FR 2506615 A1 19821203 FR 8110789 A 19810601 La présente invention a trait à un nouveau vaccin contre les brucelloses humaines ainsi qu'à un procédé de préparation de ce vaccin. On sait que la brucellose, qui est une zoonose majeure, affecte essentiellement les bovins, les ovins et les caprins, plus rarement les porcins. Parmi les espèces de Brucella d l'origine d'infections humaines, Brucella melitensis entratne les formes d'infection les plus graves. En raison des nombreuses sources de contamination existant dans les zones infectées et de la résistance de ces bactéries, il existe, notamment dans les zones d'élevage, de véritables foyers endémiques dans lesquels se trouve largement touchée une population a haut risque constituée de professionnels tels qu'agriculteurs, vétérinaires, bouchers, équarisseurs, techniciens de loboratoires.Par ailleurs, en dehors des problèmes médicaux posés par la maladie elle-mtme, on doit encore tenir compte du fait que l'homme brucellisé, guéri d'une infection clinique ou inapparente reste ensuite en état d'hyperactivité de type retardé. Ces sujets sont allergiques et peuvent devenir hyperallergiques de sorte que, notamment chez les professionnels constamment exposésa la contamination, il existe en milieu infecté une véritable pathologie de l'allergie brucellienne. On a donc dEjd proposé un certain nombre de vaccinsantibrucelliques. Les uns constitués de cellules bactériennes tuées ne paraissent pas avoir conféré une immunité convenable. Les vaccins vivants ont eu des résultats meilleurs mais on pense qu'ils ne sont pas sans danger et, de plus, il créent des états d'allergie avec tous les inconvénients qui ont été vus. Afin de remédier à ces inconvénients, J. ROUX et A. SERRE ont proposé un vaccin préparé d partir d'une souche de Brucella melitensis dans lequel les bactéries entières sont d'abord délipidées par un mélange à parties égales d'alcool et d'éther puis traitées par le phénol ce qui permet d'obtenir finalement une fraction insoluble dans le phénol, dite fraction phénol-insoluble ou fraction PI, in soluble dans l'eau. Cette fraction est mise en suspension très homogène et permet ainsi d'obtenir un vaccin efficace. Ce vaccin présente cependant quelques inconvénients. En particulier, étant propagé à partir d'une souche particulièrement pathogène, sa àbrication n'est pas aise et relativement dangereuse et donc conteuse. La présente invention se propose donc de fournir un nouveau vaccin contre les brucelloses qui présente les avantages du vaccin précité1 et notamment une très bonne immunité vaccinale tout en étant de fabrication facile et de prix de revient réduit. Un autre objectif encore de l'invention est de fournir un tel vaccin qui soit efficace non seulement contre les infections d Brucella melitensis mais également les infections à Brucella abortus et a Brucella suis. L'invention a pour objet un vaccin contre les brucelloses caractérisé en ce qu'il comporte, dans un véhicule convenable, la fraction phénol-insoluble de Brucella abortus. Parmi les souches de Brucella abortus a été préférée la souche Brucella abortus B19. Cette souche est bien définie dans la littérature (voir par exemple Bulletin de l'institut Pasteur, 1972, 70 p. 163-165). Brucella abortus 319, qui a été principalement développée pour des vaccins contre la brucellose bovine, est accessible, entre autresauprès de l'administration américaine Unîtes States Department cf Agriculture, Animal and Plant Heaith Inspection Service Veterinary Service Post Office Bos 70 Ames Iowa 500 lO U.S.A. Le vaccin selon l'invention, quand il est prêt à Entre administré, comporte dans un véhicule liquide une suspension homogénéisée de ladite fraction phdnol-insoluble de Brucella abortus. Le vaccin comprend avantageusement entre 1,7mg et 2,3 mg d'extrait sec par ml de soluté et de pré férence, on adopte une suspension d'environ 2mg d'extrait sec par ml de soluté. Le soluté physiologique convenable est de préférence un soluté physiologique phénolé. De préférence, le vaccin est réparti en conditionnements unitaires, ampoules ou seringues, sous un volume de 0,5 ml. On a constaté que le vaccin selon l'invention assure une protection non seulement contre l'espèce homologue Brucella abortus mais également contre les espèces hétérologues Brucella mélitensis et Brucella suis. On dispose donc ainsi d'un vaccin particulièrement efficace d large spectre. De plus, aux doses utilisées, le vaccin est dépourvu de toxicité et n'entratne que des réactions d'hypersensibilité extrmementdiscrètes et acceptables. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de ce vaccin, caractérisé en ce qu'on effectue une délipidation de bactéries Brucella abortus entibres, que l'on recueille la fraction solide, que l'on soumet cette fraction préalablement desséchée d une extraction au phénol, de préférence saturé d'eau et à une température de l'ordre de 600C, puis que l'on lave le produit final, purifié et filtré, de préférence a l'alcool puis a l'éther, et que l'on prépare a partir de ce produit une suspension homogénéi- sée et stérilisée. L'invention sera maintenant décrite plus en détail a propos d'un mode de mise en oeuvre particulier fait a titre d'exemple non limitatif. Souche utilisée Brucella abortus St 19 culture ORIGINAL SEED (lyophilisé) serial 15202, produit en février 1972, par Biological Reagents Section, Animal Realth Diagnostic, APHIS MADL Ames Ioaza 50010 U.S.A. La souche est en phase lisse. Avec cette souche on prépare tout d'abord un lot de semence en reprenant la souche en tube à milieu trypticase soja, puis après repiquage et nouvelles cultures on récolte la suspension bactérienne et, après adjonction d'un substrat de lyophilisation on la répartit en ampoules et on la lyophilise. Culture des bactéries On prépare ensuite un inoculum reprenant le contenu d'une ampoule du lot de semence dans quelques millilitres du milieu et on la repique dans un tube. Après culture dans le tube on ensemence un erlen de 100 ml contenant toujours le milieu trypticase soja et on met en culture pendant 24 heures.Apartir de l'erlen on ensemence un flacon contenant 100 ml de milieu et on effectue une nouvelle culture toujours de 24 heures d 370C sous agitation. A partir de la culture du flacon, on ensemence par transfert, un préf ermenteur de 40 litres de volume utile. La culture est poursuivie pendant 24h a 370C sous agitation puis la totalité de la suspension du préfermenteur est introduite dans un fermenteur de 400 litres de volume. Le milieu utilisé dont la composition est à la portée de l'homme de l'art comporte les produits suivants dans de l'eau déminéralisée Peptone, trypticase, extrait de levure, chlorure de sodium, glutamate de sodium, thiosulfate de sodium, sulfate de magnésium, sulfate ferreux, sulfate de manganèse, vitamines B1, 35, PP, B12, glucose anhydre, phosphate disodique et phosphate monopotassique. La culture dans le fermenteur est effectuée pen nt 24 à 48 heures puis lorsque la concentration en germes est satisfaisante, le contenu de la cuve est centrifugé a basse température puis le culot bactérien est lavé. Il est ensuite remis en suspension dans du soluté physiologique tamponné de façon à obtenir un concentré bactérien. PrEDaration de la fraction WhEnolfinsoluble Le concentré bactérien en solution physiologique est repris dans un mélange alcool éther (en volumes égaux) à raison de un volume de concentré pour un volume de mélange et maintenu sous agitation a + 40C pendant 48 heures. Le mélange est filtré puis repris une nouvelle fois dans un mélange alcool éther a raison de 125g de -frac- tion solide par litre de mélange et laissé à température ambiante. Il est ensuite filtré et séché. Cette phase constitue la phase de délipidation des bactéries qui demeurent entières, c'est-d-dire non lysées. Elles sont ainsi notamment détoxifiées. L'extrait sec est repris a raison de 60g par 300ml d'eau distillée. La suspension obtenue réchauffe à 600C