FR 2402704 A1 19790406 FR 7825482 A 19780905 La présente invention se rapporte à un procédé microbiologique et en particulier à la production de protéine d'unicellulaires à partir de méthanol par culture de bactéries génétiquement modifiées, à ces bactéries et à un procédé pour les obtenir. L1 élaboration d'une - prot'éiae; par assimilation micro biologique de méthanol et d'ammoniac fait intervenir deux mécanismes d'assimilation de l'ammoniac reconnus esquissés ci-dessous. (a) Assimilation directe (glutamate déshydrogénase) HO2C(CH2)2CO.CO2H + NH3 + NAD(P)H a-c étoglutarate glutamate Cette réaction est catalysée par la glutamate déshydrogénase (GDH) et consomme 1 mole de RAD(P)E correspondant à 3 moles d'ATP par mole de glutamate produit. (b) Assimilation en deux stades (glutamine synthétase-glutamate synthétase) glutamate glutamine Cette réaction-. est catalysée par la glutamine synthétase (Gs). Cette réaction est catalysée par la glutamate synthétaste. Cette combinaison de réactions consomme 1 mole d'ATP au premier stade et l'équivalent de 3 moles au second pour la produit tion de 1 mole de glutamate. Aux fins de l'invention, les abréviations sont les suivantes RAD(P) co-facteur de la glutamate déshydrogénas e ou de la gluta mate synthétase sous sa forme oxydée; ITAD(P)H co-facteur de la -glutamate déshydrogénas e ou de la gluta mate synthétase sous sa forme réduite; adénosine triphosphate; ADP adénosine diphosphate AI)N acide désoxyribonucléique qui représente le matériel gé nétique des organismes concernés; iP icri phosphate. Le mécanisme exact de consommation de l'adénosine triphosphate est sans importance, mais la consommation d'ensemble plus élevée d'adénosine triphosphate dans le mécanisme en deux stades se traduit par la conversion d'une plus grande quantité de méthanol de départ en dioxyde de carbone que par le mécanisme en un stade. La Demanderesse a découvert par une étude soigneuse que le mécanisme en deux stades est prépondérent dans la production de protéine d'unicellulaires suivant les procédés proposés jusqu'à présent, malgré la présence d'abondantes quantités d'ammoniac libre et/ou d'ionsammonium dans le mélange de réaction et que le mécanisme direct plus économique est possible à la condition d'utiliser un micro-organisme génétiquement modifié. L'invention a pour objet un procédé de production de protéine d'unicellulaires par culture aérobie de micro-organismes contenant du matériel génétique spécifiant la fixation de 1' am- moniac par la voie de la glutamate déshydrogénase. Le matériel génétique est, par exemple, de l'acide désoxyribonucléique de plasmide ou d'hybride de plasmide ou bien de l'acide désoxyribonucléique de phage ou d'hybride de phage. Le procédé est exécuté dans un milieu de culture aqueux comprenant du méthanol comme source de carbone assimilable et de l'ammoniac et/ou des ions ammonium en concentration suffisante pour entretenir le mécanisme de réaction par la glutamate déshydrogénase, après quoi la protéine d'unicellulaires ou une composition en contenant est isolée du milieu de culture. Les.conditions d'application du procédé sont avantageusement telles que décrites dans les brevets anglais n 1.370.892 et 1.451.020 sauf que la concentration totale en ammoniac et ions ammonium est de préférence maintenue à plus de C,5 millimole/lie dans les zones de concentration maximale en méthanol. En raison de la diminution de la consommation d'adénosine triphosphate, la conversion d'ensemble du méthanol en dioxyde de carbone diminue et par conséquent le procédé est moins exothermique et exige un refroidissement moins poussé pour le maintien de la température dans l'intervalle préféré de 34 à 450C. Pour une économie optimale, le micro-organisme actif métabolise de façon prépondérente et par préférence exclusivement le méthanol par la voie de la glutamate déshydrogénase. L'invention a aussi pour objet ces micro-organismes cultivés en aérobiose qui appartiennent à une ou plusieure espè- ces capables de métaboliser le méthanol pour produire de la matière cellulaire protéique par le mécanisme de fixation de 11 ammoniac par la glutamate déshydrogénase en conséquence d'une modification génétique par des plasmides ou hybrides de plasmides ou par des phages ou hybrides de phages dont chacun apporte de l'acide désoxyribonucléique spécifiant la production de la glutamate déshydrogénas e. Les organismes de base dont dérivent les organismes modifiés sont notamment, en particulier, les suivants: MethyloPhilus methylotrophus (appelé aussi