FR 2509177 A1 19830114 FR 8200510 A 19820114 La présente invention concerne un vaccin pour poissons et son procédé de préparation. Plus particulièrement l'invention concerne des vaccins contre Vibrio anguillarum et d'autres vibrions très proches et son procédé de préparation. L'invention a été réalisée dans le cadre d'un contrat fédéral NOAA Sea Grant nO NA79AA D-00054. Un obstacle majeur du succès de la pisciculture ou de l'aquiculture est la maladie. La vibriose est une maladie dont le taux de mortalité est particulièrement élevé qui atteint les saumons (salmonidés) et de nombreuses autres espèces de poissons anadromes et catadromes (1). Cette maladie est due à une infection à Vibrio anguillarum et à d'autres vibrions très proches. Cette maladie est caractérisée par une septicémie hémorragique et elle s'accompagne d'une destruction massive de cellules et de tissus de types divers (2). Bien qu'on ait souvent tenté de mettre au point un vaccin efficace contre cette maladie, les résultats ont été décevants. Plus particulièrement, les tentatives de protection contre les formes les plus virulentes de Vibrio anguillarum ont soit échoué soit eu un succès très limité (3), (4). L'invention a pour objets un vaccin amélioré contre Vibrio anguillarum et d'autres vibrions très proches un procédé amélioré pour préparer un vaccin contre Vibrio anguillarum et d'autres vibrions très proches ; et un vaccin contre Vibrio anguillarum et d'autres vibrions très proches qui est très efficace contre beaucoup des couches virulentes. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description qui suit faite en regard des dessins annexés dans lesquels - la figure 1 est un graphique de la cinétique de la fixation du fer radio-actif par des cellules ne se multipliant pas de Vibrio anguillarum dans des conditions de restriction en fer ; et - la figure 2 est une reproduction photographique illustrant la gamme des concentrations en chlorure de fer dans laquelle la production de protéines de surfaces spécifiques de Vibrio anguillarum est induite. De façon très générale, une forme du procédé de l'invention consiste à cultiver des cellules exprimant la protéine OM2 de 86 000 daltons qui est présente dans la membrane ex térieure de Vibrio anguillarum cultivé avec une restriction en fer. Ces cellules peuvent être soit Vibrio anguillarum soit des cellules hôtes non pathogènes ayant un ADN susceptible de rêplication codant pour au moins une portion importante de la protéine OM2. Ensuite, les cellules sont soit atténuées soit tuées et utilisées comme vaccin ou la protéine OM2 est isolée des cellules et utilisée comme vaccin. On a montre que la virulence de Vibrio anguillarum est associée à la présence d'unplasmide particulier dans l'agent pathogène (5). Ce type spécifique de plasmide est absent des souches à faible virulence (6). L'association de ce type de plasmide spécifique et de la virulence de Vibrio anguillarum a été établie (7). On a de plus signalé des preuves établissant que le plasmide de virulence de Vibrio anguillarum détermine un système très efficace de séquestration du fer (7). Ceci permet à la bactérie de survivre dans des conditions de disponibilité limitée du fer. De ce fait les bactéries peuvent survivre et se développer bien qie les mécanismes de défence de l'hâte provoquent une liaison du fer aux protéines transferrine et lactoferrine. On a indiqué que beaucoup de souches virulentes de Vibrio anguillarum du biotype I isolées dans la région nordouest des Etats-Unis bordant le Pacifique hébergent un plasmide spécifique de type pJMl qui est absent des souches à faibles virulence (5). Des expériences suggèrent que la virulence est associée à ce type particulier de plasmide. Le mécanisme de la virulence semble être la capacité que présentent les souches virulentes contenant le plasmide, à fixer le fer bien que les mécanismes de défense du poisson hotte infecté produisent de la transferrine et de la lactoferrine pour fixer le fer (6). Comme Vibrio anguillarum contenant ce plasmide est capable de se développer dans des conditions de restriction en fer, en récupérant le fer uni à une protéine fixant le fer, les bactéries envahissantes sont capables de proliférer dans les humeurs et les tissus. On a découvert que les souches de Vibrio anguillarum qui sont caractérisées par le système de fixation à médiation plasmidique ont certaines protéines de membrane extérieure spécifiques dont au moins une est produite lorsque le plasmide de virulence est présent. Ces protéines de la membrane extérieure semblent être associées à la fonction de fixation du fer. I1 semble que ces protéines de la membrane extérieure forment un récepteur pour le