FR 2407000 A1 19790525 FR 7830517 A 19781026 La présente invention concerne le domaine des vaccins pour l'immunisation contre les infections provoquées par Haemophilus influenzae > type b, telles que la méningite. Plus particulièrement l'invention concerne (1) un procédé pour isoler un polysaccharide antigénique constitué de polyribosylribitol-phosphate (PRP) des cultures d'Haemophilus influenzae type b; et (2) un procédé pour préparer un vaccin combiné contenant du PRP et des antigènes de B. pertussis. Le PRP de l'invention est également efficace lorsqu'on l'utilise en association avec d'autres souches de bactéries non pathogènes telles que E. coli, B. subtilis, S. aureus, B. punilus et L. plantarum, pour déclencher une réponse de production d'anticorps chez les animaux a sang chaud. On a étudié les caractéristiques d'agent immunogène protecteur du poly-ribosylribitol-phosphate (PRP) d'Haemophilus influenzae type b. Cependant on n'est pas parvenu a obtenir une réponse antigénique active chez les enfants et les jeunes animaux. Le procédé de purification de l'art antérieur utilise de l'éthanol et du Cetavlon (bromure d'hexadécyltriméthylammonium). On élimine les contaminants les endotoxines et les substances pyrogènes avec du phénol froid ou du chloroforme et du butanol tertiaire, ce qui peut réduire la nature antigénique de ce polysaccharide. La demanderesse a découvert un nouveau procédé pour l'isolement et la purification de PRP å activité immunologique a partir d'Haemophilue influenzae type b. Le procédé de l'invention, qui est décrit ci-après, présente des avantages importants par rapport aux procédés de l'art antérieur en ce que tous les contaminants (acides nucléiques, protéines et endotoxines) sont éliminés jusqu'a une teneur minimale par traitement avec l'hydroxy-apatite. Le PRP produit selon le procédé de l'invention est un polysaccharide dont le poids moléculaire a une valeur supérieure à celles précédemment indiquées. Surtour le PRP préparé selon le nouveau procédé de l'invention est très immunogène pour les animaux sang chaud, contrairement au PRP produit selon des procédés de l'art antérieur. Pour éliminer les contaminants (protéines, acides nucléiques et endotoxines) du polysaccharide PRP, on traite le polysaccharide partiellement purifié avec un adsorbant phosphaté qui n'adsorbe par le polysaccharide dans les conditions indiquées. L'invention concerne également un procédé pour préparer un vaccin combiné constitué de PRP et d'antigènes de B. pertussis ayant un caractère très immunogène chez les jeunes animaux. L'invention va être maintenant décrite en détail. (I) Isolement et purification du poly-ribosylribitol-phosphate qui est le polysaccharide capsulaire d'Haemophilus influenzae, type b. Organismes, milieu de culture et culture On utilise deux souches d'Haemophilus influenzae type b. La souche Rab a été fournie par Grace Leidy, Babies Hospital, Columbia University New York. La souche CK a été isolée chez un patient au Waterbury Hospital, Waterbury, Connecticut. On a repiqué les organismes plusieurs fois sur des souris pour assurer leur virulence. On a isolé les organismes du tissu cérébral des souris autopsiées, on les a repiqués sur, soit un milieu à 3,7 7. d'infusion de cervelle et drinfusion de coeur (Brain Heart Infusion1 BRI, de Difco Lab., Detroit, Michigan) soit une gélose à 5% de BRI additionnée de 0,01 % de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) (P-L Biochemicals, Milwaukee, Wisconsin) et 1X (en volume) de sang de cheval défibriné (Animal Blood Center, Syracuse, New York), puis, après répartition dans des ampoules de I ml, on a lyophilisé et conservé à -700C. Le milieu de base utilisé pour la culture des microorganismes contient 3,7% de BHI. Le milieu de base est additionné de 10 mg de NAD et de 20 mg d'hémine (Eastman Kodak, Rochester, New York) par litre. On