FR 2381787 A1 19780922 FR 7705830 A 19770228 La présente invention concerne de nouvelles substances, no tangent les dérivés N,N,N-triméthylés des antibiotiques amphotères polyéniques, leur procédé de préparation et leurs applications Les nouveaux composés selon 1'invention exercent une action antifungique, ils peuvent etre utilisés en médecine pour le traitement des mycoses, Les composés selon l'invention n'ont pas été décrits dans la littérature. Les nouveaux composés selon l'invention, dérivés N,N,N-triméthylés des antibiotiques amphotères polyéniques, répondent à la formule générale suivante dans laquelle R représente une aglycone d'un antibiotique amphotère polyénique sans groupement carboxylique. Selon l'invention, les représentants les plus caractéristiques de ce groupe de composés sont la N. N. N-triméthvlamhothéncine B, de formule générale suivante et la N,N,N-triméthylnystatine, de la formule générale suivante : OH 6 D A 3 ao? "o o OH OR OH OH o GW Les composés mentionnés sont des sels internes avec la charge positive sur le groupement aminé quaternaire et la charge négative sur le groupement carboxylique. Ils se présentent sous la forme de poudres de couleur jaune, solubles dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et dans un mélange de diméthylformamide et d'acide acétique. Le spectre ultraviolet des composés indiqués coïncide avec celui des antibiotiques initiaux, ce qui confirme l'invariabilité du système des doubles liaisons conjuguées dans la molécule. L'indice d'absorption infrarouge spécifique de la N,N,N-triméthylamphothéricine purifiée indique la présence du groupement carboxylique com piétement ionisé dans la molécule. Par titrage potentiométrique on a démontré la présence du groupement ammonium quaternaire. Les dérivés N, N, N-triméthylés des antibiotiques amphotères polyéniques ont une activité antibiotique, ils suppriment le développement des levures, des micro-organismes levuriformes et des champignons filaires. Dans les essais d'activité des composés in vitro par la méthode de dilution en série en milieu liquide, ils exercent une action fongistatique sur la plupart des champignons pathogènes à des concentrations comprises entre 0,31 et 12,5 yg/ml. Les résultats des essais de l'activité des dérivés N,N,N-triméthylés de la nystatine et de l'amphothéricine B sont donnés dans le tableau I ci-dessous. TABLEAU I Micro-organismes N,N,N-triméthylampho- N, N, N-trimé- théricine B thylnystatine Candida albicans 0,39 6,25 Candida tropicalis 1,5 6,30 Cryptococcas neoformans 3,2 1,57 Epidermophyton Kauffman-Wolf 3,2 6,25 Trichophyton gypseum 3,2 12,5 Trichophyton rubrum 6,3 12,5 Penicillium granulatum 3,2 6,3 Fusarium solani 3,2 6,3 L'étude de la toxicité aiguë de la N,N,N-triméthylamphothéricine B et de N,N,N-triméthylnystatine a été réalisée dans des essais avec des souris blanches pesant de 18 à 20 g. On a mis & l'épreuve les complexes hydrosolubles des dérivés N,N,N-triméthyliques avec la polyvinylpyrrolidone contenant de 22 à 24 % de substance active. On a dissous les produits dans lteau distillée et on les a injectés dans la veine caudale des animaux. Les résultats des expériences examinés selon Krber ont témoigné de la proximité de différents lots de N,N,N-triméthylnystatine et de N,N,N-triméthylamphothéricine quant å leur toxicité. La DL50 de ces produits a oscillé entre 60,5 et 100 mg/kg, la moyenne étant de 80,2 + 7,0 mg/kg. Les dérivés N,N,N-triméthyliques de l'am- phothricine B et de la nystatine sont de 10 à 15 fois moins toxiques que les antibiotiques initiaux, dont la DL5o est de 