FR 2356937 A1 19780127 FR 7719322 A 19770623 La présente invention concerne des réactifs enzymatiques pour la détermination de la teneur en cholestérol, qui contiennent de oxydase de cholestérol. Les réactifs enzymatiques actuels utilisant'l'oxydase de cholestérol pour mesurer le cholestérol dans un échantillon, mesurent la quantité de peroxyde d'hydrogène produit par la réaction entre l'oxygène et le cholestérol, qui est transformée en une mesure de la quantité de cholestérol dans l'échantillons Les mesures du peroxyde d'hydrogène sont généralement basées sur la réaction entre le peroxyde d'hydrogène et un colorant qui provoque un changement de couleur. Ce changement de couleur est mesuré et est transformé en une mesure indiquant la quantité de peroxyde d'hydrogène présent. Des substances réductrices, comme la glutathione, l'acide ascorbique et l'acide urique qui sont présents dans les fluides humaines, réagissent avec le peroxyde d'hydrogène et empêchent que tout le peroxyde d'hydrogène réagisse avec le colorant. Cela provoque une perte de précision dans la détermination de la teneur en cholestérol0 Une solution à ce problème consiste à mesurer le taux de consommation d'oxygène dans une conversion enzymatique du cholestérol en cholest-4-èn-3-one et peroxyde d'hydrogène et à transformer la mesure en quantité de cholestérol présent. Un analyseur du taux d'oxygène et un procédé procurant une telle mesure sont décrits dans les brevets UOS Nos. 3.857.771 et 3.9330593 à James C. Sternberg, ces brevets étant incorporés ici à titre de référence Tandis que des systèmes de mesure du taux d'oxygène comme ceux décrits dans les brevets ci-dessus mentionnés, peuvent utilement être employés pour mesurer le cholestérol total dans un échantillon, la présence de substances dans l'échantillon qui inhibent la réaction des enzymes avec le cholestérol et/au les esters de cholestérol, ou qui inhibent la disponibilité du cholestérol pour la réaction avec les enzymes (i seront ci-après appelées généralement agents inhibants) peut rendre de telles mesures assez imprécises. En particulier, les agents inhibants qui semblent être présents dans un sérum turbidetcontenant plus de la concentration normale en triglycérides, semblent diminuer la disponibilité du cholestérol pouvant réagir et/ou diminuer le taux auquel les enzymes catalysent les réactions conduisant à la consommation d'oxygène (ce qui sera appelé ci-après généralement effets inhibants sur la consommation d'oxygène), Dans chaque cas, il en résulte une réduction par rapport au taux normal de consommation d'oxygène telle que la mesure du taux de la consommation d'oxygène en présence de tels agents inhibants ne donne pas une mesure précise de la concentration en cholestérol0 Par exemple, on a trouvé qu'en utilisant le système de mesure du taux d'oxygène pour déterminer le niveau total de cholestérol dans certains échantillons, le taux de la consommation en oxygène était inférieur à celui auquel on aurait pu s'attendre à partir de la teneur en cholestérol dans l'échantillon, la teneur réelle en cholestérol dans l'échantillon ayant été anterieurement déterminée par la détermination bien acceptée du cholestéroltotsldeAbell, J. BiolO Chem., 195:367 (1952), cet article étant incorporé ici comme référence, On a découvert qu'en ajoutant un agent tensio-actif cationique à un réactif enzymatique pour la détermination de la teneur en cholestérol, du type comprenant de l'oxydase de cholestérol et un agent tampon, le taux d'oxygène consommé n'était sensiblement pas affecté par la présence des agents inhibants ci-dessus dans l'échantillon déterminé.Par suite, le taux de la consommation d'oxygène mesuré par des analyseurs du taux d'oxygène comme ceux décrits dans les brevets cidessus mentionnés, peut être accompli en quelques secondes, et sera une mesure réelle du cholestérol total contenu dans l'échantillon qui est analysé, Pour éviter de soumettre l'échantillon à un processus séparé de saponification, il est préférable que le réactif enzymatique