FR 2476127 A1 19810821 FR 8102931 A 19810213 I La Prr:ente invention concernedes antibiictiuls Actino'iadura-L-31A, B et leur priparation.Les antibiotiques Actinominadura-L-31A,B sont de nouveaux antibiotiques peptides contenant du snufre. On connait certains antibiotigues peptidescontenant du soufre.Les an- tibiotinues peptides contenant du soufre classiques connus comprennent la Tbiopeeptne(J. Antibiot 23,113(1970)),la thiostreptone(Antibiotics Annual, p 554(1955/1056)),la Taitomveine(J.4ntibiot,A 12 1,(1959)),1a Siomycine(J. Anti- boint992 64(1969)),1a Pepthiomnvcine(J.Antibiot,1 429(1968)),la Gardimycine (J.Antibiot,29 501(1976)),la Kobenomycine(J.Antibiot,21 320(1968)),la Leuci- nanycire(J.Antibiot,A 20 194(1967)),la Macromomycine(J.Antibiot,21 44(1968)) et!a.'Ocrzinostatine(J.AntiBiot, 8,68(1065)). Un objet d- la présente invention est de fournir de nouveaux antibio- tlq.,-,s.-c LnoiMdura-L-31 A,B. !.s cerat ristioues de l'antibiotique Actinomadura-L-31 A sous for- me de sel. chlerhydrate sont: aspect: noudre blanche ou Jaune pele point do fusior: tiintq fusion peu clair rotation spt;ifiue: L.3 -34 (C:O,5, plH:7,5 eau) ann!-Tse élrrentaire: (trouvé) C:51,71%; li:6,23%; 0:20,03%; N:13,94%; S:5,82%; Cl:L,17% aminoacides co stittifs: acide aspartioue; acide glutamique; glycine; valine; phnylaalnine; hystidine; leucine; tryptophane spectre d'absorption ultravi.let: Fieure 1 r:aximum l'absorption: 280 nm: E1 -45,2 290 nm: épaulement El m38 spectre infraroure: Figure 2 absorption(cm) 3350,3050,2950,1660,1530, 1430,1395,1340,1255,1235, 1100,745,700 et celles de l'antibiotique Actinomadura-L-31 B sous forme de sel chlorhydrate sont: aspect: point de fusion: rotation spécifique: analyse élémentaire: poudre blanche ou Jaune pâle peu clair [X] 2 -26 (C:0,5;pH:7, 5 eau) (trouvé) C:51,10%; H:6,34%; 0:20,75% N:14,81%; S:5,91%; C1:1,08% aminoacides constitutifs: acide aspartiaue;thréonine;acide glutamique; proline;glycine;valine;phénylalanine;tryptophane spectre d'absorption ultraviolet: Figure 3 maximum d'absorption:280 nm: Em =44,8 - 290 nm: Elcm373 lcm spectre infra-rouge: Figure 4 absorption (cm-) 3350,3050,2950,1660,1520,1440,1390,1340,1260),1230, 1100,745,700 La demanderesse a trouvé comment produire et accumuler les substances antibiotiques en cultivant un microorganisme appartenant au genre Actinomadura qu'elle a isolé et a réussi la séparation des substances antibiotiques. Du point de vue des propriétés physicochimiques,les antibiotiques de la présente invention sont considérés comme des antibiotiques reptides corte- ! nant du soufre,mais ces antibiotiques sont différents de la Thiopentine, de la Thiostreptonç,de la Taitomycine,de la Siomycine,de la Pepthiomycine,d-d la Gar- dimvcine,de la Kobénomvcine,de la Leucinamycine,de la Macrmopycine có de la Néocarzinostatine.Les antibiotiques selon la présente Lp;tion sont de nou- veaux antibiotiques désignés Actinomadura-L-31 et ils s Pr Duoduits Pr] e de L-31 A et L-31 B. L'antibiotique Actinomadura-L-31 peut Utre produit en cultivant un microorganisme du genre Actinomadura produisant du L-3] et en séparant le L- 31 du milieu cultivé. Le microorganisme utilisé pour produire Actinomadura-L-31 peut être tout microorganisme du genre Actinomadura qui possède la fonction de produire L-31.I1 est particulièrement préférable d'utiliser la souche Actinomadura sp. L-31 isolée et déposée par la Demanderesse au "Fermentation Research Institute' du Japon sous le numéro de référence FERM-5324 le 