FR 2505829 A1 19821119 FR 8208355 A 19820513 La présente invention concerne un nouveau procédé amé- lioré pour l'élimination du groupe N-formyle de peptides, ou de leurs esters, N-formylés, par traitement desdits peptides ou de leurs esters, en solution alcoolique, dans des condi- tions de p H bien définies, avec de l'hydrazine ou des dérivés de l'hydrazine. Il est connu d'après la littérature chimique, que le groupe amino d'un aminoacide peut être bloqué par le résidu formyle afin de le protéger au cours d'une synthèse peptidi- que Il convient évidemment à la fin du procédé, de libérer ce groupe amino en éliminant ledit résidu Toutefois, alors que le premier stade du procédé, à savoir la formylation, est presque toujours aisément réalisé, on n'obtient pas des ré- sultats aussi bons lorsque l'on procède à la déformylation finale suivant les méthodes classiques. En effet, bien que les conditions de déformylation adoptées communément soient assez simples, les résultats ob- tenus sont souvent décevants car ils s'accompagnent d'altéra- tions plus ou moins profondes du peptide qui affectent égale- ment la liaison peptidique elle-même Ceci se produit lors- qu'on opère dans les conditions courantes de déformylation, c'est-à-dire en solutions hydro-alcooliques (avec des al- cools comportant 1-5 atomes de carbone), en présence d'acides forts, tels que les acides chlorhydrique, sulfurique, nitri- que, para-toluènesulfonique ou trifluoroacétique. Les altérations précitées sont encore plus manifestes lorsque au lieu d'être représentées par un peptide formylé, le substrat est représenté par un peptide à la fois formylé et estérifié, car en dehors des inconvénients mentionnés ci- dessus, on observe également de façon plus ou moins marquée, l'hydrolyse du groupe ester et la formation de la dicétopipé- razine correspondante. On trouve des notes bibliographiques relatives à la déformylation des peptides dans: Zehra, A, Ber 23,3625 ( 1890); Hillmann-Elies, A, Naturforsch, 6 B, 340 ( 1951); Waley, S G, Chem Ind, 1953, 107; Boissonnas, R A, Helv. Chim Acta, 36, 875 ( 1953); Sheehan, J C, J Am Chem Soc. ,1154 ( 1958); on trouve d'autres descriptions détaillées dans la chimie classique des peptides (J Greenstein: Chem. of Acids, II, 1244, 46, 47) Les auteurs cités ci-dessus ont étudiés la déformylation en milieu acide. Plus récemment, d'autres chercheurs ont opéré dans des conditions différentes et ont obtenu de meilleurs résultats en utilisant comme agents déformylants, d'autres substances, telles que le chlorure d'acétyle ou encore l'hydroxylamine ou l'hydrazine, en déclarant toutefois que cette dernière n'est pas adaptée à la déformylation des esters du fait qu'elle conduit à la formation des hydrazides correspondants (Lefran- cier, Bull Soc Chim France 1965, 3668; Geiger, brevet bri- tannique N 1 182 450). D'autres encore ont déformylé des peptides ou des es- ters de peptides par oxydation avec H 202 (Losse, Am Chem. 1960, 636, 140) ou par hydrogénolyse (Losse, J Prakt Chem. 1964, 24, 118). L'importance de la N-déformylation des peptides, ou de leurs esters Nformylés est également évidente du point de vue industriel. Un exemple à ce sujet est fourni par la préparation d'un composé connu de structure peptidique, ayant des carac- téristiques édulcorantes intenses, à savoir l'ester méthyli- que de l'o -L-aspartyl-L-phénylalanine, également connu sous le nom de laspartame". Ladite substance a été préparée de nombreuses façons différentes et suivant pratiquement tous les procédés utili- sés dans les synthèses classiques des peptides, et de façon particulière par l'intermédiaire du blocage