FR 2370972 A1 19780609 FR 7733598 A 19771108 la présente invention concerne un procédé immunologique de dosage en vue d'une détermination quantitative de substances immunologiquement actives dans des liquides physiologiques ou dans des extraits de cellules et de tissus. les tests iinmunologiques sont fondés sur une réaction entre un antigène et un anticorps. Toutefois, les méthodes immunologiques de dosage élaborées jusqu'alors ont pour inconvénient soit de présenter, dans le cas d'un test d'exécution simple (test d'agglutination ou test de précipitation), une sensibilité relativement faible et de ne fournir que des résultats qualitatifs ou semi-quantitatifs, soit d'être très coûteuses (test d'immunofluorescence, test radioimmunologique, test enzymiinmu- nologique). Conformément à l'invention, on a maintenant découvert un procédé ou test immunologique qui, tout en étant d'une mise en oeuvre simple et rapide, présente une très grande sensibilité (ordre de grandeur : ng/ml) et fournit des résultats quantitatifs. l'invention concerne plus précisément un procédé de dosage quantitatif d'une substance immunologiquement active dans un échantillon d'analyse, procédé caractérisé par le fait qu'on mesure par photométrie, eu égard à l'augmentation de l'extinc- tion, la cinétique de la réaction immunologique, rendue mesurable au moyen de particules d'un support polymère sensibilisé, entre la substance immunologiquement active et un partenaire de réaction immunologique et que l'on détermine, à partir de la cinétique de cette réaction immunologique, la concentration de la substance immunologiquement active qu'il s'agit de doser. En tant que "substances immunologiquement actives", on peut mentionner tous ceux des constituants de liquides physiologiques ou d'extraits de cellules ou de tissus pour lesquels un partenaire de réaction immunologique est présent ou peut être formé. Ces constituants peuvent être notamment des amines primaires, des amino-acides, des peptides, des protéines, des lipoprotéines, des glucoprotéines, des stérols, des stéroïdes, des lipoides, des acides nucléiques, des enzymes, des hormones, des vitamines, des polysaccharides et des alcaloides. Des substances immunologiquement actives préférées ou leurs partenaires de réaction immunologique sont classés dans le tableau suivant. Tableau I I. Antigènes obtenus à Partir de microorganismes. Bactéries 1. Coccus Gram-positif s. - streptocoques (S. psogene, S. fecalis et S. viri dans) - staphylocoques (S. aureus et S. albus) - pneumocoques (D. pneumoniae) 2. Coccus Gram-négatifs. - Neisseria (N. gonorrhoeae et N. meningitidis) 3. Bacilles Gram-positifs aérobies - Bacillus anthracis - Oorynebacterium diPhtheriae - Erysipelothrix - Listeria monocytogenes 4. Bacilles Gram-positifs anaérobies. - clostridies (C. botulinum, C. perfringens, C. welchii et C. tetani) 5. Bacilles Gram-négatifs anaérobies. - Bacteroides 6. Bacilles Gram-négatifs intestinaux. - Escherichia - Les viella - Enterobacter - Proteus - Pseudomonas - Salmonella - Shigella 7. Bacilles Gram-négatifs non intestinaux. - Pasteurella (P. pestis et o. tularensis) - Hemophilus influenzae - Brucella (B. malitensis, B. abortus et B. suis) - Bordetella Pertussis - Malleomyces 8. Spirochètes. - Treponema pallidum - leptospira - Borrelia 9. Mycoplasmes. 10. Mycobactéries. 11. Vibrions 12. Âctinomyces. Protozoaires 1. Protozoaires intestinaux. Amibes 2. Flagellés. - Trichomonas - Leishmania - Trypanozomes - oxoplasma (g. gondii) 3. Sporozoaires. - Plasmodia (P. vivax, falciparum, malariae et ovale) Champignons 1. Sporotrichum 2. Oryptococcus 3. Blastomyces 4. Histoplasma 5. Coccidioides 6. Candida Virus et rickettsies 1. Rickettsies 2* Virus - hépatite du chien - shope papilloma - influenza A et B - pest avière - herpès simplex - adénovirus - polyoma - Sarcome de Rous - vaccine - virus de la poliomyélite rougeole - maladie des chiens (maladie de Carré) - leucémie - oreillons - maladie de Newcastle - sendai - virus ECHO - fièvre aphteuse - psittacose - rage - ectromélie - virus Ârbor II. Antigènes étrangers polysaccharides hyaluronidase toxine du tétanos ovalbumine sérum-albumine du mouton gamma-globulines du plasma humain sérum-albumine humaine III. Antigènes naturels 1. Hormones insuline glucagon hormones de la thyroïde gonadotrophine chorionique hormone chorionique de-croissancs - prolactine 2. Enzymes chymotrypsinogène du pancréas procarboxypeptidase désoxyrîbonucléase ribonucléase catalase créatine-kinase 3. Antigènes spécifiques d'organes rein foie peau coeur (myoglobine) tractus gastro-intestinal prostate