FR 2531453 A1 19840210 FR 8312710 A 19830802 La présente invention se rapporte à un procédé pour déterminer l'activité d'un enzyme, d'un inhibiteur d'enzyme, d'un activateur d'enzyme ou d'une substance zymogène qui consiste à permettre à l'enzyme de réagir avec un substrat de la formule suivante: R 1- 2 () o R 1 représente un acide aminé ou un oligopeptide combiné sous forme d'ester par le carbone du groupe carboxyle terminal dudit acide aminé ou dudit oligo- peptide et R 2 représente un atome d'hydrogène ou de brome afin d'hydrolyser le substrat, puis à permettre au produit de l'hydrolyse de la formule O 2 de réagir avec un sel FR-ITR (Fast-Red-ITR salt(sel de diazonium du N,N'diéthyl-4-méthoxymétanilamide)) afin de former un pigment et à déterminer le pigment. L'enzyme auquel il est fait référence ici est celui qui est capable d'hydrolyser le composé de la formule (I) Ces enzymes comprennent les protéases du type sérine comme la trypsine, la chymotrypsine, la kallikréine, la plasmine, la thrombine, l'urokinase, le facteur Xa, Cls et Clr et d'autres protéases et estérases, et des enzymes inconnus capables d'hydrolyser les composés de la formule (I) Comme exemples de la détection des enzymes inconnus par le procédé de l'invention, il peut être fait mention de la détermina- tion électrophorétique de la configuration des enzymes du-sang oude l'murine etde la colorationdesceiules. Le présent procédé est effectivement appliqué à la détection de la protéase sérine du type E C. 3.4 21 parmi divers autres enzymes Parmi les protéases du type sérine qui sont plus particulièrement détectées avec efficacité par le présent procédé, il convient de citer la trypsine, la chymotrypsine,'la kallikréine, la plasmine, la thrombine, l'urokinase, le facteur Xa, Cls et Clr Il est également possible d'appliquer le présent procédé à la recherche d'inhibiteurs, d'acti- vateurs et de zymogène pour les-enzymes ci-dessus, tels que, par exemple, l'antithrombine III, l'héparine, l'a 2-plasmine-inhibiteur,a 1-trypsineinhibiteur, la streptokinase, Echis carinatus venom (ECV), la prékal- likréine, le plasminogène et la prothrombine. Dans la formule (I), R 1 représente un acide aminé ou un oligopeptide qui est combiné sous la forme d'un ester par le C-terminal du groupe carboxyle dudit acide aminé ou dudit oligopeptide L'expression "acide amin é"ou oligopeptide" est utilisée ici pour désigner n'importe quel acide aminé ou oligopeptide simple comprenant 2 à 4 acides aminés qui peuvent être identiques ou différents, le terminal N restant libre ou portant un groupe acyle ou sulfonyle Comme exemples d'acides aminés, on peut mentionner les formes L, D et DL de Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Phe, Gln, Glu, pyro Glu, Lys, Lys(Me), Arg et Tyr. Comme exemples de substrats appropriés de la formule (i), on peut mentionner ceux dans lesquels R 1 est A-R 3-R 4 R 5-R 6-CO-, o A représente un atome d'hydrogène ou un groupe acyle ou sulfonyle, R 3 à R 5 représentant chacun Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Gln, Glu, pyro Glu, ou une simple liaison, et R 6 représente Lys, Lys(Me), Arg, Met ou Tyr Les exemples préférés de A comprennent un atome d'hydrogène Ac, Bz, Tos, Boc, Cbz, dansyle et Glt Des exemples de substrats préférés sont ceux dans lesquels R 1 est A-Tyr-, A-Ar g-, A-Lys-, A-Gly-Lys-, A-Phe-Arg- , A-Gly-Gly-Arg-, A-Leu-Gly-Arg-, A-Gln-Gly-Arg-, A-pyro Glu-Gly-Arg-, ALeu-Ala-Arg-, A-Pro-Phe-Arg-, A-Val-Leu-Lys-, A-Phe-Val-Arg-, ou A-Ile-Glu-Gly-Arg-. Des exemples des substrats les plus volontiers utilisés sont ceux de la formule (I) de Tos-Lys-a-NE 1 Ac-Tyr-Q-NE, Bz-Leu-Ala-Arg-a-NE, Ac-PheArg-0 NE, H-Pro-Phe-Arg NE, et Ac-Gly-Lys-a-NE. Dans la formule (I), R 2 est un atome d'hydrogène ou de brome Comme exemples de dérivés du brome, on peut mentionner ceux dans lesquels l'atome de brome est attaché à la position 6 Ainsi, le composé de la formule (I) selon la présente invention est un composé dans lequelde Cterminal des acides aminés mentionnés ci-dessus ou des oligopeptides est combiné avec le composé de la formule R HO _R 2 par une liaison ester. Bien que la durée et la température de la réaction entre l'enzyme et le substrat dépendent des réactivités et des quantités des deux réactants, on peut dire que le temps de réaction est généralement égal ou inférieur à 2 heures, étant de préférence compris entre 30 secondes et 90 minutes, tandis que la température de réaction est généralement comprise entre 20 et 40 C, de préférence entre 20 et 37 C Le sel FR-ITR (Fast Red-ITR salt (sel de diazonium N,N'- diéthyl-4-méthoxymétanilamide)) a la formule suivante: SO 2 N (CI 2 X 12 Ma'X lcs B 3 (o X représente un atome d'halogène), de