ajoute 1% en volume de sang de cheval défibriné pour 50 ml de culture d'ensemencement. On utilise des additifs fraîchement préparés que l'on filtre avant l'emploi avec une unité filtrante Nalgene (ou45 pm) de Nalge Sybron Corp., Rochester, New York. Lorsqu'on cultive les organismes dans un fermenteur de 14 litres on ajoute de plus au milieu 0,5% de glucose. Pour préparer un flacon d'organismes d'ensemencement, on décongèle 1 ml de la culture stock congelée et on le transfère dans 50 ml de milieu enrichi en BHI additionné de sang de cheval défibriné et de NAD. On cultive pendant 8 heures a 370C sur un agitateur rotatif a 150 tr/min. On introduit les organismes sous forme d'un inoculum de 1% dans des portions de 500 ml de bouillon enrichi en BUl dans des flacons de 2 litres et on incube a 370C avec agitation modérée sur un agitateur rotatif pendant 8 heures (pour l'isolement du PRP) Ou 14 heures (pour les cultures d'ensemencement). On amorce la fermentation de chaque lot dans un fermenteur de 14 litres par transfert aseptique de 700 ml de la culture d'ensemencement dans 7 litres de bouillon enrichi en BHI additionné d'hémine au lieu de sang de cheval défibriné. On maintient en continu la culture à 37+1 C. On agite la cuve å 150 trfmin et on maintient un débit d'air de 0,25 1/1 de culture par minute. Pendant la culture on ajoute la demande 0,0017. d'une silicone antimousse (FD-82, Hodag Chemical Corp.). On poursuit les cultures jusqu'à la dernière phase logarithmique (8 à 10 x 109 cellules viables/ml) généralement pendant environ 8 heures, puis on arrête la culture par addition de formaldéhyde à 0,4% et repos pendant une nuit à 40C. Isolement du poly-ribosylribitol-phosphate (PRP) On centrifuge le bouillon de culture préparé comme précédemment décrit a 27 000 x g pendant 30 minutes 40C. On recueille le surnageant débarrassé des cellules et on le traite de la façon suivante Stade 1. précipitation par l'éthanoî On ajoute au surnageant de la culture, de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 4%. On ajuste le pH de la solution à 6,0-6,2 et on ajoute lentement en agitant énergiquement à 4"C, 44 litres d'éthanol dénaturé selon la formule 3A des Etats-Unis d'Amérique. On ajuste le pH du mélange a 6,8 avec de l'acide acétique glacial, puis on laisse reposer pendant 12 heures a 30C. On recueille le précipité par décantation, puis on centrifuge pour obtenir le PRP brut. Stade 2. traitement par le Cetavlon (bromure d'hexadécyltriméthylammonium) On dissout le précipité du stade 1 dans de l'eau distillée apyrogène et on centrifuge pour éliminer le résidu. On ajoute lentement la solution brune limpide à 100 ml d'une solution aqueuse 9 10% de Cetavlon en mélangeant (la concentration finale est de 0,5%). On agite le melange pendant 1 heure, puis on centrifuge; On mélange le précipité constitué de complexe du Cetavlon avec les acides nucléiques et le PRP avec 2 litres de chlorure de sodium 0,3 M On centrifuge la solution trouble pour éliminer les matières insolubles telles que les sels d'acide nucléique et de Cetavlon. On dilue le surnageant avec un volume égal d'eau pour que le sel de PRP et de Cetavlon précipite. On agite le melange,pendant une heure et on recueille le précipité par centrifugation, puis on le dissout dans 2 litres de chlorure de sodium 0,3M. Stade 3, précipitation par 1'méthanol. On élimine le Cetavlon et les contaminants constitués d'acides nucléiques et de protéines par précipitation par l'éthanol (au moins deux fois). un précipite le PRP comme décrit dans le stade 1, le Cetavlon étant dissous dans la solution alcoolique. On recueille le PRP par centrifugation, on le dissout dans 2 litres d'eau distillee apyrogène, puis on reprécipite comme précédemment décrit. On solubilise le précipité final de PRP dans une solution de phosphate de sodium 20 mM à pH 6,8. Stade 4 traitement