FR 2361330 A1 19780310 FR 7624299 A 19760809 La présente invention concerne un procédé de préparation de l'acide citrique qui trouve des applications dans l'industrie alimentaire et pharmaceutique ainsi que dans d'autres branches. On connatt un procédé de préparation de l'acide citrique qui consiste en ce qu'on cultive la souche EU-ll9 Aspergillus niger, productrice de l'acide citrique, sur un milieu nutritif de la composition suivante mélasse (teneur en sucre étant de 15 Z en poids) 300-320 g/l ferrocyanure de potassium 1,1 gll phosphate de potassium monosubstitué 0,16 gJl sulfate de zinc 0,005 g/l eau, complément à 1 litre pH du milieu 6,8 à 7,0 On conduit le processus de fermentation dans des cuves de fermentation à une température de 30 à 32"C pendant 9-10 jours. La souche EU-119 Aspergillus niger connue indiquée est caractérisée sur des milieux de moflt gélosé et de Czapek-Dox par une colonie ronde géante; le diamètre des colonies d'une culture âgée de 5 jours sur le milieu de moût gélosé constitue 95 mm, sur le milieu de Czapek-Doz 55 mm le diamètre du chapelet de conidie sur le milieu de Czapek-Dox est de 105 à 115 y, la longueur du conidiophore est de 0,7 à 5 , le diamètre des conidies est de 3,4 ut la culture a des stérigmes bi-couches. Le rendement en acide citrique, au cours de la culture de la souche indiquée sur le milieu nutritif cité est 88 à 89 7. en poids par rapport au sucre consommé, sur les milieux de mélasses la souche donne 93-94 % d'acide citrique calculé sur la somme d'acides. Le rendement n 2 acide citrique par 1 m de surface pendant 24 heures constitue 1800-1830 g (certificat d'auteur N 170898 de l'Union des républiques socialistes soviftiques). L'inconvénient du procédé connu est un bas rendement en acide citrique à cause d'une faible activité de la souche utilisée et d'une stabilité insuffisante vis-à-vis des microrganismes infectant les milieux de fermentation. La présente invention vise à éliminer les inconvénients indiqués. Conformément à cet objectif, on s'est proposé d'augmenter le rendement en produit visé par utilisation dans le processus d'une nouvelle souche. La solution consiste en ce que dans le procédé d'obtention de l'acide citrique par culture du producteur de l'acide citrique, Aspergillus niger, sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote et de sels minéraux avec élimination ultérieur du mycélium et récupération du produit visé à partir de la liqueur culturale, on utilise, conformément à l'invention, en tant que producteur la souche R-1 Aspergillus niger, sélectionnée à partir de la souche EU-119 Aspergillus niger par une action combinée sur cette souche des rayons ultraviolets, d1éthylène-imine et de N-nitroso-méthylurée, souche présentant des aspects morphologiques et des propriétés physiologiques suivants : sur le mofit gélosé la colonie géante ronde atteignant au bout de 5 jours un diamètre de 90 mm, le centre de la colonie a des rares sporophores de couleur brun foncé, au-delA du centre la zone de sporophores abondants, puis la zone asporogène; les chapelets de conidies sont en moyenne de 125 d 145 > i; les conidiophores sont d'une longueur de plus de 4 mmà les conidies sont circulaires de 6,u de diamètre, les stérigmes sont mono-couches, sur le milieu de Czapek-Dox île forme au bout de 5 jours une colonie géante à un diamètre de 45 à 50 mm, la zone asporogène est de 6 mm; le mycélium de suostrat forme des plis rayonne , la sperulation est pauvre de couleur brun foncé avec un mycélium aérien duveteux; les chapelets de conidies sont arrondis en moyenne de 205 à 215 , les stérigmes sont monoccucbes de 10 AI de longueur, les conidiophores sont de 3 9 4 inm de longueur, les conidies sont cir-ulaires de 7 de diamètre; la souche est douée d'une résistance levée aux bactéries antagonistes, inhibe le développement des bactéries formant des gaz, des acides et des nitrites qu'on trouve lors du processus fermentatif de préparation de l'acide citrique cli fermente bien des solution de mélasse, le rendement est jusqu'à 99 % en poids calcul par rappcrt au sucre consommé, sur des milieux à mélasse la souche donne de n7 à 98 % d'acide citrique calcule sur la somme d'acides. La nouvelle souche R-1 Aspergillus niger indiquée est déposée en collection de l'Institut de Microbiologie de August