FR 2347051 A1 19771104 FR 7610455 A 19760409 L'invention est relative à de nouveaux agents immunogènes contre la peste porcine classique, et à un procédé de préparation de ces agents, ainsi qu'aux vaccins contenant ces agents. les mesures prophylactiques contre la peste porcine évoluent, en France, en fonction des risques de propagation. En 964, à la suite de l'épizootie constatée, et dont l'origine était la peste porcine dite "africaine11, les autorités avaient décidé l'abattage des animaux des élevages infectés. Ces mesures drastiques avaient permis l'éradication de la maladie, ainsi que simultanément celle de la peste porcine dite classique ou "européenne" qui sévissait auparavant de façon endémique. L'infection ayant disparu, les mesures ont cessé d'hêtre appliquées. Depuis lors, on a constaté le renouveau, en Europe, de foyers de peste porcine classique.En raison du nombre limité des cas enregistrés, de l'ordre d'une vingtaine par mois en France, la politique d'abattage, dont le codt est relativement élevé, n'a pas été reprise et, actuellement, la prophylaxie passe par la vaccination préventive des animaux A l'heure actuelle, les vaccins utilisés sont constitués de préparations contenant des virus modifiés vivants. Pour obtenir ces virus modifiés, on utilise notamment des sou ches ayant subi un nombre important de passages sur des animaux non réceptifs tels que le lapin. On a aussi proposé d'utiliser des virus mutants, obtenus par culture à des températures inférieures aux températures normales. les avantages des vaccins vivants sont essentiellement la rapidité et la durée (un à deux ans) de la protection conférée. ae- pendant, ces vaccins vivants ne sont, semble-t-il, pas capables dlentratner l'éradication complète de la maladie. L'hypothèse a même été avancée que cette population virale qui est répandue par la vaccination, par des modifications inverses de celles qui ont abouti à sa "modification", pourrait conduire au développement naturel de variétés pathogènes, lorsqu'elle rencontre des conditions favorables, et notamment chez des hôtes réceptifs. l'usage d'un vaccin contenant des virus inactivés ne présente pas ces risques, et son utilisation est donc particulièrement souhaitable, Chronologiquement, les premiers vaccins utilisés contre la peste porcine étaient du type à virus inactivés.Ils étaient constitués de broyats de rates d'animaux infectés inactivés à l'aide de cristal violet (chlorure de méthylrosanilinium). Leur utilisation a cependant été abandonnée au profit des vaccins contenant les virus modifiés. En effet, la préparation et l'utilisation de ces vaccins rudimentaires, que constituent les broyats inactivés, posent de grandes difficultés. En premier lieu, il est nécessaire de disposer de façon continue d'animaux donneurs infectés ; en second lieu, en raison même de leur mode d'obtention, il est pratiquement impossible d'aboutir à des préparations présentant des caractéristiques bien définies. De tels vaccins ne peuvent à l'évidence pas convenir à des traitements organisés de façon systématique. Récemment, diverses tentatives ont eu lieu pour préparer un vaccin inactivé qui réponde aux conditions exigées dans la pratique. Jusqu'à présent, aucune n'a permis la mise au point de techniques convenables, c'est-h-dire aboutiasa;n2; à un vaccin à la fois efficace, dénué de tout risque pathogène, et dont les caractéristiques soient bien définies et reproductibles. L'invention a donc pour but de fournir un procédé d'obtention d'agents immunogènes contre la peste porcine et formés à partir de virus inactivés répondant à ces exigences. Be procédé de préparation d'agents immunogènes contre la peste porcine selon l'invention est caractérisé par la réalisation d'une inactivation de culture de virus pathogènes de la peste porcine à l'aide d'un agent alkylant, la nature dudit agent et sa concentration étant choisies de façon que la cinétique de'la réaction d'inactivation puisse etre contrôlée, et obtenir ainsi l'inactivation complète des virus sans aller au-delà des limites pour lesquelles on aboutirait à la dénaturation des virus et, par suite, à la disparition du pouvoir immunogène. Dans le procédé selon l'invention, on peut utiliser n'importe quelle souche de virus pathogène de la peste porcine, en particulier la souche isolée au Laboratoire Central de Recherches Vétérinaires de Xaisons-Alfort et désignée par l'abréviation A-19, les virus obtenus sont inactivés chimiquement par un agent al kylant. Les conditions de cette inactivation doivent permettre l'élimination complète du pouvoir pathogène des virus ; autrement dit, leur capacité de réplication doit être complètement