FR 2335237 A1 19770715 FR 7539179 A 19751219 L'invention est relative à un vaccin contre l'hépatite virale de type B et à un procédé de préparation de ce vaccin. L'hépatite B, ou hépatite sérique, est connue pour se transmettre accidentellement à 11 occasion de transfusions de sang contaminé ou par l'usage de seringues contaminées. Il semble que ces modes ne sont pas les seuls possibles et qu'en fait la transmission puisse avoir lieu de façon beaucoup plus générale. Il est donc important de disposer, pour lutter contre l'hépatite, d'un vaccin efficace, facile à mettre en oeuvre et d'une parfaite innocuité. On a déjà proposé de préparer un vaccin contre l'hépatite B à partir du virus correspondant, provenant de sérum d'individus chez lesquels la présence du virus est décelée. A cet effet, le sérum recueilli est porté à une température d'environ 1000G pour détruire les composants infectieux présents dans le sérum. Ce traitement particulièrement énergique s' explique par la volonté d'obtenir un produit parfaitement stérile, ce qui ne va pas sans dommage pour l'activité immuno- gène du produit. A l'inverse, un traitement à température plus faible, pour préserver les qualités immunogènes, ne présente pas toute la sécurité nécessaire quant à l'innocuité du produit. En outre, on remarquera que le vaccin obtenu par simple stérilisation contient, en plus de l'agent immunogène, tous les constituants initiaux du sérum. On a également déjà proposé d'isoler des agents immunogènes spécifiques de lthépatite B à partir de sérum. Pour obtenir ces agents, le sérum qui les contient est soumis, entre autres, à une opération de digestion enzymatique. En fait, un tel traitement, s'il permet bien dM1mnPr les protéines sériques,- agit également sur les composants du virus, de telle sorte que I1 activité immunogénique du produit final est, dans ce cas encore, affectée par le traitement de purification. le but de l'invention est de faurnir un procédé d'obtention dlun agent immunogène conte hépatite 3, très pur, qui, lorsqu'il fait partie d'une compositian de vacc, présente toutes les garanties d 'innocuité et dteffica- cité. L'invention a encore pour but de fournir, contre I'hépatiteB, des vaccins contenant l'agent immunogène obtenu par ledit procédé. Grâce à l'invention, on a maintenant montré qu'il était possible d'isoler un antigène à l'état pratiquement pur et sans risque d'altération de celui-ci au cours des opérations conduisant à son obtention, et que cet antigène, lorsqu'il est administré à un hôte dans une composition vaccinale, développe des réponses immunitaires vis-à-vis de l'hépatite B, et présente une parfaite innocuité. Des études antérieure avaient révélé, chez les individus atteints d'hépatite B, la présence de plusieurs types d'antigènes identifiés comme étant respectivement le virus complet (particule de Dane), l'antigène constitué par la nucléocapside du virus et l'antigène d'enveloppe, ces deux derniers étant respectivement dé signés par les initiales HBC et H sX le procédé selon l'invention vise à séparer et à purifier l'antigène d'enveloppe par des techniques qui ne modifient ni n'altèrent ses propriétés physico-chimiques, ni surtout immunologiques. te procédé d'obtention de l'antigène B s selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend au moins une Qpe'ratîon dans laquelle du sérum contenant ledit antigène est mis en contact avec un support sur lequel est fixée, de façon irréversible, au moins une immuno globuline spécifique de l'antigène HBS, , lequel est ainsi retenu sur le support de façon sélective ; on élimine par lavage du support les constituants sériques autres que l'antigène, notamment les protéines sériques, et l'on élue ensuite l'antigène qui est récupéré. On trouve l'antigène KB notamment dans le sérum des personnes atteintes par l'hépatite aiguë ou chronique, mais aussi diez -certine porteurs "sains", c'est-à-dire qui n'ont jamais présenté de manifestations pathologiques de l'infection. On