FR 2486400 A1 19820115 FR 8015242 A 19800709 La présente invention a pour objet l'appli- cation en thérapeutique de levures ou d'extraits insolubles de levures qui ont en commun la même activité pharmacologique et appartiennent aux familles des ascosporogènes, des sporobolomycetaceae et des cryptococcaceae. A la connaissance de la Demanderesse, le Saccharomyces cerevisiae est la seule espèce utilisée en thérapeutique, en particulier comme protecteur ou régénérateur de la flore bactérienne intestinale et en diététique. Par ailleurs, certains auteurs ont étudié des extraits de Saccharomyces cerevisiae ou leurs glucanes dans leur action sur le système réticulo-endothélial (RlGGI et Di Luzio, Am. J. Physiol. (1961) 200, 2, pages 297-300 ou dans leur action antitumorale (HAMURO et coll., CA., (1978) 89, 40 704 b). Or, les inventeurs ont déjà trouvé que les levures appartenant aux genres Pichia et Hansenula, ainsi que leurs extraits de glucanes insolubles possèdent des propriétés pharmacologiques spécifiques justifiant leur application en tant que médicaments de maladies infectieuses (voir les demandes de brevets français nO 79.01879 et 80.00890 au nom de la Demanderesse), et on a maintenant pu vérifier que ces propriétés sont générales à l'ensemble des levures appartenant aux familles des ascosporogènes, des sporobolomyceteceae et des cryptococcaceae ainsi qu'à leurs glucanes insolubles. La présente invention concerne donc un médicament à base de levures ou de leurs extraits insolubles caractérisé par le fait que ces levures appartiennent aux familles des ascosporogènes, des sporobolomycetaceae ou des cryptococcaceae, à l'exception des genres Saccharomyces, Pichia et Hansenula. La famille des ascosporogènes (Endomycetales) comprend notamment les sous-familles des dipodascaceae, des endomycetacae, des saccharomycetaceae et des spermophtoraceae. En ce qui concerne la sous-famille des saccharomycetaceae, qui a été plus spécialement étudiée par les inventeurs, 11 invention comprend notamment les médicaments à base des levures des genres Schizosaccharomyces, Nadsonia, Saccharomycodes, Hanseniaspora, Wickerhamia, Kluyveromyces, Lodderomyces, Wingea, Pachysolen, Citeromyces, Debaryomyces, Schwanniomyces, Dekkera, Saccharomycopsis ou Lipomyces et plus particulièrement à base de Schizosaccharomyces, Wingea ou Debaromyces, ou de leurs extraits insolubles. L'invention exclut les médicaments à base de Saccharomyces, Pichia ou Hansenula pour les raisons indiquées plus haut. La famille des sporobolomyceteceae comprend notamment les genres Sporobolomyces, Bullera et Rhodosporidium. L'invention comprend plus particulièrement les médicaments à base de Rhodosporidium ou de leurs extraits insolubles. La famille des cryptococcaceae comprend la sous-famille des cryptococcoideae à laquelle appartiennent notamment les genres Cryptococcus, Torulopsis, Pitysporum, Brettanomyces, Candida, Kloeckera et Trigonopsis,et les sousfamilles des Rgodotoruloideae et des Trichosporoideae, en particulier le genre Rhodotorula. L'invention comprend les médi- caments à base de ces levures ou de leurs extraits insolubles. Toutes ces levures sont connues en tant que telles et sont accessibles dans la plupart des collections de cultures de micro-organismes. On citera ci-après à titre d'exemples quelques espèces de levures ainsi que leurs numéros: Schizosaccharomyces Pombe CBS 1042 Wingea CBS 2934 Debaromyces CBS 4349 Rhodosporidium diobovatum CBS 6084 Cryptococous laurentii CBS 139 Torulopsis -'CBS 6380 Brettanomyces bruxellensis CBS 72 Rhodotorula lactosa ATCC 9536 CBS : Centraalbureau Voor Schimmel Cultures, Delft, Pays-Bas ATCC : American Type Culture Collection Les souches de levures utilisables selon l'invention peuvent etre entretenues et cultivées de manière connue sur des milieux d'entretien et de fermentation habituellement utilisés pour les levures.Les cellules obtenues peuvent être séchées à 500 sous vide ou,de préférence lyophilisées. Les extraits insolubles utilisables selon l'invention, qui sont principalement des glucanes insolubles, peuvent être isolés de la paroi des cellules de manière connue, par exemple selon la méthode indiquée par Bell et Northcote (J. Chem. Soc. (1950), pages 1944-47), éventuellement modifiée, par exemple selon Peat et coll. (idem, 1958a, pages 3862-3868). Le principe consiste à éliminer de la masse cellulaire obtenue par fermentation, d'abord les protéines et les lipides et les mannanes par traitement'alcalin, puis le glycogène et les glucanes solubles par traitement acide. Les exemples suivants, relatifs à la culture de Wingea et à l'obtention de produits directement utilisables, sont données à titre indicatif. EXEMPLE I Procédé de fermentation de Wingea a) Préparation des pieds de cuve. On prépare le pied de cuve à partir de la culture d'entretien de la souche de Wingea robertsii Celle-ci est obtenue par incubation pendant 48 heures à 30"C de la levure sur pente gélosée contenant Milieu (1) eau de levure ......... 