FR 2477175 A1 19810904 FR 8103791 A 19810225 2477 1 75 La présente invention se rapporte d'une façon générale aux enzymes et elle concerne, plus particulièrement, des procédés d'immobilisation d'enzymes sur une matrice solide. De nombreux procédés ont été proposés pour immobiliser des enzymes sur des matrices solides et des recherches sont conti- nuellement poursuivies pour permettre d'immobiliser des enzymes sur des ma- trices solides par des techniques plus simples. L'invention a pour but principal de réaliser des matrices solides portant des enzymes immobilisées dans les matrices sous une forme technologiquement "viable". L'invention vise également à utiliser à titre de catalyseurs, aussi bien dans la synthèse que pour les analyses chimiques ou biologiques, des substances possédant l'activité spécifique des enzymes natu- relles qu'on emploie dans les réactions d'immobilisation. On a utilisé plusieurs schémas de réaction pour l'immobilisation. Par exemple, on a utilisé à grande échelle l'adsorption sur une matrice solide. D'autre chercheurs ont proposé de former une liaison covalente entre la macro- molécule de l'enzyme et un support solide qui est ou bien activé d'une façon convenable ou bien contient des groupes réactifs appropriés. On a également proposé d'englober les enzymes dans un support convenable tel qu'un gel de polymère, une membrane sur une base protéinique ou un polymère synthétique. Enfin, on a proposé la polymérisation de monomères convenables en présence d'enzymes ou la copolymérisation d'un monomère convenable avec des enzymes spécialement activées. Ces deux derniers procédés offrent certains avantages par rapport aux méthodes antérieures car la matrice solide sur laquelle l'en- zyme est fixée peut être préparée convenablement en vue de l'utilisation par- ticulière requise et des caractéristique physico-chimiques appropriées, ainsi que des caractéristiques de stabilité mécanique, de porosité, d'hydrophobie et d'hydrophilie. Les procédés d'immobilisation qui utilisent des réactions de polymérisation sont notamment décrits par J.J. Hamsher dans la demande de brevet français n0 7 325 614. Cependant ces procédés sont basés sur une pré- réaction entre un monomère vinylique contenant un groupe réactif et une enzyme avec formation d'une enzyme portant des groupes vinyliques, suivie d'une réac- tion de copolymérisation amorcée à l'aide de catalyseurs qui ne constituent pas des activants spécifiques de la réaction d'immobilisation. Dans d'autres cas, on a utilisé des réactions de polymérisation en présence d'enzymes mais on a obtenu l'immobilisation des enzymes avec des réactifs fonctionnels qui développent des réticulations entre les enzymes et certains polymères réactifs, tels que le bromure de cyanogène, la chlorotria- zine, le carbodiimide avec des polymères ayant une base d'acrylate de polydy- droxyéthyle ou une base d'acide polyacrylique etc. 2477 1 75 L'expression "copolymérisation des protéines" désigne des pro- cédés qui sont analogues à celui décrit ci-dessus et étudié par D. Jaworek, H. Botsch et J. Maier, dans "Methods in enzymologyv 44, Ed. Laus Mosbach, Academic Press; New York, 1976 p. 195-201; ainsi que par D. Jaworek, dans les demandes de brevet allemand non examinées n0 2 260 185 et 2 128 743. Ces procédés sont fondés sur la réaction de vinylation d'enzymes avec des monomères bifonctionnels, par exemple des agents d'acylation et/ou d'alkylation, tels que le 3,4-époxybutène, le 2,3-époxyacrylate de propyle et le chlorure d'acryloyle. Par ce procédé il est possible d'immobiliser plusieurs enzymes vinyliques en utilisant principalement un gel de polyacrylamide comme support avec un rapport de polymère synthétique à l'enzyme qui est en général de plus de 10. Le procédé qui fait l'objet de l'invention permet l'immobilisa- tiond 'une quantité très importante d'enzymes, de préférence dans des zones superficielles ou des zones facilement accessibles de la matrice qui agit à la façon d'un support solide et qui est formé de polysaccharides contenant de petites quantités de monomères vinyliques, ces quantités étant fréquemment inférieures ou égales à la quantité de