FR 2485739 A1 19811231 FR 8014598 A 19800630 L'invention concerne un procédé pour détecter et évaluer l'activité de substances à action cytostatique,telles que l'interféron. L'invention concerne aussi les applications d'un tel procédé, notamment à la mesure de l'activité cytostatique de substances à activité antitumorale,ainsi que pour mesurer d'une manière précise l'activité cytostatique de l'interféron humain, ou d'un interféron bactérien produit par manipulation génétique. On sait que dans certaines conditions,des lignées établies à partir de cancers humains,tels que des lymphomes,peuvent former des colonies dans un milieu gélifié par de l'agarose. Il faut alors que la concentration cellulaire dans ce milieu gélifié soit égale ou supérieure à une concentration critique caractéristique de chaque lignée. A titre de documents illustrant la technique antérieure dans ce domaine, on peut citer les articles suivants: L. MONTAGNIER & I. Mac PHERSON Croissance sélective en gélose de cellules de hamster transformées par le virus polyome C.R. Acad. Sci. 258, 4171-4173 (1964) L. MONTAGNIER La croissance en gélose de cellules transformées par un virus sarcomatogène Path. Biol. 14 , 244-251 (1966) L. MONTAGNIER, P. VIGIER, J. BOUE et A.BOUE Transformation en milieu gélifié d'une souche diplolde de cellules embryonnaires humaines par le virus de Rous (souche de Schmidt-Ruppin).C.R. Acad. Sci. 265 D 2161-2164 (1967). MONTAGNIER, L. & GRUEST, J. Cell Density dependence for growth in agarose of two human lymphoma lines and its decrease after Epstein-Barr virus conversion. Int. J. Cancer,1979, 23, 71-75. L'invention tire profit de la propriété mentionnée précédemment,en vue de permettre la détection et l'évaluation de l'activité de substances de toutes origines exerçant des effets cellulai- res. Le procédé de l'invention trouve une application particulièrement intéressante pour la mesure de l'activité de l'interféron,protéine à action antivirale,dont l'effet cytostatique parait actuellement prometteur pour le traitement de certains cancers. Dans l'art antérieur1 on a déjà proposé de doser l'interféron humain. Ainsi,l'article de GRESSER et al "Interferon and Cell Division V. Titration of the Anticellular Action of Interferon Preparations "Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. Vol. 137 n"4,p.1258-1261 (1971)*a proposé de doser l'action anticellulaire de l'interféron par des cultures en agarose,l'interféron étant directement incorporé dans le milieu agarose. Un tel procédé, bien que basé sur l'inhibition de la formation des colonies de cellules L 1210 ,n'est cependant pas facile à mettre en oeuvre car il est nécessaire de compter les colonies macroscopiques après un certain nombre de jours d'incubation. Le comptage des colonies est un travail fastidieux qui peut en outre donner lieu à des inexactitudes de lecture. L'invention a pour objet un procédé qui est aisé à mettre en oeuvre, et qui permet de détecter et d'évaluer avec précision l'activité de substances exerçant une action cellulaire. Sous sa forme la plus générale,l'invention a pour objet un procédé pour la détection et l'évaluation de l'activité de substances à action cytostatique,en particulier d'interféron,caractérisé en ce qu'il consiste à introduire en milieu agarose des cellules indicatrices, à disposer au moins un disque de papier filtre à la partie supérieure de la couche d'agarose,à imbiber le disque avec une solution de la substance dont on désire tester l'effet cytostatique et à observer la diffusion de ladite substance dans le disque au cours de la croissance cellulaire dans l'agarose,en déterminant la zone annulaire du disque exempte de colonies, ladite zone correspondant à la concentration de la substance qui est suffisante pour inhiber la multiplication cellulaire. Le procédé de l'invention permet d'évaluer rapidement l'action cytostatique de nouveaux composés anticancéreux. On peut alors utiliser pour la culture cellulaire des cellules humaines de même type histologique que les cancers à traiter. Ainsi on peut utiliser des lignées de cellules leucémiques myéloides et lymphodes, de lymphomes de Burkitt, d'ostéosarcomes,de carcinomes mammaires,de carcinomes du col de l'utérus et autres. Lorsque la culture in vitro est possible,on peut même utiliser les cellules I tumorales du malade à traiter. Des cellules résistantes peuvent également être aisément détectées par leur capacité à former des colonies dans la zone du halo. En outre,en plaçant sur deux disques dans une même boîte des inhibiteurs différents,on peut détecter l'effet synergique de ces derniers (augmentation du halo dans la zone de