FR 2471383 A1 19810619 FR 7930333 A 19791211 L'invention concerne un nouveau procédé d'obten- tion d'alcaloïdes peptidiques du type ergoline ou ergolène le nouveau procédé convient pour l'obtention dalca- loïdes peptidiques sous la forme d'épimères dextrogyres aussi bien à partir de drogues d'ergot de seigle que sous forme de cultures saprophytes de Claviceps purpurea. Les alcaloïdes peptidiques à structure ergolique sont dune part des substances actives indis- pensables en thérapeutique, et d'autre part des produits de départ importants dans la préparation de dihydroalcaloldes ergot de seigle encore plus efficaces. Parmi les représentants les plus importants des alcaloïdes peptidiques à structure d'ergoline ou d'ergolène il faut mentionnerl'ergotamine et les 3 alcaloïdes du groupe de l'ergotoxine, l'ergocristine, l'ergocornine et l'ergocryptine.Dans les procédés procédés industriels mo- dernes par lesquels on prépare auJourd'hui les alca bides d'ergot de seigle, on utilise des souches sélectionnées de Claviceps aussi bien aux fins de production de sclérote parasitaire que de fermentation sa prophyte. Selon les premiers brevets consacrés à l'ob- tention d'alcaloSdes d'ergot de seigle, on a préparé des mélanges d'alcaloldes à partir d'ergot de seigle croissant à l'état sauvage (cf p ex. brevet hongrois n 14t 063). Les chercheurs ont été stimulés par le difficile problème, de loin non encore résolu sur le plan industriel, de la séparation des alcaloïdes peptidiques les uns des autres, à préparer des souches sélectionnées de Claviceps (brevets hongrois n 154 035 et 155 148).Dans la préparation à grande échelle d'alcaloides d'ergot de seigle, ces-souches sélectionnées produisent cependant également des alcaloïdes plus ou moins étrangers, particulièrement solubles dans l'eau (p ex. l'ergométrine), comme on le voit par exemple d'après le brevet hongrois nO 155 158. D'après le brevet hongrois nO 142 407, ces alcaloïdes solubles dans l'eau doivent être isolés au cours d'une étape particulière du procédé0 Dans le procédé décrit dans le brevet hongrois nO 152 934, les alcaloïdes solubles dans liteau sont traités tout au plus comme sous-produits. Pour les procédés d'obtention d'alcaloldes peptidiques connus jusqu'ici, il est caractéristique que le produit obtenu par extraction puis préparé apparaît à l'état amorphe, donc non cristallin0 Dans la purification de ce produit brut amorphe, le produit brut est enrichi surtout par purification chromatographique pour retirer les charges inertes présentes et ayant une action très dommageable dans les étapes ultérieures du procédé, en particulier dans la conversion (cf brevet anglais nO 1 158 380, brevet hongrois n 164 166, brevet allemand no 2 113 281)-. L'étape suivantendu procédé est l'épimérisation du mélange des isomères dextrogyre et lévogyre en composé lévogyre puis la préparation du produit final.Selon certains procédés on obtient par un moyen extrêmement doux immédiatement et sans conversion un produit final lévogyre (brevet hongrois nO 164 116), mais une purification du produit est ici nécessaire0 On ne peut cependant employer un tel procédé que dans les cas où le produit de départ ne convient pas ou ne contient que très peu d'isomère dextrogyre. En résumé on peut assurer que l'ensemble des procédés d'obtention d'alcaloldes peptidiques du type ergoline bu ergoline connus' 3usqu' ici est compliqué et se comme pose de nombreus"es'étapes, celles-ci n'ayant pour but que de débarrasser des impuretés les alcaloldes peptidi gues présents dans la drogue ou dans le liquide de fermentation.Ces étapes consistent pour l'essentiel en opérations d'extraction dans lesquelles les composés ergoline cu ou ergolène lorsqu'ils sont en milieu aqueux sont transformés en sels pour augmenter leur solubilité, et lorsqu'ils doivent être introduits dans la phase organique, sont libérés à partir de leurs sels. Chaque étape de ce changement de phase répété comporte cepenM dant des pertes dues à une certaine solubilité des alcaloïdes ergoliques dans l'autre phase. L'invention a donc pour objet d'éviter les inconvénients ci-dessus mentionnés et de simplifier le procédé d'obtention par l'élaboration d'un nouveau procédé dans lequel la capacité de préparation