l'enzyme. Le procédé selon l'invention permet également d'éliminer les réactions préalables avec des substances, comme cela se produit fréquemment dans le cas des enzymes vinyliques donnant naissance à des produits non homogènes.en ce qui concerne le degré de substi- tution et également responsables de phénomènes de désactivation des enzymes. On peut également, avec le procédé selon l'invention,éviter tous les inconvé- nients constatés avec les réactions de copolymérisation amorcées par des rayon- nements à haute énergie, réactions qui aboutissent fréquement à une désactiva- tion des enzymes et/ou à la formation de produits dont les propriétés cinéti- ques diffèrent suffisamment des propriétés correspondantes des enzymes libres ayant servi de matières de départ. En particulier plusieurs enzymes immobilisées sur des copolymères ont été préparées dans la technique antérieure après vinylation de la molécule d'enzyme sur une matrice de polyhydrate de carbone, mais l'efficacité de la réaction n'est pas satisfaisante. On a trouvé que le choix approprié du système servant à initier la réaction de polymérisation, le choix approprié de la matrice utilisée comme support et le choix convenable du monomère vinylique et de l'enzyme ont permis d'obtenir des enzymes immobilisées sur une matricesolide préformée insoluble dans une phase aqueuse de telle sorte que la matrice préserve à un degré notable l'activité biologique originelle de l'enzyme. Plus précisément, on peut obtenir des produits avec un meilleur 2477 1 75 rendement d'immobilisation de l'enzyme, ayant des propriétés cinétiques plus proches de celles de l'enzyme libre en utilisant une technologie sensiblement moins complexe. On obtient les produits sous formre de poudres, fibres, perles, pellicules, feuilles, gels, etc., selon la nature de la matrice ayant servi de support. L'essence de l'invention concerne la formation de radicaux libres produits par la lumière ultra- violette en présence de chlorures métalliques appropriés qui transfèrent facilement leur activité aussi bien à la matrice servant de support qu'à l'enzyme et au monomère vinylique, selon le schéma de réaction ci-après: MeX +J V + support = support. n + + enzyme = enzyme. + + monomère = monomère X=Cl: n=2,3 ou 4; Me-Fe On peut également utiliser des chlorures de cérium et de cuivre ainsi que les chlorures d'autres métaux mais on préfère le chlorure de fer. La formation de l'enzyme immobilisée sur le copolymère a lieu par l'intermé- diaire d'une polymérisation du monomère et se termine conformément aux diverses réactions possibles d'achèvement des macroradicaux pendant le stade de crois- sance du polymère, c'est-à-dire principalement par transfert aux molécules du monomère, transfert aux macromolécules de l'enzyme, transfert aux macromo- lécules du support ou une combinaison de deux macroradicaux. Selon le procédé qui fait l'objet de l'invention, on peut utili- ser une suspension ou une solution d'un polyhydrate de carbone dans un milieu aqueux. On ajoute simultanément le monomère vinylique et l'enzyme de préférence en solution aqueuse, puis on introduit le catalyseur qui est en général sous forme d'un sel ferrique. On élimine ensuite l'oxygène dissous dans la sus- pension ou solution en y faisant barboter de l'azote ou un autre gaz inerte. On utilise ensuite une source de lumière ultra-violette ayant un spectre com- pris entre environ 250 et 340 nyLi- pour irradier la matière. On laisse l'ir- radiation se poursuivre pendant une période allant de quelques minutes à une heure environ. Après un lavage minitieux, la matière solide obtenue peut servir telle quelle ou bien elle peut être conservée à l'état humide ou encore lyophi- lisée. On a trouvé que des monomères vinyliques particulièrement effi- caces répondent à la formule 24 77 1 7 5 H C=C-R' R dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou le radical méthyle, R' représente le groupe CN ou COOR", o R" est un radical alkyle inférieur, ce dernier contenant facultativement des groupes époxy ou hydroxy. On a également constaté qu'on peut utiliser avec des résultats tout aussi efficaces certains dérivés N-acryloyliques de composés