FR 2384845 A1 19781020 FR 7624243 A 19760805 L'invention concerne une nouvelle souche virale, un procédé d'obtention de cette souche à partir d'une souche virale de myxomatose spontanée et à titre d'applications de cette nouvelle souche, un vaccin pour la protection des lapins contre la myxomatose et un procédé de vaccination. On connsit b l'heure actuelle un vaccin con- tre le myxomatose dénommé vaccin fibromateux, qui contient un virus naturel, à savoir le virus du fibrome de Shope. Ce vaccin est inoffensif mais il présente le défaut de procurer une immunité qui n'est pas totalement satisfaisante sur le plan de la solidité et sur le plan de la durée ; on admet que ce vaccin 8p- porte une protection efficace de 70 % à 75 % environ des sujets inoculés, 25 à 30 Z étant atteints de la maladie et ce, mortellement pour une fraction importante de ce pourcentage. La présente invention se propose de pallier le défaut ci-dessus évoqué en fournissant un nouveau vaccin d'efficacité très notablement améliorée. A cet effet, un objectif de l'invention est de fournir une nouvelle souche virale de faible pouvoir pathogéne, pour la réalisation de ce vaccin. Un autre objectif est d'indiquer un procédé dé d'obtention de cette nouvelle souche. La nouvelle souche conforme à l'invention résulte d'une mutation d'une souche virale de myxomatose spon tanée et est du type de celle déposée le 21 juillet 1976 sous le numéro 1.028 auprès de la collection nationale de cultures de micro-organismes tenue par l'institut Pasteur. Cette souche virale possède les caractères marqueurs suivants s - elle se développe sur des cellules d'embryon de poulet à une température de 330C pour donner une culture totale de titre compris entre 10+5 et 10+7 doses cytopathogènes par millilitre , pour cellules rénales de lapin, - elle possède un faible pouvoir pathogène se manifestant chez le lapin par le simple développement au point d'inoculation d'une lésion locale de dimension inférieure à 3cm de diamètre, sans généralisation et avec régression et disparition au plus tard au cours de la 3e semaine, - e.lle possède un pouvoir immunisant efficace a-légsrd d'une épreuve virulente consistant en une inoculation de 1 000 à 10 000 doses minima infectantes d'une souche de virus myxomateux de virulence 1, pratiquée dans la 3ème semaine suivant la vaccination. Cette souche peut eAtre obtenue à par tir d'une souche virale de myxomatose spontanée par tassages successifs sur cellules rénales de lapin, clonage des populations obtenues et passages successifs sur cellules embryonnaires de poulet ; au cours de la succession des passages sur cellules embryonnaires de poulet, il est utile d'intercaler des clonages sur cellules rénales de lapin. Les passages sur cellules rénales de lapin et sur cellules embryonnaires de poulet sont effectués à basse tempérsture, en particulier comprise entre 300 et 350 C environ ; cette température est de préférence ajustée à 330 C. Le nombre de passages sur cellules rénales de lapin peut par exemple être compris entre 60 et 100, et le nombre de passages sur cellules embryonnaires de poulet entre 3 et 30. L'invention s'étend, à titre d'spplicas- tion de la nouvelle souche, à un vaccin contre la myxomatose, constitué par une culture de la souche virale sus-évoquée sur cellules de lapin ou sur cellules embryonnaires de poulet. La dose unitaire de vaccination contient, de préférence, entre 50 et 200 doses infectantes 50 ffi de la souche virale. La culture qui compose le vaccin, peut être conditionns sous forme lyophilisée, appelée à être rehydratée lors de l'utilisation. Un procédé de vaccination pour la protection des lapins consiste à inoculer par voie intradermique le vaccin ci-dessus décrit. Les exemples suivants sont destinés à illustrer la présente mention. Exemple 1 Cet exemple fournit les divers détails du processus par lequel la souche virale nO I. 028 déposée à l'institut Pasteur a été obtenue. L'origine de la souche se situe sur un lapin sauvage, tué dans la région toulousaine et apporté, pour diagnostic, à l'Ecole Vétérinaire en octobre 1973. L'identification de la