FR 2518573 A1 19830624 FR 8123855 A 19811221 Procédé de saccharification de matières lignocellulosiques au moyen d'un prétraitement par une amine et hydrolyse enzymatique. L'invention concerne un procédé de saccharification de matières lignocellulosiques par un procédé en deux stades, comprenant (1) un prétraitement par une amine et (2) hydrolyse enzymatique. On connatt différents procédés de transformation de matières cellulosiques en sucre, dont les principaux sont l'hydrolyse acide et lthydrolyse enzymatique. L'hydrolyse acide peut etre mise en oeuvre par des acides dilués ou cohcentrés. L'utilisation d'un acide peu concentré a une température de 140-1900C, comme dans le procédé Madison-Scholler permet d'obtenir des rendements en sucres de l'ordre de- 50% avec comme produit final une solution très diluée en sucre contenant des sous-produits gênants. L'augmentation du rendement peut être obtenue en utilisant des températures plus élevées, mais on ne dépasse pas un rendement de 70%. L'utilisation d'un acide concentré donne de meilleurs résultats, mais fait intervenir un recyclage de cet acide, triés coûteux en énergie. Les procédés d'hydrolyse acide posent en outre des problèmes de corrosion et nécessitent l'utilisation de matériaux coûteux. L'hydrolyse enzymatique est nettement plus avantageuse, notamment elle est mise en oeuvre une température modérée, de l'ordre de 40-600C et donne de bons rendements de transformation en sucre. L'application de l'hydrolyse enzymatique S la transformation des matériaux lignocellulosiques a fait l'objet de nombreux travaux. Deux difficultés ont été mises en évidence dues d'une part à la structure cristalline de la cellulose qui gène l'attaque des liaisons glucosidiques par les enzymes et d'autre part à la présence de lignine qui protège la cellulose de l'attaque des enzymes. La difficulté due a la structure cristalline de la cellulose peut être résolue, comme l'a montré Reese, en utilisant les cellulases issues du champignon Trichoderma reesei En effet, la cellulase C1 obtenue a partir de ce champignon, détruit la structure cristalline de la cellulose et permet l'attaque des autres cellulases jusqu'a la dégradation finale en glucose L'élimination de la lignine qui est nécessaire pour augmenter la surface de contact entre la cellulose et les enzymes peut s'accompagner, suivant le procédé employé, d'une réduction de la structure cristalline de la cellulose et peut etre obtenue de diverses manières On connaît notamment (a) le traitement du-type fabrication de pite a papier; (b) l'attaque microbienne de la lignine; (c) l'utilisation de solvants sélectifs de la cellulose;; (d) l'utilisation de solvants délignifiant; Le prétraitement du type iabrication de pâte à papier, ne convient pas comme prétraitement pour la saccharification de la cellulose car il nécessite l'utilisation d'un autoclave, de températures et pressions élevées et est par conséquent cot- teux en frais d'installation et en énergie L'attaque microbienne de la lignine présente l1inccnvé- nient d'être très lente L'utilisation d'un solvant sélectif de la cellulose permet d'obtenir une cellulose facilement attaquée par hydrolyse enzymatique Ce procédé décrit par TSAO et LADISCH, dans l'article intitulé cellulose to sugars" in "SCIENCE" 201 (1978) 743-745 préconise comme solvant de la cellulose le "Cadoxène", obtenu en dissolvant 5% d'oxyde de cadmium dans 28% d'éthylènediamine en solution aqueuse Le "Cadoxène" détruit la structure cristalline de la cellulose; cependant un tel solvant se prête mal - une utilisation industrielle du fait de sa toxicité En outre, l'utilisation d'un solvant de la cellulose présente l'inconvénient de nécessiter une tape supplémentaire de reprécipitation de la cellulose dissoute Le prétraitement utilisant un solvant délignifiant est décrit notamment dans le brevet U.8. 