FR 2345516 A1 19771021 FR 7608965 A 19760326 La présente invention a pour objet un procédé pour déter- miner la résistance des bactéries aux antibiotiques, plus particulièrement aux antibiotiques appartenant à la famille des pénicillines et des céphalosporines. L'invention concerne aussi les matériels pour la mise en oeuvre dudit procédé. En clinique ou en milieu hospitalier, la résistance ou la sensibilité des bactéries aux antibiotiques est habituellement caractérisée par un antibiogramme. Cette teohnique de routine se pre- te très bien à l'étude simultanée d'un grand nombre de souches. Toutefois, ces antibiogrammes ne sont lisibles qu après 12 à 18 heures d'incubation. Ce délai peut être parfois considéré comme excessif, si l'état du malade est sérieux. L'invention a pour objet un procédé permettant d'obtenir très rapidement des informations précieuses sur la sensibilité ou la résistance des bactéries aux pénicillines ou céphalosporines. Tout comme les techniques connues d'antibiogramme, le procédé de l'invention permet une mesure semi-quantitative de la résistance des bactéries aux antibiotiques. Sous son aspect général, l'invention concerne donc un procédé dé pour déterminer la résistance des bactéries aux antibiotiques caractérisé en ce qu'on forme un gel au sein duquel est immobilisé un complexe d'amidon et d'iode, on réalise des puits dans la masse du gel, on verse dans les puits en quantités dosées une solution aqueuse de l'antibiotique à étudier et une suspension aqueuse des bactéries et on mesure au bout d'une durée déterminée les zones de décoloration de l'iode autour de chaque puits, ce qui fournit une information semi-quantitative sur la résistance des bactéries aux antibiotiques. Selon une caractéristique avantageuse, le procédé de l'invention met en oeuvre un gel réticulé dans les mailles duquel se trouve enfermé de l'amidon, lequel n'est plus susceptible d'être ensuite solubilisé. L'invention concerne aussi des gels non réticulés, par exemple des gels d'agar; dans de tels gels, l'amidon reste susceptible d'être ultérieurement solubilisé. Dans tous les cas,le gel contient de l'iode, qui forme un complexe avec l'amidon et reste immobilisé dans le gel. A titre de gels convenant aux fins de l'invention, on peut utiliser tous matériaux solides permettant d'éviter une diffusion trop rapide de l'iode. En outre, le matériau constitutif du gel doit être neutre" du point de vue redox. Au sens de la présente invention, un tel matériau ne possède pas de propriétés oxydantes, ni réductrices au point de vue électro-chimique, grâce à quoi il n'interfère pas avec les propriétés réductrices des produits de dégradation des pénicillines et céphalosporines. On peut donc utiliser dans le procédé de l'invention une grande variété de matériau aux qui sont capables, sous l'effet d'une polymérisation ou d'une prise en masse quelconque, d'immobiliser de l'amidon et de l'iode. A titre d'exemples, des gels convenant aux besoins de l'invention sont les gels de polyacrylamide, polyvinylpyrrolidone (pop) polymères d'acides acryliques, copolymères d'acides acryliques-acrylamide, polymères d'acide vinylsulfonique, de vinylsulfonamide, de méthylène-bis-vinylsulfonamide, copolymères provenant de polyamines par exemple résultant de la polymérisation de l'aziridine, avec des acides ou amides o(- n insaturés , agar de diverses origines, car- boxyméthyl cellulose (CMC), hydroxyétbyl-cellulose. Dans le cas des gels obtenus par polgmérisation d'un monomère ou de plusieurs comonombres, il est avantageux de réaliser la polymérisation en solution ou en suspension en présence de l'amidon et des réactifs à base d'iode, par exemple une solution iode-iodure de potassium,après quoi la masse polymérisée contient en son sein le complexe amidon-iode rendu ainsi insoluble. Dans le cas d'un gel non réticulé, tel qu'un gel d'agar,on dissout à chaud,par exemple à l'ébullition, la substance formant le gel (agar) et l'amidon dans un milieu aqueux tamponné. On ajoute