FR 2480780 A1 19811023 FR 8009041 A 19800422 Procédé de transfonnation de cellules, notamment eucaryotes, nar un ADN circulaire tel que celui du virus de l'hépatite B et préparations contenant les produits d'expressiondesdits ADN L'invention est relative à une préparation contenant des antigènes possédant des propriétés immunologiques, notamment antigeniques, caractéristiques des virus de diverses formes d'hépatites, telles que l'hépatite virale B ou diverses autres formes d'hépatites telles que celles qui sont connues pour se développer chez certains sujets à la suite de transfusions sanguines, par exemple les hépatites dites "non A" ou "non B".L'invention concerne plus particulièrement des préparations de ce type, qui sont caractérisées par une pureté élevée, l'absence de protéines d'origine humaine et, lorsqu'il s'agit de préparations ayant des propriétés antigèniques analogues à celles des antigènes HBs, exemptes de particules de Dane. Elle est également relative à un procédé de production d'antigènes, notamment appropriés à la fabrication des susdites préparations. L'invention concerne également encore des techniques permettant de détecter la possibilité pour des génomes de virus, tels que ceux qui ont été mentionnés cidessus, ou de façon plus générale encore, pour des ADN circulaires pourvus d'une origine de transcription qui leur est propre, à être exprimés dans des catégories de cellules eucaryotes déterminées, et ce même lorsque ntest pas connue la position dans 1'ADN concerné de l'origine de transcription et, en cas de reaction positive,à en assurer la réalisation. En ce qui concerne plus particulièrement le virus de l'hépatite B, on sait que certaines de ses propriétés antigéniques spécifiques doivent être attribuées à un antigène appelé "Antigène HBs" ou"HBsAg", essentiellement formé par l'enveloppe du virus de l'hépatite virale du type B (HBV) ou particule de Dane. Cet antigène qui est à l'heure actuelle, obtenu à partir d'échantillons de sérum humain possède des propriétés vaccinantes à l'égard de l'hépatite virale du type B. Son utilisation en thérapeutique préventive, n'est cependant pas dépourvue de risques sérieux, en raison de l'origine de ces échantillons de sérum.En effet il provient en général de personnes qui ont été exposées au virus de l'hépatite virale B, de sorte que la présence de particules de Dane dans les préparations d'antigène d'HBsAg d'origine sérique ne peut pas toujours être complètement exclue, même dans le cas de préparations ex armement purifiées. Les particules de Dane peuvent dans certains cas encore posséder des propriétés hautement infectieuses.En outre, les préparations d'antigène HBsAg de 1 t état de la technique contiennent toujours encore des protéines sériques ou autres composants éventuellement antigéniques dont les proportions vis-à-vis des quantités d'antigènes isolés peuvent rester importantes, quel que soit le niveau de purification atteint, compte tenu de la faible teneur initiale en HBsAg vis-à-vis de celle des protéines du sérum initial (par exemple de l'ordre de 50 rg d'HBsAg vis-à-vis de 80 mg de protéine dans 1 ml de sérum). Ces protéines pourraient induire chez les sujets traités des réactions immunitaires néfastes. On ne dispose d'ail leurs.pas à l'heure actuelle d'autres sources d'approvisionnement en HBsAg, en raison des caractéristiques particulières du virus de l'hépatite B (HBV). Il semble n'être capable d'infecter que l'homme et, peut-être, un nombre réduit de primates parmi lesquels le chimpanzé. Il n'a pas été possible jusqu'à ce jour de le propager in vitro dans des cultures de cellules. On connaît certes des lignées d'hépatocarcinomes qui synthétisent de l'HBsAg. On conçoit cependant les objections qui peuvent être soulevées par les spécialistes à l'égard de l'utilisation chez l'homme de cellules cancéreuses pour la production de parcicules à caractère vaccinant. Malgré les difficultés rencontrées pour disposer de quantités suffisantes de virus, il a été établi que le génome du virus de l'hépatite B est formé d'une molécule d'ADN circulaire partiellement à simple brin, dont le brin le plus long comporte de l'ordre de 3200 nucléotides (STIMERS J. et coll. (1975) Proc. Nat. Sci. U.S.A. 72, 4597-4601). Au surplus, il a été possible de localiser le gène codant la partie de la protéine de l'antigène HBsA , qui est responsable des propriétés immunologiques de ltenvelonpe du virus de l'hépatite B. La position de ce gène. dénommé "gène S" résulte notamment de la carte schématiaue du génome de la particule de Dane. qui est donnée dans la figure 1 des dessins. Il comporte deux brins b1 et b2, le plus court d'entre eux (b2) étant normalement dépourvu de la partie représentée par une ligne en trait interromnu dans le dessin. Il est connu que cet ADN ne comporte qu'un seul site EcoRi. La flèche f1 donne le sens de la numérotation des nucléotides dont est composé le brin le plus long b1 et la flèche f2 donne le sens de la transcribtion du gène S Dar la machinerie cellulaire des cellules envahies par le virus de l'hépatite Th. Le site EcoRI peut donc être numéroté 0, ou 3 182 (dans le cas des virus de l'hépatite B appartenant ai sérotvpe 3 (182). Le cercle en trait plein intérieur e donne l'échelle en % de longueur de l'AND et permet de préciser les positions de certaines de ses parties. Les nombres 3' , 5' et 5', 3' à la partie inférieure de la carte visent les extrémités terminales porteuses de mêmes nombres dans