Pseudomonas methylotropha) dont les caractéristiques sont décrites dans le brevet anglais n 1.370.892 et dont des cultures de souches sont déposées comme précisé ci-après : NCIB : 10508 à 10515 et 10592 à 10596, tous inclusivement NRRL : : B5352 à B5364 inclusivement RI : 1215 à 1227 inclusivement Pseudomonas methvlonica dont les caractéristiques sont decrites dans le brevet anglais n 1.451.020 et dont des cultures sont déposes comme précisé ci-après : EBI : 2247 (nov. sp.) et 2248 (nov. (sp.). D'autres exemples d'organismes de base convenant aux fins de 11 invention sont notamment: Ps eudomonas methanolica brevet anglais n 1.352.728 ATCC 21704 Pseudomonas sp. brevet anglais n 1.326.582 ACG 21438 et 21439 Nethylomonas methanolica brevet anglais n 1.420.264 Methylomonas methanolica (suite) NRRL : B-5458 Pseudomonas outil ils brevet anglais n 1.444.072 FRI : 1690 et 1691 Ps eudomonas inaudita brevet anglais n 1.444.072 FRI : 1693 et 1694 Bes abréviations ont les signifleations suivantes: NCIB : National Collection of Industrial Bacteria, Lorry Research Station, Aberdeen, Ecosse; NRRL: Collection entretenue au département de l'agriculture des Etats-Unis d'Amérique, Peoria, Illinois; ATCC :American Type Culture Collection; FR1 : Fermentation Research Institue, Japon. L'invention a aussi pour objet un procédé pour obtenir les micro-organismes génétiquement modifiés par incorporation d'un ou plusieurs plasmides ou d'un ou plusieurs phages apportant le gène du mécanisme par glutamate déshydrogénase dans les espèces ci-dessus. Pour opérer la modification au moyen d'un plasmide, on applique un procédé suivant lequel:: (a) on produit à partir de l'organisme de base un mutant déficient en matériel génétique spécifiant la synthèse du glutamate par le mecanisme de la glutamate synthétase; (b) on prépare un hybride de plasmide consistant en acide désoxyribonucléique de plasmide uni par covalence à de l'acide désoxyribonucléique spécifiant la production de la glutamate déshydrogénase; (c) on introduit l'hybride de plasmide dans l'organisme de base déficient en glutamate synthétase; (d) on met l'organisme résultant en culture dans des conditions favorisant la croissance par le mécanisme de la glutamate déshydrogénase; (e) on sélectionne un ou plusieurs clones dtorganismes croissant par le mécanisme de la glutamate déshydrogénase. Lorsqu'on opère la modification au moyen d'un phage, on applique un procédé suivant lequel: (a) on produit (comme ci-dessus) à partir de ltorganis- me de base un mutant déficient en matériel génétique spécifiant la synthèse du glutamate par le mécanisme dé la glutamate synthé tase; (b) on identifie un acide désoxyribonucléique de phage ou un phage tempéré pour l'organisme de base; (c) on introduit dans ce phage ou acide désoxyribonucléique de phage un fragment d'acide désoxyribonucléique spécifiant la production de la glutamate déshydrogénas e pour obtenir un hybride de phage; (d) on lysogénise l'organisme de base déficient en glutamate synthétase au moyen de l'hybride de phage; (e) on cultive l'organisme résultant dans des conditions favorisant la croissance par le mécanisme de la glutamate déshydrogénase;; (f) on sélectionne un ou plusieurs clones d'organismes croissant par le mécanisme de la glutamate déshydrogénase. Des techniques générales appropriées permettant d'opérer ces modifications sont décrites dans la demande de brevet anglais n 34994/74 de la Demanderesse. Quelle que soit la voie choisie, l'invention a aussi pour objet, à titre de composition, chacun de ces produits à des stades intermédiaires. Le mutant peut être obtenu suivant les techniques habituelles, par exemple par traitement-au moyen d'un agent mutagène physique, comme le rayonnement gamma, le rayonnement X ou le rayonnement ultraviolet,ou d'un agent mutagène chimique, comme l'acide nitreux, un ester méthanesulfonique comme l'ester mé thylique ou éthylique), la 5-bromouridine, le 5-bromouracile, la 2-aminopurine ou la moutarde azotée,ou bien d'un agent mutagène biologique, comme un phage Un traitement visant à produire un mutant par délétion est préféré. Ce mutant restenormalement capable de la réaction par la glutamine synthétase et peut donc être sélectionne sur la base de son aptitude à eroître dans un milieu contenant du gXltamate,mais Izon de Pammomiac comme seule satire d'azote. Outre qu'il est déficient en glutamate synthetase, l'organisme de base mutant sélectionné pour la poursuite du traitement est de préférence un orFnisme auquel manquent aussi les gènes A