FR 2412315 A1 19790720 FR 7738613 A 19771221 lia présente invention concerne l'hépatite B et, plus particulièrement, un vaccin contre l'hépatite B, ainsi qu'un procédé pour purifier l'antigène de l'hépatite 3, en vue de l'utiliser comme vaccins L'hépatite B est l'une des formes d'hépatite virale qui a pour résultat une infection systémique accompagnée des principales modifications pathologiques se produisant au niveau du foie, Cette maladie affecte principalement les adultes et se trouve essentiellement entretenue par transmission-de l'in- Section à partir de porteurs à long terme du virus.Cette maladie se propage habituellement à la suite de transfusions san guines, par des aiguilles ou des seringues contaminées, à tra- vers la peau ouverte par des coupures ou des égratignures, par des instruments dentaires non stérilisés ainsi que par la salive, par des contacts vénériens, ou encore par exposition a' un sang infecté aérosolisé. La période d'incubation de l'hépatite B est relative ment longue. En effet, il peut s'écouler de 5 semaines à 6 mois entre l'infection et la manifestation des premiers sympr8mes cliniques. Cette maladie commence habituellement par une fatigue intense et une anorexie qui sont parfois accompagnées d'un myalgie et d'une gepe abdominale. On peut observer ultéri6ure- ment l'apparition d'un ictère, d'urines sombres, de selles claires et d'une légère hépatomégalie.Dans certains cas, la déclaration de la maladie peut être ranide avec apparition d'un ictère d'abord en association avec une fièvre, des reeroidisse- ments ou une leucocytose4 Dans d'autres cas, 11 ictère ne se mani- feste jamais, et le patient pense uniquement qu'il est atteint d'une maladie de type grippal On estime que la majorité des hépatites infectieuses se traduit par des maladies légères sans manifestation d'ictère. lia matière de départ pour l'antigène superficiel dthépatite B (HBsAg) purifié selon la présente invention est du plasma provenant de donneurs atteints d'hépatite B, par exemple par plasmaphorèse. La quantité d'antigène peut être mesurée de manière connue par age radio-immunologique, hémoaggluti- nation passive ou fixation du complément. On refroidit le plasma et le cryoprécipité qui se forme est sépare par centrifungation douce.Le HBsArg dans le plasma clarifié résultant est isolé par une étape de fractionnement isopycnique suivie d'une étape de fractionnement zonai de vitesse; Dans le fractionnement isopycnique, le concentré partiellement purifié est mis en contact avec un milieu liquide ayant un gradient de densité qui comprend la densité de l'anti- gène particulier isolé.On soumet ensuite le milleu liquide à une ultracentrifugation de manière a obtenir une distribution d'équilibre des constituants du sérum dans le gradient de den Sité en fonction ae leurs densités individuelles. es fractions successives du milieu sont déplacées et celles contenant l'antigène désiré, c'est-à-dire les fractions ayant une nasse volumi- que comprise entre environ 1,21 et environ 1,24 g/cm , sont séparées. L'application de cette technique a la purification de HBsAg est décrite dans le brevet DT 2 049 515 et dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 636 191.Les concentrations des solutions formant le gradient sont choisies de manière à englober la plage de masses volumiques d1 environ 1,0 a environ 1,41 g/cm . Le milieu liquide peut; etre utilisé sous la forme d'un gradient linéaire ou d'un gradient échelonné. De préféren- ce, il est utilisé sous la forme dtun gradient échelonné et rai- son de sa meilleure capacité inhérente de fractionnement. Dans le fractionnement zonal de vitesse, le concentré partiellement purifié est soumis à une ultracentrifugation en contact avec un milieu liquide