FR 2398504 A1 19790223 FR 7723372 A 19770729 L'invention est relative à la production de virus de l'hépatite Â (complet ou incomplet) sur des systèmes cellulaires, ainsi qu'à le production d'antigènes réactifs spécifiques, d'immunsérums et de vaccins contre l'hépatite A. En 1967, Krugman et Gilles confirment l'existence de deux agents étiologiques distincts de l'hépatite virale. L'un dénommé MS1 est responsable de l'hépatite infectieuse A, l'autre MS2 est responsable de l'hépatite sérique B. En 1970, Bogg et ai., en injectant la souche NSI (sérum infectieux) à des volontaires de la Joliet Prison (U.S.A.), reproduisent l'hépatite de type A. Trois ans plus tard, feinstone et rl, mettent en évidence l'existence dune particale virale de 27 n dans des extraits de selles de prisonniers de la Joliet Prison. Une autre souche (dénommée CH326), décelée dans les selles d'un sujet de Costa Rica atteint d'hépatite épidémique et sérologiquement identique à la souche MS1, a été décrite par Nascoli et al. Il est possible de produire du virus d'hépatite A, in vivo, par inoculation expérimentale d'un milieu infecté à des primates : chimpauzés et marmousets. Le matériel viral peut, dans ce cas, âtre extrait à partir du foie, des selles, de la bile ou du plasma de ces animaux infectés. Mais une telle méthodologie de production du virus de l'hépatite À présente deux inconvénients majeurs t - d'une part, il est difficile d'isoler les particules du virus À de certains contaminants, comme, par exemple, des entérovirus dans le cas d'extraits de selles ou bien du virus GB dans le cas d'extraits de foie de marmousets, - d'autre part, l'approvisionnement de primates réceptifs en quantité suffisante pour une production industrielle se heurterait à de sérieux obstacles. L'objet de l'invention est un procédé complet permettant d'isoler le virus de l'hépatite A, de le concentrer et d'en assurer une large repro duction sur des systèmes cellulaires en vue de produire, après purification et éventuellement sélection du matériel viral ainsi obtenu, des antigènes réactifs utilisables dans le diagnostic sérologique de l'hépatite À, des immunsérums spécifiques à but diagnostique ou thérapeutique et des vaccins contre l'hépatite virale de type A. Le procédé qui fait l'objet de la présente invention est caractérisé en ce qu'il comprend une opération préalable dans laquelle du virus d'hé- patite À complet, c'est-à-dire possédant on matériel génétique, est extrait-de selles, de sang ou de ses dérivés provenant de sujets (hommes ou animaux) atteints d'hépatite A, ou encore du foie, de la bile ou n'impor te quel organe ou humeur d'animaux infectés expérimentalement, l'extraction du virus s1 effectuant par centrifugation, adsorption, chromatogra- phie- et ultracentrifugation, ladite extraction tant suivie, s'il y a lieu, d'une concentration pour atteindre un taux de population virale cor respon ant au seuil minimal pratique de replication du virus sur des cultures de cellules diploïdes, l'opération de replication comportant plusieurs passages sur cultures cellulaires du matériel viral ainsi produit, passages au cours desquels la vitesse apparente de développement du virus s'accélère pour aboutir L une production importante, industriellement exploitable, d'un virus d'hépatite A, constitué par un mélange de particules virales complètes et de capsides vides de matériel génétique, ces dernitres constituant un matériel de choix pour une vaccination, alors que les partielles virales complètes obtenues par ce procédé constituent de leur côté, entre autres, un produit d'ensemencement déjà adapté, capable d'assurer une production rapide et importante de matériel viral utile sur des cellules diploïdes, comme il est dit plus haut, cette mise on oeuvre directe d'une souche sélectionnée du virus complet et adapté d'hépatite A entrant naturellement dans le cadre de la présente invention. Dans le procédé qui fait l'objet de l'invention, l'extrait initial contenant