FR 2388585 A1 19781124 FR 7712518 A 19770426 La présente invention concerne un procédé perfectionné pour la séparation et la purification de protéines ou d'unités morphologiquement organisées de masses -moléculaires très diverses, par la méthode chromatographique d'exclusion, en phase liquide, combinée ou non aux procédés de purification déjà connus. Elle s'applique en particulier à la séparation ou/et purification de virus à partir du milieu de culture de ces derniers,- ou à partir du milieu déjà concentré et partiellement purifié. L'invention concerne tout particulièrement un procédé de séparation et purification des virus de la grippe. L'invention concerne également l'appareillage nécessaire à la réalisation industrielle du procédé. Malgré le succès rencontré par les méthodes chromatographiques, en analyse et dans l'extraction de différentes substances, ces méthodes n'ont pas pu jusqu'à présent s'appliquer utilement au traitement industriel de protéines de basses et très hautes masses moléculaires ; c'est notamment le cas des virus. L'utilisation desméthodes de chromatographie d'exclusion pour la purification et la séparation des macromolécules solubles ou organisées en unités morphologiques plus ou moins complexes telles que micelles lipidiques, fractions organisées de corps bacatériens, virus, est déjà décrite dans divers documents de la litz té rature. C'est ainsi qu'une amélioration de la pureté des protéines, en particulier de virus a été obtenue par l'application de la chro matographie d'exclusion sur gels souples notamment sur des billes d'agar (Bengtsson et Philipson Biochim. Biophys. Acta 79 (399) 1964) : cependant, ces s#upports, manquant de résistance mécanique se prêtent mal à une exploitation économique et industrielle où de forts débits, correspondant à des pressions relativement élevées, doivent être appliqués à la colonne chromatographique. D'autre part ces gels ne supportent pas la stérilisation par la chaleur, ce qui limite leur emploi pour la séparation de produits qui doivent être conservés stériles. Il est également connu que l'on peut utiliser en chromatographie d'exclusion ou dlaffinité,des supports rigides, tels que billes de verre connus commercialement sous le nom'controlled pore glass (C.p.G.)". Ces gels présentent l'avantage d'une résistance mécanique élevée, pouvant supporter des pressions élevées ; ils ont également l'avantage de pouvoir etre stérilisés avant utilisa tion.Ces supports présentent toutefois l'inconvenient d'une adsorption importante de protéines ; cet inconvénient a pu être atténué par un prétraitement du support avec des réactifs bloquant les sites actifs adsorbants du support ; ainsi est-il connu de traiter les supports par du polyethylène-glycol t cependant ce traitement ne conduit pas à des résultats stables et les sites actifs réapparaissent peu à peu au cours du traitement. Il est à noter également que, dans l'art antérieur (Analytical Biochemistry 58, 30-38, 1974) des protéines n'ont pu être séparées par la chromatographie d'exclusion en phase liquide, sur du gel de silice poreux, que sous des fortes pressions de l'ordre de dizaines de bars. D'autre part, cette technique s'ap- pliquait seulement à des protéines de masses moléculaires de 250#00b 800.000 et à des fins analytiques seulement. Le problème restait entier, lorsqu'il s'agissait de séparer avec des débits industriels, sous des pressions voisines de l'atmosphérique, des protéines de très hautes masses moléculaires, notamment au-dessus du million, comme c'est particulièrement le cas pour les virus de la grippe, dont la moyenne des masses moléculaires est supérieure à quelques millions. Ce problème est résolu par la présente invention qui permet de séparer efficacement des protéines de très hautes masses molaires de l'ordre de plusieurs millions, aussi bien que celles dont les masses vont d'environ 101000 à 1.000 000. On connait d'autre part divers procédés de séparation et de purification de virus. Parmi ces procédés certains comportent une séparation par densité sur appareil d'ultracentrifugation en continu, les virus étant piégés dans un gradient continu de saccharose ; d'autres consistent en une adsorption spécifique (sur