FR 2347930 A1 19771110 FR 7611141 A 19760415 La presente invention, à la réalisation de laquelle ont participé Messieurs Jean FLORENT, Jean LUNEL et Madame Denise MANCY, concerne une nouvelle substance antifongique désignée ci-après par le numéro 32232 RP, son procédé de prép@ration et les compositions qui la contiennent. Le 32232 RP presente un intérêt tout particulier par suite de activité qu'il manifeste sur les champignons et levures. Le 32232 RP peut être obtenu à partir des milieux deculture appropriés d'un nouveau microorganisme identifié plus complètement ci-après, appartenant au genre Streptomyces et désigné par l'appellation Streptomyces incarnatus DS 26068 (NRRL 8089). Le 32232 RP est caractérisé par les-propriétés physico-chimiques suivantes - aspect : poudre amorphe blanche - solubilité : facilement soluble dans l'eau très peu soluble dans le méthanol et le diméthylformamide et pratiquement insoluble dans l'acétone. - composition centésimale : le 32232 RP contient du carbone, de lthydrogène, de l'oxygène et de l'azote. Sa composition centésimale est voisine de C % = 48,0 H % = 5,8 O % = 21,0 N % = 25,2 - point de fusion (déterminé au bloc Maquenne) : 2810 C - titrage potentiométrique :1e titrage potentiométrique en milieu aqueux au moyen d'acide chlorhydrique permet de mettre en évidence une fonction basique dont le pK est 8,1. Le poids moléculaire apparent est voisin de 390. - spectre ultraviolet : détermination à partir d'une solution à 10,35 mg/l dans un tampon phosphate à pH 7 Le 32232 RP présente un maximum d'absorption à 258 nm (E1cm1% = 365) Le spectre est représenté par la figure t. (Le tampon phosphate à pH 7 est obtenu par dissolution de 5,304 g de KH2PO4 et 13,9075 g de K2HPO4, 3H20 dans l'eau en quantité suffisante pour obtenir 1000 cm3.) - spectre infra-rouge : (détermination à partir de comprimés en mélange avec .KBr) Ce spectre est représenté par la figure 2 sur laquelle on a porté - en abcisses, d'une part les longueurs d'ondes exprimées en microns (échel 1e supérieure) et d'autre part les nombres d'ondes en cm-1 (échelle infé rieure) et en ordonnées les densités optiques. Dans le tableau I, on indi- que les principales bandes d'absorption infra-rouge pour ce produit expri- mées en nombre d'ondes (cm-1). TABLEAU I 3420 tF 1415 m 760 ép 3350 ép 1400 ép 720 m 3270 ép 1370 f 665 ép 3180 F 1330 m 645. m 3090 ép 1300 m 575 ép 2930 m 1245 m 535 m 2870 ép 1205 m 440 ép 2700 ép 1170 f 2340 ép (CO2) 1125 m 2100 tf 1080 m 1640 tF 1040 m tF très forte 1595 F 1010 ép F forte 1570 F 900 tf m moyenne 1505 f 845 ép f faible 1475 m 825 m tf très faible 1455 ép 795 m ép épaulement - spectre de résonance magnétique nucléaire du proton : ce spectre,qui est représenté par la figure 3, a été enregistré sur un spectromètre CAMECA TSN-250 à la fréquence de 250 MHz à partir d'une solution à 50 mg/ml dans l'eau lourde.Il présente les caractéristiques suivantes (les déplacements chimiques sont comptés positivement en p.p.m. vers les champs faibles par rapport au TMS pris en référence externe) : Déplacement chimique Forme du signal ; constante de couplage (J) et en p.p.m. nombre de protons 1,6 à 2,0 multiplet (4 H) 2,0 à 2,2 multiplet (2 H) 3,36 multiplet (i H) 3,64 multiplet (1 H) 4,30 multiplet (2 H) 4,72 double doublet, J = 4 Hz et 4 Hz (1 H) 5,96 doublet, J = 4 Hz (i H) 7,98 singulet (i H) 8,16 singulet (1 H) D'après ce spectre, l'antibiotique 32 232 RP contient 14 protons non échangeables. - spectres de résonance magnétique nucléaire du 13C : ces spectres,qui ont été enregistrés sur un spectromètre CAMECA TSN-250 a' la fréquence de 62,86 NHz à partir d'une solution dans l'eau lourde contenant une trace de dioxanne pris en référence interne, présentent des caractéristiques qui sont rassemblées dans le tableau suivant (les déplacements chimiques sont comptés positivement vers les champs faibles à partir du TMS ; le dioxanne pris en référence interne donne dans le spectre totalement découplé un singulet compté à 66,59 ppm. par rapport au TMS). Déplacement chimique Forme du signal et constante de couplage en p.p.m. (1J13C-H) sur le spectre non détouplé par rapport au TMS 177,1 singulet 154,8 singulet 152,3 doublet, J = 203 Hz 148,0 singulet 139,7 doublet, J = 215 Hz 118,3 singulet 88,3 doublet, J = 167,9 Hz 80,3 doublet, J = 149,5 Hz 73,5 doublet, J = 151,0 Hz 73,3 doublet, J = 149,5 Hz 66,59 dioxanne 55,0 doublet, J = 143,4 Hz 48,4 doublet, J = 143,4 Hz 36,7 triplet, J = 126,6 Hz 30,1 triplet, J = 114,4 Hz 28,2 triplet, J = 115,5 Hz D'après ces spectres, l'antibiotique 32 232 RP contient 15 atomes de carbone qui se répartissent en 4 atomes de carbone quaternaire (-C-), 8 atomes de carbone tertiaire (-CH) et 3 atomes de carbone secondaire (-GH2-). Après l'ensemble des données analytiques, la formule brute de l'antibiotique 32 232 RP serait : C15 H19-23 N7 O4-5 - migrations chromatographiques Le 32232.RP peut être caractérisé par chromatographie ascendante sur couche mince de gel de silice en