FR 2411008 A1 19790706 FR 7737256 A 19771209 Cette invention concerne de manière générale une composition en poudre comprenant une masse de cellules viables séchées du oen- re Bifidobacterium (appelées ci-après cellules Bifidobacteria) à administrer par voie orale pour promouvoir ou conserver l'état favorable de la flore intestinale. Plus particulièrement, cette invention concerne une composition en poudre comprenant une poudre contenant des cellules Bifidobacteria viables et une poudre contenant du lactulose, cette composition pouvant conserver un taux de survie élevé pendant une longue période de conservation. On sait que Bifidobacterium se trouve normalement dans l'intestin humain et est un micro-organisme utile. On sait également que l'administration orale d'une préparation contenant des cellules Bifidobacteria viables est efficace pour prévenir et traiter les troubles intestinaux, en particulier la diarrhée, la grippe intestinale, la dyspepsie, la constipation et la substitution des microbes de l'intestin (microbisme substituée après traitement par antibiotiques. Pour de tels besoins, diverses compositions de poudre contenant des cellules Bifidobactéria viables séchées sont vendues sur le marché. Dans les compositions classiques en poudre, le taux de survie des cellules Bifidobacteria est cependant trop faible pour être satisfaisant, et le problème de base consiste à améliorer le taux de survie des cellules et à permettre de conserver le nombre viable de cellules Bifidobacteria à un certain niveau pendant une période de stockage longue désirée. Par exemple, la teneur en cellules Bifidobacteria viables dans un gramme de produits en poudre fournis par 12 sociétés au Japon et dans le lait en poudre contenant des cellules Bifidobacteria et une petite portion de lactulose fournie par une compagnie Allemande, est généralement aussi faible que 5 ou 6x107 ou une valeur approchante. En outre, le nombre viable des cellules dans ces produits diminue rapidement pendant la conservation. Dans de telles conditions, de nombreux essais permettant d'a méliorer la durée de conservation des produits contenant des cellules Bifidobacteria ont été faits. rapport de recherche de Ohta, intitulé " Research for freezing and freeze drying Lactobacillus bifidusI dans le journal japonais " Ochanomi zu Igaku Zasshi (Ochanomi zu Medical Journal)" Vol. 7, No. 11 (1959), pp. 2967-2975, concerne la viabilité des cellules Bifidobacteria lyophylisées que l'on a ---rées par divers procédés de séchage et avec divers agents de mise en suspension. Dans ce rapport de recherche, il est indiqué que le glutamate de sodium comme agent de mise en suspension pour la lyophylisation des cellules Bifidobacteria peut donner un meilleur taux de survie des cellules quand on conserve à 370C les cellules Bifidobacteria lyophylisées , et le lait écrémé, l'amidon soluble et le saccharose le suivent ensuite. Et l'on observe les meilleurs résultats quand on utilise du glutamate de sodium à une concentration de 3% en poids, mais le taux de survie dans ces meilleurs cas diminue à 18 après seulement 2 mois de conservation. Smiha indique dans le "Journal of Food Science" Vol. 39 (1974) pp. 641-642 que lton obtient 55% de taux de survie après 2 mois de conservation à 300C quand on soumet des cellules de Lactobacillus bifidus (ancienne nomenclature scientifique du genre Bifidobacterium) à une lycShylisation en utilisant comme agent de mise en suspension du lait écrémé additionné d'acide asoerbique, de thiourée et de chlorure d'ammonium. Cette valeur est quelque peu supérieure mais le produit préparé par ce procédé n'est pas indiqué pour l'utilisation dans le système de distribution habituel, car on considère que le nombre viable de cellules de Lactobacillus bifidus dans ce produit diminue rapidement pendant une période de conservation supérieure à 2 mois. Comme mentionné précédemment, la diminution du taux de survie pendant la conservation nuit de façon importante à la valeur commerciale de ces produits en poudre, car la densité de cellules Bifidobacteria diminue pendant la conservation même si les produits ont initialement une densité élevée en cellules. En conséquence, dans les produits classiques contenants des cellules Bifidobacteria viables, on a ajouté du lactose, de l'amidon, etc..., comme milieu de suspension pour protéger les cellules. Néanmoins, les compositions en poudre classiques contenant un milieu de suspension connu n'obtiennent pas une viabilité suffisante. De tels milieux de suspension n'ont donc pas en fait le role de proteger les cellules, et ont seulement pour orale de diluer les cellules Bifidobacteria lyophylisées, En fait, la densité de cellules Bifidobacteria viables dans les produits en poudre vendus à l'heure actuelle sur le marché est très faible. On ne connait pas de produits en poudre contenant des cellulus Bifidobacteria séchées pouvant maintenir une densité élevée de cellules viables pendant une période de conservation prolongée. C'est donc un but de la présente invention de fournir une compositon en poudre contenant des cellules Bifidobacteria viables séchées à une concentration élevée en cellules, qui-peut conserver un taux de survie supérieur des cellules pendant une période de conservation prolongée; de fournir une composition en poudre contenant