FR 2508928 A1 19830107 FR 8209607 A 19820602 27-désamidosécrétine, préparation de celle-ci par la technique de l'ADN recombinant, ainsi que souche d'Escherichia coli transformée, polydésoxyribonucléotides à deux chaînes et plasmides utilisés dans cette préparation. L'invention concerne la 27-désamidosécrétine (U27n sera parfois omis ci-après) et sa préparation. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé de préparation de désamidosécrétine par une technique de génie génétique avec utilisation d'un gène de structure approprié a' la désamido- sécrétine et que l'on a synthétisé chimiquement. La sécrétine est un compose connu comme l'une des hormones gastro-intestinales. Il est deux connu qu'elle a des activités physiologiques telles qu'une action favorisant la sécrétion d'eau et de bicarbonates par le pancréas et on l'u- tilise pratiquement pour un test de la fonction pancréatique ou comme agent thérapeutique pour l'ulcère duodénal. Dans la suite de la présente description, on se re férera aux publications suivantes, qui, dans un souci de concision, seront désignées par les chiffres de référence 1) à 24) de la liste qui suit. Références 1) Acta Chemica Scandinavica, 15, 1790, (1961) 2) a) Chemical industry, 1966, 1757, b) Journal of the American Chemical Society, 89, 6753, (1967) ; 3) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of América , 75 , 3737, (1978) 4) a) Science, 198, 1056, (1977), b) Proceedings of the National Academy cf Sciences of the United States of America, 75, 5765, (1978), c) Nature, 281, 18, (1979), d) Biochemistry, 1980, 6096, (1980) 5) Science, 203, 614, (1979) ; 6) a) Nucleic Acids Research, 8, 5491, (1980), b) Nucleic Acids Research, 8, 5193, (1980), c) Tetrahedron Letters, 21, 4159, (1980) d) Nucleic Acids Research, 8, 2331, (1980) ; 7) a) The Journal of Biologîcal Chemistry (J. Biol.Chem.), 241, 2014, (1966), b) Nucleic Acids Research, 1, 1665, (1974) ; 8) Nucleic Acids Research, 8, 5753, (1980) ; 9) Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 26, 2396, (1978) 10) Genetic Engineering, 1978, 17, (1978) 11) Guidelineafor Recombinant DNA Experiment, publié en Août 1979 12) The Japanese Journal of Pharmacology, 21, 325, (1971) 13) a) Chemische Berichte, 105, 2508, (1972), b) Chemische Berichte, 105, 2515, (1972) 14) Tetrahedron Letters, 1978, 2727, (1978) ; 15) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 73, 3900, (1977) 16) Gene, 2, 95, (1977) 17) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 76, 106, (1979) ; 18) The operon, 31 (1980) ( & it par J.H. Miller, W.S. Resni koff, publié par Cold Spring Harbor Laboratory) ; 19) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74, 1507, (1977) ; 20) Volumes supplementaires de nProtein, nucleic acid & BR enzymes, dernier volume p. 19, (1973) 21) Methods in Enzyioîogy, 68, 265, (1979) 22) Microbiological Reviews, 44, 1-50, (1980) 23) Nature, 224, 768, (1969) 24) Nature, 217, 1110, (1968). On rappelle que la sécrétine est un polypeptS.de qui a pour formule structurale 5 10 His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser- 15 20 Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 Afin d'obtenir cette sécrétine, on a proposé des procédés tels que l'extraction 1) dtune sécrétine de provenance naturelle (classiquement, la sécrétine porcine, mais on a aussi trouvé que la séquence d'aminoacides de la sécrétine bovine est identique à celle de la sécrétine porcine) et la synthèse chimique . Toutefois, chacune ces procédés comporte des inconvénients en ce qui concerne le cotit, la rapidité, le rendement etc.En outre, selon le procédé antérieur dans lequel on extrait la sécrétine de l'intestin grêle de porcs et on la purifie, on a rencontré une difficulté en ce sens que la multitude des hormones gastro-intestinales (motiline, VIP, CCKPZ, GIP, GLI etc.) s'oppose au dosage biologique ou radioimmunologique précis de la sécrétine. Par ailleurs, les progres récents de la technique dite du génie génétique utilisant un gene synthétique ont été si notables que lton commence maintenant à fabriquer commercialement par cette technique divers polypeptides physiologiquement actifs. En conséquence, si l'on pouvait préparer la sécrétine par génie génétique, il serait possible de découvrir des indications permettant de résoudre les problèmes mentionnés plus haut et qui se posent dans les procédés antérieurs. il est généralement établi qu'il est possible de préparer un polypeptide par une technique de génie génétique en utilisant un gène synthétique par des étapes qui comprennent la synthèse chimique d'un gène de structure, l'insertion du gêne dans un plasmide approprié servant de vecteur, la transformation d'un hôte approprié et la préparation et la récupération d'un polypeptide désiré, par culture du transformant, mais il ntest pas nécessairement possible de savoir a l'avance avec certitude si l'on peut, par ce procédé, obtenir un polypeptide particulier ayant une activité physiologique désirée. Si l'on considère ce problème dans le cas de la sécrétine, étant donné que l'extrémité C du polypeptide sécré- tine est une amide de valine, comme indiqué plus haut, l'extrémité de 1'ADN du gène de structure exprimant le polypeptide de doit nécessairement comprendre le codon correspondant à la valine, et, par suite, le polypeptide obtenu est considéré comme portant la valine en tant qu'extrémité C. Avec ce raisonnement, il est douteux que le polypeptide obtenu présente l'activité physiologique de la sécrétine. On est arrivé à l'invention en confirmant qu'un gène de structure exprimant un dérivé de sécrétine dont l'ex- trémité C est la valine sous forme non amide, donc la désami dosécrétine, peut 8tre synthétisé chimiquement, que l'on peut insérer ce gène dans un plasmide approprié servant de vecteur pour former un plasmide chimère, qu'il est possible de transformer avec le plasmide chimère une cellule hSte appropriée ainsi que de préparer et de récupérer la désamidosécrétine en cultivant le transformant, que la désamidosécrétine obtenue a une activité similaire à celle de la sécrétine et, en outre, que le système d'expression de l'opéron de lactose peut autre utilisé dans la préparation de la désamidosécrétine et que l'on peut augmenter fortement lp rendement de désamidosécrétine en utilisant ce système d'expression. Ainsi, la 27-désamidosécrétine selon l'invention constitue un polypeptide représenté par la séquence d'aminoacides His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser Arg Leu-Arg-Asp-SerAl a-Arg-Leu-Gln Arg -Leu- Leu-Gln-Gly-Leu-Val-CH dans laquelle Val-OH indique que l'extrémité C du polypeptide comprenant la valine est un acide carboxylique. L'invention propose aussi un procédé de préparation de 27-désamidosécrétine comprenant les étapes suivantes (1) on synthétise chimiquement un gène de structure approprié à la désamidosécrétine, correspondant au polypeptide dans lequel l'aminoacide de l'extrémité C est la va line, (2) on insère ce gène dans un plasmide vecteur capable de proliférer dans une cellule hôte pour former un plasmide chimère capable de proliférer dans la cellule, (3) on transforme la cellule hôte avec le plasmide chimère, (4) on cultive le transformant obtenu et lton récupère la désamidosécrétine formée. Un autre procédé, préférentiel, pour la prépara tion de 27-désamidosécrétine selon l'invention, comprend les étapes suivantes (1) on synthétise chimiquement un gène de structure approprié à la désamidosécrétine, correspondant au polypeptide dans lequel l'aminoacide de l'extrémité C de la sécrétine est la valine, (2) on prévoit un plasmide vecteur capable d'utiliser l'opéron de lactose et capable aussi de proliférer dans une cellule hAte prédéterminée, (3) on insère le gène de structure dans le plasma de vecteur pour obtenir un plasmide chimère capable de proliférer dans la cellule, (4) on transforme la cellule h8te avec le plasma de chimère, (5) on cultive le transformant obtenu et l'on récupère la désamidosécrétine formée. Le procédé de préparation de 27-désamidosécrétine selon ltinvention comprend, sous son aspect le plus large, les étapes suivantes (1) on prévoit un plasmide chimère qui comprend un fragment d'un gène de structure approprié à une désamidosécrétine correspondant à un polypeptide dans lequel ltamino- acide de l'extrémité C est la valine, le plasmide chimère étant capable de proliférer dans une cellule hôte prédéterminée et étant capable d'exprimer le gène de structure approprié â une désamidosécrétine dans la cellule hôte, (2) on transforme la cellule hutte avec le plasmide chimère, (3) on cultive le transformant obtenu et l'on récupère la désamidosécrétine formée. Un exemple typique des cellules h8tes à utiliser dans le procédé de transformation défini plus haut est l'Escherichia coli, appartenant au genre Escherichia, et l'opéron de lactose est tiré de l'Escherichia coli. Ainsi, le procédé préférentiel de préparation de la 27-désamidosécrétine selon l'invention peut aussi être défini comme un procédé qui consiste à cultiver un microorga nisme producteur de désamidosécrétine appartenant à l'espèce Escherichia coli et auquel on a incorporé un plasmide contenant le gène de structure de la désamidosécrétine et â récupérer la désamidosécrétine formée lors de l'utilisation de ltopéron de lactose dans 12Escherichia coli. Sous un autre aspect, l'invention a aussi pour objet une culture d'Escherichia coli à utiliser dans la pratique de l'invention, cet Escherichia coli ayant été transforné de manière à avoir un phénotype tel que la souche produise, lorsqu'on la cultive, la 27-désamidosécrétine. L'invention propose donc un Escherichia coli