FR 2499589 A1 19820813 FR 8102321 A 19810206 La présente invention est relative à un procédé pour régler la quantité et les proportions des alcaloïdes produits dans des conditions saprophytes, par des souches mutantes de Claviçeps purpurea qui produisent principalement de l'ergocornine, de I'cret de la 8-ergocryptine. I1 est connu que le méthane-sulfonate et l'éthanesulfonate de dihydroergotoxine, respectivement, sont utilisés en médecine en tant que régulateurs du métabolisme central ainsi que de la circulation centrale et périphérique. La préparation augmente la synthèse des protéines du système nerveux central et inhibe l'adénylcyclase stimulée par les catécholamines. Ce produit exerce en outre une action faiblement sédative, inhibe la tachycardie de réflexe, améliore l'irrigation sanguine du cerveau et abaisse la pression sanguine. En médecine, le produit est principalement utilisé pour le traitement des maladies qui sont dues a des troubles circulatoires périphériques ou cérébraux. La dihydroergotoxine est préparée par hydrogénation de l'ergotoxine. Le produit qui se forme est un mélange de dihydroergocristine, de dihydroergocornine et de dihydroergocryptine (cf. Brevet Hongrois nO 129 061). La dihydroergocryptine se présente sous la forme de deux variantes, à savoir les formes a- et ss- (Experientia23, 991 19677) et selon les travaux les plus récents, l'action pharmacologique des deux formes n'est pas tout- - fait identique. La forme a- est plus active dans un test contraceptif sur des rats, tandis que la forme ss- exerce une action de vasopresseur plus forte sur des chats décérébrés(Experientia 33, 1552 /i9727). C'est la raison pour laquelle dans les prescriptions de préparationscon- tenant de la dihydroergotoxine, la proportion d'a- et de B-dihydroergocryptine est bien déterminée.La proportion de la forme a- à la forme ss- considérée comme idéale est 2:1 et la dihydroergotoxine présentant la composition optimale contient les composants dihydroergocristine, dihydroergocornine, a-dihydroergocryptine et ss-dihydro- ergocryptine dans un rapport 3:3:2:1. Les tolérances admissibles dans le rapport entre la forme a- et la forme S- sont différentes dans les divers pays. Ainsi, a u x ETATS-UNIS et dans plusieurs pays européens, les valeurs limites admissibles de la teneur en ss-dihydro- ergocryptine sont de 26,7 à 44 % de la teneur totale en dihydroergocryptine, tandis. que dans d'autres pays européens et au JAPON, la tolérance est de 28,6-40 t. L'étape initiale de la préparation du méthanesulfonate ou de l'ethane-sulfonate de dihydroergotoxine est la préparation des alcaloïdes non hydrogénés de l'ergot de seigle (ergocristine, ergocornine, a- et B-ergocryptine). Ces alcaloldes sont préparés par voie biologique. Une possibilité de préparation est représentée par la biosynthèse parasitaire dans laquelle on infecte du seigle et on obtient l'alcaloide produit par extraction du végétal. Cette méthode est principalement utilisée pour la préparation de l'ergocristine (souches utilisées : la souche déposée à l'American Type Culture Collection sous le nO ATCC 20103 et décrite dans le Brevet Britannique nO 1 192 912 de la Societa Farmaceutici Italia; la souche déposée par Richter Gedeon Vegyészeti Gyar RT sous le nO MNG 00163 dans la Collection Nationale Hon groins4. Par ailleurs, la biosynthèse peut avoir lieu par voie saprophyte en isolant les alcaloïdes du bouillon de fermentation. Les souches les plus connues pour la mise en oeuvre par cette voie, sont la souche ATCC 20102 qui produit l'ergocryptine et l'ergotamine (Brevet Britannique 1 158 380), la souche ATCC 20106 qui produit ltergocornine et l'ergosine (Brevet Britannique I 184 039), la souche ATCC 20019 qui produit l'ergocryptine (Brevet des ETATS-UNIS D'MERIQUE nO 3 485 772), la souche de la Società Farmaceutici Italia qui produit de la ss-ergocryptine et de l'ergosine (qui est déposée dans la Collection personnelle de cette Société sous le nO FI 7374 et qui est décrite dans le Brevet Belge nO 824 987). Il ressort de ce qui précède que ces souches sélectionnées ne produisent pas seulement les alcaloïdes importants pour la préparation de l'ergotoxine, mais également d'autres alcaloldes de l'ergot de seigle, c'està-dire que leur fermentation n'est pas orientée de façon sélective vers la production d'ergotoxine. Des Chercheurs Hongrois ont sélectionné pour la première fois des souches de Claviceps purpurea qui produisent principalement de l'a- et de la ss-ergocryptine (Brevet Hongrois nO 152 238 ; nO dépôt de la souche MNG 0022 ; Brevet Hongrois nO 164 816, nO de dépôt de la souche : MNG 0088). Toutefois, meme dans le cas de ces souches, le réglage des proportions des alcaloïdes les uns par rapport aux autres pendant la fermentation, n'est pas réalisé.Les proportions des trois alcaloïdes produits les unes par rapport aux autres ne peuvent êtres réglées qu'ultérieurement en décomposant le mélange d'alcaloIdes obtenu, en ses composants, à l'aide des méthodes compliquées disponibles, et en mélangeant à nouveau entre eux les composants séparés, dans des rapports appropriés. L'on connaît d'autre part un procédé dans lequel on fait fermenter simultanément deux souches (Brevet Suisse nO 577 556) dont l'une produit de l'ergocornine, de l'ergocryptine et leurs isomères, tandis que l'autre produit de l'ergocristine. L'on obtient les alcaloldes indiqués dans un rapport qui n'est pas mentionné de façon plus précise, à partir du jus de culture commun des deux souches. Un réglage de ces proportions n'est pas obtenu non plus avec ce procédé. Le fait que la fermentation qui met en oeuvre simultanément deux souches peut être beaucoup plus difficilement maitriséequ1un procédé dans lequel l'on ne doit tenir compte que de l'optimum de culture d'une seule souche, constitue également un problème. H. KOBEL a établi (dans la conférence qu'il a faite en 1977 à BALE à la réunion de la Fédération des Sociétés Microbiologiques EuropeenneX,que la biosynthèse des alcaloides peptidiques peut étire influencée par certains amino-acides.La biosynthèse de l'ergocornine contenant de la valine dans sa partie peptidique, peut être favorisée par addition de valine, la biosynthèse de l'a-ergocryptine qui contient de la leucine, peut être favorisée par l'addition de leucine. Par contre, la biosynthèse de la S-ergocryptine qui contient de l'isoleucine, ne peut pas être influencée par 11 addition d'isoleucine. H.KOBEL a indiqué que la cause vraisemblable de ce phénomène remarquable serait représentée par le fait que la croissance des souches aptes a produire de la ss-ergocryptine serait inhibee par ltisoleucine. Comme dans les jus de culture des souches connues qui produisent de l'ergocryptine ou de l'ergocornine et de ltergocryptine, la proportion de la $-ergocryptine est également inférieure à celle requise, la proportion appropriée ne peut pas non plus être réglée. La présente invention a en conséquence pour but d'influencer la fermentation de mutants de la souche claviceps purpurea dans une direction favorable. La Demanderesse a à present pu mettre en évidence de façon surprenante que la fraction de B-ergocrptin pré sente dans le jus de fermentation augmente lorsque l'on influence la production d'alcaloides des souches mutantes de Claviceps purpurea, en utilisant à la place de l'isoleucine, un