FR 2520006 A1 19830722 FR 8300685 A 19830118 Procédé de mesure quantitative des acides gras insaturés. La présente invention est relative à un procédé nouveau de mesure quantitative des acides gras insaturés et est particulièrement utile pour la détermination de l'acide gras insaturé libéré dans la mesure de l'activité d'une lipase, en utilisant un glycéride d'acide gras insaturé comme substrat. Les lipases sont des enzymes ayant une activité de transformation du glycéride en glycérol et en acides gras, et elles se distinguent des estérases qui agissent sur des glycérides d'acides gras à chaine courte. On trouve ces lipases dans beaucoup de tissus animaux et elles existent en particulier dans le suc pancréatique en une concentration éle uvée. La mesure de l'activité d'une lipase dans du sérum est utilisée, ainsi, pour mettre en évidence des maladies du pancréas, puisque des lipases viennent dans le sang dans le cas de telles maladies. Comme procédés de mesure de l'activité d'une lipase dans du sérum, on connait jusqu'ici des procédés tels que décrits dans DeutscheMedizinische Wochenschrift, 90, 1970 (1965), Analytical Biochemistry, 6, 451 (1963) et Clin. Chem., 21, 1469 à 1473 (1975). En effet, ces procédés ont été pratiqués de manière à permettre à une quantité en excès de triglycéride qui est un substrat des lipases, d'agir par exemple sur du sérum à examiner, et à déterminer ensuite, par une alcalimétrie en utilisant un indicateur tel que la phtaléine du Thymol, etc., ou par une extraction à l'aide de sels de cuivre, la quantité d'acides gras libérés par l'activité d'une lipase. Mais, dans ces procédés, la mesure de l'acide gras par des photomètres s'effectue mal, en raison du trouble de la solution provoqué par les substrats utilisés, et la mesure quantitative de l'acide gras était très difficile parce que la quantité qui en était libérée était aussi petite que par exemple 0,0005 millimole, même après une durée de réaction de 10 minutes en utilisant 1 ml de sérum.On a indiqué récemment un autre procédé de mesure de l'ac- tivité d'une lippe dans du sérum, dans Clinical Chemistry, 27, 163 à 165 (1931). Suivant ce document, on laisse du sérum agir sur le triglycéride de l'acide linolénique, à titre de substrat pour libérer de l'acide linolénique, l'acide linolénique obtenu étant oxydé par de la lipoxygénase et la quantité d'oxygène consommée dans la réaction d'oxydation étant ensuite déterminée par voie électrochimique, par une électrode à oxygène.Mais ce procédé a les inconvénients d'être beaucoup affecté par la stabilité de détection et par la sensibilité de l'électrode à oxygène elle-même, puisque la mesure quantitative de l'oxygène consommé est effectuée au moyen d'une électrode à oxygène ; en outre, la mesure photométrique ne convient pas non plus, en raison du trouble provoqué par le triglycéride utilisé comme substrat. On a maintenant trouvé que l'on peut mesurer d'une manière précise et commode la quantité d'acide gras insaturé par un changement spectrophotométrique particulier dûà un donneur d'hydrogène utilisé dans le système réactionnel. En effet, on utilise un monoglycéride, un diglycéride ou un triglycéride d'acide gras insaturé comme substrat, en libérant de l'acide gras insaturé du substrat par l'activité de lipase du liquide à examiner, on transforme l'acide gras insaturé obtenu en son peroxyde par de la lipoxygénase en la présence d'oxygène, et on permet à la peroxydase et à un donneur d'hydrogène d'agir sur ce peroxyde. L'invention a été effectuée sur la base de ce qui précède. L'invention vise en effet un procédé de mesure quantitative d'acide gras insaturé qui est caractérisé en ce qu'il consiste à permettre à de la lipoxygénase d'agir sur le liquide à examiner contenant l'acide gras insaturé, en la