FR 2439402 A1 19800516 FR 7829482 A 19781017 La présente invention concerne la mesure électronique des réactions protéiques, et plus particulièrement un procédé et un appareil pour la détection de telles réactions par perception de laggrégation de particules enrobées de protéine, utilisant un procédé à battements de tension, en abrégé "BT". Une mesure de la réaction antigène-anticorps à l'aide du procédé BT peut présenter un intérêt clinique manifeste du fait qu'il permet de détecter de petites quantités d'antigène dans le sérum d'un patient. Par ce procédé, on peut atteindre une sensibilité voisine de celle que permet la mesure radio-immunologique que l'on prend couramment comme référence en matière de sensibilité pouvant être atteinte en clinique. Pour la mise en oeuvre classique du procédé BT, appliqué à la détection de réactions antigène-anticorps, on utilise des particules de latex revêtues d'un anticorps et on observe l'aggrégation initiale des particules en présence de l'antigène correspondant en comptant l'augmentation du nombre relatif des multiplets de particules. De petites augmentations dans le nombre relatif de dimères, trimères, etc. reflètent aved sensibilité la réaction antigène-anticorps, et le procédé BT convient idéalement à la mesure de la taille des particules et des multiplets de particules. On peut ainsi obtenir une très grande sensibilité à de petites quantités d'antigène. L'un des inconvénients printipabx qui limite l'utilisation du procédé,uandil s?ågkt-de détecter de petites quantités d'antigène, estqu'il existe, avant même l'addition de l'antigène, des multiplets dans la suspension de particules. Ces multiplets se forment par suite des procédés mis en oeuvre à l'occasion de la préparation des particules à la surface desquelles est fixé l'anticorps. Ainsi, il se produit une agglomération des particules enrobées d'anticorps en suspension, lors de la formation de la suspension. On a maintenant découvert que le procédé BT appliqué à la détection de particules est tout-à-fait capable de mesurer exactement les distributions de taille de particule, tout en évitant les interférences que peuvent causer, dans l'analyse, les mesures touchant des multiplets de suspensions de particules n'ayant pas réagi. Pour aboutir à de telles mesures exactes, on prépare deux suspensions de partictiles, les particules des deux suspensions étant revêtues avec le même anticorps mais les particules individuelles appartenant à l'une des suspensions ayant un plus grand volume que les particules individuelles appartenant à l'autre suspension, le rapport entre les volumes ayant une valeur prédéterminée.En l'absence d'antigène spécifique aux revêtements d'anticorps, le mélange des deux suspensions de particules renfermera des multiplets de l'un et l'autre type de particules, mais pas de combinaison des deux types. Ainsi, si par exemple, on a un rapport de volume entre les particules individuelles de pour 1, on peut s'attendre à ce que dans le mélange de telles particules en suspension, il y ait des particules et des multiplets de particules ayant des volumes de 1, 2, 3, 4,.. et de 1, 3, 4, quand les volumes sont exprimés en unités de volume des plus petites particules individuelles utilisées dans les suspensions de particules de départ. On a cependant découvert qu'en présence d'antigène,il se forme un couplage grosse particule-petite particule dans le mélange.Cela se traduit par la possibilité d'obtention d'un signal BT à un volume de multiplet de particules de 2s, ce qui correspond à un volume de multiplet de particules ou à un volume de particule qui n'existerait pas en l'absence d'antigène. Les signaux BTobtenus à partir de volumes de multiplets de particules de 2 constituent donc une indication d'une interaction anti corps-antigène dépourvue d'interférence d'arrière plan, comme si l'essai était accompli avec une seule taille de particule et sans multiplets initiaux. L'invention améliore donc de manière significative la sensibilté du procédé BT appliqué à la détection de ré- actions immunologiques. En bref, selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, le procédé de détection de la survenue d'une réaction antigène-anticorps consiste à préparer une première suspension de particules d'une première taille prédéterminée, chaque particule de la première suspension étant revêtue d'une couche d'une première protéine, et à préparer une seconde suspension de particules d'une seconde taille prédéterminée, chaque particule de cette seconde suspension étant revêtue d'une couche de la première protéine. La seconde taille prédéterminée est supérieure de plus d'une fois et de moins de deux fois au volume de la première taille prédéterminée. On combine ensuite les première et seconde suspensions en un mélange avec la solution à essayer en vue de déterminer si cette dernière renferme une seconde protéine spécifique de la première. On cherche ensuite à détecter les multiplets de particules qui sont formés de l'aggrégation d'une