FR 2511006 A1 19830211 FR 8115091 A 19810804 La présente invention est relative à un procedé de synthèse de polydésoxynu-léotide à partir de 2'- dés9xynucléotide 5'-triphosphatesà l'aide d'une enzyme DNA polymérase qui contient un groupe mercapto-libre extérieur au centre actif, en présence de cations divalents et éventuellement d'un complexe matrice-primaire dans une solution aqueuse tamponnée, à un pH compris entre 6,5 et 9,5 et à une temperature comprise entre 15 et 42 OC requise par l'enzyme mise en oeuvre Le complexe matrice-primaire est du même type que la molécule polymère à synthétiser. Ainsi que cela est connu, la synthèse enzymatique des polydésoxynucléotides est effectuée dans de réactions en phase homogène. Ces méthodes sont décrites: par exemple, par J.F. Burd et RD. Wells, J. Mol Biol 53, 435-459 (1970); F.J. Bollum, "Procedures in Nucleic Acid Research", p. 591, G.L. Cantoni et D.R. avives, eds., Harper et Row, New-York 11966); J. Sagi, A. Szabolcs, A. S emro et L. Otvös, Nucleic Acids Research 4, 2767-2777 (1977).Dans ces procédés, la solution aqueuse tamponnée contient les substrats, le complexe matrice-primaire, I1 enzyme et les cations nécessaires au fonctionnement optimal de l'enzyme. Le mélange réactionnel est incubé et lorsque la réaction est achevée, l'enzyme est dénaturée (par exemple par chauffage de la solution) et la protéine d'enzyme précipitée est éliminée du melange. Le polydésoxynucléotide produit présentant un poids moléculaire élevé, est alors séparé du mélange par dialyse. Les polydésoxynucléotides obtenus de cette manière sont utilisés comme modèles de DNA pour l'étude des propriétés physiques, chimiques, biochimiques et biologiques des acides nucléiques. Un modèle de DNA généralement utilisé est, par exemple, le copolymère à double hélice à alternance stricte du 2' -désoxyadénosine-5'-monophosphate dAMP] et du thymine-5' -monophosphate FdTMP] ... -dAMP-dTMP-dAMP-dTMP- .,., qui est représenté.par l'abrévation : poly d[A-T] La séquence de nucléotides d'un brin de DNa synthétisé par des enzymes DNA polymérases DNA - dépendantes, est déterminée par la séquence de nucléotides de la matrice de DNA mise en oeuvre. Pour préparer des molécules de poly drA-T), il faut donc une molécule matrice de poly d (A-T).De cette façon, on peut préparer des polydésoxynucléotides de différentes structures en présence de matrices d'amorçage convenables telles que, par exemple, le polyEdA3, le polydT], le poly dG-C,le poly d[I-C], le poly(dG]..polydCj, le poly Idi]. polyrdC],etc., où A = adénine, T = thymine, r = guanine, I = inosine et C = cytosine. Certains types de DNA polymérases sont capables de synthétiser de novo du poly d (A-T), c'est-à-dire sans addition de poly d lA-Ti exogène au mélange réactionnel initial. Une telle enzyme est, par exemple, la DNA polymérase I isolée à partir de l'Escherichia coli bacterium. L'inconvénient que présentent les procédés connus mentionnés ci-dessus pour la synthèse de polydésoxynucléotides, réside en ce que l'enzyme ne peut être utilisée qu'une seule fois et que l'enzyme est dénaturée tandis qu'elle est éliminée du mélange lors du traitement de celui-ci. La présente invention a pour but de pourvoir à une méthode qui supprime cet inconvénient. La présente invention repose sur la constatation que ce but peut être atteint si la synthèse des polydésoxynucléotides est réalisée à l'aide d'une enzyme DNA polymérase fixée à une phase solide. De cette façon, l'enzyme peut être éliminée du mélange réactionnel par filtration et peut être utilisée à nouveau. Une autre base sur laquelle repose l'invention est représentée par le fait que la Demanderesse a constaté que des enzymes DNA polymérases