FR 2359612 A1 19780224 FR 7623473 A 19760730 L'invention est relative å des fractions et substances nouvelles de bas poids moléculaires, ayant des propriétés du type de celles que possèdent 1e5"chalonesft, lesquelles consituent, selon la définition qui en a été donnée par BULLOUGH (In the Evolution of Differentiation - Academic Press London-New York (1967) un produit de secrétion interne produit par un tissudans le but de régler, par la mise en jeu d'une inhibition, l'activité mitotique de ce tissu. Il doit plus particulièrement posséder des propriétés d'inhibition à l'égard de la synthèse de l'ADN dans les tissus lymphoïdes et/ou des propriétés immunosuppressives. L'invention concerne également des procédés d'obtention de fractions ayant les susdites propriétés, plus particu lièrement des fractions et substances à bas poids moléculaires telles qu'elles ont été définies ci-dessus. Un certain nombre d'extraits ou fractions possédant une action inhibitrice à l'égard de la division cellulaire (ou de la synthèse de l'ADN, dans le tissu lymphoide) ont déjà été décrits. Cette action inhibitrice était notamment appréciée par la propriété qu'ils possèdent de bloquer l'incorporation de la 3H-thymidine (ou thymidine tritiée) dans différentes lignées cellulaires. Ainsi a-t-on déjà décrit des "chalones lymphocytaires" ayant des poids moléculaires de l'ordre de 40.000 - 45.000. En particulier, il a déjà été décrit dans le brevet français antérieur ne 70 32576 déposé le 8 septembre 1970, aussi au nom de l'AGENCE NATIONALE DE VALORISATION DE LA RECHERCHE (ANVAR), un procédé permettant d'obtenir, à partir de lymphocytes ou de rate de boeuf, un extrait aqueux ayant des propriétés appréciables d'inhibition de l'incorporation de la thymidine tritiée dans différentes lignées cellulaires.On rappellera que cet extrait aqueux, qui contient une ou plusieurs protéines ayantunposmo- léculaireproche de 45.000, est obtenu par un procédé dont les étapes essentielles consistent à soumettre, après séparation préalable du sérum, des lymphocytes humains ou des cellules de rate de boeuf à un choc hypotonique, par mise en suspension dans de l'eau distillée, à homogénéiser ladite suspension, à séparer les fractions solides, notamment par centrifugation, à recueillir le surnageant, à le dialyser contre de l'eau désionisée et, après séparation du précipité produit par la dialyse, à recueillir la phase aqueuse qui constitue l'extrait aqueux susdit. On obtient un extrait encore plus actif par addition d'alcool à l'extrait aqueux jusqu'à obtenir une concentration en'alcool de 75 % en volume, élimination du précipité forme reprise du surnageant, évaporation de celui-ci sous vide partiel à une température ne dépassant pas 40 C, et reprise du résidu sec qui contient l'activité. Il peut être conservé pendant 6 mois à -20" C, sans perte d'activité. -On obtient ainsi un extrait actif (désigné dans ce qui suit par l'expression "fraction F", capable d'inhiber la synthèse d'ADN in vitro et in vivo et possédant en outre une action immunosuppressive, laquelle peut être mise en évidence par la propriété que possèdent les lymphocytes d'animaux antérieurement traités avec cette fraction F d'inhiber la formation de plaques d'hémolyse de globules rouges de mouton (GRM).Le spectre d'absorption dans l'ultraviolet de cette fraction F est caractérisé par un pic d'absorption compris entre 270 et 290 nm et son analyse révèe la présence de protéines. d'un poids moléculaire de l'ordre de 45.000, dont la majeure partie peut être obtenue dans le premier pic d'élution d'une solution aqueuse de cette fraction F sur un tamis moléculaire notamment du type de ceux qui sont constitués par un polysaccharide tridimensionnel formé par des chaines linéaires de dextrane réticulées par l'épichlorhydrure, formé de billes de 40 à 120 de diamètre, apte à permettre le fractionnement de mélanges contenant des constituants dont les poids moléculaires sont compris entre environ 5.000 et environ 50.000.Le tamis qui est commercialisé sous la marque tSEPHADEX G 75" fait partie des tamis répondant à cette définition. La fraction correspondant au premier pic d'élution (mis en évidence par absorption dans l'ultraviolet respectivement à 280 et 260 nm) sera désignée dans ce qui suit par l'expres- sion "fraction fol". L'invention découle de la découverte que l'on peut isoler entre autres, à partir de cette fraction F, de la fraction Fl ou de fractions analogues, des constituants actifs de poids moléculaires beaucoup plus faibles, tous inférieurs à 10.000 dont au moins certains ne sont pas de nature protéinique. L'invention a par conséquent pour but l'obtention de fractions contenant ces constituants actifs à bas poids molécu laires ayant des activités antimitotiques et/ou immunosuppressives, notamment beaucoup plus importantes et présentant un degré de purification considérablement plus élevé que les extraits du type F ou F1 connus à ce jour. L'invention a également pour but de fournir des procédés d'obtention de ces nouvelles fractions, dont au moins un, en variante, d'une mise en oeuvre particulièrement efficace et simple dans la pratique, que-ce soit à partir des fractions F, F1 ou de fractions analogues par certaines de leurs caractéristiques analytiques, qui seront précisées ci-après L'invention concerne plus particulièrement, au niveau des extraits ou produits, ceux qui, tels ceux qui sont obtenus à partir des fractions F ou F1 ou de fractions analogues, ont des poids moléculaires inférieurs à 10.000, possèdent des propriétés inhibitrices de l'incorporation de H-thymidine dans l'ADN des cellules de lymphocytes, notamment des lymphocytes humains, et cette activité se manifestant préférentiellewentdans les cellules originaires de la rate, plutôt que dans celles provenant d'autres organes, dont les solutions dans liteau donnent lieu, lorsqu'elles sont soumises à une filtration sur une colonne d'un tamis moléculaire du type SEPHADEX G 75, à une fraction d'élution repérable par des pics d'absorption dans l'ultraviôlet, à 260 et 280 nm respectivement, qui apparaît après passage au travers de la colonne d'environ 4 fois le volume mort Vo de la colonne, la majeure partie, sinon toute activité propre à cette fraction étant recueillie avant que soit achevé le passage à travers ladite colonne d'un volume d'élution correspondant au volume mort Vo. Cette dernière fraction d'élution est désignée ci-après par -l'expression "fraction F6". Pour la simplicité du langage, il sera fait état dans ce qui suit de ce que les extraits selon l'invention, tels que la fraction F6, sont contenus dans le volume V élué entre environ 4 et environ 5 Vo, étant entendu qu'un langage équivalent sera adopté pour définir les extraits encore davantage enrichis en principe actif, susceptibles d'être obtenus à partir des extraits tels que sus-définis, notamment par des fractionnements chromatographiques supplémentaires. Les solutions de l'extrait qui sont éluées sur SEPHADEX G 75 entre environ 4 et environ 5 Vo sont notamment celles qui sont désignées par les lettres F6 et F'6 dans les graphiques d'élution représentés dans les figures 1 et 2 d'une solution aqueuse de la fraction F (ou extrait aqueux F)-obtenue par un procédé sensiblement conforme à l'invention décrite dans le brevet antérieur nO 70 32576 déjà mentionné et dune fraction F' analogue, obtenue parun.procédé en variante, qui fait également partie de la présente invention. Ce procédé en variante est caractérisé par les étapes (de préférence réalisées à une température inférieure à l'ambiante) que constituent - la mise en suspension et l'homogénéisation d'un tissu lymphorde, préalablement haché menu ou, d'une façon générale, amené à l'état divisé dans de l'acétone, pour en extraire notamment des lipides, - la récupérationda la partie solide, notamment par filtration, - la-remise en suspension et une nouvelle homogénéisation dans l'acétone, suivies d'une nouvelle séparation de la fraction in soluble, ces dernières opérations étant si besoin répétées, pour finalement obtenir une matière délipidée, sensiblement déshydra tée (qui peut être conservée à l'état de poudre sèche (poudre acétonique) à -20 C pendant plusieurs mois), - la -reprise et l'homogénéisation dans l'eau de la poudre acéto nique, - la récupérationde la phase aqueuse qui, notamment après filtra tion, de préférence sous vide, contient une fraction active hydrosoluble. De préférence, le susdit tissu lymphoide provient de la rate d'un animal, notamment du boeuf, lequel est préféré en raison de sa taille. La fraction active obtenue, qui sera désignée ci-après par l'expression "fraction F' ", se révèle être essentiellement analogue à la fraction F, que ce soit par ses propriétés biologiques ou par ses propriétés physico-chimiques. En effet, mise en solution et soumise à une filtration sur tamis moléculaire SEPHADEX G 75 dans des conditions analogues à celles utilisées pour la fraction F, la fraction F' donne lieu à un spectre d'élution (fig. 2) tout à fait analogue à celui de la fraction F. L'on obtient dans les deux cas l'élution immédiate (dès après le passage d'un volume d'élution égal à Vo), d'une fraction active, notamment au niveau de l'inhibition de l'incorporation de la 3H-thymidine dans l'ADN des cellules de lymphocytes et contenant une protéine d'un poids moléculaire de l'ordre de 45.000 (fraction F1) et ultérieurement, après élution d'un volume de solution approximativement egal à 4 Vo, notamment entre environ 4 et environ 5 Vo, une fraction active dans les mêmes tests et possédant des-constituants à poids moléculaires inférieurs à 10.000 (fraction F'6). D'une façon générale, une matière première à laquelle il est avantageux d'avoir recours pour obtenir des fractions actives à bas poids moléculaires, douées de propriétés anti mi to tiques et immunosuppressives dans les tests qui ont été rappelés et dont des protocoles opératoires précis seront indiqués plus loin, peut être constituée par toute matière renfermant des constituants à poids moléculaires élevés et donnant lieu sur SEPHADEX G 75 à des profils d'élution semblables à ceux des figures 1 et 2, en tous les cas à des profils d'élution conduisant à la séparation de fractions actives dans les volumes élués V entre environ 1 et environ 1,5 Vo, d'une part, entre environ 4 et environ 4,7-5 Vos d'autre part. Conformément. à une caractéristique supplémentaire du procédé selon l'invention, de nouvelles fractions actives à bas poids moléculaires peuvent également être obtenues par ultrafiltration de solutions de la fraction F1 (ou F'1) à travers une membrane ultrafiltrante permettant la séparation des molécules de poids moléculaires inférieur ou au plus égal à 10.000, des molécules de poids moléculaire plus élevée Les ultrafiltrats, qui constituent les fractions Flu, sont alors de nouveau actifs dans le test indiqué plus haut. De même, il est encore possible obtenir des fractions à bas poids moléculaire en procédant à une nouvelle chromatographie d'une solution de la fraction Fl ou de la fraction F'1 sur le tamis moléculaire SEPHADEX G 75. L'étude des fractions d'élution obtenues conduIt à nouveau à l'obtention d'une première fraction élusse tout de suite, contenant une protéine de poids moléculaire élevé, de tordre de 45,000, et pr6sentent encore une activité d'inhibition de l'incorporation de la 3H-thymidine dans les lymphocytes, mais aussi, entre 4 Vo et 5 Vo, d'une nouvelle quantité de fraction-active à bas poids moléculaire, du type des susdites fractions F6 ou fraction F'6. On obtient encore des résultats analogues par électrophorèse sur gel de polyacrylamide ou analogue de fractions du type F1 ou F'1, comme on le décrira encore plus en détail ci après, dans les exemples. L'analogie des fractions F6 et des fractions F1U sur le plan de leurs caractéristiques physico-chimiques et biologiques, et les autres possibilités d'obtention de fractions à bas poids moléculaire qui ont été évoquées ci-dessus à partir de la fraction F1 (ou de la fraction F'1), donnent à penser que les fractions actives F1 et F6 semblent devoir leur activité biologique à la présence de constituants à faibles poids moléculaires, semblables sinon identiques.On peut donc penser que ceux qui peuvent encore être extraits ne sont en fait fixés sur (ou asso ciels avec) les constituants de poids moléculaires plus élevés des fractions F1 ou F'1 que d'une façon suffisamment labile, pour