FR 2520380 A1 19830729 FR 8301233 A 19830127 La présente invention concerne un procédé de déter nation très sensible. Jusqu'à présent, comme procédés de détermination très sensibles, on connaissait le procédé par fluorescence, le procédé par luminîscence et d'autres. Toutefois, dans ces procédés, des échantillons tels que les fluides du corps causent des erreurs dans la détermination, concernant par exemple la valeur de réglage et l'extinction, en raison d'impuretés dans le fluide du corps. Des procédés de détermination par recyclage de coenzyme sont bien connus. Toutefois, dans le procédé antérieur, une réaction d'indication est nécessaire après la réaction de recyclage, ce qui est cause d'une mise en oeuvre compliqude, et la réaction d'indication elle-même est influencée par la substance autre que la substance à déterminer. De plus, il faut un récipient à réaction spécial pour matière grasse et un volume réactionnel extrêmement petit. De plus, dans le procédé antérieur, la co-enzyme n'ayant pas réagi à décomposer est décomposée par addition d'un acide ou d'un alcali, chauffage et neutralisation du mélange de réaction, et dans ces opérations il est important d'ajouter la quantité exacte d'acide ou d'alcali afin de neutraliser le mélange de réaction et, si le pH du mélange de réaction neutralisé varie, cela a un effet sur le taux de recyclage. Ces phénomènes causant des erreurs dans la détermination. On a trouvé que dans la réaction de recyclage, la réaction de recyclage elle-meme peut étre utilisée comme réaction d'indication-, ce qui rend inutile l'utilisation spéciale d'une réaction d'indication et des réactifs correspondants. De plus, des méthodes de détermination par point de virage et de détermination de vitesse deviennent possibles et on n'a plus besoin d'un récipient à réaction special. On a trouvé aussi que le réglage du pH s'effectue facilement par addition d'un excès d'ester d'alcoyle inférieur d'acide formique de façon à éviter que le taux de recyclage soit influencé par des variations du pH à la neutralisation. Un but de la présente invention est de fournir un procédé de détermination dans lequel la réaction de recyclage elle-même est la réaction d'indication, sans qu'on ait besoin d'apérations et de réactifs pour la réaction d'indication, et sans influence des substances autres que la substance à déterminer. Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé de détermination non seulement pour une méthode de détermination par point de virage, mais aussi pour une méthode de détermination de taux, Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé de détermination simple n'exigeant pas un récipient à réaction sp8cial;- n'exigeant, pas un volume réactionnel extrêmement petit et pouvant se mettre en oeuvre dans un coffret à température constante classique. Un autre but encore de la présente invention est de fournir un procédé de détermination dans lequel le pu du mélange de réaction peut être réglable facilement par addition d'un excès d'ester d'alcoyle inférieur d'acide formique de façon à éviter une erreur de mesure résultant de ce que le taux de recyclage est influencé par une variation dans le pH dans le cas où l'addition exacte de la quantité d'acide ou d'alcali n'est pas effectuée lors de la neutralisation du mélange de réaction après décomposition de la co-enzyme n'ayant pas réagi. Un autre but encore de la présente invention est de fournir un procédé de détermination n'exigeant pas des opérations de purification et de concentration de la substance à déterminer, Des modes de mise en oeuvre des principes de la présente invention sont les suivants. (1) Système de réaction principal où AH2 ou A : substance à déterminer NAD(P) : NAD+ ou NADP+ NAD(P)H : forme réduite de NAD+ ou de NADP+ (2) Réaction de décomposition Neutralisation Neutralisation de l'alcali ; où M : métal alcalin et R : groupe alcoyle inférieur. (3) Réaction de cyclisation Dans la présente invention, l'oxydoréductase utilisée dans la réaction principale n'est pas limitée et a une action sur la substance à déterminer comme substrat en même temps que N D(P) ou NAD(P)H comme co-enzyme. Ces enzymes peuvent être une enzyme nouvelle ou une enzyme connue. On trouve des exemples des enzymes connues antérieurement et des substrats dans "Enzyme Handbook" (Shiro Akabori Ed. Asakura publ. Co, Tokyo). La quantité du mélange réactionnel varie entre 10 ml et 3 ml. La quantité de la co-enzyme est de 0,1 mole à 10 mmoles. La quantité mesurable minimale de la substance à déterminer est de 10 8 - 10 15 mole et la quantité de co-enzyme est une quantité en excès par rapport au rapport d'action sur la substance à déterminer. La réaction ci-dessus se produit au pH optimal de l'oxydoréductase et dans un intervalle optimal de température. Ensuite, la co-enzyme n'ayant pas réagi est décom posde simultanément avec l'achèvement de la réaction principale. Dans ce système de réaction de décomposition, en cas de forme oxydée de co-enzyme NAD ou NADP +, on ajoute un alcali pour qu'il reste une forme réduite de co-enzyme, NADH ou NADPH, provenant de la réaction principale. Egalement, on arrive à ce qu'il reste NAD+ ou NADP.+ en ajoutant un acide et en chauffant, dans le cas où la coenzyme n'ayant pas réagi est NADH ou NaDPH. Les exemples d'alcalis sont habituellement un hydroxyde de métal alcalin tel qu'un hydroxyde aqueux de sodium ou de potassium. De plus, on peut utiliser de l'hydroxyde de lithium aqueux, du carbonate de sodium ou du carbonate de potassium. La concentration de l'alcali doit être telle que le pH de la solution soit un pH alcalin au-dessus de 12. Une concentration préférable est comprise entre 0,001M et 0,5M. Les conditions de chauffage varient suivant la concentration de l'alcali, la température de chauffage ou la durée du chauffage. NAD ou NADP est complètement décomposé après 10 minutes à 1000C dans une solution 0,lN de NaOH. Les exemples d'acides sont tels que l'acidité de la solution aqueuse correspondande à un pH au-dessous de 2, comme dans les cas de l'acide chlorhydrique ou de l'acide sulfurique. Une concentration préférable de l'acide est comprise entre 0,00lu et 0,5M. Les conditions de chauffage varient suivant la concentration de l'acide, la température de chauffage et la durée du chauffage. Par exemple, NADH ou NADPH peut être décomposé après 3 minutes à 500C daps upe solution lN de HCl. Dans l'étape de réaction de neutralisation après décomposition de la co-enzyme n'ayant pas réagi, dans le cas où NAD+ ou NADP est décomposé par un alcali, le mélange de réaction est décomposé par addition d'un ester d'alcoyle inférieur d'acide formique. Des exemples d'esters d'alcoyle inférieur d'acide formique sont le formiate de méthyle, le formiate d'éthyle, le formiate de propyle ou le formiate de butyle.Dans le procédé classique, le pH du mélange de réaction est dispersé si l'addition d'acide n'est pas effectuée exactement, et le rapport de cyclisation varie pour causer une erreur dans la valeur de détermination, Toutefois, dans la réaction de neutralisation ci-dessus, même si on ajoute un excès d'ester d'alcoyle inférieure d'acide formique par rapport à la quantité utilisée dans la neutralisation, par exemple dix fois la quantité ndces- saire pour la neutralisation, seulement la quantité d'ester d'alcoyle inférieur d'acide formique correspondant à la quantité d'alcali peut réagir, et donc une neutralisation exacte du mélange de réaction peut être effectuée et le réglage du pH peut être effectué facilement. Dans le cas où NADH ou NADPH est décomposé par un acide, on rajoute un léger excès d'alcali pour neutralisation, après quoi on joute un ester d'alcoyle inférieur d'acide formique comme