FR 2380299 A1 19780908 FR 7703610 A 19770209 La présente invention concerne un nouveau produit doté d'une activité hypoglycémiante, son application en tant que médicament, ainsi que son procédé de préparation. Conformément à la présente invention, ledit produit est obtenu par extraction solide-liquide à partir de racines de grenadier, dit Punica granatum. Selon une autre caractéristique de la présente invention, ledit produit est extrait à partir d'une poudre de racines de la variété de grenadier nain à fleurs blanches, dit Punica granatum, variété Albescens. Selon une autre caractéristique de la présente invention, ledit produit est extrait à partir d'une poudre de racines décortiquées de la variété ordinaire de grenadier, dit Punica granatum à fleurs rouges. I1 a également été constaté que les propriétés hypoglycémiantes dudit produit objet de l'invention étaient l'apanage de glucosides de l'acide gallique et de glucosides de l'acide ellagique, et notamment du penta-O-galloyl-bEta-glucose. , Selon une autre caractéristique de la présente invention, le penta-O-galloyl-bêta-glucose peut etre préparé en faisant réagir un dérivé de l'acide gallique avec l'anomère bêta du D-glucose en ayant préalablement protégé les trois fonctions hydroxylées du dérivé de l'acide gallique, puis en libérant à nouveau lesdites fonctions hydroxylées après achèvement de la réaction. D'autres caractéristiques de la présente invention apparateront à la lecture de la description détaillée faite ci-après. La demanderesse a donc découvert que les racines de Punica granatum contenaient un produit à activité hypoglycémiante, susceptible d'être obtenu par extraction solide-liquide à partir d'une poudre de racines de la variété de grenadier nain àfleurs blanches, dit Punica granatum,variété Albescens. Les racines de cette variété de grenadier ont une éccrce très fine et ne contiennent pas d'alcaloîdes du groupe de la pelletiérine ou d'alcaloides apparentés à ceux que l'on trouve dans l'écorce des racines de Punica granatum variété ordinaire à fleurs rouges. Il a donc été possible de réduire directement en poudre les racines entières de Punica granatum variété albescens en vue de procéder à l'extraction au moyen d'un solvant approprié, par exemple au moyen d'eau chaude. Dans pareil cas, 11 extrait aqueux injecté par voie intra-veineuse chez le lapin a permis de mettre en évidence une activité hypoglycémiante manifeste. La demanderesse a par ailleurs constaté que, si l'on décortiquait les racines de grenadier ordinaire à fleurs rouges, en vue d'éliminer la partie contenant les alcaloides, et si l'on broyait les racines décortiquées, on pouvait également obtenir des extraits dotés d'un haut pouvoir hypoglycémiant. Les racines décortiquées et broyées peuvent être extraites par divers solvants appropriés habituellement utilisés pour l'obtention extraits végétaux, tels que les alcools aliphatiques inférieurs ; dans la pratique, le mélange solvant constitué par une partie d'acide chlorhydrique 0,1 N et de trois parties d'acétone s'est avéré pleinement satisfaisant. On indiquera ci-après un exemple particulier,-non limitatif, d'extraction solide-liquide du produit actif selon l'invention, à partir de racines décortiquées de la variété ordinaire de grenadier dite Punica granatum à fleurs rouges. 100 g de racines décortiquées et broyées de grenadier ordinaire à fleurs rouges sont extraits au moyen du mélange acide chlorhydrique 0,1 N-acétone (1-3). On fait un premier extrait avec 400 ml de ce mélange solvant, puis trois extractions avec 250 ml de ce meme mélange. Les extraits acétoniques sont mélangés entre eux et filtrés sur verre fritté nO 3. Le filtrat liquide est alors additionné d'ammoniaque pour amener le pH à une valeur voisine de 8. Il se forme ainsi un précipité qui est recueilli puis séché.Il est alors possible de titrer l'activité biologique de ce précipité de la manière suivante Une partie du précipité correspondant à 150 mg de poudre de racines (par souris) est émulsionnée dans-l'eau avec par exemple de la gomme arabique, puis injectée par voie intrapéritonéale à des souris Swiss mâles ou femelles de 20 à 25 g. Après 16 heures on recueille du sang par voie rétro-orbitale et le glucose y est dosé par la méthode à la glucose oxydase peroxydase. On constate alors une chute de la glycémie de l'ordre de 50 A. Ce même extrait, lorsqu'il