FR 2385714 A1 19781027 FR 7730339 A 19771007 La présente invention est relative à un nouvel antibiotique dénommé C-15005 et appelé ci-après antibiotique C-15003, à un procédé de préparation de celui-ci et ainsi qu'un procédé permettant de préparer des dérivés de ce dernier, et son application comme médicament notamment comme antibiotique et comme agent anti-tumoral. La demanderesse a effectué de nombreuses recherches en collectionnant, notamment de nombreux échantillons de sol et a procédé à un triage des microorganismes isolés à partir de tels échantillons. Elle a découvert au cours du triage ou "screening" que certains microorganismes étaient capables de produire un nouvel antibiotique, ces microorganismea appartenant au genre Nocardia, ceci en cultivant l'un quelconque de ces microorganismes dans un milieu approprié, elle a constaté qu'il était possible d'obtenir une accumulation dudit antibiotique dans ledit bouillon de cultnre.Il a également été trouvé que des dérivés pouvaient etre obtenus à partir dudit antibiotique. L'invention a donc pour objet l'antibiotique C-15003 répondant à la formule générale (1) s dans laquelle R représente (2) Un procédé de préparation de l'antibiotique C-15003, ca ractérisé par le fait que ledit procédé consiste à cultiver une souche produisant l'antibiotique C-15003 appartenant au genre Nocardia dans un milieu permettant à la souche d'élaborer et d' accumuler l'antibiotique C-15003 dans le bouillon de culture et que l'on récupère ensuite l'antibiotique C-15003 à partir dudit bouillon ; et (3) un procédé de préparation d'un composé répondant à la formule générale (II) : caractérisé par le fait que ce dit procédé consiste à hydro lyser l'antibiotique C-15003 répondant à la formule séné- rale (1) s dans laquelle R représente Dans le contexte delinvention, le terme antibiotique C-15003 signifie, de façon générique, les trois composés répondant à la formule générale (1) constituant soit un groupe soit un mélange de deux ou trois desdits composés ou plusieurs de l'un quelconque desdits composés.Par référence à la formule générale (1) le composé dans lequel R désigne est désigné ci-après comme étant l'antibiotique C-15003 P-3 ou plus brièvement C-15003 P-3 ; le composé dans lequel R désigne -CO-CH2-CH2-CH3 est désigné ci-après comme antibiotique C-15003 P-3t ou, plus brièvement C-15003 P-3' ; le composé dans lequel R désigne est désigné ci-après comme étant l'antibiotique C-15003 P-4 ou plus briF- vement C-15003 P-4 et le composé dans lequel R désigne H dans la formule générale (II) est appelé antibiotique C-15003 P-O ou plus brièvement C-15003 P-0 Comme mentionné plus haut, l'antibiotique C-15003 peut Entre obtenu en cultivant un microorganisme appartenant au genre Nocardia et étant capable de produire l'antibiotique a-15003 dans un milieu de culture contenant une source de carbone assimilable, une source d'azote digestible jusqu'à ce que l'antibiotique ait été accumulé de façon substantielle dans le bouillon de culture suivi par la récupération de celui-ci. A titre d'exemple de souches de microorganismes produisant l'antibiotique 0-15003, on peut mentionner la souche actinomycete n C-15003 qui a été isolée à partir du sol et d'autres échantillons au cours du triage de microorganismes produisant des antibiotiques. Les caractères microbiologiques de la souche N O-15003 ont été examinés par des procédés analogues à ceux proposés par Schirling & Cottlieb (International Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966). Les résultats de ces observations à 280C pendant 21 jours sont les suivants t 1 ) Caractéres morphologiques Le mycelium végétatif s'étend bien et se développe en branches tant sur gélose qu'en milieu liquide. Beaucoup des hyphes ont un diamètre compris entre 0,8 et 1,2 m et en certains cas se divisent en fragments ressemblant à des bactéries en batonnets ou en hyphes ramifiés avec des banches de longueur courte.La souche croit bien sur différents milieux taxonomiques avec un mycelium aérien superposé sur le mycelium végétatif, bien qu'il se forme fréquemment des corps re.ssem- blant à des corémies (50-200 x 200 - 1000 Zm) sur lesquels d'autres croissances aériennes peuvent se former.Beaucoup de ces mycelles aériennes sont flexueuses mais on a rencontré en certaines occasions des configurations droites ou légèrement en forme de spirales.Un examen microscopique de cultures plus vieilles révèle que seulement dans certains cas, les cellules en forme de conidies se présentent en chaînes, alors que les suspensions de cellules obtenues à partir des surfaces de telles cultures contiennent des arthrospores qui à l'examen mi-' croscopique se présentent sous forme de corps e1lipsodeux allongés (0,8 à 1,2 m 1,2 m x 4,8-6,8 m) et sllipsoïdel (098 - 1,2 x 1,0 - 2,0 Fm) . Un examen électron-microscopique montre que ces corps ont des surfaces lisses. 20) Les constituants des cellules La souche a été cultivée par secousses dans un milieu ISP No 1 modifié à 280C pendant 66 à 90 heures, au bout de ce temps les cellules ont été collectées et rincées. L'ensemble des cellules a été examiné ensuite pour leur composition en acide diamino-pimelique et en sucre par la méthode de B. Becker et Al (Applied Microbiology 12, 421 (1964) et la méthode de M.P. Lechevalier (Journal of Laboratory and Clinical Medicine 71, 934, (1968). Le premier a été découvert comme ayant la forme meso alors que des spots ont été détectés qui correspondent au galactose et ltarabinose. 30) Caractéristiques sur milieux taxonomiques Les souches présentent comparativement une bonne oroissan- ce sur différents milieux avec le mycelium végétatif qui est incolore à jaune pale dans la phase initiale de culture et légèrement jaunâtre tan à jaunâtre tan dans les phases ultérieures. La souche produit des pigments solubles jaunes à jaunâtres tan, dans différents milieux taxonomiques. Le mycellium aérien est en forme de poudre et généralement donne lieu à une croissance modérée et il a une couleur blanc à jaune ou légèrement jaunâtre tan. Les caractéristiques de la souche dans différents milieux taxonomiques sont décrites dans le tableau 1. Tableau 1 Caractéristiques de culture de la souche No C-15003 sur des milieux taxonomiques. (4) Gélose au nitrate sucrose : Croissance (G) s Modérée, il se forme des corps similaires à des corémies de couleur jaune melon lumineuse (3 ia)x Q tan ambre (3 lc)X f Mycelium aérien (AM) peu abondant, blanc Pigment soluble (SP) : aucun ou couleur pâle jaunâtre tan. (B) Gélose au nitrate glycérol : G t modéré, il se forme des corps similaires à des corps mies de couleur légèrement ivoire (.2 oa)x, AM t modéré, blanc, SP : rien (c) Gélose à l'asparagine glucose s G : modéré, couleur soucis lumineuse (3 pa)X à jaune lumineux (2 par AM t peu abondant, blanc SP : jaune lumineux (2 pa)X (D) Gélose à l'asparagine glycérol G : modéré, corps en forme de corémie légèrement ivoire (2 ca)X AM : peu abondant, blanc SP : rien (E) Gélose d'amidon G : modéré, il se forme des corps en forme de corémie de couleur légèrement ivoire (2 ca)X à légèrement couleur blé (2 ea)X AM : abondant, couleur légèrement ivoire (2 ca)X SP : rien (F) Gélose nutritive G : modéré, il se forme des corps similaires à des corps mies de-couleur légèrement ivoire (2 ca)X à jaune colonial (2 ga)x , AM : peu nombreux, blanc SP : rien. (G) Gélose au malate calcium s G : modéré des corps en forme de corémies sont formés de couleur légèrement ivoire (2 ca)x à une couleur blé clair (2 ea)x, AM : modéré, blanc à ivoire clair (2 ca)X SP : rien (Hj Gélose avec extrait de levure et extrait de malt : G : modéré, des corps en forme de corémies sont formés de couleur ambre (3 lc)X à jaune lumineux (3 la)Xs AN : modéré, blanc à ivoire clair (2 ca)X SP : rien (I) Gélose à la farine d'avoine G : modéré, corps similaires à des corémies formés ayant une couleur ivoire clair (2 ca) à jaune colonial (2 ga) * AM : peu abondant, blanc à jaune pâle 8P : rien (J) Gelose à l'extrait de levure peptone fer G : modéré, jaune colonial (2 ga) * AN : rien SP : jaune colonial (2 ga) (K) Gelose à la thyrosine G t modéré des corps blancs similaires aux corémies sont formés de couleur ivoire clair (2 ca) à jaune melon clair (3 ea) AN : modéré blanc à ivoire clair (2 ca) * SP z couleur chameau (3 ie) * Des codes de couleurs sont définis selon le manuel d'Harmonie des Couleurs (Color Hormony Manuel) 4ème édition Container Corporation of America 1958) 4) Caractères