FR 2391254 A1 19781215 FR 7715616 A 19770520 La présente invention concerne l'obtention de films et de revêtements biochimiquement actifs ; elle concerne également les produits amémliorés obtenus. On connatt déJå des procédés pour l'immobilisation d'enzymes. C'est ainsi que la fixation d'enzymes sur des supports a notamment été décrite : - par E.M. CROOK dans Colloquium on properties of enzymes attached to solid matrices" (Proceedings of the Biochemical Society; 478ème Réunion, 5.1.1968), - par F.A. QUIOCRO et al. dans Froc. Nat. Acad. Sci. U.S. Vol. 52, 1964, pages 833-839, - par I.H. SILMAN et ai. dans Biopolymers, Vol. 4, 1966, pages 441-448, - par HABEEB dans Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 119, 1967, pages 264-268, - dans les brevets US 3.157.595, 3.278.392, 3.639.558 et 3.691.016, - dans les brevets FR 1.293.278 et 1.565.628, et plus récem ment encore dans Methods in Enzymology, Vol.XLIV, 1976, Ed. Klaus MOSBACH, Academic Press, New York, D'autre part, dans le brevet FR 1.604.982, ainsi que dans les ler et 2ème certificats d'addition y rattachés, portant respectivement les n 69.01451 et 69.07897, on a déJi décrit des produits ou articles préparés par coréticulation avec des agents bifonctionnels de substrats macromoléculaires protéiniques et de supports divers. parmi les produits insi préparés sont signalées des mem branes à base de collagène contenant des enzymes actives. Compte tenu de ces développements antérieurs de la technique, on doit donc~considerer que la coréticulation des enzymes avec des macromélécules protéiques (sérum albumine, collagène et autres) à laide agents bifonctionnels (notamment le glutaraldéhyde) a pu être mise à profit pour la formation de membranes enzymatiques ou de divers articles enzymatiquement actifs. Mais si les membranes enzymatiques obtenues présentent bien d'excellentes activités biochimiques, elles nsadhèrent pas à toutes les surfaces et doivent -être maintenues sur un support par un artifice accessoire, de nature mécanique ou physique.De plus, dans le cas où les produits obtenus sont effectivement des membranes, celles-ci doivent avoir une épaisseur minimale environ 50 à 200 microns, car sinon leur tenue mécanique est inacceptable. Le collagène natif a été proposé comme support insoluble pour la fixation d'enzymes comme il est décrit par JUELIARD JH, GODINOT C. et GAUTHERON D.C., dans FEBS. Letters, 1971, 14, 185 ; l'enzyme est alors fixée par covalence sur le collagène insoluble. Mais les membranes ou autres articles qu'on peut obtenir ainsi sont indépendants et ne peuvent pas adhérer sur des supports tels que des métaux, des verres minéraux ou organiques, ou des polymères de synthèse en général. En ce qui concerne d'autre part l'albumine, quelle qu'en soit l'origine, elle est en fait très soluble dans l'eau, mais ssest précisément révélée être trop soluble dans liteau pour les applications présentement envisagées. Plus récemment, il a été montré, dans la UT-OS 2.438.436, qu'il était possible de réaliser des revEtemetts à activité biochimique exl mélangeant des enzymes avec des colles tradiditionnelles du commerce. Cependant, il n'est jamais possible par un tel procédé de former des membranes en films minces, qui puissent ne pas être solidlbres d'une surface support. On a maintenant trouvé de façon inattendue qu'on peut obtenir des films et des revêtements biochimiquemeut actifs, dans des conditions et avec des caractéristiques du produit fini parttônli-- èrement avantageuses, en mettant en oeuvre un procédé original utilisant une gélatine en tant que constituant protéique inactif desdits films ou revetements. La présente invention a pour premier obJet un procédé pour la réalisation de films et de revêtements biochimiquement actifs, comprenant (1) la fusion dune gélatine en solution aqueuse, (2) le rerroidissement sensiblement à température ambiante de ladite solution contenant la gélatine, Jusqu'd formation d'un sol encore fluide, (3) l'incorporation d'une quantité appropriée djau moins une substance biochimique active choisie, en solution aqueuse, (4) éventuellement une homogénéisation, (5) le coulage de la solution de gel-substance biochimique active sur un support approprié-,--- ou le trempage ou l'enduetaon dun tel support avec la solution de gel-substance biochimique active, (6) le séchage jusqu'à ce que le caractère anisotrope d'une pellicule de gélatine sèche se révèle, et (7) la réticulation par trempage dans une solution d'un agent multifonctionnel, à une concentration tt d un pH tampon appropriés et choisis en fonction des résultats recherchés et compte tenu des produits mis en oeuvre, ainsi que (8), dans le cas où on désire obtenir un film indépendant, 1 décollement du revêtement de son sup port de préparation. Le revêtement finalement obtenu peut être soit séché, notamment à l'air ambiants soit conservé en milieu humide ; un stockage en réfrigérateur est recommandé. Les conditions de conservation sont les mêmes pour un film, qui est simplement obtenu par décollement de son support de préparation, par tout moyen physique ou chimique convenable, des revêtements obtenus selon le procédé ci-dessus. L'invention a également pour obJet les films et revêtements biochimiquement actifs obtenus par ledit procédé, ainsi