est administré à la souris par voie orale, par exemple en suspension dans une émulsion d'huile d'olive-eau (1-1), provoque une hypoglycémie de longue durée. Il a été constaté que l'importance de la chute de la glycémie variait dans le même sens que les doses d'extrait ingérées. Au cours des expériences effectuées, on a mis en suspension diverses quantités de l'extrait dans 7 ml d'un mélange d'huile d'olive-eau (1-1). On a alors administré 0,2 mi de cette suspension par tubage duodénal à une souris de 20 g. Les résultats observés lors de cette expérience ont été consignés dans le tableau figurant ci-après. TABLEAU Quantité d'extrait Dose Chute de la glycémie en présent dans 3 ml de adminis suspension tree en 20 h en 24 h 225 mg 0,2 ml 68 % 54 % 112 mg 0,2 ml 62 % 56 mg 0,2 ml 2-3 %4 28 mg 0,2 ml 16 % Par chromatographie bidimensionnelle sur cellulose ou sur silice erck en employant divers systèmes d'éluants et de réactifs révélateurs, il s'est avéré que l'activité hypoglycémiante du produit selon l'invention était principalement l'apanage de glucosides de l'acide gallique et de glucosides de l'acide ellagique, notamment de pentaglucosides galliques, tels que le penta-G-galloyl-bêta-glucose. La présente invention fournit également un procédé pour la préparation du penta-O-galloyl-bêta-glucose, qui se caractérise par le fait que l'on fait réagir un dérivé de l'acide gallique avec l'anomère bêta du D-glucose en ayant préalablement protégé les trois fonctions hydroxylées du dérivé de l'acide gallique puis en libérant à nouveau, après achèvement de la réaction, lesdites fonctions hydroxylées. Le penta-0-galloyl-bta-glucose a été en particulier synthétisé par réaction du chlorure de tri-0-benzylgalloyle et du bêta-glucose, suivie d'une hydrogénolyse, selon le schéma réacticnnel en cinq étapes suivant : SCHEMA REACTIONNEL DE LA PREPARATION DU PENTA-O-GALLOYL-BETA-GLUCOSE COOCH3 COOCH3 COOH COOCl #-CH2Cl KOH SOCl2 # # # # # # # MeOH HO HO OBz OBz OBz OBz OBz OBz OH OBz OBz OBz # &alpha;;-D-glucose O O R'-C-O-C-H R-C-O-C-H O O H-C-O-C-R' H-C-O-C-R O O H2 R'-C-O-C-H # R-C-O-C-H O # O Pd/C H-C-O-C-R' H-C-O-C-R H-C-O H-C-O CH2O-C-R' CH2O-C-R O OBz OH O OBz OH Bz = -CH2-# R = -#-OBz R' = -#-OH OBz OH Exemple de mise en oeuvre particulière du procédé de préparation de penta-O-galloyl-bêta-glucose. 1. -PréParation du tri-0-benzvIallate de méthyle. Cette étapepréalable a pour but de protéger les trois fonctions hydroxylées. Le gallate de méthyl (40g) est ajouté à 1000C sur un mélange de carbonate de potassium (107g), d'iodure de potassium (26,7g) et d'acétophénone (320 ml). On porte le mélange réactionnel obtenu à une température environ comprise entre 1400 et 1500C et on y ajoute en une heure du chlorure de benzyle (117 ml), sous atmosphère de dioxyde de carbone, puis on agite encore le mélange pendant 4 heures à cette même température. On effectue un entratnement à la vapeur, et,après refroidissement, on isole le produit solide restant (107 g). On purifie par chromatographie sur alumine (50 x 5 cm), avec du benzène comme éluant, puis par deux recristallisations sucessives dans l'acétate d'éthyle-hexane. On obtient 80 g (81 %) de produit cristallisé blanc, P.F. : 950C. 2. Préparation de l'acide tri-O-benzylgallique. On porte au reflux un mélange de tri-O-benzylgallate de méthyle (72g) et de méthanol (575 ml). On ajoute en une heure une solution de potasse à 20% (66 ml). On laisse encore pendant une heure au reflux, on refroidit, on acidifie avec une solution d'acide chlorhydrique 4 N (100 ml), on essore le précipité et on lave à lteau. On obtient 66 g (95 f) de produit cristallisé blanc, P.F.: 192-193 C. 3. Préparation du chlorure de tri-0-benzvlgalloyle. On porte à reflux pendant une heure un mélange d'acide tri-0-benzylgallique (63 g), de chlorure de thionyle (315 ml) et de benzène (315 ml). On refroidit puis l'on concentre à sec. On recristallise le produit brut (78 g) dans l'acétate d'éthyle- hexane On obtient ainsi, en deux jets, 60 g (91,5 %) de produit cristallisé blanc, P.F.: 113-114 C. 4. Préparation du penta-O-(tri-O-benzylgalloyl)-bêta-glucose. On agite pendant 30 heures, jusqu'à mise en solution totale, un mélange de chlorure de tri-0-benzylgalloyl (38,4 g), de glucose (2,5 g), de pyridine (15 ml) et de chloroforme (100 ml). On porte à 610C et l'on laisse sous agitation pendant 20 jours. On