FR 2455053 A1 19801121 FR 7910696 A 19790426 La présente invention se rapporte à un procédé pour la production de stérolglucosides individuels à partir d'un mélange de stérolglucosidoequi se trouve dans des substances naturelles, rapidement et en grandes quantités. Les substances obtenues à partir de la présente invention ont un effet hémostatique et un effet de renforcement des vaisseaux sanguins et sont, de ce fait utiles comme produits pharmaceutiques. Comme on le sait déjà en général, les sucres constituant les stérolglucosides,qui se trouvent dans des substances naturelles, sont généralement du glucose, alors que les stérols les constituant se composent ordinairement de ceux ayant plusieurs structures extrêmement semblables, comme dans le cas de stérols libres qui existent dans la nature, et leur existence sous la forme d'un stérolglucoside individuel parfaitement pur n'a pas été considérée actuellement. Meme dans le cas ot l'on a indiqué dans le passé que des substances obtenues à partir de certaines plantes existaient sous la forme d'un stérolglucoside individuel, on a maintenant indiqué clairement, par suite de nouvelles études selon l'analyse par spectrométrie de masse-chromatographieen phase gazeuse (qui sera désignée ci-après sous le nom de GC-MS), etc. que ces substances contiennent différents genres de stérolglucosides sans exception.Puisque les stérols constituant les stérolglucosides ont des structures extrêmement semblables, comme mentionné cidessus, les procédés de purification appliqués jusqu'à présent, par exemple le procédé de recristallisation, divers genres de chromatographies en phase liquide, la réaction de précipitation avec des sels de métaux alcalins, etc., ont seulement rendu possible la séparation d'un mélange de stérolglucosides à partir de substances indifférentes vis-à-vis de cette séparation et mélangées avec ces stérolglucosides, et ces procédés ont été totalement impuissants pour séparer les stérolglucosides les uns des autres. Ainsi, on a considéré comme difficile la séparation d'un mélange de stérolglucosides, qui se trouvent dans des substances naturelles, les uns des autres, et l'obtention d'un Stérolglucoside pur, même si sa quantité est la plus faible, et il n'y a jamais eu aucun exemple de succès. La demanderesse a réalisé des études importantes afin de surmonter cette situation difficile, et, par suite elle a fourni un procédé de séparation selon lequel il est pos sible de produire un stéroîglucoside individuel recherché, à partir d'un mélange de stérolglucosides qui se trouvent dans des substances naturelles, avec une grande pureté et à l'échelle industrielle. Elle est alors arrivée à la présente invention. La présente invention sera mentionnée ci-dessous en détail dans l'ordre de son mode opératoire. (1) Choix des matières premières Pour séparer et obtenir un stérolglucoside recherché avec certitude, avec une grande pureté et avec un rendement élevé, il est nécessaire d'obtenir correctement les genres et la proportion de constitution des constituants respectifs d'un mélange de stérolglucosides dans une matière première, parce que, même lorsqu'une chromatographie en phase liquide comme mentionné ci-dessous est appliquée, la séparation résultante a, par elle-même, une limitation, et, de ce fait, il est nécessaire de choisir, au stade avant la chromatographie en phase liquide, une matière première ne contenant pas d'autres genres de stérolglucosides qui sont difficiles à séparer à partir d'un stérolglucoside recherché.Des mélanges de stérolglucosides qui se trouvent dans des substances naturelles, sont intrinsèques dans les genres de ces substances naturelles, et, également, les genres et les proportions constitutives sont modifiés et distribués à l'infini. En conséquence, nonobstant le fait que la séparation selon la chromatographie en phase liquide, comme mentionné ci-dessous, a une limitation, il devient possible d'isoler tous les genres de stérolglucosides à partir de substances naturelles, par le choix d'une matière première adéquate. Selon le stérolglucoside recherché, une analyse détaillée des stérolglucosides avec un certain nombre de matières premières est nécessaire pour trouver