FR 2422717 A1 19791109 FR 7831350 A 19781106 L'information génétique est codée sur l'acide désoxyribonucléique a deux chaînes ("AND" ou "gènes") selon l'ordre dans lequel la chaîne de codage de l'ADN présente les bases caractéristiques de ses motifs nuclétidiques. L' "expression" de l'information codée pcur former des polypeptides implique un processus en deux parties. Selon les instructions de certaines régions de commande ("régulons") dans le gène, l'ARN-poly- mérase peut être amenée à se déplacer le long de la chaîne de codage, en formant 1'ARN (acide ribonucléique) messager dans un processus appelé "transcription". Dans une étape ultérieure de "traduction", les ribosomes des cellules, en conjonction avec 1'ARN transfert, transforment le "message" de 1'ARN m en polypeptides.Sont inclus dans l'information que 1'ARN m transcrit de l'ADN, les signaux de départ et d'arrêt de la traduction ribosomique, ainsi que l'identité et l'ordre des amino-acides qui constituent le polypeptide. La chaîne de codage de l'ADN comprend de longues séquences de triplets nuclétidiques appelées "codons" parce que les bases caractéristiques des nucléotides dans chaque triplet ou codon codent des données spécifiques d'information. Par exemple, 3 nucléotides lus comme ATG (adénine-thymine-guanine) donnent un signal de l'ARN m interprété comme "traduction début" alors que les codons de fin TAG, TAA et TGA sont interprétés "traduction arrêt ou stop". Entre -les codons de départ et d'arrêt se trouve le gène dit de structure dont les codons définissent-la séquence d'amino-acides finalement traduite. Cette définition se fait selon le "code génétique" bien connu (par exemple J.D. Watson, Molecular Biology of the Gene W.A. Benjamin Inc., N.Y., 3rd ed. 1976) qui décrit les codons pour les différents amino-acides. Le code génétique est dégénéré au sens que différents codons peuvent donner le même amino-acide, mais précis en ce que pour chaque amino-acide existent un ou plusieurs codons pour lui seul et pour aucun autre. Par exemple, tous les codons TTT, TTC, TTA et TTG, quand ils sont lus tels quels, codent la sérine et aucun autre amino-acide. Pendant la transcription1 la phase de lecture ou le schéma de lecture approprié doit être maintenu. Considérons par exemple ce qui se produit quand 1'ARN-polymérase transcripteur lit des bases différentes comme début d'un codon (souligné) dans la séquence . . CCTCGTTGTAAG..: GCT GGT TGT AAG . . Ala-Gly-Cys-Lys . . Go CTG GTT CTA AC. . Leu-Val-Leu . . . . GC TGG TTG TAA A . . . Trp-Leu-(STOP). Le polypeptide finalement produit dépend donc essentiellement de la relation spatiale du gène de structure par rapport au régulon. On aura une meilleure compréhension du processus de l'expression génétique une fois que certaines composantes du gène auront été définies : Operon -- un gène comprenant un ou des gènes de structure pour l'expression des polypeptides, et la région de commande ("régulon") qui régule cette expressicn. Promoteur -- un gène dans le régulon, auquel l'ARN-polymérase doit se lier pour le démarrage de la transcription. Opérateur -- un gène auquel peut se lier une protéine répressive, en empêchant ainsi l'ARN-polymerase de se lier au promoteur adjacent. Inducteur -- une substance qui désactive la protéine répressive, en libérant l'opérateur et en permettant à polymérase de se lier au promoteur et de commencer la transcription. Site de liaison d'une protéine activatrice catabolite ("PAC") -- un gene qui lie ou fixe la PAC "médiée" par le monophosphate d'adénosine cyclique ("AMP c"), également souvent nécessaire au démarrage de la transcription. Le site de liaison de PAC peut ne pas être nécessaire dans des cas particuliers. Par exemple, une mutation du promoteur dans l'opéron lactose du phage > plac UVS élimine la nécessité de la présence de AMPc et de PAC pour l'expression. J. Beckwith et al, J. Mol. Biol 69, IS5-160 (1972). Système promoteur-opérater -- tel que défini ici, une région de commande "opérationnelle" d'un opéron, eu égard ou non à l'inclusion d'un site de liaison de PAC dans cette région ou à son aptitude au codage pour l'expression d'une protéine répressive. On donnera également les définitions suivantes utilisées en particulier dans la-discussion de l'ADN recombinant. Vecteur de clonage -- ADN à double chaîne non chromosomique comprenant un "duplicon" intact de telle sorte que le vecteur est dupliqué, quand il est placé dans un organisme unicellulaire ("microbe") par un processus de "transformation". Un organisme ainsi transformé est appelé un "transformant". Plasmide -- pour les besoins de la présente invention, un vecteur de clonage dérivé des virus ou des bactéries, ces derniers étant des "plasmides bactériens". Complémentarité -- une propriété conférée par les séquences de bases de 1'ADN à une seule chaîne qui permet la formation de 1'ADN à deux chaînes par liaison hydrogène entre les bases complémentaires de chaque chaîne. L'adénine (A) est le complément de la thymine (T), et la guanine (G) est le complément de la cytosine (C). Les progrès en biochimie au cours des dernières années ont permis la construction de vecteurs de clonage "recombinants" dans lesquels, par exemple, les plasmides sont faits de façon à contenir de 1'ADN exogène. Dans des cas particuliers, le recombinant peut inclure de 1'ADN "hétérologue", ce qui signifie de l'ADN qui code des polypeptides normalement non produits par l'organisme susceptible de transformation par le vecteur recombinant. Ainsi, on coupe les plasmides pour donner de 1'ADN linéaire ayant des terminus ou extrémités ligaturables. Ils sont liés à un gène exogène ayant des extrémités ligaturables pour donner-un groupement fonctionnel, au point de vue biologique, avec un duplicon intact et une propriété phénotype désirée.La partie recombinante est insérée dans un micro-organisme par transformation et les transformants sont isolés et clonés, avec pour but d'obtenir des populations abondantes pouvant exprimer la nouvelle information génétique. Les méthodes et les moyens de formation de vecteurs de clonage recombinants et d'organismes transformants à partir d'eux sont largement décrits dans la littérature. Voir par exemple H.L. Heynecker et al, Nature 263, 748-752 (1976) ; Cohen et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1972) ; ibid., 70, 1293 (1973) ; ibid., 70, 3240 (1973) ibid., 71, 1030 (1974) ; Morrow et al, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 71, 1743 (1974) ; Novick, Bacteriological Rev., 33r 210 (1969) Hershfield et al, Proc. Soc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 71, 3455 (1974) et Jackson et al, ibid, 69, 2904 (1972). Une discussion générale du sujet se trouve dans S. Cohen, Scientific American 233,. 24 (1975). Ces publications et les publications auxquelles elles se réfèrent sont incorporées ici par voie de référence. On dispose de diverses techniques pour la recombinaison de 1'ADN, selon lesquelles les extrémités contiguës de fragements d'ADN séparés sont adaptées d'une façon ou d'une autre pour faciliter la ligature. Ce dernier terme se referme à la formation de liaisons phosphodiester entre les nucléotides contigus, le plus souvent par l'intermédiaire d'une enzyme, la T4 ADN ligase. Ainsi, les extrémités inertes peuvent être directement ligaturées. Ou bien, des fragments contenant des chaînes uniques complémentaires à leurs extrémités contiguës sont avantagés par une liaison hydrogène qui positionne les extrémités correspondantes pour une ligature ultérieure.De telles chaînes uniques, appelées "extrémites cohésives" (ou encore terminus cohésifs), peuvent être formées par l'addition de nucléotides à des extrémités inertes en utilisant la transférase terminale, et parfois simplement en détruisant une chaîne d'une extrémité inerte par une enzyme comme la h-exonuclase. Egalement, et le plus souvent, on a recours à des endonucléases de restriction, qui coupent les liaisons phosphodiester dans et autour des séquences uniques de nucléotides d'une longueur d'environ 4 à 6 paires de bases. On connaît un grand nombre d'endonucléases de restriction et leurs sites de reconnaissance, l'endonucléase dite Eco RI étant la plus largement utilisée. Les endonucléases de restriction qui coupent l'ADN -à double chaîne aux "palindromes" de symétrie de rotation laissent des extrémités cohésives. Ainsi, on peut couper un plasmide ou un autre vecteur de clonage, en laissant des extrémités qui comportent chacune la moitié du site de reconnaissance de l'endonucléase de restriction.Un produit de coupure de 1'ADN exogène obtenu avec la même endonucléase de restriction aura des extrémités complémentaires de celles du plasmide. Ou bien, comme décrit ci-dessous, de 1'ADN synthétique comportant des extrémités cohésives peut être fourni pour l'insertion dans le vecteur coupé. Pour empêcher la réunion des extrémités cohésives des vecteurs pendant l'insertion de 1'ADN exogène, on peut faire digérer les extrémités par la phosphatase alcaline, en fournissant une sélection moléculaire des produits fermés incorporant le fragment exogène.L'incorporation d'un fragment ayant l'orientation appropriée par rapport aux autres aspects du vecteur peut être améliorée quand le fragment supplante 1'ADN vecteur excisé par deux endonucléases de restriction différentes et que lui-même comporte des extrémités constituant respectivement la moitié de la séquence de reconnaissance des endonucléases differentes. En dépit de travaux importants au cours des dernières années dans la recherche sur l'ADN recoSbinant, peu de résultats susceptibles d'applications immediates et pratiques ont été obtenus. Ceci s'est révélé vrai en particulier dans le cas des essais sans succès pour exprimer des polypeptides et des composés similaires codés par 1' "ADN synthétique", qu'il soit construit nucléotide par nucléotide de la manière classique ou obtenu par transcription inverse à partir d'ARN in (complémentaire ou "ADNc") isolé. La présente demande de brevet décrit ce qui apparaît représenter la première expression d'un polypeptide fonctionnel à partir d'un gene synthétique, ainsi que les diverses mises au point qui promettent une large application.Le polypeptide produit auquel on se réfère est la somatostatine (brevet des E.U.A. -N0 3 904 594 de Guillemin), un inhibiteur