FR 2458585 A1 19810102 FR 8012797 A 19800609 Procédé de production de protéines par expression des gènes. correspondants- dans des micro-organismes et vecteurs susceptibles d'etre mis en oeuvre dans de tels procédés. L'invention concerne un procédé pour la production de protéines déterminées mettant en jeu l'expression dans un micro-organisme des ADN correspondants préalablement insérés dans un site de coupure approprié d'un vecteur capable de transformer un tel micro-organisme, notamment une levure. Elle concerne également de nouveaux plasmides utilisables à titre de vecteurs et capables de transformer des micro-organismes, tels que bactéries ou levures, et comportant au moins un site de coupure dans lequel peut etre inséré 1'ADN correspondant'à toute protéine dont l'expression dans de tels micro-organismes est recherchée. On a déjà décrit dans la demande de brevet nO 78 17221 déposée le 8 juin 1978 un plasmide susceptible d'etre mis en oeuvre pour la production de protéines par des micro-organismes, notamment de protéines nutritives, plus particulièrement encore d'une protéine comprenant au moins une partie de la séquence d'acides aminés caractéristique de l'ovalbumine, par exemple l'ovalbumine de poulet. Cette séquence d'acides aminés sera dénommée ci-dessous "ovalbumine" pour la commodité du langage. Un plasmide préféré décrit dans cette demande de brevet comprend dans une partie non essentielle de son génome un fragment d'ADN dérivé lui-même d'un fragment de phage A, lié à un fragment d'opéron bactérien, notamment d'un opéron lactose, comprenant au moins le promoteur bactérien et un fragment du gène lié à ce promoteur, tel que le gène Z codant la production de la ss-galactosidase dans l'opéron lactose, ce fragment de gène étant éventuellement limité au premier ou aux premiers triplets de nucléotides codant le premier ou les premiers acides aminés de la protéine correspondante, la 6-galactosidase dans le cas de l'opéron lactose, ce plasmide étant caractérisé en ce qu'il est pourvu, au niveau duit fragment de gène (AZ), d'un site de coupure par une endonucléase déterminée, de préfé rence à l'exclusion de tout autre site de coupure par la même endonucléase dans les autres parties de son génome. Avantageusement, le site de coupure en question estun site clivable par l'enzyme EcoRI. La susdite demande de brevet concerne également un plasmide vecteur, notamment du type sus-indiqué, capable de transformer des bactéries, et contenant un fragment d'ADN, susceptible de coder la production de l'ovalbumine, de préférence un fragment d'ADN, ci-après dénommé "cADN", préalablement obtenu par synthèse enzymatique à partir de 1'ARN messager correspondant. Un plasmide préféré selon l'invention de la susdite demande de brevet est constitué d'un recombinant de 1'ADN du plasmide pBR322 décrit par BOLIVAR et al, 1977, GENE, 2, 95, et d'une séquence contenant le susdit fragment d'ADN sous le contrôle d'un promoteur d'opéron bactérien, notamment de opéron lactose. Ce dernier comprend notamment un fragment de gène Z apte à coder les 7 premiers acides aminés de la ss-galactosidase bactérienne (ou les 8 premiers acides aminés si on compte la formyl-méthionine en tant que premier acide aminé). La présente demande de brevet a pour objet une extension à d'autres vecteurs, plus particulièrement du type de ceux capables de transformer des levures. Le vecteur selon l'invention résulte de la transformation d'un vecteur du type de ceux qui sont capables de transformer les levures, telles que Saccharomyces cerevisiaej par insertion dans l'un de ses propres sites de coupure d'une séquence d'ADN comportartun promoteur, notamment d'opéron bactérien, tel que l'opéron lactose, celuici comportant de préférence en outre un fragment de gène Z, notamment apte à coder les 7 premiers acides aminés de la ss-galacto- sidase bactérienne (ou les 8 premiers acides aminés si on compte la formyl-méthionine en tant que premier acide aminé). L'invention concerne encore plus particulièrement un vecteur de ce type contenant le cADN de l'ovalbumine inséré dans l'un de ses sites de coupure, les extrémités