FR 2488695 A1 19820219 FR 8114926 A 19810731 PROCEDE ET TROUSSE DE MARQUAGE DE GLOBULES ROUGES AVEC DU TECHNETIUM-99m - La présente invention concerne un procédé de marquage de globules rouges avec du technétium-99m, consistant: (i) à mélanger un échantillon de sang avec un anti- coagulant, des ions stanneux et un tampon; (ii) à ajouter une solution saline à ce mélange; (iii) à centrifuger le mélange; (iv) à séparer le surnageant des globules rouges; et - (v) à mélanger du pertechnétate radioactif et un agent oxydant avec les globules rouges. La présente invention concerne également une trousse destinée à être utilisée pour le marquage des globules rouges avec du technétium-99m, comprenant un premier récep- tacle qui contient un anticoagulant, des ions stanneux, et un tampon, et un second réceptacle qui contient un agent oxydant. Les globules rouges ont déjà été marqués avec du technétium-99m et utilisés en médecine nucléaire pour les déterminations du volume des globules rouges, la localisa- tion du placenta, l'imagerie cardiaque et les études de circulation sanguine et, après dénaturation par la chaleur, pour l'imagerie de la rate. Des méthodes in vitro et les méthodes in vivo ont été décrites pour le'marquage de globules rouges avec du technétium-99m, et les deux types de méthodes font appel à des ionsstanneux pour la réduction de l'ion pertechnétate. Cette réduction apparaît nécessaire pour le marquage satis- faisant des globules rouges. Ainsi que cela a été signalé dans la bibliographie, la quantité d'ions stanneux utilisée dans ces méthodes est cruciale; voir, par exemple, le brevet des E.U.A. N 3.988.429 et J. Nucl. Med., 18: 305- 308. Le marquage in vivo des globules rouges fait appel à des injections intraveineuses d'ions stanneux, puis de technétium-99m sous la forme d'ions pertechnétate. Cette méthodologie s'est avérée commode et aboutit à un rendement de marquage de 90 % environ. Par "rendement de marquage", on entend le pourcentage de technétium-99m disponible qui est associé avec les globules rouges. Les globules rouges mar- qués in vivo ne peuvent, cependant, être utilisés pour les mesures du volume du sang et pour l'imagerie de la rate. Divers procédés de marquage in vitro des globules rouges avec du technétium-99m ont été révélés dans la biblio- graphie; voir, par exemple, J. Nucl. Med. Tech., 5: 32-34. Les méthodes décrites utilisent un récipient stérile et- dépourvu de substances pyrogènes, par exemple un sac en matière plastique, un tube de prélèvement mis sous vide partiel, ou une seringue. Le brevet des E.U.A. N0 3.988.429 et J. Nucl. Med., 17: 126-132 décrivent une trousse relativement simple pour le marquage in vitro des globules rouges. La trousse décri- te est commercialisée par la firme Brookhaven National Laboratories. Comme décrit dans le brevet mentionné en dernier lieu, la quantité de technétium-99m utilisée pour le marquage est limitée. C'est un objectif. de la présente invention de procurer un procédé de marquage des globules rouges avec du techné- tium-99m, et,de préférence, avec de hauts niveaux d'activité-_ du technétium-99m. C'est un autre objectif de la présente invention de - procurer un procédé de marquage des globules rouges qui puisse faire appel à un excès d'ions stanneux comme agent réducteur, ce qui facilite la fabrication. Les composants fondamentaux de la trousse selon l'invention sont un premier réceptacle à réactifscontenant un anticoagulant, des ions stanneux et un tampon,et un second réceptacle séparé contenant un agent oxydant. Il est préférable que le réceptacle à réactifs soit du type qui peut être mis sous vide partiel et être utilisé (en combinaison avec une aiguille hypodermique) pour préle- ver un échantillon de sang d'un patient. Un tel réceptacle supprime la nécessité de manipulations inutiles de l'échan- tillon de sang et des réactifs. Il est également préférable que les réactifs contenus dans le réceptacle à réactifs soient lyophilisés. L'anticoagulant particulier utilisé n'est pas crucial. La quantité utilisée dépendra du volume de sang à échantil- *, *c, lonner. L'héparine est l'anticoagulant préféré et on peut, éventuellement, l'utiliser sous la forme d'un sel d'héparine (l'héparine sodique par exemple). On utilise le tampon pour stabiliser les ions stanneux dans la solution vis-à-vis de l'oxydation. On choisit les tampons sur la base de leur aptitude à protéger la forme particulière d'ions stanneux utilisée. Le citrate de sodium s'est révélé particulièrement efficace lorsque les ions stanneux sont présents sous la forme de fluorure stanneux. Le volume de tampon sera déterminé par la quantité d'ions stanneux présents dans chaque trousse. Les ions stanneux peuvent être présents sous la forme de fluorure stanneux, de pyrophosphate stanneux, de citrate stanneux, de chlorure stanneux, de tartrate stanneux, ou d'un sel similaire. Ainsi que cela sera décrit plus en détail ci-après, il a été constaté que l'on pouvait obtenir un grand rendement de marquage des globules rouges avec le technétium-99m en