FR 2461951 A1 19810206 FR 7919048 A 19790724 La présente invention concerne un procédé et un appareil pour la préparation de spécimens de cellules sanguines à l'analyse diagnostique. Plus précisément, elle vise la fixation ou préservation de la morphologie des cellules en vue d'une analyse automatique ultérieure. L'invention vise en particulier la fixation opérée sur les cellules, au cours d'un stade précis et critique de la préparation des échantillons, pour préserver leur morphologie en vue de l'analyse ultérieure. On réduit ainsi au minimum les déformations qui apparaissent avec d'autres procédés de préparation d'échantillons comportant des cellules portées par une lame micro sceptique. Sans que l'invention soit pour autant limitée à un genre particulier de cellules ou d'échantillons, on se réfèrera pour la décrire à la préparation rapide d'hématies à l'analyse automatique.L'un des changements d'aspects notés jusqu'à présent, avec les modes connus de préparation de lames microscopiques, est une altération morphologique subie parcertaines hématies, notamment par disparition de leurs concavités centrales, le globule prenant un aspect plus arrondi analogue à celui de sphérocytes ou d'autres globules ou cellules de diamètre analogue. Le diagnostic de diverses anémies est facilité par l'analyse précise des grosseurs des hématies et de certains paramètres quantitatifs tels qu'indices de Wintrobe de volume globulaire moyen, taux d'hémoglobine moyen et la concentration globulaire moyenne en hémoglobine (valeur globulaire). A l'heure actuelle, on obtient typiquement ces indications au moyen d'un compteur de Coulter qui mesure le nombre d'hématies par millimètre cube, le taux d'hémoglobine et le volume globulaire moyen dans un appareil à circulation de liquide.En plus de ces données fournies par le compteur de Coulter, il serait extrêmement utile de disposer d'une analyse précise des espèces globulaires présentes dans l'é- chantillon réparties en catégories hématologiques: normocytes, macrocytes, cellules en cible, microcytes,polkilocytes, ovalocytes hypochromes, sphérocytes etc. Un procédé et un appareil permettant de répartir individuellement des globules dans de telles catégories et d'obtenir des paramètres globulaires sur les hématies de chaque catégorie sont décrits dans le brevet US 4 097 845 (James W. Bacus) intitulé "Procédé et appareil pour la classification automatique d'hématies", dont il est formellement fait état comme s'il était intégralement reproduit ici. La méthode la plus ancienne et la plus courante de pré paration de lames microscopiques en vue d'une évaluation manuel le sous microscope comporte l'opération consistant à étaler une certaine quantité de sang, portée par une lame en verre en couche mince sur la surface de cette lame à l'aide d'une seconde lame. Après le séchage de la couche, qui n'exige qu'un temps bref, on trempe la lame dans un agent colorant, puis on observe la lame au microscope et l'on analyse visuellement les globules rouges. Ou tre que ce processus est long, l'effet physique exercé par la lame frottante tend à déformer de nombreuses hématies. Typiquement, dans des conditions optimales, seule une fraction de l'aire su perficielle de la masse se prête à l'analyse. Du fait de ces dé formations, cette technique d'étalement à la lame ne convient pas pour l'analyse automatique des hématies. On a mis au point, en particulier pour l'analyse des leucocytes, une technique de toupillage permettant de répartir sur une lame des leucocytes en une couche monocellulaire en vue de leur analyse automatique ultérieure. L'appareil utilisé agit essentiellement pour faire tourner une lame et le sang qu'elle porte dans un plan passant par la surface sur laquelle repose le sang, l'excès de sang étant chassé par effet centrifuge de la sur face de la lame. Par des effets de tension de surface et/ou au tres, une couche de sang monocellulaire est retenue sur la lame. Pour un examen leucocytaire, on laisse sécher les globules répar tis en couche monocellulaire, puis on les colore à l'aide d'un colorant de Wright ou autre et on les analyse automatiquement comme décrit dans le brevet US 3 883 852. Bien