FR 2363577 A1 19780331 FR 7626640 A 19760903 Plusieurs procédés différents ont été décrits pour la production du facteur antihémophilique (ou facteur VIII) destiné à une utilisation thérapeutique, comme par ple une précipitation sélective, une absorption et de l'élution par lots discontinus, une extraction dons des milieux faible ment ioniques et la chromatographie. Les substances chimiques servant le plus fréquemment à la précipitation comprennent de ltalcool, 11 acide tannique, le sulfa.te d'ammonium, la glycine et du polyéthylène-glycol. La purifi.cation du facteur VIII entrain ltélimination de diverses autres. protéines du plasma. te fibrinogène est de loin la plus importante et la plus ennuyeuse de ces protéines, en pa.rticulier lorsqu'il a été dénaturé par des processus comme une précipitation à l'alcool7 une congélation et une décongélation. Ce fibrinogène dénaturé rend difficile la filtration du facteur antihémophilique, il provoque des pertes importantes de ce facteur au cours des stades de sa purification et il diminue la solubilité du produit lyophilisé dans le fluide servant à sa reconstitution. Ainsi, un procédé satisfaisant pour purifier le facteur antihémophilique exige 11 enlèvement de quantités appréciables du fibrinogène. Les techniques de précipitation sélective décrites ci-dessus sont destinées à cela, mais elles présentent toutes les inconvénients de dénaturer encore davantage le fibrinogène et le facteur antihémophilique ou bien de provoquer des pertes inopportunes en facteur antihémophilique, Les procédés utilisant une simple précipitation à froid sans faire appel à des substances chimiques (cryoprécipitation) sont limités à de la production à faible échelle, habituellement dans des banques du sang, et ces procédés aboutissent à des taux élevés de fibrinogène dans le sang lors luron utilise les produits pour la thérapeutique, ce que certains experts en ce domaine considèrent comme peu intéressant. tes modes opératoires impliquant ltextraction du facteur VIII du produit de cryoprécipitation dans des tampons à faible force ionique diminuent quelque peu la teneur en fibri nogene du produit final, mais celui-ci présente encore une teneur excessivement élevée en protéines; il faut un équipement spécial et des modes opératoires particuliers pour la centrifugation, et il existe une limite supérieure pour la quan tité du facteur antihémophilique que l'on peut extraire du produit de cryoprécipitation sans nuire à la purification. D'autres problèmes couramment associés à la. fabricar. tion à grande échelle du facteur antihémophilique sont la contamination du produit final par des substances pyrogènes et par des virus provoquant de l'hépatite (antigène associé à lthépatite).Avec les agents chimiques de précipitation, ces impuretés inopportunes peuvent m.ême être augmentées. te procédé décrit dans le présent mémoire élimine virtuellement ces problèmes ; il ne présente pas les inconvénients associés à des agents chimiques de précipitation et il repose sur le mode opératoire simple d'une précipitation sélective à froid du fibrinogène et de ses produits de dénaturation et de dégradation (lorsqu:on se réfère ci-après à l'enlèvement du fibrinogène, on entend également désigner l'enlèvement du fibrinogène ainsi que l'enlèvement de ses produits de dénaturation et de dégradation) a précipitation sélective du fibrinogène sans perte associée du facteur VIII n'a pas été antérieurement réalisée comme procédé pratique pour fabriquer à grande échelle un concentré purifié du facteur antihémophilique. En fait, M.Wickerhauser ("targe scale fractionation of Factor VIII Concentrate from cryoeethenol precipitate"; Thromb. fliath. Haemorrh. 43:165 (1971)(Fractionnement à grande échelle du facteur VîlI-Concentré obtenu à partir du précipité produit par le cryoéthénol)) souligne l'importance de limiter le temps et la température lorsqu'on extrait le facteur antihémophilique "on a obtenu des rendements un peu plus élevés en fa.cteur antihémophilique grâce à une extraction prolongée au-delà de 60 mn avec du Tris à 300C mais l'extrait a été contaminé de façon croissante par du fibrinogène aggloméré qui a rendu le concentré final peu filtrable.Inversement, on a obtenu des rendements inférieurs et variables en facteur antihémophilique pour de plus courtes durées d'extraction ou en opérant à une plus faible température. te mode opératoire décrit dans le présent mémoire élimine tous ces problèmes, car l'on enlève au