FR 2422699 A1 19791109 FR 7810738 A 19780412 La présente invention a pour objet un nouveau matériau capable de fixer de façon réversible des macromolécules biologiques, sa préparation et son application. La -présente invention a plus précisément pour objet de nouveaux matériaux solides poreux aptes à être utilisés comme phases stationnaires dans des colonnes de chromatographie, caractérisés par le fait qu'ils sont constitués par un support minéral poreux revêtu par un polymère polysaccharidique, ou par un polymère polysaccharidique modifié de formule schématique I dans laquelle R représente un reste de polymère polysaccharidique n est un nombre entier pouvant varier de 1 à 10 et de préférence de 2 à 5, R1 et R2 identiques ou différents, représentent un radical alkyle inférieur ou un radical alkyle inférieur hydroxyle, ledit revêtement polysaccharidique étant si nécessaire à 11 état réticulé pour favoriser sa stabilité, et par le fait que sur ledit revêtement polysaccharidique ou polysaccharidique modifié se trouvent greffées des molécules ou macromolécules aminées capables de constituer un site réactif en chromatographie, ladite molécule ou macromolécule aminée répondant à la formule R' - NH2, R' étant le reste de ladite molécule ou macromolécule aminée, la liaison de greffage de ladite molécule ou macromolécule aminée répondant à la formule schématique 3 - CH2 - NH - R' R' étant défini comme précédemment et R3 - CH2 - représentant le reste dudit polymère polysaccharidique ou dudit polymère polysaccharidique modifié après que celui-ci ait été soumis à une coupure oxydante suivie dtune réduction.Dans ce qui précède on désigne par "alkyle inférieur un radical alkyl ayant 1 à 4 et de préférence 1 ou 2 atomes de carbone. Les polymères polysaccharidiques et polysaccharidiques modifiés utilisables pour réaliser le matériau solide poreux de l'invention sont des polymères polysaccharidiques modifiés ou non capables de donner lieu à la réaction bien connue de coupure oxydante à l'aide d'agents oxydants tels que les périodates ou le tétracétate de plomb. Selon des modes de réalisation préférés - le support minéral poreux est constitué notamment par un oxyde mtall;que tel que la silice, l'alumine, la magnésie ou un oxyde de titane, ou par des dérivés synthétiques ou naturels de ces oxydes tels que les verres, les silicates, les borosilicates, le kaolin, etc.. ; - le polymère polysaccharidique est notamment la cellulose - le polymère polysaccharidique modifié est un polymère de formule I dans laquelle R est un reste dextran, d'amidon ou de cellulose et notamment le diéthylaminoéthyldextran, DEAE Dextran, le diéthylaminoéthylamidon, ou la diéthylaminoéthylcellulose - le revêtement de polymère polysaccharidique est si nécessaire stabilisé par réticulation, l'agent réticulant étant par exemple un composé dicarbonylé, une halohydrine ou un diépoxyde, notamment le 1, 4-butanedioldiglycidyléther, I 'épichlorhydrine, l'épibromhydrine, ou un époxyde de formule :: dans laquelle R5 est un alkyle ayant 1 à 20 atomes de carbone, de préférence un alkyle inférieur ayant de 1 à 4 atomes de carbone et R4 et R6 présentent une chaîne hydrocarbonée ayant 1 à 10 atomes, de préférence un radical alkylene inférieur ayant 1 à 4 atomes de carbone ; - la molécule ou macromolécule aminée de formule R'-NH2, pouvant servir de site réactif en chromatographie peut être toute molécule porteuse de fonctions NH2 utilisable en chromatographie d'affinité biospécifique, chimique ou physico-chimique.Il s'agit de molécules susceptibles de donner lieu à des interactions réversibles de type biospécifique, chimique ou physico-chimique, par exemple des interactions ioniques, des interactions faisant intervenir des propriétés d'hydrophobie, des interactions faisant intervenir une affinité biospécifique ou chimique, par exemple la formation de complexes réversibles.La molécule ou macromolécule aminée peut avoir un caractère cationique susceptible d'être mis à profit dans des réactions d'échange d'anions ; elle peut comporter des groupements anioniques tels que des groupements carboxylique ou sulfonique, et donner lieu à des réactions d'échange de cations ; elle peut être aussi une molécule ou macromolécule aminée pouvant servir de site réactif en chromatographie biospécifique et constituer par exemple un substrat ou un inhibiteur d'enzymes, un récepteur d'hormones, de protéines, de virus ou de bactéries, un antigène ou un anticorps.Ladite molécule ou macromolécule aminée peut être notamment