que le.séchage des leucocytes ne provoque pas de déformations sensibles du point de vue de l'analyse leucocytaire, on constate que celui des hématies provoque des altérations indé sirables, notamment la disparition pendant séchage des concavités centrales de nombreuses hématies. On ne connaît pas entièrement les motifs de ces changements de forme, mais ceux-ci résultent apparemment d'effet de tension superficielle, de charge et/ou de séchage. La technique de toupillage provoque la formation sur la lame de la couche d'hématies monocellulaire préférée, les héma ties étant séparées, c'est-à-dire espacées, les unes des autres. Si l'on plonge une telle lame dans un liquide de fixation ou de coloration avant que les cellules ne soient sèches, les hématies sont éliminées de la lame par lavage donc souhaitable de fixer les hématies après formation d'une telle couche, mais avant séchage. En conséquence, la présente invention a pour but général de proposer un procédé permettant de fixer la morphologie cellulaire de cellules portées par une lame après formation de la couche monocellulaire, mais avant séchage des cellules sur la lame, pour conserver à celles-ci leurs aspects caractéristiques en vue d'une analyse ultérieure. D'autres buts et avantages de l'invention ressortiront de la description détaillée que l'on va maintenant donner en se référant aux dessins annexés, sur lesquels: la figure 1 est une vue schématique de dessus, avec grossissement, d'une lame microscopique portant une couche monocellulaire d'hématies dont certaines comportent et d'autres ne comportent pas de concavité centrale; la figure 2 est une vue de profil correspondant la figure 1; la figure 3 représente en perspective, ouvert, un appareil selon l'invention; la figure 4 représente ce même appareil fermé. D'une manière générale, selon le procédé visé par l'invention, un place une certaine quantité d'échantillon sanguin sur une lame microscopique qu'on fait ensuite entraîner par une toupilleuse centrifuge. Le toupillage chasse le sang de la lame, sous réserve d'une couche monocellulaire. Avant que l'échantil- lon ait subi un séchage normalement suffisant pour déformer les hématies, on applique sur la couche monocellulaire un agent de fixation apte à préserver les formes des hématies afin que celles-ci ne subissent pas, pendant la suite du séchage, une altération suffisante pour faire disparaltre leurs concavités centrales. La figure 3 représente un appareil pour la mise en oeuvre du procédé décrit, comprenant une toupilleuse centrifuge 10 qui comporte une enveloppe 12 définissant une chambre intérieure 14, ouverte au sommet, dans laquelle est disposé un plateau rotatif monté sur l'extrémité d'un arbre 18. Ce plateau reçoit sur saface supérieure plate une lame microscopique 20 afin de la fai re tourner dans un plan horizontal. La lame 20 est temporairement immobilisée sur le plateau par des moyens appropriés 22 tels qu'oreilles ou analogues, ayant sur la surface du plateau l'espa- cement voulu pour recevoir la lame. L'arbre 18 est entraîné par des moyens moteurs non représentés, la vitesse et la durée de toupillage étant commandées par des moyens classiques bien connus du technicien.On trouve dans le commerce des toupilleuses adéquates, qui peuvent être du genre décrit dans les brevets US 3 853 092 et 3 906 890. Selon un aspect de l'invention, le sommet ouvert de la chambre de toupilleuse peut être recouvert par un couvercle 24, conçu pour reposer sur l'enveloppe 20 au-dessus du sommet ouvert. Dans l'exemple décrit, le couvercle 24 communique, par exemple par un conduit 26, avec une source de vapeurs d'agent de fixation, telle que cartouche 28 contenant l'agent fixant, Un obturateur 30 interposé sur le conduit 26 commande le débit de passage de vapeurs de la source à l'intérieur de la chambre 14 de la toupilleuse. Dans l'exemple illustré, l'obturateur 30 est un opercule semi-circulaire 31 articulé en son centre sur un axe 33 fixé sur le couvercle. On peut faire pivoter l'opercule, pour masquer ou démasquer l'orifice du conduit 26, en déplaçant en arc de cercle un goujon de préhension 35 qu'il porte.Pour que les vapeurs s'écoulent vers la