FR 2398762 A1 19790223 FR 7723223 A 19770728 La présente invention a pour objet des gels aqueux activés, leurs procédés de prépsration et leur emploi dans les techniques d'immobilisation de substances naturelles, notamment les protéines et en particulier les enzymes Les gels aqueux activés selon l'invention sont obtenus par activation de gels aqueux de copolymères hydrophiles nouveaux. Ces copolymères hydrophiles sont des copolymères statistiques réticulés tridimensionnels, insolubles dans l'eau, qui contiennent, sous forme copolymérisee a) 25 % à 98 % en poids de N-[tris(hydroxyméthyl)méthyl]acrylamide ou de N-[tris(hydroxyméthyl)méthyl] methacrylamide, ou d'un mélange de ces deux composés. ) ) 2 à à 50 % en poids d'un ou plusieurs monomères possédant plu- sieurs doubles liaisons éthyléniques polymérisables et un ou plusieurs troupes hydroxy, et exempts de groupes NH2 ou CDOH, c) fl ?. 50 en poids d'un ou plusieurs monomères possédant une double liaison éthylénique polymérisable et un ou plusieurs groupes amino ou carboxylique. Les monomères a) sont des produits connus. Ils ont été décrits, avec leurs procédés de préparation, dans diverses publications (cf, par exemple, JEDLINSKI et PAPROTNY, ROCZNIKI Chemii, Ann. Soc. Chim. Polonorum, t966, 40, p 1487 - 1493 ; Tetrabedron Letters No 6, 1975, p 357 - 358). Les monomères b), qui sont des agents réticulants, répondent de préférence à l'une des formules générales (I) ou (II) ci-dessous dars lesquelles R est un atome d'hydrogène ou ur groupe méthyle, R' est un atome d'hydrogène nu un groupe hydroxyméthyle, X est un atome d'hydrogène ou un groupe OH, n et m sont des nombres ertiers allant de O à 5, avec la restriction que X et Rt ne peuvent être simultanément des atomes d'hydrogène. Comme exemples de monomères b) on peut citer en particulier la N,N'-diallyl-tartradiamide, le glyoxal-his-acryle mide, la N,N'méthylène-bis-hydroxyméthylacrylamide. Comme exemples de composés c) on peut citer, entre autres, la N-[(N-acryloxyl)glycyl]glycine, la N-[(N-méthacryloyl) glycyl]glycine, l'acide N-acryloyl #- aminocap Selon ur mode particulier de réalisation de l'in- ventions les copolymères utilisés contiennent, sous forme copolymérisée, 50 % à 98 % en poids de monomères a), le complément à 100 % étant constitué par un ou plusieurs monomères b), et tout spécialement 50 % à 98 % en poids de N-[tris(hydroxyméthyl)méthyl] acrylamide, le complément à 100 % étant constitué par un ou plusieurs monomères b). Les copolymères hydrophiles réticulés peuvent être préparés, selon des procédés connus, par polymérisation radicalaire des divers monomères en solution aqueuse. La polymérisation est effectuée à une température de 0 E a 1002C, de préférence 400C à 60 C, et en présence des initiateurs habituellement utilisés en polymérisation radicalaire. Comme tels on peut citer, par exemple, les systèmes red-ox comme N,N,N : N' tétraméthyl éthylénediamine (TEMED) + persulfate alcalin ou diméthylaminopropionitrile + persulfate alcalin, les peroxydes organiques comme le peroxyde de benzoyle, et ltazo-2,2'-bis- isobutyronitrile.La concentration totale en monomères[c'est-à-dire la concentretion en monomères a) + b) + c) # des solutions aqueuses soumises à la polymérisation va de 20 g/l à 300 g/i et le pourcentage en poids de monomère b) dans les monomères totaux est de 2 % à 50%. La polymérisation peut être une polymérisation en bloc ou en émulsion. Dans le cas de la polymérisation en bloc, la solution aqueuse- contenant les divers monomères et l'initiateur est soumise à une polymérisation en phase homogène. Le bloc de gel aqueux obtenu est ensuite fractionné en grains, par exemple par passage à travers les mailles d'un tamis. La polymérisation en émulsion, qui est le mode de préparation préféré car elle fournit directement le gel aqueux sous forme de granules sphériques de taille