FR 2348969 A1 19771118 FR 7712297 A 19770422 La présente invention concerne un procédé pour produire de l'acide citrique par fermentation en utilisant une nouvelle source de carbone, ainsi que l'obtention d'une source très peu coûteuse de fructose dont I'intért économique est comparable à celui du saccharose. Le fructose a une saveur sucrée importante et il est environ 1,5 à 2 fois plus sucré que le saccharose. On connaît de nombreux procédés de préparation du fructose, cependant le colt de fabrication est trop important et par conséquent les débouches du fructose sont limités à des utilisations particulières telles que les aliments pour diabétiques, Le saccharose est couramment utilisé comme matière première pour la préparation du fructose. Cependant il est difficile de traiter la liqueur mère après récupération du fructose. On a étudié de nombreux procédés de traitement de la liqueur mère qui consistent par exemple à la traiter avec de la glucose-isomerase, mais on n'a pas à ce jour mis au point de procédé satisfaisant du point de vue économique. Le brevet des Etats-Unis d'Amerique nO 3.793.146 décrit la recupération du fructose A partir d'un hydrolysat de saccharose sous forme d'un produit d'addition avec le chlorure de calcium et l'emploi de la liqueur mère comme source principale de carbone pour la production de l-'acide citrique par fermentation. Cependant le fructose préparé selon ce procédé est croûteux car le saccharose de départ doit être pur. De plus la nature de la fermentation est limitée car des quantités importantes d'ions calcium et d'ions chlore demeurent dans la liqueur mère et inhibent la fermentation. La demanderesse a découvert que, lorsqu'on récupère lefructose din hydrolysat de saccharose sous forme d'un produit d'addition avec 1 'hydroxyde de calcium et qu'on neutralise la liqueur mère, la liqueur mère convient comme source de carbone pour l'obtention par fermentation de l'acide citrique. La matière première que l'on peut utiliser dans l'invention est constituée de divers produits de la fabrication du sucre & canne et de betterave, tels que les jus de canne et de betterave, le sucre brut et les mélasses On peut effectuer l'hydrolyse du saccharose de la matière première selon des procédés connus en utilisant par exemple un acide minéral ou une enzyme. Par exemple, si l'on ajuste le pH de la matière première à 1,5-2 avec de l'acide sulfurique et qu'on chauffe s 60-1000C pendant O,S A 4 heures, on peut hydrolyser la majeure partie du saccharose en hexoses, c 'est-à-dire en glucose et en fructose. Lorsqu'on hydrolyse la matière première avec un acide mineral, on neutralise l'hydrolysat avec un alcali tel que l'hydroxyde de calcium ou l'hydroxyde de sodium. On mélange ensuite l'hydrolysat neutre avec de l'hydroxyde de calcium, de préférence à raison de 0,7 1s5 fois la quantité molaire des hexoses. Au lieu d'hydroxyde de calcium on peut utiliser de l'oxyde de calcium. Dans ce cas on transforme tout d'abord l'oxyde de calcium en hydroxyde de calcium dans l'hydrolysat, puis on le fait réagir avec le fructose. On doit effectuer ce mélange avec précaution. On refroidit tout d'abord l'hydrolysat neutre en dessous de 100C, de préférence en dessous de 50C et on ajoute å l'hydrolysat froid l'hydroxyde de calcium à raison de 1,2 à 1,6 fois la quantité molaire du fructose. On ajoute ensuite de préfé- rence des germes constitués du produit d'addition du fructose et de l'hydroxyde de calcium et on laisse mtirir le mélange amorcé pendant 15 à 60 mn en agitant modérément. On peut également cristalliser le produit d'addition sans amorçage. On ajoute progressivement le reste de l'hydroxyde de calcium en environ 1 9 2 heures. Pendant la réaction de l'hydroxyde de calcium et du fructose, on maintient dé préférence la température du milieu réagissant en dessous de 50C pour réduire la décomposition du fructose et du glucose. On obtient ainsi de gros cristaux du produit d'addition qui se prêtent particulièrement