préférence sous la forme d'un produit d'addition avec 1/2 Zn Cl 2. Le pigment formé par la réaction entre le sel FR-ITR et le composé HO R qui est produit par l'hydrolyse du substrat (formule I) avec un enzyme, est aussi un azopigment La durée de cette réaction colorée est de 2 heures ou moins, éventuellement de 30 secondes à 90 minutes La réaction entre un substrat et un enzyme et la réaction colorée avec le sel FR-ITR peuvent être exécutées successivement ou simultanément La quantité de pigment qui est formée est mesurée spectroscopiquement en utilisant un colorimètre ou un spectrophotomètre ou visuellement. La longueur d'onde utilisée pour la mesure spectroscopi- que est 450 à 550 nm dans la plupart des cas L'estima- tion visuelle est utilisée dans la détermination par comparaison avec un étalon, dans la détermination électrophorétique de la configuration d'un enzyme ou dans la coloration de la cellule. La détermination de l'activité d'un enzyme est importante dans le contrôle de la qualité des préparations contenant des enzymes, dans les examens cliniques et dans le diagnostic de diverses maladies en examinant les enzymes contenus dans le sang ou l'urine. On connait divers procédés pour contrôler l'activité enzymatique Le procédé utilisant un substrat synthétique est celui le plus fréquemment utilisé. Parmi les substrats synthétiques, un ester de naphtol d'un acide aminé ou un peptide est connu comme étant un excellent substrat (demande de brevet japonais "kokai" (publiée) n 63 049/79 et 59 151/80; par la suite, le procédé décrit dans ces demandes sera qualifié de "procédé publié") Selon le procédé publié, dans lequel l'activité enzymatique est contrôlée en utilisant un ester du naphtol, le naphtol libéré par l'hydrolyse avec une enzyme peut réagir avec un sel FVB (Fast Violet B salt (sel de diazonium du 6-benzamido-4-méthoxy-m-toluidine)) pour donner un azo pigment qui est alors déterminé Dans le procédé publié, la réaction entre le napthtol libéré et le sel FVB est exécutée pendant un refroidissement dans l'eau glacée, car autrement il se produit une hydrolyse du diazonium lui-même ou une interaction du diazonium qui se traduit par une fluctuation de l'absorbance ou du X observée Par contre, dans le procédé de la présente max invention, la réaction entre le composé libéré Hot C r R 2 HO y et le sel FR-ITR est exécuteé dans' une gamme de tempéra- tures comprise entre O C et 40 C, sans provoquer une fluctuation de l'absorbance observée ou du XA, comme max ono il est décrit plus loin dans l'exemple 1 Dans le procédé publié, la durée de la réaction entre le naphtol libéré et le sel FVB doit être étroitement con- trôlé car l'absorbance varie avec la durée de la réaction Par contre, dans le procédé de la présente invention, la réaction entre le composé libéré Ho R 2 et le sel FR-ITR est rapidement achevée et l'absorbance reste inchangée, même après l'achèvement de la réaction. Comme il a été expliqué ci-dessus, dans le procédé publié, il est nécessaire de changer les conditions de température du système de réaction de celles (généralement de 200 à 400 C) de l'étape de réaction entre l'enzyme et le substrat pour arriver à celles ( O C ou approximativement) convenant à l'étape de la réaction colorée et, de plus, pour effectuer la mesure d'absorbance en accord avec le programme prescrit En conséquence, un avantage important du procédé de la présente invention est qu'il n'est plus nécessaire de maintenir différentes températures dans les deux étapes et d'établir une limite de temps ou de durée précise dans l'étape de la réaction colorée Ceci a une grande importance car la présente invention, outre qu'elle simplifie la procédure d'analyse, rend aussi possible l'exécution de cette procédure dans un analyseur automatique o il est difficile de changer la température opératoire. Un autre inconvénient du procédé publié est la fluctuation des valeurs observées qui se produit fréquemment au cours de la détermination de l'activité des enzymes dans l'urine On a trouvé que cette fluctuation était causée par la présence d'ions nitrite qui est inévitable quand un microorganisme contamine l'urine La présence d'ions nitrite dans l'urine, qui est indépendante des enzlmes, a été un obstacle à l'application du procédé publié pour la détermination des enzymes dans l'urine. (Nippon Rinsho (Japan Clinic) volume 37-, numéro spécial de l'été, 2668 ( 1979)> Le procédé de l'invention a l'avantage d'être à-l'abri des effets nuisibles des ions nitrite, comme il est décrit plus loin dans l'exemple 2. Dans la pratique, il arrive souvent que la réaction entre un enzyme et un substrat. soit terminée par l'acidification du mélange de réaction avant la réaction colorée