FR 2474313 A1 19810731 FR 8100964 A 19810120 La présente invention se rapporte à une pré- paration de plasminogène provenant d'animaux à sang chaud, y compris l'espèce humaine,et un procédé pour la stabiliser. Elle vise plus particulièrement une prépara- tion de plasminogène caractérisée en ce qu'elle est mélangée à une quantité efficace d'un stabilisant du plasminogène, et un procédé de stabilisation d'une pré- paration de plasminogène caractérisé en ce qu'on ajoute à celle-ci une quantité efficace d'un stabilisant du plasminogène. Le plasminogène est activé par l'urokinase ou par lastreptokinase en se transformant en plasmine, qui décompose à son tour la fibrine En une matière soluble, c'est-à-dire provoque une fibrinolyse, de sorte que le plasminogène, associé à l'urokinase et à la streptokinase, est connu comme un médicament ayant des utilisations cliniques variées en dehors du traitement de la thrombose. Il est connu cependant que le plasminogène est inactivé par traitement dans des conditions énergiques, par exemple par traitement thermique ou par lyophilisation, ou par stockage prolongé. Il est nécessaire de remédier à cet inconvénient lors de la production d'une prépara- tion de plasminogène. Compte tenu de ce qui précède, la demanderesse a effectué des études approfondies qui ont abouti à cette découverte que lorsque l'on ajoute à une préparation de plasminogène, dans une proportion déterminée, un composé particulier, qui a été choisi parmi un grand nombre de composés, le plasminogène peut être stabilisé même vis- à-vis de conditions rigoureuses comme le traitement ther- mique ou la lyophilisation, et a fortiori vis-à-vis des conditions ménagées habituelles. C'est ainsi que la présente invention a été réalisée. Un des buts de l'invention est de fournir un procédé de stabilisation du plasminogène consistant à ajouter une quantité efficace de stabilisant du plasmi- nogène à une solution aqueuse contenant du plasminogène ou à une poudre sèche de plasminogène. Un autre but de l'invention est de fournir des préparations de plasminogène stabilisées. D'autres buts et avantages de l'invention res- sortiront de la description donnée ci-après. La solution aqueuse contenant du plasminogène utilisée dans l'invention n'est pas soumise à des limi- tations particulières. Elle comprend celles pouvant être obtenue-s par divers procédés de purification connus des fractions contenant du plasminogène, telles que la frac- tion III du fractionnement par l'alcool à basse tempé- rature selon Cohn dans le fractionnement des protéines du plasma sanguin généralement utilisé pour la production de médicaments biologiques importants tels que le sérum sanguin, le plasma sanguin et les liquides ascitiques de l'homme et des animaux, et aussi du fibrinogène, de la dglobine et de l'albumine du plasma sanguin. La poudre sèche de plasminogène comprend la poudre sèche provenant des solutions aqueuses contenant du plasminogène ci- dessus, en particulier la poudre lyophilisée de celles- ci. Comme exemples typiques de procédés de purifi- cation du plasminogène brut, on citera les procédés uti- lisant un stabilisant du plasminogène immobilisé (demande de brevet japonais de Kokai n0 153 592/1980) et l'utili- sation de lysine-sapharose (Science, 170, 1095 (1970)). Le stabilisant du plasminogène utilisé dans l'invention comprend des sels minéraux physiologiquement acceptables, la lysine et ses sels, le fluorure de phényl- méthanesulfonyle, l'aprotinine et l'inhibiteur de la trypsine du soja. Ces stabilisants peuvent être utilisés seuls ou en association. On peut utiliser dans l'invention n'importe quel sel minéral, pourvu qu'il soit physiologiquement acceptable, par exemple des sels de métaux alcalins, comme les sels de sodium et les sels de potassium, des sels de métaux alcalino-terreux, comme les sels de magnésium et les sels de calcium, et des sels d'ammo- nium, d'acides minéraux tels que les acides chlorhy- drique, sulfurique, borique (acide orthoborique, acide