FR 2531718 A1 19840217 FR 8214170 A 19820816 2531718- Réactif permettant un dosage de très haute sensibilité de l'antigène caractéristique du virus de l'hépatite B dans les liquides biolo- giques humains. La présente invention ounerne des*-réactifs utiles pour le diagnostic des hépatites virales de type B, un procédé pour la préparation de ces réactifs et un procédé pour utiliser ces réactifs en-vue de réaliser le dosage quantitatif de très haute sensibilité de l'antigène caractéristique du virus de l'hépatite B dans le sérum humain. Les hépatites virales sont des maladies infectieuses transmissibles très fréquentes, dont l'agent causal est un virus et qui se caractérisent habituellement par une nécrose et -une inflam- nation hépatiques, fréquemment accompagnées d'ictère Bien que ces maladies soient généralement bénignes, près de 1 %-des cas sont mortels et environ 5 % des cas conduisent à des formes prolongées ou chroniques On distingue les hépatites de type A dont le virus, est principalement transmis par voie orale (nourriture, boisson), les hépatites de type B dont le virus est le plus souvent transmis par voie parentérale et enfin d'autres hépatites (non A non B). En ce qui concerne les hépatites de type B, les sujets lés plus susceptibles de contracter la maladie sont ceux qui sont soumis à des transfusions sanguines ou des hémodialyses, le personnel médical et paramédical, le personnel des centres de transfusion sanguine Le virus de l'hépatite B est de ce'fait recherché en dépistage systématique chez tous les donneurs de sang car il est connu que le virus peut persister longtemps dans le sang de sujets apparemment sains. la corrélation que l'on observe entre l'augmentation' de sensibilité des techniques de dépistage et la réduction de fréquence des hépatites posttransfusionnelles plaide très fortement en faveur de la disponibilité de réactifs et de techniques de dosage de haute sensibilité, aisées à mettre en oeuvre, de réponse rapide et de coût peu élevé. Il faut noter en outre la corrélation existant, notamment chez certaines populations africaines, entre la présence dans le sang de virus de l'hépatite B et l'apparition de cancers primitifsdu foie Cette observation plaide également en faveur de possibilités de diagnostic de masse chez ces populations. L'antigène de surface du virus de l'hépatite B, dit antigène H Bs ou antigène Australia, est généralement reconnu comme le marqueur le plus important du virus et c'est cet antigène que l'on cherche à doser-dans le sang Les méthodes actuellement dis- ponibles pour atteindre la sensibilité requise -le seuil de détec- tion devant être inférieuré 1 nanogramme par millitre de sérum- sont toutes de nature radioimmunologique et présentent notamment les inconvénients suivants liés à la manipulation de substances radioactives: appareillages spécialisés et coûteux, problèmes de contamination possible (préjudiciables à la qualité du résultat et à la sécurité du personnel), obligation de disposer de personnel très qualifié et controlé sur le plan médical et radiotoxicologique, contraintes imposées par la loi pour l'aménagement des locaux et la sécurité, durée de validité -limitée des réactifs Les réactifs et procédés objets de la présente invention sont d'une nature radicalement différente, n'impliquant aucune manipulation de substances radioactives par l'utilisateur et évitant donc tous les inconvénients cités ci-dessus Le principe retenu pour ces dosages est celui de la néphélémétrie à support microparticulaire de très haute sensibilité. La néphélémétrie est une méthode physique très connue en chimie analytique Lorsque le même&principe est appliqué à la quantification de réactions antigène/anticorps, elle prend alors le nom d'immunonéphélémétrie Elle a été principalement employée pour le dosage spécifique des protéines du sérum par la mesure de l'intensité de la lumière diffusée par les complexes immuns inso- lubles formés entre chacune de ces protéines et un immun-sérum correspondant L'amélioration des appareillages, notamment par l'emploi de sources lumineuses à laser, apermis d'atteindre des sensibilités de l'ordre du microgramme de protéine à doser par ml de liquide biologique. Les appareils de ce type sont maintenant largement. diffusés dans les laboratoires, mais la sensibilité ainsi atteinte est encore très insuffisante pour le dosage de l'antigène HB 5. Dès 1976, BONNEFOY et GRANGE (C R Acad Sc Paris D 283, 1976, 115-118) ont proposé d'améliorer Ies performances de l'immunonéphélémétrie par l'emploi de microspheres de polystyrène portant l'un des composants de la réaction antigène/anticorps à étudier Cette modification introduit le principe de l'emploi des supports microparticulaires en immunonéphélémétrie. Des travaux analogues ont fait l'objet de publi- cations (voir notamment J Immunolo Methods 18, 1977, 214-224; ibid 33, 1980, 159-173; Immunochemistry 13, 1976, 955-962 et 963- 966; Molec Immunol 17, 1980, 81-92) et de brevets (notamment brevet déposé en France au nom de 1 'INSERM (inventeur G A QUASE) le 06/03/79) Ces techniques emploient de préférence des micro- spliares de polystyrène sur lesquelles