FR 2419518 A1 19791005 FR 7806808 A 19780309 La présente invention est relative à un nouveau procédé de dosage enzymatique de microquantités de NAD(H) à L'aide d'un nouveau système d'amplification, à ce système d'amplification, ainsi qu'à un ensemble pret-à-l'emploi, ou kit, comprenant les réactifs prédosés nécessaires à la réalisation d'un tel dosage. On rappellera tout d'abord que le NAD, ou nicotinamideadénine-dinucléotide, est le coenzyme de nombreuses enzymes du type des déshydrogénases et qu'il a pour propriété essentielle de fixer l'hydrogène sur le noyau pyridinique de l'amide nicotinique, pour donner le NADH qui est fluorescent (alors que le NAD ne l'est pas). Comme on le sait, les méthodes de dosage enzymatique utilisent la spécificité des enzymes qui transforment exclusivement un produit à doser : cette transformation est mesurée par la formation d'une quantité stoechiométrique de chromophore ou de fluorophore. La sensibilité de ces méthodes est fonction des possibilités de détection des produits (coefficient d'extinction du chromophore ou rendement quantique du fluorophore formés). Les méthodes utilisant directement la fluorescence du NADH ou du NADPH permettent de mesurer seulement des concentrations de produits supérieures à 0,1 ou Molaire. Les méthodes analytiques qui se terminent par un dosage spectrophotométrique du NAD ou du NAD(H) s'appliquent au dosage d'un très grand nombre de substrats ou d'enzymes tant dans le domaine de la chimie analytique que dans celui de la biochimie clinique. En considérant la réaction (1) ci-après on voit que l'on peut, par la mesure du NADH formé (mesure directe ou mesure cinétique), doser les substrats S, les produits formés P ou encore les déshydrogénases spécifiques. Ainsi, l'on peut doser par exemple - par la mesure directe du NADH formé en quantité stoechiométri que, différents produits comme l'alcool, le glucose, le galac tose, le glycérol, le lactate , le pyruvate , l' rate , etc... - par la mesure cinétique du D, différentes activités enzyma tiques comme celles de l'alcool déshydrogénase, de la glucose 6 phosphate déshydrogénase, de l'isocitrate déshydrogénase, de la lactate déshydrogénase, de la malate déshydrogénase, de la sorbitol déshydrogénase, etc. L'on peut également doser toute molécule spécifiquement transformée par une enzyme en un produit non chromophore, mais dont un système auxiliaire permet la conversion en NADH, comme par exemple l'acétal coenzyme A, les nucléotides (CTP, CMP, CDP, etc... ). Il n'en demeure pas moins que malgré les avantages que procurent ces méthodes, elles ne permettent cependant pas le dosage de quantités de produits inférieures à O,S nanomole environ dans la prise d'essai, ce qui constitue un handicap certain, en particulier dans le domaine de la biochimie clinique. Aussi, s'est-on efforcé de mettre au point des systèmes d'amplification de ces dosages, c'est-à-dire des systèmes multiplicateurs qui augmentent la sensibilité de ces méthodes de dosage. Dans ces systèmes, le coenzyme non transformé par la réaction enzymatique est détruit sélectivement par un traitement alcalin ou acide, le coenzyme transformé en quantité stoechiométrique du substrat à doser, est utilisé comme facteur limitant dans un système à deux enzymes qui le réduit et l'oxyde alternativement. Dans ces conditions, la vitesse de formation des produits est proportionnelle à la concentration en coenzyme, c'est-à-dire en substrat à doser et on parvient ainsi à des sensibilites de détection de l'ordre de 80 à 100 fentomoles.Les systèmes amplificateurs proposés dans l'Art antérieur peuvent être représentés schématiquement de la manière suivante Substrat réduit 1ère enzyme Zeme enzyme Schéma I Si ce nouvel outil analytique permet de repondre à de nombreux problèmes de dosage posés par le biochimie clinique, il n'a cependant pas été possible de l'appliquer en routine car il présente de nombreux inconvénients:-le dosage des produits formés par les systèmes amplificateurs décrits dans l'Art antérieur nécessite en effet la destruction totale des enzymes du système amplificateur, et l'introduction d'une étape de dosage supplémentaire (chimique, physique ou enzymatique). De plus, le rapport pondéral entre les deux enzymes du système amplificateur doit être déterminé très strictement tout en tenant compte des conditions opératoires et de l'éventuelle compétitivité des deux enzymes, ce qui est souvent très diffi cile à réaliser. En outre, les dosages utilisant les systemes amplifi cateurs proposés conformément à l'Art antérieur ne permettent pas de suivre l'évolution de la réaction d'amplification : le résultat ne peut être obtenu et lu qu'à la fin de la réaction, en sorte que ce travail "en aveugIe" ne permet pas un contrôle en cours d'opération, et a pour conséquence qu'il est souvent nécessaire de recommencer plusieurs fois l'opération de dosage. Les méthodes d'amplification proposées dans l'Art an térieur sont relativement longues et lentes, peu reproductibles, insuffisamment sensibles et relativement peu précises. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à un système d'amplification permettant le dosa ge enzymatique de microquantités de NADouNADH,quirépond mieux aux nécessités de la pratique que les systèmes d'amplification antérieurement connus, notamment en ce qu'il abaisse le seuil de sensibilité jusqu'à 50 fentomoles, et même 10 fentomoles, tout en demeurant très précis, en ce qu'il est simple et parfaitement reproductible, en ce qu'il permet de suivre les opérations de dosage tout au long de leur déroulement depuis le temps zéro,en procédant à des lectures successives pour contrôler le déroule ment de la réaction, en ce qu'il aboutit toujours à la formation d'un chromophore sans requérir d'autres étapes de transforma tion physique ou chimique, et en ce qu'il fournit une très grande précision de dosage dans la gamme comprise entre 50 fen tomoles et 200 picomoles à laquelle les méthodes de dosage par fluorescence et les autres méthodes de dosage direct ne permet tent pas d'accéder. La présente invention a pour objet un nouveau système d'amplification permettant le dosage de microquantités de NAD ou NADH,caractérisé en cequ'ilcomprend:-une enzyme unique à double spécificité catalysant aussi bien la transformation du NAD en NADH que la transformation du NADH en NAD , - un substrat stéroide en C19 ou C18 comportant une double liaison ti50u b 5{ Suivant un mode de réalisation avantageux du système conforme à la présente invention, l'enzyme unique est une 3F-17P hydroxystéroide déshydrogénase. Cette enzyme catalyse en effet par sa fonction 17déshydro- génase la transformation du NADH en NAD et par sa fonction 3 ss déshydrogénase,la transformation du NAD en NADH : ces deux transformations réciproques se font indéfiniment, tant que le système n'est pas arrenté, et à une vitesse constante. Suivant un autre mode de réalisation avantageux du système d'amplification conforme à la présente invention, 1 'isomérase qui déplace la réaction vers la formation irréversible du chromophore est une a 5,3-cétostérolide isomérase. Suivant une modalité particulière de ce mode de réalisation, la quantité d'isomérase présente dans le milieu réactionnel est comprise entre 10 et 1000 milli U.I. Suivant un autre mode de réalisation avantageux du système conforme à la présente invention, 1' enzyme unique à double spécificité est utilisée après purification pour la débarrasser du NAD. Un des facteurs limitant la sensibilité du système d'am- plification à deux enzymes réside dans l'importance de la. con- tamination par le coenzyme qui est apporté par les deux enzymes à NAD du système amplificateur de l'Art antérieur. Cette contamination est considérablement réduite par le système ampli ficateur à enzyme unique conforme à la présente invention, qui est, de plus,débarrassé du NAD, ce qui permet d'augmenter encore la sensibilité du système. Le système d'amplification conforme à la présente invention est applicable non seulement au dosage du NADH, mais éga lement au dosage du NAD. La présente invention a également pour objet un procédé de dosage enzymatique de microquantités de NAD(H) formé en quantité stoechiométrique du produit à doser, à l'aide du nouveau système d'amplification conforme à l'invention, lequel procédé consiste : - à oxyder un substrat par une enzyme à NAD spécifique de ce substrat, en présence de NAD, pour obtenir un produit P1 d'oxydation du substrat, leRADH en quantité stoechio métrique du substrat, et un excès de NAD ; - puis à détruire le NAD en excès par chauffage en milieu alcalin, à une température de l'ordre de 65 à 100 C, - et à doser le bAD!H) par l'intermédiaire du système d'amplification conforme à l'invention, par dosage spectrophotométrique direct du chromophore stable obtenu par oxydo-réduction du produit P1 par l'enzyme à double