présence d'oxygène, pour former le peroxyde de l'acide gras insaturé, à permettre à de la peroxydase et à un donneur d'hydrogène d'agir sur le mélange, et à mesurer le changement décelable dans le système réactionnel par des moyens spectrophotométriques. L'invention est particulièrement utile comme procédé de mesure de l'activité d'une lipase, puisqu'elle ne nécessite pas des processus compliqués comme dans l'art antérieur. En outre, suivant l'invention, le processus de mesure n'est pas rendu inadéquat en raisondu trouble de la solution réactionnelle, et il n'y a pas non plus d'influences dues aux électrodes, la mesure pouvant au contraire être effectuée d'une manière précise et commode en peu de temps, par des moyens spectrophotométriques, en mesurant la faible activité d'une lipase par l'utilisation du glycéride comme substrat. L'invention procure donc un procédé utile de mesure quantitative d'un acide gras insaturé. Suivant l'invention, comme liquides à examiner contenant un acide gras insaturé on peut utiliser tout liquide qui contient un acide gras insaturé, et de préférence un liquidé contenant un acide gras insaturé qui est libéré et qui est formé par 1' ac tivité d'une lipaeà partir du glycéride de l'acide gras insaturé, lequel est un substrat pour la mesure de l'activité d'une lipase.Plus particulièrement, la solution à examiner qui est préférée est préparée habituellement de telle manière qu'une quantité définie d'une solution ayant une activité de lipase, telle qu'une solution de lipase dans du sérum ou une solution d'un réactif de lipase, est mélangée à une quantité définie d'une solution de substrat contenant du glycéride d'un acide gras insaturé, qui est ajustée à une concentration donnée et le mélange est mis à réagir à 370C environ pendant 5 minutes ou davantage, pour libérer de l'acide gras insaturé du substrat en raison de son activité de lipase. Comme glycéride d'acide gras insaturé qui est utilisé comme substrat dans la mesure de l'activité de lipase, on peut utiliser n'importe quel monoglycéride, diglycéride et triglycéride, et de préférence un monoglycéride ou un diglycéride. L'acide gras insaturé constituant le glycéride ou le liquide contenant de l'acide gras insaturé à examiner utilisé suivant l'invention est de préférence un acide gras insaturé de type cis ayant deux ou plusieurs doubles liaisons et de 12 à 20 atomes de carbone, tel que l'acide 2,4-dodécadiénoique, l'acide 9, 12-hexadécadiénoîque, l'acide linolique (acide cis-9, cis-12-octadécadiénofque), l'acide linolénique (acide 9, 12, 15-octadécatriénoTque), l'acide 6, 9, 12-octadécatriénoTque, l'acide 11, 14 eicosadiénoique, l'acide 5, 8, 11-eicosatriénolque, l'acide 8, 11, 14-eicosatriénoique, l'acide arachidonique (acide 5, 8, 11, 14-eicosatétraénoSque), etc. Comme lipoxygénases, on peut utiliser des enzymes bruts ou purs qui ont une aptitude à catalyser au moins la réaction pour produire 1 mole de peroxyde d'acide linolique à partir d'l mole d'oxygène et d'l mole d'acide linolique comme substrat (Commission des Enzymes 1.13.1.13.Linoleate : oxygène oxydoréductase) et à catalyser la réaction enzymatique suivant l'invention. Les enzymes peuvent être ceux qui sont disponibles dans le commerce ou peuvent être isolés et recueillis à partir d'une plante légumineuse telle que le soja, le pois, etc., l'orge, le blé, etc. (A.L. Tappel, Food Research, 18, 104 (1953), H. Theorell, etal, Acta Chem. Scand., 1, 571 (1947)). On utilise des lipoxygénases à raison, habituellement, de 1000 unités ou davantage et, de préférence, à raison de 10.000 à 50.000 unités environ par test. Comme peroxydases, on peut utiliser commodément des peroxydases disponibles dans le commerce provenant du raifort. La quantité de peroxydases à utiliser n'est habituellement pas