500 ml peptone pancréatique 2 g glucose massé ......... 10 g gélose ................ 18 g eau ordinaire q.s.p 1 litre On décolle la culture de la pente gélosée par environ 10 mi de sérum physiologique stérile par tube. On verse la suspension ainsi obtenue de manière stérile dans un erlenmeyer de 6 litres contenant 1,5 litre de milieu de de fermentation ayant la composition Milieu (2) glucose ............... 15 g extrait de levure ..... 2,5 g sulfate d'ammonium .... 5 g phosphate monopotassique 5 g sulfate de magnésium(7H20) 0,05 g chlorure de calcium ... 0,01 g sulfate ferreux (7H20).. 0,01 g chlorure de potassium.. 0,01 g eau ordinaire q.s.p.... 1 litre L'incubation dure 24 heures à 270 + 10 sur agitateur rotatif à environ 115 t/minute. b) Fermentation. On ensemence le contenu de 2 erlenmeyer tel qu'obtenu ci-dessus (environ 3 litres) dans une cuve de fermentation stérile remplie de 200 litres de milieu (2) décrit ci-dessus. On effectue la fermentation pendant 20 heures sous aération de 20 m3/heure. Ensuite on centrifuge le contenu de la cuve afin de récolter la masse contenant les cellules de Wingea. On obtient 2,77 kg de masse cellulaire (humidité 81%). EXEMPLE 2 Obtention de cellules desséchées. En séchant à 500C sous vide 1 kg de la masse cellulaire obtenue dans l'exemple 1, on obtient 295 g de cellules prêtes à être utilisées. Une variante, pour obtenir un produit plus facile à conserver et à utiliser, consiste à lyophiliser la masse cellulaire obtenue dans l'exemple 1; à partir de 1 kg de masse cellulaire on obtient ainsi 234 g de cellules utilisables. EXEMPLE 3 Obtention de glucanes On traite 1 kg de masse cellulaire fraîchement centrifugée obtenue selon l'exemple 1, par 3 litres d'une solution de soude à 6 % pendant 1 heure 30 å 80"C ; on recueille le résidu par centrifugation (4000 t/minute pendant 15 minutes) et on traite ensuite par 5 litres d'une solution de soude à 3 % pendant 18 heures à température ambiante ; on centrifuge à nouveau et on traite le produit insoluble de nouveau par une solution de soude à 3 % pendant 1 heure 30 à 800C. On centrifuge et on reprend le culot de centrifugation par 3 litres d'eau. On amène la suspension ainsi obtenue à pH 4,5 par de l'acide acétique (ou chlorhydrique) et on porte à 800C pendant 2 heures sous agitation.On lave le résidu obtenu par centrifugation 3 fois par 1 litre d'eau bouillante et reprend par 2,5 litres d'une solution d'acétate de sodium 0,02 M puis procède à un autoclavage à 2 bars pendant une heure. On lave la partie insoluble à l'eau, puis à l'éthanol, à l'acétone et on sèche sous vide à 500C maximum. On obtient après broyage du produit obtenu 14,7 g d'une poudre crème. L'alternative consiste à lyophiliser. A partir de la même quantité de cellules on obtient 13,3 g d'extrait. La pureté chimique vérifiée par analyse élémentaire fournit les résultats suivants N = L'action de l'amylase d'origine pancréatique sur l'extrait ne libère que des traces de composés réducteurs, indiquant l'absence de glycogène. L'extrait utilisable selon l'invention est caractérisé par son insolubilite dans l'eau, les solutions alcalines ou acides, et les solvants organiques usuels, tels que l'éthanol, l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle, l'acétone, le chloroforme, etc... On constate toutefois une très légère solubilité dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Infrarouge : le spectre obtenu avec pastille de KBr présente une absorption à 890 cm 1 caractéristique des liaisons " I1 ressort de ces données que les extraits obtenus de la paroi des levures sont principalement des polymères ramifiés de glucoses liés par une majorité de liaisons ss. L'action de l'hexo-ss-(1-3)D) glucanase sur l'extrait libère des composés réducteurs confirmant ainsi l'existence de liaisons ss-(1-3)-D- glucanes. Ces extraits seront appelés simplement "glucanes" dans la suite du texte. Toutes les levures et leurs glucanes considérés selon l'invention peuvent être obtenus sous forme directement utilisable à la manière décrite dans l'exemple ci-dessus. La pureté des glucanes de chaque levure a été contrôlée par analyse chimique élémentaire permettant de vérifier en particulier l'absence de phosphore et une très faible teneur en azote ( Les levures et leurs glucanes utilisables selon l'invention ont été soumis à des essais pharmacologiques. Toxicité. Aucune toxicité n'a été constatée chez la souris par voie orale pour chacune des levures et leurs glucanes. Immunostimulation. 