composé qui se comporte en tant que précursseur dans la biosynthèse de l'isoleucine. Par conséquent, les précurseurs de l'isoleucine n'inhibent pas la croissance des souches. La Demanderesse a en outre pu mettre en évidence que la production d'alcaloldes peut également être réglée en utilisant des composés qui stimulent la formation d'isoleucine, par suite d'une régulation biochimique. Les précursseurs et les composés régulateurs sont des céto-acides, des hydroxy-acides,des amino-acidescomportant de 4 à 6 atomes de carbone, dont la biosynthèse part de l'acide aspartique ou du phosphate de cet acide. Pour influencer la fermentation dans un sens favorable, la Demanderesse a également sélectionné de nouvelles souches mutantes. Au cours de ces essais, elle a sélectionné une nouvelle souche mutante de Claviceps purpurea, qui a été déposée le 9 Mai 1979 sous le nO MNG 00186 dans la Collection Nationale Hongroise. Cette souche présente une morphologie analogue à celle d'une levure et produit principalement de l'ergocornine et de la 6-ergocryptine, en sorte qu'elle est propre à augmenter la teneur en B-ergocryptine. La Demanderesse a enfin pu mettre en évidence que les proportions des alcaloïdes produits ne se modifient pratiquement pas, et que la quantité totale des alcaloses dans le jus de fermentation augmente cependant, lorsque l'on met en oeuvre la nouvelle souche pour la production d'alcaloides et que l'on ajoute au jus de fermentation un composé qui se comporte en tant que précurseur dans la biosynthèse de l'isoleucine ou un composé qui stimule la formation d'isoleucine par suite d'une régulation biochimique. La présente invention a en conséquence pour objet un procédé pour régler la quantité et les proportions des alcaloïdes produits dans des conditions saprophytes, par des souches mutantes qui produisent principalement de l'ergocornine-, de l'a- et de la e-ergocryptine. La caractéristique essentielle du procédé conforme å la présente invention est représentée par le fait que l'on utilise dans la fermentation, qui est connue en ellemême, en tant que régulateur, un composé qui se comporte en tant que précursseur dans la biosynthèse de l'isoleucine ou un composé qui stimule la formation d'isoleucine en conséquence d'une régulation biochimique. Conformément à l'invention, l'on met en oeuvre dans le procédé des souches mutantes de Claviceps purpurea qui produisent principalement de l'ergocornine, de l'aet de la ss-ergocryptine. Les souches préférées sont les souches déposées dans la Collection Nationale Hongroise sous les nO MNG 0022, MNG 0088 et MNG 00186. La fermentation est effectuée en culture immergée , dans des conditions aérobies, sur un milieu nutritif liquide contenant des sources de carbone et d'azote, des sels minéraux et éventuellement d'autres additifs, a une température comprise entre 20 et 260C et à une valeur de pH comprise entre 5,2 et 6,8, pendant 4 à 8 jours. La fermentation est réalisée en présence d'un additif (précurseur) régulateur des proportions desalcaloides. En tant qu'additif régulateur , on utilise un composé qui se comporte en tant que précurseur dans la biosynthèse de l'isoleucine (Lehninger : Biochemistry, Worth Publ. Inc. N.Y.,page7o4 t19757) ou un composé qui stimule la biosynthèse de l'isoleucine par régulation biochimique. Les précursseurs de l'isoleucine dans la biosynthèse de cette dernière sont, dans l'ordre de leur formation, les suivants: par l'intermédiaire de l'homosérine et de la thréonine ou de l'acide 3-méthylaspartique (acide 2-amino-3-méthylsuccinique) et de l'acide méthyl oxalacétique (acide 2-méthyl-3-oxo-succinique), de l'acide a-cétobutyrique, puis en passant