FR 2353294 A1 19771230 FR 7616391 A 19760531 La présente invention concerne de nouveaux composés organiques et plus particulièrement de nouveaux antibiotiques et leur procédé de préparation. Ces nouveaux composés peuvent être représentés par la formule générale dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un radical formyle ou alcanoyle contenant jusqu'à 12 atomes de carbone. Les trois antibiotiques dans lesquels R représente un atome dthydrogene, un radical acétyle,ou un radical propionyle, respectivement, sont désignés par AM 31a, AM 317 et AM 31ss, respectivement, et sont obtenus par fermentation.Les composés dans lesquels R représente un radical formyle ou alcanoyle peuvent être facilement préparés par formylation ou alcanoylation de l'antibiotique AN 31a par des techniques classiques bien connues. L'invention comprend également les antibiotiques sous forme diluée, sous forme de concentrés bruts, et sous forme cristalline pure. La structure de ces nouveaux antibiotiques, ainsi que leurs propriétés chromatographiques et spectrales, les différencient des agents antibactériens décrits auparavant. Les nouveaux antibiotiques selon l'invention forment des sels d'addition d'acides avec un grand nombre de réactifs formant de tels sels pharmaceutiquement acceptables. C'est ainsi que l'on forme des sels d'addition d'acidespar mélange de la base antibiotique avec un, deux ou trois (lorsque R représente un atome d'hydrogène) équivalents d'un acide, convenablement dans un solvant neutre, par exemple avec des acides tels que l'acide sulfurique, phosphorique, chlorhydrique, bromhydrique, nitrique, citrique, lactique, tartrique etacétique, et les acides analogues. Selon l'invention, les bases libres antibiotiques sont équivalentes aux sels d'addition d'acidesnon toxiques. Les nouveaux antibiotiques AM 31a, AN 31 et AN 31y sont formés par culture dans des conditions contrôlées d'une nouvelle souche de Streptoverticillium netropsis. Cette nouvelle souche produisant les antibiotiques est isolée du sol proche de Emna, Indiana, E.U.A. Une culture viable du nouveau micro-organisme a été déposée au Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois. Cette souche est déposée sous le n" NRRL 5774. La description et l'identification de ce nouveau microorganisme, conservé par la Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York sous le n" AM 31,ont été effectuées par le docteur H.D. Tresner appartenant à ces laboratoires. On trouvera ci-dessous une description générale du micro-organisme Streptoverticillium netropsis, surla base des caractéristiques diagnostiques observées. On a effectué des observations concernant les caractéristiques de culture, physiologiques et morphologiques de l'organisme, selon les techniques décrites par Shirling et Gottlieb (Shirling, E.B. et D. Gottlieb, 1966, MethOds for characterization of Streptomyces species. (Internat. Journ. Syst. Bacteriol. 16 : 313-340).On trouvera dans les tableaux I-IV ci-après des détails de description, et une description générale de la culture est donnée ci-dessous. L'échelle de coloration est celle de Jacobson et coll. (Jacobson et coll. 1948, Color Harmony Nanual. 3ème édition. Container Corporation of America, Chicago). Croissance Intense sur la gélose de Bennett, de Kuster aux flocons d'avoine, de Hickey et Tresner, de farine d'avoine/pâte de tomate et gélose nutritive; bonne sur les géloses à l'extrait de levure, asparagine/dextrose, de Benedict et au riz ; modérée sur les géloses porine de terre/dextrose, et faible sur la gélose à la solution de Czapek. Mycélium aérien et sporulation: Mycélium aérien rosatre-blane, devenant Pearl Pink (3 ca) à Bisque (4 ec) et Cork Tan (4 ie) dans les zones à sporulation de la plupart des milieux. Pigments solubles Jaunâtre à jaunatre-brun ou brunâtre sur plusieurs milieux ; aucun sur les géloses à l'extrait de levure, amidonisels inorganiques, et à la solution de Czapeck. Coloration du verso Jaunâtre-brun à brunâtre sur la plupart des milieux. Réactions physiologiques diverses Peptonisation totale du lait au pourpre ; pas de formation de spirales ; pas de réduction des nitrates en 14 jours ; liquéfaction totale de la gélatine en 7 jours ; uniquement des traces de pigments mélanoRdes- sur une gélose peptone-fer ; tolérance à NaCl sur une gélose à l'extrait de levure supérieure ou égale à 7 X, mais inférieure à 10 %. Utilisation des sources de carbone, selon Pridham et Gottlieb (Pridham, T.G. et D. Gottlieb, 1948) : "The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination. J.Bacteriol. 56 : 107-114" page 5 bonne utilisation du i-inositol; du glycérol, du d-tréhalose, et du dextrose utilisation médiocre à nulle de ltadonitol, du l-arabinose, du d-galactose, du d-fructose, du lactose, du d-mannitol, du d-mélibiose, d-raffinose, du l-rhamnose, de la salicine, du saccharose et du d-xylose. Micromorphologie Chaînes de spores sous forme de branches monoverticillées régulièrement espacées. sur le mycélium aérien. Les chaînes de spores élémentaires se terminent fréquemment par des crochets ou des spirales à un ou deux tours. Spores allongées cylindriques. La plupart des chaînes de spores contiennent quelques spores phalangiformes. Dimensions des spores 0,5-0,6#u x 1,0-1,2#u. La surface des spores est lisse par microscopie électronique. La culture n AM 31 appartient au genre Streptoverticillium des Actinomycétales. Ce genre est caractérisé par des chaînes de spores en verticilles environ 40 membres reconnus. Lorsque l'on effectue une comparaison avec les descriptions publiées (Locci, R., E. Baldacci, and B. Petrolini Baldan. 