FR 2490221 A1 19820319 FR 8117405 A 19810915 La présente invention concerne un nouveau dérivé de la leucylalanylarginine, un procédé pour sa production et un procédé de mesure de l'activité d'enzymes utilisant ce composé comme substrat. Jusqu'à présent, on connaissait de nombreux procédé pour la mesure de l'activité des enzymes. L'un d'entre eux consiste à mettre en contact un ester alkylique d'un acide aminé en temps que substrat avec une enzyme et à déterminer l'activité de l'enzyme à partir du degré d'hydrolyse de l'ester alkylique. On citera comme exemple de ces procédés, le procédé bien connu de Hestrin. Il s'agit d'un procédé qui consiste à mettre en contact une enzyme avec un ester alkylique d'un acide aminé, à convertir le groupe ester restant au bout d'une période de temps donnée avec de l'hydroxylamine en un acide hydroxamique, à le laisser réagir avec du chlorure ferrique jusqu'à ce qu'il apparaisse une couleur, et à mesurer la couleur en temps d'absorbance, puis à déterminer l'aptitude de l'enzyme à hydrolyser l'ester, c'est-à-dire, l'activité de l'enzyme à partir de l'absorbance. En outre, il existe un procédé dans lequel on utilise un paranitronilide d'un acide aminé comme substrat et dans lequel on utilise l'aptitude à hydrolyser celui-ci comme indice, etc.... Dans ces procédés, une très grande quantité d'enzymes est nécessaire, et lorsque la concentration en enzymes est faible, ou lorsque celle-ci présente une faible activité, il est difficile de mesurer l'activité de l'enzyme. La demanderesse a poursuivi des études approfondies sur des composés satisfaisants les trois conditions suivantes: ils présentent une affinité vis- à-vis d'une enzyme, la détermination de leur quantité est aisée, et la sensibilité de détection des composés est satisfaisante. En conséquence, la demanderesse a découvert des composés utilisables comme substrats qui présentent d'excellentes propriétés en ce qui concerne les conditions mentionnées ci-dessus, par comparaison aux composés classiques, ainsi qu'un procédé simple pour mesurer l'activité des enzymes en utilisant ces composés. La présente invention a pour objet de four- nir un nouveau dérivé d'acide aminé utilisable comme substrat d'excellente qualité pour une enzyme. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de production de ce nouveau dérivé d'acide aminé. L'invention a également pour but de fournir un procédé pour mesurer l'activité d'une enzyme en utilisant ce nouveau dérivé d'acide aminé comme substrat pour l'enzyme. D'autres buts et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description ci-après: L'invention concerne un dérivé de la leucylalanylarginine répondant à la formule: - NH H3C3 CH 2 j NH-R3 CH2 3 (0H 2)3 (C) Ri-NH CO-NH C-NH COOR4 dans laquelle R1 est l'hydrogèneou un groupe de protec- tion des radicaux amino; R2 et R3 sont l'hydrogène ou des groupes de protection des radicaux guanidino; et R4 est un naphtyle. L'invention fournit en outre un procédé pour la production d'un dérivé de la leucylalanylargi- nine répondant à la formule (I)^ qui consiste à soumettre à une déshydratation-condensation un composé (II) répondant à la formule: H C CH3 3 013 CH2 CH3 CHS -C'.i3 (II) R1 INH_ CO-NH C00H0 dans laquelle R1, représente un groupe de protection des radicaux amino, et un dérivé d'arginine (III) répondant à la formule: NH NH11-R3, (CH02)3 2)-.