est additionnée d'un volume égal de phénol saturé a la mème température et le mélange obtenu est maintenu sous agitation pendant 15 minutes puis centrifugé. Les culots de centrifugation sont soumis à une deuxième extraction phénolique puis le culot de centrifugation réextrait et dialysé 96 heures contre de l'eau distillée. Cette extraction, qui provoque la lyse bactérienne, permet d'obtenir un culot composé par la fraction phdnol-insoluble recherchée. Cette fraction purifiée et dialysée est ensuite filtrée puis séchée à l'alcool puis à l'éther et finalement déshydratée sous vide. Elle se présente alors sous l'aspect d'une poudre sèche pouvant être stockée å + 40C. Chaque extrait sec est une poudre essentiellement constituée de peptidoglycane, débarrassé. des lipides toxiques et renfermant une grande partie des éléments immunogènes de la bactérie. Préparation du vaccin Chaque dose de 1 mg d'extrait correspond à environ total bactéries et représente la dose humaine à mettre pour l'utilisation, en suspension dans 0,5 ml de soluté physiologique phénolé. Pour cela on prépare tout d'abord une suspension à partir de la fraction sèche que l'on reprend dans du soluté physiologique tamponné. Cette suspension est homog6- néisée puis stérilisée par chauffage 1200C pendant 10 minutes. Après refroidissement on ajoute une solution sature de phénol dans l'eau à raison de 100g de phenol pour 10 g d'eau et l'ensemble/en ampoules ou seringues dont le volume extractible n'est pas inférieur à 0,5ml. La concentration en matière sèche est de 2 mg par millilitre de soluté. Essais pharmacologiques de toxicité En ce qui concerne la-toxicitd primaire, les essais suivants ont été effectués - Toxicité anormale. Elle a été recherchée sur souris et cobayes et tentatives de culture de Brucella après sacrifice des animaux. Les animaux traités ont reçu par injection intrapéritonéale 0,5 mi de vaccin. Aucun symptôme ne s'est manifesté tant chez les souris que chez les cobayes traités, les animaux témoins recevant le méme volume de soluté seul. Les poids enregistrés ont montré un accroissement normal. Après sacrifice des animaux, aucune lésion organique ni péritonéale n'a été enregistrée et aucune culture de Brucella n'a pu être faite. - Tolérance locale et pouvoir dermonécrotique. Les essais effectués sur cobayes,espbce très sensible,n'ont permis de relever aucun point de nécrose. Seules de petites lésions congestives, disparaissant rapidement ont pu Entre observées. - Toxicité aiguë à court terme en administration unique. Les essais sur souris et sur cobayes ainsi que sur singes Macacus cynomolgus ont été effectués en utilisant sur souris et cobayes une dose double de la dose humaine et huit doses humaines pour le singe. Tous les animaux ont survécu et aucun n'a manifesté de trouble général ou local, ni de lésions organiques. - Toxicité chronique à lonq terme en administra- tion Prolonvée réitOrée. Les essais ont été effectués sur le chien et sur le singe et tous les animaux ont survécu, aucun n'ayant manifesté de trouble général important ou local ni de lésions organiques. La toxicité secondaire a été recherchée de la façon suivante - Toxicité directe anaphylactique (hypersensi bilité de type 1) : des cobayes ont reçu par voie sous- cutanée 0,5 ml puis quatorze jours apuras la meme dose par voie cardiaque. Les cobayes ont survécu après avoir pré senté des symptômes d'anaphylaxie. - Toxicité directe allergique : Les essais ont été effectués sur cobayes. Il existe des différences individuelles de réactivité mais la moyenne des résultats est faible et n'est pas significativement différente de celle des témoins. Le pouvoir réactogène à court terme (Dix semaines) après infection brucellique sur le cobaye a montré un pouvoir réactogène réel mais faible vis-à-vis d'une infection brucellique sensibilisante par Brucella abortus virulente. A long terme (un an de vaccination chez le cobaye) on constate que le vaccin présente un pouvoir de sensibilisation