Dans le procédé publié utilisant le sel FVB, la réaction colorée ne se déroule pas dans une région acide (p H 1-4), alors que dans le procédé de l'invention, la coloration a lieu même dans une telle région acide De ce fait, un autre avantage du présent procédé est que, après que la réaction entre l'enzyme et le substrat a été terminée par l'acidification, Ie mélange de réaction peut être directement soumis à la réaction de coloration. Comme il est décrit dans ce qui précède, la présente invention, utilisant le sel FR-ITR comme agent de coloration, est un excellent procédé pour déterminer l'activité enzymatique, gui offre un certain nombre d'avantagesimportants. Dans le présent mémoire descriptif et dans les revendications qui y sont annexéesg on a utilisé les abréviations suivantes Gly glycyle -HN-CH 2-CO CH Ala alanyle i 3 -HN-CH-CO- Val valyle CH(CH 3)2 -._ -HN-CH-CO- Leu leucyle CH(CH 3)2 i CH 2 -NH H-CO- 25314 5 3 Ile isoleucyle CH 3 Uh 2 un %un 3) -i Nn-ulrl-uu- méth-ionyle Met CH 3 b (CH 2) 2 -NH-CH-CO- c >Co- N C 6 H 5 I Cri 2 I -Nh-un-%-U- CONH 2 (CH 2) 2 -NH-H-co- COOH %-x I 212 Pro prolyle Phe phénylalanyle Gln glutaminyle Glu glutamyle 2 53 1 4 5 3 CO- N pyro Glu pyroglutamyle Tyr tyrosyle OH CH 2 -NM-Uh-UU- NE 2 %-n 2 14 -NH-CH-CO- Lys lysyle NH 2 (CH 2) 4 -N-CE-CO- CE 3 (X-N-methyllysyle Lys (Me) NE 2 C=NH NE i (CH 2) 3 i -NH-CH-CO- arg inyle Arg CH 3 Co- acétyle (C::)-co- CE -C SO - 3 O (CH 3)3 COCO- CH 2 OCO- -D benzoyle p-toluenesulfonyle tert-butoxy ' carbonyle benzyloxycarbonyle dansyle rsy 1 glutaryle 4, methyl HOOC (CE 2) 3-Co- CH 3 ester de naphthyle -:.-r-e-NE ester de 6-bromo- -naphthyle *iméthylsulfoxide 253145 3 -0 ( Br Le procédé pour déterminer l'activité enzymatique qui fait l'objet de l'invention est illustré plus en détail ci-après en regard d'exemples de référence o tous les acides aminés sont de la forme L, sauf spécification contraire. Cette description, donnée à titre purement illustratif et nullement limitatif, sera faite en référence aux dessins annexés dans lesquels: la figure 1 montre l'influence des ions nitrite sur l'absorbance observée avec le procédé de l'invention et avec le procédé classique, la figure 2 montre la thrombine avec 1 la figure 3 montre la trypsine avec ce la figure 4 montre l'urokinase, la figure 5 montre la plasmine, la figure 6 montre facteur Xa, la figure 7 montre Cir, la figure 8 montre Cli, la figure 9 montre la chymotrypsine, la de la de la de figure 10 montre la thrombine, figure 11 montre la trypsine, figure 12 montre 1 'urokinase, les résultats d'analyse de procédé objet de l'invention, les résultats d'analyse de L procédé, les résultats d'analyse de les résultats d'analyse de les résultats d'analyse du les résultats d'analyse du les résultats d'analyse du les résultats d'analyse de les résultats d'analyse les résultats d'analyse les résultats d'analyse la de la de figure 13 montre les résultats d'analyse l'antithrombine III, figure 14 montre d'autres résultats d'analyse l'antithrombine III, la figure 15 montre les résultats d'analyse de la prékallikréine présente dans un plasma, la figure 16 montre les résultats de la thrombine, la figure 17 montre la configuration d'un enzyme dans le sang déterminée par le procédé selon l'invention, la figure 18 montre les résultats d'analyse du plasminogène, la figure 19 montre les résultats d'analyse de l'antiplasmine, la figure 20 montre les résultats de l'héparine, la figure 21 montre les résultats de l'antithrombine III, et la figure 22 montre les résultats d'analyse de la prothrombine. EXEMPLE 1 Influence de la température de réaction et de la durée de celle-ci sur la détermination de l'activité de la kallikreine dans l'urine en utilisant HPro-Phe-Arg-a-NE comme substrat et un sel FR-ITR ou FVB comme agent de coloration. A 1 ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à 50 m M (p H 7) contenant 0,015 % de sodium dodécyl sulfate_(SDS), on ajoute 0,1 ml d'urine et 0,1 ml d'une solution aqueuse à 1,5 m M de H-Pro-Phe- Arg-a-NE On laisse le mélange incuber à 37 C pendant 30 minutes Apres l'addition de 0,1 ml d'une solution aqueuse de sel FR-ITR à 1 % ou d'une solution aqueuse à 1 % de sel FVB, on laisse le mélange réagir dans les différentes conditions de température et de temps suivantes: O C-10 minutes, C-10 minutes, 25 C-30 minutes, 37 -10 minutes, et 37 C-30 minutes Ensuite, on incorpore dans - chaque mélange de réaction 1 ml d'acide acétique glacial et on mesure l'absorbance Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 1 ciaprès. TABLEAU 1 Conditions de Condtons de sel FVB sel FR-ITR réaction Temp, Temps Absorbance o C min ma oc min (Amax ' nm) (Amax, inm) 0 10 0,620 ( 500) 0,620 ( 477) 10 0 t 153 ( 