18 décembre 1979, ainsi qu'à l'American Type Culture Collection sous le n 31793. Le microorganisme de la souche Actinomadura sp.L-31-utilisé dans la présente invention poss;de un mycélium substrat pur et un mycélium aérien, pro- duit une chaine de spores mais ni sporangium ni planospore dans son sporophore et possède des propriétés aérobiques et mésophiliques.On trouve que les com- rosants de l'ensemble de l'hydrolysat de la souche Actinomadura sp.L-31 con- tiennent l'acide méso-diaminopimélique,la 3-o-méthyl galactose et la galacto- se mais ne contiennent pas l'acide L,L-diaminopimélicue,l'arabinose et le xy- lose.On considère que Actinomadura sp.L-31 est une souche du genre Actinomadu- ra dans l'ordre Actinomycétales.La souche Actinomadura sp.L-31 possède les ca- ractéristiques suivantes. (I) Caracteristiques morphologiques: Le mycélium substrat est bien développé et ramifiF et il ne forme ras la spore pure.Le mycelium suhstrit possde un diamètre d'environ n,5 m et ne donne pas une forme ramifiée er zi--zap.I] n'y a pas de framentation du myce- lium pour donner des éléments bacillaires et coccoides et troubler le milieu Iiquide en culture statique dans un milieu liquide tel nue le milieu de bouil- lon tryptone extrait de levure 3 28 C pendant 2 semaines. Le mycélium aérien provoque des adhésions modérées ou plus dans un milieu amidon-agar, glvcerol- malate de calcium akar et glucose-agasparagine agar plus extrait de levure, pour donner une poudre d'aspect bleu gris pâle. D'après l'observation microscopinue,iI possède un axe long flexueux ou droit bien développé et de courtes sporophores qui sont ramifiées de manière opposée ou alternative,mais il ne possède pas de verticils purs. Le sporophore forme une courte chaine de spores de 15 ou moins en forme de crochet,boucle ou va- eue,mais ne forme pas une spirale pure dans les milieux arar mentionnés ci- dessus ou dans les milieux tyrosine agar,extrait de levure-extrait de malt a- gar et farine d'avoine agar.La spore possède une forme oblongue,une dimension d'environ 0,8mxl1,2/m,des verrues sur sa surface,une limite nette mais elle ne possède pas de sporangium,de pseudosporangium,de sclérotium,de corémium et de planospore. (II) Caractéristiques de culture: Selon le test décrit dans E.B.Shirling et coll. Int. J. Syst. Bacteriol Vol. 16,page 313-340(1966),on effectue les tests à la fois avec les tests con- nus et les milieux connus. La couleur est déterminée sous la lumière standart de la larme a xénon en accord avec le "Color Harmony Manual" 4- èmedition (Container corporation of America,Chicago,1958) comme standart de couleur.Lorsque le pic de couleur correspondante est trouvé,on l'indique par le nom commum,mais les noms commums ne sont pas répétés dans la description.Le code du pic de la couleur d'après le "Color Harmony Manual" est indiqué entre parenthèses. Les données suivantes montrent les conditions de croissance dans chaque milieu de culture à 28'C pendant un mois sauf mention contraire. (l)milieu sucrose-nitrate agar (Difco-Bacto) croissance: ténu, partiellement légèrement bonne surface:sans couleur à abricot (4 ea); couleur non modifiée dans HC1 aq. O,05N nu NaOHan.,O05N mycélium aérien: aucun pigment soluble: aucun (2) milieu glucose-asparagine agar croissance: modérée,bambou,buffle,paille,blé (2 fb) mycélium aérien: aucun à l'oeil nu pigment soluble: aucun (3) milieu 1lvcérol-asparaeine agar (ISP-5,Difco-Bacto) croissance: pratiquement aucune mycélium aérien: aucun à l'oeil nu pigment soluble: aucun (4) milieu amidon-agar (ISP-4 Difco-Bacto) croissance: modérée pratiouement sans couleur mycélium aérien: pulvérulent,bon,bleu voilé (13 ec) pigment soluble -:aucun autre: hydrolyse remarquablement faible de l'amidon: non-solubilité du carbonate de calcium (5) milieu tyrosine agar (ISP-7 Difco-Bacto) croissance: bonne:légèrement étendue,4 ea.