détruite et, en même temps, l'inactivation ne doit pas tre trop poussée afin d'éviter la dénaturation des virus. A cet effet, on choisit des agents alkylants dont l'action soit suffisamment progressive pour que la réaction puisse entre bien contrôlée. Des essais préalables permettent, pour chaque agent alkylant, pour chaque concentration et pour chaque température, de déterminer le temps minimum nécessaire pour obtenir ltinactivation de la culture virale. Dans ces essais, on étudie la cinétique de la réaction ; autrement dit, on mesure, en fonction du temps écqulé depuis le début de la réaction, la teneur du mélange en virus non encore inactivés. Pour effectuer cette mesure, on peut utiliser notamment une technique d'immunofluorescence. La répétition de ces mesures à intervalles de temps réguliers permet de déterminer, par extrapolation, le temps nécessaire pour aboutir à l'inactivation complète de la suspension virale dans les conditions particulières de l'essai. Selon l'invention, on opère l'inactivation des virus avec un agent alkylant tel qu'il n'induise pas la perte de l'activité imma- nogène des virus traités après une durée de contact égale à au moins trois fois le temps nécessaire à leur inactivation complète. De préférence, les conditions d'inactivation sont alors maintenues pendant le double du temps nécessaire à l'inactivation complète. Dans ces conditions, on est certain de l'innocuité de la préparation, et du fait que les propriétés immunogènes de celle-ci ne sont pas affectées de façon rédhibitoire. On stoppe la réaction dtinactivation au moment voulu en introduisant dans la solution une quantité suffisante d'un agent inhibant l'action du composé dtalkylation, par exemple un sérum. la solution de l'agent viral obtenue est conservée jusqu'à son utilisation. Selon l'invention, un agent alkylant préféré est constitué par le glycidaldéhyde, mais d'autres agents alkylants peuvent également être utilisés, à condition que leur action soit progressive et permette le contrôle de la réaction. Si l'on utilise le glycidaldéhyde, sa concentration est avantageusement comprise entre 0,01 % et 0,001 %, et de préférence est d'environ 0,005 %. Toujours pour ce mEme agent alkylant, la température de la réaction est avantageusement comprise entre 200C et 350C, et de préférence est d'environ 28 C. Comme il est indiqué dans un des exemples qui illustrent l'invention, il faut environ trois heures pour aboutir à l'inactivation complète des virus loraqu'elle est effectuée avec le glycidaldéhyde à concentration de 0,005 ffi et à une température de 28 C. Ainsi qu'on l'a indiqué précédemment, la production d'un vac cin contre la peste porcine nécessite qu'on dispose de virus en quantité abondante et régulière. En outre, pour que le vaccin final présente une bonne efficacité, il faut que sa concentration en antigène vaccinant soit suffisante. Par suite, la teneur en virus de la culture initiale doit être aussi élevée que possible, afin de limiter les opérations de concentration. On choisit, de préférence, des conditions de culture permettant d'obtenir une concentration qui ne soit pas inférieure à 106 UPP/ml (unité formant plage), et de préférence supérieure à 5 . 106 UFp/ml. La réplication du virus ne peut se produire-clue sur des cellules vivantes capables d'être parasitées. Les cultures sur organes posent de nombreuses difficultés matérielles, et on leur préfère les systèmes de lignées cellulaires perpétuelles. Pour cultiver les virus de la peste porcine, on utilise avantageusement, selon l'invent ion, la culture cellulaire dénommée PK.15 (de l'anglais Pig -Kidney). Lorsque les cultures sont parvenues à un stade de développement convenable, on rompt les cellules du milieu de culture afin de libérer le maximum de virus, ce qui peut être obtenu de façon traditionnelle, par exemple par une succession d'opérations de congélation et de décongélation. Les virus sont ensuite séparés du milieu de culture suivant des procédés usuels, tels notamment que la centrifugation et la filtration. La centrifugation permet notamment d'éliminer les cellules ou les débris cellulaires, le milieu récu périe étant ensuite concentré en virus, par exemple par ultrafiltra tison. L'invéntfon concerne aussi les préparations médicamenteuses contenant les agents immunogènes contre la peste porcine et issus du procédé précédemment décrit. L'invention concerne notamment des vaccins contenant une dose efficace de ces agents immunogènes associés, le cas échéant, avec des excipients ou adjuvants facilitant leur administration, ou favorisant l'accroissement du taux de for mation des anticorps a Avantageusement, les préparations de vaccins sont dosées de façon à contenir au moins 106 unités d'antigène, et de préférence au moins j07, et plus particulièrement entre 5 . 