FR 2489098 A1 19820305 FR 8026494 A 19801212 Lait fermenté contenant des bactéries du genre Bifidobacterium et son procédé de préparation. La présente invention est relative a un lait fermenté contenant des bactéries du genre Bifidobacterium qu'on appellera ci-dessous bifidobactériesetunprocédé de préparation du lait fermenté. Les bifidobactériessont des microorganismes utiles qui s'installent et qui se développent a l'intérieur de l'intestin humain. En ce qui concerne leur importance physiologique, il a été reconnu que les bifidobactéries possèdent une aptitude à inhiber la croissance des micro-organismes pathogènes en raison d'une diminution de la valeur du pH intestinal provenant de la présence d'acide lactique, d'acide acétique, d'acide formique, etc., et possèdent également d'autres possibilités.Eu égard au fait que les propriétés physiologiques avantageuses des bifidobactéries sont universellement connues, une grande variété de produits contenant des cellules vivantes de bifidobactéries sont venus occuper une partie du marché des produits laitiers. Cependant, les bifidobactéries ont des propriétés bactériologiques différentes de celles des bactéries ordinaires utilisées dans l'industrie laitière produisant de l'acide lactique, qui ont été adoptées jusqu'ici pour la préparation de lait fermenté. A la différence de la culture des lactobactéries produisant de l'acide lactique, mise en oeuvre dans la préparation usuelle de lait fermenté, la culture des bifidobactéries est extrêmement difficile et le produit de culture obtenu amauvais gout pour les raisons suivantes (1) Les bifidobactéries présentent une auxotrophie compliquée et exigeante et atteignent une croissance très faible dans un milieu lacté qui ne contient pas de facteur de croissance tel qu'un extrait de levure. (2) Bien que les bifidobactéries se développent dans un milieu lacté contenant un facteur de croissance, le facteur de croissance est généralement onéreux et en outre, le produit de la culture a mauvais goût. (3) Tandis que les lactobactéries produisant de l'acide lactique appartiennent aux anaérobies facultatifs, les bifidobactéries appartiennent aux anaérobies obligatoires qui ne se développent pas en presence d'oxygène. Le lait fermenté contenant des bifidobactéries a donc été produit par des procédés tels que (A) la préparation d'un lait fermenté en utilisant des bactéries ordinaires de l'industrie laitière produisant de l'acide lactique, la collecte de cellules de bifidobactéries cultivées séparément et l'addition des cellules recueillies au lait fermenté, et (B) l'addition au lait de certains facteurs de croissance appropriés pour les bifidobactéries qui permettent la fermentation du lait contenant des bifidobactéries. Cependant, tous ces procédés présentent les inconvénients suivants (A) ils sont extrêmement onéreux, ils nécessitent du temps et du travail supplémentaires en raison de la culture séparée, et (B) ils sont incapables d'empêcher totalement la présence du mauvais goût dans les produits fermentés. Un essai de production de lait fermenté contenant des bifidobactéries, par une sinople opération ducornerce, se heurte à un problème contradictoire qui est dû à ce que la croissance des bifidobactéries est difficile à obtenir dans un milieu de lait pur et le lait fermenté obtenu dans un milieu de lait contenant certains facteurs de croissance a un goût trop mauvais pour être utilisé comme aliment. Les inventeurs ont effectué des études en vue de résoudre toutes ces difficultés. Ils ont mis au point la présente invention. La présente invention a pour objet un lait fermenté contenant des bifidobactéries et un procédé pour la production d'un lait fermenté contenant des bifidobactéries consistant à inoculer des bifidobactéries et des levures dans un milieu àbase de lait et à cultiver ces micro-organismes mélangés dans des conditions aérobies. La présente invention a également pour objet un lait fermenté contenant desbifidobactéries ayant une saveur et un goût agréables par procédé d'exécution facile, ce qui n'a été atteint par aucun des procédés usuels. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaltront à la lecture de la description qui va suivre. La présente invention vise un lait fermenté contenant des bifidobactéries ayant un goût agréable, préparé par un procédé qui consiste à inoculer des bifidobactéries et des levures dans un milieu à base de lait et à cultiver les micro-organismes mélangés dans des conditions aérobies. En conséquence, les effets suivants sont obtenus grâce àla pré sente invention. (1) Les bifidobactéries se développent abondamment dans le'milieu à base de lait dans lequel les bifidobactéries, lorsqu'elles sont utilisées seules, ont une croissance très faible. (2) La culture mélangée confere au lait fermenté contenant les bifidobactéries un arôme qui n'a jamais été obtenu par l'un des procédés usuels. (3) La culture des bifidobactéries peut être exécutée facilement dans des conditions aérobies dans un milieu à base de lait pur ne contenant pas de facteursde croissance généralement onéreux. (4) L'un quelconque des appareils utilisés jusqu'ici pour la préparation de laitfermenté avec des bactéries de l'industrie laitière produisant de l'acide lactique,peut être utilisé. Par conséquent, la présente invention vise un lait fermenté contenant des bifidobactéries ayant un goût agréable préparé par un procédé pouvant être mis en oeuvre facilement, ce qui n'a été atteint par aucun des procédés usuels. Les personnes qui ingèrent le lait fermenté contenant des bifidobactéries, peuvent attendre des effets physiologiques avantageux. Les espèces du genre Bifidobacterium pouvant être utilisées dans la présente invention comprennent toutes les espèces mises a la disposition du public ainsi que leurs résistants et mutants. Spécifiquement, Bi-fidobacterium bifidium, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum et leurs résistants et mutants sont avantageusement utilisés dans la présente invention. Les espèces de levures à utiliser ne sont pas non plus spécifiquement limitées. Par exemple, des espèces du genre Saccharomyces, du genre Candida, du genre Debaryomyces, du genre Hansenula, du genre Pichia, du genre Torulopsis et du genre Trichosporon, peuvent être utilisées. Des espèces particulièrement préférées sont celles qui sont capables de produire-une saveur agréable en cours de culture. Un exemple préféré de levure qui procure un effet remarquable dans la mise en oeuvre de l'invention est le genre Saccharomyces. En tant que milieu de culture pouvant être utilisé pour la culture mixte des bifidobactéries et des levures, on utilise le lait qui est généralement utilisé pour la culture des bactéries de l'industrie laitière produisant dé l'acide lactique. Dans ce milieu lacté, les bifidobactéries utilisées seules ne se développent pas totalement dans les conditions aérobies. Le fait qu'une croissance abondante des bifidobactéries puisse être obtenue dans ce milieu lacté caractérise la présente invention. Des exemples de formes sous lesquelles le lait peut être utilisé pour les besoins de l'invention, comprennent le lait entier, le lait écrémé, le lait concentré et le lait reconstitué pouvant provenir de lait en poudre ou de lait concentré. Bien que la concentration des solides du lait d'un tel lait utilisé dans la présente invention ne soit pas specifiquement limitée,il est généralement avantageux qu'elle soit comprise dans l'in tervalle allant de 3 à 30%. Au milieu lacté de la présente invention, on peut ajouter de manière appropriée divers additifs en des quantités suffisamment faibles pour éviter de nuire aux qualités inhérentes au lait utilisé en tant que milieu de culture. Les additifs pouvant être utilisés dans la présente invention sont ceux qui servent à améliorer la saveur, à conférer une couleur ou un goût, à enrichir la valeur nutritive, à améliorer la stabilité, etc.Naturellement, l'utilisation d'autres additifs qui n' ont aucune influencé sur la croissance ou sur toute autre proprieté des bifidobactéries, ne constitue pas une modification de la présente invention. Le terme "culture mixte" tel qu'utilisé dans la présente invention se réfère aux conditions de culture dans lesquelles la croissance des bifidobactéries dans le milieu lacté a lieu, tandis que les levures sont présentes dans ce milieu. La culture mixte par conséquent peut être accomplie en cultivant des bifidobactéries et des levures à l'état mélangé, le mélange de micro-organismes étant contenu au départ dans le milieu lacté, ou en cultivant séparément des bifidobacteries et des levures pures et en ajoutant chacune d'entre elles au milieu lacté dans des quantités prescrites, ou en ajoutant d'abord au milieu lacté l'une ou l'autre des bifidobactéries et des levures de départ pour amorcer la culture et, après qu'un temps approprié se soit écoulé, en ajoutant l'autre micro-organisme de départ au milieu lacté pour continuer la culture. - Une source stable de micro-organismes de départ dans la production en masse commerciale de lait fermenté peut être obtenue facilement en effectuant une culture