(pas de changem couleur dans un acide ou une base) mycélium aérien: modéré,pulvérulent rose chair,rose pâle,rose rose écaille (6 ca) pigment soluble: aucun ent de pétale, autre: (6) milieu agar croissance: mycélium aérien: aucune production de pi.ments mélanoides nutritif (Difco-Bacto) modérée:couleur creme peu pique:blanc pigment soluble: aucun (7) milieu extrait de levure-extraitde malt agar (ISP-2 Difco-Bacto) croissance: modérée bonne, hâlé(3gc) mycélium aérien: bon,en poudre -blanc poussiéreux piRment soluble: aucun (8)milieu farine d'avoine agar(ISP-3) croissance: bonne,étendue plate,perle,teinte coquille (3ba} mycélium aérien: bon,pulvérulent,teinte albâtre (13 ba) pigment soluble: aucun (9) milieu glycérol-malate de calcium agar croissance: modéree:étendue,ivoire (3db) mycélium aérien: modéri, pulverulent bleu poussiéreux,bleu gris Pnle, bleu brumeux (16 re) pigment soluble: aucun autre: (10) milieu 2lucose croissance: non solubilité du malate de calcium asnaraQine ajar additionne de 0,2% d'extrait de levure modérre:chameau,tan de sucre d'érable (3 ie) ou cris bleuatre - mycélium aérien: modéré ou bon,pulvérulent,bleu sombre (15 ch) pi-ment soluble: brun brillant (III) Caractéristiques physiologiques et biochimiques: (1) domaine de températire (milieu glucose asparagine agar additionné de 0,2% d'extrait de levure;2 semaines) température optimum: 28-35 C temperature de non croissance: limite supérieure 40eC limite inférieure 16 C (2) liquéfaction de la glucose-peptone-qelatine (26 C;1 mois): positive (3) hydrolyse de l'amidon (milieu amidon agar, réaction ISP-4 I-IK): négative à peu positive(légère) (4) coagulation et peptonisation du lait écrémé (37 C): peptonisation substantielle sans coagulation (5) production de mélanine: négative dans le bouillon tryptone-extrait de levure,dans le milieu peptone-extrait de levure-feragar ou dans le milieu tyrosine agar: dans le milieu agar de formation de mélanine à 28 C négative après une semaine,légèrement positive après deux semaines (brun rougeâtre), positive après trois semaines (brun) (6) solubilité de la xanthine,hypoxanthine,adénine,tyrosine: positive: tyrosine, hypoxanthine; négative: adénine, xanthine (7) tolérance à NaCl ( milieu a.ar de Bennett NaCl +0,4,7,13%) croissance jusqu'à 4% aucune croissance à 7% (IV) Assimilation de sources de carbone (milieu agar de base de Pridham et Gottlieb ISP-9,Difco-Bacto; milieu C-2 agar): positive: T)D-glucose, L-arabinose, D-xylose, L-rhamnose négative: D- fructose, sucrose,i-inositol,raffinose, D-muannitol, salicine On trouve les mêmes résultats indépendemment des milieux de bases et addition ou non de vitamines B (0,5 mg de rihoflavine,O,5 mg de niacine,O,I mg de pyridoxine-HCl,0,5 mg de i-inositol,0,5 mg de pantothénate de Ca,O,Smg de PABA, 0,25 mg de biotine et 0,5 mg de thiamine-HCI dans 1 litre), (V) Composants caractéristiques de l'hydrolysat de l'ensemble des cellules Les composants caractéristiques comprennent l'acide meso-diaminopimé- lique,la 3-O-méthyl-D-galactose et la galactose mais ne comprennent pas l'aci- 1 h - de L,L-diaminopimélique,l'acide 