bien à la séparation à l'échelle industrielle, Si l'on effectue le mélange sans précautions, la solution obtenue est crémeuse et constituée essentiellement de cristaux fins. La séparation industrielle des cristaux est donc difficile. Si on mélange l'hydrolysat neutre à du chlorure de calcium au lieu d'hydroxyde de calcium, on ne peut séparer les cristaux du produit d'addition car ils sont très fins et la solution est très visqueuse. On recueille les cristaux ainsi produits par filtration ou centrifugation. On lave de préférence les cristaux recueillis avec de l'eau refroidie. On peut préparer à partir des cristaux recueillis, selon des procédés connus, des cristaux de fructose ou une solution de fructose à faible teneur en glucose. L'agent que l'on préfère pour neutraliser l'hydroxyde de calcium dans le produit d'addition est le dioxyde de carbone. Dans ce cas on met les cristaux en suspension dans l'eau puis on fait barboter du dioxyde de carbone gazeux dans la suspension. Après barbotage, on sépare le précipité pour obtenir une solution de fructose brute. Si on le désire on peut soumettre la solution de fructose a une purification complémentaire selon des procédés connus, par exemple par cristallisation, emploi d'une résine échangeuse d'ions et décoloration pour préparer les cristaux de fructose finals. Le rendement en fructose à partir de l'hydrolysat dans la solution ci-dessus peut atteindre 70% et il est généralement de 50 à 65X. On neutralise la liqueur mere. Des agents de neutralisation appropriés sont le dioxyde de carbone, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, les résines échangeuses de cations ou similaires. Lorsqu'on effectue la neutralisation en utilisant un de ces agents on peut séparer s'il est nécessaire les ions calcium du précipité formé. Parmi les agents précités, on préfère tout particulièrement le dioxyde de carbone car le carbonate de calcium-est préférable pour la production de l'acide citrique par fermentation. Comme le fructose et le glucose sont instables en solution alcaline, il est nécessaire de les maintenir au froid pendant le traitement ci-dessus. I1 est nécessaire également, apres séparation du produit d'addition avec le fructose, de neutraliser rapidement le produit d'addition et la liqueur mère. La liqueur mere, c'est- -dire la solution appauvrie en fructose, convient comme source de carbone pour la production de l'acide citrique par fermentation. Les micro-organismes que l'on peut utiliser dans l'invention sont ceux appartenant aux genres Aspergillus et Candida, par exemple Aspergillus niger ATCC 6275, Aspergillus awamori FERM-P 3512, Candida citroformans FERM-P 3072 et Candida citroformans FERM-P 3397. On a obtenu Candida citroformans FERM-P 3397 en traitant Candida citroformans FERM-P 3072 par la N-mëthyl N'-nitro N-nitrosoguanidine. Les micro-organismes identifiés par des numéros de référence FERM-P sont fournis au public par l'institut de Recherche sur les. Fermentations, Service des Sciences et Technologies Industrielles du Ministère de l'industrie et du Commerce International du Japon. Les propriétés microbiologiques de Candida citroformans FERM-P 3072 sont les suivantes : Culture en bouillon MY : la culture est peu abondante. Les cellules sont sphériques s ovales, mesurant (2,5-5) x (3-6) pm à (3-9) x (3,5-9,3) px et sont isoles par paires ou en chaînes courtes. La reproduction végétative s'effectue par bourgeonnement. il se forme un sédiment. Iln'y a pas de pellicule. Il n'y a pas de formation de gaz. Culture sur gélose MY : la culture est abondante. La forme et la taille des cellules sont semblables a celles obtenues en bouillon MY. La culture en stries est blanc grisâtre, terne, butyreuse, lisse, surélevée, à bords ondulés. Culture en lame sur gélose à la farine de mais : formation d'un pseudomycelium. Présence de blastospores. Les cellules du pscudomycelium sont; souvent ramifiées et courbes. Formation d'ascospores : absente sur gélose de