FR 2353289 A1 19771230 FR 7616466 A 19760601 La présente invention concerne des composés chimiques nouveau, des procédés pour leur préparation et l'application de ces composés en tant qu'agents de stérilisation, de conservation et comme médicaments. Elle concerne plus particulièrement des acides hydroxamiques de formule générale dans laquelle la ligne pointillée représente une double liaison éventuelle ment présente ; n représente O ou 1 R1 et R2 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, ou bien R1 et R2 forment ensemble un cycle saturé ou insaturé, substitué ou non substitué, contenant éventuellement un ou plusieurs hétéro-atomes ; et R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle ainsi que les sels de ces composés. Les groupes alkyle représentant R1, R2, R3 et R4 peuvent être avantageusement des groupes alkyle inférieurs, code par exemple les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, etc. Dans le cas où R1 et R2 forment ensemble un cycle, ce cycle peut être avantageusement un cycle à 6 charnons saturé ou insaturé et contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, comme par exemple un noyau cyclohexane, phényle, pyridine, pyrazine, etc. Ce cycle peut comporter un ou plusieurs substituants, tels que des groupes alkyle, acyle, amino ; deux de ces substituants pouvant former à leur tour un autre système cyclique. Les composés de formule I ci-dessus existent en équilibre avec leur forme tautomère correspondante, selon le schéma ci-dessous Comme exemples représentatifs des composés selon l'invention, on peut citer les composés du tableau I cidessous Tableau I Composé Formule développée Nom chimique nO HOOC CO-NH-OH 1 C=C Acide (N hydroxy carbamoyl)-3 / cis E H cis propène-2 olque (Acide malé ique monohydroxamique) CO-NH-OH 2 M |t Acide (N hydroxy carbamoyl)-2 &num;;COOH benzolque (Acide orthophtalique - x COOH monohydroxamique) CO-NH-OH Sel monosodique de l'acide N COO-.Na+ hydroxy carbamoyl-2 benzolque CO-NH-OH . 4 l ll CH2 H (N hydroxy carbamoyl)-2 benzoate M X ~N + de trihydroxy méthyl amino ' 3 7 2 )EI méthane CH OH Tableau I (Suite) Composé Formule développée Nom chimique n0 CO-NH-OH N CO-NH-OH Piélange des isolsères : 5 l l Mélange des isomères :: M s - Acide (N hydroxy carbamoyl) kW / COQH pyridine carborylique-3 et - Acide (N hydroxy carbamoyl) pyridine carboxylique-2 CO-NH-OH 6 t Acide (N hydroxy carbamoyl)-3 COOH N' COOH pyrazine-2 carboxylique CO-NH-OH M COOH 7 i Acide N hydroxycarbamoyl-3 M COOH benzène dicarboxylique-1,2 HOOG CO-NH-OH 8 ,CO-NH-OH Mélange des isomères :: - - Acide N hydroxy carbamoyl-4 COOH benzène dicarboxylique-1,3 - Acide N hydroxy carbamoyl-3 O O benzène dicarboxylique-1 ,4 9 C &num;/ Hé lange des isomères :: 9 a Acide carbaaroyl-2(N hydroxy H hss COOH - Acide carbanoyl)-7 dioxo-1,4 O phtalazine carboxylique-6 - - Acide carbamoyl-2(N hydroxy carbanoyl)-6 dioxo-1 ,4 phtalazine carboxylique7 0 10 H Ne lange des isomères 10 H2N ouc Cs S OO-NB-OH Acide thiocarbs-oyl-2(N :: COOH droxy carbamoyl)-7 dioxo-f,i t COOH drory carbamoyl)-7 dioso-1,4 phtalazine carboxylique-7 - Acide thiocarbamoyl-2(N hy droxy carbamoyl)-6 dioxo-1,4 phtalazine carboxylique-7 Tableau I (Suite) Composé Formule développée Nom chimique n0 11 C I CO-NH-OH i 11 v M CO-NH-OH Acide (N hydroxy carbamoyl)-2 XC As v -COOH dicarbosimido-4w5 benzoique II O 12 HOO CO-NH-OH Mélange des isomères :: - - Acide di(N hydroxy carbamoyl) HD-HN-OC. 2,5 benzène dicarboxylique .COOH 1,4 - - Acide di(N hydroxy carbaoyl) 2,4 benzène dicarboxylique 1,5 H2N Hélange desCO-NH-OH 13 C Nélange des isomères .GC)C)H - Acide amino-4(N hydroxy carba moyl)-2 benzoique - Acide amino-5(N hydroxy carba H moyl)-2 benzoique N É0 M CO-NH-OH 14 l Mélange des isomères COOH 9 > , ~COOH - Acide acétylamino-4(N hydr9zy CH3 M carbamoyl)-2 benzoïque - Acide acétylamino-5(N hydroxy carbamoyl ) -2 benzoïque CO-NH-OH 15 il Hé lange des isomères COOH ,LCOOH - Acide (titra hydro pyranyl 0OCM oxycarbon l)-4(N hydroxy carbamoyl -2 benzolque - Acide (tétra hydro pyranyl oxycarbonyl) -5(N hydroxy carbamoyl -2 benzoïque Selon l'invention, les composés de formule I peuvent être obtenus par l'action d'une solution méthanolique d'hydroxylamine base sur l'anhydride interne du diacide correspondant de formule II, selon l'équation : où R12 R2 R3, R4 et n ont la meme signification que ci dessus. Les anhydrides internes de formule II peuvent être eux-mêmes formés par déshydratation des diacides vicinaux de formule III dans laquelle R1, R2' R3, R4 et n ont la même signification que ci-dessus, au moyen de l'anhydride acétique ou du chlorure d'acétyle, suivant le mode opératoire décrit dans Organic Synthesis (1943 b). Mode opératoire général a) formation de la fonction anhydride 0,1 mole du diacide de foule III est chauffé lentement dans 0,2 mole d'anhydride acétique jusqu'à dissolution. Le chauffage est maintenu 10 minutes supplémentaires. Par refroidissement, on observe la cristallisation de l'anhydride formé qui est isolé par filtration, lavé plu sieurs fois par petites fractions d'éther, et séché au four quelques minutes. L'anhydride est utilisé directement pour la préparation du dérivé monohydroxamique selon Organic Synthesis (1943 a). Rendement (Rt) compris entre 60 et 80 *. b) formation du dérivé monohydroxamique - préparation de la solution méthanolique d'hydroxylamine base On dissout dans un erlenmeyer . 0,1 mole de chlorhydrate d'hydroxylamine par agitation à chaud dans 30 ml de méthanol pour analyse. . 0,1 mole de potasse en pastille dans 15 ml de méthanol pour analyse. Les deux solutions refroidies sont mélangées en agitant dans un bêcher à la température du bain de glace. On maintient à OtC pour assurer la précipitation complète du chlorure de potassium. On filtre alors rapidement sur büchner, lave le précipité de KCl avec quelques millilitres de méthanol glacé. - formation du dérivé monohydroxamique Dans un bécher équipé pour une agitation magnétique et plongé dans un bain glace-sel, on laisse refroidir la solution d'hydroxylamine base à une température infé rieure à -100C. On ajoute alors par petites portions à la spatule 0,1 mole d'anhydride d'acide préparé anté rieurement, en réglant la vitesse d'addition sur la vitesse de dissolution de l'anhydride dans la solution d'hydroxylamine. La température interne du milieu réactionnel ne doit pas dépasser OOC au cours de cette opération. L'agitation est maintenue environ 60 à 90 minutes. On isole selon les cas le dérivé monohydroxamique par filtration lorsque celui-ci est insoluble. . par précipitation au moyen de l'éther éthylique ou de l'acétate d'éthyle dans les autres cas. Les produits obtenus peuvent être recristallisés dans leur solution méthanolique par évaporation lente au réfrigérateur. La formation du dérivé monohydroxamique peut etre suivie par le test au perchlorure de fer à 5 * coloration rouge bordeaux. En variante, on peut préparer les composés de formule I par l'action d'un acide arylsulfohydroxamique en milieu basique sur les acides Waldéhydiques correspondants de formule IV dans laquelle R1, R2' R3, R4 et n ont la même signification que ci-dessus selon la réaction d'ANGELI-RIMINI. A