FR 2519004 A1 19830701 FR 8124442 A 19811229 Acide adénosine 5'-triphosphorique modifié et procédé de dosage de substances biologiques susceptibles de fixer des produits de dégradation de l'acide adénosine 5'-triphosphorique. L'invention est relative à un dérivé de l'acide adénosine 5'-triphosphorique (en d'autres termes à un dérivé de 1'ATP) et à un procédé de dosage de substances biologiques susceptibles, en présence de l'enzyme appropriée, d'incorporer un produit de dégradation de 1'ATP, en d'autres termes l'acide adénosine 5'-monophosphate (AMP) ou de l'acide adénosine 5'-diphosphate (ADP). I1 est connu qu'une catégorie de substances bio- logiques, notamment certains antibiotiques, plus parti culièrement ceux de la classe des aminoglycosides, sont capables, en présence d'enzymes spécifiques, d'incor- porer de 1'ADP ou de 1'AMP, ces dernières molécules étant susceptibles d'être fournies à cet antibiotique à partir de 1'ATP. Cette incorporation est schématisée par l'équation de réaction suivante, dans laquelle R-OH représente l'antibiotique R-OH + ATP enzyme spécifique R-O-AMP + PPi Les abréviations PPi (pyrophosphate) et Pi (phosphate) sont quelquefois utilisées en biologie pour désigner les dérives "inorganiques" du phosphore qui sont libérés à l'occasion de réactions biologiques du type sus-indiqué. Ce type de réaction est certes déjà utilisé dans des dosages de substances biologiques du type sus-indiqué, mais les moyens de révélation connus deviennent inopérants, lorsque ces substances biologiques ne sont présentes qu'en quantités infimes dans les échantillons étudiés. L'invention a pour but de fournir des réactifs suffisamment sensibles et permettant précisément l'utilisation de cette réaction pour doser de telles substances biologiques, même lorsqu'elles n'existent dans les échantillons biologiques étudiés qu'en quantités infimes, notamment du nanogramme ou même beaucoup moins. te réactif selon l'invention consiste dans un produit de modification de l'ATP, ce produit étant caractérisé par la fixation de façon covalente sur cet ATP d'une molécule chimique portant au moins un groupe non engagé dans la liaison covalente susdite et couplable directement ou indirectement avec une molécule ou un produit ayant une affinité spécifique pour ce groupe et permettant par conséquent la reconnaissance sélective des substances biologiques susdites. En particulier ce groupe permet une liaison affine chimique ou immunologique avec une molécule ou un produit lui-même directement révélable ou susceptible d'être révélé à son tour par couplage avec un autre produit révélateur. En outre cc groupe est tel qu'il ne modifie pas là capacité de l'enzyme choisie d'assurer l'incorporation du dérivé modifié d'AMP ou d'ADP portant les mêmes groupes de modification que l'ATP modifié initial, dans ou sur la substance à doser, et ce dans les conditions normales d'incorporation de l'AMP ou de l'ADP non modifié sur la même substance en présence de la même enzyme, L'invention concerne également un procédé de dé téction ou dosage d'une substance appartenant à la catégorie de substances ci-dessus définie consistant à faire réagir la composition présumée contenir une telle substance avec l'ATP modifié selon l'invent-on, en présence de l'enzyme spécifique correspondante, dans des conditions permettant l'incorportation d'un AMP ou d'un ADP modifié correspondant, dans ou sur ladite substance et, le cas échéant, après élimination de l'excès d'ATP modifié libre, à placer la composition obtenue dans des conditions permettant l'éventuel couplage des groupes de modes fication portés par l'AMP modifié ou l'ADP modifié incorporté à ladite substance, avec la molécule ou le produit permettant la reconnaissance du groupe de modification du dérivé initial d'ATP et à détecter ou à doser la susdite substance éventuellement présente portant lesdits produits de reconnaissance. Dans le cas d'aminoglycoside, le dosage mettra par conséquent en oeuvre une réaction qui peut être schématisée par l'équation suivante ou encore pour d'autres substances comme les oses-1 phosphate Le dosage du composé R-O-AMP-M (ou du composé R-O-ADP-M), après élimination de l'éventuel excès d'ATP-M, est d'une sensibilité considérable. Dans le cas des antibiotiques, cette méthode permet de doser des quantités d'un nanogramme d'antibiotique. Parmi les substances susceptibles d'être dosées par une telle méthode, on citera, outre les antibiotiques