzymes sont inactivées en augmentant le p H à 9,0 au moyen de N;a OH 4 N Le mélange réactionnel est main- tenu tel quel pendant 30 minutes et le p H est ensuite réajusté à 4,5 au moyen de HC 1 6 N. 6 Le mélange réactionnel est centrifugé et on récupère le produit de centrifugation ainsi que la boue. 7 Le produit de centrifugation de l'étape 6 subit une filtration de contrôle sur un filtre presse (le filtre est lavé à l'eau avant la filtration de contrôle). 8 Le filtrat de contrôle est soumis à une ultrafiltratior à une diafiltration et ensuite encore à une ultrafiltra- tion sur une membrane présentant une valeur de coupure de 30 000 (DDS GR 60-P de De Danske Sukkerfabrikker), en ayant recours aux paramètres suivants: 1 Ultrafiltration correspondant à une concentration de volume de 6. 2 Diafiltration jusqu'à ce que le pourcentage en matière sèche dans le perméat soit égal â(I O Brix), 3 Ultrafiltration jusqu'à-environ 15 % de matière sèche dans le concentrat. La température est de 50 C, le p H est de 4,5 et la pression moyenne de 3 bars. 9 Le concentrat soumis à l'ultrafiltration est refroidi jusqu'à 5 C et on ajoute un volume égal d'éthanol à 96 %. 10 On récupère le précipité au moyen d'une centrifugeuse. 11.Le précipité est lavé deux fois par de l'éthanol dans l'eau à 50 % v/v, correspondant au volume du produit de centrifugation de l'étape 10, c'est-à-dire qu'on effectue deux centrifugations. 12 Le précipité lavé est remis en solution dans l'eau en un volume qui correspond au volume de concentrat de l'étape 9 soumis à ultrafiltration. 13.Le liquide de l'étape 12 est soumis à une filtration de contrôle sur un filtre de verre. 14 Le filtrat clair contenant du SPS pur est lyophylisé. 251 '8570 TABLEAU SY-, 'OPTIQUE Z 1 li O Na OH jusqu'à p H 8 Farine de soja serais 2 e d"i%,drolyse Alcalase O 6 L (E/S= 4 %) yse 1 heure avant déc 11-iargeme p'1-stat 8 T = 50 ' CI Na OH 4 LI 1)roduit de lère centrifugation III 4 "centrifug 1 boue 1 1 vers décharge H ler 1-avace produit -de 2 c centrifugation V cen tri fug 2 boue 2 ' vers décharge H 2 O 2 c lavage T'roduit de trifugation VU r 7 c cen E C_ entrifug 3 boue 3, fers décharge C II 1 Z;ouveau mélange d'hydrolys lJI Na Cii issu, à r, i i = 5 Ilydrolvse 1 avant décharqement pli 50,C) I:aoli, n-duit de 4 c centrîfu:aticn X C(, ntrifug 4 ALCALASE 0,6 L boue 4 vers décharge H 20 ier lavage 1)1 iduit de e centrifugation I I C -r-ntrifug 5 1 E_ -1-1 - 247 1 H Décomposition par pectinase et 1, 2, 3, 4,5 cellulose li 1 = 1 5: 24 hetirp, y- 1 Centrifugation -1- I i:'1 traticn-de ccn'rÈlei y j Précipita-lion r _ y - I 2518570 _ r AB-L EiU SYNOPTYQUE No 2 1000 g Pectinex Super Conc L cr Celluclast 250 S kg rémanence séchée par pulvérisation Bnuf, 3 à kg' Ultrafiltration, diafiltration, ultrafiltration (GR60 P) ( 19 à26OC) - T surnageant ic; 2 5 I('z à goe" (décharge) produit de centrifugation 1 _,_ 10 ité 2 x produit de Centrifugatior 2 x lavage 1 centrifugation- 1 1 précipité 1 3 Redissolution y 1 Bc JUP de r)rotéi Drc - -:111 de conti Er (décharge) 1 - y 1 Lyophïlisat 310 g de SPS lyophilisé 18 1 H 20 __ 24-1 de per- méat 1 O récir y 2 1 H 20 PARTIE 2 CARACTERISATION DUSPS, EN PARTICULIER DISTRIBUTION DU POIDS MOLECULAIRE DE CELUI-CI. On a déterminé (fig 4), la distribution du poids moléculaire du SPS dont la productioh est effectuée comme indiqué dans ce mémoire, au moyen d'une chromatographie sur gel dans un équipement f IPLC (pompe Waters, modèle 6000, module de données 730 de Waters et réfractomètre R 401 de Waters) On a également déterminé (fig 5) la distribution du poids moléculaire des produits de décomposition du SPS par la SPS-ase suivant le mime brocédé En outre, on a montré par la m éme methode,l'effet de liaison entre la prot Aine de soja et le SPS (fig 6) et l'absence d'effet de liaison entre la protéine de soja et le SPS décomposé par l'agent suivant l'invention (fig 7). La courbe de calibrage (le logarithme du poids moléculaire en fonc- tion de Rf o la valeur Rf pour le glucose est arbitrairement léfinie corme étant 1 et o la valeur Rf d'un dextrane smécifique est définie en tant que temps de rétention de ce dextrane divisé par le temps de rétention du glucose) a été établie au moyen de plusieurs dextranes étalons ayant des poids moléculaires connus (T 4, T 10,T 40, T 70, T 110, T 500) vendus par Pharmacia Fine Chemicals AB, Boite 175, S-75104, Uppsala, Suède On a trouvé la valeur R, pour le maximum de chaque pic de dextrane et le poids moléculaire correspondant a été calculé en tant qu n ou est la valeur moyenne pondérale du poids molécu- laire et M est la valeur moyenne numérique du poids molé- n culaire On a utilisé du a Nal O 3 0,1 MI corie éluant pour ce processus chrcmatographique Les colonnes utilisées dans ce processus chromatocraphique sont la colonne PW 5000 de cm suivie par une colonne PW 3000 de 60 cm vendues par Toyo Soda Mtanufacturing Co, Japon On a établi la relation entre le poids moléculaire et la valeur R pour les dextranes indiqués ci-dessus de cette manière, cfr fig 3. A partir de la fig 4, on peut calculer que le SPS présente une distribution de poids moléculaire qui est Islis O caractérisée par une valeur ew d'environ 5,4 x 105 et par w 4 une valeur;i d'environ 4,2 x 10 Il apparaît également n dans cette figure que le chromatogramme présente deux pics distincts à un temps de rétention de 34,5 minutes ( 6 %) correspondant à un poids moléculaire d'environ 5 x 10 et a un temps de rétention de 47,12 minutes ( 67 %) correspon- dant a un poids moléculaire d'environ 4,9 x 10 Il apparaît également de cette courbe qu'il existe un épaule- ment entre ces deux pics à un temps de rétentibn de 41,25 minutes ( 27 %) correspondant à un poids moléculaire de 2,8 x 105 Après la décomposition du SPS par la SPS-ase, le mélange d'hydrolyse a été filtré sur membrane et le filtrat a été soumis à la chromatographie On a trouvé qu'environ 55 % du SPS est décomposé en monosaccharide, disaccharide ' et trisaccharide et que le résidu de 45 % a été décomposé en un polymère présentant trois pics correspondant au poids moléculaires suivants: 5 x 104, 10 et 44 x 103, cfr fig 5. Dans le but de démontrer l'effet de la liaison entre la pro- téine de soja et le-SPS et la réduction substantielle de l'effet de liaison entre la protéine ce soja et le SPS décomposé au moyen de la SPSase, on a effectué les essais suivants 3 % de SPS dans un tampon acétate 0,10 M à pli 4,5 est ajouté à une boue d'un isolat de soja (Purina E 500) afin de générer une suspension présentant le rapport isolat/ SPS correspondant à 10:1 On fait incuber cette suspension pendant 18 heures dans un bain agité à 50 o C Apres incubation, la suspension est centrifugée et le surnageant cla r es L analysé par IIPLC con me décrit précédem ent En comparant la fig 6 à la fig 4, il apparaît que le SPS est complètement adsorbé sur l'isolat de soja. Le-m mre processus que celui mentionné dans le paragraphe précédent est mis en oeuvre avec une solution à 3 % de SPS hydrolysé avec une SPS-ase produite par CBS 101 43 (fig 7) En comparant la fig 7 et la fig 5, on constate qu'aucun composé du SPS hydrolysé présentant un poids moléculaire inférieurà-environ 104 n'est adsorbé sur l'iso- lat de soja L'hydrolyse réduit la liaison quantitative jusqu'à environ 10 à 15 % par rapport à la liaison du SPS à la protéine de soja. Une analyse R 4 K du SPS, dont la production est effectuée commrse indiqué dans ce mémoire, révèle la composi- tion approximative suivante du SPS: 1) acide c-galacturonique en une quantité d'environ 45 %, approximativement 40 % de la quantité totale d'acide c-galacturonique étant présentsen tant qu'ester méthylique. 2) rhamnopyrannose en une quantité d'environ 20 %, 3) galacto O yrannose en une quantité d'environ 15 %, et t 5 4) -1 xylopyrannose en une quantité d'environ 20 %. Les constituants semblent être présents suivant une structure comprenant une chaîne principale rhamnogalacturo- nicue et des chaînes latérales de xylose et de galactose. L'hydrolyse acide co>lète du SPS ( 8 heures dans H 2504 IN) et l'analyse par chromatographie en couche mince (TLC)ultérieure ont révélé qu'il y a également de faibles quantités de monosaccharides fucose et arabinose dans le SPS hydrolysé. Une analyse HPLC du SPS décomposé par le complexe d'enzymes SPS-ase formé par CBS 101 43 montre une importante réduction du poids moléculaire De manière semblable, le spectre R M du SPS décomposé con-me indiqué cidessus montre qu'une majeure partie des groupes ester a disparu et que, également, la teneur en xylose et galactose dans la substance A poids moléculaire plus élevé a diminué Le spectre P-l de la partie du produit de décomposition du SPS qui précipite par addition d'un volume d'éthanol à un volume de produit de décompositiondu SPS est semblable au spectre R- :; du SPS qui a subi les modifications susmentionnées en ce qui concerne les groupes ester et la teneur en xylose et galactose PARTIE 3 ESSAIS PROUVANT LA DIFFERENCE ENTRE SPS ET APS On a préparé le APS comme mentionné dans-Agr. Biol Chem, Vol 36, No 4, p 544 550 ( 1972). On a ensuite hydrolysé ce polysaccharide et le SPS avec ci'fférentes cenzymes, puis on a soumis le mélange de décomoresition à une chromatographie sur gel par un équipement Hi PLC, comme mentionné dans la deuxième partie, "Caractérisation du SPS, en particulier la dis. tribution du poids moléculaire de celle-ci". Plus précisément, on a effectué les hvdrolyses par traitement d'une solution de 25 ml de 2 % de APS ou de 2 % de SPS dans un tampon acetate 0, 1 M ayant un p H-de 4,5 par 10 mg de KRF 68 ou 30 mg de Pectolyase Le IRF 68 est une préparation de SPS-ase dont la fabrication est décrite à l'exemple 1 Les résultats sont repris dans le tableau suivant: PARTIE 4 SELECTION DE MICROORGANISMES PRODUISANT DE LA SPS-ASE. Le microorganisme à tester est soumis à une incubation sur un substrat incliné d'agar présentant une cor mosition qui permet la croissance du microorganisme. Aprè's une croissance initiale sur le substrat incliné d'agar, le microorganisme est transféré dans un substrat principal liquide dans lequel la source de carbone princi- pale est le SPS (préparé comme indiqué), dans lequel la Poivsaccharide| Enzym-e J Chrcmatogranme Polysaccharide _ __ IIPLC sur gel De Cfc Sép JO I I l I I l' 'as e APS ct ' fig 8 x APS KRF 63 fici9 x SPS r ectc fig 10 x l_.ase S PS,-Ut F 68 fig 5 source d'azote est du NO 3,NH 4 de l'urée, des acides aminés libres, des protéines ou d'autres composés conte- nant de l'azote et qui contient en outre, un mélange de sels nécessaires et de vitamines, de préférence sous forme d'un extrait de levure La composition du substrat prin- cipal dépend du genre du microorganisme, la considération principale consistant en ce que le substrat principal est capable de supporter la croissance et le métabolisme du microorganisme Lorsque la croissance a eu lieu pendant une durée adéquate, de l'ordre de 1 à 7 jours, en fonction de la vitesse de croissance du microorganisme en question, on analyse un échantillon du bouillon de culture pour la détermination de la SPS-ase suivant la détermination enzy- matique de la SPS-ase décrite dans cette description ou suivant toute autre détermination de SPS-ase adaptée à des utilisations spécifiques de la SPS-ase différentes de l'utilisation en tant que composant d'un agent de décompo- sition de la rémanence de soja. Afin d'avoir une technique plus sensible pour la détermination de l'activité enzymatique, on peut abaisser la température à 40 C et on peut augmenter le temps d'incu- bation à 20 heures pendant la détermination de l'activité de SPS-ase, des antibiotiques pouvant être ajoutés au substrat dans le but d'éviter une infection. Par cette technique, on peut trouver d'autres microorganis- mes produisant de la SPS-ase appartenant au genre Aspergillus ainsi qu'à d'autres genres. PARTIE 5 CARA Cr ERISATION DE CERTAINS MICROORGANISMES FORMA@T DE LA SPS-ASE Par la technique de sélection pour des microorga- nismes produisant de la SPS-ase indiquée dans ce mémoire descriptif, on a trouvé que les microorganismes cités dans la partie supérieure du tableau suivant sont des producteurs de SPS-ase Le tableau contient également une souche appartenant à l'espèce Asp ja Donicus qui n'est pas un producteur de SPS-ase Une identification courte des souches indiquées' ci-dessus peut être trouvée dans les catalogues de culture suivants List of Cultures 1978, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Pays-Bas. List of Cultures, 1972, 5 è édition, de l'"Institute for Fermentation" Osaka, 17-85,Juso -honmachi 2-Chorite, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japon The American Type Culture Collection Catalogue of Strains I, 14 è édition 1980, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Etats-Unis d'Anmérique. Toutes les souches du tableau indiqué ci-dessus correspondent étroitement à la description taxonomique-de S' espèces Asp japonicus et Asp aculaétus décrites dans "The genus Aspergillus" de Raper et Fennell, 1965 (voir particulièrement les pages 327 à 330). PARTIE 6 DESCRIPTP'ION ' GE ERALE DE LA TECHNIQUE DE RECOUVREMENT ASSOCIEE A r ES I",MUN'OELECTROPHIORESES. La demanderesse a dévelo Dpé un procédé donommé "tech- niaue de recouvrement de top-a Tar" nour identifier les caposants individuels d'un complexe d'enzymes par immunoelectrophorèse croisée au moyen d'un anticorps polyspécifique pourtous les cc osants d'enzyme du complexe d'enzymes Le -procédé est 7 roducteurj e -S ascEspèces Dénomrination Premier 2.e SF S-asóI Epce Js.: I de la Dénomination dépôt Oui |;on j ajo laédemnanderesse officielle année x x A 805 CBS 101 43; DSI 1 M 2344-1943 x x A 1443 IFO 4408; DSM 23461950 -x x A 1384 ATCC 20236-; DSM 23451969 basé sur le fait que les enzymes sont encore actives après la liaison spécifique entre l'enzyme et l'anticorps ou, exprimé de manière différente, le procédé est basé sur le fait que le site enzymatique actif n'est pas identique au site de la liaison enzyme- anticorps Les complexes enzyme-anticorps précipitent en tant qu' arcs distincts dans le gel pendant l'électrophorèse La plaque de gel est recouverte avec du SPS soluble dans' diu"top-agar' Après chauffage à 45 C pendant 20 heures dans une atmosphère ayant une humidité relative de 100 %, l'arc qui possède une activité de SPS-ase apparaît en tant que zone claire dans la couverture de SPS après précipitation par un mélange de parts &,ales en voiic d'éthanol et d'acétone, lorsqu'on regarde du dessus contre up fond noir Les arcs qui ne présen- tcmt pas d'activité SPS-ase restent invisibles. PARTIE 7. CARACTERISATION I' -I Ur NOELECTROPHORETIQUE DE LA SPS-ASE AVEC UN ANTICORPS POLYSPECIFIQUE ET RECOUWRE 1 E Nt T. On a irmmunisé des lapins par le complexe d'enzymes contenant la SPS-ase Cbtenu par fermentation de Aspergillus aculeatus CBS 10 11 o 43, comme indiqué dans l'exen Dmple 1 (KRF 68) et on a récupéré l'anticorps