une matière première qui est en fait convenable dans ce but. La demanderesse a établi un procédé pour obtenir les genres et la proportion de stérols constituant les stérolglucosides dans une matière première, de manière simple, correctement et dans un temps bref, et ainsi a résolu ce problème. Le procédé consiste à choisir une matière première, basée sur la découverte selon laquelle "les genres et la proportion de stérols libres qui coexistent toujours dans un échantillon recherché, qui se trouve dans des substances naturelles, sont bien en accord avec ceux des sterolglucosides". Jusqu'à présent, par exemple, l'analyse d'un mélange de stdrolglucosides dans une plante a été étudiée par un mode opératoire consistant d'abord à extraire un mélange de stérolglucosides, à le séparer et à le purifier, ensuite à le soumettre à la décomposition par un acide dans un alcool, et à analyser les stérols libres résultants.Cependant, un tel procédé non seulement a été ennuyeux dans son fonctionnement et a exigé un temps important, mais aussi il a un inconvénient décisif du fait que, dans le cas de certains genres de stérols, leur décomposition durant le procédé de traitement par un acide est prevu, alors que, dans le cas de certains autres stérols, l'isomerisa- tion se produit et, de ce fait, il est impossible d'obtenir correctement des stéroîglucosides qui sont réellement présents.Par exemple, les L\ 24(28)-stérols qui sont distribués dans la nature d'une manière considérablement large se transforment en composés ayant une double liaison ayant changé de position, comme présenté cidessous 24(28) - > aîc"o+î rr+ 23(24) + 50 % 24(25) alcool > 50 % ss + 50 % Ainsi, on a indiqué souvent des résultats d'après lesquels il semblait qu'une différence était présente entre les stérols libres et les stérolglucosides dans le même genre de plantes.Cependant, comme mentionné ci-dessous, sèlon le procédé d'analyse directe mis au point par la demanderesse, une étude comparative correcte sur les deux stérols est devenue possible, et, d'après les résultats d'étude avec un certain nombre de plantes, on a con firmé clairement pour la première fois que les genres et la proportion constitutive des deux stérols étaient bien en accord. En ce qui concerne les matières premières obtenues à partir de blé, etc., des exemples sont présentes dans le tableau I TABLEAU I Comparaison de stérols constituant les stérols libres avec ceux constituant les stérolglucosides Campesté- Stigma- ss-sitoste- 24-méthylè- Avénasté roi stérol rol necholes- rol stérol Blé f. 22 % 1 - % 72 % 1 % 5 % G. 20 - 75 1 4 Riz f. 18 15 63 1 3 G. 15 17 65 0.5 2,5 Mails f. 23 7 66 1 3 G. 20 9 68 1 2 Soja f. 22 20 54 1 3 G. 23 19 55 1 2 Kapok f. 9 8 80 0,5 2,5 G. 10 9 78 0,5 2,5 Grai- f. 4 - 95 - 1 nes de coton G. 4 - 95 - 1 Grains f. 20 21 54 1 4 de café G. 17 22 57 1 3 (f. représente le stérol libre et G. représente les stérolglucosides). L'analyse des stérols libres n'exige pas de traitement particulier tel que la décomposition par un acide etc., par comparaison avec le cas de stérolglucosides, et également une analyse précise est possible avec une très légère quantité d'échantillon, sans purification particulière, au moyen de GC-MS, etc. dans un temps bref; de ce fait, il est possible de juger bientôt, en se basant sur les résultats analytiques des stérols libres, si les stéroîglucosides à isoler sont convenables ou non comme matières premières. En pratique, en ce qui concerne la décision de savoir s'ils sont convenables ou non comme matières premières,une norme de jugement a consisté à considérer si les A - et les t 7-stérolglucosides sont mélangés ou non. Par exemple, dans le cas où l'isolement de 5-stErolglucosides est prévu, une matière pre- mière ne contenant presque pas de #7-stérolglucosides doit être choisie, alors que, dans le cas où l'isolement de # 7-sterolglu- cosides est prévu, une matière première ne contenant pas de stérolglucosides, telles qu'un certain nombre de plantes appartenant aux cucurbitacées etc., doit être choisie. Dans le cas de plantes dont les compositions de stérols ont déjà été suffisamment étudiées, il est possible d'utiliser les résultats comme matière pour choisir