de la détermination de la teneur en cholestérol comprenne de plus de l'esterase de cholestérol. On pense que l'esterase de cholestérol catalyse la réaction entre l'eau et les esters de cholestérol présents dans l'échantillon pour donner du cholestérol et un acide gras comme sous-produit. Le cholestérol produit par l'esterase de cholestérol et tout cholestérol initialement présent dans l'échantillon réagissent avec l'oxygène par l'action catalytique de l'oxydase de cholestérol pour donner de la cholest-4-èn-3-one et du peroxyde d'hydrogène0 La vitesse ou le taux auquel l'oxygène est consommé dans la réaction avec le cholestérol, peut Qtre transformé par des techniques connues en une mesure de la concentration en cholestérol. Le réactif enzymatique pour la détermination de la teneur en cholestérol selon la présente invention comprend de l'oxydase de cholestérol, un agent tampon en une quantité pour produire une solution ayant un pH entre environ 5,5 et environ 8, et un agent tensio-actif cationique en une quantité suffisante pour neutraliser sensiblement tous les effets des agents inhibants présents dans un échantillon à déterminer, sur la consommation d'oxygène. De préférence, les réactifs comportent également de ltesterase de cholestérol. Les agents tensio-actifs cationiques employés dans la présente invention sont utilisés en une quantité suffisante pour neutraliser les effets inhibants sur la consommation d'oxygène, des triglycérides et autres agents inhibants. Une méthode pour déterminer les quantités minimale et maximale, et par conséquent l'étendue, de l'agent tensio-actif cationique pouvant être utilisé dans le réactif enzymatique de la détermination de la teneur en cholestérol est la suivante. On détermine d'abord la teneur en cholestérol total dans une série d'échantillons par une méthode de référence, comme celle de Abell mentionnée ci-dessus0 Les valeurs de cholestérol total de cette série d'échantillons sont alors déterminées en utilisant la méthode du taux d'oxygène (comme cela est décrit dans les brevets U.S. Nos. 3.933.593 et 3.8570771) avec un groupe de réactifs enzymatiques faisant partie du cadre de la présente invention, comme dans les Exemples I à VIII cidessous, où les éléments de ce groupe contiennent diverses quantités de l'agent tensio-actif cationique. La quantité minimale de l'agent tensio-actif cationique requis est la quantité qui donne des valeurs de cholestérol total pour tous les échantillons qui sont égales aux valeurs obtenues par la méthode de référence (comme an l'a indiqué ci-dessus, à des niveaux inférieurs au minimum de l'agent tensio-actif cationique, les valeurs de cholestérol total pour certains échantillons semblent plus faibles qu'avec la méthode de référence). Quand l'agent tensio-actif cationique est présent en une quantité supérieure à la quantité maximale souhaitable, il se produit une dénaturation par l'agent tensio-actif de l'oxydase de cholestérol et de l'esterase de cholestérol. Cette dénaturation provoque à la fois le retard de la vitesse de conversion des esters de cholestérol en cholestérol et de la vitesse de conversion du cholestérol en cholest-4-èn-3-ol. Si la quantité de l'agent tensio-actif cationique augmente au-dessus de cette quantité maximale, la vitesse de consommation d'oxygène dans la réaction devient de plus en plus lente jusqu'à ce qu'il devienne impossible de mesurer cette vitesse. En plus de ce qui précède, il est préférable que le réactif enzymatique selon l'invention comprenne environ 0,0:i à environ 0,4 et mieux environ 0,005 à environ 0,2 pour cent en poids de la solution finale de l'agent tensioactif cationique. De façon optimale, ce réactif comprend 0,1 pour cent en poids de l'agent tensio-actif cationique. On peut virtuellement employer tout agent tensio-actif cationique dans la présente invention0 Une compilation des agents tensio-actifs cationiques commercialisés que l'on peut utiliser dans la présente invention est parue dans McCutcheon's Detergents & Enulsifiers, 1975, North American