comportant un gradient de densité, mais en utilisant cette fois la technique zonale de vites- se, c'est-à-dire à une vitesse et pendant une période telles qu'un équilibre ne soit pas atteint, le HBsAg et les autres constituants résiduels du sérum étant distribué dans le milieu conformément à leurs coefficients de sédimentation dans le mi- lieu. lies concentrations des solutions formant le gradient échelonné sont choisies de manière à englober la plage de masses volumiques allant d'environ 1,0 à environ 1,28 g/cm .L'étape zonale de vitesse est conduite jusqu a ce que le HBsAg se trouve dans la région de masse volumique ce 1,13 à 1,16. A ce moment, le HBsAg est séparé de la majeure partie des protéines du plasma brut ot, ce qui est très important, est séparé aussi du complément macroglobuline du plasma. Si l'étape zonale de vitesse est conduite d'une manière telle que l'antigène HBsAg désiré atteigne sa position d'équilibre, c'est-à-dire environ 1,18 a environ 1,20 g/cm3, on a trouvé qu'une fraction de macroglobuline de plasma apparaîtra comme impureté dans la fraction désirée d'antigène HBsAg. les milieux liquides utilisés dans le fractionnement isopycnique et dans l'étape zonale de vitesse peuvent être d'un gradient de densité quelconque dans les intervalles appropriés. Les substances dissoutes de la technique antérieure pour de telles solutions comprennent, par exemple, du sucrose, du bromure de potassium, du chlorur-e de césium, du tartrate de potassium, etc.. L'étape de fractionnement isopycnique est conduite commodément dans une centrifugeuse, par exemple Electronucleo nics-E, en remplissant le rotor immobile de solution saline, puis en déplaçant successivement la solution saline vers le haut avec des portions d'une solution de milieu liquide de densité croissante jusqu'à ce qu'un gradient échelonné soit formée Le plasma est introduit au sommet du rotor, déplaçant du fond. un peu de la solution de plus forte densité0 Typìque- ment, le volume de plasma est compris entre environ 15% et envi- ron 40% de celui du gradient échelonné. On augmente la vitesse de la centrifugeuse grâce à un système de commande à vitesse programmée qui empeche un mélange durant la phase initiale de réorientation. Quand l'équilibre est atteint et que le produit se trouve dans la position correspondant à sa densité, on ralentit le rotor grace au même système pour empêcher un mélange lors de la réorientation à la configuration initiale On fait ensuite écouler le gradient par le bas et on recueille la fraction de densité appropriée. On utilise une technique similaire dans le fractionnement zonal de vitesse. La fraction de densité appropriée provenant du fractionnement zonal de vitesse est le concentré désiré d'antigène d'hépatite B. En raison des petites dimensions, environ 20 nm, de HBsAg, l'étape de fractionnement isopycnique est très longue demandant environ 18 heures de centrifugation. Comme résultat, m8me en opérant 24 heures par jour et- 7 jours par semaine, il est possible de préparer seulement environ 4 lots de plasma clarifié par centrifugeuse. On peut augmenter la productivité, évidemment, en utilisant des centrifugeuses supplémentaires. Cela exige toutefois, l'investissement d'un capital énorme, car chaque centrifugeuse coûte environ 100 000 dollars. On a maintenant trouvé que lton obtient des accroissements importants de productivité et des coûts opératoires sensiblement réduits par chargement multiple du gradient de fractionnement isopycnique. Par "chargement multiple", on entend qu'on soumet un échantillon de plasma clarifié contenant du HBsAg à des conditions de fractionnement isopycnique pendant un temps suffisant pour permettrs à la quasi-totalité du HBsAg présent dans le plasma clarifié