physiologiques Les caractères physiologiques de la souche sont représentés dans le tableau 2. La température pour la croissance varie entre 1200 et 36 C. La gamme de températures dans laquelle il se produit une bonne croissance aérienne sur gélose (ISP n 2) est comprise entre 20 et 3500. Tableau 2. Caractères physiologiques de la souche nO 0-15003. Gamme de températures pour la croissance : 12 à 380C Gamme de températures pour une croissance aérienne s 20 à 350C Liquéfaction de la gélatine : positive Hydrolyse de l'amidon : : positive Réduction des nitrates t positive Peptonisation du lait : positive Coagulation du lait : négative Décomposition de la caséine : positive Production de pigments mélanoïdes : négative sur gélose fer extrait de levure peptone), positive sur gélose de thyrosine. Décomposition de la thyrosine : positive Décomposition de la xanthine : négative Décomposition de lthyposanthine : négative Tolérance au lysozyme : positive Tolérance au chlorure de sodium : 2 % 5) Utilisation de sources de carbone diverses L'utilisation de différentes sources de carbone a été examinée en utilisant un milieu décrit dans Pridham et Gottlieb (Journal of Bacteriology 56, 107 (1948) et un milieu de base de la mime composition contenant en plus 0s1 % d'extrait de levure. Le spectre résultant est représenté dans le tableau 3. Tableau 3 - Utilisation des sources de carbone par la souche n C 15003 Source de car- Croissance Source de Croissance bone carbone D-Xylo se + ++* Raffinose # # * L-Arabinose + + Nelibiose + + D-Glucose +* ++ i-Inositol - D-Galactose + + D-Sorbitol - D-Fructose +++ ++ D-Mannitol ++ ++ L-Rhamnose + + Glycérol - - D-Mannose +++ ++ Amidon soluble + + Sucrose ++ ++ Controle - Lactose - - * Maltose + + Trehalose + ++ * Un milieu de base avec 0,1 % d'extrait de levure a été additionné. Note s +++ : croissance luxuriante ++ : bonne croissance + : croissance : : croissance pauvre - : pas de croissance 6) Autres caractéristiques. Les cellules ont été récoltées par le procédé décrit ci-dessus sous le n 2 et la DNA a été préparée par un procédé analogue à celui décrit par J. Marmur et ai. (Journal of Molecular Biology 3, 208, 1961). La teneur en G-C guanine-cytosine) de DNA a été trouvée comme étant environ de 71 moles % la méthode de coloration de Gram du Mycellium végétatif de cette souche a été positive. Les caractéristiques surnommées de la souche n C 15003 ont été comparées avec les descriptions de S.A. Waksman "Les Actinomycètes - Vol. 2 CThe Williams and Wilkuns Col 1961). R.E. Buchanan et N.E. Gibbons, "Manual of Determinative Bacteriology de Bergey, 8ème édition, 1974" ; et d'autres littératures. Bien que la souche peut Btre considérée comme appartenant au groupe III du genre Nocardia, le fait de ne pas trouver une espèce ayant les caractères tels que décrits ci-dessus parmi les souches connues nous a conduit à considérer que cette souche représente une nouvelle espèce de microorganismes. Cette souche n C-15003 a été déposée à Fermentation Research Institut Agency of Industrial Science and Technoîogy (FERM) sous le numéro de réception 3992 ; à l'Insstituts for Fermentation, Osaka (IFO) sous le nombre d'accession IFO 13726 et à 1'American Typè Culture Collection (AtCC), Maryland, U.S.A. sous le nombre d'accession 31281. Bien que la soubhe C-15003 est une espèce nouvelle du genre Nocardia comme mentionné ci-dessus, elle est susceptible, comme tous les microorganismes de façon générale, de subir des variations et des mutations, soit spontanément ou sous l'influence d'un agent mutagène. Par exemple les nombreux variants de la souche qui peuvent être obtenus par irradiation par les rayons X, rayons s; ;amma, la lanière ultraviolette, etc.. par Isolation monocellulaire,par culture sur milieu contenant différents traitements de produits chimiques ou par tout autre traitement mutagène, ain situe les mutants dérivant spontanément de la souche ne doivent pas être considérés comme représentant une espèce différente,mais que tout variant ou mutant capable d'élaborer C-150Q3 P-3, P-32 et/ou P-4 doit être utilisé de façon invariable dans les buts de l'invention, A titre d'exemple, en soumettant la souche nO C 15003 à différents traitements mutagènes on forme des mutants qui ne possèdent pas de façon essentielle la propriété de produire des pigments solubles, des mutants dont les mycelles du substrat sont incolores, jaune-vert, rouge-tan ou orange-rouge, des mutants dont les hyphes sont prêts à se fragmenter en éléments bacillaires ou en fragments d'hyphes ramifiés et des ::nitants avec d'abondantes mycelles aériennes ou sans mycelles aériennes. Le milieu utilisé pour la culture d'une telle souche productrice d'antibiotique C-15003 peut être constitué par un milieu liquide ou solide s'il contient des nutriments que la souche peut utiliser, ceci malgré le fait que le milieu liquide est préféré pour avoir une production élevée. Le milieu peut comprendre des sources de carbone et d'azote que la souche nO C-15003 peut assimiler et digérer, des matières inorganiques, des traces de nutriments, etc. A titre- de source de carbone on peut mentionner le glucose, le lactose, le sucrose, le maltose, la dextrine, l'amidon, le glycérol, le mannitol, le sorbitol, etc.. des huiles et des graisses (par exemple huile de soja , l'huile de gras de porc, l'huile de poussin, etc..) ainsi que d'autres matières similaires.La source d'azote peut être constituée par exemple d' extrait de viande, d'extrait de levure, de levures sèches, de farine de soja, de liqueur de macération de mais, de peptone, de farine grains de coton, de mélasse épuisée, d'urée, de sels d'ammonium (sulfate d'ammonium, chlorure d'ammonium, acétate d'ammonium, etc.) par exemple.Le milieu peut contenir encore des sels de sodium, de potassium, de calcium, de magnésium, etc.. des sels de fer, de manganèse, de zinc, de cobalt, de nickel, etc.. des sels d'acide phosphorique, borique et des sels d'acide organique tels que des acétates et des propionates. Le milieu peut également contenir, sous forme additionnée, différents acides aminés, comme par exemple l'acide glutamique, l'acide aspartique, l'alanine, la glycine, la lysine, méthionine, la proline, etc..) des peptides tels que des dipeptides et tripeptides, etc..) des vitamines telles que par exemple B1 B2, l'acide nicotinique, B12, C, E, etc.. les acides nucléiques tels que la purine, la pyrimidine et des dérivés de ceux-ci, ainsi que des composés similaires.Dans les buts d'ajuster le pH du milieu on peut additionner un acide inorganique ou organique, un agent alcalin, un tampon, etc. Les quantités appropriées d'huile, de graisse, d'agent de surface, etc.. peuvent également être additionnées comme agents antimousse. La culture elle-même pourrait être effectuée par l'une quelconque des méthodes de culture qui peut être stationnaire, par agitation, aérobie submergé ainsi que d'autres conditions. Pour avoir des rendements de réaction élevés, une culture aérobie submergée est naturellement préférée. Bien que les conditions de culture dépendent naturellement des conditions de la co:posi- tion du milieu, de la souche, la méthode de culture et d'autres facteurs, il est normalement préféré d'effectuer l'incubation à une température de 20 à 350C en ayant un pH initial d'environ 7O. De façon plus particulièrement souhaitable la température est comprise entre 23 et 300C dans une étape intermédiaire do culture avec un PH initial de 6,5 à 7,5. Bien que la durée d'in- cubation peut également varier en fonction des mimes facteurs comme enseigné ci-dessus, il est souhaitable de continuer l'in- cubation jusqu'à ce que le titre de l'antibiotique désiré soit maximum, Dans le cas d'une culture par agitation ou aérobie submergé en milieu liquide le temps nécessaire normalement est con- pris entre 48 et 144 heures. L'activité de l'antibiotique a été testée avec tétra hymena pyriformis W à titre de microorganisme d'essai. Ce microorganisme a été amené à croître sur un miieu d'essai (20 g de proteose-peptone (Difco), 1 g d'extrait de levure (Difco), 2 g de glucose, 1000 ml d-'eau distillée et 10 ml d'un tampon I M-phosphate pH 7,0 à 280C pendant 44 à 48 heures et-l'activité de l'antibiotique a été déterminée par la méthode de dilution en série avec un enregistrement de la turbidité de croissance, essai sur des cellules de tumeur ascite et par chromatographie en couche mince (TIC). Le nouvel antibiotique C-15003 P-3, P-3' et/ou