FR 2351172 A1 19771209 FR 7614479 A 19760513 La présente invention concerne un nouveau procédé pour la biosynthèse d'un insecticide microbien contenant des spores et une endotoxine cristallisée, caractérisé en ce que l'on fait pousser un microorganisme du genre Bacillus thuringiensis ou un bacille voisin dans un milieu nutritif avec sporulation en évitant la lyse cellulaire prématurée provoquée par l'aération au cours de la culture submergée avant la fin de la sporulation. On sait que la lyse prématurée de cellules au cours de la culture conduit à des rendements plus failles et une cff icacité réduite du bioinsecticide,ainsi qu'à une augmentation de sa toxicité. L'invention concerne un procédé amélioré pour la production de spores et d'endotoxine cristallisée, dans laquelle la lyse prématurée des cellules bactériennes est produite habituellement par des processus enzymatiques qui sont induits par l'aération. Le retard de la sporulation pendant la croissance végétative de bactéries est attribué à l'action d'un ou dc plusIeurs inhibiteurs albuminoîdes. La dégradation protéolytique d'inhibiteurs proposés conduit à un début de sporulation. En outre, on a présenté diverses théories concernant la fonction de la protéase qui est l'un ces phénomènes prématurés liés au début de la sporulation ( J. Mandelstam et w,M. Waites, Biochem. J. volume 109, pages 793 à 801, 1968).Selon Schaeffer, on a proposé que, lors de la croissance des bactéries dans un substrat nutritif rapidement métabolisé et en présence d'une source d'azote utilisable, il se forme des produits d'échange c:ui supprimeraient la synthèse de protéases extracellulaires et d'une enzyme spécifique de la s sporulation, peut être de manière analogue au cycle de Krebs (P. Schaeffet, Bacteriol. Rev. volume 33, pages 48 à 71, 1969). Le résultat de cette suppression est l'accumulation d'acide acétique et d'acide pyruvique, ce qui provoque en général une chute du pH et une lyse prématurée des cellules bactériennes. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, on réussit à empêcher pendant la sporulation la lyse prématurée des cellules bactériennes, en effectuant la biosynthèse en conditions aérobies pendant 4 à 6 h et en maintenant le pH au cours de la biosynthèse dans l'intervalle de 6,3 à 7. I1 est notamment possible selon l'invention de récupérer les substances protéiques cristallisées accompagnant les spores (#-endotoxine) et de les débarrasser de l'exotoxine soluble dans l'eau (ss-exotoxine), qui doit être éliminée en raison de sa toxicité pour les mammifères. La meilleure technique pour l'élimination de l'exotoxine selon l'invention utilise des membranes semi-perméables. On sait que les micto-organismes du groupe Bacillus thuringiensis sont caractérisés par la formation de cristaux d'endotoxine contenant des protéines dérivant des spores. Le caractère pathogène par in-stion pour les insectes de Bacillus thuringiensis, vis-à-vis d'une gra@de série de larves de lépidoptères doit être tout d'abord attribué à l'activité de l'endotoxine. Certaines souches de Bacillus thuringiensis produisent) outre l'endotoxine intracellulaire, une exotoxine extracellulaire soluble d-rs l'eau et stable à la chaleur.On entend ci-après par exotoxine une substance active dérivée des cellules vivantes, qui se dépose dans le mi@ieu, contrairement à l'endotoxine qui n'est libérée qu'après la dés@@régstion des cellules. On décrit ci-après, pour une meilleure comprétension de l'invention, les caractéristiques des toxines ci-dessus mentionnées. Endotoxine cristallisée. Une inelusion cristallisée contenant une protéine a été isolée d'une cultur sporulée de Bacillus thuringiensis (C. L. Hannay et . @itz-James, CanJ J. Microbiol., volume 1, pages 694 a 710, 1955). les etRodes au microscope électronique ont montré qu'il y a formation, pendant la sporulation de Bacillus thuringiensis, d'un corps cristallin en plus de spores. On en a déduit l'existence d'une nouvelle relation entre la formation des spores et des cristaux d'endotoxine. Des études récentes ont montré que l'endotoxine cristalline consiste en un constituant protéique de poids moléculaire élevé et un squelette siliceux.On peut récupére les Furs et le cristaux d'endotoxine d'un milieu de culture dans @ sédiment d'une centrifugeuse à grand rendement. La séparation de l'endotoxide cristallisée des spores a été effectuée de diverses manières, par exemple par sédimentation fractionnée, sédimentation progressive et séparation dans un système à deux phases. Exotoxine. Outre l'endotoxine cristallisée, certaines souches de Bacillus thuringiensis précipitent dans le milieu pendant la phase de croissance végétative une fraction toxique chimiquement apparentée aux addninenucléotides. Il n'existe aucun lien entre la production de l'endotoxine cristalline et de l'exotoxine. Diapres les études effectuée, ltexotoxine ne peut être produite que par certains