FR 2518571 A1 19830624 FR 8221455 A 19821221 251857-1 Agent de décomposition de la rémanence végétale, procédé de préparation d'une protéine végétale purifiée utilisant cet anent et orotéine véqgtale murifiée ainsi obtenue. La présente invention concerne un agent amélioré pour la décomposition de la rémanence végétales particu- lièrement la rémanence de soja, un procédé de préparation d'une protéine végétale purifiée utilisant cet agent ainsi * 5 aue -la protéine végétale purifiée ainsi obtenue. Un procédé de préparation d'une protéine végétale purifiée (pvp) par élimination enzymatique de la rémanence, sans dissolution et reprécipitation de la protéine, est décrit dans le brevet BE 882 769. Dans ce brevet, on décrit également l'importance du fait que l'activité protéolytique doit être maintenue aussi basse que possible La pureté de la pvp pouvant être obtenue par le procédé connu n'est pas satisfaisante et demande donc à être améliorée Dans les exemples, on a montré une pureté de la pvp d'environ 85 % Même s'il est possible d'obtenir une pvp présentant une pureté d'environ 90 % suivant le procédé connu, ceci n'est possible qu'en utilisant certaines substances de départ prétraitées, par exemple un concentré de protéines de soja Il serait souhaitable d'obtenir une pureté de pvp supérieure à 90 % en utilisant une gamme de substances de départ beaucoup plus large, particulièrement de la farine de soja décortiquée et dégraissée. La présente invention repose sur la découverte surprenante consistant en ce qu'une certaine partie du produit de la décomposition de la rémanence tel qu'il ap- parait pendant le traitement enzymatique indiqué ci-dessus, à savoir un hydrate de carbone à poids moléculaire élevé soluble dans l'eau se fixe lui-même sur une partie de la protéine ainsi qu'il sera expliqué plus en détail ci- après Il en résulte, bien entendu, une pureté moins bonne de la protéine. Par conséquent, un bbjet de l'invention consiste à fournir un agent pour la décomposition de la rémanence végétale, en présence d'une protéine végétale, la rémanence végétale étant particulièrement la rémanence de soja, de manière à obtenir une pureté améliorée de la pvp; un autre objet consiste en un procédé de préparation d'une pvp. Le principe de l'invention peut être décrit de la manière suivante en référence à la figure 1 quin'indi- que que des substances existant en tant que solides non- dissous alors que tous les surpageants sont omis Une charge de farine de soja a été divisée en deux parties égales, partie I et partie II (colonne a dans la figure 1). La partie I a été décomposée par voie protéolytique un DH d'environ 8 au moyen d' ALCAIASE (nom coxmercial nour une enzyme Drotéoly- tique produite au moyen de B licheniformis et vendue par NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsvaerd, Danemark) et a ensuite été lavée à un p H d'environ 8 afin d'éliminer la quantité totale de protéine et la rémanence a été séparée du surnageant et a été lavée (voir partie I, colonne a et b, figure 1) De cette manière, on a isolé une rémanence pure (désignée par rémanence I) (colonne b à la figure 1). La partie TT Ide la farine de soja n'a pas été traitée; pour plus de brièveté, la rémanence de la partie II est dénommée rémanence II (colonne b à la figure 1) Ensuite, la rémanence I et la partie II sont décomposées au moyen d'une nectinase ca Tnerciale, Dar exem Dle PEC Ti NEX (nom cornercial tour une enzye pectolytique produite par Schweizerische Ferment A/G, Bâle, Suisse) (voir colonnes b et c à la figure 1) On a décou- vert de manière inattendue, que la partie non dissoute de la rémanence I est beaucoup plus faible que la partie non dissoute de la rémanence II, sur la base des bilans d'azote et de la masse des matières sèches (voir figure i dans laquelle les surfaces hachurées de la colonne c correspon- dent aux substances insolubles, non Drotéiques dans l'étape indiquée cidessus) En outre, si le surnageant de la rémanence I traitée à la pectinase est ajouté à la suspension de protéine de soja à p H 4,5, un polysaccharide du surnageant est lié à la protéine de soja Ce polysaccharide du surnageant de la rémanence I, qui est une partie du produit de décomposition de la rémanence et qui est nettement soluble dans l'eau en absence de protéine de soja mais est lié à la protéine de soja au point isoélectrique de la protéine de soja ou autour de ce point si celle-ci est présente, est désigné par SPS {soluble 2 olysaccharide), voir figure 1 Le SPS présente une distribution de poids moléculaire comprise entre 5 x 10 et 4,9 x 10 La préparation de SPS isolé apparalt dans le diagramme synoptique représenté à la figure 2 qui recouvre également certains des procédés indiqués à la figure 1 Le problème consiste donc à trouver un agent qui est capable de décomposer le SPS de telle manière que les produits de décomposition de SPS ne lient pas la protéine de soja ou lient celle-ci dans une mesure beaucoup moindre que le SPS ne lie la protéine de soja. Bien que la description concerne principalement la décomposition d'une protéine de soja, l'invention n'est pas limitée à une telle protéine mais recouvre également tous genres de protéines végétales, notamment par exemple les protéines citées dans le brevet BE 882 76 q, cage 1. Suivant la présente'invention, on a, àIprésent, trouvé qu'en examinant l'aptitude à décomposer du SPS de soja, il est possible de sélectionner des micro-organismes qui sont aptes à produire un composé qui présente une activité enzymatique, qui décompose effectivement le SPS de soja, composé désigné ci-dessous, pour plus de brièveté, 2-518571 SPS-ase. Par conséquent, on peut dire que la SPS-ase est une carbohydrase qui est capable de décomposer le SPS de soja dans des conditions adéquates en des produits de décomposition qui se fixent eux-mêmes à la/protéine végétale, en milieu aqueux, en une mesure moindre que le SPS de soja avant décomposition ne se serait fixé lui-même à la même protéine végétale dans des conditions correspondantes. Suivant un premier aspect, la présente invention vise donc à fournir un agent pour la décomposi- tion de la rémanence végétale, notamment de la rémanence / de soja, en présence d'une protéine végétale, particuliê- rement la protéine de soja, cet agent convenant bien pour la préparation d'une pvp présentant une pureté de la protéine d'environ 90 % à partir d'une Drotéine végétale pouvant être dégraissée ou partiellement dégraissée en tant que substance de départ, comprenant une enzyme à activité de solubilisation de la rémananence, caractérisé en ce que l'agent comorend une enzyme capable de décomposer le SPS de soja (SPS-ase) et en ce qu'il est essentiellement exempt d'activité protéolytique L'agent est essentielle- ment exempt d'activité protéolytique lorsque celle-ci est égale ou inférieure à l'activité protéolytique qui entraînerait une perte totale de urotéine dans la pvp obtenuenon supérieure& 30 %, de préférence non supérieure à %, tout particulièrement non supérieure à 10 %, lorsqu' environ 65 % de la rémanence a été solubilisée sur la base du bilan d'azote et de la masse de matière sèche. On a trouvé que la SPS-ase, capable de décomposer le SPS de soja, permet de décomposer de manière plus complète que le font les pectinases et cellulases commerciales, les polysaccharides semblables au SPS d'origine végétale ou provenant de fruits. La pureté de la protéine végétale finale nécessairement améliorée par une élimination totale ou partielle du SPS de la protéine végétale finale par rapport à la pureté de la protéine végétale finale obtenue suivant le procédé connu du brevet BE 882 769, dans la mesure o cette protéine végétale connue était contaminée par du SPS. On ne sait pas à présent si la SPS-ase décrite ci-après développe son activité enzymatique à partir d'une seule enzyme ou à partir d'un complexe d'enzymes comprenant au moins deux enzymes Certaines recherches semblent indiquer qu'au moins deux enzymes sont responsa- bles de l'effet de décomposition de la SPS-ase, unede ces enzymes étant capable de n'effectuer qu'une légère décom- position du SPS, après quoi une ou plusieurs enzymes sont capables d'effectuer une décomposition plus importan- te du SPS Une telle hypothèse ou des hypothèses semblables ne doivent cependant pas limiter la portée de l'invention. Suivant un mode d'exécution préféré de l'agent selon l'invention, la SPS-ase est produite au moyen d'un microorganisme appartenant au genre Aspergillus. Suivant un autre mode d'exécution préféré de l'aqent selon l'invention,le composé actif est dérivé des enzymes pouvant être obtenues au moyen de Asp aculeatus CBS 101 43 La même SPS-ase peut être obtenue par Asp. japonicus IFO 4408 On a trouvé que Asp aculeatus CBS 101 43 produit également des enzymes très puissantes solubilisant la rémanence, des cellulases, des pectinases et des hemicellulases En outre, on a trouvé que toute souche appartenant à l'espèce Asp aculeatus ou à l'espèce Asp japonicus ne convient pas pour produire une SPS-ase nécessaire dans le but de l'invention Ainsi comme il apparaît dans un paragraphe ultérieur de la présente description, on a prouvé que l'Asp japonicus ATCC 20236 ne produit pas suffisamment de SPS-ase pour être détectée par la détermination enzymatique de la SPS-ase dé- crite dans le présent mémoire descriptif. Suivant un autre mode d'exécution préféré de l'agent selon l'invention, la SPS-ase est identique au point de vue de l'immunoélectrophorèse à ia SPS-ase-produisible au moyen de Asp aculeatus CBS 101 43 et identifiable au moyen de la technique de recouvrement électrophorétique, cf par- ties 6 et 7. Suivant un autre mode préféré de réalisation de l'agent suivant la présente invention, le rapport de l'ac- tivité protéolytique en unités HUT et de l'activité solu- bilisante de la rémanence en unités SRUM-120 est inférieur à environ 2:1, de préférence inférieur à 1:1 et plus par- ticulièrement inférieur à 0,25:1 On a trouvé qu'il existe une corrélation nette entre l'activité de la protéase ex- primée en unités HUT (à définir plus loin) à p H 3,2 (p H d'activité optimale de la protéase) et la perte en protéine. Cette corrélation est spécifique pour la préparation de SPS-ase produisible au moyen de Asp aculeatus CBS 101 43. Il est à noter que cette corrélation ne peut exister en relation avec un autre microorganisme qui forme une SPS-ase qui diffère de la SPS-ase produisible au moyen de CBS 101 43, mais qu'un homme du métier pourra trouver une corrélation similaire qui remplira les exigences en ce qui concerne la perte en protéine définie selon l'invention L'activité SRUM120 (à définir plus loin) est une mesure des activités classiques de solubilisation'de la rémanence, de cellulase, de pectinase et d'hémicellulase et d'autres activités Les unités SRUM-120 sont mesurées à p H 4,5 Il est à noter qu'on a choisi ce p H, étant donné que la décomposition de la rémanence s'effectue à la valeur isoélectrique du p H de la protéine de soja ou aux environs de celle-ci et qu'il faut utiliser un autre procédé de mesure de l'activité enzymatique dans le cas o la décomposition de la 18571 rémanence est effectuée à un autre p IH. Suivant un autre mode d'exécution préféré de l'agent suivant la présente invention, l'agent comporte une activité cellulase et celle-ci est partiellement ou totalement dérivée de Trachoderma reseei Cette cellulase permet de dissoudre la cellulose cristalline et cet agent produit une pvp présentant une pureté élevée. Suivant un autre mode d'exécution particulière- ment préféré de l'agent suivant la présente invention, celui-ci comporte une activité cellulase (Cx), une activité pectinase (PU, PGE, UPTE, PEE) et une activité hémicellula- se (VHCU). Dans Agr Biol Chem 40 ( 1), 87 92, 1976, on décrit qu'une souche de Asp japonicus, ATCC 20236, produit un complexe d'enzymes qui est capable d'effectuer une dégradation