des cellules Bifidobacteria viables séchées, qui permet d'établir une flore de Bifodobacterium dans l'appareil intestinal quand elle est administrée par voie orale; de fournir une composition en poudre comprenant une poudre contenant des cellules Bifidobacteria viables et une poudre contenant du lactulose. Selon cette invention, les buts mentionnés précédemment sont obtenus en mélangeant de façon homogène une poudre contenant des cellules Bifidobacteria viables avec une poudre contenant du lactulose. En d'autres termes, cette invention est basée sur la découverte qu'en mélangeant une quantité spécifique de poudre contenant du lactulose et contenant une proportion prépondérante de lactulose, entant qu'agent devise en suspension, avec une poudre contenant des cellules Bifidobacteria viables, on obtient un effet surprenant sur l'amélioration du taux de survie des cellules. La poudre contenant des cellules Bifidobacteria utilisée dans cette invention contient des cellules Bifidobacteria séchées et un milieu de dispersion comme du lait écrémé en poudre, du glutamate de sodium, de la gélatine, du lactose, etc..., et contient par gramme au moins 20 x 1010 cellules Bifidobacteria viables. Une telle poudre peut être préparée par des procédés classiques. La poudre contenant du lactulose utilisée dans cette invention contient au moins 55 % en poids de lactulose par rapport à sa teneur totale en solides,et une légère teneur en eau. La teneur en solides restants peut être constituée de lactose et de galactose résiduels provenant du mélange réactionnel de préparation du lactose. I1 est nécessaire que la composition en poudre finale selon cette invention que l'on prépare en mélangeant de façon homogène 40 à 70 e en poids de la poudre contenant des cellules Bifidobacteria viables avec 60 à 30 e en poids de la poudre contenant du lactulose, contiennent au moins 8 x 1010 cellules Bifidobacteria viables par gramme de produit final, 28 à 57 % en poids de lactulose et moins de 2,5 % en poids d'eau dans le produit final. La composition en poudre selon cette invention améliore de façon importante le taux de survie des cellules Bifidobacteria après une période de conservation relativement longue et empêche la diminution du taux de survie des cellules si on prolonge la période de conservation. La souche microbienne de cellules Bifidobacteria utilisées dans cette invention peut être une quelconque souche connue d'espèces appartenant au genre Bifidobacterium, mais il est préférable d'utiliser une ou plusieurs des souches suivantes Bifidobacterium adolescentis (ATCC 15703 et autres), Bifidobacterium longum (ATCC 15707 et autres), Bifidobacterium bifidum (ATCC 11146 et autres) que l'on peut toutes trouver normalement dans l'appareil intestinal de l'homme quel que soit son age. Selon la présente invention, la composition en poudre contient des cellules Bifidobacteria viables et du lactulose, tous deux selon des densités élevées. La composition en poudre de cette invention peut être obtenue en mélangeant de façon homogène une poudre contenant des cellules Bifidobacteria viables et une poudre contenant du lactulose. La poudre contenant du lactulose que l'on utilise pour préparer la composition en poudre de cette invention peut être obtenue par un quelconque procédé connu, par exemple en séchant un sirop de lactulose. Dans le brevet japonais N0874.954 (Publication de Brevet Japonais N02984/1977), Nagasawa et al ont décrit que l'on peut obtenir un sirop de lactulose contenant plus de 80 % de lactulose par rapport au poids des solides totaux, en mélangeant une solution aqueuse de lactose avec 2 à 10 % en poids d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium contenant de 0,27 à 0,54 % d'hydroxyde de sodium par rapport au poids de lactose, en chauffant ladite solution mélangée à une température de 70 à 1300C pour isomériser le lactose de façon à minimiser la formation de sous-produits comme le galactose et d'autres substances, puis à concentrer le liquide réactionnel pour séparer le lactose du liquide réactionnel (voir le brevet des E.U.A.N03.816.174, le brevet belge N0783.690, le brevet français N072 13213, le brevet néerlandais N0 150.513 et le brevet allemand N02.224.680) Un procédé de préparation d'une poudre de lactulose à partir de sirop de lactulose est décrit dans le brevet japonais N0778.564 (Publication de Brevet Japonais N049-44331, voir le brevet des E.U.A. N 3.716.408, le brevet belge N0774.451, le brevet français N071 38.472, le brevet allemand N02.148.159, le brevet néerlar;dais N0147.784 et le brevet britannique N01.318.494). Selon le procédé, on peut obtenir une poudre de lactulose contenant plus de 55 t en poids de lactulose par rapport à la teneur en solides, en mélangeant une solution aqueuse ayant un pH inférieur à 7,0 et contenant plus de 60 %, en poids, de lactulose par rapport à la teneur totale en solides, avec une solution aqueuse dans laquelle est dissoute plus de 0,3 %, par rapport au poids dudit lactulose, de poudre konnyaku, et en séchant le mélange résultant avec un appareil classique de séchage par, ulvérisation à air chaud (la poudre konnyaku provient du cormus % herbe vivace Arnorphophalus konjac appartenant à la famille des Araceae, et est essentiellement un glucide composé de mannane). Dans la publication de brevet