FR 2500847 A1 19820903 FR 8104137 A 19810302 marqueurs génétiques sélectifs pour cellul.es eucaryotes, procédé de mise en oeuvre de tels marqueurs et application ues cellules contenant un tel marqueur à la fabrication de protéines déterminées après leur transformation par un ADN correspondant. L'invention concerne un nouveau marqueur génétique, dominant, susceptible de pénétrer dans une grande variété de cellules eucaryotes, plus particulièrement celles provenant d'organismes supérieurs et de leur conférer un caractère spécifique stable permettant la détection aisée des cellules ainsi transformées, lorsque celles-ci sont placées dans des milieux de culture spécifiques. L'invention concerne donc également un procédé de détection de cellules eucaryotes auxquelles un caractère particulier aura ainsi été conféré, ainsi que l'application de telles cellules à la fabrication de protéines déterminées, procaryotes, eucaryotes ou virales, lorsque ces cellules auront au préalable été transformées par un fragment d'ADN étranger contenant une séquence d'ADN, telle que gène ou cADN codant pour ladite protéine. Il est bien connu que l'une des difficultés les plus importantes à surmonter, à la suite d'une opération tendant à transformer par un tel ADN des cellules eucaryotes d'une culture effectuée dans les conditions appropriées, réside dans la détection et l'isolement de celles des cellules eucaryotes dans lesquelles l'ADN aura été effectivement transféré, parmi les cellules en nombre considérablement plus important qui n'auront pas été affectées par ce même ADN. Il n'a guère été envisagé jusqu'à ce jour de mettre à profit,dans des cultures de cellules eucaryotes, les techniques bien connues dans le domaine des cellules procaryotes,consistant à incorporer à celles des cellules procaryotes qui doivent être détectées, un facteur de résistance à un antibiotique et à réaliser une culture des cellules en cause dans un milieu approprié contenant l'antibiotique correspondant, seules les cellules marquées étant alors aptes à survivre et à former des colonies.Ces techniques n'ont cependant guère été jusqu'à ce jour transposées à des cultures de cellules euearyotes, ne serait-ce que pour a raison que la plupart des mati- biotiques ne sont pas susceptibles de pénétrer dans la plupart des celles eucaryotes et/ou de les détruire par un processus toxique. C'est pour remédier a cette difficulté que la plupart des essais de transfert de gènes dans des cellules eucaryotes ont été faits jusqu'à ce jour en mettant en oeuvre des marqueurs génétiques constitués par des fragments d'ADN, voire même les ADN entiers, du type de ceux qui sont connus pour leur capacité à pénétrer et à être exprimés d & s des cellules eucaryotes. A ce type d'ADN appartiennent notamment ceux du virus dit "Herpès simplex Virus"du type 1 (HSV1), le gène de la thymidine kinase (TK). le gène de l'adénine phosphoribosyl transférase (APW) et de la dihydrofolate réductase (DHFR), etc. ou de l'enzyme xanthine-guanine phosphoribosyl transférase (XGPRT). Les activités enzymatiques induites par ces ADN, plus particulièrement de la thymidine kinase et de l'adénine phosphoribosyl transférase peuvent être détectées aisément. Les techniques utilisées restent cependant d'une mise en oeuvre difficile, car elles impliquent l'utilisation de cultures de cellules présentant des mutations~ca- ractéristiques, notamment des cellules ayant fait l'objet d'une mutaton induite ou provoquée affectant le gène correspondant. Par exemple, la.technique de détection mettant en oeuvre un gène de thymidine kinase du virus de l'herpès, peut être réalisée dans des cellules de souris du type L d'abord modifiées par une mutation induite ou provoquée affectant leurs gènes de thymidine kinase endogène, comme cela a déjà été décrit par M. WIGLER et coll. ('Cell.", vol. II, 223-232, 1977).En outre, ces cellules doivent être cultivées dans des milieux spéciaux, par exemple en ce qui concerne les cellules présentant une déficience au niveau de leurs gènes de la thymidine kinase (cellules dites TK ), dans un milieu tel que celui connu sous le nom "milieu HAT" (contenant de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine). Seules peuvent alors se développer dans un tel milieu les cellules TK dont le patrimoine génétique aura été modifié par incorporation du gène TK du virus de l'herpès. Des techniques semblables ont été mises en oeuvre avec d'autres gènes. Cependant les cellules mutantes mises en oeuvre dans les essais de marquage ne présentent en général pas le caractère de stabilité des cellules L TK de souris.Le caractère acquis par la mutation produite se perd rapidement au cours des divisions cellulaires successives des cellules en cause. Aux difficultés d'isoler les mutants appropriés, s'ajoutent donc de façon générale celles résultant de la perte rapide des phénotypes recherchés et la nécessité chaque fois de mettre en oeuvre des milieux de culture spécifiques. Une autre voie d'investigation a récemment été ouverte par A. JIMENEZ et J. DAVIES dans un article intitulé "Expression of a transposable