de la sécrétion de l'hormone de croissance, de l'insuline et du glucagon dont les effets suggèrent l'application dans le-traitement de l'acromégalie, de la pancréatite aiguë et du diabète dépendant de l'insuline Voir R. Guillemin et al, Annual Rev. Med. 27, 379 (1976). Le modele de la somatostatine montre clairement les possibilités d'application des nouveaux développements décrits ici sur de nombreux fronts, comme on le verra d'après les dessins et plus clairement d'après la description détaillée qui suit. Les dessins annexés illustrent un contexte dans lequel les modes de réalisation préférés de l'invention trouvent application, c'est-à-dire l'expression de l'hormone, la somatostatine pour les Figures 1 à 7 et l'insuline humaine pour les Figures 8 ét 9, par des transformants bactériens comprenant des plasmides recombinants. Fiaure 1 : Schéma du processus : le gène de la somatostatine, préparé par synthèse chimique d'ADN, est fusionné au gène de la S-galactosidase de E. coli sur le plasmide pBR322. Après transformation dans E. coli, le plasmide recombinant dirige la synthèse d'une protéine précurseur qui peut être spécifiquement coupée ffn vitro aux restes méthionine par le bromure de cyanogène en donnant l'hormone polypeptidique active chez les mammifères. A, T, C et G notent les bases caractéristiques (adénine, thymine, cytosine et guanine) des désoxyribonucléotides de la chaine de codage du gène de la somatostatine. Figure 2 : structure schématique d'un gène synthétique dont la chaîne de codage (c'est- -dire la chaîne 11supérieure") comprend les codons de la séquence d'amino-acides de la somatostatine (donnée). Figure 3 : Illustration schématique d'une méthode préférée pour la construction de trimères nuclétidiques utilisés dans la construction de genes synthétiques. Dans la notation conventionnelle utilisée pour décrire les nucléotidesdanslaFigure3, le 5' OH est a gauche et le 3' OH est à droite, par exemple Figure 4 : Schéma de construction d'un plasmide recombinant (par exemple pSOM11-3) pouvant exprimer une protéine contenant de la somatostatine ("SOM"), en partant du plasmide parental pBR322. Sur la Figure 4, le poids moléculaire approximatif de chaque plasmide est indiqué en daltons ("d"). Apr et Tcr dénotent respectivement les gènes de la résistance à l'ampicilline et a la tétracycline, alors que Tcs désigne la sensibilité à la tétracycline résultant de l'excision d'une portion du cène Tcr. Les positions relatives des divers sites de coupure spécifiques par des endonucléases de restriction sont indiquees sur les plasmides (par exemple Eco RI, Bam I, etc.). Figures 5A et 5B : Elles représentent les séquences nuclétidiques des portions clés de deux plasmides, ainsi que le sens de la transcription par 1'ARN messager ("ARNm"), qui se fait invariablement à partir de l'extrémité 5' de la chaine de codage. Les sites substrats pour les endonucléases de restriction sont tels qu'indiques. Chaque séquence décrite contient à la fois les éléments de commande de l'opéron lac (lactose), et les codons de l'expression de la séquence d'amino-acides de la somatostatine (en italique). Les nombres de la séquence d'amino-acides pour la S-galactosidase ("ss-aal") sont entre crochets. Figures 6 à 8 : Comme plus particulièrement décrit dans la partie expérimentale ci-dessous, elles donnent les résultats d'expériences de radio-immuno-essais comparatifs qui démontrent l'activité de somatostatine du produit exprimé par les plasmides recombinants. Figure 9 : Structure schématique de gènes synthétiques dont les chaines de codage comprennent les codons des séquences d'amino-acides des chaines A et B de l'insuline humaine. Figure 10 : Schéma de construction d'un plasmide recombinant pouvant exprimer la chaîne B de l'insuline humaine. 1. Préparation de gènes codant le polypeptide hétérologue On peut préparer de 1'ADN codant un quelconque polypeptide dont on connaît la séquence d ' amino-acides, en choisissant les codons selon le code génétique. Pour des facilités de purification, etc., on prépare séparément des fragments d'oligodésoxyribonucléotides ayant d'environ 11 à environ 16 nucléotides par exemple, puis on les assemble dans l'ordre ou la séquence désiré. Ainsi, on prépare une premiere et une deuxième séries de fragments d'oligodésoxyribonucléotides de taille appropriée. La premier surie, une fois réunie dans l'ordre approprié, fournit une chaîne de codage d'ADN pour l'expression du polypeptide (voir par exemple la Figure 2, fragments A, B, C et D). Ladeuxième série, une fois réunie de même dans l'ordre approprié, fournit une chalne complémentaire de la chaîne de codage (par exemple Figure 2, fragments E, F, G et H). Les fragments des chaînes respectivement se chevauchent de préférence de sorte que la complémentarité promeut leur auto-assemblage par liaison hydrogène des extrémités cohésives des fragments. Après assemblage, le gène de structure est complété par ligature de la manière conventionnelle. La dégénérescence du code génétique permet une liberté substantielle dans le choix des codons pour une quelconque séquence d'amino-acides donnée. Pour les besoins présents cependant, le choix des codons est avantageusement guidé par trois considérations. Premièrement, on choisit les codons et les fragments et l'on prévoit l'assemblage par étapes des fragments de façon à éviter une complémentarité indue des fragments les uns par rapport aux autres, sauf pour les fragments adjacents dans le gène recherché. Deuxièmement, on évite les séquences riches en paires de bases AT (par exemple environ cinq ou plus), en particulier quand elles sont précédées par une séquence riche en paires de bases GC, pour éviter un arrêt prématuré de la transcription. Troisièmement, au moins la majeure partie des codons choisis sont ceux.préférés dans l'expression des génomes microbiens (voir par exemple W. Fiers, et al, Nature 260, 500 (1976). Pour les besoins des revendications annexées, on définit les suivants comme des codons préférés pour l'expression des génomes microbiens" TABLEAU I Attribution préférée des codons lere posi- Seconde position 3ème position (ex- (Lire de gauche à droite) tion (ex trémité 5') T C A G trémité 3') Lire vers Lire vers le bas le bas phe --- --- cys T T phe ser tyr --- C leu --- Stop Stop A ser Stop trp G leu pro his arg T C leu pro his arg C leu pro gln --- A --- pro gln --- G ile thr asn --- T A ile thr asn ser C --- --- --- --- A met (départ) thr lys --- G val ala asp gly T G val --- asp --- C val --- glu --- A val ala glu --- G De préférence encore dans le cas de la somatostatine, les relations (codons) pour les amino-acides du gène de structure sont gly (GGT) ; cys (TGT) ; lys (AAG) ; trp (TGG) ; ala (GCT, GCG) ; asn (AAT, AAC) ; phe (TTC, TTT) ; thr (ACT, ACG) ; et ser (TCC, TCG). Quand le gène de structure d'un polypeptide désiré est à insérer dans un vecteur de clonage pour l'expression tel quel, le gene est précédé par un codon "départ" (par exemple ATG) et immédiatement suivi d'un ou plusieurs codons d'arrêt ou stop (voir. la Figure 2). Cependant, comme décrit ci-dessous, la séquence d'amino-acides d'un polypeptide particulier peut etre exprimée avec une protéine additionnelle la précédant et/ou la suivant. Si l'utilisation finale du polypeptide nécessite la coupure de la protéine additionnelle, des sites de coupure appropriés sont codés près de la jonction du polypeptide et du codon de la protéine additionnelle. Ainsi, en prenant la Figure 1 comme exemple, le produit de l'expression est une protéine précurseur comprenant la somatostatine et la plus grande partie du polypeptide qu'est la ss-galactosidase. Ici, ATG n'est pas nécessaire pour coder le debut de la traduction car la construction ribosomique de la protéine supplémentaire, S-gal, se lit dans le gène de structure de la somatostatine.L'incorporation du signal ATG code cependant la production de méthionine, qui est un amino-acide coupé spécifiquement par le bromure de cyanogène, ce qui fournit un procédé facile pour transformer la protéine précurseur en polypeptide désiré. La Figure 2 donne également un exemple d'une autre caractéristique préférée dans 1'ADN hétérologue prévu pour une utilisation de recombinant, c'est-à-dire la fourniture d'extrémités cohésives, comprenant de préférence l'une des deux chaînes d'un site de reconnaissance d'une endonuclease de restriction. Pour les raisons préalablement indiquées, les extrémités sont de préférence conçues pour créer, par recombinaison, des sites de reconnaissance respectivement différents. Bien que les mises au point décrites ici se soient révélées satisfaisantes avec le modele de somatostatine, on verra que l'on peut utiliser, avec les modifications nécessaires, le codage de 1'ADN hétérologue pour pratiquement toute séquence d'amino-acides connue. Ainsi, les techniques décrites ci-avant et ci-après sont applicables, avec les modifications nécessaires, à la production de poly(-amino)acides, comme la polyleucine et la polyalanine enzymes ; de séro-protéines , de polypeptides analgésiques, comme les B-endomorphines, avec & s seuils de douleur modulés, etc. De préférence encore, les polypeptides produits tels quels seront des hormones des mammifères cu leurs intermédiaires.Parmi ces hormones, on peut mentionner, par exemple, la somatostatine, l'insuline humaine, l'hormone de croissance de l'homme et de boeuf, l'hormone de lutéinisation, 1' hormone adrénocorticotrophique, le polypeptide pancréatique, etc. Les intermédiaires comprennent, par exemple, la pré-pro-insuline humaine, la pro-insuline humaine, les chaînes A et B de l'insuline humaine, etc. En plus de 1'ADN préparé in vitro, 1'ADN hétérologue peut comporter 1'ADN c résultant de la transcription inverse de l'ARNm. Voir par exemple Ullrich et al, Science 196, 1-313 (1977). 