les renresentations conventionnelles des extrémités des chaînes d'acide nucléiaue. Il a été montré que le "gène S" constituait essentiellement le fragment du brin le plus long b1 situé entre les positions 73,6 et 95,1 de la carte schématique de la figlsre 1 (en % de longueur vis-à-vis.du brin b1 le plus long, dans le sens de la numérotation, comme schématiquement représenté sur le cercle c de la figlire 1, ou encore dans le sens de la transcription du gène S). Les abréviations "Start" et "Stop" renrésentent les points d'initiation et d'arrêt de la transcription du gène "S". Le brin le Dlus court (b2) du génome de la particule de Dane petit être "réparé" in vitro en pré- sence de nucléotides précljrseurs et d'une polymérase, Dar exemple selon la technique de T.A. LANDERS et coll., J. VIROL, 23, 1977. p. 368 - 376. Les génomes ainsi séparés des virus de l'hépatite virale (ou tout ADN suscettible de coder les mêmes séquences d'acides aminés) seront,ci-après, désignés par 1' abréviation DNA HBV. L'invention a donc pour but de fournir des procédés tels qi'ils ont été spécifiés-plus haut, qui soient applicables d'une facon générale à l'étude et à l'expression dans des cellules eucaryotes de tolet oii partie de Génomes entiers de virus, dont DNA HBV. Elle a étalement pour but la production de vecteurs.modifiés permettant la mise en oeuvre de ces procédés. L'invention a enfin plus particulièrement pour but la production de préDarations contenant des antigènes présentant la même spécificité immunologique que l'HBsAg ou d'un antigène anslogue de haute pureté, comme il a été indiqué plus haut, à partir d'un système antre que le sérum humain , système qui est à la fois reproductible et stable (ou dont la stabilité d'un certain nombre de caractères déterminés peut faire l'objet d'une surveillance permanente). Le procédé selon l'invention pour déterminer la possibilité éventuelle de transformation d'une culture de cellules déterminées par un ADN normalement circulaire ou un gènome ent.ier de microorganisme tel qu'un virus, comprend l'opération qui consiste à mettre cette culture de cellules en contact avec un vecteur, nlus particulièrement un plasmide contenant lui-meme une séquence d'insertion formée d'au moins deux de ces ADN orientés dans la même direction de transcription et dans laquelle la queue de l'un est reliée à la tête de l'autre (séquence dite "en tandem" lorsuq'elle ne comprend que deux de ces ADN).Dans ce qui suit il sera souvent, Dour la commodité du language, fait référence à la "séquence tandem", étant entendu que cette expression s'étendra aussi aux séquences comprenant de deux ADrl du genre en question,sauf lorsque spécifié autrement De préférence, l'on se place dans des conditions qui permettent en même temps in marquage des cellules transrormées, de facon à rendre leur détection aiséexpar exemple en mettant en oeuvre des cellules (ou mutants de ces cellules) rendues déficientes, à des fins de sélection, en un ozène marqueur sélectionnable normalement nécessaire à leur croissance (déficience naturelle ou induite) lorsau' elles sont placées dans certains milieux de culture déterminés, ces cellules étant néanmoins susceptibles de se développer à nouveau dans l'un au moins de ces mêmes milieux de culture, après introduction dans ces cellules d'un zène ou fragment d'ADN homologue, quoique d'origine étrangère (ADN de complémentation), susceptible de compenser ou "complémenter" ladite déficience, le procédé consistant alors; soit à tenter de réaliser ladite transformation avec le seul vecteur contenant la séquence d'ADN étudié, lorsqu'il contient également dans son propre ADN un tel "ADN de comDlémentation", soit, lorsque tel n'est pas le cas, à produire la co-transformation (ou transformation simultanée) d'au moins certaines des cellules d'une telle culture au sein d'in tel milieu, d'une part par ledit vecteur; d'autre part, par un vecteur, de préférence un plasmide, préalablement modifié par l'insertion dans son génome d'un tel ADN de complémentation. Dans la mesure où un tel ADN est susceptible d'être exprimé dans la cellule de ladite culture, la séquence tandem (ou contenant plus de deux unités de l'ADN en auestion) doit normalement se comporter comme le ferait l'ADN circulaire corresDondant ainsi introduit dans la cellule, en l'absence de tout vecteur. L'utilisation d'un tel vecteur. notamment plàsmi- de, en lieu et place de l'ADN circulaire lui-même est d'un très grand intérêt en ce que l'on peut disposer de quantités imDortantes d'un tel vecteur après amDlification par clonage d'une bactérie du vecteur préalablement construit in vitro Le procédé selon l'invention Dermet donc de tester la capacité d'un ADN circulaire ou dtexnrimer un génome entier de virus dans des cellules eucaryotes, même lorsaue la position du promoteur sous le contrôle duquel est placée la transcription, n'est pas connue. Il va de soi que certaines parties de la séquence tandem d'insertion dans le plasmide vecteur peut comporter un certain nombre de délestions dans la mesure où la connaissance de la structure de l'ADN.