indiqué ci-dessus pour neutralisation et alors le mélange de réaction peut être neutralisé exactement. Un exemple de l'alcali est habituellement une solution aqueuse d'un hydroxyde de métal alcalin. L'étape suivante de la réaction dans la présente invention, à savoir la réaction d'amplification par recyclage de co-enzyme, peut être conduite en combinant le système d'oxydoréductase, qui agit sur la coenzyme transformée restante correspondant à la substance à déterminer et un excès de substrat, et le système de transformation dans lequel le sel de tétrazolium est transformé en formazan par la diaphorase ou la substance de transfert d'électrons. L'oxydoréductase du sisttr,le cidessus n'est pas limitée en ce qui concerne son origine et est une déshydrogénase qui exige une co-enzyme NAD(P)+ ct forme NAD(p)H en agissant sur un excès de substance spécifique. On trouve des exemples de ces enzymes et substrats dans l'ouvrage "Enzyme Handbook" mentionné ci-dessus. La quantité d'enzyme utilisée dépend de l'activité de l'enzyme, du type du substrat et du taux de recyclage de la co-enzyme. La quantité molaire de substrat doit être en excès important par rapport à la co-enzyme recyclée et sa concentration peut être supérieure à celle correspondant à la vitesse maximale de réaction de l'oxydoréductase et est de préférence de 0,1-50 U/ml dans le mélange réactionnel. Un exemple de la substance de transfert d'électrons est une substance ayant une activité oxydante sur NAD(P)H pour donner NAD(P) et sans action nuisible sur la réaction de recyclage'de la co-enzyme, par exemple le méthosulfate de phénazine, le Bleu de Meldola et la pyrocyanine. Sa concentration peut être choisie d'après le taux de recyclage et est de préférence de l jig à 1 mg par mi du mélange réactionnel.Des exemples de sel de tétrazolium le 3,3'-(3,3' diméthoxy-4,4'-diphénylène) bis /2 - (p-nitrophényl)-5phényl-chlorure de tétra-zoliu~/ (NTB), le chlorure de 2-(p-nitropbényl)-3-(p-iodophényl)-5-phényltétrazolium (INT) ou le bromure de 2-(4',5'-diméthyl-2'-thiazolyl)-3,5diphényltétrazolium (4,5-MTT). La concentration du sel de tétrazolium est un peu limitée par les solubilités du sel de tétrazolium et du formazan finalement formé et est de 3 à 100 mg par ml du corps en réaction. La réaction de recyclage peut être conduite entre la température ambiante et 37 0C, de préférence à 30-370C. On peut arrêter la réaction à un moment estimé en ajoutant un acide comme de l'acide chlorhydrique ou de l'acide phosphorique. On peut de préférence ajouter un agent tensio-actif de manière à éviter la précipitation de formazan. Un exemple d'agent tensio-actif est un agent tensioactif non-ionique tel que Triton X-100 ou Adekarol S0-14 (noms commerciaux). La concentration de l'agent tensioactif est de 0,01-3 % par rapport au corps en réaction. L'addition de l'agent tensio-actif fournit un accroissement de sensibilité de la détermination et une stabilisation du pigment formazan. La détermination colorimétrique du pigment formazan ainsi formé peut être effectuée en mesurant la densité optique (DO) à la longueur d'onde d'absorption spécifique du formazan, par exemple 500-550 nm. Une substance peut être déterminée par le procédé expliqué ci-dessus. Selon le procédé de la présente invention, on peut effectuer non seulement la détermination au point de virage, mais aussi une détermination de vitesse. Les exemples suivants illustrent la présente invention, mais ne doivent pas être considérés comme la limitant. Exemple 1 Détermination quantitative de NAD Réactifs (1) Solution 0,2M de tampon phosphate (pH 8,0) (2) Solution INT-Adekatol / INT (100 mg) dissous dans une solution à 2 % d'Adekatol-SO-145 (100 ml)7 (3) Diaphorase ou substance de transfert d'électrons. 