FR 2464942 A1 19810320 FR 8019545 A 19800910 Polypeptide, procédé pour son isolement, et ses utilisations thérapeutiques. La présente invention se rapporte à un nouveau polypeptide purifié, à l'état libre ou à l'état de seS physiologiquement acceptable > ;à un procédé pour l'isoler et le purifier et à ses utilisations thérapeutiques, notamment en tant qu'agent spasmolytique. Le polypeptide purifié selon l'invention, qu'on peut isoler à partir du pancréas de porc, s'est avéré contre toute attente posséder des effets de relaxation des muscles lisses ou des effets spasmolytiques. On lui a par conséquent donné un nom commun polypeptide pancréatique spasmolytique, en abroge ci-après pour des raisons de simplicité et de oermnité PPS.Le PPSpossed"ed'intéressantes propriétés pharmacologiques. Les agents spasmolytiques ou antispasmodiques comme l'atropine, les médicaments apparentés et les médica ment s de synthèse possédant des effets analogues à ceux de l'atropine, sont très souvent utilisés pour le traitement de troubles variés, et en particulier pour le traitement des spasmes des muscles lisses et des états d'hypermotilité.Toutefois, l'effet bénéfique de ces médicaments s'accompagne habituellement d'un certain nombre d'effets secondaires attribuables à leur caractère général d'agents anti-cholinergiques. On utilise également couramment des médicaments anti-cholinergiques du genre de l'atropine en tant que produits auxiliaires de diagnostic en radiologie gastrointestinale, en particulier conjointement avec un produit de visualisation des rayons X afin d'améliorer la visua lisation.des voies gastro-intestinales, biliaires et urinaires. Un tel médicament est habituellement administré par voie parentérale, et en raison de l'importance de la dose nécessaire pour provoquer la relaxation, on rencontre en général les effets secondaires habituels à ces agents. Récemment, on a proposé en remplacement,, pour diminuer la motilité gastro-intestinale à l'occasion d'examens radiographiques, l'administration parentérale de l'hormone peptidique glucagon, consistant en 29 acides aminés (cf. brevet des Etats-Unis nO 3.862.301). Toutefois, le glucagon exerce dans l'organisme des effets multiples, y compris une forte influence- sur les fonctions régulatoires métaboliques, les effets les plus manifestes étant l'induction de l'hyperglycémie et de la lipolyse. Ainsi, si l'introduction du glucagon en endoscopie apporte certains avantages, on n'a pas éliminé totalement les effets secondaires indésirables. La présente invention vise à la mise au point d'un agent spasmolytique qui, possédant des effets anti-spasmodiques et de relaxation des muscles lisses comparables à ceux des agents connus, présente également des effets secondaires considérablement réduits. Dans l'un de ses aspects, l'invention concerne donc un nouveau polypeptide purifié présentant la composition ci-après en acides aminés Trp (2), Lys (4), His (1), Arg (5), Asx (10), Thr (3), Ser (9), Glx (12), Pro (12), Gly (6),Ala(6)Cysl/2(14),Val(7), Met (2), Ile (3), Leu (I), Tyr (2), Phe (7). Les déterminations sont sujettes à l'erreur habituelle de + 10 9s des chiffres indiquées. On pense que la séquence partielle d'acides aminés comprenant au total 45 acides aminés à partir de l'azote terminal est la sui vante pyrGlu-Lys-Pro-Ala-Ala-Cys-Arg-Cys-Ser-Arg-Glx -Asx-Pro- 5 10 Lys-Asx-Arg-Val-Asx-CysT ly-Phe-Pro-Gly-Ile-Thr-Ser-Asx - 15 20 25 Glx-Cys-Phe-Thr-Ser 4 ly-Cys-Cys-Phe-Asx -Ser-Glx-Val-Pro- 30 35 40 Gly-Val-Pro-Trp. 45 Dans le schéma ci-dessus, pyrGlu (résidu 1) représente l'acide pyroglutamique. Les abreviations utilisées pour les acides aminés sont celles figurant dans J.Biol.Chem. 243 (1968), 3558. L'invention comprend également un procédé pour préparer le PPS purifié, procédé qui consiste à isoler le PPS du tissu pancréatique du porc de préférence du gateau de relargage de l'insuline, par une combinaison d'opérations de chromatographie et de précipitation. Le gâteau de relargage de l'insuline peut être préparé de la manière suivante : on broie finement à l'état congelé des glandes pancréatiques de porc dégraissées avec soin et on les soumet à l'opération classique d'extraction pour isolement de l'insuline, c'est-à-dire qu'on extrait par un mélange d'eau et d'un solvant organique miscible à l'eau, par exemple un alcanol aliphatique inférieur comme