par rapport a lui-meme réel mais discret. Pouvoir Protecteur : Le test d'activité de la vaccination-épreuve a été razBté appliqué chez la souris d'une part avec épreuve homologue, c'est-à-dire infection à partir de la souche Brucella abortus 544 virulente immunologiquement correspondante à la souche originelle dont le vaccin est issu, et par épreuve hétérologue vis-à-vis des souches Brucella melitensis (M15) et Brucella suis (1330) virulentes, toutes souches pathogènes pour l'homme. Les souris ont été immunisées par voie sous-cutanée avec 0,5 ml de vaccin dilué au 1/10 en eau physiologique tamponnée phénolée Vingt jours après vaccination les souris vaccinées ont été inoculées par injection sous-cutanée d'un millilitre de suspension bactérienne contenant 106 UFC (unités formant colonies).Le vaccin montre une activité protectrice spécifique homologue et hétérologue. L'expertise clinique a été conduite sur un groupe de 262 personnes dépourvues d'hypersensibilité retardée d'après le bilan biologique tintradermordaction à la mélitine et à la fraction phénol-insolable et étude sérologique). La dose vaccinale a été de 0,5 ml contenant un mg d'extrait sec. Chaque sujet a reçu une première injection suivie d'une deuxième injection quatorze jours plus tard. 80% des sujets ont présenté une réaction locale (érythème, induration ou douleur) t la fréquence est de l'ordre de 20 % si l'on considdre l'association de deux types de réaction chez une méme personne et inférieure à 10 % si l'on considère les sujets ayant présenté les trois composantes de la réaction locale. Environ 70% des sujets ont présenté au moins une des trois réactions générales (température, malaise ou frissons) t moins de 4 % des sujets ont présenté l'en- semble des réactions générales. L'étude épidémiologique chez les sujets vaccinés qui est en cours, montre que la vaccination est efficace si l'on considère les statistiques de morbidité. Bien que l'inver,tion ait été décrite a propos d'une forme de réalisation particulière, il est bien entendu qu'elle n'y est nullement limitée et qu'on peut lui apporter diverses modifications. Ainsi on peut préparer des vaccins selon l'invention en utilisant des souches de Brucella abortus différentes de la souche 319, comme par exemple Brucella abortus 544 et Brucella abortus 99. REVENDXCATZONS 1. Vaccin contre les brucelloses, caractérisé en ce qu'il comporte, dans un véhicule convenable, la fraction phénol-insoluble de Brucella abortus. 2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte la fraction phénol-insoluble de Brucella abortus B 19. 3. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comporte entre 1,7 mg et 2,3 mg de fraction sèche par ml de soluté et notamment 2 mg par ml. 4. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est réparti en conditionnement unitaire sous un volume d'environ 0,5 ml. 5. Vaccin selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite dose comporte environ 1 mg de fraction sèche. 6. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le véhicule comporte un soluté physiologique phénolé. 7. Procédé de préparation du vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on effectue une délipidation de bactéries Brucella abortus entières, que l'on recueille la fraction solide obtenue, que l'on soumet cette fraction préalablement desséchée a une extraction au phénol, notamment au phénol saturé d'eau et à une température de l'ordre de 6O0C, puis que l'on lave le produit final purifié et filtré et que l'on prépare à partir de ce produit une suspension homogénéisée et stérilisée. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on effectue la délipidation dans un mE- lange d'alcool éther. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 et 8, caractérisé en ce que l'on effectue le lavage à l'alcool puis a l'éther. 10. Procédé selon l'une quelconque des reven dications 8 et 9, caractérisé en ce que l'on stérilise le vaccin par chauffage à 1200C pendant environ 10 minutes.