FR 2496123 A1 19820618 FR 8123261 A 19811214 La présente invention est relative à un nouveau procédé pour réaliser ltextraction de bouillons de fermentation non filtrés, principalement l'extraction de bouillons de fermentation non filtrés obtenus lors de l'application des souches Claviceps purpurea dans des conditions saprophytes.Les souches Claviceps purpurea cultivées dans des conditions saprophytes, produisent surtout des alcaloïdes peptidiques par ailleurs connus sous le nom d'alcaloï type ergotoxine, principalement l'ergocornine et son épimère, ltergocorninine, ainsi que l'a- et la B-ergocryptine et leurs épimères, les aet B-ergocryptinine, et de plus éventuellement, des alcaloïdes du type non-peptidique, tel que l'ergomAtrine et son épimère, l'ergométrinine. Parmi les alcaloïdes ainsi produits, l'ergométrine et son épimère sont solubles dans l'eau. Le Brevet hongrois nO 164 658 décrit la production d'alcaloides solubles dans l'eau, qui sont obtenus par extraction d'un bouillon de fermentation filtré, à un pH basique. Ce procédé ne résout pas le problème du traitement du mycélium filtré. Le Brevet britannique nO 1 158 380 est relatif à la préparation d'alcaloldes appartenant principalement au type ergotoxine. Ici, le bouillon de fermentation est filtré et le filtrat ainsi que le mycélium sont séparément extraits. Les alcaloïdes du type ergotoxine sont extraits du mycélium avec un mélange d'une solution aqueuse d'acide tartrique a 2 % et d'acétone, l'extrait est épaissi, puis les alcaloldes du type ergotoxine sont dissous dans du chloroforme à un pH basique, et ensuite ils sont purifiés par chromatographie. On obtient d'autres alcaloïdes du type ergotoxine, en traitant le bouillon de fermentation filtré avec du chloroforme. Le Brevet hongrois nO 171 659 se réfere, de meme, au traitement de bouillons de fermentation filtrés. Ici, les alcaloïdes du type ergotoxine sont dissous à un pH basique dans le mycélium séparé par filtration, avec de l'acétate d'éthyle ammoniacal. Comme la filtration d'importants volumes de bouillons de fermentation nécessite une capacité de filtration plutôt élevée et que la filtrabilité du bouillon de fermentation influence fortement la possibilité que l'on a d'obtenir les alcaloldes distincts, on essaie d'éliminer la filtration en élaborant les procédés plus récents. Dans les procédés n'impliquant pas de filtration, cependant, les alcaloïdes solubles dans l'eau et les alca bides du type ergotoxine, apparaissent ensemble dans 1'ex- trait et une certaine quantité de ces deux types d'alca bides reste aussi dans le mycélium ; il est donc nécessaire de procéder à des échanges de phase supplémentaires pour séparer les deux types dwalceloldes. Le procédé décrit dans le Brevet hongrois nO 164 116 repose sur une telle méthode traitant des bouillons de fermentation non filtrés. Conformément à ce procédé, on ajuste le pH du bouillon de fermentation non filtré à 7, puis on sature celui-ci de sulfate d'ammonium et on l'extrait avec de l'acétone. Le pH de l'extrait est ajusté a 3,5 , 11 extrait est partiellement évaporé, puis les alcaloïdes du type ergotoxine sont séparés du résidu par une extraction avec du chloroforme et purifiés par chromatographie. Le Brevet hongrois -publié nO RI-631 décrit partiellement une méthode qui repose également sur le traitement de bouillons de fermentation non filtrés. Le pH de ceux-ci est ajusté à 9-10, les alcaloldes peptidiques sont extraits avec de la méthylisobutylcétone, puis dissous dans de l'eau acide et encore à nouveau dans du chloroforme. On a maintenant constaté que les trois étapes utilisées pour obtenir les alcaloldes peptidiques, peuvent etre réduites à une seule étape d'extraction, si le bouillon de fermentation non filtré est extrait dans la gamme des pH acides, à un pH compris entre 4,0 et 5,5. Dans cette gamme de pH caractéristique, l1extrac- tion des alcaloïdes peptidiques se révèle encore sélective de façon satisfaisante. A savoir, bien que le pH soit plus élevé, par rapport à ce que l'on pratiquait dans le procédé antérieur (pH = 3,5, milieu acide tartrique), les