FR 2388047 A1 19781117 FR 7811347 A 19780418 Les procédés connus de production d'hydrolysats de protéines, décrits dans les brevets japonais n 24 748 et no 10 543, ainsi que dans le brevet URSS 350 452, conduisent à des produits très hétérogènes quï, s'ils ne sont pas suppléés, doivent être caractérisés, du point de vue biologique, comme étant des préparations atix possibilités d'utilisation limitées, à cause de leur composition qualitative et quantitative nettement incomplète, tant du point de vue du contenu en aminoacides, que du contenu en substances d'un poids moléculaire élevé ou en minéraux.Cela est principalement dû aux conditions énergiques selon lesquelles steffectue le processus de décomposition hydrolytique des protéines, ce qui place ces hydrolysats en dehors du groupe des préparations pouvant être administrées par voie parentérale et donc remplissant les conditions requises pour une préparation alimentaire et un succédané du sang.Le brevet URSS n 350 452 décrit un procédé de production d'un hydrolysat protéique, selon lequel la viande broyée, constituant la matière première protéique, est submergée par un volume et demi d'eau, après quoi on procède à 11 extraction, pendant 2 heures, dans un autoclave, à la température de 393 E. Le mélange obtenu est filtré sur un entonnoir~filtrant, et le bouillon recueilli est refroidi, dégraissé et évaporé sous vide à la température de 303-313 E, de façon à obtenir 30% de masse sèche. Le résidu est traité avec de la NaOR 0,1 N, le tout étant mélangé pendant 1 heure.On filtre ensuite la solution alcaline de protéines, on sépare les matières grasses, et le résidu est traité avec 1 kg- de charbon activé et 30 litread'acide chlorhydrique concentré ayant un poids spécifique de 1,19. On mène l'hydrolyse pendant 6 heures à la température de 3730K, après quoi on évapore le surplus d'eau à la température de 333 K pendant 4 heures, jusqu'à ce que le volume du fluide atteigne 120 1, après quoi l'hydrolyse est poursuivie pendant 4 heures sous une pression augmentée jusqu'à 2 atmosphères Le tout est filtré sur un entonnor filtrant, puis lthydrolysat subit une séparation sur une colonne remplie avec un échangeur d'ions EflE-jOF,- en amenant la valeur du pH à 4,5.Pour clarifier l'hydrolysat, on ajoute du charbon activé A et on filtre le mélange sur un entonnoir filtrant. La neutralisation de lthydro- lysat est accomplie avec du bicarbonate de soude et une solution alcaline de protéines. Un hydrolysat ainsi préparé est évaporé sous vide à la température de 333 K, de façon à obtenir 25% de masse sèche, après quoi on mélange avec le bouillon obtenu auparavant et on déshydrate dans un sécheur atomiseur, à la température de 3630g - 368 K, de façon à obtenir 95% de masse sèche. Le procédé selon l'invention élimine les inconvénients des procédés de dégradation de protéines utilisés jusqu'à présent. Il consiste en une dégradation enzymatique contrôlée des protéines. La matière première, sous forme de protéines animales, avantageusement, sous formes d'isolés et de concentrés de protéines contenant entre 10% et 90% de substance sèche, de préférence entre 10% et 40%, est soumise à l'action d'enzymes protéolytiques, tels que la pepsine, la trypsine, la papaïne, à une concentration de 0,596- 4% (en solution) ou sous la forme de complexes formés au moyen de liaisons covalentes avec des porteurs insolubles (Cebra J.J., Givol D., Silman H.I., Katchalski E., J. Biol. Chem. 1961, 236, 1720), pour les séparer plus facilement de l'hydrolysat.Le tout est chauffé, de préférence à la température de 308 K - 321 K, en mélangeant continuellement et en contrôlant que le pH soit égal à une saleur optimale pour l'action de l'enzyme ou des enzymes utilisés. Les mélanges dont le pH est alcalin sont conservés avec 1% - 9,' de chloroforme et/ou de toluène.L'hydrolyse est interrompue, lorsque l'on obtient, dans l'hydrolysat, de préférence entre 15 et 100 mg/ml d'azote total et/ou, de préférence, de 4 à 6 types de peptides aux poids moléculaires augmentant entre 1500 et 50.000, présents dans les quantités moyennes suivantes I - 5% + 2%, II - 6* + 3%, III - 17% + 4%, Iv - 16% + 3%, v 30 -+ 7%, VI - 24% + 7%, et un contenu en aminoacides libres de préférence entre 0,5% et 4%. l'hydrolysat subit ensuite une congélation répétée, selon le contenu en protéines, de préférence à une température entre 2650K et 249 K, après quoi le pH est amené à la valeur neutre de pH=7 avec de la NaOR ou du HCl, selon le pH initial. Le chloroforme et/ou le toluène est évaporé sous vide à la température de 313 C, le tout est centrifugé et/ou filtré sur des entonnoirs de filtration, et filtré ensuite sur des filtres bactérologiques s'il est destiné à être utilisé comme succédané du sang non immunogène, et/ou l'hydrolysat obtenu est soumis à un processus de déshydratation contrtlée, selon des procédés connus, par exemple, dans un sécheur atomiseur, de préférence jusqu'à ce que l'on obtienne entre 90% et 99,5% de substance sèche, si la préparation obtenue est destinée à être utilisée sous forme de préparation protéique, non immunogène, biologiquement active, pouvant compléter le bilan de la demande journalière de lthomme en protéines d'origine animale, indépendamment de la voie d'administration. La préparation a un goat salé, n'a ni odeur ni couleur, est du type de la "diète des cosmonautes",- est absorbée sans résidus dans le tube digestif; elle a en outre la propriété d'agir comme émulsifiant et/ou d'agent spumogène naturel. Les procédés de production de préparations protéiques non immunogènes, biologiquement actives, sont illustrées dans les exemples ci-dessous. Exemple I. A 50 g de protéines isolées du corps des poissons et/ou d'organismes marins, contenant 30% de protéines dans la masse sèche, on ajoute 250 ml d'une solution acide de pepsine à 0,5%, le pH égal à 2 étant obtenu avec une solution 1N de HCl. Le mélange est maintenu à la température contante de 311 0K en mélangeant continuellement et en maintenant la valeur du pH égale à 2. Le processus hydrolytique est interrompu lorsque le contenu en aminoacides libres dans la solution atteint 1% et/ou contient 5 types de peptides dont les poids moléculaires varient entre 1500 et 50.000, présents dans les quantités moyennes suivantes : I - 11% + 5%, Il - 17% + 5%, III - t65S + 3%, IV - 30% + 7%, V - 24% + 7%, et 42 mg d'azote total dans 1 ml de solution. Après avoir terminé le processus de dégradation enzymatique de l'isolé de protéines, la préparation est congelée deux fois à la température de 263 K, après quoi elle est dé congelée dans le but de précipiter les protéines de l'enzyme, lesquelles sont éliminées par centrifugation à 10.000 tours/minute et/ou par filtration sur un entonnoir de filtration. L'hydrolysat est neutralisé avec une solution IN de NaOH, jusqu'à pH 7, et il est filtré sur des filtres bactériologiques, pour entre utilisé comme succédané du sang. Exemple II. A 50 g de protéines d'origine animale, isolée des poissons et/ou d'organismes marins, contenant 21,5% de protéines dans la masse sèche, on ajoute 250-ml d'une solution acide de pepsine à 1%, le pH égal à 2 étant obtenu avec une solution 1 N de HCl Le mélange est maintenu à la température de 313 K, en mélangeant sans cesse jusqu'à ce que l'on obtienne une teneur en azote total de l'ordre de 50 mg/ml, 1,5 g d'aminoacides libres et/ou 6 types de peptides dont les poids moléculaires varient entre 1500 et 50.000, présents dans les quantités moyennes suivantes I - 5% + 2%, II - 6% + 3%, III - 17% + 3,', IV - 16% + 3%, V - 30% + 3,', VI - 24% + 3%, après quoi le processus hydrolytique est interrompu. Le tout est neutralisé jusqu'au pH=7 avec une solution 1N de NaOR et deux fois congelé à la température de 252 K, avec décongélation successive, après quoi les protéines précipitées sont éliminées par filtration sur entonnoir de filtration, l'hydrolysat étant ensuite déshydrate dans un séchoir sous vide, à la température de 3130K jusqu'à ce que l'on obtienne 99% de masse sèche. la préparation alimentaire d'une haute valeur biologique est ensuite emballée dans des emballages étanches. Exemple III. A 50 g de protéines d'origine animale, isolées du corps des poissons et/ou d'organismes marins, contenant 25% de protéines dans la masse sèche, on ajoute 200 ml d'une solution aqueuse de trypsine à 1% et à pH-8,2, après quoi le mélange est additionné de 9 ml ae toluène pur et 1 ml de chloroforme pur. L'hydrolyse est menée à la température de 313 K en mélangeant sans cesse et en maintenant la valeur du pli de la solution à un niveau constant de pH=8,2. Le processus hydrolytique est interrompu lorsque le contenu en azote total atteint une valeur de l'ordre de 40 mg/ml, le mélange contenant en outre 1,5% d'aminoacides libres et/ou 5 peptides.Après avoir terminé 1'hydrolyse, on évapore le toluène et le chloroforme dans un séchoir sous vide à la température de 3530K et le produit obtenu est neutralisé jusqu'au pH=7 avec une solution 1N de ROI, après quoi ce produit est filtré sur un entonnoir et, ensuite, sur des filtres bactériologiques. L'hydrolysat est déshydraté dans un séchoir sous vide à la température de 313 K, Jusqu'd ce que l'on obtienne 99% de masse sèche ; il est ensuite emballé dans des emballages étanches. Exemple IV. A 60 ml d'hydrolysat peptinique, obtenu selon l'exemple II, après la neutralisation avec une solution 1N de NaOH, on ajoute 30 ml d'une solution aqueuse de trypsine, après quoi on ajoute 5 ml de toluène pur. Le pH du mélange est amené à 8,2, et le tout est maintenu à la température de 318 K en mélangeant sans cesse et en maintenant la valeur constante du pH jusqu'à ce que l'on obtienne 64 mg/ml d'azote total et 45; d'aminoacides libres. Le mélange est congelé deux fois à la température de 261 K, et neutralisé jusqu'à pH=7 avec une solution 1N de HCl.Après avoir évaporé le toluène dans un séchoir à vide à la température de 313 K, l'hydrolysat est neutralisé jusqutà pH=7 et filtré, d'abord sur un entonnoir, ensuite sur des filtres bactériologiques, enfin évaporé dans un séchoir atomiseur, à la température de 363 K, jusqu'à ce que l'on obtienne 99% de masse sèche. Exemple V. A 100 g de concentré de protéines de poissons contenant 40 de masse sèche, on ajoute 400 ml d'eau distillée et 16 g de trypsine liée à de la OM cellulose (carboxyméthylcellulose). L'enzyme, sous forme insoluble, est préparé en suspendant de la trypsine pure dans une suspension homogénéisée de CX cellulose dans un tampon phosphaté à pH=7,5, dans une proportion cellulose: trypsine égale à 2:1-. La solution est remuée pendant 8 heures à la température de 277 K, après quoi elle subit 10 centrifugations successives avec un eXcès de tampon phosphaté. La dernière centrifugation est accomplie dans une solution aqueuse de NaCl à 0,9%. L'enzyme insoluble ainsi obtenu est lyophilisé. Le mélange, auquel on a ajouté l'enzyme insoluble, est amené à pH=8,2, 2 > avec une solution IN de NaOH et, en mélangeant sans cesse, on mène lthydrolyse à la température de 313 K jusqu'à ce que l'on obtienne 100 mg/ml d'azote total. L'hydrolysat est filtré sur un entonnoir, après avoir amené le pli d 7 ; il subit ensuite un processus de ddshydratation contrôlée dans un séchoir atomiseur, à la température de 369 K, jusqu'à ce que l'on obtienne 99% de masse sèche, après quoi il est emballé. Exemple VI.- 20,4 g d'hydrolysat pepsinique liquide, obtenus comme dans l'exemple I, sont traités dans un mélangeur au régime de 8000 tours/minute. On obtient une écume persistante, dont l'indice de durabilité selon Love eêt égal à 0,15 et la spumosité est égale à 1,28. Exemple VII. 10,1 g d'hydrolysat déshydraté, obtenus comme dans l'exemple V, contenant 99% de masse sèche, sont traités dans un mélangeur au régime de 6000 tours/minute. On obtient une écume persistante, dont l'indice de durabilité selon Love est égal à 0,18 et la spumosité est égale à 1,45. Exemple VIII. L'hydrolysat sous forme déshydratée et/ou native dans une solution physiologique de chlorure de sodium, a été administré par voie intrapéritonéale à des souris de race 13alb/C dans les quantités suivantes : 0,5 ml/2,85 mg d'azote total, 1,5 ml/8,55 mg d'azote total et 2,0 ml/I 1,4 mg d'azote total. Aux animaux du groupe de contrôle, on a administré 2 ml de solution physiologique de chlorure de sodium. Au bout d'une observation de 48 h, on a constaté que la préparation n'est pas toxique si la dose ne dépasse pas 0,57 g/kg du poids du corps. Après avoir répété l'expérience, en administrant des doses supérieures, on a constaté que la préparation n'est pas toxique même si elle a été administrée à une dose égale à 900 mg/kg de poids du corps.Le pouvoir fébrigène de lthydrolysat a été déterminé selon le codex medicamentarius polonais du mois de Mars 1954, page 751, sur des lapins de race mixte, de 3 kg de poids, Dans aucun cas, l'élévation de la température après 3 heures d'observation à partir du moment de l'administration de l'hydrolysat, n'a dépassé 0,500. Exemple IX. Les expériences sur le caractère immunogène des hydrolysats ont été effectuées sur deux groupes d'animaux, chacun de 20 individus, en pratiquant deux tests, chacun répété deux fois. 1. L'intradermo-réaction comme expression de lthyperergie tardive. L'expérience a été effectuée sur des cobayes. Le groupe de contrôle comprenait des animaux sensibilisés avec de l'albumine bovine. Ces animaux ont été sensibilisés avec une technique immunologique typique, en utilisant l'adjuvant complet de Freund (0,1 ml de l'hydrolysat contrôlé + 0,1 ml de l'adjuvant. Au bout de 14 jours, on a administré par voie intracutanée, 0,1 ml d'hydrolysat, après avoir rasé la peau de l'animal. sur le dos). 2. Le choc anaphylactique comme expression de l'hyperergie précoce. Les animaux ont été sensibilisés deux fois avec l'antigène dissous dans du NaOl au 0,85%. Le choc a été provoqué par une administration intracardiaque de l'antigène. Le groupe de contrôle était constitué par des animaux sensibilisés avec de l'albumine bovine, administrée deux fois dans un intervalle de deux jours, à une dose de 2 mg d'albumine à chaque fois. Le choc a été provoqué par une administration intracardiaque de 4 mg d'albumine bovine. Les doses de l1hydrolysat étaient identiques L'expérience a été répétée en administrant, aux animaux, 50 mg de sérum et d'hydrolysat comme dose de choc.Le choc anaphylactique était déterminé en mesurant le pli du sang, la pression partielle du C02 (pC02)-, la pression partielle de l'02 (P02) en utilisant le Mikroastrup BC-1 Radiometer, Copenhagen. Toutes ces expériences ont démontré que les hydrolysats obtenus sont privés de propriétés immunogènes, qu'ils ne donnent pas l'intradermo-réaction et ne provoquent pas de chocs anaphylactiques chez les animaux de laboratoire. Aucun des animaux immunisés n'est mort, tandis que dans le groupe de contrôle, immunisé avec l'albumine, le choc s1 est manifesté dans 100% des cas. Exemple X. Cet exemple concerne-des examens hématométriques et volumétriques des poumons, effectués après avoir administré l'hydrolysat à des lapins sains et à des lapins subissant un choc post-hémorragique. Les expériences ont été effectuées sur des lapins de race mixte, des deux sexes, d'un poids entre 3 et 4 kg. Xes-animaus ont été nourris selon une diète standard. Après avoir effectué une analgésie par imbibition avec une solution de lidocaine à 1%, on a effectué des artériotomies et des phlébotomies et l'on a introduit des sondes en polyéthylène dans la veine jugulaire externe droite, pour mesurer la tension veineuse, dans la veine fémorale gauche pour effectuer la saignée et dans l'artère fémorale droite pour mesurer la tension artérielle. On a également effectué "une trachéotomie pour pouvoir faire des mesures volumétriques des poumons. On a mesuré, avec un volumètre de Wright, l'air respiratoire (TV), le débit ventilatoire minute (MV) et la fréquence respiratoire (f). On a également introduit un cathéter dans la vessie pour déterminer la diurèse horaire.Un électrocardiographe Simplicard a été connecté aux membres par des électrodes à aiguilles. La bande se déplaçait à une vitesse de 50 mm/sec. Le choc post-hémorragique était provoqué par une saignée d'un volume de sang corréspondant au 30% du volume total du sang circulatoire du lapin, c'est-à-dire 110 ml environ pendant 30 minutes. L'hydrolysat a été administré dans la veine fémorale par une perfusion goutte-à-gowtte, à raison de 50-40 gouttes par minute. Les mesures ont été effectuées avant l'administration de l'hydrolysat et pendant son administration. Les résultats des examens figurent dans le tableau 1. (voir page 10) Comme cela résulte desdonnées du tableau 1, lthydrolysat examiné porte à une normalisation de la tension sanguine, une normalisation du fonctionnement du coeur et une normalisation des données volumétriques dans une période précoce du choc posthémorragique chez les animaux contrôlés. L'hydrolysat déshydraté, contenant 9$ de masse sèche, a été marqué avec du chrome radioactif 51Cr, produit par l'Institut des Recherches Nucléaires à Ssierk. L'hydrolysat marqué a été administré à des rats de race Wistar, dans une dose de 10 mg, ce qui correspondait à 9.106 CPX/5 minutes. L'absorption de l'hydrolysat et ses transformations dans le corps de l'animal ont été examinées au cours d'une période de 24 heures, 5 jours, 11 jours et 45 jours après l'administration. La radioactivité a été mesurée dans le sang, le plasma, les globules, le coeur, les reins, le foie, la rate et l'urine (après l'avoir recueillie pendant 24 heures).L'activité était déterminée dans un compteur à scintillations SCEO-Electronics. Les résultats des mesures sont exprimés en nombre d'impulsions / 1 ml de l'échantillon / 100 sec., ce nombre étant ensuite utilisé pour calculer l'entre activité d'un organe ou, dans le cas des muscles et des tissus, pour 5 g de tissu. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 1. Comme cela a été montré sur la figure 1, l'hydrolysat, après avoir été administré par voie buccale aux rats, est absorbé par les divers organes, où il est lentement transformé, ce qui constitue une preuve de sa valeur biologique. Pendant les premières 24 heures, 23% du marquage est expulsé avec l'urine, tandis que pendant le 11ème nycthèmère, les 45% du marquage sont retenus par le foie des rats. Dans les autres organes, on trouve une très légère radioactivité quiy reste pendant 45 jours, ce qui prouve que l'hydrolysat obtenu est transformé plutôt lentement dans l'organisme. En se basant sur les résultats des expdriegoes et sur les propriétés biologiques des hydrolysats obtenus par le procédé selon l'invention, on peut constater, que les hydrolysats obtenus - ne sont pas immunogènes pendant une administration intraveineuse prolongée ches les animaux de laboratoire - ne sont pas toxiques et peuvent être administrés pendant longtemps par voie intraveineuse aux animaux de laboratoire ; - ne provoquent pas de choc anaphylactique chez le cobaye ; - sont incorporés dans les organes et les tissus, exercent une action favorable pendant le choc post-hémorragique expérimental et l'anémie post-hémorragique. T a b l e a u 1 Type Valeurs Choc post- 30min Valeurs après l'achèvement d'exa- de hémorragique après Hydrolysat en ml de l'administration men contrô- saignée le le 20 50 100 125 150 200 15 30 45 1 15% 30% choc min min min heure Tens. 100 60 30 30 50 60 75 80 90 90 100 95 95 100 arter. tens. vein. +2 +4 +4 +4 +5 +3 +3 +4 +4 +3 +3 +4 +4 +4 Pouls 253 260 213 187 200 200 205 177 173 170 177 180 180 173 MV 2852 3024 3240 3380 3264 3174 3384 3010 2860 3055 2494 3055 2520 2728 TV 46 56 54 52 48 46 47 43 45 44 47 43 42 44 f 62 54 60 65 68 69 72 70 68 65 65 58 60 62 ECG : Durant le développement du choc post-hémorragique, on observe des anomalies du rythme du type arythmique avec les caractéristiques de l'iechémie du muscle caridaque. Pendant l'administratration de l'hydrolysat, on observe une normalisation de l'ECG avec régression des signes de l'ischémie du muscle cardiaque. REVENDICATIONS 1 - Procédé de production de préparations enzymatiques, non immunogènes, biologiquement actives, à partir de protéines non solubles, caractérisé en ce qu'il comprend les étopes suivantes : de proféines &alpha;) les proféines, notamment les isolés et les concentrés/d'origine animale, contenant entre 10 % et 90 % de substance sèche, sont soumises à l'action d'enzymes protéolytiques à une concentration entre 0,1 % et 10 %, en solution et/ou sous la -forme de complexes formés au moyen de liaisons covalentes, obtenues par des procédés connus, avec des porteurs insolubles, b) le mélange est maintenu à une température, de préférence, entre 3080 K et 3210 K en mélangeant sans cesse, en maintenant le pH au niveau optimum pour l'action de l'enzyme et/ou des enzymes, en conservant les mélanges dont le pH est alcalin, avec du chloroforme ou du toluène, à une concentration entre I % et 9 %, c) I'hydrolyse est interrompue, lorsque l'on obtient, dans l'hydrolysat, de préférence entre 15 et 100 mg/ml d'azote total et/ou, de préférence, de 4 à 6 types de peptides aux poids moléculaires augmentant entre 1500 et50 000, présents dans les quantités moyenne suivantes : 1 - 5 % + 2 %, II - 6 % + 3 %, 111 - 17 % + 4 %, IV - 16 % + 3 %, V - 30 % + 7 %, VI - 24 % + 7 %, et un contenu amino-acides libres, de préférence entre 0,5 % et 4 %, d) I'hydrolysat subit une congélation répétée, de préférence à une température entre 2650 K et 2490 K, suivie dlune décongélation, e) le pH est ramené à la valeur neutre de pH = 7 avec de la NaOH ou du HCI selon le pH initial et, f) le chloroforme et/ou le toluène sont évaporés dans un séchoir à vide à la température de 313 o K. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les protéines soumises à l'étape a) contiennent entre 10 % et 40 % de substance sèche. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que, dans l'étape a), les protéines sont soumises à l'action d'enzymes protéolytiques à une concentration entre 0,5 % et 4 %. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 appliqué à la préparation d'un succédané du sang non immunogène caractérisé en ce que le produit issu de l'étoupe f) est centrifugé et/ou filtré sur des entonnoirs et ensuite sur des filtres bactériologiques. 5 - Procédé sel on l'une quelconque des revendications 1 à 3 appliqué à l'ob- tention d'une préparation destinée à etre utilisée sous forme de préparation protéique, non-immunogène, biologiquement active, pouvant compléter le bilan de la demande journalière de lthomme adulte en protéines d'origines animale, indépendamment de la voie d'administration, caractérisé en ce que l'hydrolysat obtenu est soumis à un processus de déshydratation jusqu'à ce que l'on obtienne entre 85 % et 99,5 % de substance sèche par des procédés connus, par exemple dans un sécheur atomiseur. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'hydrolysof obtenu est soumis à une déshydratation jusqu'à ce que llon obtienne entre 90 et 99,5 % de substance sèche.