510) 0,628 (") , 0,207 ( 510) 0625 ( 37 10 0, 227 ( 513) 0,625 () r 0, 334 ( 513) 0,621 (") _ _ _ j_ _ _ _ _ _ Comme dans le tableau on le voit par les résultats indiqués 1, quand on utilise le sel FVB, l'absorbance et Xmax sont tous deux affectés par la durée et la température de la réaction, comme - si la concentration de la kallikreine dans l'urine avait été modifiée, tandis que quand on utilise le sel FR-ITR selon l'invention, il n'y a pratiquement aucun changement dans l'absorbance ou dans Xmax' les deux valeurs restant pratiquement constantes. EXEMPLE 2 Influence du nitrite de sodium sur la détermination de l'activité de la kallikreine dans l'urine en utilisant le H-Pro-Phe-Arg-c L-NE comme substrat et le sel FR-ITR ou FVB comme agent de coloration. A 1 ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à 50 m M (p H 7) contenant 0,015 % de SDS, on ajoute 0,1 ml d'urine contenant du nitrite de sodium à une concentration de 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 m M et 0,1 ml d'une solution aqueuse à 1,5 m M de H-Pro-Phe-Arg-a-NE On laisse chaque mélange incuber à 37 C pendant 30 minutes Dans le cas de l'utilisation du sel FRITR on ajoute 0,1 ml d'une solution aqueuse à 1 % de sel FR-ITR et on laisse le mélange résultant réagir à 370 C pendant minutes Après l'addition de 1 ml d'acide acétique glacial, on mesure le mélange de réaction pour déterminer l'absorbance à 475 nm Dans le cas de l'utilisation du sel FVB, on ajoute 0,1 ml d'une solution aqueuse à 1 % de sel FVB et on laisse le mélange réagir à O C pendant 10 minutes Apres l'addition de 1 ml d'acide acétique glacial, on mesure l'absorbance du mélange de réaction à 505 _nm. Les résultats de la mesure sont ceux représentés sur la figure I o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la concentration du nitrite de sodium; la courbe marquée avec des " O " représente le cas de l'utilisation selon l'invention du sel FR-ITR_ tandis que la courbe marquée avec "O" représente le cas du sel FVB Il ressort des résultats ci- dessus que Auand on utilise le sel FVB Ecomme agent de coloration, l'absorbance est considérablement influencée par la présence du nitrite de sodium comme si la concentration de la kallikreine dans l'urine avait été modifiée, tandis qu'avec le sel FR-ITR utilisé conformément à l'invention, l'absorbance présente une valeur pratiquement constante, et n'est pas affectée par la présence du nitrite de sodium. EXEMPLE 3 Procédure d'analyse de la thrombine en utilisant Tos-Lys-a-NE: A 1,7 ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à 50 m M (p H 7), on ajoute 0,1 ml d'une solution de thrombine ( 1, 2 ou 3 NIH-U/ml) dans une solution saline physiologique et 0,2 ml d'une solution aqueuse à 1 m M de Tos-Lys-a-N Eo On laisse chaque mélange incuber à 25 C pendant 10 minutes. Après l'addition de 0,2 ml d'une solution saline aqueuse à 1 % de sel FRITR, on laisse le mélange réagir à 25 C pendant 5 minutes On ajoute à ce mélange 2 ml d'acide acétique à 50 % et on mesure l'absorbance à 475 nm Les résultats des mesures ci-dessus sont ceux que montre la figure 2, d l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité de thrombine. EXEMPLE 4 Procédure d'analyse de la trypsine en utilisant Tos-Lys-c-NE: A 1,7 ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à 50 m M (p H 7), on ajoute 0,1 mld'une solution de trypsine ( 0,25, 0,5 ou 0,75 'ug/ml) dans une solution saline physiologique et 0,2 ml d'une solution à 1 m M de Tos-Lysa-NS On incube chaque mélange à 25 C pendant 15 miîutes Après l'addition de 0,2 ml d'une solution aqueuse à 1 % de sel FR-ITR, on laisse le mélange réagir à 25 C pendant 5 minutes On incorpore ensuite dans le mélange de réaction 2 ml d'acide acétique à 50 % esure l'absorbane à 475 n Les résultats et on mesure l'absorbance à 475 nm Les résultats des mesures sont ceux que montre la figure 3 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité de trypsine. EXEMPLE 5 -Procédure pour analyser l'urokinase en utilisant Ac-Gly-Lys-a-NE: A 1,7 ml d'une solution tampoîide phosphate de sodium à 50 m M (p H 7), on ajoute 0,1 ml d'une solution d'urokinase ( 60, 120, 180, 240 ou 300 UI/ml) dans une solution saline physiologique et 0,2 ml d'une solution aqueuse à 1 m M de Ac-Gly-Lys-a - NE On soumet chaque mélange à une incubation de 15 minutes à 25 C Apres l'addition de 0,2 ml d'une solution aqueuse à 1-% de sel FR-ITR, on laisse le mélange réagir à 25 C pendant 5 minutes. On incorpore ensuite dans le mélange de réaction 2 ml d'acide acétique à 50 % et on mesure l'absorbance à 475 nm Les résultats des mesures sont ceux que montre la figure 4 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité d'urokinase. EXEMPLE 6 