FR 2531436 A1 19840210 FR 8213804 A 19820806 "Pentasaccharides substitués possédant des propriétés biologiquest leur préparation etleurs applications en tant que médicaments" L'invention est relative à de nouveaux pentasaccharides possédant dcs propriétés biologiques leur permettant, notamment de ne contrôler que certaines étapes de la coagulation sanguine Elle a également pour objet un procédé de synthèse de dérivés à structure pentasaccharidique. L'invention concerne en outre, l'application des pentasaccharides biologiquement actifs en question en tant que principes actifs de médicaments Les recherches des inventeurs, qui ont amené à la mise au point de l'invention, portent sur l'obtention, par voie de synthèse,d'oligosaccharides comportant des motiffs constitutifs de channes hépariniques et présentant une activité anti-Xa (Yin-Wessler) plus élevée que celle de l'h@parine avec une activité anticoagulante globale (mesurée selon le test USP ou APTT) plus faible que celle de l'héparine. On rappelle que la détermination de l'activité anti-Xa selon le test de Yin-Wessler est rapportée nar ces auteurs dans J,La Cbim.Med. 1976, 81,298-300. Le test USP est décrit dans "Pharmacopea O í7 the United States of America", pages 229-230 (voir également le deuxieme supplément USP-NFF,p.62 et le quatrième supplement USP~NF, p.90,respectivement intitulés "Drug substances" et "Dosage forms"). Le titre APTT est mcsuré selon la méthode de J. Caen et al, dans l'hémo@tase,Expansion scientifique française, Paris, 1968, pages 1@3-135. Les travaux effectués par les inventeurs ont montre qu'en réalisant la condensation de motifs saccharidiques substitués selon une stratégie donnée, il était possible d'obtonir des pentasaccharides d'un Intérêt tout particulier au regard de leurs propriétés anticoagulantes spécifiques. L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux pentasaccharides dont la structure de base comporte des motifs constitutifs des chaines d'héparine. Elle vise également un procédé d'obtention de composés à structure pentasaccharidique substituée par voie de synthèse, ce qui permet donc, selon un avantage essentiel de l'invention, d'élaborer de tels composés à l'échelle industrielle et avec un degre d pureté très élevé. L'invention vise; en outre, à fournir des principes actifs @t les médicaments eux-mêmes, capables d'inhiber certains facteurs del coagulation et tout particulièrement le acteur Xa,quand ils sont présents dans le sang,avec un degré de sélectivité élevé vis-à-vis d'autres facteurs dont e facteur Il ce qui est lié à une très faible activité sur la coagulation globale. Les pentasaccharides de l'invention répondent à la formule (I) dans laquelle - les groupes R,identiques ou différents les uns des autres, représentent un atome d'hydrogène ou un '--radical, physiologiquement accep@able, type -R1R2, dans lequel R1 représente avantageusement un anion minéral, en particulier un groupe SO3 et R2 représente un cation métallique, notamment un metal alcalin tel que le sodium ou alcaiino-terreux, tel que le calcium ou le magnésium, ou un cation organique tel qu'un dérivé ae base organique azotée, et - les substituants A, identiques ou différents les uns des autres, représentent un atome d'hydrogène, ou encore un cation métallique ou un cation organique sels que définsi cidessus. Dans des pentasaccharides préférés cours les groupes R sont identiques entre eux. Dans d'autres pentasaccharides, tous les groupes A sont, en outre, idontiques entre eux. Un pentasaccharide de ce type, particulièrement préféré comporte comme substituants de type R, un groupe -S03Na et comme substituants A un groupe Na. Ce pentasaccharide répond ainsi à la formule III) suivante Les pentasaccharides de l'invention sont, en outre, caractérisés par des titres Yin-Wessler largement supérieurs à ceux de l'héparine. Plus spécialement, le pentasaccharide de formule Il est doté d'une activité anti-Xa (Yin-Wessler) égaie ou supérieure à 2000 u/mg,atteignant 2500 u/mg. Dans un test utilisant un substrat chromogène, cette activité a meme été de 4000 unités anti Xa/mg (méthode de TEIEN A.M. et LIE modifiée ; Thromboses Research No 10,1977, 388-410.) Ce test consiste à utiliser le facteur Xa commercialisé par la Société SIGMA en solution à 8 u/ml dans du sérum physiologique, la concentration du substrat étant de 1,33 mM. Pour effectuer ce test, on peut procéder de la façon suivante. On mélange 10 pl de solution à doser et 300 1 de plasma humain dilué avec du tampon Tris maléate 0,02 M, pH 5. On laisse incuber une minute à 37 OC. On ajoute 100 1 du susdit facteur Xa (8 u/ml) et une minute