FR 2476092 A1 19810821 FR 8003700 A 19800220 La présente invention a pour objet un procédé de synthèse de polynucléotides. De façon plus précise, elle se rapporte à la synthèse de polynucléotides par un procédé consistant à former une liaison phosphotriester entre dérivés de nucléotides et/ou de polynucléotides, au moyen d'un agent de condensation approprié. On sait que la synthèse des polynucléotides présente un grand intérêt dans différents domaines de la biologie moléculaire, en particulier pour la synthèse de gènes et également pour l'extraction et la purification des acides ribonucléiques messagers. Jusqu'à présent, la synthèse de polynucléotides par formation de liaisons phosphotriester a été réalisée au moyen d'agents de condensation tels que le chlorure de l'acide triisopropylbenzènesulfonique, ou des dérivés de cet acide. Cependant, l'utilisation de ces agents de condensation présente certains inconvénients. En effet, le chlorure de l'acide triisopropylbenzènesulfonique conduit à la formation de sous-produits de sulfonation parasites, et il ne permet d'obtenir que de très faibles rendements (10 à 20%) pour la préparation de polynucléotides renfermant la base guanine. On suppose que la faiblesse de ces rendements peut être attribuée à la libération d'acide chlorhydrique qui provoque la rupture de la liaison N-glycosylique de cette base. Aussi, on a envisagé l'utilisation de dérivés de l'acide triisopropylbenzènesulfonique par exemple de dérivés comportant des groupements imidazolinium, triazolinium ou tétrazolinium. Parmi ces dérivés qui ont permis de réaliser la synthèse de fragments d'ADN, le triisopropyl benzènesulfonate de tetrazolinium présente une bonne réactivité, mais il a l'inconvénient de ne pas etre stable et de craindre l'humidité. De cé fait, on doit le préparer juste au moment de son utilisation, ce qui constitue un inconvénient particulièrement important car la réaction a lieu le plus souvent à un stade avancé de la synthèse, et les résultats obtenus avec un agent de condensation non fraîchement préparé sonttrès mauvais. Par ailleurs, ces agents de condensation ne permettent pas l'obtention de polynucléotides de longueur de channe relativement grande, par exemple supérieure à 6. La présente invention a justement pour objet un procédé de synthèse de polynucléotides par formation d'une liaison phosphotriester au moyen d'un nouvel agent de condensation qui présente l'avantage d'être stable dans le temps et de permettre la synthèse de polynucléotides ayant une longueur de chaîne relativement élevée, avec de bons rendements. Selon l'invention, le procédé de synthèse de polynucléotides par formation d'une liaison phosphotriester entre dérivés de nucléotides et/ou de polynucléotides au moyen d'un agent de condensation, se caractérise en ce que ledit agent de condensation est constitué par un sel de benzotriazolyl N-oxytrisdialkylaminophosphonium répondant à la formule suivante dans laquelle R1 et R2 qui sont identiques ou différents représentent un radical alkyle et A représente un anion peu nucléophile. Selon l'invention, les radicaux alkyles sont avantageusement des radicaux en C1 à C6, et l'anion A, peu nucléophile, est avantageusement constitué par PF6, BF4, ou a d'autres anions ayant sensiblement le même pouvoir nucléophile. L'agent de condensation peut être par exemple l'hexafluorophosphate de benzotriazolyl N-oxytrisdiméthylaminophosphonium, c 'est-à-dire le composé répondant à la formule (I) dans laquelle A représente PF6 et R1 et R2 représentent chacun un radical méthyle. On précise que ce composé qui est disponible dans le commerce peut être préparé par le procédé décrit dans l'article suivant : B. CASTRO, J.R. DORMOY, G. EVIN et C. SELVE Tetrahedron Letters NO 14, pages 1219-1222 (lu75). De préférence, on l'utilise pour la synthèse de polynucléotides de type ADN. Dans ce cas, le procédé consiste a) à faire réagir en présence dudit agent de con densation : - un dérivé de nucléotide ou de polynucléotide répondant à la formule (II) : dans laquelle B et B qui peuvent etre identiques ou différents, représentent une base purique ou pyrimidique qui lorsqu'elle comporte un groupe NH2 est substituée par un groupe protecteur de ce groupement NE2, yl représente un groupe protecteur d'une fonction hydroxyle, y2 et Y3 qui peuvent etre identiques ou différents, représentent un groupe protecteur d'un groupe phosphate, X représente un cation1 et n = Q ou représente un nombre entier ; et dans laquelle lorsque n est supérieur à 1, B2 et Y2 peuvent être identiques ou différents dans les n