l'méthanol ou l'isopropanol, dans un milieu acide, par exemple un milieu présentant un pH dans l'intervalle de 1,5 à 5, la mesure étant faite à l'aide d'un pHmètre dans le mélange.Le pH acide est obtenu par addition d'un acide, Dans le mélange, le solvant organique est present R une concentration dans l'intervalle d'environ 40 à 80 en volume après mélange de tous les composants. La dispersion obtenue est agitée à une température dans l'intervalle d'environ 50C à la température ambiante, après quoi on élimine les ré- sidus des glandes, par exemple par centrifugation. L'extrait est ensuite neutralisé à un pH dans l'intervalle d'environ 5 à 9, puis clarifié, par exemple par centrifugation. On acidifie alors l'extrait à un pH d'environ 3 à 4, puis on élimine tous les solvants organiques, par exemple par évaporation m pression réduite, puis les composés lipidiques, par exemple par centrifugation.L'insuline, en mélange avec d'autres protéines et polypeptides comme le PPS, est relarguée de l'extrait concentré obtenu dans ces conditions, par exemple par addition de chlorure de sodium à une concentration dans l'intervalle d'environ 10 à 30 % (poids/volume) ; on isole le précipité par exemple par centrifugation ; c'est ce précipité qui constitue le gâteau de relargage. Le gâteau de relargage, ainsi obtenu,neut ensuite etre dissous dans l'eau; on isole alors l'insuline brute par préci pitation isoélectrique à un pH dans l'intervalle d'environ 4,9 à 5,7, par exemple environ 5,3, éventuellement en présence d'ions métalliques, par exemples d'ions zinc, et on l'isole, habituellement par centrifugation. On règle le liquide surnageant à un pH d'environ 5,7 à 7, de préférence environ 6,5. Le précipité formé qui contient un peu d'insuline est centrifugé. Pour éliminer les produits d'accompagnement tels que les sels, on ajoute au second surnageant ci-dessus un excès d'acide éthylène-diamine tétracétique, puis un solvant organique miscible à l'eau, de préférence l-'éthanal (habituellement de 5 à 20 volumes). On laisse le mélange précipiter une nuit à 40C environ puis on centrifuge.On sèche le précipité sous vide ; on obtient une poudre sèche qu'on appellera ci-après "protéine du liquide surnageant". Ce mode opératoire permet de récupérer pratiquement les protéines contenues dans les "protéines du liquide surnageant". Le PPS peut etre obtenu sous une forme cristallisée brute à partir d'une solution de "protéine du surnageant" dans l'eau (environ 10 parties). On agite la solution avec modération et on ajoute un acide, par exemple l'acide acétique, en trois heures environ, jusqu'à un pH dans l'intervalle d'environ 3,8 à 4,8, de préférence environ 4,3. Le melange est ensuite réfrigéré et l'agitation poursuivie pendant trois jours, de préférence à 40C environ. On isole une récolte de cristaux biréfringents en forme de tablettes relativement grosses, par exemple par centrifugation, et on sèche sous vide. Le produit obtenu dans ces conditions peut être purifié plus profondément, de préférence par des opérations consécutives de chromatographie par échange d'anions et de chromatographie par échange de cations. A titre d'exemple, on peut effectuer une chromatographie par échange d'anions dans les conditions suivantes : on utilise une colonne de "QAE-Sephadex A-25", (produit de la firme Pharmacia AB, Suède), à une dimension de lit de 2,5 x 80 cm ; l'éluant consiste en Tris (il s'agit du tris(hydroxyméthyl)aminométhane)O,08 M, Hcl 0,02 N, NaC1 0,08 M, éthanol à 50 % en volume, pH 8,5. On effectue l'opération sur les cristaux obtenus à partir des protéines du liquide surnageant. On opère à la vitesse d'élution d'environ 40 ml/heure et la dimension de chacune des fractions est d'environ 13 ml. Le chromatogramme obtenu par mesure continue de la densité optique des fractions à 276 nm présente un pic principal. Il est représenté dans la figure 1 des dessins annexés.La partie recueillie, correspondant au pic principal, est réglée à pH 7,4, puis mélangée avec un solvant organique miscible à l'eau, par exemple l'éthanol (4 volumes) . Après repos de deux jours à 40C, on recueille par centrifugation un précipité qu'on sèche sous vide. Le produit ainsi obtenu peut encore être purifié par chromatographie d'échange de cations, par exemple sur une colonne de "SP-Sephadex C-25" de la firme Pharmacia, Suède. La dimension du lit est de 2,5 