japonais N052-21.063, Nagasawa et al ont également décrit que l'on peut obtenir une poudre de lactulose très pure en refroidissant du sirop de lactulose à une température comprise entre -200C et -450C, intervalle dans lequel le sirop n'est pas congelé, et en le soumettant à une lyophilisation pour produire un sirop condense, puis en séchant thermiquement le sirop condensé jusqu'à obtention d'une masse poreuse séchée, et enfin en pulvérisant lamasse poreuse en poudre sous une atmosphère desséchée. Ces procédés permettent d'obtenir une poudre de lactulose comprenant plus de 55 e en poids de lactulose. A l'heure actuelle il est possible de produire industriellement une poudre de lactulose très pure allant jusqu'à 96 %, et dans cette invention, il est indique drutiliser une poudre contenant du lactulose très pure jusqu' la valeur la plus grande possible de façon à obtenir un taux de survie supérieur des cellules Bifidobacteria dans le produit final. Comme il sera décrit ci-après, il est indiqué que la teneur en eau du produit final soit inférieure à 2,5 % en poids, et pour cette raison la teneur en eau de la poudre de lactulose est de préférence maintenue aussi faible que possible, et sera de préf é- rence inférieure à 0,7 %. Le Bifidobacterium utilisé dans cette invention peut être une quelconque souche connue d'espèces appartenant au genre Bifidobacterium (voir Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Eighth Edition, édité par R.E. Buchanan & N.E. Gibbones, pp. 669676, 1974, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, U.S.A.), mais il est préférable d'utiliser une ou plusieurs des souches suivantes : B. adolescentis (ATCC 15.703 et autres), B. longum (ATCC 15.707 et autres) et B. bifidum (ATCC 11.146 et autres) que l'on peut toutes normalement trouver dans l'intestin humain indépendamment de l'âge. Ces souches se trouvent dans le catalogue de Strains, Eleventh Edition (1974), The American Type Culture Collection, et peuvent y etre obtenues. On peut utiliser un quelconque procédé de fermentation et un quelconque milieu de culture connu pour préparer les cellules Bifidobacteria, mais le milieu de culture décrit par Nagasawa et al dans la publication de demande de brevet accélérée japonaise N050-89.587 convient, car les souches microbiennes du genre Bifidobacterium peuvent bien se développer dans le milieu de culture qui est bon marché. Le milieu de culture contient de la liqueur de macération de mais et du foie de poisson comme sources d'azote ; et on ajoute du lactose, des sels minéraux et de la cystine pour former une composition de base désirée ; et on y ajoute en outre des extraits provenant de son de riz ou des germes de divers types de céréales. Le milieu de culture H de Yuka Hara et al qui contient de l'extrait de viande, de l'extrait de levure, KH2PO4, K2HPO4, CH3COONa, du lactose et de la cystine et qui a un pH de 6,8, est également indiqué car il est facilement préparé (voir Journal of Japanese Society of Food and Nutrition, Vol. 18, N01 (1965), p.10). Après leur propagation, on peut recueillir les cellules Bifidobacteria en centrifugeant le milieu de culture. On met ensuite les cellules recueillies en suspension dans une solution isotonique stérilisée de chlorure de sodium en quantité correspondant à celle du milieu de culture, puis on les extrait par lavage du milieu de culture et des métabolites et autres produits qui adhèrent à la surface des cellules et on les recueille à nouveau en centrifugeant la solution. on obtient normalement 6 à 10 g de cellules humides à partir d'un litre de milieu de culture, et ces cellules humides contiennent 60-80 x 109 cellules Bifidobacteria par gramme. On met ensuite les cellules humides en suspension dans la solution aqueuse stérilisée, à reison de 60 g de cellules humides par litre de solution, solution qui contient 4 % en poids de lait écrémé, 1 % en poids de glutamate de sodium,-0,4 % en~poids de gélatine, 5 % en poids de saccharose comme agent de mise en suspension, puis on lyophilise la solution et on la pulvérise en poudre-selon des procédés classiques.La poudre contenant des cellules Bifidobacteria séchées que l'on a ainsi obtenue a une composition d'environ 74 % en poids d'agent de mise en suspension, environ 22 % de cellules séchées, 4 % ou moins d'eau, et au moins 20 x 1010 de cellules Bifidobacteria viables par gramme de poudre. Au moins 20 X 1010 de cellules viables par gramme de poudre contenant les cellules Bifidobacteria séchées sont nécessaires pour obtenir la densité élevée désirable de cellules Bifidobacteria dans la composition en poudre finale La teneur en eau de la poudre contenant des cellules Bifidobacteria séchées est normalement environ 2,0 e à 4,0 % en poids, mais il est indique qu elle soit aussi faible que possible pour augmenter le taux de survie des cellules dans la composition On mélange la poudre ainsi obtenue contenant des cellules de Bifidobacteria séchées et la poudre contenant du lactulose à un rapport de 40-70 % et 60-30 % en poids respectivement à l'aide d'un malaxeur de type V sous une atmosphère à faible humidité.La composition en poudre ainsi obtenue contient environ 28 à 57 % en poids de lactulose et 2,5 % en poids ou moins d'eau, et 1 g de la composition en poudre contient au moins 8 x 1010 cellules Bifidobacteria