utilisant divers mélanges de solvants - n. butanol/acétone/eau/acide acétique/ammoniaque 11 N (35-25 - 21 - 15 - 4 en volumes) :Rf = 0,25 - n. butanol/méthanol/eau/ammoniaque 11 N (50-25-25-5 en volume3 : Rf - 0,25 - fixation sur supports -: Le 32232 RF peut etre fixé sur divers supports à partir desquels il peut être élué : SUPPORT ELUANT Résine cationique (en cycle Na+ par Soude (pH : 11) à une température exemple) comprise entre 20 et 100 C Résine anionique (en cycle OH-); méthanol eau (90-10 en volume) résine Dowex 1 X 2(cycle OH- par additionné de 2 % HCl 12 N exemple) Résines adsorbantes (Amberlite eau ou méthanol eau (10-90 en XAD2 par exemple) volume) activité bactériostatique in vitro Le 32232 RP est, d'une manière générale, dépourvu d'activité bactériostatique vis-a-vis des bactéries. Son manque d'activité a été vérifié vis-à-vis d'un certain nombre de germes. pans le tableau II ci-après , il est montré que les germes se développent, dans un milieu nutritif approprié, en présence de 150 Fg/cm3 de 32232 RP. TABLEAU II Développement en présence de Organismes bactériens essayés 150 g/cm3 de 32232 RP dans un bouillon nutritif approprié Staphylococcus aureus, souche 209 P positif ATCC 6538 P Staphylococcus aureus, souche Smith positif Sarcina lutea - ATCC 9341 positif Streptococcus pyogenes hemolyticus, positif souche Dig 7 (Institut Pasteur) Diplococcus pneumoniae, souche Til positif (Institut Pasteur) Neisseria catarrhalis (A 152, positif Institut Pasteur) Bacillus subtilis - ATCC 6633 positif Bacillus cereus - ATCC 6630 positif Mycobacterium species - ATCC 607 positif Escherichia coli - ATCC 9637 positif Shigella dysenteriae (Institut positif Pasteur de Li Ile) Salmonella paratyphi A (souche Lacasse, positif Institut Pasteur) Salmonella paratyphi B (souche Fougenc, positif Institut Pasteur) Proteus vulgaris (IPA 272) positif Pseudomonas aeruginosa (35559, Institut positif Pasteur i Lille) - toxicité Chez la souris, par voie orale, le 32232 RP présente une dose létale 50 % (DL50) supérieure à 1000 mg/kg. - activité antifongique in vitro L'activité antifongique du 32232 RP vis-à-vis d'un certain nombre de champignons a été déterminée par une des méthodes de dilution couramment employées à cet effet. Pour chaque champignon, on a déterminé la plus petite concentration de substance active qui, dans des conditions définies, entrante 95 à 100 % d'inhibition du champignon (CA95-100). Les résultats des diverses déterminations sont rassemblés dans le tableau III ci-dessous où les concentrations minimales actives sont exprimées en microgrammes de substance par cm3 de milieu d'essai. TABLEAU III Concentration minimale Champignons d'essai active en pg/cm3 CANDIDA ALBICANS Pa 1 ..................... 3 CANDIDA ALBICANS IP 200 .................... 5 CANDIDA ALBICANS Hi 7 ....................... 5 CANDIDA KRUSEI IP 208 .................... 4 HANSENULA ANOMALA ........................... 2 BLASTOMYCES DERMATITIDIS ................... 5 SACCHAROMYCES BASTORIANUS .................. 0,3 SACCHAROMYCES ELLIPSOIDEUS ................. 0,9 SACCHAROMYCES CEREVISIAE .................... 0,3 MICROSPORUM CANIS ......................... > 500 MICROSPORUM RUBRUM ......................... > 500 EPIDERMOPHYTON FLOCCOSUM ................... > 500 TRICHOPHYTON MENTAGROPHYTES ................ > 500 ASPERGILLUS NIGER w gt; 7 500 ASPERGILLUS FUMIGATUS ....................... > 500 RHIZOPUS NIGRICANS ........................ > 500 MUCOR CORYMBIFER ........................... > 500 FUSARIUM OXYSPORUM ......................... > 500 BOTRYTIS CINEREA -. ) 500 PENICILLIUM DIGITATUM ...................... 15 - activité antifongique in vivo Sur la candidose généralisées à Candida albicans, de la souris, le 32232 RP s'est montré particulièrement actif par voie orale ou sous-cutanée à des doses voisines de 25 mg/kg par jour pendant 4 jours consécutifs. L'organisme producteur de l'antifongique 32232 RP est une souche de Streptomyces qui a été isolée à partir d'un échantillon de terre prélevé en Inde, et à laquelle a été attribué le numéro DS 26068. Un échantillon de cet organisme a été déposé au Northern Regional Research Laboratory de l'U.S. Department of Agriculture à Peoria, Illinois (Etats-Unis) où il a été enregistré sous la référence NRRL 8089. L'isolement en a été effectué en suivant la méthode générale qui consiste à mettre une petite quantité de terre en suspension dans de l'eau distillée stérile, à diluer la suspension à différentes concentrations, et à étaler un petit volume de chaque dilution sur la surface de boites de Pétri contenant un milieu nutritif gélosé. Après une incubation de quelques jours à 260C, qui permet aux microorganismes de se développer, les colonies que l'on veut isoler pour en poursuivre l'étude sont prélevées et repiquées sur des géloses nutritives afin d'en obtenir des cultures plus abondantes. Streptomyces incarnatus DS 26068 forme des spores ovales à cylindriques à bouts arrondis, mesurant environ 0,8 à 1,0 