FR 2433027 A1 19800307 FR 7823336 A 19780808 La présente invention à laquelle ont participé Messieurs Jean-Bernard DUCEP, Daniel FARGE, Gérard PONSINET et Daniel REISDORF concerne un nouveau procédé de préparatiOn des dérivés de la doxorubicine de formule générale: dans laquelle le symbole R représente un radical de formule générale dans laquelle R1 représente un atome dthydrogène, ou un radical alcoyle (éventuellement substitué par un radical- amino, alcoylamino, dialcoylamino, hydroxy, mercapto ou méthylthio), un radical phényle ou un radical benzyle éventuellement substitué sur le cycle par un ou deux radicaux hydroxy et R2 représente un atome dlhydrogène ou forme avec Ri un radical alcoyle contenant 3 ou 4 atomes de carbonate, ainsi que leurs sels d'addition avec-les acides, étant entendu que les radicaux et portions alcoyles cités ci-dessus sont en channe droite ou ramifiée et contiennent 1 à 4 atomes de carbone et que les produits de formule générale (I) dérivent le cas échéant des formes D, L et D,L de ltamino acide de formule générale? Selon ltinvention, les produits de formule générale (I) peuvent être obtenus à partir de dérivés de la daunorubicine de formule générale:: dans laquelle R étant défini comme précCdeiancnL, R3 représente un radical de formule générale : dans laquelle les symboles X qui représentent des atomes d'oxygène ou de soufre sont identiques et les symboles R4 représentent des radicaux alcoyles contenant 1 à 4 atomes de carbone en chaîne droite ou ramifiée ou phényle substitué en position para par un radical méthyle, méthoxy ou méthylthio, ou forment ensemble un radical alcoylène contenant 2 à 4 atomes de carbone, ou bien les symboles X sont différents et les symboles R4 forment ensemble un radical alcoylène contenant 2 à 4 atomes de carbone, par toute méthode connue en soi pour obtenir un alcool à partir d'un ester sans toucher au reste de la molécule. On opère généralement par hydrolyse alcaline ou par transestérification en milieu basique. De préférence on réalise la transestérification par alcoolyse en présence de carbonate de potassium. La réaction s'effectue par exemple dans un solvant organique tel que le mélange chioroforme-méthanol à une température comprise entre 0 et 150C. Les produits de formule générale (IV) peuvent être obtenus par action d'un dérivé réactif d'un amino acide de lormule générale (III) dont la fonction amine est préalablement protégée, sur un dérivé de la daunorubicine de formul.e générale dans laquelle R3 est défini comme précédemment, ou sur l,un de ses sels. La/les fonction(s) amine(s) peut/peuvent être protégée(s) par toute méthode connue en soi pour bloquer le radical amino dssun amino acide, et dont les conditions de blocage et de déblocage sont compatibles avec la stabilité du reste de la molécule. La fonction acide de lamine acide de formule générale (III) peut ttre activée soit sous forme d'anhydride mixte, soit sous forme d'ester réactif. 1) La fonction acide de lamino acide de formule générale (III) peut êttre activée par formation d'un anhydride mixte par réaction de l'amino acide avec par exemple un chloroformiate d'éthyle, dtisobutyle ou de sec. butyle. Lorsque l'on utilise lfamino acide de formule générale (III) sous forme d'un tel anhydride mixte (qui peut être préparé in situ), on protège préalablement la/les fonction(s) amine(s) par un radical f(biphénylyl-4)-2 propyl-2 oxycarbonyle qui peut etre introduit selon la méthode décrite par P. SIEBER et B. ISELIN, Helv. Chim. Acta. 51, 622 (1968), et qui est facilement éliminé en milieu acide dilué, notamment en présence diacide chlorhydrique. La condensation de l'anhydride mixte du produit de formule générale (ils) sur le dérivé de la daunorubicine de formule générale (VI) sleffectue alors en milieu anhydre dans un solvant