de transfert des micro-organismes de départ à l'état mélangé. Chacune des bifidobactéries et des levures de départ est inoculez généralement en une quantité allant de 0,5 à 10% en volume sur la base du milieu de culture. Le nombre d'espèces de bifidobactéries et de levures à utiliser n'est pas limité à une seule espèce de chaque micro-organisme. I1 est permis d'utiliser de manière appropriée plusieurs espèces en combinaison. L'expression "conditions aérobies" telle qu'utilisée dans la présente invention se réfère à la culture dans l'atmosphère sans exécuter d'échange de gaz servant à expulser l'oxygène. Par exemple, les conditions de culture dans lesquelles est généralement effectuee la préparation des yaourts et d'autres boissons, produites par des bactéries produisant l'acide lactique uti).iséesdans l'industrie laitière, satisfont aux exigences. La température de culture est choisie de manière appropriée dans l'intervalle allant de 20 à 400C. Normalement, la culture est exécutée à une température voisine de 370C, qui convient au développement des bifidobactéries, et cette culture est continuée pendant une période appropriée dépendant de l'utilisation envisagée pour le lait fermenté produit. Dans le cas où l'on désire spécifiquement faire ressortir la saveur prenant naissance dans les levures, la culture peut être exécutée à une température comprise entre 20 et 300C convenant au développement de la saveur par les levures.Suivant une autre variante, la culture peut être exécutée d'abord à une température inférieure convenant aux levures, et poursuivie ensuite à une température supérieure convenant au développement des bifidobactéries, ou inversement, d'abord à une température plus élevée et ensuite à une température inférieure. I1 est possible d'utiliser le lait fermenté produit comme décrit ci-dessus en tant que produit de départ dans les cycles suivants de fermentation. Le lait fermenté obtenu par l'opération décrite cidessus peut etre utilisé soit directement tel quel, ou en y ajoutant des édulcorants, des jus de fruits et des agents aromatisants généralement acceptés pour les aliments, en tant que yaourt ou en tant que matière première pour la préparation de desserts, de gâteaux, de tablettes et de diverses autres compositions commestibles. Le lait fermenté peut naturellement être transformé en produits en poudre pour des usages similaires. La présente invention va maintenant être décrite plus spécifiquement ci-dessous à l'aide d'expériences et d' exempes. Dans toutes les expériences et dans tous les exemples indiqués ci-dessous, le nombre de cellules viables est indiqué sous forme de la valeur déterminée par millilitre du fluide de culture et l'acidité est exprimée par le nombre de-millilitres d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 0,lN nécessaire pour neutraliser 10 ml du fluide de culture. Expérience 1. La culture est exécutée de manière statique à 37"C dans des conditions aérobies pendant 24 heures,- en utilisant comme milieu de culture un lait écrémé reconstitué à 10% ayant subi un traitement à l'autoclave à 1210C pendant 15 minutes. Les bifidobactéries et les levures soumises séparément à une culture pure sont inoculées chacune dans le milieu à raison de 10%. Le fluide de culture obtenu en répétant deux fois la même inoculation à raison de 10% afin d'empêcher les effets possibles des milieux de culture pure utilisés, est employé comme produit de départ dans la culture principale.La culture principale est exécutée avec ce produit de départ ajouté à raison de 10% au milieu de culture. on prélève des échantillons dans le milieu de culture avant et après la culture, et on détermine les variations du nombre de cellules viables et de l'acidité. La variation du nombre de cellules viables est indiquée dans le tableau 1 et celle de l'acidité dans le tableau 2, respectivement. Tableau 1. Variation du nombre de cellules viables/ml de fluide de culture. emps incu a ion ('1.) Souches o 24 B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 812x106 612x106 B. breve, ATCC 157Q1 9,4x103 1)0x104 B. lonqum, ATCC 15707 5,4x1O3 610x103 B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 7,8x106 2 1x108 7 Saccharomyces cerevisiae, ATCC 2365 1J2X10 2/0x10 B. breve, ATCC 15701 710x105 4r6x107 Saccharomyces cerevisiae, ATCC 2365 1,7x105 7x106 5 B. longum, ATCC 15707 1;0x105 3 2x106 Saccharomycses rerevisiae, ATCO 2365 5 6x10 8, 6x106 Nota FERM : Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology. ATCC : American type Culture Collection. Tableau 2. Variation de