que les films et les revêtements biochimiquement actifs tels qu'ils seront définis plus loin. I1 est important de noter que, loin de découler de manière évidente de la technique eonnue, le procédé selon ltinvention a nécessité une réelle adaptation des moyens exigés pour sa réalisation, alors même que la technique antérieure était soit silencieuse à certains égards, soit de nature à induire l homme de l'art en erreur, du rait que certains enseignements étaient parfois divergents, voir contradictoires. C'est ainsi que la gélatine est bien un produit obtenu par hydrolyse des collagènes. La gélatine est un dérivé d'hydrolyse partielle des collagènes qui possède des propriétés originales par rapport au constituant initial dont elle est issue, par suite d'une variation de l'état de polymérisation et du fait qu'un réarrangement des enchainements polypeptidiques est intervenu au niveau de la structure tertiaire des molécules. La gélatine présente en particulier des propriétés originales de solubilité, ainsi que des caractéristiques mécaniques propres après séchage et tannage. Du fait de ces propriétés, la gélatine est utilisée cas siquemçnt dans 11 industrie pharmaceutique (pour la réalisation de gélules et de suppositoires), dans la fabrication de nombreux adhésifs et colles comme agent épaississant pour les peintures et dans l'industrie alimentaire, ainsi que comme support de culture en microbiologie ; mais c'est surtout en tant que constituant des films dans l'industrie photographique-que la gélatine trouve son application essentielle. Du point de vue de la fabrication, on distingue 2 types de gélatines : celle obtenue par voie acide, qui a un point isoélectrique pHi compris entre 7 et 9, et celle obtenue par voie al- caline, qui a un point isoélectrique pHi compris entre 4,7 et 5. Or, on a trouvé que la gélatine obtenue tant par l une que par l'autre de ces deux voies est utile dans la mise en oeuvre de la présente invention. Les propriétés essentielles de la gélatine sont les suivantes - 'après les données de P, NEUMAN (Arch. Biochem., 1949, page 289) > la composition en aminoacides de la molécule polypeptidique de la gélatine de voie alcaline présente les valeurs moyennes ci-dessous: Glycocolle 26 % Proline 15 % Hydroiyproline 14,1 % Acide glutamique 10,2 % Alanine 8,7 % Arginine 8,6 % Acide aspartique 5,5 % Leucine 3,2 % Lysine 4,1 % Sérine 3J2 % Valine 1,5 ffi Thréonine 1,9 % Phénylalanine 2,2 % Hydroxylysine 1,0 % Méthionine 0,6 % Histidine 0,6 % Tyrosine o5-% % - La gélatine est insoluble dans l'eau froide, aux environs de la neutralité, tandis quelle gonfle en absorbant de 5 à 10 fois son poids d'eau. - De plus, la gélatine est soluble dans liteau chaude et dans des mélanges glycérine-eau à chaud, contrairement aux collagènes, qui sont insolubles dans liteau pour des valeurs de pH comprises entre 1 et 10 et à des forces ioniques inférieures ou égales à 1 M. - On peut tanner la gélatine, c'est-à-dire la rendre insoluble dans l'eau, grace à des pontages entre les chaines polypeptidiques. Parmi les moyens connus et largement utilisés pour ce tannage, on peut citer le formaldéhyde (comme décrit par A. ROUSSELOT dans Sciences et Ind. Photo, tome IX, 1938, pages 161-174), les sels de métaux trivalents, parmi lesquels essentiellement Al 3+ et Cr 3+ (voir A. ROUSSELOT, Sciences et Ind. Photo., tome VII, 1936, pages 190-203), et les irradiations U.V. après sensibilisation au bichromate de sodium {Technical Catalogue, Autotype Noxprint, 1975). - La force en gelée, qui correspond à la dureté de la gélatine, s'exprime en "Bloom", qui correspond au nombre de grammes à appli quur sur un plongeur de 1/2 seconde d'angle de diamètre pour qu'il s'enfonce de 4 mm dans une gelée à une concentration de 6,67 %, après une maturation de 16 à 18 h à 10 C + 0,1 C (selon A. ROUSSE LOT, Inf. Tech., 1973, p.8). - Les gélatines ont, de manière générale, des valeurs de Bloom comprises entre 140 et 250. - Les gélatines de voie alcaline, ou gélatines chaulées (point isoélectrique pHi : 4,7 à 5), notamment celles présentant des valeurs de Bloom de 240 environ, sont susceptibles de fournir une solution aqueuse encore bien fluide à 250C et à une concentration environ 50 g/l, après une fusion de 30 minutes à environ 50 C.La solution quelles forment est bien homogène et ses propriétés d'adhérence, notamment de tension superficielle, permettent de réaliser un bon "enduit" en film, par trempage ou par étalement sur des surfaces diverses, telles que des surfaces de métaux, de verres, de bois, de polymères de synthèse, de poudres d'oxydes métalliques, etc. I1 est d'autre part connu qu'on peut stériliser les gélatines pour des usages microbiologiques ; pour des solutions aqueuses en renfermant Jusqu'à 40 g/l, on obtient des solutions qui ne gélifient pas à température ordinaire, après avoir été stérilisées à lTautoclave à 1200C pendant en pratique environ 45 minutes.On peut sécher l'enduit ainsi obtenu en l'abandonnant simplement à la température ambiante, ou en le maintenant à 2500 pendant qufflqueshe=maretmame le tanner. Malgré toutes ces connaissances acquises, l'homme de l'art n'était pas à même de concevoir le procédé décrit plus haut sans faire oeuvre d'invention ; en particulier, le choix des moyens, l'ordonnancement