3-hyvdroxydiaminopimiélique,l'arabinose et le xylose. Dans l'art anterieur,les souches du Genre Actinomadura co- nues avec ces caractéristiques taxonomiques comprennent 5. Actinomadura verrucosospora Nonomura et Ohara 1971 (Hakko Kogaku 49 11, p. 904, 1971) Actinomadura citrea Lavrova et coll. 1972 (Antibiotiki 17 11, p. 965 1972) Actinomadura coerulea Preobrazhenskaya et coll. 1975 (Antibiotiki 20 5, p. 404 1975) Actinomadura luteofluorescens (Shinobu) Preobrazhenskaya et colt. (Microbiologa 44 p. 524, 1975) Dans "Actinomycetes and Related Microorganisms "12 1,,.30,1977,par Preobrazhenskaya et coll.,il est décrit que la couleur du mvNcélium atrien sur des milieux synthétiques est d'abord rose puis se chanae en bleue.Par ailleurs dans "International J. Systematic Bacteriology"19,p. 391-512,1969il est dE- crit que la couleur du mvcélium aérien sur des milieux IS? est iaune ou selon des séries de rouge et que la couleur du mycélium substrat est iaune ou Jaune verdâtre sur le milieu extrait de levure-extrait de malt aar et orange rou- getejuâr geâtre ou rose jaunâtre sur le milieu amidon agar ou tlycerol-asrarag4ne a-nr. D'autre part,la couleur de la croissance de la souche Actinomadura s. Li31 est beige sur lespremiersmilieuxet pratiquement sans couleur sur les deu:der- niers milieux.C'est tout à fait différent des premieres, En ce qui concerne les sources de carbone,les premières utilisent le D-fructose,le sucrose et le D-mannitol alors nue la souche Actinomadura sp. L-31 ne les utilisent pas. C'est une des différences. La couleur du mycélium aérien de Actinomadura citrea est d'abord jau- ne puis se change en bleue,et le piment soluble sur les milieux syntbhétiques est jaune.Cela diffère de Actinomadura sp.L-31. Dans Actinomadura verrucosospora,la couleur du mvcélium substrat est rose ou orange sur le milieu amidon agar et sur le milieu glycérolasparagi- ne agar, du mycélium aérien gris pâle se forme sur le milieu amidon azar et le D-fructose et le D-mannitol sont utilisés. Ceci est différent de la souche Actinomadura sp. L-31. 1I 7 Actinomadura coerulea ne peut pas être identifié puismu'il n'est nas déposé. Il est possible d'utiliser les souches obtenues par certaines trans- formations artificielles de la souche Actinomadura sp. L-31 après application des rayons ultraviolets,des rayons X,des rayons radioactifs etd'un réactif chimique. La culture peut s'effectuer selon la méthode de culture classique pour les Actinomycetes ou les souches résultant de leur transformation.Dans la cul- ture industrielle,il est préférable d'utiliser une fermentation aérobie dans un réservoir de fermentation. La température de la culture se situe dans un domaine permettant la croissance du microorcanlsme pour donner l'Actinomadura L-31 et se situe généralement de 25 à 35 C. Les milieux de culture peuvent être préparés en employant les substan- ces utilisées pour la culture des Actinomycetes.Les sources de carbone peuvent être le glucose,la dextrine,l'amidon,etc..Les sources d'azote peuvent être le germe de froment,la farine de soja,la liqueur de macération du mals,l'extrait de viande et le sulfate d'ammonium.On peut incorporer un sel minéral tel que le sel de sodium,de potassium ou de calcium.Il est prgférable de controler le pH de la culture pour qu'il se situe entre 5 et 9.11 est préférable que le milieu de culture comprenne 0, 5 à 20% P/V de source de carbone et 0,5 i 10% P/V de source d'azote. Le temps de culture dépend des conditions et se situe en général