le produit viral infectieux est constitué de préférence par un mélange de plusieurs extraits provenant de sujets différents, par exemple de 3 ou 4 sujets, cette diversité permettant d'obtenir une population virale plus sûrement capable d'adaptation ou de sélection, car tous les éléments viraux d'hépatite A, ne sont pas également capables de se reproduire, in vitro, sur cellules diploïdes. Selon l'invention, on utilise de préférence comme matériel de départ, soit des selles d'enfants atteints d'hépatite À, recueillies ds les premiers signes de la maladie (si possible avant la phase ictérique au début de l'élévation de la transaminémie), soit des foies de primates infectés expérimentalement. Sur les extraits obtenus, on vérifie l'absence d'autres virus pouvant se développer sur les systèmes cellulaires employés et notamment l'absence d'entéro-virus (ECHO virus, Polio virus, Coxsackie) au moyen de techniques classiques d'inoculation à des systèmes cellulaires sensibles, ainsi qu'à des souriceaux nouveaux-nés, et identification par séroneutralisation. Selon lrinvention, on utilise de préférence comme système de replication du virus de l'hépatite À des cultures diploïdes d'origine humaine ou animale dont le virus est extrait après lyse des cellules (spontanée ou prevoquée) par différentes étapes de concentration (ultrafiltration, relargage par le polyethylèneglycol) et purification par adsorption spécifi- que ou non, chromatographie et ultracentrifugation. L'antigène ainsi purifié peut servir soit comme antigène réactif utilisable pour un diagnostic sérologique (quelle que soit la méthode), soit, après atténuation ou inactivation du virus, pour la production de vaccin contre l'hépatite À on pour l'immunisation (homme ou animal) en vue de l'obtention d'immunsérums spécifiques utilisables à titre de médicament biologique (prévention et traitement de la maladie) ou de réactif. Les modes opératoires décrits ci-après, donnés à titres d'exemples indicatifs, permettent de mieux comprendre les caractéristiques de l'in vention, les particularités décrites faisant bien entendu partie de ltin- vention. La préparation du virus de l'hépatite A à partir d'un extrait de sel- les humaines, en vue de la production de virus sur des cellules diploïdes peut, selon l'intention, s'opérer de la façon suivante, Au cours d'une épidémie d'hépatite virale sévissant dans une collectivité, des échantillons de selles sont recueillis pendant la période d'é lévation de la transaminémie, avant ou as début de la phase ictérique. A partir d'un pool de 9 à 4 selles sélectionnées, on prépare une suspension à 10% dans de l'hydrolysat de lactalbumine à l'aide d'un broyeur.La majo rité des débris fécaux sont éliminés par deux centrifugations successives, l'une de 30 n à 3000 t/mn, l'autre de 15 mn à 10 000 t/mn dans une centri lugeuse Berk an L5-65 utilisant un rotor type 35 à angle fixe. Le strna- geant ainsi obtenu est mélangé volume à volume avec du trichlorétylène agit 10 mn puis centrifugé à basse vitesse (15 mn à 3000 t/mn). La phase aqueuse constitue l'extrait de selles; Un contrôle de vérification de ce milieu peut être fait par immunomicroscopie-électronique (IME) pour déterminer la présence du virus de l'hépatite À et estimer sa concentration. Dans ce but, on mélange Q,5 ml de l'extrait de selles à 0,5 ml d'immunsé- rum anti-virus de l'hépatite A dilué au 1/10 (sérum d'un sujet atteint d'hépatite À prélevé à la phase de convalescence). Ce mélange est incubé à-37eC pendant une heure, puis déposé dans un tube de 13 ml d'un roter Beckman type 65 à angle fixe. Le tube est complété avec du tampon TRIS 0,01 M de pH 7,4, puis centrifugé pendant 90 mn à 23 000 t/mn. Le culot obtenu est repris sous un volume de 0,1 ml, puis déposé sur une grille de 400 mesh recouverte de carbone. Les particules virales sont colorées à l'acétate d'uranyle, puis observées à un grossissement de 70 000.On ob- serre ainsi des agrégats de 2 à 10 particules de 27 nm. Il s'agit pour la majorité d'entre elles de virions complets. Une concentration du matériel viral présent dans l'extrait de selles est obtenue on ajoutant à la suspension virale du polyethylèneglycol 6 000 à la concentration finale de 10%. Après 18 heures d'agitation à 4 C, le dépôt est recueilli après une centrifngation de 10 n à 3 000 t/ne Le culot obtenu est repris dans du tampon TRIS 0,01 M - pH 7,4, sous 1/10 du volume initial de l'extrait de selles. La préparation du virus de l'hépatite A, à partir d'un foie de prima- te (chimpanzé ou marmouset) infecté expérimentalement peut, selon l'inven tion, s'opérer de la façon suivante. Le matériel de départ est constitué par le foie prélevé lors de l'é- lévation de la transaminémie sur un chimpanzé ou un marmouset, inoculé expérimentalement avec un milieu infecté de l'hépatite A. On réalise une suspension tissulaire à 10% dans un tampon physiologique (PBS ou liquide de Hanks). Après action des ultrasons, la suspension est centrifugée sic- cessivement à basse vitesse (15 mn à 3 000 t/mn) puis 15 mn à 10 000 t/mn. Le surnageant ainsi obtenu constitue le matériel infectieux. Une concentration en virus de cette suspension virale, avant sen application sur des cultures de cellules diploïdes, n'est pas nécessaire car le seuil minimal pratique de replication di virus sur des cellules diploïdes se trouve ainsi généralement atteint. Le culture du virus de l'hépatite A, sur des cellules diploïdes humaines, peut, selon l'invention, s'opérer de la façon suivante. Une culture monocellulaire de cellules diploïdes humaines, par exemple du type WI 38, en milieu hydrolysat de lactalbumine à 10% de sérum de poulain agée de 3 jours est inoculée avec 0,25 ml de l'extrait de selles, ou de ioie, préparé à une concentration virale suffisante, comme indiqué plus haut. Au cours des premiers passages dits d'adaptation, on observe un effet cytopathogène discret vers le 10-12ème jour, caractérisé par la présence de rares amas de cellules arrendies et réfringentes. Après cette adaptation du viras à une réplication in vitro, l'effet cytopathogène s'observe dans des délais de plus en plus courts.Dès le 6e passage, ou observe après 18-24 heures de nombreux foyers infectieux avec destruction complète du tapis cellulaire en 48-72 heures. Après coloration (au May- Grunvald Giemsa), on observe,à l'intérieur des cellules infectées, un neyau pycnotique, plissé, refoulé le plus souvent contre la membrane cytoplasmique. Le cytoplasme contient dans certaines cellules une énorme inclusion d'aspect non homogène qui parfois semble constituée par l'assem- blage de corpuscules de tailles différentes. L'observation au microscope électronique de coupes cellulaires révèle la présence de particules virales de 27 nm dans le cytoplasme. Le titre des suspensions virales obtenues au cours de l'adaptation croit avec le nombre des passages et peut atteindre 106 à 108 UFP/ml. Le virus se multipliant sur les cellules diploïdes (WI 38) est identifiable au virus de l'hépatite A par ses caractéristiques ultrastructurales et antigéniques. Il s'agit d'un virus de 27 nanomètres, de symétrie cubique,se présentant, soit sous l'aspect de particules pleines, soit sous forme de capsides vides de matériel génétique. Ce virus est identique du point de vue morphologique au virus de l'hépatite À détecté dans les selles de sujets atteints d'hépatite épidémique et au virus présente dans le foie de primates infectés expérimentalement. Cette identité du virus peut être confirmée par immuno-microscopie électronique. En effet, ces virus sont agrégés, soit par un immunsérum de chimpanzé, convalescent d'une inoculation expérimentale avec la souche virale MSl (positif au 1/8 000 en immunocytoadhérence), soit par le sérum prélevé à la phase de convalescence d'un sujet ayant présenté une hépatite de type À (positif au 1/64 000 en immunocytoadhérence). REVENDICATIONS i.) Procédé complet permettant d'isoler, de concentrer et de produire en abondance le virus de lthépatite A, ledit procédé caractérisé par une opération préalable dans laquelle du virus d'hépatite À complet, c'est-à-dire possédant son matériel génétique, est extrait de selles, de sang ou de ses dérivés, provenant de sujets (hommes ou animaux) atteints d'hépatite A, ou encore du foie, de la bile ou de n'importe quel organe ou humeur d'animaux infectés expérimentalement, ltestrac- tion du virus s'effectuant par centrifugation, adsorption, chromato graphie et ultracentrifugation, ladite extraction étant suivie, s'il y a lieu, d'une concentration pour atteindre un taux de population vi rale correspondant au seuil minimal pratique de replication du virus sur des ewltures diploldes, l'opération de replication comportant plusieurs passages, sur des cultures cellulaires, dn matériel viral ainsi produit, passages- au cours desquels la vitesse apparente de dé veloppement du virus n'accélère pour aboutir à une production impor tante, industriellement exploitable, d'un virus d'hépatite A, consti tué par un mélange de particules virales complètes et de capsides vi des de matériel génétique, ces dernières constituant un matériel de choix pour une vaceination, alors que les particules virales complè tes obtenues par ce procédé constituent, entre autres, un produit d'ensemencement déjà adapté, capable d'assurer une nouvelle produc tion rapide et importante de matériel viral utile sur des cellules di ploides, comme il est dit plus haut, cette mise en oeuvre directe sur cellules diploldes d'une souche sélectionnée du virus complet et adap té d'hépatite À entrant naturellement dans le cadre de la présente invention. 20) Procédé suivant revendication i, mais dans lequel on utilise comme ma tériel de départ n'importe quel produit pathologique, soit naturel (eau ou coquillages par exemple), soit du matériel viral pris à un stade plus ou moins avancé de préparation selon le procédé complet de la revendication 1. 3 ) Procédé suivant revendication 1 ou 2, dans lequel le système cellulai re de culture est constitué de cellules diploldes d'origine humaine ou animale et, en particulier, de cellules connues sons la désigna tion de WI 38. 48) Procédé suivant revendication 1 ou 2 dans lequel le matériel viral utile obtenu sur culture cellulaire diplolde est séparé par ultracen trifugation en produit à forte prépondérence de particules virales complètes, on produit à forte prépondérence de capsides vides de matériel génétique et de capserbres. 5 ) Procédé suivant revendication 1 ou 2, dans lequel le matériel viral obtenu dans les extraits infectieux est débarrassé, à l'aide d'un sol vant comme du trichloréthylène ou à l'aide d'un détergent ou encore à l'aide d'enzymes, de certains constituants adsorbés à la surface vi rale, afin d'obtenir une replication sur cultures cellulaires, 6 ) Procédé suivant revendications i à 3, dans lequel le virus cultivé sur cellules diploïdes peut être adapté à d'autres systèmes cellulaires. 7 ) Procédé suivant revendications 1 à 4, dans lequel le virus de l'hépa tite A extrait de ces cultures cellulaires est employé à la prépara tion d'antigène réactif, en particulier pour le diagnostic sérologique de l'hépatite A. 8.) Procédé suivant revendications i à i, dans lequel l'antigène purifié obtenu est employé à l'immunisation de l'homme ou des animaux en vue de la préparation de gammaglobulines spécifiques. 9 ) Procédé suivant revendications 1 à 4, dans lequel le virus extrait des cultures cellulaires est employé à la préparation de vaccins contre l'hépatite virale de type A. 100) Procédé suivant revendication 9, dans lequel ledit vaecin est obtenu inactivation du virus. 11 ) Procédé suivant revendication 9, dans lequel ledit vaccin peut être vivant, le virus étant atténué par des procédés biologiques on physi cochimiques connus. 12 ) Procédé suivant revendication 9, dans lequel ledit vaccin peut être à base de capsides vides de matériel génétique et aussi de capsomères.