1) Consommation du complément L'augmentation de la consommation du complément est le signe d'une stimulation immunitaire. La technique qui a été utilisée est effectuée in vitro-avec du sérum humain normal titrant 40 UH 50. Les levures ou leurs giucanes sont mis en suspens ion dans du tampon de MEYER, aux concentrations indiquées dans les tableaux A et B ci-après. Le dosage du complément est effectué après une incubation de 15 minutres à 370C du mélange sérum humainsuspension de levures. Les résultats sont évalués en pourcentage d'activité restante, le 100 90 étant l'activité témoin. Les résultats rassemblés dans les tableaux A et B suivants et donnés à titre d'exemple ont été obtenus à partir de diverses levures des 3 familles Ascosporogènes, Cryptococcaceae et Sporobolomycetaceae et de leurs glucanes. Tableau A : levures entières Levures ' 5 mg/ml 10 mgXml : 25 mg/ml 50 mg/ml: Wingea 25 12 10 :Debaryomyces : 28 10 16 Schizosaccharomyces - 29 : 13 9 Rhodosporidium 43 24 : 13 11 :Cryptococcus : 25 : 17 : 18 11 Brettanomyces 27 : 15 15 : 8 Torulopsis 24 : 16 : 13 10 Rhodotorula 41 O O O Tableau B : glucanes Glucanes de : 5 mg/ml 10 mg/ml : 25 mg/ml : 50 mg/ml: :Saccharomyces : 30 : 14 : 11 :Wingea : 31 : 12 : 16 Debaryomyces : 28 : 19 : 13 :Schizosaccharomyces : 29 : 15 : 18 : :Rodosporidium : 35 : 29 : 16 : 17 :Cryptococcus : 28 : 19 : 20 : 15 :Brettanomyces . 33 : 17 : 17 : 12 :Torulopsis : 27 : 18 : 14 : 19 :Rhodotorula : 45 : 10 : 9 : 5 On constate d'après ces résultats que le com piment a bien été absorbé en majeure partie par ces différentes levures et leurs extraits de glucanes1 ce qui prouve leur activité immunostimulante. 2) Protection contre une injection expérimentale mortelle; traitement préventif. Les animaux utilisés sont des souris SPF IFFA CREDO, femelles, de 18-20 grammes, nourries avant expérience durant 8 jours avec un régime dépourvu de levures mais contenant la dose de vitamines ncessaires et réparties en lots de 10 souris. Pour chaque expérience il y a un lot témoin d'infection et un lot infecté et traité soit par la levure soit par ses glucanes. Dans ces expériences les souris ont été infectées par voie I.V. par environ 1 x 106 Staphylococcus aureus pathogènes (souche Institut Paster 54.146) ou par environ 1 x 104 Klebsiella pneumoniae. Le traitement a été effectué par voie I.P. - pour les levures à la dose de 50 mg/kg - pour les glucanes à la dose de 10 mg/kg, sous forme de deux injections (jour -7 et jour -4) avant 1'in- fection (jour O), et le nombre de souris mortes dans chaque lot a été nots chaque jour. Ces essais ont été effectués avec les mêmes levures que le test de consommation du complément (voir 1 cidessus) Dans les lots traités par les levures ou leurs glucanes on relève un pourcentage de souris mortes de 20 à 40 96, alors que dans le lot témoin non traité le pourcentage de souris mortes était de 90 à 100 %. Etant donné la virulence du germe injecté, la protection conférée par l'injection I.P.- des levures ou de leurs glucanes est très importante. Cette protection est attribuable à une immunostimulation non spécifique. Par ailleurs on a pu constater chez la souris infectée par Staphylococcus aureus la potentialisation d'un antibiotique tel que la tétracycline par les glucanes des levures utilisables selon l'invention, notamment Wingea et Rhodotorula. Les essais relatés ci-dessus ont mis en évidence que l'administration des levures appartenant aux familles des ascosporogènes, sporobolomyceteceae et cryptococcaceae ou de leurs glucanes, d'une part, diminue par immunostimulation non spécifique la mortalité d'animaux infectés par un germe pathogène et, d'autre part, potentialise l'action d'antibiotiques. Ces levures sont donc susceptibles d'être utilisées pour renforcer la résistance de l'organisme contre les agents infectieux et pour améliorer les défenses immunitaires. Les levures utilisables selon l'invention et les glucanes qui en sont extraits étant