x 25 cm et l'éluant consiste en CH3COOH 0;4 M, CH3COONa 0,05 M, éthanol à 50 % en volume, pH 4,7. La vitesse d'élution est d'environ 50 ml/heure et la dimension de chacune des fractions d'environ 15 ml. Le chromatogramme obtenu comme décrit ci-dessus présente un pic principal. Il est représenté dans la figure 2 des dessins annexés.La partie recueillie, correspondant au pic principal, est évaporée à sec ; on redissout le résidu dans l'eau à un pH dans l'intervalle d'environ 6 à 8, par exemple environ 7, on mélange avec un excès (environ 12 volumes) d'un solvant organique miscible à l'eau, par exemple l'éthanol, et on abandonne une nuit dans des conditions semblables à celles indiquées cidessus. Le PPS purifié qui précipite de la solution est isolé par centrifugation, lavé à ltéthanol et séché sous vide. On peut également obtenir des protéines contenant du PPS à partir des liqueurs-mères obtenues lors de l'isolement du gâteau de relargage par utilisation du chlorure de sodium à une concentration de 10 à 20 % (poids/volume) par une nouvelle opération de relargage. On recueille le précipité, par exemple par centrifugation. On peut obtenir le PPS purifié à partir du précipité par des chromatographies anioniques et/ou cationiques dans un ordre quelconque. Dans un autre procédé, on peut isoler les protéines contenant le PPS de l'extrait de glandes pancréatiques décrit ci-dessus à l'aide d'un mélange d'eau et d'un solvant organique miscible à l'eau par adsorption sur un échangeur de cations ou anions, par exemple de l'acide alginique, du polystyrène sulfoné ou de l'aminoéthyl- cellulose. On lave ensuite l'échangeur d'ions et on élue les protéines par un milieu aqueux. L'isolement par utilisation d'un echangeur d'ions est réalisé selon des modes opératoires analogues à des modes opératoires connus. Le PPS obtenu par l'un quelconque des procédés cidessus possède les caractéristiques ci-après: Poids moléculaire, calculé à partir de la composition en acides aminés : environ 11.700. Poids moléculaire, déterminé par électrophorèse dans un gel de dodécyl sulfate de sodium (Neville : J. Biological Chemistry 246 (1971) 6328) : environ 10.700. Caractéristiques de l'électrophorèse L'électrophorèse discontinue basique ("DE basique") dans un gel de polyacrylamide, effectuée comme décrit par J. Schlichtkrull et coll. (Horm.Metabol.Research, Suppl. Series 5 (1974) 134) présente essentiellement une bande unique à R f 0,65-0,75. On obtient un résultat analogue par l'électrofocalisation analytique dans un gel de polyacrylamide, ce procédé permettant de déterminer le pI qui est d'environ 4,4. Les produits obtenus par traitement du PPS par la trypsine, l'a-chymotrypsinez CNBr, un acide ou la pyroglutamate aminopentidase,coinire écrit ci-apres,ont une activité spasmolytique du même ordre de grandeur que celle du PPS. Traitement à la trypsine On dissout 20 mg de PPS dans 20 ml de NH4HC03 0,01 M (pH 7,8) et on soumet à pré-incubation de 5 minutes à 370C. Après addition de 100 ijl d'HCl 0,001 M contenant 0,4 mg de TPCK-trypsine (de la firme Worthington Biochem. Corp.), on soumet le mélange à incubation de 15 minutes à 370C puis on lyophilise. Traitement à l'a-chymotrypsine On dissout 20 mg de PPS dans 200 pl de NaOH 0,1 M et on ajoute 1800 1ll de NH4HC03 0,05 M (pH 8,0). On soumet la solution à une pré-incubation de 5 minutes à 370C et on ajoute 50 lll d'HCl 0,001 M contenant 100 llg d'a-chymotrypsine (de la firme Sigma Chemical Company). On poursuit l'incubation pendant une heure à 370C puis on arrete la réaction par addition de 50 1ll d'acide acétique concentré on lyophilise ensuite la solution. Traitement avec du CNBr On dissout 20 mg de PPS dans 2 ml d'acide formique à 70 % en volume contenant 72 mg de CNBr. On conserve le mélange à température ambiante pendant 40 heures puis on lyophilise. La lyophilisation est ensuite répétée après addition de 2 ml d'eau. Traitement à l'acide On soumet des échantillons d'l mg de PPS dissous dans 100 ml d'acide chlorhydrique 0,5 N à incubation à 370C pendant 2, 10 et 21 jours. Après incubation, on précipite la protéine de chacun des échantillons quantitativement par addition de 2 ml d'acétone. On isole le précipité par centrifugation, on lave par 2 ml d'acétone et on sèche sous vide. On analyse les échantillons obtenus avec un échantillon de PPS non traité par DE basique (voir