sidérophore ferrique (composés fixant le fer produits par les bactéries) nécessaire à son transport dans la cellule. L'analyse des protéines de la membrane extérieure présentes dans Vibrio anguillarum contenant les plasmides de virulence, montre qu'au moins deux protéines de membrane extérieure sont induites dans des conditions de culture où la teneur en fer est limitée å certaines valeurs. Une de ces protéines, appelée 0012, a un poids moléculaire de 86 000 daltons et est associée à la présence du plasmide pJMl. Bien que cette protéine ne soit présente que dans les souches contenant le plasmide, on ne sait pas de façon certaine si le plasmide code pour cette protéine et si elle est induite en réponse à une baisse de la concentration en fer, ou s'il s'agit d'un produit d'origine chromosomique. La seconde protéine détectée dans la membrane extérieure a été appelée OM3 et a un poids moléculaire de 79 000 daltons. L'association de cette protéine et du plasmide pJMl demeure obscure. Selon l'invention, on prépare le vaccin à partir de cultures de cellules cultivées de telle sorte que la protéine OM2 soit exprimée. De préférence ces cellules sont des cellules de Vibrio anguillarum cultivées avec une restriction en fer suffisante pour induire l'expression de la protéine OM2. Cependant on peut également produire la protéine par production d'une cellule hôte ayant un ADN susceptible de replica- tion codant pour au moins une portion importante de la pro téine OM2. Les techniques de recombinaison d' ADN sont bien connues de l'homme de l'art et peuvent être utilisées pour produire de telles cellules hâtes. Dans les deux cas, on atténue ou tue ensuite les cellules et on les utilise comme vaccins ou on isole la protéine OM2 des cellules et on l'utilise comme vaccin.Par exemple on a étudié de la façon suivante des souches de Vibrio anguillarum dont certaines contiennent le plasmide de virulence et certaines sont des dérivés peu virulents de souches portant le plasmide Corrélation entre la fixation du fer, la présence du plasmide et la virulence de souches de Vibrio anguillarum Souche de Présence du Fixation de Vibrio plasmide de 55 b c anguillarum virulence a Fe 50 (cpm/min) 775 (pJMl) + 11 500 1,0 x 133S (pJMl) + 12 000 1,3 x 103 LS174 (pJMl) + 15 000 5,0 x 10 LS174-WTI - 700 2,0 x 107 H775-3 - 550 3 x H775-8 - 450 2,5 rl06 E775-100 - 600 2 x 10 a L'ADN du plasmide a été déterminé selon une méthode d' électrophorèse sur agarose comme décrit en (6). b Les valeurs ont été obtenues à partir d'expériences ci nétiques semblables à celles illustrées par la figure 1, par détermination du rapport 55Fe cpm/temps au point 20 minutes. DL50 déterminées comme décrit ci-dessous. Comme le montre le tableau, on a étudié la capacité de fixation du fer et la dose létale moyenne des souches particulières. La mesure de la fixation du fer a été effectuée de la façon suivante On cultive les souches bactériennes pendant plusieurs gé nérations à 220C dans un milieu minimal à faible teneur en fer (14) (teneur en fer 2 uM) additionné de 0,5% (p/v) de glucose et des amino-acides nécessaires, d'acide aspartique et d'histidine à 20 ug/ml. On centrifuge les cultures en croissance exponentielle, on lave les cellules et on les remet en suspension à la densité de 0,4 x 108 cellules/ml dans un milieu semblable si ce n'est que la teneur en fer est alors inférieure à 0,5 M de fer. Après une nouvelle incubation de 2 heures à 250C pour épuiser les réserves intracellulaires de fer, on centrifuge les cultures, on lave les cellules et on les remet 8 en suspension à une densité de 4 x 108 cellules/ml dans un mi- lieu semblable dépourvu d'amino-acides essentiels mais 100 pM en nitrilotriacétate de sodium. Dans certaines expériences,on ajoute à ce stade 2 St de KCN (inhibiteur respiratoire).On ajoute en agitant aux suspensions cellulaires du 55fez13 sans support (1 uCi/ml), on prélève des échantillons de 1 ml à divers intervalles et on les filtre sur des membranes filtrantes Millipare (taille des pores : 0,45 um). On lave les filtres avec du citrate de sodium 100 mEI, on sèche et on compte avec un compteur à scintillation liquide Packard-TriCarb avec un cocktail de scintillation à base de toluène contenant de l'Omnifluor (New England Nuclear) à 4 g/l. Pour déterminer si la capacité des souches de Vibrio anguillarum à forte virulence porteuses de plasmide dans des conditions de restriction en fer est due à un système efficace de fixation du fer, on mesure directement la fixation du fer radio-actif par des cellules ne se multipliant pas. On cultive dans un milieu minimal environ 2 vM en FeC13 (concentration minimale en fer pour laquelle la souche H775-3 peut se