FR 2340723 A1 19770909 FR 7603690 A 19760211 La présente invention a pour objet à titre de nouveaux produits le i 1,6-di (N1 (parafluorophényl) N5 - biguanido) 1,6 Hexane ci-après dénommé, en abrégé, difluorhexidine, ainsi que trois de ses dérivés, savoir : les difluorhydrates, dichlorhydrates et digluconates. L'invention a également pour objet les procédés de préparation desdits dérivés, l'étude de leurs propriétés bactéricides, fongicides et cariostatiques et leurs applications. Le 1 ,6-di[N1 (parafluorophenyl) N5-biguanido] hexane ou difluorhexidine C22H30N10F2 présente la foule développée suivante La synthèse de la difluorhexidine comporte trois stades - la préparation du parafluorophényldicyandiamide, - la condensation du précédent dérivé cyané avec le di-chlorhydrate de diamino-1,6 hexane qui donne le dichlorhydrate de difluorhexidine, - la libération de la base du dichlorhydrate. A/p-FLUORO-PHENYL - 1 CYANO- 3 GUANIDINE- (ou p-fluoro-phényl-dicyan-diamide). a) Réaction. b) Matières premières.- - Para-fluoro-aniline - Acide chlorhydrique - Nitrite de sodium - Cyano-guanidine ou di-cyan-diamide - Soude - P -ss-éthoxy-éthanol ou éther mono-éthylique d'éthylène-glycol. c) Mode opératoire.1.- On diazote en maintenant la température du mélange réactionnel à OOC et en ajoutant goutte à goutte une solution de 70g. (mole) de Nitrite de Sodium dans 400 mi. d'eau, à une solution de 110 g. (1 mole) de para-fluoro-aniline fraîchement rectifiée dans 208 ml. d-HC1 concentré dans 800 ml. d'eau. 2.- On introduit la précédente solution de sel de diazonium à une solution de 92 g. (1,08 mole) de cyano-guanidine ou di-cyan-diamide dans 2800 mi. d'eau. Durée d'addition : de 10 à 15 minutes.3.- Avec un bain de glace (extérieur) on alcalinise avec une solution de 100 g. de Soude (en pastilles) dans 250 ml. d'eau jusqu'à pH + 10. On laisse au repos pendant 30 minutes et un précipité se forme. Sous agitation mécanique vigoureuse, on acidifie jusqu'à pH f 4 avec CH3COOH (environ 210 ml. d'Acide Acétique). On essore le triazène formé On le lave deux fois avec soma. d'eau glacée chaque fois. On le sèche à l'air libre puis au dessicateur ou à l'étuve (chauffante ventilée).- Poids sec de triazène = + 250 g. à 320 g. 4.- Sous vigoureuse agitation, en maintenant la température vers 28-300C, on introduit par fractions le triazène (bien desséché) dans une solution de 920ml. d'éthoxy-éthanol ou éther éthylique de l'ethylène-glycol 120 ml. d'HC1 12 N. On continue l'agitation à la neume température encore quatre heures environ jusqu'à cessation de dégagement d'azote. On ajoute alors 2000ml. d'eau et on laisse au repos pendant une nuit dans une chambre froide. - 5.- On essore le précipité. On le dissout dans une solution aqueuse de Soude (60g. de Soude en pastilles dans 1500ml. d'eau) en tiédissant s'il le faut. On filtre sur "coton de verre", puis on laisse refroidir partielle ment et on acidifie avec une solution d'HC1 diluée, jusqu'à pH 1 à 2.6.- On essore, on lave avec un peu d'eau glacée, on sèche à l'air et on recristallise dans du Méthanol à 50 t (avec décoloration au noir animal). On recueille Poids humide = 85 à 95 g. Poids sec = 0 70 g. F= 2090-211" Les eaux-mères (concentrées au bain-marie sous vide) donneront encore quelques grammes.