FR 2511702 A1 19830225 FR 8116174 A 19810824 ANTICORPS MONOCLONAUX ANTIPOLIOVIRUS POUR L'IDENTIFICA- TION DU TYPE ET LA DIFFERENCIATION INTRATYPIQUE DE SOUCHES ISOLEES DE POLIOVIRUS, HYBRIDES CELLULAIRES POUR LEUR FABRICATION ET PROCEDE DE DIAGNOSTIC IN VIffiO METTANT EN JEU DES ANTICORPS. L'invention concerne des anticorps monoclonaux antipoliomyélitiques pour l'identification du type et la différenciation intratypique d'une souche isolée de poliovirus, notamment pour la détermination de l'origine sauvage ou vaccinale de cette souche de poliovirus, des hybrides cellulaires pour la fabrication de ces anticorps et un procédé pour réaliser les susdites identification et différenciation. Les anticorps secrétés par les lignées d'hybridomes étant monoclonaux, ils sont en principe dirigés contre un seul déterminant antigénique, et constituent donc un matériel de choix pour l'étude de la variation antigénique. On sait qu ril existe trois types sérologiques de poliovirus (types 1, 2 et 3) qui ont les mêmes carac tères biologiques et la même propriété de provoquer chez l'homme la poliomyélite paralytique. Les trois types sont séparables les uns des autres par réaction avec les anticorps respectifs dans des tests de- reconnaissance sérologique. En effet les anticorps relatifs à des antigènes appartenant à un type déterminé neutralise spécifiquement la propriété du poliovirus correspondant de se répliquer dans la cellule animale. En sus des souches sauvages virulentes qui existent dans l'environnement, provenant d'individus excréteurs de virus, on trouve aussi dans la nature des souches atténuées non virulentes. Les souches atténuées non virulentes proviennent essentiellement de sujets qui ont reçu le vaccin antipoliomyélitique oral (appelé vaccin Sabin). Les sujets vaccinés deviennent porteurs de virus et excrètent dans les selles, pendant de longues périodes, le virus du vaccin. La présence chez l'individu sain ou dans l'environnement (eaux potables eu résiduelles) du poliovirus pose le problème de l'origine de ce virus. Il faut savoir par un test simple, si ce virus provient du vaccin oral, ou s'il s'agit d'un virus sauvage. Ce problème a été abordé par l'O.M.S. (J. Biol. Standard 9-163 (1981)), pendant plusieurs études collaboratives, sans pouvoir dégager un procédé efficace, dans un rapport intitulé Markers of poliovirus strains from cases temporarily associated with the use of live poliovirus vaccine (Marqueurs de souches de poliovirus associés à l'utilisation du vaccin vivant de poliovirus). L'invention a pour but de remédier à ces difficultés, de fournir des moyens et plus particulièrement des batteries d'anticorps permettant de réaliser les identifications de type et différenciations intratypiques de souches à l'intérieur d'un même type de poliovirus, une technique de fabrication de ces anticorps et une méthode pour les mettre en oeuvre dans ces essais d'identification et de différenciation intratypique. L'invention met à profit la découverte qui a été faite qu'il était possible d1 isoler des anticorps spécifiquement dirigés contre un nombre réduit, voire un seul déterminant antigénique, à partir de cultures d'hybrides cellulaires, préalablement formés dans les conditions qui seront indiquées ci-après, ces spécificités pouvant être orientées selon les besoins, soit à ltégard à la fois des souches sauvages et des souches atténuées ou seulement à l'égard de l'une ou de l'autre dans un type donné. L'invention tire profit de la capacité de certains hybrides cellulaires ou "hybridomes" de produire des anticorps monoclonaux spécifiquement dirigés contre un seul déterminant antigénique. L'invention propose encore une méthode permettant de les identifier et de les discriminer. L'invention fait application des techniques décrites par KOHLER et MILSTEIN (1975 - "Continuous cultures of fused tells secreting antibody of predefined specificity" - Nature, 256, 495), qui ont montré que des cellules provenant de tumeurs myélomateu- ses de souris pouvaient être fusionnées avec des cellules immunocytes, plus particulièrement des cellules spléniques d'un animal immunisé au préalable, pour obtenir des cellules hybrides qui acquièrent la propriété 8rimmortalité des cellules de tumeurs myélomateuses et la capacité des cellules d'immunocytes, notamment des cellules spléniques, de secréter des quantités importantes d'anticorps homogènes. Il est remarquable que l'on ait pu, par la sélection de lignées d'hybridomes monoclonaux, dans les