FR 2528854 A1 19831223 FR 8210892 A 19820622 'Nouveaux dérivés de tétrasaccharides et leur préparati L'invention a pour objet de nouveaux dérivC:; de tétrasaccharides et leur préparation. Elle concerne plus particulièrement des tétrasaccharides formés d'un enchainement de motifs à structure acide glucuronique,D-glucosamine, acide L-iduronique et D-glucosamine,de formule dans laquelle - R4,R5,R6 et R10 représentent un atome d'hydrogène, un groupe sulfate, ou un groupe protecteur, l'un au moin de ces radicaux représentant alors dans ce dernier cas un atome d'hydrogene ou un groupe sulfate, R1. R2, R3, R7, R8 et Rg représentent un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur, - les substituants R, identiques ou différents représen- tent un groupe alcoyle, en particulier renfermant 1 à 3 atomes de carbone, de préférence un groupe méthyle, ou un cation métallique, notamment le sodium, ou encore un cation organique,tel qu'un dérivé de base organique azotée, - Z représente un précurseur d'un groupement fonctionnel azoté ou ce groupement azoté lui-mëme, en particulier un groupe azide, un groupement amine, éventuellement substitué, ou un groupe -NHS03 . Une famille préférée de tétrasaccharides de l'invention renferme avantageusement deux motifs D-glucosamine comportant un groupe N-sulfate en position 2. Des tétrasaccharides de ce type sont,en outre,avan tageusement substitués en position 6 par un groupe -O sulfate. Dans d'autre tétrasaccharides préférés,R4 représente un groupe sulfate, cette disposition pouvant avantageuse ment s'ajouter à celles qui précedent. Dans une autre famille préférée, les tétrasaccharides ci-dessus renferment en outre un motif acide L-iduronique comportant un groupe O-sulfate en position 2. Les positions restantes de ces tétrasaccharides sont libres ou protégées par des groupements de bloquage selon l'application envisagée pour ces produits. D'une manière avantageuse, ces tétrasaccharides correspondent à dessequences de fractiom ou fragments de channes d'héparine douées d'une activité anticoagulante spécifique élevée (mesurée selon la méthode de Yin-Wessler décrite dans J.Lab.Clin.Med. 1976,81.-298-300 ) ~ tandis que leur activité anticoagulante globale (exprimée par le titre USP, mesuré selon la méthode décrite dans "Pharmacopea of the Uni tex States of Arrerica"pp 229-230)est plus faible que celle de l'héparine. pa Ces Ces tétrasaccharides sont donc avantageusement utilisables comme substances de référence pour soles études de structure. Ils constituent également des produits intermédiaires de grand intéret en synthèse osidique, plus spécialement pour la synthèse d'oligosaccharides constitutifs de chaines d'héparine ou d'héparan~sulfat6. Conformément à l'invention, le ou les groupes -O-sulfate des motifs constitutifs des tétrasaccharides sont obtenus à partir de groupements-O-acétyle(-O-COCit3). Dans une première étape, on procède à l'élimination partielle de groupes -O-acétyle. par exemple à l'aide de carbonate de potassium dans du méthanol, ou à une élimination complète de tous les groupements -Oacétyle du tétrasaccharide à l'aide, par exemple, de soude. Les groupes -OH ainsi libérés sont alors soumis à un traitement de sulfatation. A cet effet, on utilise, par exemple, un complexe de tétramethyl; amine /S03. Les groupes -N-sulfate sont avantageusement obtenus par sulfatation de groupes amine. Comme produit de départ, on met avantageusement en oeuvre un tétrasaccharide, tel qu'obenu selon le pro cédé décrit dans la demando dc brevet ~~ - - - FR 82 02526 du 16 février 1982 au nom de la Demanderesse. Dans ce tétrasaccharide, les groupes de bloquage sont convenablement choisis selon le type de substitution souhaité dans le produit final. Ainsi, on a plus spécialement recours à un tétrasaccharide comportant des groupes -OCOCH3 sur les positions à sulfater et des groupes de bloquage inertes vis-à-vis de la réaction de désacétylation et de sulfatation et compatibles entre eux pour les autres positions. Les produits intermédiaires mis en oeuvre dans lé procédé évoqué ci-dessus sont nouveaux et, en tant que tels, entrent également dans le cadre de l'invention. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans les exemples qui suivent relatifs à la synthèse de tétrasaccharides de l'invention. Le schéma de synthèse est représenté sur 3a figure.Les composés y sont désignés par les memes numéros que dans les exemples.Les symboles utilisés dans la description ct la figure ont les significationr suivantes Ac : acétyle, Me : méthyle, Bn : benzyle, S : S03 ido : motif iduronique, gluco : motif glucosamine, : triméthylamine, A : benzyloxycarbonyle. EXEMPLE 1 - Synthèse du tétrasaccharide 2 Une solution de tétrasaccharide 1 (28mg) dans le méthanol anhydre (3ml) est refroidie à -150C sous atmosphère d'argon sec. Du carbonate de potassium anhydre (12 mg) est ajouté et le mélange est agité 6 heures dans ces conditions. Les solides sont alors essorés, le filtrat est évaporé et le résidu est repris avec du chloroforme (15 ml). La phase organique est lavée avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, avec de l'eau,séchée (sulfate de sodium), fil- trée et évaporée. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (2 g). L'élution par le mélange acétate d'éthyle/hexane (3:2,v/v) donne le tétrasaccharide 2 sous forme d'un verre incolore (22mg, 85x). Spectre RMN (270 MHz,CDCl3) & 7,30 (m,35H, 7 Ph) 5,37 (d,lH, H1, J1" " : 3.5 Hz); 5,29 (d. de d., 1H, H3, J2", 3": 10 Hz, J3 ",4 ": 8,5H;z); 5,09 (d, 1H, H1, J1,2 : 3,5 Hz); 3,57 (s,3H, COOMe ido) 3.43 (s, 3H, COOMe gluco) , 2,06 (s, 3H,OAc). Ce composé 2 qui est un dérivé mono-O-acétylé (en posi- tion 3 sur le 2ème motif) du tétrasaccharide 6, est un intermédiaire potentiel pour la synthèse d'un analogue de ce tétrasaccharide qui ne serait pas sulfaté sur la position 3 du deuxième motif. EXEMPLE 2 - Synthèse du tétrasaccharide 3 Une solution du tétrasaccharide 1 (40 mg) dans un mélange de 1,2-diméthoxyéthane (3 ml) et de méthanol (lml) est refroidie à -15 C, Une solution aqueuse M de soude (1 ml) est ajoutée goutte à goutte en 10 mn. et le mélange réactionnel est agité 5 heures à 0 C. De l'acide chlorhydrique M est alors ajouté goutte à goutte jusqu'à pH = O et le mélange est versé dans de l'eau glacée (50 ml). Après extraction avec du chloro forme (5 fois 5 ml), les phases organiques sont lavées avec del'eau, sechées (sulfate de sodium) filtrées et évaporées. Le résidu est dissous dans du méthanol (1 mi) et traité par une solution éthérée de diazométhane jusqu'd persistance de la coloration jaune. Après 30 mn, le mélange réactionnel est évaporé à sec. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (3 g). L'élution par le mélange acétate d'éthyle/ hexane (2:1, v/v) donne le tétrasaccharide 3 (27 mg, 75%) : P.F 126-127 C (éthanol);[&alpha;]D + 55 (cl,chloroforme). Spectre RMN (90 MHz, CDCl ) : absence totale de 3 signaux OAc(versS =2). Analyse élémentaire : conforme avec la structure recherchée. EXEMPLE 3 : Synthèse du tétrasaccharide 4. A une solution du dérivé 3 (24 mg) dans le DMF (1 ml). on ajoute le complexe TMA/SO (24 mg). Après une nuit 3 à 50 C, la réaction de sulfatation est complète. Du méthanol (0,5 ml) est ajouté au mélange réactionnel puis celui-ci est déposé sur une colonne de Séphadex Lls- 20 équilibrée en chloroforme méthanol (1:1, v/v). Les fractions-contenant 4 sont regroupées. Après ovaporation à sec, le résidu est chromatographié sur gel de sili ce 1O g) dans le mélange acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau (160:77:19:42 : v/v/v/v). Les fractions pures sont regroupées. Après concentration à sec, le résidu est passé au travers d'une colonne Dowex 50W x 4. Na+ éluée avec de l'eau. Le produit obtenu (30 mg) est homogène en chromatographie sur couche mince dans le solvant ci-dessus. Son spectre RMN confirme la structure. [&alpha;]D 20 = + 39 du (1,méthanol). EXEMPLE 4 - Synthèse du tétrasaccharide 5 - Une solution du dérivé 4 (10 mg) dans un mélange de méthanol (1,8 ml) et d'eau (0,2 ml) est agitée sous une pression d'hydrogène de 0,2 bar en présence de Pd/C à 5% (10 mg). Après 95 heures, le cata liseur est éliminé par filtration. L'analyse en ultra violet confirme l'absence de noyaux aromatiques. Après évaporation, le dérivé 5 est utilisé tel quel pour la preparation du dérivé 6. EXEMPLE 5 - Synthèse du tétrasaccharide 6 Le dérivé 5 obtenu à l'étape précédente, est dissous dans l'eau (2 ml). Le pH de cette solution est ajusté à 9,5 ; il est maintenu à cette valeur pendant toute la durée de la sulfatation. Le complexe TMA/S03 (14 mg) est ajouté. Une deuxième addition est faite après 24 heures (14 mg) Après 48 heures, le pH est amené à 12, puis à 7, deux heures plus tard. Le mélange réactionne] est alors chromatographié sur une colonne de Sephadez G-25 (50 ml). Les fractions contenant le dérivé 6 {détection par réaction colorée des acides uroniques) sont regroupées, passées au travers d'une colonne de résine Dowex 50 W x 4 Na puis lyophilisées. On obtient ainsi le tétrasaccharide 6 (2 mg). L'analyse colorimétrique des constituants du dérivé 6 donne 1,84 moles de glucosamine pour 2,06 moles d'acides uroniques. La structure du dérivé 6 (séquence, anomérie, position desgroupes sulfates) est confirmé par le spectre R::.l (270 MHz, TMS) :# pour les protons anomeres respectivement des ler, 2ème, 3ème et 4ème motifs 4,72 ; 5,30 : 5,55 , et 5,67. REVENDICATION Tétrasaccharides formés d'un enchainement de motif a' structure acide glucuronique D-glucosamine, acide L-iduronique et D-glucosamine, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule.: dans laquelle - R4,R5,R6 et R 10 représentent un atome d'hydrogène, un groupe sulfate, ou un groupe protecteur, l'un au oin de ces radicaux représentant alors dans ce dernier cas un atome d'hydrogène ou un groupe sulfate, - Rl, R2, R 3' R, R8 et Rg représentent un atome d'hy drogène ou un groupement proteteur, - les substituants R, identiques ou différents rpresen- tent un groupe alcoyle, en particulier renfermant 1 à 3 atomes de carbone, de préférence un groupe méthyle ou un cation métallique, notamment le sodium, ou encore un cation organique tel qu'un dérivé de base organique azotée. - Z représente un précurseur d'un groupement fonctionnel azoté ou ce groupement azoté lui-méme, en particulier un groupe azide, un groupement amine,éventuellement substitué, ou un groupe -NHS03 .