par l'acide a-acétyla-hydroxybutyrique, l'acide a ss-dihydro-ss-méthylvalérianique et l'acide a-céto-B-méthylvalérianique. Les composés qui stimulent la formation de l'isoleucine par régulation biochimique appartiennent biochimiquement aux aspartates, c'est-à-dire à des composés dont la biosynthèse part de l'acide aspartique ou de son phosphate. Il s'agit principalement de céto-acides,d'hydroxyacides et d'amino-acidescontenant de 4 à 6 atomes de carbone. L'homocystéine ou la méthionine sont préférées. Le composé qui règle la production des alcaloïdes est ajouté au jus de fermentation à raison de 0,01 à 3 3 10 kg/m , et de préférence à raison de 0,05-5,0 kg/m3. La solution aqueuse,éventuellement faiblement acide,du composé régulateur est ajoutée après stérilisation, en une seule fois, ou divisée en plusieurs fractions, ou de façon continue pendant l'une des périodes de la fermentation. Dans les Demandes de Brevets antérieures, la teneur du jus de fermentation en alcaloïdes est fréquemment indiquée par les valeurs mesurées par spectrophotométrie. La teneur totale en alcaloides a également été mesurée, dans le cas présent,par spectrophotométrie; toutefois, les résultats des mesures ne se sont pas avérés spécifiques. Les différents composants de l'ergotoxine ont été déterminés séparément par chromatographie par élution ou par chromatographie quantitative en phase liquide. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la pré sente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre, sont donnés uniquement à titre d'illustration de i'objet de l'invention, dont-ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 On ensemence 200 ml de milieu nutritif GK introduit dans un Erlenmeyer de 500 ml, d'une culture de la souche Claviceps purpurea MNG 0022 cultivée sur du milieu nutritif agar-agar AIC. L'Erlenmeyer est incubé pendant trois jours sur une table a secousses, secoue à la fréquence de 300 min 1. inoculum ainsi obtenu est lui-même ensemencé sur 5 litres d'un milieu nutritif St dans un fermenteur d'un volume de 10 litres. La culture est effectuée pendant 7 jours à 240C à une vitesse d'agitation de 240 minez sous aération par 0,5 litre d'air par litre de jus de fermentation et par minute.On ajoute au jus de fermentation à la 40ème, a la 64ème, à la 88ème et a la 112ème heures,comme précurseur, une solu ticn aqueuse à 10 % d'acide méthyloxalacetique (0,5 g de précurseur/litre de jus de fermentation). Les proportions des alcaloides ergocornine et ergocrytpine atteignent au 7ème jour de la fermentation, la valeur recherchée. La teneur totale en alcaloldes,mesurable a l'aide d'une réaction colorée, est de 1150 y/ml. Le dosage par chromatographie en couche mince (J. of Chrom. 87, 433 g1973/) fait apparaitre la présence de 300 y/ml d'ergocornine, de 180 y/ml d'ergocryptine et de 110 y/ml de leurs épimères dextrogyres.Le rapport entre l'a- et la 8-ergocryptine est de 66:34 par examen par chromatographie en phase liquide sous pression élevée (J. Pharm. Sci. 67, 98 1978/). Les alcaloldes sont isolés d'une manière connue en elle-même a partir du jus de fermentation. Les milieux nutritifs utilisés ont la composition suivante milieu nutritif à 11 agar-agar AIC . Mannitol 40,0 g . Acide citrique 7,0 g . Liqueur de macération de mais 2,0 g . Phosphate monopotassique 1,0 g . Sulfate de magnésium 0,3 g . Poudre d'agar-agar 25,0 g . Ammoniaque jusqu'à pH 5,2-5,3 . Eau jusqu'à 1000 ml La valeur de pH recherchée pour le milieu nutritif est ajustée pendant l'ébullition.Puis le milieu nutritif est introduit en fractions de 6 ml chacune dans des tubes à essai et on le laisse durcir en plaçant les tubes à essai dans une