FR 2466469 A1 19810410 FR 8021038 A 19801001 I La présente invention concerne des perfectionne- ments relatifs au (6R,7R)-7-ZJZ)-2-(2-aminothiazole-4- yl)-2-(2-carboxyprop-2-oxyimino)-acétamido7-3-(1 -pyridi- niumméthyl)-céph-3-ème-4-carboxylate de la formule H /CONH HS CH O-C-COOH H N CH3 ne CHl3 COOe, On a constaté que ce composé,auquel on se réfère de manière variée sous les appellations ''ceftazidime'' et ''GR 20263 ", possédait une activité antibiotique à large spectre et, plus particulièrement, une activité inhabituellement élevée contre des organismes Gram- négatifs, y compris de nombreuses souches Gram-négatives productrices de P-lactamases, comme décrit dans le brevet britannique NI 2 025 398. Ce composé possède une excel- lente activité contre des organismes normalement diffi- ciles à combattre par des antibiotiques P-lactamiques, comme les organismes du type Providence, Serratia, Proteus indole-positifs et, plus particulièrement, Pseudomonas et, en o utre, ses propriétés antibacté- riennes ne sont pas affectées par le sérum humain. Au surplus, l'effet d'inoculuns accrt contre le composé est faible et le composé est rapidement bactéricide en concentratio rsprochesde la concentration inhibitrice minimale. Il est parfaitement réparti ou distribué dans les corps de petits rongeurs donnant des taux thérapeu- tiques intéressants après injection sous-cutanée. Des infections expérimentales chez des souris provoquées avec des bactéries Gramnégatives ont été traitées avec succès en utilisant le composé et, en particulier, on a obtenu une excellente protection contre des-souches r' 2466469 de Pseudomonas aeruginosa, un organisme normalement insensible au traitement par des antibiotiques du type des céphalosporines. Cette protection était comparable au traitement par un aminoglycoside, tel que l'amikacine. Les essais de toxicité aiguë avec le composé sur des souris ont donné des valeurs de la LD50 (LD = dose mortelle) supérieures à 6 g/kg. On n'a observé aucune néphrotoxi- cité chez des rats en doses de 2,0 g/kg. Au cours d'étu- des effectuées sur des volontaires humains, le composé -10 a fait preuve de bonnes propriétés pharmacocinétiques, donnant des taux sériques élevés et de longue durée après l'injection. La longue demi-vie sérique suggère que des doses moins fréquentes pourraient être néces- saires pour des infections moins graves. Les résultats cliniques précoces suggèrent que le composé reproduit en clinique les excellentes propriétés antibiotiques dont il a fait preuve in vitro et sur les animaux expérimen- taux. Le brevet britannique N 2 025 398 décrit également des solvates et des sels atoxiques, par exemple des sels avec des bases et des sels d'addition d'acides de la céphalosporine susmentionnée. Le brevet britannique NO 2 025 398 décrit, entre autres, un procédé de préparation de la céphalosporine susmentionnée (I), comme aussi de solvates et de sels atoxiques de ce composé, caractérisé en ce que: on acyle un composé de la formule: H H \ /!CH2N! de préférence sous la forme du sel d'addition d'acide du type bischlorhydrate, avec un acide de la formule: j- R1 S C. COOH NO-C. COOR2 CH3 (dans laquelle R1 représente un groupe amino ou un groupe amino protégé et R2 représente un groupe bloquant la fonc- tion carboxyle), ou avec un agent d'acylation qui y corres- pond; ensuite, on met en oeuvre les réactions suivantes: i) élimination de n'importe quel groupe protecteur et du groupe bloquant la fonction carboxyle R2 et, si on le souhaite, ii) conversion d'un groupe carboxyle en un sel atoxique. Le composé souhaité de la formule (I) susmentionnée et son