FR 2336939 A1 19770729 FR 7540041 A 19751229 L'invention est relative à une fraction inductrice d'une résistance aux infections bactériennes, à un procédé d'extraction de cette fraction à partir de bactéries, notamment de bactéries gram négatif, ou de leurs parois et plus particulièrement de celles des parties de ces bactéries qui comprennent les couches extérieures de ces parois, et les couches intermédiaires entre ces couches extérieures et la couche rigide contenant la muréine, ces parties contenant éventuellement aussi desconstituants endocellulaires. Elle concerne également des médicaments contenant les susdites fractions à titre de principes actifs. Il existe depuis les travaux de Teague et Mc Williams, en 1917, une très abondante littérature sur les propriétés des bactéries gram négatif, et plus particulièrement de leurs lipopolysaccharides, également connus sous le nom d'endotoxines, auxquelles ont été attribuées jusqu'à ce jour les diverses pro priétés dont il sera question ci-après. On sait que ces lipopolysaccharides, qui seront souvent ci-après désignés par labréviation "LPS" sont essentiellement contenus dans les couches extérieures de la plupart des bactéries gram négatif. Ces LPS sont constitués de macromolécules comprenant une fraction lipidique, dite Lipide A", Cà laquelle sont en général attribuées la plupart des propriétés caractéristiques des endotoxines dont il sera question ci-après) et une fraction polysaccharidique liée par des liaisons covalentes au Lipide A.Cette fraction polysaccharidique comprend un polysaccharide de base appelé "core", lequel contient des consiituants communs à tous les "cores" des LPS des bactéries gram négatif les plus diverses, et une partie polysaccharidique dite "polysaccharide O-spécifique" à laquelle est attribuée une partie au moins des propriétés immunologiques propres à chaque type de bac téries gram négatif. I1 est à noter que les bactéries gram négatif dites "rough (R)" sont complètement dépourvues de ce "polysaccharide O-spécifique". De cette littérature, il ressort que ces LPS ont souvent d'importantes propriétés inductrices d'une résistance in vivo aux infections bactériennes. Au moins certaines d'entre elles sont également susceptibles de favoriser des nécroses tumorales et/ou possèdent aussi des effets immunostimulants, adjuvants ou mitogènes. Malheureusement, ces propriétés, qui pourraient être d'un intérêt considérable, s'accompagnent également d'effets toxiques trop importants (létalité, chocs, pyrogénicité) pour que l'on puisse envisager l'utilisation de ces en en thérapeutique humaine ou vétérinaire. Cette toxicité est telle que, à titre d'exemple, une dose de 0,1 microgramme d'endotoxine, préparée à partir de Salmonella enteritidis entraine la mort de 5 souris sur 5, qui la reçoivent par voie intraveineuse, lorsque ces souris ont au préalable été sensibilisées par 12,5 microgrammes d'actinomycine D, administrée par voie intrapéritonéale. De nombreux auteurs ont tenté de faire subir à ces LPS des modifications sous l'action d'agents physiques, chimiques ou biologiques, en vue de supprimer les actions toxiques, sans sensiblement influencer les propriétés, notamment leur capacité d'induction d'une résistance aux infections bactériennes, dont l'application pourrait être bénéfique en thérapeutique. On doit à ces diverses tentatives une contribution importante à la connaissance approfondie des constituants de la paroi bactérienne, notamment des LPS qu'elle renferme, de même que de ses autres constituants, plus particulièrement de ceux qui sont compris entre la membrane externe et la couche rigide renfermant la muréIne de ladite paroi bactérienne (également dénommée "mucopeptide" ou "peptidoglyzane"; On ne peut cependant citer que peu de résultats vraiment favorables, témoignant d'une dissociation, au moins à un degré satisfaisant, des propriétés nettement anti-infectieuses désirées et des effets toxiques initialement constatés dans les fractions non modifiées. Parmi ces nombreuses tentatives, il convient de citer celles dans lesquelles on a eu recours à une hydrolyse acide ou alcaline des lipopolysaccharides obtenus à partir de bactéries gram négatif, notamment par la méthode désormais classique de Westphal, selon laquelle on détache ou sépare de la paroi bactérienne ces fractions endotoxiniques par traitement de ces bactéries ou de leurs parois par un mélange phénol/eau, à une température au-dessus de celle ambiante, par exemple de l'ordre de 600C à 70-C. Dans les essais d'hydrolyse alcaline, il a déjà été constaté que l'on pouvait, dans certaines conditions, obtenir une réduction de la toxicité des fractions traitées, souvent attribuée à la perte d'acides gras par le "Lipide A". Cette réduction de la toxicité peut s'accompagner aussi d'une réduction, voire de la suppression de l'activité inductrice d'une résistance bactérienne. Ainsi Raistrick et Topley (Brit. J. Exptl. Pathol. 15, 113 (1934)) ont constaté qu'une fraction d'endotoxine chauffée au bain-marie, en présence d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,2 N, perdait l'action protectrice qu'elle exer çait auparavant chez la souris à l'égard de doses létales de bactéries infectieuses. Il a été montré récemment que l'on pouvait, à partir des LPS,séparér et obtenir par hydrolyse acide douce, d'une part, le'lipide A" qui conserve à la fois des propriétés d'induction d'une résistance aux infections bactériennes et sa toxicité et, d'autre part, une fraction hydrosoluble qui n'est plus toxique mais qui ne possède tout au plus que peu ou pas de propriétés inductrices de la résistance aux infections bactériennes. Il a été également proposé de soumettre les fractions toxiques à l'action d'enzymes. C'est ainsi que Tauber et Russel (Exptl. Med. Surg. 19, 161 (1961)) ont étudié l'action d'une série d'enzymes, telles que le lysozyme, la trypsine cristallisée, la chymotrypsine, la lipase pancréatique et la lipoprotéinelipase, sur des endotoxines obtenues à partir de diverses espèces de Neisseriae d'Escherichia et de S.abortus equi, dans des conditions de pH voisines de la neutralité. Les auteurs aboutirent à la conclusion que les endotoxines traitées n'avaient été ni hydrolysées, ni détoxifiées. Bien d'autres auteurs encore ont décrit des essais de détoxification relative de diverses endotoxines à l'aide de diverses enzymes avec des résultats qui peuvent en général être considérés comme médiocres sinon nuls. Des résultats relativement meilleurs furent obtenus par Kim et Watson (Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 115, 140 (1964)) avec une papaIne activée sur des endotoxines extraites de E. Coli 08 (C008) et S. enté ritidis (SE) surtout en milieu acidifié, notamment à pH 4. Ces auteurs émirent l'hypothèse que la détoxification constatée pouvait être due à une hydrolyse effective des endotoxines traitées par la papaïne activée. Cette hypothèse a cependant été contestée par d'autres auteurs, notamment Rudbach et coll. (Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 119, 115 (1965)) qui, étudiant les travaux de Kim et Watson, émirent au contraire l'hypothèse que les toxicités, plus particulièrement la pyrogénicité, réduites observées devaient être attribuées à la formation d'un complexe entre l'endotoxine et la paparne, plutôt qu'à une action hydrolysante de cette dernière. On citera encore les tentatives de détoxification des endotoxines qui ont été décrites et qui mettent en oeuvre des réactions d'acylation des endotoxines. Les résultats sont meilleurs en que l'on observe effectivement une réduction assez sensible de la toxicité des fractions traitées. Sous certaines conditions d'administration, la capacité de ces fractions ainsi détoxifiées d'induire une rés-istance aux infections causées par diverses bactéries ne semble pas modifiée. Dans d'autres conditions d'utilisation ou d'administration, il a cependant été constaté une diminution de la capacité de protection contre les infections deces fracttons,comparée à celle de l'extrait initial. Tel était par exemple le cas lorsque l'agent infectieux, ayant été administré par voie intrapéritonéale, l'extrait étudié avait été administré par voie intraveineuse. D'une façon générale, on constate, dans les meilleurs des cas évoqués ci-dessus, une diminution relative de la toxicité vis-à-vis des propriétés d'ordre thérapeutique, diminution qui,dans la pratique, ne s'avère cependant pas suffisante pour que l'on puisse envisager une application en thérapeutique des extraits ainsi traités, du moins dans le domaine de l'induction d'une protection contre les infections bactériennes. Dans les études qui précèdent, il a naturellement déjà été proposé de séparer les fractions solubles, notamment au sein d'une phase ou d'une solution aqueuse, et les fractions insolubles respectivement obtenues à l'issue de traitements hydrolytiques ou enzymatiques du lipopolysaccharide . initial qui ont été décrits. Les propriétés endotoxiques de l'une et/ou de l'autre des fractions