diffusion commune) ou leur effet antagoniste. Ainsi,le procédé de l'invention peut être aisément appliqué à la mesure de l'activité cytostatique de n'importe quelle-substance antitumorale ou de n'importe quel type de cellule capable de croître en milieu semi-solide. Dans une application particulièrement intéressante, le procédé de l'invention permet de détecter et de mesurer l'effet cytostatique de l'interféron. On préfère alors utiliser,selon l'invention,des cultures cellulaires particulièrement sensibles à l'action de l'interféron,notamment des lignées dérivées du lymphome de Burkitt. A cet égard,la lignée de lymphome de Burkitt DAUDI s'est avérée très sensible à l'interféron,comme l'ont montré les travaux de: STEWART II, .E. GRESSER, I., TOVEY, M.G. BANDU, M. T. & LEGOFF,S., Identification of the cell-multiplication-inhibitory factors in interferon preparations as interferons. Nature,1976,262 300-303. et J. HILFENHAUS, H. Dams & 8 R. JOHANNSEN Sensitivity of Various Human Lymphoblastoid Cells to the Antiviral and Anticellular Activityof Human Leukocyte Interferon. Archives of Virology 54,271-277(1977). Le procédé de l'invention est alors très sensible:il permet de détecter des halos d'inhibition à partir de 1 à 2 unités internationales d'interféron leucocytaire humain. Mais on peut également appliquer le procédé à la détection de clones bactériens producteurs d'interféron au cours d'expériences de manipulation génétique. On a constaté que le halo de l'inhibition de la colonie autour du disque était directement proportionnel au logarithme de la concentration d'interféron, ce qui permet une détermination précise de l'effet cytostatique de l'interféra n . Lorsqu'on a comparé l'effet cytostatique de l'interféron extrait de bactéries et purifié, et l'interféron leucocytaire humain authentique, on a trouvé que les courbes de réponse ne pouvaient pas être distinguées,ce qui permet de conclure que l'interféron fabriqué à partir de bactéries a la même aptitude à inhiber la croissance des cellules DAUDI que l'interféron authentique, pour un rapport unités antivirales /unités anticellulaires qui ne diffère pas de manière significative dans les deux cas. Selon une caractéristique du procédé de l'invention,on utilise des disques de papier filtre imbibés de solution de substances dont on veut tester l'effet cytostatique. Bien entendu,on utilise avec le plus d'avantages des solutions aqueuses. Cependant, le procédé est applicable également à des substances non hydrosolubles en utilisant des dilutions aqueuses de solutions-mères dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)à condition que la concentration finale de DMSO sur les disques ne dépasse pas 1% en volume environ. Pour la mise en oeuvre pratique de l'i*vention,on utilise la technique connue de coulage de l'agarose en couches contenant la suspension cellulaire appropriée On dispose ensuite sur la couche d'agarose le ou les papiers filtres. Ceux-ci ont un diamètre généralement compris entre 6 et 9 mm. Chaque papier filtre est imbibé d'une faible quantité (10 ou 20 microlitres) de la solution de l'inhibiteur cytostatique à tester. Il importe que le papier filtre présente des caractéristiques physiques telles qu'il soit exempt de cendres et de graisse. Avant utilisation, les disques sont autoclavés et séchés en étuve. Il faut que le papier filtre n'écrase pas le gel de culture, lequel a une consistance relativement molle.Il faut donc mettre en place délicatement les disques de papier après imbibition, sur la couche d'agarose solidifiée au préalable. Dans ces conditions, on atteint rapidement un gradient de concentration gracie à la diffusion de la substance à tester autour du disque. Lorsque la concentration en inhibiteur atteint une valeur suffisante pour inhiber la multiplication cellulaire,les cellules ne sont plus capables de former des colonies et demeurent isolées. Après quelques jours d'incubation à 37"C en atmosphère contrôlée par exemple 10 jours, on peut observer un halo d'inhibition autour du disque, qui est exempt de colonies et qui est entouré de colonies ayant une taille normale. La frontière entre les deux zones est bien délimitée,ce qui indique que la diffusion de l'inhibiteur est rapide et atteint les cellules avant qu'elles réalisent leur première division. Il va sans dire que la coloration des colonies à l'aide d'un colorant vital,tel que le chlorure de 2(p-iodophényl-3-(p-nitrophényl) -5-phényQ 2H-tétrazoliumBpermet d'augmenter le contraste entre les deux zones et facilite la lecture. En étudiant les courbes de réponse en fonction de la concentration,on a constaté que le diamètre du halo était