1969. "The genus Streptoverticillium n ; "A taxonomic study" Giornale di Nicrobiologia 17 : 1-60 ; (Shirling, E.B. and D. Gottlieb. 1968 "Cooperative description of type cultures of Streptoayces III" Internat. Journ. Syst. Bacteriol. 18 : 279-392), ainsi qu'avec les spécimens disponibles, on s'aperçoit que la culture n AN 31 correspond très étroitement au Streptover ticiîlium netropsis. Pour l'obtention des nouveaux antibiotiques AM 31a, AM 31ss et AM 31&gamma; l'invention n'est bien entendu pas limitée à ce micro-organisme particulier ou aux micro-organismes correspondant tout à fait aux caractéristiques microscopiques et de croissance indiquées, qui ne sont données quwà des fins d'illustration. En fait, on pense utiliser des mutants obtenus a partir du micro-organisme décrit, par différentes techniques, par exemple exposition d des rayons X, à un rayonnement ultraviolet, à des actinophages, de la moutarde azotée, et analogues. Fermentation La culture du micro-organisme Streptoverticillium netropsis NRRL 5774 peut être effectuée dans un grand nombre de milieux de culture liquides. Les milieux utiles pour l'obtention des trois antibiotiques comprennent une source de carbone assimilable telle qu'amidon, sucre, mélasses, glycérol, etc., une source d'azote assimilable telle que protéines, hydrolysats de protéines, polypeptides, aminoacides, liqueur de macération du mails, etc., ainsi que des cations et anions inorganiques tels que sodium, potassium, calcium, sulfate, phosphate, chlorure, etc. Des traces d'éléments tels que le bore, le molybdène, le cuivré, etc., sont introduitssous forme d'impuretés contenues dans d'autres constituants du milieu.L'aération dans les réservoirs et flocons est obtenue par de l'air stérile que l'on force dans ou a la surface du milieu de fermentation. Une agitation supplémentaire dans les réservoirs est obtenue au moyen d'un agitateur mécanique. On peut ajouter, si cela est nécessaire, un agent anti-mousse tel que l'huile de lard. Préparation d'un inoculum On prépare un inoculum en flacon secoué de Streptoverticillium netropsis NRRL 5774 par inoculation de 100 ml d'un milieu liquide stérile, dans des flacons de 500 ml,par des eaux de lavage ou des frottis de spores provenant d'une plaque de gélose de la culture. On trouvera ci-dessous un exemple d'un milieu convenable: Amidon de mais 24 g Bactotryptone 5 g Extrait de levure 5 g Extrait de boeuf 3 g Glucose 1 g Eau .........qsp 1000 ml Le pH est réglé 7,0 par NaOH. On effectue une incubation des flacons a 25-29 C, de préférence 280C,et l'on agite vigoureusement dans un dispositif d'agitation rotatif, durant 30 9 48 h. Ces fractions de 100 ml d'inoculum sont utilisées pour inoculer des fractions de 1 et 12 1 du même milieu, dans des fermenteurs en verre de 2 et 20 1, à 28 C. La masse inoculée est aérée par de l'air stérile durant la croissance, que l'on continue durant 40 a 45 h. Ces fractions sont utilisées pour inoculer les fermenteurs. Fermentation en réservoir Pour l'obtention des antibiotiques AM 31a, AM 31ss et AN 317 dans des fermenteurs, on utilise de préférence le milieu suivant Farine de soja 40 g Mélasses........... 20 g Glucose............ 10 g Carbonate de calcium 3 g Eau . qsp 1000 ml. On inoculechaque cuve avec 3 à 107. d'inoculum préparé comme décrit ci-dessus. On effectue l'aération à un débit de 0,2-0,8 1 d'air stérile par litre de bouillon et par minute et on agite le mélange de Lermen- tation au moyen d'un agitateur à hélice tournant à 200-400 tr/mn. On maintient la température à 25-29 C, ordinairement 280C. On poursuit ordinairement la fermentation pendant 80 à 100 h, après quoi on récolte la bouillie. Isolement du mélange des antibiotiques AM 31a, AM 31ss et AM 31y: Lorsque la fermentation est terminée, on filtre la bouillie recueillie et on fait passer le filtrat a pH 7,8, à un débit de 250 ml/mn, à travers une colonne d'échange d'ions contenant 5 1 d'une résine échangeuse d'ions du type acide méthacrylique-divinylbenzène vendue sous le nos d'Amberlite IRC-50, sous la forme NH4+. Après avoir lavé la colonne avec 25 1 d'eau désionisée, on élue la matière douée d'activité antibiotique avec 30 1 de NH40H 2N et on la décèle par l'essai classique de diffusion sur disque de gélose contre Klebsiella pneumoniae. On réduit les 30 l d'éluat à pH 11,7 jusqu'à 2 1 et on ajuste à pH 8,1 par HCl 0,1 N.On adsorbe les antibiotiques contenus dans.ce concentrat sur une résine échangeuse d'ions acide méthacryliquedivinylbenzène vendue sous le nom d'Amberlite CG-50, sous Il forme Ni, , dans une colonne et on élue par NH4OH 1.5N. On concentre l'éluat dela colonne dans un évaporateur rotatif jusqu'à 65 ml d'un sirop visqueux orange. On fait passer ce concentrat dans une colonne contenant une résine triméthylbenzylammoniumpolystyrène réticulée par 2 7. de