FR 2523155 A1 19830916 FR 8204099 A 19820311 La présente invention concerne un procédé pour la production d'un Facteur de Croissance des Cellules T humaines, ci-après désigné en abrégé par FCCTh. FCCTh est une substance protéinique, de type hormonal, habituellement préparée à partir du sérum humain, qui stimule la croissance des cellules T, et se range en conséquence dans une famille des activités stimulantes de la multiplication, humaines. Les cellules T sont des lymphocytes qui jouent un rôle important dans l'immunité cellulaire in vivo, par exemple dans l'hypersensibilité à retardement et l'immunité antitumorale. Comme le FCCTh stimule la croissance de ces cellules T et les active, elle constitue une possibilité intéressante pour l'étude thérapeutique et l'immunothérapie de maladies humaines comme l'asthme et les tumeurs malignes, en plus de son utilisation courante comme activeur de croissance in vitro des cellules T ; aussi espère-t-on beaucoup de la possibilité d'une production en masse du FCCTh. Comme décrit par Hisashi Narimatsu dans The Metabolism, Vol. 17, pp. 2063-2077 (1980), "T-cell Growth Factor (TCGF) and its Applications", ce facteur (FCCT) est également appelé "Interleukin" et n'esfpas spécifique d'une espèce. Bien que ce fait suggère que l'on puisse utiliser un FCCT provenant d'une origine cellulaire animale au lieu de FCCTh, une telle substitution présente le danger de provoquer une réaction indésirable antigbne- anticorps, par exemple un choc anaphylactique. Il s'ensuit qu'il est préférable d'utiliser, pour le traitement des maladies humaines, du FCCTh provenant de cellules humaines vivantes, pour des raisons de sécurité, car il n'y a alors pas de danger de provoquer une immunoréaction indésirable.Bien que l'on sache que le sérum humain constitue une bonne source pour la production de FCCTh, il est très difficile d'avoir un apport suffisant en sérum humain à bas prix, car on n'obtient ce dernier que par séparation à partir de sang humain frais, t sa conservation s'avère difficile. Pour toutes ces raisons, on n'a pu réaliser à ce jour une production à l'échelle industrielle de FCCTh, en quantité suffisante pour satisfaire les besoins des traitements prophylactiques et thérapeutiques des maladies humaines. La demanderesse a étudié des procédés pour la production de FCCTh facilement réalisable à l'échelle industrielle. Ces efforts ont conduit à la découverte inattendue que la production de FCCTh obtenue, lors de la multiplication des cellules humaines dans un animal à sang chaud, était bien supérieure, environ 2 à 10 fois supérieure et même plus, à la production obtenue à l'aide de cellules humaines multipliées par un procédé de culture de tissu in vitro.En particulier, l'invention concerne un procédé amélioré pour la production de FCCTh, caractérisé en ce qu'on transplante des cellules humaines capables de produire FCCTh dans un animal à sang chaud, ou bien dans un dispositif alimenté par le fluide nutritif corporel d' un animal à sang chaud, on laisse se multiplier les cellules dans l'animal ou le dispositif, et on laisse le FCCTh se libérer dans les cellules ainsi multipliées. Le procédé selon l'invention, tout en fournissant une grande quantité de FCCTh, ne nécessite que peu ou pas de milieu nutritif contenant du sérum coûteux, et rend plus facile le maintien du milieu de culture pendant la multiplication cellulaire, que dans le cas de la culture de tissu in vitro ; on peut aisément réaliser une multiplication efficace des cellules humaines, capables de produire du FCCTh, par transplantation directe de ces cellules dans un animal à sang chaud, ou bien en plaçant ces cellules dans une chambre de diffusion de type classique, conçue pour recevoir le fluide corporel nutritif de l'animal alimenté de manière habituelle. En outre, le procédé selon l'invention permet une multiplication cellulaire plus stable et plus abondante et une production accrue de FCCTh par cellule, par rapport à la cul ture de tissu in vitro. Les cellules humaines, utilisables selon l'invention, sont les cellules capables de produire du FCCTh et de Sultiplier dans un animal à sang chaud, lorsqu'on les y transplante : conviennent par exemple des cellules humaines normales, comme celles du sang périphérique, de la rate et des amygdales ; des cellules de carcinome humain comme celles du carcinome du foie ou du poumon, et de l'abcès tonsillaire t ainsi que des lignées de cellules établies des cellules ci-dessus. Les lignées de cellules établies peuvent être choisies à partir de KS-5, MOLT-3, MT-1, Mono-1 et OUMS-19, comme décrit par exemple dans The Tissue Culture, Vol. 6, pp. 527-546 (1980).En particulier, -l'utilisation d'une