est fixé (par adsorption ou par covalence) le composant convenable de la réaction antigène/anti- corps à étudier. Les performances ont encore été améliorées par l'emploi de supports microparticulaires à caractère hydrophile, par opposition aux précédents qui étaient hydrophobes et présentaient une instabilité par autoagglutination et sédimentation lente et des risques liés notamment à des adsorptions non spécifiques Ces nouveaux supports microparticulaires hydrophiles ont été décrits et brevetés notamment par REMBAUM et ses collaborateurs (REMBAUM et alo Macromolecules 9 ( 2), 1976, 328-336; REMBAUM et alo J Macromolo Sci Chem A 13 ( 5), 1979, 603-632; brevet français n 2 258 406 du 17 janvier 1975; brevets des Etats-Unis d'Amérique n 4 138 383 du 6 février 1979 et 4 206 094 du 3 janvier 1980) mais en vue d'utilisations biomédicales sans rapport avec l'immunonéphélémétrie, ni avec le dosage de l'antigène H Bs Les supports du même type ont s aussi été utilisés par DUHEILLE et ses collaborateurs (MONTAGNE et alo Groupe d'Etude Laser Behring, septembre 1979; MONTAGNE et alo I Ve Congrès International d'Immunologie -Paris 21-26 juillet 1980) pour le dosage immunonéphélémétrique des complexes immuns circulants. Toutefois, aucune technique de ce type n'a jamais été appliquée au dosage de l'antigène HBO Poursuivant ses études sur la formation du signal néphélémétrique en fonction de la taille, du nombre et des carac- téristiques des particules dispersantes, la demanderesse a découvert le grand intérêt de nouveaux supports microparticulaires qui se comportent comme indicateurs et amplificateurs remarquables du signal néphélémétrique Ce sont ces supports et leur application au dosage de l'antigène H Bs qui font l'objet de la présente invention Ces nouveaux supports ont les caractéristiques et avantages suivants: 1 Ce sont des microparticules sphériques, hydro- phyles, polyfonctionnelles, à charge électrique variable de façon controlée, de taille très uniforme et parfaitement contrlable dans la gamme de diamètres moyens allant d'environ 10 nanomètres à environ micromètres. 2 De telles caractéristiques éminemment favorables au but poursuivi, et qu'aucun des supports antérieurement décrits ne possède toutes ensemble, découlent de la nature chimique de ces particules qui résultent de la copolymérisation réalisée en milieu strictement aqueux d'au moins trois monomères acryliques hydroso- lubles, en présence d'un agent de réticulation et d'un agent tension actif, eux-rmmes également hydrosolubles. Toutes les caractéristiques, géométriques (taille moyenne et dispersion des tailles autour de la moyenne), physiques (hydrophilie et densité de charges électriques superficielles) et chimiques (fonctions chimiques présentes en surface) de ces parti- cules sontentièrement régies par le choisx de-la nature des consti- tuants du milieu réactionnel, de leurs proportions relatives et des conditions dans lesquelles a lieu la copolymérisation. 3 Les monomères acryliques utilisés sont chbisis parmi les substances définies ci-après: a) un aldéhyde acrylique de formule générale: R / 1 CH = C cio o R est l'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur Ce monomère peut représenter de 5 à 95 % en poids de l'ensemble des monomères, mais le plus souvent entre 40 et 60 %. Il apporte des fonctions aldéhyde qui seront préservées lors de la polymérisation et seront présentes et accessibles à la surface des microsphères obtenues, permettant ainsi la simplification et la diversification 'des procédures de couplage par covalence de protéines ou de glycoprotéines ou d'autres m acromolécules ou r: olécules naturelles ou hénisynthétiques convenables à la surface des microphères b) un dérivé acrylique carboxylique de formule générale: CH 2 =C COOR 3 o R 2 est l'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur R est l'hydrogène. Ce monomère peut représenter de O à 15 7 % en poids de l'ensemble des monomères et apporte aux microsphères des grou- pements carboxyliques dont le caractère anionique à p H physiolo- gique est essentiel à la régulation de la charge électrique super-. ficielle des microsphères et, par là, à la stabilité du réactif en suspension Tout ou partie de ces groupements carboxyliques peuvent aussi être utilisés comme fonctions chimiques disponibles pour assurer le couplage covalent des molécules à fixer sur ies micro- sphlres, selon les techniques usuelles de la chimie. c) un autre dérivé acrylique de formule générale: R 2 CH 2 = C COOR 3 o R 2 a la même signification que précédemment et COOR 3 représente un groupe de structure -COOR 4-/ _ 4 R 6 o R 4, R 5 et R 6 sont des groupes aikyle inférieurs identiques ou différents. Ce monomère peut représenter de O à 15 %'en poids de l'ensemble des monomères et apporte aux microsphères des grouu pements amine tertiaire dont le caractère cafionique à p H physio- logique participe à la régulation de la charge électrique super- ficielle des microsphères et, par là, à la stabilité du réactif en supension. d) un autre dérivé acrylique de formule générale x 2 CH = C COOR 3 o R a la même signification que précédemment et R 3 est un groupe