Kirchenstein de l'Académie des Sciences de la République Sccialiste SovioLique de Lettonne. La nouvelle souche R-1 Aspergillus niger est isolée à partir de la couche EU-119 Aspergillus niger par action combinée sur cette dernière des rayons ultraviolets, d'éthylène-imine et de N-nitroso-méthylurée. Les propriétés morphologiques de la nouvelle souche ont été étudiées sur une culture cultivée sur le milieu de Czapek-Dox et sur le milieu de mosst gélosé à une température de 320C. Les propriétés culturelles de 12 souche et le caractère de la croissance ont été étudiés sur les milieux nutritifs utilisés pour la culture de Aspergillus niger : le milieu de Czapek-Dox, de moût gélosé et un milieu fermentatif utilisé pour préparer l'acide citrique. Les caractères antagonistes de la nouvelle souche et de la souche de départ ont été parallèlement testés vis-b-vis des microrganismes participant au processus de préparation de l'acide citrique : moisissures, bactéries et levures. La souche nouvelle proposée présente des propriétés morphologiques culturelles suivantes 1. Propriétés morphologiques Milieu de Czapek-Dox. La forme des conidies d'une culture âgée de 5 à 7 jours est circulaire de 7 de diamètre. Les chapelets de conidies sont arrondis de 205 à 215 en moyenne. Les vésicules sont d'une forme légèrement allongée de 27 > a en moyenne. Les stérigmes sont monocouches d'une longueur de 10 p. La longueur de conidiophores varie de 3 à 4' mm Le diamètre de la section des conidiophores est de ZO,u. Moût gélosé. La forme des conidies d'une culture agée de 5 jours est circulaire d'un diamètre de 6 Ici. tes chapelets de conidies sont en moyenne de 125 A 145 p. Les vésicules sont arrondies en moyenne de 27 à 29 p. La longueur des conidiophores dépasse 4 mm Le diamètre de la section est de 15 p. Les aspects morphologiques de la souche nouvelle se distinguent de la souche initiale, ce qui est représenté sur le tableau ci-dessous. TABLEAU N Indices Unités de Souche EU-119 Souche R-l mesure Aspergillus Aspergillus nager ~~~~~~~~~~~ niger niger 1 Diamètre du chapelet conidien p 10 > -115 205-215 2 Diamètre de vésicule u 34-35 27-30 3 Longueur de stérigmes p du ler ordre 11 10 du 2e ordre 7,5 néant 4 Diamètre de conidies p 3,4 7 5 Conidiophores : longueur mm 0,7-5 3-4 diamètre u 13 20 2. Caractères culturaux. Milieu de Czapek-Dox. Une colonie géante, cultivée sur la boite de Pétri a une température de 320C, au bout de 5 jours a une forme circulaire de 45 à 50 mm de diamètre. Les bords de la colonie sont planes, la zone asporogène est de 6 mm. Le mycélium de substrat est radialement plissé. Les sporophores sont radiaux (sous l'influence du mycélium plisse, rares, brun foncé avec un mycélium aérien duveteux. Le milieu est le moat gélosé. La colonie d'une culture âgée de 5 jours est circulaire, géante. Le diamètre de colonie est dé 90 mm. Le centre de la colonie avec les sporophores rares brun foncé, au-delà du centre, la zone des sporophores bas, abondants, puis la zone asporogène. s Milieu de fermentation (composition g/l : mélasse avec la teneur en sucre de 15 % en poids - 300-320; ferrocyanure de potassium -1*1; phosphate de potassium monosubstitué - 0,16; sulfate de zinc - 0,005; eau - complément à 1 litre). Le mycélium âgé de 24 heures est fin, plissé, brunStre. Au cours du cycle le mycélium devient blanchâtre, plus dense et plissé. La base du mycélium devient brunâtre, Le mycélium est élastique, il ne forme pas de conidies ou les forme insuffisamment. 3. Propriétés antagonisticues. La souche est douée d'une résistance élevée aux bactéries - antagonistes et inhibe le développement des bactéries formant des gaz, des acides et des nitrites, participant au processus fermentatif de préparation de l'acide citrique. 