lignée de cellules humaines établies, qui peut être aisément soumise à un repiquage, dans laquelle peut être introduit un gène codant une production élevée de FCCTh, au moyen d'une technique de fusion cellulaire utilisant du polyéthylène glycol ou du virus de Sendar, ou par une technique de recombinaison gé nétique utilisant la ligase, enzyme de restriction et 1' ADN polymérase, aboutit avantageusement à un taux de multiplication cellulaire supérieur, et à une production plus élevée de FCCTh par cellule, c'est-à-dire environ 2 à 10 fois supérieure, ou même plus.En outre, comme la transplantation de cette lignée de cellules humaines dans un animal à sang chaud conduit à la formation d'une tumeur massive, qui peut être facilement désagrégée et n'est guère mélangée à des cellules de l'hôte animal, on peut facilement récolter les cellules humaines vivantes, multipliées. A ces fins, on utilise avantageusement des lignées de lym phoblastoldes humains, dérivéeide leucémie humaine ou de lymphome malin humain, par exemple Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 et JBL. Comme animaux à sang chaud, utilisables dans le procédé suivant l'invention, on peut prendre tout animal pourvu que les cellules humaines se développent dans son organisme. Par exemple, on peut employer avantageusement des volailles, telles que poulets ou pigeons, et des mam misères comme chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue. Comme la transplantation des cellules humaines à l'animal provoque une réaction immunitaire indésirable, l'emploi d' un animal très jeune, nouveau-né ou au stade le plus précoce possible, par exemple d'oeuf, d'embryon ou de foetus, est souhaitable. Pour réduire autant que possible la réaction immunitaire, on peut traiter l'animal, avant la transplantation cellulaire, par irradiation avec des rayons X ou Y à raison d'environ 200 à 600 rems, ou par injection d'un antisérum ou d'un agent immunosuppresseur. Comme la souris nue, lorsqu'on l'utilise comme animal hôte, présente une réaction immunitaire plus faible, même à l'état adulte, on peut de façon pratique lui transplanter des lignées cellulaires humaines établies, pour qu'elles se multiplient rapidement,sans qu'un prétraitement soit nécessaire. On peut effectuer la multiplication cellulaire, stabilisée, et l'accroissement de la production de FCCTh par transplantation répétée avec une combinaison de diff4- rents animaux à sang chaud ; par exemple on peut atteindre les objectifs visés, en implantant d'abord les cellules humaines à des hamsters, pour qu'elles se multiplient, puis multipliées en réimplantant ces cellules des souris nues. La transplan- tation répétée peut avoir lieu avec des animaux à sang chaud de la même classe, du même groupe, de la même espèce ou du même genre. On peut implanter les cellules humaines en un site quelconque de l'animal, pourvu qu'elles s'y multiplient : par exemple, on peut effectuer l'implantation dans la cavité allantorque, par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée. En dehors de la transplantation cellulaire directe, décrite, on peut faire se multiplier facilement des li gonzes cellulaires humaines, établies par inclusion, par exemple par voie intrapéritonéale, dans l'organisme d'un animal, d'une chambre de diffusion classique, de forme et de taille appropriées, munie d'une membrane filtrante poreuse, d'un ultrafiltre ou de fibres creuses ayant des pores d'environ 10 7 à 10 5 m de diamètre, empêchant la contamination de la chambre par les cellules de l'animal hôte et permettant l'apport du liquide nutritif de l'organisme de l'animal aux cellules.De plus, la chambre de diffusion peut, s'il le faut, être conçue pour être placée par exemple sur le corps de l'animal hôte, rendre possible la circulation du liquide de l'organisme de l'animal dans la chambre, permettre l'observation des cellules humaines contenues dans la chambre par une ou plusieurs fenêtres latérales, transparentes, dont sont munies une ou plusieurs parois de la chambre et permettre l'échange rapide de cette chambre avec une chambre neuve ; la multiplication cellulaire peut ainsi être poursuivie pendant la durée de vie de l'animal, sans qu'il soit nécessaire de sacrifier celui-ci et avec accroissement de la production cellulaire par hôte.De plus, par l'utilisation d'une telle chambre de diffusion, l'absence de contact direct des cellules humaines transplantées avec les cellules de l'animal hôte, a pour résultat de ne pas provoquer de réaction immunitaire, si bien que l'on peut employer divers animaux à sang chaud, comme hôtes, sans avoir à effectuer un prétraitement pour réduire leurs réactions immunitaires, et l'on peut recueillir facilement