2. Recombinants codant l'expression de la protéine précurseur Dans le processus décrit schématiquement sur la Figure 1, l'expression fournit une protéine précurseur comprenant un polypeptide codé par un gène de structure hétérologue spécifique (somatostatine) et une protéine additionnelle (comprenant une portion de l'enzyme qu'est la 13-galactosidase). Un site de coupure sélective adjacent à la séquence d'amino-acides de la somatostatine permet la séparation ultérieure du polypeptide désire et de la protéine superflue. Le cas illustré est représentatif d'une grande classe de modes opératoires rendus accessibles par les techniques décrites ici. Plus couramment, on effectuera la coupure en denors de l'environnement de duplication du plasmide ou de tout autre vecteur, comme par exemple après la récolte de la culture microbienne. De cette façon, la conjugaison temporaire de petits polypeptides avec une protéine superflue peut protéger les premiers, par exemple d'une dégradation in vivo par les enzymes endogenes. En même temps, la protéine additionnelle privera généralement le polypeptide désiré d'une activité biologique pendant la coupure extra-cellulaire, avec pour effet d'améliorer la sécurité biologique du mode opératoire. Dans des cas particuliers, évidemment, il peut être indique d'effectuer la coupure dans la cellule.Par exemple, des vecteurs de clonage pourraient être munis d'ADN codant des enzymes qui transforment les précurseurs de l'insuline en leur forme active, opérant en tandem avec un autre ADN codant l'expression de la forme précurseur. Dans le cas préféré, le polypeptide particulier désiré ne posséde pas de sites de coupure internes correspondant à ceux utilisés pour couper la protéine superflue, mais on verra que, quand cette condition n'est pas respectée, des réactions de concurrence donneront encore le produit désiré, bien qu'avec un rendement inférieur. Quand le produit désiré est exempt de méthionine, la coupure par le bromure de cyanogène au niveau de la méthionine proche de la séquence désirée s'est révélée être très efficace. De même, les produits exempts d'arginine et de lysine peuvent être coupés par voie enzymatique, par la trypsine ou la chymotrypsine par exemple , aux sites de coupure arg-arg, lys-lys ou similaires adjacents à la séquence désirée.Dans le cas où la coupure laisse une arginine indésirée, fixée par exemple au produit désiré, elle peut être enlevée par digestion par une carboxypeptidase. Quand on utilise la trypsine pour couper à des sites arg-arg, les sites lysine contenus dans le polypeptide désiré peuvent d'abord être protégés, comme avec les anhydrides maléique ou citraconique. Les techniques de coupure décrites ici à titre d'exemple ne sont que représentatives des nombreuses variantes que l'homme de l'art découvrira à la lumière de la descrl;2tion. La protéine, pouvant être coupée, peut etre exprimée aux cxtrémités C ou N d'un polypeptide spécifique, ou même dans le polypeptide lui-même, comme dans le cas de la séquence incluse qui sépare la pro-insuline et l'insuline. De nouveau, le vecteur utilisé peut coder llexpression d'une protéine comprenant des séquences répetées du polypeptide désiré, chacune séparée par des sites de coupure sélective. Mieux encore, cependant, les codons de-la protéine superflue seront traduits en avant du gène de structure du produit désiré, comme dans le cas illustré sur les figures. Dans chaque cas, il faut prendre soin de maintenir le schema de lecture approprié vis-à-vis du régulon. 3. Expression des immunogènes La possibilité d'exprimer un polypeptide spécifique avec une protéine superflue constitue un outil utile pour la production de substances immunogènes. Des "haptènes11 polypeptidiques (c'està-dire des substances contenant des déterminants spécifiquement liés par des anticorps et des composés similaires, mais généralement trop petits pour donner une réaction immunologique) peuvent être exprimés sous forme de produits conjugués à une protéine additionnelle, de dimension suffisante pour conférer l'immuno génicité. En fait, le produit conjugué -gal/somatostatine produit ici titre d'exemple a une dimension immunogène et on peut s'attendre à ce qu'il provoque la formation d'anticorps qui lient l'haptène somatostatine.Les protéines comportant plus de 100 amino-acides, et le plus souvent plus de 200, présentent un caractère immunogène. Des produits conjugués préparés de la manière précédente peuvent être utilisés pour se lier aux anticorps utilisés dans des analyses de l'haptene par radio-immuno-essais ou par d'autres techniques, ou bien dans la production de vaccins. On décrira ciaprès un exemple de cette dernière application. Le bromure de cyanogène, ou d'autres produits effectuant la coupure de l'enveloppe protéique des virus, fournira des oligopeptides qui se lient à l'anticorps fixé à la protéine elle-même.Etant donné la séquence d'amino-acides d'un tel haptène oligopeptidique, 1'ADN hétérologue approprié peut etre exprimé sous forme d'un produit conjugué à une protéine additionnelle qui confère l'immunogenicite-. L'utilisation de tels produits conjugués comme vaccins pourrait diminuer les réactions secondaires qui accompagnent l'utilisation de l'enveloppe protéique elle-même pour conférer l'immunité. 4. Les éléments de commande La Figure 1 décrit un processus dans lequel un organisme transformant exprime un produit peptidique à partir de 1'ADN hétérologue sous le commandement d-'un régulon "homologue" à l'organisme dans son état non transformé. Ainsi, 1'ADN chromosomique de E. coli dépendant du lactose comprend un opéron lactose ou "lac" qui sert de médiateur à la digestion du lactose, entre autres en élaborant la ss-galactosidase. Dans le cas particulier illustré, les éléments de commande lac sont obtenus à partir d'un bactériophage, Aplac 5, qui est infectieux pour E. coli. L'opéron lac du phage est lui-même obtenu par transduction à partir de la même espèce bactérienne, dZoA 1' "homologie".Les régulons homologues convenant pour l'utilisation dans le procédé décrit peuvent également provenir de l'ADN plasmidique natif de l'organisme. La simplicité et l'efficacité du système promoteur-opérateur lac commandent son utilisation dans les systèmes décrits ici, ainsi que son aptitude à être induit par 1'IPTG (isopropylthio-ss- D-galactoside). Evidemment, on pourrait également utiliser d'autres opérons ou des portions de ceux-ci, par exemple le promoteuropérateur A, l'opéron de ltarabinose (phi 80 dara), ou les opérons colicine El, galactose, phosphatase alcaline ou tryptophane. On s'attendrait à ce que les promoteurs-opérateurs provenant de ce dernier (c'est-à-dire "opéron tryp") confèrent une répression de 100 % pendant l'induction (avec l'acide indol-acrylique) et la récolte. 5. Construction du plasmide de manière générale Les détails du processus illustré schématiquement sur la Figure 4 se trouvent dans la partie expérimentale ci-dessous. I1 est cependant utile de décrire ici brièvement les diverses techniques utilisées pour construire le plasmide recombinant du mode de réalisation préféré. Le clonage et l'expression du gène synthétique de. la somatostatine utilisent deux plasmides. Chaque plasmide a un site substrat EcoRI à une région différente du gène de structure de la ss-galactosidase (voir les Figures 4 et 5). L'insertion du fragment d'ADN de somatostatine synthétique dans les sites EcoRI de ces plasmides porte l'expression de l'information génétique dans ce fragment sous la comande des éléments de commande de l'opéron lac. Après l'insertion du fragment de somatostatine dans ces plasmides, la traduction doit donner un polypeptide de somatostatine précédé par 10 amino-acides (pS1) ou par presque toute la structure sous-unitaire de la -galactosEdase (pSOll-3). Le schéma de construction du plasmide part du plasmide pBR322, un vecteur de clonage bien caractérisé. L'introduction des éléments lac dans ce plasmide est effectuée par insertion d'un fragment (203 nucléotides) de 1 'endonucléasede restriction HaeIII portant le promoteur lac, le site de liaison PAC, l'opera- teur, le site de liaison du ribosome et les codons des 7 premiers amino-acides du gène de structure de la ss-galactosidase. Le fragment HaeIII provient de 1'ADN de #plac5. Le plasmide pBR322 coupé par EcoRI dont les extrémités sont réparées par la T4 ADN polymérase et les triphosphates de désoxyribonucléotides, subit une ligature aux extrémités inertes avec le fragment de HaeIII pour créer des extrémités EcoRI aux points d'insertion. La jonction de ces extrémités HaeIII et EcoRI réparées forme le site de restriction EcoRI (voir les Figures 4 et 5) à chaque extrémité. Les transformants de E. coli RR1 avec cet ADN sont sélectionnés en fonction de la résistance à la tétracycline (Tc) et à l'ampicilline (Ap) sur un milieu de 5-bromo-4-chloro indolylgalactoside (X-gal). Sur ce milieu indicateur, on identifie par leur couleur bleue les colonies constitutives pour la synthèse de la ss-galactosidase, en raison du nombre accru des opérateurs lac titrant le répresseur.Deux orientations du fragment HaeIII sont possibles mais elles se distinguent par l'emplacement asymétrique d'un site de restriction Hha dans le fragment Le plasmide pBHl0 est ensuite modifié pour éliminer le site d'endonucléase EcoRI distal de l'opérateur lac (pBH20). Les huit oligodésoxyribonucléotides synthétisés par voie chimique (Figure 2) sont margués aux extrémités 5' avec [32P]-&gamma;- ATP par la polynucléotide-kinase et réunis par la T4 ADN-ligase. Par liaison hydrogène entre les fragments se chevauchant, le gène de la somatostatine s'assemble et enfin se polymérise en plus grosses molécules en raison des extrémités cohesives des sites de restriction. Les produits ligaturés sont traités par des enzymes de restriction EcoRI et BamHI pour former le gène de la somatostatine comme décrit sur la Figure 2. Le fragment de gène de somatostatine synthétique avec des extrémités EcoRI et BamI est ligaturé au plasmide pBH20, qui a préalablement été traité par les endonucléases de restriction EcoRI et BamHI et la phosphatase alcaline. Le traitement par la phosphatase alcaline permet une sélection moléculaire des plasmides portant le fragment inseré. Les transformants résistant à l'ampicilline obtenus avec cet ADN ligature sont sélectionnés en fonction de leur sensibilité à la tétracycline et on en examine plusieurs pour déterminer l'insertion d'un fragment EcoRI-BzmHI de la dimension appropriée. On analyse la séquence de nucléotides des deux chaînes de fragments EcoRI-BamHI provenant de deux clones, en partant des sites BamHI et EcoRI. On prolonge l'analyse de la séquence dans les éléments de commande lac ; la séquence du fragment lac est intacte, et dans un cas, pSOMl, on détermine indépendamment la séquence de nucléotides des deux chaines, en obtenant pour chacune la séquence donnée sur la Figure SA. Le fragment EcoRI-Pst du plasmide pSONl, avec l'élément de commande lac, a été enlevé et remplace par le fragment EcoRI-Pst de pBR322 pour produire le plasmide pSOMll. Le fragment EcoRI de #plac5, portant la région de commande de l'opéron lac et la majeure partie du gène de structure de la ss-galactosidase, a été inséré au site Eco de pSOMIî. Deux orientations du fragment Eco-RI-lac de #plac5 sont possibles. L'une de ces orientations maintient le schéma de lecture approprié vers le gène de la somatostatine, l'autre non.L'analyse de clones isolés indépendamment, pour déterminer l'activité de la somatostatine, permet ensuite d'identifier les clones contenant le gène orienté de la bonne façon, dont fait partie le clone désigné par pSOM11-3. 