FR 2498204 A1 19820723 FR 8101175 A 19810122 La présente invention concerne de nouvelles substances, un procédé d'obtention et leur application à titre d'agents antifongiques, ainsi que les compositions antifongiques les contenant. Les substances selon l'invention présentent un intérêt particulier par suite de leurs activités antifongiques sur les champignons, les levures et les algues. Les substances selon l'invention sont extraites du microorganisme Phoma Linqam Tode. Ce microorganisme existe sous une forme parfaite, qui est très difficile à observer et une forme imparfaite sexuée, la plus répandue. La forme parfaite apparait dans la nature chaque année lors de la reproduction, car son apparition est nécessaire pour sa dissémination à l'air. Mais, comme le sait l'homme de l'art dans le domaine des champignons, la forme parfaite et la forme imparfaite correspondent au même microorganisme. Ainsi, le microorganisme utilisé selon l'invention peut être dénommé Phoma Linqam Tode, forme imparfaite ,ou Leptosphaeria Maculans (Desm.) Ces et Not, pour sa forme parfaite. Une touche de microorganisme Phoma Lingam ou Leptosphaeria Maculans a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de microorganismes (C.N.C.M.) sous le nO I-144 le 17 octobre 1980. Dans la suite de la description, il sera fait référence au microorganisme Phoma Linqam mais il est bien entendu que l'on peut aussi utiliser le mycélium de la forme parfaite de ce microorganisme, à savoir Leptospheria Maculans. Le mycélium de Phoma Linqam est obtenu par culture de ce microorganisme sur un milieu de fermentation approprié, qui favorise la croissance mycélienne de ce microorganisme. Un tel milieu doit contenir des éléments de croissance et des sels minéraux. A titre d'exemple, le milieu de fermentation ayant la composition ci-après convient pour la croissance mycélienne de Phoma Linqam (NH4)2 C4H406 0,5 g ; NH4NO3 lg ; KP2 P04 lg , Mg S04, 7H20 0,5g CaC12 0,13 g ; NaCl 0,1 g ; saccharose 30 g ; extrait de levure Difco lg (q.s.p.l litre). Les cultures sont effectuées à l'obscurité et à la température ambiante, avantageusement dans des boites de Roux ou tout autre dispositif approprié du meme type. Les cultures sont effectuées jusqu'à ce qu'elles atteignent un pH de 6,0 à 65, ce qui correspond à environ 21 jours de culture statique sur le milieu défini ci-dessus. Il faut noter que les cultures en boites de Roux non agitées sont préférées, car les rendements en substances antifongiques sont plus faibles avec des cultures agitées. Le mycélium de Phoma Lingam est recueilli par filtration du milieu de culture par exemple sur étamine. Le gâteau de mycélium résultant est utilisé tel quel à titre de matière de départ dans le procédé selon l'invention. Un procédé pour l'obtention desdites substances consiste - à soumettre le mycélium de Phoma Lingam à une extraction alcoolique - à traiter ensuite le résidu alcoolique avec de l'acétate d'éthyle - à le reprendre ensuite avec du chloroforme - à soumettre la solution chloroformique résultante à une chromatographie sur gel de silice et - à récupérer les fractions actives après révélation biologique par exemple avec Penicillium Digitatum. La matière première mise en oeuvre dans le procédé selon l'invention est le mycélium du microorganisme Phoma Linqam Tode, forme imparfaite ou Leptosphaeria Maculans (Desm.) Ces et Not pour sa forme parfaite. Le procédé ci-dessus défini comporte trois extractions successives et une chromatographie sur gel de silice. Les extractions consistent en une première extraction à l'alcool, par exemple à l'éthanol à 950, puis une extraction du résidu alcoolique avec de l'acétate d'éthyle et ensuite une extraction avec du chloroforme, la fraction chloroformique étant ensuite chromatographiée sur gel de silice. Selon un mode opératoire préféré de l'invention, on met en oeuvre les étapes ci-après qui consistent (1) à broyer du mycélium de Phoma Lingam dans de l'éthanol à 950 ; (2) à filtrer et évaporer à siccité l'extrait alcoolique (3) à reprendre le résidu avec de l'eau et à l'acidifier jusqu'à pH 5,0 (4) à extraire la solution résultante avec de l'acétate