du groupe amino de l'acide aspartique, de l'activation de son groupe v-car- boxyle sous forme d'ester actif ou d'anhydride, de la réac- tion de condensation avec l'ester méthylique de la phénylala- nine, et le déblocage du groupe amino du peptide estérifié ainsi obtenu. Les procédés de productions industrielles concernant la préparation de l'ester méthylique de l'o(-L-aspartyl-L- phénylalanine se heurtent à des difficultés pratiques nota- bles pour ce qui est du choix du schéma théorique à adopter, comme du fait que nombre de ces schémas comportent l'emploi de substances toxiques, telles que le phosgène ou d'utilisa- tion difficile telles que le chlorure de benzyloxycarbonyle, comme, enfin, du fait que lesdits schémas conduisent au pro- duit voulu avec des rendements très bas. Le procédé industriel relativement le plus approprié à la préparation de l'aspartame, comporte la condensation de l'anhydride de l'acide N-formyl-L-aspartique avec l'ester méthylique de la L-phénylalanine et la N-déformylation sub- séquente de l'ester méthylique de la N-formyl-" -L-aspartyl- L-phénylalanine, ainsi obtenu On met en oeuvre la N-déformy- lation en opérant soit en présence d'un solvant spécifique et d'acides inorganiques forts (Takemoto, demande de brevet de la République Fédérale Allemande publiée sous le NO 2 635 948) soit avec l'hydroxylamine (Takemoto, demande de brevet de la République Fédérale Allemande publiée sous le NO 2.554 421), ou par chauffage avec de l'eau (Takemoto, Jap. Kokai, 76 39 602), ou avec de l'acide chlorhydrique méthano- lique (demande de brevet de la République Fédérale Allemande publiée sous le NO 2 256 055) Les méthodes décrites dans ces documents constitués par des brevets présentent les inconvé- nients que l'on peut rencontrer, de façon plus-générale, dans les réactions de déformylation d'autres peptides (ou de leurs esters) Nformylés, et en tout premier lieu, l'insuffisance des rendements obtenus au niveau du stade final de la synthè- se, accompli sur des intermédiaires relativement coûteux. Comme toujours, cette insuffisance de rendement s'accompagne en outre de l'impureté notable du produit qui doit être évi- demment purifié avec une augmentation ultérieure des coûts de préparation. On a maintenant trouvé de façon surprenante selon l'intervention que l'élimination du reste formyle de peptides (ou de leurs esters) Nformylés peut être réalisée de façon simple, avec une augmentation inattendue et considérable des rendements de réaction en réalisant le clivage en présence d'hydrazine ou de dérivés de l'hydrazine, dans un intervalle de p H critique, et précisément compris entre 1 et 3,5. Le but de l'invention est par suite atteint par un procédé pour l'élimination du groupe N-formyle à partir de peptides, ou de leurs esters, N-formylés et en particulier pour l'élimination dudit groupe de l'ester méthylique de la N-formyl-o(-L-aspartyl-L-phénylalanine par traitement avec de î'hydrazineou des dérivés del'hydrazine de formule I: R--NH-NH 2 (I) dans laquelle R représente un reste alkyle en C 1-C 5, saturé ou insaturé, à chaîne linéaire ou ramifiés, ou un reste cy- cloalkyle, ou un reste aryle, portant éventuellement d'autres groupes fonctionnels, ou un groupe amino, ce traitement étant effectué à un p H compris entre 1 et 3,5. Comme déjà mentionné ci-dessus, dans le procédé de l'invention, le p H doit être compris entre 1 et 3,5 Même lorsque l'on opère uniquement avec des acides en absence d'hydrazine ou de dérivées de formule (I), si la réaction est conduite à p H inférieur à 1, déjà après une heure à 60 C, l'ester formylé de départ a complètement disparu, mais