du type aminoglycosides, et à titre d'exemples, les oses-1-phosphate comme le galactose-1-phosphate (étude de la galactosémie) et le glucose 1-phosphate, l'acide N-acétylneuraminique, l'acide 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphorique ... L'enzyme spécifique intervenant dans cette transformation sera en général constituée par une adénylyltransférase, une acylneuraminate citidylyltransférase, une glucose 1-phosphate uridyltransférase, 1'ATP phosphoribosyltransférase Le groupe chimique lié de façon covalente à 1'ATP peut revêtir les formes les plus diverses, dès lors qu'il possède un groupe permettant son couplage avec des substances affines permettant sa révélation, de préférence sous forme directement visualisable, et qu'il n'empêche pas l'enzyme susdite de catalyser l'incorporation du dérivé d'AMP ou d'ADP correspondant sur la susbtance sus-visée. Parmi les groupes chimiques préférés suscep tibles d'être fixés sur les bases des susdits ribonucléotides, on mentionnera tout groupe susceptible d'être reconnu spécifiquement par une autre molécule ou par un produit, lui-même aisément détectable, de préférence par une méthode de visualisation. Cette autre molécule ou cet autre produit consiste par exemple en une enzyme, dont la présence peut être révélée par l'action qu'elle est susceptible d'exercer sur un substrat, de préférence un substrat donnant lieu à des réactions de coloration ou de décoloration, ou plus généralement encore de modification de spectres d'absorption respectivement décelables par colorimétrie ou spectrophotométrie. On peut naturellement avoir recours à des molécules ou produits donnant lieu à des réactions dc fluorescence, à des modifications de densité optique, etc., par exemple des produits comprenant des groupes dérivés de l'aminofluorène, du chlorure de dansyle, de la rhodamine, etc.. Parmi les groupes de modification appropriés, on mentionncra les groupes chimiques dont e-st connue l'affinité pour un autre type de molécule chimique. Parmi ces groupes de modification chimique, on peut mentionner la biotine ou l'avidine, dont on connaît les affinités réciproques, les groupes dérivés de l'une de ces molécules pouvant servir à la modification du ribonucléotide choisi et l'autre de molécule couplable avec un réactif marqué par unc enzyme ou susceptible d'être fixéeâ une enzyme, par exemple dans les conditions décrites dans le brevet nO 78 10975 de l'INSTITUT PASTEUR déposé le 13 avril 1978. Ce réactif consiste par exemple en un anticorps spécifique dirigé contre le groupe de modification ou en une molécule ayant une affinité spécifique pour ledit groupe de modification. Parmi les groupes de modification utiles du :ribo- nucléotide initial, figurent également des antigènes ou haptènes susceptibles d'être reconnus par des anticorps préalablement formés contre ces antigènes ou contre ces haptènes, plus particulièrement lorsque ceux-ci ont été fixés au préalable sur une macromolécule support, telle qu'une sérum-albumine ou un polypeptide, par exernple une polylysine. Parmi ces antigènes ou haptènes, on peut citer la biotine et l'avidine elles-mêmes, des groupes acétylaminofluorène, des peptides, horrnones ou prostaglandines, notamment ceux auxquels correspondent des antisérms ou anticorps spécifiques, des lectines, dont est connue la capacité à être couplées à des enzymes permettant leur révélation, notamment des péroxydases, ss-galactosidases, etc... De tels sérums ou anticorps sont disponibles dans le commerce. Mais la molécule ou le produit présentant des caractéristiques d'affinité vis-à-vis du groupe de modification susdit, sert éventuellement aussi seulement de relais vis-à-vis d'une autre molécule ou d'un autre produit susceptible d'être visualisé à son tour, notamment dans les conditions sus-indiquées ; par exemple le produit présentant les caractéristiques d'affinité, vis-àvis du groupe de modification susdit, est constitué par un anticorps lui-même non marqué, mais reconnaissable à son tour par des anticorps contre lui-même, ces derniers anticorps étant eux-mmes couplés à l'enzyme susceptible réagir sur un substrat spécifique, dans les conditions classiques en matière de dosage immunoenzymatique. D'une façon générale, le groupe de modification du ribonucléotide est constitué par toute molécule ou produit chimique fixable sur l'ATP et ensuite détectable dans les conditions qui ont été indiquées, dans la mesure où il répond aux