FR 2366304 A1 19780428 FR 7629451 A 19760930 La présente invention concerne des composés organiques, plus particulierement des composes doués d'activité biologique ou chimique, par exemple des biopolymeres tels que les enzymes, les anticorps, les protéines et les peptides. Ces composés organiques sont fréquemment utilisés dans les réactions chimiques et biochimiques et il est avantageux pour ces applications, et d'autres, d'utiliser ces composés sous une forme insoluble dans l'eau, facile à séparer. On connaît bien les. techniques utilisées a cet effet. Par exemple, les enzymes insolubilisées sont maintenant très répandues comme instruments biochimiques utiles. On a utilisé diverses matrices d'insolubilisation, par exemple par adsorption sur des échangeurs d'ions (Gray, C C.J., e t Yeo, T.H., Carbohyd.Res., 27, page 235 (1973)) et fixation par liaison covalente d'une partie de la molécule de l'enzyme sur des centres d'un polymère préformé (Barker, S.A ; Doss, S H ; Gray, C.J.; Kennedy, J.F. ; Stacey, M. et Yeo, T.H. ; Carbohyd. Res., 20, page 1 (1971)). L'invention concerne des composés organiques sous une forme insoluble dans l'eau facilement séparable sur un support métallique, convenablement mis sous la forme de poudre ou de barreaux métalliques. Les avantages que peut entraîner la présentation du composé organique sous cette forme comprennent les suivants (bien que toutes les compositions selon l'invention ne possèdent pas tous ces avantages) a) les composés organiques peuvent être utilisés plusieurs reprises b) le composé organique peut être plus stable a la chaleur et d'autres conditions d'inactivation que le composé correspondant libre ou soluble c) la composition a les propriétés de densité élevée et de dimension de particules et de forme imposées par le support métallique d) la densité élevée de la composition assure qu'elle se dépose rapidement et soit facilement séparée de la suspension dans des milieux aqueux ou d'autres milieux liquides e) lorsque le support métallique est magnétique, la vitesse et la facilité d'élimination de la composition des milieux liquides par un champ magnétique assurent qu'un procédé de lavage ou d'incubation puisse être terminé rapidement et efficacement, en permettant un centrale stricte de la température de la solution ou de la durée de réaction ;; f) des agitateurs internes sous forme de barreaux ne sont pas nécessaires pour effectuer les réactions, car les supports métalliques magnétiques peuvent agiter considérablement les solutions lorsqu'on les place dans un champ magnétique tournant g) on peut aussi utiliser ce procédé d'insolubilisation dans liteau des enzymes pour concentrer les enzymes produites dans un milieu de fermentation, un extrait cellulaire, un liquide biologique ou d'autres liquides aqueux contenant ces enzymes, soit seules, soit en mélange avec d'autres composés. De plus, on peut fixer simultanément plus d'une enzyme ou d'un antisérum particulier sur le support déposé sur un métal lors de l'insolubilisation.Ces préparations d'enzymes ou antisérumsinsolubilisés dans l'eau, stables, sur des supports métalliques peuvent être récupérées dans certains cas où d'autres prdparations enzymes ou antisérumsinsolubilisés sont difficiles ou impossibles å récupérer, par exemple lorsqu'elles sont en suspension colloSdale ou bien en présence d'autres particules indissoutes, en raison de leur vitesse élevée de sédimentation et de leurs propriétés magnétiques h) par l'utilisation d'antisérums liés par covalence aur des barreaux métalliques, un essai radio-immunologique simplifié est possible, dans lequel l'addition et la séparation de l'anticorps (ou de l'antigene) sont effectuées facilement,complètement et rapidement (sans centrifugation) par un procédé impliquant moins d'habilité de la part de l'opérateur. Ltinvention a donc pour objet un revêtement stable insoluble dans l'eau sur différents métaux, dans lequel on peut lier par covalence des protéines douées d'activité biologique, de telle sorte que le produit possèdeles propriétés biologiques de la protéine et les propriétés mécaniques et magnétiques du support métallique. L'invention a donc pour objet une composition dans laquelle le composé organique doué d'activité biologique ou chimique est porté sur un support métallique, ladite composition comprenant un support métallique insoluble dans l'eau dont la surface est enduite avec un polymère intermédiaire auquel peut être fixé le composé organique, la composition présentant l'activité biologique ou chimiquedu composé organique non