- CONTROLE JNALYTIQUE.- L'analyse centésimale est conforme à la théorie. Le test de pureté par chromatographie sur couche mince se fait sur un support CCM-Silicagel F 1500 LS 254 Selecta, avec acétate d'éthyle/méthanol: 25/5 comme solvants. Révélateur = W Rf = 0,78 Le composé présente une seule tache et est donc pur. B/ CONDENSATION DE p-FLUORO-PHENYL-1 CYANO-3GUANIDINE AVEC LE DI-CHLORHYDRATE DE DIAMINO-1,6 HEXANE.- a) Réaction b) Matières premières. - Di-chlorhydrate de diamino-1,6 Hexane ou d'Hexaméthylène-1,6 Diamine - Nitrobenzène étêté - Ethanol absolu. c) Mode opératoire On dissout séparément 36g. (soit 0,20 mole) de cyanoguanidine et 20 g. (soit 0,11 mole) de di-chlorhydrate de diamine dans un minimum de Méthanol absolu. - On mélange les deux solutions alcooliques et on chasse l'excès de solvant au bain-marie sous vide jusqu a siccité.- On reprend le résidu dans 100 mi. de Nitrobenzène étêté. Avec un bain d'huile thermostaté et dans un réacteur (muni d'un réfrigérant ascendant avec garde de Chlorure de Calcium), on chauffe d'abord à 100 C (sans réfrigérant pour laisser évaporer les dernières traces de Méthanol), puis à 1450C (température intérieure) avec une bonne agitation magnétique pendant 16heures. A partir de la troisième heure, il commence a se former un précipité cristallisé. On laisse refroidir puis on essore le précipité.- On chauffe au doux reflux le précipite avec 120 ml. d'Ethanol absolu (avec agitation magnétique) pendant 1 heure trente minutes. On refroidit on essore puis on sèche dans un dessicateur (avec des pastilles de potasse qui absorbent les dernières traces de Nitro-benzène). On obtient environ de 15 à 25 grammes. On recristallise le Dichlorhydrate de Difluorhexidine dans l'eau distillée (1 g. dans 50 mi. d'eau). Fins cristaux P.F. = 2550C solubles dans le Méthanol, dans le DMF, moyennement solubles dans l'eau, presque insolubles dans l'Ethanol. CONTROLE ANALYTIQUE.- L'analyse centésimale est conforme à la théorie P.M. 472,5 + 73 + 36 = 581,50 Analyse centésimale : calc. trouvé - Carbone % 45,48 45,12 ; 45,12 - Hydrogène % 6,25 6,65 ; 6,58 - Azote % 24,11 24,17 ; 23,95 - Fluor % 6,55 6,35 Le test de pureté par chromatographie sur couche mince se fait sur un support CCM - Silicagel F 1500 LS 254 Selecta, avec Acétate d'Ethyle/ Méthanol/Ammoniaque : 25/8/8 comme solvants. Révélateur une Rf = = 0,45 C/ LIBERATION DE LA BASE DIFLUORHEXIDINE.- Sous agitation, dissoudre 10 g. de Di-chlorhydrate dans 500 ml. d'eau (solution limpide). Alcaliniser avec la Soude à 10 % jusqu'à pH 9. Agiter encore une heure. Refroidir et essorer, laver avec de l'eau glacée. Sécher. Recristalliser dans le Benzène ou dans le Méthanol absolu. Fins cristaux incolores, insolubles dans l'eau P.F. = 1180C. CONTROLE.- L'analyse centésimale est conforme à la théorie C2210N10F2 (P.m. = 472,5) analyse centésimale : calc. trouvé - Carbone % 55,92 55,90 - Hydrogène 6,40 6,43 - Azote 29,65 29,27 - Fluor 8,04 7,75 Le test de pureté se fait avec le même support que précédemment et avec l'acétate d'éthyle et le méthanol comme solvants.Le composé apparaît pur. - La synthèse du difluorhydrate et du di-glucomate de difluorhexidine se fait à partir de la base difluorhexidine libérée du dichlorhydrate préparé précédemment.