conditions qui seront indiquées plus loin, isoler des hybridomes producteurs d'anticorps qui, -d'une part, sont suffisamment différenciés pour distinguer des souches sauvages et des souches atténuées et, d'autre part, des anticorps distincts, capables de reconnaître à la fois et les unes et les autres à l'intérieur du même type. L'originalité deltinvention réside entre autres dans le fait d'avoir posé dans ces termes le problème de la recherche des anticorps distincts, qui permettrait d'opérer les discriminations voulues, et d'en avoir tiré les conséquences pour la mise au point d'une méthode d'identification et de différenciation applicable à des souches nouvellement isolées sur le terrain, dans des conditions n impliquant pas des essais techniquement délicats ou compliqués. Dans l'un de ses premiers aspects, l'inven- tion concerne donc une batterie d'anticorps monoclonaux pour le diagnostic et l'identification de poliovirus, ca ractérisée par trois groupes d'anticorps à l'égard de poliovirus, appartenant respectivement aux sous-types sérologiques (1), (2) ou (3), les anticorps monoclonaux de chaque groupe se répartissant en - une première catégorie d'anticorps actifs, mais ne pré sentant pas de différenciation intratypique, - une deuxième catégorie d'anticorps actifs contre les souches atténuées, mais essentiellement dépourvus d'ac tivité à ltégard des souches sauvages correspondantes, - une troisième catégorie d'anticorps actifs contre la souche sauvage appartenant au sous-type sérologique considéré, mais essentiellement dépourvus d'activité à l'égard des souches atténuées correspondantes. De préférence, les anticorps appartenant aux première et deuxième catégories dans chacun des groupes susdits sont respectivement actifs contre - la souche LSc 2ab, - la souche P 712 CH 2ab, - la souche Leon 12alb. Ces dernières souches, appelées aussi souches Sabin, sont en effet celles qui sont le plus couramment utilisées dans le monde entier pour la constitution des vaccins vivement atténués. Elles sont disponibles dans la plupart des laboratoires et peuvent être obtenues auprès de l'Organisation Mondiale de la Santé. Elles sont essentiellement a l'origine de la plupart des souches atténuées que l'on trouve maintenant dans l'environnement, aux cotés des souches sauvages, en particulier des souches Mahoney, MEF 1 et Saukett, dont elles ont en fait été dérivées. Comme déjà indiqué plus haut, on sait que les techniques usuelles ne permettent pas, à l'intérieur d'un même type, de distinguer les souches sauvages et les souches atténuées. Dans une batterie préférée d'anticorps selon l'invention, les anticprps appartenant aux première et troisième catégories, dans chacun. des groupes susdits, sont respectivement actifs contre ces souches, c'est à-dire - la souche Mahoney, - la souche MEF 1 et - la souche Saukett. On sait en effet que les souches atténuées LSc 2ab, P 712 CH 2ab et Leon 12a1b sont dérivées des souches sauvages. L'invention concerne aussi la batterie d'hybrides cellulaires pour la production des groupes d'anticorps monoclonaux qui ont été définis plus haut et qui sont caractérisés en ce qu'ils résultent de la fusion des cellules d'une lignée myélomateuse et de cellules immunocytes, notamment de rates d'animaux, respectivement vaccinés au préalable contre des poliovirus atténués, d'une part, sauvages, d'autre part, provenant de cultures des trois types correspondants. Les techniques de culture mises en oeuvre, dont un exemple sera d'ailleurs indiqué plus loin, sont en elles-mêmes connues. On peut à cet égard se reporter à l'article de SABLER etMILSTEIN déjà mentionné plus haut. En ce qui concerne des types de cellules de myélomes, des techniques préférées d'immunisation de l'animal contre les antigènes auxquels correspondent les anticorps destinés à être produits par les cellules d'immunocytes, notamment les cellules spléniques qui seront fusionnées avec les cellules des lignées myélomateuses préférées, les animaux d'épreuve préférés et les conditions de culture aboutissant à la formation des hybrides cellulaires du genre en question, on peut encore se reporter par exemple aux demandes de brevet européen nO 004516 0018794 et 0018795 ou à la demande de brevet français nO 78 17545, publiée sous le nO 2.394.607. La batterie préférée d'hybrides selon l'invention est caractérisée par trois groupes de lignées aptes à respectivement secréter des anticorps actifs à l'égard de virus appartenant aux types (1)-, (2) et (3), et