qu'une nouvelle quantité de ces constituants à bas poids moléculaires puisse de nouveau en être détachée, lorsque les fractions Fl ou F'1 (ou de façon plus générale des constituants à poids moléculaires élevés contenus dans les fractions F) sont de nouveau soumises à des techniques de séparation du type de celles qui visent normalement à permettre la séparation de constituants à poids moléculaires supérieurs à 10.000 de constituants à poids moléculaires inférieurs à 10.000. La susdite labilité apparente de la fixation des fractions actives du type F6 ou F1U sur des constituants à poids moléculaires plus élevés est à l'origine d'une variante supplémentaire du procédé selon l'invention, pour obtenir directement des fractions actives à bas poids moléculaires, telles qu'elles ont été définies ci-dessus, à partir de fractions du type F ou F'. Conformément à cette variante, la matière première active est diluée en solution aqueuse, et plus particulièrement dans de l'eau, à un degré suffisant pour permettre le "détachement" au sein même de la solution des constituants à poids moléculaires inférieurs à 10.000 au seindb la solution aqueuse, d'où la possibilité de les séparer directement à partir des fractions du type F ou F', sans passer par une séparation intermédiaire de constituants du type F1 ou F'l. Cette séparation directe est notamment obtenue lorsqu'au préalable la matière active initiale est diluée de façon telle que les solutions finalement obtenues aient une concentration en matière active inférieure à 10, de préférence à 4 UD026 par millilitre. On rappelle que 1 UDO260 correspond à la quantité de substance qui, lorsqu'elle est dissoute dans 1 millilitre d'eau, donne lieu à une absorption dans-l'ultraviolet, à 260 nm, correspondant à une densité optique égale à 1, sous un trajet optique de 1 centimètre. Il est significatif que,faute d'opérer au préalable une dilution suffisante de la matière première active, le détachement sus-indiqué ne peut pas être effectué Cette propriété est d'ailleurs avantageusement mise à profit pour procéder à une séparation préalable des constituants inactifs, à bas poids moléculaires, qui sont contenus dans la matière première active. On pourra notamment procéder comme suit : Partant par conséquent dune solution de matière première active ayant une concentration en substance supérieure à lCsavantageus3irEde l'ordre de 60 à 80 UD0260 par millilitre, on procède à une première séparation des substances à bas poids moléculaires, notamment inférieurs à 10.000, par une technique usuelle, telle que ultrafiltration ou diafiltration sur membrane ultrafiltrante, on élimine les fractions à bas poids moléculaires qui sont inactives et l'on recueille les fractions à hauts poids moléculaires, lesquelles peuvent éventuellement encore, si besoin, être "lavées" par un volume d'eau permettant la reconstitution d'une nouvelle solution aqueuse de ces constituants, mais à concentration toujours encore très supérieure à 10 UD0260 par millilitre,en vue de permettre une séparation d'une quantité supplémentaire de constituants inactifs à bas poids moléculaires, l'obtention des constituants à bas poids moléculaires qui contiennent l'activité antimitotique et immunosuppressive,à partir de la fraction contenant les constituants à poids moléculaires élevés ainsi préalablement débarrassés d'une partie au moins des constituants inactifs à bas poids moléculaires qu'elle contenait auparavant, impliquant alors ensuite la dilution ou la remise en solution de cette dernière fraction, jusqu'à obtenir une concentration inférieure à 10, et de préférence même inférieure à 4 UD0260 par millilitre, avant de procéder enfin à une nouvelle séparation, par l'une des techniques déjà mentionnées ou analogues, des constituants à bas poids moléculaires, parmi lesquels ceux qui retiennent l'activité antimitotique et immunosuppressive, qui se seront alors "détachés" des constituants à poids moléculaires élevés. Ce sont les fractions à bas poids moléculaires, qui ont été obtenues dans les conditions qui viennent d'être indiuées, qui dans la suite seront d6signées par l'expression "fractions PU". On peut aussi, partant d'une fraction du type F ou F', procéder à une séparation préalable des constltuants à poids mo léculaires élevés, par exemple supérieurs à 50.000 ou 100.000, par exemple par diafiltration d'une solution des fractions F ou Fw, puis opérer les susdites opérations de dilution sur la fraction récupérée contenant les constituants à poids moléculaires élevés, avant de procéder à la séparation dans des conditions semblables d'une fraction à bas poids moléculaires retenant l'activité. La séparation de ces constituants à bas poids moléculaires peut naturellement être effectuée par tout moyen connu, notamment par ultrafiltration des solutions diluées à travers une membrane ultrafiltrante, ou par diafiltration (ultrafiltration avec réalimentation en eau de la cellule d'ultrafiltration du côté des constituants à poids moléculaire élevé pour maintenir sensiblement constant le volume de la solution contenant ces constituants, au fur et à mesure que s'opère le passage des constituants à bas poids moléculaires à travers la membrane). On peut aussi en principe procéder par filtration sur tamis moléculaire, du type SEPHADEX ou analogue. L'ultrafiltration est cependant, évidemment, plus facile à mettre en Oeuvre. Les fractions du type FU qui sont ainsi obtenues se révèlent présenter des caractéristiques analogues à celles qui ont été définies à propos des fractions FlU et F6 décrites plus haut. Toutes les fractions selon l'invention peuvent encore être davantage caractérisées par : - les spectres d'élution auxquels elles donnent lieu dans des opérations de chromatographie effectuées dans des systèmes différents - par les constituants qui peuvent être révélés en chromatogra phie en couche mince de certaines des fractions d'élution ob tenues par chromatographie dans le système en question. Plus particulièrement, les fractions actives selon l'invention (F1U-, F6, FU ou F14) sont également caractérisables par le spectre d'élution auquel leurs solutions aqueuses sont susceptibles de donner lieu, sur gel de polyacrylamide pour chro matographie, en billes, dont les diamètres sont compris entre approximativement 37 et 74 microns, qui ont une limite d'exclusion exprimée en daltons de 1800, qui sont appropriées à opérer des fractionnements dans lintervalle 100-1800 daltons. Un gel répondant à ces conditions est par exemple celui qui est commercialisé par la Société BIO-RAD, sous la désignation commerciale "BIO-GEL P2", désignation qui sera utilisée dans la suite de cet exposé-pour la commodité du langage. En par ticulier, on a recours à ceux des gels de ce type dont les diamètres de billes sont compris entre 37 et 74 microns, ou encore, pour utiliser la terminologie américaine courante dans ce domaine, de 200-400 mesh. On constate que pour ce qui est des autres caractéristiques de ce type de gel de polyacrylamide, on peut se référer au catalogue 1974-1975 de la Société BIO-RAD LABORATORIES, intitulé "Chromatography Electrophoresis and Membrane Technology. Parmi les fractions selon l'invention qui présentent les caractéristiques qui ont déjà été définies plus haut, sont comprises celles qui, par chromatographie de leurs solutions aqueuses sur un gel du type ordinaire "BlO-GEL P2" tel que défini ci-dessus, donnent lieu à l'isolement de l'essentiel de l'activité dans un volume d'élution V compris entre environ 2,5 Vo et environ 4 Vo, Leurs constituants actifs ont un poids moléculaire inférieur à 2.000. On peut en séparer des constituants actifs à poids moléculaires inférieurs à 500, qui peuvent être isolés par les techniques classiques à cet effet, notamment par ultrafiltration sur une membrane d'ultrafiltration telle que celle commercialisée sous la désignation "AMICON UM-O,5". Les dernières fractions susmentionnées sont encore plus particulièrement caractérisées en ce que leur analyse par chromatographie en couche mince (CCM) sur plaque de cellulose dans un système de solvants formé par un mélange contenant 60 volumes de butanol, 15 volumes d'acide acétique et 25 volumes d'eau (mélange qui dans la suite de l'exposé sera désigné par la forme abrégée "BuOH, AcOH, H20 (60/15/25)") fait apparaître des taches révélables par le rayonnement ultraviolet à 254 nm aux Rf 0,47-0,55. Ces fractions peuvent en outre contenir des taches également détectables à l'ultraviolet dont les Rf se situent entre environ 0,65 et environ 0,75, cette dernière fraction contenant un constituant qui, dans cette opération de chromatographie en couche mince, a un comportement analogue à celui de la thymidine. Le traitement de plaques de cellulose, sur les quelles ont été réalisées des chromatographies en couche mince analogues, par une solution de phénol sulfurique suivie d'un chauffage, permet également de conclure à la présence de sucres dans ces fractions. Elles peuvent également contenir des constituants qui, dans le système de chromatographie en couche mince considéré, migrent à un emplacement de la plaque de cellulose correspondant à un Rf de l'ordre de 0,26-0,28 et qui sont détectables par le réactif ninhydrine/collidine, qui de ce fait témoigne de la présence dans ces constituants de groupes NH2 libres. Ces fractions ne contiennent par contre pas d'esters phosphorylés de sucres, comme en témoigne la réaction négative dans le test de coloration des taches par une solution de molybdate en milieu perchlorique et chlorhydrique dans l'acétone. La chromatographie en couche mince sur cellulose, avec de l'eau pour tout système de solvants, permet un fractionnement des fractions actives éluables à partir du BID-GEL P2 de ces mêmes fractions essentiellement en plusieurs taches, parmi lesquelles les deux suivantes qui correspondent à des fractions présentant les caractéristiques suivantes Pour la première de ces taches (désignée ci-après par FA2) :: - Rf de l'ordre de 0,54 dans le système de CCM sur cellulose, mettant en oeuvre l'éludant formé par le mélange BuOH/AcOH/H20 (60/1S/25) ; - Rf de l'ordre de 0,66 dans le système de CCM sur cellulose mettant en oeuvre l'éluant formé par de l'eau - elle est révélable par examen en lumière ultraviolette - le spectre d'absorption ultraviolette dans l'eau est carac térisé par une absorption maximum vers 248 nm et une absorption minimum vers 222 nm ;; Pour la seconde des susdites taches (désignée ci-après par FA4) r - elle est révélable par examen en lumière ultraviolette et par le réactif ninhydrine/collidine - le spectre d'absorption ultraviolette dans l'eau présente une absorption maximum vers 264 nm et une absorption minimum vers 240 nm - le rapport D0260/D028o est de l'ordre de 2,90 - Rf de l'ordre de 0,54 dans le premier système de CCM sus-indiqué, accompagné d'une faible tache à un Rf de 0,46 - Rf de l'ordre de 0,76 dans le second des susdits systèmes de CCM. On signale que les valeurs de Rf peuvent varier dans de faibles proportions, compte tenu de l'expérimentateur, des modifications des conditions extérieures (par exemple température qui peut influencer la vitesse d'évaporation, la fluidité des solvants). En général, ces valeurs ne dépassent pas f 5 %, en tous les cas jamais 10 %. Les valeurs indiquées dans les tableaux qui suivront peuvent être reliées aux références que conStituent les Rif de la thymidine et de l'inosine dans les premier et deuxième systèmes de CCM susdits : respectivement de 0,74 et 0,79 pour la thymidine et 0,43 et 0,65 pour l'inoslne. L'invention concerne aussi plus particulièrement les fractions dans lesquelles les substances correspondant à ces taches (ou à d'autres des taches qui seront caractérisées dans les exemples) sont associées avec des molécules inertes de poids moléculaires inférieurs à 10.000, de préférence à 2.000, notamment encore à S00, ces substances se trouvant dans ces fractions, soit à l'état libre, soit liées de façon non covalentes à ces molécules inertes. Il va de soi que les propriétés pharmacologiques qui ont déjà été indiquées et qui sont constatées lors de la mise en oeuvre des protocoles opératoires rappelés ci-après, contribuent à la caractérisation des fractions selon l'invention. Les résultats d'ordre pharmacologique ou biologique dont on fera état dans les exemples ci-après ont, dlune façon générale, été obtenus par la mise en oeuvre des protocoles expérimentaux rappelés ci-après. 