FR 2508059 A1 19821224 FR 8112310 A 19810623 La présente invention concerne des plasmides incorporant le gène pnp, des souches bactériennes comportant ces plasmides et un procédé de production de polynucléotide phosphorylase. La polynucléotide phosphorylase est une exonucléase capable, soit de dégrader séqentiellement les ribopolymeres, soit de polymériser les ribonucléosides 5' diphosphates en polymère de très grande taille. En outre, l'enzyme à haute concentration et dans certaines conditions synthétise des oligoribonucléotides de séquence prédéterminée ; ce type d'activité catalysée in vivo reste à démontrer. Bien que présente chez toutes les bactéries, la polynucléotide phosphorylase ne possède aucune fonction connue et aucun phénotype ne lui est rattaché. L'intérêt présenté par cette enzyme réside dans les produits formés, essentiellement les ribopolymères et les homopolymères tels que polyA, polyU et polyG par exemple, ou hétéropolymères tels que polyAU et polyAUG par exemple, ainsi que les oligo ribonucléotides qui peuvent etre de composition variée. Ces produits sont utilises quotidiennement dans de multiples laboratoires de recherche. Pour certains d'entre eux, polyA par exemple, la demande pourrait devenir très grande car il vient d'être montré que le polka intervient comme adjuvant dans la rémission des cancers du sein. Les expérimentations actuelles exigent une production de polyA de l'ordre de la centaine de grammes. Un autre domaine intéressant est constitué par la synthèse d'oligodésoxyribonucléotides à séquence définie. Il s'agit, en fait, de la synthèse de petits fragments d'ADN dont la séquence est déterminée par l'expérimentateur. De tels fragments sont extrèmement recherchés sur le "marché scientifique" car ils permettent de réaliser une multitude de constructions génétiques : en effet, grâce à eux, il est possible de joindre deux brins d'ADN coupés par différents enzymes de restriction. Il est aussi possible d'introduire à volonté de nouveaux sites de restriction préalablement choisis, simplifiant alors considérablement les opérations de clonage. Enfin, en copiant une séquence d'ADN connue et en modifiant intentionnelle nt une paire de bases, il est possible d'obtenir une mutagénèse dirigée par intégration du fragment au sein d'une cible bien définie. Actuellement, les ribopolymères sont vendus par quelques firmes (Miles, Boehringer, Choay) qui vendent également de la polynucléotide phosphorylase peu purifiée (Miles, Sigma, Boehringer) à l'exception de Choay qui vend une enzyme très pure. Mais, la synthèse in vivo s'effectue en faible quantité (de l'ordre de 0,02 %) et sa purification est difficile et coûteuse car longue et d'un rendement faible. Il était donc intéressant de mettre au point un procédé permettant de préparer la polynucléotide phosphorylase en quantités importantes en utilisant des mutants surproducteurs. C'est pourquoi la présente invention concerne un plasmide, caractérisé en ce qu'il comporte au moins - le fragment d'ADN bactérien porteur du gène structural de la polynucléotide phosphorylase et - un fragment d'ADN d'un plasmide bactérien. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, on utilise comme plasmide vecteur un fragment du plasmide pBR322, en outre le fragment d'ADN bacterien porteur du gène de la polynucléotide phosphorylase oui sera appelé ci-après "gène pnp" mesure de préférence environ 1,5 Md. L'invention concerne également un procédé de préparation d r un plasmide, caractérisé en ce que l'on intègre dans un plasmide bactérien un fragment d'ADN porteur du gène pnp et d'un gène voisin conférant un phénotype particulier. En effet, le gène pnp ne présentant aucun phénotype connu, il a fallu chercher à isoler un fragment de restriction assez grand pour porter, outre le gène pnp, un gène voisin permettant ainsi une sélection positive. La figure l représente la localisation du gène pnp par rapport aux gène voisins sur le chromosome d'Escherichia coli. Les distances sur le chromosome sont exprimées en minutes et les gènes représentés sont les suivants argG : gène structural de l'arginirosuccinate synthétase, nusA : gène nécessaire à l'expression du gène N du bactériophage A, psO : gène structural de la protéine ribosomfque S15, pnp : gène structural de la polynucléotide phosphorylase, mtr : mutation provoquant la résistance au 5-méthyltryptophane. C'est le gène argG qui a été choisi car il permet de supprimer l'auxotrophie en arginine et se trouve au voisinage du gène pnp comme cela ressort de la figure 1. Afin d'isoler le fragment d'XDN porteur de ces deux.gènes, il a fallu avoir recours à un mutant obtenu par insertion dans le gène pnp du transposon Tn5 qui code pour la résistance a la kanamycine. C'est en s'appuyant sur le poids moléculaire du transposon inséré que la tactique a été définie. En effet, ce transposon possède une masse relativement élevée (3,7. 106 daltons), aisément repérable dans les systèmes d'analyse. On a donc comparé deux fragments d'ADN porteurs lu gène pnp, l'un des deux fragments portant en sus le transposon inséré dans le gène pnp. Le découpage de ces fragments par des enzymes de restriction ne coupant pas le transposon permet de repérer aisément, par électrophorèse sur gel d'agarose, le fragment porteur du gène pnp intact (pnp+) et d'en déterminer ainsi la masse. L'expérience permet ainsi de montrer que le gène pnp est porté par un fragment de restriction d'environ~107 daltons, assez grand pour porter également le gène argG. Dans un premier temps, on vérifie, en clonant dans un plasmide le fragment ainsi obtenu porteur du gène muté, que le gène argG est bien aussi sur ce fragment. Dans un deuxième temps, on clone directement le gène pnp en sélectionnant pour l'auxotrophie en arginine d'une souche argG. Le plasmide ainsi obtenu est isolé, sa carte de restriction établie, et un fragment plus petit sous-cloné dans un autre plasmide pBR322. Le gène pnp constitue -ainsi environ 50 % du fragment d'ADN cloné. L'invention concerne, en outre, les souches bactériennes, en particulier d'Escherichia coli, transformées a l'aide des plasmides selon l'invention, ainsi qu'un procédé de préparation de polynucléotide -phosphorylase caractérisé en ce qu'on met en fermentation un milieu de culture par une souche transformée et en ce qu'on récupère la polynucléotide phosphorylase produite. La souche Escherichia coli JC 357/pBP 111 a été déposée le 23 juin 1981 dans la Collection Nationale de Culture de Microorganismes de 1'INSTITUT PASTEUR -sous le numéro I 162. Les exemples suivants sont destinés a illustrer la présente invention mais ne la limitent en aucune façon. Extraction de l'ADN é-pisomal Le procédé mis en oeuvre est adapté des procédés décrits par Thompson R, Hugues SG, Broda P (1974), Plasmid identification using specific endonucleases, Mol. Gen. Genet. 133 : 141-149 et par Birnboim HC, Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, Nucal. Acids Res. 7 : 1513-1523. Un litre de culture bactérienne est lysé comme cela est décrit par Thompson et centrifugé 30 mn à 24 000 tours/minute sur un rotor SW27. Le surnageant est écarté et le culot est dissous à 200C dans 7 mi de tris-HCl, 25 mM, pH 8, contenant 10 mM d'EDTA, après addition de 13 ml de soude 0,2 N contenant 1 % de SDS. Après dissolution totale, 10 ml d'acétate de sodium 3 M, pH 4,8, sont ajoutés t après précipitation pour 60 mn à 200C, le complexe de nucléoprotéine est éliminé par centrifugation durant 5 mn à 6 000 g et l'ADN épisomal est récupéré par précipitation dans l'éthanol à -200C pendant 2 heures. Le culot obtenu après 30 mn de centrifugation à 4 000 g est redissous dins tris-HCl, 10 mM, pH 7,5, contenant 10 mM d'EDTA et 0,8 M NaCl puis de nouveau reprécipité avec 2 volumes d'éthanol. Cet ADN est centrifuge à l'équilibre avec un gradient de chlorure de césium contenant du bromure d'éthidium comme cela a déjà été décrit dans Thompson. Les deux bandes résultantes correspondent à 1'ADN épisomal et 1'ADN relaxé contaminé par un petit ADN chromosomique.Les bandes sont collectées et le bromure d'éthidium est éliminé par 3 à 4 extractions avec du 2-propanol.