FR 2491950 A1 19820416 FR 8103860 A 19810226 La présente invention concerne un milieu de culture à préparation instantanée, ainsi qu'un procédé pour stéri- liser des milieux de culture sans les passer à l'autoclave. Dans la très grande-majorité des laboratoires, la pratique routinière courante consiste à stériliser les milieux de culture de microbiologie et de bactériologie en les soumettant à un processus de chauffage appelé "passage en autoclave". Ce passage constitue une forme de "cuisson sous pression', selon laquelle les matières nutritives ou les milieux sont soumis à de la vapeur "emprisonnée" ou sous pression dans un "autoclave" ou "cuiseur sous pression" qui est un récipient robuste fonctionnant habituellement sous une pression de l'ordre de 1,033 bar pour produire durant minutes environ une température d'environ 121C. L'exposition du milieu à cette "vapeur surchauffée" garantit la destruction ou l'annihilation de toutes les formes de vie, végétative et autre (par exemple des spores thermo- résistantes). Les inconvénients de cette méthode largement utilisée pour stériliser des milieux de culture comprennent 1) une caramélisation; 2) des variations du pH; 3) de la désagrégation, de la dénaturation et/ou de la décomposition des protéines; 4) une inactivation de certaines vitamines et facteurs de croissance; ) l'obscurcissement et des effets nuisibles exercés sur la clarté optique du milieu; 6) le risque que des actions et interactions physiques et/ou chimiques éventuellement inopportunes puissent se produire entre et sous l'effet des différents ingrédients du milieu; 7) une hydrolyse de la gélose 8) la fréquence des pannes, erreurs, risques et acci- dents liés à l'équipement de stérilisation par chauffage, à savoir l'autoclave; et 9) la longueur du temps nécessaire. On a donc besoin d'un milieu de culture évitant les inconvénients précités de l'art antérieur et ayant une longue durée possible de magasinage. La présente invention vise principalement à proposer un tel milieu. Des milieux de culture selon la présente invention comprennent, en pourcentage en poids: environ 0,0 % à 5 % d'un agent de gélification; environ 0,015 à 0,03 % d'un agent de blanchiment doué de propriétés germicides et biocides et contenant au moins un halogène, ou un composé libérant de l'halogène, capable d'assurer dans l'eau une concentration finale en halogène d'environ 50 à environ 100 millionnièmes; cet agent doit être compatible avec l'agent de gélification, si on en utilise un; environ 0,22 à 0Q06 % d'un agent d'inactivation de l'halogène, et qui comporte au moins un groupe thio, mercapto ou sulfhydryle; environ 7 % à 50 % de matières nutritives stérilisées et concentrées, de préférence des matières nutritives con- centrées. à froid; et de l'eau pour constituer le reste, notamment de l'eau stérile,distillée ou démineralisée. Plus particulièrement, les milieux comprennent les constituants suivants: A) de la gélose ou agar-agar ou un ou plusieurs agents similaires degélification, comme de la carraghénine, de la pectine, du gel de silicone, de la gomme guar, de la gomme de caroube, de l'amidon de mais, de l'acide alginique, du varech, et divers polysaecharides gélifiables; B) un agent de blanchiment, qui comprend un ou plu- sieurs des divers halogènes et composés pouvant libérer de l'halogène, habituellement sous forme de poudre sèche, de façon à obtenir dans l'eau une concentration finale en halogène de 50 à. 100 millionnièmes. Des exemples de ce ou ces composés sont le chlore, l'iode et le brome, tels quels et/ou leurs dérivés aussi. bien organiques que minéraux. Voici des exemples typiques: du liquide à 5 % d'hypochlorite de sodium; de l'hypochlorite de lithium; et de l'hypochlo- rite de calcium ("poudre blanchissante"). Des exemples typiques de dérivés organiques sont des isocyanurates chlorés comme les sels de sodium ou de potassium de la dichloro-s-triazinetrione; des hydantolnes halogénées o10 comme la N-bromo-N-chloro- et de la 1,3-dichloro-5,5- diméthylhydantoine ("halane'); l'acide p-N,N-dichloro- sulfamyl-benzoique ("halazone"'); de la trichloro-s- triazine-trione et l'acide trichlorisocyanurique. Ces compo- sés ont de bonnes propriétés biocides et suffisamment de solubilité dans l'eau. Des hypobromites, desocomposés inter- halogénés comme du chlorure de brome, du chlorure d'iode et du bromure d'iode peuvent également convenir. On peut également utiliser des halogénures d'ammoniums quaternaires communément appelés "Quats", comme par exemple du chlorure de benzalkonium et des "Quats" du type hyamine. On peut également utiliser des