- PREPARATION DU DIFLW RHYDRATE DE DIFLoeRHExIDiNE. - Matières premières. PM (1 mole) di-fluorhexidine (base) .* 472,5 (2 moles) acide fluorhydrique * 40 Mode opératoire. - Bien tarer un récipient en alliage Monel ou en plastique. Introduire d'abord 4,725 g. de base puis, avec une pipette en plastique, 0,40g. d'acide fluorhydrique à 100 t (ou 2 g. d'acide Fluorhydrique à 20 %). Tiédir le récipient au bain-marie et ajouter de l'eau distillée jusqutà dissolution complète (environ 50 ml. d'eau). Laisser refroidir et évaporer au bain-marie sous vide jusqu'à sec. Fins cristaux P.F. = 218O C. CONTROLE. L'analyse centésimale est conforme à la théorie La formule du Di-fluorhydrate de "Di-fluorhexidine" est 472,5 + 40 = 512,5 Analyse centésimale : calc. trouvé "GDX-509" - Carbone % 51,54 51,34 - Hydrogène 6,30 6,55 - Azote 27,34 27,16 - Fluor 14,85 14,56 ; 14,65 La teneur en fluor se répartit en Fluor ionique : 50 % Fluor aromatique : 50 t Rendement quantitatif (p= 5 g.) PREPARATION DU DI -GLUCONATE DE DIFLUORHMIDINE.- Matières premières. L'acide gluconique a la formule L'acide gluconique, de formule C6H1207, n'existe que sous forme de solution aqueuse à 50 t. Pm. (1 mole) Difluorhexidine (base) 472,5 (2 moles) acide gluconique 392 Mode opératoire.- A une solution aqueuse de 7,84 g. d'acide gluconique à 50 t on ajoute 5,725 g. de difluorhexidine (base). Tiédir légèrement pour tout dissoudre. Concentrer au bain-marie sous vide jusqu'S siccité. Fins cristaux P.F. = 100"C. CONTROLE.- C22H30N10F2 + 2(C6H1207) ou C34H54N10014F2 Poids moléculaire : 864,88 Analyse centésimale : calc. trouvé - Carbone % 46,25 ( 45,65 ( 45,42 - Hydrogène 6,38 6,21 ; 6,17 - Azote 15,87 15,81 ; 15,87 - Fluor 4,30 4,02 ; 4,07 La toxicité aiguë du difluorhydrate de difluorhexidine a été étudiée chez la souris et chez le rat. Les animaux provenaient d'un élevage homogène. Les souris pesaient entre 19 et 21 g. et les rats pesaient de 120 à 140 g. Les souris étaient groupées par lots de 10 et les rats par lots de 8. Les animaux ont subi une période d'acclimatation d'une semaine dans l'animalerie et ont été observés pendant 10 jours après les administrations de médicaments. Les administrations ont eu lieu par voie buccale, en solution aqueuse, sous un volume de 0,5 mi. pour 20 g. de souris et de 1 ml. pour 100 g. de rat. La dose léthale DL50 a-été déterminée par la méthode de Lichtfield et Wilcoxon. Les tableaux ci-après indiquent les résultats obtenus Souris - voie orale. Doses (mg/kg) 125 250 500 1000 1500 2000 Animaux par lot 10 10 10 10 10 10 Morts J + 1 0 0 4 8 10 10 J + 2 0 1 4 8 10 10 J + 5 0 1 4 9 10 10 J + 10 0 1 4 9 10 îb DL50 = 525 mg/-kg Rat - voie orale. Doses (mgZkg) 250 500 750 1000 1250 1500 Animaux par lot 8 8 8 8 8 8 Morts J + 1 0 0 2 2 Z 3 J + 4 0 0 2 5 4 5 J+5 0 0 3 5 5 8 j±6 0 0 3 6 6 8 J +10 0 0 3 6 6 8 DL50 = 875 mg/kg. De meme la toxicité du Difluorhydrate de dichlorhexidine a été étudiée et résumée dans les tableaux ci-dessous Souris - voie orale. Doses (mg/kg) 500 750 1000 1500 2000 2500 2750 Animaux par lot 10 10 10 10 10 10 10 Morts J + 1 0 0 2 5 8 10 10 J + 2 0 0 2 5 8 10 10 J + 5 0 0 4 8 9 10 10 J + 10 0 0 4 8 9 10 10 DL50 = 1150 mg/kg Rat - voie orale Doses (mg/kg) 250 500 750 1000 1250 1500 Animaux par lot 8 8 8 8 8 8 Morts J + 1 0 0 0 0 0 0 J+5 0 0 0 0 0 2 J + 10 0 0 0 0 0 2 Le difluorhydrate de difluorhexidine est plus toxique que le dufluorhydrate de dichlorhexidine. Si l'on compare les doses léthales DL50 du difluorhydrate de difluorhexidine à celles du fluorure de sodium dont les doses toxiques sont bien connues, on trouve DL 50 a) Souris .....DFDFH .......... 