FR 2407471 A1 19790525 FR 7732660 A 19771028 La présente invention concerne un procédé de dosage du facteur thymique sérique et les moyens pour la mise en oeuvre de ce procédé. Les lymphocytes T (thymo-d6pendants) acquièrent leur immunocompétence sous l'influence du thymus. Cette action diffé- renciatrice du thymus a fait l'objet de nombreuses recherches depuis la découverte des effets immunosuppresseurs de la thymectomie néonatale (j. SMILLER, Nature 195 (1962) 1318). La restauration de l'immunocompétence par l'injection d'extraits thymiques a suggéré que le thymus joue un rôle de glande endocrine et a permis de mettre en évidence de manière plus directe l'existence d'hormones thymiques. Plusieurs substances furent alors isolées du thymus ou caractérisées, telles que notamment la thymosine, le facteur humoral thymique et la thymopoletine. Par ailleurs, il a été démontré que les extraits thymiques induisent l'apparition de marqueurs T sur des cellules de moëlle osseuse, intiaisnoet dépourvues de ces marqueurs (J.F. BACH et Coll., Proc. Nat. Acad. Soi. (USA) 68 (1971) 234). Il a été démontré que le sérum contient un facteur ayant la même activité que les extraits thymiques. La disparition de ce facteur après thymectomie vtablit la preuve de l'origine thymique de ce principe actif, (J.F. BACH et M. DARDENNE, Transpl. Proc. 4 (1972) 345).Ce facteur appelé facteur thymique sérique (FTS) a été isolé à partir du sérum de porc par ultrafiltration, chromatographie -sur tamis moléculaire et sur échangeur d'ions. On a pu alors déterminer que le FTS est un nonapeptide répondant à la séquence Glx-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn dans laquelle Glx est soit PyroGlu, soit Gln et que le nonapeptide synthétique, pour lequel Glx est PyroGlu, possède les mêmes propriétés chimiques et biologiques que le FTS d'origine naturelle (J.F. BACH et Colt, Nature 266 (1977) 55). Depuis, l'analogue nonapeptidique pour lequel Glx est Gln ainsi que d'autres analogues hexa-, hepta-, octa- et nona peptidiques du FTS ont e été synthétisés (Demande de brevet fran- çais 77 15963 du 25 mai 1977). Au couru de sa purification, le FTS a été caractérisé par un essai biologique, communément appelé "essai des rosettes", fondé sur l'induction de la sensibilité à l'azathioprine de cellules formant des rosettes de la rate de souris thymectomisée. L'essai des rosettes a été décrit antérieurement par J.F. BACH et M. DARDENNE dans Immunology, 25 353 (1973), le contenu de cet article étant incorporé ici à titre de référence. Selon cet essai, on détermine l'activité thymique du FTS en le mettant en incubation dans un tube à hémolyse avec 3 x 106 cellules de la rate provenant de souris C 57/ex 6 adultes (fournies par le Centre d'Elevage des Animaux de Laboratoire du C.N.R.S. (45 Orléans, La Source) thymectomisées 10 à 20 jours plus tôt. La méthode de thymectomie est décrite par M. DARDENNE et J.F. BACH dans Immunology, 25, 343 (1973) à la page 344. Le contenu de cet article est incorporé ici à titre de référence. L'incubation est effectuée pendant 90 minutes à 370C en présence d'azathioprine (Az) à une concentration de 10 Zg/ml. Cette concentration est intermédiaire entre la concentration minimale de Az inhibant 50 * des cellules de la rate formant des rosettes (RFC) provenant de souris normales (1 ,ug/ml) et provenant de souris thymectomisées adultes (25-100 pg/ml). A la fin de l'incubation 12 x 106 cellules rouges de sang de mouton (SRBC) sont ajoutées aux cellules dans l'échantillon d'essai. Les cellules dans l'échantillon sont centrifugées pendant 6 minutes à 200 g et remises en suspension doucement et avec précaution par rotation sur un rouleau (10 cm de diamètre) à petite vitesse (10 tours par minute). On compte les RFC dans un hématocytomètre. En l'absence d'activité thymique, le nombre de RFC est de 