viables. I1 est nécessaire de maintenir la composition en poudre dans un endroit frais et sombre, car la composition est très hygroscopique. La composition en poudre peut être conditionnée de façon étanche ou introduite dans des capsules puis conditionnée de façon blanche pour la distribution La dose appropriée de la composition en poudre de cette invention est de 1 à 1,5 g pour les nourrissons, de 1,5 à 3 g pour les enfants et de 3 à 6 g pour les adultes, par jour. Comme mentionné précédemment, le taux de survie des cellules Bifidobacteria dans la composition en poudre de la présente invention est fortement accru par mélange avec une poudre contenant du lactose, et la composition en poudre peut contenir des cellules Bifidobacteria viables à une densite de cellules qui correspond à 103 fois celle des produits classiques qui sont dilués par un milieu de mise en dispersion. Quand on réduit dans la composition en poudre le rapport de la teneur en lactulose à la teneur en cellules Bifidobacteria, on diminue le taux de survie des cellules et on a noté que la teneur en lactulose est de préférence supérieure à 28 % du poids du produit final. On a également trouvé que lorsqu'on augmente trop le rapport, on diminue légèrement le taux de survie des cellules et en outre l'hygroscopicité de la composition de poudre est accrue par la poudre de lactulose, ce qui entrasse une tendance à l'aglomération de la composition de poudre. Comme on le verra d'après les exemples suivants, on a trouvé que la teneur en lactulose de la composition de poudre est de préférence inférieure à 57 % en poids.Quand on augmente au-dessus de 2,8 % en poids la teneur en eau de la composition de poudre, le taux de survie des cellules diminue rapidement et il est donc important au point de vue pratique de maintenir la teneur en eau à 2,5 % en poids ou moins. On verra maintenant qu'il est nécessaire pour préparer la composition en poudre de cette invention de préparer une poudre contenant une densité élevée de cellules Bifidobacteria et de préparer une poudre contenant une concentration élevée de lactulose. On terra d'après les exemples et les résultats des essais comparatifs que la demanderesse fournit une composition en poudre qui contient une densité élevée de cellules Bifidobacteria viables et qui présente un excellent taux de survie des cellules dû au mélange avec une poudre contenant du lactulose, et que cette composition permet d'établir un état favorable de la flore intestinale, si on compare aux exemples comparatifs ou l'on remplace la poudre de lactulose par un milieu de dispersion classique (comme l'amidon et le lactose). Exemple 1 On prépare une poudre contenant du lactulose de la même maniere que dans l'Exemple 1 du brevet japonais N0778.564. On prepare 3 kg de solution aqueuse de lactulose de pH 6,5, comprenant 53,8 % de lactulose, 8,2 96 de galactose, 6,3 % de lactose, 31,1 % d'eau et 0,6 % d'autres substances (tous les pourcentages étant en poids). A 1,5 1 d'eau, on ajoute 7,8 g (0,5 % par rapport à la teneur en lactulose de la solution aqueuse) de poudre konnyaku disponible dans le commerce (poudre broyée, Fukushima Préfecture, Japon) en agitant pour la gonfler uniformément et on filtre en utilisant une toile filtrante de 149 microns pour éliminer les matières insolubles. On ajoute le filtrat aux 3 kg de solution aqueuse de lactulose et on mélange bien.Cette solution mélangée a une viscosité de 140 cp à 200C (mesurée à l'aide d'un viscosimètre de type B fabriqué par Tokyo Keiki Co., Ltd., selon le procédé classique). On chauffe - 450C la solution mélangée puis on la sèche à Plaide d'un sechoir par pulvérisation (fabriqué par Anhydro Co.) avec une température d'entrée drair chaud de 1700C, une température de sortie de 900C et une vitesse de rotation de 9.000 t/mn de l'atomiseur. On obtient 1,75 kg de poudre blanche, la poudre contient 78,2 % en poids de lactulose, 0,51 en poids d'eau et est fluide et facilement soluble dans l'eau. On prépare la poudre contenant les cellules Bifidobacteria selon le procédé (appelé ci-après procédé A) décrit ci-dessous. On prépare un milieu de culture de manière à dissoudre dans 10 1 d'eau 3,0 % de foie de poisson, 2,0 % de liqueur de macération de mais, 2,0 % de lactose, 0,1 % de KH2P04, 0,1 % de K2HPO4, 0,5 % de CH3COONa et 0,04 % de 1-cystine (tous les pourcentages étant en poids), puis on ajuste le pH de la solution aqueuse à 6,8 en ajoutant une solution aqueuse 1N d'hydroxyde de sodium, puis on sterilise la solution à l'aide d'un autoclave à 121oC pendant 15 mn et on la refroidit. On ajoute une culture de démarrage en vrac de Bifidobacterium longum (ATCC 15.707) au milieu de culture à une concentration de 4 % et on mélange uniformément en agitant. Puis on effectue la fermentation de façon anaérobie dans des fermenteurs Jar Fermentor à l'aide de gaz carbonique à 370C pendant 12 heures. Pendant cette fermentation, on ajoute environ 20 % en poids de solution aqueuse de CaCO3 au milieu de culture pour ajuster son pH à environ 7. Puis on refroidit le milieu de culture à 50C et on le centrifuge (10.000 t/mn) pour recueillir les cellules Bifidobacteria qui sont en suspension, en utilisant une centrifugeuse continue à vitesse élevée et à refroidissement, après quoi on met de nouveau les cellules ainsi recueillies en