le trouve également chez certains animaux tels que le-s chimpanzés. La présence de cet antigène dans le sérum d'une personne ou d'un animal peut être décelée par les techniques habituelles d'immunologie telles que l'immunodiffusion, ltélectro- immunodiffusion, l'hémagglutinatîon passive, la radio-immunologie. Selon l'invention, on utilise avantageusement un sérum contenant l'antigène B s pratiquement dépourvu de virus complet et d'antigène HBC. Un tel sérum provient par exemple de porteurs sains ou d'animaux porteurs de cet antigène. Ces derniers peuvent Qtre des porteurs naturels ou des animaux chez lesquels la formation d'antigène EBs est provoquée consécutivement à une innoculation expérimentale. Dans ce cas, pour favoriser au maximum la formation des antigènes, il est avantageux de soumettre les animaux à un traitement immunodépresseur0 te sérum utilisé peut présenter une teneur en antigène HBS très variable.De préférence, on utilise des sérums dont la teneur est relativement élevée, par exemple ceux dont le titre en électroimmunodiffusion est au moins égal à 1/16. L'innocuité des sérums utilisés, c'est-à-dire l'absence totale de particules de Dane ou d'antigène H3c, est vérifiée avant leur traitement. Ce contré peut etre effectué par toutes les méthodes permettant de mettre en évidence la présence ou, dans le cas présent, l'absence de ces particules. On montrera, par exemple, l'absence d'agrégats contenant le virus complet (particules de Dane), ou encore l'absence de l'antigène HBC, en microscopie électronique. On pourra également utiliser une méthode permettant de montrer l'absence d'activité ADN polymérasique, pour mettre en évidence l'absence d'acides nucléiques. De préférence, on utilise le sérum tel quel ; néanmoins, il peut s'avérer nécessaire de le diluer lorsque les conditions de contact avec le support en sont facilitées. l'opération inverse, c'est-à-dire un accroissement relatif du taux des antigènes HB par rapport aux constituants sériques est plus souvent nécessaire. Lorsque cela est nécessaire, et principalement lorsque le titre initial en antigène est trop faible, on a recours avantageusement à cette étape de "concentration" préalable qui peut être réalisée suivant des procédés tels que l'ultra-centrifugation sur gradient de concentration qui conduit à une séparation en fonction de la densité des particules, ou encore par une méthode d'adsorption moléculaire sur des milieux tels que les poudres de silice, d'a ne ou d'aluminosilicate. Pour support, on utilise un matériau qui puisse fixer des immunoglobulines par l'intermédiaire d'un agent de couplage, et, de préférence, du type de ceux qui sont mis en oeuvre dans des techniques de séparation des protéines. Des matériaux préférés sont notamment ceux du type gel d'agarose ou gel de dextranemodifié. Des supports de ce type sont notamment ceux commercialisés sous le nom "Séphade2" ou "Sépharose" par la Société PHUHUItCIA UPSALA. la fixation des immunoglobulines sur le support est faite de telle sorte qu'elle soit pratiquement irréversible, ctest-à-dire qu'elle reste inaffectée par la répétition d'opérations d'adsorption et d'élution dans les conditions précisées ci-dessous. On utilise avantageusement à cet effet le bromure de cyanogène pour activer le support qui doit fixer les immunoglobulines. tes immunoglobulines spécifiques de l'antigène RBs sont extraites du plasma de porteurs de cette immunoglobuline, suivant des techniques usuelles de séparation des immunoglobulines comme, par exemple, le relargage au sulfate d'ammonium suivi d'une séparation, par exemple par chromatographie d'échange dtion .La fi2ationdel'im- munoglobuline sur le support activé est effectuée à un pR de préférence compris entre 6et7,et,de préférence, d'environ 6,5 On fixe avantageusement de l'ordre de 20 mg d'immunoglobuline par millilitre de support.On a constaté que, pour avoir un bon rendement des mécanismes de fixation et d'élution de l'antigène HBS sur le support