portant des groupes mercapto libres extérieurs au centre actif, peuvent être fixées sur une phase solide et être utilisées sous cette forme dans les buts ci-dessus. Grâce à ce groupe mercapto-(thiol), l'enzyme peut être fixée a une phase solide appropriée sans qu'il y ait perte ou réduction de son activité. Sur la base de ces constatations, la présente invention a pour objet une méthode pour réaliser la synthèse de polydésoxynucléotides à partir de 2'-désoxynucléotides à l'aide d'une enzyme DNA polymérase qui contient un groupe mercaptolibre à l'extérieur du centre actif, en présence de cations divalents et éventuellement d'un complexe matrice-primaire dans une solution aqueuse tamponnée à un pH compris efltre 6,5 et 9,5 et à une température comprise entre 15 et 42 OC nécessitée par l'enzyme utilisée. Conformément à la présente invention, on utilise une enzyme DNA polymérase fixée parue liaison covalente à une phase solide qui est capable de former des liaisons avec des groupes mercapto-. Conformément à un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, on utilise comme phase solide, un réactif contenant un groupe thiol immobilisé. On a constaté que les phases solides capables de former des liaisons avec un groupe mercapto- qui conviennent pour réaliser l'immobilisation des enzymes sont les suivantes des réactifs à groupe thiol immobilisé à base d'agarose modifié, tels que par exemple - le Thiopropyl-Sépharose 6B (brochure d'information éditée par Pharmacia, 1977) ou le Thiol-Sepharose 4B activé (brochure d'information de Pharmacia, 1974) La structure du Thiopropyl-Sépharose 6B est représentée à la figure 1. La matrice est de l'agarose modifié. Le Thiopropyl-Sépharose 6B renferme environ 20 moles de groupes 2-thiopyridyles par ml de gel gonflé ; 1 g de poudre lyophilisée regonfle en donnant environ 3 ml de gel sédimenté.Le groupe thiol immobilisé, protégé et activé par un groupe 2-thiopyridyle, peut être débarrassé de sa protection de différentes manières et on peut rapidement le faire réagir avec des réactifs qui forment une liaison disulfure mixte. Dans cette réaction, le groupe 2-thiopyridyle mobile présente un coefficient d'extinction molaire de 8,08 X 103 M 1cm 1 à 343 nm selon la brochure d'information de Pharmacia, 1977. On fait gonfler le réactif en phase solide dans un tampon phosphate de potassium (pH 7,4) et on le verse dans une colonne, au sommet de laquelle on place l'enzyme dissoute. Conformément à la présente invention, on utilise une enzyme qui contient un groupe mercapto- réactif libre. Une telle enzyme est la DNA polymérase I d'Escherichia coli (polymérase de Kornberg). Il s'agit d'une molécule sphérique de 109 000 Daltons sans sous-unités, contenant 975 acides aminés; elle comporte, entre autres, une molécule de lysine et une molécule d'arginine dans le centre actif. La molécule ne contient qu'une seule liaison disulfure et qu'un seul groupe thiol. On peut faire réagir c dernier avec de l'iodoacétate ou des sels de mercure sans que cela réduise l'activité de l'enzyme. De façon analogue à la DNA polymérase I isolée à partir d'E. coli, des enzymes du type de la polymérase I isolées d'autres bactéries telles que Bacillus subtilis, Micrococcus luteus et Mycobacterium tuberculosis, ne sont pas inhibées par des agents bloquant le groupe sulfhydryle et lton peut supposer donc qu'elles peuvent être immobilisées comme l'enzyme provenant d'E. coli. Par contre, des enzymes DNA polymérases des types II et III isolées à partir des bactéries ci-dessus, sont inhibées par des réactifs bloquant le groupe sulfhydryle et ne peuvent donc pas être fixées à une phase solide de la même façon. Parmi les enzymes DNA-polymérases (EC 