polyspé- cifique d'une manière connue en soi Au moyen de cet anticorps poiyspécifique on a effectué une immunoélectro- phorèse croisée du complexe d'enzymes obtenu par fermentation de l'Aspergjillus aculeatus CBS 101 43, comme indiqué à l'exemple I (KRF 68), i'immunoélectrophorèse croisée ayant été décrite par N l Axelser et autres, dans "A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis", Eune édition/ 1977 On se réfère à la fig 11 qui montre les arcs correspondant aux différentes protéines produites par le microorcanisme On a trouvé, au moyen de la"technique de recouvrnement de "top-agar" décrite précéde mment, que la surface hachurée correspond à la SPS-ase. Si l'hypothèse susmentionnée supposant que la SPS-ase consiste en au moins deux enzymes est correcte, la surface hachurée est la surface dans laquelle se trouvent toutes les enzymes responsables de l'activité de SPSase Si, suivant d'autres modes d'exécution de la présente invention, on peut séparer des enzymes par irmunoélectrophorèse de telle manière qu'elles ne couvrent aucune surface mutuelle, on peut-encore identifier une partie de l'activité de SPS-ase aul moyen d'immunoélectro- phorèse avec un recouvrement avec à la fois le SPS et une pectinase commerciale. PARTIE 8. PURIFICATION D'UNE PREPARATION DE SPS-ASE. On a effectué la purification de la préparation de SPS-ase KRF 92 (voir exemple 1) par échange d'ions. Le tampon est le Tris (tris-hvdroxvnéthvlamino-méthane ( 50 m 1) qui est réglé à p H 7 au moyen de HC 1 La colonne est une colonne K 5/30 vendue par Pharmacia, Suede La substance d'échange d'ions est du DEAE-trisacryl vendu par LKB, Bromma, Suède ( 300 ml) La vitesse de passage est de ml/heure. On a dissous 15 g de la préparation de SPS-ase KRF 92 dans 450 ml de I 120 at 6 C et toutes les opérations indiquées ci-dessous ont été effectuées entre 6 et 10 C. On a réglé le p H à 7,0 au moyen de Tris 1 La colonne a été équilibree au moyen du tampon et on a ensuite introduit l'"chantillon de SPS-ase dans la colonne On a mesuré OD 280 (densité optique à 280 nm) et la conductivité de l'éluat; voir à la fig 12 La fraction 1 correspond à l'éluat qui n'est pas lié à la substance d'échange d'ions Ensuite la colonne a été lavée avec 2000 ml de tampon, ce cui donne la fraction 2 On a ensuite établi un gradient de Na Cl 0-500 iri ce crui donne les fractions 3 9 Les neuf fractions ont été concentrées à 200 ml et ont été dyalisées contre l'eau à une conductivité de 2 m Si par dialyse (Hollow Fiber DP 2 de Amicon, Massachussetts, U S A) Ensuite les neuf fractions ont été lyophilisées Uniquement les fractions 1 et 2 présentaient une activité de SPS-ase. La fraction 1 a été purifiée ultérieurement par une filtration sur gel On a dissous 1,5 g de la fraction 1 dans 10 ml d'acétate de sodium 50 m M ayant un EDH de 4,5 (KCl 500 m M) La colonne est une colonne de 2,5 x 100 cm de LKB La substance servant à la filtration sur gel est le Sephacryl S200 de Pharmacia, Suède La vitesse de passage est de 30 ml/heure Les fractions contenant des substances ayant un poids moléculaire compris entre 70 000 et 100 000, calibrées avec des protéines globulaires, contenaient un complexe d'enzymes-désigné par facteur G qui ne peut décomposer le SPS lorsque l'on pratique l'essai suivant le test qualitatif d'agar; cependant, le SPS est décomposé suivant le test qualitatif d'agar lorsque l'on rélange le facteur G avec une pectinase Ona trouvé que le facteur G est capable de séparer le galactose, le fucose et certains acides galacturoniques du SPS; mais le produit de décomposition principal suivantl'analyse HPLC est encore un oroduit à poids moléculaire élevé ressemblant très fort au SPS. PARTIE 9. DLEPENDAI CE DE L'ACTIVTIE A L'EGARD DU pl I ET DE LA TEMPERA- T'Rs E Tr S/LBILITE D'Ui L SPS-ASE La fig 13 montre l'uctivité en fonction du p H de la préparation de SPS-ase XRF 68 De pli 2,7 à 3,5 on a utilisé un système de tampon à l'acide formique et de p H 3,7 à 5,5 on a utilisé un système de tampon à l'acétate. La fig 14 montre l'activité en fonction de la texoérature de la préparation de SPS-ase KRF 68. La fig 15 montre la stabilité thermique de la préparation de SPS-ase KRF 68. PARTIE 10 DETERMINATION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE. Le tableau repris ci-dessous donne un apçrçu des différentes déterminations de l'activité enzymatique relevant de la présente invention Définition de l'unité d'activité et description de la détermination de l'activité enzymatique Genre d'activité,ixiblique Décrit plus désignationment loin dans ce Erzye abrégée disponible mémoire Référence SPS-ase SPS-ase X Solubi 1 RU x lisantla VR J_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ r a r- aenc e,_'_' SRU ':120 x Protéase HUT x Ce lulase C x 2 PU x 3 ?GE x 4. Pectirase UPTE x 5 pt.'X 6 U 7.-icellu VHCU x 7 lase Il Les références indiquées dans la dernière colonne du tableau susmentionné sont détaillées dans' le tableau suivant Réf l Identification de la N, Iréfêérence -Les -r Céférences peuven t être obtienues de NOVO IN- DUSTRI A/S N.OVO Allé, 2880 Bags- voe rd, Danemark de Schwei- zerische Fornment AG Bâle, Suisse Analytical Biochemis- try, 84, 522 à 532 'C tnai ytical mnethod 149/6-o GB du 25-05-1981 x TDétermination of Pec- tinase Activity with 3 J Citr-us Pectin (PU)X 1 du 23-03-1976 \Viskosiretrische Po- 4 lygalacturonase-Be- stirrr (PG-E 7)du X Bestiz 7-ung der Pectin- transelimir ase (UPTE/ x lg) du 24-09-19715 Déterm-ination of the 6 Pectinester-ase acti- 6 vity(non daté)portant ' les initiales 'ij A/c-, lnalvt ical method i F 156/1-G 13 c En ce qui concerne la détermination de l'activi- té-de cellulase, il est à noter que l'analyse a 'été effec- tuée co:rune indiqué dans AF 149/6-GB et que les principes de déteritination sont expliqués dans Analytical Biochemis- try. Io 5 dans une bibi io- thèque p ARTIE l a DE-TIMINATION ENZYMATIQUE DE SPS-ASE La détermination enzymatique de SPS-ase est effectuée en deux étapes, c'est-à-dire un essai qualitatif sur plaque d'agar et une détermination quantitative de D l'activité SPS-ase, basée sur la mesure de la quantité totale de sucres libérée Si l'essai qualitatif sur plaque d'agar est négatif, l'activité SPS-ase est nulle quelle: que soit la valeur provenant de la détermination quanti- tative de l'activité en SPS-ase Si l'essai qualitatif sur plaque d'agar est positif, l'activité en SPS-ase est égale à la valeur provenant de la détermination quantitative de l'activité en SPS-ase. I Essai qualitatif sur plaque d'agar. On a préparé une plaque de SPS-agar de la manière suivante On a préparé un tampon (B) en amenant de l'acide acétique 0,3 M à p H 4,5 au moyen de Na OH 1 N. On dissout 1 g de SPS dans 20 ml de B On mélange 1 g d'agarose (HSB Litex) avec 80 ml de B et on chauffe jusqu'au point d'ébullition en agitant Lorsque l'aga- rose est dissoutela solution de SPS est lentement ajoutée La solution qui en résulte à 1 %de SPS-agarosè est disposée dans un bain d'eau à 60 C Les plaques sont ensuite coulées en versant 15 ml de la solution à 1 % de SPS-agarose sur une plaque en verre horizontale ayant les dimensions de 10 cm x 10 cm Ensuite on esta z me 9 "puits" dans la couche solidifiée de SPS-agarose à une distance de 2,5 cm Dans chaque puits on introduit 10 ul d'une solution à 1 % de la pro- téine enzymatique tester en ce qui concerne l'activité en SPS-ase On fait incuber la plaque pendant 18 heures à C et à une humidité relative de 100 % Ensuite le SPS ren encore déccr csé est précipité par une solution à parts - égales en volumes d'éthanol et d'acétone L'essai de la SPS-ase sur laplaque d'agar est positif pour un échantillon placé dans un puits spécifique si une zone annulaire claire apparaît autour de ce puits. II DETERMINATION QUANTITATIVE DE L'ACTIVITE DE SPS-as A Le but de cet essai est de déterminer les activités enzymatiques qui sont capables de décomposer le SPS d'une telle façon que les produits de décompo- sition présentent une affinité à l'adsorption ou à la liaison de protéine de soja fortement réduite ou ne présentent pas d'affinité, à l'adsorption ou à la liaison de protéine de soja Des essais ont montré que la partie des produits de décomposition de SPS qui n'est cas précipitée par le mélange de parts égales en volume S d'eau et d'éthanol ne présente aucune affinité à l'ad- sorption ou à la liaison à la protéine de soja. La détermination de la SPS-ase est basée sur une 515 hydrolyse du SPS dans des conditions standard suivie par une précipitation de la partie de SPS qui n'a pas été hydrolysée par l'éthanol Apres la précipitation, la teneur en hydrate de carbone qui n'est pas précipitée est déterminée par une analyse quantitative pour le sucre total (suivant AF 169/1, disponible chez NOVO INDUSTRIE A/S, 2880 Bagsvoerd (Danemark). Les conditions standard sont: Température: 50 C p H: 4,5 Temps de réaction: contrôle pendant 210 minutes uniquement avec le substrat, suivi par 2 minutes l'enzyme étant additionnée. Temps de réaction: valeur principale 212 minutes L'_cuiuement comprend Bain d'eau agité thermostatisé à 50 C. Agitateur de type Whirlimixer Centrifugeuse Un bain d'eau glacé. Les réactifs comprenncrit: Tampon: acide acétique 0,6 M dans l'eau déminéralisée (a) et Na OH 1,0 M (b). Substrat:la valeux du p H de 50 ml de a est règlée à 4,5 au moyen de b, ensuite on ajoute 4,0 g de SPS et après dissolution de celui-ci, le p est réglé une nouvelle fois à 4,5 et le volume est porté à 100 ml au moyen d'eau désioniaée. Réactif u'arrêt:Ethanol absolu. Unre unité d'activité SPS-ase (SAE ou SP Su) est définie ccnmó l'activité SPS-ase qui libère une quantité d'hydrate de carbone soluble dans de l'éthanol à 50 % équivalente à 1 mole de galactose par minute, dans les conditions standard susmentionnées. iême si la partie initiale de la courbe standard de l'enzyme est une ligne droite, il faut noter qu'elle n'iniersècte pas le point ( 0,0). PARTIE 10 B DETERMINATION ENZY-TIQUE DE L ACTIVITE SOLUBILISANT LA REAINCE EXRIMEE EN SRUM 120. Princioe. Dans le procédé pour la détermination de l'acti- vité d'hydrolyse, la artie insoluble de la farine de soja dégraissée, déprotéinisée et décortiquée est hydrolysée dans des conditions standard La réaction de l'enzyme est arrêtée avec un réactif d'arrêt et la fraction insoluble est séparée par filtration La quantité de polysaccarides dissous est déterminée par spectrophotométrie après une hydrolyse acide suivant AF 169/1, disponible chez Novo Industri A/S, 2880 Bagsvoe rd (Danemark). Les carbohydrases présentant une activité endo ainsi que celles présentant une activité exo sont déterminées suivant le procédé. Le substrat faisant partie de cette détermina- tion enzymatique est identique au substrat de la rémanence décrit pour la méthode SRU Le substrat est dissous sous forme d'une solution à 3 % dans le talmon au citrate indiqué ci-dessous: Tarpon au citrate-phosphate 0,1 i N de p H 4,5 K,2 Aq d'acide citrique monohydraté (Plerck Art 244) 8,12 g d'hydrogène-phosphate disodique bihydraté (Merck Art 6580) Amnené à 1 litre par de l'eau déminéralisée p H 4,5 + 0,05 Stable pendant 14 jours. Le réactif ld'arrêt présente la composition suivante: ml de Na Ol 0,5 N' ml d'éthanol à 96 % A garder dans un réfrigérateur jusqu'au moment de l'utilisation. Conditions standard: Temperature: 50 "C pli: 4,5 Temps de réaction, échantillon:120 minutes à blanc: 5 minutes Définition de l'unité: Une unité d'activité solubilisante la rémanence de soja (SRU:S) 120 (M pour manuel) correspond à la quantité d'enzyme qui, dans les conditions de réaction données, libère, par minute, des polysaccharides solubilisés équivalant à une micro-mole de galactose. DETEP R::;ATION ENZYM:A 'TIQUE DE L'ACTIVITE PROTEOLYTIQUE _SU E 'HUT Procédé pour la détermination de la protéinase dans un milieu acide. Le procédé est basé sur la digestion d'hémoglo- bine dénaturée par l'enzyme à 40 C, à pli 3,2, pendant 30 minutes L'hémoglobine non digérée est précipitée au moyen d'acide trichloracé tique à 14 % (poids/volume). Tous les échantillons d'enzymes sont préparés en dissolvant celles-ci dans un tampond'acétate 0,1 M, p H 3,2. Le substrat d'hémoglobine est préparé en utili- sant 5,0 g de poudre d'hémoglobine bovine lyophilisée, conservée avec du Thicrersalate à 1 % et 100 ml d'eau déminéralisée qui est agitée pendant 10 minutes, avant de règler le p H à 1,7 au moyen de IIC 1 0,33 N. Après une agitation ultérieure de 10 minutes, on règle le p H à 3,2 au moyen de Na OH 1 N Le volume de cette solution est porté à 200 ml au moyen d'un tampon acétate 0,2 M Ce substrat d'hémoglobine doit être * refroidi pour être gardé pendant 5 jours. Le substrat d'hémoglobine est porté à termperature ambiante Au temps zéro, 5 ml du substrat sont intro- Nuits dans une éprouvette contenant 1 ml d'enzyme Apres agitation d'une seconde, l'éprouvette est mise dans un bain d'eau à 40 C pendant 30 minutes Après exactement minutes, on ajoute 5 ml d'acide trichloroacétiqueà 14 % dans l'éprouvette qui est ensuite agitée et portée à température ambiante pendant 40 minutes. Pour l'essai à blanc, le substrat d'hémoglobine est porté à température ambiante Au temps zéro, on ajoute 5 ml du substrat dans une éprouvette contenant 1 ml d'enzyme Après une agitation d'une seconde, l'éprouvette est mise dans un bain d'eau à 40 C pendant 5 minutes -Après exactement 5 minutes, on ajoute 5 ml d'acide trichloroacétique à 14 % dans l'éprouvette qui est ensuite a Jit( et lJ 3 rtce à température ambiante pendant 40 minutes. Après 40 minutes, les essais à blanc et les échantillons sont agité 5 s, filtrés une ou deux fois à travers un filtre de type Berzelius N 0, et disposés dans un spectrophotomètre L'échantillon est lu par rapport à l'essai à blanc à 275 nm en ajutant le spectrophoto- mètre par rapport à de l'eau. Etant donné que l'absorbance de la tyrosine à 275 nm est un facteur connu, il n'est pas nécessaire d' établir une courbe standard de tyrosine à moins qu'il ne soit nécessaire de contrôler le spectrophoto- mètre de Beckman. Calculs:' 1 HUT est la quantité d'enzyme qui forme, en une minute, un hydrolisat équivalent en ce qui concerne l'absorbance à 275 nm à une solution de 1,10 micro- gramme/ml de tyrosine dans du HC 1 0,006 N Cette valeur de l'absorbance est de 0,0084 La réaction s'effectue à 40 C, à p H 3,2 et pendant 30 minutes. HUT = Lchantillon à blanc x Volume en ml 0,0084 termps de réaction en mn. E-chantillon à blanc 1 1 HUT = -cantillon= ( E-B) x 43,65 0,0084 30 HUT/g enzyme = DûB) x 43,65 g enzyme dans 1 ml Un essai pour déterminer la dépendance de la stabilité du p H de la protéase dansle KRF 68, effectué 0 au moyen d'une analyse HUT avec des valeurs de p H de 2,0 à 8, 0,a montré que la stabilité de la protéase à p H supérieur à 8,0 était très faible, cfr fig 16. Dans le but d'illustrer la présente invention,on se reftrera aux exemples suivant 1 à 10, dans lesquels l'exemple 1 illustre la préparation de SPSase et dans lesquels les exemples 2 à 10 illustrent l'application de la SPS-ase. On a effectué à l'échelle du laboratoire, de nombreuses fer- mantations avec les souches Asn aculéatus et Asp japonicus indiquées ici Ainsi on a obtenu des préparations qui contenaient la SPS-ase suivant les essais de SPS-ase indiqués ci-dessus Cependant, étant donné qu'on a besoin de quantités assez importantes de SPS-ase afin d'exécuter les essais, on a effectué des fermentations semblables à l'échelle d'une installation pilote; cfr exemple 1 suivant. 