FR 2409309 A1 19790615 FR 7832244 A 19781115 La présente invention concerne la production de polysaccharides par des microorganismes du genre Xanthomonas. Les polysaccharides produits par des espèces de Xanthomonas, appelés couramment gommes de xanthane, sont utilisés de plus en plus dans diverses applications commerciales. Les propriétés rhéologiques spéciales de solutions aqueuses de gommes de xanthane confèrent a celles-ci un intérêt particulier dans des domaines aussi divers que l'industrie alimentaire, les soins dentaires et le forage des puits de pétrole. La production est effectuée en général par un procédé par lots successifs dans lequel une souche de Xanthomonas est cultivée dans des conditions qui sont jugées les meilleures pour la production de polysaccharide avec le maximum d'économie en ce qui concerne le glucide utilisé comme substrat. De même que dans tous les processus de fermentation, une fermentation continue serait manifestement souhaitable, eu égard aux avantages qu'elle offre du point de vue de la régularité de production, de la réduction de l'équipement et de la facilité de contrôle. Divers procédés continus de fermentation pour la production de gomme de xanthane ont été décrits. Le brevet des Etats Unis nO 3 328 262 (Lindblom et Patton) décrit un procédé continu a phases multiples, dans lequel une première phase consiste à provoquer la croissance dans un milieu appauvri en substrat glucidique. Cette première phase était apparemment nécessaire pour une production continue de la gomme dans des conditions stables. Toutefois, dans la première phase avec insuffisance de glucide, il n'est guère produit, sinon pas du tout de gomme de xanthane, la production de gomme n'étant obtenue que dans les phases ultérieures, lorsqu'un excès de sucre est introduit dans le milieu. Ce mémoire est typique de l'état antérieur de la technique, d'après lequel on considérait comme essentiel, pour la production d'un polysaccharide par une fermentation bactérienne, l'emploi d'une surabondance de substrat glucidique (en général du saccharose ou du glucose). I1 est certain que si l'on considère la première phase du procédé décrit dans le brevet des Etats-Unis nO 3 328 262, une insuffisance dé glucide a dû être considérée comme une hérésie pour la production de polysaccharide. Par exemple, le brevet des Etats-Unis nO 3 485 719 (Rogovin) et un article de Silman et Rogovin (Biotechnology and Bioecgineering 12, 75-83, 1970) décrivent un procédé continu de fermentation a une seule phase, d'après lequel l'élément du milieu servant à limiter la croissance était la source d'azote, un quart environ du glucide contenu dans le milieu y restant sans être converti. Il y a lieu d'indiquer que dans des conditions continues de fermentation, une fois que ltequilibre a été atteint, on limite le développement du système en jouant sur la quantité introduite de l'un des substrats nécessaires.Une augmentation de la quantité de ce substrat fournie au milieu se traduit par un déplacement immédiat de l'état stationnaire de la fermentation, jusqu'à ce que le substrat redevienne limiteur de croissance å son nouveau taux ou jusqu'd ce que la croissance soit limitée par la quantité introduite d'un autre substrat essentiel. Or, il a été découvert avec surprise que si l'on utilise la source de carbone comme substrat limiteur de croissance dans une fermentation continue de ce genre, le rendement de conversion de la source de carbone en polysaccharide peut être augmenté effectivement, et, en outre, l'effluent de la fermentation ne contient pratiquement pas de glucides. D'après la présente invention, il est donc proposé un procédé pour la production d'un polysaccharide, dans lequel une souche productrice de polysaccharide du genre Xanthomonas est cultivée en une fermentation continue dans laquelle le substrat limiteur de croissance est le glucide servant de source de carbone. L'élévation du rendement de conversion rend le procédé plus économique, mais ce n'est pas le seul avantage. Des problèmes de pollution se posent lorsque les effluents du traitement contiennent des taux importants de glucides et il est donc souhaitable que l'effluent ait une DOB (demande d'oxygène biologique) aussi basse que possible. Or, le choix du glucide comme substrat limiteur de croissance se traduit par le fait que lteffluent du