FR 2431700 A1 19800215 FR 7918081 A 19790712 DETERMINATION DES 1 7-HYDRDXYCORTICDSTEROIDES ET REACTIFS POUR L'EXTRACTION DE CEUX-CI La présente invention concerne des méthodes d'extraction et de déter mination des 1 7-hydroxycorticostéroldes, et un systeme réactif destiné a cette fin. Le cortisol est le principal stérolde sécrété par la cortico-surrénale. Le dosage des métabolites de cortisol est utile pour déterminer l'état fonctionnel de ladite glande. Ce dosage peut être réalisé en dosant les cor ticostéroldesj qui sont des hormones stéroldes sécrétées dans les urines. Les méthodes le plus souvent employées pour la détermination des corticostéroldes urinaires ont comme base la réaction Porter-Silber bien connue. En 1950, Porter et Silber ont décrit une réaction de coloration ayant comme base la formation d!un pigment jaune quand certains corticostéroldes réagissent avec de la phénylhydrazine en présence d'acide sulfurique, C. C. Porter et R. H. Silber, A Quantitative Color Reaction for Cortisone and Related 17, 21dihydroxy, 20-ketosteroids, J.Biol.Chem. 185, 201 (1950). Toutefois, comme il a eté remarqué par S. C. Chattoraj dans l'Fundamentals of Clinical Chemistry", éditeur Norbert W. Tietz, publié par W. B. Saunders Co, Philadelphie (1970), la réaction de coloration ne comprend pas tous les métabolites du cortisol. Cette réaction a été perfectionnée par J. fl. Moran dans un procédé publié dans l'encart sur les essais 17-hydroxy publié par Hycel Inc., Houston, Texas P/N 511389. Afin d'extraire les 17-hydroxycorticostéroldes urinaires, qui sont présents en grande partie sous forme conjuguée avec l'acide glucoronique à ltétat de glucuronides, dans la réaction de Moran de l'art antérieur, l'hydro- lyse est effectuée. L'hydrolyse transforme les 17-hydroxycorticostéroldes conjugués en leur forme libre. Les 1 7-hydroxycorticostéroìdes libres sont extraits à l'aide de chlorure de méthylène.Les 17-hydroxycorticostéroldes extraits sont dosés par une réaction de coloration. La réaction de coloration peut être caractérisée comme suit: 17,21-dihydroxy, 20-cétostéroìde + phénylhydraziné phénylhydrazone (jaune) Cette méthode exige aussi une étape d'évaporation pour la récupération des 17-hydroxycorticostéroldes extraits. Une telle étape prolonge le temps exigé par un procedé. L'un des objets de la présente invention est de prévoir un système réactif et une méthode pour la récupération quantitative des 17-hydroxycorticostéroldes à l'aide d'un solvant d'extraction constitué d'un mélange de solvants. Un autre objet de la présente invention est de prévoir un système réactif et une méthode du type décrit qui n'exige pas d'étape d'évaporation pour la récupération des 17-hydroxycorticostéroldes extraits. Selon la présente invention, les 17-hydroxycorticostéroides aussi bien libres que conjugués sont extraits d'un échantillon d'urines à l'aide d'un solvant d'extraction en milieu acide. Un solvant d'extraction est prévu7 de préférence constitué de chlorure de méthylène et d'alcool butylique ou qui peut être constitué de diéthyléther et d'alcool butylique, employé dans une solution acidifiée contenant un sel de dissociation élevée dans l'acide, tel que le sulfate de sodium. La solution acidifiée peut etre ajoutée avant l'addition du solvant d'extraction pour éliminer les chromogènes non spécifiques.Egalement prévue est une méthode employant le solvant d'extraction nouveau, En général, la méthode de la présente invention compore la prise d'échantillons d'urines, d'étalons et de blancs, l'élimination des chromogènes non spécifiques, l'extraction de tous les 17-hydroxycorticostéroldes, le lavage des substances extraites et la réalisation d'une réaction de coloration comme décrit plus haut. L'urine contient des chromogènes non spécifiques qu'il faut eliminer afin de ne pas avoir un niveau élevé de blanc dans la réaction de coloration. Puisque