erythrocytes, ou sur complexe insoluble de polymère et de sels bivalents) suivie d'une désorption, ou bien en une adsorption sur des sels insolubles (phosphate de calcium, sulfate de baryum) ou en une simple précipitation (par sulfate d'ammonium, polyethylèneglycol par exemple et solvants organiques). Ces procédés combinés entre eux et qui sont à l'heure actuelle des procédés industriels conduisent encore à des produits insuffisamment purifiés ; ce qui peut nécessiter ultérieurement des traitements chimiques par solvants qui dénaturent les protéines et solubilisent les lipides. En outre leurs rendements ne sont pas optimum. La présente invention apporte un perfectionnement à la séparation et à la purification de protéines, d'unités morphologiquement organisées tels que virus dans un grand éventail de masses mo léculaires, par l'application de la chromatographie d'exclusion pratiquée d'une façon nouvelle qui remédie aux inconvénients de l'art antérieur, ou par l'application de la combinaison des moyens industriels déjà connus et de la chromat#ographie d'exclusion selon l'invention. Le procédé suivant l'invention permet des opérations à l'échelle industrielle, conduisant avec des rendements voisins de 100 % à des protéines, des unités morphologiquement organisées, des virus, d'une très grande pureté, extraits des milieux qui les contiennent. Le nouveau procédé et ses variantes donne en particulier d'excellents résultats dans la séparation et la purification des virus de la grippe multipliés spécialement sur oeufs embryonnés ou sur substrats cellulaires multipliés in vitro. Le procédé suivant l'invention consiste à séparar une protéine et/ou des unités morphologiquement organisées du milieu qui les contiennent au moyen d'une colonne chromatographique d'exclusion, dont le support est un gel rigide de silice dont le diamètre poreux moyen est de 5 à 200 nm, la surface spécifique étant respectivement de 500 à 20 m2/g, le support étant en grains de 40 à 200 microns. Après passage du milieu renfermant la protéine ou l'unité morphologiquement organisée à séparer, à travers ce support, le produit est élué par de l'eau à PH tamponné entre 5,5 et 7,5, à une température comprise entre 0- et 300C et de préférence entre 4 et 200C, à une pression correspondant à la perte de charge de la colonne. Le PH préféré de l'éluant a une valeur proche de 7, pratiquement 6,5 à 7,5. La pression est en général de 1 à 2 bars. La nature du tampon doit, bien entendu, être compatible avec celle des protéines, des unités morphologiquement organisées, des virus à traiter, afin d'éviter des précipitations ou altérations de ceux-ci. Les tampons à base de phosphates alcalins, connus en soi, conviennent bien à cet effet. D'autre part, il est avantageux que l'eau d'élution renferme-également un électrolyte fort, qui peut être du chlorure de sodium, à la concentration de 0,1 à 0,2M. Les gels de silice, convenant à la réalisation du procédé suivant l'invention, se trouvent dans le commerce, sous la dénomination de Sphérosil. On peut utiliser tout autre gel de même qualité. Lorsque les conditions opératoires sus-indiquées sont res pectées, il devient possible d'utiliser des colonnes de diamètres intérieurs allant de 8 à 200 mu, susceptibles de débits de l'ordre de 3 à 30 1/h correspondant à des productions biologiques industrielles. La hauteur de la colonne dépend de la nature des produits à séparer et à purifieBdes caractéristiques du support et de la courbe chromatographique du système donné ; elle peut, par exemple, être de 0,5 à 2 mètres. Une description de l'appareillage qui fait également partie de l'invention est donnée ci-dessous. L'invention peut être avantageusement réalisée à l'aide de plusieurs colonnes disposées en séries et -chargées éventuellement de supports sus-indiqués aux caractéristiques différentes ; cela permet de séparer les unes des autres différentes protéines, unites morphologiquement organisées, virus ou/et# parachever la purification d'un produit donné. Comme dans les procédés connus, il est recommandable de traiter au préalable le support suivant l'invention par un réactif susceptible de bloquer les sites adsorbants de la silice ; de tels réactifs sont des