après on injecte la solution obtenue dans le substrat. L'activité anticoagulante qlobale de ces produits est très faible, 4 u/mg dans le test APTT. Ces propriétés leur permettent de cont ler, de manière spécifique, certaines étapes de la coagulation sanguine. L'étude de ces produits montre qu'iis scnt capables d'exercer une activité antithrombotique puis sante et que les risques dthémorragie sont avantageu sement pratiquement éliminés en raison de leur faible activité anticoagulante globale. Les pentasaccharides de l'invention sont, en outre avantageusement dépourvus de toxic té. Ces produits sont donc particulièrement précieux pour l'élaboration de médicaments utilisables, notamment, pour le traitement des thromboses. L'invention est donc relative à des préparations pharmaceutiques qui renferment lesdits pentasaccharides a activité anti-Xa élevée. Elle est plus particulièrement relative à des préparations pharmaceutiques dépourvues desllbstances pyrogènes, contenant une quantité efficace deprincipes actifs en association avec des excipients pharmaceutiques. Elle concerne également les compositions dans lesquelles le véhicule pharmaceutique est approprié pour l'administration par voie orale. Des formes d'administration de l'invention appropriées pour l'administration par voie orale peuvent être avantageusement des gélules gastrorésistantec, des comprimés ou tablettes, des pilules, ou encore présentées sous forme de liposomes. D'autres compositions pharmaceutiques comprennent ces pentasaccharides en association avec les excipients appropriés pour l'administration par voie rectale. Des formes d'administration correspondantes sont constituées par des suppositoires. D'autres formes d'administration de l'invention sont constituées par des aérosols ou despommades. L'invention concerne également dns compositions pharmaceutiques injectables, stériles ou stérilisables. pour administration tant par voie intraveineuse, qu'intra- musculaire ou sous cutanée. Ces solutions renferment avantageusement 1000 à 100 000 u (Yin-Wessler)/ml de pentasaccharides, de préférence de 5000 à 50 000, par exemple de 25 000 u/l, lorsque ces solutions sont destinées à l'injection par voie sous-cutanée. Elles peuvent contenir, par exemple, de 500 à 10 000, notamment 5000 u/ml de pentasaccharides lnrsu'clles sont destinées à l'injection par voie intraveineuse ou par perfusion Avantageusement, de telles preparations pharmaceu- tiques sont présentées sous la forme de seringues non récupérables, prestes à l'emploi. L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques contenant lesdits pentasaccharides en association avec un autre principe actif, utilisable en particulier pour la prophylaxie et le traitement de thrombose, tel qu'un agent veinotonique comme la dihydroergotamine, un sel d'acide nicotinique ou un agent thrombolytique comme l'urokinase. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont particulièrement adaptées pour le contrôle (préventif ou curatif) de certaines étapes de la coagulation du sana chez l'homme ou l'animal), notamment dans le cas où le patient est soumis à des risques d'hypercoagulabi- lité résultant notamment d'opérations chirurgicales, de processus atheromateux, de développement de tumeurs t a troubles de la coagulation par des activateurs bactériens ou enzymatiques etc.. Afin d'illustrer l'invention. on indique, ci-après, un exemple de posologie utilisable chez l'homme cette posologie comprend, par exemple, l'administration au patient de 1000 à 25 000 u (Yin et Wecsler) par voie sous-cutanée, une à trois fois par jour, selon le niveau des risques d'hypercoagulabilité ou la condition thrombotique du patient, ou de 1000 à 25000 u/2^ heures, par voie intraveineuse, en administrations discontinues à intervalles réguliers, ou continues par perfusion, ou encore de 1000 à25 000 u (trois fois par semaine) par voie intramusculaire ou sous-cutanée (ces titres sont exprimés en unités Yin-Wessler).Ces doses peuvent etre naturellement ajustées pour chaque patient en fonction des résultats et des analyses de sang effectuées auparavant, la nature des affections dont il souffre et, d'une manière générale, son état de santé. L'invention se rapporte également à l'application des pentasaccharides de l'invention, à la constitution de réactifs biologiques, utilisables en laboratoires, notamment comme élpments de comparaison pour l'étude d'autres substances dont on souhaite tester l'activité anticoagulante, notamment au niveau de l'inhibition du facteur Xa et du dosage de l'antithrombine III. Elle vise également l'application de ces pentasaccharides en médecine