107 et 108 unités d'antigène. le volume de ces doses de vaccin est commodément compris entre 0,5 et 10 ml, et de préférence entre 1 et 8 ml. Pour favoriser l'action iiumunogène des virus inactivés selon l'invention, on peut associer ceux-ci à des adjuvants de type classique, et notamment des adjuvants huileux sous forme d'émulsion. Des composés huileux, utilisés comme adjuvants immunologiques pour les vaccins selon l'invention, sont par exemple des huiles de paraffine, de vaseline, des éthers glycoliques d'alcools gras ou des huiles analogues, éventuellement additionnés d'agents émulsionnante. D'autres détails de l'invention apparaîtront dans les exemples d'obtention des antigènes de la peste porcine et des vaccins qui les contiennent, et oui font l'objet de la suite de la description0 Dans cette suite de la description, les titres en virus sont exprimés en UFP/ml les mesures ont été effectuées par immunofluo- rescerce indirecte sur cellules PK.15. 10 > Production du virus On a utilisé la souche virale dénommée A-19 du Laboratoire Central de Recherches Vétérinaires de Maisons-Alfort. Cette souche pathogène est issue d'une souche "sauvage" qui a été passée 19 fois sur un milieu cellulaire constitué de cellules lignées de rein de porc du type PK.15. Cette souche de virus est pathogène et se multiplie bien sur les cellules PK.15. la souche d'origine conservée titre 106 UFP/ml. La culture est développée par étapes à partir des souches. A chaque etape, le protocole utilisé est le suivant - on prépare une culture de cellules PK.15 sur milieu essentiel de Beagle (M.E.M.) additionné de 8 % de sérum de veau foetal (Flobio) ; après 36 heures de culture, le tapis cellulaire à peine confluent est inoculé avec la souche virale - pendant 1 heure, à 370C, on laisse se développer l'adsorption du virus ;; - on rajoute du milieu M.E.M. sans sérum mais avec les antibioti- ques suivants penicilline 100 U.IO/ml streptonycine 0,2 mgXml polymyxine 100 U.I./ml - la culture est maintenue 60 heures à 380 C pour parvenir à un titre maximum en virus - pour rompre les cellules du milieu de culture et récolter les virus, on ajoute au milieu 5 % de diméthyl-sulfoxyde et on congèle et décongèle deux fois ; la suspension virale est clarifiée par centrifugation à 10 000 g pendant 30 minutes. les différentes étapes, dont le protocole vient entre indi que, sont les suivantes : - 5 ml de virus de souc'ne sert à inoculer un récipient Falcon de 60 ml ; on récupère 8 ml de suspension virale ; - avec celle-ci, on inocule 1 boîte de Roux d'un litre et on ootient 80 mi de suspension virale - on inocule ensuite 8 bottes de Roux d'un litre t On obtient 800 ml de suspension virale ;; - on inocule enfin des flacons roulants d'un litre à raison de 20 ml de la suspension virale précédente, et l'on recueille 100 ml de suspension virale par flacon,dont le titre est de 5 . 106 UFP/ml Pour la dernière étape de la culture, c'est-à-dire dans les flacons roulants, on n'ajoute pas de diméthyl-sulfoxyde qui rendrait difficile l'étape de concentration ultérieure. On concentre la suspension virale, préparée de la façon qui vient d'être décrite, par ultrafiltration sur membrane Xi4.100 de la Société AMICON, dans une cellule de 350 ml sous agitation et sous pression de 0,7 bar en atmosphère d'azote (qualité médicale). On opère à + 4 C. On récupère la suspension virale lorsque son volume est réduit au 1/30 du volume initial. Le rendement est pratiquement de 100 . On obtient ainsi une suspension dont le titre moyen est compris entre 5 . 107 et 108 UFP/ml. 20) inactivation des virus L'inactivation est effectuée sous agitation à l'abri de la lumière, à température constante de 280C maintenue par un bainmarie. On a utilisé du glycidaldéhyde à la concentration de 0,005 % comme agent alkylant. Pour déterminer le temps nécessaire à l'inactivation de la suspension virale dans ces conditions, on prélève toutes les heures un échantillon aliquote que l'on dose après dilution au 1/10. On détermine ainsi la courbe d'inactivation de la suspension, ctest-à-dire le nombre d'UFP/ml (rapporté en unités logarithmiques) en fonction du temps d'inactivation. L'extrapolation de cette courbe pérmet de déterminer le temps nécessaire pour obtenir l'inactivation complète. Dans le cas présent, ce temps est d'environ 3 heures, et l'on a maintenu la réaction d'inactivation au total pendant 6 heures La réaction est arrêtée par addition à la suspension de 2,5 % de sérum de veau foetal. Cette suspension d'antigène est eonservée