partielle d'un polysaccharide acide dans la sauce de soja, nommé APS, dont une fraction est désignée par APS-I Ce polysaccharide acide n'est pas identique au SPS, ce qui sera montré plus loin et plus en détail dans ce mémoire descriptif à la partie 3 Ainsi, les chroma- tograrmes de chromatographie liquide haute performance HPLC, de filtration sur gel du SPS et de 1 'APS sont nettement différents et, en outre, les chromatograrmes de filtration sur gel de 1 'APS décomposé par la pectinase commerciale Pectolyase et du SPS traité avec la pectinase commerciale Pectolyase sont nettement différents En outre, il n'apparaît pas dans cet article-que le polysaccharide. acide est lié à la protéine de soja et que le polysaccha- ride acide décomposé n'est pas lié à la protéine de soja ou y est lié à un degré nettement inférieur à celui d'un polysaccharide acide non décomposé On a également prouvé que cette souche ne forme pas de SPS-ase en une quantité suffisante pour une détection au moyen d'une 'détermination enzymatique de la SPS-ase décrite dans ce mémoire Ceci crée un préjugé à l'égard de toute souche de Asp japonicus en tant que producteur de SPS-ase; cependant, suivant 8 _ l'invention, on a trouvé de manière inattendue que certaines souches de à japonicus sont des producteurs de SPS-ase. Suivant un deuxième aspect, la présente inven- tion vise à fournir un procédé pour la préparation d'une protéine végétale purifiée en éliminant la rémanence d'une protéine végétale brute servant de substance de départ, caractérisé en ce que la substance de départ est traitée avec l'agent suivant l'invention dans un milieu aqueux, à un p H qui ne diffère pas plus de 1,5 unité de p H du point isoélectrique de la partie principale de la fraction de protéine de la substance de départ, à une température comprise entre environ 20 et environ 70 'C, jusqu'à ce qu'au moins environ 60 % de la rémanence, sur la base du bilan d'azote et de la masse de matière sèche, de préférence au moins environ 70 % de celle-ci, plus particulièrement au moins environ 80 % de celle-ci, aient été solubilisés et en ce qu'on sépare du produit surna- geant, la phase solide contenant la protéine végétale purifiée. Suivant urn mode particulièrement préféré du procédé de la présente invention, la séparation est effec- tuée à une température comprise entre la température ambiance et le point de congélation du surnageant On obtient ainsi un haut rendement en protéines. Suivant un autre mode d'exécution particuliè- rement préféré du procédé de l'invention, la substance de départ est une protéine végétale dégraissée ou une protéine végétale dégraissée et de plus partiellement purifiée Cette substance de départ est facile à obtenir. Suivant un autre mode d'exécution particuliê- rement préféré du procédé de l'invention, la substance de départ est de la farine de soja Cette substance de d 4 part çst bon marché et facile à obtenir. Suivant un autre mode d'exécution particuliè- rement préféré du procédé de l'invention, la substance de départ est une farine de soja traitée thermiquement, de préférence une farine de soja cuite au jet Dans ce cas, on peut utiliser un dosage moins important de l'enzyme et on peut, en outre, obtenir un rendement plus élevé. Suivant un autre mode d'exécution particulière- ment préféré du procédé de l'invention, la substance de départ peut traverser un tamis ayant une ouverture de mailles d'environ 2,5 mm Ceci assure un temps de réaction raisonnablement court. On ne peut fournir que le rapport de dosage (en unités SAE) pour l'activité de SPS-ase dans le traitement de la farine de soja au moins environ 35 unités SAE par grammes de farine de soja cuite au jet, et 350 unités SAE par 100 grammes de farine de soja non cuite En pratique, la relation exacte des activités enzymatiques nécessaires pour décomposer le SPS n'est pas connue et c'est pourquoi on ne peut fournir des dosages et proportions minimum pour la pectinase, la cellulase et l'hémicellulase Cependant, une activité composite dans le traitement de la farine de soja en unités SRUM peut être fournie, à savoir au moins environ 60 unités SRUM- par 100 grammes pour la farine de soja cuite, environ 600 unités SRUM-120 par 100 grammes pour la farine non chauffée Les valeurs données à titre d'exemples ci- après semblent être supérieures au dosage minimum On- peut utiliser des essais d'arrét-mesure pour établir les proportions et temps de réaction opératoires optimum pour convertir le substrat de soja en pvp. Suivant un troisième aspect, la présente invention vise à fournir une protéine végétale purifiée produite par le procédé suivant la présente invention. Afin de mieux expliciter la nature de la présente invention, on se référera à la description qui suit et qui est divisée en différentes parties numérotées de 1 à 10 décrivant chacune les détails spécifiques relatifs à la présente invention Les différentes parties sont comme suit: 1 Préparation du SPS. 2 Caractérisation du SPS, en particulier distribution du poids moléculaire de celui-ci. 3 Essais prouvant la différence entre SPS et APS. 4 Sélection de microorganismes produisant de la SPS-ase. Caractérisation de certains microorganismes formant de la SPS-ase. 6 Description générale de la technique de recouvrement associée à des immunoéleçtropho- rèses. 7 Caractérisation immunoélectrophorétique de la SPS-ase avec un anticorps polyspécifique et recouvrement. 8 Purification d'une préparation de SPS-ase. 9 Dépendance de l'activité à l'égard du p H et de la température et stabilité d'une SPS-ase. Détermination de l'activité enzymatique. PARTIE 1. PREPARATION DU SPS. Comme déja mentionné précédemment, la substance de départ pour la préparation du SPS peut être la rémanence de soja C'est pourquoi, on décrira d'abord la préparation d'une rémanence de soja. La rémanence de soja est une fraction d'hydrate de carbone exempte de protéines (qui, en pratique, peut contenir de faibles quantités de lignine et matières miné- l O rales), contenue dans la farine de soja dégraissée et décortiquée, ladite fraction d'hydrate de carbone étant insoluble dans un milieu aqueux à p H 4,5 et pouvant être préparée de la manière suivante, en référence au tableau synoptique no 1. La farine de soja dégraissée (Sojamel 13 de Aarhus Oliefabrik A/S) est mise en suspension dans de l'eau désionisée à 50 'C dans un proportion pondérale de farine de soja à l'eau de 1:5, dans un réservoir contenant un équi- pement de stabilisation de p H et de température On règle le p H à 8,0 au moyen de Na OH 4 N (I) On effectue une hydrolyse à p H stationnaire aul moyen d'ALCALASE 0,6 L (une enzyme protéolytique à base de B licheniformis ayant une activité de 0,6 unités Anson par gramme, l'activité étant déterminée suivant la méthode Anson, comme décrit dans NOVO ENZYME INFORMATION IB No 058 e-GB) Le rapport enzyme/ substrat correspond à 4 % de la quantité de protéines dans la farine de soja (II) Après une hydrolyse pendant une heure, la boue est séparée par centrifugation (III) et on lave (IV), cette opération étant effectuée deux fois (V, VI, VII) La boue ainsi traitée est ensuite hydrolysée une fois de plus pendant une heure au moyen d'ALCALASE 0,6 L (VIII, IX), de manière similaire à ce qui a été dit ci-dessus. Ensuite la boue séparée par centrifugation (X) est lavée deux fois (XI, XII, XIII, XIV), la boue finalement lavée ( 6) étant séchée par pulvérisation (XV) La poudre ainsi produite, séchée par pulvérisation est la rémanence de soja servant de matériau brut pour la production de SPS. Le SPS est la fraction soluble à l'eau de poly- saccharide qui est obtenue par un traitement classique de la rémanence de soja susmentionnée avec de la pectinase. Le SPS est préparé de la manière suivante au moyen des 14 étapes réactionnelles indiquées ci-dessous, en référence au tableau synoptique n 2. 1 On détermine la teneur en matière sèche de la rémanence susmentionnée et on dilue la rémanence de soja dans de l'eau à raison de 2 % de matière sèche et ladite rémanence de soja est maintenue en suspension à 50 C dans un réservoir comportant un règlage de température. 2 On règle la valeur du p Hà 4,50 au moyen de Na OH 6 N. 3 On ajoute en une quantité de 200 g/kg de matière sèche du Pectinex Super concentréL(pectinase commerciale de la Schweizerische Ferment AG, Bâle, Suisse, présentant une activité en pectinase de 750 000 MOU, déterminée suivant le feuillet "Determination of the Pectinase units of Apple Juice (MOU)" du 12 6 1981, disponible à la Schweizerische Ferment AG, Bâle, Suisse) et on ajoute également en quantité de 20 g/kg de matière sèche du Celluclast 200 L (cellulase commerciale décrite dans le feuillet NOVO enzymes, information sheet B-153 e-GB 1000 juillet 1981, disponible chez NOVO INDUSTRIE A/S, Novo Alle, 2880 Bagsvaerd, Danemark). 4 Le contenu du réservoir est maintenu à 50 C pendant 24 heures en agitant. Les enzymes sont inactivées en augmentant le p H à 9,0 au moyen de Na OH 4 N Le mélange réactionnel est main- tenu tel quel pendant 30 minutes et le p H est ensuite réajusté à 4,5 au moyen de HC 1 6 N. 6 Le mélange réactionnel est centrifugé et on récupère le produit de centrifugation ainsi que la boue. 7 Le produit de centrifugation-de l'étape-6 subit-une filtration de contrôle sur un filtre presse (le filtre est lavé à l'eau avant la filtration de contrôle). 8 Le filtrat de contrôle est soumis à une ultrafiltration à une diafiltration et ensuite encore à une ultrafiltra- tion sur une membrane présentant une valeur de coupure de 30 000 (DDS GR 60-P de De Danske Sukkerfabrikker), en ayant recours aux paramètres suivants: 1 Ultrafiltration correspondant à une concentration de volume de 6. 2 Diafiltration jusqu'à ce que le pourcentage en matière sèche dans le perméat soit égal à O (O O Brix), 3 Ultrafiltration jusqu'à environ 15 % de matière sèche dans le concentrat. La température est de 50 C, le p H est de 4,5 et la pression moyenne de 3 bars. 9 Le concentrat soumis à l'ultrafiltration est refroidi jusqu'à 5 C et on ajoute un volume égal d'éthanol à 96 %. 10 On récupère le précipité au moyen d'une centrifugeuse. 11.Le précipité est lavé deux fois par de l'éthanol dans l'eau à 50 % v/v, correspondant au volume du produit de centrifugation de l'étape 10, c'est-à-dire qu'on effectue deux centrifugations. 12 Le précipité lavé est remis en solution dans l'eau en un volume qui correspond au volume de concentrat de l'étape 9 soumis à ultrafiltration. 13.Le liquide de l'étape 12 est soumis à une filtration de contrôle sur un filtre de verre. 14 Le filtrat clair contenant du SPS pur est lyophylisé. 18571 TABLEAU SYNOPTIQUE N O 1 Farine de soja dégraissée H 20 v Na OH jusqu y Mélange d'hydrolyse I à p H = 8 Alcalase 0 6 L (E/S-4 %)j Hydrolyse i heureavantdéchargement I p Hstat (pli = e T = 500 CY Na OH 4 m N 1- il 1 ère centrifugation H 20-* 1 er lavage II 1 rroduit de III centrifug i vers décharge fl_-poentrifuag 2 2 e centrifugation t boue 2 2 e lavage vers décharge 1 VI i 3 e centrifugation H 2 Op s boue '3 Nouveau mélange d'hydrolyse Na OH 11 Jp H = If Hydrolyse 1 heure -avant déchargement- p T 4-qti-t (p H = 8-0 T = 500 ci à t VII oeuitde ECC ntrifug 3 vers décharge' HII 1 I x 1 Na OH 4 NJ ALCALASE 0,6 L H 2 f 4 e centrifugation t boue 4 * 1 er lavage Ix F zroduit de oentrifug 4 vers décharge I xi I I 1 1 I I L e centrifugation le houe 5 vers décharge HPO 2 e lavage 6 e centrifugation lrpoduit de j IV centrifug vers décharge 1 séchage par pulvérisation 1 xv H 2 O L L l KIII 1 25185 ?'1 TABLEAU SYNOPTYQUE N 2 1000 g Pectinex Super Conc L g Celluclast 2505 kg rémanence séchée par pulvérisation 247 1 H 20 Décomposition par pectinase et 2 v l oc cellulase C: p% = 4 5: t 24 hpurep Centrifugation I ? 