FR 2519005 A1 19830701 FR 8124443 A 19811229 Fragments d'ADN marqués à l'une au moins de leurs extrémités par des ribonucléotides modifiés reconnaissables par des molécules affines et procédé pour réaliser une analyse de tels fragments d'ADN. L'invention est relative à des fragments d'ADN marqués à l'une au moins de leurs extrémités par des fragments de nucléotides modifiés, plus particulièrement de ribonucléotides modifiés reconnaissables par des. molécules affines, et à un procédé pour réaliser une analyse de séquence de tels fragments. Parmi les techniques d'analyse des séquences de nucléotides contenues dans un ADN, on mentionnera à titre principal la-méthode dite de MAXAM & GILBERT (Proc. Natl. Acad. Sci. USÀ, vol. 74, NO 2, pop. 560-564, février 1977), méthode qui consiste à soumettre l'ADN à analyser, à des réactions de clivages différentiels au niveau des bases guanine et adénine, à des clivages à proportions égales au niveau des bases cytosine et thymine et enfin à des clivages au niveau des seules bases cytosine.Cette méthode implique cependant que l'ADN étudié ait auparavant été marqué à l'une de ses extrémités par un marqueur radioactif, notamment le 32p, d'où la possibilité, après séparation des fragments obtenus après les susdites opérations de clivage, notamment par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide, de reconstituer la séquence d'enchaînement des différents nucléotides dont était initialement constitué l'ADN étudié, plus particulièrement à partir des images autoradiographiques qui peuvent être formées sur un film impressionnable appliqué sur le gel. Les difficultés qu'implique la révélation autoradiographique des produits des clivages sur la plaque de gel sont bien connues. En raison de la diffusion du rayon nement des isotopes marqués dans toutes les directions de l'espace, une résolution satisfaisante des différentes bandes de migration dans le gel suppose l'utilisation de plaques extrêmement minces. En général, l'épaisseur de ces plaques ne dépasse pas 0,3 mm d'épaisseur. L'utilisation de plaques de gel plus épaisses entraînerait une diminution rapide du pouvoir de résolution du procédé autoradiographique. L'utilisation de la radioactivité en elle-même n'est pas non plus sans dangers. L'invention a pour but de remédier à ces difficultés, notamment de fournir un procédé de modification des ADN dont la séquence doit être étudiée, rendant plus aisée la détection ultérieure des fragments d'ADN susceptibles d'être obtenus par un procédé d'analyse de séquences (tel qu'il a été rappelé plus haut, ou par tout autre procédé susceptible de conduire à des résultats analogues). L'ADN modifié selon l'invention est caractérisé par le fait qu'un oligomère de ribonucléotides modifiés, de préférence un ribonucléotide modifié unique, est fixé à l'une au moins de ses extrémités, la modification du ribonucléotide lui-même consistant en une molécule chimique fixée de façon covalente à ce ribonucléotide et portant au moins un groupe non engagé dans la liaison covalente susdite et couplable directement ou indirectement avec une molécule ou un produit ayant une affinité spécifique pour ce.groupe et permettant par conséquent la reconnaissance sélective de 1'ADN modifié En particulier, ce groupe permet une liaison affine chimique ou immunologique avec une molécule ou un produit lui-même directement révélable ou susceptible d'être révélé à son tour par couplage avec un autre produit révélateur.En outre, ce groupe est tel qu'il ne modifie pas la capacité de ce ribonucléotide à être fixé à l'extrémité d'un ADN, en présence d'une ADN-transférase terminale, lorsqu'il est mis en contact avec cet ADN, dans des conditions permettant la fixation d'un ou de plusieurs ribonucléotides sur cette extrémité. L'invention concerne également un procédé pour obtenir un tel ADN modifié, ce procédé consistant à traiter l'ADN à étudier avec un tel ribonucléotide modifié, en présence d'au moins celui des ribonucléotides normalement susceptible de s'apparier dans un ADN avec le ribonucléotide en question, porteur ou non d'un tel groupe de modification, et d'une ADN-terminale transférase, le cas échéant, et lorsque le produit de fixation à