étudié est suffisam- ment connue pour que l'cn sache de façon certaine que les parties délétées ne contenaient pas le promoteur ou l'ori- gine de transcription. I1 peut par exemple en être ainsi de la partie terminale du second ADN de la séquence tandem et notamment de la partie en aval du gène S dans le sens de la transcription lorsque ladite séauence est formée à partir d'unités de DNA HBV. Les vecteurs modifiés contenant de telles séquences tandem d'insertion, dont,le cas échéant,des parties essentielles sont délétéesF font eux-mêmes Dartie de l'invention. Les vecteurs modifiés dans lesquels la séquence tandem est à base de DNA HBV peuvent être exprimés dans des cultures de cellules de souris. Un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention dans lequel on met en oeuvre une culture de cellules eucaryotes, notamment des fibroblastes de souris, déficientes en un gène marqueur sélectionnable normalement nécessaire à leiir croissance (déficience naturelle ou induite) lorsqu'elles sont placées dans certains milieux de culture déterminés, ces cellules étant néanmoins susceptibles de se développer à nouveau dans l'lin au moins de ces mêmes milieux de culture. après introduction dans ces cellules d'un gène ou fragment d'ADN homologue, quoique d'origine étrangère (ADN de complémentation) susceptible de compenser ou "complémenter" ladite déficience, ce procédé comprenant l'étape consistant à produire la co-transformation (ou transformation simultanée) d'au moins certaines des cellules d'une telle culture au sein d'un tel milieu - d'une Dart, par un vecteur, de préférence un plasmide, préalablement modifié par l'insertion dans son génome d'un tel ADN de complémentation; - d'autre part, oar un vecteur. de préférence un plasmide, préalablement modifié par l'insertion dans le DNA d'un fragment d'ADN dérivé d'un DNA HBV ou d'unités répétitives d'ADN HBV reliées (par leurs têtes et queues respectives). ledit fragment comprenant au moins une partie d'un tel DNA HBV, y inclus son site EcoRI unique et respectivement. de part et d'autre de ce site EcoRI, d'une part un sousfragment contenant la séquence de.nucléotides du gène S qui est apte à coder le polyDeptide responsable des propriétés immunologiques de l'antigène UBs et, d'autre part, un sous-frgment suffisamment lone pour qu'il soit susceptible d'inclure le Dromoteur du gène S. En d'autres termes ce second vecteur modifié comprend notamment, si l'on se réfère à la figure 1, d'une part le sous-fragment compris entre les positions numérotées de 73,6 à 100 (ou O), lorsaue ce sous-fragment comprend le gène S dans son entier et d'autre part. un sous-fragment compris entre la nosition 0 et une position correspondant à un nombre suffisemment éloigné de la position 0, dans le sens de la flèche fl Dour que le promoteur susdit soit suscentible d'y être incllls. La culture des cellules cotransformées dans le milieu susdit entraîne l'expression dudit fragment dérivé du DNA HBV et la Production de Doly- peptides présentant les propriétés immunologiques de l'HBsAg, dont au moins une partie peut en général être excrétée- dans le milieu de culture. Il va de soi que la co-transformation susdite peut être remplacée par une transformation Dar le seul second vecteur ci-dessus mentionné s'il contient lui même également l'ADN de complémentation. Dans un mode de mise en oeuvre nréféré du nrocédé selon l'invention, ledit fragment dérivé de DNA HBV comprend deux unités DNA HBV. la têt.e de l'une de ces unités étant reliée à la queue de l'autre (en tandem) au niveau d'un site EcoRI central ce fragment étant excisable du plasmide dans lequel il est inséré également au niveau de deux sites EcoRI distincts. Ce fragment sera dénommé ci-après "DNA HBV tandem". Chacun des sous-fragments de ce "DNA HBV tandem" est alors constitué nar un DNA HBV pratiquement entier. Bien entendu ledit fragment dérivé de DNA HBV peut n'être constitué que d'une partie d'un"DNA HBV tandem" (u n'être assimilable qu'à une partie d'un DNA HBV tandem) délimités par des extrémités, caractéristiques de sites de coupures pnr des endonucléases identiques ou différentes entre elles, néanmoins toutes) deuu distinctes de EcoRI. cependant à condition que le DNA HBV tandem partiel ainsi obtenu, comprenne toujours encore les sous-fragments définis plus haut, de part et d'autre d'un site EcoRI interne. En ce qui concerne l'autre vecteur, de préférence plasmide, il contient de préférence au titre de "l'ADN de complémentation" le fragment d'ADN contenant le gène de la thymidine-kinase du virus Herpès simplex HSV-1, fragment qui peut être excisé du génome du virus par des enzymes de restriction spécifiques, tels que BamHI. A ce gène de la thymidine-kinase d'origine virale correspondent, dans de nombreux tynes de cellules eucaryotes, des gènes homologues propres à diriger la svnthèse de la thymidine-kinase (enzyme phosphorylant la thymidine exogène fournie par le milieu de culture). La possibilité de suppléer, par l'introduction préalable du gène entier de la thymidine-kinase du virus de l'herpès dans des cellules de souris du type L antérieurement déficientes, en raison d'une mutation induite ou provoquée affectant leur gène de la thymidine-kinase endogène, a déjà été décrite par M.WIGLER et coll. (Cell. Vol.II,223-232, 1977). Les cellules déficientes. dites TK sont sélection nées en raison de leur incapacité de svnthétiser la thymidinekinase dans un milieu tel que celui connu sous le nom de "milieu HAT" (contenant de l'hypoxanthine et de l'amino-ptérine en sus de la thymidine). Ce milieu est connu polir n'autoriser l'éventuelle synthèse de thymidine phosnhate que par l'intermédiaire d'une voie métaboliaue dite "voie de sauvetage". (salvation pathway).Cette voie impliquant cependant que soit nréservée l'intégrité du gène TK des cellules susceptibles de