chambre, on maintient la cartouche 28 sous pression supérieure à celle régnant dans la chambre de toupillage, par exemple au moyen d'un ventilateur 32 monté dans la cartouche 28 ou d'une pompe à air 34 envoyant de l'air dans la cartouche. Comme noté dans l'introduction, pour préparer un échantillon sanguin à l'analyse, on dépose une certaine quantité 36 de cet échantillon sur la lame 20, qu'on monte alors sur le plateau de toupillage 16 disposé dans la chambre 14. On fait tourner cette lame à la vitesse et pendant le temps nécessaires pour obtenir une couche monocellulaire d'hématies uniformément réparties sur la surface de la lame. Couramment, on maintient une vitesse de toupillage constante de 4.000 à 10.000 tr/mn pendant le temps de toupillage relativement bref, par exemple de moins d'une seconde à 2,5 secondes, nécessaire à l'obtention d'une couche monocellulaire satisfaisante. Comme décrit dans l'article de James W. Bacus "Erythro cyte Morphology and Centrifugal Spinner( Blood Film Préparations" paru dans The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 22:7: 506-516, 1974, on dilue de préférence les échantillons sanguins pour ajuster leurs viscosités de plasma afin de pouvoir obtenir, par toupillage de l'échantillon pendant un temps constant et à une vitesse constante, la couche monocellulaire de cellules convenablement séparées et à concavités centrales bien marquées. A titre d'exemple, on peut diluer un échantillon de sang total avec une solution de sérum-albumine à viscosité relative de 1,3 pour ajuster l'hématocrite de chaque échantillon à 18%. La viscosité relative est rapportée à uen valeur de 1,0 pour H20 et une gamme type de viscosités relatives de plasma sanguin va de 1,2 à 1,8. En variante, on peut utiliser comme diluant, pour la plupart des sangs, une solution saline isotonique standard dans un rapport convenable, par exemple de 1:1. Comme le sait le technicien; si le temps de toupillage est trop court, les globules sont groupés au lieu d'être isolés, et il est donc impossible de les classifier individuellement. Si le temps de toupillage est trop long, les globules subissent des déformations inadmissibles. Au lieu d'ajuster la viscosité du plasma et de prévoir un temps de toupillage constant, ce qui est préférable, on peut utiliser un appareil de toupillage apte à régler le temps de toupillage. Un tel appareil, décrit dans le brevet US 3 827 805, comporte un faisceau lumineux qui traverse la lame et l'échantil- lon pendant toupillage. Par mesure du degré auquel le faisceau est dispersé par les globules, on peut arrêter le toupillage lors de l'obtention d'une distribution prédéterminée des globules. Un autre appareil de réglage du temps de toupillage est décrit dans le brevet US 3 906 890. Cet appareil permet à l'opérateur de déterminer la concentration approximative de l'échantillon en globules sanguins et de régler en conséquence le temps de toupillage. La présente invention peut, mais à titre non limitatif, être mise en oeuvre à l'aide d'un de ces appareils brevetés. Avantageusement, la couche monocellulaire d'hématies portée par la lame est fixée et séchée dans la mesure permettant sa manutention mécanique sans rupture ni déplacement des globules. Typiquement, une couche monocellulaire portée par une lame sèche en 10 à 15 secondes après l'arrêt du toupillage, ce temps variant avec l'humidité et d'autres conditions. Jusqu'à présent, le séchage de la couche monocellulaire provoque, comme noté dans l'introduction, de fâcheuses déformations des hématies qui gênent pour identifier les globules à concavité centrale et faussent l'identification des malformations globulaires. A titre d'exemple, les hématies 40 et 42 présentent sur la figure 1 des concavités centrales 44, que lion fixe au moyen d'un agent de fixation arrivant suivant les flèches portées sur la figure 2 pour éviter qu'elles ne disparaissent au cours du séchage ultérieur des globules. Si elles n'ont pas subi de fixation avant séchage, les hématies s'aplatissent et prennent les formes indiquées en traits interrompus en 40a et42a sur la figure 2. Les hématies ainsi aplaties en 42a et 40a, dont la concavité centrale est supprimée