l'extrémité de l1ADN résultant de ce traitement consiste en un oligomère de nucléotides mo modifiés, à éliminer les ribonucléotides modifiés de cet éventuel oligomère, à l'exception du ribonucléotide directement fixé au déoxyribonucléotide terminal d'extrémité de 1'ADN en question.Cette élimination est de préférence faite au moyen d'une base alcaline, notamment de la soude, dans des conditions permettant la séparation des liaisons que forment entre eux lesribonucléotides dans ce fragment d'oligomère. On peut obtenir de façon en soi connue, à partir d'un ADN portant à ses deux extrémités des ribonucléotides eux-mêmes modifiés, comme défini ci-dessus (ou à partir d'un ADN n'en portant qu'à l'une de ses extrémités), des fragments d'ADN plus petits,soit par action d'agents chimiques susceptibles de provoquer des clivages, notamment au niveau de nucléotides déterminés, soit, de préférence, par action d'endonucléases, notamment d'enzymes de restriction appropriées, dans la mesure où 1'ADN correspondant comporte le site de restriction correspondant. Le traitement de ce fragment d'ADN avec plusieurs enzymes de restriction permet, par récupération des différents fragments marqués à la même extrémité, l'établissement éventuel d'une carte de restriction de cet ADN. Lorsqu'à une certaine enzyme de restriction correspond un site de restriction unique, le traitement dudit fragment d'ADN par cette enzyme permet l'obtention de fragments de longueur déterminée, se prêtant à une analyse de la séquence des déoxyribonucléotides dont ils sont formés. En effet, l'invention concerne aussi, dans l'une de ses applications préférées, un procédé comprenant les étapes qui consistent à traiter un ADN ainsi marqué à l'une de ses extrémités par un ribonucléotide modifié comme ci-dessus défini, avec des agents chimiques permettant d'opérer au sein de cet ADN des clivages différentiels au niveau de certaines bases, notamment celles qui ont été décrites par MAXAM & GILBERT dans l'article déjà mentionné plus haut, à recueillir et à séparer des fragments d'ADN dans un système permettant de les trier par ordre de tailles, et à les faire réagir avec des réactifs permettant la réalisation d'un couplage des groupes chimiques portés par les ribonucléotides terminaux de ceux des fragments qui en portent, avec une molécule ou an produit ayant une affinité sélective à l'égard du groupe chimique de modification desdits ribonucléotides terminaux. Les ribonucléotides modifiés fixés à l'extré- mité des ADN concernés sont principalement dérivés - de l'acide adénosine 5'-triphosphorique (ATP), - de l'acide guanosine 5'-triphosphorique (GTP), - de l'acide cytidine 5'-triphosphorique (CTP) et - de l'acide uridine 5'-triphosphorique (UTP). Le groupe chimique lié de façon covalente à ces ribonucléotides peut revêtir les formes les plus diverses, dès lors qu'il possède un groupe permettant son couplage avec des substances affines permettant sa révélation, de préférence sous forme directement visualisable, et qu'il n'empêche pas une ADN-transférase terminale d'assurer la fixation des ribonucléotides modifiés obtenus aux extrémités d'un ADN. Parmi les groupes chimiques préférés susceptibles d'être fixés sur les bases des susdits ribonucléotides, on mentionnera tout groupe susceptible d'être reconnu spécifiquement par une autre molécule ou par un produit, lui-même aisément détectable, de préférence par une méthode de visualisation. Cette autre molécule ou cet autre produit consiste par exemple en une enzyme, dont la présence peut être révélée par l'action qu'elle est susceptible d'exercer sur un substrat, de préférence un substrat donnant lieu à des réactions de coloration ou de décoloration, ou plus généralement encore de modification de spectres d'absorption respectivement décelables par colorimétrie ou spectrophotométrie. On peut naturellement avoir recours à des molécules ou produits donnant lieu à des réactions de fluorescence, à des udfications ae densité optique, etc., par exemple des produits comprenant des groupes dérivés de l'aminofluorène, du chlorure de dansyle, de la rhodamine, etc.. Parmi les groupes de modification appropriés, on mentionnera les groupes chimiques dont est