entre 3 i 8 jours.L'Actinomadura L-31 est inclus dans les m9célia et le filtrat. Se- lon les conditions de culture et le genre de souche utilisé, l'Actinomadura L- 31 A et L-31 B se forme dans des proportions diverses. Afin de séparer et de purifier l'Actinomadura L-31 du produit cultivé, on peut utiliser les nrocédés classiques et les combiner en fonction des pro- priétés physicochimiques du produit,par exemple, on peut combiner comme on le souhaite les méthodes d'extraction a l'aide de divers solvants organiaues,le transfert de phase,ou la chromatozraphie de partage ou par absorbants. L'antibiotique Actinomadura L-31 formé dans le produit cultivé est i- solé de préference de la manière suivante. Pour extraire l'Actinomadura L-31 du produit cultivé,on v ajoute un solvant organique tel que methanol,éthanol et acetone.On sépare les mvcélia par une filtration,on ajuste le pH du filtrat do 2'3 puis on extrait l'Acti- nomadura L-31 avec le dit solvant organique.Dans le même procEd6,on peut ex- traire l'Actinomadura L-31 des mvcélia. La solution extraite est traitée par une distillation à l'aide de sol- vant,un transfert de nhase,une réextraction,une précipitation ou une concen- 1 8 tration lusriu'B siccite etc.poursénarer un mélange d'Actinomadura L-31 A et L-31 B.Le mélange est traité par chromatopraphie à l'aide d'un solvant con- venable te] que butanol-acide acétique-eau pour recueuilir la fraction qui confère une activité antibiotique pour le Bacillus stearothermophilus,la frac- tion est concentrée sous pression réduite et est ensuite traitée si n9cessai- re pour donner l'Actinomadura L-3I A et L-31 B purs.Les Actinomadura L-31 A et L-31 B sont des composés un peu acidesqui peuvent être recueuillis sous forme libre et sous forme d'un sel de sodium ou de potassium ou sous forme d' un chlorhydrate ou d'un sulfate. Les Actinomadura L-3I A et L-31 B selon la présente invention possè- dent des activités antibiotiques et sont efficaces comme antibiotiques ou comme produits de départ pour des antibiotiques.On constate une activité an- tibiotique dans un test sur plaque, et on trouve un effet protecteur excellent dans un test avec infection par Escherichia colt etc. chez des souris. La présente invention sera illustrée par certains exemples. Exemple l: Dans 70 ml d'un milieu liquide contenant 1% de glycérine,lZ de gluco- se,l% d'amidon,l% de germes de blé,O,5% de NZ-amine,0,2% de levure de bière, 0,5% de liqueur de macération de mals et 0,2% de carbonate de calcium,on ino- cule la souche Actinomadura spe3FERM-5324) pour la cultiver selon la méthode 2O dite de "culture secouée" à 28 C pendant 5 jours afin de préparer une solutio de préculture. Dans un réservoir de fermentation de 200 litres,on introduit 100O li- tres d'un milieu liquide contenant 2% de glycérine,2% de glucose,2% d'amidon, 1% de Fermes de blé,0,5% de NZ-amine,0,2% de levure de bière,O, 5% de liqueur de macération demais et 0,2% de carbonate de calcium et on inocule I litre de la dite solution de préculture pour la cultiver à 28 C pendant 6 jours dans des conditions d'aération au moyen de hulles à un débit de 100 litreVmin. et un nombre de rotations par minute de 250 t.p.m.. Une fois la culture achevée,on controle le produit cultivé et on ajus- te le pH à 2 à l'aide de HCl,on ajoute 2% de terre de diatomées au produit cultive et on filtre.On effectue une extraction du produit en ajoutant un vo- lume étal de butanol B 80 litres du filtrat.Par ailleurs,on extrait les myce- lia avec 80 litres d'un solvant 80% ae'tone-eau..Anrrs élirmination de l'aceto- ne par distillation,on extrait la Dhase anueuse avec du hutanol.Le hutarol ex- trait est m1élancé avec la phase solv-nt obtenue-'Partir du filtrat de la cul- ture et le mélan9e est concentrr sous pression reduite.La solution copcentr.r est mlan-ee avec 10 litres d'acetate d'ethvle nour donner un rrtcinit. nui est filtré et sche sous pression rrduite:on obtient 50 - d!e noudre rute d' (nea çSL:Hd'!