FR 2455017 A1 19801121 FR 7910589 A 19790426 La présenLe invention concerne un procédé de préparation du chloro-3 méthyl-2 propanol optiquement actif par hydrolyse stéréospécifique enzymatique d'un mélange des formes dextrogyre et lévogyre d'un ester de formule générale dans laquelle R représente un radical alcoyle contenant i a 17 atomes de carbone, au moyen de lipase pancréatique de porc immobilisée sur un support. Les lipases d'origine microbienne possèdent la propriété d'hydrolyser les esters mais elles ne sont généralement pas stéréospécifiques. Il a cependantété trouvé que la lipase pancréatique, de préférence, de porc permettait une hydrolyse plus rapide de l'isomère lévogyre d'un ester de formule générale (I). Cependant, l'utilisation de la lipase pancréatique, de préférence, de porc sous forme d'extrait enzymatique soluble ou sous forme purifiée ne permet pas de réaliser l'hydrolyse de l'ester de formule générale (I) dans des conditions pratiques optimales. Il a maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, que l'hydrolyse enzymatique stéréospécifique des esters de formule générale (I) peut être réalisée beaucoup plus aisément en utilisant la lipase pancréatique immobilisée sur un support insoluble. La lipase sous forme d'extrait enzymatique soluble ou sous forme purifiée n'hydrolyse les esters à une vitesse constante et êlevée que lorsque les esters sWnt sous forme insoluble c'est-à-dire lorsque la concentration en propionate de chloro-3 méthyl-2 propanol est supérieure à 2 % (p/v). La lipase immobilisée permet l'hydrolyse à la vitesse maximale dès que La concentration en propionate de chloro-3 méthyl-2 propanol est égale ou ster'ure à 0,2 % (p/v). De plus, l'intérêt d'utiliser une enzyme immobilisée réside dans la possibilité d'opérer en continu et de récupérer l'enzyme. La lipase pancreatique peut être fixée sur: différents supports tels que des silices dont la granulométrie est voisine de ### et le diamètre des pores est compris entre 1000 et 3000 (commercialisées sous le nom de Sphérosil) portant différentes fonctions : iodurest radicaux organiques (amines aromatiques ou aliphatiques, aldéhydes ou les alumines, portant ou non des fonctions iodurés Le support est chois de telle manière que l'actif vité spécifique de l'enzyme immobilisée soit maintenue à un taux suffisammeng élevé par rapport à celle de l'enzyme soluble. Par ailleurs, la lipase adsorbée possède une activité spécifique plus ilWortante que celle immobilisée par covalence.Dans ces conditions, parmi les supports qui conviennent particulièrement bien, peuvent être citéesles silices iodées. La lipase pancréatique purifiée est obtenue à partir d'un extrait enzymatique selon la méthode de R. Verger et coll., Biochim. Biophys. Acta, 188, 262-282 (1969) modifiée par M. Rovery et collez Biochim. Biophys. Acta, 525, 373-379 (1978). L'extrait enzymatique est obtenu à partir de poudre de pancreas délipidée dont on a extrait les protéines (55 % en poids environ) et inhibé les protéases. La fixation de l'enzyme sur le support est généralement effectuée en faisant passer une solution de lipase (lipase purifiée ou extrait pancréatique) sur le support équilibre préalablement à un pH convenable, de préférence compris entre 5,85 et 9 1 la meilleure fixation est obtenue vers le pH correspondant au point isoélectrique de la protéine. L'utilisation de l'extrait enzymatique immobilisé est particulièrement avantageuse car l'activité, ramenée à 1 mg de protéines, est supérieure à celle de l'extrait soluble, la lipase étant immobilisée préférentiellement sur le