suspension dans 1.000 ml d'une solution de chlorure de sodium isotonique stérilisée et refroidie (50C) pour éliminer par lavage les impuretés puis on centrifuge ladite solution (à 10.000 t/mn) pour recueillir les cellules bactériennes lavées. On met 60 g des cellules Bifidobacteria humides ainsi obtenues en suspension dans 1 1 d'une solution aqueuse stérilisée d'un agent de mise en suspension comprenant 40 g de saccharose, 15 g de mucine, 5 g de gélatine, 15 g d acide glutamique et 15 g d'acide aspartique (acide aminosuccinique), puis on la lyophilise selon le procédé classique pour obtenir 96 g de poudre de cellules Bifidobacteria contenant 23,0 % de cellules, 74,7 % d'agent de mise en suspension et 2,4 % d'eau.Le nombre viable de cellules de Bifidobacteria dans 1 g de poudre est 36 x 1010 Enfin, on mélange de façon homogène 90 g de ladite poudre contenant du lactulose et 90 g de ladite poudre contenant des cellules Bifidobacteria, à l'aide d'un malaxeur de type V (Tokuju Seisakusho Co., Ltd.) dans une pièce maintenue à une faible teneur en humidité, puis on introduit environ 180 g de la composition en poudre dans une bouteille teintée et après fermeture hermétique à l'air on conserve la bouteille dans un lieu frais, sombre et de faible humidité. La composition de poudre ainsi obtenue contient 39 % en poids de lactulose et 1,46 % en poids d'eau, et le nombre viable de cellules Bifidobacteria qu'elle contient est 18 x 1010/g. Exemple 2 Selon le procédé décrit dans l'Exemple de la publication de brevet japonais N052-21.063, on prépare comme suit une poudre contenant du lactulose On verse 500 g de sirop de lactulose comprenant 56 % de lactulose, 7 % de galactose, 4,0 % de lactose, 1,0 % d'autres substances et 32 z d'eau (tous les pourcentages étant en poids), sur une profondeur de 5 mm dans une cuvette dans un lyophilisateur à étages, et on commence la lyophilisation à -400C sous un vide de 1 mm de mercure ; environ 2 h après on ajuste à -300C la température dans le lyophilisateur ; puis on l'élève progressivement jusqu'à 800C en 4 h, tout en diminuant progressivement le vide jusqu'à 30 mm de mercure. Pendant ce temps, le sirop forme progressivement des bulles jusqu'à une hauteur de 20 cm et devient une masse mousseuse alvéolée uniforme.En 2 h, on élève progressivement la température jusqu'à 350C ; puis on maintient la température pendant 16 h et l'on obtient 340 a d'une masse alvéolée séchée. Pendant ce temps, on fait passer le vide de 6 x 10 2 mm de mercure à 2 x 10 2 mm de mercure. La masse mousseuse séchée est pulvérisée en poudre dans une chambre desséchée. La poudre obtenue est blanche et suffisamment fluide et contient 8C,8 z en poids de lactulose et 0,5 % en poids d'eau. On prépare séparément une poudre contenant des cellules Bifidobacteria selon le-même procédé que dans l'Exemple 1, sauf que l'on utilise Bifidobacterium adolescentis (ATCC 15.705) (procédé appelé ci-après procédé B). On obtient 92 g de poudre contenant des cellules Bifidobacteria. Le nombre de cellules viables est 287 x 109 g, et la poudre contient 3,0 % en poids d'eau, 74,6 % en poids d'agent de mise en suspension et 22,4 % en poids de cellules Bifidobacteria. On mélange de façon homogène de la même manière que dans l'Exemple i 40 g de la poudre de lactulose obtenue précédemment et 60 g de la poudre contenant des cellules Bifidobacteria, et l'on obtient environ 100 g de composition en poudre. Le nombrede cellules Bifidobacteria viable est 172 x 109 g, et la poudre contient 32,3 % en poids de lactulose et 2,02 % en poids d'humidité. Essai 1 On effectue un essai comparatif concernant la relation entre le taux de survie des cellules et diverses périodes de conservation. Les échantillons utilisés dans l'essai sont trois produits en poudre contenant des cellules Bifidobacteria A, B et C qui sont vendus sur le marché par trois sociétés A, B et C, une poudre D contenant des cellules Bifidobacteria comme exemple comparatif dans lequel on-a utilisé un milieu dispersant classique au lieu de la poudre contenant du lactulose selon la présente invention et les compositions en poudre obtenues dans les Exemples 1 et 2 ci-dessus. Les produits A et C utilisés dans l'essai sont ceux qui ont des limites d'efficacité d'environ 2,6 mois , valeurs calculées d'après les indications portées sur les conditionnements. Bien qu'il soit possible que plusieurs mois se soient écoulés entre la date de la fabrication et la date de l'achat, dans cet essai on les a utilisé en supposant qu'ils avaient été fabriqués le jour oG ils avaient été achetés. On pèse 50 g de chacun des produits A-C dans une chambre déshumidifiée dans un flacon et on ferme hermétiquement le flacon pour empêcher l'humidification du produit. On prépare l'échantillon comparatif D en mélangeant une partie en poids de poudre contenant des cellules Bifidobacteria obtenue dans le procédé A avec 0,8 partie en poids d'amidon et 0,2 partie en poids de lactose, en tant qu'agent de mise en dispersion. On pèse également respectivement dans les mêmes flacons (pouvant contenir 100 ml) 50 g de l'échantillon comparatif D et des compositions de poudre des exemples 1 et 2 puis on les ferme hermétiquement pour les empêcher de s'humidifier. On conserve les 6 échantillons pendant 6 mois â 200C, et on conserve en outre les échantillons