par l'intermédiaire des immunoglobulines spécifiques, il est préférable d'avoir une concentration limitée de ces dernières. A cet effet, un sérum, dont ces immunoglobulines anti-ISBs sont extraites, présente, de préférence, un titre exprimé par une positivité en électro-immunodiffusion comprise entre 1 et 1/16. le sérum passe sur une colonne contenant le support sur lequel sont fixées les immunoglobulines spécifiques. On lave la colonne pour éliminer les protéines sériques avec une solution dont le pH est, de préférence, compris entre environ 7 et environ 8, c'est-à-dire voisin de celui du sérum initial qui se situe à environ 7,4. On utilise avantageusement, à cet effet, une solution de Tris 0,02 M (hydroxy méthylaminométhane). Pour éliminer certaines protéines sériques qui peuvent se fixer sur la colonne en même temps que l'antigène HBS, on lave avantageusement la colonne à l'aide d'une solution d'un thiocyanate métallique dont la concentration est au plus molaire et à un pH de l'ordre de 7 à 8. Avantageusement, on utilise une solution de thiocyanate de sodium G,5 M à pli de l'ordre de 7,4. Pour éluer l'antigène, on utilise de préférence soit une solution concentrée d'un thiocyanate métallique, dont la molarité n'est pas inférieure à 2 et présentant un pH compris entre 6 et 8, et, de préférence, une solution environ 7 M de thiocyanate d'un métal alcalin à un pH d'environ 7,4, soit une solution dont le pli est inférieur à 6. Ces conditions sont déterminées dans tous les cas par deux impératifs, à savoir : permettre une élution suffisamment rapide de l'antigène, et ne pas endommager la capacité de fixation de la colonne, de telle sorte que celle-ci puisse être réutilisée. A ce stade de la préparation, on recueille une solution d'antigène qui contient encore souvent quelques traces dtimmunoglobuli- nes sériques, princinalement des types A, G et M. Ces immunoglobulines sont en proportion suffisamment faible dans la pratique pour que l'on puisse préparer un vaccin contenant l'antigène et ces traces d'immunoglobulines ; néanmoins, pour obtenir un produit pratiquement pur, on procède avantageusement à une séparation supplémentaire. Pour cela, il est avantageux, par exemple, d'employer une technique analogue à la procédente mais dans iaquelle on fixe sélectivement les immunoglobulines sériques et on recueille directement l'antigène.Ceci peut être obtenu en préparant une colonne d'sdsorp tion sélective d'une façon analogue à celle décrite précédemment, mais en remplaçant les immunoglobulines anti-5 par des immunoglobulines d'un sérum hétérologue jouant le rle d'antisérum total. On peut utiliser à cet effet des immunoglobulines extraites de sérum de cheval. a solution récupérée qui contient l'antigène est avantageusement débarrassée du thiocyanate par une opération de dialyse contre une solution saline isotonique conduite dans des conditions en soi connues. Il peut etre encore avantageux de concentrer la solution d'antigène, ce que l'on peut obtenir, par exemple, par une opération d'ultra-filtration. Pour préparer des compositions de vaccin selon l'invention, on utilise les solutions d'antigène HBB obtenues par le procédé décrit ci-dessus après que celles-ci aient été mises dans des conditions qui permettent leur administration. On a déià mentionné l'élimina- tion des thiocyanates par dialyse ; on rétablit en outre un pH voisin du pH physiologique, c'est-à-dire d'environ 7,4. la solution d'antigène est ensuite avantageusement amenée à un titre standardisé pour faciliter le dosage du vaccin. Avantageusement, on prépare une solution dont le titre d'antigène EBg est exprimé par une positivité d'environ 1/2 en électro-immunodiffusion. Ceci correspond à un titre d'environ 1/512 en agglutination passive, ou encore d'environ au moins 1/1000 en radio-immunologie. Sur la solution ainsi préparée, on effectue une série de con tries pour vérifier sa pureté. Par des méthodes immunologiques telles que I'éle ctro-immunodiffusion