la présente méthode emploie 11 extraction par solvants, il est souhaitable d'éliminer l'excédent de chromogdnes avant ltétape d'extraction, de fanon que les chromogenes ne soient pas dissous dans le solvant d'extraction. Afin de réaliser le procédé d'élimination de I'excédent de chromogenes, un sel clarifiant est ajouté a un échantillon d'urines. Ensuite, de l'acide est ajouté pour produire un pH de moins d'environ 4,5. Comme alternative, on peut ajouter de l'acide en premier. L'emploi d'un milieu acide empêche aussi la production de coloration de fond a cause de la bilirubine.La bilirubine est, à titre d'exemple, parmi les chromogènes non spécifiquess elle est soluble dans une base et elle absorbe la lumière dans la même fourchette de longueurs d'onde que les 17-hydroxycorticostéroìdes dans la réaction de coloration. On croit que les substances chromogénes non spécifiques sont des particules colloldales chargées. La décharge de ces particules en facilite la pracipita- tien. Un sel clarifiant est un sel qui, lorsqu'il est dissous dans l'urine acidifiée, provoque la précipitation des chromogènes non spécifiques. Le sulfate de sodium et le sulfate de lithium sont des sels clarifiants préférés. Une solubilité de ces sels de jusqu'à cinq grammes pour 12ml de solution acidifiée d'urines dans la fourchette de pH décrite ci-dessus s'est avérée suffisante. Le sulfate d'ammonium peut aussi s'avérer utile. Le sulfate de potassium est moins convenable à cause de sa moindre solubilité dans une solution acide. L'expression sel clarifiant telle qu'employée ici peut aussi signifier un mélange de sels convenable. L'emploi des hydrocarbures pour l'élimination des niveaux excdent- aires de chromogènes non spécifiques est également bien connu, L'éMpe de l'emploi d'un hydrocarbure est utile dans le cas des échantillons d'urines fortement colorés. L'emploi de tels hydrocarbures, ici dénommés hydrocarbures éliminateurs de chromogènes, facilitera ltélimination de tout autre chromogène non spécifique qui n'aura pas été précipité par l'emploi de la solution acidifiée de sel décrite. Les hydrocarbures préférés sont les éthers de pétrole ayant un point d'ébullition de 35 a 65 C. La ligroïne est également utile avec de tels composants.Les hommes de l'art pourront facilement choisir un hydrocarbure éliminateur de chromogenes sans faire trop d'expériences en mesurant le résultat de l'élimination de chromogenes produite par celui-ci. L'hydrscarbure éliminateur de chromogènes formera une couche supérieure qu'il faudra éliminer d'un récipient de réaction apres la réalisation de ce procédé, et il faudra filtrer le liquide restant. Pour cette fin, un filtre Whatman No. 1 est convenable. D'autres filtres convenant a la filtration des agents précipitants de ce type sont bien connus. Pour ltétape d'extraction, un solvant d'extraction nouveau selon la présente invention est employé. Le solvant d'extraction est constitué d'un mélange de chlorure de méthylene et d'alcool. Le méthanol et ltéthanol peuvent s'avérer trop miscibles à l'eau On pourrait employer le propanol ou les alcools supérieurs. Toutefois, ils sont onéreux. L'alcool amylique peut produire des céphalees chez l'utilisateur, et beaucoup estiment que l'odeur de l'alcool octylique est désagréable. L'alcool butylique est donc préféré. L'alcool butylique doit être libre de composants susceptibles de produire une coloration de fond dans la réaction a la phénylhydrazine. De tels composants comprennent les aldéhydes, les composants carbonyliques et les cétones. Un mélange de dix a vingt-cinq parties d'alcool butylique pour cent parties de chlorure de méthylene en volume s'est avéré outre le mélange préféré, et ce rapport a été optimisé dans la pratique au rapport de 13 parties d'alcool butylique pour 87 parties de chlorure de méthylène en volume. Une quantité d'alcool butylique de 5 a 90 parties