génotypes de variétés particulières de Bacillus thuringiensis. La méthode pour la production de l'exotoxine a été mise au point par De Barjac. Selon cette méthode, on cultive Bacillus thiringiensis dans un milieu qui, outre des sels minéraux, contient encore 0,75X de peptone et 1% de glucose, pendant 70 h à 30"C. La préparation des insecticides microbiens selon l'invention s'effectue de préférence par les étapes suivantes A) Culture. On obtient les cultures directement à partir des spores d'une culture d'origine de Bacillus thuringiensis. Le milieu nutritif pour la préparation de l'inoculum végétatif dans des flacons pour culture agitée a la composition suivante Bacto-tryptone ("Difcott) 0,8% en poids Glucose 2,5% en poids MgSO4,7H20 0,2% en poids ZnSO4,7H2O 0,2% en poids Fe2(S04)3 0,2Z en poids MnSO4,5H2O 0,1 / en poids Le milieu pour les cultures sur géloses inclinées est le même que ci-dessus avec une addition de 2% de gélose. On obtient de bons résultats en effectuant la culture dans les milieux suivants Milieu I Mélasse (50% de solides) 1,4% en poids levure 0,3% en poids (NH4)2SO4 0,1% en poids C.S.L. (liqueur de trempage de mats) 0,1% en poids CaCO3 0,1% en poids pH après stérilisation : 6,8. Milieu II Amidon 1,3% en poids Levure 1,0% en poids Na2HP04 0,4% en poids C.S.L. (liqueur de trempage de maîs) 0,2% en poids CaCO3 6,8% en poids pH après stérilisation : 6,8. Le milieu nutritif pour l'inoculum végétatif (300 ml) est contenu dans des flacons stérilisables à fond plat de 1 litre de capacité. On stérilise le milieu nutritif dans les flacons pendant 45 mn à 121"C. On stérilise séparément le glucose par la méthode de tindalisation et on l'ajoute par voie aseptique au milieu stérilisé. On prépare le milieu nutritif pour la culture en fermenteurs et on le stérilise par portions dans le fermenteur pendant 45 mn à 121"C. On effectue la culture dans des fermenteurs en acier inoxydable. On agite la culture à 150 tr/mn avec aération à 0,5 1 par litre et par minute et la température d'incubation est de 28 à 3O0C. On applique un "choc anaérobie" par interruption de l'aération pendant 3 à 6 h à la douzième heure de la culture submergée. On détermine l'instant de l'interruption d'aération au moyen de l'analyseur d'oxygène. On peut effectuer la culture sans lyse prématurée des cellules ni application du'choc anaérobie" décrit si l'on règle le pH pendant la culture de telle sorte qu'il ne tombe pas au-dessous de 6,3. La sporulation avec libération des cristaux d'endotoxine est terminée au bout de 35 à 40 h de culture. B) Séparation et purification. Après désagrégation complète des bactéries avec libération des spores et des cristaux d'endotoxine, on sépare les spores et l'endotoxine cristalline de l'exotoxine. On élimine l'exotoxine soluble dans l'eau, de préférence par dialyse. Selon cette méthode, on obtient un mélange de spores et d'endotoxine cristalline qui n'est pas toxique pour les mammifères. La présence ou l'absence d'exotoxine soluble dans l'eau est déterminée par l'essai biologique décrit par Bond et colt. On prépare un milieu nutritif pour l'essai biologique par chauffage d'un mélange de 10 g de gélose pulvérisée, 500 ml de lait frais et 7 g de levure.On transfère alors un échantillon de 10 ml dans une botte de Pétri contenant déjà 250pu de la solution d'essai. Dès que le gel s'est solidifié, on ajoute 20 oeufs de Musca domestica. On maintient les plaques pendant 48 h dans un incubateur à 30"C. On observe le développement des larves et la perturbation du gel de gélose (R.P.M. Bond, C.B.C. Boyce et S.J. French, Biochem. J. volume 114, pages 477 à 488, 1969). Le produit obtenu, qui est débarrassé de l'exotoxine soluble dans l'eau, peut entre traité de la manière habituelle et utilisé pour la préparation d'insecticides. C) Séchage. Le séchage peut s'effectuer selon l'une des méthodes sui vantes - Par agitation du mélange de spores et de cristaux d'endotoxine obtenu avec des argile bentonitiques et introduction dans un séchoir aéré à plaques, sous forme de pellicules minces, à une température de 4C à 45 C. - On met en suspension le mélange obtenu dans l'eau et on le sèche dans un séchoir rotatif ou pneumatique. - Par pulvérisation du mélange obtenu dans une opération de séchage par pulvérisation. D) Broyage et tamisage. Lorsque le séchage s'effectue dans un séchoir par pulvéri- station, le produit obtenu ne nécessite plus de broyage. Dans le séchage en séchoirs aérés sur des plaques on broie le produit dans un appareil du type Alpina et on le passe au tamis dont la finesse correspond au moins à environ 0,080 mm (tamis n 180). E) Détermination de l'activité. La détermination effectue selon les méthodes suivantes - Par comptage des spores vivants présents selon la méthode des plaques et essais biologiques sur des insectes. - Les prodults obtenus sont normalisés selon les déterminations standards des Laboratoires Français de Lutte Biologique et de Biocinétique de la Minière (I.N.R.A.). Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 h partir d'une culture d Bacillus thuringiensis var. Berliner, on effectue la culture en milieu liquide aéré en utilisant le milieu T ci-dessus selon la méthode décrite. La température d'incubation au cours de la culture submergée est d'environ 28 C. On agite à 150 tr/mn et le taux d'aération est de 015 1 par litre et par minute. Vers la douzième à quatorzième heure de culture on interrompt l'aération pendant 3 à 6 h. L'instant d'interruption de l'aération est déterminé au moyen de l'analyseur d'oxygène; on interrompt l'aération dès que le pourcentage de solubilité et de consommation de ltoxygène diminue et que le pH tombe à environ 5,8. Après 3 à 6 h, on reprend l'aération à la mdme vitesse de 0,5 1 par litre et par minute.On peut effectuer la culture sans lyse prématurée sans anaérobiose si le pH du milieu est maintenu dans l'intervalle de 6,3 à 6,5. On effectue à nouveau la culture submergée jusqu'à ce que les spores et l'endotoxine cristalline soient accumulées dans le milieu (en moyenne 35 à 40 h). On verse alors le milieu de culture dans le récipient où l'on effectue la purification pour séparer l'exotoxine soluble dans l'eau que l'on met en oeuvre par dialyse. On peut utiliser à cet effet un appareil tel que représenté dans la figure annexée. On remplit avec le milieu de culture d du fermenteur le récipient A qui est maintenu par un support c et muni d'un agitateur e et d'une membrane de dialyse a. La membrane peut être collotdale ou de tout autre type habituel dans la pratique.La dialyse a lieu plus rapidement lorsque l'on ajoute, dans le récipient B, de l'eau désionisée b. On détermine la prdsence ou l'absence d'exotoxine soluble dans l'eau par l'essai biologique décrit ci-dessus. On ajoute une matière de charge en poudre au mélange d stores et d'endotoxines cristallines obtenu et on sèche le m mélange sur des plaques dans un four de séchage. On broie le produitr. obtenu dans un appareil du type Alpina et on le tamise pour obtenir une poutre. EXEMPLE 2 Le mode opératoire est le même qu'à l'exemple 1, mais on utilise le milieu Il ci-dessus pour la culture submergée en fermenteur. EXEMPLE 3 On procède comme à l'exemple 1 mais après la culture submergée des bactéries et la dialyse, c'est-à-dire après l'élimination de l'exotoxine, on sèche le produit obtenu dans un séchoir centrifuge et ensuite on le br@is dans un appareil Alpine. EXEMPLE 4 Le mode opératoire est le même qu'à l'exemple l, mais,après la culture submergée des bactéries et la dialyse, on remet le produit obtenu en suspension dans une certaine quantité d'eau et on pulvérise cette suspension dans un séchoir à pulvérisation. La température du séchoir est de 90-100 C. Les séchoirs à pulvérisation présentant des disques tournant à 10 000-15 000 tr/sn sont tout b fait appropriées à cet effet. Le produit est une poudre très fine qui doit encore être, soit broyée soit tamisée. L'exotoxine n'est pas présente dans ce produit final. L'invention peut aussi être appliquée à d'autres souches de ce type de bactéries, par exemple Bacillus thuringiensis var. sotto, Bacillus thuringiensis var. subtoxicus, etc. Toutes ces bactéries sont décrites en détail dans la littérature. Un avantage de l'invention réside dans l'activité plus éle- vée du produit obtenu et l'excellente pureté du produit en ce qui concerne l'exotoxine, pour des rendements élevées en spores et endotoxines cristallisées. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de mise en oeuvre préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changement sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1 - Procédé pour la biosynthèse d'un insecticide microbien contenant des spores et une endotoxine cristallisée, caractérisé en ce que l'on fait pousser un micro-organisme du genre Bacillus thuringiensis ou un bacille voisin dans un milieu nutritif avec sporulation en évitant la lyse cellulaire prématurée provoquée par l'aération au cours de la culture submergée avant la fin de la sporulation. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on purifie par dialyse l'insecticide microbien obtenu pour séparer l'exotoxine hydrosoluble toxique. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue la fermentation de Bacillus thuringiensis sans lyse avant la fin de la sporulation en interrompant l'aération et en effectuant la fermentation temporairement en conditions anaérobies. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue la fermentation sans lyse cellulaire de Bacillus thuringienis avant la fin de la sporulation en maintenant le pH au cours de la 'culture dans l'intervalle de 6,3-7. 5 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on sépare le matière contenant les spores et l'endotoxine cristalline de l'exotoxine toxique par dialyse b travers une mer.tbrane semi-perméable.