FR 2394606 A1 19790112 FR 7632722 A 19761029 La présente invention concerne un procédé ae conservation et de protection des microorganismes biologiquement actifs et u tilisables en agronomie avec des argiles, ainsi que les eomposi- tions obtenues par un tel procédé. L'invention concerne en outre l'application de ces compositions notamment à la lutte contre les insectes. Depuis ces dernières années, en raison des problèmes de protection de l'environnement (pollution et recyclage), des re- cherches sont effectuées sur l'utilisation pratique des microorga nismes en agronomie. Les études sur les associations symbiotiques ont montré en tre autres l'intérêt de la bactérisation des légumineuses par enro bage des semences avec des cultures de Rhizobium (BONNIER C et IEERUN F: Méthode de préinoculation des graines de légumineuses. Ann. Inst. Pasteur, 1963,105,133-142), de la bactérisation des non légumineuses avec les engrais bactériens à base de Azotobacter ou de Bacillus megaterium (MISHUSTIN E.N., "Action d'Azotobacter sur les végétaux supérieurs", Ann. lnst. Pasteur, 1966,111,121-135) et de la mycorrhization des arbres tels que les conifères avec le champignon Pisolithus Tenctorius (MARKS G.C. and KOZLOWSKI, 1973 "Ectomycorrhizae. Their Ecology and Physiology", Acad". Press, 444 pp). Des travaux récents ont conduit par ailleurs à proposer des méthodes biologiques de lutte contre les maladies des plantes gra- ce à l'emploi de souches hypovirulentes (TIVOLI B, LEMAIRE J.M. et JORAN B "Prémunition du blé contre Ophiobolus graminis SACC. par des - souches peu agressives de mEme porosité", Ann. Phyto pathol., 1974, 6,395-406; LITTLEFIELD L.J., "Fla: mst resistance induced by prior inoculation with an avirulent race of Melampsora lini" Phytopathology, 1969, 59, 1323 - 1328). Enfin, les impasses phytosanitaires, provoquées par l'em- ploi abusif des pesticides de synthèse, ont orienté les recherches vers le remplacement des insecticides classiques par des produits biologiques permettant de lutter efficacement contre les insectes nuisibles (BURGES M.D. and MUSSEY N.W. Ed "Microbial Control bf Insecte and Mites", Acad. Press. 1971, 861 ppi LEE A.BULLA Ed. "Regulation of Insect Populations by Micro-organisms", Ann.N.Y. Acad. Sci., 1973, 217, 243 pp). Les microorganismes entomo pathogènes utilisables en lutte biologique sont soit des bactéries : groupe des Bacillus thuringiensis et agents des "milky diseases", soit des virus : agents des polyédroses nucléaires (NPV), des polyédroses cytoplasmiques (CPV) ou des granuloses (GV), soit des champignons : Phycomycètes (Entomophthore sp., Massospore sp.), Ascomycètes (Cordyceps sp.,), Basidiomycètes et Deutéromycètes (avec notamment les genres Beauveria, Eletarrhizium, Nomur@ea-Spicaria et Paecilomyces-Isaria), soit des protozoaires. L'emploi de ces microorganismes pose néanmoins un problème d'une part de conservation et/de protection et, d'autre part, de main- tien de l'efficacité lors d'un stockage prolongé. L'effet protecteur de l'argile sur les composants des "i croécosystèmes a reçu déjà quelques illustrations. Ainsi, on a montré (PIERRE J.F., KILBERTUS G, REISINGER O, Observations ultrastructurales de la biodégradation d'une algue dans un écosystème aquatique", Bull. Soc. Lorr. Sci, 13-137-148,1974 et GUCKERT A., BREISCH H., REISINGER O., Interface sol-racine I/Etude au microscope électronique des relations mucigel-argile-microorganis- mes.Soil. Biol. Biochem. 7,241-250, 1975), que les polysacohari- des végétaux associés aux particules argileuses résistent à l'ac- tion lytique de la microflore. I1 en est de même pour les polysaccharides bactériens dont la dégradation devient lente et reste incomplète dans les sols argileux comme on l'a démontré par des techniques chimiques (TOK H.H. "Etude de la biodégradation des polysaccharides en présence de substrats minéraux". Thèse Dort. Ing. I.N.P. Nancy 1975. L'effet des argiles sur la croissance et la physiologie des bactéries ou des champignons a été également étudié invitro (FILIP Z., HAIDER K., MARTIN J.P., "Influence of clay minerals on growth and metabolic activity of Epicoccum nigrum and Stackybotrys chartarum."Soil. Biol. Biochem. 