composés aliphatiques hydrosolubles, porteurs d'hydroxyles. Ainsi peut-on employer des polyéthylène-glycol, polypropylène-glycol, polybutylène-glycol, alcool polyvinylique, polyvinylpyrrolidone, copolymère (polyéthylène-polypropylène-. polyéthylène) glycol, etc. Il est préférable que la masse moléculaire du réactif soit de l'ordre de 5 000 à 30 000. Le blocage des sites adsorbants du support est obtenu par passage d'une solution aqueuse du réactif choisi, par exemple du polyéthylène-glycol, de poids moléculaire 20 000, assez dilue, par exemple à 0,5 à 5g par litre, à travers la charge de la colonne le volume de cette solution doit être égal à plusieurs fois celui de la charge ; un ordre de grandeur de 10 fois ce volume est approprié. Cependant cette passivation était très insuffisante, une partie des protéines ou produits à séparer restant fixés sur le support.Les demanderesses ont découvert et ce point fait partie de l'invention, qu'une excellente passivation était obtenue en complément de la passivation déjà connue par un ou plusieurs passages d'une solution aqueuse de protéines de poids moléculaire in férieur à celui des protéines, unités morphologiquement organisées, virus à traiter. Dans le cas de la séparation et purification des virus de la grippe, d'excellents résultats étaient obtenus par un ou plusieurs passages de liquide allantoïque prélevé sur des oeufs embryonnés non infectés par le virus grippal. Dans ces conditions, la colonne de gel de silice a perdu tout son pouvoir de fixation des virus.Elle est stable, elle peut fonctionner pendant des mois avec l'gluant tamponné, indiqué plus haut, pour extraire des pro téines, des unités morphologiquement organisées, des virus, sans que ceux-ci subissent une adsorption par la silice. Le procédé et appareil suivant l'invention permettent d'obtenir des produits protéiniques très purs a partir de milieux aqueuxet, en particulier, des virus à partir de milieu de culture de ces microorganismes. Toutefois, étant donné le mécanisme de la chromatographie d'exclusion, qui comporte- l'élution avec des volumes plus ou moins grands de liquide, la concentration de la pro téine cherchée, dans la solution purifiée obtenue, n'est généralement pas très forte. Quand I'utilisation-envisagée n'exige pas une solution très concentrée, le produit obtenu; comme décrit cidessus, convient parfaitement ; mais, si des concentrations plus élevées sont nécessaires, elles peuvent être atteintes par une variante de la présente invention. La variante de la présente invention consiste en la combinaison de la chromatographie d'exclusion en phase liquide avec des moyens de purification faisant appel à des principes de séparation différents, par exemple moyens de separation par précipitation, adsorption, ouXet ultracentrifugation.Cette variante peut être pratiquée de deux manières différentes : la protéine, l'unité morphologiquement organisée, le virus recherchés sont d'abord concentrés et/ou purifies par une des méthodes ci-dessus#connues, de façon à former une solution concentrée et/ou semi-purifiée du produit recherché qui est ensuite extrait purifié par la chromatographie décrite p#lus haut ; ou bien le milieu initial est soumis à la chromatographie d'exclusion en vue de la séparation des produits recherches à l'état de bonne pureté, et Ra solution ainsi obtenue est ensuite concentrée, et le produit recherché extrait purifié par une des méthodes sus-indiquées. Ainsi, dans le cas de la séparation du virus de la grippe à partir de solutions allantoiques, la p#remière opération peut être la concentration du virus par adsorption-désorption sur héma ties ; adsorption sur le phosphate de calcium, puis relarguage par complexation du calcium ;précipitation par des sels tels que BaSO4 ou (NH4)2SO4 ou bien par du polyéthylène-glycol, ou autre poiy (oxy-alcène), ultracentrifugation zonale en gradient de densite ; adsorption sur verre poreux ou gel de silice suivie d'une désorption par élévation du PH, ultrafiltration sur membranes ou fibres creuses,#ou bien la séparation du virus est d'abord réalisée par la chromatographie d'exclusion suivant l'invention, après quoi la solution de ce virus est soumise à la concentration par une