Procédure pour analyser la plasmine en utilisant H-D-Val-Leu-Lys-c L-NE: A 1,7 ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à 50 m M (p H 7), on ajoute 0,1 ml d'une solution de plasmine ( 0,125, 0,25, 0,375, 0,5 ou 0,625 CU/ml) dans une solution saline physiologique et 0,2 ml d'une solution aqueuse DMSO à 10 % contenant lm M de H-D-Val-Leu-Lys-a-NE On soumet chaque mélange à une incubation de 15 minutes à 25 C. Après l'addition de 0,2 ml d'une solution aqueuse à 1 % de sel FR-ITR, on laisse le mélange réagir à 25 C pendant 5 minutes On incorpore ensuite dans le mélange de réaction 2 ml d'acide acétique à 50 % et on mesure l'absorbance à 475 nm Les résultats des mesures sont ceux que montre 11 figure 5 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité de plasmine. EXEMPLE 7 Procédure pour analyser le facteur Xa en utilisant Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-aNE: A 1,7 ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à 50 ml (p H 7), on ajoute 0,1 ml d'une solution de facteur Xa ( 0,05, 0,1, 0,15, ou 0,2 U/ml) dans une solution saline physiologique et 0,2 ml d'une solution aqueuse de DMSO à 10 % contenant 1 m M de Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-a-NE On fait subir à chaque mélange une incubation à 200 C pendant 15 minutes Après l'addition de 0,2 ml d'une solution aqueuse à 1 % de sel FR-ITR, on laisse le mélange réagir à 20 C pendant 5 minutes On incorpore ensuite dans le mélange 2 ml d'acide acétique à 50 % et on mesure l'absorbance à- 475 nm -Les résultats des mesures sont ceux que montre la figure 6 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité de facteur Xa. EXEMPLE 8 Procédure pour analyser Clî en utilisant Ac-Gly -Lys-a-NE: A 1,7 ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à 50 m M (p H 7), on ajoute 0,1 ml d'une solution de Cl I ( 2,5, 5, 7,5, ou 10 1 g/ml) dans une solution saline pbysiologique et 0,2 ml d'une solution aqueuse à 1 m M de Ac-GlyLys-a-NE On fait subir à ce mélange une incubation de 15 minutes à 25 C Après l'addition de 0,2 ml d'une solution aqueuse à 1 % de sel FR-ITR, on laisse le mélange réagir à 250 C pendant 5 minutes On incorpore ensuite dans le mélange 2,0 ml d'acide acétique à 50 % et on mesure l'absorbance à 475 nm Les résultats des mesures sont ceux que montre la figure 7 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité de Clr. EXEMPLE 9 Procédure d'analyse de Cls en utilisant Ac-Tyr-a-NE: A 1,7 ml d'une solution -tampon de phosphate de sodium à 50 m M (p H 7), on ajoute 0,1 ml d'une solution de Cls ( 2,5, 5, 7,5 ou 10;lg/ml) dans une solution saline physiologique et 0,2 ml d'une solution aqueuse de DMSO à 10 % contenant 1 m M de Ac-Tyr-c -NE On fait subir à ce mélange une incubation de 15 minutes à 25 C Après l'addition de 0,2 ml d'une solution aqueuse à 1 % de sel FR-IT Re on laisse le mélange réagir à 25 C pendant 5 minutes. On incorpore ensuite au mélange de réaction 2 ml d'acide acétique à 50 % et on mesure l'absorbance à 475 nm Les résultats des mesures sont ceux que montre la figure 8 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité de Cls. EXEMPLE 10 - Procédure pour analyser la chymotrypsine en utilisant Ac-Tyr-a-NE: A 1,7 ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à 50 m M (p H 7), on ajoute 0,1 ml d'une solution de chymotrypsine ( 0,2, 0,4, 0,6 ou 0,8 g/ml) dans une solution saline physiologique et 0,2 ml d'une solution aqueuse de DMSO à 10 % contenant 1 m M de Ac-Tyr-a-NE On fait subir à ce mélange une incubation de 15 minutes à 25 C Après l'addition de 0,2 ml d'une solution aqueuse à 1 % de sel FR-ITR, on laisse le mélange réagir à 25 C pendant 5 minutes. On incorpore ensuite à ce mélange de réaction 2 ml d'acide acétique à 50 % et on mesure l'absorbance à 475 nm Les résultats des mesures sont ceux représentés sur la figure 9 o l'ordonnée représente l'absorbance et lgabscisse la quantité de chymotrypsine. EXEMPLE 11 Procédure pour analyser la thrombine en utilisant Bz-LE-Ala-Arg-a-NE: A 1, 7 ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à 50 m M (Ph 7), on ajoute 0,1 ml d'une solution de thrombine ( 0,25, 0,5, 0,75 ou 1 NIH-U/ml) dans une solution saline physiologique et 0,2 ml d'une solution aqueuse à 1 m M de Bz-Leu-Ala-Arg-a-NE. On fait subir à ce mélange une incubation à 25 C pendant 15 minutes Après l'addition de 0,2 ml d'une solution aqueuse à 1 % de sel FR-ITR, on laisse le mélange réagir à 25 C pendant 5 minutes O On incorpore ensuite dans le mélange de réaction 2 ml d'acide acétique à 50 % et on mesure l'absorbance à 475 nmo Les résultats de ces mesures sont ceux que montre la figure 10 o l'ordonnée représente l'abserbance et l'abscisse la quantité de thrombineo EXEMPLE 