ci-dessus), mais on ramène la durée d'électrophorèse de manière à parvenir à une valeur de Rf egale à 0,53 pour le PPS. Dans l'échantillon soumis à incubation pendant 2 jours, on observe une série de bandes avec des valeurs de Rf allant de 0,53 à 0,86. Dans les échantillons soumis à incubation pendant 10 et 21 jours, on n'observe qu'une seule bande avec une valeur de Rf de 0,86. Ces résultats montrent qu'il s'est produit une désamidation partielle du PPS au bout de 2 jours, et une désamidation complète au bout de 10 jours d'incubation. Traitement à la pyroglutamate aminopeptidase On dissout un échantillon de 6 mg de PPS dans 2 ml d'une solution de 50 mM dthydrogéno phosphate de sodium 30 mM de p-mercaptoéthanol, 1 mM d'un tampon de EDTA avec un pH de 7,8. On ajoute une solution de 2,5mg de pyroglutamate aminopeptidase de Boehringer Mannheim dans 0,5 ml du tampon ci-dessus. On incube le mélange pendant 16 heures à 370C, puis on le lyophylise (2,6mg.dc.-la pyroglutamate aminopeptidase utilisée contiennent environ 10 mU d'activité enzymatique). La pureté du PPS final peut être contrôlée par focalisation isoélectrique analytique ("IEF") et électro porc se discontinue basique (DE basique, voir ci-dessus). Le produit migre essentiellement sous forme d'une bande unique dans les deux systèmes. L'IEF est effectué selon les instructions de la brochure I-1804-E02 de la firme LKB-Produkter AB, Bromma, Suède "LKB Ampholine PAG, plates for analytical electrofocusing on polyacrylamide gels". De même, la filtration du polypeptide sur gel, le " Biosel P-30" de la firme Biorad Laboratories, Richmond, Californie, Etats-Unis, avec l'acide acétique 1M comme éluant, ne révèle qu'un seul pic. Le PPS a été analysé pour un certain nombre d'immuno-réactivités selon des modes opératoires connus. Les résultats obtenus sont rapportés dans le ta bleau I ci-après Tableau I. Immunoréactif Teneur (ppm) Insuline (IRI) 3à6 Glucagon total (GLI total) Glucagon pancréatique (GLI pancréatique) Peptide intestinal vaso-actif (VIP) Polypeptide pancréatique (de porc) X 0,08 C-peptide (de porc) Somatostatine X 0,002 L'immuno-réactivité du PPS a été mesurée par un radioimmunotest à haute spécificité mis au point pour déceler des quantités pouvant tomber à 250 mg par ml. On a préparé des anticorps par immunisation de lapins avec la "protéine du surnageant" (0,5 ml d'une solution contenant environ 4 mg de protéine par ml) en mélange avec 0,5 ml d'adjuvant de Freund, deux fois par semaine pendant 26 semaines. En commençant le 13ème jour après la première immunisation, on a recueilli au total 10 échantillons de sang (10 ml) de chacun des animaux pris à intervalles réguliers en une durée de 172 jours. Les anti-sérums obtenus ont été soumis à des tests pour affinité et capacité et on a choisi un anti-sérum approprié pour utilisation dans le radioimmunotest. 125 On a préparé du 125I-PPS par le mode opératoire à la lactoperoxidase mis au point par Thorell et Johansson (Biochim.Biophys.Acta 251 (1971) 363). Le PPS radio-iodé a été purifié par chromatographie d'échange d'ions selon un mode opératoire connu et utilisé pour le radio-immunotest des polypeptides selon le mode opératoire mis au point par L.G. Heding (Diabeto)ôgica 7 (1971), lo). L'invention comprend également les sels du PPS et par exemple des sels de cations tels que les cations sodium, potassium, magnésium, calcium et zinc et des sels formés par addition avec des acides organiques ou minéraux tels que les acides formique, méthane-sulfonique, chlorhydrique et sulfurique. L'expression "composés de PPS" couvre le PPS et ses sels physiologiquement acceptables. On a constaté que les composés de PPS et le glucagon avaient une activité à peu près egale d'inhibition de l'amplitude des contractions de l'iléum de cobaye stimulé électriquement in vitro ; cf. tableau II ci-après. Le PPS et le glucagon ont été dissous dans du chlorure de sodium à 0, 9 % avec 0,1 % de sérum-albumine humaine. Tableau II. Concentration dans Effet d'inhibition en pourcentage le bain d'organe, M PPS Glucagon 10-5 89 1o-6 49 51 21 21 24 Cet effet des composés de PPS est bloqué par la phentolamine mais non par la naloxone. La motilité spontanée de l'iléum isolé de cobayes traités à la réserpine est inhibée par le PPS. De meme, on a constaté que le PPS et ses sels avaient une activité à peu près égale à celle du