6. Le micro-organisme Divers micro-organismes unicellulaires ont été proposés comme-candidats à la transformation, comme les bactéries, les champignons et les algues, c'est-à-dire les organismes unicellulaires qui peuvent se développer par culture ou fermentation. Les bactéries sont, pour la plus grandie part, les organismes les plus commodes à utiliser. Les bactéries susceptibles de transformation comprennent les membres des Entérobactériacées,comme les souches d'Escherichia coli et de Salmonella ; des Bacillacées, comme Bacillus subtilis ; Pneumococcus ; Streptococcus et Haemophilus influenzae. L'organisme particulier choisi pour le travail expérimental sur la somatostatine décrit ci-dessous est E. Coli souche RR1, génotype : Pro Leu Thi RB MB rec A+ Strr Lac y. E. Coli RR1 dérive de E. Coli HB101 (H.W. Boyer et al, J. Mol. Biol. (1969) 41, 459472) par accouplement avec E. Coli K12 souche KL16 comme donneur de Hfr. Voir J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972). Des cultures de E. Coli RR1 et de E. Coli RR1 (pBR322) ont été déposées à l'American Type Culture Collection, sous les numéros ATCC 31343 et 31344.L'organisme producteur de somatostatine a de même été déposé [ATCC N0 31447 j Dans le cas de l'insuline humaine, les gènes des chaînes A et B ont été clonés dans E. Coli K-12 souche 294 (extrémité A, thi ,hsr , hsmk ), ATCC N031446 , et cet organisme a été utilisé dans l'expression de la chaîne A (E. Coli K-12 souche 294 [pIA1], ATCC N 31448 ). La chaîne B de l'insuline humaine a été exprimee d'abord dans un dérivé de HB101, c'est-à-dire E. Coli K-12 souche D1210, lac+ (iQO zty ), et cet organisme contenant le gène B a de même été déposé (ATCCNO 31449 ). Ou bien, le gène B peut être inséré et exprimé dans l'organisme mentionné d'abord, c'est-à-dire la souche 294. PARTIE EXPERIMENTALE I - SOMATOSTATINE 1. Construction de fragments du gène de la somatostatine On construit d'abord huit oligodésoxyribonucléotides, appeles respectivement A à H sur la Figure 2, principalement par la méthode par triester modifié de K. Itakura et al, J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975). Cependant, dans le cas des fragments C, E et H, il faut utiliser une technique améliorée dans laquelle on prépare d'abord des trimères totalement protégés comme unités de bases pour construire des oligodésoxyribonucléotides plus longs. La technique améliorée est décrite schématiquement sur la Figure 3, où B est la thymine, l'adénine N-benzôylée, la cytosine N-benzoylée ou la guanine N-isobutyrylée. En bref, et en se référant à la Figure 3, avec un excès du composé I (2 mmoles), la réaction de copulation avec le composé II (1 mmole) se fait pratiquement totalement en 60 minutes à l'aide d'un agent de copulation puissant, le tétrazolure de 2,4,6-triisopropylbenzenesulfonyle (TPSTe, 4 mmoles ; 2). Après élimination du groupement protecteur en position 5' avec une solution à 2 % d'acide benzènesulfonique, on peut séparer le dimère 5'-hydroxylé de formule V de l'excès du monomère 3'-phosphodiester de formule IV par une simple extraction par solvant avec une solution aqueuse de NaHCO3 dans du chloroforme. On prépare la séquence trimère totalement-protégée avec succès en partant du dimère 5'-hydroxylé de formule V, du composé I (2 mmoles) et de TPSTe (4 mmoles),et on l'isole par chromatographie sur gel de silice, comme dans B.T. Hunt et al, Chem, and Ind. 1967, 1868 (1967). Les rendements en trimères préparés selon cette technique améliorée se trouvent dans le Tableau II. TABLEAU Il Rendements en trimères totalement Protégés Séquence Rendement Séquence Rendement TTT 81 % ATG 69 % TTT 75 t GCC 61 % GGA 41 % CCA 72 % AGA 49 % CAA 72 % ATC 71 % TTA 71 % CCT 61 % CAT 52 % ACA 63 % CCC 73 % ACC 65 % AAC 59 % CGT 51 % CAT 60 % On purifie les huit oligodésoxyribonucléotides, après élimination de tous les groupements protecteurs, par chromatographie en phase liquide sous pression élevée sur Permaphase AAX (R.A Henry et al, J. Chrom. Sci. II, 358 (1973)).On contrôle la pureté de chaque oligomère par homochromatographie sur couche mince de DEAE-cellulose, et également par électrophorèse sur gel dans une plaque d'acrylamide à 20 %, après marquage des oligomères avec [&gamma;-32p]-ATP en présence de polynucleotide-kinase. On obtient un produit marqué principal à partir de chaque fragment d'ADN. 2. Ligature et analyse sur gel d'acrylamide de l'ADN de somato statine On effectue la phosphorylation séparée par la T4 polynucléotide-kinase des terminus 5' OH des fragments A à H synthétisés par voie chimique. On utilise [32p]-&gamma;- ATP dans la phosphorylation de sorte que les produits de réaction peuvent être contrôlés par voie autoradiographique, mais on verra que l'on pourrait utiliser de 1'ATP non marqué et se dispenser de l'autoradiographie. Juste avant la réaction avec la kinase, on évapore à siccité dans des tubes d'Eppendorf de 0,5 ml 25 Ci de [&gamma;-32p]ATP (environ 1500 Ci/mmole) (Maxam and Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 74, 1507 (1977). On fait incuber cinq microgrammes de fragment avec 2 unités de T4 ADN-kinase (fraction à l'hydroxylapatite, 2500 unités/ml ; 27) dans 70 mM d'un tampon Tris-HCl à pH 7,6, 10 mM de MgCl2, 5 mM de dithiothréitol dans un volume total de 150 p1, pendant 20 minutes à 37 C. Pour assurer une phosphorylation maximale des fragments dans un but de ligature, on ajoute 10 l d'un mélange comprenant 70 mM de tampon Tris-HCl de pH 7,6, 10 mM de MgCl2, 5 mM de dithiothréitol, 0,5 mM de ATP et deux unités d'ADN-kinase et l'on poursuit l'incubation pendant 20 minutes supplémentaires à 70C. On conserve les fragments (250 ng/pl) à - 200C sans autre traitement.On ligature les fragments traités par la kinase A, B, E et F (1,25 pg chaque) dans un volume total de 50 pi contenant 20 mM de tampon tris-HCl de pH 7,6, 10 mM de MgCl2, 10 mM de dithiothréitol, 0,5 mM d'ATP et deux unités de T4-ADN-ligase (fraction à l'hydroxylapatite, 400 unités/ ml ; 27), pendant 16 heures à 40C. On ligature les fragments C, D, G et H dans des conditions similaires. On prélève des échantillons de 2 pi pour l'analyse par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 10 g suivie d'une autoradiographie (H.L.-Heyneker et al, Nature 263, 748 (1976), où les fragments d'ADN n'ayant pas réagi sont représentés par le matériau migrant rapidement et la forme monomère des fragments ligaturés migre avec le bleu de bromophénol (BBP).Une certaine dimérisation se produit également en raison des extrémités cohésives des fragments ligaturés A; B, E et F, et des fragments ligaturés C, D, G et H. Ces dimères représentent le matériau migrant le plus lentement, et peuvent etre coupés par les endonucléases de restriction Eco RI et Bam HI respectivement. Les deux demi-molécules (A + B + E + F ligatures et C + D + G + H ligaturés) sont réunies par une étape supplémentaire de ligature effectuée dans un volume final de 150 pi à 40C pendant 16 heures. On prélève un microlitre pour l'analyse. On chauffe le mélange réactionnel pendant 15 minutes à 650C pour inactiver la T4 ADN-ligase. Le traitement thermique ne modifie pas le schéma de migration du mélange d'ADN. On ajoute suffisamment d'endonuclease de restriction BamHI au mélange réactionnel pour couper les formes polymeres de llADN de la somatostatine, en 30 minutes à 370C. Après addition de NaCl jusqu'à 100 mM, on digère 1'ADN avec l'endonucléase EcoRI.On arrête les digestions par les endonucléases de restriction par extraction de 1'ADN par un mélange phénol-chloroforme. On purifie le fragment d'ADN de somatostatine pour le séparer des fragments d'ADN n'ayant pas réagi et partiellement ligaturés, par électrophorèse préparative sur gel de polyacrylamide à 10 %. On excise du gel la bande contenant le fragment d'ADN de somatostatine et on élue 1'ADN en découpant le gel en petits morceaux et en extrayant 1'ADN avec un tampon d'élution (0,5 M d'acétate d'ammonium, 10 mM de MgCl2, 0,1 mM d'EDTA, 0,1 % de SDS) pendant une nuit à 650C.On fait précipiter 1'ADN avec 2 volumes d'éthanol, on centrifuge, on redissout dans 200 l d'un tampon 10 mM en Tris-HCl de pH 7,6 et on le dialyse vis-à-vis du même tampon, ce qui donne une concentration en ADN de somatostatine de 4 vg/ml. 3. Construction des plasmides recombinants La Figure 4 décrit schématiquement la manière selon laquelle on peut construire des plasmides recombinants comprenant le gel de la somatostatine, et on peut s'y référer lors de la discussion suivante plus détaillée. A. Le plasmide parental pBR322 Le plasmide choisi pour le clonage expérimental de la somatostatine est pBR322, un plasmide petit (poids moléculaire environ 2,6 megadaltons) portant des gènes de résistance aux antibiotiques ampicilline (Ap) et tétracycline (Tc). Comme indiqué sur la Figure 4, le gène de résistance à l'ampicilline comprend un site de coupure pour l'endonucléase de restriction Pst I, le gène de résistance à la tétracycline comprend un site similaire pour l'endonucléase de restriction-Bam HI, et un site Eco RI se situe enre les gènes Apr et Tcr. Le plasmide pBR322 dérive de pBR313, un plasmide AprTcrColimm de 5,8 megadaltons (R.L. Rodriguez et al, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology 5, 471-77 (1976) et R.L.Rodriguez et al, Construction and Characterization of Cloning Vehicles, dans Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression, pp. 471-77, Academic Press, Inc. (1976). Le plasmide pBR322 est caractérisé et la façon dont on le transforme est totalement décrite dans F. Bolivar et al, 'Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II. A Multipurpose Cloning System", Gene (Novembre 1977). B. Construction du plasmide pBHlO On fait digérer cinq microgrammes d'ADN de plasmide pBR322 par 10 unités de l'endonucléase de restriction EcoRI dans 100 mmoles de tampon Tris-HCl de pH 7,6, 100 mM de NaCl, 6 mM de MgCl2 à 370C pendant 30 minutes. On arrête la réaction par une extractif phenol-chloroforme ; puis on fait précipiter 1'ADN avec deux volume et demi d'éthanol et on le met de nouveau en suspension dans 50 ul d'un tampon contenant la T4 ADN-polymérase (67 mM de Tris-HCl pH 8,8, 6,7 mM de MgC12, 16,6 mM de (NH4)2SO4, 167 pg/ml de sérumalbumine de boeuf, 50 pM de chacun des dNTP , A. Panet et al, Biochem. 