une matière première, mais, dans le cas de la présente invention où l'isolement de stérolglucosides de haute pureté est prévu, différents genres de stérolglucosides qui sont difficiles à séparer ne doivent pas être contenus, même si leur quantité est de 1 % ou plus faible, et, même dans le cas d'isolement de stérolglucosides représentatifs illustrés dans les exemples mentionnés ci-dessous, les matières premières ont été strictement choisies selon les moyens mentionnés ci-dessus pour atteindre l'objet recherché. Ensuite, dans le cas ou des matières premières sont prises en considération d'un point de vue économique, toutes les matières premières qui se trouvent à l'origine dans des substances naturelles et ont été actuellement traitées à l'échelle industrielle sont utilisables, et un certain nombre d'autres substances diverses qui sont facilement disponibles, telles que des produits, des gâteaux d'extraction de graines par l'huile, des parties inutiles évacuées, des sous-produits, etc., peuvent être utilisées. (2) séparation de mélanges de stérolglucosides et leur acétylation La séparation de mélanges de stérolglucosides à partir d'une matière première peut être réalisée selon des procédés connus, et il est aussi possible de les obtenir facilement avec une grande pureté, selon une réaction de précipitation spécifique entre les stérolglucosides et un carbonate de métal alcalin dans un alcool inférieur décrit par la demanderesse (demande de brevet japonais nO 9.996/1975 déposée le 22 janvier 1975 sous le titre "Procédé de 0ncaLion de sHWiglucosides à partir de gâteaux hideux de plantes" au nom de la société dite Nippon Shinyaku Co., Ltd.).Bien que les stérolglucosides soient difficilement solubles dans des solvants organiques généralement utilisés le traitement d'une grande quantité de stérolglucosides au moyen d'un certain nombre de solvants organiques devient possible en les acétylant pour former leurs tétraacétates de manière classique, et il est aussi possible d'étendre les genres de phases mobiles dans la chromatographie en phase liquide. (3) Séparation du mélange de tétraacétates de stérolglucosides au moyen de chromatographie en phase liquide Comme déjà décrit ci-dessus, jusqu'à présent, on n'a pas de moyens efficaces pour séparer le mélange de stérolglucosides, et leur séparation a été très difficile, mais la demanderesse, par suite d'études préliminaires,a trouvé un moyen pour séparer des stérolglucosides les uns des autres selon un procédé de chromatographie enphase liquide et elle a essayé de séparer le mélange de tétraacétates de stérolglucosides selon une chromatographie en phase liquide dans diverses conditions.Par suite, il est apparu clairement qu'en ce qui concerne la phase stationnaire, qui est efficace pour la séparation, du gel de silice, du gel de silice imprégné de nitrate d'argent,de l'oxyde de magnésium, de l'alumine, du produit dit Florisil, etc. présentent une aptitude à la séparation en même proportion que dans le cas de la séparation de stérols libres et, dans le cas de stérolglucosides, également, la séparation est très efficacement réalisée, en se basant principalement sur la différence de structures des stérols constitutifs. La phase stationnaire mentionnée ci-dessus peut être employée pour la séparation de stérolglucosides tout à fait de la même manière que- dans le cas où elle a été appliquée à des stérols libres, en choisissant un solvant convenable de la phase mobile. La demanderesse a, en outre, réalisé les études sur les conditions de séparation qui sont plus pratiques et présentent une performance supérieure; par suite, elle a établi un procédé de séparation selon une chromatographie en phase liquide à grande performance (désignée par HPLC), où un gel de silice microfine stable-ODS (matière obtenue par liaison chimique d'un groupe octadécyle au gel de silice) est employé comme phase stationnaire et un solvant unique, tel que du méthanol, de l'acétonitrile, etc., est employé comme phase mobile.Ainsi, il est devenu possible pour la première fois d'isoler du cholesterolglucoside, du bras sicastérolglucoside, du campestérolglucoside, du stigmastérolglucoside, du p-sitostérolglucoside et des n 