de ce cADN ou celles du plasmide préalablement ouvert au moyen de l'endonucléase correspondante ayant le cas échéant été préalablement modifiées de façon en soi connue, en vue de la ligature possible de ce cADN dans le site correspondant. Un plasmide préféré ainsi modifié est donc caractérisé en ce qu'il contient un fragment d'ADN correspondant à la fusion d'une séquence de triplets de ceux des nucléotides qui sont susceptibles de coder la traduction des huit premiers acides aminés, y inclus la formyl-méthionine, de la ss-galactosidase bactérienne, d'une part, et d'une séquence apte à coder la majeure partie de l'ovalbumine, éventuellement à l'exception des premiers amino-acides de celleci (notamment des 5 premiers), liée à la séquence précédente, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un nombre entier des triplets choisis parmi ceux qui ne sont pas susceptibles d'interrompre la traduction, d'autre part. Avantageusement, le plasmide selon l'invention comporte également une séquence de plasmide bactérien, tel que pBR322, le plasmide ainsi perfectionné pouvant se répliquer soit dans des levures, soit dans des bactéries. La position du fragment contenant à la fois le promoteur lactose et le cADN de l'ovalbumine dans le plasmide n'est pas essentielle pour son expression. Un plasmide préféré selon l'invention, apte à transformer des levures, notamment Saccharomyces cereoisiae, déposé à la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes (C.N.C.y) sous le nO I-01)5 le 27 mai 1979, contient au moins une séquence du "plas mide 8", dénolzle aussi pull, qui a été déposé à la C.N.C.M. sous le nOI-093 le 23 mai 195e plasmide tel que défini ci-dessus, contenant la séquence correspondant à l'ovalbumine modifiée telle que défini ci-dessous, peut être incorporé dans un plasmide susceptible de transformer des souches de levure, notamment Saccharomyces cerevisiae. La protéine modifie est alors susceptible d'etre exprimée aussi dans ces levures. Contrairement à ce que l'on pouvait attendre, le fragment en question paraît donc dépourvu de tout marqueur déclenchant des mécanismes de restriction de ladite levure vis-à-vis de ce fragment d'origine bactérienne. La séquence théorique de ladite ovalbumine modifiée est la suivante formyl-méthionine - thréonine - méthionine - isoleucine thréonine - acide aspartique - sérine - leucine - alanine alanine - sérine - méthionine - acide glutamique les 8 premiers acides aminés provenant de la ss-galactosi- dase et les 5 suivants formant les premiers acides aminés du fragment d'ovalbumine Hha ov (auquel manquent d'ailleurs les 5 premiers amino-acides naturels de l'ovalbumine), défini par HUMPHRIES et al, 1977. L'invention concerne d'une façon générale des plasmides du genre défini ci-dessus, dans lesquels la séquence d'ADN correspondant à l'ovalbumine est remplacée par un cADN codant pour toute autre protéine et résultant de la transcription enzymatique de l'ARN messager correspondant. I1 sera éventuellement nécessaire de prévoir l'insertion d'une ou de deux paires de bases (le cas échéant complétées d'un nombre entier de triplets) entre, d'une part, le fragment de gène Z ou analogue, lié au promoteur, tel que le fragment contenant les triplets codant les 7 (ou 8) premiers acides aminés de la B-galactosidase et, d'autre part, la séquence d'ADN codant la production de la protéine nutritive, pour assurer la mise en phase correcte de ces deux fragments à l'occasion de leur traduction ultérieure. L'invention fournit donc aussi un procédé de fabrication d'une protéine hybride dont une partie appartient à une protéine normalement codée, dans une cellule-hôte naturel procaryote ou eucaryote, par le gène correspondant appartenant-au génome de cette dernière cellule, procédé qui consiste à introduire dans un micro-organisme, plus particulièrement une levure, telle que Saccharomyces cerevisiae, un plasmide recombinant résultant de l'insertion par fusion génétique du gène déterminé susdit (ou, de préférence, à 1 ' ADN enzymatiquement reconstitué à partir de l'AP.N messa- ger correspondant) dans le plasmide selon l'invention, plus