525mg/kg FNa ............ 280mg/kg b) Rat ......... DFDFH .......... 875mg/kg FNa ............ 450mg/kg On voit que le difluorhydrate de difluorhexidine est environ un peu moins de 50 % moins toxique que le fluorure de sodium. Comme les doses d'utilisation du nouveau produit sont de l'ordre de 50 à 100 mg. pour 100 g. de produit fini dans des formes pharmaceutiques pour usage local bucco-dentaire, on voit aisément que cette molécule en fonction de ses destinations et modes d'utilisation ne présente pas de problème sur le plan toxicologique. On a trouvé que les nouveaux composés selon l'invention présentaient des propriétés bactéricides, fongicides et cariostatiques. En particulier, le difluorhydrate de difluorhexidine étant une molécule organique fluorée renfermant 14,85 t de fluor, dont 50 % sous forme ionique et 50 Oo sous forme aromatique, possède une activité remarquable dans le domaine des affections bucco-dentaires. On a mis en évidence une activité bactériofongistatique sur les germes de la salive, de la plaque dentaire et des lésions inflammatoires du parodonte, une activité cariostatique et analgésique, grâce au rôle du fluor ionisé en application topique. L'action se fait directement sur la structure minérale de ltemail, sur les enzymes bactériennes et les germes pathogènes. L'action désensibilisante du fluor topique est nette dans les phénomènes d'hyperesthésie dentinaire. On a déterminé le pouvoir du difluorhydrate de difluorhexidine par déterminations de la C.M.I. (concentration minimale inhibitrice) et de la C.M.B. (concentration minimale bactéricide) par rapport au difluorhydrate de dichlorhexidine, choisi comme molécule de référence. TE(THNIQUE. - -1.- Solutions à tester. On prépare des dilutions croissantes de DFDF et DFDC. 2.- Inoculum. A partir d'une culture en bouillon en phase exponentielle, ou ayant juste atteint la phase stationnaire de sa croissance, on prépare une dilution en bouillon de façon à obtenir 105 à 106 unités viables par millilitre. - On ajoute 1 ml. d'inoculum à chaque tube de la gamme contenant mimi. de dilution de produit à tester. Un témoin sans produit servira à faire une numération de contrôle par filtration sur membrane Millipore. Après séjour de 18 à 24 heures à l'étuve à 37 , la lecture sera effectuée. RESULTATS. C.M.I. : concentration la plus faible donnant un mélange limpide mais une culture positive après repiquage sur gélose : effet bactériostatique. C.M.B. : concentration la plus faible donnant un mélange limpide et une culture négative après repiquage sur gélose : effet bactéricide. SOUCHES ETUDIEES PRODUIT D.F.D.F. /ml D.F.D.C. t/ml C.M.I. C.M.B. C.M.I. C.M.B. Staphylococcus aureus Réf.53156 1 1,5 0,5 2 Streptococcus pyogenes Réf.561 0;5 0,5 0,5 1 Streptococcus Mitans (OM 2176) 0,3 1,5 0,5 2 Streptococcus Mitis (IP 5625) 0,5 1,5 0,7 2 Streptococcus Lacis (IP A 216) 0,4 1,4 045 2 Streptococcus Sal ivarius (IP 55126) 