conditions sus-indiquées. L'invention comprend également un test de reconnaissance des groupes compatibles. Ces groupes sont ceux qui n' empêchent pas la fixation de l'AMP modifié correspondant sur des aminoglycosides, notamment la tobramycine en présence d'adénylyl-transférase dans les conditions sus-indiquées, cet AMP modifié devant naturellement être fourni par l'ATP préalablement modifié par le groupe de modification étudié. Le groupe de modification chimique sus-indiqué est fixé sur la position 6, de préférence 8, du groupe adénine. Cette fixation intervient avantageusement par l'intermédiaire d'un bras du type -N-(CH2)x-X, ou -CO-(CH2)X-X, dans lequel x varie de 2 à 20, notamment de 6 à 12, et X est un groupe assurant la liaison entre un groupe M, choisi parmi ceux qui sont susceptibles d'une réaction de liaison avec un agent chimique ou immunologique ayant une affinité sélective pour ce groupe. Les groupes CH2 du bras susdit peuvent en partie être remplacés par des groupes CO ou NH, à condi tion naturellement que ces groupes de remplacement ne soient pas adjacents à des groupes identiques. Par exemple, si l'on considère le cas de la modification du groupe adénine de l'ATP en sa position 8, le ribonucléotide modifié obtenu peut être représenté par la formule (cas d'un bras du type NH (CH2)x X ) dans laquelle R est un groupe triphosphate, x, X et M ont les significations sus-indiquées. Avantageusement, le groupe X est constitué par un groupe NH ou CO. Un procédé pour fabriquer le dérivé de formule I, par exemple à partir de l'ATP préalablement bromé en position 8, consiste à le faire réagir dans les conditions appropriées, avec un composé de formule H2N-(CH2)X-X-Y, dans lequel Y représente un radical auquel sera ensuite substitué le groupe M susdit,notam- ment par la mise en oeuvre d'une réaction de condensation avec une molécule MZ, au cours de laquelle est alors formé le produit de condensation de formule I, avec libération d'une molécule Y-Z. Lorsque le groupe X est NH, Y est avantageusement de l'hydrogène. Lorsque X est CO, Y est avantageusement un hydroxyle. Z peut être constitué par tout groupe susceptible d'être détaché de M dans la susdite réaction de condensation, par exemple le fluor lorsque la molécule chimique donneuse du groupe recherché est le fluoro -1-dinitro-2,4 benzène, ou un hydroxyle ou de l'hydrogène dans le cas d'un peptide.Dans ce dernier cas, la fixation de ce peptide à l'extrémité du bras susdit peut, lorsque le groupe XY est constitué par un groupe tsH2 ou COOH, être effectué par la mise en oeuvre de réactions de couplage, traditionnelles dans la chimie des protéines, entre groupes carboxyle et amine, respectivement portés par les deux éléments peptidiques distincts à coupler, par exemple par condensation en présence d'un agent de condensation, tel que le dicyclohexyl-carbodiimide ou après formation préalable d'un ester activé à la fonction carboxylique de celui de ces deux éléments peptidiques qui le portent. La position 8 sur le cycle adénine de l'ATP ne constitue évidemment pas le seul point sur lequel peut se brancher une chaîne porteuse d'un groupe de modification tel qu'il a été défini plus haut. A titre d'exemple, on peut également substituer l'un des atomes d'hydrogène porté par le carbone en position 6 du cycle adénine par une chaîne porteuse de ce groupe.A titre d'exemple, on mentionnera la possibilité de substitution qui consiste à faire réagir avec l'ATP de l'acide iodoacétique ou un acide organique iodé équivalent, permettant la formation préalable d'un sel quaternaire, faisant intervenir l'azote en position 1, sel qui se transforme ensuite par chauffage en milieu basique à 350C, à pH légèrement basique, notamment à pH 8, pendant le temps suffisant, par exemple 72 heures, en un produit de substitution de l'un des hydrogènes du groupe NH2 fixé sur le carbone en position 6 du groupe adénine (réaction du type connu sous l'expression "réarrangement de Dimroth"). On obtient alors (lorsque l'acide organique iodé est constitué par l'acide iodoacétique) le composé de formule II ci-après Ce composé peut ensuite être transformé, par réaction avec le composé de formule H2N-(CH2)x-X-Y déjà défini plus haut, dans des conditions permettant la liaison chimique entre le groupe carbonyle initialement contenu dans le groupe carboxyle dans le composé de formule II et le groupe imino appartenant initialement à la fonction aminée du composé