P-4 est produit et accumulé dans le bouillon de fermentation résultant de façon extracellulaire et intracellulaire. Ces substances ont également été détectées par TIC. si, le bouillon de fermentation est séparé en cellules et on filtrat par filtration ou centrifugWation et le filtrat est extrait avec le même volume d'acétate d'éthyle. On additionne aux cellules la même quantité d'un mélange acétone-eau à 70 % que le filtrat et après une agitation de 1 heure à 200C la suspension est filtrée. L'acétone est éliminée du filtrat et le filtrat aqueux résultant est extrait avec l'acétate d'éthyle. Chacun des extraits est concentré à 1/100 en volume et soumis à une chromatographie en couche mince sur une plaque en verregel de silice (Merck, Allemagne de l'Ouest, Kieselgel 60 P 254 0,25. mm, 20 x 20) le système de solvant utilisé est chlorofor- me-méthanol dans les proportions de 9sl. L'activité a été d6- terminée sur la base de l'intensité des spots détectés par irradiation à la lumière ultraviolette à 2537 A . En raison du fait que les substances C-15003 P-3, P-3 et/ou P-4 ainsi produites dans le bouillon de fermentation sont des substances neutres lipophiles telles peuvent être facilement récupérées par séparation et purification qui sont les procédés habituellement utilisés pour récolter de tels métabolites microbiens.Par exemple on peut utiliser un-procédé mettant en oeuvre la différence de solubilité entre l'antibiotique et les impuretés, des moyens mettant en oeuvre l'affinité par adsorption de différents adsorbants tels que le charbon activé, des résines non-ioniques macroporeuses, du gel de silice, l'alumine etc.., un procédé d'élimination des impuretés au moyen d'une résine échangeuse d'ions, ainsi que d'autres méthodes similaires qui peuvent être utilisées séparément ou dans une combinaison appropriée ou appliquées en répétition. En raison du fait comme mentionné ci-dessus, C-15003 P-3, P-3' et P-4 sont présents dans le filtrat et les cellules, les antibiotiques sont séparés et purifiés au moyen d'un adsorbant si celui-ci est utilIsé, soit directement ou après extraction par solvant dans le cas du filtrat ou après une extraction par solvant dans le cas de cellules microbiennes. L'extraction par solvant peut eAtre mise en oeuvre par l'une quelconque des méthodes suivantes ainsi que d'autres méthodes, comme par exemple s (1) l'extraction par solvant à partir du bouillon de culture avant la séparation des cellules et (2) l'extraction par solvant des cellules et du filtrat obtenu par filtration, centrifugation ou d'autres procédés.Pour extraire le filtrat et les cellules de façon indépendante, le procédé suivant peut être mis en oeuvre de façon avantageuse. Les solvants appropriés pour l'extraction du filtrat sont des solvants organiques non miscibles dans l'eau tels que les esters d'acide gras comme par exemple l'acétate d'éthyle, l'acétate d'amyle, des alcools tels que le butanol ; des hydrocarbures halogénés, comme par exemple le chloroforme et les cétones, par exemple la méthylisobutylcétone. L'extraction est effectuée à un pH proche de la neutralité et de préférence le fluide de culture6S2u préalable ajusté à un pH de 7 et extrait avec de l'acétate d'éthyle. L'extrait est lavé avec de l'eau et concentré sous pression réduite. On additionne ensuite un solvant non polaire tel que l'éther de pétrole ou l'hexane en vue de concentrer et le produit brut I contenant le composé actif est récupéré.En raison du fait que par chromatographie en couche mince un certain nombre de spots sont détectés en plus de celui de l'antibiotique C-15003, le produit de formule I est soumis successivement aux procédés de purification suivants. Ainsi un procédé de purification de routine tel que chromatographie par adsorption est utile et dans ce but l'un quelconque des adsorbants habituelleient utilisé tels que le gel de silice, l'alumine, un adsorbant non-ionique macroporeux, résineux, etc.. peut être employé. En vue de purifier le produit brut de formule I, le gel de silice est plus particulièrement utile. Le développement peut être effectué par exemple en commençant avec l'éther de pétrole et l'hexane et I'élution de l'antibiotique C-15003 est mis en oeuvre par addition d'un solvant polaire tel que l'acétate d'éthyle, l'acétone, l'éthanol ou le méthanol. Dans un procédé typique mettant en oeuvre le gel de silice (Merck, Allemagne de l'Ouest 0,05 - 0,2 mm) à titre de support, la chromatographie sur colonne est effectuée avec un rapport croissant de l'hexane par rapport à l'acétate dlé- thyle.L'éluat est stocké en échantillons et examiné par chromatographie en couche mince et les fractions contenant C-15003 sont stockées et concentrées sous pression réduite L'éther de pétrole ou l'hexane est ensuite additionné au concentrat de façon à obtenir le produit brut de formule 11. Comme ce produit contient encore des impuretés, il est encore purifié de la façon suivante, par exemple le produit II peut être purifié au moyen d'une seconde colonne de gel de silice mettant en oeuvre un système de solvant différent.Le système développeur peut entre constitué dans ce but par un hydrocarbure halogéné tel que le dichlorométhane ou le chloroforme avec addition d'un solvant polaire tel qu'un alcool comme par exemple le méthanol ou l'éthanol, une cétone comme par exemple la cétone ou la méthyléthylcétone, etc.. L'antibiotique C-15003 est ainsi isolé. L'ordre des systbmes de solvant pour les première et seconde colionnes de gel de silice peut être inversé et en plus des solvanta organiques ordinaires peuvent être utilisés avec un sys tème ci-dessus si nécessaire. Lorsqu'une résine adsorbante macroporeuse est utilisée comme moyen de purification pour le produit brut II, 1' élu- tion de l'antibiotique C-15003 est accomplie avec un mélange d'eau et d'un alcool inférieur,d'une cétone inférieure ou d'un ester. L'alcool inférieur peut, par exemple, être le méthanol , méthanol, le propanol ou le butanol et la cétone inférieure peut être, par exemple l'acétone, la méthyléthylcétone .L'ester peut être par exemple l'acétate d'éthyle, Dans un procédé typique, le produit brut Il est dissous dans un mélange d'eau et de mtha- nol à 60 % et adsorbé sur une colonne de Diaion HP-10 (Mitaubishi- Kasei K.K . La colonne est lavée avec un mélange eau-méthanol à 70 % et ensuite l'élution est effectuée avec un mélange eau-méthanol à 90 % . On obtient, de cette façon, par élution l'antibiotique C-15003 à partir de la colonne. Dans l'un quelconque des procédés décrits ci-dessus les fractions contenant l'antibiotique C-15003 sont stockées et concentrées sous pression réduite. On additionne au produit sec 5 à 8 volumes d'acétate d'éthyle et le mélange est maintenu au repos de façon à ce qu'il se sépare des cristaux de l'antibiotique C-15003. Ces cristaux contiennent C-15003 P-3, P-3' et P-4. Ces composés sont ensuite séparés l'un de l'autre au moyen d'un adsorbant tels que ceux mentionnés ci-dessus. Ainsi, en utilisant du gel de silice ou un adsorbant résineux non ionique macroporeux et les solvants susmentionnés, les composés désirés peuvent être élués en fractions.Lorsque, par exemple, le gel de silice est utilisé, le développement est effectué avec l'hexane, l'acétate d'éthyle, un mélange chloroforme-méthanol. Au cours de ce procédé les antibiotiques C-15003 P-4 , P-3 et P-3 apparaissent dans cet ordre . Après détection au moyen de la chromatographie en couches minces, les fractions correspondant à C-15003 P-4, P-31 et P-3 sont respectivement concentrées sous pression réduite et de l'acétate d'éthyle est additionné au concentrat. fle cette façon, les composés respectifs peuvent outre obtenus sous forme de cristaux.Lorsqu'une résine adsorbante non ionique macroporeuse est utilisée, une élution par gradient avec un rapport variable d'alcool, de cétone ou d'ester par rapport à l'eau peut entre utilisée' Par exemple, en utilisant la méthode d'élution par gradient mettant en oeuvre l'utilisation d'un mélange eau-méthanol à 60 % et eau-méthanol à 95 % additionnée de 5 % de chlorure de sodium, on obtient les antibiotiques C-15003 P-3, P-3' et P-4 dans cet ordre. Après échantillonnage et détection au moyen de la chromatographie en couches minces, chaque groupe de fractions actives est concentré sous pression réduite et cristallisé à partir de l'acétate d'éthyle0 Les cristaux isolés comprennent l'acétate d'éthyle, comme solvant de cristallisation et, après séchage sur du