FR 2385099 A1 19781020 FR 7708389 A 19770321 La présente invention concerne une nouvelle méthode de détermination immunoenzymologique ainsi que 11 ensemble des moyens permettant de mettre en oeuvre ladite méthode, ces moyens étant avantageusement presentes sous forme de coffrets renfermant tous les ingredients et réactifs nécessaires pour mettre en oeuvre la nouvelle méthode de détermination immunoenzymologique. L'invention a pour objet de proposer une nouvelle méthode de détermination immunoenzymologique selon laquelle la durée des modalités opératoires est considérablement diminuée par rapport aux techniques utilisées dans l'art ant- rieur.Ainsi, pour ltélution (qui sera précisée ci-après) la méthode selon l'invention est de quelques secondes alors que selon l'art antérieur elle était de 24 heures.Par ailleurs, la méthode selon l'invention présente l'avantage d'être três sensible,elle s'applique indifféremment aux dosages des antigènes et des anticorps. Par substance antigénique on entend ici toute substance directement antigénique (par exemple les protéines) ou pouvant devenir antigénique après traitement (par exemple les peptides, les hormones stéroldiques et certains médicaments tels que les barbituriques). ta méthode de détermination immunoenzymologique selon l'invention pour le dosage d'une substance choisie parmi l'ensemble constitué par les substances antigéniques et les anticorps, dans laquelle on marque la substance doser ou son opposé spécifique, au moyen d'un enzyme, notamment la peroxydase, on forme un complexe antigène-anticorps comprenant la totalité ou une fraction te l'enzyme de marquage, on sépare ledit compleXe antigene-anticorps notamment par fixation sur un support immunoadsorbant, et on assure la réaction de mise en évidence de l'enzyme fixée sur la substance à doser, puis on procède à une dilution du produit de réaction formé fixé sur le support immunoadsorbant, ladite méthode étant caractérisée en ce que l'dilution est effectuée en milieu acide. La formation du complexe antigène-anticorps peut être effectuée selon une méthode connue en soi. On préconise à cet effet la mise en compétition de la substance à doser avec une quantité connue de la même substan- ce marquée au moyen d'un enzyme vis- -vis d'un anticorps spécifique si la substance doser est une substance antigénique, ou vis- -vis d'une substance antigénique spécifique si la substance doser est un anticorps. Dans ce qui suit, on a donné par commodité les modes de mise en oeuvre de la méthode de détermination immunoenzymologique selon l'invention quand ils sont appliqués au dosage des substances antigéniques. Il est cependant bien entendu que ces modes de mise en oeuvre sont applicables sans difficultés au dosage des anticorps. Selon un mode préféré, la mise en oeuvre de la méthode de détermination immunoenzymologique pour le dosage d'une substance antigénique A est caractérisée en ce que a) on met en compétition la substance A avec une quantité connue de substance couplée At identique à A aais marquée au moyen d'un enzyme, notamment la peroxydase, en mettant en contact A et Ai avec un anticorps B spécifique de A, b) on met en contact l'ensemble constitué par A, At, A-B et a#-B avec un anticorps C anti B lié à un support immuno- adsorbant D, A-B et At-B jouant alors le rôle d'antigènes par rapport a C-D, afin d'obtenir la précipitation des complexes antigènes-anticorps A-B-C-D et A*-B-C-D que l'on recueille notamment par centrifugation et, c) on révèle l'activité enzymologique du mélange de A-B-C-D et de A*-B-C-D au moyen d'un réactif spécifique de l'enzyme de couplage du stade a), on élue le p@@duit formé en milieuacide. Comme indiqué ci-dessus, l'élution du stade-c) qui est effectuée en milieu acide permet (notamment en présence de HCI) de gagner beaucoup de temps dans la mesure et de ramener l-'élution spontanee-, qui est de 24 heures pour être complète, à quelques secondes. Parmi les substances antigéniques