antigènes de l'embryon (par exemple, CRIA, antigène carcino-embryonnaire) antigènes de tumeurs 4. Composants de tissus conjonctifs muscles collagène amyloïde 5.Antigènes de cellules sanguines, subtances des groupes sanguins et autres iso-antigènes. plaquettes mégacaryocytes leucocytes érythrocyte 9 substances des groupes sanguins antigène Forrsman antigènes d'histocompatibilité 6. Protéines du plasma fibrine et fibrinoide plasminogène et plasmine 7. Globulines pathologiques myélomes, protéines macroglobulinémiques et dysglobuli némiques facteur rhumatoïde protéine susceptible c'une réaction C IV.Anticorps naturels 1. Gamma-globuline naturelle anticorps naturels - anticorps néphrotoxiques complément 2. Auto-anticorps facteur antinucléaire auto-anticorps de la thyroïde auto-anticorps des surrénales auto-anticorps pour des cellules gastro-pariétales dans 1' anémie pernicieuse auto-anticorps pour les spermatozoïdes auto-anticorps du muscle dans la myasthénie grave auto-anticorps pour le tissu nerveux auto-anticorps contre les tissus fibreux et les compo sants vasculaires auto-anticorps contre les plaquettes et les mégacaryo- cytes anticorps contre les trophoblastes 3. AnticorEs induits contre immunoglobulines des classes IgG, IgM et IgÀ ou des espèces différentes. V. Composés haPténiques alcaloide de l'opium (morphine) antipyrine acide barbiturique Des substances immunologiquement actives particulièrement préférées sont la, gonadotrophine chorionique humaine, le facteur rhumatoïde, les Toxoplasma, Candida et Trypanosoma, l'antigène CEA (antigène carcino-embryonnaire) et la myoglobine. l'expression "particules de support polymère sensibilisées" comprend des particules de support polymère immunologiquement inerte et qui sont recouvertes de la substance immunologiquement active à doser ou de son partenaire de réaction immunologique. les supports polymères immunologiquement inertes sont constitués par un produit polymère finement divisé et insoluble dans l'eau (d'une masse spécifique correspondant à peu près à celle de l'eau) qui est immunologiquement inactif et auquel on peut fixer, physiquement et/ou chimiquement, la substance immunologiquement active ou son partenaire de réaction immunologique (antigène ou anticorps). Pour la mise en oeuvre de la présente invention, on préfère particulièrement des particules de support d'une taille comprise entre environ O,o5Fz et 0,9 Des particules support particulièrement appropriées sont des suspensions de latex, par exemple de résines de polystyrène d'une taille de particules comprise entre 0,05 et de résines polyméthacryliques d'une taille de particules comprise entre 0,07 et 0,9 , de polystyrènes, de copolymères de butadiène et styrène, de copolymères carboxylés de styrène et butadiène, de polystyrènes carboxylés porteurs ou non de groupes amino, de polymères de 1' acide acrylique, de polymères de l'acide méthacrylique, de copolymères d'acrylonitrile de butadiène et de styrol, de polyacrylates d'acétate de vinyle, de polyvinylpyridines, de polyacrylate de chlorure de vinyle, etc., en particules de taille comprise entre 0,05/u et O,9/u. En général, infixe 0,1 à 15,0 % en poids d'antigène ou d'anticorps au support immunologiquement inerte. Toutefois, chacun des différents produits immunologiquement actifs est com biné avec le support dans la proportion qui convient le mieux aux exigences spécifiques. Dans le procédé suivant l'invention, les particules du support polymère sensibilisé servent d'indicateur de- la réaction immunologique. On a notamment constaté qu'après le mélange de particules de support polymère, convenablement sensibilisées, avec l'échantillon d'analyse, de très faibles quantités de substance immunologiquement active provoquent une augmentation de l'extinction qu'on peut déterminer par photométrie et dont on peut déduire la concentration en substance immunologiquement active dans l'échantillon d'analyse. Les particules de support polymère sensibilisées peuvent être présentes en différentes quantités dans le mélange de réaction. Toutefois, on choisit avantageusement la concentration du support de manière à ce que l'on puisse mesurer exactement, par photométrie, l'augmentation d'extinction au cours de la réactison immunologique. Si l'on utilise des particules de latex, la concentration du support dans le mélange de réaction est de préférence comprise entre 0,06 et 0,9 mg/sl cependant qu'une concentration de 0,3 à 0,5 mg/ml est particulièrement appropriée. Pour le maintien d'un pH optimal pouvant ere compris entre 5 et 10 et, de préférence, entre 7 et 8,5, on effectue