indus- trielle est augmentée par la simplification du procédé et, en dépit de la diminution du nombre des changements de phase, le produit est obtenu à l'état cri- tallin et non à l'état amorphe. L'invention se fonde sur les trois observations suivantes : 1 - Lorsqu'on concentre, éventuellement par évaporation, l'extrait obtenu par la première extraction et qu'on extrait ou qu'on distille de façon fractionnée le concentré ou le résidu d'évaporation avec un mélange ternaire de formamide, d'eau et d'acide, on obtient les alcalotdes peptidiques, étant donné la solubilité extraordinairement bonne du formamide, non encore utilisé jusqu'ici pour l'obtention de tels alcaloldes peptidiques, dans un très petit volume de mélange de solvants ;; 2 - Lorsqu'on extrait la solution des alcaloldes pep tidiques bruts, obtenue de la manière indiquée ci dessus, avec un solvant non miscible à l'eau, qu'on concentre l'extrait par évaporation, qui on dissout le résidu obtenu dans un alcanol ayant de 1 à 6 atomes de carbone et qu'on laisse reposer la solution,on obtient les alcaloldes peptidiques du type ergoline ou ergolène à l'état cristallin et sous la forme des épimères dex trogyres moins solubles avec un rendement presque quantitatif, en échange de quoi on ne peut obtenir les épimères lévogyres sous forme cristalline qu'après de longues opérations de purification ;; 3 - Lorsquton dégraisse les épimères dextrogyres cris tallins obtenus avec un dissolvant des graisses, de préférence avec de la méthylisobutylcétone ou de l'a cétate de butyle, en phase hétérogène, on obtient les épimères dextrogyres avec une telle pureté qu'après épimérisation on peut les utiliser immédiatement dans des buts thérapeutiques. L'invention est donc un procédé d'obtention d'alcaloïdes peptidiques du type ergolins ou ergolènr à partir de drogues d'ergot de seigle ou de cultures submergées de souches de Claviceps par extraction et purification de l'extrait par changement de phase, caractérisé en ce qu'on dissout le mélange épimérique brut d'alcaloïdes peptidiques du type egoline ou ergolènedlns un soflvantprotique, de préférence dans un alcool ayant de 1 à 6 atomes de carbone, en ce qu'on laisse reposer la solution et en ce qu'on sépare les épimères dextrogyres précipités, en ce qu'on les dégraisse en phase hétérogène avec un dissolvant des graisses, de préférence avec de la mé thylisobutylcétone ou avec de l'acétate de butyle, et en ce qui on isole le produit obtenu. Lors de la réalisation du procédé selon l'invention, on extrait les sclérotes ou le liquide de fermentation non filtré de la fermentation effectuée avec Claviceps purpurea avec un solvant non miscible à l'eau, c'est-à-dire avec une cétone, un ester d'acide carboxylique ou un hydrocarbure chloré en présence d'une base. On sépare extrait de solvant des sclérow tes ou du liquide de fermentation, puis on répète l'extraction au moins encore une fois, mais alors sans base, avec le solvant pur. Comme solvant on peut utiliser pour cette extraction de pré préférence de la méthylisobutylcétone comme cétone, de l'acétate d'éthyle ou du carbonate de diéthyle comme ester d'acide carboxylique, ou du chloro- forme comme hydrocarbure chloré et de préférence de l'hydroxyde d'ammonium comme bases On concentre alors ou on concentre jusqu'à siccité par évaporation l'extrait obtenu de la manière indiquée ci-dessus, et on extrait les alcaloïdes peptidiques du type ergoline ou ergolène a partir du concentré ou a partir du résidu d'évaporation avec le mélange ternaire constitué d'un amide d'acide carboxylique, d'eau et d'un acide, et ce au moins une fois, de préférence trois fois Comme amide d'acide carboxylique on peut utiliser en pratique le formamide et comme acide de préférence l'acide phosphorique ou l'acide tartrique. On extrait alors les alcaloïdes peptidiquesdu type ergoline ou ergolène présents dans l'extrait réui,a partir du mélange de solvants aqueux avec une cétone, un ester d'acide carboxylique ou un hydrocarbure chloré. Pour cette extraction il peut être intéressant d'utiliser comme cétone la méthylisobutylcétone, comme ester d'acide carboxylique l'acétate d'éthyle ou comme hydrocar bure chloré le chloroforme. On rassemble les extraits obtenus, on fait