en volume pour 100 parties de chlorure de méthylène s'est également avérée utile bien qu'une récupération sensiblement complete ne sera PeutAmtre pas obtenue. Comme alternative, on peut employer un solvant d'extraction constitué d'un alcool et d'un éther, de préférence l'alcool butylique et le diéthyléther en proportion d'environ une partie d'alcool butylique pour trois parties de diéthyléther en volume. Le solvant d'extraction est employé en milieu acide, ce qui signifie un milieu ayant un pH de moins d'environ 4,5 dans la forma préférée, le solvant d'extraction est employé a pH ne dépassant pas un. On croit que l'extraction des 1 7-hydrocorticostéroldes sous forme ionique est difficile, et le degré élevé d'acidité produit moins de dissociation de la substance conjuguée extraite. Une récupération de plus de 95% de 1 7-hydroxycorticostéroìdes a été obtenue avec des valeurs de pH de jusqu'a environ 2,5. Le pourcentage de ré cupération baisse brusquement aux valeurs de pH de plus de 4.Les solutions en acide chlorhydrique ou en acide sulfurique sont préférées, Il est nécessaire d'effectuer l'extraction avec un sel d'extraction qui possede les mêmes qualités nécessaires que le sel clarifiant tel que décrit ci-dessus, tel que le sulfate de lithium ou de sodium, afin d'obtenir une récupération sensiblement complet. La présente méthode est avantageuse dans le sens que le sel prévu dans l'étape d'élimination de l'excédent de chromogenes est présent dans l'étape d'extraction, étant resté dans le filtrat avec les 17 hydroxycorticostéroldes extraits. Ainsi la même solution de sel peut être ajoutée avant l'étape d'extraction pour l'emploi dans ltétape d'élimination. Pour un échantillon d'urines de 10ml auquel 2ml de solution acide à 15% en volume sont ajoutés pendant l'étape d'élimination des chromatogènes et 25ml de solvant d'extraction sont ajoutés, une molarité préférée de sulfate de lithium ou de sodium a employer est d'environ 1,4 a 3,2 dans le mélange d'échantillon, de solvant et de solution; 2,3 semble être la molarité optimale. D'autres sels qui satisfont les exigences décrites ci-dessus peuvent être employés en molarité similaire. Il est envisagé dans la réalisation préférée que seuls des cations monovalents seront utilisés. Les 1 7-hydroxycorticostéroldes extraits tels que dissous dans le mélange solvant sont séparés, a titre d'exemple par centrifugation, et le milieu aqueux restant est éliminé. Le mélange solvant contenant les 17-hydroxy corticostéroldes doit être lavé pour éliminer toute substance non désirée restante. Une solution de lavage préférés est une solution acidifiée de sulfate de sodium, ou autre sel, telle que décrite ci-dessus. Il est souhaitable de pre- voir au moins la même concentration acide et une molarité de sel similaire à celle des étapes antérieures. On peut ensuite effectuer la réaction de coloration. La solution restante à ce point comprend les 17-hydroxycorticostéroldes extraits dans du chlorure de méthylene et de l'alcool butylique. Des aliquotes de la solution restante pour constituer un échantillon à blanc et un échantillon à doser sont assurés. L'échantillon à doser est mélangé avec un réactif de coloration connu, dans la présente réalisation le chlorhydrate de phénylhydrazine, dissous dans une solution acide de préférence à 55%-65% en volume. L'échantillon à blanc est mélangé avec de l'acide mais sans phénylhydrazine. La concentration acide qui en résulte est d'environ 41% à 49%.Une fois mélangés les deux échantillons, des couches se forment, et on permet aux couches de se séparer, Une couche supérieure est constituée principalement de chlorure de méthylène, et celle-ci est aspirée. Les échantillons sont maintenant constitues des couches inférieures restantes et comprennent de l'alcool butylique et des 17 hydroxycorticostéroldes et, dans ltéchantillon à doser, de la phénylhydrazine. Les