FR 2530471 A1 19840127 FR 8209930 A 19820608 La présente invention a pour objet des compositions pharmaceutiques à base d'un extrait purifié d'Annona senegalensis Pers. La plante Annona Senegalensis est un arbuste de 1 à 2 m de haut faisant partie-de la famille des Annonacées. Cette plante pousse dans les sous-bois des savanes arborées au sud du Sahara dans les pays suivants : Bénin, Cameroun, Côte d'Ivoire, Gabon, Gambie, Ghana, Guinée, Mali, Republique Centre Africaine, Sénégal, Togo. L'extrait utilisé selon l'invention-est obtenu à partir de l'écorce de la tige et renferme 60 % de tanins condensés accompagnés de glucose, d'acides aminés et de peptides. Le tanin pur a été isolé par chromatographie liquide preparative en utilisant comme support de la silice greffée RP8 (Merck) et comme éluant du méthanol contenant 70 % d'eau, apres. élution successive par de l'eau distillée et de l'eau contenant 10 % de méthanol. Les dosages réalisés par la méthode à la poudre de peau et à l'aide du réactif de Stiasny montrent la seule présence de tanins condensés. On prépare l'extrait purifié d'Annona senegalensis de la manière suivante On soumet l'écorce de la tige d'Annona senegalensis seche et réduite en poudre à une lixiviation par 5 fois son poids d'un mélange méthanol 55/ eau 45 (en poids). Le liquide obtenu est concentré sous pression réduite jusqu'à évaporation du méthanol. La solution aqueuse résiduelle est extraite à deux reprises par un volume identique d'acétate d'éthyle. Les fractions solubles dans l'acétate d'éthyle sont éliminées. La phase aqueuse résiduelle est ensuite séchée par atomisa-tion ou lyophilisation. Le résidu est extrait à chaud et à deux reprises par dix fois son poids d'un mélange acétone/ acétate d'éthyle (1/1 en volume). L'insoluble est solubilisé dans l'eau et séché par atomisation ou lyophilisation. L'extrait d'Annona senegalensis obtenu est une poudre marron clair, très soluble dans l'eau, partiellement soluble dans le méthanol et l'éthanol et insoluble dans l'acétone et l'éther. Les tanins condensés contenus dans l'extrait ont été caractérisés par plusieurs tests et réactifs 1. Le chauffage à l'ébullition de quelques mg de l'extrait dans 5 ml d'HCl 5N a conduit à la formation d'une colora tion rouge intense. Après refroidissement, il y a préci pitation d'un phlobaphène insoluble. Cette réaction est caractéristique des tanins condensés dérivés des flava ne-diols. 2. Par addition de 50 ml du réactif de Stiasny (25 ml de formol à 40 % et 25 ml d'acide chlorhydrique) à une solution de 100 mg de l'extrait dans 100 ml d'eau, il se forme un précipité marron, caractéristique des tanins condensés. 3. L'addition de 0,5 ml d'une solution de Fez13 à 2 % 5 ml d'une solution aqueuse à 0,5 % d'extrait conduit à une coloration verte, caractéristique de la présence de phénols. 4. L'addition à 2 ml d'une solution à 2 %. d'extrait d'l ml d'H2SO4 0,1 N et de 3 ml d'une solution aqueuse de molyb date dtammonium à 10 % conduit à une coloration jaune orangée caractéristique des orthodiphénols. 5. On dissout 0,2 g d'extrait dans 10 m d'HCl 5N puis on porte la solution au bain marie pendant 2 minutes. Après refroidissement, on extrait l'anthocyanidine formée par 1 ml d'alcool isoamylique. On identifie l'anthocyani dine par chromatographie. Cyanidine témoin Papier whatman n 1 Solvant Forestal* Rf 0,17 0,17 CCM Cellulose Merck HCOOH-HCl-H2O(10-1-3) Rf 0,42 0,42 2 CCM Cellulose Merck Alcool amylique- Rf 0,46 0,46 CH3COOH-H2O (2-1-1) Forestal a CH3COOH-HCl Conc-H20 (5-3-10) Après chromatographie sur papier, les taches sont éluées par du méthanol Merck. L'essai et le témoin présentent un maximum d'absorption à. 537 nm en spectroscopie Ces 2 essais permettent de caractériser la cyanidine après hydrolyse acide du tanin. 