H2N-(CH2)x-X-Y, lequel peut alors être couplé à son tour avec un composé de formule MZ, dans les conditions qui ont déjà été définies plus haut. Il va de soi que tous les éléments qui précèdent ne visent qu'à illustrer des modes de préparation particuliers qui permettent de fixer sur 1'ATP un groupe de modification choisi parmi ceux auxquels correspondent des molécules affines, comme cela a été défini plus haut. D'autres caractéristiques de l'invention ap paraîtront encore au cours de la description d'exemples de mises en oeuvre préférées de l'invention. Préparation du 8- 0-N-(dinitro-phényl)-amino-hexyl2- aminoadénosine 5'-triphosphate. On fait réagit du 8-(aminohexyl)-aminoadéno sine 5' -triphosphate avec du fluoro-1-dinitro-2,4-benzène, au sein d'un mélange eau-éthanol 10/1 volumes %, à pH 8,8, à 40 C, et en présence d'un sel, notamment chlorure,de magnésium. Le produit de réaction finalement obtenu a pour formule On récupère le dérivé de formule III, ci après dénommé ATP-DNP, après une purification comprenant la fixation du ribonucléotide sur DEAE cellulose, élu tion avec un gradient de LiCl 0,2 N, pH 5,5, à LiCl 0,5 is, pH 2 et filtration sur tamis molculaire du type SEPl7ADEX G50. Lc rendcmcnt rcactionncl cst de 52 %.Les fractions recueillies sont analysées par spec trophotométrie d'absorption de rayonnements de longueurs d'onde de 280 et 360 nanomètres respectivement. On recueille celle des fractions dont les densités optiques dans les deux susdits domaines de longueurs d'onde sont dans un rapport (DO280/DO360) egal à 4. Le produit contenu dans cette fraction correspond à celui résultant de la fixation de 1 mole de DNP sur 1 mole d'hTP. Il ne donne également qu'une tache dans un système de chromatographie en couche mince. Le produit de cette fraction est lyophilisé. Ce produit présente la caractéristique d'être reconnu par des anticorps formés au préalable à l'égard de dinitro-S,4 benzene, qui avait préalablement été fixé sur un support macromoléculaire du type de la serum-albumine. Des anticorps de ce type sont par ailleurs disponibles dans le commerce. Préparation du 8-(N-biotinyl-aminohexyl)-aminoadénosine 5' -trlphosphate. On condense du 8-(aminohexyl)-amino-adénosine- 5'-triphosphate avec le biotinyl-N-hydroxysccinimidc-- ester, dans les conditions décrites par LANCER et al, telles qu'appliquées à la fabrication du biotinyl-UTP à partir de la 5-(3-amino)allyluridine. On obtient alors le composé de formule Dosage de tobramycine. L'échantillon présumé contenir le susdit antibiotique est constitué par du sérum provenant d'un patient traité par un aminoglycoside. Ce sérum est préalablement déprotéinisé. Cet échantillon est mis en solution dans une solution tamponnée dont la composition est la suivante Tris HCl 50 mM, pH 7,5 MgCl2 10 mM, DTT 1 mM. On ajoute à la solution ainsi formée 10 micromoles d'ATP-DNP et on laisse incuber pendant 1 heure à 370 C avec 10 U d'adénylyltransférase extraite de StaphzZococcus rivet ou de Escherichia coli R55. Une partie du produit de réaction est alors prélevée, notamment par une pipette d'EPPENDORF (GILSON) comprenant dans sa partie inférieure un échangeur de cations capable de fixer l'antibiotique modifié par l'AMP-DNP, les autres constituants, y compris l'excès d'ATP-DNP et les phosphates organiques formés restant alors dans la solution. L'échangeur de cations (Amberlite CG- 50, 200 400 mcsh, forme Nu4+) est alors lavé avec la susdite solution tampon. L'antibiotique modifié est ensuite élué à partir de l'échangeur de cations, à l'aide d'une solution d'ammoniaque 1N. Le soluté obtenu est ensuite neutralisé avec H51 1N. Le dosage comprend alors finalement l'étape consistant à mettre en contact la susdite solution avec un anticorps anti-DNP couplé à de la péroxydase, à recueillir l'éventuel complexe formé entre, d'une part, l'aminoglycoside dans lequel est incorporé le produit de dégradation de 1'ATP-DNP, et, d'autre part, le susdit anticorps et à le mettre en contact avec un substrat colorable de la péroxydase. La présence d'antibiotique est alors manifestée par la coloration du substrat de la péroxydase, coloration qui permet même de fournir des indications quantitatives concernant la quantité d'antibiotique que contenait initialement l'échantillon traité. Dans I'exemple-considéré le substrat est avantageusement constitué par une solution contenant - de l'eau oxygénée : 10 ul d'H2O2 à 110 volumes, - de l'acétate de potassium : 9,5 ml 