18570 Exemple i Production d'une SPS-ase à l'échelle d'une installation pilote. On a préparé une SPS-ase par fermentation submergée d'Aspergillus aculeatus CBS 101 43. On a préparé un substrat d'agar présentant la composition suivante dans un flacon de Fernbach. Peptone Difco 6 g Aminoline Ortana 4 g Glucose 1 g Extrait de levure Difco 1 g Extrait de viande Difco 1,5 g KH 2 PO 4 Merck 20 g 2 2 g Extrait de malt Evers 20 g H 20 déminéralisée jusqu'à 1000 ml On a règlé le p H à une valeur entre 5,30 et 5,35. Ensuite on a ajouté 40 g d'agar Difco et on a maintenu le mélange dans un autoclave pendant 20 minutes à 120 C (le substrat est denatmé E-agar) La souche CBS 101 43 a été cultivée sur un plan incliné de E-agar ( 37 C) Les spores du plan incliné ont été mis en suspension dans du lait écrémé stérilisé et la suspension a été lyophilisée dans des fioles La teneur d'une fiole lyophilisée a été transvasée dans un flacon de Fernbach Le flacon a ensuite été soumis à une incubation pendant 13 jours à 30 C. On a préparé un substrat ayant la composition suivante dans un réservoir de fermentation de 500 litres- Ca CO 3 1,2 kg Glucose 7,2 kg Rofec (matière sèche d'une liqueur de mais) 3,6 kg Huile de soja 1,2 kg On a ajouté de l'eau de robinet jusqu'à unvolume total d'environ 240 litres On a règlé le p H à environ 5,5 avant d'ajouter du Ca CO 3 On a stérilisé le substrat dans le fermentateur a'inoculation pendant une heure à 1210 C. Le volume final avant inoculation était d'environ 300 litres. La suspension de spores dans le flacon de Fernbach a été transférée dans le fermentateur d' inocula- tion Les conditions de fermentation de l'inoculat étaient: Type de fermentateur: Réservoir de fermen- tation classique aéré et agité présentant un rapport hauteur/diamètre d'environ 2,3. Agitation: 300 tours/minute ( 2 hélices de turbine) Aération: 300 litres N d'air/minute Température:30 à 31 C Pression:0,5 atmospère relative Temps; Environ 28 heures. Environ 28 heures après l'inoculation, on a transféré 150 litres du fermentateur d'inoculation Vers le réservoir de fermentation principal. On a préparé un substrat ayant la composition suivante dans un réservoir de fermentation principal de 2500 litres: Farine de soja grillée: 90 kg KH 2 PO 4: 20 kg Pluronic (nom commercial): 150 ml On a ajouté de l'eau de robinet à un volume total d'environ 900 1 La farine de soja grillé a été mise en suspension dans l'eau On a règlé le p H à 8,0 au moyen de Na OH et on a augmenté la température à 50 C Ensuite on a ajouté environ 925 unités Anson d'ALCALASE 0,6 L à la suspension On a maintenu le mélange pendant 4 heures à 50 C et à p Hli 8,0 (addition de Na 2 CO 3) sans aération, sous une pression relative de zero atmosphère relative et une agitation à raison de 100 tours/minute Ensuite on a ajouté les composants restants de substrat et on a règlé le p H à environ 6 au moyen d'acide phosphorique On a stérilisé le substrat dans le réservoir de fermentation 18570 principal pendant 1 1/2 heure à 123 C Le volume final avant inoculation était d'environ 1080 litres. Ensuite on a ajouté 150 litres-de culture d'inoculation Les conditions de fermentation sont: Type de fermentateur:Réservoir de fermen- tation classique aéré et agité présentant un rapport hauteur/diamètre d'environ 2,7. Agitation: 250 tours/minute ( 2 hélices de turbine) Aération: 1200 1 N d'air/minute. Température: 30 C Pression: 0,5 atmosphère relative Temps: environ 151 heures. A partir de 24 heures de fermentation jusqu'à environ 116 heures de fermentation on a ajouté une solution de pectine de manière aseptique au réservoir de fermenta- tion principal à raison d'une vitesse constante d'environ 8 litres par heure La solution de pectine ayant la composition suivante a été préparée dans un réservoir de dosage de 500 litres. Pectin genu: 22 kg Acide phosporique concentré: 6 kg Euronic (nanom ccoercial): 50 ml x Genu pectin (du genre citrus NF de "The Copenhagen pectin factory Ltd"). On a ajouté de l'eau de robinet à un volume total d'environ 325 litres Le substrat a été stérilisé dans un réservoir de dosage pendant 1 heure à 121 C Le volume final avant le début du dosage était d'environ 360 litres. Lorsque cette partie a été énuisée)on a nréDaré une autre partie similaire Le volume total de la solution de pectine pour une fermentation était d'environ 725 litres. Après environ 151 *heures de fermentation on a arrêté le processus de fermentation Le bouillon de culture d'environ 1850 litres a été refroidi à environ 5 C et on a récupéré les enzymes selon l technique suivante. Le bouillon de culture a été filtré sur un fiblre tambour sous vide (Dorr Oliver), qui était enrobé -'une terre de diatonées Hy-flo-super-cel (adjuvant de filtration) Le filtrat a été concentré par évaporation à environ 15 % du volume du bouillon de culture Le concentré a été filtré sur une feuille de filtre Seitz (type supra 100) comportant 0,25 % de Hiyflo-super-cel à titre d'adjuvant de filtration (dénommé filtration I dans le tableau suivant) Le filtrat a été précipité au moyen de 561 g de(NH 4) 2 SO 4/l à un p H de 5,5 et on a ajouté 4 % de terre de diataore Hy-flosuper-cel à titre d'adjuvant de filtration Le précipité et l'adjuvant de filtration sont séparés par filtration sur un filtre à cadre Le * 15 gâteau de filtre est dissous dans de l'eau et les fractions insolubles sont séparées par filtration sur un filtre à cadre Le filtrat est soumis à un essai de filtration sur une feuille filtrante Seitz (de type supra 100) avec 0,25 % de Hy-flo-super-cel à titre d'adjuvant de filtra- tion (dénormé filtration II dans le tableau suivant) Le filtrat est soumis à une diafiltration dans un appareil d'ultrafiltration Aorès diafiltration, le liquide est concentré jusqu'à une teneur en matière sèche de 12,7 % (dénommée, dans le tableau suivant, teneur en matière sèche du concentré). Un traitement de base facultatif pour éliminer partiellement l'activité de protéase peut être effectué à cette étape Dans le cas d'un traitement de base, celui-ci est effectué à un pli de 9,2 pendant une heure, le p Hli étant ensuite règlé à 5,0. Ensuite le-liquide est soumis à une filtration de contrôle et filtrédans le but d-'une réduction de germes et le filtrat est lyophilisé dans un équipement de lyophili- sation de Stokes. On a effectué quatre fermentations de la manière '18570 indiquée ci-dessous; la souche utilisée pour la fermen- tation, l'utilisation facultative d'un traitement de base et d'autres paramètres variant, comme indiqué dans le tableau suivant. x Apres filtration de réduction des germes, le filtrat est concentré par évaporation en un rapport de 1:2,3 Une Paible partie du filtrat concentré a été séchée par pul- vérisation et la partie restante a été lyophilisée. Afin de réduire encore plus l'activité de protéase, certaines préparations indiquées ci-dessus sont traitées comme indiqué ci-dessous, en n'utilisant qu'une des trois possibilités A, B, ou C. A On dissout 100 g de préparation de SPS-ase dans un litre d'eau désionisëe en agitant à 10 C + 2 C On règle le p H à 9,1 au moyen de Na OH 4 N Ce traitement de base est effectué pendant une heure On règle ensuite le p H à 4,5 au moyen d'acide acétique glacial et on dialyse en opposition à l'eau désionisée froide à une conductivi- té de 3 m Si Ensuite on effectue la congélation et la lyophilisation. B On dissout une préparation de 500 y de SPS- ase dans 4 litres d'eau désionisée en agitant à 10 C + 2 C. On règle le p H à 9,1 au moyen de Na O Hi 4 N 1 Ce traitement de base est effectué pendant une heure On règle ensuite le p H à 5,0 au moyen d'acide acétique glacial La substance obtenue est lyophilisée. Traitenrnt de Code Concentration ( 5) d 'leneur base de l'adjuvant de filtraen rat Prépl tion r-ur: úSche ration du icroorganisuti non uti filt/-prc-ci filtra duemar j concen T_. lisé iisé tion I pitat ioni r es ticn tr CES 101 43| i RF 68 0,5 5 0,2 k 28 l_ _ " __ A-CC 20236 x j}E 74 2,0 4 0,4 7,5 i.O 4 4 C 8j x KRF 83 1,0 5 -0,25 12,4 _)_ CES 101 43 x KRF 92 0,25 4 0,25 12,7 18570 C On dissout 50 g d'une préparation de SPS-ase dans 400 ml d'eau désionisée en agitant à 10 C + 2 C On règle le p H à 9,1 au moyen de Na OH 4 N Ce traitement de base est effectué pendant une heure Ensuite on réduit le p H à 5,7 au moyen d'acide acétique glacial La substance- obtenue est lyophilisée. Préparation de SPS-ase Traitement de Code de la en tant que substance base utilisé préparation de départ pour le trai teent de base B C KRF 68 x KRF 6 G Bl I KR? 63 x KRF 65 BIII KRF 92 x KRF 92 BI Les préparations indiquées ci-dessus sont carac- térisées par leur activité des enzymes selon la présente invention dans le tableau suivant. Activité enzymatique par g KRF 68 IERF 68 Bl I KPF 68 BIII KRF 74*KRF 83 KRF 92 KRFW 92 E 1 SAS, esade plaqw + + + + essai quantita 350 301 349 Q 168 476 430 t i f_ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ SRTJ 737 507 481 142 683 626 757 SRUM 120 2125 1560 1720 578 753 1640 1030 UT ph 3,2 67000 105 339 1630 12800 5960 397 C 80008044 9396 1320 8040 5700 3092 PU 1 È 3000009000000 880000,0 8400 '00 7500000 8400000 7600000 ______________ 119400 72000 77700 4100 64600 60000 68800 UPTÉ 78100 83700 76900 15130 327000 44000 62400 PEE 840 910 770 370 690 1000 7190 Vlicu 16000003,100000 10000001 65000 2200000 1100000 742000 o. M'f vo u n C 1 , Exemple 2 (exemple d'application) Cet exemple décrit la fabrication de p v p à partir de farine de soja dégraissée et décortiquée, "Sojamel 13 " (disponible dans le conerce auprès de Aarhus Olie- fabrik A/S) La teneur en matière sèche de cette farine était de 94,0 % et la teneur en (N x 6,25) sur la base des matières sèches était de 58,7 % La farine de soja a été traitée avec les préparatio rsde SPS-ase KRF 68 Bl I (exemple 1) de la manière suivante: On a mis 85,2 g de la farine de soja en suspen- sion et on a maintenu en agitation à 50 C dans 664,8 g d'eau et on a règlé le p H à 4,5 au moyen de 7,5 ml de H Cl 6 N On y a ajouté 50 g d'une solution contenant 4,00 g de ladite préparation de SPS-ase et on a ensuite agité le mélange réactionnel pendant 240 minutes à 50 C Le méange a ensuite été centrifugé dans une centrifugeuse de laboratoire (modèle Beckman J-6 B) pendant 15 minutes à 3000 xg On a pesé le surnageant et on l'a analysé suivant la méthode de Kjeldahl afin de déterminer l'azote et les matières sèches. La phase solide a ensuite été lavée avec un volume d'eau équivalent à la masse de surnageant obtenue lors de la première centrifugation Cette opération a été effectuée deux fois La phase solide a ensuite été lyophilisée, pesée et analysée suivant la méthode de Kjeldablpour dater- miner l'azote et les matières sèches chez Qvist's Labora- torium, Marselis Boulevard 169, 8000 Aarhus C, Danemark. Ce laboratoire est agrée par l'Etat pour les analyses d'aliments pour bétail et des produits laitiers Les résultats obtenus apparaissent dans le tableau 2 1: 1 SPS ase 4,00 75,6 6,4 % - 1 Produit de centrigugation 66,6 1,50 5,04 21,2 % 42,0 % p.v p 44,5 87,5 95,7 82,7 % 53 2 % On a donc obtenu une p v p présentant une pureté de protéine, c'est-à-dire N x 6,25 sur la base des matières sèches, de 91,4 % et avec un rendement total en protéine de 83 % - Exemple 3 (exemple d'application) Cet exemple a été effectué afin de comparer les rendements en protéine, la qualité nutritive et certaines propriétés fonctionnelles de produits à base de protéine de soja préparés suivant les trois techniques suivantes: A: La précipitation isoélectrique classique pour la préparation d'un isolat de protéine de soja B: Le lavage isoélectriqueclassique pour la préparation de concentré de protéine de soja. C: Le lavage isoélectrique suivant l'invention comportant une enzyme solubilisant la réma- nence, pour la préparation d'une p v p. Afin de créer une comparaison valable du procédé de l'invention (C) avec les procédés classiques de prépara- tion de protéine de soja (A et B), on a utilisé la même substance brute dans les trois cas De même, les essais ont été effectués de telle manière que les temperatures correspondantes et les durées de traitement soient les mêmes dans les trois cas Uniquement les valeurs de p H étaient différentes étant donné les différences fondamentales entre les trois essais. A La précipitation isoélectrique classique pour la préparation d'un isolat de protéine de soja. On a extrait 425,8 g de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) dans 3574,2 g d'eau de robinet à 50 C On a règlé le p H à 8,0 avec 20,1 g de Na OH 4 N Après une agitation d'1 heure, on a centrifugé la suspension à 3000 x g pendant 15 minutes en utilisant quatre bechers d'l 1 litre dans une centrifugeuse de laboratoire (modèle Beckman J-6 B) Le produit de centrifugation I et le précipité I ont été pesés Le précipité I a été soumis à une nouvelle extraction avec de l'eau jusqu'à atteindre un poids total de 4000 g On a maintenu la température à 500 C, on a règlé le p H à 8 au moyen de Na OH 4 N et on a agité la suspension pendant 1 heure On a effectué la centrifugation et le pesage du produit de centrifugation II et du précipité II comme décrit ci-dessts. On a retiré des échantillons des produits de centrifugation I et II et du précipité II pour les analyses suivant Kjeldahl et pour la mesure des matières sèches Ensuite, les produits de centrifugation I et II ont été m Alangbs et maintenus à 50 C La protéine a ensuite été précipitée isolélectriquement à p H 4,5 au moyen de 45 g de HC 1 6 N. Apres une agitation d'l heure à 50 C, on a récupéré la protéine par centrifugation à 3000 x g pendant 15 minutes. Le produit de centrifugation III a été pesé et analysé pour les déterminations Kjeldahl-N et les mesures de matière sèche La phase solide III a été pesée et lavée à l'eau en une quantité correspondant au poids du produit de centrifugation I Le lavage a été effectué en agitant pendant 1 heure à 50 C La protéine lavée a été récupérée par centrifugation à 3000 x g pendant 15 minutes Le produit de centrifugation IV et la phase solide IV ont été pesés Le produit de centrifugation IV a été analysé pour la détermination de Kjeldahl-N et pour la mesure des matières sèches La phase solide a été mise en suspension dans 1550 g d'eau à 50 C et on a règlé le p H à-6,5 au moyen de 17 g de Na OH 4 N Le mélange a été maintenu en agitation pendant 1 heure et on a de nouveau règlé le p H à 6,5, si