cours du refroidissement toute contamination excessive par du fibrinogène cependant qu'on ne perd pas du tout de facteur antihémophilique. t'effet du refroidissement a été antérieurement noté par Hershgold et ses collaborsteurs (Hershgold, E.J., Pool, J.G. et Papperfhager, A.R. : "The potent antihemophilic concentrate derived fron a cold insoluble fraction of human plasma Characteriazation and further data on preparation and clinical trial. J. Lab. Clin. Med., 67:25 (1966) (Concentré antihémophilique puissant obtenu à partir d'une fraction insoluble froide de plasma humain ; caractérisation et autres données concernant la. préparation et les essais cliniques)).Ces auteurs demandent 18 à 30 heures à 40C et nront pu obtenir ni suggérer la précipitation accélérée et sélective du fibrinogène et des isohemagglutinines à la température plus faible de 00-20C. (En fait, dans un travail ultérieur, Hershgold et ses collaborateurs ont totalement éliminé un stade de refroidissement lorsqu'ils ont essayé de produire du facteur antihémophilique très fortement purifié (Hershgold, E.J. Davison, A.M. & Janzen, M.E. " Isolation and some chemical properties of human Factor VIII (antihemophilic Factor)" J-. Lab. Clin. Med. 77:185 (1971)(Isolement et certaines propriétés chimiques du facteur VIII humain (facteur antihémophilique)). Dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 631 018 de 1971 ( "Production of stable high potency human AHF using polyethylene glycol and glycine to fractionate a cryoprecipitate cf AHF ccncentratett (Production d'un facteur antihémophilique humain à grand pouvoir et stable, en utilisant du polyéthylène-glycol et de la glycine pour fractionner un cryoprécipité de concentré de facteur antihémophilique), on admet ne pas avoir été capable de produire un concentré thérapeutique pouvant être constamment filtre' de façon stérile ; il a fallu faire appel à des stades supplémentaires de précipitation par de l'alcool ou par de la glycine. Les perfectichnements remarquables de la présente invention ent éré une surprise inatterdue si@@'on se réfère au rapport décourageant de Hershgcld et de ses collaborateurs. James et Wickerhauser (James, H.L. et Wickerhauser, M.: "Development of large seale fractionation methods" Vos Sang 23:402 (1972) (Développement de procédés de fractionnement à grande échelle) indiquent : "en outre, puisque le procédé doit être mie en cauvre à la température ambiante pour éviter une précipitation du fibrincgène", mais ils n'ont pas réussi à mettre au point un mode opératoire permettant de produire un concen tré du facteur VIII en utilisant les principes de 7.a présente invention0 Leur produit final a également été obtenu avec un rendement bien moindre et en une pureté moindre, en comparaison de ce qui est décrit dans la présente invention, La poursuite du traitement avec du polyéthylène-glycol pour enlever le fibrinogène et augmenter la pureté a abouti à des pertes encore plus frappantes en facteur VIII (voir Wickerhauser, M : "Large scale fractionation of Factor VIII - Concentrate from cryoethenol precipitate" Thromb. Diath. Haemorrh. 43:165, (1971) déjà cité et Sgouris, J.T. et Wickerhauser, M. :"Use of frozen cryoprecipitate for the preparation of clinical Factor VIII concentrate" Transfusion 13:399 (1973 (Utilisation d'un cryoprécipité congelé pour la préparation d'un concentré de facteur VIII clinique)). Ainsi, il semble que d'autres chercheurs aient estimé depuis longtemps ou qu'ils aient conclu d'après leurs expériences qu'il ne fallait pas attendre d'amélioration particulière des résultats lorsqu'on utilise des températures qui ne sont que légèrement inférieures dans la précipitation et l'enlèvement du fibrinogène après seulement une très ccurte période de précipitation0 Les résultats inattendus et très grandement améliorés qui ont été trouvés et qui font l'objet du présent mémoire sont contraires aux enseignements et aux suggestions de l'art antérieur. La Demanderesse est parvenue à ces résultats, au cours de stades initiaux de recherches, plus par coincidences et hasard que par application d'un plan concerté. La présente invention vise un procédé spécifique pour la fabrication à grande échelle d'un concentré du facteur VIII. Parmi les caractéristiques les plus remarquables de l'invention, il y a la précipitation sélective à froid de quantités excessives de fibrinogène, de ses formes dénaturées et de ses produ.its de dégradation dans une solution à faible force