alkyle inférieur hydroxylé. Ce monomère peut représenter de 5 à 90 en poids d l'ensemble des monomères et le plus souvent entre 40 et 70 I l apporte des fonctions hydroxyles en grand nombre qui confèrent aux microsphères leur hydrophilie et un caractère parfaitement mouillable par les solvants aqueux, ce qui participe aussi à la stabilité du réactif. Il est ainsi évident qu'un choix judicieux de la proportion des monomères appartenant aux classes b), c) et d) définies ci-dessus règle exactement comme on le souhaite à la fois 1 'hydro- philie et la charge électrique nette des microsphères Cette régu- lation est essentielle pour permettre au réactif d'atteindre la sensibilité maximale du dosage En effet, la sensibilité du dosage sera maximale si la charge électrique des microsphères est réglée de telle sorte que les répulsions électrostatiques entre-sphères soient juste assez fortes pour empêcher l'auto-aggrégation et néanmoins assez faibles pour permettre l'agglutination spécifique de deux sphères par la réaction antigène-anticorps minimale Les mêmes conditions favorisent aussi l'accélération des réactions d'agglutination spécifiques, ce qui représente un élément très favorable pour la mise en oeuvre pratique du dosage. Il faut enfin noter que l'absence de tout monomère hydrophobe permet d'obtenir un milieu réactionnel -aqueux homogène, favorable à la plus grande régularité dans l'amorçage et le dérou- lement de la polymérisation, ce qui entraîne une excellente homo- généité de taille des sphères formées, quelle que soit la taille moyenne que l'on cherche à obtenir. 4 En plus des monomères acryliques décrits ci-dessus, le milieu de polymérisation contient en outre un agent réticulant destiné à assurer las pontages entre chaînes linéaires de polymères acryliques et de ce fait la cohésion du réseau tridi- mensionnel de copolymère Cet agent réticulant est caractérisé en ce qu'il est un diène non conjugué et, notamment le N-N'-méthylène bis acrylamide, soluble dans l'eau et qu'il représente de 0,1 à % en poids de l'ensemble des monomères et le plus souvent entre 0,5 et 5 % La proportion choisie d'agent réticulant a également pour rôle de contrôler la porosité des microsphères obtenues. Enfin, le milieu de polymérisation contient un agent tensioactif qui peut être de type ionique -et notamment le dodécylsulfate de sodium ou de type non ionique Il est utilisé à une concentration comprise entre 0,01 7 et 5 % en poids du milieu réactionnel total et son rôle principal est de régler les modalités de croissance des sphères pendant la polymérisation et, de ce fait, la taille finale des microsphères obtenues. 6 Au cours de-nos travaux, il a été reconnu que la taille finale des microsphères obtenues pouvait être le plus favorablement réglée en influant, d'une part, sur la concentration en agent tensioactif et, d'autre part sur la concentration finale en mélange total de manomères dans le milieu réactionnel de polymérisation. Toutes choses égales par ailleurs,le diamètre des microsphères obtenues est d'autant plus grand que la concentration de l'agent tensioactif est faible et que la concentration totale en monomères est élevée La concentration totale en monomères dans le milieu réactionnel peut être choisie entre 4 et 16 % en poids 7 Le mélange des monomères choisis, de l'agent réticulant et de l'agent tensioactif étant réalisé dans les conditions permettant d'obtenir des microsphères de caractéristiques voulues, ce milieu réactionnel est réparti dans des ampoules de verre borosilicaté de taille convenable qui sont ensuite scellées sous vide Ces ampoules sont fixées sur un agitateur soit alternatif, soit rotatif et l'ensemble est placé dans la chambre d'irradiation d'une bombe au cobalt 60 L'irradiation qui provoque la réaction de polymérisation est réalisée à raison de 0,01 à 0,5 mégarad par heure et par cm de milieu réactionnel pour une durée qui n'est jamais inférieure à 15 minutes et peut atteindre jusqu'à 10 heures. N Ds études ont également montré qu'à dose d'irra- diation constante la taille des billes est plus grande si le flux est plus faible et la durée d'irradiation corrélativement plus élevée. Après irradiation, les ampoulessont ouvertes et le milieu réactionnel dilué dans un égal volume d'une solution aqueuse réductrice (et notamment une solution à 1 g/1 d'hydroquinone) afin, d'une part, d'arrêter les réactions de polymérisation et, d'autre part, de prévenir l'oxydation des fonctions aldéhyde présentes sur les microsph-res Les préparations obtenues sont alors parfaitement stables et conservées à 4 C dans ces conditions jusqu'à l'emploi ultérieur Les microsphères obtenues peuvent être examinées et con- tr Mées par microscopie électronique, ce qui permet à la fois de déterminer la taille moyenne et la dispersion des tailles autour de cette moyenne Dans les conditions employées l'écart-type des tailles Pour une préparation donnée est toujours inférieur à un dixième de la moyenne. Pour pouvoir être utilisées en vue du dosage de l'antigène H Bs, les microsphères obtenues doivent encore être préalablement couplées chimiquement aux anticorps dirigés contre l'antigène