FR 2466019 A1 19810327 FR 8015195 A 19800708 Compositions appropriées pour l'examen de tissus et/ou de liquides biologiques et son procédé d'utilisation." La présente invention concerne une composition spéciale appropriée pour l'examen de tissus et/ou de liquides bio- logiques, c'est-à-dire pour y contrôler la présence de cons- tituants particuliers. Elle concerne également le mode opé- ratoire utilisant ladite composition. Pour mieux comprendre le sujet et les objets de la présente invention, il est avantageux de considérer certains concepts généraux qui constituent le support théorique pour le sujet en question. Quand une substance absorbe la lumière visible ou la lumière ultraviolette, on sait qu'un électron qu'elle con- tient passe de son stade de base à un stade activé "singulet". Un croisement intersystème peut avoir lieu avec la création de stades métastables "triplets" dans lesquels l'élec- tron reste emprisonné jusqu'à ce qu'il se produise une désactivation par une réaction de rupture de chaîne (par rencontre avec une autre molécule) ou par émission de lumière (phosphorescente) ou par d'autres procédés, tous étant relati- vement lents. Ces phénomènes sont facilement remarqués dans diverses catégories de colorants naturels et synthétiques. Un procédé largement utilisé pour étudier et déterminer quantitativement ce phénomène est le procédé dit "photolyse instantanée", procédé dans lequel l'échantillon contenant la substance à étudier est soumis à la radiation d'une source de lumière pulsée (éclair) qui fait passer un certain nombre de molécules colorées à l'état d'électrons activés. Le développement du procédé mentionné ci-dessus est ob- servé en décelant l'absorption d'un faisceau de lumière mono- chromatique continu par l'échantillon, cette absorption étant enregistrée en fonction du temps avec un dispositif électro- nique approprié (oscilloscope, etc.). Ce type de procédé s'est considérablement et qualitati- vement développé ces dernières années, en ce qui concerne une sensibilité plus élevée obtenable en utilisant les lasers pulsés comme la source de perturbation. Il est connu d'utiliser des procédés du type ci-dessus pour étudier et caractériser les tissus et/ou les liquides biologiques, à l'exception notable du cas dans lequel le tissu à examiner contient une grande quantité de substances naturel- les photosensibles, comme dans le cas des pigments de la photosynthèse chlorophyllienne, la rhodopsine et la carboxy- hémoglobine. Sous ce rapport, dans le cas d'un tissu qui est seulement légèrement coloré, l'éclair subira de préférence un processus de diffusion plutôt qu'une absorption. Cependant, le tissu peut être coloré avec des colorants synthétiques comme cela est fait couramment dans les procédés optiques d'observation au microscope. Sous ce rapport, le fait que le colorant teint un tissu signifie qu'il se lie à ce tissu d'une certaine façon. Toutefois, on se heurte au moins à deux difficultés principales en utilisant les techniques de photolyse instan- tanée dans ce contexte pour les échantillons possédant un fort pouvoir de diffusion. Premièrement, étant donné que les concentrations du colorant lié sont plutôt faibles, il n'est pas certain que l'on puisse obtenir des signaux significatifs en utilisant ce procédé. Deuxièmement, on ne peut pas prévoir à l'avance si les signaux dus aux absorptions caractérisant des états métastables du colorant seront différents, dans le cas d'un colorant lié à un tissu particulier, de ceux dus aux molécules en solution ou liées différemment. Les auteurs de la présente invention ont découvert d'une façon tout à fait surprenante qu'il était possible de surmonter ces deux difficultés en préparant des produits d'addition du constituant du tissu et/ou du liquide biologiquesconcernésavec un colorant qui est synthétique ou tout au moins n'existe pas dans les fluides ou solutions physiologiques, en mettant en contact un échantillon à examiner avec une composition qui constitue le premier objet de la présente invention, et qui est constituéepar le