12 Procédure pour analyser la trypsine en utilisant Tos-Lys-(Me)-5-NE: A 1 a 7 ml d'une solution tampon à 50 mr 4 de Tris-HCL (p H 7), on ajoute 0,1 ml d une solution de trypsine ( 0,25, 0,5, 0,75 ou 1: g/ml) dans une solution saline physiologique et 0,2 ml d'une solution aqueuse à 1 m 14 de Tos-Lys(ME)-5-NE On fait subir à ce mélange une incubation de 15 minutes a 25 Co Après l'addition de 0,2 ml d'une solution aqueuse à 1 % de sel FR-ITR, on laisse le mélange réagir à 25 C pendant 5 minutes A ce mélange de réaction on Aj oute ensuite 2 ml d'acide acétique glacial et on mesure l'absorbance à 495 nm Les résultats de ces mesures sont ceux que nous montre la figure 11 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité de trypsine. EXEMPLE 13 Procédure pour analyser l'urokinase en utilisant Ac-Gly-Lys-6-Br-e-NE: A 1,7 ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à 50 m M (p H 7), on ajoute 0,1 ml d'une solution d'urokinase ( 300, 600, 900 ou 1200 UI/J 1) dans une solution saline physiologique et 0,2 ml d'une solution aqueuse à 1 m M de Ac-Gly-Lys-6-Br-e-NE. On fait subir à ce mélange une incubation de 15 minutes à 25 C Après l'addition de 0,2 ml d'une solution à 1 % de sel FR-ITR, on laisse le mélange réagir à 25 C pendant 5 minutes On incorpore ensuite au mélange de réaction 2 ml d'acide acétique glacial et on mesure l'absorbance à 500 nm Les résultats des mesures sont ceux que montre la figure 12 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité d'urokinase. EXEMPLE 14 Procédure pour analyser l'antithrombine III en utilisant Tos-Lys-a-NE: A l ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à 50 m M (p H 7,4) contenant 1 UI/ml d'héparine, on ajoute 1,5 i 1 de plasma contenant de l'antithrombine III à une concentration de 0,25, 50, 75, 100 ou 125 % de celle d'un plasma normal et 0,1 ml d'une solution de trombine ( 1,5 NIHU/ml) dans une solution saline physiologique Au mélange, qui a subi une incubation de 10 minutes à 37 C, on ajoute 0,1 ml d'une solution aqueuse à 2 m M de Tos-Lys-a-NE On fait subir au mélange résultant une nouvelle incubation de 10 minutes à 37 C. Après l'addition de 0,1 ml d'une solution à 1 % de sel FR-ITR dans de l'acide acétique à 50 %, on laisse le mélange réagir à 37 C pendant 5 minutes. On incorpore ensuite dans le mélange de réaction 1 ml d'acide acétique à 50 % et on mesure l'absorbance à 475 nm Les résultats des mesures sont ceux que montre la figure 13 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité d'antithrombine III. EXEMPLE 15 Procédure pour analyser l'antithrombine I It par un autoanalyseur utilisant Tos-Lys-a-NE A 20,il d'un plasma contenant de l'antithrombine III à une concentration de 0, 25, 50, 75, 100 ou % de sel du plasma normal, on ajoute 1 ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à 50 m M (p H 7,4) contenant de la thrombine ( 4 U/ml), de l'héparine ( 5 U/ml) , et de l'albumine de sérum bovin ( 1 mg/ml) A-ce mélange, qui a subi une incubation de 2 minutes à 37 C, on ajoute 0,1 ml d'une solution aqueuse à 2 m M de Tos-Lys-a-NE contenant 1 % de sel FR-ITR et on lui fait subir une nouvelle incubation de 30 secondes à 37 C. A ce mélange de réaction on ajoute 1 ml d'acide acétique à 50 % et, uneminute après, on mesure l'absorbance à 540 nm L'autoanalyseur utilisé était un "Cobas-Bio" (Kabi Co) Les résultats des mesures sont ceux représentés sur la figure 14 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité d'antithrombine III. EXEMPLE 16 Procédure pour analyser la prékallikreine présente dans un plasma en utilisant H-Pro-Phe-Arg-a- NE: A 2 ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à 50 m M (p H 6), on ajoute un plasma citraté ( 5, 10 ou 15 1) et 10 -il d'une solution aqueuse de sulfate de dextrane (poids moléculaire 500 000) ( 30 tg/ml) A ce mélange, qui a subi une incubation de 5 minutes à 370 C, on incorpore 0,2 ml d'une solution aqueuse à 2 m M de H-Pro-Phe-Arg- a.-NE contenant 0,1 % de SDS et on lui fait subir une nouvelle incubation de 10 minutes à 37 C. Après l'addition de 0,2 ml d'acide acétique à 50 % contenant 1 % de sel FR-ITR, on laisse le mélange réagir à 37 C pendant 5 minutes On ajoute ensuite à ce mélange de réaction 2 ml d'acide acétique à 50 % et on mesure l'absotbance à 475 nm Les résultats des mesures sont ceux que montre la figure 15 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité de plasma. EXEMPLE 17 Procédure pour analyser la-thrombine en utilisant Tos-Lys-a-NE: A 1,7 ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à 50 m M (p H 8), on ajoute 0,1 ml d'une solution de thrombine ( 0,5, 1 ou 1,5 NIH-U/ml) dans une solution saline physiologique et 0,2 ml d'une solution aqueuse à 1,5 m M de