évaporer le solvant, on dissout le résidu dans un alcool aliphatique monovalent, de préférence dans un alcanol contenant de 1 2 6 atomes de carbone et on laisse reposer la solution pendant un temps assez long, de préférence pendant environ 20 H. Pendant cette durée les alcaloldes peptidiques du type ergoline ou ergolène se séparent de la solution sous forme cristalline presque quantitativement sous la forme de leurs épimèresdextrogyres. On sépare par filtration les cristaux obtenus de cette manière, on lave et on seche. On met alors en suspension dans un dissolvant des graisses les cristaux, qui contiennent encore des quantités notables d'impuretés graisseuses ; on sépare alors par filtration les cristaux-dégraissés obtenus de cette manière, on lave et on sèche. Comme dissolvant des graisses on peut utiliser les cétones, les.esters d'acide carboxyliques ou les hydrocarbures0 Comme exemple de cétones pratiquement utilisables on peut citer la méthylisobutylcétone, ccimme ester d'acide carboxylique l'acétate de n-butyle et comme hydrocarbure l'essence. On peut ainsi obtenir les alcaloïdes peptidiques du-type ergoline--ou ergolène dextrogyres dégraissés de la manière indiquée ci-dessus sous forme cristalline, avec des rendements de 95-99% Dans la purification des drogues du type ergotamine on extrait alors la drogue selon un mode de réalisation très avantageux du procédé de l'invention, on débarrasse 1' extrait du solvant immédiatement sans autre changement de phase, on dissout le résidu dans un alcanol ayant de 1 à 6 atomes de carbone, de préférence dans le méthanol et on laisse reposer la solution méthanolique ; on sépare par filtration l'ergotaminine précipitée sous forme cristalline, on lave et on sèche puis on dégraisse par mise en suspension dans la né- thylisobutylc étone0 Le procédé selon l'invention est représenté plus précisément par les exemples suivants, mais il faut cependant remarquer que l'invention n'est limitée en aucune manière au contenu de ees exemples concrets0 Pour déterminer les composés du type ergoline ou ergolène décrits dans les exemples, on utilise le procédé analytique suivant Extraction de la drogue ç on mélange 2 g d'ergot de seigle broyés à une granulométrie d'au plus 0,5 aa avec 25 ml d'acétate d'éthyle et 1,5 ml de solu- tion à l0% d'hydroxyde d'anmonium. On agite le mélangé pendant 30 min, on filtre et on extrait encore 2 fois l'ergot de seigle resté sur le filtre avec à chaque fois 25 ml d'acétate d'éthyle. On rassemble les extraits et on les traite ensuite comme il est dit cidessous à propos de l'extraction des liquides de fermentation. Extraction des liquides de fermentation : on amène à pH 8-8,5 25 mi de liquide de fermentation avec une solution concentrée d'hydroxyde d'ammonium, on mélange avec 75 mi d'acétate d'éthyle et on agite vivement pendant 2 minutes On sépare les phases dans une centrifugeuse par sédimentation et on extrait encore deux fois la phase aqueuse avec à chaque fois 25 mi d'acétate d'éthyle. On rassemble les phases organiques et on concentre sous vide à 50 ml. On agite 4 fois le concentré obtenu de cette manière, ou l'extrait obtenu lors de l'extraction de la drogue, avec à chaque fois 25 ml d'eau contenant 5 % d'acide phosphorique.On rassemble les extraits d'acide phosphorique et d'eau, on amène à pH 8-8,5 avec une solution à 10% d'hydroxyde d'ammonium et on extrait 3 fois en secouant la solution ainsi rendue alcaline avec à chaque fois 25 ml de chloroforme. On rassemble les phases chloroforme, on sèche avec du sulfate de sodium anhydre et on concentre jusqu'à siccité. On dissout le résidu dans 2 ml d'un mélange 1:1 de chloroforme et de méthanol. A partir de cette solution on dépose, pour déterminer l'ergotamine et l'ergocristine, 0,1 ml sur une couche de 5 x 20 cm de gel de silice G, ou pour déterminer l'ergocornine et ltergocryptine, 0,2 ml sur une couche d'oxyde d'aluminium 60 E. On développe le chromatogramme, dans le cas de l'ergotamine et de l'ergocristine, dans un mélange 90:10 de chloroforme et d'éthanol, dans le cas de lergocornine et de l'ergocryptine, dans un mélange 4,5 : 4,5 : 0,625 de diethyléther, d'acétate de n-butyle et d'isobutanol. On détermine les taches à la lumière W diffuse et on élue avec 