FR 2450110 A1 19800926 FR 7904940 A 19790227 La présente invention concerne un procédé de traitement de poulets et autres animaux domestiques avec la lysozyme ou un sel de cette dernière, isolément ou en combinaison avec d'autres substances d'usage courant. Certains des sels utilisés sont des composes nGu - veaux. La lysozyme, qui est une protéine découverte en 1922 par Pléming, se retrouve dans tous les organismes vivants (végétaux, animaux, bactéries, algues, champignons, etc...). Son activité a lieu au niveau des membranes de nombreuses bactéries, en particulier de bactéries gram-positif. Chez les animaux supérieurs, cette protéine représente un facteur naturel d'immunité dans la défense contre les infections. Outre sa propre activité lytique, la lysozyme est capable de potentialiser l'action de nombreux antibiotiques, les micro-organismes partiellement lysés par la lysozyme devenant plus sensible aux antibiotiques. Une autre caractéristique avantageuse de la lysozyme est son effet bénéfique sur les processus de digestion chez les mammi férues, qui se manifeste par une normalisation rapide de la flore intestinale, et un rétablissement ou une amélioration résultant du métabolisme azoté. Bien que la lysozyme se retrouve å la fois dans les règnes animal et végétal, on la produit couramment à l'échelle industrielle exclusivement par extraction à partir de blanc d'oeuf. Les demandeurs ont récemment effectué des essais avec la lysozyme sur les poulets pour lutter contre certaines des maladies les plus fréquentes et pour étudier l'effet éventuel de la lysozyme sur la croissance. On vaccine habituellement les poulets par des aérosols å trois reprises au cours de leur existence afin d'empêcher des développements pathologiques. Cependant, 48 h après la vaccination, on observe des symptômes de stress et les volailles tombent dans un tat de prostration avec perte d'appétit et, par conséquent, interruption de la croissance. Pour empêcher cette débilité, on administre aux poulets un traitement par des antibiotiques, 36 h après la vaccination.Le plus souvent ce traitement donne des résultats positifs mais il est connu que les antibiotiques peuvent également provoquer le développement de souches résistantes et lorsqu'on utilise ce traitement pour lutter contre certaines formes de maladies de l'appareil respiratoire, les résultats obtenus ne sont pas efficaces par suite de formes bactériennes résistantes qu'on trouve chez les poulets malades. A la suite des divers essais, les demandeurs ont trouvé que si on lutte contre les stress de vaccination & l'aide de la lysozyme, on bénéficie de deux avantages qui sont : l) la possibilité d'abaisser la dose des antibiotiques administrés et 2) la possibilité d'éliminer fréquemment tout le traitement par les antibiotiques de sorte qu'on peut réserver ce dernier uniquement à la lutte contre les maladies bronco-pulmonaires lors de l'apparition d'une telle maladie. I1 est facile d'administrer la lysozyme, par exemple dans l'eau de la boisson. Dans ces conditions, on assure une administration continue pendant toute la journée; si on le préfère, on peut également mélanger la lysozyme avec un vaccin ou l'administrer avec la nourriture. La durée du traitement est habituellement de 3 X 4 jours après la vaccination. Les poulets sont très exposés aux maladies des organes respiratoires. Ce phénomène se manifeste en général en automne ou en hiver, c'est- & dire durant les périodes au cours desquelles les renouvellements d'air dans les poulaillers sont moins fréquents par suite de la différence entre la température intérieure et la température extérieure. On utilise aussi normalement le traitement par les antibiotiques pour lutter contre des manifestations qui, dans la pratique, comprennent des malaises avec perte d'appétit, d'où retard de croissance. Le traitement avec la lysozyme a permis de résoudre de nombreux problèmes lorsque des traitements prolongés aux antibiotiques se sont révélés inefficaces.Très fréquemment on utilise un antibiogramme pour choisir l'antibiotique le plus approprié mais une substance qui se révèle efficace in vitro ne l'est pas toujours in vivo. Au cours des essais effectués par les demandeurs, quatre groupes d'environ 11 000 poulets chacun (moyenne d'âge 45 jours) ont été exposé & une maladie des voies respiratoires qui n'était pas guérie même après dix jours de traitement par les antibiotiques. On a donc administré de la lysozyme dissoute dans l'eau de la boisson a' une dose de 15 mg/kg/jour, à 3 groupes Environ 24 h plus tard, les poulets ont recommencé à récupérer et & manger régulièrement, alors que l'état des poulets n'ayant pas subi ce traitement a continué à empirer et il a fallu les tuer. On a poursuivi cette thérapie à la lysozyme pendant une autre période de 15 à 20 jours, après quoi on a sacrifié les poulets. Lors du contrôle du poids moyen des poulets traités, on a constaté que non seulement ces poulets avaient repris le poids perdu pendant les dix jours de mauvaise alimentation, mais que ces poulets avaient atteint un poids moyen final d'environ 10 % supérieur à leur poids normal. Ce fait a été confirmé dans un autre essai dans lequel on a utilisé la lysozyme pour combattre le stress de vaccination. On a traité les poulets à trois reprises (aux âges respectifs de 2, 18 et 35 jours), pendant 5 jours dans chaque cas, correspondant à trois vaccinations. A la fin de l'expérience, les 11 000 poulets traités à la lysozyme ont fait preuve d'une augmentation de poids de 6 % par rapport à celle des poulets non traités. A la suite de ces observations, on a procédé à des essais spécifiques pour vérifier l'action auxétique de la lysozyme et on a obtenu des résultats très satisfaisants. Les demandeurs ont donc vérifié l'action auxétique de la lysozyme en combinaison avec d'autres substances déjà connues comme étant dotées d'une telle activité, afin d'envisager un effet synergique possible. La totalité de ces essais a donné des résultats positifs ce qui démontre la validité d'un tel traitement. On a pu constater en outre que très fréquemment des supplé ment s alimentaires peuvent contenir des antibiotiques qui, d'une part, agissent comme des agents auxétiques et, d'autre part, comme des immunodépresseurs, comme on le voit fréquemmentdans les grands élevages de volailles à caractère intensif où une infection d'un type tout å fait courant risque parfois d'avoir des conséquences désastreuses sous forme d'une incidence importante de la peste aviaire. Plus encore dans ce cas, l'utilisation d'une combinaison avec la lysozyme semble utile car une telle combinaison n'est pas seulement dotée d'une action auxétique mais aussi d'un effet proimmunisant. Pour conclure, les demandeurs considèrent qu'il est avantageux d'utiliser la lysozyme à des doses allant de 1 à 50 et, de préférence, de 2 à 15 mg/kg/jour en combinaison avec une alimentation classique et des suppléments techniques d'alimentation pour animaux, en tenant compte de l'activité précitée dont cette enzyme est dotée. On a trouvé qu'on peut obtenir d'excellents résultats aussi bien par une administration journalière que par l'administration de la lysozyme au cours des derniers jours de "confinement". Comme mentionné précédemment, un autre aspect de l'invention est que des sels particuliers de la lysozyme sont d'une utilisation très pratique dans les cas cités. Les sels de lysozyme sont facilement solubles dans l'eau et on peut donc les administrer dans l'eau de la boisson. Il n'est donc pas indispensable de combiner la lysozyme avec les aliments. Dans d'autres cas, des sels de lysozyme qui ne sont que légèrement solubles dans l'eau ont été préparés et, quand il en est ainsi, on a intérêt à les mélanger à l'état solide avec les aliments. Parmi les sels testés, aussi bien de type soluble qu'insoluble dans l'eau, certains sont déjà connus dans la littérature spé cialisée alors que d'autres sont des sels nouveaux. On peut préparer les sels solubles par salification de la lysozyme base avec un acide libre approprié alors que pour préparer des sels insolubles, on peut utiliser un double échange entre un sel soluble de lysozyme, par exemple le chlorhydrate et un sel soluble de l'anion nécessaire, par exemple un sel de sodium. Les sels nouveaux de lysozyme qui ont été préparés sont notamment le phosphate, le glycérophosphate, le lactate, le gluconate et l'hexamétaphosphate de lysozyme. On décrira ci-après les divers essais qui ont été effectués avec la lysozyme et les sels de lysozyme. SZKESS DE VACCINATION CHEZ LES VOLAILLES On vaccine 3 groupes d'environ 10 000 poulets chacun par la technique de l'aérosol.36 heures après la vaccination, on administre les antibiotiques à un premier groupe et la moitié de la quantité du même antibiotique avec la lysozyme, à une dose de 5 mg/kg/ jour à un second groupe, la durée de traitement étant dans les deux cas de cinq jours. Les poulets du troisième groupe ne reçoivent que la lyso- zyme à une dose de 15 mg/kg/jour, en dissolution dans l'eau, en débutant ce traitement le même jour que la vaccination et en le poursuivant pendant 4 jours de plus. On prélève des échantillons de sang chez 20 poulets de chaque groupe pour des examens microbiologiques de la quantité de lysozyme avant vaccination, 24 heures après vaccination et vers la fin du traitement par les antibiotiques et la lysozyme ou par la lysozyme seulement. Dans le tableau ci-après on indique la teneur moyenne en lysozyme chez les poulets de chacun des 3 groupes aux périodes indiquées. Taux de lysozyme dans le sang chez les poulets vaccinés sous traitement antistress Antibiotiques seulement Moitié de la dose d'antibiotique 15mg/kg/jour de lyszyme + 5mg/kg/jour de lysozyme avant après fin du avant après fin du avant après fin du vaccin. vaccin. traitement vaccin. vaccin. traitement vaccin. vaccin. traitement 1,87 2,34 2,05 1,91 2,27 1.98 1.95 2,4 3,27 Les taux de lysozyme sont exprimés en microgrammes par ml de sérum. On peut constater à l'examen du tableau ci-dessus, qu'après vaccination, les poulets ont tendance à augmenter leur propre taux de lysozyme dans le sang et qu'après administration des antibiotiques, cette valeur retombe aux alentours de la valeur initiale avant vaccination. D'autre part l'administration de la lysozyme à raison de 15 mg/kg/jour provoque une augmentation considérable du taux de lysozyme. D'une façon générale, on ne constate aucune différence entre les 3 groupes. Pour conclure, on peut dire que la lysozyme peut remplacer les antibiotiques pour lutter contre le stressde vaccination. Maladies broncho-pulmonaires chez les volailles 4 groupes de li 000 poulets chacun (âgés de 40 jours) sont atteints d'une maladie respiratoire sérieuse. Les 4 groupes ont été régulièrement vaccinés à 3 reprises et à chaque fois ils ont reçu des antibiotiques pour combattre le stress de vaccination. Lors de l'apparition de la maladie broncho-pulmonaire, on traite les poulets avec des antibiotiques mais au bout de 10 jours on ne constate aucun signe de guérison; au contraire, l'état de santé des poulets continue à se détériorer et ils ne mangent pratiquement rien. On administre ensuite å- 3 groupes de la lysozyme dissoute dans l'eau à la dose de 15 mg/kg/jour. Les poulets guérissent pres qutimmédiatement alors que les poulets du groupe non.traité doivent être tués car ils sont dans un état permanent de prostration. Leur poids est de 1,6 à 1,7 kg et ils sont âgés de 56 jours. On poursuit le traitement par la lysozyme dans les 3 groupes, toujours à la même dose, pendant 1S jours de plus c'est-å-dire jusqu'à ce que les poulets soient âgés de 65 jours. A ce moment on les sacrifie et on constate que leur poids moyen est de 2,510 kg. Lysozyme comme Facteur de croissance chez les volailles Pour vérifier l'effet auxétique de la lysozyme, on procède à des essais sur 4 groupes de 10 000 poulets chacun. Le premier groupe reçoit une alimentation normale et le second groupe reçoit la même alimentation mais avec la lysozyme â une dose de 2 mgXkg/jour, ajoutée à l'eau de la boisson, pendant toute la vie des volailles. Le troisième groupe reçoit une alimentation et de l'eau pendant les 50 premiers jours alors que pendant les 15 derniers jours, on leur administre la lysozyme à une dose de 15 mg/kg/jour en dissolution dans l'eau de la boisson et on leur donne la même alimentation. Les poulets du quatrième groupe sont traités de façon identique excepté que la lysozyme (toujours à la même dose) est mélangée aux aliments. Quand les poulets atteignent l'âge de 66 jours on sacrifie les 4 groupes et on détermine leur poids. Les poids moyens sont Ier groupe : 2,314 kg 2ème groupe : 2,541 kg 3ème groupe : 2,639 kg 4ème groupe : 2,607 kg Etude chez les mammifères On effectue des études expérimentales pour déterminer l'action de sauf garde ou d'augmentation du métabolisme azoté par laly- sozyme lorsque cette dernière est ajoutée â la nourriture d'animaux domestiques (lapins, porcs, chiens, bétail, moutons, chèvres,etc...) L'un des essais comporte l'alimentation de porcelets âgés de 20 jours avec du lait de vache reconstitué. Les demandeurs ont choisi ces animaux du fait que leur flore intestinale est très similaire à celle d'autres mammifères et aussi du fait de la facilité d'une étude de métabolisme sur les animaux de cette catégorie. On effectue l'essai sur deux groupes d'animaux : le premier groupe comprend 3 porcelets et le second groupe comprend également 3 porcelets de la même portée. Le-petit nombre d'animaux utilisé pour chaque essai s'explique par le fait qu'il est indispensable que les animaux proviennent de la même portée. Les porcelets sont sevrés au bout de 20 jours et on les place ensuite dans des cages d'études de métabolisme et on les nourrit avec du lait de vache partiellement écrémé en poudre, après une reconstitution appropriée. La composition du lait est la suivante N = 336 mg par 100 g Ca = 108 mg par 100 g P = 90 mg par 100 g On maintient l'apport calorifique rigoureusement en proportion du poids corporel de l'animal pendant toute la durée de l'essai, alors qu'on administre la lysozyme (ou ses sels) à une dose de 10 mg pour 100 g de lait de vache reconstitué. On calcule six périodes de trois jours d'équilibre métabo- lique plus une période initiale avant le traitement à la lysozyme (période 0) pour tous les porcelets. On utilise le procédé de Kjeldhal pour déterminer la quantité d'azote dans les selles à la fin de chaque période. Les résultats obtenus apparaissent au tableau suivant Equilibre azoté (mg/kg/jour) Période 0 I II III IV V VI Témoins non traités (3 porcs) 368,2 366,6 526,5 576,4 499,8 574,9 656,8 Traités (3 porcs) 364,6 462,8 466,1 579,5 586,0 577,5 655,2 Pourcentage de N administré per os et évacué dans les selles Période O I II III IV V VI Témoins non traités 5,3 (3 porcs) 4,8 4,8 3,9 4,0 6,1 5,7 Traités (3 porcs) 4,9 3,5 3,4 3,0 5,4 5,4 4,5 On peut déduire de l'examen de ces résultats que le pourcentage des substances azotées absorbées par les voies gastro-intestinales des porcelets nourris au lait de vache augmente notablement après le traitement par la lysozyme (ou un sel de celle-ci) ajouté à l'alimentation normale du jeune mammifère. Ce facteur apparait par la plus faible valeur d'azote ingéré et évacué dans les selles ; les resultats observés chez les porcelets sont également constatés chez d'autres mammifères, après la période d'allaitement, lorsqu'on ajoute la lysozyme ou un sel de celle-ci & une dose de 10 mg pour 100 mg de nourriture. Les exemples suivants servent à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. La lysozyme, aussi bien sous forme de base que sous forme d'un sel avec un acide organique ou minéral, se révèle particulièrement efficace comme additif dans une alimentation quelconque ou un supplément d'alimentation animale contenant des antibiotiques (tétracycline, bacitracine, zincobacitracine, sulfate d'aminoxydine, etc...), des oligo-éléments, des vitamines, des aminoacides, des agents de minéralisation, etc... EXEMPLE 1 100 g d'une alimentation classique à base de farine de mais, de farine de luzerne, de farine de soja, de farine fossile contiennent Citrate de lysozyme 10 mg Thiamine 0,5 mg Riboflavine 0,6 mg Niacine 8 mg Pantothénate de calcium 2 mg Phosphate de pyridoxal 0,6 mg Inositol 100 mg Chlorure de choline 150 mg Biotine 0,3 mg Acide folique 0,5 mg Ménadione 0,5 mg Z -tocophérol 0,5 ag EXEMPLE 2 A un mélange de 120 g de farine de mais et 70 g de farine de soja on ajoute Hexamétaphosphate de lysozyme 15 mg Farine d'os 7 g Sels d'iode 2 g Vitamine A 400 mg Vitamine D3 400 mg Sulfate de manganèse 60 mg EXEMPLE 3 A un mélange sous forme de farine comprenant 50 g de farine de malus, 5 g de farine de blé, 3 g de farine de luzerne -et 30 g de farine de soja, on ajoute Lysozyme 3 mg Carbonate de calcium 1,5 g Farine d'os 3g du mycélium entier contenant de la chlorotétracycline, à raison de 2,5 % par rapport-au poids total. EXEMPLE 4 A une alimentation normalisée ayant la composition suivante: 78,5 % de farine de mais, 15,5 % de farine de soja, 2,5 % de farine d'os et 0,5 % de carbonate de calcium, on ajoute Sels d'oligoéléments 2 % Riboflavine, pentothénate de calcium, chlorure de choline, niacine, vitamine D3 1 % Phosphate de lysozyme : 0,01 % EXEMPLE 5 A une alimentation normale intégrée, on ajoute 250 à 350 g par quintal d'une matière biologique contenant des cellules vivantes naturelles de Saccharomyces et Kluyveromyces. La composition de l'additif est la suivante (%) Lactate de lysozyme : 0,02 Cultures contenant plus de 6 000 000 000/9 de cellules vivantes 0,20 Protéines : 18,75 Matières grasses : 3,86 Fibres brutes (déchets) : 7,88 Produits d'extraction non azotés 52,98 Substances organiques 6,93 Eau 9,60 La colonie des cellules vivantes et la lysozyme déterminent la fermentation de -la masse alimentaire d'oû une augmentation de l'absorption des éléments nutritifs et de llantagonisme microbien vis-a-vis des micro-organismes pathogènes. EXEMPLE 6 Hexamétaphosphate de lysozyme 0,02 % Levure séchée 10 % Farine de mais 60 % Barley farine d'orge 4 % Farine de soja 10 % Alfalfa farine de luzerne 5 % Graisses animales 0,5 % Carbonate de calcium 4,35 % Farine d'os 3 % Phosphate bicalcique 1,75 % Chlorure de sodium 0,35 % Méthionine 0,05 % Prémélange 1 % Le prémélange présente la composition suivante par kg du produit final ; vitamine A : 10 000 U.I. ; vitamine D3 : 2 000 U.I.; vitamine E : 20 mg ; vitamine K : 2 mg ; vitamine B1 : 1 mg ; vitamine B2 : 5 mg ; vitamine B6 : 1 mg ; vitamine B12 : 0,01 mg ; acide nicotinique, 25 mg ; acide pantothénique : 5 mg ; acide follique 1 mg; choline 250 mg ; Fe 20 mg ; Co 2 mg ; Mn 100 mg Cu 15 mg ; I 2*mg ; Se 0,2 mg ; Mo 0,1 mg ; BTH 100 mg. EXEMPLE 7 A une alimentation normalisée pour lapins ayant la composition suivante par 100 g Farine de soja 11 g Farine de tournesol 4g Viande de boeuf 3g Lait écrémé sec 4 9 Farine de mais 30 g Farine d'orge 15 g Farine de luzerne 10 g Purée de blé 15 g Farine de mais glutinée 5 g Carbonate de calcium Ig Phosphate bicalcique dihydraté 1 g Chlorure de sodium 0,5 g Complexe multivitaminé et d'oligoéléments minéraux 0,5 g (1) on ajoute 10 mg de lactate de lysozyme (de préférence en mélange avec 4 g de lait écrèmé sec). (1) voir l'exemple 6 pour la composition de ce complexe. EXEMPLE 8 A une alimentation normalisée pour bétail comprenant du foin séché et de l'eau ad libitum, on ajoute en une proportion variant entre 10 et 30 ppm, une composition auxétique comprenant (96) Farine de mais 66,7 Farine de blé 15,8 Farine de soja 6,7 Farine de luzerne déshydratée 5 Produits minéraux 5 Complexe d'oligoéléments et de vitamines : 0,8 (voir exemple 6 pour la composition de ce complexe.) On ajoute de la lysozyme à une dose de 20 mg/kg d'animal/jour. Les exemples suivants décrivent la préparation des nouveaux sels de lysozyme selon l'invention. EXEMPLE 9 On met en suspension 4,76 g de lysozyme base dans 50 ml d'eau, on ajoute 237 mg d'acide phosphorique en solution dans 20 ml d'eau, tout en agitant le pH décroissant jusqu'à 3,40. La solution obtenue est opalescente et on la filtre â travers de la terre d'in- fusoires. On lyophylise ou on précipite à l'aide d'un solvant la solution limpide obtenue qui contient le phosphate de lysozyme. Le phosphate de lysozyme est une poudre microcristalline blanche ayant les caractéristiques suivantes pH (solution à 1 % dans l'eau) = 3,45 Teneur en lysozyme : 91,5 % dans le sel anhydre Phosphore : 2,57 % en poids, ce qui correspond à 8,1 % en poids d'acide phosphorique dans le cas du sel anhydre. EXEMPLE 10 Tout en agitant, on ajoute 261 mg d'acide lactique en solution dans 10 ml d'eau, à une suspension de 4,98 g de lysozyme base dans 50 ml d'eau. A mesure qu'on introduit l'acide, la lysozyme base tend à se dissoudre et le pH diminue. Après l'addition de la totalité de l'acide, on obtient une solution légèrement trouble qu'on filtre et lyophilyse. Le lactate de lysozyme obtenu est une poudre blanche ayant les caractéristiques suivantes pH (Solution à 1 % dans l'eau ) : 4,40 Teneur en lysozyme : 88,7 % dans le sel anhydre. EXEMPLE 11 Tout en agitant, on ajoute 256 mg d'hexamétaphosphate de sodium en solution dans 10 ml d'eau, à une solution de 5 g de chlorhydrate de lysozyme dans 60 ml d'eau. On obtient un précipité blanc qu'on filtre, lave â l'eau glacée et sèche sous vide. On obtient l'hexamétaphosphate de lysozyme sous forme d'une poudre blanche insoluble dans l'eau et ayant les caractéristiques suivantes pH (suspension à 1 % dans l'eau ) : 3,70 Lysozyme : 90,3 % dans le sel anhydre Phosphore : 3,42 % en poids dans le sel anhydre, ce qui correspond à 8,82 % en poids sous forme d'acide hexamétaphosphorique. REVENDICATIONS 1. Composition pour le traitement d'animaux domestiques souffrant d'une infection provoquée par des microorganismes, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif de la lysozyme ou un sel non toxique de cette dernière. 2. Produits nutritifs solides ou liquides pour animaux domestiques, caractérisés en ce qu'ils comprennent la lysozyme et/ou au moins un sel non toxique de cette dernière. 3. Aliments pour animaux domestiques, caractérisés en ce qu'ils comprennent la lysozyme et/ou au moins un sel non toxique de cette dernière.