FR 2508766 A1 19830107 FR 8113118 A 19810703 La présente invention est relative à une nouvelle substance antifongique obtenue à partir d'une souche de Bacillus subtilise La souche de Bacillus subtilis productrice de cette substance antifongique est déposée à 1'Institut Pasteur sous le no Elle présente les caractéristigues de la famille de bacillaceae, du genre Bacillus subtilis, décrit dans Bergeys manual of determinative bacteriology, 8ème édition, P 531. Morphologie gros bacille à bouts carrés avec parfois endospore, prenant la coloration de Gram. A l'état frais, le germe est mobile; sur milieu solide gélosé, les colonies sont plates, sèches, du type "rough", grisâtres. Parfois, un pigment grisâtre diffuse dans la gélose. Sur milieu liquide, la culture aérobie-anaérobie facultative développe un voile, puis un dépôt grisâtre. La température optimale de croissance est de 330C. Biochimie : Les principaux sucres sont fermentés (glucose, galactose, saccharose). Le lactose n'est pas fermenté. Pas d'uréase - Indole négatif. La gélatine est liquéfiée. La nouvelle substance antifongique selon la présente invention, qui est appelée Bacillomycine F, est caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes 1 - Couleur et état physique : poudre incolore; 2 - Point de fusion : F = 2430C; 3 - Caractéristiques chromatographiques = = 0,47 dans chloroforme-raéthanol-eau (65:25:4) RF = 0,63 dans diméthylformamide-eau-chloro forme (44:6:50) 4 - Réactions colorées : réaction positive au réactif de Pauly et à la rhodamine. : réaction négative à la ninhydrine. 5 - Absence de migration électrophorétigue à pH = 8,0 et à pH = 4,0. 6 - Le spectre IR présente des bandes caractéristiques à 3,0-3,1; 6,1 et 6,5-6,6 m. 7 - Le spectre UV effectué dans méthanol à 95 % présente deux maxima, l'un à 203 nm, l'autre à 275 nm. 8 - Solubilité : soluble dans l'éthanol à 95 Oc, insoluble dans le propylène glycol. L'analyse de la substance selon la présente invention a montré que cette substance, bien qu'elle soit homogène dans ses caractéristiques (telles que valeurs de Rf), est en fait un mélange de plusieurs constituants dont le constituant majoritaire répond à la formule les autres constituants ne différant de celui-ci que par la longueur ou par la position de la ramification de la chaîne lipidique (c'est-à-dire que la partie peptidique cyclique est la mem. La nouvelle substance antifongique selon la présente invention peut être obtenue par culture de la souche de Bacillus subtilis dans les conditions habituelles de culture des souches de Bacillus subtilis. Elle est isolée du milieu de culture par acidification et extraction du précipité formé par le méthanol ou l'éthanol. On décrira ci-après plus en détail des conditions permettant d'obtenir la nouvelle substance antifongique, ainsi que les caractéristiques de cette substance. I - Conditions de culture Les précultures sont effectuées dans un milieu renfermant 37 g/l de "coeur-cervelle" (Bio Mérieux) pendant 15 heures à 33 0C. Elles sont utilisées pour l'ensemencement des cultures dans un rapport de volume 1/1 0. La culture est effectuée pendant 5 jours à 330C, sous agitation, soit sur milieu synthétique, soit sur milieu semi-synthétique renfermant de l'extrait de le vure. Les meilleurs rendements ont été obtenus avec les milieux suivants 1) Milieu synthétique : D glucose 20 g; acide Lglutamique 5 g; MgSO4 0,5 g; KCl 0,5 g; KH2P04 1 g; Fe2(S04)3 1,2 mg; MnS04 0,4 mg; CuSO4, 5H20 1,6 mg pour 1 1, pH 7,2 ajusté avec NaOH. 2 - Milieu semi-synthétique : saccharose 100 g; acide citrique 11,7 g; Na2SO4 7 g; extrait de levure 5 g; (NH4)2 H P04 4,2 g; KCl 0,76 g; MgCl2, 6H20 0,42 g; ZnCl2 10,4 mg; FeCl31 6H20 24,5 mg; MnCl2, 4H20 18 mg pour 1 1, pH 6,8 ajusté avec NH4OH. II - Extraction de la substance antifongique du milieu de culture La substance antifongique brute est obtenue après acidification par HCl 12 N jusqu'd pH 2 soit du milieu de culture renfermant les bactéries, soit du milieu de culture après élimination des bactéries par centrifugation. Dans les deux cas, il se forme un précipité qui est récupéré par centrifugation. Ce précipité est traité différemment selon le mode de précipitation. 