de ces méthodes, ou par lyophilisation. Un procédé remarquable pour la combinaison avec la chromatographie consiste en l'adsorption semi-spécifique par addition dans le liquide contenant le virus purifié ou non, d'un polyalky lène-glycol ou poly toxy-alcène)-en particulier du polyéthylèneglycol et d'un sel bivalent spécialement le chlorure de calcium Le complexe insoluble polymere-Ca++ qui dans son insolubilisation a entraîné les virus, est redissous dans une solution aqueuse d'acide éthylène diaminotétra-acétiqueou de ses sels alcalins (particulièrement sel de sodium) ou de tout autre agent décomplexant le calcium. La solution concentrée ainsi obtenue est alors soumise à la chromatographie d'exclusion décrite plus haut. Cette dernière fournit ainsi une solution à la fois concentrée et très pure. Bien que le principe de cette méthode soit connu en soi (Ph. Adamowicz, B. Legrand, J. Guerche et P. Prunet ; Bull. off. int. Epiz 1974, 81, (11-12) , 1125, 1150) sa combinaison avec la purification chromatographique suivant l'invention comporte une adaptation, sans laquelle les résultats ne seraient pas satisfaisants. En effet, selon la méthode connue, le polyéthylène-glycol utilisé à la complexation conjointement avec un sel de métal bivalent, doit avoir une masse moléculaire d'au moins 100 000, pouvant aller à 300 000 ; or, suivant la présente invention, des polymères de masses moléculaires nettement plus faibles doivent être appliqués car avec 100 ooo ou plus le fonctionnement de la chromatographie peut être perturbé par la viscosité élevée et conduire à des préparations moins pures, le polymère étant moins bien séparé des virus. Conformément à l'invention, le polymère d'oxyde d'alkylène utilisé doit avoir un degré de polymérisation limité à environ 80 à 1 400, ce que -dans le cas du polyéthylène-glycol- correspond à des masses moléculaires d'environ 5 000 à 85 000 ; des masses pré férées sont de 6 000 à 30 000 et plus particulièrement 10 000 à 25 0.00. Des résultats équivalents ont également été obtenus en utilisant les polymères cités précédemment. Le nouveau procédé et ses variantes donnent d'excellents résultats dans la préparation de solutions concentrées en virus pur de la grippe. Généralement les virus de la grippe destinés à la préparation des vaccins sont multipliés dans la cavité allantolque des oeufs de poule embryonnés. Lors de la récolte, les liquides allantoiques, déjà chargés de diverses protéines et sels peuvent être contaminés avec les phospholipides prélevés accidentellement par altération de la membrane vitelline. C'est de ce milieu de culture que seront extraits les virus de la grippe, purs. Les virus de la grippe sont caractérisés par leur propriété d'agglutiner les hématies de poule, ce qui permet une détermination quantitative rapide exprimable en unités internationales hémagglutinaites. Les dispositifs servant à la chromatographie d'exclusion pour la préparation de diverses substances sont connus, mais à des fins analytiques seulement, les colonnes ayant un diamètre inté- rieur de 8 mm environ. Aucun matériel automatique de chromatographie d'exclusion de grande capacité n'existe actuellement Le dispositif pour la réalisation industrielle suivant l'invention est représenté par la figure 4 : une pompe (2) pousse en permanence dans la colonne (5) le solvant d'élution contenu dans le réservoir (1).La solution à fractionner contenue dans le réservoir (4) est injectée dans la colonne (5) à intervalles de temps réguliers par un systeme automatique (3-) constitué d'électrovannes et d'une boucle d'echantillonage de 500 ml (par exemple). La colonne (5) est en acier inoxydable de grande capacité (par exemple 10 cm de diamètre et 120 cm de hauteur) ; elle est entourée d'une double enveloppe (10) en acier inoxydable égalemen# pouvant suporter des pressions de stérilisation par la vapeur, et raccordée également à une circulation réfrigérante (+4bC par exemple). Le gel de silice est disposé dans la colonne (5).Des produits issus de la chromatographie peuvent être 'récoltés par fractions sélectionnées et le contrôle de l'effluent de la colonne est effectué'à l'aide d'un détecteur ultra-violet (6) dont la réponse est transmise à une