caractérisés en ce que (1) le premier groupe comprend trois catégories d'hybrides respeeivement capables de produire des anticorps - actifs à la fois contre les souches LSc 2ab et Mahoney - actifs contre la souche LSc 2ab, mais inactifs contre la souche Mahoney, - actifs contre la souche Mahoney, mais inactifs contre 1 n .sol hO 2b (2) le deuxième groupe comprend trois catégories d'hy brides respectivement capables de produire des anti corps - actifs à la fois contre les souches P 712 CH 2ab et MEF 1, - actifs-contre la souche P 712 CH 2ab, mais inactifs contre la souche MEF 1, - actifs contre la souche MEF 1, mais inactifs contre la souche P 712 CH 2ab (3) le troisième groupe comprend trois catégories d'hy brides respectivement capables de produire des anti corps - actifs à la fois contre les souches Leon 12alb et Saukett, - actifs contre la souche Leon 12alb, mais inactifs contre la souche Saukett, - actifs contre la souche Saukett, mais inactifs contre la souche Leon 12a1b. Un procédé d'obtention préférée d'une batterie d'hybrides cellulaires susceptibles de former la batterie d'anticorps susdite est caractérisé par les étapes qui consistent - à immuniser des animaux respectivement contre des virus appartenant aux trois types principaux (1), (2) et (3) et, à l'intérieur de chacun de ces types, à, d'une part, une souche sauvage et, d'autre part, à une souche atténu-ée ; - à prélever sur les animaux les cellules immunocytes, de préférence les cellules de la rate et à les mettre en culture ;; - à fusionner les cellules de ces cultures avec des cel lules d'une lignée myélomateuse ou analogue, propres à former des lignées d'hybrides cellulaires avec les précédentes, séparables des cellules myélomateuses non fusionnées, et à récupérer des clones cellulaires individualisés résultant de la fusion ;; - à incuber ces clones cellulaires et à tester la capa cité de leurs surnageants respectifs à inhiber l'effet cytopathogène de cultures de virus homologues dans des essais de séroneutralisation, - à recueillir et à répartir en groupes les cultures d'hybrides cellulaires recueillies par types, selon les activités des anticorps qu'ils sont susceptibles de produire à l'égard des trois types de virus homologues considérés et, à l'intérieur de chaque groupe, par catégorie d'hybrides cellulaires, en fonction de l'acti vité des anticorps qu'ils sont susceptibles de produire à l'égard des souches respectivement atténuées et sau vages homologues correspondantes, - à sélectionner et récupérer dans chaque groupe et dans chacune des deux catégories correspondantes, dans des essais répétés de séroneutralisation de cultures cellu laires sensibles, en présence, d'une part, de virus sau vages et, d'autre part, de virus atténués appartenant tous deux au même type, ceux des clones qui inhibent (1) à la fois le virus sauvage et le virus inactivé, (2) le virus sauvage, à l'exclusion des virus atténués, (3) le virus atténué, à ltexclusion des virus sauvages. De préférence, les tests de séroneutralisation mis en oeuvre dans le susdit procédé sont realisés sur des cultures de cellules semblables, telles que;cellules d'origine cancéreuses humaines couramment utilisées pour l'étude des poliovirus,par exemple les cellules HEp-2 ou Helo en presence de doses de 102 à 10 DCP 50 de virus homologues et hétérologues , dans les épreuves de sélection finale, on recueille dans chacun des groupes considérés les clones qui produisent respectivement - les anticorps monoclonaux d'une première catégorie qui présentent un index de neutralisation au moins égal à 2, de préférence supérieur à 3, tant vis-à-vis de la souche atténuée que de la souche sauvage correspondante, - les anticorps monoclonaux d'une deuxième catégorie qui présentent un index de neutralisation au moins égal à 2, de préférence supérieur à 3, à l'égard de la souche atténuée, et un index de neutralisation pratiquement nul vis-à-vis de la souche sauvage, - les anticorps monoclonaux d'une troisième catégorie, qui présentent un index de neutralisation au moins égal à 2, de préférence supérieur à 3, à l'égard de la souche sauvage, et un index de neutralisation pratiquement nul vis-à-vis de la souche atténuée. On rappellera, pour mémoire, que les unités DCP 50 dont question dans ce qui précède représentent les doses cytopathogènes 50 de virus qui correspondent à la dilution de virus entraînant la mort de 50 % des hôtes sensibles à leur contact. On rappellera aussi que l'expression "index de neutralisation" correspond