7,0 etll,Omg/kg, respectivement, pour les complexes analogues avec la polyvinylpyrrolidone. A des doses inférieures à 5 mg/kg, la N,N,N-triméthylamphothéricine B ne provoque pas de montée de la température rectale chez les lapins de plus de 1 C. L'étude de l'activité chimiothérapique des dérivés N,N,N-triméthylés des antibiotiques amphotères polyéniques a été réalisée sur un modèle de candidose généralisée chez des souris blanches. On a préparé l'inoculum pour la contamination des animaux à partir de la culture de Candida albicans de 2 jours, qui a été ensuite injectée par voie intraveineuse à une dose de 10 à 12 millions de cellules par souris. On a utilisé pour les expériences des souris blanches sans race, des deux sexes, pesant de 18 à 20 g. Les dérivés N,N,N-triméthylés des antibiotiques amphotères polyéniques sous forme d'un complexe hydrosoluble avec la polyvinylpyrrolidone et contenant de 22 & 24 1 de substance active ont été dissous dans une solution à 5 ode glucose et injectés par voie intraveineuse 1 fois par jour. La survie des animaux des groupes différents, comparée & celle du groupe de souris contaminées, n'ayant pas reçu de traitement a servi de critère de l'efficacité des produits. Le schéma du traitement avec les dérivés de N,N,N-triméthy- lés de 1'amphothéricine B et de la nystatine consistait en deux traitements de 4 et 5 jours, avec un intervalle de 2 jours entre eux ou en un traitement continu de 7 jours. Tous les animaux témoins ont péri lors des expériences différentes entre le 9ème et 16ème jour. Vers ce moment dans les groupes de souris, traités selon le schéma 1 avec des doses de 10 et 20 mgZkg de N, N, N-triméthylamphothéricine B, 94 & 100 % d'animaux ont survecu. La dose minimale parmi les doses essayées, à savoir 1 mg/kg - a assuré la survie de 50 % de souris. Les résultats du traitement avec la N,N,Ntriméthylamphothê- ricine B de la candidose généralisée des souris, selon le schéma discontinu sont résumés dans le tableau 2. TABLEAU 2 Nombre de souris Dose Nombre de souris mortes dans le groupe (mg/kg) en 2 semaines en 3 semaines en 4 semai nes 16 20 1 1 1 16 10 0 2 2 16 5 5 6 7 16 1 8 9 9 16 sans trai- 14 16 -16 tement Un effet net du produit sur le développement de l'infection dans l'expérience selon le schéma continu de traitement a été déjà enregistrée après l'injection de 0,1 à 0,2 mg/kg de produit. Les résultats du traitement avec la N,N,N-triméthylamphothéricine B de la candidose généralisée des souris selon le schéma continu sont présentés dans le tableau 3. TABLEAU 3 Nombre de Dose Nombre de souris mortes souris dans (mg/kg) en 9 jours en 2 en 3 en 4 le groupe semaines semaines semaines 16 0,8 8 8 9 10 31 0,4 11 13 15 19 31 0,2 19 22 27 29 16 0,1 10 13 14 15 16 0,05 11 14 15 16 16 0,025 16 16 16 16 31 sans 31 31 31 31 traitement On a réalisé le traitement avec la N,N,N-triméthylnystatine également selon deux schémas. Dans le cas du traitement selon le schéma discontinu, vers le moment de la perte de tous les animaux du groupe de témoins, parmi les souris, qui ont reçu le produit, 25 å 87,5 % de souris ont survécu en fonction de la dose. Les résultats du traitement avec la N,N,N-triméthylnystatine de la candidose généralisée des souris, selon le schéma discontinu sont présentés dans le tableau 4. TABLEAU 4 Nombre de Nombre de souris mortes souris dans Dose en 2 semaines en 3 semaines en 4 semaines le groupe (mg/kg) 16 40 2 2 2 16 20 5 5 5 16 10 10 10 10 16 5 10 12 12 16 sans 14 16 16 traitement On a aussi obtenu des mêmes résultats après l'injection quo tidienne du produit pendant 7 