Edition, McCutcheon Division, Mc Publishing Co., Glen Rock, N.J., Etats Unis d'Amérique, cette publication étant incorporée ici comme référence. Dans la présente invention on peut utiliser des agents tensio-actifscatimique d'imid oMkdum quaternaire, de pyridinium, de quinolinium, et d'ammonium quaternaire. On peut citer comme agents tensio-actifs qui sont particulièrement utiles dans la présente invention le chlorure de 8 hydroxyéthylbenzyl stéaryl imidazolinium, le chlorure de laurylpyridinium et le bromure de laurylisoquinoliniumo Par ailleurs, des agents tensio-actifs d'ammoniumquateaixecatLonique comprenant du chlorure de di-isobutyl phénoxy éthoxyéthyl diméthyl benzyl ammonium, du chlorure de di-isobutylcrésoxy- éthoxyéthyl diméthyl ammonium et du chlorure de méthyldodécylw benzyl triméthyl ammonium semblent être une classe préférée d'agents tensio-actifs cationiques. Plus particulièrement, on préfère parmi les agents tensio-actifs cationiques d'ammonium quaternaire, les sels d'alkyldiméthylenzylaiimonium. Les sels particuliers d'alkyldiméthylbenzylammonium qui sont utilisés dans les modes de réalisation de 17invention sont l'Hyamine 3500 fabriquée par Rohm & Haas de Philadelphie, U.S.A, et le chlorure Zephiran fabriqué par Winthrop Laboratories, une division de la Sterling Drug Company, New York, U.S.A.L'Hyamine 3500 est une dénomination commerciale du chlorure de sodium-alkyldiméthylbenzylaemonium où le groupe alcoyle est un mélange d'alcoyles contenant environ 50% de C14H29 environ 40% de C12H25, et environ 10%' de C16H33. Le chlorure Zephiran est une dénomination commerciale du chlorure d'alkyldiméthylbenzylammonium où le groupe alcoyle est un mélange d'alcoyles de C8H17 à C18H370 Tout agent tampon compatible avec les autres constituants du réactif peut étire utilisé ici.On peut citer comme agents tampon que l'on peut utiliser, les sels de phosphate comme l'orthophosphate de potassium, les sels de citrate comme le citrate de sodium ou les sels d'acétate comme l'acétate de sodium. L'agent tampon est présent en une quantité pour produire une solution ayant un pH entre environ 5,5 et environ 8 et de préférence un pH de l'ordre de 6. On peut utiliser toute oxydase de cholestérol dans le réactif de la présente invention. La quantité exacte de l'oxydase de cholestérol employée dans le réactif n'est pas critique. De préférence, on emploie dans la présente invention de l'ordre de 0,2 à environ 5, mieux de l'ordre de 0,5 à 2 et encore mieux de l'ordre de 1 à environ 1,5 Unités Internationalespar millilitre du réactif de l'oxydase. de cholestérol. On peut éventuellement employer environ 1 ,2 Unités Internatio nales pr millilitre du réactif d'oxydase de cholestérol. On peut utiliser toute esterase de cholestérol dans la présente invention. La quantité exacte de l'esterase de cholestérol employée dans la présente invention n'est pas critiquez On emploie, dans la présente invention, de l'ordre de O à environ 5, de préférence del'ordre de 0,001 à environ 1 et mieux de O,005 à 0,05 Unité Internationale par millilitre du réactif, d'esterase de cholestérol dans la présente inven tison0 De façon optimale, on utilise environ 0,014 Unité Internationale par millilitre du réactif d'esterase de cholestérol. Dans un mode de réalisation préféré, on utilise un agent tensio-actif non ionique pour maintenir le cholestérol et les esters de cholestérol du serum en solution. Quand on l'emploie dans le réactif selon la présente invention, la quantité de l'agent tensio-actif non ionique utilisé n'est pas critique, mais il est de préférence présent en une quantité de l'ordre de 0,01 à environ 0,5, et mieux de l'ordre de 0,05 pour cent en poids du réactif. On peut virtuellement employer tout agent tensio-actif non ionique dans la présente invention. Une compilation des agents tensio-actifs non ioniques commercialisés que l'on peut utiliser dans la présente invention est parue dans McCutcheon's Detergents & Emulsifiers, 1975, North American Edition. On peut indiquer comme exemples d'agents