divinylbenzène (0,149-0,297 mm) sous la forme OH et on développe la colonne par l'eau. On divise l'effluent bioactif en deux fractions principales selon la couleur visible et la bioactivité.Une fraction (I) contient un mélange des antibiotiques AN 31a, R et y scus forme d'une poudre blanche sensiblement exempte d'impuretés indésirables. La fraction,obtenue à l'état liquide à cause des impuretés, peut être ensuite traitée pour donner davantage de mélange antibiotique. On fait passer cette fraction liquide à travers une colonne contenant une résine Dowex 1-X2 sous la forme OH (0,037-0,074 mm). On développe la colonne par l'eau et on obtient trois fractions principales, deux fractions (II et IV) sous forme d'une poudre blanche et une fraction (III) sous forme d'un sirop jaune épais.On purifie ensuite ce sirop jaune par adsorption sur une colonne contenant une résine de polystyrène sulfoné réticulée par 8 X de divinylbenzène, vendue sous le nom de Dowex 50-X9, sous la forme H . On rince la colonne avec 250 ml d'eau et on élue les antibiotiques avec 500 ml de NH40H 1,5N. On obtient deux fractions bioactives dans les portions 60-70 ml et 290-700 ml de l'éluat de la colonne. On réduit chaque fraction jusqu'a un faible volume à l'évaporateur rotatif et ensuite on les lyophilise pour obtenir une poudre blanche fine (v) et une poudre hygroscopique blanche (VI). Toutes les fractions contiennent des mélanges des trois constituants Séparation des antibiotiques AM 31a, AN 31 et AM 31y par chromatographie sur papier On différencie les constituants les uns des autres par chromatographie sur papier en utilisant le butanol-l saturé par l'eau et additionné de 2 % d'acide p-toluènesulfonique. Les valeurs de R f obtenues par le réactif à la ninhydrine sont de 0,61 ; 0,43 et 0,31. Activité in vitro Le mélange des antibiotiques AM 31a, ss et r est actif contre une grande variété de bactériesgram-positf et gram-négatif, comme on le détermine par la technique normalisée de diffusion sur gélose avec puits. Les résultats de cet essai sur le complexe des trois constituants apparaissent dans le tableau V ci-après. Résultats in vivo Les trois constituants antibactériens AM 31a, AM 31ss et AM 31y sont actifs in vivo contre divers micro-organismes. Ces nouveaux antibactériens sont donc potentiellement intéressants comme agents thérapeutiques dans le traitement des infections bactériennes chez les mammifères. On peut s'attendre que les nouveaux antibactériens soient utilisés de manière utile pour le traitement ou la lutte contre les infections bactériennes, par administration parentérale. L'utilité de ces nouveaux agents antibactériens est démontrée par leur aptitude a combattre des infections mortelles générales ches les souris.Un mélange de ces trois nouveaux antibiotiques présente une activité antibactérienne élevée in vivo chez la souris contre Escherichia coli, Salmonella typhosa et Klebsiella pneumoniae, lorsqu'on l'administre en une seule dose sous-cutanée à des groupes de souris Carworth Farms CF-1 pesant environ 20 g, infectées par voie intrapéritonéale avec 0,5 ml de la dilution indiquée d'un bouillon de culture de 5 h des organismes suivants : Escherichia coli, 10 ; Salmonella typhosa, non diluée ; Klebsiella pneumoniae, 10-4. Le tableau VI ci-après illustre l'activité antibactérienne in vivo d'un mélange des antibiotiques AM 31a, AM 31 et AM 31&gamma; contre ces trois bactéries. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1. Préparation de l'inoculum On prépare un milieu stérile caractéristique utilisé pour faire pousser l'inoculum primaire, ayant la composition suivante : Amidon de maïs.......... 24 g Bactotryptone 5 g Extrait de levure 5 g Extrait de viande de boeuf 3 g Glucose 1 g Eau................qsp 1000 ml On ajuste le pH à 7,0 par NaOH. On utilise des spores de Streptoverticillium netropsis NRRL 5774, obtenues par lavage ou grattage d'une gélose inclinée, pour inoculer deux flacons de 500 il contenant chacun 100 ml d'un milieu stérile ci-dessus. On place les flacons dans une secoueuse rotative et on agite vigoureusement pendant 48 h à 28 C. On transvase l'inoculer résultant dans un fermenteur en verre de 18,9 1 contenant 12 1 du meme milieu stériLe. On aere la bouillie d'inoculum avec de l'air stérile pendant la culture pendant 48 h a 280C, apres quoi on utilise le contenu du fermenteur pour ensemencer un fermenteur de 300 1. Exemple 2. Fermentation On prépare un milieu de fermentation de composition suivante: Farine de soja.......... 40 g Mélasses................ 20 g Glucose................. 