s' développer. Des cellules TK deviennent néanmoins capables de se développer dans ce mPme milieu dès lors qu'elles ont été modifiées par incorporation du ozène TK du virus de l'herpès au patrimoine génétique transmissible par ces cellules à leur descendance. comme suite à leurs divisions cellulaires successives. De "TK " qu'elles étaient anté rieurement, avant la susdite incor@oration, ces cellules sont alors devenues "TK+" du fait de la restauration alors constatée de leur capacité de phosphorvler la thymidine d dans le susdit milieu et. par conséauent, de s'y développer. Bien entendu. le fragment d'ADN contenant le ozène de 1a thymidine-kinase Deut être remnlacé par tout autre ADN de complémentation apDroDrié. A titre d'exemple d'autres gènes de complémentation qui peuvent être utilisés pour la constitution des vecteurs selon l'invention, on citera celui contenant celui de la dihvdrofolate réductase (DHFR), ou d'une façon générale, tout ozène de comnlémentation dont de nombreux exemples existent dans la nature. L'ADN de complémentation peut naturellement comporter un gène naturel. Il peut aussi être synthétisé, notamment de façon enzymatique. par copie d'un ARN messager correspondant. En ce qui concerne la technique de co-transformation elle-même, il est avantageux d'utiliser le vecteur dans lequel est inséré le gène de complémentation et le vecteur dans lequel est inséré le fragment dérivé de DNA HBV dans un rapport élevé supérieur à 100, par exemple de l'ordre de 1 000. Plus ce rapport est élevé, plus le nombre de cellules co-transformées par les deux vecteurs à la fois est grand. Les cellules co-transformées pourront être aisé- ment repérées par l'intermédiaire du marqueur que consti tllent d'une nart l'ADN de complémentation, tel aue le gène de la thvmidine-kinase pour le premier vecteur. Il est avantageux d'avoir recours aux mêmes vecteurs de base nour former les deux types de vecteurs modifiés utilisés Dour la co-transformation. Un vecteur de base Darticulièrement favorable est constitué par le olasmide pBR 322. L'on pourra en Darticulier insérer un "DNA HBV tandem" dans son site EcoRI polir former l'un des vecteurs modifié.; de co-transformation (p/CP10). Par l'insertion d'un ozène tkHSV, soit dans un site PvuII. soit dans iin site BAM HI dii même nlasmide PBR 322, on peint obtenir le second vecteur de co-transformation (nAGO). En ce qui concerne les conditions de culture, il va naturellement de soi aue le milieu préalablement utilisé pour atteindre à un dévelopDement suffisant des cultures, doit être remDlacé au moment de la transformation ou neu après celle-ci par un milieu (tel que le milieu HAT dans le cas où l'ADN de complémentation choisi est un gène de thymidine-kinase) dans lequel les cellules non complémentées sont incanables de se développer. La réalisation desdites co-transformations, Darticulièrement lorsnue 1 'on met en jeu des plasmides modifiés préférés qui ont été mentionnés dans ce qui précède. conduit au résultat remarquable que constitue ltexerétion par les cellules co-transformées dans le milieu de culture. de Darticules présentant des nronriétés immunologiques caractéristiques des enveopnes du virus de l'hépatite B, notamment en ce qui concerne leur agglutination par des anticorps susceptibles d'agglutiner les antigènes HBsAg naturels, tels ou 'isolés des sérums humains.La. présence de particules excré tées agglutinables par des anticorps antiHBsAg peut être détectée par des essais radioimmunologiques classiques, par exemple par immunofluorescence indirecte mettant en jeu des sérums anti-HBsAg et des anti-IgG fluorescents de lapins. Les quantites formées peuvent être dosées par des tests d'hémagglutination passive directe. de façon en soi connue pour les HBsAg naturels. Il est également remarquable que les particules excrétées ne contiennent nas de traces détectables d'antigènes HBcAg et HReAg, détectables par immunofluorescence directe mettant en jeu des anticorps humains fluorescents anti-HBc et anti-HBe/1,2,3. Par mise en contact des cellules co-transformées elles-mêmes avec un sérum anti HBsAg des granules cytoplasmiques individualisées sont révélées par immunofluorescence indirecte dans la majeure partie des cellules co-transformées. Ces particules Deuvent être également repérées anrès lyse des cellules. Dans la plapart des cas. les particules excrétées forment la majeure partie des. particules agglutinables par des anticorps anti HBsAg susceptibles d'être produites. Les particules formées, qu'elles soient excrétées dans le milieu ou retenues dans le cytoplasme des cellules co-transformées présentent encore les propriétés qui seront encore mentionnées plus loin dans la description d'exemples. Il est ainsi possible d'obtenir des préparations d'antigènes présentant les caractéristiques immunologiques de l'antigène HBsiAg, dépourvues de toute particule de Dane et des autres antigènes caractéristiques contenus dans ces dernières, en l'absence de composants d'origine humaine, notamment de toute protéine sérique L'invention concerne donc plus particulièrement des compositions de vaccins contenant lesdits antigènes (tels qu'ils peuvent être récupérés à partir des milieux de culture desdites cellules co-transformées ou de lysats de ces dernières) le cas échéant, associes à tout véhicule pharmaceutique approprié à la constitution de vaccin actif contre l'hépatite virale5 susceptible d'être administré par voie orale ou parentérale . Elle concerne