azotés hétérocycliques, comme par exemple la N,N'-bis-acryloylpipérazine et la N,N',N"-tris-acryloyl-symhexahydrotriazine. Il convient de remarquer que le sel ferrique aux concentrations habituellement utilisées agit fréquement comme un inhibiteur de la réaction enzymatique, alors que dans le procédé selon l'invention, l'effet inhibiteur qu'on peut attribuer au fer est sensiblement réduit ou même nul. On a constaté que la formation d'une enzyme immobilisée sur le copolymère est effectuée pendant le procédé selon l'invention. Cette forma- tion est démontrée par l'expérience suivante qui illustre également la pos- sibilité d'immobilisation des protéines de tous les types, c'est-à-dire des protéines ne possédant pas nécessairement d'activité enzymatique. Immobilisation d'albumen avec l'acrylate de méthyle On dissout 100 mg d'albumine dans 5 ml d'eau. On ajoute une dose de 250-ml d'acrylate de méthyle et on expose la matière à un rayonnement ultra-violet provenant d'une lampe, par exemple une lampe à vapeur de mercure à basse pression, telle que la lampe Philips, en présence de chlorure ferrique FeC13, en une proportion comprise entre environ 0,1 et 100 millimoles. On fait barboter de l'azote dans la solution pour chasser l'oxygène gazeux. On laisse la réaction se poursuivre pendant 30 minutes. Le produit ainsi formé prÉcirite de la solution laiteuse à la suite de l'addition de 1 volume de méthanol à une température de 4 à 200C. On recueille le précipité et on l'extrait de façon répétée avec de l'acétone, qui est un solvant pour le polyacrylate de méthyle mais n'est pas un solvant de l'albumine, à une température de 4 à 100C pour éliminerl'homopolymère, c'est-à-dire le polyacrylate de méthyle, qui a pu se former. On extrait de façon répétée le résidu insoluble dans l'acétone avec un tampon à pH 5, 6 qui est un solvant de l'albumine, afin d'enlever toute l'albumine éventuelle qui n'a pas réagi. On répète avec ce résidu le procédé d'extraction avec l'acétone et avec la solution aqueuse. De cette façon, on obtient à titre de produit final, un résidu insoluble dans l'acétone et dans l'eau qu'on soumet à une analyse I.R. Le spectre indique des bandes d'absorption qu'on peut attribuer à la fois à l'albumine et au polyacrylate de méthyle, ce 2477 1 75 qui confirme la composition du copolymère. Selon le procédé qui fait l'objet de l'invention, on peut pré- parer généralement les copolymères d'une enzyme quelconque et en particulier, d'enzymes protéolytiques telles que la papalne, la trypsine et la chymotrypsine. Le procédé est également applicable aux enzymes hydrolytiques telles que les amylases, cellulases,. -glucuronidase-arylsulfatases, estrases, héparinases, pénicillinamidases et uréases, aux oxydases tels qu aminoacidoxy- dases, diaphorases, glucoseoxydases et peroxydases; aux hydrogénases tels que stéroidodéshydrogénases, déshydrogénases d'acide lactiqueldéshydrogénases d'alcools aux catalases; aux isomérases tels que invertases et stéroidoisomé- rases. Comme il a déjà été mentionné on peut préparer des copolymères de polysaccharides et de protéines même, dans le cas o les protéines ne sont pas des enzymes. Les exemples suivants, dans lesquels toutes les proportions sont en poids, servent à illustrer l'invention, en particulier différents monomères, différentes enzymes et des supports variés, sans aucunement en limiter la portée. EXEMPLE 1 Préparation de peroxydase celluloses-copolyglycidylméthacry- late On met en suspension dans 10 ml d'eau de la cellulose à raison de 100 mg sous des formes physiques variées, telles que des fibres, des pel- licules ou des feuilles. On ajoute ensuite entre 0,1 et 100 mg de FeC13 tout en réglant le pH de la suspension à environ 4. On ajoute de I à 100 mg d'un peroxydase, par exemple du type"peroxydase de raifort" et aussi de 1 à 100 mg de méthacrylate de glycidyle. On irradie le mélange avec une source de lumière U.V. à l'aide d'une lampe à vapeur de mercure à basse pression, tout en prenant les disposi- tions nécessaires pour absorber les rayonnements thermiques à l'aide d'un filtre convenable. On laisse la copolymérisation se poursuivre en atmosphère d'azote