3-585*104* Ce brevet préconise l'élimination de la lignine et des hémicelluloses par cuisson des matières lignocellulosiques au moyen d'alcools et/ou de cétones aliphatiques inférieures et de préférence au moyen de l'éthanol en solution aqueuse a 20-758, Ce prétraitement favorise l'hydrolyse enzymatique, cependant une durée d'hydrolyse d'au moins 48 heures est nécessaire pour obtenir une conversion satisfaisante de la cellulose. La demanderesse a découvert qu'il est possible de réaliser la saccharification enzymatique des matières lignocellulosiques, pratiquement en 24 heures, en utilisant avant la saccharification un prétraitement par une amine et de préférence par une éthanolamine. On entend par n saccharification de matières lignocellulosiques" la saccharification de la cellulose et des hemicelluloses se trouvant dans les matières lignocellulosiquesi L'invention a par conséquent pour objet un procédé de saccharification de matières lignocellulosiques comprenant un prétraitement suivi d'une hydrolyse enzymatique au moyen de cellulases, caractérisé par le fait que le prétraitement est réalisé au moyen d'un solvant délignifiant, choisi parmi les amines et de préférence parmi les éthanolamines. Le prétraitement selon l'invention peut être appliqué à toute sorte de matières lignocellulosiques, notamment la paille ou au bois et permet d'obtenir une dégradation enzymatique de la cellulose et des hemicelluloses en un temps relativement très court. Le procédé selon l'invention est essentiellement caractérisé par le fait qu'on soumet la matière lignocellulosique à l'action d'un solvant délignifiant choisi parmi les amines et de préférence parmi les éthanolamines (monoéthanolamine, diéthanolamine et triéthanolamine) Ce prétraitement est suivi d'une hydrolyse enzymatique utilisant les cellulases provenant de bactéries ou de champignons. La mise en oeuvre d'un tel procédé permet d'obtenir, d'une manière tout a fait inattendue, un rendement en sucre de l'ordre de 908 à 95%, après seulement 24 heures d'hydrolyse enzymatique. Un tel résultat est surprenant car les prétraitements appliqués jusqu'ici ne permettaient d'obtenir des rendements de cet ordre qu'après 48 heures ou plus d'hydrolyse enzymatique. Le prétraitement peut être effectué en présence d'une amine, -avantageusement d'une éthanolamine et de préférence en présence de monoéthanolamine, a une température de 80 a 170 C avantageusement de 1400 a 17O0C et plus avantageusement â 1600C, Le rapport en poids amine utilisée pour le prétraitement : matières lignocellulosiques, peut varier entre 3 : 1 et 15 : 1 et de préférence entre 5 : 1 et 10 : 1, suivant la nature et la taille des particules des matières lignocellulosiques mise en oeuvre. Apres prétraitement, le produit de la réaction peut être séparé de l'amine par n'importe quel moyen approprié, par exemple par essorage ou filtration Le gateau obtenu peut éventuellement être lavé avec l'amine utilisée pour le pre- traitement, ce lavage étant suivi de plusieurs lavages l'eau Entre les différents lavages on procède avantageusement à un essorage ou une filtration. Avant l'essorage final, on effectue avantageusement un défibrage. Le procédé selon l'invention sera mieux compris à l'aide des exemples non limitatifs ci-après EXEMPLES DE PRETRAITEMENT EXEMPLE 1 Dans un réacteur en acier inoxydable, muni d'un agitateur, on introduit successivement 500 g de paille de blé broyée (poids sec 450 g) et 5'kg de monoéthanolamine. La température est portée a 1600C, en l'espace de 2 heures, et on maintient S cette température pendant 1 heure. Le produit obtenu est essoré 5000 tours/minute. Le gâteau est lavé avec 2,5 kg de monoéthanolamine puis essoré. Le gâteau est ensuite lavé avec 2,5 litres d'eau, puis essoré Cette opération est effectuée deux fois. Les produits- prétraités sont ensuite soumis a une hydrolyse enzymatique. EXEMPLE 2 Dans un réacteur identique 9 