échantillons sont incubés, de préférence a 600C. La réaction est lente à température ambiante. A 100 C, des réactions secondaires non désirées comme dans le cas des chromogénes non spécifiques sont susceptibles de se produite et les 17-hydroxycorticostéroldes sont susceptibles d'être détruits. A la température préférée, tout chlorure de méthylène restant aura tendance à être chassé des échantillons par ébullition. Il faut faire chauffer les échantil- lons assez longtemps pour obtenir une bonne réaction de coloration. Une période d'au moins vingt minutes s'est avérée satisfaisante. Un chauffage trop prolongé est susceptible de produire les memes effets nuisibles qu'une température trop élevée.Après le refroidissement, des lectures spectrophotométriques sont faites de fanon connue, de préférence à 410 nm. EXEMPLE No. 1 Dans la réalisation préférée, on employa les réactifs suivants: Réactif à blanc - 76% d'acide sulfurique en poids, 63% en volume. Hydrocarbure éliminateur de chromogènes. Solvant d'extraction constitué de chlorure de méthylène et d'alcool butylique en proportion de 87:13 en volume. Etalon 17-hydroxy constitué de tétrahydrocortisone. Solution de lavage du solvant consiituée de sulfate de sodium 20% en poids, d'acide sulfurique 3,5% en poids et d'eau désionisée 76,5% en poids. Réactif de phénylhydrazine de travail constitue' de chlorhydrate de phénylhydrazine. Le réactif de phénylhydrazine de travail a été préparé à partir de 50ml de réactif a blanc et 50mg de chlorhydrate de phénylhydrazine. Les étal- ons ont été préparés en diluant 0,10mol de solution mare à 1 Oml avec de l'eau désionisée ou distillée afin de produire un étalon à lOmg/l. De l'eau désionisée ou distillée a été employée comme blanc. Des aliquotes d'échantillons des urines de 24 heures ont été bien mélangés et filtrées a travers un papier filtre Whatman No. 1 dans des éprouvettes individuelles de 25 x 150mm. Les aliquotes de 10ml des urines (échantillons à doser), les étalons et les blancs ont été mis chacun dans une éprouvette de 25 x 150mm. Environ trois grammes de sulfate de sodium ont été ajoutés à chaque éprouvette, et ensuite mélangés pour produire une solution homogène, à laquelle 2,0ml d'acide sulfutique à 15% ont été ajoutés et mélangés. Dix ml d'hydrocarbure éliminateur de chromogènes constitué de ligroine ont été ajoutés à ltéchantillon à doser. Les éprouvettes ont ensuite été obturées a l'aide de capsules perforées et tourbillonnées énergiquement pendant une minute.Afin de séparer chaque mélange en deux couches, il a éte centrifugé pendant trois minutes à 2000 t/m, après quoi la couche de ligroine a été éliminée. Le liquide restant a été filtré à travers un papier filtre Whatman No. 1 et 6,0ml de chaque filtrat ont été transvasés dans des éprouvettes de 25 x 15dom. Exactement 25ml de solvant d'extraction ont été ajoutés à chaque éprouvette, qui a ensuite été capsulée et tourbillonnée énergiquement pendant trois périodes séparées, chacune de 30 secondes, et ensuite centrifugée pendant trois minutes à 2000 t/m. La couche aqueuse supérieure > à ce stade contenant les urines ou le blanc ou la solution étalon, le sulfate de sodium et l'acide, a été éliminée.Le solvant d'extraction restant, contenant le 17-hydroxycorticostérolde a été lavé dans 10ml de solution acidifiée de sulfate de sodium. Après le tourbillonnement et la centrifugation, la solution de lavage a été éliminée, laissant le solvant et les corticostéroldes y contenus prêts à servir à la réaction de coloration. Pour la réaction de coloration, deux aliquotes chacune de 10ml ont été transvasées à deux éprouvettes de 19 x 150mm, l'uns étant mélangée avec 4ml de réactif à blanc et l'autre étant mélangée avec 4ml de réactif de phényl- hydrazine de travail. Après les avoir mélanges toutes les deux sur un mélangeur tourbillonnaire et avoir permis aux couches de se séparer, la