l'acidité. (ml) Temps d' incubation Souches . , L ~ B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 I B. breve, ATCC 15701 I B. longum, ATCC 15707 118 1 8 B. longum, C-1762, FERM-P 5687 215 617 Saccharomyces cerevisiae, ATCC 2365 . . ~ B. breve, ATCC 15703 21 46 Saccharomyces cerevisiae, ATCC 2365 ) B. longym, , ATCC 15707 21 41 Saccharomyces cerevisiae, ATCC 2365 2 I1 ressort des tableaux 1 et 2 qu'on n'observe pratiquement aucune variation du nombre de cellules viables et de l'acidité lorsque les bifidobactéries sont cultivées seules. Par contre, il est net que dans la culture mixte de bifidobactéries et de levures, le nombre de cellules viables de bifidobactéries est notablement augmenté ainsi d'ailleurs que l'acidité par rapport à la culture pure. Dans tous les cas de cultures mixtes, une saveur adoucie est produite. Expérience 2 Dans un milieu de culture traité à l'autoclave à 1210C pendant 15 minutes, des suspensions de cellules lavées de diverses espèces de bifidobactéries et de levures cultivées séparément sont inoculées en tant que produits de départ, chacune à raison de 2%,et soumisesà une culture statique à 370 dans des conditions aérobies. Au cours de la culture, on prélève à intervalles déterminés des échantillons du fluide de culture et on détermine sur ces échantillons les variations du nombre de cellules viables et d'acidité au cours du temps. Dans certaines séries d'essais, on utilise en tant que milieu de culture du lait écrémé reconstitué à 10%. Dans les autres séries d'essais, on utilise du lait écrémé reconstitué à 10% auquel on a ajouté un extrait de levure recueilli par un procédé ordinaire à partir de la levure utilisée comme micro-organisme de départ, en une quantité correspondant à 107 cellules de levure par millilitre de milieu. La variation du nombre de cellules viables est indiquée dans le tableau 3, la variation d'acidité dans le tableau 4 et le test sensoriel de saveur du lait fermenté dans le tableau 5. Tableau 3. Variation du nombre de cellules viables/ml de fluide de culture Temps d'incubation (h.) Milieux de culture Souches 0 17 24 LE B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 1,0x107 2,9x107 2,1x107 " B. infantis, ATCC 15697 7,3x106 9,1x105 1,3x105 " B. longum, ATCC 15707 1,3x104 6,3x103 3,2x103 " B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 9,1x106 5,5x108 4,9x108 Hansenula anomala, IFO 0145 1,9x107 2,0x107 1,3x107 " B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 9,8x106 4,1x108 4,0x108 Picia farinosa, IFO 0193 8,3x105 2,0x106 4,5x106 " B. infantis, ATCC 15697 6,6x106 1,1x107 4,2x107 Saccharomyces cerevisiae, ATCC 2365 2,2x106 2,9x106 3,5x106 " B. lcnqum, ATCC 15707 1,3x104 8,9x105 1,3x108 Kluveromyces fracilis, IFO 0288 8,4x105 3,6x106 1,5x107 " B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 8,4x105 2,0x108 3,8x108 Schizosaccharomyces Pombe, ATCC 2476 1,6x104 2,2x104 5,4x104 " B. longum, ATCC 15707 3,0x103 5,9x105 2,8x107 Saccharomyces heterogenicus CW-27, 8,0x104 5,3x105 7,6x105 FERM-P 5686 LE additionné d'extrait de leuvre (Hansenula anomala, B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 1,1x107 2,9x107 3,1x107 IFO 0145) LE additioné d'extrait de levure (Picla farinosa, B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 1,2x107 3,3x107 3,3x107 IFO 0193) LE additionmé d'extrait de levurn (Saccharomyces cerevisiae, ATCC B. infantis, ATCC 15697 7,9x106 8,6x105 1,0x105 2365) Le additionné d'extrait de levure (kluyveromyces fraqilis, IPO B. longum, ATCC 15707 1,1x104 7,9x103 2,4x103 0288) Nota : LE : lait écrémé reconstitué à 10%. IFO : Institute for Ferment6ation, Osaka, Japon. Tableau 4. Variation d'acidité (ml) Temps d'incubation (h.) Milieus de culture Souches 0 17 24 LE B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 1,6 1,8 2,6 " B. infantis, ATCC 15697 1,9 1,9 1,9 " B. longum, ATCC 15707 1,7 1,7 1,7 " B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 1,6 2,5 3,3 Hansenula anomala, IFO 0145 " B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 1,6 2,4 3,3 Pichia farinosa, IFO 0193 " B. infantis, ATCC 15697 1,9 2,1 2,7 Saccharomylces cerevisiae, ATCC 2365 " B. longum, ATCC 15707 1,8 3,4 4,3 Kluyveromyces fragilie, IFO 0288 " B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 1,9 2,8 4,3 Schizosaccharomyces pombe, ATCC 2476 " B. longum, ATCC 15707 Saccharomyces heterogenicus CW-27, 1,9 2,0 2,5 FERM-P 5686 LE additionné d'extonit de levure (Hansenula anomala, B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 1,6 2,0 3,2 IFO 0145) LE additionné d'extrait de levure (Pichia