FR 2477551 A1 19810911 FR 8005332 A 19800310 NOUVEAUX DERIVES DE L'a,a-TREHALOSE ET MEDICAMENTS LES CONTENANT L'invention est relative à de nouveaux composes doués de propriétés biologiques et pharmacologiques de grande valeur, et notamment parmi ces produits à ceux qui présentent des propriétés régulatrices des mécanismes immunitaires. L'invention concerne aussi les applications de ces nouveaux produits, ainsi que les compositions spécialement appropriées à leur mise en oeuvre. Les composés selon l'invention sont des dérivés de l'a-D-glucopyranosyl-a-D-glucopyranoside (a,a'-tréhalose), substitué asymétriquement sur ses deux fonctions alcools primaires, en position C-6 de chacun des monosaccharides constituants, selon la formule générale dans laquelle - R1 est un groupe lipophile comprenant au moins 30 atomes de carbone, de préférence de 60 à 90 atomes, notamment un acide mycolique comprenant de 80 à 90 atomes de carbone ;; - R2 est soit OH, soit un ester OR dans lequel R est un radical comprenant de 1 à 10 carbones, soit un NH2 > les hydrogènes du groupe amino pouvant être substitués par des restes alcoyles de 1 à 4 carbones, un résidu aminoacyle substitué ou non - X1 est soit un hydrogène, soit un résidu muramyle ou nor-muramyle ou homo-muramyle pouvant ou non être substitué sur la fonction amino en C-2 par des groupements acétyle ou glycolyle, sur la fonction hydroxyle en c-4 par un groupement acyle comprenant au plus 4 carbones et sur la fonction hydroxyle en C-6 par un groupement acyle comprenant jusqu'à 90 carbones ; - X2 est un résidu aminoacyle du groupe comprenant :: L-alanyle > L-arginyle, L-asparaginyl, L-aspartyle, L-cysteinyle, L-glutaminyle, L-glutamyle, glycyle, L-histidyle, L-hydroxyprolyle, L-isoleucyle, L-leucyle, L-lysyle, Lméthionyle, L-ornithyle, L-phénylalanyle, L-prolyle, L-séryle, L-thréonyle, L-tryptophanyle, L-tyrosyle et L-valyle, l'atome d'azote de l'élément de chaîne caractéristique -NH-9H-CO- dudit résidu aminoacyle étant le cas échéant N- substitué par un groupe hydrocarboné, notamment alcoyle, comprenent de 1 à 4 atomes de carbone - X3 peut soit ne pas exister, soit être un résidu aminoacyle du groupe indiqué ci-dessus ou bien un reste hydrocarboné comprenant jusqu'à 10 carbones dans la formule duquel se trouvent deux fonctions, telles que par exemple alcool, amine ou carboxyle, aptes à être couplées, d'une part avec la fonction y-carboxylique du résidu D-glutamyle et,d'autre part, avec la fonction alcool en C-6 du résidu glucopyranosyle. Le groupe X1 peut plus particulièrement être représenté par la formule dans laquelle -R3 est un atome d'hydrogène ou un groupe CH2OH ou CH3; - R4 est de l'hydrogène ou un groupe acyle comprenant au plus 4 atomes de carbone; - R6 est de l'hydrogène ou un groupe acyle comprenant jusqu'à 90 atomes de carbone - R7 est un atome d'hydrogène ou un radical méthyle ou méthyle. Les composés préférés selon l'invention sont ceux dans lesquels X2 est un résidu L-alanyle, -N-méthyl-L-alanyl ou L-séryle. Dans ces composés, le groupe R3 est plus particulièrement un groupe méthyle. Dans les composés selon l'invention, le groupe R7 est de préférence un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle. De préférence encore, et dans les différentes classes de composés envisagées ci-dessus, R2 est un groupe amino ou ester, notamment ester n-butylique. D'une façon générale, l'invention concerne également encore à titre de composés préferés ceux dans lesquels les groupes R4 et R6 sont tous deux de l'hydrogène-. X3 est avantageusement un groupe L-alanyle. Les produits selon l'invention sont avantageusement fabriqués par réaction entre un composé de formule dans laquelle Ts est un groupe tosyle, capable de réagir avec le sel alcalin, par exemple de potassium d'une fonction carboxylique, et un composé de formule dans laquelle : -X1, X2 et X3 ont les significations sus-indiquées, les autres fonctions du produit de formule IV, notamment les fonctions amine, étant protégées de façon en soi connue. Les dérivés de tréhalose de formule III peuvent être préparés selon la méthode décrite dans POLONSKY et al. Carbohydr. Res. 65 (1978),295-300. Les dérivés de formule IV peuvent également, de leur côté, être fabriqués par toute méthode générale connue, par exemple celle décrite dans la demande de brevet européen publiée nO 79400183.4 déposée le 20 mars 1979. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaitront encore au cours de la description d'exemples de fabrication de composés préférés selon l'invention, de leurs propriétés biologiques et des conditions dans lesquelles ils peuvent être mis en oeuvre, afin que se manifestent les différentes activités biologiques qui les caractériscnt. 6-(Boc-L-alanyl) 6-(Mycoloyl)-&alpha;,&alpha;-tréhalose (1) A 34 mg du sel de potassium de la Soc-L-alanine (150 moles) et à 40 mg d'un éther du type de celui connu sous la désignation "18-CROWN-6" solubilisés dans 2 ml de benzène anhydre, sont ajoutés 170 mg du 6, (tosyl) 6 (mycoloyl)-&alpha;,&alpha;'-tréhalose (100 umoles) en solution dans 2 ml de benzène. Le mélange réactionnel est porté à reflux dans des conditions rigoureusement anhydres, puis, 2't bout de 6 heures, concentré à sec. Lt sirop obtenu est chromatographié sur une colonne de gel de silice éluée par le mélange chloroforme-méthanol (7/1):132 mg. 6, - (L-alanyl) 6'(mycoloyl)-&alpha;,&alpha;-tréhalose, chlorhydrate (II) 132 m de (l) sont traités pendant 45 minutes pour 1 ml d'NCl N dans l'acide acétique glacial. Le mélange réac- tionnel est concentré à sec . 109 mg 6,-(Boc-L-alanyl=D-isoqlutaminn L-alanyl)5(mycoloyl)- &alpha;, &alpha;-tréhalose (III) (ou DP-L-Ala-tréhaloer m6ycolate) A 25 mg de Boc-L-Ala-D-IsGln -(pLEFRANCIER et E. BRICAS, Bull. Soc.Chim. Biol. (1967., 49, 135) dissous dans 2 ml de THF anhydre sont ajoutés 10 ul de chlor-ofor- miate d'éthyle et 6 l de N-éthyimorpnoline, à - 15 . Après 5 minutes, sont ajoutés au mélange réactionnel 109 mg de (II) dissous dans 1 ml de TRF-anhydre contenant 5 l de N-méthyl morpholine. Après 4 heures à température ordinaire, le mé- lange réactionnel est étendu par 50 ml d'un mélange acétate d'éthyle-éther (1-1) et est lavé successivement avec NaHCO3 M, eau, acide citrique 10 %, eau. La phase organique est séchés sur Na2SO4 et concentrée en un sirop (129 mg). Celui- ci est purifié par chromatographie sur une colonne dc gel de silice éluée avec le mélange chloroforme-méthanol (4-1), puis par chromatographie préparative sur couche mince de Gel de silice, développée dans le mélange chloroforme-éthanol (1-1) : 32,5 mg (17 %). 6/-(L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanyl)sl(mycoloyl) ~ tréhalose, chlorhydrate (IV) 32,5 mg de (III) sont traités pendant 45 minutes par 1 ml d'HCl N dans l'acide acétique glacial. Le mélange réactionnel est concentré à sec : 29 mg. Rf. (chloroforme-méthanol 4-1). Analyse élémentaire : calculé pour C107H2030l7N4Cl, 2, 5CH3COOH, 1CHCl3 : C % 64, 0,1-H % 10,1-N % 2,6 - Trouvé : C %64,11-H % 10,0 % 2,4. 6; - (N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanyl)-6l (mycoloyl)a,a-tréhalose (V) (ou MDP-L-Ala-tréhalose-mycolate) A 66,5 mg de N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (3) en solution dans 5 ml d'un mélange THF-DMF (1-1) contenant 15 ul de N-méthylmorpholine, sont ajoutés 18 l de chloroformiate d'isobutyle, à -15 . Après 5 minutes, on ajoute 148 mg de (II) en solution dans 5 ml de THF, contenant 10 pl de N-méthylmorpholine. Après 2 heures, on ajoute 200 ul de KHCO32,5 M, puis 60 ml d'eau, à 0 C. L'émulsion est extraite par un mélange éther-acétate d'éthyle (1-1), puis par le chloroforme. Les deux phases organiques sont réunies et concentrées à sec : 140 mg.Le produit est obtenu par chromatographie sur colonne de gel de silice éluée par le mélange chloroforme-méthanol (7-1) : 82,3 mg. o'12D0 = +38 ,4 (0,8-CHCl3) analyse