FR 2508171 A1 19821224 FR 8112150 A 19810619 Appareil d'étude biochimi ue ar mesure des caractéristiques optiques d'un échantillon La présente invention a pour objet un appareil de mesure des caractéristiques optiques d'un échantillon fluide et permet notamment de suivre et analyser les transformations biochimiques subies par un tel échantillon. On connait déjà des appareils de mesure comprenant un porte-échantillon, destiné à recevoir un réceptacle contenant l'échantillon lui-même,et des moyens optiques. Ces derniers permettent d'envoyer un faisceau de lumière dans l'échantillon et de recueillir la lumière transmise ou diffusée dans une direction déterminée. La présente invention vise notamment à fournir un appareil permettant d'obtenir une meilleure précision. Dans ce but, les moyens optiques comprennent des premiers moyens pour envoyer un faisceau de lumière suivant une direction déterminée dans l'échantillon, des seconds moyens pour recueillir la lumière transmise à travers l'échantillon et fournir un signal électrique représentatif de cette lumière, des troisièmes moyens pour recueillir la lumière diffusée sous un angle déterminé et fournir un signal électrique représentatif de cette lumière diffusée, et des moyens électriaues amplificateurs reliés auxdits seconds et troisièmes moyens et fournissant un signal représentatif de la différence ou du rapport des signaux fournis par lesdits moyens. Le troisièmes moyens peuvent avantageusement comporter d'une part un transducteur permettant de recueillir la lumière rétrodiffusée, d'autre part, un transducteur permettant de recueillir la lumière diffusée sous un angle daterminé, avantageusement de 90". Chacun de ces deux transducteurs est alors associé à un amplificateur différentiel -distinct qui reçoit également le signal de sortie d'un transducteur constituant les seconds moyens. L'échantillon est fréquemment le siège de phénomènes qui ont une incidence, non seulement sur l'intensité de la lumière absorbée ou diffusée, mais aussi sur les paramètres caractéristiques d'une lumière polarisée envoyée sur l'échantillon. C'est notamment le cas en hématologie, notamment lorsque l'on s'intéresse à l'analyse de phénomènes membranaires. Dans ce cas, les premiers moyens seront avantageusement d'un type envoyant dans l'échantillon un faisceau de lumière polarisée, et les troisièmes moyens comporteront alors, en amont du transducteur sur le trajet de la lumière, un analyseur croisé avec le polariseur. On pourra ainsi suivre les modifications de polarisation de la lumière transmise au cours du déroulement d'un processus réactionnel. On peut de plus déterminer le déphasage donné à la lumière en provoquant un phénomène de battement entre une fraction du faisceau incident, prélevé à l'aide d'une lame semi-réfléchissante, et une fraction déterminée du faisceau rétrodiffusé. L'évolution de la phase pourra par exemple etre suivie par comptage du nombre de franges d'interférence qui défilent devant la fente d'un diaphragme. L'invention vise également à résoudre un problème qui se pose en cas d'analyse d'un certain nombre de phénomènes, et notamment de phénomènes membranaires, problème rencontré sur la quasi totalité des appareils d'analyse de phénomènes membranaires existant actuellement et dont la source n avait pas été décelee jusqu'ici. Ces appareils d'analyse utilisent une agitation électromagnétique du liquide dans la cellule réactionnelle, à l'aide d'un barreau magnétique ou d'une hélice entrainée par un moteur électrique situé à proximité immédiate de l'échantillon. Les inventeurs ont constaté que le champ électromagnétique variable ainsi imposé à l'échantillon modifie de façon considérable les échanges à travers les membranes et, par voie de conséquence, divers processus tels que l'aggrégation.Pour écarter cette difficulté, un appareil de mesure selon un autre aspect de l'invention comprend des moyens purement mécaniques d'agitation, permettant de donner au porteéchantillon un mouvement alternatif suivant deux directions, typiquement dans le sens vertical et en rotation autour d'un axe vertical. Pour protéger encore davantage l'échantillon, le porte échantillon est avantageusement muni d'un blindage. par exemple en mumétal. L'invention vise encore à améliorer les processus de transfert de'lumière entre l'échantillon et l'extérieur et, dans ce but, propose un