à la différence entre les logarithmes des titres correspondant aux doses de virus nécessaires à la destruction de 50 % des cultures cellulaires sensibles au contact desquelles ils se trouvent placés, dans les conditions qui ont été rappelées cidessus, lorsque les mesures sont effectuéesjd'une part, en présence et, d'autre part, en l'absence de la catégorie d'anticorps monoclonaux dont le niveau d'activité est recherché.En l'occurrence, on dira qu'unie catégorie d'anticorps monoclonaux présente un index de neutralisation égal à 2, lorsque, en sa présence,le titre des virus nécessaires à l'obtention d'une destruction de 50 % des hôtes cellulaires à leur contact est égal à îoe fois la valéur du titre conduisant au meme résultat, en l'absence de ces anticorps. L'invention conerne également l'application des batteries d'anticorps monoclonaux selon l'invention à un diagnostic relatif au caractère atténué ou sauvage d'une souche inconnue nouvellement isolée, caractérisée par les étapes qui consistent - dans une premièrPétape, en des essais de séroneutrali sation de cultures de cellules sensibles en présence respectivement des trois anticorps monoclonaux de "première catégorie" des trois groupes susdits, le virus isolé étant présumé comme appartenant aux premier, second ou troisième type, selon que le virus isolé est inhibé par l'anticorps appartenant aux susdits premier, deuxième et troisième groupes susdits, et - dans une seconde étape, en des essais de séroneutrali sation répétés dans des conditions semblables vis-à vis d'anticorps respectivement de "deuxième catégorie" et"troisième catégorie" du groupe correspondant au type déterminé dans les premiers essais de séroneutra lisation, le virus isolé étant présumé comme appartenant à une souche atténuée ou sauvage, selon qu'il est inhibé par les anticorps de deuxième catégorie" ou par les anticorps de "troisième catégorie". De préférence, on réalise à des fins de contrôle les mimes essais de séroneutralisation avec les mêmes anticorps à l'égard des virus homologues, tant en ce qui concerne le type qu'en ce qui concerne les catégories de virus homologues à l'intérieur de ce même type, la présomption de rattachement du virus isolé à un type et à une catégorie particulière de souches à l'intérieur de ce type étant alors d'autant plus forte que les index de neutralisation mesurés sont du même ordre de grandeur que ceux obtenus avec la souche homologue, de même type et de même catégorie. D'autres caractéristiques de l'invention apparateront encore au cours de la description qui suit d'exemples de fabrication de lignées cellulaires productrices des différents anticorps monoclonaux entrant dans les groupes et catégories sus-définis, ainsi que des conditions de leur utilisation, notamment dans des épreuves dé diagnostic du type et de la catégorie auxquels peut se rattacher un poliovirus nouvellement isolé chez un individu ou dans le milieu ambiant. I - Préparation des hybridomes. Les anticorps monoclonaux qui ont été préparés sont diriges contre les souches suivantes Type 1 : a) souche Manoney - prototype de laboratoire pour le virus sauvage et virulent b) souche LSc 2ab - prototype de virus atténué utilisé dans la préparation du vaccin oral ; Type 2 : c) souche MEF 1 - prototype de laboratoire pour le virus sauvage et virulent ; d) souche P 712 CH 2ab - prototype de virus atténué utilisé dans la préparation du vaccin oral ; Type 3 : e) souche Saukett - prototype de laboratoire de virus saurage virulent ; f) souche Leon 12alb - prototype de laboratoire de virus atténué, utilisé dans la prépara tion du vaccin oral. Plus particulièrement, on a préparé des anticorps monoclonaux qui ont en principe deux propriétés fondamentales a) ils sont capables de reconnaître le type de polio virus (1, 2 ou 3) b) ils sont capables, à l'intérieur de chaque type, de reconnaître le sous-type. Cette spécificité de sous type permet la différenciation des souches sauvages de celles provenant du vaccin oral. Les séquences successives de la préparation ont été les suivantes A A - Immunisation des souris. 1. Antigène. L'antigène pour l'immunisation des animaux est constitué d'une suspension de poliovirus active en partant des souches type 1 : Mahoney et LSc 2ab, type 2 : MEF 1 et P 712 CH2ab, type 3 : Saukett et Leon 12alb. Les virus sont d'abord inoculés sur des cultures de cellules humaines, HEp-2 qui proviennent d'un cancer humain. Lorsque les cellules sont complètement détruites par le virus, on récolte le liquide surnageant qui contient le virus. Cette suspension virale est ensuite ultracentrifugée pendant 3 heures à 100.000 x g pour concentrer le virus. La suspension finale doit contenir une quantité de virus d'environ 109 unités infectieuses par millilitre. 