FR 2464269 A1 19810306 FR 7921811 A 19790830 L'invention est relative à un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique capable de coder une séquence peptidique immunogène correspondant à l'anty;ène de surface du virus de l'hépatite virale B, et aux polypeptides et peptides obtenus . Elle Elle concerne également un procédé permettant d'ob- tenir un tel acide nucléique. L'hépatite B est une maladie virale fréquente tout particulièrement en Afrique Tropicale, en Asie du Sud-Est et en Extrême-Orient. L'agent étiologique est un virus (HBV) ou particule de Dane, comprenant une enveloppe antigène Australia ou antigène HBs), une capside (antigène HBc), une polymérase endogène et une molécule d'ADN circulaire partiellement simple brin; le brin le plus long de cette molécule d'ADN comporte près de 3.200 nucléotides (SUMMERS J., O'CONNELL, A et MILLMAN I. (1975) Proc. Nat.Acad.Sci.U.S.A. 72, 45974601). L'ADN polymérase endogène peut etre utilisée pour réparer in vitro le brin le plus court (T.A.LANDERS, H.B. GREENBERG et J.S.ROBINSON, J.VIROL., 23, 1977, p.368-376). L'analyse électrophorétique des protéines de l'en- veloppe a montré la présence de 2 à 7 polypeptides dont les principaux sont appelés : polypeptide I et polypeptide II. (PETERSON,D.L., ROBERTS,I.M. et VYAS,G.N. (1977) Proc.Nat. Acad.Sci., USA, 74, 1530-1534, et PETERSON, D.L., CHIEN, D.Y., VYAS, G.N., NITECKI, D. et BOND, H. (1978) In Viral Hepatitis, ed.G.VYAS, S.COHEN et R.SCHMID, The Franklin Institute Press, Philadelphie, 569-573). Le polypeptide I a un poids moléculaire de-22.000 à 26.000 daltons. Le polypeptide II est glycosilé et a un poids molécillaire de 28.000 à 30.000 daltons. La composi tion en acides aminés de ces deux polypeptides est très sem blable, de sorte que l'hypothèse a été formulée que le poy- peptide II pourrait ne différer du polypeptide I que par une glycosilation. Les séquences que forment, respectivement, leurs 15 premiers amino-acides (à partir de l'extrémité N-terminale) et leurs 3 derniers amino-acides sont identiques. L'étude de ces polypeptides est extremement difficile dans la mesure où l'on ne dispose d'aucun système de culture cellulaire permettant la propagation du virus. Cette difficulté a déjà en partie été contournée,plus particulièrement en ce qui concerne le sérotype avw de 1'ADN entier (génome) du virus, qui a été identifié et cloné, notamment dans E.Coli, après son insertion préalable dans le site uni que Eco RI d'un vecteur Agt.WES. X B, selon la technique dé- crite par FRITSCH, A., POURCEL, C., CHARNAY, P. et TIOLLAIS, (P (1978) C.R. Acad.de Paris, 287, 1453-1456). A ce jour, l'identification des polypeptides I et II eux-memes, la localisation dans l'ADN viral de la séquence codant ces peptides n'ont pas été réalisées. L'invention a pour but l'obtention d'une séquence d'ADN beaucoup plus petite que l'ADN viral lui-meme, contenant la séquence apte à coder la séquence peptidique douée de propriétés immunogènes permettant, lorsqu'elle est introduite dans l'organisme d'un hôte vivant, d'induire la fabrication par ce dernier d'anticorps susceptibles de protéger ultérieurement ce meme hôte à l'égard du virus de l'hépatite virale B, notamment lorsque celui-ci se trouve à l'état viruilent L'invention découle non seulement de l'analyse nucléotidique complète du génome de la particule de Dane à laquelle ont procédé les inventeurs, mais à l'idée qu'ils ont eue pour identifier le gène codant (ci-après dénommé "gène S") des susdits polypeptides, de rechercher dans la structure nucléotidique complète ainsi préétablie du génome de la particule de Dane, celles des séquences de nucléotides susceptibles de coder les séquences peptidiques proximales et terminales connues de ces polypeptides. On rappellera que PETERSON et collaborateurs ont rapporté, notamment dans les articles dont les références ont été rappelées plus haut, que la séquence proximale (premier amino-acide N-terminal) des 15 premiers amino-acides s'analysait en principe comme