appareil dans lequel les trajets optiques entre l'échantillon et lesdits moyens sont réalisés par des fibres optiques qui doivent évidemment avoir une flexibilité suffisante pour tolérer les déplacements relatifs entre les moyens et le porte-échantillon lorsque celui-ci est associé à des moyens permettant de le faire osciller pour agiter l'échantillon. On peut ains placer lesdits moyens à poste fixe, de sorte que l'équipage oscillant peut avoir une masse très faible. Les fibres optiques seront monomodes lorsqu'elles doivent maintenir la polarisation de la lumière qu'elles transmettent à l'échantillon ou qu'elles reçoivent de l'échantillon. De telles fibres monomodes étant de très faible diamètre, elles ont automatiquement une grande souplesse leur permettant de tolérer les oscillations de l'échantillon. De plus, la faible surface de leur tranche terminale permet de les utiliser pour transmettre la lumière vers un échantillon de très faible volume et à partir de celui-ci. Pour tenir compte de la faible valeur des flux lumineux qui les traversent, les transducteurs des seconds et des troisièmes moyens pourront alors être constitués par des photomultiplicateurs, qui ont une meilleure sensibilité que la plupart des autres transducteurs envisageables. Lorsque l'appareil est destiné à etre utilise en hématologie, les premiers moyens seront avantageusement choisis de façon à fournir de la lumière dans le spectre visible ou ultraviolet proche, On pourra en particulier utiliser un laser à colorant, qui permet, à l'aide de techniques classiques d'échantillonnage, d'effectuer simultanément l'étude des variations d'absorption, des variations du temps de polarisation et de déphasage pour plusieurs longueurs d'ondes différentes. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit d'appareils qui en constituent des modes particuliers de réalisation, donnés à titre -d'exemples non limitatifs. La description se réfère aux dessins qui l'accompagnent, dans lesquels - la Figure 1 est un schéma de principe montrant une constitution particulièrement simple de l'appareil, - la Figure 2 est un schéma de principe montrant la partie optique d'un appareil permettant d'analyser la cinétique d'un phénomène par suivi des variations d'absorption, de polarisation et de déphasage dans un échantillon, - la Figure 3 est un schéma de principe montrant la matérialisation des trajets optiques à l'aide de fibres optiques monomodes, - la Figure 4 montre un mécanisme agitateur mécanique pour appareil de mesure, en coupe suivant un plan vertical, - la Figure 5 est un schéma cinématique représentant, vue de dessus, la cinématique d'entrainement du porte-échantillon en oscillation autour d'un axe vertical. Pour simplifier, on décrira maintenant diverses réalisations suivant l'invention que l'on supposera destinées à l'étude de phénomènes membranaires, tels que notamment la cinématique d'aggrégation de produits sanguins. Dans ce cas, les inventeurs ont constaté que les phénomènes membranaires proprement dits ont notamment une incidence sur la polarisation de la lumière diffusée, tandis que les phénomènes de chimie extracellulaires ont une incidence plus marquée sur l'absorption de lumière et la phase de celle-ci. Dans le mode de réalisation le plus simple, montré en Figure 1, l'appareil comporte un réceptacle 10 dans lequel est placé un échantillon 11 du produit sanguin dont la cinématique d'évolution est à suivre. La cellule de mesure ainsi constituée est placée dans un porte-échantillon 12. Des premiers moyens optiques, schématisés sous forme d'une source 13, permettent d'envoyer dans l'échantillon, à travers le réceptacle transparent lo, un faisceau 14 de lumière qui sera généralement monochromatique. La lumière transmise par l'échantillon 11 est recueillie, également à travers le réceptacle 10, par des seconds moyens, qui peuvent se limiter à un transducteur 15. Le signal de sortie de celui-ci, proportionnel à l'intensité lumineuse qu'il reçoit, est appliqué sur l'une des entrées d'un amplificateur différentiel 16.Des troisièmes moyens, destinés à recueillir la lumière rétrodiffusée, comportent, dans le mode de réalisation de la figure I, un transducteur unique 17 qui peut etre similaire au transducteur 15. La sortie électrique de ce transducteur est appliquée à la seconde entrée de l'amplificateur différentiel 16, qui fournit un signal de