la réaction immunologique dans un système tampon approprié. Des tampons préférés sont par exemple des tampons au phosphate, des tampons au tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane, des tampons à la triéthanolamine, des tampons au borate ou des tampons au glycocolle. On effectue de préférence la réaction immunologique à une temperature comprise entre zéro et 400C. Une température comprise entre 250 et 370C est particulièrement avantageuse. De plus, on peut prendre des mesures pour la stabilisation des particules de support sensibilisé et pour l'exclusion de réactions non spécifiques. Conformément à l'invention, on peut effectuer le dosage de la substance immunologiquement active soit de manière directe, soit de manière indirecte (test d'inhibition). Pour le dosage, par le procédé direct, d'une substance immunologiquement active, on mélange l'échantillon à analyser et les particules de support sensibilisées par le partenaire de réaction immunologique correspondant et l'on détermine la cinétique de la réaction immunologique en mesurant de manière appropriée l'augmentation d'extinction du mélange de réaction. Dans le cas du dosage, par le procédé indirect (test dtinhibition), d'une substance immunologiquement active, on mélange 11 échantillon à analyser avec une guantité déterminée du partenaire de réaction immunologique correspondant et l'on ajoute ensuite à ce mélange des particules- de support qui sont sensibili- sées par la substance immunologiquement active. On détermine la cinétique de la réaction immunologique d'après l'augmentation d'extinction du mélange de réaction. Dans le procédé de dosage suivant l'invention, la réaction immunologique se manifeste par une augmentation d'extinction qui peut être mesurée par photométrie. A partir de cette augmentation d'extinction, on calcule la concentration, dans l'échantillon d'analyse, de la substance immunologiquement active qu'il s'agit de doser. Pour la détermination de la cinétique de réaction immunologique, on peut, dans le procédé de dosage suivant l'invention, mesurer l'augmentation initiale de l'extinction, de préférence pendant 30 secondes à 5 minutes et, plus particulièrement, pendant les une ou deux premières minutes. En dedans de cette période, on doit choisis au moins deux points de mesure. Dans le procédé de dosage direct, l'augmentation d'extinction par unité de temps au début de la réaction immunologique est directement proportionnelle à la concentration en substance immunologiquement active dans l'échantillon d'analyse. Dans le cas du procédé indirect (test d'inhibition), la vitesse de la réaction immunologique diminue à mesure qu'on augmente la concentration en substance immunologiquement active dans l'é- chantillon d'analyse et l'augmentation de l'extinction par unité de temps (mesurée pendant la phase initiale de la réaction immunologique) est inversement proportionnelle à la concentration en substance immunologiquement active dans Béchantillon d'analyse. Dans un procédé automatique, on peut suivre de manière continue l'augmentation d'extinction et, par conséquent, le déroulement de la réaction et calculer, par exemple au moyen d'un ordinateur, la concentration en substance immunologiquement active. Les mesures de l'extinction peuvent être effectuées dans un intervalle de longueurs d'onde de 400 à 1000 nm. Toutefois, de préférence, on effectue les mesures à une radiation de grande longueur d'onde, comprise par exemple entre 500 et 750 nm. Le procédé de dosage suivant l'invention est de préférence mis en oeuvre dans des cellules optiques et l'augmentation d'extinction peut être déterminée par exemple au moyen d'un colorimètre, d'un spectrophotomètre, d'un néphélomètre ou autre instrument analogue. le test immunologique peut être effectué manuellement ou dans un analyseur automatique. Tout instrument permettant d'enregistrer la cinétique de la réaction immunologique convient à la mise en oeuvre de l'invention. Comme échantillon à analyser, on peut utiliser des liquides organiques tels que du plasma, du sérum, de la lymphe, de l'urine, de la salive ou des extraits de cellules et de tissus. On peut recourir au procédé de dosage cinético-photométrique suivant l'invention - pour le contrôle de qualité des particules de support sensibilisées, - pour ltélaboration rapide de conditions de réaction optimales des systèmes de test immunologique, - pour le réglage quantitatif d'anti-sérums pour le test de dosage immunologique indirect, - pour le dosage quantiatif de substances immunologiquement actives dans des liquides physiologiques ou dans