organique tel que le chlorure de méthylène ou le tétrahydrofuranne, en présence d'une base azotée telle que la triéthylal.ine ou la N-méthylmorpholine, à une température comprise entre -20 et OOC. De préférence on opère sous azote. L'élimination du groupement protecteur de la/des fonction(s) amine(s) s'effectue en présence d'acide chlorhydrique dans un solvant organique tel que le chlorure de méthylène à une température comprise entre 4 et 250C. 2) La fonction acide de l'amino acide de formule générale (III) peut être activée par-estérification avec des composés hydroxylés tels que la N-hydroxysuccinimide. Cet ester activé peut entre préparé en situ. Lorsque llon.opère selon cette variante on peut protéger la/les fonction(s) amine(s de llamino acide de formule générale (III) par un groupement tel que le radical trityle qui peut être éliminé en milieu acide dilué. Dans ces conditions, la réaction de condensation de l'ester activé avec le produit de formule générale (VI) s'effectue dans un solvant organique tel que l'acétate d'éthyle ou le diméthylformamide en présence d'un carbodiimide tel que dicyclohexylcarbodiimide,à une température comprise entre -15 et 250C, éventuellement en présence d'une base organique telle que la triéthylamine. Les- produits de formule générale (VI) peuvent être obtenus selon la méthode décrite dans le brevet belge BE 848 219. Les produits de formule générale (I) peuvent être éventuellement purifiés par des méthodes physiques (telles que la cristallisation ou la chromatographie) ou chimiques (telles que la formation des sels, cristallisation, puis décomposition de ceux-ci) Les produits de formule générale (I) peuvent être transformés le cas échéant en sels d'addition avec les acides. L'exemple suivant donné à titre non limitatif illustre la présente invention. EXEMPLE On dissout 3 g de chlorhydrate de N-(L leucyl) diéthoxy-acétoxy-14 daunorubicine dans 150 cm3 d'un mélange 1 : i en volumes de chloroforme et de méthanol. On refroidit à 0 C et ajoute 1,51 g de carbonate de potassium anhydre. On agite à 0 C durant 20 minutes. On dilue à l'eau, ajuste le pH à 8 par addition diacide chlorhydrique 0, i N et décante. La phase organique est lavée deux fois avec 300 cm3 d'eau et séchée sur sulfate de sodium. On filtre et concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 40 C. On obtient 2,3 g d'un solide rouge que lton dissout dans 50 cm3 de chlorure de méthylène. On refroidit à 0 C et ajoute en agitant 4,6 cm3 de solution 0,77 N d'acide chlorhydrique sec dans du dioxanne. On agite 5 minutes et on filtre le précipité. Après lavage au chlorure de méthylène,on sèche le solide rouge sous pression réduite (i mm de mercure) à 200C.On obtient ainsi 2,21 g de N-(L leucyl) doxorubicine sous forme de chlorhydrate qui-est une poudre rouge 20 [&alpha;]= + 343 # 18 (c = 0,3, méthanol) D Rf = 0,20 C silicagel ; chlorure de méthylène - méthanol - acide formique eau (88 - 15 - 2 - 1 en volumes)). Analyse % Calc. C 57,18 H 5,96 Cl 5,11 N 4,04 Z trouvé. 57,2 6,1 4,2 3,7 Le chlòrhydrate de N-(L leucyl) diéthoxyacétoxy-14 daunorubicine peut être préparé de la manière suivante: Dans un ballon tricol, préalablement séché, on dissout sous atmosphère d'azote 7,66 g de L N - [(biphénylyl-4)-2 propylj-2 oxycarbonyl leucine dans 100 cm3 de tétrahydrofuranne et ajoute 2,9 ml de triéthylamine conservée sur pastilles de potasse. On refroidit à -200C et ajoute en une fois 2,48 cm3 de chloroformiate d'isobutyle. On agite à -200C durant 30 minutes. On ajoute en une seule fois, en maintenant la température du milieu réactionnel à. -200C, une solution de 12,3 g de chlorhydrate de diéthoxyacétoxy-14 daunorubicine dans 200 cm3 de chlorure de méthylène sec contenant 2, cm3 de triéthylamine conservée sur pastilles de potasse. On agite 15 minutes à -200C. On