caractérisé par le fait qu' il a été transformé par un plasmide auquel on a incorporé ou dans lequel on a inséré un gène de structure, synthétisé chimiquement, de la désamidosécrétine correspondant au polypeptide dont l'aminoacide de l'extrémité C est la valine, ce plasmide étant capable dtutiliser l'opéron de lactose et capable aussi de proliférer dans une cellule haute prédéterminée. Sous un autre aspect de l'invention, on propose un polydésoxyribonucléotide & deux channes qui comprend le gène de structure exprimant la 27-désamidosécrétine. Sous un autre aspect encore, on propose un plasmide qui comprend le gène de structure exprimant la 27-désamidosécrétine. Selon l'invention telle qu'elle est résumée ci-dessus, on peut donc éviter les problèmes d'extraction et de pu rification rencontrés dans le cas de l'extraction ae la sécrétine naturelles & laquelle on avait recours comme seul moyen commercialement praticable, lorsqu'on utilise comme matiere première l'extrait du gène recombinant selon l'in- vention. Selon le procédé de l'invention, il est possible de modifier une ou plusieurs sortes d'aminoacides constituant un peptide,de sorte qugil devient possible d'étudier les corrélations entre les structures et les activités des hormones peptidiques. Autrement dit, on propose un procédé permettant dtobtenir facilement ntimporte quel dérivé désiré d'un peptide physiologiquement actif, substitué par un aminoacide. On peut dire que la formation d'un dérivé de polypeptide par manipulation de gènes est le meilleur procédé, étant donné que la formation d'un dérivé de polypeptide à poids moléculaire élevé par synthèse chimique est très difficile selon les procédés dont on dispose actuellement. En outre, en utilisant le système hSte-vecteur,com- me dans le procédé préférentiel de préparation de désamidosécrétine mentionné plus haut, il est devenu possible de préparer une désamidosécrétine ayant une activité de sécrétine qui correspond à environ 3 x 104 molécules par cellule date, ce que l'on peut appeler un rendement pratiquement applicable. D'autre part, si l'on se base sur la protéine fusionnée décrite plus loin, on a un rendement de 2,85 x 105 molécules/cellule, valeur qui suggère que la préparation de la désamidosé- crétine avec un rendement élevé est rendue possible par expression directe au moyen du plasmide chimère selon l'invention dans des bactéries, sans action destructive (protéolytique) exercée par des protéases. I1 existe aussi des polypeptides autres que la sécrétine qui ont une extrémité C sous forme d'amide et l'invention suggère la préparation de dérivés désamidés de ces autres polypeptidesainsi que l'expression de leur activité physiologique. 1 Désamidosécrétine La 27-désamidosécrétine selon l'invention est un polypeptide représenté par la séquence d'aminoacides (I) cidessous His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Aïa-Arg-Leu-Gln-Arg- Leu-Gln-Gly-Leu-Val-CH .t (I) Dans la formule (I), His et les autres symboles sont des symboles admis pour désigner les aminoacides tels que lthistidine etc. Le polypeptide est différent de la sécrétine en ce sens que la valine de l'extrémité C ntest pas sous forme d'amide (Val-NH2) mais sous forme carboxylique (Val-OH). La désamidosécrétine, qui a une activité physiologique similaire à celle de la sécrétine, par exemple une action favorisant la sécrétion du suc pancréatique, peut elle stbe être utilisée comme polypeptide physiologiquement actif similaire à la sécrétine. D'autre part, on peut aussi utiliser la désamidosécrétine après l'avoir amidée sur le fragment carboxylique de l'extrémité C qui est la sécrétine. On peut effectuer l'amidation par un procédé purement chimique, un procédé enzymatique ou un procédé biologique in vivo. 2. Préparation de la désamidosécrétine Bien que l'on puisse obtenir la désamidosécrétine en modifiant l'extremité C de la sécrétine, on la prépare de préférence par des techniques de génie génétique selon l'in- vention en synthétisant chimiquement un gène de structure de ce polypeptide, en préparant un plasmide de façon que le polypeptide puisse outre exprimé, en transformant une cellule hôte avec le plasmide, en préparant le peptide désiré par culture du transformant et en récupérant la désamidosécrétine. 1) Gène de structure (1) Constitution du gène La séquence fondamentale d'ADN qui constitue le gène de structure de la sécrétine est inconnue. Par conséquent, parmi certains codons qui désignent les aminoacides constituant le peptide, on choisit, pour la synthèse de l'ADN, ceux qui remplissent les conditions suivantes (i) il doit être déterminé de façon telle que la région enrichie en paires fondamentales A - T ne suive pas consécutivement la région enrichie en paires fondamentales G-C; (ii) il doit aussi être déterminé de façon telle que chaque fragment synthétique tel que décrit ci-après ne comporte pas de séquence fondamentale complémentaire indési- rable, en position intramoléculaire ou intermoléculaire. I1 est désirable, aussi, pour choisir facilement la souche transformée, de réaliser le gène de structure de façon telle qutil contienne une ou plusieurs séquences fondamentales de reconnaissance d'enzymes de restriction. Dans le cas de la désamidosécrétine, il est préférable que le gène comporte des séquences fondamentales de reconnaissance de Hinf I et Hae il. A ce point de vue,- des exemples typiques de codons désignant des aminoacides dans le gène de structure de la dé samidosécrêtîne sont les suivants Aminoacide Codon His CAC Ser TCT, TCA Asp GAT Gly CGT Thr ACT, ACC Phe TTC Glu GAA Leu TTG, CTC, CTA, CTG, TTA, CTT, Arg CGT, CGC Ala GCA Gln CAA, CAG Val GTT En conséquence, un mode de réalisation préférentiel du gène de structure de la désamidosécrétine selon l'invention comporte une séquence fondamentale comme celle qui est indiquée ci-après dans les exemples expérimentaux et sur le schéma structurel donné & la fin de la présente description (sur ce schéma, la séquence fondamentale est bien entendu le fragment qui va de CAC, correspondant â His, à GTT, correspondant a' Val). Autrement dit, l'invention a pour objet, sous un aspect, un polydésoxynucléotide à deux channes comprenant un gène de structure qui exprime la 27-désamidosécrétine comme indiqué plus haut et un mode de réalisation préférentiel du gène de structure qui comporte une séquence fondamentale comme celle qui est indiquée ci-dessous His Ser Asp Gly Thr Phe Thr CAC - TCA - GAT - GGT - ACT - TTC - ACC GTG - AGT - CTA - CCA - TGA - AAG - TGG Ser Glu Leu Ser Arg Leu Arg TCA - GAA - CTA - TCT - CGT - CTA - CGT - AGT - CTT - GAT - AGA - GCA - GAT - GCA - Asp Ser Ala Arg Leu Gln Arg GAT - TCA - GCA - CGC - CTC - CAG - CGC CTA - AGT - CGT - GCG - GAG - GTC - GCG Leu Leu Gln Gly Leu Val TTG - CTG - CAA - GGT - CTC - GTT AAC - GAC - GTT - CCA - GAG - CAA Le mode d'expression d'un tel gene structural est décrit en détail par exemple dans la demande de brevet japonais publiée N 92696/1979. Dans le cas où l'on utilise pBR 322 comme plasmide auquel il s'agit d'incorporer le gène et quand la désamidosécrétine doit être exprimée sous forme de protéine fusionnée avec son opéron de lactamase, le point où il faut incorporer le gène est avantageusement, dans l'opéron, le point de reconnaissance d'enzyme de restriction Pst I. Autrement dit, le codon ATG de la méthionine, qui est le point & attaquer par le bromure de cyanogène, est prévu du coté de l'extrémité St du gène de structure tandis qu'un ou plusieurs codons d'arr8t sont prévus sur l'extrémité 3'.Ensuite, en vue de la synchronisation 3) avec le cadre qui commence avec le codon initial du gène de lactamase, on applique au gene, sur le caté 5' de ATG, des bases choisies au hasard au nombre de 2 + 3n (n = 0, 1, 2...) et, en outre, une séquence fondamentale de reconnaissance de Pst I pour former des extrémités collantes aux deux extrémités.En général, les gènes de structure sont conçus et synthétisés 4) dans un état oà les deux extrémités "collantes" sont dégagées, mais, si on le désire, les deux extrémités peuvent autre tronquées, de sorte qutil est nécessaire de prévoir deux ou plusieurs bases choisies au hasard en d'autres parties extérieures de la séquence fondamentale de reconnaissance, pour augmenter l'efficacité d'hydrolyse de l'enzyme de restriction. Les paires optionnelles de bases à prévoir du côté S' de AGT sont 3m paires, (3m + 1) paires ou (3m + 2) paires, m étant un nombre entier, soit O ou 1 ou davantage. Ces considérations ayant ainsi été pesées, un m.ode d'exécution préférentiel du gène de désamidosécrétine propre à servir dans l'invention est celui qui est indiqué ci-après dans les exemples expérimentaux Autrement dit, un mode d'exécution préférentiel du gène de la désamidosécrétine présente la structure indiquée ci-dessous Met ACCTGCAGCC - ATG TGGACGTCGG - TAC His Ser Asp Gly Thr Phe Thr CAC - TCA - GAT - CGT - ACT - TTC - ACC GTG - AGT - CTA - CCA - TGA - AAG - TGC Ser Glu Leu Ser Arg Leu Arg TCA - GAA - CTA - TCT - CGT - CTA - CGT AGT - CTT - GAT - AGA - GCA - GAT - GCA Asp Ser Ala Arg Leu Gln Arg GAT - TCA - GCA - CGC - CTC - CAG - CGC CTA - AGT - CGT - GCG - GAG - STC - GSG Leu Leu Gln Gly Leu Val TTG - CTG - CAL - CGT - CTC - GTT AC - GAC - GTT - OCA - GAG - CAA - FIN FIN TGA - TAG - GGCTGCTGGT ACT - ATC - CCGACGTCCA (2) Synthèse Pour la synthèse du gène conçu de la façon décrite ci-dessus, on peut diviser en fragments chacune des deux chatnos + et - . On peut synthétiser chimiquement ces fragments et, ensuite, on rattache ensemble les fragments respectifs. Il est préférable de diviser chaque chatne en environ 16 fragments dont chacun comprend 9 a 16 