ionique sans addition de substances chimiques et sans perte inopportune de l'activité du facteur antinémophilique0 Une caractéristique supplémentaire remarquable est le rendement étonnamment élevé en facteur VIII, environ 25 à 40 ss du plasma théorique. En outre, et malgré le taux élevé d'extraction du facteur antihémophilique, la teneur en protéines a été réduite de 50 à 75 ffi en comparaison d'autres produits.Cela est illustré au tableau suivant. La nécessité d'un concentré de facteur antihémophilique de grande pureté, obtenu avec un rendement élevé par lyophilisation, a été admise à l'échelle internationale et a fait 11 objet d'études internationales ("Recent Advances in Hemophilia." Ann. N.Y. Acad. Sci. 240, 1-426 (1975)("Progrès récents en hémophilie") J.G. Pool. "Recnet chapters in the Factor VIII saga : perils of a protein" West.J. of Med. 122:406 (1975)(Chapitres récents dans l'épopée du facteur VIII ; les périls d'une protéine)), et il est généralement admis que les concentrés du commerce donnent habituellement moins de 20 % de la quantité théorique de facteur antihémophilique présente dans le plasma (voir les progrés récents en hémophilie, les chapitres récents sur l'épopée du facteur VIII (précités) et le. brevet des Etats Unis d'Amérique N 3 803 1.15 "Stabilization of AHI? using heparin" (Stabilisation du facteur antihémophilique à l'aide de l'héparine))0 TABLEAU 1/ Quelques caractéristiques du concentré de facteur VIII 2/ Produit Unités de Volume Nombre Fibrinogène Protéines Sodium Chlorure Prix Source facteur total total total(g) totales total total total VIII/ml administré d'urités (g) (MEQ) (MEQ) (FF)# (ml) du facteur VIII (1) plasma frais banque du congelé 0,5 8000 4000 8,0 240 1200 800 2400 sang (2) cryoprécipité 103/ 400 4000 4,0 20 40 40 2000 " " (3) concentration Armour em facteur 10 400 4000 0,8 14 96 80 2400 Pharmaceutical (4) facteur anti- Laboratoire hémophilique Abbott FAH 10 400 4000 --4/ 20 80 48 2400 (5) "Hemofil" 25 160 4000 1,0 5,6 25 20 2700 Hyland (6) FAH 5/ 10 400 4000 6,0 Shanborm (7) FAH 6/ 10 400 4000 2,0 Shanborm 1/ Pour ce tableau, sauf ce qui est indiqu6 dans la colonne "source" comme "Shanbrom", les renseignements proviennent de "Recent Advances in Hemophilia" Ann. N.Y. Acad. Sciences 240:165-171 (1975) de Robert T. Breckenridge. Ce qui est indiqué comme "Shanbrojm" résulte de linvention ici décrite. 2/ Les chiffres se fondent sur l'expérience du centre d'hémophilie du Comté de Rochester et de Monroe, et ils sont exprimés comme les totaux nécessaires pour traiter un patient de 70 kg avec une unité par ml. Ces chiffres supposent une récupération de 80% de la matière utile in vivo. 3/ Variable, mais se situe habituellement entre 7 et 12 mierons/ml. 4/ Il n'a pas été possible de mesurer le fibrinogène par suite d'une précipitation à 37 C. 5/ Un seul stade sans précipitation ultérieure. 6/ Précipitation ultérieure à l'aide d'un polyol. # en francs français (F.F.) Exemple Voici une description plus détaillée du procédé de l'invention. On décongèle à une température comprise entre environ -50C et environ +20C du plasma congelé (par exemple 100 à 3 000 litres) et l'on collecte dans une cuve ou un récipient approprié. On peu.t traiter des volumes plus grands, mais les opérations deviennent alors difficiles. On collecte la. fraction insoluble à froid (cryoprécipité), de préférence dans des centrifugeuses à écroulement continu (centrifugeuse "Sharpless" ou analogues), à une température inférieure à 3 C. On peut utiliser d'autres procédés pour la collecte, mais ils sont 4 moins efficaces.On pèse le cryoprécipité puis on le mélange à une faible quantité d1eau distillée sans pyrogènes, de préférence durant quelques secondes dans un malaxeur de type Waring pour produire une suspension ou une émulsion. On extrait ensuite la suspension dans 2 à environ 3 volumes d'veau distillée sans pyrogènes à un pH d'environ 7,0 durant environ 30 à environ 60 mn après avoir réchauffé à 200-300C. On ajoute 10 à 70 ml de gel d'hydroxyde d'aluminium par litre et on laisse l'adsorption s'effectuer durant 15 mno On peut ajouter 0,5 à 2 % en poids de phosphate tricalcique pour une purification plus poussée, et diminuer la quantité d'hydroxyde d'aluminium. Ce stade facilite l'enlèvement des lipides, des protéines dénaturées et du complexe de prothrombine . On effectue la totalité de ces opérations dans un réacteur comportant une enveloppe avec une agitation continue, en prenant soin d'éviter un mous