bischlorhydrate sel du brevet britannique N 2 025 398 étaient obtenus sous forme de solides amorphes et leur stabilité n'est pas particulièrement satisfai- sante, en particulier aux températures élevées. On a découvert à présent que le bischlorhydrate de (6R,7R)-7-ZTZ)-2-(2-aminothiazole-4-yl) -2-(2-carboxyprop- 2-oxyimino)-acétamido7-3--(l-pyridiniumméthyl)-céph-3- ème-4-carboxylate (I) pouvait être avantageusement pré- paré et isolé sous forme cristalline. La forme cristalline du bischlorhydrate en question est de qualité généralement supérieure, eu égard à sa pureté et à sa stabilité. Plus particulièrement, on a constaté que la nouvelle forme de chlorhydrate possédait une structure cristalline bien définie et il s'est révélé qu'elle était remarquablement stable, même lorsqu'elle était conservée pendant une période prolongée à une tempé- rature de 50 C. Ces propriétés en font un composé de grande valeur pour l'utilisation en pharmacie, comme aussi pour la préparation d'autres céphalosporines actives. On a découvert que le nouveau bischlorhydrate cris- tallin sel de la céphalosporine susmentionnée pouvait se préparer dans des conditions réglées. Par exemple, on a constaté que le bischlorhydrate cristallin souhaité- pouvait être préparé par cristallisation à partir d'un milieu approprié, comprenant, par exemple, de l'acétone et de l'acide formique. On a également découvert qu'il était possible de recristalliser le bischlorhydrate -10 cristallin dans toute une série de milieux. Des exemples d'autres milieux de cristallisation ou de recristallisa- tion comprennent l'alcool industriel dénaturé au méthanol et des mélanges de méthanol, de n-propanol et d'éther diisopropylique. La cristallisation du bischlorhydrate se réalise, de préférence, à une température qui fluctue de 10 à C, commodément à une température d'environ 200C, en procédant ensuite à la mise en oeuvre d'une étape de refroidissement, afin d'augmenter le rendement en cris- taux, jusqu'à une température qui fluctue de O à 150C. Après la précipitation, on peut récupérer le bis- chlorhydrate cristallin par filtration ou le laver et le sécher-d'une manière classique. On peut préparer le bischlorhydrate sel à utiliser pour la préparation du nouveau bischlorhydrate cristallin conforme à l'invention, par mise en oeuvre du procédé décrit dans le brevet britannique susmentionné NO 2 025 398, c'est-à-dire par un procédé impliquant la méthode susmentionnée. On a soumis le nouveau bischlorhydrate cristallin conforme à l'invention à des Eudes de diffaction des rayons X sur poudre. On a utilisé le produit de l'ex- emple 2 qui suit pour obtenir une photographie de dif- fraction des rayons X sur poudre de Debye-Scherrer par exposition pendant 12 heures au rayonnement CoKcc et une seconde photographie par exposition pendant 3 heures au rayonnement CuKa. On a comparé les intensités des lignes à un jeu de standards afin d'obtenir les intensités rela- tives qui sont présentées dans le tableau I qui suit. Le nouveau sel selon la présente invention a égale- ment été caractérisé par son spectre infra-rouge. On a o b ten u le spectre infra-rouge du produit de l'exemple 2 qui suit dans du Nujol et il était tel que représenté sur la figure unique annexée au présent mémoire. On peut utiliser le bischlorhydrate cristallin conforme à l'invention pour la préparation d'un penta- hydrate cristallin du composé de la formule (I) par l'addition d'une base organique ou inorganique à une solution aqueuse du bischlorhydrate jusqu'à un pH de 3,3 à 4,0, de préférence d'environ 3,7. On a également découvert que le pentahydrate ainsi obtenu