pendant 30 minutes. On lave la matière solide ainsi obtenue de façon répétée avec une solution-tampon à pH 6 et ensuite, également de façon répétée, avec une solution 0,3 % M de NaCI. Finalement on détermine l'activité enzymatique du copolymère en effectuant la réaction spécifique pour le peroxydase, par exemple, une détermination spectrophotométrique avec H202- guaiacol ou paminophénazone. On obtient une efficacité de réaction exprimée en termes de la quantité d'acti- vité enzymatique immobilisée par quantité d'activité enzymatique ayant réagi, le résultat étant multiplié par 100 et représentant de 10 à 24 % selon la con- centration de l'enzyme. On peut également préserver le copolymère à l'état humide à une température de 4 à 5 C et dans ce cas il conserve 80 % de son activité au bout d'une période de plus d'un an. Les propriétés analytiques correspondent aux propriétés de la composition contenant le peroxydase de cellulosepolyglycidyl- méthacrylate. EXEMPLE 2 Préparation de peroxydase-cellulose-copolyacrylate de méthyle. On effectue la même réaction que dans l'exemple 1, sauf que le monomère vinylique est l'acrylate de méthyle. On lave la matière solide recueil- lie de la réaction avec des solutions à pH 5,3. Par détermination de l'activité enzymatique du copolymère, on établit que l'efficacité d'immobilisation corres- pond à une valeur de 3 %. EXEMPLE 3 Préparation de peroxydase-cellulose-copolyacrylonitrile. On répète la réaction de l'exemple I avec les modifications suivantes: la cellulose est constituée de 5 g d'une matière gonflée sous forme de perles et le monomère vinylique est l'acrylonitrile. Après lavage avec des solutions à pH 5,3, le copolymère présente une activité de peroxydase, l'effica- cité de la réaction étant de 70 %. EXEMPLE 4 Préparation de peroxydase-cellulose-copolymnthacrylate de méthyle. On procède comme dans l'exemple -2 sauf que le monomère vinylique est le méthacrylate de méthyle. L'efficacité de la réaction est de 7 %. EXEMPLE 5 Préparation de peroxydase-cellulose-copoly(hexahydro-trisacryloyl- s-triazine). On effectue la même réaction que dans l'exemple 1, sauf que le monomère est l'hexahydrotriacryloyl-s-triazine. L'efficacité de la réaction est de 28 %. EXEMPLE 6 Préparation de peroxydase -cellulose-copoly(bis-acryloylpi- pérazine). On procède comme dans l'exemple 1, sauf que le monomère vinylique est la bis-acryloyI-pipérazine. L'efficacité de la réaction est de 20 %. EXEMPLE 7 Préparation de Cellulase-Sépharose (marque déposée)-copolyglylidylméthacrylate. On met en suspension 100 mg de Sépharose dans 10 ml d'eau, on ajoute de 0,1 à 100 mg de FeC13, on règle le pH à une valeur de 4 à 5, 1 pour mg de cellulase, comme par exemple de Cellulase F et on ajoute du méthacry- late de glycidyle à raison de 1 à 100 mg. On peut également utiliser l'un des monomères qui ont été employés dans les exemples 2 à 6. On maintient la tempéra- ture au dessous de 20 C. On effectue l'irradiation avec une source de lumière U.V. qu'on obtient à l'aide d'une lampe à vapeur de mercure à basse pression. On laisse la copolymérisation se poursuivre pendant 30 minutes, puis on lave le copolymère comme dans l'exemple 1 et on détermine l'activité enzymatique en utilisant comme substrat une carboxyméthylcellulose. L'efficacité d'immo- bilisation qu'on calcule sur la base d'une mesure d'activité est de 82 %. EXEMPLE 8 Préparation d' d -amylase-Sépharose (marque déposée)-copolymé- thacrylate de glycidyle. On immobilise 1' i -amylase avec la même réaction que dans l'exemple 7, sauf que l'enzyme est 1' ( -amylase. L'efficacité de l'immobilisa- tion est de 5 %. EXEMPLE 9 Préparation de peroxydase-Sépharose (marque déposée)-copoly (hexahydrotriacryloyl-s-triazine). On répète la même réaction d'immobilisation avec le Sépharose que dans l'exemple 7, en apportant les modifications suivantes: l'enzyme uti- lisée est la peroxydase et le monomère vinylique est l'hexahydrotriacryloyl-s- triazine. L'efficacité d'immobilisation est de 38 %. EXEMPLE 10 Préparation de glucose-oxydase-Sépharose (marque déposée)- copolyméthacrylate de glycidyle. On effectue la même réaction que dans l'exemple 6 sauf que