7-stérolglucosides et leurs substances de réduction etc., qui y correspondent, à partir de mélanges de stéroîglucosides qui se trouvent dans des substances naturelles, cette séparation ayant été impossible selon d'autres procédés. Un exemple du chromatogramme HPLC de tétraacétates de stérolglucosides à partir de lécithine de soja dans ces conditions est présenté sur la figure unique du dessin ci-joint, qui représente un chromatogramme en phase liquide, à haute performance, du tétraacétate de stérolglucosides de la lécithine de soja.Les abscisses représentent le temps d'élution et les ordonnées repré- sentent la hauteur de pic. Du gel de silice-ODS (4 ml x 30 cm) a été employé comme colonne; la quantité d'échantillon déversé était 10 mg; l'acétonitrile a été employe comme phase mobile; la pression était 50 kg/cm2; le débit était 1,3 ml/mn; un réfractomètre a été employé comme détecteur; et la température de mesure était 250C.Sur les pics, 1 représente le tétraacétate de 24-méthylène cholestérolglucoside. 2 le tétraacétate d'avénastérolglucoside, 3 le tétraacétate de stigmastérolglucoside, 4 le tétraacétate de campestérolglucoside, 5 le tétraacétate de p-sitostérolglucoside, et 6 le tétraacétate de stigmastanolglucoside. En outre, cette séparation selon 1'HPLC est fournie avec toutes les conditions avantageuses nécessaires pour l'augmentation d'échelle de fabrication et une production a l'échelle industrielle est également possible. (4) Désacétylation Quand le tétraacétate de stérolglucoside résultant individuel est soumis à un traitement par un alcool en milieu alcalin, d'une manière classique, un stérolglucoside difficilement soluble, désacétylé, précipite quantitativement à partir de 1' alcool et il est possible d'obtenir facilement un stérolglucoside pur recherché. Ensuite, l'isolement de trois genres de stérolglucosides, qui sont très abondamment présents dans la nature, sera décrit dans l'exemple 1, et un exemple de séparation des quantités les plus faibles de stérolglucosides sera décrit dans l'exemple 2. EXEMPLE 1 Isolement de p-s i tos térolglucoside (I), de s tigmas térolg lucosiae (II) et de campestéroîglucoside (III) Des stérols libres contenus dans des extraits acétoniques à partir d'environ 10 genres de plantes ont été analysés selon la GC-MS, et des plantes ne contenant presque pas de t n7-stérol- glucoside, telles que des graines de kapok, le soja, l'olive, le mais et le blé, etc., ont été choisies comme matières premières convenables pour l'isolement de (I); de la pomme de terre ne contenant presque pas de (III), qu'il est difficile de séparer selon 1'HPLC, a été choisie comme matiere première convenable pour l'isolement de (II), et des germes de blé ne contenant presque pas de (Il), ont été choisis comme matièrespremièrss convenables pour l'isolement de (III). Ces matieres premières sont chacune traitées selon le mode opératoire suivant gui leur est commun Une matiere première séchée et dégraissée est extraite deux fois avec de l'acétone en quantité égale à deux fois le volume, basé sur le poids de la matière première, puis de l'acétone est retirée par distillation. Une solution méthanolique de KOH à 10 %, en quantité de 20 fois le volume basé sur le poids du resi- du, est ajoutée. Après reflux pendant 1 heure, R2C03 est ajouté jusqu'S ce que la saturation soit atteinte, et successivement le reflux est réalisé pendant 3 heures.Le précipité résultant est lavé avec du méthanol et puis avec de l'eau, et séché pour obtenir un mélange de stérolglucosides de grande pureté, qui est alors transformé en tétraacétates avec de l'anhydride acétique dans la pyridine, de manière classique. Les tétraacétates sont employés comme échantillons pour la separation selon l'HPLC. Les conditions de 1'HPLC sont les suivantes Phase stationnaire : Gel de silice-ODS (5lu) (colonne, diamètre 10 mm x 30 cm) Phase mobile : Acétonitrile (Débit, 10 ml/mn) Dans ces conditions, la quantité d'échantillon une fois traité est 0,1 g et le temps exigé est dans la limite des 10 minutes.Par une seule séparation, la substance recherchée pourrait être complètement isolée à partir de chaque échantillon, sans perte de la substance. Les tétraacétates correspondant