FR 2466247 A1 19810410 FR 7924593 A 19791003 L'invention concerne une nouvelle préparation immuno- stimulante et son application en immunothérapie, notamment dans le traitenent et la prévention des cancers. I1 a été démontré, depuis les travaux de J. Freund (Proc. Soc. exp. Biol. (N.Y.) 1937, 37, 509-513) que l'utilisation d'une émulsion eau dans l'huile comme véhicule pour l'administration d'un antigène soluble et l'adjonction à ce véhicule d'une mycobactérie, potentialisait de façon importante les réactions immunitaires. Une telle émulsion permet à l'antigène d'entrer en contact intime et stable avec la mycobactérie qui confère ainsi à cet antiqène l'aptitude de provoquer une réponse immunitaire qualitativement similaire à celle qui est induite par le mélanqe mycobactérie-huile vis-à-vis de l'antiqène spécifique de la mycobactérie. De plus, le véhicule huileux ralentit l'absorption et la diffusion de l1antiqène en constituant un dépôt localisé, permettant un contact plus prolongé avec les cellules immunocompétentes du système réticulo-lympho- histiocytaire. Enfin, il a été démontré que l'huile seule et le mélanqe huile-mycobactérie possèdent éqalement une activité immustimulante (International Symposium on Adjuvants of Immunity, S. Karqer, Bâle, N.Y. 1967). L'huile minérale utilisée par Freund a l'inconvénient d'entrainer des réactions secondaires gênantes chez les patients auxquels l'adjuvant est administré. Ces inconvénients sont évités lorsque l'on utilise la préparation suivant l'invention, qui en outre a l'avantage de mettre à profit les propriétés propres d'une mycobactérie particulière, dans une association synerqique. Selon l'invention, une nouvelle préparation adjuvante de l'immunité, douée éqalement de propriétés immunostimulantes, est constituée par le mélange d'une huile d'origine animale, le perhydrosqualène, d'un émulsifiant, tel que plus spécialement le mono oléate de mannide, et de corps bactériens tués par la chaleur et provenant d'une mycobactérie saprophyte non pathogène à croissance rapide, d'une souche Mycobactérium Smegmatis telle que la souche ATCC 607. De préférence, la préparation suivant l'invention comprend une suspension aqueuse de mycobactéries de concentration comprise entre 1 et 5 mg/ml environ, éventuellement ajoutée à l'huile au moment de l'administration. Elle comprend avantageusement de l'ordre de 50 à 500 mg de mycobactéries pdur 100 ml d'huile. D'autre part la concentration de l'émulsifiant peut être notamment de l'ordre de 10 à 20% (en volume) par rapport à l'huile. Cette préparation peut être administrée par exemple par injection parentérale ou sous-cutanée ou souks forme de topique cutané. Dans le traitement et la prévention des cancers humains, elle peut etre utilisée par exemple à la dose de 0,05 à 1 ml par jour, de préférence comprise entre 0,1 et 0,5ml par jour, soit seule (immunothérapie active non spécifique) soit en association avec un antigène spécifique (immunothérapie active spécifique). I1 a été en effet constaté que la préparation adjuvante de l'immunité suivant l'invention permet, lorsqu'elle est administrée avec un antigène, notamment par injection par voie parentérale, d'augmenter la production d'anticorps sériques spécifiques à cet antigène et d'augmenter ou d'induire un état d'immunité à médiation cellulaire, vis-à-vis de ce même antigène. Elle peut être utilisée comme immunostimuline permettant de réhausser le potentiel immunologique global de l'organisme en lui permettant, lorsqu'elle est injectée par voie parentérale, ou éventuellement par injection locale ou sous forme de topique cutané, de s'opposer à la croissance des cancers. Elle peut aussi être utilisée comme un adjuvant de- l'immunité cellulaire spécifique, permettant lorsqu'elle est injectéé par voie parentérale ou locale ou appliquée sous forme de topique cutané, avec un antigène tumoral, de provoquer au niveau de la tumeur homologue, des réactions immunitaires cytoly- tiques entraînant la destruction et le rejet des cellules cancéreuses. Pour ces applications, on peut notamment utiliser l'une ou l'autre des compositions particulières suivantes Composition A Préparation constituant un adjuvant complet, destiné à être utilisé avec un antigène soluble, tel qu'un antigène tumoral pour l'immunothérapie active spécifique des cancers PHS ........................ 