possédait une structure cristalline bien définie. On a constaté que ce pentahydrate était remarquablement stable, même lors- qu'il était conservé à une température de 50 C pendant une période prolongée. Le pentahydrate possède les propriétés antibiotiquesdu composé (I) susmentionné et présente, de manière analogue, un grand intérêt à titre d'antibiotique. Les exemples qui suivent servent à illustrer la préparation dubIs-chlorhydrate conforme à l'invention. Dans ces exemples, toutes les températures sont indi- quées en degrés Celsius. On adéterminé lesEpectres de résonance magnétique protonique (p.m.r.) à 100 MHz. Les intégrales étaient en accord avec les attributions, les constantes de couplage, J, étant indiquées en Hz, les signes notant pas déterminés: s = singlet, t = triplet, d = doublet, dd = double doublet, m = multiplet et ABq = quartet AB. Tous les exemples qui suivent illustrent la prépa- ration du bischlorhydrate de (6R,7R)-7-ZTZ)-2-(2-amino- thiazole-4-yl)-2-(2-carboxyprop-2-oxyimino)-acétamido7- 3-(1-pyridiniumméthyl)-céph-3-ème-4-carboxylate. Exemple 1 On a ajouté de l'acide formique (84 ml), sous agitation, au solvate du (6R,7R)-7-/TZ)-2-(2-tritylamino- thiazole-4-yl)-2-(2-t-butoxycarbonylprop-2-oxyimino) acétamido7-3- (1pyridiniumméthyl)-céph-3-ème-4-carboxy- late avec le N,N-diméthylformamide (41,8 g)>un refroi- dissement à l'eau étant mis en oeuvre pour maintenir la température en-dessous de 28 . On a refroidi la solu- tion ainsi obtenue jusqu'à 20 et on y a ajouté de -10 l'acide chlorhydrique concentré (17,0 ml), sous agitation, en l'espace de 5 minutes. On a agité le mélange pendant 3 heures à la température ambiante, puis on l'a filtré pour le débarrasser du triphénylméthanolo On a ajouté le filtrat à de l'acétone agitée (800 ml). On a lavé le triphénylméthanol à l'aide d'acide formique (3 x 7 ml) et on a ajouté les liqueurs de lavage réunies au mélange de filtrat et d'acétone. On a agité la suspension ainsi obtenue pendant 1,25 heure, puis on l'a filtrée. On a lavé le solide cristallin à l'acétone et on l'a séché sous vide de façon à obtenir le composé indiqué dans le titre (20,2 g), r(D20) 0,95 (d, J6Hz, pyridinium 2- et 6-H), 1,29 (dd, J6Hz, pyridinium, 4-H), 1,80 (dd, J6Hz, pyridinium 3- et 5-H), 2,77 (s, thiazole 5-H), 4,02 (d, J5Hz, 7-H), 4,10 et 4,47 (ABq, J16Hz, 3-CH2), 4,59 (d, J5Hz, 6-H), 6,17 et '6,54 (ABq, Jl8Hz, 2-H2 et 8,36 (s, C(CH3)2); Chlore trouvé: 11,0 %; calculé pour C22H24N607S2C12: 11,5 %; XA (tampon phosphate à pH 6) 257 nm 1% a 1% 1% 1o (BEóm 347), inf à 240 (E1cm 310) et 290 nm (1cm 150). Exemple 2 - On a ajouté le solvate du (6R,7R)-7-/TZ) -2- ( 2-t-butoxycarbonylprop-2-oxyimino) - 2- ( 2-tritylaminothiazole-4-yl) acétamido7-3- (1-pyridi- niumméthyl)-céph-3-ème-4-carboxylate avec le N,N-diméthyl- formamide (5 g) à de l'acide formique agité (10 ml). Lorsque la solution se fut limpidifiée, on a ajouté de l'acide chlorhydrique concentré (2,1 ml), l'addition se faisant goutte à goutte et en l'espace de 2 minutes et on a agité la suspension ainsi obtenue à la tempé- rature ambiante pendant 3 heures supplémentaires. On a filtré la suspension et on a lavé le lit de filtration avec plusieurs petites fractions d'acide formique (tota- lisant 2,5 ml). On a versé le filtrat dans de l'alcool industriel dénaturé au méthanol (100 ml) et on a ensuite évaporé le solvant sous vide sur un évaporateur rotatif (vide -10 de la trompe à eau, température du bain 40 ), de façon à obtenir une huile. On a ajouté de l'acétate d'éthyle (50 ml) et on a poursuivi l'évaporation. On a répété ce procédé avec une quantité supplémentaire d'acétate