myxomatose, affirmée à la seule vue des lésions caractéristiques a été confirmée par inoculation à 2 lapins domestiques, qui a provoqué le développement d'une myxomatose clessique à évolution lente : un lapin a survécu, l'autre est mort en 34 jours. Le virus a été isolé à partir du lapin mort, par culture sur membrane chorio allantow d'oeuf de poule embryonné ågé de 10 jours ; il a été ensuite cultivé sur celluies rénales de lapin (cellules de lignée R.L.) en couche monocellulaire obtenue sur milieu MEM de BEAGLE, supplémenté avec hydrolysat de lactalbumine, sérum de veau et antibiotiques habituels : dans ces conditions la réplication de la souche est perçue grâce à son effet cytopathogène (dégénérescence et lyse des cellules infectées) perceptible en 48 à 72 h. Ius passages en série sont réalisés dans les conditions suivantes - 5 passages à 370, - 2 passages à 350, - 79 passages à 330 Deux clonages sont effectués avec les virus des 36ème et 65ème passage à 330 : clonage sur cellules R.L. selon la technique des plages obtenues après inoculation du tapis cellulaire (à l'aide de diverses dilutions du surnageint après centrifugation de la culture virale préalablement broyée au POQUER), lavage et addition de milieu gélosé. Deux plages bien isolées sont successivement prélevées au quatrième jour de culture pour permettre la réalisation des trente-septième et soixante sixième passages. Le virus du 79ème passage a été inoculé sur une couche de cellules d'embryon de poulet (C.E.P.) de première explantation : (embryon de dix jours soumis à trypsination ; cellules récoltées et mises en culture sur milieu MEM de VAGIE supplémenté au hydrolysat de Lactalbumine, sérum de veau et antibiotiques habituels). Après 5 jours de culture à 330 , aucun effet cytopathogène n'est perceptible ; la multiplication virale est cependant décelée par immuno-fluorescence, fixation du complément et inoculation à des cellules R.L. Une seconde culture est effectuée dans les mêmes conditions et sert à cloner le virus sur cellules R.L. : 3 plages isolées sont repérées et prélevées pour oestre inoculées à des C.E.P. ; les trois clones ainsi obtenus sont inoculés à des lapins de façon à apprécier leur pouvoir pathogène respectif l'un d'eux est retenu et fait l'objet de passages ultérieurs sur C.E.P. et clonages sur R.L. : vingt-cinq passages à 330 C sur C.E.P. ont été ainsi effectués, entrecoupés de trois clonages des virus du sixième , dixième , et vingt quatrième passage. Le vingt cinquième passage représente la souche déposée à l'Institut Pasteur sous le n I. 028. Exemple 2 Cet exemple illustre l'obtention d'un vaccin par culture de la souche n I. 028 sur cellules rénales de lapin. La souche est inoculée sur des cellules de lignée R.L. (provenant de cellules rénales de lapin), cultivées en flacon de Roux en milieu M.E.M. de VAGIE supplémenté avec de la glutamine et 5 % de sérum foetal de veau et les antibiotiques habituels. Le culture est effectuée à 330 C pendant soixante douze à quatre vingt dix heures. Les flacons sont alors congelés en totalité. Après décongélation, milieux et cellules sont homogénéisés et répartis en quantité aliquotes. Par titrage, on détermine la dose mi nima infectante pour lapin et la dose cytopathogène pour cellule R.L. ; les titres obtenus par millilitre pour la culture totale sont compris entre 104 et 106 doses minima infectantes 50 ffi pour lapin et entre 105 et 107 doses cytopethogènes pour cellules R.L. En fonction, des titres mesurés, le vaccin est dilué en milieu protecteur pour lyophilisation, réparti en ampoules, congelé et lyophilise. Exemple 3 Cet exemple illustre l'obtention d'un vaccin par culture de la souche n I. 028 sur cellules embryonnaires de poulet. La souche est inoculée sur des cellules d'embryon de poulet de première explantation, cultivées en flacon de Roux en milieu M.E.M. de VAGIE supplémenté avec de l'hydrolysat de lactalbumine et 2 % de sérum de veau et les antibiotiques habituels. La culture est effectuée à 330 C pendant quatre vingt dix à cent vingt heures ; la suite des opérations est irl-i,tique à celle de l'exemple précédent ; les titres