1) Inhibition de lincorporation de 3H-thymidine dans des cul tures de cellules, in vitro. Des cellules, obtenues à partir de rates de souris de la lignée C57D1/6 sont placées dans le milieu connu par la désignation l1640 RPMI1'. Les cellules sont soumises à une légère agitation et on les fait passer à travers une colonne stérile de mailles de nylon. Elles sont ensuite récupérées par centrifugation. Pour ces opérations, on se conforme sensiblement à la technique décrite par ERNSTROM et NORDLING 11Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. A., (1974), 82, 445-449, Les cellules sont ensuite lavées deux fois, le surna geant étant chaque fois éliminé et les cellules finalement obtenues sont remises en suspension dans le susdit milieu. L'expérimentation réalisée avec les différents extraits qui seront décrite plus loin met en jeu la mesure de l'incorporation de 3H-thymidine dans des cellules de rate, par la micro-méthode de HARTZMAN et colle "Transplantation (1971), 11, 268-273. Les cellules sont mises en suspension dans le milieu RPMI à raison de 9 x 106 cellules/millilitre.On inocule ensuite dans chacune des ouvettes d'une microplaque d'essai 0,2 millilitre de cette suspension, une quantité de l'extrait à étudier à différentes concentrations, les microplaques étant ensuite mises en incubation à 370 C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de gaz carbonique. 15 minutes apr8s l'introduction des fractiosn à étudier, on introduit la 3H-thymidine dans les cuvettes (1 P C/cuvette ; activité spécifique 14 Ci/mM L'incubation est poursuivie pendant 6 heures à compter de l'instant de l'introduction dans les cuvettes, des fractions à étudier. Pour apprécier le taux d'incorporation du précurseur radio-actif dans les cellules, celles-ci sont transférées sur un papier-filtre, lavées automatiquement avec un appareil commercialisé sous la désignation "MASH I" (Microbiological Associates). Le précipité de cellules obtenu est ensuite introduit dans un volume de 10 millilitres d'un fluide scintillateur et sa radioactivité déterminée dans un spectromètre à scintillation liquide. En général, des opérations analogues sont conduites sur des cultures de cellules témoins, mais en l'absence de toute fraction à étudier. 2) Inhibition de l'incorporation de 3H-thymidine dans desoellules in vivo, chez les animaux antérieurement traités avec les fractions à étudier. Les animaux traités sont des souris. Elles reçoivent les fractions à étudier sous forme de deux injections, respectivement 24 heures et 1 heure avant leur sacrifice, les doses administrées variant selon le produit à étudier. Des souris témoins reçoivent dans les mêmes conditions un volume équivalent d'une solution de NaCI à 9 pour 1000. Après le sacrifice, les différents organes, et plus particulièrement les rates, sont prélevés, disséqués aseptiquement, broyés en présence du milieu RPMI 1640, puis filtrés sur de la fibre de verre, seules les cellules passant au travers de ce filtre. Après comptage des cellules, celles-ci sont suspendues dans le milieu RPMIt de façon à obtenir une concentration initiale de 5 x 106 cellules par millilitre. Des volumes de 0,15 millilitre de cette suspension sont alors introduits dans les cuvettes ou puits d'une microplaque de culture, On y introduit également 0,05 millilitre de 3H-thymidine (10 C/millilitre dilués dans le milieu RPMI 1640). Les plaques sont ensuite incubées pendant 6 heures, à 37 C, dans une atmosphère contenant 5 X de gaz carbonique et ayant un taux d'humidité de 80 %. La suite des opérations est alors conduite de la façon façon que dans le test d'inhibition in vitro, sous 1) cidessus. 3) Etude de l'effet antagoniste des fractions selon l'invention à l"qard de la stimulation des lYmPhocytes par des mitogènes. Ce test vise à montrer que les fractions selon lin- vention inhibent l'incorporation dela 3H-thymidine même dans des lymphocytes qui ont été stimulés par divers mitogènes connus, tels que la phytohémagglutinine (PHA), les lipopolysaccharides (LPS), la concanavaline A (CON A) et des lectines de lentilles Les cultures de cellules préparées comme sous 1) cidessus sont incubées en présence de l'un des mitogènes susindiqués, divisées en une concentration finale de 3 microgrammes/ millilitre et en présence de la fraction à étudier (en général 900 mUDO 260, sauf lorsqu'il sera spécifié autrement).La 3H-thymidine (1 C par cuvette ; activité spécifique 14 Ci/mM) est ajoutée au deuxième jour de la culture* 3 heures avant la ré- coite des cellules de la culture. L'incorporation de thymidine tritiée est alors appréciée dans les mêmes conditions que celles qui ont êté év oquées plus haut. 4) Etude de l'hypersensibilité retardée aux globules rouges de mouton et au dinitrochlorobenzène (DNCB). Ce test vise à montrer l'action immunosuppressive induite par les fractions selon l'invention des réactions immuni- taires chez l'animala) Hypersensibilité retard6e aux globules rouges de mouton (GRM). On procède à une injection intraveineuse de GRM sur un lot de souris ; un rappel est effectue 4 jours plus tard, par une nouvelle injection de GRM dans la paume de la patte. Celles des souris sur lesquelles doit être expérimentée l'une des fractions à étudier reçoivent 24 heures et 1 heure avant le rappel (challenge), une injection intrapéritonéale de cette fraction. 24 heures plus tard, on évalue l'inflammation, par mesure de l'épaisseur de la patte qui a reçu la fraction à étudier et on la compare à l'épaisseur de l'autre patte (patte con trôle). Les fractions chalones selon l'invention entraînent une diminution de la réaction d'hypersensibilité retardée, donc de l'inflammation. b) Hypersensibilité retardée aux DNCB L'expérimentation est conduite dans les mêmes conditions que ci-dessus, sauf que l'on réalise la sensibilisation, par application duDNCB sur l'abdomen des souris à traiter. Après le traitement de rappel sur une oreille, on mesure et compare les épaisseurs des oreilles d'une même souris. 5 > Test de "cellules formatrices de plaques". On étudie l'effet inhibiteur de lymphocytes de souris traitées au préalable, in vivo, avec les fractions à étudier sur la formation de plaques dans une culture de cellules spléniques en présence de GRM, selon la technique de JERNE et C(aRDLN, décrite dans l'article intitulé "Plaque formation in agar by single antibody producing celles, publié dans Science, 1963, 140, 405. L'effet immunosuppresseur de la fraction étudiée s'apprécie par la réduction du nombre de plaques formées dans la culture correspondante pàr rapport à celui d'une culture témoin. 6) Test d'exclusion au Trypan bleu. On effectue les cultures cellulaires comme décrit cidessus et à la fin de ces cultures, les cellules sont traitées avec une solution de Trypan bleu préparée à partir de quatre parties d'une solution de Trypan bleu à 2 grammes par litre dans de l'eau distillée et une partie d'une solution de chlorure de sodium à 0,425 %. 0,1 millilitre des cultures cellu- laires à tester sont diluées avec 0,9 millilitre de cette so- lution. On compte ensuite le nombre de cellules mortes et on établit le pourcentage des cellules vivantes. D'autres caractéristiques encore de l'invention ap paraîtront au cours de la description qui suit d'exemples de fractions à activité chalone selon l'invention et de leurs modes de préparation, notamment en rapport avec les dessins dans lesquels : - les fig. 1 à 7 sont des graphiques représentatifs de spectres d'élution de diverses fractions actives ayant fait l'objet de chromatographies - les fig. 8 à 12 sont des spectres d'absorption dans l'ultra violet de différentes fractions actives purifiées conformes à l'invention. On décrira tout d'abord les matières premières à partir desquelles peuvent être obtenus les extraits ou fractions selon l'invention, ainsi que les procédés pour les obtenir. L'un de ces procédés (procédé 1) découle de celui qui a été décrit dans le brevet 70 32576 déjà mentionné et conduit à une fraction F. On décrit-également un procédé en variante conforme à l'invention (procédé 2), qui permet d'obtenir une fraction Ft présentant les mêmes caractéristiques essentielles que la fraction F. 1) Obtention de lafraction F par le "procédé 1" Partant de trois rates de boeuf conservées dans de la glace, on procède à l'élimination des capsules et du tissu fibreux, on obtient 1.500 grammes de tissu lymphoide. Ce tissu est haché jusqu'à le réduire à un état très divisé, mis en suspension dans 4.500 millilitres d'eau distillée et homogénéisé à pH 5,5, en omettant tout lavage du tissu avec une solution saline. La suspension est ensuite conservée pendant 2 heures et centrifugée dans une centrifugeuse à débit continu, du type de celle commercialisée par SHARPLES, à 12.000 g pendant 30 minutes. Le surnageant est dialysé pendant 48 heures contre cinquante fois son volume d'eau distillée, laquelle est renouvelée en continu.Le précipité obtenu par dialyse dans le sac à dialyse au cours de l'opération est ainsi éliminé par centrifugation dans une centrifugeuse à débit continu, du type de celle commercialisée par SHARPLES, la solution aqueuse étant reprise, amenée à une température inférieure à 20C et soumiseàune préclpitation alcoolique à -150C.L'alcool (éthanol)est ajouté au surna geantàraisonde lOOmillilitres parminute, sous agitation vigoureuse, pour obtenir une condentration finale de 72 % en volume. Après centrifugation de la -suspension, le surnageant est concentré dans un évaporateur sous pression réduite, la température de la vapeur étant maintenue à une valeur inférieure à 40 C.Après élimination des matières insolubles, . le concentré est lyophilisé. On obtient 20 grammes de poudre sèche, contenant 30 X en poids de protéines. -Cette poudre sèche peut être conservée à -20 C pendant plus de six mois, sans perte substantielle d'ac activité. Elle forme la fraction F. 2) Obtention de la fraction F par le "procédé 2" Le tissu lymphoïde divisé préparé comme indiqué plus haut est mis en suspension-dans l'acétone à raison de 1 partie en poids de tissu pour 3 parties en volume d'acétone. La suspension est ensuite homogénéisée dans un mélangeur du type WADING BLENDER" pendant 5 minutes à vitesse maximum. L'homogénat est ensuite maintenu sous agitation à la chambre froide pendant 16 heures, puis filtré sur verre fritté. Le gâteau solide obtenu est remis en suspension dans 2 litres d'acétone, de nouveau homogénéisé dans le mélangeur sus-indiqué et soumis à une filtration. Cette opération est encore répétée une fois, le gâteau final étant ensuite séché à l'air et tamisé pour fournir une "poudre acétonique". On obtient 159 grammes de poudre acétonique sèche à partir de 1 kilogramme de tissu lymphoSde humide. 