il s'est formé peu de produit déformylé (environ 15 %), tandis qu'en CCM (chromatographie sur couche mince) on observe la présence abondante de "dicétopipérazine" Si l'on opère au contraire à p H supérieur à 3,5, la déformylation se produit de façon insignifiante même en prolongeant de façon excessive les temps de réaction L'intervalle de p H dans lequel on doit opérer doit par suite être maintenu constant au cours de la réaction étant donné qu'à mesure que la base se trouve libé- rée, le p H tend à s'élever Ce contrôle peut être réalisé par addition graduelle au mélange réactionnel, d'une solution d'un acide inorganique, cornme par exemple une solution d'aci- de chlorhydrique à 10 % ou d'acide sulfurique, ou encore d'acide ptoluènesulfonique On peut également faire usage de solutions tampons convenables. On a déjà mentionné ci-dessus le fait que d'autres chercheurs ont estimé que l'hydrazine n'est pas adaptée à la déformylation des esters de peptides N-formylés à cause de la formation possible des hydrazides correspondants (P Lefran- cier et coll, Bull Soc Chim France, 1965, 3668). On a toutefois constaté d'une manière surprenante que cet inconvénient peut être réduit au minimum si l'on opère, selon l'invention, dans l'intervalle de p H compris entre 1- 3,5 Du point de vue des conditions expérimentales, la quan- tité d'hydrazine peut varier de 1 à 3 moles par mole de pep- tide (ou son ester) à déformyler, tandis que le solvant peut être le méthanol, ou des mélanges de méthanol et d'eau, ou également d'autres solvants, bien que la nature et la quan- tité desdits solvants ne soit pas très significatives Dans tous les cas, pour un bon déroulement de la réaction, il faut également ici amener initialement le p H du mélange comme déjà observé dans l'intervalle de 13,5 et de maintenir cette valeur au cours de la réaction, qui peut être conduite entre 20 WC et 1000 C, naturellement pendant des durées diffé- rentes suivant la température L'acide à utiliser peut être un acide minéral, tel que l'acide chlorhydrique ou sulfurique ou nitrique, ou également l'acide para-toluènesulfonique. On a enfin constaté dans le cadre de l'invention que la N-déformylation se produit avec des rendements encore amé- liorés lorsqu'on effectue la réaction en présence de substan- ces du type R-?NH-NH dans laquelle R est défini comme spécifié ci-dessus Ladite réaction se déroule avec une simplicité particulière dans des conditions d'altération minimale et avec des rendements très bons, variant de 75 % àplus de 90 % selon le composé employé On a ob- servé que l'efficacité des substances du type R-C-NH-NH comme agents de déformylation est particulièrement accentuée dans le cas de l'acétylhydrazine (qui est le composé le plus simple), de la benzoylhydrazine, du chlorure de triméthylami- noacétyl-hydrazide (Girard T, qui est plus complexe et qui contient d'autres groupes fonctionnels) et du semicarbazide. Dans la mesure o l'on se réfère aux conditions expérimenta- les, la quantité du composé déformylant est comprise entre 1 et 5 moles par rapport à une mole du peptide (ou son ester) à déformyler On peut également employer des quantités plus grandes du réactif, mais sans aucun avantage économique. Le solvant est de préférence le méthanol ou des mélan- ges de méthanol-eau dans le cas des peptides, tandis que dans le cas des peptides estérifiés, il est constitué de préféren- ce par l'alcool dont est formé l'ester du peptide Toutefois également ici, la nature du solvant n'est pas déterminante, si bien que l'on peut également employer un autre alcool à nombre d'atomes de carbone variant de 2 à 5, ou