4,135-145, 1972 et MAIGETTER R.Z., PFISTER R.H. ," A mixted bacterial population in a continuous culture with and without kaolinite", Can. J. Microbiol. 21 173180, 1975). I1 faut cependant noter que ces travaux relatifs au fonctionnement physiologique des microorganismes en présence de matériel phylliteux n'apportent que peu de renseignements sur la conservation des espèces examinées.Dans le cas des bactéries et des champignons, la conservation s'effectue en effet en absence de croissance et avec un fonctionnement physiologique très réduit. Dans une étude bibliographique, MARSHALL K.C. ("Clay mineralogy in relation to survival of soil bacteria", Ann. Rev. Phytopath. 13,357-373, 1975) réunit les données concernant la sur vie des bactéries en relation avec la présence d'argiles. Des exemples cités, il apparat que,dans l'environnement naturel, les argiles peuvent protéger efficacement les bactéries contre la dessication, les températures élevées et les rayonnements létaux. Elles modifieraient également le rapport h8te-parasite par inac tlvation des bactériophages après adsorption sur les feuillets mi- ndraux. Les particules argileuses peuvent dgalement-immobiliser les antibiotiques et modifier ainsi un facteur très important de l'écologie microbienne (HASKA G."Influence of clay mineras on sorption of bacteriolytic enzymes" Microbial Ecology, 1, 234-245, 1975). Quant aux champignons, BAKERSPIGEL A.("Soil as a storage medium for fungi Mycologia, 45, 595-604, 1953) étudie le sol st4- riais comme milieu possible pour la conservation des souches de collection. Les techniques de conservation et de protection des microorganismes se proposent de résoudre les problèmes de sensibilité aux agressions extérieures et d'autolyse des unités biologiques. Il est très souhaitable de mettre au point une technique et des compositions permettant de conserver le potentiel dtinocu- îum et Inactivité spécifique de tels produits (potentiel de colonisation ou potentiel infectieux). L'invention a pour objet un procédé pour la conservation et la protection des microorganismes, qui remplit à la fois deux exigences contradictoires, à savoir, d'une part, qui protège effet cacement le microorganisme contre les actions extérieures, en par. ticulier contre l'action des rayons ultraviolets ou contre les attaques microbiennes et, d'autre part, qui permet une reprise ultérieure aisée de l'activité spécifique desdits agents lors de leur application, tout en gardant intégralement leur pouvoir de colonisation ou leur pouvoir pathogène. La présente invention permet donc de résoudre les problèmes de conservation et de protection de microorganismes et de maintien de leur potentiel dtinoculum. A cet effet, la présente invention a pour objet un procédé de conservation et de protection de microorganismes avec des argiles, caractérisé en ce qu'on mélange une préparation aqueuse de ces agents avec une suspension aqueuse d'argile, qu'on agite ensuite le mélange résultant puis qu'on élimi- ne l'eau en excès jusqu'à obtention d'une composition dans laquez le le microorganisme est enrobé par l'argile. Les microorganismes biologiquement actifs et utilisables en agronomie sont choisis parmi les agents symbiotiques, les souches hypovirulentes et les agents entomopathogènes. Ces microorganismes peuvent entre soit des virus, soit des bactéries, soit des champignons. Les agents entomopathogènes peuvent être des protozoaires. La préparation aqueuse des microorganismes, en particulier bactéries et champignons, est obtenue à partir d'un milieu de cul ture de ces agents qu'on centrifuge ou qu'on filtre, qu'on lave à plusieurs reprises avec de l'eau et qu'on remet finalement dans l'eau en vue de son mélange avec la suspension aqueuse d'argile. Le mélange d'argile et des microorganismes est agité pendant au moins 5 minutes. Le fait d'opérer en milieu liquide permet d'obtenir une bonne couverture par l'argile dont les feuillets se collent à la face externe de la paroi des microorganismes biolo giquement actifs. Quelques soient les microorganismes utilisés, champignonsa virus ou bactéries, le rapport