40 grammes de cette poudre sont soumis à une extraction par quinze fois son volume d'eau, le mélange étant homogénéisé dans le susdit mélangeur pendant 3 minutes. La suspension est ensuite maintenue sous agitation à 4 C pendant environ 20 heures, puis centrifugée à 45.000 g pendant 90 minutes. On récupère le surnageant, qui est ensuite lyophilisé. Il constitue la fraction Ft. On obtient 8 grammes de matière lyophilisée, à partir de 40 grammes de npoudre acétonique. Les fractions F et F', qui possèdent des propriétés à la fois antimitotique et immunosuppressive, telles que révélées notamment par les tests dont les protocoles opératoires sont indiqués ci-après, sont aussi caractérisées par les profils d'élutions analogues, comme on peut le constater à l'examen des figures 1 et 2, lorsqu'elles sont soumises à une chromatographie sur "SEPHADEX G 75", dans les conditions de l'exemple I. EXEMPLE I : Obtention par chromatographie sur "SEPHADEX G 75", à partir des fractions F et F', de fractions actives à bas poids moléculaires s Fractions F6 et F'6. Le mode opératoire est décrit en rapport avec le traitement de la fraction F, étant entendu que le traitement de la fraction F', se fait dans des conditions identiques. La fraction F est dissoute dans un tampon phosphate de sodium 0,05 M à pH 6,8 (à raison de 2 grammes dans 10 millilitres de tampon) et passée sur un gel "SEPHADEX G 75" dans une colonne de 100 centimètres de long et de 5 centimètres de diamètre. Le débit horaire de la solution éluée est de 28 millilitres par heure. On prélève les fractions éluées, 10 millilitres par iOminutes,'eton effectue sur chacune d'elles une mesure des densités optiques à 260 nm et 280 nm respectivement. Les courbes des fig. 1 et .2 sont représentatives des variations de densités optiques (DO sur ltaxe des ordonnées) qui sont observées par absorption dans l'ultraviolet à 260 nm (courbes in terrompues) et à 280-nm (courbes en trait plein) en fonction du rapport du volume total élué au volume mort de la colonne (V/Vo). Les fractions successives de 10 millilitres sont, après mesure des susdites densités optiques, regroupées en sept fractions successives F1, F2, F3, F4, F5, F6 et F7, eu égard aux pics, épaulements des courbes qui ont été-ainsi établies ou encore aux zones relativement plates (F4) de ces mêmes courbes. Les volumes de chacune de ces fractions découle des limites correspondantes du rapport V/Vo, qui apparaissent dans les dessins. Le tableau I qui suit contient les résultats obtenus dans les tests in vitro d'inhibition de l'incorporation dans des cellules de rate de la 3H-thymidine que sont susceptibles d'induire chacune des fractions Fl, F2 .... F6, F7, d'une part, F'1, FO2 .... F6, F7 (obtenues dans des conditions semblables à partir de la fraction F), d'autre part. Le tableau 1 fournit les valeurs de radio-activité mesurées dans le test tel qu'il a été défini ci-dessus, dans les cellules qui ont été cultivées respectivement en présence du produit à tester et en l'absence de celui-ci (témoin). Les résultats sont exprimés par les nombres mesurés de "désintégrations par minute" (dpm) et en "pour cent (%) d'inhiber tion" induite par le produit à étudier vis-à-vis des témoins. TABLEAU 1 "Procédé 1" Fractopm Radio- Inhibition chromato- activité graphique dpm Témoin 5700 F1 2600 56 Témoin 5000 F2 18000 - 260 Témoin 51000 - 21 F3 62000 Témoin 6700 4 F4 6400 Témoin 5200 - 4 F5 5400 Témoin 6000 - 83 F6 1000 Témoin 7300 -119 F7 16000 "Procédé 2" Fraction Radio chromato- activité Inhibition graphique dpi Témoin 626 F'1 276 56 Témoin 626 F'2 886 -41 Témoin 626 -24 F'3-F'5 781 Témoin 626 54 F'6 292 % Témoin 626 24 F'7 476 Concentration des différentes fractions 50 g protéine / ml TABLEAU 2 Témoin R1 F6 Tissu Radio- Radio- Inhibi- Radio- Inhibi activité activité tion activité tion dpm dpm % dpm % Rate 2988 1920 34 527 82 Exp. 1 Rein 3052 4532 -27 4307 -20 Foie 1337 1641 -24 1179 11 Testicule 4434 5303 -33 4312 - 8 Rate 1373 571 36 359 60 Exp. 2 Rein 971 1032 -10 957 - 2 Fole 2187 1615 - 6 1850 8,5 Testicule 1671 1739 - 5 1565 15 Rate 18427 7171 60 11116 38 Rein 3918 3808 - 6 3923 -10 Exp. 3 Foie 16851 13715 28 15801 17 Testicule 1188 1554 -31 2256 -90 Concentration des différentes fractions 50 g protéine /ml Comme on peut le constater, la fraction F1 (ou F'1) qui correspond au premier pic d'élution est active. Les fractions suivantes F2 à F5 (ou F'2 à F'5) sont inactives, ou tendent même à avoir une action stimulante de l'aincorporation de l'incorporation de la 3H-thymidine dans les cellules de rate. Il fallait, conformément à l'invention, pousser l'élution jusqu'à obtenir la fraction F6 (ou F'6), correspondant à un volume d'élution V compris entre environ 4 et environ 4,7-5, pour obtenir une nouvelle fraction très active, constituée par des constituants à poids moléculaires inférieurs ou au plus égaux à 10.000. Le tableau 2 rapporte les résultats des tests relatifs à l'incorporation de la 3H-thymidine dans l'ADN de cellules de rate, d'une part, et de cellules d'autres organes du même animal et cultivées dans des conditions analogues, d'autre part. Les mesures sont effectuées dans les mêmes conditions que pour les tests reflétés par le tableau 1. L'observation du tableau 2 fait apparaître une spdcifi- cité tissulaire assez nette des fractions testées dans l'exemple considéré, en l'occurrence Fl et F6, spécificité qui découle du taux d'inhibition élevé de l'incorporation de la 3H-thymidine qui est observé à l'égard des cellules de rate, alors qu'il est négligeable(sinon faiblement inversé) à l'égard des cellules et plus particulièrement des ADN des cellules de rein, de foie et de testicule dans la série d'essais concernée. La fraction F6 témoigne également d'un effet antagoniste de la transformation lymphoblastique, induite par des agents mitpgènes, particulièrement ceux indiqués dans tableau 3 ciaprès. TABLEAU 3 Substance S heures 3 jours Pas de stimulation Pas de stimulation Phytohémagglutinine Lipopolysaccharide Radio- Inhibition Radio- Radio- Inhibition Radio- Inhibition activité % activité Inhibition activité % activité % dpm dpm % dpm dpm Contrôle 25041 0 4888 0 17620 0 8774 0 Chalone Fraction 9245 60 1704 65 5476 69 6963 81 F Fraction F1 1741 93 269 94 314 98,2 188 98 Fraction F6 541 98 86 98 425 97,6 411 95 Concentration des différentes fractions 50 g protéine /ml Ce dernier tableau fait apparaitre que la fraction F6, comme la fraction F1, peut, dans les conditions expérimentales décrites, bloquer de façon pratiquement complète l'action mitogène qui serait autrement induite par les composés mitogènes identifiés dans le tableau dans des cultures de cellules lympho tdes de rate. La fraction F6, tout comme la fraction F1 n'est pas toxique, comme il découle du test d'exclusion au bleu Trypan, bien classique dans ce domaine, et dont les résultats figurent dans le tableau 4 ci-après. Celui-ci fait apparaitre l'absence d'effet des fractions étudiées sauf, partiellement, pour des concentrations extrêmement élevées de ces fractions, sur différentes cultures tissulaires. Les résultats indiqués établissent globalement l'absence de toxicité de ces fractions. TABLEAU 4 Fraction % de cellules mortes dans des cultures tissulaires g protéine/ml rate rein foie testicule Témoin 0 0 0 0 (40 7 5 0 0 Fl 80 3 7 O O 40 3 O O O F6 # 80 3 13 O O Les figures 1 et 2 font également apparaître à la fois l'analogie des fractions Fet F' quant à leurs constituants essentiels, et les pics caractéristiques des spectres d'élution, tels que révélés par photo-absorption dans l'ultraviolet, mesurée à 260 et 280 nm, que doit normalement présenter une matière première utilisable pour l'extraction de fractions à bas poids moléculaires conformes à l'invention. En particulier le passage sur gel "SEPHADEX G 75" donne solution aqueuse d'une telle matière première et son élution doivent normalement fournir soit une fraction active immédiatement éluée dès qu'un volume mort d'une solution aura passé à travers la colonne, notamment entre environ 1 et 2 Vo, de préférence 1 et 1;5 Vo, soit une fraction éluable-entre approximativement 4 Vo et approximativement 5 Vo, soit encore les deux à la fois. EXEMPLE Il Séparation de fractions actives à bas poids moléculaires à partir de constituants à poids moléculaires élevés, préalablement séparés de la fraction F. La matière première utilisée est constituée par la fraction F, dont ont auparavant été séparés la majeure partie des constituants à poids moléculaires inférieurs à 100.000 par diafiltration sur une membrane ultrafiltrante dont la limite d'exclusion se situe autour de 100.000. Cette fraction F enrichie est alors soumise à une chromatographie sur le gel "SEPHADEX G 75", dans les conditions qui. ont été décrites pour les fractions F et F' dans l'exemple I. La courbe de la figure 3 est représentative des variations de la densité optique mesurée par absorption dans l'ultraviolet à 280 nm, en fonction du rapport V/Vo, dans des conditions analogues à celles indiquées dans l'exemple I. Comme dans ce dernier, on retrouve un spectre d'élution semblable, du moins en ce qui concerne les constituants actifs essentiels. On élue après le passage de volumes de liquide semblable des fractions Fi et F"6 qui se révèlent toutes deux actives dans le test d'inhibition de l'incorporation de la 3H-thymidine dans des cellules de rate in vitro. Le tableau 5 ci-après fournit les résultats observés, exprimés par les mêmes paramètres que plus haut. Les deux fractions isolées ont toutes deux une action importante. d'inhibition de la susdite incorpora- tion. TABLEAU 5 Fractions Rado-activité Inhibition chromatographiques dpm Témoin 34.000 Fl 4.700 86 Témoin 7,300 F2 900 81 Concentration des fractions 50 po protéine/ml EXEMPLE III Obtention d'une fraction active à partir de la fraction F?, par une nouvelle chromatographie de cette dernière sur "SEPHADEX G 75". La fraction Fl peut elle-même constituer une matière première à partir de laquelle peuvent être extraits des constituants actifs à bas poids moléculaires. Redissoute dans un tampon phosphate de sodium 0,05 M à pH 6,8, à raison de 1000 milligrammes de protéines par millilitre de tampon, et passée à nouveau à travers une colonne de gel "SEPHADEX G 75", elle fournit à nouveau des fractions actives éluées entre-environ l Vo et environ 1,5 Vo, d'une part, èt entre environ 4 Vo et environ 4,7 Vo, d'autre part (fractions se montrant actives dans les tests indiqués plus haut). EXEMPLE IV Obtention de fractions actives à partir de la fraction F1 par électrophorèse sur gel de polyacrylamide : fraction F 14. La fraction FI peut être fractionnée en plusieurs constituants par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Dans l'expérience rapportée ci-après, les fractions déplacées par le champ électrique dans le gel de polyacrylamide sont recueillies sur une colonne de gel "SEPHADEX G 25" de constitution chimique analogue à celle du gel "SEPHADEX G 75" mais approprié au fractionnement de substances de poids moléculaires compris entre environ 100 et environ 5.000. Ce gel permet d'assurer aisément l'élution des fractions successives produites par l'électro- phorèse. On peut en particulier procéder comme suit Une colonne (diamètre de i centimètre, hauteur de 90 centimètres), terminée par une plaque de verre fritté et un bouchon muni d'un robinet, est garnie du gel connu sous la dési- gnation commerciale "SEPHADEX G 25 en suspension dans le tampon de l'électrophorèse. Celui-ci-est constitué par une solution à pH 8,35 constituée d'acide borique 0,08 M Tris-hydroxymethylaminométhane 0,093 M, éthylène diamine tétracétique (EDTA) 0,003 M. Le gel "SEPHADEX" est surmonté dans la partie supérieure de la colonne d'un gel de polyacrylamide de 4 centimètres de haut, lequel est avantageusement obtenu par polymérisation directe dans-la partie supérieure de la colonne d'un mélange de 314 milligrammes d'acrylawide, 9,2 milligrammes de bisacrylamide, 10 microlitres du-catalyseur de polymérisation constitué par le N, N, N', ' tétraméthylène diamine (T.E.M.D.) et 10 milligrammes de persulfate d'ammonium Lorsque la polymérisation est terminée, le gel est recouvert de tampon, le bouchon inférieur est retiré et l'extré- mité inférieure de la colonne est plongée dans un récipient (compartiment anodique) contenant le tampon.Une fraction FI, telle qutobtenue par la mise en oeuvre du procédé de l'exemple I (dont le rapport DO 260 / DO 280 est égal à 1,37) est dissoute dans 400 l d'une solution de sucrose à 10 % dans le tampon d'électrophorèse N/5 ; on ajoute comme marqueur 10 l d'une solution de sérum albumine (1 UD0260) colorée au bleu de bromothymol. Le mélange est appliqué à la surface du gel de polyacrylamide. La colonne est surmontée à sa partie supérieure d'un réservoir à tampon (compartiment cathodique). Les électrodes sont placées dans les deux compartiments contenant du tampon et une tension de 1100 volts est appliquée entre les électrodes. Après 28 heures, l'électrophorèse est arrêtée, le marqueur a migré d'environ 25 à 28 centimètres dans le gel "SEPHADEX".Le bouchon est replacé à la partie inférieure de la colonne, les compartiments anodique et cathodique sont retirés et l'on procède, après avoir retiré le bouchon de polyacrylamide, à l'élution des substances qui ont migré dans la colonne de 'SEPHADEX" avec le tampon utilisé pour l'électrophorèse. Dans ces conditions, on note qu'lune faible quantité de substance forme un trouble blanc qui n'a pas pénétré dans le gel ; par contre la totalité des substances de nature protéique susceptibles de migrer par électrophorèse sont déplacées du gel de polyacrylamide à la colonne de "SEPHADEX, ainsi que le prouve l'absence de coloration du gel de polyacrylamide traité à l'amido-black en milieu acétique. Le rendement de l'opération varie suivant les expériences de 70 à 95 %. Le profil d'élution obtenu par lecture de l'adsorption des différentes fractions à 260 nm (courbe en trait interrompu) et 280 nm (courbe en trait plein) est représenté à la fig. 4. Il permet de distinguer cinq fractions numérotées de F11 à F15. Détermination de l'activité