sortie représentatif de la différence des signaux d'entrée. Ce signal de sortie est appliqué à un enregistreur qui montrera l'évolution en fonction du temps de la lumière rétrodiffusée. On sait que la proportion rétrodiffusée va augmenter au fur et à mesure que se développe le phénomène d'aggrégation, les aggrégats de plaquettes provoquant une réflexion de la lumière. L'appareil dont le schéma optique est montré en Figure 2 constitue une variante de réalisation de celui de la figure 1 et, pour cette raison, les organes correspondant à ceux de la figure 1 sont désignés par le me me numéro de référence. Cet appareil de la figure 2 permet de suivre l'évolution des propriétés optiques d'absorption de lumière, de rotation du plan de polarisation et de déphasage. Dans ce but, l'appareil de la figure 2 comporte un polariseur 18 placé sur le trajet de la lumière incidente fournie-par la source 13, typiquement une source cohérente. On utilisera généralement dans ce but un laser à colorant de type disponible dans le commerce, capable de fournir une lumière de longueur d'onde ajustable dans le spectre visible et dans le proche ultraviolet. La lumière rétrodiffusée est renvoyée sur le détecteur 17 par un système optique comportant un miroir 19 et une lame semi-réfléchissante 20 qui permet de prélever une fractIon de la densité du faisceau, dans un but qui sera expliqué plus loin. L'amplificateur différentiel 16 donnera, comme dans le cas illustré en figure 1, un signal de sortie qui est fonction dé la proportion de lumière rétrodiffusée. L'appareil de la figure 2 comprend, pour permettre de suivre les variations des propriétés de polarisation de 11 échantillon 11, une chaîne de mesure de la lumière diffusée à 900. Cette chaîne comprend un analyseur 21 croisé avec le polariseur 18, sur le trajet de la lumière vers un transducteur 22. Celui-ci attaque l'une des entrées d'un amplificateur différentiel 23 dont l'autre entrée reçoit le signal de sortie du transducteur 15. Avant tout début d'aggrégation, le signal de sortie du transducteur 22 est sensiblement nul, la lumière qui pénètre dans l'échantillon 11 ne subissant aucune rotation de son plan de polarisation.Au fur et à mesure de l'évolution des phénomènes intéressant les membranes des plaquettes, il se produit une rotation du plan de polarisation de la lumière recueillie par l'analyseur 21 et, en conséquence, l'apparition d'un signal de sortie sur le transducteur 22. Enfin, pour permettre le suivi de l'évolution du déphasage introduit par les phénomènes de chimie extracellulaires, l'appareil montré en figure 1 comporte un système pour créer des franges d'interférence par battement d'une fraction du faisceau de lumière incident avec une fraction du faisceau de lumière rétrodiffusée. Dans ce but, une lame semi-transparente 24 est placée sur le trajet du faisceau incident, en amont du polariseur 18, sur la fente d'un diaphragme 25. Cette fente reçoit également une fraction de la lumière rétrodiffusée, préievée par la lame semitransparente 20 et réfléchie par un miroir 26. Les franges d'interférence sont observées par un transducteur 27 associé à un amplificateur différentiel 28.Un système de comptage (non représenté) placé à la sortie de l'amplificateur différentiel 28 permet de déterminer le nombre de franges qui ont traversé la fente et donc le déphasage. Dans le mode de réalisation montré en figure 3 (où les organes correspondant à ceux des figures 1 et 2 sont désignés par le même numéro de référence), les trajets de lumière sont matérialisés par des fibres optiques. Seules des fibres optiques monomodes peuvent être utilisées lorsque les mesures s'effectuent non seulement sur l'intensité de la lumière, mais aussi sur la polarisation et le déphasage. En effet, les mélanges qui interviendraient dans les fibres multimodes interdiraient toute mesure significative de déphasage et de rotation du plan de polarisation. Sur la figure 3, les mesures sont effectuées uniquement sur la lumière diffusée à 90a. La source 13 qui fournit un faisceau de lumière monochromatique polarisée sera généralement un laser. Le faisceau de sortie de ce laser étant très supérieur au diamètre de la partie active de la fibre monomode d'amenée de lumière, les dimensions de ce faisceau doivent être réduites. On Deut utiliser dans ce but, placés en cascade, une optique réductrice classique 31 