support. L'enzyme soluble et l'enzyme immobilisée ont sensiblement la même stabilité à la température : elles sont stables jusqu'à 25 C et perdent environ 50 % de leur activité par une incubation de 1 heure à 50 C à pH 8,5. A 25 C, la lipase soluble est stable de pH 5,5 à pH 9,8 tandis que la lipase immobilisée serait légèrement plus stable en milieu acide et moins stable en milieu basique (pH supérieur à 9). La lipase soluble a une activité optimale à une température de l'ordre de 32oc sur le propionate de chloro-3 méthyl-2 propanol tandis que la lipase immobilisée a une activité pptimale vers 4o.c sur le rnftre substrat. La lipase soluble est totalement active sur le propionate de chloro-3 méthyl-2 propanol à des pH compris entre 7,2 et 8,8 à 25 C tandis que la lipase immobilisée a une activité qui augmente constamment de pH 7 à pH 10. Selon la présente invention, l'hydrolyse stéréospécifique des mélanges d'esters de formule générale (I) est réalisée en milieu aqueux. La quantité d'enzyme utilisée pour l'hydrolyse de l'ester de formule générale CI) est généralement choisie de telle manière que la quantité d'acide libéré par minute soit comprise entre 10 et 50 Moles. Le pH du mélange réactionnel est maintenu à la valeur désirée par addition d'une solution aqueuse de soude dont la normalité est telle que le volume ajouté soit de préférence inférieur à 10 % du volume réactionnel. Par ailleurs, la quantité de soude ajoutée pour maintenir la valeur du pH permet de définir le pourcentage d'hydrolyse de l'ester de formule générale (I). Généralement, la réaction d'hydrolyse s'effectue à un pH compris entre 7 et 9 et de préférence voisin de 8,5. Il a été montré que la teneur en chloro-3 méthyl-2 propanol levogyre est une fonction linéaire du taux d'hydrolyse de l'ester de formule générale (I). lorsque ce dernier crott jusqu'à 100 %, le pourcentage isomère lévogyre dans l'alcool obtenu varie de 100 à 50 %. Il est, par ailleurs, particulièrement avantageux d'arrêter la réaction d'hydrolyse lorsque le taux d'hydrolyse est compris entre 20 et 50 Z afin d'obtenir du chloro-3 méthyl-2 propanol suffisamment enrichi en isomère lévogyre. Généralement un taux d'hydrolyse voisin de 40 Z permet d'obtenir du chloro-3 méthyl-2 propanol contenant environ 80 Z isomère lévogyre. Généralement, la teneur en ester de formule générale (i) dans le milieu réactionnel au début de la réaction est compris entre 2 et 30 X. La température du milieu réactionnel au cours de la réaction est en général comprise entre 20 et 40 C et de préférence voisine de 25 C. La durée de la réaction est principalement fonction du taux d'hydrolyse que l'on désire obtenir. Le chloro-3 méthyl-2 propanol et l'ester de formule générale (I) qui n'a pas été hydrolyse peuvent etre séparés du milieu réactionnel après extraction de ce dernier au moyen d'un solvant organique tel que l'éther éthylique ou le chloroforme. La séparation de l'alcool et de l'ester correspondant peut etre effectuée soit par extraction sélective, l'alcool et l'ester n'ayant pas le n9me coefficient de partage entre l'eau et l'hexane soit par chromatographie sur acide silicique en éluant avec un mélange hexane-éther éthylique pour isoler l'ester qui n'a pas réagi puis avec de l'éther éthylique ou du méthanol pour isoler le chloro-3 méthyl-2 propanol. La mesure du pouvoir rotatoire des produits obtenus, par comparaison à celui de l'alcool ou de l'ester purs, permet de déterminer leur pureté optique. Le procédé selon la présente invention permet, en particulier de préparer du chloro-3 méthyl-2 propanol dont la teneur