farinosa, B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 1,6 1,8 2,6 IFO 0193) LE additionné d'extrait de levure (Saccharomyoes cerevisiae, ATCC B. infantis, ATCC 15697 1,9 1,9 1,9 2365) LE additionné d'extrait de levure (Kluy veromyces fragilis, IFO B. longum, ATCC 15707 1,7 1,7 1,7 0288) Nota : LE : lait écrémé reconstitué à 10%. Tableau 5. Test sensoriel de saveur du lait fermenté. Saveur de Evaluation Milieux de culture Souches fermentation totale LE B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 Odeur faihie de fermentation mauvaise pas d'arome " B. infantis, ATCC 15697 " " " B. longum, ATCC 15707 " " " B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 Saveur aromatique honne Sansenula anomala, IFO 0145 de fermentation " B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 " " Pichia farinosa, IFO 0193 " B. infantis, ATCC 15697 Sacharomyces cerevisiae, ATCC 2365 " " " B. longum, ATCC 15707 Kluyveromyces fragilis, IFO 0288 " " " B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 Schbizosaccharomyces pombe, ATCC 2476 " " " B. longum, ATCC 15707 Saccharomyces heterogenicus CW-27, FERM-P 5686 " " LE additionné d'extrait Faible odeur de de levure fermentation, (Hansenula anomala, B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 pas d'arôme mauvaise IFO 0145) LE additionné d'extrait de levure (Pichia farinosa, B. bifidum C-1762, FERM-P 5687 " " IFO 0193) LE additionné d'extrait de levure (Saccharomyuces cerevisiae, ATCC B. infantis, ATCC 15697 " " 2365) LE additioné d'extrait de levure (Kluyveromyces fragilis, IFO B. longum, ATCC 15707 " " 0288) Nota : LE : lait écrémé reconstitué à 10% (le test sensoriel est répété trois fois par 12 membres d'un groupe). I1 ressort clairement des tableaux 3, 4 et 5 que le nombre de cellules viables de bifidobactéries décroîtnette- ment ou augmente très légèrement avec le temps d'incubation et que l'acidité varie très faiblement ou augmente très légèrement lorsque les bifidobactéries sont cultivées seules. En ce qui concerne la saveur et le goût du lait fermenté, l'odeur de fermentation est faible et pratiquement aucun arôme n'est produit. Lorsque l'extrait recueilli à partir des levures de départ utilisées est ajouté au milieu de culture, la tendance à la variation du nombre de cellules viables de bifidobactéries et de l'acidité ainsi que de la saveur et du goût du lait fermenté est la même que lorsque le milieu ne contient pas d'extrait de levure. Lorsque les mêmes bifidobactéries et levures sont soumises à une culture mixte, le nombre de cellules viables de bifidobactéries augmente nettement et l'acidité également. Dans tous les échantillons de culture mixte, les produits de fermentation ont une saveur aromatique. Exemple 1 Un Erlenmeyer ayant un volume interne de 5 litres contenant 3 litres de lait écrémé reconstitué à 10% est obturé avec une feuille d'aluminium et placé dans un autoclave à 1210C pendant 15 minutes. Il est ensuite refroidi à 370C. En suivant le procédé de l'expérience 2, Bifîdobacterium bifidum C-'762 FERM-P 5687 et Saccharomyces cerevisiae, ATCC 2365, cultivés séparément, sont inoculés dans le milieu, puis soumis à une culture statique dans des conditions aérobies pendant 24 heures pour produire un lait fermenté contenant les deux souches de micro-organismes mentionnées ci-dessus.Dans le lait fermenté produit, le nombre de cellules viables de Bifidobacterium bifidium est 2,9 x 108 cellules/ml et le nombre de cellules viables de Saccharomyces cerevisiae est de 1,6 x 106 cellules/ ml, l'acidité est 7,1 ml. Le lait fermenté possède une saveur aromatique. Exemple 2 On exécute la culture mixte de la souche BifidDbacteriut 1onv3us, ATCC 15707 et de la souche de Kluyveromyces fragilis, IFO 0288 en suivant le mode opératoire de l'exemple 1 pour produire un lait fermenté. Dans le lait fermenté produit, le nombre de cellules viables de Bifidobacterium lonaum est 1,3 x 108 cellules/ml, le nombre de cellules viables de Kluyveromyces fragilis est 1,2 x 107 cellules/ml et l'acidité est de 4,4 ml. Le lait fermenté possède une saveur aromatique. Par lyophilisation de 1 litre de ce lait fermenté, on obtient environ 90 g de lait en poudre. REVENDICATIONS 1. Erocédé de préparation d'un lait fermenté contenant des bactéries du genre Bifidobacterium ou hifidobactéries, caractérisé par le fait qu'on inocule des bifidobactéries et des levures dans un milieu lacté et qu'on les soumet à une culture mixte dans des conditions aérobies. 2. Lait fermenté contenant des bifidobactéries obtenu par le procédé selon la revendication 1.