FR 2424960 A1 19791130 FR 7813327 A 19780505 La présente invention concerne une lipase de provenance microbienne susceptible d'être activée par les sels biliaires et dont les caractéristiques sont nouvelles, ainsi qu'un procédé pour sa préparation et une culture biologiquement pure pour produire cette lipase microbienne. On entend ici par lipase de provenance microbienne ou "lipase microbienne" une lipase produite par un micro-organisme. La lipase microbienne selon l'invention présente les caractéristiques suivantes 1) le optimal d'activité est d'environ 9+ 0,5, 2) la température optimale d'activité est d'environ 400C à environ 480C, 3) l'activité lipasique est activée par les sels biliaires, 4) elle presente une activite cholestérol-estérasique, et 5) son poids moléculaires est d'-environ 30 x 1Q4 à environ 40 x 104. On connaît des procédés de préparation de lipase microbienne qui utilisent divers micro-organismes, en particulier des bacteries et par exemple des micro-organismes appartenant aux genres Pseudomonas, Chromobacterium, Achromobacterium, Staphylococcus, Brevibacterium et Corynebacterium. La demanderesse a effectué des recherches approfondies pour tenter de mettre au point une lipase ayant un pH optimal d'activité dans la région alcaline ét pouvant titre activée par les sels biliaires. Ces recherches ont conduit à la découverte du fait que la souche FERM-P nO 3187 d'Alcaligenes sp. PL-266 Meito déposée à- l'institut de Recherches sur les Fermentations, Ministère des Sciences et Technologies Industrielles, Japon qui est un micro-organisme appartenant au genre Alcaligenes que la demanderesse a isolé du sol, est capable de produire une lipase ayant un pH optimal d'activité dans la région alcaline et qui peut être activée par les sels biliaires.La demanderesse a déposé la demande de brevet japonais publiée nO 21 387/77 qui décrit les caractéristiques microbiologiques de cette souche et les caractéristiques enzymatiques de la lipase produite. A la suite d'autres recherches, la demanderesse a isole une espece différente appartenant au même genre, à partir du sol de la banlieue de Tokyo, Japon. Elle a ensuite découvert que ce micro-organisme extrait capable de produire une lipase ayant un pH optimal d'activité dans la rétion alcaline et qui peut être activée par les sels biliaires, mais qui diffère de la lipase décrite dans la demande publiée précitée et qui est plus utile que celle-ci. La demanderesse a également séparée la lipase produite par cette nouvelle souche: Ce nouveau type de lipase a une activité cholestérolestérasique que ne possède pas la lipase précédemment décrite, en plus de son activité lipasique.Par suite de cette activité, cette lipase est également utile comme réactif de diagnostic, notamment pour déterminer les teneurs en cholestérol. La quantité de lipase produite par le micro-organisme nouvellement découvert atteint par exemple environ 2000 unités/ml du filtrat du bouillon de culture, ce qui est bien supérieur à la quantité de lipase produite par le micro-organisme décrit dans la demande de brevet publiée précitée qui est d'environ 320 unités/ml du filtrat du bouillon de culture. L'invention constitue donc un progrès technologique dans le domaine des lipases présentant un pH optimal dans la région alcaline et que l'on peut administrer par voie orale à l'homme ou à des animaux, comme eupeptique par exemples et qui sont activées par la bile dans l'intestin (suc intestinal alcalin}. L'invention a donc pour objets - un nouveau type de lipase microbienne présentant des avantages remarquables - un procédé de préparation de cette lipase microbienne; et - une culture biologiquement pure utile pour produire cette lipase microbienne D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description qui suit. La souche Alcaligenes sp. PL-679 Meito utile pour préparer la lipase microbienne de l'invention est déposée à l'institut de Recherches sur les Fermentations, Ministère des Sciences et Technologies Industrielles, Japon, sous la référence FERM-P no 3783. La même souche a été déposée à l'American Type Culture Collection, USA, sous le numéro ATCC 31371. La souche a été également déposée à la Collection Allemande de Micro-organismes, Allemagne, sous le n de dépOt DSM 1239. TSes propriétés microbiologiques de la souche Alcaligenes sp. PL-679 sont les suivantes A. Caractéristiques morphologiques Bâtonnets ; 0,5 à 0,7 x 1,O à 4,0 m ; séparés ou éventuellement en channes de 2 à 4 éléments sur gélose nutritive ou en bouillon nutritif. Pas de pléomorphisme. Mobiles grace à 1 à 6 flagelles péritriches. Pas de formation de spores. Gram négatif. Culture abondante avec formation de colonies rouges sur la gélose au cristal violet. Pas d'acido-résistance. B. Caractéristiques culturales Colonies sur gélose nutritive : circulaires, rugueuses, lacérées, translucides, brun jaunâtre avec un centre brun. Pas de production d'un pigment diffusible. Gélose nutritive inclinée : colonies ayant tendance à se propager ou à former-des prolongements pointus, translucides, résineuses, orangé à brun jaunâtre. Bouillon nutritif : culture abondante, brun jaunâtre, trouble avec pellicule et sédiment. Culture par piqûre sur gélatine : filiforme, pas de liquéfaction. Culture abondante, brun jaunâtre à la surface du milieu. Lait tournesolé : alcalin. Pas de peptonisation. Pomme de terre : culture abondante, orangée devenant brun clair. C. Caractéristiques physiologiques Production de nitrites à partir des nitrates. Pas de production de gaz sur le bouillon