nucléaire, en tant que produits radiopharmaceutiques. Ces produits sont alors marqués par des traceurs choisis parmi ceux couramment utilisés dans ce domaine, et notamment à l'aide de technétium 99 m. A cet effet, on transforme le technétium 99 m obtenu à partir de générateurs du commerce, sous forme de pertechnétate desodium de valence 7 non réactif, en technétium réduit de valence 4 qui serait la forme la plus réactive du technétium. Cette transformation est effectuée grâce à un système réducteur réalisé à partir de sels d'étain (chlorure stanneux), de sels de fer (sulfate ferreux), de sels de titane (tri chlorure de titane) ou autres sels. La plupart du temps, cette simple rédu@tion du terhnétium suffit, dans des conditions de pH données, à réaliser la fixation du technétium sur la molécule considérée. On peut utilise les produits de l'invention, qui constituent en quelque sorte un support, à des doses de l'ordre de 100 à 200 u Yin-Wessler. Pour l'élaboration de ces réactifs radiopharmaceu- tiques, on peut opérer confor@ément à la méthode de P.V. KULKARNI et al. dans The Journal of Nuclear Médecine 21, No 2,. p. 117-121. Les produits ainsi marqués sont avantageusement utilisés dans des tests in vivo pour la détection et le diagnostic d'extension des thromboses et des états thrombotiques. Les nouveaux pentasaccharides biologiquement actifs-de l'invention sont avantageusement obtenus par réaction d'un monosaccharide à structure D-glucosamine de formule (III) avec un tétrasaccharide formé d'un enchalnement de motifs respectivement de structure (acide glucuronique)-(D-glucosamine)- (acide-L-iduroniquej-(D-glucosamine) répondant à la formule (Iv) Dans ces formules -B1, B2 et A1 représentent des groupements de blocage des groupes -OH éliminables de manière à permettre d'introduire successivement les substituants désirés sur les motifs saccharidiques sans que les groupements de bloquage restant ne soient affectés, ou de libérer des groupes -OH donnes, - Z représente un groupement fonctionnel azoté, précurseur d'un groupement aminé, en particulier un groupe azido N3 ou un groupe benzyloxy carbonyl amino, - X représente un atome d'halogène, notamment, du brome ou du chlore. On remarquera que dans les produits de départ (III) et (IV) toutes les positions sont bloquées, excepté "les positions réactives" ctest-à-dire celles qui doivent etre impliquées dans la réaction de glyco sylation. Ces positions réactives, sur chacun des produits de départ, sont alors substituées par des radicaux capables de réagir en permettant l'établissement d'une liaison glycosidique, et qui sont compatibles avec les groupements de blocage Dans les produits choisis, ces radicaux sont respectivement constitués par un halogène et un alcool. Les groupements de blocage sont choisis parmi les groupements inertes vis-à-vis de la réaction de glycosylation. il s'agit des groupements Z qui permettent le maintien durant tout le processus de synthèse d'un groupement azoté qui pourra ensuite être transformé en un dérivé fonctionnel aminé et avantageusement en un sel d'amine. Les autres groupements de blocage assurent la protection des groupes -OH des différents motifs saccharidiques des produits de départ. Ces groupements sont choisis de manière à permettre d'introduire, de manière spécifique, des substituants donnés sur les motifs saccharidiques. On a alors avantageusement recours à des groupes de blocage différents, à savoir, B1, B2, A1, selon le substituant a introduire. Les groupes k , qui protègent des groupes OH destinés à être salifiés, en particulier sulfatés, sont avantageusement constitués par des groupes acyle, en particulier acétyle. Les groupes de blocage B2 qui doivent etre éliminés pour libérer les groupes -OH en fin deprocessus, sont choisis parmi des groupes inertes durant la réaction de sulfatation, et sont avantageusement constitués par des groupes benzyle. Les groupes A1 permettent le blocage des groupes carboxyle en position 6 tout au long des étapes mises en oeuvre pour l'introduction des divers substituants et sont éliminables pour permettre, en particulier, d'effectuer une réaction de salification des groupescarbo xyle. L'utilisation de radicaux alcoyle, en particulier, méthyle, s'avère à cet égard satisfaisante. La réaction de condensation mise en oeuvre dans l'invention est basée, comme indiqué ci-dessus, sur la réaction d'un halogénure et d'un alcool. Cette réaction est avantageusement réalisée en mi- lieu. solvant, en particulier dans un solvant organique du type du dichlorométhane, et en présence de cataly seurt tel que du triflate d'argent et également d'un