particulièrement, soit dans le fragment de gène Z (ou le fragment de gène correspondant dans le cas d'un opéron bactérien différent), soit de façon immédiatement contiguë à celui-ci, la protéine hybride contenant le fragment recher ché étant alors récupérable à partir des protéines cellulaires formées par ladite bactérie. Les plasmides du genre en question contenant plus particulièrement un cADN de l'ovalbumine, constituent également eux-mêmes des vecteurs permettant l'expression (sous la forme d'une protéine hybride) d'un ADN distinct correspondant à une protéine déterminée, préalablement inséré dans l'un des sites de coupure du fragment ovalbumine. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront encore au cours de la description de la construction de plasmides préférés susceptibles de transformer une levure,de son amplification, de la transformation d'une levure avec ce plasmide modifié et de la détection de l'expression de ce plasmide modifié. I1 sera fait référence aux figures 1 à 4 qui représentent des plasmides obtenus à divers stades de la construction. Le plasmide initial à partir duquel est construit le plasmide de l'invention est formé du recombinant ovalbumine - ci-après dénommé pOMP2 - décrit dans la demande de brevet nO 78 17221 du 8 juin 1979 et schématiquement représenté dans la figure 4e de cette même demande. 10) Extraction à partir du plasmide pOMP2 de la séquence Zac-ovalbumine. pOMP2 est ouvert par l'enzyme de restriction HhaI dont deux sites de reconnaissance se trouvent de part et d'autre du fragment Hha ov qu'il contient. Après réinsertion de ce fragment dans un autre vecteur, il est aisément reconnu par la capacité qu'il a de rendre les bactéries transformées lac constitutives (celles-ci étant alors susceptibles de produire de grandes quantités de ss-galactosi- dase, donc formant des colonies bleues en présence du colorant X-gal(S-bromo-4-chloro-indolylgalactosid Il a en particulier été procédé comme suit 20 ug de l'ADN de pOMP2 ont été digérés par HhaI (Biolabs; 25 unités) pendant 30 minutes à 370C.La réaction est ensuite arrêtée par chauffage à 650C pendant 10 minutes en présence de EDTA 10 m. Le mélange de réaction est en suite -placé sur un gradient de sucrose 5-20 pour cent (poids/volume dans une solution d'acétate de sodium pH 6,0, EDTA 10 mM et SDS 0,5 ), puis centrifugé à 31.000 tours/ minute pendant 16 heures à 200C (centrifugeuse BECKMAN rotor de type SW41). On recueille le fragment le plus lourd qui porte la séquence "Zac-ovalbumine". 20) Formation plasmide 8" (C.N.C.M. nO I93) contenant le fragment "EcoRI-D". Il est obtenu par recombinaison in vitra d'un plasmide pBR322 comportant un marqueur génétique ura (décrit par Marie-Louise Bach, François Lacroute et David Botstein dans PNAS 1979,-vol. 176, n 1, pp. 386-390) préalablement ouvert par EcoRI, et du fragment "EcoRI-D" (décrit par Cameron et al, Nucl. Ac. Research, 1977, vol. 4, n 5, pp. 1429-1448) originaire du "plasmide 2 p", dont a auparavant été décrite l'aptitude à transformer des levures telles que Saccharomyces cerevisiae. Le"plasmide 8" obtenu est également appelé pFL1. Il est représenté dans la fig. 1 du dessin.La partie provenant du plasmide 2 p (ou 2 um) est représenté par la ligne en petits zigzags.Elle jouxte le marqueur ura représenté en pointillés. La partie originairede pBR322,comportant des sites de résistance à l'ampicilline (ApR) et à la tétracycline (TcR),est représentée par une ligne continue. 3 ) Formation d'un recombinant du "plasmide 8" et du frag ment de pOMP2 contenant la séquence "Zac-ovalbumine". 30 microgrammes de l'ADN du plasmide 8 sont coupés par 1,5 unités de HhaI au sein d'un tampon classique, par contact mutuel pendant 5 minutes à 370C. La réaction est ensuite interrompue par chauffage à 650C pendant 10 minutes en présence de EDTA 10 M. Les molécules linéaires sont purifiées par centrifugation sur un gradient de saccharose 5-20 % dans un tampon Tris-HCl 10 2M, EDTA 103M, NaCl 10 1M pendant 4 heures à 200C à 40.000 tours par minute, dans une centrifugeuse BECKMAN rotor de type SW41. 