1, 2, 3, 4,5 Boue 38 kg Filtration de contrôle V 18 1 H 20 - 1 C 2 H 5 OH à 50 % Ultrafiltration, diafiltration, ultrafiltration (GR 60 P) ( 19 à 26 o C) V Précipitation _ surnageant (décharge) 1 de per- méat | Centrifugation _ p récioité I 2 x lavaqe produit de centrifugation 2 x produit de J centrifugation I 1 précipité 2 1 H 20 Redissolution I Filtration de contrôle Boue de protéinî Fitaio ecotôe (décharge) I Lyophilisation 310 g de SPS lyophilisé I _ 16- PARTIE 2 CARACTERISATION DU SPS, EN PARTICULIER DISTRIBUTION DU POIDS MOLECULAIRE DE CELUI-CI. On a déterminé (fig 4) la distribution du poids moléculaire du SPS dont la production est effectuée comme in- diqué dans ce mémoire, au moyen d'une chromatographie sur gel dans un équipement HPLC (pompe Waters, modèle 6000, module de données 730 de Waters et réfractomètre R 401 de Waters) On a également déterminé (fig 5) la distribution du poids molécu- laire des produits de décomposition du SPS par la SPS-ase suivant-le même procédé En outre, on a montré par la même méthode l'effet de liaison entre la protéine de soja et le SPS (fig 6) et l'absence d'effet de liaison entre la protéi- ne de soja et le SPS déconposé par l'agent suivant l'invention (fig 7). La courbe de calibrage (le logarithme du poids moléculaire en fonction de Rf, o la valeur Rf pour le glu- cose est arbitrairement définie comme étant 1 et o la valeur Rf d'un dextrane spécifique est définie en tant que temps de rétention de ce dextrane divisé par le temps de rétention du glucose) a été établie au moyen de plusieurs dextranes éta- lons ayant des poids moléculaires connus (T 4, T 10, T 40, T 70, T 110, T 500) vendus par Pharmacia Fine Chemicals AB, Boite 175, S-75104, Uppsala, Suède On a trouvé la valeur Rf pour le maximum de chaque pic de dextrane et le poids moléculaire correspondant a été calculé en tant que W Mn o M est la valeur moyenne pondérale du poids moléculaire _w et Mn est la valeur moyenne numérique du poids moléculaire. On a utilisé du Na NO 3 0,1 M comme éluant pour ce processus chromatographique Les colonnes utilisées dans ce processus chromatographique sont la colonne PW 5000 de 60 cm suivie par une colonne PW 3000 de 60 cm vendues par Toyo Soda Manufacturing Co, Japon On a établi la relation entre le poids moléculaire et la valeur Rf pour les dextranes indiqués ci-dessus de cette manière, cfr fig 3 - A partir de la fig 4, on peut calculer que le SPS présente une distribution de poids moléculaire qui est caractérisée par une valeur Md'environ 5,4 x 10 et par _ w 4 une valeur M d'environ 4,2 x 10 Il apparaît également n dans cette figure que le chromatogramme présente deux pics distincts à un temps de rétention de 34,5 minutes ( 6 %) correspondant à un poids moléculaire d'environ 5 x 106 et à un temps de rétention de 47,12 minutes ( 67 %) correspon- dant à un poids moléculaire d'environ 4,3 x 104 Il apparait également de cette courbe qu'il existe un épaule- ment entre ces deux pics à un temps de rétention de 41,25 minutes ( 27 %) correspondant à un poids moléculaire de 2,8 x 105. Après la décomposition du SPS par la SPS-ase, le mélange d'hydrolyse a été filtré sur membrane et le filtrat a été soumis à la chromatographie On a trouvé qu'environ 55 % du SPS est décomposé en monosaccharide, disaccharide et trisaccharide et que le résidu de 45 % a été décomposé en un polymère présentant trois pics correspondant au poids moléculaires suivants: 5 x 104, 104 et 4,4 x 103, cfr fig. 5. Dans le but de démontrer l'effet de liaison entre la pro- téine de soja et le SPS et la réduction substantielle de l'effet de liaison entre la protéine de soja et le SPS décomposé au moyen de la SPSase, on a effectué les essais suivants. 3 % de SPS dans un tampon acétate 0,10 M à p H 4,5 est ajouté à une boue d'un isolat de soja (Purina E 500) afin de générer une suspension présentant le rapport isolat/ SPS correspondant à 10:1 On fait incuber cette suspension pendant 18 heures dans un bain agité à 50 o C Après incubation, la suspension est centrifugée et le surnageant clair est analysé par HPLC comme décrit précédemment En comparant la fig 6 à la fig 4, il apparaît que le SPS est complètement adsorbé sur l'isolat de soja. Le même processus que celui mentionné dans le paragraphe précédent est mis en oeuvre avec une solution à 3 % de SPS hydrolysé avec une SPS-ase produite par CBS 101 43 (fig 7) En comparant la fig 7 et la fig 5, on constate qu'aucun composé du SPS hydrolysé présentant un poids moléculaire inférieur à environ 104 n'est adsorbé sur l'iso- lat de soja L'hydrolyse réduit la liaison quantitative jusqu'à environ 10 à 15 % par rapport à la liaison du SPS à la protéine de soja. Une analyse RMN du SPS, dont la production est effectuée comme indiqué dans ce mémoire, révèle la composi- tion approximative suivante du SPS: 1) acide a-galactur Qnique en une quantité d'environ 45 %, approximativement 40 % de la quantité totale d'acide a-galacturonique étant présents en tant qu'ester méthylique. 2) rhamnopyrannose en une quantité d'environ 20 %, 3) galactopyrannose en une quantité d'environ 15 %, et 4) 3-xylopyrannoseen une quantité d'environ 20 %. Les constituants semblent être présents suivant une * structure comprenant une chaîne principale rhamnogalacturo- nique et des chaînes latérales de xylose et de gala Ctose. L'hydrolyse acide oemlète du SPS ( 8 heures dans H 2 SO 4 1 N) et l'analyse par chromatographie en couche mince (TLC) ultérieure ont révélé qu 'il y a éqalenent de faibles quantités de monosaccharides fucose et arabinose dans le SPS hydrolysé. Une analyse HPLC du SPS décomposé par le complexe d'enzymes SPS-ase formé par CBS 101 43 montre une importante réduction du poids moléculaire De manière semblable, le spectre RMN du SPS décomposé comme indiqué cidessus montre qu'une majeure partie des groupes ester a disparu et que, également, la teneur en xylose et galactose dans la substance à poids moléculaire plus élevé a diminué Le spectre MN de la partie du produit de décomposition du SPS qui précipite par addition d'un volume d'éthanol à un volume de produit de décomposition du SPS est semblable au spectre RMN du SPS qui a subi les modifications susmentionnées en ce qui concerne les groupes ester et la teneur enxyloseet galactose. PARTIE 3 ESSAIS PROUVANT LA DIFFERENCE ENTRE SPS ET APS On a préparé le APS comme mentionné dans Agr. Biol Chem, Vol 36, No 4, p 544 550 ( 1972). On a ensuite hydrolysé ce polysaccharide et le SPS avec différentes enzymes, puis on a soumis le mélange de décomposition à une chromatographie sur gel par un équipement HPLC, comme mentionné dans la deuxième partie, "Caractérisation du SPS, en particulier la dis- tribution du poids moléculaire de celle-ci". Plus précisément, on a effectué les hydrolyses par traitement d'une solution de 25 ml de 2 % de APS ou de 2 % de SPS dans un tampon acétate 0, 1 M ayant un p H de 4,5 par 10 mg de KRF 68 ou 30 mg de Pectolyase Le KRF 68 est une préparation de SPS-ase dont la fabrication est décrite à l'exemple 1 Les résultats Sont repris dans le tableau suivant: PARTIE 4. SELECTION DE MICROORGANISMES PRODUISANT DE LA SPS-ASE. Le microorganisme à tester est soumis à une incubation sur un substrat incliné d'agar présentant une composition qui permet la croissance du microorganisme. Après une croissance initiale sur le substrat incliné d'agar, le microorganisme est transféré dans un substrat principal liquide dans lequel la source de carbone princi- pale est le SPS (préparé comme indiqué), dans lequel la Polysaccharide Enzyre Chromatograrme Polysaccharide HPLC sur gel Décposé Non décorposé APS Pecto fig 8 x lyase APS KRF 68 fig 9 x SPS Pecto fig 10 x lvase SPS KRF 68 fig 5 x source d'azote est NO 3, NH 4, de l'uréé, des acides aminés libres, des protéines ou d'autres composés contenant de l'azote, le substrat contenant en outre un mélange des sels et vitamines nécessaires, de préférence sous la forme d'un extrait de levure La composition du substrat principal dépend du genre de microorganisme, la considération princi- pale étant que le substrat soit capable de supporter-la croissance et le métabolisme du microorganisme Lorsque la croissance a eu lieu pendant une période de temps adéquate, de l'ordre de 1 à 7 jours, dépendant de la vitesse de. croissance du microorganisme en question, on analyse un échantillon du bouillon de fermentation pour-déterminer la SPS-ase suivant la détermination enzymatique de la SPS-ase. décrite dans ce mémoire. Afin d'avoir une technique plus sensible pour déterminer'l'activité enzymatique, on peut abaisser la température à 40 C et augmenter le temps d'inicubation à 20 heures pendant la détermination de l'activité de la SPS-ase, tout en ajoutant aussi des antibiotiques au substrat afin d'empêcher une infection. Par cette technique, on peut trouver d'autres microorganismes produisant de la SPS-ase pouvant apparte- nir au genre Aspergillus et à-d'autres genres. PARTIE 5. CARACTERISATION DE CERTAINS MICROORGANISMESFORMANT DE LA SPS-ASE. Par la technique de sélection pour des microorga- nismes produisant de la SPS-ase indiquée dans ce mémoire descriptif, on a trouvé que les microorganismes cités dans la partie supérieure du tableau suivant sont des producteurs de SPS-ase Le tableau contient également une souche appartenant à l'espèce Asp japonicus qui n'est pas un producteur de SPS-ase. Une identification courte des souches indiquées ci-dessus peut être trouvée dans les catalogues de culture suivants: List of Cultures 1978, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Pays-Bas. List of Cultures, 1972, 5 è édition, de l'"Institute for Fermentation" Osaka, 17-85, J Uso-honmachi 2-Chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japon. The American Type-Culture Collection Catalogue of Strains I, 14 è édition 1980; 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Etats-Unis d'Amérique. Toutes les souches du tableau indiqué ci-dessus correspondent étroitement à la description taxonomique des espèces Asp japonicus et Asp aculéatus décrites dans "The genus Aspergillus" de Raper et Fennell, 1965,(voir particulièrement les pages 327 à 330) PARTIE 6 DESCRIPTION GENERALE DE LA TECHNIQUE DE RECOUVREMENT ASSOCIEE ADESIMMUNOELECTROPHORESES. La demanderesse adéveloppé un procédé dénommé"technique de recouvrementde top-agar"pour identifier les composants individuels d'un complexe d'enzymes par immunoelectrophorèse croisée au moyen d'un anticorps polyspécifique pourtous les composants d'enzyme du complexe d'enzymes Le procédé est Producteur de SPS-aseEspèces Dénomination Premier Oui Non japo-acu _ _ _de la Dénomination dépôt: Ouion sp acul-demanderesse officielle année nici i c Af-l,,, x x A 805 CBS 101 43; DSM 23441943 x x A 1443 IFO 4408; DSM 23461950 x x A 1384 ATCC 20236; DSM 23451969 basé sur le fait que les enzymes sont encore actives après la liaison spécifique entre l'enzyme et l'anticorps ou, exprimé de manière différente, le procédé est basé sur le fait que le site enzymatique actif n'est pas identique au site de la liaison enzyme-anticorps Les complexes enzyme-anticorps précipitent en tant qu' arcs distincts, dans le gel pendant l'électrophorèse La plaque de gel est recouverte avec du SPS soluble dans dlu"top-agar" Après chauffage à 45 C pendant 20 heures dans une atmosphère ayant une humidité relative de 100 %, l'arc qui possède une activité de SP Sase apparaît en tant que zone claire dans la couverture de SPS après précipitation par un mélange de parts égales en volume d'éthanol et d'acétone, lorsqu'on regarde du dessus contre ur fond noir Lesarcs qui ne présen- tant pas d'activité SPS-ase restent invisibles PARTIE 7. CARACTERISATION IMMUNOELECTROPHORETIQUE DE LA SPS-ASE AVEC UN ANTICORPS POLYSPECIFIQUE ET RECOUVREMENT. On a immunisé des lapins par le complexe d'enzymes contenant la SPS-ase obtenu par fermentation de Aspergillus aculeatus CBS 101 43, comme indiqué dans l'exemple 1 (KRF 68) et on a récupéré l'anticorps polyspé- cifique d'une manière connue en soi Au moyen de cet anticorps polyspécifique on a effectué une immunoélectro- phorèse