refroidit et l'on dilue avec du chloroforme (250 ml). On lave ensuite à l'eau, à l'acide sulfurique à 10 % et au bicarbonate de sodium à 10 f. On sèche la phase organique (MgS04) on filtre et lton concentre le filtrat à sec à 200C. On reprend alors le résidu pâteux dans le benzène (500 ml) et on élimine l'insoluble. On concentre à 200C pour réduire le volume à 50 ml et l'on élimine l'insoluble (P. F. = 160 C).On concentre alors le filtrat à sec et l'on reprend le résidu huileux (37 g) dans 10C ml de benzène On passe sur une colonne d'alumine (30 x 5 cm) préalablement lavée avec l'acétate d'éthyle et l'on élue avec du benzène (2 l). En concentrant l'éluat à sec, on obtient 16,3 g (51 %) de produit cristallisé jaune clair, P.F.: 50 à 600C. 5. Préparation du penta-0-gallql-bêta-Rlucose. Cette étape a pour but de libérer à nouveau les trois fonctions hydroxylées. On hydrogène le penta-O-(tri-O-benzylgalloyl)-bêta-glucose (15 gj dans du tétrahydrofuranne sec (120 ml) en présence de palladium sur charbon (1,5 g) préalablement lavé à l'eau jusqu'à pH neutre des eaux de rinçage. La réduction dure 4 heures à température et à pression ambiantes. On filtre le catalyseur sur de la poudre de cellulose, on rince avec de l'éthanol préalablement désoxygéné. On concentre alors le filtrat à sec, puis on reprend le résidu dans l'acétone et l'on concentre à sec à 250C. En répétant trois fois cette opération, on obtient 7 g (100 %) de produit cristallisé crème ayant pour caractéristiques: P.F.: environ 12O0C (irrégulier) Indice de saponification : démontre 10 OH phénoliques et 5 esters. Pouvoir rotatoire : de 17 à 18 en solution à 2 % dans l'acétone Spectre I.R. voir figure annexée. Remarque En ce qui concerne le spectre I.R., il convient de remarquer que le spectre obtenu à partir du penta-O-galloyl-bêta- glucose préparé par voie synthétique commue indiqué ci-dessus est identique au spectre du penta-galloyl-glucose obtenu par méthanolyse du tanin hydrolysable suivie d t une chromatographie sur colonne de cellulose et de lapurification du produit extrait obtenu L'activité hypoglycémiante de ce glucoside préparé comme indiqué ci-dessus a été mise en vidence lors de l'injection intra-péritonéale à la dose de 5r mg/kg de souris. On a ainsi obtenu une chute de 40 , de la glycémie, chute qui dure environ 48 heures. Compte te de leurs activités hypoglycémiantes de longue durée, le produit selon l'invention obtenu par extraction solide-liquide à partir de Punica granatum, et les glucosides de l'acide aulique et de 1'acide ellagique notamment le penta O-galloyl-bêta-glucose, sont susceptibles d'être utilisés en médecine humaine ou vétérinaire, en particulier dans le traitement du diabète. Les -compositions pharnaceutiques contenant, à titre de principe actif, le produit selon l'invention et/ou des glucosides de l'acide gallique et de l'acide ellagique, en articuler le penta-0-galloyl-bêta-glucose, peuvent se présenter sous une forme convenant à une administration par voie orale ou par voie parentérale. Il a par ailleurs été vérifié que la quantité nécessaire pour obtenir l'activité anti-diabétique, à savoir la chute de la glycémie, correspondait bien à une posologie parfaitement supportée par l'animal. REVENDICATIONS 1.- Les glucosides de l'acide gallique et de l'acide ellagique. 2.- Le penta-0-galloyl-bêta-glucose selon la revendication 1. 3.- Procédé de préparation de penta-0-galloyl-bêta-gluco se caractérisé par le fait que l'on fait reagir un dérivé de l'acide gallique avec l'anomère bêta du D-glucose en ayant préalablement protégé les trois fonctions hydroxylées du dérivé de l'acide gallique puis en libérant à nouveau, après achèvement de la réaction, lesdites fonctions hydroxylées. 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'on protège les fonctions hydroxylées de l'acide gallique en formant 1' acide tri-0-benzylgallique. 5.- Procédé selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé par le fait que le dérivé de l'acide gallique est le chlorure d'acide. 6.- A titre de médicaments nouveaux, les composés selon l'une des revendications 1 et 2. 7.- Composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle comprend, à titre de principe actif, au moins un des composés selon l'une des revendications 1 et 2. 8.- Application des composés selon l'une des revendications 1 et 2 en tant qu'agents hypoglycémiants.