{(III) H2N C00R4 dans laquelle R2, et R3, sont des groupes de protection des radicaux guaàidino et R4 représente-un naphtyle, par un procédé classique, ce qui donne un composé (IV) répondant à la formule: NH H3c CH3 R2'-f-iNHR 2 1 NH-R 3, Cf2' CH3 (1CH2)3 (IV) ER X CNH CO-NH CO-Nil COR4| dans laquelle Ri,, R2,, R3,, et R4sont tels que défi- nis ci-dessus,puis si nécessaire, à éliminer le groupe de protection des radicaux amino- et/ou le groupe de protection des radicaux guanidino du composé (IV) par un procédé classique. L'invention concerne en outre un procédé pour mesurer l'activité d'une enzyme qui consiste à mettre en contact l'enzyme avec un dérivé de la leucylalanylar- ginine répondant à la formule (I) en temps que substrat. Le composé de départ- (II) utilisé dans la production du composé (I) de l'invention est disponible dans le commerce ou peut être préparé par condensation d'un composé (V) répondant à la formule: - 3 CH2 ,K (V) Rl,-HN COOH dans laquelle R1, est tel que défini ci-dessus, avec un composé répondant à la formule: - CH3 NH2 COOR5 (VI) dans laquelle R5 représente un alkyle, en un ester (VII) répondant à la formule: H3C. CH3 CH2 CH 3t 3.VII) R2,-N5 CO-NH COOR dans laquelle R1, et R5 sont tels que définis ci-dessus, puis en hydrolysant l'ester (VII). Les dérivés d'arginine de départ (III) peu- vent être l'ester l-naphtylique de la N6, N -dibenzylo- xycarbonyl-L-arginine et peuvent être préparés par naphtylation d'un dérivé d'arginine (III') contenant un groupe protecteur approprié à la formule _N__/NH 2' | NH-R3 (CH)3 2 (III') R6-NH COOH dans laquelle R2, et R3, sont tels que définis ci-dessus, et R6 représente un groupe de protection des radicaux amino différent des groupes R2, et R3,, ce qui donne un composé (III") répondant à la formule: NH NR2 (III") * 3 R6-NH.1 COOR4 dans laquelle R2',, R31, 44 et R6 sont tels que définis ci-dessus, puis en n'éliminant sélectrivement que le groupe de protection des radicaux amino se trouvant sur la position a du composé (III"). Dans les formules (I), (II), (III), (III'), (III"), (IV), (V) et (VII), le groupe de protection des radicaux aminos peut être un groupe protecteur couram- ment utilisé dans la synthèse d'une peptide, telle qu'un radical tbutyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, acétyle, benzyole, tosyle, etc o.., parmi lesquels on préfère l'acétyle et le benzoyle et le groupe de protec- tion des radicaux guanidino peut être un radical nitro, tosyle, benzyloxycarbonyle, etc...., ou bien le groupe guanidino peut donner un sel d'addition aux acides par addition des protons, le composé préféré étant le benzyloxycarbonyle. 4902 1 Pour produire le composé (IV} on dissout le composé (II) et le dérivé d'arginine {III) dans un solvant approprié, et on ajoute à la solution obtenue un agent d'activation couramment utilisé tel que le dicyclohexylcarbodiimide (DCC) 1le diphenylphoshorylazide (DPPA), un chlorocarbonate d'alkyle, etc.oo. puis, si nécessaire, on y ajoute une base telle que la triéthylaminine, etc... et on agite le mélange contenu, ce qui donne le composé (IV). Comne solvant, on peut utiliser des solvants classiques tels que le chloro- Lorme, dichlorométhanev le diméthl7 forimamide, le tétrahydrofurane, etc o... pour autant que les produits de départ puissent y être dissous. La température réactionnelle peut être comprise entre 0 et 40 C. Une fois la réaction achevée, on peut isoler le composé (IV) du mélange réactionnel par un traitement classique. Plus precisément, lorsqu'on utilise du DCC comime agent d'activation, on filtre la dicyclohexylurée (DCUI) précipitée et on ajoute au filtrat un solvant d'extraction approprié tel que l'acétate dléthyle, puis on lave l'extrait avec une solution aqueuse d'acide citrique, une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium et une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, on le sèche sur du sulfate de magnésium anhydride puis on