celui de l'exemple 1, on introduit successivemment 1 kg de copeaux de bois de hêtre (ayant un poids sec de 900 g) et 10 kg de monoéthanolamine. On met en marche l'agitation a 500 tours/minute, on porte la température à 1600C, l'augmentation de température étant de 800C/heure. Ce traitement est poursuivi a cette température pendant 3 heures. Après refroidissement, le produit obtenu est essoré à 5000 tours/minute. On obtient un gâteau constitué principalement d'un mélange de matière cellulosique et d'amine. Ce gâteau est lavé avec 20 litres d'eau 9 la température ambiante puis essoré. Cette opération est effectuée quatre fois. HYDROLYSE ENZYMATIQUE La température de l'hydrolyse enzymatique, choisie pour une activité optimale des enzymes utilisés, est généralement comprise entre 30 et 600C et de préférence entre 35 et 55 C Les matières cellulosiques sont mises en suspens ion dans l'eau, une concentration de 0,1 a 50% en poids (1 a 500 g/l), avantageusement de 0,5 a 30% en poids (5 a 300 g/l) et de préférence de 1 a 10% en poids (10 a 100 g/l). Les enzymes sont ajoutés S la suspension, sous forme de poudre ou de solution dans l'eau, de façon a obtenir- un rapport enzyme commercial : matières cellulosiques de 10-4 a 2, avantageusement de 10 à 1,5 et de préférence de 10-1 a 1. L'hydrolyse est effectuée a un pH constant, compris entre 3,5 et 6 et de préférence entre 4 et 5,5. Cette acidité constante est maintenue au moyen de milieux tampons ou d'une neutralisation continue. Afin d'éviter une dégradation par.attaque microbienne des sucres formés au cours de l'hydrolyse, la suspension de matière cellulosique peut être stérilisée avant l'hydrolyse ou être additionnée d'un antibiotique. La progression de l'hydrolyse est suivie en dosant le glucose formé, par la méthode spécifique de Boehringer et les sucres réducteurs totaux (hexoses + pentoses) par la méthode a l'acide dinitro-3,5 salicylique (DNS). EXEMPLES 3 A 14 Dans un réacteur de 4 litres contenant 3 litres -d'eau distillée, on met en suspension des matieres cellulosiques provenant des prétraitements décrits dans les exemples 1 et 2. On utilise respectivement 1%, 3% et 10% en poids de matière cellulosique par rapport l'eau. On utilise des cellulases. Trichoderma reesei (marques MILES) contenant 490 mg de protéines par gramme d'enzyme commercial, sous forme de poudre, qu'on ajoute au milieu de manière a obtenir le rapport en poids enzyme : matière cellulosique désiré. Ce rapport est dans les exemples respectivement de 0,1 et i. Le pH est maintenu 4,8 par un tampon au citrate de sodium. La température est maintenue 500C pendant la durée de 1 'hydrolyse L'évolution de l'hydrolyse est suivie pendant 48 heures en faisant des prélèvements et en dosant les sucres formés. Les conditions opératoires et les résultats figurent sur les tableaux 1 et 2. Le taux de conversion indiqué correspond au rapport en poids sucres réducteurs totaux produits : sucres potentiels présents dans les matières cellulosiques utilises pour l'hydrolyse. TABLEAU 1 Hydrolyse de paille prétraitée Teneur en matières i 3 10 cellulosiques, % poids Concentration d'en zymes, % en poids 0,1 1 0,3 3 1 10 Enzymes ::matières cellulosiques, rap port en poids Taux de conversion après une durée d'hydrolyse de 5 heures 0,50 0,85 0,60 0,93 0,32 0, j 24 heures 0,90 0,98 0,74 0,97 0,42 0,8 48 heures 0,99 0,99 0,95 0,99 0,60 0,9 TABLEAU 2 Hydrolyse de copeaux de bois prétraités Teneur en matières cellulosiques, % en poids 1 3 10 Concentration d'en zymes % en poids 0,1 1 0,3 3 1 10 Enzymes matières cel lulosiques, rapport en poids 0,1 1 0,1 1 0,1 1 Taux de conversion Taux de conversion après une durée d'hydrolyse de 5 heures 0,40 0,78 0,52 0,90 0,35 0, 65i 24 heures 0,81 0,98 0,70 0,95 0,47 0,85 48 heures 0,98 0,98 0,94 0,98 0,65 0,9 Afin de mieux mettre en évidence l'influence du prétraitement, selon l'invention, sur