titre d'exemple, on décrira la synthèse de l'acide (N hydroxycarbamoyl)-2 benzoïque (composé n 2) par les deux procédés indiqués ci-dessust ANHYDRIDE PHTALIQUE ET HYDROXYLAMINE A O, 125 mole d'une solution méthanolique d'hydroxylamine on ajoute lentement, à froid ( ACIDE ORTHOPHTALALDEHYDIQUE ET ACIDE BENZENESULFONHYDROXAMIQUE A 0,1 mole d'acide phtalaldéhydique on ajoute deux équivalents de potasse en solution méthanolique, puis, en refroidissant au bain glace sel, un équivalent d'acide benzène sulfohydroxamique, Par agitation le milieu devient limpide ; la neutralisation à froid par l'acide sulfurique dilué conduit à la cristallisation du produit. Dans les deux cas, le produit est isolé par filtration et lavé au méthanol glacé. Rendement compris entre 60 et 80 *. La présente invention concerne également, à titre d'agents de stérilisation et/ou de conservation, les composés de formule I et plus particulièrement les composés du tableau I. Les composés selon l'invention présentent un large spectre d'activité contre les micro-organismes, aussi bien les bactéries, les levures, les moisissures que les dermatophytes. Le spectre d'activité étendu et la faible toxicité de ces composés les rendent particulièrement utiles comme agents de stérilisation et de conservation, notamment en cosmétologie et en chirurgie. Les composés selon la présente invention constituent également des médicaments antiseptiques destinés notamment au traitement et à la prévention d'affections causées par des bactéries Gram positives et négatives en médecine humaine et vétéri naira Les composés peuvent être utilisés seuls ou en mélange, notamment avec d'autres composés à activité antibactérienne, en vue d'élargir le spectre d'activité des compositions obtenues. Compte tenu de leur bonne solubilité dans l'eau, les composés selon la présente invention pourront être utilisés de préférence sous forme de solutions aqueuses, mais ils pourront être conditionnés sous d'autres formes telles que des pâtes (par exemple des savons), des crèmes, des granulés solubles, des poudres ou des solutions alcooliques, suivant leur destination. Les formes liquides conviennent tout particulièrement à la stérilisation du matériel et des appareillages. Les composés selon la présente invention pourront être administrés à l'homme ou à l'animal par voie orale ou parentérale. En outre, ils pourront être ajoutés à l'alimentation des animaux. Les études rapportées ci-dessous ont porte plus particulièrement sur les composés 1 et 2, à savoir l'acide maléique monohydroxamique et l'acide orthophtalique monohydrowamique. Toxicité Les études de toxicité effectuées chez la souris ont montré pour tous ces composés une DL50 comprise entre 1200 g/ kg et 2500 mg/kg. Etude de l'activité antibactérienne Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) par dilution en milieu solide Les différentes bactéries étudiées comprennent trois souches de STAPHYLOCOCCUS aureus, STREPTOCOCCUS faecalis et ESCHERICHIA coli, une souche de PROTEUS vulgaris, SALMONELLA typhi, KLEBSIELLA pneumoniae, sept souches de SERRATIA et neuf souches de PSEUDOMONAS aeruginosa. Le composé à étudier est incorporé à diverses concentrations dans un milieu gélosé solide à la surface duquel on effectue l'ensemencement des souches bactériennes. On prépare une gamme de dilution du composé à étudier en eau distillée stérile, selon une progression géométrique de raison de 2. On ensemence ainsi deux boîtes de Pétri par dilution du composé à tester, et, pour chaque essai, deux boîtes de Pétri sans produit servant de témoins inoculum. Les