-L'ADN est alors précipité avec 4 volumes d'alcool à 70 * en 60 mn à -200C ; le précipité est centrifugé et 1'ADN est redissous dans une solution de tris-HCl, 10 mM, pH 7,5 contenant 0,1 nLM d'EDTA. Extraction de l'ADN plasmidique L'ADN plasmidique est obtenu par le procédé décrit par Birnboim, puis purifié lorsque cela est nécessaire par centrifugation dans un gradient de chlorure de césium comme cela a été dit précédemment. L'ADN ainsi obtenu est redissous dans un tris-HCl, 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM et extrait à 200C en deux foi; par un mélange 50/50 phénol/chloroforme. Après précipitation à l'éthanol, 1'ADN est séché et redissous dans 1'EDTA 1mM. Digestion La digestion de 1'ADN par les endonucléases de restriction est effectuée comme cela est indiqué par le fournisseur des différentes enzymes dans des volumes variant de 10 à 20 l pendant des périodes variables. Après digestion, la réaction est stoppée par addition d'EDTA 10 mM et chauffage à 650C pendant 10 mn. Lorsque 1'ADN doit être digéré par deux enzymes, la première digestion est toujuurs conduite avec l'enzyme nécessitant la force ionique la plus faible. Electrophorèse sur gel d'agarose L'ADN rprès découpage ou ligation est analysé sur gel d'agarose à 0,7 % dans un tri-acetate 40 mM, pE 7,7, contenant 5 mM d'acétate de sodium et 1 mM d'EDTA. L'électrophorèse est conduite à un potentiel de 1,5 V/cm pendant 18 heures. Le gel est alors fixé dans une solution de bromure d'éthidium à 1 ug par ml et les bandes d'ADN sont détectées par fluorescence sous lumière ultra-violette. Le poids moléculaire de ces bandes est déterminé par comparaison avec les distances de migration obtenues à partir de marqueurs de poids moléculaires connus. Ligation des fragments d'ADN La réaction est en général conduite dans le tampon suivant (volume final 1 à 60 l) : tris-HCl 57,5 mM pH 7,6 ; MgCl2 7 mM ; NaCl 50 mM ; dithiotreitol (Calbiochem) 10 mM ; EDTA 1 mM ; ATP 0,1 mM. A ce tampon on ajoute 3 à 30 g d'ADN et 1 à 2 unités de T4 AD ligase. L'incubltion dure 16 heures à une température comprise entre 12 et 220C, l'avancement de la réaction est contrôlé par analyse d'une partique aliquote sur gel d'agarose. Transformation Les transformations sont conduites selon le procédé décrit par Cohen SN, Chang ACY, Hsu L. (1972) Non chromosomal antibiotic resistance in bacteria : genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl. Acad. Sci., USA 69 : 2110-2114. Avant d'étaler les bactéries sur milieu sélectif, elles sont incubées pendant au moins 90 mn à 370C sur milieu riche (LB) tel que décrit par Miller J.H. (1972) ; Experiments in molecular gènetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, p. 431. La concentration en antibiotiques des plaques est la suivante (g/ml) ampicilline (Ap) 25 J . tetracycline (Tc) 10 , chloramphénicol (Cm) 25 kanamycine (Km) 50 Les procédés généraux décrits précédemment sont utilisés dans ce qui va suivre pour préparer les plasmides selon la présente invention. -Identificati-o-n des- fragments d'ADN portant les gènes pnp + L'ADN des épisomes JCH5 (pnp ) (Takata R (1978) Genetic studies of the ribosomal proteins in Escherichia coli I Mapping of the genes for L21, L27, S15 and S21 by using hybrid bacteria and overproduction of these proteins in the merodiploid strains, Mol. Gen. Genet. 160 : 151-155) et JCP (pnp::Tn5) (Portier C (1980), Isolation of a polynucleotide phosphorylase mutant using a kanamycine resistant determinant. Mol. Gen. Genet. 178 : 343-349) sont mis à digérer avec EcoR1 qui ne coupe pas Tn5. Dans ces conditions, un fragment de restriction d'environ 13,5 Md est clairement distingué dans le profil de digestion de l'épisome JCP portant Tn5 et est absent dans le profil de restriction de l'épisome JCH5-. Toutefois, dans ce profil de restriction on distingue un fragment d'environ 10 Md. La différence de poids moléculaire peut raisonnablement correspondre à la présence dans le fragment le plus lourd des 3,8 Md de Tn5. Ainsi il est très probable que le fragment de 10 ? porte le gène pnp ainsi que le gène argG, car la distance entre argG et pnp correspond à un maximum de 5 à 7 Md. Clonage des gènes pnp::Tn5 et argG dans le vecteur pACYC184 Le plasmid pACYC184, décrit par Chang ACY, Cohen SN (1978) Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid; J. Bacterial 134: 1141-1156, code pour les résistances au chloramphénicol et a la tétracycline. A cause de son site de restriction EcoR1 unique