une polyamine telle que la 3-diéthylaminopropylamine ou la N,N-diéthyléthylènediamine, la taurine, l'acide e-amino-caprolque, la lysine, la phenylalanine, la phénylhydrazine, l'acide métaaminophénylboronique, les antigènes bactériens, les globulines, notamment les gammaglobulines, les toxines bactériennes, les virus ou leurs produits de dégrada- tion tels que les divers antigènes viraux, les récepteurs cellu lairds tels que les produits d'hydrolyse des gangliosides possédant des fonctions WH2, en particulier les produits d'hydrolyse du ganglioside GM1 tel que le lysoganglioside GMlJ ou les produits d'hydrolyse partielle du ganglioside Giyl. On sait que les gangliosides possèdent un groupement N-acyle (acyle dérivé d'un acide gras tel que l'acide stéarique) et au moins un groupement N-acetyle (en position 3 d'un fragment galactose), d'autres groupements N-acétyle portés par des molécules d'acides sialiques étant éventuellement présents. Ces groupements N-acyle ou N-acétyle sont partiellement ou totalement hydrolysables en groupements -NH2. Par analogie avec la nomenclature proposée par SVENNERHOLM pour le ganglioside G on désignera ciaprès par "lysogangliosides" les produits obtenus par hydrolyse totale des groupements N-acyle et N-acétyle des gangliosides en groupements -NH2.Les produits d'hydrolyse partielle des gangliosides, dans lesquels certains groupements NH2 ont été désacylés ou désacétylés par hydrolyse alcaline, constituent des dérivés également utilisables comme molécules aminées pouvant servir de sites réactifs dans le matériau de l'invention. Il convient en outre de noter que les matériaux de l'invention sur lesquels se trouve fixé du lysoganglioside GMi sont capables de retenir la toxine cholérique même après des traitements en milieux fortement acides, par exemple à pH 1. Or il est connu qu'en milieu acide les gangliosides perdent une ou plusieurs molécules d'acide sialique et peuvent être transformés en mono-sialo- ou a-sialogangliosides (ou-lysogangliosides). Il en résulte que pour fixer la toxine cholérique, on peut utiliser un matériau selon l'invention sur lequel on a fixé, comme molécule aminée de formule R'-NH2, un dérivé d'un ganglioside quelconque (dont les groupements N-acetyle et N-acyle ont été totalement ou partiellement hydrolysés pour faire apparaître des groupements Nu2), à condition de soumettre ensuite ledit matériau à un traitement acide pendant un temps suffisant pour permettre la transformation des dérivés de poly-sialoganglioside en dérivés de mono-on a-sialogangliosïdes. L'invention a également pour objet un procédé de préparation du nouveau matériau tel que défini ci-dessus Ce procédé est caractérisé par le fait que l'on effectue un revêtement du support minéral poreux par le polymère polysacoha- ridique ou par le polymère polysacoharidique modifié, que si desiré on transforme le revêtement polysacoharidique en revêtement polysaccharidique modifié, que l'on effectue si nécessaire une réticulation pour stabiliser le revêtement, que l'on soumet ledit revêtement polysaccharidique ou polysaccharidique modifié à une coupure oxydante, que l'on fait réagir le produit d'oxydation ainsi obtenu avec la molécule ou macromolécule aminée de formule R' NH2, puis que l'on soumet le dérivé iminé obtenu à l'action d'un agent réducteur capable de réduire la liaison imine en liaison amine. Le procédé décrit ci-dessus consiste donc notamment à fixer la molécule ou macromolécule aminée sur le revêtement polysaccharidique ou polysaccharidique modifié par la suite de réactions suivantes a) coupure oxydante des groupements alpha-glycol pour donner des dérivés carbonylés que l'on peut schématiser par la formule R4 - CHO, R4 étant le reste de la molécule polysaccharidique après la réaction de coupure oxydante ; b) réaction de la molécule ou macromolécule aminée sur les groupements carbonylés selon la réaction R4 - CHO + R' - NH2 #R4 - CH = N - R' + H20 ; puis c) réduction de la liaison imine en liaison amine stable, par exemple par l'hydrogène naissant, selon la réaction R4 - CH = N - Rl + 2H-#'R3- CH2 - NH - R', R3 étant défini comme précédemment. Ces diverses transformations chimiques peuvent être effectuées à température ambiante dans une colonne de chromatographie. Pour la réaction de coupure oxydante qui est connue en soi, on peut utiliser par exemple le tétraaoétate de plomb, l'acide periodique ou un de ses dérivés, tel qu'un periodate alcalin. Dans le cas ot le polymère polysaccharidique modifié est un polysaccharidique