8,75 ml Arlacel A (Mannide mono oléate) ............... 1,25 ml Mycobactérium Smegmatis (tué et séché)..................... 20 mg Conditionnement en ampoules de 1 ml. L'addition de l'antigène en solution aqueuse se fait au moment de l'emploi. L'émulsion est réalisée par agitation ou en aspirant et rejetant plusieurs fois le mélange à l'aide d'une seringue munie d'une aiguille. Composition B Préparation constituant une immunostimuline destinée à être employée seule aux fins d'immunothérapie active non spécifique antitumorale. PHS ........................ 8,75 ml Arlacel A .......................... 1,25 ml Cette préparation est additionnée, au moment de l'emploi, d'une quantité équivalente d'une suspension aqueuse de Mycobactérium Smegmatis à la concentration de 2 mq/ml. L'émulsion est réalisée extemporanément par aqitation ou en aspirant et rejetant le mélange plusieurs fois à l'aide d'une serinque munie d'une aiguille. L'une ou l'autre de ces préparations peut être incorporée à un véhicule permettant de l'utiliser comme topique cutané. Les propriétés de ces compositions, considérées à titre d'exemple, sont illustrées par les exemples de mise en oeuvre ci-après. exemple I Le perhydrosqualène (en abrégé PHS), utilisé pour la préparation faisant l'objet de l'invention, est un produit d'origine naturelle obtenu par hydrogénation du squalène qui est un des composants de l'huile de foie de requin. Chimiquement, il s'agit de llhexaméthyl - 2, 6, 10, 15, 19, 23, tétra- cosane. C'est un hydrocarbure ramifié et saturé de P.M. 422,8 et de formule brute C30H62. Le squalène se présente sous la forme d'une huile transparente et inodore. Sa densité est d = 0,808 et la qualité utilisée a un degré de pureté supérieurà 99%. Cette matière première est conforme aux normes de la pharmacopée française. La source du produit utilisé dans cet exemple est une filiale de Rhône-Poulenc. Les impuretés éventuellement retrouvé-es à l'état de traces sont constituées par la trio lésine du glycérol qui ne-présente pas de toxicité. Comme il sera montré dans cet exemple et l'exemple suivant, le PHS, utilisé pour la préparation faisant l'objet de l'invention, possède déjà à lui seul une activité intéressante comme stimulant et comme adjuvant des réactions immunitaires. En outre, il n'a pas d'activité toxique. L'activité immunostimulante a été étudiée chez la souris, par comparaison avec d'autres huiles. Le protocole expérimental est le suivant 9 lots de souris Swiss CF femelles (23,9 g + 0,8 g) reçoivent une injection intra-péritonéale de 500 microlitres(,ul) d'huile. Chaque lot reçoit une huile différente. Les huiles testées sont désignées dans le tableau I. Les animaux sont sacrifiés au 7ème jour après l'in injection et on procède pour chaque animal à une numération des macrophages péritonéaux et à une autopsie. Les chiffres indiqués pour les macrophages sont une moyenne pour chaque lot. Parallèlement et au cours du même protocole expéri 'mental, 4 lots de souris identiques sont utilisés, dans les mêmes conditions, avec les produits suivants 1 lot témoin reçoit 500 ,ul d'eau physiologique à 9 %0 . 1 lot témoin reçoit un mélange de 50 jil de Tween 80, 50 ul d'Arlacel A et 400 pl d'eau physiologique. 2 lots reçoivent une suspension de Mycobacterium Smegmatis tués (par la chaleur) dans 500 > 11 d'eau physiologi- que l'un à la concentration de 1 mg de M. Smegmatis pour 500 rl d'eau physiologique, l'autre à la concentration de 500 g de M. Smegmatis pour 500 pl d'eau physiologique. Arlacel A. est le nom commercial du mono oléate de mannide, émulsifiant connu fabriqué aux USA par Sandria et distribué en France par Atlas Chemical France. Mycobacterium Smegmatis est une mycobactérie non virulente facile à manipuler qui a été utilisée avec succès dans l'immunothérapie du cancer bronchique humain. On utilise ici des mycobactéries de la souche ATCC 607. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau I. On peut en conclure que, dans ces conditions expérimentales a) le PHS possède une activité immunostimulante au moins identique et souvent supérieure à celle des autres huiles testées. b) le PHS est la seule huile qui ne provoque aucune lésion anatomique des organes examinés après autopsie. Exemple 2 L'activité adjuvante des réactions immunitaires a été étudiée après émulsion avec un antigène soluble : la sérum albumine bovine (BSA), et par comparaison avec les deux huiles suivantes - une huile minérale (vaseline) - une huile végétale (ricin). Le protocole expérimental est le suivant 3 lots de cobayes femelles Hartley de 455 g reçoivent chacun une injection par voie intra-dermique, dans le coussinet plantaire des pattes postérieures, de 155 pl d'une émulsion faite de - 90 1 d'huile testée - 7,5 1 d'Arlacel A + 7,5 1 de Tween 80 - 50 1 d'eau physiologique à 9 ZO contenant 1,5 mg de BSA (sérum albumine bovine). Chaque lot reçoit ainsi 180 pl d'huile testée 3 l de BSA. Au 21ème jour suivant l'injection, on procède pour chaque lot - à un dosage des anticorps sériques précipitants anti BSA, (méthode de dosage biochimique des protéines). - à un test cutané d'hypersensibilité retardée (HSR) à BSA. Les résultats sont exprimés dans le tableau II. I1 apparaît clairement, dans ces conditions expérimen- tales, 1) qu'aucune des huiles testées n'est susceptible d'induire à elle seule un état d'immunité à médiation cellulaire vis-à-vis de BSA. 2) que le PHS provoque la formation d'un taux d'anticorps supérieur à celui obtenu avec les autres huiles testées. Les chiffres donnés pour les taux d'anticorps sont des moyennes pour chaque lot exprimées en. unités par pg de complexe Ag-Ac/ml. Exemple 3 Mycobacterium Smegmatis ATCC 607 est une mycobactérie saprophyte à croissance rapide : un inoculat deux. Smegmatis ATCC 607 sur milieu de Lowenstein-Jensen, placé à l'étuve à 37 C, donne naissance en 4 à 8 jours à une culture très riche en bacilles, formée de nombreuses colonies. Pour l'utilisation dans la préparation faisant l'objet de l'invention, les colonies obtenues sur milieu de Lowenstein-Jensen sont prélevées et mises en suspens ion dans l'eau distillée de façon à obtenir une suspension bacillaire de 2 mg/ml. Cette suspension bacillaire est ensuite tuée par la chaleur et elle peut être utilisée telle quelle ou à l'état sec après dessication. Le pouvoir immunostimulant anti-tumoral de M. Smegmatis a été étudié chez l'animal et chez l'homme. Chez l'homme, l'activité immunostimulante a été démontrée sur 145 patients atteints de cancers bronchiques opérés et suivis pendant plus de 5 ans. Chez l'animal, on a procédé à l'étude de l'activité immunostimulante par les épreuves suivantes - granulopexie (carbone colloïdal), mise en évidence de l'activité des macrophages, - plages d'hémolyse en gel, suivant la technique de Jerne, cellules spléniques de la souris, mise en évidence de l'activité des cellules B, - activation des cellules lymphocytaires spléniques chez la souris, mise en évidence par l'étude de l'incorporation de la thymidine tritiée, - réponse des cellules lymphocytaires spléniques de la souris à la PHA (incorporation de thymidine tritiée) (activité des cellules T), - étude sur les tumeurs greffées sarcome 180 - B.G. mélanocarcinome B. 16 leucémies : P.388, L.1210, AKR, leucosarcomatose. Ces études ont montré une action stimulante sur les lymphocytes spléniques de la souris et une action dépressive sur l'activité mitogène de la PHA vis-à-vis des mêmes cellules, ainsi qu'une activité sur le carcinome B 16, la leucémie AKR. P.388 et LSTRA. Exemple 4 Etude de la toxicité du mélange PHS - Arlacel A. A. Smegmatis ATCC 607, chez l'animal Le protocole expérimental est le suivant 10 lots de souris Swiss femelles (19,0 q + 0.5 q) reçoivent, par injection intra-péritonéale la préparation suivante 500 pl de l'huile testée, 50 > il d'Arlacel A, 500 1 d'eau physiologique à 9%. contenant en suspension 100 o de M. Smeqmatis ATCC 607 tués par la chaleur. Le mélange de l'huile et de l'Arlacel A avec l'eau phyeiologioue contenant M. Smegmatis en suspension est réali-' sé au moment de l'injection par agitation de façon à obtenir une émulsion homogène. Les animaux sont sacrifiés au 7ème jour après l'in iection. Les résultats sont exprimés dans le tableau III pour différentes huiles. On peut constater à l'examen du tableau III que la préparation PHS + Arlacel + M. Smegmatis ne provoque aucune lésion des organes prélevés, mise à part une tuméfaction des ganglions. lymphatiques abdominaux. Au plan histologique, ces oanslions sont le siège d'une hyperplasie lymphoïde. On constate d'autre part que l'association du PHS avec M. Smegmatis est plus efficace que chacun des constituants utilisé séparément. Exemple 5 Etude de l'activité adiuvante du mélange L'étude de l'activité adjnvante de l'immunité de la préparation faisant l'objet de l'invention a été réalisée chez le cobaye - Le protocole expérimental est le suivant 3 lots de cobayes femelles Hartlev de 450 g. reçoi- vent par voie intra-dermique, dans le coussinet plantaire des pattes postérieures les mélanges suivants 1er lot 155 1 d'une émulsion composée de - huile minérale (vaseline) .......... 90 pl - Arlacel A ................................ 7,5 1 - Tween 80 ................................. 7,5 1 - suspension aqueuse, contenant 100 g de M.Smegmatis et 1,5 mg de BSA ............. 50 1 2ème let 155 pl d'une émulsion composé-e de - huile végétale (ricin) ................. 90 l - Arlocel A ................................ 7,5 1 - Tween 80 ................................. 7,5 1 - suspension aqueuse contenant 100 g de M. Smegmatis et 1,5 mg de BSA .......... 50 > 11 dème lot 155 ul d'une émulsion composée de - PHS..................................90 1 - Arlacel A ................ 7,5 l - Tween 80 ......................... 7,5 P1 - suspension aqueuse contenant 100 pg de M. Smegmatis et 1,5 mg de BSA ......... 50 Le tableau 4 exprime les résultats obtenus. On peut constater que la préparation faisant l'obit de l'invention provoque la formation d'un taux d'anticorps anti-BSA supérieur à ceux que provoquent les préparations d'huile minérale ou d'huile végétale. De plus, elle provoque un état d'immunité cellulaire comme en témoigne la forte positivité de la réaction cutanée d'hypersensibilité retardée à BSA. Exemple 6 Etude de la toxicité chez l'homme 20 patients ont reçu par voie sous cutanée une injection de 0,2 ml de l'émulsion suivante PHS ......................................... 0,875 ml Arlacel A ...................... 0,125 ml Suspension aqueuse contenant 2 mg par ml de M. Smegmatis ATCC 607 tués par la chaleur ....................... 1 ml Au 21ème jour, aucun de ces patients n'avait présente de réaction systémique. Tous, sauf deux, présentaient une réaction locale au niveau de l'injection d'un diamètre moyen de 37,5 mm, faite de rougeur et d'induration. Chez deux patients aucune réaction locale n'a été observée, mais il convient de noter que l'un d'entre eux recevait un traitement par les corticoldes et que l'autre présentait un état d'immunodépression avec des réactions cutanées négatives à différents antigènes sollicitantle système immunutaire à médiation cellulaire. La composition précise utilisée ci-dessus n'est pas limitative. On peut notamment faire varier les proportions. des constituants sans sortir du cadre de l'invention, de même que l'on peut modifier la forme galénique et le mode d'administration. Cependant, les exemples ont montré notamment - que par l'association du perhydrosqualène et de Mycobacterium Smegmatis, la préparation de l'invention constitue un adjuvant complet destiné à être utilisé avec un an tigène soluble. L'antigène soluble peut être un antigène tumoral, et dans ce cas la préparation peut être utilisée aux fins d'immunothérapie active spécifique des cancers solides humains. - qu'en l'absence d'un antigène spécial, elle est efficace comme immunostimuline destinée à être utilisée pour l'immunothérapie active non spécifique des cancers solides humains. - que la préparation s'est montrée capable expérimentalement de provoquer la formation d'un taux d'anticorps élevé vis-à-vis d'un