4. Aspects biochimiques,La nouvelle souche fait fennanter des milieux de mélasse, le rendement en acide citrique étantssjusqu' & 99 X en poids, calculé par rapport au sucre consommé. Le procédé de préparation de l'acide citrique avec utilisation de la nouvelle souche peut être réalisé tant à la surface que par la méthode submergée. Le procédé proposé de préparation de l'acide citrique est mis en oeuvre de la manière suivante. On prépare préalablement la semence de la culture Aspergillus niger R-1. On cultive la culture de la souche sur un milieu nutritif de la composition suivante (en 7. en poids) urée 0,05-0,1 NaCl 1-2 CuSO4 0,001 sélose 2-3 solution aqueuse du moût de bière ou de l'extrait de malt (6-8 X en poids en sucre) - complément à 100, On effectue la culture -à une température de 30 à 320C pendant 9-10 jours dans des cuves de 10 à 12 dm de surface. On sépare les conidies mûres à partir du mycélium à l'aide d'un pinceau ou un dispositif à vide. Le rendement en spores (conidies) par 1 dm de surface du milieu est de 1,0 à 1,1 g.On preseche les conides recueillies et on les mélange avec le charbon activé stérile dans un rapport de 1 : 2, On introduit la semence obtenue dans le milieu de fermentation nutritif. On utilise pour la fermentation un milieu nutritif de la composition suivante mélasse avec la teneur en sucre de 15 % en poids 300-320 gSl ferrocyanure de potassium 1,1 g/I phosphate de potassium monosubstitué 0,16 g/l sulfate de zinc 0,005 g/l eau, complément à 1 litre pH du milieu 6,8 à 7,0 On effectue la fermentation à une température de 30 a 320C, Après 20-24 heures de la fermentation il se développe le mycélium brunâtre, plissé. La durée de fermentation est de 5 à 9 jours. La fermentation terminée, on détermine la teneur en acide citrique du milieu de culture. La teneur en acide citrique est jusqu'à 99 % en poids calculé par rapport au sucre consommé. Après la séparation du mycélium, on isole l'acide citrique et on le purifie par des procédés connus. Le procédé proposé grace a l'utilisation de la nouvelle souche permet d'augmenter le rendement en acide citrique jusqu 99 % en poids par rapport au sucre consommé comparativement au procédé connu (jusqu'à 89 X en poids par rapport au sucre consommé). La quantité d'acide citrique par unité de la surface augmente en moyenne de 14 A 15 Z par comparaison au procédé connu. L'utilisation de la nouvelle souche permet de diminuer presque de deux fois la teneur'en acides secondaires de la solution fermentée (de 6 % en poids selon le procédé connu jusqu'd 2-3 % en poids selon le procédé proposé). La nouvelle souche est moins sensible à la composition chimique de la mélasse de départ, c'est pourquoi une mélasse d'une qualité plus basse comparativement au procédé connu peut être introduite dans la composition du milieu nutritif. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation concrets. Exemple 1 On prépare la semence de la souche R-l Aspergillus niger par ensemencement d'une culture pure de la souche sur un milieu nutritif de la composition suivante, en % en poids urée 0,05-0,1 NaCl 1-2 CuSO 0,001 gélose 2-3 solution aqueuse de bière ou d'extrait de r malt (6-8 % en poids en sucrej complément à 100 On effectue la culture à une température de 30 a 320C pendant 9-10 jours et à une température de 23 à 250C pendant 1 jour dans des cuves de 10 à 12 dm de surface. On sépare les conidies mûres à partir du mycélium à l'aide d'un pinceau ou d'un dispositif à vide. On mélange les conidies recueillies préséchées avec charbon'activd stérile dans un rapport de 1 : 2 et on les utilise pour l'ensemencement du milieu de fermentation nutritif dans les béchers. La composition du milieu de fermentation mélasse (15 % en poids en sucre) 300-320 g/l ferrocyanure de potassium 1,1 g/l phosphate de potassium mon on substitué 0,16 g/l sulfate de zinc 0,005 g/l eau complément à 1 Li tre pH du milieu 6,8 à 7,0 On chauffe la solution de mélasse jusqu'à une température de 100 C et on ajoute une quantité calculée de ferrocyanure de potassium. On maintient la solution à cette température pendant 30 à 45 minutes, on ajoute le phosphate de potassium monosubstitué et le sulfate de zinc et on ajuste le pH à 6,8-7,0 par addition de l'acide sulfurique ou de la soude. On verse la solution obtenue dans les béchers de 700 lia a une hauteur de couche de 12 cm. La surface de la fermentation constitue 0,54 dm2. On ensemence la semence de la souche sur la surface de la solution. La température de la fermentation est de320C. Après 8 jours de fermentation, on enlève le mycélium, on détermine par la méthode de titration le rendement en acide citrique calculé par rapport au sucre consommé et la quantité d'acide obtenue à partir de la surface de la fermentation. On obtient 104 g d'acide citrique ( partir de 700 ml de milieu nutritif), ce qui constitue 99 % en poids par rapport