glucagon vis-a-vis de 1' inhibition in vivo du péristaltisme chez les souris ; cf. tableau III ci-après ; cet effet peut égale- ment être bloqué par la phentolamine. Tableau III. Médicament (50 mg/kg par Pourcentage d'intestin voie sous-cutanée) traversé par du charbon, comparativement à un témoin PPS 78 Glucagon 66 Sulfate d'atropine 64 Le PPS diminue la motilité intestinale chez les lapins in vivo après administration intra-veineuse ou intra-luminale dans l'intestin. La motilité est enregistrée par un cathéter à ballon placé dans l'intestin et relié à un transducteur de pression. Pour 5 lapins sur 5, (pesant 2,5 à 3,0 kg chacun), 400 ug de PPS administrés par voie intra-veineuse ou 5 cm du ballon dans le lumen de l'intestin provoquent une diminution marquée de la motilité intestinale,presque jusqu'à l'atonie. 200 g ont un effet net sur 3 lapins sur 5. Le glucagon a le même effet, mais seulement lorsqu'il est administré par voie intra-veineu se. On a trouvé que le PPS retardait l'absorption de l'hydrolysat de protéine [U-14Cj chez les porcs et chez les chiens pancréatectomisés et de l'ovalbumine [U-14C] chez les chiens pancréatectomisés, après administration perorale dans une capsule contenant 3 mg de PPS. Les porcs et les chiens pesaient environ 30 kg. On a mélangé 100 ci -4 'hydrolysat de protéine tU-14Cg ou 5 Ci d'oval butine [U~14Css avec une suspension d'lg/kg d'un concentré de protéine tel que celui ccxanercialisé par Ferrosan sous la dénomination Idon et on a administré par sonde gastrique.Les valeurs maximales de dpm du plasma ont été atteintes 30 à 40 minutes après 1 ' administra- tion du PPS,oeTparativement à une administration plaoebo.Ce retard d'abc sorption provoqué par environ 100 p/kg de PPS par voie orale reflète proba blement une mobilité gastro-intestinale réduite. On a constaté que les composés de PPS étaient dépourvus de tout effet in vitro sur la libération du glucagon ou de l'insuline ou sur la lipolyse et de tout effet in vivo sur le glucose du sang. Une dose allant jusqu'à 1 mg/kg injectée par voie intra-veineuse n'exerce pas non plus d'effet marquP sur la pression sanguine du rat anesthosié. Les résultats d'essais pharmacologiques rapportés ci-dessus mettent en évidence la valeur potentielle des composés de PPS pour la prévention et le traitement des états de spas- mes des muscles lisses, par exemple dans l'intestin. Du fait qu'ils ne provoquent pas d'effets métaboliques,les composés de PPS peuvent être utilisés avantageusement comme substituts du glucagon en endoscopie et dans des opéra tions radiologiques. Ils possèdent avantageusement une innocuité importante. L'étude de leur toxicité aigüe n' a pas permis de constater d'effet néfastes après injection par voie intrapéritonéale de 200 mg de PPS/kg de souris. Les composés de PPS peuvent être administrés par voie intra veineuse,à l'état de bol alimentaire ou à l'état d'infusion.Lorsqu'on dé sire un effet prolongé plus lent à se déclencher, on peut administrer les composés de PPS--------------------------------------------------- à l'état de-dépôt lentement mobilisé par le courant sanguin, par exemple le dépôt sous-cutané ou intramusculaire dans une région à bonne circulation périphérique.Le fait que l'activité biologique et l'immuno-réactivité se conserve vent après exposition du PPS au suc gastrique, à la tryp- sine et à la chymotrypsine et les résultats des essais décrits ci-dessus mettant en évidence l'absorption retardée après administration orale du PPS indique que la voie orale est une voie d'administration possible. Par conséquent, le PPS peut être administré au moyen d'un endoscope au cours des opérations d'endoscopie ; il peut être mélangé avec le milieu de contraste, par exemple le sulfate de baryum, pour des opérations de radiologie. Les doses des composés de PPS peuvent être réglées selon l'importance de la réponse voulue et les autres facteurs pris habituellement en considération. A titre d'exemple, on peut indiquer des doses de 10 à 200 ug par kg de poids corporel, mais on peut administrer des doses plus faibles ou plus fortes. Dans le cas d'administration dc composés de PPS selon l'inven- tion sous forme de solutions aqueuses stériles,on utilisera avantageusement des solutions renfermant ces derniers en une concentration de'O,l à 200 mg/ml, de préférence de 0,5 à 25 mg/ml. L'invention comprend