2. Schéma d'immunisation. Des groupes de 3-4 souris Balb/c reçoivent par voie intrapéritonéale une première injection de virus (0,2 ml). Après quatre semaines, une deuxième injection avec la même quantité de virus est effectuée, cette fois par voie intraveineuse. Trois à quatre jours après la dernière injection, les souris sont sacrifiées et la rate est prélevée et mise en culture. B - Mise en culture, fusion et sélection (myélome + cellules de rate). Les cellules spléniques sont fusionnées avec les cellules HGPRT déficientes de la lignée myélomateuse Sp2/0-Agl4 (SHULMAN M., TILDE C.D. and KOHLER d. (1978) IT A better cell line for making hybridomas secreting spe- cific antibodies" - Nature, 276, 269-270). Les mélanges des celludes-parentales sont incubés en présence de polyéthylène-glycol (PEG) 1000 à 30 %. Après élimination du PEG, les cellules sont distribuées dans des plaques à cupules multiples. Après 48 heures d'incubation, le milieu sélectif contenant de l'azasérine (10 pM) et de l'hypoxanthine (50 vM) est ajouté.Ce milieu ne permet la croissance que des seules cellules hybrides dont les colonies deviennent visibles vers le huitième jour. A partir du quatorzièeme jour, les surnageants des cupules contenant les colonies hybrides suffisamment développees sont testés pour la présence des anticorps antipolio (voir ≈C). Les hybridomes positifs sont sous-clonés par la technique des dilutions limites pour, d'une part, s'assurer du caractère monoclonal des anticorps secrétés etss d'autre part, dans certains cas obtenir la stabilité de la secrétion. C - Sélection des hybridomes secrétant des anticorps antipolio. Tous les clones cellulaires obtenus après la fusion et la sélection ne secrètent pas les anticorps souhaités. Il est donc nécesaaire de sélectionner 1 ) les clones cellulaires fabriquant des anticorps et 20) les clones secrétant une certaine catégorie d'anti corps. Dans ce but, on utilise la réaction de neutralisetion et la réaction immunoenzymatique appelée ELISA (AVRAMEAS S. and TERNYNCK T. (1971) - "Peroxidase labelled antibody and Fab conjugates with enhanced intracellular penetratioflft - Immunochem., 8, 1175 et VOLLER A., BIDWELL D. & BARTLETT A. (1976) - "Microplate enzyme immunodiagnosis of virus infeetion" - Manual of Clinicla Immunology (Eds Rose N.R. & Friedman H.). Amer. Soc. Microbiol., p. 506) II - Détection des anticorps monoclonaux. A - Séroneutralisation Le surnageant de culture d'hybridomesà tester est mis en contact deux heures à 370C avec 100 DCP 50 de virus homologue (le même que celui utilisé pour l'immunisation des souris). L'effet cytopathogène restant est déterminé sur une culture de cellules HEp-2. Les surnageants qui inhibent 11 effet cytopathogène sont considérés comme positifs et les clones de cellules qui l'ont produit sont sélectionnés et utilisés comme source d'anticorps monoclonaux (AM). On effectue ensuite la sélection des AM spécifiques dans les conditions qui ont été indiquées plus haut par le titrage, pour chaque type, du pouvoir neutralisant des AM correspondants contre la souche homologue (par exemple la souche sauvage) et hétérologue (par exemple la souche atténuée) du même type sérologique, pour déterminer leurs index de neutralisation dans les conditions qui ont été mentionnées plus haut et qui seront rappelées plus loin, lorsque le même type de mesure sera fait à l'égard de l'identification de souches sauvages dans des essais de diagnostic in vitre. B - Test immunoenzymatique. L'antigène de référence (le virus utilisé comme antigène immunisant) est fixé sur un support solide (par exemple des plaques à 96 cupules en polystyrène, membranes de nitrate de cellulose). Les surnageants des cultures d'hybridomes sont mis en contact avec les surfaces recouvertes d'antigène. Si des AM homologues à l'antigène existent, ils vont être retenus par l'antigène. Leur présence peut être ensuite détectée avec des anticorps anti-souris de chèvre marqués à la péroxydase. La présence de la péroxydase détermine le changement de couleur d'un réactif qui contient le substrat spécifique de l'enzyme (H202). Donc, tout changement de couleur va indiquer la présence dans le surnageant respectif des AM reconnaissant 11 antigène