développer) pendant plusieurs générations Vibrio anguillarum 775 portant le plasmide (pJM1) et le dérivé sans plasmide H775-3. On centrifuge les cultures en phase exponentielle, on lave les cellules avec un milieu à faible teneur en fer (teneur en fer inférieure à 0,5 vM) et on remet en suspension à la densité de 0,4 x 108 cellules/ml dans un milieu semblable ayant une teneur en fer inférieure à 0,5 vM. Après incubation dans ce milieu pour épuiser les réserves intracellulaires de fer, on centrifuge les cultures, on lave les cellules et on les remet en suspension à la densité de 4 x 108 cellules/ ml dans un milieu semblable dépourvu d'amino-acides essentiels mais contenant du nitrilotriacétate puis on les met en 55 présence de Fe comme décrit précédemment.La figure 1 et le tableau précédent montrent que dans les mêmes conditions de fixation, les cellules ne se multipliant pas de Vibrio anguillarum à grande virulence portant le plasmide 775 (pJMl), 133S (pJMl) ou LS174 (pJMl) fixent le fer radio-actif plus rapidement que le dérivé à faible virulence isogène sans plasmide H775-3. On obtient des fixations faibles semblables avec les autres dérivés à faible virulence sans plasmide figurant dans le tableau. Une information complémentaire relative au phénomène provoquant l'accumulation de fer a été obtenue par emploi de l'inhibiteur respiratoire qu'est le KCN. Un processus à dépendance énergétique de transport du fer à l'intérieur de la cellule est inhibé par le XCN tandis que la fixation du fer à la membrane bactérienne qui est sans dépendance énergétique n'est pas inhibée. La figure 1 montre que l'accumulation du fer par la souche portant le plasmide de Vibrio anguillarum 775 (pJMl) est fortement inhibée par 2 mM de KCN ce qui suggère que le processus est une fixation et non une simple liaison aux membranes bactériennes, bien que la présence de la petite quantité d'accumulation de fer sans dépendance énergétique (en présence de KCN) pourrait être due à un certain type d'association semblant également avoir une médiation plasmidique. Ces résultats montrent que la présence du plasmide de virulence dans Vibrio anguillarum implique une fixation du fer plus rapide et plus efficace. Cette observation explique la capacité de Vibrio anguillarum portant le plasmide à se développer en présence de chélateurs du fer. Pour effectuer une étude complémentaire de la présence d'un système de fixation du fer à médiation plasmidique dans Vibrio anguillarum, on a recherché si une protéine d'enveloppe cellulaire spécifique était induite dans les conditions de restriction en fer, comme c'est le 'cas des systèmes de fixation du fer de certaines antérobactéries. Pour cela on cultive Vibrio anguillarum 775 (pJMl) et son dérivé à faible virulence sans plasmide H775-3 dans un milieu minimal auquel on ajoute du fer sous forme de Fez13 à diverses concentrations. Dans certains cas on ajoute 3 pM de transferrine au milieu de culture. On prépare à partir des cellules cultivées dans ces diverses conditions les enveloppes cellulaires totales ainsi que les membranes extérieures et on les analyse par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide.Sur la figure 2 les pistes A à H montrent les enveloppes cellulaires totales des deux souches àdifférentes concentrations en FeC13 ; tandis que les pistes I et J montrent les protéines de la membrane extérieure obtenues à partir de cellules cultivées avec 2 uM de FeC13. Cinq protéines principales de la membrane extérieure (OM1-5) sont présentes dans les souches portant le plasmide cultivé avec 2 pM de FeC13. Une de ces protéines, 1'OM2, n' existe pas dans le dérivé sans plasmide. L'analyse des enveloppes cellulaires totales de la souche contenant le plasmide montre nettement qu'il existe un seuil de la concentration en Fez13 (en dessous de 4 vM) pour lequel 1'OM2 et 1'OM3 sont inductibles alors que ces protéines ne sont pas détectables à des concentrations en fer supérieures dans les souches portant le plasmide (pistes A-F). La piste A montre que comme prévu 1'OM2 et 1'OM3 sont présentes dans la souche portant le plasmide cultivée en présence de 3 uM de transferrine.Dans le cas de la souche sans plasmide, la protéine OM3 est la seule protéine induite à 2 pM de FeC13 (concentration minimale en fer permettant la croissance de cette souche) (comparer les pistes G, J et H). Donc les conditions de restriction en fer qui permettent une fixation très rapide du fer radio-actif par les souches portant un plasmide de Vibrio anguillarum induisent également la synthèse de deux protéines spécifiques de membrane extérieure OM2 et OM3 respectivement de 86 000 et 79 000 daltons (ces valeurs étant mesurées avec des