inférieure à 1 unité et, de préférence, est comprise entre 2 unités et 20 unités environ par test. Comme donneurs d'hydrogène, on peut utiliser des composés oxydables. Ces composés sont un réactif coloré dont la coloration vire dans le domaine visible par oxydation, un réactif fluorescent émettant de la fluorescence et un réactif luxainescent , réactif donnant une coloration lorsqu'il est soumis à un rayonnement ultraviolet, etc. Comme réactif coloré, on peut utiliser souvent une association d'un accepteur d'électron 'et d'un composé phénolique. Des exemples d'accepteur d'électron sont la 4-aminoantipyrine, le 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2, 4-tri- azole, la 3-méthyl-2-benzothiazolinone hydrazone, le 2-amino-benzothiazole, etc.Comme exemples de composés phénoliques, on peut citer le phénol, le p-chlorophénol, le 2,4-dichlorophénol, le 2,4-dibromophénol, le p-hydroxybenzoate de sodium, le 4,6-dichloro-o-crésol, le 3,5-dichloro-2-hydroxybenzènesulfonate de sodium, le 3,5-xylénol, la N,N-diéthyl-mtoluidine, la N, N-diéthanol m-toluidine, la Nethyl-N-sulfo- procylttoiuidine, la N,N-diméthylaniline, la N,N-diéthyl-aniline, la N,N-diméthylm-méthoxyaniline, la 3-acétamino-N ,N-diméthylani- line, la 3-méthyl-N-ethyl-N-(ss-hydroxyéthyl)aniline, la N-éthyl-N- (3-méthyl-phényl) -N'-acétyléthylènediamine, etc. Cor.me substrats fluorescents dans un réactif de fluorescence ou dans un réactif luminescents , on peut mentionner, par exemple, le bis(2,4,6-trichlorophénol)oxalate, la phénylthiohydantolne, l'acide homovanillique, l'acide 4-hydroxyphénylacétique, la vanillylamine, la 3-méthoxytyramine, l'acide phlorétique, l'hordénine, le monoanion de luminol, la lucigénine, la wafine, etc. Les réactifs mentionnés ci-dessus ne sont donnés qu'à titre d'illustration et ne doivent pas être considérés comme une liste limitative du donneur d'hydrogène suivant l'invention. On peut déterminer la quantité de ces donneurs d'hydrogène à utiliser en fonction de la quantité d'acide gras insaturé contenue dans le liquide à examiner, ou du peroxyde qui en est obtenu.Bien que la quantité du donneur d'hydrogène ne soit pas habituellement inférieure à 5 moles pour 1 mole d'acide gras insaturé, elle peut varier d'une manière arbitraire suivant la quantité de liquide à examiner, le degré de liaison insaturée et la teneur du liquide à examiner en acide gras insaturé, etc. En outre, quand on effectue la réaction, on peut utiliser n'importe quel milieu de réaction convenable, tel que le tampon à l'acide diméthylglutariquehydroxyde de sodium, le tampon à l'acide phosphorique, le tampon à l'acide chlorhydrique tris, le tampon à l'acide borique ou d'autres tampons utilisés en général. On ajuste de préférence le pH de la solution entre 5 et 9. C'est ainsi, par exemple, qu'on peut préparer d'abord une composition pour la mesure de 1 'aci- de gras insaturé, qui comprend de 0,1 à 0,2 ml d'un accepteur d'électron tel que de la 4-aminoantipyrine à 0,3 %, de 0,1 à 0,2 ml d'un donneur d'hydrogène constitué d'un composé phénolique à 0,2 % tel que le phénol ou le 2,4-dichlorophénol, de 5 à 20 unités de peroxydase, de 10.000 à 30.000 unités de lipoxygénase et de 1 à 2 ml de tampon à l'acide borique 0,1M. (pH 9,0) ou de tampon à l'acide chlorhydrique tris 0,2M. Dans la mesure quantitative de l'acide gras insaturé, on chauffe au préalable la composition ainsi préparée pour la mesure, par exemple à 370C, puis on lui ajoute 50 p1 du liquide à examiner contenant l'acide gras insaturé et on laisse le mélange réagir à 370C pendant 10 à 20 minutes. La réaction achevée, on mesure le degré de coloration par des absorbances aux longueurs d'ondes d'absorption spécifiques en utilisant un spectrophotomètre. On calcule ainsi, à partir de son absorbance et on détermine