au nitrate en conditions anaérobies. Test du rouge de méthyle négatif. Test de Voges-Proskauer négatif. Pas de production d'indol. Production diacide sulfhydrique Pas d'hydrolyse de l'amidon. Utilisation des citrates comme seule source de carbone gélose de Koser et gélose de Christensen). Utilisation des nitrates et des sels d'ammonium comme seules sources azote il n'y a pas de production dun pigment diffusible sur la gélose nutritive a la gélatine nutritive ou la gélose glucosée a la pomme de terre. Production dGun pigment brun pale diffusible sur gélose A de King et gélose de Czapek-Dox. Production d'un pigment diffusible faiblement coloré en brun jaunâtre sur gélose B de Ring Pas de production d'uréase. Oxydase positive. Catalase positive Gamme des pH de culture culture entre 5,5 et 11,0. Pas de culture en dessous de 5,0 ou au-dessus de 12O. Gamme des températures de culture : culture entre 5 C et 40 C. Culture optimale entre 150C et 350C. Aérobie Test oxydation-fermentation o pas de production d'acide ni de gaz en tubes ouverts ou fermés. A partir du D-fructose et du glycérol, formation d'un acide (après une période de latence), mais pas de production de gaz dans le milieu d'oxydation-fermentation de Hugh et Leifson en tubes ouverts. Pas de production d'acide ni de gaz a partir du L-arabinose, du D-xylose, du D-glucose, du D-mannose, du D-galactose, du maltose, du saccharose, du lactose, du tréhalose, du D-sorbitol, du D-mannitor, de l'inositol ou de l'amidon en tubes ouverts ou fermés. D. Autres caractéristiques Production d'une lipase. Pas de production-de céto-3 lactose. Production faible d'ammoniac a partir de l'arginine. Teneur en G + C de 1'ADN : 66,7 moles% On a étudié la classification de la présente souche dont les caractéristiques microbiologiques viennent d'être exposées, selon le Manual of Determinative Bacteriology, 8ème édition (1 974) de Bergey et on a déterminé qu'elle appartenait au genre Alcaligenes. Le manuel de Bergey ne décrit aucun microorganise connu du genre Alcaligenes présentant les caractéristiques microbiologiques ci-dessus et de plus la présente souche diffère de la souche Alcaligenes sp. PL-266 Meito décrite dans la demande de brevet précitée. Donc la présente souche a été appelée Accaligenes sp. PL-679 Meito. Les différences principales entre la souche Alcaligenes sp. PL-679 Meito utile pour préparer la lipase microbienne de l'invention et la souche PL-266 Meito décrite dans la demande de brevet antérieure figurent dans le tableau 1 ci-après. VOIR TABLEAU PAGE SUIVANTE T A B L E A U I Caractéristiques Souche PL-266 Meito Souche PL-679 Meito (utilisée dans l'in vention) Calories sur entières, blanc gri- lacérées, brun jaunâtre gélose nutritive # sâtre ou jaune ou brun grisâtre Gélose nutritive blanc grisâtre ou orange ou brun jaunâtre inclinée jaune grisâtre Bouillon nutritif - pas de trouble pas trouble avec pellicule de pellicule Culture en piqûre cratériforme deve- pas de liquéfaction sur gélatine nant stratiforme Lait tournesole peptonisation pas de peptonisation Réduction des # négative positive nitrates Production d d'acide positive (faible) positive sulfhydrique Test OF oxidation ni oxydation ni fermen tation Assimilation des sucres L-arabinose positive négative D-xylose " " D-glucose " " D-mannose " " D-galactose inositol " maltose saccharose " lactose I' .. tréhalose " " D-sorbitol " " mannitol .. K Teneur en G+C de 1'ADN 74,2 moles % 66,7 moles z On peut préparer la lipase microbienne présentant les caractéristiques (13 à (5) précédemment indiquées, qui n'a jamais été précédemment décrite dans a littérature, de la façon suivante. On cultive en aérobiose un micro-organisme appartenant au genre Alcaligenes, capable de produire la lipase microbienne présentant les caractéristiques (1) à (5) précédemment indiquées, dans un milieu de culture nutritif contenant des sources de carbone et d'azote et des composés minéraux à une température d'environ 50C à environ 400C, de préférence d'environ 100C à environ 40 C, à un pH d'environ 5,5 à environ 11 et de préférence d'environ 6 à environ 10 et on recueille la lipase microbienne dans le bouillon de culture obtenu. L'invention concerne également une culture biologiquement pure d'Alcaligenes sp. PL-679 Meito présentant les caractéristiques des souches déposées sous les références FERM-P nO 3783, ATCC 31373 et DSM 1239 et capable de produire une lipase microbienne pouvant être activée par les sels biliaires et présentant les caractéristiques (1) à (5) précédemment décrites, obtenue par fermentation aérobie dans un milieu de culture nutritif contenant des sources de carbone et d'azote et des composés minéraux à un pH d'environ 5,5 à environ 11 et de préférence d'environ 6 environ 10 et à une température d'environ 5- C à environ 400C, de préférence d'environ 100C à environ 400C. La source de carbone, la source d'azote et les composés minéraux peuvent être l'une quelconque des matières généralement utilisées pour la culture des micro-organismes. La source de carbone peut par exemple être constituée de glucose, de fructose, de maltose, d'amidon soluble, d'amidon, de dextrine, de mélasse, de glycérol, d'huiles et de graisses, de son de blé, de lactose et de saccharose. Les sources d'azote sont constituées par des composés azotés organiques ou minéraux tels que la poudre de soja, la poudre de soja dégraissée, un résidu de graines de coton, un résidu de colza, une peptone, de l'extrait de viande, de l'extrait de levure, du gluten, de l'infusion de mats, du Casamino