pentoxyde de phosphore à 700C pendant 8 heures, ils présentent les propriétés physiques et chimiques suivantes indiquées dans le tableau 4 Tableau 4 Antibiotique C 15003 P-3 P-3' P-4 C32H43ClN2O9 = 635,169 C32H43ClN2O9 = 635,169 C33H45ClN2O9 = 649,196 Point de fusion ( C) 190 - 192 182 - 185 177-180 Rotation spécifique -136 # 10 -134 # 10 -142 # 10 [&alpha;;]D22 (C = 0,375 CHCl3) (C = 0,11 CHCl3) (C = 0,522 CHCl3) Analyse élémentaire C 60,06 60,09 60,65 H 7,04 7,02 7,05 Trouvé (%) N 4,33 4,34 4,25 Cl 5,37 5,99 5,23 Analyse élémentaire C 60,51 60,51 61,05 H 6,82 6,82 6,99 Calculé (%) N 4,41 4,41 4,32 Cl 5,58 5,58 5,46 Antibiotique C-15003 P-3 P-3@ P-4 C32H43ClN2O9 = 635,169 C32H43ClN2O9 = 635,169 C33H45ClN2O9 = 649,16 Spectre ultravio- 233 (30250) 240 (épau- 233(30155) 240 épaule- 233(29900) 240(épaulement let d'absorption lement 28450) ment 280(5750) 28240) nm( #) dans le 252(27640) 280(5750) 252(27600) 280(5750) 252(27590) 280(5712) méthanol 288(5700) 288(5700) 288(5680) Spectre infra- 1740, 1730, 1670, 1580 1740, 1730, 1670, 1580, 1740, 1730, 1670, 1580 rouge 1445, 1385, 1340, 1255 1445, 1385, 1340, 1255, 1445, 1385, 1340, 1255 1180, 1150, 1100, 1080 1180, 1150, 1100, 1080 1180, 1150, 1100, 1080, 1038 1038 1038 Spectre RMN 1,27(d) 3H) 1,06(t) 3H) 1,03(d) 6H) (ppm) 1,28(d) 3H) 100 MHz dans CDCl3 Spectre de masse 573, 485, 470,450 573, 485, 470,450 587, 485, 470,450 Solubilité Insoluble dans éther de Insoluble dans éther de Chsoluble dans éther de pé pétrole, hexane et eau pétrole,hexans et eau, trole,hexane et eau. Fai faiblement soluble dans faiblement soluble dans blement soluble dans benzè benzène et éther.Soluble benzène et éther.Soluble ne et éther.Soluble dans dans chloroforme acétate dans chloroforme,acétate chloroforme, acétateféthyle, d'éthyl@ acétone,éthanol, d'éthyle, acétone,éthanol, acétone, éthanol,méthanol méthanol,pyridine, téra- méthanol, pyridine,tétra- pyridine, tétrahydrofurane hydrofurane et diméthyl- hydrofurane et diméthyl- et diméthylsulfoxyde thylsulfoxyde thylsulfoxyde Réactions colo- Dra gendorff : Positive Dra gendorff : Positive Dragendorff : Positive rées Beilstein : Positive Beilstein : Positive Beilstein : Positive Sur la base des formules moléculaires ci-dessus et des résultats d'activités antimicrobiennes et antitumorales indiqués ci-après, le présent antibiotique a été comparé avec des groupes connus d'antibiotiques.Une recherche dans la littérature n'a pas permis de localiser un groupe distinct similaire à l'antibiotique C-15003. Cependant, une recherche pour des substances qui pourraient donner des absorptions ultraviolettes similaires à celles de l'antibiotique faisant l'objet de la présente invention parmi les composés de plantes ou présents de façon naturelle a conduit les inventeurs au groupe des maytanacines. En se basant sur les formules moléculaires, en particulier , il a été considéré que l'antibiotique appartient au groupe des maytanacines ou groupes de composés contenant 2 atomes d'azote La maytanacine a été obtenue comme dérivé de plantes et a été signalée dans le Journal of American Chemical Society 97, 5294 (1975).Le spectre de masse de la maytanacine est le suivant t 0 (a) M+ - (a+b) 485-CH3 485-Cl 545 485 470 450 (a > H20 + HNCO La présence d'un rapport m/e de 483, 470 et 450 pour C-15003 P-3 P-3* et P-4 a convaincu la demanderesse que ces composés ont au moins une structure de squelette identique à celle du squelette de la maytanacine, la différence étant essentiellement dans la nature du groupement acyl en position 3 Il est, de ce fait, parfaitement clair que l'antibiotique C-15003 est un composé nouveau.Lorsque les antibiotiques C-15003 P-3, P-3' et P-4 ont chacun été dégradés avec un agent alcalin et analysé par chromatographie en phase gazeuse en vue de déterminer les acides carboxyliques libérés, il a été trouvé que l'acide isobutyrique, l'acide butyrique et l'acide isovalérique pouvaient être obtenus pour C-15003 P-3, C=15003 P-3' et C-15003 P-4 respectivement. La figure I représente les structures basées sur les résultats susmentionnés de C-15003 P-3, P-3' et PO. Fig 1. Activité biologique: A) L'activité antimicrobienne : En utilisant comme milieu d'essais de la gélose tri pticase-soja (BBL), les concentrations inhibitrices à ltencon- tre des microorganismes indiqués ci-dessous ont été examines suivant la méthode de disques de papier. Ainsi, les disques en papier de filtre (Toyo Seisakusho, du type mince 8 mm dia.) imprégnés chacun avec 0,02 ml d'une solution à 300 pg/ml de C-15003 P-3, P-3' ou P-4 ont été placés sur des plaques respectivement inoculées avec les microorganismes indiqués ci-dessous en vue de déterminer les concentrations inhibitrices minimales. Les résultats montrent que les antibiotiques n'ont pas d'activité à l'encontre des microorganismes suivants. Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa , Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Mycobacterium avium. Par ailleurs , avec des plaques de gélose contenant le milieu d'essai suivant [3,5 g d'hydrogéno phosphate disodique, 0,5 g de dihydrogeno phosphate monopotassique, 5 g d'extrait de levure (Difco), 10 g de glucose, 15 g de gélose, 1000 ml d'eau distillée et un pH de 7,0] la croissance d'inhibition à l'en- contre de Talaromyces avellaneus a été testée. Dans cet essai, les concentrations inbtbitrices minimales étaient de 3 Fg/ml pour C-15003 P-3 et P-3' et de 1,5 g/ml pour C-15003 P-4.De plus, la souche sauvage de Tétrahymena pyriformis W à titre d'organisme d'essai a été cultivée sur un milieu d'essai composé de (20 g Proteose-peptone (Difco), 1 g d'extrait de levure, 2 g de glucose, 1000 ml d'eau distillée et 10 ml de 1 Mtampon au phosphate à pH 7,0) à 280C pendant 44 à 48 heures et l'activité inhibitrice de croissance des antibiotiques à l'en- contre de ce microorganisme particulier a été déterminée par différents procédés de dilution en série. L'inhibition de croissance est constatée à 1 pg/ml pour C-15003 P-3 et P-3' et à 0,5 pg/ml pour C-15003 P-4. L'activité antifongique est représentée dans le tableau 5. Comme on peut le constater sur le tableau , C-15003 a une activité inhibitrice de croissance à l'encontre des microorganismes causes des maladies de-plantes. Les disques en papier filtre imprégnés avec 0,02 ml d'une solution de 1000 g/ml de C-15003 sont placés sur des plaques inoculées respectivement avec des microorganismes comme indiqué dans le tableau 5 suivant. Tableau 5 Spectre anti-microbien Organismes testés Nombre Milieu Durée Diamètre IFO (heure) d'inhibition Alternaria kikuchiana 7515 PSA* 48 38 Fusicladium levieri 6477 PSA* 90 68 Helminthosporium 5273 PSA* 48 55 sigmoideum var. - irregulare Pyricularia oryzae - PSA* 48 53 Elsinoe fawcetti 6417 PSA* 90 55 Fusarium oxysporum f. cucumerinum - PSA* 48 20 Guignardia laricina 7888 PSA* 48 12 Cochlioborus miyabeanus 5277 PSA* 48 60 viaporthe citri 9170 PSA* 48 55 Gibberella zeae 8850 PSA* 48 37 Sclerotinia sclerotiorum 9395 PSA* 90 65 Venturia pirina 6189 PSA* 48 50 Pellicularia sasakii 9253 PSA* 48 50 Pythium aphanidermatum 7030 PSA* 48 58 Botrytis cinerea - PSA* 48 48 Aspergillus niger 4066 PSA* 48 0 Penicillium chrysogenum 4626 PSA* 48 35 Tableau 5 (suite) Organismes testés Nombre Milieu Durée Diamètre IFO (heure) d'inhibition Rhizopus nigricans 6188 PSA* 48 25 Saccharomyces cerevisiae 0209 PSA* 48 o Rhodotorula rubra 0907 PSA* 48 28 Trichophyton rubrum 5467 GB** 48 38 Trichophyton mantagrophytes 7522 G3** 48 38 Candida albicans 0583 GB** 48 0 Candida utilis 0619 GB** 48 0 Cryptococcus neoformans 0410 GB** 48 43 *PSA : milieu gélose sucrose de patate **GB : milieu gélose nutriment glucose B) Activité antitumorale : La demanderesse a constaté que l'antibiotique C-15003 P-3, P-3' et P-4 a une activité permettant de prolonger le temps de survie d'animaux à sang chaud portant une ou plusieurs tumeurs telles que la leucémie, le sarcome, le mastocytome, le mélanome, le carcinome. L'antibiotique C-15003 a éga-lement un effet tendant à la régression de tumeurs solides poussaut, de façon subcutanée , intramusculaire ou dans autres organes. C) Toxicité : Un test de toxicité aigue avec des souris à titre d'animaux d'essai en mettant en oeuvre des injectons intrapéri- tonéales de C-15003 P-3, P-3', et P-4 montre, pour tous ces antibiotiques, une ID50 supérieure à 0,313 mg/kg. Comme mentionné ci-dessus, les antibiotiques C-1Ç003 faisant l'objet de la présente invention ont une activité inhibitrice