d'autres sol- vants hydrosolubles, tels que le dioxanne, l'acétone, l'acé- tonitrile ou le diméthylformamide, ou encore d'autres sol- vants non solubles dans l'eau, tels que des hydrocarbures, des hydrocarbures chlorés, des éthers, des cétones, des es- ters ou des mélanges desdits solvants Tous ces solvants peu- vent être employés en présence ou en l'absence d'eau et, on peut observer des cas dans lesquels sont présentes une seule phase ou deux phases Les températures de réaction ne sont pas déterminantes, car seuls les temps de réaction diffèrent en fonction desdites températures Pour définir un ordre de grandeur, on peut dire que les températures peuvent varier de 201 C à 1500 C suivant les solvants utilisés, tandis que les temps de réaction peuvent varier de 30 minutes à 30 heures selon la température à laquelle on opère Les exemples qui suivent illustrent le procédé de l'invention dans ses diffé- rentes variantes, sans toutefois limiter ladite invention dans son cadre et son esprit. Le déroulement de la réaction est généralement très bien contrôlé par CCM, qui démontre en outre clairement la faible altération que l'on observe au cours des réactions En effet, on peut noter avec netteté, outre la présence du pro- duit déformylé, uniquement de petites quantités de "dicétopi- pérazine" Ledit composé, à savoir l'acide 2-benzyl-3,6-di- céto-5-pipérazinyl-acétique, est normalement présent dans l'aspartame du commerce en quantités de l'ordre de 2 %, si bien que la Food and Drug Administration des Etats d'Amérique (Titre 21, paragraphe 121 1258, Code of Federal Regulations) prescrit une limite maximale précisément de 2 % pour ledit composé Dans les essais de pureté effectués sur l'aspartame obtenu avec le procédé de l'invention (essais effectués au moyen de la HPLC ou chromatographie liquide sous haute pression), la teneur en "dicétopipérazine" précitée n'a jamais été supé- rieure à 0,6-0,7 %. On obtient une amélioration analogue par rapport aux produits commerciaux, en ce qui concerne une autre impuretd habituelle de l'aspartame, à savoir 1 c -aspartyl-phényla- lanine, qui est présente dans les aspartames commerciaux en quantités de l'ordre de 1 %, tandis que dans celui qui est préparé selon l'invention, sa teneur n'estjamais supérieure à 0,3 %. L'évaluation quantitative du produit de réaction s'effectue par contre en CGL (chromatographie gaz-liquide). EXEMPLE 1 On dissout 3,2 g d'ester méthylique de N-formyl-v aspartyl-L-phénylalanine ( 10 mmoles) dans 32 ml de méthanol. On ajoute 3,2 ml d'eau, puis on amène à p H 2 avec 0,5 ml de HC 1 à 3 % On chauffe à 70 C et on maintient à cette tempéra- ture pendant 10 heures en réglant de façon continue le p H par addition de la solution de HC 1 à 3 %, de façon à le maintenir dans l'intervalle de 1,5-3. Contrôle par CCM (éluant: méthyléthylcétone/acide acétique/pyridine/eau, 32-4-2-6). Révélateur ninhydrine: Une tache abondante Rf 0,35 (aspartame) Une tache Rf 0,1 (peptide déformylé et déméthylé) Une tache non attribuée Rf 0,9 Analyse par CGL Ester méthylique d'o aspartyl-L-phénylalanine 1,91 g (rendement: 65 %) EXEMPLE 2 On dissout 3,2 g d'ester méthylique de N-formyl-01-L- aspartyl-L-phénylalanine ( 10 mmoles) dans 32 ml de méthanol. On dissout à part 1,5 g de monohydrate d'hydrazine ( 30 mmoles) dans 5 ml d'eau et on amène à p H 1,5 avec HC 1 à 15 %. On ajoute cette solution à la précédente et on amène le p H à 1,5 avec HCL à 15 % On chauffe à 70 C et on maintient à cette température pendant 7 heures et demie, en maintenant toujours le p H entre 1,5-3,5 par addition de HC 1 à 15 %. Analyse par CGL: ester méthylique