placé dans le gène codant pour la résistance au chloramphénicol, pACYC184 représente un, excellent vecteur pour cloner par sélection en utilisant la résistance à la tétracycline et l'inactivation par insertion de la résistance au chloramphénicol.Le fragment EcoRl de JCP est ligaturé avec 1'ADN de pACYC184 digéré par EcoR1 puis utilisé pour transformer la souche JC1553 (argG@), on sélectionne d'abord les clones résistant à la tétracycline (Tcr). La réplication de ces clones sur une plaque contenant de la kanamycine permet d'identifier 39 clones Kmr, dont 33 sont capables de croitre sur un milieu supplémenté avec de la méthionine, de l'-histidine et de la leucine. L'ensemble de ces clones est également sensible au chloramphénicol (Cms). On peut donc en déduire que ces 33 plasmides portent une insertion permettant l'expression des gènes pnp::Tn5 et argG. Ces souches sont purifiées et l'AND et les plasmides sont extraits. Ces plasmides présentent le même poids moléculaire, environ 15,5 Md. Ceci est en accord avec les valeurs attendues, 13,5 Md pour le fragment EcoRI deJCP, plus de 2,65 Md pour le vecteur, c'est- -dire un total de 16,15 Md. L'un de --s plasmides pBP200 est choisi pour être utilisé dans ce qui va suivre. Clonage des gènes pnp+ dans le vecteur pACYO184 Le clonage du gène sauvage pnp est conduit comme cela a été décrit précédemment avec les deux seules différences suivantes 1) la souche réceptrice est JC357 (Pnp ArgG), et 2) les transformants Tcr sont criblés pour leur caractère argG+ et leur sensibilité au chloramphénicol. Un clone JC357/pBR280 est isolé qui présente le caractère Tcr, Cms, Arg+. Détermination de l'activité polynucléotide phosphorylase L'activité de phosphorolyse et d'échange est mesurée sur des extraits bruts de bactéries après sonication et dialyse comme cela a été décrit dans Portier C. (1980), Isolation of a polynucleotide phosphorylase mutant using a kanamycin resistant determinant. Mol. Gen. Genet. 178 : 343-349. La localisation de l'activité polynucléotide phosphorylase in situ dans un gel de polyacrylamide en utilisant la réaction de polymérisation a déjà été décrit dans Thang MN, Thang DC, Léautey J. (1967), Séparation et identification de polynucléotide phosphorylase par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, CR. Acad. Sci., Paris 265 : 1823-1826. Les résultats observés avec le clone JC357/pBP280 sont- représentés au tableau I. L'activité spécifique de polynucléotide phosphorylase de la souche JC 357/pBP 280 est 5 à 6 fois supérieure à celle de la souche sauvage. Ainsi le plasmide pBP280 porte bien le gène pnp+. Le poids moléculaire de cet ADN est d'environ 12 Md, ce qui correspondant au poids moléculaire attendu dans ler; limites de l'erreur expérimentale. Carte de restriction de pBP280 et pBP200 Comme Tn5 est inséré dans le gène pnp de pBP200, la position approximative du gène pnp est ainsi donnée par-localisation du transposon sur le fragment d'ADN clone. Aorès une simple ou double digestion avec HindIII, BamHI et Smalt et TABLEAU I Activité spécifique de polynucléotide phosphorylase dans un extrait brut -de souches avec un plasmide comportant le gène pnp+ Activité spécifique ( mole/mg x h) Réaction Souches JC357 JC357/pBP280 Jc357/pBP111 phosphorolyse - 1,3 2,0 échante 0,02 7,9 22,6 TABLEAU II Propriétés des plasmides hybrides Origine du Site dans Plasmide Phénotype Fragment cloné fragment cloné Vecteur le vecteur pBP 280 Arg+, Tcr, Cms, Kms, Pnp+ EcoRI F' (JCH5) pACYC 184 EcoRI pBP 200 Arg+, Tcr, Cms, Kmr, Pnp- EcoRI F' (JCP) pACYC 184 EcoRI pBP 111 Apr, Tcs, Kms, Pnp+ EcoRI-HindIII pBP 280 pBR 322 EcoRI/HindIII pBP 202 Apr, Tcs, Kmr, Pnp- EcoRI-HindIII pBP 200 pBR 322 EcoRI/HindIII pBP#2 Apr, Tcs, Kms, Pnp- EcoRI-SacII2/SacII1-HindIII pBP 111 pBR 322 EcoRI/HindIII pBP#60 Apr, Tcs, Kms, Pnp- EcoRI-HpaI4/HapI3-HindIII pBP 111 pBR 322 EcoRI/HindIII pBP#93a Apr, Tcs, Kms, Pnp+ EcoRI-HindIII pBP 111 pBR 322 EcoRI/HindIII pBP#61 Apr, Tcs, Kms, Pnp+ EcoRI-HpaI2/HpaI1-HindIII pBP 111 pBR 322 EcoRI/HindIII pBP#C9 Apr, Tcs, Kms, Pnp- EcoRI-PstI5/PstI3-HindIII pBP 111 pBR 322 EcoRI/HindIII pBP 22 Aps, Tcr, Kms, Pnp+ PstI1-PstI5 pBP 111 pBR 322 PstI a) pBP#93 est formé par suppression