acid, de l'urée, des sels d'ammonium et des sels de type nitrate.On peut citer comme exemples de composés minéraux les sels de type phosphate a les sels de magnésium, les sels de fer, les sels de potassium; les sels de sodium et les sels de calcium. Si on le désire, on peut ajouter au milieu de culture diverses autres substances organiques ou minérales utiles pour la croissance des micro-organismes ou la production des enzymes, telles que des huiles de silicone a des anti-mousses, des vitamines et des composés phosphorés. Lorsquaon incorpore un agent tensio-actif non ionique au milieu de culture nutritif de l'invention, on peut accroStre faclhenizt a quantité de lipase microbienne produite. On peut également accroître la production de lipase microbienne de l'invention par emploi de sels capables de libérer des ions fer tels que le chlorure de fer et le sulfate de fer en association avec les sels de sodium dt acides organiques tels que lacétate de sodium ou le citrate de sodium. La quantité dtagent tensio-actif non ionique que lBon utilise est comprise entre environ 0,01 et environ 2 % en poids par rapport au poids du milieu de culture nutritif. On peut citer comme exemples d'agents tensio-actifs non ioniques, les esters allyliques de sorbitane, les esters alkyliques de polyoxyéthylène-sorbitane, les éthers alkyliques de polyoxyéthylène, les éthers alkylaryliques de polyoxyéthylène, les esters alkyliques de polyoxyéth'jlène, un copolymère de polyoxyéthylène et de polyoxypropylene et les monoglycérides diacides gras. On effectue la culture en conditions aérobies et on peut utiliser une technique de culture submergée ou une technique de culture en surface. Cependant généralement la culture submergée est préférable. Dans l'industrie, il est avantageux d'effectuer une culture submergée avec aération et agitation. Un procédé approprié consiste à effectuer une préculture à petite échelle et à ensemencer un milieu de culture principal avec le bouillon de culture obtenu. Les conditions de culture varient quelque peu selon par exemple la nature de la souche utilisée et la composition du milieu de culture. Il est souhaitable de choisir les conditions les plus avantageuses pour la production de la lipase constituant le produit final. La température de culture est généralement d'environ 50C à 400C, de préférence d'environ 100C à environ 40cC. On préfère particulièrement des températures de 200C à 300C. La durée de culture varie selon les conditions, mais elle est généralement d'environ 1 à environ 4 jours. On peut arrêter la culture lorsque la quantité de lipase accumulée atteint un maximum. Le pH du milieu de culture peut être compris entre une acidité faible et l'alcalinité lors de la préparation du milieu de culture. Généralement il n'est pas nécessaire d'ajuster particu lièrement le pH. De façon générale, le pH du milieu de culture est compris entre environ 5,5 et environ 11 et de préférence entre environ 6 et environ 10 et mieux entre environ 7 et environ 10. On peut effectuer la culture en ajustant le pH dans les gammes précitées à la demande. On peut recueillir la lipase microbienne de l'invention dans le bouillon de culture obtenu selon des procédés connus utilises pour la séparation et la purification de la lipase. En particulier dans le cas de la culture en surface, on extrait le bouillon de culture par l'eau ou un autre agent d'extraction pour former un extrait. Dans le cas de la culture submergée, on sépare les cellules microbiennes ou les constituants solides du bouillon de culture selon des techniques connues de filtration ou de centrifugation pour obtenir un extrait ou un filtrat. On peut utiliser l'extrait ou le filtrat tels quels ou après concentration lorsqu'on traite l'extrait, le filtrat ou leur produit de concentration selon des techniques connues telles que la précipitation, le séchage par pulvérisation ou la lyophilisation, on peut obtenir là lipase microbienne de l'invention sous forme d'un produit solide.Les agents précipitants appropriés utilisés dans le procédé de précipitation sont par exemple des sels solubles tels que le chlorure de sodium, le sulfate d'ammonium et le sulfate de sodium, et des solvants organiques hydrophiles tels que l'éthand, le méthanol et l'acétone. Des adjuvants de stabilisation appropriés utilisés dans la technique de séchage par pulvérisation sont la maltodextrine, le lactose, la carboxyméthylcellulose, le polyéthylèneglycol, le lait écrémé, la caséine, le sorbitol et le chlorure de sodium. De plus on peut recueillir la lipase produite selon l'invention et présentant la pureté et l'activité lipasique désirées selon une ou plusieurs techniques connues de purification telles que l'adsorption et l'élution avec des résines échangeuses d'ions, un gel de phosphate de calcium, de l'alumine ou de la bentonite ; un procédé utilisant un tamis moléculaire tel que le Sephadex ou le Biogel ; un procédé chromatographique utilisant la cellulose ou un échangeur d'ions de type Sephadex; un procédé de précipitation utilisant un agent précipitant les protéines tel qu'un tannin et des sels de calcium ; un procédé de précipitation au point iso-électrique ; un procédé de dialyse ; et un procédéd' électrophorèse. A la connaissance de la Demanderesse, la lipase microbienne de l'invention est caractérisée par (1) un pH optimal d'activité d'environ 9 + 0,5, (2) une température optimale d'activité d'environ 400C à environ 480C, (3) une activité lipasique activée par les sels biliaires, (4) une activité cholestérol-estérasique, et (5) un poids moléculaire d'environ 30 x nta jamais été décrit dans la littérature. Les lipases (fractions I et II) décrites dans la demande de brevet japonais publiée précitée sont très semblables à la nouvelle lipase microbienne de l'invention. Cependant on peut nettement distinguer la lipase microbienne de l'invention des lipases I et II par les caractéristiques (2), (4) et (5) précédemment décrites et également par les différences -des caractéristiques d'inhibition de l'activité. Le tableau II résume les caractéristiques de la lipase microbienne de l'invention par rapport à celles des lipases I et Il de la demande précitée. (voir tableau page suivante) TABLEAU 2 Lipase de la demande de brevet japonais publiée Caractéristiques Lipase de N 21 387/77 l'invention Lipase I Lipase II Activité lipasique + + + Activité cholestérol estérasique + - Activité lipoprotéine lipasique + + + pH optimal d'activité 9 # 0,5 9 + 0,5 10 + 0,5 Température optimale d'activité 40-48 C 70-75 C 70-80 C Poids moléculaire 34x104-37x104 18 # 1x104 3,2x104-3,7x104 Inhibition de l'acti- inhibée par vité par Cd++ (10-20%) Hg++, Fe++, Zn++, inhibée mais non par Sn++, Cd++ ou Cr++ (plus de pas inhibée les autres (concentration, 10- 50 %) ions métal mole) liques Inhibition de l'acti- inhibée vité par l'ascorbate (plus de pas inhibée pas inhibée de sodium 50 %) (concentration, 10- mole) Inhibition de l'acti vité par l'acide inhibée mono-iodoacétique (plus de pas inhibée pas inhibée (concentration, 50 % 10- mole) Les caractéristiques enzymatiques de la lipase microbienne de l'invention sont décrites en détails ci-après. Dans la présente description on effectue les mesures et les déterminations de ces caractéristiques de la façon suivante - Préparation des échantillons On separe le mycélium et les autres matières solides par filtration du bouillon de culture. On refroidit le filtrat à environ 50C et on ajoute au filtrat du sulfate d'ammonium en agitant jusqu'à 40 % de la saturation. On laisse le mélange reposer à environ 50C pendant 24 heures. On recueille l'enzyme précipitée et on la dialyse contre de l'eau courante à environ 180C pendant 2 jours, avec une membrane de dialyse en cellophane. On soumet le dialysat à une nouvelle dialyse à environ 50C pendant 24 heures contre une solution de tampon Tris (concentration 0,01 M ; pH 9,0). On applique la solution enzymatique dialysée à environ 50C à une colonne échangeuse d'ions de DEAE-cellulose équilibrée suffisamment par du tampon Tris (concentration 0,01 M pH 9,0). On lave ensuite la colonne avec du tampon Tris (concentration 0,01 M ; pH 9,0) et on élue avec du tampon Tris (concentration 0,01 M ; pH 9,0) en portant progressivement la concentration du chlorure de sodium du tampon à 0,4 M. On mesure l'activité de l'effluent et on recueille les fractions actives. On place ensuite les fractions actives dans une membrane de dialyse en cellophane et on concentre avec de la poudre de polyéthylène- glycol. On dialyse le concentré dans de liteau courante à environ 180C pendant 24 heures, comme précédemment décrit et on dialyse à nouveau contre du tampon Tris. On chromatographie à nouveau le dialysat et on concentre à nouveau les fractions actives obtenues, comme précédemment décrit. On centrifuge ensuite le concentré pour éliminer les matières solides. On soumet la solution enzymatique obtenue à une filtration sur gel avec une colonne de Sephadex G-200 en utilisant le meme tampon Tris que précédemment et on recueille les fractions actives. On concentre les fractions actives obtenues et on les centrifuge comme précédemment et on soumet la solution enzymatique obtenue à une filtration sur gel comme précédemment avec une colonne de Sepharose 4B. On obtient ainsi un échantillon purifié. Avec cet échantillon purifié on détermine et mesure les caractéristiques (1) à (7) de la façon suivante. (4) Activité cholestérol-estérasique On mesure l'activité cholestérol-estérasique selon le mode opératoire décrit par Leschroue et coll. dans Z. Klin. Chem. Klim. Biochem., 12, 403 (1974). (5) Poids moléculaire On mesure et on calcule le poids moléculaire selon la méthode décrite par P. Andrews dans Biochem. J. 91, 222 (1964). On garnit une colonne de 2,5 x 100 cm d'un gel de Sephadex G-200 et on utilise comme standards la catalase (poids moléculaire 240 000) et la ferritine (poids moléculaire : 540 000). On utilise du tampon Tris-HCl 1/100 M (pH 8,7) comme tampon d'élution. (6) Activité lipoprotéine lipasique On détermine l'activité lipoprotéine-lipasique selon la méthode de Saiki et coll. (Agr. Biol. Chem. 32 1459 (1968)). Comme sérum humain, on utilise du plasma humain frais lyophilisé (Miles Laboratories Inc.) et comme huiles et graisses on utilise du Fatgen (produit de Dainippon Pharmaceutical Co,Ltd). (7) Inhibition de l'activité par l'ascorbate de sodium et l'acide mono-iodoacétique Orr met une solution aqueuse de l'échantillon de lipase (environ 3 unités/ml) au contact de chacun des agents inhibiteurs à 370C pendant 10 minutes et on mesure l'activité lipasique. La concentration de l'ascorbate de sodium est de 10 2 mole et celle de l'acide mono-iodoacétique est de 10 3 mole. Les méthodes de détermination des caractéristiques (1), (2) et (3) sont decrites ci-après à propos des caractéristiques enzymatiques de la lipase microbienne de 11 invention. (1) Mode d'action La lipase microbienne de l'invention est unie enzyme qui hyârolise les huiles et les graisses en glycérol et en acides gras et produit des quantités importantes de monoglycêrides