traitement est pratiquement dépourvu de glucide et qu'il a donc une DOB très basse. Le milieu utilisé pour la fermentation peut être n'importe quel milieu convenant pour la production de polysaccharide par une espèce de Xanthomonas. De façon générale, il contiendra, outre la source glucidique, des sources d'azote, de phosphore, de magnésium, de potassium et d'oligoéléments. I1 est commode d'utiliser les différents substrats ou éléments nutritifs sous forme de sels inorganiques et de glucose pur, ce qui permet un contrôle précis de leurs concentrations relatives dans le milieu, bien que l'on puisse utiliser aussi bien d'autres substrats organiques traditionnels, tels que l'extrait de levure, la farine de soja, etc... L'espèce de Xanthomonas productrice de polysaccharide qui est utilisée dans le procédé selon la présente invention peut être n'importe quelle espèce appropriée, en particulier celles qui se rangent dans le "groupe campestris",tel qu'il est défini dans le "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7ème édition. C'est ainsi par exemple qu'on peut utiliser des souches de Xanthomonas campestris ou d'autres espèces du groupe dit "Campestris". D'après le Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, les bactéries Xanthomonas peuvent être identifiées de la manière suivante "Bâtonnets droits monocellulaires. Dimensions 0,2 a 0,8 par 0,6 a 2,0 , ordinairement 0,4 a 1,0 ç environ. Mobiles au moyen d'un flagelle polaire. Ne produisent pas de gaines. Aucun stade connu de vie ralentie. Gram négatif. Après croissance sur milieu a l'agar-agar, ordinairement Jaunes." Chimioorganotrophes. Métabolisme respiratoire, jamais fermentatifs, l'oxygène moléculaire est l'accepteur d'électrons. Réaction a l'oxydase négative ou faible. Réaction a la catalase positive. Dans un milieu faiblement tamponné, de l'acide est produit en petites quantités a partir de multiples glucides, mais non a partir de rhamnose, d'inuline, d'adonitol, de dulcitol, d'inositol ou de salicine et rarement a partir de sorbitol. Pas d'acide produit dans le lait pourpre de bromothymol. Acétate, citrate, malate, propionate et succinate sont utilisés, mais généralement pas le benzoate, l'oxalate ou le tartrate ; le gluconate peut être utilisé après un certain délai. La plupart des espèces hydrolysent rapidement l'amidon et le Tween 80. Nitrates non réduits. Sulfure d'hydrogène produit à partir de cystéine et, parla plupart des espèces, a partir de thiosulfate et de peptone. Acétone et indole non produits, hippurate de sodium non hydrolysé. Les exigences minimales pour la croissance sont complexes et comprennent ordinairement de la méthionine, de l'acide glutamique et de l'acide nicotinique dans diverses combinaisons. L'asparagine n'est pasttilisée comme source unique de carbone et d'azote. Croissance sur milieu nutritif à l'agar-agar inhibée par 0,1 % et, ordinairement, par 0,02 8 de chlorure de triphé nyltétrazolium. Strictement aérobies. Température optimale 25-270C ; pas de croissance a 50C, la plupart croissent a 70C, mais certains sont incapables de croître au-dessous de 90C ; tous croissent a 300C, aucun ne croit a 400C. La teneur en G + C de 1'ADN de 29 espèces dénommées du groupe Xanthomonas campestris varie entre 63,5 et 69,2 moles % (le plus souvent I1 a été constaté qu'il est particulièrement avantageux d'utiliser une source de Xanthomonas campestris déposée dans la Collection américaine de cultures types (American type culture collection) sous le numéro de dépôt ATCC 13951. Cette souche possède les caractéristiques mentionnées ci-dessus de façon générale pour X. campestris et elle est un producteur particu lièrement performant de polysaccharide intéressant. Mis à part le fait que la fermentation doit être menée en continu dans un état stationnaire, on peut adopter n'importe quel mode opératoire approprié. Toutefois, le taux de dilution est réglé de préférence de telle manière qu'un volume de la culture soit remplacé toutes les 7 a 70 h (taux de dilution de -1 0,143 à 0,0143 h ), et notamment toutes les 10 à 50 h, par exem- ple toutes les 20 ou 30 h (taux de dilution de 0,05 à 0,034 h 1). Le polysaccharide peut être récolté de la manière habituelle par précipitation par un alcool et on constate que l'effluent ne contient pratiquement pas de glucose. La concentration de polysaccharide