FR 2336477 A1 19770722 FR 7633608 A 19761108 L'invention a pour objet un procédé de production d'acide citrique par fermentation et elle vise notamment un procédé de fermentation en volume qui permet d'obtenir un rendement élevé en acide citrique à partir de substrat de mélasse de betteraves sucrières, de mélasse de dattes ou d'un mélange des deux. Les procédés de production d'acide citrique par fermentation consistent à transformer le sucre contenu dans des solutions de sucre en faisant agir sur ces dernières certains champignons qui ont la faculté de se développer dans ces solutions par fermentation oxydative et qui assurent dans certaines conditions particulières de culture la transformation du sucre en acide citrique. La plupart des procédés utilisés jusqu'à présent font appel à l'activité de l'Aspergillus Niger sur des substrats de mélasse de betteraves sucrières, et ils ont été mis en oeuvre pour la production d'acide citrique en réalisant la culture de ce micro-organisme soit à la surface de la solution de mélasse, soit au sein même de cette solution, c'est-àdire par un procédé de fermentation en volume, la solution dans ce cas étant soumise à une agitation de façon que l'air nécessaire au processus puisse pénétrer à l'intérieur du liquide. Afin de favoriser le développement de l'Aspergillus Niger par fermentation, le substrat ou milieu de culture doit présenter une carence en certains métaux lourds et il est de ce fait nécessaire de le traiter préalablement pour éliminer les traces de métaux lourds qu'il contient. D'autre part, ces procédés ne permettent pas d'éviter la formation simultanée d'acide oxalique par fermentation, spécialement lorsque le milieu de culture ne comprend pas d'azote ou lorsque son pH est compris entre 3,5 et 7. Cette formation d'acide oxalique nuit au rendement en acide citrique. La présente invention a pour objet un procédé de production d'acide citrique par fermentation qui pallie ces divers inconvénients grace à l'emploi de microorganismes spécifiques qui permettent d'améliorer le taux de production d'acide citrique obtenu. Le procédé considéré se caractérise en ce qu'on réalise la culture d'un microorganisme choisi dans le groupe comprenant l'Aspergillus Niger 1015, l'Aspergillus Nigex 10577, l'Aspergillus Niger 11414, l'Aspergillus Niger 12846, l'Aspergillus Niger 9142, l'Aspergillus Niger 13794, l'Aspergillus Niger 26036, le Mucor Piriformis 16296 et leurs mutants sur un substrat de mélasse de betteraves sucrières, de mélasse de dattes ou d'un mélange des deux. Selon une première caractéristique de ce procédé, on réalise ladite culture au sein dudit substrat soumis à une agitation. Selon une deuxième caractéristique de ce procédé, on traite au préalable le substrat de mélasse par addition de ferrocyanure de potassium. Selon une troisième caractéristique de ce procédé on modifie le pH dudit substrat au cours de la culture, de préférence au bout de 24 heures, de manière à l'amener à une valeur au plus egale à 3 et de préférence à la valeur de 2,7, le pH initial dudit substrat étant avantageusement compris entre 4,5 et 6,5, Le procédé tel que caractérisé ci-dessus, présente notamment l'avantage de conduire à un meilleur taux de production d'acide citrique. En premier lieu, la nature du microorganisme utilisé et éventuellement le stade de pré-traitement du substrat ou milieu de culture par addition de ferrocyanure de potassium, permettent d'éliminer l'influence nuisible des traces de métaux lourds présentes initialement dans ce milieu de culture.En second lieu, l'addition au substrat de mélasse de betteraves sucrières d'une proportion donnée de mélasse de dattes etZou l'étape de changement de pH du milieu au cours de la culture permettent de favoriser la productiond'acide citrique au détriment de l'acide oxalique. De cette façon on parvient à obtenir un taux élevé de production d'acide citrique, tout en diminuant la production d'acide oxalique, On précise que les souches des microorganismes mentionnés ci-dessus sont enregistrées sous ces références dans la collection internationale "AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION" lieme edition 12301 PARKLAWN DRIVE ROCKVILLE r MARYLAND 20852 (301) 881-2600 USA Les mutants de ces microorganismes conviennent également à la mise en oeuvre du procédé de l'invention. On rappelle que les mutants d'un