colorant, un milieu compatible avec le tissu et/ou le liquide biologiqueset une substance capable de désactiver les molécules de colorant quand elle les 24660 19 rencontre (extincteur). Comme on vient de la dire, la composition qui forme le produit d'addition avec le constituant physiologique est formée par (a) un colorant choisi parmi la famille des azines, oxazines, acridines ou du xanthène, ou bien parmi certains colorants solubles dans l'eau de la famille des diazoiques ou du triphénylméthane; (b) un milieu compatible avec le constituant physiologique et constitué par une solution aqueuse contenant divers sels tels que NaCl, CaC12 et sels analogues, en une concentration telle, qu'elle soit sensiblement isotonique avec le composant physiologique (de 0,1 à 1% en poids) et d'autres composants en proportions plus petitestels que glucose, mélanges tampons, etc. sont ajoutés afin de conditionner la vitalité des cellules présentes, le pH du milieu pouvant varier jusqu'à un certain point autour de la neutralité (pH de 4,5 à 9,5) et de petites quantités de solvant organique pouvant être ajoutées afin d'augmenter la solubilité du colorant; et (c) un extincteur (c'est-à-dire une substance provoquant rapidement la désactivation des molécules du colorant quand les deux molécules se rencontrent) qui peut être du iodure de potassium (ou de sodium)(environ de -2 à 0,2 M), ou bien le sel d'un métal de transition para- magnétique (de 10-2 à 0,2 M de Co, Fe, Ni, choisi sous la forme de CoCl2 ou produits analogues), éventuellement en présence d'une substance dechélation telle que l'acide éthylènediaminotétracétique (EDTA); ou enfin l'extincteur utilisé peut être une quantité définie d'oxygène moléculaire (02) dissous dans l'eau (par exemple en saturant la solution de l'échantillon avec de l'oxygène à une température déterminée). La composition établie précédemment est utilisée pour réaliser un procédé d'examen pourdes tissus et/ou des liquides biologiques, procédé qui à son tour constitue le second objet de la présente invention. Ce procédé consiste à traiter d'abord l'échantillon de substance à examiner avec la composition, à irradier la substance obtenue avec un premier rayonnement de lumière pulsée, à faire traverser l'échantillon ainsi traité par un second rayonnement de lumière monochromatique et à analyser l'intensité optique de sortie de ce dernier en fonction du temps. Les auteurs de la présente invention ont découvert de cette façon que les signaux dus à l'absorption des états métastables des molécules de colorant liées dans les cellules à examiner sont nettement différents en ce qui concerne la variation d'amplitude et/ou du temps, des signaux dus aux molécules en solution ou provenant d'autres cellules. Le procédé réussit ainsi à caractériser chacune des cellules présentes dans le tissu. Ce procédé a été trouvé particulièrement approprié pour l'examen des cultures de cellules de fermentation, dans la distinction des cellules mortes,des cellules vivantes, et des cellules de levure,des cellules bactériennes; et dans l'analyse quantitative des leucocytes du sang. Le procédé peut d'une part fournir des mesures automa- - tiques (demandant juste quelques secondes) en remplaçant les procédés classiques longs et ennuyeux nécessaires dans le cas du microscope optique. Il peut également réussir à révéler des caractéristiques non visibles à l'oeil nu, concernant l'interaction spécifique moléculaire du colorant avec certains constituants des cellules. Par conséquent, le procédé peut être utilisé pour des examens qui ne pouvaient pas être réalisés jusqu'à présent ou qui n'étaient possibles qu'en utilisant des procédés bien plus compliqués. En particulier, il est facile de prévoir son utilisation dans la diagnose des tumeurs à cause de la possibilité d'une détermination quantitative de l'interaction ADNcolorant. La figure 1 est une représentation schématique, à titre d'exemple non limitatif, de l'appareil utilisé par les auteurs de la présente invention dans ces examens. S1 est la lampe à vapeur de mercure et S2 est