nécessaire Finalement, le produit a été lyophilisé, pesé et analysé pour la détermination suivant Kjeldahl-N et pour la mesure des matières sèches Les calculs de bilan massique sont représentés au tableau 3 1. Tableau 3 1:Calculs du bilan massique de la précipitation isolélectrique classique pour la préparation d'un isolat de protéine de soja - Opérations etfractions Masse de Protine Matière ndement Rendement fraction % sèche % pn pro en matière 9 (Nx 6,25) téine % sèche % Extraction: Farine de soja 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 Eau 3574,2 O O O O Na OH 4 N 20,1 O 16,0 O 0,8 1.Centrifugation:E 4020,1 5,9 10,0 100,9 100, 4 Centrifugat I 3141,0 4,4 6,9 58,8 54,1 Précipité I 805,0 Réextraction: Précipité I 805,0 - Eau 3195,0 O O O O 2.Centrifugation: Centrifugat II 3104,0 0,5 0,9 6,6 7, 0 Précipité II 820,0 9,1 17,2 31,7 35,2 Agitation et acidifica- tioe ton / Centrifugats I+II 6245,0 HC 1 6 N 45,0 O 21,3 O 2,4 3.Centrifugation:i 6290,0 Centrifugat III 5650,0 0,3 1,9 7,2 26,8 Précipité III 308,0 Lavage: Précipité III 308,0 Eau 3141,0 O O O O 4. Centrifugation: Z 3449,0 Centrifugat IV 3113,0 0,04 0,1 O i 5 1,2 Précipité IV 291,0 Neutralisation: Précipité IV 291,0 Eau 1550,0 O O O O Na OH 4 N 17,0 O 16,0 O 0,7 Séchage: poudre 128,0 93,8 96,3 51,1 30,8 B Lavage isoélectrique pour la préparation d'un concentré de protéine de soja. On a lavé 425,6 g de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) dans 3574 g d'eau à 50 C On a règlé le p H à 4,5 au moyen de 44,8 g de HC 1 6 No On a effectué le lavage pendant 4 heures en agitant La suspension a ensuite été centrifugée à 3000 x g pendant 15 minutes dans une centrifugeuse de laboratoire (modèle Beckman J-6 B) utilisant 4 béchers d'l 1 Le produit de centrifuga- tion I a été pesé et analysé pour la détermination suivant Kjeldahl-N et la mesure des matières sèches La phase solide I a été pesée et lavée une nouvelle fois à l'eau jusqu'à un poids total de 4000 g Le p H a de nouveau été règlé à 4,5 au moyen de 1,7 g de HC 1 6 N et on a main- tenu la suspension sous agitation pendant 30 minutes à 50 Co On a effectué une centrifugation et une pesée du produit de centrifugation II et des solides II comme précédemment. La phase solide II a été remise en suspension dans 1575 g de H 20 à 50 C et on a règlé le p H à 6,5 au moyen de 34,5 g de Na OH 4 N; On a maintenu le mélange sous agitation à 50 C pendant une heure et on a de nouveau règlé le p H à 6,5, si nécessaire Finalement le produit de protéine a été lyophilisé, pesé et analyse suivant Kjeldahl-N et pour la mesure des matières sèches Le bilan massique est représenté dans le tableau 3 2. Tableau 3 2:Calculs du bilan massique du lavage isoîlectri-que pour la préparation d'um concentré de protéine de soja. Opérations et Masse de Protéine Matière Rende Rendement fractions la frac tion, g Drotine% sèche % Lavage farine de soja 425,8 55,2 94,0 100,0 100, 0 eau 3574,0 O O O O H Cl 6 N 44,8 O 21,3 O 2,4 l.Centrifugation: 4044,6 Centrifugat I 3150,0 0,6 3,2 8,0 25,2 Solides I 846,0 Nouveau lavage: Solides I 846,0 _ eau 3154,0 O O O O : HC 1 6 N 1,7 O 21,3 O 0,1 2.Centrifugation: 1 4001,7 Centrifugat II 313 G O O 1 0,4 1 > 3 3,2 Solides II 863,0 Neutralisation: Solides II 863 O eau 1575,0 O O O O Na OH 4 N 34,5 O 16,0 O 14 Séchage:poudre 281,0 72,5 98,4 86,7 69,1 C Lavage isoélectrique comprenant une enzyme solubilisant la rémanence, pour la préparation d'une p v p, On a lavé 425,8 g de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) dans 3524,2 g d'eau à 50 C On a règlé le p H à 4,5 en utilisant 43, 7 g de H Cl 6 N On a dissous 24 g de la préparationde SPS-ase, KRF 68 BIII (exemple 1) dans 26 g d'eau et on l'a ajoutéeau mélange de lavage On a ensuite effectué le lavage pendant 4 heures sous agitation On a ensuite effectué la purifi- cation comme décrit dans l'essai B, les quantité de HC 1 6 N, de Na OH 4 N et d'eau pour la nouvelle suspension étant les seuls paramètres présentant des valeurs différentes Le bilan massique est représenté dans le tableau 3 3. Tableau 3 3: Calcul du bilan massique du lavage isoélec- trique comportant un enzyme solubilisant la rémanence pour la préparation d'une p v p. 1) Analysé par Bioteknisk Institut, Holbersvej 10, DK-6000 Kolding, Danemark 2) Analysé par Qvist's Laboratorium, Marselis B Oulevard 169, DK-8000, Aarhus C, Danemark Propriétés nutritives Les compositions en acides aminés des trois produits de protéine ont été déterminées, voir tableau 3 4 La teneur totale en acides aminés essentiels, la teneur chimique et l'indice d'acides aminés essentiels (EAAI) sont calculés en utilisant le document de référence-FAO de 1957. La teneur en inhibiteur de trypsine des trois produits a été déterminée au moyen de la méthode décrite dans A O C S Tentative Method Ba 12-75 (A O C S est une Rendement Rende- Opérations et Masse de Protéine Matière en prote ment en fractions Eraction %(N x 6,25 sèche % ine, matière _ % sèche % Lavage farine de soja 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 eau 3540,2 O O O HC 1 6 N 43,7 O 213 O 2,3 SPS-ase:KRF 68 BIII 24,0 75,3 96,0 7,7 5 8 1.Centrifugation: E 4043,7 Centrifugat I 3420, O 1,7 5 t 2 24,7 44,4 Solides I 620,0 Nouveau lavage Solides I 620,0 _ eau 3380,0 O 0 00 H Cl 6 N 1,3 O 21,3 0 0,1 2. Centrifugation: Z 4001,3 Centrifugat II 3400,0 0,2 0,6 2,9 5,1 Solides II 577,0 Neutralisation: Solides II 577,0 eau 1700,0 O O 0 0 Na OH 4 N 25,3 O 16 A O O 1 '0 séchage: poudre 211,0 87 31) 96,71) 78,2 51,1 86,92) 97,02) abréviation pour American Oil Chemists' Society) Les ré- sultats sont représentés dans le tableau 3 5 qui comporte également les rendements et le rapport protéine/matière sèche des trois produits. Tableau 3 4: Conposition d'acides aminés et évaluation nutritive des trois produits de protéine A, B, et C 1)aas = teneur en acides aminés (amino-acid score) basée sur 11 document de référence FAO de 1957. A.Isolat de pro B Concentré de C Isolat de pro- téine de soja protéine de soj téine de soja Acide aminé g/16 g N (P P- Acide_ _ ___g/16 g N _ aas 1 g/16 g N aas C/16 g N aas 1 Non-essentiel: Acide asparti 12,4 11,3 11,9 - que Sérine 4,'62 4,69 4,81 - Acie olutamic e 21,3 18,2 17,7 - Proline 6,07 5,19 4,76 - Glycine 4,13 4,26 4,33 - Alanine 3,54 4,27 4,55 - Histidine 2,83 2,78 2,50 - Arginine 8,09 7,57 7,04 - Essentiel: Isoleucine 4,87 > 100 4,97 > 100 5,19) 100 Leucine 7,80 > 100 7,98 > 100 8,09 > 100 - Lysine 6,24 > 100 6,09 > 100 5,57 > 100 Phénylalanine 5,47 > 100 10 5,35 > 10 ' 5,17 100 > 10 Tyrosine 3,38 > 0100 J3,88 > 10 J 4,44 001 J Cystine 1,29 64 IA 1,32 6662 1,44 72,0 Mthioni N e 1,0 49, 1 1 9, Méthionine 1,08 1,21 55,0) 1,31 5 Thréonine 3,10 > 100 3,60 > 100 3,97 > 100 Tryptophane 1,06 75,7 1,37 97,9 1,32 94,3 Valine 4,90 > 100 5,23 > 100 5,57 > 100 - T'eneur totale I en acides am i, 38,36 41,31 42,21 nés essentiels% Teneur chimique 56,4 % 60,2 % 65,5 % EAAI 86,7 % 90,2 % 91,3 % Tableau 3 5: Caractéristiques du processus et teneur en inhibiteur de trypsine des trois produits de protéine A, B et C Propriétés fonctionnelles L'indice de solubilité de l'azote (NSI: Nitrogen solubility index) a été déterminé respectivement, dans une dispersion de protéine à 1 % à p H 7,-0 dans Na Cl 0,2 M et dans l'eau distillée Après avoir agité pendant 45 minutes au moyen d'un agitateur magnétique, on a centrifugé la suspension à 4000 x g pendant 30 minutes et on a analysé le surnageant pour déterminer l'azote La solubilité de l'azote a été calculée comme le rapport: % N soluble/ % N total Les résultats de cette évaluation effectuée sur les trois produits sont représentés dans le tableau 3 6. La capacité d'émulsification a été déterminée trois fois sur chaque produit par un titrage de Swift légèrement modifié 4,0 g de (N x 6,25) du produit ont été mélangésdans 250 ml de Na Cl 0,5 M au moyen d'unagitateur Sorval Omnimixer à vitesse lente On a transféré 50 ml de la suspension dans un récipient mélangeur en verre et on y a ajouté 50 ml d'huile de soja Le mélange total a ensuite été pesé Le mélange huile-eau a ensuite été homogénéisé A Isolat de B Concentré C Isolat de protéine de protéin Eprotéine de de soja de soja soja (p v p C aractéris Protéine dans matière sèche 97,4 % 73,7 % 90,0 % tiques du _ processus Rendement en Protéine 51,1 % 86,7 % 78,2 % Inhibiteurs de trypsine34 000 21 000 9 000 TUI/g Protéine TUI/g 36 250 28 970 21 810 à 10 000 tours/minute, le récipient étant disposé dans un bain de glace On a ajouté une quantité supplémentaire d'huile de soja à une vitesse de 0,3 ml par seconde jusqu'à ce que l'émulsion s'effondre La quantité totale d'huile ajoutée avant le "point final" a été déterminée par pes Ae. La capacité d'émulsification est calculée comme le nombre de ml d'huile par gramme de protéine (N x 6,25) La densité de l'huile a été supposée égale à 0,9 g/ml. Les résultats moyens de la détermination de la capacité d'émulsification des trois produits sont représen- tés au tableau 3 6. L'expansion au fouettement a été détermtinée dans une solution de protéine à 3 %,à p H 6,5 On a fouetté 250 ml d'une dispersion aqueuse des Ecbantilions de protéine à la vitesse III pendant 4 minutes dans un agita- teur Hobart (modèle N-50) comportant un fouet en forme de fil L'expansionau fouettement a été calculée selon la formule Expansion au fouettement = V 250 x 100 % dans laquelle V représente le volume de fouettement final. en ml. La valeur V est mesurée en remplissant le ré- cipient mélangeur avec de l'eau On a doublé les essais de chacun des trois échantillons Les résultats moyens sont représentés au tableau 3 6. La stabilité de la mousse est déterminée en tant que rapport entre la quantité de mousse abandonnée après égouttage pendant 30 minutes et la quantité de mousse à l'origine Un gramme de mousse produitepar le procédé précédent a été introduit dans un cylindre en plastique (diamètre 7 cm, hauteur 9 cm) comportant un filet à mailles de 1 mm x lmmo Le cylindre a été disposé au-dessus d'un entonnoir monté sur un cylindre en verre et le poids (B) du liquide égoutté dans le cylindre en-verre est mesuré La stabilité de la mousse FS (foam stability) est déterminée par l'équation A -B FS A A x 100 % Les résultats de la mesure sont représentés au tableau 3 6. La résistance du gel est définie dans cette description en tant que la viscosité de Brookfield mesurée au moyen de mandrins T sur un statif de Brookfield Helipath Les gels sont produits par traitement thermique de suspensions de protéine à 12 % dans du Na Cl 0,5 M Le traitement thermique a été effectué dans des bidons fermés ayant un diamètre de 7,3 cm et une hauteur de 5,0 cm, plongés dans un bain d'eau, maintenu P Pn et 1000 C, pendant N mn chacun Les bidons ont été refroidis et thermostati- sés à 20 C avant de les ouvrir et avant d'effectuer ies mesures Les résultats de ces mesures sont représentés dans le tableau 3 6. Tableau 3 6: Propriété fonctionnelles des trois substances de protéine A, B, et C Propriétés A Isolat de B Concentré de C Isolat-de fonctionnelles protéine de protéine de protéine soja so O ja de soja(pvp) % NSI dans Na Cl 0,2 M 39,5 20,3 25,6 % NSI dans l'eau 53,9 25,1 28,6 Capacité d' érmulsifi- cation: mi huile/g 218 182 354 (N x 6,25) Expansion au fouette 120 120 340 120 ' 340 mnnt % Stabilité de la 50 50 20 musse % 50 50 20 mousse % Résistance du gel 3 4 2 C (Na Cl 0,5 M) 1,7 x 10 1,2 x 104 3,3 x 104 1000 C (Na Cl 0,5 M) 2,0 x 10 4,0 x 10 1,3 x 10 ïi Nôi _ __ Exemple 4 (exemple d'application) On a produit une p v p suivant le processus décrit à l'exemple 3 C sauf que l'activité de cellulase était partiellement dérivée de Trichoderma reseei La préparation de cette cellulase commerciale CELLUCLAST, produite par Novo Industri A/S, a été traitée au moyen d'une base à faible temperature, de lamanière suivante Le p H d'une solution à 10 % de CELLUCLAST dans l'eau a été règlé à 9,2 au moyen de Na OH, et la solution résultante a été refroidie à 5 C Après séjour d'une heure à ce p H et à -cette température, on a règlé le p H à 4,7 au moyen d'acide acétique à 20 % Cette solution a été maintenue à 5 C pendant la nuit et ensuite été filtrée de manière stérile. Le produit de filtration a été lyophilisé On a ajouté 4 g du produit lyophilisé à la préparationde SPS-ase, KRF 68 BIII (exemple 1) Les deux enzymes ont été dissoutes dans 172 g d'eau avant d'être ajoutées au mélange de lavage Les déterminations du-bilan massique de cet exemple sont représentées dans le tableau 4 1. L'essai prouve que cette préparation particu- lière de SPS-ase contient déjà une cellulase efficace étant donné qu'une addition de CELLUCLAST ne semble pas affecter le rapport protéine/matière sèche Cependant, d'autres préparations de SPS-ase peuvent contenir moins de cellulase, par exemple KRF 92, voir le tableau précédant immédiatement l'exemple 2: Tableau 4 1: * Calculs du bilan massique du lavage isoélec- trique comportant une préparation de SPS-ase et du CELLUCLAST pour la'production du p v p. Opérations et Massede E Protéine Matière endement Rendement fractions fraction % sèche en enmatière ___ granmes (Nx 6,25) % irotéine% sèche % Lavage: Farine de soja 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 Eau 3546,2 O O O O H Cl 6 N 43,1 O 21,3 O 2,3 SPS-ase:KRF 68-BIII 24,0 75,3 96 7,7 5,8 CELLUCLAST 4,0 43,6 96 0,7 1,0 Centrifugation: ú 4043,1 Centrifugat I 3382,0 1,9 5,5 27,3 46,5 Solides I 661,0 Nouveau lavage: Solides I 661,0 Eau 3339,0 O O O O HC 1 6 N O O O O O 2 e Centrifugation:Z 000,0 Centrifugat II 3414,0 0,2 0,7 2,9 6,0 Solides II 582,0 Neutralisation: Solides II 582,0 Eau 1691,0 O O O O O Na OH 4 N 25,3 O 16,0 O 1,0 Séchage: Poudre 206,0 88,8 98,9 7718 5-09 Exemple 5 (exemple d'application) On a produit une p v p. suivant le procédé décrit dans l'exemple 3 C sauf que toutes les masses ont eté divisées par un facteur de 5 et que le mélange réactionnel a été refroidi à environ 5 C avant la centrifugation Sur base des résultats analytiques en rapport avec les produits de centrifugation, on obtient un rendement théorique en protéine précipitée, comme montré dans le tableau 5 1. Tableau 5 1: Rendements théoriques en protéine obtenus lors de la production d'une p v p. a Moyenne de 87,5 (Bioteknisk Institut) et 86,9 (Qvist's Laboratorium); la teneur en matière sèche est respective- ment de 97,6 et 98,0 %. b Calculé en tant que masse totale de protéine perte en protéine dans les produits de centrifuqations. Exemple 6: (exemple d'application) D Amonstration de la liaison Drotéique du SPS On a dissous 40 g de (Nx 6,25) d'un isolat de protéine de soja commercial (Purina 500 E de Ralston Purina) dans 680 g d'eau On a chauffé le mélange dans un bain d'eau à 50 C et on a règlé le p H à 4,50 au moyen de H Cl 6 N On a transféré 90 g de ce mélange dans 5 flacons d'Erlenmeyersde 250 ml et on y a ajouté 10 g de solution aqueuse contenant respectivement O g, 0,2 g, 0,4 g 0,8 g et 1,6 g du SPS préparé comme décrit précédemment dans