obtenus sont analogues. Exemple 4 Cet exemple démontre l'innocuité du vaccin conforme à l'invention. Dans une première phase, le vaccin préparé comme indiqué en l'exemple 2 a été injecté par voie intradermique à cent cinquante lapins de deux à quatre mois. Cette injection est suivie au troisième-quatrième jour par l'ap- parition d'un nodule vaccinal qui atteint son développement maximum en six-huit jours, son diamètre étant compris entre un et trois centimètres ; ce nodule régresse ensuite jusqu'à disparattre, sans générelieation du processus, avant la troisième semaine. Le virus vaccinal est retrouvé dans les ganglions lymphatiques voisins du point d'inoculation. La virémie post-vaccinale, recherchée sur deux lapins pris su hasard, n'a été constatée que sur l'un d'entre eux ; elle a été de faible intensité (5 doses infectantes 50 % par millilitre de sang) et éphémère (apparition au quatrième et cinquième jour seulement). Dans une seconde phase, le vaccin a été injecté à dix sept lapereaux à la sortie du nid, dont l'a- ge était de trois à quatre semaines : les réactions vaccinales observées ont été plus faibles que les précédentes. Dans une troisième phase, le vaccin a été injecté à des adultes reproducteurs (2 mâles et 4 femelles), qui ont été accouplés quinze à vingt-et-un jours après la vaccination ; la fécondité a été normale et aucune action tératogène n'a été constatée sur les nouveaux-nés. Exemple 5 Xet exemple illustre l'efficacité du vaccin sur le plan de la solidité. 22 lapins ont été vaccinés par voie intradermique à l'aide du vaccin préparé comme indiqué en l'ex- emple deux. Ils ont été éprouvés trois semaines après la vaccination par injection intradermique de 1 000 doses infectantes 50 ffi de virus myxomateux virulent dont la souche disponible à l'Ecole Vétérinaire de Touloupe présente une virulence de classe 1. 21 lapins ont été protégés contre l'inoculation qui a tué 8 témoins sur 8, en dix à treizejours. L'immunité obtenue est donc très satisfaisante et bien meilleure que celle obtenue par le vaccin fibromateux. Exemple 6 Cet exemple illustre l'efficacité du vaccin sur le plan de la durée. Plusieurs lots de lapins ont été vec- cinés et éprouvés dans les conditions de l'exemple 5 à des échéances variables par rapport à la vaccination. Les résul tats ont été les suivants - épreuves réalisées deux mois après vaccination : treize lapins protégés sur treize - épreuves réalisées trois mois après vaccination : dix lapins protégés sur 10 - épreuves réalisées quatre mois après vaccination : huit lapins protégés sur neuf - épreuves réalisées cinq mois après vaccination : cinq lapins protégés sur cinq - épreuves réalisées six mois après vaccination : huit lapins protégés sur huit - épreuves réalisées huit mois après vaccination : trois lapins protégés sur cinq Aucun des témoins non vaccinés n'a survécu à l'épreuve virulente. Une protection satisfaisante est donc assurée pendant six mois par le vaccin. Exemple 7 Cet exemple illustre la précocité de l'immunité obtenue. Six lapins vaccinés et éprouvés au huitième jour dans les conditions déjà évoquées ont parfaitement résisté ; le lapin peut donc être considéré comme immunisé à partir du huitième jour qui suit la veccination. Exemple 8 Cet exemple illustre la stabilité de la souche vaccinale. L'épreuve a consisté à réaliser huit passages en série sur lapins : chaque passage a été effectué sur deux lapins recevant chacun par voie intra-dermique 0,1 millilitre de dilution à mm5 du broyat de nodule vaccinal, récolté au cinquième-sixième jour (le broyat étant formé par un mélange des nodules des deux lapins du passage précédent). Au huitième passage les suites de l'inoculation étaient tout à fait comparables à celles du virus de départ (réaction locale sans généralisation ; immunité). Exemple 9 Cet exemple illustre l'antigénicité du vaccin. La recherche et le titrage des anticorps dans des sérums de lapins ont été effectués par fixation du complément en utilisant comme antigène un broyat de nodule de myxomatose sauvage de virulence 1. Le titrage effectué sur les sérums de trente cinq lapins, 21 à 27 