FR 2420542 A1 19791019 FR 7807933 A 19780320 La présente invention concerne un procédé d'immobilisation d'une enzyme industrielle du type présure par adsorption sur support organique insoluble. La présure est utilisée en industrie laitière. Le terme de présure désigne les enzymes coagulant extraites des caillettes de jeunes veaux non sevrés. Elle est constituée de chymosine et de pepsine. Le substrat spécifique de la présure est la K - caséine. L'intérêt de la présure fixée se situe au niveau du traitement en continu du lait avec formation du caillé en deux phases : une phase enzymatique primaire d'hydrolyse spécifique de la K - caséine et une phase secondaire correspondant à la polymérisation des micelles qui aboutit à la formation d'un coagulum. L'immobilisation d'enzymes industrielles est étudiée notamment en vue d'accroitre leur stabilité et de réaliser une économie de consommation de ces enzymes. Les différentes méthodes de fixation peuvent être regroupées en trois catégories : l'adsorption, l'inclusion et la fixation par liaison covalente. On a proposé l'immobilisation par liaisons covalentes de présure ou d'enzymes à activité voisine, ainsi que celle de rennine - présure purifiée - sur aminoéthylcellulose et de pepsine sur verre poreux en vue de leur application dans le traitement du lait en continu. Certaines de ces fixations ont été réalisées avec plues ou moins de succès et l'adsorption s'est révélée etre la technique de choix pour immobiliser les enzymes industrielles. De plus, on comprendra que diverses méthodes déjà expérimentées soient difficilement applicables en industrie laitière dans la mesure où elles font appel à des réactifs chimiques toxiques devant être en contact avec les produits alimentaires. On a recherché à associer la présure, enzyme bon marché, à un support d'insolubilisation également peu couteux et dont l'emploi soit compatible avec les exigences de l'industrie fromagère, en vue d'obtenir un complexe présure - support dont l'activité enzymatique soit stable. I1 a été trouvé un procédé d'immobilisation simple d'une enzyme industrielle du type présure par adsorption sur support organique selon lequel la présure est fixée sur une résine adsorbante synthétique macroporeuse, dite de qualité alimentaire, dont le diamètre moyen des pores est supérieur à 500 Angstroems. Les complexes enzymatiques enzyme - support macroporeux, obtenus par le procédé de l'invention, sont actifs et stables alors que les complexes formés avec des supports de meme nature chimique, mais du type "gel", ctest-à-dire avec des pores de diamètre moyen 40 Angstroems, ne présentent aucune activité enzymatique. L'immobilisation sur résine macroporeuse est surtout un phénomène d'adsorption,et il a été remarqué que les résines adsorbantes synthétiques macroporeuses, dont le diamètre moyen des pores est au moins égal à 1.300 Angstroems, conduisent à de très bons résultats. Les résines macroporeuses convenant à la réalisation du procédé peuvent être des résines phénoliques ou des résines du type résine macroréticulée échangeuse cationique fortement acide. Parmi les résines du type macroréticulée, les résines polymères de styrène divinylbenzène échangeuse cationique fortement acide, notamment constituées par 20 % en poids de divinylbenzène et dont le groupe fonctionnel est Si, , sont particulièrement intéressantes. Il est avantageux d'utiliser une résine échangeuse sous forme sadique pour éviter les trop fortes modifications de pH du milieu au cours de la fixation. Selon le procédé, la résine est mise en contact avec l'enzyme en solution. Le contact entre la résine et l'enzyme est assuré par tous moyens adaptés pour obtenir le meilleur effet sans attrition de la résine, tels mise en mouvement de la résine ou de la dilution d'enzyme, et agitation du milieu de fixation ... La présure est diluée en milieu aqueux, tamponné de manière telle que le pH du milieu pendant l'immobilisation de la présure sur le support soit toujours maintenu entre 4 et 6,5. A un pH inférieur à 4, la fixation devient insuffisante. Au-dessus