ce mémoire maintenus sous agitation au moyen d'un aimant dans-un bain d'eau à 50 C pendant 240 minutes. On a ensuite centrifugé les suspensions à 3000 x g Masse Protéine Rendement Exemple 3 Fractions g (Nx 6,25)en pro Protéine Rendement % téine % (Nx 6,25) en rotine Farine de soja 85,2 55,2 10055,2 100 SPS-ase KRF-68 BIII 4,8 75,3 7,7 75,3 7,7 lère centrifugation639 0,99 13,5 1,7 24, 7 2 è centrifugation595 0,13 1,6 0,2 2,9 p.v p 87,2 a 92,6 b 87,1 801 b _______________________________________ ____________ _________________ ____________________ _ 8 O, 1 b__________ pendant 15 minutes et les produits de centrifugation I ont été analysés suivant Kjeldahl-N et pour la détermination des matières sèches Les phases solides-ont été lavées à l'eau à température ambiante et centrifugées une nouvelle fois Cette étape a été répétée Ensuite on a dispersé les solides dans 50 ml d'eau et on a règlé le p H à 6,50 par une addition goutte à goutte de Na OH 6 N Les produits neutralisés ont été lyophilisés et analysés suivant Kjeldahl- N et pour déterminer les matières sèches (MS) En se basant sur les analyses représentées au tableau 6 1, on a calculé le pourcentage de protéine récupérée et le pour- centage de SPS qui a été lié à la protéine au moyen des formules représentées en relation au tableau 6 2. Cet exemple démontre que le SPS est lié intime- ment à la protéine de telle sorte que le rapport protéine/ matière sèche diminue pour une teneur croissante en SPS. Le rapport protéine/SPS présent dans la farine de soja correspond à une teneur en SPS comparable à environ 0,4 g dans 10 g d'eau, ajouté à 5 g d'isolat de protéine. Le pourcentage de liaison du SPS est une valeur calculée Le pourcentage de liaison du SPS diminue à cause de la saturation de la protéine en SPS aux faiblesrapports protéines/SPS. Tableau 6 1: Mesures suivant l'exemple 6 Rapport Produit de Précipité sèché Protéine/ centrifugation I SPS 62 % N %M 4 S % N % N x 6,25%MS % MS 0 0,068 20,62 13,2 82,5 93,1 88,6 0,045 0,49 13,4 83,8 97,3 86,1 12,5 0,038 0,45 13,0 81,3 97,9 83,0 6,25 0,031 0,45 12,6 78,8 98,1 80,3 3,125 0,026 0,61 11,8 73,8 97,9 75,3 : 2518570 Tableau 6 2: Récupération de protéine liaison du SPS et pourcentage de Rapport Pourcentage de récupé % de liaison du SPS )2) Protéine/ pération de protéine I) SPS 91,5 O 94,4 77 12,5 95,3 90 6,25 96, 1 70 3,125 96,8 60 Pourcentage de récupération de protéine = -l 1 NC 1 x 6,25 lx 100, o NC 1 = pourcentage d'azote dans le produit de centrift gation I. 2) pourcentage de liaison du SPS = (% P/H) (% P/H) x (% reurration protine) 5 x(% recuperation protine 100 1- l 5/ rapport de SPS J o, (% P/H) est le rapport protéine/matière sèche dans le précipité séché, et (% P/H) se rapporte au précipité sans addition de SPS. Exemple 7 (exemple d'application) Cet exemple décrit la préparation d'une p v p. en utilisant la préparation de SPS-ase KRF 92 B-I compor- tant 5 % de matière sèche Le procédé de préparation est le même que celui de l'exemple 3 C, sauf que toutes les masses sont divisées par un facteur 5 La p v p a été analysée comme décrit à l'exemple 2 Les résultats obtenus dans l'essai apparaissent dans le tableau 7 1. Tableau 7 1: Résultats obtenus à l'exemple 7 a Analysé par Bioteknisk Institut, Holbergsvej 10, DK-6000 Kolding. b Analysé par Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, DK-8000 Aarhus C. Exemple 8 (exemple d'applicatio: Cet exemple montre l'effet d'un pré-traitement de la farine de soja par une cuisson au jet de vapeur avant la préparation de la p v p. Pré-traitement: Une suspension de farine de soja dans l'eau con- sistant en 10 kg de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) par 100 kg a été pompée à travers un éjecteur de vapeur (type Hydroheater B-300) et mélangée avec de la vapeur à 8 bars en une telle quantité et à une telle vitesse qu'on a pu maintenir une température finale de 150 C pendant 25 sec dans un réacteur tubulaire pressurisé Ensuite la pression a été réduite dans une chambre de détente (un cyclone) d'o la suspension a été envoyée dans un échangeur de chaleur à plaque dans lequel elle a été refroidie à environ 50 C La boue refroi- die a pu être utilisée telle quelle pour la préparation de p v p suivant l'invention, mais, dans ce cas, la suspension Composant Masse (Nx 6,25) Matièr Rendement Rendement en sèche sn protéine mat sèche Il % % % Farine de soja 85,2 55,2 94,0 100 100 Préparation d'enzyrce4,0 71,2 6,1 - ler produit de cen632 1,88 5,44 25,3 43,0 trifugation 28 produit de cen 673 0,30 0,80 4,3 6,7 trifugation p.v p; 39,8 85, 6 a98,1 71,9 48,8 84,4 98,1 b a été séchée par pulvérisation à une température d'entrée de 200 C et à une température de sortie de 90 C Le produit pré-traité indique une teneur en matière sèche de 96,5 % et une teneur en protéine de 56-,9 % (N x 6,25). Préparation de la p v p. Cette préparation a été effectuée de la manière suivante: On a mis 70 g de matière sèche de farine de soja jet de vapeur et sèchée en suspension et on a sous agitation à 50 C dans 560 g d'eau et on a règlé le p H à 4,50 au moyen transféré 6 x 90 g de cette 250 mlet on a maintenu sous d'eau au moyen d'agitateurs Erlenmeyer on a ajouté 10 g respectivement O g, 0,025 g, 0,40 g de la préparation de mrlanges réactionnels ont ensuite de 6,5 ml d'H Cl 6 N On a suspension dans-6 flacons d'Erlenmeyers de agitation à 50 C dans un bain magnétiques -A chaque flacon d' d'une solution contenant 0,050 g, 0,10 g, 0,20 g et SPSase KRF-68-B-III Les té agités pendant 240 minutes à 50 C On a ensuite effectué une centrifugation pendant minutes à 3000 x g. Le surnageant a ensuite été analyse suivant la méthode de Kjeldahl-N et la phase solide a été lavée à l'eau l volumes égaux et a été centrifugée Cette opération a été effectuée deux fois La phase solide a ensuite été lyophilisée et analysée pour la détermination de Kjeldahl-N et des matières sèches. Un essai semblable a été effectué avec une farine de soja non traitée (Sojamel 13 de Aarhus Oliefabrik A/S) utilisée en tant que substance de départ Dans ce cas, les rapports de l'enzyme au substrat étaient de O %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 % et 8 %. En se basant sur la teneur en protéine des sur- nageants, on a pu calculer le pourcentage de protéine récupérée Le rendement en protéine est basé sur cuite au maintenu l'hypothèse que la substance d'enzyme est solubilisée à 100 % après la réaction Le tableau ci-dessous indique les résultats obtenus par les deux essais. Tableau 8 1: Rendements en protéine et rapport protéine/ matière sèche pour une p v p préparée à partir de farine de soja cuite ou brute. En ce qui concerne les processus d'extraction (isolation) appliqués à des substances différentes des pro- téines ou les processus de liquéfaction et les techniques qui y sont apparentées, on se référera au schéma général de procédés pour des applications, comme représenté au tableau synoptique n 3. Le substrat peut consister en un ou plusieurs hydrates de carbone présents dans la substance brute ou bien il peut consister en la totalité de la substance brute. Ce substrat peut être soumis à un prétraitement de nature chimique ou physique, comme expliqué plus loin à titre d'exemple, constitué par un traitement acide ou alcalin, un trempage ou un mouillage et/ou une cuisson avec ou sans vapeur. La substance brute peut être macérée, coupée, moulue à l'état humide et/ou homogénéisée (tous ces traitements étant qualifiés d'homogénéisation au tableau synoptique n 3), Farine de soja cuite Farine de soja non-traitée E/S % Rendement Protéine des Rendement en Protéine de en protéine mat sêches protéine mat sèches O 92,9 76,5 90,7 73,9 0,25 90,1 86,6 0,50 89,3 88,7 1,0 88,1 89,7 87,1 86,2 2,0 86,6 91,7 85,7 88,1 3,0 84,3 -89,5 4,0 84,7 92,2 82,6 90,9 8,0 76,2 91,1 avec ou sans addition d'eau, d'autres additifs pouvant être ajoutés pendant cette étape L'homogénéisation peut être effectuée avec différents degrés d'efficacité, diffé- rentes pressions n'étant, par exemple, qu'une fraction de la pression maximum donnée pour l'équipement d'h Iomogénéisa- tion spécifique utilisée On peut ajouter différents additifs avant ou pendant l'homogénéisation, comme représen- té par bl, b 2 bn dans le tableau synoptique n 3. Le processus réactionnel y compris la prénaration de la SPS-ase est effectué dans des conditions spécifiques, par exemple de température, de pression, de durée, de p H et de dosage d'enzyme; de même, des recommandations concernant le réacteur utilisé (par exemple discontinu, écoulement tamponné) et l'agitation, si nécessaire, sont importantes On peut utiliser-une série d'additifs pour différentes substances brutes, représentés par c c 2 cn dans le tableau synop- tique n 3. De même, les opérations de séparation peuvent être effectuées avec différents degrés d'efficacité Dans de nombreux cas, la séparation est omise ou facilitée, par exemple lorsque la substance brute est complètement liqué- fiée On peut utiliser différents dispositifs de sépara- tion (par exemple des centrifugeuses, des filtres, des dis- positifs d'ultrafiltration, des hydrocyclones, des épaissis- seurs, des tamis ou cribles ou des simples décanteurs). L'efficacité de la séparation est définie comme la proportion entre la teneur absolue en boues dans la phase des solides et la teneur absolue en boues du mélange réac- tionnel - Les phases liquides ou solides obtenues peuvent être traitées ultérieurement,par exemple concentrées, séchées ou être extraites par solvant, -afin d'éliminer certaines com- posants comme la graisse ou l'huile; elles peuvent également fermenter pour produire une biomasse, de l'alcool ou d'autres produits (des enzymes, des antibiotiques ou d'autres compo- sants utilisables). De même, les produits obtenus peuvent être recyclés dans le processus de manière à répéter le traitement. Tableau synoptique n 3 Préparation de SPS-ase cl c 2. c n ( H 1 = O 100 %) Hom Conditions de réaction à préciser -upra) ( p= O 100 %-) (sep 3 olides Traitements ultérieurs (voir texte) ou réutilisation en tant que substrat Les exemples qui suivent montrent des applications des préparations de SPS-ase et la liste suivante donne un résumé de ces applications. De même, le tableau 1 annexé indique certaines caractéristiques concernant le tableau synoptique n 3. -2518570 Liste d'applications de préparations de SPS-ase, à titre d'exemples. l Xype de prépa Référence rations de N SPS-ase Préparation de PS-ase sub- tantiellennt pxempte d'une Du plusieurs activités en- % 5 matiques non _ L 6 sirées A 1 A 2 A 3 A 4 A 5 Ba 1 Ba 2 Ba 3 Ba 5 Ba 6 Ba 7 Bb 1 Bb 2 Bb 3 Bb 4 Bb 5 Bb 6 Bc 1 Bc 2 Bc 3 Bc 4 Bc 5 Bc 6 Bc 7 Extraction d'amidon de mais, de blé et de poemmes de terre Extraction de lipides de substances végétale E Extraction d'huiles éthériques de substances végétales Extraction de colorants naturels de substan- ces v&éétales Extraction de caoutchouc du buisson guayul Production d'un substitut de lait pour ani- maux domestiques Production de substances brutes contenant de l'amidon saccharifié Liquéfaction complète de poires ou d'autres fruits Production de jus par traitement de fruits et de végétaux Traitement concernant l'extraction ou le pressage de la canne à sucre ou de la bette- rave à sucre Production de lait de soja Traitement destiné à accroître la quantité récupérable de matières solubles de café Prévention et/ou décorposition du louche de pomme Utilisation en tant que agent clarifiant de vin blanc Production de ISSPH ou d'autres hydrolisats de protéine végétale Enzyme de brassage pour l'industrie de la bière Additif enzymatique pouvant être utilisé pendant la fermentation et/ou le stockage de la bière Agent destiné à enlever la beau de l'amande Décomposition de différents déchets Saccharification et fermentation simultanée Décomposition de cellulose Application en tant que additif de cuisson Amélioration du rendement en alcool et en biomasse pendant la fermentation de la liqueur de sulfite dans la production du papier Assèchement de produits de boue biologique Additif pour aliment de bétail ensilé. 1_ I u 10 Ba Liquéfac- tion com- plète ou traite- ment sem- blable Additifs de pro- cessus Autres appli- cations Pa- ta- ltion PPS- ase bon Iix Eiée w (A w CD Lni CD (Ai Ln Additifs___ lè hcuto 2 è homo Sépara Phase Traitements ultérieurs Réf Substrat ___ génèisa généisa tion liquide a b C tion tion Phase Phase comnbinée Hc Hanq 1 Iam Sép solide (sans séparation) * i Mats Eau Eau, Na OII (Contient Opération E ou 20 -50 10 -30 30 -50 des ger de lavage- fici fles) lavage, récupéra- tion de l'huile * 2 Germe de Na QUI (Huile + mais ou O O 100 eau) Déchets- Ui Ci Purifica- tion Ba i iarne de Pasteurisation" soja (dé Eau H Cl O O O O concentration, graissée) séchage par pulvé- risation 2 a Patate Terma Na OH Levure pour la fer- douce Eau myl ou nntation de l'alcool H Cl distillation Ba Betterave Na OH Cristal (Déchet) à sucre Eau ou 10 % 10 lisation IICL Bc 12 i dtu I k Eau Cl 1 % Lvure pour la forern ______ 1 ai de tation d Ie I 'alcool, -tC ie_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ i W a i o w Ln -4.j C> A 1 Extraction d'amidon de mais, de blé et de pommes de terre. L'extraction d'amidon de mals, de blé, de pommes de terre et d'autres plantes contenant de l'amidon est effectuée par l'une ou plusieurs des étapes suivantes macération, broyage à l'eau et séparation L'utilisation d'une préparation de SPS-ase ne comportant essentiellement aucune activité amylolytique fournit les avantages suivants, le mais étant utilisé à titre d'exemple 1 La libération d'amidon est facilitée pour une période de macération plus courte, 2 La consommation d'eau peut être réduite, 3 La libération du germe de mals est facilitée sans libération de l'huile du germe de mals, 4 On peut obtenir la protéine en une pureté plus élevée, La récupération de l'eau de macération de mals est facilitée. A 2 Extraction de lipides de substances végétales. Etant donné que les-lipides d'une substance végétale sont enfermés à l'intérieur de cellules et généralement liés aux protéines, on peut extraire les lipides en phase aqueuse en les traitant avec une préparation de SPS-ase qui est essentiellement exempte de lipases Ainsi, l'huile de germe de mais est normalement isolée par extraction à l'hexane des germes sèchés de mais Cependant, l'opération de séchage est superflue si les germes de mais humides sont traités avec une préparation de SPS-ase du genre susmen- tionné De manière analogue, l'extraction de l'huile d'olive en phase aqueuse peut être améliorée, si l'enzyme utilisée pour le traitement enzymatique est une préparation de SPS-ase eu genre susmentionné, voir, par exemple, Food, Pharmaceutical and Bioengineering, No 172, volume 74, pages 93 à 94 De même, l'extraction aqueuse, par exemple, de l'huile de soja, l'huile de colza et l'huile de tourne- ' sol peut être améliorée de manière analogue. A 3 Extraction d'huiles éthériques de