par l'hydroxy-apatite On élimine sélectivement les contaminants (par exemple les acides nucléiques, les protéines et les endotoxines) de la préparation de PRP partiellement purifiée par adsorption sur un adsorbant contenant du phosphate de calcium tel que l'hydroxy-apatite (3 Ca3(PO4)2, Ca(OH2]. L'invention repose sur la découverte que le polysaccharide PRP n'est pas adsorbé par le tampon phosphate (20 mM) contenant du phosphate de calcium adsorbant ayant un pH d'environ 6,7 à 6,9 ; ou un tampon phosphate (50 mM) ayant un pH d'environ 5,8 ; cependant les contaminants (tels que les acides nucléiques, les protéines et les endotoxines) sont adsorbés dans ces conditions. On peut mettre en pratique le procédé de l'invention de façon discontinue ou en colonne. Dans le procédé discontinu, on ajoure llhydroxy- apatite a la préparation de PRP partiellement purifiée (dans du tampon phosphate 20 mM ; pH = 6,9). On mélange soigneusement et on centrifuge pour éliminer les solides indésirables (adsorbant et contaminants adsorbés par l'adsorbant).On soumet le liquide surnageant ai traitement précédent au moins encore deux fois. On filtre la solution obtenue sur des filtres Millipore, on dialyse contre de l'eau distillée apyrogène et on lyophilise. Lorsqu'on opère en colonne, on applique le PRP partiellement purifié dans du tampon phosphate 20 mM (pH au moins 5,8) a une colonne contenant l'hydroxy-apatite adsorbante que l'on a équilibrée avec du tampon phos phate 20 mM a pH 5,8 et on élue avec un gradient étagé de tampon phosphate de sodium (PH 5,8) allant de 20 mM à 100 mM. On recueille les fractions et on détermine les pentoses (pour mettre en évidence le poly-ribosylribitolphosphate). On dialyse contre de l'eau distillée apyrogène les fractions donnant une réaction positive des pentoses et on lyophilise. (II) Procédé pour préparer un vaccin combiné constitué de PRP d'H. influenzae type b et d'antigènes de B. pertussis Pour préparer un vaccin à base de PRP, on dissout du PRP lyophilisé (préparé comme précédemment indiqué) à la concentration de 20 Fg/ml dans du tampon salé phosphate (PBS) (0,113 g de phosphate monopotassique, 0,83 g de phosphate disodique et 8,5 g de chlorure de sodium par litre, pH 7,0 contenant 0,01% de thimérosal). On stérilise le vaccin par filtration sur des unités filtrantes Millipore de 0,45 Zum, on répartit en flacons de verre et on conserve à 40C. Pour préparer une solution concentrée de PRP, on pèse des quantités prédéterminées du polysaccharide et on les dissout dans du PBS de même composition que précédemment. On mélange ensuite cette solution concentrée de PRP avec un volume approprié d'une suspension de cellules fraîches de B. pertussis pour obtenir une solution stock. Les caractéristiques de B. pertussis souche 138 sont décrites dans Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8, édité par Buchanan and Gibbons, WMS and Wikins Co, Maryland, EUA, 1974, à la page 283. Cette souche est déposée et disponible a l'American Type Culture Collection, Maryland, EUA sous le n" 10.380.Le vaccin combiné de cette solution stock contient 200 yg de PRP et a une concentration cellulaire d'environ 70 unités d'opacité (op) par millilitre. On maintient la solution stock à 40C pendant 90 jours pour permettre la détoxification des antigènes de pertussis avant la préparation du produit final (vaccin) qui contient 10 pg de PRP et 3,5 unités op de cellules de pertussis par dose de 0,5 ml. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 On ajoute 2,5 g dlhydroxy-apatite (par exemple le Bio. gel HTP de Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californie) a 250 ml de préparations de PRP partiellement purifiées (après traitement par le Cetavlon et ltéthanol) contenant environ 1,0 mg de PRP/ml, dans du tampon phosphate de sodium 20 mN a pH 6,9 et on mélange au bain-marie glacé (1 a 40C) pendant 1 heure. On centrifuge le mélange avec un appareil Sorvall RC2-B pendant 30 minutes à 16 000 x g. On fait passer le liquide surnageant à travers un filtre Millipore de 0,65 pm et on répète encore deux fois le mode opératoire précédent en traitant chaque fois avec 2,5 g d'hydroxy-apatite.On filtre la solution obtenue sur des filtres Millipore de 0,65 lum et 0,45 ,um, on dialyse contre de l'eau distillée apyrogène et on lyophilise. Le produit lyophilisé présente une activité immunogène puissante (voir ci-apres le vaccin combiné et les expériences sur l'animal) et contient très peu de contaminants (tels que des acides nucléiques, des protéines et des endotoxines) (voir le tableau I ci-après). On obtient environ 170 mg de PRP lyophilisé. La récupération du PRP selon ce procédé est d'environ 70% par rapport au polysaccharide de départ. On doit conserver le PRP dans des conditions appropriées, par exemple a 4 C dans un dessiccateur sur du pentoxyde de phosphore et du gel de silice. Exemple 2 On dissout du PRP partiellement purifié (300 mg de PRP) dans 100 ml de tampon phosphate de sodium 20 mM à pH 5,8 (c'est-a-dire 3 mg de PRP/ml). On applique cette solution d la température ordinaire a une colonne (5,0 x 45 cm) d'hydroxy-apatite (avec un volume de lit d'environ 250 ml) que l'on a équilibrée avec du tampon phosphate de sodium 20 mM à pH 5,8 et on élue avec un gradient étagé de tampon phosphate de sodium 20 mM, 50 mM et 100 mM a pH 5,8. On recueille les fractions de 200 ml éluées avec le tampon phosphate 20 mM et 50 mM (pH 5,8) donnant une réaction positive des pentoses (détermination des pentoses selon la méthode a I'orcinol), on dialyse contre de l'eau distillée apyrogène et on lyophilise. On obtient environ 206 mg de PRP lyophilisé. On détermine la pureté du polysaccharide PRP par évaluation de sa contamination par les acides nucléiques, les protéines et les endotoxines. On détermine la concentration en protéines selon la méthode décrite par Lowry et coll., dans J. Biol. Chem., 193:265 (1951) avec de la sérumalbumine bovine comme étalon. On mesure les acides nucléiques par l'absorption de la solution de PRP à 260 nm. On attribue la valeur 1,0 à l'absorbance de 50 trg d'acide nucléique dans 1 ml d'eau dans une cuve ayant un trajet lumineux de 1 cm. On évalue la taille moléculaire par filtration sur gel dans des colonnes de 1,5 x 90 cm, garnies de Sepharose 4B ou 2B (Pharmacie Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey).On calcule le coefficient de partage (Kd) å partir du diagramme d'élution avec développement par réaction a l'orcinol (Herbert et coll., Methods in Microbiology, Vol. 5B, 285-291). Exemple 3 On prépare de la façon suivante un vaccin combiné contenant du PRP de H. influenzae type b et des antigènes de B. pertussis. On dissout 140 mg de PRP (préparé comme dans l'exemple 2) dans 350 ml de tampon salé phosphaté (PBS stérile), (0,113 g de phosphate monopotassique, 0,83 g de phosphate disodique et 8,5 g de chlorure de sodium par litre, a pH 7,0, contenant 0,01% de thimérosal), et on filtre sur un filtre Hillipore de 0,45 pm. On utilise cette solution concentrée de PRP (400 pg/ml) pour préparer un vaccin combiné constitué de PRP et d'antigènes de B. pertussis. A 150 ml de cette solution concentrée de PRP (400 pg/ml), on ajoute 150 ml d'une suspension cellulaire fraîche de B. pertussis (souche 138) dans le PBS à pH 7,0 (à une concentration cellulaire d'environ 149 unités d'opacité par millilitre) pour obtenir une solution stock du vaccin combiné. On maintient cette solution stock (300 ml) à 40C jusqu'à ce que la teneur en endotoxines de pertussis se soit abaissée (au moins 90 jours). On confirme la stérilité de la solution stock par des essais sur milieu au thioglycollate ( 32-330C). On contre le pH de la solution stock après 90 jours d'incubation et on l'ajuste à pH 7,0 + 