alcaloïdes solubles dans l'eau restent dans la phase aqueuse. En même temps,il est surprenant de constater que dans cette gamme de pH choisie (4,0 à 5,5), l'efficacité de l'extraction des alca loi des peptidiques est plus favorable que dans les cas où les extractions sont réalisées a des valeurs basiques de pH. Pour expliquer ce fait, au cours de ses expériences détaillées, la Demanderesse a constaté qu'en rendant alcalin le bouillon de fermentation soit avant, soit pendant l'extraction, des substances organiques de haut poids moléculaire précipitent et sont capables d'adsorber une partie importante des alcaloides. Si l'extraction est réalisée dans la gamme de pH basique et que les alcaloïdes sont précipités par relarguage, la formation de ces précipités devient plus intense et à la fois la séparabilité et les rendements se détériorent. Comme il est essentiel que le pH puisse ne pas être élevé avant l'extraction, c'est la fermentation qui doit être terminée dans la gamme de pH recherchée de 4,0 à 5,5. I1 est aussi important d'observer que, pendant la procédure d'extraction des bouillons de fermentation contenant du mycélium, deux procédés de transport ont lieu. L'un concerne le transfert des alcaloïdes des cellules mycéliales au milieu aqueux, l'autre celui des alcaloïdes du milieu aqueux vers le milieu solvant. I1 en résulte que la durée de séjour découlant de la distribution des alca lourdes et du caractère de l'équipement d'extraction n'est pas suffisante, mais qu'il faut du temps supplémentaire pour achever également l'extraction des cellules mycéliales. Ainsi, c'est un fait surprenant et caractéristique que l'on n'avait pas réalisé jusqu'à maintenant, que le temps nécessaire à l'extraction est déterminé par l'efficacité de l'extraction cellulaire. En conséquence, pendant l'extraction, il faut assurer le temps nécessaire à cette extraction cellulaire. L'extraction peut être réalisée sous une quelconque forme opérationnelle. En appliquant un extracteur à fonctionnement intermittant, on répète le mélange avec un solvant 2 à 3 fois. De plus, le bouillon de fermentation non filtré peut être extrait, par exemple, dans un extracteur RDC ou dans un extracteur tournant à contre-courant (par exemple Podbielniak). Le fait de s'en tenir à un pH compris entre 4,0 et 5,5, se traduit par un avantage opérationnel en ce que la séparation des phases devient une tAche beaucoup plus simple, puisque la formation de précipité peut être évitée. Ainsi, l'invention concerne un procédé d'extraction de bouillons de fermentation non filtrés de Claviceps purpurea, à l'aide d'un solvant non miscible à l'eau ou ayant une miscibilité limitée avec l'eau, comprenant les étapes suivantes : on extrait ce bouillon ayant un pH final compris entre 4,0 et 5,5 avec un solvant peu ou pas miscible à l'eau, au pH du bouillon de fermentation fini en assurant le temps nécessaire à l'extraction des cellules mycéliales, puis on récupère le mélange alcaloïde contenant des alcaloïdes appartenant principalement au type ergotoxine et, éventuellement, après avoir ajusté le pH à une valeur comprise entre 7 et 9, on recueille les alcaloïdes de type ergot, qui sont principalement des produits solubles dans l'eau. Conformément au procédé de la présente invention, des bouillons de fermentation non filtrés produits par les souches de champignons Claviceps purpurea,servent de matières de départ. Comme souches de champignons, on peut utiliser des souches de Claviceps purpurea produisant principalement des alcaloïdes du type ergotoxine, surtout l'ergocornine et son épimère, l'a- et B-ergocryptine,ainsi que leurs épimères, et aussi éventuellement, des alcaloïdes de l'ergot solubles dans l'eau. On emploie de préférence les souches MNG 00022, MNG 00088 et MNG 00186 déposées à l'institut National de la Santé a BUDAPEST. La fermentation elle-mtme peut être réalisée selon une méthode connue en elle-même, par exemple, de la façon décrite dans le Brevet Hongrois n0 164 016 ; il faut cependant veiller à ce qu'à la fin de la fermentation, le pH du bouillon soit compris entre 4,0 et 5,5 et de préférence