microorganisme sont généralement obtenus en faisant subir à ce microorganisme une mutation induite par un agent externe tel qu'un rayonnement ultraviolet, un rayonnement ionisant ou une substance particulière Selon le procédé de la présente invention, on emploie, de préférence, un mutant de l'Aspergillus Niger 9142 dont la mutation a été induite sous l'influence d'un rayonnement ultraviolet. Ce mutant désigné par le Biochemical and Bioenvironmental Research Centre Arya-Mehr University of Technology d'Iran sous la référence F01 présente notamment l'avantage de ne pas & re sensible à l'action néfaste des métaux et des acides qui dans le cas de l'Aspergillus Niger empechaient le développement de ce dernier par fermentation. Ce mutant a été isolé et sélectionné en fonction de son efficacité pour la production d'acide citrique à partir de souches mutantes obtenues par irradiation ultraviolette d'une suspension aqueuse stérile de spores d'Aspergillus Niger 9142. On l'obtient de la façon suivante. En premier lieu, on prépare une solution aqueuse de spores de la souche mère Aspergillus Niger 9142 en mettant en suspension dans 25 cm 3 d'eau distillée stérile des spores de cette souche mère et infiltrant la solution pour obtenir des spores isolés. La solution obtenue présente une concentration en spores de 106 spores par ml et elle est introduite dans une boîte de Pétri sans couvercle puis soumise à l'action d'un rayonnement ultraviolet dans une chambre d'inoculation HAdolphe Kuhner" pendant 7 minutes, en étant maintenue sous agitation par un agitateur magnétique. Après irradiation, on prépare des dilutions au 1/10, au 1/100 et au 1/1000 de cette solution, et on les inocule sur des bottes de Pétri contenant de la gélose de pommes de terre et de glucose. Quand les souches isolées apparaissent elles sont inoculées dans des milieux de culture identiques à celui qui est utilisé pour la production d'acide citrique. On réalise ensuite leur culture dans des Erlen Meyer de 100 cm 3 contenant 25 mi du milieu de culture dans des conditions de fermentation analogues à celles du procédé de production d'acide citrique. De la sorte, on peut sélectionner la souche la plus efficace, en fonction des résultats obtenus lors de ces cultures. Les conditions de fermentation sont les suivantes - le milieu de culture est soumis à une agitation sur table agitante tournant à 250 tours/minute et il est constitué par une solution de mélasse de betteraves sucrières compre nant 150 g par litre de sucre, - la température est de 300C, le pH du milieu de culture est ajusté entre 6 et 6,5 et la durée de fermentation est de 7 jours. En fin de fermentation, on évalue la quantité d'acide citrique obtenue dans chaque récipient et on sélectionne la souche mutante F01 qui correspond à la plus grande quantité d'acide citrique obtenue dans ces conditions. La souche mutante la plus efficace est ensuite mise en oeuvre dans le procédé de l'invention. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit donnée à titre d'exemple non limitatif et se référant aux dessins annexés sur lesquels - la figure la represente les courbes de production d'acide citrique, de rendement du procédé de fermentation et de poids de mycélium obtenu en fonction du pH initial du substrat pour une mise en oeuvre du procédé de fermentation à l'aide de l'Aspergillus Niger FOI sur un substrat de mélasse de betteraves contenant 145 g par litre de sucre, - la figure lb représente les courbes de production d'acide citrique, de rendement du procédé de fermentation et de poids de mycélium obtenu en fonction du pH initial du substrat pour une mise en oeuvre du procédé de fermentation à l'aide de l'Aspergillus Niger Fol sur un substrat de mélasse de dattes contenant 118 g par litre de sucre, 0,25 g par litre de NH4NO3 et 0,2 g par litre de KH2PO4 - les figures 2a, 2b, 2c, 2d représentent les courbes de production d'acide citrique, de rendement du procédé, de pourcentage d'acidité dû à l'acide citrique et d'acidité totale en fonction de la nature du substrat utilisé dans le procédé de fermentation, soit en fonction du rapport en volumes de mélasse de betteraves sucrières/mélasse de dattes. Préalablement à la mise en oeuvre du procédé de-l'invention, on réalise la croissance dans des milieux de culture appropriés de la souche mutante de l'Aspergillus Niger référen- cée F01 par