10 g Carbonate de calcium 3 g Eau............... qsp 1000 ml On utilise 12 1 d'înoculum préparé comme décrit à l'exemple 1 pour inoculer 300 1 du milieu de fermentation stérilisé ci-dessus. On effectue la fermentation pendant 89 h a 28 C avec un taux d'aération de 0,5 1 d'air par litre de bouillie et par minute. On agite la bouillie avec un agitateur à hélice tournant à 300 tr/mn. On récolte la bouillie. Exemple 3. Isolement d'un mélange d'antibiotiques AM 31a, AM 315 et AN 31y On filtre une portion de 300 1 d'une bouillie récoltée complète préparée comme décrit a l'exemple 2. On fait passer le filtrat qui a un pH de 7,8 un débit de 250 ml/mn à travers une colonne de 10 x 152 ci contenant 5 1 de résine Amberlite IRC-50 sous la forme NH4. On lave la colonne avec 25 1 d'eau désionisée. On élue l'activité antibiotique avec 30 1 de NH40H 2N et on la décèle par l'essai de diffusion sur disque de gélose contre Klebsiella pneumoniae.On réduit les 30 1 d'éluat à pH 11,7 a 2 1 et on ajuste à pH 8,1 par HCl O, lN. On adsorbe 1 1 de ce concentrat sur une colonne de 3 x 52 cm contenant une résine Amberlite CG-50 sous la forme NH4 et on élue par 500 ml de NH40H 1,5N. On effectue un essai en duplication avec le concentrat de 1 1 restant, oa combine les éluats des deux essais et on concentre à l'évaporateur rotatif jusqu'á 65 ml d'un sirop visqueux orange. On fait passer ces 65 mi de concentra t 9 travers une colonne de 2 x 54 cm contenant une résine Dowex 1-X2 sous la forme OH (0,149-0,297 mm) et on développe la colonne par l'eau. On divise l'effluent bioactif en deux fractions d'après la couleur visible et la bioactivité.On recueille une fraction d'après la portion de 735-1200 ml d'effluent de la colonne. On le lyophilise pour obtenir 132 mg d'une poudre blanche (I). On obtient l'autre fraction à partir de la portion de 270-734 ml de l'effluent de la colonne. Lorsqu'on la lyophilise, elle reste à l'état liquide en raison des impuretés. On dissout la fraction liquide dans l'eau et on fait passer la solution à travers une colonne de 1,5 x 21 cm de résine Dowex 1-X2 sous la for e OH (0,037-0,074 mm). A mesure que l'on développe la colonne par l'eau, on obtient trois fractions principales avec les volumes d'élution suivants fraction II, 55-114 ml ; fraction IV, 361-775 mi ; et fraction III, 115-360 ml d'effluent de la colonne. On lyophilise les fractions Il et IV pour obtenir 4,76 g et 2,15 g d'une poudre blanche, respectivement.On concentre la fraction III jusqu 75 ml d'un sirop jaune que l'on adsorbe sur une colonne de 3 x 30 c. de résine Dowex 50-X8 sous la forme H . On rince cette colonne avec 250 ml d'eau et on élue ensuite avec 500 ml de NH40H 1,5N. On obtient deux fractions bioactives dans les portions 60-70 ml et 290-700 ml de l'effluent de la colonne. On réduit chaque fraction a un faible volume en évaporateur rotatif, on lyophilise et on recueille les solides, pour obtenir 685 mg d'une poudre fine (fraction v) et 6,78 g d'une poudre hygroscopique blanche traction VI). Rendement total 12,572 g. Les spectres infrarouge et de résonance magnétique nucléaire suggèrent que les fractions ci-dessus sont toutes des mélanges des constituants &alpha;, ss et &gamma; ayant sensiblement la même composition. Fraction II : [&alpha;]D25 =85,0#2,4 (c = 0,41, dans H20). Analyse élémentaire : trouvée : C:42,03 % ; H:8,08 Z ; N:10,47 Z. Les spectres de résonance magnétique nucléaire et infrarouge d'un mélange des constituants sont indiqués dans les figures 1 et 2 du dessin annexé respectivement. Exemple 4. Préparation du dérivé N-acétyl-O-triméthylsilyl du complexe antibiotique AN 31 On prépare le dérivé N-acétyl-O-triméthylsilyl du complexe antibiotique AN 31 de ia manière suivante pour la caractérisation par le spectre de masse. On mélange 4 mg du complexe AM 31 avec 0,50 ml de méthanol et 0,30 ml d'anhydride acétique. On laisse reposer cette solution pendant une nuit à la température ambiante. On précipite le dérivé N-acétylé par 3-4 ml d'éther diéthylique, on lave plusieurs fois par l'éther diéthylique et on sèche dans un exsiccateur.On prépare alors le dérivé O-triméthylsilyl par addition de 0,5 ml d'un mélange tout prêt contenant du triméthylchloro silane,vendu par la Société Pierce Chemical Company, de Rockford, Illinois, sous le nom de TRI-SIL. La silylation s'effectue dans un exsiccateur pendant 2 h à température ambiante, après quoi on élimine l'excès de réactif sous vide. On redistribue le résidu dans le benzène. On sépare la matière soluble dans le benzène d'un éventuel résidu solide et on évapore la solution jusqu'a un résidu en courant d'azote. Les données du spectre de masse du dérivé N-acétyl-Otriméthylsilyl sont indiquées dans les tableaux VII et IX ci-après. Le spectre de masse du produit de dégradation du complexe An 31, le dérivé N-acétyl-Otriméthylsilyl du diaminobisdésoxyalditol, est indiqué dans le tableau VIII ci-après. Ces spectres sont obtenus avec un appareil de chromatographie gazeuse/spectre de masse Varian CH7 ayant un pouvoir séparateur M/A H de 2000, une tension de ionisation de 70 eV et une température de source de 2000 C. Les conditions de chromatographie gazeuse sont les suivantes la colonne pour la chromatographie en phase gazeuse a une longueur de 1,8 m. Le support consiste en 0,7 Z de OV-l sur du verre Chrom Q (0,074-0149 mm). La température de la colonne est de 230 C, la température de l'orifice d'injection est de 2500C et la température du détecteur de 2100 C. Le gaz de support est l'azote. Les temps de rétention des constituants sont de 24 mn et 27,4 mn. Exemple 5. Séparation des constituants antibiotiques par chromatographie sur papier On différencie les trois constituants du mélange antibiotique en utilisant du butanol-l saturé par de l'eau additionnée de 2 % d'acide p-toluènesulfonique. Les valeurs de R f des constituants, obtenues par le réactif la