milieux ensemencés sont incubés à l'étuve à 37 . Des lectures sont effectuées à 24 h, 48 h et 72 heures. Les résultats sont reportés au tableau II ci-après. Tableau II Concentrations minimales inhibitrices (CMI) Composé n 1 Composé ne 2 Souches CMI en H/I CMI CM en M/l CMI x 10-3 en g/ml x 10-3 en g/ml Streptococcus faecalis ATCC 10541 1,25 - 162 1,25 226 Streptococcus faecalis IPL 9 1,25 162 1,25 226 Streptococcus faecalis IPL 4740 1,25 162 1,25 226 Staphylococcus aureus (*) 1,25 162 1,25 226 Staphylococcus aureus IPL 9602 1,25 162 0,63 113 Staphylococcus aureus ATCC 6538 1,25 162 1,25 226 Escherichia coli (* 1,25 t62 o,63 113 Tableau II (Suite) Composé n 1 Composé n 2 Souches CMI en M/l CMI CMI en M/l . CMI x 10-3 en g/ml x 10-3 en g/ml Escherichia coli IPL 2570 1,25 162 1,25 226 Escherichia coli TOC 10536 1,25 162 1,25 226 Proteus vulgaris IPL 411 1,25 162 1,25 226 Salmonella typhi IPL 7722 1,25 162 1,25 226 Klebsiella pneumoniae IPL 21 1,25 162 1,25 226 Serratia marcescens IPL 9591 2,5 325 1,25 226 Sarratia marcescens var. marcescens S 1 2,5 325 2,5 452 Serratia liquefaciens S 3 2,5 325 1,25 226 Serratia marcescens var. marcescens S 6 2,5 325 2,5 452 Serratia rubideae S 44 1,25 162 0,63 113 Serratia marcescens var. kiliensis S 52 2,5 325 1,25 226 Serratia liquefaciéns S 60 2,5 325 1,25 226 Ps eudomonas aeruginosa (*) 1,25 162 0,63 113 Pseudomonas aeruginosa IPA 22 1,25 162 1,25 226 Pseudomonas aeruginosa IPL 9543 1,25 162 1,25 226 Pseudomonas aeruginosa IPL 9541 1,25 162 1,25 226 Tableau II (Suite) Composé n 1 Composé n 2 Souches CMI en M/l CMI CMI en M/l CMI x 10-3 en g/ml x 10-3 en g/ml Pseudomonas aeruginosa IPL 9539 1,25 162 1,25 226 Pseudomonas aeruginosa IPL 9542 2,5 325 1,25 226 Pseudomonas aeruginosa IPL 9547 1,25 162 1,25 226 Pseudomonas aeruginosa IPL 9548 1,25 162 1,25 226 Pseudomonas aeruginosa IPL 9550 2,5 325 1,25 226 Ps eudomonas aeruginosa IPL 9556 2,5 325 1,25 226 (*) Collection du Laboratoire de Microbiologie et Immunologie Pharmaceutique - Professeur Maurice CARRAZ. IPL - Institut Pasteur de Lyon. ATCC - Aserican Type Culture Collection. Composé n 1 (Acide maléique monohydroxamique) Les CMI sont de 1,25.10-3 H/l, soit 162 yg/ml pour 20 des 29 souches bactériennes testées (tableau II). Les souches les plus résistantes ont des CHI de 2,5.10 3 M/l, c'est-à-dire 325 g /ml , et ce sont toutes les souches de SERRATIA - hormis SERRATIA rubidaea - et trois souches de PSEUDOMONAS aeruginosa (IPL 9543, IPL 9550, IPL 9556) parmi les dix souches étudiées. Composé n 2 (Acide orthophtalique monohydroxamique) Les CMI reportées dans le tableau II sont de 1,25.10-3 M/l pour la plupart des souches bactériennes testées, ce qui correspond à 226 g /ml. Les souches de SERRATIA marcescens var. marcescens S1 et s6 sont les plus résistantes, puisque les CMI sont de 2,5.10-3 M/l, soit 452 g/ml. Les souches les plus sen sibles à l'action bactériostatique du composé n 2 sont ESCHERICHIA coli (1) et PSEUDOMONAS aeruginosa (+) STAPHYLOCOCCUS aureus IPL 9602 et SERRATIA rubidaea 544 pour lesquelles les CMI sont de 0,63.10-3 M/l, soit 113 g/ml. En définitive, pour ensemble des souches testées, les CMI vont de 0,63 à 2,5.10-3 M/l. Détermination de la concentration minimale bactéricide (CMB) La technique consiste à verser sur une membrane filtrante stérile le mélange bactéries - substance à étudier, après un temps de contact déterminé des bactéries avec la substance. Les bactéries sont retenues sur la membrane tandis que le produit est éliminé dans le filtrat Plusieurs lavages successifs permettent d'éliminer la majeure partie du