les cellules humaines multipliées. On peut alimenter l'animal hôte de façon classique, même après la transplantation cellulaire, et aucun soin particulier n'est nécessaire. La multiplication des cellules atteint gdnérale- ment un maximum 1 à 20 semaines après la transplantation. Lorsque la lignée de cellules humaines, transplantées à 1' animal hôte, est une lignée de cellules tumorales ou lym phoblastoide établie, on peut obtenir la multiplication cellulaire maximale 1 à 5 semaines après la transplantation, par suite de la multiplication extrêmement intense de ces cellules. Selon le procédé de l'invention, le nombre de cellules humaines, obtenues par hôte, est d'environ 107 à 1012 ou plus. En d'autres termes, le nombre de cellules humaines, transplantées à l'animal, s'accroît d'environ 102 à 107 fois ou plus : cela représente environ 10 à 106 fois plus par rapport à ce que l'on obtient par la méthode de culture in vitro. Les cellules humaines obtenues peuvent donc être avantageusement utilisées pour la production en masse de FCCTh, conformément à l'invention. Pour laisser les cellules humaines, libérer FCCTh, on peut appliquer tout procédé conduisant à la libération de cette substance par les cellules. Par exemple, on met en suspension dans un milieu nutritif préchauffé entre 20 à 400C environ des cellules humaines, obtenues par multiplication en suspension dans le liquide d'ascite et récolte dans ce liquide, ou par extraction d'une tumeur massive, formée sous la peau, puis récolte après désagrégation de la tumeur, pour obtenir une concentration cellulaire d' environ 104 à 108 cellules/ml ; on met ensuite à incuber à même température pour produire le FCCTh. Au cours de l'incubation, le milieu nutritif peut être, si nécessaire, additionné avec un inducteur de FCCTh. Conviennent comme inducteurs de FCCTh les inducteurs qui suscitent la production de FCCTh par les cellules humaines multipliées dans le corps d'un animal à sang chaud ; on peut utiliser des inducteurs classiques, par exemple des mitogènes comme phytohémoagglutinine, concanavaline A, lipopolysaccharide, bactérie, virus, acide nucléique, polynucléotide, ou un mitogène végétal ("pokeweed"). Le milieu de culture peut également, pendant la production de FCCTh, être additionné avec un agent'de stabilisation du FCCTh formé, qui augmente encore la production de celui-ci. On peut facilement recueillir FCCTh, ainsi obtenu, par des techniques de purification et de séparation utilisant des opérations classiques, telles que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration et lyo philisation. Si l'on désire une préparation plus purifiée, on peut y arriver en combinant les opérations précitées avec une ou plusieurs autres, telles qu'adsorption et désorption, avec échange d'ions, filtration sur gel, chromatographie par affinité, fractionnement au point isoélectrique et/ou électrophorèse. La préparation de FCCTh, ainsi obtenue, est identique du point de vue immunologique à celles que l'on obtient à partir du sérum humain par des procédés classiques; elle n'est pas contaminée par le virus de l'hépatite et/ou des pyrogènes. Donc on peut utiliser la préparation de fa çon avantageuse, isolément ou en combinaison avec un ou plusieurs agents, par exemple vitamine, hormone ou agent carcinostatique, par administration par voie interne ou injection pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de diverses maladies humaines. Dans la présente description, les titres de FCCTh sont déterminés par une modification de l'essai d'incorporation de thymidine (3H), exposé antérieurement par S, Gillis et coll. dans J. Immunology, Vol. 120, pp. 2027-2932 (1978) : on place des cellules de thymus de souris BALB/c sur des microplaques de manière à avoir une concentration de 100 /litres (105 cellules) par creux, puis on addition ne ces microplaques avec 100 FCCTh diluées en série ; on met ensuite à incuber ces mélanges à 370C pendant 2 jours. Puis onájoute aux micropla ques O,5 o i de thymidine (3H) par creux, et 4 heures après cette incorporation on mesure, à l'aide d'un compteur de scintillation liquide, la quantité de thymidine incorporée. Le titre de 1 unité de FCCTh est défini comme la dilution d'un échantillon de FCCTh qui donne un compte de scintillation de 5 000 cpm. Le procédé selon l'invention sera mieux compris à la lumière des exemples non limitatifs suivants. EXEMPLE I On transplante par voie intrapéritonéale chez des souris nues adultes, une lignée NT-1 de lymphoblastoldes humains du type cellule T, provenant du sang périphérique humain, et les animaux sont nourris de manière habituelle pendant 3 semaines. Après extraction des tumeurs massives résultantes, formées