l'hydrolyse enzymatique, on a réalisé des essais comparatifs sur les mêmes-matières lignocellulosiques, en utilisant des prétraitements différents, à savoir broyage ou hydrolyse acide. L'influence de ces prétraitements sur les rendements de l'hydrolyse enzymatique est illustrée par les exemples 15 ci.27 ci-aprèas EXEMPLES 15 A 26 (exemples de comparaison) Les matériaux lignocellulosiques utilisés comme matière première dans les exemples 1 et 2 sont broyés pour obtenir des particules d'une taille moyenne de 1 mm qu'on soumet a une hydrolyse enzymatique, dans les mêmes conditions que dans les exemples 3 a 14. Les conditions utilisées et les résultats obtenus sont indiqués sur les tableaux 3 et 4 ci-dessous. TABLEAU 3 Hydrolyse de la paille de blé prétraitée par broyage Teneur en matières cellulosiques, % poids 1 3 10 Concentration d'en zymes, % en poids 0,1 1 0,3 3 1 10 Enzymes ::matières cellulosiques, rap port en poids 0,1 1 0,1 1 0,1 1 Taux de conversion après une durée d'hydrolyse de 5 heures 0,01 0,02 0,01 0,03 0,02 0,0 48 heures 0,07 0,27 0,05 0,25 0,05 0,2 TABLEAU 4 Hydrolyse de copeaux de bois de hêtre prétraités par broyage Teneur en matières cellulosiques, % en poids 1 3 10 centration d'en es, % en poids 0,1 1 0,3 3 1 10 Enzymes : matières cellulosiques, Rapport en poids 0,1 1 0,1 1 0,1 1 0,1 1 0,1 1 Taux de conversion d'hydrolyse de 5 heures 0 0,02 0,01 0,02 0,01 0,02 48 heures 0,05 0,20 0,03 0,21 0,03 0,18 On constate que l'hydrolyse enzymatique de matières lignocellulosiques n'ayant pas subi le prétraitement selon l'invention donne des rendements beaucoup plus faibles EXEMPLE 27 Dans un réacteur en acier inoxydable, muni d'un agitateur, on introduit successivement 500 g de paille.de blé hachée, identique a celle utilisée pour l'exemple 1, et 5 litres d'acide sulfurique a 0,5t en poids.Le prétraitement acide est effectué pendant 2 heures à 1000C, Le produit obtenu est essoré puis lavé deux fois à l'eau. Après ce traitement, la paille contient-45,5% en poids de cellulose, 19% en poids d'hémicellulose et 17% en poids de lignine. La paille prétraitée est soumise ! un traitement d'hydrolyse enzymatique, dans des conditions identiques à celles utilisées dans les exemples 3 à 14. La teneur en matière cellulosique est de 1% en poids (10 g/l) et le rapport enzyme : matière cellulosique est de 1, Après 24 heures d'hydrolyse, le taux de conversion des sucres potentiels, présents dans la paille prétraitée, en sucres réducteurs totaux est de 0,58. Les résultats obtenus par l'hydrolyse enzymatique des matières lignocellulosiques prétraitées par broyage ou par hydrolyse acide dans les exemples 15 à 27, montrent que même avec une faible teneur en matière cellulosique à hydrolyser et des rapports enzymes/matières cellulosiques élevés, les taux de conversion sont beaucoup plus faibles que par le procédé selon l'invention Le mécanisme par lequel le procédé de prétraitement selon l'invention agit sur l'hydrolyse n'est pas tout à fait élucidé, cependant, on a découvert que les éthanolamines et plus particulièrement la monoéthanolamine favorisent, dans certaines conditions, la croissance des champignons Trichoderma reesei qui produit les cellulases utilisées au cours de la degrada- tion enzymatique. Cette action est illustrée par les exemples suivants dans lesquels plusieurs solvants délignifiants ont été essayés à diverses concentrations. EXEMPLES 28 A 39 Une souche de Trichoderma reesei est cultivée (inoculum 0,8 g/l) dans un milieu liquide contenant du malt, de l'extrait de levure et le solvant étudié L'incubation est réalisée dans un incubateur orbital pendant 72 heures d 290C L'effet des solvants sur la croissance est évalué par examen microscopique, par détermination de la vitalité et par mesure du poids sec par comparaison avec des cultures témoins effectuées en l'absence de solvant L'influence des différents solvants est