biologique des fractions recueillies sprès l'électrophorèse. Les dosages ont montré que la fraction F14 contient la majeure partie de l'activité. Il faut à ce stade éviter l'opération de dialyse préalable des fractions F11 à F15, en vue d'éliminer les sels introduits par le tampon de l'électrophorèse, car on ne retrouve alors plus trace de l'activité de toutes ces fractions, fraction F14 comprise, après l'opération de dialyse. Cette constatation semble confirmer que les molécules actives contenues dans la fraction F14 ont un poids moléculaire extrêmement faible, ce qui a été vérifié par fractionnement de la fraction F14 par ultrafiltration sur une membrane ultrafiltrante dont la limite d'exclusion est de 500 daltons, telle que celle commercialisée par la Société AMICON sous l'abréviation "UM-OS". Les résultats des dosages biologiques, notamment en ce qui concerne le pourcentage d'inhibition de l'incorporation de la H-thymidine dans l'ADN de cellules de rate, in vitro, sont rassemblés dans le tableau 6 ci-après. TABLEAU 6 Electrophorèse de F1 Fraction placée Quantité de substance % d'inhibition de on lacée en test en l'incorporation de test mU260 la 3H-thymidine dan @00 l'ADN contrôle - 0 F1 80 62 24 3 16 - 20 F11 + F12 24 12 16 I 8 9 F13 16 44 8 11 F14 - concentré UM-05 24 17 16 16 8 Il - ultrafiltrat UM-05 16 53 s 18 F15 16 - 9 8 - 12 En ce qui concerne la fraction F14, le tableau fait apparaître les résultats obtenus avec l'ultrafiltrat résultant de l'ultrafiltration de la fraction F14 sur la membrane "UM-05" (ultrafiltrat UM-05) et la fraction restante, contenant les molécules de poids moléculaires plus élevés (concentré UM-OS). L'examen de ce tableau fait apparaître que, d'une part, l'activité recueillie est essentiellement concentrée dans la fraction F14 et, d'autre part, que l'activité de la fraction F14 elle-même est presque exclusivement retrouvée dans l'ultrafiltrat. Il est donc possible par électrophorèse de la fraction FI, dans les conditions qui ont été indiquées, d'isoler une fraction active, ayant certaines des propriétés du type de celles des chalones et ayant un poids moléculaire inférieur ou au plus égal à 500. EXEMPLE V : Obtention de fractions à bas poids moléculaires par ultrafiltration d'une solution diluée de la fraction F1 : fraction F1U". Une solution diluée de la fraction F1, contenant initialement 8 UD0260 par millilitre de matière est effectuée sur une membrane.ultrafiltrante PM.10, suivie d'une concentration sur une membrane ultrafiltrante connue sous la désignation commerciale "MINICON B-lSt. Ces deux systèmes de concentration permettent la retenue des molécules dont le poids moléculaire est supérieur à 10-000 dans un concentrat désigné ci-après sous l'expression "concentré F1C". On recueille l'ultrafiltrat formé d'une solution de la fraction F1U contenant les constituants à poids moléculaires inférieurs à 10.000. On peut effectuer la détermination des activités biologiques des fractions F1C et F1U. On détermine-leur effet sur l'incorporation de la 3H-thymidine dans une culture de cellules de rate et dans les conditions qui ont déjà été indiquées antérieurement. Les résultats font l'objet du tableau 7 ci-après. TABLEAU 7 Ultrafiltration sur PM10 de la fraction F1 Quantité % d'inhibition Quantité placée de l'incorpora Fraction en en test tion de la U260 en mU260 H-thymidine dans l'ADN Contrôle 0 F1 1210 100 76 24 54 16 46 Ultrafiltrat 460 50 86 F1U 24 74 16 65 Concentré 620 100 31 F1C 50 14 24 19 Comme on peut le constater à l'examen de ce tableau, la majeure partie de l'activité biologique est concentrée dans la fraction de faible poids moléculaire F1U. EXEMPLE VI Obtention.dune fraction active formée de constituants à poids moléculaires inférieurs à 10.000, directement à partir de la fraction F'. On forme une fraction F' à partir de S grammes de poudre acétonique qui sont soumis à une extraction par 100 millilitres d'eau. La suspension obtenue est homogénéisée dans l'appareil 'WARRING BLENDER", à la vitesse maximum pendant 3 minutes, à la suite de quoi la suspension est laissée au repos pendant 20 heures à 40 C, puis centrifugée 90 minutes à 30.000 g. Le surnageant obtenu (80 à 90 millilitres, 60 à 80 UD0260 par millilitre) est concentré dix à quinze fois dans une cellule AMICON sur membrane ultrafiltrante UM-1O, ce qui permet une première séparation de substances inactives ayant un poids moléculaire inférieur à 10.000. Le premier ultrafiltrat UF1 obtenu est testé pour son activité biologique. Le concentré restant, contenant les constituants à poids moléculaires supérieurs à 10.000, est "lave" avec un volume d'eau pour reconstituer le volume initial, puis soumis à une nouvelle ultrafiltration, pour fournir un deuxième ultrafiltrat contenant à nouveau des constituants de poids moléculaires inférieurs à 10.000. Suite à ce traitement, la fraction contenant les constituants de poids moléculaires élevés (et qui dans le tableau ci-après sera désigné comme suit : "F (PM > 10.000)" est alors diluée à l'eau jusqu'à obtenir une solution ayant une concentration d'environ 10 UD0260 par millilitre, cette solution étant ensuite soumise à nouveau à une opération d'ultrafiltration. On recueille à la fois la fraction concentrée en constituants à poids moléculaires élevés (Fc) et l'ultrafiltrat (Fu). Propriétés biologiques des différentes fractions isolées. Le tableau 8 ci-après rapporte les résultats qui ont été obtenus avec les différentes fractions dans le test d'inhibition de l'incorporation de la 3H-thymidine dans des cellules de rate "in vitro" (essais 1 et 2). Ce tableau indique également les résultats .obtenus dans un "essai 3", mis en oeuvre dans des conditions analogues à celles des deux premiers, sauf que la fraction "F(PM)10.000)" est diluée jusqu'à obtenir une solution ne contenant que 2 Ut0260 par millilitre, avant d'être soumise à l'étape finale d'ultrafiltration. Il fournit - la concentration des solutions soumises à ultrafiltration en UD0260 par millilitre - deux nombres séparés par un trait incliné, donnant les quantités de chaque fraction rapportées à la quantité totale de poudre acétonique mise en oeuvre, d'une part, et à 1 gramme de cette même poudre, d'autre part - les activités mesurées en "inhibition %" de différentes doses de chacune des fractions testées : les doses testées figurent dans la troisième rangée du tableau et les valeurs bd'inhiber tion %" dans la quatrième rangée - les activités spécifiques exprimées en unités CH(UCH) par UD0260, étant entendu que 1 unité UCH correspond à la quantité de substance qui induit une inhibition de 50 X de l'incorpora tion de la 3H-thymidine dans les lymphocytes, dans les condi tions du test décrit, et enfin - le rendement en "%". TABLEAU 8 Ultrafiltration de la fraction F : Extraction de la fraction FU Essau 1 F UF1 UF2 F 10.000) Fc Fu Concentration de la solution 53 10 filtrée en UDO 260/ml 2820 / 1007 580 / 207 150 / 53 2000 / 714 1540 / 550 210 / 75 Quantité en UDO 260 : totale par mg de poudre 24 16 8 24 16 8 24 16 8 100 25 16 8 100 25 16 8 50 24 16 8 Dose en MUDO Activité Inhibition % 37 23 21 29 4 45 29 25 15 74 23 17 9 47 16 13 13 80 73 53 45 Activité spécifique UCH/UDO 260 13 N.D. N.D. 20 N.D. 161 Rendement % 20 5 71 55 7,5 Essai 2 Concentration de la solution 73 10 filtrée en UDO 260/ml Quantité en UDO : totale 12.667 / 1266 3100 / 310 136 / 13 9400 / 940 8000 / 800 1300 / 130 par mg de poudre Activité Dose en mUDO 260 100 24 16 8 100 24 16 8 100 24 16 8 100 24 16 8 100 24 16 8 50 24 16 8 Inhibition % 30 9+21+45 52 25 8 16 68 35 33 19 49 20 20 17 44 3 5 0 66 52 45 23 Activité spécifique UCH/UDO 260 3 12 22 9 44 Rendement % 24 1 74 63 10 Essai 3 Concentration de la solution 28 filtrée en UDO 260/ml 2 Quantité en U260 : totale 1200 / 522 281 / 122 noneffectué 900 / 391 600 / 260 150 / 65 par mg de poudre Dose en mUDO 260 54 27 13 64 32 16 72 29 14 83 20 8 30 22,5 15 Activité Inhibition % 19 0 0 55 56 5 52 29 +9 6 +10 0 68 67 53 Activité spécifique UCH/UDO 260 N.D. 20 (7) 14 74 Rendement % 23 75 50 12,5 Le tableau 8 fait apparaître que, partant d'une fraction F ayant une activité spécifique donnée, on peut, par les deux lavages successifs qui ont été décrits, éliminer des proportions importantes de constituants à poids moléculaires faibles, sans perte importante d'activité, comme il résulte de l'examen des chiffres correspondant aux deux fractions SUFI, UF2.Ce lavage a d'ailleurs pour effet de conduire à une augmentation notable de l'activité spécifique de la fraction contenant les poids moléculaires élevés et les fractions actives qui sont fixées dessus, comme on peut le constater lorsque l'on compare les résultats chiffrés obtenus avec les fractions F, d'une part, F (PM / 10.000), d'autre part0 Le traitement de cette dernière fraction par dilution importante, suivie d'une séparation des constituants FU, fait apparaitre que la majeure partie de l'activité est retenue dans cette dernière fraction. Cecl est particulièrement vrai pour l'essai 3, qui fait apparaître que la dilution~préalable de la fraction F (PM) 10.000) jusqu'à obtenir une solution ne contenant plus que 2 UD0260 par millilitre, entraînait le détachement quasiment-complet des fractions actives qui se retrouvent toutes dans l'ultrafiltrat Fu. Dans ce cas, la fraction Fc qui est essentiellement formée de constituants à poids moléculaires supérieurs à 10.000 est pratiquement dépourvue d'activité. Ces résultats montrent bien qu'un facteur actif peut être entièrement dissocié des fractions de hauts poids moléculaires par simple dilution suivie d'une ultrafiltration, sans qu'on puisse cependant exclure la possibilité d'une dénaturation au cours de la dilution d'un second facteur actif de haut poids moléculaire type protéine. Des résultats tout à fait analogues ont été obtenus dans un essai différent, dans lequel la fraction F(PM > 10.000) a été diluée jusqu'à obtenir une concentration en matière de 4 UD0260 par millilitre, avant d'être soumise à une ultrafiltration. On remarque également que l'activité spécifique de la fraction Fu finale est au moins treize à quatorze fois supérieure à celle de la fraction initiale F et de cinq à six fois supérieure à celle de la fraction F(PM > 1O.OOO). EXEMPLE VII Purification des fractions FlU, F6, FU et F14 par chromatographie sur tBIO-GEL P2gt(200-400 mesh) Les différentes fractions obtenues dans les exemples précédents contiennent des constituants actifs analogues comme il résulte de l'opération de purification décrite ci-après. On fait passer une solution de ces divers constituants dans l'eau bidistillée sur une colonne (hauteur de 55 cen timètres, diamètre de 2 centimètres) de 'DIO-GEL P2t' (200-400 mesh) sous un débit de 100 millilitres par heure. Les fractions éluées font l'objet de mesures de densités optiques à 260 et 280 nm respectivement, les variations de ces densités optiques mesurées en fonction du volume élué faisant l'objet des figures 5, 6 et 7, en ce qui concerne les fractions F1U, F6 et FU respectivement. Les courbes des figures 5, 6 et 7 suggèrent déjà par elles-mêmes une relative identité de composition de ces différentes fractions, qui ne diffèrent entre elles que par les proportions relatives des différents constituants. Cette relative identité est confirmée par la localisation de l'essentiel de l'activité de chacune de ces fractions dans des volumes d'élution voisins : entre 2,6 et 3w8 Vo pour la fraction FU, entre 2,9 et 3,4 Vo pour la fraction FlU et entre 2,5 et 3,6 Vo pour la fraction FU. Le tableau 9 rend compte de ces résultats. Il précise les volumes d'élution de celles des fractions qui sont actives, cette activité étant exprimde par l'inhibition de lincor- poration de la 3H-thymidine dans 1'ADN de cellules de rate. TABLEAU 9 Quantité de Inhibition Substance Volume substance de l'incor chromato- Fraction d'élution placée en poration de graphique test en la 3H-thymi- mU260 dine dans l'AND % F1.U F1U1 1-1,4 24 40 16 43 8 30 F1U2 1,4-2,6 24 1 16 0 8 +19 F1U3 2,6-3,5 24 74 16 66 8 48 F1U4 3,5-3,8 24 66 16 57 8 37 FlUS 3,8-5 24 22 16 13 8 0 F6 F61 1-1s8 24 48 8 56 F62 1,8-2,9 24 # 2 16 2 8 + 4 F63 2,9-3,4 20 80 14 76 7 50 F64 3,4-4,7 42 16 28 15 14 7 FU FU1 1-1,4 24 0 16 + 7 8 +6 4 0 FU2 1,4-2,4 24 18 16 +14 8 +10 4 1 FU3 2,5-3,1 24 78 16 70 8 55 4 30 FU4 3,1-3,6 24 66 16 61 8 39 FU5 3,6-4,5 4 31 24 17 16 12 8 19 4 13 Des résultats-analogues sont obtenus avec la fraction F14, laquelle conduit à une