également les réactifs de laboratoire contenant des doses déterminées de ces antigènes susceptibles notamment d'être utilisés a titre détalons ou de références vis-à-vis desquels peut être apprécié le degré de pureté de préparations contenant des antigènes HBsAg, d'origine naturelle ou non, en ce qui concerne en particulier leurs teneurs relatives en protéines sériques, ou autres antigènes, tels que HBcAg ou HBeAg, etc. L'invention sera encore davantage illustrée par la description d'exemples de mise en oeuvre dés plasmides modifiés (qui font eux-mêmes partie de l'invention) en vue de la fabrication des antigènes ayant des propriétés Lmxnologiques de l'HBsAg. Il sera à cette occasion encore fait référence à la figure 1 déjà mentionnée et aux figures 2a, 2b et 2c, lesquelles représentent des cartes schématiques du plasmide du genre en question. Les nombres entre parenthèses renvoient à la bibliographie ajoutée à la fin de la présente description. Construction d'un recombinant contenant l'ADN du virus de l'hépatite- virale B 200 ng de pBPs 322 sont soumis à digestion par l'endonucléase EcoRI et traités avec 2,6 unités de phosphatase alcaline (9) dans 100 nM de de Tris-HCl pH 8, à 60 C pendant 60 minutes. Après deux extractions au phénol puis trois extractions à 1' éther, l'ADN est précipité par l'éthanol. Le résidu solide est dissous dans de l'eau et lion ajoute à la solution 100 ng de Eco HBV DNA. La ligature est effectuée selon la méthode décrite dans (10). On procede à une culture de E.coli DP 50 dans un milieu de culture constitué par un bouillon L contenant 100 pg /ml d'acide diaminopimélique et 20 pg/ml de thymidine. Les bactéries sont alors transformées selon la méthode décrite dans (10) par le mélange de ligature sélectionnées selon leur capacité de résistance à des doses de 100 ug/ml d'ampicilline et 15 pg/ml de tétracycline. 900 colonies sont obtenues. Elles sont toutes testées en vue de.la détermination de la présence ou non de HBV DNA par hybridation in situ (11, 12). Le test est positif pour 800 colonies. On recueille les 16 colonies qui induisent un signal d'hybridation d'intensité plus élevée. Les plasmides sont extraits et leur structure est analysée par digestion en présence de EcoRi, Xho I, Hind III et Xba I. La structure du recombinant obtenu résulte des figures 2a et 2b dans lesquelles ont été schématiquement représentés d'une part la structure du gène EcoHBV DNA et d'autre part la structure du plasmide modifié pCP10 et telle qu'elle résulte de l'insertion dans le plasmide pBR 322 d'un fragment d'ADN constitué par deux fragments Eco ilBV DNA successifs, la tête de l'un étant reliée à la queue de l'autre, au niveau d'un site EcoRI (insertion en tandem tete à queue). Il s'est avéré que parmi les 16 colonies ci-dessus qui ont été retenues, 14 d'entre elles hébergeaient des plasmides du type pCP 10, dans lesquels les deux Eco tIBV DNA se trouvaient insérés selon l'arrangement tandem tête à queue dans les deux directions d'orientation possibles. C'est en particulier grace aux digestions avec les endonucléases Hind III et xba I qu'il a été possible de déterminer les directions d'insertion des fragments d'ADN Eco HBV DNA. Les intégrations dans le plasmide pCP 10 de deux fragments Eco HBV DNA sont démontrées par la digestion en présence de l'endonucléase XhoI,lesquelles produisent l'excision d'un fragment d'ADN ayant une taille similaire à celle de Eco HBV DNA à partir du plasmide hybride pCP 10. Ce dernier comporte 10 626 paires de bases Les Positions respectives du gène S dans Eco HBV DNA(figs 2a et 2b) et dans le plasmide hybride pCP 10 sont respectivement représentées par les calèches S dessinées en traits renforcés. Les aétites flèches latérales situent les positions relatives de certains des sites de restriction dans les chaînes d'ADN correspondantes. Les positions des facteurs de résistance à l'ampicilline (ApR) et à la tétracycline H (TcR) sont également représentées de façon schématique Les mêmes conventions s'appliquent au plasmide pAGO (Figure 1c) qui a été obtenu par insertion dans le site Pvu Il du plasmide pBR 322 du gène de la thymidinekinase du virus Herpès simples HXV-1 (HSV-tk) (25). Culture et transformation par les susdits plasmides de cellules de souris déficientes en thymidine-kinase (Ltk -). Des mutantes de cellules de souris LM déficientes en thymidine-kinase (Ltk ) sont cultivées dans le milieu minimum essentiel MEM O 111 Gibco, le cas échéant en présence dc sérum de veau à 10 %. Des monocouches confluentes de ces cellules (2 X 106 cellules par. 25 cm2 ) dans des flacons de Falcon ont été inoculées avec les ADN correspondant auxdits plasmides, en vue de leur transformation selon la méthode de GRAHAM et VAN DER EB (14) modifiée par STOW et WILKIE (15). On utilise pour effectuer cette transformation à la rois le plasmide pAGO (linéarisé nar l'endonucléase Hind III )et le plasmide pCP10 linéarisé ou non par la même enzyme. Dans tous les essais le rapport moléculaire pAGO/ pCP 10 a été de l'ordre de 1/1 000. On a utilisé de 1'ADN de sperme de saumon à titre de véhicule pour ajuster la concentration en ADN à au moins 10 Fg/ml.. Après la transformation les cultures cellulaires sont maintenues dans ce milieu contenant en outre 15yug/ml d'hyposanthine, 0,1 g/ml d'aminoptérine et 5 g/ml de thymidine (milieu sélectif de HAT selon LITTLEFIELD (13)). 