p/0,4 à 0,5 p. Ses sporophores sont en grappes. En général ses channes de spores sont longues, comprenant jusqu'à plusieurs dizaines de spores, et montrent un certain degré de polymorphisme, certaines étant droites ou plus ou moins flexueuses, d'autres se recourbant en forme de crochet ou même stenroulant en décrivant une spirale plus ou moins ouverte de un à occasionnellement quelques tours. Par son mode de sporulation, Streptomyces incarnatus DS 26068 se situe dans la Section Retinaculum Apertum de la classification de Pridham. Streptomyces incarnatus DS 26068 se développe bien à 260C et à 370 C, mais pas à 500 C. Il présente un mycélium aérien sporulé de couleur rose clair. La coloration de son mycélium végétatif va, suivant les milieux, de jaune brun ou brun jaune à brun très foncé. I1 donne en général une production assez abondante de pigment mélanique sur les milieux organiques, et en particulier sur la gélose spéciale tyrosine- extrait de levure de Waksman (Melanin formation medium) ; sur les milieux synthétiques gélosés il produit le plus souvent du pigment soluble brun, plus ou moins foncé suivant le cas. Dans ses cultures, effectuées à 260 C, il présente les caractères biochimiques suivants - Production de mélanine : positive - Production de H2S : positive - Tyrosinase : positive - Liquéfaction de la gélatine : négative - Utilisation de la cellulose : négative - Production de nitrites à partir : positive, faible des nitrates - Hydrolyse de l'amidon : positive - Culture sur lait écrémé : peptonisation sans coagulation Les caractères culturaux de Streptomyces incarnatus DS 26068 sont rassemblés dans le tableau IV ci-après. Ce sont ceux de cultures arrivées à un bon stade de développement, c'est-à-dire d'environ 2 à 3 semaines à 26 C sauf indications contraires.Ces caractères ont été observés sur des géloses nutri- tives et des bouillons habituellement utilisés pour déterminer les caractères morphologiques des souches de streptomyces, les cultures sur milieux gélosés étant effectuées sur des géloses inclinées. Un certain nombre des milieux de culture employés ont été préparés d'après les formules indiquées dans "The Actinomycetes", S.A. WAKSMAN, p. 193-197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S.A., 1950 ; dans ce cas ils sont indiqués par la lettre W suivie du numéro qui leur a été attribué dans "The Actinomycetes". Les références ou constitutions des autres milieux de culture sont les suivantes - Réf. A. "Hickey and Tresner's Agar"-T.G. PRIDHAM et col.- Antibiotics Annual, 1956-1957, p. 950 - Réf. B. "Bennett's Agar" - S.A.WAKSMAN - The Actinomycetes, vol. 2, p. 331, n 30 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961. - Réf. C. Pormule W-23, additionnée de 2 Z de gélose - Réf. D. "Yeast Extract Agar" - T.G. PRIDHAM et col. - Antibiotics Annual 1956 - 1957, p. 950 - Réf. E. "Tomato Paste Oatmeal Agar" - T.G.PRIDHAM et col. - Antibiotics Annual, 1956 - 1957, p. 950 - Réf. F. "Melanin formation medium" - S.A. WAKSMAN - The Actinomycetes, vol.2, p. 333 - n 42 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961 - Réf.G. W.E. GRUNDY et col - Antibiotics and Chem. 2, 401, 1952 - Réf. H. - "Inorganic Salts - Starch Agar" - T.G. PRIDHAM et col. - Antibiotics Annual, 1956 - 1957, p. 951 - Réf. I. W.E. GRUNDY et col. - Antibiotics and Chenu. 1, 310, 1951 - Réf.J. correspond à la formule W-1, ou 30 g- de saccharose sont remplacés par 15 g de glucose - Réf. K. correspond à la formule W-I, où 30 g- de saccharose sont remplacés par -15 g; de glycérine - Réf. L. correspond à la formule W-18, où 30 g de saccharose sont remplacés par 15 g de glucose - Réf. M. correspond à la formule W-18, où le saccharose est supprimé et rem placé par de petites bandes de papier filtre immergées partiellement dans le liquide. - Réf. N. "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" - Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y. - II50-18 - Réf. P. "Plain gelatin" - préparé suivant les indications du "Manual of Me thods for Pure Culture Study of Bacteria". Society of American Bacteriolo gists, Geneva, N.Y. - Réf. Q. Lait écrémé en poudre commercial, reconstitué selon les indications du fabricant. - Réf. R. Milieu indiqué pour la recherche de la production de H2S par H.D. TRESNER et F. DANGA - Journal of Bacteriology, 76, 239-244, 1958 TABLEAU IV (Voir pages 1 20 - 21 - 22 - 23) La capacité de Streptomyces incarnatus DS 26068à utiliser diverses sources de carbone et d'azote pour assurer son développement a été déterminée en suivant le principe de la méthode de Pridham et Gottlieb (J. of Bact. 56, 107-114, 1948) ; le degré de développement a été observé, après un temps convenable d'incubation à 25 C, sur le milieu de base indiqué par les auteurs en remplaçant soit le glucose par les diverses sources de clone respectivement essayées, soit S04(NH4)2 par les diverses sources d'azote respectivement essayées.Les résultats sont indiqués dans le tableau V suivant TABLEAU V Sources de