utilisé dans le test. III - Utilisation des anticorps monoclonaux antipolio virus. Exemple 1. Identification du type de poliovirus par les anticorps monoclonaux. Le type sérologique d'un virus polio isolé en terrain peut être déterminé à l'aide des anticorps monoclonaux neutralisants spécifiques de type. On utilise une batterie de trois AM, correspondant aux trois types du virus polio, dans un test de séroneutralisation. Une dose d'environ 102 - 103 DCP 50 de virus à tester est mise en contact avec chacun des trois types d1AN. Ensuite, l'effet cytopathogène (ECP) restant dans chaque mélange virus-anticorps est déterminé sur une culture de cellules HEp-2. Le type de virus est établi par rapport au type d'AM qui ont neutralisé le virus (Tableau I). De préférence, on a recours à des essais comparatifs confirmatifs. Tableau I Virus ECP après contact avec t Type polio culture de antipolio AN1 2 - virus antipolio typ e3 du réf. type 1 + -- - + + 1 réf. type 2 + + - + 2 réf. type 3 + + + - 3 souche 2/73 F + - + 2 souche 35/74 + + + - 3 souche 6/80 + LÀ + + 1 Les types des trois souches testées (les trois dernières dans le tableau) sont indiqués dans la colonne de droite. Exemple 2. Détermination du sous-type de virus polio (différenciation du virus sauvage du virus atténué). Les AM permettent, par leur capacité discriminatoire, l'identification de l'origine génétique des souches de poliovirus isolées en terrain. La caractérisation antigénique des poliovirus dont le type a déjà été établi se fait avec des AM spécifiques de souche (sauvage ou atténuée) avec un test d'index de neutralisation. La souche à contrôler est titrée en absence et en présence d'AM spécifiques des souches sauvage et atténuée du même type sérologique. L'appartenance antigénique est établie par rapport à la différence du log titre du virus en absence et en présence de chaque catégorie d'AM (index de neutralisation).On considère une souche comme ayant une origine sauvage ou atténuée quand l'index de neutralisation face aux AM respectifs est du même ordre que celui de la souche de référence homologue (tableau II). Dans le tableau II, on présente un exemple de test d'identification intratypique des trois souches de poliovirus, pour établir leur origine sauvage (virus virulent S) ou atténuée (virus provenant du vaccin : A). Tableau II Index de neutraisation a) [Index de neutralisation a) Caractérisation I Virus polio type 1 antigénique b) Mahoney LSc 2ab Références - Mahoney (sauvage) 3,5 O S - LSc 2ab (atténuée) 0,5 4,0 A à tester - souche 8/79 3,5 0 S - souche 9/79 3,0 o S - souche 21/80 0 4,5 A a) Index de neutralisation = différence entre le log titre du virus en absence et en présence des AM respectifs ; b) S = sauvage (virulent, type Mahoney), A = atténué (du vaccin, type LSc 2ab). Les anticorps selon l'invention peuvent être utilisés tels quels, dans les surnageants de culture, après séparation des hybrides cellulaires. Ces surnageants peuvent être conservés par congélation. Ils peuvent aussi être lyophilisés. On pèut également obtenir les anticorps à l'état purifié, notamment par précipitation à l'aide d'un agent, tel que le sulfate d'ammonium, susceptible de modifier la force ionique du milieu. Be caractère monoclonal des anticorps permet d'atteindre des concentrations élevées. Ces anticorps peuvent être l'objet de nombreuses applications. Par exemple, il est évident qu'un autre avantage considérable des anticorps monoclonaux est le fait qu'ils remplacent les animaux qui servent à produire les sérums hyperimmuns (lapin, cheval, veau, etc...). A la place des animaux qui coûtent très chers et demandent un endroit spécial pour la mise en stabulation et qui produisent des sérums de spécificité mediocre (mélanges d'anticorps inconnus et variables d'un animal à l'autre), l'invention permet de préparer des anticorps dans une culture de cellules au niveau du laboratoire. Ils peuvent aussi être utilisés pour laprépara- tion des colonnes de chromatographie d'affinité, par exemple pour la production du vaccin ; ou encore comme sonde immunologique pour la détection des polypeptides viraux dans la cellule bactérienne ou animale. Ce dernier cas concerne surtout la situation quand une copie du génome ARN du poliovirus où un segment du génome est inséré dans la cellule bactérienne ou animale par les méthodes de recombinaison de l'ADN. Les souches d'hybridomes appartenant à une batterie de souches préférées ont été déposées le 24 aout 1981 