2,7,7,7) isolées jusqu'à maintenant à partir de sources issues de mammifères, l'alpha-polymérase et la gamma-polymérase sont également inhibées, tandis que la béta-polymérase n'est pas inhibée par des agents bloquant le groupe sulfhydryle. L'enzyme disposée sous forme de couche sur le haut de la phase solide dans une colonne, est lavée avec un tampon et l'on fait circuler la solution resultante dix fois dans le système au moyen d'une pompe péristaltique pour achever la réaction d'immobilisation. La réaction se déroule selon le schéma 1 de réaction illustré dans le dessin ci-joint, dans lequel E = enzyme DNA polymérase I et R = Sépharose La quantité de polymérase immobilisée peut outre déterminée directement par la mesure du coefficient d'extinction des molécules de thiopyridine et indirectement par la mesure du DNA synthétisé dans la réaction catalysez par l'enzyme. Lorsque la réaction d'immobilisation est achevée, le tampon est éliminé et le gel est lavé avec un autre quantité de tampon jusqu'à ce que le spectre du tampon éliminé soit identique à celui du tampon de cpai.t (environ 10 ml); le gel est ensuite lavé avec 40 ml supplémentaires de tampon à la vitesse de 1 ml/minute On utilise un spectrophotomètre enregistreur Zeiss Specord tv VIS pour réaliser les détermi- nations spectrophotométriques. L'enzyme polymérase fixée de cette façon, est alors utilisée pour la synthèse d polydésoxynucléotides. Le mélange réactionnel utilisé pour la synthèse contient des désoxynucléotides comme substrats et une matrice d'amorçage dans une solution aqueuse. Des concentrations de tampon et de sel (de préférence MgC12) nécessaires pour assurer une activité optimale de l'enzyme, sont utilisées à l'intérieur d'une gamme de pH allant de 6,5 à 9,5. Le mélange réactionnel (37 "C) est envoyé dans la colonne, qu'un thermostat maintient à une température de 37 oC et on le fait circuler au moyen d'une pompe péristaltique. La réaction peut être contrôlée par différentes méthodes mesure de la radioactivité du produit insoluble dans les acides, chromatographie sur papier, réaction témoin ou mesure de la quantité de polymère produit. La mesure de la radioactivité nécessite la présence de substrats marqués dans le mélange réactionnel. Dans ce but, on peut utiliser par exemple du [3HJ dATP. On effectue la mesure en prélevant des échantillons de 22n1 du mélange qui circule dans la colonne à l'aide d'une micropipette de Hamilton, à différents intervalles de temps. Les aliquots sont placés à l'aide d'une pipette sur un filtre en fibres de verre GF/C (de diamètre 2,5 cm, Whatman). Les filtres sont recueillis dans une solution froide (0-5 OC) d'acide tri chloroacétique à 5 % (TCA) et de pyrophosphate de sodium à 1 % (10 ml de solution par filtre, 0-5 OC, lo minutes).Les filtres sont lavés deux fois avec du TCA à 5 %, deux fois avec de l'éthanol à 96 % et deux fois avec du diéthylether, puis séchés à l'air. La radioactivité des polymères insolubles dans les acides (au delà des décamères) est mesurée dans un mélange de toluène, dans un spectromètre Packard. La réaction témoin peut être réalisée et suivie de la même façon. Par chromatographie sur papier, la réaction peut être suivie de façon quantitative en présence de substrats radioactifs et de façon qualitative en présence de substrats non marqués. On dépose des échantillons de 5 à 25 pl sous forme de taches sur des bandes de papier DE 81 (1 X 15 à 18 cm, DEAE-cellulose, Whatman) et l'on développe des chromatogrammes avec du NH4HC03 0,15M; la valeur de R f des nucléotides est comprise entre 0,35 et 0,55,tandis que les polymères restent au point de départ. On ajoute au mélange réactionnel séparé et extrait du gel par lavage (vérifié