0,05, pH 5,1, - du 3-amino-9-éthylcarbazole : 2 mg dissous dans 0,5 ml de N-N'-diméthylformamide. On peut par cette méthode doser des quantités de tordre du nanogramme par millilitre du susdit aminoglycoside. L'invention ne se limite évidemment pas aux modes de réalisation décrits ci-dessus à titre d'exemples et lthomme de l'art peut y apporter des modifications sans pour autant sortir du cadre des revendications ci-après. REVENDICATIONS 1 - ATP modifié consistant en une molécule chimique fixée de façon covalente au cycle adénine de cet ATP et portant au moins un groupe non engagé dans la liaison covalente susdite et couplable directement ou indirectement avec une molécule cu un produit ayant une affinité spécifique pour ce groupe et permettant sa reconnaissance, ledit groupe étant en outre tel qu'il n' em- pêche pas l'ATP modifié qui le porté à fournir l'AMP modifié ou l'ADP modifié correspondant dans une forme in çorporable dans une substance biologique du type de celles qui, mises en présence d'ATP et de l'enzyme appropriée, sont normalement susceptibles d'incorporer de L'AMP ou de l'ADP. 2 - ATP modifié selon a revendication 1, caractérisé en ce que le susdit groupe de modification est susceptible d'être reconnu spécifiquement et directement par une autre molécule ou par un produit, lui-même aisément détectable, par une méthode de visualisation. 3 - ATP modifié selon la revendication 2, caractérisé en ce que le susdit groupe de modification est constitué par un antigène ou un haptène susceptible d'être reconnu par un anticorps préalablement formé contre cet antigène ou contre cet haptène. - - ATP modifié selon la revendication 1, carac- térisé en ce que le susdit groupe de modification sert de relais vis- > -vis d'une autre molécule ou d'un autre produit susceptible d'être visualisé à son tour. 5 - ATP modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le susdit groupe de modification ou, selon le cas, la susdite molécule relais, est couplable chimiquement avec une molécule affine marquée par une enzyme ou immunologiquement avec un anticorps marqué par une enzyme et ayant une affinité sélective pour ledit groupe de modifica- tion ou la susdite molécule relais. 6 - ATP modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par la fixation à l'une au moins de ses extrémités d'au moins un groupe ribonucléotide modifié dérivé de l'ATP modifié-par un groupe de modification fixé de façon covalente sur la position 6, ou de préférence 8, de son groupe adénosine, par l'intermédiaire d'un bras du type -H-(CH2)x-X, ou -CO-(CH2)x-X, dans lequel X varie de 2 à 20, notamment de 6 à 12, et X est un groupe assurant la liaison entre un groupe M, choisi parmi ceux qui sont susceptibles d'une réaction de liaison avec un agent chimique ou immunologique ayant une affinité sélective pour ce groupe. 7 - ATP modifié selon la revendication 6, caractérisé en ce que les groupes CH2 du bras susdit peuvent en partie être remplacés par des groupes CO ou NH, à condition naturellement que ces groupes de remplacement ne soient pas adjacents a des groupes identIques. 8 - ATP modifié selon l'une quelconque des re vendicaticns 1 à 7, caractérisé en ce que le susdit groupe de modification comprend un groupe dérivé de la biotine, de l'avidine ou un groupe dinitro-2,4-phényle. 9 - Application de l'ATP à la détection ou au dosage d'une substance appartenant à la catégorie de substances biologiques, telles que certains antibiotiques plus particulièrement ceux de la classe des aminoglycosides, qui sont capables, en présence d'enzymes spécifiques, d'incorporer de 1'ADP ou de 1'AMP, ces dernières molécules étant susceptibles d'être fournies å ces substances biologiques à partir d'ATP en présence d'une enzyme spécifique appropriée, caractérisée par les étapes qui consistent à mettre la composition présumée contenir la substance recherchée avec l'ATF modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, en présence de l'enzyme susdite et, le cas échéant, après élimination de ces ATP modifiés libres, à placer la composition obtenue dans des conditions permettant l'éventuel couplage des groupes de modification portés par l'AMP modifié ou 1'ADP modifié incorporé à ladite substance, avec la molécule ou le produit permettant la reconnaissance du groupe de modification du dérivé initial d'ATP, et à détecter ou à doser la susdite substance éventuellement présente portant lesdits produits de reconnaissance.