FR 2399250 A1 19790302 FR 7723661 A 19770801 L'invention est relative à des préparations ou fractions d'origine animale contenant des produits présentant des activités antibactériennes , aux médicaments contenant de telles préparations ou fractions et à un procédé d'obtention de tels produits, préparations, fractions ou extraits, plus particulièrement à partir d'animaux, préalablement traités in vivo par des injections successives, espacées dans le temps, de lipopolysaccharides de bactéries gram négatif (ci-après dénommées "LPS") ou de substances ou agents immunostimulants analogues ou dérivés du LPS ou de ces agents immunostimulants, et d'un agent infectant tel que Klebsiella nneumoniae L'invention découle en effet de la découverte qu'il était possible d'induire dans l'animal la production de produits ayant une activité antibactérienne qui peuvent être recueillis avec le sérum ou obtenus a' partir de celui-ci, lorsque 1 'animal a préalablement été traite in vivo par des injections successives, espacées dans le temps, de LPS ou-d'un agent immunostimulant analogue et d'un agent infectant, tel que Klebsiella pneumonie L'invention concerne donc un nouveau produit constitué par le sérum d'un tel animal, ce sérum contenant un ou des produits hydrosolubles et atoxiques, présentant une activité antibactérienne appréciée par la capacité qu'a cet extrait d'accroître les possibilités de survie de souris contre un agent infectant a' une dose létale à 100 % chez des témoins, notamment dans le protocole expérimental qui consiste à leur administrer par injection une dose de 1,5106 cellules de Klebsiella pneumoniae, souche ATCC 9997, 1 à 4 jours après ltinjection du susdit extrait de foie L'invention concerne aussi plus particulièrement des procédés d'isolement de tels fractions à partir du sérum contenant des produits actifs, tels qu'ils ont été définis ci-dessus. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que, partant d ' au moins un animal ayant au préalable été traité par -tino dose non létale de lipopolysaccharides de bactéries gram négatif et, après un temps suffisant à l'acquisition par cet animal d'une protection contre l'infection, sous l'effet de ces lipopolysaccharides, on lui administre une dose d 'un agent infectant, tel que Klebsiella Pneumoniae,supérieure à la dose létale 100 chez les mimes animaux non protégés~au préalable, mais inférieure à celle qui entratnerait la mort de l'animal traité, ou, dans le cas de l'application du procédé à plusieurs animaux, la mort de tous les animaux traités par le LPS, et en ce que, après un temps suffisant à la biosynthèse d'un ou des produits ayant des propriétés antibactériennes, on prelève le sérum contenant ce ou ces produits ayant des propriétés antibactériennes Le LPS dans le procédé sus-indiqué peut être remplacé par des substances ou agents immunostimulants analogues capables d'induire la susdite biosynthèse ou par des dérivés du LPS ou des agents immunostimulants. Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention, les LPS sont originaires d'une souche bactérienne du-type Salmonella enteritidis et l'agent infectant est constitué par Klebsiella pneumoniae. De préférence, l'intervalle de temps séparant les injections des LPS et de l'agent infectant est de tordre de 24 heures. On obtient des résultats particulièrement satisfaisants lorsque la dose de LPS extraite des Salmonella enteritidis, administrée à des souris est de l'ordre de 20-251ug par animal et lorsque la dose de Klebsiella pneumoniae, administrée 24 heures plus tard, est de l'ordre de 1,5.10 cellules par animal. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, on prélève le sérum des animaux entre quelques heures (après l'injection de Klebsiella pneumoniae)et 15 jours (après l'injection des (LPS), notamment entre 1 et 9 jours après l'administration des LPS. L'invention porte aussi sur les fractions enrichies qui peuvent etre précipitées par le sulfate d'ammonium hors des sérums susdits, lorsqu'ils contiennent de tels produits actifs. En particulier, l'invention concerne la fraction enrichie en produits actifs qui peut être obtenue à partir du sérum et qui est précipitable au moins en partie au sein d'une solution de sulfate d'ammonium dont la teneur en ce dernier sel est comprise entre environ 48 et environ 75 %. Il est entendu que les pourcentages indiqués en sulfate d'ammonium des