spontanée des sites HpaI2-3 de pBP111. en connaissant la position des sites de restriction dans pACYC184 et dans le transposon Tn5, il est possible de construire la carte de restriction indiquée dans la figure 2. La digestion de pBP200 avec SmaI permet de -déterminer l'orientation du transposon car Tn5 présente un seul site SmaI placé de façon asymétrique. Le transposon est ainsi localisé dans le fragment de 3 Md défini par le site EcoRl et le sint HindIII. La position des extrémités de Tn5 peut être déduite, car la longueur est connue : une est localisée à environ 1 Md du site EcoRI et l'autre à 2 Md du site HindîlI (voir figure 2). Sous-clonage de-s gènes pnpe et pnp:-: Tn5 dans le plasmide pBR322 Le poids moléculaire des sous-unités de polynucléotide phosphorylase (Portier C. (1975), Quaternary Structure of polynucleotide phosphorylase from Escherichia coli : evidence of a complex between two types of polypeptide chains. Eur. J. Biochem. 55 573-582), suggérerait que les gènes nécessitent environ 1,5 Md de capacité de codage ADN. Ceci représente environ 50 * du fragment EcoR1 HindIII qui contient probablement le gène pnp intact. Ce fragment est clone dans pBR32 et de nombreux plasmides hybrides avec un poids moléculaire correspondant à 5,8 Md (2,8 Md le pBR322 + le fragment de 3 Md) sont sélectionnés. L'un d'entre eux, pBP111, possède un seul site EcoRl, HindîlI et SmaI. Ce plasmide transforme la souche JC357 avec une haute fréquence en donnant les clones Pnp+, Apr et Tcs. L'activité de polynucléotide phosphorylase déterminée soit par échange, soit par phosphorolyse, (résultats indiqués au tableau I) montre que l'extrait brut contient une activité de 10 à 20 fois supérieure pour JC357/pBPlll que pour la souche sauvage. Ces résultats démontrent que le gène pnp est certainement localisé dans le fragment de 3Md EcoR1-HindIII. Les génotypes des souches bactériennes utilisées et les phénotypes des plasmides de la technique- antérieure sontrappelés dans le tableau III. Des études complémentaires par restriction de 1'ADN portant le gène pnp conduisent à des plasmides représentés schématiquement à la figure 3 et présentant des phénotypes indiqués au tableau Il. Cette étude démontre que le gène pnp est situé à gauche de HpaI3 et s'étend au-del du site PstI3. TABLEAU III Souches bactériennes Souches Génotype Origine / référence JC 1553 F- argG6, metB1, his1, leu6, recA1, C G S C a mt112, xy17, malA1, gal6, lacY1, rpsL104, tonA2, tsxl, #R, #-, supE44 JC 355 F- argG6, metB1, his1, leu6, mt12, C G S C a xy17, malA1, gal6, lacY1, tonA2, tsxl, #R, R-, supE44 JCH5/JC 1553 F' argG+/JC 1553 R. Takata JC 3559 rspL dérivé de JC 355 (mutant spontané) JC 3560 pnp::Tn5 dérivé de JC 3559 transduction P1 JC 357 Dérivé recA de JC 3560 Plasmides Phenotype pACYC 184 Cmr, Tcr Chang and Cohen (1978) PBR 322 Apr, Tcr Bolivaret al. (1977) a Col i Genetic Stock Center, Yale University, U.S.A. REVENDICATIONS 1) Plasmide, caractérisé en ce qu'il comporte au moins : - le fragment d'ADN bactérien porteur du gène structural de la polynucléotide phosphorylase, et - un fragment d'ADN d'un plasmide bactérien. 2) Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fragment d'ADN d'un plasmide bactérien provient de pBR322. 3) Plasmide selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le fragment d'ADN bactérien porteur du gène structural de la polynucléotide phosphorylase mesure environ 1,5 Md. -4) Plasmide selon l'une des revendications 1 à 3, pBP 280 et pBP 111. 5) Procédé de préparation d'un plasmide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on intègre dans un plasmide bactérien un fragment d'ADs porteur du gène pnp et d'un gène voisin conférant un phénotype particulier. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le phénotype particulier est le phénotype ArgG 7) Souches transformées par un plasmide selon l'une des revendications 1 à 4. 8) Souches selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'il s'agit d'Escherichia coli. 9) Procédé de préparation de polynucléotide phosphorylase par mise en fermentation d'un milieu de culture par une souche selon l'une des revendications 7 et '8 et récupération de la polynucléotide phosphorylase produite.