lié ou une activité correspondante. Le métal doit être solide et ne pas réagir avec l'eau, soit b l'étant non protégé, soit, si nécessaire, a l'état protégé. Le métal est de préférence, mais non essentiellement, magnétique, par exemple ferromagnétique ; ceci apporte des avantages pour certaines applications, tels que la séparation facile de milieux liquides, le lavage facile, le transfert automatisé et le comptage numérique faciles (par exemple, pour l'emballage). Le choix du métal dépend fortement des conditions du procédé de revêtement. Avec un monomère acide, les métaux plus électropositifs sont moins satisfaisants puisqu'il y a rapidement production d'hydrogène provoquant la rupture de la surface du polymère intermédiaire à mesure qu'il est appliqué. Le métal peut aussi être sous une forme modifiée, par exemple enrobé dans un support A l'état libre ou enrobé, le métal peut être pur, impur ou allié. En outre, des matières plastiques "magnétiques" sont disponibles et certains oxydes métalliques magnétiques peuvent également être utilisés sur le support métallique. Dans tout ce qui précède, la surface du métal peut être modifiée, par exemple sous forme d'une pellicule d'oxyde. Si le matériau final est destiné å être utilisé pour une détermination riobiolcgique avec compétition, il est préférabk d'utiliser un métal dans lequel l'absorption de la radiation est relativement faible. Les métaux préférés sont l'aluminium, le cobalt, le fer, l'étain et, en particulier, le nickel. La forme du support métallique peut être choisie pour s'adapter aux exigences. I1 conviendra souvent d'utiliser une poudre métallique. Suivant un autre mode de mise en oeuvre,-le support métallique peut etre sous forme de barreaux métalliques ferromagnétiques et, dans ce cas, il suffit d'en utiliser un seul a la fois. Ces barreaux peuvent avoir une forme convenable pour éviter le frottement pendant l'agitation ou bien, par l'utilisation d'un champ magnétique convenable, ils peuvent être utilisés suspendus sans aucun contact avec les parois du récipient réactionnel. Une forme préférée est celle dans laquelle un barreau métallique est enduit avec un mélange du polymère intermédiaire et du métal sous forme de poudre. D'autres formes possibles pour le support métallique comprennent des surfaces, plaques, particules, sphères, tiges, barreaux et formes irrégulières. Le polymère intermédiaire doit former sur le support métallique un revêtement adhérent continu et pouvoir être couplé au composé organique. I1 est de préférence, mais non nécessairement, hydrophile et, de préférence, mais non nécessairement, macroporeux. Il peut être avantageusement formé in situ sur le support métallique. Lorsqu'il est ainsi formé, le polymère doit dériver de préférence d'au moins un monomère acide, de manière à faciliter la polymérisation sur le support métallique. Bien qu'il existe diverses manières de coupler le composé organique sur le polymère intermédiaire, la plus importante utilise les liaisons de covalence résultant de l'interaction chimique de groupements réactifs de l'un et de l'autre. Ce type de couplage est bien connu et peut être effectué,par exemple, au moyen d'acide nitreux, ou d'un aldéhyde ou d'un carbodiimide.Le polymère intermédiaire peut comporter à cet effet une grande variété de groupements réactifs, y compris les groupes amino aliphatique, amino aromatique, sulfhydryle (protégé si nécessaire), hydroxy, aldéhyde (protégé si nécessaire) et acide carboxylique, et on peut utiliser pour les buts de l'invention des polymères appropriés portant ces groupes ou d'autres groupes convenables. I1 peut être possible d'incorporer les groupements réactifs dans le polymère sur le support métallique. Les polymères appropriés comprennent les polymères de styrène, de styrènes substitués, de dérivés du naphtalène, d'acides acryliques et méthacryliques, d'acrylamide et de méthacrylamide, les résines phénolaldéhyde et les résines amine-aldéhyde et les copolymères de ces composés entre ou avec des monomères copolymérisables ne contenant pas de groupements réactifs de fixation.Le polymère peut être utilisé en mélange avec une charge inerte. Les polymères particulièrement intéressants de ce point de vue sont les polymères d'aminoacides aromatiques et d'aldéhydes. Parmi les aminoacides aromatiques, on préfère les acides 2-, 3- et 4-amino benzotques et les acides 2,4- et 3,5-diaminobenzotques, bien que d'autres acides entrent en ligne de compte, par exemple acide aminobenzènesulfonique, tyrosine, acides aminosalicyliques, acides