Tos-Lys-a-NE. On fait subir à ce mélange une incubation de 10 minutes à 37 C, puis on y incorpore 0,2 ml d'une solution à 1 % de sel FR-ITR dans de l'acide acétique à 50 % et on laisse réagir à 37 C pendant 5 minutes. Après l'addition de 2 ml d'acide acétique à 50 %, on mesure l'absorbance du mélange de réaction à 475 nm Les résultats des mesures sont ceux que montre la figure 16 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité de thrombine. EXEMPLE 18 Détermination électrophorétique pour déterminer la configuration des enzymes dans le sang: On prépare une colonne avec un gel-de polyacrylamide en utilisant un tube de verre ayant un diamètre intérieur de 4 mm et une longueur de 7 cm On charge cette colonne avec 40 l 1 d'un 2 '53 1 453 sérum et on la soumet à une électrophorèse d'environ minutes à 2 m A On enlève le gel du tube, puis on l'immerge dans 10 ml d'une solution à 0,5 m M de Tos-Lys-a-NE dans une solution tampon de phosphate de sodium à 100 m M (p H 7), puis on procède à une incubation de 30 minutes à 25 C Après l'addition de 1 ml d'une solution aqueuse à 1 % de sel FR-ITR, on laisse le gel reposer à 25 "C pendant 10 minutes pour effectuer la coloration Il a été ainsi possible d'observer la configuration des enzymes dans le sang sous la forme de bandes rouge-orangé La figure 17 montre les résultats obtenus en utilisant un sérum humain normal. EXEMPLE 19 Procédure pour colorer les cellules sanguines: On prépare un frottis sanguin et on le fixe à la vapeur de formol Après l Qavoir lavé avec de l'eau, on plonge l'échantillon dans 10 ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à m M (p H 7) contenant 0,2 m M d'un substrat (Ac-Tyra-NE, Tos-Lys-a-NE ou Ac-Gly-Lys-a-NE) et 0,1 % de sel FR-ITR, et on procède à une incubation de 90 minutes à 250 C On lave l'échantillon avec de l'eau et on l'observe sous le microscope Les résultats de la coloration sont ceux indiqués dans le tableau 2. TABLEAU 2 Monocyte + + Granulocyte Neutrophi +++ Eosinophi R - Basophile + + Nota: -non-coloration; + à +++: degré de col EXEMPLE 20 La sensibilité à différents enzymes, déterminée par les procédures des exemples 1 à 17, a été portée dans le tableau 3. oration TABLEAU 3- substrat Enzyme Sensibilité unités H-pyro Glu-Gly-Arg-a-NE Thrombine, 0 197 60,D/Nlg-U/min H-Leu-Gly-Arg-a-NE Thrombine' 0 261 ào,,D/NIH-U/min à-b-Val-Leu-Arg-a-NE Kallikréin? 1 387 ào D/Ku/min. Bz-Phe-Val-Arg-a-NE Thrombine 0 053 AOD/NIH-U/min Tos-Gly-Pro-Arg-a-NE Kallikréine 1 747 AOD/KU/min H-phe-Val-Arg-a-NE Thrombire 0 173 60,D/NjllU/min Glt-Gly-Arg-a-NE Thrombine O 115 AOD/NIII-U/mi'n Il-Gly-Gly-Arg-aNE Thrombine 0 377 60,D/NIH-U/min H-Phe-Atg Kàllikrein-e 1 420 AOD/k U/min Tos-Gly-Pro-Lys-a-NE Urokinase 3 55 x 10-4 ào D/lu/min el, Ac-Met- a-NE Kallikrelnp, 0 0347 AOD/KU/min r Id vi I u Li (A EXEMPLE 21 Procédure pour analyser le plasminogène en utilisant Tos-Lys-a-NE: A 1 ml d'une solution de plasma humain ( 3, 2,5, 2, 1,5, 1 ou 0,5 1 l de plasma/50 Sr M de solution tampon de phosphate de sodium), on ajoute 0,1 ml d'une solution aqueuse de streptokinase ( 1000 U/ml) On fait subir à ce mélange une incubation de 10 minutes à 37 C, puis on y incorpore 0,1 ml d'une solution à 2 m M de Tos-Lys-a-NE, puis on la soumet à une nouvelle incubation de 10 minutes à 370 C A ce mélange, on ajoute 0,1 ml d'une solution à 1 % de sel FR-ITR dans de l'acide acétique à % On laisse le mélange réagir à 37 C pendant 10 minutes Après l'addition de 1 ml d'acide acétique glacial, on mesure l'absorbance à 475 nm du mélange de réaction Les résultats des mesures sont ceux que montre la figure 10 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité de plasma. EXEMPLE 22 Piocédure pour analyser l'antiplasmine en utilisant Tos-Lys-a-NE A 1 ml d'une solution de plasma humain ( 15, 12,5, 10, 7,5, 5 ou 2,5 j 1 de plasma/50 m M de solution tampon de phosphate de sodium (p H 7,4)), on ajoute 0,1 ml d'une solution aqueuse de plasmine ( 0,1 CU/ml) On fait subir à ce mélange une incubation de 20 secondes à 37 C, puis on y incorpore 0,1 ml d'une solution à 2 m M de Tos-Lys-a-NE, puis on le soumet à une nouvelle incubation de 10 mibnutes à 37 C A ce mélange, on ajoute 0,1 ml d'une solution à 1 % de sel FR-ITR dans de l'acide acétique à 50 %. On laisse le mélange réagir à 37 C pendant 10 minutes Après l'addition de 1 ml d'acide acétique glacial, on mesure l'absorbance du mélange de *2531 453 réaction à 475 nm Les résultats des mesures sont ceux que montre la figure 19 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité de plasma. EXEMPLE 23 Procédure pour analyser l'héparine en utilisant Tos-Lys-a-NE: A 0,05 ml d'une solution aqueuse contenant 0,01, 0,02, 0,03, ou 004 UI/ml d'héparine, on ajoute 