directement proportionnel au logarithme de la concentration initiale de substance dans le disque. Il est alors possible de choisir une unité arbitraire,par exemple telle que la concentration fournissant un halo de 10 mm de diamètre,compte non tenu du diamètre du disque en papier. Selon une application intéressante de l'invention, on évalue l'activité de substances neutralisant l'action anticellulaire d'inhibiteurs cytostatiques,tels que l'interféron et on met en évidence les clones cellulaires producteurs de ces substances (en particulier hybridomes producteurs d'anticorps monoclonaux), en incubant préalablement l'inhibiteur cytostatique avec le surnageant de culture des cellules productrices de la substance neutralisante, en inhibant le disque du mélange ainsi obtenu et en déterminant la dilution maximale supprimant le halo d'inhibition dû à l'inhibiteur cytostatique. L'invention sera maintenant davantage illustrée sans être aucunement limitée par les exemples ci-après. EXEMPLE 1 Cet exemple illustre la technique générale d'utilisation du procédé de l'invention pour la détermination de l'activité cytostatique de composés anti-cancéreux Cellules: on utilise des lignées provenant de lymphomes humains de Burkitt contenant ou non le virus d'Epstein-Barr. On met avantageusement en oeuvre la lignée provenant d'un lymphome de Burkitt BJAB. MENEZES, J. LEIBOLD, W. KLEIN, G., and CLEMENTS, G.B., Establishment and characterization of an Epstein Barr virus (EBV)-negative lymphoblastoid B cell line (BJAB) from an exceptional EBV-genome-negative African Burkitt's lymphoma, Biomedicine,22,276-284(l975b). Les cellules sont multipliées en suspension non agitée dans des flacons plastiques de 75 cm3 dans du milieu RPMI 16-40. Ce milieu est obtenu commercialement à l'état de poudre et est dilué dans de l'eau distillée de haute qualité, dépourvue de matière organique. On utilise de préférence de liteau obtenue par le procédé objet du brevet FR 76 18 150 déposé le 15 Juin 1976. Cette eau est commercialement disponible sous la dénomination "eau hyperhydor Pasteur". Le milieu des cultures est renouvelé aux 2/3 trois fois par semaine. Mise en agarose: on utilise de l'agarose "Indubiose 37" (Industrie Biologique Française-Gennevilliers). Pour 100 ml de milieu final,on pèse dans un bécher Pyrex 0,40 g d"'Indubiose". On ajoute 76,5 ml d'eau "hyperhydor et on laisse dans un bain -marie à l'ébullition jusqu'à complète dissolution de l'agarose (enviren 10 minutes). La solution est ensuite placée dans un bain-marie à 44 C. Après équilibrage de la température ,on ajoute à la solution d'agarose les constituants du milieu nutritif,à savoir dans l'ordre: -9 ml RPMI 10 fois concentré (Gibco) en milieu acide, -3,5 ml bicarbonate de sodium à 35go (autoclavé). On ajuste le pH à 7,0 en ajoutant de l'hydroxyde de sodium 5N (soit environ 0,2 ml pour 100 ml de milieu ); -10 ml de sérum de veau foetal "Rehatuin" (Reheis, Armour Chemical Co) - 1 ml de glutamine à 29,2 mg/ml -0,05 ml d'Auréomycine "Specia "à 10 mg;/ml -0,05 ml de Fungizone "Squibb" à 2,5 mg/ml. Coulage de l'agarose: on coule 6 ml avec une pipette graduée à large col dans chaque bote de Petri plastique "Falcon" ou similaire de 60 mm de diamètre. Après prise du gel,on ajoute à 0,4 ml de la suspension cellulaire contenant le nombre de cellules désiré, soit 4.lot dans le cas des cellules BJAB,l ml du milieu à l'agarose maintenu à 450C ,et on coule le mélange immédiatement sur la sous-couche d ' agarose. Après solidification de la surcouche à la température ambiante, on ajoute délicatement les disques de papier.Immédiatement auparavant, chaque disque tenu par une pince stérile reçoit 10 à 20P1 du produit à tester,ce qui imbibe tout le disque. Préparation des disques: les disques sont en papier-filtre sans cendres et sans graisse ( commercialisés par la Société Durieux ,Paris,n"lll) de 6 ou 9 mm de diamètre Ils sont autoclavés dans des bottes de Petri en verre préalablement rincées avec de l'eau "hyperhydor. Après autoclavege ils sont séchés dans une étuve à 550Co Incubation: Les botes d'agarose sont incubées à 37"C dans un caisson étanche contenant 2 boîtes de Petri de 100 mm remplies d'eau additionnée de bleu de méthylène ,de façon à maintenir un haut degré d'hygrométrie ,et gazé pendant 5 minutes avec un mélange d'air 90 et C02 10%, passant dans un flacon laveur rempli d'eau additionnée de bleu de méthylène et à travers un filtre Millipore de 0,45 p. Les colonies sont comptées après 10 ou 12 jours dans le cas de cellules humaines à multiplication relativement lente. Ce temps peut être réduit à 5 jours pour des cellules tumorales à multiplication