1) Précipité obtenu à partir du milieu de culture renfermant des bactéries Le précipité est extrait directement sous agitation pendant 24 heures par l'éthanol à 95 % (1 litre d'éthanol par litre de culture). Cette extraction est répétée deux fois. Les extraits éthanoliques sont alors concentrés et séchés (rendement : 1,9 g d'extrait par litre de milieu). Cet extrait présente une activité antifongique sur Penicillium chrvsoqenum, 2) Précipité obtenu à partir du milieu de culture après élimination des bactéries Le précipité est mis en suspension, neutralisé et lyophilisé (rendement : 1,7 g/litre de milieu). Le lyophilisat est extrait successivement, par l'acétone, puis par le méthanol, sous agitation, deux fois pendant 24 heures. Les extraits sont concentrés sous vide et leur activité antifongique est recherchée sur Penicillium chrysogenum. Seul, l'extrait méthanolique renferme l'activité (rendement: 500 mg/litre de milieu). III - Purification de la substance antifongique Les extraits éthanoliques ou méthanoliques peuvent être purifiés soit par chromatographie sur colonne d'acide silicique Bio Sil HA 325 mesh, soit sur colonne d'alumine 90 (activité II-III, 70-230 mesh). On dépose 1 g d'extrait sur 100 g d'adsorbant. - Dans le premier cas, l'élution se fait par un gradient discontinu de méthanol dans le solvant hexanechloroforme-méthanol (25:45:10). Le produit est élué par le solvant hexane-chloroforme-méthanol (25:45:26). - Dans le deuxième cas, l'élution se fait par le chloroforme, puis par un gradient discontinu de méthanol dans le chloroforme. Après passage de chloroforme, puis du mélange chloroforme-méthanol (8:2), le produit est élué par le mélange chloroforme-méthanol (6:4). On obtient un produit coloré en jaune clair, sa pureté peut être évaluée à environ 90 %. En vue d'une étude structurale une purification ultérieure a été effectuée par chromatographie préparative sur couches minces de gel de silice dans le solvant chloroforme-méthanol-eau (65:25:4). Le produit est élué du gel par le solvant chloroforme-méthanol (2:1), puis reprécipité dans le méthanol, le précipité est lavé deux fois par le méthanol et séché. Rendement en produit pur : 50 mg par litre de milieu. Il faut noter qu'il existe d'autres possibilités de purification, en particulier la reprécipitation en milieu alcoolique, méthanol ou éthanol,du produit brut. IV - Caractéristiques de la substance obtenue Ce sont celles indiquées précédemment. Le spectre IR qui est représenté sur la Fig. 1 présente les bandes caractéristiques de la liaison peptidique à 3,0-3,1, 6,1 et 6,5-6,6 m. Le spectre UV effectué dans méthanol 96 % présente deux maxima, l'un à 203 nm (= 25 200), l'autre à 275 nm (e= 920). Il est représenté sur les Fig. 2 et 3 avec des concentrations différentes. Le produit provenant de la chromatographie sur colonne (pureté 90 %) est soluble dans l'éthanol 95, le mélange éthanol à 95%-eau (1:1), (1:2) et donne une solution opalescente dans l'éthanol à 95%au (1:3). Il est insoluble dans le propylène glycol et le mélange propylène glycol-eau (1:1) et donne une solution opalescente dans propylène glycol-eau (1:2). V - Composition de la substance antifongique (Bacillo mycine F) L'hydrolyse par HCl 6 N, 8 h à 1500C donne une fraction liposoluble et une fraction hydrosoluble. A - Fraction hydrosoluble Elle est constituée de 5 acides aminés qui ont été identifiés par chromatographie sur couches minces de cellulose dans différents solvants. Ce sont les acides aminés suivants : acide aspartique, acide glutamique, thréonine, proline, tyrosine. L'analyse quantitative a été faite après formation des N-heptafluorobutyl n-butylesters et chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire de silicone SE 30 avec programmation de température. Les résultats obtenus donnent la formule brute suivante Asp31 Glu1, Pro1, Thr1, Tyr 1) Configuration des acides aminés Les configurations optiques ont été déterminées par des méthodes enzymatiques avec la D-aminoacide oxydase pour Pro, Thr et Tyr, la L-glutamate décarboxylase pour Glu et la 2-oxogutaate-aminotransférase pour Asp. Les acides aminés- sont dosés avant et après action de l'enzyme. Les résultats sont D-Asp2, L-Asp1, L-Glu1, L-Thr11 L-Pro1, D-Tyr1. 2) Détermination de la chaine peptique par coupure a) Action du N-bromosuccinimide 63 mg de Bacillomycine F dans 6,3 ml d'acide acétique 70 % sont traités par 63 mg de N-bromosuccinimide 2 heures à température ambiante. On arrete la réaction par addition de quelques gouttes d'acide formique. On évapore sous vide. Le produit est purifié par chromatographie sur colonne d'acide silicique Bio Sil HA 325 mesh. Le solvant d'élution est le mélange chloroforme-méthanoleau (65:25:4). L'oxydation de la Bacillomycine F par le N-bromosuccinimide coupe la chaine au niveau du résidu tyrosyle et donne un nouveau peptide avec un acide aminé N-terminal. Il donne une réaction positive à la ninhydrine. b) Détermination de la séquence peptidique La séquence N-terminale est faite par la méthode d'Edman suivant la technique de Tarr appliquée à des microquantités. A chaque dégradation, l'acide aminé est identifié sous forme de phénylthiohydantolne (PTH) par chromatographie sur couches minces de gel de silice 60F254 dans le solvant chloroforme-méthanol(95:5) pour les PTH de la tyrosine et de la proline et avec le solvant chloroforme-méthanol (85:15) pour les PTH de l'asparagine , de la glutamine et de la thréonine. Après chaque cycle de dégradation la composition en acides aminés du peptide résiduel est déterminée. Les résultats sont présentés dans le tableau I. T A B L E A U I Résultats des dégradations d'Edman PTH Composition en acides &alpha; aminés (rapports molaires) acide aminé Asp Glu Pro Thr Tyr Peptide initial 2,9 0,9 1,2 0,8 forme osycée 1ère dégradation Asn 2,0 0,8 1,2 0,8 2ème dégradation Gln 2,0 0,3 1,2 0,8 3ème dégradation Pro 2,0 0,3 0,4 0,8 4ème dégradation Asn 1,0 0,2 0,2 0,8 5ème dégradation Thr 1,0 0,2 0,2 0,2 La séquence de ce peptide est donc la suivante Asn # Gln # Pro # Ans # Thr # acide ss aminé # (Asp,Tyr oxydée) Bien que la dégradation d'Edman ne permette pas de démontrer la séquence acide ss aminé # Asp # Tyr la coupure de la liaison peptidique du COOH de Tyr, spécifique du N-bromosuccinimide, implique cette séquence. c) Hydrolyses partielles de la Bacillomycine F Deux peptides sont obtenus après hydrolyse partielle . Le peptide P1 est obtenu après hydrolyse à 1050C par HCl 6N pendant 15 heures et le peptide P2 après hydrolyse à 1050C par HCl 6N pendant 1 heure. Ils sont purifiés par chromatographie sur couches minces préparatives de gel de silice dans le solvant chloroforme-méthanol-eau (65:25:4). La révélation est faite soit par la nihydrine, soit par le réactif de Pauly spécifique des groupements tyrosyles libres. L'acide