particule de première taille prédéterminée et d'une particule de la seconde taille prédéterminée. Si la première protéine est un anticorps, la seconde est un antigène, et vice-versa. L'invention est décrite, avec plus de détails, en référence aux dessins annexés dans lesquels - la figure 1 est un schéma de l'appareil utilisé pour la détection de la réaction antigène-anticorps par le procédé BT, selon lequel la réaction produit une aggrégation de particules de la manière décrite ci-dessus ; et, - la figure 2 est une illustration graphique des battements de ten sion produites par le passage de particules de différentes tailles, et par le passage des trois types d'aggrégats de particules, au travers d'un pore unique pratiqué dans la membrane de l'appareil utilisé dans la figure 1. Pour la mise en oeuvre de l'invention, on prépare deux suspensions de particules séparées, les particules de chacune des suspensions étant revêtues du même anticorps. Les suspensions ainsi formées sont conductrices de l'électricité en raison de leur contenu en sel et en protéine. La première suspension est préparée en déposant l'anticorps sur des sphères de latex ayant avantageusement un diamètre de 175 nanomètres, dialysées pour éliminer les tensio-actifs et autres contaminants. Cette opération peut être accomplie en agitant les particules dans, par exemple, une solution de glycérine qui peut contenir un anticorps de type immunoglobuline-G.On prépare la seconde suspension en déposant l'anticorps sur des sphères de latex ayant avantageusement un diamètre de 200 nanomètres, également dialysées pour éliminer les tensioactifs et autres contaminants, puis en agitant les particules dans une solution de même composition que la précédente. On mélange ensuite les deux suspensions avec la solution à essayer en vue de détecter si elle renferme l'antigène correspondant et le mélange conducteur résultant est ensuite soumis à la détection comme indiqué plus loin. Le choix de la taille des particules de latex est critique pour la mise en oeuvre convenable de l'invention. Un rapport de volume de particule compris entre 1 et 2 : 1, avantageusement de 1 s 1 entre les deux types de particules en suspension, est satisfaisant, bien que l'on puisse utiliser d'autres tailles de particules. En l'absence, dansila solution-, d'antigène qui soit spécifique à l'anticorps, il se forme des multiplets de l'un ou l'autre types de particules, mais pas de combinaison de ces deux types. La solution ne renferme donc que des particules et des multiplets de particules ayant un volume individuel de 1, 2, 3, 4 etc. et l, 3, 4, etc. Cependant, en présence de l'antigène, il se forme un couplage grosse particule-petite particule. Un signal BT peut donc être détecté pour un volume de multiplet de 2e, èe qui révèle une interaction anticorps-antigène, la détection étant accomplie à l'aide de l'appareil représenté à la figure 1. Si l'on se réfère à cette figure 1, on voit une cellule 10 constituée, par exemple, d'un matériau résineux tel que le Plexiglas, et séparée en deux chambres ayant chacune un volume de un 3 cm environ, par une membrane non-conductrice formée d'une feuil- le de polycarbonate coulé 11 ne présentant qu'un pore 12,nayant normalement que plusieurs dixièmes de microns de diamètre et plusieurs microns de long. La fabrication d'une feuille de polycarbonate présentant un tel pore est décrite par R.L. Fleischer et coll. dans l'article intitulé "Nouveau filtre pour matériaux biologiques" publié dans Science, 143, 249-250, Janvier 1964. Le pore 12 est d'une taille suffisante, normalement d'un diamètre compris entre 0,3 et 10 microns, pour permettre le passage. séparé de multiplets de particules de latex en solution.On fait passer la solution à analyser au travers du pore 12 en appliquant une pression dans l'une des chambres, par l'un des tubes de remplissage 13 et 14. La cellule renferme, de chaque côté de la membrane 11, une électrode argent-chlorure d'argent 15 et 16. Une tension, provenant d'une source de courant continu 17, telle qu'une batterie, est appliquée entre les électrodes 15 et 16, par l'intermédiaire d'un répartiteur de tension 19 formé d'un rhéostat 18 et d'une résistance à effet de limitation de courant 20 monté en série avec la source de courant continu. I1 est prévu une résistance de charge 21, montée en série avec l'électrode 15, et suffisamment grande (par exemple, de un ou plusieurs gigaohms) pour faire de l'appareil un système à courant pratiquement constant comme le montre le nanomètre 22 monté en série avec l'électrode 16. En conséquence, un passage de courant pratiquement constant se fait dans la solution entre les électrodes 15 et 16, au travers du pore 12. Des particules, soit séparées soit en aggrégats, sont en général entraînées au travers du pore 12 sous les effets combinés de la pression appliquée, de l'électroosmose et de l'électrophorèse. Une particule ou multiplet 23 pénètrant dans le pore 12 évincei une partie du liquide conducteur contenu dans ce