bases, de sorte que 6 a 7 bases se chevaucheront. Comme procédé de synthèse de chaque fragment, on peut mentionner le procédé au du ester 5), le procédé au triester ), le procédé en phase solide 4), le procodé en phase liquide ou le procédé utilisant une enzyme 7). Etant donné la durée de la synthèse, le rendement et la purification, le pr cédé en phase solide au triester est celui qui convient le mieux. Pour les détails de la synthèse, il y a lieu de se référer à la littérature citée et aux exemples expérimentaux décrits ci-après. (3) Purification Lorsqu'on synthétise un oligonucléotide, la sépa ration et la purification du produit final deviennent généralement plus difficile à mesure que la channe s'allonge. En particulier, dans le procédé synthétique en phase solide, on condense de façon échelonnée des blocs oligonucléotides convenablement protégés et, par suite, la purification ne peut pas s'effectuer facilement par des techniques classiques telles que la filtration sur gel, l'électrophorèse de gel, la colonne échangeuse d'ions, la chromatographie liquide à grande vitesse etc. Dans la colonne à phase inverse, le temps de retenue diffère fortement selon que l'oligonucléotide présente ou non un groupe protecteur lipophiles En conséquence, lorsquton utilise a' l'étape finale de condensation an bloc oligonucléotide présentant un groupe protecteur stable dans les conditions d'élimination d'autres groupes protecteurs, en éliminant ensuite de façon appropriée les autres groupes protecteurs, on peut obtenir un mélange d'oligonucléotides présentant seulement les groupes protecteurs stables dans le produit final désiré. En tirant parti de la nature lipophile du groupe protecteur, on peut séparer le produit final désiré du mélange des espèces inaltérées au moyen dorme colonne à phase inverse, après quoi on élimine le groupe protecteur pour obtenir l'oligonucléotide désiré. Selon ce procédé, on peut séparer et purifier avec un bon rendement l'oligonucléotide ainsi synthétisé et qui est melangé aux espèces inaltérées. (4) Phosphorylation et corrdination On coordonne successivement entre eux les fragments synthétiques ainsi prépares, au moyen d'une ligase d'ADN. Pour préparer les fragments synthétiques servant de substrats à enzymes il est nécessaire de phosphoryler les groupes 5'-hy- droxyle des fragments. A cet effet, on utilise généralement une kinase de polynucléotide, mais la phosphorylation chimique est possible également @). Bien que l'on opère généralement la coordina tion de fragments au moyen d'une ligase dtADN, il est possible aussi d'utiliser le procédé dans lequel on active les groupes acide phosphorique des extrémités 5' par un moyen approprié (par exemple imidazolylation) et on les coordonne chimiquement, la chatne du cé opposé servant de modèle9). 2) Préparation d'un @ vecteur comportant l'opéron de lactose Dans le procédé préférentiel de préparation de 27-desamidosécretine selon l'invention, il est possible d'u- tiliser divers plasmides contenant la totalité ou une partie de l'opéron de lactose provenant de I'ADN des chromosomes d'E. coli et qui sont capables de proliférer dans E. coli. On peut effectuer la préparation de ces plasmides selon les procédés courants bien connus dans le domaine de la biologie molécu- laire. L'ADN contenant l'opéron de lactose peut être tiré directement du chromosome d'E. coli, mais on obtient divers bactériophages de transduction contenant la totalité ou une partie de l'opéron de lactose (par exemple Pldl, F'-lac, X Odplac, #h80dlac, #plac etc.) et, par suite, une part nécessaire de l'opéron de lactose peut avantageusement être tirée de ces bactériophages.En outre, afin que le plasmide soit capable de proliférer dans E.coli, il est nécessaire de coordonner la partie nécessaire de l'opéron de lactose ci-dessus avec un autre plasmide provenant d'E. coli (par exemple pBR322, p9C101, XdVl) pour former un seul vecteur plasmide. Dans un exemple de l'invention, on utilise le bactériophage de transduction #plac523) comme opéron de lactose contenant de 1'ADN. L'ADN de #plac5 peut titre tiré par exemple d'E. coli PK1512, qui est une bactérie lysogène, selon un procédé classique20). Ce #plac5 présente la région de lwopé- ron de lactose qui va du milieu du gène "i" au milieu du gène "y" et, avantageusement, il ne contient pas d'autre gène d'E coli que l'opéron de lactose ), de sorte qu'il est préférable dans l'invention.Comme plasmide tiré dtE. coli, on utilise le pBR322, que l'on a choisi parce que c'est l'un des plas mides les plus facilement accessibles, que toute la séquence fondamentale est déterminée et qu'il a des gènes marqueurs ré sistant à l'ampicille et résistant à la tétracycline. En outre, dans la coordination de ces gènes, on traite chaque gène ( hplac5 et pBR322) par les enzymes de restriction ECORI et HindIII, on retire le fragment de 3,8 Md (mégadaltons)15) pour #plac5 et le fragment plus grand16) pour pBR322 et on les rattache ensemble pour former le vecteur plasmide désiré. Ce vecteur est appelé pRE dans l1invention. On a choisi l'opéron de lactose tiré du chromosome dtE. coli pour l'expression de la désamidosécrétine désirée, par exemple parce qu'on peut insérer un gène étranger dans le gène "z" de l'opéron de lactose au point de reconnaissance de l'enzyme de restriction EcoRI, pour l'exprimer sous la forme dtune protéine fusionnée avec la ss-galactosidase4a) ) 17) parce que l'on peut préparer une protéine en grande quantité, que l'on peut effectuer une production provoquée lorsqu'on utilise un microorganisme kôte approprié et que l'on peut récupérer facilement le produit de façon stable sous la forme d'une protéine fusionnée pratiquement pure. Ainsi, il est désirable que le vecteur préparé dans l'invention ne présente qu'un point de reconnaissance de lten- zyme de restriction EcoRI et, a' cet effet, on utilise des fragments d'ADN que l'on obtient en clivant #plac5 et pBR322 respectivement avec EcoRI et HindIII, de la façon décrite plus haut, ceux-ci étant à leur tour enchaînés entre euxO 3) Plasmide chimère (1) Préparation Dans une position appropriée du vecteur, prévue pour un gène étranger à exprimer comme indiqué ci-dessus, on incorpore le gène de structure de désamidosécrétine susdit. L'opération d'incorporation en elle-même peut s'effectuer sn- lon un procédé bien connu dans le domaine de la biologie moléculaire. Pour les détails du procédé utilisé, il faut se référer aux exemples expérimentaux ci-après. Selon un mode d'exécution de l'invention, on utilise pBR322 comme plasmide vecteur et on incorpore le gène au point de reconnaissance de PstI de celui-ci pour former un plasmide chimère. Dans l'invention, ce plasmide chimère est appelé pMG. Les principales raisons pour lesquelles on a choisi pBR322 comme plasmide vecteur sont que c'est l'un des plasma des les plus facilement accessibles, que toute la séquence de base est déterminée et qu'il a des gènes margneurs résistant à l'ampicilline et résistant à la tétracycline. Le plasmide pBR322 est déposé à llAmerican Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, E.U.A. sous le nunéro ATCC37017.Les raisons principales pour lesquelles on a choisi le site PstI comme lieu d'incorporation du gène sont que l'on peut utiliser l'opéron de lactamase tel quel, que l'on peut facilement rechercher le transformant parce que la résistance à l'ampicilline (Apr) est changée en sensibilité à l'aicilline(Ap5) et quril n'y a qu'un seul point PstI dans pBR322. Dans le procédé préférentiel de préparation de la 27-désanidosécrétine , décrit plus haut, selon un autre mode d'exécution de l'invention, on utilise comme plasmide vecteur pREl, qui sera décrit plus en détail ci-après, et on incorpore, au point de reconnaissance d'EcoRI de celui-ci, un gène contenant le gène de structure de désamidosécrétine pour obtenir un plasmide chimère. Dans l'invention, ce plasmide chi mére est appelé pLS. Dans ce mode d'exécution préférentiel de l'inven tion,également, le gene contenant le gène de structure' ci-dessus, c'est-à-dire celui qui présente la séquence fondamentale représentée par le schéma donné in fine, est préférable. Afin d'incorporer à pREl ce gène qui présente des points de reconnaissance d'enzyme de restriction PstI à ses deux extrémités, il est nécessaire de convertir les points de reconnaissance d'enzyme de restriction PstI en EcoRI. (2) Agent dwenchatnement Ainsi, dans le procédé préférentiel de préparation de désamidosécrétine selon l'invention, on a besoin d'un ADN à deux chaînes pour l'agent d'enchatnement entre le gène con tenant le gène de structure et pREl. Autrement dit, 1'ADN à deux chines est nécessaire pour avoir deux points de reconnaissance d'enzymes de restriction, PstI et EcoRI, les paires de bases entre les deux points de reconnaissance d'enzyme de restriction étant 3n + 1 (n = 1, 2, 3...) de manière à tre synchronisées avec le cadre de lecture destiné à la translation et qui commence au codon initial du gène p-galactosi- dase (les sortes de paires de bases étant choisies au hasard, du moment quel ntapparatt pas un codon de non-sens). Toutefois, il est nécessaire que la partie destinée à l'agent d'enchaînement ait en fin de compte la fonction ci-dessus et il est possible d'obtenir l'agent d'enchatnement par le procédé par lequel on synthétise le gene structural ci-dessus. Dans un mode d'exécution de l'invention qui est un exemple d1un tel procédé synthétique, on obtient l'agent d'enchaînement en appliquant un procédé comme celui qui est décrit ci-après. D'abord on réalise un ADN à une seule chaine, com- me indiqué ci-dessous, présentant des points de reconnaissance d'enzymes