HB et qui provoqueront la réaction d'agglutination spécifique qui est la base de la formation du signal néphélémétrique. Les anticorps utilisables selon l'invention peuvent être: soit polyclanaux-et isolés par les techniques connues à partir d'immun-sérums spécifiques obtenus chez l'anim al après immunisation par l'antigène H Bg purifié, s soit monoclonaux et purifiés par les méthodes connues après production à partir de cellules hybrides (hybridomes) résultant de la fusion de plasmocytes d'animaux immunisés contre l'antigène HB et de cellules de myélome possédant les s caractéristiques convenables. Les anticorps utilisables peuvent aussi résulter de mélanges de plusieurs immunoglobulines spécifiques de l'antigène HB afin de ne laisser aucun variant rare de l'antigène échapper s au dosage. Afin de coupler les anticorps anti-H Bs aux micro- sphères choisies, la suspension de microsphères est préalablement dialysée pour éliminer les excès de réactifs puis ajustée à une concentration connue et comprise entre 1 et 50 mg de particules par ml (concentration déterminée par poids sec) dans un milieu tamponné isotonique et additionnée d'une solution de l'anticorps dans le même solvant Le couplage s'effectue spontanément en quelques heures à température ambiante par réaction des fonctions aminées de la protéine avec les groupes aldéhyde portés par les microsphères pour former des liaisons mines. Après que la réaction a attgint le degré d'avan- cement requis (entre 1 et 30 heures), les groupements aldéhyde en excès sont bloqués par réaction avec un excès d'une amine primaire et de préférence d'une amine primaire hydroxylée telle que l'étha- nolamine dont les groupements hydroxyle contribuent aussi à l'hy- drophilie des particules ainsi revêtues Cette étape est réalisée par incubation à température ambiante pendant à nouveau 1 à heures. Alternativement, l'étape de -blocage des groupes aldéhyde en excès peut être remplacée par une étape de réduction à l'aide d'un hydrure métallique et notamment le borohydrure de sodium Ce traitement entraîne à la fois la réduction des fonctions imine-en fonctions amine secondaire, ce qui stabilise la fixation de l'anticorps sur les microsphères et en même temps réduit les groupes aldéhyde en aldool, ce qui, comme précédemment, favorise l'hydrophilie des particules. La.suspension des microsphères ainsi obtenues est ensuite purifiée par centrifugation en présence d'un gradient de densité convenable (par exemple un gradient de saccharose de 10 à 60 %) La couche contenant les particules est récupérée et finalement dialysée contre un tampon isotonique Une telle préparation d'immunosphères (microsphères portant un anticorps spécifique) peut être utilisée directement pour le dosage néphélémétrique de l'antigène HB dans tout liquide biologique humain-et notamment le srum ou le plasma, liquide biologique humain -et notamment le sérum àu le plasma, 25.31718 1 O éventuellement convenablement dilué La procédure est celle classi- que ment employée o, après qu' a eu lieu la réaction antigène' anticorps, on compare le signal néphélémétrique donné par la cuvette contenant l'échantillon inconnu à une courbe d'étalonnage réalisée en mesurant les signaux obtenus en présence de quantités connues de l'antig Zne étalon. routes les possibilités techniques présentées par les néphélémètres à laser modernes telles que soustraction auto- matique de blanc, possibilités d'effectuer les mesures en cinétique ou en point final, automatisation, miniaturisation, calculateurs incorporés, traitement électronique du signal, etc peuvent natu- rellement être exploitées afin d'obtenir des résultats de la meil- leure qualité possible dans l'application particulière qui fait l'objet de cette invention ' En outre, et compte tenu de ce que les appareils de différentes marques ne présentent pas des caractéris- tiques et possiblités identiques, il est possible de tirer parti de la très grande souplesse qu'offre le procédé objet de la présente invention pour optimiser la préparation des réactifs et les adapter à chaque type d'appareillage afin d'assurer les performances maximales. Les exemples suivants permettent de mieux comprendre l'invention sans en limiter la portée. Exemple 1 Préparation de microsphères de diamètres moyens 50 ou 110 ou 190 nanoziètres: Tous les réactifs utilisés sont d'origine commer- ciale et soigneusement redistillés juste avant l'emploi La pro- cédure générale employée est la suivante: des ampoules à sceller en verre borosilicaté de dia:n tre 35 mn et de capacité totale 150 ml sont préparées et l'on introduit dans chacune d'elles les quantités voulues de chacun des monomères, de l'agent réticulant, de l'agent tensioactif et d'eau préalablement dégazée sous vide pour obtenir dans dans tous les cas 100 ml de milieux ayant les compositions respectives données dans le tableau 1 Après barbotage d'un courant d'azote, les milieux réactionnels sont congelés par immersion dans l'azote liquide et les ampoules sont aussitôt scellées sous vide La poly- mérisation est provoquée par irradiation par les rayons y d'une bombe à 6 Co Les flux de radiations et les temps