la quantité d'acide gras insaturé dans le liquide à examiner. Pour la détermination de l'acide gras insaturé, en vue de la mesure de l'activité d'une lipase, on peut déterminer aussi l'acide gras insaturé libéré en permettant au liquide à examiner ayant une activité de lipase d'agir sur un substrat pour la mesure de l'activité d'une lipase. De préférence, on détermine l'acide gras insaturé en un stade en préparant une composition comprenant la composition de mesure de l'acide gras insaturé et un substrat pour la mesure de l'activité de lipase qui y est ajoutée, et en leur permettant de réagir sur le liquide à examiner pour la mesure de l'activité d'une lipase. Comme .substrats utilisés pour la mesure de l'activité d'une lipase, on peut préparer par exemple une solution éthanolique 0,1M de glycéride. On utilise de 20 à 50 p1 de cette solution pour 1 à 2 ml de ladite composition pour la mesure de l'acide gras insaturé. Lors de la mesure de l'ac- tivité d'une lipase, on peut ajouter en outre à la composition un agent tensio-actit tel que le désoxycholate de sodium. En outre, suivant l'invention, les conditions de réaction telles que le pH, la durée de réaction, la longueur de mesure, etc., peuvent varier suivant les réactifs à utiliser respectivement, et on peut choisir arbitrairement toute condition convenable. Les exemples suivants illustrent l'invention. EXEMPLE 1 Tampon à l'acide borique O,1M 0,2 ml '(PH 9,0) 4-aminoantipyrine à 0,3 % 0,1 ml Phénol à 0,2 % 0,1 ml Peroxydase (50 U/ml) 0,2 ml Lipoxygénase (500.000 U/ml) 20 iii Eau distillée 0,38 ml Total 1,0 ml On chauffe au préalable à 370C, 10 ml de la composition de réaction pour la mesure quantitative de l'acide gras insaturé, constitué des constituants mentionnés ci-dessus, et on y ajoute de O à 50 l d'une solution éthanolique d'acide linolique à 1 mM, ou de O à 50 pl d'une solution éthanolique d'acide linolénique à 1 mM, à titre de liquide à examiner. On laisse le mélange réagir à 370C pendant 10 minutes. Après achèvement de la réaction, on y ajoute 2 ml d'eau distillée et on mesure la couleur de la solution obtenue par l'absorbance à la longueur d'onde de 500 nm -A 500 nm) en utilisant le spectrophotomètre. Les résultats sont donnés à la figure 1, dans laquelle les symboles "-" et "o" représentent les résultats dans le cas de l'acide linolique et de l'acide linolénique respectivement. Comme le montre la figure 1, on obtient des résultats de mesure quantitative très satisfaisants. EXEMPLE 2 Tampon à l'acide chlorhydrique tris 0,2M (pH 8,5) 0,8 ml Désoxycholate de sodium à 2 % 0,1 ml Solution éthanolique O,lM de 40 l dilinoléine Lipoxygénase (500.000 U/ml) 50 l Peroxydase (50 U/ml) 0,2 ml 4-aminoantipyrine à 0,3 % 0,2 ml 2,4-dichlorophénol à 0,2 % 0,2 ml Eau distillée 0,41ml Total 2,0 ml On chauffe au préalable à 370C, 2,0 ml de la composition de réaction constituée des constituants mentionnés ci-dessus, et on y ajoute de O à 5 vl d'un réactif de lipase à 0,1 U/ml vendu sur le marché (qui provient de Chromobacterium viscosum fourni par Toyo Jozo Co.). On laisse le mélange réa- gir à 370C pendant 10 minutes. Après achèvement de la réaction, on mesure la coloration de la solution obtenue par l'absorbance à la longueur d'onde de 505 nm (AA 505 nm) en utilisant le spectrophotomètre. Les résultats obtenus sont donnés à la figu re 2. Comme le montre la figure 2, on obtient des résultats de mesure de l'activité de la lipase qui sont très satisfaisants. EXEMPLE 3 Tampon à l'acide chlorhydrique 0,8 ml tris 0,2M (pH 8,0) Désoxycholate de. sodium à 2 % 0,1 ml Solution éthanolique O,1M de 40 ul dilinoléine Lipoxygénase 500.000 U/ml) 50 ul Peroxydase (50 U/ml) 0,2 ml 4-aminoantipyrine à 0,3 % 2,4-dichlorophénol à 0,2 % 0,2 ml Eau distillée 0,41ml Total 2,0 ml On chauffe au préalable, à 