de ceux-ci, les nécessaires adaptations que des essais et travaux de mise au point ont révélées, ainsi que les variantes possibles et les résultats avantageusement obtenus pour chacune d'elles étaient loin de découler de manière évidente de l'état de la technique, Bien au contraire, ainsi qu'il ressortira mieux encore de la suite du présent contexte, il faut se plier à un certain nombre de contraintes pour une bonne mise en oeuvre du procédé selon l'invention si l'on veut obtenir un réel résultat industriel. La fusion de la gélatine e solution aqueuse peut être réalisée, avantageuseme.t, par chauffage à environ 50-550C d'une gélatine à 5 % dans ae l'eau déminéralisée. Le refroidissement de la solution obtenue doit Outre poursuivi jusqu'à ltobtention d'un sol encore fluide, soit en pratique sensiblement jusqu'à la température ambiante, et de préférence Jusqu'à 2500 environ, C 7 est alors seulement que doit être incorporée à la solution ainsi refroidie une quantité appropriée de la (ou des)substan- ce(s) biochimique(s) active(s) choisie(s), en solution aqueuse. Les substances biochimiques actives susceptibles d'être immobilisées ou fixées selon l'invention sont notamient les enzymes, les anticorps, des agglutinines particulières, les inhibiteurs compétitifs d'enzymes, les antigènes, les haptènes, les activateurs ou inhibiteurs métaboliques, et de façon générale des molécules Fr6- sentant des activités biochiiques, immunologiques ou biologiques. Si on le désire, on peut faire suivre l1étape dincorpo- ration des substances biochimiques actives d'une homogénéisation. Cette dernière assure simplement une meilleure répartition de ladite substance (ou dudit mélange de substances) dans la solution. On coule ensuite la solution de gel-substance biochimique active sur un support approprié. En variante, on trempe un tel support dans ladite solution de gel-substance biochimique active, ou on enduit celle-ci sur le support, par tout moyen approprié. On peut ainsi revêtir, par une adhérence physique directe, des surfaces polies ou chimiquement inertes, telles que des surfaces de métaux polis, de verres, etc. On peut également revêtir selon lzintention par des substances biochimiques actives des supports préalablement activés par une action biochimique faisant notamment intervenir une formation ou une libération de fonctions aminées réactives et réalisant une fixation par liaisons covalentes, au moyen dun agent multifonc- tionnel pontant, entre ledit support, la gélatine et les substances biochimiques actives incorporées dans celle-ci dans les étapes pré- cédantes. Selon une autre variante du procédé conforme i la présente invention, comportant la mise en oeuvre de l étape optionnelle (8) indiquée plus haut, on pet obtenir des films actifs de gélatine renfermant les substances biochimiques actives voulues ; ces films sont autonomes, e est-à;-dire indépendants de tout support solide, et sont obtenus de la même manière que les revêtements sur supports polis susdits au moyen d'un simple décollement de leur support de préparation, par une opération secondaire classique, de nature physique et/ou chimique, de revêtements obtenus conformément aux étapes (1) à (7) du procédé susdit. Une forme de mise en oeuvre tout particulièrement avantageuse du procédé conforme à cette variante consiste à utiliser comme support, de l'aluminium, par exemple sous forme de feuilles ou de plaques. Avec un tel support, il suffit en effet d'un simple arrachement, avec une force d'arrachement moyenne, pour isoler le film de son support de préparation. L'étape (6)de séchage précédant l'étape de réticulation (7) est essentielle selon l'invention et doit être conduite de fa çon à procurer au produit soumis audit séchage, et avant l'addition à celui-ci de l'agent bifonctionnel réticulant, le caractère anisotrope d'une pellicule de gélatine sèche, pellicule translucide à la lumière. Pour ce faire, il convient en pratique d'effectuer un sé- chage modéré, à l'air froid, c'est-à-dire avec de l'air à température ambiante, et à une humidité résiduelle qui est celle de l'atmosphère ambiante normale. Si, par contre, on effectuait le séchage avec de l'air chaud, on provoquerait une rétraction de la pellicule qui se forme, tandis que, si on réalisait un séchage insuffisant, ne conduisant pas au stade annoncé de formation d'une pellicule de gélatine sèche, on n t obtiendrait qu'un produit ayant, même après la réticulation, de mauvaises propriétés mécaniques, et qui serait en particulier suJet à un effritement parasite. Eh ce qui concerne l'étape ultérieure de réticulation, celle-ci celle-ci sTeffedue par trempage de la pellicule de gélatine sèche, imprégnée de substance biochimique active, préaBtlement formée, dans une solution d'un agent multifonctionnel approprié, à une concentration et à unpH tampon appropriés et choisis en fonction des riaRtaX Shenhés et compte tenu des produits mis en oeuvre ; en particulier, ladite concentration et le pH tampon à respecter sont des fonctions de la gélatine utilisée, des enzymes ou autres substances biochimiques actives incorporées, ainsique d'autns facteurs que l'homme de l'art est à même de déterminer et de prendre en compte après de simples essais de routine. Il est important que étape de