ainsi séparées étaient alors éventuellement étudiées et comparées aux propriétés endotoxiques de l'extrait endotoxinique initial.Il est cependant significatif de constater que les auteurs des travaux concernés ne se sont pas attachés à isoler, plus particulièrement à partir des susdites fractions hydrosolubles, des sous-fractions hydrosolubles formées de constituants dont les poids moléculaires soient compris dans des intervalles déterminés, en vue de l'étude de la préservation ou de la disparition, dans ces constituants, des propriétés toxiques, d'une part, et d'autres propriétés biologiques, plus particulièrement l'induction d'une protection contre les infections bactériennes, d'autre part. Ils se sont encore moins attachés à étudier les conditions dans lesquelles le traitement hydrolytique ou enzymatique initial devait être mené afin que l'on puisse effectivement obtenir de telles sousfractions, qui soient à la fois actives, notamment à l'encontre des infections bactériennes, et atoxiques. Certes, une telle approche du problème de la détoxification des endotoxines, par dissociation des complexes macromoléculaires qu'elles forment,en sous-unités de masse moléculaire plus faible, a été envisagée par d'autres auteurs, qui ont aussi eu recours à d'autres traitements des fractions endotoxiniques obtenues à partir des bactéries gram négatif, notamment par la méthode de Westphal. En particulier, Oroszlan et Mora (Biochem. Biophys. Res. Commun. 12, 345 (1963)) et Ribi et colle (J. Bacteriol. (1966), 92, 143) proposèrent de réaliser cette dissociation en ayant recours à des détergents ou agents tensio-actifs. Ils constatèrent cependant que les sous-unités obtenues avaient perdu une grande partie de leur activité et, au surplus, qu'elles se réagrégeaient en constituant des particules de poids moléculaires beaucoup plus élevés, dès que le détergent ou l'agent tensio-actif était éliminé. En particulier, Ribi et coll. relatent que des endotoxines obtenues à partir de E. Coli, par extraction au phénol, pouvaient être dissociées jusqu'a' l'obtention de sous-unités d'un poids moléculaire moyen d'environ 20.000, en présence de concentrations suffisantes de désoxycholate de sodium, mais que ces sous-unités se réagrégeaient en une population de particules endotoxiques relativement uniforme ayant un poids moléculaire moyen d'environ 500.000 à 1.000.000, après séparation du désoxycholate de sodium. Dans tous les cas, on constate aussi une restauration des effets toxiques des produits traités. Divers autres auteurs devaient d'ailleurs exprimer l'avis que l'on pouvait s'attendre à que des petites parti cules pourraient perdre certaines de leurs propriétés biologiques caractéristiques, tout en conservant une toxicité élevée (Beer et coll., Rev. Immunol. 1, 533 (1935) et Marx et coll., Zentr. Bakteriol., Parasitenk., Abt.I.Orig. 207, 313 (1968)). D'autres estimaient qu'une taille critique minimum des particules pou vait être nécessaire à la présence chez les endotoxines de leurs propriétés biologiques caractéristiques (Tarmina et colle J. Immunol. (1968), 100, 444). Ces divers travaux ne pouvaient donc qu'éloigner de nouveaux chercheurs de cette voie de recher che visant à la découverte de fractions extractibles à partir des constituants des parois de bactéries, et plus particulièrement de bactéries gram négatif, ayant des activités biologiques importantes, notamment ence qui concerne leur capacité d'induc tion d'une résistance à l'infection bactérienne, tout en étant sensiblement dépourvues de toxicité.C'est pourtant cette voie de recherche que la demanderesse a empruntée avec succès, puis qu'il a été possible d'isoler, à partir de bactéries, et plus particulièrement de bactéries gram négatif ou de leurs parois, des fractions dont les constituants, de poids moléculaire faible, notamment au plus égal à environ 10.000, ont une activité antibactérienne extrêmement importante tout en étant sensiblement dépourvues de toxicité. L'invention concerne en effet des fractions, dites ci après "fractions biologiquement actives atoxiques' extractibles de bactéries, notamment gram négatif, caractérisées en ce que - elles sont hydrosolubles - elles sont constituées de substances dont les poids molécu laires sont au plus égaux ou inférieurs à environ 10.000 - elles sont thermostables - elles sont stables d'une façon générale entre pH 5 et pH 9 et surtout à pH neutre - lorsqu'administrées par voie intrapéritonéale chez la souris, à raison de 1microgranmv & moins, cite fractionsactives par animal, elles protègent 10 animaux sur 10 dans le protocole expérimental qui consiste àleur injecter 1,5 x 106 cellules de Klebsiella (souche Klebsiella pneumoniae, ATCC n 9997), lorsque ces animaux ont reçu 1 jour auparavant lesdites fractions - elles n'induisent pas de choc endotoxinique et de létalitéchezla souris préalablement sensibilisée par12 microgrammes d'acti nomycine D, par voie intrapéritonéale, lorsqu'administrées par voie intraveineuse jusqu'à des doses de 10, voire même 100 microgrammes par animal. En particulier, l'invention concerne des fractions biologiquement actives atox5?es contenant des constituants ayant des poids moléculaires compris entre environ 500 et 10.000. Parmi les "fractions biologiquement actives atoxiques" selon l'invention, on cite aussi celles dont le spectre en ultraviolet présentent un maximum d'absorption à 267-270 nm. L'invention concerne également un procédé pour l'obtention de ces fractions, caractérisé en ce que, partant d'un produit d'extraction bactérienne, ci-après dénommé "extrait brut", hydrosoluble, ayant, entre autres propriétés, celle d'induire une protection contre les infections bactériennes, et contenant des constituants de poids moléculaire élevé supérieur à 10.000, parmi lesquels éventuellement les endotoxines de bactéries dont ce produit d'extraction est issu, on le met en contact avec un agent, notamment enzymatique, dè préférence au sein d'une solution aqueuse, cet agent étant apte à permettre le détachement à partir de "l'extrait brut" hydrosoluble, de fractions formées de constituants à bas poids moléculaire, au plus égal ou inférieur à environ 10.000, dans des conditions de traitement suffisamment douces pour que des propriétés biologiques favorables de "l'extrait brut", plus particulièrement céle d'induire une protection contre les infections bactériennes, soient préservées dans les fractions à bas poids moléculaire. On peut alors recueillir à partir de ce milieu les constituants à bas poids moléculaire, notamment inférieur à 10.000, exempts de constituants à poids moléculaire plus élevé et du susdit agent. De préférence, et si besoin, on procède à la séparation et à la mise à l'écart des fractions contenant les constituants à poids moléculaire plus élevé et éventuellement de l'agent susdit, lequel peut aussi éventuellement être détruit ou dénaturé.La fraction recueillie contenant les constituants à bas poids moléculaire, et qui constitue la susdite "fraction biologiquement active atoxique", est à la fois-biologiquement active, notamment au niveau de l'induction d'une résistance aux infections bactériennes, et atoxique. Les constituants de cette dernière fraction peuvent être récupérés de toute façon en soi connue à partir de la solution, par exemple par précipitation alcoolique, par évaporation de l'eau ou par lyophilisation de la solution, éventuellement après concentration préalable de celle-ci. Il est entendu que l'hydrosolubilité de ce qui a été ci-dessus appelé "extrait brut" hydrosoluble signifie essentiellement que "l'extrait brut" en question est retenu dans la phase aqueuse dans tout procédé permettant de l'obtenir à partir des bactéries concernées entières ou de leurs parois, après séparation des résidus solides obtenus au terme de l'opération d'extraction et, le cas échéant, d'une autre phase non aqueuse et non miscible à la phase aqueuse. D'une façon générale, "l'extrait brut" hydrosoluble susdit, qui constitue la matière première mise ultérieurement en contact avec l'agent enzymatique, résulte de la solubilisation d'une partie, sinon de la totalité, des constituants solubilisabies dans l'eau des couches des parois bactériennes extérieures vis-à-vis de la couche rigide et, de ce fait, d'au moins une partie des LPS de ces bactéries. Outre les LPS, cet extrait brut hydrosoluble contient éventuellement aussi les substances qui participent à la biosynthèse des LPS et des constituants endocellulaires. Cet "extrait brut" hydrosoluble peut encore présenter lui-même une toxicité considérable. D'une façon générale, cet "extrait brut" peut être obtenu par toutes méthodes permettant l'extraction en solutions aqueuses des constituants solubilisables dans l'eau des couches déjà indiquées des bactéries traitées, la condition essentielle à ce stade étant que les propriétés d'induction d'une résistance aux infections bactériennes des constituants des couches externes des parois bactériennes, du type de celle qui est connue pour les