connue l'affinité pour un autre type de molécule chimique. Parmi ces groupes de modification chimique, on peut mentionner la biotine ou l'avidine, dont on connalt les affinités réciproques, les groupes dérivés de l'une de ces molécules pouvant servir à la modification du ribonucléotide choisi et l'autre de molécule couplable avec un réactif marqué par une enzyme ou susceptible d'être fIxée à une enzyme, par cxemple dans les conditions décrites dans le brevet n0 78 10975 de l'INSTITUT PASTEUR déposé le 13 avril 1978. Ce réactif consiste par exemple en un anticorps spécifique dirigé contre le groupe de modification ou en une molécule ayant une affinité spécifique pour ledit groupe de modification. Parmi les groupes de modification utiles du ribonucléotide initial, figurent également des antigènes ou haptènes susceptibles d'être reconnus par des anticorps préalablement formés contre ces antigènes ou contre ces haptènes, plus particulièrement lorsque ceux-ci ont été fixés au préalable sur une macromolécule support, telle qu'une sérum-albumine ou un polypeptide, par exemple une polylysine. Parmi ces antigènes ou haptènes, on peut citer la biotine et l'avidine elles-mêmes, des groupes acétylaminofluorène, des peptides, hormones ou prostaglandines, notamment ceux auxquels correspondent des antisérums ou anticorps spécifiques, des lectines, dont est connue la capacité à être couplées à des enzymes permettant leur révélation, notamment des péroxydases, S-galactosidases, etc...De tels sérums ou anticorps sont disponibles dans le commerce. Mais la molécule ou le produit présentant des caractéristiques d'affinité vis-à-vis du groupe de modification susdit, sert éventuellement aussi seulement de relais vis-à-vis d'une autre molécule ou d'un autre produit susceptible d'être visualisé à son tour, notamment dans les conditions sus-indiquées ; par exemple le produit présentant les caractéristiques d'affinité,vis-à- vis du groupe de modification susdit, est constitué par un anticorps lui-même non marqué, mais reconnaissable à son tour par des anticorps contre lui-même, ces derniers anticorps étant eux-mêmes couplés à l'enzyme susceptible d'agir sur un substrat spécifique, dans les conditions classiques en matière de dosage immunoenzymatique. D'une façon générale, le groupe de modification du ribonucléotide est constitué par toute molécule ou produit chimique fi.xable sur un ribonucléotide et ensuite détectable dans les conditions qui ont été indiquées, dans la mesure où il ne perturbe pas la capacité du nucléotide modifié obtenu à être attaché à l'extrémité d'un ADN, sous l'action d'une ADN-transférase terminale ; cette propriété est également à la base du test de reconnaissance qui permet d'en constater la réalité, savoir la visualivat3.0n effective, notamment dans les conditions sus-indiquées, d'un fragment d'ADN déterminé porteur à l'une au moins de ses extrémités du ribonucléotide modifié par la molécule ou produit étudié, dans la mesure où un tel ADN transformé aura été formé, à l'issue de la réaction du fragment d'ADN correspondant avec le ribonucléotide modifié, en présence d'une ADN-transférase terminale dans des conditions permettant normalement la fixation du même ribonucléotide non modifié ou d'un oligomère de tels ribonucléotides, à l'une au moins des extrémités de ce fragment d'ADN. Lorsque le ribonucléotide initial est constitué par l1ATP, le groupe de modification chimique sus-indiqué est fixé sur la position 6, de préférence 8, du groupe adénine. Cette fixation intervient avantageusement par l'intermédiaire d'un bras du type -NH-(CH2)x-X, ou -CO-(CH2)x-X, dans lequel x varie de 2 à 20, notamment de 6 à 12, et X est un groupe assurant la liaison entre un groupe M, choisi parmi ceux qui sont susceptibles d'une réaction de liaison avec un agent chimique ou immunologique ayant une affinité sélective pour ce groupe. Les groupes CH2 du bras susdit peuvent en partie être remplacés par des groupes CO ou NH, à condi tion naturellement que ces groupes de remplacement ne soient pas adjacents à des groupes identiques. Par exemple, si l'on considère le cas de la modification du groupe adénine de l'ATP en sa position 8, le ribonucléotide modifié