en poids du microorganisme à l'argile d-2 le mélange est compris entre 15 et 5:1. L type d'argile utilisé n'est pas critique. Son choix est dicté uniquement par des considérations d'économie et d'activité. Dans un iode de réalisation, l'argile utilisée est une montorillo- nite activée calcique ou une bentonite à base de montmorillonite activée sodique. Etant donné que, dans les compositions selon l'invention, les microorganismes biologiquement actifs sont complètement recouverts, l'argile protège/aus ces microorganismes contre les bactéries, ce qui procure donc une première protection mécanique contre l'agression des bactéries antagonistes. En outre, l'argile capte les enzymes émises par les bactéries antagonistes, ce qui prolonge encore la vie des microorganismes, d'où une augmentation de la durée de l'activité de la composition dans le sol. Pour les compositions selon l'invention, l'activité des microorganismes est libérable et ils conservent leur caractère spécifique, par exemple leur pathogénicité dans le cas des agents entomopathogènes. On notera que les moyens mis on oeuvre dans.le procédé de l'invention présentent une importance critique. D'une part, il est indispensable, pour obtenir un enrobage satisfaisant des agents microbiens, que le mélange avec l'argile soit réalisé en milieu liquide. On a en effet constaté que, si lton se contente de mélanger des spores ou des virus avec des feuillets d'argile, ces derniers possèdent la propriété d'adsorber l'agent actif, mais celui-ci subit alors une perte dtactivité. D'autre part, le lavage des microorganismes obtenus sur milieu nutritif, afin d'éliminer le substrat alimentaire, est un élément déterminant de l'efficacité de la proteçtion. On a noté en effet que la présence d1 éléments nutritifs dans le mélange mi eroorganismes -argile représente un appel trophique en faveur des bactériens, ce qui diminue considérablement l'efficaèité de la protection de l'argile. Gracie au procédé de l'invention, les microorganismes, en particulier les spores, sont d'abord protégés par enrobage d'argille, mais leurs activités spécifiques, tell que la pathogénicité, sont ensuite libérables lors de leur application. Sans que la portée de l'invention puisse entre limitée par des considérations théoriques, on pense que, dans les conditions du procédé de l'invention, 1 'argile se comporte comme une charge active d'enrobage qui coopère avec les microorganismes, en particulier par des échanges ioniques avec les spores. L'invention concerne en outre les compositions contenant dos microorganismes enrobés par une argile et obtenus par le procédé décrit ci-dessus. Ainsi qu t on l'a déjà mentionné ei-dessus, les microorganismes utilisés sont soit des agents symbiotiques, soit des souches hypovirulentes, soit des agents entomopathogènes. L'invention concerne également l'application des oomposi- tions selon l'invention. Si la composition contient des microorganismes qui sont des agents symbiotiques, cette composition peut etre utilisée pour le traitement des semences et des arbres. Ce traitement peut cotre effectué soit par trempage des semences dans la composition, soit par enrobage ("pelleting") de ces semences, soit mEme par épandage de la composition. Si la composition contient des micro-organismes qui sont des souches hypovirulentes, la composition peut être utilise pour la lutte contre les maladies des plantes. Dans ce cas, le traitement des plantes est normalement effectué par épandage de la co- position. Si, finalement, la composition contient des microorganismes qui sont des agents entomopathogènes, la composition peut entre utilisée pour la lutte contre les insectes. Dans ce cas,on traite soit le sol, soit la matière végétalejsoit les deux avec la compo- sition et on opère généralement par pulvérisation. Le produit peut être conditionné soit sous forme humide, soit sous forme de poudre .11 est à noter que le séchage de la préparation aqueuse suivant le procédé de l'invention est beaucoup moins éprouvant que le séchage de la suspension de microorganismes sans argile. Les exemples suivants servent à illustrer le procédé de l'invention sans