forte à l'encontre des fungis et des protozoaires et sont, de ce fait, de grande valeur à titre d'agent antifungique ou antiprotozoaire. De plus, en raison du fait que l'antibioti que'C-150Q3 a une action tendant à prolonger la vie pour des animaux mammifères portant des tumeurs comme, par exemple, la souris, il est également entendu que ces composés peuvent Qtre utilisés comme médicament à activité antitumorale. Lorsque l'antibiotique C-15003 est utilisé comme agent antifungique ou agent antiprotozoaire il peut être utilisé de façon avantageuse pour l'établissement d'une écologie bactérienne dans le sol, les boues actives, les fluides issus du corps animal, etc. Ainsi, lorsque des bactéries valorisables doivent Outre isolées à partir d'échantillons du sol ou lorsque les actions des bactéries doivent entre évaluées indépendamment de celles des fungis ou des protosoaires , notamment lors des opérations et analyses de boue active utilisée dans le traitement des eaux résiduaires, le présent antibLotique peut être utilisé pour obtenir une croissance sélective de la flore bactérienne sans pour autant permettre la croissance des Sungis et des protozoaires concomitants dans le spécimen. Dans un cas typique X l'échantillon est additionné à un liquide ou à un solide et 0,1 ml d'une solution de 10 à 100 Ag/ml d'antibiotique dans un mélange méthanol 1 % - eau sont additionnés par millilitres du milieu qui est ensuite incubé. Les antibiotiques C-15003 faisant l'objet de la pré- sente invention peuvent également etre utilisés comme agent antimicrobien pour le traitement des maladies des plantes causées par des microorganismes mentionnés dans le tableau 5 ci-dessus0 Dans une application typique, l'antibiotique C-15003 est utilisé sous forme d'une solution aqueuse méthanolique à 1% contenant 0,5 Ag/ml à 5 g/ml d'antibiotique. Par exemple, l'antibiotique C-15003 peut être utilisé pour le contrôle de la wourri- ture des enveloppes rouge-brun, le blast , les taches sur les feuilles dues à Helminthosporium et la rouille de l'enveloppe de riz. En vue de l'administration aux animaux à sang chaud portant une ou plusieurs tumeurs, l'antibiotique C-15003 est généralement utilisé sous forme d'injection. L'injection peut être intramusculaire, intratoracique, intraabdominale, intra-utérine, intrathecale , intraartérielle, subcutane,e ou intraveineuse. De telles injections peuvent être préparées suivant des méthodes connues en elles-mêmes , c'est-à-dire que l'antibiotique C-15003 est dissous ou mis en suspension dans un milieu liquide aqueux contenant un agent de solubilisation habituel tel qu'un alcool comme par exemple l'éthanol, des polyalcools comme, par exemple le propylène glycol, le polyéthylène glycol 200-300, des agents de surface non ioniques, une solution physiologique saline et isotonique. Les exemples typiques de milieu liquide sont des so- lutions contenant 1 % d'éthanol - 0,85 % d'une solution physiologique saline, 2,5 % de méthanol - 0,85 % d'une solution physiologique saline et 1 % de Tween 80 - 0,85 % de solution phy- siologique saline Les concentrations de l'antibiotique C-15003 dans le liquide sont comprises entre 0,5 mcg/ml et 500 mcg/ml. Les injections peuvent entre stérilisées et/ou contenir des substances auxiliaires telles que des agents de conservation, des agents de stabilisation, des agents mouillants, des agent s émulsifiants. L'antibiotique C-15003 est administré aux animaux à sang chaud portant des tumeurs à à une dose ce 0,8 à 50 mog/kg/jour. Comme mentionné ci-dessus, l'antibiotique 0-15003 comprend l'antibiotique C-15003 P-3, P-3' et P-4 et dans les compositions pharmaceutiques selon l'invention, un antibiotique C-15003 P-3, P-3 ou P-4 isolé peut être utilisé ou un mélange de un ou plusieurs de ceux-ci, c' est-à-dire un mélange d'antibiotiques O-15003 P-3 et P-4 , un mélange d'antibiotique C-15003 Pour et P-4 , un mélange d'antibiotique C-15003 P-3 et P-31 et un mélange d'antibiotique C-15003 P-3, P-3' et P-4. De fagon pratique, un mélange de l'antibiotique C-15003 P-3, P-3' et P-4 est préférable. Chacun des composants ou leur mélange ne sont pas nécessairement purifiés. Comme il a été indiqué ci-dessus, les antibiotiques C-15003 P-3 , P-3' et P-4 sont tous des composés nouveaux ayant la même structure de base et ils peuvent être utilisés également comme intermédiaire pour la préparation d'autres composés pharmaceutiquement utiles. En procédant à une réaction de déacylation, on peut obtenir P-15003 P-O (maytansinol) portant un groupement hydroxyle en position 3.En raison du groupement acyle en position beta par rapport au groupement carbonyle, la réaction d'hy drolyse réductrice usuelle peut être employée de façon avantageu se. Ainsi au moyen d'un complexe d'un nitrure métallique comme par exemple nitrure de lithium aluminium (LiAlH4) à température basse (par exemple 20-0 C) la liaison O-ester en position 3 peut être coupée par voie hydrolytique sans, pour autant, affecter d'autres groupements fonctionnels comme, par exemple, le groupement carbonyle, époxy , des doubles liaisons carbone-carbone en vue de former le maytansinol. Les caractéristiques physiques et chimiques de l'échantillon de maytansinol, ainsi obtenu, correspondent aux indications fournies par Kupchan et al dans 'Journal of American Chemical Society 97, 5294 - 5215 (1975)." Les exemples suivants sont destinés à illustrer, sans pour autant limiter l'invention. Dans ces exemples les parties sont les parties en poids à moins d'indication contraire et la relation entre parties et parties en volume correspond à celle existant entre grammes et millilitres et le pourcentage est bas sur le rapport poids/volume à moins d'indications contraires. Exemple 1 Une souche Nocardia n C-15003 (IFO 13726 ; FERM 3992; ATCC 31281) amenée à croître sur un milieu de glose à l'extrait de malt et à l'extrait de levure a été utilisée pour inoculer un fermenteur à 200 parties en volume contenant 40 parties en volume d'un milieu de culture d'ensemencement (2 % de glucose, 3 % d'amidon soluble, 1 % de farine de soja brute, 1 % de liqueur de macération de mais, 0,5 % de polypeptone, 0,3 % de NaCl, 0,50% de CaCO3 et un pH de 7,0). le milieu inoculé a été incubé à 280C pendant 48 heures pour obtenir un inoculé, 0,5 partie en volume d'une portion dudit inoculum ainsi obtenu est transféré dans un fermenteur à 200 parties en volume contenant 40 parties en volume d'un milieu de fermentation composé de 5 ffi de dextrine, 3 * de liqueur de macération de mais, 0,1 % de polypeptone et 0,5 ffi de CaCO3, pH 7,0), et l'on cultive à 280C pendant 90 heures pour former un inoculum (culture d'ensemencement). Comme cela a été déterminé par la méthodes de dilution en série en utilisant Tétrahymena Pyriformis W à titre d'orga nlsme d'essai et l'antibiotique C-15003 P-3 à titre d'échantillon standard, on a trouvé que la culture ainsi préparée a un tiare de 25 g/ml. Exemple 2 10 parties en volume d'une portion de l'inoculum (ensemencement) obtenue dans l'exemple 1 sont transférés dans un fermenteur à 2000 parties en volume contenant 500 parties en volume d'un milieu de culture d'ensemencement, la même que ci-des sus et l'ensemble est incubé à 280C pendant -48 heures. Une portion de 500 parties en volume de la culture résultante est- trans- férée dans un tank en acier inoxydable à 50.000 parties en volume contenant 30.000 parties en volume du milieu d'ensemencement et l'ensemble est cultivé à 280C sous aération (30.000 parties en volume par minute) agitation (280 tours par minute (1/2 DT) et à une pression interne de 1 kg/cm2 pour obtenir une culture d'ensemencement.Cette culture est utilisée pour ensemencer un tank en acier inoxydable à 200.000 parties en volume contenant 100.000 parties en volume d'un milieu de fermentation similaire à celui utilisé dans l'exemple 1 à une vitesse d'inoculation de 10 56 . te milieu inoculé a été incubé à 280C sous aération (100.000 parties par volume par minute) , agitation (200 tours par minute (1/2 DT) et à une pression interne de 1 kg/cm2 pendant 90 heures. Comme déterminé par le mEme procédé que celui décrit dans l'exemple I , on a trouvé un titre pour la culture de 25 g/ml. Exemple 3 On additionne à 95.000 parties en volume de la culture obtenue dans l'exemple 2, 2000 parties de Hyflo-supercel(R) (Johnes and Manville Produts, Etats-Unis) et après mélange complet, le mélange est filtré avec un filtre sous pression pour obtenir 85.000 parties