le faisceau laser. L1, L2, L3, L4sont des lentilles de quartz. M1, M2 sont des miroirs et D1, D2 sont des détecteurs de l'état solide qui détectent l'impulsion du laser. MC est le monochromateur à grande luminosité. S indique la position de l'échantillon et PM est le photomultiplicateur. Les filtres et les diaphragmes ne sont pas montrés pour plus de clarté. Le faisceau de lumière pulsée est obtenu à partir d'un laser à Néodyme, notamment d'un laser du commerce "YAG" (Chromatix mod. 1000) qui émet des impulsions de lumière de 0,1 à 0,5 mJ d'environ 150 ns en longueur et avec une fréquence de répétition d'environ 50 Hz. La couleur du laser varie du bleu (À = 473 nm) au proche infra-rouge. Le faisceau d'observation est produit par une lampe à vapeur de mercure à haute pression, équipée de filtres appropriés. Les deux faisceaux sont focalisés dans une zone de l'échantillon d'environ 0,2 mm de diamètre d'une façon telle, qu'ils forment un angle d'environ 150 entre eux. La cellule à échantillon a une épaisseur de 2 mm. La lumière provenant de la lampe traverse un monochromateur à grande ouverture et est envoyée à un photomultiplicateur ("Philips XP 1113"). Le signal de sortie électrique du photomultiplicateur est enregistré continuellement sous forme de la valeur moyenne et est également envoyé à un pré-amplificateur avec une bande passante comprise entre 0,5 KHz et 30 MHz puis amplifié, enregistré dans des mémoires numériques et stocké dans un petit calculateur ("LABEN 70"). Le signal obtenu à partir d'une simple impulsion est enregistré et ajouté à ceux de centaines d'impulsions ana- logues. Donc, une moyenne des signaux est obtenue dans laquelle le bruit est réduit d'un facteur supérieur à 10 par rapport au signal provenant d'une seule impulsion. Etant donné que la fréquence de répétition des impulsions est rela- tivement élevée, le résultat des mesures est obtenu en exac- tement quelques secondes. Le stockage dans le calculateur permet de reproduire et de traiter le signal en utilisant un ruban magnétique, des tracteurs de courbe, etc. Le signal stocké contient une quantité considérable de données telles que l'amplitude de l'absorption à diverses longueurs d'onde d'observation et sa variation avec le temps. Si cette amplitude est V ( A, t), il est généralement possible de fixer A et t de façon telle que: V( t0, t0) = k1 + k2 ncS o ncest le nombre de cellules cor- respondant au travail des auteurs de la présente invention, et k1 et k2 sont des constantes pouvant être obtenues par un processus d'étalonnage, c'est-à-dire en introduisant un échantillon de composition connue dans l'appareil. La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après. EXEMPLE 1 Examen de culture de cellules. Essai de vitalité. Cet examen est appliqué à des cultures de levure du type Saccharomyces, telles que le Saccharomyces lactis, Saccharomyces fragilis ou levures analogues. L'essai donne une mesure quantitative du nombre de cellules mortes présentes dans la fermentation. Procédé expérimental. On mélange l'échantillon de cellules à examiner avec un mélange contenant 1O4 M de colorant bleu "Trypan Blue", simultanément avec>par litre, 0,1 g de NaN3, 6,8 g de KH2 PO4 réglé à pH 7,2 avec KOH, et 8,76 g de NaCl. On ajoute du CoCl à une concentration finale de 10-2 M en présence d'une concentration égale dé EDTA. Le mélange est agité pendant quelques minutes, puis mesuré avec l'appareil décrit ci-dessus. L'échantillon est irradié dans une cellule de 2 mm en utilisant le laser pulsé à A = 659 mn, et les variations de l'absorption à/À = 405 et 435 nm sont observées après l>is de retard provenant de l'impulsion laser. L'étalonnage est néces- saire afin de mesurer l'amplitude observée par rapport à l'amplitude de l'impulsion laser, l'alignement optique, etc. Dans ce but, on utilise une suspension dans laquelle les cellules de levure sont comptées puis toutes tuées par ébul- lition pendant quelques minutes. Résultats Sur la figure 2, les ordonnées représentent l'absorption temporaire (en millivolts) observée à = 435 nm quand une suspension contenant des cellules de Saccharomyces lactis partiellement tuées et du "Trypan Blue" est soumise à un rayonnement pulsé à 659 nm comme décrit précédemment. Les abscisses représentent la durée en microsecondes (os). 