endotoxines, soient conservées dans les fractions solubilisées. L'invention découle donc de la découverte que, de "ces extraits bruts hydrosolubles, peuvent être détachées des fractions de bas poids moléculaire présentant notamment les susdites propriétés d'induction d'une résistance aux infections bactériennes, sans cependant posséder la toxicité des endotoxines. Ce détachement doit cependant s'opérer dans des conditions douces, compte tenu de ce que ces fractions à bas poids moléculaire tendent à s'inactiver, à des pH acides ou des pH trop alcalins, notamment, dans ce dernier cas, lorsque le pH dépasse 10. Parmi les bactéries gram négatif susceptibles de donner lieu à "l'extrait brut" tel que défini ci-dessus, on cite, à titre préférentiel, les entérobacteriaceae. I1 est intéressant de noter à leur sujet que les endotoxines des entérobacteriaceae ont en commun un Lipide A qui ne fait l'objet, tout au plus, que de variations extrêmement mineures.P a i les entéro bacteriaceae, les Salmonella constituent une source préférée des fractions biologiquement actives atoxiques selon l'invention. "L'extrait brut" hydrosoluble constituant la matière première, à laquelle est appliqué le procéda selon L'invention, est par exemple constitué par la phase aqueuse qui est obtenue en appliquant à des bactéries gram négatif le procédé bien connu de Westphal, en vue de l'extraction de leurs endotoxines. Comme on l'a déjà rappelé plus haut, ce procédé consiste à traiter ces bactéries ou leurs parois avec un mélange phénol/eau, notamment tel que les proportions finales en volume de phénol et d'eau dans le milieu de traitement soient approximativement égales, à une température de l'ordre de 60 à 70 C. La phase phénolique est séparée et écartée et la phase aqueuse peut être lyophilisée, éventuellement après concentration préalable.Il est à noter qu'une tentative de procéder à une séparation des constituants de poids moléculaires inférieurs à 10.000, à partir de la phase aqueuse ou d'une solution obtenue par dissolution du lyophilisat dans une solution aqueuse, ne permet pas à ce stade d'obtenir une "fraction biologiquement active atoxique" répondant aux critères qui ont été définis plus haut. Il en est de même, lorsque cette phase aqueuse ou cette solution a au préalable été remise en contact avec du phénol, même aux températures plus élevées qui ont été indiquées. Un "extrait brut" préféré est cependant constitué par celui obtenu par traitement des bactéries avec un détergent au sein d'une solution aqueuse. Le recours à un détergent permet en général d'obtenir un rendement en extrait brut actif beaucoup plus important que la technique classique de Westphal, par exemple de l'ordre de 10 X en poids de matière sèche au lieu de 2,5 %, dans le cas où les bactéries traitées initialement sont constituées par des Salmonella enteritidis et/ou le détergent est constitué par du sodium dodécyl sulfate (SDS). Il est alors également possible d'obtenir à partir de cette quantité d'extrait sec plus importante un rendement également plus important en "fractions biologiquement actives atoxiques" selon l'invention. D'une façon générale, la mise en contact des bactéries ou de leurs parois avec le détergent s'effectue au sein d'un milieu aqueux. De préférence, on a recours à un détergent ayant une force telle et utilisé dans un milieu tel et dans des conditions telles, notamment de température et de durée, que l'on fasse passer en solution au moins la partie externe des bactéries traitées (ou la partie correspondante des parois éventuellement initialement rompues et récupérées de ces mêmes bactéries), qui comprend la couche lipopolysaccharidique, Se préférence aussi les couches sous-jacentes, intermédiaires entre la couche externe et la couche rigide interne. "L'extrait brut est constitué par le contenu de la phase aqueuse obtenue, après séparation du matériel bactérien et après élimination du détergent. Dans un mode de mise en oeuvre préfér du procédé selon l'invention, les bactéries ou parois de bactéries sont au moins partiellement délipidées par mise en contact avec des solvants organiques, du type de ceux qui sont usuellement utilisés à cet effet, préalablement à l'action du détergent. A titre d'exemple, on citera parmi les solvants de délipidation usuels qui peuvent être utilisés, le chloroforme, le méthanol, l'acétone, l'éther, l'alcool inamylique, etc., ces solvants étant pris seuls ou en mélange, ou utilisés les uns après d'autres, dans des traitement de délipidation séquentiels successifs. Les nombreux détergents qui peuvent ensuite être utilisés sont naturellement bien connus de l'homme de l'art. On citera à titre d'exemple en plus du SDS déjà mentionné, le lauryl sulfate, le désoxycholate de sodium, les détergents connus sous la désignation commerciale "TRITON XîOO", lequel est constitué par l'éther mono p-(tétraméthyl-1, 1,3,3-butyl)phénylique de polyéthylène glycol ou celui connu sous la désignation commerciale "NONIDET P40" (extrait du pétrole, commercialisé par la Société dite SHELL?, etc. L'opération de traitement des bactéries ou des parois de ces dernières avec le détergent est de préférence réalisé au sein d'une solution aqueuse, à un pH 6,5 - 8,5, notamment avoisinant la neutralité, notamment au sein d'un tampon stabilisateur du pH, par exemple le tampon Tris 1 -2 M (à base de tris-hydroxy-méthylaminométhane), en une concentration comprise par exemple entre environ 0,1 et 10 X, de préférence 0,4 à S %, par exemple de l'ordre de 4 %, pendant une durée variable, par exemple de 5 minutes à 1 heure, à une température allant de l'ambiante à 100" C, de préférence entre environ 50 et 100 C, souvent à la température de reflux du milieu. Les précisions qui précèdent n'ont évidemment qu'unie valeur strictement indicative des différents paramètres dont dispose l'homme de l'art pour effectuer le choix, éventuellement suite à quelques vérifications expérimentales, des paramètres les plus favorables à l'obtention, à partir de la souche bactérienne choisie, des "extraits bruts" constituant la matière première dont seront ultérieurement "détachées" les fractions biologiquement actives atoxiques selon l'invention. D'une façon générale, le détergent et les conditions du traitement choisis doivent permettre l'extraction d'une matière première contenant au moins une partie, sinon la totalité de 11 activité d'induction d'une action protectrice à l'égard des infections bactériennes. La présence de cette activité, dans les parties extraites, peut être constatée ou vérifiée par exemple à l'aide du test consistant à vérifier l'existence de l'effet protecteur contre les infections bactériennes, notamment chez la souris, à une dose cependant inférieure à la dose létale pour l'animal d'expérience. L'élimination du détergent à partir de la phase aqueuse obtenue est réalisée de toute façon en soi connue. Avantageusement, on a recours à une précipitation des fractions actives contenues dans la phase ou solution aqueuse dans des conditions telles que le détergent reste dans la solution. Cette précipitation, effectuée de préférence sur la solution refroidie jusqu'à la température ambiante, ou même jusqu'à une température inférieure, par exemple 60C, est réalisée au moyen de solvants organiques, par exemple de l'alcool. De préférence, le précipité est repris dans une solution aqueuse, notamment au sein d'un tampon et la solution est dialysée pour éliminer les ions et traces de SDS restantes.Par lyophilisation du dialysat, éventuellement concentré au préalable, on obtient l'extrait brut susceptible d'être mis en oeuvre dans le procédé conforme à l'invention pour le détachement de la fraction biologiquement active atoxique, dont des modes de mise en oeuvre préférés sont indiqués plus loin. A ce stade, "l'extrait brut" obtenu, est en général biologiquement très actif. Il est cependant aussi d'une très grande toxicité. Il importe de souligner que le produit en question ne doit pas être mis au contact trop longtemps d'un milieu acide ou dissous dans ce dernier, compte tenu de la grande sensibilité aux acides de la fraction biologiquement active atoxique finalement désirée. Ceci est d'ailleurs en accord avec ce qui a déjà été constaté par certains auteurs, au moins en ce qui concerne la perte par des extraits endotoxiniques soumis à une hydrolyse acide de leur capacité d'induction d'une résistance aux infections bactériennes, même si par ailleurs les produits résultant de l'hydrolyse acide peuvent encore posséder d'autres propriétés susceptibles d'un grand intérêt thérapeutique.De même, il est souhaitable que le pH du milieu d'extraction contenant le détergent choisi reste voisin de la neutralité ou tout au plus ne présente qu'une très légère alcalinité, compte tenu de ce que la fraction biologiquement active finale tend rapidement à perdre son activité à un pH dépassant i0, Le cas échéant, "l'extrait brut peut, avant détachement des fractions biologiquement actives atoxiques, faire l'objet de