accepteur de protons, tel que la sym-coliidine. Les conditions réactionnelles, en particulier concernant la température, la durée, la concentration en réactifs, sont choisies de manière à réaliser la liaison de glycosylation sans alterer la structure et les substituants des différents motifs et seront aisément etablies par l'homme de l'art pour l'obtention d'un type donné de produits. Le pentasaccharide forme à l'issue de cette condensation est ensuite traité de manière à éliminer par séquence les groupements de blocage prèsents et pour. introduire successivement les groupements fonctionnels désirs et libérer les fonctions -OH dans des positions. données. On procède avantageusement dans une première étape a l'élimination des groupes B1, à l'aide, par exemple, de soude dans le cas de groupes acétyle; ce qui libére les positions -OH.correspondantes qui seront ensuite, au cours d'une deuxième étape, soumises à un traitement aux fins de sulfatation de ces seules positions. Pour introduire un groupe sulfate, on-utilise avantageusement un agent de sulfatation tel qu'un complexe de triméthylamine/S03. L'introduction du cation R2 désiré peut être notamment réalisée à l'aide d'une résine échangeuse d'ions comprenant ce cation, ou encore, après passage sous forme acide, par neutralisation avec la base du cation. Après l'étape de sulfatation, on libère les'grou pes -OH de leurs substituants benzyl.iques et,en meme temps,on transforme le groupe Z en groupe anine par hydrogénetion,par exemple, sous courant d'hydrogène,en présence de catalyseur d'hydroge- nation,en opérant dans des conditions compatibles avec le maintien du groupe sulfate en position 6 des motifs D-glucosamine. Pour disposer de motifs glucosamine comportant en position 2 des groupes azotés fonctionnels, on soumet le pentasaccharide obtenu à l'issue de l'étape précédente à l'action d'un agent approprié. L'introduction de groupes sulfate est ainsi avantageusement réalisée avec l'agent de sulfatation triméthylamine/S03 indiqué ci-dessus. Il apparat approprié d'effectuer cette réaction à pH basique, d'environ 9 à 10. Pour obtenir le sel recherché, on utilise avantageusement une résine échangeuse d'ions contenant le cation que l'on souhaite introduire, ou encore, après passage sous forme acide, on neutralise avec la base du cation. Au cours.d'une étape supplémentaire, les groupements protecteurs des groupes carboxyliques sont éliminés en vue de la salification des fonctions acide, par exemple, à l'aide d'un hydroxyde métallique. Les pentasaccharides intermédiaires sont des produits nouveaux et en tant que tels entrent également dans le cadre de l'invention. Le tétrasaccharide de formule lV mis en-oeuvre dans la réaction de condensation évoquée ci-dessus est avantageusement obtenu à partir du produit correspondant, mais comportant en position réactive (à savoir sur le carbone en position 4 du motif à structure acide uronique) un groupe de blocage temporaire. On désigne par ce terme un groupe qui permet de protéger provisoirement un groupe - OH destiné à etre engagé durant le processus de synthèse dans une réaction de glycosylation et non un -groupe -OH destiné à être libéré ou fonctionnalisé. Ce groupe doit etre choisi parmi ceux compatibles avec les autres groupements présents ainsi qu'avec les conditions mises en oeuvre dans le processus. de synthèse. Un groupe approprié est, par exemple, du type monochloracétyle. Mais il est clair que d'autres groupements répondant aux exigences ci-dessus peuvent hêtre utilisés. Selon un mode préféré de réalisation du procédé de l'invention, le tétrasaccharide comportant le groupement de blocage temporaire ci-dessus est avantageusement obtenu par réaction d'une part d'un disaccharide de structure (acide glucuronique) - (D-gluco samine) répondant à la formule (V) avec un disaccharide de structure (D-glucosamine)-(acide L-iduronique) répondant à la formule (VI) Dans ces formules, les substituants Al, s1, B2, Z et X présentent les significations données ci-dessus et B3 un groupement de blocage temporaire tel que défini plus haut. La reaction de condensation entre ces deux disaccharides est avantageusement réalisée dans des conditions du type de celles utilisées pour la réaction du tétrasaccharide de formule (IV) avec le monosaccharide de formule (III). Le disaccharide de formule (V) est a son tour avantageusement obtenu à partir d'un monosaccharide à structure acide uronique de formule (VII) et d'un monosaccharide à structure D-glucosamine de formule (VIII) dans lesquelles A1, 1 B3, X et Z présentent les signifi cations données ci-dessus. De manière préférée, les