entre 4,7 et 5,2. Eventuellement, un additiL augmentant la pression osmotique du milieu de culture est fourni au bouillon de fermentation conformément à la méthode décrite dans le Brevet Hongrois 153 739.Des additifs accroissant la pression osmotique utilisables sont d'abord des sels minéraux ou organiques, tels que le chlorure, le sulfate, le carbonate, le phosphate, l'acé- tate, le succinate ou l'asparaginate de sodium, de potassium, de calcium et de magnésium ou bien des mono- ou disaccharides, par exemple : mannite, sorbite, glucose ou saccharose. Après la fermentation, le bouillon de fermentation non filtré est extrait dans un extracteur fonctionnant en continu ou en discontinu, avec une solution peu ou pas miscible à l'eau, sans qu'un changement préalable du pH du bouillon de fermentation soit effectué. Comme agent d'extraction, on peut utiliser surtout des cétones ali phasiques inférieures peu ou pas miscibles h l'eau, de préférence la méthylisobutylcétone ou des carboxylates aliphatiques inférieurs, de préférence l'acétate d'éthyle, ou des hydrocarbures chlorés, de préférence le chloroforme ou le dichloroéthane. En effectuant l'extraction, il faut veiller à assurer un contact convenable du bouillon de fermentation non filtré avec l'agent d'extraction pendant une période suffisante pour obtenir une extraction appropriée des cellules de champignon. L'extraction est réalisée de préférence sous agitation et avec utilisation d'un récipient de préagitation inséré avant l'extracteur, de telle sorte que l'agent d'extraction et le bouillon de fermentation non filtré restent ensemble pendant une période de temps appropriée. Avec une agitation convenable, on peut atteindre en 3 minutes une extraction correspondant à 95 % de la valeur maximale d'extraction des cellules de champignons. En général, les durées optimales d'extraction sont comprises entre 3 et 15 minutes, de préférence entre 3 et 8 minutes en fonction des conditions d'agitation. Les alcaloïdes du type ergotoxine peuvent être obtenus à partir de l'extrait par évaporation etfou précipita- tion avec de l'éther de pétrole. Le pH du bouillon de fermentation extrait est alors ajusté à une valeur comprise entre 7 et 9, puis les alcaloldes solubles dans l'eau sont récupérés d'une façon connue en elle-même, de préférence sous forme de sels d'acide maléique. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du compl6- ment de description qui va suivre qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. I1 doit titre bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 250 litres d'une culture noyée, obtenue par culture de la souche MNG 00088 de Claviceps purpurea selon la méthode décrite dans le Brevet Hongrois 164 816, sont extraits, à la différence près qu'un additif augmentant la pression osmotique du milieu de culture et ddcrit dans le Brevet Hongrois 153 739, est utilisé. La culture renferme 0,812 mg/ml d'alcaloïdes du type ergotoxine et 0,350 mg/ml d'ergométrine. L'extraction est effectuée au propre pH (4,8) du bouillon de fermentation original, avec 125 litres de méthylisobutylcétone, tandis qu'une agitation est assurée pendant 10 minutes. Ensuite, le bouillon de fermentation extrait et le mycélium, ainsi que le mélange contenant l'extrait, sont filtrés dans un filtre-centrifuge, puis les phases sont séparées. On ajoute encore 125 litres de méthylisobutylcétone à la phase aqueuse, puis on réajoute le mycélium et on agite à nouveau le mélange pendant 10 minutes. Après filtration, les phases sont séparées. La phase solvant est évaporée sous vide à un volume de 2 litres à une température ne dépassant pas 400C, puis le résidu d'évaporation est versé dans 20 litres d'éther de pétrole sous agitation intense. On laisse reposer le précipité séparé pendant 10 minutes, puis on le filtre, on le lave deux fois avec 0,1 1 d'éther de pétrole à chaque fois, puis on sèche sous vide à une température ne dépassant pas 400C. On recueille 279,5 g de produit. Le produit renferme 730 mg/g d'alcaloïdes de type ergotoxine et 20 mg/g d'ergométrine. Le pH du mélange de la phase aqueuse et du mycélium