purifications préalables supplémentaires en vue de l'obtention d'une activité spécifique plus élevée dans la fraction biologiquement active atoxique finale. Eventuellement, "l'extrait brut" peut être soumis à un traitement de délipidation plus poussé encore, à l'aide des solvants organiques tels qu'indiqués plus haut, lesquels ne sont pas aptes à causer le détachement des fractions biologiquement actives atoxiques,à partir de "l'extrait brut" ainsi traité. De préférence aussi, l'extrait hydrosoluble est préalablement déprotéinisé. Bien que les protéines, éventuellement présentes dans le milieu à l'état libre ou liées à d'autres consttuants du milieu, ne semblent pas devoir jouer en ellesmêmes un rôle dans l'opération de détachement de la fraction biologiquement active atoxique, leur présence peut se traduire par une réduction de l'activité spécifique de la fraction biologique active atoxique finalement obtenue. Les susdites protéines peuvent aussi gêner l'action des enzymes utilisées dans les opérations de détachement de la fraction biologiquement active atoxique. On peut d'ailleurs noter que cette déprotéinisation est déjà au moins en partie réalisée sur ceux des "extraits bruts" hydrosolubles qui sont obtenus par la méthode classique de Westphal déjà mentionnée plus haut. Cette déprotéinisation n'est cependant pas acquise d'avance dans le cas des "extraits bruts" hydrosolubles obtenus par l'action d'un détergent sur les bactéries ou parois de bactéries traitées. Cette déprotéinisation peut alors être réalisée par application à cet "extrait brut lui-même, de la technique phénol-eau déjà mentionnée pour le traitement des bactéries ou parois de bactéries, en vue d'en séparer les endotoxines. Coma les solvants organiques de délipidation, le phénol n'est pas apte à produire le détachement des fractions biologiquement actives atoxiques à bas poids moléculaire à partir de "extrait brut", même par traitement à une température audessus de l'ambiante. Un procédé préféré de déprotéinisation de "l'extrait brut consistera donc dans un traitement d'une solution aqueuse de celui-ci, notamment au sein d'un tampon proche de la neutralité, dans du phénol, si besoin à chaud. La phase aqueuse résultant de la réunion du milieu aqueux séparé de la phase phénolique et des lavages de la phase phénolique est ensuite avantageusement soumise, si besoin, à des opérations de purification visant à éliminer à la fois les sels minéraux provenant des tampons, éventuellement utilisés, notamment par dialyse, et les traces de phénol résiduel, notamment par diafiltration. "L'extrait brut déprotéinisé peut être obtenu à nouveau à partir de la solution aqueuse de toute façon en soi connue, par exemple par précipitation alcoolique.Dans ce dernier cas, on a avantageusement recours à une redissolution du précipité obtenu dans un tampon proche de la neutralité, en vue de sa lyophilisation. C'est ce lyophilisat ou une solution aqueuse de ce lyophilisat qui constitue alors "l'extrait brut" préféré duquel est ensuite détachée la fraction biologiquement active atoxique, notamment en ayant recours au traitement par une ou plusieurs enzymes, notamment dans les conditions décrites ci-après. Les enzymes qui peuvent être utilisées pour réaliser le détachement de la "fraction biologiquement active atoxique" à partir de "l'extrait brut" sont celles qui permettent précisément l'obtention de fractions formées de constituants de poids moléculaire au plus égal à 10.000 et dans lesquelles les propriétés biologiques, plus particulièrement leur aptitude à induire une protection contre les infections bactériennes est -conser- vée, ce qui ne peut en fait être constaté, du moins dans le cas où le produit traité contient encore après incubation en présence de ces enzymes des constituants ayant un poids moléculaire plus élevé, que lorsque celles-ci ont été séparées et écartées.Un test qui peut être donc utilisé pour reconnaitre celles des nombreuses enzymes qui peuvent être utilisées repose donc sur un essai de séparation à partir de "l'extrait brut" traité en présence de l'enzyme, de fractions formées de constituants ayant un poids moléculaire inférieur à 10.000 et présentant les propriétés biologiques particulières qui ont été définies plus haut, à savoir la capacité de protection de la souris contre des bactéries infectant, notamment des Klebsiella et l'absence de choc endotoxinique et de létalité chez les souris préalablement sensibilisées par l'actinomycine D, et ce jusqu'à des doses de 10 microgrammes par animal. Parmi ces enzymes figurent celles qui sont capables d'effectuer la lyse soit de l'ADN, soit d'esters contenus dans les parties lipidiques de "l'extrait brut" traité.On peut ainsi avoir recours à des nucléases, notamment les désoxyribonucléases, à des lipases, par exemple la lipase, soit pancréatique, soit extraite de Rhizopus, ou de Candida albicans. Une lipase préférée est celle extraite de Rhizopus. On peut aussi avoir recours à d'autres groupes d'enzymes telles que les phosphatases, les phosphodiestérases et les protéases. Bien entendu, on peut avoir recours à un traitement avec des enzymes distinctes associées ou encore réaliser des séquences d'incubation successives avec des enzymes distinctes. Le traitement enzymatique s'effectue normalement en solution aqueuse, de préférence au pH optimal d'action de l'enzyme utilisée, notamment à un pH compris entre environ 7 et environ 8, par exemple au sein d'un tampon à pH 7,6. La séparation des fractions biologiquement actives de bas poids moléculaire et des fractions toxiques de plus haut poids moléculaire (qui sont écartées) peut être réalisée de toute façon en soi connue. Avantageusement, on a recours à des filtrations sur des membranes ultrafiltrantes telles qu'elles ne laissent pas passer des molécules ayant un poids moléculaire plus élevé que la valeur maximum choisie, de l'ordre de 10.000. On peut aussi utiliser des tamis moléculaires et ne retenir que les parties des éluats qui contiennent des constituants de poids moléculaire inférieur à 10.000. Les constituants biologiquement actifs et atoxiques contenus dans les ultrafiltrats obtenus peuvent ensuite être obtenus de toute façon en soi connue à partir de ces ultrafiltrats, par exemple par lyophilisation. Après traitement, l'enzyme peut être déactivée de toute façon en soi connue. Elle est d'ailleurs séparée en même temps que les constituants de poids moléculaire plus élevé qui restent dans le milieu après le traitement enzymatique, lorsque son eZvHLe do moléculaire est nettement supérieur à flC.O^O et lorsque cette séparation est effectuée par filtration sur membrane ultrafiltrante ou sur tamis moléculaire. C'est ainsi que la lipase de Rhizopus a un poids moléculaire de l'ordre de 25.000. On constate souvent dans un tel cas que l'on peut encore détacher des proportions de fractions biologiquement actives atoxiques, qui peuvent être très supérieures aux quantités obtenues après la première filtration, en procédant à une redis solution dans une solution aqueuse, notamment dans le même tampon, des parties retenues sur le filtre (constituants de poids moléculaire supérieur à 10.000 et enzymes) auxquelles on se réfèrera dans ce qui suit sous l'expression "concentrat", et par réincubation du milieu ainsi obtenu ettoutraitement au phénol à froid et si besoin à chaud (60 - 70"C), avant de procéder à une nouvelle opération de séparation, notamment par filtration, dans les mêmes conditions que sus-indiqué, des fractions contenant une teneur supplémentaire en constituants de poids moléculaire inférieur à 10.000, le nouveau concentrat étant alors éliminé. On notera que le traitement au phénol du premier concentrat a pour effet de dénaturer l'enzyme et de le rendre soluble dans la phase phénol, et contribue à l'obtention de quantités supplémentaires de fractions biologiquement actives et atoxiques. Dans ce qui suit, on décrira les conditions préférées de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, y compris l'obtention d'un "extrait brut" hydrosoluble, qui peut être appliqué à des bactéries gram négatif, notamment à des entérobacteriaceae, telles que les Salmonella enteritidis. 