aminé analogue au DEAE dextran, il est utile, après la rea tion d'oxydation, de saturer ces groupements cationiques par des ions, tels ques des ions halogènure, pour éviter tout risque de pertubation de la réaction ultérieure de la molécule ou macromolécule aminée avec les groupements aldéhyde du support. Pour la réaction de réduction on peut utiliser par exemple un hydrure tel que le borohydrure de sodium. Pour effectuer le revêtement du support minéral poreux par le polymère polysaccharidique ou par le polymère polysacoha- ridique modifié, on peut procéder par exemple comme décrit dans la demande de brevet principale, c'est-à-dire que l'on introduit dans une colonne de chromatographie le support minéral poreux sous forme de poudre,-on fait passer un tampon de pH 3 à 12, jusqu'à équilibre, on introduit une solution dudit polymère dans le même tampon puis on élue jusqu'à absence de polymère dans les éluats, ou bien on imprègne le support minéral poreux à l'aide d'une solution aqueuse dudit polymère à un pH compris entre 3 et 12 puis sèche à l'étuve entre 50 et 1200C jusqu'à poids constant. Lorsque la molécule aminée R'-NH2, fixée sur le support poreux, par le procédé qui vient d'être décrit, est un produit d'hydrolyse partielle ou totale d'un poly- ou mono-sialo ganglio side, le procédé de l'invention comprend en outre un stade final facultatif de traitement acide du matériau obtenu pendant un temps suffisant pour transformer ledit produit d'Hydrolyse en produit d'hydrolyse correspondant d'un mono- ou a-sialo ganglioside.Pour effectuer ce traitement acide on peut utiliser par exemple une solution aqueuse d'acide chlorhydrique de concentration supérieure ou égale à O, 1N Pour obtenir un revêtement de cellulose il est avantageux d'opérer de la façon suivante : on imprègne le support minéral poreux à l'aide d'une solution d'un ester de cellulose, on sèche et soumet le support revêtu à l'action d'un agent d'Hydrolyse, par exemple à l'action d'une solution aqueuse alcaline, de façon à hydrolyser les groupement#s esters. On obtient de cette façon un support minéral poreux revêtu de la cellulose ainsi régénérée. Le revêtement de cellulose ainsi obtenu est très stable et tapisse parfaitement les pores du support minéral poreux. Il est inutile de stabiliser ce revêtement par réticulation. Il est possible ce stade de transformer le revêtement de cellulose en revêtement de cellulose modifiée en le faisant ravir avec n agent approprié, par exemple en faisant réagir avec un composé de formule cyans laquelle n, Rl, et R2 sont définis comme précédemment et X est un atome d'halogène. On peut par exemple faire réagir le support minéral poreux impregné de cellulose avec la 2-calorotriethylamine à pH alcalin et obtenir ainsi un revêtement de diéthylaminoéthylcellulose. L'invention a également pour objet, le procédé de revêtement, sur un support minéral poreux, de cellulose ou de cellulose modifiée qui vient d'être décrit. Le support minéral poreux utilisable selon l'invention doit avoir une porosité contrôlée bien définie. La surface interne du support doit être inférieure ou égale à 100 m2/g et si possible être comprise entre 5 et 80 m2/g. Le diamètre poreux moyen doit être supérieur ou égal à 25 nm et si possible compris entre 50 et 1000 nm, des intervalles plus précis peuvent être conseillés suivant le type d'application envisagé. Pour des surfaces plus grandes ou des diamètres poreux faibles la surface interne du support devient inacessible au polymère polysaccharidique aminé et ultérieurement aux macromolécuîes à séparer.Selon un mode préféré de l'invention, le support poreux minéral est de la silice ou de l'alumine et de préférence un support de silice poreuse à caractère anionique obtenue par exemple selon les procédés décrits dans les brevets français NO 1.473.239, NO 1.473.240, NQ 1.475.929 et NO 1.482.867. On utilise par exemple des silices poreuses commercialisées par RHONE-POULENC CHIMIE FINE sous les dénominations de SPHEROSILS XOB 030, XOB 015 et XOC 005, ces silices ayant des surfaces respectives de 50, 25 et 10 m2/g. Le polymère polysaccharidique ou polysaccharidique modifié qui sert à imprégner et à recouvrir la surface interne du support poreux minéral a un poids moléculaire au moins égal à 10 daltons et de préférence compris entre 105 et 106 daltons. L'invention a également pour objet l'application des nouveaux matériaux décrits ci-dessus à la purification ou à la séparation des macromolécules biologiques. D'une façon générale