0,05 ml d'un plasma standard dilué dix fois avec une solution saline physiologique, 1 ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à m M, et 0,1 ml d'une solution aqueuse de thrombine ( 1,5 NIH-U/ml) A ce mélange, on ajoute, après une incubation à 370 C pendant 10 minutes, 0,1 ml d'une solution à 2 m M de Tos-Lys-a-N Eo On fait subir une nouvelle incubation au mélange résultant à 37 "C pendant 10 minutes Après l'addition de 0,1 ml d'une solution à 1 % de sel FR-ITR dans de l'acide acétique à 50 %, on permet au mélange de réagir à 37 "C pendant 10 minutes, puis on y incorpore 1 ml d'acide acétique glacial et on mesure l'absorbance à 475 nm Les résultats des mesures sont ceux que montre la figure 20 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité d'héparine. EXEMPLE 24 Procédure pour analyser l'antithrombine III en utilisant Tos-Lys-=-NE: A 0,5, 10, 15, 20 ou 25 I 1 d'un plasma, on ajoute 3 ml d'une solution tampon de phosphate de sodium à 50 m M (p H 7,4) contenant 0,8 NIH-U/ml de thrombine, 4 UI/ml d'héparine et 10 KIE/ml d'aprotinine On place une fraction de 50 -1 de ce mélange dans un tube à essais et on lui fait subir une incubation de 10 minutes à 37 C Au mélange, on ajoute 0,1 ml d'une solution à 2 m M de Tos-Lys-a-NE On fait subir au mélange résultant une nouvelle incubation de 10 minutes à 37 C. Apres l'addition de 0,1 ml d'une solution à 1 % de sel FR-ITR dans de l'acide acétiques 10 %, on laisse le mélange réagir à 37 C pendant 10 minutes, puis on y incorpore 2 ml d'acide acétique à 30 % et on mesure l'absorbance à 475 nm Les résultats des mesures sont ceux que montre la figure 21 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité de plasma. EXEMPLE 25 Procédure pour analyser la prothrombine en utilisant Tos-Lys-c-NE: A 1 ml d'une solution de plasma humain ( 2, 1,6, 1,2, 0,8 ou 0,4:1 l de plasma/50 m M de solution tampon de phosphate de sodium), on ajoute 0,1 ml d'une solution de venin de serpent (venin de Echis carina&ua_; 10 lg/ml) dans la solution tampon On fait subir au mélange résultant une incubation de 5 minutes à 37 C, puis on y incorpore 0,1 ml d'une solution à 2 m M de Tos-Lys-a-NE et on le soumet à nouveau à une incubation de 30 minutes à 25 C Après l'addition de 0,1 ml d'une solution à 1 % de FR-ITR dans de l'acide acétique à 50 %, on-laisse le mélange réagir à 37 C pendant minutes On incorpore dans le mélange de réaction 1 ml d'acide acétique glacial et on mesure l'absorbance à 475 nm Les résultats des mesures sont ceux que montre la figure 22 o l'ordonnée représente l'absorbance et l'abscisse la quantité de plasma. 253 1453 REVENDICATIONS 1 Procédé pour déterminer l'activité d'un enzyme, d'un inhibiteur d'enzyme, d'un activateur d'enzyme ou d'une substance zymogène qui consiste à permettre à l'enzyme de réagir avec un substrat de la formule: R 1-0 R 2 (I) to R 1 représente un acide aminé ou un oligopeptide combiné sous la forme d'un ester par le carbone du groupe carboxyle terminal dudit acide amiué ou dudit oligopeptique et R 2 représente un atome d'hydrogène ou de brome) afin d'hydrolyser le substrat, puis à permettre au produit de l'hydrolyse répondant à la formule: HO 2 de réagir avec un sel FR-ITR (Fast Red-ITR salt (sel diazonium de N,N'-diéthyl-4-méthoxymétanilamide)) afin de former un pigment et à déterminer le pigment. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R 1 correspond à la formule A-R 3-R 4-R 5-R 6-CO-, dans laquelle A représente un atome d'hydrogène ou un groupe acyle ou sulfonyle, R 3, R 4 et R 5 représentent chacun Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Gln, Glu, pyro Glu ou une liaison simple, et R 6 représente Lys, Lys (Me), Arg, Met ou Tyr. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que A est un atome d'hydrogène ou bien Ac, Bz, Tos, Boc, Cbz, Dansyl ou Glt. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que R est A-Tyr-, AArg-y A-Lys-, A-Gly-Lys-, A-Phe-Arg-, A-Gly-Gly-Arg, A-Leu-Gly-Arg-, AGln-Gly-Arg-, A-pyro Glu-Gly-Arg-, A-Leu-Ala-Arg-, A-Pro-Phe-Arg-, A-DVal-Leu-Lys-, A-Phe-Val-Arg-, ou A-Ile-Glu-Gly-Arg-. 5 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la formule (I) est Tos-Lys-a-NE, Ac-Tyr-a-NE, Bz-Leu-Ala- Arg-c L-NE, Ac-Phe-Arg-a-NE, H-Pro-Phe-Arg-a-NE, ou Ac-Gly-Lys-a-NE. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'enzyme est une protéase du type sérine de E C 3 4 21. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'enzyme est la trypsine, la chymotrypsine, la kallikréine, la plasmine,la thrombine, l'urokinase, le facteur Xa, Cls ou Clh, tandis que l'inhibiteur, l'activateur ou la substance zymogène est l'antithrombine III, l'héparine, l'antiplasmine, la prékallikréine ou le plasminogène.