à A 40C. 3 ) Préparation vaccinale contre la peste porcine On utilise, pour la préparation des vaccins, un adjuvant huileux formé d'huile de vaseline et d'un mélange d'éthers polyglycoliques d'alcools gras. Le mélange se fait en ajoutant progressivement, et sous agitation douce, la suspension d'antigène préparée en 20) dans la phase huileuse, les deux phases étant en quantités égales. On obtient ainsi le vaccin sous forme d'une émulsion blanche qui est conservée à + 4 C. les vaccins préparés comme il vient d'être dit ont fait l'objet d'essais in vivo, à la fois pour contrôler leur innocuité et leur activité. Contrôle d 'innocuité Plusieurs lots de vaccins ont été contrôlés sur des porcs dont on s'assure au préalable, par des tests sérologiques, qu'ils 'ont jamais été en contact avec le virus. h cet effet, six porcs ont reçu une injection de 5 ml du vaccin préparé comme il vient d'être dit. Pendant les 30 jours suivant l'injection, on nta constaté ni hyperthermie au-delà de 4O0C, ni signes cliniques de l'infection. Par ailleurs, 15 porcs ont été plscés au contact des animaux vaccinés de I'esaai qui est reporté ci-après. Après 10 semaines, aucun des 15 animaux ne présente d'anticorps contre la peste por cine Contrôle d'activité a) Deux porcs de 30 et 40 kg ont été vaccinés au moyen de 5 mi d'un vaccin dont le titre est 108 UFP/ml, et qui a été inactivé à 25 3O0C, pendant 4 heures 30, avec 0,05 o de glycidaldéhyde. 15 Jours après la première injection, les porcs reçoivent de nouveau 5 ml du même vaccin. On a vérifié la protection conférée par cette vaccination en injectant 2 ml d'un broyat au t/10 de rate virulente, six semaines après la deuxième vaccination. Le dosage des anticorps pestiques par immuno-fliorescence estné- gatif 15 joursaprès la première vaccination. 50 jours après la seconde vaccination, l'index de neutralisation, à l'aide d'un sérum à la dilution 1/20, est respectivement de 3 et de 5 pour chacun des porcs. Pendant le mois suivant l'injection de la dose d'épreuve, les animaux vaccinés n'ont présenté ni signes cliniques, ni hyperthermie au-delà de 400C, alors que, dans les mêmes conditions, un animal témoin, non vacciné, est mort 8 jours après l'inoculation. b) Quatre porcs de 50 kg ont reçu, à 15 jours d'intervalle, 5 ml de vaccin dont le titre est 107, et dont l'inactivation a été effectuée à 25 - 27 C, pendant 5 heures 30, avec du glycidaldéhyde à 0,005 %. On a suivi, chez ces animaux, l'évolution de l'index de neutralisation avec le sérum au 1/20. les résultats obtenus sont les suivants. Tableau 1 --------------------------------------------------- Nombre de jours après Index Nombre de pores la lère vaccination --------------------------------------------------- 15 nul 2 faible 2 --------------------------------------------------- 30 - #1 2 2 2 --------------------------------------------------- 37 1 1 2 2 3 1 --------------------------------------------------- 42 3 4 --------------------------------------------------- 75 3 4 --------------------------------------------------- Chez les témoins au contact des porcs vaccinés, on ne décèle aucune formation d'anticorps. 90 jours après la première vaccination, on effectue l'inJec- tion d'épreuve comme précédemment. A la suite de cette injection, on ne remarque aucun signe clinique ni hyperthermie chez les animaux vaccinés, alors que le témoin meurt après une hyperthermie à 41-420C. c) On a renouvelé les essais de vaccination sur des lots d'animaux en faisant varier les doses administrées. Le vaccin utilisé titre 5 . et a été inactivé à 28 C pendant 5 heures 45. La composition des lots et les traitements effectués sont les suivants - 13 animaux ont reçu 2 fois 5 ml de vaccin à 15 jours l'inter- valle, - 13 animaux ont reçu 2 fois 2,5 ml de vaccin à 15 jour dtintervalle, - 13 animaux ont reçu 2 fois 1 mi de vaccin à 15 jours d!intervalle, - 7 animaux ont reçu 1 fois 5 ml de vaccin, - 15 animaux témoins ont été placés au contact des animaux vaccines. La recherche des anticorps et leur titrage en dilution sérique sont réalisés 10 semaines après la première vaccination ; les résultats obtenus sont les suivants. Tableau 2 ------------------------------------------------------------- Vacoination Titre Titre moyen ------------------------------------------------------------- 2 x 5 ml 1/80, 1/80, 1/160, 1/80, 1/100 1/80 ------------------------------------------------------------- 2 x 2,5 ml 1/160, 1/160, 1/80, 1/80 1/40, 1/20, 1/40 ------------------------------------------------------------- 2 x 1 ml 1/10, 1/20, 0, 1/20, 1/20 1/20, 1/40 ------------------------------------------------------------- 1 x 5 ml 1/10, 1/20, 