sageO On refroidit ensuite le contenu du récipient jusqutà une température interne environ 1 C à environ 20C, durant environ une demi-heure à deux heures. On sépare par centrifugation dans un appareil à écoulement continu (par exemple une centrifugeuse Sharpless) le lourd précipité qui se forme. On stabilise la liqueur surnageante auec du citrate trisodique 0,02 molaire et de la glycine 0,1 molaire à Ta tompérature de 20 -25 et T'on ajuste avec de l'acide citrtT le p.H à 7,0, On clarifie ensuite la solution et on la stérilise en faisant passer le liquide dans des filtres à membranes "millipores" de 293 @m (ou dans des cartouches équivalentes) ayant. de façon @ypique, des pores dont le diamètre est de 1,2 micron, 0,65 m cron, 0,45 micron ou -0,3 micron.La solution stérile résultante, qui contient environ 25 % à 40 % du facteur VIII dans le plasma d'origine, est lyophilisée de façon usuelle en vue de sa conservation par magasinage. On peut utiliser des variations pour la technique de fabrication, en particu.lier en utilisant un cryoprécipité recongelé ou des variantes de la. fraction 1 de Cohn, mais alors le rendement en facteur VIII sera diminué et il dépend de sa concentration dans la matière de départ. On peut effectuer 11 extraction du facteur antihémophilique dans d'autres tampons à faible force ionique comme du tampon Tris. On peut également faire varier le temps de refroidissement, l'allonger ou effectuer des opérations répétées avec un peu plus d'agglomération du fibrinogène, sans sortir du cadre de ltinvention. De même, on peut prolonger jusqutà 24 heures le temps d'extraction en se situant dans le mode opératoire décrit. On peut conserver à +50C le produit résultant pendant de longues périodes de temps, au moins un an, et le reconstituer dans de l'eau distillée ou dans une solution saline physiologique. En raison de sa teneur relativement faible en fibrinogène et de sa teneur supérieure en albumine, il passe très rapidement en solution. Puisque la durée complète du traitement est très courte en comparaison d'autres procédés de fabrication partir du moment ou l'on ouvre les sacs de plasma, la. crois- sauce bactérienne est limitée. Le fait que l'extraction est effectuée dans de l'eau distillée diminue la quantité de fibrinogène et de gamma-globulines passant en solution.Grâce au refroidissemet à +2 C, il se produit une précipitation sélec tive de l'excès de fibrinogène et de ses produits de déna.turation et de dégradation ainsi que des isohémagglutinines (macroglobulines) sans porte appréciable du facteur antihémophilique. En outre, le forty préclpité floconneux de fibrinogène enferme @@bablement toute la matière pyrogène éventuellement présente et il diminue les quantités de l'antigène associé à l'hépatite ou du virus de l'hépatite. Cela aboutit à un produit purifié de 30 à 60 fois par rapport au plasma et qui présente une très faible 6teneur en fibrinogène et en ischémagglutinines "salines". Si on le désire. on peut encore purifier et concentrer ces produits par des modes opératoires connus ou par de nouveaux modes opératoires. Dans un exemple de nouveau mode opératoire, on peut fabrirluer une préparatioll de facteur VIII de pureté ex+rê- mement élevée grâce à un stade supplémentaire qui consiste à ajouter 3 à 6 % de polyol (polyéthylène-glycol ou "Pluronic") et à refroidir à nouveau durant une à deux heures à 00-20C (voir "The Wonderful World of Pluronic Polyols (1971)" de BASF Wyandatte Corp. ; il s'agit d'un copolymère à blocs d'alpha hydro-pmêga-hydroxy-poly( oxyéthylène )poly( oxypropylène )poly- (oxyéthylène)(voir le produit 7 au tableau ci-dessus). Un grand avantage de la présente invention est la possibilité de produire du facteur antibémophilique extr,Emement pur en moins de 8 heures, en comparaison d'une période de temps 2 ou 3 fois plus prolongée que lton a connue avec les modes opératoires antérieurs. L'exemple présenté ci-dessus constitue le meilleur mode opératoire actuellement connu pour la mise en oeuvre de l'invention. Il apparaîtra cependant que lton peut mettre l'in vention en pratique en appliquant des techniques classiques de traitement et des matières classiques. Par exemple, bien qu'il ne soit généralement pas praticable du point de vue économique de partir avec moins d'environ 100 litres de plasma ou dtun cryoprécipité provenant de cette quantité de plasma, il n'y a bien évidemment aucun caractère fondamental pour les valeurs supérieures ou inférieures de volume que l'on