est alors ajusté à 8 avec une solution aqueuse concentrée d'hydroxyde d'ammonium, puis sous agitation, le mélange est extrait à deux reprises avec 125 1 de méthylisobutylcétone. A partir du mélange de réaction, on obtient les extraits contenant les alcaloïdes solubles dans l'eau à l'aide d'une filtration et d'une séparation des phases liquides. La phase organique combinée est évaporée sous vide à une température maximale de 400C, jusqu'à un volume de 5 1, puis sous agitation vigoureuse, une solution d'acide maléique dans la méthylisobutylcétone est ajoutée au résidu d'évaporation jusqu'à obtention d'un pH de 4. Le maléate d'ergométrine précipité est filtré, lavé avec 2 x 300 ml de méthylisobutylcétone, puis séché sous vide à une température maximale de 400C.Le produit obtenu pèse 116,4 g et renferme 683 mg/g d'ergométrine sous forme de maléate d'ergométrine. EXEMPLE 2 Après arrêt de la fermentation, 100 1 du bouillon de fermentation préparés avec la souche différente de Claviceps purpurea déposée sous le nO MNG 00186, conformément au procédé de fermentation qui est décrit dans le Brevet hongrois nO 164 816, sont introduits dans un extracteur-mélangeur, au propre pH du bouillon de fermentation, à raison de 40 1/h et en même temps, l'acétate d'éthyle est ajouté à raison de 30 l/h. Dans les 100 1 de bouillon de fermentation, l'ergocornine et son épimère sont présents à la concentration de 0,351 mg/ml, l'a-ergocryptine et son épimère à la concentration de 0,137 mg/ml, et la 6-ergo- cryptine et son épimère à la concentration de 0,152 mg/ml. Ensuite, le mélange agité est séparé avec un séparateur à chambre à vidange automatique, en une phase acétate d'éthyle et une phase aqueuse de mycélium. Cette opération est conduite de telle sorte que la durée de séjour du bouillon de fermentation dans l'extracteur est comprise entre 6 et 8 minutes. Après la séparation, dans l'extrait d'acétate d'éthyle, l'ergocornine et son épimère sont présents a la concentration de 0,427 mg/ml, l'u-ergocryptine et son épimère à la concentration de 0,172 mg/ml et la ss-ergocryptine et son épimère à la concentration de 0,187 mg/ml. EXEMPLE 3 10 m du bouillon de fermentation obtenus à partir d'une souche de Claviceps purpurea déposée sous le nO MNG 00022 , conformément au procédé décrit dans le Brevet hongrois nO 164 816, sont extraits à deux reprises, au propre 3 pH (4,5) du bouillon de fermentation non filtré. Les 10 m du bouillon de fermentation contiennent l'ergocornine et son épimère à une concentration de 0,423 mg/ml, l'a-ergocryptine et son épimère à la concentration de 0,381 mg/ml et la S-ergocryptine et son épimère à la concentration de 0,093 mg/ml.L'extraction est réalisée avec de l'acétate d'éthyle dans un extracteur du type Podbielniak D 36 tra vaillant à raison de 1500 tpm. On utilise 2 x 400 1 d'acétate 3 d'éthyle pour 1 m de bouillon de fermentation. Afin d'assurer une durée de séjour moyenne de 6 minutes, on utilise un récipient de prémélange, dans lequel on mélange le bouillon de fermentation non filtré avec 40 % en volume d'acétate d'éthyle et respectivement après démarrage de l'extraction, avec 40 % en volume d'extrait d'acétate d'éthyle. On fait fonctionner l'extracteur de telle façon que l'acétate d'éthyle forme la phase continue dans l'extracteur et que le bouillon de fermentation soit dispersé dans celle-ci.Il en résulte que, dans la partie active située à l'intérieur de l'extracteur, on utilise environ 1 litre d'acétate d'éthyle pour 0,1 à 0,15 litre de bouillon de fermentation. Les extraits d'acétate d'éthyle sont rassemblés et mis de coté pour un traitement ultérieur (ensuite : extrait obtenu à un pH acide). Le pH du bouillon de fermentation restant est alors ajusté a 8,5 avec une so- lution laqueuse concentree d'hydroxyde d'ammonium, puis celui-ci est extrait deux fois avec de l'acétate d'éthyle. Les extraits sont rassembles. L'extrait d'acétate d'éthyle obtenu a un pli acide est évaporé à un volume de 50 litres sous vide, à une température ne dépassant pas 400C, puis sous agitation vigoureuse, le résidu d'évaporation est versé dans 500 litres