antibiotic resistance element in Saccharomyces (Expression d'un élément transposable de résistance à un antibiotique dans Saccharomyces) ("Nature", volume 287 du 30 octobre 1980, pages 869-871). Ces auteurs ont mis en évidence la propriété que possède un antibiotique appartenant à la famille des aminoglycosides, ayant une structure proche de ce-lle de la gentamicine, connue sous la désignation G418, d'inhiber le développement de certaines souches de levure, telles que Saccharomyces cerevisiae, pour produire des colonies résistant à cet antibiotique dans un milieu de culture le contentant, après incorporation préalable,dans les cellules ayant donné naissance à ces colonies, d'un gène porté par un "élément transposable" ou "transposon" et codant pour l'aminoglycoside phosphotransférase(3' )-I (APH(3')-I), cette enzyme étant apte à phosphoryler et inactiver un certain nombre d'antibiotiques du type aminoglycoside. On rappellera que l'expression "transposon" dé signe des éléments d'ADN dont de nombreux représentants sont bien connus, qui contiennent un gène codant pour une "transposase", leur permettant aussi bien de s'inté grer dans un premier ADN, notamment celui du patrimoine génétique d'un premier type de cellules, que de s'en détacher pour se transposer ou s incorporer dans un autre ADN, par exemple celui d-'un bactériophage. Mais, comme l'indique également ces auteurs, la résistance des cellules de levure transformées par l'antibiotique G418 tend à se perdre lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu ne contenant plus les antibiotiques. Le défaut de stabilité et la faible proportion de cellules effectivement transformées rendent cette technique difficilement transposable au marquage des cellules eucaryotes, surtout lorsque celles-ci proviennent d'organismes supérieurs. On sait que les phénomènes déjà très rares (inférieurs à 10 7)qutont représentés l'incorporation au hasard,dans les conditions décrites par ces auteurs,d'un gène procaryote dans l'ADN des levures mises en oeuvre lesquelles sont encore elles-mêmes proches des cellules procaryotes, et leur expression sous le contrôle d'un promoteur endogène, ne peuvent se produire que plus rarement encore à l'égard de cellules eucaryotes plus complexes, notamment celles provenant d'organismes supérieurs. L'invention a pour but de rendre applicables à des cellules eucaryotes, et plus particulièrement à celles provenant d'organismes supérieurs, les techniques de marquage mettant en jeu des gènes de résistance ou analogues à ceux des antibiotiques qui, tels le G418, se sont révélés ou qui se révèleront encore aptes à inhiber le développement de ces cellules eucaryotes. Elle a encore pout but l'obtention de marqueurs génétiques sélectifs utilisables en rapport avec une grande diversité de cellules eucaryotes, y inclus celles pro venant d'organismes supérièurs, autorisant une grande efficacité de transformation desdites cellules et leur conférant un caractère stable qui soit maintenu parmi les descendants des cellules transformées au cours de leurs divisions successives, sans qu'il soit besoin de toujours réaliser les cultures en présence d'un tel antibiotique. L'invention a naturellement également pour but les procédés mettant en oeuvre de tels marqueurs, ainsi que l'application des cellules ainsi marquées à la mise en oeuvre de cultures productrices de protéines particulières, après leur transformation préalable par un ADN contenant la séquence codant pour une telle protéine déterminée. Le marqueur selon l'invention est constitué par un ADN, circulaire ou non, contenant un promoteur eucaryote ou reconnu par sa capacité à diriger l'expression dans une cellule eucaryote d'un gène qui lui est normalement associé et une séquence d'ADN codant pour une enzyme capable d'inactiver un antibiotique, tel que l'antibiotique G418, lié à ce promoteur et sous son contrôle direct. Avantageusement, la séquence d'ADN codant pour l'enzyme d'inactivation est choisie parmi celles qui codent pour un aminoglycoside 3'-phosphotransférase (APH(3')). Le procédé selon l'invention de marquage de cellules eucaryotes est caractérisé par la mise en contact de ces cellules avec le marqueur selon l'invention dans des conditions aptes à permettre la transformation d'une partie au moins de ces cellules et de les mettre en culture dans un milieu approprié à leur développement et contenant un antibiotique, tel que l'antibiotique G418, normalement toxique à l'égard de ces cellules et susceptible d'être inactivé par l'enzyme d'inactivation, notamment une aminoglycoside 3'-phosphotransférase synthétisée par la susdite séquence dADN. Avantageusement, le marqueur selon l'invention comporte > d'une part, une partie originaire d'un ADN procaryote, tel que phage ou de préférence plasmide comme prenant une origine de réplication permettant son clonage dans une culture bactérienne, et, d'autre part, incorporés dans cette partie d'ADN procaryote, le susdit promoteur eucaryote ou apte à diriger l'expression d'un gène associé dans une cellule eucaryote, ainsi que ladite séquence d'ADN codant pour