suit met glu asn ile thr ser gly phe leu gly pro leu leu val ser et que la séquence terminale de ces mêmes polypeptides (der- nier amino-acide C terminal) était la suivante val tyr ile La figure 1 est une carte schématique du génome de la particule de Dane. Celui-ci comporte deux brins b1 et b2; le plus court d'entre eux (b2) étant normalement dépourvu de la partie représentée par une ligne en trait interrompu dans le dessin. Il est connu que cet ADN ne comporte qu'un seul site EcoRI. La flèche f1 donne le sens de la numérotation des nucléotides dont est composé le brin le plus long b1, et la fleche f2 donne le sens de la transcription de 1'ADN du virus, no- tamment par la machinerie cellulaire des cellules envahies par le virus de l'hépatite B, pour ce qui concerne l'expression du gène S. Le site EcoRI peut donc être numéroté O ou, comme on l'a maintenant déterminé de façon plus exacte pour celui des virus de l'hépatite B appartenant au sérotype aym,3182. Le cercle en trait plein intérieur e donne l'échelle en % de longueur de l'ADN et permet de préciser les nositiors Se certaines de ses parties. Les nombres 3',5' et 5',3' à la partie inférieure de la carte visent les extrémités terminales porteuses de mêmes nombres dans les représentations conventionnelles des extrémités des chaines d'acide nucléique. Selon l'invention, il a été montré que le "gène S" constituait essentiellement le fragment du brin le plus long bl situé entre les positions 73,6 et 95,1 de la carte schématique de la figure 1. Les abréviations"Start"et"Stop" représentent les points d'initiation et d'arret de la transcription du "gène S". La figure 2 est représentative de la partie terminale du susdit génome, comprise notamment entre les positions 6O, et 100 (en % de longueur de l'ADN). Chacune des lettres figurant dans la figure 2 correspond de façon conventionnelle à l'un des 4 nucléotides de base de 1'ADN A : Adénine G Guanine T : Thymine C : Cytosine Les lignes inférieures, dans chaque paire de lignes dont est constituée la figure 2, correspondent à l'acide nucléique correspondant à la chaine nucléotidique b2. La technique d'analyse utilisée pour établir la carte plus détaillée dont témoigne la figure 2, sera brièvement rappelée ci-après. La caractérisation de la séquence nucléotidique-du "gène S" telle qu'elle est. proposée dans le cadre de la pré sente invention, et dont les extrémités proximale E "S" et ter- minale t sont indiquées dans la figure 2, résulte de la constatation que - les 14 premiers triplets (dans le sens de la lecture f2) à partir du nucléotide numéroté 3030 vis-à-vis de l'extrémité terminale EcoRI, sont respectivement capables de coder les 14 premiers amino-acides de la séquence proximale des 15 premiers amino-acides des susdits polypeptides, - que les 4 derniers triplets GTA TAC ATT rAA lus sur la haine complémentaire b2 à la chaîne transcrite bl correspondent respectivement aux 3 aino-acides terminaux des susdits polypeptides et à un codon d'arrêta - que cette séquence de nucléotides (678 nucléotides) ne comprend aucun codon d'arret, du moins lorsque l'on adopte le cadre de lecture impliquant que le premier triplet"lu" par la machinerie cellulaire soit AITG, (correspondant sur l'autre brin à qW 'la traduction complète de l'information génétique com- mençant avec le codon initial ATG conduit à un polypeptide théorique de 226 amino-acides,ayant un poids moléculaire de 25.422 daltons. La structure nucléotidique du "gène S" ainsi que la chaine polypeptidique résultant de la traduction du "gène S" sont représentées à la figure 3. Ces valeurs sont tout à fait conformes aux données ahalytiques qui résultent de la mobilité électrophorétique du polypeptide I sur des gels de polyacrylamide qui ont déjà été décrits par les auteurs précédents (références 9-12 selon la biblographie figurant à à la fin de la description de la présente demande de brevet). La différencie observée au niveau du 15ème aminoacide de la séquence peptidique proximale du