ou fortement déformée, s'avèrent difficiles à distinguer d'un véritable sphérocyte 46 tel que représenté sur la figure 1, qui n'a jamais présenté de concavité centrale, au moyen d'un appareil d'analyse automatique. Or on constate que, par le procédé décrit, on peut sécher adéquatement des hématies, sans altérer leur morphologie globulaire, en les fixant pendant ou immédiatement après le toupillage, lorsqu'elles se sont réparties en couche monocellulaire avec une dispersion adéquate, mais avant que le séchage n'ait suffisamment progressé pour altérer la morphologie globulaire à un degré inadmissible. Il s'avère que cette fixation conserve aux globules leur géométrie physique, de sorte que le séchage de la couche peut se poursuivre sans qu'apparaissent les déformations globulaires selon la technique antérieure. De préférence, on opère la fixation une fois la couche formée et le toupillage arrêté, afin qu'elle ait lieu avant que le séchage soit trop accusé. On obtient ce résultat, selon l'invention, en introduisant dans la chambre de toupillage un agent de fixation qui est sous forme de vapeurs, de sorte qu'il n'exerce aucun effet facheux sur l'échantillon sanguin. Cette fixation assure sensiblement la préservation de la morphologie globulaire. On a constaté qu'une fixation des globules opérées avant le toupillage empêche les globules de Ee disperser en la couche monocellulaire souhaitée, de sorte qu'ils forment plutôt des amas ou des chapelets pendant le toupillage ultérieur. On constate aussi que le dépôt, après toupillage, mais avant séchage d'un agent de fixation liquide sur la lame perturbe la distribution des glo bules, au point même que l'échantillon sanguin soit chassé par lavage de la lame en rotation. Un agent de fixation qui s'avère efficace est le formaldéhyde, gazeux à température ambiante normale. Dans l'appareil décrit, la cartouche 28 contient de la formaline (une solution aqueuse à environ 37-50% de formaldéhyde et environ 15% de méthanol, en volume). Le formaldéhyde s'échappe de la solution et est canalisé par le conduit 26 vers la chambre 14 de la toupilleuse 10. En variante, on peut retirer rapidement la lame 20 portant la couche sanguine monocellulaire et la placer sous atmosphère de vapeurs de formaldéhyde. Cette variante est moins indiquée étant donné la brièveté du délai - d'environ 5 secondes dans lequel il faut opérer le transfert pour effectuer la fixation avant que le séchage n'exerce des effets fâcheux.En outre, le circuit "fermé" établi par l'appareil représenté est préférable parce qu'il maintient enfermées les vapeurs de formaldéhyde, toxiques à une concentration dépassant 0,005 o/oo et dangereuses à des concentrations supérieures. Une exposition d'environ cinq minutes de la couche monocellulaire à une atmosphère de vapeurs de formaldéhyde assure la fixation désirée des hématies. Pendant le toupillage, l'échantillon est en majeure partie chassé de la lame sur la face intérieure de l'enveloppe de toupilleuse 12. Ce sang peut contenir des organismes nuisibles, de sorte que dans certaines toupilleuses, on fait ruisseler un liquide (usuellement eau) sur la face intérieure de l'envelop- pe 12, pendant toupillage, pour établir un joint hydraulique de sécurité empêchant ces organismes de s'échapper de la chambre. Le sang projeté est ainsi entravé par lavage à travers un trou de purge ménagé dans le fond du compartiment de toupillage. Selon un mode de mise en oeuvre de l'invention, on substitue à cette eau de ruissellement de la formaline. Ainsi, des vapeurs de formaldéhyde se dégagent dans la toupilleuse dès le début du toupillage. Selon ce mode de mise en oeuvre, le toupillage provoque la formation d'une couche monocellulaire dans un délai assez bref - de 0,5 seconde au moins - pour que, bien que des vapeurs de formaldéhyde soient intialement présentes dans la chambre de toupillage, la fixation n'ait lieu qu'une fois les globules mis par dispersion sous forme de couche monocellulaire. Une fois l'échantillon fixé et séché, on retire la la me 20 de la chambre de toupillage ou de fixation et l'on opère une analyse automatique. On constate que des hématies 40 et 42, fixées de la