fraction F144 contenant l'essen- tiel de l'activité et qui est éluée entre environ 2,5 et environ 3,6, dans le même protocole expérimental. L'analyse par la chromatographie en couche mince sur cellulose (notamment celle commercialisée par la Société BRlNKMANN) des fractions FlU, F6 et FU conduit, lorsque l'éluant utilisé est constitué par le mélange BuOH/AcOH/H20 (60/15/25), à des résultats tout à fait semblables. On obtient pour chacune des fractions des taches - dans la région de Rf 0,26-0,28 révélées par le réactif ninhydrine/collidine, - dans la mgion de Rf 0,47-0,55, les substances concernées étant révélées à la lumière ultraviolette et paraissant, de ce fait, constituées par des nucléosides, et enfin - dans la région de Rf 0,65-0,75, ces taches étant également ré vélées par la lumière ultraviolette. La nature nucléosique de ces substances est également confirmée par leur spectre ultraviolet. Propriétés biologiques de ces fractions. La fraction testée est constituée par la fraction FA qui résulte du mélange des fractions FU3 et FU4 (voir tableau 8 ci-dessus), c'est-à-dire la fraction d'élution du "BlO-GEL P2tt de FU qui est comprise entre 2,5 et 3,6-Vo. La capacité des fractions selon l'invention d'inhiber l'incorporation de la thymidine in vitro résulte déjà de ce qui précède. Cette inhibition témoigne d'une certaine spécificité tissulaire, comme il ressort du tableau 10 ci-apre4s, qui fait apparaître les effets de la fraction FA, non seulement sur des cellules de rate, mais également sur des cellules de rein, de foie, de testicule. Ce tableau fait clairement apparaitre que l'effet d'inhibition de l'incorporation de la thymidine tritiée induite par la fraction FA s'exerce préférentiellement dans les cultures de cellules de rate. Des effets analogues sont observés in vivo. TABLEAU 10 Tissu Contrôle FA Inhibition Contrôle FA Radio-activité Dose an mU260 Radio-activité % de cellules % de cellules dpm placé en dpm % mortes mortes test Rate 50.098 24 4.128 92 5 7 12 17.943 64 6 6 48.704 27 4 Rein 7,555 24 5.145 39 7 10 12 6.818 19 8 6 7,863 7 7 Foie 7,609 24 3.745 50 10 10 12 6.051 20 10 6 7.610 0 9 Testicule 6.995 6.161 12 6,5 9 6.892 8 8,5 7.732 2 7 ProEridtés immunosuressives de la fraction FA. Elles ont été mises en évidence par l'inhibition, après l'administration de la fraction FA, des réactions d'hypersensibi lité retardée aux globules rouges de mouton (GRM) et au dinitrochlorobenzène (DNCB) chez des souris qui avaient été sensibilisées à cet antigène. De même, les lymphocytes de souris préalablement traités par la fraction FA inhibent la formation de plaques de JERNE dans une culture de cellules spléniques en présence de GRM, ce qui ressort nettement du tableau Il ci-après. TABLEAU 11 Substance Dose en Nombre de pla injectée mUD0260/souris ques d'hémolyse inhibition Contrôle - 37 + 3 3 FA 500 13 + 2 65 Innocuité de la fraction FA. Elle résulte également de l'examen des deux dernières colonnes du tableau 10, lesquelles mettent en évidence que la substance FA n'induit pas une augmentation significative du pourcentage de cellules mortes, dans le test au bleu Trypan. EXEMPLE VIII Obtention de fractions très purifiées par chromatographie en couche mince. Les opérations de chromatographie en couche mince ont également été effectuées sur la fraction FA. Les trois systèmes suivants ont été utilisés - Système 1 - Plaque : cellulose (BRINKMANN) Eluant : BuOH/AcOH/H20 (60/15/25) - Système 2 - Plaque : cellulose (SCHLEICHER-SCHULL) Eluant : H20 - Système 3 - Plaque : PEI-cellulose (SCHLEICHER-SCHULL) Eluant : Tampon phosphate P04K31, 5M ; pH 3,4. La détection des substances chromatographiées a été effectuée a - par examen en lumière ultraviolette à 254 nm (U.V.) b - après aspersion par le réactif à la ninhydrine puis chauf fage ; ceci révèle, par coloration, les substances présen tant un groupement NH2 libre, c - après traitement par une solution de phénol sulfurique et chauffage, ce qui permet la détection des sucres (S), d - par une solution de molybdate en milieu perchlorique et chlo rhydrique dans l'acétone, qui permet la révélation des esters phosphorylés de sucres (F). Le tableau 12 ci-après fburnit,dans sa moitié supérieure, les Rf des taches que donne la fraction FA dans chacun des trois systèmes. On retrouve, en particulier, dans le système 1, les substances initialement contenues dans FA, localisées dans les intervalles de Rf : (0,75-0,72), (0,55-0,47), (0,28-0,26), et plus particulièrement la tache correspondant à FA2 dans le tableau 12 (Rf 0,54 dans le premier système et Rf 0,76 dans le deuxième système). Des tests de révélation sus-indiqués parait découler que la fraction FA2 contient un constituant majoritaire formé d'un nucléoside, contenant des sucres, éventuellement aussi des groupes NH2 libres. Elle est cependant apparemment exempte d'esters phosphorylés de sucres. Dans le milieu du tableau sont indiqués les Rf des taches obtenues, lors du fractionnement plus poussé de FA par chromatographies successives dans les systèmes 2, puis 1, puis de nouveau 2. En particulier, on reprend dans l'eau les constituants de taches autres que FA2 (après la première chromatographie susdite et après isolement de FA2), et on les soumet à une nouvelle chromatographie en couche mince sur le support du système 2. On obtient alors des taches correspondant à la fraction FA3. On les soumet de nouveau à une chromatographie sur le support du système 1, pour obtenir des taches correspondant à FA3, FA5 et à une fraction FA4 impure.. La tache correspondant à cette fraction FA4 impure est à nouveau reprise. dans le solvant du système 2 et soumise à une nouvelle chromatographie dans le système 2 ce qui a conduit à la fraction FA4 purifiée dont les Rf dans les systèmes 1 et 2 sont indiqués dans le milieu du tableau. TABLEAU 12 Fraction Système 1 Système 2 Système 3 RF des taches Méthode de Rf des taches Méthode de Rf des taces Méthode de détectées détection détectées détection détectées détection UV N S P UV N UV FA 0,26 + + - 0,56 + 0,82 + 0,65 + 0,63 + 0,54 + + + - 0,76 + + 0,78 + 0,74 + + + - 0,86 FA1 0,74 + 0,91 + FA2 0,54 + 0,76 + FA3 0,53 + 0,66 + ( 0,42 + FA4 0,54 + + ( 0,48 + FA5 ( 0,26 0,76 + + ( 0,28 + ( 0,86 + ( 0,91 + Thymidine 0,74 + 0,79 + Inosine 0,43 + 0,65 + Détection par chromatographie sur couche mince des constituants de la fraction FA. Le tableau 12 fait apparaître également que les fractions FA1, FA2, FA3 et.FA4 sont détectables par la lumière ultraviolette et leur-spectre d'absorption de la lumière ultraviolette indique qu'elles contiennent des constituants du type nucléosidique. FA4 contient en outre des groupes NH2 libres, révélés par le réactif ninhydrine/collidine.Il en est de même de FA5. Les fractions FA1 à FA5 ont des spectres d'absorption dans l'ultraviolet (en solution dans l'eau), dont les fig. 8 à 12 respectivement rendent compte, et dont les caractéristiques principales sont indiquées dans le tableau 13 ci-après. TABLEAU 13 Caractéristiques des spectres ultraviolet des différentes fractions (les substances sont dissoutes dans l'eau). maux. min. #nm #nm FA1 265 234 FA2 248 222 FA3 250 230 FA4 264 240 FA5 265 236 Thymidine 265 234 Désoxyinosine 248 222 Désoxycytidine 270 249 Les activités biologiques des cinq fractions FA1 à FA5 ont été déterminées in vitro et in vivo et comparées à celles des fractions FA dont elles dérivent.En accord avec les propriétés de la fraction FA, aucune des cinq fractions ne présentent de cytotoxicité vis-à-vis des cellules en culture étudiées ; d'autre part, excepté pour la fraction FA5 qui ne présente pas d'activité, invitro, toutes les autres fractions inhibent préférentiellement, comparées aux autres cellules étu- diées, l'incorporation de la 3H-thymidine dans l'ADN des lymphocytes en culture (tableau 14). TABLEAU 14 Activité biologique in vitro des différentes fractions. Cytotoxicité et inhibition de l'incorporation de la 3H-thymidine dans l'ADN de cellules de rate, de rein, de foie et de testicule de souris en culture. RATE REIN FOIE Testicule Fraction Dose en Radio* Inh.* C.M.* Radio* Inh.* C.M.* Radio * Ihn.* C.M.* Radio* Inh.* C.M.* mise en mUDO 260 act. en % % act. en % % act. en % % act. en % % culture place en dpm dpm dpm dpm test Contrôle 24 50098 3 7555 0 7609 1 6995 2 12 4128 92 7 5145 39 10 3745 50 10 6161 12 9 FA 6 17943 64 6 6818 19 8 6051 20 10 6892 8 8 48704 27 4 7863 7 7 7610 0 9 7732 2 7 Contrôle 16190 10095 19574 0 19442 0 FA1 24 7115 56 3 11643 15 4 22827 +16 0 23417 +20 0 8 10949 32 3 10015 0 4 20925 + 6 7 23582 +21 3 Contrôle 20090 21055 16427 15845 FA2 24 12657 38 4 18104 14 5 15078 8 3 12879 8 2 8 17310 16 1 16585 21 2 15449 6 4 14607 2 3 Contrôle 20090 21055 16427 15845 FA3 24 6703 67 2 20096 4 1 14936 9 3 13486 15 1 8 7811 62 3 20513 2 1 14086 14 5 14809 6,5 2 Contrôle 20090 21055 16427 15845 FA4 24 2357 88 2 17001 19 2 15242 7 2 15522 2 3 8 7821 61 1 18369 13 2 18662 +13 0 14808 6,5 0 Contrôle 16190 10095 19574 19442 FA5 24- 13217 18 4 14036 +39 2 21503 +10 2 21323 +9 1 8 13377 17 2 13892 +37 - 20548 + 5 - 21586 +11 # Radio act = Radio - activité Inh. = Inhibition C.M. = Cellules mortes Lorsque les différentes fractions sont administrées in vivo à des souris, et que l'évaluation de l'incorporation du précurseur radio-actif dans l'ADN est effectuée sur les cellules des différents organes des animaux en culture, les résultats obtenus (tableau 15) montrent que les différentes fractions inhibent l'incorporation de la 3H-hymidine préférentiellement dans les lymphocytes, ce qui soutient les résultats de spécificité tissulaires obtenus in vitro. Par ailleurs, le fait que la fraction FA5 inactive in vitro apparaisse active in vivo peut suggérer la nécessité d'une réactivation biologique in vivo, ou la possibilité d'un stade d'action sur les lymphocytes, différent de la phase S de synthèse de l'ADN. TABLEAU 15 RATE REIN FOIE TESTICULE Substance Dose en Radio- Inh. Radio- Inh. Radio- Ihn. Radio- Inh. injectée mUDO 260/ act. en % act. en % a ct. en % act. en % souris dpm dpm dpm dpm Contrôle 21000 22400 21000 27900 FA 500 7200 66 21500 4 26200 +24 17900 36 FA1 500 11900 43 20700 7,5 16800 20 27400 2 FA2 500 9400 55 24800 +10 19600 6 18300 34 FA3 500 6300 70 22000 2 19600 6 23900 14 FA4 100 6600 68 25300 +13 15600 26 22300 20 FA5 500 10500 50 23800 + 6 21000 0 18500 33 Activité biologique in vivo des différentes fractions. Inhibition de l'incorporation de la 3H-thymidine dans l'ADN de cellules en culture de rate, de rein, de foie et de testicule prélevées sur des souris traitées. TABLEAU 16 Inhibition de la formation de plaques d'hémolyse des globules rouges de mouton par les lymphocytes d'animaux sensibilisés aux G.R.M., puis traités par les différentes fractions. Nombre de plaques % Inhibition Substance injectée Dose en mUDO 260 / souris d'hémolyse Contrôle - 37 # 3 FA 500 19 # 2 65 FA1 500 20 # 2 46 FA2 500 9 # 3 76 FA3 500 17 # 3 54 FA4 100 15 # 3 59 FA5 500 12 # 2 67 L'activité immunosuppressive des différentes fractions a été déterminée in vivo chez la souris dans le test d'inhibition de la formation des plaques d'hémolyse de JERNE. Les résultats obtenus (tableau 16) indiquent que comparé à l'action de la fraction FA, la fraction FA1 présente peu d'activité et ne doit pas contenir le ou les principes actifs principaux. Les quatre autres fractions, y compris la fraction FA5, présentent une activité notable. Dans la limite de précision du test, les résultats sembleraient indiquer une activité immunosuppressive localisée préférentiellement dans les fractions FA2 et FA4. Cette dernière substance administrée in vivo ne semble pas avoir d'effet inhibiteur vis-à-vis des cellules souche de la moelle, ainsi qu'il apparaît par le dénombrement des "unités formant des colonies" ("colon forming units") après greffe des cellules de la rate des souris ttaitées,chez des animaux irradiés. Les propriétés pharmacologiques qui ont été indiquées font des fractions selon l'invention des réactifs biologiques particulterement intéressants. Ces propriétés, de même que leur absence de toxicité et leur absence de spécificité d'espèce, en font des produits qui présentent les propriétés particulièrement désirables de médicaments utiles, notamment dans le traitement de maladies auto-immunes, d'affections néoplasiques, malignes ou tumorales, et, d'une façon générale, dans toute affection impliquant le contrôle de la multiplication lymphocytaire. L'utilisation des