polypeptide I leucine selon les cartes des figures 2 et 3 mentionnées ci dessus, et non sérine selon les constatations des susdits auteurs, peut peut-être être attribuée au fait que ces auteurs ont travaillé avec un variant génétique différent de celui ayant fait l'objet de la présente étude. On notera que la différence peut d'ailleurs être rapportée à la substitution d'un seul nucléotide dans le triplet concerné "TTA" dans le "gène S" particulier représenté dans les cartes des figures 2 et 3, au lieu de "TCA", l'un des triplets susceptibles d'etre traduits en sérine. L'invention concerne donc plus particulièrement les fragments d'acide nucléique qui peuvent être excisés de l'ADN de la particule de Dane, ces fragments étant plus particulièrement caractérisés en ce qu'ils contiennent la partie du "gène S" susceptible de coder la partie de la protéine de l'enveloppe du virus qui est responsable des propriétés immunologiques du virus de l'hépatite B. A ce titre, l'invention concerne donc un acide nucléique comportant au plus de l'ordre de 1000-1100 nucléotides, plus particulièrement caractérisé en ce qu'il est apte à coder une séquence peptidique immunogène, elle-même apte à induire in vivo la production d'anticorps actifs à l'égard du virus de l'hépatite B, cette séquence peptidique contenant essentiellement la structure représentée à la figure 3, ou toute séquence peptidique ayant des propriétés immunogènes équivalentes. On observera que 1 e premier acide aminé de la séquence susdite : méthionine, est N-terminal et que l'amino-acide de l'extrémité opposée : isoleucine, est Cterminal. L'invention concerne encore, plus particulièrement, la séquence nucléotidique représentée à la figure 4 codant la séquence peptidique telle qu'elle résulte de la figure 5 ou toute séquence peptidique analogue douée de propriétés immunogènes équivalentes. Il va de soi que par "séquence peptidique équivalente" il faut entendre toute séquence peptidique dans laquelle certaines parties peuvent n'être pas rigoureusement identiques aux parties correspondantes de la séquence peptidique représentée dans les figures 3 et 5, ces variations pouvant être dues à des mutations locales n'affectant pas le caractère immunogène général de la protéine ou à des modifications de structure tenant aux différents sérotypes sous lesquels les protéines du genre en question sont susceptibles de se présente (notamment sérotypes adw, adr et air). L'invention concerne plus particulièrement la séquence nucléotidique contenant la séquence peptidique telle qu'elle est représentée à la figure 6 ou toute séquence peptidique analogue douée de propriétés immunogènes équivalentes. L'invention concerne plus particulièrement encore les séquences peptidiques suivantes Alanine - Glutamine - Glycine - Thréonine - Sérine Thréonine - Alanine Glutamine - Glycine - Thréonine - Sérine Thréonine - Thréonine - Alanine - Glutamine - Glycine - Thréonine - Sérine Dans le premier peptide sus-indiqué l'extrémité alanine est N-terminale et l'extrémité sérine est C-terminale. Dans le deuxième et troisième peptide sus-indiqués, l'extrémité thréonine est N-terminale et l'extrémité sérine est C-terminale. A titre d'exemple, on peut notamment préparer le pentapeptide en partant de la sérine C-terminale à laquelle on accroche la thréonine par la méthode de Castro décrite dans Tétrahédron Letters, 1975, nO 14, page 1219-1222. Ensuite les acides aminés glycine, glutamine, alanine sont rajoutés par la mÉthode dite de l'anhydride mixte répétée (méthode rema) décrite par Beierman dans Chemistry and Biology of Peptides, Ed. J. Meienhofer, Ann. Arbour Science Publ., Ann. Arb. Mich. 351 [1972). L'invention concerne également les produits résultant de la fixation du pentapeptide sur une molécule porteuse plus grosse, notamment de type polypeptide ou protéine, les compositions contenant ce pentapeptide en produits de fixation, notamment en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et plus particulièrement des vaccins contre l'hépatite B. Ces véhicules pharmaceutiques sont appropriés, de façon en soi classique, au mode d'administration choisi, notamment par voie orale, parentérale, rectale ou par nébulisation sur des muqueuses, notamment nasales. L'hexapeptide et le polypeptide à 7 acides aminés peuvent etre synthétisés par des techniques de synthèse peptidique classiques. Ces peptides sont, selon la présente invention, tenus pour être le site antigénique des polypeptides de plus grande taille dont question plus haut et responsables du pouvoir vaccinant de l'enveloppe virale journal of Biol. Stand. 