élémentaire : calculé pour C121H229O24N5, 3CH3COOH:C % 65,79 - H % 10,47-N % 3,02 - Trouvé : C % 65, 32-H % 10,68-N % 3,25. Propriétés biologiques Les composés selon l'invention ont des propriétés inrrtunostimulantes non spécifiques, notamment adjuvantes de l'immunité et anti-infectieuses. Ils présentent également des propriétés antitumorales à l'égard de certains types de tumeurs, notamment celles qui sont susceptibles d'être traitées par des injections intra-lésionnelles. Les propriétés adjuvantes se retrouvent plus particulièrement dans les composés de l'invention dans lesquels le groupe X1 est un dérivé du type muramique . Elles peuvent être mises en évidence notamment par l'administration de ces substances au sein d'une émulsion eau dans l'huile chez le cobaye vis-à-vis de l'ovalbumine. Les résultats sont indiqués dans le tableau I , par comparaison a u x propriétés adjuvantes de la N-acétyl-muramyl-L-alanyl D-isoglutamino (MDP). La technique utilisée est celle décrite dans la demande de brevet européen publiée mentionnée plus haut. Tableau I Adjuvanticité des composés chez le cobaye (administrée en émulsion eau dans l'huile minérale) vis-é-vis de l'ovalbumine. Intradermo réaction Titre hémagglutinant Témoins 0 600 MDP (50 ug) . 15 3200 Dp-L-Ala-tréhalose mycolate (50 g) O 800 MDP-L-Ala-tréhalose- mycolate (50 pe) 20 6400 La mise en évidence des propriétés ant-infectieuses est également faite en ayant recours 4 la ttchnique décrite dans la susdite demande de brevet européen.Les résultats obtenus avec les composés utilisés à titre d'exemplc figurent dans le tableau II ci-dessous Tableau Il Protection contre une infectioi? par voie instramussulaire avec 1,5 x 10' K. pneumoniae Traitement i.v. Suivie au jour 10 de l'infection au jour -1 dose ( g) No/total Protection (%) % Témoins - 4/24 MOP-L-Ala-tréhalose mycolate 100 19/24 62 P 0,01 Témoins - 4/24 DP-L-Ala-tréhalose mycolate 100 16/24 50 P 0,01 %Pourcentage de de survivant dans le lot d'animaux traités moins celui des témoins. Les propriétés antitumorales peuvent etre mises en évidence en ayant recours à la téchnique décrite par ELIYAHU YARKONI et collahorateurs; " International Journal of Cancer": 22,564-569 (1978), par injection d'une émulsion des eomposés selon l'invention dans des greffes de fibrosarcome murin syngénéique chez le cobaye ou la souris. Pour constituer l'émulsion on peut avoir recours à toute huile pharmaceutiquement acceptable, notamment celle onnue sous le noei de squaléne ou squalane.L'effet antitumoral se manifeste par une régression sensible des tumeurs. L- invention concerne des réactifs biologiques qui peuvent être constitués à l'aide des composés selon 11invention, notamment en vue d'étudier les éventuelles pro priétés adjuvantes standards ou,au contraire, comme. age'.t susceptible de s'opposer à certains effets lies à l'administration de substances immunosuppressives. Plus particulièrement, l'invention est relative à des médicaments rei,fer..ant à titre de principe actif au moins i'un des composés selon l'invention, ce médicament étant applicable en tant que régulateur de la réponse immu- nitaire du sujet auquel il est administré. Ces médicaments sont notamment applicables pour le traitement des maladies infectieuses d'origine bacté rienne ou parasitaire, ou l'inhibition d'affections tumo rales. Particulièrement, les médicaments renfermant les composés selon l'invention peuvent être utilisés pou le traitent des infections caueces par des aqents résistant aux antibiotiques. L'application de ces médicaments n'est pas seulement curative, elle peut aussi se faire à titre préventif. Les médicaments selon l'invention peuvent etre administrés-à un hôte - animal ou etre humain - de toute façon approprie à l'obtention de l'effet désiré. L'invention concerte naturellement aussi les diverses compositions pharmaceutiques auxquelles les composés selon l'invention peuvent etre