comme intermé- diaires lors de l'hydrolyse. (2) Spécificité vis- -vis du substrat Les activités lipasiques de la lipase microbienne de 11 invention sur des huiles et des graisses, ainsi que divers esters, figurent dans le tableau III ci-après où elles sont exprimées en pourcentages par rapport à l'activité observée sur l'huile d'olive. TABLEAU 3 Substrat Activité relative (%) Huile d'olive 100 Méthyl n-butyrate 1 Méthyl n-caproate 3 Méthyl n-caprylate 6 Méthyl n-caprate 6 Méthyl laurate 6 Méthyl myristate 7 Méthyl palmitate 34 Méthyl stéarate - 33 Méthyl oléate 18 Tributyrine 60 Tricaprolne 52 Tricapryline 123 Tricaprine 100 Trioléine 141 Monoléine 86 Monolaurine 40 Dilaurine 75 Trilaurine 128 Span 85 29 Tween 85 20 Huile de ricin 85 Graisses de beurre 53 Comme le montre le tableau III, la lipase microbienne de l'invention agit non seulement sur les esters du glycérol des acides gras supérieurs, tels que les huiles et graisses naturelles, mais également sur des esters solubles dans l'eau, tels que le Tween 85. La lipase microbienne de l'invention agit également sur les esters du cholestérol et des acides gras qu'elle transforme en acides gras et en cholestérol. [3] Gamme optimale de stabilité [détermination de la caractéristique (1)7. On dissout la lipase de l'invention à la concen tration de 2,5 z à 5 U/ml et on étudie le pH optimal. Les résultats sont illustrés par la figure 1 qui montre que l'on observe l'activité maximale à un pH d'environ 9 + 0,5. On maintient la lipase de l'invention à une concentration de 50-100 U/ml dans des tampons à divers pH à C pendant 24 heures, puis on ajuste le pH à 8,6 avec un tampon glycine. On mesure l'activité lipasique résiduelle et on obtient les résultats qui sont illustrés par la figure 2. On voit que la lipase est pratiquement stable dans la gamme des pH d'environ 6,5 à environ 10,5. On utilise le tampon de McIlvaine (acide citrique 1/10 M ; Na2HPO4 1/5 M) pour la gamme de pH de 2,5 à 8,0 ; un tampon tris-maléate 1/5 M pour la gamme de pli de 5;5 à 8,5 ; un tampon Na2oe3-H3B04-KCl 1/10 M pour la gamme des pH de 8,0 à 10,5 ; et un tampon Na2HP04-NaOH 1/5 pour la gamme des pH de Il à 12. [4] Température convenant à l'activité [détermination de la caractéristique (2)]. La gamme des températures convenant à l'activité de la lipase de l'invention est illustrée par la figure 3 qui montre que la température optimale est comprise dans la gamme d'environ 40 à environ 48 C. Le mode de mesure est le suivant. On préchauffe à diverses températures pendant 10 minutes le substrat réactionnel utilisé dans le procédé de détermination de l'activité décrit ci-après et on ajoute 1 ml d'une solution de l'enzyme (concentration 0,01 mg/ml) et on fait réagir pendant 10 minutes à la température de préchauffage. On exprime l'activité aux diverses températures par le pourcentage relatif à l'activité de la lipase à 45 C. ES Conditions d'inactivation par le pli et la température On dissout la lipase dans l'eau à la concentration de 4 U/ml et on maintient la solution à une température de 70 ou 80 C. On examine périodiquement les variations de l'activité de la lipase selon la méthode d'essai décrite ciaprès. Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 4. On voit que le traitement par chauffage à 80 C pendant 30 minutes inactive presque totalement la lipase. On dissout la lipase dans de l'eau à la concentration de 25-50 U/ml et on mélange avec une quantité égale de tampon de Mclîvaine (pli 3,0) ou de tampon Na2HP04-NaOH 1/4 M (pH 12,0). On maintient chacun des mélanges à 370C et on prélève des échantillons à des moments prédéterminés.On dilue les mélanges prélevés au 1/5 avec du tampon glycine 1 M (pH 8,7) et on mesure l'activité de la lipase. A un pH de 3,0, plus de 95 % de l'activité lipasique disparaissent en 10 minutes ; à un pH de 12,0, plus de 95 % de l'activité lipasique disparaissent en 120 minutes. [6] Inhibition On met la lipase à une concentration d'environ 3 U/ml en contact avec divers agents inhibiteurs à 370C pendant 10 minutes, puis on mesure l'activité lipasique. Lorsque la concentration de l'agent inhibiteur est de 10- @ mole, l'activité de la lipase est inhibée de plus de 50 % par les ions Hg++, Fe+++, Zn++, Sn++, Cd++ et Cr+++. De plus l'inhibition est supérieure à 50 % avec de l'ascorbate de sodium 10- M ; d'anviron 100 % avec l'acide mono-iodoacétique 10 3M ; d'environ 10 à environ 20 % avec le ferricyanure de potassium, les sels de type pyrophosphate, l'acide de sodium et l'éthylènediaminetétra-acétate de sodium 10 2 M , d'environ 95 % avec l'iode 10- M , et d'environ 70 % avec l'anhydride éthoxyformique 1O2M. 77 Activation [méthode de détermination de la caractéristique (3)] Dans la détermination de l'activité lipasique décrite au paragraphe [8] ci-après, on dissout divers sels biliaires dans l'eau distillée et on mesure l'activité lipasique. Comme le montre le tableau IV, la lipase de l'invention est nettement activée par les sels biliaires. T A B L E A U 5 pH Tempéra- Facteur Cholestérol Poids Lipopro- Inhibition Micro- ture d'activa- molécu- teine- par les Références organisme optimal optimale tion par estérase laire lipase bibliographiques ( C) les sels réactifs biliaires Chromobacte- Agr. Biol. Chem. rium visco- 37, 999 (1973) ; sum ver. 7,0 65 1,5 - 120 000 Brevet japonais paralipoly- Non - publié N 29787/71 ; tica 30 000 J. Biochem. 81, 1639 (1977) Pseudomonas Brevet japonais stutzeri 9-9,5 - 6-10 - - - - publié N 10754/69 (ATCC 19154) Brevet japonais publié N 17559/75 ; Abstracts of Papers at the 1974 Annual Phycomyces 6-7 40 2 - 26 500# Oui - Meeting of the Agrisp. 