d' -L-aspartyl-L- phénylalanine 2 g (rendement: 70 %). EXEMPLE 3 On dissout 3,2 g d'ester méthylique de N-formyl-o-L- aspartyl-L-phénylalanine ( 10 mmoles) dans 32 ml de méthanol. On ajoute 3,2 ml d'eau et 2,2 g d'acétylhydrazine ( 30 mmoles) et on amène à p H 2,5 avec une solution de HC 1 à 10 % On chauf- fe à 54 C et on maintient à cette température pendant 8 heures, en maintenant le p H entre 1,5-3,5. Contr 8 le par CCM (éluant: méthyléthylcétone/acide acétique/pyridine/eau 32-4-2-6) Révélateur ninhydrine: Une tache Rf 0,35 (aspartame) Une tache très faible Rf 0,1 (peptide déformylé et déméthylé) Analyse par CGL Ester méthylique d'c,-L- aspartyl-L-phénylalanine 2,65 g (rendement: 90 %) EXEMPLE 4 On dissout 3,2 g d'ester méthylique de N-formyl-ci,-L- aspartyl-L-phénylalanine ( 10 mmoles) dans 32 ml de méthanol. On ajoute 3,2 ml d'eau et 5 g de réactif de "Girard T" ( 30 mmoles) et on amène à p H 2,5 avec une solution de HCA à 10 %. On chauffe à 70 C et on maintient à cette température pendant 7 heures, en maintenant le p H entre 1,5 3,5. Contr 8 le par CCM (éluant: méthyléthylcétone/acide acétique/pyridine/eau 32-4-2-6) Révélateur ninhydrine: Une tache Rf 0,35 (aspartame) Une petite tache Rf 0,1 (peptide déformylé et déméthylé) Analyse par CGL: Ester méthylique d} i -L- aspartyl-L-phénylalanine 2,2 g (rendement: 76 %) EXEMPLE 5 On dissout 3,2 g d'ester méthylique de N-formyl-ç -L- aspartyl-L-phénylalanine ( 10 mmoles) dans 32 ml de méthanol. On ajoute 3,2 ml d'eau et 3,33 g de chlorhydrate de semi-car- bazide ( 30 mmoles) Le p H est égal à 2 et par suite il n'est pas nécessaire de le corriger On chauffe à 70 C et on main- tient à cette température pendant 8 heures, en maintenant le p H entre 1,5-3,5. Analyse par CGL: ester méthylique d 'o -L-aspartyl-L-phény- lalanine 2,4 g (rendement: 83 %). EXEMPLE 6 On dissout 3,2 g d'ester méthylique de N-formyl-c(-L- aspartyl-L-phénylalanine ( 10 mmoles) dans 32 ml de méthanol. On ajoute 3,2 ml d'eau et 4 g de benzoylhydrazide ( 30 mmoles) On amène le p H à 1,5-3,5 On chauffe à 70 C et on maintient à cette température pendant 4 heures, en maintenant le p H dans l'intervalle prescrit. On évapore à siccité à température inférieure à 40 C, on reprend avec 10 ml d'eau, on amène le p H au point isoélec trique (p H = 5,2), on refroidit à O C et on filtre à la pompe. On obtient 2,5 g d'aspartame analytiquement pur (rendement ,4 %). EXEMPLE 7 On dissout 12,825 kg d'ester méthylique de N-formyl- À-L-aspartyl-L-phénylalanine dans 30 1 de dichloroéthane auquel on ajoute 10 1 d'acide acétique glacial, 10 1 de mé- thanol, et 14 kg d'acétylhydrazine On amène à 64 C et on rè- gle le p H en l'amenant à 2,2-2,3 par addition d'une solution d'acide chlorhydrique concentré En maintenant toujours le p H dans l'intervalle de 2,2-2,3, on chauffe à 64 C Dans ces conditions, la réaction de déformylation est terminée au bout de 5 heures. Le volume final est de 80 1. Sur la solution de réaction, on détermine, par des analyses en HPLC, la teneur en ester méthylique d' -L- aspartyl-L-phénylalanine: 132 mg/ml. Les conditions analytiques sont les suivantes: Colonne: RP 8 10/;, température de la colonne 45 C, débit 2 ml/min, révélateur UV à 215 nm. Eluant: tampon au phosphate à p H 7,5 0,01 M/acétonitrile lichrosolve = 9/1 Temps de rétention de l'ester méthylique de 1 ' o(-L-aspartyl- L-phénylalanine (aspartame) 5,2 min. Le rendement en ester méthylique d' o -L-aspartyl-L- phénylalanine est de 10,55 kg ( 90 % de la théorie). On élimine sous vide le dichloroéthane et le méthanol, on ajoute 50 litres d'eau et on amène à p H 5,2, le point iso- électrique de précipitation de