aucunement en limiter la portée. EXEMPLES 1) Procédé de conservation et de protection des agents entomopa- thogènes. Pour les essais,on a utilisé 3 souches cryptogamiques différentes de la mycothèque I.N.R.A. de la Station de Recherches de Lutte Biologique ("Souches de microorganismes", Bull. SROP, 1973,3, 30 pp) dont deux isolats de Beauveria bassiana (Bb 18 et Bb 32) et un isolat de Paecilomyces fumoso-roseus (P.f.r.4) d'une part, et une préparation virale agent de la polyédrose nucléaire (NVP) de la Noctuelle du choux Mamestre brassicae d'autre part. D'après les données disponibles, les biopréparations à base de propagules fongiques entomopathogènes comprennent soit des spores obtenues sur milieu stable en culture de surface (EVLAKHOVA A.A. "Culture intensive de champignons entomopathogènes", Zashita Rastenti", 1966,11,43)soit des blastospores obtenues à partir de culture en profondeur (brevet FR 72.35.452),soit des conidiospores aussi obtenues à partir de culture en profondeur (Certificats d'auteur soviétiques N0 301 .142 et N 313.531), soit enfin des spores de résistance touJours à partir de culture en fermenteur. Les produits technologiquement les plus rentables sont bien entendu ceux provenant de culture en profondeur, c'est-à-dire en fermenteurs indus triels.On a choisi pour les essais les blastospores > car ce sont les propagules les plus fragiles, les plus sensibles aux conditions du milieu et les plus sujettes à la lyse. Ceci a donc permis d'étudier la biodégradation du germe en se plaçant dans les conditions les plus défavorables à sa survie et de tester ainsi la valeur du procédé de protection proposé. la préparation virale obtenue à la Minière, composée de virions inclus dans des protéines, est mélangée avec du lactose. Elle contient î x 109 polyèdres par gramme (Lot nO 3575 INRA la Minière). Pour enrober ces agents on a utilisé deux types d argile - soit la montmorillonite nO 25 des Etablissements Ward's Natural Science Inc. New York. (Cette argile sodique est transformée en argile calcique avant l'emploi), - soit l'argile dite Clarsol "KC2"des Etablissement CECA Velizy-Villacoublay (bentonite sodique activée obtenue par traitement d'une bentonite calcique au carbonate de sodium). Les organes fongiques (blastospores) obtenus en milieu liquide agité sont recueillis par centrifugation (3500 tours/ minute). Ils sont ensuite lavés quatre fois afin d'éliminer toute trace d'aliments (lavage dans l'eau suivi chaque fois par une centrifugation). Après le dernier lavage, le matériel pesé est remis en suspension dans l'eau. Parallèlement, une meme quantité d'argile est également mise en suspension dans l'eau. Les deux suspensions sont ensuite mélangées et agitées pendant quelques minutes. Le temps minimum d'agitation est de 5 minutes. Après centrifugation (3500 t/nn), le mélange est soit immédiatement employé, soit déshydraté. La préparation virale est enrobée de la meme manière, mais dans des rapports en poids de 1 (virus) : 2 (argile). Les résultats obtenus sont indiqués ci-dessous. 2) Résultats a) Examen au microscope électronique. Les blastospores enrobées par l'argile ou non sont fixées au tétraoxyde d'osmium (90 minutes) et traitées ensuite par la technique habituelle pour des examens au microscope électronique afin de vérifier la qualité d'enrobage ou l'état des cellules a près exposition à une microflore tellurique. Les résultats de ces examens seront mis davantage en évidence en se référant aux figures 1 à 4 représentant des blastospores de la souche Bb32 après 1 'enrobage par l'argile. Sur ces figures,AG représente les feuillets d'argile, Pi le plasmalemxe, N le noyau de la blastospore, M les mitochondries et P la paroi fongique. L'examen de ces figures montre que la plupart des cellules sont parfaitement couvertes de feuillets d'argile. la relation entre ces derniers et la paroi fongique s'effectue au moins en partie par l'intermédiaire des substances de nature polysaccharidique (figure 3). A la vue de ces figures, on peut également affirMer que la technique d'enrobage par l'argile ne modifie pas la structure cellulaire. b) Vérification du potentiel d'inoculum