obtenu peut être repré- senté par la formule (cas.d'un bras du type NH (CH2)x X ) dans laquelle R est un groupe triphosphate, x, X et M ont les significations sus-indiquées. Avantageusement, le groupe X est constitué par un groupe NH ou CO. Un procédé pour fabriquer le dérivé de formule I, par exemple à partir de l'ATP préalablement bromé en position 8, consiste à le faire réagir dans les conditions appropriées, avec un composé de formule il2N (CH2)x X-Y, dans lequel Y représente un radical auquel sera ensuite substitué le groupe M susdit, notamment par la mise en oeuvre d'une réaction de condensation avec une molécule MZ, au cours de laquelle est alors formé le produit,de condensation de formule I, avec libération d'une molécule Y-Z. Lorsque le groupe X est NH, Y est avantageusement de l'hydrogène. Lorsque X est CO, Y est avantageusement un hydroxyle. Z peut être constitué par tout groupe susceptible d'être détaché de M dans la susdite réaction de condensation, par exemple le fluor lorsque la molécule chimique donneuse du groupe recherché est le fluoro -1-dinitro-2,4 benzène, ou un hydroxyle ou de l'hydrogène dans le cas d'un peptide.Dans ce dernier cas, la fixation de ce peptide à l'extrémité du bras susdit peut, lorsque le groupe XY est constitué par un groupe NH2 ou COOH, être effectué par la mise en oeuvre de réactions de couplage, traditionnelles dans la chimie des protéines, entre groupes carboxyle et amine, respectivement portés par les deux eléments peptidiques distincts à coupler, par exemple par condensation en présence d'un agent de condensation, tel que le dicyclohexyl-carbodiimide ou après formation préalable d'un ester activé à la fonction carboxylique de celui de ces deux éléments peptidiques qui le portent. La position 8 sur le cycle adénine de l'ATP ne constitue évidemment pas le seul point sur lequel peut se brancher une chaîne porteuse d'un groupe de mo dification tel qu'il a été défini plus haut. A titre d'exemple, on peut également substituer l'un des atomes d'hydrogène porté par le carbone en position 6 du cycle adénine par une chaine porteuse de ce groupe. A titre d'exemple, on mentionnera la possibilité de substitution qui consiste à faire réagir avec l'ATP de l'acide iodoacétique ou un acide organique iodé équivalent, permettant la formation préalable d'un.sel quaternaire, faisant intervenir l'azote en position 1, sel qui se transforme ensuite par chauffage en milieu basique à 350C, à pH légèrement basique, notamment à pH 8, pendant le temps suffisant, par exemple 72 heures, en un produit de substitution de l'un des hydrogènes du groupe NH2 fixé sur le carbone en position 6 du groupe adénine (réaction du type connu sous l'expression "réarrangement de Dimroth"). On obtient alors (lorsque l'acide organique iodé est constitué par l'acide iodoacétique) le composé de formule II ci-après Ce composé peut ensuite être transformé, par réaction avec le composé de formule H2N-(CH2)X-X-Y déjà défini plus haut, dans des conditions permettant la liaison chimique entre le groupe carbonyle initialement contenu dans le groupe carboxyle dans le composé de formule II et le groupe imino appartenant initialement a la fonction aminée du composé H2N-(CH2)x-X-Y, lequel peut alors être couplé à son tour avec un composé de formule MZ, dans les conditions qui ont déjà été définies plus haut. Il va de soi que tous les éléments qui précèdent ne visent qu'a illustrer des modes de préparation particuliers qui permettent de fixer sur l'ATP un groupe de modification choisi parmi ceux auxquels correspondent des molécules affines, comme cela a été défini plus haut. On peut de façon analogue fabriquer des dérivés du GTP, les groupes de modification chimique susdéfinis étant alors fixés dans des conditions analogues sur la position 2 ou de préférence 8 du groupe guaniné du GTP. Les mêmes mécanismes de réaction sont normalement applicables. De même, on peut mettre en oeuvre, dans les applications préférées qui ont été indiquées, de l'UTP ou du CTP modifié par un groupe chimique répondant aux conditions sus-indiquées, en ayant cependant recours au procédé tout à fait différent décrit dans l'article de P.R. LANGER