500 cultural Chemical Society of Japan ; Abstracts of Papers at the 1977 Meeting of the Central and Agricultural Chemi cal Society of Japan T A B L E A U 5 (suite) pH Tempéra- Facteur Cholestérol Poids Lipopro- Inhibition Micro- ture d'activa- molécu- teine- par les Références organisme optimal optimale tion par estérase laire lipase bibliographiques ( C) les sels réactifs biliaires Yakuzaigaku ("phar Mucor macie") 27 314m. javanicus 7,0 - 2-5 - - - - (1967) ; Eisei73) ; Kagaku ("Chimie hygiénique") 13, 257 (1967) I 8,5-9,5 70-75 2 Non 180 000 Oui non inhibé Demande de brevet # 10 000 par l'acide japonais publiée Alcaligenes ascorbique et N 21387/77 sp. PL-266 l'acide mono Meito iodoacétique II 9,5-10,5 70-80 2 Non 32 000- Oui 37 000 Alcaligenes sp. PL-679 inhibé par (Meito 8,5-9,5 40-48 2 Oui 300 000- Oui l'acide dans l'in- 400 000 ascorbique et vention) l'acide mono iodoacétique Les activités figurant dans le tableau ci-dessus sont des pourcentages déterminés par rapport à l'activité lipasique en l'absence de sels biliaires. Z ç Détermination de l'activité a) Composition d'un mélange réactionnel Solution enzymatique 1,0 ml Tampon glycine (1 M ; pH 8,7) 2,0 ml Emulsion d'huile d'olive 2,5 ml Eau distillée 0,5 ml Pour préparer l'émulsion d'huile d'olive, on ajoute 20 g d'huile d'olive à 180 ml d'une solution aqueuse à 10 % de gomme arabique, on homogénéise le mélange à 11 000 tr/mn pendant 15 minutes en le refroidissant entre 5 et 10 Oc, puis on ajuste le pH du mélange homogénéisé à 8,7. b) Mode opératoire On place le mélange réactionnel dans un tube de 25 ml muni d'un bouchon de verre et on fait réagir~pendant 10 minutes à 370C. On arrête ensuite la réaction par addition de 1 ml d'acide sulfurique 2N et on ajoute 15 ml d'un mélange 11/4 d'heptane normal et d'isopropanol. On agite énergiquement le mélange pendant 30 secondes et on laisse reposer pendant plus de 30 minutes. On recueille 5 ml de la couche supérieure et on titre sous azote avec une solution d'hydroxyde de potassium 0,01 N dans l'méthanol avec du bleu de thymol comme indicateur. On ajoute une solution d'acide sulfurique 2 N à un mélange réactionnel want la même composition que ci-dessus, puis on ajoute la solution enzymatique. On traite le mélange comme précédemment et on titte le produit obtenu avec une solution d'hydroxyde de potassium et on soustrait la valeur mesurée de la valeur mesurée précédemment obtenue. On calcule la quantité d'acide gras libérée à partir du titrage en se reportant à une courbe d'étalonnage préparée avec une quantité connue d'acide palmitique. Par définition, une unité lipasique est la quantité d'enzyme qui libère I Mmole d'acide gras en 1 minute dans les conditions de détermination précédemment décrites. Z f Procédé de purification On peut purifier la lipase de l'invention par relargage, chromatographie d'échange ionique sur cellulose et filtration sur gel, ces techniques étant employées séparément ou en combinaisons apprôpriées Un mode de réalisation de purification est illustré par lexemple 5 Comme précédemment décrit, les propriétés de la lipase de l'invention sont très semblables à celles de la lipase pancréatique d'origine animale, en particulier en ce qui concerne le pH optimal (alcalin) de l'activité et l'activation par les sels biliaires. La lipase de l'invention est également capable de décomposer les esters de cholestérol (c'est-à-dire qu'elle présente une activité cholestérol-estérasique). On ne connaissait pas à ce jour de lipase produite par un micro-organisme du genre Alcaligenes qui présente cette propriété. Le tableau V résume les caractéristiques de la lipase de l'invention et permet de les comparer à celles de lipases microbiennes connues susceptibles d'être activées par les sels biliaires. Comme le montre le tableau 5, les lipases produites par Chromobacterium viscosum, Phycomyces sp. et Mucor javanicus sont semblables à la lipase de l'invention en ce qui concerne l'activation par les sels biliaires, mais les pH optimaux de ces lipases sont dans la région neutre et elles diffèrent donc de la lipase microbienne de l'invention. La lipase produite par Pseudomonas stutzeri diffère de la lipase de l'invention en ce qui concerne l'activation par les sels biliaires et son pH optimal diffère nettement de celui de la lipase de l'invention (voir figure 1). La lipase de l'invention diffère également de la lipase produite par Alcaligenes sp. PL-266 Meito précédemment décrite par la demanderesse en ce qui concerne la température optimale d'activité et l'activité cholestérol-estérasique. Comme le montre le tableau 2, il existe également des différences relatives par exemple au poids moléculaire et à l'inhibition par les ions métalliques. On peut utiliser la lipase microbienne de l'invention dans une grande diversité d'applications, par exemple comme médicament et comme réactif de diagnostic et également pour produire des acides gras, du glycerol et des monoglycérides, pour ameliorer la saveur du lait, améliorer la qualité du pain et des galettes, l'utiliser pour le traitement des eaux résiduaires et l'ajouter à des agents de tannage du cuir, des agents pour le rinçage des cheveux, des produits de bain, des produits pour le lavage du visage et des aliments pour animaux. De plus, comme la lipase microbienne de l'invention a un pH optimal dans la région alcaline et peut être activée par les sels biliaires, elle présente l'avantage lorsqu'on l'admi nitre par voie orale