d'éther de pétrole. Le mélange alcaloïde précipité est filtré dans un filtre-centrifuge, lavé deux fois avec 15 litres d'éther de pétrole, puis séché sous vide à une température maximale de 40ex. Le produit obtenu pèse 12,19 kg et présente la composition suivante 302 mg/g d'ergocornine et son épimère, 270 mg/g d'a-ergocryptine et son épimère, et 68 mg/g de S-ergocryptine et son épimère. EXEMPLE 4 250 litres du bouillon de fermentation obtenu à partir de la souche Claviceps purpurea déposée sous le nO MNG 00088, conformément au procédé décrit dans le Brevet hongrois n0 164 816, sont extraits au propre pH du bouillon de fermentation non filtré (4,7), dans un extracteur du système RDC (colonne à plateau tournant) avec de l'acétate d'éthyle. Les 250 litres du bouillon de fermentation renferment 822 mg/ml d'alcaloïdes du type ergotoxine et 0,150 mg/ml d'ergométrine. Le diamètre intérieur de l'extracteur est de 150 mm, le nombre de tours du mélangeur est de 150 par minute, le nombre de cellules actives se monte à 50. Avant l'extracteur, un récipient de prémélange est placé, assurant une durée de séjour moyenne de 5 minutes et dans le- quel le bouillon de fermentation non filtré est mélangé a 40 % % en volume d'acétate d'éthyle et, après le début de l'extraction, avec 40 e en volume de l'extrait d'acétate d'éthyle.Au cours de l'extraction, le bouillon de fermentation prémélangé est introduit dans la première cellule supérieure (n 1) de l'extracteur continu a contre-courant RDC à la vitesse de 60 i/h, tandis qu'à la cellule infE- rieure n 50, de l'acétate éthyle est envoyé 8 raison de 48 l/h. Pour 100 litres de bouillon de fermentation, on utilise 80 litres d'acétate d'éthyle. Dans l'extracteur, l'acétate d'éthyle constitue la phase continue,et dans la partie active (mélangée) de lgestracteur, 0,1 a 0,25 litre de bouillon de fermentation est dispersé dans 1 litre d'acétate d'éthyle.Après une période d'indu:tion d'environ 90 minutes, la concentration en alcaloïdes de l'extrait sortant (la phase acétate d'éthyle quittant le système par la cellule supérieure) et celle du raffinat (le bouillon de fermentation extrait sortant par la cellule inférieure), deviennent constantes et l'on considère alors que le fonctionnement de l'extracteur est équilibré. Le récipient récepteur est alors échangé,et en faisant fonctionner l'extracteur pratiquement pendant la durée optimale, on peut recueillir des extraits et respectivement des raffinats ayant la composition à l'équilibre dans les récipients collecteurs. En rassemblant les extraits et les raffinats obtenus en introduisant exactement 100 litres de bouillon de fermentation, on recueille 63 litres d'extrait et 110,5 litres de raffinat. L'extrait comprenant principalement des alcaloldes du type ergotoxine, renferme 1,217 mg/ml d'alcalol- des du type ergotoxine et 0,011 mg/ml d'ergométrine. Le raffinat comprenant principalement l'ergométrine, renferme 0,0529 mg/ml d'alcaloïdes du type ergotoxine et 0,133 mg/. d'ergométrine. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits -de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 10- Procédé pour l'extraction de bouillons de fermentation non filtrés de Claviceps purpurea avec un solvant peu ou pas miscible à l'eau, caractérisé en ce qu'on extrait le bouillon ayant un pH final compris entre 4,0 et 5,5 avec un solvant peu ou pas miscible à l'eau, au pH du bouillon de fermentation fini en assurant la durée de contact nécessaire pour l'extraction des cellules mycélialus, puis l'on récupère le mélange alcaloïde contenant des alcaloldes principalement du type ergotoxine,et éventuellement,après avoir ajusté le pi à une valeur comprise entre 7 et 9, on récupère les alcaloïdes ergotiques principalement du type soluble dans l'eau. 20- procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise à titre d'agent d'extraction, une cétone aliphatique inférieure peu ou pas miscible a l'eau, ou bien un ester carboxylique ou un hydrocarbure chloré. 3 - Procédé selon la Revendication 1, caractéri- sé en ce que l'extraction est réalisée à un pH compris entre 4,7 et 5,2.