des Exemples 1 et 2 pendant 6 mois supplémentaires. On détermine le nombre de cellules viables dans les échantillons par un procédé mentionné ci-dessous immédiatement après leur fabrication (pour les échantillons A à C, immédiatement après leur achat), après 2 mois de conservation, après 4 mois de conservation et après 6 mois de conservation pour tous les échantillons, et après 12 mois de conservation seulement pour les échantillons des Exemples 1 et 2. On calcule le taux de survie des cellules en utilisant l'équation suivante Natte viable après Taux de survie des cellules (%) = ################# x 100 diatement après fabrication Le procédé de détermination du nombre des cellules viables est le suivant On met 1 g précisément pesé de chacun des échantillons en suspension dans 9 ml d'une solution isotonique stérilisée de chlorure de sodium. On dilue chacune de ces suspensions initiales en série 102 à 108 fois en utilisant une solution isotonique stérilisée de chlorure de sodium. On ajoute 1 ml de chacune des suspensions diluées à 9 ml du milieu de culture H semi-solide que l'on a préparé en ajoutant 0,5 % de gélose au milieu de culture H préalablement mentionné, et on mélange de façon homogène pour faire une suspension diluée finale. On verse 5 ml de chaque suspension diluée dans 4 tubes de Winberg et on fait incuber de façon anaérobie à 370C pendant 48 h selon un procédé classique. Après incubation, on choisit les tubes de winberg dans lesquels se sont formées 30 à 300 colonies et on compte les colonies. On considère que les valeurs de la moyenne arithmétique calculée à partir de nombre de colonies déterminées pour chaque échantillon est le nombre de cellules viables. Les résultats de cet essai sont donnés dans le tableau 1. T A B L E A U 1 Viabilité des cellules dans les échantillons Echantillons Conservation Immêdiatemeent Après Après Après Après après fabrica- 2 mois 4 mois 6 mois 12 mois tion A Nombre viable 76 x 105 32 x 105 10 x 105 12 x 105 Taux de survie (%) 100 42,1 13,2 15,8 B Nombre viable 122 x 105 22 x 105 13 x 105 7 x 105 Taux de survie (%) 100 18,0 10,7 5,7 C Nombre viable 200 x 104 48 x 104 30 x 104 28 x 104 Taux de survie (%) 100 24,0 15,0 14,0 D Nombre viable 175 x 109 102 x 109 73 x 109 71 x 109 Taux de survie (%) 100 58,3 41,7 40,6 Exemple 1 Nombre viable 180 x 109 152 x 109 150 x 109 147 x 105 130 x 109 Taux de survie (%) 100 84,4 83,3 81,7 72,2 Exemple 2 Nombre viable 172 x 109 147 x 109 143 x 109 141 x 109 118 x 109 Taux de survie (%) 100 85,5 83,3 82,0 68,6 Note : Le nombre viable donne le nombre de cellules Bifidobacteria viables dans 1 g de chacun des échantillons Comme on peut le voir d'après le Tableau 1, les taux de survie des cellules après 6 mois de conservation dans les poudres contenant des cellules Bifidobacteria disponibles dans le commerce (échantillons A - C) sont extrêmement faibles. Le taux de survie des cellules des échantillons D est assez bon par rapport à ceux des échantillons A à C, mais il n'est pas comparable à ceux que l'on obtient pour les échantillons des exemples 1 et 2 de cette invention. Essai 2 On effectue un essai pour déterminer l'influence du rapport de la teneur en poudre contenant du lactulose à la teneur en poudre contenant des cellules bactériennes (appelé ci-après rapport L/B) sur le taux de survie des cellules. On prépare une poudre de lactulose comprenant 95,5 8 en poids de lactulose par rapport aux solides, et 0,6 z en poids d'humidité, selon l'Exemple 4 du brevet japonais N0778.564 d'une manière telle que l'on ajoute 29,4 g (0,5 % par rapport à la teneur en lactulose) de poudre de konnyaku disponible dans le commerce (poudre broyée, Fukushima Préfecture, Japon) à 4,5 I d'eau tout en agitant pour provoquer un gonflement uniforme, et on filtre en utilisant une toile filtrante de 149 microns pour éliminer les matières insolubles, et on ajoute le filtrat à 3 kg d'une solution aqueuse de lactulose ayant un pH de 6,4 et ayant une composition de 68,0 % de lactulose, 1,2 % de galactose, 0,1 8 de lactose, 30,0 % d'eau et 0,7 % d'autres substances, obtenue par épimérisation de lactose puis oxydation de l'aldose obtenue comme sous-produit. On mélange cette poudre contenant du lactulose à une poudre contenant des cellules Bifidobacteria préparées par le procédé A, selon différents rapports L/B représentés dans le Tableau 2, pour obtenir 9 échantillons de compositions en poudre, et l'on effectue un essai de viabilité des cellules selon le même procédé que dans l'Essai 1. Pendant ce temps, on détermine la teneur en lactulose et la teneur en humidité des échantillons selon le procédé de Sweeleys (Journal of the American Chemical Society, Vol. 85 (1963) ; p. 1497) et par un procédé classique, respectivement. Les résultats de cet essai sont donnés dans le Tableau 2. Tableau 2 Taux de survie des cellules dans les compositions en poudre différents rapports (L/B) N de Pourcentage de Pourcentage de Teneur en Teneur en Nombre viable de cellules B. dans l'échan- Taux de l'é- poudre conte- poudre conte- lactulcse eau des tillon survie des chan- nant du lactu- nant des cellu- des échan- échantil- cellules après tillon lose dans la les B. dans la tillons lons Immédiatement aprè Après 6 mois 6 mois de con composition composition (%) (%) fabrication servation (%) 1 70 30 66,9 1,14 108 x 