carbone Utilisation Sources d'azote @@@@@sation @@@@@sation essayées essayées D-Ribose faible et lente NO3Na positive D-Xylose positive N02Na positive L-Arabinose positive S04(NH4)2 positive L-Rhamnose positive P04H(NH4)2 positive D-Glucose positive Urée positive D-Galactose positive L-Asparagine positive D-Fructose positive Glucosamine positive D-Nannose positive Glycocolle positive L-Sorbose - négative 1 Sarcosine négative Lactose postive | DL-Alanine positive Maltose positive DL-Valine positive Saccharose positive Acide DL-aspartique positive tréhalose positive Acide DL-glutamique positive Cellobiose positive L-Arginine positive Raffinose positive L-Lysine positive Dextrine positive DL-Sérine positive Inuline négative DL-Thréonine positive Amidon positive DL-Méthionine négative Sources de carbone Sources d'azote essayées Utilisation essayées Utilisation Glycogène Positive Taurine négative Glycérol positive DL-Phénylalanine positive Erythritol négative L-Tyrosine positive Adonitol négative DL-Proline positive Dulcitol négative L-Hydroxyproline positive D-Nannitol positive L-Histidine positive D-Sorb to i négative L-Tryptophane positive t Inositol positive Bétaine positive Salicine négative Streptomyces incarnatus DS 26068 présente un ensemble de caractères qui ne coincide exactement avec aucun de ceux des souches déjà décrites, et c'est pourquoi on doit le considérer comme une espèce nouvelle. En considérant les espèces décrites dans "The Actinomyces" (vol. 2, S.A. WAKSMAN, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961) ainsi que dans le Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7ème édition, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957), l'espèce dont Streptomyces incarnatus DS 26068 se rapprocherait le plus est Streptomyces venezuelae qui, comme lui, forme des pigments mélaniques sur les milieux organiques, présente un mycélium végétatif allant de jaune à brun suivant les milieux de culture, et un mycélium aérien sporulé de couleur rose. Toutefois, il doit être distingué de cette espèce dont le séparent un certain nombre de différences qui sont indiquées dans le tableau VI ci-après TABLEAU VI Streptomyces incarnatus Streptomyces venezuelae DS 26068 (The Actinomycetes -vol.2 p. 280-281 S.A. WAKSMAN) Node de sporulation (Section dans la Retinaculum Apertum Rectus Flexibilis classification de Pri dham) Utilisation de : Saccharose positive négative Raffinose positive négative Mannitol positive négative Inositol positive négative Salicine négative positive Liquéfaction de la nulle rapide gélatine Gélose au malate N.v. pauvre, incolore M.v. jaune à brun de calcium à grisâtre M.a. nul M.a. gris Gélore saccharose - N.a. blanc-grisâtre, M.a. lavande clair nitrate (Czapek) à l'état de traces Gélore nutritive M.a. nul N.a. gris Pomme de terre M.a. nul - ou blanche N.a. gris tre, très faiblement développé M.v.= mycelium végétatif M.a*= mycelium aérien Le procédé de préparation du 32232 RP consiste essentiellement à cultiver Streptomyces incarnatus DS 26068 ou ses mutants producteurs, sur un milieu et dans des conditions appropriés et à séparer le produit formé au cours de la culture. La culture de Streptomyces incarnatus DS 26068 peut être effectuée par toute méthode de culture aérobie en surface ou en profondeur mais cette dernière est à préférer pour des raisons de commodité. On utilise à cette fin les différents types d'appareils qui sont d'un usage courant dans l'industrie des fermentations. On peut en particulier adopter la marche suivante pour la con duite des opérations Streptomyces incarnatus DS 26068 - stock culture sur gélose culture en fiole agitée culture inoculum en fermenteur culture de production en fermenteur Le milieu de fermentation doit contenir essentiellement une source de carbone et une source d'azote assimilables, des éléments minéraux, en particulier des chlorures, et éventuellement des facteurs de croissance, tous ces éléments pouvant être apportés sous forme de produits bien définis ou par des mélanges complexes, tels qu'on en rencontre dans des produits biologiques dtorigines diverses. Comme sources de carbone assimilable , on peut utiliser les hydrates de carbone tels que le glucose, le saccharose, le maltose, les dextrines, l'amidon ou d'autres substances carbonées comme des sucres alcools (glycérol) ou comme certains acides organiques : acides lactique, citrique. Certaines huiles animales ou végétales comme lthuile de lard ou lthuile de soja peuvent remplacer avantageusement ces différentes sources carbonées ou leur être adjointes. Les sources convenables d'azote assimilable sont extrbemement variées. Elles peuvent être des substances chimiques très simples comme les sels minéraux ou organiques d'ammonium, l'urée, certains acides aminés. Elles peuvent aussi être apportées par des substances complexes contenant principale -ment de l'azote sous forme protidique : caséine, lactalbumine, gluten et leurs hydrolysats, farine de soja, d'arachide, de