1976, 4, 295-304, Rao -et Vyas "Biocheminal Characterization of Hepatitis B Surface Antigen in Relation to Serologic Activity"). L'invention concerne également encore les fragments d'ADN susceptibles de coder la production de tels pentapeptide , hexapeptide et polypeptide à 7 acides amines. Il s'agit pour le pentapetide, notamment du polynucléotide de formule 5' GCT CAA GGA ACC TCT 3' 3' GGA GTT OCT TGG AGA 5' pour l'hexapeptide, notamment du polynucléotide de formule 5' ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3' 3' TGA CGA GTT OCT TGG AGA 5' pour le polypeptide à 7 acides aminés du polynucléotide de formule 5' ACT ACT GOT CAA GGA ACC TCT 3' 3' TGA TGA CGA GTT OCT TGG AGA 5' ou dans chacun des trois cas, du plynucléotide complémentaire relatif aux trois polynuécléotides respectifs précédents ou encore tout polynucléotide dans lequel chacun des triplets peut être remplacé par tout triplet analogue capable de coder la production du même amino-acide. L'acide nucléique selon l'invention peut encore etre caractérisé en ce qu'il comporte au moins l'un des deux brins mutuellement complémentalHes d'une séquence d'ADN telle que représentée dans la figure 4 (dans laquelle figurent également les nombres correspondant aux positions des premiers nucléotides de chacun des fragments successifs de 10 nucléotides représentés vis-à-vis de la position EcoRI non représentée dans la figure : il va de soi que ces nombres n'interviennent pas au niveau de la caractérisation de la séquence nucléotidique du genre en question). Ce fragment dtADN est délimité par deux sites HincII. On appréciera que cette séquence nucléotidique correspond à l'information génétique dont la traduction conduit à la séquence peptidique représentée à la figure 5. L'invention concerne naturellement les séquences nucléotidiques équivalentes à simple brin ou à double brin, dont notamment le brin ayant la structure qui découle de la succession des lignes inférieures de la figure Lt, 1'ADN à double brin correspondant, ou les ARN messagers correspondants , notamment celui représenté par les enchainements com plémentaires de nucléotides constitués par les lignes nnférietares des paires de lignes de la figure Lt (sens de la flèche f2). De meme entrent dans le champ de l'invention les chaines nucléotidiques qui se différencient des précédentes par certains triplets ou petites séquences de triplets, dans la mesure où ces séquences nucléotidiques restent aptes à coder un polypeptide conservant les activités immunogènes caractéristiques des virus de l'hépatite virale B. D'une fa çon générale, il s'agit de chaines de nucléotides qui, le cas échéant, après dénaturation de l'ADN à double brin pour produire les acides nucleiques à simple brin correspondants, restent susceptibles de s'hybrider sur au moins environ 90% de leur longueur avec l'un des brins de l'AON de la figure4. Des acides nucléiques préférés selon l'invention sont encore ceux qui peuvent etre excisés à partir de l'ADN de l'hépatite virale et qui, lorsqu'ils sont à double brin, sont caractérisés par l'existence à l'un de leurs bouts d'une extrémité HincII, HhaI, AvaI ou EcoRI, et à leur autre bout par une extrémité Avalîl, HincII ou HhaI. Les positions de ces diverses extrémités vis-a-vis du site EooRI sont schématisées dans la figure 2. L'acide nucléique selon l'invention est destiné à l'incorporation dans un vecteur permettant son