1.Pour préparer le produit final (vaccin) utilisé pour les expériences sur l'animal, on dilue la solution stock combinée avec du PBS pour qu'elle contienne 10 (g de PRP et ait une concentration de cellules de pertussis de 3,5 unités d'opacité par dose de 0,5 ml. Les résultats de la réponse de production d'anticorps à ce vaccin combiné chez le jeune rat sont illustrés par les figures 1 et 2 ciaprès qui représentent la détermination radio-immunologique des teneurs en anticorps anti-PRP chez le rat Wistar, la moyenne géométrique du titre (cpm/100 l) étant représentée en ordonnées et le temps en semaines étant représenté en abscisses. Exemple 4 On prépare une solution stock de PRP (400 > ig/ml) par dissolution de 30 mg de PRP (préparé comme dans l'exemple 1) dans 75 ml de tampon salé phosphaté (PES). stérile et on filtre avec une filtre Millipore de 0,45 um. A 25 ml de ce PRP concentré on ajoute un volume égal (25 ml) d'une suspension cellulaire fraiche de B. pertussis (souche 138) dans le PBS à pH 7,0 (ayant une concentration cellulaire d'environ 149 unités d'opacité/ml) pour préparer une solution stock du vaccin combiné. On maintient cette solution stock a 40C pendant 90 jours au moins. On contrôle la stérilité de cette solution stock comme précédemment indiqué avec des milieux au thioglycollate. Le pH de la solution stock est de 7,0 + 1.Pour préparer le produit final (vaccin) utilisé pour les expériences sur l'animal, on dilue la solution stock combinée avec du PBS pour qu'elle contienne lOug de PRP et ait une concentration en cellules de pertussis de 3,7 unités d'opacité par dose de 0,5 ml. Exemple 5 On prépare une solution stock de PRP (200ug/ml) dans le PBS pH 7,0 comme dans l'exemple 4. Pour préparer une solution stock de pertussis (a 70 unités d'opacité/ml), on dilue 25 ml d'une suspension cellululaire fraîche de B. pertussis (149 unités d'opacité/ml) avec un volume égal de PBS. On incube séparément les deux solutions stock a 40C pendant 90 jours ou un peu plus. Pour préparer le vaccin combiné, on mélange 14 ml de solution stock de PRP (200 g/ml) et 14 ml de solution stock détoxifiée d'antigènes de pertussis (75 unités d'opacité/ml) et on dilue avec 112 ml de PBS (volume final : 140 ml).Le vaccin final utilisé pour les expériences sur l'animal contient 10 ug de PRP et 3,7 unités d'opacité de pertussis par dose de 0,5 ml. Les résultats de la réponse de production d'anticorps a ce vaccin combiné chez le jeune rat sont illustrés par la figure 3 (semblable aux figures 1 et 2) et sont regroupés dans le tableau II ci-après. Bien entendu diverses modifications peuvent etre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. TABLEAU I Caractéristiques physico-chimiques du PRP préféré Analyse Endotoxine Mode opératoire Taille moléculaire Pentose Acides nucléiques Protéines Test de pyrogéni- Test du lyset d (%) (%) (%) cité sur le lapin Limulusd Exemple 1 0a 36,0 0,8 0,7 10,0 1/400 Exemple 2 0,44b 33,8 0,3 0,7 10,0 1/1000 a) Avec du Sepharose 2B et 4B, poids moléculaire > 2.107 b) Avec du Sepharose 4B. c) Dose ( g de PRP/kg de poids corporel de lapins) ne provoquant pas de fièvre. d) Inverse de la dilution du PRP (100 g de PRP/ml) lorsqu'on effectue la comparaison avec l'El de Bureau of biologics (étalon d'endotoxine). L'exemple 1 décrit les caractéristiques d'Haemophilus influenzae type b, souche CK, disponible à l'ATCC sous le n 31 441. L'exemple 2 décrit les caractéristiques d'Haemophilus influenzae type b, souche Rab, disponible a la Babies Hosp. Columbia University de New York, EUA. TABLEAU II Imaunogénicité du complexe PRP-Pertussis chez le jeune rata Dose unique Activité en anticorps anti-PRP (cmp du H-PRP fixé/50 l de sérum ou multiple semaine après l'injection Facteur d'accroissement à la 3e semaine après l'injection par raport à la va Vaccin 0 1 2 3 leur avant l'immunisation Tampon salé