1210/106 cellules + 120 (écart type, SD).En présence d'activité thymique, la quantité de RFC est réduite à un niveau de 200 à 400/106 cellules. En l'absence de Az, le FTS ne provoque pas d'inhibition des RFC. L'activité thymique est définie comme l'inhibition de plus de 50 % des cellules formant des rosettes. L'essai des rosettes a permis de démontrer que le taux sérique de FTS est modifié dans certaines situations pathologiques immunitaires, telles que le lupus, et les myasthénies (J.F. BACH et Coll., Ann. N.Y. Acad. Sci. 242 (1975) p. 186.). Etant donné que l'essai des rosettes est un essai semiquantitatif, il est apparu nécessaire de développer un procédé de dosage quantitatif qui soit suffisamment sensible pour permettre un dosage direct du FTS dans le sang. Selon l'invention, con amis au point un procédé de dosage du facteur thy mique sérique (FIS) dans un échantillan, selon lequel on met en présence une quantité déternanée dudit édiantilion de FTS avec une quantité déterminée de FIS marqué et une quantité détermine d'anticorps anti-FTS de manière à provoquer une réaction de compétition entre le FTS marque' et le FTS de 1' échantillon dans leur liaison avec l'anticorps anti-FTS, on détermine apréséquilibre de la réaction la quantité de FTS marqué, soit libre, soit lié à l'anticorps, et on comparecette valeur à celles obtenues pour des quantités comices et croissantes deFTS .11 convient toutefois d 'observer que l'ordre et le caractère extemporané de l'addition des divers réactifs n'est pas critique. C'est ainsi que, de manière à augmenter la sensibilité du dosage, l'échantillon biologique peut être préalablement incubé avec l' awticorps anti - FTS avant 1 ' addi tion du FTS marqué, ou encore le FTS marqué peut être préalablement incubé avec l'anticorps anti-ETS avant 1' addition de l' échantillon biologique. Pour préparer l'anticorps anti-FTS nécessaire à la mise en oeuvre du procédé de dosage, on fixe le FTS ou un analogue polypeptidique du FTS sur un support en vue d'obtenir un immunogène, on injecte ensuite cet immunogène à un animal et on recueille ultérieurement le sérum de 1 'animal. Pour préparer I 'immunogène indique ci-dessus il est donc nécessaire de disposer d'une certaine quantité de FTS ou d'un analogue polypeptidique du FTS. Les composés polypeptidiques pour la préparation de nu- nogène peuvent être préparés conformément aux procédés de synthèse décrits dans la demande de brevet français 77 15963 du 25 mai 1977, dont le contenu est incorporé présentement à titre de référence. Les composés polypeptidiques en question, qui comprennent le FTS et les analogues du FTS, concernent par conséquent les coi- posés de séquence Olx-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn dans laquelle Glx représente PyroGlu ou Gln, leurs dérivés comportant 1 ou 2 acides aminés modifiés, et les hexa-* hepta- et octa-peptides de ces composés et dérivés qui conservent leur séquence C-terminale ou N-terminale. L'expression "acide aminé modifié" entend signifier que l'acide aminé considéré est remplacé par son antipode optique ou par un autre acide aminé ou bien est protégé par un groupe de protection temporaire utilisé dans la synthèse des peptides selon l'invention. En tant qu'acides aminés de remplacement pour les acides aminés modifiés, on peut citer, à titre d'exemples non limitatifs Alla, Cyano-Ala, Asn, Thio-Asn, Asp, D-Lys, Orn, Lys (N & cétyl), Glu, D-Gln, Glu( -cyano), Glu( -CS-MH2), les radicaux 2-aminohexanoyle, 2,6-diamino-hexynoyle et 2,6-diamino-hesenoyle, D-Ser, N-méthyl-Ser, Thr, Sar. L'expression "séquence N-terminale" entend désigner toute séquence partielle de la séquence Glx-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly Gly-Ser-Asn dont le premier résidu d'acide aminé est wGlx" et l'expression "séquence C-terminalet entend désigner toute séquence