l'évapore sous pression réduite pour éliminer le solvant, ce qui donne le composé (IV)o Le groupe de protection des radicaux amino et/ou le groupe de protection des radicaux guanidino du composé (IV) est élimine par un procédé classique. Plus précisément, lorsque le groupe de protection des radicaux aminos et que:les.grwupes.de Protection des radicaux guanidinos sont un radical benzyloxycarbonyle, on dissout le composé (IV) dans un solvant approprié et on ajoute à la solution obtenue un catalyseur tel que du palladium sur carbone, etc...,o pour éliminer par réduction le ou les groupes protecteurs, ou bien on ajoute le composé (IV) à une solution d'acide bromhydrique dans de l'acide acétique et on filtre le bromhydrate du composé cherché précipité, ce qui donne le composé (I). Le composé (I) de l'invention est utilisable comme substrat d'excellente qualité pour diverses enzymes telles que la trypsine, la plasmine, la kalli- kréine, l'urokinase, la Cl-estérase, la thrombine, etc.... Plus précisément, lorsque le composé (I) de l'invention est mis en contact avec une enzyme, le composé joue le rôle d'un substrat et du naphtol est libéré par hydrolyse par l'enzyme au bout d'un temps donné, puis on mesure la quantité de naphtol pour déterminer l'activité de l'enzyme. Le fait que l'acti- vité d'une enzyme puisse être mesurée aisément est d'une grande importance pour les analyses quantitatives d'une préparation enzymatique, pour les diagnostics par mesure du bilan enzymatique dans le sang, pour les diagnostics par mesure de la concentration enzymatique du sang ou de l'urine, etc Lorsque l'on mesure l'activité d'une enzyme selon le procédé de l'invention, on met en contact avec une quantité donnée du composé (I) de l'invention et une solution tampon appriopriée, et au bout d'un temps donné à une température donnée, on mesure la quantité de naphtol libérée, pour ainsi déterminer l'activité de l'enzyme. La solution tampon peut être une solution appropriée ayant le pH optimal vis-à-vis de l'enzyme. La réaction peut s'effectuer dans des conditions constantesappropriées, en ce qui concerne la température et la durée, bien qu'il soit préférable de mesurer la quantité de naphtol libérée à une tempé- rature de 250 to 370C au bout de 30 minutes. La mesure de la quantité de naphtol peut s'effectuer par l'un quelconque des procédés connus, comme par exemple une méthode physicobhimique telle que la chromatographie en phase gazeuse, la chromato- graphie sur couches minces, etc...; ou par un procédé chimique tel que la réaction avec le chlorure ferrique, la réaction de copulation diazoique, la méthode du sel Fast Violet B (FVB), etc..., bien que l'on préfère une méthode qui consiste à ajouter du FBV au mélange réaction- nel pour faire apparaître une couleur et à mesurer l'absorbance au moyen d'un photomètre compte tenu de sa simplicité et de sa sensibilité de détection. Lorsque l'on mesure l'activité de la thrombine en utilisant l'ester l-naphtylique de la benzoyl-L- leucylalanyl-L-arginine en tant que substrat selon le procédé de l'invention, la sensibilité de celui-ci est environ 50 fois supérieure à celle de l'ester méthylique de la Nu-tosyl-L-arginine ou de l'ester éthylique de la beznoyl-arginine qui sont utilisés dans la méthode d'Hestrin. La quantité de naphtol mesurée par le procédé de l'invention correspond à l'activité ou à la quantité de l'enzyme. Selon le procédé de l'invention, il est pos- sible de déceler facilement une variation de la concen- tration enzymatique dans le sang ou dans l'urine résultant de diverses maladies. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. Les des- sins annexés représentent des courbes étalons de la concentration en thrombine, les ordonnées représentant l'absorbance et les abscisses représentant la quantité (unité internationale) de thrombine, étant entendu que les numéros entre parenthèses désignent la quantité de thrombine dans le cas de l'esther méthylique de la N-a-tosylarginine. La courbe A représente l'esther naphtylique de la leucylalanylarginine, la courbe B l'ester naphtylique de la benzoylleucylalanylarginine et la courbe C, l'ester méthylique de la Na-tosylarginine. Exemple 1 Production du p-toluènesulfonate de l'ester l-naphtylique de la L-leucyl-L-alanyl-arginine. Dans 15 ml de N,N-diméthylformamide {DMF), on dissout 1,Olg de benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L- alanine et 2,05g de trifluoracétate de l'ester 1-naphytilique de la N,N dibenzyloxycarbonyl-arginine, puis on ajoute à la solution en refroidissant par de la glace 742 mg de DCC, 446 mg de l-hydroxybenzotria- zole (HOBt) et 0,41 ml de triéthylamine (TEA). On agite le mélange obtenu à la même température pendant trois heures, puis à la température ambiante pendant 24 heures. Une fois, la réaction ahevée, on filtre le DCU ainsi précipité et on ajoute au filtrat de l'acétate d'éhtyle.-on lave le mélange obtenu avec une solution d'acide citrique à 10 %, une solution de bicarbonate de sodium saturée et une solution de chlorure de sodium saturée, dans cet ordre, on le sèche sur du sulfate de magnésium anhydre, puis on l'évapore sous pression réduite pour éliminer le solvant. On fait absorber le résidu ainsi obtenu sur une colonne de gel de silice et on le purifie avec du chloroforme contenant 0,3 % en poids de méthanol. On recristallise le résidu purifié dans du chloroforme-étherdiéthylique, ce qui donne 1,2 g (rendant: 4,5 %) d'ester l-naphtylique de benzyloxycarbonyle-L-leucyl -L-alanyl -N 6,Nw-di- benzyloxycarbonyle-L-arginine sous forme d'une poudre blanche, Pf: 179-183 C. IR v KBrcm-1: 3 400, 3 250, 1 740, 1 715, 1 640. max NMR t ppm (CDCl3 + DMSO-d6): 0,9 (6H, d, CH3y CH3), 1,3 (3H, d, 1 3), 1,7 (6H, b, -CH2-), -CH- 2,0 (3H, b,)CH2, >CH-), 4,2 (3H, b,-NHCHCO- x 3), 5,1 (4H, s, -O-CH2 protons aromatiques). 249022O Dans 10 ml de DMF, on dissout 886 mg de l'ester décrit ci-dessus et on ajoute à la solution mg de palladimn sur carbone à 5 % (Pd-C, et 571 mg d'acide p-toluènesiulfonique monohydrateo On agite le mélange obtenu pendant 2 heures thout en y faisant barboter de l'hydrogène gazeiuz, puis on élimine le Pd-C par filtrageo On ajoute le filtrat de l'éther diéthylique anhydre et on recueille la poudre blanche ainsi précipitée, ce qui donne 690 mg (rendant: 83 %) de p-toluènesulfonate de l'ester 1lnaphtylique de la L-leucyl L-alanyl -L-arginine, Pf 71 C (décomp.) IRv KBrcm-' 3 400, 1 750, 1 650 max NMR 6 ppm (DMSO-d6) 0,9 (6H, b _.), 1 e3 (3H, d, i5 CH3-CH-), 1,3-2,3 (7H, b, -CH -CH-) 3,2 (2H, b, -CH2-NH-), 4,0-4,8 (3H, b, NHCIiCO- x 3), 7,2-8,2 (17H, m protons aromatiques). Exemple 2 Production du p-toluènesulfonate de liester 1-naphtylique de la benzoyle-L-leucyl -L-alanyl -L- arginine. Dans 15 ml de DMF, on dissout 920 mg de benzoyle-L-leucyl -L-alanyl- et 2,05 g de trifluora- cétate de l'ester l-naphtylique de la N,N -dibenzyl- oxycarbonyle-L-arginine, puis on ajoute à la solution obtenue avec refroidissement par de la glace 446 mg de HOBt et 0,42 ml de TEA. On agite le mélange obtenu à la même température pendant 3 heures, puis à la température ambiante pendant 24 heures. On filtre le DCU ainsi précipité et on ajoute au filtrat de l'acétate d'éthyle, puis on lave le mëlange obtenu avec de l'acide citrique à 10 % en poids, une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium et une solu- tion aqueuse saturée de chlorure de sodium, dans cet ordre, puis on le sèche sur du sulfate de magnésium anhydre. On élimine le solvant par évaporation. On recristallise 3 fois le résidu dans du chloroforme- éther diéthylique, ce qui donne 1,8 g (rendant: 70,0 %) d'ester l-naphtylique de la benzoyle-L-leucyl -N6,N - dibenzyloxycarbonyle-L-arginine sous forme d'une poudre blanche, Pf: 178-187 C. IR vKBr cm1: 3 380, 3 270, 1 740, 1 718, 1 630 max NMR eppm (CDC13): 0,9 (6H, d), 1,3 (3H,d), 1,5-2,2 (7H, m), 4,0 (2H, m), 4,2-5,0 (3H, m), ,1 (2H, s), 5,2 (2H, s), 7,0-8,0 (protons aro- matiques). Dans 15 ml de DMF, on dissout 1,28 g de l'ester mentionné ci-dessus, puis on ajoute 200 mg de Pd-C à 10 % et 342 mg d'acide p-toluènesulfonique monohydrate. On agite le mélange obtenu avec refroi- dissement par de la glace pendant 3 heures tout en y faisant barboter de l'hydrogène. On filtre le mélange réactionnel pour éliminer le Pd-C et on ajoute au filtrat de l'éther diéthylique anhydre. On recueille la poudre blanche précipitée, ce qui donne 1,0 g (rendant: 88 %) de ptoluènesulfonate de l'ester l-naphtylique de la benzoyle-L-leucyl -L-alanyl.- L- arginine, Pf: 86 C (décomp.). IR vKBrcm-1: 3 400, 1 750, 1 635. max CH NMR 6 ppm (DMSO-d6): 0,9 (6H, b, C H2 -), 3 1,3 (3H, d), 1,5-2,3 (7H, b, -CH2 x 3, -CH-), 2,3 (3H, s, CH3 - (17H, b, protons aromatiques). Exemple 3 Mesure de l'activité de la thrombine.en utilisant comme substrat l'éther l-naphtylique de la benzoyle-L-leucyl -L-alanyl -L-arginine. A 1,7 ml d'une solution tampon de phosphate mM (pH: 7,0), on ajoute 0,1 ml de thrombine à diverses concentrations et 0,2 ml d'une solution d'ester l-napthylique de benzoyle-L-leucyl -L-alanyl - L-arginine (1 mM) dissoute dans une solution aqueuse à 10 % de sulfoxyde de diméthyle et on soumet le mélange obtenu à une incubation à 25 C pendant 30 minutes. On ajoute ensuite au mélange 20 microlitres d'une solution aqueuse à 8 % en poids de laurysulfate de sodium et on refroidit le mélange avec de la glace puis on y ajoute 0,2 ml de FVB à 1 %. On laisse reposer le mélange obtenu à 0 C pendant 10 minutes et on y ajoute 2 ml d'acide acétique glacial. On mesure l'absorbance de la couleur azoique qui s'est formée (505 nm) au moyen d'un spectrophotomètre, pour déter- miner la quantité de naphtol libérée par hydrolyse par l'enzyme. A titre de témoin, on remplace le mélange de solution tampon et de thrombine par la mûme solu- tion tampon que ci-dessus mais sans thrombine. La quantité de naphtol libérée correspond à l'activité de l'enzyme. Les résultats de la mesure de l'absorbance pour chaque concentration de thrombine selon le procédé ci-dessus sont représentés dans les dessins annexés (courbe B). La mesure de l'activité de la thrombine en utilisant l'ester l-naphtylique de la L-leucyl- L-alanyl -L-arginine a été effectuée par un procédé identique à celui décrit pour l'ester l-naphtylique de la benzoyle-L-leucyl -L-alanyl -Larginine (courbe A). Exemple comparatif 1 Mesure de l'activité de la thrombine en utilisant l'ester méthylique de la Na-tosyl-L-arginine comme substrat. - A 0,1 ml de thrombine, on ajoute 0,3 ml d'une solution de l'ester méthylique de la Na-tosyl-L- arginine (10 micromoles/O,4 ml de DMSO à 5 %) et 0,6 ml d'une solution tampon de phosphate 20 mM (pH: 7,4), et on soumet le mélange obtenu à une incubation à 37 C pendant 30 minutes, puis on y ajoute 1,5 ml d'une solution d'hydroxylamine (mélange de quantités égales de ch.lorhydrate de NH2OH 2M .2 et de NaOH 3,5 M). On laisse reposer le mélange obtenu à la température ambiante pendant 15 minutes. On y ajoute 1 ml d'une solution