d'éthyle (2 x 50 ml) jusqu'à la formation d'une mousse. On a repris la mousse dans de l'alcool dénaturé au métha- nol (100 ml) et on a précautionneusement poursuivi l'éva- poration jusqu'àl'observation de signesde cristallisation. On a réfrigéré la solution trouble jusqu'au lendemain et on a isolé le solide blanc par filtration et on l'a séché à 400 sous vide, de façon à obtenir le composé indiqué dans le titre (150 mg). L'évaporation précautionneuse poursuivie des liqueurs a donné une seconde petite récolte du composé indiqué dans le titre (150 mg). On a soumis les liqueurs à base d'alcool industriel dénaturé au méthanol résiduel à un soufflage avec un courant d'azote et une copieuse récolte de matière cristalline se sépara. On a isolé ce produit par filtration et on l'a séché sous vide à 400 de façon à obtenir le composé indiqué dans le titre. (1,6 g). "Max (tampon au phos- 1% ax106 phate à pH 6) 257 nm (Eîcm 348), et Xi. 243 nm (E m316) et Xinf290 nm (E1'cm 152); pmr ressemblait à celui de l'exemple 1, titre en chlore 11,3 %, eau selon Karl Fischer 3,0 %. La diffraction des rayons X sur poudre d Debye-Scherrer a montré que la matière était cristalline. ExemDle 3 On a dissous le composé indiqué dans le titre> cristallin, solide (0,5 g), préparé de la manière décrite à l'exemple 1 ci-dessus, dans du méthanol (5 ml), on a ajouté du n-propanol (15 ml) et on a traité la solution par de l'éther diisopropylique (20 ml) en l'espace de 20 minutes. On a chauffé la suspension jusqu'à 50 et on l'a agitée à la températue ambiante pendant 30 minutes. On a filtré la suspension et on l'a lavée de façon à obtenir le composé indiqué dans le titre recristallisé. (0,48 g). Xmax (phosphate à pH 6) 257 (E% 349, s21,660) et Xinf à 245 (EmO 321, E19,920) et 285 (E1m 170, s10.550); r(D20) identique à celui de l'exemple 1; impuretés selon la chromatographie en phase liquide sous pression élevée: 1,2 %, teneur en eau selon le procédé de Karl Fischer 4, 0 %; chlore trouvé: 10,6 % (C22H24N607S2C12 1,4 H20 exige 10,9 5). COMPOSITIONS PHARKACEUTIQUES Le bischlorhydrate cristallin conforme à la présente invention présente des propriétés antibiotiques du composé (I) susmentionné et peut 8tre utilisé pour le traitement de toute une série de maladies provoquées par des bacté- ries pathogènes,tant chez les êtres humains que chez les animaux, comme les infections des voies respiratoires et les infections des voies urinaires. Par conséquent, conformément à une autre de ses ca- ractéristiques, la présente invention a aussi pour objet des compositions pharmaceutiques qui contiennent le nouveau bischlorhydrate, adapté à l'usage en médecine humaine ou vétérinaire. On peut présenter de telles compositions de manière classique à l'aide de n'importe quels excipients ou véhicules pharmaceutiques nécessaires. On peut présenter le bischlorhydrate antibiotique suivant l'invention sous forme de compositions qui conviennent à l'injection et ces dernières peuvent adopter la forme de doses unitaires dans des ampoules, ou bien on peut les introduire dans des récipients qui en contiennent des doses multiples, au besoin avec un conservateur additionnel. Les compositions peuvent également adopter des for- mes comme des suspensions, des solutions ou des émulsions dans des véhicules huileux ou aqueux et peuvent contenir des agents de mise en composition, comme des agents de mise en suspension, de stabilisation et/ou de dispersion. L'ingrédient actif peut aussi se présenter sous la forme d'une poudre destinée à être introduite dans un véhicule approprié,par exemple de l'eau apyrogène stérile, avant l'emploi. Il