l'enzyme utilisée est le glucose-oxydase (E.C.). L'efficacité d'immobilisation est de 52 %. EXEMPLE 1l1 Préparation de peroxydase-amidon-conolyméthacrylate de glycidyle. - On dissout 100 mg d'amidon dans 10 ml d'eau et on effectue les additions suivantes: 0,1 à 100 mg de FeCI3 pendant qu'on règle le pH à 4; puis I à 100 mg de méthacrylate de glycidyle-peroxydase. On peut également utiliser l'un des monomères qui ont été employés dans les exemples 2 à 7. On maintient la température au dessous de 20 C. On utilise comme source de lumière U.V. une lampe à vapeur de mercure à basse pression. On laisse la copolymérisa- tion se dérouler pendant 30 minutes. On lave le précipité obtenu comme dans l'exemple I et on détermine l'activité du copolymère. On calcule l'efficacité d'immobilisation en se basant sur la mesure de l'activité et on trouve 40 %. Les propriétés analytiques du produit correspondent, comme on pouvait s'y attendre, à un produit de type peroxydase-amidon-polyméthacrylate glycidylique. - Les exemples ci-dessus ne constituent que quelques versions du procédé d'immobilisation d'enzymes sur un support solide comprenant un polyhy- drate de carbone, en utilisant des réactions simples d'immobilisation. Il est évident que l'efficacité du procédé dépend de plusieurs facteurs tels que les propriétés physiques du support, les propriétés physiques du monomères et les propriétés physiques de l'enzyme. -_ Il convient également de remarquer qu'on peut immobiliser plusieurs enzymes simultanément sur la même matrice. 2477 1 7 5 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un copolymère de polysaccharide pos- sédant une activité enzymatique, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter à une suspension de polysaccharide en milieu aqueux, un monomère vinylique et une enzyme, puis un catalyseur qui comprend un sel métallique et à irradier le mélange résultant avec une source de lumière ultra-violette. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sel métallique est un sel ferrique. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le monomère vinylique est un monomère de formule: H2C = C-R' R (I) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou le radical méthyle, R' représente CN ou COOR" et R" représente un radical alkyle inférieur. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que dans le monomère vinylique, R" est substitué par au moins un groupe époxy ou hydroxy. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le monomère vinylique est l'acrylate de méthyle. 6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le monomère vinylique est le méthacrylate de glycidyle. 7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le monomère vinylique est l'acrylonitrile. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le monomère vinylique est un dérivé N-acryloylique d'un composé contenant un noyau azoté hétérocyclique. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le monomère vinylique est la bis-acryloylpipérazine. 10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le monomère vinylique est la N,N,.N"-trisacryloyl-hexahydrotriazine symétrique. 11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est une enzyme protéolytique choisie parmi la papalne, la trypsine et la chymotrypsine. 12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est une enzyme hydrolytique choisie parmi les amylases, cellulases, glucuronidase-arylsulfatases, estérases, héparinases, pénicillinamydases et uréases. 13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est une oxydase choisie parmi les aminoacidoxydases, les diaphorases, 2477 1 75 les glucosesoxydales et les peroxydases. 14. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est une déshydrogénase choisie parmi les stéroidoacidrogénases, les hydrogénases de l'acide lactique et les déshydrogénases d'alcools. 15. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est une catalase. 16. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est une isomérase choisie parmi les inVertases et les stéroidoisomé- rases. 17. Copolymère de polysaccharide obtenu par mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.