croisée du complexe d'enzymes obtenu par fermentation de l'Aspergillus aculeatus CBS 101 43, comme indiqué à l'exemple 1 (KRF 68), l'immunoélectrophorèse croisée ayant été décrite bar N H Axelsen et autres, dans "A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis", 6 ème édition, 1977 On se réfère à la fig 11 qui montre les arcs correspondant aux différentes protéines produites par le microorganisme On a trouvé, au moyen de la"technique de recouvrement de top-agar"décrite précédemment, que la surface hachurée correspond à la SPS-ase. Si l'hypothèse susmentionnée supposant que la SPS-ase consiste en au moins deux enzymes est correcte, la surface hachurée est la surface dans laquelle se trouvent toutes les enzymes responsables de l'activité de SPSase Si, suivant d'autres modes d'exécution de la présente invention, on peut séparer des enzymes par immunoélectrophorèse de telle manière qu'elles ne couvrent aucune surface mutuelle, on peut encore identifier une partie de l'activité de SPS-ase au moyen d'immunoélectro- phorèse avec un recouvrement avec à la fois le SPS et une oectinase commerciale. PARTIE 8. PURIFICATION D'UNE PREPARATION DE SPS-ASE. On a effectué la purification de la préparation de SPS-ase KRF 92 (voir exemple 1) par échange d'ions. Le tampon est le Tris (tris-hydroxyméthylaminométhane) m M qui est réglé à p H 7 au moyen de H Cl La colonne est une colonne K 5/30 vendue par Pharmacia, Suede La substance d'échange d'ions est du DEAE-trisacryl vendu par LKB, Bromma, Suède ( 300 ml) La vitesse de passage est de ml/heure. On a dissous 15 g de la préparation de SPS-ase KRF 92 dans 450 ml de H 20 at 6 C et toutes les opérations indiquées ci-dessous ont été effectuées entre 6 et 10 C. On a réglé le p H à 7,0 au moyen de Tris 1 M La colonne a été équilibrée au moyen du tampon et on a ensuite introduit l'échantillon de SPS-ase dans la colonne On ame- suré OD 280 (densité optique à 280 nm) et la conductivité de l'éluat;voir à la fig 12 La fraction 1 correspond à l'éluat qui n'est pas lié à la substance d'échange d'ions Ensuite la colonne a été lavée avec 2000 ml de tampon, ce qui donne la fraction 2 On a ensuite établi un gradient de Na Cl 0-500 m M, ce qui donne les fractions 3 9 Les neuf fractions ont été concentrées à 200 ml et ont été dyalisées contre l'eau à une conductivité de 2 m Si par dialyse (Hollow Fiber DP 2 de Amicon, Massachussetts, U S A) Ensuite les neuf fractions ont été lyophilisées Uniquement les fractions 1 et 2 présentaient une activité de SPS-ase. La fraction 1 a été purifiée ultérieurement par une filtration sur gel On a dissous 1,5 g de la fraction 1 dans 10 ml d'acétate de sodium 50 m M ayant un p H de 4,5 (K Cl 500 m M) La colonne est une colonne de 2,5- x 100 cm de LKB La substance servant à la filtration sur gel est le Sephacryl S-200 de Pharmacia, Suède La vitesse de passage est de 30 ml/heure Les fractions contenant des substances ayant un poids moléculaire compris entre 70 000 et 100 000, calibrées avec des protéines globulaires, contenaient un complexe d'enzymes désigné par facteur G qui ne peut décomposer le SPS lorsque l'on pratique l'essai suivant le test qualitatif d'agar; cependant, le SPS est décomposé suivant le test qualitatif d'agar lorsque l'on mélange le facteur G avec une pectinase On a trouvé que le facteur G est capable de séparer le galactose, le fucose et certains acides galacturoniques du SPS; mais le produit de décomposition principal suivant l'analyse HPLC est encore un produit à poids moléculaire élevé ressemblant très fort au SPS. PARTIE 9. DEPENDANCE DE L'ACTIVTE A L'EGARD DU p H ET DE LA TEMPERA- TURE ET STABILITE D'UNE SPS-ASE La fig 13 montre l'activité en fonction du p H de la préparation de SPSase KRF 68 De p H 2,7 à 3,5 on a utilisé un système de tampon à l'acide formique et de p H 3,7 à 5,5 on a utilisé un système de tampon à l'acétate. La fig 14 montre l'activité en fonction de la- température de la préparation de SPS-ase KRF 68. La fig 15 montre la stabilité thermique de la préparation de SPS-ase KRF 68. PARTIE 10 DETERMINATION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE. Le tableau repris ci-dessous donne un aperçu des différentes déterminations de l'activité enzymatique relevant de la présente invention. Genre d'activité, désignation abrégée Définition de l'unité d'actiyité et description de la détermination de l'activité enzymatique Publique- ment disponible Décrit plus loin dans ce mémoire Référence SPS-ase SPSase x Solubi SRU lisant la rémranence __ SRUM-120 x_ Protéase HUT x Cellulase C x 2 PU x 3 PGE x 4 Pectinase UPTE X 5 PEE x 6 HemicelluVHCU x 7 lase ___________________________________ Les références indiquées dans la dernière colonne du tableau susmentionné sont détaillées dans le tableau suivant. Enzyme - Identification de la référence Les références peuvent être obtenues de NOVO IN- DUSTRI A/S NOVO Allé, 2880 Bags- voe rd, Danemark de Schwei- zerische Ferment AG Bàle,Suiss Analyseforskrift AF 154/4 du 01-12-1981 x Analytical Biochemis try, 84, 522 à 532 x Analytical method 149/6- G du 25-05-1981 x Détermination of Pec- tinase Activity with 3 Citrus Pectin (PU). du 23-03-1976 Viskosimetrische Po- 4 lygalacturonase-Be- 4 x stimmung (PGE) du -11 1977 Bestimmung der Pectin- transeliminase (UPTE/ x g) du 24-09-1975 Détermination of the Pectinesterase acti- 6 vity(non daté)portant les initiales WJA/GW 7 Analytical method AF 156/1GB x En ce qui concerne la détermination de l'activi- té de cellulase, il est à noter que l'analyse a été effec- tuée comme indiqué dans AF 149/6-GB et que les principes de détermination sont expliqués, dans Analytical Biochemis- try. Réf N dans une biblio- thèque - - l - A DETERMINATION ENZYMATIQUE DE SPS-ASE. La détermination enzymatique de SPS-ase est effectuée en deux étapes, c'est-à-dire un essai qualitatif sur plaque d'agar et une détermination quantitative de l'activité SPS-ase, basée sur la mesure de la quantité totale de sucres libérée Si l'essai qualitatif sur plaque d'agar est négatif, l'activité SPS-ase est nulle quelle que soit la valeur provenant de la détermination quanti- tative de l'activité en SPS-ase Si l'essai qualitatif sur plaque d'agar est positif, l'activité en SPS-ase est égale a la valeur provenant de la détermination quantitative de l'activité en SPS-ase. I Essai qualitatif sur plaque d'agar. On a préparé une plaque de SPS-agar de la manière suivante On a préparé un tampon (B) en amenant de l'acide acétique 0,3 M à p H 4,5 au moyen de Na OH 1 N. On dissout 1 g de SPS dans 20 ml de B On mélange l g d'agarose (HSB Litex) avec 80 ml de B et on chauffe jusqu'au point d'ébullition en agitant Lorsque l'aga- rose est dissoute,la solution de SPS est lentement ajoutée La solution qui en résulte à 1 % de SPS-agarose est disposée dans un bain d'eau à 60 C Les plaques sont ensuite coulées en versant 15 ml de la solution à 1 % de SPS-agarose sur une plaque en verre horizontale ayant les dimensions de 10 cm x 10 cm Ensuite on estampe 9 "puits" dans la couche solidifiée de SPS-agarose à une distance de 2,5 cm Dans chaque puits on introduit 10 pl d'une solution à 1 % de la pro- téine enzymatiaue à tester en ce qui concerne 1 'activité en SPS-ase On fait incuber la plaque pendant 18 heures à C et à une humidité relative de 100 % Ensuite le SPS rnn encore déccapcsé est précipité par une solution à parts égales en volumesd'éthanol et d'acétone L'essai de la SPS-ase sur plaque d'agar est positif pour un échantillon placé dans un puits spécifique si une zone annulaire claire apparaît autour de ce puits. II DETERMINATION QUANTITATIVE DE L'ACTIVITE DE SPS-ase. Le but de cet essai est de déterminer les activités enzymatiques qui sont capables de décomposer le SPS d'une telle façon que les produits de décompo- sition présentent une affinité à l'adsorption ou à la liaison de protéine de soja fortement réduite ou ne présentent pas d'affinités à l'adsorption ou à la liaison de protéine de soja Des essais ont montré que la partie des produits de décomposition de SPS qui n'est pas précipitée par le mélange de parts égales en volumes d'eau et d'éthanol ne présente aucune affinité à l'ad- sorption ou à la liaison à la protéine de soja. La détermination de la SPS-ase est basée sur une hydrolyse-du SPS dans des conditions standard suivie par une précipitation de la partie de SPS qui n'a pas été hydrolysée par l'éthanol Après la précipitation, la teneur en hydrate de carbone qui n'est pas précipitée est déterminée par une analyse quantitative pour le sucre total (suivant AF 169/1, disponible chez NOVO INDUSTRIE A/S, 2880 Bagsvoerd, Danemark). Les conditions standard-sont Température 500 C p H 4,5 Temps de réaction: contrôle pendant 210 minutes uniquement avec le substrat, suivi par 2 minutes l'enzyme étant additionnée. Temps de réaction: valeur principale 212 minutes L'équipement comprend: Bain d'eau agité thermostatisé à 500 C. Agitateur de ty De Whirlimixer Centrifugeuse Un bain d'eau glacé. Les réactifs comprennent Tampon acide acétique 0,6 M dans l'eau déminéralisée (a) et Na OH 1,0 M (b). Substrat:la valeur du n H de 50 ml de a est règlée à 4,5 au moyen de b, ensuite on ajoute 4,0 g de SPS et après dissolution de celui-ci, le p H est réglé une nouvelle fois à 4,5 et le volume est porté à 100 ml au moyen d'eau désionisée. Réactif d'arrêt:Ethanol absolu. Une unité d'activité SPS-ase (SAE ou SP Su) est définie comme l'activité SPS-ase qui libère une quantité d'hydrate de carbone soluble dans de l'éthanol à 50 % équivalente à 1 mole de galactose par minute, dans les conditions standard susmentionnées. Même si la partie initiale de la courbe standard de l'enzyme est une ligne droite, il faut noter qu'elle n'intersècte pas le point ( 0,0). B DETERMINATION ENZYMATIQUE DE L'ACTIVITE SOLUBILISANT LA REMANENCE EXPRIMEE EN SRUM 120. Principe. Dans le procédé pour la détermination de l'acti- vité d'hydrolyse, lapartie insoluble de la farine de soja dégraissée, déprotéinisée et décortiquée est hydrolysée dans des conditions standard La réaction de l'enzyme est arrêtée avec un réactif d'arrêt et la fraction insoluble est séparée par filtration La quantité de polysaccarides dissous est déterminée par spectrophotométrie après une hydrolyse acide suivant AF 169/1, disponible chez Novo Industri A/S, 2880 Bagsvo rd (Danemark). Les carbohydrases présentant une activité endo ainsi que celles présentant une activité exo sont déterminées suivant le procédé. Le substrat faisant partie de cette détermina- tion enzymatique est identique au substrat de la rémanence décrit pour la méthode SRU Le substrat est dissous sous forme d'une solution à 3 X dans le tampon au citrate indiqué ci-dessous: Tampon au citrate-phosphate 0,1 N de p H 4,5 ,24 g d'acide citrique monohvdraté (Merck Art 244) 8,12 g d'hydrogène-phosphate disodique bihydraté (Merck Art 6580) Amené à 1 litre par de l'eau déminéralisée p H 4,5 + 0,05 Stable pendant 14 jours. Le réactif d'arrêt présente la composition suivante: ml de Na OH 0,5 N ml d'éthanol à 96 % A garder dans un réfrigérateur jusqu'au moment de l'utilisation. Conditions standard Temperature: 50 C p H: 4,5 Temps de réaction, échantillon:120 minutes "i ", à blanc: 5 minutes Définition de l'unité - Une unité d'activité solubilisantela rémanence de soja (SRUM) 120 (M pour manuel) correspond à la quantité d'enzyme qui, dans les conditions de réaction données, libère, par minute, des polysaccharides solubilisés équivalant à une micro-mole de galactose. C DETERMINATION ENZYMATIQUE DE L'ACTIVITE PROTEOLYTIQUE MESURE HUT Procédé pour la détermination de la protéinase dans un milieu acide. Le procédé est basé sur la digestion d'hémoglo- bine dénaturée par l'enzyme à 40 C, à p H 3,2, pendant 30 minutes L'hémoglobine non digérée est précipitée au moyen d'acide trichloracétique à 14 % (poids/volume). Tous les échantillons d'enzymes sont préparés en dissolvant celles-ci dans un