à 260 nm) une solution de NaCl 2,5 M et d'EDTA 0,038 M (0,65 volume) et on le maintient à 700 C pendant 10 minutes.Le mélange froid est ensuite secoué trois fois avec un mélange de chloroforme : alcoolisoamylique (24:1) de même volume. Les phases sont séparées (par centrifugation ou sur papier séparateur de phase, Whatman); la phase aqueuse est dialyséecontre de l'eau redistillée (Bio-Fiber 50 Minibecker, Bio-Rad Lab, Inc., 4 C). La conductivité de l'eau quittant le dialyseur est évaluée. Lorsqu'elle diminue (à 0,8-1 litre) jusqu'à la valeur présentée par l'eau redistillée de départ (0,2 à 0,6 on on introduit une quantité supplémentaire de 0,4 à 0,5 litre d'eau.Le polymère est alors lyophilisé, dissous dans une solution lu 3M de TRIS, HCl (pH = 7,4), 10 M d'EDTA (500 wul). On prélève des échantillons à partir de cette solutionmère de polydésoxynucléotides pour déterminer le rendement, les spectres, la stabilité thermique et l'activité de la matrice. La solution de polymère est conservée à -25 OC. Réaction témoin : de l'enzyme est ajoutée à 165 Fl de mélange réactionnel et le tout est incubé à 37 OC. Des échantillons (25 ,ul) sont prélevés et placés sur des filtres GF/C parallèlement à ce qui est réalisé pour la réaction à contrô- ler,et les filtres sont traités de la façon indiquée plus haut. Le stockage et la réutilisation de l'enzyme immobilisée peuvent être réalisés de la façon suivante Le mélange réactionnel est séparé et extrait par lavage, puis le gel est lavé avec une quantité supplémentaire (100 ml) de tampon phosphate de potassium 60 mw, puis avec 20 ml d'azide de sodium à 0,02 % et conservé dans cette solution dans la colonne ou éliminé de celle-ci à 3-6 OC. L'enzyme immobilisée peut être réutilisée après élimination de la solution d'azide de sodium. On n'observe qu'une légère diminution de l'activité (O à 5 %). La préparation la plus souvent étudiée et la plus stable, est celle de l'enzyme DNA polymérase I, qualité II d'E. coli : on n'a pu détecter aucune diminution d'activité après 6 réutilisations en deux mois. Les principaux avantages du procédé conforme à la présente invention sont les suivants a) L'enzyme DNA polymérase fixée par covalence à une phase solide prend part à une réaction hétérogène dans la synthèse des polydésoxynucléotides et peut être éliminée du mélange réactionnel sans être dénaturée à la fin de la réaction. b) L'enzyme immobilisée peut être utilisée de façon répétée, c) L'enzyme immobilisée peut être utilisée de façon continue. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère au dessin annexé ainsi qu'à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple l a) Preparation du Thiopropyl-Searose 6B On fait gonfler l g du réactif à groupe thiol immobilisé constitué par du Thiopropyl-Sépharose 6B, préparé de façon industrielle, lyophilisé, pendant 15 minutes à la température ambiante dans 60 mM de tampon phosphate de potassium (pH 7,4). Le gel gonflé est versé dans une colonne de verre (1,5 X 18 cm) équipée d'une enveloppe thermostable et d'un filtre de verre à sa partie inférieure, puis il est lavé avec 200 ml du tampon ci-dessus de façon à le débarrasser des conservateurs. b) Immobilisation de l'enzyme DNA-Polymerase Au dessus du gel sédimenté, on dépose à la pipette (à l'aide d'une micropipette Hamilton), 100 unités (20,ul) d'enzymes DNA-polymérase I, qualité I provenant d'E. coli MRE 600 (3850 unités par mg de protéine, Boehringer-Mannheim GmbH) dans un tampon débarrassé de bulles (environ 0,5 ml). (Une unité d'enzyme DNA-polymérase incorpore 10 nmoles de nucléo tides totaux à 370 C pendant 30 minutes d'incubation pour former un produit insoluble dans es acides, en présence d'un complexe