vis-d-vis d'immuno-sérums spé cifiques ou l'immuno-électrophorèse, on vérifie l'absence de protéines sériques. On vérifie également l'absence de thiocyanate, par exemple par une méthode argentimétrique. La stérilité de la préparation est vérifiée par culture. On utilise, par exemple, un milieu liquide thioglycolate et une gélose nutritive ordinaire. Les tubes ensemencés sont maintenus 15 jours à une température de 20 à 370C et ne montrent ltapparition d'aucune culture. Eventuellement, par mesure supplémentaire de sécurité, la solution d'antigène peut être en outre inactivée. Pour ce faire, on utilise les moyens usuels d'inactivation. Par exemple, on traite la solution par du formol, de telle sorte que la concentration du mélange ne soit pas supérieure à 1/1000 en formol. Après l'inactivation, l'excès de formol est avantageusement éliminé, par exemple par dialyse. Pour constituer la composition de vaccin, on peut utiliser, outre la solution d'antigène HBS, des excipients ou adjuvants traditionnels. Avantageusement, on ajoute à cette solution de l'hydro- xyde d'aluminium tel que sa concentration dans la solution s'établisse entre environ 1 et 3/1000. Des doses préférées de vaccin selon l'invention contiennent 1 ml d'une solution d'antigène liB dont le titre est exprimé en électro-immunodiffusion par une positivité d'environ 1/2. Ces doses sont réparties dans des ampoules et maintenues dans des conditions stériles. Le vaccin préparé selon l'invention est administré par voie sous-cutanée. L'injection d'une dose de rappel est normalement nécessaire pour obtenir une réponse immunitaire suffisante, ce que l'on peut déceler par l'apparition d'anticorps anti-HB8 chez la personne vaccinée. Ce rappel est effectué dans les mimes conditions que la première injection, et environ un mois après cette dernière le cas échéant, un second rappel peut être également pratiqué. L'invention sera expliquée de façon plus détaillée dans l'exem- ple qui est donné ci-après d'un mode dtobtention des antigènes BB et de préparation du vaccin correspondant. Exemple 1 ) Préparation des supports sur lesquels sont fixées les immunoglobulines spécifiques de l'antigène HBS. On utilise pour support le gel d'agarose, commercialisé sous le nom "Sépharose 4B" par la Société PHAR5IACIA UPSALA. La taille des billes d'agarose est de 40 à 190/u. On active 400 ml de gel par une solution dans de l'eau distillée de bromure de cyanogène, à raison de 25 mg de CNBr par millilitre de gel. L'activation est faite sous agitation. L'activation, qui se traduit par la formation de fonctions imidocarbonates réactives sur les mailles du gel, s'accompagne d'une importante chute de pli. Pendant toute l'opération, on compense cette chute en introduisant goutte à goutte une solution de soude 3N, de manière à maintenir le pH à environ 11. La fin de la réaction est marquée par la stabilisation du pH. Le gel est immédiatement transféré sur un filtre de verre fritté, de porosité 90 à 150/u, et lavé successivement avec deux litres des tampons suivants : bicarbonate 0,07 M, pH 6,5,et carbonate 0,15 M, pli 6,5, pour éliminer les déchets de l'activation et ramener le gel au pli optimum pour le couplage des immunoglobulines. les immunoglobulines anti-HBs d'origine humaine sont purifiées par précipitation au sulfate d'ammonium, puis chromatographie d'échange d'ions. Ces immunoglobulines, dans le sérum dont elles sont extraites, sont à un titre correspondant à une positivité 1/2 en électro-immunodiffusion. Elles sont dialysées une nuit contre un tampon carbonate 0,15 M, pli 6,5. On les mélange au gel dès la fin du lavage, à raison de 20 mg d'immunoglobulines anti-EBs par millilitre de gel activé. le support est ensuite stocké 16 heures à + 40C: pour permettre l'hydrolyse totale des sites non couplés. Le support est placé dans une colonne de dimensions 25 x 1000 mm, et équilibré au moyen d'un tampon Tris 0,02 M à pli 7,4. La préparation du support sur lequel sont fixées les immunoglobulines antisérum humain total est faite dans les mimes conditions que celles qui viennent d'être décrites. On remplace, dans cette préparation, les immunoglobulines anti-HBs par les immunoglobulines antisérum humain total extraites de sérum de cheval. 