en volume d'un filtrat et 32.000 parties de cellules humides. Le filtrat à 85.000 parties en volume est agité et extrait avec 30.000 parties en volume d'acétate d'éthyle le. Ce procédé a été répété une fois. La couche acétate d'éthyle a été stockée, lavée deux fois avec des portions de 30.000 parties en volume d'eau, séchée par addition de 500 parties de sulfate de sodium anhydre et concentrée sous pression réduite jusqu'à 200 parties en volume. L'éther de pétrole est additionné au concentrat et le précipité résultant est récupéré par filtration (53 parties). Ce produit brut, de formule I, a été agité avec 100 parties en volume d'acétate d'éthyle et les insolubles ont été séparés par filtration. Le filtrat est agité avec 10 parties de gel de silice (Merck Allemagne de l'Ouest o,a5-0,2 mE) et l'acétate d'éthyle a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été appliqué au sommet d'une colonne de gel de silice (400 parties par volume). L'élution est effectuée avec 500 parties en volume d'hexane, 500 parties en volume de mélange hexane-acétate d'éthyle 3:1, 500 parties en volume du mélange hexane-acétate d'éthyle 1:1, 500 parties en volume d'un mélange hexane-acétate d'éthyle 1:1, 500 parties en volume d'un mélan- ge hexane-acétate d''éthylel:3, 500 parties en volume d'acétage d'éthyle et 1000 parties en volume d'un mélange acétate d'éthyle-méthanol 50sl , l'éluat ayant été collecté dans des fractions de 100 parties en volume. Une portion de 1 partie par volume de chacune des fractions a été concentrée jusqu'à siccité et 0,1 partie par volume d'acétate d'éthyle a été additionnée au concentrat pour donner un mélange. Le mélange a été disposé à 2,5 cm à partir du bord inférieur de la plaque en verre de gel de silice (MerckW Allemagne de l'Ouest 60 F254, 0,25 mm 20 x 20) et développé sur environ 17 cm avec un systeme de solvant acétate d'éthyle-mE- thanol 19:1. Après développement la détection est effectuée avec la lumière ultraviolette (2537 ). Les fractions actives n 23-n 28 de Rf 0,6 - 0,65 ont été collectées et concentrées sous pression réduite jusqu'à environ 20 parties en volume. On a additionné à ce concentrat 150 parties en volume d'éther de pétrole pour obtenir 15 parties d'un produit brut Il. Exemple 4 32.000 parties des cellules humides obtenues dans l'exemple 3 ont été extraites sous agitation avec 50.000 parties en volume d'un mélange acétone 70 % eau pendant 3 heures et en-, suite filtrées avec un filtre sous pression. L'extraction avec 50.000 parties en volume du mélange acétone eau et la filtration subséquente a été répétée une fois encore. les filtrats ont été stockés et l'acétone a été éliminée par concentration sous pression réduite Le système aqueux résultant est amené à passer à travers une colonne de 5.000 parties en volume de Diaion HP-10 de Mitsubishi Kasei K.K. La colonne a été lavée avec 20.000 parties en volume d'eau et d'éthanol à 50 %, puis suivie par éluiton avec 15.000 parties en volume d'un mélange eau-méthanol à 90 %.L'éluat est concentré sous pression réduite jusqu'à 3.ObO parties en volume et agité avec 3.000 parties en volume d'eau et 3.000 parties en volume acétate d'éthyle.Le procédé cidessus est répété une seconde fois. Les couches d'acétate d'éthyle sont combinées, lavées avec de l'eau et séchées par addition de sulfate de sodium anhydre et concentrées sous pression réduite jusqu'à 200 parties en volume. Après addition d'éther de pétrole, le précipité est récupéré par filtration (28 parties) Le produit susnommé est purifié au moyen d'une colonne de gel de silice en vue de récupérer 8,0 parties de produit brut Il. Exemple 5 On dissout dans 10 parties en volume d'acétate d'éthyle 1,5 partie du produit brut de formule II obtenu dans l'ex- emple 3 et la solution est agitée avec 4 parties de gel de silice (Merck, Allemagne de l'Ouest 0,05-0,2 mm). L'acétate d'éthyle est éliminé sous pression réduite. Le résidu est appliqué au sommet de la colonne contenant 300 parties en volume de gel de silice et la colonne a été tout d'abord lavée avec 500 parties en volume de chloroforme et puis éluée avec 500 parties en volume d'un mélange chloroforme-méthanol (50:1), 500 parties en volume d'un mélange chloroforme-méthanol (20:1) et 500 parties en volume d'un mélange chloroforme-méthanol (10:1). L'éluat est collecté dans des fractions de 25 parties en volume.Des portion de 0X5 partie en volume de chaque fraction sont concentrées sous pression réduite. On additionne au concentrat 0,05 partie en volume d'acétate d'éthyle et le mélange sous forme d'échantillon est soumis à une chromatographie en couche mince de gel de silice en utilisant un système de développement I chloroforme-méthanol (9:1) Les fractions n 39 et 40 absorbant à 2537 A dans la zone de Rf 0,50-0,60 sont collectées et concentrées jusqu'à siccité sous pression réduite.On additionne au résidu 2 parties en volume d'acétate éthyle et le mélange est maintenu au repos de sorte qu'il se forme 0,150 partie de cristaux de l'anti- biotique C-15003 Les cristaux susnommés de l'autibiotique C-15003 (0,150 partie) sont dissous dans 15 parties en volume de méthanol suivie par une addition de 0,300 partie de chlorure de sodium et de 15 parties en volume d'eau.Une colonne est garnie avec 200 parties en volume de Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei K.E) et calibrée avec 100 parties en volume d'un mélange méthanol-50% eau contenant 5 * de NaC l'échantillon de solution préparé cidessus est passé à travers la colonne et on effectue une élution en gradient en utilisant 1.500 parties en volume d'un mélange méthanol 60 56 - eau contenant 5 % de NaCl et 1500 parties en volume d'un mélange méthanol-eau à 95 % . L'éluat est collecté dans des fractions de 15 parties en volume et chaque fraction est examinée par chromatographie en couche mince sur gel de silice.Les fractions 145 à 153 contiennent C-15003 P-3, les fractions 167 à 180 contiennent C-15003 P-3' et P-4 et les fractions 185 à 190 contiennent C-15003 P-4. Chaque troupe de fraction est concentré et dissous par addition de 50 parties en volume d'eau et 100 parties en volume d'acétate d'éthyle. la solution est secouée dans un entonnoir séparé et la couche aqueuse est séparée et après lavage avec des portions de 50 parties en volume d'eau, la couche d'acétate d'éthyle est séchée sur du sulfate de sodium anhydre concentré et maintenu au repos. On obtient ainsi des cristaux correspondant à chaque groupe de fractions. Ces cristaux sont collectés par filtration et séchés. C-15003 P-3 0,070 partie C-15003 P-3' p~4 0,018 partie C-15003 P-4 0,015 partie Les-cristaux mélanges de C-15003 P-3' et P-4 (0,018 partie) sont dissous dans 0,3 partie en volume d'acétate d'éthyle et appliqués sur une ligne à une distance de 2,5 cm à partir du bord inférieur de la plaque en verre de gel de silice (Merck, -Allemagne de l'Ouest, Kieselgel 60 S254 0,25 mm, 20 x 20), On procède ensuite au développement avec un mélange acétate d'éthyle-méthanol (19:1). Après développement jusqu'à environ 18 cm ma bande d'absorption à Rf 0,68 (P-4) et Rf 0,65 (P-3') sont séparées et chacune a été extraite indépendamment deux fois avec de l'acétate d'éthyle contenant une faible quantité d'eau. L'extrait d'acétate d'éthyle résultant est lavé avec de 1'eau, séché sur du sulfate de sodium anhydre concentré sous pression réduite et maintenu au repos. 