également des compositions thérapeutiques contenant des composés de PPS avec un ou plusieurs véhicules acceptables pour l'usage pharmaceutique.Parmi ces véhicules, on peut citer des préservateurs et du chlorure de sodium. Pour être sur de parvenir au résultat recherché après administration des composés de PPS, il est recommandé de les préparer à partir d'un produit de départ permettant d'arriver dans le produit final à une pureté d'au moins 50S de préférence d'au moins 90% du composé de PPS. Selon des résultats de recherches non publiés antérieurement, les pilules de pancréatine contiennent du PPS (par exemple environ b/cc). En raison de leur teneur en enzymes, les pilules de pancréatine ont été utilisées chez les patients pancréatectomisés et chez les patients souffrant de pancréatite chronique. On a également trouvé que 1' insuline du commerce contenait environ 30 ppm de PPS. Toute nouvelle caractéristique ou combinaison de caractéristiques décrite dans la présente demande est considérée comme essentielle. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée ; dans ces exemples, les indications de parties et de pourcentages s'entendent en poids, sauf mention contraire. D'autre part, lorsqu'on parlera d'un PPS à haute pureté, il s'agira d'un PPS qui migre essentiellement à l'état de bande unique dans les systèmes IEF et DE basique décrits cidessus. Exemnle 1. On dissout un gâteau de relargage obtenu à partir de 94 kg de glandes pancréatiques de porc dans l'eau, à un volume de 3,2 1. On règle le pH de la solution à 5,3 et on sépare le précipité par centrifugation. On règle le pH du liquide surnageant à 6, 5 .et on centrifuge la suspension. On mélange la solution avec 32 ml d'éthylènediaminotétracétate tétrasodique 0,5 M et 35 1 d'éthanol. On abandonne le mélange pendant une nuit à 40C, puis on centrifuge. On sèche le précipité sous vide ; on obtient 50 g de poudre de protéine sèche de surnageant. On agite une solution de la poudre dans 500 ml d'eau avec modération en ajoutant lentement de l'acide acétique à l'aide d'une pompe péristaltique, jusqu'à pH 4,3 (après 3 heures environ de pompage) . On poursuit l'agitation pendant 3 jours à 40C ; il se produit une cristallisation. On récolte les cristaux (en forme de tablettes apparemment, peut-être orthorhombiques et présentant le phénomène de biréfringence) par centrifugation, on les met en suspension dans 500 ml d'eau à 40C et on agite pendant une nuit ; on centrifuge et on sèche sous vide. Rendement : 5,2 g. On dissout 4 g de ce produit dans 50 ml d'éthanol à 50 % en volume et 50 ml de l'éluant consistant en Tris 0,08 M, HCl 0,02 N, NaCl 0,08 M, éthanol à 50 % en volume,à pH 8,6 (cf. figure 1).La solution est soumise à chromatographie par échange d'anions comme décrit plus haut et illustré dans la figure 1 des dessins annexés. La partie recueillie correspondant au pic principal est réglée à pH 7,4, mélangée avec 4 volumes d'éthanol à 96 % en volume, puis maintenue 2 jours à 40C. On isole le précipité par centrifugation, on lave à deux reprises avec 150 ml d'éthanol à 96 % en volume et on sèche sous vide. Rendement 2,6 g. On dissout 2,5 g de ce produit dans 125 ml d'éthanol à 50 7s en volume et 125 ml de l'éluant consistant en CH3COOH 0,4 M, CH3COONa 0,05 M, éthanol à 50 % en volume, à pH 4,7, et on soumet à chromatographie d'échange de cations comme décrit plus haut et illustré dans la figure 2 des dessins annexés. La partie recueillie correspondant au piz principal (le seul visible) est évaporée à sec. On dissout le résidu dans l'eau et on règle le pH de la solution à 7,1 (volume final environ 90 ml). On mélange la solution avec 1200 ml d'éthanol à 96 % en volume et on conserve le mélange une nuit à 40C. On isole le précipité par centrifugation, on lave à deux reprises avec 150 ml d'éthanol à 96 % en volume et on sèche sous vide. Rendement : 1,8 g de PPS à haute pureté répondant aux exigences de pureté indiquées dans le tableau I cidessous Exemple 2. On dissout 20 g de la poudre de protéine du surnageant obtenue comme décrit dans l'exemple 1, dans 200 mi d'eau. On ajoute 208 ml d'éthanol à 96 % en volume et on règle à pH 4,6 par l'acide acétique. On élimine par centrifugation un petit précipité. Le liquide surnageant qui se trouble lentement est soumis à chromatographie d'échange de cations sur une colonne de 2,5 x 80 cm de "SP-Sephadex