et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 78, No. 11, p. 6633-6637, novembre 1981). D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront encore au cours de la description d'exemples de mises en oeuvre préférées de l'invention. Préparation du 8- L-N-(dinitro-phényl)-amino-hexyl- aminoadénosine 5' -triphosphate. On fait réagit du 8-(aminohexyl)-aminoadénosine 5'-triphosphate avec du fluoro-1-dinitro-2,4-benzène, au sein d'un mélange eau-éthanol 10/1 volumes %, à pH 8,8, à 400C, et en présence -d'un sel, notamment chlorure,de magnésium. Le produit de réaction finalement obtenu a pour formule On récupère le dérivé de formule III, ciaprès dénommé ATP-DNP, après une purification comprenant la fixation du ribonucléotide sur DEAE cellulose, élution avec un gradient de LiCl 0,2 N, pH 5,5, à LiCl 0,5 N, pH 2 et filtration sur tamis moloculaire du type SEPHADEX 50. Lc rendcmcnt réactionncl est de 52 %.Les fractions recueillies sont analysées par spec trophotometrie d'absorption de rayonnements de lon gueurs d'onde de 280 et 360 nanomètres respectivement. On recueille celle des fractions dont les densités optiques dans les deux susdits domaines de longueurs d'onde sont dans un rapport (DO 80/D0360) égal à 4. Le produit contenu dans cette fraction correspond à celui résultant de la fixation de 1 mole de DNP sur 1 mole d'ATP. Il ne donne également qu'une tache dans un système de chromatographie en couche mince. Le produit de cette fraction est lyophilisé. Ce produit présente la caractéristique d'être reconnu par des anticorps formés au préalable à l'égard de dinitro-2,4 benzène, qui avait préalablement été fixé sur un support macromoléculaire du type de la serum-albumine. Des anticorps de.ce type sont par ailleurs disponibles dans le commerce. Préparation du 8-(N-biotinyl-aminoheYyl)aminoadénosine 5'-triphosphat. On condense du 8-(aminohexyl)-amino-adénosine- 5' -triphosphate avec le biotinyl-N-hydroxysuccinimideester, dans les conditions décrites par LANGER et al, telles qu'applIquées à la fabrication du biotinyl-UTP à partir de la 5-(3-amino)allyluridine. On obtient alors le composé de formule Fabrication d'un ADN marqué à ses extrémités par des ribonucléotides modifiés. 600 micromoles d'ATP-DNP et 10 microgrammes d'un fragment d'ADN comportant 500 paires de bases sont mis à réagir en présence de 30 unités d'ADN-terminal-transférase à 370C et pendant 24 heures, au sein d'une solution tampon, dont la composition est la suivante(volume final 200 microlitres): cacodylate de potassium : 100 mM sérum d'albumine bovine : 1 mg/ml dithiothreitol : 1 mM chlorure de cobalt :1mM L'ADN retenant à ses extrémités des groupes ATP DNP est purifié, par passage de la solution sur une colonne du tamis moléculaire commercialisé sous la marque SEPHADEX G 50. Une goutte de cette fraction est déposée sur un filtre de cellulose. Après séchage du filtre, on met celui-ci au contact d'une solution d'anticorps anti DNP de lapin. L'anticorps non fixé est rincé. Le filtre est ensuite mis au contact d'une solution d'anticorps de lapin liée à de la péroxydase. Après rinçage de l'excès d'anticorps non fixé., on révèle la présence d'anticorps fixés sur le filtre avec une solution d'un substrat pour la péroxydase. Cette solution contient - de. l'eau oxygénée : 10 ijl d'11202 à 110 volumes, - de l'acétate de potassium : 9,5 ml 0,05 M, pH 5,1, - du carbazole:2 mg pour 0,5 ml de N-N'-dimethy.lforrlide. La présence de l'anti-anticorps de lapin sur le filtrat est alors révélé par la formation d'un précipité brun rouge. La sensibilité de la méthode est telle qu'elle permet de détecter des quantités extrêmement faibles d'ADN, notamment 380.10 4 picomoles. Application des ADN modifiés conformes à l'invention à l'analyse des séquences de déoxynucléotides qui les constituent. Les premières étapes de la méthode permettant l'analyse des séquences de nucléotides contenus à l'intérieur d'un ADN déterminé à double-brin sont schématisées ci-après. -3'HO- -------- 5' (1) 5t ~~ 3'oH terminale-transférase + ATP - DNP 1 t DNP DNP DNP I AMP AMP I (2) AMP - AMP - AMP 5' (2) AMP AMP - --------AMP - AMP - AMP - 3' I I DNP DNP DNP NaOH DNP AMP 5' (3) 5' AMP - 3' DNP enzyme de restriction DNP (4)3'-AMP -- 