ninhydrine, sont de 0,61, 0,43 et 0,31. Exemple 6. Préparation et identification du fragment diaminoalditol du complexe antibiotique AM 31 On chauffe un échantillon de 100 mg d'antibiotique AN31 dans 5 ml de HC1 6N pendant 16 h à 1400C. On filtre lthydrolysat résultant pour séparer un précipité noir important, on évapore jusqu'a un résidu et on le dissout dans 1 ml d'eau. On verse cette solution sur une colonne de 1 x 2 cm de Dowex 1-X2 sous la forme OH (0,037-0,074 mm), puis on ajoute 5 fois le volume du lit d'eau. On recueille par lyophilisation de l'effluent de colonne 33,9 mg d'un solide hygroscopique brun foncé.On utilise une portion de 10 mg pour préparer un dérivé N-acétyl-O-triméthylsilyl en vue des études de spectre de masse de la manière suivante : on mélange 10 mg du produit avec 1,25 ml de méthanol et 0,75 ml d'anhydride acétique et on laisse reposer pendant une nuit a la température ambiante. On precipite le composé N-acétylé avec 3-4 ml d'éther diéthylique, on lave plusieurs fois par l'éther diéthylique et on sèche dans un exsiccateur et on effectue la silylation par un mélange tout prêt contenant du triméthylchlorosilane vendu par la Société Pierce Chemical Company, de Rockford, Illinois, sous le nom de TRI-SIL. Lasilylation s'effectue dansunexsiccateurpendant 2 h A température ambiante, après quoi, on élimine l'excès de réactif sous vide. On redistribue le résidu dans le benzène.On sépare la matière soluble dans le benzène d'un éventuel résidu solide et on évapore la solution jusqu'a obtenir une résine claire dans un courant d'azote. Exemple 7. Préparation et identification du fragment glucosamine de l'antibiotique AM 31 Qn dissout une portion de 5 mg d'antibiotique AM 3-1 dans 3 ml de HC1 3N et on chauffe dans une fiole scellée a 100-llO"C pendant 5 h. On évapore le produit jusqu'a un résidu que l'on redissout dans l'eau et on évapore pour séparer les fumées de HC1. On dissout le résidu dans 0,5 ml d'eau et on en asperge des feuilles de papier Whatman n 1. On développe les chromatogrammes par la techniques descendante et on laisse le solvant s'égoutter hors des feuilles. L'hydrolysat d'AM 31 comprend un constituant qui ne se différencie pas de la glucosamine par la mobilité et les réactions colorées dans les systèmes suivants : butanol-l-pyridine-eau (6:4:3) 11,0 cm par rapport l'origine ; acétate d'éthyle-pyridine-eau 72:20:23 1,5 cm par rapport l'origine. On décèle les zones par la ninhydrine et le réactif de Pollens. Exemple 8. Préparation du dérivé butyrylé de l'antibiotique AM 31a On chauffe au reflux pendant 7 h 30 mn une solution de 10 g d'un mélange de AM 31g et AH 31r, 11,3 g de dimédone et 200 ml de pyridine, puis on laisse reposer à la température ambiante pendant une nuit. On évapore la pyridine sous pression réduite et on traite le résidu par 150 ml d'un mélange méthanol-eau 1:1 et 1,3 g de dimédone et on chauffe au reflux la solution résultante pendant 6 h. On élimine complètement le solvant sous pression réduite pour obtenir un solide gommeux jaune. Par trituration avec 2 7. de 50 ml d'éther diéthylique, on obtient après séchage à l'air 21,6 g d'un solide jaune. On dissout le solide dans 250 ml d'un mélange méthanol-eau 1:1 et on place la solution sur une colonne contenant 350 ml de résine Dowex 1-X2 sous la forme OH . On élue la colonne avec un mélange méthanol-eau 1:1 jusqu'à ce que l'on ne puisse plus déceler de produit sur une plaque de chromatographie sur couche mince (on utilise 2,5 1 d'éluant). On place l'éluat sur une colonne contenant 800 ml de résine Dowex 50-X4 sous la forme R+. On rince ia colonne avec 600 ml d'eau, ensuite on élue par la pyridine à 2 X dans l'eau. La fraction d'éluat comprise entre 2,5 et 5,5 1 contient le produit. On élimine le solvant sous pression réduite pour obtenir une mousse gommeuse jaune pale qui est le dérivé bis-dimédone (II) (II) (R=acétyle ou (III) propionyle) On dissout la mousse dans 200 ml d'eau, on traite par 25 g d'hydroxyde de baryum hydraté et on chauffe le mélange au reflux pendant 1,25 h. On filtre le mélange et on traite le filtrat par le dioxyde de carbone à pH 6,0.On filtre le mélange, on lave le gâteau de filtration avec environ 100 ml d'eau et on place le filtrat sur une colonne de 700 ml de résine Dowex 50-X4 sous la forme H . On lave la colonne avec 1 1 d'eau, 2 1 de pyridine à 2 % dans l'eau et ensuite on élue avec 3 1 d'hydroxyde d'ammonium 2N. On évapore l'éluat sous pression réduite pour obtenir 9,8 g d'une mousse jaune. On lyophilise la mousse et on obtient 8,9 g d'un solide de couleur crème de très faible densité, qui est l'intermédiaire protégé (III). On refroidit a % C. une solution de 11,8 g de l'intermédiaire protégé (III) dans 400 ml de méthanol et on traite par 20 ml d'anhydride butyrique. On agite le mélange 0 C pendant 1 hpuis a la température ambiante pendant 16 h. On concentre la solution sous pression réduite, on dissout le résidu dans 300 ml d'un mélange méthanol-eau 1:1 et on place la solution sur une colonne de 700 ml de résine Dowex50z4 sous la forme H+. On lave la colonne avec 2 1 de mélange méthanol-eau 1:1, puis on élue par la pyridine a 2 7. dans l'eau. Le produit (IV) est élué dans la fraction comprise entre 