partielle de la séquence Gls-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn dont le dernier résidu d'acide aminé est "Asn". Les composés polypeptiques servant à la préparation de l'immunogène précité peuvent encore être définis comme étant les composés de séquence X-Gln-Gly-Gly-Y dans laquelle Y représente -Ser-Asn et X représente Ser-, Lys Ser-, Ala-Lys-Ser-, Glx-Ala-Lys-Ser- ; et lorsque X représente Gîx-Ala-Lys-Ser-, Y peut représenter en outre -Ser ; ainsi que leurs dérivés comportant 1 ou 2 acides aminés modifiés. Les abréviations utilisées pour les acides aminés sont les suivantes : PyroGlu = acide-L-pyroglutamique Ala = L-alanine D-Ala = D-alanine Lys = L-lysine Ser = L-serine Gln = L-glutamine Gly = L-glycine Asn = L-asparagine Asp = acide L-aspartique Glu = acide L-glutamique Orn = L-ornithine Thr = L-thréonine Sar = L-sarcosine La fixation du FTS ou de l'analogue polypeptidique du FTS s'effectue sur un support convenant à la préparation des immunogènes. Parmi ces supports on peut citer en particulier les protéines, et autres molécules de poids moléculaire élevé comme par exemple les polymères synthétiques. Parmi les protéines utilisables comme support, on pré fère tout particulièrement la sérum albumine bovine (BSA). Etant donné que le couplage de la BSA ne peut être réalisé directement, on le réalise avantageusement soit en présence de glutaraldéhyde, soit en présence de N-hydroxysuccinimide et de dicyclohexylcarbodiimide. Pour préparer le FTS marqué nécessaire à la mise en oeuvre du procédé de dosage, on utilise comme produit de départ soit le FTS, soit un analogue synthétique du FTS comme indiqué plus haut. A ce propos, il convient de signaler que le produit de départ utilisé pour la préparation du FTS marqué n'est pas nécessairement le même que celui utilisé pour la préparation do l'anticorps anti-FrS. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le FTS ou l'analogue peptidique du FTS est marqué par un isotope radioactif et, de façon particulièrement avantageuse, par 125I ou 131I Dans ce cas particulier, on réalise avantageusement le marquage par Na125I ou Na131I en introduisant au préalable une molécule iodable sur le FTS ou l'analogue polypeptidique du FTS ou bien encore en couplant le FTS ou l'analogue polypeptidique du FTS avec un dérivé déjà marqué par Na125I ou Na131I. Dans ce mode de réalisation préféré, on dispose d'un procédé de dosage radioimmunologique dans lequel on incube dans des tubes des quantités déterminées de FTS marqué par 125i ou 131I, de solution standard de-FTS ou d'échantillon à doser, et d'anti-corps anti-FTS, on sépare ensuite les fractions libre et liée du FTS, on centrifuge les tubes, on élimine le surnageant et on mesure la radioactivité du culot. La séparation des fractions libre et liée peut être faite par différents procédés selon que l'on veut mesurer la radioactivité de la fraction libre ou de la fraction liée. Dans le premier cas on choisira par exemple une séparation au moyen de charbon ajouté au milieu à'incubation et dans le deuxième cas on précipitera sélectivement la fraction liée par un agent précipitant comme un alcool ou un sérum anti-gamma globuline On peut ainsi, en partant de quantités connues et croissantes de FTS en solution standard, tracer une courbe d'étalonnage montrant les variations de quantité de FTS marqué lié en fonction de quantités croissantes de FTS standard.En remplaçant ensuite la solution standard de FTS par l'échantillon à doser, on détermine dans les mêmes conditions que précédemment la quantité de FTS marqué lié en présence de 1'échantillon à doser et, en portant cette valeur sur la courbe d'étalonnage, on en déduit la valeur correspondante de la teneur en FTS de 1'échan- tillon. Pour permettre de réaliser facilement des opérations de dosage d'échantillons de FTS, l'invention