d'acide trichloracétique à 18 % en poids, 1 ml d'acide chlorhydrique 4 N et 1 ml d'une solution de chlorure ferrique à 10 % en poids. On agite énergiquement le mélange obtenu puis on le soumet à une centrifugation à 3 000 tours/ minutes pendant 30 minutes. On mesure l'absorbance de la couleur du produit surnageant qui s'est ainsi développé (à 530 nm) au moyen d'un spectrophotomètre. La valeur obtenue correspond à la quantité du substrat restant non hydrolysé par la thrombine, et par consé- quent, l'activité de l'enzyme correspond à la dif- férence entre la valeur obtenue en l'absence d'enzyme (témoin) et la valeur obtenue après réaction avec l'enzyme (courbe C). REVENDICATIONS 1. Dériyvé de la leucylalanylarginiine répon- dant à la formule C NH. H3 C2 H3 l 3-2 ER R -Nn f-$ COIsHL CON COOR4 dans laquelle R1 représente l'hydrogène ou un groupe de protection des radicaux amino i R2 et R3 repré- sentent l'hydrogène ou des groupes protecteurs des radicaux guanidino; et RA représente un naphtyle. 2. Dérivé de la leucylalanylarginine selon la revendication 1, caractérise en ce que R1 est l'hydrogène. 3. Dérivé de la leucy!alanylarginine selon la revendication 1, caractérisé en ce que R1 est l'acétyle, le benzoyle ou le benzyloxycarbonyle. 4. Dérivé de la leucylalanylarginine selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que R2 et R3 sont des benzyloxycarbonyleso 5. Ester 1-naphtylique de la L-leucylalanyl- L-arginine. 6. Ester 1-naphtylique de la benzoyl-L- leucylalanyl-L-arginineo 7. Procédé pour la production d'un dérivé de la leucylalanylarginine répondant à la formule NH H C- CH R -N 3 3 C CH) N-R (I) CH2 3 R,-NH CONH CONH COOR 4 1L 249022à dans laquelle R, représente l'hydrogène ou un groupe protecteur des radicaux amino; R2 et R3 représentent l'hydrogène ou des groupes protecteurs des radicaux guanidino; et R4 représente un naphtyle, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre à une déshydratationcondensation, un composé (II) répondant à la formule H3C H3 CC3 H3 3I) 2 R11-NH w CONH 0 COOH dans laquelle R1, représente un groupe protecteur des radicaux amino, et un dérivé d'arginine (III) ré- pondanit à la formule NH R2 -N_ B2T (C=H2) 3 (III) H2N COOR4 dans laquelle R2, et R3, représentent des groupes protecteurs des radicaux guanidino et R4 représente un naphtyle, par un procédé classique, ce qui donne un composé (IV) répondant à la formule: NH- H3C CH3 R2,-N N- NH-R 3 CH j NH-R3 CH2 3 (CH2)3 (IV) R1 i-NH CONH - CONH COOR dans laquelle Ri,, R2,, R3, et R4 sont tels que définis ci-dessus, et en éliminant facultativement le groupe protecteur des radicaux amino et/ou les groupes protecteurs des radicaux guanidino du compose (IV) par un procédé classique. 8. Procédé selon la revendication 7, carac- térisé en ce que la réaction de déshydratation-conden- sation s'effectue à une température de O à 40 C dans un solvant. 9. Procédé de mesure de l'activité d'une enzyme, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact l'enzyme avec un dérivé de la leucylalanyl- arginine répondant à la formule:N H3 CH3 R2 1 - Cil2 CH (C) CH2 3 iR -NiCONH CONH COOR4. dans laquelle R1 représente l'hydrogène ou un groupe protecteur des radicaux aminos; R2 et R3 représentent l'hydrogène ou des groupes protecteurs des radicaux guanidinos et R4 représente un naphtyle, en tant que substrat. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'enzyme est mise en contact avec ledérivé de la leucylalanylarginine (I) pendant un temps donné, puis en ce que l'on mesure la quantité de naphtol libérée par hydrolyse par l'enzyme. 11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'enzyme est la thrombine.