dépourvus de toxicité peuvent donc être utilisés dans la prévention et/ou le traitement des maladies infectieuses aigües ou chroniques, en particulier des maladies de la sphère ORL et/ou pulmonaire, mais aussi de toute autre maladie d'origine virale ou bactérienne. Leurs propriétés immunostimulantes non spécifiques permettent également d'envisager leur utilisation comme agents antitumoraux. Ils peuvent donc être utilisés comme médicaments seuls ou en association avec un ou plusieurs antigènes ou encore en association avec un ou plusieurs antibiotiques. Les cellules entières des levures peuvent être administrées par voie orale à des doses quotidiennes de 100 à 2000 mg (produit sec) par jour, de préférence dans des gélules contenant les cellules lyophilisées et éventuellement des excipients usuels, ou bien en ampoules buvables, les cellules étant en suspension dans leur milieu de culture. Exemple de composition d'une gélule - Cellules lyophilisées de levure (p.ex. Rhodotorula) ....................... 50 mg - Lactose .; 7 mg - Stéarate de magnésium ..................... 2 mg - Sucre glace q.s.p. une gélule de ......,... 150 mg Les jlucanes des levures peuvent aussi être administrées par voie orale, à des doses quotidiennes de 20 à 500 mg, ou seront utilisés également sous forme de suspensions injectables, à raison de 5 à 100 mg par jour. On peut aussi envisager l'usage des glucanes sous forme de crèmes dermiques ou d'aérosols. Exemple de composition de suspens ion injectable - Glucanes de Wingea micronisés .......... 0,010 g - Polysorbate 80 ......................... 0,025 g - Polyvinylpyrrolidone ................... 0,025 g - Phosphate monosodique .................. 0,025 g - Chlorure de sodium q.s.p. isotonie merthiolate de sodium ......... 0,0002 g - Eau distillée apyrogène q.s.p. 1 ampoule injectable de 5 ml Exemple d'aérosol - Glucanes micronisés *................... 0,050 g - Polysorbate 80 ........................ 0,2 g - Glycérides oléiques polyoxyéthylènes ....................... 1 g - Phosphate monosodique .................. 0,1 g - Chlorure de sodium q;s.p. isotonie merthiolate de sodium ......... 0,0008 g - Eau purifiée ...q.s.p................. 20 ml x (particules (50 pm dont 80 % C 10 pm) REVENDICATIONS 1.- Médicament à base de levures ou de leurs extraits insolubles, caractérisé par le fait que ces levures appartiennent aux familles des ascosporogènes, des sporobolomycetaceae ou des cryptococcaceae, à l'exception des genres Saccharomyces, Pichiaet Hansenula0 2.- Médicament selon ia revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est constitué de cellules entières de levures. 30- Médicament selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est constitué d'extraits insolubles de paroi de levures obtenus par un procordé consistant à éliminer des cellules de levures, les protéines, les lipides et les mannanes par traitement alcalin, puis le glycogène et les glucanes solubles par traitement acide. 40- Médicament à base d'extraits selon les revendications 1 ou 3, caractérisé par le fait que les extraits insolubles sont principalement constitués de glucanes. 5.- Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que la levure appartient à la famille des ascosporogènes. 6.- Médicament selon la revendication 5, caractérisé par le fait que la levure appartient à la sousfamille des saccharomycetaceae. 70- Médicament à base de levures du genre Wingea ou de leurs glucanes. 8.- Médicament à base de levures du genre Debaromyces ou de leurs glucanes. 9.- Médicament à base de levures du genre Schizosaccharomyces ou de leurs glucanes. lot ~ Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que la levure appartient à la famille des sporobolomycetaceaeO 11,- Médicament à base de levures du genre Rhodosporidium ou de leurs glucanes 120- Médicament selon l'une. quelconque des revendications l.à 4, caractérisé par le fait que la levure appartient à la famille des cryptococcaceae 130- Médicament selon la revendication 12, caractérisé par le fait que la levure appartient à la sousfamille des cryptococcoideae. 14.- Médicament à base de levures du genre Cryptococcus, Torylopsis ou Brettanomyces, ou de leurs glucanes. 15.- Médicament à base de levures du genre Rhodotorula ou de leurs glucanes. 16 - Composition pharmaceutique renfermant à titre de substance active une levure ou ses extraits insolubles tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 15, ainsi qu'un véhicule pharmaceutique acceptable.