cette application consiste à utiliser les propretés d'affinité de la molécule ou macromolécule aminée greffée sur le support, dans une colonne de chromatographie, soit pour fixer sélectivement des macromolécules biologiques que l'on désire isoler ou purifier soit pour retenir sélectivement des impuretés ou autres protéines non désirées. Cette application est caractérisée par le fait que l'on fait passer dans une colonne contenant le matériau objet de l'invention une solution contenant les macromolécules biologiques que l'on désire isoler ou purifier. Dans le cas ou le matériau fixe les macromolécules biologiques que l'on désire purifier ou isoler, celles-ci sont ensuite éluées avec une solution convenable, permettant de séparer, selon les méthodes connues lesdites macromolécules biologiques d'avec la molécule R H2 à laquelle elles sont fixées par affinité.Par exemple, dans le cas où les macromolécules biologiques à isoler sont fixées par affinité biospéci- fique sur un ligand, on les sépare, selon les méthodes connues de séparation des macromolécules biologiques d'avec leur ligand. Bien entendu, selon la macromolécule biologique à isoler ou purifier, on choisira un matériau poreux sur lequel est fixée une molécule R'-NH2 douée d'affinité pour ladite macromolécule biologique, Dans le cas où le matériau fixe les impuretés on recueille directement la macromolécule biologique désirée en solution, le matériau poreux étant alors revêtu d'une molécule aminée R'-NH2 douée d'affinité pour l'impureté que l'on désire éliminer. On peut ensuite éluer les impuretés avec une solution convenable et régénérer ainsi le matériau pour une nouvelle opération. Lorsque la macromolécule biologique à isoler, ou l'impureté à retenir est fixée sur le matériau de l'invention en mettant à profit les propriétés d'échange d'ions de celui-ci, l'élution de la molécule ainsi fixée est effectuée à l'aide d'une solution de pH et de molarité convenables. Lorsque l'on ne désire pas utiliser les propriétés d'échange d'ions du matériau de l'invention, par exemple lorsque l'on veut utiliser uniquement les propriétés d'affinité bio-spécifique, il convient d'utiliser dans la colonne des solutions de force ionique suffisante afin de neutraliser les fonctions échangeuses d'ions.Ainsi dans le cas où le matériau de l'invention comporte àes sites -cationiques, il convient de neutraliser les groupements cationiques, par exemple par des ions Cle pour éliminer tout: interaction non spécifique de type ionique Dans certains cas, il est possible de mettre à profit à la fois les propriétés d'échange d'ions et d'autres propriétés d'affinité, par exemple des propriétés d'affinité blo-spécifique, du matériau de l'invention pour séparer en une seule chromatogra pnie plusieurs protéines différentes.Par exemple, avec un matériau possédant à la fois des sites cationiques et des sites à affinité bio-spécifique, on peut aisément réaliser la séparation d'un mélange de trois protéines : une première protéine à caractère électropositif, une seconde protéine à caractère éléctroné- gatif et une troisième protéine capable de se fixer sur les sites d'affinité blo-spécifique En effet, lorsqu'on procède à la chromatographie d'un tel mélange, la première protéine ne se fixe pas et est donc retrouvée à la sortie de la colonne La seconde protéine se fixe sur les sites cationiques et peut être éluée à l'aide d'une solution contenant des anions capables de la déplacer des sites cationiques, par exemple une solution de chlorure de sodium.La troisième protéine se fixe sur les sites d'affinité biospécifique et peut être séparée de ceux-ci avec un éluant convenable. Quelques exemple d'application selon l'invention sont donnés ci-après à titre non limitatif. A. Purification de la toxine cholérique On sait qu'en se développant dans un milieu de culture approprié le vibrion cholérique secrète une toxine appelée cholé ragène ou entérotoxine qui est responsable des diarrhées provoquées chez l'homme par ce germe. Après centrifugation et filtration du milieu de culture final, il est possible d'obtenir un infiltrat de culture brut" contenant la toxine cholérique mélangée à de nombreuses autres macromolécules du milieu de culture ini tial ou secrétées par les vibrions. La toxine cholérique se transforme partiellement et progres vivement en forme-non toxique appelée chloléragénolde, Le cholé ragénoide a une structure voisine de celle du choléragène, mais le choléragène possède en plus une channe polypeptidique A responsable de