produit, toujours plus ou moins adsorbée sur la membrane. Cette dernière sera introduite dans un bouillon de subculture ou déposée à la surface d'un milieu gélosé. Les souches utilisées sont : ESCHERIClIIA coli ATCC 10 536 PSEUDOMONAS aeruginosa IPA 22 STREPTOCOCCUS faecalis ATCC 10 541 STAPHYLOCOCCUS aureus ATCC 6 538 Les résultats sont indiqués au tableau III ci-après Tableau III Concentrations minimales bactéricides (CMB) templs de Composé n 1 Composé n 2 Souches contact x 10-2 M/l g/l x 10-2 M/l g/l Eschericha 15' 1,25 1,62 > 2,5 > 4,52 coli ATCC 10536 30' 1,25 1,62 > 2,5 > 4,52 Pseudomonas 15' 2,5 3,25 1,25 2,26 aeruginosa 30' 1,25 1,62 1,25 2,26 IPA 22 Streptococcus 15' > 5 > 6,50 > 2,5 > 4,52 faecalis ATCC 1054 1 Staphylococcus 15' > 5 > 6,50 > 2,5 > 4,52 aureus 30' > 5 > 6,50 > 2,5 > 4,52 ATCC 6538 Les deux composés sont plus actifs sur les bactéries Gram - que sur les bactéries Gram + et, à une concentration de 1,25.10-2 SI/l, ils sont tous deux bactéricides pour PSEUDOMONAS aeruginosa IPA 22 après 30 minutes de contact. L'acide maléique monohydroxamique est bactéricide à 1,62 g/l après un contact de 15 minutes avec ESCHERICHIA coli et un contact de 30 minutes avec PSEUDOMONAS aeruginosa. Pour STAPHYLOCOCCUS aureus et STREPTOCOCCUS faecalis, les CEX sont supérieures à 6,50 g/l. L'acide orthophtalique monohydroxamique est bactéricide pour le bacille pyocyanique à 2,26 g/l, pour un temps de contact de 15 minutes, mais ne provoque pas une destruction de 99,999 * des trois autres souches à la plus forte concentration testée (4,52 g/i). Etude de l'activité fungistatique L'étude de l'activité fungistatique a porté sur 15 souches mycéliennes, représentant un assez large éventail des principales espèces de champignons inférieurs rencontrés en pathologie médicale. Ces souches ont été classées en trois groupes LEVURES MOISISSURES DERMATOPHYTES Levures Sept souches de levures anascosporées ont été testées : CANDIDA albicans, CANDIDA tropicalis, CANDIDA pseudotropicalis, CANDIDA krusei, CANDIDA parapsilosis, TORULOPSIS glabrata, GEOTRICHUM candidum. On a également testé une souche de levure formant des ascospores SACCHAROMYCES oerevisiae. Moisissures et dermatophytes ASPERGILLUS fumigatus, ASPERGILLUS niger, ASPERGILLUS versicolor et PENICILLIUM glaucum représentent les quatre souches de moisissures testées. Pour les dermatophytes, o n a retenu une espèce des trois principaux genres en pathologie humaine MICROSPORUM canifs, TRICHOPHYTON mentagrophytes et EPIDERMOPHYTON floccosum. L'étude de l'activité fungistatique a été effectuée conformément à la méthode classique de dilution en milieu solide. Les milieux ensemencés sont placés à l'étuve à 280 dans tous les cas. Des lectures sont effectuées à 2, 3 et 5 jours pour les levures, à 2, 5 et 7 jours pour les moisissures et à 8, 15 et 21 jours pour les dermatophytes. Dans tous les cas, des témoins de croissance sont réalisés, soit en eau distillée, soit en solvant, aux mêmes concentrations, et l'on détermine la concentration minimale inhibitrice (CMI) qui est la plus faible concentration finale de la substance étudiée provoquant une inhibition totale de la croissance du microorganisme. Les résultats sont reportés au tableau IV ci-après. Tableau IV 1 Composés N, 1 NO 2 Souches C. tropicalis C, pseudotropicalis - > 10-3 10'3 C. krusei > 10'3 10-3 10'3 C. krusei > îo > C. parapsilosis > 10-3 10-3 S. cerevisiae . > 10 3 > T. glabrata > 10'3 > G. candidum > 10 3 A. fumigatus > 10 3 > A. niger > 10 3 > A. versicolor > 10 > P. glaucum , > 10 M canis > îo Tr. mentagrophytes , > 10 