position oblique,sous forme d'agar-agar oblique. milieu nutritif GK . Trypcasine 7,0 g . Acide citrique 4,1 g . Phosphate monopotassique 0,3 g . Sulfate de magnésium 0,3 g . Ammoniaque jusqu'à pH 5,7-5,8 . Eau jusqu'à 840 ml On introduit le milieu nutritif dans des ballons à raison de fractions de 80 ou de 168 ml chacune. On ajoute dans chaque ballon 16 et 32 ml respectivement d'une solution de glucose à 50 %. milieu nutritif St . Saccharose 100,0 g . Acide succinique 10,0 g . Phosphate monopotassique 0,25 g . Sulfate de magnésium 0,25 g . Nitrate d'ammonium 1,0 g . Chlorure de calcium 1,0 g . Ammoniaque jusqu'à pH 5,2-5,3 . Eau jusqu'à 1000 ml On stérilise le milieu nutritif par fractions de 0,1 ou 5 ou 100 litres. EXEMPLE 2 On ensemence 200 ml de milieu nutritif GK contenu dans un Erlenmeyer de 750 ml, d'une culture de la souche mutante de Clavicepspurpurea MNG 0088 cultivée sur du milieu nutritif à l'agar-agar AIC. La culture est incubée pendant 3 jours à 240C sur une table à secousses secouée à la fréquence de 300 min 1. On ensemence 5 litres d'un milieu de culture TC 54 contenu dans un fermenteur de laboratoire de 10 litres, de la culture obtenue.La culture est incubée pendant 3 jours à 240C et à une vitesse d'agitation de 240 min 1 sous aération à l'aide de 0,5 1 d'air par litre de jus de fermentation et par minute. On ensemence 100 litres du milieu de culture St contenu dans un fermenteur résistant a la corrosion par les acides, équipé d'un agitateur, de l'inoculum obtenu et l'on fait fermenter la culture pendant 6 jours à 240C et à une vitesse d'agitation de 120 min 1, sous aération par 0,3 litre d'air par litre de jus de fermentation et par minute. On ajoute à la culture au cours des 5 premiers jours de fermentation, une solution aqueuse à 5 z d'acide a-cétobutyrique, en tant que précursseur, à une vitesse de 20 ml/heure. Après l'interruption de la fermentation, la teneur totale en alcaloldes est de 920 y/ml. En utilisant la méthode par chromatographie en phase liquide indiquée à l'Exemple 1, l'on décèle la présence de 260 y/ml d'ergocornine, de 155 y/ml d'a-ergocryptine et de 95 y/ml de B-ergocryptine. On peut en outre mesurer dans le jus de fermentation 80 y/ml d'ergocorninine-cryptinine. Le milieu nutritif TC 54 a la composition suivante . Saccharose 100,0 g . Acide citrique 10,0 g . Chlorure de sodium 10,0 g . Phosphate monopotassique 0,5 g . Sulfate de magnésium 0,5 g . Ammoniaque jusqu'à pH 5,7-5,8 . Eau jusqu'à 1000 ml Le milieu nutritif est stérilisé dans un fermenteur de laboratoire par fractions de 5 litres. EXEMPLE 3 On ensemence 100 ml de milieu nutritif GK contenu dans un Erlenmeyer de 500 ml, d'une culture de la souche mutante de Claviceps purpurea MNG 0088 cultivée sur du milieu nutritif à l'agar-agar St. La culture est incubée pendant 3 jours à 240C sur une table à secousses secouée à une fréquence de 300 min 1. On ensemence 100 ml du milieu nutritif T 25 de 10 ml de la culture obtenue. Cette culture est incubée pendant 5 jours à 20"C également sur une table à secousses. A la 20ème heure, on ajoute 0,5 g de thréonine en tant que précursseur au jus de fermentation. Le 5ème jour, la concentration totale en alcaloïdes du jus est de 1200 y/ml.En utilisant la méthode indiquée à l'Exemple 1, on décèle 260 y/ml d'ergocornine, 140 y/ml d'a-ergocryptine et 80 y/ml de B-ergocryptine. La teneur totale en ergocorninine et en ergocryptinine est de 130 y/ml. Le milieu nutritif à l'agar-agar St se distingue du milieu nutritif liquide St indiqué à l'Exemple 1 en ce qu'on lui ajoute 25 g de poudre d'agar-agar(Difco) par litre. Après l'addition de l'agar-agar, l'on porte le milieu nutritif à