l'enzyme d'inactivation, notamment une APH(3') sous le contrôle direct de ce promoteur. Avantageusement, dans un marqueur préféré de l'ion vention, le promoteur est celui sous le contrôle duquel s'exerce la transcription du gène de la thymidine kinase dans les cellules dont il est originaire, et le gene codant pour l'APH(3')-II est un gène de résistance à la kanamycine et/ou à la néomycine, tel que celui porté par le transposon bien connu sous la désignation "Tn5". On peut naturellement avoir recours à d'autres promoteurs, tels que ceux des marqueurs génétiques antérieurement utilisés et qui ont été identifiés plus haut, ou encore à des promoteurs appartenant à des virus connus pour leur aptitude à infecter les cellules eucaryotes mises en oeuvre, par exemple des promoteurs provenant de l'ADN du virus de l'hépatite virale B lorsque les cellules eucaryotes mises en oeuvre sont constituées par des cellules provenant de chimpanzés. En ce qui coricerne la séquence d'ADN codant pour l'enzyme d inactivation, on peut avoir recours à toute séquence apte à synthétiser une enzyme douee de propriétés d'inactivation vis-à-vis de l'antibiotique qui sera mis en oeuvre dans le milieu de culture utilisé pour opérer la sélection des cellules auxquelles aura été incorporté le marqueur génétique. Dans le cas où l'antibiotique incoroporé au milieu est constitué par l'antibiotique G 418, il est avantageux d'avoir recours aux enzymes de ptlosphorylation du type APH(39 déjà mentionné. Il va naturellement de Soi que l'on peut avoir recours à lous autres types de séquences d'ADN synthetisant une enyme ayant une capacité d'inactivation analogue de l'antibiotique,. par exemple par acétylation des fonctions hydroxyle correspondantes de l'antibiotique. La séquence d'ADN du genre en question peut provenir de toute source appropriée.On peut par exemple substituer au transposon Tn5 susmentionné, le transposon Tn601(903) mentionné par JIMENEZ et DAVIES, ou tout autre gène de résistance à des antibiotiques susceptible d'interagir avec l'antibiotique de sélection utilisé dans le milieu de culture, le cas échéant après avoir établi au préalable la carte de restriction du gène de résistance en question, notamment pour en isoler la séquence d'ADN codant spécifiquement pour l'enzyme d'inactivation. L'intérêt de disposer plus spécifiquement de la séquence codant pour l'enzyme résultera des explications données ci-après, en ce qui concerne les marqueurs génétiques préférés de l'invention. Naturellement, on peut également avoir recours à des séquences homologues au gène susdit, notamment à des cADN résultant de la transcription chimique ou enzymatique d'ARN messagers correspondants. Conformément à une caractéristique préférée supplémentaire de l'invention, les premières paires de nu- cléotides de la séquence d'ADN codant pour l'APH(3') ou analogue sont rendues aussi proches que possible des dernières paires de nucléotides du promoteur dans la direction de la transcription, notamment à une distance,expri- mée en nombre de paires de nucléotides,inférieure à 1.000, de préférence encore à 500, voire même inférieure à 100 paires de nucléotides. Il a en effet été constaté que la réduction de cette distance > notamment par le recours à des délétions appropriées, avait pour effet une considérable augmentation du rendement de transformation, comme cela apparaitra au cours de la description plus loin de marqueurs préférés conformes à l'invention. De préférence encore les ADN marqueurs de l'invention contiennent également, en aval du gène de 1'APH(3') un site de polyadénylation, celui-ci étant de préférence également rendu aussi proche qu'il est possible, de la dernière paire de nucléotides du gène codant pour l'APH(3'). De préférence, la distance exprimée en nombre de paires de bases entre l'extrémité de ce dernier gène et, soit le site de polyadénylation, soit les codons stop" de traduction de ce gène,est est inférieure à 1.000, de préférence à 500 paires de bases, voire même encore inférieure à 100 paires de bases. Le rendement de marquage peut encore être accru si l'on confère à l'ADN marqueur une origine eucaryote de réplication par incorporation d'un fragment le contenant, tel que par exemple les fragments répétitifs de l'ADN du virus connu sous la désignation "virus de l'herpès Saimiri". L'existence de formes épisomales de ce virus et de sous-unités d'ADN de 1,4 kilobases en formes multimères dans des génomes correspondants défectifs donnent à penser que ces sous-unités contiennent une origine de réplication. Des marqueurs préférés selon l'invention sont obtenus par modification des plasmides pAGO ou pFG5, eux-mêmes dérivés de pBR322. Le plasmide pAGO est préféré en ce qu'il comporte > outre un gène TK, deux facteurs de résistance supplémentaires à l'ampicilline et à la tétracycline. On a représenté schématiquement la structure de pAGO dans la figure 1 des dessins. Y sont notamment représentés schématiquement le gène TK par un arc de cercle en traits interrompus et divers sites de restriction plus particulièrement mis à profit dans la construction