substances végétales Si des substances végétales contenant des huiles éthériques sont extraites au moyen d'une solution aqueuse d'une préparation de SPS-ase qui est essentiellement exempte d'activité enzymatique capable de décomposer ou de modifier d'une autre manière les huiles éthériques, celle- ci sont récupérées en des rendements élevés, à des frais très bas. A 4 Extraction de colorants naturels de substances végé- tales. Si l'on traite des substances végétales conte- nant des colorants, par exemple des racines de betteraves contenant le colorant rouge bétanine ou le colorant conte- nu dans les airelles, avec une préparation de SPS-ase qui est essentiellement exempte d'activités enzymatiques capa- bles de décomposer ou de modifier d'une autre manière les colorants, ceuxci sont récupérés en de hauts rendements, à des frais très bas. A 5 Extraction de caoutchouc du buisson guayul. Un autre exemple de substrat pour une prépara- tion de SPS-ase qui est essentiellement exempte d'une activité enzymatique capable de décomposer le caoutchouc naturel est la substance de parois cellulaires dans les racines et branches du buisson guayul. Ba 1 Production d'un substitut de lait pour animaux domes- tiques, de préférence un substitut de lait pour veau. On peut produire un substitut de lait pour veau qui est soluble dans l'eau froide à un p H d'environ 4,5 par une liquéfaction complète en milieu aqueux de fèves de soja, de graines de tournesol, de graines de c oton, de fèves faba ou de pois des champs En utilisant une substance brute contenant de l'amidon comme des fèves faba ou pois des champs,on peut accomplir la liquéfaction-de l'amidon au moyen d'une alpha-amylase avant, après ou 18570 66. pendant le traitement avec la SPS-ase qui solubilise fina- lement les polysaccharides qui ne sont pas de l'amidon et qui sont présents en tant que substance formant la structu- re des parois cellulaires On montre un exemple détaillé ci-dessous, en utilisant des fèves faba, qui scnt c Pparées au soja,en se référant au tableau I Le prétraitement des fèves de soja peut, de préférence, consister en une cuisson par jet de vapeur, ce qui améliore la solubilisation de la rémanen- ce. Exemple Ba 1 1 On met 15 kg de farine de fève faba (Farine de Fèves des GRANDES MINOTERIES A FEVES DE FRANCE, Paris) en suspen- sion dans 35 litres d'eau On ajoute 75 g de Termamyl L et 18 g de Ca C 12 On a chauffé la suspension à 95 C en utilisant un récipient à chemise de vapeur et en agitant. La suspension a ensuite été traitée à cette température pendant 60 minutes Ensuite on a règlé le p H à 4,5 et le produit a été refroidi à 50 C On a dissous 300 g de la préparation de SPS-ase KRF 68 dans 1 litre d'eau et on l'a ajouté à la suspension La réaction a été effectuée pendant 440 minutes Lorsqu'on a introduit 10 g de Fungamyl 800 L la fraction d'amidon a été transformée prin- cipalement en disaccharide (maltose) Ensuite, le mélange de réaction a été pasteurisé à 90 C, pendant 2 mn Une partie aliquote du produit est ensuite lyophilisée et utilisée pour des essais de stabilité L'échantillon a ens:ite été solubilisé à 10 % de matière sèche et la solution du produit a pu être maintenue stable sans sédimentation pen- dant plusieurs jours. De la graisse ou de l'huile fondue peut être facilement émulsifiée dans le produit en obtenant une com- position finale très semblable au lait de vache Une émulsion contenant 3,5 % d'huile (huile de soja) a égale- ment pu être maintenue stable sans sédimentation pendant plusieurs jours. Exemple Ba 1 2 On a fait cuire au jet de vapeur à 150 'C pendant secondes, comme décrit à l'exemple 8, de la farine de soja (Sojamel 13) La farine de soja cuite au jet de vapeur a été sèchée par pulvérisation et utilisée pour des recher- ches ultérieures décrites ci-après. A: On a mélangé 50 g de farine de soja cuite au jet de vapeur avec 450 g d'eau et on a règle le p H à 4,5 au moyen de 4,1 ml de H Cl 6 N Le mélange a ensuite été chauffé à 450 C dans un bain d'eau et on a ajouté 0, 250 g de la préparation de SPS-ase KRF-68 au mélange chauffé que l'on a fait réagir pendant 5 heures sous agitation. Ensuite, on a chauffé le mélange à 80 C pendant 2 minutes- afin d'inactiver l'enzyme On a centrifugé un échantillon de 100 ml à température ambiante pendant 15 minutes à 3000 x g (g = gravité) Le surnageant a été soumis à un échange ionique et a été analysé par HPLC pour déterminer la compo- sition de l'hydrate de carbone Le surnageant a également été analysé pour la détermination de l'azote par la méthode de Kjeldahl, des matières sèches et du degré de solubilité de l'azote 'nitrogen solubility index NSI); on a également calculé le degré de solubilité des matières sèches (dry matter solubility index DSI); voir les résultats du tableau Ba I On a introduit 100 ml du mélange réaction- nel refroidi à 200 C dans un récipient de 100 ml gradué et on l'a maintenu à 40 C pendant 2 jours La stabilité à la. dispersion ( %) a été mesurée en lisant le volume des dis- persions obtenues (tableau Ba II) après l et 2 jours. On a ajouté 8 g d'huile de soja à 200 ml du mélange réactionnel (à 20 'C) On a préparé une émulsion en mélangeant pendant 2 minutes dans un mélangeur de Waring. La stabilité de l'émulsion (%) a été mesurée comme ci- dessus après 1 et 2 jours. B: On a effectué une réaction comme ci-dessus, dans ce cas, cependant, on a utilisé 1,00 g de la préparation de SPS-ase On a effectué les mêmes genres d'analyse et de mesures de stabilité que ceux décrit à la partie A Les- résultats sont représentés dans les tableaux Ba I et Ba II. Des analyses chimiques des surnageants, il apparaît que les valeurs de NSI (%) et de DSI (%) obtenues dans l'essai B sont plus élevées que celles obtenues pour l'essai A Cependant, les essais de stabilité effectués sur les mélanges réactionnels donnent une meilleure valeur pour les échantillons A Ceci est probablement da à la plus grande longueurde la chaine de peptides des protéines du mélange réactionnel résultant du dosage plus faible en enzymes. De la composition de l'hydrate de carbone déter- minée par HPLC, il apparait que l'on produit principalement des monosaccharides et des disaccharides De ce fait, des oligosaccharides dont il est connu qu'ils provoquent la diarrhée et la flatulance lorsqu'on les donne aux veaux en de quantités trop importantes, ne sont présentes qu'en de faibles quantités. Tableau Ba I Propriétés chimiques du surnageant. EssaisDosage des x Résultats enzymes par NSI, % DSI, % H P L C (compo rapport (à p H = (à p H = sition de -sucres au substrat 4,5) 4,5) neutres) % en poids DP + DP 2:79,7 % A E/S = 0,5 % 39,9 62,4 1 2, DP 3: 7,4 % DP:12,2 % DP 4 +: 8,1 % DP_ + DP:84,4 % B E/S = 2,0 % 57,0 67 DP 2 6,1 % DP 3: 6,1 % DP: 3,7 % DP: 5,7 % NSI = Degré de solubilité de l'azote "DSI= Degré de solubilité des matières sèches 1 O Tableau Ba II Essais de stabilité des mélanges réactiornnels Essais Dosage des Essai de stabilité enzymes par Sans huile Avec huile rapport au substrat Dispersion Dispersion Emulsion Emulsion % en poids ler jour 2 è jour ler jour 2 è jour A E/S = 0,5 % 80 % 63 % 100 % 87 % *B E/S = 2,0 % 66 % 35 % 85 % 71 % Ba 2 Production de substances brutes contenant de l'amidon saccharifié. En ce qui concerne la saccharification du manioc et de patates douces et d'autres substances végétales contenant de l'amidon, l'addition d'une préparation de SPS- ase peut résoudre des problèmes de viscosité En utilisant une préparation de SPS-ase, il est possible de produire des suspensions d'amidon présentant une teneur en matières sèches de 25 à 30 %, et après saccharification, la pate peut fermenter pour obtenir un éthanol bon marché. Exemple Ba 2 1 On prépare une purée présentant uneteneur en matières sèches de 24 % à partir de patates douces (Japon) fraîches et rapées La teneur en amidon des patates douces se situe aux environs de 70 % de la teneur en matières sèches de celles-ci Une première liquéfaction au moyen de l'amylase bacterielle Termamyl 60 L (désignation commerciale) en me quantité de 0,5 kg/t, d'amidon a ôté effectu Ae en chauffant la purée C Ensuite elle a été maintenue à 90 C pendant 30 minutes On a ensuite mesuré la viscosité 771 du mélange réactionnel au moyen d'un fuseau HAAKE à 90 C. On a ensuite fait refroidir le mélange réaction- nel à 55 C, et on a règlé le p H à 5,0 au moyen de H 2 SO 4 2 N. On a ensuite initié une saccharification par addition de la gluco-amylase SAN 150 (marque déposée par NOVO INDUSTRIA/S) en un dosage de 1,75 litre/tonne d'amidon Le mélange de I Si 18570 X saccharification a ensuite été divisé en trois parties, A, B et C qui ont été traitées pendant 15 minutes par des enzymes comme représenté ci-dessous avant qu'on ne mesure la viscosité: At Cette partie est l'essai A blanc La viscosité 7 2 a été mesurée, voir tableau Ba III. B: On a ajouté la cellulase Tricoderma viride de Celluclast 200 N en une quantité de 1 kg par tonne de matières sèches de patates douces. La viscosité q 3 a été mesurée, voir tableau Ba III. C: On a ajouté la préparation de SPS-ase KRF-68 en une quantité de 0,25 kg/tonne de matières. sèches de patates douces On a mesuré la viscosité 74, voir tableau Ba III. Tableau Ba III: Viscosités Ainsi, on peut donc constater que la viscosité du mélange réactionnel peut effectivement être réduite au moyen de la SPSase à dosage faible par rapport au CELLUCLAST (désignation commerciale) et au SAN 150. Ba 3 Liquéfaction complète de poires ou d'autres fruits. Si l'on traite ultérieurement avec une prépara- tion de SPS-ase des poires entières qui ont été écrasées mécaniquement, on effectue une liquéfaction complète et on produit un jus de poires clair après avoir éliminé de faibles quantités de matières solides Un procédé analogue peut être utilisé pour d'autres fruits semblables, par Mélange réactionnel Viscosité Viscosité à 90 C à 55 C Patates douces X = 770 cp X 2 = 2190 cp A 2 = 2190 cp - B B 73 = 1970 cp C 4 = 950 cp exemple les pommes. Exemple Ba 3 1. Des pommes fraîches sont grossièrement broyées au moyen d'un broyeur central Bucher La purée de pommes est ensuite pasteurisée dans un réservoir chauffé à 90 C, pendant 5 minutes, et elle est ensuite refroidie à tempé- rature ambiante Les pommes pré-broyéessont ensuite écrasées une deuxième fois dans un broyeur Fryma comportant un appa- reillage à pierre de corindon,jusqu' à ce que la purée soit lisse au toucher La pàte a ensuite été pasteurisée une seconde fois à 80 C pendant 10 minutes et refroidie à 50 C. Les réactions enzymatiques ont ensuite été effectuées à 50 C pendant 30 minutes au moyen du dispositif Contraves Rheomat 15 en agitant et en effectuant simultané- ment la mesure de viscosité (par rapport à un pourcentage lu sur le Rhéometre à vitesse 13) Après la fin de la réaction enzymatique on a retiré un échantillon de 100 g et on l'a centrifugé dans un tube gradué à 3000 x g pendant minutes A ce stade, on a mesuré le pourcentage de jus et le pourcentage de dépôt On a également mesuré le p H et- le pourcentage en matières sèches au réfractomètre, en o Brix Le tableau Ba IV montre une comparaison entre l'effet de la SPS-ase, la combinaison de Celluclast et de SPS-ase et la combinaison de Celluclast et de Pectinex On a utilisé la préparation de SPS-ase KRF-68. Tableau Ba IV: Résultats des essais de liquéfaction totale avec une purée de pommes à 50 C pendant 30 minutes P-ase Celluclast| Pectinex Viscosité Centrifugation Jus -/hl de 200 1 3 x g/hl de finale% %jus % dépt p H purée g/hl de purée pure 0 O O 100 59 49 3,8 9,7 O O 19 81 19 3,510,5 50 O O 15 79 21 3,510,7 50 O 4,8 83 17 3,5 10,8 3,8 83 17 3,1 12,5 0 50 200 9,5 83 17 3,2 12,9 0 50 2000 4,0 -82 18 3,1 13,2 Ba 4 Production de jus par traitement de fruits et de végétaux. On a trouvé que des préparationrsde SPS-ase conviennent bien pour la production de jus par traitements de différents fruits, baies et de végétaux, par exemple la carotte, les pois, les tomates, les pommes, les poires, le cassis, les fèves et -le choux Dans ce cas, on obtient des rendements améliorés en jus et une meilleure extraction des pigments et arômes par rapport aux préparations commerciales de pectinase et de cellulase. Exemple Ba 4 1 On se réfère à l'exemple Ba 3 1 dans lequel on a comparé la préparation de SPS-ase aux produits commerciaux de cellulase et de pectinase Celluclast 200 L (désignation coamerciale) et Pectinex 3 x (désicnation camoerciale) Il apparaît du tableau que le rende- ment en jus peut être légèrement amélioré avec seulement 50 g/hl de SPSase par rapport à 2000 g/hl de Pectinex, les deux étant en combinaison avec 50 g/hl de Celluclast La viscosité était également légèrement plus basse De ce fait, il semble que la SPS-ase-est environ 40 fois plus efficace que le Pectinex. Ba 5 Traitement concernant l'extraction ou le'pressage de la canne à sucre ou de la betterave à sucre. On a trouvé qu'il est possible d'améliorer le rendement de processus de simple extraction, si l'on utili- se la préparation de SPS-ase pour le traitement de la canne à sucre ou de la betterave à sucre avant et/ou pendant l'extraction ou le pressage de celles-ci De même, la rémanence (la bagasse) peut être traitée avec la préparation de SPS-ase, ladite rémanence étant partiellement convertie en sucres fermentables qui peuvent être utilisés en tant que substance brute pour une fermentation d'éthanol. Exemple Ba 5 1 On a broyé 2 fois, dans un broyeur Fryma (type MZ-110), 10 kg de rémanence de betterave sucrière tpulpe) obtenue par une extraction continue à contre-courant dans un diffuseur-DDS chez Nakskov Sugar Factory On a ajouté de l'eau de traitement pendant l'opération de broyage. On a traité par enzyme des fractions de 300 g de pulpe à 450 C pendant 18 heures au moyen des dosages d'en- zymes représentés au tableau Ba V On a ajouté le produit enzymatique sec (KRF-68) à la pulpe qui a été agitée par une tige pendant la première heure Ensuite, la pulpe a été liquéfiée de manière à pouvoir effectuer une agitation par agitateur magnétique pendant le temps restant A la fin de la réaction on a mesuré le p H (on n'a pas effectué de correction de pli pendant le début de la réaction) et on a centrifugé le mélange réactionnel jusqu'à ce que l'on obtienne un surnageant clair On a effectué des détermina- tions de matières sèches du mélange réactionnel et des sur- nageants Les pourcentages de matières sèches solubilisées ont été calculés sur base de ces résultats Les corrections ont été faites pour les matières sèches solubles du produit enzymatique dans tous les calculs. Les surnageants N's 2, 3 et 4 ont été soumis à un échange ionique et ont été analysés par HPLC pour déterminer la composition des hydrates de carbone. Tableau Ba V Résultats obtenus par une liquéfaction enzymatique d'une pulpe de betterave Essais Dosage des No enzymes par Mesures finales rapport aux Mélange réactionnel Surnageants matières sèches FI p H (final) matières matières matières sèches __ èches_ E 5 sèches % sèches % solubilisées % 1 O 5,5 4,18 0,0 0,0 2 0,35 3,6 3,85 2,85 66,9 3 0,56 3,5 3,81 2,56 66,2 4 1,02 3,5 3,86 2,73 70,4 1,58 3,3 3,17 2,34 73,4. 