2,5 et 4,5 1 d'éluat. On évapore l'éluat sous pression réduite et on hydrolyse la gomme résiduelle sans purification supplémentaire. On dissout l'antibiotique protégé (IV) (environ 12 g) dans 400 nil d'eau, on refroidit à 0-5 C et on traite avec une solution préalablement refroidie (50C) de chlore a 3Z dans le tétrachlorure de carbone. On traite le mélange avec 50 ml de méthanol et on agite a 0-5 C pendant 30 mn. On sépare les couches et on lave la portion aqueuse avec 100 ml de tétrachlorure de carbone, puis avec deux fois 100 ml de chloroforme et on traite avec l'hydroxyde d'ammonium concentré jusqu'à pH 5,0 (volume nécessaire environ 5 ml). On traite cette solution avec une solution de bisulfite de sodium dans l'eau pour éliminer le traces de chlore (détection a l'essai amidon-iodure). On traite ensuite à nouveau par l'hydroxyde d'ammonium jusqu'a pH 5,0 (encore 4 ml). On évapore la solution de l'antibiotique brut (V) sous pression réduite jusqu'a un volume de 25-50 ml et on le soumet à la chromatographie. Exemple 9. Purification du dérivé butyrylé (V) de l'antibiotique AM 31 On place la solution (10 ml) de l'antibiotique brut (V) sur une colonne de 1,5 x 22 cm de résine Amberlite XAD-2. On élue ensuite la colonne par 250 ml de chacun des solvants suivants : méthanol, méthanol aqueux a 50 Z et eau. L'antibiotique est élué de la colonne dans la portion de 12-144 ml de l'effluent et on le décèle par l'essai de diffusion sur gélose (disque de papier) avec Klebsiella pneumoniae conne micro-organisme d'essai. On évapore cette fraction sous vide jusqu'à un résidu que l'on dissout dans l'eau et lyophilise pour obtenir 8,6 g d'une poudre blanche.On dissout 7 g de cette substance dans un faible volume d'eau et on l'adsorbe sur une colonne de 2 x 32 cm de résine Dowex 50-X8 sous la forme NH4+ (0,149-0,297mm). On rince la colonne avec 250 ml d'eau et ensuite on élue avec 250 ml de .NH40H l,iN 5N tandis que l'on recueille des fractions de 7 ml. L'antibiotique, décelé dans les fractions 32-67 par l'essai au disque de gélose, est recueilli par évaporation sous vide des fractions réunies jusqu'à un résidu que l'on dissout dans l'eau et on lyophilise pour obtenir 475 mg d'une poudre blanche. On identifie l'antibiotique par le spectre de masse d'un dérivé N-acétyl-O-triméthylsilyl ayant des ions caractéristiques m/e 912 (M±15), 722, 663 et 448.Le spectre de RMN présente des pics a 1,01 (CH3, t), 1,78 (CH2, m) et 2,44 (CH2, t) pour le groupe butyryle, conjointement avec les signaux attendus pour les autres parties de la molécule, L'activité in vitro de ce dérivé butyrylé est semblable a celle de l'antibiotique AM 31ss et il protège les souris contre les infections mortelles par Klebsiella pneumoniae à une dose de 256 mg/kg de poids corporel. Exemple 10. Préparation des derivés octanovlé et dodécanovlé de l'antibiotique AM 31a On prépare les dérivés octanoylé et dodécanoylé de l'antibiotique AM 31&alpha; par le mode opératoire de l'exemple 8, sauf que l'on utilise l'anhydride caprylique et l'anhydride laurique, respectivement, 8 la place de l'anhydride butyrique de cet exemple. Ces dérivés possèdent une activité in vitroXmais sensiblement inférieure (environ 1/50) a celle de l'antibiotique AM 31ss. Exemple 11. Préparation de l'antibiotique AM 31ss a partir du diaminoalditol On prépare le N,N'-diéthoxycarbonyldiaminoalditol (VI) à partir du diaminoalditol (obtenu à partir de l'hydrolysat d'antibiotique) par un mode opératoire sensiblement identique a celui décrit par Nishinaira et coll. dans Bull. Chem. Soc. Japan 43, page 2960 (1970) pour préparer la N,N-diéthoxycarbonyldésoxy-2 streptamine. A une solution de 5,0 g de (VI) dans le diméthylformamide anhydre,on ajoute 500 mg d'acide p-toluènesulfonique anhydre et 10 ml de diméthoxy-l,l cyclohexane anhydre. On agite la solution résultante à 5O0C sous 33 mmHg pendant 2 h et ensuite on l'évapore jusqu'à un résidu que lton mélange vigoureusement avec l'acétate d'éthyle et une solution aqueuse saturée d'hydroxyde de baryum. On sépare la couche organique, on la lave à l'eau et on l'évapore pour obtenir 5,2 g du mono-O-cyclohexylidène N,N-diéthoxycarbonyldiaminoalditol (VII).On mélange une solution de 1,0 g de (VII) dans 20 ml de mélange anhydre benzène-dioxanne 2:1 avec 2,0 g de Drierite, 2,0 g de cyanure mercurique séché et 2,0 g de bromure de tris-O-acétyl 3,4,6 N(p-méthoxybenzylidène) a-D-glycosaminyle (Hardy et coll., J. Chem. Soc., page 3360 (1963) et on agite le mélange à la température ambiante pendant 4 h. On sépare la Drierite par filtration et on évapore le filtrat jusqu'à une huile que l'on dissout dans le chloroforme, on lave par NaHCO3 aqueux et par l'eau, puis on évapore jusqu'à une huile visqueuse consistant en le produit de condensation désiré (VIII) d'autres isomères et des impuretés. On dissout l'huile visqueuse contenant le composé (VIII) dans 5 ml de méthanol et dn ajoute 2,5 ml d'acide acétique à 50 %. On chauffe cette solution au bain de vapeur pendant 1 h et on l'évapore jusqu'à une huile que l'on dissout dans 100 ml de méthanol. On refroidit cette solution au bain de glace, on ajoute 30 mi d'anhydride propionique et on laisse ensuite reposer le mélange de réaction a la température