à (I) - (III) isolés résultants sont décrits collectivement dans le tableau Il, avec ceux obtenus dans l'exemple 2. En hydrolysant les tétraacétates avec KOH à 5 % dans du méthanol, les stérolglucosides précipitaient quantitativement à partir de méthanol et des stéroîglucosidespurs pouvaient être facilement obtenus. EXEMPLE 2 Séparation de 24-méthylènecholestérolglucoside (IV) et d'avénastérolglucoside (V). (IV) et (V) sont généralement présents dans les mélanges de stérolglucosides en tant que composant en faible quantité. Dans cet exemple, une lécithine de soja du commerce a été employée comme matière première, et des stéolglucosides ont été sépares, en utilisant une réaction de précipitation avec K2C03 dans du méthanol (voir demande de brevet japonais nO 9.996/1975 citée précé- demment), purifiés et, en outre, transformés en tétraacétates pour préparer des échantillons de séparation (IV) et (V). (IV) et (V) contenus peuvent être séparés par application directe d'HPLC, mais l'efficacité résultante est inférieure.Ainsi, ils ont été soumis à une chromatographie sur colonne en employant un gel de silice imprégné de nitrate d'argent comme phase stationnaire, et les stérolglucosides principaux (I)-(III) s'écoulant initialement ont été retirés pour obtenir un mélange se composant principalement de tétraacétates de (IV) et de (V), seuls, qui ont été alors employés comme échantillons pour 1'HPLC. Dans la séparation selon la chromatographie sur la colonne, avec un gel de silice imprégné de nitrate d'argent, un gel de silice imprégné de nitrate d'argent à 20 % (diamètre 4 cm x 40 cm) a été employé comme phase stationnaire et du chloroforme/cyclohexane (5 : 1) a été employé comme solvant de la phase mobile; en une seule fois, 5 g d'un échantillon ont été traités pour obtenir environ 1 g d'un mélange de tétraacétates de (IV) et de (V) à partir de 25 g de l'échantillon.Ensuite, en employant ce mélange comme échantillon, la séparation selon 1'HPLC a été réalisée dans les conditions de l'exemple 1 pour séparer (IV) et (V). En outre, selon l'essai de pureté par HPLC et par chromatographie en phase gazeuse, on a confirmé qu'un produit ayant une pureté de 99 % ou plus a été obtenu pour (IV) et qu'un produit ayant une pureté de 97 % ou plus a été obtenue pour (V). Les tétraacétates séparés sont résumés dans le tableau II. Les tétraacétates séparés ont été simplement désacétylés avec KOH à 5 %-méthanol, et les quantités correspondantes de stérolglucosldes ont précipité quantitativement. TABLEAU II Valeurs observées des tétraacétates isolés 'Substance Rendement Point de Analyse élémentajre Pureté isolée (g) x fusion (Valeur 1(Valeur par ( C) observée, calculée, HPLC superieure) inférieure) et GC C H 5-sitoste- 69,48 9,31 rolgluco- I 175-177 699'4328 i 99 99 % ou side 69,32 9,20 plus Stigmasté- 69,60 8,91 rolgluco- 0,40 128-130 side 69,54 8,89 Campeste- 68,97 9,29 rolgluco- 0,18 172-174 side 69,01 9,10 24-méthylè- 69,03 8,98 necholes- 0,41 166-168 térolglu- 69,23 8,80 coside Avénasté- 69,32 9,14 rolgluco- 0,48 181-183 97 % ou side 69,54 8,89 lus x Rendement obtenu par traitement de 1 g de l'échantillon par HPLC. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à l'homme de l'art. REVEND ICAT IONS 1 - Procédé de production de stérolglucosides de pureté élevée, caractérisé en ce qu'on choisit une matière première très convenable à partir de diverses matières premières, en utilisant des stérols libres coexistant dans ces matières premières, comme indication pour la sélection, en ce- qucon extrait un mélange de stérolglucosides à partir de la matière première choisie, en ce qu'on transforme l'extrait résultant en tétraacétates, en ce qu'on sépare ensuite une fraction recherchée seule selon la chromatographie en phase liquide, et en ce qu'on hydrolyse cette fraction pour obtenir les stérolglucosides d'origine. 2 - A titre de produits industriels nouveaux, stérolglucosides de pureté élevée, obtenus par le procédé de la revendication 1. 3 - Composition pharmaceutique à effet hémostatique et de renforcement des vaisseaux sanguins, caractérisée en ce qu'elle renferme, en tant qu'ingrédient actif, au moins un des sterolgluco- sides de la revendication 1.