de marqueurs préférés conformes à l'invention dont la description sera fournie plus loin. La flèche tr du gène TK donne le sens de la transcription. Le point 0 correspond au site EcoRI de ce plasmide.Les sites EPR et PAS correspondent aux positions de la région du promoteur du gène TK et du site de polyadénylation du gène TK respec vivement Les marqueurs génétiques préférés selon l'inven- tion sont ceux qui résultent de la recombinaison de pAGO et du transposon Tnf (décrite par JORGENSEN, R.A., ROTHSTEIN, S.J. et REZNIKOPF, W.S. (1979) "Molec. Gen. Genets 177, 65-72), dont la figure 2 fournit une représentation schématique et qui ont été obtenus à partir du plasmide bactérien ColEl Tn5 contenu dans la souche de E. coli GM4pHN5 déposée à la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes le 2 mars 1981 sous le n I-149. L'antibiotique préféré mis en oeuvre dans les procédés de détection sus-indiqués est certes constitué par l'antibiotique G4î8 dont a été reconnue la capacité de pénétrer dans la plupart des cellules eucaryotes et de les détruire par un processus toxique. il va naturellement de soi que l'on pourra utiliser un autre antibiotique, pour autant qu'il se révèle toxique de la même façon à l'égard du type de cellules eucaryotes qui seront mises en oeuvre dans le procédé de détection qui leur sera alors appliqué dans les conditions de l'invention. Bien entendu, le marqueur correspondant devra comporter en conséquence une séquence d'ADN apte à synthétiser une enzyme d'inactivation susceptible d'inhiber plus particulièrement l'antibiotique choisi. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description de marqueurs préférés dont les constitutions résultent schématiquement des figures 3 à 6 des dessins. Pour le clivage en des sites spécifiques des plasmides et pour les ligatures, on a eu recours respectivement aux endonucléases de restriction produites par BIOLABS et à la T4 DNA-ligase produite par BETHESDA RESEARCH LABORATORIES (Rockville, M.D.). Les conditions de réaction mises en oeuvre ont été celles recommandées par les fabricants. Les souches bactériennes utilisées pour les transformations ont été les souches E. coli 1106 (80rkmk) et 1107 (803rkmk) (MURRAY, N.E., BRAMMAR, W.J. and MURRAY, K. (1976), "Molec. Gen. Genet.", 150, 5361). Les souches eucaryotes utilisées ont été des clones 1D de souris L TK-, des cellules de chimpanzés Vero, des cellules OMK et des cellules humaines HeLa. Les cultures de ces cellules ont été réalisées dans un milieu de EAGLE modifié par DULBECCO, complété avec du sérum de veau à 5 ou 10 %. Les techniques de transformation des cellules par les ADN de plasmide ont été réalisées comme décrit par COLBERE-GARAPIN et al (COLBERE-GARAPIN, F., CHOUSTERMAN, S., HORODNICEANU, F., KOURILSKY, P. et GARAPIN, A.C. (1979), "Proc. Natl. Acad.Sci., U.S.A.", 76, 3755-3759), en mettant en oeuvre la technique de préci pitation.par le calcium de GRAHAM et VAN DER EB (GRAHAM, F.L. et VAN DER EB (1973), "Virolofgy", 52, 456-467). Les cellules transformées exprimant l'enzyme APH(3')-II ont été sélectionnées dans un milieu contenant de 10 à 400 microgrammes par millilitre de l'antibiotique G418. Les cellules TK+ ont été sélectionnées dans le milieu de HAT, également dans les conditions décrites par COLBERE GARAPIN et Coll. Pour le clonage des cellules, les colonies individuelles ont été isolées au hasard et cultivées jusqu'à produire des cultures confluentes. Construction des plasmides recombinants Le promoteur utilisé provient de la"région du promoteur eucaryote: provenant du gène HSV1 TK EPR(ciaprès dénommé EPR) et qui dans le plasmide pAGO se trouve située entre le site PvuII et HincII au début du gène TK (figure 1). Cet EPR comprend à l'extrémité 5' du gène deux régions TATA (TATA boxes), l'une d'entre elles étant maintenant connue comme jouant un rôle important pour la transcription du gène TK (MC KNIGHT, S.L. (1980) Nucl.Acids Res., 8, 5949-5964).On produit un recombinant par ligation d'une part d'un fragment d'ADN HincII-HincII de 2480 paires de bases auquel est incorporé le gène de résistance à la kanamycine (schématiquement représenté par la flèche "kanar") que contient normalement le transposon Tn5, lequel a été représenté de façon schématique à la figure 2 > 2, et, d'autre part,du plasmide pAGO ouvert au niveau du site HincII par digestion partielle en présence de cette enzyme de restriction. Le recombinant obtenu a servi à la transfection d'une souche d' Escherichia coli 1106 (803 ru mu ) On sélectionne les colonies résistantes aux trois antibiotiques que sont la kanamycine, la té.tracycline et l'ampicilline.Deux plasmides recombinants,pAG40 et pAG45 ont ainsi été obtenus. L'analyse par restriction montre que le fragment de 2480 paires de bases issues de Tn5 a été incorporé dans le site HincII situé dans la séquence TK à la position 2301 de pAGO (Fig.1). L'orientation de ce fragment a été déterminée par analyse de ces plasmides au moyen de restrictions par XhoI et EcoRI. Le site XhoI de Tn5 est situé à proximité de l'extrémité 5' du gène APH(3')-II. On constate (Fig. 