des extraits de cellules et de tissus, auquel cas, au lieu du titrage antérieur de l'échantillon d'analyse, on effectue le dosage avec une seule charge d'essai et on obtient en outre des résultats quantitatifs, - pour le dosage de substances immunologiquement actives qui sont présentes dans les échantillons d'analyse en une concentration si faible qu'elles ne peuvent être dosées par les tests d'agglutination classiques, - pour le dosage de substances immunologiquement actives au moyen d'analyseurs automatiques munis d'un dispositif de mesure cinétique. les exemples suivants illustrent la mise en oeuvre de l'invention. ExemPle i On mélange 2,0 ml (0,1 mole/l) de tris-(hydroxyméthyl)- aminométhane additionné de HC1 à pH 7,5 avec 75/il d'un latex contenant 13 mg/ml de copolymère carboxylé de styrène et de butadiène auquel est fixé, par covalence, de la gonadotrophine chorionique humaine (ERG) et on ajoute ensuite 0,10 ml d'antisérum HCG (lapin). Cet antisérum HCG est dilué de telle manière qu'il présente dans la charge d'essai les titres suivants (1:4000, 1:8000, 1:16000, 1:32000, 1:64000 et 1:128000). Pour chaque charge d'essai, on mesure aussit8t l'augmentation d'extinction (LE) par minute, à 379C et pour la longueur d'onde de 578 nm. Les résultats sont consignés dans le tableau suivant. TABLEAU II Titre de l'antisérum BCG Axe578 nm/37 C/min dans la charge d'essai I : 4 000 0,132 1 : 8 000 0,066 1 : 16 000 0,030 1 : 32 000 0,016 1 : 64 000 0,006 1 : 128 000 0,004 Ce tableau II montre que l'augmentation d'extinction, par minute, de la concentration anti-HCG est directement proportionnelle à la dilution du sérum, de 1 : 4 000 à 1 : 128 000. Exemple 2 À 1,0 ml d'antisérum HCG (dilution 1 : 2 000), on ajoute 1,0 ml d'une solution de HCG de l'une des teneurs suivantes en HCG : O ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml et 30 ng/mlO après incubation du mélange obtenu, à 370C pendant 2 minutes, on ajoute à chaque charge d'essai un latex contenant 13,5 mg/ml d'un copolymère carboxylé de styrène et de butadiène auquel de la HCG est fixée par covslence. Pour chaque charge, on mesure aussitôt l'augmentation d'extinction par minute, à 370C et pour la longueur d'onde de 578 nm. Les résultats sont consignés dans le tableau suivant. ABIRAU III Concentration en HCG, mg/ml 578 nm/min/370C 0 0,120 10 0,075 15 0,051 20 0,025 Ce tableau III montre qu'on peut déceler de manière stre la HCG jusqu 'à une concentration de seulement 2 ng/ml. Exemple 3 À 1,5 ml (0,1 mole/l) de tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane additionné de HCl jusqu'à pli 8,2, on ajoute 0,5 ml d'un latex contenant du polyacrylonitrile aux particules duquel est fixée par covalence de la gamma-globuline dénaturée (latex Rf). On dilue 0,1 ml de sérum de facteur rhumatoïde (sérum R) de manière à ce qu'après mélange de 0s1 ml de sérum Rf dilué avec le latex, on ait dans la charge d'essai, pour le sérum Rf, les titres suivants : 1 : 200, 1 : 400, 1 : 800 et I : 1600. Pour chaque charge d'essai, on mesure aussitôt l'augmentation d'extinction par minute, à 370C et pour la longueur-d'onde de 578 nm. les résultats sont consignés dans le tableau suivant. TABLEAU IV Titre de sérum Rf LE578 nm/min/37 C dans la charge d'essai 1 : 200 0,220 1 : 400 0,110 1 : 800 0,060 1 : 1600 0,025 Exemple 4 À 1,0 ml (0,1 mole/l) de tris-(hydroxyméthyl)-amino- méthane additionné de HCl jusqu'à pli 8,2, on ajoute 0,1 ml d'un latex contenant un copolymère carboxylé de styrène et de butadiène auquel de la morphine est fixée par covalence. On ajoute à ce latex 5, 10, 20 et 50/ul de sérum anti-morphine (dilué à 1 : 60) et, pour chaque charge d'essai, on mesure aussitôt l'augmentation -d'extinction par minute, à 370C et à la longueur d'onde de 578 nm. les résultats sont consignés dans le tableau suivant. TABLEAU V Quantité de sérum #E578 nm/min/370C anti-morphine ( l) 5 0,010 10 0,017 20 0,033 50 0,085 - RGVESTDICATIONS 1- Procédé de dosage quantitatif d'une substance immunologiquement active dans un échantillon d'analyse, caractérisé par le fait qu'on mesure par photométrie, eu égard à l'augmentation de l'extinction, la cinétique de la réaction immunologique, rendue mesurable au moyen de particules d'un support polymère sensibilisé, entre la substance immunologiquement active et un partenaire de réaction immunologique et que l'on détermine, à partir de la cinétique de cette réaction immunologique, la concentration de la substance immunologiquement active à doser. 