enregistreur (8). Les différents produits élués sont recueillis dans un-collecteur de fractions (7) constitué par une vanne automatique tnvoies (20 voies par exenple) soit par un ensemble d'électrovannes. Les différentes opérations, injections et collectes, sont effectuées automatiquement à l'aide d'un programmateur du commerce. Cet appareil peut fonctionner en en continu 24 heures sur 24. A titre d'exemple, indiquons qu'il est possible de traiter avec l'appareillage décrit 450 à 500 ml de liquide par heure, soit une quantité de 10,8 à 12 litres par jour, pour obtenir un produit parfaitement purifié. Dans le cas de la purification du virus -de la grippe il est possible de traiter 12 litres de liquide allantoi- que/j. Qn voit ainsi l'intérêt que présente la variante précédemment décrite et qui consiste à traiter sur la colonne un liquide préalablement concentré et partiellement purifié. Etant donné qu'il est possible de concentrer le liquide allantoique 40 fois, la quantité de liquide allantoique provenant des oeufs qui peut être traitée est de 400 - 480 1, ce qui correspond à la production fournie par 60.000 oeufs environ. Les exemples qui suivent illustrent non limitativement la présente invention. EXEMPLE 1 Préparation de la colonne La colonne décrite précédemment a un diamètre intérieur de 10 cm et une hauteur de 120 cm. Elle est chargée avec de la poudre de gel de silice en particules de 100 à 200 microns, dont le diamètre poreux moyen est de 60 nm et la surface spécifique 50m2/g, le volume poreux de la charge est de 1 cm3/g. Le gel de silice utilisé est le "SPHEROSIL XOB 030" (Rhône Poulenc). Après stérilisation par la vapeur, le gel placé dans la colonne, est préalablement traité "passive") par une solution aqueuse de polyéthylène glycol de masse molaire 20 000, à 1 % pen -dant 24 h de façon à bloquer ses sites adsorbants. La colonne reçoit ensuite une charge de 500 ml de liquide allantoique non chargé de virus grippal. Ce double traitement de passivation est suivi d'un lavage avec une solution aqueuse, tampon, de phosphate monopotassique et disodique stérile, de PH 7,5 renfermant du NaCl à la concentration 0,15 M. Une telle colonne est prête pour le traitement de solutions de produits à purifier. EXEMPLE 2 Séparation du virus de la grippe, souche A/X53, de son milieu de culture allantoique. La solution de virus traitée provient de la culture classique dans la cavité allantoique de l'oeuf de poule embryonné, après 10 à 12 jours d'incubation ; elle titre 1 200 unités HA (méthode d'hémato-agglutinantion) par 0,25 ml. 450 ml de cette solution étaient injectés dans la colonne, avec un débit de 150 ml/mn, soit en 3 minutes, et toutes les heures. Pendant ce temps, on faisait passer en permanence, à travers la colonne un débit de la solution tampon décrite plus haut. Ce débit étant de 9 1/h, tant que seul le virus apparaissait à la sortie de la colonne. A ce débit le virus commence à apparaître au bout de 30 minutes ; le débit était triplé, c'est-à-dire était de 27 1/h, lorsque l'éluat commençait à renfermer les impuretés du virus Cela permettait d'achever l'opération plus rapidementonotam- ment en 1 heure. La colonne étant équipée de dispositifs d'automation connus en soi, il était possible de la faire fonctionner sans interruption pendant tout le temps voulu. La détection des composants de l'éluat, à la sortie de la colonne, était effectuée au moyen d'un dispositif de détermination de la densité optique dans l'ultra-violet de longueur d'onde de 252 nm ; cet appareil étant bien connu dans l'art, il n'y a pas lieu de le décrire ici. La perte de charge dans la colonne étant assez faible, la circulation de la solution à travers la colonne n'exigeant qu'envi- ron 1 bar de surpression à l'entree de celle-ci. A partir des 450 ml de solution virale, traitée, on a obtenu, après chromatographie, 1 050 ml d'éluat renfermant du virus très pur, tandis que les impuretés se trouvaient dans le reste de la solution tampon passée par la colonne. Sur la figure 1, qui montre la courbe chromatographique de cette opération (densités optiques en ordonnées, volumes d'éluat en abscisses), on peut voir le pic V correspondant au virus et le pic I aux impuretés ; la