plus rapide. Le diamètre du halo est linéairement proportionnel à la concentration du produit essayé. EXEMPLE 2 La technique générale décrite à l'exemple 1 a été utilisée pour évaluer l'effet d'une substance connue à activité antitumorale dénommée BD40 sur des cellules leucémiques L 1210 de souris La substance BD40 est décrite dans LIDEREAU, R., CHERMANN, J C. GRUEST,J. MONTAGNIER, L. DUCROCQ, L., RIVALE C & BISAGNI, E., Antitumoral activity of dipyrido/4y3~b7/x\4-fhndoles on L 1210 leukemia. Bull. Cancer (Paris), 1980, 67, 1-8. On a utilisé une quantité de 3.104 cellules par boîte de 60 mm. Les résultats sont reportés à la figure 1 des dessins annexés, qui montre les halos obtenus pour des concentrations de BD40 ,respectivement de 0,1, 2, 3, 4 et 10 micromoles sur le disque On On constate que le diamètre du halo est proportionnel au logarithme de la concentration du produit. EXEMPLE 3 Cet exemple concerne la détermination de l'action cytostatique de l'interféron leucocytaire humain. On utilise une lignée de lymphome de Burkitt DAUDI. / plein et col: Cancer Res.28, 1300(1310 (1068) 7 On coule, selon les conditions précédemment décrites à l'exemple l, 30105 cellules/boîte de Petri de 60 mm ou 1.106 cellules/boite de Petri de 100 mm. On place sur les disques 10 à 20 rl de solution d'interféron leucocytaire humain à des concentrations variables. Les cellules sont incubées 12 jours à 370C. Le diamètre du halo d'inhibition est proportionnel à la dose d'interféron.On peut détecter des halos d'inhibition à partir de 1 à 2 unités internationales d'interféron leucocytaire humain Les résultats d'un-essai typique sont reportes à la figure 2 qui est un graphique sur lequel on a porté en ordonnée le diamètre du halo d'inhibition et en abcisse la concentration en interféron exprimée en unités internationales. La courbe obtenue est une droite parfaite, ce qui permet de déterminer avec précision une valeur de concentration correspondant à une unité de halo donnée. Des expériences préliminaires ont indiqué également que la sensibilité de l'effet pouvait être augmentée en traitant au préalable les cellules indicatrices avec du n-butyrate de sodium (lO 3 Mdans le milieu de culture 48 h avant la mise des cellules en agarose). EXEMPLE 4 Dâns cet exemple on a utilisé la technique de l'exemple 3 pour comparer l'effet cytostatique d'un interféron extrait de bactéries et purifié, et d'un interféron leucocytaire authentique, les deux produits présentant des titres antiviraux identiques. On a utilisé les cellules DAUDI qui ont été coulées en milieu agarose comme décrit à l'exemple 3. On a imbibé des disques en papier avec 20 ul de l'échantillon d'interféron à essayer,et on a placé les disques sur le milieu agarose après solidification de la surcouche. Les boîtes d'agarose sont incubées pendant 10 - 12 jours en atmosphère contrôlée (mélange d'air 90% et C02 10%) après quoi on mesure sur des photcgraphies les diamètres des halos d'inhibition. Dans l'essai considéré,les rapports unité antivirale/ unité anticellulaire étaient respectivement de 3,3 pour l'interféron bactérien et de 3,9 pour l'interféron leucocytaire authentique. On rappellera qu'une unité anticellulaire correspond à la concentration fournissant un halo d'inhibition de 10 mm. On a porté les résultats sur un graphique avec,en or donnéetle diamètre du halo, le diamètre du disque (6 mm) étant soustrait,et en abscisse la concentration de l'interféron dans le disque, exprimée en unités internationales antivirales. Au dessin de la figure 3,la courbe A correspond au résultat obtenu avec l'interféron bactérien produit au cours de manipulations génétiques, et la courbe B est un témoin comprenant un interféron leucocytaire authentique mélangé avec des extraits bactériens et traité comme l'interféron bactérien précité. Les résultats illustrés par le graphique de la figure 3 montrent que les deux courbes de réponse ne peuvent pratiquement pas être distinguées,ce qui amène à conclure que l'interféron produit à partir de bactéries a la même capacité d'inhiber la croissance des cellules DAUDI qu'un interféron authentique, puisque les rapports unités antivirales/unités anticellulaires ne diffèrent pas d'une manière significative. Il va sans dire que le procédé de l'invention n'est pas limité aux applications qui ont été décrites dans les exemples ci-dessus,lesquels sont purement illustratifs . Le procédé de l'invention est en effet applicable d'une manière générale à la détection des effets cytostatiques et transformants d'agents biologiques et chimiques sur des cellules humaines et animales. Il est applicable asec grand intérêt en cancérologie