aldéhydes comme du formaldéhyde (1:50001:10 000) ainsi que ses dérivés; la formaline et le paraformaldéhyde. N) Les agents d'inactivation de l'halogène comprennent du thiosulfate de sodium, du thioglycolate de sodium et d'autres composés comportant un groupe thio, mercapto ou sulfhydryle. On les utilise en une fois et demie à deux fois la quantité du composé halogéné. Cela représente un excès garantissant une inactivation complète et irréversible de l'halogène résiduel actif. Dans le cas des aldéhydes, c'est-à-dire du formaldéhyde, un agent oxydant comme du persulfate de sodium., tel celui fabriqué sous la marque "Oxone " par DuPont, inactivera l'aldéhyde. C): Les matières nutritives concentrées utilisées sont n'importe quelle matière classique présentant 10 à 20 fois leur concentration normale dans le milieu particulier de culture. Ce coDcentré est stérilisé ou préstérilisé par microfiltra- tion ou par un autre procédé classique. Il convient de noter que certaines matières nutritives sont disponibles sous une forme naturellement stérile et qu'elles n'exigent pas de stérilisation, comme celles présentées en des con- centrations appropriées dans de l'alcool ou dans du chloro- forme. La présente invention propose également un procédé pour former et stériliser un milieu de culture, selon lequel on introduit dans un récipient contenant un milieu de culture au moins un agent biocide et germicide hydrosoluble contenant au moins un halogène ou un composé pouvant libérer de l'halo- gène et capable d'assurer dans l'eau une concentration finale de l'halogène d'environ 50 à 100 millionnièmes; on ajoute une quantité d'un agent d'inactivation de l'halogène suffisante pour inactiver ou neutraliser tout l'halogène - éventuellement résiduel, puis l'on ajoute une solution concentrée et stérilisée contenant des matières nutritives classiques. Après addition des matières nutritives, on peut ajouter un agent stérile d'enrichissement et verser ensuite la solution dans des récipients stériles. Les exemples non limitatifs suivants permettent de mieux comprendre l'invention. EXEMPLE 1 Le milieu du présent exemple contient (pour un litre) "A": gélose pour bactériologie............. 15 g Chlorure de sodium.................... 5 g Sels tampons (pH 7,4)................. 3 g "B": Dihydrate de dichloro-striazinetrione sodique pure....................... 0,2 g "N": Solution stérile à 10 % de thiosulfate de sodium........... t 5 cm3 "C": Produit de digestion enzymatique de la caséine............................ 15 g Produit de digestion enzymatique de la farine de soja..................... 5 g Eau distillée......................... 50 cm3 Voici comment préparer ce milieu Dans une fiole d'Erlenmeyer propre et sèche, de 2 litres (fiole n 1), on verse entièrement le contenu du paquet "B" ci-dessus. On ajoute dans la fiole 950 cm3 d'eau distillée. On ferme la fiole avec un capuchon à vis ouun capuchon de caoutchouc au néoprène. On dissout le composé complètement et uniformément en secouant la fiole vigoureu- sement. On la met ensuite de côté momentanément. Dans une autre fiole d'Erlenmeyer, sèche et propre, de 2 litres, on verse entièrement le contenu du paquet "A". On mesure 300 à 500 cm3 de la solution du composé halogéné provenant de la fiole n 1 que l'on ajoute prcgressivement à "A", en secouant assez énergiquement pour disperser et maintenir en suspension les particules solides dans l'eau halogénée. On ]5 introduit dans la suspension un barreau magnétique (à utiliser avec un agitateur magnétique à plaque chauffante comme par exemple "Gyrotherm"). On chauffe la suspension à l'ébullition tout en continuant à mélanger directement sur la flamme ou en utilisant la plaque chauffante ("Gyrotherm") durant 2 à 3 minutes. On ajoute le reste de l'eau chlorée provenant de la fiole n 1 à la solution de gélose fondue en maintenant l'action de mélange exercée par le barreau magnétique. On ajoute 5 cm3 de N" (solution -à 10 % de thiosulfate de sodium) tout en maintenant l'action de mélange exercée par le barreau magnétique. Avec des précautions pour garantir la stérilité, on ajoute "C" tout en maintenant l'action d'agitation à l'aide du barreau ma5nétique.Le milieu est alors prêt à être distribué ou "versé" dans des récipients stériles afin de s'y solidifier. En variante, on peut ajouter un milieu stérile d'enrichissement (sang stérile de mouton ou de cheval) tout en maintenant l'action d'agita- tion. Le produit obtenu, une gélose au sang, est alors prêt à être versé selon les désirs dans des récipients stériles. EXEMPLE 2 En opérant comme à l'exemple 1, on prépare instan- tanément un milieu de Mueller-Hinton destiné à des essais de sensibilité aux antibiotiques par la méthode Kirby- Bauer, de façon; à former 1000 cm3 du milieu mélangé Paquet -"'A" Gélose.. ............................ 