discontinuité du pic I est due au changement du débit de 9 à 27 1/h. Lorsqu'on examine, dans une colonne chromatographique analytique de 0,8 cm de diamètre sur 120 cm de haut, garnie de la même silice que plus haut, un#échantîllon de 3 ml, prélevé dans les 1 050 ml de solution purifiée, on trouve un pic du virus seul, figure 2, les impuretés étant complètement absentes. On voit que la purification du virus a été remarquable. Le bilan de l'opération a été déterminé par la mesure de l'activité suivant la méthode d'hémato-agglutination (HA). Les 450 ml de solution allantoïque de départ titraient 1 200 unités HA/0,25 ml, tandis que ltactivite des 1 050 ml obtenus était de 480 unités HA/0,25 ml. On avait donc au départ un total de 2 160 000 unités HA, et on en a retrouvé 2 016 000 dans la solution purifiée. Le rendement était donc de (2 016 000 : 2 160 000) x 100 = 93,3 % ce qui peut être considéré comme très élevé, car les méthodes classiques donnent des résultats de beaucoup inférieurs. EXEMPLE 3 séparation du virus grippal par un double procédé d'adsorption - élution sur érythrocytes suivie d'une purification par chromatographie sur gel de silice. 50 litres de liquides allantoïques virulents provenant d'oeufs de poule embryonnés de 10 à 12 jours sont préalablement clarifiés selon l'art antérieur par centrifugation ce qui élimine les substances insolubles. Elle possède un titre exprimé en unités hémagglutinantes (méthode d'hémato-agglutination) de 1 200 unités HA dans 0,25 ml. On ajoute ensuite 4 % (V/V) d'un culot d'hématies de poule à cette suspension. Après un temps de contact de 8 à 16 heures à la température de +40C ou +370C, les érythrocytes sont séparées par centrifugation à 3 000 tours/minute, et le virus est éludé par un tampon phosphate sous un volume de 5 litres. L'élut a un titre hémagglutinant de 12 000 unités HA dans 0,25 mI. 450 ml de cette suspension virale sont automatiquement injectés dans la colonne, en 3 minutes à un débit de 150 ml/mn. Pendant ce temps, on fait passer en permanence, à travers la colonne un débit de la solution tampon décrite dans l'exemple 1. Ce débit est de 9 litres/heure tant que seul le virus apparait à la sortie de la colonne. Il est triplé (27 litres/heure) lorsque l'éluat ne renferme plus de virus mais des protéines contaminantes. Chaque opération dure 1 heure. Grâce à son dispositif d'automatisme la colonne fonctionne en continu jusqu'à épuisement des 5 litres de concentrat d'éluats. Les pics correspondant aux virus purifiés sont rassemblés et représentent un volume de 15 litres. Leur titre en unité hemagglutinante est 3 200 unités HA pour 0,25 ml, ce qui représente un rendement de l'ordre de 100 %. EXEMPLE 4 En partant de 10 litres d'une solution de liquide allantouque infecté par le virus grippal, similaire à celle de l'exemple 2, on procède en première étape à une concentration-purification sur complexe polymère calcium d'après les principes décrits dans l'invention. Pour cela on ajoute à cette solution aqueuse 2 % en poids de polyéthylène-glycol de masse moléculaire 20 000 ainsi que 12 g de CaC12 en poudre. Après mélange homogène pendant 30 minutes, le précipité est séparé par décantation suivie de centrifugation ; il est ensuite repris pour élution du virus, dans environ 500 ml d'une solution aqueuse à 0,2 M, du sel disodique de l'acide éthylène-diamino-téraacétique, réajusté à pH 7,5 par de la soude 6 N. La solution ainsi obtenue est centrifugée pour éliminer l'insoluble, et le liquide clair surnageanttsoit environ 500 ml est conserve. Le rendement de cette opération de concentration purification a été trouvé voisin de 65 % de pureté. Les 500 ml de cette solution concentrée sont chromatographies par exclusion dans une colonne de 10 cm de diamètre intérieur sur 120 cm de haut, garnie de la mème silice qu'à l'exemple 1. On utilise également la même solution tampon. Les 500 ml ont été injectés comme dans l'exemple 2. Le pic virus à été recueilli par élution dans 1 500 ml de solution ; cette solution titre 10 8000 UHA/0,25 ml ce qui correspond à un-rendement de purification voisin de 98 %. Ce procédé a permis d'obtenir une solution de virus à la fois concentrée et très pure. EXEMPLE 5 Du liquide allantoique infecté comme décrit ci-dessus est concentré par diafiltration sur des membranes ou fibres creuses ayant un point de coupure de 1.106. 