réticulation suive l'étape de séchage (6) indiquée plus haut et n'interfère pas avec elle En effet, le fait par exemple d'inclure au contraire l'agent bifonctionnel dans la solution de gel-enzyme ne conviendrait pas ; c'est ainsi que, si l'on incluait à titre d'exemple 2 % en poids/ volume d'une solution de glutaraldéhyde à 25- ç dans lTeau dans une solution aqueuse à 5 % de gélatine, ce qui correspondrait pourtant à ltoptimum de la fixation théorique, on obtiendrait en réalité une coagulation presque immédiate de la solution de gel-enzyme et il serait par conséquent impossible dtutiliser ensuite cette solution pour réaliser un revêtement ou t film. Une fois cette réticulation par trempage (7) effectuée, on peut soit sécher à l'air ambiant le revêtement formé, soit conserver ledit revêtement, sans séchage, dans un milieu humide, par exemple dans de liteau. On conserve de préférence les films ou les revêtements obtenus selon l'invention dans un réfrigérateur ou une chambre froide. Les gélatines utiles selon l'invention sont les gélatines de toutes origines, avec une préférence cependant pour les gélatines de voie alcaline. A titre d'exemple de gélatines utiles, on peut citer les gélatines d'osséine chaulées, ou encore les gélatines de "Pig Skin" acides, les unes et les autres pouvant avoir des valeurs de Bloom de 140 à 250, et notamment une valeur de Bloom de 120 ou de 240. En particulier, on peut utiliser des préparations commerciales de ces gélatines sous forme de solutions aqueuses à environ 5 % en poids/volume. Les agents multifonctionnels mis en oeuvre peuvent être choisi parmi les agents bi-ou multi fonctionnels classiques eonnus de lthomme de liard, et notamment parmi les composés ayant deux ou plus de deux groupes aldéhyde, azo, acide sulfonique, fluoro activés par des groupes nitro, azide, imine, ou chloro réactifs reliés à des structures cycliques ayant une résonance appropriée. Ces groupes réactifs sont en effet aptes à réagir avec les groupes contenus dans les substances biochimiques actives à immobiliser, ainsi que dans la gélatine. Un agent bifonctionnel tout particulièrement préféré est le glutaraldéhyde. L'invention a également pour objet les revêtements et les films obtenus par ledit procédé. Un autre objet de l'invention est constitué par des films ou des revêtements biochimiquement actifs composés d'une pellicule mince de gélatine renfermant des substances biochimiques actives et tannée ou réticulée au moyen d'un agent multifonctionnel, ladite pellicule mince laissant très accessibles les substances biochimiques actives et ayant des propriétés exceptionnelles et avantageuses de charge locale en gaz dissous, en particulier en oxygène dissous. Un autre objet encore de la présente invention est constitué par des films ou des revêtements biochimiquement actifs compost d'une pellicule mince de gélatine renfermant des substances biochimiques actives et tannée ou réticulée au moyen dtun agent multMbnc- tionnel, ladite pellicule ayant une épaisseur d'environ 50 à 250Mm, un module de traction environ 0,4 à 0,7 kg/mm et un module de compression d'environ 0,2 à 0,9 kg/mm2 En pratique, il convient d'utiliser dans le procédé selon l'invention une quantité d'agent multifonctionnel de 0,1 à 7,5 % en poids/volume environ, tandis que la proportion de gélatine par rapport au total des substances biochimiques actives et de la gélatine est avantageusement dtau moins 60 %. On laisse en pratique l'étape de réticulation se dérouler sur une durée allant environ 5 minutes à environ 1 heure. Le procédé et les produits sous forme de revêtements sein la présente invention permettent la réalisation de revêtements biochimiquement actifs, par exemple pour diverses pièces faisant Tartie des réacteurs ou des capteurs, telles que les parois de auves, les agitateurs, les canalisations, les tubes réactifs pour utilisation en Sux continu, ou les surfaces sensibles de capteurs divers pour des analyses spécifiques (en particulier de thermocouples, thermopiles, thermoréSistances, électrodes diverses, sondes à bioluminescence, etc.) ainsi que la réalisation de revêtements protéiniques biocompatibles pour des prothèses. L'invention permet aussi de réaliser des revêtements biochimiquement actifs de billes, de flacons ou de fils de diverses natures, utiles comme supports spécifiques, notamment pour les purifications et les séparations par affinité (par exemple supports chromatographiques) comme immunoabsorbants dans les diverses techniques de l1immunochimie et de llimmunologie, comme microsupports actifs ("microcarriers" dans les cultures en phase liquide agitée pour les cellules animales et végétales ou les microorganismes, ou comme moyens efficaces lorsqu'il stagit de mettre en oeuvre des spécificités biochimiques de microsupports dispersés. Selon l'inventions on peut également réaliser des films biochimiquement actifs couplés, dénués de support solide, utilisables comme membranes biochimiquement actives ultraminces, comme surfaces perméables dans des réacteurs divers à diffusion, ou pour doter d'une membrane spécifique des surfaces sensibles de capteurs divers, tels que par exemple des électrodes de mesure, notamment électrodes polarographiques (voir à ce sujet la demande de brevet FR déposée ce jour au