poisson, extraits de viande, de levure, distiller's solubles, corn-steep. Parmi les éléments minéraux ajoutés, certains peuvent avoir un effet tampon ou neutralisant comme les-phosphates alcalins ou alcalino-terreux ou les carbonates de calcium ou de magnésium. D'autres apportent l'équilibre ionique nécessaire au développement de Streptomyces incarnatus DS 26068 et à ltélaboration du 32232 RP comme les chlorures et sulfates de métaux alcalins et alcalino-terreux.Enfin certains agissent plu-s spécialement comme activateurs des réactions métaboliques de Streptomyces incarnatus DS 26068, ce sont les sels de zinc, de cobalt, de fer, de cuivre, de manganèse. Les facteurs de croissance sont des produits de nature vitaminique tels que la riboflavine, l'acide folique, l'acide pantothénique. Le pH du milieu de fermentation au départ de la culture doit être compris entre 5,8 et 7,8 et de préférence entre 6,2 et 7,4. La température optimale pour la fermentation est comprise entre 25 et 300C, mais une production satisfaisante est obtenue pour des températures comprises entre 23 et 330 C L'aération de la fermentation peut varier entre des valeurs assez larges. On a pendant trouvé que des aérations de 0,3 à 3 litres d'air par litre de bouillon et par minute conviennent particulièrement bien. Le rendement maximal en 32232 RP est obtenu après 2 à 8 jours de culture, ce temps dépendant essentiellement du milieu utilisé. L'antibiotique 32232 RP peut être isolé des mouts de fermentation de la manière suivante Le moût de fermentation peut être filtré en présence d'un agent de filtration à un pH qui est généralement celui du milieu à la fin de la phase de production. Le 32232 RP qui est présent dans le filtrat et dans les eaux de lavage du gâteau de filtration est ensuite fixé sur un support qui peut être constitué par une résine cationique ou anionique, ou une résine adsorbante. L'antifongique 32232 RP est ensuite isolé de son support par lavage de ce dernier au moyen d'un éluant convenable, tel que l'eau ou l'eau additionnée d'un électrolyte ou d'un solvant miscible-à l'eau. L'antifongique 32232 RP peut ensuite être précipité de sa solution par addition de celle-ci à un mauvais solvant tel que l'acétone ou un mélange méthanol-acétone. Le 32232 RP ainsi obtenu peut être éventuellement purifié par filtrations ou fixations sur divers supports, ces dernières suivies d'élutions par des éluants convenables et précipitations au moyen d'un mauvais solvant ou non-solvant miscible à l'eau. Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, montrent comment l'invention peut être mise en pratique. L'activité des mélanges contenant du 32232 RP est déterminée à l'aide de la méthode microbiologique de diffusion avec comme germe sensible Saccharomyces ellipsoldeus et par rapport au 32232 RP titrant 1000 pg/mg. Cette activité est exprimée en pg/mg pour les solides et en pg/cm3 pour les solutions. Exemple 1 A - Fermentation On charge dans un fermenteur de 170 litres - Peptone 1200 g - Extrait de levure 600 g - Chlorure de sodium 600 g - Eau de ville complément pour 107 litres. Le pH est égal à 7,0 . On stérilise le .milieu par barbotage de vapeur à 1220C pendant 40 minutes Après refroidissement, du fait de la condensation de la vapeur au cours de la stérilisation, le volume du bouillon est de 117 litres ; on le complète à 120 litres par addition de 3 litres d'une solution aqueuse stérile contenant glucose monohydraté : 1200 g. Le pH du milieu est de 7,0. On ensemence alors avec 200 cm3 d'une culture en erlenmeyer agité de Streptomyces incarnatus DS 26068. La culture est développée à 300C pendant 26 heures en agitant et un aérant avec de l'air stérile ; elle est alors convenable pour l'ensemencement de la culture productrice. La culture productrice est effectuée dans un fermenteur de 800 litres chargé avec les substances suivantes -- Corn-steep (à 50 X matières sèches): 10kg - Glucose monohydraté : 5 kg - Huile de soja : 10 litres - Chlorure de cobalt hexahydraté ....: 0,015 015 kg - Eau de ville complément pour :465 litres. Le pH du milieu est ajusté à 6,40 par addition de 700 cm3 de soude 10 N, puis on ajoute : - Carbonate de calcium : 2,5 kg. Le pH du milieu est alors de 6,50. On stérilise le bouillon par barbotage de vapeur à 1220C pendant 40 minutes. Après refroidissement, du fait de la condensation de la vapeur au cours de la stérilisation, le volume du bouillon est de 500 litres. Le pH du milieu est 6,85. On ensemence alors avec 50 litres de la culture inoculum en fermentation de 170 litres décrite ci-dessus. La culture est développée à 300C pendant 90 heures en agitant avec une turbine tournant à 160 tourslmn et en aérant avec un volume d'air stérile de 30 m3/h. En fin d'opération, le pH de la culture est de 8,00 et le volume de 480 litres . La production de 32232 RP est de 36 g/cm3. B - Extraction 880 1 de moût obtenu comme indiqué précédemment et titrant 30 pg/cm3 sont filtrés sur filtre presse après addition de 45 kg d'adjuvant de filtration. Le gâteau de filtration est lavé sur le filtre par 200 1 d'eau. Le filtrat et le lavage sont réunis et chromatographiés sur une colonne contenant 40 1 de résine cationique "Amberlite IR 120", cycle Na+. La résine est lavée sur la colonne par 120 1 d'eau distillée. L'effluent et le lavage sont jetés. La résine est reprise par 200 1 d'eau sous agitation et le pH est ajusté à 11 par addition de 1 litre de soude 6 N. La résine est agitée pendant environ 30 minutes à 900 C, puis filtrée et lavée sur le filtre par 50 1 d'eau distillée à une température voisine de 200 C. L'éluat et le lavage sont réunis et le pH est ajusté à 6 par addition de 580 cm3 d'acide chlorhydrique 6 N. La solution est concentrée sous pression réduite (5 à 10 mm de mercure) jusqu'à un volume de 1 litre. On ajoute alors 6 1 de méthanol et on précipite le 32232 RP en versant la solution dans 60 1 d'acétone sous agitation. Le précipité est séparé par filtration, lavé sur le filtre par 2 1 d'acétone et séché sous pression réduite à 350 C. On obtient ainsi 175 g de 32232 RP brut titrant 110 pglag. C - Purification 175 g du produit brut obtenu précédemment sont mis en solution dans 1 1 d'eau. L'insoluble est éliminé par filtration. La solution est chromatographiée sur une colonne contenant 3 1 de résine cationique "AEberlite IR 120", cycle Na . La résine est lavée sur la colonne par 3 1 d'eau distillée. La résine est mise en suspension dans 3 1 d'eau ajustée à pH il par addition de 30 cm3 de soude 6 N. a suspension est agitée pendant 30 minutes à 900C puis filtrée, on obtient un ler éluat. La résine est reprise dans les mêmes conditions pour obtenir un 2ème éluat. Les deux éluats sont réunis, neutralisés jusqu'à pH 7 par addition de 50 cm3 d'acide chlorhydrique 6 N et concentrés sous pression réduite jusqu'à un volume de 900 cm3. Ce concentré est passé à travers une colonne contenant 0,8 I de résine "Amberlite XAD2". La résine est lavée sur la colonne par 5 1 d'eau, l'effluent et le lavage étant collectés par factions de 250 ml. Les fractions 1 à 10 sont réunies puis concentrées sous pression réduite jusqutà un volume de 110 cm3. On ajoute 300 cm3 de méthanol et on précipite le 32232 RP en versant lentement la solution dans 800 cm3 d'acétone sous agitation. Le précipité est filtré, lavé sur le filtre par 100 cm3 d'acétone et séché sous pression réduite (5 mm de mercure) pendant 15 heures à 350 C. On obtient ainsi 27,2 g de 32232 RP titrant 411 pg/mg. Ce produit est mis en solution dans 300 cm3 d'eau et la solution est chromato- graphiée sur une colonne contenant 1 1 de résine cationique "Amberlite IRC 50?', cycle NH4+. La résine est lavée par 1 1 d'eau. L'élution est effectuée par 6 1 d'un gradient linéaire eau-ammonia-que 0,2 N (1-1 en volume). L'effluent, le lavage et l'éluat sont recueillis par fractions de 250 cm3, Les fractions actives sont sélectionnées par la mesure de la densité optique' à 260 nm. On réunit les fractions 17 à 21 et on les concentre sous pression réduite jusqu'à un volume de 70 cm3. Le concentrat est dilué par addition de 70 cm3 de méthanol et le 32232 RP est précipité en versant lentement ce concentrat dans 500 cm3 d'acétone sous agitation. Le précipité est filtré, lavé sur le filtre par 50 cm3 d'acétone et séché sous pression réduite (5 mm de mercure) pendant 15 heures à 350 C. On obtient 10,5 g de 32232 RP titrant 812 g/mg. 10 g de 32232 RP obtenu précédemment sont mis en solution dans 100 cm3 d'eau et passés à travers une colonne contenant 1 kgde gel de dextrane "Séphadex G 25" gonflé dans l'eau. L'élution est effectuée par de l'eau. L'effluent et l'éluat sont recueillis par fractions de 20 cm3. Les fractions actives-sont sélectionnées par mesure de la densité optique à 260 nm. Les 220 premières fractions (4400 cm3) sont éliminées et les 53 suivantes (1060 cm3) sont concentrées sous pression réduite jusqu'à un volume de 120 cm3. La solution est ensuite lyophilisée. On obtient ainsi 6,94 g de 32232 RP pur. La présente invention concerne également les compositions médicinales contenant l'antifongique 32232 RP en association avec tout autre produit compatible qu'il soit inerte ou physiologiquement actif. Ces compositions peuvent être utilisées par voie orale, parentérale, ou rectale ou par traitement top:ique.Elles contiennent habituellement de 99,9 à 0,01 % de 32232 RP. Comme compositions solides pour administration orale peuvent être utilisés des comprimés, des pilules, des poudres ou des granulés. Dans ces compositions, le produit actif selon l'invention est mélangé à un ou plusieurs diluants ou adjuvants inertes, tels que saccharose, lactose ou amidon. Ces compositions peuvent comprendre des substances autres que les diluants, par exemple un lubrifiant tel que le stéarate de magnésium. Comme compositions liquides pour administration orale, on peut utiliser des solutions pharmaceutiquement acceptables, des suspensions, des émulsions, des sirops et des élixirs contenant des diluants inertes tels que l'eau ou l'huile de paraffine. Ces compositions peuvent également comprendre des substances autres que les diluants, par exemple des produits mouillants, édulcorants ou aromatisants. Les compositions pour administration parentérale peuvent etre des solutions stériles aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule on peut employer le propylèneglycol, le polyé- thylèneglycol, les huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, et les esters organiques injectables, par exemple l'oléate d'éthyle. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants, en particulier des agents mouillants, émulsifiants ou dispersants. La stérilisation peut se faire de plusieurs fa çons > par exemple à l'aide d'un filtre bactériologiques en incorporant à la composition des agents stérilisants, par irradiation ou par chauffage.Elles peuvent être également préparées sous forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes au moment de l'emploi dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable. Les compositions pour administration rectale sont des suppositires qui peuvent contenir, outre le produit actif, des excipients tels que le beurre de cacao ou la suppo-cire. Les compositions pour le traitement topique peuvent se présenter sous forme de lotions, pommades, crèmes, laits, poudres ou aérosols. Ces compositions peuvent contenir en outre des additifs tels qu'agents déodorants ou antiperspirants. Dans ces compositions la teneur en antifongique 32232 RP est généralement comprise entre 0,01 et 5 Z. Les lotions sont soit des solutions aqueuses, soit des solutions hydroalcooliques qui contiennent entre 0,01 et 1 % en poids de 32232 RP. Les crèmes et les ponmades sont des émulsions d'une huile minérale, animale ou végétale dans l'eau qui contiennent entre 0,01 et 5 Z en poids d'an antifongique 32232 RP. Les compositions sous forme de poudres contiennent entre 0,01 et 5 X en poids de 32232 RP en mélange avec du talc et un ou plusieurs agents antiagglomérants. Les compositions sous forme d'aérosols contiennent une solution comprimé ou hydroalcoolique de 32232 RP et au moins un gaz propulseur/liquéfié sous pression. En thérapeutique humaine ces compositions sont particulièrement actives sur les maladies à levures et plus spécialement sur les candidoses telles que les candidoses buccales et intestinales, toutes les mycoses profondes (pulmonaires, sinusiennes, biliaires, urinaires ou généralisées), les candidoses cutanéo-muqueuses et les infections génitales à Candida albicans. D'une façon générale, le médecin déterminera la posologie qu'il estime la plus appropriée en fonction de l'age, du poids, du degré de l'infection et des autres facteurs propres au sujet à traiter. Généralement, les doses sont comprises entre 1 et 10 g par jour par voie orale pour un adulte. L'exemple suivant, donné à titre non limitatif, illustre une composition selon l'invention. Exemple 2 On prépare des comprimés dosés à 500 mg ayant la composition suivante - antifongique 32232 RP .......... 0,500 g - amidon de blé .................. 0,200 g - silice colloïdale .............. 0,045 g - stéarate de magnésium .......... 0,005 g. Tableau IV Degré Mycélium végétatif Appareil aérien Observations et proprié Milieux de (M.v.)ou Envers de (comprenant l'ensemble Pigment tés biochimiques de culture dévelp- la culture du mycélium aérien(M.a.) soluble pement et de la sporulation) Gélose de Hickey bon envers brun très blanchâtre à rose gri- brun noir Spores ovales à cylindriques et Tresner foncé sâtre. à bouts arrondis, mesurant (Réf. A) bien développé. 0,8 à 1,0 /0,4 à 0,5 . Sporophores en grappes. Chaînes de spores droites ou flexueuses, ou recourbées en crochet, ou formant une spirale plus ou moins ouverte de 1 à quelques tours. Gélose de Bennett bon envers brun jaune blanchâtre. brun jaune (Réf. B) moyennement développé. Gélose d'Emerson bon envers brun jaune blanc. brun foncé (Réf. C) modérément développé. Gélose à l'extrait bon envers brun jaune blanchâtre à rose gri- brun noirâtre de levure de sâtre clair. Pridham (Réf.D) moyennement développé. Gélose à la farine bon envers brun jaune blanchâtre à rose gri- brun foncé d'avoine et à l'ex- sâtre clair, trait de tomate de bien développé. Pridham (Réf. E) Gélose glucose- assez M.v. brun jaune blanchâtre. brun noirâtre peptone (W-7) bon très pauvrement développé. Degré Mycélium végétatif Appareil aérien de (M.v. ou Envers de (comprenant l'ensemble Figment Observations et propriétés Milieux déve- la culture du mycélium aérien (M.a.) soluble biochimiques de culture loppe- etde la sporulation) ment Gélose nutritive modéré M.v. brun jaune Nul: brun jaune (W-5) foncé Gélose tyrosine - assez M.v. brun très Nul - ou grisâtre, à noir Production de mélanine : extrait de levure pauvre foncé l'état de traces@ positive (lectures effecpour formation de tuées selon les recommanmélanine dations de l'auteur) (Réf. F) Gélose au malate très M.v. incolore à Nul Nul Solubilisation du malate : de calcium