FR 2494297 A1 19820521 FR 8024437 A 19801118 La présente invention concerne des cellules ou des microorganismes comportant une mutation localisée dans un locus régulateur de l'expression des gènes de la fixation de l'azote (gènes nif) qui permet l'expres- sion de ces gènes en présence d'ions ammonium indépendamment du contrôle exercé par la glutamine synthétase (expression dite "constitutive"). L'information génétique pour la fixation de l'azote atmosphérique ne se trouve que chez les organismes procaryotes (bactéries et cyanophycées). Cependant, cette information conditionne tout le reste de la vie sur la terre puisque les autres organismes vivants (plantes, animaux) ont un besoin absolu d'azote combiné. Dans la présente description, le terme "azote" sera utilisé pour désigner l'azote gazeux, en particulier l'azote atmosphérique, par opposition a azote combiné" ou "azote fixe", c'est-a-dire l'azote élément en combinaison chimique avec d'autres éléments comme dans les sels d'ammonium ou les nitrates par exemple. Une caractéristique absolument générale de tous les organismes fixateurs d'azote étudiés jusqu'd présent est qu'ils n'expriment cette propriété que dans un environnement dépourvu d'azote combiné, en particulier dépourvu de sel d'ammonium ou de nitrate. Dans le cas le mieux connu, celui de Klebsiella pneumoniae, les gènes responsables de la fixation de l'azote, localisés près de l'opéron histidine, sont au nombre de 15 organisés en 7 unités de transcription localisées dans l'ordre : nifJ, nifHDK, nifEN, nifUSVM, nifF, nifLA, nifBQ. Dans la souche sauvage, l'activité de fixation de l'azote n'est pas exprimée dans un milieu contenant des ions ammonium. Ce mécanisme de contrôle met en jeu deux facteurs, d'une part la glutamine synthétase (GS) ou le produit d'un autre gêne impliqué dans la régulation de la GS, d'autre part, le produit du gène nifA. Quand les bactéries sont cultivées en absence d'azote fixe, la GS (ou une protéine impliquée dans la régulation de la GS) permet la transcription du gêne nifA dont le produit, à son tour, active la transcription des autres gènes nif. Quand les bactéries sont cultivées en présence d'azote combiné, l'activation de la transcription du gène nifA ne se fait pas, de sorte qu'aucun autre gène nif n'est exprimé. Compte tenu du besoin des plantes en azote et de leur incapacité a fixer l'azote atmosphérique, le développement de l'agriculture intensive n'a pu se faire et ne peut se maintenir que par l'apport massif d'engrais azotés de synthèse (azote combiné) qui sont absolument indispensables à la culture des plantes non naturellement symbiotiques, c'est-à-dire autres que les légumineuses. Or, les organismes, en particulier bactéries, associés à la rhizosphère, tel qu'Azotobacter par exemple, ou symbiotiques des plantes, telles que Rhizobium, qui sont des organismes génétiquement capables de fixer l'azote, n'expriment pas totalement cette propriété et utilisent préférentiellement l'ammoniaque ou les nitrates du sol compte tenu d'un mécanisme de contrôle vraisemblablement analogue à celui décrit précédemment. L'obtention de bactéries fixatrices d'azote dépourvues de ce système de contrôle a donc un intéret double puisque, non seulement de telles bactéries n'utilisent pas l'azote combiné du sol, mais qu'en plus elles en produisent. D'autre part, en ce qui concerne la question du transfert et de l'expression des gènes nif dans des organismes non naturellement fixateurs, procaryotes ou eucaryotes, le contrôle par la GS limite l'expression de ces gènes puisque les propriétés de la GS varient d'un organisme à l'autre. I1 en résulte que l'obtention de gènes nif dont l'expression serait indépendante de la GS representerait une contribution majeure à cette question dont les retombées appliquées peuvent également être importantes. La présente invention constitue une première approche de la solution de ce problème en décrivant une mutation nif de Klebsiella Dneumoniae qui permet une expression constitutive des gènes nif chez K. pneumoniae et chez E. coli. La présente invention concerne une cellule ou un microorganisme, comportant l'ensemble des gènes nif et un opéron nifLA présentant une mutation qui confère, à cette cellule ou à ce microorganisme, le phénotype NifC. Par "cellule" on entend désigner indifféremment une cellule eucaryote ou procaryote et par "microorganisme" notamment les bactéries et les