nom de la même demanderesse et intitulée wCeî lule de mesure pour microdosages comprenant des électrodes à membranes enzymatiques", à laquelle on pourra se référer utilement). tes exemples ci-après sont donnés à titre dtillustration de conditions précises de mise en oeuvre de l'invention pour des cas particuliers, mais ne limitent nullement celle-ci. Exemple 1. Revêtement de gélatine glucose -oxydase sur verre. On a utilisé une gélatine d'osséine chaulée de 240 Blooms, ayant un point isoélectrique compris entre 4,7 et 5. On en a préparé une solution à 50 g/l dans de lteau distillée et on a porté à 500C environ, pendant 30 minutes. La fusion étant ainsi réalisée, on a ramené à 250C. La solution étant alors fluide, ony a aJouté llé- quivalent de 5 g/l de glucose-oxydase crue ("crude") è 0,43 Unité Internationale (UI) par mg, à partir d'une solution mère enzymes. On a homogénéisé par agitation lente. Sur une tige de verre (ou bien un tube en verre Pyrex, ou encore une électrode de verre) dégraissé et nettoyé normalement sans précautions particulières, on a étalé au pinceau le mélange ainsi préparé. La quantité moyenne appliquée était de l'ordre de 50 g de mélange par m2 de surface, mais elle pouvait être ajusté en fonction de ltépaisseur moyenne souhaitée. On a ensuite séché pendant 4 heures à 25 C. On a immergé les objets préalablement traités comme indiqué ci-dessus pendant 15 minutes dans une solution de glutaraldéhyde à 2,5 fi dans du tampon phosphate 0,02 M pH 6,8. On a ensuite rincé pendant 30 minutes dans le même tampon et on a laissé pendant 4 heures 825"C. te revêtement final obtenu était sensiblement transparent, de couleur jaune et parfaitement résistant ; il était solidaire de 1 objet recouvert. Pour en déterminer les propriétés essentielles, on a procédé comme suit - on a évalué Inactivité enzymatique au moyen d'un pH stat, par de la soude IN, avec une solution de glucose à 50 g/l ; le point de consigne du pH était de 7,5 On a assuré un barbottage constant d'air (ou, en variante, d'oxygène) pendant les mesures. Les résultats obtenus étaient les suivants Activité en UI/mg d'enzyme avec barbottage d'air d'oxygène enzyme fixée 1,36 2,04 enzyme libre 0,42 1,26 Comme on peut le constater à la simple lecture de ce tableau, la glucose- oxyda se fournit des résultats particulièrement intéressants dans des revêtements à base de gélatine selon l'invention. Les rendements après immobilisation sont supérieurs à 100 %. On a pu confirmer ces résultats avec d'autres enzymes, telles que par exemple I'acétylcholinestérase, lap -galactosidase, l'alcool-déshydrogénase, etc. -Après avoir laissé vieillir pendant un ois:un revêtement selon l'invention de glucose-oxydase sur des tubes à essais en verre, à 2 UI/mg à pH 5 dans une solution de glucose à 50 g/l, on n'a constaté à la température ambiante et à l'air libre aucune perte d1activi- té. Exemple 2. On a procédé conformément à l'exemple 1, mais au lieu d'étaler au pinceau le mélange destiné au revêtement, on a simplement trempé les obJets à revêtir dans la solution de revêtement réalisée au préalable et on a laissé égoutter. On a alors obtenu un revêtement transparent de 30 microns environ, qu'on a également séché ensuite pendant 4 heures à 250C avant de le soumettre à l'opé- ration de tannage-réticulation telle que décrite dans l'exemple 1. Les résultats obtenus étaient semblables à ceux indiqués dans l'exemple 1. Exemple 3. Revêtement d'agitateurs mécaniques en acier inoxydable par de la présure. On a réalisé des revêtements en opérant selon l'invention à partir d'une solution de gélatine préparée comme indiqué dans l'exemple I et amenée à 0,1 % en présure animale de veau, force 10.000. On a enduit au pinceau de la même manière qu'à l'exemple 1, un agitateur de cuve en acier inoxydabl-e. On a étudié l'activité en faisant travailler l'agitateur dans du lait à 35 Cs additionné de 1 g/l de CaC12, et pendant des temps allant de 2 à 10 minutes pds ai e retiré l'agitateur et on a noté le temps d'apparition du caillé. L'agitation étant d'une durée de 2 minutes à chaque fois, on a relevé des temps dTapparition du caillé de 32 + 1 minutes pour plusieurs opérations successives ; on n t a pas noté de variations de ce temps donc de variations de l'activité apparente, pendant une semaine de travail à raison de 10 opérations dtemprésurage par jour. Exemple 4. Utilisation de capteurs thermiques revêtus selon ltin- vention pour la mesure spécifique de molécules biologiques. On a réalisé desrevêtements de gélatine glucose-oxydase de 2 UI par cm2 sur une thermopile ou une thermistance, en opérant comme indiqué par l'exemple 1. Après introduction du système ainsi réalisé dans une solution de glucose, on a réalisé une mesure différentielle de la variation de température entre l'interface revêtement-capteur thermique et le milieu extérieur. La différence de potentiel (ddp) obtenue variait linéairement avec la concentration en substrat de la solution dans laquelle était immergé le capteur. On peut utiliser un tel système pour mesurer, en continu ou en discontinu, la concentration de tous les substrats des réactions enzymatiques qui se déroulent avec une variation d'enthalpie. A ce sujet, on peut préciser que les équations de conservation de masse et de chaleur