6. Après hydrolyse simple et oxydative de l'extrait en pre se-nce de FeCl3, on sature la-phase aqueuse avec du chloru re de sodium-et on extrait par de l'éther. La phase éthérée agitée avec une solution aqueuse de FeCl3 à 0,5 % ne donne pas de coloration bleue caractéris tique d'acide gallique, l'extrait ne contient donc pas de tanins hydrolysables de type gallique. 7. La recherche d'alcaloïdes et de saponosides est négative, contrairement à ce qui est décrit dans la littérature. 8. Spectrocopie dans l'ultra-violet . Le tanin pur en solution dans de l'eau distillée à la dilution de 25 pg/ml présente un maximum d'absorption à 279-280nm. . A 280nm la DO doit être comprise entre 0,30 et 0,33. L'extrait-purifié à 60 % en solution dans de liteau dis tillée à la dilution de 25 pg/ml présente un maximum d'absorption. à 27-9-280 nm. A 280 nm, a DO doit étre comprise entre 0,18 et 0,20. La caractérisatitn du glucose a été effectuée par- réaction positive à la bandelette à la glucose-oxydase et par chroma tographie en couche mince sur gel de silice GF 254 Merci Le solvant de développement est un mélange isopropanol/acide borique M (85/l5 en volume). 30 La révélation est effectuée par pulvérisation de phtalate d'aniline et chauffage à l'étuve à 1050C pendant 5 minutes. L'essai et le témoin glucose présentent une tache de cou leur marron, de Rf identique voisin de 0,5. La caractérisation des acides aminés totaux est réalisée au moyen de l'amino-acide analyseur Carlo-Erba type 3A 27 B suivant la technique décrite par P. Molla, thèse de doctorat de spécialité, Marseille, 1975. Après hydrolyse acide par HCl SN ont été identifiés - 5 amino-acides basiques : acide gamma-aminobutyrique; ornithine, lysine, histidine, arginine. - 12 amino-acides neutres : acide aspartique, thréonine, sérine, proline, acide glutami que, glycine, alanine, valine, isoleucine, leucine, tyrosine, phénylalanine. Le dosage en tanins condensés de l'extrait a été effectué par rapport au tanin pur isolé au moyen de la chromatographie liquide préparative. Les trois méthodes utilises méthode utilisant la poudre de peau, méthode utilisant le réactif de Stiasny, méthode par spectroscopie en UV à 280 nm, donnent un titre de 60 + 3%. L'activité pharmacologique de l'extrait à 60% d'Annona senegalensis a été déterminée dans trois domaines: action toniveineuse, action sur la perméabilité capillaire, action sur la résistance capillaire. 1. Action toniveineuse L'action vasoconstrictrice veineuse a été vérifiée par perfusion par voie aortique d'un train postérieur de la pin, la diminution du débit veineux en fonction du temps est notée. Cet essai est complété par un essai toniartériel sur artère isolée pour vérifier l'absence d'action toniartérielle per mettant d'affirmer une action toniveineuse authentique. -L'extrait d'Annona à 60 % possède une action toniveineuse intense et spécifique puisqu'elle n'est accompagnée d'au cune activité toniartérielle. Par ailleurs cette action peut être attribuée sans équi voque aux tanins condenses de cette plante puisque le tanin pur isolé presente lui-meme une action toniveineuse sans activité -toni artérielle. (1. Balansard P., Faure F., Balansard G., Delaage M., Roussey A. Bouyard P., Action toniveineuse d'un extrait purifié d'Hamamelis virginl na , Thérapie, XXVII, page 7-93, 1972. 