de passer dans le gradient, mais insuffisant pour qu'on arrive å l'équilibre et qu'on répète cette étape au moins une fois avec un échantillon supplémentaire de plasma clarifié contenant du HBsAg, avant de continuer les conditions de fractionnement isopycnique pendant un temps suffisant pour qu'on arrive à l'équilibre. Si on le désire, un gradient peut être chargé avec jusqu'a environ 6 échantillons de plasma clarifié.Comme le temps nécessaire pour que le HBsAg dans le plasma clarifié entre dans le gradient est seulement une fraction de celui nécessaire pour qu'on arrive à l'équilibre, et comme le temps nécessaire ensuite pour qu'on arrive à l'équilibre est le même que le gradient soit chargé en une seule ou en plusieurs fois, on obtient dtimnor- tantes économies de temps et des réductions importantes des coûts opératoires par unité. Bien que la productivité accrue et les coûts réduits de la technique de fractionnement à chargement multiple selon la présente invention puissent entre obtenus avec n'importe quel gradient aproprié, le gradient est de préférence du bromure de sodium, On conduit le fractionnement isopycnique à l'équilibre par centrifugation entre environ 40 000 x g et environ 80 000 x g pendant environ 10 heures ou plus. On a trouvé, toutefois, qu'en centrifugeant le plasma pendant 4 heures environ, on fait passer dans le gradient de fractionnement isopycnique la quasi-totalité du HBsAg. Ensuite, on enlève l'échantil- lon de plasma usé et un échantillon frais de plasma d'un volume égal à celui du premier échantillon est déposé en couche sur le gradient.La centrifugation peut alors être continuée comme précédemment pendant 10 heures environ ou plus de manière que le HBsAg dans les deux échantillons de plasma passe à la région de densité d'équilibre du gradient (1,21 é environ 1,24 g/cm ) pour achever le fractionnement. En variante, la centri fugation peut être continuée pendant 4 heures, le plasma usé enlevé et un troisième échantillon de plasma frais dépose en couche sur le gradient. Cette techniq;;ue de chargement multiple peut etre répétée six fois ou même plus avant achèvement du fractionnement par centrifuLation pendant-18 heures environ, lie rapport du volume de la charge (plasma) au volume du gradient est compris entre 1:3 environ et 1:6 environ;Quand une seule charge de plasma est appliquée au gradient et centri- fue dans des conditions de fractionnement isopycnique (par exemple entre environ 16 et environ 20 heures a 30 000 tpm dans la centrifugeuse K-II), le produit résultant aura généralement une teneur en protéine d'environ 4 à 10 mg/cm3 dans un volume de 1,8 litre, suivant la quantité de protéine dans 3.e plasma initial. Quand un double charge de plasma est appliquée au gradient et centrifugée dans des conditions de fractionnement isopycnique (pendant une période d'environ 16 à envirin 20 heures à 30 000 tpm) le produit résultant aura une teneur en protéine qui est additive pour les charges utilisées, typiquement de 8-20 mg/cm environ dans un volume de 1,0 litre, suivant la quantité de protéine dans-le plasma initial. La teneur en pro- téine augmente de cette manière pour chaque charge suivante de plasma appliquée au gradiente lie produit est ensuite soumis à un fractionnement zonal de vitesse. On effectue le fractionnement zonal de vitesse jusqu'à ce que le HBsAg se trouve dans la plage de masse volu- mique d'environ 1,13 à environ 1,16 g/cm .Typiquement, cela demande d'environ 16 heures à environ 20 heures, de préférence d'environ 17 à environ 18 heures, entre environ 30 000 x g et environ 60 000 x g. Belon un aspect de la présente invention, le gradient est formé de bromure de sodium, que l'on utilise ou non la technique à chargement multiplex A la