6 3,10 3,4 3,23 2,49 76,4 7 7,52 3,4 2,66 2,18 80,5 Conditions de réaction: M = 300 g S = 4,18 % de matières sèches E/S commemontré ci-dessus p H non règlé T = 45 C t = 18 heures Tableau Ba VI: Données HPLC Genre de sucre Essais ne (neutre) 2 1 3 4 % de sucres neutres Poids moléculaire élevé 43,6 31,9 25, 3 (DP 4 +) Disaccharides 4,6 4,8 - Glucose 20,4 23,7 27,8 Falactose 5,0 5,9 7,3 Fructose/Arabinose 26,4 32,2 33,2 Acide Galacturonique pas mesuré Tous les sucres formés suivant le tableau Ba VI ci-dessus peuvent fermenter en alcool ou être utilisés dans d'autres buts. Ba 6 Production de lait de soja On peut facilement produire du lait de soja par une liquéfaction totale de soja broyé et par une homogénéi- sation ultérieure du mélange obtenu Le lait de soja est souvent produit en trempant les fèves de soja dans de l'eau bouillan- te, en broyant les fèves imprégnées en extrayant l'eau et en séparant ensuite les résidus insolubles, par exemple les protéines et les polysaccharides Afin d'améliorer le ren- dement en lait de soja, ces résidus insolubles peuvent être liquéfiés par réaction avec la SPS-ase Exemple Ba 6 1 Le procédé de production de lait de soja est expliqué plus en détail par les séries de réaction enzymati- que suivantes, les calculs du degré de solubilité de protéine (PSI, %, protein solubility index) et du degré de solubilité de matières sèches (DSI, %, dry matter solubili- ty index) représentent les rendements obtenus après sépara- tion à p H 7 (voir tableau Ba VII) Les réactions enzymati- ques ont été effectuées dans les conditions suivantes Substrat: farine de soja non dégraissée (Dansk Sojakage- fabrik A/S) Masse du mélange réactionnel: 220 g Masse du substrat: 20 g Température: 50 C p H: 4,5 (H Cl 6 N) Temps de reaction: Séries A: I heure Temps de réaction: Séries B: 0,5 à 6 heures Enzyme: SPS-ase (KRF-68) Quantité d'enzyme: Séries A: rapport E/S (poids/poids) O à 8,0 % Séries B: rapport E/S (poids/poids): 1,0 % Après la réaction, on a règlé le p H à 7 au moyen de Na Ol H 4 N et on a effectué une séparation par centrifugation à 3000 x g, pendant minutes. Tableau Ba VII: Calculs du bilan en masse du procédé enzymatique de production de lait de soja eries Tunps de Quantité d' Mélange réactionnel Surnageant Indices de solubilit réaction ezfl Zets % protéine %mat % protéine % mat % PSI % DSI hures E/S sèches sches 1,0 O 3,65 8,70 1,87 5,72 49,6 63,,7 1,0 0,5 3,68 8,74 2,41 6,28 63,7 70,0 A 1,0 1,0 3,71 8,78 2,48 6,43 65,1 71,4 1,0 2,0 3,78 8,86 2,98 7,18 77,5 79,5 1,0 4,0 3,92 9,03 3,36 7,69 84,6 83,9 1,0 8,0 4,19 ' 9,37 3,76 8,08 88,5 85,0 0,5 1,0 3,64 8,78 2,39 6,41 64,0 71,1 1,0 1,0 3,64 8,78 2,56 6,60 68,7 73,4 B 2,0 1,0 3,63 8,78 2,79 6,91 75,2 77,'1 4,0 1,0 3,63 8,78 3,10 7,29 84,0 81,7 6,0 1,0 3,63 8,78 3,39 7,69 92,3 86,5 -J a' r%> Ui C.à Co Ln Ba 7 Traitement destiné à accroître la quantité récupérable de matières-solubles de café. On a trouvé que le traitement de graines de café à différentes étapes, pendant la production de -café instan- tané, résulte en une augmentation du rendementde matières solubles de café Ainsi, par exemple,le marc de café épuisé ou des graines vertes peuvent être traitées par des enzymes avec des résultats avantageux. Bb 1 Prévention et/ou décomposition du louche de pomme Après la production d'un jus de pomme ou de poire ou d'autres jus de fruits, qui doivent être clairs et qui ont antérieurement été traités avec des préparations de pectinase et cellulase classiques afin d'éviter la forma- tion de turbidité, il peut apparaître un louche de pomme ou des louches de fruits analogues On a trouvé que des préparations de SPS-ase conviennent bien pour la décomposi- tion de tels louches qui consistent principalement en arabanne liée aux protéines. Exemple Bb 1 On a constaté que le concentrat de jus de poire produit par liquéfaction enzymatique de déchets de conser- veries de poires en utilisant du Celluclast et du Pectinex se trouble au repos Le louche a été isolé et hydrolysé au moyen de H 2 SO 4 0,01 N pendant 24 heures et a été analysé par HPLC Le chromatogramme montre de l'ara- binose et de faibles quantités d'oligosaccharides. En faisant incuber 0,5 % poids/volume de cet hydrate de carbone dans 1 m M de tampon acétate à p H 4,5, pendant 3 heures, à 40 C, avec la SPS-ase (KRF-68 + KRF 92, 1:1) présentant une concentration en enzyme de 0,05 % poids/volume, on a trouvé que 84 % de l'hydrate de carbone du louche initial (matière sèche) ont été transformés en arabinose. On a également traité un concentré de poire dilué ( 20 'Brix) pendant 2 heures à 40 C avec une quantité d'enzyme SPS-ase susmentionée de 0,15 % poids/volume ou avec un produit commercial connu sous la désignation o Emerciale de Clarex en une quantité de 1 % poids/volume On a trouvé que la SPS-ase était capable de réduire de 86 % la surface relative du pic HPLC du louche semblable à l'arabanne, alors que la réduction correspondante au moyen de Clarex -(utilisé en une quan- tité nettement supérieure à la préparation de SPS-ase) n'était que de 78 %. Bb 2 Utilisation en tant que agent clarifiant de vin blanc. On a trouvé que les vins blancs présentant une turbidité très indésirable peuvent ûtre clarifiés efficace- ment au moyen d'une SPS-ase On a montré que la substance trouble consiste principalement en arabinogalactanes qui sont liés à des résidus d'hydroxyproline dans une protéine structurelle de parois cellulaires. Bb 3 Production de ISSPH ou d'autres hydrolisats de protéine végétale. Avant la séparation du ISSPH (isoelectric soluble soy protein hydrolyzate hydrolisat de protéine de soja, isoélectriquement soluble) ou d'autres hydrolysats de pro- téine végétale de la boue, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis N 4 100 024 ou dans Process Biochemistry, vol. 14, No 7 ( 1979), pages 6 à 8 et 10 11, on peut traiter le mélange réactionnel avec une préparation de SPS-ase. Ceci permet d'obtenir une séparation plus facile. Bb 4 Enzyme-de brassage pour l'industrie de la bière. Dans la production d'hydrates de carbone de bière à partir de substances brutes, par exemple les beta-glucannes de malt et d'orge,on observe une influence sur la viscosi- té et la filtrabilité du moût L'addition d'une SPS-ase pendant le brassage réduit la viscosité du moût et améliore sa filtrabilité ainsi que le rendement à l'extraction En outre, l'addition d'une SPS-ase pendant le brassage augmen- te la fermentabilité du moût ainsi que la teneur en azote 2518570 g dans le moût. Exemple Bb 4 1 Au laboratoire, on a brassé ensemble 50 g de gruau d'avoine moulu consistant en 50 % de malt et 50 % d'orge avec 275 gr d'eau ( 15 % de matières sèches) selon le schéma de brassage suivant: 52 o C ( 60 minutes) / 63 C ( 60 minutes)/76 C ( 30 minutes): Afin de prouver l'effet de la SPS-ase on a effec- tué quatre essais, voir le tableau donné ci-dessous, dans lesquels les enzymes (p H du brassin 5,5 - ont 6,0) été ajoutés pendant le brassage BGU représente des unités de béta-glucanase déterminées selon le procédé analytique AF 70/4-GB, dis- ponible chez NOVO Industri A/S. FBG représente des unités de béta-glucanase fongiques déterminées selon le procédé analytique AF 70 1/ 2-GB disponible chez NOVO Industri A/S. Enzyme Néant Cerefl SPS-ase (KRF-68) Activité de béta-gluca O 200 BGU 1630 FBG 1630 FBG nase/g Dosage d'en- zyme par kg O 1,5 g 0,05 g 0,18 g de gruau Quantité to- tale d'unités d'activité O 300 BGU 80 FBG 300 FBG d'enzyme par g de gruau itesse de filtration 120 ml 135 ml 160 ml 170 ml u moût après 10 mn Viscosité du mont 10 Bal 1,52 c P 1,36 c P 1,36 c P 1,30 c P ling ( 25 C) o ' La seule différence entre BGU et FBG est le- p H auquel on effectue la détermination de l'enzyme: p H 7,5 pour BGU et p H 5,0 pour FBG. Cereflo est une préparation de béta-gluonase bactérielle décrite dans le document d'information B 214 b- GB 1500, Juillet 1981, disponible chez NOVO Industri A/S. Exemple Bb 4 2 Au laboratoire, on a brassé ensemble 50 g de gruau d'avoine moulu consistant en 40 % de malt et 60 % d'orge avec 150 g d'eau ( 25 % de matières sèches) selon le schéma de brassage suivant: 450 C ( 60 minutes) /63 C ( 90 minutes)/75 C ( 15 minutes). Afin de prouver l'effet de la SPS-ase on a effectué trois essais, cfr le tableau ci-dessous, dans lesquels on a ajouté les enzymes pendant le brassage (p H de la boue 5,5 6,0). Enzyme Néant Ceremix SPS-ase (KRF-68;+Ceremix ajouté comme dans les essais précédents Activité de 200 BGU 1630 BGU béta-glucanase/ g Dosage d'enzyme 1,65 g 0,033 g par kg de gruau Quantité totale d'unités d'acti O 330 BGU 50 FBG vité d'enzyme par kg de gruau Vitesse de fil- tration du moût 48 ml 98 ml 111 ml après 15 min. Extrait, Balling 18,6 19,0 19,5 Viscosité du moût 10 Balling 1,72 c P1,37 c 1,27 c P ( 25 C) ,. La définition de BGU et FBG est la même que celle donnée à l'exemple Bb 4 1 La dernière colonne du tableau ci-dessus ne donne que l'activité et la quantité provenant de la SPS-ase comme indiqué. Ceremix est une préparation de béta-glucanase bactérielle décrite dans le document d'information B 216 b-GB 1000, Février 1982, disponible chez NOVO Industri A/S. Bb 5 Additif enzymatique pouvant être utilisé pendant la fermentation et/ou le stockage de la bière. On peut ajouter de la SPS-ase pendant la fermen- tation du moût ou pendant le stockage de la bière afin de réduire la teneur en béta glucannes et pour améliorer la f il- tration-de la bière et la stabilité de celle-ci par rapport au louche La SPS-ase exerce également un effet sur les protéines responsables d'un louche se formant à froid. Bb 6 Agent destiné à enlever la peau de l'amande. Pendant l'étape mécanique qui consiste à enlever la peau des amandes, qui suit l'étape d'émondage des amandes, un certain pourcentage de peau d'amandes n'est pas éliminé On a trouvé qu'un traitement enzymatique des amandes provoque une diminution du pourcentage indiqué ci- dessus. Bc 1 Décomposition de différents déchets. Dans certains procédés de fabrication, on produit de grandes quantités de carbohydrates contenus dans des dé- chets, Ceci est le cas, par exemple, lors de la produc- tion d'un isolat de soja par extraction à l'eau et préci- pitation au moyen de l'acides de lait de soja et de tofu (un type particulier de fromage japonais)-A cet égard, on peut également citer la pulpe résiduelle des pommes, des poires ou des agrumes On a trouvé qu'une préparation de SPS-ase est capable de liquéfier complètement ces déchets contenant des hydrates de carbone et de produire des sucres fermentables qui peuvent être utilisés en tant que substance de départ pour une fermentation d'éthanol. Exemple Bc 1 1 Lors de la production classique de lait de soja ou de tofu, on plonge souvent les fèves de soja dans l'eau bouillante, mélange et extrait avec de l'eau chaude, après quoi on effectue une séparation Le résidu de cette sépa- ration est la substance utilisée dans cet essai La phase liquide est constituée par le lait de soja qui peut être traité ultérieurement pour produire du tofu. On a broyé 10 kg de fèves de soja entières ob tenues chez Aarhus Oliefabrik A/S simultanément avec 70 litres d'eau bouillante dans un broyeur Fryma du type MZ La boue de broyage a-été maintenue au-dessus de 85 'C pendant 15 minutes afin d'inactiver les enzymes de graines naturelles qui développent l'odeur désagréable connue du soja. Ensuite on centrifuge 5 litres de cette boue de soja dans le laboratoire pendant 15 minutes à 3000 x g (g = gravité). On a trouvé, par analyse, que la rémanence contenait 20,45 % et 20,06 % de matières sèches (mesures faites en double, moyenne calculée: 20,26 %) On a ajouté lentement du HCI 6 N qui a été trituré dans la rémanence au moyen d'une spatule jusqu'à ce qu'un p H-mètreindique 4,50, lorsque l'électrode est introduite directement dans la masse. On a effectué, à 500 C, dans un becher de 500 ml des réactions d'enzyme avec 2 x 200 g de la masse avec les deux dosages de SPS-ase (KRF-68), E/S = 0,5 % par rapport aux matières sèches et E/S = 3,0 % par rapport aux matières sèches L'enzyme sèche a été ajoutée à-la masse. Pendant les 1 à 2 premières heures, on a effectué l'agita- tion au moyen d'une spatule et-ensuite la masse a été liquéfiée à une telle mesure que l'on puisse efficace- ment effectuer l'agitation au moyen d'un agitateur magné- tique Le temps de réaction total était de 21 heures On a mesuré l'osmolalité au moyen d'un osmomètre, pendant la durée de la réaction (Advanced Digimatic 3 DII disponible chez Advanced Instruments Inc) Les résultats du tableau - Bc I montrent l'évolution de la réaction A la fin de l'essai, les mélanges ont été centrifugés à 3000 x g pendant 15 minutes Une couche d'huile est apparue à la surface du surnageant et le volume de celle-cia été déterminé Une couche de boue non tassée est -apparue comme couche de fond Le surnageant contenant l'huile a été retiré au moyen d'une pipette L'huile a été co mbi- née avec la phase d'eau claire par homogénéisation et on a retiré un échantillon pour la détermination des matières sèches Les résultats donnés au tableau Bc I montrent clairement que ce déchet peut être liquéfié par une réac- tion enzymatique et que l'on peut produire de l'huile brute comme mentionné à la partie A 4 Après avoir récupéré l'huile, on peut utiliser de différentes manières la rémanence solubilisée, par exemple pour une fermentation en composés utilisables ou par une utilisation en tant que aliment pour bétail ou produit alimentaire après concen- tration et séchage ou pour des produits utiles après une purification ultérieure. Tableau Bc I Résultats obtenus lors de la liquéfaction de lait de soja et de boue de tofu. Conditions de réaction et résultats Essai A Essai B Masse de résidus 200 g 200 g asse de SPS-ase 0,20 g 1,20 g (KRF-68) empérature 50 C 50 C p H 4,50 4,50 Temps de réaction 21 heures 21 heures Résultats mesurés sur t osmo a os t osmo àosmo lalité morma mali maaité n osmomètre pendant mn m Osm lité mn té m Osm l'évolution de la r Osn m Osr r 15éaction O 287 0 O 282 O 313 26 10 386 86 A Osmolalité est la 25 497 215 vaieur corrigée dp 40 391 104 45 601 319 l'osmolalité du mélange 95 501 214 95 718 436 t = O 250 634 347 250 875 593 1260 907 620 1260 1145 863 élange réactionnel: 4 atière sèche 20,3 % 20,7 % surnageant: katière sèche 18,0 % 19,4 % Surnageant: reneur en huile 8 à 10 % 8 à 10 % 3 alculs du % des matières sèches solubi 88,6 % 93,5 % lisées Bc 2 Saccharification et fermentation simultanées. Les substances végétales contenant des hydrates de carbone, par exemple les tubercules comme les topinam- * bours, les pommes de terre, les patates douces, le manioc ou la pulpe de tels tubercules, à savoir la substance restant après avoir éliminé les composants extraits, peu- vent