solutions étudiées.m sa rapportent ou sont à rame- ner aux proportions volumiques d'une solution saturée de sulfate d'ammonium (à 707 g par litre) vis-à-vis de 100 ml des solutions étudiées. Par exemple, une solution est dite avoir une concentration en sulfate d'ammonium à 30 %, lorsque sa teneur en ce sel correspond à celle qu'aurait une solution de 100 ml, formée à partir de 70 ml d'une solution exempte de sulfate d'ammonium et de 30 ml d'une solution saturée de sulfate d'ammonium. Les fractions enrichies qui peuvent ainsi être obtenues par précipitation sélective au sulfate d'ammonium, peuvent être débarrassées des traces de ce sel qu'elles peuvent contenir, par leur remise en solution dans de l'eau distillée et dialyse contre une solution tamponnée, par exemple une solution du type de celle qui a été utilisée pour procéder aux premières extractions des produits actifs à partir du foie, et que l'on dilue 10 fois. Des fractions encore davantage enrichies en produits actifs peuvent être obtenues à partir des précédentes, en mettant à profit la propriété qui a été découverte des produits actifs, de subir une fixation sélective sur des résines échan geuses d d'ions, notamment du type diéthylaminoéthyl-cellulose (DEAE cellulose) notamment lorsque celles-ci ont auparavant été équilibrées avec une solution tamponnée à pH sensiblement neutre et sensiblement exempte de sels de sodium. Les produits actifs fixés dans leur plus grande partie peuvent ensuite etre élués, notamment au moyen d'une solution de chlorure de sodium.Une élution d'ailleurs sélective peut être produite en prenant soin de déterminer les concentrations ou le gradient de concentration qui autorise une élution de l'essentiel des produits actifs fixés, tout en permettant à la résine de retenir encore des produits antérieurement fixés mais non actifs L'invention concerne aussi plus particulièrement les fractions qui sont fixées sur une résine échangeuse dotions DEAE cellulose, notamment du type DE 52, équilibrée avec un tampon, tel que Tris-HCl 10 M ; pH 7,5;EDTA 10 2 M; MgC12 10 M etA -mercaptoéthanol 10-3M et éluables par le même tampon contenant du chlorure de sodium en concentration comprise entre environ 0,25 et environ 0,40 M Plus particulièrement encore, l'invention concerne des fractions à faibles poids moléculaires, inférieurs ou au plus égaux à 10.000, qui peuvent être séparais à partir des fractions précédentes, notamment par filtration sur tamis moléculaire ou membranes ultrafiltrantescapable de produire la séparation de constituants à poids moléculaires au plus égaux à 10.000, de constituants ayant des poids moléculaires plus élevés. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit des exemples d'extraction de fractions actives à partir de sérums d' animaux, et plus particulièrement des fractions purifiées successives qui peuvent etre obtenues et dans lesquelles se trouvera chaque fois concentré l'essentiel des produits actifs recherches Le matériel utilisé dans les exemples qui suivent a été le suivant - lipopolysaccharides (LPS : préparé à partir de Salmonella ente ritidis, souche ATCC 31.194 par la méthode d'extraction à chaud selon WESTPHAL (0. Westphal, O. Luderitz, F. Bister, Z.Natur forsch. 7b, 148 (1952)), - souches bactériennes : Klebsiella pneumoniae, souche ATCC 9.997, Salmonella enteritidis, souche ATCC 31.194, - tampon de dilution et de purification : Tris 10 2M contenant EDTA 10-2M, chlorure de magnésium 10-3M, 0 -mercaptoéthanol 10 M, - tampon de dialyse : même tampon dilué 10 fois, - tampon d' élution : tampon de purification additionné de NaCl de de O à 1M, - ultrafiltre PM10 - Sociéte AMICON, France. EXEMPLE I 1) Traitement des animaux et prélèvement du sérum. On utilise comme espèce animale pour l'induction in vivo des souris Swiss (20 animaux) pesant environ 20 g. Les animaux reçoivent 25ug de LPS au jour J par voie intrapéritonale (IP). 24 heures après, soit à J + 24 heures, les animaux reçoi vent1 par voie In une injection infectante de Klebsiella pneumoniae, souche ATCC 9.997, 1,5 x 106 cellules. Les animaux sont protégés par le LPS et on les sacrifie à J + 42 heures. On prélève le sérum des animaux par exsanguination totale. On réunit le sang des 20 animaux. 