1) Délipidation des bactéries. Partant de bactéries lavées, isolées d'une culture de bactéries réalisée de façon en soi connue, on procède à une délipidation des cellules bactériennes pour séparer et éliminer au moins partiellement les lipides externes faiblement liés, par traitement dans des solvants organiques polaires, notamment dans un mélange chloroforme/méthanol contenant au moins 10 vo lumes et de préférence 24 volumes de chloroforme pour 1 volume de méthanol, pendant une durée d'au moins 12 heures, de préférence de l'ordre de 24 heures, sous agitation. Les cellules sont ensuite séparées par centrifugation et les traces de solvant éliminées par plusieurs lavages, notamment 5 lavages, successifs, avec un tampon ayant un pH voisin de 8, de préférence un tampon Tris 10 2M, les cellules étant chaque fois récupérées par centrifugation.Toutes ces opérations sont réalisées à la température ambiante ou, de préférence, légèrement inférieure, par exemple de l'ordre de 15 C. 2) Traitement des bactéries délipidées Par un détergent. Les bactéries délipidées ainsi obtenues sont alors soumises à l'action d'un détergent,avantageusement du SDS, au sein du même tampon. La concentration du milieu en SDS peut être comprise entre environ 0,4 et environ 5 %, avantageusement de l'ordre de 4 %, le contact étant maintenu pendant une durée d'environ 5 minutes à environ 1 heure, de préférence 1/2 heure, à une température supérieure à l'ambiante, notamment de 50 à 1000 C, de préférence à 1000 C. Le mélange est ensuite refroidi rapidement, notamment dans de la glace, jusqu'à l'obtention d'une température de préférence inférieure à l'ambiante, par exemple de 'ordre de 60 C. Par centrifugation, on élimine les parties non dissoutes et l'on recueille le surnageant, lequel est précipité par addition de 2,5 à 5 volumes, notamment 4 volumes d'alcool absolu refroidi à -200 C. Le milieu est centrifugé et le précipité redissous dans un tampon à pH proche de la neutralité, de préférence dans un tampon Tris 10 M, pH 7,4, la solution est soumise à--une dialyse en vue d'en extraire notamment les traces de phénol restantes, pendant 24 heures contre du tampon Tris, notamment 10 volumes de tampon Tris. Les constituants de la solution (ci-après appelée "dialysat"), qui ne passent pas à travers la membrane de dialyse forment "l'extrait brut", qui peut être directement traité par une enzyme notamment une lipase, apte à détacher les fractions biologiquement actives atoxiques retenues dans cet "extrait brut". 3) Déprotéinisation de "l'extrait brut". De préférence, on réalise cependant au préalable une déprotéinisation de cet "extrait brut" hydrosoluble, notamment en opérant de la façon suivante. On ajoute au dialysat obtenu ci-dessus une quantité d'un mélange de phénol et d'eau de tampon Tris, par exemple à 90 % de phénol (préalablement équilibré à un pH proche de la neutralité, de préférence 7,4), de façon à obtenir finalement approximativement de 40 à 60 %, de préférence de l'ordre de 50 % en volume de ce mélange phéncl/eau (ou tampon Tris) pour 60 à 40 %, de préférence de ltordre de 50 % de dialysat. On effectue une incubation du milieu à une température comprise entre environ 60 et environ 70 C, par exemple de l'ordre de 680C, pendant une durée de 5 à 30 minutes, de préférence de l'ordre de 10 minutes. La phase aqueuse est recueillie par décantation et la phase phénolique, lavée deux fois avec un même volume de tampon proche de la neutralité, i préférence le tampon Tris 10-2M pH 7,4. Les phases aqueuses sont ensuite réunies et soumises à une dialyse pendant une durée de 24 à 48 heures contre un grand volume d'eau distillée, formée d'au moins lo volumes pour 1 volume de phase aqueuse à purifier. Le dialysat est alors soumis à une ultrafiltration ou diafiltration sur une membrane ultrafiltrante, par exemple n'autorisant le passage que de molécules ayant un poids moléculaire inférieur à environ 10.000, afin d'éliminer les traces résiduelles de phénol. La partie retenue sur le filtre ou concentrat" est reprise dans de lteau distillée et la solution précipitée par l'addition de 2,5 à 5 volumes, notamment 4 volumes d'alcool absolu préalablement refroidi à -200C. La précipitation est favorisée par l'additiond'une petite quantité d'acétate de potassium, dosée pour obtenir une concentration en ce sel de l'ordre de 0,01 M. Le précipité formé, recueilli par centrifugation, est dissous dans un tampon Tris 10 2M proche de la neutralité, de préférence de pH 7,4, la solution obtenue étant finalement lyophilisée. Le lyophilisat obtenu constitue "l'extrait brut hydrosoluble déprotéinisé qui est ensuite soumis à l'action de la lipase ou d'ailleurs de toute autre enzyme apte à effectuer le détachement des susdites fractions biologiquement actives atoxiques à partir des constituants de masse moléculaire plus élevée que contient cet extrait hydrosoluble. 4) Détachement de fractions bioloqiques atoxiques. Lorsque l'enzyme est constitué par de la lipase, notamment de Rhizopus ou de la DNase, on peut notamment opérer comme suit. On met d'abord le lyophilisat en solution dans un tampon de pH 7 à 8, de préférence 7,6, de manière à obtenir une concentration en "extrait brut" de l'ordre de 1 milligramme par millilitre de tampon. On ajoute ensuite au milieu, l'enzyme, à raison de l'ordre de 25 à 100 microgrammes par millilitre, notamment de l'ordre de 50 microgrammes par millilitre. On produit ensuite une incubation du milieu à la température où l'efficacité de l'enzyme est maximum, notamment à 37 C, pendant une durée par exemple de 4 à 24 heures. 5) Séparation des "fractions bioloqiquement actives atoxiques". On refroidit alors le mélange d'incubation à la température ambiante et l'on réalise la séparation des fractions biologiquement actives atoxiques qui se sont détachées par ultrafiltration ou diafiltration, notamment sur une membrane ultrafiltrante ne laissant passer que les molécules de poids moléculaire plus faible que 10.000, par exemple une membrane du type de celle qui est commercialisée sous la désignation "AMICON PMîO". Le concentrat retenu sur la membrane peut être redissous dans le tampon ou étendu avec celui-ci, éventuellement soumis à une deuxième incubation, et ensuite traités par du phénol dans les conditions qui ont déjà été indiquées, afin de détacher des quantités supplémentaires de fractions biologiquement actives atoxiques et en même temps de dénaturer l'enzyme, les protéines résultant de la dénaturation de l'enzyme restant dans la phase phénol, comme on l'a déjà indiqué plus haut. Le traitement au phénol peut être effectué à froid. La quantité supplémentaire de fraction biologiquement active atoxique peut alors être séparée par une nouvelle ultrafiltration sur "AMICON PM10", réunie au premier ultrafiltrat contenant la première fraction biologiquement active atoxique avant de procéder, le cas échéant, à la lyophilisation de l'ensemble. Il est à noter qu'il peut être avantageux de procéder en deux temps, pour ce qui est de la séparation des quantités supplémentaires de fractions biologiquement actives atoxiques à partir du premier concentrat, après le traitement phénolique, c'est-à-dire en procédant à une première filtration sur une membrane filtrante ayant des pores plus importants, par exemple une membrane du type de celle commercialisée sous la désignation "AMICON XMîOO", laquelle retient les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à 100.000, ce qui permet d'éliminer dans un premier temps les plus grosses molécules, avant de procéder, dans un deuxième temps, à la filtration sur membrane type tAMICON PM10" ou analogue, pour séparer lesdites quantités supplémentaires de fractions biologiquement actives atoxiques à partir du dernier filtrat. D'autres caractéristiques de l'invention apparaitront encore au cours de la description à titre non limitatif d'exemples d'extraction à partir de bactéries gram négatif, plus particulièrement de S. enteritidis, de fractions biologiquement actives atoxiques ainsi que de certaines des propriétés que ces dernières possèdent. Les bactéries initiales ont toutes été isolées à partir d'une culture obtenue dans les conditions qui ont été décrites dans le paragraphe A de l'exemple I qui suit. Il va de soi que la technique de culture des bactéries ne fait pas partie de l'invention, et que l'on pourrait avoir recours à toutes autres formes de cultures, qu'il s1 agisse de méthodes décrites dans la littérature ou mises au point par l'expérimentateur. De même, le procédé selon l'invention pourrait être appliqué à une matière première constituée par les parois desdites bactéries, parois qui peuvent être obtenues par tout procédé en soi connu décrit dans la littérature. EXEMPLE I A - CULTURE DE S.ENTERITIDIS ET RECOLTE DES BACTERIES GRAM NEGATIF. Al - Milieu de culture I1 contient - 8 g/litre de nutriment broth" (Difco) -20 g/litre du produit "Agar-noble" (Difco). A2 - Maternel utilisé - fioles de Roux. A3 - Préculture en tubes : - A partir d'une souche entretenue sur le milieu ci-dessus et repiquée tous les mois, on ensemence, à l'anse de platine, des tubes de 20 x 200 contenant le milieu (1 tube sert à ensemencer 20 fioles de Roux). - On incube à 37 C pendant 24 heures. A4 - Culture en fioles de Roux : - Chaque fiole de Roux contient 200 ml du milieu. - On ensemence à l'anse de platine à partir des tubes de préculture de 24 heures, 160 fioles pour un lot de fabrication en utilisant 8 tubes. - On incube à 370C pendant 24 heures. A5 - Récolte - On récolte les bactéries par centrifugation et on reprend le culot dans du soluté chloruré isotonique formolé à 3 X et glacé, de façon à avoir un volume final de 2.000 ml. - On centrifuge à 3.000 g pendant 30 minutes. - On reprend les culots en soluté chloruré isotonique glacé de façon à avoir un volume final de 2000 