est souhaitable que de telles compositions pul- vérulentes contiennent une base atoxique appropriée afin d'améliorer l'hydrosolubilité de l'ingrédient actif et/ou d'assurer que lorsque la poudre est ajoutée à de l'eau, le pH de la composition aqueuse ainsi obtenue soit physiologiquement compatible. La base peut aussi être présente dans l'eau à laquelle on ajoute la poudre. La base peut être, par exemple, une base inorganique, comme le carbonate de sodium, le bicarbonate de sodium ou l'acétate de sodium, ou une base organique comme la lysine ou lacétate de lysine. On peut également présentErle composé antibiotique selon l'invention, sous forme de suppositoires qui contien- nent, par exemple des bases pour suppositoires classiques, comme du beurre de cacao ou d'autres glycérides. Pour le traitement des yeux ou des oreilles, on peut présenter les préparations sous la forme de capsules in- dividuelles, sous forme liquide ou semi-liquide, ou sous la forme de gouttes. Les compositions destinées à l'usage en médecine vétérinaire peuvent également être présentées, par ex- emple sous la forme de préparations intramammaires dans des bases à action prolongée ou à libération rapide de la substance médicamenteuse. Les compositions peuvent contenir depui.s 0,1 %o, par exemple de 0,1 à 99 c5o, de matière active en fonction du 2466469. mode d'administrcticn. Lorsque les compositions se présen- tent sous la forme de doses unitaires, chaque dose uni- taire contient, de préférence, de 50 à 1500 mg de l'in- grédient actif. La dose telle qu'utilisée pour le trai- tement de l'être humain adulte varie, de préférence, de 500 à 6000 mg par jour, en fonction du mode et de la fréquence d'administration. Par exemple, pour le trai-? tement de l'être humain adulte, 1000 à 3000 mg de sub- stance active par jour administrés par voie intravei- neuse ou intramusculaire doivent normalement suffire. Cependant, des doses quotidiennes supérieures peuvent être nécessaires pour le traitement d'infection par Pseudomonas. On peut administrer le composé antibiotique confor- me à l'invention en combinaison à d'autres agents thé- rapeutiques, comme des antibiotiques, par exemple des pénicillines ou d'autres céphalosporines. J Valeur "d" ,6 7,9 6,6 6,4 ,65 X43 )07 4,90 4,70 4,54 4,25 4,12 - 3,97 3,82 3.75 3,34 3X07 2,95 2,87 2,81 T A B L E A U I Intensité Valeur "d" relative I A) 93 2,76 22 2,73 2,65 2,59 2,53 2,48 2,43 2,39 12 2,35 2,26 2X24 2;19 diffus 2,11 2,09 2,06 2,03 1,963 1y919 diffus 1,886 18 diffus 1,870 1,836 22 1,812 1,776 1;748 Intensité relative I trace trace On donnera ci-après des résultats d'essais phar- macologiques effectué avec le composé selon l'invention. 1 - Détermination de la concentration inhibitrice minimale. ' On prépare une série de dilution par deux à partir de solutions d'essais fraichement préparées du composé testé dans de la-casitone -agar avec ou sans enrichissement et on les verse dans des boites de Petri. On inocule les plaques à l'aide d'un inoculateur multipoint avec un inoculum conte- nant approximativement 105 unités formant colonie des micro- organismes indiqués au tableau II, qui sont tous des micro- organismes isolés en clinique. On détermine la plus faible concentration qui inhibe la croissance (CIM) en microgram- mes/ml après 18 heures d'incubation à 37 C. oC Staph. aureus 853E+ w Staph. aureus 663E o h.I I Micrococcus E. coli T spp 1810E 1193E+ "J a o0 isB F- Ft k-- -'h o E. coli 851E S. typhimurium 804E Shigella sonnei 1608E o E. cloacae 1321E K. pneumoniae 1082E K. pneumoniae 1522E o z o Pr. mirabilis 431E m o 3 O o Pr. morganii 1606E o Pr. vulgaris 1805E Ps. aeruginosa 1371E -_ Ps. aeruginosa 150E n Ps. aerugiosa 1607E FI Ps. aeruginosa 160715E Ps. aeruginosa 1615E o S. marcescens 1324E -o o Providence spp. 1497E - H. influenzae 1184E H. influenzae., 1788E+ úr 69f999Z + tr o o n oi D I 1> m n (D ri ti- pi H H 2466469. 