différence des matières utilisées antérieurement, le bromure de sodium présente des avantages nets. La solubilité du bromure de sodium permet l'utilisation de solutions de fortes densités dans la formation de gradients à la température du réfrigérateur (2-6 C). Il y a des avantages économiques nets à l'utilisation de bromure de sodium plutôt que d'un sel comme le chlorure de césium, en plus du fait qu'on n'a pas à se précocuper du problème de toxicité pour les êtres humains résultant d'ions de césium résiduels et liés à HBsAg.Dans un gradient bromure de sodium, tous ions liés au HBsAg, en raison de caractéristiques biophysiques, seront ceux d'un sel de sodium très compatible avec le système biologique humain et na posant pas de problème de toxicité. Les caractéristiques biophysiques du HBsAg sont bien connues (J. Clinical Investigation 52, 1176 (973). J. of Virology 10, 469 (1972)] comme étant celles d'une particule chargée négativement. En présence d'une très forte concentrations d'ions de sodium chargés positivement, il se forme une molécule de sel sodium-HBsAg. Ce type de molécule est compatible avec le système biologique humain. Contrairement aux produits de la technique arterieure, le HBsAg du mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention est sensiblement exempt d'autres cations, en particulier d'ions de césium et de potassium. ajoutés. La solubilité supérieure de NaBr à des températures abaissées par rapport à KBr permet l'utilisation de températures plus basses qui sent plus favorables pour la stabilité des mat tières biologiques. L'utilisation d'un gradient échelonné plu tôt que d'un gradient linéaire est préférée parce qu'il accumule les impuretés aux limites des écholons et permet de trai- ter un plus grand volume de plasma dans un seul gradient. L'antigène de la présent invention est utile par lui même comme antigène pour l'hépatite B et peut être utilisé comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 636 191. 'antigène HBsAg de la présente invention est un produit hautement purifié. L'étape de fractionnement isopycnique entraîne une purification du HBsAg d'un coefficient 100 environ par rapport à la protéine normale de plasma0 L'étape de fractionnement zonai de vitesse entraîne une purification supplémentaire du HBsAg d'un coefficient 20 environ par rapport a la protéine nornale de plasma0 La combinaison des deux étapes fournit une purification du HBsAg d'un coefficient 2000 environ par rapport a la protéine normale de plasma.On a montré ofte le produit résultant est sensiblement exempt des substances A et B des groupes sanguins, comme mesuré par des techniques sérologiques et électrophorétiques. De plus, l'antigène de la présente invention peut être utilisé comme matière de départ pour l'antigène de l'hépatite B de la demande de brevet US 577 483 du 14 Mai 1975. Les exemples non limitatifs suivants montreront bien comment la présente invention peut être mise en oeuvre. - EXEMPLE 1 lie rotor d'une centrifugeuse, Electronucleonics IC, est rempli de 8 400 cm de tampon phosphate. Après avoir fait tourner le roter jusqu'à 10 000 tpm pour dégazer le système, on refoule le gradient échelonné suivant dans le fond du rotor immolile :: 1. 2 400 cm de NaBr à 10%, #= 1,08 2. 1 000 cm3 de NaBr a 20%, # 1,17 3e i 500 cm3 de NaBr à 30%, P 1,28 4. 3 500 cm de NaBr à 40%,# = 1,41 Du plasma contenant de l'antigène Australia (HBsAg), 1 750 cm3, est refoulé dans le haut du rotor immobile, dUpla- ayant 1 750 cm3 de solution à 40% de NaBr du fond du rotor.On accélère le roter jusqu'à 30 000 tpm et on le fait tourner à cette vitesse pendant 18 heures0 Après arrêt du roter, on recueille 500 cm de matière riche en HBsAg dans la plage de masse volumique de 1,21 à 1,24 g/cm et on dialyse cette matière contre un tampon phosphate. On remplit ensuite le rotor avec du tampon phosphate, on le dé gaz comme ci-dessus et on refoule le gradient échelonné suivant dans le fond du rotor immobile 1. 