spécificité, suivie de la transformation par isomérisation enzymatique du produit P2 de l'oxydo-réduction, en un chromophore qui est dosé directement par spectrophotométrie d'absorption. Ce procédé s'applique au dosage de substances pour lesquelles on dispose d'une enzyme spécifique conduisant à la formation d'une quantité stoechiométrique de NAD(H), et notamment au dosage des acides biliaires dans le plasma, au dosage des hormones stéroides qui conduisent à la formation de NADH tzar action d'hydroxystérolde-déshydrogénase, au dosage des prostaglandines, qui conduisent à la formation deNADH par action de-la15 OH prostaglandine-déshydrogénase La présente invention a également pour objet, un ensemble de dosage prêt-à-l'emploi, ou "kit" d'amplification et de dosage, caractérisé en ce qu'il comprend trois tubes contenant - l'un : environ 40 pg/ml de substrat - le deuxième : environ 10 milli U.I./ml de 3 0-170 hydroxysté- roide-déshydrogénase - le troisième : environ 100 milli U.I./ml d'isomérase. L'efficacité du nouveau système d'amplification conforme à la présente invention, c'est-à-dire sa sensibilité et sa précision,fait que les méthodes de dosage aboutissant à la détection du NAD(H) peuvent être étendues à la mesure de microquantités de substances qui leur étaient jusqu'ici inaccessibles. Il suffit, comme on l'a dit plus haut, de disposer pour ces dosages d'une enzyme spécifique du substrat à doser conduisant à la formation d'une quantité stoechiométrique de NAD(H), puis de mettre en oeuvre le système d'amplification conforme à la présente invention : la formation irréversible d'un chromophore à molaire élevé,comme la testostérone (t M =16600) ajoute à la grande sensibilité de ce nouveau systeme, une grande précision. La sensibilité du système d'amplification conforme à la présente invention, est supérieure à celle de tous les systèmes d'amplification connus utilisés jusqu'à présent. Pour la mise en oeuvre du procédé de dosage objet de la présente invention, l'on procede de préférence comme suit 1 - Une première réaction enzymatique spécifique permet la for mation d'une quantité de NAD ou de NADH égale à celle du substrat à doser, conformément à la réaction (1) ci-dessus. L'on fait donc agir sur le substrat à doser, une enzyme à ND suffisamment spécifique pour qu'il se forme du NADE en quantité stoechométrique de la quantité de substrat. Conformément à la presente invention, il s'est avéré que pour un substrat à doser présentant par exemple les caractéristiques d'un acide biliaire 3&alpha;OH, l'enzyme dont la spécificité est la meilleure pour- obtenir la transforma tion du NAD en NADH en quantité stoechiométrique de la quantité de substrat à doseur, est la 3 ot-hydroxystéroide déshydrogénas e (3 oL-HSDH) 2 - L'excès de NAD obtenu dans la réaction (1) est éliminé par chauffage à 65-100 C en milieu alcalin, pendant 30 minutes à une heure. 3 - Le NADH formé dans la réaction (1), en quantité stoechiomé trique de la quantité de substrat à doser, est alors dosé par l'intermédiaire du système d'amplification objet de l'invention, conformément au schéma réactionnel (2) ci-des sous, qui part, à-titre d'exemple non limitatif, d'un sub strat en C19 tel que défini plus haut, présentant une double liaison 5-6 : le chromophore (produit IV) obtenu est dosé par son absorbance à 248 nm; la vitesse d'apparition de ce chromophore est proportionnelle à la concentration en NADH, et donc, à la concentration en substrat à doser S. Cette mesure est effectuée directement à l'aide des appareils de lecture spectrophotométrique du commerce ; elle est très sensible et très rapide. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention-com- prend encore d'autres dispositions,qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de dosage à l'aide du système d'amplification conforme à la présente invention. Il doit être bien entenau, toutefois, que cet exemple est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'in- vention, dont il ne constitue en aucune manière une limitation. EXEMPLE DE DOSAGE DES ACIDES BILIAIRES SERIQUES A - Précipitation du sérum par le métnanol acide 50 pl de sérum sont introduits dans 400 l de méthanol HCl 10 N, on centrifuge lo minutes dans des tubes coniques de 1,5 ml, on prélève 40 pl de surnageant qui est évaporé dans l'étuve à 110 C. B - Transformation (oxvdation des acides biliaires) On reprend le résidu d'évaporation en tampon, par 2 ml Tris-HCl 