phosphaté (M)b 99 116 107 158 1,6 Pertussis (M) 113 108 117 149 1,3 PRP (K) (Exemple 1) (M) 110 136 148 142 1,3 PRP (K) (3 mois) (U)d 108 136 132 147 1,4 + Pertussis (3 mois) (M) 101 136 1002 1771 17,5 (Exemple 5) PRP (K)+Pertussis (U) 93 146 135 140 1,5 (3 mois) Exemple 4) (M) 119 154 751 1410 11,8 a) 10 g de PRP ou 3 unités d'opacité de pertussis par dose de 0,5 ml. b) Rappel - respectivement à la deuxième et à la troisième semaines (injections multiples). c) Moyenne de dix rats. d) Injection unique. REVENDICATIONS I. Procédé pour isoler et purifier du poly-ribosylribitol-phosphate (PRP) à activité immunologique, le PRP étant le polysaccharide capsulaire d'Haemophilus influenzae type b, selon lequel on fait fermenter des souches d'Haemophilus influenzae type b dans des conditions connues en soi, on isole le PRP par précipitation classique par ltethanol, puis on isole le PRP sous forme d'un complexe avec le bromure d' h?xadécyltriméthyl-ammonium selon des procédés classiques, caractérisé en ce que, pour purifier le PRP ainsi isolé, on le traite par un adsorbant contenant du phosphate de calcium tel que l'hydroxy- apatite L! Ca3 (P04)2 > Ca(OH)2f dans du tampon phosphate de sodium 0,02 M à un pH de 6,5 à 7,0 environ ou dans du tampon phosphate de sodium à 0,05 M à un pH d'environ 5,8. 2. Procédé selon la revendication 1 > caractérisé en ce que, pour purifier le PRP , on ajoute de 1'hydroxy-apatite t3Ca3(P04)2 , Ca(OH)2 dans du tampon phosphate de sodium 20 millimolaire à un pH d'environ 6,5 à environ 7,0, on mélange à une température d'environ 2 à 100C, on centrifuge, on élimine le surnageant et on répète les opérations précédentes au moins encore deux fois, on filtre le surnageant sur des filtres appropries, on dialyse contre de l'eau distillée apyrogène, puis on lyophilise. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on purifie le PRP par chromatographie sur colonne dans du tampon phosphate de sodium 0,02 N, à un pH d'environ 5,8.sur de 1'hydroxy-apatite /3 Ca3(P04)2, Ca(OH)2/, on elue avec un gradient étagé de tampon phosphate de sodium 0,02 H et 0,05 M à un pH d'environ 5,8 , on isole les fractions par détermination analytique du PRP et on dialyse les fractions contre de l'eau distillée apyrogène, puis on lyophilise. 4. Polyribosy-ribitol-phosphate isolé et purifié à partir de polysaccharide capsulaire d'Haemophiîus influenza type b, selon le procédé défini dans la revendication 1, 2 ou 3, précédente. 5. Vaccin combiné provoquant la formation d'anticorps anti-PRP (poly-ribosylribitol-phosphate) et anti-pertussis chez l'enfant et les jeunes animaux à sang chaud, caractérisé en ce qu'il est constitué de poly-ribosyl ribitol-phosphate isole et purifié à partir du polysaccharide capsulaire d'Haemophilus influenzae type b, selon la-revendication 4, -et d'antigènes de Bordetella pertussis. 6. Vaccin combiné selon la revendication 5, caractérisé en ce que lton obtient les antigènes de Bordetella pertussis a partir de Bordetella pertussis souche 138. 7. Vaccin combiné selon la revendication 5, caractérisé en ce que lton obtient le poly-ribosylribitol-phosphate à partir d'Haemophilus influenzae type b, souche Rab. 8. Vaccin combiné selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on obtient les antigènes de-Bordetella pertussis à partir de Bordetella pertussis, souche 138 et le poly-ribosylribitol-phosphate à partir d'Haemophilus influenzae type b, souche Rab. 9. Vaccin combiné selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on obtient ledit poly-ribosylribitol-phosphate à partir t'Haemophilus influenzae type b, souche CK. 10. Vaccin combiné selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on obtient lesdits antigènes de Bordetella pertussis à partir de Bordetella pertussis, souche 138, et ledit poly-ribosylribitol-phosphate à partir d'Haemophilus influenzae type b, souche CK.