1) solution de diaphoraze (NADH) 100 U/ml. 2) solution de méthosulfate de phénazine (PMS) 100 mg/ 20 ml. 3) solution de pyrrocyanine 10 mg/20 ml. 4). solution de Bleu de Meldola 10 mg/20 ml, (4) Ethanol (5) Alcool déshydrogénase 250 U/ml, (6) solution 10 mM de NAD (Dans la réaction principale7 NAD est formé et NADH n'ayant pas réagi est décom posé par un acide et par chauffage, puis neutralisé par un alcali, et ensuite complètement neutralisé au moyen de formiate d'éthyle). (7) 0,1 N HCl Mode opératoire Dans chacun d'un certain nombre de tubes à essai séparés, on place du tampon phosphate (0,5 ml), du INT Adekatol (0,2 ml), de l'méthanol (20 ssl), de l'eau (30 ssl) et de l'alcool déshydrogénase (0,1 ml), respectivement. On y ajoute de la diaphorase (NADH) ou de la substance de transfert d'électrons (50 iil) et on fait incuber à 37 C pendant 3 minutes. On ajoute ensuite une solution 10 zM de NAD (0, 10, 20, 40, 60, 80 ou 100 yl), respectivement, on ajuste chaque volume à un total de 1,0 ml et on fait incuber à 37"C pendant exactement l0 minutes. On ajoute 0,1 N HCl (2 ml) dans chaque tube pour arrêter la réaction et on mesure la DO à 50 nm. On ajoute de l'eau (0,1 mi) à la place de NAD comme témoin, Résultat Le résultat est représenté sur la figure i, où la quantité de NAD en même temps que la diaphorase ou la substance de transfert d'électrons et la densité optique d'absorption ont une bonne linéarité. Le résultat montre que la réaction de recyclage est exacte et est très sensible. Exemple 2 Effet de l'oxydoréductase utilisée dans la réaction de recyclage Réactifs (l) 0,2 M tampon phosphate pH 8,0 (2) même solution INT-Adekatol que dans l'exemple l (3) solution de diaphorase (NADH) (4) solution de substrat 1) 100 mM alcool éthylique 2) solution 100 mM glycérol-3-phosphate 3) 100 mM acide lactique 4) 100 mM acide malique (5) oxydoréductase 1) solution d'alcool déshydrogénsae (ADH) 25000 U/ml 2) solution de glycérol-3-phospbate déshydrogénase (G-3-PDH) 600 U/ml 3) solution de lactate déshydrogénase (LDH) 1500 U/ml 4) solution de lamtate déshydrogénase (MDH) 4600 U/ml 5) solution 10 zM de NAD+ 6) 0,1 N HCl Mode opératoire Dans chacun d'un certain nombre de tubes à essai séparés, on introduit du tampon phosphate (0,5 ml), du INT-Adekatol (0,2 ml), de la diaphorase (NADH) (50 l), de la solution de substrat (50 l), une oxydoréductase agissant sur la substrat ci-dessus (5 tii) et de l'eau (95 tii), séparément, et on fait incuber à 37 C pendant 3 minutes. On ajoute la solution 10 ssM de NAD+ (0, 10, 20, 40, 60, 80 ou 100 til) à chacune des enzymes, respectivement, on ajuste à un volume total de 10 ml et on fait incuber à 37 C pendant exactement 10 minutes. On ajoute 0,1 N HCl (2 ml) dans chaque tube pour arrêter la réaction et on mesure la DO à 500 nm. On utilise de l'eau (100 tiI) à la place de la solution de NAD+ comme témoin. Résultat Le résultat est représenté sur la figure 2. Dans chaque oxydoréductase, une bonne linéarité est présentée et indique la réaction de recyclage exacte et une haute sensibilité. Exemple 3 Détermination quantitative de NADP Réactifs (1) 0,2 M tampon phosphate pH 8,0 (2) solution INT-Adekatol [INT (100 mg) dissous dans une solution à 2 % d'Adekatol S0-145 (100 ml)1 (3) solution de NADPH-diaphorase (NADpH) 100 U/ml (4) solution de substrat 1) 100 mM glucose-6-phosphate (G-6-P) 2) 100 mM acide glutamique (GA) (5) solution d'oxydoréductase l) solution de glucose-6-phosphate déshydrogénase (G-6-PHD) 1000 U/ml 2) solution de glutamate déshydrogdnase (GlDH) 1000 U/ml (6) solution 10 ssM de NADP+ (7) 0,1 N HCl Mode opératoire Dans des tubes à essai séparés, on introduit du tampon phosphate (0,5 ml), du INT-Adekatol (0,1 ml), de la diaphorase (NADPH) (100 til), du substrat (50 rl), de l'enzyme (50 l) et de l'eau (30 l), respectivement, et on fait incuber à 37 C pendant 3 minutes, puis on y ajoute de la solution -10 ssM de NADP+ (0, 10, 20, 40, 60, 80 et 100 ijîl, respectivement. On ajuste le volume total à 1,0 ml en ajoutant de l'eau et on fait incuber à 37 C exactement pendant 10 minutes. On ajoute 0,1 N HCl (2 ml) pour arrêter la réaction et on mesure la DO à 500 nm. On ajoute de l'eau (100 tii) à la place de la solution de NADP comme témoin. Résultat Le résultat est représenté sur la figure 3, où on obtient une bonne linéarité, et NADP+ peut être déterminé avec une haute sensibilité en même temps que la glucose-6phosphate déshydrogénase et la glutamate déshydrogénase. Exemple 4 Détermination quantitative de l'acide malique Echantillon Solution d'acide malique (acide malique : 0, 1, 2, 4, 6, 8 et 10 ssM) 20 l Réactifs (1) Réactif I : solution mixte de 0,2 M tampon phosphate pH 8,0 (0,2 ml), solution 10 mM de NAD+ (0,1 ml) et solution de malate ddshydro- génase (120 U/ml) (100 pl) (2) 0,2 N NaOH (3) formiate d'éthyle (4) Réactif II : solution mixte de 0,5 M tampon phosphate pH 8,0 (0,1 mi), alcool éthylique (10 l), alcool déshydrogénase (250 /ml)(50 tii), diaphorase (NADH) (100 /mi) (100 tii), solution à l z de NTB (20 l) et solution de Triton X-100 -20 tii) (5) 0,1 N HCl Mode opératoire : Dans des tubes à essai séparés, on introduit des échantillons, on ajoute le réactif I (0,2 mi) et ensuite on fait incuber à 37 C pendant 15 minutes.On ajoute 0,2 N NaOH (0,1 ml) au mélange de réaction, on chauffe à 100 C pendant 10 minutes, on refroidit immédiatement, puis on neutralise avec du formiate d'éthyle (20 ss Après incubation à 370C pendant 5 minutes, on ajoute le réactif II (0,3 ml) et on fait incuber à 37 C pendant exactement 10 minutes. On ajoute 0,l,N HCl (2,5 ml) pour arrêter la réaction et on mesure la DO à 550 nm. On utilise de l'eau (100 l) à la place de la solution de NAD comme témoin. Résultat Le résultat est représenté sur la figure 4. La quantité d'acide malique est en relation avec la DO avec moins d'erreur. L'acide malique a été déterminé avec une haute sensibilité. Exemple 5 Détermination quantitative de l'acide gamma-aminobutylique Echantilon : Sérum humain (50 pl) dans lequel on a ajouté de l'acide gamma-aminobutylique (GABA) (0, 10, 20, 30, 40 et 50 pM)-. Réactifs (l) Réactif I : solution mixte de tampon 0,1 M pyrophos phate, pH 8,3 (1,0 ml), solution 10 mM de NADP (0,2 mi), solution 0,1 M d'alpha cétoglutarate (10 ml) et GABASE (2 U/ml, 0,4 ml, enzyme disponible dans le commerce dérivée de Pseudomonas fluorescens) (2) solution 0,5 N de NaOH (3) formiate d'éthyle (4) Réactif II : solution mixte de solution INT-Adekatol [0,1 ml, INT (100 mg) dissous dans une solution à 2 z d'Adekatol SO-145 (100 ml)7, solution de diaphorase (NADPH) (100 U/ml, 1,0 ml), solution 0,1 M-de glucose-6-phos phate (0,2 ml) et solution de glucose-6 phosphate déshydrogénase (100 U/ml, 2,0 tii). Mode opératoire On ajoute le réactif I (0,35 ml) à l'échantillon et on fait incuber à 37 C pendant 30 minutes. On ajoute 0,5 N NaOH (0,1 ml) et on chauffe à 1000C pendant 10 minutes. Après refroidissement, on ajoute du formiate d'éthyle (20 l) pour neutralisation et on fait incuber à 37 C pendant 5 minutes. On ajoute le réactif II (0,2 ml) et on fait incuber à 37 C pendant exactement 10 minutes. On ajoute 0,1 N HCl (2 ml) pour arrêter la réaction et on mesure la DO à 500 nm. On utilise un témoin sans GABA. Résultat Le résultat est présenté sur la figure 5. La quantité de GABA dans le sérum humain peut être repérée sur la ligne représentant la relation linéaire avec la valeur de DO, On peut déterminer GABA avec une haute sensibilité et sans séparation de la protéine. REVENDICATIONS 1. Procédé de détermination très sensible d'une substance, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de réaction suivantes 1) système de réaction principal transformant la co-enzyme correspondant à une quantité de la substance à déterminer par l'actioh d'oxydoréductase pour cette substance en présence de co-enzyme NAD ou NADH ou NADP ou NADPH 2) système de réaction de décomposition décomposant et neutralisant une co-enzyme n'ayant pas réagi à la fin du système de réaction principal 3) système de réaction de recyclage amplifiant la réaction au moyen d'un recyclage de co-enzyme consistant en une combinaison d'une réaction d'oxydoréduction qui agit sur du substrat en excès et la co-enzyme transformée correspondant à la quantité de substance à déterminer et une réaction de transformation de sel de tétrazolium en formazan en présence de diophorase ou une substance de transfert d'électrons ; et 4) mesure colorimétrique du formazan ainsi formé. 2. Procédé de détermination selon la revendication l, caractérisé en ce que la quantité molaire de co-enzyme dans le système de réaction principal est en excès par rapport à la quantité molaire de substance à déterminer. 3. Procédé de détermination selon la revendication l, caractérisé en ce que la co-enzyme n'ayant pas réagi dans le cas de NAD et de NADP est decomposée par addition d'un hydroxyde aqueux de métal alcalin et chauffage, et neutralisation. 4. Procédé de détermination selon la revendication 3, caractérisé en ce que la concentration de l'hydroxyde aqueux de métal alcalin est une concentration donnant un pH de plus de 12. 5. Procédé de détermination selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'hydroxyde de métal alcalin est de l'hydroxyde de sodium ou de l'hydroxyde de potassium. 6. Procédé de détermination selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on effectue le chauffage jusqu'à décomposition complète de NAD+ ou de NADP+. 7. Procédé de détermination selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on effectue la neutralisation en ajoutant un ester d'alcoyle inférieur d'acide formique. 8. Procédé de détermination selon la revendication 1, caractérisé en ce que la co-enzyme n'ayant pas réagi, dans le cas de NADH ou de NADPH, est décomposée par addition d'un acide aqueux et chauffage, et neutralisation. 9. Procédé de détermination selon la revendication 8, caractérisé en ce que la concentration de l'acide aqueux est une concentration donnant une acidité correspondant à un pH au-dessous de 2. 10. Procédé de détermination selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'acide est une substance donnant une acidité au-dessous du pH 2 dans sa solution aqueuse. 11. Procédé de détermination selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'acide est de l'acide chlorhydrique ou de l'acide sulfurique. 12. Procédé de détermination selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on effectue le chauffage jusqu'à décomposition complète de NADH ou de NADPH. 13. Procédé de détermination selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on effectue la neutralisation en ajoutant un petit excès de solution d'hydroxyde de métal alcalin et en ajoutant immédiatement un ester d'alcoyle inférieur d'acide formique. 14. Procédé de détermination selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'hydroxyde de métal alcalin est de l'hydroxyde de sodium ou de l'hydroxyde de potassium. 15. Procédé de détermination selon l'une des revendications 7 et 13, caractérisé en ce que l'ester d'alcoyle inférieure d'acide formique est du formiate de méthyle, du formiate d'éthyle, du formiate de propyle ou du formiate de butyle. 16. Procédé de détermination selon la revendication l, caractérisé en ce que la substance de transfert d'électrons dans la réaction de recyclage est du méthosulfate de phénazine, du bleu de Meldola ou de la pyrocyanine. 17. Procédé de détermination selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute un agent tensio-actif. 18. Procédé de détermination selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'agent tensio-actif est un agent tensio-actif non-ionique.