être saccharifiés par un traitement avec une prepara- tion de SPS-ase et, simultanément, les saccharides fermen- tables obtenus peuvent être fermentés en éthanol. Exemple Bc 2 1 La production d'éthanol par fermentation des topinambours décomposés contenant de l'inuline à été expérimentée à l'échelle de laboratoire par une sacchari- fication simultanée avec une SPS-ase et une inulinase et par quatre prétraitements différents des topinambours. SPS-ase: On a utilisé la préparation de SPS-ase KRF-68. Inulinase: L'inulinase a été produite par fermentation de Asp ficuum (CBS 55 565) L'activité d'inulinase est déterminée comme décrit dans Research Disclosure No 21234 (Décembre 1981) p 456 à 458. Fermentation au laboratoire: On a fait fermenter des fractions de 150 gr de purée prétraitée (décrite plus loin) après avoir ajouté 4,5 g de levure de boulangerie et 1 ml d'une solution de Pluronic à 4 % en tant qu' agent anti- moussant Les flacons de fermentation sont munis de pièges de CO 2 contenant de l'acide sulfurique à 98 % et la fermentation est suivie par une mesure de la perte en poids du à la libération de CO 2 Le contenu du flacon est agité pendant la fermentation qui est effectuée à 300 C On a utilisé trois flacons pour chaque paramètre étudié. Dans le tableau Bc II, la perte en poids due à la libération de CO 2 est convertie en éthanol, en supposant qu'lmole de C 02 libérée équivaut à 1 mole de C 2 H 50 H, à savoir 1 g CO 2 4 g C 25 OH. Prétraitements des topinambours: Traitement A: On a effectué une cuissonsuivant le procédé de Henze de 14,1 kg de topinambours à 140 C et à 4 à 5 atm pendant 20 minutes Le poids après cuisson était de 19,0 kg ( 16,9 % de matière sèche) Les fermen- tations-ont été effectuées directement sur la purée. Traitement B: Des topinambours lavés et coupés en tranches ont été mélangés avec de l'eau ( 1:1) et ont été mêlés dans un mélangeur Waring La Durée a ensuite été soumise à un traitement ther- mique-pendant une heure, à 85 C et à p H= 4,5. Traitement C: Comme le traitement B, mais le p H n'a pas été règlé. Traitement D: Comme le traitement B, mais on n'a pas effec- tué de traitement thermique et on n'a pas règlé le p H. Résultats: Les résultats du tableau Bc II montrent l'effet de l'addition d'une SPS-ase à la purée prétraitée sur le rendement en éthanol On a obtenu une amélioration nette du rendement en éthanol sur toutes les purées prétraitées lors- qu'on a ajouté une SPS-ase. Tableau Bc II Résultats de fermentation l Qrs d'une fermentation simultanée et d'une saccharification enzymatique de topinambours. Prétrai Unité d'inuli SPS-ase Perte en CO 2 (g)% éthanol produit temoent nase ajoutée E/S % après 42 à 44 par rapport aux à 1 g de ma I hres de fernmen matières,sèches tière sèche tation 1,5 O 7,65 + 0,05 31,5 A 1,5 0,27 8,07 + 0,08 33,2 B 1,5 O 4,85 + 0,03 29,7 _ _ 1,5 0,40 5,41 + 0,03 33,1 1,5 O 5,70 + 0,05 34,8 1,5 0,10 5,97 + 0,01 36,5 C 1,5 0,20 6,13 + 0,06 37,5 1,5 0,30 6,13 + 0,00 37,5 1,5 0,40 6,18 + 0,05 37,8 1,5 O 5,77 + 0,02 35,3 1,5 0,10 5,89 + 0,00 36,0 D 1,5 0,20 6,04 + 0,11 36,9 1,5 0,30 6,01 + 0,01 36,7 1,5 0,40 6,02 + 0,03 36,8 0 0,40 5,48 + 0,02 33,5 Bc 3 Décomposition de cellulose On a trouvé que des substances contenant de la cellulose comme de la paille, par exemple la paille de blé, la sciure, du papier et de la lignocellulose, peuvent être hydrolysées en une mesure plus grande au moyen d'une pré- paration de SPS-ase qu'avec des cellulases classiques Ceci est montré par l'exemple suivant dans lequel une substan- ce de cellulose cristalline (AVICEL) est traitée au moyen d'une cellulase classique Celluclast 200 produite par la souche Trichoderma reesei et au moyen de la préparation de SPS-ase KRF-68 - Exemple Bc 3 1 On a mis 1 ' Avicel en suspension dans l'eau ( 20 % de matière sèche); on a réglé le p H à 5 et on a maintenu la température à 50 C Après un temps de réaction de 24 heures, on a filtré la boue et on a mesuré la teneur en sucre réducteur (mg de glucose/g AVICEL) En utilisant des quantités d'enzyme de 5 et 20 % de la teneur en cellulose, on a obtenu les valeurs suivantes. Tableau Bc III. Bc 4 Application en tant que additif de cuisson. On a également constaté que les préparations de SPS-ase conviennent particulièrement comme additifs (adjuvants)de cuisson de boulangerie Ainsi, lorsqu'on ajoute une préparation de SPS-ase à une farine sèche, avant production de la pâte, il est possible d'obtenir un pain présentant une qualité supérieure en ce qui concerne le volume, la mie et le goût De ce fait, il est possible d'obtenir un pain de haute qualité avec une *farine de blé Enzyme f E/S % mg glucose/g AVICEL Celluclast 5 80 SPS-ase 5 200 Celluclast 20 100 SPS-ase 20 340 2.518570 de moins bonne qualité si on utilise la préparation de SPS-ase en tant que additif Bc 5 Amélioration du rendement en alcool et en bio- masse pendant la fermentation de la liqueur de sulfite dans la production du papier. On a également trouvé que le rendement en éthanol peut être amélioré si l'on traite la liqueur de sulfite du papier avec une préparation de SPS-ase avant qu'elle ne soit utilisée à titre de source d'hydrate de carbone pour la fermentation en éthanol La liqueur de sulfite du papier peut également être utilisé pour la production de biomasse, par exemple une protéine unicellu- laire, par fermentation; même dans ce cas, le rendement en biomasse a été amélioré lorsqu'on a traité préalable- ment la liqueur de sulfite avec une préparation de SPS-ase. De même, la décomposition due à-la présence de la prépara- tion de SPS-ase et la fermentation peuvent être effectuées simultanément. Bc 6 Assèchement de produits de boue biologique. Lors d'extraction classique à l'eau de nombreuses substances biologiques provenant de substances végétales brutes, on obtient de grands volumes de résidus insolubles consistant en grande partie de polysaccharides gonflés. Ce cas se présente, par exemple lorsqu'on produit-du lait de soja, du tofu ou un isolat de soja par extraction à l'eau de fèves desoja,defarine de soja dégraissée ou de flocons blancs La substance de polysaccharides gonflés structu- rée peut ensuite être traitée en une petite mesure avec une SPS-ase, ce qui ouvre la structure en réseau de la substance et, de ce fait, il n'y a que de faibles quantités d'hydrates de carbone qui sont solubilisés Ainsi, la substance est déshumidifiée et on obtient, par conséquent, une teneur en matière sèche plus élevée dans la boue par rapport au produit obtenu sans traitement enzymatique De ce fait, le procédé enzymatique présente l'avantage qui consiste en une consommation en énergie considérablement plus faible pour éliminer l'eau par séchage et ledit traitement permet également de produire un aliment pour bétail sec meilleur marché ou un agent de masse pour des applications alimentaires, Bc 7 Additif pour aliment de bétail ensilé. Il est connu d'ajouter des additifs enzymatiques au fourrage ensilé afin d'accroître la vitesse du processus d'ensilage et la digestibilité du fourrage ensilé On a trouvé qu'une préparation de SPS-ase est supérieure com- paré aux additifs enzymatiques connus pour le fourage ensilé. Afin d'être plus clair, on donne ci-dessous un aperçu des figures auxquelles on a déjà fait référence. La fig N Concerne Décrit 1 La partie générale L'effet de liaison entre le de la description SPS et la protéine de soja 2 La partie générale Tableau synoptique décrivant de la description la préparation du SPS 3 2 ème partie Courbe de calibrage pour la chromatographie HPLC à fil- tration sur gel 4 2 ème partie Chromatogramme HPLC à fil- tration sur gel du SPS 2 ème partie Chromatogramme HPLC à filtra tion sur gel du SPS décompo- sé par la SPS-ase 6 2 ème et 3 ème C Oranatogramie HPLC à filtration parties _ sur gel du surnageant provenant de 3 PS, soumis a incubation avec une prot&ine de soja 7 2 ème partie Chromatogramme HPLC à filtration sur gel du surnageant provenant de SPS décaposé, soumis à incuba- tion avec une protéine de soja 2518570- La fig N Concerne Décrit 8 3 ème partie Chromatogramme HPL à filtration sur gel de APS déocposé par Pectoly- ase 9 3 ème partie Chromatogramre HPLC à filtration sur gel de APS décarposé par la SPS-ase 3 ême partie Chromatogramme HPLC à filtration sur gel du SPS traité avec la Pectolyase 11 7 ème partie Pics immunoélectrophorétique- comportant un pic de SPS-ase identifié par la technique de recouvrement 12 8 ème partie Chromatogramme à échange ionique d'une SPS-ase 13 9 ème partie Dépendance de l'activité du p H d'une SPS-ase 14 9 ème partie Dépendance de l'activité de la température d'une SPS-ase 9 ème partie Stabilité à la température d'une SPS-ase 16 10 ème partie Stabilité du p H d'une proté- ase dans une préparation de SPS-ase Et REVENDICATIONS 1 S P S -a S e, c o N S t i t u é e p a r une carbohydrase sous une forme utilisable et capable de décomposer le SPS de soja dans des conditions appropriées pour donner des produits de décomposition qui se fixent euxmêmes sur une protéine, en milieu aqueux, à un degré moindre que celui auquel le SPS de soja se serait fixé lui-méme, avant décomposition, sur la même protéine dans des conditions correspondantes. 2 SPS-ase suivant la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle est capable de décomposer le SPS de soja, en milieu aqueux, pour donner des produitsde décomposition qui se fixent eux-mêmes sur une protéine végétale, en milieu aqueux, à un degré moindre que celui auquel le SPS de soja se serait fixé lui-même, avant décomposition, sur la même protéine végétale, en milieu aqueux. 3 SPS-ase suivant l'une des revendications 1 ou 2 caractérisée en ce qu'elle est capable de décomposer le SPS de soja, en milieu aqueux, à un p H ne s'écartant pas plus de 1,5 unités de la valeur 4,5, pour donner des produits de décomposition qui se fixent eux-mêmes sur une protéine de soja, en milieu aqueux, à un degré moindre que celui auquel le SPS de soja se serait fixé lui-même, avant décompositio 4 sur la protéine de soja, en milieu aqueux. 4 SPS-ase suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3 caractérisée en ce que les produits de décompo- sition du SPS de soja se fixent eux-mêmes,après dégradation complète, sur la protéine de soja à un degré,représentant une valeur inférieunà 50 %, en particulier inférieure à 20 %, que celui auquel le SPS de soja se serait fixé lui-même, avant décomposition, sur la protéine végétale, en milieu aqueux. SPS-ase suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4 caractérisée en ce qu'elle réagit positivement au test de la SPS-ase lorsqulil est exécuté suiivant le procédé de détermination qualitative et quantitative de la SPS-ase. 6 SPS-ase suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 à 5 caractérisée en ce que la SPS-ase est produite au moyen d'un microorganisme appartenant au genre Aspergillus, de préférence appartenant au groupe Aspergillus niger. 7 SPS-ase suivant l'une quelconque des r 3 nvendica- tions 1 à 6 caractérisée en ce qu'elle est dérivée des enzymes qui peuvent être produites par Asp -aculeatus CBS 101 43. 8 SPS-ase suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 à 7 caractérisée en ce qu'elle est identique au point de vue de l'immunoélectrophorèse à la SPS-ase produite au moyen de Asp aculéatus CBS 101 43 et qu'elle peut être identifiée au moyen de la technique de recouvre- ment immunoélectrophorétique. 9 SPS isolé caractérisé en ce qu'il est produit à partir d'une protéine végétale brute servant de substance de départ ' SPS isolé suivant la revendication 9 et caracté-' risée en ce que la protéine végétale brute est une farine de soja dégraissée. 11 Procédé de sélection d'un microorganisme produi- sant une SPS-ase permettant de produire la SPS-ase suivant- l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en que le microorganisme à tester est cultivé sur un milieu de fermentation dont la source principale de carbone est du SPS suivant la revendication 9 ou 10, après quoi un échantillon du milieu de fermentation est analysé pour déterminer la SPS-ase et le-microorganisme en question est choisi en tant que microorganisme produisant une SPS-ase, si l'analyse de la SPS-ase est positive. 12 Procédé de production de SPS-ase suivant l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce qu'une souche choisie suivant le procédé de-sélection de la revendication 11 est cultivée dans un milieu nutritif. 13 Procédé suivant la revendication 12 caractérisé en ce que la souche Asp aculeatus CBS 101 43 ou Asp. japonicus IFO 4408 est cultivée dans un milieu nutritif. 14 Procédé suivant la revendication 12 ou 13 carac- térisé en ce que la culture est effectuée en culture noyée à un p H compris dans l'intervalle de 3 à 7, de 1-référence de 4 à 6, à une température dans l'intervalle de 20 à 40 C, de préférence de 25 à 350 C, et en ce que le milieu nutritif contient des sources de carbone et d'azote et des sels inorganiques Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 12 à 14 caractérisé en ce que le milieu nutritif contient de la farine de soja. 16 Procédé suivant la revendication 15 caractérisé en ce que la farine de soja est traitée par une enzyme protéolytique avant d'être utilisée comme composant du substrat, l'enzyme protéolytique étant, de préférence, produite par voie microbienne au moyen de Bacillus licheniformis. 17 Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 12 à 16 caractérisé en ce qu'une solution stérile de pectine est ajoutée de manière aseptique au bouillon de fermentation pendant la culture. 18 Procédé de décomposition de polysaccharides, de préférence des polysaccharides de parois cellulaires de plantes, au moyen d'une carbohydrase, caractérisé en ce qu'on met une préparation de SPS-ase suivant l'une quel- conque des revendicationsi à 8 en-contact avec un substrat pour ladite préparation de SPS-ase, exception faite des décompositionsdéjà décrites dans la demande de brevet danois N O 5691/81. 19 Procédé de décomposition de polysaccharides, suivant la revendication 18, caractérisé en ce que la décomposition est accompagnée par l'isolement ou l'extrac- tion d'une substance biologique différente de la protéine de soja et des protéines végétales apparentées provenant d'une substance biologique brute, la préparation de SPS- ase étant essentiellement exempte de-toute enzyme capable de décomposer ladite substance biologique. Procédé de décomposition de polysaccharides suivant la revendication 18 ou 19 caractérisé en ce que un ou plusieurs des produits de réaction, sans distinguers'ils sont des produits finals recherchés ou des déchets, sont traités ultérieursement en même temps que le traitement enzymatique ou après celui-ci. 21 Procédé de décomposition de polysaccharides suivant la revendication 20 caractérisé en ce que le trai- tement ultérieur est une fermentation alcoolique dans le cas o l'un des produits de la réaction est un sucre fermentable.