d'éthyle (5) à évaporer à siccité sous vide à 50 C la fraction acétate d'éthyle résultante (6) à dissoudre le résidu résultant dans du chloroforme et à chromatographier la solution chloroformique ainsi obtenue sur du gel de silice et (7) à récupérer les fractions actives après révélation biologique. Selon ce mode opératoire, la chromatographie est avantageusement réalisée avec un gradient linéaire de chloroforme et du mélange acétate d'éthyle/méthanol (1/1 en volume), le gradient étant réalisé dans un rapport 400 ml/600 ml. La chromatographie ci-dessus permet de séparer deux zones d'activité, la première sortie de colonne correspond à la substance dénommée ci-après PLM II et la seconde correspond à la substance dénommée ci-après PLMI. On procède ensuite à la purification des fractions obtenues, selon un mode opératoire préféré le solvant d'élution est évaporé sous vide à 500C. Chaque culot correspondant respectivement aux substances PLMI et PLM II est rincé avec de l'éther éthylique à froid, centrifugé, et le surnageant est écarté le rinçage est réalisé jusqu'à l'obtention d'un culot blanc. Les substances ainsi obtenues sont ensuite soumises à une purification, qui consiste en une chromatographie sur colonne de gel de silice avec élution avec du chloroforme et de l'éthanol d'une solution chloroformique des culots obtenus ; on utilise de préférence un gradient linéaire de chloroforme et d'éthanol. Les fractions actives, constituant les substances selon l'invention, sont toujours caractérisées par une révélation biologique minces sur couches/de gel de silice avec le solvant d'élution. Les substances selon l'invention sont faiblement solubles dans le méthanol et l'acétate d'éthyle, insolubles dans le chloroforme, solubles dans le diméthylsulfoxyde et elles forment un sel de sodium soluble dans l'eau. Elles ont toutes un poids moléculaire voisin de 594. En solution dans le méthanol, elles possèdent respectivement un pouvoir rotatoire [&alpha;]D20 méthanol de + 73 (PLMI) et de + 92 (PLMII, 10,8 mg/ 1,5 ml). Les substances selon l'invention sont d'une manière générale dépourvues d'activité bactériostatique. Elles inhibent la croissance des algues, des champignons et des levures. En conséquence, la présente invention a également pour objet l'application des substances selon l'invention à titre d'agents antifongiques. Elle concerne également les compositions antifongiques contenant à titre d'ingrédient actif une quantité efficace d'une substance selon l'invention en combinaison avec un véhicule approprié. L'invention va être maintenant décrite plus en détail par les exemples ci-après non limitatifs EXEMPLE 1 Préparation des substances anti-fonaiques PLM I et PLM II. La souche Phoma Lingam a été conservée sur du malt 2 X gélosé à 2 X en boite de Petri plastique et à la lumière artificielle. On a cultivé cette souche sur le milieu nutritif ayant la composition ci-après (NH4)2 C4H406 0,5 g ; NH4NO3 lg ; Kp2PO4 lg ; Mg Su41 2 0,5g CaCl2 0,13 g ; NaCl 0,1 g ; saccharose 30 g ; extrait de levure Difco lg (-.s.p.l litre). Le microorganisme a été cultivé en boites de Roux non agitées, à l'obscurité et à la température du laboratoire à raison de 200 ml par boite. La culture a été poursuivie jusqu'à ce qu'elle atteigne un pH de 5,0 à 6,5, ce qui correspond à environ 21 jours de culture statique. Le mycélium a été recueilli par filtration sur étamine. Le gâteau de mycélium a été alors broyé dans de l'éthanol à 950. L'extrait éthanolique a été filtré et évaporé presque à sec. Le résidu a été repris par 2 litres d'eau distillée, ajusté à pH 5,0 avec du HC1, puis épuisé 4 fois par 500 ml d'acétate d'éthyle. La fraction acétate d'éthyle a été évaporée à sec sous vide et à 500C. Le culot a été repris par 10 ml de chloroforme. La solution chloroformique a été chromatographiée sur une colonne de gel de silice (/ = 2,5 cm,h = 30 cm). Dans un premier temps, la colonne a été éluée par 200 ml de chloroforme puis l'élution a été poursuivie par un gradient linéaire de chloroforme et du mélange acétate d'éthyle, méthanol (1/1, v/v). Le gradient a été réalisé dans le rapport 400 ml/600 ml. La