utilisant un excès d'ions stanneux. L'emploi de grandes quantités d'ions stanneux est, bien entendu, tout à fait souhaitable car, sans cela, un bon rendement de mar- quage ne peut être obtenu avec de fortes concentrations de technétium-99m. Un excès d'ions stanneux se traduit égale- ment par une durée de conservation prolongée de la trousse. Les ions stanneux doivent être présents en quantité au moins égale à 0,5 pg par ml environ de sang à échantillonner. De préférence, les ions stanneux seront présents dans une quan- tité égale à au moins 1,0 pg paf ml environ de sang à échan- tillonner. Le second composant de la trousse est un réceptacle contenant un agent oxydant. C'est cet agent oxydant qui permet l'emploi d'un excès d'ions stanneux sans compromettre le rendement de marquage lorsque les globules rouges sontûar- qués avec du technétium-99m. Bien que le mécanisme ne soit pas tout à fait élucidé, on pense que les globules rouges absor- bent une quantité fixe d'ions stanneux et, à mesure que la quantité d'ions stanneux contenue dans la trousse augmente, une plus grande quantité d'ions stanneux reste à l'extérieur des globules rouges. Le marquage avec du technétium-99m (sous la forme d'ions pertechnétate) se fait parce que les ions pertechnétate peuvent franchir la membrane des globules rouges, être réduits à l'intérieur des globules et s'y fixer. Cependant, si les ions pertechnétate sont réduits à l'extérieur des globules rouges (par un excès d'ions stanneux), ils ne peuvent franchir la membrane des globules rouges, et la fixation ne peut avoir lieu. Par conséquent, - l'agent oxydant est nécessaire pour empêcher les ions stan- neux qui ne sont pas associés à des globules rouges (c'est- à-dire qui ne se trouvent pas à l'intérieur des globules rouges) de réduire les ions pertechnétate. Des exemples d'agents oxydants que l'on peut utiliser dans la présente invention sont l'hypochlorite de sodium, le peroxyde d'hydrogène, l'iodate de potassium et les oxydants similai- res; l'hypochlorite de sodium a la préférence. Dans une forme de réalisation préférée de l'invention, on ajoute un antioxygène à la formule d'anticoagulant d'ions stanneux et de tampon pour accroître la durée de conservation de la trousse. Font partie des nombreux anti- oxygène qui peuvent être utilisés dans la présente inven- tion l'acide-ascorbique, le sulfite de sodium, le thio- sulfate de sodium et les anti-oxygène similaires. L'acide ascorbique a la préférence. La quantité d'acide ascorbique utilisée représentera, de préférence, de cinq à dix fois le poids des ions stanneux contenus dans la trousse. La trousse selon l'invention peut comprendre faculta- tivement un récipient de solution saline. Comme décrit ci- après, on utilise une solution saline dans le procédé selon l'invention. Cependant, son incorporation à la trousse selon l'invention est facultative car de nombreux utilisa- teurs de la trousse disposent d'une solution saline dans leurs propres laboratoires. Le procédé selon l'invention consiste à mélanger d'abord un échantillon de sang avec une formule comprenant un anticoagulant, des ions stanneux et un tampon. Il est préférable que l'échantillonnage de sang et le mélange se fassent avec un même réceptacle. Comme décrit ci-dessus, on peut facilement réaliser cela en fournissant la formule dans un réceptacle mis sous vide partiel qui, une fois relié à une aiguille hypodermique, peut être utilisé pour obtenir l'échantillon de sang nécessaire. On ajoute la solution saline au mélange,-et on secoue et centrifuge le mélange pour rassembler les globules rouges. La solution saline dilue le plasma et réduit ainsi la quantité de plasma emprisonnée dans la fraction cellu- laire. Après centrifugation, on sépare le surnageant des globules rouges,. On peut faire cela en retirant soit le surnageant, soit les globules rouges du réceptacle. Il est préférable de retirer et de jeter le surnageant, et de pour- suivre le procédé dans le même réceptacle. Le marquage des globules rouges se fait en mélangeant des ions pertechnétate radioactifs (99MTcO4) et l'agent oxydant avec les globules rouges. Les ions pertechnétate radioactifs peuvent être facilement obtenus sous la forme d'une solution saline de pertechnétate de sodium radioactif par élution de générateurs commerciaux avec une solution saline; voir, par exemple, le brevet des E.U.A. N03.920.995. On peut mélanger d'abord l'agent oxydant et les ions pertechnétate, puis mélanger le tout avec les globules rouges, ou bien on peut les mélanger tous les deux séparément avec les globules rouges, peu important celui des deux agents qui est ajouté le premier. On va maintenant décrire une forme de réalisation pré- férée du procédé selon l'invention: (i) Aspirer le sang du patient dans un tube mis sous vide partiel qui contient une formule lyophilisée comprenant de l'héparine s6dique, du fluorure stanneux, du citrate de sodium et de l'acide ascorbique, et mélanger doucement le contenu. (ii) Ajouter une solution saline au tube (et aspirer le même volume d'air pour