dans le milieu extrait du récipient de fermentation dépendra évidemment de la concen tration de glucose ou d'autre source glucidique utilisée dans le milieu. Des concentrations appropriées de glucose pour le milieu se situent dans la gamme de 5 à 50 g/l, bien que l'on puisse également utiliser des concentrations s'écartant de cette gamme. Les exemples qui suivent illustrent l'invention de façon plus détaillée. EXEMPLE 1 Une souche de laboratoire de Xanthomonas campestris (dérivée de ATCC 13951) a été cultivée de façon continue dans un fermenteur de 5 litres de capacité, équipé d'un agitateur. Les paramètres de fermentation étaient les suivants : pH 7,0 température 300C ; vitesse-des rotors 850 tr/mn ; diamètre des rotors 8,4 cm (rotors à ailettes recourbées en arrière par rapport au sens de rotation) ; débit d'air 2,0. 1/mn. La formation de mousse était inhibée, en cas de nécessité, par addition de polypropylène-glycol 2025 (BDH Chemical Co. Ltd., Poole, Dorset). La composition du milieu de cultureest donnée dans le tableau 1 Tableau 1 Glucose (anhydre) 15,00 g/l (NH4)2s04 2,67 g/l KH2P04 1,00 g/l MgS04 7H20 0,20 g/i Acide citrique.H20 2,10 g/l Mélange d'oligoéléments a 10 ml/l t Mélange d'oligoéléments Eci conc. 13,00 ml CaC03 2,00 g ZnO 0,40 g FeCl3.6H2O 5,40 g MnCl2.2H2O 1,00 g CuCl2.ZH2O 0,17 g CoC12.6H20 0,24 g H3B05 0,06 g Eau distillée qs.p. 1 litre Le volume de travail était réglé à 2,9 litres de milieu non inoculé au moyen d'un déversoir, mais il s'est élevé à 3,6 litres avec l'augmentation de la viscosité de la culture. Des électrodes étaient introduites dans le récipient par deux orifices latéraux. L'agitation était assurée au moyen de deux rotors à ailettes recourbées, distants de 8,4 cm. Le rotor inférieur était placé au point le plus bas sur l'arbre des rotors. L'air était introduit au-dessous du rotor inférieur. Le mélange était favorisé par quatre chicanes disposées longi tudinalement autour de la circonférence du récipient de culture. Le fermenteur était équipé d'un régulateur automatique de pH assurant le maintien du pH a 7,0 par introduction dosée de KOH 1M, ainsi que d'une électrode d'oxygène. Le fermenteur était stérilisé de la manière habituelle avant 1'introduction du milieu. Au milieu contenu dans le récipient de culture, on a ajouté 100 ml d'une culture développée dans le bouillon MYGP (extrait de malt, 3,0 g/l ; extrait de levure, 3,0 g/l ; glucose, 10,0 g/l ; peptone, 5,0 g/l ; pH non réglé) dans des flacons agitateurs. La culture s'était développée par lots pendant 36 h dans les conditions mentionnées. Puis une alimentation continue en milieu de culture a été établie à un taux de dilution de 0,05 -1 (180 ml/h).La culture était surveillée par : (a) mesure du pH ; (b) mesure de l'oxygène dissous ; (c) mesure de l'absorption d'O2 à l'aide d'un analyseur d' 2 et du dégagement de C02 dans l'air effluent (à l'aide d'un analyseur de CO2 à l'infra-rouge) ; (d) mesure de la matière totale précipitable par l'isopropanol (TPM) (le précipité à partir de 1,5 volumes d'isopropanol était recueilli par filtration et séché sous vide à 450C pendant 24 h) ; (e) mesure optique de la densité des cellules à 540 nm ; (f) mesure de l'azote résiduel par une microanalyse de Kjeldahl ; (g) dosage du glucose résiduel par un procédé à la glucose-oxydase ; (h) mesure de la viscosité du bouillon de culture à l'aide d'un viscosimètre à cône et plaque (cône de 0,80) à 250C. On a laissé la culture atteindre un "état stationnaire. Un échantillon mesuré a été dilué à 1/10 dans l'eau distillée et mélangé complètement. L'échantillon a été centrifugé à 23 000 g pendant 90 mn et le liquide surnageant a été extrait par décantation. Les cellules ont été lavées dans l'eau, séchées à 1050C pendant 12 h et pesées Le polysaccharide a été précipité a partir du liquide surnageant avec 1,5 volumes d'isopropanol. Le precipité a été recueilli par filtration et séché par évaporation de la glace. Les viscosités apparentes des bouillons de culture ont été mesurées dans une gamme de taux de cisaillement dans un viscosimètre à cône et plaque" (cône de 0,8 O) à 250C. Le logarithme de la viscosité apparente a été porté sur un graphique en fonction du logarithme du taux de cisaillement et une extrapolation a été faite pour déterminer l'indice de consistance K. Les résultats relatifs a une culture