0,010 partie de cristaux de C-15003 P-4 et 0,003 partie de cristaux de C-150Q3' ont été obtenues à partir de fractions de RS 0,68 et Rf 0,65 respectivement. Exemple 6 Un millier de parties en volume de la culture de l'exemple 2 sont inoculés dans un tank de 200.000 parties en volume en acier inoxydable contenant 100.000 parties en volume d'un milieu de culture d'ensemencement et le milieu inoculé a été incubé à 280C sous aération (100.000 parties en volume/minute) et une agitation de 200 tours/minute pendant 48 heures pour préparer une culture d' asemencement. Cette culture d'ensemencement est transférée dans un tank en acier inoxydable de 2.000.000 de parties en volume contenant 1.000.000 de parties en volume d'un milieu de fermentation similaire à celui utilisé dans l'exemple 1 à une vitesse de transplantation de 10 %.La culture est effectuée à 280C sous aération (1.000.000 de parties en volume/minute) une agitation de 120 tours/minute (1/3DT) et une pression interne de 1 kg/cm2 pendant 90 heures. La culture résultante a été trouvée comme ayant un titre de 20 Fg/ml- la suite du procédé de test décrit dans l'exemple 1. A 900.000 parties en volume de la culture susnommée on additionne 900.000 parties en volume d'acétone et après une agitation d'une heure, 20.000 parties de Hyflo-Supercel (Johnes & Manville, U.S.A) sont additionnées. Le mélange est encore agité et filtré sur une machine de filtration sous pression. A 1.700.000 parties en volume du filtrat résultant on additionne 500.000 parties en volume d'eau et on extrait dans un Podbielniak (Podbielniak, Inc.) le mélange avec 1.000.000 de parties en volume d'acétate d'éthyle. La couche d'acétate d'éthyle est lavée avec de l'eau , séchée par addition de sulfate de sodium anhydre et concentrée sous pression réduite On additionne au concentrat de l'éther de pétrole et le précipité résultant est récupéré par filtration et séché. On obtient par le procédé susnommé 66 parties d'un produit brut de formule I. Le produit brut, comme dans les exemples 3, 4 et 5 est ensuite sé ché en vue d'obtenir 9,5 parties de C-15003 P-3, 0,300 partie de C-15003 P-3' et 2,5 parties de C-15003 P-4. Exemple 7 On dissout dans 1 partie en volume de tétrahydrofura ne 0,015 partie de cristaux d'antibiotique C-15003 obtenu dans l'exemple 5 et après que la solution ait été refroidie à -5 C, on additionne 0,012 partie d'hydrure de lithium aluminium. Le mélange est maintenu au repos pendant 2 heures. Après addition dd 0,5 partie en volume d'une solution aqueuse à 1 % de H H04, le mélange réactionnel est extrait avec 2 parties en volume d'acétate d'éthyle. La couche d'acétate d'éthyle est lavée avec de l'eau, séchée par addition de sulfate de sodium anhydre et concentrée sous pression réduite.La chromatographie en couche mince sur gel de silice prêparative a été effectuée sur le concentrat et la zone de Rf 0,25 à 0,3 a été grattée et extraite avec de l'acétate d'éthyle contenant une faible quantité d'eau. Cet extrait est lavé avec de l'eau, séché sur du sulfate de sodium anhydre et concentré sous pression réduite pour former des cristaux. On obtient par ce procédé 0,010 partie de P-15003-P-O, point de fusion : 174 C. Analyse élémentaire, trouvé C 59,65 ; H 6,58 ; N 5,02; C1 6,51 ; calculé pour C28H37C1 N208 C 59,52 ; H 6,60, N 4,96 ; C1 6,27. IR s 1715, 1670, 1580 (cm-) UV (nm) : 232 (32750) , 244 (épaulement 30850), 252(31650), 281(5750), 288(5700). Ce produit est identique en ce qui concerne ses propriétés au maytansinol. ESSAIS DE L'ACTIVITE ANTITUMORAIE DE L'ANTIBIOQUE C-15003 Dans ces essais les termes tumeurs, néoplasie, leucémie, sarcome, carcinome, sont utilises de façon interchangeable. Tous ces essais en ce qui concerne l'activité antitumorale de l'antibiotiqueC-15003 ont été effectués suivant les protocoles de triage et les méthodes d'évaluation des agents antitumoraux décrits par le-National Cancer Institute, Nationale Institute of Health, U.S.A. (Protocole NCI) (voir également Cancer Chemotherapy Reports (Partie 3) Volume 3, No 2, 1972, pages 1-103. le mélanome B 16 et la leucémie L 1210 obtenus à partir du National Cancer Institute, U.S.A en 197L ont été maintenus dans des souris C57B1/6 et DBA/2 (Cancer Chemotherapy Reports (Partie 1) Volume 50, No 5, 1975, pages 919-928), respectivement. La leucémie P388 fournie par le Japan Cancer Chemotherapy Center en 1975 a été maintenue dans des souris DBA/2. Le mastocytome P 815 dans des souris DBA/2, le carcinome de Ehrlich et le sarcome 180 dans des souris JCR-JCL. Différentes souches de souris femme et mâle ayant un âge de 5 à 7 semaines, ont été utilisées pour chaque tumeur. Essais n0 1 Effets de C-15003 (Mélange de C-15003 P-3, C-15003 P-3' et C-15003 P-4) sur le temps de survie pour des souris portant la leucémie P-388 Des souris (C57Bl/6 x DBA/2)F1 (BDF1) (dans un groupe de 3 ou 5 souris) pesant 18 4 à 22 g ont été inoculées de façon in- trapéritonéale avec 1 x 106 cellule de leucémie P388 au jour 0. L'antibiotique C-15003 (un mélange de C-15003 P-3 (60 à 65 % en poids/poids), C-15003 P-4 (30 à 35 % en poids/poids et C-15003 P-3') sont mis en suspension dans une solution contenant 1 % de Tween 80-0,85 * d'une solution saline physiologique et la suspension est administrée de façon intrapéritonéale. à des animaux inoculés de tumeurs (0,2 ml/pour chaque souriq) une fois par jour pendant 9 jours, 24 heures après l'inoculation de la tumeur. Pour évaluer l'activité antitumorale de l'antibiotique C-15003 on a calculé le rapport 5!/C % qui est le rapport x 100 de la durée moyenne de survie de souris portant la leucémie P388 traitées (T) avec l'antibiotique C-15003 par rapport aux souris non traitées (C) .Un rapport T/C * supérieur à 125 a été con déré comme étant une activité antitumorale positive suivant les protocoles NCI Tableau 5 Dose n des Durée de survie T/C % mog/kg/jour souris moyenne (jours) 25 3 24,5 227 12,5 3 20,0 185 6,25 3 21,5 199 (contrôle) 11 10,8 50 5 9,5 82 25 5 22,5 194 12,5 5 22,5 194 6,25 5 22,5 194 3,13 5 19,5 168 1,6 5 15,0 129 0,8 5 12,5 108 0,4 5 12,5 108 (contrôle) 20 11,6 L'administration de doses intrapéritonéale journalières de 1,56 à, 25 mcg/kg de l'antibiotique pendant 9 jours prolonge la durée de survie de souris traitées de façon significative. On constate, en particulier, la prolongation la plus importante du temps de survie pour des souris traitées pour une dose de 25 mcg/kg (dose optimale) (T/C % de 227). Essais n 2 Effets de C-15003 P-3 et C-15003 P-4 sur le temps de survie de souris portant la leucémie P388 Des souris BDF1 (5 souris par groupes testés) pesant 18 à 22 g, ont té inoculées de façon intrapéritonéale avec 1 x 106 cellules de leucémie P388 au jour 0 . Chaque antibiotique a été dissous dans une solution contenant 2,5 % de méthanol-0,85 % de solution physiologique saline et la solution a été adminis- trée de façon intrapéritonéale à des souris (0,2 ml pour chaque souris) une fois journalièrement pendant 9 jours, 24 heures suivant l'inoculation de la tumeur. Comme décrit dans l'exemple 1, plus de 125 dans le rapport T/C % sont considérés comme une activité antitumorale positive conformément au protocole NCI Comme cela est résumé dans le tableau 6 suivant, 1' admi- nistration de C-15003 P-3 à des doses journalières intrapéritonéale de 1,6-25 mcg/kg ou celle de C-15003 P-4 à des doses intrapéritonéales de 0,8 à 50 mag/kg prolonge la durée de survie de souris traitées de fagon significative. Un effet maximum a été observé pour une dose journalière de 25 mcg/kg de chacun des agents testés. Tableau 6 Dose T/C % mcg/kg/jour C-15003 P-3 C-15003 P-4 50 118 125 25 223 195 12,5 177 177 6,25 168 180 3,13 159 145 1,6 144 141 0,8 123 132 0,4 105 105 Effet de l'antibiotique C-15003 (un mélange de C-15003 P-3 C-15003 P-3 et C-15003 P-4) sur la durée de survie de souris. portant le mélanome B 16 Un gramme de tumeur-a été homogénéisé avec 10 ml d'une solution physiologique saline à 0,85 * froide et 0,5 ml de cette solution homogène de tumeur a été inoculé intrapéritonéalement à des souris BDF1 (5 animaux par groupes testés) comme cela est décrit dans le protocole NCI. D'antibiotique C-15003 (un mélange -de C-15003 P-3 (60 à 65 % en poids/sur poids), C-15003 P-4 (30 à 35 % en poids) et C15003 P-3') est mis en suspension dans une solution à 1 % de Tween 80-0,85 * de solution physiologique saline et la suspension est administrée de façon intrapéritonéale à des souris une fois par jour pendant 9 jours , 24 heures après l'inoculation de la tumeur. (5 souris dans chaque groupe et 15 souris dans le groupe de contrôle ont été utilisées). Le rapport T/O f en ce qui concerne le temps de survie mo- yen a été calculé comme décrit dans l'exemple 1 et un rapport T/C % à 125 a été considéré comme une activité antitumorale positive. Comme cela est représenté dans le tableau 7, la durée de survie de souris traitées avec l'antibiotique C-15003 a été nettement plus longue que celle des souris non traitées. Tableau 7 Dose No de Durée de mcg/kg/jour souris survie moyenne (jour) T/C * 24 5 29,5 159 12 5 31,5 170 6 5 35,5 192 3 5 34,) 186 1,5 5 29,0 157 (Contrôle 15 18,5 24 5 31,5 213 12 5 28,5 193 6 5 22,5 152 3 5 16,2 109 (Contrôle) 15 14,8 Exemple 5 Effets de C-1500) P-5 - Essais C-15003 P-4 sur le temps de survie de souris portant le mélanome B-16 Des souris BDF1 (5 animaux par groupes testés) sont inoculées intrapéritonéalement avec une suspension de mélanome B 16 suivant le procédé décrit dans l'exemple 3. Chaque antibiotique est dissous dans une solution à 2,5 % de méthanol-0X85 