glucosaminobenzorques, acides alkylformylaminobenzotques et composés apparentés, tels qu'acides hydroxy benzotques, glycine, acide glutamique et diaminobenzènes et leurs dérivés. Parmi les aldéhydes, on préfère le formaldéhyde et l'acétaldéhyde, bien que d'autres mono- et dialdéhydes entrent en ligne de compte, tels que le glutaraldéhyde. L'utilisation d'un mélange d'un monoaldéhyde et d'un dialdéhyde, par exemple formaldéhyde et glutaraldéhyde, peut permettre de conserver inchangés les seconds groupes aldéhyde de ce dernier, ainsi disponibles pour le couplage avec le composé organique. Le polymère intermédiaire peut avantageusement être préparé par polymérisation en émulsion, en solution ou en suspension dans un milieu liquide (généralement aqueux) contenant le support métallique. Ainsi, par exemple, on peut ajouter lentement un aldéhyde à une solution aqueuse d'un acide aminobenzotque contenant un support métallique et récupérer le support métallique revêtu du liquide. Il peut aussi être utile d'amorcer la polymérisation en perles sur la poudre métallique comme germes. Des substances telles que le dextranne ont été polymérisées en perles et offrent telles quelles de très bonnes matrices pour l'immobilisation. On peut aussi enduire le support métallique avec le polymère préformé, par exemple par trempage ; cette technique semble particulièrement appropriée pour des polymères tels que la cellulose et le polyéthylène. Au lieu de couplet directement la matière organique sur le polymère intermédiaire, il peut être avantageux de former un pont entre les deux. Les techniques pour réaliser ces ponts sont bien connues. Un avantage d'un pont est que le composé organique peut être placé à une plus grande distance du polymère intermédiaire et présenter par conséquent une plus grande activité spécifique. Un autre avantage est que des groupements fonctionnels différents peuvent ainsi être fixés sur le polymère intermédiaire pour le couplage avec le composé organique. On sait que les biopolymères peuvent être immobilisés sur un verre convenablement modifié. Selon l'invention, le polymère intermédiaire peut être un verre sous la forme d'un revêtement sur le support métallique. La surface du verre peut être modifiée, par exemple par formation d'un dérivé diazosilane ou succinimide avec lequel le composé organique peut ensuite être couplé. Un revêtement de polystyrène peut convenir pour le couplage par simple adsorption et peut donc ne pas nécessiter une modification chimique. Suivant un autre mode de mise en oeuvre, le polymère intermédiaire peut être activé par irradiation pour donner des centres de radicaux libres pour le couplage avec le composé organique. L'imprégnation du polymère intermédiaire avec un sel de métal de transition peut aussi fournir des centres pour le couplage du composé organique par chélatation. L'invention.concerne également, selon un autre de ses aspects une composition comprenant un support métallique insoluble dans l'eau dont la surface est enduite avec un polymere intermédiaire, de préférence un produit de condensation d'un acide aminobenzotque avec un aldéhyde, ladite composition étant appropriée pour le couplage avec un composé organique. Le composé organique est de préférence un biopolymère, ctest- -dire une substance polymère (ou oligopolymère) d'origine biologique ou douée d'activité biologique, par exemple une activité hormonale, une activité antigénique, une activité d'anticorps, une activité enzymatique ou une activité de récepteur. Les biopolymères comprennent des protéines et des substances protéinacées (comprenant des glycoprotéines, des complexes polysaccharide-protéine, des immunoglobulines, des enzymes) ; des peptides et des glycopeptides, des polysaccharides, tels qu'amidon et dextranne > et des acides nucléiques et leurs dérivés. Les biopolymères synthétiques commencent à être disponibles et leur utilisation entre également dans le cadre de l'invention. D'autres composés organiques comprennent les composés monomères doués d'activité biologique et d'autres substances qu'il pourrait être souhaitable de fixer sur des supports métalliques, par exemple des antibiotiques, des inhibiteurs d'enzyme, des toxines,. des agents hydrophobes et des ligands spécifiques de certaines enzymes. L'invention concerne l'utilisation des composés radioactifs marqués correspondants et également leurs formes modifiées chimiquement ou enzymatiquement. Plusieurs de ces composés organiques contiennent des groupements réactifs par lesquels ils peuvent être couplés au polymère