10 ml d'éthanol anhydre. Mesure : spectrométrique à 314 nm, dans une cuvette de quartz d'1 cm. Calcul : par rapport à la norme. Dans l'analyse du produit on dissout 25 mg dans 5 ml d'un mélange 1:1 de chloroforme et de méthanol ; les déterminations s'effectuent, dans le cas de l'ergotaminîne ou de l'ergocristine, avec 0,1 ml, dans le cas de l'ergocornine ou de l'ergocryptine, avec 0,2 ml de cette solution, selon le procédé de chromatographie en couche mince décrit ci-dessus. Exemple 1 On broie jusqu'à une granulométrie d'au plus 2 mm 1 kg de drogue du type de l'ergocristine (produit selon le procédé décrit dans le brevet hongrois n 154 035 ; teneur en alcaloïde de l'ergot : ergocrlso tine 2,1%, ergocristinine 0,8%, ergotamine 0,2%, ergotaminine 0,1%, et autres alcaloïdes du type de l'acide lysergique 1%). On ajoute 4 1 d'acétate d'é thyle et de 250 ml de solution aqueuse à 10% dthydro- xyde d'ammonium, on agite le mélange pendant 3 H puis on filtre.On répète 2 fois l'extraction de la drogue avec à chaque fois 2 1 d'acétate d'éthyle On rassemble les phases acétate d'éthyle filtrées, on concentre sous vide à 0,5 1 à 4CPC et on extrait le concentré obtenu de cette manière avec à chaque fois 100 ml d'un mélange 6:10:1 de formamide, dseau et de solution concentrée d'acide phosphorique.On rassemble les phases aqueuses et on les mélange avec 200 ml d'eau et 100 ml d'acétate d'éthyle. On agite d'abord le mélange puis on le rend alcalin avec une solution aqueuse con- centrée d'hydroxyde d'ammonium jusqu'à pH 8-10. On interrompt l'agitation et on sépare les phases. On extrait encore 2 fois la phase aqueuse avec à chaque fois 100 ml d'acétate d'éthyle.On rassemble les phases acétate d'éthyle et on concentre jusqu'à siccité sous vide à 4oeC. On dissout le mélange d'alcaloïdes peptidiques du type ergoline ou ergolène brut obtenu dans 10 mi de méthanol à 15-250C et on laisse reposer la solution pendant 20 h à la température ambiante aux fins de cristallisation. On filtre les cristaux obtenus, on les lave 2 fois avec à chaque fois 2 ml de méthanol et on sèche. On obtient de cette manière 3,4 g d'épimère dextrogyre (composition : ergocristinine 77%, ergocristine 1%, ergotaminine 2% et diverses impuretés, surtout graisseuses). On met en suspension le produit brut obtenu dans 6,8 ml de méthylisobutylcétone et on laisse reposer pendant 1/2 H. On filtre les cristaux obtenus, on lave 2 fois avec à chaque fois 2 ml de méthylisobutylcétone et on sèche. On obtient 2,7 g de mélange d'alcaloïdes de composition suivante : ergocristinine 97%, ergocristine 1% et ergotaminine 2%. ExemPle 2 On broie jusqu une granulométrie d'au plus 2 mm 1 kg de drogue du type ergotamine (produit selon le procédé décrit dans le brevet hongrois n0 155 148 ; teneur en alcaloïdes de l'ergot ; ergotamine 3,2 %, ergotaminine 0,9%, ergocristine et ergocristinine 0,3%, ainsi qu'l,3% d'autres alcaloïdes du typa de l'acide lysergique). L'extraction de la drogue s'effectue de la manière décrite dans l'exemple 1. On concentre sous vide à 500 ml les extraits réunis et on extrait 4 fois les alcaloldes de l'ergot qui se trouvent dans l'extrait avec à chaque fois 50 ml d'un mélange 5 :5 : 0,3 de formamide, d'eau et de solution concentrée d'acide phosphorique.On mélange les extraits réunis avec 70 ml de chloroforme et on les rend alcalins jusqu'à pH 9-10 en agitant avec une solution aqueuse concentrée d'hydroxyde d'ammonium. On sépare les phases et on extrait encore 3 fois la phase aqueuse avec à chaque fois 40 ml de chloroforme. On rassemble les phases chloroforme et on concentre jusqu'à siccite sous vide à 4onc. On dissout le mélange d'épimères d'alcaloPdes peptidiques du type ergoline ou ergolène brut obtenu comme résidu dans 10 mi de méthanol à 15-25 C, on laisse reposer la solution pendant 20 H à la température ambiante puis on filtre. On lave les cristaux obtenus avec à chaque fois 2 ml de méthanol et on sèche. On obtient de cette manière 5,3 g d'un mélange brut d'épinières dextrogyres (composition : ergotaminine 71%, ergocristinine 1%, ainsi que des impuretés surtout graisseuses). On met en suspension le Produit brut obtenu de la manière indiquée ci-dessus dans 10,0 ml de mé- thylisobutylcétone, on agite la suspension