15,00 g Chlorure de sodium...................DTD: .... 5,00 g Sel tampon (pH 7,4)........................... 3,00 g Amidon....................................... 1,50 g Paquet' "B" Dihydrate de dichloro-s-trïazinetrione sodique.. 0,20 g Paquet "'C" Bouillon d'infusion de boeuf, à partir de...... 300,00 9 Caséine digérée à l'acide...................... 17,50 g Eau distillée.......................DTD: ... 50,00-.100,00 cm Paquet' "N" Solution (stérile) à 10 % de thiosulfate de sodium...................................... 5,00 cm..DTD: EXEMPLE 3 En opérant comme à l'exemple 1, on prépare instanta- nément un milieu G-C pour du gonocoque de façon à obtenir 1000 cm3 du mélange: Paquet "A" Gëlose.......................................... 12, 50 g Chlorure de sodium.............................. 5,00 g Sels tampons (pH 7,4)...................... 3,00 g Amidon de mais...................... .......... 1,00 g Paquet '"B" Dihydrate de dichloro-s-triazinetrione sodique. 0,20 g Paquet "C" Peptone (produit de digestion de viande)....... . 10,00 g Extrait de levure.............................. 3,00 g Extrait de foie............................. 3,00 g Dextrose........................DTD: . 2,00 g Phosphate dipotassique.................... 2,00 g Paquet 'N' Solution (stérile) à 10 %-20 % de thiosulfate de sodium.....................DTD: ..................... 5,00 cm..DTD: 249 1950 EXEMPLE 4 En répétant le mode opératoire de l'exemple 1, on obtient un milieu de culture en utilisant du chlore gazeux dans de l'eau comme agent de stérilisation, du thiosulfate de sodium comme agent d'inactivation et le paquet "C" de l'exemple 1. EXEMPLE 5 On prépare un milieu de culture comme à l'exemple 1 en utilisant de l'iode dans de l'eau comme agent de stérili- sation, de la gomme de caroube comme agent de gélification, du thiosulfate de potassium comme agent d'inactivation et le paquet "C" de l'exemple 1. EXEMPLE 6 On prépare comme à l'exemple 1 un milieu liquide de culture en utilisant une solution à 5 % d'hypochlorite de sodium comme agent de stérilisation, pas d'agent de gélifi- cation, du thioglycolate de sodium comme agent d'inactiva- tion et le paquet "C" de l'exemple 1. EXEMPLE 7 On prépare comme à l'exemple 1 un milieu de culture en utilisant de la Nbromo-N-chloro-5, S-diméthyl-hydantolne comme agent de stérilisation, de la carraghénine comme agent de gélification, du thiosulfate de sodium comme agent d'inactivation de l'halogène, et le paquet "C" de l'exemple 1. EXEMPLE 8 On prépare comme à l'exemple 1 un milieu de culture en utilisant de l'acide alginique comme agent de gélifica- tion, de l'acide p-(N,N-dichlorosulfamyl)-benzoique comme agent de stérilisation, du thiosulfate de sodium comme agent d'inactivation de l'halogène, et le paquet 'C" de l'exemple 1. EXEMPLE 9 On prépare comme à l'exemple 1, un milieu de culture en utilisant du varech comme agent de gélification, une solution d'hypochlorite de lithium comme agent de stérili- sation, du thiosulfate de sodium comme agent d'inactivation de l'halogène, et le paquet "C'' de l'exemple 3. EXEMPLE 10 On prépare comme-â l'exemple 1 un milieu de culture en utilisant de la gélose et de la pectine comme agent de gélification; de la 1,3-diïchloro5,5-diméthylhydantoine comme agent de stérilisation, du thiosulfate de sodium comme agent d'inactivation de l'halogène, et le paquet "C'z de l'exemple 3. EXEMPLE 11 On prépare comme à l'exemple 3 un milieu de culture en utilisant de la gomme guar comme agent de gélification, de l'acide N-bromo-Nchlorosulfamyl-benzoique comme agent de stérilisation, du thioglycolate de sodium comme agent d'inactivation de l'halogène, et le paquet "C" de l'exemple 2. EXEMPLE 12 On prépare comme à l'exemple 2, un milieu de culture en utilisant de la gélose comme agent de gélificationdu chlorure de brome comme agent de stérilisation, du thiosul- fate de sodium comme agent d'inactivation de l'halogène, et le paquet "C" de l'exemple 2. EXEMPLE 13 On prépare comme à l'exemple 4, un milieu de culture en utilisant du chlorure de benzalkonium comme agent de stérilisation, de la gélose comme agent de gélification, du thioglycolate de sodium comme agent d'inactivation du germicide, et le paquet "C" de l'exemple 3. Le milieu de la présente invention est instantanément prêt à être versé ou bien, si on le désire, 50 cm3 de sang frais, défibriné et stérile de mouton ou de cheval peuvent