FR 2454464 A1 19801114 FR 7922694 A 19790911 Procédé de production de spores de clostridium butyricum miyairi La pressente invention concerne un procédé de production de spores de cïostridium butyricum miyairi par une technique de culture en récipients multiples. Elle concerne plus particulierement un procédé de production de spores en quantites plus importantes que par les procédés classiques, en régime stable, pendant une duree prolongée, grâce à des améliorations apportées à l'appareillage de fabrication ainsi qu'aux taux de dilution qui seront définies plus loin. Des procéd6s de culture continue de la bactérie clostri- dienne miyairi ont déjà été proposés, par exemple par le Drevet japonais n 543.246. Avec leurs caractéristiques avantageuses, ils ont apporté des contributions non négligeables au progrès de la technique. La présente invention propose une nouvelle amélioration des procédés de l'art antérieur. Elle concerne un procédé de production de spores de clostridium butyricum miyairi caract6risé en ce que, dans la culture continue de la bactérie en utilisant un certain nombre de récipients, le taux de dilution pour le premier recipient est fixé dans un intervalle déterminé à l'avance et en ce que, sur cette base, les taux de dilution des récipients suivants sont fixés en conséquence, ce premier récipient étant constitué d'un certain nombre de sous-récipients qui sont utilises tour à tour.Plus précisément, le procédé utilise un second et un troisième recipient commue récipients suivants et fixe le taux de dilution pour le premier récipient à une valeur non supérieure, à 0,75./h, le taux pour le second récipient dans l'intervalle de 0,06 à 0,07 /h, et le taux pour le troisième récipient dans l'intervalle de 0,04 à 0,05 / h. En général, le premier recipient est destiné à la formation de cellules nutritives, le second récipient à la formation d'endospores, et le troisième à la formation de spores murs. La bactérie pouvant être trait6e conformément à l'invention est la suivant : Nom de la bactérie : clostridium butyricum miyairi Institut auquel a êté remise la souche Researche Institute of Microbial Industrial Technologies, Agency of Industrial Science and Technology, JAPAN. Souche enregistrée sous le n 1.467. Aux fins de l'invention, le terme "taux de dilution" désigne ici le rapport de l'alimentation par heure (l/h) à la quantité de iquide dans un récipient donne. Par exemple, si deux litres de liquide sont pportes par heure dans un récipient contenant deux litres de liquide, et 'il s'en ecoule en même temps deux litres par heure, le taux de dilution pour e recipient est de 1,0/h. Lorsque l'apport de liquide dans un récipient ontenant deux litres de liquide et la quantite qui en sort sont tous deux 'un litre par heure, le taux est de 0,5/h. La sporogénèse, ou la production de spores, de lostridium butyricum miyairi s'effectue suivant la séquence : cellules utritives, endospores, spores mûrs. La presente invention met à profit la transformation articulière que subit cette bacterie avec le temps, c'est-à-dtre le fait u'elle se développe de la cellule nutritive au spore mûr en adoptant des aux de dilution différents pour les récipients individuels dans un système e culture continu. Ainsi, en régime permanent, des cellules nutritives se orment dans le premier recipient, des endospores dans le second récipient et es spores mûrs dans le troisième, de sorte que l'on peut produire avec un endement extrêmement relevé des spores d'agie pratiquement uniforme et idenique. Le succes de la sporogénése par le procédé de culture e l'invention depend des conditions de culture dans te premier récipient. n fait, cent heures environ après le début de la culture continue, les cellules utritives subissent une transformation. Si la culture est poursuivie, le ombre de spores dans le troisième récipient décroît (la cause de ce phénomène este à élucider). C'est pour cette raison que l'on utilise dans la présente Invention plusieurs