comme eupeptique par exemple, d'être activée par les -sels biliaires du suc intestinal et de présenter ainsi un accroissement de son activité. La lipase microbienne de l'invention décompose bien les lipoprotéines des aliments car elle a une activité lipoprotéine-lipasique. Lorsqu'on utilise la lipase de l'invention comme eupeptique, on peut l'administrer par voie orale à la dose de 1 000 à 8 000 U/jour, par exemple. Comme réactif de diagnostic, on peut l-'utiliser pour déterminer la teneur en cholestérol dans le sang à raison de 0,1 à 2;0 U de cholestérol-estérase par détermination.De plus, lorsqu'on utilise 100 à 1 000 U de lipoprotéine-lipase par détermination, on peut doser la teneur en triglycérides du sang. Lorsqu'on administre la lipase de l'invention à des rats à la dose de 2,5 ou~S,Q g/kg pendant un mois ou à la dose de 2,5 g/kg pendant 3 mois, selon une technique d'ingestion naturelle, pour en déterminer la toxicité subaiguë, on n'observe pas de changements du comportement général, des fèces, des urines, des examens hématologiques, des constatations à l'autopsie et du poids des organes. On n'observe pas de changements notables à l'examen histologique. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 Dans des flacons à agitation de 500 ml, on introduit 50 ml d'un milieu de culture constitué de 3 % de poudre de soja, 1 % de poudre de soja dégraissée, 1 % d'infusion de malus, 0,5 % de phosphate dipotassique et 0,25 % de nitrate de sodium dont on a ajusté le pH à 8,0 et on stérilise le milieu de culture par la vapeur d'eau à 1200 C pendant 15 minutes. On ensemence les milieux avec Alcaligenes sp. PL-679 Meito (souche FERM-P nO 3783) et on cultive en agitant à 300 C pendant 40 heures. On centrifuge le bouillon de culture et on mesure l'activité lipasique du liquide surnageant qui est de 50 U/ml. On ajoute du sulfate d'ammonium à 50 % de la saturation à 100 ml de bouillon de culture. On recueille le précipité formé et on le sèche pour obtenir 1,5 g de poudre enzymatique brute ayant une activité lipasique de 2 560 U/g. Exemple 2 On reprend le mode opératoire de l'exemple 1 si ce n'est qu'on ajoute 0,5 % de l'ester oléylique du sorbitane au milieu de culture. L'activité lipasique du liquide sur-nageant obtenu après centrifugation du bouillon de culture est de 351 U/ml. On recueille 1,4 g de poudre enzymatique comme dans l'exemple 1 à partir du bouillon de culture. L'activité lipasique de cette poudre est de -16 000 U/g. Exemple 3 On ajuste à 9,5 le pH d'un milieu de culture liquide contenant 3 % de poudre de soja, 0!5 % de poudre de soja dégraissée, 0,5 % d'infusion de maïs, 0,1 % d'amidon de blé, 0,2 % de phosphate dipotassique, 0,5 % d'éther stéarylique de polyéthylène, 1,0 % de nitrate de sodium et 0,075 % de silicone. On introduit 50 ml du milieu de culture dans un flacon à agitation de 500 ml et on stérilise à la vapeur d'eau à 1200 C pendant 15 minutes. On ensemence avec Alcaligenes sp. PL-679 Meito (souche FERM-P nO 3783) et on cultive en agitant à 300 C pendant 40 heures, puis on filtre le bouillon de culture. On constate que le filtrat a une activité lipasique de 500 U/ml, une activité cholestérol-estérasique de 3,7 U/ml et une activité lipoprotéine-lipasique de t55 U/ml. A 500 ml de filtrat, on ajoute de lracétone froide à la concentration de 80 %. On recueille le précipité, on lave avec de l'acétone froide et on sèche sous vide à la température ordinaire pour obtenir 12,5 g de poudre enzymatique brute.La poudre a une activité lipasique de 13 200 U/g, une activité cholestérol-estérasique de 99 U/g et une activité lipoprotéine-lipasique de 4 100 U/g. Exemple 4 A 15 litres du milieu de culture décrit dans l'exemple 3, on ajoute 0,4 % de citrate de sodium et 0,028 % de sulfate ferreux, puis on place le mélange dans un fermenteur de 30 litres. Comme antimousse, on ajoute 5 g d'une huile de silicone et on stérilise le mélange à la vapeur d'eau. On ensemence le milieu de culture ainsi préparé avec Alcaligenes sp. PL-679 Meito (souche FERM-P nO 3783) et on cultive en aérant et en agitant à 240 C pendant 38 heures. On filtre le bouillon de culture pour obtenir 12,0 litres d'un filtrat ayant une activité lipasique de 800 U/ml. L'absorbance de ce filtrat à 280 nm est de 100. Le filtrat a une activité cholestérol-estérasique de 6 U/ml et une activité lipoprotéinelipasique de 25Q U/ml. On ajoute du sulfate d'ammonium d-2,4 litres de ce filtrat à 40 % de la saturation, puis on laisse le mélange reposer à 50 C pendant 24 heures. On décante le liquide surnageant et on recueille le précipité par centrifugation. On recueille environ 73 % de l'activité lipasique dans le précipité formé par addition de sulfate d'ammonium. Exemple 5 On place le précipité obtenu dans exemple 4 par addition de sulfate dsammonium dans un tube de cellophane et on dialyse dans l'eau courante pendant deux jours, puis à 50 C pendant 24 heures contre du tampon Tris 0,01 M ayant un pH de 9,0. On filtre le dialysat pour obtenir 1,3 litre d'une solution enzymatique ayant une activité lipasique de 1 020 U/ml et une absorbance de 28,5 à 280 nm. On applique la solution enzymatique à une colonne échangeuse d'ions constituée de DEAE-cellulose convenablement équilibrée avec du tampon Tris 0,01 M ayant un pH de 9,0. On lave la solution enzymatique absorbée avec le même tampon et on élue avec du tampon Tris (0,01 M, pH 9,0) dont la concentration en chlorure de sodium staccrolt progressivement jusqu'à 0,4 M. Les fractions à activité lipasique sont éluées pour une concentration en