24 heures après la transformation on ajoute au milieu une solution de HAT concentrée 100 fois, solution concentrée qui est changée une semaine plus tard, puis tous les trois jours. Après 15 jours de culture en présence des deux types de plasmides ( co-transformation) dans le milieu sélectif de IfAT on observe lå formation de colonies. 20 jours après la co-transformation on détecte la p r o d u c t i o n d'HBsAg dans le milieu de culture par des tests radioimmunologiques. Des cultures formées dans les mêmes conditions et transformées à des fins de comparaison avec le seul plasmide p AGO n'induisent aucune production d'}!BAg. Les colonies tk+ résistantes au milieu HAT sont recueillies avec une pipette Pasteur (20 jours après la co-transformation) et transférées dans des cultures de tissus en en microplaques. On effectue des passages des colonies tous les 5 jours et on les maintient sous pression sélective continue dans le milieu de culture HAT. Cinq des colonies obtenues à partir de la co-transformation en @résence de pCP 10 linéarisé et dix colonies obtenues à partir de la co-transformation des cellules de souris avec le pCP 10 circulaire ont été prélevées et cultivées dans le milieu HAT. Toutes les cultures ont produit de l'NBsAg qui a été libéré dans le milieu de culture externe. Les quantités d'HBsAg synthétisé sont variables d'une culture à l'autre (dans des limites se trouvant dans un rapport de 1 à 30). Les quantités produites sont stablesirême après plusieurs passages desdites cultures. L HBSAg peut être récupéré par centrifugation du surnageant des cultures et purifiés par centri fugation dans un gradient de densité à base de CsCl. On recueille les HBsAg dans la zone de densité 1 20 g/ml. Ces HBsAg sont complètement neutralisés par une solution de sérum anti-HBsAg (dans un rapport 10/1) après incubation à 370C pendant une heure, comme détectable par les essais de radio1mmUinologie. A l'examen sous le microscope électronique on observe des particules sphériques ayant des tailles s'échelonnant de 18 à 25 nm (en moyenne 22 nm). Leur morphologie rappelle celle des particules sphE- riques d'antigènes de 22 nm qui peuvent être isolées à partir de sérum humain. Des structures filamenteuses telles que celles visibles parmi les antigènes extractibles de sérum humain n'ont pas été observées, du moins dans les conditions de l'expérience. Aucune particule de Dane n'a pu être détectée. Le tableau suivant illustre la capacité de production des cellules de souris tk qui ont été co-trans- formées par les plasmides en question Le rapport P/N correspond au rapport du nombre de désintégrations par minute (dpm) mesuré sur le -surnageant au nombre de dpm mesuré sur une culture témoin lorsque les dosages de HBsAg sont faits par tests immunologiques 20 jours après la co-transformation des cellules. Un rapport P/N supérieur à 2,1 est considéré comme significatif. TABLEAU I Co-transfonnation de cellules Ltk- de souris avec des plasmides pCP10 et pAGO lacon pAGO pCP10 li- pCP10 cir- ADN de sper- Nombre de P/N linéa- néarisé culaire me de saumon colonies risé tk b 0.010 10 - - 140 c 0.005 - 5 15 - 200 16 f 0.010 - - 15 .26 1 Après lyse des cellules préalablement lavées, digestion des protéines en présence de protéinase, extraction et purification de l'ADN cellulaire, dosage de l'ADN cellulaire par la technique de SOUTHERN modifiée par WAHL et col. (16, 17) en ayant recours à une sonde Eco HBV DNA préparée selon la technique de WEINSTOK et Colt.(18) il a été constaté que la quantité de HBsAg intracellulaire qui avait été synthétisée correspond approximativement au tiers de l'HBsAg qui avait été excrété dans le milieu de culture. Dans les conditions de l'expérience les clones les plus actifs ont produit jusqu'à 150 ng/ml d'HBsAg. En sus de l'absence déjà mentionnée de particules de Dane, on relève l'absence des antigènes HBcAg et HBeAg au moins à un niveau détectable par immunofluorescence directe mettant en jeu des anticorps fluorescents d'origine humaine anti-HBc et anti-HBe/1,2,3(19). On n'a pas davantage noté la production d'ADN-polymérase, par mesure de l'activité ADN-polymérase par la méthode de KAPLAN et Coll.(tant dans le résidu de centrifugation du surnageant que dans celui du lysat des cellules préalablement transformées. Par extraction des ADN de poids moléculaire élevé de certains des clones produits, digestion de ces ADN en présence de EcoRi, Hind III et XhoT, fractionnement des fragments obtenus par électrophorèse sur gel d'agarose, transfert sur des filtres de nitrocellulose, hybridation de ces fragments avec des sondes Eco HBV DNA marquées au phosphore 32, il a été établi que plusieurs copies du plasmide pCP 10 pouvaient être intégrées à 1'ADN cellulaire. Il a été noté également la présence de dimeres d'HBV DNA tant dans les copies de plasmide contenues dans les cellules transformées que parmi les fragments éventuellement intégrés dans les ADN cellulaires. Il a été également déterminé au moyen d'études cinétiques que dans les conditions expérimentales qui ont été décrites, des particules d'antigène HBsAg peuvent être excrétées dans le milieu par les cellules, à raison de I' 2 x 10 à 4 x 104 particules/cellules/2Lt heures, soit de 2 000 000 à 4 000 ooa de molécules de polypeptides/cellules/ 24 h, si l'on suppose que chaque particule contient environ 100 molécules de polypeptides. L'invention fournit donc un produit susceptible d'une pureté inaccessible jusqu là ce-jour. Elle concerne plus particulièrement les préparations formées de façon quasi exclusive de particules