3) que le site XhoI est très proche dans pAG40 du site HincII, lui-meme contigu à la région TK EPR. Au contraire le fragment est dans la direction opposée dans le plasmide pA045.Le plasmide pAG40 a donc été reconnu comme approprié pour expression dans des cellules eucaryotes. Ce plasmide qui s averse egalement contenir le promoteur bactérien de APH(3')-II a été capable de résister jusqu'à 60 pg/ml de kanamycine. La distance dans pAG40 entre l'EPR et le premier tripletAUG du gène codant pour APH(3')-II est d'environ 1500 paires de bases. Afin d'obtenir une expression améliorée ultérieure, un nouveau recombinant a été formé entre,d'une part ,un fragment .BglII situé dans pAG40 entre les coordonnées 3670 et 4795 de sa carte de restriction, et d'autre part pAGO, lequel avait été ouvert au niveau du site BglII du fragment TK DNA. Les plasmides obtenus, pAG50 (Fig. 4) et pAG55, lesquels se distinguent de pAGO par la présenced'un insertdell25 paires de bases délimité par des extrémités BglII, la plus proche de ces dernières se trouvant à une distance d'environ 130 paires de bases de la région EPR.Par restriction au moyen de l'enzyme SmaI et par analyse sur gels il a été déterminé que l'extrémité 5' du gène APH(3')-II était connectéeà l'EPR de TK, alors que l'insert était intégré dans la direction opposée dans le plasmide pAG55. C'est donc le plasmide pAG50 qui a été choisi pour l'obtention de l'expression de l'enzyme sous le contrôle de la région régulatrice de TK. Le poids moléculaire de pAG50 (comme celui de pAG55) est de7490 + 50 paires de bases. Le site de polyadénylation TK (PAS dans les dessins) est situé dans pAG50 immédiatement en aval du site SmaI dans la direction de transcription du gène TK (dans la région de coordonnées 4608 dans la figure 4. Par excision d'un fragment d'ADN de 1,2 k/base entre les deux sites SmaI (de coordonnés 3243 et 4608 dans la carte) de pAG5O, la distance séparant l'extrémité 3' du gène APH(3')-II et le site de polyadénylation TK (McKNIGHT) a été réduite de 1 365 paires de bases. Le codon stop TGA de TK est situé à une distance correspondant à 21 paires de bases en aval du site SmaI. La position du codon stop de APH(3')-II n'est pas exactement connue. Elle en est néanmoins très proche.Le nouveau plasmide obtenu a été désigné sous lSexpression pAG60 (Fig.5). Il a une longueur correspondant à environ 6 150 paires de bases. Dans le but d'améliorer encore davantage l'effi- cacité de transformation de pAG60, on a tenté de lui incorporer une origine de réplication eucaryote. A cette fin on a eu recours au génome défectifs mentionné plus haut de 1'ADN du virus de l'Herpès Saimiri, ce génome d'effectifs comprenant une forme multimère d'une sousunité de 1,4kllobases dont on pense qu'elle contient une origine de réplication. Ce gène d'effectifs (provenant de la souche 11 du virus de l'Herpès Saimiri, décrit par Fleckenstein et coll.(1979) Biochim. Biophys. Acta 560 301 - 342) a été clivé par l'enzyme TaqI puis ligaturé au vecteur pAG0 lui-meme préalablement clivé par l'en- zyme ClaI. Les plasmides recombinants obtenus contenaient soit une (pFG22) soit deux unités répétitives en tandem (pFG 24).Les séquences répétitives isolées de pFG 24 par excision au moyen de l'enzyme TaqI, ont été liées par ligation à pAG60 préalablement linéarité par ClaI, pour former le plasmide recombinant pAG70 (Fig. 6). Les effets de G-418 sur des cellules eucaryotes Comme l'ont déjà indiqué JIMENEZ et DAVIES, l'antibiotique G-418 a une activité de synthèse d'une grande variété de protéines inhibitrices.La toxicité de cet antibiotique a par conséquent été testée vis-à-vis des cellules de souris L TK-, , clone ID, de cellules de chimpanzés (non clonées ou cloneVCI0) et de cellules OMK ainsi qu'à l'égard de cellules humaines HeLa. Le nombre des cellules a doublé dans les cultures dans les premières 48 heures qui ont suivi l'addition deG-418. Sous une concentration de 25 ptg/ml d'antibiotique les cellules ID ne se détachèrent pas avant un mois. Mais à la concentration usuelle d'antibiotique (150 ,ug/ml) les cellules ID moururent et se détachèrent des plaques dans les 10 jours. Contrairement aux cellul.es ID, les cellules Vero non clonées ne moururent qu'un mois plus tard à la merle concentration de G-418. Des colonies présentant des résistances spontanées n'ont jamais été obtenues à des doses de 50 à 400 g/ml (fréquence de colonies à résistance spontanée Transformation des cellules de souris avec les plasmides recombinants Le clone ID des cellules de souris L TK est fortement sensible à la transfection, comme l'ont montré WIGLER et coll. (1978) Cell, 14, 725-731). Ces cellules ont donc été choisies pour étudier la capacité de transfert et d'expressíon du marqueur sélectif de l'invention. Les transfections ont été réalisées comme indiqué plus haut dans des flacons contenant chacun environ 3.106 cellules. L'agent sélectif C-418 a été ajouté 48 heures après la transfection, à une concentration de 15O,ug/ml. Les colonies ont été comptées trois semaines après la transfection. Les résultats sont présentés dans le tableau I