chlorure de sodium comprise entre 0,05 et 0,2 M. On mesure l'activité et on recueille les fractions actives. an concentre les fractions recueillies et on les soumet à une filtration sur gel avec du Sephadex G-200, puis du Sepharose 4B et on recueille les fractions actives. On soumet les fractions actives recueillies à une nouvelle dialyse et à une nouvelle chromatographie sur une colonne de DEAE-cellulose On élue les fractions actives avec un gradient de concentration de chlorure de sodium. On concentre les fractions ayant une activité lipasique et on les lyophilise pour former 293 g d'une poudre de lipase purifiée. Une solution aqueuse à 0,1 % de la poudre enzymatique purifiée a une absorbance de 0,43 à 280 nm. La poudre enzymatique a une activité lipasique de 890 U/mg, une activité cholestérolestérasique de 6,6 U/mg et une activité lipoprotéine-lipasique de 275 U/mg. La lipase a une gamme optimale du pH d'environ 9 + 0,5 et une température optimale d'environ 450 C. On peut environ doubler son activité d'origine avec 0,2 % de taurocholate de sodium. Le poids moléculaire est d'environ 35 x 104. L'ascorbate de sodium inhibe l'activité de cette lipase à environ 52 % et l'acide mono-iodoacétique à environ 98 %. Exemple 6 On introduit dans un flacon à agitation de 500 ml, 50 ml d'un milieu de culture liquide contenant 3 % de poudre de soja, 1 % de fructose, 0,2 % de phosphate de potassium, 1 % de nitrate de sodium, 06 % de citrate de sodium! 0,03 % de sulfate ferreux heptahydraté, 0,5 % d'éther stéarylique du polyéthyleneglycol et 0,2 % d'un antimousse et on stérilise par la vapeur d'eau à 1200 C pendant 15 minutes. On ensemence le milieu de culture stérilisé avec Alcaligenes Sp. PL-679 Meito (souche FERM-P nO 3783) et on cultive en agitant à 250 C pendant 42 heures . On centrifuge le bouillon de culture et on mesure l'activité enzymatique du liquide surnageant. On constate une activité lipasique de 2 000 U/ml, une activité cholestérol-estérasique de 15 U/ml et une activité lipoprotéine-lipasique de 625 U/ml. A 100 ml du liquide surnageant obtenu, on ajoute 400 ml d'acétone froide. On recueille le précipité obtenu, on le déshydrate par l'acétone et on le sèche sous vide à 250 C pour obtenir 1,8 g d'une poudre enzymatique ayant une activité lipasique de 77 000 U/g, une activité cholestérol-estérasique de 585 U/g et une activité lipoprotéine-lipasique de 24 000 U/g. REVENDICATIONS 1. Lipase de provenance microbienne, caractérisée en ce qu'elle présente (1) un pH optimal d'activité d'environ 9 + 0,5, (2) une température optimale d'activité d'environ 40 à 480 C, (3) une activité lipasique activée par les sels biliaires, (4) une activité cholestérol-estérasique, et (5) un poids moléculaire d'environ 30 x 104 à 40 x 104. 2. Lipase microbienne selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente en outre une activité lipoprotéino-lipasique. 3. Lipase microbienne selon la revendication I ou 2, caractérisée en ce qu'elle a une activité cholestérol- estérasique d'au moins 300 U/g à l'état brut et d'au moins 6 600 U/g à l'état purifié. 4. Lipase microbienne selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que, de plus, son activité est inhibée à au moins environ 50 * par l'ascorbate de sodium à la concentration de 10- M et l'acide mono-iodoacétique à la concentration de 10 3 M. 5. Lipase microbienne selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est produite par un micro-organisme du genre Alcaligenes capable de la produire. 6. Lipase microbienne selon la revendication 5, caractérisée en ce que le micro-organisme présente des caractéristiques permettant de l'identifier comme une souche d'Alcaligenes sp. PL-679 Meito. 7. Lipase microbienne selon la revendication 6, caractérisée en ce que le micro-organisme est la souche Alcaligenes sp. PL-679 Meito, FERM-P n 3783, la souche Alcaligenes sp. PL-679 Meito ATCC 31371 ou la souche Alcaligenes sp. PL-679 Meito DSM 1239. -8, Procédé de préparation de la lipase microbienne selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver en aérobiose un micro-organisme du genre Alcaligenes capable de produire cette lipase microbienne dans un milieu de culture nutritif contenant une source de carbone, une source d'azote et des composants minéraux, à un pH d'environ 5,5 à environ 11 et à une température d'environ 50 C à environ 400 C et à recueillir la lipase microbienne dans le bouillon de culture obtenu. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le milieu de culture renferme de pLus un agent tensioactif non ionique. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérise en ce que la quantité d'agent tensio-actif non ionique est d'environ 0,01 à environ 2 % en poids par rapport au poids du milieu de culture nutritif. 11. Culture biologiquement pure d'Alcaligenes sp. PL-679 Meito présentant les caractéristiques d'identification des souches FERM-P nO 3783, ATCC 31371 ou DSM 1239 et capable de produire une lipase microbienne pouvant être activée par les sels biliaires et ayant (1) un pH optimal d'activité d'environ 9 + 0,5, (2) une température optimale d'activité d'environ 40 C à environ 480 C, (3) une activité lipasique activée par les sels biliaires, (4) une activité cholestérol-estérasique, et (5) un poids moléculaire d'environ 30 x 10 à environ 40 x 10 , par fermentation aérobie dans un milieu de culture nutritif contenant une source de carbone, une source d'azote et des constituants minéraux à un pH d'environ 5,5 à environ 11 et à une température d'-environ 50 C à environ 400 C.