indiquée de la manière suivante dans le tableau 5 ci-après. O sans influence 0+ influence légèrement favorable 0- influence légèrement défavorable D influence défavorable I inhibition de la croissance. TABLEAU 5 Concen Solvant tration \ testé dans le milieu Diméthyl Ethylène Monoétha g/l \ sulfoxyde diamine nolamine 0,25 0- D 0+ 0,5 o~ O- D 1 O- D 5 . I I Les résultats obtenus montrent, qu' certaines concentrations, la monoéthanolamine exerce, d'une manière inattendue, une influence favorable sur la croissance de Trichoderma reesei Un autre avantage inattendu du procédé selon l'invention est par conséquent que l'on peut cultiver le champignon Trichoderma-reesei sur les matières cellulosiques à hydrolyser et produire ainsi d'une manière plus économique des enzymes non contaminés et mieux a-daptés- aux matières cellulosiques å traiter Les enzymes obtenus au cours de la culture peuvent-être utiliséS directement, après séparation du milieu, par tout moyen connu. La production de cellulases partir du champignon Trichoderma reesei peut être réalisée, en fioles à toxines aérées et agitées Selon un mode de réalisation préféré l'ae- ration est de 25 1/heurte pendant les quatre premiers jours puis de 15 1/heurte par la suite. L'agitation peut être réalisée au moyen par exemple d'un agitateur à va-et-vient å raison de 40 cycles par minute. La température est avantageusement de 290C environ Le milieu de culture peut être, par exemple de la paille prétraitée, dans les conditions de l'exemple 1, à une concentration d'environ 1% (10 g/I). Les solutions de cellulases sont avantageusement recueillies par filtration sur filtre Millipore de diamètre 0,45 microns REVENDICATIONS 1. Procédé de saccharification de matières lignocellulosiques comprenant un prétraitement suivi d'une hydrolyse enzymatique au moyen de cellulases, caractérisé par le fait que le prétraitement est réalise au moyen d'un solvant délignifiant choisi parmi les amines et de préférence parmi les éthanolamines 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on utilise comme éthanolamine la monoéthanolamine, 3. Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que le rapport amine : matières cellulosiques est de 3 à 15 et de préférence de 5 à 10. 4. Procédé selon les revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le prétraitement est effectué à une tempéra- ture de 80 à 1700C, 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le prétraitement est effectué a" une température de 140 à 1700C. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le prétraitement est réalisé a" une température d'environ 1600C, 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que l'hydrolyse enzymatique est réalisée au moyen de cellulases provenant de Trichoderma reesei 8. Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 7, caractérisé par le fait que la concentration du milieu d'hydrolyse en matières lignocellulosiques est de 0,5 à 30% en poids (5 à 300 g/l). 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que la concentration du milieu d'hydrolyse en matières lignocellulosiques est de 1 à 10% en poids (10 à 100 g/l). 10 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait qu'au cours de l'hydrolyse enzymatique le rapport enzyme : matières lignocellulosiques est de 10-4 2. il. Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que le rapport enzyme : matières lignocellulosiques est de 10-2 à 1,5. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que le rapport en poids enzyme : matières lignocellulosiques est de 10-1 à 1. 13. Procédé selon les revendications 1 à 12, caractérisé par le fait que la température d'hydrolyse est de 35 à 55 C. 14. Procédé selon les revendications 1 à 14, caractérisé par le fait que le pH du milieu d'hydrolyse est de 3,5 à 6. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que le pH du milieu d'hydrolyse est de 4 à 5,5.