jours. Les résultats du traitement avec la N, N,N-triméthylnystatine de la candidose généralisée des souris, selon le schéma continu, sont présentés dans le tableau 5. TABLEAU 5 Nombre de Dose Nombre de souris mortes souris dans (mg/kg) en 2 semaines en 3 semaines en 4 semaines le groupe 20 10 7 10 13 19 5 7 10 12 18 2,5 11 14 16 20 1,0 16 18 20 30 sans 28 30 30 traitement Les deux produits, lors du traitement avec des doses élevées, ont montré un résultat assez stable, vu que la survie des animaux surveillés pendant 4 semaines n'a pratiquement pas changé. Conformément à l'invention, le procédé de préparation des nouveaux composés indiqués, dérivés N,N,N-triméthylés des antibiotiques amphotères polyéniques de formule générale dans laquelle R est une aglycone de l'antibiotique amphotère polyénique sans groupement carboxylique, consiste en ce que l'on soumet l'antibiotique amphotère polyénique à une méthylation complète du groupe aminé à l'aide d'un agent de méthylation, choisi parmi les halogénures de méthyle, l'ester méthylique de l'acide sulfurique et les esters méthylique d'un sulfacide organique; on réalise le procédé dans un solvant organique avec isolement ultérieur du produit désiré. Il est préférable d'employer en qualité d'agent de méthylation l'iodure de méthyle ou le sulfate de diméthyle. Il est avantageux d'effectuer le procédé au sein de diméthylsulfoxyde ou de diméthylformamide. Afin de fixer l'acide dégagé lors de la méthylation on réalise le procédé en présence de bicarbonate de sodium pris dans un rapport pondéral par rapport à l'antibiotique initial de 0,5 à 2,5/1 respectivement. Il est avantageux de réaliser la méthylation à une température de 25 à 45 OC. Le procédé proposé est réalisé de manière suivante On dissout l'antibiotique amphotère polyénique dans un solvant organique. Les solvants préférables à cette fin sont le diméthylsulfoxyde ou le diméthylformamide, parce que 1' antibiotique polyénique se dissout bien dans ces solvants et, de plus, ces solvants contribuent à rendre plus complète la réaction de méthylation. Tout en agitant la solution obtenue, on y ajoute un agent de méthylation, choisi parmi les halogénures de méthyle, les esters méthyliques de l'acide sulfurique ou les esters méthyliques des sulfacides organiques, par exemple, l'iodure de méthyle, le sulfate de diméthyle, l'ester méthylique, l'acide paratoluène-sulfonique,etc... Lors de la.méthylation a lieu la substitution des protons du groupe aminé par des radicaux méthyliques, il se dégage alors l'acide correspondant. Pour fixer l'acide qui se dégage, il est utile de réaliser le procédé en présence de bicarbonate de sodium, que l'on introduit de préférence en une proportion pondérale par rapport à l'antibiotique initial de 0,5 A 2,5/1, respectivement. Le bicarbonate de sodium fixe l'acide dégagé et de ce fait les conditions d'équilibre de la réaction se déplacent vers la formation du produit désiré. La méthylation se termine par l'addition de trois radicaux méthyliques à l'azote du groupe aminé, et l'azote acquiert alors la charge positive. Ainsi, la combinaison obtenue représente un sel interne avec la charge positive sur l'atome quaternaire de l'azote et avec la charge négative sur le groupe carboxylique complètement ionise. I1 est avantageux, afin de réduire la formation de produits secondaires pendant la méthylation, de réaliser la méthylation en chauffant le mélange réactionnel jusqu'à une température comprise entre 25 et 45 C. On isole le produit désiré obtenu en le faisant précipiter par l'eau avec centrifugation subséquente