et/ou E spécifiant la synthèse du tryptophane. I1 en est ainsi parce qu'une voie commode pour obtenir les plasmides ou phages spécifiant la synthèse de la glutamate déshydrogénase assure aussi la présence d'acide désoxyribonucléique spécifiant la synthèse du tryptophane, comme décrit ci-après. Les plasmides peuvent provenir d'une source quelconque à la condition d'être capables de transfert dans l'un des organismes de base Des sources appropriées sont notamment E. coli, Pseudomonas et Kiebsiella. Des plasmides du groupe d'incompatibilité tlptl conviennent parce qu'ils sont aisément transmissibles dans différentes bactéries gram-négatives qui pourraient être retenues comme organismes de base. Par exemple, le plasmide RP4 du groupe "P" de E. coli est transmissible. de la sorte et exprime sa propriét-é particulière (kta+) de résistance à la kanamycine, à la tétracycline et à l'ampicilline, quel que soit l'organisme dans lequel il est transféré. L'hybride de plasmide peut entre obtenu directement à partir de nombreux plasmides,notamment ceux éventuellement contenus dans l'organisme de base. Néanmoins, en raison de l'éten- due des connaissances acquises dans sa manipulation, le plasmide RP4 -de E. coli résistant aux antibiotiques constitue un point de départ favorable. Le premier stade consiste alors à préparer un dérivé du plasmide RP4 qui conserve l'aptitude à la réplication dans de nombreux organismes hôtes différents, mais sans les marqueurs conférant la résistance aux antibiotiques.La variante sans élimination initiale des marqueurs conférant la résistance aux antibiotiques est en principe possible, mais dangereuse du point de vue écologique pour une application sur une grande échelle. Ltopération peut être effectuée par "brouillage" de l'information génétique sur le plasmide RP4 au cours d'un traitement au moyen d'une endonucléase de classe ii, ctest-à-dire du type qui engendre de nombreux fragments d'acide désoxyribonucléique avec des coupures échelonnées et donc des "extrémités collantes", puis par réunion des fragments au hasard. Une endonucléase appropriée est celle appelée E Co R1. La réunion des fragments est effectuée par voie enzymatique, avantageusement au moyen de ligase. Suivant une forme d'application préférée de ce procédé général, le brouillage de l'information génétique du plas mide,indépendamsent du fait que celui-ci comprend ou non des marqueurs conférant la résistance aux antibiotiques,est exécuté en présence d'un fragment d'acide désoxyribonucléique supplémentaire contenant un marqueur génétique, comme des gènes spécifiant la synthèse du tryptophane. Ces gènes peuvent être préparés aisément comme décrit ci-après par excision à partir d'un génome de phage trans ducteur approprié au moyen de lvendonucléase E Co R1.Les gènes E, C et D spécifiant la synthèse du tryptophane de E.coli sont des cibles pour les enzymes restrictives Hind III qui peuvent donc être utiliséespour l'insertion ultérieure des fragments d'acide désoxyribonucléique hétérologues sans destruction du marqueur sélectif, du fait que les gènes A et E tombent en dehors des cibles Hind III et que leur fonction peut être sélectionnée aisément. Les fragments de plasmide sont alors mis à incuber avec de la ligase qui rétablit des liaisons covalentes dans l'acide désoxyribonucléique en double hélice et produit certains plasmides comprenant les gènes spécifiant la synthèse du tryptophane, mais exempts de résistance aux antibiotiques. Les plasmides contenant les gènes spécifiant la synthèse du tryptophane sont à utiliser spécialement avec des organismes de base contenant une mutation déficiente en de tels gènes, comme décrit ci-dessus. Lors de chaque opération de brouillage au moyen de l'endonucîéase E Co R1, les conditions doivent être telles que l'activité E Co Ri* soit conférée à l'enzyme, c'est å dire que l'activité se manifeste à un pH élevé et à une faible concentration en ions magnésium. Dans ces conditions, la séquence de base: dans la double hélice de Itacide désoxyribonucléique est reconnue et clivée avec formation des mêmes extrémités collantes que l'enzyme produit lors de la rupture en: dans les conditions normales. La séquence de reconnaissance plus courte de E Co R1* signifie que des fragments beaucoup plus nombreux d'un acide désoxyribonucléique en double hélice quelconque sont susceptibles dtêtre clivés. Gi-dessus,les symboles ont les significations suivantes: A = adénine C = cytosine G = guanine T = thymine Pour le procédé avec phage et au cas où un phage est