2 - Protection de la souris (DE 50) On a administré à des groupes de 5 souris des microorganismes par voie intraperitonéale dans 0,5 ml d'une suspension gastrique à 3 %. Deux doses du composé testé sont administrés par voie souscutanée 1 et 5 heures après le microorganisme, dans 0,2 ml de solution physiologique. On compte le nombre de survivants 5 jours après l'inocula-- tion et l'activité du composé testé est exprimé en DE 50. La souche de E.coli utilisée est une souche sensible à la cephalosporine. DE 50 (mg/dose Ecoli 851 du composé testé 0,9 3 - Stabilité aux > lactamases On a déterminé par spectrophotométrie la stabili-- té aux -lactamases en suivant l'absorption UV du noyau b -lactame (normalement dans la région 260 - 265 nm) pour le composé testé et on l'a exprimé par comparaison avec la Cephaloridine (à qui on a attribué la valeur 1 vis à vis de chaque enzyme). Le composé est stable vis-à vis des P-lactamases P 99, K 1 et TEM avec une stabilité supérieure à 30 par rap- port à la cephaloridine. 4 - Toxicité On a déterminé la toxicité de la base correspon- dant au composé de l'invention, à savoir le(6R,7R)-7-[(Z)- 2- (2-aminothiazol-4-yl)-2-(2-carboxyprop-2-oxyimino) acetamido] -3-(1pyridiniumméthyl) céph-3-em-4-carboxylate sous forme de son pentahydrate, On a préparé une solution aqueuse du sel de so- dium du composé avec du bicarbonate de sodium. On adminis- tré par voie intraveineuse une solution à 20 % pds/ v du composé à des groupes de souris femelles CRH albino (pesant 16 - 22 g) et on a déterminé les valeurs de DL 50. On a obtenu une valeur de DL 50 de 6,3 g/kg. REVENDICATIONS 1. ( (6R,7R)-7-/1Z)-2-(2-Aminothiazole-4-yl)-2-(2- carboxy-prop-2-oxyimino)-acétamido7-3- (1 -pyridiniumméthyl)- céph-3-ème-4-carboxylate sous la forme d'un bischlorhy- drate cristallin qui présente sensiblement les valeurs 'd'' suivantes et les intensités relatives quisuivent lorsqu'il est soumis à une diffraction des rayons X sur poudre de Debye-Scherrer, en utilisant le rayonnement CoKc: *10 Valeur "d" Intensité Valeur "d" Intensité relative relative (A) (I) (A) (T) , 6 6,6 6,4 ,65 X07 4,90 4X70 4,54 4,25 4,12 3,97 3,89 3,82 3,75 3,60 3, 51 3,34 3X26 2,95 2,81 O100 diffus diffus 18 diffus 2,76 2X73 2,59 2,53 2, 48 2,43 2,39 2,35 2,26 2,24 2;19 2,11 2,09 2,06 1,963 1,919 1,886 1,870 1, 836 1,812 1,776 1X748 Li100 - 12 trace trace 2. Procédé de préparation du bischlorhydrate cris- tallin tel que défini à la revendication 1, caractérisé en ce que l'on cristallise lebis-chlorhydrate souhaité à partir du bischlorhydrate de (6R,7R)-7-LZZ)-2-(2-amino- thiazole-4-yl)-2-(2-carboxyprop-2-oxyimino)-acétamido7- 3-(1pyridiniumméthyl)-céph-3-ème-4-carboxylate, dans un milieu choisi parmi l'acide formique et l'acétone, l'alcool industriel dénaturé au méthanol et des mélanges de méthanol, de n-propanol et d'éther diisopropylique. 3. Compositions pharmaceutiques caractériséesen ce qu'elles contiennent à titre d'ingrédient actif, le bis- chlorhydrate cristallin tel que décrit dans la revendica- tion 1, adaptés à l'usage en médecine humaine ou en méde- cine vétérinaire. 4. Utilisation du bischlorhydrate cristallin tel que défini à la revendication 1, pour la préparation de penta- hydrate de (6R,7R)-7-LZTZ)-2-(2-aminothiazole-4-yl)-2-(2- carboxyprop-2-oxyimino)-acétamido7-3-(l-pyridiniumméthyl)- céph-3-ème-4-carboxylate.