à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (C.N.C.M.) de INSTITUT PASTEUR sous les numéros (1) I-i?? 1-169 et I-171 , pour les souches produisant des anticorps monoclonaux respectivement actifs - contre à la fois LSc 2ab et Mahoney, - contre LSc 2ab seulement, - contre Mahoney seulement (2) I-170 , I-173 et I-172 , pour les souches produisant des anticorps monoclonaux respectivement actifs - contre à la fois P 712 CH 2ab et WF 1, - contre P 712 CH 2ab seulement - contre MEF 1 seulement (3) 1-174 , I-175 et I-176 , pour les souches produisant des anticorps monoclonaux respectivement actifs - contre à la fois Leon 12a1b et Saukett, - contre Leon 12alb seulement, - contre Saukett seulement. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagé ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes. REVENDICATIONS 1 - Batterie d'anticorps monoclonaux pour le diagnostic et l'identification de poliovirus, caractérisée par trois groupes d'anticorps à l'égard de poliovirus, appartenant respectivement aux sous-types sérologiques (1), (2) ou (3), les anticorps monoclonaux de chaque groupe se répartissant en - une première catégorie d'anticorps actifs, mais ne pré sentant pas de différenciation intratypique, - une deuxième catégorie d'anticorps actifs contre les souches atténuées, mais essentiellement dépourvus d'ac tivité à l'égard des souches sauvages correspondantes, - une troisième catégorie d'anticorps actifs contre la souche sauvage appartenant au sous-type sérologique considéré, mais essentiellement dépourvus d'activité à l'égard des souches atténuées correspondantes. 2 - batterie d'anticorps monoclonaux selon la revendication 1, caractérisée en ce que les anticorps appartenant aux première et deuxième catégories dans chacun des groupes susdits sont respectivement actifs contre - la souche LSc 2ab, - la souche P 712 CH 2ab, - la souche Leon î2aîb. 3 - Batterie d'anticorps monoclonaux selon la revendication 1, caractérisée en ce que les anticorps appartenant aux première et troisième catégorie dans chacun des groupes susdits sont respectivement actifs contre - la souche Mahoney, - la souche MEF 1, - la souche Saukett. 4 - Batterie d'anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 3, caractérisée en ce que, dans chacun des susdits groupes - les anticorps de la première catégorie présentent un index de neutralisation au moins égal à 2, tant vis-à vis de la souche atténuée que des souches sauvages, - les anticorps de la deuxième catégorie présentent un index de neutralisation au moins égal à 2 à l'égard de souches atténuées et un index de neutralisation pratique ment nul à l'égard des souches sauvages, - les anticorps de la troisième catégorie présentent un index de neutralisation au moins égal à 2 à l'égard des souches sauvages et un index de neutralisation pratique ment nul à l'égard des souches atténuées. 5 - Batterie selon la revendication 4, caractérisée en ce que les index de neutralisation non nuls, témoignant de l'activité des anticorps vis-à-vis d'un type ou sous-type déterminé de poliovirus, sont au moins égaux à 3. 6 - Batterie d'hybrides cellulaires pour la production des groupes d'anticorps monoclonaux selon les revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'ils sont formés par des hybrides cellulaires résultant de la fusion des cellules d'une lignée myélomateuse et de cellules immunocytes, notamment de rates d'animaux, respectivement vaccinés au préalable contre des poliovirus atténuées, d'une part, sauvages, d'autre part, provenant de cultures des trois types correspondants. 7 - Batterie d'hybrides cellulaires selon la revendication 6, caractérisée par trois groupes de lignées aptes à respectivement secréter des anticorps actifs à l'égard de virus appartenant aux types (1), (2) et (3) > et caractérisée en ce que (1) le premier groupe comprend trois catégories d'hybrides respectivement capables de produire des anticorps - actifs à la fois contre les souches LSc 2ab et Mahoney, - actifs contre la souche LSc 2ab, mais inactifs contre la souche Mahoney, - actifs contre la souche Mahoney, mais inactifs contre la souche LSc 2ab ;; (2) le deuxième groupe comprend trois catégories d'hybrides respectivement capables de produire des anticorps - actifs à la fois contre les souches P 712 CH 2ab et MEF 1, - actifs contre la souche P 712 CH 2ab, mais inactifs contre la souche MEF 1, - actifs contre la souche MEF 1, mais inactifs contre la souche P -712 CH 2ab (3) le troisième groupe comprend trois catégories d'hybrides