ambiante pendant une nuit. On évapore ensuite le mélange de réaction jusqu'à un sirop que l'on agite ensuite pendant une nuit à température ambiante avec 100 ml d'hydroxyde de baryum aqueux saturé dans une fiole scellée. On sépare l'excès d'hydroxyde de baryum par précipitation par C02. Le filtrat contient l'antibiotique AM 31ss que l'on peut purifier par chromatographie d'échange d'ions sur résine Amberlite IRC-50 sous la forme NH4+ ou Dowex 50-X8 sous la forme NH4+, comme décrit précédemment pour l'antibiotique naturel. I1 est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de mise en oeuvre préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. TABLEAU I Caractéristiques de culture de Streptoverticillium netropsis NRRL 5774 Incubation : 14 jours Température : 28 C Milieu Croissance Mycélium aérien et/ou spores Pigment soluble Coloration Remarques du verso Gélose à l'ex- Bonne Mycélium aérien rosâtre-blanc deve- Aucun Lt. Amber trait de levure nant Bisque (4 ec) à Cork Tan (4 ie) (3 ic) dans les zones à spores. Bonne formation de spores. Gélose Aspara- Bonne Mycélium aérien rosâtre-blanc deve- Jaunâtre-brun ; Cocoa Brown gine/dextrose nant Bisque (4 ec) à Cork Tan (4 ie) faible (5 ni) dans les zones à spores. Bonne formation de spores. Gélose de Bene- Bonne Mycélium aérien rosâtre-blanc de- Jaunâtre ; Lt. Amber Exsudat incolore dict venant Bisque (4 ec) dans les zones faible (3 ic) et abondant à spores. Formation modérée de les colonies spores. Gélose de Intense Mycélium aérien rosâtre-blanc de- Jaunâtre-brun ; Cocoa Brown Exsudat jaunâtre Bennett venant Bisque (4 ec) à Cork Tan faible (5 ni) et abondant sur (4 ie) dans les zones à spores. les colonies. Formation intense de spores. Gélose amidon/sels Bonne Mycélium aérien rosâtre-blanc de- Aucun Cork Tan inorganiques venant Bisque (4 ec) à Cork Tan (4 ie) (4 ie) dans les les zones á spores. Bonne formation de spores. TABLEAU I (suite) Milieu Croissance mycélium aérian et/ou spores Pigment soluble Coloration Remarques du verso Gélose aux Intense Mycélium aérien rosâtre-blanc de- Brunâtre ; Lt. Spice flocons d'a- venant Bisque (4 ec) à Cork Tan modéré Brown voine de Kuster (4 ie) dans les zones á spores. (4 lg) Formation intense de spores. Gélose á la so- Faible Mycélium aérien rosâtre-blanc de- Aucun Pearl Pink lution de Czapek venant Bisque (4 ec) dans les zones (3 ca) à spores. Formation légère de spores. Gélose dextrose/ Modérés Mycélium aérien rosâtre-blanc de- Jaunâtre-brun; Lt. Brun Exsudat incolore pomme de terre venant Pearl Pink (3 ca) à Bisque modéré (4 ng) abondant sur les (4 ec) dans les zones à spores. colonies. Formation légère de spores. Gélose de Hickey Intense Mycélium aérien rosâtre-blanc de- Brun ; Dk. Wine et Tresner venant Bisque (4 ec) à Cork Tan intense (7 pi) (4 ie) dans les zones á spores. Formation intense de spores. Gélose farine Intense Mycélium aérien rosâtre-blanc de- Brun ; Cocoa Brown Exsudat jaunâtred'avoine/pâte venant Bisque (4 ec) á Cork Tan intense (5 ni) brun abondant sur de tomate (4 ie) dans les zones á spores. les colonies. Formation intense de spores. Gélose nutri- Intense Mycélium aérien rosâtre-blanc de- Brunâtre ; Lt. Spice tive venant Bisque (4 ec) dans les faible Brown zones à spores. Formation intense (4 lg) de spores. Gélose au riz Bonne Mycélium aérien rosâtre-blanc de- Jaunâtre-brun ; Lt. Brown venant Pearl Pink (3 ca) à Bisque faible (4 ng) (4 ec) dans les zones à spores. Formation modérée de spores. TABLEAU II Micromorphologie du Streptoverticillium netropsis NRRL 5774 Dimension Milieu Mycélium aérien et/ou structures sporifères Forme du spore du spore Surface du spore ( ) Gélose amidon/sels Les chaînes de spores se présentent sous forme Spores allongés, 0,5-0,6 Lisse (déterminainorganiques de branches régulièrement espacées, monoverti- cylindriques. x tion par microscocillées, sur le mycélium aérien. La plupart des pie électronique Les chaînes de spores élementaires se termi- chaînes contien- 1,0-1,2 en transmission). nent souvent en crochet ou en hélice à un ou nent quelques deux tours. spores phalangiformes. TABLEAU III Diverses réactions physiologiques du Streptoverticillium netropsis NRRL 5774 Température : 28 C. Milieu Durée d'incubation Croissance Réaction physiologique Lait au pourpre Peptonisation complète : de bromocrésol 14 jours bonne il ne reste pas de grumeaux Bouillon au nitrate organique 7 jours bonne Pas de réduction des nitrates Bouillon au nitrate organique 14 jours bonne Pas de réduction des nitrates Gélatine 7 jours bonne Gélatine totalement liquefiée Gélose peptone-fer 48 heures bonne Trace de pigments mélanoides Gélose à l'extrait de levure + (4, 7, 10 et 13 % NaCl) 10 jours bonne 7 % NaCl TABLEAU IV Utilisation des sources de carbone Streptoverticillium netropsis NRRL 5774 Incubation : 10 jours Température : 28 c Source de carbone Utilisation* Adonital 0 1-Arabinose 0 d-Galactose -- O d-Fructose 0 i-Inositol 3 Lactose O d-Mannitol 0 Glycérol 3 d-Mélibiose 0 d-Raffinose O 1-Rhamnose 0 Salicine 1 Saccharose O d-Tréhalose 3 d-Xylose O Dextrose 3 Témoin négatif o * 3 bonne 1 médiocre 2 passable O nulle TABLEAU V Organisme Zone d'inhibition (mm)* Bacillus cereus (Waksman) 2,9 Klebsiella