12, 5045 (1973). On démarre la réaction par addition de deux unités de T4 ADN-polymérase. Après incubation pendant 30 minutes à 370C, on arrête la réaction par extraction de 1'ADN par un mélange phénol-chloroforme, puis on précipite avec de l'éthanol. On fait digérer 3 g d'ADN de #plac5 (Shapiro et al, Nature 224, 768 (1969)) pendant une heure à 370C par l'enzyme de restriction HaeIII (3 unités) dans 6 mM de Tris-HCl de pH 7,6, 6 mM de MgCl2, 6 mM de ss-mercaptoéthanol dans un volume final de 20 p1. On arrête la réaction en chauffant pendant 10 minutes à 650C. On mélange l'ADN traité de pBR322 avec l'ADN de #plac5 digéré par HaeIII, et on effectue la ligature sur l1extrémité inerte dans un volume final de 30 l avec 1,2 unité de T4 ADN-ligase (fraction à l'hydroxyl- apatite ; A.Panet et al, ci-dessus) dans 20 mM de tampon Tris-HCl de pH 7,6, 10 mM de MgCl2, 10 mM de dithiothréitol, 0,5 mM d'ATP pendant 12 heures à 120C. On dialyse le mélange d'ADN ligaturé visà-vis de 10 mM de tampon Tris-HCl de pH 7,6, et on l'utilise pour la transformation de la souche de E. coli RR1. On sélectionne les transformants en fonction de la résistance à la tétracycline et à l'ampicilline sur des plaques de milieu minimal contenant 40 pg/ml de milieu de 5-bromo-4-chloro-indolylgalactoside (X-gal) LJ.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972)j. On identifie par leur couleur bleue les colonies dont la constitution permet la synthèse de la ss-galactosidase. Après sélection de 45 colonies bleues isolées de façon indépendante, on trouve que trois d'entre elles contiennent 1'ADN de plasmide portant deux sites EcoRI séparés par environ 200 paires de bases. La position d'un fragment HhAI placé de façon asymétrique dans le fragment de commande lac de HaeIII 203 p.b. Lw. Gilbert et al, in Protein-Ligand Interactions, H. Sand et G. Blauer, Eds. (De Gruyter, Berlin, (1975) pp.- 193-210] permet la détermination de l'orientation du fragment HaeIII, maintenant un fragment EcoRI, dans ces plasmides.On montre que le plasmide pBH10 porte le fragment dans l'orientation désirée, c'est-à-dire la transcription lac allant dans le gène Tcr du plasmide. C. Construction du plasmide pBH20 On modifie le plasmide pBH10 pour éliminer le site EcoRI distal de l'opérateur lac. On effectue ceci par coupure préférentielle par l'endonucléase EcoRI au site distal, en utilisant une protection partielle par l'ARN-polymerase de l'autre site EcoRI placé entre les promoteurs Tcr et lac, qui sont seulement séparés par 40 paires de bases Après fixation de l'ARN-polymérase, on fait digérer 1'ADN (5 pg) avec EcoRI (1 unité) dans un volume final de 10 p1 pendant 10 minutes à 370 C. On arrête la réaction en chauffant à 650C pendant 10 minutes.On fait digérer les terminus cohésifs EcoRI par la nucléase S1 dans un tampon 25 nb! d'acétate de sodium à pH 4,5, 300 mM de NaCl, 1 mM de ZnCl2 à 250C pendant 5 minutes. On arrête la réaction par addition d'EDTA (10 mM à la fin) et du tampon Tris-HCl de pH 8 (50 mM à la fin). On extrait 1'ADN par un mélange de phénol et de chloroforme, on le précipite avec de l'éthanol et on le remet en suspension dans 100 l de tampon de ligature de T4 ADN. On ajoute 1 p1 de T4 ADN-ligase et l'on fait incuber le mélange à 120C pendant 12 heures. On transforme l'ADN ligaturé dans la souche de E. coli RR1, et l'on sélectionne les transformants AprTcr sur un milieu X-gal-antibiotique.L'analyse par des enzymes de restriction de 1'ADN sélec tionné à partir de 10 colonies bleues isolées révèle que ces clones portent l'ADN de plasmide avec un site EcoRi. Sept des trois colonies ont conservé le site EcoRI placé entre les promoteurs lac et Tcr. La séquence de nucléotides allant du site EcoRI vers la zone de commande lac de l'un de ces plasmides, pBH20, a été confirmée. On utilise ensuite ce plasmide pour cloner le gène de la somatostatine. D. Construction du plasmide pSOM 1 On fait digérer 20 g du plasmide pBH20 totalement par des endonucléases de restriction EcoRI et BamHI dans un volume final de 50 pl. On ajoute de la phosphatase alcaline bactérienne (0,1 unité de Worthington BAPF) et on poursuit l'incubation pendant 10 minutes à 650C. On arrête les réactions par extraction par un mélange phénol-chloroforme et on précipite l'ADN avec 2 volumes d'éthanol, on le centrifuge et on le dissout dans 50 p1 de 10 mM de Tris-HCl de pH 7,6 et de 1 mM d'EDTA.Le traitement par la phosphatase alcaline empêche effectivement l'auto-ligature de 1'ADN de pBH20 traité par EcoRI et BamHI, mais il peut encore se former par ligature des plasmides recombinants circulaires contenant 1'ADN de la somatostatine. Comme E. coli RR1 est transformé avec une efficacité très faible par 1'ADN de plasmide linéaire, la majorité des transformants contiendront des plasmides recombinants. On ligature 50 ul d'ADN de somatostatine (4 Vg/ml) avec 25 l de 1'ADN de pBH20 traité par la phosphatase alcaline et par BamHI et EcoRI dans un volume total de 50 pl contenant 20 mM de Tris-HCl de pH 7,6, 10 q de MgCl2, 10 mM de dithiothréitol, 0,5 mM d'ATP et 4 unités de T4 ADN-ligase à 220C.Après 10, 20 et 30 minutes on ajoute de 1'ADN de somatostatine supplémentaire (40 ng) au mélange réactionnel (l'addition progressive de 1'ADN de somatostatine peut favoriser la ligature sur le plasmide par rapport à 1 t auto-ligature). On poursuit la ligature pendant une heure, puis on dialyse le mélange vis-à-vis de 10 mM de Tris-HCl pH 7,6. Dans une expérience témoin, on ligature de 1'ADN de pBH20 traité par la phosphatase alcaline, par BamHI et par EcoRI, en l'absence d'ADN de somatostatine dans des conditions similaires. On utilise les deux préparations sans autre traitement pour transformer E. coli RR1. On effectue les expériences de transformation dans un équipement P3 (National Institutes of Health, U.S.A., Recombinant DNA Research Guidelines, 1976). On sélectionne les transformants sur des plaques de milieu minimal contenant 20 pg/ml dWAp et 40 pg/ml de X-gal. On isole dix transformants qui sont tous sensibles à Tc. Pour des raisons de référence, on les appelle pSOM1, pSOM2, etc... pSOM10. Dans l'expérience témoin, on n'obtient pas de transformants. Quatre des dix transformants contiennent des plasmides avec à la fois un site EcoRI et un site BamHI.La dimension du petit fragment EcoRI BamHI de ces plasmides recombinants est dans les quatre cas similaire à la dimension de I'ADN de somatostatine préparé in vitro. L'analyse de la séquence de bases selon Maxam and Gilbert Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 74, 560 (1977), révèle que le plasmide pSOM1 contient le fragment d'ADN de somatostatine désiré. L'analyse de la séquence d'ADN du clone portant' le plasmide pSOMl prédit qu'il doit produire un peptide comprenant la somatostatine. Cependant, on n'a détecté aucune activité radio-immunologique de somatostatine dans les extraits de pastilles de cellules ou de liqueurs surnageantes de culture, ni la présence de somatostatine quand on ajoute directement la culture en croissance à de l'acide formique à 70 % et du bromure de cyanogène. On a observé que les extraits de E. coli RR1 dégradent tres rapidement la somatostatine exogène. L'absence d'activité de somatostatine dans les clones portant le plasmide pSOWI1 pourrait bien résulter de la dégradation intracellulaire par des enzymes protéolytiques endogènes. Le plasmide pSOMl est donc utilisé pour construire un plasmide codant une protéine précurseur contenant de la somatostatine et suffisamment importante pour qu'on puisse supposer qu'elle résiste à la dégradation protéolytique. E. Construction des plasmids pSOM 11 et pSOM 11-3 On construit un plasmide dans lequel le gène de la somatostatine pourrait être place au terminus C du gène de la ss-galacto- sidase, en maintenant la traduction en phase. La présence d'un site EcoRI près du terminus C de ce gène et de la séquence d'aminoacides disponibles de cette protéine [B. Polisky et al, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 73, 3900 (1976), A.V. Fowler et al, Id., 74, 1507 (1976), AI. Bukhari et al, Nature New Biology 243, 238 (1973) et K.E. Langley, J. Biol. Chem. 250, 2587 (1975)] permet d'insérer le gène EcoRI BamHI somatostatine dans le site EcoRI tout en maintenant le schéma de lecture approprié. Pour la construction d'un tel plasmide, on fait digérer 50 ug d'ADN de pSOMl par es enzymes de restriction EcoRI et PstI dans un volume final de 100 ul. On utilise un gel de polyacrylamide à 5 % préparatif pour séparer le grand fragment Pst-EcoRI qui porte le gène de la somatostatine du petit fragment qui porte les éléments de commande lac.On excise du gel la bande importante et on élue 1'ADN en découpant le gel en petits morceaux et en extrayant l'ADN à 650C pendant une nuit. D'une manière similaire, on fait digérer 50 pg d'ADN du plasmide pBR322 par les endonucléases de restriction PstI et EcoRI et l'on purifie les deux fragments d'ADN résultants par électrophorèse préparative sur un gel de polyacrylamide à 5 %. On ligature le petit fragment PstI-EcoRI de pBR322 (I pg) avec le grand fragment Pst I-EcoRI ADN (5 pg) de pSOM1, dans un volume final de 50 p1, avec une unité de T4 ADN-ligase à 12 C pendant 12 heures. On utilise le mélange ligaturé pour transformer E. coli RRI, et l'on sélectionne les transformants en fonction de leur résistance à l'ampicilline sur un milieu X-gal. Comme on s'y attend, pratiquement tous les transformants Apr (95 %) donnent des colonies blanches (pas d'opérateur