intermédiaire. Par exemple, de nombreux bippolymères contiennent des groupes phénoliques ou des groupes tyrosyle ou histidinyle pour le diazocouplage, ou bien peuvent contenir des groupes carboxyle ou d'autres groupes convenables pour le couplage par une réaction avec un carbodiimide. Lorsque ces groupes ne sont pas présents, il il normalement nécessaire d'introduire des groupements convenables, tels que des groupes hydroxyle, amino ou carboxyle aromatiques. La réaction du carbodiimide est importante car c'est un exemple de réaction permettant d'effectuer le couplage sans l'utilisation d'un acide. La demanderesse a trouvé que l'utilisation d'un acide dans la réaction de couplage peut parfois nuire aux propriétés du polymère intermédiaire. On devra garder présent à l'esprit le fait que la modification du composé organique, soit par introduction de groupements réactifs, soit par couplage avec le polymère intermédiaire, peut influencer ou, dans certains cas, détruire l'activité chimique ou biologique qui est sa propriété recherchée. Le spécialiste dans ce domaine aura connaissance de ce danger, connaîtra la portion de la molécule organique qui est essentielle pour l'activité chimique ou biologique en question et cherchera à s'assurer qu'une modification du composé organique n'affecte pas cette portion de la molécule.Cependant, il n'est souvent pas possible de prévoir si un composé organique donné conservera son activité biologique ou chimique après couplage avec un polymère intermédiaire spécifique sur un support métallique spécifique, et une certaine expérimentation de routine peut donc être inévitable pour parvenir à une combinaison convenable composé organique-polymère intermédiaire-support métallique. L'activité biologique ou chimique présentée par la composition peut être inférieure, égale ou supérieure à celle du composé organique non couplé. Le composé organique peut être couplé au polymère intermédiaire par les moyens connus. Dans de nombreux cas, le composé organique est dissous ou mis en-suspension dans un milieu aqueux et couplé au polymère intermédiaire au moyen d'acide nitreux de glutaral aldéhyde, d'un carbodiimide, ou d'acide nitreux et de m-diazobenzène. Comme il est bien connu de l'homme de ltart, l'acide nitreux peut être formé in situ a partir de nitrite de sodium et d'un acide, par exemple d'acide chlorhydrique ou perchlorique. En général, le polymère intermédiaire est appliqué sur le support métallique avant le couplage avec le composé organique. Après le couplage avec le composé organique, il est normalement souhaitable de bloquer les centres réactifs inutilisés sur le polymère intermédiaire. Ceci peut s'effectuer convenablement au moyen d'un agent de blocage, par exemple, dans le cas d'un polymère diazoté acide aminobenzoSque-formaldéhyde, un composé phénolique, par exemple 2-naphtol ou thyrosine, ou borohydrure de sodium. Il est envisagé que les compositions selon l'invention soient utilisées dans des déterminations par compétition, par exemple-par radio-isotopes, en particulier des déterminations radio-immunologiques. L'invention concerne donc également un coffret pour déterminations par compétition comprenant une source d'une composition telle que définie ci-dessus dans laquelle le composé organique est, soit le composé à.déterminer, soit une forme marquée de celui-ci. L'invention concerne également un procédé pour effectuer une détermination par compétition utilisant une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle le composé organique est, soit le composé a déterminer, soit une forme marquée de celui-ci. Lorsque l'activité chimique ou biologique du composé organique est épuisée, on peut séparer le composé, conjointement avec le polymère intermédiaire, par hydrolyse et réutiliser le support métallique par une technique de réenduction. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Les exemples 1 à 10 concernent des supports métalliques revêtus avec le polymère intermédiaire. Les exemples 11 à 13, 18 et 19 concernent le couplage du composé organique au polymère intermédiaire. Les exemples 14 à 18 concernent l'activité biologique du composé couplé. EXEMPLE 1 On dissout 6 g d'acide p-aminobenzoSque dans 100 ml d'eau distillée bouillante. On ajoute 15 g de poudre de nickel et on la laisse dans la solution pendant 5 mn. On ajoute goutte à goutte à la solution bouillante 0,1-1,0 ml de solution de formaldéhyde 40 %. On filtre le produit, on le broie légèrement et on lave plusieurs fois l'eau distillée. EXEMPLE 2 On remplace dans le mode opératoire