ensuite à température modérée (50-600C) une solution iode-iodure de potassium. On verse l'ensemble dans une botte de pétri. Le milieu prend en masse et se conserve au froid. A titre d'amidon, on peut utiliser n'importe quel polysaccharide capable de complexer l'iode. Te procédé selon l'lnventlon~est essentiellement applicable à des antibiotiques appartenant à la famille des pénicillines et des céphalosporines. L'invention met ainsi à profit les propriétés réductrices bien connues des acides pénicilloiques ou céphalosporo laques qui sont les produits résultant de l'attaque des bactéries productrices de g -lactamase sur les antibiotiques correspondants. La décoloration de 11 iode autour des puits est liée à la formation de ces acides pénicillolques ou céphalosporoiques, la surface des zones de décoloration étant fonction de la vitesse de formation des dits acides, ainsi que de la vitesse de diffusion de ceux-ci dans le gel. Ainsi qu'on l'a dit précédemment, le choix du matériau for- mant le gel permet de réduire au minimum la diffusion de l'iode à l'intérieur des puits. I1 convient, par ailleurs, que le complexe amidcrrbode soit réparti de façon uniforme dans la masse du gel.En genéral, la concentration en poids d'amidon par rapport au gel sera au moins égale à 0,1 % en poids par rapport au poids-du gel hydraté.On a constaté qu'il n'y avait pas d'intérêt réel à utiliser de fcrtesquantités d'amidon, qui dépasseraient notamment la limite de solubilité de l'amidon dans le milieu aqueux de formation du l. Dans la pratique, la quantité d'amidon peut être voisine de 0,5 ffi en poids par rapport au poids du gel hydraté. La concentration en iode à choisir dépend essentiellement de la quantité d'amidon utilisée. I1 convient que tout l"iode soit complexé avec l'amidon, de sorte que la concentration en iode ne doit pas dépasser la valeur de complexation avec l'amidon. Par ail leurssune quantité trop élevée d'iode risquerait de dénaturer les enzymes au cours de la mise en oeuvre du procédé de l'invention.Oa utilise donc une quantité diode compatible avec l'activité enzymatique, car la quantité à mettre en oeuvre est limitée par la sensibilité des enzymes à ce réactif.Dans la pratique, on utilise une quantité diode correspondant à la quantité nécessaire pour complexer 0,5 en poids d'amidon, rapporté au poids du gel hydraté.- Selon le procédé de l'invention, on introduit dans les puits des quantités dosées dkune solution aqueuse de l'antibiotique à étudier et d'une suspension aqueuse des bactéries. L'homme de l'art adaptera aisément l'une à l'autre les concentrations relatives de l'anti- biotique et de la culture bactérienne.Dans la pratique, pour une concentration donnée en antibiotique, il est en effet possible de déterminer par des essais préalables de routine la dilution qutil convient d'adopter pour la suspension bactérienne, comme cela sera illustré en référence à la figure 1 ci-après Une autre caractéristique importante du procédé de 1' inven- tion, qui représente d'ailleurs l'un de ses avantages essentiels, est constitui par le temps de lecture. Pour que le procédé soit parfaitement reproductible, il convient, en effet, de fixer une-durée séparant le moment de l'inoculation et le moment de la lecture proprement dit, c'est-8-dire de la mesure des zones de décoloration de l'iode autour de chaque puits. En pratique, les temps de lecture ne dépassent pas 24 heures et sont en général de l'ordre de 2 à 5 heures. En fait, les lectures sont possibles au bout d'une durée aussi brève qu'une heure: la mesure est dès lors semi-quantitative.Au bout de 24 heures environ, la mesure n'est plus que qualitative. L'homme de l'art choisira donc le mode de mise en oeuvre qui lui convient. On ne doit pas cependant dépasser des temps de lecture de 11 ordre de 72 h., car, par la suite,les observations ne sontplus lisibles. Ces constatations sont en nette-contradiction avec les antibiogrammes utilisés jusqu'à présent. La mesure proprement dite s'effectue sur