incorporés, le échéant en association avec d'autres substances actives. Des compositions pharmaceutiques avantageuses sont constituées par des solution ou suspensions injec tables contentant une dose efficace d'au moins un produit selon l'invention. De préférence, ces solutions ou suspensions sont réalisées dans une phase aqueuse stérilisée isotonique, de préférence saline ou glucosée. L'invention concerne plus particulièrement de telles suspensions ou solutions qui sont aptes à etre administrées par injections intradermiques, intramusculaires ou sous-cutanées, ou encore par scarifications. D'autres compositions pharmaceutiques avantageuses sont constituées par les formes liposomiques des composés selon l'invention. Comme on le sait, les liposomes, en raison de la nature lipidique (et notamment phospholipidique) des éléments entrant dans leur composition, constituent, pour certains cas, une présentation particulièrement appropriée. L'invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques administrables par d'autres voies, notamment par voie orale ou rectale, ou encore sous des formes destinées à venir en contact avec des muqueuses, notamment les muqueuses oculaires, nasales, pulmonaires ou vaginales. En conséquence, elle concerne des compositions pharmaceutiques dans lesquelles l'un au moins des composés selon l'invention se trouve associé à des excipients pharmaceutiquement acceptables, solides ou liquides, adaptés à la oonstitution de formes d'administration orale,oculaire ou nasale ou avec des excipients adaptés à la constitution de formes d'administration rectale, ou encore avec des excipients adaptés à l'administration vaginale, par exemple gélatineux. Elle concerne enfin des compositions destinées à la voie pulmonaire, notamment des solutions préparées en vue de l'administration au moyen d'un appareil d'aérosol classique. L'invention consiste également en un procédé visant à renforcer les défenses immunitaires de l'hôte, consistant à lui administrer une dose efficace de l'un au moins des produits selon l'invention, sous l'une des formes d'administration qui a été évoquée ci-dessus. A titre d'exemple de doses susceptibles d'induire une action, on mentionnera des doses de 10 à 1000 pg par kg. de corps, par exemple de 50 pg lorsque l'administration est effectuée par voie parentérale, ou encore d'une dose de 200 à 20000 g par kg. de corps, par exemple de 1000 ,ug pour d'autres modes d'administration, tels que par exemple la voie orale. L'invention concerne encore les compositions contenant l'un au moins des composés selon l'invention et se présentant sous forme d'émulsions eau-dansl'huile. A titre d'exemple, ces émulsions contiennent de 1 à 10 en volume d'huile, notamment de squalène ou de squalane. Ces compositons peuvent être utilisées pour réaliser des injections intra-lésionnelles dans des tumeurs du type tumeurs mammaires, mélanomes et autres tumeurs solides. L'invention concerne enfin des compositions du type sus-indiqué contenant, en sus des composés selon l'invention, notamment aux doses unitaires qui ont été indiquées plus haut, des principes actifs de vaccin l'usage de ces compositions étant alors recommandé lorsque l'on veut tire profit de l'effet adjuvant, immunologiquement non-spécifique des composés selon l'invention en vue de renforcer l'effet des susdits principes vaccinants. L'invention concerne donc également des compositions de vaccins contenant au moins l'un des susdits composés . A titre d'exemple d'antigène vaccinant formantle principe actif de telles compositions, on peut citer celui de la grippe. L'invention ne se limite évidemnent pas aux modes de réalisation décrits cidessus à titre exemple et lhcmme de l'art neut y apporter des modifications sans pour autant sortir du cadre des revendications ci-après. REVENDICATIONS 1 - Composés dérivés de 1$s -D-glucopyranosyl- -D- glucopyranoside (&alpha;, &alpha;'-tréhalose), substitué