manière décrite, conservent leurs concavités centrales caractéristiques 44 et d'autres caractéristiques physiques, de sorte que les échantillons ainsi préparés permettent d'obtenir, par analyse à l'analyseur automatique, des indications non faussées et précises sur la morphologie des globules. Bien que l'agent de fixation préféré soit le formaldéhyde, on devrait pouvoir lui substituer d'autres alcools, méthylique, éthylique ou à chaîne courte, ou opérer la fixation par d'autres moyens tels que chauffage, par exemple par micro-ondes, ou autre méthode physique ou chimique. L'invention n'est donc pas limitée à aucun agent de fixation particulier. De manière générale, les dispositions décrites se prêtent à diverses modifications, sans sortir pour autant du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation et de fixation d'un spécimen constitué par une couche monocellulaire de cellules humides séparées portée par une lame microscopique en vue d'une analyse automatique ultérieure, caractérisé en ce que: on place sur un support une certaine quantité des cellules humides et l'on soumet les cellules et le support à un toupillage, pendant quelques secondes ou moins, pour obtenir sur le support une couche monocellulaire adéquate de cellules séparées et pour projeter hors du support les cellules excédentaires, on arrête le toupillage puis, avant que les cellules humides ne commencent à sécher et à changer sensiblement de forme, ce qui se produit en un temps de 15 secondes ou moins sous exposition à l'atmosphère ambiante, on fixe les cellules humides avec un agent de fixation en un temps de durée sensiblement plus longue pour préserver les formes des cellules, et l'on sèche ensuite les cellules fixées, sur ledit support, pour obtenir sur ce dernier une couche monocellulaire de cellules séparées fixées et séchées en vue d'une analyse autosa- tique ultérieure. 2. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on fixe les cellules humides en les exposant à des vapeurs de formaldéhyde pendant un temps de fixation d'au moins cinq minutes. 3. Procédé selon la revendication 2, selon lequel les cellules du spéciment comportent des hématies, caractérisé en ce qu'on fixe les concavités centrales des hématies avant de sécher celles-ci et l'on fixe les autres hématies pour éviter qu'il n'y apparaissent des formations artificielles ressemblant, après séchage, à des concavités centrales. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu 'on engendre des vapeurs d'agent de fixation en un point extérieur à une chambre dans laquelle on soumet ledit support du toupillage et l'on envoie ces vapeurs dans la chambre de toupillage pour fixer les cellules humides de la couche monocellulaire portée par le support. 5. Appareil pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une enveloppe définissant une chambre de toupillage, un plateau rotatif disposé sensiblement à l'horizontal dans cette chambre et apte à re cevoir un support sur lequel sont déposées les cellules humides, des moyens moteurs aptes à faire tourner ledit plateau, des moyens réglant le temps d'action de ces moyens moteurs de façon que les cellules sanguines humides s'étalent sur le support en couche sensiblement monocellulaire, et des moyens assurant l'apport de vapeurs d'agent de fixation à ces cellules humides après leur dispersion en couche sensiblement monocellulaire sur le support et avant leur séchage accompagné de déformations. 6. Appareil selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'enveloppe de la chambre de toupillage présente une surface intérieure et en ce que lesdits moyens d'apport de vapeurs d'agent de fixation comprennent des moyens faisant ruisseler sur ladite surface intérieure un liquide qui établit un joint étanche de sécurité pendant la rotation dudit plateau, ce liquide.déga- geant lesdites vapeurs d'agent de fixation dans la chambre de toupillage. 7. Appareil selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'un moyen de canalisation amène des vapeurs d'agent de fixation dans ladite chambre, à partir d'une source extérieure, pour fixer les cellules humides alors qu'elles sont encore dans la chambre de toupillage.