prévoit également un coffret de réactifs comportant un flacon d'anticorps anti FTS, un flacon de FTS marqué et un flacon de solution standard de FTS pour permettre le tracé d'une courbe d'étalonnage. Un tel coffret permettra de réaliser des opérations de dosage du FTS sur un sérum préalablement traité, comme indiqué plus loin, pour inactiver les molécules présentes dans le sérum qui sont susceptibles d'interférer dans le dosage. D 1autres caractéristiques et avantages de l'invention résulteront de l'exemple détaillé suivant, donné à titre purement illustratif et nullement limitatif de l'invention. EXEMPLE I Préparation d'anticorps anti-FrS a) Préparation des immunogènes Le FTS est rendu immunogène en le couplant à la sérum albumine bovine (BSA). Un tel couplage peut être effectué de deux manières différentes : soit en présence de glutaraldéhyde qui se lie aux groupements aminés du FTS et de la BSA, soit en présence de carbodiimide et de N-hydroxysuccinimide qui active le groupe COOH terminal du FTS et permet ensuite après addition de la BSA la formation d'une liaison peptidique avec les groupements e aminés de cette dernière. - Couplage en présence de glutaraldéhyde. On dissout 2,5 mg de FTS synthétique (pour lequel Glx est PyroGlu, préparé selon la demande de brevet français 77 15963 précitée) et 5 mg de BSA dans 1 ml de tampon borate 0,1 M, pH 8,4, contenant 1 % de glutaraldéhyde et on laisse incuber pendant 16 h à 40c. - Couplage avec formation intermédiaire d'un N-hydroxy-succinimide ester du FTS. On dissout 2,5 mg de FTS dans 0,250 ml de diméthyl formamide contenant 25 mg de N-hydroxysuccinimide et 50 mg de dicyclohexylcarbodiimide et on incube le mélange pendant 16 h à 40C. Le milieu de réaction est ensuite évaporé sous vide. Le résidu sec est repris avec 0,2 ml d'une solution de BSA (40 mg/ml) dans du tampon borate 0,1 M, pH 8,4, et incubé pendant 24 h à la température ambiante. Les deux immunogènes ainsi préparés sont dialysés pendant 48 h à 40C contre une solution de NaCl à 9 /00, puis conservés à -200C. b) Immunisation des animaux On immunise deux groupes de quatre lapins de race New Zealand avec chacun des deux immunogènes préparés comme Indiqué ci-dessus. On émulsifie des parties égales d'adjuvant de Freund complet et desolution d'immunogène et on injecte l'émulsion par voie intradermique, en plusieurs points, selon la méthode de VAITUKAITIS (j. Clin. Endocrinal. Metab. 33 (1971) 988), à raison de 1 mg d'îmmunogène par lapin. Trois mois après, les animaux reçoivent une injection de rappel dans les m8mes conditions dtémulsion mais à raison de 0,5 mg d'immunogène par lapin. Un mois après la première injection, on saigne les lapins chaque semaine et les sérums obtenus sont testés, dilués dans du glycérol (V/V) et conservés à -200C. II Iodation par Na125I du FTS Etant donné que le FTS ne comporte pas dans sa structure d'acide aminé pouvant être iodé, le marquage direct à l'iode ne peut être envisagé. On utilise une méthode dérivée de celle dé- crite par BOUTON et HUNTER (Biochem. J. 193 (1973) 529) en alkylant préalablement le FTS par le p. hydroxyphénylpropionate N-hydroxysuccinimide ester et en iodant par Na125I le dérivé alkyl obtenu. a) Préparation du dérivé alkylé On dissout 0,1 mg de FTS dans 50 l de tampon borate 0,1 M, pH 8,4, puis on incube avec 0,1 mg de p. hydroxyphénylpropionato N-hydroxysuccinimide ester pendant 16 h à 40C. Le produit obtenu est purifié par filtration sur gel sur une colonne de Sephadex G 10 (0,9 cm x 50 cm) éluée par une solution de NaCl à 9 /ee. La fraction correspondant au volume d'exclusion de la colonne (FTS alkylé) est recueillie et répartie en aliquots de 2,5 g puis con servée à -200C. b) Iodation nar Na125I du FTS allyle On traite 2,5 g de FTS alkyld par 1-2 mCi de Na125I en présence de chloramine T suivant la méthode de HUNTER et