2) Purification partielle du sérum. On laisse le caillot se former pendant 45 minutes dans le volume de sang recueilli. On centrifuge à 5.000 tours/minute en tube à hémolyse. On récolte le sérum, soit 7 ml pour 20 animaux; sa cencentration en protéines est de 69 mg/ml. Le sérum est dilué cinq fois avec le tampon d'extraction, soit 35 ml. On ajoute 34 ml d'une solution saturée de sulfate dtammo nium pH 8 pour obtenir une concentration finale de 48 % en sulfate d'ammonium. On laisse sous agitation magnétique pendant environ I heure. On centrifuge pendant 10 minutes à 15.000 g. On récolte le précipité et le surnageant. Le précipité sera testé. Le surnageant, soit 48 ml, est additionné de 10 ml d'une solution saturée de sulfate d'ammonium pH 8 pour obtenir une concentration finale de 65 % en surate d'ammonium. On laisse sous agitation mécanique pendant environ 1 heure. On centrifuge 10 minutes à 15.000 g. On récolte le précipité et le surnageant. Le précipité sera testé. Le surnageant, soit 52 ml, est repris et additionné de 12 mi de solution saturée de sulfate d'ammonium pH 8 pour obtenir une concentration finale de 75 % en sulfate d'ammonium. On laisse sous agitation magnétique pendant environ 1 heure. On centrifuge 10 minutes à 15.000 g. On récolte le précipité et le surnageant qui seront testés. 3) Etude pharmacoloqique des extraits purifiés obtenus. Les précipités sulfo-ammoniques obtenus, ou plus exactement les précipités s'étant formés au sein des solutions de sulfate d'ammonium et dialysées au préalable, telles que définies ci-dessus, font 11 objet des essais indiques ci-après. - Essai d'activité L'essai consiste à étudier la survie d'un groupe de souris Swiss pesant environ 20 g (10 animaux) traité préventivement par voie IP par le produit à tester et qui reçoivent au jour JO une injection infectante par voie IP de 1,5 x 106 cellules de Klebsiella pneumoniae, souche ATCC 9.997. Le nombre de survies est comparé à celui d'un groupe témoin ntayant reçu aucun traitement protecteur ; chez ces animaux l'injection infectante est mortelle au bout de 24 heures. - Essai de toxicité : On étudie la toxicité du produit à tester sur des souris préalablement surrénalectomisées. Ce traitement en effet hypersensibilise les animaux aux endotoxines et des doses de LPS de l'ordre de 5 ng par animalXadministrées par voie intraveineuse} provoquent leur mort dans un délai de 24 heures. On note le nombre d'animaux survivants. Les résultats figurent dans le tableau I ci-après. Les extraits testés sont identifiés dans la colonne sous le titre général wFRACTIONS tt, Les différentes fractions de précipitations sulfo-ammoniques sont désignées par les lettres PSA, suivies d'une première valeur numérique indiquant la concentration en sulfate dtammonium de la solution, à partir desquelles elles ont été précipitées Les doses des extraits utilisés sont rapportées à leurs teneurs en protéines, dosees par la méthode du biuret On indique pour chaque essai le nombre d'animaux ayant survécu au traitement tel que défini ci-dessus, sur le nombre d'animaux ayant reçu la dose de la fraction à tester. Les résultats mettent en évidence que, dans l'exemple considéré, la fraction active du sérum précipite à une concentration située entre 65 et 75 % L'activité des fractions obtenues est mise en relief par les essais effectués sur des témoins ntayant reçu aucun traitement préalable et sur d'autres qui n'ont reçu que le sulfate a 'ammonium. Celui-ci ntest pas actif.Bien au contraire, il est extrêmement toxique, puisque les animaux qui l'ont reçu sont décédés avant administration de l'injection infectante de Klebsiella pneumoniae Tableau 1 ACTIVITE TOXICITE Dose/souris Survies Dose/souris Survies en mg s/total ant en mg s/total ani TRAITEMENT FRACTIONS protéines maux traités protéines maux traités LPS + Klebsiella. Sérum tel quel 5,9 8/10 6,9 7/7 Sacrifice et prélèvement * PSA 48 % 0,95 0/10 0,75 7/7 du sérum à J + 42 h. * PSA 65 % 0,75 3/10 0,95 7/7 * PSA 75 % 0,86 9/10 0,86 7/7 Surnageant de pré cipitation de PSA 75 % Tous les animaux décédés avant Klebsiella Témoins 2/10 0/10 0/10 * PSA = précipité sulfo-ammonique. EXEMPLE Il Les purifications partielles décrites ci-après sont effectuées sur les mêmes fractions actives initiales que dans l'exemple précédent. 