empêcher une élévation de pression dans le tube) et faire tourner trois.ou quatre fois le tube. (iii) Centrifuger le tube. (iv) Retirer le surnageant et le jeter. (v) Ajouter au réceptacle la quantité de technétium- 99m ayant l'activité nécessaire (sous la forme de Na +TcO-) en solution saline, puis ajouter de l'hypochlorite de sodium à la solution. On agite doucement le réceptacle pendant cinq f488695 minutes. Tous les composants de la trousse selon l'invention doivent être stériles. En outre, le procédé selon l'inven- tion doit être mis en oeuvre en utilisant des techniques aseptiques. L'exemple suivant constitue une forme de réalisation spécifique de l'invention. Exemple Préparation de la trousse On prépare une première solution en dissolvant 5 mg de fluorure stanneux dans 1,0 ml d'acide chlorhydrique concentré, et on prépare une seconde solution en dissolvant 2,24 g de citratetrisodique (Na3c6H5O7.2H20) dans 25 ml d'eau purgée à l'azote. On ajoute goutte à goutte-la pre- mière solution à la seconde, et on ajoute 25 mg d'acide ascorbique à la solution résultante. On ajuste le pH de la solution à 6,0 à l'aide de soude 1N, et on ajuste le volume de la solution à 100 ml. avec de l'eau. A cette solution, on ajoute 100 ml d'héparine sodique (de concentration 1000 U/ml) préparée en dissolvant de l'héparine sodique dans une solu- tion saline normale. On ajoute la solution préparée ci-dessus à des récep- tacles [par exemple, un "Vacutainer" (marque déposée) de Becton-Dickinson] dans une quantité de 0,2 ml, et on lyophi- lise à siccité. Chaque réceptacle contient 3,8 pg d'ions stanneux. On bouche les réceptacles au niveau-de vide appro- prié pour aspirer 6,0 ml de sang du patient. Pour chaque réceptacle, il est fourni un second réceptacle qui contient 1,0 ml d'une solution d'hypochlorite de sodium (0,025 %) dans une solution saline normale. Marquage des globules rouges On aspire directement du sang (6,0 ml) de chiens dans des réceptacles préparés comme décrit ci-dessus, et on mélange doucement le contenu de chaque réceptacle. On ajoute aseptiquement à chaque réceptacle du chlorure de sodium pour injection (2, 0 ml), et on aspire le même volume d'air. On fait tourner doucement les réceptacles, puis on centrifuge - pendant 5 minutes à 2.000 tours/minute. On retire le surnageant et on le jette. On marque ensuite les globules rouges contenus dans chaque réceptacle en utilisant 2,0 ml d'une solution de marquage contenant 1,0 mCi de technétium- 99m, et on ajoute à chacun la totalité du contenu du second réceptacle qui contient l'hypochlorite de sodium. Un mélange pendant 5 minutes complète la procédure de marquage. REVENDICATIONS 1. Procédé de marquage de globules rouges avec du technétium-99m, consistant: (a) à mélanger un échantillon de sang avec un anti- coagulant, des ions stanneux et un tampon; (b) à ajouter une solution saline au mélange; (c) à centrifuger le mélange; (d) à séparer le surnageant des globules rouges; et (e) à mélanger un pertechnétate radioactif et un agent oxydant avec les globules rouges. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'anticoagulant est l'héparine ou un sel d'héparine. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la source d'ions stanneux est le fluorure stanneux ou le pyrophosphate stanneux. 4. Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caracté- risé en ce que le tampon est le citrate de sodium. 5. Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'agent oxydant est l'hypochlorite de sodium. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, consistant: (a) à aspirer le sang d'un patient dans un tube mis sous vide partiel qui contient une formule lyophilisée comprenant un anticoagulant, des ions stanneux et un tampon; (b) à ajouter une solution saline au tube; (c) à centrifuger le tube; (d) à retirer le surnageant du tube; et (e) à ajouter au tube des ions pertechnétate radio- actifs et un agent oxydant. 7. Trousse destinée à être utilisée pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend un premier réceptacle qui contient un anticoagulant, des ions stanneux et un tampon, et un second réceptacle qui contient un agent oxydant. 8. Trousse selon la revendication 7, caractérisée en ce que la formule contenue dans le premier réceptacle comprend un anti-oxygène. 9. Trousse selon la revendication 7 ou 8, caractéri- sée en ce que le premier réceptacle est mis sous vide partiel et peut être utilisé en combinaison avec une aiguille hypodermique pour prélever un échantillon de sang d'un patient. 10. Trousse selon la revendication 7, 8 ou 9, carac- térisée en ce que la formule contenue dans le premier récep- tacle est lyophilisée. 11. Trousse selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisée en ce que le premier réceptacle con- tient de l'héparine ou un sel d'héparine, du fluorure stanneux et du citrate de sodium, et le second réceptacle contient de l'hypochlorite de sodium. 12. Trousse selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, un troisième réceptacle qui contient une solution saline.