109 77 x 109 71,3 2 65 35 62,1 1,22 124 x 109 96 x 109 77,4 3 62,8 37,2 60,0 1,27 133 x 109 106 x 109 79,7 4 60 40 57,3 1,30 144 x 109 119 x 109 82,6 5 50 50 47,8 1,50 180 x 109 147 x 109 81,7 6 40 60 38,2 1,69 215 x 109 173 x 109 80,5 7 30 70 28,7 1,86 252 x 109 202 x 109 80,2 8 25 75 23,9 1,95 273 x 109 162 x 109 59,3 9 20 80 19,1 2,03 287 x 109 121 x 109 42,2 Note : Le nombre viable indique le nombre de cellules Bifidobacteria viables. Comme on le voit d'après le Tableau 2, les échantillons 1-7 qui contiennent environ 28,7 z de lactulose présentent les taux de survie supérieurs après 6 mois de conservation. Quand on augmente le rapport L/B à une certaine valeur comme dans les échantillons 1-3, les compositions en poudre tendent cependant às'agglomérer en raison du caractère hygroscopique de la poudre de lactulose, bien que les taux de survie ne soient pas trop abaissés. Quand on diminue le rapport L/B jusqu'à une certaine valeur comme dans les échantillons 8 et 9, le taux de survie est abaissé lorsqu'on diminue la quantité de poudre contenant du lactulose utilisé comme agent de mise en suspension. En conséquence, on a trouvé que la composition en poudre de cette invention doit de préférence etre préparée en mélangeant 40 z a 70 % en poids de poudre contenant des cellules Bifidobacteria lyophilisées avec 60 à 30 % en poids de poudre contenant du lactulose, et que la teneur en lactulose dans la composition en poudre soit de préférence comprise entre 28 et 57 % en poids. Essai 3 On effectue un essai pour déterminer l'influence de la teneur en eau dans la composition en poudre de cette invention, sur le taux de survie. On prépare 6 échantillons des compositions en poudre en mélangeant la poudre contenant du lactulose utilisée dans l'essai 2 (95,5 % en poids de lactulose par rapport à la teneur en solides, 0,6 % en poids d'eau) avec de la poudre contenant des cellules Bifidobacteria préparées par le procédé A et ayant différentes teneurs en eau. On soumet ces échantillons à un essai de viabilité des cellules selon le même procédé que dans l'Essai 2. Les résultats de cet essai sont donnés dans le Tableau 3. TABLEAU 3 N des Teneur en eau de la Teneur en eau de la Nombre viable de cellules B. dans la teneur de échan- poudre contenant compositin (%) survie après tillons des celles B. (%) Immédiatement après Après 6 mois 6 mois de fabrication conservation 1 5,62 3,13 122 x 109 9 x 109 7,4 2 5,08 2,83 153 x 109 68 x 109 44,4 3 4,42 2,51 182 x 109 145 x 109 79,7 4 3,75 2,16 182 x 109 149 x 109 81,9 5 2,40 1,49 170 x 109 137 x 109 80,6 6 2,06 1,33 177 x 109 148 x 109 83,6 Note : Le nombre viable indique le nombre de cellules Bifidobacteria viables. Comme on le voit d'après ce tableau, le taux de survie est considérablement abaissé quand les compositions en poudre contiennent plus de 2,51 - en poids d'eau, et le taux de survie est très nettement abaissé quand la teneur en humidité est supérieure a 3 t en poids. On voit que les échantillons qui ont une teneur en humidité inférieure a 2,50 - présentent plus de 80 z de survie après 6 mois de conservation. En conséquence il est essentiel que la teneur en eau de la composition en poudre soit inférieure à 2,50 Ó en poids. Essai 4 Pour examiner l'efficacité de la composition en poudre selon la présente invention, pour rétablir un état favorable de la flore intestinale, on effectue l'essai suivant en utilisant la composition en poudre de l'Exemple 1 de cette invention, la composition en poudre de l'échantillon D de l'Essai I et la composition de l'échantillon A de l'Essai 1. On prend pour l'essai 5 patients qui ont été traités aux antibiotiques en raison de troubles intestinaux. L'âge et le sexe des patients sont donnés dans le tableau 4. On observe dans la totalité de leurs selles moins de 104 cellules Bifidobacteria viables par gramme de selles. Comme indiqué dans le tableau 4, ces patients sont séparés en trois groupes, et l'on administre 2 g de chaque échantillon aux sujets 3 fois par jour à des heures fixes pendant 7 jours consécutifs. Au bout de 3 jours et après 7 jours à partir du debut du traitement, on recueille lesselles des 6 patients et l'on met un gramme de chaque échantillon en suspension dans 9 ml d'une solution stérilisée isotonique de chlorure de sodium.Chacune de ces suspensions initiales est diluée en série 10 à 108 fois en utilisant la solution isotonique serilisée de chlorure de sodium. On place 0,1 ml de la dilution sur une plaque de gélose du milieu de culture H additioné de pénicilline et de gélose à raison respectivement de 0,1 UI et 0,015 g par ml de milieu de culture, et on le répartit uniformément avec un bâton de verre en forme de L. On compte les colonies de cellules Bifidobacteria après 72 h d'incubation anaérobie à 370C par la methode de la laine d'acier (Azuma et al, Japanese Journal of Bacteriology, Vol. 17 (1962), pp. 802-806, cette méthode étant une modification de la méthode de Parker décrite dans Australian Journal of Experimental Biology, Vol. 33 (1955), pp. 33-38). Le but de l'addition de pénicilline au milieu de culture H est de limiter la croissance des bactéries autres que celles du genre Bifidobacterium sur la plaque de gélose. Les résultats de cet essai sont donnés dans le tableau 4. TABLEAU 4 Effet de la poudre contenant des cellules Bifdobacteria