de l'exemple 1 l'acide p-aminobenzoSque par l'acide 3,5-diaminobenzoique. EXEMPLE 3 On remplace dans le mode opératoire de l'exemple 1 l'acide p-aminobenzorque par l'acide m-aminobenzotque. EXEMPLE 4 On remplace dans le mode opératoire de l'exemple 1 l'acide p-aminobenzotque par l'acide o-aminobenzoSque. EXEMPLE 5 On remplace dans le mode opératoire de l'exemple 1 le formaldéhyde par l'acétaldéhyde. EXEMPLE 6 On remplace dans le mode opératoire de l'exemple 1 la poudre de nickel par la poudre de cobalt. EXEMPLE 7 On remplace dans le mode opératoire de l'exemple 1 la poudre de nickel par la poudre de fer. EXEMPLE 8 On remplace dans le mode opératoire de exemple 1 la poudre de nickel par la poudre d'aluminium. EXEMPLE 8a On remplace dans le mode opératoire de l'exemple 1 la poudre de nickel par la poudre d'étain. EXEMPLE 9 On remplace dans le mode opératoire de l'exemple 1 la poudre de nickel par 100-200 barreaux de nickel de 7,5 mm x 2,0 mm de diamètre et on supprime l'étape de broyage. EXEMPLE 10 On ajoute les barreaux enduits de l'exemple 9 à 6 g d'acide p-aminobenzoRque dans l'eau distillée bouillante et on agite doucement en continu. On ajoute lentement 5 g de poudre de nickel jusqu' former un nouveau revêtement. On filtre le produit et on le lave plusieurs fois a l'eau distillée. EXEMPLE 11 Couplage de supports d'enzvmes. déposés sur métal a la ss-D-glucosidase au moyen de l'acide nitreux On lave le support enzyme déposé sur métal (100 mg ou un barreau métallique enduit) avec 5 fois 12 ml d'eau distillée et on l'ajoute & un mélange de 5 ml de nitrite de sodium 1,0 N glacé et 5 ml d'acide chlorhydrique dilué 0,6-1,0 N glacé et on agite pendant 1 a 2 mn à 0-40C.On lave le support diazoté avec trois fois 15 ml de tampon à l'acétate 0,1 M a pH 4,8 a 0-4 C et on le couple à la -D-glucosidase (par exemple amandes douces, Koch-Light Laboratories Limite, 1-4 mg/ml) dans 1 à 2 ml de tampon a l'acétate 0,1 M 9 pH 4,8 pendant 2 b 18 h à 0-40C. On décante la solution aqueuse et on ajoute une solution saturée de p-naphtol dans l'acétate de sodium saturé (5 ml). On agite le mélange pendant 2 h à 0-40C. On lave le produit résultant avec 10 fois 15 ml de tampon à l'acétate 0,1 M à pH 4,8 et avec une solution de substrat d'enzyme (O-nitrophényî-P-D glucopyranoside, 1 mg/l ml) dans le tampon à l'acétate avant l'utilisation. EXEMPLE 12 Couplage de supports d'enzymes déposés sur métal a la ss-D-glucosidase au moyen d'acide nitreux et de m-diaminobenzèhe Le support métallique enduit pour enzyme est couplé à la p-D-glucosidase comme à l'exemple 11 avec addition de 2 mg de m-diaminobenzène à l'acide chlorhydrique avant l'emploi. EXEMPLE 13 Couplage de supports d'enzymes,dépoeés sur métal, avec la ss-D-glucosidase au moyen de glutaraldéhyde On lave 100 mg(ou un barreau métallique) enduit du support d'enzyme déposé sur métal avec 5 fois 12 ml d'eau distillée et on l'ajoute à 2 ml d'une solution à 2,5 Z de glutaraldéhyde et on agite pendant 2-5 h à 200C. On décante la solution aqueuse et on lave le produit avec 5 fois 12 ml de tampon a l'acétate 0,1 N, pH 4,8. Le support est couplé A la p-D-glucosidase dans 2 ml de tampon l'acétate (1 mg/ml à 0-40C pendant 6 a 18 h). On lave le produit résultant avec 10 fois 15 ml de tampon 9 l'acétate avant l'emploi. EXEMPLE 14 Activité des préparations de ss-D-glucosidase couplée au support d'enzyme déposé sur métal vis-à-vis du O-nitrophényl-ss-D-glucopyranoside comme substrat On détermine l'activité des préparations de ss-D-glucosidase couplée par incubation de 100 mg, ou unbarreau enduit, avec le O-nitro phdnyl-p-D-glucopyranoside (1 mg/ml) dans 1 ml de tampon a l'acétate 0,1 N, pH 4,8 à 200C. On prélève a divers intervalles de temps des parties aliquotes de 0 I ml et on les ajoute z 0,5 ml d'une solution de carbonate de sodium 0,1 N. On termine l'absorption de la solution résultante a 420 nm. On détermine une unité d'activité de ss-D-glucosidase comme étant l'activité de 1 y de l'enzyme non couplé. Exemple de Protéine couplée, Enzyme, Enzyme, Exemple couplage &gamma;/g de solide unit6/g unité/barreau de solide métallique 1 1 1725 558 1 2 - 1100 1 3 320 5 1 - 100 6 1 - 480 7 1 1005 200 9 1 - - 1,0 10 1 - - 9 > 0 10 2 - - 18,5 10 3 - 5,0 EXEMPLE 15 Activité de la ss-D-glucosidase libre et couplée au support enzyme déposé sur métal,vis- -vis du O-nitrophényl-B-D-glucopyranoside comme substrat. en fonction du pH L'enzyme couplée utilisée dans cette expérience est celle obtenue à l'exemple 1 avec l'exemple de couplage 11.On détermine l'activité des enzymes libres et couplées pour une série de valeurs du pH en utilisant les techniques suivantes (a) Enzyme libre On fait incuber l'enzyme et le substrat (concentrations finales 1 mg/l et 1 mg/ml, respectivement) dans les solutions tamponnées appropriées (voir tableau) pendant 30 mn à 200C. On ajoute ensuite une partie aliquote (0,1 ml) du mélange de réaction à 0,5 ml de solution de carbonate de sodium 0,1 N et on détermine la densité optique à 420 nm. (b) Enzyme couplée On agite enzyme couplée sur métal (100 mg) en présence du substrat (1 mg/ml, 1 ml) dans les solutions tamponnées appropriées (voir tableau) pendant 30 mn à 200C. On ajoute une partie aliquote (0,1 ml) de la liqueur surnageante à 0,5 ml d'une solution de carbonate de sodium 0,1 N et on détermine la densité optique a 420 nm. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau ci-dessous. TABLEAU Activité de la B-D-glucosidase libre et couplée au support d'enzyme déposé sur métal, vis-à-vis du 0-nitrophényl--D-glucopyranoside Activité (% de l'activité maximale) pH Tampon Enzyme libre Enzyme couplée 4,00 Phosphate-citrate (0,1 M) 36 50 4,65 Phosphate (0,1 M) 70 90 5,35 Phosphate 100 100 6,10 Phosphate 64 98 6,30 Phosphate 58 97 7,50 Phosphate 44 73 8,70 Phosphate 23 28 EXEMPLE 16 Aptitude à la réutilisation de la ss-D-glucosidase couplée au support d'enzyme déposé sur métal Le support d'enzyme déposé sur métal (100 mg) préparé comme à l'exemple 1 est couplé A la ss-D-glucosidase (comme à l'exemple 11).On détermine à plusieurs reprises l'activité de ss-D-glucosidase du produit (comme l'exemple 14) en utilisant le O-nitrophényl-ss-D-glucopyranoside comme substrat en lavant entre les incubations par le tampon à l'acétate (0,1 N, pH 4,8, 3 fois 15 ml). Détermination de l'activité % de l'activité initiale 1 (100) 2 103 3 122 4 124 5 130 6 127 7 117 8 132 EXEMPLE 17 Stabilité thermique de la ss-D-glucosidase insolubilisée On fait incuber à 200C et 370C des échantillons (100 mg) de ss-D-glucosidase couplée au support d'enzyme déposé sur métal > (exemple 1, exemple 11) et de ss-D-glucosidase soluble de même activité et on détermine l'activité comme à l'exemple 14 ; l'enzyme soluble et l'enzyme insolubilisée sont toutes deux dans le tampon à l'acétate 0,1 Mà pH 4,8, mais la durée d'incubation pour la détermination de l'enzyme vis- -vis du Ó-nitrophényl- ss-D-glucopyranoside comme substrat est chaque fois de 3 mn.On fait incuber simultanément des substrats témoins et les déterminations individuelles sont corrigées. % de rétention d'activité Température Durée Enzyme couplée Enzyme libre 200C 168 h 102 15 37 C 15 h 92 18 EXEMPLE 18 Couplage de supports d'enzymes déposés sur métal a des sérums antigonadostimuline hypophysaire folliculos timulante On lave le support d'enzyme déposé sur métal (100 mg, exemple 1) avec l'eau distillée (5 fois 12 ml) et on l'ajoute à un mélange de nitrite de sodium glacé (1,0 N, 5 ml) et d'acide chlorhydrique dilué glacé (0,6-1,0 N, 5 ml) et on agite (1-2 mn, 0-40C).On lave le support diazoté par le tampon i l'acétate (0,1 M, pH 4,8, 3 fois 15 ml, 0-40C) et on le couple avec des sérums antigonadostimuline hypophysaire folliculostimulante (anti-FSH) humaine, obtenus à partir de sang de lapin, après injectioremultiples avec la gonadostimuline hypophysaire folliculostimulante humaine pure (4 mg/ml), dans le tampon à l'acétate (2 ml) pendant 6 h à 0-4 C. On décante la solution aqueuse et on ajoute une solution saturée de ss-naphtol dans l'acétate de sodium saturé (5 ml). On agite le mélange pendant 2 h (0-4 C).On lave le produit résultant avec le tampon à l'acétate (0,1 M, pH 4,8, 10 fois 15 ml), et on détermine l'aptitude à fixer la FSH du produit lui-même ou en présence d'un excès de FSH par la technique de détermination radio-immunologique de Butt, W. R. et Lynch, S. S., dans Clinica. Chim. Acta 22, page 79 (1968).On obtient les résultats suivants Fixation de la FSH, % Antisérum couplé, mg Sans excès de FSH Avec excès de FSH 1 11,4 3,7 2 14,6 5,0 4 35,3 5,5 EXEMPLE 19 Couplage de supports d'enzvees. dés sur métal à des sérums antigonado- atimuline hypophysaire iolliculostimulante au moyen d'un carbodjimide soluble dans l'eau On ajoute le sérum anti-FSH (10 mg) dans l'eau distillée (1 ml) à 15-20 barreaux revêtus de polymère (exemple 4). On ajoute du 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide jusqu'à ce que la solution ait une concentration 0,1 M et on ajuste le pH a 5,0 par le tampon au phosphate (pH 4,0 ou 8,0, 0,1 M) et on maintient à ce pH pendant 24 h à la température ambiante. On lave ensuite vigoureusement les barreaux (10 fois 15 ml) par le tampon à l'acAtate (pH 4,8, 0,1 M) après le couplage. On montre que le produit de l'exemple 18 est capable de produire une courbe d'inhibition en présence de mélanges de FSH marquée et non marquée. On a montré plus haut que les acides aminobenzoîques en solution aqueuse peuvent être utilisés pour former le polymère intermédiaire. Le formaldéhyde donne ordinairement dans ces réactions des produits de condensation avec l'azote du groupe amino en conditions alcalines, mais il forme en milieu acide des ponts méthylène. Ces ponts sont formés en ortho-para du reste amine aromatique et en méta du reste acide carboxylique aromatique. Le rapport molaire préféré de l'aldéhyde à l'acide amino benzotque dans le polymère intermédiaire est de 1:7 à 2:1. Le rapport molaire optimal du formaldéhyde à l'acide 4-aminobenzoSque est d'environ 1:5 et > si l'on augmente la teneur en formaldéhyde auquel8 de cette valeur par rapport à l'acide aminobenzotque, il y a une perte progressive de l'aptitude au couplage avec l'enzyme.On suppose qu'à de faibles concentrations dans le formaldéhyde la réaction prédominante a lieu par des ponts méthylène entre- les noyaux aromatiques, mais que, lorsque la concentration augmente, un plus grand nombre de fonctions amine sont bloquées par condensation avec l'excès'de formaldéhyde. La quantité d'acide aminobenzotque qui a réagi avec le polymère intermédiaire déposé sur le métal dépend dans une grande mesure de la surface spécifique du métal et il reste souvent une grande quantité d'acide aminobenzorque dans la liqueur après la réaction.On suppose qu'une partie du formaldéhyde serait réduite par l'hydrogène formé par la réaction de l'acide benzorque chaud avec re métal et réduirait de cette manière les poches de -gaz qui pourraient être emprisonnées sous la matrice de résine en formation. I1 est possible que l'hydrogène libéré puisse également réduire le mélange amine-formaldéhyde pour donner des amines secondaires. L'analyse infrarouge du produit de l'exemple 1 montre de nettes différences avec l'acide 4-aminobenzotque. Celles-ci sont tout à fait apparentes dans la région de déformation C-H dans le plan (1000-1300 cl 1) et hors du plan (800-950 cl 1), en raison du changement de substitution benzénique, et dans les régions de tension N-H (3300-3500 cml) et de déformation (1600-1650 cl 1) Il y a également une apparence de pics -l d'absorption à 1380 cm 1 due peut-etre à l'ion carboxylate. Il semblerait que le polymère est maintenu sur le métal par des liaisons électrostatiques. La matrice polymère déposée sur le métal contient des groupes amino libres qui pourraient être utilisés pour insolubiliser des enzymes par couplage diazotque avec des groupes tyrosine de l'enzyme. On a utilisé la ss-D-glucosidase comme exemple caractéristique enzyme, mais comme exemple facile à obtenir et de détermination rapide. La courbe d'activité en fonction du pH de la p-D-glucosidase couplée (exemple 15) présente un effet d'élargissement par rapport à l'enzyme libre. Cet effet est le plus évident dans la région alcaline. L'ionisation partielle, ou totale, des groupes acide carboxylique donnerait lieu à une matrice chargée négativement élevant le pH local de la solution au-dessus de celui mesuré pour la masse de la solution. Ceci est une confirmation supplémentaire de la nature électrostatique de la liaison avec le métal de la matrice. Les résultats des essais d'aptitude la réutilisation montrent une augmentation initiale de l'activité de l'enzyme. Ceci indique qu'il y a peu ou pas d'absorption physique de la ss-D-glucosidase active sur le support après Ia technique de lavage de routine, mais il peut y avoir une élution progressive initiale de la -D-glucosidase inactive ou de l'inhibiteur d'enzyme qui réduisait l'activité apparente de l'enzyme couplée à la matrice, jusqu'à l'élimination. L'effet d'une agitation magnétique à vitesse moyenne de la composition est de réduire son activite spécifique d'environ 1 % par heure, même en présence du substrat, Cette perte n'est pas importante lorsque les incubations ne sont ordinairement que de 3-5 mn et la perte pourrait être réduite par une agitation moins vigoureuse. La perte d'activité est probablement due à l'élimination progressive du revêtement par frottement. Des composés organiques insolubilisés ont montré de diverses manières leur utilité. On les utilise lorsque leur stabilité accrue, leur reutilisation et leur récupération relativement plus faciles qu'avec le composé non couplé sont plus importantes que le travail et les frais supplémentaires de l'opération de couplage. Ils peuvent etre facilement récupérés à partir de la solution-par de simples opérations de filtration on centrifugation, ou bien on peut les utiliser comme garnissages de colonne dans les opérations à écoulement continu. Leur utilisation répétée compense les fraies plus élevés de fabrication.Les avantages de pouvoir coupler des composés organiques à des métaux aussi facilement usinables que le nickel et l'aluminium, comme le montre la fixation de la ss-D-glucosidase sur du fil de nickel et de la feuille d'aluminium, ont de nombreuses applications possibles dans l'industrie de l'ingénierie biologique, par exemple lorsque le support métallique peut être sous forme de petites sphères pour des réactions à écoulement continu en colonne ou des séparations par chromatographie d-'affinité, comme palette métallique, dans det réactions agitées, ou sous forme de canalisation pour des réactions impliquant un transport rapide de substance. il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration, et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1. Composition insoluble comportant un composé organique doué d'activité biologique ou chimique porté sur un support métallique, caractérisée en ce qu'elle comprend un métal de support insoluble dans l'eau dont la surface est revêtue avec un polymère intermédiaire auquel est couplé le composé organique, ladite composition présentant l'activité biologique ou chimique du composé organique non couplé ou une activité correspondante. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisésen ce que le métal du support est le nickel, le cobalt, le fer ou l'aluminium. 3. Composition selon la revendication 1 ou 23 caractérisée en ce que le métal du support est ferromagnétique. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications l à 3, caractérisée en ce que le métal du support est sous forme de barreaux ou de poudre. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le polymère intermédiaire est un produit de condensation d'un acide aminobenzorque avec un aldéhyde. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'aldéhyde est le formaldéhyde. 7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le composé organique est un biopolymère. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications l a 7, oeractérisée en ce que le composé organique est une protéine. 9. Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que le composé organique est la p-D-glucosidase. 10. Composition selon la revendication 8 > caractérisée en ce que le composé organique est le sérum antigonadostimuline hypophysaire humaine produit chez le lapin. 11. Coffret pour déterminations par competition5 caractérisé en ce qu'il comprend une source d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle le composé organique est soit le composé à déterminer ou une forme marquée correspondante, soit un réactif spécifique du composé à déterminer ou une forme marquée correspondante. 2. Composition comprenant un support métallique insoluble dans l'eau dont la surface est revêtue avec un produit de condensation d'un acide aminobenzotque avec un aldéhyde, caractérisée en ce qu'elle convient pour le couplage avec un composé organique. 13. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce que le métal du support est le nickel, le cobalt, le fer ou l'aluminium. 14. Composition selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce que le métal du spport est ferromagnétique. 15. Composition selon l'une quelconque des revendications 12 a 14, caractérisée en ce que le métal du support est sous forme de barreaux ou de poudre. 16. Composition selon l'une quelconque des revendications 12 15, caractérisée en ce que l'aldéhyde est le formaldéhyde. 17. Composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, czractérisée en ce qu'elle convient pour le couplage avec une protéine. 18.- Procédé de fabrication d'une composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 17, caractérisé en ce qu'on ajoute lentement l'aldéhyde à une solution aqueuse de l'acide aminobenzotque contenant le support métallique et on récupère le métal revêtu du liquide. 19. Procédé pour effectuer une détermination par compétition en utilisant une composition selon l'une quelconque des revendications 1 a 10, caractérisé en ce le compose -organique est soit le composé à déterminer ou une forme marquée correspondante, soit un réactif spécifique du composé à déterminer ou une forme marquée correspondante.