la toxicité. Le choléragène et le choleragenolde se fixent tous deux sélectivement sur un récepteur qui a été identifié en 1973 et qui a été désigné "Ganglioside GMl1, Plusieurs auteurs ont décrit l'intérêt du choléragène et du choléragénode pour la préparation de vaccins et on conçoit donc qu'il est utile de pouvoir obtenir des quantités importantes de ces produits. La purification du choléragène et du choléragénoide a été décrite par de nombreux auteurs mais nécessite souvent de nombreuses étapes pour arriver à des produits correctement purifiés et standardisés ; de ce fait ces méthodes sont difficilement industrialisables. Par chromatographie d'affinité biospécifique il est théoriquement possible d'obtenir en une seule étape le produit recherche dans un état très purifié. Dans cet esprit, CUATRECASAS (1973) a décrit une méthode pour capter sélectivement la toxine cholérique par chromatographie d'affinité. Des colonnes chromatographiques d'agarose étaient modifiées chimiquement pour fixer le ganglioside GMl par liaison covalente.Grâce à son affinité pour le G1 la fixation de la toxine cholérique était effectivement possible mais la récupération de cette toxine était rendue difficile en raison d'une affinité extrêmement forte entre le GM1 lié à l'agarose et la toxine. Ceci rendait obligatoire l'utilisation de milieux dénaturants pour dissocier le complexe et entraînait une dénaturation et de mauvais rendements en fin d'opération. D'autre part la méthode d'activation de l'agarose préconisée exige l'emploi de bromure de cyanogène très dangereux à manipuler et pouvant donc entraîner des complications non souhaitables dans un-éventuel développement industriel. Par ailleurs, les dérivés préparés sur agarose par la méthode au bromure de cyanogène, se sont révélés assez instables surtout pour des pH acides (pH La présente application permet d'exploiter l'efficacité et la rapidité des chromatographies à affinité biospécifique mais en utilisant un support chromatographique convenant parfaitement pour un usage industriel. L'utilisation de ce support en affinité biospêcifique n'est possible qu'après avoir immobilisé le ligand choisi sur la surface interne des pores. Deuv sortes de ligands différents, tous deux spécifiques de la toxine cholérique ont été utilisés. Le premier est un dérivé du gangliosde GMl qui est doué d'une "affinité biochimique" forte et spécifique pour le choléragène ou le choléragénolde. Le second est l'anticorps anti-toxine cholérique, doué d'une "affinité i=munologique" spécifique vis à vis du choléragène et du choléragénoide. L'affinité de la toxine pour le ganglioside G est connue pour être très forte et probablement plus forte que l'affinité pour l'anticorps Cependant après greffage du ganglioside 21 à la surface de la silice par les procédés qui seront indiqués, on a découvert que l'affinité obtenue entre le GMl ainsi greffé et la toxine cholérique est tout à fait réversible. Contrairement aux résultats de CUATRECASAS, il est alors possible de récupérer la toxine cholérique dans des conditions d'élution relativement douces. Ceci n'est pas explicable par la théorie, et constitue un résultat surprenant. Pour éluer la toxine cholérique fixée sur le matériau de l'invention, on peut utiliser un tampon acide, par exemple un tampon citrate acide, une solution fortement concentrée en urée, en guanidine, en iodure (par exemple iodure de sodium), en thio oyanate (par exemple thiocyanate de potassium) ou tout autre agent chaotropique ou dénaturant. En ce qui concerne la stabilité des ligands greffés, un progrès important a également été obtenu grâce à la présente invention. En effet, il est possible de laver régulièrement les supports avec des solutions telles que HC1 0,1 N ou NaOH 0,1 N, c'est-à-dIre de pH 1 à pH 13 sans que les qualités d'affinité biospécifique en souffrent. De telles stabilités n'existent pas sur les supports connus par exemple à base d'agarose qu'il faut éviter d'amener à des pH extrêmes. Enfin sur le plan mécanique, les débits possibles de 200 à 400 ml/cm2/h et l'absence de tassement du support ont bien confirme l'intérêt de ces nouvelles méthodes pour le développement industriel envisagé. B-Autres applications Avec le matériau de l'invention, réalisé avec la lysine comme molécule aminée, il est possible de mettre à profit l'affinité lysine-plasminogène pour isoler et purifier le plasminogène du sang. Avec le matériau de l'invention, réalisé avec l'acide métaaminophényl boronîque comme molécule aminée, il est