dernier. Du fait que la particule de latex est relativement non-conductrice, il se produit, quand elle passe longitudinalement -dans le pore 12, une augmentation de la résistance électrique du pore et de la tension entre l'un et l'autre côté du pore, telles que mesurées dans la direction de passage au travers du pore.La variation ou battement detensionauniveau du pore est détecté par l'électrode 15 , puis amplifié par un amplificateur de haute impédance (c'est-à-dire 11 supérieure à 1011 ohms), désigné par la référence 24, tel que le modèle MPA-6 vendu par la Transidyne General Corporation, Ann Arbor, Michigan, cet appareil permettant également de lire la tension dans la cellule au moyen d'un voltmètre 25 réuni au cires cuit amplificateur. Les battements BT produits au niveau du pore sont contrôlés sur un oscilloscope à écran emmagasinant 26, tel que le modèle 5103/Dll, avec amplificateurs 5A20N et 5A15N et base de temps 5B10, vendu par Tektronix, Inc., Beaverton, Oregon, E.U.A.Les deux battements de 12 millivolts qui sont affichés, correspondent probablement au passage de deux dimères de particules de 570 nanomètres de diamètre ( bien que l'un des battements ou les deux puissent correspondre au passage de trimères de particules de 500 nanomètres de diamètre et le battement de 8millivolts qui est affiché correspond au passage d'un dimère de particules de 500 nanomètres de diamètre. En cas de réaction immunologique, les dimères de particules de 500 et 570 nanomètres de diamètre se combinent et leur existence se manifestent sous la forme de battements d'amplitude au voisinage de 10 millivolts (comme indiqué par la ligne en pointillés à la figure 2). Dans ce cas, le nombre de battements au voisinage de 10 millivolts d'amplitude, sur un histogramme de hauteurs de battements, constitue une mesure de la force de la réaction immunologique. Bien qu'à des fins de concision, on ne se soit référé, dans la présente description, qu'à l'utilisation de particules de latex revêtues d'anticorps pour détecter la présence d'antigènes, il est clair que l'invention est tout aussi applicable à l'utilisation de particules de latex revêtues d'antigène pour détecter la-présence d'anticorps. Ce qui précède décrit un procédé et un appareil pour la détection, avec une grande sensibilité, de la survenue d'une réaction immunologique. L'invention permet d'améliorer la sensibilité du procédé à battements de tension appliqué à la détection de réactions immunologiques et constitue une technique clinique simple pour une telle détection. REVENDICATIONS 1- Procédé de détection de la survenue d'une réaction antigène-anticorps, caractérisé en ce qu'il consiste - à préparer une première suspension de particules ayant une première taille prédéterminée, chaque particule de cette première suspension étant revêtue d'une couche d'une première protéine - à préparer une seconde suspension de particules ayant une seconde taille prédéterminée, chaque particule de cette seconde suspension étant revêtue d'une couche de cette première protéine, la seconde taille prédéterminée étant plus dunaWfois-,-mais moins. de deux fois, plus grande en volume que la première taille prédéterminée; - à combiner, en un mélange, les première et seconde suspen- sions avec une solution à analyser en vue de détecter la présence d'une seconde protéine spécifique à la première ;; et, - à détecter les multiplets de particules pour identifier ceux qui sont formés de l'aggrégation d'une particule de la première taille prédéterminée et d'une particule de la seconde taille prédéterminée. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la première protéine est constituée d'un anticorps et en ce que la seconde protéine est constituée d'un antigène spécifique à cet anticorps. 3 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape de détection des multiplets de particules consiste - à induire un passage de courant sensiblement constant selon une direction longitudinale au travers d'une zone renfermant une petite quantité du mélange - à contraindre ce mélange à s'écouler longitudinalement au travers de cette zoné,; et - à contrôler la tension longitudinalement au niveau de cette zone tandis que le mélange s'y écoule pour détecter les battements de tension d'une amplitude prédéterminée, révélant la présence des multiplets formés de l'aggrégation d'une particule de la première taille prédéterminée et d'une particule de la seconde taille prédéterminée. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la seconde taille prédéterminée est environ égale, en volume, à 1 fois la première taille prédéterminée. 5 - Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce qui comporte le fait de diviser cette zone en deux parties réunies par un passage ayant un diamètre de 0,3 à 10 microns. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 os 5, caractérisé en ce que la première protéine est constituée d'un antigène et en ce que la seconde protéine est constituée d'un anticorps spécifique à cet antigène.