au sucre conet-sé. La quantité d'acide citrique obtenue d'une surface de fermentation égale A 1 dm2 constitue 2 100 g par jour. exemple 2 La préparation de la semence et du milieu de fermentation nutritif est réalisée d'une façon analogue à celle décrite dans l'exemple 1. On conduit le processus de fermentation dans une chambre 2 de fermentation A une surface de fermentation égale à 140 m . Le volume total de la solution A une hauteur de la çouche de 12 cm constitue 16800 1. On verse le milieu nutritif fermentatif préparé dans les cuves et on ensemence par la culture. La quantité de semence est de 30 à 50 mg/m de surface de fermentation. Après la formation complète du mycélium, en phase d'une òreation active des acides, on maintient la température de culture dans des limites entre 31 et 32 C, l'aération étant de 15 å 18 m3/m2 /h. L'éva poration au cours du cycle complet de fermentation-constitue 45-50 Z de volute initial de la solution. La solution fermentée contient 97-98 % en poids d'acide citrique et 2-3 7. en poids d'acides gluconique, oxalique, malique, saccharique, fumarique, succinique, malonique, adipique. Le régime susmentionné donne après 9 jours de fermentation 2249 kg d'acide citrique. il reste 0,5 % en poids de sucre non fermenté. La souche productrice a utilisé 2436 kg de sucre de la mélasse, le rendement en produit visé calculé par rapport au sucre ooneollrC étant de 92,3 Z en poids. Exemple 3 La préparation de la semence est effectuée d'une façon analogue b celle décrite dans l'exemple 1. On conduit le processus de fer mentation par la méthode submergée. Le milieu de fermentation est de composition suivante, g/l mélasse (8 % en poids en sucre) 150-160 ferrocyanure de potassium 0,56 phosphate de potassium monosubstitué 0,16 sulfate de magnésium 0,25 sulfate de zinc 0,005 nitrate d'ammonium 2,0 eau complément A 1 litre pH du milieu 6,6 A 7,2. Dans des ballons de 750 ml de capacité, on introduit le milieu nutritif en quantité de 100 ml et la semence à raison de 1,5 g/m3 de milieu. On réalise le processus de fermentation a une température de 320C et sous une agitation de 240 tours/minute. Le processus dure 5 jours. On obtient 5,6 g d'acide citrique par 100 ml de milieu nutritif, ce qui constitue 70 % en poids par rapport au sucre consommé. REVENDICATION I. Procédé de préparation de l'acide citrique par culture Aspergillus niger sur un milieu nutritif, contenant des sources de carbone, d'azote et de sels minéraux avec séparation ultérieure du mycélium et l'isolement du produit visé A partir de la liqueur culturale, caractérisé en ce qu'on utilise en tant que souche productrice la souche R-l Aspergillus niger, sélectionnée à partir de le souche EUll9 Aspergillus niger, par action combinée sur cette dernière des rayons ultraviolets, d'éthyldne-imine et de N-nitroso-méthylurée, souche possédant des aspects morphologiques et propriétés physiologiques suivantes : sur le moult gélosé au bout de 5 jours il se forme une colonie géante circulaire de 90 mm de diamètre, dans le centre de la colonie scnt des sporophores rares, brun foncé, au-delà du centre - la zone des sporophores abondants, bas, puis la zone asporogène; les chapelets de conidies sont en moyenne de 125 145 p; les conidiophores sont d'une longueur au-delà de 4 mm; les conidies sont circulaires de 6 p de diamètre, les stérigmes sont monocouches; sur le milieu de Czapek-Dox elle forme au bout de 5 jours une colonie géante de 45 50 mm de diamètre; la zone asporogène est de 6 mm; le mycélium de substrat est radialement plissé, les sporophores rares, brun foncé, avec le mycélium aérien duveteux, les chapelets de conidies sont arrondies de 205 A 215 p en moyenne, les stérigmes sont monocouches d'une longueur de 10 p; la longueur de conidiophores est de 3 à 4 mm, les conidies sont arrondies de 7 wu de diamètre; la souche possède une haute résistance aux bactéries antagonistes, inhibe le développement des bactéries formant des gaz, des acides et des nitrites participant au processus fermentatif de préparation de l'acide citrique; elle fait bien fermenter les solutions de mélasse, le rendement en acide citrique est Jusqu'd 99 70 en poids calculé par rapport au sucre consommé, sur les milieux de mélasse elle donne en moyenne de 97 98 Z d'acide citrique exprimé en somme d'acides.