couche supérieure a été éliminée par aspiration. Toutes les éprouvettes ont ensuite été incubées dans un bain-marie à 600C pendant 30 minutes. Après l'incubation, toutes les éprouvettes ont été placées dans un bain-marie à température ambiante pendant cinq minutes et chacune a été tourbillonnée pendant dix secondes. La densité optique de chacune a été lue à 410nom dans des cuvettes de 12 x 75mm. Des échantillons avec de la phénylhydrazine ont été lus par rapport au blanc à l'aide de réactif de phénylhydrazine à blanc. L'écart entre chaque lecture d'échantillon et la lecture å blanc correspondante a été rapporté de fanon linéaire au résultat obtenu pour l'étalon. Les résultats ont été obtenus sur les témoins Ortho I ayant une valeur d'essai imprimée de 3,2 t 1,2 et Ortho II ayant une valeur d'essai imprimée de 10,5 t 3. Les valeurs moyennes d'essai ont été de 2,9 et de 9,7 respectivement. Ces résultats sont dans les limites publiées. L'étalon retenu a un effet sur la corrélation du résultat avec la valeur de mi-fourchette. EXEMPLE II Les susdits réactifs ont éte employés selon l'Exemple I, exception faite de l'utilisation d'un solvant d'extraction constitué de diéthyléther et d'alcool butylique en proportion de 3:1 en volume, et la récupération sensiblement complante des 17-hydroxystérodes a été obtenue. Ce qui est donc prévu est une méthode perfectionnée de détermination des 17-hydroxycorticostéroldes qui est plus simple et plus rapide que beaucoup des procédés connus. En outre, un solvant d'extraction perfectionné et une solution acidifiée de sel utile pour ltélimination des chromogènes non specif- iques et utile aussi pour faciliter ltétape d'extraction sont assurés. Le procédé est encore simplifié par le fait que la même solution acidifiée de sel peut être présente tant pour ltélimination de l'excedent de chromogènes que pour ltétape d'extraction. Les enseignements de la description permettront aux hommes de l'art de prévoir de nombreuses autres formes spécifiques de détermination, de solvant de réaction et de solution acidifiée de sel dans le cadre de la présente invention. REVENDI CATIONS 1. Une méthode, pour la détermination de la concentration en 17-hydroxycorticostéroldes d'un fluide biologique en milieu acide, comportant les étapes d'extraction des 17-hydroxycorticostéroldes aussi bien libres que conjugués en ajoutant au fluide un sel d'extraction, de l'acide pour produire un milieu acide, et un solvant d'extraction constitué d'un alcool ayant de trois à huit atomes de carbone et un composé solvant choisi parmi le groupe constitué du chlorure de méthylène et du diéthyléther. 2. La méthode -selon la revendication 1 dans laquelle ltétape d'addition du solvant d'extraction comporte l'addition de chlorure de méthylène et d'alcool butylique respectivement en proportion de 100 parties pour environ 5 à 90 parties en volume. 3. La méthode selon la revendication 2 dans laquelle ltétape d'addition du solvant d'extraction comporte l'addition de chlorure de méthylène et d'alcool butylique respectivement en proportion de 100 parties pour environ 10 à environ 25 parties en volume. 4. La méthode selon la revendication 3 dans laquelle l'étepe d'addition de la solution acidifiée de sel comporte l'addition d'une solution acidifiée de sel constituée du sel sulfate de lithium. 5. La méthode selon la revendication 4 dans laquelle l'étape d'addition d'une solution acidifiée de sel comporte l'addition d'une solution de sel ayant un pH ne dépassant pas un. 6. La méthode selon la revendication 5 dans laquelle l'étape d'addition de ladite solution de sel comporte l'addition d'une solution de fanon à produire une molarité de sel d'environ 1,4 à 2,8. 7. La méthode selon la revendication 1 dans laquelle l'étape d'addition du solvant d'extraction comporte l'addition de diéthyléther et d'alcool butylique respectivement en proportion d'environ trois parties pour une partie en volume. 