24660 19 Sur la figure 3, les ordonnées représentent l'amplitude temporaire (en mV) observée après une ps depuis le début de l'impulsion laser. Les abscisses représentent le pourcentage de cellules mortes dans la suspension lu par des moyens clas- siques, c'est-à-dire par comptage au microscope optique. La corrélation est très bonne et permet de mesurer auto- matiquement le nombre de cellules mortes en exactement quelques secondes. La sensibilité pouvant être obtenue peut varier autour de 100 à 1 000 cellules/mmi3, c'est-à-dire moins de 1% de la population totale présente dans le bouillon. EXEMPLE 2 Examen des cultures de cellules. Contamination par diverses souches. La même composition utilisée pour le mélange réactionnel de l'exemple 1, contenant le colorant bleu "Trypan Blue", permet de distinguer divers types de cellules dans une fermen- tation. Pour deux levures différentes du type Saccharomyces, l'amplitude temporaire observée à = 435 nm varie différemment avec le temps, par exemple la demi-vie (c'est-à-dire le temps durant lequel l'amplitude temporaire est réduite d'un facteur de 2) est de 2,3 ps pour le Saccharomyces lactis et de 1,7 ps pour le Saccharomyces fragilis. On n'observe pas d'amplitude temporaire dans les cellules bactériennes mortes du type Arthrobacter. Le procédé est par conséquent approprié pour examiner la contamination de levures dans des cultures bactériennes, ou pour différencier diverses levures. Dans ce but, l'échantillon à analyser est prélevé, toutes les cellules présentes sont tuées par ébullition pendant quelques minutes, l'échantillon est ensuite traité avec le mélange contenant le colorant et on mesure l'amplitude et le temps d'affaiblissement de l'amplitude temporaire enregistrée à = 435 nm quand l'échantillon est irradié avec des impulsions de k = 650 nm. EXEMPLE 3 Mesure de la quantité d'ADN présente dans les tissus. Le procédé est applicable pour la mesure quantitative des acides nucléiques présents dans les globules humains. Les globules blancs du sang de diverses compositions sont utilisés pour cet essai. Des échantillons contenant divers globules renfermant des quantités facilement mesurables d'ADN sont obtenus à partir de sang humain traité à l'héparine par des procédés connus, comprenant la centrifugation dans un gradient de Ficoll. Un gradient de Ficoll linéaire de 18 % à 15 % est utilisé, les globules stratifiés sur le gradient sont centrifugés pendant minutes à 50 x g et pendant 7 minutes à 250 x g. Diverses fractions sont obtenues qui, une fois purifiées, contiennent des lymphocytes, des monocytes et des granulocytes avec de petites quantités de corpuscules rouges. Les globules blancs ainsi obtenus sont comptés et analysés sur des lamelles au microscope en utilisant les procédés classiques. Ceci permet d'évaluer l'ADN contenu dans l'échantillon quand le taux moyen de chromatine dans chaque type de globule est connu. Les diverses fractions obtenues sont colorées les unes et les autres séparément puis mélangées entre elles dans des proportions connues. Afin de les colorer, les globules sont centrifugés et mis en suspension dans une solution contenant 5 x 10 5 M d'Orangé d'acridine dans une solution physiologique contenant 0,05 M d'un tampon phosphate à pH 7,2 et contenant également 10 2M de CoCl et 102 M de EDTA. La suspension obtenue est irradiée par impulsions en utilisant l'appareil décrit plus haut à une longueur d'onde comprise entre A = 473 et A= 532 nm. La suspension est observée avec une lumière continue à > = 435 nm. Le même procédé est suivi pour un échantillon contenant les mêmes réactifs mais sans le colorant. Cette dernière opération est nécessaire parce que de petites quantités de carboxy-hémoglobine présentes pourraient contribuer à l'absor- ption temporaire. L'absorption temporaire obtenue en utilisant