d'irradiation sont aussi donnés dans le tableau 1 Pendant toute l'irradiation, les ampoules sont fixées sur un agitateur à plateau tournant à tours/minute et disposées de facon à assurer la plus grande homogénéité d'irradiation Des dosimètres disposés dans la chambre d'irradiation permettent de contrôler les doses de radiation. Après polymérisation, les ampoules sont ouvertes et leur contenu versé dans un égal volume d'une solution aqueuse à 1 g/l d'hy- droquinone Les préparations sont simplement conservées dans ces conditions en récipient bien bouché et à 4 C jusqu'à utilisation. Le diamètre des microsphères est déterminé sur des préparations examinées au microscope éeectronique. TABLEAU 1 Taille des microsphères (nm) 50 110 190 Composition des milieux réac- tionnels (% en poids du total des monomères) - Acroléine 45,1 47,0 47,0 Méthacylate d'hydroxyéthyle 51,3 49,7 50,7 Acide méthacrylique 2,3 2,0 1,0 N-N 1-méthylène bis acrylamide 1,3 1,3 1,3 Total des monomères (% du volume total du milieu) 7,4 8,0 12,0 Dodécylsulfate de sodium 0,60 0,60 0,90 0,60 0,60 0,90 (g/1 de milieu final) Flux de radiation 0,3 0,3 1,1 (krad ml-l min) Temps dkrradiation (heure) 1,5 1,5 1,5 Exemple 2 Couplage des anticorps monoclonaux anti-H Bs sur les microspnères de diamètre 50 nm: a) Anticorps monoclonaux: La préparation d'anticorps monoclonaux utilisée dans cette expérience est constituée par le mélange des immuno- globulines de souris monoclonales anti-H Bs (de classe G et de sous- s classes 1, 2 a et 2 b), purifiées sur colone de protéine A de Staphy- locoque immobilisée sur Sépharose à partir des liquides d'ascite de souris chez qui avaient été respectivement implantés (dans le péri- toine) cinq hybridomes différents producteurs d'anticorps mono- clonaux spécifiques de l'antigène Bs ao b) Couplage: La suspension de microsphères de diamètre 50 nm préparée comme indiqué dans l'exemple 1 est tout d'abord amenée à isotonicité par addition de chlorure de sodium à concentration finale 14 Cm M puis dialysée exhaustivement contre un tampon iso% tonique (PBS) constitué par du tampon phosphate 10 m M contenant du chlorure de sodium 140 m M et ajusté à p H 7,2 Ce tampon est soigneusement dégazé avant utilisation Une aliquote de la suspen- sion obtenue est encore dialysée contre de l'eau pure afin de déterminer par poids sec la concentration de la suspension en microsphères. Pour le couplage, une aliquote de suspension de microsphères dans le tampon PBS, contenant 11 mg de particules, est ajoutée à une aliquote de solution d'anticorps anti-HB contenant 10-8 moles d'immunoglobulines dans le même tampon et le volume total est porté à 1 ml par le tampon PBS Après 18 heures à température ambiante sous agitation très douce, on ajoute 200 mi- crolitres d'une solution 0,2 M d'éthanolamine ajustée à p H 7,2 à l'aide d'acide chlorhydrique et l'on maintient encore 2 heures dans les mêmes conditions. Le milieu réactionnel est déposé dans un tube à centrifuger contenant un gradient de saccharose de 10 à 60 % (poids par volume) préformé et le tube est centrifugé 2 heures à 4 C et à 000 tours/minute La couche contenant les microsphères est Z$ 31718 prélevée et celles-ci sont dialysées contre 3 fois 1 litre de tampon PBS. Exemple 3 Utilisation des immunosphères anti-H Bs pour le dosage néphélé- s métrique de l'antigène IBE- a) Appareillage utilisé: Pour les expériences décrites, l'appareillage utilisé est le néphélémètre laser PDQ HYLAND équipé d'un laser He/Ne de 0,5 el à 632,8 nm etmesurant l'intensité lumineuse à un angle de lecture de 31,8 par rapport à l'axe du faisceau incident. Les cuvettes permettent de Travailler sur un volume total de 1 ml. b) Conditions générales des essais: Dans tous les cas, le volume total de milieu dans la cuvette est de I ml Les immunosphères obtenues comme indiqué à l'exemple 2 sont introduites par 100 microlitres d'une dilution convenable de la suspension-mère qui sont additionnés en dernier au mélange préparé dans la cuvette et contenant l'échantillon à examiner dilué convenablement dans du tampon PBS contenant'l 1 g/l de sérum albumine bovine et 1 g/l de Tween 80 et amené à un volume total de 900 microlitres par le même diluant La réaction d'agglutination spécifique génératrice du signal néphélémétrique débute lors de l'addition des immunosphères et peut être suivie -dans le temps (lecture cinétique) ou mesurée à temps fixe Sauf indication contraire, la mesure est effectuée au temps 1 lheure après mise en contact des immunosphères spécifiques avec l'antigène dans la cuvette L'expérience a montré qu'après ce délai l'es- sentiel du signal néphélémétrique spécifique est obtenu et que la prolongation du délai jusqu'à 8 ou 16 heures n'apporte pas d'avan- tage pratique notable Tous les résultats présentés ci-après sont donnés après soustraction des blancs correspondant à chaque essai -et représentent donc le signal spécifique de la réaction évaluéeo c) Echantillons utilisés: -un sérum humain de référence titré à 31 micro- grammes d'antigène H Bs par millilitre, - s un sérum humain positif d'origine hospitalière titrant environ 5 microgrammes par ml. d) Etudes réalisées: 1 l