sous-recipients au lieu d'un seul pour former le premier réciient.Ceci permet de passer d'un sousrécipient dans lequel les cellules nutritives viennent de se transformer à l'autre sous-recipient, de telle sorte ue les cellules peuvent toujours être cultivées de façon satisfaisante dans N premier récipient en vue du développement à l'état de spores, et la producion es spores s'effectue sans interruption pendant une durée prolongée. Les milieux de culture utilisables avec le procédé de 'invention sont les suivants : apres avoir étudié des saccharides, des aminoides, des sels minéraux et d'autres milieux possibles, on a trouvé que 'amidon de maïs et la fécule de pomme de terre sont des sources de sucres adéurates, que des aminoacides appropriés sont les produits de décomposition de la viande, la peptone, le cazaminoacide et une solution d'aminoacides mélangés obtenue en hydrolysant du soja dégraissé, ét que des sels minéraux utilisables comprennent Mn S04, Fe S04 et Ca C03 Parmi ceux-ci, on préfère l'amidon de mais, la solution d'aminoacides mélanges et CaC03 pour leurs effets favorables sur la multiplication des cellules nutritives et la sporogénese. Lorsqu'on utilise un de ces milieux de culture appropriés, un taux de dilution pour le premier récipient de plus de 0,75/h a pour résultat que les microorganismes s'écoulent hors du récipient au lieu d'y rester comme on le désire, en n'y laissant pas de cellules nutritives, mais seulement le milieu de culture. Le taux de dilution du premier récipient est donc de préfé- rence non supérieur à 0,75/h; un tel taux donnera de bons résultats tant en ce qui concerne la multiplication des cellules nutritives que la production de spores. Pour ce récipient, on préfère un taux-de dilution compris entre 0,3 ét 0,6/h, car un taux compris dans cet intervalle augmente le rendement de la production et permet de maîtriser aisément la culture continue. Les taux de dilution pour les second et troisieme recipients ou se forment les spores, sur la base du taux de dilution pour le premier récipient de 0,75/h, sont respectivement compris dans les intervalles de 0,05-0,1 et 0,03-0,1s~et mieux dans les intervalles de 0,06-0,07 et 0,04 0,05/h. L'adoption de ces taux de dilution permet d'obtenir des spores du même age sans qu'il soit nécessaire de disposer d'un quåtrieme, d'un cinquième, etc... recipient. L'invention sera mieux comprise à partir de la description détaillée ci-après et des dessins annexés. La figure unique est une représentation schématique d'un appareil adapté a la mise en pratique de l'invention. Tout d'abord, on commence la culture en discontinu dans un des deux premiers récipients 1 et dans. un second récipient 3. Dans lrautre premier récipient 2, l'inoculation bactérienne précède d'une durée prédéterminée celle dans le premier récipient 1, de sorte qu'il peut être pret, si nécessaire, pour une commutation immediate de l'écoulement vers le second récipient, du premier recipient 1 à l'autre premier recipient 2. Par exemple, si la durée de culture en discontinu pour le premier récipient 1 est fixée à douze heures, l'inoculation dans le premier récipient 2 doit etre effectuée deux heures plus tôt de façon que la durée de culture pour ce dernier soit de quatorze heures. Au cours de la culture, les microorganismes sont constamment agités pour obtenir un melange intime.Au cours de la culture en discontinu, en particulier, du gaz carbonique est apporté par les canalisations Il pour maintenir des conditions anaerobies. Lorsqu'on a atteint une phase de développement logarithmique dans le premier récipient 1, on commence à envoyer un milieu de culture par une canalisation d'alimentation 6. En même temps, on fait passer la solution de culture du premier récipient 1 dans le second récipient 3, et de là dans le troisième recipient 4, au moyen des groupes P. La solution de culture est retenue dans le récipient 4 jusqu'à ce que des spores mûrs soient formés et le produits est évacué par un