l'ebullition.puis on l'introduit par fractions de 6 ml chacune dans des tubes à essai, on stérilise et on le laisse durcir en plaçant les tubes à essai dans une position oblique, pour obtenir de l'agaragar oblique. Le milieu nutritif T 25 a la composition suivante . Saccharose 300,0 g . Acide citrique 15,0 g . Extrait de levure 1,0 g . Phosphate monopotassique 0,5 g . Sulfate de potassium 0,5 g . Ammoniaque jusqu'à-pE 5,2-5,3 . Eau jusqu'à 1000 ml On introduit le milieu nutritif dans des ballons par fractions de 100 ml et on stérilise. EXEMPLE 4 L'on procède comme décrit à l'Exemple 3, en utilisant toutefois 0,05 g dthomoserine comme précurseur à la place de la thréonine.Au 5ème jour de la fermentation, la teneur totale en alcaloïdes est de 880 y/ml. Le jus de fermentation contient 220 y/ml d'ergocornine, 150 y/ml d'a-ergocryptine et 80 y/ml de ss-ergocryptine. L'ergocorninine et l'ergocryptinine représentent ensemble 180 y/ml. EXEMPLE 5 L'on procède comme décrit à l'Exemple 3, en utilisant cependant 0,05 g d'homocystéine comme précurseur. Au 5ème jour de la fermentation, la concentration totale en alcaloses est de 700 y/ml. Le jus de fermentation contient 190 y/ml d'ergocornine, 85 y/ml d'a-ergocryptine et 90 y/ml de ss-ergocryptine. L'ergocorninine et l'ergocryptinine représentent ensemble 150 y/ml. EXEMPLE 6 On ensemence 100 ml de milieu nutritif GK contenu dans un Erlenmeyer de 500 ml, dune culture de la souche de Claviceps purpurea MNG 00186 cultivée sur du milieu nutritif à l'agar-agar St. Cette culture est incubée pendant 4 jours à 240C sur une table à secousses secouée à la fréquence de 300 min 1. Des fractions de 10 ml de la culture obtenue sont introduites chacune dans 8 ballons qui contiennent chacun 100 ml de milieu nutritif St. Les cultures sont fermentées pendant 7 jours à 240C également sur une table à secousses. On n'ajoute aucun précurseur à 4 des ballons. Dans les 4 autres ballons, on ajoute à la 24ème et à la 48ème heures de la fermentation,0,02 g de méthionine dissoute dans 2 ml d'eau. On interrompt la fermentation le 7ème jour. Les jus de fermentation cultivés sans addition de précurseur sont réunis et leur teneur en alcaloïdes est déterminée : ergocornine : 80 y/ml; a-ergocryptine 15 y/ml ; B-ergocryptine : 30 y/ml. Les jus de fermentation cultivés avec le précurseur sont également réunis et examinés. Ils présentent une concentration totale en alcaloïdes de 250 y/ml, 50 y/ml d'a-ergocryptine et 100 y/ml de B-ergocryptine. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 - Procédé pour régler la quantité et les proportions des alcaloides produits dans des conditions saprophytes par des souches mutantes de Claviceps purpurea qui produisent principalement de l'ergocornine, de l'a-et de la ss-ergocryptine, lequel procédé est caractérisé en ce que l'on utilise lors de la fermentation connue en elle-même, en tant que régulateur, un composé qui se comporte en tant que précurseur dans la biosynthèse de l'isoleucine,ouuncc'posé qui stimule la formation d'isoleucine par régulation biochimique. 2 - Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise comme précurseur de l'isoleucine l'acide methyloxalacétique, 1' acide a-cétobutyrique, la thréonine et/ou l'homosérine. 3 - Procédé selon la Revendication 1 ou la Revendication 2, caractérisé en ce que l'on utilise comme composé stimulant la formation d'isoleucine par voie biochimique,l'homocystéine et/ou la methionine. 40- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 a 3, caractérisé en ce que l'on utilise le régulateur à raison de 0,01 à 10 kg/m3 de jus de fermentation, et de préférence à raison de 0,05-5,0 kg/m3 de jus de fermentation.