les diamètres des zones de décoloration? On constate que, pour un mAeme antibiotique, plus le diamètre de la zone est grand, plus le degré de rssZstanee est élevé. Ce résultat est illustré à la figure 2 (voir ci-après). L'invention concerne également le matériel pour la mise en oeuvre du procédé. t'invention concerne ainsi un matériel essentiel lement constitué par une botte, du genre botte de Petri, contenant un gel au sein duquel est enfermé un complexe d'amidon et d'iode et qui présente un certain nombre de puits verticaux. Une telle botte peut être associée dans un ensemble-cofrret unitaire à des quantités dosées d'antibiotiques susceptibles d'être mises sous firme de solution aqueuse préparée d'avance ou extempo ranément. Dans ce dernier mode de réalisa' tion, toutes les instruc tions sont données à l'utilisateur du coffret pour qu'il établisse des solutions aqueuses d'antibiotiques ayant une concentration pç- déterminée, ce qui permet d'utiliser des suspdnsions bactériennes de concentrtion correspondante. Le matériel selon l'invention consiste, us sa forne la plus simplex en une botte de Petri contenant un milieu solide (gel) tel que derini précédemment, qui permet de détecter aisément et rapidement les bactéries résistantes aux antibiotiques appartenant à la famille des pénicillines et des céphalosporines. En outre, 1' invention permet également de tester les inhibiteurs possibles des enzymes d' inactivation. En nlSet, sous un autre aspect, on peut appliquer le procédé et le matériel de l'invention à l'étude des inhibiteurs enzymes. Si l'on met simultanément dans un puits un substrat d'une p -lacta mase et un inhibiteur potentiel de cette enzymes la réduction du diamètre de décoloration est directement liée à l'activité de l'in hibiteur. L'invention peut donc StrewuKilisée pour l'exploration; des propriétés de-substances nouvelles. L'homme de l'art comprendra que le procédé de 11 invention présente des avantages importants qui sont notamment - simplicité de mise en oeuvre, le matériel étant très sim- ple et de faibleprix de revient ; - bonne conservation des bottes de Petri chargées moyennant quelques précautions élémentaires, il est possible de conserver ces bottes pendant plusieurs mois, - obtention de bons résultats à partir de quelques colonies bactériennes directement prélevées sur un isolement. Ceci évite toute autre manipulation comme,par exemple,la nécessité de réaliser une culture bactérienne importante, une extraction enzymatique,etc. L'invention sera maintenant illustrée sans être aucunement limitée par la description de certains de ses modes de réalisation. Exemple 1. Protocole expérimental : tkbotte de Pétri de diamètre 90 mm est remplie d'une solution d'acrylamiZe (2 g)-bis-acrylamide (160 mg) dans 21 ml d'une solution d'amidon à 0,5 % contenant en outre 0,15 ml d'une solution iode (0,08 M)-iodure de potassium ( (3,2 M). La polymérisation est catalysée par 50 mg de persulfate de sodium et 15 /1 de TEMED (tétraméthyl éthylène diamine) sous lumière ultraviolette En variante, on peut remplacer le système de polymérisation TEMED - persulfate de potassiumpar un système à base de riboflavine qu'on active par irradiation U.V. Des puits de 5 mm de diamètre sont réalisés à I'emportecpi8ces dans la masse solide obtenue. On remplit ces puits de 25 1 d'une solution de 10 mg/ml de la pénicilline ou de la céphalosporine à étudier et de 25 rl d'une suspension de 5 à 10 colonies bactériennes prélevées sur un isolement, dans 200 1 d'eau distillée sté ralle. Au bout de deux heures à 200C, on observe des zones de décoloration de l'iode autour de chaque puits. En utilisant le protocole expérimental ci-dessus, on a étudié l'évolution des zones de décoloration en fonction du temps de réaction, ainsi que de la dilution d'une même culture bactérienne. Les résultats sont illustrés par la figure 1 qui est un graphique dans lequel on a porté en ordonnées le logarithme du diamètre des zones de décoloration (Log d) et en abscisses les