le Biochemical and Bioenvironmental Research Centre Arya-Mehr University of Technology d'Iran, de façon à obtenir une quantité suffisante de ce micro-organisme en vue de l'inoculer dans le milieu de culture. On réalise cette croissance à partir d'une souche con serrée à 49C sur de la gélose nutritive de pommes de terre et de sucre. Pour empêcher l'agglutination des micro-organismes en boulettes dans le milieu de culture lors du procédé de fermentation en volume qui sera décrit ci-après, on réalise une première croissance du micro-organisme en inoculant des conidies provenant de la souche conservée, dans un milieu contenant 30 % en poids de mélasse non traitée et 3 % en poids de carboxyméthylcellulose de sodium. Cette culture est réalisée dans un flacon Erlen-Meyer de 500 ml environ contenant 100 mi du milieu, placé sur un support agitateur rotatif tournant à 250 tours/ minute, le milieu étant maintenu à une température de 30 C. Après deux jours de culture, les mycéliums sont extraits du flacon puis cultivés successivement dans un premier milieu contenant seulement 30 % de mélasse non traitée, à une température de 300C puis dans un second milieu contenant également 30 % de mélasse non traitée, à une température de 300C pendant la phase de croissance et de 270C pendant la phase de production. La première culture est réalisée dans un flacon Erlen Mener de 500 ml contenant 100 ml du milieu, placé sur un agitateur rotatif tournant à 250 tours/minute.La seconde culture est réalisée soit dans un fermenteur d'une capacité de 30 1 contenant 15 1 du milieu, soit dans un fermenteur d'une capacité de 150 1 contenant 75 1 du milieu, Pour la production d'acide citrique, le substrat ou milieu de culture est constitué par exemple de mélasse de betteraves sucrières, de mélasse de dattes ou d'un mélange des deux. On ajuste au préalable le pH de ce milieu à une valeur de 6,5 à l'aide d'acide chlorhydrique et on soumet ce milieu à une stérilisation. Après cette stérilisation, on ajoute du ferrocyanure de potassium dans le milieu chaud pour atteindre une concentration finale qui est habituellement de tordre de 0,75 à 1 gr/l. de ferrocyanure de potassium. On inocule dans le milieu régulé à 300C un inoculum à 2 % obtenu précédemment par croissance du micro-organisme.Après 24 heures de culture, on ajuste le pH du milieu de culture à la valeur 3 et on poursuit la culture du microorganisme en vue de la production d'acide citrique. Les résultats obtenus après une durée globale de culture de l'ordre de 5 jours 1/2 montrent que la production d'acide citrique est beaucoup plus importante que dans le cas d'une mise en oeuvre du procédé ne comportant pas de pré-traitement du milieu de culture et d'étape de changement de pH. Ainsi lorsque le milieu de culture est constitué de mélasse de betteraves sucrières, on obtient 116 g/l d'acide citrique, ce qui représente 95 % de la production totale d'acide qui est de 121 g/l. En se reportant au tableau 1, on peut voir les résul tats obtenus lors de la mise en oeuvre du procédé sur un sub-strat de mélasse de betteraves sucrières, selon plusieurs variantes qui se différencient par le fait qu'elles comportent ou non, soit une étape de pré-traitement du milieu par le ferrocyanutre de potassium, soit une étape de changement de pH au cours de la culture, soit une combinaison de ces deux étapes. En se reportant aux figures la et lb, on voit que le pH initial du milieu exerce une certaine influence sur la production d'acide citrique. Ainsi, dans le cas d'une mise en oeuvre du procédé, sans étape de prétraitement du milieu par le ferrocyanure de potassium et sans étape de changement de pH au cours de la culture, les meilleurs résultats sont obtenus, pour un milieu constitué de mélasse de betteraves sucrières contenant 145 g/l de sucre avec un pH initial de 6,5 (Figure la) et pour un milieu constitué de mélasse de dattes contenant 118 g/l de sucre, 0,25 g/l de NH4NO3 et 0,2 g/l de KH2P04 avec un pH initial d'au moins 4,5 (figure lb). En se reportant aux figures 2a, 2b, 2c, 2d, on voit l'influence du rapport en volumes des constituants du milieu de culture pour des mélanges de mélasse de betteraves sucrières et de mélasse de dattes, sur la production d'acide citrique, sur le rendement en acide citrique par rapport au sucre consommé, sur le pourcentage d'acidité due à l'acide citrique par