C-25", équilibré par l'éluant 1 (acide acétique 0,4 M, acétate de sodium 0,05 M, éthanol à 50 % en volume, pH 4,6). L'élution par gradient linéaire est effectuée de 3 l de l'éludant 1 à 3 l de l'éludant 2 (acétate de sodium 0,3 M, éthanol à 50 % en volume, pH 8,7). On recueille des fractions de 10 ml à la vitesse d'élution de 40 ml/h. On rassemble les fractions correspondant au pic important apparaissant des fractions 100 à 130. On règle la partie recueillie à pH 8, puis on mélange avec 1,8 l d'éthanol à 96 % en volume. On conserve le mélange à 40C pendant 24 heures. On isole la protéine qui a précipité par centrifugation, on la lave à deux reprises avec 150 ml d'éthanol à 96 % en volume et on sèche sous vide. Rendement : 2,8 g. On dissout 2,5 g de ce produit dans 250 ml d'un tampon Tris (Tris 0,0575 M, HCl 0,05 N, pH :7,4 ) . On soumet la solution à chromatographie d'échange d'anions sur une colonne de 2,5 x 50 cm de "QAE-Sephadex A-25", équilibré par un tampon au Tris (Tris 0,115 M, HC1 0,1 N, pH 7,4). On élue la colonne par le tampon d'équilibrage à la vitesse de 30 ml/h. On recueille des fractions de 10 ml.On assemble les fractions correspondant à la partie principale centrale du pic dont le maximum se situe à la fraction 225. Cette partie recueillie (620 ml) est mélangée avec 60 ml de chlorure de sodium 5 M et 12 1 d'éthanol à 96 % en volume. On conserve le mélange à 40C pendant 24 h. On isole la protéine qui a précipité par centrifugation, on la lave à deux reprises avec 150 ml d'éthanol à 96 % en volume et on la sèche sous vide. Rendement : 1,7 g de PPS à haute pureté. Exemple 3. A 150 1 d'une solution aqueuse obtenue par évaporation d'un extrait de 250 kg de glandes pancréatiques de porc débarrassées des matières insolubles, on ajoute 22,5 kg de chlorure de sodium. On agite pour dissoudre le sel ajouté, on sépare le précipité par centrifugation on obtient ainsi le gâteau de relargage. Aux liqueursmères (162 l), on ajoute 34 kg de sulfate d'ammonium en agitant en permanence pendant 2 heures à température ambiante ; on obtient un précipité qu'on isole par centrifugation. On redissout 223 g du produit humide par addition de 500 ml d'un tampon (tampon 0,05 M en acide formique, 0,01 M en hydroxyde de sodium, pH 3,2). On réduit la conductivité de la solution à 4 mS par dialyse contre l'eau.On met la solution sur une colonne de 5 x 50 cm de "SP-Sephadex C-25" équilibré par le tampon I (acide formique 0,1 X, hydroxyde de sodium 0,02 M, pH 3,2). On élue ensuite la colonne par un gradient linéaire de chlorure de sodium de O à 0,27 M dans le tampon I. Le volume total d'éluant est de 5,5 1. On élue encore la colonne par le tampon I contenant le chlorure de sodium à la concentration 0,27 M. Le débit, au cours de l'alimentation sur la colonne et de l'élution, est de 100 ml/h et les fractions recueillies sont de 15 ml. Le chromatogramme obtenu par contrôle continu de la densité optique des fractions à 276 nm présente un pic principal allant de la fraction 420 à la fraction 530. On rassemble la partie correspondant au pic principal et on la règle à pH 7,4, puis on la mélange avec 20 volumes d'éthanol à 96 X en volume. Après un repos de 48 heures à 40C, on sépare un précipité par centrifugation et on le sèche sous vide. Rendement : 6 g.Le produit est purifié plus profondément par chromatographie d'échange d 'anions sur une colonne de "QAE-Sephadex A-25", comme décrit dans l'exemple 2. Rendement : 3,4 g de PPS haute pureté. EXEMPLE 4 On élabore une préparation pour l'administration parentérale contenant 1 mg de PPS/ml en procédant comme suit On dissout 1 g. de PPS et 99 g de lactose dans 1 1 d'eau distillée et on ajuste le pH à 7,0. La solution est ensuite filtrée de manière stérile. On remplit des fioles de 10 ml avec la solution stérile de telle manière que chaque fiole contienne 10 ml de la solution. Ensuite, les solutions sont lyophylisées et les fioles sont scellées dans des conditions aseptiques. La préparation de chacune de ces fioles sera dissoute dans 10-ml d'eau stérile avant administration. EXEMPLE 5 Des préparations pour administration par voie orale peuvent être préparées comme suit On mélange 100 mg de PPS avec 9 g d'amidon de malus, 9 -g de lactone et 180 mg de stéarate de magnésium jusqu'à obtention d'un mélange homogène. On remplit des capsules de gélatine duxe No 3 à l'aide du