déterminée, peut être effectuée comme suit La solution aqueuse contenant les divers monomères est versée lentement dans une phase liquide organique, non miscible à l'eau, maintenue en agitation et contenant. éventuellement un agent émulsifiant. La vitesse d'agitation est règle de façon à obtenir une émulsion de la phase aqueuse dans la phase organique ayant la taille de gouttelettes voulue. Le contrôle de cette tailla, donc le règlage de l'agitation, est effectué par examen au microscope de prélèvements faits sur l'émulsion.Une fois règlée la vitesse d'agitation, on introduit dans l'émulsion l'initiateur, qui déclen- che la polymérisation. Cette dernière est poursuivie jusqu'à son terme en conservant les mêmes conditions d'agitation. Les perles de gel aqueux ainsi obtenues sont lavées avec un solvant ou un tensio-actif afin de les débarasser des traces de phase organique, puis avec de l'eau. Comme phase organique liquide utilisable on peut citer, par exemple, les huiles végétales (huile de soja, huile d'arachide, huile d tournesol, etc...) ou minérales (huile de paraffine, huile de silicones), les produits de distillatinn frac- tionnée du pétrole (benzène, toluène, etc...) les hydrocarbures chlorés (tétrachlorure de carbone, chlorure de méthylène, etc..) et les mélanges de ces divers composés. La phase organique liquide peut éventuellement contenir un agent émulsionnant comme les produits connus sous la dénomination commerciale " Spans " ou "Tweens", à la concentration de 0,1 % à 4 % en volume. Les perles de gel aqueux obtenues par le procédé de polymérisation en émulsion ont une diamètre de particules qui varie, suivant les conditions opératoires, de 10 flin à 600 um. Les gels aqueux obtenus par l'un des procédés exposés ci-dessus peuvent être conservés en suspension dans de l'eau ou dans une solution tampon-aqueuse, en présence de traces d'un bactériostatique comme, par exemple, l'azothydrate de sodium. Une concentration de 0,02 % en an azothydrate de sodium suffit à assurer la conservation. Les gels aqueux peuvent aussi être séchés par les procédés conventionnels (lysphilisation, traitement par un solvant organique miscible à liteau, etc..). On obtient ainsi les copolymère res sous forme d'une poudre blanche, réhydratable au moment de l'emploi. La réhydratation s'effectue par simple contact avec de l'eau ou une solution tampon aqueuse. Les poudres de copolymères représentent une forme très commode de stockage car elles occupent un volume très faible et peuvent être conservées indéfiniment, sans addition de conservateurs et bactériostatiques. Les crpolymères selon l'invention sont stables thermiquement (ils résistent à des températures atteignant 120 C à 130971 et insensibles à l'attaque bactérienne ou enzymatique. En outre ils sont stables chimiquement en présence de solutions aqueuses nettement acides (pH2) ou basiques(pH 13), ce qui permet leur emploi dans un domaine de pH très étendu. Les copolymères hydrophiles définis précédemment peuvent être utilisés, sous forme de gels aqueux, en tant que support pour l'immobilisation ou la chromatographie d'affinité des macromolécules biologiques telles que, par exemple, les protéines et en particulier les enzymes. A cet effet les copolymères sont au pre alabla activés, ctest-à-dire que les groupes alcool primaire du copolymère sont transformés, par réaction chimique avec des composés bi-ou polyfonctionnals, en groupes capables otentrainer le greffage des macromolécules biologiques sur le support (par exem ple des groupes imidocarbonate). Les copolymères sont activés selon des méthodes connues en soi (voir à ce sujet les brevets anglais 1.183.257 et 1.343.703, et le DOS 2.061.008) Comme exemples d'agents d'activation utilisables on peut citer le bromure de cyanogène an milieu alcalin, le glutaraldéhyde, les dérivés épaxydés comme l'épichlorhydrine ou l'éther