ml. - On lave sur agitateur magnétique 30 minutes. - On centrifuge à 3Q00 g pendant 30 minutes. - On répète trois fois les opérations préie'dentes : reprise dans du soluté chloruré isotonique glacé, puis lavage et centrifugation. On obtient pour 160 fioles, c'est-à-dire 32 litres-de milieu 55 g de cellules humides qui correspondent à 5,4 g de cellules sèches. B - PREPARATION D'UN "EXTRAIT BRUT" HYDROSOLUBLE DE S.ENTERITIDIS. - - Délipidation des cellules : On met en suspension 50 g de cellules congelées dans un mélange chloroforme/méthanol 24/1 pour un volume final de 1 litre. On agite pendant une nuit à 20 C sur une table d'agitation. On centrifuge pendant 20 minutes à 3000 g, et on élimine le surnageant. Le sédiment est repris dans 200 ml de Tris 10 2M pH 7,6 de façon à éliminer les solvants résiduels. Cette opération est répétée quatre fois. On recueille les cellules délipidées après centrifugation à 3.000 g effectuée pendant 30 minutes. B2 - Traitement des cellules délipidées par un détergent. Les cellules délipidées sont reprises par 150 ml de Tris 10 2M pH 7,6. On ajoute 50 ml d'une solution aqueuse de SDS à 16 %. La concentration finale en SDS est de 4 %. On place le mélange dans un bain-marie bouillant pendant 30 minutes. On refroidit le mélange dans de la glace pilée. On centrifuge à 10.000 g pendant 15 minutes. On recueille le surnageant. Cette solution est dialysée pendant une nuit contre du Tris 10 2M pH 7,6. Le volume après dialyse est de 160 mi. On ajoute ensuite 4 volumes d'alcool éthylique, soit 640 ml à la solution dialyséew On obtient un précipité blanc floconneux. On centrifuge à 3.000 g pendant 10 minutes. On reprend le culot par 200 ml du même tampon. C - DEPROTEINISATION DE L'EXTRAIT BRUT" HYDROSOLUBLE. A la solution précédente on ajoute 200 ml de phénol chauffé à 70 C et saturé à 90% avec du tampon Tris 10 2M pH 7,6. On incube le mélange à 70 C pendant 10 minutes. On refroidit dans la glace pilée jusqu'à ce que la température du mélange soit 10 C. On centrifuge à 3.000 g pendant 30 minutes. On obtient ainsi une phase aqueuse et une phase phénolique. On effectue 4 lavages de la phase phénol par 100 ml du même tampon. On sépare les phases comme précédemment par centrifugation. On réunit les phases aqueuses, pour obtenir, après dia filtration, 580 ml de solution aqueuse. On concentre par évaporation sous vide entre 37 et 400C, jusqu'à obtenir un volume de 60 ml. On ajoute 6 ml d'acétate de sodium 0,1 M et 180 ml d'éthanol absolu refroidi à -20 C. On laisse au repos pendant une nuit à - 20 C. On centrifuge à 10.000 g pendant 20 minutes. Le précipité ainsi obtenu est repris par 50 ml de tampon Tris 10-3M pH 7,4. La suspension ainsi obtenue est desséchée par lyophilisation. On obtient 542 mg de produit sec, ce qui représente un rendement d'environ 10 % par rapport poids de cellules séches. Ce produit a une DO (densité optique) à 250 nm de 12 DO/mg. I1 constitue la Fraction C, dont des propriétés biologiques sont indiquées plus loin. D - DETACHEMENT DES "FRACTIONS BIOLOGIQUEMENT ACTIVES ATOXIQUES". Cette opération est effectuée sur 30 mg du produit obtenu à l'étape précédente. 30 mg de produit sec sont mis en suspension dans du tampon Tris 10 M pH 7,4 à raison de 30 ml pour 30 mg. On ajouteî,Smg de lipase de Rhizopus (Produit Calbiochem, activité spécifique 500 unités/mg). On effectue une incubation à 37 C sous agitation magnétique pendant 22 heures. On arrête la réaction en portant le mélange à basse température dans de la glace pilée. E - SEPARATION DES "FRACTIONS BIOLOGIQUEMENT ACTIVES ATOXIQUES". Le mélange refroidi est soumis à une filtration sur filtre"AMICON XM100" (produit commercialisé sous cette marque et cette référence par la Société Amicon). On obtient un filtrat qui correspond à 600 g/ml. Ce filtrat est filtré sur membrane "AMICON PM10". On obtient un filtrat qui correspond à 300 g de substance, ayant les caractéristiques suivantes : Il constitue la "Fraction D (lipase) dont certaines propriétés biologiques sont indiquées plus loin. Son spectre en UV présente un maximum d'absorption à 267 nm. PM inférieur à 10.000. Dans les conditions expérimentales décrites plus loin, la fraction s'est avérée active en protégeant tous les animaux à la dose de 0,2jug par animal. Les animaux n'ont présenté aucun choc à l'injection. A la dose de 10 g, soit 50 fois plus que la dose active, les animaux n'ont présenté aucun signe de toxicité 8 jours après l'injection. Dans les opérations de séparation qui précèdent, on relèvera que la teneur en poids sec du filtrat obtenu après filtration sur le filtre "AMICCN PMîO" est de l'ordre de 10 % de la teneur en substance sèche active de 1,ltextrait "brut" hydrosoluble déprotéinisé initial Il constitue le "premier ultrafiltrat" dont des propriétés biologiques seront indiquées plus loin. On peut encore obtenir des quantités importantes de "fractions biologiquement actives atoxiques" à partir du "con centras retenu sur le filtre "AMICON PMîO". A cet effet, il est redissous ou étendu dans du tampon Tris 10-2 pH 7,4 à raison de 1 millilitre par 10 DO de poids sec.A la solution obtenue, on ajoute le même volume d'un mélange de phénol et d'eau contenant 90 % en volume de phénol et après un contact à froid pendant une durée de 30 minutes, sous agitation, on sépare les deux phases et on soumet la phase aqueuse à une première ultrafiltration sur un filtre du type "AMTCON XM100tf (qui ne laisse passer que les molécules de poids moléculaire inférieur à 100.000) ce qui permet d'obtenir un premier fil trat dont la teneur en matière sèche active est de l'ordre de 50 % vis-à-vis du contenu du susdit "concentrat".On soumet alors ce premier filtrat à une nouvelle ultrafiltration sur le filtre "AMICON PMîO". On recueille un nouvel ultrafiltrat contenant les "fractions biologiquement actives atoxiques" selon l'invention, qui représentent un pourcentage en poids sec de 60 % vis-à-vis de la quantité de concentrat mise en oeuvre. Cette nouvelle fraction (ou "deuxième ultrafiltrat" dans le tableau de résultats plus loin) présente les mêmes propriétés que celles indiquées pour la fraction D (lipase)" qui ont déjà été indiquées plus haut. EXEMPLE II DETACHEMENT DES "FRACTIONS BIOLOGIQUEMENT ACTIVES ATOXIQUES" SOUS L'ACTION D'UNE ASSOCIATION DE RNase et de DNase : On dissout 10 milligrammes de "l'extrait brut" hydrosoluble déprotéinisé (Fraction C) de l'exemple I dans Il ml d'eau distillée, jusqu'à obtenir une solution titrant 110 DO. On introduit dans cette solution 0,1 ml d'une solution titrant 5,5 mg/ml de RNase et 0,1 ml d'une solution titrant 5,5 mg/ml de DNase, de façon à obtenir une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre de chacune de ces enzymes. On réalise une incubation à 37 C pendant 1 heure. On arrête la réaction par addition d'un mélange phénol/eau à 90 % de phénol. On recueille la phase aqueuse, laquelle est lavée à l'éther. On procède ensuite à une ultrafiltration de la solution obtenue sur membrane "AMICON PM10", comme dans la partie E de l'exemple I. On obtient : - 8 ml d'ultrafiltrat contenant 8,7 DO/ml à 268 (nanomètre), soit au total 69,6 DO de matière active. EXEMPLE III On obtient des résultats tout à fait semblables en procédant comme dans l'exemple II, sauf que la seule enzyme utilisée est constituée par la DNase, à raison de 50 microgrammes par millilitre. Les fractions biologiquement actives atoxiques obtenues dans les exemples II et III ont des propriétés tout à fait analogues à celles des fractions biologiquement actives atoxiques obtenues dans l'exemple I. Des résultats numériques sont indiqués dans le "tableau de résultats" qui sera donné plus loin. EXEMPLE V OBTENTION DE FRACTIONS BIOLOGIQUEMENT ACTIVES ATOXIQUES" A PARTIR D'UN !8EXTRAIT BRUT" HYDROSOLUBLE PROVENANT DU TRAITE MENT DES CELLULES DE SALMONELLA ENTERITIDIS PAR LA METHODE AU PHENOL ET A L'EAU. On forme une suspension de bactéries dans une solution de Tris 10 M pH 7,6, à raison de 5 g de cellules sèches par litre de solution. On ajoute à la suspension un volume égal de phénol saturé à 90" C avec du tampon Tris 10 2 M pH 7,6 et l'on incube le mélange à 700 C pendant 30 minutes. On refroidit dans de la glace pilée et par centrifugation on sépare la phase aqueuse à la fois des résidus bactériens non solubilisés et de la phase phénolique. La phase aqueuse obtenue constitue la fraction LPS W" figurant dans le tableau de résultats indiqué plus loin. A cette fraction, on fait subir les traitements décrits dans les parties B, C, D de l'exemple I et l'on sépare par ultrafiltration sur membrane "AMICON PMîO" un ultrafiltrat qui constitue la fraction dite "LPS W - lipase" dans le tableau de résultats indiqué plus loin. PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES DES "FRACTIONS BIOLOGIQUEMENT ACTIVES ATOXIQUES". Les propriétés biologiques favorables des fractions actives obtenues dans le cadre des exemples I à IV, plus particulièrement leur capacité d'induction d'une résistance aux infections bactériennes,et leur "atoxicité",ont été mises en évidence à l'aide des tests pharmacologiques dont la description suit. Les résultats obtenus sont regroupés dans le tableau ci-après. 