Stabilité des suspensions d'imnunosphères: Les signaux correspondant à quatre suspensions différentes d'immunosphères anti-HB seules (sans'antigène) de s concentrations comprises entre 3,5 et 28 pg/ml ont été mesurés répétitivement pendant une période de 96 heures sans agitation du contenu des cuvettes Ces signaux se révèlent d'une excellente stabilité puisque les valeurs extrêmes observées ne s'écartent jamais de plus de 2 % de la valeur moyenne pour la suspension la plus concentrée et de plus de 7 % pour la suspension la plus diluée Ce résultat démontre l'extrême stabilité des suspensions d'immunosphères dans lesconditions pratiques de leur utilisation, y compris pour des délais incomparablement plus longs que ceux qui sont nécessaires aux applications analytiques. 2 Q Etalonnage du dosage: 2-1 Lorsque la concentration des immunosphères est fixée à 7 microgrammes par millilitre, une gamme d'étalonnage effectuée à partir de dilutions du sérum étalon montre que le signal néphélémétrique spécifique permet d'explorer valablement un domaine de concentrations en antigène I Bs extrêmement vaste puisqu'il s'étend depuis environ 0,15 ng/ml jusqu'à près de 80 ng/ml Cette courbe d'étalonnage est représentée sur la figure 1 sur laquelle on a porté en ordonnée l'intensité lumineuse diffusée (en unités arbitraires) et en abscisse la concentration antigène HB en s nanograimes par millilitre. Cette caractéristique présente-un grand intérêt pratique dans la mtesure o elle évite à l'utilisateur de devoir préparer un grand nombre de dilutions d'un échantillon inconnu pour obtenir une mesure comprise dans la partie exploitable de la gamme d'étalonnage. 2-2 Lorsque la concentration des immunosphères est abaissée jusqu'à 1,4 microgramme par millilitre, une courbe d'éta- lonnage analogue montre que la sensibilité limite peut aisément être abaissée jusqu'à une-concentration d'antigène de l'ordre ou même inférieure à 0,1 ng/ml Cette courbe d'étaionnage est repré- sentée sur la figure 2 sur laquelle on a porté en ordonnée l'inten- f sité lumineuse diffusée (en unités arbitraires) et en abscisse la concentration antigène HB en nanogramme par millilitre Ce résultat s est extrêmement important puisqu'il démontre que la méthode mise au point permet d'atteindre des sensibilités limites au moins aussi élevées que celles des meilleurs dosages radid-immunologiques actuellement disponibles sans présenter aucun des inconvénients liés à la manipulation de substances radioactives. 3 Contrôles de spécificité: Si,dans des conditions identiques à celles du paragraphe 2-1, on incube les solutions d'antigène pendant 24 heures avec de l'anticorps libre (ncn couplé aux immunosphëres) à la concentration finale de 70 microgrammes/millilitre, aucun signal distingable du blanc de réactifs napparaîto Ceci démontre qu'en l'absence de son couplage aux mmunosphères l'anticorps spécifique, rmïe à concentration élevée, est incapable de provoquer l'apparition d'un signal néphélémetrique spécifique. Si, dans les mêmes cuvettes, on ajoute alors les imwunosphères spécifiques, onn'observe à nouveau aucune apparition d'un signal spécifique Ceci démontre que l'antigène présent a bien été neutralisé par l'excès d'anticorps libre dans la première étape et n'est donc plus disponible pour provoquer l'agglutination spécir fique des immunosphères dans la deuxième étapeo Ce résultat démontre la spécificité de reconnaissance de l'antigène H Bs par les immuno, s sphères utilisées. 40 Dosage d'un sérum inconnu 4-1 Afin de permettre une évaluation réaliste de la capacité des réactifs objets de la présente invention à assurer une grande souplesse d'utilisation dans le dosage de l'antigène H Bs dans des sérums de titre inconnu, un sérum humain de provenance hospitalière a été employé Une série de 14 dilutions de ce sérm en progression géométrique de raison 2 a été réalisée et des aliquotes de toutes ces dilutions ont été soumises à la réaction avec les irmmunosphëres dans les conditions décrites au paragraphe 2-1 o Les courbes de la figure 3 montrent que le signal néphélémétrique spé- cifique de toutes ces dilutions est aisément mesurable à condition de choisir la gamme de sensibilité convenable de l'appareil et Q jusqu'à des dilutions extrêmement grandes de sérum de départ, puisque le signal est encore significatif pour une dilution au 1/100 000 Cette observation démontre qu'en pratique avec un maximum de 5 dilutions on peut en une seule étape, dont la durée ne dépasse pas une heure, obtenir le dosage d'un sérum inconnu quel que soit son titre entre 1 ng/ml et 10 pg/ml. Sur cette figure n 3,on a porté, en ordonnée, l'intensité lumineuse en unites arbitraires et, en abscisse, la dilution du sérum Les mesures ont été effectuées avec des immuno- sphères de 7 mg/ml et avec trois sensibilités différentes de l'ap- pareil. 4-2 Dans le cas précis du sérum utilisé, la comparaison des signaux obtenus pour les dilutions les mieux situées dans la gammie de mesure avec la courbe d'étalonnage de la figure 1 conduit à une valeur moyenne du titre du sérum de 5,9 mg d'anti- gène H Bs par ml, les valeurs extrgmes notées sur 6 mesures en simple exemplaire à des dilutions différentes étant 5,3 et 6,4. Cette précision est excellente pour des dosages de ce type. Répétabilité des résultats: Dans des conditions analogues à celles indiquées ci-dessus, lorsque, pour deux dilutions différentes de sérum, et sur les gammes de sensibilité correspondantes, on mesure les signaux donnés par 10 cuvettes indépendantes mais de composition identique, l'analyse statistique des valeurs obtenues conduit aux résultats suivants: lère dilution 2 e dilution ( 1/40) ( 1/5120) Nombre de mesures 10 10 Signal moyen 52,2 69,5 (unités arbitraires) Ecarttype 2,72 4,36 Coefficient de 5,2 6,3 variation (%) 17. Ces résultats confirment l'excellente répé- tabilité de l'ensemble du dosage, y compris en particulier la réaction'd'agglutination des immunosphèresspécifiques par l'anti- gène à doser. - Ces différents essais mettent en évidence les caractéristiques-et avantages de la méthode de dosage de l'anti- gène HB à l'aide des réactifs et procédés objets de la présente s invention Ils démontrent en particulier: la très grande sensibilité du dosage qui atteint des seuils de détection au moins aussi bas que ceux des meilleures méthodes actuellement disponibles pour ce même dosage (de l'ordre de 0,1 ng d'antigène par ml); la haute spécificité assurée par le choix d'anticorps monoclonaux stictement spécifiques de l'antigène à doser; la facilité de mise en oeuvre de l'ensemble du dosage dont les opérations se limitent à quelques pipettages en microméthode, qui peuvent indifféremment être réalisés soit manuellement, soit d'une façon entièrement automatisée; la très bonne conservation des réactifs qui restent valables pendant des mois (et problablement des années) à 4 C; le faible prix de revient de chaque dosage qui n' exige pas de personnel de haute qualification et qui ne consomme que des quantités extrêmement faibles de réactifs (de * quelques microgrammes à quelques dizaines de microgrammes d'immuno- spheres par essai, selon les appareils utilisés); la possibilité d'adapter la technique à tous les néphélémètres à laser commerciaux qui sont communément répandus dans les laboratoires, sans perte importante de performances globales; le court délai de réponse de l'ensemble de la manipulation analytique puisque l'étape la plus longue est celle requise par la réaction entre antigène et anticorps et que celle-ci peut ne pas dépasser une heure; la versatilité de la méthode: en effet, les Z 531718 exemples décrits concernent seulement le dzsage direct de l'anti- gene par agglutination des imiunosphères portant l'anticorps spécifique Selon un principe tout è fait analogue, on peut aussi bien coupler sur les microspères l'antigène purifié Si l'on introduit alors dans les cuvettes de mesure des microsphères à antigène en quantité constante et de l'anticorps spécifique, également en quantité constante, pour assurer l'agglutination spécifique génératrice du signal néphélémétrique, on dispose d'un système dans lequel toute introduction d'antigène libre sous la forme d'une aliquote convenablement diluée d'un sérum à doser (ou d'un sérum étalon) provoquera une inhibition mesurable du signal de base, d'o la possibilité de réaliser un dosage quanti- tatif par inhibition Les coffrets de réactifs qui seront mis sur le marché en application de la présente invention comprendront notaumient: a) pour la mesure directe de l'antigène: Le réactif spécifique sous la forme d'immuno- sphères porteuses de l'anticorps spécifique anti-IH Bs qu'il soit polyclonal ou constitué d'une ou plusieurs immunoglobulines mono- clonales entières ou sous forme de fragments ayant conservé la capacité de reconnaissance de l'antigène Ce réactif sera présenté soit en solution à diluer ou non pour l'emploi, soit lyophilisé à reconstituer pour l'emploi dans un solvant indiqué à l'utilisa- teur ou livré dans le coffret, toutes ces préparations pouvant contenir en outre des additifs tels que coservateurs et stabili- sants - b) pour la mesure de l'antigène par inhibition: Deux réactifs spécifiques qui sont: des mierosphères porteuses de l'antigène spécifique, présentées dans des conditions analogues a celles décrites pour les immunosphères spécifiques du cas a) ci-dessus, un agent capable de provoquer l'aggluti:- nation tel que toute préparation convenable contenant un antisérum total anti-HB, ou des immunoglobulines spécifiques polyclonales ou monoclonales anti-H Bs, purifiées ou non, entières ou-à l'état de fragments comportant la capacité de reconnaissance de l'antigène 31718 spécifique et d'agglutination des microsphères portant l'antigène spécifique Cet agent sera présenté soit en solution tamponnée ou non, à diluer avant emploi ou non, soit sous forme de lyophilisats à reconstituer dans un solvant indiqué à l'utilisateur ou livré dans le coffret, cette préparation pouvant contenir en outre des additifs tels que conservateurs et stabilisants. En outre, quel que soit le mode de dosage adopté, le coffret pourra comprendre des réactifs communs qui seront notamment un diluant unep repjaratîonétalon d'antigène HB 1 des préparations de contrôle telles que par exemple des sérums de contrôle de concentration basse, moyenne et haute par rapport à l'étendue de la gamme normale de dosage un sérum de contrôle négatif, garanti exempt d'antigène HB s Ces réactifs communs seront présentés soit en solution tamponnée ou non, à diluer avant l'emploi ou non, soit sous forme de lyophisats à reconstituer dans un solvant indiqué à l'utilisateur ou livré dans le coffret Ces préparations pourront en outre contenir des additifs tels'que conservateurs, stabilisants, agents tensio-actifs, agents de'dispersion, tous ces additifs pouvant être macromoléculaires (et en particulier protéiques) ou non. Revendications 1 Microparticules sphériques hydrophiles, polyfonction- nelles de taille uniforme, de diamètres moyens entre environ nanomètres et environ 10 micromètres, caractérisées en ce qu'elles comportent de 5 à 95 % et de préférence de 40 à 60 % en poids de motifs provenant de la copolymérisation d'un aldéhyde acrylique de formule CH = CR dans Cl laquelle R 1 est un radical alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone de 5 à 90 % et de préférence de 40 à 70 % en poids de motifs provenant de la copolymrisation d'un R R 2 dérivé acrylique de formule CH 2 = C dans COOR laquelle R est choisi parmi l'hydrogène et les groupes alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone et R 3 est un radical alkyle inférieur hydroxylé de O à 15 % en poids d'au moins un dérivé acrylique R 2 choisi parmi les dérivés de formule CH 2 = 2 CX COON R 2 -et CH 2 ( t R 5 dans l Iaquelle R 4, R 5, R 6 COOR N R. sont des groupes alkyle inférieurs ( 1 à 4 atomes de carbone) identiques ou différents et de 0,1 à 10 %', et de préférence de 0,5 à 5 % en poids de motifs provenant d'un agent réticulant qui est un diène non conjugué, puis en particulier le N-N'-méthylène bis acrylamide. 2 Procédé pour la préparation des microparticules selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'onh réalise la copo- lymérisation, en milieu aqueux, de monomères en proportions relativessuivantes de 5 à 95 %é et de préférence de 40 à 60 % en poids d'un / 1 aldéhyde acrylique de formule CH 2 = C 2 CHO dans laquelle R est un radical alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone de 5 à 90 % et de préférence de 40 à 70 % en poids d'un R / 2 dérivé acrylique de formule CH 2 = C 2 \ dans COOR 3 laquelle R est choisi parmi l'hydrogène et les groupes alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone et R 3 est un radical alkyle inférieur hydroxylé de O à 15 % en poids d'au moins un dérivé acrylique R 2 /2 choisi parmi les dérivés de formule CH 2 = C COOH 3. ledit agent /R 2 - et CH 2 = C O R 5 COOR N dans laquelle R 4, R 5, R 6 R 6 sont des groupes alkyle iuférieurs ( 1 à 4 atomes de carbone) identiques ou différents et de 0,1 à 10 % et de préférence de 0,5 à 5 % en un agent r 9 tieulant qui est un diène non conjugué en particulier le N-N'- méthylène bis acrylamide, ladite copolymérisation étant réalisée en présence d'un agent tensio actif soluble dans l'eau. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que tensioactifest de nature ionique ou non ionique et qu'il est utilisé à raison de 0,01 à 5 c% en poids par rapport au volume du milieu de polyn risation. 4 Procédé selon l'une des revendications 2 et 3 caractérisé en ce que la concentration totale des mon Dmères dans le milieu aqueux de polymérisation est c Zipris entre 4 et 16 i en poids par rapport au volume du milieu de polym érisation. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4 carac- térisé en ce que la copolymérisation est réalisée sous l'influence d'un rayonnement de haute énergie (tel que le rayonnement y du cobalt) utilisé à une dose de 0,01 à 0,5 mngarad par heure et par cm du mélange et pendant une durée d'au moins 15 minutes, la solution de copolymérisation étant agitée. 6 Utilisation des mricroparticules selon la revendi- cation 1 pour le dosage de l'antigène H Bs caractérisée en ce que s lesdites microparticules, convenablement purifiées, sont mises en contact dans un milieu liquide avec un anticorps choisi parmi les anticorps polyclonaux et isolés par les tech- niques connues à partir d'immun-sérums spécifiques obtenus chez l'animal après immunisation par l'anti- gène HB purifié, s et les anticorps monoclonaux et purifiés par les iéthodes connues après productions à partir de cellules hydrides (hybridomes) résultant de la fusion de plasmocytes d'animaux immunisés contre l'antigène HB et de cellules de nyélomne possédant s les caractéristiques convenables. 7 Utilisation des microparticules selon la revendi- cation 6 caractérisée en ce qu'après mise en contact desdites parti- cules avec ledit anticorps le produit obtenu est traité avec une amine primaire en excès de façon à bloquer les fonctions aldéhydes libres. 8 Utilisation des microparticules selon la revendi- cation -6 caractérisée en ce qu'après mise en contact desdites par- ticules avec ledit anticorps le produits obtenu est réduit par traitemer nt à l'aide d'un hydrure métallique. 9 Utilisationi des microparticules traitées selon l'une des revendications 6,7 et 8 pour le dosage néphélémétrique de l'antigne lib dans un liquide biologique. s