expression dans une bactérie et dans les cellules eucaryotes, notarmellt en vue de la production d'une protéine ou d'un peptide susceptible d'induire dans l'organisme d'un hôte vivant la production d'anticorps actifs contre le virus de l'hépatite virale B.La protéine ou le peptide résultant de la traduction de la séquence nucléoti dique selon l'invention peuvent être utilisés comme agent vaccinant- ou comme agent servant pour le diagnostic L'acide nucléique selon l'invention peut également être utilisé comme sonde pour dépister la présence ou non dans des échantillons de sang ou de sérum d'épreuve, de particules de Dane, d'antigène HBs ou de fragments de celui-ci, etc. (par technique classique d'hybridation ADN-ADN). D'autres caractéristiques de l'invention résulteront encore de la description brève qui suit des techniques (l'analyse, d'identification et d'obtention de fragments d'ADN conformes à l'invention. Référence sera naturellement faite aux dessins dont les figures ont déjà été prises en consideration dans ce qui précède. Les chiffres ou nombres entre parenthèses correspondent aux références de la bibliographie annexée à la présente description. Les produits et méthodes utilisés. - Les enzymes et les produits chimiques utilisés~ Les enzymes de restriction utilisées : BamHI, HhaI, Hincîl, HaeIII, XbaI, MboI, Hindi, HpaII, XhoI, sont celles fabriquéespar BIOLABS. On a utilisé 1' DN-EcLymérase I de BOEHRINGER. La phosphatase alcaline bactérienne et la polynucléotide-kinase ont été fournies par P.L.BIOCHEMICALS. Les agents chimiques étaient les suivants Diméthyl sulfate (ALDRICH) Hydrazine (Eastman Kodak) Acrylamide et bis-acrylamide (2 fois cristallises, (Serva) Dideoxy nucleotide triphosphates et deoxynucleotide triphosphates (P.L.Biochemicals) Piperidine (MERCK) redistillée sous vide. - Preparation d'ADN HBV Le génome HBV entier (sous-type avw) a été cloné dans E.Coli en mettant en jeu le site unique de restriction EooRI du vecteur Agt.WES. AB (14). L'ADN cloné est dénommé ci après "Eco HBV DNA". Le bactériophage recombinant a été amplifié en boite de Pétri sur Agar et on a extrait l'ADN recherché de façon en soi connue. Après digestion de l'ADN par l'enzyme de restriction EcoRI, on a purifié la séquence Eco HBV DNA par ultra centrifugation, dans un gradient de sucrose, selon la technique décrite dans les références bibliographiques (16,17). - Prép~ration ~e~f~aqments~d'A~N~margués~5'3~P~ 10 à 20 picomoles d'ECO HBV DNA ont été complètement hydrolysés par les différentes enzymes de restriction, dans les conditions recommandées par le fabriquant. Les fragments d'ADN ont été déphosphorylés par la phosphatase alcaline, celle-ci ayant ensuite été inactivée par un traitement alcalin. L'ADN a alors été précipité à l'éthanol, selon la technique décrite dans l'article(18). Après redissolution dans un tampon à base de spermidine, les ADN ont été marqués à leurs extrémités 5' avec un ATP {&gamma;p } (3000 Ci/mM fabriqué par New England Nuclear) et avec de la poly-nucléotide-kinase (selon la technique visée à l'article (19) ). Les fragments d'ADN de restriction ont été séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, puis élués. Les extrémités marquées ont fait l'objet de ségrégatioX par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de façon en soi connue, après restriction avec uneautre enzyme ou par dénaturation des fragments d'ADN-du genre en question. - Détermination de~la structure des séuences de ~ nucléo tide de 1'ADN. La structure primaire des fragments d'ADN à double brin ou simple brin a été déterminée essentiellement selon la technique décrite par Maxam et Gilbert (19).L'on a aussi eu recours à la méthode des inhibiteurs terminaux de chaines décrite par SANGER et al (20) et adaptée par MAAT et SMITH (21), pour ce qui est des fragments à double brin marqués à l'une de leurs extrémités 5'. Les produits de réaction chimique et enzymatique ont été analysés par électrophorèse dans des gels de séquence d'acrylamide à 8,16 