ci-après. TABLEAU I Plasmide ADN de plasmide ADN support colonies par flacon Colonies/ g de par flacon ( g) par flacon ( g) plasmides 0 10 0 - 0 - 0 - 0 0 pAG40 10 0 27 - 58 - 49 - 14 3.7 2 8 15 - 3 - 5 - 4 3.3 pAG55 10 0 7 - 22 - 7 - 11 1.2 2 8 1 - 1 - 5 - 0 0.8 pAG50 10 0 149 - 182 - 210 - 160 17.5 2 8 66 - 56 - 43 - 49 27 pAG60 10 0 Confluence 2 8 107 - 157 - 162 - 163 74 Le tableau fait apparaître que l'on a obtenu des colonies transformées résistant à l'antibiotique G-1118 après transfection avec les plasmides recombinants contenant le gène APH(3')-II. Des rendements de transformation relativement faibles, de l'ordre de 1 à 3 colonies par fig d'ADN, ont été obtenues avec le transposon bactérien Tn5 et les plasmides pAG45, pAG40 et pAG55.On constate cependant que lton a obtenu une efficacité de transformation beaucoup plus importante avec pAG50 dans lequel la région promoteur de TK a été rapprochée de beaucoup de l'extrémité 5' du gène APH(3')-II (20 à 30 colonies par ,ug) . On a obtenu une efficacité de transformation encore davantage accrue, avec le plasmide pAG60, dans lequel le site de polyadénylation TK a été rapproché de l'extrémité 3' du gène APH(3')-II (70-80 colonies/,ug) On a obtenu un rendement de 50 % encore plus élevé avec le plasmide pAG70 contenant les sous-unités répétitives du virus Herpès Saimiri.Il a été constaté que le rendement de transformation n'était pas dépendant dans une grande mesure des concentrations en G-418 à des doses comprises entre 150 et 300 ZgXml ni de l'intervalle de temps séparant la transfection et l'addition du G-418. On constate cependant que les rendements de transformation se réduisent à des doses de G-418 supérieures à 400 g/ ml). Ces résultats ont été obtenus avec des ADN circularisés, lineaires (notamment par ouverture d-e pAG60 au moyen de ClaI). Dans le dernier cas l'on obtient des rendements de transformation de 2 à 3 fois plus grands (175 colonies par pg d'ADN). Le phénotype de résistance à l'antibiotique G-418 est stable dans les conditions de culture mis en oeuvre en vue de la sélection. Il en est encore de même, même lorsque les cellules sont cultivées dans le même milieu, mais en l'absence de l'antibiotique. Les cellules ne deviennent pas sensibles à l'antibiotique G-418, même après plusieurs passages. Transformation par les plasmides recombinants de cellules de singes et de cellules humaines. On a comme dans le cas précédent obtenu des lignées résistantes à l'antibiotique G-418, après transfection de cellules de singes (VC10, OMK) et de cellules humaines (lignée HeLa) après transfection avec les plasmides pAG50 et pAG60. Aucune colonie résistante n'a cependant été obtenue en utilisant uniquement le support ADN issu du sperme de saumon.Le rendement de transformation obtenu avec ces cellules, a été inférieur à celui auquel ont conduit les cellules de souris L TK . pAG50 s'est révélé transformer les cellules HeLa avec une efficacité d'environ une colonie par Fg d'ADN. pAG60 a permis la transformation de cellules de singes VC10 et OMK avec une efficacité de 0.1 à 1 colonie par Ag d'ADN. Transferts simultanés du gène HSVî TK et du marqueur sélectif APH(3')-II Pour étudier les possibilités de co-transformation ou de transformations simultanées d'un gène déterminé avec le marqueur sélectif APH(3')-II on a eu recours au gène HSV1 TK du fait de sa capacité de détection aisée. Les plasmides circularisés pAG60 et pFG24 portant respectivement les gènes APH(3')-II et TK respectivement ont été utilisés en vue d'opérer des co-transformations ou transformations simultanées de cellules TK 1D. Les deux plasmides ont été utilisés dans des proportions massiques correspondant à 5 APH(3')-II pour 8 TK. Après une opération de sélection dans un milieu ne contenant que l'antibiotique G-418,on a isolé 20 clones. Neuf clones parmi les 20 précédents (soit 45 %) se sont révélés capables de se développer également dans le milieu sélectif HAT. Ces 9 clones possédaient par conséquent à la fois le phénotype APH(3')-II et TK . Partant de colonies répliquées à partir de 5 des clones résistants au milieu HAT de 4 clones sensibles au ilie HAT et après culture en présence du seul G-418, on a testé l'activité TK in vitro des 9 cultures obtenues. Les 5 clones qui présentaient le phénotype TK se sont révélés avoir une activité enzymatique importante. Des résultats semblables ont été obtenus avec des cellules co-transformées par pAG50 et pFG24. Cet essai est évidemment représentatif des possibilités qu'offrent les marqueurs génétiques sélectifs selon l'invention, de repérer les cellules eucaryotes trains formées par un autre ADN, dont l'expression pourrait être recherchée, tel que par exemple un ADN ou cADN codant pour une protéine, telle que l'insuline, l'interféron humain, etc., ou une protéine virale destinée à la production de vaccins, telle que l'antigène HBs du virus de l'hépatite virale B, etc... Le rendement de transformation et de détection est évidemment susteptible d'être plus important si l'on a recours, non à une co-transformation des cellules, telle qu'elle a été décrite