2. Balansard P., Délaage M., Faure F., Bouyard P. Méthode d'étude quantitative de l'action veinotrope Thérapie XXV, page 675, 1970). 2. Action sur la perméabilité capillaire. La technique utilisée dérive de celle de Lefebvre (Lefebvre - CR.Soc. Biol. 1962, 1, 183). La méthode permet d'apprécier les modifications du temps de diffusion du bleu trypan chez des rats soumis à une injection d'histamine selon qu'ils sont traités ou non par l'extrait purifié à 60 %. Les résultats sont comparés avec les résultats du test réalisé dans les mêmes conditions avec la rutine. Le délai moyen d'apparition du colorant lorsque les animaux sont traités par l'extrait d'Annona est supérieur à celui obtenu avec les animaux témoins et les animaux traités par la rutine. Ce résultat montre une activité de l'extrait d'Annona superieure à celle de la rutine. 3. Action sur la résistance capillaire La-technique utilisée est celle qui est décrite par Lavollay (Lavollay J. Neumann J., Pharmacology of Plant Phenolics. Symposium d'Oxford 1958, 103). Elle consiste à déterminer la valeur de la dépression minimale appliquée au moyen d'une ventouse reliée à une pompe à vide, sur la peau dénudée de l'animal, nécessaire pour faire apparaitre des pétéchies en moins de 10 secon des. Les essais ont été effectués sur deux espèces animales, rat et lapin. L'augmentation de la résistance capillaire chez les animaux traites par l'extrait à 60 % dtAnnona est significative par rapport aux animaux témoins. La toxicité de l'extrait d'Annona senegalensis à 60 % a été déterminée par voies orale et intrapéritonéale sur des souris. La DL50 a été mesurée et comparée à celle du tanin pur et à celle de la fraction peptidique. Fraction Extrait 3 & - Tanin pur Peptidique DL 50 > 4 g/kg 2,5 g/kg / 1O g/kg voie orale DL 50 voie I.P. 0,6 g/kg 0,4 g/kg 8 g/kg Ces résultats pharmacologiques montrent que l'extrait d'Annona senegalensis à 60% de tanins condensés, obtenu selon l'invention, peut être utilisé en thérapeutique pour le traitement de tous les symptômes consécutifs à une insuffisance veineuse et capillaire, en particulier hémorroldes, jambes lourdes, varicosités, varices, fragilité capillaire. Le tanin condensé d'Annona possède à la fois une action toniveineuse et une action vitaminique P sur les capillaires en augmentant leur résistance et en diminuant leur perméabilité. La posologie quotidienne peut aller de 0,1 à 2 g d'extrait. L'extrait d'Annona senegalensis à 60% de tanins condensés peut être présenté sous toute forme appropriée pour l'administration orale ou parentérale, comprimés, dragées, gélules, solutions injectables, etc., seul ou en association avec tout excipient approprie. REVENDICATIONS 1. Extrait purifié d'Annona senegalensis Pers contenant 60 % de tanins condensés, caractérisé par le fait quil se présente sous la forme d'une poudre marron clair très soluble dans l'eau, partiellement soluble dans le métha nol et l'méthanol et insoluble dans l'acétone et l'éther. 2. Procédé d'obtention de l'extrait selon la revendication 1, procédé caractérisé en ce qu'on soumet llécorce de la tige d'Annona Senegalensis sèche et réduite en poudre à une lixiviation par 5 fois son poids d'un mélange méthanol/eau 55/45 en poids puis on concentre le liquide obtenu et sèche le résidu obtenu après purifica tion. 3. Médicament caracterisé en ce qu'il contient l'extrait selon la revendication 1. 4. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient l'extrait selon la revendication 1 en associa tion avec tout excipient approprié.