matrice-primaire approprié dans un tampon donné).On laisse le tampon contenant l'enzyme s'écouler dans le gel à raison de 0,1 à 0,2 ml/minute, puis on envoie l'enzyme dans le gel en la lavant avec une quantité supplémentaire de 10 ml de tampon à la température ambiante. On fait ensuite circuler l'ensemble du tampon à dix reprises au moyen d'une pompe péristaltique. c) Synthèse du poly d (A-T) La colonne est maintenue à 370 C à l'aide d'un thermostat, puis le mélange réactionnel suivant est versé sur le gel 60 mM /1 de tampon phosphate de potassium, (pII = 7,4), 6 mM/1MgCl2, 1mM/l [ H]dATP du complexe matrice-primaire de poly d JATJ activé dans de l'eau redistiliée (volume final: 10 ml). On démarre la circulation du système, on rejette les 2-3 premiers millilitres du mélange (vérifiés par spectrophotométrie), puis on fait circuler le mélange au moyen d'une pompe péristaltique à la vitesse de 0,5 ml/minute.La réaction est suivie par mesure de la radioactivisn de la substance insoluble dans les acides. Après 24 heures d'incubation, la quantité de polymère formé est de 3,04 mg déterminée en fonction de l'incorporation de [3H] dAMP dans le produit insoluble dans les acides. 45 % des substrats sont consommés. La substance à bas poids moléculaire est éliminée par dialyse. La quantité de poly d (AT) pur de haut poids moléculaire est de 2,2 mg. Exemple 2 150 unités (100 pl) d'enzyme DNA-polymérase I, qualité II d'E. coli MRE 600 (116 unités par mg de protéine, Boeringer-Mannheim GmbH) sont appliquées a un réactif à groupe thiol immobilisé de la façon décrite dans l'exemplz 1.La synthèse est réalisée selon la procédure qui est également décrite dans l'exemple 1. Les substrats utilisés sont : 2 mM/l de [ H] dATP et 2 mM/l de dTTP. La quantité de polymère syn thétisée pendant 4 heures d'incubation est de 2,37 mg, déterminée en fonction de la mesure de la radioactivité, et :18% des substrats sont incorporés dans la matière polymère.Le poly d(A-T) isolé et purifié est de bas poids moléculaire (5 000 à 200 000 Daltons) l la quantité obtenue est de 1,78 mg. Exemple 3 45 unités (50 ul) d'enzyme à larges fragments de DNApolymérase d'E. coli MRE 600 (enzyme de Klenow w 6940 unités par mg de protéine, Boehringer-Mannheim GmbH) sont appliquées au réactif à thiol immobilisé de la façon décrite dans l'exemple 1. La synthèse est réalisée selon la procédure qui est décrite dans 11 exemple 1. Les substrats. sont ; 0,5 mM/l de 3H] dATP et 0,5 mM/l de dTTP. Calculée d'après les mesures de radioactivité, la quantité de polymère synthétisée en 24 heures d'incubation, est de 2,74 mg et 82 % des substrats sont incorporés dans la matière polymère. Le poly dJA-TJ isolé et purifié présente un poids moléculaire élevé (supérieur à 200 000 Daltons) ; la quantité obtenue est de 2,12 mg. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à 1 1esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 0 - Procédé de synthèse de polydésoxynucléotides à partir de 2'- désoxynucléotide-5'-triphosphates à l'aide d'une enzyme DNA-polymérase contenant un groupe mercapto-libre extérieur à son centre actif, en présence de cations divalents et éventuellement d'un complexe matrice-primaire, dans une solution aqueuse tamponnée dans une gamme de pH allant de 6,5 à 9,5, à une température comprise entre 150 et 420 C requise pour l'enzyme mise en oeuvre, lequel procédé est caractérisé en ce qu'une enzyme DNA-polymérase fixée par une liaison covalente à une phase solide capable de former des liaisons avec des groupes mercapto-, est utilise comme enzyme polymérase. 20 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé -en ce qu'un réactif à groupe thiol immobilisé est utilisé comme phase solide.