suivie du lavage à l'eau et du séchage. Le rendement en produit désiré est de 70 à 90 % en poids du rendement théorique. Les exemples suivants illustrent l'invention de réalisation du procédé d'obtention des dérivés N,N,N-triméthylés des antibiotiques amphotères polyéniques. EXEMPLE 1 Dans un ballon doté d'un agitateur on charge 1,5 g d'ampho- théricine B à extinction E1 cm 1% = 1 500 à une longueur d'onde de 382 nm. Ensuite, on y verse 40 nil de diméthylsulfoxyde et on agite jusqu'à la solution complète de l'amphothéricine B. On ajoute 0,7 g de bicarbonate de sodium à la solution obtenue et on y verse une solution contenant 1 g d'iodure de méthyle dans 10 g de diméthylsulfoxyde. On agite le mélange réactionnel contenu en ballon et on le maintient & une température comprise entre 40 et 45 0C pendant 1,5 - 2 heures. Ensuite, on refroidit le ballon et on fait précipiter son contenu par l'eau. On sépare le précipité dans une centrifugeuse, on le lave & l'eau, ensuite à l'acétone et on le sèche dans un séchoir-armoire & vide. On obtient 1,2 g de produit avec une teneur en N > N,N-triméthyîampho- théricine B de 70 %. Le spectre ultraviolet du produit purifié : L'absorption maximum aux longueurs d'ondes de 273 + 2 nm; 283 - 2 nm; 345 4 2 nm; 363 + 2 nm; 382 4 2 nm; 406 + 2 nm; L'extinction & une longueur d'onde de 382 nm est de 1 500. Le spectre infrarouge : 1720cm-1; 1590 (extrêmement fort); 1420cm -1 ; 1190cm -1 ; 1080cm -1 ; 1020cm -1 ; Le titrage potentiométrique d'un gramme de produit purifié: 0,1 N KOH - 0,52 nil; 0,1 N HC1 - 10,1 ml; Le coefficient de distribution dans le système méthanol chloroforme - tampon borate avec pH 8,27, pris dans une proportion de 2/2/1, est de 0,82. EXEMPLE 2 Dans un ballon doté d'un agitateur on charge 5 g de. nystatine à extinction E1% = 850 à une longueur d'onde de 304 nm. On y 1 cm verse encore 40 ml de diméthylsulfoxyde et on agite jusqutà la solution complète de l'antibiotique. A la solution obtenue on ajoute 13 g de bicarbonate de sodium et on y verse une solution contenant 6 g de sulfate de méthyle dans 10 ml de diméthylsulfoxyde. On agite le mélange réactionnel pendant 1,5 heures à une température de 30 OC, ensuite on refroidit le ballon et l'on fait précipiter le contenu du ballon par l'eau. On sépare le précipité dans une centrifugeuse, on le lave à l'eau, ensuite à l'acétone, et on le sèche dans un séchoir-armoire à vide. On obtient 3,7 g de produit avec une teneur en N,N,N-triméthylnystatine de 68 %. Le spectre ultraviolet du produit purifie L'absorption maximum aux longueurs d'ondes de 292 :t 2 nm; 304 - 2 nm; 318 t 2 nm; L'extinction à une longueur d'onde de 304 nm est de 800. Le titrage potentiométrique d'un gramme de produit purifié 0,1 N KOH - 0,75 ml; 0,1 N HCl - 9,86 ml; Le coefficient de distribution dans le système méthanol-chloroforme-tampon borate avec pH = 8,27, pris dans une proportion de 2/2/1, est de 1,25. EXEMPLE 3 Dans un ballon doté d'un agitateur on charge 5 g de mycohep tine à extinction Ex% = 1200 à une longueur d'onde de 384 nm. On 1 cm y verse encore 80 ml de diméthylsulfoxyde et on agite jusqu'à la solution complète de l'antibiotique. A la solution obtenue on ajoute 3,0 g de bicarbonate de sodium et on y verse une solution contenant 3,5 g d'ester méthylique de l'acide paratoluène-sulfonique dans 20 ml de diméthylsulfoxyde. On agite le mélange réactionnel pendant 1,5 heure & une température de 35 OC, ensuite on le refroidit et on isole le produit conformément à la description de l'exemple 1. On obtient 4,2 g de produit avec une teneur en N,N,N-triméthylmycoheptine