en isomère lévogyre est supérieure à 80 % et de récupérer l'ester du chloro-3 méthyl-2 propanol dont la teneur en isomère dextrogyre est de l'ordre de 70 Z si l > on effectue l'hydrolyse à partir du racémique jusqu'à un taux de 40 Z. Par ailleurs, si le taux d'hydrolyse est plus élevé, par exemple voisin de 80 7., il est alors possible d'obtenir d'une part un mélange des formes actives de l'alcool et d'autre part de l'ester dextrogyre dont la pureté optique est supérieure à 90 %. Par hydrolyse de cet ester en présence d'un excès de lipase, il est possible d'obtenir le chloro-3 méthyl-2 propanol dont la teneur en isomère dextrogyre est supérieure à 90 Z. Les chloro-3 méthyl-2 propanols obtenus selon le procédé de la présente invention sont particulièrement utiles comme intermédiaires dans la synthèse de produits thérapeutiquement actifs, tels que la méthotriméprazine qui est un analgésique puissant. Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, illustrent la présente invention. Dans ce qui suit - l'activité enzymatique est déterminée sur l'huile d'olive selon la méthode de M.F. MAYLIE et coll., Biochem. Biophys. Res. Comn., 52, 291-297 (1973), - le dosage des protéines dans extrait pancréatique est effectué selon la méthode de Lowry et coll., J. Biol. Chem., 193, 266-275 (1951). Par ailleurs, l'unité "lipase" est définie comme la quantité de protéine qui libère 1 iimole d'acide par minute dans les conditions de tests ci-dessus. Exemple 1 fixation des protéines de l'extrait pancréatique sur silice iodée (granulométrie : 100 Il ; diamètre des pores 3000 d) 28 g de silice iodée sont mis en suspension dans 20 cm3 d'un mélange eau-éthanol (50-50) ét la suspension est dégazée. La silice iodée est alors placée dans une colonne et lavée par 20 cm3 d'eau et équilibrée avec 10 à 20 cm3 d'une solution de chlorure de sodium 0,2 M tamponnée par du tétraborate de sodium 0,5 mM à pH 8,5 à 4 C. 20 cm3 d'extrait pancréatique contenant 6,6 mg/cm3 de protéines (activité spécifique sur huile d'olive = 48) sont passés à travers le lit de la colonne à un débit d'environ 20 cm3/heure. Le support est ensuite lavé par 10 cm3 d'eau, puis par une solution de chlorure de sodium 0,2 M et de tétraborate de sodium 0,5 mM à pH 8,5. L'éluat est collecté en fraction de 3 à 5 cm3. Les protéines et l'activité lipasique de chaque fraction est mesurée. Les lavages sont poursuivis jusqu'a obtention de valeurs nulles de ces deux dernières mesures. Les fractions de ltéluat sont réunies (36 cm3). L'élut contient 42,4 mg de protéines (activité spécifique sur huile d'olive = 11). La quantité de protéines retenues est de 89,5 mg soit 29,8 mg/g de silice iodée. L'activité de cette enzyme fixée sur le propionate de chloro-3 méthyl-2 propanol est de 16,5 U/mn/g de support. Exemple 2 fixation de la lipase pancréatique sur silice iodée (Rr?nulometrie 100 p , diamètre des portes 1250 R) En opérant comme à l'exemple 1 et en utilisant une solution de lipase pancréatique purifiée (17 mg/cm3, 13 cm3, activité specifique sur huile d'olive 2200) et 2 g de silice iodée, on obtient après les lavages décrits à l'exemple 1, 8,25 mg de lipase immobilisée par g de silice iodée dont 'activait sur propionate de chloro-3 méthyl-2 propanol est d'environ 85 U/mn/g de support. exemple 3 - Hydrolyse du propionate de chloro-3 méthyl-2 propanol par extrait pancréatique immobilisé sur silice iodée comme décrit à l'exenple 1 2 cm3 de propionate de chloro-3 méthyl-2 propanol sont émulsifiés par agitation dans 30 cm3 de chlorure de sodium 0,2 M tamponné par du tétraborate de sodium 0,5 inH