antigène soluble, et qu'elle s'est montrée apte à induire un état d'ilzmunité cellulaire vis-à-vis de cet antigène. Ainsi, la préparation peut être appliquée à l'immu- nothérapie non spécifique des cancers humains, et associée à un antigène tumoral, elle pout également être appliquée à l'immunothérapie active spécifique de ces cancers. Dans les deux cas, elle peut âgalement être appliquée à la prophylaxie des cancers et a la prophylaxie et à la prévention d'autres moluâies non cancérouses, tel les que les infections par exemple.D'autre part, la souche ATCC 607 peut être remplacée par d'autres souches de Mycobacterium Smegmatis. TABLEAU N 1 ACTIVITE IMMUNOSTIMULANTE DE DIFFERENTES HUILES CHEZ LA SOURIS LESIONS OBSERVEES A L'AUTOPSIE NDMERATION HUILE TESTEE ganglions Foie Rate Reins sur- Coeur Poumons Thymis DES abdominaux rénales MACROPHAGES 1. Huile d'olive - 0 ++ 0 0 0 + 350 2. Huile de vaseline ++ 0 0 0 0 0 + 410 3. Huile de ricin + 0 ++ 0 0 0 0 400 4. Huile d'avocat + 0 + 0 0 0 + 325 5. Perhydrosqualène 0 0 0 0 0 0 0 245 6. Huile d'amandes douces + 0 0 0 0 0 + 420 7. Huile d'oeillette ++ + + 0 0 0 0 380 8. Huile de lin ++ + ++ 0 0 0 @ 510 9. Huile de sésame + 0 + 0 0 0 0 300 10. Témoin : sérum 9% 0 0 0 0 0 0 0 150 11. Témoin : Tween 80 + Arlacel A 0 0 0 0 0 0 0 510 12. M. Smegmatis dose + 0 ++ 0 0 0 + 225 faible 13. M. Smeqmatis dose + 0 + 0 0 0 0 135 faible TABLEAU N 2 ACTIVITE ADJUVANTE ET TMMUNOSTIMULANTE DE DIFFERENTES HUILES CHEZ LE COBAYE RESULTATS HUILE TESTEE DOSAGE DES HSR à ANTICORPS BSA ANTI-BSA 1. Huile minérale + BSA 400 (vaseline) 2. Huile animale + BSA 650 (perhydrosqualène) 3. Huile végétale + BSA 280 (ricin) N.B. : unité ug de complexe Ag-Ac/ml TABLEAU N 3 ACTIVITE IMMUNOSTIMULANTE DE DIFFERENTES HUILES ASSOCIEES A M. SMEGMATIS CHEZ LA SOURIS LESIONS OBSERVEES A L'AUTOPSIE NUMERATION HUILE TESTEE ganglions Foie Rate Reins sur- Coeur Peumons Thymus DES abdominaux rénales MACROPHAGES 1. Huile d'olive ++ + # 0 0 0 + 310 2. Huile de vaseline ++ + ++ 0 0 0 + 700 3. Huile de ricin ++ 0 + 0 0 0 0 630 4. Huile d'avocat 0 0 0 0 0 0 0 205 5. Perhydrosqualène ++ 0 0 0 0 0 0 120 6. Huile d'amandes douces 0 0 0 0 0 0 0 210 7. Huile d'oeillette + ++ ++ 0 0 0 0 160 8. Huile de lin ++ 0 0 # 0 0 0 580 9. Huile de sésame ++ 0 + 0 0 0 0 200 10. Huile de cèdre Décts de tous les suiets en 10 mn TABLEAU N 4 ACTIVITE ADJUVANTE ET IMMUNOSTIMULANTE DE DIFFERENTES HUILES ASSOCIEES A M.SMEGMATIS CHEZ LE COBAYE HUILE TESTEE. RESULTATS DOSAGE DES HSR ANTICORPS ANTI-BSA M. Smeg. BSA 1.Huile minérale + BSA (vaseline) 440 + + + + M. Smegmatis 2. Huile animale + BSA (perhydrosqualène) 1000 + + + + + M. Smegmatis 3. Huile végétale + BSA 296 + # (ricin) + M. Smegmatis 4. Lot témoin : sérum physiologique à la place 184 + # de l'huile N.B. : unité : ug de complexe Ag-Ac/ml. REVENDICATIONS 1. Préparation immunostimulante, caractérisée en ce qu'elle comprend, sous forme d'une émulsion eau dans huile, du perhydrosqualène comme huile, un émulsifiant et des mycobactéries d'une souche Mycobacterium Smegmatis. 2. Préparation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un antigène tumoral soluble dans l'eau, éventuellement ajouté au moment de l'administration. 3. Préparation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les mycobactéries sont des mycobactéries de la souche Mycobacterium Smegmatis ATCC 607t 4. Préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend une suspension aqueuse de mycobactéries de concentration comprise entre 1 et 5 mg/ml environ, éventuellement ajoutée à l'huile au moment de l'administration. 5. Préparation selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend de l'ordre de 50 à 500 mg de mycobactéries pour 100 ml d'huile. 6. Préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'émulsifiant est du monooléate de mannide, de préférence en concentration de l'ordre de 10 à 20% dans l'huile. 7. Application de la préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 en immunothérapie active, spécifique ou non spécifique, notamment dans la prévention et le traitement des cancers et dans le traitement des infections.