intrapéritonéalement, et pesant environ 10 g chacune, on les désagrège par hachage et mise en suspension dans du sérum physiologique contenant de la trypsine. Après lavage des cellules humaines avec du milieu RPMI 1640 exempt de sérum (pH 7,2), on les remet en suspension dans du milieu frais de composition identique, de manière à avoir une concentration de l'ordre de 105 cellules/ml, et l'on met à incuber à 370C pendant 3 jours, pour produire du FCCTh. Lorsque l'incubation est terminée, on centrifuge le milieu de culture à environ 8 000 tours/minute pendant 30 minutes, et l'on essaye le titre en FCCTh de la partie surnageante résultante. La production de FCCTh est d'environ 1 600 uni tés/100/Llitre de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin s'effectue comme suit : la lignée MT-1 de lymphoblastoldes humains est cultivée in vitro à 370C dans du milieu de Eagle (pH 7,2), additionné de 1% en volume/volume de sérum foetal de veau et 20% en volume/volume d'extrait de viande, et les cellules humaines, multipliées, sont traitées comme plus haut, en vue de la production de FCCTh . Cette production n'est que d'environ 40 u nités/100 rclitre de suspension cellulaire. EXEMPLE 2 On met en suspension ensemble des cellules humaines d'abcès tonsillaire désagrégé obtenues par extraction et hachage et des cellules de la lignée lymphoblastolde, humaine, Namalwa, dans un récipient avec une solution salée contenant 140 mM Nazi, 54 mM KCl, 1 mM en NaH2PO4et 2 mM Cal2, pour obtenir une concentration de chaque type de cellules d'environ 1 x 103 cellules par ml.On mélange la suspension cellulaire, en refroidissant par la glace, avec une préparation fratche de la même solution salée contenant du virus Sondai préalablement inactivé par irradiation par les ultraviolets ; on transfère dans une étuve à 370C au bout de 5 minutes, après le mélange, et on agite pendant 30 minutes, pour effectuer la fusion cellulaire et introduire la capacité de production de FCCTh des cellules humaines de la lignée MT-1 dans les cellules de Namalwa. Les cellules de Namalwa hybrides, résultantes, sont alors transplant8és par voie intrapéritonéale chez des souris nues adultes, que l'on nourrit de manière habituelle pendant 5 semaines. Les tumeurs massives, formées intrapéritonéalement, et pesant environ 15 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour produire FCCTh, à ceci près que le milieu RPMI 1640, exempt de sérum, contient 1/ > g de phytohdmoagglutinine/ml. La production de FCCTh est de l'ordre de 5 800 unités/100?litre de suspension cellulaire.Dans l'expérimentation témoin, au cours de laquelle les cellules hybrides de Namalwa sonsscultivdes in vitro comme dans l'expérimentation témoin de l'exemple 1, et les cellules humaines multipliées sont soumises à la production de FCCTh, la production de celui-ci n'est que de l'ordre de 90 unités/100 / litre de suspension cellulaire. EXEMPLE 3 Après avoir injecté à des hamsters nouveau-nés un antisérum préparé à partir du lapin selon un procédé classique, pour réduire leur réaction immunitaire, on implante aux animaux, par voie sous-cutanée, des cellules de la lignée lymphoblas tolde,humaine, JBL auxquelles on a conféré, comme dans l'e xemple 2, la capacité de production de FCCTh des cellules humaines de l'abcès tonsillaire, puis on alimente les animaux de facon habituelle pendant 3 semaines extrait les tumeurs massives résultantes, formées sous la peau et pesant environ 18 g chacune, et les cellules sont traitées comme dans l'exemple 1 pour produire du FCCTh, à ceci près que le milieu RPMI 1640, exempt de sérum, est remplacé par du milieu de Eagle (pH 7,2) additionné de 20% en volume/volume d'extrait de viande, et de 50 /trg/ml de milieu, de concanavaline A. La production de FCCTh est voisine de 12 000 unités/100 / litre de suspension cellulaire. Au cours de l'expérimentation témoin, dans laquelle les cellules JBL hybrides sont cultivées in vitro comme dans l'expérimentation témoin de l'exemple 1, et les cellules humaines multipliées sont ensuite soumises à la production de FCCTh, la production de ce dernier n'est que de 150 unités/ 100?litre de suspension cellulaire. EXEMPLE 4 On implante par voie intraveineuse à des rats nouveau-nés une lignée de lymphoblastoldes hybrides, humains, BALL-1, auxquels on a conféré, comme dans l'exemple 2, la capacité de production de FCCTh de cellules humaines d'abcès tonsillaire, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 semaines. On extrait les tumeurs massives résultantes pesant environ 35 g chacune et on traite ces cellules humaines comme dans l'exemple 2 pour produire FCCTh. La production de ce produit est de l'ordre de 5 300 unités/ 