La mise en culture des préparations avec ou sans argile montre que la présence des feuillets autour des blastospores ne modifie pas le pouvoir germinatif des cellules fongiques. A titre d'exemple, une préparation de la souche Bb18 contient 9,8 x 1010 spores par gramme de matière sèche. Après l'enrobage par l'argile et en tenant compte des différences de taux d'humidité, la préparation finale par graoeoee de matière sèche fongique contient en moyenne 9,5 x 1010 unités de dissémination. c) Vérification du potentiel infectieux. Des études sur des insectes, effectuées en employant des préparations avec ou sans argile > montrent que l'enrobage ne modifie pas de manière sensible le pouvoir pathogène du champignon. Si on utilise par exemple de la souche Bb18 sur doryphore (larves L4), on note 90% de mortalité après 3-4 Jours aussi bien avec les blastospores seules qu'avec la préparation blastospores + argile. L'argile seule ne donne pas une mortalité significative. Des résultats analogues sont obtenus sur la Noctuelle du choux Mamestre brassicae (chenilles L5) traitée par Paecilomyces fumoso-roseus (souche P.f.r. n 4) seul ou enrobé d'argile. d) Essai de résistance aux rayons U.V. Dans le cas des champignons, une quantité connue de matériel est remise en suspension dans l'eau stérile. Après une dilution convenable, des bottes de Pétri contenant un milieu solide (généralement l'extrait de malt à 2% gélosé à 2%) sont ensemen codes en surface. Deux lots sont ainsi réalisEs, ltun avec des blastospores seules (témoin), l'autre avec des blastospores enrobées par l'argile. Les bottes sont ensuite exposées à l'action d'une lampe germicide (U.V.) pendant des temps variables. la lecture steffectue après 5 jours d'incubation des bottes, par déno- brement des colonies formées. Si on expose, par exemple pendant 5 minutes aune culture Bb32 à une lampe germicide, la perte du potentiel dtinoculum est de 90% pour les blastospores témoins alors que cette perte est seulement de 37% avec des blastospores enrobées par l'argile. e) Exposition aux adents microbiens. Le mode opératoire est celui utilisé régulièrement dans l'étude de la biodégradation des cellules fongiques ou des produits naturels. Une quantité connue de blastospores, enrobées ou non d'argile, est enfermée dans un sac en tissu de verre. Elle est ensuite déposée dans un/cylindre contenant de la terre. L'ensemble est incubé à 2O0C et le taux d'humidité du sol est rajusté à la capacité de rétention tous les 7 jours. Ce processus permet d'accélérer les phénomènes de biodégradation. Des prélèvements périodiques permettent de suivre la perte de poids du matériel fongique. Des ensemencements sur le milieu nutritif détinssent Itévolution du potentiel d'inoculum (dans le cas des champignons) et le degré d'invasion bactérienne de la masse de matériel biologique étudié. Les résultats concernant la biodégradation de la souche Bb18 dans le sol sont indiqués dans le tableau I. TABLEAU I Temps d'incuba- Bb18 (blastospores) Bb18 (blastospores) + tion ; a argile,proportion Perte de Nombre Potentiel Perte Nombre de Poten : de :micro- zd'inocu-: de :microorg. :tiel d': poids org./.g. lum(per- poids g. mat. / inocu mat. sè- tes en sèche lum : che : %) : : :(per- : : : a : a tes en: % ------------------------------------------------------------------ 1 semaine 39% 12x1010 97% 10% 6 x 1010 27% ------------------------------------------------------------------ 2 semaines 76% 48x1010 100% 27% 7 x 1010 35% ------------------------------------------------------------------ 9 semaines 94% 13x1010 100% 34% 1 x 1010 53% L'argile employée est celle dite "Clarsol" à proportion de 1:1.L'analyse des résultats montre que la perte de poids après une semaine d'incubation est de 39% sans agrile alors qu'avec l'argile elle 'est que de 10%. Une différence sensible existe même après 3 à 9 semaines. Le taux dtinvasion bactérienne et l'évolution du potentiel d'inoculum montrent aussi que l'argile protège efficacement les blastospores contre les agents biologiques. Il en est de même pour la souche Bb32 qui a été enrobée par la montmorillonite calcique dans les proportions de 