tensio-actifs non ioniques que l'on peut employer dans la présente invention, le nonylphénoxypolyéthylèneoxy éthanol et le monolaurate de sorbitol polyoxyéthylé. On a obtenu des résultats satisfaisants en utilisant l'agent tensio-actif non ionique Triton X-100 an une quantité de l'ordre de O,G5 pour cent en poids de la solution totale. Triton X-100 est une marque de l'isooctylphénoxypolyethoxy- méthanol0 il est également préférable d'ajouter au système réactif selon l'invention, un sel de bile. Quand on l'emploie dans le réactif de la présente invention, la quantité du sel de bile utilisé n'est pas critique mais il est présent de préfé renceen quantités de l'ordre de 0,01 à environ 0,1 et mieux de l'ordre de 0,08 pour cent en poids de la solution totale. Les sels de bile semblent maintenir les esters de cholestérol et le cholestérol en condition soluble, et les rendant disponibles pour la réaction par les enzymes On peut citer comme exemples de sel de bile pouvant être utilisé dans le réactif, le cholate de sodium, le taurocholate, le déoxycholate et le taurodéoxycholate0 Dans le mode de réalisation préféré, le sel de bile préféré est le cholate de sodiums Des compositions de systèmes réactifs préférés selon la présente invention sont données ci-dessous Exemple I Esterase de cholestérol 0,007 UI/ml Oxydase de cholestérol 1 Ul/ml K2HP 4 et KH2PO4 mélangés 1,0 molaire pour produire un pH de la solution de 6,0 Triton X-100 0,05% Cholate de sodium 0,08% Hyamine 3500 0,1,' Exemple II Esterase de cholestérol 1 UI/ml Oxydase de cholestérol 1 UI/ml K2HP 4 et KH2PO4 mélangés 1 ,O molaire pour produire un pH de la solution de 6,0 Cholate de sodium 0,08% Hyamine 3500 0,08% Exemple III Esterase de cholestérol 1 UI/ml Oxydase de cholestérol 1 UI/ml K2HP04 et KH2P 4 mélangés 1,0 molaire pour produire un pH de la solution de 6,0 Triton X-100 0,05% Tairocholate de sodium 0,08% Chlorure de ss -hydroxy- 0,1% éthylbenzyl stéaryl imid azo 1 inium Exemple IV Esterase de cholestérol 1 UI/ml Oxydase de cholestérol 1 UI/ml Acide citrique et citrate 1,0 molaire de sodium mélangés pour pro duire un pH de 6,0 Triton X-100 0,5% Hyamine 3500 0,1% Cholate de sodium 0,08,' Exemple V Esterase de cholestérol 0,014 UI/ml Oxydase de cholestérol 1 UT/ml Acide citrique et citrate 1,0 molaire de sodium mélangés pour pro duire un pH de 6,0 Chlorure de Laurylpyridinium 0,1% Cholate de sodium 0,08% Exemple VI Esterase de cholestérol 1 UI/ml Oxydase de cholestérol 1 Ul/ml Acide acétique et acétate de 1,0 molaire sodium mélangés pour produire un pH de 6,0 Hyamine 3500 0,1% Monolaurate-sodium de sorbitol 0,05% polyoxyéthylé Exemple VII Esterase de cholestérol 1 UI/ml Oxydase de cholestérol 1 UI/ml Acide acétique et acétate de 1,0 molaire sodium mélangés pour produire un pH de 6,0 Hyamine 3500 0,08% Triton X-100 0,05% Taurocholate de-sodium 0,08% Exemple VIII Esterase de cholestérol 0,014 UI/ml Oxydase de cholestérol 1,2 UI/ml K2HP04 et KH2P34 mélangés 1,0 molaire pour produire un pH de la solution de 6,0 Triton X-100 0,05 Cholate de sodium 0,08% Hyamine 55500 0,1% D'autres exemples de systèmes réactifs préférés sont tels qu'indiqués dans l'Exemple I en remplaçant l'Hyemine 3500 par environ 0,1 pour cent en poids de l'un des agents tensio-actifs cationiques d'ammonium quaternaire indiqués ci dessus Dans les systèmes réactifs préférés décrits ici, on emploie l'esterase de cholestérol pour hydrolyser les esters de cholestérol en cholestérol. Cependant, l'invention n'est pas limitée à l'esterase de cholestérol pour accomplir cette hydrolyse, mais elle comprend des réactifs employant d'autres agents d'hydrolyse comme des matériaux alcalins qui peuvent remplacer l'esterase de cholestérol.On peut citer comme matériaux alcalins, la potasse dans 1 'méthanol et la soude dans ltéthanol. Si un matériau alcalin remplace 1' esterase de cholestérol pour effectuer l'hydrolyse des esters de cholestérol, le serum doit d'abord réagir avec le matériau alcalin. Un fragment peut alors réagir avec un système réactif semblable