et à la chimiothérapie anticancéreuse. En particulier, il permet de mesurer avec précision,rapidité et facilité l'action cytostatique de l'interféron,qu'il s'agisse d'interféron leucocytaire humain authentique ou d'interféron bactérien produit par les souches soumises à manipulations génétiques. Dans cette dernière application,il permet de détecter rapidement les clones bactériens qui sont les meilleurs ; > roducteurs d'interféron. On peut également appliquer le procédé au titrage du pouvoir neutralisant d'un anticorps anti-interféron, en particulier d'un anticorps monoclonal. Dans ce cas, on préincube une concentration fixe d'interféron pendant 3 h à 370C,avec diverses dilutions d'un sérum antiinterféron ou d'un anticorps monoclonal, et les mélanges sont ensuite placés sur les disques. On détermine ainsi de manière précise la dilution maximale de l'anticorps supprimant le halo d'inhibition dû à l'interféron. REVENDICATIONS l.Procédé pour la détection et l'évaluation de l'activité de substances à action cytostatique,en particulier d'interféron, caractérisé en ce qu'il consiste à introduire en milieu agarose des cellules indicatrices,à disposer au moins un disque de papier filtre à la partie supérieure de la couche d'agarose, à imbiber le disque avec une solution de la substance dont on désire tester l'effet cytostatique et à observer la diffusion de ladite substance dans le disque au cours de la croissance cellulaire dans l'agarose,en déterminant la zone annulaire du disque exempte de colonies,ladite zone correspondant à la concentration de la substance qui est suffisante pour inhiber la multiplication cellulaire. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que pour la culture cellulaire on utilise n'importe quel type de cellules capables de croître en milieu semi-solide. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que, pour évaluer l'action cytostatique de composés anticancéreux, on utilise pour la culture cellulaire des cellules humaines de même type histologique que les cancers à traiter, par exemple des lignées de cellules leucémiques myélomes et lymphodes,de lymphomes de Burkitt, d'ostéosarcomes,de carcinomes mammaires, de carcinomes du col de l'utérus et autres, et même, lorsque la culture in vitre est possible,les cellules tumorales du moîadte à traiter. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3,caractérisé en ce qu'on dispose sur une même boîte deux disques imbibés d'inhibiteurs différents, ce qui permet de détecter l'effet synergique de ces derniers (augmentation du halo dans la zone de diffusion commune) ou leur effet antagoniste. 5. Procédé selon t'une quelconque des revendications 1 à 4,caractérisé en ce qu'on détecte et mesure l'effet cytostatique de l'interféron,qu'il s'agisse d'interférons authentiques ou des interférons similaires produits à partir de clones bactériens obtenus par manipulations génétiques. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,caractérisé en ce que pour l'imbibition des disques de papier filtre on utilise des solutions aqueuses de la substance dont on veut mesurer l'effet cytostatique ou,pour des substances non hydrosolubles,des dilutions aqueuses de solutions-mères dans le diméthylsulfoxyde (DMSC y. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6,caractérisé en ce que pour des papiers-filtres ayant un diamètre généralement compris entre 6 et 9 mm on utilise 10 à 20 de la solution de l'inhibiteur cytostatique à tester. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que,en vue d'accroître la sensibilité, on traite au préalable les cellules indicatrices avec du n-butyrate de sodium. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on mesure le diamètre du halo d'inhibition dans le disque, ledit diamètre étant directement proportionnel au logarithme de la concentration initiale de substance dans le disque. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on colore les colonies afin d'augmenter le contraste entre la zone de non inhibition et la zone d'inhibition dans le disque. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'on évalue l'activité de substances neutralisant l'action anticellulaire d'inhibiteurs cytostatiques,tels que l'interféron,et on met en évidence les clones cellulaires producteurs de ces substances (en particulier hybridomes producteurs d'anticorps monoclonaux),en incubant préalablement l'inhibiteur cytostatique avec le surnageant de culture des cellules productrices de la substance neu tralisante,en inhibant le disque du mélange ainsi obtenu et en déter minant la dilution maximale supprimant le halo d'inhibition dû à l'inhibiteur cytostatique.