1/20, 1/10, 1/10 1/10 ------------------------------------------------------------- témoin - ------------------------------------------------------------- Dix semaines après la première vaccination, les animaux re çoivent l'injection d'épreuve de 2 ml de broyat de rate virulente dilué au 1/10. Le comportement des animaux dans chaque lot, posté rleurement à l'inoculation, est le suivant. ter lot (2 x 5 ml) - On constate une hyperthermie fugace pour deux animaux. - Un animal est mort 15 jours après l'épreuve, sans hyperthermie ni signes cliniques de l'infection. L'autopsie montre l'absence de lésions pestiques typiques, et la présence d'une forte péritonite. L'iamunofluorescence des broyats de rate est négative. - Il n'y a rien à signaler pour les autres animaux du lot. 2e lot (2 x 2.5 ml) - Deux animaux présentent une hyperthermie (- # 410C). - Rien à signaler chez les autres animaux0 3e lot (2 z t mlY - Cinq animaux présenten une hyperthermie (- # 41 C). - Deux animaux sont morts, dont l'un était chétif (culot de portée). Le diagnostic est celui de la peste porcine. - Rien à signaler pour les autres animaux. 4e lot (1 x 5 ml) - Trois animaux présentent des oscillations thermiques entre 40 et 410C. - Rien à signaler pour les autres animaux a Témoins - Les quinze animaux sont morts dans les 10 jours suivant l'inocu- lation, après avoir présenté une hyperthermie supérieure à 410G et les signes cliniques de la peste porcine tes essais en immunofluorescence sur la rate ont été positifs. Ces résultats montrent que la protection conférée par les vaccins selon l'invention est très satisfaisante, même lorsqu'on effectue une injection unique, ou encore lorsqu'on opère deux injections à faible dose (et ceci bien que le taux d'antigènes circulants reste faible). REVENDICATIONS i - Procédé de préparation d'agents immunogènes contre la peste porcine, caractérisé par la réalisation d'une inactivation de cultures de virus pathogènes de la peste porcine à l'aide d'un agent alkylant, la nature dudit agent et sa concentration étant choisies de façon que la cinétique de la réaction d'inactivation puisse être contrôlée, de telle sorte que l'inactivation soit complète sans aller au-delà des limites pour lesquelles on aboutirait à la dénaturation des virus, et que l'on stoppe la réaction d'inactivation en neutralisant l'agent alkylant en excès. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les virus utilisés sont ceux de la souche pathogène A-19. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la durée de la réaction d'inactivation est comprise entre 1 et 3 fois la durée nécessaire pour obtenir l'inactivation complète de la suspension virale telle que celle-ci est déterminée par l'étude de la cinétique de la réaction dtinactiva- tion. 4 - Procédé selon lune quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'agent alkylant est le glycidaldéhyde et qu'il est employé à raison de 0,01 % à 0,001 %, et de préférence environ 0,005 %0. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la température d'inactivation est de 200C à 50C, et de préférence d'environ 28 C. 6 - Procédé selon la revendication 4 ou la revendicatisn T; caractérisé en ce que la réaction d'inactivation est maintenue entre 4 et 7 heures. 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précé dentes, caractérisé en ce que les virus proviennent de cultures sur un milieu cellulaire du type à lignée perpétuelle. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le milieu cellulaire est constitué par des cellules de reins de porcs connues sous la désignation PK.15. 9 - Procédé selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisé en ce que les virus -cultivés en suspension dans le milieu de culture sont concentrés jusqu'à un titre au moins égal à 106 USPlml, et de préférence au moins égal à 5 . 106 UFP/ml. tO - Agents immunogènes contre la peste porcine présentant les caractéristiques de ceux obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. 11 - Composition de vaccins contenant les agents immunogènes obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. 12 - Composition de vaccins selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle contient, par dose, au moins 106 unités d'arti- gène, et de préférence au moins 107. 13 - Comiposition de vaccins selon la revendication il ou la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle contient, outre l'agent immsnogène, un adjuvant huileux, et se présente sous forme d'émulsion. 14 - Composition de vaccins selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'adjuvant huileux contient des huiles de vaseline et des éthers glycoliques d'alcools grasO