2 400 cm de sucrose à 5%, # = 1,02 2. 1 750 cm de sucrose à 15%, # = 1,06 3. 1 750 cm de sucrose à 25%, # = 1,10 4. 2 500 cm3 de sucrese à 50%, #- 1,23 La matière riche en HBsAg proenant de l'étape de fractionnement isopycnique au NaBr, 500 cm , est nefoulée dans le haut du rotor, déplaçant 500 cm de sucrose à 50% du fond du roter. On fait ensuite tourner le rotor à 28 000 tpm pendant 18 heures. Après arret du rotor, on recueille 5CO cm de matière riche en HBsAg dans la plage de masse volumique 1,135-1,165 g/cm . - EXEMPLE 2 lie rotor d'une centrifugeuse est rempli de 8 400 cm de tampon phosphate. Après avoir fait tourner le rotor jusqu'à 10 000 tpm pour dégazer le système, on refoule le gradient échelonné suivant dans le fond du rotor immobile :: 1. 2 400 cm de NaBr à 10%, # = 1,08 2. 1 000 cm de NaBr à 20%, # = 1,17 3. 1 500 cm de NaBr à 30%, # = 1,28 4. 3 500 cm de NaBr à 40%, # = 1,41 Du plasma contenant du HBsAg, 1 750 cm , est refoulé dans le haut du roter immobile, déplaçant 1 750 cm ae NaBr a 40% du fond du roter. On accélère le roter jusqu'à 30 000 tpm et on le fait tourner à cette vitesse pendant 4 heures. On arrête ensuite le rotor et on refoule 1 750 cm3 de NaBr à 40% dans le fond du rotor, poussant le plasma vers le haut. Une quantité supplémentaire de I 750 cm de plasma frais contenant du HBsAg est refoulée dans le haut du rotor, déplaçant un volume égal de NaBr à 40% du fond u rotor.On Tait onsuite tourner le roter à 30 000 tpm pendant 18 heures. Après arrêt du rotor, on recueille 1 000 cm3 de matière riche en HBsAg dans la région de nasse volumique de 1,21-1,24 g/cm et on dialyse cette matière contre du tampon phosphate. On remplit ensuite le rotor avec du tampon phosphate, on le dégaze comme ci-dessus et on refoule le gradient échelonné suivant dans le fond du rotor immobile 1. 2 400 cm3 de sucrose à 50%, A 1,02 2. 1 750 ca3 de sucrose à 15%, #= 1,06 3. 1 750 cm de sucrose à 25%, # = 1,10 # 4. 2 500 cm3 de sucrose à 50%, #= 1,?3 Da matière riche en HBsAg provenant de l'étape de fractionnement isopycnique au NaBr, 1 000 cm , est refoulée dans le haut du rotor, déplaçant 1 000 cm de sucrose à 50% du fond du rotor. On fait ensuite tourner le rotor à 28 000 tpm pendant 18 heures. Après arrêt du rotor, on recueille 1000 cm3 do matière riche en HBsAg dans la région de masse volumique 1,135-1,165 g/cm . - EXEMPLE 3 lie rotor d'une centrifugeuse, Electronucleenics K, est rempli de 8 400 cm de tampon phosphate. après avoir fait tourner le roter jusqu'à 10 000 tpm pour dégazer le système, on refoule le gradient échelonné suivant dans le fond du roter arrêté : 1. 2 400 cm de NaBr à 10%, # = 1,08 2. 1 000 cm de NaBr à 20%, # = 1,17 3. 1 500 cm3 de NaBr à 30%, #= 1,28 4. 3 500 cm de NaBr à 40%, # = 1,41 On refoule du plasma contenant du HBsAg, 1 750 cm , dans le haut du rotor arrêté, déplaçant 1 750 cn3 de NaBr à 40% du fond du rotor. On accélère le rotor jusqu: à 30 000 tpm et on le fait tourner à cette vitesse pendant 4 heures. On arrête ensuite le rotor et on refoule 1 750 cm3 de NaBr a 40% dans le fond du rotor, poussant le plasma vers le haute Une quantité supolémentaire de 1 750 cm de plasma frais contenant du HBsAg est refoulée dans le haut du roter, déplaçant un volume égal de NaBr à 40% du fond du rotor. On accélère le rotor jusqu'à 30 000 tpm et on le fait tourner a cette vitesse pendant 4 heures. On arrête ensuite le roter et une troisième charge de 1 750 cm3 de plasma frais contenant du HBsAg est refoulée dans le haut du rotor, déplaçant un volune égal de NaBr à 40% du fond du roter. On fait ensuite tourner le rotor a 30 000 tpm pendant 18 heures.Après arrêt du rotor, on recueille 1 500 cm de matière riche en HBsAg dans la région de masse volumique 1,21 - 1,24 g/cm et ou dialyse cette matière contre du tampon phosphate. On remplit ensuite le roter de tampon phosphate, on le dégaze comme ci-dessus et on refoule le gradient échelonné suivant dans le fond du roter arrêté : 1. 