deux substituants -O-B3 dans le dérivé de formule (VIII) forment un pont 1,6-anhydro. Le disaccharide résultant de la condensation des monosaccharides VIIet viiiest traité, selon les techniques habituelles, pour disposer d'une seule position réactive, à savoir sur le carbone anomère,et introduire donc un groupe X sur ce carbone. Le dérivé de formule (VIII)est avantageusement obtenu à partir du dérivé ,décrit dans la demande de brevet FR No 82 09392 du 28 mai 1982 au nom de la Demanderesse,qui est alors traité selonles techniques classiques de manière à introduire le groupe de blocage B3 et le groupe reactif X. Comme disaccharide de formule V -on utilise avantageusement un produit tel qu'obtenu selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR No 82 01575 du 1.02.1982, au nom de la Demanderesse. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans la description des exemples qui suivent et en se reportant aux figures 1 à 4 qui représentent l'exemple du schéma fractionnel correspondant aux synthèses décrites dans les exemples. Les références numériques utilisées dans ces figures pour les composés sont reprises dans les exemples pour désigner les mêmes composés. Les abréviations utilisées ont les significations suivantes - Ac représente un groupe acétyle, - B un groupe benzyle - Me un groupe méthyle - McAO un groupe monochloroacétyle, et - Y un groupe -COoB. EXEMPLE 1 Synthèse du disaccharide 3 ou(l-bromo-3,6-di-O-acétvl-2- azido-4-0/2,3-di-0-benzyl-4-0-chloroacétyl-ss-D-glucopyranosyl) uronate de méthyle/-D-glucopyranose, Cette synthèse comporte A) la préparation du monosaccharide 14 ou (1-bromo-2,3-di-0-benzyl-4-0-chloroacétyl-&alpha;-D-glucopy- ranosyl)uronate de méthyle; B)- la condensation du composé 14 avec le monosaccharide 15 conduisant au disaccharide 1; C) l'acétolyse du composé 1 conduisant au disaccharide 2; et D) la bromuration du disaccharide 2 pour donner le dérive 3 A) Préparation du monosaccharide 14 Cette synthèse est effectuée à partir du monosaccharide 16 ou (prop-l'-ényl 2,3-di-0-benzyl -a-D-glucopyranoside) uronate de méthyle, (dont la synthèse est rapportée dans le demande de brevet FR 8209392)par 1 : chloroacétylation du composé 16en position d 2 : déblocage du carbone anomère; 3 : bromuration du carbone anomère 1 ehloroacétylation du composé 16 conduisant au compo sé 17, à savoir le (prop-l'-ényl 2,3-di-0-benzyl-4 0-chloroacétyl-&alpha;-D-glucopyranoside)uronate de mé thyle On dissout 2,8 g du composé 16 dans 30 ml de pyridine (6,56 mmoles) . Après refroidissement à OOC, on ajoute goutte à goutte 10 mi d'une solution de 2 ml de chlorure de chloroacétyle dans 20 ml de aichlorométhane. Après 30 minutes, on évapore à sec, on reprend le résidu par 200 ml de chloroforme, on lave avec une solution à 10 % de KH S04, puis avec de l'eau, on sèche et on concentre. Le sirop obtenu est chromatographié sur gel de silice (200 g; éluant ;AcOEt /hexane; 1/3; v/v). On obtient ainsi 2,7 g de composé 17 pur sous forme de sirop (rendement 80 %); [&alpha;]@20= + 2 (c = 1,5; chioroforme). L'analyse élémentaire et le spectre de RMN confirment la structure attendue. 2) Déblo-cage du carbone anomère conduisant au composé 18 ou (2,3-di-0-benzyl-4-0-chloroacétyl-D-glucopyra nose)uronate de méthyle On dissout 2, 7 g (5,3 mmoles) du dérivé 17 dans 80 ml d'un mélange acétone/eau (5/1; v/vi. De l'oxyde mercurique (3,1 g) est ajouté suivi d'une solution de chlorure mercurique (3,9 g) dans l'acétone (27 ml). Après 5 minutes, les sels sont éliminés par filtration. Après concentration a sec, le résidu est repris par du chloroforme. La phase chloroformique est lavée avec une solution de KI a 10 % puis avec de l'eau.Après éva- poration, le produit est cristallisé dans un mélange acétate d1éthyle/hexane. On obtient 2 g d'un solide de pf 105-1070C; --20 = - 4,70 (eq, 1; chloroforme). L'analyse élémentaire et l'étude en RMN confirment la structure (rendement 80 %). 3) Bromuration du carbone anomère conduisant au compose 14 ou (1-bromo-2,3-di-0-benzyl-4-0-chloroacétyl-&alpha;-D- glucopyranosyl)uronate de méthyle On dissout 2 g (4,30 mmoles) du compos 18 dans 50 ml de dichlorométhane. On ajoute 4,8 ml (34,4 mmoles) de sym-collidine à 0 C suivie de bromure de bjo- mométhylène diméthyl ammonium (17 mmoles) préparé selon HEPBURN D.R. et HUDSON H.R.J. Chem Soc. Perkin I (1976) 754-757. Après 4 heures de réaction, le melange est dilué par 100 ml de dichlorométhane, puis versé dans de l'eau glacée. Après lavage avec de l'eau glacée; le solvant est évaporé. Après chromatographie sur gel de silice (20 g; éluant hexane/acétate d'éthyle, 2/l; v/v), on obtient 2,06 