utilisé directement, il doit être du type (notamment les mutants) qui comprend l'organisme de base dans son spectre natu rel d'hôtes.Lors de l'utilisation de l'acide désoxyribonucléi- que de phage, celui-ci peut être extrait d'un phage naturel ou d'un phage qui ne comprend pas normalement l'organisme de base dans son spectre naturel d'hôtes Dans l'un ou l'autre procédé, lorsque le gène spécifiant la synthèse de la glutamate déshydrogénase a été introduit dans le mutant deficient en glutamate synthétase de l'organisme de base au cours de l'opération (c) du procédé par plasmide ou de l'opéra- tion (d) du procédé par phage, la présence de l'organisme utilisant la glutamate 'déshydrogénase est mise en évidence par-son aptitude à consommer l'ammoniac comme unique source d'azote Dans les tableaux ci-après: le tableau I expose la façon la plus simple pour obtenir ltorga- nisme modifié par la voie des plasmides; le tableau II expose une forme préférée de la voie du tableau I; le tableau III expose une modification préférée de la voie du tableau Il; le tableau IVexpose trois formes du procédé par phage. Les tableaux sont explicites. I1 convient cependant de préciser à propos du tableau III que les fragments B d'acide désoxyribonucléique,du fait qu'ils ont été obtenus à partir d'un organisme complet,ne contiennent les gènes G1)H+ requis qu'en faible concentration et que par conséquent la probabilité que ces gènes stunissent à des plasmides P (kta', trp+ A-E) n'est pas élevée.Si' toutefois les fragments B d'acide désoxyribonucléique sont unis à des fragments C d'acide désoxyribonucléique provenant d'un phage X ou d'un plasmide, la combinaison d'acide désoxyribonucléique résultante peut être cultivée dans un E. coli déficient en glutamate déshydrogénase, puis en être séparée et le produit est formé par des gènes GDH+ en concentration relativement élevée en présence uniquement de l'acide désoxyribonucléique contenu dans le phage ou le plasmide où il se trouve en quantité plus faible que dans un organisme complet. La probabilité d'union avec des plasmides P (kta , trp+ A-E) est donc utilement augmentée. Les matériels-de départ mentionnés auxtableaux appelent les précisions ci-après: phage ok transducteur de trp : ce phage bien caractérisé est disponible sous des formes contenant les gènes A-E de l'opérontrp; acide désoxyribonucléique spécifiant le synthèse de la glutamate déshydrogénase: cet acide désoxyribonucléique est identifié par production d'un hotte utilisant de la glutamate déshydrogénase, par séparation de l'acide désoxyribonucléique de cet hote, par rupture de l'acide désoxyribonucléique au moyen d'une enzyme restrictive, comme Hind III et par liaison avec des fragments d'un acide désoxyribonucléique vecteur qui ont été obtenus à l'aide de la meme enzyme restrictive.L'acide désoxyribonucléSque après la liaison est transfecté dans un hôte déficient en glutamate déshydrogénase, l'hOte transfecté est mis en culture dans des conditions dans lesquelles la voie par la glutamate déshydrogénase doit agir, puis l'acide désoxyribonucléique hybride vecteur est isolé de lxhote. Une enzyme particulière mentionnée dans les tableaux n'est indiquée qu'à titre d'exemple. T A B L E A U I Organisme Organisme organisme GUSde GUS+ mutation de GUS- transfeo- GDH+ base GDH- base GDH- tion E. coli isolement plasmides du Hind III fragments groupe F A d'ADN P (GDH+) Organisme ADN fragments ligase GDH + GDH+ Hind III B d'ADN T A B L E A U II Organisme Organisme GUS- transfection Organisme GUSde GUS+ mutation de GDH- modifié GDH+ base GDH- 2 fois base trp A- E- trp+ E. coli isolement RP4 (kta+) E Co R1 * fragments C ktarésistant d'ADN ligase P trp+ A - E phage &gamma;transducteur fragments de trp E Co R1 * trp A - E Hind III kta E. coli (GDH+) ADN (GDH+) fragments D D P trp+ A et E Hind III d'ADN ligase GDH+ T A B L E A U III fragments A d'ADN fragements B ou D d'ADN ou P(kta-, trp+ A-E); ou trp A & E unique phage (GDH+) ment ligase plasmide (GDH+) Hind III phage &gamma; ADN fragments F d'ADN ou plasmide Hind III hybride de phage (GDH+) E. coli (GDH-) transfection, oroissance, hybride de plasmide (GDH+) # ADG isolement puri fié T A B L E A U IV Organisme de GUB+ Organisme Organisme GUSbase GDH- mutation de GUS- lysogénisation modifié GDH+ base GDH Phage tempéré Hind III fragments addition de hybride GDH+) (naturel) ADN GDH+ de ligase phage ADN fragments addition de ADN GDH+ ADN (GDH+) Hind III ligase phage (non naturel) REVENDICATIONS 1.