vitesse d'élution était de 35 ml/h. Les fractions actives ont été sélectionnées par une révélation biologique avec Penicillium expansum, après une migration sur plaque chromatographique de gel de silice avec pour solvant : acétate d'éthyle/méthanol/ chloroforme/acide acétique (10/3/6/0,1 : v/v). Cette chromatographie a permis de séparer deux zones d'activité. La première sortie de colonne correspondait à la substance PLM II, la deuxième correspondait à la substance PLM I. Le solvant d'élution a été évaporé sous vide à 500C. Chaque culot correspondant respectivement aux substances PLM I et PLM II a été rincé par 5 ml d'éther éthylique à froid, centrifugé et le surnageant écarté. Le rinçage a été réalisé jusqu'à l'obtention d'un culot blanc (5 fois). La poursuite de la purification des fractions PLM I et PLM II est identique dans les deux cas. Dans chaque cas, le culot a été repris par 5 ml de chloroforme et chromatographié sur colonne de gel de silice 2,5 cm , H = 30 cm),éluée par un gradient linéaire de chloroforme, éthanol (3/1, v/v) et chloroforme, éthanol (2,5/1, v/v) dont le rapport des volumes est 600 ml/600 ml. La vitesse d'élution était de 1 ml/l mn. 45 sec. Les fractions actives ont toujours été caractérisées par une révélation sur couches minces de gel de silice avec le solvant précédemment cité. Après évaporation du mélange d'élution, le résidu obtenu était la substance PLM I ou la substance PLM II à l'état pur. Les quantités obtenues pour 10 litres de culture étaient PLM I = 500 mg PLM II = 50 mg La substance PLM I ainsi obtenue est caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes ASPECT : Poudre blanche amorphe. SOLUBILITE : Faiblement soluble dans le méthanol et l'acétate d'éthyle. Insoluble dans le chloroforme. Soluble dans le diméthylsulfoxyde. Il forme un sel de sodium soluble dans l'eau. COMPOSITION CENTESIMALE : Le PLM I contient du carbone, de l'hydrogène et de l'oxygène. Sa compo sition centésimale est voisine de C % = 68,17 H % = 10,80 O % = 21,71 POINT DE FUSION : (pris au bloc Kofler) : 1490 - 1520 C POUVOIR ROTATOIRE : (mesuré en solution dans le méthanol) [&alpha;]20 = + 73 SPECTRE ULTRAVIOLET : Ce spectre a été enregistré à partir d'une solution à 55 mg/l dans le méthanol.Le PLMI pré sente un seul maximum d'absortion à 232 nm ( = 9,06 x 103). Le spectre est représenté fi gure 1. SPECTRE INFRAROUGE : Le spectre du PLM I a été enregistré à partir d'une pastille en mélange dans le KBr. Ce spectre est représenté par la figure 2. Dans le tableau I, on indique les princi pales bandes d'absorption infrarouge pour ce produit exprimées en nombre d'ondes (cul) SPECTRE DE RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE DU PROTON Ce spectre, qui est représenté par la figure 31a été enre gistré sur un spectromètre CAMECA-250 à la fréquence 250 MHz à partir d'une solution à 70 mg/ml dans le méthanol tétradeutéré à 500 C. I1 présente les caractéristiques suivantes (des déplacements chimiques sont comptés positivement vers les champs faibles en ppm à partir du tétraméthylsilane pris comme référence interne). TABLEAU NO I 3380 tF 1590 tf 875 F 1455 ép 840 tF 3320 tF 1450 F 2950 F 1425 F 2920 F 1395 F 2862 m 1350 m 2850 m 1325 f 1735 m 1280 tf 1720 m 1230 f 1700 f 1160 tf 1690 ép 1120 tf 1620 f 1060 F 1050 F 1560 m 1010 m 1580 m 960 F LEGENDE tF : très forte F : forte m : moyenne f : faible tf : très faible ép : épaulement Déplacement chimique Forme du signal : constante en ppm de couplage (J) et nombre de protons 5,93 Singulet 1 H 5,75 à 5,48 Multiplet 6 H 5,14 doublet 1 H J = 9,4 Hz 4,32 à 4,00 multiplet 6 H 3,72 doublet 1 H 3= 8,1 Hz 2,70 multiplet 1 H 2,42 à 2,20 multiplet 6 H 1,76 doublet 3 H J = 1,2 Hz 1,74 à 1,00 multiplet 11H 0,97 doublet 3 H J = 6,7 Hz 0,90 doublet 3 H J = 6,7 Hz 0,87 doublet 3 H J &num; 7 Hz 0,85 singulet ou triplet 3 H 0,83 doublet 3 H J = 6,7 Hz D'après ce spectre, le PLM I contient 51 atomes d'hydrogène non échangeables. SPECTRE DE RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE DU 13C : Ce spectre, qui est représenté par la figure 4, a été enregistré sur un spectornètre CAMECA-250 à la frequence 62,86 z à