5' 3t 5' 5' 3' 5'- AIMP-3' DNP (A) (B) L'ADN initial (1) est schématisé par deux traits parallèles comportant l'indication des extrémités respectives 3', 5' de chacun des brins de cet ADN. Par réaction avec l'ATP-DNP, en présence d'ADN-terminale-transférase, on obtient le fragment d'ADN modifié représenté en (2), dont les extrémités 3' portent des oligomères d'AMP-DNP (trois motifs AMP-DNP par oligomère, dans le cas de l'exemple considéré ; avec AMP désignant les éléments dérivés du ATP-DMP après l'élimination de deux groupes phosphate par monomère d'ATP-DMP, du fait de ltoligomérisation). L'ADN ainsi modifié est soumis à une hydrolyse alcaline au sein d'une solution de soude 1 à 40 OC, ce grâce à quoi on obtient un ADN modifié, à nouveau récupérable par filtration à travers un tamis moléculaire, ne portant plus à chacune de ses extrémités terminales qu'un seul ribonucléotide modifié (3). Par action d'une enzyme de restriction, par exemple dans les conditions décrites par MAXAM & BR GILBERT, on produit deux fragments repérés par A et B en (4).On remarquera que l'on peut évidemment modifier à volonté l'ordre des opérations (2), (3) et (4). Après isolement et purification par exemple des fragments B, ceux-ci sont répartis en plusieurs lots respectivement soumis aux différentes réactions de clivage différentiel, telles que celles et dans les conditions décrites par MAXAM & GILBERT. Les produits résultant de ces réactions de clivage sélectif sont soumis à des opérations d'électrophorèse sur gel d'acrylamide, dans les conditions décrites par les mêmes auteurs, pour séparer les différents fragments d'ADN, respectivement marqués à leurs extrémités par ordre de tailles, et en différentes bandes. Conformément à l'invention, on procède ensuite à la révélation des différents fragments marqués par exemple in situ dans le gel, par mise en contact de ces derniers avec les solutions d'anticorps, dans les conditions qui ont été indiquées plus haut. On peut aussi transférer au moins en partie les bandes de migrations distinctes sur un filtre de cellulose ou support analogue, par application de ce filtre sur le gel, les différents fragments ou bandes étant alors détectés sur le filtre lui-même, par exemple dans les conditions qui ont déjà été indiquées plus haut. On appréciera que cette méthode extrêmement sensible n'implique plus l'utilisation antérieurement nécessaire de plaques de gel extrêmement minces, puisque la détection peut maintenant s'effectuer par visualisation directe des bandes de fractionnement soit dans le gel, soit sur le filtre. L'invention concerne naturellement les ribonucléotides modifiés eux-mêmes lorsqu'ils sont nouveaux. Tel est en particulier le cas pour les ribonucléotides modifiés dans les conditions sus-indiquées, lorsqu'ils sont dérivés de l'ATP. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullen;ent à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes. REVENDICATIONS 1 - ADN modifié par un oligomère de ribonucléotides modifiés, de préférence un ribonucléotide modifié unique, fixé à l'une au moins de ses extrémités, la modification du ribonucléotide lui-même consistant en une molécule chimique fixée de façon covalente à ce ribonucléotide et portant au moins un groupe non engagé dans la liaison covalente susdite et couplable directement ou indirectement avec une molécule ou un produit ayant une affinité spécifique pour ce groupe et permettant sa reconnaissance, ledit groupe étant en outre tel qu'il n'empêche pas un ribonucléotide qui le porte à être fixé à l'extrémité d'un ADN, en présence d'une ADN-transférase terminale, lorsqu'il est mis en contact avec cet ADN, dans des conditions permettant la fixation d'un ou de plusieurs ribonucléotides sur cette extrémité. 2 - ADN modifié selon la revendication 1, caractérisé en ce que le susdit groupe de modification est susceptible d'être reconnu spécifiquement et directement par une autre molécule ou par un produit, lui-même aisément détectable, par une méthode de visualisation. 3 - ADN modifié selon la revendication 2, caractérisé en ce que le susdit groupe de modification est constitué par un antigène ou un haptène susceptible d'être reconnu par un anticorps préalablement formé contre cet antigène ou contre cet haptène. 