100 t litre de suspension cellulaire. Au cours de l'expérimentation témoin, dans laquelle les cellules hybrides BALL-1 sont cultivées in vitro, et les cellules humaines multipliées sont soumises à la production de FCCTh, la production de ce dernier n'est que de 110 unités/100Litre de suspension cellulaire. EXEMPLE 5 Après avoir irradié des souris adultes avec un équivalent de dose de rayons g d'environ 400 rems pour réduire leurs réactions immunitaires, on implante aux animaux par voie sous-cutanée une lignée établie de cellules humaines de type monocyte-macrophage, Mono-i, provenant de sang humain périphérique, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 semaines. On extrait les tumeurs massives résultantes, formées sous la peau, pesant environ 20 g chacune, et on traite les cellules humadeincTRmme dans l'exemple 3 pour produire FCCTh. La production/est d'environ 3 500 unités/100 litre de suspension cellulaire. Au cours de l'expérimentation témoin, dans laquelle la lignée Mono-1 est cultivée in vitro, et les cellules humaines multipliées sont ensuite soumises à la production de FCCTh, la production de ce dernier n'est que de 30 unités/ 100 litre de suspension cellulaire. EXEMPLE 6 On met une suspension de lignée de lymphoblastoldes humains de type. cellule T, MT-1, provenant de sang humain périphérique, dans du sérum physiologique, dans une chambre de diffusion cylindrique, en matière plastique, ayant un volume intérieur d'environ 10 ml et munie d'une membra ne filtrante ayant des pores d'environ 0,5 05 m de diamètre. Après inclusion intrapéritonéale de la chambre à un rat adulte, on alimente l'animal de façon habituelle pendant 4 semaines puis on retire la chambre. La densité des cellules humaines dans la chambre obtenue dans l'opération ci-dessus est d'environ 109 cellules par ml ce qui est environ 102 fois ou plus supérieur à ce que l'on obtient par culture de tissu in vitro, avec un incubateur à C02. On traite les cellules humaines ainsi obtenues comme dans l'exemple 3 pour produire FCCTh. La production de FCCTh est d'environ 3 200 unités/100 litre de suspension cellulaire. EXEMPLE 7 On implante dans les cavités allantorques d'oeufs embryonnés que l'on a préincubés à 370C pendant 5 jours, une lignée de lymphoblastoIdes humains BALL-1 auxquels on a con féré comme dans l'exemple 4 la capacité de production de FCCTh des cellules d'abcès tonsillaire humains. Après incubation des oeufs à cette température pendant encore une semaine, on récolte les cellules humaines multipliées. On traite les cellules ainsi obtenues comme dans l'exemple 1 pour produire FCCTh. La production de FCCTh est d' environ 2400 unités/100litre de suspension cellulaire. Revendications 1. Application du procédé qui consiste à transplanter des cellules humaines dans un animal à sang chaud ou dans un dispositif, dans lequel circule le fluide nutritif corporel d'un animal à sang chaud, et à laisser ces cellules se multiplier dans l'animal ou dans le dispositif, caractérisée en ce que les cellules sont des cellules humaines T, capables de produire le facteur de croissance (FCCTh),et que l'on laisse les cellules multipliées libérer ce facteur. 2. Application selon la revendication 1, caractérisée en ce que les cellules humaines capables de produire FCCTh proviennent du sang périphérique, de la rate, des amygdales, d'abcès de l'amygdale, ou de carcinome du poumon ou du foie, ou bien sont des lignées établies de ces cellules. 3. Application selon la revendication 2, caractérisée en ce que les lignées de cellules établies sont KS-5, MOLT3, Mono-l ou OUMS-19. 4. Application selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les cellules humaines capables de produire FCCTh, sont des lymphoblastoldes humains hybrides. 5. Application selon la revendication 4, caractérisée en ce que ces lymphoblastoldes hybrides sont des lignées de Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 ou JBL, auxquelles a été conférée l'aptitude à produire du FCCTh des cellules humaines suivant la revendication 2. 6. Application selon une des revendications 1 à 5, ca ractérisée en ce que les cellules multipliées sont soumises à l'action d'un inducteur de FCCTh, pour favoriser la production de celui-ci. 7. Application selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'inducteur est un mitogène, un virus, un acide nucléique ou un poly-nucldotide. 8. Application selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'inducteur de FCCTh est la phytohémoagglutinine ou la concanavaline A. 9. Application selon une des revendications 1 à 8, dans laquelle l'animal à sang chaud est un poulet, pigeon, chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue.