FR 2474032 A1 19810724 FR 8001188 A 19800121 La leucovorine (ou acide folinique) calcique est une substance intéressante pour abaisser la toxicité et contrebalancer l'effet de trop fortes doses d'antagonistes de l'acide folique administrées par erreur, ainsi que dans le traitement d'anémies mégaloblastiques dues à la sprue, à un défaut de nutrition ou à une grossesse, ou encore du bas age (Physicians Desk Reference, 31 me Edition 1977, pages 904, 905). La leucovorine calcique est un agent puissant pour neutraliser les effets toxiques immédiats du méthotrexate, et elle est utilisée comme agent de "secours" pour antagoniser les effets toxiques périphériques de ce médicament (ou d'autres agents antifoliques) à la suite de leur emploi en chimiothérapie anti-néoplastique. Mais la leucovorine calcique est une substance extrêmement coûteuse, principalement du fait que les méthodes de synthèse dont on dispose jusqu'ici donnent un produit nécessitant une purification très poussée pour satisfaire aux spécifications de la pharmacopée, et presque toujours la purification nécessite une chromatographie sur colonne, qui constitue un stade très coûteux de la préparation de leucovorine calcique, demandant par exemple beaucoup de temps et de travail et un équipement coûteux, ainsi que de très grandes quantités de solvant pour l'élu- tion. Or, la présente Demanderesse a trouvé qu'en employant une base aminée pour ouvrir le cycle de l'anhydroleucovorine en vue d'obtenir la leucovorine, la leucovorine calcique ainsi formée contient beaucoup moins d'impuretés que dans le cas où l'on utilise une base minérale. D'une manière étonnante, dans la plupart des cas, la leucovorine calcique qui a été préparée avec une base aminée pour ouvrir le cycle est suffisamment pure pour satisfaire aux spécifications de la pharmacopée simplement après filtration, lavage et séchage, c'est-à-dire qu'une chromatographie sur colonne n'est plus nécessaire. Des bases aminées utilisables sont celles qui ne donnent pas lieu a la présence de quantités notables de sels inorganiques contaminant la leucovorine calcique isolée, et avec lesquelles la contamination par des matières organiques est également moindre. Des bases aminées préférées comprennent la méthylamine, l'éthylamine, la triéthylamine, la morpholine, l'hydroxyde de tétraéthylammonium et la N,N-diéthyléthanolamine, mais d'autres bases conviennent aussi, bien que moins préférables, par exemple l'ammoniac, l'aniline, la p-chloroaniline, la triméthylamine, la n-butylamine, la cyclohexylamine, la diéthanolamine, la triéthanolamine, la diéthylamine, la diméthylamine, la N,N'-diméthylaniline, la piperidine, la pipérazine, la N-méthylpipérazine, la N,N'-diméthylpipérazine, la pyridine, l'imidazole, la benzylamine, l'éthylène-diamine, la o,- m- ou p-toluidine et la o-, mou p-anisidine. Les spécialistes pourront encore trouver et choisir d'autres bases aminées pour l'exécution du procédé selon cette invention. Si l'on utilise l'ammoniac, il peut être souhaitable d'opérer dans un appareil clos sous pression pour éviter les pertes d'ammoniac par évaporation, de même que si l'on utilise des amines volatiles. Pour effectuer la réaction, on mélange l'acide 5,10-méthényl-5,6,7,8-tetrahydrofolinue (ou anhydroleucovorine) avec la base aminée et de l'eau, et on chauffe le mélange entre 500C environ et la température de reflux pendant une durée de l'ordre de 5 à 7 heures pour former la leucovorine, le pH du mélange étant ajusté et maintenu entre 5 et 7 par addition ou enlèvement, selon le cas, des quantités voulues de la base aminée. L'anhydroleucovorine peut être employée sous la forme de son sel interne (zwitterion) ou sous la forme d'un sel avec un anion approprié, de préférence le chlorure, normalement à l'état d'hydrate. Lorsque l'ouverture du cycle est terminée, le mélange est en général refroidi et filtré, puis on ajoute au filtrat un peu plus que la proportion équimolaire (par rapport à l'anhydroleucovorine) d'un sel de calcium hydrosoluble tel que par exemple le chlorure, le bromure, l'iodure, le nitrate ou l'acétate, en solution aqueuse ou à l'état solide, et on précipite la leucovorine calcique en ajoutant un solvant organique hydrosoluble, par exemple un alcanol inférieur comme le méthanol, l'éthanol ou l'isopropanol, ou encore de l'acétone. La leucovorine calcique est ensuite isolée par filtration, lavée avec un solvant