aux exemples à l'exception que le système réactif ne contient pas d'esterase de cholestérol. Le système réactif selon la présente invention tel que décrit ici peut être préparé sous forme d'un seul réactif contenant tous les constituants décrits ci-dessus, ou peut être préparé en un ensemble se composant de deux ou trois réactifs0 En préparant un ensemble comprenant deux réactifs, un réactif peut contenir de l'esterase de cholestérol et de l'oxydase de cholestérol et le réactif restant peut contenir la solution tampon et tout autre-ingrédient indiqué cidessus. Pour préparer un ensemble réactif se composant de trois réactifs séparés, un premier réactif peut se composer d'une solution d'oxydase de cholestérol, un second peut se composer d'esterase de cholestérol et un troisième peut se composer d'une solution aqueuse d'un tampon, d'un agent tensio-actif et de tous autres ingrédients décrits ci-dessus. Le système réactif du mode de réalisation préféré est un ensemble se composant de deux réactifs séparés, parce qu'on pense que la durée de conservation du système réactif sera étendue si les enzymes et les composants restants du réactif sont séparés les uns des autres jusqu'à ce qu'ils soient prêts pour une utilisation.Cela peut empêcher la possibilité de toute réaction se produisant parmi les constituants du système réactif s'ils sont mélangés ensemble et maintenus pendant des périodes prolongées au repos avant utilisation 0 Le système réactif selon l'invention peut être stocké et utilisé sous forme d'une solution aqueuse ou bien la solution peut être séchée par congélation par un moyen classique et reconstituée avec de l'eau déionisée quand elle est prête pour une utilisation Ce système réactif peut également btre préparé en utilisant ses constituants sous forme pulvé nilente, et en les solubilisant avec de l'eau au moment de 1 'utilisation0 Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui ntont été dorllés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits, ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. REVENDICATIONS 1. Réactif enzymatique pour la détermination de la teneur en cholestérol, du type comprenant de l'oxydase de cholestérol et un agent tampon en une quantité pour produire une solution ayant un pH entre environ 5,5 et environ 8, caractérisé en ce qu'il comprend de plus un agent tensioactif cationique en une quantité suffisante pour neutraliser sensiblement tous les effets inhibants sur la consommation de l'oxygène, des agents inhibants présents dans un échantillon à déterminer. 2. Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de plus de l'esterase de cholestérol. 3. Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend - de l'ordre de 0,2 à environ 5 Unités Internationales d'oxydase de cholestérol par millilitre du réactif; - de l'ordre de O à environ 5 Unités Internationales d'esterase de cholestérol par millilitre du réactif; et - de l'ordre de 0,01 à environ 0,4 pour cent en poids du réactif dudit agent tensio-actif cationique0 4. Réactif selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent tensio-actif cationique précité est choisi dans un groupe consistant en imidazolinium quaternaire, pyridinium, quinolinium et ammonium quaternaire. 5. Réactif selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'agent tensio-actif cationique précité est de l'ammonium quaternaire. 6. Réactif selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'ammonium quaternaire cationique comme agent tensio-actif précité est - un sel d' alkyldiméthylbénzy lammonium . 7. Réactif selon la revendication 6, caractérisé en ce que le sel précité d'alkyldiméthylbenzylamnonium est choisi dans un groupe consistant en chlorure d'alkyldiméthyBsnzyl- ammonium et ses mélanges, où le fragment alcoyle contient de 8 à 18 atomes de carbone. 8o Réactif selon la revendication 6, caractérisé en ce que le sel précité d'alkyldiméthylbenzylammonium est un mélange comprenant environ 50% de chlorure de sodium tetradécyldiméthylbenzylammonium, environ 4096 de chlorure de sodium dodecyldiméthylbenzylsmmonium et environ 1096 de chlorure de sodium hexadëcyldiméthylbenzylammonium. 