à pll 8,5, à 250C. On ajoute 8 cm3 d'une suspension contenant la lipase ifln)obilisée sur silice iodée de l'exemple 1 (2,8 g de support). L'agitation est maintenue à un niveau suffisant pour réaliser une bonne homogénéisation du milieu. Le pll du milieu réactionnel est maintenu à pH 8,5 par addition de soude 2,15 N en contrôlant à l'aide d'un pH-stat. La réaction est arrêtée par refroidissement dans la glace. On ajoute en 145 minutes 2210 cm3 de soude 2,15 N (soit un taux d'hydrolyse de 37,2 %). Les produites, propionate de chloro-3 méthyl-2 propanol et chloro-3 méthyl-2 propanol sont extraits par 3 fois 30 cm3 d'éther éthylique. Après évaporation du solvant à une température inférieure à 200C, le résidu est repris par 5 cm3 d'hexane et la solution est chromatographiée sur une colonne contenant 20 g d'acide silicique (diamètre : 2 cm ; hauteur : il cm). A un débit de 70 à 80 cm3/heure, on élue d'abord par 150 cm3 d'un mélange hexane-éther éthylique (90-10 en volumes). Après évaporation du solvant on obtient 1155 mg de propionate de chloro-3 méthyl-2 propanol (rendement 88 %) dont le pouvoir rotatoire spécifique est de + 4,30 à 589 nm (c = 10, hexane). Cet ester contient 67 X d'isomère dextrogyre. On élue ensuite par 70 cm3 d'éther éthylique. Après évaporation du solvant on obtient 443 nlg de chloro-3 méthyl-2 propanol (rendement 86 % de la théorie) ayant un pouvoir rotatoire spécifique de -12,6a à 589 um (c = 10, hexane). Cet alcool contient environ 89 % d'isomère lévogyre. Le support, récupéré et lavé, possède 80 7. de son activité initiale. Exemple 4 - Hydrolyse du propionate de chloro-3 méthyl-2 propanol par la lipase pancréatique immobilisée sur silice iodée comme preparée à ltexemnle 2. On opère comme à l'exemple 3 en utilisant 2 cm3 de propionate de chloro-3 méthyl-2 propanol émulsifiés dans 33 cm3 d'une solution de chlorure de sodium 0,2 M contenant 0,5 mM de tétraborate de sodium à pH 8,5 et à 25 C. On ajoute 5 cm3 d'une suspension contenant 0,575 g de silice iodée comme préparée à l'exemple 2. La réaction est maintenue à pH 8,5 par addition d'une solution de soude 2,15 N. On ajoute ainsi 2,215 cm3 de soude en 135 minutes le taux dthydrolyse est de 37,5 %. Après extraction et séparation sur une colonne d'acide silicique comme indiqué à l'exemple 3 on obtient - 1008 mg de propionate de c loro-3 méthyl-2 propanol (rendement 77 %) ayant un pouvoir rotatoire spécifique de + 5,cl à 589 nm (c = 10, hexane).Cet ester contient environ 69,5 % d'isomère d'extrogyre et - 400 mg de chloro-3 méthyl-2 propanol (rendement 77 7. de la théorie) ayant un pouvoir rotatoire spécifique de - 10,40 à 589 nm (c = 10, hexane). Cet alcool contient environ 82,5 Z d'isomère lévogyre. Exemple 5 - Hydrolyse de l'acétate da chloro-3 méthyl-2 propanol par la lipase pancréatique ineobilisée sur silice iodée comme préparée à l'exemple 2. 1 cm3 d'acétate de chloro-3 méthyl-2 propanol est émulsifié dans il cm3 d'une solution de chlorure de sodium 0,2 H, contenant 0 5 nH de tétraborate de sodium à 250C. On ajoute 8 cm3 d'une suspension contenant 0,70 g de silice iodée de l'exemple 2. Après 70 minutes de réaction, il a été rajouté 2,76 cm3 de solution de soude N pour maintenir le pH à 8 ; le taux d'hydrolyse est de 39,2 Z. Après extraction par l'éther éthylique et séparation sur colonne d'acide silicique, on obtient 528 mg d'acétate de chloro-3 méthyl-2 propanol (rendement 82 % de la théorie) ayant un pouvoir rotatoire spécifique de + 4,450 à 589 nm (c voisin de 10, hexane) et 249 mg de chloro-3 méthyl-2 propanol (rendement 84 % de la théorie) ayant un