tampon acetate O,1 M, à p H 3,2. Le substrat d'hémoglobine est préparé en utili- sant 5,0 g de poudre d'hémoglobine bovine lyophilisée, conservée avec du Thicrersalate à 1 % et 100 ml d'eau déminéralisée qui est agitée pendant 10 minutes, avant de règler le p H à 1,7 au moyen de H Cl 0,33 N. Après une agitation ultérieure de 10 minutes, on règle le p H à 3,2 au moyen de Na OH 1 N Le volume de cette solution est porté à 200 ml au moyen d'un tampon acétate 0,2 M Ce substrat d'hémoglobine doit être refroidi pour être gardé pendant 5 jours. Le substrat d'hémoglobine est porté à température ambiante Au temps zéro, 5 ml du substrat sont intro- duitsdans une éprouvette contenant 1 ml d'enzyme Après agitation d'une seconde, l'éprouvette est mise dans un bain d'eau à 40 'C pendant 30 minutes Après exactement minutes, on ajoute 5 ml d'acide trichloroacétique à 14 % dans l'éprouvette qui est ensuite agitée et portée à température ambiante pendant 40 minutes. Pour l'essai à blanc, le substrat d'hémoglobine est porté à température ambiante Au temps zéro, on ajoute 5 ml du substrat dans une éprouvette contenant 1 ml d'enzyme Après une agitation d'une seconde, l'éprouvette est mise dans un bain d'eau à 400 C pendant 5 minutes Après exactement 5 minutes, on ajoute 5 ml d'acide trichloroacétique à 14 % dans l'éprouvette qui est ensuite agitée et portée à température ambiante pendant 40 minutes. Après 40 minutes, les essais à blanc et les échantillons sont agités, filtrés une ou deux fois à travers un filtre de tyoe Berzelius NO O, et disoosés dans un spectrophotomètre L'échantillon est lu par rapport à l'essai à blanc à 275 nm en ajustant le spectrophoto- mètre par rapport à de l'eau. Etant donné que l'absorbance de la tyrosine à " 2518571 275 nm est un facteur connu, il n'est pas nécessaire d' établir une courbe standard de tyrosine à moins qu'il ne soit nécessaire de contr&ler le spectrophoto- mètre de Beckman. Calculs: 1 HUT est la quantité d'enzyme qui forme, en une minute, un hydrolisat équivalent en ce qui concerne l'absorbance à 275 nm à une solution de 1,10 micro- gramme/ml de tyrosine dans du H Cl 0,006 N Cette valeur de l'absorbance est de 0,0084 La réaction s'effectue à 40 C, à p H 3,2 et pendant 30 minutes. HUT = Echantillon à blanc x Volume en ml 0,0084 temps de réaction en mn. HUT = Echantillon blanc x = (E-B) x 43,65 0,0084 30 HUT/g enzyme = (E-B) x 43,65 g enzyme dans 1 ml Un essai pour déterminer la dépendance de la stabilité-du p H de la protéase dans le KRF 68, effectué 0 au moyen d'une analyse HUT avec des valeurs de m H de 2,0 à 8, 0,a montré que la stabilité de la protéase à p H supérieur à 8,0 était très faible, cfr fig 16. Dans le but d'illustrer la présente invention,on se refèrera aux exemples suivant 1 à 10, dans lesquels l'exemple 1 illustre la préparation de SPSase et dans lesquels les exemples 2 à 10 illustrent l'application de la SPS-ase. On a effectué, à l'échelle du laboratoire, de nombreuses fermentations avec les souches Asp aculeatus et Aso jaonicus in- diquées ici Ainsi on a obtenu des préparations qui contenaient:la SPS-ase suivant les essais de SPS-ase indiqués ci-dessus Cependant, étant donné qu'on a besoin de quantités assez importantes de SPS-ase afin d'exécuter les essais, on a effectué des fermentations semblables-à l'échelle d'une installation pilote; cfr exemple 1 suivant. Exemple 1 Production d'une SPS-ase à l'échelle d'une installation pilote. On a préparé une SPS-ase par fermentation submergée d'Aspergillus aculeatus CBS 101 43. On a préparé un substrat d'agar présentant la composition suivante dans un flacon de type Fernbach: Peptone Difco 6 g Aminoline Ortana 4 g Glucose 1 g Extrait de levure Difco 1 g Extrait de viande Difco 1,5 g KH 2 PO 4 Merck 20 g Extrait de malt Evers 20 g H 20 déminéralisée jusqu'à 1000 ml On a règlé le p H à une valeur entre 5,30 et 5,35. Ensuite on a ajouté 40 g d'agar Difco et on a maintenu le mélange dans un autoclave pendant 20 minutes à 120 C (le substrat est dénommé E-agar). La souche CBS 101 43 a été cultivée sur un plan incliné de E-agar ( 37 C) Les spores du plan incliné ont été mis en suspension dans du lait écrémé stérilisé et la suspension a été lyophilisée dans des fioles La teneur d'une fiole lyophilisée a été transvasée dans un flacon de Fernbach Le flacon a ensuite été soumis à une incubation - pendant 13 jours à 30 C. On a préparé un substrat ayant la composition suivante, dans un réservoir de fermentation de 500 litres: Ca CO 3 1,2 kg Glucose 7,2 kg Rofec (matière sèche d'une liqueur de mals) 3,6 kg Huile de soja 1,2 kg On a ajouté de l'eau de robinet jusqu'à un volume total d'environ 240 litres On a règlé le p H à environ 5,5 avant d'ajouter du Ca CO 3 On a stérilisé le substrat dans le fermentateur d'inoculation pendant une heure à 121 C. Le volume final avant inoculation était d'environ 300 litres. La suspension de spores dans le flacon de Fernbach a été transférée dans le fermentateur d'inocula tion Les conditions de fermentation de l'inoculat étaient: Type de fermentateur: Réservoir de fermen- tation classique aéré et agité présentant un rapport hauteur/diamètre d'environ 2,3. Agitation:300 tours/minute ( 2 hélices de turbine) Aération:300 litres N d'air/minute Température:30 à 31 C Pression:0,5 atmospère relative Temps; Environ 28 heures. Environ 28 heures après l'inoculation, on a transféré 150 litres du fermentateur d'inoculationvers le réservoir de fermentation principal. On a préparé un substrat ayant la composition suivante dans un réservoir de fermentation principal de 2500 litres: Farine de soja grillée: 90 kg KH 2 PO 4: 20 kg Pluronic (nom commercial):150 ml. On a ajouté de l'eau de robinet à un volume total d'environ 900 1 La farine de soja grillé a été mise en suspension dans l'eau On a règlé le p H à 8,0 au moyen de Na OH et on a augmenté la température à 50 C Ensuite on a ajouté environ 925 unités Anson d'ALCALASE 0,6 L à la suspension On a maintenu le mélange pendant 4 heures à 50 O C et à p H 8,0 (addition de Na 2 CO 3) sans aération, sous une pression relative de zero atmosphère relative et une agitation à raison de 100 tours/minute Ensuite on a ajouté les composants restants de substrat et on a règlé le p H à environ 6 au moyen d'acide phosphorique On a stérilisé le substrat dans le réservoir de fermentation principal pendant i 1/2 heure à 123 C Le volume final avant inoculation était d'environ 1080 litres. Ensuite on a ajouté 150 litres de culture d'inoculation. Les conditions de fermentation sont: Type de fermentateur:Réservoir de fermen- tation classique aéré et agité présentant un rapport hauteur/diamètre d'environ 2,7. Agitation: 250 tours/minute ( 2 hélices de turbine) Aération: 1200 1 N d'air/minute Température: 30 C Pression: 0,5 atmosphère relative Temps: environ 151 heures. A partir de 24 heures de fermentation jusqu'à environ 116 heures de fermentation on a ajouté une solution de pectine de manière aseptique au réservoir de fermenta- tion principal à raison d'une vitesse constante d'environ 8 litres par heure La solution de pectine ayant la composition suivante a été préparée dans un réservoir de dosage de 500 litres. Pectin genu x: 22 kg Acide phosporique concentré: 6 kg Euronic (nom commercial): 50 ml x Genu pectin (du genre citrus NF de "The Copenhagen *pectin factory Ltd"). On a ajouté de l'eau de robinet à un volume total d'environ 325 litres Le substrat a été stérilisé dans un réservoir de dosage pendant 1 heure à 121 C Le volume final avant le début du dosage était d'environ 360 litres. Lorsque cette partie a été épuisée, on a préDaré une autre partie similaire Le volume total de la solution de pectine pour une fermentation était d'environ 725 litres. Après environ 151 heures de fermentation on a arrêté le processus de fermentation Le bouillon de culture d'environ 1850 litres a été refroidi à environ 5 C et on a récupéré les enzymes selon la technique suivante. Le bouillon de culture a été filtré sur un fibre tambour sous vide (Dorr Oliver), qui était enrobé d'une terre de diatomées Hy-flo-super-cel (adjuvànt de filtration) Le filtrat a été concentré par évaporation à environ 15 % du volume du bouillon de culture Le concentré a été filtré sur une feuille de filtre Seitz (type supra 100) comportant 0,25 % de-Hyflo-super-cel à titre d'adjuvant de filtration (dénommé filtration I dans le tableau suivant) Le filtrat a été précipité au moyen de 561 g de(NH 4) 2 SO 4/1 à un p H de 5,5 et on a ajouté 4 % de terre de diatcmée Hy-flosuper-cel à titre d'adjuvant de filtration Le précipité et l'adjuvant de filtration sont séparés par filtration sur un filtre à cadre Le gâteau de filtre est'dissous dans de l'eau et les fractions insolubles sont séparées par filtration sur un filtre à cadre Le filtrat est soumis à un essai de filtration sur une feuille filtrante Seitz (de type supra 100) avec 0,25 % de Hy-flo-super-cel à titre d'adjuvant de filtra- tion (dénommé filtration II dans le tableau suivant) Le filtrat est soumis à une diafiltration dans un appareil d'ultrafiltration Apres diafiltration, le liquide est concentré jusqu'à une teneur en matière sèche de 12,7 % (dénommée, dans le tableau suivant, teneur en matière sèche du concentré). Un traitement de base facultatif pour éliminer partiellement l'activité de protéase peut être effectué à cette étape Dans le cas d'un traitement de base, celui-ci est effectué à un p H de 9,2 pendant une heure, le p H étant ensuite règlé à 5,0. Ensuite le liquide est soumis à une filtration de contrâleet filtré dans le but d'une réduction de germes et le filtrat est lyophilisé dans un équipement de lyophili- sation de Stokes. On a effectué quatre fermentations de la manière 37. indiquée ci-dessous; la souche utilisée pour la fermen- tation, l'utilisation facultative d'un traitement de base et d'autres paramètres variant, comme indiqué dans le tableau suivant. x Après filtration de réduction des germes, le filtrat est concentré par évaporation en un rapport de 1:2,3 Une faible partie du filtrat concentré a été séchée par pul- vérisation et la partie restante a été lyophilisée. Afin de réduire encore plus l'activité de protéase, certaines préparations indiquées ci-dessus sont traitées comme indiqué ci-dessous, en n'utilisant qu'une des trois possibilités A, B, ou C. A On dissout 100 g de préparation de SPS-ase dans un litre d'eau désionisée en agitant à 10 C + 2 C On règle le p H à 9,1 au moyen de Na OH 4 N Ce traitement de base est effectué pendant une heure On règle ensuite le p H à 4,5 au moyen d'acide acétique glacial et on dialyse en opposition à l'eau désionisée froide à une conductivi- té de 3 m Si Ensuite on effectue la congélation et la lyophilisation. B On dissout une préparation de 500 g de SPS- ase dans 4 litres d'eau désionisée en agitant à 10 C + 2 C. On règle le p H à 9,1 au moyen de Na OH 4 N Ce traitement de base est effectué pendant une heure On règle ensuite le p H à 5,0 au moyen d'acide acétique glacial La substance obtenue est lyophilisée. Traitement de Code Zoncentration (%) de Teneur base de l'adjuvant de filtraen mat Micro Prépation pour: sèche organisme uti-non uti-ration filt réci filtra du Remar- :concert lsé lsé ion I pita tion II trconeues __ _, _ _ __ tion CBS 101 43 x KRF 68 0,5 5 0,2 28 ATCC 20236 x KRF 74 2,0 4 0,4 7,5 O 4408 x KRF 83 1,0 5 0,25 12,4 CBS 101 43 x KRF 92 0,25 4 0,25 12,7 C On dissout 50 g d'une préparation de SPS-ase dans 400 ml d'eau désionisée en agitant à 10 C + 2 C On règle le p H à 9,1 au moyen de Na OH 4,N Ce traitement de base est effectué pendant une heure Ensuite on réduit le p H à 5,7 au moyen d'acide acétique glacial La substance obtenue est lyophilisée. Préparation de SPS-ase Traitement de Code de la en tant que substance base utilisé préparation de départ pour le trai A B C l O A B C ltement de base KRF 68 x KRF 68 BII KRF 68 x KRF 68 BIII KRF 92 -x KRF 92 BI Les préparations