20) Source d'antigène On utilise le sérum d'un donneur de sang porteur sain de l'antigène ROBS. Ce sérum est exempt de particules de Dane7 d'antigènes H3c et d'anticorps anti-RB5. Le titre de ce sérum en électro-immunodiffusion est de 1/16. 30) Traitement du sérum On passe 50 ml du sérum sur la colonne contenant les immunoglobulines anti-HBs, à un débit de 10 ml par heure. On lave ensuite par un tampon Tris 0,02 M à pli 7,4 pour éliminer les protéines sériques non fixées. les protéines sériques adsorbées sont éluées au moyen d'une solution tampon de thiocyanate de sodium de concentration 0,5 M et à pi 7,4. L'antigène HBS est ensuite élué par 100 ml d'une solution 3 M de thiocyanate de sodium à pH 7,4. On récupère la solution d'élution qui est ensuite dialysée contre une solution saline isotonique et filtrée sur une membrane pour ultra-filtration, commercialisée sous le nom "Diaflo XM 300" par la société AMICON. La solution obtenue contient encore quelques immunoglobulines sériques de type A, G et M. On ne décèle, par contre, plus d'5 macroglobuline, ni de )5 -lipoprotéines. On élimine les traces d'immunoglobulines encore présentes par passage de la solution sur la colonne contenant les immunoglobulines antisérum humain total. Partant des 50 ml de sérum, on obtient une quantité d'antigène correspondant à 100 doses de 1 ml chacune de solution vaccinante dont la concentration est exprimée par une positivité 1/2 en électro-immunodiffusion. 40) Préparation du vaccin La solution d'antigène est ajustée à une concentration correspondant à la positivité 1/2 en électro-immunodiffusion (soit 1/512 en agglutination passive, et 1/1000 en radio-immunologie). le pH de la solution est aussi ajusté à 7,4. On a vérifié l'absence de protéine sérique vis-à-vis d'une série d'immuno-sérums spécifiques par électro-immunodiffusion et im muno-éle ctrophorè se. L'absence de thiocyanate est vérifiée par argentimétrie. On a contrôlé la stérilité par ensemencement avec l'antigène de milieux thioglycolate et gélose nutritive, et incubation pendant 15 jours. La solution d'antigène est ensuite inactivée par 1/1000 de formol pendant 48 heures à 370C, et une semaine à 40C. La solution est additionnée de 2/1000 d'hydroxyde d'aluminium et répartie dans des ampoules, à raison dtun millilitre par ampoule. Essais pharmacologique8 Les vaccins, préparés comme il est décrit ci-dessus, ont fait l'objet de contrôles d'innocuité et d'efficacité. 10) Essai sur des chimpanzés Pour ces essais, cinq chimpanzés indemnes d'hépatite ont été choisis. Le sérum de ces chimpanzés ne présente ni antigène Robs, ni anticorps anti-HBs, ni anti-HBe, et présente un taux de transaminase normal. Chaque chimpanzé reçoit deux injections sous-cutanées de 1 ml de vaccin à un mois d'intervalle. Les chimpanzés sont mis en observation pendant quatre mois pour déceler l'apparition éventuelle d'hépatite B. On constate qu'aucun d'entre eux ne manifeste de signe clinique ou biologique de l'hépatite B. On constate, par contre, l'apparition des anticorps anti-HBs. L'efficacité a également été vérifiée,par innoculation par injection de sérum riche en particules de Dane, deux mois après la vaccination. Chez aucun des animaux, l'infection ne stest développée. 