de restriction PstI et EcoRi: 5' 1 2 3 4 S 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 3' C T G A A T T C A G C T C T G C A G A G Eco RI Pst I et dans lequel 1, 2, 9 & 12, 19, 20 peuvent être choisis au hasard, du moment qu'ils remplissent les conditions suivantes. Condition (1) : 1 et 10, 2 et 9, 11 et 20, et 12 et 19 sont autant de paires de ba ses complémentaires l'une de leau- tre Condition (2) : la séquence 9, 10, 11 n'est pas un codon dit de non-sens. L'ADN à une seule chaste ainsi désigné (appelé agent de pré-enchaînement dans l'invention), étant donné qu'il est complémentaire en lui-meme, prend une structure d'ADN à deux chaînes longues présentant un certain nombre de failles (coupures sans espacement formées sur l'une des deux channes d'ADN). En conséquence, on peut en tirer un ADN à deux chaî- nes sans espacement en faisant agir une ADN-ligase. L'ADN à deux channes ainsi préparé est un poly-ADN à deux channes présentant alternativement les points de reconnaissance des en zymes de restriction Pst I et Eco RI, à savoir des séquences de bases récurrentes selon 1 à 20 ci-dessus. Donc, en traitant 1'ADN à deux chines par ltenzy- ne de restriction Pst I, on peut obtenir un agent d'enchaîne- ment de Pst I-Eco RI-Pst I présentant des extrémités de cohésion. De façon générale, un agent d'enchaînement présentant des points de reconnaissance de deux enzymes de restriction a divers usages et on a atteint les buts dans la technique antérieure en utilisant deux sortes dtoligomères. L'idée ici mentionnée permet d'y parvenir en utilisant une seule sorte d'oligomère selon le procédé décrit plus haut et l'ADN à une seule.chaîne peut être représenté comme suit : n...X'2X'1 Point de reconnaissance d'enzyme X1X2...YnYm ... Y2 Y1 Point de reconnaissance d'enzyme #Y', Y'2...Y'm de restriction B X et X', Y et Y' étant toutes bases désirées (A, G, C, T) complémentaires l'une de l'autre (n et m = O, 1, 2...) Dans le cas de l'invention, A est EcoRi et B est Pst I et n+m = 3p + 1 (p = 1, 2 ), p valant avantageusement 1 ou 2. (3) Détermination de la direction Pour déterminer la direction du gène de 27-désamidosécrétine incorporé au plasmide, on peut cliver le point spécifique contenu dans le gène de structure avec une enzyme (Hae II) reconnaissant ce point spécifique, cliver un autre point dans une certaine position hors du gène de structure et analyser la grandeur du fragment obtenu. 4) Transformation. (1) Cellule hate Un exemple typique de la cellule hôte à transformer au moyen d'un plasmide chimère auquel est incorporé le gène de structure de désamidosécrétine comme décrit plus haut, tel que le pMG ci-dessus, est une souche d'E. coli Ki2C6OO (FERM BP-115, déposée à l'Institude of Fermentation Research, Agency of Industrial Science and Technology, Japon). La souche d'E. coli K12C600 est décrite dans la littérature24) et ses propriétés bactériologiques y sont décrites aussi. Un autre exemple du plasmide chimère auquel-est in corporé le gène de structure de désamidosécrétine comme indiqué plus haut est pLS, par exemple pLS 58, à utiliser dans le procédé préférentiel de préparation de désamidosécrétine selon l'invention. Un exemple typique de la cellule hôte à transformer au moyen de pLS 58 est la souche d'E. coli XA35 dérivée de la souche connue d'E. coli K1222) et ayant les propriétés indiquees ci-dessous, les autres propriétés n'étant pas diffé- rentes de celles de la souche K 12. [ Smr, Lac-(i3-,z-)] La transformation avec le plasmide chimère auquel est incorporé le gène de structure de désamidosécrétine selon l'invention est possible chez toutes les souches d'E. cola, Toutefois, afin de récupérer la désamidosécrétine sous forme de protéine fusionnée avec la p-galactosidase, il est préférable d'utiliser une souche déficiente en gene de p-galactosi- dase pour éviter la présence de p-galactosidase normale mélangée dans la protéine. De façon générale, la formation de protéine est réglée par le gène répresseur (gène) de l'opéron de lactose.Donc, lorsqu'on utilise un B. coli de type sauvage, la production provoquée de la protéine fusionnée est possible avec un inducteur, par exemple l'IPTG (isopropyl-thiogalactoside) ; lorsqu'on utilise une souche avec un gène très sensible à la température, on peut former la protéine fusionnée en élevant la température ; lorsqu'on utilise une souche déficiente en gène, on peut toujours obtenir la protéine fusionnée18) Dans le procédé préférentiel de préparation de la desamidosécrétine selon l'invention, on utilise la souche d'E. coli XA35 qui est déficiente en gènes de ss-galactosidase et en gène. Il faut noter aussi que la transformation avec le plasmide auquel est incorporé le gène de structure de désa- midosécrétine n'est pas limitée à E. coli comme hôte, mais que l'on peut aussi choisir un hôte approprié dans un plus large spectre d'especes de bactéries, si l'on choisit un vecteur approprié, de façon bien connue dans le domaine de la biolo gie moléculaire. On peut trouver un exemple typique d'une telle cellule hôte dans la demande de brevet japonais précitée N 92696/1979. (2) Transformation On peut conduire l'opération de transformation elle-même selon des techniques classiques bien connues dans le domaine de la biologie moléculaire Pour les détails des prc- cédés utilisés, on doit se référer aux exemples experimentaux décrits ci-après. (3) Transformant Un exemple typique des transformants est celui que l'on obtient en transformant K12C600 par pMG. 11 est appelé, selon l'invention, Kl2C6O0 (pMG103). Le transformant K12C600 (pMG103) a les propriétés génétiques suivantes : [ m, r , F , lacY, Leu, Thr, tonA, supE, recBC i Un autre exemple des transformants est celui que l'on obtient en transformant avec pLS 58 la souche d1E. coli XA35 à utiliser dans le procédé préférentiel de préparation de désanidosécrétine selon l'invention, comme décrit ci-dessus. On l'appellera ici E. coli XA35 (pLS58). La souche transformante E. coli XA35 (pLS 58) diffère de la souche E. coli XA35 par les propriétés suivantes, coi- expliqué dans les exemples expérimentaux décrits ci-après: [Apr, Lac+] 5) Préparation de la désamidosécrétine On peut préparer la désamidosécrétine en cultivant la bactérie ainsi transformée selon un procédé classique Pour les détails sur le procédé, il faut se référer aux exemples expérimentaux ci-apres. 3. Exemples expérimentaux Exemple 1 Conception du gène de désamidosécrétine 1) On prévoit un gène présentant la séquence de base qui consiste en une combinaison des blocs A, B et C comme le montre le schéma final . Ces blocs comprennent respectivement les fragments ci dessous s Bloc Fragment A S"1 - S-4, S-6 B S-5, S-7 - S-10, S-12 C S-ll, S-13 - S116 2) Le procédé de conception est décrit ci-dessous (1) Sélection des codons On sélectionne les codons comme l'indique le schéma. (2) On ajoute le codon ATG de la méthionine à l'extrémité N, de sorte que le polypeptide synthétisé est clivé en ce point par le traitement chimique (+CNBr). (3) A l'extrémité C, on ajoute deux codons de terminaison de translation (TAG ou TGA), de sorte qu'il ne se forme pas de peptide superflu. (4) Aux fins de synchronisation avec le cadre qui commence au codon initial du gène de lactamase, on ajoute, en amont de la méthionine, deux paires de bases choisies, génie ralement 2 + 3n (n = O, 1, 2, 3 3,....). (5) On ajoute tout nombre désiré de paires de ba ses immédiatement avant le point Pst I, en aval, si cela convient à la synthèse de chaque fragment. (6) Finalement, on ajoute aux deux extrémités deux paires de bases choisies à volonté pour augmenter l'efficacité d'hydrolyse de l'enzyme de restriction Pst I. Le gène conçu comme ci-dessus contient le point Hinf I et le point Hae Il dans le gène de structure de 27désamidosécrétine. Synthèse chimique du fragment 1) Synthèse On conduit la synthèse des fragments selon le procédé en phase solide décrit dans la littérature6a). Toutefois, on effectue l'isolement et la purification des fragments synthétiques selon le procédé perfectionné décrit ci-après. Les rendements de synthèse des fragments respectifs sont indiqués au tableau suivant Fragment Séquence de base Longueur de chaSne Rendement S-1 ACCTGCAGCATGChC 16 33 S-2 GCTGCAGGT 9 52 S-3 TCAGATGGTACTT 13 56 S-4 ATCTGAGTGCATG 13 42 S-5 TCACCTCAGAACTAT 15 43 S-6 GAGGTGAAAGTACC 14 47 S-7 CTCGTCTACGTGATT 15 38 S-8 AGACGAGATAGTTCT 15 27 S~9 CAGCACGCCTOCAGC 15 32 S-10 OGTGCTGAATCACGT 15 43 S-11 GCTTGCTGCAAGGT 14 22 S-12 AGCAAGCGCTGGAGG 15 44 S113 CTCGTTTGATAGG 13 47 5-14 AAACGAGACCTTGC 14 42 S-15 comme S-2 S-16 ACCTGCAGCCCTATC 15 32 2) Purification A 50 mg de la résine qui a subi la synthèse en phase solide, on ajoute 0,5 mole d' d -picolinique-aldoxime-té- traméthylguanidine et 100 & 200 l d'un mélange de dioxane et d'eau (1:1)14) et on laisse reposer le mélange plusieurs heu res à la température ambiante. On ajoute alors au mélange 2 ml d'ammoniac aqueux concentré et on laisse à nouveau reposer une nuit à 55 C avec bouchage hermétique. On filtre le mélange obtenu pour séparer la résine et on concentre le filtrat et on le soumet à la filtration sur gel. On effectue l'élution avec 50 mmol de tampon TEAB (pH 7,5) et on recueille les fractions éluées dans le volume vide.On les concentre et on les soumet à la chromatographie liquide à haute pression sur colonne à phase inversée C-18 (Waters : "Radial Pack A", diamètre 8 cm x 10 cm) pour accomplir l'éluvion dans un tampon diacétate d'éthylènediamine 0,01 M (pH 7,8) avec un gradient de concentration d'acétonitrile de 10 % à 32 ,% à un débit de 2 ml/mn en l'espace de 16 minutes. On recueille les fractions éluées en 11 à 12 minutes. Pendant