indiquées ci-dessus sont carac- térisées par leur activité des enzymes selon la présente invention dans le tableau suivant. Activité enzymatique KRF 68 KRF 68 Bl I KRF 68 BIII KRF 74 KRF 83 KRF 92 KRF 92 BI par g SAE, essai de plaqe+ + + + + + + essai quantita 350 301 349 O 168 476 430 tif SRU 737 507 481 142 683 626 757 SRUM 120 2125 1560 1720 578 753 1640 1030 IUT ph 3,2 67 '000 105 339 1630 12800 5960 397 Cx 8000 8044 9396 1320, 8040 5700 3092 PU 1 0300000 9000000 8800000 840000 7500000 8400000 7600000 PGE 119400 72000 77700 4100 64600 60000 68800 UPTE 78100 83700 76900 15130 327000 44000 62400 EE 840 910 770 370 690 1000 790 H.U 1600000 1100000 1000000 65000 2200000 1100000 742000 HCU 1600000 1100000 1000000 65000 2200000 1100080 742000 w w rn Co n Exemple 2 (exemple d'application) Cet exemple décrit la fabrication de p v pi à partir de farine de soja dégraissée et décortiquée, "Sojamel 13 " (disponible dans le commerce auorès de Aarhus Qlie- fabrik A/S) La teneur en matière sèche de cette farine était de 94,0 % et la teneur en (N x 6,25) sur la base des matières sèchesétait de 58,7 % Lafarine de soja a été traitée avec les préparatiors de SPS-ase KRF 68 BII (exemple 1) de la manière suivante: On a mis 85,2 g de la farine de soja en suspen- sion et on a maintenu en agitation à 50 C dans 664,8 q d'eau et on a règlé le p H à 4,5 au moyen de 7,5 ml de H Cl 6 N On y a ajouté 50 g d'une solution contenant 4,00 g de ladite préparation de SPS-ase et on a ensuite agité le mélange réactionnel pendant 240 minutes à 50 e C Le mélange a ensuite été centrifugé dans une centrifugeuse de laboratoire - (modèle Beckman J-6 B) pendant 15 minutes à 3000 xg On a pesé le surnageant et on l'a analysé suivant la méthode de Kjeldahl afin de déterminer l'azote et les matières sèches. La phase solide a ensuite été lavée avec-n volume d'eau équivalent à la masse de surnageant obtenue lors de la première centrifugation Cette opération a été effectuée deux fois La phase solide a ensuite été lyophilisée, pesée et analysée suivant la méthode de Kjeldahlpour déter- miner l'azote et les matières sèches chez Qvist's Labora- torium, Marselis Boulevard 169, 8000 Aarhus C, Danemark. Ce laboratoire est agrée par l'Etat pour les analyses d'aliments pour bétail et des produits laitiers Les résultats obtenus apparaissent dans le tableau 2 1: Tableau 2 1 Résultats obtenus On a donc obtenu une p v p présentant une pureté de protéine, c'est-à-dire N x 6,25 sur la base des matières sèches, de 91,4 % et avec un rendement total en protéine de 83 %. Exemple 3 (exemple d'application) Cet exemple a été effectué afin de comparer les rendements en protéine, la qualité nutritive et certaines propriétés fonctionnelles de produits à base de protéine de soja préparés suivant les trois techniques suivantes: A: La précipitation isoélectrique classique pour la préparation d'un isolat de protéine de soja. B: Le lavage isoélectriqueclassique pour la préparation de concentré de protéine de soja. C: Le lavage iso Mlectrique suivant l'invention comportant une enzyme solubilisant la réma- nence, pour la préparation d'une p v p. Afin de créer une comparaison valable du procédé de l'invention (C) avec les procédés classiques de prépara- tion de protéine de soja (A et B), on a utilisé la même substance brute dans les trois cas De même, les essais ont été effectués de telle manière que les températures correspondantes et les durées de traitement soient les mêmes dans les trois cas Uniquement les valeurs de p H étaient différentes étant donné les différences F Rendeoent Rendement Composant Masse N x 6,25 Matière en pro en matières g % sèche, téine, % seches, Farine de soja 85,2 55,2 94,0 100 % 100 % Préparation de SPS ase 4,00 75,6 6,4 % - 1 Produit de centrigugation 66,6 1,50 5,04 21,2 % 42,0 % p.v p 44,5 87,5 95,7 82,7 % 53 2 % 0 n fondamentales entre les trois essais. A La précipitation isoélectrique classique pour la préparation d'un isolat de protéine de soja. On a extrait 425,8 g de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) dans 3574,2 g d'eau de robinet à 50 C On a réglé le p H à 8,0 avec 20,1 g de Na OH 4 N Après une agitation d'l heure, on a centrifugé la suspension à 3000 x g pendant 15 minutes en utilisant quatre béchers d'l litre dans une centrifugeuse de laboratoire (modèle Beckman J-6 B) Le produit de centrifugation I et le précipité I ont été pesés Le précipité I a été soumis à une nouvelle extraction avec de l'eau jusqu'à atteindre in poids total de 4000 g On a maintenu la température à 50 C, on a règlé le p H à 8 au moyen de Na OH 4 N et on a agité la suspension pendant 1 heure On a effectué la centrifugation et le pesage du produit de centrifugation II et du précipité II comme décrit ci-dessu. On a retiré des échantillons des produits de centrifugation I et II et du précipité II pour les analyses suivant Kjeldahl et pour la mesure des matières sèches Ensuite, les produits de centrifugation I et II ont étémélangés et maintenus à 50 C La protéine a ensuite été préc'ipite isolélectriquement à p H 4,5 au moyen de 45 g de-HC 1 6 N. Apres une agitation d'l heure à 50 C, on a récupéré la protéine par centrifugation à 3000 x g pendant 15 minutes. Le produit de centrifugation III a été pesé et analysé pour les déterminations Kjeldahl-N et les mesures de matière sèche La phase solide III a été pesée et lavée à l'eau en une quantité correspondant au poids du produit de centrifugation I Le lavage a été effectué en agitant pendant 1 heure à 50 C La protéine lavée a été récupérée par centrifugation à 3000 x g pendant 15 minutes Le produit de centrifugation IV et la phase solide IV ont été pesés Le produit de centrifugation IV a été analysé pour la détermination de Kjeldahl-N et pour la mesure des 18571 matières sèches La phase solide a été mise en suspension dans 1550 g d'eau à 50 C et on a règlé le p H-à 6,5 au moyen de 17 g de Na OH 4 N Le mélange a été maintenu en agitation pendant 1 heure et on a de nouveau règlé le p H à 6,5, si nécessaire Finalement, le produit a été lyophilisé, pesé et analysé pour la détermination suivant Kjeldahl-N et pour la mesure des matières sèches Les calculs de bilan massique sont représentés au tableau 3 1. Tableau 3 1:Calculs du bilan massique de la précipitation isolélectrique classique pour la préparation d'un isolat de protéine de soja. Opérations etfractions Masse de Protéine Matière Rendement Renderent fraction % sèche % N pro en matière 9 (Nx 6,25) éine % sèche % Extraction: Farine de soja 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 Eau 3574,2 O O O O Na OH 4 N 20,1 O 16,0 O 0,8 l.Centrifugation:Z 4020,1 5,9 10,0 100,9 100, 4 Centrifugat I 3141,0 4,4 6,9 58,8 54,1 Précipité I 805,0 Réextraction: Précipité I 805,0 Eau 3195,0 O O O O 2.Centrifugation: Centrifugat II 3104,0 0,5 0,9 6,6 7,0 Précipité II 820,0 9,1 17,2 31,7 35,2 Agitation et acidifica- tion Centrifugats I+II 6245,0 HC 1 6 N 45,0 O 21,3 O 2,4 3.Centrifugation:E 6290,0 Centrifugat III 5650,0 0,3 1,9 7,2 26,8 Précipité III 308,0 Lavage: Précipité III 308,0 Eau 3141,0 O O O O 4. Centrifugation: Z 3449,0 Centrifugat IV 3113,0 0,04 0,1 0,5 1,2 Précipité IV 291,0 Neutralisation: Précipité IV 291,0 Eau 1550,0 O O O O Na OH 4 N 17,0 O 16,0 O 0,7 Séchage: poudre 128,0 93,8 96,3 51,1 30,8 -2518571 44 *- B Lavage isoélectrique pour la préparation d'un concentré de protéine de soja On a lavé 425,6 g de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) dans 3574 g d'eau à 50 C On a règlé le p H à 4,5 au moyen de 44,8 g de HC 1 6 N. On a effectué le lavage pendant 4 heures en agitant La suspension a ensuite été centrifugée à 3000 x g pendant 15 minutes dans une centrifugeuse de laboratoire (modèle Beckman J-6 B) utilisant 4 bêchers d'I 1 Le produit de centrifuga- tion I a été pesé et analysé pour la détermination suivant Kjeldahl-N et la mesure des matières sèches La phase solide I a été pesée et lavée une nouvelle fois à l'eau jusqu'à un poids total de 4000 g Le p H a de nouveau été règlé à 4,5 au moyen de 1,7 g de HC 1 6 N et on a main -tenu la suspension sous agitation pendant 30 minutes à 50 C On a effectué une centrifugation et une pesée du produit de centrifugation II et des solides II comme précédemment. La phase solide II a été remise en suspension dans 1575 g de H 20 à 50 C et on a règlé le p H à-6,5 au moyen de 34,5 g de Na OH 4 N; On a maintenu le mélange sous agitation à 50 C pendant une heure et on a de nouveau règlé le p H à 6,5, si nécessaire Finalement le produit de protéine a été lyophilisé, pesé et ânalysé suivant Kjeldahl-N et pour la mesure des matières sèches Le bilan massique est représenté dans le tableau 3 2. Tableau 3 2:Calculs du bilan massique du lavage isoélectrique poir la préparation d'm concentré de protéine de soja. Opérations et Masse de Protéine Matière Pende Rendemen fractions la frac %(Nx 6,25) sèche,% menten en mat. rations tion,g Drotéine sèche, % Lavage: farine de soja 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 eau 3574,0 0 O O HC 6 N 44,8 O 21,3 O 2,4 1.Centrifugation:S 4044,6 Centrifugat I 3150,0 0,6 3,2 8,0 25,2 Solides I 846,0 Nouveau lavage: Solides I 846,0 eau 3154,0 O O O O -HC 1 6 N 1,7 O 21,3 O 0,1 2.Centrifugation: z 4001,7 Centrifugat II 313,0 O,1 0,4 1 > 3 3,2 Solides I 863,0 Neutralisation: Solides II 863 O eau 15750 O O O O Na CH 4 N 34,5 O 16,0 O 1 4 Séchage:poudre 281,0 72,5 98,4 86,7 69,1 C Lavage isoélectrique comprenant une enzyme solubilisant la rémanence, pour la réparation d'une p v p. On a lavé 4 5,8 g de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) dans 3524,2 g d'eau à 50 C On a règlé le p H à 4,5 en utilisant 43,7 g de H Cl 6 N On a dissous 24 g de la préparation de SPS-ase, KRF 68 BIII (exemple 1) dans 26 g d'eau et on l'a ajoutée au mélange de lavage On a ensuite effectué le lavage pendant 4 heures sous agitation On a ensuite effectué la purifi- cation comme décrit dans l'essai B, les quantité de HC 1 6 Nr de Na OH 4 N et d'eau pour la nouvelle suspension étant les seuls paramètres présentant des valeurs différentes Le bilan massique est représenté dans le tableau 3 3. Tableau 3 3: Calcul du bilan massique du lavage isoélec- trique comportant un enzyme solubilisant la rémanence pour la préparation d'une p v p. Rende- Opérations et Masse de Protéine, Matière Rendenent ment en fractions fraction %(N x 6,25 sèche,% en pro matière g ____ téine, % seche,% Lavage: farine de soja 425; 8 55,2 94,0 100,0 100,0 eau 35402 O O HC 1 6 N 43 k O 21,3 2,3 SPS-ase:KRF 68 BII 24,0 75,3 96,0 7,7 5,8 I. Centrifugation: Z 4043,7 Centrifugat I 34200,7 52 24,7 44,4 Solides I 620 O: _ _ Nouveau lavage: Solides I 620,0 eau 3380,0 0 O O O HC 1 6 N 1,3 O 21,3 O 0,1 Centrifugation: 4001,3 Centrifugat II 3400; O 0,2 0,6 2,9 5,1 Solides II 577,0 Neutralisation: Solides II 577,0 - eau 1700,0 0 O O O Na OH 4 N 25,3 O 160 160 1 O séchage: poudre211,0 87 31) 96,71) 78,2 51,1 À_ 86,92) 97,02) 1) Analysé par Bioteknisk Institut, Kolding, Danemark 2) Analysé par Qvist's Laboratorium, DK-8000, Aarhus C, Danemark Propriétés nutritives Holbersvej 10, DK-6000 Marselis B Oulevard 169, Les compositions en acides airi ns des trois produits de protéine ont été déterminées, voir tableau 3 4 La teneur totale en acides aminés essentiels, la teneur chimique et l'indice d'acides aminés essentiels (EAAI) sont calculés en utilisant le document de référence FAO de 1957. La teneur en inhibiteur de trypsine des trois produits a été déterminée au moyen de la méthode décrite dans A O C S ' Tentative Method Ba 12-75 (A O C S est une abréviation pour American Oil Chemists' Society) Les ré- sultats sont représentés dans le tableau 3 5 qui comporte également les rendements et le rapport protéine/matière sèche des trois produits. Tableau 3 4: Composition d'acides aminés et évaluation nutritive des trois produits de protéine A, B, et C 1)aas = tneur en acides aminés (amino acid score) basée sur le