respectivement capables de produire des anticorps - actifs à la fois contre les souches Leon 12alb et Saukett, - actifs contre la souche Leon 12alb, mais inactifs contre la souche Saukett, - actifs contre la souche Saukett, mais inactifs contre la souche Leon 12alb. 8 - Procédé d'obtention d'une batterie-d'hy- brides cellulaires susceptibles de zoner respectivement une batterie d'anticorps conformes à la revendication 7, caractérisé par les étapes qui consistent - à immuniser des animaux respectivement contre des virus appartenant aux trois types principaux (1), (2) et (3) et, à l'intérieur de chacun de ces types, à d'une part, une souche sauvage et, d'autre part, à une souche atténuée-; à à prélever sur les animaux les cellules immunocytes, de préférence les cellules de la rate et à les mettre en culture ;; à à fusionner les cellules de ces cultures avec des cel lules d'une lignée myélomateuse ou analogue, propres à former des lignées d'hybrides cellulaires avec les précédentes, séparables des cellules myélomateuses non fusionnées, et à récupérer des clones cellulaires individualisés résultant de la fusion ;; à à incuber ces clones cellulaires et à tester la capa cité de leurs surnageants respectifs à inhiber l'effet cytopathogène de cultures de virus homologues dans des essais de séroneutralisation, à à recueillir et à répartir en groupes les cultures d'hybrides cellulaires recueillies par types, selon les activités des anticorps qu'ils sont susceptibles de produire à l'égard des trois types de virus homologues considérés et, à l'intérieur de chaque groupe, par catégories d'hybrides cellulaires, en fonction de l'actifs vité des anticorps qu'ils sont susceptibles de produire à l'égard des souches respectivement atténuées et sauva ges homologues correspondantes, - à sélectionner et récupérer dans chaque groupe et dans chacune des deux catégories correspondantes, dans des essais répétés de séroneutralisation de cultures cellu laires sensibles, en présence, d'une part, de virus sau vages et, d'autre part, de virus atténués appartenant tous deux au même type, ceux des clones qui inhibent (1) à la fois le virus sauvage et le virus inactivé, (2) le virus sauvage, à l'exclusion des virus atténués, (3) le virus atténué, à l'exclusion des virus sauvages. 9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que les tests de séroneutralisation susdits sont réalisés sur des cultures de cellules sensibles en présence de doses de virus de 102 à 107 DCP 50 de virus homologues et que, dans l'épeuve de sélection finale, on recueille dans chacun des groupes considérés les clones qui produisent respectivement - les anticorps monoclonaux d'une première catégorie qui présentent un index de neutralisation au moins égal à 2, de préférence supérieur à 3, tant vis-à-vis de la souche atténuée que de la souche sauvage correspondante, - les anticorps monoclonaux d'une deuxième catégorie qui présentent un index de neutralisation au moins égal à 2, de préférence supérieur à 3, à l'égard de la souche atténuée, et un index de neutralisation pratiquement nul vis-à-vis de la souche sauvage, - les anticorps monoclonaux d'une troisième catégorie, qui présentent un index de neutralisation au moins égal à 2, de préférence supérieur à 3, à l'égard de la souche sauvage, et un index de neutralisation pratiquement nul vis-à-vis de la souche atténuée. 10 - Application des anticorps monoclonaux sur l'une quelconque des revendications 1 à 9 à un diagnostic relatif au caractère atténué ou sauvage d'une souche inconnue nouvellement isolée, caractérisée par les étapes qui consistent - dans une première étape, en des essais de séroneutra lisation de cultures de cellules sensibles en présence respectivement des trois anticorps monoclonaux de "première catégorie" des trois groupes susdits, le virus isolé étant présumé comme appartenant aux premier, second ou troisième type, selon que le virus isolé est inhibé par l'anticorps appartenant aux susdits premier, deuxième et troisième groupes susdits, et - dans une seconde étape, en des essais de séroneutrali sation répétés dans des conditions semblables vis-à vis d'anticorps respectivement de "deuxième catégorie et "troisième catégorie1, du groupe correspondant au type déterminé dans les premiers essais de séroneutra lisation, le virus isolé étant présumé comme apparte nant à une souche atténuée ou sauvage, selon qu'il est inhibé par les anticorps de "deuxième catégorie" ou par les anticorps de "troisième catégorie