ço:D) (- 'wg 7:anb$ITaads aaToweoa aToAnod() ITUID sud: uoTsn; ap juTod(z) aIed aune no aqaueiq aapnod: 13adsv(I) :( eap/Kqaoplq) V T-I-vanpemou!ozV saiuevAns sanbtaTqDoDTs qd sal g -eladoad sel iuapassod a IE-I la V 1ú--uinpemouzzV sanbTio qtzue sae aapnod ap ameao; snos saleapKqaoltq ammoi (zm oz) and a úg-1 al l (2mgl) and V IC-1-vanpemoutliv,l aualqo anod asolnllaz ans a!qdeaâoulmoaqD aun aed inaq aeuelui np M z a$Tjand uo'l aldmaxal ap apaoaa alI uolaS aapnod ap auuoj snos g 1ú- la V 1ú-'i eanpem ouzVP naiq aoueaIm un,p 0 Oú uoaAua aluazqo anod alTnpa uotssaad snos alTzzis g ia. uaoouoD la nal t aaA -el isa ioueinq ap zleaxap uolnlos el 'Iouuinq apsaall ç atoAe lluaxa xse zuepoad al la ú y Z op Hd un aauuop anod anbTLapqaoluq ap!De,p ap!e,l e oa! -Iple isa asnanue aseqd e.asuqd ap uoleaEdas Il anljo;ja anod %I L unlpos ap aleuoqaiDJq ap sallI ç DaAe ea:uuelut zsa iouevnq op uo!inpos lg Àoueoanq ap aTuaixa,p uotinIos op saJilI ç Da.e qa-uIui Ts ou -evnq ap uofinîos el la lTnpoad eal aiaTuxe anod Iouvinq ap saaTi: 0I aauel -gm isa aaIuaauoa uo!nIos- 1va'ilnpga uo!ssaid snos uo0!T.L; uI zulUaauoD uo l Aejze uolieal eI ailI!n n oa anod Lez op id un iueae nve-auoiaowve %OL ap saeil ç Daae ltnpoad al itaxa uo0nua-louvqlau om ap sia0î E aaue snd nea,l ú aqaospe jueXe laoddns eal ael uo la('(paq puI IziuaqD lqs!qns4ih avd enb!aqe;)OZ-dH uoieul op saill ú uoaITtua as zel!$o al aqaospe uo 'snan -ile aued- aluaouoa Iouuwnq op lluaixep uoinIos aun aTualqo anodtI aldaxalI ap gpgaoad al aud etianm sael aleal uo0'alITj la vIaAmr ua ak.IzInD jïnpoad el aaedos uo l aanilna el ania$jja uo'l aldwexa,l ap CpgDoad al uolaoS 9 :Z a [duaxa *apnod ua saaapAqaolqD slas ap autoj snos (uI 81) and U iú-1 allaI (Uim Si) and V 1-j vanpeuouliV,l a!ualqo anod aj!npa uo!ssad snos aqDas uo qa nea,l l ouvnq ap a4onoD eU aeul u'I ouvnq op amloe. awmaw al e oae qlnpoad al jeax uo la0I Oi ii S 1 ap Hd un ato. anoud anb!apdqaollq ap!oe[ ap opae asnanbe aseqd el aljIp!D uogasuqd ap uolwaads el aonajja anod i, uinTpos ap aleuoqauviq ap [u ooE aenote uo s[nd ioueinq ap Itu o0 suvp nplsga al qnoss!p uo'ai!np -aa uotssaad snos!o-sallae aatuaouoD uo' suoilDIaj sal allfanoaa U0 V IEt-1 PI s!nd a 1ú,-'1 IuipemouP3oVit 2"nl9 pLoïT p isa!suv:lueuAlos ap aouuIju al Daée asoltllan ap auuoloa ns anqdsahoe -oaqa aun anrae;a ua oa aqnaq aapnod ve ap ' g inosstp uo(-[::i7:) neoanb- -gae ap-ta-loueznq suuelos ap aeuvL', unp g!lu!ii- ollad aun sutj a Lú-'I wa V [LE-,l i'npLaouitilDVp a-uul5îi un LZL9Z'Z 1 10 (4)Solubilité:soluble dans le méthanol,l'cthanol.le propanol,le bu- tanol,l'acide acétique et le dimethylformamide: insoluble dans l'acétate d'éthyle,le chloroforme,l'éther l'hexane et l'eau (5) Stabilité:relativement stable à pH 2à 8 (6)Réaction colorée:positive au permenganate de potassium,à la réaction de Ehrlich et à la réaction à]a ninhydrine: n6éative a la réaction au chlorure ferrique (7)Analyse élémentaire: C: 51,71%7; l: 6,23%; 0: 21,03%; N:13,94%; S: 5,82%; Cl: 1, 17% (8)Spectre d'absorption ultraviolet: La figure 1 est mesurée dans le méthanol maximum d'absorption: 280 nm (E1% =45,2) c 15. 