fractions selon l'invention doit se révéler particulièrement utile chaque fois qu'il est nécessaire de protéger le système lymphoïde, notamment par sa mise au repos, dans tout traitement médical mettant en oeuvre des agents cyclodépendants (qui agissent à un moment donné de la division cellulaire). Ainsi, il sera utile d'associer un traitement mettant en oeuvre les fractions ou constituants selon l'invention aux traitements du genre sus-indiqué, pour combattre des affec- tions néoplasiques, malignes ou- tumorales, tels que chimiothérapie ou traitements par rayons, qui sont souvent assez agressifs, notamment à l'égard du système lymphoide. Le traitement avec les fractions ou constituants selon l'invention peut être interrompu en même temps que les traitements avec les susdits autres agents ou peu après.Le système lymphoYde qui aura alors été préservé, au moins en partie sinon totalement, sera alors plus apte à parachever, si nécessaire, l'action des susdits agents, notamment à détruire des cellules tumorales résiduelles. La corrélation entre les propriétés pharmacologiques ou biologiques qui ont été décrites et les indications thérapeutiques indiquées ci-dessus est bien établie commele montre la littérature, On se réfèrera par exemple à l'ouvrage de J.C. HOUCK, intitulé "Les Chalones", édité en 1976 par NORTH HOLLAND. Les fractions selon l'invention peuvent être associées à tous excipients permettant leur administration par voie orale ou rectale. Cependant, les meilleurs résultats seront obtenus par voie parentérale, par injection d'une solution des fractions ou constituants selon l'invention au sein d'une solution injectable, isotonique et stérile. A titre indicatif et sans que celui puisse, en aucune façon, avoir un caractère limitatif, les doses unitaires adminis trées, notamment par injection, devraient normalement être comprises entre environ 20 à environ 250 mg de matière active. Comme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécia- lement envisagés ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1 - Fraction active ayant un ensemble de propriétés biologiques que constituent des propriétés inhibitrices de l'incorporation de la 3H-thymidine dans i'ADN des cellules de lymphocytes in vitro et in vivo, et des propriétés immunosuppressives qui se manifestent par un effet antagoniste à l'égard de la stimulation des lymphocytes par des mitogènes, une capacité d'induire une diminution de l'hypersensibilité retardée aux globules rouges de mouton, d'une part, au dinitrochlorobenzène, d'autre part, par une réduction du nombre de plaques formées qu'induisent les lymphocytes d'animaux préalablement traités avec la susdite fraction active, dans une culture de cellules spléniques en présence de globules rouges de mouton ,selon la technique de JERNE et NORDIN, caractérisée en ce qu'elle est formée de constituants ayant des poids moléculaires inférieurs à 10.000 et en ce que, lorsqu'une solution aqueuse de cette fraction est soumise à une filtration sur une colonne d'un tamis moléculaire formé d'un gel de polydextrane réticulé, tel que celui commercialisé sous la marque "SEPHADEX G 75tut, formé de billes de 40 à .120 ju de diamètre,et permettant le fractionnement d'un mélange de constituants dont les poids moléculaires sont compris entre environ 5.000 et 50.000, elle donne lieu à un eluat actif contenu dans un volume V élué entre environ 4 Vo et environ 5 Vo (Vo = volume mort de la colonne). 2 - Fraction selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient des constituants qui, lorsqu'une solution de cette fraction est soumise à une filtration sur un gel de polyacrylamide pour chromatographie, tel que celui commercialisé sous la marque BIO-GEL P2", se présentant sous forme de billes, dont les diamètres sont compris entre approximativement 37 et 74 microns, ce gel présentant une limite d'exclusion exprimée en daltons de 1800, et étant approprié au fractionnement de mélanges de constituants dont les poids moléculaires sont compris dans l'intervalle 100-1800 daltons,donnent lieu lors de l'élution des susdits constituants, à l'isolement de l'essentiel de l'activité dans un volume d'élution V compris entre environ 2,5 Vo et environ 4 Vo (Vo = volume mort de la colonne). 3 - Fraction possédant le susdit ensemble de propriétés biologiques, caractérisée en ce qu'elle est formée de consti tuants qui donnent lieu - lorsqu'une solution aqueuse de ces constituants est soumise à une filtration sur un gel de polyacrylamide du type de celui envisagé à la revendication 2, dans des conditions analogues, à un volume d'élution contenant la majeure partie de l'activi té, compris entre environ 2,5 Vo et environ 4 Vo, et - lorsqu'une solution aqueuse de ces constituants est soumise à une filtration sur gel de polydextrane, du type de celui défini dans la revendication 1, dans des conditions analogues.à un volume d'élution V contenant la majeure partie de l'activité, compris entre environ 4 Vo et environ 5 Vo. 4 - Fraction selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que son analyse par chromatographie en couche mince (CON) sur plaque de cellulose, dans un système de solvants formé par un mélange contenant 60 volumes de butanol, 15 volumes d'acide acétique et 25 volumes d'eau, fait apparaitre des taches révélables par le rayonnement ultraviolet aux Rf 0,47 - 0,55, ces taches étant également colorables par une solution de phénol sulfurique après chauffage, mais non colo rables par une solution de molybdate en milieu perchlorique et chlorhydrique dans l'acétone. 5 - Fraction selon la revendication 4, caractérisée en ce que son analyse par chromatographie en couche mince dans le même système fait aussi apparaître, soit des taches également détectables à l'ultraviolet dont les Rf se situent entre envi ron 0,65 et environ 0,75, ces taches étant également colorables par une solution de phénol sulfurique après chauffage, soit des taches caractérisées par un Rf de l'ordre de 0,26-0,28 et qui sont détectables par le réactif ninhydrine/collidine, soit les deux à la fois, ces taches n'étant pas non plus colorables par une solution de molybdate en milieu perchlorique et chlorhydrique dans l'acétone. 6 - Fraction possédant le susdit ensemble de propriétés biologiques, caractérisée en ce que son analyse par chromatogra phie en couche mince (CCM) sur plaque de cellulose, dans un sys tème de solvants forgé par un mélange contenant 60 volumes de butanol, 15 volumes d'acide acétique et 25 volumes d'eau, fait apparaître des taches révélables par le rayonnement ultraviolet aux Rf 0,47 - 0,55, ces taches étant également colorables par une solution de phénol sulfurique après chauffage, mais non colo rables par une solution de molybdate en milieu perchlorique et chlorhydrique dans l'acétone, en ce qu'elle est formée de constituants qui donnent lieu - lorsqu'une solution aqueuse de ces constituants est soumise à une filtration sur un gel de polyacrylamide du type de celui envisagé à la revendication 2, dans des conditions analogues, à un volume d'élution contenant la majeure partie de l'activi té, compris entre environ 2,5 Vo et environ 4 Vo, et - lorsqu'une.solution aqueuse de ces constituants est soumise à une filtration sur gel de polydextrane, du type de celui défini dans la revendication 1, dans des conditions analogues, à. un volume d'élution V contenant la majeure partie de l'activité, compris entre environ 4 Vo et environ 5 Vo. 7 - Fraction selon la revendication 6, caractérisée en ce que son analyse par chromatographie en couche mince dans le même système fait aussi apparaitre, soit des taches également détectables à l'ultraviolet dont les Rf se situent entre environ 0,65 et environ 0,75, ces taches étant également colorables par une solution de phenol sulfurique après chauffage, soit des taches caractérisées par un Rf de l'ordre de 0,26-0,28 et qui sont détectables par le réactif ninhydrine/collidine, soit les deux à la fois, ces taches n'étant pas non plus colorables par une solution de molybdate en milieu perchlorique et chlorhydrique dans l'acétone. 8 - Fraction selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle contient des constituants donnant lieu par chromatographie en couche mince à au moins l'une des deux taches telles que définies ci-dessous, - soit,2our l'une de ces taches (FA2) - Rf de l'ordre de 0,54 dans le système de CCM sur cellulose mettant en oeuvre l'éluant formé par le mélange BuOH/AcOH/ H20 (60/15/25) (premier système) --Rf de l'ordre de 0,66 dans le système de CCM sur cellulose mettant en oeuvre l'éludant formé par de l'eau (deuxième système) ; - elle est révélable par l'ultraviolet ; ; - elle possède un spectre d'absorption ultraviolette dans l'eau tel que représenté dans la fig. 9, caractérisé par une absorption maximum vers 248 nm et une absorption minimum vers 222 nm - soit, pour l'autre de ces taches (FA4) - Rf de l'ordre de 0,54 dans le système de CCM sur cellulose mettant en oeuvre l'éluant formé par le mélange BuOH/AcOH/ H20 (60/12/25) (premier système) - Rf de l'ordre de 0,76 dans le système de CCM sur cellulose mettant en oeuvre l'éluant formé par de l'eau (deuxième système) - elle est révélable par l'ultraviolet et par le réactif ninhy drine/collidine - elle possède un spectre d'absorption ultraviolette dans l'eau tel que représenté dans la fig. 11, caractérisé par une ab sorption maximum vers 264 nm et une absorption minimum vers 240 nm. 9 - Fraction selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle contient en outre des constituants donnant lieu, par chromatographie en couche mince à au moins trois groupes de taches, à savoir pour le premier groupe (FA1) : - une tache dans le premier système tel que défini ci-dessus, révélable à l'ultraviolet, de Rf de l'ordre de 0,74 - une tache dans le deuxième système, révélable à l'ultraviolet, de Rf de l'ordre de 0,76 - un spectre d'absorption dans l'ultraviolet, tel que reproduit dans la fig. 8 Tour le deuxième grouSe (FA3) :: - une tache dans le premier système, .rév.élable à l'ultraviolet, de Rf de l'ordre de 0,53 deux taches dans le deuxième système, révélables à l'ultra violet, de Rf de l'ordre de 0,42 et 0,48 respectivement; - un spectre d'absorption dans l'ultraviolet, tel que représenté dans la fig. 10 pour le troisième groupe (FA5) : - une tache dans le premier système,colorable par le réactif nînhydrine/collidine, dans la région des Rf 0,26-0,28 ; - une tache dans le deuxième système, colorable par le réactif ninhydrine/collidine, dans la région des Rf 0,86 - 0,91 - un spectre d'absorption dans l'ultraviolet, telle représenté dans la fig. 12. 