qui ramène le faisceau à un diamètre de l'ordre de 0,8 mm et un objectif de microscope 32 qui focalise la lumière sur la tranche d'entrée de la partie active de la fibre. La partie terminale opposée de cette dernière peut etre encastrée dans le porte-échantillon 12, plus haut que dans le cas illustré en figure 1.La tranche terminale de la fibre émettra alors dans un clone, représenté en tirets sur la figure 3. Seule la partie de l'échantillon située dans ce cône fournira une réponse et l'on voit que l'on aura généralement intérêt a travailler sur des micro-échantillons de faibles volumes, qui peuvent être inférieurs aux volumes réactionnels classiquement utilisés en hématologie, compris entre 200 et 300 ml. Deux autres fibres optiques 33 et 34 permettent respectivement de ramener la lumière transmise et la lumière diffusee aux transducteurs 15 et 22. Etant donné la faible intensité lumineuse recueillie, on aura intérêt à constituer ces transducteurs par des photomultiplicateurs. Comme dans les cas précédents, l'amplificateur différentiel 23 fournit un signal représentatif de la différence entre la composante en quadrature de la lumière diffusée à 90O et l'ensemble de la lumière transmise. Grâce à ce montage différentiel, on élimine encore les variations dues à l'émission, à une absorption chromatique sélective, aux hétérogénéités accidentelles, etc. L'utilisation de fibres optiques souples permet de tolérer des déplacements de l'échantillon. Par voie de conséquence, elle permet de remplacer l'agitation par un organe mobile, tel que barreau magnétique ou hélice, impliquant de soumettre l'échantillon à un champ électromagnétique variable, par une agitation mécanique du réceptacle 10. A titre d'exemple, les figures 4 et 5 montrent un mécanisme d'agitation du réceptacle à échantillon 10 destiné à etre incorporé dans un appareil de mesure où les trajets de lumière sont matérialisés par des fibres optiques flexibles. I1 n'est pas nécessaire de décrire ici l'en- semble de la constitution de l'appareil, étant donné qu'elle ne soulève aucun problème de réalisation. Le mécanisme montré en figures 4 et 5 comprend un socle 39 sur lequel est fixée une plaque 40 portant un moteur électrique rotatif 41. L'arbre de sortie de ce moteur entrain, par l'intermédiaire d'une liaison biellemanivelle, visible en figure 5, un doigt 42 appartenant à un équipage rotatif, désigné dans son ensemble par la référence 43. Ainsi, la mise en rotation du moteur 41 fait osciller l'équipage rotatif d'une extrémité à l'autre de l'angle a (figure 5). L'équipage mobile en rotation est guidé par deux coussinets 44 portés l'un par la plaque support 40, l'autre par une plaque supérieure 38 solidarisée de la plaque support par des moyens non visibles sur les figures. I1 comporte une partie fixe en translation axiale, formée par un barillet 45 muni du doigt 42. Ce barillet est percé d'un trou axial dans lequel peut coulisser la tige d'une platine chauffante 46 percée de trous radiaux de réception des fibres optiques 30 et 31. Le porte échantillon 12 prévu pour s'emboiter dans la platine chauffante 46 comporte des trous dont l'emplacement doit colncider avec celui des fibres optiques. Pour assurer cette coïncidence, un dispositif de réglage peut être prévu et comporter un écrou 47 sur lequel prend appui une excroissance 48 du porteéchantillon. Dans le mode de réalisation montré en figure 4, la platine 46 est percée d'un trou supplémentaire de passage de la lumière vers la fibre 34 et l'excroissance 48 est percée d'un trou de réception de la partie terminale d'une fibre optique 49 de retour de lumière rétrodiffusée. Les moyens permettant de donner à la platine chauffante un mouvement de va-et-vient vertical, indiqué par la flèche f, sont constitués par un électro-aimant dont le bobinage 50 est fixé à la plaque 40 et dont l'armature se prolonge par une tige 51 fixée à la tige de la platine. Pour empêcher la tige de l'armature de tourner, une goupille 52 qui la traverse est emprisonnée dans des fentes 53 du barillet 45. Le moteur électrique 41 et l'électro-aimant 50 sont susceptibles de créer des champs électromagnétiques variables. Pour soustraire l'échantillon à leur action, la cavité de la platine 46 qui reçoit le porte-échantillon est avantageusement revêtue d'une enveloppe en mumétal 54. L'excitation du moteur 41 et de l'électro-aimant 50 peut être effectuée par un programmateur qui permet d'effectuer n'importe quelle composition de mouvement requise et notamment une agitation permanente suivant les deux mouvements, une agitation alternée, ou une excitation pendant des intervalles de temps séparés par des périodes de repos. L'invention est susceptible de nombreuses variantes de réalisation portant aussi bien sur la constitution de l'appareil que sur son mode d'exploitation. En particulier, lorsqu'on utilise une source monochromatique de longueur d'onde ajustable, il est possible de déterminer simultanément les variations des paramètres de l'échantillon pour plusieurs longueurs d'onde différentes. I1 suffit dans ce but d'utiliser des techniques d'échantillonnage et de répéter à intervalles réguliers un cycle de n mesures identiques,mais pour des longueurs d'onde d'émission du laser. Revendications 1. Appareil de mesure des caractéristiques optiques d'un échantillon fluide susceptible de subir des transformations biochimiques modifiant lesdites caractéristiques en fonction du temps, comprenant un porteéchantillon (12) destiné à recevoir un réceptacle à échantillon (10) et des moyens optiques, caractérisé en ce que les moyens optiques comprennent des premiers moyens (13) pour envoyer un faisceau de lumière dans l'échan- tillon, des seconds moyens (15) pour recueillir la lumière transmise par l'échantillon et fournir un signal électrique représentatif de cette lumière, des troisièmes moyens (17 ou 22) pour recueillir la lumière diffusée sous un angle déterminé et fournir un signal électrique représentatif de cette lumière diffusée, et des moyens électriques amplificateurs reliés aux seconds et troisièmes moyens et fournissant un signal représentatif de la différence ou du rapport des signaux fournis par lesdits seconds et troisièmes moyens. 2. Appareil suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les troisièmes moyens comportent, d'une part, un transducteur (17) de recueil de la lumière rétrodiffusée et un transducteur (22) de recueil de la lumière diffusée sous un angle déterminé, avantageusement de 900C environ. 3. Appareil suivant la revendication 2, caractérisé en ce que chacun des deux transducteurs (17, 22) est associé à un amplificateur différentiel distinct (16, 23) qui reçoit également le signal de sortie d'un transducteur (15) constituant les seconds moyens. 4. Appareil suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que les premiers moyens sont d'un type envoyant dans l'échantillon un faisceau de lumière polarisée et en ce que les troisièmes moyens comportent, en amont d'un transducteur (22) sur le trajet de la lumière, un analyseur (21) croisé avec le plan de polarisation de la lumière envoyée dans l'échantillon. 5. Appareil suivant la revendication 4, caractérisé par des moyens pour prélever une fraction du faisceau de lumière émis par la source et le faire battre avec une fraction du faisceau diffusé, typiquement rétrodiffusé, par l'échantillon, en vue de déterminer le déphasage donné par l'échantillon à la lumière. 6. Appareil suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens purement mécaniques d'agitation de l'échantillon, constitués pour donner au porte-échantillon (12) un mouvement alternatif suivant deux directions différentes, typiquement dans le sens vertical et en rotation autour d'un axe vertical. 7. Appareil suivant lttune quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le porteéchantillon est muni d'un blindage magnétique. 8. Appareil suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les trajets optiques entre l'échantillon et lesdits moyens sont réalisés par des fibres optiques de flexibilité suffisante pour tolérer les déplacements relatifs entre les moyens et le porte-échantillon lorsque celui-ci est associé à des moyens permettant de le faire osciller pour agiter l'échantillon. 9. Appareil suivant la revendication 8, caractérise en ce que les fibres optiques sont monomodes et en ce que les seconds et les troisièmes moyens comportent des transducteurs constitués par des photomultiplicateurs. 10. Appareil suivant l'une quelconque des revendications précédentes, destiné à l'hématologie, caractérisé en ce que les premiers moyens sont choisis de façon à fournir de la lumière dans le spectre visible ou ultraviolet proche et peuvent notamment être constitués par un laser à colorant.