4 - ADN modifié selon la revendication 1, caractérisé en ce que le susdit groupe de modification sert de relais vis-à-vis d'une autre molécule ou d'un autre produit susceptible d'être visualisé à son tour. 5 - ADN modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le susdit groupe de modification ou, selon le cas, la susdite molécule relais, est couplable chimiquement avec une molécule affine marquée par une enzyme ou immunologiquement avec un anticorps marqué par une enzyme et ayant une affinité sélective pour ledit groupe de modification ou la susdite molécule relais. 6 - ADN modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par la fixation à l'une au moins de ses extrémités d'au moins un groupe ribonucléotide modifié, dérivé de l'ATP modifié par un groupe de modification fixé de façon covalente sur la position 6, ou de préférence 8, de son groupe adénine, par l'intermédiaire d'un bras du type -NH-(CH2)X-X, ou -CO-(CH2)x-X, dans lequel x varie de 2 à 20, notamment de 6 à 12, et X est un groupe assurant la liaison entre un groupe M, choisi parmi ceux qui sont susceptibles d'une réaction de liaison avec un agent chimique ou immunologique ayant une affinité sélective pour ce groupe. 7 - ADN modifié selon la revendication 6, caractérisé en ce que les groupes CH2 du bras susdit peuvent en partie être remplacés par des groupes CO ou NH, à condition naturellement que ces groupes de remplacement ne soient pas adjacents à des groupes identiques. 8 - ADN modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le susdit groupe de modification comprend un groupe dérivé de la biotine, de l'avidine ou un groupe dinitro-2,4-phényle. 9 - Procédé de modification d'un ADN comprenant es étapes consistant à traiter ledit ADN avec un ribonucléotide, portant un groupe de modification tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8, en présence d'au moins celui des ribonucléotides normalement susceptible de s'apparier dans un ADN avec le ribonucléotide en question, porteur ou non d'un tel groupe de modification, et d'une ADN-terminale transférase, puis le cas échéant, et lorsque le produit de fixation à l'extrémité de l'ADN résultant de ce traitement consiste en un oligomère de nucléotides modifiés1 à éliminer les ribonucléotides modifiés de cet éventuel oligomère, à l'exception du ribonucléo tide directement fixé au déoxyribonucléotide terminal d'extrémité de l'ADN en question, de préférence par l'action d'une base alcaline, notamment de la soude, dans des conditions permettant la séparation des liaisons que forment entre eux les ribonucléotides dans ce fragment d'oligomère. 10 - Application de la modification de l'ADN à l'une de ses extrémités par un ribonucléotide portant un groupe de modification tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8, à l'obtention d'une carte de restriction de cet ADN par action des enzymes de restriction correspondantes, et par récupération, tri-et comparaison des tailles des fragments obtenus et portant tous le même ribonucléotide modifié à l'une de ses extrémités. 11 - Application de la modification de l'ADN à l'une de ses extrémités par un ribonucléotide portant un groupe de modification tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8, à la réalisation d'une analyse de la séquence de nucléotldes dont est constitué cet ADN, par un procédé comprenant les étapes consistant à traiter cet ADN avec des agents chimiques permettant d'opérer au sein de cet ADN des clivages différentiels au niveau de certaines bases, à recueillir et à séparer des fragments d'ADN dans un système permettant de les trier par ordre de tailles, et à les faire réagir avec des réactifs permettant la réalisation d'un couplage des groupes chimiques portés par les ribonucléotides terminaux de ceux des fragments qui en portent, avec une molécule ou un produit ayant une affinité sélective à l'égard du groupe chimique de modification desdits ribonucléotides terminaux, en vue de leur visualisation, et à déterminer les nucléotides terminaux non modifiés de chacun de ces fragments d'ADN, eu égard à la nature de l'agent chimique utilisé pour le clivage à son niveau.