d'antigènes HBsAg essentiellement sériques-. Elles sont totalement exemptes de particules de Dane décelables par les méthodes usuelles de dosage radioimmunologique. Elles sont au surplus totalement exemptes de protéines, notamment protéines sériques d'origine humaine. Elles sont exemptes d'ADN polymérase.Le cas échéant on peut, en ayant recours à des techniques antérieurement connues et pour des raisons de sécurité renforcées, exciser certaines parties extérieures au gène S du DNA HBV, de façon à n'utiliser pour la constitution des "sé- quences tandem susdites des génomes défectifs qui ne sont plus capables de coder des particules de Dane entières La capacité des vecteurs modifiés selon l'invention d'être exprimée dans des cellules eucaryotes semble témoigner du fait que la transcription du gène de l'HBsAg est sous le contrôle d'un promoteur viral contenu dans le fragment dérivé d'HBV DNA.Ces vecteurs ,tels que le plasmide pCP10 peuvent éventuellement être eux-mêmes utilisés à titre de vecteurs pour réaliser l'expression dans des cellules eucaryotes d'un ADN étranger préalablement inséré dans lesdits vecteurs. L'avantage des vecteurs modifiés selon invention vis-à-vis notamment de l'ADN dénommé "SV 40 DNA" (20,31),devrait alors résider dans le fait qu'ils n'induisent pas une lyse des cellules-hôtes. De plus le gène S peut être considéré comme disposant d'une séquence-signal sous le contrôle de laquelle la protéine hybride formée, résultant de l'expression dans les cellules hôtes de l'ADN étranger préalablement inséré dans le vecteur susdit, serait excrétée dans le milieu de culture.La récupération de cette protéine hybride s'en trouverait évidemment considérablement facilitée. Bien que le procédé de l'invention ait été décrit dans ce quiprécède, principalement dans son application à DNA HBV, il peut s'étendre à tous autres ADN circulaires ou génomes entiers. En particulier il peut être appliqué à l'étude des ADN circulaires des virus des picornavirus, des virus de la polyomyélite, de la fièvre aphteuse et autres "petits virus". Dans chaque cas il conviendra alors à des fins d'amplification de - cloner l1ADN à étudier dans une bactérie, notamment E.coli; i; - établir une carte de restriction de l'ADN en vue de choisir une enzyme de restriction (ou autre endonucléase) à la quelle ne correspond dans l'ADN circulaire qu'un seul site de restriction; - traiter in vitro cet ADN ainsi qu'un vecteur possédant le même site de restriction par cette enzyme de restriction, puis traiter les fragments par une ligase, en vue de réa liser une fusion génétique entre les fragments ;; - transformer une culture de bactéries avec les recombinants et sélectionner ( notamment au moyen d'une méthode d'hybri dation in situ avec une sonde marquée radioactivement préparée au préalable)parmi les colonies formées et recon nues comme hébergeant un recombinant du plasmide dans lequel est inséré au moins un ADN du virus étudié, celles qui paraissent en contenir au moins deux, dans une séquence tandem; - le cas échéant, vérifier par un nouveau traitement avec l'enzyme de restriction choisie, que lton retrouve bien parmi les fragments d'ADN amplifiées obtenus, des fragments présentant la même longueur que l'ADN étudié initial. Toutes ces opérations peuvent être menées à bien en ayant recours à des techniques désormais classiques, telles qu'elles ont été illustrées ci-dessus dans les exemples relatifs au DNA HBV. Les plasmides obtenus, qui contiennent alors une "séquence tandem" de l'ADN étudié peuvent alors être mis en oeuvre, conjointement avec un marqueur approprié, tel qu'un plasmide le contenant, vis-à-vis de diverses cultures de cellules eucaryotes; en vue d'opérer un " screening" des cellules dans lesquelles la séquence tandem est susceptible d'être exprimée, sous le contrôle du promoteur contenu dans cet ADN. Ci-après la bibliographie relative à l'état de la technique et à laquelle référence est faite dans la présente description 1. Barker, L.F., Maynard, J.E., Purcell, @.H.. Hoofnagle, J.H., Berquist, H.R. & London, W.T. (1970) Am. J. ed. Sci. 276, 189-193. 2. Alexander, J.J., Bey, E.M., Geddes. E.W. & Lecatsas, G. (1976) S.A. Med. J. 50, 2124-2128. 3. Aden, D.P., Fogel, A., Plotkin, S., Damjanov, I. & Knowles, B.B. (1979) Nature (London) 283, 615-616. 4. Valenzuela, P., Gray, P., Quiroga, M., Zaldivar, J., Goodman, H.M. & Rutter, W. (1979) Nature (London) 280, 815-819. 5. Charnay, P., Mandart, E., Hampe, A., Fitoussi, F., Tiollais, P. & Galibert, F. (1979) Nucleic Acids Res 7, 335-346. 6. Galibert, F., Mandart, E., Fitoussi, F., Tiollais, P. & BR Charnay, P. (1979) Nature (London) 281, 646-650. 7. Pasek, M., Goto, T., Gilbert, W., Zink, B., Schaller, H., MacKay, P., Leadbetter, G. & Murray, K. (1979) Nature (London) 282, 575-579. 8. Wigler, M., Sweet, R., Sim, G.K., Wold, B., Pellicer, A., Lacy, E., Maniatis, T., Silverstein, S. & Axel, R. (1979) Cell 16, 777-785. 9. Ullrich, A., Shine, J., Chirgwin, J., Pictet, R., Tischer, E., Rutter, W.J. & Goodman, H.M. (1977) Science 196, 1313-1318. 10. Tiollais, P., Perricaudet, M., Petterson, U. & Philipson, L. (1976) Gene 1, 49-63. 11. Grunstein, M. & Hooness, D. (1975) Proc. Natl. Acad. 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(1979) Nature (London) 281, 35-40. 