de pauvre grisâtre positive, mais faible et Krainsky (Rég.G) très pauvrement très lente développé Gélose à l'oval- très M.v. brun jaune gris rose gris brunâtre bumine (W-12) modéré pauvrement développé faible Gélose glucose- assez envers jaune brun blanchâtre à rose brun jaune asparagine (W-2) bon à brun foncé grisâtre clair assez bien développé Gélose gycérine- assez M.v. brun jaune blanc-grisâtre brun jaune asparagine (W-3) bon à l'état de traces Gélose amidon- bon envers brun jaune blanchâtre à rose brun grisâtre - Hydrolyse de l'amidon : sels minéraux clair grisâtre faible positive de Pridham assez bien développé - Spores ovales à cylindri (Réf. H) ques à bouts arrondis, mesurant 0,8 à 1,0 /0,4 à 0,5 . Sporophores en grappes. Chaînes de spores droites, ou fle euses, ou recourbées en crochet, ou formant une spirale plus ou moins ouverte de 1 à quelques tours. Degré Appareil aérien de Mycélium végétatif Milieux de (comprenant l'ensemble Pigment Observations et propriétés déve- (M.v.)ou envers de culture du mycélium aérien(M.a.) soluble biochimiques loppe- la culture et de la sporulation) ment Gélose à l'amidon modéré envers brun clair rose grisâtre gris rosé faible (W-11) légèrement rosé bien développé Gélose à l'amidon assez envers brun jaune rose grisâtre brunâtre et au bon bien développé faible PO4H(NH4)2 de Grundy (Réf. I) Gélose synthéti- moyen envers brun jau- blanc grisâtre brunâtre que de Czapek au nâtre à l'état de traces faible saccharose (W-1) Gélose synthétique moyen envers brun jaune blanc-grisâtre brun jaune de Czapek au glu- à l'état de traces grisâtre faible cose (Réf. J) Gélose synthétique moyen M.v.jaune brun nul - ou blanchâ- brun jaune de Czapek à la jaune tre, à l'état de glycérine traces (Réf. K) Bouillon amidon- assez voile brunâtre blanc nul - ou bru- Production de nitrites : nitrate (W-19) bon très modérément nâtre très positive, faible développé faible Bouillon de Czapek très culture flocon- nul nul Productions de nitrites : au glucosa modéré neuse blanchâtre positive, faible (Réf. L) Degré Appareil aérien Milieux de de Mycélium végétatif (comprenant l'ensemble Pigment Observations et propriétés culture déve- (M.v.)ou envers de du mycélium aérien(M.a. soluble biochimiques loppe- la culture et de la sporulation) ment Bouillon de Czapek nul Utilisation de la cellulose à la cellulose négative (Réf. M) Bouillon nutritif pauvre anneau brunâtre nul brun très Production de nitrites : nitraté pauvrement déve- foncé douteuse (Réf. N) loppé Culture sur assez M.v. grisâtre à nul - ou blanchâtre noir pomme de terre bon marron foncé très faiblement (W-27) développé Gélatine pure moyen M.v. brun foncé nul brun noir Pas de liquéfaction à 12 % (Réf. P) Lait écrémé bon anneau brun jaune nul - Pas de coagulation (Réf. Q) peptonisation positive Gélose de Tresner modéré M.v. brun très nul noir Production de H2S : et Danga foncé positive (Réf. R) (lectures effectuées selon les recommandations des auteurs) REVENDICATIONS 1. Nouvelle substance antifongique désignée par le numéro 32232 RP caractéri sée en ce que c'est une poudre amorphe blanche facilement soluble dans l'eau très peu soluble dans le méthanol et le diméthylformamide et pratiquement insoluble dans l'acétone. - sa composition élémentaire centésimale est voisine de : C % = 48,0 H % = 5,8 O % = 21,0 et N % = 25,2 - son point de fusion (déterminé au bloc Maquenne) est de 2810C - son spectre ultra-violet déterminé à partir d'une solution à 10,35 mg/L dans un tampon phosphate à pH 7 présente un maximum d'absorption à 258 nm (E11 cm = 365) - son spectre infra-rouge présente des bandes d'absorption à 3420, 3350, 3270, 3180, 3090, 2930, 2870, 2700, 2340, 2100, 1640, 1595, 1570, 1505, 1475, 1455, 1415, 1400, 1370, 1330, 1300, 1245, 1205, 1170, 1125, 1080, 1040, 1010, 900, -1 845, 825, 795, 760, 720, 665, 645, 575, 535 et 440 cxa - son spectre de résonance magnétique nucléaire du proton montre qu'il contient 14 protons non échangeables, 13 - son spectre de résonance magnétique nucléaire du C montre qu'il contient 15 atomes de carbone, - en chromatographie ascendante sur couche mince de gel de silice avec un melange de n-butanol-acétone-eau-acide acétique-ammoniaque 11 N (35-25-21-15-4 en volume) son Rf est Q25 et avec un mélange de n-butanol-méthanol-eau-ammo- niaque il N (50-25-25-5 en volume) son Rf est de 0,25. 2. Un procédé de préparation de la substance selon la revendication 1 caractétisé en ce que l'on cultive en aérobiose Streptomyces incarnatus DS 26068 (NRRL 8089) ou ses mutants producteurs sur un milieu et dans des conditions habituelles pour la culture des Streptomyces puis sépare la substance 32232 RP du milieu de culture et la purifie. 3. Composition médicinale caractérisée en ce qu'elle contient- une dose pharma- ceutiquement active de la substance selon la revendication 1 en association avec un ou plusieurs produits inertes ou pharmaceutiquement actifs. 4. Le nouveau microorganisme Streptomyces incarnatus DS 26068 (NRRL 8089).