370C, 2,0 ml de la composition de réaction constituée des constituants mentionnés ci-dessus et on y ajoute 50 ul d'une solution diluée de sérum à titre de liquide à examiner. On laisse réagir le mélange à 370C pendant 20 minutes. La réaction achevée, on mesure la coloration de la solution obtenue par l'absorDance à la longueur d'onde de 505 nm t A 505 nm) en utilisant le spectrophotorllètre. Las résultats obtenus sont excellents, comme le montre la figure 3. EXEMPLE 4 On chauffe au préalable, à 370C, 2,0 ml de la composition de réaction constituée des mêmes constituants qu'à l'exemple 3, et on y ajoute 50 pl d'une solution diluée de sérum. On laisse réagir le mélange à 370C. On calcule le changement de coloration de la solution obtenue après une durée de 5 minutes en mesurant les absorbances à la longueur d'onde de 505 nm, 5 minutes et 10 minutes après l'achèvement de la réaction, respectivement, en utilisant le spectrophotomètre. Les résultats obtenus sont donnés à la figure 4. EXEMPLE 5 On mesure l'activité de lipase de 39 échantillons en utilisant le même procédé qu'à l'exemple 4, et le procédé connu pour la mesure de l'activité d'une lipase dans du sérum (procédé au sel de cuivre; Clin. Chem. 21, 1469 à 1473 (1975)). En résultat, on indique à la figure 5 la relation entre le procédé suivant l'invention et le procédé classique, le coefficient de corrélation étant de 0,976 et l'equa- tion de régression étant représentée par : y = 1,28 + 8,6. Il s'avère que la relation obtenue est très satisfaisante. REVENDICATIONS 1. Procédé de mesure quantitative d'un acide gras insaturé, caractérisé en ce qu'il consiste à préparer du peroxyde de l'acide gras insaturé en permettant à de la lipoxygénase d'agir sur un liquide à examiner qui contient l'acide gras insaturé, en la présence d'oxygène, à faire agir sur le peroxyde de la peroxydase et un donneur d'hydrogène, et à mesurer le changement décelable dans le système réactionnel, par des moyens spectrophotométriques. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le liquide à examiner contient de l'acide gras insaturé qui est libéré et produit à partir de glycéridesd'acide gras insaturé par l'activité d'une lipase. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le glycéride d'acide gras insaturfs sont des monoglycerides, des diglycérides ou des tri glycéridesd'acide gras insaturé 4. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que l'acide gras insaturé est un acide ayant de 12 à 20 atomes de carbone. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que l'acide gras insaturé ayant de 12 à 20 atomes de carbone est l'acide 2,4-dodéca diénolque, l'acide 9,12-hexadécadiénorque, l'acide linolique, l'acide linolenique, l'acide 6,9,12-octa décatriénolque, l'acide 11,14-eicosadiénoïque, l'acide 5,8,11-eicosatriénorque, l'acide 8,11,14 eicosatriénolque ou l'acide arachidonique. 6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le donneur d'hydrogène est un composé oxydable tel qu'un réactif coloré, un réactif fluorescent, ou un réactif luminescent. 7. Procédé suivant la revendication 1, carac térisé en ce que les moyens spectrophotométriques sont des moyens dans lesquels on mesure un changement décelable à une longueur d'onde d'absorp-tion particulière. 8. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le liquide à examiner, qui contient de l'acide gras insaturé, est un liquide à examiner pour la mesure de l'activité d'une lipase. 9. Procédé suivant la revendication 1, carac térisé en ce que la lipoxygénase est un enzyme (Commission des Enzymes 1.13.1.13. Linoléate : oxygène oxydoréductase) qui est apte à catalyser au moins la réaction de production d'l mole de peroxyde d'acide linolique à partir d'l mole d'oxygène et d'l mole'd'acide linolique comme substrat