ajoute 1000 cm3 d'eau glacée, décante et lave la phase organique 3 fois avec 200 cm3 d'eau. On sèche la phase organique sur sulfate de sodium. On filtre et concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 300C. Le résidu est dissous dans le minimum de chlorure de méthylène et cette solution est versée sur une colonne (diamètre 5cm, hateur 60cm) contenant 450 g de gel de silice dans du chloroforme. On élue successivement avec 4000 cm3 de chlorure de méthylène contenant 10% (en volumes) d'acétate d'éthyle puis avec 5100 cm3 de chlorure de méthylène contenant 25% (en volumes) d'acétate d'éthyle en recueillant l'élut par fractions de 300 cm3. On réunit les fractions 14 à 30. On concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 300C puis sèche sous pression réduite (i nra de mercure) à 200C. On obtient ainsi 11,3 g de N -[N-(biphénylyl-4)-2 propyle]-2 oxycar bonyl}L leucyl] diéthoxyacétoxy-14 daunorubicine sous forme d'un solide rouge amorphe ; 20 [&alpha;] D = + 126 # 16 (c = 0,182, chloroforme). On dissout 11,3 de N - LN-(biphénylyl-4)-2 propyl)-2 oxycarbonylL leucyl] diéthoxyacétoxy-14 daunorubicine dans 130 cm3 de chlorure de méthylène. Le mélange est refroidi à +4 C par un bain de glace et d'eau. On ajoute en agitant et en une seule fois 25,7 cm3 de solution 0,77 N d'acide chlorhydrique sec dans du dioxanne. Après 10 minutes, on ajoute 300 cm3 d'acétate d'éthyle et 500 cm3 d'éther éthylique. Le précipité rouge obtenu est filtré, lavé avec de l'éther éthylique et séché sous pression réduite (1 me de mercure) à 20 C. La poudre rouge est mise en suspension dans 100 cm3 d'acétate d'éthyle. On agite 15 minutes et filtre. Le solide rouge obtenu est lavé trois fois avec 100 cm3 d'acétate d'éthyle et séché sous pression réduite (1 mm de mercure) à 40 C. On obtient 6,62 g de N-(L leucyl) diethoxyacétoxy-14 daunorubicine sous forme de chlorhydrate qui est une poudre rouge. : [&alpha;] 20 = + 255 #18 (c = 0,216, méthanol) D Rf = 0,66 [silicagel ; chlorure de méthylène - méthanol - acide formique - eau (88 - 15 - 2 - 1 en volumes)] Analyse 7. Calc. C 56,90 H 6,24 C1 4,31 N 3,40 % Tr. 56,4 6,5- 4,4 3,5 Le chlorhydrate de diéthoxyacétoxy-14 daunorubicine peut être obtenue selon la méthode décrite dans le brevet belge 848 219 La L N-(biphényl-4)-2 propyl)-2 oxycarbonyl leucine peut être obtenu selon la méthode décrite par P. SIEBER et B. ISELIN, Helv. Chim. Acta, 51, 622 (1968). Les produits de formule générale (I) et: leurs sels d'addition avec les acides possèdent d'interressantcs propriétés antitumorales jointes à une faible toxicité. Ils se sont montrés particulièrement: actifs chez la souris DBA2 sur la leucémie L 1210 (administration intrapéritonéale). Les essais ont été effectués sur des souris agées de 1 mois et pesant 18 à 20 g greffes par voie intra-péritonéale avec 106 cellules de la leucémie L 1210 et traitées à des doses journalières comprises entre 5 et 60 mg/ kg i.p. Pour l'emploi thérapeutique, les produits de formule générale (I) peuvent être utilisées à l'étant libre ou sous forme de sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables, c'est à dire non toxiques aux doses dwutilisa- tion. Comme exemples de sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables, peuvent être cités des sels d'acides minéraux (tels que chlorhydrates, sulfates, nitrates, phosphates) ou organiques (tels que acétates, propionates, tartrates, théophilline-acétates, salicytates, phénolphtalinates, méthylène bis-h-oxynaphtoates). Dans les compositions médicinales les contenant, les produits de formule générale (I) et/ou leurs sels peuvent être associés avec tout autre produit pharmaceutiquement acceptable qu'il soit inerte ou physiologiquement actif. Ces compositions peuvent être présentées sous toute forme appropriée à la voie d'administration prévue. La voie parentérale est la voie dwadminis- tration préférentielle et notamment la voie intraveineuse. Les compositions selon l'invention pour administration parentérale peuvent être des solutions stériles aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer le propylèneglycol, les huiles végétales, en particulier lthuile d'olive, et les esters organiques injectables, par exemple l'oléate d'éthyle. Ces compositions peuvent également comprendre des adjuvants en particulier des agents mouillants, émulsifiants et dispersants. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple à laide dtun filtre bactériologique, en incorporant à la composition des agents stérilisants, par irradiation ou par chauffage.Elles peuvent également être préparées sous forme de compositions stériles solides qui peuvent être dissoutes ou dispersées au moment de l:emploi dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable. Les produits de formule générale (I) et leurs sels sont plus particu lièrement utilisés dans le traitement des leucémies aiguës lymphoblastiques et myeloblastiques, des lymphosarcomes, de la maladie de E{ODGKIN et des tumeurs solides (cancer pulmonaire, cancer mammaire, cancer du tube digestif et métastases) à des doses journalieres généralement comprises entre i et 5 mg/kg par voie intraveineuse pour un adulte. L'exemple suivant illustre une composition à base d'un produit répon dant à la formule générale (I). EXEMPLE On prépare une solution contenant 17,39 mg/cm3 de chlorhydrate de N-(L leucyl) doxorubicine en dissolvant 17,39g de ce produit dans du soluté physiologique apyrogène en quantité suffisante pour obtenir 100 cm3. La solution obtenue est répartie aseptiquement en ampoules à raison de 5 cm3 par ampoule. Les ampoules sont scellées et contiennent chacune 80 mg de N-(L-leucyl)doxorubicine (base). R E V E N D I C A T I O N S 1 - Nouveau procédé de préparation d'un dérivé de la doxorubicine de formule générale dans laquelle le symbole R représente un radical de formule générale dans laquelle R1 représente un atome dhydrogène, ou un radical alcoyle (éventuellement substitué par un radical amino, alcoylamino, dialcoylamino, hydroxy, mercapto ou méthylthio), un radical phényle ou un radical benzyle éventuellement substitué sur le cycle par un ou deux radicaux hydroxy et N représente un atome d'hydrogène ou forme avec R1 un radical alcoylène contenant 3 ou 4 atomes de carbone , les radicaux et portions alcoyles cités ci-dessus étant en channe droite ou ramifiée et contenant 1 à 4 atomes de carbone, ainsi que de ses formes diastéréoisomères et leurs mélanges, et de ses sels dtaddition avec les acides, caractérisé en ce que l'on traite un dérivé de la daunorubicine de formule générale: dans laquelle R étant défini comme précédemment, R3 représente un radical de formule générale dans laquelle les symboles X qui représentent des atomes d'oxygène ou de soufre sont identiques et les symboles R4 représentent des radicaux alcoyle contenant i à 4 atomes de carbone au phényle substitué en position para par un radical méthyle, méthoxy ou méthylthio , ou forment ensemble un radical alcoylène contenant 2 à 4 atomes de carbone, ou bien les symboles X sont différents et les symboles R4 forment ensemble un radical alcoyle contenant 2 à 4 atomes de carbone, par toute méthode connue en soi pour obtenir un alcool à partir d'un ester sans toucher au reste de la molécule, puis transforme éventuellement le produit obtenu en sel d'addition avec un acide. 2 - Un procédé selon la revendication l, caractérisé en ce que l'on pratique ltalcoolyse en milieu alcalin d'un dérivé de la daunorubicine de formule générale dans laquelle R et R3 sont définis selon la revendication l, puis transforme éventuellement le produit obtenu en un sel d'addition avec un acide.