d'un pH de 6,5, l'on peut craindre une dégradation importante de l'enzyme. Toutefois, avec des temps de contact relativement courts, on peut envisager de réaliser la fixation à un pH de 6,5 voisin du pH moyen du lait, ce qui permet d'éviter une désorption ultérieure de l'enzyme au cours du traitement du lait. Il parait avantageux de choisir une zone de p11 au voisinage du point isoélectrique de la présure, c'est-à-dire entre 4,5 et 4,8. La température du milieu pendant la fixation de la présure sur le support est comprise entre 15 et 370C. L'immobilisation de l'enzyme est favorisée par l'élévation de la température et la durée de fixation peut être relativement brève; le maximum de fixation étant obtenu après au moins deux heures de mise en contact. On a remarqué que l'efficacité du procédé est accrue en travaillant en solution d'au moins 6 unités présure U.P. par ml. L'unité présure est définie comme étant la quantité d'enzyme qui peut coaguler 10 ml de substrat standard en 100 secondes à 300C dans les conditions de l'essai (méthode de Berridge). Il a été considéré comme avantageux, du point de vue rendement de fixation et efficacité du complexe enzymatique, de mettre en contact l'enzyme avec le support macroporeux à raison d'au moins 6 U.P. par gramme de résine humide. A des teneurs moindres en enzyme par rapport au support, l'activité du complexe enzymatique devient trop faible. Après fixation, on procède au lavage du complexe enzymatique actif par de l'eau, éventuellement par du lait,et enfin par une solution contenant des ions calcium, telle une solution de chlorure de calcium. Ce dernier traitement est particulièrement important, notamment dans le cas d'un support constitué par une résine échangeuse, car il évite toute interférence du support macroporeux avec les ions calcium du lait L'excès de calcium est éliminé par lavage à l'eau. La conservation du complexe enzyme-supE rt netst aisée et de pré- CdntelPaTlt férence elle s'effectue dans une solution diluée/des ions calcium, telle une solution de chlorure de calcium notamment quand le support est une résine échangeuse, et une solution tampon notamment quand le support est une résine adsorbante. La température de conservation du complexe est de ltordre de quelques degrés centigrades. La technique de fixation, selon l'invention, permet d'obtenir un dérivé enzymatique actif stable qui peut etre utilisé dans une colonne à lit fixe, thermostatée à 150C environ pour traiter le lait en continu. A cette température, on réalise l'hydrolyse de la K-caséine, le coagulum étant formé dans un autre réacteur à une température de l'ordre de 30 C. Le dérivé enzymatique peut également être utilisé dans un réacteur à lit fluidisé en milieu liquide. Il est donné, ci-après, des exemples qui illustrent l'invention à titre non limitatif. EXEMPLE 1. a./ Préparation du complexe enzymatique par fixation de présure sur résine macroporeuse échangeuse. La présure industrielle est un extrait de présure vendue sous la marque commerciale "Hansen" dans laquelle 27 microlitres d'extrat contiennent une unité présure U.P., telle que définie précédemment. La résine est une résine macroporeuse échangeuse cationique fortement acide, sous forme sodique, macroréticulée, dont la matrice est un polymère de styrène divinylbenzène (20 % de divinylbenzène en poids), dont le groupe fonctionnel est S03, vendue sous la marque commerciale "Amberlite 200" par la Société RHOH et HAAS. Le diamètre des pores est au moins égal à 1.300 A. Avant fixation, la résine est soumise au traitement classique de préparation. On met en suspension 20 g de résine dans 20 ml de préparation enzymatique contenant 37 U.P. par ml, obtenue par dilution au demi de l'extrait de présure "Hansen" dans un tampon citrate-phosphate 0,2 M, pH 4,6. On maintient en contact sous agitation pendant trois heures à la température de 200C. On sépare le complexe enzymatique par gravité et on lui fait subir la série d'opérations suivantes constituées par un lavage pendant 15 minutes par dix fois 100 ml d'eaubidistilée