avec limitation typique de la croissance par le carbone sont donnés dans le tableau 2. Après qu'un état stationnaire a été atteint, 200 ml d'une solution de glucose a 60 % en poids/volume ont été ajoutés dans le récipient fermenteur. L'absorption d'O2 et le dégagement de C02 ont augmenté presque instantanément, ce qui démontre que la culture était limitée par le carbone (tableau 3). On a également observé que la concentration des cellules augmentait a la suite de l'addition, ce qui était mis en évidence par une augmentation du trouble. Tableau 2 Taux de dilution 0,05 h Taux de glucose dans le milieu 15,0 g/l E540 (dilution à 1/10 en poids) 0,45 TPN 13,6 g/i Rendement (= TP 8 taux de glucose) 91 ffi Poids à sec d polysaccharide sans cellules 9,5 g/i Poids à sec des cellules 3,7 g/i Absorption de 2 5,13 mmoles/l/h Dégagement de C02 5,96 mmoles/l/h Rapport cellules/polymère 1/2,6 Indice de consistance du bouillon de culture (K) 12 000 cps Tableau 3 Croissance limitée 30 mn après addi- 2 h après par le carbone tion de glucose addition de supplémentaire glucose sup plémentaire Absorption d'O2 (mmoles/l/h) 5,13 8,45 9,96 Dégagement de C02 (mmoles/l/h) 5,96 8,58 10,19 Une purification du polymère, par la technique de précipitation au bromure de-cétyl-triméthylammonium, a montre que le polymère contenait du glucose et du mannose dans le rapport 1,1-1,2/1. Le polysaccharide brut, obtenu par précipitation du bouillon de culture avec l'isopropanol, contenait du glucose et du mannose dans le même rapport, sans quantités appréciables d'autres sucres neutres. EXEMPLE 2 On a répété le mode opératoire de l'exemple 1, a cette exception qu'on a utilisé dans le milieu de culture 25 g/l de glucose a la place des 15 g/l et que le taux de dilution a été réglé à 0,034 h Les tableaux 4 et 5 qui suivent donnent les résultats des expériences. Tableau 4 Taux de dilution 0,034 h Taux de glucose dans le milieu 25,Q1g/l E540 (dilution à 1/10 en poids) 0,45 TUPI4 23,2 v 1 Rendement (2PM/taux de glucose) 92,8 % Poids à sec du polysaccharide sans cellules 15,3 g/l Poids à sec des cellules 4,4 g/i Absorption d'O2 4,53 mmoles/l/h Dégagement de C 2 4,95 mmoles/l/h Rapport cellules/polymère 1/3,5 Indice de consistance (E) du bouillon de culture 12 000 cps Tableau 5 Croissance limitée 2 h après addition de par le carbone glucose supplémentaire Absorption d'O2 (mmoles/l/h) 4,53 9s50 Dégagement de C02 (mmoles/l/h) 4,95 9,53 EXEMPLE 3 On a répétéle mode opératoire de exemple 1, à cette exception que X. campestris ATCC 13951 a été cultivé de façon continue dans un chimiostat d'une capacité de 1000 ml (Modèle C30 ; New Brunswick Scientific Co. Inc. New Brunswick, New Jersey, U.S.A.)-. Les paramètres de la fermentation étaient les suivants : pH 7,0 ; température 300C ; vitesse des rotors 500 tr/mn ; débit d'air 0,65 l/mn. La composition du milieu était semblable a celle qui a déjà été décrite dans l'exemple 1, cette exception qu'on a utilisé 5,0 g/l de glucose et 2,0 g/l de (NH4)2SO4. Le volume de travail était réglé a 300 ml au moyen d'une dérivation latérale. Le mélange était effectué par un rotor a palettes multiples, accouplé magnétiquement. Au milieu dans le récipient, on a ajouté 45 ml d'une culture de 48 h, développée dans des flacons agitateurs contenant un bouillon nutritif. Les résultats de l'expérience sont présentés dans le tableau 6. Tableau 6 Taux de dilution 0,050 -1 Taux de glucose dans le milieu5,0 g/l E540 (dilution à 1/10) 0,24 TPM 4,0 env. Rondement (= TPlf4taux de glucose) 80 ?,o env. Poids à sec du polysaccharide sans cellules 2,70 g/l Poids à sec des cellules 1,10 g/i Rapport cellules/polymère 1/2,45 A titre de comparaison, on notera que, dans le brevet des Etats-Unis n 3 485 719 appliquant des conditions de limitation par l'azote, le rendement (TP.M/taux de glucose) est de 62 %. REVENDICATIONS 1.- Procédé pour la production d'un polysaccharide par culture d'une souche productrice de polysaccharide du genre Xanthomonas par fermentation continue, caractérisé en ce que le substrat choisi pour limiter la croissance est la source glucidique de carbone. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la culture est une souche de X. campestris ou d'une autre espèce du groupe campestris. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est mené a un taux de dilution de 0,143 à 0,0143 h