lac) sur les plaques indicatrices de X-gal.On utilise le plasmide résultant, pSOMll, dans la construction du plasmide pSOM11-3. On fait digérer un mélange de 5 pg d'ADN de 5 pSOMll et 5 pg d'ADN de Aplat avec EcoRI (10 unités pendant 30 minutes à 370C). On arrête la digestion par l'endonucléase de restriction par extraction par un mélange phenol-chloroforme. Puis on précipite 1'ADN avec de l'éthanol et on le remet en suspension dans un tampon de T4 ADN-ligase (50 p1). On ajoute une unité de T4 ADN-ligase au mélange et on le fait incuber à 12 C pendant 12 heures. On dialyse le mélange ligaturé vis-à-vis d'un tampon de 10 mM de Tris-EICl, pH 7,6, et on l'utilise pour transformer la souche RRI de E. coli.On sélectionne les transformants en fonction de leur aptitude Ap r sur des plaques de X-gal contenant de l'ampicilline et on les sélectionne en fonction de la production de ss-galactosidase due à leur constitution. Environ 2 % des colonies sont bleues (pSOM11-1, 11-2, etc..). L'analyse par des enzymes de restriction de 1'ADN de plasmide obtenu à partir de ces clones montre que tous les plasmides portent un nouveau fragment EcoRI d'environ 4,4 mégadaltons, qui porte les sites de commande de l'opéron lac et la majeure partie du gène de la ss-galactosidase. Comme deux orientations du fragment EcoRI sont possibles, on utilise l'emplacement asymétrique d'un site de restriction Hindîli pour déterminer lesquelles de ces colonies portent ce fragment EcoRI avec la transcription lac se faisant dans le gène de la somatostatine. Des digestions doubles par HindIII et BamHI indiquent que seuls les clones portant les plasmides pSOM11-3, pSOM11-5, pSOM11-6 et pSOM11-7 contiennent le fragment EcoRI dans cette orientation. 4. Radio-immuno-essai de l'activité de somatostatine On modifie les radio-immuno-essais (RIE) classiques de la somatostatine [A. Arimura et al, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 148, 784 (1975)] en diminuant le volume d'essai et en utilisant un tampon phosphate. On iode de la Tyr11-somatostatine en utilisant un mode opératoire utilisant la chloramine T (voir la référence ci-dessus). Pour titrer la somatostatine, on sèche l'échantillon, généralement dans de l'acide formique à 70 % contenant 5 mg/ml de bromure de cyanogène, dans un tube en polypropylène conique (0,7 ml, Sarstedt) sur KOH humide sous vide.On ajoute 20 pl de tampon PBSA (75 mO1 de NaCI ; 75 mM de phosphate de sodium, pH 7,2 ; 1 mg/ml de sérum albumine de boeuf , et 0,2 mg/ml d'azoture de sodium) puis on ajoute 40 l d'un "cocktail" de [125I]-somato- statine et 20 p1 d'une dilution à 1 000 fois dans le tampon PBSA d'immun-sérumd'antisomatostatine de lapin S39 (Vale et al, Metabolism 25, 1491 (1976). Le cocktail de[1251] somatostatine contient, par ml de tampon PBSA : 250 pg de -gamma-globuline de lapin normal (Antibodies, Inc.), 1500 unités d'inhibiteur de protéase ("Trasylol", Calbiochem) et environ 100 000 coups de [125I]Tyr11-somatostatine.Après au moins 16 heures à la température ambiante, on ajoute aux tubes d'échantillon 0,333 ml de gamma-globuline anti-lapin de chèvre (Antibodies, Inc., P=0,03) dans le tampon PBSA. On fait incuber le mélange pendant 2 heures à 370C, on le refroidit à 50C, puis on le centrifuge à 10 000 x g pendant 5 minutes. On enlève la liqueur surnageante et on détermine le nombre de coups de la pastille dans un compteur gamma. Avec la quantité d'antiserum utilisée, 20 % des coups ont été précipités sans somatostatine compétitrice non marquée. Le fond avec une quantité infinie de somatostatine (200 ng) est généralement de 3 t. On obtient une demi-compétition maximale avec 10 pg de somatostatine. Des expériences initiales avec des extraits de la souche E. coli RRI (souche réceptrice) indiquent que moins de 10 pg de somatostatine peuvent facilement être détectés en présence de 16 pg ou plus de protéine bactérienne traitée par le bromure de cyanogène. Plus de 2 pg de protéine provenant des extraits bactériens traités par l'acide formique gênent quelque peu en augmentant le fond, mais la coupure par le bromure de cyanogène réduit de façon importante cette interférence.Des expériences de reconstruction montrent que la somatostatine est stable dans les extraits traités au bromure de cyanogène. A. Compétition par des extraits bactériens On cultive à 37 C les souches E. coli RR1 (pSOM11-5) et E. coli RR1 (pSOM11-4) jusqu'à 5 X 108 cellules/ml dans un bouillon de Luria. On ajoute ensuite de I'IPTG jusqu'à 1 met et on poursuit la croissance pendant 2 heures. On centrifuge des parties aliquotes de 1 ml pendant quelques secondes dans une centrifugeuse Eppendorf et l'on met les pastilles en suspension dans 500 pl d'acide formique à 70 % contenant 5 mg/ml de bromure de cyanogène. Après environ 24 heures à la température ambiante, on dilue les parties aliquotes dix fois dans de l'eau et l'on titre, en triple, la somatostatine dans les volumes indiqués sur la Figure 6. Sur la Figure 6, "B/B " est le rapport de la [125I-somatostatine liée o en présence d'échantillons à celle liée en l'absence de somatostatine compétitrice. Chaque point est la moyenne de trois essais. La teneur en protéine des échantillons non dilués est déterminée comme étant de 2,2 mg/ml pour E. coli RRI (pSOM11-5) et 1,5 mg/ml pour E. coli RRI (pSOM-4). B. Sélection initiale des clones pSOtEll pour la somatostatine On prépare des extraits traités par le bromure de cyanogène de 11 clones (pSOMîî-2, pSOMîl-3, etc.) comme décrit ci-dessus pour la Figure 6. On prélève en triple pour le radio-immuno-essai 30 p1 de chaque extrait, les résultats de l'analyse étant donnés sur la Figure 7. L'intervalle des points d'analyse est indiqué. Les valeurs de la quantité de somatostatine en picogrammes sont lues d'après une courbe étalon obtenue dans la même expérience. Les résultats des radio-immuno-essais ainsi décrits peuvent être résumés comme suit. Au contraire des résultats des expériences avec pSOM1, on a trouvé que quatre clones (pSOM11-3, 11-5, 11-6 et 11-7) ont une activité radio-immunologique de somatostatine facilement détectable (Figures 6 et 7). L'analyse des fragments obtenus par restriction révèle que pSOM11-3, pSOM11-5, pSOM11-6 et pSOM11-7 ont l'orientation désirée de l'opéron lac, alors que pSOM11-2 et 11-4 ont l'orientation opposée. I1 y a donc une corrélation parfaite entre l'orientation correcte de l'opéron lac et la production de l'activité radio-immunologique de la somatostatine. C. Effets de l'induction par IPTG et de la coupure par CNBr sur les clones positifs et negatifs La conception du plasmide de somatostatine indique que la synthèse de la somatostatine serait sous la commande de l'opéron lac. Le gène répresseur lac n'est pas inclu dans le plasmide et la souche réceptrice (E. coli RR1) contient le gène répresseur lac chromosomique de type sauvage qui produit seulement 10 à 20 molécules répressives par cellule. Le nombre de copies du plasmide (et donc le nombre d'opérateurs lac) est environ 20 à 30 par cellule, de sorte qu'une répression totale est impossible.Comme le montre le Tableau III ci-dessous,l'activite spécifique de la somatostatine dans E. coli RR1 (pSOM-11-3) est augmentée par 1'IPTG, un inducteur de l'opéron lac. Comme attendu, le degré d'induction est faible, variant de 2,4 à 7 fois. Dans l'expérience faite (Tableau III), l'activité a qui est une mesure des 92 premiers amino-acides de la B-galactosidase, est également induite par un facteur de deux. Dans plusieurs expériencés, on ne peut détecter d'activité radio-immunologique de la somatostatine avant la coupure par le bromure de cyanogène de la protéine cellulaire totale.Comme I'antiséum utilisé dans le radio-immuno-essai, S 39, nécessite une alanine à N-terminal libre, on ne peut attendre aucune activité avant la coupure par le bromure de cyanogène. TABLEAU III Activité spécifique radio-immunologique de la somatostatine Abréviations : bouillon de Luria, BL ; isopropylthiogalactoside, IPTG ; bromure de cyanogène, CNBr ; somatostatine, SS. On mesure la protéine par la méthode de Bradford, Anal. Biochem. 72, 248 (1976) Numéro de Souche Milieu IPTG CNBr pg SS/pg l'expérience 1 Mm 5 mg/ml protéine 1 11-2 BL + + 11-3 BL + + 12 11-4 b1 + + 11-5 BL + + 15 2 11-3 BL + + 12 11-3 BL + - 3 11-3 BL + + 61 11-3 BL - + 8 11-3 BL + - 4 11-3 BL + + 71 11-3 VB + glycérol* + + 62 5 11-3 BL + glycérol + + 250 6 11-3 BL + + 320 11-2 BL + + 7 11-3 BL t + 24 11-3 BL - + 10 Milieu minimal de Vogel-Bonner plus glycérol D.Filtration sur gel des extraits traités par le bromure de cyanogène On réunit les extraits traités par l'acide formique et le cyanogène des clones positifs (pSOM 11-3, 11-5, 11-6 et 11-7) (volume total de 250 l), on sèche et on remet en suspension dans 0,1 ml d'acide acétique à 50 %. On ajoute de la [3H1leucine et l'on applique l'échantillon sur une colonne de 0,7 x 47 cm de Sephadex G-50 dans de l'acide acétique à 50 %. on titre la somatostatine dans des parties aliquotes de 50 p1 des fractions de la colonne. On traite de façon identique les extraits réunis de clones négatifs (11-2, 11-4 et 11-11). Les résultats apparaissent sur la Figure 8. Sur la même colonne, la somatostatine connue (Beckman Corp.) élue comme indiqué (SS). Dans ce système, la somatostatine est bien séparée des peptides importants exclus et des petites molécules totalement incluses. Seuls les extraits des clones positifs vis-àvis de la somatostatiné présentent une activité radio-immunologique dans les fractions de la colonne, et cette activité est éluée à la même position que la somatostatine synthétisée par voie chimique. RESUME DE L'INFORMATION SUR L'ACTIVITE Les données établissant la synthèse d'un polypeptide contenant la séquence d'amino-acides de la somatostatine sont résumées comme suit : (1) l'activité radio-immunologique de la somatostatine est présente dans les cellules de E. coli ayant le plasmide pSOM11-3 qui contient un gène de. somatostatine ayant une séquence correcte prouvée et qui a l'orientation correcte du fragment d'ADN lac EcoRI.Les cellules contenant le plasmide apparenté pSOM11-2, qui a le même gène de somatostatine mais une orientation opposée du fragment lac EcoRI, ne produit pas d'activité de somatostatine détectable , (2) comme predit par le schéma de conception, on n'observe pas d'activité