X de solution physiologique saline et la solution est administrée de façon intrapéritonéale à des souris (0,2 ml pour chaque souris) une fois par jour pendant 9 jours, 24 heures après l'inoculation de la tumeur. Comme cela est représenté dans le tableau 8, l'administration de C-15003 ; P-3 ou C-15003 P-4 à des doses journalières de 1,6-50 mcg/kg prolonge le temps de survie de souris traitées de façon significative. Tableau 8 Dose mog/kg/jour C-15003 P-3 T/C% C-15003 P-4 50 > 219 > 219 25 > 219 > 219 12,5 207 199 6,25 189 182 3,13 156 159 1,6 128 122 0,8 116 103 o,4 105 104 Exemple 5 Effets de l'anibiotique C-15003 (un mélange de C-15003 P-3 C-15003 P-3' et C-15003 P-4) et C-15003 P-3 sur le temps de survie de souris portant la leucémie 11210. Des souris BDF1 (5 animaux par groupes testés) sont inoculées de façon intrapéritonéale avec 1 x 105 cellules de leucémie L1210 au jour 0. I L'antibiotique C-15003 (un mélange de C-15003 P-3 (60 à 65% en poids/poids), C-15003 P-4 (30 à 35 % en poids/poids et C-15003 P-3') et C-15003 P-3 sont respectivement dissous dans une solution de 2,5 0% de méthanol - 0,85 5 % de solution physio- logique saline et chaque solution est administrée intrapéritonéa -lement a' des souris inoculées avec une tumeur (0,2 ml/souris) une fois par jour pendant 9 jours, 24 heures après l'inoculation de la tumeur. L'évaluation de l'activité antitumorale des agents testés, a été effectuée en déterminant le rapport T/C % et le rapport x 100 de la durée de survie moyenne de souris portant T1210 traitées avec lesdits agents aux souris non traitées (un groupe de 25 souris) comme cela est décrit dans les protocoles NCI Un rapport T/C * de 120 a été considéré comme une valeur mini- male en ce qui concerne l'activité antitumorale des agents. Comme cela ressort du tableau 9, les mélanges de C-15003 P-3 C-15003 P-3' et C-15003 P-4, et C-15003 P-3 sont efficaces pour prolonger le temps de survie de souris portant la leucémie 11210. Tableau 9 Agent Dose No de Durée de mog/kg/jour souris surive T/C % moyenne (jours) Le mélange de 40 5 12,0 128 C-15003 P-3 30 5 12,2 130 C-15003 P-3' 20 5 11,0 117 et C-15003 P-4 10 5 10,2 109 C-15003 P-3 40 5 11,0 117 30 5 12,2 130 20 5 11,2 119 10 5 10,4 111 Contrôle 25 9,4 Exemple 6 Effets de C-15003 P-3 et C-15003 P-4 sur la durée de survie de souris portant le sarcome 180 Des souris ICR-JCL (achetées de Japon Clea Tokyo) (5 animaux par groupement groupes testés) sont inoculées de façon intrapéritonéale avec 4 x 106 cellules de sarcome 180 au jour 0. ; Chaque antibiotique est dissous dans une solution de 2,5 % de méthanol-0,85 % de solution physiologique saline et la solution est administrée intrapéritonéalement à des souris inoculées de la tumeur (0,2 ml pour chaque souris) une fois par jour pendant 7 jours, 24 heures après l'inoculation de la tumeur. On calcule le rapport T/C % en temps de survie moyen comme décrit dans l'exemple 1. Comme cela ressort du tableau 10 les deux agents ont une efficacité significative en ce qui concerne leur prolongation de la durée de survie d'animaux portant le sarcome 180. Tableau 10 Agent Dose No Durée de sur- T/C % mog/kg/jour souris vie moyenne (jours) C-15003 P-3 25 5 24,5 188 C-15003 P-4 25 5 33,5 258 Contrôle 10 13,0 C-15003 P-3 50 5 33,5 284 25 5 30,5 258 12,5 5 15,5 131 6,25 5 17,8 150 Contrôle 10 11,8 ExemPle 7 Effets de C-15003 P-3 et C-15003 P-4 sur le temps de survie de souris Portant le carcinome d'Ehrlich Des souris ICR-JCL (5 animaux par groupes testés) sont inoculées de façon intrapéritonéale de 4 x 106 cellules du carcinome d'Ehrlich au jour 0. Chaque antibiotique est dissous dans une solution à 2,5 % de méthanol-0,85 % de solution physiologique de saline et la solution est administrée intrapéritonéalement à des souris (0,2 ml/souris) une fois par jour pendant 7 jours, 24 heures après l'inoculation de la tumeur. Le rapport T/C % en durée de vie moyenne comme décrit dans l'exemple 1 a été calculé. Comme cela ressort du tableau Il, les deux agents ont été efficaces de façon significative en ce qui concerne la prolongation de la durée de survie de souris portant le carcinome d1Ehrlich Tableau 11 Agent Dose No de Dure moyenne D/C % mcg/kg/jour souris de survie (jours) C-15003 P-3 50 5 > 21,5 > 171 25 5 > 21,5 > 171 12,5 5 > 21,5 > 171 6,25 5 2l,5 > 171 C-15003 P-4 25 5 > 21,5 > 171 Contrôle 10 12,6 Exemple 8 Effets de C-15003 P-3 et C-15003 P-4 sur le temps de survie de souris portant le mastocytome P 815 Des souris BDF1 (5 animaux par groupes testés) sont inoculées de façon intrapéritonéale de 1 x 106 cellules de mas- tocytome P 815 au jour 0. Chaque antibiotique est dissous dans une solution à 2,5 % de méthanol 0,85 * de solution physiologique saline et la solution est administrée de façon intrapéritonéale à des souris inoculées de la tumeur (0,2 ml/par animal) une fois par jour pendant 7 jours, 24 heures après l'inoculation de la tumeur. Le rapport T/C % en durée de survie moyenne tel-que décrit dans l'exemple 1 a été calculé. Comme cela ressort du tableau 12, les deux agents étaient efficaces de façon significative en ce qui concerne la prolongation de la durée de survie de souris-portant le mastocytome P 815 à des doses utilisées dans l'essai. Tableau 12 Agent Dose No de Durée de survie - T/C % mog/kg/jour souris moyenne (jours) C-15003 P-3 50 5 10,3 61 25 5 > 28,5 > 170 12,5 5 > 28,5 > 170 6,25 5 > 28,5 > 170 C-15003 P-4 25 5 > 28,5 > 170 > 170 (Contrôle) 10 16,8 REVENDICATIONS 1. Antibiotique dénommé C-150Q3 caractérisé par le fait qu'il répond à la formule générale dans laquelle R représente 2. Antibiotique selon la revendication 1 dans laquelle R désigne 3. Antibiotique selon la revendication 1 , caractérisé par le fait que R désigne -CO-CH2-CH2-CH3 4. Antibiotique selon la revendication 1 , caractérisé par le fait que R désigne 5.Procédé de préparation de l'antibiotique C-15003, caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver un microorganisme appartenant au genre Nocardia et qui est capable de produire l'antibiotique C-15003 dans un milieu de culture contenant des sources de carbone assimilable, des sources d'azote digestible jusqu'à ce que l'antibiotique soit substantiellement accumulé dans ledit milieu et que l'on récupère ensuite l'antibiotique C-15003 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le microorganisme est Nocardia No C-15003 (ATCC 31281; IFO 13726 ; FERM 3992). 7. Procédé de préparation du composé répondant à la formule s caractérisée par le Sait qu'il consiste à soumettre l'actif biotique C-15003 répondant à la formule générale s 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que l'hydrolyse réductrice est conduite en utilisant un complexe d'hydrure de métal, 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le complexe de l'hydrure de métal est l'hydrure de lithium aluminium. 10. Composition à activité antifungique et antiprotozoaire, caractérisée par le fait qu'elle contient au moins un antibiotique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1à4 11. Composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle contient, à titre de substance active, une quantité et- ficace de l'antibiotique C-15003 telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 4. 12. Composition pharmaceutique selon la revendication 11, caractérisée par le fait. qu'elle contient à titre de substance active l'antibiotique C-15003 P-3. 13. Composition pharmaceutique selon la revendication 11 caractérisée par le fait qu'elle contient à titre de substance active, l'antibiotique C-15003 P-3'. 14. Composition pharmaceutique selon la revendication l1 caractérisée par le fait qu'elle contient comme ingrédient actif l'antibiotique 0-15003 P-4. 15. Composition pharmaceutique selon la revendication 11, caractérisée par le fait que la substance active est constituée par un mélange de l'antibiotique C-15003 P-3, l'antibiotique C-15003 P-3' et l'antibiotique C-12003 P-4. 16. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisée par le fait qu'elle se présente sous la forme d'une injection. 17. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications ll à 16, caractérisée par le fait que la composi- -tion comprend l'antibiotique C-150Q3 et un milieu liquide. 18. Composition pharmaceutique destinée au traitement d'animaux à sang chaud portant une ou plusieurs tumeurs, caractérisée par le fait que la composition est telle que définie dans lune quelconque des revendications 11 à 17.