mélange de telle manière cT1le chaque cap- sule contienne 1 mg de PPS. REVENDICATIONS 1. Polypeptide purifié caractérisé en ce qu'il présente la composition en acides aminés ciapres Trp (2) Lys (4), His (1), Arg (5), Asx (10), Thr (3), Ser (9), Glx (12), Pro (12), Gly (6), Ala (6), Cysl/2(l4), Val (7), Met (2), Ile (3), Leu (1), Tyr (2), Phe (7), les déterminations étant sujettes à l'erreur habituelle de + lO % des chiffres indiqués, et en ce qu'il présente vraisemblablement, d'après les connaissances actuelles, la séquence partielle d'acides aminés, à partir de l'azote ci-après pyrGlu -Lys-Pro-Ala-Ala-Cys-Arg-Cys-Ser -Arg-Glx-Asx -Pro 5 10 Lys-Asx-Arg-Val-Asx-Cys Wly-Phe-ProWly-Ile-Thr -Ser-Asx- 15 20 25 GIx Cys-PheThr-Ser-Gly-Cys-Cys-Phe-Asx-Ser-Glx-VaI-Pro- 30 35 40 Gly-Val-Pro-Trp, 45 dans laquelle pyrGlu (résidu 1) représente l'acide pyroglutamique, et ses sels . physiologiquement acceptables. 2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente une pureté supérieure à 50 % en poids, et de préférence supérieure à 90 % en poids. 3. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est à l'état cristallisé. 4. Procédé pour isoler un polypeptide purifié selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on isole ce polypeptide à partir des glandes pancréatiques de porc par une combinaison de chromatographies et de précipi- tations. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on extrait les glandes par un mélange d'eau et d'un solvant organique miscible à l'eau dans un milieu acide, on élimine le précipité, on neutralise l'extrait et on isole le polypeptide de l'extrait ainsi obtenu en utilisant les méthodes de séparations connues per se, après quoi; si on le désire, on le convertit en un sel. 6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on isole le polypeptide d'un gâteau de relargage de l'insuline. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'isolement est réalisé par chromatographie au moyen dtun échangeur de cations et/ou d'un échangeurs d'anions. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on procède également à une opération de cristallisation. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la chromatographie est réalisée avec récolte de la majeure partie du produit correspondant au pic principal du polypeptide. 10. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on isole le polypeptide des liqueurs .mères obtenu lors de la préparation d'un gâteau de relargage d'insuline en procédant à un nouveau relargage suivi de chromatographie à l'aide d'échangeurs d'anions et/ou d'échangeurs de cations. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que le gâteau de relargage est pratiquement débarrassé de l'insuline par séparation du précipité formé dans une solution du gâteau de relargage avec un pH dans l'intervalle d'environ 4,9 à 5,7, de préférence environ 5,3, et le cas échéant séparation du précipité formé dans ladite solution du gâteau de relargage à un pH dans l'intervalle d'environ 5,7 à 7,0, de préférence environ 6,5, avant les opérations de chromatographie. 12. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'opération de cristallisation est réalisée par réglage du pH de la solution à une valeur dans l'intervalle d'environ 3,8 à 4,8, de préférence environ 4,3. 13. Polypeptide purifié nar un Procédé selon la revendication 1 purifié par un procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 12. 14.- Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace d'un polypeptide purifié selon l'une quelconque des revendications 1 a 3 et 13 en association avec un véhicule ou un excipient purifié pharmaceutiquement acceptable. 15.- Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle consiste en une solution aqueuse stérile du polypeptide purifié, contenant de préférence 0,9S environ de chlorure de sodium et le cas échéant des préservateurs tels qu'un parahydroxybenzoate ou du phénol. 16.- Composition pharmaceutique selon la revendication 15, caractérisée en ce que lé polypeptide purifié est présent dans la solution à une concentration de 0,1 à 200 mg/ml, de préférence de 0,5 à 25 mg/ml. 17.- Application d'un polypeptide purifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 13 en tant que médicament notamment en tant qu'agent spasmolytique, produit auxiliaire de diagnostic, agent thérapeutique et agent prophylactique.