radio-immunologique de somatostatine détectable avant le traitement par le bromure de cyanogène de l'extrait cellulaire ; (3) l'activité de la somatostatine est sous commande de l'opéron lac, comme le montre l'induction par IPTG qui estun inducteur de l'operon lac ; (4) l'activité de somatostatine est chromatographiée en même temps que la somatostatine connue sur Sephadex G-50 ; (5) la séquence d'ADN du gène de somatostatine cloné est correcte.Si la traduction se faisait hors de phase, il se formerait un peptide qui serait différent de la somatostatine en toute position. On détecte l'activité radio-immunologique, ce qui indique qu'un peptide très proche de la somatostatine est préparé, et la traduction doit être en phase. Comme la-traduction se fait en phase, le code génétique impose la fabrication d'un peptide ayant la séquence exacte de la somatostatine ; (6) enfin, les échantillons précédents d'extraits de E. coli RR1 (pSOM11-3) inhibent la libération de l'hormone de croissance dans les cellules pituitaires du rat, alors que des échantillons de E. coli RR1 (pSOM11-2) préparés en parallèle et avec une concentration identique en protéine n'ont aucun effet sur la libération de l'hormone de croissance. STABILITE, RENDEMENT ET PURIFICATION DE LA SOMATOSTATINE Les souches portant le fragment d'opéron EcoRI lac (pSOM11-2, pSOM11-3, etc...) subissent une ségrégation par rapport au phénotype plasmidique. Par exemple, après environ 15 générations, environ la moitié de la culture de E. coli RR1 (pSOM11-3) est "constitutive" vis-à-vis de la 6-galactosidase, c'est-à-dire qu'elle porte l'opérateur lac, et environ la moitié de celles-ci sont résistantes à l'ampicilline. Les souches positives (pSO.N511-3) et négatives (pSOM11-2) vis-à-vis de la somatostatine sont instables, et donc le désavantage de croissance vient vraisemblablement de la surproduction de la galactosidase importante mais incomplète et inactive.Le rendement en somatostatine varie de 0,001 à 0,03 % de la protéine cellulaire totale (Tableau 1) vraisemblablement par suite de la sélection des cellules dans la culture qui comportent des plasmides avec une région lac enlevée. Les rendements les plus élevés en somatostatine proviennent de préparations dans lesquelles on a commencé la croissance à partir d'une seule colonie constitutive résistante à l'ampicilline. Même dans ce cas, 30 % des cellules à la récolte ont des manques de la région lac. La conservation à l'état congelé (lyophilisé) et la croissance jusqu'à la culture à partir d'une seule telle colonie sont donc indiquées pour le système décrit. On peut augmenter les rendements en ayant recours par exemple à des souches bactériennes qui surproduisent le répresseur lac de sorte que l'expression de la protéine précurseur soit pratiquement totalement réprimée avant l'induction et la récolte. Ou bien, comme décrit précédemment, on peut utiliser un système a base de tryptophane ou un autre système opérateur-promoteur qui est habituellement totalement réprimé. Dans l'extrait brut résultant de la rupture des cellules dans une presse Eaton par exemple, la protéine précurseur B-galactosidase-somatostatine, est insoluble et on la trouve dans la première pastille de centrifugation à faible vitesse. L'activité peut être solubilisée dans de l'acide formique à 70 %, du chlorhydrate de guanididium 6M ou du dodécylsulfate de sodium à 2 %. De préférence cependant, l'extrait brut provenant de la presse Eaton est extrait avec de l'urée 8M et le résidu coupé avec du bromure de cyanogène. Dans des expériences initiales, l'activité de somatostatine provenant de la souche E. coli RR1 (pSOM11-3) a été enrichie environ de 100 fois par extraction alcoolique du produit de coupure et chromatographie sur Sephadex G-50 dans de l'acide acétique à 50 %.Quand on chromatographie à nouveau le produit sur Sephadex G-50 et qu'on le soumet à une chromatographie liquide sous pression élevée, on peut obtenir de la somatostatine essentiellement pure. Il. INSULINE HUMAINE Les techniques décrites précédemment ont ensuite été appliquées à la production de l'insuline humaine. Ainsi, on conçoit les genes pour la chaine B de l'insuline (IC4 paires de bases) et pour la chaîne A de l'insuline (77 paires de bases) à partir de la séquence des amino-acides du polypeptide humain, chacun avec des terminus cohésifs à une seule chaîne pour les endonucléases de restriction EcoRI et BamHI et chacun conçu pour l'insertion séparément dans des plasmides pBR322.Les fragments synthétiques, de déca- à pentadéca-nucléotides, sont synthétisés par la méthode phosphotriester en séquences utilisant des trinucléotides comme séquences de construction et sont enfin purifiés par chromatographie liquide sous pression élevée (HPLC). Puis on clone séparément dans le plasmide pBR322 les gènes synthétiques des chaînes A et B de l'insuline humaine. On introduit les gènes synthétiques clonés dans un gène de S-galactosidase de E. coli comme précédemment pour obtenir une transcription efficace, une traduction efficace et une protéine précurseur stable. On coupe les peptides de l'insuline du précurseur B-galactosidase, on les détecte par radio-immuno-essai et on les purifie. Puis on forme l'activité de radio-immuno-essai de l'insuline en mélangeant les produits de E. coli. 1. Conception et synthèse des gènes de l'insuline humaine Les gènes construits pour l'insuline humaine sont décrits sur la Figure 9. Les genes pour l'insuline humaine, chaîne B et chaîne A, sont conçus pour les séquences d'amino-acides des polypeptides humains. Les extrémités 5' de chaque gène ont des extrémités cohésives à une seule chaîne pour les endonucléases de restriction EcoRI et BamHI, pour l'insertion correcte de chaque gène dans le plasmide pBR322. On incorpore un site de reconnaissance de l'endonucléase HindIII au milieu du gène de la chaine B pour la séquence d'amino-acides Glu-Ala, pour permettre l'amplification et la vérification de chaque moitié du gene séparément avant la construction du gène de la chaîne B entier.Les gènes de la chaîne B et de la chaîne A sont conçus pour etre construits à partir de 29 oligodésoxyribonucléotides différents, allant des décamères aux pentadécamères. Chaque flèche indique le fragment synthétisé par la méthode par phosphotriester améliorée, H1 à H8 et B1 à B12 pour le gène de la chaine B et Al à Ail pour le gène de la chaîne A. 2. Synthèse chimique des oligodésoxyribonucléotides Les matériaux et les procédés de synthèse des oligodésoxyribonucléotides sont essentiellement ceux décrits dans Itakura, K. et al (1975) J. Biol. Chem. 250, 4592 et Itakura, K. et al (1975) J. Amer. Chem. Soc. 97, 7327, sauf pour les modifications suivantes a) Les mononucléotides totalement protégés, les phosphates de 5'-O-dimethoxytrityl-3'-p-chlorophenyl-ss-cyanoethyle, sont synthétisés à partir des dérivés de nucléoside en utilisant l'agent de phosphorylation monofonctionnel, le phosphorochlorhydrate de p-chlorophényl--cyanoéthyle (1,5 équivalent molaire), dans l'acétonitrile en présence de 1-méthyl-imidazole [Van Boom, J.H. et al (1975) Tetrahedron 31, 2953]. On isole les produits sur une grande échelle (100 à 300 g) par chromatographie liquide préparative (Prep 500 LC, Waters Associates). b) En utilisant la méthode d'extraction Far solvant [Hirose, T. et al (1978) Tetrahedron Letters, 2449j, on synthétise 32 trimères bifonctionnels (voir le Tableau IV) sur une échelle de 5 à 10 mmoles, et 13 trimères, 3 tétramères, 4 dimères en tant que séquences terminales 3', sur une échelle de 1 mmole. On contrôle l'homogénéité des trimères totalement protégés par chromatographie sur couche mince de gel de silice dans deux systèmes solvants méthanol/chioroforme : solvant a, 5 E volume/volume et solvant b, 10 % volume/volume (voir le Tableau IV).En partant de ce stock de composés, on synthétise 29 oligodésoxyribonucléotides de séquence définie, 18 pour le gène de la chaine B et 11 pour le gène de la chaine A. Les unités de base utilisées pour construire les polynucléotides sont deux types de séquence trimère, c'est-à-dire les séquences trimères bifonctionnelles du Tableau IV et les trimères à terminaison 3' correspondants protégés par un groupement anisoyle en position 3'-hydroxy. Le trimère bifonctionnel est hydrolysé en composant 3-phosphodiester correspondant à l'aide d'un mélange de pyridine, de triéthylamine et d'eau (3:1:1 en volume/ volume) et également en dérivé 5'-hydroxylé correspondant avec de l'acide benzènesulfonique à 2 %. La séquence à extrémité 3' à laquelle on s'est référé précédemment est traitée par de l'acide benzènesulfonique à 2 % pour obtenir le dérivé 5'-hydroxylé correspondant. La réaction de copulation d'un excès du trimère 3'-phosphodiester (1,5 équivalent molaire) avec le composé 5' hydroxylé cependant obtenu (1 équivalent molaire) en présence de tétrazolure de 2,4,6-triisopropylbenzènesulfonyle (TPSTe, 3 à 4 équivalents) se fait presque totalement en 3 heures. Pour chasser l'excès du réactif à séquence 3'-phosphodiester, on fait passer le melange réactionnel sur une courte colonne de gel de silice réalisée dans un filtre en verre fritté. On lave la colonne, d'abord avec CHCl3 pour éliminer certains produits secondaires et le réactif de copulation, puis avec un mélange 95:5 volume/volume de chloroforme et de méthanol dans lequel élue pratiquement tout l'oligomère totalement protégé. Dans ces conditions, le réactif à séquence 3'-phosphodiester chargé reste dans la colonne.De même, on peut répéter les copulations des séquences jusqu'à construction de la longueur désirée. On utilise de façon importante une chromatographie liquide sous pression élevée (HPLC) pendant la synthèse des oligonucléotides pour a) l'analyse de chaque séquence trimère et tétramère, b) l'analyse des fragments intermédiaires (hexamères, monamères et décamères), c) l'analyse de la dernière réaction de copulation, et d) la purification des produits finals. On effectue la HPLC en utilisant un chromatographe en phase liquide Spectra Physics 3500B. Après élimination de tous les groupements protecteurs par l'ammoniaque concentré à 500C (6 h) et 80 % de AcOH à la température ambiante (15 minutes), on analyse les composés sur Permaphase AAX (Dupont) [Van Boom, J. et al (1977) J.Chromatography 131, 169j, avec une colonne de 1 