2 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on réunit directement l'échantillon d'analyse avec un réactif immunologique contenant, comme particules de support polymère sensibilisé, des particules à répartition discrète, d'un support polymère immunologiquement inerte et qui sont recouvertes du partenaire de réaction immunologique de la substance à doser, on mesure par photométrie l'augmentation d'extinction et on en déduit la concentration de la substance immunologiquement active à doser. 3 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'après mélange de la substance immunologique à doser avec son partenaire de réaction immunologique, on réunit l'échantillon d'analyse avec un réactif immunologique contenant, comme particules de support polymère sensibilisé, des particules à répartition discrète, d'un support immunologiquement inerte, particules recouvertes de la substance immunologiquement active à doser, on mesure l'augmentation d'extinction et on en déduit la concentration de la substance immunologiquement active à doser. 4 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que les particules à répartition discrète du support polymère inerte ont une masse spécifique correspondant à peu près à celle de l'eau. 5 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que les particules à répartition discrète du support polymère inerte sont d'une taille comprise entre 0,05 et O,9. 6 - Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait que, comme support, on utilise une suspension de latex. 7 - Procédé suivant la revendication 6, caractérisé par le fait qu'on utilise comme latex une suspension d'un copolymère carboxylé de styrène et de butadiène. 8 - Procédé suivant la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisé par le fait qu'on choisit la proportion de latex de manière que sa concentration dans le mélange de réaction soit comprise entre C,06 et 0,7 mg/ml. 9 - Procédé suivant la revendication 8, caractérisé par le fait qu'on choisit la proportion de latex de manière à ce que sa concentration dans le mélange de réaction soit comprise entre 0,3 et 0,5 mg/ml. 10 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait qu'on ajoute au mélange de réaction un tampon pour régler le pH entre 5 et 10. Il - Procédé suivant la revendication 10, caractérisé par le fait qu'on ajoute au mélange de réaction un tampon pour régler le pH entre 7 et 8,5. 12 - Procédé suivant la revendication 11, caractérisé par le fait que le tampon est à base de tris-(hydroxyméthyl)aminométhane. 13 - Procédé suivant la revendication 11, caractérisé par le fait que le tampon est à base de triéthanolamine. 14 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé par le fait qu'on ajoute au mélange de réaction des produits pour stabilise ta suspension de polymère. 15 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé Éar le fait qu'on ajoute au mélange de réaction des produits pour exclure des réactions non spécifiques. 16 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé par le fait qu'on mesure par photométrie, en augmentation de l'extinction, la cinétique de la réaction immunologique. 17 - Procédé suivant la revendication 16, caractérisé par le fait qu'on effectue la mesure photométrique dans un intervalle de longueurs d'onde de 400 à 1000 nm. 18 - Procédé suivant la revendication 17, caractérisé par le fait qu'on effectue la mesure photométrique dans un inter valle de longueurs d'onde de 500 à 750 nm. 19 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé par le fait qu'on mesure la cinétique au début de la réaction immunologique. 20 - Procédé suivant la revendication 19, caractérisé par le fait qu'on effectue au moins deux mesures photométriques dans les 1 à 2 premières minutes la réaction. 21 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé par le fait qu'on suit de manière continue le déroulement de la réaction immunologique et qu'on exploite les résultats des mesures au moyen d'un ordinateur. 22 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 21, caractérisé par le fait qu'on effectue la réaction immunologique à une température comprise entre zéro et 400 C. 23 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 22, caractérisé par le fait que la mesure de la cinétique de la réaction immunologique est effectuée à l'aide d'un photomètre. 24 - Application du procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 23 au dosage de la gonadotrophine chorionique humaine. 25 - Application du procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 23 au dosage d'un facteur rhumatoïde 26 - Application du procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 23 au dosage de la morphine.