approprié tel que de l'éthanol aqueux, l'éthanol, l'acétone, l'éther, l'acétate d'éthyle ou autres, et elle est séchée. Une chromatographie sur colonne n'est généralement pas nécessaire, le produit obtenu satisfaisant ou même dépassant les spécifications de la pharmacopée. On peut tolérer la présence dans le mélange réactionnel de petites quantités de bases minérales, mais des quantités plus importantes auraient naturellement un effet préjudiciable, et de préférence le mélange ne contiendra pratiquement pas de bases inorganiques. La leucovorine calcique qui a été formée par le présent procédé est plus facile à séparer d'autres sels et impuretés que le produit obtenu par les procédés antérieurement connus. EXEMPLE 1 : On ajoute en une fois 10 g de chlorure de l'acide 5,10-méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofolique, sous la forme du chlorhydrate dihydraté, à un mélange de 6,5 ml de méthylamine à 40 % et 90 ml d'eau à 600C, on porte le mélange au reflux et on ajuste le pH à 6,0 en éliminant par distillation l'excès de base, et au cours de la période de reflux de 4 heures qui suit, on maintient le pH entre 5,9 et 6,1 en ajoutant de la méthylamine à 40 %. On refroidit ensuite le mélange à la température ordinaire, on en forme une suspension avec 10 g de silicate de magnésium synthétique et on filtre. On conserve le filtrat à -50C pendant 16 heures, puis on le laisse revenir à la température ordinaire et on lui ajoute de 2,25 g de chlorure de calcium.On précipite le produit formé par addition de 30 ml d'éthanol et on le recueille par filtration, on lave le gâteau avec de l'éthanol aqueux à 50 % et de l'éther et on le sèche sous pression réduite, ce qui donne 5,9 g, soit un rendement de 55 %. Analyse par chromatographie en phase liquide - 93,1 %. Pharmacopée des E.U.A. (Vol. XIX) Titrage par chromatographie en couche mince pour la leucovorine calcique - 96 et 100 %. EXEMPLE 2 On ajoute en une fois 20 g du chlorure de l'acide 5, 10-méthényl-5 , 6,?, 8-tétrahydrofolique sous la forme du chlorhydrate dihydraté à un mélange agité, à 650C, de 20 ml de triéthylamine et 100 ml d'eau. On chauffe le mélange au reflux et on ajuste le pH à 6,0 en éliminant par distillation l'excès de base, puis on maintient le pH entre 5,6 et 6,1 pendant une période de reflux de 5 heures en ajoutant de la triéthylamine. On continue ensuite à agiter le mélange à la température ordinaire pendant 16 heures, puis on le met en suspension pendant 30 minutes avec 15 g de silicate de magnésium synthétique et on filtre. On ajoute au filtrat 4 g de chlorure de calcium, on refroidit le mélange dans un bain de glace et on lui ajoute 40 ml d'éthanol, on sépare par filtration le précipité formé, on le lave avec 40 ml d'éthanol aqueux à 50 %, puis avec 30 ml d'éthanol et 30 ml d'éther, et on le sèche sous pression réduite. On obtient 12,1 g de produit, soit un rendement de 57 %. Analyse par chromatographie en phase liquide - 94,5 %. Pharmacopée des E.U.A. (Vol. XIX) Titrage par chromatographie en couche mince pour la leucovorine calcique - 96,4 et 98,3 %. EXEMPLE 3 On met en suspension dans 35 ml d'eau 4 g du chlorure de l'acide 5,10-méthényl-5,6,7,8-tetrahydrofolique sous la forme du chlorhydrate hydraté, on ajuste le pH à 6,5 par addition de la quantité nécessaire de morpholine et on maintient le mélange au reflux pendant 6 heures, puis on le refroidit, on le met en suspension pendant 20 minutes avec du silicate de magnésium synthétique et on filtre On ajuste le filtrat à pH 8,0 avec de la morpholine et on lui ajoute 0,9 g de chlorure de calcium dans 4 ml d'eau, puis on dilue la solution avec de l'éthanol jusqu'à ce qu'il se forme un trouble et on la refroidit alors à - 5"C pendant une heure. On isole par filtration le produit solide formé, on le lave avec 15 ml d'éthanol et 20 ml d'éther et on le sèche sous pression réduite, ce qui donne 2,43 g, soit un rendement de 55 t. Analyse par chromatographie en phase liquide - 83 t. Une nouvelle dilution avec de l'éthanol de la liqueur mère initiale donne une nouvelle quantité de 0,87 g (20 %) de produit solide. Analyse par chromatographie en phase liquide - 83 %. z PLE 4 On ajoute en une seule fois 10 g du chlorure de l'acide 5,10-méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofolique, sous la forme du chlorhydrate dihydraté, un mélange à 500C de 20 ml d'hydroxyde de tétraéthyl-ammonium à 1 % et 100 ml d'eau, on ajoute encore environ 30 ml de la base pour ajuster le pH à 6 puis on maintient le mélange au reflux pendant 4 heures tout en maintenant le pH entre 5,5 et 6,0 par addition d'hydroxyde de tétraéthyl-ammonium, on ajuste ensuite le pH à 6,35 et on poursuit le reflux pendant encore 16 heures. On refroidit alors le mélange et on le met en agitation pendant 24 heures à la température ordinaire, puis on lui ajoute 15 g de silicate de magnésium synthétique, on maintient en suspension pendant 30 minutes et on filtre.On dilue la solution à 150 ml avec de l'eau, on ajuste le pH à 8,7 avec de l'hydroxyde de tétraéthyl ammonium et on ajoute 50 ml de SD3A, puis on ajoute goutte à goutte 2 g de chlorure de calcium dans le minimum d'eau, on sépare par filtration à 50C le précipité formé, on le lave avec 50 ml de SD3A aqueux à 50 % et on le met en suspension pendant 1 heure dans 200 ml d'hydroxyde de tétraéthyl-ammonium à 0,1 % dans du SD3A. On sépare le produit solide par filtration, on le lave avec de l'acétone et on le sèche sous pression réduite, ce qui donne 4 g, soit un rendement de 38 %. Analyse par chromatographie en phase liquide - 94,4 %. EXEMPLE 5 A 100 ml d'eau à 6O0C on ajoute en une fois 20 g du chlorure de l'acide 5,10-methényl-5,6,7,3-txtrahydro- folique sous la forme du chlorhydrate dihydraté, puis on ajoute 14,9 g de N,N-diéthyléthanolamine pour ajuster le pH à 6, et on maintient le mélange au reflux pendant 5 heures tout en réglant le pH entre 5,7 et 6,2 par addition de N,N-diéthyléthanolamine. Ensuite on refroidit, on ajoute 15 g de silicate de magnésium synthétique que l'on maintient en suspension, on filtre sur de la Celite et on dilue avec 40 ml de SD3A. On maintient le filtrat à -50C pendant 16 heures puis on ajoute goutte à goutte au filtrat froid 4 g de chlorure de calcium aqueux, on isole par filtration le précipité formé, on le lave avec 100 ml de SD3A et 100 ml d'acétate d'éthyle et on le sèche sous pression réduite. Le rendement est de 61 %, soit 13 g. Pharmacopée des E.U.A. (Vol. XIX) Titrage par chromatographie en couche mince pour la leucovorine calcique - 91 %. REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation de leucovorine calcique à partir de l'anhydroleucovorine, caractérisé en ce que l'on utilise une base aminée pour ouvrir le cycle de l'anhydroleucovorine. 2.- Procédé selon la revendication 1, carac térisé en ce que l'on mélange l'anhydroleucovorine avec un solvant aqueux et une quantité de la base aminée donnant un pH de 5 à 7, on chauffe le mélange et si nécessaire on lui ajoute une nouvelle quantité de la base pour maintenir le pH entre 5 et 7, on lui ajoute ensuite une proportion d'un sel de calcium hydrosoluble à peu près équimolaire par rapport à l'anhydroleucovorine, et on isole la leucovorine calcique formée. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la base aminée est choisie parmi l'ammoniac, la méthylamine, la diméthylamine, la triéthylamine, la morpholine, la triméthylamine, l'hydroxyde de de tétraéthylammonium, la N,N-diéthyléthanolamine, l'aniline, la p-chloro-aniline, la n-butylamine, la cyclohexylamine, la diéthanolamine, la triéthanolamine, la diéthylamine, la pipéridine, la N,N-diméthylaniline, la pipérazine, la N-méthylpipérazine, la N,N'-diméthylpipérazine, la pyridine, l'imidazole, la benzylamine, l'éthylènediamine, l'o-toluidine, la m-toluidine, la p-toluidine, l'o-anisidine, la m-anisidine et la p-anisidine. 4.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la base aminée est choisie parmi la méthylamine, la triéthylamine, la morpholine, l'hydroxyde de tétraéthylammonium, la N,N-diéthyléthanolamine et l'éthylamine. 5.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la base aminée est choisie parmi la méthylamine, la triéthylamine et la N,N-diéthyléthanolamine. 6.- Procédé de préparation de leucovorine, caractérisé en ce que l'on mélange l'anhydroleucovorine avec un solvant aqueux et une quantité d'une base aminée donnant un pH de 5 à 7, on chauffe le mélange et si nécessaire on lui ajoute une nouvelle quantité de la base aminée pour maintenir son pH entre 5 et 7. 7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la base aminée est l'une de celles spécifiées aux revendications 3 à 5. 8.- La leucovorine calcique obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 9.- La leucovorine obtenue par le procédé selon la revendication 6 ou 7.