aminé N-terminal est déterminé sous forme de dinitrophényl-dérivé et l'acide aminé C-terminal est identifié après hydrazinolyse par chromatographie sur couches minces. Les résultats sont donnés dans le tableau Il. T A B L E A U I I RF et composition des peptides liposolubles P1 et P2 RF dans Détection Acide Composition en acides &alpha; aminés chloroforme- par le (rapports molaires) Peptide méthanol- réactif ss aminé eau de Pauly Asp Glu Pro Thr Tyr (65:25:4) P1 0,29 - 1 1,0 P2 0,56 + 1 1,0 0,8 0,8 Le peptide P1 a pour acide aminé N-terminal la thréonine. Après une dégradation d'Edman on obtient les acides B aminés. Il a donc la séquence LThr acidess aminé. Le peptide P2 a pour acide aminé N-terminal la thréonine. L'acide aminé C-terminal est la tyrosine. La configuration de Asp est faite sur un hydrolysat du peptide P2, elle est L. La séquence Thr acides aminé étant déjà établie, le peptide P2 est donc LThr + acidess aminé + LAsp + DTyr. L'ensemble des résultats précédents permet d'écrire la séquence suivante DAsn + LGln # LPro + DAsn # LThr + acide ss aminé + LAsp DTyr. 3) Structure cyclique L'absence de carboxyle a été démontrée par électrophorèse à pH 8,2 et par méthylation de laB acillomycine F par le diazométhane gazeux. En effet par électrophorèse à pH 8,2 il n'y a pas de migration du produit et après méthylation on obtient un seul dérivé méthylé correspondant à la méthylation de l'hydroxyle de la tyrosine. L'absence de NH2 libre a été démontrée. Après dinitrophénylation du produit par le 2,4 dinitrofluorobenzène puis hydrolyse, on obtient uniquement de la O-Dnp tyrosine. D'autre part, l'absence de fonctions ester a été démontrée après oxydation chromique . La disparition de la thréonine et de la tyrosine indique que ces deux acides aminés ont leur hydroxyle non substitué. L'ensemble de ces résultats indique une structure cyclique pour la molécule de Bacillomycine F et l'absence de résidu aspartyle ou glutamyle dans la channe peptidique. La structure proposée est donc la suivante B - Partie liposoluble La partie lipidique est analysée par chromatographie sur couches minces de gel de silice 60 dans chloroforme-méthanol-eau (65:25:4). On observe un composé révélable à la ninhydrine de R F 0,63 identique aux acides aminés déjà identifiés dans les antibiotiques peptidolipidiques du groupe de l'iturine. La structure de ces acides -aminés a été étudiée après formation des N-acétyl méthylesters et chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire de silicone WCOT SE 30 à 1400C couplée avec la spectrométrie de masse. Le chromatogramme obtenu renferme deux pics principaux X2 (58 %), X5 (23 ) et trois pics de plus faible intensité X1 (6 %), X3 (3 %) et X4 (10 %). L'étude des spectres de masse et des temps de rétention a permis de conclure aux structures suivantes X1 : est l'acide 3-amino 12-méthyl tétra décanoique X2 : est l'acide 3-amino 14-méthyl penta décanoique X3: est l'acide 3-amino hexadécanoique X4 : est un acide en C17 X5 : est l'acide 3-amino 14-méthyl hexadécanoïque. On donnera ci-après les résultats d'une étude de l'activité de la substance antifongique selon l1in- vent ion ou Bacillomycine F sur divers moisissures et levures. Ces résultats sont rassemblés dans le tableau III. T A B L E A U I I I Activité antifongique mesurée par la méthode de dilution dans la gélose* après trois jours, ou cinq jours pour les champignons phytopathogènes (phyt), d'incubation à 28C. C O N C E N T R A T I O N ( g/ml) 0 1 2 4 5 8 10 20 40 80 160 320 Champignons Aspergillus niger ++ ++ ++ ++ # - - Botrytis cinerea (phyt.) ++ + + # - - - Fusarium oxysporum (phyt.) ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + Mycosphaerella pinodes (phyt.) ++ + # - - - - Neurospora crassa ++ ++ ++ ++ + # - Penicillium chrysogenum ++ ++ + # ~ - - Pleospora herabarum (phyt.) ++ + # - ~ - - Rhodotorula pillimanae ++ ++ ++ ++ + # - Sclerotinia fructigena (phyt.) ++ ++ + + # - - Sclerotinia sclerotinum (phyt) ++ ++ + + # # - Stemphylium radicinum (phyt.) ++ ++ ++ ++ ++ + + Trichophyton mentagrophytes ++ ++ # Levures Candida albicans ++ ++ + # Candida tronpicalis ++ ++ ++ + + # - Saccharomyces cerevisiae ++ ++ ++ ++ + - # - - - * Pour S. cerevisiae, l'activité a été déterminée après 17 heures d'incubation à 28 C. ++ pas d'inhibition ++ croissance normale + faible inhibition ou + croissance nettement diminuée # forte inhibition # très faible croissance - inhibition totale - croissance nulle Ainsi, la Bacillomycine F peut être utilisée pour lutter contre les champignons dans différents milieux tels que par exemple les eaux des circuits de refroidissement. La Bacillomycine F peut en général être Jncorpo- rée à raison de 0,001 à 10 % en poids selon l'usage spécifique envisagé. Deplus, la Bacillomycine F présente une faible toxicité. Ainsi, par administration intrapéritonéale chez la souris, on n'observe aucune mortalité à la dose de 10 mg/kg. En conséquence, la Bacillomycine F peut être utilisée en particulier en thérapeutique pour lutter contre, notamment, les affections mycosiques des tégumentis, muqueuses, phanères. L'application se fait alors par voie externe à l'aide de formes galéniques adaptées, telles que crèmes ou laits dermiques, pulvérisations ou lotions. La concentration en principe actif peut alors varier de 0 > 1 à 1 % en poids, selon la forme pharmaceutique. La substance antifongique selon la présente invention peut également être utilisée pour lutter contre le développement des champignons phytopathogènes sur les plantes cultivés. REVENDICATIONS 1. Substance antifongique caractérisée par lespropriétés suivantes 1 - Couleur et état physique : poudre incolore: 2 - Point de fusion : F = 2430C; 3 - Caractéristiques chromatographiques : RF = 0-,47 dans chloroforme-méthanol-eau (65:25:4); RF = 0,63 dans diméthylformamide-eau-chloroforme (44:6:50); 4 - Réaction colorée : réaction positive au réactif de Pauly et à la rhodamine, réaction négative à la ninhydrine; 5 - Absence de migration électrophorétique à pH : 8,0 et à pH : 4,0; 6 - Le spectre IR présente des bandes caracté- ristiques à 3,0-3,1, 6,1 et 6,5-6,6 m; 7 - Le spectre UV effectué dans l'éthanol à 95 % présente deux maxima, l'un à 203 nm, l'autre à 275 nm; 8 - Solubilité : soluble dans éthanol à 95 % insoluble dans le propylène glycol. 2. Substance antifongique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend comme constituant majoritaire 3. Substance antifongique selon la revendication 2, caractérisée en ce que les autres constituants pos sèdent la même partie peptidique et ne diffèrent que par la n a t u r e de la channe lipidique. 4. Procédé d'obtention de la substance antifongique selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on cultive une souche de Bacillus subtilis productrice de la substance antifongique et l'on isole la substance du milieu de culture. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la substance est isolée par acidification et extraction du précipité formé par le méthanol ou l'éthanol. 6. Utilisation d'une substance antifongique telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour lutter contre les champignons. 7. Composition pharmaceutique ayant une activité antifongique, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif une substance selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.