ce processus, on élue comme crête d'injection des oligonucléotides dépourvus de groupe trityle. On concentre l'éluat et, après y avoir ajoute 1 ml d'acide acétique à 80 %, on laisse reposer à la température ambiante pendant 15 minutes.On élimine le trita- nol par extraction, on concentre la couche aqueuse et on l'applique à nouveau à la colonne à phase inversée. Dans les mê- mes conditions que ci-dessus, on effectue l'élution avec un gradient de concentration d'acétonitrile de O à 20 % et on recueille les fractions élues en 12 à 13 minutes. Phosphorylation On dissout chaque fragment (30 g) dans 30 mmol de tampon Tris-HCl (pH 7,5) et on ajoute à la solution 60 uCi (19,8 pmol) de /&gamma;32P/ATP et 2 l (9 unités) de T4 polynucléotide-kinase pour faire une quantité totale de 50 p1, après quoi on fait incuber à 37 C pendant 20 minutes. Ensuite, on ajoute au mélange 10 équivalents relativement au fragment d'ATP et de T4 polynucléotide-kinase (9 unités), puis on fait incuber à 37 C pendant 20 minutes. On arrête la réaction en chauffant à 100 C pendant 2 minutes et on purifie le produit par filtration sur gel. Chaque fragment est confirmé par électrophorèse sur gel à 20 %. Coordination des fragments On dissout chacun de 0,05A260 de S-i, S-2, S-3, S-4 et S-6 dans un tampon (20 mmol de Tris-HCl pH 7,5, 10 mmol de MgC12, 10 mmol de DTT (dithiothréitol), 0,2 mmol dlATP (triphosphate d'adénosine) pour former une solution contenant au total 30 l. On ajoute à la solution 1 ul (150 unités) de T4-ADN-ligase et on laisse reposer la solution une nuit à IOOC. La réaction est confirmée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 8 %. De façon similaire, on synthétise les blocs B et C. On mélange les mélanges réactionnels du bloc A et du bloc B et, après avoir ajouté 3 p1 d'ATP 0,2 mM et 1 p1 (150 unités) de T4-ADN-ligase, on laisse reposer le mélange une nuit à 10 C. Une fois que la réaction a été confirmée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 8 %, on ajoute le mélange réactionnel du bloc C et on laisse la réaction se dérouler de façon similaire pendant une nuit. Le progrès de la réaction est confirmé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 5 %. On chauffe le mélange à 68 C pendant 15 minutes, puis on le refroidit à la température ambiante. On ajoute alors 15 l de NaCl 0,5 M et 80 unités de l'enzyme de restriction Pst I et on laisse reposer le mélange une nuit à 37 C. On arrête la réaction en chauffant à 90 C pendant une minute et on soumet le mélange à la séparation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 5 %. On sépare la bande qui a la plus grande longueur de chatne et on la transfère à l'électro- phorèse sur gel d'agarose à 1 % à bas point de fusion pour extraire la bande obtenue. Clonage On ajoute le plasmide pBR 322 (4 pg) à un mélange (quantité totale : 50 l) de 100 mmol de tampon Tris-HCl, 5 mmol de MgCl2 et 50 mmol de NaCl et on conduit la réaction en utilisant 6 unités de l'enzyme de restriction Pst I à 37 C pendant 2 heures. Ensuite, on arrête la réaction en chauffant à 68 C pendant 15 minutes. On ajoute au mélange réactionnel le gène synthétique ci-dessus et on conduit la réaction de coordination de façon similaire en utilisant la T4 ADN-li- gase. En utilisant 5 l du mélange obtenu, ce qui est équivalent à 0,68 g de pBR322 ADN, on effectue la transformation de la souche d'E. coli K12C600 selon le procédé de Kuschner10) dans une installation de confinement physique P-311). On sélectionne la souche transformée sur un plateau L (1 % de "Bactotripton11, 0,5 X dVextrait "Bactoyeast", 0,5 % de NaCl, 1,5 % de '1Bactoagar") contenant 10 pg/ml de tétracycline (Tc) et on examine 500 des souches transformées pour déterminer leur résistance â l'ampicilline et on isole 45 souches transformées par Tcr/Aps. On les appellera ici C600 (pMG 101) à C600 (pMG 145). Parmi les souches transformées de Tcr/Aps, on choisit au hasard 8 souches (C600 (pMG 101) à C600 (pMG 108) ) et on isole le plasmide ADN par sédimentation à l'équilibre à travers un gradient de densité doe chlorure de césium contenant du bromure d'éthidium. Le plasmide AJN ainsi isolé sera appelé ici pMG 101 ta pMG 108. Confirmation de la direction On dissout 5 pg du plasmide dans un mélange (30 pl) de 10 mmol de tampon Tris-HCl, 66 mmol de MgCl2, 6 mmol de ss-mercaptoéthanol et 60 mmol de NaCi et on ajoute les 30 unités de l'enzyme de restriction Hae II1 à la solution, après quoi on chauffe à 37 C pendant une heure. On extrait des frag- ments de 375 bp par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5 % à bas point de fusion. On hydrolyse de façon similaire les fragments ains extraits en utilisant 18 unités de l'enzyme de restriction Hae II et on hydrolyse le produit à 191 bp et 176 bp, déterminés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 5 %, et on l'évalue comme un plasmide ayant la direction correcte. Identification de la protéine fusionnée avec des minicellules On transforme un Es coli producteur de minicellules (F-, thr+, ara+, leu+, azis, tonAs, mina, minB, gal+, #-, sfrr, malA, xyl, mtl, thi, sup ) avec pMG 103 et pBR 322 selon le procédé de Kuschner10) pour obtenir un transformant de Tcr/Aps. On précultive le transformant dans 20 ml de milieu de culture minimal Davis contenant 0,5 % de "Casamino acidn, 20 pg/ml de thymine, 2 pg/ml de thiamine et 10 g/ml de tétracycline, à 37 C pendant 16 heures et,en inoculant 500 ml du même milieu (mais sans tétracycline) avec 10 ml de la préculture, on poursuit la culture jusqu'à OD620 = 0,6 à 0,8. On soumet le bouillon de culture à la centrifugation au moyen d'une centrifugeuse réfrigérée Hitachi (modèle RPR-9 à 3 000 tours/mn), pendant 12 minutes, pour éliminer les cellules hô- tes et, ensuite, à la centrifugation à 8500 tours/mn, pendant 25 minutes, pour obtenir des boulettes de minicellules. On lave celles-ci en les mettant en suspension dans 25 ml de tampon "To" (1 mole de Tris-HCl, pH 7,3, MgSO4.7H2O 150 mg, 1 mi de gélatine à 1 %, 1 mol de CaC12, 0,25 ml/l de H2O). On soumet la suspension à la centrifugation à 10 000 tours/mn (dans un rotor RPR-20), pendant 15 minutes, et on met en suspension les précipités de minicellules obtenus dans 1 ml de tampon Tl. On soumet la suspension obtenue à la centrifugation avec gradient échelonné de densité 10 %-15%-20% (à 4 000 tours/mn, dans un rotor RPRS-4, pendant 25 minutes) pour récupérer des minicellules. Puis on met en suspension la suspension de minicellules dans 20 ml de tampon T1 et on répète des opérations similaires. On met en suspension les minicellules dans 1 ml de milieu de culture minimal Davis contenant une concentration finale de 50 g/ml de chacun de 18 aminoacides (alanine, valine, isoleucine, proline, phénylalanine, tryptophane, glucine, sérine, thréonine, cystine, tyrosine , asparaguine, acide aspartique, glutamine, acide glutamique, lysine, arginine, histidine), 20 pg/ml de thymine et 2 pg/ml de thiamine et on chauffe avec agitation à 37 C pendant 12 minutes. Après avoir ajouté à la suspension 20 pCi de (35S)-méthionine (NEN, New 27 England Nuclear : 1260,1 Ci/mmol) et 5 C1 de ( H)-leucine (NEN : 115,2 Ci/mmol), on chauffe encore le mélange pendant 10 minutes.Ensuite, immédiatement, on ajoute aumelange le mêne tampon contenant 50 mmol de NaN3, 100 Mg/ml de méthionine ne et 100 g/ml de leucine. On effectue alors la centrifugation à 3 000 tours/mn pendant 20 minutes pour récupérer des minicellules que l'on met à nouveau en suspension dans 20 ul d'un tampon échantillon (H20 6 nil, 1,25 mol de Tris-HCî (pH 6,8) 1 ml, SDS (dodécylsulfate de sodium) 0,4 g, glycé- rol 2 ml, 2-mercaptoéthanol 1 ml, BPB (bleu bromophénol) 4mg) et on chauffe à 100 C pendant 3 minutes. Puis on soumet 18 p1 de cette suspension à la séparation par électrophorèse sur SDS-polyacrylamide. Dans les cellules d'E. coli K12C600 (pBR 322) (FERM-P 6017), de la p-lactamase s'est synthétisée et il apparatt sur le gel d'électrophorèse une raie correspondant à un poids moléculaire d'environ 29 kilodaltons, mais on ne detecte pas cette protéine d'environ 29 kilodaltons dans les extraits de cellules d'E. coli K12C600 (pMG 103). Au lieu de cela, il apparat carme raie nouvelle un polypeptide d' en- viron 24 kilodaltons. Il s4 agit visiblement du gène formé par codage avec pMG 103 et il est lié à la disparition de la raie p-lactamase.Le pMG 103 a une structure dans laquelle une partie du gène p-lactamase de pBR 322 (codage de 182 aminoacides en partant de l'extrémité amine du peptide de signal de la protéine structurale de ss-lactamase est coordonnée en aval (pour la transcription) avec le gène 27-désamidosécrétine (codant 27 aminoacides) et il faut détecter le gène forme en tant que protéine fusionnée de fragment ss-lactamase (182 aminoacides) 27-désamidosécrétine (27 aminoacides). Le poids moléculaire calculé du produit fusionné est de 23,4 kilodaîtons et, donc, on peut considérer que la raie nouvellement apparue dans les extraits d'E. coli K12600 (pMG 1023 représente cette protéine fusionnée. Purification de la protéine On soumet l'E. coli K12C600 (pMG 103) à une culture agitée dans 3 litres de bouillon Luria a 37 C et on centrifuge lorsque la concentration de microorganismes atteint en 9 viron 1 x 10 cellules/ml.-On lave les boulettes obtenues avec 10 mmol de tampon Tris-ElCl (pH 8,0) et 1 mmol de fluorure de phénylméthylsulfonyle et on centrifuge à nouveau. On met à nouveau les boulettes en suspension dans le même tampon. On traite la suspension par l'EDTA à une concentration finale de 10 mmol à O C pendant 5 minutes et ensuite on traite par la lysozyme de blanc d'oeuf à une concentration finale de 0,1 mg/ml à O OC, pendant 30 minutes, pour effectuer la lyse de formation de sphéroplaste. On traite le lysat obtenu au moyen d'un appareil générateur d'ondes ultrasoniques Kubota "Insonator 200 Mn au débit maximal (200 W), pendant 10 minutes, pour détruire complètement les-cellules bactériennes. On effectue ensuite la séparation centrifuge (en utilisant une centrifugeuse réfrigérée Hitachi, modèle 20 PR52, avec rotor RPR20-2, à 18 000 tours/mn, pendant 30 minutes, à O C) pour éliminer les débris de cellules.Au liquide qui surnage (110 ml), on ajoute du chlorure de magnésium à une concentration finale de 50 mmol, puis on soumet le mélange à la centri- fugation (au moyen du rotor ci-dessus à 8 000 tours/mn pendant 10 minutes à O C). Au liquide surnageant, on ajoute 400 Fig de DNase I et 5 mg de RNase I pour effectuer le traitement à 4 C pendant une heure et ensuite, on relargue les pro téines et les peptides avec du sulfate d'ammonium saturé à 80K. On dissout les précipités obtenus par centrifugation (au moyen d'un rotor RPR 20-2, à 8000 tours/mn, pendant 10 minutes, à O C) dans 10 mmol de Tris-HCl (pH 8,0), on dessale avec le même tampon et on centrifuge (dans les conditions ci-dessus). On ajoute alors au liquide surnageant de l'acétone à une concentration finale de 75 % et on traite pendant une nuit le précipité formé avec 1,0 g de bromure de cyanogène dans 20 ml d'acide formique à 80 %. Après évaporation, on extrait le résidu par 40 ml d'isopropanol, puis par un volume égal de méthanol. Ensuite, on effectue à nouveau l'évaporation et on dissous le résidu dans de l'acide acétique O,lN. Après avoir éliminé la fraction insoluble par centrifugation ( 3 000 à 4 000 G, pendant 5 minutes ), on conduit la filtration sur une colonne de gel "Sephadex G-25" (fabriquée par Pharmacia Co.), on-recueille les fractions ayant des poids moléculaires de 1 000 à 10 000 et on les lyophilise. Dosage biologique On soumet l'échantillon lyophilise à une méthode de dosage biologique 12) dans laquelle on dissout l'échantillon dans un volume total de 2 ml de solution isotonique de chlorure de sodium ; on injecte dans l'aine de cinq rats, par voie intraveineuse, des portions de 0,25 ml chacune ; on me sure à des intervalles de 10 minutes les quantités de suc pan créatique sécrété, s'écoulant dtun tube pancréatique artificiel ; on détermine l'accroissement de quantité qui représente l'activité biologique de la sécrétines Comme sécrétine étalon, on injecta au préalable aux mêmes rats, par voie intraveineu- se, du "secrepan" (Eisai, Japon) a raison de 0,25 U/kg et 0,50 U/kg et on mesure les quantités de suc pancréatique sécrété pour déterminer la correspondance avec l'unité Eisai (pratiquement égale à l'unité Crick Harper Raper).Par suite, les échantillons tirés de E. coli K12C600 (pMG 103) causent une augmentation de 2Q2 % +76 (moyenne + # écart-type) du suc pancréatique sécrété, 10 minutes après l'injection, et de 180 % - 37,6, 20 minutes après l'injection. D'autre part, le "Secrepan" cause respectivement une augmentation de 162 % + 28 et de 206 % * 58 au bout de 10 à 20 minutes dans le cas d'in- jection de 0,25 U/kg, et respectivement de 159,8 % # 83,7 et 250,8 + 216,5, 10 et 20 minutes après l'injection de 0,5 U/kg. Ces valeurs, résultant d'un essai "t" donnent une différence significative à raison de p Dosage radio-immunologique On dilue l'échantillon avec 50 mmol de Tris-HCl (pH 8,0)/0,1 % d'albumine sérique de boeuf. On effectue le dosage radioimmunologique de l'échantillon dilué en utilisant le "Secretin Kit Kaiichi" fabriqué par Daiichi Radioisotope Research Institude, Japon, selon la méthode prescrite pour confirmer son activité. Exemple 2 On conduit les étapes menant à la réaction de coordination entre les fragments de façon similaire à l'Exemple 1. Préparation de #plac5 ADN et pBR322 ADN On tire le A #plac5 ADN de la bactérie lysogène E. coli PK 1512 (IFO 14149) et on conduit les opérations de préparation selon le procédé d'Oshima20). On tire le pBR322 ADN de l'E. coli K-12 C600 (pBR 322) (FERM-P 6017) et on effectue la préparation selon le procédé de M. Kahn et coll.21). Préparation de pREl On ajoute du #plac5 ADN (10 pg) à un mélange (quantité totale : 20 l) de 100 mmol de tampon Tris-HCl pH 7,5, 7 mmol de MgCl2 et 50 mmol de NaCl et on conduit la réaction en utilisant 10 unités de l'enzyme de restriction EcoRI et 10 unités de l'enzyme de restriction Hind III à 37 C, pendant 2 heures. Ensuite, par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %, on purifie 3,8 mégadaltons de fragments ADNo n ajoute 1 g de pBR322 ADN à un mélange (quantité totale 10 l) similaire au mélange ci-dessus et on conduit la réaction en utilisant 1 unité de l'enzyme de restriction EcoRI et 1 unite de l'enzyme de restriction Hind III à 37 C pendant 2 heures. Ensuite, par électrophorèse sur gel d'aga- rose à 1 %, on purifie 2,6 mégadaltons de fragments ADN. On ajoute les fragments obtenus à un mélange (quantité totale : 10 l) de 50 mmol de tampon Tris-HCl pH 7,8, 10 mmol de MgCl2, 20 mmol de DTT et 1 mmol d'ATP et on conduit la réaction en utilisant 30 unités de T4ADN-ligase à 14 C pendant 24 heures. En utilisant le mélange réactionnel, , on effectue la transformation de la souche d'E. coli X 35 selon le procédé deKuschner10) dans une installation de confinement phy sique p-111). On sélectionne la souche transformée sur un plateau L (1 % de "Bactotrypton", 0,5 % d'extrait "Bactoyeast", 0,5 % de NaCl, 1,5 % de "Bactoagar") contenant de l'Ap (20 g/ml) et on réapplique les souches transformées sur un plateau EMB-lac (2,25 % de bouillon "Bacto-EMB", 1,5 % de "Bactoagar"). En outre, on sélectionne les souches converties en Las (colonie rouge). Entre ces souches, on choisit 5 souches au hasard pour preparer un plasmide que l'on analyse avec plusieurs sortes d'enzymes de restriction et on trouve alors que les quatre souches sont formées d'un fragment da 3,8 mégadalton de Aplac5ADN coordonne à un fragment @co RI-Hind ITI de pBR 322 ADN.De ces souches, on appelle l'une E. coli X 35 (pRE 1). Autrement dit, 1'E. coli transformant XA 35 (pRE 1) est différent de la souche d'E. coli XA 35 susdite par les propriétés suivantes [Apr, Lac+] Agent d'enchaînement On effectue la synthèse d'un fragment présentant la séquence fondamentale CTGAATTCACTCTGCAGAG. On conduit la synthèse et la purification selon les procédés de synthèse et de purification des gènes de structure respectifs, décrits plus haut (rendement 40 %). Dans l'invention, cet ADN à une seule channe est appelé agent de préenchaînement. On fait incuber l'agent de préenchatnement (15 pg) avec 20 unités de T4-polynucléotide-kinase à 37 C pendant 40 minutes dans un mélange (quantité totale : 30 l) de 50 mmol de tampon Tris-HCl pH 7,5, 10 ZmOL de MgC12, 0,1 mmol de spermidine, 0,1 mmol d'EDTA, 10 mmol de DTT et 0,2 mmol d'ATP. On arrête la réaction en chauffant à 60 C pendant 2 minutes. Après avoir laissé reposer le mélange à la température ambiante pendant une heure, on ajoute 300 unités, 1 l, de T4-ADN- ligase et on conduit la réaction à 14 C pendant une nuit. En chauffant à 60 C pendant 2 minutes, on arrête la réaction. On laisse reposer le mélange à la température ambiante pendant 1 heure et on ajoute 20 unités de l'enzyme de restriction Pst I pour conduire la réaction pendant 5 heures. En chauffant à 60 C pendant 2 minutes, on arrête la réaction. On obtient ainsi 15 g de l'agent d'enchatnement Pst I-Eco RI-Pst I. Préparation du gène de structure EcoRI-EcoRI On ajoute l'agent d'enchainement Pst-I-EcoRI-PstI préparé comme ci-dessus (4 g) et le gène de structure PstI Pst-I mentionné plus haut à l'Exemple 1 (0,6 pg) à un mélange (quantité totale : 35 l) de 100 mmol de tampon Tris-HCl pH 7,5, 7 mmol de MgCl2 et 50 mmol de NaCl et on conduit la réaction en utilisant 300 unités de T4 ADN-ligase à 14 C pendant 24 heures. On arrête alors la réaction en chauffant à 68 C pendant 10 minutes, puis on refroidit graduellement le mélange. Au mélange obtenu, on ajoute l'enzyme de restriction Eco RI (100 unités) pour conduire la réaction à 37 C pendant 5 heures, puis on purifie le fragment ADN à 120 paires de bases par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 5 %. Préparation de pLS et clonage On ajoute 0,25 pg de pREl à un mélange (quantité totale 4 pl) de 100 mmol de tampon Tris-HCl pH 7,5, 7 mmol de MgC12 et 50 mmol de NaCl, et on conduit la réaction en utilisant une unité de l'enzyme de restriction Eco RI à 37 0C pendant 1 heure. On ajoute le plasmide pRE 1 ainsi préparé (clivé par EcoRI) (0,25 pg) et 0,02 g du gène de structure EcoRi- EcoRI à un mélange (quantité totale : 10 l) de 50 mmol de tampon Tris-HCl pH 7,8, 10 mmol de MgCl2, 20 mmol de DTT et 1 mmol d'ATP et on conduit la réaction en utilisant 30 unités de T4 ADN-ligase à 14 C pendant 24 heures. En utilisant le mélange obtenu9 on effectue la transformation de la souche dtE. coli XA35 selon le procédé de Kuschner10) dans une installation de confinement physique P-311) On sélectionne la souche transformée sur un plateau L contenant Ap (20 eg/ml) (comme décrit plus haut). On réapplique les souches transformées sur le plateau EMB-lac (comme indiqué plus haut) pour une nouvelle sélection de la souche Lac . Parmi ces souches, on sélectionne 200 souches pour préparer des ADN de plasmide dont on analyse la structu re au moyen de l1en:yme de restriction Pst I ou Hae II pour confirmer que 11 souches ont le géne de structure ci-dessus. Détermination de la direction On conduit l'expérience suivante pour chaque plasmide des 11 souches ayant le gène de structure. On ajoute le plasmide (20 g) à un mélange (quantité totale : 20 l) de 10 mmol de tampon Tris-HCl pH 7,5, 66 mmol de MgC12 et 60 mniol de NaCl et on ajoute encore à la solution 20 unités de l'enzyme de restriction Hae 11. on conduit alors l'incubation à 37 C pendant 2 heures. Du mélange obtenu, on extrait, par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %, des fragments d'environ 1 mégadalton et des fragments d'environ 0,7 mégadalton. on clive les fragments respectifs avec l'enzyme de restriction EcoRI selon le procédé ci-dessus et on les soumet à ltélectrophorèse sur gel de polyacrylamide à 15 %.Le plasmide dans lequel1 par électrophorèse des fragments d'ADN à 40 paires de bases sont tirés du fragment d'environ 1 mégadalton et le fragment ADN à 80 paires de base est tiré du fragment d'environ 0,7 mégadalton aétéévalné comme le plasmide dans lequel le gène de structure a été inséré dans la direction correcte. Par ces expériences, on trouve que 5 souches de plasmide, sur les 11 souches qui ont le gène structural, ont la direction cor-ecte. On choisit au hasard l'une de ces souches et on l'appelle E. coli XA35 (pLS58). Identification et purification de la protéine fusionnée On soumet l'E. coli XA35 (pLS58) à une culture agitée dans 1 litre de bouillon "Luria" contenant 20 g/ml d'am- picilline à 37 C jusqu'à ce que le nombre de cellules bactériennes atteigne 5 x 108 cellules/ml. On recueille alors les cellules bactériennes par centrifugation et on les met en suspension dans un mélange (quantité totale : 100 ml) de 10 mmol de tampon Tris-HCl (pH 7,5)/10 mmol de MgC12 et on traite la suspension au moyen d'un générateur d'ultrasons Kubota "Insonator 200 M" pendant 30 minutes pour détruire les cellules bactériennes. On soumet la solution ainsi obtenue (2 l) à l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS à 7,5 % et on reconnaît une raie d'une protéine d'une grosseur de 120 000 daltons. On ne reconnaît pas de telles raies dans l'extrait tiré, de façon similaire, de la bactérie sans plasmide (souche E. coli XA35). On considère donc que cette protéine est dérivée du plasmide pLS58. I1 se confirme aussi que la protéine a pratique ment la même grosseur que la ss-galactosidase19) tirée d'E.coli, ce qui n'est donc pas en contradiction avec la grosseur (117 873 daltons) de la protéine fusionnée de la désamidosé- crétine et de la ss-galactosidase. On conclut donc que cette protéine à environ 120 000 daltons est la protéine fusionnée et on effectue la purification de celle-ci. On soumet à la centrifugation extrait obtenu par destruction ultrasonique et on récupère les précipités. On récupère la protéine fusionnée essentiellement dans les pré- cipités. On met les précipités en suspension dans un mélange (quantité totale : 100 ml) de 10 mmol de tampon Tris-HCl pH 7,5 et 1 mmol de MgCl2 et on les soumet à la centrifugation, suivie de la récupération des précipités. On répète encore deux fois cette opération pour éliminer les corps hydrosolu- bles. On dissout les précipités obtenus dans un mélange (quantité totale : 100 ml) de 20 mmol de tampon Tris-HCl pH 7,5, 1 mmol de MgC12, 10 mmol de NaCl et 7 moles d'urée et on applique à une colonne (5 cm de diamètre x 3 cm) de cellulose DEAE équilibrée avec le même tampon. Après lavage avec 20 ml du m8me tampon, on lave å nouveau la colonne avec 100 nil d'un tampon similaire dans le- quel la concentration de NaCi est portée à 50 mmol. On élue alors la protéine fusionnée avec 150 mi d'un tampon similaire dans lequel la concentration de NaCl est portée à 150 mmol. A l'éluat obtenu, on ajoute du ss-mercaptoéthanol jusqu'à la concentration finale de 1 % et on dialyse trois fois le mélange vis-à-vis de S litres d'eau. On soumet le dialysat à la centrifugation pour récupérer la protéine fusionnée comme précipités. La protéine fusionnée obtenue dans une raie pratiquement unique à l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS, à raison d'environ 28 mg pour 1 litre de bouillon de culture, ainsi qu'on le calcule d'après l'absorption à 280 nm. On calcule que cette valeur correspond à environ 280 000 molécules/cellule. On dissout la protéine fusionnée purifiée -dans 2 ml d'acide formique à 70 % et on la traite par 100 mg de bromure de cyanogène pendant 18 heures. Après évaporation, on extrait le résidu par 5 ml dtisopropanol puis par 5 ml de méthanol, cette extraction étant suivie d'une lyophilisation. Dosage biologique On dose l'échantillon lyophilisé ainsi obtenu par une méthode de dosage biologique ) dans laquelle on dissout l'échantillon lyophilisé dans un volume total de 25 ml de so- lution isotonique de chlorure de sodium ; on injecte dans l'aine de 5 rats, par voie intraveineuse, des portions de 50 1 chacune ; on mesure à des intervalles de 5 minutes les quantités de suc pancréatique sécrétées et stécoulant, d'un tube pancréatique artificiel et on détermine l'incrément comme étant l'activité biologique de la sécrétine.Comme sécrétine étalon, on injecte au préalable aux mêmes rats, par voie intraveineuse, du "Secrepant' (Eisai, Japon) à raison de 1 unité, 2 unités et 4 unités/rat et on mesure les quantités de suc pancréatique sécrété pour déterminer la correspondance avec l'unité Eisai (pratiquement égale à l'unité Crick Harper Raper). Le résultat est que les échantillons tirés de E.coli XA35 (pLS58) ca'isent une augmentation de la sécrétion de suc pancréatique. Par contre, lorsqu'on essaie par la meme méthode l'échantillon que l'on obtient en partant des extraits de cellules bactériennes tirées du clone contenant seulement pREl et exempt du gène de désamidosécrétine, on ntobserve pas d'augmentation de la sécrétion de suc pancréatique. Cela indi que qu'une substance ayant une activité biologique analogue à celle de la sécrétine est produite dans les cellules d'E. coli XA35 (pLS58), tandis que la production d'une telle substance nta pas lieu dans les cellules dlE. coli XA35 (pREl). En portant les quantités accrues de suc pancréatique sécrété sous 1 traction des échantillons tirés de 1'E. coli XA35 (pLS580 sur une ligne droite que l'on a obtenue en portant en ordonnées sur un papier semilogarithmique les quantités accrues de suc pancréatique sécrété et en abscisses les unités "Secrepan" (échelle logarithmique), on peut déterminer par interpolation que l'unité sécrétine est de 3 unités Eisai/ 50 ul/rat, ce qui représente environ 1 soe unités Eisai sous forme de 25 ml de solution isotonique de chlorure de sodium contenant l'échantillon lyophilisé.Etant donné qu'il est connu que la sécrétine la plus pure présentel3) une activité spécifique de 16 00o unités CHR/mg, 1500 unités correspondent à environ 26 nmol de sécrétine, ce qui indique qu'il s'est biosynthétisé une désamidosécrétine dont l'activité correspond à 1,6 x 1016 molécules de sécrétine. Lorsqu'on prépare la désamidosécrétine en utilisant comme matière première envuron 5 x 1011 cellules d'E. coli XA35 (pLS58), on récupère au moinx 3 x 104 molécules d'équivalent sécrétine par cellule bacté- rienne. D'après ce résultat, on peut conclure que le gène synthétique de 27-désamidosécrêtine est exprimé par l'action de l'adjuvant d'opéron de lactose d'E. coli dans les cellules de l'E. coli XA35 (pLS58) et que son produit de translation, à savoir la 27-désamidosécrétine, présente une activité similaire à celle de la sécrétine. Dosage radio-immunologique On dilue l'échantillon avec SO mmol de Tris-HCl (pH 8,0)/0,1 % d'albumine sérique de boeuf. On conduit le dosage radio-immunologique de l'échantillon dilué au moyen du "Secretinkit Daiichi", fabriqué par Daiichi Radioisotope Research Institute, Japon, selon la méthode prescrite pour confirmer son activité. 4. Schéma du gène Le diagramme ci-après indique la séquence fondamentale du gène comprenant le gène de structure de la 27-dé- samidosécrétine séparément dans les blocs A, B et C tandis que a est une paire de bases facultative, b le point Pst I, c une paire de bases facultative, d un codon initial, e le point Hinf I et f le point Hae II. Schéma du gène Bloc A Mot I@@s Ser Asp Gly Thr Phe S - 1 S - 3 A C C T G C A G C C A T G-C A C-T C A-G A T-G G T-A C T-T T G G A C G T C G G T A C-G T G-A G T-C T A-C C A-T G A-A A G-T G G-A G a b c d S - 2 S - 4 S - 6 Bloc B Phe Thr Ser Gln Leu Ser Arg Leu Arg Asp Ser Ala Arg Leu Gn Arg S - 5 S - 7 S - 9 T C-A C C-T C A-G A A-C T A-T C T-C G T-C T A-C G T-G A T-T C A-G C A-C G C-C T C-C A G-C T-C T T-G A T-A G A-G C A-G A T-G C A-C T A-A G T-C G T-G C G-G A G-G T C-G C G-A A C-G A e f S - 8 S - 10 S - 12 Bloc C Arg Leu Leu Gln Gly Leu Val Fin Fin S - 11 S - 13 S - 15 G C-T T G-C T G-C A A-G G T-C T C-G T T-T G A-T A G-G G C T G C A G G T C-G T T-C C A-G A G-C A A-A C T-A T C-C C G A C G T C C A b a S - 14 S - 16 5.Dépôt de microorganismes E. coli K12C600, E. coli XA35 et son transformant E. coli XA35 (pRE1) avec le plasmide Prel ont été déposés, en application du Traité de Budapest sur la reconnaissance internationale du dépôt and de microorganismes aux fins de la procédure de brevet au Fermentation Research Institude, Aaency of Industrial Science Technology (FERM), 1-3, Higashi l-cho- me, Yatabemachi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken, Japon, sous les références FERM BP-115, en date du 9 juin 1981, FERM BP-116, en date du 7 janvier 1982, et FERM BP-117, en date du 7 janvier 1983.Le plasmide pBR322 est déposé au FERM sous la forme d'un transformant d'E. coli K12C600 avec pBR322, à savoir sous la désignation E. coli Kl2C600 (pBR322), sous le numéro FERM P-6017, en date du 9 Juin 1981. E. coli K12C600 (pMG 103) aui est le transformant obtenu avec le plasmide chimère pMG, a été déposé à l'Ameri- can Type Culture Collection (ATCC), 12301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, E.U.A., sous le N ATCC 39042, en date du 26 Janvier 1982. E. coli PK 1512, qui ost la bactérie lysogène #plac5, a été déposé à ItInstitude for Fermentation, Juso- Hommachi 2-17-85, Yodogawa-ku, Osaka-Shi, Japon, sous le nu métro IFO N 14149, en date du ler Février 1982. E. coli XA 35 (pLS58), qui est le transformant obtenu avec le plasmide chimère, a été déposé en vertu du Traité de Budapest à 1ATCC sous le numéro ATCC 39 040 en date du 11 Janvier 1982. R E V E N D I C A T I O N S 1 - 27-désamidosécrétine, constituant un polypeptide représenté par la formule de séquence d'aminoacides His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu Ser-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln Arg-leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-OH dans laquelle Val-OH indique que l'extrémité C du polypeptide, formée de valine, est un acide carboxylique. 