l'aspartame On refroidit avec de la saumure à -5 C pendant 10 heures et on centrifuge l'as- partame ainsi obtenue, en lavant bien le gateau de produit. Après déssiccation à 45 C dans un courant d'air, on obtient 9 kg d'aspartame ayant les caractéristiques qualitatives sui- vantes: Titre (HPLC): 99,3 à sec Dicétopipérazine (acide 2-benzyl-3,6-dicéto-5-pipérazinylac- étique): 0,5 %. N-L-o -Aspartyl-L-phénylalanine (aspartame déméthylé): 0,1 %. Les eaux-mères contenant environ 1,5 kg d'aspartame sont re- cyclées dans l'opération suivante, ce qui permet d'obtenir en pratique une récupération pratiquement quantitative de l'aspartame produit. Deux échantillons commerciaux de provenance différente ont fourni les résultats analytiques suivants: Echantillon "A" Titre (HPLC) 98,4 %; "Dicétopipérazine" 0,7 %; aspartame déméthylé 2,1 %; Echantillon "B" Titre (HPLC) 97,0 %; "Dicétopipérazine" 2,74 %; aspartame déméthylé 0,45 %. Sur le produit final, les conditions analytiques ob- tenues par HPLC sont les suivantes: Colonne: lichrosorbe RP 18, 10/,, longueur 25 cm, diamètre intérieur 4 mm. Eluant: tampon au phosphate p H 4/méthanol: 60/40 pour la détermination du titre de l'aspartame; 75/25 pour la déter- mination des impuretés. Débit: 2 ml/min. Révélateur: UV à 210 nm. Temps de rétention: Aspartame: 12,8 min ( 3,6 min dans la détermination du titre) "Dicétopipérazine": 5,1 min. aspartame déméthylé: 3,3 min. REVENDICATIONS 1 Procédé pour l'élimination du groupe N-formyle de peptides N-formylés ou d'esters de peptides N-formylés, ca- ractérisé par le fait que l'on fait réagir les peptides N- formylés ou leurs esters avec de l'hydrazine ou des hydra- zines substituées de formule I R-C-NH-NH 2 (I) dans laquelle R rep ésente un reste alkyle en Cl-C 5, saturé ou insaturé, à chaîne linéaire ou ramifiée, ou un reste cycloalkyle, ou un reste aryle, comportant éventuellement d'autres groupes fonctionnels, ou un groupe amino, dans des conditions de p H maintenu constant entre 1 et 3,5 pendant la réaction, soit par addition d'un acide inorganique, soit par addition d'une substance tampon. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise l'hydrazine ou le composé de formule I à raison de 1-5 moles par mole de peptide, ou de son ester, N-formylé. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise comme composé de formule I, l'acé- tylhydrazide. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise comme composé de formule I, le ben- zoylhydrazide. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise comme composé de formule I, le réac- tif de 'Girard Tu. 6 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise comme composé de formule I, le semi- carbazide. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-6, caractérisé par le fait que la température de réaction est comprise entre environ 200 C et environ 1500 C. 8 Procédé selon l'une quelconque des revendication 1-7, caractérisé par le fait que l'on opère dans des solvants constitués par des alcools comportant 1 à 5 atomes de car- bone, éventuellement en présence d'eau. 9 Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé p le fait que l'on opère dans des solvants choisis dans le groupe constitué par les cétones, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, l'acétonitrile, les esters aliphatiques, les hydrocarbures, les hydrocarbures chlorés, ou leurs mélan- ges, éventuellement en présence d'eau. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé par le fait que le composé soumis à la N-déformylation est l'ester méthylique de la N- formyl-c -L-aspartyl-L-phénylalanine, le produit obtenu étant l'aspartame.