pneumoniae i 5,8 (Friedlanders) Alcaligenes sp. ATCC 10153 | 4,1 Bacillus subtilis il 5,8 (Stansly R-78) Bacillus subtilis (Résistant à la i 1,0 Streptothricine) (Stansly R/6) Mycobacterium smegmatis 2,6 (&num;;607) Staphylococcus aureus 2,5 @ (résistant a la tétracycline) Escherichia coli 4,0 (Parke Davis) Escherichia coli 7,3 (résistant au chloramphénicol) I Staphylococcus aureus 209 P 6,5 (resistant ltérythromycine) Corynebacterium xerosis 8,5 NRRL B-1397 Salmonella gallinarium &num; 605 7,3 Staphylococcus aureus CSmith) 5,3 Klebsiella pneumoniae (AD) j 9,2 Pseudomonas aeruginosa 4,6 ATCC 10145 Escherichia coli (Culture Upjohn) 4,8 Aerobacter aerogenes 5,2 Proteus mirabilis 1,6 Salmonella typhosa ATCC 6539 | 7,4 Staphylococcus aureus | 1,3 ATCC 14154 Escherichia coli 311 | 5,0 Pseudomonas aeruginosa PA7 | 3,6 * Distance bord du puits/bord extérieur de la zone d'inhibition TABLEAU VI Dose sous-cutanée unique Souris vivantes/total des souris traitées, 7 jours après (mg/kg) l'infection Escherichia coli 512 2/2 256 2/2 128 2/2 64 2/2 32 0/2 Témoins infectés/non traités 2/10 Dose sous-cutanée unique Salmonella typhosa (mg/kg) 512 2/2 256 2/2 128 2/2 64 0/2 Témoins infectés/non traités 0/10 TABLEAU VI (suite) Dose sous-cutanée unique Souris vivantes/total des souris traitées, 7 jours (mg/kg) après l'infection Klebsiella pneumoniae 512 2/2 256 2/2 128 0/2 64 0/2 Témoins infectés/non traités 0/10 TABLEAU VII Spectre de masse haute résolution pour le dérivé N-Acétyl-O-Triméthylsilyle du complexe AM31 Masse exacte Observée Calculée Composition 898,4324 898,4408 C36H80N3O11Si6 884,4238 884,4252 C35H78N3O11Si6 694,3380 694,3406 C28H60N3O9Si4 635,2995 635,3035 C26H55N2O8Si4 581,2909 581,2929 C23H53N2O7Si4 420,2056 420,2057 C17H38N1O5Si3 TABLEAU VIII Hesure à haute résolution pour le dérivé N-acétyl-O-triméthylsilyle du diaminodidéoxyalditol. (produit de degradation du complexe AN31) Masse exacte Observée Calculée Composition 537,2668 537,2659 C21H49N2O6Si4 378,1952 378,1942 C15H36N1O4Si3 347,1822 347,1818 C14H31N2O4Si2 288,1450 288,1450 C121126N103Si2 t 276,1421 276,1450 C11H26N1O3Si2 217,1081 217,1080 C9H21O2Si2 198,0949 198,0959 C9H16N1O2Si 186,0934 186,0950 C8H16N102Si 174,0929 174,0950 C71116N102Si TABLEAU IX Proportion relative d'ions détérminé par chromatographie en phase gazeuse/spectre de masse du dérivé N-acétyl-O-triméthylsilyle du complexe AM31 Composants &alpha; et &gamma; Composant ss Ion (m/a) Proportion relative (m/a) Ion (n/a) Proportion relative % 174 25 174 20 186 50 186 35 276 3,5 276 3,5 420 100 434 100 581 2,5 581 2,5 635 32,5 649 22,5 694 8,5 708 7,5 884 6,0 898 4,0 REVENDICATIONS 1. Nouveaux dérivés de diaminoalditol, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale dans laquelle R est un atome d'hydrogène ou un groupe alcanoyle en Cl-cl2Xet leurs sels d'addition d'acides. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est un atome d'hydrogène. 3. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est un groupe formyle. 4. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est un groupe acétyle. 5. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est un groupe propionyle. 6. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est un groupe butyryle. 7. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est un groupe octanoyle. 8. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est un groupe dodecanoyle. 9. Procédé pour la production d'un mélange d'antibiotiques répondant à la formule générale ci-dessus dans laquelle R est un atome d'hydrogène ou un groupe acétyle ou propionyle, dénommés AM 31a, AM 31ss et AM 31y, caractérisé en ce que l'on cultive un micro-organisme ayant les caractéristiques de Streptoverticillium netropsis NRRL 5774 ou ses mutants dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources de carbone et d'zzote assimilables et des sels inorganiques en conditions aérobies submergées jusqu'a ce qu'une activité antibactérienne notable soit accumulée dans ledit milieu et ensuite on recueille le mélange antibiotique du milieu. 10. Procédé pour la préparation d'un dérivé de diaminoalditol de formule générale dans laquelle R1 est un groupe alcanoyle en C1-C12 , caractérisé en ce que l'on fait réagir un composé de formule générale dans laquelle R est un groupe méthyle ou éthyle avec la dimédone puis on soumet le composé obtenu à la désacylation par une base - puis à l'acylation par un anhydride d'acide en C4-CI2 ou l'anhy- dride mixte d'acide formique et d'anhydride acétique, on élimine les groupements protecteurs dimédone et enfin on recueille le produit final. Il. Nouveaux médicaments, utiles notamment carme antibiotiques, caractérisés en ce qu'ils consistent en composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et leurs sels d'addition d'acides acceptables pour l'usage pharmaceutique. 12. Nédicaments. selon la revendication 11, caractérisés en ce qu'ils sont sous la forme de base libre. 13. Compositions thérapeutiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent comme ingrédient actif au moins un médicament selon la revendication 11 ou 12. 14. Formes pharmaceutiques d'administration des compositions selon la ravendication 13, notamment par administration parentérale.