FR 2376665 A1 19780804 FR 7700247 A 19770106 La présente invention est relative à un vaccin destiné à l'immunisation du porc et d'autres animaux contre une infection due au Bordetella bronchiseptica. On a établi que le Bordetella bronchiseptica est la cause principale de la maladie qui est largement répandue chez le porc et que l'on appelle habituellement "atrophie turbinée", parce que, après l'infection primaire, les os turbinés du nez subissent fréquemment une sérieuse détérioration. On peut se reporter à cet effet à Canad. J. Comp. Met , 31, 53-57 tel967) et aux références bibliographiques qui y sont citées. La bactérie Bordetella bronchiseptica peut persister dans les cavités nasales, en menant à une infection des produits des truies d'élevage. Les porcelets sont infectés très tt par le Bordetella bronchiseptica (avant l'age de quatre semaines), ce qui soulève le problème particulièrement difficile d'une protection efficace, car le système d'immunisation des très jeunes porcelets n'est pas sensible aux vaccins de manière satisfaisante. Pour une production efficace d'anticorps, on administre habituellement les vaccins aux porcs à l'age d'environ six à huit semaines. A ce moment, si les porcs ont déjà été infectés par le Bordetella bronchiseptica, une détérioration des os turbinés peut se produire,meme siles porcs sont ensuite immunisés contre l'infection. Le premier traitement qui s'est montré intéressant pour réduire le problème de l'infection chez les porcelets a consisté en l'administration d'un agent thérapeutique sulfamidé, tel que de la sulfaméthazine ou de la sulfaéthoxypyridazine, et ce dans les rations données aux troupeaux d'élevage. On a signalé cette méthode dans la littérature et elle a été brevetée par Dr. Wiliam P. Switser: Vet.Med., 58, 571-574 (1963); brevet des Etats-Unis d'Amérique 3.336.190, Toutefois, l'efficacité d'une thérapeutique par sulfamidé pour l'élimination d'une infection due au Bordetella bronchiseptica a été limitée par le développement de souches de l'organisme, qui sont résistantes aux sulfamidés.A titre d'exemple, une étude faite en 1967 a montré que des matières isolées de Bordetella bronchiseptica, récupérées de 80% des animaux inspectés, étaient résistantes aux sulfamidés [ Am. J. Vet. Res., 30, 1621-1624 (Sept., 1969)].Ces résultats ont mis en évidence la nécessité de pouvoir disposer de médicaments supplémentaires ou, plus particulièrement, d'agents efficaces d'immunisation, Avant la présente invention, aucun autre traitement préventif utilisable dans l'élevage industriel des porcs n'a toutefois été proposé. On a trouvé que l'introduction de cellules vivantes d'une souche à faible virulence de ,t,rdetella bronchiseptica dans les cavités nasales de porcs non immunisés produit une infection relativement modérée et que, par la suite, le porc est immunisé contre une infection ultéribure, notamment une infection par des souches plus virulentes deliorganisme [Voir J. Vet. Res., 30, 1161-1166 (Juillet, 1969)], Une telle souche de faible virulence, qui n'a-pas été disponible au public, a été identifiée par le code privé "Souche"D-l". C'est cette meme souche qui a été utilisée pour préparer le vaccin à cellules entières tuées, utilisable par voie parentérale, suivant la présente invention. Toutefois, au cours des travaux antérieurs, on a trouvé que des cellules vivantes de la Souche D-l persistaient dans les cavités nasales des porcs guéris. Par conséquent, la Souche D-1 a été écartée en tant que vaccin intranasal à cellules entières vivantes. De plus, on ne connatt aucune autre souche de Bordetella bronchiseptica qui assurerait une immunité et qui s'éliminerait ensuite d'elle-meme des conduits nasaux des porcs immunisés. On a également procédé à des essais pour créer un vaccin au départ de cellules tuées de Bordetella bronchiseptica, vaccin qui pourrait créer une immunité par une administration parentérale. L'un des premiers vaccins expérimentaux de ce genre a été préparé au départ d'une souche virulente de Bordetella bronchiseptica (identifiée sous le nom de "Souche B"), Toutefois, ce vaccin à cellules entières n'est pas parvenu à créer