sur le rétablissement de la flore intestinale Patient N Echantillons Nombre viable de cellules Age & Sexe du Après 3 Après 7 B. dans la composition en patient jours * jours* poudre Age Sexe 1 Composition de l'Exemple 1 de 180 x 109/g 27 # 38 x 109 28 x 1010 cette invention 2 45 # 29 x 108 10 x 1010 3 Composition de l'échantillon D 175 x 109/g 23 # 10 x 105 19 x 109 de l'Essai 1 4 48 # 105 72 x 108 5 Composition de l'échantillon A 1 x 107/g** 28 # 105 105 de l'Essai 1 6 23 # 105 71 x 106 * Nombre viable de cellules Bifidobacteria par gramme ** Nombre viable dans la composition en poudre de l'échantillon obtenu en se basant sur les instructions données pour la posologie. Comme on le voit d'après le Tableau 4, le nombre viable de cellules Bifidobacteria dans les selles des sujets 1 et 2 qui ont été traités par la composition en poudre de cette invention sont 38 x 109/g et 29 x 108/g seulement 3 jours après le début du traitement, et le 7ème jour après le traitement ce mombre augmente respectivement à 28 x 1010/g et 10 x 1010/g. La composition en poudre de cette invention induit donc la préduminance de cellules Bifidobacteria dans la flore intestinale des patients, car la quantité totale de flore intestinale est de l'ordre de 109 à 1011/ g de selles. Dans les selles des patients 5 et 6 qui ont été traités par la composition en poudre de l'échantillon A, le nombre viable de cellules Bifidobacteria n'est pas augmenté et dans un cas (N 5) le nombre viable de cellules Bifidobacteria n'est pas au niveau de 105/g de selles après le début du traitement. Dans l'autre cas, le nombre viable de cellules Bifidobacteria est de 107/g le 7ème jour après le début du traitement mais on ne peut pas considérer qu'un nombre viable aussi faible penmette de rétablir un. état favorable de la flore intestimale. Dans le cas des sujets 3 et 4 qui ont été traités par la composition en poudre de l'échantillon D, observe seulement 19 x 109/g et 72 x 108/g de cellules Bifidobacteria viables même le 7ème jour après le début du traitement, bien que ces valeurs soient assez proches de celles des sujets 1 et 2 qui ont été traités par la composition en poudre de la présente invention, mais le développement et l'installation des cellules Bifidobacteria dans l'intestin sont apparemment retardés par rapport à ceux se produisant dans les cas 1 et 2 précédents. On verra qu'il y a une différence remarquable entre la croissance et l'installation des cellules Bifidobacteria dans l'intestin entre les sujets traités par l'échantillon D et les sujets traités par la composition en poudre de la présente invention, même si on leur administre pratiquement la même quantité de cellules Bifidobacteria, et il est donc clair que la composition de poudre contenant des cellules Bifidobacteria et de poudre contenant du lactulose selon cette invention est particulièrement efficace pour le rétablissement d'un état favorable de la flore intestinale. Comme mentionné précédemment, la composition en poudre de la présente invention présente un excellent taux de survie des cellules Bifidobacteria perdant la conservation et peut garder oe taux de survie élevé pendant une période très longue, et en outre il est apparent qu'elle peut avoir un effet sur le rétablissement d'un état favorable de la flore intestinale A la lumière de la description précédente, on voit que la composition en poudre de la présente invention est efficace pour rétablir l'état favorable de la flore intestinale dû à la réduction des bactéries saprogères dans l'intin humain, et pour traiter la constipation dûe à une augmentation du nombre de cellules Bifidobacteria viables après administration, et celle est également efficace pour traiter l'encéphalopathie protosysté zaique dûe la réduction de la concentration ext ammonium dans le sang, en reduisant l'absorption d'ammoniac gazeux qai est produit par la digestion des protéines dans 11 appareil intestinal. REVENDICATIONS thérapeutique 1. Composition/en poudre qui contient 28 à 57 % en poids de lactulose, moins de 2,5 % en poids d'eau et au moins 8 x 1010 cellules viables lyophilisées du genre Bifidobacterium dans 1 g de ladite composition et ne presentant pas d'abaissement de la viabilité desdites cellules dans ladite composition pendant la conservation, composition comprenant (a) 40 à 70 % en poids de mélange en poudre contenant au 11 moins 2 x 101 desdites cellules par gramme dudit mélange et un agent de mise en suspension et (b) 60 à 30 % en poids de lactulose en poudre contenant au moins 55 en poids de lactulose, et du lactose et du galactose résiduels provenant du mélange réactionnel de la préparation du lactulose; 2. Composition en poudre selon la revendication 1, oA la souche microbienne desdites cellules est choisie entre Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum et leurs mélanges. 3. Composition selon la revendication 1, ou ledit mélange comprend environ 74 % en poids d'agent de mise en suspension, environ 22 % en poids de cellules viables lyophilisées du genre Bifidobacterium et environ o % en poids d'eau. 4 Composition selon la revendication 3, od ledit agent de mise en suspension comprend environ 28 % en poids de lait écrémé en poudre, environ 7 % en poids de glutamate de sodium, environ 3 % en poids de gélatine et environ 36 % en poids de saccharose.