50 litres sont ainsi ramenés à un volume de 5 litres ou moins. Après clarification, ce concentrat est directement injecté sur une colonne conforme au modèle décrit dans les exemples précédents, et selon le même procédé. Le pic viral contient la totalité des unités hémagglutinantes qui ont été déposées. Cette solution très purifiée du point de vue protéique peut encore être contaminé par des phospholipides du sac vitellin organisés en micelles. Ce contaminant peut être séparé d'après la densité par une opération d'ultra centrifugation sur gradient de saccharose. Toutes les impuretés ayant été éliminées par la chromatographie d'exclusion, les rendements de cette opération s'en trouvent très améliorés. EXEMPLE 6 500 litres de liquide allantolque infectieux comme décrit ci-dessus, sont purifiés par une première opération d'ultracentrifugation sur gradient de saccharose. Le pic viral récolté représente un volume de I litre. Le rendement de cette opération est compris entre 30 et 80 %. Le pic viral est déposé automatiquement sur une colonne de gel de silice, telle que celle décrite dans l'exemple 2, et en utilisant le même procédé. Le volume récolté est de 3 litres. Le rendement de l'opération de chromatographie est voisin de 100 % comme précédemment, et il peut étre vérifié que le pic viral issu de l'opération d'ultra-centrifugation zonale contient encore un important contaminant protéique. EXEMPLE 7 Les opérations réalisées selon cet exemple sont identiques à celles décrites dans les exemple 2, 3, 4, 5 et 6. Cependant, elles se différencient par le fait que la suspension virale soumise à l'opération de chromatographie d'exclusion est préalablement inactivée par le formol, ou la #-propiolactone ou les ultrauiolets et/ou#traitée par un solvant organique. EXEMPLE 8 La colonne chromatographique ainsi préparée selon l'exemple 1, est utilisée å la purification d'une solution aqueuse impure de catalase (extraite dans des opérations préliminaires, du foie de boeuf). Cette solution présente une activité de 220 Unités Internationales. L'éluant est tamponné à PH 7. On obtient unesolution à activité 180 U.I. soit un rendement de 86 % dans la fraction S1 du chromatogramme représenté par-la figure 3. r, Les conditions du débit d'éluant, de la quantité de liquide à traiter injectée dans la colonne, la fréquence de cette injection décrites dans les exemples ne sont pas limitatives ; elles peuvent varier dans d'assez larges limites ; la combinaison des conditions décrites dans les exemples précédents conduisent à la fois à un produit parfaitement purifié et à un rendement voisin de 100 %. REVENDICATIONS 1.- Procédé pour la séparation et la purification de pro téines, et/ou d'unités morphologiquement organisées (virus), de masses moléculaires très diverses par chromatographie d'exclusion en phase aqueuse, sur un support rigide de sili#ce, caractérisé en ce que ce support présente un diamètre poreux moyen de 5 à 200 nm, une surface spécifique de 500 a 20m2/g et est constitué par des grains de 40 à 200 microns, le liquide d'élution étant constitué par de l'eau tamponnée àpH 5,5 à 7,5 et de préférence de 6,5 à 7,5, et en ce que l'opération de chromatographie d'exclusion est combinée ou non avec des pro cédés connus de séparation utilisant des principes différents de celui de l'encombrement spatial. 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le tampon du PH est à base de phosphates et contient, de préférence, un électrolyte #fort, en particulier chlorure de sodium, à une concentration de l'ordre de 0,1 a 0,2M. 3.- Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la silice est préalablement traitée par un réactif susceptible de bloquer les sites adsorbants et, en particulier par un composé aliphatique portant un hydroxyle, notamment polyethylène-glycol, polypropylène-glycol, polybutylène-glycol, alcool polyvinylique, polyvinylpyrrolidone, copolymère (polyéthylène-polypropyléne polyéthylène) glycol. 4.- Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la passivation de la silice est complétée par la passage sur la colonne d'une solution de protéines de masses molécu laires inférieures à celles des produits à purifier. 5.- Procédé suivant une des revendications 1 à 4, caracté risé en ce que la protéine, le virus, l'unité morphologiquement organisée sont d'abord concentrés et purifiés par des moyens de précipitation, agglutination, adsorption-désorption ou/et centrifugation connus en soi, et la solution résultante est soumise à la chromatographie suivant les revendications 1 à 4. 6.- Procédé suivant une des revendications 1 à 4, caractérisé en que la solution de protéines ou de virus puri fiés obtenue est soumise à la concentration par une méthode connue en soi, comportant la précipitation, l'agglutination, l'adsorption ou/et la centrifugation. 7.- Application du procédé suivant l'une des revendications 1 à 6,caractérisée en ce qu'il concerne la séparation et purification du virus de la grippe de son milieu de culture, ce milieu étant le liquide allantoique infecté par le virus. 8.- Application du procédé suivant les revendications 3, 4 et 7,caractérisée en ce que le gel de silice est passivé par du polyéthylène-glycol et du liquide allantoique non infecté par le virus de la grippe. 9.- Application du procédé suivant l'une des revendications 1 à 7,caractérisée en ce que la séparation du virus de la grippe, avant l'opération de chromatographie, ou la concentra tion de la solution contenant le virus purifié, après l'opéra- tion de chromatographie comprend une opération d'adsorption spécifique sur érythrocytes. 10.- Application du procédé suivant l'une des revendications 1 à 7,caractérisée en ce que la séparation du virus de la grippe, avant I'opération de chromatographie ou la concentra tion de la solution contenant le virus purifié, après l1opé- ration de chromatographie comprend l'adsorption sur un com complexe insoluble formé entre un sel bivalent et un polyal kylène glycol définj dans la revendication 3, de degré de polymérisation de 80 à 1.400, suivie de la redissolution du complexe dans une solution aqueuse d'acide éthylène diamino tétracétique ou de ses sels alcalins, de préférence le sel de sodium ou de tout autre agent décomplexant le calcium. 11.- Application selon la revendication 10, caractérisée en ce que le polyalkylène glycol est le polyéthylène glycol de masse moléculaire 5 000 à 80 000 et, de préférence 6 000 à 30 000, le sel étant du chlorure de calcium. 12.- Application du procédé suivant l'une des revendications 1 à 7,caractérisée en ce que 11 opération de chromatographie d'exclusion est précédée ou suivie par une opération de cen trifugation sur gradient de saccharose. 13.- Application du procédé suivant l'une des revendications 1 à 7,caractérisée en ce que l'opération de chromatographie est précédée ou suivie d'une précipitation par le sulfate de baryum, ou d'ammonium, une adsorption-désorption sur gel de silice et verre. 14.- Application du procédé suivant l'une des revendications 1 à 6,caractériSéé en ce qu'il concerne la séparation et la purification de la catalase. 15.- Dispositif pour la réalisation industrielle du procédé suivant l'une des revendication 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend une colonne chromatographique remplie avec un gel de silice, de grande capacité, entourée d'une double enveloppe pouvant supporter des pressions de stérilisation par la vapeur, et raccordée à une circulation réfrigérante, une pompe qui pousse dans la colonne l'élut contenu dans un réservoir,# et, à intervalles réguliers la solution à purifier contenue dans un autre réservoir par un système automatique, un collecteur de fractions issues de la chromatographie, constitué par "n" voies. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce que la colonne et son enveloppe sont en acier inoxydable, la colonne a un diamètre intérieur de 10 cm et une hauteur de 120 cm. 17.- Dispositif selon les revendications 15 et 16, caracté risé en ce que le débit d'eluant, la quantité de liquide à traiter, injectée dans la colonne, la fréquence de cette injection varient entre de larges limites ; ces conditions sont de préférence : débit dteluant et de liquide à traiter 150 ml/mn, quantité de liquide à traiter : 450 à 500 ml/heure.