32. Brechot, C., Pourcel, C., Louise, A., Rain, B. & Tiollais, P. submitted for publication. REVENDICATIONS 1 - Procédé pour déterminer la possibilité éventuelle de transformation d'une culture de cellules déterminées, notamment eucaryotes, par un ADN normalement circulaire ou un génome entier de micro-organisme tel qu'un virus, caractérisé par l'opération qui consiste à mettre cette culture de cellules en contact avec un vecteur, plus particulièrement un plasmide,contenant lui-même une séquence d'insertion formée d1au moins deux de ces ADN orientés dans la même direction de transcription et dans laquelle la queue de l'un est reliée à la tête de l'autre. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par l'utilisation de marqueurs assurant la détection aisée des cellules éventuellement transformées par le susdit vecteur. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules de la culture mise en oeuvre sont ou ont été rendues déficientes, à des fins de sélection, en un gène marqueur sélectionnable normalement nécessaire à leur croissance (déficience naturelle ou induite) lorsqu'elles sont placées dans certains milieux de culture déterminés, ces cellules étant nénamoins susceptibles de se développer à nouveau dans l'un au moins de ces mêmes milieux de culture, après introduction dans ces cellules d'un gène ou fragment d'ADN homologue, quoique d'origine étrangère (ADN de complémentation), tel qu'un gène de thymidine-kinase ou de déhydrofolate-réductase, susceptible de compenser ou "complémenter" ladite déficience, le procédé consistant alors, soit à tenter de réaliser ladite transformation avec le seul vecteur contenant la séquence d'ADN étudié, lorsqu'il contient également dans son propre ADN un tel "ADN de complé mentation", soit, lorsque tel n'est pas le cas, à produire la co-transformation (ou transformations simultanées) d'au moins certaines des cellules d'une telle culture au sein d'un tel milieu, d'une part par ledit vecteur, d'autre part, par un vecteur, de préférence un plasmide, préalablement modifié par l'insertion dans son génome d'un tel ADN de complémentation. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les susdits ADN orientés contenus dans ladite séquence d'insertion sont, du fait de certaines délétions, dépourvues de certaines parties. 5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les susdits ADN orientés répétitifs sont constitués d'unités de DNA HBV ou de fragments ou sous-fragments de tels DNA HBV. 6 - Procédé selon la revendication Il, caractérisé en ce que les sudits ADN orientés sont constitués par des fragments ou sous-fragments de DNA-HBV, la queue de lVun étant reliée à la tête de l'autre au niveau d'un site EcoRI. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite séquence d'insertion comporte, de part et d'autre du susdit site EcoRI, d'une part un sous-fragment de DNA HBV contenant la séquence de nucléotides du gène S qui est apte à coder le polypeptide responsable des propriétés immunologiques de l'antigène HBs et, d'autre part, un sous-fragment de DNA HBV suffisamment long pour qu'il soit susceptible d'inclure le promoteur du gène S. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que la culture de cellules dont la transformation est recherchée est une culture de cellules, notamment fibroblastes de souris. 9 - Vecteur, tel que plasmide, comprenant une séquence d'insertion formée d'au moins deux ADN choisis parmi des ADN normalement circulaires ou des génomes entiers de microorganismes, notamment de virus, orientés dans la même direction de transcription et dans laquelle la queue de l'un de ces ADN est reliée à la tête de l'autre. 10 - Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce que la séquence d'insertion est une séquence tandem. 11 - Vecteur selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisé en ce que les susdits ADN orientés de la séquence d'insertion peuvent être dépourvus de certaines parties délétées ne contenant, en ce qui concerne notamment le premier des susdits ADN orientés dans le sens de la transcription, ni le promoteur, ni l'origine de transcription. 12 - Vecteur selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisé en ce que la séquence d'insertion susdite est formée d'au moins deux unités répétitives de DNA HBV,.la tête de hune étant reliée à la queue de l'autre. 13 - Vecteur selon les revendications 10 et 11 consi dérées ensemblé, caractérisé en ce que la séquence d'insertion est constituée de fragments ou sous-fragments de DNA HBV, ladite fréquence d'insertion comprenant, de part et d'autre de ce site EcoRI, d'une part, un sous-fragment de DNA HBV contenant la séquence de nucléotide du gène S qui est apte à coder le polypeptide responsable des propriétés immunologiques de l'antigène HBs et, d'autre part, un sousfragment de DNA HBV suffisamment long pour qu'il soit susceptible d'inclure le promoteur du gène S. 14 - Vecteur selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que le vecteur dans lequel est insérée la susdite séquence d'insertion est dérivé du plasmide pBR322. 15 - Application du vecteur selon l'une quelconque des revendications 9 à 14 à la fabrication des produits d'excrétion susceptibles d'être codés par les ADN ou fragments d'ADN contenus dans la séquence d'insertion susdite, par transformation d'une culture de cellules, notamment eucaryotes, dont aura au préalable été déterminée la possibilité de transformation par un tel vecteur. 16 - Application selon la revendication 15 d'un vecteur conforme à l'une quelconque des revendications 12 à 14 à la production d'antigènes HBs par transformation de cellules de souris par un tel vecteur.