partir d'une solution à 70 mg/ml dans le méthanol tétra- deutéré à 500C. Il présente les caractéristiques suivantes (les déplacements chimiques sont comptés positivement vers les champs faibles en ppm et à partir du tétraméthylsilane pris comme référence interne). Déplacements chimiques des signaux en ppm par rapport au tétraméthylsilane (TMS) 180,39 45,42 139,85 45, 15 136,72 41,63 136,66 41,57 136,45 41,45 135,96 32,98 135,78 31,34 134,27 30,46 129,68 29,55 128,65 (2 carbones) 22,79 83,53 20,72 73,58 20,27 73,34 17,81 72,09 13,50 68,75 11,53 61,29 46,79 (2 carbones) L'ensemble des résultats permet de conclure à l'existence de 10 atomes de carbone doublement liés, 1 groupement acide carboxylique, 6 groupements hydroxyliques et 6 groupements méthyliques pour une formule brute probable de : C34 H5808. La substance PLM II obtenue selon le mode opératoire cidessus est caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes ASPECT : poudre blanche amorphe. SOLUBILITE : faiblement soluble dans le méthanol et acétate d'éthyle. Insoluble dans le chloroforme. Soluble dans le diméthylsulfoxyde. POINT DE FUSION (pris au bloc Koffer) : 890 - 900C. POUVOIR ROTATOIRE (mesuré en solution dans le méthanol) 20 / a /D = + 920 (10,8 mg / 1,5 ml) SPECTRE ULTRAVIOLET : ce spectre a été enregistré à partir d'une solution à 40 mg/l dans le métha nol. X max = 233,2 nm (fig 5) (g = 2,2 x 103) SPECTRE INFRARouGE : (fig 6) SPECTRE DE RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE DU PROTON : (fig 7). EXEMPLE 2 Migration chromatographigue et révélations chimiques et biolo gigues. Les substances PLM I et PLM II sous leur forme acide ont été caractérisées par chromatographie ascendante sur couche mince de gel de silice en utilisant le mélange de migration suivant : Acétate d'éthyle/méthanol/chloroforme/acide acétique (10/3/ 6/0,1, v/v). Les Rf étaient pour PLM I de 0,14 et pour PLM II de 0,23. La visualisation sous une lampe UV à 254 nm a permis de faire apparaltre le PLMI et PLMII sous l'aspect de spots absorbants sur plaques de silicagel avec un indicateur de fluorescence à 254 nm. La pulvérisation d'acide sulfurique à 10 % dans le méthanol sur la plaque chromatographique et un chauffage de quelques minutes à 1100C ont fait apparaitre deux taches brunes correspondant aux substances PLM I et PLM II. La révélation de la plaque peut être une révélation biologique utilisant les propriétés antifongiques des substances PLM I et PLM II. Elle consiste à pulvériser sur la plaque chromatographique une suspension de spores de Penicillium expansum ou de Botrytis cinerea incorporée dans une solution nutritive de malt à 2 % gélosé à 1 % et maintenue fluide à la température de 400C. La plaque inoculée est maintenue à 300C en humidité saturante. Après 48 h, deux zones d'inhibition de la croissance de ces champignons indiquent la présence du PLMI et du PLM II. EXEMPLE 3 ACTIVITES BACTERIOLOGIQUES IN VITRO La substance PLM I obtenue selon l'exemple 1 est d'une manière générale dépourvue d'activité bactériostatique. On a indiqué dans le tableau ci-après les concentrations minimales inhibitrices pour certains germes. Germes testés Concentrations minimales inhibitrices en Pg/ml Proteus vulgaris sup. à 48 Staphylococcus aureus sup. à 74 Enterococcus proteiformis sup. à 110 Escherichia coli sup. à 74 Pseudomas fluorescens sup. à 21 On a obtenu sensiblement les mêmes résultats avec la substance PLM II. EXEMPLE 4 Activités sur les algues in vitro. Pour Chlorella pyrenoida, la dose inhibitrice de la croissance 50 % (DI - 50) se situe à 6 pg/ml et la concentration inhibitrice est inférieure à 50 pg/ml pour la substance PLMI. EXEMPLE 5 Activités antifongigues "in vitro" L'activité antifongique du PLM I vis-à-vis de quelques champignons et levures a été déterminée. Pour chaque champignon ou levure, on a déterminé la plus petite concentration de substance active qui, dans des conditions définies, entraine 95 à 100 % d'inhibition du champignon ou levure. Concentration minimale Germes testés inhibitrice en ug/ml Saccharomyces pastorianus 200 Fusarium oxysporum sup. à 500 Botrytis cinerea 100 Trichophyton mentagrophytes