FR 2443679 A1 19800704 FR 7834680 A 19781208 ta présente invention concerne un procédé pour la détermination des cellules microbiennes contenues dans un échantillon et, plus précisément, un nouveau procédé pour déterminer la matière réactive microbienne au moyen d'une analyse bioluminescente ou chimioluminescente. A ltheure actuelle, les procédés utilisés pour la détermination des concentrations microbiennes par analyse de luminescence comprennent généralement une incubation et une extraction des cellules microbiennes dans des échantillons aqueux d'un volume de 0,1 à 1 ml contenues dans une cuve, l'injection du réactif dans ltéchantillon, ou vice versa, et la mesure de la luminescence résultante au moyen de photodétecteurs. Quand l'échantillon contient des cellules microbiennes et non microbiennes, le procédé de détection devient plus compliqué.Le défaut le plus grave de tous les systèmes de réaction en volume est leur manque de sensibilité car, suivant ces procédés, on ne peut déceler qlre des concentrations de cellules microbiennes de plus de 104 par échantillon de 0,1 ml. I1 semble que cela soit dt à la dilution du réactif dans l'échantillon aqueux, à la quantité limitée d'oxygène qui est un élément nécessaire au processus de réaction, et à la présence d'autres matières réactives dans l'échantillon. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique nO 3 745 090 décrit un système de réaction en volume. Les brevets des Etats-Unis d'Amérique nO 3 690 832, 3 940 250 et 4 013 418 au nom de la société demanderesse concernent la détermination de matière réactive dans les cellules au moyen d'une réaction à luminescence. La figure unique ci-annexée représente la relation entre l'intensité de luminescence et la concentration microbienne au-dessus et au-dessous de la lumière endogène pour des échantillons de E. coli. On peut déceler la présence d'un nombre relativement peu élevé de cellules microbiennes dans un échantillon comprenant pour la plupart des cellules non microbiennes en traitant l'échantillon de façon à broyer tous les solides présents dans l'échantillon en faisant éclater les parois de toutes les cellules non microbiennes pour extraire la matière microbienne qui s'y trouve, en filtrant l'échantillon pour en éliminer toute la matière extraite, en faisant éclater les parois des cellules microbiennes pour libérer la matière réactive qui s'y trouve, retenant de préférence la matière réactive microbienne comme résidu non dilué sur la surface du filtre en introduisant un réactif provoquant une réaction de luminescence pour saturer la matière réactive microbienne extraite, de préférence tandis que le résidu se trouve sur la surface du filtre, et en décelant et enregistrant une indication de l'intensité de luminescence émise par la r é a c t i o n entre 1 ' agent réactif et la matière réactive microbienne. Dans les modes de mise en oeuvre préférés de l'invention, on fait éclater les cellules de matière non microbienne à l'aide d'une enzyme choisie de façon à agir sur les cellules non microbiennes particulières qui sont présentes, tandis qu'elle n'aura qu'un effet minime sur les cellules microbiennes. Pour désagréger les fractions solides de l'échantillon et libérer la matière réactive non microbienne, on se sert d'enzymes hydrolysantes choisies qui n'affectent pas les cellules microbiennes. Ensuite, on fait passer l'échantillon à travers une membrane filtrante dont les pores ont en général une dimension moyenne de 0,45/u. Si besoin est, on se sert, après la filtration, de liquides de lavage pour une élimination complète de la matière réactive non microbienne. Enfin, on fait éclater les cellules microbiennes qui restent sur le filtre pour en extraire la matière réactive microbienne. I1 existe de nombreux moyens d'extraction. On peut, par exemple, réaliser l'extraction avec des substances chimiques organiques et inorganiques en faisant passer des vapeurs de liquides volatils, tels que l'éther ou l'acétone, à travers l'unité de filtration. On peut faire appel aussi à des moyens d'extraction non chimiques, tels que les ultrasons et la chaleur. Un serpentin de chauffage disposé sur la plaque de sortie de l'unité de filtration extrait les cellules d'une manière satisfaisante. Les solvants d'extraction les plus utiles dans cette technique sont le chlorure de méthylène, l'acide nitrique et le dioctylsulfosuccinate de sodium. ta quantité de solvant utilisée varie de 0,001 à 0,25 ml suivant les dimensions du filtre utilisé. Pour des surfaces de filtration de 10 à 20 ma de diamètre, il suffit de 0,015 ml de solvant d'extraction. Une partie du solvant d'extraction s'évapore sur le filtre et une partie est absorbée en quelques secondes, laissant ainsi la matière réactive extraite et non diluée sur la surface du filtre. On pulvérise alors l'agent réactif sur la surface du filtre de façon à saturer la zone de réaction. La matière réactive non diluée se combine avec l'agent réactif pour produire une réaction. Pour les analyses par bioluminescence, on emploie de préférence comme agent réactif un mélange luciférase-luciférine vendu sous forme lyophilisée par les Sociétés DUPONT, VITATECT CORP et par d'autres fournisseurs. La concentration est de 0,71 millimole de luciférine avec 100 unités de luciférase, diluées dans 0,5 à 0,75 ml de "TRIS" avec addition de Mg++. Pour les analyses par chimioluminescence, on emploie de préférence comme agent réactif une solution de luminol avec du perborate de sodium ou du peroxyde d'hydrogène. On extrait la matière réactive microbienne des cellules par des moyens chimiques ou autres qui font éclater les cellules et libèrent la matière réactive microbienne sans l'éliminer ou la diluer. Quand on mélange la matière réactive microbienne non diluée avec l'agent réactif, que l'on ajoute en excès, toutes les molécules de la matière réactive réagissent, ce qui augmente la précision quantitative. Comme le filtre est exposé à l'air, et à mesure que l'agent réactif s'étale progressivement pour couvrir toute la surface où se trouve la matière réactive, l'air est constamment présent et fournit l'oxygène nécessaire aux molécules en réaction. L'épaisseur de la couche de réaction est de 0,05 à 0,5 mm, ce qui permet d'avoir une source adéquate d'oxygène pour toutes les molécules en réaction et, par conséquent, on obtient une réaction complète. Selon le procédé de l'invention, comme on utilise de petites quantités d'agent réactif et comme on a éliminé les matières réactives non microbiennes, la courbe de variation de la concentration microbienne en fonction de l'intensité de luminescence est rectiligne. Le point le plus bas de la partie rectiligne coïncide approximativement avec la valeur de la lumière endogène émise par la matière réactive et dépend des caractéristiques de l'agent réactif et de sa préparation. Un volume d'environ 0,05 ml de réactifs du commerce utilisés dans ce procédé émet une luminescence qui équivaut à la réaction de 500 à 1000 cellules microbiennes (E. coli.).Bien que l'on puisse purifier l'agent réactif afin de réduire le niveau de la lumière endogène, la pente de la courbe de réaction varie quel que soit le niveau de la lumière endogène et tend linéairement vers la concentration zéro, comme le montre la figure. Ce phénomène est du au fait que l'intensité de la lumière de la réaction est inférieure à l'intensité normale de la lumière endogène et qu'il se produit, en même temps, une diminution du niveau de l'intensité de la lumière endogène due à la neutralisation de l'agent réactif par la matière réactive microbienne au cours de la réaction dans une gamme comprise entre zéro et le niveau normal de la lumière endogène. Par conséquent, l'augmentation ou la diminution de la teneur en matière microbienne réactive dans une gamme inférieure au niveau normal de la lumière endogène règle la quantité active de l'enzyme qui, à son tour, agit sur l'intensité. de la lumière endogène servant d'indicateur de la quantité de matière réactive microbienne entrant en jeu dans la réaction. Pour effectuer une détermination bactériologique de divers produits alimentaires et d'humeurs de l'organisme, il faut désagréger les échantillons pour éliminer les cellules non bactériennes et les faire passer à travers une membrane filtrante qui retiendra les cellules microbiennes en vue de leur examen. On a procédé à des essais avec un certain nombre de produits chimiques et d'enzymes pour la désagrégation et l'hydrolyse de divers échantillons, mais seuls quelques-uns sont efficaces pour la filtration d'échantillons préparés pour des expériences de luminescence. Un dispositif qui convient à la mise en oeuvre de l'invention est décrit dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique Serial nO 659 534 et dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique nO 3 690 382 et n0 3 940 250. Les exemples ci-après illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 On effectue l'analyse d'un échantillon de lait de la manière suivante (1) On ajuste à 8 le pH du lait par addition d'acide citrique ou d'hydroxyde de sodium. (2) Afin d'obtenir des cellules bactériennes ne contenant pas de cellules non bactériennes (cellules blanches et rouges et protéines) que l'on rencontre dans le lait, on mélange l'échantillon avec une solution de protéase vendue par la Société ROHM & HAAS CORP. et par d'autres fabricants. On prépare de la manière suivante la solution de protéase : on ajoute 5 ml d'eau à 1 g de protéase en poudre. On centrifuge le mélange à 12 000 G et on filtre le liquide surnageant sur un filtre de 0,2/u. On mélange 1 ml de cette solution de protéase avec 9 ml de l'échantillon de lait et on laisse reposer 10 min pour la désagrégation. Le processus de désagrégation fait éclater les cellules non bactériennes. On peut diluer l'échantillon dans 4 ou 5 parties d'eau afin d'avoir une meilleure filtration. (3) On filtre ensuite l'échantillon pour éliminer la fraction liquide qui contient la matière initiale des cellules non bactériennes éclatées. Les cellules bacteriennes, qui n'ont pas été affectées par la protéase, restent dans le filtre. On envoie alors à travers la membrane filtrante 1 à 3 ml de l'échantillon de lait désagrégé et dilué. (4) On rince le filtre avec 1 à 5 ml d'eau. (5) On envoie de l'air à travers le filtre afin de le débarrasser de tout le liquide qui sty trouve. (6) On introduit dans le filtre 0,015 ml de HNO3O, IN comme solvant d'extraction (pour une surface filtrante de 10 mm de diamètre). On attend 1 min pour l'extraction. Celle-ci fait éclater les cellules bactériennes (microbiennes) et libère la matière réactive bactérienne telle que 1'ATP (adénosine triphosphate) et l'hémoglobine. (7) On sature le filtre avec le réactif pour la réaction luminescente avec la matière réactive microbienne. Exemple 2 Dans l'analyse d'échantillons de viande et de poisson en vue de déterminer la concentration microbienne dans l'échantillon, on peut faire appel b un mode opératoire semblable à celui que l'on a utilisé pour l'analyse du lait, car les protéases décomposent également les protéines de la viande et du poisson. On emploie le procédé décrit à l'exemple 1, la dilution de la protéase par rapport à l'échantillon étant de 0,5 à 5 % pour une protéase de 1000 unités liquéfiantes. Exemple 3 On peut appliquer la technique décrite dans l'exemple 1 ci-dessus pour la détermination de cellules microbiennes présentes dans un échantillon par désagrégation, filtration, extraction et réaction de la matière réactive non diluée sur une membrane filtrante, à beaucoup d'échantillons, y compris les produits alimentaires et laitiers, les boissons, les produits pétroliers, les alcools et les humeurs de l'orga- nisme telles que l'urine, le sang, etc. Ces humeurs contiennent diverses cellules non bactériennes telles que les glucoprotéines et les leucocytes et érythrocytes, que les protéases peuvent désagréger de la même manière que les cellules blanches du lait. Exemple 4 Pour faciliter la filtration, on peut traiter les jus de fruits naturels avec des enzymes pectiques. Les enzymes pectiques décomposent la structure cellulaire des morceaux de fruits en suspension dans les jus, libérant ainsi les cellules microbiennes sans altérer leur structure. Des enzymes pectiques sont vendues par la Société ROHM & HAVAS COMPAS et d'autres fabricants sous différents noms de marques. Avant d'introduire les enzymes pectiques dans ltéchantillon de jus, on dilue 1 partie en poids de poudre d'enzyme pectique dans 10 parties d'eau. Ensuite, on filtre la dilution dans un filtre de 02 P et on mélange 1 partie avec 10 parties de jus naturels et on laisse reposer un certain temps pour l'hydrolyse, qui dépend de la concentration cellulaire des jus, On peut effectuer les procédés de filtration, extraction et réaction comme on l'a décrit pour les échantillons de lait de l'exemple 1. Exemple 5 Les enzymes pectiques décomposent la structure cellulaire de la plupart des fruits et légumes, libérant ainsi les cellules microbiennes sans altérer leur structure. Pour chaque sorte d'échantillons, on peut ajuster les enzymes pectiques à des valeurs normalisées. La dilution d'enzyme pectique pour les fruits et légumes est semblable à celle que l'on a décrite pour les jus de fruits dans l'exemple 4. Comme les fibres des fruits et des légumes ne peuvent pas toujours être désagrégées, une filtration préalable peut être nécessaire avant d'analyser la fraction liquide de l'échantillon. Les techniques de filtration, d'extraction et de réaction luminescente sont semblables à celles décrites dans l'exemple 1. Exemple 6 Pour la désagrégation des produits amylacés et la libération des cellules microbiennes en vue de la filtration, on fait appel à des diastases et des amylases, qui sont des enzymes ayant une action liquéfiante sur les amylacés, pour attaquer les liaisons a-glucosidiques 1,4 des amylacés qu'elles convertissent en glucose, maltose et dextrines. Ces deux types d'enzymes sont vendus sous divers noms de marques par les Laboratoires MILLES et ROHM & HAAS. Les techniques de filtration, d'extraction et de réaction luminescente sont semblables à celles décrites dans l'exemple 1. I1 est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de realisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour déterminer la présence de cellules microbiennes dans un échantillon contenant un mélange de cellules microbiennes et de cellules non microbiennes, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes A) combinaison de l'échantillon avec une enzyme qui fait éclater les parois des cellules non microbiennes pour extraire la matière réactive non microbienne qui s'y trouve; B) séparation de la matière réactive non microbienne extraite des cellules non microbiennes par filtration dudit échantillon sur une surface filtrante pour éliminer la matière réactive non microbienne et produire sur la surface filtrante un résidu contenant des cellules microbiennes; C) éclatement des parois des cellules microbiennes sur la surface filtrante pour extraire et retenir sur la surface filtrante la matière réactive microbienne;; D) combinaison de la matière réactive microbienne sur la surface filtrante avec un réactif provoquant une réaction de luminescence avec production d'une quantité de lumière qui est fonction de la quantité de matière réactive ainsi combinée; et E) mesure de la quantité de lumière ainsi produite sur la surface filtrante. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape d'éclatement des parois des cellules non microbiennes comporte la combinaison de l'échantillon avec une enzyme qui attaque les parois des cellules non microbiennes. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'étape d'éclatement des parois des cellules microbiennes comporte l'étape de mise en contact des cellules microbiennes avec un solvant d'extraction choisi parmi les acides organiques et inorganiques. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape d'éclatement des parois des cellules microbiennes comporte l'étape de traitement des cellules microbiennes par des ultrasons. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape d'éclatement des parois des cellules microbiennes comporte l'étape de traitement des cellules microbiennes par la chaleur. 6. Procédé faisant appel à une réaction de luminescence pour déterminer optiquement la présence de cellules microbiennes dans un échantillon qui contient un mélange de cellules microbiennes et non microbennes, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes A) éclatement des cellules non microbiennes dans l'échantillon au moyen d'une enzyme pour faciliter la filtration, libérer les cellules microbiennes et extraire la matière réactive non microbienne des cellules non microbiennes dudit échantillon sans altérer les cellules microbiennes; B) filtration dudit échantillon sur une surface filtrante pour éliminer la matière réactive non microbienne des cellules non microbiennes et produire sur la surface filtrante un résidu contenant les cellules microbiennes;; C) éclatement des cellules microbiennes dudit résidu, tandis qu'elles se trouvent sur la surface filtrante en vue d'en extraire une matière réactive microbienne non diluée sur ladite surface filtrante; D) mise en contact de la matière réactive microbienne non diluée et d'un agent réactif en vue d'une réaction luminescente; et E) détermination et enregistrement de la quantité de lumière ainsi émise comme indication de la quantité de matière réactive microbienne présente dans ledit échantillon. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on réalise l'éclatement des cellules non microbiennes contenues dans l'échantillon et on extrait la matière réactive non microbienne des cellules non microbiennes par mélange avec un agent hydrolysant. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'échantillon contient des fruits ou des légumes et l'enzyme est choisie dans le groupe des enzymes pectiques en vue de désagréger les pectines présentes dans la structure cellulaire de ces fruits ou légumes et, par conséquent) libérer les cellules microbiennes et faciliter la filtration. 9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'échantillon contient un produit amylacé et l'enzyme est choisie dans le groupe des diastases de façon à désagréger lesdits échantillons amylacés. 10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'échantillon contient un produit amylacé et l'enzyme est choisie dans le groupe des amylases de façon à désagréger lesdits échantillons amylacés. 11. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'échantillon contient des protéines et l'agent hydrolysant est choisi dans le groupe des protéases de façon à dissoudre lesdites protéines et, par conséquent, à libérer la matière non microbienne réactive. 12. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'échantillon contient des protéines et l'agent hydrolysant est un hydroxyde d'ammonium-quaternaire de façon à dissoudre lesdites protéines et, par conséquent, à libérer la matière non microbienne réactive. 13. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape d'éclatement des cellules microbiennes dans ledit résidu tandis qu'il se trouve sur ladite surface filtrante, est mise en oeuvre par introduction de très faibles volumes de solvant de moins de 0,025 ml en vue de faire éclater les cellules microbiennes, ce solvant s'évaporant et étant absorbé par la matière filtrante et ne laissant, par conséquent, aucun liquide pouvant diluer la matière extraire. 14. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'éclatement des cellules microbiennes dans ledit résidu, tandis qu'il se trouve sur ladite surface filtrante, est effectué par introduction de gaz et de vapeurs dans l'unité filtrante en vue de faire éclater les cellules microbiennes dans un milieu sec. 15. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape de filtration dudit échantillon sur une surface filtrante comporte la filtration en vue d'éliminer toute la fraction liquide dudit échantillon et le rinçage du résidu en vue d'éliminer toute la matière non microbienne réactive de façon à retenir sur la surface filtrante un résidu de l'échantillon contenant les cellules microbiennes. 16. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les étapes A et B comportent en outre des étapes successives pour faire éclater différents types de cellules non microbiennes d'après leur sensibilité progressive au liquide d'extraction. 17. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la mise en contact de la matière réactive microbienne et de l'agent réactif comporte l'application uniforme de l'agent réactif liquide sur la matière réactive microbienne non diluée se trouvant sur le filtre. 18. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la mise en contact de la matière réactive microbienne et de l'agent réactif comporte l'introduction de l'agent réactif et de la matière réactive microbienne en couches minces afin d'assurer l'alimentation en oxygène. 19. Perfectionnement au procédé de détermination de matière réactive microbienne provenant des cellules d'un échantillon par éclatement des cellules extraction de la matière réactive microbienne de l'échantillon et combinaison de la matière réactive microbienne avec un agent réactif provoquant une réaction de luminescence pour l'obtention d'une lumière dont l'intensité est fonction de la quantité de matière réactive microbienne, pour l'utilisation dans laquelle la courbe de ladite fonction présente deux valeurs ambiguës de quantité de ladite réactive microbienne pour de faibles intensités lumineuses entre O et la valeur de la lumière endogène du réactif, ledit perfectionnement étant caractérisé en ce que A) on effectue un premier essai d'une quantité donnée de l'échantillon afin de déterminer l'intensité lumineuse; ; B) si l'intensité lumineuse se trouve dans la gamme devalairs faibles et, par conséquent, ambiguës, on modifie la quantité de l'échantillon et on effectue un second essai; C) on enregistre la plus faible des deux valeurs ambiguës si la variation de la quantité de l'échantillon en fonction de l'intensité lumineuse entre les deux essais a une pente négative, et la plus élevée de ces deux valeurs si cette pente est positive. 20. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la quantité de lumière est inférieure à la valeur de la lumière endogène du réactif.