g de composé 14 sous forme d'un sirop (rendement 90 %) --20 = + 82,50 (c = 1,5; chloroforme).L'analyse élémentaire et l'étude en RMN confirment la structure. B) Préparation du disaccharide 1 ou (3,0-acetyl-1,6- anhydro-Z-aziåo-4-0-/(2,3-di-0-benzyl-4-0-chloroacé- tyl-ss-D-glucopyranosyl)uronate de méthyle/ss-D-gluco pyranose. Cette synthèse est basée sur la condensation des monosaccharides 14 et 15. A une solution de 870 mg (3,8 mmoles) de com-posé 15 dans le dichlorométhane, on ajoute 1 g de driérite (0,5 g de tamis moléculaires 4 A, en poudre et 0,525 g de carbonate d'argent fraîchement préparé. Après 2 heures d'agitation,on ajoute goutte à goutte, à OOC, 670 mg (1,3 mmoles) du composé 14. Après 6 jours, les solides sont éliminés par filtration. Le sirop obtenu après concentration est chromatographié sur gel de silice (50 g; éluant : chloroforme/acétate d'éthyle; 4/1, v/v). On obtient le disaccharide 1 sous forme de mousse (421 mg; 50 %). [&alpha;]D20 = - 17 (c = 1; chloroforme). L'analyse élémentaire confirme la structure. L'étude en RMN confirme la configuration ss de la liaison interglycosidique. C) Préparation des disaccharides de structure 2 par acé tolyse du disaccharide 1 On prépare le disaccharide 2 en soumettant le disaccharide 1 à une réaction d'acétolyse comme suit. 300 mg du composé 1 sont dissous dans un mélange de 4 ml d'anhydride acétique et de 0,5 mi d'acide trifluoracétique fraîchement distillé. Le mélange réac- tionnel est soumis à agitation durant 18 h à 180C, puis évaporé à sec et co-évaporé avec du toluène. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (15 g). Par élution avec un mélange dichlorométhane, acétate d'éthyle (19/1, v/v). On récupère 282 mg d'un mélange d'acétates anomères de structure 2 sous forme d'un sirop incolore (rendement 86 %). Le rapport des formes &alpha; aux formes ss, déterminé par 'analyse par RNM, est de 4/1. Spectre RMN (90 MHz, CDC13) # : 7,35 (m, 10 H, 2 Ph); 6,28 (d, H9 Jî,2 = 3,5 Hz); 5,56 (d, H1ss, J1,2 = 8,5 Hz); 5,50 (d.de d., H3ss, J2,3 = gHz, J3,4 = 8,5 Hz); 5,15 (d.de d., H@&alpha; J2,3 : 9 Hz, J3,4 = 8,5 Hz); 4,43 (d, 1H, H'1, J1,2. 8 8 Hz); 3,80 (système AB, 2H, Cl-CH2-CO); 3,75 (s, 3H,COOMe); 3,60 (d.de d., H2ss, J1,2 : 8 Hz, J2,3 9 Hz); 3,57 (d.de d., H2&alpha;, J1,2 = 35 Hz, J2,3 = 9 Hz); 2,25; 2,10; 2,09 (3s', 9 H, 30Ac) D) Préparation du disaccharide 3 par bromuration des di saccharides 2 On soumet le mélange d'acétates de structure 2 à l'action de-TiBr4:On soumet à agitation une solution de 140 mg du mélange d'acétates 2 dans un mélange de 3 mi de dichiorométhane et de 0,3 ml d'acétate d'éthyle à 17-18 C, sous atmosphère d'argon sec, en présence de 140 mg de TiBr4 (# 2 équivalents) pendant 20 heures. Après refroidissement à 00C et dilution avec 30 ml de dichlorométhane, le mélange est lavé avec de l'eau glacee, puis avec une solution aqueuse à 5 % de bromure de potassium et ensuite avec de l'eau et séché sur du sulfate de sodium, filtré et évaporé. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (10 g).Par élution avec un mélange dichlorométhane - acétate d'é- thyle (19 : 1, v/v),on récupère, par ordre d'élution - le bromure 3 (74 mg; rendement 50 %) sous forme d'un sirop incolore, instable (immédiatement engagé dans la réaction suivante); spectre RMN (90 MHz, CDCl3) # : 7,35 (m, 10H, 2Ph); 6,38 (d, 1H, H1, J1,2 = 3,5 Hz); 5,55 (d.de d., 1H, H3, J2 3 = 10 Hz, J3 4 = 8,5 Hz); 5,15 (t, 1H, H4', J3',4'=J4',5' = 9 Hz); 4,80 (système AB + ls, 4H, 2 OCH2 Ph); 4,42 (d, 1H, H1' , J1,',2' = 7 Hz); 3,79 (système AB, 2H, Cl-CH2-CO); 3,75 (s, 3H, COOMe); 2,24; 2,10 (2s, 6E, 20Ac) - une fraction (28 mg; rendement 20 %) correspondant au produit de départ qui n'a pas réagi, - une fraction migrant peu correspondant à des produits de 0-débenzylation partielle. EXEMPLE 2 synthèse du tétrasaccharide 6 On prépare le tétrasaccharide 6 en effectuant dans l'étape a) la condensation des disaccharides 3 et 4, en soumettant au cours de l'étape b) le tétrasaccharide 5 formé à une réaction sélective de -0-démonochloroacéty- lation en position 4.Ie dérivé 4 est préparé selon la demande FR 82 01575. a) Réaction de condensation Un mélange de 64 mg (80 M) du bromure 3 fraîchement préparé, de 51 mg (60 uM) du composé 4 et de 80 mg de tamis moléculaire 4 A en poudre dans 1,5 ml de dichloroéthane anhydre est soumis à agitation durant une demi heure à la température ambiante, sous atmosphère d'argon sec, puis est refroidi à - 200C.On ajoute successivement 20 ml (150 PM > de-sym-collidine et 31 mg (120 um) de triflate d'argent. Le melange réactionnel est soumis 1h. à agitation à - 200C, puis on laisse la température remonter vers la température ambiante pendant 15 h. Après dilution avec 50 ml de dichiorométhane, les solides sont essorés et le filtrat est lavé avec une solution aqueuse glacée d'acide chlorhydrique 1 M puis avec de l'eau (deux fois). On le sèche ensuite sur du sulfate de sodium, on le filtre puis on évapore. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (8 g, gel 230-400 mesh). L'élution par le mélange hexane-acétate d'éthyle (4:3, v/v) permet de récupérer 37 mg de tétrasaccharide 5 (rendement 39 %) sous forme d'un verre incolore. [&alpha;]D20= + 56 (c 0,6; CHCl3); spectre RMN (90 MHz, CDCl3) 6: 7,30 (m, 30H, 6Ph); 5,41 (d.de d., 1H, H3, J2"3" = 10 Hz, J3,,4, = 9 Hz); 5,05 (d.de d., 1H, H"'4, J3"',4"' = 9,5 Hz;J4"',5"' 8,5 Hz); 5,00 (d, H1", J1",2" faible,recouvrementavec d'autres protons); 3,72 (système AB + Is, 5H, Cl-CH2CO et COOMe); 3,63 (s, '3P, COOMe), 3,20 (d.de d., 1H, H2", J1",2" 3,5 Hz, J2",3" : 10 Hz) 2,20; 2,11, 2,00 (3s, 12H, 40Ac). Par élution de la colonne avec le mélange acétate d'éthyle - hexane (2:1, v/v), on récupère 23 mg du produit de départ 4 (rendement 44 %). b) Réaction de -0-déchloroacétylation Une solution de 36 mg (23 M) du tétrasaccharide S dans 1,25 ml d'un mélange de pyridine et 0,25 ml d'éthanol absolu est chauffée à 1000C en présence de 7 mg (100 M) de thiourée pendant 20 mn. Après refroidissement et évaporation à sec, le résidu solide est repris avec 20 ml d'eau et extrait avec du chloroforme (5 fois 5 ml). Les phases organiques sont lavees avec une solution aqueuse à 10 % d'hydrogénosulfate de sodium, avec de l'eau, séchées sur du sulfate de sodium, filtrées et évaporées. Le résidu est chromatographie sur une colonne de gel de silice (3 g). Par élution avec un mélange acétate d'éthyle - hexane (3:2, v/v) on obtient 27 mg du dérivé 6 (rendement 80 %) sous forme d'un verre incolore; [&alpha;]D20= + 61 (c = 0,8; chloroforme); spectre RMN (90 MHz, CDCl3, puis D20) #: 7,30 (m, 30 H, 6 Ph); 5,45 (d.de d., 1H, H3"' J2",3"= 10 Hz, J3"4"=9Hz); 3,83 (s, 3H, COOMe); 3,67 (s, 3H, COOMe); 3,25 (d.de d.) 1H, H2'" J1",2"' 3,5 Hz, J2",3": 10 Hz); 2,75 (1H, OH, échangé par D20, OH en 4,du motif acide uronique. 2,15; 2,04 (25, 12H, 4 OAc) EXEMPLE 3 Synthèse du pentasaccharide 8 ou 1) On effectue une réaction de condensation entre le tétrasaccharide 6 et le monosaccharide z, ce qui conduit au pentasaccharide 8. Un mélange de 27 mg (54 M) de bromure 7 préparé selon H. PAULSEN und W. STENZEL, Chem. Ber., 111 (1978) 2334-2347, de 26 mg (18 M) du tétrasaccharide 6 et de 50 mg de tamis moléculaire 4 en poudre dans 0,8 ml de dichloroéthane est soumis à agitation durant 1/2 h à la température ambiante sous atmosphère d'argon sec, puis refroidi à - 200C. 16 ml (120 pM) de svm-collidine et 26 mg (100 M) de triflate d'argent sont ajoutés successivement et le mélange réactionnel est soumis à agitation pendant 18h en laissant la température remonter lentement vers la température ambiante. Après traitement identique à celui décrit pour la préparation de 5, le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (5g, gel 230-400 mesh). Par solution avec un mélange hexane-acétate d'éthyle (4:3, v/v), on récupère 30 mg de pentasaccharide 3 sous forme d'un verre incolore (rendement 90 %). [&alpha;]D20= + 670 (c 1; chloroforme). Spectre RMN (90 MHz, CDCl3). #: 7,30 (m, 40 H, 8 Ph); 5,53 (d, 1H, H1"", J1"",2""= 3,5 Hz); 5,40 (d.de d.1H,H3'" J211,3 : 10 Hz, J3",4"= 9 Hz); 3,76 (s, 3H, COOMe); 3,61 (5, 34, cooMe); 3,30-3,10 (2 d.de d. recouvrement, 2H, H2" et H'21, J = 3,5 et 10 Hz); 2,10; 2,03; 2,00 (3s, 15 H, 50Ac EXEMPLE 4 Préparation du pentasaccharide 13 On a recours aux étapes suivantes a) d'élimination des groupes acétyle (pentasaccharide 9) b) de sulfatation des groupes -OH ainsi libérés (pentasaccharide 10) c) d'hydrogénation pour libérer les groupes -OH protegés par des groupes benzyle et pour trans former le groupe -N3 en groupe -NH2 (pentasaccharide 11) d) de sulfatation des groupes NH2(pentasaccha rïde (12) nuis saponification des groupes -COOMe en position 6 (pentasaccharide 13). Ces étapes sont réalisées comme suit a)-- élimination des groupes acétyle du dérivé 8 Une solution de 28 mg du pentasaccharide 8 dans un mélange de 2,5 ml de 1,2-diméthoxyéthane et de 0,8 ml de méthanol est refroidie à 0 C sous agitation. On ajoute alors 1 ml d'une solution îM de soude, goutte à goutte, en 10 mn. Le mélange réactionnel est soumis à agitation 1 h à 0 C, puis 12h à la tempe rature ambiante. Après refroidissement à OOC, on ajoute 3 ml d'acide chlorhydrique 1M et le mélange laiteux est immediatement extrait avec du chloroforme (5 