indique dans exemple, et des variations de 50 % environ de ces valeurs ne gêneront pas l'invention.Dans l'exemple optimal, on effectue les opérations en utilisant un équipement bien connu et facilement disponible, comme la centrifugeuse Sharpless, le malaxeur Waring, etc, mais tout le monde admettra que ces stades n'ont par eux-m8mes (en les isolant du principe de l'invention) aucun caractère fondamental, et que ltéquipement ici cité n'a pas non plus un caractère fondamental. On peut apporter, dans le cadre de l'invention, de grandes variations à la discrétion de l'opé- rateur selon la main d'oeuvre et l'équipement disponibles, etc. L'adsorption sur de l'hydroxyde d'aluminium est un stade bien connu en lui-même et qui n'est pas fondamental pour le concept de l'inventlon. On dispose d'une latitude considérable pour la mise en oeuvre de ce stade, grâce à La substitution d'autres agents d'adsorption, etc, ou bien on peut parvenir au même objectif grâce à un stade équivalent ou bien on peut tout simplement l'omettre. Puisque l'on obtient le liquide. surnageant , contenant le facteur VIII, avec un degre élevé de récupération ou d'extraction, on traite ce liquide de façon classique pour sa conservation par magasinage et sa reconstitution. Par exemple, on le clarifie et le stérilise Tar -)re filtration sur un filtre à microspores classiques, on lyophilise pour concentrer le facteur VIII en un faible volume facile à conserver et l'on effectue la reconstitution en utilisait du liquide classique, par exemple de l'eau sans pyrogènes ou avec une solution saline physiologiqueO Il va de soi que la présente invention n'a été décrite ci-dessus qu'à titre illustratif du meillevr mode actuellement connu, mais non limitatif, et que l'invention est susceptible de recevoir diverses variantes entrant dans son cadre et dans son esprit. REVENTICATIONS 1. Procédé pour concentrer et purifier le facteur VIII (facteur antihémophilique), ce procédé étant caractérisé en ce qutil consiste essentiellement en les stades selon lesquels : on collecte le cryoprécipité obtenu à partir d'environ 100 litres de plasma congelé ou davantage on extrait le cryoprécipité ainsi collecté dans environ 2 à environ 3 volumes d'eau sans pyrogènes à environ 25 C- 300C et à un pH d'environ 7 durant environ 30 à environ 60 mn ;; on enlève, par adsorption, les lipides, les protéines dénaturées et le complexe de la prothrombine de la solution d'extrait on précipite le fibrinogène, ses produits de dénaturation et de dégradation, sans enlever de quantités importantes du facteur VIII de l'extrait résultant dans le liquide à faible force ionique en refroidissant le liquide jusqu'à une température comprise entre environ +1 C et environ +2 C durant une période d'environ 1/2 heure à environ 2 heures on sépare, on stabilise, on clarifie et stérilise le liquide surnageant contenant environ 80 % ou davantage du facteur VIII contenu dans la matière de départ ;; on lyophilise le liquide surnageant stabilisé pour produire un concentré de facteur VIII que l'on peut conserver pendant de longues périodes de temps, et que lson peut facilement reconstituer par dissolution dans de l'eau distillée ou dans une.solution saline physiologique. 2. Procédé perfectionné pour concentrer et purfier le facteur VIII, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il com- prend les stades selon lesquels on extrait le cryoprécipité dans un milieu aqueu@ de faible force ionique au voisinage de la température embiante on précipite ensuite le fibrinogène de cette solution à faible force ionique simplement en refroidissant e-et tion jusqu'à une température d'environ +10C à enviro +2 C durant environ une 1/2 heure ou davantage ;; on sépare le liquide surnageant résiTt ant, conte@ant au moins 80 ffi environ du facteur VIII qui était présent dans le cryoprécipité de départ et l'on traite le liquide pour la conservation à long terme d'un concentré du facteur VIII que ce liquide contient. 3. Procédé selon la. revendication 2, caractérisé en ce qu?il comporte le stade supplémentaire selon lequel on purifie le facteur VIII en ajoutant environ 3 à environ 6% d'un polyol au liquide surnageant contenant au moins 80 % environ du facteur VIII (par rapport à la matière de départ) et l'on refroidit le mélange résultant jusqu'à une température dtenvi- ron 0 à +20C durant une à devx heures pour précipiter une quantité supplémentaire de fibrinogène et de ses produits de dénaturation et de dégradation0