FR 2446111 A1 19800808 FR 7901301 A 19790112 La présente invention concerne un procédé de préparation de substances antigéniques , à partir de divers microorganismes , permettant la fabrication de nouveaux vaccins et les vaccins obtenus selon ce procédé. Le but du procédé est de fournir des antigènes sous une forme améliorée tant du point de vue qualitatif que quantitatif L'utilisation de ce procédé permet de définir des complexes antigéniques nouveaux utilisables en thérapeutique humaine Procédé de fabrication 1. Cultures Les microorganismes sont cultivés en milieu liquide selon des méthodes connues en microbiologie : Il sont centrifugés et lavés dans un tampon à pH 7 2. Isolement des membranes Les germes sont mis en suspension dans un tampon à pH 7 puis broyés par les méthodes les plus appropriées, telles que : congéla- tion-décongélation , broyage mécanique à basse température en présence de désoxyribonucléase à la concentration de 0, 1 mg/l . Le broyat homogène ainsi obtenu est alors centrifugé à 15.000 G pendant 2 heures . Le surnageant est éliminé.Le culot contient la fraction membranaire 3. Solubilisation des membranes La fraction membranaire après lavage est suspendue dans trois volumes de sérum physiologique à pH.7 et subit l'action simultanée du lysozyme à la concentration de 1 mg/ml, du désoxycholate de sodium en quantité variable selon les microorganismes traités ( en général de 0,5 à 5 mg de désoxycholate par mg de protéine ) et de l'Ethylène - diaminotétracétate de sodium dite " EDTA " à la concentration de 25 m Moles . Le mélange est agité pendant 12 à 24 heures à 206 C . Au bout de cette période les membranes sont solubilisées . On élimine l'insoluble ( protéines dénaturées ) par centrifugation prolongée à 1,5 . 104 G 4.Obtention de la fraction anffgénique Le surnageant obtenu contient en solution les complexes antigéniques et après dilution et stérilisation sur membrane de 0,-45 L sert directement de vaccin Avantages du procédé 1) Le procédé permet l'emploi d'appareils ( homogénéiseurs centrifugeuses ) à grands rendements, et de traiter dans un même temps de grandes quantités de microorganismes au moyen d'appareils de grande capacité 2) Le produit obtenu présente par rapport aux procédés n'utilisant pas l'association lysozyme~désoxycholate ( E.D.T.A. ) l'avantage de créer des complexes antigéniques nouveaux à partir de souches connues. La solubilisation totale de la membrane des microorganismes met en présence trois types de molécules antigéniques a ) - des protéines hydrophobes portant des sites réactionnels b ) - des lipopolysaccharides c ) - des peptidoglycanes Ces trois types de molécules antigéniques coopèrent pour former de nouveaux complexes antigéniques en présence de désoxycholate de sodium. Ces complexes se forment grâce aux intéractions hydrophobes entre les protéines membranaires , les lipopolysaccharides et le désoxycholate de sodium . Ces intéractions ont pour effet de stabiliser la structure des molécules antigéniques et permettent à celles-ci de conserver leur structure native En outre le désoxycholate de sodium permet de former des complexes hybrides On peut donc parler de la formation d'une nouvelle classe d'anti gènes La formation de ces complexes antigéniques stabilisés par liaisons hydrophobes permet également de favoriser la solubilité de ces complexes du fait que les piles hydrophobes sont liés et que les pôles hydrophiles sont démasqués ( arrangements pseudo micellaires ) Il y a donc synergie avec le rôle de détergent du désoxycholate de sodium 3) En application thérapeutique la conservation de l'intégrité structurale des molécules antigéniques permet une reconnaissance plus rapide par les cellules spécialisées de l'organisme De plus l'absence d'enzymes protéolytiques ( trypsine , chymotrypsine ) et/ou d'agents dénaturants ( sodium dodécyl sulfate, phénol ) autorise une meilleure conservation du produit Enfin il a été mis en évidence l'effet protecteur du désoxycholate sur les protéines membranaires par l'expérience suivante Des aliquots de membranes sont solubilisés d'une part par le désoxycholate de sodium , d'autre part par un autre détergent , le Triton X 100 . Dans chacune des- deux fractions de membranes solubilisées on ajoute des enzymes protéolytiques ( Trypsine , chymotrypsine , pepsine ) et l'on suit la dégradation spectrophotométriquement des cytochromes membranaires .Les échantillons solubilisés par le désoxycholate sont restés stables pendant deux jours . Cet effet a amené à conserver le désoxycholate dans le produit final Application thérapeutique Il a été choisi de préparer, selon le procédé objet de l'invention, un vaccin des voies respiratoires supérieures et des voies bronchiques, à partir de 19 souches microbiennes qui sont le plus souvent en cause lors des affections du rhinopharynx C'est ainsi qu'il a été préparé un vaccin à partir de germes suivants Souches Sérotype N Collection - Streptococcus Pyogènes Groupe A type I IP NO 5641 Streptococcus Pyogènes Groupe A type IV ATCC N 10 402 - Streptococcus Pyogènes Groupe A type 12 ATCC N" 12 351 - Staphylococcus Aureus Serotype I IP NO 656 - Staphylococcus Aureus Serotype Il IP N" 657 - Staphylococcus Aureus Serotype III IP N" 658 - Staphylococcus Aureus Serotype 14 IP N" 6521 - Staphylococcus Aureus Serotype 18 IP N 6525 - Diplococcus Pneumonie Serotype I IP N 692 - Diplococcus Pneumonie S erotype II IP NO A146 - Xlebsiella Pneumonie Type B IP N 52 145 - H. mophilus Influenza Type A IP NO 52 151 - Neisseria Catarrhalis ATCC NO 23 246 - Neisseria Elongata IP N 7511 - Escherichia Coli 011 B4 IP N 52 167 - Escherichia Coli 086 B7 ATCC N 12 701 - Escherichia Coli 0127 B8 ATCC N 12 740 - Proteus Mirabilis IP N A 235 - P seudomonas Aerugino sa IP NO A22 ANALYSE 1 ) - Tous les antigènes ont été mis en évidence par la technique d'immuno-diffusion sur gel selon Outcherlony J Munoz-Methods in Immunology and lmmunochemistry Vol III chap.l4 B p. 146.168 Academic Press. Les résultats peuvent s'exprimer selon le tableau N 1 de la planche 1 Ce tableau porte les résultats aux dilutions 1/2 et 1/4 en sérum P et il a été constaté qu'à la dilution 1/8 les résultats sont toujours né natifs. 