2 - Procédé de préparation de 27-désamidosécrétine, caractérisé par les étapes suivantes (1) on synthétise chimiquement un gène de structure appropriée à la désamidosécrétine, correspondant au polypeptide dans lequel l'aminoacide de l'extrémité C est la valine, (2) on insère ce gène dans un plasmide vecteur capable de proliférer dans une cellule hotte pour former un plasmide chimère capable de proliférer dans la cellule, (3) on transforme la cellule h8te avec le plasmide chimère, (4) cn cultive le transformant obtenu et l'on récupère la désamidosécrétine formez 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la cellule hotte est un Escherichia coli. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'E. coli est E. coli K12C600, FERM BP-ll5. 5 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que ie plasmide vecteur est pBR322. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le plasmide chimère est p auquel est incor- poré le gène de structure au point de reconnaissance Pst I de pBR322. 7 - Procédé de préparation de 27-désamidosécrétine caractérisé par les étapes suivantes (1) on synthètise chimiquement un gène de structure appropriée à la désamidosécrétine, correspondant au poly peptide dans lequel l'aminoacide de l'extrémité C de la sécrétine est la valine, (2) on prévoit un plasmide vecteur capable d'utiliser l'opéron de lactose et capable aussi de proliférer dans une cellule hôte prédéterainée, (3) on insère le gene de structure dans le plasmide vecteur pour obtenir un plasmide chimère capable de proliférer dans la cellule, (4) on transforme la cellule hôte avec le plasmide chimère, (5) on cultive le transformant obtenu et l'on récupère la désamidosécrétine formée. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que la cellule hôte est un Escherichia coli. 9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'E. coli est E. coli XA35, FERM BP-116, souche déficiente en gène de p-galactosidase et déficiente aussi en gène "i". 10 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'opéron de lactose est tiré d'E. coli. Il - Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que le plasmide vecteur contient la totalité ou une partie de l'opéron de lactose tiré de 1'ADN des chromosomes d'E. coli et qu'il est capable de proliférer dans E. coli. 12 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le plasmide vecteur est tiré d'un bactériophage de transduction contenant la totalité ou une partie de l'opéron de lactose et un plasmidetiré d'E. coli. 13 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que le bactériophage de transduction est pdld, F'-lac, t80dplac, Ah80dlac ou #plac. 14 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que le plasmide tiré d'E. coli est pBR 322, pSC 101 ou #dvl. 15 - Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait que le bactériophage est XplacS, 16 - Procédé selon la revendication 14, caracté- risé par le fait que le plasmide est pBR 322. 17 - Procédé selon l'une des revendications 15 et lô, caractérisé par le fait que le plasmide vecteur est pRE qui comprend les 3,8 Md du fragment #plac5, enchaîné au plus grand des fragments obtenus par digestion de pBR322 avec EcoRI et Hind 1II. 18 - Procédé selon la revendication 17, caractérisé par le fait que le le plasmide chimère est pLS qui est un produit d'insertion du gene de structure mentionné dans pRE à son point de reconnaissance d'EcoRI. 19 - Un Escherichia coli transformé par un plasmide de auquel est incorporé un gène de structure de la désamido- sécrétine synthétisé chimiquement, correspondant au polypeptide dont l'aminoacide de l'extrémité C est la valine et capable d'utiliser l'opéron de lactose et aussi de proliférer dans une cellule hotte prédéterminée. 20 - Un E. coli selon la revendication 19, qui est E. coli XA35 (pLS58), ATCC 39040. 21 - Polydésoxyribonucléotide à deux chaînes comprenant un gène de structure expriment la 27-désamidosécrétine. 22) Un polydésoxyrubenucléotide à deux chaînes selon la revendication 21, caractérisé par le fait que le gène de structure présente la séquence fondamentale : His Ser Asp Gly Thr Phe Thr CAC - TCA - GAT - GGT - ACT - TTC - ACC GTG - AGT - CTA - CCA - TGA - AAG - TGG Ser Glu Leu Ser Arg Leu Arg TCA - GAA - CTA - TCT - CGT - CTA - CGT AGT - CTT - GAT - AGA - GCA - GAT - GCA Asp Ser Ala Arg Leu Gln Arg GAT - TCA - GCA - CGC - CTC - CAG - CGC CTA - AGT - CGT - GCG - GAG - GTC - GCG Leu Leu Gln Gly Leu Val TTG - CTG - CAA - GGT - CTC - GTT AAC - GAC - GTT - CCA - GAG - CAA. 23 - Un polydésoxyribonucléotide à deux chaines selon l'une des revendications 21 et 22, caractérisé par le fait que le gène de structure contient un codon désignant la méthionine à l'extrémité 5t et un ou plusieurs codons servant à désigner l'arrêt de translation à l'extrémité 3t. 24 - Un polydésoxyribonucléotide a deux channes selon la revendication 23, caractérisé par le fait que l'ex- trémité 5t du codon de méthionine et l'extrémité 38 du codon d'arrêt de translation présentent 3m paires de bases, (3m + 1) paires de base ou (31 + 2) paires de bases (m étant O ou un nombre entier au moins égal à 1) de bases choisies au hasard. 25 - Un polydésoxyribonucléotide à deux chatnes selon la revendication 24, caractérisé par le fait qu'il comporte une séquence fondamentale de reconnaissance de toute en de de restriction désirée aux deux extrémités et qu'il présente, hors des extrémités résultantes, au moins deux paires de bases, de tanière à donner des extrémités émoussées choisi sies au hasard. 26 - Un polydésoxyribonucléotide à deux chaînes selon la revendication 21, caractérisé par le fait qutil présente la structure suivante : Met ACCTGCAGCC - ATG TGGACGCGG - TAC His Ser Asp Gly Thr Phe Thr CAC - TCA - GAT - GGT - ACT - TTC - ACC GTG - AGT - CTA - CCA - TGA - AAG - TGG Ser Glu Leu Ser Arg Leu Arg TCA - GAA - CTA - TCT - CGT - CTA - CGT AGT - CTT - GAT - AGA - GCA - GAT - GCA Asp Ser Ala Arg Leu Gln Arg GAT - TCA - GCA - CGC - CTC - CAG - CGC CTA - AGT - CGT - GCG - GAG - GTC - GCG Leu Leu Gln Gly Leu Val TTG - CTG - CAA - GGT - CTC - GTT AAC - GAC - GTT - CCA - GAG - ss FIN FIN TGA - TAG - GGCTGCAGGT ACT - ATC - CCGACGTCCA 27 - plasmide comprenant un gène de structure qui exprime la 27-désamidosécrétine. 28 - Plasmide selon la revendication 27, caracte- risé par le fait qu'il provient de pBR322. 29 - Procédé de préparation de 27-désamidosécréti- ne, caractérisé par les étapes suivantes t (1) on prévoit un plasmide chimère qui comprend un fragment d'un gène de structure appropriée à une désamidosécretine correspondant à un polypeptide dans lequel l'aminoacide de l'extrémité C est la valine1 le plasmide chi- mère étant capable de proliférer dans une cellule hôte prédé- terminée et étant capable d'exprimer le gène de structure appropriée à une désamidosécrétine dans la cellule hôte, (2) on transforme la cellule hôte avec le plasmide chimère, (3) on cultive le transformant obtenu et l'on récupère la désamidosécrétine formée. 30 - Procédé selon la revendication 29r earacté- risé par le fait que le plasmide chimère est capable d'utili- ser l'opéron de lactose. 31 - Procédé selon la revendication 30, caractérisé par le fait que l'on obtient le plasmide chimère en insérant le gène de structure dans un plasmide vecteur capable d'utiliser l'opéron de lactose et capable aussi de proliférer dans la cellule hôte. 32 - Procédé selon la revendication 31, caractéri- sé par le fait que le plasmide vecteur contient la totalité ou une partie de l'opéron de lactose tiré de ltADN des chromosoies d'E. coli et qu'il est capable de proliférer dans E.coli. 33 - Procédé selon la revendication 32, caractérisé par le fait que le plasmide vecteur est tiré d'un bactério- phage de transduction contenant la totalité ou une partie de l'opéron de lactose et un plasmide tiré d'E. coli. 34 - Procédé selon la revendication 33, caractérisé par le fait que le bactériophage de transduction est pldl, '-lac, 80dplac, h80dplac ou J plac. 35 - Procédé selon la revendication 33, caractérisé par le fait que le plasmide dgE. coli est pBR322 pSC101 ou dvl. 36 - Procédé selon la revendication 34, caractérisé par le fait que le bactériophage est #plac5. 37 - Procédé selon la revendication 35, caractéri- sé par le fait que le plasmide est pBR322. 38 - Procédé selon les revendications 36 et 37, caractérisé par le fait que le plasmide vecteur est pRE, qui comprend les 3,8 Md du fragment de #plac5 enchaîné au plus grand des fragments obtenus par digestion de pBR322 avec EcoRI et HindIII. 39 - Procédé selon la revendication 38, caractéri- sé par le fait que le plasmide chimère est pLS, qui est un produit d'insertion du gène de structure dans pRE à son point de reconnaissance d'EcoRI.