fois 5 ml). Les phases organiques sont lavées avec de l'eau, séchées sur du sulfate de sodium, filtrées et évaporées. Le résidu est repris dans 2 ml de méthanol et traité par une solution éthérée de diazométhane (excès jusqu'à persistance de la coloration jaune) pendant une demi-heure. Après évaporation à sec, le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (2 g, gel 230-400 mesh). L'élution par le mélange dichlorométhaneméthanol (15:1, v/v) permet de récupérer 18 mg du pentasaccharide 9 (rendement 72 %) sous forme d'un verre in colore. [&alpha;]D20= + 570 (c = 1; chloroforme); Spectre RMN (90 MHz, CDCl3, puis D20): 6: 7,30 (m, 40 H, 8 Ph); 5,50 (d, 1H, J1,2 = 3,5 Hz, H1 d'une unité 2-azido); 3,78 (s, 3H, cooMe); 3,28 (s, 3H-, COOMe); absence de signaux OAc dans la zone 1,50 b) sulfatation des groupes -OH A une solution du composé 9 (22 mg) dans le diméthylforma- mide (0,5 ml), on ajoute du complexe triméthylamine/S03 (22 mg, 2,5 éq/OH) . Le mélange réactionnel est chauffé à 500C durant environ 14 h.On ajoute alors à nouveau du complexe triméthylamine/S03 (10 mg) et laisse la réaction évoluer durant 24 heures On ajoute au mélange réactionnel du méthanol (0,5 ml) et du chloroforme (0,5 ml) .La solution est introduite au sommet d'une colonne de séphadex LH20 équili brée dans un mélange CHCl3/CH3OH (1/1 ; v/v). Les fractions con tenant le produit sulfaté sont regroupées et le solvant est évaporé. On obtient ainsi un verre (30 mg) . Ce verre est ensuite chromatographié sur gel de silice (10 g) dans un solvant constitué de 3 parties du mélange acétate d'éthylènc/pyridine acide acétique/eau, (6/2/0, 6/1, v/v/v/v) et de 2 parties du mélange acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau, (5/b/1/3, v/v/v/v) parties du mélange acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau, 5/5/1/3, v/v/v/v. Les fractions contenant le produit désiré sont rassemblées et concentrées. Après évaporation des solvants, le résidu obtenu est dissous dans du méthanol additionnéd'eau, puis passé au travers d'une colonne de Dowex 50 W x 4,Na+, équilibrée dans un mélange méthanol/eau (50/50, v/v). On obtient ainsi le sel de sodium; c) hydrogénation Le produit obtenu ci-dessus est dissous dans du méthanol (3,7 ml) additioné d'eau (0,3 ml). A cette solution, on ajoute le catalyseur (Pd/c,5%,40 mg) et on agite sous atmosphère d'hydrogère pendant 5 jours. Après élimination du catalyseur nar filtration, l'analyse du spectre U.V de la solution obtenue montre Ja disparition totale de l'absorption due auxgroupesbenzyle. Le solvant est alors évaporé, laissant un résidu, à savoir le composé 11. d) sulfatation des groupes -NH2, puis saponification des groupes carboxyle. Le composé est dissous dans l'eau (4ml). Le pH est ensuite ajusté à 9,5 puis on ajoute à la solution du complexe triméthylamine/S03(54 mg). Le pH est maintenu à 9,5 pendant toute la durée de la réaction par addition de soude O,lN. Après une nuit, on procède à une nouvelle addition d'agent de sulfatation (27 mg). Une dernière additionest effectuée après 24 h. Après 48 h, on ajoute de la soude (3M, 34 ml) au composé 12 formé, puis la solution est sounlise à agitation pendant 3 heures à température ambiante de manière à hydrclyser les méthylesters des motifs de type acide uronique. Le mélange réactionnel est ensuite neutr@licé puis concentré jusqu'à un volume d'environ 2 ml. La solution ainsi obtenueest déposée au soumet d'une colonne de Séphadex G 25 (100 ml) éluée avec de l'eau. Les fractions collectéessont analysées par absorption Uv (206 nm) zt en polarométrie,(265 4nm). Les fractions présentant une activité optique sont regroupées, le solvant est éliminé et le résidu repris par environ 2 ml d'eau et lyophilisé. On obtient ainsi le dérivé 13 sous forme de poudre blanche (5,6 mg, 25% par rapport au produit 9). L' étude en RNN confirme la structure attendue. - REVENDICATION Pentasaccharides caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule (i) suivante dans laquelle - les groupes R,identiques ou différents les uns des autres, représentent un atome d'hydrogène ou un radi cal physiologiquement acceplable,de type -R1R2, dans lequel P*1 représente avantageusement un sel minéral, en particulier un groupe S03 et R2 représente un cation métallique, notamment un métal alcalin tel que le sodium ou alcalino-terreux, tel que le calcium ou le magnésium, ou un cation organique tel qu'un dérivé de base organique azotée, et - les substituants A, identiques ou différents les uns des autres, représenteut un atome d'hydrogène, ou encore un cation métallique ou un cation organique @els que définsi ci-dessus.