diglycidylique du butanediol-1,4, et les dérivés de 13 trichloro-1,35 triazine-2,4,6. Les copolymères utilisés se prêtent particulièrement bien à l'activation par le bromure de cyanogène. L'immobilisation, ctest-à-dire le greffage, des protéines sur les gels aqueux de copolymère activé est effectuée selon des méthodes classiques, par exemple en agitant, durant plusieurs heures,les perles de gel activé dans un milieu tampon aqueux contenant la protéine à fixer. En fin dloPération, les perles de gel, qui ont fixé au moins partiellement la protéine, sont séparées et conservées dans un milieu tampon adéquat. Comme exemples de protéines qui peuvent ainsi être immobilisées sous forme de combinaison avec des gels activés de copolymères on peut citer l'arginase, l'invertase, la glucose oxydase, l'uréase, la phosphatase alcaline, la trypsine et la chymotryp- sine. Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter. EXEMPLE 1 : Préparation d'un copolymère N-[tris(hydroxyméthyl) méthyl]acrylamide#N,N'-diallyl-tertradiemide sous forme de gel aqueux, par polymérisation an bloc. Dans 100 ml d'eau déminéralisée, contenus dans un récipient placé au bain-maria à 50 C, on dissout 10 ç de N-[tris (hydroxyméthyl)méthyl]acrylamide et 1 g de N,N'-diallyl-tartradiamide. La solution est ensuite filtrée, dégazeifiée sous vide et replacée au bain-marie à 50 C. La solution est agitée doucement à l'aide d'un agitateur magnétique et on y introduit 150 mg de persulfate d'ammonium et 0,16 ml de TEMED. Au bout de quelques minu- tes on observe un-léger échauffement du milieu réactionnel, suivi nar la prise en masse de la solution. On obtient ainsi un bloc de gal aqueux rigide et-transparent. Ce bloc est fragmenté en grains par passage sur un tamis ayant des mailles de 100 um. Les grains sont lavés et conservés dans la solution tampon choisie. Le gel homogène ainsi obtenu peut être utilisé, après activation, pour immobiliser les macromolécules biologiques. EXEMPLE 2 à 4 -On opère comme à l'exemple 1 mais en employant, pour 100 ml d'eau deminéralisée, les quantités suivantes de mono mères N-[tris(hydroxyméthyl)méthyl] N,N'-diallyl acrylamide tartradiamide Exemple 2 5 g 1 g 3 3 10 g 0,5 g 4 4 20 g 19 On obtient des gels transparents homogènes, de aractéristiques variées. Le gel de l'exemple 2 est peu compact, celui de l'exemple 3 est compact et celui de l'exemple 4 est très dur. Ces gels sont utilisables comme support pour l'immobilisation des macromolécules biologiques. EXEMPLE 5 : Préparation d'un copolymère N-[tris (hydroxyméthyl) méthy acrylamldeIglyoxal-bis-acrylamide sous forme de perles de gel aqueux. Dans un réacteur de 700 ml, on introduit 350 ml d'huile de paraffine et 2 ml de l'agent émulsifiant connu sous la dénomination commerciale " Span-85". On agite mécaniquement le mélange et le chauffe à 550C. Par ailleurs on dissout, dans 200 ml d'eau chauffée à 55 C, 40 g de N-[tris(hydroxyméthyl) méthyl]acrylamide et 4 g de glyoxal-bis-acrylamide et ajoute à cette solution 300 mg de persulfate d'ammonium. La solution ainsi obtenue est versée dans l'huile de paraffine agitée. La vitesse d'agitation est règlée de façon à obtenir une émulsion stable dont les gouttelettes ont un diamètre d'environ 100 Fm. Au bout de 10 minutes d'agitation, on introduit dans l'émulsion 0,32 mi de TEMED et on poursuit l'agitation pendant encore 30 minutes. On refroidit alors le milieu réactionnel par addition d'eau glacée, arrete l'agitation et laisse reposer le mélan- ge quelques heures. La phase huileuse surnageante est éliminée par succion et les perles de gel obtenues, d'un diamètre d'environ 100 um, sont récupérées par décantation. Ces perles sont lavées à l'aide d'une solution aqueuse de Triton X - 100 à 0,1 %, pour éliminer les restes d'huile, puis avec de l'eau déminéralisée jusqu'à élimination totale du détergent. Les perles peuvent