l'échantillon sans colorant est soustrait de celle obtenue avec les mélanges complets, pour obtenir les résultats montrés sur la figure 4. Les ordonnées représentent l'amplitude de l'absorption temporaire (en millivolts), et les abscisses représentent le temps en as. La variation de l'absorption temporaire est observée à = 435 nm quand on irradie une suspension contenant des granulocytes humainset de l'orangé d'acridine à 532 nm comme décrit précédemment. L'amplitude de l'impulsion de î1is après irradiation avec le laser est proportionnelle au taux d'ADN de l'échantillon comme le montre la figure 5. Sur cette figure, l'amplitude de l'absorption temporaire (en mV) est montrée en fonction du taux d'ADN (exprimé en mg/l) pour divers types de globules, notamment les lymphocytes et les monocytes en diverses proportions, ou les monocytes seuls, ou les granulocytes seuls, ou tous les leucocytes. Les échantillons contiennent diverses quantités d'éry- throcytes, et proviennent de divers donneurs. Le fait que cette proportionnalité soit obtenue pour divers taux de différents globules prélevés sur divers individus permet de supposer que le procédé peut également être appliqué d'une façon fiable aux tissus biologiques d'autre origine, tels que les tissus épithéliaux, etc. La mesure du taux d'ADN en même temps que la mesure du nombre de globules présents dans le tissu pourrait être importante dans la diagnose initiale des états cancéreux. EXEMPLE 4 Caractérisation des leucocytes dans le sang humain. Cette caractérisation est appliquée à des échantillons de sang qui a été rendu non-coagulant. Elle fournit une évaluation quantitative du nombre total de leucocytes et du nombre de granulocytes, de monocytes et de lymphocytes. Mode opératoire. A un échantillon de sang veineux humain, qui a été rendu non coagulant avec de l'héparine en une concen- tration de 0,1 à 0,2 mg/ml de sang, ou avec le sel de sodium de 1'EDTA en une concentration de 1 mg/ml, on ajoute une solution contenant 3,5 % de dextrane (poids moléculaire 24660 19 250 000) jusqu'à ce qu'on ait une concentration finale de 1,5 %, le mélange étant ensuite maintenu dans un thermostat à 370C pendant 20 minutes. Le liquide surnageant est éliminé et contient les familles de globules blancs et environ 1 % de globules rouges, puis on ajoute de l'eau distillée afin de ramener la concentration en sel à 0,25 /. Après exactement secondes, le caractère isotonique est rétabli en ajoutant une solution aqueuse contenant 3,5 de NaCl. Les globules sont recueillis par centrifugation à 400cg pendant 5 minutes et sont ensuite délayés dans une solution de NaCl à 0,9 % ou dans un tampon phosphate 0,1 M de pH 7,1 en un volume tel, qu'il y ait 8000 lymphocytes environ par mm. La récupération des leucocytes est d'environ 95 % avec une composition en % qui ne peut pas être distinguée de celle du sang; les globules rouges qui restent sont dans un rapport d'environ 1/1 avec les globules blancs. Les mesures sont effectuées sur 200 microlites d'une suspension de globules, dans une cellule ayant un trajet optique de 2 mm,o ont été ajoutésun colorant et un extincteur. Les globules peuvent être fixés au préalable. Plus particulièrement, on utilise les techniques de coloration suivantes: A la suspension de globules, on ajoute l'extincteur CoC1 -EDTA plus le colorant vert "Brillant Green" en les con- 2 -2 -4 centrations finales de 10 et 9.10 M, respectivement. Une autre technique de coloration consiste à fixer les globules avec de l'éthanol à une concentration finale de 12 VnO. Après 1 minute, on ajoute le CoCl 2-EDTA et le colorant bleu "Brillant Cresyl Blue" en les concentrations finales de î2 et 5. 10-5 M, respectivement. Un troisième procédé de coloration qui s'est révélé utile est identique au second décritdans la présente demande, mais le colorant bleu est le "Nile Blue" à 8. 10 M. Les échantillons ainsi obtenus sont ensuite irradiés avec le système laser à impulsions, décrit au début de la présente demande, à = 659 nm, et sont observés ensuite avec une lumière monochromatique à À = 435 nm et / = 547 nm. Avec deux techniques de coloration différentes, on peut ainsi obtenir quatre absorptions temporaires différentes dont les caractéristiques sont telles, qu'elles sont en corrélation 24660 19 il avec les amplitudes à mesurer. Résultat: L'observation des échantillons sanguins ainsitraités correspond à celle obtenue par les procédés classiques, c'est-à-dire par l'observation au microscope des raies du sang complet. Sur les figures 6 et 7, on a reporté à titre d'exemple quelques-unes de ces absorptions temporaires. Plus particulièrement, la figure 6 montre l'amplitude (en milli- volts) observée à A = 547 nm dans l'échantillon coloré avec le colorant bleu "Brillant Cresyl Blue" et fixé avec de l'éthanol: en abscisses, est porté le temps en microsecondes, L'amplitude tV ainsi mesurée sur la figure entre le maximum et la valeur après de longues durées est proportionnelle au nombre total de monocytes. Il faut remarquer que dans cet exemple, la présence de Co-EDTA est essentielle afin de déter- miner la disparition des signaux provenant des autres globules ou des colorants libres. Sur la figure 7, sont reportées les absorptions temporaires observées à À = 435 nm dans l'échantil- lon coloré avec le colorant vert "Brillant Green" (les ordon- nées sont en millivolts et les abscisses en microsecondes, com- me dans le cas précédent). La largeur du palier correspondant à l'activation de l'état triplet du colorant, qu'on suppose lié au noyau cellulaire, comme on peut le voir au microscope, peut être en bonne corrélation avec le nombre total de leuco- cytes. La tendance à l'affaiblissement est, de plus, à deux phases, comme on peut le voir sur le dessin. Le stade rapide qui est communément mesuré aussi bien à X = 435 nm qu'à = 547 nm, est finalement proportionnel au nombre de lymphocytes. Ainsi, on a déterminé les trois paramètres indépendants (nombre de lymphocytes (1), nombre de monocytes (m) et nombre de granulocytes (g), le nombre total de leucocytes (n) étant égal à la somme des trois, c'est-à-dire n = 1 + m + g. Il faut remarquer que une seule petite fraction de l'in- formation contenue dans le tracé enregistré pour les absorp- tions temporaires observées a été utilisée pour ces déter- minations et l'une permet l'observation indépendante du temps d'affaiblissement des stades triplet et les rapports entre les amplitudes à différentes valeurs de A, pour effectuer des contrôles d'autre nature tels que par exemple pour indiquer la présence de cellules pathologiques. REVENDICATIONS 1. Composition appropriée pour l'examen des constituants des tissus et/ou liquides biologiques, caractérisé par le fait qu'elle est constituée par: a) un colorant choisi parmi les familles du xanthène, des azines, des oxazines ou des acridines, ou bien parmi des colorants solubles dans l'eau de la famille des diazoiques ou du triphénylméthane; b) un milieu compatible avec le tissu et/ou le liquide biologiques; c) une substance pouvant désactiver rapidement les molécules de colorant quand elle les rencontre (c'est-à-dire un extincteur). 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée par le fait que le colorant est présent à une concentration comprise entre 10-5 et 10-4 moles. 3. Procédé pour l'examen des tissus et/ou des liquides biologiques, caractérisé par le fait qu'il consiste à traiter l'échantillon concerné avec une composition comprenant: a) un colorant choisi parmi les familles du xanthène, des azines, des oxazines ou des acridines, ou bien des colorants solubles dans l'eau de la famille des diazoiques ou du triphénylméthane; b) un milieu compatible avec le tissu et/ou le liquide biologiques; c) une substance capable de désactiver rapidement les molécules de colorant quand elle les rencontre, (c'est-à-dire un extincteur), puis à irradier le mélange résultant avec un premier faisceau de lumière pulsée, et à faire passer un second faisceau de lumière monochromatique à travers l'échantillon ainsi traité, et à analyser l'intensuté optique de sortie de ce second faisceau en fonction du temps.