possible de fixer réversiblement des sucres et des macromolécules comportant des sucres à fonction cis-a-glycol (glycoprotéines, acides nucléiques et lipopolysaccharides). De la même façon, en utilisant comme molécule aminée des antigènes bactériens, il est possible de fixer réversiblement les anticorps correspondants; en utilisant comme molécule aminée des gammaglobulines, il est possible de fixer réversiblement les antigènes correspondants; en utilisant comme molécule aminée les toxines-bactériennes, il est possible de fixer notamment les anticorps correspondants; etc... Les exemples illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 - Greffage du lysoganglioside GM1 sur support minéral poreux imprégné de diéthylamineéthyl dextran secondairement réticulé 1.1. - Le support à base de DEAE Dextran est préparé selon l'une des techniques citées dans le brevet principal. 10 g de Sphérosil XOB 030 sont additionnés de 30 ml de DEAE Dextran 7,5 % à pH 11,5. L'ensemble est séché une nuit à 800C, puis additionné de 30 ml d'une solution de butanedioldiglycidyléther à 1,5 % dans l'éther éthylique. L'éther est évaporé sous un courant d'air, puis l'ensemble est mis 15 h à 800C, pour obtenir la réticulation du DEAE Dextran. 1.2. - La solution de cangliosides est préparée par chromatographie d'échange d'ions sur silice poreuse imprégnée de DEAE Dextran selon la méthode décrite à l'exemple 8 de la demande de brevet français n0 76 23176. La solution brute de ganglioside ainsi obtenue contient environ 40 % de ganglioside GMl utile dans la -présente application. Les deux fonctions N-acétyle et la fonction N-acyle du ganglioside G1 sont alors hydrolysées en fonctions aminées NH2, par hydrolyse alcaline selon le procédé décrit antérieurement par HOL1GREN, MANSSON et SVENNERHOLM, Medical Biology (197t), 52, 229-233. Le produit ainsi obtenu est appelé lysoganglioside, il possède trois fonctions NH2 par molécule. Après lyophilisation la poudre obtenue est dissoute dans un tampon carbonate 0,01 M de pH 9 contenant 20 g/l de Nazi, à la concentration de 1 mg/ml. 1 mi de cette solution contient environ 370 ijg acide sialique par ml. 1.3. - dation periodrque du support Les 10 g de sphérosil XOB 030 imprégnés de DEAE Dextran secondairement réticulé, sont additionnés de 100 ml d'une solution aqueuse de pcriodate de sodium 0,02 M (pH voisin de 4,5). Le temps d'oxydation est de 2 h, la température ambiante convient très bien pour cette opératIon. Le support est ensuite lavé dans une solution de carbonate de sodium 0,01 M, de pH 9, additionnée de 20 gZl chlorure de sodium. La force ionique élevée de ce tampon est destinée à saturer les groupements cationiques-dll DEAE Dextran réticulé et oxyde, par des ions #i# et à les empêcher de fixer ultérieurement le lysoganglioside par des forces électrostatiques risquant de gêner la réaction des groupements aminés sur les fonctions aldé- hyde du support. A ce stade il est facile de mettre en évidence les fonctions aldéhyde du support oxydé. En présence de réactif de Schiff, une coloration rose violacé intense se développe. 1.4. - Greffage du lysoganglioside Le support précédent est lavé puis additionné de 50 mi de lai solution de lysoganglioside GMl. Après un temps de contact de 2 h, le surnageant de contact est décanté. Par un dosage d'acide sialique il est facile de montrer que la quasi totalité du iysoganglioside a été couplée (95 à 100 t). Le support est rincé en tampon carbonate pH 9. A ce stade il est facile de montrer également que la coloration du support avec le réactif de Schiff est beaucoup plus faible que dans l'étape précédente, indiquant une bonne fixation du lysoganglioside sur les fonctions aldéhyde du support oxyde. 1.5. - Réduction par le borohydrure de sodium 50 ml d'une solution 0,2 M de baSH4 dans Liteau (pH 9f sont additionnés au support précédent. Après un temps de contact de 2 h à température ambiante, le support est rincé à l'eau puis monté en colonne. Apyres équilibrage dans le tampon de chromatographie choisi (tampon phosphate 0,01 M de pH 7,2 contenant 20 g/l de Nacl), la colonne d'affinité biospécifique est prête à l'emploi. A ce stade aucune trace de fonction aldéhyde n'est plus décelable par coloration avec le réactif de Schiff. Les fonctions aldéhyde n'ayant pas réagi avec le lysoganglioside sont elles-mêmes tranformées en fonctions alcool primaire. Il faut noter que le support ainsi obtenu peut fonctionner parfaitement comme échangeur d'ions. Si l'on veut supprimer les intéractions ioniques