2 ) - Le contrôle a été effectué par la technique de déviation du complément type XOLMER , à froid selon " Complément et fixation du complément " dans " Experimental Immuno-chemistry " par A. KABAT et MAYER ( Chat.4) ) chez THOMAS SRINGFIELD ( 1951 ) On utilise comme animaux test quatre lapins de même poids ( 2 Kg 500 ) répartis en deux lots. Avant tout traitement, un premier prélèvement sanguin est effectué afin d'évaluer le taux d'anticorps naturels des animaux vis-à-vis des antigènes du vaccin - Les animaux sont alors immunisés par voie intramusculaire trois fois par semaine pendant trois semaines. - Le lot A est immunisé avec -O,1 ml de vaccin par kg - Le lot B est immunisé avec 1 ml de vaccin par Kg - A la fin de la 40 semaine une seconde prise de sang est effectuée pour la recherche des anticorps après immunisation - Un rappel est effectué la 60 semaine à partir du début de l'expérimentation le lot A reçoit 1 ml de vaccin/kg le lot B reçoit 2 ml de vaccin/kg - Un troisième prélèvement sanguin est effectué la 70 semaine pour une nouvelle détermination des anticorps sériques. On utilise donc la technique du type Kolmer de déviation du complément pour le dosage des Anticorps spécifiques a) - l'antigène utilisé dans un premier temps est le vaccin lui-même La fixation du complément se fait avec deux unités de la fraction C' du complément. Les résultats sont donnés par le tableau NO 2 de la planche 2 Conclusion : Les réactions montrent que les animaux immunisés ont très bien répondu à la stimulation antigénique b) - Réactions de déviation du complément avec comme antigènes une des bactéries de chaque groupe entrant dans la composition du vaccin , selon les résultats figurant au tableau ND 3 de la planche 3 dans lequel figure pour chaque sujet le résultat selon trois états du sujet 1 = sérum avant immunisation 2 = sérum après immunisation 3 = sérum après rappel les résultats étant 0 = réaction négative +1/x = réaction positive avec un sérum dilué à 1/x 3 ) - Réaction de fixation du complément ( type Kolmer ) Un lapin immunisé pendant trois semaines par pulvérisation dans chaque narine matin et soir . Arrêt une semaine , puis une semaine de traitement supplémentaire . Les résultats sont donnés au tableau NO 4 de la planche 4 Deux autres lapins sont traités identiquement au précédent, mais on leur fait une prise de sang supplémentaire à la fin de la semaine de repos .Les résultats sont donnés au tableau NO 5 de la planche 2 Conclusion : Importante montée d'anticorps circulants chez le la pin , après immunisation intranasale . Donc on a , en plus d'une immunisation locale , une immunisation générale qui se traduit par cette augmentation des anticorps circulants. 4) - Test de Toxicité On inocule à cinq souris femelles , race Swiss , 0,5 ml de vaccin par voie intrapéritonéale Parallèlement on inocule à cinq souris témoins de même race 0,5 ml d'excipient ne contenant pas les bactéries lysées Résultats :1On observe tous les jours pendant quinze jours les deux lots et on ne constate aucune anomalie ( lésions, nécroses ) aucun décès parmi les souris ayant reçu le vaccin Le produit a été conservé durant zlus de deux ans sans qu'il y ait perte de caractéristique du produit initial Le produit peut être utilisé en thérapeutique humaine sous forme d'atomisations pernasales et buccales , mais d'autres vecteurs peuvent être utilisés : injections , pâtes gingivales etc... REVENDICATIONS 1 0) - Procédé permettant l'extraction de complexes antigéniques Caractérisé en ce que l'on solubilise les parois de divers microorganismes ( préalablement purifiées ) par l'action simultanée du désoxycholate de sodium ( 0,5 à 5 mg par mg de protéines ) du lyzozyme ( 1 mg/ml ) et de l'ethylène-diaminotétracétate de sodium ( 25 m Moles ) 20) - Procédé selon la revendication 1, Caractérisé en ce que ladite solubilisation est effectuée à pH neutre pendant 12 à 24 heures à 200 C 30) - Procédé selon les revendications 1 et 2 Caractérisé en ce que l'extrait est centrifugé , et que la fraction soluble surnageant est utilisée directement comme source d'antigènes, sans élimination des solubilisants 40) - Produit obtenu selon le procédé conforme aux revendications précédentes, Caractérisé en ce qu'en lui la réassociation pseudomicellaire des protéines hydrophobes, des lipopolysaccharides et des peptidoglycanes en présence du désoxycholate de sodium par interaction hydrophobe crée des complexés antigéniques inter et intraspécifiques dans lesquels les sites antigéniques ne sont pas dénaturés 50) - Produit selon la revendication 4, Caractérisé en ce que le désoxycholate reste présent dans le produit final afin de coopérer à la formation de complexes antigéniques hydrophobes solubles et de contribuer à la protection de ces complexes antigéniques contre l'action de protéases contaminantes