A susceptibles d'être testées selon la méthode de l'invention, on peut notamment citer les protéines par exemple les PDF (produits-dc dégradation du fibrinogene), llACTH, la MSH (&alpha;-MSH et 6-MSH) la ss-LPH, les lactoprotéines (B-lactoglobuline, &alpha;-lactalbumine),globulines-immunes, protéoses-peptones, lactoferrine, sérum transferrine et les hormoes,en particulier les hormones stéroïdiques, les peptides et certains médicaments (qui deviennent antigéniques après fixation sur une grosse molécule). Parmi les anticorps B spécifiques de A, on-peut notamment citer pour les PDF les anti-fibrinogenes. De même, parmi les anticorps C devant réagir avec les antigènes A-B et At-B, on peut notamment citer, lorsque B a été obtenu par immunisation d'un lapin, les &gamma;-globulines de mouton anti- globulines de lapin. Le support D préféré est constitué par des petites billes de verre, en particulier les petites billes de verre activées par un dérivé de N-hydroxy-su-ccinimide, notamment un ester, commercialisees par la Société Pierce Laboratories. Ces billes de verre activés par un ester de N-hydroxysuccinimide permettent d'obtenir un produit qui présente une chaîne aliphatique reliée par une liaison covalente de 10 t tersinée par le groupe ester N-hydroxy-succinimide. Ce support activé permet l'immobilisation des protéines par l'intermédiaire des groupes amino primaires libres.Les billes de verre activées sont du point de vue de la sensibilité et la précision de la méthode de dosage préférables au support constitué par la sépharose activée par CNBr. Bien entendu, d'autres billes de verre activées peuvent être utilisées. Le réactif spécifique du stade c) peut être n'importe quelle substance permettant la mesure de l'activité enzymatique. Dans le cas od l'enzyme de marquage est la peroxydase, le réactif utile pour la détersination enzymologique est alors l'eau oxygénée, en présence d'ortho-dianisidine, l'ortho-dianisidine permettant, du fait de la coloration qu'elle développe, une mesure de l'activité enzymologique par densité optique. L'originalité caractéristique de l'invention réside dans l'élution de la coloration fixée sur les billes du stade c) effectuée en milieu acide, les ions H+ accélérant l'élution de la coloration, donc la lecture de la densité optique. Selon un autre mode préféré de mise en oeuvre, le procédé de détermination immunoenzymologique selon l'invention, dans lequel on met en compétition une substance antigénique avec une quantité connue d'une substance antigénique couplée, marquée au moyen d'un enzyme notamment la peroxydase, vis-è-vis d'un anticorps spécifique, puis on met en contact le milieu réactionnel résultant afin de précipiter le complexe substance antigénique - anticorps agissant alors comme antigène avec un anticorps îie t un support immunoadsorbant constitué par des billes de verre, on fait réagir ensuite le précipité ainsi obtenu avec le réactif spécifique de l'enzy e de marquage, ledit procédé étant caractérisé en ce que le réactif spécifique de l'enzyme comporte un colorant et en ce que solution de la coloration -fixée sur les billes de verre est effectuée en milieu acide. De préférence, l'enzyme de marquage est la peroxydase et le réactif spécifique de cet enzyme est H202 en présence de ortho-dianisidine. La mesure de l'activité enzymatique après élution de quelques secondes est effectuée par densité optique å 405 nm. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris b la lecture qui va suivre d'un exemple de réalisation nullement limitatif mais donné a titre d'illustration. EXEMPLE Determination de PDF A - Préparation des divers réactifs. Tampon albumine de Merskey : tampon phosphate-citrate selon la formulation de Nerskey. et al, Soc. Exp. Biol. (1969) 131, 871, dans lequel on a dissous 10 g/l d'albumine de boeuf. PDF : un ml de fibrinogène humain purifié à 10 mg/ml est mis en incubation avec 25 unités de streptokinase a 370 C pendant 30 minutes ou 18 heures (pour préparer les PDF"pré- coces" en anglais"early FDP"- et respectivement les PDF "tardifs"-en anglais "Late FDP").Après l'incubation du fibrinogène avec la streptokinase,cette dernière est inhibée par additiond d'un in hibiteur de plasmine (0,3ml).Ainsi, 1 ml de PDF correspond à 7,5 mg de fibrinogène protéolysé. La nature des PDF ainsi obtenus est contrôlée par immunoélectrophorèse. PDF marqués à la peroxydase : la solution de PDF tardifs a été utilisée pour le couplage. Le couplage avec la peroxydase est effectue en présence de glutaraldéhyde en deux étapes selon Avrameas et al. Immunochemistry (1971), 8, 1175 : à 0,7 ml de peroxydase (5 mg) activée par le glutaraldéhyde, on ajoute 0,5 ml de PDF à 7,5 mg/ml préalablement dialysés contre NaCl 0,15 M et 0,05 ml de tampon carbonate-bicarbonate M i pH 9,5. Après 24 heures d'incubation à 240C, on dialyse de nouveau contre NaCl 0,15 M tamponné à pH 7,4 (avec tampon phosphate 0,01 M). Les PDF ainsi marqués sont stables pendant plusieurs mois à 4 C. Le sérum normal ou le sérum du patient sont recueillis par centrifugation de 2 ml de sans pris sur 0,05 ml de substance antiplasmine et 0,05 ml de throumbine i 40 unités/ml. Les sérums sont recueillir après 1 heure i 37 C. La mesure de l'activité antigénique des PDB maiqués 8 la peroxydase a été effectuée selon la technique de Merskey d'inhibition de l'hémagglutination décrite dans l'article indiqué ci-dessus. L'activité antigénique de la solution correspond W celle d'une solution de fibrinogène non dégradé à 3.000 g/ml.Le contre antigénique des PDF marqués la peroxydase peut atre effectué par immuncélec- trophorèse. Isolation de gamma-globuline du sérum de mouton anti-gammaglobuline de lapin t on précipite la gamma-globulines du sérum de mouton dilué au 1/2 avec une solution de NaCl 0,15 M au moyen de sulfate d'ammonium saturé i 40 %. Après 10 minutes i 40C, le précipité est recueilli par centrifugs- tion et redissous dans un volume d'eau distillée égal à celui du sérum de départ. La solution résultante est sou- mise i une nouvelle précipitation dans les mémes conditions décrites ci-dessus, la purification étant répétée d@ux fois. Le précipité est redissous dans de l'eau distillée (1/3 du volume du sérum de départ) puis dialysé pendant 48 heures contre une solution de NaCl 0,15 M tamponné è pH 7,4 (au moyen de phosphate 0,01 M). Après dialyse, la quantité de protéine est déterminée et la solution est amenée à une teneur de 10 mg de proteine pour 1 ml au moyen d'une solution de NaCl 0,15 M tamponne è pH 7,4 (avec tampon phosphate 0,01 M). Préparation de l'immunoadsorbant : on utilise des petites billes en verre (de porosité contrôlée) activées au moyen d'un ester de N-hydroxy-succinimide (billes de verre commar- cialisées par la Société Pierce Laboratories). 1 g de support activé est ajoute à 10 ml de NaCl 0,15 M tamponné à pH 7,4 contenant 100 mg d'immunoglobulines de mouton antiimmunoglobulines de lapin. Aprés addition de la protéine, le pH est maintenu à 7,4 environ par addition de NaOH 0,1 N. Le mélange est agité lentement à 40C pendant 18 heures puis filtré. La solution peut entre conservée à 4 C pour préara- tion ultérieure de billes de verre sensibilisées1 car la totalité des Ig n'a pas été fixée sur les billes. Le couplage des billes est terminé par réaction de glycine 1 M avec les groupes esters actifs restants, pendent 18 heures à 4 C sous une lente agitation. L'immunoadsorbant est ensuite lavé avec un large volume de NaCl 0,15 M tamponné i pH 7,4 et mis en suspension dans 40 ml du milieu tampon.Les billes de verre ainsi préparées sont conservées a 4 C, Au cours des dosages, pour éviter la sédimentation des billes de verre pendant les pipetage8, l'immunoadsorbant est continuellement agité au moyen d'un agitateur magnétique et on utilise une pipette automatique. D'autres billes de verre activées peuvent être utilisées comme support. Détermination de l'activité de la peroxydase : on utilise la méthode décrite par Maehly et al, Methods of Biochemical Analysis vol. 1, page 357 Intersciences Publishers Inc. (New York) 1954. Le réactif utilisé est constitué de 0,6 ml de tampon phosphatc 1 M à pH 6, de 0,6 ml d'une solution aqueuse de H202 à 30 Z (poids/volume) diluée X 1/100 dans de l'eau, de 0,5 ml d'ortho-dianisidines à 1% en solution dans le méthanol, et d'eau distillée en complément jusqu'à 60 ml, La mesure de l'activité de la peroxydase est réalisée comme suit : on ajoute 0,1 ml d'enzyme a 2,9 mi de réactif, on laisse la coloration se développer pendant l heure à la température ambiante (15-200C) puis on stoppe la réaction par addition de 0,05 ml de HCl 5 N et on mesure la densité optique à 405 nm. B- Diagramme des mécanismes reactionnels. Les mécanismes réactionnels ont été schématisés dans le diagramme I ci-après. C - Modalités opératoites. Les modalités opératoires ont été résumées dans le tableau I donné ci-après. Remarques Lorsque on applique les modalités opératoires de l'exemple donné ci-dessus pour la détermination des PDF de sérum de patient, en utilisant des dilutions de 1/2 et 1/10, on obtient une bonne corrélation entre les niveaux de PDF. Toutefois, on peut obtenir une sensibilité encore amélio- rée et une plus grande précision dans les cas pathologiques si a) le niveau de PDF est supérieur a 150/ug/ml il convient d'utiliser une dilution plus importante de celle de 1/10 ; et b) le niveau de PDF est compris entre 20 et 150 /ml, il suffit de calculer le résultat an utilisant uniquement la dilution au 1/10. La méthode de détermination iwmuncenzyaologique selon l'inven- tion appliquée aux PDF permet de bien séparer les PDF précoces des PDF tardifs. De plus, elle présente les avantages suivants 1 ) elle est indépendante de la nature des PDF ; 2ç) elle est trBJ sensible puisqu'elle peut être appliquée la détermina- tion des niveaux de PDF dans les fluides biologiques contenant de façon normale ou de façon pathologique très peu de PDF ; 3o) elle est spécifique puisque les autres protéines de sérum n1 interfèrent pas compte tenu de l'utilisation d'un anticorps B spécifique 4 ) elle est reproductible et est mise en oeuvre pendant une durée de temps relativement plus courte que les durés des techniques antérieures. Selon l'invention, on préconise pour mettre en oeuvre la méthode de détermination immunoenzymologique des coffrets renfermant les divers ingrédients requis pour chaque mesure spécifique de substance antigéniques A ou d'anticorps. TABLEAU I Protocole pour la détermination immunoenzymologique des PDF Standard Essai Sérum normal (ml) (a) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 PDF concentra tion en ( g/ml) (b) - 7 14 23 35 58 Tampon albumine de Merskey 0,2 Mélange (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Sérum à 0,1 0,1 tester (ml) (1/2) (1/10) (d) (d) Sérum anti fibrinogène (ml) (c) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Incubation pendant 15 min. à la température ambiante PDF marqués a la peroxydase (ml) (e) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Incubation pendant 30 min. å la température ambiant. Immunoadsorbant -billes de 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 (ml) (f) Agitation modérée pendant 2 h. à température, Centrifugation à 4 C. Deux lavages avec le tampon albumine de Merakey. Elimination du surnageant. Remettre en suspension les bille. de verre au moyen du réactif enzymologique (H202 et ortho-diani.idine) Réactif pour la révélation de la peroxydase (ml) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Agitation modérée pendant 1 heure à température ambiante. Centrifugation. Elution de la coloration des billes de verre avec 4 ml de HCl 0,1 N. Lecture de la densité optique à 405 nut. Notes (a) : le sérum normal est utilisé à une dilution de 1/8 dans le tampon albumine de Merskey. (b) : utiliser 0,2 ml de la dilution de PDF dans le tampon albumine de Merskey. (c) : le sérum