levures. On entend désigner par "phénotype Nif" (c'est-a-dire constitutif) la propriété pour une cellule ou un microorganisme de fixer l'azote enprésence d'ions ammonium, indépendamment du contrôle par la GS. Les gènes nif mentionnés dans la présente description sont identifiés selon la nomenclature standard rappelée précédemment pour Klebsiella pneumoniae. L'opéron nifLA présentant une mutation conférant le phénotype NifC peut constituer l'unité de transcription LA de "l'ensemble des gènes nif" ou bien être porté par un plasmide ou un chromosome complémenté respectivement par un chromosome ou plasmide portant les gènes nif de complémentation. Dans ce cas, il est possible que les gènes nif de complémentation portent une unité de transcription nifLA du type sauvage car la mutation de l'opéron nifLA est transdominante sur l'allèle sauvage comme cela sera noté plus loin pour la mutation nif 8388. De préférence, la mutation de l'opéron nifLA est située dans le locus L. L'ensemble des gènes nif peut d'ailleurs comporter d'autres mutations ou insertions dans la mesure ot celles-ci n'empêchent pas l'expression du phénotype Nife. Parmi les cellules et microorganismes utilisables, il faut citer plus particulièrement les bactéries telles que Klebsiella pneumoniae et, notamment, celles présentant le caractère recA, c'est-à-dire déficientes pour la recombinaison, dans lesquelles le phénotype NifC ne tend pas à la ségrégation. Parmi les plasmides portant l'opéron nifLA présentant une mutation, on peut citer les plasmides comportant au moins une partie de l'ADN du plasmide pCEl. La présente invention concerne également un procédé de préparation de telles cellules ou microorganismes, en particulier de bactéries, dans lequel on introduit, dans une cellule ou un microorganisme ne présentant pas le phénotype Nifc mais éventuellement une partie des gènes nif, un plasmide portant la totalité des gènes nif ou au moins les gènes nif complémentaires et portant un operon nifLA présentant une mutation conférant à ladite cellule ou audit microorganisme le phénotype Nif . Dans ce cas, la mutation dans l'opéron nifLA peut être obtenue à partir de mutants Nif d'insertion dans ce locus de 1'ADN du bactériophage Mu, bien que la présence de 1'ADN dudit bactériophage ne soit pas absolument nécessaire à l'expression de la mutation, comme cela sera démontré dans les exemples. Il est également possible de transduire une souche ne présentant pas le phénotype Nifc par un lysat de bactériophage (tel que le bactériophage P1) d'une souche portant un opéron nifLA présentant une mutation et de sélectionner les mutants transduits présentant le phénotype Nife. Le phénotype Nif c peut être déterminé par le procédé qui sera décrit dans les exemples. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront dans les exemples de réalisation qui sont donnés ci-après à titre illustratif. Exemple 1 On a préparé une série de 121 plasmides dérivant du plasmide pCE1 par insertion du bactériophage Mu dans différents locus des gènes nif comme cela est décrit dans l'article de Merrick M. et col., J. Gen. Microbiol., 117, 509-520 (1979). Ces différents plasmides sont introduits dans la souche de Klebsiella pneumoniae UNF107 présentant une delétion totale des gènes nif décrite par Dixon et col., Molec. gen. Genet., 157, 189-198 (1977). Après culture en milieu complexe (LB) (Luria 9 10 Broth), 10-10 cellules de chacune des-souches Nif obtenues ont été étalées sur milieu nutritif solide dépourvu d'azote (milieu NFM - Cannon F.C. et col. J. gen. Microbiol., 80, 227-239 (1974). Des mutants réverses spontanés Nif+ apparaissent après 5 jours d'incubation en jarre anaérobie à 300C, les différentes souches sont testes pour déterminer leur phénotype. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau I ci-après. TABLEAU I Gènes nif portant Nombre de mutants Nombre de mutuants Fréquence de phénotype l'insertion Mu testés réverses ayant le Nifc parmi les mutants phénotype Nif+ Nif+ (%) (*) J 17 3 0 H 13 1 0 D 9 0 K 14 3 0 E 10 5 0 N 3 0 U 7 1 0 S 14 3 0 V 1 0 M 8 3 0 F 5 1 0 LA 17 8 > 90 B 3 0 (*) Le caractère Nifc a été déterminé par étude de l'activité de la nitrogénase selon la méthode décrite par Elmerich C. et col., Molec. gen. Genet., 165, 181-189 (1978), en utilisant un milieu exempt d'azote (NFM) auquel est ajouté 20 mM NH4Cl dans un flacon de 10 ml. On constate que seuls les mutants de la région nifLA présentent le phénotype Nifc. Sur 17 mutants de la région nifLA étudiés, 8 ont donné naissance a des réverses Nif+ a une fréquence d'environ 10 . Les 8 mutants reverses portaient tous une insertion dans le locus nifL et la grande majorité de ces réverses avaient un phénotype Nif C. Dans tous les réverses Nifc étudiés, le phénotype NifC a été trouvé associé à la présence d'un plasmide résident dérivant de pCEl. Un de ces plasmides, pPC852, obtenu à partir d'une souche dans laquelle avait été introduit le plasmide pPC552 (nifL8552: Mucts62) (décrit par Merrick et col. ci-dessus) a été particulièrement étudié. Exemple 2 Le plasmide pPC852 a été transféré dans Escherichia coli JC5466 (T.rp,His,RecA)décrit par Cannon et col., J. gen. Microbiol., 93,111-123 (1976), puis retransféré dans Klebsiella pneumoniae UNF107. La souche UNF107 (pPC852) est instable, une culture de cette souche contient,après 30 générations dans un milieu LB, 20 % de ségrégants Nif . Par contre, aucune ségrégation n'apparat dans la souche Escherichia coli JC5466 (pPC852) qui est recA. Cette souche est déposée à la CNCM sous le n0 I-139 depuis le 13 novembre 1980. Afin de démontrer l'activité des mutants selon l'invention, l'activité spécifique de la nitrogénase a été testée - pour la souche d'origine et les mutants de UNF107 comportant le plasmide pCE1, le plasmide pPC852 et le plasmide pPC552 ; - pour la souche d'origine et les mutants de Klebsilla pneumoniae KP5060 (glnA), Streicher et coll., 1974,J.Bact. 120,p.815-821, comportant les plasmides PCEl, pPC522 et pPC852. Une culture de 12 heures dans un milieu complet (LB) à 300C est inoculée une D0575=0,05 dans un flacon sous argon contenant un milieu sans azote (NFM) dans lequel est ajouté ou non de l'ammoniaque. Dans le cas de KP5060, 500 ug/ml de glutamine sont également ajoutés. Après incubation à 300C, la réduction de l'acétylène est mesurée sur les cellules entières lorsque la DÔ est d'environ 1. 575 Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau II ci-après TABLEAU II Souche UNF107 KP5060 UNFiO7 KP5060 Activité nitrogénase:n.moles méthylène/ min/mg pro t. NII4 (mM) NH4+ (mM) > o 20 200 0 20 200 Plasmide - ND ND pCE1 106 pPC552 ND ND pPC852 60 20 12 13 7 10 Ces résultats démontrent pour la souche UNF107 que le plasmide pPC852 lui confère le phénotype Nif+ comme le plasmide pCE1 dont il provient, mais que le plasmide pPC852 permet l'expression de l'activité de la nitrogénase en présence d'ions NH4+ jusqu'à 0,2M à la différence de la souche portant pCE1 qui est entièrement réprimée à 0,02M d'ions NH4 Les résultats observés pour les mutants de KP5060 confirment que la mutation Nifc dans pPC852 rend l'activité de la nitrogénase indépendante de la GS puisque la souche KP5060 (glnA) comportant le plasmide pPC852 fixe l'azote en présence d'ions ammonium jusqu'à 0,2M alors que cette souche ne fixe pas l'azote, même en l'absence de NH4 lorsqu'elle contient le plasmide pCEl. Exemple 3 Afin d'isoler la mutation responsable du phénotype Nifs, on effectue la transduction de la souche de Klebsiella pneumoniae UNF5023 (His - Nif+), décrite dans l'article de Dixon (Molec. Gen. Genet., 1977, 157, 189-198) par un lysat de bactériophage P1 d'Escherichia coli PC91 (pPC852). La souche PC91 a été déposée à la CNCM sous le n" I-138 le 13 novembre 1980. Il s'agit d'une souche de E. coli K12 dont le génotype est A(his gnd) # (lac pro)thi nal. Parmi les recombinants His , 6 % présentent le phénotype Nifs. L'une de ces souches, PC88, a été étudiée plus particulièrement. Dans la souche PC88 la mutation Nifc est sur le chromosome et le phénotype Nifc est plus stable que dans UNF107 (pPC852). Après 30 générations dans un milieu LB, 95 % des clones PC88 sont encore Nifc. Un essai d'hybridation selon la méthode de Southern E.M., J; Mol. Biol., 98, 503-517 (1975) entre 1'ADN de PC88 et un échantillon d'ADN de Mu radioactif a été entièrement négatif, ce qui tend à démontrer l'absence d'ADN du bactériophage Mu dans PC88. On prépare des mutants Nif à partir de la souche PC88 par mutagénèse à l'éthylméthane sulfonate. Parmi ces mutants Nif on étudie les souches : - PC883 comportant une mutation dans le locus J, - PC831 comportant une mutation dans le locus H, - PC893 comportant une mutation dans le locus M, toutes sur le chromosome. Les souches diploïdes correspondantes obtenues en introduisant le plasmide pCE1 présentent