ou 25 ide 1 mm d'épaisseur. Les techniques et les résultats de l'analyse. Afin de déterminer si le génome HBV est capable de coder les polypeptides I et II, tous les fragments HaeIII (sites de restriction HaeIII du génome HBV représentés sur la figure 1 par de petites flèches) ont été marqués à leurs extrémités 5' . Des parties substantielles de leurs structures primaires ont été déterminées par la méthode de Maxam et Gilbert. Les séquences de nucléotides susceptibles de coder les séquences d'amino-acide proximales et terminales des polypeptides I et Il ont été localisées dans les fragments HaeIII E et HaeIII F, préalablement localisés sur la carte de restriction du génome HBV (selon la technique décrite dans la ré- ference (17) ).Ce sont ces séquences de nucléotides qui ont été considérées comme consistant en les extrémités du "gène S" occupant elles-memes les positions 73,6 et 95,1 vis-à-vis du site de restriction EcoRI (figure 1) pour les raisons déjà indiquées. L a séquence de nucléotides entre ces deux positions a été analyse en ayant recours aux techniques chimiques connues, notamment par la méthode de dégradation chimique à l'hydrazine diméthyl sulfate et la méthode des terminai on de chaînes. On a eu recours, parmi les réactions chimiques variées proposées par Maxam et Gilbert à une dépu rination partielle par l'acide formique et au clivage par la pipéridine, méthodes qui donnent des bandes d'intensité gale slXr ics alltoradiograns,les pour les fragpents terminés par une guanine et une adénine.On a également utilisé les reactions à l'hydra- zine suivies d'un clivage à la pipéridine, pour obtenir des bandes d'égale intensité, pour les nucléotides cytosine et : thymidine : le fractionnement électrophorétique des produits de ces deux réactions donne pour toutes les bases une tache dans l'une ou l'autre des. colonnes de gel utilisées.Cette procédure facilite la lecture de l'autoradiogramme du gel. La réaction à l'hydrazine en présence de chlorure de sodium spécifique pour la cytosine permet de aistinguer ce nucléotide de la thymidine utla réaction au diméthylsulfate suivie d'un clivage par la pipéridine spécifique de la guanine permet de distinguer ce dernier nucléotide de l'adénine. De façon à s'assurer du plus grand possible degré de précision, des séquences distinctes de nucléotides formant différents fragments se chevauchant mutuellement ont été produites par hydrolyse d'Eco HBV DNA par divers enzymes de restriction BamHI, HinfI, HpaII, HaeIII et HincII. De cette façon l'analyse de chacun des sites de restriction utilisés comme points de départ de premiers fragments étudiés a été confirmée par l'analyse des fragments distincts dans lesquels les sites de restriction des premiers fragments se trouvaient compris entre les nouvelles extrémités de ces fragments distincts. LeXgène S" représenté à la figure 3, qui commence car le codon d'initiation ATG, comprend 227 triplets, dont un codon d'arret TAA. Les 3 codons correspondant aux 3 acides aminés de l'extrémité carboxy terminale du polypeptide correspondant sont situés dans le meme cadre de lecture, immédiatement avant le codon d'arret TAA. L'un des deux autres cadres de lecture (respectivement décalésvis-à-vis du précédent de 1 et 2 nucléotides) est également dépourvu de codon d'arret, mais code une protéine tout à fait différente des polypeptides I et II susmentionnés. Le troisième cadre de lecture comprend 10 codons d'arrêt (5 TAG, 4 TGA, 1 TAA). Sur l'autre brin d'ADN, les trois cadres de lecture se trouvent respectivement fermés par 11, 11, et 6 codons d'arrêt distribués le long de la séquence d'ADN. Comme on lta déjà indiqué plus haut, la traduction complète de l'information génétique débutant par le codon d'initiation ATG conduit à un polypeptide théorique de 226 amino-acides correspondant à un poids moléculaire de 25.422 daltons. Il est intéressant de souligner que la séquence nucléotidique correspondant au "gène S" devrait normalement être lue entièrement au cours de