9. Réactif selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend de plus un sel de bile et un agent tensioactif non ionique. 10. Réactif selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend de plus de l'ordre de 0,01 à environ 0,1 pour cent en poids dudit réactif, de sel de bile et de l'ordre de 0,05 à environ 0,4 pour cent en poids du réactif dudit agent tensio-actif non ionique. 11. Réactif selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend - l'agent tampon précité en une quantité pour produire une solution ayant un pH de l'ordre de 6; - environ 1,2 Unités Internationales d'oxydase de cholestérol par millilitre du réactif; - environ 0,014 Unité Internationale d'esterase de cholestérol par millilitre du réactif; - environ 0,08 pour cent en poids du réactif du sel de bile précité; - environ 0,05 pour cent en poids du réactif d'isooctylphénoxypolyéthoxyéthanol; et - environ 0,1 pour cent en poids dudit réactif d'un sel d'alkyldiméthylbenzylammonium Q 12 Réactif selon la revendication 11, caractérisé en ce que le sel précité d'alkyldiméthylbenzylammonium est un mélange comprenant environ 50% de chlorure de sodium tetradecyldiméthylbenzylammonium, environ 40,' de chlorure de sodium dodecyldiméthylbenzylammonium et environ 10% de chlorure de sodium hexadécyldiméthylbenzylammonium. 130 Ensemble réactif enzymatique pour la détermination de la teneur en cholestérol du type comprenant - un premier réactif comprenant de l'esterase de cholestérol et de l'oxydase de cholestérol; et - un second réactif comprenant une solution tampon ayant un pH de l'ordre de 5,5 à environ 8, caractérisé en ce que ledit second réactif comprend de plus un agent tensio-actif cationique en une quantité suffisante pour neutraliser sensiblement tous les effets inhibants sur la consommation d'oxygène des agents inhibants présents dans un échantillon à déterminer. 14. Ensemble réactif enzymatique pour la détermination de la teneur en cholestérol du type comprenant - un premier réactif comprenant de l'esterase de cholestérol; - un second réactif comprenant de 11 oxydase de cholestérol; et - un troisième réactif comprenant une solution tampon ayant un pH de l'ordre de 5,5 à 8, caractérisé en ce que ledit troisième réactif comprend de plus un agent tensio-actif cationique en une quantité suffisante pour neutraliser sensiblement tous les effets inhibants sur la consommation d'oxygène des agents inhibants présents dans un échantillon à déterminer0 15.Ensemble selon la revendication 14, caractérisé en ce que le troisième réactif précité comprend de plus un sel de bile et un agent tensio-actif non ionique0 160 Ensemble selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend, en se basant sur une solution combinée des premier, second et troisième réactifs précités, - une solution aqueuse d'orthophosphate de potassium en une quantité pour produire une solution ayant un pH de l'ordre de 6; - environ 0,08 pour cent en poids de la solution combinée de cholate de sodium; - environ 0,05 pour cent en poids de la solution combinée d' isooctylphénoxypolyéthanol; - environ 0,1 pour cent en poids de la solution combinée d'un sel d'alkyldiméthylbenzylammonium; - environ 1,2 Unités Internationales d'oxydase de cholestérol par millilitre de la solution combinée; et - environ 0,014 Unité Internationale d'esterase de cholestérol par millilitre de la solution combinée. 17. Ensemble réactif selon la revendication 16, caractérisé en ce que le sel précité d'alkyldiméthylbenzylammonium est un mélange comprenant environ 50% de chlorure de sodium te'tradécyldiméthylbenzylammonium, environ 4096 de chlorure de sodium dodécyldiméthylbenzylammonium, et environ 10% de chlorure de sodium hexadecyldiméthylbenzylammoniumO 18. Réactif enzymatique pour la détermination de la teneur en cholestérol séché par congélation, caractérisé en ce qu'il est préparé à partir du réactif selon la revendication lo