être conservées dans l'eau ou dans une solution tampon appropriée. Le gel aqueux transparent homogène ainsi obtenu est très dur. EXEMPLES 6 à 8 On opère comme à exemple 5 mais en employant, pour 200 ml d'eau, les quantités suivantes de monomères N-[tris(hydroxyméthyl)méthyl] glyoxal-bis acrylamide acrylamide Exemple 6 10 g 1 g " 7 20 g " 8 40 g On obtient des gels transparents homogènes, utilisables comme support pour l'immobilisation des macromolécules biologiques. EXEMPLE 9 : Application à l'immobilisation des enzymes. Dans une fiole conique de 20 mi, on place 5 ml des perles de gel aqueux obtenues à l'exemple 7 et 15 ml d'eau déminéralisée. On agite et ajoute 4 ml d'une solution aqueuse de bromure de cyans gène à 50 mg/ml. On continue à agiter en maintenant le pH à 11 par addition de souda N. Après stabilisation du pH, on agite encore pendant 30 minutes, filtra les perlas, les lave rapidement avec 100 ml d'une solution aqueuse 0,1 M de bicarhonate de sodium, puis avec une solution M de chlorure de sodium. Les perles de gel activé ainsi obtenues sont utilisées ensuite pour la fixation de l'argi- nase. t gel activé est placé dans 10 ml d'un milieu tampon maléate/Mn Cl2 5 x 10 2M, pH 7,2, contenant 10 mg d'arginase à 15 unités/mg. On agite la suspension sur une balancelle pendant 24 h à 40C. Puis on filtre les perles, les lave avec 25 ml d'une solution M de chlorure de sodium et 25 ml d'eau déminéralisée. Le dérivé gel activé - arginase ainsi obtenu est conservé en suspension dans un tampon maléate/Mn Cl2 5 x 10 2M, pH 7,2. La quantité d'enzyme fixée sur le gel activé est déterminée indirectement en dnsant enzyme restant dans le filtrat par la méthode classique au réactif de FOLIN (cf LOWRY et coll. J. Biol. Chem, 1951, t93, 265). L'activité enzymatique dudérivé gel activé arginasa est déterminée par la méthode d'hydrolyse de l'arginine (J.J. HAGAN et R.D. DALLAM, Anal. Biochem. 1968, 22, 518). Les résultats obtenus dans deux essais similaires sont donnés dans le tableau suivant Essai mg d'arginase % d'arginase % d'activité fixée par ml fixé sur le résiduelle de l'ar de gel gel activé ginase fixée 1 1,3 65 % 36 % 2 1,47 73,5 % 37 % Le pourcentage d'activité résiduelle, qui traduit l'activité enzymatique du dérivé, est défini par la formule dans laquelle M3 représente la masse d'enzyme fixée et M1 la masse d'enzyme natif ayant même activité que la masse d'en- zyme fixée. - REVENDICATIONS 1 ) Gels aqueux activés, caractérisés en ce qu'ils résultant de la réaction d'un composé bi-ou polyfonctionnel avec un gel aqueux d'un copolymère statistique reticulé tridimantionnel, insoluble dans l'eau, contenant sous forme copolymérisée a) 25 % à 98 % en poids de N-ftris(hydroxyméthyl) méthyl] acrylamide ou de N-[tris(hydroxyméthyl) méthyl] méthacrylamide, ou d'un mélange de ces deux composés, b) 2 à a 50 % en poids d'un ou plusieurs monomères possédant plusieurs doubles liaisons éthyléniques polymérisables et un ou plusieurs groupes hydroxy, et exempts de groupes NH2 ou COOH, c) 0 % à 50 % en poids d'un ou plusieurs monomères possédant une double liaison éthylénique polymérisable et un ou plusieurs groupes amino ou carboxylique. 2 ) Gels aqueux activés tels que définis dans la revendication 1 caractérisés en ce que le composé bi-ou polyfonctionnel est le bromure de cyanogène, le glutaraldéhyde, l'épichlorhydrine, l'éther diglycidyldque du butanediol-1,4, ou un dérive de la trirhloro-1,3,5 triazine 2,4,5. 30) Combinaisons gel aqueux activé-macromoléculP biologique, caractérisées en ce que le gel aqueux activé est un gel tel que défini-dans chacune des revendications 1 et 2. 40) Combinaisons telles que définies dans la revendication 3, caractérisées en ce que la macromolecure biologique est ine protéine. 50) Combinaisons telles que définies dans la revendication 4, caractérisées en ce que 13 protéine est un enzyme.