290 nm ( épaulement E 1% =38) 1 cm (9)Spectre infra-rouge:La figure 2 est mesurée suivant la méthode K Br absorption( cm-l) 3350, 3050, 2950, 1660, 1530, 1430, 1395, 1340, 1255, 1235, ' 1100, 745, 700 (10)Chromatographie en couche mince de gel de silice valeur Rf: Sov.ant Rf butanol saturé d'eau OD butanol:acide acétinue:eau(2:l:l) 0,6 butanol:eacide acgtique:e-u(4:1:1) 0,2 (11)Aminoacides constitutifs: (a) Avant l'analvse le produit est hydrolysé avec HCl 6N C pendant 17 heures. acide aspartique;acide -lutamique;plycine;valine;leuci- ne;phénylalanine;histidine;deux autres aminoacides in- connus. (b)Analyse par spectre ultraviolet: tryptophane (12)Spectre antimicrobien: Diamêtres d'inhibition de croissance mesurés nar la mé- thode sur plaque indiques dans le tableau 1 Actinomadura-L-31 B (chlorhydrate): (1)&spect:blane ou laune pâle I nedLqul al suep s9gnbTpuI duos an:eld lnis apoqag et Leu snsauL uesstouLD ap Uo0!qTqu,p SdaliWLep sa :uagqo.a&FuTue aa3aouS([I) oqaulco3dal :3alvlO *a.e'n a.lzads led aSaleu (q) *snuuozuT Sú sup[ieoulume sallne xnaptautuetelAugqd:autIe. uautDAlt :au![oadlànl.TeTnI3 api elau1uoIaq3flnotaedse apte *saanaq il Luepuad 3DoII U N9-lDJH ap apieI a osA[O.apXq lsa inpo.l alIasAIeueI lue'Ay(e) :sjlnz;lsuoo saplDeoulmv(II) O (': L:)nea:anbFIe ap!3e:loueinq L() (I:t:g)nea:anbTDe ap$De:lOue3nq u'o neap danIes ioueinq FU dp onaleA aux apoq41L slat (C'c= 3 l 3ueAlos :aaitls ap la> ap azutw tuD noa ua aTqLdelouemoaqlD(OI) 00L 'sg '0011 0gOZ 0091 '01ogI '0Gú 'Opp7l OZSgI '0991 '09S6 '090S '0gE (_mD) uoTidiosqe el uolas anuaeqo zsa z ainT j e'I :a:noi-e.iut aalzadS(6) luatalnuda) wu 06Z (g' mWalg) wu 68Z:uolldiosqup wnmTxem ioueqlgwa l suep aairtsat:sa g a unuç eq.- :zalotIaUaln uo'[quaosqe,p !% L6(OZ:U!Zvú4:H OI5: Si aiz3ads(8) alIeUulamal Bs leuv(L) anà4laaj aanaolqla ne uo2iDoea el E aMTekau !aulapAquIu el UO1DeCa el t' la qaTtllap uoilea el e'mnpsse3od ap aevueuauLuuad ne aAT3Tsod: L Z HU k alqels auowamTelaa: nea,I la vuexak4I 9aoloaD uo!14eUa(9) (TITqe2s(g) aai'I'dauaoJgaol4qa a1'elgq41,p ae4Dti,t suep a3qnlusul :uplwuT ojtIqA44uWTp d[ 3a dnoL39aU epIZeU,'lOUU -nq Ul'tUuuuuu o['[ouuq ['loue3,ul '[ suep a[Linlos: y9lîFqnlos() (nOeu 'SL:} d ' 'O:J) o9- G[a.:arlbTJ1uds aToiejoa a1oanod(E) alelu sed: uoTsn; ap juiod(Z) il ZZL 9ZZ S I 1 12 Tableau 1: gnectre antimicrobien (I3)Ouand bien même l'effet d'inhibition de croissance n'est pas constaté par la méthode sur plaque,on trouve un effet protecteur pour les êtres vivants Par exemple,l'infection par Escherichia coli chez des souris est prévenue dans une proportion de 40 à 80% et 50 à 100Z par injection intrap&ritonea- le d'Actinomadura-L-31 A et L-31 B à des doses de 50 à 100 mg. Test d'infection bactérienne: (ge: 5 semaines - (âge: 5 semainesX On utilise comme formant un eroupe,10 souris femelles ICR/Wf,et on admi- nistre chaque médicament par injection intrapéritonéale(i.p.)5 la dose de mg/Kg par souris pour l'Actinomadura-L-31 A et à la dose de 25 mg/Kgpar souris pour l'Actinomadura-L-31 B,trois iours avant l'inoculation des bactéries.Sept jours après l'inoculation,on observe le nombre de souris qui ne sont pas mortes. Les résultats sont indinués dans le tableau 2. diamètre d'inhibition de croissance.