ci-dessus à titre d'exemple, par un plasmide marqueur conforme à l'invention et par un plasmide distinct, porteur de la séquence d'ADN dont l'expression est recherchée, mais à une transformation par le plasmide marqueur selon l'invention lui-même, dans lequel aura été insérée au préalable la séquence d'ADN dont l'expression est recherchée.Cette dernière insertion peut, dans le cas des plasmides préférés qui ont été décrits cidessus, être réalisée avec avantage dans l'un des sites contenant les facteurs de résistance à la tétracycline et à l'ampicilline, qu'ils ont en commun avec pAGO et qui n'ont pas été affectés par la modification qui a conduit aux plasmides selon l'invention. L'invention s'applique naturellement de la même manière et dans des conditions analogues à la transformation et la détection de cellules eucaryotes supérieures par un ADN ou cADN codant pour une protéine déterminée. En particulier, les résultats qui précèdent démontrent que l'invention peut être mise en oeuvre pour la transformation et la détection de lignées cellulaires de singes (Vero et OMK) et humaines HéLa, pour ne retenir que quelques exemples. En particulier, les résultats précédents font apparaître que les séquences contenant un facteur de résistance à certains antibiotiques, tel que le gène du transposon Tn5 qui code pour l'APH(3')-II, qui est dépourvu d'introns, peuvent être exprimées après leur transfert dans des cellules de mammifères. Le système sélectif qui a été décrit présente un nombre de caractéristiques et d'avantages particulièrement intéressants. Tout d'abord, on observe que la sélection n'implique pas l'utilisation de voies métaboliques spéciales ou de voies de synthèse de nucléotides spéciales, contrairement à ce que requièrent les techniques antérieures utilisant à titre de marqueurs des gènes TK, APRT, XGPRT ou DHFR. Le procédé selon I'invention peut également être appliqué à ltétude des efficacités relatives de différents promoteurs, que ces efficacités s'expriment en rendements de transformation vis-à-vis d'un type de lignée cellulaire déterminé ou à égard du nombre plus ou moins important de cellules eucaryotes d'origines différentes que peut transformer chacun des promoteurs testés.Il est à cet égard intéressant-de noter l'efficacité toute particulière des promoteurs qui normalement contrôlent la transcription des gènes TK. L'invention fournit par conséquent des marqueurs qui peuvent être exprimés dans des lignées variées de cellules de mammifères, particulièrement dans des lignées cellulaires dépourvues de tout caractère oncogène, comme par exemple les lignées cellulaires hétéro ploies Véro de primates non humains, telles que celles décrites par PETRICCIANI, J.C., KIRSCHSTEIN, R.L., HINES, J.E., WALLACE, R.E. et MARTIN, D.P. (1973), 'tJ. Natal. Cancer Inst.", 51, 191-196, ces dernières cellules s'étant révélées non tumorigènes, même lorsque testées dans des singes soumis à un traitement immunosuppresseur. Les cellules marquées obtenues sont donc particulièrement utiles pour la synthèse de produits des tinés à des usages biologiques ou thérapeutiques, par exemple l'insuline ou lXinterféron, ou encore des principes actifs de vaccin, tels que les séquences polypeptidiques correspondant à l'antigène HBs du virus de l'hépatite virale B. D'une façon générale, l'invention s'étend à tous les équivalents des différents marqueurs qui ont été décrits ou définis plus haut. A cet égard, il importe encore de fa.ire les observations complémentaires suivantes. La définition " promoteur eucaryote connu ou reconnu par sa capacité à diriger l'expression dans une cellule eucaryote d'un gène qui lui est normalement associé, s'étend aussi aux promoteurs associés à des gènes homologues dans d'autres types de cellules ou mircro-organismes, y inclus les virus qui codent pour une protéine homologue à celle spécifiée par le promoteur eucaryote correspondant. En l'occurrence, il s'agit des promoteurs associés à des "ADN de complémentation", au sens qui a été donné de cette expression dans la demande de brevet européen nO 80400828 déposée le 9 juin 1980. En particulier, il a été fait usage d'un tel promoteur dans l'exemple sus-expose. il est signalé que les plasmides pAGO et pGFS sont également décrits dans la susdite demande de brevet européen. L'i.nventionconcerne naturellement et d'une façon générale tous procédés de marquage des cellules eucaryotes, caractérisés par la mise en contact de telles cellules avec un marqueur tel qu'il a été défini ci-dessus, dans des conditions aptes à permettre la transformation d'une partie au moins de ces cellules et par la mise en culture de ces cellules dans un milieu approprié à leur développement et contenant un antibiotique inactivable par l'enzyme pour lequel code la séquence d'ADN du susdit marqueur. L'invention concerne aussi les cellules eucaryotes, notamment originaires du singe ou de l'homme, plus particulièrement appropriées à la fabrication de vaccins et contenant le marqueur selon l'invention à titre de marqueur génétique interne sélectif. REVENDICATIONS 1 - Marqueur génétique sélectif constitué par un ADN,circulaîre ou non, contenant un promoteur eucaryote ou reconnu par aa capacité à diriger l'expression dans une cellule eucaryote d'un gène qui lui est normalement associé et une séquence d'ADN codant pour une enzyme susceptible dtinactiver un antibiotique, capable de pénétrer dans au moins certaines cellules eucaryotes ou de les détruire par un processus toxique ou les deux à la fois, cette séquence étant liée au promoteur susdit et sous son contrôle 2 - Marqueur selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant. pour l'enzyme capable d'inactiver un antibiotique est choisie parmi celles qui codent pour uneenzyme capable d'inactiver l'antibiotique G418. 