asymétriquement sur ses deux fonctions alcools primaires, en position C-6 de chacun des monosaccharides constituants, selon la formule générale dans laquelle - R1 est un groupe lipophile comprenant au moins 30 atomes de carbone, de préférence de 60 à 90 atomes, notamment un acide mycolique comprenant de 80 à 90 atomes de carbone - R2 est soit OH, soit un ester OR dans lequel R est un radical comprenant de 1 à 10 carbones, soit un NH2, les hydrogènes du groupe amino pouvant être substitués par des restes alcoyles de 1 à 4 carbones, un résidu aminoacyle substitué ou non;; - X1 est soit un hydrogène, soit un résidu muramyle ou nor-muramyle ou homo-muramyle pouvant ou non être substitué sur la fonction amino en C-2 par des groupements acétyle ou glycolyle, sur la fonction hydroxyle en C-4 par un groupement acyle comprenant au plus 4 carbones et sur la fonction hydroxyle en C-6 par un groupement acyle comprenant jusqu'à 90 carbones; - X2 est un résidu aminoacyle du groupe compre nant :L-alanyle, L-arginyle, L-asparaginyle, L-aspartyle, L-cysteinyle, L-glutaminyle, L-glutamyle,glycyle, Lhistidyle, L-hydroxyprolyle, li-isoleucyle, L-leucyle, L-lysyle, L-méthionyle, L-ornithyle, L-phénylalanyle, Lprolyle, L-séryle, L-thréonyle, L-tryptophanyle, L-tyrosyle et L-valyle, l'atome d'azote de l'élément de chaine caractéristique -NH-9H-CO- dudit résidu aminoacyle étant le cas échéant N- substitué par un groupe hydrocarboné, notamment alcoyle, comprenant de 1 à 4 atomes de carbone;; X3 peut soit ne pas exister, soit être un résidu aminoacyle du groupe indiqué ci-dessus ou bien un reste hydrocarboné comprenant jusqu'à 10 carbones dans la formule duquel se trouvent deux fonctions, telles que par exemple alcool, amine ou carboxyle, aptes à etre couplées, d'une part avec la fonction If-carboxylique du résidu D-glutamyle et, d'autre part, avec la fonction alcool en C-6 du résidu glucopyranosyle. 2 - Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que dans la formule (I), le radical X1 est caractérisé par la formule dans laquelle - R3 est un atome d'hydrogène ou un groupe CH2OH ou CH3; - R4 est de l'hydrogène ou un groupe acyle comprenant au plus 4 atomes de carbone; - R6 est de l'hydrogène ou un groupe acyle comprenant jusqu'à 90 atomes de carbone; - R7 est un atome d'hydrogène ou un radical méthyle ou éthyle 3 - N Composé selon la revendication 2 caractérisé en ce que dans le groupe représenté par la formule (I) X2. est un résidu L-alanyle, N-méthyl -L-alanyl ou L-séryle. 4 - Composé selon la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisé en ce que dans le groupe représenté par la formule (II) R3 est un groupe méthyle. 5 - Composé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4 caractérisé en ce que dans le groupe représenté par la formule (II) R7 est un atome d'hydrogène ou un méthyle. 6 - Composé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5 caractérisé en ce que dans le groupe représenté par la formule (I ) R2 est un groupe amino ou ester, notamment butyle. 7 - Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 6 caractérisé en ce que dans le groupe représenté par la formule (II) R4 et R6 sont tous deux de l'hydrogène. 8 - Le 6 (Boc-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanyl) 6' (mycoloyl) - , , 1-tréhalose. 9 - Composition pharmaceutique présentant notamment des propriétés immunostimulantes et antitumorales, caractérisée en ce qu'elle contient une dose efficace d'au moins un composé selon l'une quelconque -des revendications 1 à 8 en association avec un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable. 10 - Composition pharmaceutique selon la revendication 9 constitué par une solution ou suspension dudit composé dans un milieu injectable, notamment sous forme d'une solution aqueuse ou d'émulsion eau-dans-l'huile. 11 - Composition selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle contient en outre un principe vaccinant.