1) Première purification partielle des sérums par précipitation au sulfate d'ammonium. Premi8re précipitation sulfo-ammonique, concentration de 50 % en sulfate d'ammonium. Deuxième précipitation, le surnageant est additionné de sulfate d'ammonium jusqu'à obtention d'une concentration de 65 %. Troisième précipitation, le surnageant 65 % est additionné de sulfate d'ammonium jusqu'à obtention d'une concentration de 80 ,0. Les précipités sulfo-ammoniques successivement obtenus sont dissous dans de l'eau distillée et dialysés contre 100 volumes du tampon Tris 10-2M pH7,2, dilué dix fois. La dialyse stef- fectue pendant une nui; à + 4 C. 2) Purificat}on Elus Eoussée de l'une des fractions obtenues sous 1) par chromatographie et par ultrafiltration. La purification s'effectue sur le dialysat obtenu à partir du culot de la deuxième précipitation sulfo-ammonique susindiquée. On soumet ce dialysat à une chromatographie sur une colonne de DEAE cellulose DE 52 (2 x 20 cm), préalablement équilibrée avec un tampon Tris-HCl 10 M, pH 7,5, EDTA 10-2M, Mg Cl2 10-3M et ss-mercaptoéthanol 10-3M. La chromatographie est développée avec le même tampon. On étudie le profil d'élution par mesure des densités optiques à 260 et 280 nm. L'effluent de chromatographie contenant les protéines non adsorbées constitue la fraction qui a été intitulée "Pic A". L'élution des protéines adsorbées est effectuée grâce à un gradient linéaire de chlorure de sodium de O à 1 M utilisant le même tampon (2 x 200 ml). On obtient deux fractions principales, l'une éluée entre 0,25 et 0,40 M. NaCl (Pic B), la seconde éluée entre 0,40 et 0,50 M Nacl (Pic C). La fraction Pic B est filtrée sur un filtre AMICON PM10 et les concentrats et filtrats sont recueillis separément. L'ensemble des résultats est rapporté dans le tableau II. ci-joint. 3) Propriétés pharmacologiques des fractions purifiées obtenus. Les fractions obtenues dans l'exemple II ci-dessus ont été testées dans les mêmes conditions que les fractions de exemple I. Les résultats sont indiqués dans le tableau II ciaprès. On donne tout d'abord les significations des différentes abréviations utilisées pour désigner les différentes fractions qui ont été testées S = Surnageant. PSA = Précipité sulfo-ammonique. Pic A = Fraction, protéines non adsorbées (effluent). Pic B = premier éluat, gradient NaCl 0,25 - 0,40 M, Pic C = deuxième éluat, gradient NaCl 0,40 - 0,50 M. CC PM10= Concentrat de filtration sur AMICON PM1Q. F PM10 = Filtrat de filtration sur AMICON PM10. Tableau 2 PURIFICATION DE FRACTIONS DE SERUMS ACTIVITE TOXICITE Dose/souris Survies Dose/souris Survies en mg s/total ani- en mg s/total ani TRAITEMENT FRACTIONS protéines maus traités protéines maux traités LPS + Klbsiella Sérum 7,0 3/10 sacrifice J = 42 h. 5,4 3/10 et prélèvement PSA 0 - 50 % 1,1 3/10 PSA 50 - 65 % 1,0 6/10 DEAE sur PSA 50 65 % : pic B 0,7 20/20 Pic B CC PM10 0,8 2/10 0,8 5/5 F PM10 0,08 6/10 0,08 5/5 Sérum des témoins 0/1 0/10 0/10 1/10 On constate que, dans l'exemple II, les fractions actives sont situées dans les culots de précipitation sulfo-ammonique 50-65 %, et qu'elles sont éluées avec le Pic B.Le filtrat PNl0 est actif aussi L'invention est également relative à des compositions administrables in vivo contenant à titre de principes actifs les constituants des fractions actives décrites, notamment pour la prévention des infections bactériennes. Les compositions selon l'invention présentent donc à ce titre les qualités d'un médicament à action antibactérienne. Elle concerne plus particulièrement, mais non-exclusive- ment, les solutions injectables formées par la dilution ou la dissolution de ces fractions actives au sein d'un milieu physio logiquement acceptable. Elle concerne naturellement aussi les compositions propres à être administrées, in vivo, par d'autres voies Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes REVENDICATIONS I - Procédé d'obtention d'une fraction hydrosoluble présentant une activité antibactérienne, caractérisé en ce que, partant d'au moins un animal ayant au préalable été traité par une dose non létale de lipopolysaccharidesde bactéries gram négatif et, après un temps suffisant à l'acquisition par cet animal d'une protection contre l'infection, sous l'effet de ces lipopolysaccharides, on lui administre une dose d'un agent infectant, tel que Klebsiella Pneumoniae, supérieure à la dose létale 100 chez les mêmes animaux non protégés au préalable, mais inférieure à celle qui entrainerait la mort de l'animal traité, ou, dans le cas de l'application du procédé à plusieurs animaux, la mort de tous les animaux traités par le LPS, et en ce que, après un temps suffisant à la biosynthèse d'un ou des produits ayant des propriétés antibactériennes, on prélève le sérum contenant ce ou ces produits ayant des propriétés antibactériennes. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on soumet le sérum obtenu contenant 11 activité antibactérienne à une opération de précipitation sélective des fractions actives par le sulfate d'ammonium, ces fractions actives étant précipitables pour des taux de sulfate d'ammonium compris entre environ 48 et environ 7-5 ,ó- 3 - Procédé selon la revendication 2, oractérisé encre que le précipité obtenu, qui contient l'activité antibactérienne, est redissous dans une solution tamponnée, après dialyse d'une solution de ce précipité, pour êlimlner les traces de sulfate d'ammonium, en ce que l'on fixe sélectivement les produits actifs sur une résine DEAE cellulose etque l'on élue ensuite sélectivement également les produits actifs à partir de la résine. 4 - Procédé selon la revendication 3,caractérisé en ce que la fixation est réalisée sur une résine DEAE cellulose du type de celle commercialisée sous la désignation "DEAE cellulose DE 52", équilibrée avec un tampon Tris-HCl 10-2M, pH 7,5 ; EDTA 10-2 M ; MgCl2 10-3M et ss-mercaptoéthanol 10-3M, et que l'on réalise ensuite l'éluvion de la fraction active avec le même tampon contenant du chlorure de sodium en concentration comprise entre 0,25 et environ 0,40 M. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'éluat susdit est soumis à un fractionnement visant à séparer les constituants à poids moléculaires supérieurs à 10.000, d'une part, et les constituants à poids moléculaire inférieur à 10.000 et retenant une activité antibactérienne, d'autre part, notamment en ayant recours à une ultrafiltration à travers une membrane permettant le passage à travers ses pores des constituants à poids moléculaires inférieurs à 10.000 mais retenant les constituants de poids moléculaires plus élevés, que l'on écarte la fraction contenant ces derniers et que l'on recueille celle co ntenant les constituants à bas poids moléculaires ayant une activité antibactérienne 6 - Fraction hydrosoluble extraite de sérum animal, caractérisée en ce qu'elle contient des constituants ayant une activité antibactérienne appréciée par la capacité qu'a le sérum d'accroître les possibilités de survie de souris contre un agent infectant administré à une dose létale à 100 % chez des témoins, notamment dans le protocole expérimental qui consiste à leur administrer par voie intrapérîtonéale une dose de 1,5. io6 cellules de Klebsiella pneumoniae souche ATCC 9997, 1 ou 4 jours après l'injection du susdit sérum 7.- Fraction selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est soluble dans une solution de sulfate d'ammonium d'environ 48 % et précipitable dans une solution de sulfate d' ammo- nium d'environ 65 - 75 b . 8 - Fraction selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, caractérisée en ce qu'elle est fixable sur une résine échangeuse d'ions DEAE cellulose, notamment du type DE 52, équilibrée avec un tampon, tel que le tampon Tris-HCl 102M, pH 7,5; EDTA 10-2M ; MgCl2 10-3M et ss -mercaptoéthanol 10-3M, et éluable par le même tampon contenant du chlorure de sodium en concentration comprise entre environ 0,25 et environ 0,40 M 9 - Fraction originaire d'un sérum animal, caractérisée en ce qu'elle est pratiquement soluble dans une solution de sulfate d'ammonium à 48 % et précipitable dans une solution de sulfate d'ammonium d'environ 65-75% caractérisée en ce qu'elle est fixable sur résine DEAE cellulose, notamment celle du type DE 52, équilibrée avec un tampon tel que le tampon Tris-HCl 10-2M, pH 7,5 ; EDTA 10-2M ; MgCl2 10-3 M et ss - mercaptoéthanol 10-3M, et éluable par le même tampon contenant du chlorure de sodium en concentration comprise entre 0,25 et environ 0,40 M 10 - La fraction contenant les substances de poids molé culaires inférieurs à 10.000 qui peut être séparée à partir de celle de la revendication 9 Il - Fraction hydrosoluble ayant une activité antibactérienne et d'une façon générale les propriétés essentielles des fractions susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 12 - Médicament contenant à titre de principe actif une fraction telle qu'obtenue par le procédé défini dans l'une quelconque des revendications 1à 5 ou une fraction telle que définie dans les revendications 6 à Il