inf. à 50 Candida krusei 13 Candida albicans inf. à 50 Penicillium digitatum inf. à 50 Rhizopus migricans sup. à 500 Aspergillus niger inf. à 50 REVENDICATIONS 1. A titre de produit nouveau, la substance PLMI, caractérisée en ce qu'elle possède les propriétés ci-après ASPECT : poudre blanche amorphe SOLUBILITE : Faiblement soluble dans le méthanol et l'acétate d'éthyle. Insoluble dans le chloroforme. Soluble dans le diméthylsulfoxyde. Forme un sel de sodium soluble dans l'eau. COMPOSITION CENTESIMALE : PLM I contient du carbone, de l'hydro- gène et de l'oxygène , sa composition centésimale est voisine de C% = 68,17 H % = 10,80 0 % = 21,71 POINT DE FUSION : (pris au bloc Kofler) : 1490 - 1520C. POUVOIR ROTATOIRE : (mesuré en solution dans le méthanol) [&alpha;]20 + 73 D possède 10 atomes de carbone doublement liés, 1 groupe acide carboxylique, 6 groupes hydroxyliques et 6 groupes méthyliques. SPECTRE ULTRAVIOLET : figure 1 (un seul maximum d'absorption à 232 nm) SPECTRE INFRAROUGE : figure 2 SPECTRE DE RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE DU PROTON : figure 3 SPECTRE DE RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE DU 13C : figure 4 2. A titre de produit nouveau, la substance PLMII caractérisée en ce qu'elle possède les propriétés ci-après ASPECT : poudre blanche amorphe. SOLUBILITE : faiblement soluble dans le méthanol et acétate d'éthyle. Insoluble dans le chloroforme. Soluble dans le diméthylsulfoxyde. POINT DE FUSION (pris au bloc Koffer) : 890 - 900 C. POUVOIR ROTATOIRE (mesuré en solution dans le méthanol) Iffla + = + 920 (10,8 mg / 1,5 ml) ~ ~ D SPECTRE ULTRAVIOLET : ce spectre a été enregistré à partir d'une solution à 40 mg/l dans le métha nol. X max = 233,2 nm (fig 5) (g = 2,2 x 103) SPECTRE INFRAROUGE : (fig 6) SPECTRE DE RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE DU PROTON : (fig. 7) 3. Procédé pour l'obtention de substances possédant notamment une activité antifongique, à partir de mycelium de Phoma Linqarn caractérisé en ce qu'il consiste : - à soumettre le mycélium de Phoma Lingam à une extraction alcoolique ; - à traiter ensuite le résidu alcoolique avec de l'acétate d'éthyle - à le reprendre ensuite avec du chloroforme - à soumettre la solution chloroformique résultante à une chromatographie sur gel de silice et - à récupérer les fractions actives par révélation biologique. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'extraction alcoolique est réalisée à l'aide d'éthanol. 5. Procédé selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que l'on utilise du mycélium de Phoma Lingam cultivé sur le milieu de culture ayant la composition ci après (NH4)2 C4H406 0,5 g ; NH4NO3 lg ; KP2PO4 lg ; Mg SO4, 7H2O 0,5g; CaC12 0,13 g ; NaCl 0,1g ; saccharose 30 g : extrait de levure 2 Difco lg (q.s.p.l litre), la culture étant effectuée à l'obscurité et à la température ambiante jusqu'à ce que le pH soit de 6,0 à 6,5. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste (1) à broyer du mycélium de Phoma Lingam dans de l'éthanol à 950 ; (2) à filtrer et évaporer à siccité l'extrait alcoolique (3) à reprendre le résidu avec de l'eau et à l'acidifier jusqu'à pH 5B0 ; (4) à extraire la solution résultante avec de l'acétate d'éthyle, (5) à évaporer à siccité sous vide à 500C la fraction acétate d'éthyle résultante, (6) à dissoudre le résidu résultant dans du chloroforme et à chromatographier la solution chloroformique ainsi obtenue sur du gel de silice et (7) à récupérer les fractions actives par révélation biologique. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la chromatographie de l'étape (6) est réalisée avec un gradient linéaire de chloroforme et du mélange acétate d'éthyle/méthanol (1/1 en volume). 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que les fractions actives sont récupérées par révélation biologique avec Penicillium exDar.sum ou Botrytis cinerea après migration sur plaque chromatographique de gel de silice avec pour solvant le mélange acétate d'éthyle/ méthanol/chloroforme/acide acétique (10/3/6/0,1 en volume). 9. Substances obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 8.