avec les protéines pour ne conserver que les interactions biospécifiques, il est donc important d'avoir une force ionique minimum. En pratique une concentration minimale de 10 g/l NaCi suffit à supprimer l'effet d'échange d'ions. 1.6. - En suivant rigoureusement la même technique il a été possible de greffer aussi efficacement la lysine, la phénylalanine, la phényihydrazine, l'acide métaaminophénylboronique. On conçoit qu'il soit possible de greffer aussi toute molécule porteuse de fonctions NH2 comme par exemple : un substrat ou un inhibiteur d'enzymes, un récepteur d'hormones, de protéines, de virus ou bactéries, un antigène ou un anticorps, et d'utiliser chacun de ces supports en chromatographie d'affinité biospécifique EXEMPLE 2 Greffage du lysoganglioside G##1 sur support minéral poreux Imprégné de cellulose 2.1. - Imprégnation en cellulose 10 g de Sphérosii XOC 005 (ou de tout autre support minéral poreux) sont additionnés de 30 mi d'une solution acétonique d'acétate de cellulose à 3 % (le propionate de cellulose ou d'autres esters solubles en milieu organique solvant et hydrolysables peuvent convenir aussi bien pourvu qu'ils puissent redonner la cellulose originale par hydrolyse alcaline). L'ensemble est séché sous un courant d'air chaud. La poudre peut alors être tamisée, si nécessaire, et montée en colonne. Un lavage par 10 1 de solution aqueuse de Na0H 0,1 N est alors pratiqué en continu à un débit de 500 ml/h pendant toute une nuit. Après cette hydrolyse alcaline, la colonne peut être lavée à l'acétone ou à l'eau quel qu'en soit le pH, la cellulose ainsi régénérée n'est plus soluble et reste parfaitement à l'in térieur des pores du support minéral poreux, qu'elle tapisse d'autant mieux que le polymère initial a pu accéder aisément à la totalité de la surface interne. L'emploi d'esters de cellulose de poids moléculaire aussi faible que possible est conseillé pour cette raison. 2.2. - Préparation de la solution de lysoganglioside G à fonctions aminées Mêmes conditions que dans le paragraphe 1.2 2.3. - Oxydation periodioue du support Mêmes conditions que dans le paragraphe 1.3. 2.4. - reffaqe di lysoganglioside mc conditions que dans le paragraphe 1.4. 2.5. - Réduction par le borohydrure de sodium NaBH4 Mêmes conditions que dans le paragraphe 1.5. A la différence du support préparé selon l'exemple précédent, celui-ci ne possède pas de propriétés d'échangeur d'ions, et donc peut etre utilisé éventuellement pour des forces ioniques moins élevee, dans les cas où cela pourrait être un avantage. Pour l'affinité entre le lysoganglioside et la toxine cholérique ceci est indifférent. 2.6. - En suivant rigoureusement la même technique il a été possible de greffer des fonctions échangeuses d'anions notamment avec la 3-diethylaminopropylamine ou la N,N-diéthyléthylènedia- mine et d'utiliser les supports ainsi obtenus dans la chromato graphe des protéines. 2.7. - En suivant toujours la même technique il a été possible de greffer divers ligands à fonctions aminées dont la lysine, la phénylalanine, la phênylhydrazine, l'acide métaaminophényibo- ronique et d'utiliser les supports ainsi obtenus en chromatographie d'affinité biospécifique. De la même manière on peut greffer toute molécule à fonction(s) an inée (s) cornue par exemple : un substrat ou un inhibiteur d'enzymes, un récepteur dthormones, de protéines, de virus ou bactéries, un antigène ou un anticorps et utiliser chacun de ces supports en chromatographie d'affinité biospécifique. EXEMPLE 3 - Application à l'isolement et à la purification de la toxine cholérique Les colonnes décrites dans les exemples précédents (sauf 2. 6.) sont utilisables en chromatographie affinité biospécifique. ta présence de 10 à 20 g/l de llaCl dans le tampon de chromatographle est recommandée pour éliminer toute interaction non spécifique de type ionique avec les charges électriques des fonctions échangeuses d'ions, des ligands, ou des protéines présentes sur le support. En passant un filtrat de culture de vibrions cholériques additionné de 10 gfl de NaCI sur chacune de ces colonnes il est facile de vérifier que le choléragène et le choléragénoide s'accrochent sur le support. En effet à condition de rester en dessous de la capacité maximale de fixation de la colonne, le filtrat obtenu en sortie de colonne est complètement dépourvu d'activité toxique mesurable par les tests connus. Après lavage par le tampon de chromatographie pour élimIner les protéInes non fixées, il est possible de récupérer le choléragène