la traduction. Sont également parties de l'invention des channes de nucléotides du type du "gène S" ci-dessus décrit, qui oom porte de petites séquences supplémentaires pouvant contenir jusqu'à une centaine de nucléotides ou qui au contraire peu vent en être dépourvues, sans que soit pour autant altérée 1' infor- mation génétique correspondante (22, 23). Les différents fragments de l'invention qui ont été définis plus haut peuvent être obtenus à partir de la séquence d'ADN dite Eco HBV DNA, en ayant recours aux enzymes de restriction correspondantes et aux techniques de fractionnement connues des fragments d'ADN, notamment sur gel de polyacrylamide et en mettant à profit leurs migrations sur des distances qui sont fonction de leurs poids moléculaires. Ainsi peut-on par exemple obtenir le fragment dont l'une des extrémités est délimitée par un site EcoRI et l'autre par un site Avalîl en opérant une restriction Eco HBV DNA par l'enzyme Avalîl, le fragment recherché consistant dans le plus petit fragment obtenu (un seul site AvalII dans Eco HBV DNA). Le fragment délimité par des extrémités opposées EcoRI et HhaI est obtenu par hydrolyse d'Eco HBV DNA par EcoRI d'abord, puis par hydrolyse partielle par l'enzyme de restriction HhaI. L'on récupère alors parmi les produits de restriction celui qui contient le site AvaIII. Ces techniques de restriction n'ont évidemment été proposées qu'à titre d'exemple, étant bien entendu que le spécialiste est à même de déterminer les ordres de traitement par les enzymes de restriction pour isoler, à partir notamment d'Eco HBV DNA, les fragments ayant les extrémités de restriction utiles. A toutes fins utiles, on rappellera que ces opérations de restriction peuvent être réalisées au sein d'un tampon Tris 10 mM;py 7,8; ydgC12 6 mM,6-mercapto-éthanol 6mM, le même milieu contenant en outre et de préférence 50 mM de NaCl lorsque EcoRI est utilisé. Comme il a déjà été dit, l'invention concerne l'ut i- lisation des fragments d'ADN décrits à titre de sonde permettant le diagnostic de la présence dans un sérum de particules de Dane ou particules dérivées de la précédente, porteuses d'un ADN susceptible de coder une protéine immunogène caractéristique de l'hépatite B. L'ADN selon l'invention peut également être incorporé à un vecteur permettant, à condition que l'incorporation ait été réalisée en phase, l'expression de cet ADN dans une bactérie ou autre microorganisme, ou dans des cellules eucaryotes. L'invention peut par conséquent permettre la production d'une protéine de masse moléculaire plus faible que les polypeptides I ou II susvisés, douée des mêmes propriétés immunogènes. Comme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. En annexe de cette description figure la bibliographie, et en particulier les références qui ont été citées dans le cadre de la présente description. REFERENCES 1 - Blumberg, B.S. (1977) Science 197, 17-?5. 2 - Dane, D.S., Cameron, C.Ei. and Brigss, M. 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Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comporte au plus de l'ordre de 1000-1100 nucléotides et qu'il est apte à coder une séquence peptidique immunogène, elle-même apte à induire in vivo la production d'anticorps actifs à l'égard du virus de l'hépatite B. 2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence nucléotidique capable de coder la séquence peptidique représentée dans la figure 3 ou une- séquence peptidique analogue douée de propriétés immunogènes équivalentes. 3. Acide nucléique selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence nucléotidique représentée à la figure 4, capable de coder la séquence peptidique représentée dans la figure 5 ou une séquence peptidique analogue douée de propriétés immunogènes équivalentes. 4. Acide nucléique selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence nucléotidique capable de coder la séquence peptidique représentée à la figure 6 ou une séquence peptidique analogue douée de propriétés immunogènes équivalentes représentée à la figure 6. 5. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4; caractérisé en ce qu'il contient une séquence capable de coder la séquence peptidique : Alanine tN-termi- nale) - Glutamine - Glycine - Thréonine - Sérine (C-terminale). 6. Acide nucléique sleon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il contient une séquence capable de coder la séquence peptidique : Thréonine (N-ter- minale) - Alanine - Glutamine - Glycine - Thréonine - Sérine (C-terminale) 7. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il contient une séquence capable de coder la séquence peptidique : Thréonine (N-terminale) - Thréonine - Alanine - Glutamine - Glycine - Thréonine - Sérine (C-terminale). 8. Acide nucléique selon 1 'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comporte au moins l'un des deux brins mutuellement complémentaires d'une séquence d'ADN telle que représentée dans la figure 4 ou un brin susceptible de s'hybrider avec le précédent. 9. Acide nucléique selon la revendication 8, caractdri- sé en ce qu'il comporte au moins l'un des deux brins mutuellement complémentaires d'une séquence d 'ADN telle que représentée dans la figure 3 ou un brin susceptible de s'hybrider avec le précédent. 10. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications i è 7, caractérisé en ce qu'il est à double brin et en ce qu'il est délimité à l'un de ses bouts par une extrémité Hindi, HhaI, AvaI, ou EccRI, et à son autre bout par une extrémité AVILI, HincII, ou HhaI. 11. Acide nucléique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il contient la séquence 5' GCT CAA GGA ACC TCt 3' ou la séquence complémentaire de la précédente, ou encore une séquence dans laquelle l'un au moins des susdits triplets est remplacé par un autre triplet, cependant capable de coder le même amino-acide. 12. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il contient la séquence 5 ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3', ou la séquence complémentaire de la précédente, ou encore une séquence dans laquelle l'un au moins des susdits triplets est remplacé par un autre triplet, cependant capable de coder le même amino-acide. 13. Acide nucléique selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il contient la séquence 5' ACT ACT GCT CAA CGA ACE TACT 3', ou la séquence complémentaire de la précédente, ou encore une séquence dans laquelle l'un au moins des susdits triplets est remplacé par un autre triplet, cependant capable de coder le même amino-acide. 14. Application de l'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, à la constitution d'un vecteur qusceo- tible d'être exprimé dans un micro-organisme ou dans une cellule eucaryote en vue de la production d'une protéine comportant une séquence peptidique codée par ledit acide nucléique. 15. Peptide, caractérisé en ce qu'il comporte une sé quence peptidique codée par l'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13. 16. Peptide selon la revendication 15, caractérisé par la séquence suivante : Alanine - Glutamine - Glycine Thréonine - Sérine, dans laquelle l'extrémité alanine est N-terminale, et l'extrémité sérine est C-terminale. 17. Peptide selon la revendication 15, caractérisé par la séquence suivante : Thréonine - Alanine - Glutamine Glycine - Thréonine - Sérine, dans laquelle l'extrémité thréonine est N-terminale et l'extrémité sérine est C-terminale. 18. Peptide selon la revendication 15, caractérisé par la séquence suivante : Thréonine - Thréonine - Alanine Glutamine - Glycine - Thréonine - Sérine, dans laquelle l'ex- trémité thréonine est N-terminale et l'extrémité sérine est C-terminale. 19. Composition pharmaceutique, notamment de vaccin au de réactif de diagnostic de l'hépathite B, contenant en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptablE le polypeptide selon l'une quelconque des revendications ie, 17 et 18, soit seul, soit au préalable fixé sur une molécule porteuse, notamment de type polypeptide ou protéine.