E. floccosum > 10 L'acide orthophtalique monohydroxamique (composé n 2) est bactériostatique à 5.10-- M/l vis-à-vis des dermatophytes 15 et de PENICILLIUM glaucum. Il résulte de cette étude que les composés de l'invention, et plus particulièrement les composés 1 et 2, présentent une activité bactériostatique sur un- assez large éventail de bactéries. Ces deux composés ont des concentrations minimales inhibitrices exprimées en M/l sensiblement identiques puisque, sur l'ensemble des souches testées, la CMI moyenne est de 1,25 H/i. Ces acides hydrexamiques ont donc un spectre d'action relativement large et possèdent une activité sur les bacilles Gram négatifs et, plus spécialement, les espèces responsables de lthospitalisme La sensibilité à ces produits de plusieurs souches de SERRATIA biochmiquement différentes est à peu près la même SERRATIA rubidaea est cependant la plus sensible notamment à l'acide orthophtalique monohydroxamique et à l'acide maléique hydroxyamique. Le fait le plus remarquable est certainement que le bacille pyocyanique, un des microorganismes les plus résistants à l'action des agents antimicrobiens, soit aussi sensible à ces deux acides hydroxamiques que les autres germes. Les composés de l'invention peuvent donc être utilisés comme agents de stérilisation et/ou de conservation et médicaments pour la prévention ou le traitement des affections à bacilles Gram positifs et Gram négatifs indiqués plus haut. REVENDICATIONS 1. Composés de -formule dans laquelle la ligne pointillée représente une double liaison éventuelle ment présente, n représente O ou 1 R1 et R2 représentent indépendamment l'un de l'autre un atone d'hydrogène ou un radical alkyle, ou bien R1 et R2 forment ensemble un cycle saturé ou insaturé, substitué ou non substitué, pouvant contenir un ou plusieurs hétéro-atomes ; et R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, ainsi que leurs sels. 2. Un composé selon la revendication 1, à savoir l'acide maléique monohydroxamique de formule 3. Composés selon la revendication 1, caractérisés en ce que R1 et R2 forment ensemble un cycle à 6 chainons. 4. Composé selon la revendication 3, à savoir l'acide orthopht alique monohydroxamique de.formule : formule 5. A titre d'agent de stérilisation et/ou de conservation, un composé de formule I selon l'une des revendications 1 à 4. 6. A titre de médicament convenant notamment au traitement des affections causées par des bactéries Gram positives et Gram négatives, un composé de formule I selon l'une des revendications 1 à 4. 7 . Une composition pharmaceutique contenant, à titre d'ingrédient actif, un composé de formule I selon l'une des revendications 1 à 4, ainsi qu'un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 8. Procédé de préparation d'un composé de formule I selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on fait réagir une solution méthanolique d'hydroxylamine base sur un composé de formule dans laquelle R1, R22 R3, R4 et n ont la même signification que dans la revendication 1. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le composé de formule II est préparé par déshydratation d'un composé de formule dans laquelle R1, R2, R3, R4 et n ont la meme signification que dans la revendication 1, au moyen de l'anhydride acétique ou du chlorure d'acétyle. 10. Procédé de préparation d'un composé de formule I selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait réagir un acide arylsulfohydroxamique en milieu basique sur un composé de formule dans laquelle R1, R2, $R3, R4 et n ont la même signification que dans la revendication 1.