200 ng du susdit fragment Zac-ovalbumine de 2,67 kb (kilobases) et 600 ng du plasmide 8 rendu linéaire sont incubés à 4 C en présence de T4 ADN-ligase dans un volume final de 5 microlitres d'un tampon Tris pH 7,5, 40 mM, MgC12 10 mM, DTT 10 mM, ATP 0,1niI, sérum-albumine (0,05 mg par ml). Des cellules lysogènes de la souche 1398 (E. coZi K12) (C.N.C.M. nO I-094 le 27 mai 1979) sont transformées avec des recombinants et les cellules transformées sélectionnées sur milieu de culture contenant de l'ampicilline (20 microgrammes par millilitre) par hybridation in situ avec une sonde comportant un ADN spécifique de la séquence ovalbumine. Le dosage radio-immunologique indique la présence de protéines contenant de l'ovalbumine dans les bac tueries préalablement transformées. 40) Amplification et récupération du plasmide. On transforme une colonie de bactéries E.coZi C600 rk mk + inductibles en bactéries lac constitutives avec l'ADN isolé au cours de l'opération précédente et après développement de la colonie, on a recours pour la récupération du plasmide à des techniques classiques de rupture des bactéries, suivies de la récupération des ADN, séparation de la bande de plasmide circulaire dans un gradient de chlorure de césium en présence de bromure d'éthidium. On choisit arbitrairement deux des recombinants isolés et amplifiés. Ainsi le plasmide pOMP 225 (fig. 2) a été choisi parmi les clones résistant à l'ampicilline (ApR)et à la tétracycline (Tc R) et le plasmide pOMP 915 (fig. 3)parmi les clones résistant à l'ampicilline (api), mais sensibles à la tétracycline (TcS). Leurs cartes ont été établies selon les techniques usuelles, à l'aide de différents enzymes de restriction et vis-à-vis de sites déterminés dans lesdits plasmides. Ces déterminations ont conduit aux cartes représentées dans les fig. 2 et 3. Le fragment lac ov se trouve inséré dans la séquence de plasmide 2 p dans le cas de pOMP 225, et dans le gène Tc de pBR322 dans le cas de pOMP915.Dans ce dernier, le fragment lac ov est orienté dans le sens opposé à celui qu'il présente dans pOMP225. Cependant après transformation d'une souche de mutant ura 3 de Saccharomyces eerevsssae, on recueille parmi les plasmides de transformation le plasmide pOMP225 YI (fig. 4), dans lequel le fragment lac ov se trouve réorienté dans le sens inverse sans doute à la suite d'une recombinaison avec un plasmide 2 p endogène. 50) Transformation de la levure Saccharomyces cerevisiae (C.N.C.M. nO I-095 déposée le 27 mai 1979). La souche de levure sus-indiquée qui est ura est transformée par le susdit plasmide, notamment parla technique décrite par Hinnen et al, PNAS, 1978, vol. 75, nO 4, pp. 1929-1933, et cultivée sur un milieu de culture dépourvu d'uracile. Seules les cellules rendues ura par ledit plasmide se développent sur ce milieu. On détecte la production d'une protéine hybride contenant une séquence ovalbumine par dosage radioimmunologique dans les conditions de la demande de brevet nO 78 17221. Ainsi a-t'on détecté de l'ovalbumine parmi les produits d'expression de pOMP225, pOMP915 et pOMP225YI. Le vecteur selon l'invention contenant le gène de l'ovalbumine peut, à son tour, servir comme vecteur pour fabriquer d'autres protéines hybrides incluant une protéine distincte ; ceci pouvant être réalisé par remplacement du fragment de gène ovalbumine de ce vecteur ou addition à celui-ci du fragment de copie d'ARN correspondant à la protéine recherchée et s'exprimant sous la forme de cette protéine dans sa cellule-hôte naturel. A titre d'exemple, on pourrait y insérer le gène de la somatostatine ou de toute autre protéine. Ce vecteur modifié peut être utilisé pour transformer, soit des levures telles que définies ci-dessus, soit des bactéries. Cette application est en effet d'autant plus intéressante qu'il a été constaté que la majeure partie de la protéine hybride contenant l'ovalbumine, exprimée dans les bactéries par le vecteur sus-défini, est sécrétée dans l'espace périplasmique Ainsi, on a constaté que, lors de ltexpression de pOMP2 dans une souche de E.coZi K12, 88 % de l'ovalbumine synthétisée sont retrouvés dans le susdit espace périplasmique, 12 % seulement restant dans le cytoplasme. Ces dosages ont été effectués par la susdite méthode radio-immunologique, appliquée au milieu de culture des bactéries, après éclatement sélectif des parois bactériennes selon la méthode de Neu et Heppel décrite dans "J. Biol. Chem.", 1965, tome 240, pp. 3685-3692. On a de même dosé l'ovalbumine intracellulaire libérée par éclatement des sphéroplastes. Le vecteur contenant le fragment d'ADN correspondant à l'ovalbumine est donc approprié à l'insertion dans son génome d'un ADN correspondant à la protéine recherchée (somatostatine ou autre protéine). L'expression du vecteur ainsi modifié peut entraîner par conséquent la libération de la protéine hybride exprimée, contenant notamment la protéine recherchée, dans une partie de la bactérie (espace périplasmique) à partir de laquelle elle est aisément récupérée. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes, en particulier celle où l'on a recours à d'autres plasmides que pBR322, en particulier le plasmide pSOMl visé dans l'article de Keiichi Itakura et Coll. (Science, vol.198, pp. 1056-1063 (1977), dans la mesure où notamment l'ovalbumine exprimée peut être considérée comme n'étant pas sensible à l'action des enzymes protéolytiques endogènes de la bactérie-hôte ; ; l'invention concerne encore les plasmides modifiés selon l'invention, mais dans lesquels le fragment d'opéron au lieu d'être originaire de l'opéron lactose provient d'un autre opéron, tel qu'un opéron galactose ou un opéron tryptophane ; en ce qui concerne ce dernier, on rappelle en effet que la cons truction d'un recombinant d'un phage X et d'un opéron tryptophane a été décrite notamment par Anne Moir et W.J. Brammar dans l'article intitulé "The use of specialised transducing phages in the amplification of enzyme production" (L'utilisation de phages transducteurs spécialisés pour l'amplification de la production d'enzymes) (Molec. Gen. Genet. 149, 87-99 (1976)). REVENDICATIONS 1 - Vecteur du type de ceux qui sont capables de transformer des levures, telles que Saccharomyces cerevisiae, caractérisé par l'insertion dans l'un de ses propres sites de coupure d'une séquence d'ADN comportant un promoteur, no tangent d'opéron bactérien, tel que l'opéron lactose, celui-ci comportant de préférence en outre un fragment de gène Z, notamment apte à coder les 7 premiers acides aminés de la B-galactosidase bactérienne (ou les 8 premiers acides aminés si on compte la formyl-méthionine en tant que premier acide aminé). 2 - Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte également une séquence de plasmide bactérien, tel que pBR322, permettant également sa réplication dans des bactéries. 3 - Vecteur selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il contient au moins une séquence du"plasmide 8" qui a été déposé à la Collection Nationale de Culture de Micwo-organiswes sous le nO I-0Ç3 le 23 mai 1979. 4 - Vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il contient, inséré dans Irun de ses sites de coupure, un cADN résultant de la transcription enzymatique de L'ARIA messager correspondant, notamment un cADN contenant 1'ADN codant la majeure partie de ltovalbumins. 5 - Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce que le susdit ADN codant pour la majeure partie de l'ovalbumine contient un fragment d'ADN correspondant à la fusion d'une séquence de triplets de ceux des nucléotides qui sont susceptibles de coder la traduction des huit premiers acides aminés, y inclus la formyl-méthionine, de la 6-galactosidase bactérienne, d'une part, et d'une séquence apte à coder la majeure partie de l'ovalbumine, éventuellement à l'exception des premiers amino-acides de celle-ci (notamment des 5 premiers), liée à la séquence précédente, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un nombre entier des triplets choisis parmi ceux qui ne sont pas susceptibles d'interrompre la traduction, d'autre part. 6 - Vecteur selon la revendication 5, caractérisé en ce que le susdit ADN contenant l'ADN codant pour la majeure partie de l'ovalbumine est constitué par un fragment Hha ov délimité par des extrémités HhaI.