lui être ajoutés en prenant des précautions pour maintenir le tout stérile, en mélangeant bien, et le milieu nutritif formé de gélose au sang est alors prêt à être versé. Il n'est pas néccssaire d'attendre le refroidissement du milieu, car sa température est déjà réglée. Le milieu de la présente invention présente typique- ment une solidification ou prise rapide, en raison de sa température réglée, et il ne provoque pas la formation d'une humidité excessive sur le couvercle ou les parois des réci- pients (boîte de Pétri ou tubes, etc). La surface de ce milieu ne comporte pas de bulles. La croissance de tous les micro-organismes cultivés- sur de la gélose au sang va s'effectuer nettement mieux sur ce milieu en permettant d'obtenir le plus grand taux possible de récupération et les réactions les plus faciles à lire comme une hémolyse, l'examen de la morphologie et de la dimension des colonies, etc. On évite complètement la totalité des inconvénients précités, qui étaient inhérents à la stérilisation par la chaleur. Le milieu de la présente invention a été soumis à des essais poussés dans des conditions d'utilisation réelles, et il a été trouvé qu'il permet d'atteindre avec un succès total les buts précités de l'invention. Il a également été observé que, par exemple, la gêlose au sang à préparation instantanée montre une remarquable activité chromogène non présentée par de la gélose au sang stérilisée à chaud. Il va de soi que, dans certains cas, on pourra utili- ser certains composants de l'invention avec certains autres composants pour obtenir les meilleurs résultats et que, sans sortir du cadre de l'invention, de nombreuses modifica- tions peuvent être apportées à la composition décrite ci- dessus. REVENDICATIONS 1. Milieu de culture caractérisé en ce qu'il comprend en pourcentage en poids: environ 0,00 à 5 % d'un agent de gélification; environ 0,015 à 0, 03 % d'un agent de blanchiment ayant des propriétés germicides et biocides et contenant au moins un halogène ou un composé libérant de l'halogène et capable d'assurer dans de l'eau une concentra- tion finale en halogène d'environ 50 à 100 millionnièmes; environ 0,22 à 0,06 % d'un agent d'inactivation de l'halogè- ne, comportant au moins un groupe thio, mercapto ou sulfhy- dryle et qui est préstérilisé t environ 7 à 14 % d'un milieu nutritif stérilisé; le reste étant constitué par de l'eau. 2. Milieu de culture selon la revendication 1, 1.5 caractérisé en ce que l'agent-de blanchiment est choisi parmi le chlore, l'iode, le brome, l'hypochlorite de sodium, l'hypochlorite de calcium, l'hypochlorite de lithium, de la dich1oro-s-triazinethione sodique ou potassique; la N-chloro-N-bromo-5,5-diméthylhydantolne; la 1,3-dichloro- IO 5,5-diméthylhydantoine; l'acide p=(NN-dichlorosulfamyl)- benzoique; la trichloro-s-triazinetrione; le chlorure de brome; le chlorure d'iode, le bromure d'iode; un chlorure de benzalkonium, et leurs mélanges. 3. Milieu selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent d'inactivation de l'halogène est choisi parmi le thiosulfate de sodium, le bisulfite de sodium et du thioglycolate de sodium. 4. Milieu selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de gélification est de la gélose, de la carraghénine, de la pectine, du gel de silicone, de la gomme guar, de la gomme de caroube, de l'amidon de mais, de l'acide alginique, du varech ou un de leurs mélanges. 5. Milieu selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'eau est de l'eau distillée ou déminéralisée. 6. Procédé pour former et stériliser un milieu de 1l1 culture, caractérisé en ce qu'on introduit, dans un récipient pour milieu de culture, contenant au moins un agent biocide et germicide soluble comportant au moins un halogène ou un composé libérant de l'halogène, une quantité d'un agent d'inactivation de l'halogène suffisante pour inactiver tout l'halogène éventuellement résiduel, puis l'on ajoute au contenu du récipient un concentré stérilisé de matières nutritives. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise comme agent biocide ou germicide des halo- génures d'ammroniums ou des halogénures d'hyamines du type "Quats" (aummonium quaternaire) et en ce que l'agent de neutra- lisation ou d'inactivation est du thioglycolate de sodium. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise un aldéhyde qui est le formaldehyde ou un de ses dérivés comme du paraformaldéhyde comme agent germi- cide, et en ce que l'agent de neutralisation ou d'inactivation est d'une substance oxydante, comme du persulfate alcalin, que l'on introduit en présence de sels tampons appropriés.