0,1 M, pH 9,5, 22 % de méthanol, NAD+ 10 -5 5X. On prélève 200 l de cette solution et on lui ajoute la 3&alpha; HSDE à raison de 6- m UI/tube. On laisse réagir une demi-heure. C - Destructlon du On dilue le mélange réactionnel obtenu en B ci-aessus, par 0,5 ml de tampon Tris HCl 0,1 M, pH 9,5, on ajoute 100 l d'une solution Tris 0,5 M/l NaOH 0,5 M/l , on chauffe une heure à 1O00C. D - Dosage du NADH Le dosage du SADH est réalisé à l'aise du système d'amplification conforme à l'invention, suivant le schéma réactionnel (2) ci-dessus, dans lequel : - le produit I est la 3 ss hydroxyandrost-5-ène-17-one (déhydroépian- drostérone (DHEA) - le produit II est le 5 androstène 3 17 diol - le produit III est la 17ss F hvdrox- ss 5 androstène 3 one - le produit IV est la testostérone, chromophore. Ce dosage est effectué comme suit Le mélange réactionnel obtenu en C ci-dessus, est neutralisé par une solution d'acide phosphorique dans un mélange éthanol/eau 1/1 contenant 300 mg/l de déhydroépiandrostérone (DHEA) ; on lui ajoute 0,5 ml de tampon phosphate, pH 7,2, 0,03M, 20 % glycérol, contenant 20 mUI de 3 2,17 -hydroxystérofde- déshydrogénase (3 ,17 -HSDH) et 100 mUI des 3 cétostéroide- isomérase. Le mélange réactionnel est incubé à 25 C pendant une durée appropriée, puis l'on effectue les lectures d'absorbance à 248 nm en procédant comme suit - établissement d'une courbe étalon Le dosage du NAD (0,05 à 100 picomoles dans 100 l de tampon) est réalisé dans des tubes plastiques contenant 0,5 ml de tampon phosphate 0,03 M pH 7,4, 20 milliunités de 3 , 17 -hydroxystéroide-déshydrogénase, 100 milliunités de tS 5 3 cétostéroide-isomérase et 30 l d'une solution alcooli que de DHEA (1 mg/ml). Les tubes sont incubés à 250C. Les lectures d'absorban ce à 248 nm sont effectuées après 30 minutes d'incubation pour les concentrations de NAD comprises entre 5 et 100 picomoles, et après 2 heures d'incubation pour les concentrations compri ses entre 0,05 et 5 picomoles. La courbe étalon est tracée en portant les densités optiques en fonction de la quantité de NAD : des courbes éta lon obtenues respectivement pour des concentrations comprises entre 0,05 et 5 picomoles et pour des concentrations comprises entre 5 et 100 picomoles sont représentées aux figures 1 et 2 annexées. Ces courbes présentent une parfaite linéarité. L e système peut être utilisé tel quel pour doser de très faibles quantités de ND. L a reproductibilité du dosage est excellente, limitée seulement par celle du système de lec ture d'absorbance. - bosaqe Avant d'incuber les extraits à doser, on effectue une première lecture d'absorbance à 248 nm dès après l'addition de l'oxydo-réductase à double spécificité et de l'isomérase,puis les extraits à doser sont incubés pendant une durée appropriée (30 minutes à 2 heures selon les quantités à doser ou même notablement plus : par exemple, jusqu'à 20 heures, pour augmen ter la sensibilité du système jusqu'à 10 fentomoles) ; on ef fectue une deuxième lecture d'absorbance à 248 nm à la fin de l'incubation.La concentration en acides biliaires est déter minée d'après la variation de l'absorbance obtenue pour les échantillons, comparativement à la variation d'absorbance obtenue pour des témoins connus compris entre 1 et 200 ng. A noter que la lecture de l'absorbance peut être ef fectuée à différents stades de la durée d'incubation pour con trôler à tout moment, le déroulement de la réaction et arrêter celle-ci lorsqu'il s'avère que la quantité de NADH stoechiomé- trique de la quantité de substrat à doser s'est formée : en effet, lorsque la concentration en NADH, et donc en substrat à doser, est de l'ordre de 5 à 100 picomoles, une durée d'incu bation de 30 minutes suffit pour obtenir la quantité de NADH à mesurer,tandis que lorsque cette concentration est de l'ordre de 0,5 à 5 pi ccmoles,il faut 2 heures d'incubation et il faut une durée de 16 heures environ pour détecter des quantités aussi faibles que 50 fentcmoles. Il résulte de la description qui précède que, quels que soient les modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application adoptés, l'on obtient un nouveau système d'amplification et un procédé de dosage enzymatique de microquantités de NAD(H) à l'aide de ce nouveau système d'amplification, qui présentent par rapport aux systèmes d'amplification et aux procédés de dosage proposés dans l'Art antérieur, des avantages importants dont certains ont été