- Procédé pour produire de la protéine d'unicellulaires, caractérisi en ce quton met en culture aérobie des micro-organismes contenant du matériel génétique spécifiant la fixation de l'ammoniac par la voie de la glutamate ddshydrogé- nase. 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le matériel génétique est de l'acide désoxyribonucléique de plasmide ou d'hybride de plasmide ou bien de l'acide désoxyribonucléique de phage ou d'hybride de phage. 3.- Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on l'exécute dans un milieu de culture aqueux comprenant.du méthanol comme source de carbone assimilable et de l'ammoniac et/ou des ions ammonium en concentratiùn suffisante pour entretenir le mécanisme de réaction par la glutamate déshydrogénase, après quoi on isole du milieu de culture la protéine d'unicellulaires ou une composition en contenant. 4.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les micro-organismes modifiés dérivent d'une ou plusieurs souches de l'espèce Methylophilur methylotrohus. 5.- Micro-organismes d'une ou plusieurs espèces mis en culture aérobie, caractérisés en ce qu'ils sont capables duti- liser le méthanol pour produire de la matière cellulaire protéique par le mécanisme de fixation de l'ammoniac par la glutamate déshydrogénase en conséquence d'une modification génétique par des plasmides ou hybrides de plasmides ou par des phages ou hybrides de phages dont chacun apporte de l'acide désoxyribonucléique spécifiant la production de la glutamate déshydrogénase. 6.- Micro-organismes suivant la revendication 5, caractérisés en ce qu'ils sont produits par la modification génétique d'une ou plusieurs souches de l'espèce Methylophilus methylotrophus. 7.- Procédé pour produire des micro-organismes généti quelent modifiés utilisés pour la mise en oeuvre du procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on incorpore à des micro-organismes de base un ou plusieurs plasmides apportant le gène du mécanisme par la glutamate déshydrogénase,-de la façon suivante (a) on produit à partir de l'organisme de base un mutant déficient en matériel génétique spécifiant la synthèse du glutamate par le mécanisme de la glutamate synthétase (b) on prépare un hybride de plasmide consistant en acide désoxyribonucléique de plasmide uni par covalence à de l'acide désoxyribonucléique spécifiant la production de la glutamate déshydrogénase ; (c) on introduit l'hybride de plasmide dans l'organisme de base déficient en glutamate synthétase ;; (d) on met l'organisme résultant en culture dans des conditions favorisant la croissance par le mécanisme de la glutamate déshydrogénas e ; (e) on sélectionne un ou plusieurs clones d'organismes croissant par le mécanisme de la glutamate déshydrogénase. 8.- Procédé pour produire des micro-organismes génétiquement modifiés utilisés pour la mise en oeuvre du procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on incorpore à des micro-organismes de base un ou plusieurs phages apportant le gène du mécanisme par la glutamate déshydrogénase, de la façon suivante (a) on produit à partir de l'organisme de base un mutant déficient en matériel génetique spécifiant la synthèse du glutamate par le mécanisme de la glutamate synthétase (b) on identifie un acide désoxyribonucléique de phage ou un phage tempéré pour l'organisme de base (c) on introduit dans ce phage ou acide désoxyribonucléique de phage un fragment d'acide désoxyribonucléique spécifiant la production de la glutamate déshydrogénase pour obtenir un hybride phage (d) on lysogénise l'organisme de base déficient en glutamate synthétase au moyen de l'hybride de phage (e) on cultive l'organisme résultant dans des conditions favorisant la croissance par le mécanisme de la glutamate déshydrogénase ; (f) on sélectionne un ou plusieurs clones d'organismes croissant par le mécanisme de la glutamate déshydrogénase. 9.- Procédé suivant la revendication 7 ou 8 caractérisé en ce que les micro-organismes de base mutants choisis pour la poursuite du traitement n'ont pas les gènes A et/ou E spécifiant la synthèse du tryptophane (trp). 10.- Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que le plasmide provient de E. coli, de Pseudomonas ou de Klebsiella. 11.- Procédé suivant la revendication 10, caractérise en ce que le plasmide est le plasmide RP4 provenant de E. coli résistant aux antibiotiques. 12.- Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce qu'on exécute la préparation de l'hybride de plasmide en présence d'un fragment d'acide désoxyribonucléique supplémentaire contenant un marqueur génétique.