8. Une méthode pour la détermination des 17-hydroxycorticostéroldes dans un fluide biologique comportant les étapes d'addition audit fluide d'un sel clarifiant et de l'acide pour produire un milieu acide pour ltélimination de chromogènes non spécifiques, l'addition audit fluide d'un solvant d'extraction constitué de chlorure de méthylene et d'alcool butylique, la séparation d'une couche de fluide ayant des 17-hydroxycorticostéroldes dissous dans celle-ci et la realisation d'une réaction de coloration. 9. La méthode selon la revendication 8 dans laquelle ltétape d'addition du solvant d'extraction comporte l'addition de chlorure de méthylène et d'alcool butylique respectivement en proportion de 100 parties pour 10 à 25 parties en volume. 10. La méthode selon la revendication 9 dans laquelle l'étape d'addition d'un acide comporte l'addition d'acide pour produire un pH ne dépassant pas un. 11. La méthode selon la revendication 10 dans laquelle l'étape d'addition dudit sel clarifiant comporte l'addition d'un sel pour produire une molarité d'environ 1,4 à 2,8. 12. La méthode selon la revendication 11 dans laquelle l'étape d'addition dudit sel comporte l'addition de sulfate de lithium. 13. Une méthode pour la détermination des 17-hydroxycorticostéroldes dans les urines comportant les étapes d'addition aux urines d'un mélange constitué d'une solution d'acide et d'un sel clarifiant, de mélange de la solution dudit sel et dudit acide dans ledit fluide, la filtration du mélange ainsi obtenu, l'addition d'un solvant d'extraction constitué de chlorure de méthylène et d'alcool butylique, le mélange et la séparation d'un mélange résultant en couches, ltél mination d'une couche supérieure constituée de chlorure de méthyl- une, et la réalisation d'une réaction de coloration sur une couche inférieure. 14. La méthode selon la revendication 13 dans laquelle l'étape d'addition du solvant de chlorure de méthylène et d'alcool butylique comporte l'addition de chlorure de méthylène et d'alcool butylique respectivement en proportion de 100 parties pour 10 à 25 parties en volume, 15. La méthode selon l'une ou l'autre des revendications 13 et 14 dans laquelle ltétape d'addition de la solution acide comporte l'addition de solution acide pour produire un pH ne dépassant pas un. 16. La méthode selon la revendication 15 dans laquelle l'étape d'addition dudit sel clarifiant comporte l'addition de sel clarifiant pour produire une molarité d'environ 1,4 a environ 2,8. 17. La méthode selon la revendication 16 dans laquelle l'étape d'addition du sel clarifiant comporte l'addition de sulfate de lithium. 18. Un réactif-, pour l'extraction des 17hydroxycorticoste'roides dans un fluide biologique, comportant un alcool ayant de trois à huit atomes de carbone et un composant solvant choisi parmi le groupe constitué du chlorure de méthyl ène et du diéthyléther. 19. Le réactif selon la revendication 18 dans lequel le chlorure de méthylène et l'alcool butylique sont prévus respectivement en proportion de 100 parties pour de 10 à 25 parties en volume. 20. Le réactif selon l'une ou l'autre des revendications 18 et 19 comportant en outre un sel d'extraction et une solution acide. 21. Le réactif selon la revendication 20 dans lequel ledit sel est constitué de sulfate de lithium. 22. Le réaction selon la revendication 21 dans lequel ladite solution acide est prévue en quantité pour produire un pH dans un mélange de fluide biologique et dudit réactif ne dépassant pas un. 23. Le réactif selon la revendication 22 dans lequel un sel est prévu pour produire une molarité de sel d'environ 1,4 a 2,8. 24. Le réactif selon la revendication 18 dans lequel ltétape d'addition du solvant d'extraclion comporte l'addition de diéthyléther et d'alcool butylique respectivement en proportion d'environ trois parties pour une partie en volume.