jours après vaccination, a révélé des réactions positives pour des dilutions sériques variant selon les individus de 1/8 à 1/128. Le sérum des lapins non vaccinés a toujours été négatif à la dilution 1/4. Exemple 10 Dens tous les exemples sus-évoqués, la vaccination a été réalisée par voie intradermique. Un essai de transmission naturelle du virus vaccinal par contact, n'a pas donné de résultat positif six lapins de deux mois non vaccinés ont été entretenus pendant trois semaines avec des lapins du mEme âge, vaccinés la veille de la mise en cohabitation. Un mois après la fin de la cohabitation, ces six lapins étaient sérologiquement négatifs et n'ont pas survécu à l'épreuve virulente. Un essai de transmission néonatale n'a pas donné de résultat positif ; deux portées de lapereaux nés de mères vaccinées un mois et deux mois avant la saillie ont été éprouvés à l'sage de six semaines : aucun lapereau n'a survécu à cette épreuve. Exemple Il Un essai sur la durée de conservation du vaccin a montré que le vaccin lyophilisé a conservé son titre initial après six mois de séjour à une température comprise entre 0 et 40 C. REVENDICATIONS 1/ - Nouvelle souche virale de faible pouvoir pathogène, caractérisée en ce quelle résulte d'une mutation d'une souche virale de myxomatose spontanée et est du type de celle déposée le 21 juillet 1976 sous le numéro 1.028. auprès de la collection nationale de cultures de micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur. 2/ - Nouvelle souche virale selon la revendication 1, caractérisée en ce qutelle possède les caractères marqueurs suivants - elle se développe sur des cellules d'embryon de poulet à une température de 33"C pour donner une culture totale de titre compris entre 10 et lo doses cytopathogènes par millilitre, pour cellules rénales de lapin, - elle possède un faible pouvoir pathogène se manifestant chez le lapin par le simple développement au point d'inoculation d'une lésion locale de dimension inférieure à 3 cm de diamètre, sans généralisation et avec régression et disparition au plus tard au cours de ra 3e semaine, - elle possède un pouvoir immunisant efficace à ltégard d'une épreuve virulente consistant en une inoculation de 1000 à 10000 doses minima infectantes d'une souche de virus myxomateux de virulence 1, pratiquée dans la 3e semaine suivant la vaccination. 3/ - Procédé d'obtention de la nouvelle souche virale selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer des passages successifs d'une souche virale de myxomatose spontanée, sur cellules rénales de lapin, à cloner les populations obtenues et à effectuer des passages successifs sur cellules embryonnaires de poulet. 4/ - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que, au cours de la succession des passages sur cellules embryonnaires de poulet, sont intercales des clonages sur cellules rénales de lapin. 5/ - Procede selon lune des revendications 3 ou 4, caracterisé en ce que les passages sur cellules rénales de lapin et sur cellules embryonnaires de poulet sont effectués à une température sensiblement comprise entre 309 et 35"C et, de préférence, sensiblement égale à 33 C. 6/ - Procédé selon l'une des revendications 3, 4 ou 5, caractérisé en ce que le nombre de passages sur cellules rénales de lapin est compris entre 60 et 100 et que le nombre de passages sur cellules embryonnaires de poulet est sensiblement compris entre 3 et 30. 7/ - Vaccin contre la myxomatose, caractérisé en ce qu'il est constitué par une culture de la souche virale conforme à l'une des revendications i ou 2, sur cellules de lapin. 8/ - Vaccin contre la myxomatose, caractérisé en ce qu'il est constitue par une culture de la souche virale conforme à l'une des revendications 1 ou 2, sur cellules embryonnaires de poulet. 9/ - Vaccin selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que la dose unitaire contient entre 50 et 200 doses infectantes 50 % de la souche virale. 10/ - Vaccin selon l'une des revendications 7, 8 ou 9, caractérisé en ce que la culture qui le compose est conditionnée sous forme lyophilisée, appelée à être rehydratée lors de l'utilisation.