20) Essais cliniques chez lthomme A l'aide du même vaccin, on a traité 65 personnes fréquentant une unité d'hémodialyse (soit personnel soignant, soit patients). Deux types de réponses ont été observes. Chez certains vaccinés, on constate l'apparition précoce (1 à 3 semaines après l'injection) et l'élévation rapide du taux des anticorps anti-R35. En radio-immunologie, les rapports de positivité pour ces anticorps sont compris entre 5 et 60, alors qu'un taux significatif est atteint dès que ce rapport est supérieur à 2. Ce type de réponse correspond, semble-t-il, à des personnes présensibilisées de façon naturelle au virus de l'hépatite B. Le deuxième type de réponse après une seule injection est relativement faible. Le rapport de positivité en radio-immunologie est compris entre 2,1 et 5. REVENDICATIONS 1 - Procédé d'obtention d'antigène d'enveloppe du virus de l'hépatite B (B s) caractérisé en ce qu'il comprend au moins une opération dans laquelle du sérum contenant ledit antigène, et utilisé tel quel ou après dilution, ou encore après une opération préalable de concentration en cet antigène, est mis en contact avec un support sur lequel est fixée, de façon irréversible, au moins une immunoglobuline spécifique de l'antigène B , ce grâce à quoi on obtient une fixation sélective dudit antigène, qu'on élimine par lavage dudit support les constituants sériques autres que l'antigène, et que l'on élue ensuite l'antigène qui est récupéré, ledit procédé comprenant éventuellement, en outre, d'autres étapes de purification ou concentration ultérieures pour éliminer en particulier d'éventuels restes de protéines sériques. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise un sérum dont l'analyse immunologique, suivant des méthodes usuelles, montre qu'il ne contient sensiblement ni virus complet, ni antigène KBc, et dont le titre d'hies en électro-immunodiffusion est au moins égal à environ 1/16. 3 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'ensemble formé par le support et l'immunoglobuline spécifique de l'antigène HBB fixée sur le support est celui qui résulte de la mise en contact de ce support avec un sérumdont le titre est exprimé par une positivité en électro-immunodiffusion comprise entre environ 1 et environ 1/16. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le support est du type agarose ou dextrane modifié, et que les immunoglobulines sont fixées à l'aide de bromure de cyanogène à un pH compris entre 6 et 7. 5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le sérum est mis en contact tel quel avec ledit support sur lequel est fixée l'immunoglobuline spécifique de HBS, que les constituants autres que l'antigène EB8 sont éliminés du support par lavage à l'aide d'une solution tamponnée à pli compris entre environ 7 et environ 8. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'antigène EBS est élué au moyen d'une solution d'un thiocyanure métallique dont la molarité est supérieure à 2 et dont le pli est compris entre 6 et 8. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on utilise une solution d'un thiocyanure d'un métal alcalin dont la molarité est d'environ 3 M et le pi voisin de 7,4. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à~5, caractérisé en ce que l'antigène m35 est élué au moyen d'une solution à pi inférieur à 6. 9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce cue l'antigène élué est ultérieurement mis en contact avec un support analogue au premier mais sur lequel sont fixées des immunoglobulines antisérum humain total, qui fixent d'éventuels résidus de protéines sériques non éliminées au cours de la première opération et laissent passer l'antigène HBS qui est récupéré. 10 - Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 9, caractérisé en ce que la suspension d'antigène HBB obtenue est concentrée par dyalise ou ultra-filtration. Il - Vaccin contenant l'antigène HBS tel qutobtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 12 - Vaccin selon la revendication 11, dosé à un millilitre d'une solution de antigène HBs, dont le titre est établi pour correspondre à une positivité 1/2 en électro-immunodiffusion, ce qui équivaut à un titre d'environ 1/512 en agglutination passive, ou encore de 1/1000 par les techniques radio-immunologiques. 13 - Vaccin selon la revendication 11 ou la revendication 12, caractérisé en ce que l'antigène HBS est inactivé au moyen d'une solution de formol dont la concentration n'est pas supérieure à i/i 000.