mentionnés dans ce qui précède, et parmi lequel on mentionnera tout particulierement la sensibilité du système proposé,qui est très supérieure à celle des systèmes d'amplification connus à ce jour, et quiest favorisée par l'utilisation d'une enzyme unique à double spécificité, et par le fait que : -la production du chromophore est irréversible ; - le chromophore obtenu présente un molaire élevé ; - et le dosage de ce chromophore est instantané et peut être réalisé plusieurs fois après n'importe quel temps d'incubation. De tels avantages permettent d'éliminer deux inconvénients importants des systèmes d'amplification connus dans l'Art antérieur, et notamment la destruction des enzymes du système d'amplification et ltétape supplémentaire du dosage du produit d'amplification. De plus, la grande facilité d'emploi du système d'amplification conforme à la présente invention, qui vient s'ajouter à la parfaite reproductibilité des dosages qu'il permet de réaliser et à ses autres avantages, énumérés plus haut, autorise sa mise sous la forme d'un ensemble prêt-à-l'emploi, pour la réalisation aisée d'analyses de routine en laboratoire. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, 1' invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 10- Nouveau système d'amplification permettant le dosage de microquantités de N 4j caractérisé en ce qutil comprend - une enzyme unique à double spécificité catalysant de façon cyclique la transformation du NAD en NADH et celle du NADH en NAD ; - un substrat-appelé substrat d'amplification- stéroide en C19 ou C18 comportant une double liaison A5 ou A5(10) ou A (10) ou A1 et possédant des fonctions 3ss OH et 17 céto ; - une isomérase qui transforme le produit de la réaction d'oxydo-réduction des h5 et A5(10) stéroïdes en un chromophore 3 céto A4. 2 - Système d'amplification selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme unique est une 3ss-17ss hydroxystérolde-déshydrogénase. 3 - système d'amplification selon la Revendication 1 ou la Revendication 2, caractérisé en ce que l'isomérase qui déplace la réaction vers la formation irréversible du chromophore est une A5 3-cétostéroide isomérase. 4 - Système d'amplification selon la Revendication 3, caractérisé en ce que la quantité d'isomérase présente dans le milieu réactionnel est comprise entre 10 et 1000 milli UI. 5 - Système d'amplification selon l'une quelconque des Revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'enzyme unique à double spécificité est utilisée après purification pour la débarrasser du NAD. 6 - Procédé de dosage enzymatique de microquantités de NADH formé en quantité stoechiométrique d'un produit à doser, à l'aide du nouveau système d'amplification selon l'une quelconque des Revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste : - à-- oxyder ledit produit par une enzyme à NAD spécifique, en présence de NAD, l'excès de ce dernier étant détruit par chauffage en milieu alcalin à une température de l'ordre de 65 à 1000C ; - à doser le NADH, obtenu au cours de l'oxydation, par l'intermédiaire dudit système d'amplification, par dosage spectrophotométrique direct du chromophore stable obtenu par oxydoréduction du substrat d'amplification par l'enzyme à double spécificit puis isomération enzymatique. 7 - Procédé de dosage enzymatique de microquantités de NAD formé en quantité stoechiométrique d'un produit à doser, à l'aide du nouveau système d'amplification selon l'une quelconque des Revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste : - a réduire ledit produit par une enzyme à NADH spécifique, en présence de NADH, l'excès de ce dernier étant détruit par chauffage en milieu acide à une température de l'ordre de 65 à 100C ; -à doser le NAD, obtenu au cours de la réduction, par l'intermédiaire dudit système d'amplification, par dosage spectrophotométrique direct du chromophore stable obtenu par oxydoréduction du substrat d'amplification par l'enzyme à double spécificité puis isomérisation enzymatique. 80- Ensemble de dosage prêt-à-l'emploi ou "kit" d'amplification et de dosage permettant la réalisation d'une pluralité de dosages, caractérisé en ce qu'il comprend, pour chaque dosage de la pluralité de dosages qu'il permet de réaliser, trois tubes contenant - l'un : environ 40 Fg/ml de substrat - le deuxième : environ 10 milli UI/ml de 3ss-17ss-hydroxy- stéroide-déshydrogénase - le troisième : environ 100 milli UI/ml d'isomérase.