3 - Marqueur selon la revendication 1 ou la re vendicat5.on 2, caractérisé en ce que la séquence d'ADN cod pour l'enzyme d'inactivation est choisie parmi celles qui codent pour uneaminoglycoside 3'-phosphotransférase (APH(3')). 4 - Marqueur selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour l'enzyme d'inactivation est un gène de résistance à la kanamycine ou à la néomycine ou aux deux à la fois. a - Marqueur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le promoteur est celui sous le contrôle duquel s exerce la transcription du gène ou fragment d'ADN codant pour une thymidine lipase, notamment du promoteur du gêne TK du virus de l'herpès 6 - Marqueur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le promoteur appartient à l'un de ceux sous le contrôle desquels s exerce normalement la transcription du gène de l'adénine phosphoribosyl transférase, de la dihydrofolate réductase ou de 1' enzyme xanthine-guanine phosphoribosyl trasnférase. 7 - Marqueur selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte une partie originaire d'un ADN procaryote, tel que phage ou de préférence plasmide, comprenant une origine de réplication permettant son clonage dans une culture bactérienne, le susdit promoteur et la susdite séquence d'ADN codant pour l'enzyme d'inactivation étant incorporés à cette partie de l'ADN. 8 - Marqueur selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est dérivé du plasmide pBR322, de préférence encore plus particulièrement des plasmides pAGO ou pFG5. 9 - Marqueur selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les dernières paires de nucléotides du promoteur dans la direction de la transcription se trouvent à une distance exprimée en nombre de paires de nucléotides inférieure à 1.000, de préférence à 500, voire même encore inférieure à 100 paires de nucléotides. 10 - Marqueur selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la distance exprimée en nombre de paires de bases entre l'extrémité de la séquence d'ADN codant pour l'enzyme d'inactivation et, soit le site de polyadénylation, soit les "codons stop" de réduction de cette séquence d'ADN, est inférieure à 1.000, de préférence à 500, voire meme encore inférieure à 100 paires de nucléotides. 1f - Marqueur selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence supplémentaire comportant une origine eucaryote de réplication, telle qu'un fragment correspondant au fragment répétitif de 1'ADN du virus connu sous la désignation "virus de l'herpès Saimiri". 12 - Marqueur selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la séquence codant pour l'enzyme d'inactivation correspond au gène codant pour l'enzyme de phosphorylation contenue dans le transposon Tn5 ou Tn601 et le promoteur correspond au promoteur du gène TK du virus de l'herpès. 13 - Cellules eucaryotes, notamment originaires du singe ou de l'homme, et appropriées à la fabrication de vaccins, caractérisées en ce qu'elles contiennent, à titre de marqueur génétique interne sélectif, le marqueur selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 14 - Procédé de marquage des cellules eucaryotes, caractérisé par la mise en contact de telles cellules avec un marqueur conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans des conditions aptes à permettre la transformation d'une partie au moins de ces cellules et par la mise en culture de ces cellules dans un milieu approprié à leur développement et contenant un antibiotique inactivable par l'enzyme pour lequel code la séquence d'ADN du susdit marqueur. 15 - Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce-que le marqueur contient une séquence d'ADN codant pour une enzyme de phosphorylation ou d'acétylation conduisant à l'inactivation de l'antibiotique G418 et en ce que la culture est réalisée au sein d'un milieu contenant l'antibiotique G418, et en ce qu'après la culture on recueille les colonies ayant incorporé le marqueur génétique sélectif. 16 - Application des cellules contenant un marqueur génétique sélectif conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 13 à la fabrication d'une protéine déterminée, ces cellules ayant au préalable été transformées par un ADN codant pour la protéine déterminée du genre en question, cette transformation résultant soit de la présence de cet ADN déterminé dans le marqueur lui-même, soit de sa transformation avec un vecteur distinct contenant ledit ADN.