une résistance à l'infection nasale, comme signalé par Harris D.L., et Switzer W,P.: Am. J. Vet. Res., 30, 1161-1166 (juillet 1969).En raison de cette défaillance de tels vaccins à cellules entières, utilisés par voie parentérale, Harris et Switzer ont supposé que: "une exposition du porc aux antigènes internes de Bordetella bronchiseptica peut être nécessaire à la création d'une résistance contre l'infection nasale", Am. J. Vet. Res., 33, 1975, 1981-1982 (oct., 1972). Cette théorie s'est avérée incorrecte. Des vaccins préparés au départ de cellules rompues de Bordetella bronchiseptica, Souche D-l, ne sont pas parvenus à empêcher une infection par le Bordetella bronchiseptica, mais ont supposé une élimination accélérée lors d'un essai ultérieur d'une quarantaine de jours (A.J. Vet.Res., 33, 1975, 1979 et 19-81). On en a conclu que le type de résistance créé par un vaccin parentéral contenant les antigènes libérés de cellules tuées était différent de l'immunité du porc qui avait été- guéri d'une infection intranasale avec du Bordetella bronchiseptica vivant. Le but d'une immunisation efficace contre l'infection restait à atteindre et aucune solution à ce problème déroutant n'était donc perceptible. L'état de la technique dans ce domaine a été résumé par D.O. Farrington et W,P. Switzer, à savoir les inventeurs dans le cas présent, dans un article intitulé "Resistance to Bordetella Rhinitis", Proceedings, The George A, Young Conference on Advances in Swine Repopulation and the Thirteenth Annual Nebraska SPF Conference, Lincoln, Nebraska, 23-24 juillet 1973, pages 44-52; à la page 46 de cet article, on a signalé ce qui suit: "on sait qu'une immunisation parentérale du porc avec des bactérins (vaccins bactériens)ab Bordetella bronchiseptica accè1ère l'élimination nasale des infections de ce Bordetella bronchiseptica. En outre, le développement des fortes lésions associées à la rhiniteatrophique semble être inhibé de façon significative chez les porcs convenablement immunisés". Les essais réalisés avec des bactérins dé Bordetella bronchiseptica expérimentaux ont été résurlés dans le Tableau 1 de cet article. On en a conclu que, alors que "des bactérins parentéraux ont montré un certain degré de libération accélérée des infections nasales dues au Bordetella bronchiseptica ", "de nombreuses questions restaient sans réponse avant que le développement d'un agent d'immunisation pratique contre la rhinite due au Bordetella devienne une réalité ". Comme on l'a mentionné antérieurement, l'infection due au Bordetella bronchiseptica est la cause principale de la rhinite atrophique. Fréquemment, à la suite de l'infection, les os turbinés subissent une sérieuse atrophie. Dans la colonisation des conduits nasaux par les organismes de Bordetella ces organismes pénètrent dans la couche de mucus et s'accrochent en colonies aux cellules épithéliales. Durant l'infection, des substances toxiques sont produites, ces substances atteignant le tissuvsous-jacent et, en particulier, les cellules de formation osseuse des crêtes turbina les. On croit que ces substances.toxiques produisent des lesions créant l'atrophie turbinée.La présente invention apporte des moyens pour assurer une immunisation efficace contre les substances toxiques qui créent l'atrophie turbinée, sans empêcher l'infection primaire de Bordetella bronchiseptica. De façon plus particulière, au cours des travaux qui ont mené à la présente invention, on a découvert qu'un vaccin à cellules entières tuées pourrait être préparé au départ d'une souche de Bordetella bronchiseptica identifiée par ATCC nO 31124, ce vaccin, lorsqu'il est administré en une dose critique, étant capable d'assurer une protection efficace du porc contre le développement de l'atrophie turbinée En outre, bien que 'le porc vacciné ne soit pas immunisé contre l'infection, on obtient habitueXlement une élimination accélérée de l'infection due au Bordetella bronchiseptica. Toutefois, le résultat nouveau et principal de la présente invention est qu'on obtient une immunisation contre les lésions turbinées accompagnant l'infection due au Bordetella bronchiseptica Ceci est important car de telles lésions et la détérioration résultante des os des cavités nasales sont une cause importante de pertes économiques pour les éleveurs de porcs. En raison de la prédominance des organismes de Bordetella bronchiseptica dans les troupeaux d'élevage et de la grande difficulté pratique de maintenir ces troupeaux sans ces organismes, il est extrêmement difficile d'éviter une infection des jeunes porcs & un Age auquel-ceux-ci y sont sujets. On développe ci-après d'autres détails importants en ce qui concerne la préparation de vaccins sous la forme de do ses, suivant la présente invention, et également concernant la méthode d'utilisation-de ces vaccins. On a trouvé que des bactérins parentéraux à cellules entières tuées, préparés au départ de la souche ATCC nO 31124, sont efficaces pour empêcher l'atrophie turbinée et pour réduire la durée d'une infection due au Bordetella bronchiseptica De plus, on a trouvé que des porcelets agés de moins de 4 semaines répondent de façon satisfaisante aux bactérins suivant l'invention. La présente invention apporte, par conséquent, des moyens pour assurer aux porcelets une protection par anticorps contre l'atrophie turbinée, avant que ces porcelets aient cu l'occasion d'être infectés avec des lésions résultantes des os du nez. Avant le dép8t de la demande de brevet d'origine aux Etats-Unis d'Amérique, on a placé en dép8t auprès de l'organisa- tion "American Type Culture Collectiong xk SrgAnd, U.S.A., des échantillons viables de la souche de Bordetella bronchiseptica, que l'on peut utiliser comme cultures d'ensemencement pour la production du vaccin suivant la présente invention. Les échantillons identiques déposés, identifiés antérieurement par le code privé "Souche D-l", ont reçu le nO ATCC 31124, que l'on utilisera par conséquent comme numéro d'identification dans la présente description et les revendications. La description taxonomique disponible de la souche Bordetella bronchiseptica ATCC nO 31124 est donnée ci-après. Description toxonomique On a récupéré le ATCC n 31124 des produits d'exsudation du nez et de la trachée d'un jeune chien b tard qui présentait des signes cliniques de la maladie des chiens. On a ensuite déterminé que cette souche est avirulente pour le porc et qu'elle présente les caractéristiques suivantes d'identification: 1. Petit bâtonnet gram-nét,atif 2. Aérobie. 3. Colonie d'un diamètre d'environ 1 mm après incubation sur gelose à 5% de sang de cheval, pendant 48 heures, à 370C. 4 Colonie circulaire, de faible convexité, entière, opaque, lisse, homogène avec un bord ondulé,sur gelose à 5% de sang de cheval. 5. Alcalinisation d'un bouillon de lactose en 1824 heures sans formation de yaz. 6. Alcalinisation d'un bouillon de dextrose en 1824 heures sans formation de gaz. 7. Positive à l'uréase en 2-12 heures. 8. Positive au citrate en 12-24 heures. 9. Positive au nitrate. 10. Alcalinisation de la teinture de tournesol en 48 heures. 11. Motilité par flagelles péritrichiques, 12. Croissance sur gelose de MacConkeys en présence de sels biliaires. 13. Sensible à la sulfaméthazine au taux de 5 mg/ml lors d'une détermination sur disques. 14. Résistante à 0,02 mg/ml de furaltadone (NF-260). 15. Positive à l'hémagglutination (s;spension à 2,8% de globules rouges du mouton), 16. Hémolytique sur gelose à 5% de sang de cheval après incubation à 370C pendant 24 heures. 17, Pas de formation de spores. 18, Positive à la catalase. 19, Positive à l'oxydase. 20. Négative à l'indole. 21. Négative à l'hydrogène sulfuré 22. Négative à la liquéfaction de la gélatine. Dans la préparation du vaccin suivant la présente invention, on introduit des cellules viables de la souche ATCC nO 31124 de Bordetella bronchiseptica, qui peuvent avoir été soumises à une lyophilisation pour la conservation, dans un milieu de culture approprié que l'on soumet ensuite à incubation à une température favorisant la croissance de lsorganisme.D'une manière générale, on peut utiliser les procédés déjà publiés pour la culture des organismes de Bordetella bronchiseptica et on peut se reporter à cet effet, par exemple, à Am J. Vet. Res., 30, 1161, 1162 (1969), et à Am. J. Vet. Res., 33, 1975, 1976 (1972).De façon plus particulière, on peut utiliser un bouil lon de tryptose phosphate (TPB) pour la propagation de l'organisme. On peut se procurer un tel milieu TPB auprès de la société Difco Laboratories, Inc., Detroit, Michigan. D'autres milieux de culture utilisables sont: gelose de Bordet-Gengou (Difco), bouillon d'infusion de cervelle-coeur (Difco), bouillon tryptone-soya (Oxoid Limited,.Londres, Grande-Bretagne). Des températures de propagation de 36-380C sont favorahles. Des directives plus détaillées concernant une telle propagation sont données dans les Exemples suivants. Après propagation, la culture de ATCC nO 31124 est tuée sans rupture des parois cellulaires. Des agents appropriés pour tuer cette culture comprennent une concentration finale de 0,2% de formaldéhyde ou de 1/10000 de thimérosal (éthylmercurithiosalicylate de sodium). -Un procédé préféré consiste à ajouter de la formaline, à savoir une solution aqueuse à 37% de formaldéhyde. Des concentrations finales de formaldéhyde de 0,1 à 0,2% suffisent pour assurer une inactivation totale lorsque les cellules sont maintenues pendant 24 heures à la température ambiante (29-250C). Après cette opération, les cellules intactes peuvent être conservées sous réfrigération (à savoir à 40C).Les concentrations préférées de la bactérie vont d'environ 109 à 1011 cellules par ml, par 10 exemple 10 cellules par ml. De tels concentrés de cellules tuées conviennent bien pour la préparation de vaccins sous la forme de doses pour la mise en oeuvre de la présente invention. Comme on le sait dans la technique de préparation de vaccins parentéraux, on peut mélanger un adjuvant approprié avec les cellules tuées dans la préparation du vaccin en vue de son administration. Une quantité efficace d'un adjuvant mélangé avec les cellules tuées peut augmenter la production d'anticorps dans les animaux vaccinés. Pour des animaux deboucherie, tels que le porc, il est désirable que l'adjuvant soit absorbable, qu'il soit injecté par voie sous-cutanée ou par voie intramusculaire. I1 est par conséquent désirable, tout au moins en vue d'une utilisation aux Etats-Unis d'Amérique, d'employer un adjuvant qui a été approuvé par le "U.S.- Department of Agriculture", Veterinary Biologics Division, pour l'administration à des animaux de boucherie.L'hydroxyde d'aluminium (crème d'alumine) est intéressant comme adjuvant dans les vaccins de la présente invention et il s'agit d'un produit approuvé pour une utilisation chez les animaux de boucherie. L'utilisation de cet adjuvant est illustrée dans les Exemples suivants, Un autre adjuvant utilisable est celui que l'on prépare de la façon décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique nO 3.149.036. Une forme commerciale de cet adjuvant est vendue par la société Merk 4 Co., Inc., Rahway, New Jersey, Etats-Unis d'Amérique, sous la dénomination "Merck Adjuvant 65". La préparation et l'utilisation de cet adjuvant sont également décrites dans les Exemples. Le vaccin suivant la présente invention, sous la forme d'une dose injectable par voie parentérale, consiste essentiellement en l'adjuvant susdit en mélange avec environ 109 à 1011 cellules entières tuées de cette souche ATCC nO 31124. La dose préférée de vaccin contient de 5 à 15 x lo cellules de cette souche. De telles doses de vaccin conviennent particulièrement bien pour l'immunisation du porc contre le développement de l'atrophie turbinée.Le volume total de la dose du vaccin comprendra le volume des cellules plus le volume de l'adjuvant absorbable et injectable, Le vol-ume de la dose sera habituellement de plus de 0,5ml K de moins de 3,0 ml, mais il devrait autre d'une valeur suffisante pour englober une quantité efficace de l'adjuvant. Des volumes de dose de 0,8 à 2,5 ml conviennent par ticulièrement bien pour une administration intramusculaire ou sous-cutanée. Dans une préparation que l'on préfère, on a de 10 à 15 x 109 cellules,et le volume total de la dose est de 1,8 à 2,2 ml. On peut également utiliser le vaccin suivant l'invention pour la protection des produits d'une truie gravide contre le développement de l'atrophie turbinée. A titre d'exemple, on administre au moins une dose du vaccin contenant de 109 à 10 cellules-entières tuées de la souche ATCC nO 31124, par voie parentérale, à la truie gravide, au moins 14 jours avant que la truie ne mette bas. Suivant un procédé préféré, on ad ministre 2 à 3 doses du vaccin à la truie gravide à des intervalles non inférieurs à 5 jours entre les doses. A titre d'exemple, on peut prévoir 2 injections du vaccin, respectivement environ 28 jours et environ 14 jours avant que la truie ne mette bas. Des procédés de mise en oeuvre de la présente invention sont plus particulièrement illustrés encore par les Exemples suivants. Exemple I On peut produire des bactérins utilisables dans la mise en oeuvre de la présente invention par le procédé suivant: 1. On retire une souche D-l (ATCC nO 31124) lyophili sée,d'une conservation à - 200 et on soumet à incubation pendant la nuit à 370C dans du TPB (bouillon de tryptose phosphate). 2, On transfère la culture dans leTPB dans une quantité désirée de TPB se trouvant dans un récipient approprié. 3. On procède à une incubation aérobie pendant 24-48 heures. 4. On vérifie la pureté et on détermine les unités de formation de colonies sur de la gélose à-5% de sang de cheval. 5. On ajoute du formaldéhyde en solution à 37% (J.T. Baker, Phillipsburg, N.J., Etats-Unis d'Amérique) jusqu a une concentration finale de formaline de 1/1000 et on mélange conve noblement. 6. On procède à incubation pendant la nuit à la température ambiante, on mélange convenablement, puis on inactive et on vérifie la stérilité sur de la gélose à 5% de sang de cheval. 7. On conserve à 40C. Exemple II On peut préparer de la façon suivante des adjuvants appropriés pour la mise en oeuvre de la présente invention: Adjuvant d'hydroxyde d'aluminium 1. On 'mélange une quantité appropriée d'un gel comprimé d'hydroxyde d'aluminium, par exemple 384 g, contenant environ 9,5% de Au203, avec de l'eau désionisée en quantités variables pour donner une solution finale à 20% d'hydroxyde d'aluminium. 2, La solution finale donnera environ 2% de A1203. 3. On échantillonne en autoclave. 4. On conserve à la température ambiante. Adjuvant d'huile d'arachide 1. L'adjuvant est composé de 85,0% d'huile d'arachide, de 10,6% de mono-oléate de mannide (Arlacel A), et de 4,4% de monostéarate d'aluminium. 2. On mélange une quantité appropriée de chaque ingrédient dans les proportions précédentes, dans un récipient approprié, sur un dispositif d'agitation et de chauffage. 3. On élève la température à raison de 4QC par minute jusqu'à 12O0C 4. On agite constamment le mélange avec une baguette de verre durant le chauffage. 5. On répartit la matière homogène dans des bouteilles de couleur ambre et on traite à l'autoclave. 6. On conserve à la température ambiante. Cet adjuvant est appelé Adjuvant 65 et peut s'obte nir de la société Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., Etats-Unis d'Amérique (voir le brevet des Etats-Unis d'Amérique nO 3.149.036). Exemple III Des procédés appropriés de préparation de vaccins en utilisant les adjuvants de l'Exemple II, sont développés ci-après. Préparation d'un vaccin avec un adjuvant d'hydroxy de d'aluminium 1. Des volumes égaux de l'adjuvant d'hydroxyde d'aluminium (solution à 20t/o) et de la culture en bouillon de la souche D-l dans du TPB à l'état inactivé sont convenablement mélangés dans un récipient approprié pour former le vaccin complet. 2. Ce vaccin contient environ 1% de A1203. 3. La concentration finale du vaccin comporte environ 10 cellules par ml. 4. On conserve le vaccin à 40C jusqu'à son utilisation dans des ampoules de verre bouchées, d'une contenance de 100 ml, comportant un bouchon de caoutchouc. 5. Pour l'administration à des porcelets, on utilise 2 ml du vaccin par voie sous-cutanée. Préparation d'un vaccin avec un adjuvant d'huile d'ara chide 1. Des volumes égaux de l'adjuvant d'huile d'arachide et de la culture en bouillon de la souche D-l dans du TPB à l'état inactivé sont émulsionnés convenablement pour former le vaccin complet. 2. La concentration finale du vaccin comporte environ 1O1O cellules par ml. 3. On conserve le vaccin à 40C jusqu'à son -utilisation, dans des ampoules en verre fermées, d'une contenance de 100 ml, comportant des bouchons de caoutchouc 5. Pour l'administration à des porcelets, on utilise 2 ml du vaccin par voie sous-cutanée. Exemple IV Un procédé préféré de vaccination pour les porcelets est le suivant: 1 On administre une dose de 2 ml de l'un ou l'autre des vaccins de l'Exemple III à chaque porcelet à l'age de 1 semaine et à l'age de 4 semaines. 2. Ce vaccin est injecté par voie sous-cutanée, Exemple V Un procédé préféré de vaccination pour les truies avant que celles-ci mettent bas est le suivant: 1. On administre une dose de 2 ml de l'un ou l'autre des vaccins de l'Exemple III - chåque truie respectivement 4 semaines et 2 semaines avant qu'elle mette bas 2. Le vaccin est injecté par voie sous-cutanée. 3. On peut s'attendre à ce que des truies présentant des taux élevés d'anticorps humoraux contre le Bordetella bronchiseptica transfèrent des taux élevés de ces anticorps anti-Bordetella bronchiseptica par l'intermédiaire du colostrum aux porcelets sujets à une telle infection En résumé, pouruprotéger les porcs contre le développement de l'atrophie turbinée associée à une infection due au Bordetella bronchiseptica, on administre par voie parentérale à ces porcs à l'age de 2 à 56 jours au moins une dose d'un vaccin contenant de lo à 10 cellules entières tuées de la souche de Bordetella bronchiseptica, identifiée par ATCC nO 31124. Cette 9 dose pourra contenir par exemple 5 à 15 x 10 cellules de la sou- che susdite. On administre cette dose deux à trois fois à des intervalles non inférieurs à 5 jours. Pour protéger les produits d'une truie gravide contre le développement de l'atrophie turbinée associée à une infection due au Bordetella bronchiseptica, on administre par voie parentérale à la truie gravide, au moins 14 jours avant que cette truie mette bas,au moins une dose d'un vaccin comprenant de 109 à 10 cellules entières tuées de la souche ATCC nO 31124 de Bordetella bronchiseptica On administre de préférence deux ou trois doses de ce vaccin aux truies gravides en prévoyant des intervalles non inférieurs à 5 jours entre les doses. REVENDICATIONS 1. Vaccin sous forme d'une dose injectable par voie parentérale et destiné à être administré à des animaux sujets à une infection par le Bordetella bronchiseptica, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement un adjuvant efficace en mélange avec des cellules entières tuées de la souche de Bordetella bronchiseptica, identifiée par ATCC nO 31124, cette dose de vaccin contenant de 109 à 1011 cellules de la souche susdite. 2. Vaccin suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la dose susdite contient de 5 à 15 x 109 cellules de la souche. 3. Vaccin sous forme d'une dose utilisable par voie parentérale en vue de l'immunisation du porc contre le développement de l'atrophie turbinée associée à une infection par le Bordetella bronchiseptica, caractérisé en ce qu'il comprend un adjuvant absorbable et injectable, convenant pour une administration parentérale à des animaux de boucherie, cet adjuvant étant en mélange avec 10 à 10 cellules entières tuées de la souche de Bordetella bronchiseptica, identifiée par ATCC nO 31124. 4 Vaccin suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la dose susdite comporte de 5 à 15 x 10 cellules de la souche. 5 Vaccin suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la dose susdite a un volume total supérieur à 0,5 ml et inférieur à 3,0 ml, 6. Vaccin suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la dose susdite a un volume total de 0,8 à 2,5 mm. 7 Vaccin sous forme de dose utilisable par voie parentérale pour assurer 1 'immunisation du porc contre le développement de l'atrophie turbinée associée à une infection par le Bordetella bronchiseptica, caractérisé en ce qu'il comprend un adjucant absorbable et injectable, convenant pour une administration parentérale à des animaux de boucherie, cet adjuvant étant en mélange avec 10 à 15 x 109 cellules entières tuées de la souche ATCC nO 31124 susdite, cette dose ayant un volume total de 1,8 à 2,2 mm.