2 400 cm de sucrose à 5%, # = 1,02 2. 1 750 cm de sucrose à 15%, # = 1,06 3. 1 750 cm de sucrose à 25%, # = 1,10 4. 2 500 cm de sucrose à 50%, # = 1,23 La matière riche en HBsAg provenant de l'étape de fractionnement isopycnique au NaBr, 1 500 cm , est refoulée dans le haut du rotor, déplaçant I 500 cm3 de sucrose à 50% du fond du rotor. On fait ensuite tourner le rotor à 28 000 tpm pendant 18 heures. Après arrêt du rotor, on recueille 1 500 cm de matière riche en HBsAg dans la région de masse volumique 1,135-1,165 g/cm . - EXEMPLE 4 Le Tableau suivant montre l'accroissement marqué du rendement par unité de temps quand on utilise la technique de chargement multiple selon la présente invention (Exemples 2 et 3) par rapport à un chargement simple (Exemple 1)o Exemple Froduction (cm ) Durée totale de centri- % d'acoroissement % d'accroissement fugation isopycnique de la durée (par de la production (par de HBsAg et zonale de vitesse rapport à l'Exem- rapport à l'Exemple 1) (heures) ple 1) 1 500 36 - 2 1 000 40 11,1 % 100 % 3 1 500 44 22,2 % 200 % REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation d'un antigène superficiel purifié d'hépatite B (HBsAg) à partir de plasma de donneurs humains atteints d'hépatite B, caractérisé par le fait que l'on soumet du plasma clarifié contenant du HBsAg à un fractionnement isopycnique partiel, dans un milieu liquide ayant un gradient de densité qui comprend la densité de l'antigène particulier isolé,dans des conditions efficaces pour faire passer la quasitotalité du HBSAg du plasma clarifié dans le gradient de densité, mais inefficaces pour achever le fractionnement isopycni- que du HBsAg, que l'on enlève le plasma clarifié usé, et que lton répète au moins une fois la première étape avec un échantillon frais de plasma clarifié. 2) Procédé selon la revendication i, caractérisé par le fait que ledit milieu liquide ayant un gradient de densité qui comprend la densité de l'antigène particulier isolé est un gradient de densité de bromure de sodium. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que le gradient de densité est un gradient échelonné. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait qu'après un chargement multiple d'un gradient de densité, le fractionnement isopycnique est poursuivi dans des conditions efficaces pour arriver à un équilibre. 5) A titre de produit industriel nouveau le HBSAg obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 4 6) Le HBSAg selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l'antigène se trouve sous la forme de molécules de sel de sodium de HBSAg qui sont essentiellement exemptes d'autres cations ajoutés, dérivés d'un gradient, en particulier d'ions césium et potassium. 7) Une composition comprenant le produit selon l'une des revendications 5 et 6 dans une solution de bromure de sodium. 8) Une composition selon la revendication 7, caractérisée par le fait que ladite solution est un gradient échelonné de bromure de sodium. 9) Composition selon la revendication 7, caractérisée par le fait que le bromure de sodium a une masse volumique comprise entre environ 1,21 g/cm3 et environ 1,24 g/cm3. 10) Composition selon la revendication 7, caractérisee par le fait que bromure de sodium a une masse volumique comprise entre environ 1,13 g/cm3 et environ 1,16 g/cm3.