motifs ; et - un dérivé de nucléotide ou de polynucléotide répondant à la formule (III) dans laquelle B3 et B4 qui peuvent être iden tiques ou différents, représentent une base purique ou pyrimidique qui lorsqu'elle comporte un groupement NH2 est substituée par un groupe protecteur de ce groupement NH21 Y4 représente un groupe protecteur d'un groupement phosphate, Y5 représente un groupe protecteur d'une fonc tion hydroxyle, n' = 0 ou représente un nombre entier ; et dans laquelle lorsque n' est supé rieur à 1, B4 et Y4 peuvent être identiques ou différents dans les n' motifs ; et b) à séparer du milieu réactionnel le dérivé de polynucléotide de formule (IV) ainsi obtenu dans laquelle les différents symboles sont tels que définis ci-dessus. Cette réaction est de préférence réalisée en utilisant un large excès de l'agent de condensation, dans un solvant constitué de préférence par une base hétérocyclique azotée telle que la pyridine et en milieu anhydre. A titre d'exemple, lorsque l'agent de condensation est l'hexafluorophosphate de benzotriazolyl N-oxytrisdiméthylaminophosphonium (BOP) sa concentration dans le solvant est de préférence supérieure à 40 mg/ml. Dans certains cas, il peut être intéressant de réaliser la réaction à une température supérieure à la température ambiante, car la vitesse de réaction augmente avec la température. Cependant, la température ne doit pas être trop élevée pour éviter qu'il ne puisse se produire une décomposition des produits de réaction. On a constaté que dans le cas. du BOP, on pouvait utiliser des températures allant jusqu'à 500C et améliorer ainsi la cinétique de réaction. Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention dans le cas de la synthèse de polynucléotides à partir de dérivés répondant aux formules (Il) et (III), on utilise des groupes protecteurs appropriés tels que ceux qui sont habituellement utilisés pour ce type de synthèse, c'est-à-dire des groupes qui soient suffisamment stables dans les conditions de la réaction, tout en étant susceptibles d'être éliminés sélectivement en fin de réaction. A titre d'exemple, le groupe protecteur yl peut être constitué par un groupe diméthoxytrityle, trityle ou monométhoxytrityle. Pour les bases B1, B2, B3 et B4 qui sont des bases puriques ou pyrimidiques telles que l'adénine, la cytosine, la guanine, la thymine ou l'uracile, celles-ci sont substituées par un groupe protecteur lorsqu'elles comportent un groupe NH2 extérieur au cycle, comme l'adénine, la cytosine et la guanine. Dans ce cas, ce groupement NH2 est avantageusement substitué par un groupe protecteur capable de former avec NH2 une fonction amide, par exemple par des groupes tels que ceux décrits dans l'article :V.ARMANATH et A.D. BROOM, Chemical Review 1977, Vol. 77, page 183. Avantageusement, lorsque la base est la guanine, le groupement protecteur est l';sobu- tyryle, lorsque la base est la cytosine, le groupement protecteur est le benzoyle ou l'anisoyle et lorsque la base est l'adénine, le groupement protecteur est le benzoyle. Les groupes protecteurs Y2, Y3 et Y4 des groupements phosphate sont de préférence identiques de façon à faciliter ensuite les traitements ultérieurs de déprotection. Ces groupes Y2, Y3 et Y4 sont avantageusement constitués par un phényle substitué tel que le groupe orthochlorophényle ou parachlorophényle. Pour le groupe protecteur Y5, celui-ci peut être constitué par un groupe benzoyle, acétyle, anisoyle ou un phosphate triester. Enfin, le cation X du dérivé de formule (II) est avantageusement un cation ammonium de formule dans laquelle R3, R4 et R5 qui peuvent être identiques ou différents, représentent des radicaux alkyle. -Avantageusement, ce cation est le triéthylammonium. Toutefois, on peut utiliser d'autres cations, par exemple des cations bivalents, qui sont associés à deux anions tels que celui représenté sur la formule (II). En fin de réaction, on sépare le dérivé de formule (IV) du milieu réactionnel par des procédés classiques, puis on le soumet à une purification, par exemple par chromatographie liquide haute pression. Après purification, on élimine les groupes protecteurs des bases puriques ou pyrimidiques, les groupes protecteurs "2 Y3 et Y4 des groupements phosphates ainsi que le groupe protecteur Y de la fonction hydroxyle par des procédés classiques. Généralement, on élimine sélectivement les groupes protecteurs des bases en même temps que les groupes protecteurs Y , Y et Y4 par un traitement au moyen d'une solution basique telle que l'ammoniaque, puis on élimine le groupe yl par un traitement acide par exemple au moyen d'acide acétique. Ainsi, on obtient le polynucléotide libre que l'on soumet ensuite à un traitement de purification complémentaire par chromatographie. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture de l'exemple suivant donné bien entendu à titre illustratif et non limitatif. Cet exemple se rapporte à la synthèse d'un pentadécanucléotide par condensation d'un tétranucléotide avec un undécanucléotide, en utilisant comme agent de condensation l'hexafluorophos- phate de benzotriazolyl N-oxytrisdiméthylaminophosphonium (BOP). Pour cette synthèse, le tétranucléotide correspond à la formule (II) dans laquelle - n est égal à 3, - El représente le groupe diméthoxytrityle (DMTr), - Y2 et Y3 représentent le groupe parachlorophényle (p-Cl-), - B2 représente dans le premier motif l'adénine (A) protégée par le groupe benzoyle (bz) et dans les deux motifs suivants, la thymine (T), - B1 représente la thymine et - X représente iH(C2H5)3 f c'est-à-dire en écriture abrégé le tétranucléotide de formule : d > Tr Abz T - T - T - NH(C2il5)3I (V) dans laquelle - représente la liaison phosphotriester p-Cl-0-P=0. L'undécanucléotide correspond à la formule (III) dans laquelle - n' est égal à 10, - Y4 représente le groupe p-chlorophényle (p-Cl-#) , - B3 représente la thymine (T), - B4 représente la guanine (G) protégée par le groupe isobutyryle (ibu), l'adénine (A) protégée par le benzoyle (bz), la thymine (T), la cytosine (C) protégée par le groupe anisoyle (an) ; et 5 - Y5 représente le groupe benzoyle, c'est-à-dire, en écriture abrégée l'undécanucléotide de formule : d T-G i bU,Ab Z,Ab Z,T-Ab -Abz-T-Abz-T-Abz-Abz-can Pour cette réaction, on utilise comme solvant de la pyridine anhydre qui a été séchée o par deux passages sur tamis moléculaire 4A et stockée en flacon hermétiquement bouché. On prépare tout d'abord le sel de triéthylammonium du- tétranucléotide à partir d'un tétranucléotide obtenu précédemment par synthèse au moyen du même agent de condensation, qui correspond à la formule (II) dans laquelle X est remplacé par le groupe cyanoéthyle (CNEt), c'est-à-dire le composé de formule diDMTr nbZ-T-T-T-CNEt (VII) On dissout dans 300 l de pyridine et 100111 d'eau, 56 mg du composé de formule (VII) (0,0259 mmole). On ajoute 100 > 1 de triéthylamine à la solution et on laisse évoluer la réaction à température ambiante. Après 30 mn, on arrête la réaction en évaporant le solvant sous vide poussé. On obtient ainsi le sel de triéthylammonium du tétranucléotide, c'est-à-dire le composé de formule (V). On ajoute ensuite à ce composé 60 mg (0,0129 mmole) de l'undécanucléotide de formule (VI) en solution dans 1,5 ml de pyridine anhydre, puis on sèche le mélange sous vide pousse. On précise que l'undécanucléotide a été obtenu précédemment par synthèse en utilisant également comme agent de condensation l'hexafluorophosphate de benzotriazolyl N-oxytrisdiméthylaminophosphonium. On dissout le mélange sec dans 2 ml de pyridine, on le sèche sous vide poussé et on répète cette opération deux fois. On prépare la solution de l'agent de condensation (BOP) en dissolvant 70 mg de ce réactif dans 2 ml de pyridine anhydre et en séchant la solution sous vide poussé, cette opération étant répétée deux fois en utilisant à chaque fois 2 ml de pyridine anhydre. Après séchage on le dissout dans 1,5 ml de pyridine anhydre, puis on l'ajoute au mélange des deux polynucléotides de formule (V) et (VI) en opérant en boîte à gants sous atmosphère d'azote, et on maintient la solution sous agitation pendant 42 heures, à la température ambiante. On reprend ensuite la solution par 30 ml de chloroforme et on la lave successivement avec 20 ml de solution aqueuse à 5% de dearbonate de sodium, puis deux fois avec 20 ml de solution aqueuse saturée en chlorure de sodium et avec 20 ml d'eau. On sèche ensuite la phase chloroformique sur sulfate de sodium, on la filtre puis on la fractionne par chromatographie liquide à haute pression. Pour ce fractionnement, on utilise une colonne de chromatographie ayant une longueur de 60 cm et un diamètre de 0,96 cm remplie d'une phase stationnaire ayant une granulométrie de 10 > constituée par le produit vendu sous la marque PARTISIL qui est une silice. On réalise l'élution de la colonne avec une solution de méthanol et de chloroforme dont la concentration en méthanol, au cours de l'élution varie de O à 48 selon un gradient linéaire, pendant une durée de 15 mn, puis de 4 à 15% selon un gradient linéaire en 2 heures. Dans ces conditions, le polynucléotide obtenu qui correspond à la formule suivante (VIII) d