groupe P par une canalisation d'évacuation de la solution de culture 10. La solution de culture s'écoule ainsi de la canalisation 6 au premier recipient 1 au second recipient 3, au troisième récipient 4 et de là, à la analisation dévacuaion10. Pour simplifier, ce trajet sera désigne sous le nom de "premier canal".Au fur et à mesure que la culture continue progresse suivant le premier canal, les cellules nutritives du premier récipient 1 commencent à se transformer, reduisant la production de spores dans les recipients suivants. Pour y remédier, on déplace l'écoulement du premier recipient 1 à l'autre recipient 2 au moment où l'on commence à observer la transformation des cellules nutritives dans le premier de ces récipients (par exemple au bout d'environ cent heures de culture continue dans le premier écipient, et l'on fait alors démarrer la culture en discount nu dans ;e dernier récipient. L'inoculation dans le premier recipient 2 est effectué avec les spores provenant du troisième récipient 4. A cet effet, on recycle la solution ie culture du troisieme récipient 4 par une canalisation d'inoculation de pores 9 et un récipient à haute temperature 5 dans le premier récipient 2.Au sours de ce recyclage, on chauffe la solution de culture dans le recipient à iaute temperature 5 ( 100 C), et l'on n'inocule dans le premier récipient 2 lue les spores qui ont résisté à la chaleur. Lorsque les microorganismes du premier récipient 2 ont atteint la phase de croissance logarithmique, on effec @ue la culture continue par le trajet allant de la canalisacion d'alimentation n milieu de culture 6 en passant par le premier récipient 2, le second récipient 3 et le troisième récipient 4 jusqu'à la canalisation d'evacuation le la solution de culture 10. Cet écoulement de la solution de culture est désigné ci-après sous le nom de "second canal" de la solution.On répète la procédure décrite ci-dessus pour continuer la culture continue en utilisant alternativement le premier et le second canal. Pour une production efficace des spores de la bactérie particulière conforme à l'invention, il est souhaitable d'utiliser un milieu de culture contenant 1,0 à 5,0 % d'amidon de mals (en 9/100 ml, désignés eiaprès en abrége par % P/V), 1,0-5,0-vol % de ia solution d'aminoacides melanges et 0,5 à 1,5 % P/V de carbonate de calcium. Exemple En utilisant l'appareil représente sché'nattquement > on effectue la culture continue dans les conditions suivantes (1) taux de dilution pour les récipients premiers récipients (1 et 2) 0,5/h second récipient 0,066/h troisième recipient (2) composition du milieu de culture en discontinu amidon de mals 2 % P/V solution d'aminoacides mélangés 2 % en vol carbonate de calci-um i % P/V (3) composition du milieu pour alimentation continue amidon de mals 2 % P/V solution d'aminoacides mélangés 4 % en vol carbonate de calcium 1 % P/V Pour commencer, on introduit 2,15 l du milieu de culture discontinue dans le premier récipient 1 et dans le second récipient 3, et on l'agite au moyen d'agitateurs 7, tout en envoyant du gaz carbonique par la canalisation 11, pour effectuer la culture en douze heures. Au bout de ce temps, une phase de croissance logarithmique est atteinte dans le premier récipient 1, et le milieu de culture continue est apporté par la canalisation 6 pour constituer le premier canal. Le taux de dilution est maintenu pour le premier récipient 1 à 0,5/h, pour le second récipient à 0,05/h et pour le troisième récipient à 0,04/h, et la culture est effectuée en 123 heures. A ce moment, on commence à observer une certaine transformation irrégulière des cellules nutritives danse premier récipient 1, et on commute donc le récipient sur l'autre premier récipient 2. Comme la culture discontinue dans le récipient 2 a commencé au moins douze heures à l'avance, une phase de croissance logarithmique est dejà atteinte au moment de la commutation. On evacue alors du récipient 4 la solution de culture contenant des spores mûrs à raison de 3 à 5 % (V/V) par rapport à la quantité de milieu de culture discontinue dans le premier recipient 2, et on le recycle dans le récipiént 2 après chauffage à 100 C dansWle récipient à haute température 5. Puis, on envoie le milieu de culture continue dans le premier recipient 2, ouvrant ainsi le second canal, les taux de dilution pour les divers recipients étant fixes et maintenus de la même façon que dans le premier canal, la culture est poursuivie pendant cent vingt deux heures. On trouve ensuite qu'une irregularite commence à nouveau à se produire dans les cellules nutritives du premier récipient 2 ; on revient au premier récipient et on poursuit la culture pendant une nouvelle période de 126 heures. Les tableaux suivants donnent les nombres de cellules nutritives et de spores et les concentrations en sucre résiduel dans les réservoirs respectifs SYSTEME DE CULTURE DANS LE PREMIER CANAL Durée de culture 0 2 7 12 23 32 40 49 69 73 85 97 110 123 Premier recipient : Nbre de cellulesnutritives 3,2 2,2 4,3 6,2 6,0 6,8 6,3 6,6 8,0 8,4 6,0 7,6 6,5 6,5 (x 108/ml) Conc. en sucre résiduel 20,5 13,8 17,5 16,5 17,3 12,5 14,5 8,0 18,6 16,0 16,0 15,2 16,5 16,5 (mg/ml) Second récipient : Nbre de cellules nutritives 4,3 6,2 5,2 5,4 7,4 7,8 7,8 8,6 8,2 9,0 7,8 7,8 7,6 7,6 (x 108/ml) Nbre de spores 1,7 0,7 3,9 1,8 2,0 4,5 2,7 1,9 2,0 1,9 3,1 2,8 2,4 1,0 (x 108/ml) Conc. en sucre résiduel 17,5 13,8 17,5 20,7 6,9 0,5 0,9 1,1 1,1 2,4 2,7 0,1 0,1 0,1 (mg/ml) Troisième récipient : Nbre de cellules nutritives 1,3 1,9 4,7 4,2 3,7 2,9 3,1 6,1 4,9 3,8 (x 108 / ml) Nbre de spores 5,9 4,3 6,0 5,2 4,8 5,1 5,1 4,9 6,2 5,3 (x 108/ml) Conc. en sucre résiduel 4,5 3,3 0,6 0,4 0,4 0,3 0,1 0,3 0,1 0,1 (mg/ml) (au bout de 123 heures de culture) Durée de culture 129 140 155 163 171 180 200 214 228 245 250 Premier recipient : Nbre de cellulesnutritives 4,8 5,0 7,1 7,2 7,2 8,0 8,3 9,1 8,8 9,0 8,8 (x 108/ml) Conc. en sucre résiduel 18,9 20,5 16,0 14,2 13,8 14,0 15,2 13,9 15,3 14,2 15,0 (mg/ml) Second récipient : Nbre de cellules nutritives 6,5 8,2 6,2 5,8 7,0 7,2 6,9 7,9 7,9 8,0 8,1 (x 108/ml) Nbre de spores 0,8 1,2 2,8 2,8 3,0 3,2 2,8 3,2 3,0 2,7 2,0 (x 108/ml) Conc. en sucre résiduel 1,2 5,8 5,4 1,8 1,1 1,1 0,5 0,8 0,5 0,5 0,5 (mg/ml) Troisième récipient : Nbre de cellules nutritives 3,2 4,0 2,8 2,8 3,0 2,5 3,0 2,8 2,8 2,6 2,5 (x 108 / ml) Nbre de spores 5,4 5,4 4,8 4,9 6,0 6,1 6,3 5,8 5,4 6,0 6,2 (x 108/ml) Conc. en sucre résiduel 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,3 0,1 0,1 0,1 0.1 (mg/ml) SYSTEME DE CULTURE DANS LE PREMIER CANAL (au bout de 250 heures de culture) Durée de culture 262 270 283 295 308 316 340 353 365 376 Premier recipient : Nbre de cellulesnutritives 4,9 4,8 7,0 7,9 8,8 9,2 9,2 9,0 9,0 9,0 (x 108/ml) Conc. en sucre résiduel 16,6 16,2 16,0 13,8 14,0 12,0 11,2 10,8 11,0 12,0 (mg/ml) Second récipient : Nbre de cellules nutritives 8,8 8,2 7,8 9,0 8,0 8,5 7,0 7,5 7,9 7,9 (x 108/ml) Nbre de spores 1,3 1,8 1,6 2,8 3,1 3,0 2,8 2,7 1,9 2,0 (x 108/ml) Conc. en sucre résiduel 5,8 3,8 2,0 1,1 1,1 0,5 0,5 0,3 0,3 0,3 (mg/ml) Troisième récipient : Nbre de cellules nutritives 3,2 2,8 4,0 3,8 2,8 2,0 2,8 2,7 3,6 3,8 (x 108 / ml) Nbre de spores 5,8 5,3 6,0 4,9 5,0 5,2 5,2 6,0 6,1 5,8 (x 108/ml) Conc. en sucre résiduel 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 (mg/ml) (au bout de 376 heures de culture) Durée de culture 390 402 414 428 441 453 465 475 486 490 503 515 530 Premier recipient : Nbre de cellulesnutritives 5,1 7,1 7,1 8,3 8,6 8,2 9,8 9,6 9,7 9,0 9,2 9,2 9,0 (x 108/ml) Conc. en sucre résiduel 12,8 10,0 10,0 9,8 10,0 10,0 9,5 9,5 9,0 9,4 9,2 9,2 10,0 (mg/ml) Second récipient : Nbre de cellules nutritives 7,0 7,8 7,0 8,0 0,0 7,9 6,5 8,0 6,9 7,0 7,2 7,0 7,0 (x 108/ml) Nbre de spores 1,8 2,0 2,2 2,6 2,2 2,4 1,6 1,6 2,2 2,4 2,4 2,6 2,0 (x 108/ml) Conc. en sucre résiduel 6,8 3,4 3,2 0,6 0,5 0,8 0,5 0,3 0,3 0,3 0,5 0,5 0,6 (mg/ml) Troisième récipient : Nbre de cellules nutritives 4,0 3,6 3,2 3,4 2,6 2,8 2,5 4,2 3,8 3,8 3,0 3,2 2,2 (x 108 / ml) Nbre de spores 4,9 3,8 5,0 5,2 5,2 6,1 5,8 5,8 5,8 5,6 3,9 4,6 4,4 (x 108/ml) Conc. en sucre résiduel 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 (mg/ml) Note : le temps zéro est le mouvement ou le premier récipient a commence à être alimente en milieu de culture Par rapport au procédé de l'art antérieur (brevet japonais n 543.246), le procedé de l'invention permet d'obtenir des spores mûrs d'une plus grande uniformité d'âges avec un rendement à peu près triple par unité de volume de la solution de culture Les taux de dilution, qui sont le facteur principal du rendement de la culture continue, sont cinq fois plus élevés que ceux du procéde classique et le nombre de spores pouvant être produits par unité de temps est jusqu'à quinze fois superieur. En ce qui concerne la durée de culture, la production des spores par le procéde classique commence à presenter une tendance à la diminution en moins de cinquante heures malgre un ajustement du ph de la solution de culture. Par le procédé de l'invention, au contraire, on nta pas recours à l'ajustement du ph, mais on utilise à la place deux récipients comme premiers récipients, et on effectue alternativement la culture discontinue avec ces recipients pour culture continue, et il n'est pas nécessaire de précultiver les bactéries inoculées pour la culture discontinue, car les spores produits dans les récipients de formation de spores sont partiellement recyclés. Ceci permet une production de spores presque permanente, continue Comme il a été indiqué ci-dessus, étant donne que la simple commutation des premiers recipients permet une culture ininterrompue sur une durez prolonge, le rendement de l'opération est amelioré d façon marquee par la suppression de la perte de temps dans la culture discontinue et l'omission du nettoyage et de la stérilisation des second et trosieme récipients et des opérations qu'ils nécessitent habituellement. REVENDICATIONS 1. Procédé de production de clostridium butyricum miyairi par culture continue en utilisant plusieurs récipients, caractérisé en cé que le taux de dilution pour le premier récipient est fixé dans un intervalle determine à l'avance, en ce que, sur cette bas, les taux de dilution pour les récipients suivants sont fixes en conséquence, et en ce que le premier récipient se compose de plusieurs sous-récipients destinés à être utilises alternativement. 2. Procedé selon la revendication 1, caractérise en ce que les recipients suivants sont constitués par un second et un troisième recipients, en ce que le taux de dilution pour le premier récipient est fixé à une valeur non supérieure à 0,75 /h, en ce que le taux de dilution pour le second recipient est fixe dans l'intervalle de 0,06 à 0,07 /h, en ce que le taux de dilution pour le troisième recipient est fixé dans l'intervalle de 0,04 à ,05 /h, et en ce que le premier récipient est essentiellement destiné à la formation de cellules nutritives, le second récipient à la formation d'endospores et le troisième recipient à la formation de spores mûrs. 3. Procede selon la revendication 1, caractérisé en ce que les spores sont préleves dans le recipient de formation des spores au stade final et sontinoculés dans l'autre sous-recipient du premier récipient après un traitement thermique, et en ce que la solution de culture provenant de ce recipient est utilisée à son tour pour une culture continue. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture utilise est un milieu contenant des saccharides, des aminoacides et un sel minéral. 5. Procéde suivant l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérise en ce que le taux de dilution pour le premier récipient est compris entre 0,3 et 0,6 /h. 6. Procede selon la revendication 4, caractétisé en ce que l'on utilise comme saccharide de l'amidon de maïs. comme aminoacides une solution d'aminoacides mélangés obtenus en hydrolysant du soja degraissé et comme sel minéral du carbonate de calcium.