pouvoir rotatoire spécifique de - 10,10 à 589 nm (c voisin de 10, hexane). Cet alcool contient 81,5 Z d'isomère lévogyre. Exemple 6 - Obtention de chloro-3 méthyl-2 propanol (isomère dextrogyre) 2,638 g de propionate de chloro-3 méthyl-2 propanol sont émulsifiés dans 15 cm3 d'une solution de chlorure de sodium 0,2 M contenant 0,5 M de tétraborate de sodium à pH 8,25 à 280C. L'hydrolyse est commencée en ajoutant au milieu réactionnel 2 cm3 d'extrait pancréatique (60 mg de protéines par cm3 dont l'activité spécifique sur huile d'olive est de 40). Au cours de la réaction il est ajouté 3 fois 0,8 cm3 d'extrait pancréatique. Après 7 heures de réaction, il a été ajouté 4,750 cm3 d'une solution de soude 2,73 N pour maintenir la pH à une valeur de 8,25 ; le taux d'hydrolyse est de 81 Z. les produits sont extraits par 3 fois 30 cm3 d'éther éthylique et les produits sont séparés sur une colonne contenant 33 g d'acide silicique. Après évapo raton des solvants des fractions éluées, on obtient 450 mg de propionate de chloro-3 méthyl-2 propanol (rendement 90 Z de la théorie) ayant un powoir rotatoire spécifique de + 10,4 O à 589 nm (c voisin de 10, hexane) ce qui correspond à 90, 5 Z en isomère dextrogyre et 1190 mg de chloro-3 méthyl-2 propanol (rendement 85 % de la théorie) ayant un pouvoir rotatoire spécifique de - 3,550 à 589 nm (c voisin de 10, hexane),(ce qui correspond à 63 X en isomère lévogyre).L'ester ainsi récupéré est soumis à une hydrolyse par la lipase pancréatique immobilisée sur 0,6 g de silice iodée préparée comme à l'exemple 2 jusqu'à disparition totale de l'ester ciest-à-dire jusqu'à ltobtention d'un pH constant et qu'une nouvelle addition de lipase ne provoque pas une nouvelle variation de pH. L'extraction du chloro-3 méthyl-2 propanol est faite par 3 fois 20 cm3 d'éther éthylique. Après évaporation on obtient 240 mg de chloro-3 méthyl-2 propanol ce qui correspond à un rendement de 81 Z de la théorie ayant un pouvoir rotatoire spécifique de + 13, 15. à 589 nm (c = 10, hexane) ce qui correspond à 91 Z en isomère dextrogyre. Ce produit contient 4 mg de propionate de chloro-3 méthyl-2 propanol. REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation du chloro-3 méthyl-2 propanol optiquement actif, caractérisé en ce que l'on effectue une hydrolyse stéréospécifique d'un ester de formule générale dans laquelle R représente un radical alcoyle contenant 1 à 17 atomes ae carbone au moyen de lipase pancréatique ininobilisée sur support, et isole les produits obtenus. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support est constitué par de la silice dont la granulométrie est voisine de 100 p et le diamètre des pores est compris entre 1000 et 3000 A portant des fonctions iodurés. 3 - procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que lthydrolyse est effectuée à un pH compris entre 7 et 9. 4 - procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que l'hydrolyse est effectuée à une température comprise entre 20 et 40oC. 5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le taux d'hydrolyse est compris entre 20 et 40 % et que le chloro-3 méthyl-2 propanol est isolé avec une teneur de 90 % à 80 % en isomère lévogyre. 6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le taux d'hydrolyse est voisin de 80 % et que l'ester défini à la revendication 1 est isolé avec teneur en isomère dextrogyre supérieure à 90 X, 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'ester obtenu est à son tour hydrolysé pour obtenir le chloro-3 méthyl-2 propanol dont la teneur en isomère dextrogyre est supérieure à 90 %.