1 (blastos pores) : 2 (argile). Le taux d'inoculum après 1 mois d'incubation est de 73% du taux initial abrs que sans argile il n'est que de 32%. Les résultats concernant la biodégration de la préparation virale sont indiqués dansle tableau Il. TABLEAU II Temps dtincu- : Virus : Virus + argile bation : : proportion 1:2 : Perte de : Nombre de : Perte de : Nombre de poids : microorga- : poids : microorga : : nismes/ g. : : nismes/g, mat.sèche mat.sèche ------------------------------------------------------------ 1 semaine 77% 18 x 1010 15% 3x 1010 ------------------------------------------------------------ 2 semaines 79% 11 x 1010 33% 2x 1010 9 semaines : 88% : 18 x 109 : 49% : 2 x 109 Dans ce cas, on n'a pu suivre que l'évolution de la perte de poids et de la population microbienne. Les résultats réunis dans le tableau II montrent aussi un effet protecteur très net de l'argile. Une analyse au microscope électronique a permis de vérifier également l'état ultrastructural de la préparation biologique. Des résultats rapportés ici, il apparatt nettement que l'enrobage par l'argile ne modifie pas le pouvoir pathogène des préparations. Par contre, il permet de maintenir à un niveau élevé le potentiel d'inoculum en face d'une population tellurique natu- relle, et rend de ce fait le produit plus longtemps efficace, L'argile a également un effet protecteur efficace mon- tre les rayonnements ou la dessication. REVENDICATIONS 1. Procédé de conservation et de protection de microorganismes biologiquement actifs et utilisables en agronomie, comprenant le mélange d'une préparation aqueuse de ces microorganisnes avec une suspension aqueuse d'argile, caractérisé en ce que la prépara- tion aqueuse des microrganismes est obtenue à partir d'un milieu .de culture de ces agents, qu'on lave à plusieurs reprises avec de l'eau, qu'on centrifuge ou qu on filtre et qu t on remet finalement en suspension dans l'eau et en ce qu'on agite ensuite le mélange résultant puisqu'on élimine l'eau en excès jusqu'à l'obtention d'une composition dans laquelle le microorganisme est enrobé par l'argile. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange est agité pendant au moins 5 minutes. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'argile utilisé est du type montmorillonite activée calcique ou bent-onite à base de montmorillonite activée sodique. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le rapport en poids du microorganisme à l'argile est compris entre 1 : 5 et 5 : 1. 5 Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisée en ce que les microorganismes biologiquement actifs et utilisables dans l'agronomie sont choisis parmi les agents symbiotiques, les souches hypovirulentes et les agents entomopathogènes. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les microorganismes utilisés sont choisis parmi les virus, les champignons et les bactéries. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les agents entomopathogènes sont des protozoaires. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le virus utilisé est du type i'triniestra brassicae. 9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le champignon utilisé est une propagule fongique. 10. Procédé selonlla revendication 9, caractérisé en ce que le propagule fongique est du type Beauveria bassina de la Minière ou du type Paecilomyces fumoso-roseus. 11. Composition de microorganismes biologiquement actifs eU utilisable dans l'agronomie, obtenue par le Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que les microorganismes sont choisis parmi les agents symbiotiques, les souches hypovirulentes et les agents entomopathogènes. 12. Application au traitement des semences et des arbres de la c-omposition selon la revendication 11J dans laquelle les microorganismes sont des agents symbiotiques. 13. Application à la lutte contre les maladies des plantes de la composition selon la revendication 11, dans laquelle les microorganismes sont des souches hypovirulentes. 14. Application à la lutte contre les insectes de la composition selon la revendication 11, dans laquelle les microorganismes sont dès agents entomopathogènes.