un lavage par trois fois deux litres de lait reconstitué avec des temps de contact de respectivement 12 heures, 5 heures et 5 heures, puis, pour éviter les échanges Ca++ du lait avec les sites de la résine, un lavage par deux fois 100 ml de chlorure de calcium M . Le complexe est conservé à + 40C dans une up solution de chlorure de calcium M . L'activité du complexe est de 0,1 200 U.P. par gramme de support. b./ Etude de la stabilité du complexe "Amberlite 200" présure en réacteur continu. On teste la stabilité du complexe enzymatique préparé par l'intermédiaire de petites colonnes à lit fixe alimenté en continu par du lait standard pH 6,5. Ces colonnes possèdent une double enveloppe permettant une thermostatation à 15 C correspondant à la phase primaire d'hydrolyse spécifique de la K - caséine. Ensuite, on mesure périodiquement à 300C l'aptitude à la coagulation correspondant à la phase secondaire de polymérisation des micelles qui aboutit à la formation d'un coagulum. Une colonne contenant 30 g de complexe "Amberlite 200" présure à 0,1 U.P./g et alimentée avec un débit de 1,5 1/heure de lait standard a fonctionné en continu 6 heures sans perte d'activité. La figue 1 du dessin annexé correspondàltétudede la stabilité du complexe, les temps de coagulation T.C. exprimés en heures sont portés en ordonnées et les durées de fonctionnement continu D en heures sont portées en abscisses. Le temps de coagulation entre 1 heure et 6 heures de fonctionnement est de l'ordre de 15 minutes. Ces essais montrent que l'immobilisation confère à zyme des propriétés nouvelles, en particulier une stabilité plus grande. L'activité de la présure fixée est stable en fonctionnement continu. EXEMPLE 2. a./ Préparation du complexe enzymatique, fixation de présure sur résine adsorbante. La préparation enzymatique est obtenue par dilution de la présure commerciale "Hansen" dans les conditions de ltexemple 1 à tamponnée à pH 4,6. La résine est une résine adsorbante phénolique vendue sous la marque commerciale " Duolite ES 762" par la Société DIA PROSIM, dont le diamètre des pores est supérieur à 500 ss. Elle est préparée de manière classique. On met en suspension 150 g de résine adsorbante phénolique dans 150 ml de préparation enzymatique, on laisse en contact sous agitation à température de 300C pendant 2 heures 30. On sépare le complexe enzymatique, puis il est lavé à l'eau bidistillée et au lait dans les mêmes conditions que précédemment. Ensuite, on le conserve à + 40C dansm mélange tampon citrate - phosphate à pH Gi 45. L'activité du complexe est de 0,1 U.P par gramme de support. b./ Etude de la stabilité du complexe "Duolite ES 762" pré sure en réacteur continu. On teste la stabilité du complexe dans un appareillage identique à celui de l'exemple t, avec une thermostatation à + 150C pour la première phase et à + 300C pour la phase secondaire de coagulation. Chaque colonne contient 10 g de complexe, elle est alimentée par du lait standard p11 6,5 avec un débit de 425 ml/heure. Les résultats sont reportés sur la figure 2 du dessin annexé, le temps de coagulation TC en heures est indiqué en ordonnées et la durée du traitement en continu D en heures et les quantités correspondantes de lait traité exprimées en litres sont indiquées en abscisses. Pendant les six premières heures de fonctionnement continu, le temps de coagulation est de l'ordre de 15 minutes et après une durée de 30 heures de fonctionnement continu correspondant à 12,75 litres de lait traité, le temps de coagulation est encore inférieur à 1 heure. EXEMPLE 3. a./ Préparation d'un complexe enzymatique par fixation de présure sur résine adsorbante. La préparation enzymatique est obtenue par dilution d'un extrait de présure commerciale "Hansen" par un tampon acide citriquephosphate. La résine est la résine adsorbante phénolique macroporeuse vendue sous la marque commerciale "Duolite S 37" par la Société DIA PROSE dont le diamètre des pores est supérieur à 500 . La résine est préparée avant fixation de manière classique. On met en suspension 10 g de résine