document de référence FAO de 1957. A.Isolat de pro B Concentré de C Isolat de pro- téine de soja protéine de soj téine de soja (P.v,P) Acide anadné g 1 6 g N) p 1) Acide ai g/16 g'N aas g/16 g N aas g/16 g N aas 1) Non-essentiel: Acide asparti 12,4 11,3 11,9 - que Sérine 4,62 4,69 4,81 - cide glutamiqu 21,3 18,2 17,7 - Proline 6,07 5,19 4,76 - Glycine 4,13 4,26 4,33 - Alanine 3,54 4,27 4,55 - Histidine 2,83 2,78 2,50 - Arginine 8,09 7,57 7,04 - Essentiel: Isoleucine 4,87 > 100 4,97 > 100 5,19 > 100 Leucine 7,80 > 100 7,98 > 100 8,09 > 100 Lysine 6,24 > 100 6,09 > 100 5,57 > 100 Phénylalanine 5,47 > 100 l 00 5,35 > 1000 l 5,17 > 1000 Tyrosine 3; 38 51010 3,88 > 10 > -4,44 > 100 Cystine 1,29 64,54 1,32 601602 1,44 2 Méthionine 1,08 49, 01255,) 1,31 59,2 ' Thréonine 3,10 > 100 3,60 > 100 3,97 > 100 Tryptophane 1,06 75,7 1,37 97,9 1,32 94,3 Valine 4,90 > 100 5, 23 > 100 5,57 > 100 Teneur totale en acides ami 38,36 4131 4221 nés essentiels% Teneur chimique 56,4 % 60,2 % 65,5 % AAI 86,7 % 90,2 % 91,3 % 48- Tableau 3 5: Caractéristiques du processus et teneur en inhibiteur de trypsine des trois produits de protéine A, B et C Propriétés fonctionnelles L'indice de solubilité de l'azote (NSI: Nitrogen solubility index) a été déterminé respectivement, dans une dispersion de protéine à 1 % à p H 7,0 dans Na Cl-, 0,2 M et dans l'eau distillée Apres avoir agité pendant 45 minutes au moyen d'un agitateur magnétique, on a centrifugé la suspension à 4000 x g pendant 30 minutes et on a analysé le surnageant pour déterminer l'azote La solubilité de l'azote a été calculée comme le rapport: % N soluble/ % N total Les résultats de cette évaluation effectuée sur les trois produits sont représentés dans le tableau 3 6 La capacité d'émulsification a été déterminée trois fois sur chaque produit par un titrage de Swift légèrement modifié 4,0 g de (N x 6, 25) du produit ont été mélangésdans 250 ml de Na Cl 0,5 M au moyen d'un agitateur - Sorval Omnimixer à vitesse lente, On a transféré 50 ml de la suspension dans un récipient mélangeur en verre et on y a ajouté 50 ml d'huile de soja Le mélange total a ensuite été pesé Le mélange huile-eau a ensuite été homogénéisé A Isolat de B Concentré C Isolat de protéine de protéi protéine de de soja de soja soja (p v p Protéine dans Caractrismatière sèche 97,4 % 73,7 % 90,0 % tiques du processus Rendemoent en Protéine 51, 1 % 86,7 % 78,2 % Protéine Inhibiteurs de trypsine34 000 21 000 9 000 Protine T UI/g 36 250 28 970 21 810 Protéine TUI/g 36 250 28 970 21 810 à 10 000 tours/minute, le récipient étant disposé dans un bain de glace On a ajouté une quantité supplémentaire d'huile de soja à une vitesse de 0,3 ml par seconde jusqu'à ce que l'émulsion s'effondre La quantité totale d'huile ajoutée avant le "point final" a été déterminée par pesée. La capacité d'émulsification est calculée comme le nombre de ml d'huile par gramme de protéine (N x 6,25) La densité de l'huile a été supposée égale à 0,9 g/ml. Les résultats moyens de -la détermination de la capacité d'émulsification des trois produits sont représen- tés au tableau 3 6. L'expansion au fouettement a été déterminée dans une solution de protéine à 3 %,à p H 6,5 On a fouetté 250 ml d'une dispersion aqueuse des échantillons de protéine à la vitesse III pendant 4 minutes dans un agita- teur Hobart (modèle N-50) comportant un fouet en forme de fil L'expansion au fouettement a été calculée selon la formule Expansion au Luettement = 250 x 100 % dans laquelle V représente le volume de fouettement final en ml. La valeur V est mesurée en remplissant le xé- cipient mélangeur avec de l'eau On a doublé les essais de chacun des trois échantillons Les résultats moyens sont représentés au tableau 3 6. La stabilité de la mousse est déterminée en tant que rapport entre la quantité de mousse abandonnée après égouttage pendant 30 minutes et la quantité de mousse à l'origine Un gramme de mousse produitepar le procédé précédent a été introduit dans un cylindre en plastique (diamètre 7 cm, hauteur 9 cm) comportant un filet à mailles de 1 mm x lmm Le cylindre a été disposé au-dessus d'un entonnoir monté sur un cylindre en verre et le poids (B) du liquide égoutté dans le cylindre en verre est mesuré La stabilité de la mousse FS (foam stability) est déterminée par l'équation FS= A x 100 % Les résultats de la mesure sont représentés au tableau 3 6. La résistance du _gel est définie dans cette description en tant que la viscosité de Brookfield mesurée au moyen de mandrins T sur un statif de Brookfield Helipath Les gels sont produits par traitement thermique de suspensions de protéine à 12 % dans du Na C 1 0,5 M Le traitement thermique a été effectué dans des bidons fermés ayant un diamètre de 7,3 cm et une hauteur de 5,0 cm, plongés dans un bain d'eau, maintenus à 80 et 100 C, pendant 30 minutes chacun Les bidons ont été refroidis et thermostati- sés à 20 C avant de les ouvrir et avant d'effectuer les mesures Les résultats de ces mesures sont représentés dans le tableau 3 6. Tableau 3 6: Propriété fonctionnelles des trois substances de protéine A, B, et C Propriétés A Isolat de B Concentré de C Ipolat de fonctionnelles protéine de protéine de protéine soja soja de soja(pvp) % NSI dans Na Cl 0,2 M 39,5 20,3 25,6 % NSI dans l'eau 53,9 25,1 28,6 Capacité d'émulsifi- cation: ml huile/g 218 182 354 (N x 6 25) Expansion au fouette 120 120 340 sent % Stabilité de la 50 50 20 musse % 50 50 20 mousse % Résistance du gel 3 4 2 C (Na Cl 0,5 M) 1,7 x 104 1,2 x 104 3,3 x 104 C (Na Cl 0,5 M) 2,0 x 10 4,0 x 10 1,3 x 10 pn 1 no:ge S;___ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Exemple 4 (exemple d'application) On a produit une p v p suivant le processus décrit à l'exemple 3 C sauf que l'activité de cellulase était partiellement dérivée de Trichoderma reseei La préparation de cette cellulase commerciale CELLUCLAST, produite par Novo Industri A/S, a été traitée au moyen d'une base à faible température, de lamanière suivante Le p H d'une solution à 10 % de CELLUCLAST dans l'eau a été règlé à 9,2 au moyen de Na OH, et la solution résultante a été refroidie à 5 C Après séjour d'une heure à ce p H et à cette température, on a règlé le p H à 4,7 au moyen d'acide acétique à 20 % Cette solution a été maintenue à 5 C pendant la nuit et ensuite été filtrée de manière stérile. Le produit de filtration a été lyophilisé On a ajouté 4 g du produit lyophilisé à la préparationd SPS-ase, KRF 68 Bl II (exemple 1) Les deux enzymes ont été dissoutes dans 172 g d'eau avant d'être ajoutées au mélange de lavage Les déterminations du bilan massique de cet exemple sont représentées dans le tableau 4 1. L'essai prouve que cette préparation particu- lière de SPS-ase contient déjà une cellulase efficace étant donné qu'une addition de CELLUCLAST ne semble pas affecter le rapport protéine/matière sèche Cependant, d'autres préparations de SPS-ase peuvent contenir moins de cellulase, par exemple KRF 92, voir le tableau précédant immédiatement l'exemple 2. Tableau 4 1: Calculs du bilan massique du lavage isoélec- trique comportant une préparation de SPS-ase -et du CELLUCLAST pour la production du p v p. Opérations et Masse de Protéine Matière endement Rendement fractions fraction % sèche en enratière =________ _ granimés (Nx 6,25) % Drotéine sèche % Lavage: Farine de soja 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 Eau 3546,2 O O O O HC 1 6 N 43,1 O 21,3 O 2,3 SPS-ase:KRF 68-BIII 24,0 75,3 96 7,7 5,8 CELLUCLAST 4,0 43,6 96 0,7 1,0 Centrifugation: Z 4043,1 Centrifugat I 382,0 1,9 5,5 27,3 46,5 Solides I 661,0 Nouveau lavage: Solides I 661,0 Eau 339,0 O O O o HC 1 6 N O O O O O 2 e Centrifugation:7 000,0 Centrifugat II 3414,0 0,2 0,7 2,9 6,0 Solides II 582,0 _ Neutralisation: Solides II 582,0 Eau 691,0 O O O O Na OH 4 N 25,3 O 16,0 O 1,0 Séchage: Poudre 206,0 88,8 98,9 77,8 50,9 Exemple 5 (exemple d'application) On a produit une p v;p suivant le procédé décrit dans l'exemple par un facteur 3 C sauf que toutes les masses ont été divisées de 5 et que le mélange réactionnel a été refroidi à environ 5 C avant la centrifugation Sur base des résultats analytiques en rapport avec les produits de centrifugation, on obtient un rendement théorique en protéine précipitée, comme montré dans le tableau 5 1. Tableau 5 1: Rendements théoriques en protéine obtenus - lors de la production d'une p v p. a Moyenne de 87,5 (Bioteknisk Institut) et 86,9 (Qvist's Laboratorium); la teneur en matière sèche est respective- ment de 97,6 et 98,0 %. b Calculé en tant que masse totale de protéine perte en protéine dans les produits de centrifuqations. Exemple 6: (exemple d'application) Démonstration de la liaison Protéique du SPS. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ O _ On a dissous 40 g de (Nx 6,25) d'un isolat de protéine de soja commercial (Purina 500 E de Ralston Purina) dans 680 g d'eau On a chauffé le mélange dans un bain d'eau à 50 C et on a règle le p H à 4,50 au moyen de HC 1 6 N On a transféré 90 g'-de ce mélange dans 5 flacons d'Erlenmeyexrde 250 ml et on y a ajouté 10 g de solutionsaqueusescontenant respectivement O g, 0,2 g, 0,4 g 0,8 g et 1,6 g du SPS préparé comme décrit précédemment dans ce mémoire Les flacons ont ensuite été maintenus sous agitation au moyen d'un aimant dans un bain d'eau à 50 C pendant 240 minutes. 3 S On a ensuite centrifugé les suspensions à 3000 x g Masse Protéine Rendement Exemple 3 Fractions g (Nx 6,25)en pro Protéine Renderrent % téine % (Nx 6,25)en protéine Farine de soja 85,2 55,2 100 55,2 100 SPSase KRF-68 BIII 4,8 5,3 7,7 75,3 7,7 lère centrifugation639 0,99 13,5 1,7 24,7 2 è centrifugation595 0,13 1,6 0,2 2,9 p.v p 87,2 a 926 b 87,1,b pendant 15 minutes et les produits de centrifugation I ont été analysés suivant Kjeldahl-N et pour la détermination des matières sèches Les phases solides ont été lavées à l'eau à température ambiante et centrifugées une nouvelle fois Cette étape a été répétée Ensuite on a dispersé les solides dans 50 ml d'eau et on a règlé le p H à 6,50 par une addition goutte à goutte de Na OH 6 N Les produits neutralisés ont été lyophilisés et analysés suivant Kjeldahl-N et pour déterminer les matières sèches (MS) En se basant sur les analyses représentées au tableau 6 1, on a calculé le pourcentage de protéine récupérée et le pour- centage de SPS qui a été lié à la protéine au moyen des formules représentées en relation au tableau 6 2. Cet exemple démontre que le SPS est lié intime- ment à la protéine de telle sorte que le rapport protéine/ matière sèche diminue pour une teneur croissante en SPS. Le rapport protéine/SPS présent dans la farine de soja correspond à une teneur en SPS comparable à environ 0,4 g dans 10 g d'eau, ajouté à 5 g d'isolat de protéine. Le pourcentage de liaison du SPS est une valeur calculée Le pourcentage de liaison du SPS diminue à cause de la saturation de la protéine en SPS aux faibles rapports protéines/SPS - Tableau 6 1: Mesures suivant l'exemple 6 , Rapport Produit de Précipité séché Protéine/ centrifugation I SPS % N % MS % N % N x 6,25% MS % _____ l 0,068 0,62 13,2 82,5 93,1 88,6 0,045 0,49 13,4 83,8 97,3 86,1 12,5 0,038 0,45 13,0 81,3 97,9 83,0 6,25 0,031 0,45 12,6 78,8 98,1 80,3 3,125 0,p 26 0,61 11,8 73,8 97,9 75,3 - 2518571 Tableau 6 2: Récupération de protéine et pourcentage de liaison du SPS - Pourcentage de récupération de protéine = l 1 NC 1 x 6,25 lx 100, o , NC 1 = pourcentage d'azote dans le produit de centrifu- gation I. ) pourcentage de liaison du SPS = x(% récupération protéine) 5 x(% récupération protéine) (% P/H) (% P/H)O x 100 5/ rapport de SPS o, (% P/H) est le rapport protéine/matière sèche dans -le précipité sèche, et (% P/H) se rapporte au précipité sans addition de SPS. Exemple 7 (exemple d'application) Cet exemple décrit la préparation d'une p v p. en utilisant la préparation de SPS-ase KRF 92 B-I compor- tant 5 % de matière sèche Le procédé de préparation est le même