de 56 %. Le spectre ultraviolet du produit purifié L'absorption maximum aux longueurs d'ondes de 345 - 2 nm; 363 - 2 nm; 382 - 2 nm; 406 - 2 nom; L'extinction à une longueur d'onde 382 est de 800. Le tirage potentiométrique d'un gramme de produit purifié O,IN109 - 0,6 ml; O,INMC1 - 10,8 ml; Le coefficient de distribution est de 1,1 dans le système indiqué pour l'exemple 1. EXEMPLE 4 On répète le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, excepté que l'on dissout 5 g d'amphothéricine B dans 80 ml de diméthylformamide, on ajoute 2,8 g de bicarbonate de sodium et on y verse une solution de 4,4 g d'iodure de méthyle dans 20 ml de diméthylformamide. On obtient 4,3 g de produit avec une teneur en N, N, N-trimé- thylamphothéricine B de 65 %. La caractéristique du produit purifié correspond à celle décrite dans l'exemple 1. EXEMPLE 5 On répète le mode opératoire décrit dans l'exemple 2, excepté que l'on remplace 6 g'de sulfate de méthyle par 5 g d'iodure de méthyle. On obtient 4,5 g de produit avec une teneur en N,N,N-triméthylnystatine de 38 %. La caractéristique du produit purifié correspond à celle décrite dans l'exemple 2. EXEMPLE 6 On répète le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, excepté que l'on dissout 5 g d'amphothéricine B dans 80 ml de diméthylsulfooxyde, on ajoute 3 g de bicarbonate de sodium et on y verse une solution de 5 g d'ioduré de méthyle dans 20 ml de diméthylsulfoxyde. On agite le mélange réactionnel à la température ambiante pendant 2,5 heures. On obtient 4,6 g de produit avec une teneur en N,N,N-triméthylamphothéricine B de 35 . La caractéristique du produit purifié correspond à celle décrite dans l'exemple 1. REVENDICATIONS 1 - Dérivés N,N,N-triméthylés antibiotiques amphotères polyéniques de formule générale dans laquelle R représente une aglycone d'un antibiotique amphotère polyénique sans groupement carboxylique. 2 - N,N,N-trimAthylamphothericine B selon la revendication 1 de la formule générale 3 - N,N,N-trinéthylnystatine selon la revendication 1, de formule générale 4 - N,N.N-triméthylmycoheptine selon la revendication 1 de formule générale 5 - Procédé de préparation des dérivés N,N,N-triméthylés des antibiotiques amphotères polyéniques selon la revendication 1, ca ractérisé en ce que lton soumet l'antibiotique amphotère polyénique à une méthylation complète du groupe aminé à l'aide d'un agent de méthylation, choisi parmi les halogénures de méthyle, lester méthylique de l'acide sulfurique et les esters méthyliques de sulfacide organique} le procédé étant effectué dans un solvant organique, avec séparation ultérieure du produit désiré. 6.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on utilise l'iodure de méthyle ou le sulfate de méthyle en qualité d'agent de méthylation. 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 5, 6, caractérisé en ce que l'on utilise le diméthylsulfoxyde ou le diméthylformamide en qualité de solvant organique. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que pour fixer l'acide, qui se dégage pendant la méthylation, on réalise le procédé en présence de bicarbonate de sodium. 9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on utilise le bicarbonate de sodium en une proportion pondérale par rapport à lantibiotique initial de 0,5 à 2,5/1 respectivement. 10 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce que l'on réalise la méthylation à une température comprise entre 25 et 450C. 11 - Composition thérapeutique ayant une activité antibiotique et fungistatique, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.