dans le revêtement réalisé selon l'invention s'écrivent avec R : coefficient de conductivité thermique C : chaleur spécifique du revêtement Ho : variation d'enthalpie de la réaction enzymatique T : température en degrés Kelvin t : temps x : abcisse perpendiculaire à la surface du revêtement (origine : interface revêtement-solution) V (S) : vitess de la réaction avec S : concentration en substrat D : : coefficient de diffusion de S S la somme des équations (1) et (2) à ltétat stationnaire donne est exprimé en cm3. (0K) -l mole -1 L'intégration de (4) donne : (5) To - T = &alpha; (So - S) où To et So sont la température et la concentration dans le milieu extérieur. Avec les activités enzymatiques utilisées, S est peu différent de O et (5) devient (T) mesuré = I1 y a linéarité entre (#T) mesuré et So, par l'intermédiaire du coefficient&alpha;. Dans les systèmes décrits, le coefficient tZest compris entre 100 et 500 cm . K-.mole-. Avec cette dernière valeur, dT est compris entre O et 5.10 2 degré pour une variation de concentration de O à 10-M du substrat. A titre de variante, il convient de signaler qu on a pu améliorer (en l'augmentant) le coefficient&alpha; en introduisant environ 30 % en poids/volume de poudre d'amiante dans la composition pour la préparation du revêtement. Exemple 5. En vue de déterminer l'incidence, sur la qualité des revêtements ou des films obtenus selon l'invention,de la nature de la gélatine (protéine inactive) mise en oeuvre, on a suivi le mode opératoire de l'exemple 1, en utilisant des préparations du commerce de gélatines de concentration identique (solution à 5 % en poids/ volume), mais d'origines différentes et de valeurs de Bloom diffé rentes,- à savoir - gélatine d'osséine chaulée 240 Blooms - gélatine d'osséine chaulée 120 Blooms - gélatine de Pig Skin acide 240 Blooms - gélatine de Pig Skin acide 120 Blooms Les revêtements formés avaient tous une valeur déterminée d'activité glucose-oxydase, variable suivant le type de gélatine Ces valeurs sont consignées dans le tableau ci-dessous \s Bloom 20 120 Gélatine de Osséine 1,23 1,78 Pig Skin 0,87 1,11 Exemple 6. En vue de déterminer l'incidence, sur la qualité des revêtements ou des films obtenus selon le mode opératoire de ltetem- ple 1, de la concentration en agent multifonctionnel pontant, on a utilisé une gélatine d'osséine chaulée de 120 Blooms en solution aqueuse à 5 % en poids/volume et on a préparé une série de solutions à concentrations croissantes en glutaraldéhyde (agent bifonctionnel pontant) de pH 6,8 en tampon phosphate 0,02 M. On a opéré comme indiqué dans exemple 1 et on a effecv tué la réticulation pendant 15 minutes. On a obtenu un maximum d'activité pour une concentration en agent bifonctionnel de 0,45 ffi en poids/volume environ. En deçà de cette proportion, on a noté une insolubilisation partielle seulement, qui se traduisait par une certaine perte d'enzyme au rinçage ; au-delà de la proportion susdite, on a assisté à la réaction contraire, à savoir une décroissance de itactivité enzymatique. I1 y a en effet compétition entre,d'une part,une insolubilisation croissante d'enzyme et,dTautre part,un masquage ou une inactivation d'un nombre croissant de sites par la réaction de pontage. Cela vaut également pour d'autres susbstances biochimiques actives que les enzymes. Exemple 7. Afin de déterminer 1 r incidence du temps de réticulation sur les qualités des revEtements obtenus selon l'invention, on a préparé selon l'exemple 1 une série de revêtements sur support de verre en faisant varier le temps de mise en présence de glutaraldéhyde à 2,5 X en poids/volume à pH 6,8 en tampon phosphate 0,02 M. On a obtenu une courbe d'activité décroissante en fonction du temps. Mais cette baisse activité en fonction du temps de réticulation n'est que modérée, ce qui laisse à penser que la coréticulation se fait rapidement, mais de façon homogène ; on peut expliquer cela par l'action du phénomène de diffusion qui limite l'environnement en agent bifonctionnel pour la substance biochimique active, de sorte que celle-ci, protégée par la protéine du réseau tridimensionnel alors formé, ne voit un nombre notable de ses sites actifs dénaturés ou bloqués qu'après un temps de contact prolongé avec la solution dTagent bifonctionnel. Exemnle 8. A seule fin de déterminer les conditions optimales pour ltobtention de revêtements et de films selon l'invention ayant les meilleures qualités, on a étudié l'influence du pH de réticulation sur le rendement en activité enzymatique, en opérant selon les indications de l'exemple I, avec des gélatines de 120 Blooms dtorigi nes différentes : osséine et Pig Skin. Dans chaque cas, on a révisé la réticulation en 15 minutes avec une solution aqueuse à 0,5 % de glutaraldéhyde. Avec la gélatine d'osséine chaulée, on a obtenu, en représentation graphique des résultats, une courbe présentant un minimum à pH 5,6. Pour la gélatine de Pig Skin, la courbe présentait un minimum à pH 8,5. Ces minima correspondent l'un et l'autre au point isoélectrique (pHi) des gélatines mises en oeuvre. Comme cTest au point isoélectrique que le gonflement d'une pellicule ou film -de gélatine sèche mise dans 11 eau est maximal, il est raisonnable de relier l'activité enzymatique à la physique du gonglement