volumes décroissants de la dilution. Les différentes courbes obtenues correspondent à diverses durées de réaction. Les résultats expérimentaux illustrés à la figure 1 ont été obtenus avec la même suspension bactérienne et avec, à titre d'antibiotique, la pénicilline G. On a également mis en dvidence la relation existant entre les diamètres des zones de décoloration et les valeurs caractéris tiques CM I des antibiotiques. Pour la mesure de ces valeurs CM I en milieu solide, on a utilisé la technique de Steers (9teers E., Feltz E.L. et Graves B.S.,Antibiot. Chemother (Basel) 1959, 9, 307-310). L'étude a porté sur 14 souches de Escherichia Coli et les antibiotiques étudiés étaient l'Ampicilline ou (-)d X aminobenzylpeni- cilline et la Carbénicilline ou acide (carboxy-2-phdnyl-2-acétamido) -6 pénicillanique. Les résultats de l'étude sont illustrés par le graphique de la figure 2 dans lequel on a porté, en valeurs logarithmiques, en abscisses, les diamètres (mm) des zones de décoloration et en or données les valeurs caractéristiques CM I de chaque antibiotique. La figure 2 fait apparattre que, pour un mQme antibiotique, le diamètre de la zone est d'autant plus grand que le degré de résistance de la bactérie est élevé. On constate aussi que, moyennant un éta lonnage, l'invention permet une détermination semi-quantitative de la résistance. Exemple 2 Dans cet exemple, on illustre la préparation d'un gel d'agar. Pour une botte de Pétri de 13,5 mm de diamètre, on utilise 60 ml d'une solution aqueuse contenant 2% (poids/volume) d'agar et 0,52 ffi (poids/volume) d'amidon. L'amidon était un amidon soluble pour ana lyse mis sur le marché sous la Référence 1252 par la Société Merck (USA). On dissout à l'ébullition l'agar et l'amidon dansun tampon phosphate pH 720,1 M. On laisse refroidir la solution Jusqutà 55C. On ajoute alors 0,4 à 0,5 ml d'une solution 0,08 M en iode et 3,2M en iodure de potassium. On verse ensuite dans la botte de Pétri et on conserve au froid. Exemple 3 On a utilisé les matériels des Exemples 1 et 2 pour des essais sur des souches de collection inscrites à un catalogue officiel a Souche E.Coli MRE 600 sensible à l'ampicilline, la car bénicilline et la céphalotine. Ces bactéries n'entraînent qu'une décoloration négligeable de l'iode autour des puits correspondants. g. Souohe Pseudomonosas aeruginosa N.C.T.C. 8203 sensible à la carbénicilline et résistant à la céphalotine. On ne constate pas de décoloration de l'iode autour du point de la carbénicilline, mais au contraire, une coloration rapide autour du puits de la céphalotine. avec succès montre que le procédé de l'invention peut zetre appliqué/à des mesures sur des souches cataloguées Exemple 4 Cet Exemple a pour but d'illustrer que le procédé de l'invention peut Autre utilisé avec succès sur des souches de nature inconnue ou d'origines les plus diverses, comme cela se présente dans les services de bactériologie en milieu hospitalier. On a donc fait des essais et des mesures sur des souches isolées provenant de divers hopitaux de la région de Paris et présentant divers antibiogrammes. Les souches étudiées étaient les suivantes . Coli 27 souches S. typhi 2 Citrobacter 2 Serratia 5 Klebsiella 8 Proteus mirabilis 2 Proteus vulgaris 1 Proteus morganii rr 4 Proteus rettgeri 1 Moraxella woofri 3 Moraxella groupe II 1 Enterobacter 13 Pseudomonas aeruginosa 25 Serratia 9 w Providentia 3 " Yersinia enterocolitica 1" Dans tous-les cas, le procédé de l'invention a permis d'évaleur en moins de 2 heures la résistance de ces bactéries à divers antibiotiques connus appartenant A la classe des pénicillines et des céphalosporines. REVENDICATIONS 1. Procédé pour déterminer la résistance des bactéries aux antibiotiques, caractérisé en ce qu'on forme un gel au sein duquel est immobilisé un complexe d'amidon et d'iode, on réalise des puits dans la masse du gel, on verse dans les puits en quantités dosées une solution aqueuse de l'antibiotique à étudier et une suspension aqueuse des bactéries et on mesure au bout d'une durée déterminée les zones de décoloration de l'iode autour de chaque puits, ce qui fournit une information semi-quantitative sur la résistance- des bactéries aux antibiotiques. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, à titre de gel, on utilise un matériau solide évitant une diffusion trop rapide de l'iode et neutre du point de vue redox > par exemple des gels de poly acrylamide, polyvinylpyrrolidone (FvP),polymères d'acides acryliques, copolymères d'acides acryliques - acrylamide, polymères d'acide vinylsulfonique, de vinylsulfonamide, de méthy lène-bis-vinylsulfonamide, copolymères provenant de polyamines, par exemple résultant de la polymérisation de l'azlridine, avec des acides ou amides dW p -insaturés, agar de diverses origines,carboxyméthyl cellulose (CMC), hydroxyéthyl-cellulose. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on obtient le gel par polymérisation en solution ou en suspension d'un monomère ou plusieurs comonomères, en présence de l'amidon et et des réactifs à base d'iode, par exemple une solution iode-iodure de potassium, après quoi la masse polymérisée contient en son sein le complexeamidon-iode rendu ainsi insoluble. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise un gel non réticulé, tel qu'un gel d'agar à partir duquel l'amidon reste susceptible d'être ultérieurement solubilisé, et qu'on obtient par dissolution à chaud, par exemple à l'ébullition, de la substance formant le gel et de l'amidon dans un milieu aqueux tamponné, par addition subséquente à température plus modérée dtune solution iode-iodure de potassium, l'ensemble étant ensuite versé dans une botte de Pétri où a lieu la prise en masse: 5.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la concentration en poids d'amidon par rapport au poids du gel hydraté est au moins égale à 0,1%,de préférence égale à 0,5 % environ, tandis que la concentration en iode varie de façon correspondante, paur que la totalité de l'iode soit complexée par l'amidon , la quantité d'iode restant compatible avec 1 activité enzymatique. 6.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le temps de lecture, c'est-à-dire de mesure des diamètres des zones de décoloration est de ltordre de 2 à 5 heures, après l'inoculation des quantitées dosées des solutions aqueuses d'antibiotiques à étudier et de la suspension aqueuse des bactéries, la mesure étant semi-quantitative jusqu'à 24 heures environ, puis qualitative à partir de 24 h et Jusqu'd 72 h. environ, après quoi les observations ne sont plus lisibles. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on effectue une mesure semi-quantitative de la résistance des bactéries aux antibiotiques, le diamètre de la zone étant d'autant plus grand que le degré de résistance de la bactérie est élevé. 8. Matériel pour mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 7, essentiellement constitué par une boute du genre boîte de Pétri, contenant un gel au sein duquel est immobi isé un complexe d'amidon et d'iode et qui présente un certain nom bre de puits verticaux. 9 Matériel selon la revendication 8, caractérisé en ce que la botte est associée dans un ensemble-cofrret unitaire à des quan titis dosées d'antibiotiques susceptibles d'autre mises sous forme de solution aqueuse préparée d'avance ou extemporanément. 10. Application du procédé selon l'une quelconque des reven dications 1 à 7 ou du matériel selon l'une des revendications 8 ou 9 , à la détermination de la résistance des bactéries aux antibio tiques appartenant à la famille des pénicillines et des céphalosporines. 11. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou du matériel selon l'une des revendications 8 ou 9, en vue de l'étude des inhibiteurs d'enzymes, dans lesquels on met simultanément dans un puits un substrat d'une Flactamase et un inhibiteur potentiel de cette enzyme, la réduction du dia mètre de décoloration étant directement liée à l'activité de l'in- hibiteur (iodure de potassium).