10 - Fraction (FA2) ayant le susdit ensemble de propriétés biologiques, caractérisée en ce que - elle est formée de constituants donnant lieu par chromatogra phie en couche mince à des taches présentant respectivement les caractéristiques suivantes - Rf de l'ordre de 0,54 dans le système de CCM sur cellulose, mettant en oeuvre l'éluant formé par le mélange BuOH/AcoH/H20 (60/15/25) (premier système) - Rf de l'ordre de 0,66 dans le système de CCM sur cellulose" mettant en oeuvre l'éluant formé par de l'eau (deuxième sys tème) - elle est révél-able par l'ultraviolet - elle possède un spectre d'absorption ultraviolette dans 11 eau, tel que représenté dans la fig 9, caractérisé par une absorp tion maximum vers 248 nm et une absorption minimum vers 222 nm - elle est formée de constituants qui donnent lieu - lorsqu'unie solution aqueuse de ces constituants est soumise à une filtration sur un gel de polyacrylamide du type de celui envisagé à la revendication 2, dans des conditions analogues à un volume d'élution contenant la majeure partie de l'acti vité, compris entre environ 2,5 Vo et environ 4 Vo, et - lorsqu'une solution aqueuse de ces constituants est soumise à une filtration sur gel de polydextrane, du type de celui défini dans la revendication 1, dans des conditions analo gues, à un volume d'élution V contenant la majeure partie de l'activité, compris entre environ 4 Vo et environ 5 Vo. Il - Fraction (FA4). ayant le susdit ensemble de propriétés biologiques, caractérisée en ce que - elle est formée de constituants donnant lieu par chromatogra phie en couche mince à des taches présentant respectivement les caractéristiques suivantes - Rf de l'ordre de 0,54 dans le système de CCM sur cellulose mettant en oeuvre l'éluant formé par le mélange BuOH/AcOH/ H20 (60/12/25) (premier système) ;; - Rf de l'ordre de 0,76 dans le système de CCM sur cellulose mettant en oeuvre l'éluant formé par de l'eau (deuxième sys tème) - elle est révélable par l'ultraviolet et par le réactif ninhy drine/collidine - elle possède un spectre d'absorption ultraviolette dans l'eau, tel que représenté dans la fig. 11, caractérisé par une ab sorption maximum vers 264 nm et une absorption minimum vers 240 nom ;; - elle est formée de constituants qui donnent lieu - lorsqu'une solution aqueuse de ces constituants est soumise à une filtration sur un gel de polyacrylamide du type de celui envisagé à la revendication 2, dans des conditions analogues, à un volume d'élution contenant la majeure partie de l'acti vité, compris entre environ 2,5 Vo et environ 4 Vo, et - lorsqu'une solution aqueuse de ces constituants est soumise à une filtration sur gel de polydextrane, du type de celui dé fini dans la revendication 1, dans des conditions analogues, à un volume d'élution V contenant la majeure partie de l'acti vité, compris entre aviron 4 Vo et environ 5 Vo. 12 - Fraction (FAir ayant le susdit ensemble de propri étés blologiques, caractérisée en ce que - elle est formée de constituants donnant lieu par chromatographie en couche mince à des taches présentant respectivement les ca ractéristiques suivantes - une tache dans le premier système tel que défini ci-dessus, révélable à 1'ultraviolet, de Rf de l'ordre de 0,74 - une tache dans le deuxième système, révélable à l'ultra violet, de Rf de l'ordre de 0,76 - un spectre d'absorption dans l'ultraviolet tel que représenté dans la fig. 8 telle est formée de constituants qui donnent lieu - lorsqu'une solution aqueuse de ces constituants est soumise à une filtration sur un gel de polyacrylamide du type de celui envisagé à la revendication 2,dans des conditions ana logues, à un volume d'élution contenant la majeure partie de l'activité, compris entre environ 2,5 Vo et environ 4 Vo, et - lorsqu'une solution aqueuse de ces constituants est soumise à une filtration sur gel de polydextrane, du type de celui défini dans la revendication 1, dans des conditions analo gues, à un volume d'élution V contenant la majeure partie de l'activité, compris entre environ 4 Vo et environ S Vo. 13 - Fraction (FA3) ayant le susdit ensemble de propriétés biologiques, caractérisee en ce que elle est formée de constituants donnant lieu par chromatogra phie en couche mince à des taches présentant respectivement les caractéristiques suivantes - une tache dans le premier système, révélable à l'ultra violet, de Rf de l'ordre de 0,53 - deux taches dans le deuxième système, révélables à l'ultra violet, de Rf de l'ordre de 0,42 et 0,48 respectivement, ou seulement l'une ou l'autre de ces deux taches - un spectre d'absorption dans l'ultraviolet, tel que représen té dans la fig. 10 ;; - elle est formée de constituants qui donnent lieu - lorsqu'une solution aqueuse de ces constituants est soumise à une filtration sur un gel de polyacrylamide du type de celui envisagé à la revendication 2, dans des conditions ana logues, à un volume d'élution contenant la majeure partie de l'activité, compris entre environ 2,5 Vo et environ 4 Vo, et lorsqu'une solution aqueuse de ces constituants est soumise à une filtration sur gel de polydextrane, du type de celui dé fini dans la revendication 1, dans des conditions analogues, à un volume d'élution V contenant la majeure partie de l'acti vité, compris entre environ 4 Vo et environ 5 Vo. 14 - Fraction active (FA5) ayant un ensemble de propriétés biologiques que constituent des propriétés inhibitrices de l'incorporation de la 3H-thymidine dans l'ADN des cellules de lymphocytes in vivo et des propriétés immunosuppressives qui se manifestent par un effet antagoniste à l'égard de la stimulation des lymphocytes par des mitogènes, une capacité d'induire une diminution de l'hypersensibilité retardée aux globules rouges de mouton, d'une part, au dinitrochlorobenzène, d'autre part, par une réduction du nombre de plaques formées qu'induisent les lymphocytes d'animaux préalablement traités avec la susdite fraction active, dans une culture de cellules spléniques en présence de globules rouges de mouton, selon la technique de JERNE et:N::0DIN., caractérisée en ce que - elle est formée de constituants donnant lieu par chromatogra phie en couche mince à des taches présentant respectivement les caractéristiques suivantes - une tache dans le premier système, colorable par le réactif ninhydrine/collidine, dans la région des Rf 0,26 - 0,28 ; - une tache dans le deuxième système, colorable par le réactif ninhydrine/collidine, dans la région des Rf 0,86 - 0,91 ; - un spectre d'absorption dans l'ultraviolet, tel que repré senté dans la fig. 12 ;; - elle est formée de constituants qui donnent lieu - lorsqu'une solution aqueuse de ces constituants est soumise à une filtration sur un gel de polyacrylamide du type de celui envisagé à la revendication 22 dans des conditions analogues, à un volume d'élution contenant 1-a majeure partie de l'activité compris entre environ 2,5 Vo et environ 4 Vo, et - lorsqu'une solution aqueuse de ces constituants est soumise à une filtration sur gel de polydextrane, du type de celui défini dans la revendication 1 dans des conditions analogues, à un volume d'élution V contenant la majeure partie de l'activité, compris entre environ 4 Vo et environ 5 Vo. 15 - Fraction selon l'une quelconque des revendications 3 à 14, caractérisée en ce que les poids moléculaires de ses constituants sont inférieurs à 2.000. 16 - Fraction selon l'une quelconque des revendications 3 à 14 caractérisée en ce que les poids moléculaires de ses constituants sont inférieurs à 500; 17 - Procédé d'obtention d'une fraction ayant le susdit ensemble de propriétés biologiques et dont les constituants ont des poids moléculaires inférieurs à 10.000, caractérisé en ce que, partant d'une matière première extraite sous forme de solution aqueuse à partir d'un tissu lymphoïde, notamment de rate, telle que la rate de boeuf, possédant elle-même le susdit ensemble de propriétés biologiques et contenant des constituants à poids moléculaires supérieurs à 10.000, on procède à une dilution dans l'eau de cette matière première jusqu'à un degré suffisant pour permettre le "détachement" des constituants à poids moléculaire inférieur à 10.000 de ceux qui possèdent un poids moléculaire plus élevé au sein de la solution aqueuse, et en ce que l'on effectue ensuite la séparation, de préférence par ultrafiltration ou diafiltration, d'une fraction contenant les constituants à poids moléculaires supérieurs à i0.000, fraction qui est écartée, et d'une fraction contenant les constituants actifs à poids moléculaires inférieurs à 10.000, cette fraction étant recueillie. 18 - Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la matière première est telle que, lorsqu'une solution aqueuse de cette matière première est soumise à une filtration sur un tamis moléculaire formé d'un gel de polydextrane réticulé, lequel, tel que celui commercialisé sous la marque "SEPHADEX G 75", est formé de billes de 40 à 120,i de diamètre et apte à permettre le fractionnement d'un mélange de constituants dont les poids moléculaires sont compris entre environ 5.000 et 50.000 elle donne lieu à la séparation de constituants actifs dans le volume d'élution V compris entre environ 1 et 1,5 Vo et, le cas échéant, dans le volume d'élution compris entre environ 4 et environ 4,7 - 5 Vo. 19 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 et 18, caractérisé en ce que la matière première est constituée par un extrait aqueux due poudre acétonique de tissu lym phode, notamment de rate, ou par l'extrait aqueux obtenu par mise en contact de cellules de tissu lymphoïde avec de l'eau distillée, la matière première étant alors constituée par la solution obtenue après élimination des cellules et, le cas échéant, après séparation du précipité formé par addition d'alcool à la solution aqueuse, jusqu'à obtenir une concentration de 72 - 75 %, et évaporation sous vide partiel de l'alcool. 20 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que la matière première donne lieu à des profils d'élution sur le gel de polydextrane, tel que défini dans la revendication 17, du type de ceux qui sont représentés dans les figures 1 à 3 21 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, caractérisé en ce que la susdite dilution est poussée jusqu'à obtenir une solution contenant au plus 10 UD0260/ml de matière, de préférence encore au plus 4 UD0260/ml, voire même 2 UD0260/ml, avant de procéder à la susdite séparation des cons- tituants à poids moléculaires élevés contenus dans la matière première et la fraction active contenant des constituants actifs de poids moléculaires inférieurs à 10.000. 22 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 21, caractérisé en ce que, partant d'une solution de matière première active ayant une concentration en substance supérieure à 10, avantageusement de l'ordre de 60 à 80 UD0260 par millilitre, on procède à une première séparation des substances à bas poids moléculaires, notamment inférieurs à 10.000, par une technique usuelle, telle que ultrafiltration ou diafiltration sur membrane ultrafiltrante, on élimine les fractions à bas poids moléculaires qui sont inactives et l'on recueille les fractions à hauts poids moléculaires, lesquelles peuvent éventuellement encore, si besoin, être "lavées" par un volume d'eau permettant la reconstitution dune muvelle solution aqueuse de ces constituants, mais à concentration toujours encore supérieure à 10 UD0260 par millilitre, de préférence 60 à 80 UD0260 par ml, en vue de permettre une séparation d'une quantité supplémentaire de consti tuants inactifs à bas poids moléculaires, l'obtention des constituants à bas poids moléculaires qui contiennent l'activité antimitotique et immunosuppressive, à partir de la fraction contenant les constituants à poids moléculaires élevés ainsi préalablement débarrassés d'une partie au moins des constituants inactifs à bas poids moléculaires qu'elle contenait auparavant, impliquant alors ensuite la dilution ou la remise en solution de cette dernière fraction, jusqu'à obtenir une concentration inférieure à 10, et de préférence même inférieure à 4 UD0260 par millilitre, avant de procéder enfin à une nouvelle séparation, par l'une des techniques déjà mentionnées ou analogues, des constituants à bas poids moléculaires, parmi lesquels ceux qui retiennent l'activité antimitotique et immunosuppressive, qui se seront alors détachés des constituants à poids moléculaires élevés. 23 - Procédé selon lune quelconque des revendications 17 à 2?, caractérisé en ce que la fraction active, obtenue au sein de la solution aqueuse diluée, qui est formée de constituants à bas poids moléculaires, fait l'objet d'une nouvelle filtration d'une solution aqueuse la contenant sur un gel de polyacrylamide en billes, dont les diamètres sont compris entre approximativement 37 et 74 microns, ce gel présentant une limite d'exclusion exprimée en daltons de 1.800, et étant approprié au fractionnement de mélanges de constituants dont les poids moléculaires sont compris dans l'intervalle 100-1.800 daltons, et que l'on recueille la fraction contenue dans le volume V d'élution compris entre environ 2,5 Vo et environ 4 Vo. 24 - Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que la fraction active recueillie est soumise à une ultrafiltration ou diafiltration à travers une membrane ultrafiltrante n'autorisant le passage que de constituants dont les poids moléculaires sont au plus égaux à 500, et que l'on recueille l'ultrafiltrat ou le diafiltrat qui contient des constituants actifs. 25 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 23 et 24, caractérisé en ce que l'on produit des fractionnements supplémentaires des fractions actives obtenues par chromatographie en couche mince, notamment sur cellulose, en mettant en jeu des systèmes de solvants tels que "BuOH, AcOH H20 (60/15/25)" ou l'eau, et en ce que l'on recueille les fractions actives qui se séparent les unes des autres du fait de ce fractionnement. 26 - Composition ayant les caractéristiques d'un médicament contenant à titre de principe actif une fraction conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 16 ou celle, telle qu'obtenue par la mise en oeuvre du procédé, de l'une quelconque des revendications 17 à 25, ou analogue.