protéines de poids moléculaire standard (non représentées). La protéine OM2 est associée à la présence du plasmide pJMl. Une synthèse élevée de la protéine OM2 dans les conditions de restriction en fer pourrait refléter l'accroissement du nombre des copies du plasmide de virulence dans ces mêmes conditions. Cependant ce n'est pas le cas. Le nombre des copies de plasmide déterminé en présence de transferrine et à diverses concentrations en fer (0,05-12 pm) indique qu'il n'y a pas de changement significatif du nombre des copies tandis que dans la même gamme des concentrations, on observe des modifications considérables de l'induction de la protéine OM2 (figure 2). Les résultats précédents démontrent que la protéine de surface OM2 et éventuellement la protéine de surface OM3 sont des facteurs caractéristiques du caractère virulent de l'agent pathogène correspondant. Donc leur présence est importante pour la formation d'anticorps en réponse à ces protéines chez une espèce de poisson hâte infectée. Les vaccins de l'art entérieur ne tiennent pas compte de ce fait. Par conséquent, on peut préparer des vaccins à partir de souches bactériennes exprimant cette protéine en atténuant ou en tuant les souches selon des techniques classiques s'il est nécessaire. Sinon on peut préparer des vaccins par purification de la protéine de surface elle-même pour l'utiliser comme agent vaccinal. On voit donc que des vaccins préparées selon l'invention confèrent une immunité plus précise contre les souches très virulentes de Vibrio anguillarum et d'autres vibrions très proches. Diverses modifications de l'invention en plus de celles ici illustrées et décrites découlent de façon évidente pour l'homme de l'art de la description précédente et des illustrations annexées. Par exemple on peut utiliser les produits ici décrits avec des produits dérivant d'autres sérotypes de vibrions pour conférer une immunité plus étendue. Ces modifications entrent dans le cadre des revendications. REFERENCES 1. Fryer et al., "Vibriosis in Fish;', Prog. Fish Food Sci., 5:129-131 (1972). 2. Harbell et al., "Studies on the Pathology of Vibriosis in Coho Salmon (Oncorhynchus kisutch)", J. Fish. Dis. 2:527-535 (1979). 3. Gunnels et al., "Failure of Vaccines to Protect Salmon from Vibriosis Enzootic in Puget Sound, Washington", Am. J. Vet. Res., 37:737-740 (1976). 4. Gould et al., "Immersion Vaccination of Sockeye Salmon (Oncorhynchus nerka) with Two Pathogenic Strains of Vibrio anguillarum", J. Fish Res. Board Can;, 36:222-225 (1979) 5. Crosa et al., "Evidence for Plasmid Contribution to the Virulence of the Fish Pathogen Vibrio anguillarum", Infect. Immun. 18:509-513 (1977). 6. Crosa et al., "Curing of a Plasmid is Correlated with an Attenuation of Virulence in the Marine Fish Pathogen Vibrio anguillarun", Infect. Immun. 27:897-902 (1980). 7. Crosa et al., " Plasmid Associated with Virulence in the Marine Fish Pathogen Vibrio anguillarum Specifies an Iron Sequestering System", Nature, 284:566-567 (1980) REVENDICATIONS 1. Procédé pour preparerAun vaccin contre Vibrio anguillarum et d'autres vibrions très proches, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver des cellules de Vibrio anguillarum avec une restriction en fer suffisante pour induire l'expression de la protéine de membrane extérieure OM2 de 86 000 daltons et à atténuer ou tuer ces cellules. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la teneur en fer du milieu de culture dans lequel on cultive les cellules est inférieure à environ 4 um 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ceque la protéine de membrane extérieure OM3 de 79 000 daltons est également exprimée. 4. Procédé pour préparer un vaccin contre Vibrio anguillarum et d'autres vibrions très proches, caractérisé en ce qu'il comprend la culture de cellules exprimant la protéine OM2 de 86 000 daltons qui est présente dans la membrane extérieure de Vibrio anguillarum cultivé avec restriction en fer. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que lesdites cellules sont des cellules de Vibrio anguillarum. 6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que lesdites cellules sont des cellules htes non pathogènes ayant un ADN susceptible de réplication codant pour au moins une portion importante de la protéine OM2. 7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on atténue lesdites cellules. 8. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on tue lesdites cellules. 9. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on isole la protéine OM2 des cellules. 10. Vaccin caractérisé en ce qu'on l'a produit selon la revendication 1. 11. Vaccin caractérisé en ce qu'on l'a produit selon la revendication 4.