antifibrinogène est utilisé à une dilution de 1/500 dans le tampon albumine de Merskey. (d) : dilution de 1/2 et respectiverent 1/10 dans le tampon albumine de Nerskey. (e) : utiliser PDF marqués m la peroxydase a une dilution de 1/1000 dans le tampon albumine de Merskey; la quantité de produit marqué à la peroxydase est fixée par une expérience préliminaire : on utilise une dilution qui fournit une densité optique de 0,700 selon la technique decrite plus haut, on tient compte ensuite de la dilution effectuée par apport d'anti -fibrinogEne et du sérum à examiner (1/17). (f) : la quantité d'immunoadsorbant unilisée est déterminée au cours d'une expérience préalable : le volume qui doit être utilisé correspond la fixation totale du. complexe PDF marqué - antifibrinogene sur l'immunoadsorbant (plateau). REVENDICATIONS 1. Méthode de détermination immunoenzymologique pour le dosage d'une @ubstance choisie parmi l'ensemble constitué par les substances antigéniques et les anticorps dans laquelle on marque la substance à doser ou son opposé spécifique,au moyen d'un enzyme notamment la peroxydase,on~forme un complexe antigène-anticorps comprenant la totalité ou une fraction de l'enzyme de marquage,on sépare ledit complexe anti- gene-anticorps notamment par fixation sur un support immunoadsorbant,et on assure 14 réaction de mise en évidence de l'enzyme fixée sur-la substance à doser,puis on pro cède à une élut ion du produit de réaction formé fixé sur le support immunoadrorbant,ladite méthode étant caractérisée en ce que l'élution esteffrtueenmilieuacide. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la substance à doser est une substance antigénique. 3. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la substance à doser est un anticorps. 4. Méthode selon la revendication I pour le dosage d'une substance antigénique A, caractérisée en ce que : a) on met en compétition la substance A avec une quantit connue de substance couplée A# identique à A mais marquée au moyen d'un enzyme, notamment la peroxydase, en mettant an contact A et A# avec un anticorps B spécifique de A, b) on met en contact l'ensemble constitué par A, As A-B et A*-B avec un anticorps C anti B lié à un support imouno- adsorbant D, A-B et A*-B jouant alors le rôle d'antigènes par rapport à C-D, afin d'obtenir la précipitation des complexes antigenes - anticorps A-B-C-D et A#-B-C-D que l'on recueille notamment par centrifugation et, c) on révèle l'activité enzymologique du mélange de A-B-C-D et de At-B-C-D au moyen d'un réactif spécifique de l'enzyme de couplage du stade a),et on élue le produit formé en milieu acide. 5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que le support immunoadsorbant est constitué par des billes de verre.activées. 6. Méthode selon la revendication 1 pour le dosage d'une substance antigénique, selon laquelle on met en compétition une substance antigénique avec une quantité connue d'une substance antigénique couplée, mar quée au moyen d'un enzyme, notamment la peroxydase, vis- -vis d'un anticorps spécifique, puis on met en contact le milieu réactionnel résultant, afin de précipiter le complexe substance antigenique - anticorps agissant alors comme antigene, avec un anticorps lie à un support immunoadsorbant constitué par des billes de verre, on fait ensuite réagir le précipité ainsi obtenu avec le réactif spécifique de l'enzyme de marquage, ladite méthode étant caractérisée en ce que le réactif spécifique de enzyme comporte un colorant, et en ce que l'élution de la coloration fixée sur le support est effectuée en milieu acide. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 4 à 6, caractérisée en ce que la substance antigénique est choisie parmi l'ensemble constitué par les protéines, les hormones steroldiques, les peptides et les barbituriques. 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que la substance antigénique est constituée par les produits de dégradation du fibrinogène.