(mrm) Souche Microbienne L-31A L-31B 500J/ml 125 /ml 500 Y/ml 125 r/ml Bacillus stearothermo- 21 15 23 17 philus subsp. calidolactis C-953 Bacillus subtilis PCI 219 O O O 0 Escherichia coli NIHJ JC2 O O O O0 Tableau 2 (14)Test:Toxicité aig e:Pour mesurer la DL50,on utilise des sourie femelles ICR/JCL(agées de 5 semaines)(poids 22,0-1,Og),on ad- ministre le médicament par injection intrapéritonéa- le et on observe les résultats après une semaine.La DL50 estsupérieure à 300 mg/Kg pour l'Actinomadura L-31 A et de 150-250 mg/Kg pour l'Actinomadura-L-31B. Description des dessins: La figure 1 représente le spectre d'absorption ultraviolet de l'Acti- nomadura-L-31 A; La figure 2 représente le spectre infra-rouge de l'Actinomadura!L- 31 A obtenu selon la méthode du disque de KBr; La figure 3 représente le spectre d'absorption ultraviolet de l'Acti- nomadura-L-31 B;et La figure 4 représente le spectre ifra-rouge de l'Actinomadura-L-31 B mesuré selon la méthode du disque de KBr. Organism e Dose Compo mbre de (cell./souris) non mort Staphylococcus L-31 A, 50 mg/kg 4/10 aureus EQP 5 x 10 L-31 B, 25 mg/kg 6/10 aucun 0/10 L-31 A, 50 mg/kg 5/10 Eou ML4707 5 x 10 L-31 B, 25 mg/kg 7/10 aucun 0/10 L-31 A, 50 mg/kg 7/10 serudnasa 2 x 10 L-31 B. 25 mg/kg 8/10 IFO-2901 atrucun 0/10 L-31 A, 50 mg/kg 6/10 Proteuds 7 mirabilia 5 x 10 L-31 B, 25 mg/kg 7/10 mirabiîlia CCM- 680 'aa? 0/10 l 14 REVENDICATIONS 1) A titre de produit l'Actinomadura-L-31 A répondant,sous forme de sel chlorhydrate,aux caractéristiques suivantes: aspect:poudre blanche ou jaune pâle point de fusion:pas clair pouvoir rotatoire spécifique: 5 L 2D -34 (C:0,5; pH:7,5 eau) D analyse élémentaire:(trouvé) C:51,71%; H:6,23%; 0:21,03%; N:13,94%; S:5,82%; C1:1,17% aminoacides constitutifs:acide aspartique;acide glutamique;glycine;valine; phénylalanine;histidine;leucine;tryptophane spectre d'absorption ultraviolet: Figure 1 maximum d'absorDtion: 280 nm: E =c45,2 290 nm: épaulement E:c 38 spectre infra-rouge:Figure 2 absorption( cm-1) 3350,3050,2950,1660,1530, 1430,1395,1340,1255,1235, 1100,745,700 2) A titre de produit l'Actinomadura-L-31 B répondant,sous forme de sel chlorhydrate,aux caractéristiques suivantes: aspect:poudre blanche ou jaune pâle point de fusion:pas clair pouvoir rotatoire spécifique: 25 ID 26 (C:0,5; plH:7,5-eau) analyse élémentaire:(trouvé) C:51,10%; H:6,34%; 0:20,75%; N:14,81%; S:5,91%; C1:1,08%; aminoacides constitutifs:acide aspartique;thréonine;acide glutamique; proline; cd-.lycine;valine;phénylalanine;tryptophane spectre d'absorption ultraviolet: Figure 3 maximum d'absorption: 280 nm:Eî%m=44,8 290 nm:épaulement E lcm=37,3 spectre infra-rouge: Figure 4 absorption (cm-1) 3350,3050,2950,1660,1520, 1440,1390,1340,1260,1230, 1100,745,700 ]5 3) Antibiotique, caractérisé en ce qu'il est constitué par l'un quelconque des produits selon la revendication 1 et 2. 4) Antibiotinue Actinomadura-L-31 caractérisr on ce nu'il. crnrerd les Actinomadura-L-31 A et L-31 B selon les revendications 1 et 2. ) Actinomadura-L-31 A et L-31 B selon les revendications 1 et 2,caractérises en ce qu'ils sont obtenus en cultivant une souclhe Acti- nomadura possédant la fonction de production de J.-31. 6) Actinomadura-L-31 A et L-31 B selon les revendications 1 et 2,caractérises en ce qu'ils sont obtenus en cultivant Actinominadura sp. L-31 déposé au "Fermentation Research Irstitute" dul Japon sous le numero FERM 5324. 7) Actinomadura-L-31 A et L-31 B selon les revendications 1 et 2,caractérisés en ce qu'ils sont obtenus en cultivant une souche Acti- nomadura possédant la fonction de production de L-31 et en isolant l'Actino- madura-L-31 A et L-31 B séparément.