de la gélatine. Le gonflement est limité par le fait outil existe des liaisons intra-moléculaires ; ces liaisons maintiennent les structures secondaire et tertiaires de la protéine. Aussi, quand on s'éloigne du pHi, on peut conférer au produit une certaine plasticité, qui peut permettre un ajustement induit et, partant, un nombre de liaisons agent bifonctionnelenzyme élevé ; cet ajustement présente Itavantage de permettre de travailler avec une faible concentration en agent bifonctionnel dans une gamme de pH très étendue, en fonction de la gélatine choisie, avec la garantie d'une immobilisation optimale sans dénaturation des sites. Exemple 9. Afin de tenter une optimisation du procédé selon l'invention, avec le souci d'obtenir un rendement maximal ou une activité spécifique maximale (rapportée à l'unité de masse du support), on a réalisé, en suivant le mode opératoire de exemple 1, des préparations contenant des quantités croissantes de glucose-oxydase (d'Aspergillus niger). A mesure qu ton augmentait la concentration en glucoseoxydase, cette dernière constituait une fraction croissante du réseau tridimensionnel produit après la réticulation et le rende dement en activité enzymatique diminuait. A l'opposé, on a noté une activité extrêmement importante aux faibles concentrations en enzyme, et même une activité d'autant plus importante que ces concentrations étaient plus faibles. Ainsi, on est parvenu à avoir des activités de glucose-oxydase de 40 UI/mg à de très faibles concentrations, inférieures à 0,1 % en poids/volume, d'enzymes, alors que activité maximale qu'on a pu mesurer dans la solution d'enzyme de départ était de 14,650 UI/mg. On peut expliquer cela par le fait que, la membrane de gélatine étant saturée en oxygène, la concentration locale en oxygène devient importante par rapport à la concentration en enzyme, et l'oxygène nTest plus un facteur déficitaire limitant la réaction, d'où les activités élevées quton a pu obtenir. Exemple 10. Réalisation et utilisation d'une électrode porteuse d'activité acétylcholinestérase. On a réalisé les électrodes enzymatiques par dépôt d'une couche d'enzyme et de protéines inactives copolymérisées sur des électrodes courantes, c'est-à-dire par fixation d'une couche d'acétylcholinestérase immobilisée sur une électrode de pH. Lors de l'hydrolyse enzymatique, l'acétylcholinestérase transforme ltacétylcholine en choline acétate, avec libération d'un proton par molécule d'acétylcholine hydrolysée. On a procédé comme indiqué dans l'exemple2, en utilisant comme support une électrode de pH Metrohm EA 125, et avec simultanément des gélatines d'osséine chaulée de 2 duretés différentes. Plus précisément, on eu recours à un mélange de - 1 ml de tampon phosphate 2xlO 2 M pH 8,5 dans lequel on avait dissous 0,5 mg d'acétylcholinesté rase à 600 UI/mg, - 0,5 ml de gélatine d'osséine chaulée 120 Blooms (à 20 % en poids/volume dans un tampon phosphate 2xl02M), et - 0,5 ml de gélatine chaulée 120 Blooms (à .20 % en poids/ volume dans du tampon phosphate 2xlO 2MB, Ces électrodes mesure cowtituent des catrs chimies qui permettent drassur laconverdbn en signaux électriques de concentrations en mé- tabolites que, précisément, on souhaite connaffrequantitativement pour pouvoir étudier à partir de là des processus biologiques. La transformation directe des concentrations de métabolites biologiques en signaux électriques est encore à ce jour très limitée, et ctest par contre cetteeonversion par l'intermédiaire d'enzymes fixées selon l'invention qui permet de procéder à des do sages quantitatifs pour bon nombre de métabolites. Pour faire fonctionner ltéleetrode ainsi préparée, on la branche sur un pH mètre (pH meter 300B de Metrohm). On teste l'é- lectrode dans un "batch" thermostaté contenant un milieu de pH défini et maintenu constant à Itaide d'une deuxième électrode de pH reliée à un pH stat (Titrator E 526 et Docimat E 535 de Metrohm). Les deux pHmètres étant préalablement étalonnés, on laisse ltélectrode active se stabiliser au niveau du pH externe, et on réalise les essais à différentes concentrations de substrat. Le pH interne (indiqué par ltélectrode active) est le reflet de la diffu sion-rdaction intervenant au niveau du revêtement enzymatique. Exemple 11. De façon à revêtir intérieurement un tube de verre par le procédé selon l'invention, on a préparé une solution de gélatine à 10 %.On- a incorporai ltensyme, à savoir, dans un premier cas,dla glucose-oxydase et, dans le second cas,de l'alcool déshydrogénase, à la concentration voulue dans cette solution. On a rempli le tube avocette solution de gélatine-enzyme à l'aide d'une seringue et on a laissa le contact s'établir pendant 1 minute.On a ensuite fait passer dans le tube un jet d'air comprimé, de façon à chasser la gélatine en excès et aussi à ménager un canal pour le passage ultérieur des fluides, mais en évitant que la pression d'air soit trop forte, pour ne pas chasser toute la gélatine. On a séché sous ce courant dtair. Puis on a fait passer dans le tube une solution de glutaraldéhyde à la concentration voulue et pendant un temps déterminé approprié (par exemple à 0,25 % en poids/volume pendant 5 minutes), avec une pompe de circulation, donc en circuit fermé. Enfin, on a rincé à l'eau distillée, avec une circulation d'eau distillée en circuit ouvert, pendant environ 5 minutes, et on a séché à l'airs par une circulation forcée d'air ambiant à travers le tube. On a obtenu un tube revêtu intérieurement d'un film dtune épaiseur de 30-50 microns, dans le premier cas de gélatine glucose-oxydase et dans le second cas d'alcool deshydrogénase, utile pour déterminer les concentrations respectivement de glucose et dialcool, par exemple dans le sang à l'aide d'un auto-analyseur. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la réalisation de films et de revêtements biochimiquement actifs, caractérisé en ce qu il comprend (1) la fusion d'une gélatine en solution aqueuse1 (2) le refroidissement sensiblement à température ambiante de ladite solution contenant la gélatine, Jusqu' formation d'un sol encore fluide, (3) l1incor- poration d'une quantité appropriée dtau moins une substance biochiu mique active choisis, en solution aqueuse, (4) éventuellement une homogénéisation, (5) le coulage de la solution de gel-substance biochique active sur un support approprié, ou le trempage ou lten- duction d'un tel support avec la solution de gel-substance biochimique active, (6) le séchage jusqu'à ce que le caractère anisotrope d'une pellicule de gélatine sèche se révèle, et (7) la réticulation par trempage dans ou imprégnation avec une solution d'un agent multifonctionnel, ainsi que (8), dans le cas où on désire obtenir un film indépendant, le décollement du revêtement de son support de préparation. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une étape finale de séchage. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caracté- risé en ce qu on réalise dans ltétape (1) une fusion par chauffage à environ 50-55 C d'une gélatine à 5 % dans de l'eau dEmintrnlflsée 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu T on conduit le refroidissement constituant ITétape (2) pratiquement sensiblement jusqu'à la température ambiante, de préférence jusqu'à 25 C environ. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce quton incorpore dans lTétape (3) au moins une substance biochimique active choisie parmi les enzymes, les anticorps, des agglutinines particulières, les inhibiteurs compétitifs d enzymes, les antigènes, les haptènes, les activateurs ou inhibiteurs mStaboliques, et, de façon générale, des molécules présentant des activités biochimiques, immunologiques ou biologiques, et leurs mélanges. 6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu en vue d'obtenir un film autonome,on met en oeuvre un support de préparation composé d'aluminium. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on effectue le séchage de ltétape (6) à l'air froid, notamment avec de l'air à température ambiante et à une humidité résiduelle qui est celle de l'atmosphère-ambiante normale. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 7, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre dans l'étape (7) un agent multifonctionnel choisi parmi les composés ayant deux ou plus de deux groupes aldéhyde,azo, acide sulfonique, fluoro activés par des groupes nitro, azide, imine, ou chloro réactifs reliés à des structures cycliques ayant une résonance appropriée. 9 Procéaé selon la revendication 8, caractérisé en ce quton utilise du glutaraldéhyde en tant qu'agent bifonctionnel. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendicatiorsl 1 à 9, caractérisé en oe qu'on met en oeuvre environ 0,1 à 7,5 % en poids/ volume d'agent multifonctionnel, tandis que la proportion de gélatine par rapport au total des substances biochimiques actives et de la gélatine est d'au moins 60%. 11. Produit, caractérisé en ce qutil consiste en un film ou revêtement biochimiquement actif composé d'une pellicule de gélatine renfermant des substances biochimiques actives et tannée ou réticulée au moyen d'un agent multifonctionnel 12. Produit selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il consiste en un film ou un revêtement biochimiquement actif composé d'une pellicule mince de gélatine renfermant des substances biochimiques actives et tannée ou réticulée au moyen d'un agent bifonctionnel, ladite pellicule ayant une épaisseur d'environ 50 à 250ru, un module de traction d'environ 0,4 à 0,7 kg/mm2 et un modu 2 le de compression d'environ 0,2 à 0,9 kg/mm 13.Produit selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il consiste en un revêtement fixé par adhérence physique directe sur des surfaces polies ou chimiquement inertes, notamment des surfaces de métaux ou de verre. 14. Produit selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend un revêtement biochimiquement actif fixé sur une surface d'aluminium. 15. Produit selon la revendication 11, caractérisé en ce qutil consiste en un revêtement fixé sur un support préalablement activé par une action chimique faisant notamment intervenir une formation ou une libération de fonctions aminées réactives et réalisant une fixation par liaisons covalentes, au moyen d'un agent multifonctionnel pontant, entre ledit support, la gélatine et les substances biochimiques actives préalablement- incorporées dans celle-ci. 16. ProduitXcaractérisé en ce qu'il consiste en un film ou un revêtement biochimiquement actif obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.