1) Activité protectrice vis-à-vis d'une infection bactérienne. Ce test est effectué sur la souris. Il consiste à administrer la dose de fraction active à étudier à l'animal, par voie intrapéritonéale (au jour J - 1) et à leur administrer le lendemain par voie intraveineuse (au jour J) 1,5 x 106 cellules de Klebsiella (souche Klebsiella pneumoniae, ATCC nO 9997), dose qui est mortelle pour tous les témoins la recevant également au bout de 24 heures. L'activité protectrice des fractions actives selon l'invention s'apprécie par la survie des animaux traités et infectés avec les cellules de Klebsiella, 24 heures plus tard. Dans le tableau de résultats, sont indiquées sous la rubrique générale 1,Activité" les doses (en microgrammes) des différentes fractions qui ont été étudiées et le "nombre de survies" observé dans les différents groupes de souris traitées. Dans la colonne "Nombre de survies", on fait toujours apparaitre le "nombre de survies" observé (nombre de gauche) et le nombre de souris traitées avec la même dose de la substance à étudier dans chaque groupe (nombre de droite). On a également fait figurer dans ce tableau les résultats obtenus, à titre de comparaison, avec les "extraits bruts" hydrosolubles correspondants, à partir desquels ont été obtenues les différentes "fractions biologiquement actives atoxiques" selon l'invention. 2) Etude de la tolérance. Elle s'apprécie par différents tests. a) Observation des animaux traités par les doses de fractions à étudier, visant à déterminer l'activité de ces différentes fractions. Il s'agit des doses indiquées dans la colonne "Dose (en,ug)" dans la partie du tableau sous le titre "Activité". On observe le comportement des animaux traités par chacune des doses. Le choc à l'injection, de type endotoxinique, se manifeste immédiatement lorsqu'il est induit au moment de l'injection. Il s'apprécie par un hérissement caractéristique du poil des animaux et par une forte hypotonie. Il s'agit d'une appréciation qualitative. L'indication d'une croix dans la colonne "Choc à l'injection" vise à indiquer qu'aux doses correspondantes des substances à étudier, le choc à l'injection" se manifestait. Au contraire, l'indication "O" traduit l'appréciation qualitative d'absence de "choc à l'injection". b) Tolérance chez la souris normale, 8 jours après l'injection des doses à étudier. On étudie le comportement des animaux 8 jours après l'administration par voie intraveineuse de doses 100 à 1.000 fois supérieures des fractions à étudier, en observant plus particulièrement les manifestations de hérissement du poil, d'hypotonie et de létalité. Ces essais ont été faits essentiellement avec la "fraction C" de l'exemple I. Les résultats figurant dans le tableau montrent qu'aux doses de 100 à 200 microgrammes respectivement, les souris normales subissent une forte létalité. c) Tolérance chez l'animal sensibilisé à l'actinomycine D. L'injection préalable de 12,5 microgrammes d'actinomycine D à des souris entraîne une sensibilisation considérable de ces dernières à l'endotoxicité des lipopolysaccharides ,L'actino- mycine D est administrée aux souris par voie intrapéritonéale, à raison de 12,5 microgrammes par animal. Les doses à étudier des différentes fractions (y compris, à titre de comparaison, des extraits hydrosolubles initiaux des exemples I etIV, c'est-à-dire de la"fraction C" et de la"fraction LPS W") sont administrées par voie intraveineuse. Les-résultats sont regroupés dans la partie du tableau sous la rubrique "Toxicité". Les résultats chiffrés indiqués font également apparaître le nombre de souris que comprenait chaque groupe (nombre de droite) et le nombre de souris à l'intérieur de ce groupe décédées des suites de l'administration de la dose commune administrée à chaque souris de ce groupe. La comparaison des résultats pour la "fraction C" de l'exemple I fait apparaître le degré considérable de sensibilisation induite par l'actinomycine D. 0,05 microgrammes de la "fraction C" de l'exemple I sont létaux à 100 % pour les souris. Pour la même dose de la "fraction LPS W" 2 souris seulement sur les 5 du groupe traité avec 0,05 microgrammes de cette fraction étaient mortes 24 heures après l'administration. L'astérique accompagnant le résultat vise seulement à rappeler que les 3 autres souris du groupe étaient au moment de l'observation sous l'effet d'un choc de type endotoxinique considérable, précédant de peu la mort. La comparaison des résultats produits par les "extraits bruts" hydrosolubles, d'une part, et par les fractions actives selon l'invention, d'autre part, permet de constater le caractère "d'atoxicité" des fractions actives selon l'invention. Des doses de 100 microgrammes des "fractions (D) lipase" de l'exem- ple I n'induisent aucune mort chez les souris des groupes qui les ont reçues. L'ensemble des résultats indiqués fait apparaître le considérable degré de détoxification ou d'atoxicité des fractions actives selon l'invention. Alors que les doses actives des fractions selon l'invention sont d'un ordre de grandeur semblable à celui des doses actives des fractions de comparaison, la"toxicité" des fractions selon l'invention a été réduite dans une proportion considérable, vis-à-vis de celle qui est observée avec les"extraits bruts. Les fractions actives selon l'invention constituent des principes actifs de médicaments de grande valeur, utiles, entre autres, pour la stimulation des défenses immunologiques et plus particulièrement pour la prévention et le traitement des maladies infectieuses, notamment de celles qui résistent aux antibiotiques. L'invention concerne aussi les compositions pharmaceutiques contenant ce principe actif, notamment en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Elle concerne plus particulièrement les compositions injectables, dans lesquelles les fractions actives selon l'invention sont associées à un soluté stérile injectable, les solutions obtenues pouvant être administrées par voie intramusculaire, intraveineuse ou, le cas échéant, par perfusion. L'administration par voie parentérale est le mode d'administration préféré du médicament selon I1 invention. Il peut être administré sous d'autres formes, notamment parvoie orale, par voie rectale ou sous toute forme permettant son amenée au contact de muqueuses, par exemple sous forme d'aérosols. Les compositions déstinées à l'administration partie orale com- prennent avantageusementoutre des excipients pharmaceutiquement acceptables, un agent de protection permettant aux principes actifs de n'être pas endommagés dans une mesure trop importante, lors de leur passage à travers l'estomac. On peut avoir recours à toutes les formules connues à cet effet.On peut aussi avoir recours à des enrobages ou encapsulages résistant au milieu gastrique acide. TABLEAU DE RESULTATS ACTIVITE TOXICITS Nombre de Choc à s/souris normales s/souris Actino D 12,5) FRACTIONS Dose (en g) survies l'injection Dose (en/ g) Sécédées Dose (en g) Décédées "Fraction C" de 1 10/10 + 200 7/10 1 10/10 l'exemple I 0,1 18/18 + 100 5/10 0,1 10/10 0,05 10/10 0 0,05 20/20 0,01 0/10 0 0,01 6/10 "Fraction (p) lipase" de l'exemple I ( 1 8/8 0 100 0/5 1er ultrafiltrat ) 0,5 7/8 0 ( 0,2 10/10 0 10 0/5 ) 0,1 3/10 2ème ultrafiltrat ( 1 8/8 0 100 0/5 ) 0,5 5/8 0 "Fraction (D) DNase + RNase" de 1 8/8 0 l'exemple II 0,5 6/8 0 "Fraction (D) DNase" de 1 8/8 0 l'exemple III 0,5 8/8 0 LPS w de 30 7/8 + 0,1 5/5 l'exemple IV 20 10/10 + 0,05 2/5 10 9/18 + "Fraction (LPS W + lipase") 0,2 10/10 0 de l'exemple IV I1 est encore précisé que la souche de S. enteritidis qui a été utilisée dans les exemples est une souche Salmonella enteritidis var. Danioz, qui a été fournie par l'Institut Pasteur. Il est aussi signalé que le terme "diafiltration" tel qutil a été utilisé désigne ltopération (qui peut également être appelée "dialyse par ultrafiltration") qui consiste à soumettre la solution contenant les substances à "diafiltrer", à une ultrafiltration à travers une membrane filtrante, tout en régénérant la solution soumise à cette ultrafiltration avec le solvant ou le tampon utilisé à ce titre, du côté de la membrane où sont retenues les constituants de poids moléculaires les plus élevés, non filtrables à travers la membrane, et ce de façon à ce que le volume de cette solution soit maintenu sensiblement constant. Enfin, il est mentionné, en ce qui concerne les unités de "densité optique" utilisées pour apprécier les poids en ma tières sèches contenues dans les solutions traitées ou obtenues, que 11 DO correspondent approximativement à 1 mg de substances sèches. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes. REVENDICATIONS 1 - Procédé pour obtention d'une "fraction biologiquement active atoxique", caractérisé en ce que, partant d'un extrait brut" hydrosoluble constitué par un produit d'extraction bactérienne ayant, entre autres proprIétés, celle d'induire une protection contre les infections bactériennes, et contenant des constituants de poids moléculaire élevé supérieur à 10.000, parmi lesquels éventuellement les endotoxines de bactéries dont ce produit d'extraction est issu, on le met en contact, de préfé renée gu sein d'une solution aqueuse, avec un agent apte à permettre le détachement à partir de "l'extrait brut" hydrosoluble, de fractions formées de constituants à bas poids moléculaire, au plus égal ou inférieur à environ 10.000, dans des conditions de traitement suffisamment douces pour que des propriétés biologiques favorables de "l'extrait brut", plus particulièrement celle d'induire une protection contre les infectionsbactériennes, soient préservées dans les fractions à bas poids moléculaire. 2 - Procédé selon la revendication i, caractérisé en ce que l'on procède à la séparation à partir du milieu de rédaction, notamment par ultrafiltration ou diafiltration, et à la mise à l'écart des fractions contenant des constituants à poids moléculaires éleves, toxiques, dont le poids moléculaire est notamment supérieur à 10.000, et en ce que l'on recueille les constituants à bas poids moléculaire, notamment inférieur à 10.000, qui forment la susdite "fraction biologiquement active atoxique". 3 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le susdit agent de détachement est un agent enzymatique. 4 - Procédé selon l'une quelconque des révendications 1 à 3, caractérisé en ce que "l'extrait brut" hydrosoluble susdit résulte de la solubilisation d'une partie, sinon de la totalité, des constituants solubilisables dans l'eau des couches des parois bactériennes7 plus particulièrement de bactéries grom négatif, extérieures vis-à-vis de la couche rigide et, de ce fait, d'au moins une partie des LPS de ces bactéries, cet extrait brut hydrosoluble contenant éventuellement aussi les substances qui participent } la biosynthèse des LPS et des constituants endocellulaires. 5 - Procédé delon la revendication 4, caractérisé en ce que "l'extrait brut" est originaire de bactéries du groupe des entérobactériaceae, notamment de Salmonella, de préférence Salmonella enteritidis. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que "l'extrait brut" est obtenu par traitement des susdites bactéries ou de leurs parois par un mélange eau-phénol, à une température de l'ordre de 60-70"C, et par récupération de la phase aqueuse qui contient le susdit "extrait brut" hydrosoluble. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la quantité de phénol utilisé est telle qu'après mise en contact avec la solution de "l'extrait brut", on obtient finalement un mélange phénol-solution aqueuse comportant de l'ordre de 50 % en volume de phénol. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que "l'extrait brut" est obtenu par action d' un détergent sur les bactéries en suspension au sein d'un milieu aqueux, que l'on récupère la phase aqueuse et que l'on procède à la séparation du détergent et de la- fraction biologiquement active qui est récupérée. 9 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le détergent a une force telle qu'il peut faire passer en solution au moins la partie externe des bactéries traitées (ou la partie correspondante des parois éventuellement initialement rompues et récupérées de ces mêmes bactéries), qui comprend la couche lipopolysaccharidique, de préférence les couches sousjacentes, intermédiaires entre la couche externe et la couche rigide interne. 10 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que le détergent est constitué par du sodium dodécyl sulfate. Il - Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que le détergent est constitué par le lauryl sulfate, l'éther mono p-(tétramethyl-1, 1,3,3-butyl)phénylique de polyéthylène glycol ou par une fraction détergente extraite du pétrole. 12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que le traitement des susdites bactéries est réalisé au sein d'une solution aqueusedépH infér ur à10, de préférence à un pH 6,5 - 8,5, avec une concentration de détergent comprise entre environ 0,1 et 10 %,de préférence 0,4 à 5 %, à une température comprise entre l'ambiante et 10" C, de préférence entre environ 50 et 100" C, notamment à la température de reflux du milieu. 13 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le traitement par le détergent des susdites bactéries est réalisé au sein d'une solution aqueuse à pH sensiblement neutre. 14 - Procédé Selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, caractérisé en ce que l'on procède à la séparation du détergent,par précipitation des fractions actives à stade d'un solvant organique, notamment un alcool. 15 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 14, caractérisé en ce que I'extrait brut" hydrosoluble obtenu est soumis, préalablement à l'action de l'agent, notamment enzymatique, apte à permettre le détachement de la "fraction biologiquement active atoxique", à un traitement de déprotéinisation, de préférence par traitement avec du phénol, si besoin à chaud, le volume de phénol utilisé étant tel que la proportion en volume du phénol vis-à-vis du mélange phénol-solution aqueuse obtenu soit de l'ordre de 60 à 40 %, de préférence de l'ordre de 50 %, la phase phénol étant ensuite séparée de la phase-aqueuse qui contient la "fraction biologiquement active atoxique". 16 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent enzymatique utilisé pour réaliser le détachement de la "fraction biologiquement active atoxique" est choisi parmi les enzymes sélectionnées selon la capacité qu'elles peuvent avoir de produire le détachement à partir de l'extrait brut d'une fraction, formée de constituants, ayant des poids moléculaires inférieurs à 10.000,ayant une capacité de protection de la souris contre des bactéries infectieuses, notamment des Klebsiella, mais n'engendrant pas de choc endotoxinique et de létalité chez les souris préalablement sensibilisées par une dose de 12,5 microgrammes d'actinomycine D et ce jusqu'à des doses de 10 microgrammes par animal. 17 - Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'enzyme est choisie parmi les nucléases, notamment les désoxyribonucléases, les lipases, par exemple la lipase, soit pancréatique, soit extraite de Rhizopus, ou de Candida albicans, les phosphatases, les phosphodiestérases et les protéases. 18 - Procédé selon la revendication 17, caractérisé -en ce que la susdite enzyme est constituée par la lipase extraite du Rhizopus et que le traitement est effectué au sein -7'un tampon aqueux à pH compris entre environ 7 et environ 8, notamment de l'ordre de 7,6. 19 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1G a 18, caractérisé en ce que, après action de l'enzyme et séparation, notamment par diafiltration, de la "fraction biologiquement active atoxique" qui s'est détachée, on procède à une réincubation du concentrat contenant les constituants de poids moléculaire plus élevé et l'enzyme, et, le cas échéant, à un traitement avec du phénol, avant de procéder à une nouvelle opérationde séparation, notamment par filtration, des fractions supplémentaires formées de constituants de poids moléculaire inférieur à 10.000. 20 - Composition formée de "fractions biologiquement actives atoxiques", extractibles de bactéries, notamment gram négatif, et telles que celles obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, ces fractions étant caractérisées en ce que - elles sont hydrosolubles - elles sont constituées de substances dont les poids moléculadres sont au plus égaux ou inférieurs à environ 10.000 - elles sont thermostables - elles sont stables d'une façon générale entre pH 5 et pH 9 et surtout à pH neutre ,- - lorsqu'adrninistrées par voie ~intrapèritonéale chez la souris, à raison d'environ 1 microgramme, de fractions actives par animal, elles protègent 10 animaux sur 10 dans le protocole expérimental qui consiste à leur injecter 1,5 x 106 cellules de Klebsiella (souche Klebsiella pneumoniae, ATCC n 9997), lorsque ces animaux ont reçu 1 jour auparavant lesdites fractions - elles n'induisent pas de choc endotoxinique et de létalité chez la souris préalablement sensibilisée par 12,5 microgrammes d'actinomycine D, par voie intrapéritonéale, lorsqu'administrées par voie intraveineuse jusqu'à des doses de 10, voire meme 100 microgrammes par animal. 21 - Composition selon la revendication 20, caractérisée en ce que ses constituant ont des poids moléculaires compris entre environ 500 et environ 10.000. 22 - Composition selon l'une quelconque des revendications 21 et 22, caractérisée par un spectre en ultraviolet présentant un maximum d'absorption à 267-270 nm. 23 - médicament contenant a titre de principe actif une composition, selon l'une quelconque des revendications 20 à 22, ou avec les "fractions biologiquement actives atoxiques" obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 d 19, le cas échéant en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable.