FR 2436605 A1 19800418 FR 7827264 A 19780922 L'invention est relative à des agents ou compositions doués de propriétés immunorégulatrices, notamment inhibitrices du développement in vivo d'organismes ou cellules qui sont capables -de sécréter ou libérer-in viv-o des substances, notamment antiinflammatoires, de faib-le poids moléculaire et susceptibles même de bloquer les mécanismes normaux-de défense immunitaire de l'hôte, d'où l'expression "substances immuno-répulsives"- qui sera utilisée pour les désigner dans ce qui suit. I1 est en effet connu qu'un certain nombre de cellules et organismes, plus particulièrement certains micro-organismes, sont capables de se développer chez les êtres vivants à sang chaud-, à l'abri de leur système immunologique de surveillance. Il en est plus partieulièrement ainsi de. cellules malignes, cancéreuses, dont il a été constaté qu'elles -pouvaient librement se déveloper dans l'organisme de l'hôte à la fois sans déclencher de réponse immunitai-re et sans empêcher celui-ci de réagir normalement à l'égard d'autres molécules ou micro-organismes normalement immunogènes. I1 est maintenant établi que des cellules malignes sont en general.capables de bloquer localement les réponses immunitaires de l'hôte, réponses -qui, initialement, se manifestent normalement par une inflammation. Il a été d'ailleurs constaté que ces cellules malignes exercent un effet toxique à l'égard des macrophages (effét phagotoxique). Il a été plus particulièrement constaté que cet effet phagotoxique pouvait, au moins en partie, etre imputé à des substances ou fractions immuno-répulsives, dont les constituants ont un poids moléculaire compris entre 500 et 10.000, notamment entre environ 500 et environ 2.000, et qui peuvent être obtenues à partir du surnageant d'une culture de cellules malignes. De telles fractions ont en particulier été isolées à- partir de cultures de cellules qui sont responsables chez la souris du "carcinome de Lewis" ou encore de cellules de mélanome M1, M2 (Fauve et Coll., "Proc. Nat. Acad. Sci. USA", Vol. 71, pp.4052- 4056, 1974).Ces fractions de faible poids moléculaire se ré vèlent plus particulièrement capables d'induire une inhibition des réactions'anti-inflammatoires locales, qui peut être mise en évidence par l'effet d'inhibition qu'exercent ces fractions à l'égard de l'étalement des macrophages. Il est établi egalement-que ces fractions se comportent comme des antagonistes de la bradykinine, l'un des médiateurs essentiels normalement mis en jeu à l'occasion des premières manifestations de défense du système immunitaire de l'hôte à l'égard d'un agresseur (R.M. Fauve et M-B. Hevin, "Ann. Immunol. (Inst. Pasteur)", 1977, 128C, pp. 1079-1083). Il est à noter que l'activité anti-inflammatoire caractéristique qui paraît responsable, au moins en partie, de la prolifération des cellules malignes chez un être vivant, à l'abri de ses réactions immunitaires, n'est pas uniquement propre aux cellules malignes. Une même activité "immuno-répulsive" a également été notée chez certaines bactéries pathogènes ainsi que chez des parasites (R.M. Fauve, "Intens. Care Med.", Vol. 3, nO b, pp. 237-244, 1977). il a là aussi été constaté que le surnageant obtenu à partir de cultures du ver S. mansoni sur tissu était capable d'inhibe-r chez la souris une diapédèse de ses macrophages, notamment au niveau de la cavité péritonéale.On constate également une réduction notable de l'étalement des macrophages dans le sérum prélevé sur ces mêmes animaux. -La libération de telles substances par certaines bactéries ou parasites de ce type peut alors expliquer qu'il soit dans de nombreux cas difficile, voire impossible, de réaliser des vaccins efficaces susceptibles d'induire une réponse immunitaire spécifique à médiation cellulaire ou humorale envers les agents responsables de la "virulence" de ces agents pathogènes. On a également relevé que les trophoblastes étaient capables d'induire in vivo des phénomènes semblables à ceux que l'on observe avec les agents pathogènes susdits. L'invention a donc pour but de fournir des agents ou substances qui soient, en particulier, capables de propriétés im munorégulatrices à l'égard d'agents pathogènes du type mentionné cidessus, notamment de renforcer les défenses de l'hôte à l'égard de ces agents pathogènes. L'agent selon l'invention contient un ou-des constituants actifs de poids moléculaire plus élevé, comprenant dans leurs structures plusieurs groupes respectivement dérivés des substances immuno-répulsives de faible poids moléculaire du genre de celles que les organismes ou cellules pathogènes du genre en question sont capables de sécréter ou libérer, soit dans l'organisme de l'hôte, soit dans un milieu de culture in vitre, le nombre de ces groupes étant suffisant pour conférer aux constituants actifs de la fraction selon l'invention un poids moléculaire suffisant pour les rendre immunogènes. Avantageusement, l'agent selon l'invention est constitué par une fraction contenant des molécules polymères desdites sub stances "immuno-répulsives", obtenues notamment par réaction de ces dernières avec le glutaraldéhyde. Dans un autre mode de fabrication d'un agent selon l'inr vention, on peut avoir recours à la fixation de plusieurs des constituants de la frac-tion immuno-répulsive sur une protéine porteuse de poids moléculaire plus élevé, par exemple l'albumine, ou sur un antigène, notamment du type de ceux utilisés pour la vaccination humaine, par exemple une anatoxine tétanique, notamment encore par réaction de ltensemble de-ce produit avec le glutaraldéhyde. De préférence, l'agent- selon l'invention continent des cons tituants ayant des poids moléculaires supérieurs à 10.000, notam-. ment lorsqu'ils sont formés à partir de substances immuno-répulsives dont-le poids moléculaire est compris entre 500 et 10.000 et plus particulièrement entre environ 1.000 et 2.-000 (étant entendu que la précision des indications de poids moléculaires qui précèdent est-liée à celle .des calibrations des pores des membranes filtrantes mises sur le marché sous les désignations ou marques "DIAFLOW" ou "ANICON", ou des tamis moléculaires classiques, en vue de la séparation physique des molécules dé poids moléculaires différents) Un agent préféré selon l'invention est-constitué par un polymère de poids moléculaire de préférence supérieur à 10.000, réalisé à partir d'au moins un "monomère" qui - est de nature peptidique, - a un point isoélectrique de l'ordre de 8, - possède des propriétés anti-inflammatoires se manifestant notam ment par un effet d'inhibiteur à l'égard de la perméabilité capillaire, . de la diapédèse, notamment des leucocytes polymorphonuclé aires, des monocytes et des lymphocytes, . de l'étalement des macrophages, de la phagocytose, - n'est pas immunogène, - est un antagoniste de la bradykinine, - conserve les susdites activités biologiques après un traitement thermique à 600 C pendant 1 heure, lorsqu'il est précipité au sein d'une solution d'acide tri chloracétique à 10. % (v/v), . lorsqu'il est maintenu au sein d'une solution d'acide perchlo rique N ou d'acide chlorhydrique N, - mais les perd . après un traitement thermique à 1000C pendant 1 heurte, . lorsqu'il est mis en solution dans -la soude N, - est soluble dans l'eau, - est insoluble dans le diéthyl-éther ou dans l'acétone, - est dégradable (également avec perte d'activite) par la pronase, la trypsine, la carboxypeptidase (1,2).- Une telle substance immuno-répulsive peut notamment être obtenue à partir du surnageant d'une culture de cellules malignes de Lewis, notamment de celles connues sous la désignation "3LL". L'invention concerne donc aussi de faço'n- générale un procédé de production d'un agent doué de propriétés immunorégulatripes telles qu'elles ont été définies plus haut, qui est,particu- lièrement caractérisé par une réaction de polymérisation ou de fixation sur une protéine porteuse, notamment en présence de glutaraldéhyde, de la substance ou fra'ction -immuno-répulsive susdite obtenue ou isolée- à partir du surnageant d'une culture in vitro desdits organismes ou cellules préalablement prélevés chez l'hôte, la polymérisation ou la fixation susdite etant conduite dans des conditions'lui permettant d'atteindre un poids -moléculaire susceptible de lui conférer des propriétés immunogènes, à l'égard du même hôte, ou de les accroître. La polymérisation en présence du glutaraldéhyde peut être effectuée dans les conditions-classiques connues par la littérature pour réaliser une polymérisation ou réticulation de protéines. A titre d'exemple, la polymérisation peut être mise en oeuvre en solution aqueuse contenant de 0,1 à 20 mg par ml de substance ou fraction à polymériser et de 1 à 3 ,% de glutaraldéhyde (concentration finale), à pH 6,5 à 7,5, de préférence à pH neutre à une température de 4 à 250 C, de préférence à la tempéra- ture du laboratoire, pendant une durée de 2 à 12 heures La durée, le cas échéant, peut être déterminée expérimentatlement, en ayant recours à des tests de laboratoire simples impliquant par exemple la mise en contact du milieu avec des macrophages, en vue d'apprécier la perte par le milieu polymérisé de la capacité d'inhiber l'étalement de ces macrophages in vitre ou encore la perte par le milieu des propriétés antagonistes initiales de la substance ou fraction soumise à polymérisation, à l'égard de la bradykinine, notamment dans les conditions décrites dans les publications dont les références bibliograph-iques ont été indiquées plus haut. Lorsque laréaction est interrompue, on peut procéder à un fractionnement du milieu de réaction obtenu, notamment en ayant recours à une opération de filtration visant à éliminer les molécules de faible poids moléculaire, notamment inférieur à 2.000, voire même 10.000 daltons. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit, d'un mode de préparation préféré d'une substance polymère conforme à l'invention. La fraction de départ à polymériser est constituez par la fraction anti-inflammatoire et macrophagotoxique obtenue à partir du surnageant de culture de cellules 3LL, dans les conditions déjà décrites antérieurement Il est important que les milieux de culture utilisés aient été réalisés a-vec une eau strictement apyrogène et de très grande pureté, ("Proc. Nat. Acad. Sci.", 1974, 71, 4052-4056 - Ann. Inst. Pasteur, 1977, 128G, pp. 923-928 et 1079-1083). A partir de ce surnageant a été isolée, par filtrations successives sur des tamis moléculaires, la fraction dont les constituants ont des poids moléculaires compris entre f03 et 104. La fraction ainsi isolée est dissoute dans 10 ml d'eau strictement apyrogène et de très grande pureté à la concentration ae 0,2 mg par ml. A la solution obtenue est ajou.té sous agitation continue du glutaraldéhyde, jus-qu'à l'obtention d'une concentration. finale de 2,5 %. La solution est ensuite maintenue sous agitation continue à la température du laboratoire pendant-5 heures. Le volume de la solution est ensuite porté à 500 ml, solution qui est ensuite soumise à une opération d'ultrafiltration sur un filtre AMICON de porosité inferieure à 500 daltons (notamment pour élimi- ner l'excès de glutaraldéhyde). Après trois lavages du résidu de filtration, chaque fois avec 500 ml d'eau apyrogène et hautement purifiée, le résidu contenant des molécules ayant un poids moléculaire supérieur à 500 est mis en suspension dans un volume de 10 ml d'eau purifiée et apyrogène. La suspension est ensuite lyophilisée. Sans que cela soit nécessaire, la lyophilisation peut être poussée jusqu'à ce que le produit final ne contienne plus de glutaraldéhyde.Toutes ces operations ont effectuées de façon stérile. Le produit finalement obtenu a été testé de la façon suivante Vingt souris C57Bl6 (souris autorisant la croissance de la tumeur de Lewis) reçoivent par voie sous-cutanée dans la région dorsale une injection par semaine, pendant trois semaines, de 500 y de la "fraction polymérisée" mise en suspension dans 0,5 ml de sérum physiologique stérile apyrogène. Ces vingt souris constituent le groupe GSL. Vingt autre souris sont traitées de la même façon avec une "fraction polymérisée" obtenue de la même façon à partir du surnageant d'une culture de cellules rénales d'embryons de souris de 13 jours ("Ann. Inst. Pasteur", 1977, 128C, pp. ,1079-1083). Ces vingt souris constituent le groupe GSR. Vingt autres souris reçoivent, ,pa,r voie sous-cutanée, une injection par semaine, pendant 3 semaines, de 0,5 ml de sérum physiologique stérile apyrogène. Ces souris constituent le groupe T. Une semaine plus tard, dix souris de chaque groupe re çoivent, dans la patte arrière droite, par, voie' sous-cutanée, une injection de 0,020 ml de milieu de Eagle contenant 106 cellules 3LL et les dix autres souris reçoivent dans les mêmes conditions 105 cellules 3LL. Aux intervalles de temps indiqués dans le tableau, on mesure la différence d'épaisseur-(exprimée en mm) entre les pattes arrière, ce qui reflète ainsi l'importance de la croissance de la tumeur L'erreur standard sur la moyenne est également indiquée pour chacune des valeurs fournies dans le tableau ; à cet effet, on a eu recours aux signes suivants - N.S. = non significatif ; - signe (+) pour p0,05 - signe (-) pour p z p0,05. Ainsi qu'on le voit sur le tableau, l'injection entraîne chez les souris du groupe GSL un retard de croissance de la tumeur qui est toujours significatif, alors que le retard de croissance observé chez les souris GSR ne lest pas toujours. En ce qui concerne les métastases pulmonaires, toutes les souris du groupe témoin présentaient un cancer pulmonaire. Toutes les souris GSR présentaient un cancer pulmonaire moins développé que chez les souris témoins. En revanche, dans le groupe GSL, sur 10 souris, 4 avaient des poumons normaux, 5 présentaient de i à 3 petits nodules cancéreux au niveau du poumon et une seule souris présentait un cancer pulmonaire débutant. TABLEAU JOURS ARRÈ L'INJECTION DES CELLULES MALIGNES 3LL 0,25 1 5 6 9 10 11 12 14 0,08 0,03 0,84 1,32 2,54 T # 0,04 # 0,03 # 0,22 # 0,28 # 0,32 106 0,219 0,03 0,67 0,93 1,61 3LL GSR # 0,06 # 0,03 # 0,28 # 0,17 # 0,19 + NS NS + + GSL # 0,269 0,12 0,41 0,61 1,24 # 0,08 # 0,05 # 0,10 # 0,12 # 0,32 + + + + + T 0,03 0,05 0,20 0,35 0,62 0,92 1,52 2,01 2,84 # 0,03 # 0,02 # 0,05 # 0,08 # 0,12 # 0,16 # 0,26 # 0,35 # 0,46 105 0,02 0,03 0,05 0,15 0,30 0,75 0,86 1,42 2,22 3LL GSR # 0,02 # 0,02 # 0,03 # 0,05 0,08 # 0,16 # 0,61 # 0,24 # 0,38 NS NS + + + NS NS + + 0,06 0,04 0,04 0,05 0,09 0,21 0,57 0,86 1,36 GSL # 0,02 # 0,02 # 0,03 # 0,02 # 0,03 # 0,08 # 0,19 # 0,34 # 0,34 NS NS + + + + + + + + : P & lt; 0,05 Ces résultats prouvent donc que les souris présentent une augmentation marquée de leur résistance envers la tumeur de Lewis, lorsqu'elles reçoivent au-préalable'trois injections du t'polymère" de la fraction à activité anti-inflammatoire et macrophagotoxique. I1 est à noter que les souris n'ont par ailleurs manifesté aucun signe traduisant la moindre toxicité de l'agent selon l'invention lui-même, ni aux doses qui ont été utilisées dans les tests qui précèdent, ni à des doses trois fois supérieures. Ce sont ces propriétés favorables que l'invention met à profit. Elle est encore relative, outre à l'agent lui-même, aux différentes applications qui peuvent en être faites et aux différentes formulations ou préparations qui contiennent cet agent et qui sont appropriées à la mise en oeuvre de ces applications. L'invention 'concerne donc plus particulièrement les réactifs d'étude qui peuvent être réalisés à partir. de cette fraction, réactifs qui peuvent, par exemple, être utilisés comme substances actives de référence dans des essais comparatifs visant à déterminer les activités relatives de substances à ltétude, à l'égard de l'inhibition de la prolifération de cellules tumorales malignes, de micro-organismes pathogènes ou de parasites capables de se développer in ViVo à l'abri des réactions du système immunitaire de l'hôte. Elle concerne encore les compositions destinées à des usages thérapeutiques et dans lesquelles liagent selon l'invention est susceptible d'être utilisé à titre d'ingrédient actif principal, notamment dans des compositions visant à inhiber ou, à tout le moins, à retarder la prolifération chez l'hôte de cellules tumorales malignes et des métastases ; ou encore à empêcher le développement de micro-organismes ou parasites du type de ceux qui tendent à annihiler les mécanismes immunitaires de l'hôte ou qui sont susceptibles de se développer à l'abri de ceux-ci.De même, l'invention concerne encore des compositions thérapeutiques dans lesquelles l'agent du genre en question est associé, éventuellement co-réticulé, soit avec des principes actifs de vaccins spécifiques de cer taines maladies, mais faiblement efficaces à ce jour pour les raisons indiquées ci-dessus, soit avec des médicaments plus ou moins actifs et dont par conséquent l'activité gagnerait à être renforcée, par exemple à l'égard des micro-organismes tels Pseudomonas aeruginosa, Bordtella pertussis ; Klebsiella pneumoniae, certains mycoplasmes, etc. On peut administrer les fractionsselon-l 'invention selon les voies usuelles, notamment par voie parentérale, orale ou le cas échéant rectale. Pour la voie parentérale, on-peut notamment avoir recours -à des suspensions de la fraction active au s-ein d'une solution stérile, physiologique. Pour la voie orale, on peut associer la fraction de l'invention à des excipients soit solides, soit liquides. De même, elle peut être associée à des excipients gras classiques poules formes rectales, ou encore à'des véhicules propres à produire, par -détente, des -aérosols, pour l'application à des muqueuses. La posologie doit être envisagée en fonction de chaque cas, de ce que peut supporter l'hôte, compte tenu du retentissement que tant la maladie que le médicament peuvent avoir sur son organisme, c-omme il est bien connu des spécialistes en ce qui concerne les pathologies du genre en question. Bien que ces doses doivent être, dans chaque cas, ajustées par le praticien, on peut indiquer qu-'elles doivent en principe se situer dans un intervalle de 5 à 100 mg/kg de mammifère. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention-ne se limite nullement à ceux de ses modes e'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes. REVENDICATIONS 1 - Agent doué de propriétés immunorégùlatrices, notamment inhibitrices du développement in vifo de ceux des organismes ou cellules qui sont capables de sécréter ou libérer in uiuo des "substances immuno-répulsives", notamment anti-inflammatoires de faible poids moléculaire, caractérisé en ce qu'li contint des constituants actifs de poids moléculaire plus élevé, comprenant dans leurs structures plusieurs groupes respectivement dérivés des substances immuno-répulsives de faible poids moléculaire du genre de celles que les organismes ou cellules pathogènes du genre en question sont capables de sécréter ou libérer, soit dans l'organisme de l'hôte, soit, dans un milieu de culture in vitre, le nombre de ces groupes étant suffisant pour conférer aux constituants actifs de la fraction selon l'invention un poids moléculaire suffisant pour les rendre immunogènes. 2 - Agent selon la revendication 1, caractérisé en ce que les constituants actifs de poids moléculaire plus élevé sont formés de polymères des susdites. substances immuno-répulsives. 3 - Agent selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte plusieurs des susdits groupes -fixés sur une protéine porteuse ou sur un antigène, notamment vaccinant. 4 - Agent selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il résulte d'une polymérisation ayant fait intervenir une réaction entre ladite ou lesdites substances immuno-répulsives et le glutaraldéhyde. 5 - Agent selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la ou les substances dont il est dérivé présentent un poids moléculaire compris entre environ 500 et environ 10.000, notamment entre 1.000 et 2.000, et en ce que lui mme a un poids moléculaire supérieur à 10.000. 6 - Agent selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est dérivé au moins en partie d'une substance "monomère" qui - est de nature peptidique, - a un point isoélectrique de l'ordre de 8, - possède des propriétés anti-inflammatoires se manifestant notam ment par un effet d'inhibiteur à l'égard de- la perméabilité capillaire, . de la diapédèse, notamment de-s leucocytes polymorphonucléaires, des monocytes et des lymphocytes, . de l'étalement des macrophages, . de la phagocytose, - n'est pas immunogène, - est un antagoniste de la bradykinine, - conserve les susdites activités biologiques après . un traitement thermique à 600 C pendant 1 heure, . lorsqu' il est précipité au sein d'une solution d'acide trichloracétique à 10 % (v/v), . lorsqu'il est maintenu au sein d'une solution d'acide per chlorique N ou d'acide chlorhydrique-N, - mais les perd . après un traitement thermique à 100 C pendant 1 heure, . lorsqu' il est mis. en solution dans la-soude.N, - est soluble dans l'eau, - est insoluble dans le' diéthyl-éther ou dans l'acétone, - est dégradable (également avec perte d'activité) par la pronase, la trypsine, la carboxypeptidase (1,2) : 7 - Agent selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est lui-même un antagoniste,desdites substances immunorépulsives. 8 - Agent doué de propriétés immunorégulatrices, notamment inhibitrices du développement in vive de ceux des organismes ou cellules qui sont capables de sécréterou libérer in vive des substances immuno-répulsives , notamment anti-inflammatoires, de faible poids moléculaire, présentant les propriétés physicqchimiques et biologiques de celui qui est obtenu par polymérisation de la fraction contenant des constituants de poids moléculaire compris entre environ 500 et environ 10.000, de préférence entre 1.000 et 2.O00,et qui est obtenue à partir du surnageant d'une culture in Vitre de cellules malignes de Lewis 3LL. 9 - Procédé de production d'un agent doué de propriétés immunorégulatirces, notamment inhibitrices du développement in vivo de ceux des organismes ou cellules qui sont capables de sécréter ou libérer des substances immuno-répulsives, caractérisé par une réaction de polymérisation ou de fixation sur une protéine porteuse, notamment en présence de glutaraldéhyde, de la substance ou fraction immunorepulsive susdite obtenue ou isolée à partir du surnageant d'une culture in Vitre desdits organismes ou cellules préalablement prélevés chez l'hôte, la polymérisation ou la fixation susdite étant conduite dans des conditions lui permettant d'atteindre un poids moléculaire susceptible de lui conférer des propriétés immunogènes, à l'égard du même hôte, ou de -les accroître. 10 - Réactif de laboratoire contenant à titre de principe actif un agent tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou l'agent obtenu par le procédé selon la revendication 9. 11 - Composition contenant un agent tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou l'agent obtenu par le procédé selon la revendication 9, associé à un véhicule pharmaceutique et, le cas échéant, à un autre principe actif de médicament.