que celui de l'exemple 3 C, sauf que toutes les masses sont divisées par un facteur 5 La p v p a été analysée comme décrit à l'exemple 2 Les résultats obtenus dans l'essai apparaissent dans le tableau 7 1. Rapport Pourcentage de récupé _ro tin 1)e/ % de liaison du SP 52) Protéine pération de protéine) i,,SPS ro 91,5 O 94,4 77 12,5 95,3 90 6,25 96,1 70 3,125 96,8 60 Tableau 7 1: Résultats obtenus à l'exemple 7 a Analysé par Bioteknisk Institut, Holbergsvej 10, DK-6000 Kolding. b Analysé par Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, DK-8000 Aarhus C. Exemple 8 (exemple d'applicatior: Cet exemple montre l'effet d'un pré-traitement de la farine de soja par une cuisson au jet de vapeur avant la préparation de la p v p - Pré-traitement: Une suspension de farine de soja dans l'eau con- sistant en 10 kg de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) par 100 kg a été pompée à travers un éjecteur de vapeur (type Hydroheater B-300) et mélangée avec de la vapeur à 8 bars en une telle quantité et à une telle vitesse qu'on a pu maintenir une température finale de 150 ?C pendant 25 sec, dans un réacteur tubulaire pressurisé Ensuite la pression a été réduite dans une chambre de détente (un cyclone) d'o la suspension a été envoyée dans un échangeur de chaleur à plaque dans lequel elle a été refroidie à environ 50 C La boue refroi- die a pu être utilisée telle quelle pour la préparation de p v p suivant l'invention, mais, dans ce cas, la suspension Composant Masse (Nx 6,25) Matière P Rendement Pendement en sèche E protéine mat sèche _ _ _ _ _ _% % _o % Farine de soja 85,2 55,2 94,0 100 100 Préparation d'enzyme4,0 71,2 6,1 - ler produit de cen632 1,88 5,44 25,-3 43,0 trifugation 2 è produit de cèn673 0,30 0,80 4,3 6,7 trifugation p.v p; 39,8 85,6 a 98,1 a 71,9 48,8 84,4 98,1 a été sèchée par pulvérisation à une température d'entrée de 200 C et à une température de sortie de 90 C Le produit pré-traité indique une teneur en matière sèche de 96,5 % et une teneur en protéine de 56,9 % (N x'6,25). Préparation de la p v p. Cette préparation a été effectuée de la manière suivante: On a mis 70 g de matière sèche de farine de soja cuite au jet de vapeur et sèchée en suspension et on a maintenu sous agitation à 50 C dans 560 g d'eau et on a règlé le p H à 4,50 au moyen de 6,5 ml d'H Cl 6 N On a trans- * féré 6 x 90 q de cette suspension dans 6 flacons d'Erlenmeyer de 250 mlet on a maintenu sous agitation à 50 C dans un bain d'eau au moyen d'agitateurs magnétiques A chaque flacon d' Erlenmeyer on a ajouté 10 g d'une solution contenant respectivement O g, 0,025 g, 0,050 g, 0,10 g, 0, 20 g et 0,40 g de la préparation de SPS-ase KRF-68-B-III Les mélan- ges réactionnels ont ensuite été agitémpendant 240 minutes à 50 C On a ensuite effectué une centrifugation pendant minutes à 3000 x g. Le surnageant a ensuite été analyse suivant la méthode de Kjeldahl-N et la phase solide a été lavée à l'eau à volumes égaux et a été centrifugée Cette opération a été effectuée deux fois La phase solide a ensuite été lyophilisée et analysée pour la détermination de Kjeldahl-N et des matières sèches. Un essai semblable a été effectué avec une farine de soja non traitée (Sojamel 13 de Aarhus Oliefabrik A/S) utilisée en tant que substance de départ Dans ce cas, les rapports de l'enzyme au substrat étaient de O %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 % et 8 %. En se basant sur la teneur en protéine des sur- nageants, on a pu calculer le pourcentage de protéine récupérée Le rendement en protéine est basé sur -58 l'hypothèse que la substance d'enzyme est solubilisée à 100 % après la réaction Le tableau ci-dessous indique les résultats obtenus par les deux essais. Tableau 8 1: Rendements en protéine et rapport protéine/ matière sèche pour une p v p préparée à partir de farina de soja cuite ou brute. Exemple 9 Isolement de rotéine à partir du gluten de mais. Le gluten de mais est habituellement prod it en tant que produit secondaire dans le processus de fàbrica- tion d'amidon de mais Ce gluten de mais brut n'est pas efficacement séparé de la fraction fibreuse et c'est là une des raisons pour lesquelles il ne présente aucune propriété fonctionnelle intéressante De même, différents polysaccharides dégradables accompagnent le gluten de mais brut. On a effectué une série de traitements Dar le SPS-ase avec une préparation de SPS-ase produite suivant l'exemple 1, sauf qu'une ultrafiltration a été effectuée au lieu de la-précipitation par (NH 4)2 SO 4, par laquelle l'enzyme isolée a été soumise -à un traitement de base suivant le procédé A (pour des raisons de brièveté cette préparation de SPS-ase soumise à un traitement de base est dénommée Farine de soja cuite Farine de soja non-traitée E/S % Rendement Protéine des Rendement en Protéine des en protéine mat sèches protéine mat sèches 0 92,9 76,5 90,7 73,9 0,25 90,1 86,6 0,50 89,3 88,7 1,0 88,1 89,7 87,1 86,2 2,0 86,6 91,7 85,7 88,1 3,0 84,3 89,5 4,0 84,7 92,2 82,6 90,9 8,0 76,2 91,1 dans la suite PPS 1305) La PPS 1305 ne contient prati- quement pas d'activité protéolytique. Les conditions de réactiop suivantes ont été utilisées: La substance de protéine a été purifiée par cen- trifugation, lavée deux fois et finalement lyophilisée. Les résultats sont repris dans le tableau 9. Tableau 9. Exemple 10: Isolement de protéine à partir de farine de coton brut, de farine de tournesol ou de farine de colza Les protéines provenant de farine de graines de coton, de farine de tournesol ou de farine de colza peuvent être séparées de la même manière que les protéines provenant d'une farine de soja Ou de gluten de mais. L'isolement de protéines provenant de différentes autres Concentration du substrat: S = 10 % de matières sèches (Gluten de mais Staley p H = 4,50 T = 5 QOC t = 240 minutes E/S% = 0, 1, 2, 3, 4, 8 % Enzyme: PPS 1305 Essai N O Dose d'enzyme Rendement en Polysaccharide Pureté E/S % protéine % dissous % de la protéine (Nx 6,255 ______ _ MS) % 873 O 96 0 64 874 1 95 40 75 875 2 95 50 78 876 3 95 52 79 877 4 95 63 83 substances brutes végétales renfermant des protéines peut être effectué de la même manière Naturellement, l'isolement et/ou la-séparation doivent être effectués de préférence au point isolélectrique-de la partie principale de la part de protéine de la substance de départ, le rendement en protéine étant de cette façon maximal o Afin d'être plus clair, on donne ci-dessous un aperçu des figures auxquelles on a déjà fait référence. La figN Concerne Décrit La partie générale de la description La partie générale de la description 2 ème partie 2 ème partie 2 ème partie 2 ème et 3 ème parties 2 ème partie 3 ème partie 3 ème partie 3 ème partie La démonstration de la liai- son entre le SPS et la pro- téine de soja Tableau synoptique décrivant la préparation du SPS - Courbe de calibrage pour la chromatographie HPLC à fil- tration sur gel Chromatogramme HPLC à fil- tration sur gel du SPS Chromatogramme HPLC à fil- tration sur gel du SPS dé- composé par la SPS-ase Chromatogramme HPLC à fil- tration sur gel du surnageant de SPS, soumis à incubation avec une protéine de soja Chromatogramme HPLC à fil- tration sur gel du surnageant de SPS décomposé, soumis à incubation avec une protéine de soja - Chromatogramme HPLC à fil- tration sur gel de APS décom- posé par Pectolyase Chromatogramme HPLC à fil- tration sur gel de APS décom- posé par la SPS-ase Chromatogramme HPLC à fil- tration sur gel du SPS traité avec la Pectolyase La Fig Concerne Décrit N _ part Pics immunoélectrophorétiques com- i 11 7 me partportant un pic de SPS-ase iden- tifié par la technique de recou- vrement 12 8 ème partie Chromatogramme à échange ionique d'une SPS-ase 13 9 ème partie Dépendance de l'activité d'une SPS-ase vis-à-vis du DH 14 9 ème partie Dépendance de l'activité d'une SPS-ase vis-à-vis de la tempéra- ture 9 ème partie Stabilité à la température d'une SPS-ase. 16 10 ème partie Stabilité d'une protéase dans une préparation de SPS-ase vis-à-vis ___,_ _du m H REVENDICATIONS 1 Agent pour la décomposition de la rémanence végétale, notamment de la rémanence de soja, en présence d'une protéine végétale, en particulier de la protéine de- soja, et convenant pour la préparation d'une p v p. présentant une pureté de la protéine d'environ 90 %/à partir d'une protéine végétale qui peut être dégraissée ou partiellement dégraissée, agent contenant une enzyme à activité de solubilisation de la rémanence, caractérisé. en ce qu'il contient une enzyme capable de décomposer le SPS de soja (SPSase) et en ce qu'il est essentiellement exempt d'activité protéolytique - 2 Agent suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la SPS-ase est produite au moyen d'un microorga- nisme appartenant au genre Aspergillus, de préférence appartenant au groupe Aspergillus niger 3 Agent suivant les revendications lou 2, carac- térisé en ce que le composant actif est dérivé de l'enzyme qui peut être produite par Aspergillus aculeatus CBS 101 43 ' 4 Agent suivant l'une des revendications 1 à 3, carac- térisé en ce que la SPS-ase est immunoélectr Qphorétiquoment identique à la SPS-ase qui peut être produite par Asp. aculeatus CBS 101 43 et en'ce qu'elle peut être identifiée au moyen de la technique de recouvrement immunoélectropho- rétique. Agent suivant l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que le rapport entre l'activité protéo- lytiqueé,en unités HUT et l'activité de solubilisation de la rémanence en unités SRUM-120 est inférieur à environ 2:1, de preférence inférieur à 1:1, tout particulièrement inférieur à 0,25:1. 6 Agent suivant l'une des revendications 1 à 5, carac- térisé en ce qu'il comporte une activité de cellulase et en ce que ladite activité de cellulase est dérivée partiellement ou totalement de Trichoderma reseei. 7 Agent suivant l'une des revendications 1 à 6, carac- térisé en ce qu'il comporte une activité de cellulose (c), une activité de pectinase (PU, PGE, UPTE, PEE) et une activité d'hémicellulase (VHCU). 8 Procédé pour la préparation d'une protéine végétale purifiée produite en éliminant la rémanence d'une protéine végétale brute servant de substance de départ, caractérisé en ce que la substance de départ est traitée avec l'agent suivant l'une des revendications 1 à 7 dans un milieu aqueux, à une valeur de p H qui ne diffère pas de plus de 1,5 unité de p H du point isoélectrique de la partie principale de la part de protéine de la substance de départ et à une température comprise entre environ 20 et environ 700 C, jusqu'à ce qu'au imins environ 60 % de la r&anence, sur la base du bilan en azote et en matières sèche: de préférence au moins environ 70 % de celle -ci, plus particulièrement au moins environ 80 % de celle -ci ont été solubilisées, et en ce qu'on sépare ensuite la phase solide contenant la protéine végétale purifiée du surnageant - 9 Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'on effectue la séparation à une température comprise entre la température ambiante et le point de congélation du surnageant. 10 Procédé suivant l'une des revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que la substance de départ est une protéine végétale dégraissée ou dégraissée et encore partiellement purifiée. 11 Procédé suivant l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que la substance de départ est de la farine de soja. 12 Procédé suivant l'une des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que la substance de départ est une farine de soja traitée à la chaleur, de préférence une farine de soja cuite au jet de vapeur. I-857 1 13 Procédé suivant l'une des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que la substance de départ est capable de-passer à travers un tamis présentant une ouverture de mailles d'environ 2,5 mm. 14 Substance à base de protéine végétale purifiée telle que préparée par le procédé suivant l'une des reven- dications 8 à 13.