m x 2 mm, en utilisant un gradient linéaire du solvant B (0,05 M de KH2PO4, 1,0 M de XC1, pH 4,5) dans le solvant A (0,01 M de KH2PO4, pH 4,5). On forme le gradient en partant du tampon A et en appliquant 3 % de tampon B par minute. On effectue l'élution à 600C, avec un débit de 2 ml par minute. On effectue également la purification des 29 oligonucléotides finals sur Permaphase AAX dans les mêmes conditions que précédemment. On recueille le pic désiré, on le désale par dialyse et on le lyophilise. Après marquage des extrémités 5' avec (y-32p)ATP en utilisant la T4 polynucléotide-kinase, on contrôle l'homogénéité de chaque oligonucléotide par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 20 %. TABLEAU IV SYNTHESE DES SEQUENCES TRIMERES DE CONSTRUCTION No Compose Rend.:::: Rf Pureté:::::: Dans la Fig. 9, (%) a. b. (%) présent dans 1. AAG 47 0,15 0,40 93 B5,B6 2. AAT 49 0,25 0,52 95 H1, A1, A6 3. AAC 52 0,28 0,55 93 H5,B6,A2,A8 4. ACT 43 0,27 0,53 91 B4,B5,A6 5. ACC 56 0,33 0,60 96 B7 6. ACG 39 0,18 0,45 90 H5,B7 7. AGG 45 0r10 0,26 89 H6,H7,B9 8. AGT 33 0,14 0,40 96 B9,A2,All 9. AGC 50 0119 0,48 92 H8,B1,A5,A10 10. AGA 48 0,24 0,50 91 A9, 11. TTC 44 0,26 0,52 95 B4,B7,A3 12. TTC 49 0,11 0,31 94 B3,H5,A2,A3,A5 13. TCT 58 0,24 0,49 96 A4 14. TCA 45 0,28 0,53 92 H1,H2,H4,A1 15. TCG 39 0,12 0,34 91 A2 16.TGG 32 0,10 0l28 87 B3,Al,A10 17. TGC 51 0,18 0,47 93 B6,B2,A4,A7,A8 18. TGA 46 0,12 0,37 94 H7 19. TAC 61 0,22 0,50 90 B4,A11 20. TAA 55 0,17 0t44 95 B5,A10 21. CCT 53 0,30 0,55 97 H3,S4,B10 22. CAC 47 0,25 0X51 92 A3 23. CAA 58 0,25 0,51 93 H2,H6,G8,A7 24. CTT 41 0,28 0,54 92 B2,B9,A4 25. CGA 40 0,27 0,52 93 A7 26. CGT 75 0,25 0,50 89 H2,H4,B3,B1 27. GGT 35 0,09 0,26 90 B3 28. GTT 46 0,18 0,45 93 B2 29. GTA 38 0125 0,50 95 B6,B8,A6 30. CAA 39 0,15 0t39 88 H7,B3,B8,A5 31. GAT 52 0,22 0,49 89 B10,A9 32.GCA 42 0,14 0,39 93 A9 Tridésoxynucléotides totalement protégés ; phosphate de 5'-O-diméthoxytrityl-3'-p-chlorophényle-ss-cyanoéthyle Le Le rendement est le rendement global calculé à partir des monomères 5'-hydroxylés Basée sur l'analyse par HPLC 3. Assemblage et clonage du gène de la chaîne B et du gène de la chaîne A Le gène de la chaîne B de l'insuline a été conçu de façon à présenter un site de restriction EcoRI à l'extrémité gauche, un site HindIII au milieu et un site BamHI à l'extrémité droite. Ceci a été effectué pour que les deux moitiés, la moitié gauche EcoRI HindIII (BH) et la partie droite HindIII-BamHI (BB) puissent être séparément clonées dans le vehicule de clonage approprié pBR322 et, après vérification de leurs séquences, être réunies pour donner le gène B complet (Figure 10).On assemble la moitié BB par ligature à partir de 10 oligodésoxyribonucléotides, marqués B1 à B10 sur la Figure 9, préparés par synthèse chimique par la voie phosphotriester. B1 et B10 ne sont pas phosphoryles, en éliminant ainsi une polymérisation désirée de ces fractions par leurs extrémités cohésives (HindIII et BamHI). Après purification par électrophorèse préparative sur gel d'acrylamide et élution de la plus grande bande d'ADN, on insère le fragment BB dans le plasmide pBR322 qui a été coupé par HindIII et BamHI.Environ 50 % des colonies résistantes à l'ampicilline provenant de 1'ADN Sont sensibles à la tétracycline, ce qui indique qu'un fragment HindTII-BamHI non plasmidique a été inséré. Les petits fragments HindIII-BamHI de quatre de ces colonies (pBB101 à pBB104) sont analysés pour déterminer leur séquence et on trouve quelle est correcte telle que conçue. On prépare le fragment BH d'une manièresimilaire et on l'insère dans pBR322 qui a été coupé par les endonucléases de restriction EcoRI et HindIII. On analyse les plasmides de trois transformants sensibles à la tétracycline et resistants à l'ampi- cilline (pBH1 à pBH3). On trouve que les petits fragments EcoRI- HindIII ont la séquence de nucléotides désirée. On assemble le gène de la chaine A en trois parties. On ligature séparément les quatre oligonucléotides de gauche, les quatre du milieu et les quatre de droite, puis on les mélange et on les ligature (les oligonucléotides A1 à A12 ne sont pas phosphorylés). On phosphoryle le gène de la chaine A assemblé, on le purifie par électrophorèse sur gel et on le clone dans pBR322 aux sites EcoRI-BamHI. Les fragments EcoRI-BamHI de deux clones résistants à l'ampicilline et sensibles à la tétracycline (pA10, pA11) contiennent la séquence désirée du gène A. 4. Construction des plasmides~pour 1'expression des gènes des chaînes A et B de l'insuline La Figure 10 illustre la construction du plasmide lacinsuline B (pIB1). On fait digérer les plasmides pBH1 et pBB101 avec les endonucléases EcoRI et HindIII. On purifie par électrophorèse sur gel le petit fragment EH de pBH1 et le grand fragment de pBB101 (contenant le fragment BB et la majeure partie de pBR322), on les mélange et on les ligature en présence de Aplac coupé par EcoRT. Le fragment EcoRI de 4,4 mégadaltons de #plac5 contient la région de commande lac et la majeure partie du gène de structure de la ss-galactosidase.La configuration des sites de restriction assure une jonction correcte de EH à BB. Le fragment lac EcoRI peut être inséré dans deux orientations , ainsi, seulement la moitié des clones obtenus après transformation auront ltorienta- tion désirée. L'orientation de dix clones constitutifs de > - galactosidase et résistants à l'ampicilline est vérifiée par analyse par enzyme de restriction. Cinq de ces colonies contiennent la séquence entière du gène B et le schéma de lecture correct allant du gène de la B-galactosidase dans le gène de la chaîne B. On en choisit une, pIB1, pour les expériences ultérieures. Dans une expérience similaire, on introduit le fragment lac de 4,4 mégadaltons de #plac5 dans le plasmide pA11 au site EcoRI pour obtenir pIA1. pIAl est identique à pIBI, sauf que l'on a substitué le fragment de gène A au fragment de gène B. L'analyse des séquences de 1'ADN montre que les séquences correctes des gènes des chaînes A et B sont retenues respectivement dans pIAa et BIBI. 5. Expression Les souches qui contiennent les gènes de l'insuline correctement fixés à la ss-galactosidase produisent de grandes quantités d'une protéine de la taille de la 6-galactosidase. Environ 20 % de la protéine cellulaire totale est cet hybride S-galactosidase- chaîne A ou B de l'insuline. Les protéines hybrides sont insolubles et se trouvent dans la première pastille à faible vitesse de centrifugation, où elles constituent environ 50 % de la protéine. Pour détecter l'expression des chaînes A et B de l'insuline, on a utilisé un radio-immuno-essai (RIE) basé sur la reconstitution de l'insuline complète à partir des chaînes séparées. Le mode opératoire de la reconstitution de l'insuline de Katsoyannis et al (1967) Biochemistry 6, 2642-2655, conçu pour un volume d'analyse de 27 microlitres, fournit un essai très approprié. On obtient une activité d'insuline facilement détectable après mélange et reconstitution des dérivés S-sulfonés des chaînes de l'insuline. Les chaînes S-sulfonées séparées de l'insuline ne réagissent pas significativement, après réduction et oxydation, avec l'anticorps anti-insuline utilisé. Pour utiliser l'analyse par reconstitution, on a partiellement purifié la protéine hybride ss-galactosidase-chaine A ou B, on l'a coupée par le bromure de cyanogène et on a formé les dérivés S-sulfones. On peut résumer comme suit les résultats qui montrent que l'on a obtenu l'expression correcte de l'insuline humaine à partir de gènes synthétisés par voie chimique a) On a détecté pour les deux chaînes une activité radioimmunologique. b) Les séquences d'ADN obtenues après clonage et construction du plasmide ont été vérifiées directement comme étant correctes telles que conçues. Comme on a obtenu l'activité radio-immunologique, la traduction doit être en phase. Donc, le code génétique indique que les peptides ayant les séquences de l'insuline humaine ont été produits. c) Les produits de E. coli, après coupure par le bromure de cyanogène, se comportent comme des chaînes d'insuline dans trois systèmes chromatographiques différents qui permettent une séparation sur des principes différents (filtration sur gel, échange d'ions et HPLC en phase inverse). d) La chaîne A produite par E. coli a été purifiée sur une petite échelle par HPLC et a la composition correcte en aminoacides. REVENDICATIONS 1. Plasmide recombinant amélioré permettant la transformation d'un hôte bactérien et son utilisation comme vecteur de clonage, caractérisé en ce que le plasmide comprend (a) un régulon homologue à l'hôte bactérien dans son état non transformé ; et (b) en phase de lecture avec le régulon, un ADN inséré codant la séquence d'amino-acides d'un polypeptide hétérologue, de sorte que les bactéries transformées par le plasmide peuvent exprimer ladite séquence d'amino-acides sous forme récupérable. 2. Plasmide bactérien selon la revendication 1. 3. Plasmide selon la revendication 2, dont le régulon est essentiellement identique à un régulon ordinairement présent dans 1'ADN chromosomique de l'hôte bactérien. 4. Plasmide selon la revendication 2, caractérisé en ce que le régulon comprend le système promoteur-opérateur d'un opéron choisi dans le groupe comprenant l'opéron lac de E. Coli et l'opéron tryptophane de E. Coli. 5. Plasmide selon la revendication 3, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue est une hormone-mammifère ou un de ses intermédiaires. 6. Plasmide selon la revendication 4, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue est une hormone mammifere ou un de ses intermédiaires. 7. Plasmide selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue est choisi dans le groupe comprenant la pré-pro-insuline humaine, la pro-insuline humaine, la chaîne A de l'insuline humaine, la chaîne B de l'insuline humaine, l'hormone de croissance humaine ou bovine, l'hormone de lutéinisation, l'hormone adrénocorticotropk: ique et le polypeptide pancréatique. 8. Plasmide selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue est une hormone mammifère. 9. Plasmide selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue est la somatostatine. 10. Plasmide selon la revendication 9, caractérisé en ce que le régulon comprend le système promoteur-opérateur de l'opéron lac de E. Coli.