une activité de la nitrogénase, même en présence d'ions NH4 . On démontre ainsi que la mutation est transdominante sur l'allèle de la souche sauvage portée par ledit plasmide. La mutation chromosomique portée par PC88, co-transductible avec la mutation hisD2 et exprimant le phénotype Nifc de façon transdominante indépendamment de la présence de Mu, est appelée nif-8388. Exemple 4 Afin d'obtenir un plasmide portant la mutation + nif-8388, on transduit pour le phénotype His la souche PC91 (pCE2) avec un lysat de P1 préparé sur PC88. Le plasmide pCE2, dérivé de pCE1, porte la mutation hisD2. La souche PC91 (pCE2) est donc de phénotype His Cette souche est déposée dans la CNCM sous le n0 I-140 depuis le 13 novembre 1980. Parmi les transductants His+, un certain nombre sont Nifc. On a montré par conjugaison avec différentes souches que les phénotypes His+ et ifc étaient associés au plasmide dérivé de pCE2. Un plasmide appelé pPC868, portant la mutation nif-8388 a été étudié. Ce plasmide exprime le phénotype Nif c dans la souche de K. pneumoniae UNF107 et dans la souche de E. coli JC5466. Ce plasmide présente deux avantages - comme pCE1 il est transférable à toutes les bactéries gram (-).Cette propriété permet d'envisager l'expression du phénotype Nif+ (nif) dans les organismes où pCEl ne s'exprime pas; - d'autre part, il constitue une source d'ADN en vue de cloner un fragment d'ADN contenant l'ensemble des gènes nif qui portent la mutation NifC dans des vecteurs qui se préteraient mieux à un transfert dans les organismes procaryotes ou eucaryotes. Le schéma de construction de PC91 pPC868) selon le procédé des exemples 2 à 4 est représenté ci-après : SCHEMA DE CONSTRUCTION PC91 (pPC868) JC5466 j5466 (pPC852 | NifC transfert de pPC852 par conjugaison dans PC91 Ir PC91 (pPC852) lyse par P1 et transduction de la souche UNF5023 pour le caractère His 6% de NifC parmi les His+ dont PC88 qui porte la mutation chromosomique nif(c)8388 sans Mu Il lyse par P1 et transduction de la + souche PC91 (pCE2) pour le caractère His PC91 (pPC868) clonage in vitro a partir de pPC868 PC91 = I-138 JC5466(pPC852)= I-139 PC91 (pCE2 = I-140 REVENDICATIONS 1) Cellule ou microorganisme comportant l'ensemble des gènes nif et un opéron nifLA présentant une mutation qui confère à cette cellule ou à ce microorganisme le phénotype Nifs. 2) Cellule ou microorganisme selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mutation est localisée dans le locus nifL. 3) Cellule ou microorganisme selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'opéron nifLA présentant une mutation est porté par un plasmide. 4) Cellule ou microorganisme selon la revendication 3, caractérisé en ce que le plasmide est constitué par au moins une partie de 1'ADN du plasmide pCEl. 5) Cellule ou microorganisme selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'opéron nifLA présentant une mutation est porté par un chromosome. 6) Cellule ou microorganisme selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le microorganisme est une bactérie. 7) Cellule ou microorganisme selon la revendication 6, caractérisé en ce que la bactérie présente le caractère recA. 8) Cellule ou microorganisme selon l'une des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que la bactérie est une souche de Klebsiella Dneumoniae. 9) Procédé de préparation d'une cellule ou d'un microorganisme. selon l'une des revendications 1 à 4 et 6 a 8, caractérisé en ce que l'on introduit dans une cellule ou un microorganisme ne présentant pas le phénotype NifC un plasmide comportant au moins les gènes nif complémentaires des gènes nif portés par la cellule ou le microorganisme et comportant un opéron nifLA présentantune mutation conférant à ladite cellule ou audit microorganisme le phénotype Nifc. 10) Procédé de préparation d'une cellule ou d'un microorganisme selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que l'on transduit une souche ne présentant pas le phénotype Nifc par un lysat de bactériophage d'une souche portant un opéron nifLA présentant une mutation et on sélectionne les mutants transduits présentant le phénotype Nifc. 11) Vecteur destiné à être mis en oeuvre dans le procédé de la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un fragment d'ADNcorrespondant à l'opéron nifLA présentant une mutation, ledit plasmide conférant le phénotype NifC lorsqu'il est introduit dans une bactérie Nif+.