pendant 30 min 9 on filtre alors les cristaux obtenus, on les lave 2 fois avec à chaque fois 2 ml de méthylisobutyl- cétone et on sèche.On obtient 3,84 g de produit puri- fié ; composition ergotaminine 96%, ergocristinine Exemple 3 On extrait 1 kg de drogue du type décrit dans l'exemple 2 de la manière décrite dans l'exemple 1 avec de l'acétate d1éthyle et on débarrasse extrait du solvant, et on obtient 100 mi de produit huileux épaisse On mélange ce produit huileux avec 50 mi de méthanol et on agite pendant 20 H à la température ambiante. On filtre les cristaux obtenus, on lave 2 fois avec à chaque fois 2 ml de méthanol et on sèche0 On obtient de cette manière 5,8 g d'épimère dextrogyre brut (composition : 63% d'ergotaminine et diverses impuretés, surtout graisseuses) On met en suspension le produit dans 12 mi de méthylisobutylcétone, on laisse reposer la suspension pendant 1/2 H, et le produit recherché se sépare sous forme cristalline. On filtre les cristaux obtenus, on lave 3 fois avec à chaque fois 5 ml de niéthylisobu tylcétone et on sèche0 On obtient de cette manière 3,90 g de produit contenant 95% d'ergotaminine. Exemple 4 On extrait 10 1 de liquide-de fermentation (obtenus selon le procédé décrit dans le brevet hongrois n 164 816, par culture submergée de la souche de Claviceps purpurea OKI 88/1972, déposée à l'Institut National Hongrois d 'hygiène populaire OKI, Budapest) - teneur en alcaloldes : ergocornine 0,21 mg/ml, ergocryptine 0,17 mg/ml, ergocorninine 0,08 mg/ml, ergocryptinine 0,03 mg/ml et ergométrine 0,35 mg/ml - d'abord avec 5 l, puis 2 fois avec à chaque fois 3 l de méthylisobutylcétone, et pendant la première extraction on amène le pH du système à 9-10 avec une solution concentrée d'hydroxyde d'ammonium. Après chaque extraction on sépare les phases dans un séparateur, on rassemble les phases organiques et on concentre sous vide à 4CPC à un volume de 200 mi. On extrait le concentré 5 fois avec à chaque fois 100 ml d'un mélange 5 : 5 : 0,1 de formamide, d'eau et d'acide tartrique. On rassemble les extraits, et on les extrait 5 fois en agitant avec à chaque fois 100 ml de chloroforme. On rassemble les phases chloroforme et on les purifie plus avant, cependant qu'on met de c8té les phases aqueuses contenant le formamide et quton peut les utiliser pour obtenir de l'ergométrine. On concentre jusqu'à siccité sous vide à 40PC les phases chloroforme réunies, on dissout le mange d'Epimdres d'alcaloides peptidiques du type ergoline ou ergo lène brut obtenu comme résidu dans 20 ml de n-butanol et on laisse reposer la solution pendant 24 H à la température ambiante. Les épimères dextrogyres se séparent sous forme cristalline ; on filtre les cristaux à travers un filtre en verre fritté, on lave 2 fois avec à chaque fois 4 mi de n-butanol et on sèche. On" obtient de cette manière 5,8 g de produit constitué de cristaux mixtes dergocorninine et d'ergocryptinine ; composition du produit : ergocorninine 41%, ergocryptinine 31%, ainsi que diverses impuretés, surtout graisseuses. On met en suspension les cristaux obtenus de la manière indiquée ci-dessus dans 11,6 mi d'acétate de n-butyle refroidi à oec, on agite la suspension pendant 30 min puis on filtre. On lave 2 fois le produit restant sur le filtre avec à chaque fois 2 ml d'acétate de n-butyle refroidi à 0 C et on sèche. On obtient de cette manière 4 g de produit purifié, constitué de 59% d'ergocorninine et de 41% dgergocryptinine. PEVENDICATIONS 1 - Procédé d'obtention dlalcali̲des peptidiques du type ergoline ou ergolène à partir de drogues d'ergot de seigle ou à partir de cultures submergées de Claviceps purpurea, par extraction et purification de l'extrait par changement de phase, caractérisé en ce qu'on dissout le mélange brut d'alcaloides peptidiques du type ergoline ou ergolène dans des solvants protiques, en particulier dans des alcanols contenant de I à 6 atomes de carbone, en ce qu'on laisse reposer la solution, en ce qu'on sépare les épimères précipités, en ce qu'on dégraisse avec un dissolvant des graisses, en particulier avec la méthylisobutylcétone ou l'acétate de butyle et en ce qu'on prépare le produit obtenu. 2 - Alcaloïdes peptidiques obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1.