rapport à l'acidité totale et sur l'acidité totale obtenue lors du procédé de fermentation. Dans chacune de ces figures, les courbes supérieures ont été établies lors d'une mise en oeuvre du procédé comportant une étape de prétraitement du milieu de culture par le ferrocyanure de potassium. Les courbes inférieures ont été établies lors d'une mise en oeuvre du procédé ne comportant pas d'étape du prétraitement du milieu par le ferrocyanure de potassium. En ce qui concerne l'étape de pré-traitement du milieu de culture par le ferrocyanure de potassium, on voit d'après ces courbes que les mélasses de betteraves sucrières seules ou mélangées avec de la mélasse de dattes donnent de meilleurs résultats lorsqu'elles sont soumises à ce pré-traitement. On a vérifié également que l'acidité totale obtenue par fermenta- tion est plus importante quand des mélasses de betteraves sucrières pré-traitées sont utilisées seules et moins importante quand on utilise un mélange de 40% de mélasse de dattes et de 10% de mélasse de betteraves sucrières, n'ayant pas subi de prétraitement. Lorsqu'on utilise un mélange de mélasse de betteraves sucrières et de mélasse de dattes, on a constaté que la production d'acide citrique est maximum quand le milieu contient 25 % en volume de mélasse de betteraves sucrières contenant 150 gr/l de sucre et 25 % en volume de mélasse de dattes contenant 145 g/l de sucre, et que le rendement augmente d'environ 6 % par rapport à celui que l'on peut obtenir à partir de melasse de betteraves sucrières seules. La production maximale d'acide citrique est obtenue avec un substrat de mélasse contenant environ 270 gZl de mélasse de betteraves sucrières et 190 gZl de mélasse de dattes, ce qui correspond à un volume égal de chaque sorte de mélasse car leur densité est différente, ou encore à un milieu de culture contenant 150 g/l de sucre provenant de mélasse de betteraves sucrières et 145 g/l de sucre provenant de mélasse de dattes. Concentration initiale en sucre = 145 g/l Temps de culture = 5,5 jours. Traitement Acide citrique Poids de Sucre Acidité due à rendement basé produit (g/l) mycéliums résiduel l'acide citri- sur le sucre (g/l) (g/l) que (% total) consommé (%) Pas de pré-traitement et pas d'étape 75 22 12,5 83 57 de changement du pH Pré-Traitement par le ferrocyanure 91 16,4 10,8 82 68 (1000 ppm) Etape de changement de pH de 4,5 à 3 après 83 21 14,4 96 64 24 heures Pré-traitement par le ferrocyanure + étape de 116 16,2 15,1 95 92 changement de pH TABLEAU I EFFETS ADDITIONNELS DU PRE-TRAITEMENT PAR LA FERROCYANURE ET DE L'ETAPE DE CHANGEMENT DE pH SUR LA PRODUCTION D'ACIDE CITRIQUE. REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'acide citrique par fermentation, caractérisé en ce qu'on réalise la culture d'un microorganisme choisi dans le groupe comprenant l'Aspergillus Niger 1015, l'Aspergillus Niger 10577, l'Aspergillus Niger 11414, l'Aspergillus Niger 12846, i'Aspergillus Niger 9142, l'Aspergillus Niger 13794, l'Aspergillus Niger 26036, le Mucor Piriformis 16296 et leurs mutants sur un substrat de mélasse de betteraves sucrières et/ou de mélasse de dattes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est un mutant de l'Aspergillus Niger 9142 dont la mutation a été induite sous l'influence d'un rayonnement ultraviolet. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on réalise ladite culture au sein dudit substrat soumis à une agitation. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on traite au préalable le substrat de mélasse par addition de ferrocyanure de potassium. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 a 4, caractérisé en ce qu'on modifie nu moins une fois le pH dudit substrat au cours de la culture de manière à l'amener à une valeur au plus égale à 3. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on règle le pH à la valeur 2,7. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, caractérisé en ce qu'on modifie le pH au bout de 24 heures de culture. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que le pH initial dudit substrat est compris entre 4,5 et 6,5. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que le substrat de mélasse est constitué par un mélange de 25 % en volume de mélasse de betteraves sucrières contenant 150 g par litre de sucre et de 25 % en volume de mélasse de dattes contenant 140 g par litre de sucre.