humide dans une solutin de 10 ml de présure, constituée par 5 ml de présure commerciale "Hansen" et 5 ml de tampon acide citrique-phosphate pH 6,5. La durée de contact sous agitation est de 3 heures à la température du laboratoire, voisine de 200C. Après séparation, le complexe enzymatique est soumis à huit lavages avec 20 ml d'eau bidistillée, puis à quatre lavages avec 20 ml de lait et à deux lavages avec le tampon citrate-phosphate p11 = 6,5. On conserve le complexe présure-résine "Duolite S 37" à + 40C dans 20 ml du tampon pH 6,5. L'activité du complexe est de 0,1 U.P. par gramme de support. b./ Etude de l'activité présure. L'activité présure (mesure du temps de coagulation) d'un échantillon a été testé périodiquement, dans les mêmes conditions que précédemment. On teste la stabilité du complexe avec 1 g de complexe pour 10 ml de lait en mesurant l'activité à + 30 C. Le même échantillon a été testé 14 fois et les résultats sont consignés dans le tableau ci-dessous. Essai Temps de coagulation en nues 2 45 3 25 4 20 5 45 6 30 7 30 8 25 9 18 10 25 11 26 12 27 13 25 14 26 La lecture du tableau met en évidence la bonne stabilité du complexe présure "Duolite S 37 ". REVENDICATIONS 1. Procédé d'immobilisation d'une enzyme industrielle du type présure par adsorption sur support organique insoluble, caractérisé en ce que la présure en solution est fixée sur une résine adsorbante synthétique macroporeuse, dite de qualité alimentaire, dont le diamètre moyen des pores est supérieur à 500 Angstroems. 2. Procédé d'immobilisation d'une enzyme industrielle du type présure selon la revendication 1, caractérisé en ce que le diamètre moyen des pores de la résine synthétique adsorbante macroporeuse est au moins égal à 1.300 Angstroems. 3. Procédé d'immobilisation de présure selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la résine macroporeuse synthétique est du type macroréticulée échangeuse cationique fortement acide, tel un polymère de styrène divinylbenzène. 4. Procédé d'immobilisation de présure selon la revendication 3, caractérisé en ce que le polymère styrène divinylbenzène est constitué par environ 20 % en poids de divinylbenzène , le groupement fonctionnel étant SO 3 5. Procédé d'immobilisation de présure selon la revendication 1, caractérisé en ce que la résine adsorbante synthétique macroporeuse est une résine phénolique. 6. Procédé d'immobilisation de présure selon une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la présure est diluée en milieu aqueux tamponné de manière telle que le pIT du milieu pendant la fixation de la présure sur le support soit toujours maintenu entre 4 et 6,5; de préférence entre 4,5 et 4,8. 7. Procédé d'immobilisation de présure selon une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la température de fixation de la présure sur le support est comprise entre 15 et 370 C. 8. Procédé d'immobilisation de présure selon une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le support et la solution d'enzyme sont mis en contact pendant une durée d'an moins deux heures. 9. Procédé d'immobilisation de présure selon une quelconque des revendications t à 8, caractérisé en ce que la solution d'enzyme contient au moins 6 unités présure U.P. par ml et en ce que ladite enzyme est mise en contact avec le support macroporeux à raison d'au moins 6 unités présure U.P. par gramme de résine humide. 10. Procédé d'immobilisation de présure selon une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le complexe enzymatique actif précédemment obtenu est lavé à l'eau avec une solution contenant des ions calcium ou une solution tampon. 11. Complexe enzymatique actif et stable obtenu selon une quelconque des revendications 1 à 10,conservé dans une solution diluée, contenant des ions de calcium ou une solution tampon. 12. Application en industrie fromagère du complexe enzymatique actif et stable1 préparé selon une quelconque des revendications 1 à 9, au traitement en continu du lait sur une colonne en lit fixe constitué par ledit complexe enzymatique ou en lit fluidité.