métaborique et acide tétraborique) et les acides phos- phoriques (acide pyrophosphorique, acide orthophospho- rique et acide métaphosphorique). Comme exemples préférés de ces-sels, on citera: NaCl, KCl, MgCl2, (NH4)2504, Na2504, Na2B407, KH2HP04, K2HP04, NaH2PO4, Na2HP04, etc. On peut aussi utiliser dans l'invention n'importe quel sel de lysine pour autant qu'il soit physiologiquement acceptable, par exemple des sels de métaux alcalins, comme les sels de sodium et les sels de potassium, et des sels de métaux alcalino-terreux, comme les sels de magnésium et les sels de calcium, etc. Bien que la quantité efficace du stabilisant du plasminogène à ajouter dépende de la quantité de plasmine dans la préparation de plasminogène et de la nature des stabilisants, l'effet stabilisateur du sta- bilisant augmente avec la quantité de celui-ci dans le cas de la lysine. Cependant, cette quantité doit être ajustée en fonction de l'utilisation à laquelle la pré- paration de plasminogène est destinée. Par exemple, dans le cas d'études sur la fibrinolyse, la concentration du stabilisant est avantageusement inférieure à la valeur la plus faible effectuant la fibrinolyse. En outre, dans le cas d'applications pharmaceutiques dans lesquelles des préparations de plasminogène subissent un traitement rigoureux, par exemple un traitement thermique à 600C pendant 10 heures pour activer les virus, on ajoute une 247431.3 forte quantité de stabilisant que l'on élimine par dialyse ou par un autre procédé approprié après ce traitement rigoureux. Dans le cas du PMSF (fluorure de phénylméthanesulfonyle), de l'aprotinine et de l'inhi- biteur de la trypsine du soja, il est important d'ajouter une quantité de stabilisant suffisante pour inhiber complètement la contamination de la plasmine. Les stabilisants utilisés dans l'invention ont les concentrations suivantes: Pour des solutions aqueuses de plasminogène, le sel minéral physiologiquement acceptable est utilisé à une concentration finale de 0,002M à 0,4 M, de pré- férence de 0,01 à 0,3 M et mieux encore de 0,05 à 0,2 M; la lysine à une concentration de 0,001 à 5 % P/V, le PMSF à une concentration de 0,01 à 100 mM, l'aprotinine à une concentration de 0,1 à 1 000 K UI/ml et l'inhi- biteur de la trypsine du soja à une concentration de 0,1 à 1 000 unités de BAEE/ml. Pour une poudre sèche de plasminogène, le sel minéral physiologiquement accep- table est utilisé à une concentration finale de 0,01 à 10 % P/P, la lysine à une concentration de 0,01 à % P/P, le PMSF à une concentration de 0,01 à 10 % P/P, l'aprotinine à une concentration de 0,01 à 1 000 K UI/mg et l'inhibiteur de la trypsine du soja à une concentration de 1 à 1 000 unités de BAEE/mg. Le plasminogène est susceptible d'être inactivé lors du processus général de production, en particulier au cours du traitement thermique ou de la lyophilisa- tion, comme il a été indiqué ci-dessus. En conséquence, le procédé de stabilisation de l'invention est de pré- férence appliqué non seulement au traitement thermique d'une solution aqueuse contenant du plasminogène ou à sa lyophilisation, mais aussi à tous les stades du pro- cédé de production. Dans-le cas d'un traitement ther- mique destiné à inactiver les virus contenus dans une solution aqueuse contenant du plasminogène, par exemple d'un traitement thermique à 60 C pendant 10 heures, il est avantageux d'effectuer le traitement thermique après avoir ajouté le stabilisant et effectué la digestion à une température de 4 à 37 C, à un pH de 2 à 4, pendant à 60 minutes. On peut aussi laisser les stabilisants de l'invention tels quels dans les préparations de l'inven- tion après le traitement ci-dessus, car les stabilisants résiduels augmentent également la stabilité du plasmi- nogène au repos. Le procédé de l'invention améliore la stabi- lité du plasminogène aux stades de sa production (trai- tement thermique, lyophilisation, etc.), réduisant ainsi au minimum la perte de plasminogène au cours du proces- sus de production, et les préparations contenant ce stabilisant qui sont obtenues par ce procédé ont une sta- bilité au repos élevée. La orésente invention fournit donc un procédé industriel très intéressant pour la pro- duction de préparations de plasminogène. Il est évident que le procédé de l'invention peut être utilisé non seu- lement pour la production de préparations de plasminogène mais aussi dans un grand nombre d'autres cas o il est necessaire de stabiliser le plasminogène. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. Dans ces exemples, l'activité du plasminogène est exprimée en unités de caséine (UC) ( Vox Sang. 5, 357-376 (1960)), l'activité de l'aprotinine est exprimée par la K UI (Freg, E. K., Kraut, H. Werle, E. (1950) Kallikrein (Padutil), Enke Editeur, Stuttgart) et l'activité de l'inhibiteur de la trypsine du soja est exprimée en unités de BAEE (Laskowski, M. (1955), Method in Enzymo- logy 2, 37ème Ed. par Colowick, S. P. et Kaplan, N.O. New-York, Academic Press Inc). EXEMPLE 1 Effet stabilisant sur la solution de plasminogène. On ajoute divers types d'inhibiteurs à une solution aqueuse de 100 UC/ml de plasminogène dans du tampon Tris-HC1 (pH 7,8). On laisse les solutions séjourner dans un thermostat à 37 C pour en déterminer la stabilité. Le tableau 1 donne les résultats obtenus. TABLEAU 1 Inhibiteur Concentration finale Activité restante après séjour à 37 C pendant 24 heures (%) Lysine It PMSF l! Aprotinine ,i Inhibiteur de la trypsine du soja Pas d'additif 0,1 % 1,0 % 0,1 mM 1 mM 1 KUI/ml KUI/ml UBAEE/ml UBAEE/ml EXEMPLE 2 Effet stabilisant sur le plasminogène lyophilisé. On lyophilise les solutions de l'exemple 1 additionnées de divers types d'inhibiteurs et on laisse reposer les.lyophilisats obtenus pendant un mois dans un thermostat à 50PC ou pendant trois mois à la température ambiante pour en déterminer la stabilité. Les résultats sont donnés dans le tableau 2. TABLEAU 2 Activité restante Activité restante après Inhibiteur après séjour à 50 C 3 mois de stockage à la pendant 1 mois (%) température ambiante (%) Lysine 97 96 PMSF 94 93 Aprotinine 91 90 Inhibiteur de la trypsine 93 91 du soja Pas d'additif 32 25 EXEMPLE 3 On met en suspension la fraction III obtenue par le procédé de fractionnement par l'éthanol froid selon Cohn dans une solution aqueuse contenant 1 % P/V de chlorure de sodium et, après avoir filtré la suspension pendant un moment, on élimine la liqueur surnageante par centrifugation. Conformément au procédé de D.G. Deutsch et al (Science, 170, 1095, (1970)), on verse le liquide surnageant sur une colonne de lysine-sépharose pour faire absorber le plasminogène, puis on lave les impuretés protéiniques avec du sérum physiologique et on élimine le plasminogène adsorbé en utilisant une solution aqueuse (pH 7,0) contenant de l'acide ú-aminocaproique 0,002 M et du chlorure de sodium à 1 %. Après dialyse contre de l'eau distillée, on divise la solution de plasminogène purifiée en un grand nombre d'échantillons, que l'on classe er quatre groupes et on traite ces groupes dans les conditions respectives suivantes: Conditions D: on ajoute respectivement divers types de stabilisants aux échantillons de ce groupe, et on chauffe les solutions obte- nues à 60 C pendant 10 heures. a Conditions B: Conditions C: on ajoute respectivement divers types de stabilisants aux échantillons de ce groupe, on fait digérer les solutions obtenues à pH 3,0 à la température ambiante pendant 30 minutes, puis on leur applique un.traitement thermique à 600C pendant 10 heures. on fait digérer les échantillons de ce groupe à un pH de 3,0 pendant 3 0 minutes et après avoir ajouté respectivement aux échantillons obtenus divers types de sta- bilisants,-on soumet les solutions obtenues à un traitement thermique à 60C pendant heures. Conditions A: les échantillons de ce groupe ne sont soumis à aucun traitement en dehors de l'addition de divers types de stabilisants. Puis on détermine les activités restantes sur les échantillons suivants: les liquides surnageants des échantillons obtenus dans les conditions D, B, C et A après ajustement des pH de ces échantillons à 7,0 - 0,2. - les échantillons obtenus en lyophili- sant les solutions obtenues dans les conditions B (condi- tions E). - les échantillons obtenus dans les condi- tions E après repos à 40C pendant six mois (conditions F). Les déterminations d'activité ont été effectuées par la méthode de décomposition de la caséine conformément au mode opératoire de Sgouris et al (Vox sang. 5, 357 (1960)). le tableau 3 indique les activités restantes des divers échantillons obtenus par les traitements dans les six conditions exprimées en pourcentage de l'activité d'une préparation de plasmino- gène n'ayant jamais été chauffée, ne contenant pas d'ad- ditif. TABLEAU 3 Activités restantes (%) après des traitements dans diverses conditions Adnditif (con. Ai s Conditiorns Conditions Conditions Conditions Conditions Addii f- -- A B C D E F Pas d'additif NaCl (0.05M) " (0,10M) " (0,15M) KC1l (0,1OM) (NH4)2S0O4 (0,02M) t " (0,05M) "' (O,10M) Na2SO4 (0,02M) " (0,05M) "à (0,20M) Na2BI307 (0,10M) KH2PO4 (0,02M) " (0,05M) " (0,15M) /... r', 4:- -. %,4 TABLEAU 3 (Suite) lysine CH3COONa glucose glycine Mannitol itrate de Caprylate (0,O003M) (OlOM) (O01OM) (0,1OM) (0,lOM) sodium (050M) de sodium (0,10%) polyéthylène glycol-4000 (2,0%) J _ _ _ _ _ _ _ _ X. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ I r', 4N 4: k4 k L'examen du tableau 3 montre que les solu- tions de plasminogène, aussitôt après l'addition de stabilisants, présentent des activités de 95 à 100 %, c'est-à-dire qu'on n'observe pratiquement ni augmenta- tion ni diminution de l'activité sous l'effet des sta- bilisants (conditions A). Les solutions de plasminogène contenant les stabilisants choisis dans l'invention, qui ont été digérées à pH 3,0 pendant 30 minutes et en outre trai- tées thermiquement à 601C pendant 10 heures, ne sont pratiquement pas inactivées lorsque leurs pH sont ramenés vers la région neutre. Aucontraire, les solutions de plasminogène traitées de la même façon alors qu'elles ne contenaient pas d'additif ou contenaient de l'acide acétique, du glucose, de la glycine, du citrate de sodium, du caprylate de sodium ou du polyéthylène-glycol 4000 donnent des quantités importantes de matière inso- luble lorsque leurs pH sont ramenés vers la région neutre, et les activités de leurs liquides surnageants sont très faibles (conditions B). Les solutions de plasminogène digérées à un pH de 3,0 pendant 30 minutes avant l'addition de stabi- lisant, même mélangées avec la même quantité de stabi- lisant que dans les conditions B, donnent de grandes quantités de matière insoluble après avoir-été chauffées ou ramenées à pH neutre, et les activités résiduelles des liquides surnageants sont faibles (conditions C). Dans le cas o le traitement thermique a été effectué à 601C pendant 10 heures aussitôt après l'ad- dition de stabilisant, une quantité importante de matière insoluble se forme lorsque la solution est rame- née à un pH neutre, et l'activité résiduelle du liquide surnageant est faible (conditions D). Les faits ci-dessus montrent qu'avant d'effec- tuer le traitement thermique à 60'C pendant 10 heures, il est nécessaire d'effectuer la digestion. Les activités résiduelles des préparations obtenues par lyophilisation des solutions de plasmino- gène traitées dans les conditions B sont presque inchan- gées, c'est-à-dire que l'on n'observe pratiquement pas d'inactivation due à la lyophilisation (conditions E). En outre, ces préparations lyophilisées sont stables pendant six mois de stockage à 41C et ne présentent pas de variation d'activité (conditions F). Les préparations lyophilisées ne présentant pas de diminution d'activité ont été dissoutes dans de l'eau distillée pour injection,et 1 ml de chaque solu-. tion a été injecté à une souris pesant 20 + 2 g. L'ob- servation a été poursuivie pendant sept jours, au cours desquels aucun symptûme anormal n'a été observé. 2474313; REVENDICATIONS 1. Préparation de plasminogène caractérisée en ce qu'elle contient au moins un membre du groupe constitué des sels minéraux physiologiquement accep- tables, de la lysine et de ses sels, du fluorure de phénylméthanesulfonyle, de l'aprotinine, et de l'inhi- biteur de la trypsine du soja en quantité efficace pour stabiliser le plasminogène. 2. Préparation de plasminogène suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le sel minéral physiologiquement acceptable est un sel de métal alca- lin, ur sel de métal alcalino-terreux, ou un sel d'am- monium de l'acide chlorhydrique, de l'acide sulfurique, de l'acide borique ou de l'acide phosphorique. 3. Préparation suivant la revendication 2, caractérisée en ce que le sel minéral physiologiquement acceptable est: NaCl, KC1, MgCl2, (NH4)2S04, Na2S04, Na2 407 KH2P04, K2HP04, NaH2PO4 ou Na2HPO4. 4. Préparation de plasminogène suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le sel de lysine est un sel de métal alcalin ou un sel de métal alcalino- terreux. 5. Procédé suivant la revendication 4, carac- térisé en ce que le sel de métal alcalin est un sel de sodium ou de potassium, et le sel de métal alcalino- terreux est un sel de magnésium ou de calcium. 6. Préparation de plasminogène suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la préparation est sous la forme d'une solution aqueuse et en ce que les concentrations en sels minéraux physiologiquement acceptables, lysine, ses sels, fluorure de phényl- méthanesulfonyle, aprotinine, et inhibiteur de la tryp- sine du soja sont 0,002 à 0,4 M, 0,001 à 5 % P/V, 0,001 à 5 % P/V, 0,01 à 100 mM, 0,1 à 1 000 KUI/ml et 1 à 1 000 UBAEE/ml respectivement. 7. Préparation de plasminogène suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la prépara- tion est sous la forme d'une poudre sèche et en ce que les concentrations en sels minéraux, lysine, ses sels, fluorure de phénylméthanesulfonyle, aprotinine et inhi- biteur de la trypsine du soja sont 0,01 à 10 % P/P, 0,01 à 10 % P/P, 0,01 à 10 % P/P, 0,1 à 10 % P/P, 0,01 à 1 000 KUI/mg et 0,1 à 1 000 UBAEE/mg respectivement. 8. Procédé de production d'une préparation de plasminogène caractérisé en ce qu'on ajoute au moins un membre du groupe constitué des sels minéraux physiolo- giquement acceptables, de-la lysine, de ses sels, du fluorure de phénylméthanesulfonyle, de l'aprotinine et de l'inhibiteur de la trypsine du soja, dans une quan- tité efficace pour stabiliser le plasminogène, à une solution aqueuse contenant du plasminogène, en ce qu'on soumet si nécessaire la solution obtenue à une digestion à une température de 4 à 370C, à un pH de 2 à 4, pendant à 60 minutes, puis à un traitement thermique à 60 C pendant 10 heures, et en ce qu'on lyophilise la solu- tion obtenue. 9. Procédé suivant la revendication 8, carac- térisé en ce que ce sel minéral physiologiquement accep- table est un sel de métal alcalin, un sel de métal alcalino-terreux ou un sel d'ammonium de l'acide chlor- hydrique, de l'acide sulfurique, de l'acide borique ou de l'acide phosphorique. 10. Procédé suivant la revendication 9, carac- térisé en ce que ce sel minéral physiologiquement accep- table est NaCl, KC1, MgCl2, (NH4)2504, Na2504, Na2B407, KH2P04, K2HP04, NaH2P04 ou Na2HPO4. 11. Procédé suivant la revendication 8, carac- térisé en ce que ce sel de lysine est un sel de métal alcalin ou un sel de métal alcalino-terreux. 12. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que ce sel de métal alcalin est un sel de sodium ou de potassium et en ce que ce sel de métal alcalino-terreux est un sel de magnésium ou un sel de calcium. 13. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que ces quantités efficaces de sels minéraux physiologiquement acceptables, de lysine, de ses sels, de fluorure de phénylméthanesulfonyle, d'apro- tinine et d'inhibiteur de la trypsine du soja sont 0,002 à 0,4 M, 0,001 à 5 % P/V, 0,001 à 5 % P/V, 0,01 à 100 iM, 0,1 à 1 000 KUI/ml et 1 à 1 000 UBAEE/ml, respectivement.