GREENWOOD (Nature 194 (1962) 495). Le mélange obtenu est déposé sur une colonne de Sephadex G 25 (1,5 cm x 90 cm) et élué par de l'acide acétique 1H. Cette méthode permet de séparer le dérivé iodé du dérivé non iodé et de l'iode libre.Le pic correspondant au FTS marqué est récupéré, réparti en aliquots et conservé à -200C. La pureté radiochimique du FTS marqué par 125i est démontrée par la présence d'une seule tache radioactive par chromatographie sur couche mince dans le système de solvants chloroforme, méthanol, ammoniaque à 25 * (2:2:1), Rf : 0,6. III Dosage Toutes les dilutions employées pour le dosage sont faites dans un tampon phosphate pH 7,3 contenant 0,9 * de NaCl, 0,01 * d'acide de sodium et 0,1 * de gélatine (PB5G). On incube pendant 16 heures à 40C 0,1 ml de 125I FTS (20 000 désintégrations par minute), 0,1 ml de solution standard de FTS ( contenant 0 à 1000 pg de FTS) ou d'échantillon de FTS à doser et 0,1 ml d'anticorps anti-FTS dilué. On sépare les fractions libre et liée du FTS en ajoutant au milieu d'incubation, à 40C, 1 ml d'une suspension de charbon dextran (charbon 0,25 %, Dextran T 70 0,025 * dans PBSG). Au bout de 20 minutes on centrifuge les tubes à 2000 g pendant 20 minutes à 40C, on élimine le surnageant et on mesure la radioactivité du culot au moyen d'un compteurpour déterminer la quantité dé la fraction libre du FTS marqué qui a été retenu par le charbon. La dilution d'emploi de l'anticorps anti-FTS a été testée de façon à obtenir une liaison de 40 * de FTS marqué en l'absence de solution standard de FTS (Bo). Une fois que l'on a déterminé la quantité F de la fraction libre du FTS marqué, on en déduit par différence, connaissant la quantité initiale de FTS marqué, la quantité B de la fraction li- du FTS marqué. On peut alors établir la courbe d'étalonnage montrant les variations du rapport B/Bo en fonction de la quantité de FTS standard, cette dernière étant exprimée sous forme d'une échelle logarithmique. La figure annexée illustre à titre d'exemple une courbe d'étalonnage de ce genre montrant les variations du rapport B/Bo exprimé en pourcentage en fonction du logarithme de la quantité de FTS exprimée en pg. Il est possible bien entendu d'établir d'autres courbes dtétalonnage montrant, par exemple, les variations du rapport B/F (quantité de FTS marqué lié/quantité de FTS marqué libre) en fonction de la quantité de FTS standard. Ces courbes d'étalonnage une fois établies permettent de connaître la quantité de FTS dans un échantillon après avoir calculé le rapport B/Bo ou un autre rapport tel que B/F correspondant à cet échantillon. Comme indiqué plus haut, le dosage du FTS dans le sérum d'un sujet ne peut être fait directement sur le sérum du fait de la présence de molécules interférant avec le dosage. Il est donc nécessaire de traiter le sérum au préalable pour inactiver ces molécules gênantes. Pour cela, on traite en milieu acide à température supérieure à 5o0C l'échantillon de sérum que l'on concentre ultérieurement si nécessaire. A titre d'exemple 1 ml de sérum de porc est traité par 1 ml d'HCl 0,1 N et chauffé à 560C pendant 30 minutes. L'échantillon est neutralisé à pH 7,2 par addition de 0,8 ml de tris 0,3 M ot le FTS est dosé directement dans le milieu. Par cette méthode, on a ainsi déterminé un taux de 200 à 300 pg de FTS par mi do sérum de porc. REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage du facteur thymique sérique (FTS) dans un échantillon, caractérisé par le fait que l'on met en présence une quantité déterminée dudit échantillon de FTS avec une quantité déterminée de FTS marqué et une quantité déterminée d'anticorps anti-FTS de manière à provoquer une réaction de compétition entre le FTS marqué et le FTS de l'échantillon dans leur liaison avec l'anticorps anti-FTS, on détermine après équilibre de la réaction la quantité de FTS marqué, soit libre, soit lié à l'anticorps, et on compare cette valeur à celles obtenues pour des quantités connues et croissantes de FTS. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on prépare l'anticorps anti-FTS en fixant le FrS ou un analogue polypeptidique du FTS sur un support en vue d'obtenir un immunogène, en injectant l'immunogène à un animal et en recueillant ultérieurement le sérum de l'animal. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'on effectue la fixation du FTS ou de l'analogue polypeptidique du FTS par couplage avec une protéine. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que la protéine est la sérum albumine bovine (BSA). 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on effectue le couplage avec la sérum albumine bovine en présence de glutaraldéhyde. 6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on effectue le couplage avec la sérum albumine d'un ester formé préalablement en présence de N-hydroxysuccinimide et de dicyclohexylcarbodiimide. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que l'on prépare le FTS marqué par marquage du FTS ou d'un analogue polypeptidique du FTS avec un isotope radioactif. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que l'on effectue le marquage par iodation au moyen de Na1251. 9. Procédé selon l'une des revendications 7 et 8, caractérisé par le fait que l'on effectue le marquage en introduisant une molécule iodable sur le FTS ou î'6aîogue polypeptidique du FTS et en iodant ensuite avec Na1251 le dérivé iodable ainsi obtenu. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que l'on prépare le dérivé iodable en dissolvant le FTS ou l'analogue polypeptidique du FTS dans un tampon, en incubant la solution avec du p-hydroxyphénylpropionate N-hydroxysuccinimide ester et en purifiant le produit obtenu par filtration sur gel. 11. Procédé selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisé par le fait que l'on effectue l'iodation du dérivé alkylé en iodant ce dérivé par Na125I en présence de chloramine T, et en purifiant par filtration sur gel. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé par le fait que l'on incube dans des tubes des quantités déterminées de FTS marqué par 125I, de solution standard de FTS ou d'échantillon à doser, et d'anticorps anti-ns, que l'on sépare les fractions libre et liée du FTS, que l'on centrifuge les tubes, que l'on élimine le surnageant et que l'on mesure la radioactivité du culot. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que l'on sépare les fractions libre et liée du FTS en ajoutant du charbon au milieu d'incubation pour mesurer la radioactivité de la fraction libre retenue par le charbon. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé par le fait que l'on utilise pour préparer l'anticorps anti-FTS et pour préparer le FTS marqué un composé polypeptidique répondant à la séquence Glx-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly Ser-Asn dans laquelle Glx représente PyroGlu ou Gln, ou un dérivez de ce composé comportant 1 ou 2 acides modifiés, ou un heta-, hepta-, ou octa-peptide de ce composé ou dérivé qui conserve sa séquence C-terminale ou N-terminale. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé par le fait que l'on traite l'échantillon à doser on milieu acide et à température supérieure à 50 C de façon à inactiver les molécules susceptibles d'interférer dans le dosage. 16. A titre de moyens pour la mise en oeuvre du procédez selon l'une des revendications 1 à 15, un anticorps anti-FTS. 17. A titre de moyens pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 15, un dérivé de FTS marqué. '18. Coffret de réactifs pour le dosage du FTS dans un échantillon caractérisé par le fait qu'il comporte un flacon d'anticorps anti-FTS, un flacon de FTS marqué et un flacon de solution standard de FTS.