IIIMTr A Ab2T-T-T-T-,ibu bz~Abz~T~ AbZ T ,aribz Obzi est élué en 25 mm. L'élution du polynucléotide est repérée au moyen d'un détecteur U.V. à 320 nm. On évapore à sec les fractions du polynucléotide obtenu, et on recueille ainsi 70 mg de ce polynucléotide, ce qui correspond à un rendement de 72%. On soumet ensuite ce polynucléotide à deux traitements pour éliminer les groupes protecteurs. Le premier traitement qui assure l'élimination des groupes protecteurs des bases et du groupe parachlorophényle est réalisé au moyen d'ammoniaque, et le deuxième traitement qui est destiné à assurer l'élimination du groupe diméthoxytrityle est réalisé au moyen d'acide acétique. On purifie ensuite le polynucléotide libre ainsi obtenu par chromatographie liquide sous haute pression sur colonne échangeuse anionique commercialisée sous la dénomination PARTISIL 10 SAX, puis sur une colonne de silice greffée LICHRO SORB RP 8. On vérifie ensuite que le polynucléotide obtenu correspond bien à la formule d A-T-T-T-T-G-A-A-T-A-T-A-A-C-A bzj par la technique suivante. On le marque au phosphore 32 par la T4 polynucléotide Kinase et on vérifie que sa structure correspond bien à la formule donnée ci-dessus par la méthode de MAXAM et GILBERT. Ce polynucléotide est très bien digéré par l'exonucléase du type 3'5' qui donne l'acide adénylique marqué au phosphore 32. On constate ainsi que le procédé de l'invention permet d'obtenir un polynucléotide de longueur de channe relativement élevée avec un rendement très satisfaisant (72%). REVENDICATIONS 1. Procédé de synthèse de polynucléotides par formation d'une liaison phosphotriester entre dérivés de nucléotides et/ou de polynucléotides au moyen d'un agent de condensation, caractérisé en ce que ledit agent de condensation est constitué par un sel de benzotriazolyl N-oxytrisdialkylamino phosphonium répondant à la formule suivante : dans laquelle R1 et R2 gui sont identiques ou différents représentent un radical alkyle et A représente un anion peu nucléophile. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que A représente PF ou BF4. 6 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de condensation est 1'hexafluorophosphate de benzotriazolyl N-oxytris d iméthylaminophosphon ium. 4. procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il consiste : a) à faire réagir en présence dudit agent de conden sation - un dérivé de nucléotide ou de polynucléotide répondant à la formule (Il) dans laquelle B1 et B2 qui peuvent être identiques ou différents, représentent une base purique ou pyrimidique qui lorsqu'elle comporte un groupe NH2 est substituée par un groupe protecteur de ce groupement NH2, yl représente un groupe protecteur d'une fonction hydroxyle, y2 et Y3 qui peuvent être identiques ou différents, représentent un groupe protecteur d'un groupe phosphate, X+ représente un cation, et n = O ou représente un nombre entier et dans laquelle lorsque n est supérieur à 1, B2 et Y2 peuvent être identiques ou différents dans les n motifs ; et - un dérivé de nucléotide ou de polynucléotide répondant à la formule (111) : dans laquelle B3 et B4 qui peuvent être identi ques ou différents, représentent une base purique ou pyrimidique qui lorsqu'elle comporte un groupement NH2 est substitué par un groupe protecteur de ce groupement NRZ, Y4 représente un groupe protecteur d'un groupement phosphate, Y5 représente un groupe protecteur d'une fonc tion hydroxyle, n' = 0 ou représente un nombre entier ; et dans laquelle lorsque n' est supé rieur à 1, B4 et Y4 peuvent être identiques ou différents dans les n' motifs ; et b) à séparèr du milieu réactionnel le dérivé de polynucléotide de formule (IV) ainsi obtenu dans laquelle les différents symboles sont tels que définis ci-dessus. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que y2 Y3 et Y4 représentent un groupe para ou orthochlorophényle. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que yl représente le groupe diméthoxytrityle. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que Y5 représente le groupe benzoyle ou phosphate triester. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que X représente un cation de formule dans laquelle R3, R4 et R5 qui sont identiques ou différents, représentent un radical alkyle. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on fait réagir les dérivés de nucléotides t/ou de polynucléotides avec un excès dudit agent de condensation, dans un solvant constitué par une base hétérocyclique azotée, en milieu anhydre. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le solvant est la pyridine.