et le choléragénoide fixes, par élution avec le tampon citrate - acide citrique 0,05 M pH 2,8. La dénaturation obtenue est apparemment néglIgeable puisque les rendements obtenus varient de 50 à 100 %, mesurés par les tests classiques de dosage de la toxine cholérique. La pureté de la préparation peut être évaluée par chromatographie sur Sephadex G- 200 (le choléragène donne un pic correspondant à un poids moléculaire de 84 000, le choléragénoide donne un pic correspondant à un poids moléculaire de 56 000) ou par des méthodes immunochimiques avec des antiséums de contrôle. (Un antîsérum anti-filtrat de culture ne possédant pas d'anticorps antitoxine cholérique ne doit pas donner de ligne de précIpita- tion avec ces préparations purifiées). Une colonne de 10 g faite selon l'une des méthodes décrites dans les exemples précédents permet de traiter des quantités de filtrat de culture de 500 mi à 10 1, la quantité exacte dépendant évidemment de plusieurs paramètres, à savoir la quantité de toxine présente dans le filtrat de culture et la quantité de GM dans la solution brute de ganglioside. Les applications possibles sont les suivantes : - préparer une solution de choléragène et de choléragénoide purifiés pouvant servir à la préparation d'un vaccin. - débarrasser un filtrat de culture de vibrions cholériques de toute trace de choléragène et de choléragénoide. - préparer des antisérums vis à vis de ces deux types de solutions. EXEMPLE 4- Séparation des constituants d'un mélange de gamma globulines, d'albumine et de toxines cholériques en une seule chromatographie. Cet exemple a pour but de démontrer les possibilités d'utilisation simultanée du matériau décrit à l'exemple 1 à la fois en chromatographie d'échange d'ions et en chromatographie d'affinite. Contrairement à ce qui est realisé à l'exemple 3 précédent, on n'ajoute pas de chlorure de sodium dans le solvant de chromatographie qui contient un mélange artificiel de trois protéines garma-g.obulines, albumine et toxine cholérique. Les gamma- giobulines, qui présentent un caractère électro-positif, ne sont pas adsorbées sur la couche de DEAE Dextran modifie, tandis que l'albumine qul présente un caractère électro-négatif est fixée sur cette couche Quant à la toxine cholérique elle se fixe sur les sites de lysoganglioside GM1. En utilisant un #tampon de chromatographie de faible force ionique (tampon phosphate 0,01, pH6,8) on retrouve les gamma-globulines en sortie de colonne sous la forme d'un pic non adsorbé. Par élution subséquente avec un tampon contenant 10g par litre de chlorure de sodium, albumine est déplacée et éluée. L'élution ultérieure avec un tampon citrate de pH2,8, permet d'éluer ensuite la toxine cholérique. REV^z.{DICATIONS 1. Procédé de préparation d'un matériau solide poreux revetu de cellulose ou de cellulose modifiée, caractérisé par le fait que lton imprègne un support minéral poreux avec une solution d'un ester hydrolysable de cellulose, sèche, soumet le support revêtu ainsi obtenu à l'action d'une solution aqueuse alcaline de façon à hydrolyser les groupements ester, et obtient ainsi un support minéral poreux revêtu de cellulose, puis l'on transforme si désiré, le revêtement de cellulose en revêtement de cellulose modifiée. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on transforme le revêtement de cellulose en revêtement de cellulose modifiée en faisant réagir le matériau revêtu de cellulose avec un composé de formule X - (CH2) ~NR1(R2) dans laquelle n, est un nombre entrer pouvant varier de 1 à 10, R1R2 représentent un radical alkyle inférieur ou un radical alkyle inférieur hydro xylé et X est un atome a d'halogène. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'on fait réagir le matériau revêtu de cellulose avec la 2 chiorotriéthylamine à pH alcalin. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précedentes, caractérisé par le fait que ledit ester hydrolysable de cellulose est un ester soluble dans un solvant organique. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précé- dentes, caractérisé par le fait que ledit ester hydrolysable est l'acétate de cellulose. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que ledit ester est le propionate de cellu lose. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ledit support minéral poreux est un oxyde métallique tel que la silice, l'alumine, la magnésie, un oxyde de titane ou un dérivé syntilétique ou naturel de ces oxydes tel que les verres, les silicates, les borosilicates ou le kaolin.