0,3 0,5 0,2 1 Lactobacillus Acidophilus (IP 6218) 2 5 3 5 Candida Albioens (IP 628) 5 12 10 15 Trois essais ont été effectués par souche. On constate que le difluorhydrate de difluorhexidine selon l'invention présente un excellent pouvoir bactéricide meilleur, dans tous les cas considérés ici, que celui du produit de référence, le difluorhydrate de dichlorhexidine.Dans le cas de certains streptococci l'activité bactéricide du produit de l'invention est le double de celle du produit de référence. Des expérimentations similaires de toxicité et de propriétés bactéricides et fongicides ont été conduites sur le dichlorhydrate et le digluconate de difluorhexidine et ont conduit à des résultats équivalents. Les nouveaux dérivés de l'invention, grâce à leurs propriétés bactério-fongistatiques et fongicides associées à l'action topique du fluor, peuvent être avantageusement utilisés pour le traitement local des affections bucco-dentaires, sous la forme de solutions, bains de bouche, gels, pommades et dentifrices. Les concentrations préférées des dérIvés de difluorhexidine dans lesdites préparations pharmaceutiques sont comprises entre 50 et îOOmg. de produit actif pour 100 g. de produit fini. - Dans le cas du difluorhydrate de difluorhexidine qui contient 7,4 t de fluor ionisé, on obtient une action cariostatique du produit fini lorsqu'il contient environ cent milligrammes pour cent en fluor ionisé, c'est-à-dire 1,34 gramme de difluorhydrate de difluorhexidine par 100 g. Les excipients utilisés pour la préparation de ces formules contenant les dérivés de difluorhexidine sont les excipients habituellement utilisés pour les gels, vernis, bains de bouche et dentifrices. On peut citer, à titre d'exemple d'excipients dans le cas - des solutions, les solvants comme l'eau, l'alcool, la glycérine, le sorbitol, le propylène-glycol. - des gels, les épaississants comme les carraghénates, les hydrocolloldes naturels (gommes), les pectines, les silices colloïdales, les mélanges complexes colloïdaux de silicates de Mg. et d'Al. naturels; les liants comme la glycérine, le sorbitol, le propylèneglycol. - des vernis, les résines et gommes en solution alcoolique ou ethero alcoolique. - des dentifrices, les épaississants et liants classiques et comme charges la silice pure précipitée, les métaphosphates. Dans tous les cas, on peut ajouter des édulcorants, conservateurs et colorants habituels. Enfin, les dérivés de difluorhexidine de l'invention peuvent être introduits dans des amalgames, ciments dentaires et différents matériaux d'obturation.- - REVENDIGATIONS 1.- A titre de nouveaux produits la difluorhexidine et ses dérivés, savoir le difluorhydrate de difluorhexidine, le dichlorhydrate et le digluconate de difluorhexidine; 2.- A titre de nouveaux produits fongicides, bactéricides et cariostatiques les produits visés à la revendication 1. 3.- Préparations pharmaceutiques pour le traitement local des affections bucco-dentaires contentant, à titre de principes actifs, 50 à 100 mg de difluorhexidine ou d'un de ses dérivés, selon la revendication 1, par 100 g. de produit fini.- 4.- Préparations pharmaceutiques selon la revendication 2 sous forme de bains de bouche, de gels, de dentifrices, de vernis et de matériaux d'obturation dentaire.