Gorodkowa, gélose à l'extrait de malt et gélose au jus de légumes. Formation de ballistospores : absente sur gélose MY en boîte. Fermentation Glucose + Lactose Galactose - Raffinose Maltose - Mélibiose Saccharose- Tréhalose + Assimilation : D - arabinose - D - xylose + L - arabinose - D - glucose + D - ribose - - D - galactose + L- rhamnose - Inuline L - sorbose + Ethanol + Maltose + Erythritol Saccharose + Inositol Lactose - D-mannitol + Mélibiose - D-gluconate de potassium + Cellobiose - DL-lactate de sodium Tréhalose + Succinate de sodium + (faible) Raffinose - Ribitol + Nélézitose + Galactitol &alpha;;-méthyl-D-glucoside + D-glucitol + Arbutine - Salicine Amidon soluble Culture optimale à à pH 5,8-6,8 et à 34-35 C Température de culture : 8,5-43,5 C pH de culture : 3,5-9,0 Assimilation du nitrate de potassium : négative Décomposition de l'arbutine : négative Hydrolyse de l'urée : négative Production de composés amylacés : négative Formation d'acide : formation abondante d'acide citrique Vitamines nécessaires & la culture : biotine et thiamine Production d'esters : négative Formation de caroténoTdes : négative Culture en milieu à 8% de chlorure de sodium : négative Production de riboflavine : positive Variations du lait au pourpre de bromocrésol . négative. On effectue la fermentation de façon classique. te rendement en acide citrique à partir de la solution appauvrie en fructose est supérieur au rendement obtenu à partir de la matière première constituant la source classique de carbone pour la production de l'acide citrique par fermentation. En particulier dans le cas des mélasses, bien que l'extraction du fructose abaisse la teneur en carbonate, le rendement obtenu selon le procédé de l'invention est supérieur au rendement du procédé classique. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. EXEMPLE 1 On prépare une solution renfermant 1 kg de sucre brut par litre d'eau, on ajuste le pH à 1,5 avec de l'acide sulfurique et on hydrolyse à 600C pendant 4 heures. On neutralise l'hydrolysat avec de l'hydroxyde de calcium et on sépare par filtration le sulfate de calcium précipité. On refroidit à 0 C, 3 kg d'une solution de sucre inverti renfermant 303 g de fructose et 297 g de glucose et on ajoute progressivement à la solution une solution d'hydroxyde de calcium à 3070 renfermant 260 g de Ca(OH)2 en maintenant la température en dessous de 50C. Lorsqu'on a ajouté 60% de la quantité totale dthydroxyde de calcium, on arrtte l'addition et on amorce avec une petite quantité de cristaux du produit d'addition. On ajoute ensuite progressivement les 40% restants d'hydroxyde de calcium et on laisse mûrir la suspension pendant 30 mn. On sépare par filtration les cristaux du produit d'addition et on lave convenablement avec de l'eau refroidie. On met les cristaux recueillis en suspension dans l'eau refroidie et on neutralise la suspension à un pH inférieur à 10 en introduisant du dioxyde de carbone gazeux à OOC. On sépare par filtration le précipité de carbonate de calcium et on concentre à 420 g le filtrat dont le pH est d'environ 8,5. La solution concentrée renferme 202 g de fructose (rendement 66,770) et 8 g de glucose. On fait passer la solution concentrée à travers deux colonnes, l'une garnie d'une résine échangeuse de cations fortement acide et l'autre garnie d'une résine échangeuse d'anions faiblement basique, pour dessaler et décolorer partiellement la solution. On traite de plus l'effluent avec du charbon activé, on concentre et on obtient une solution incolore ayant une concentration en fructose de 70;6. On neutralise également la liqueur mère à un pH inférieur à 10 en introduisant du dioxyde de carbone gazeux à 00C et on sépare le précipité. Le pH du filtrat est d'environ 8,5. On concentre le filtrat et on obtient 896 g de solution concentrée appauvrie en fructose renfermant 85 g de fructose et 274 g de glucose. On effectue 4 essais de fermentation en utilisant,comme matière de départ constituant la source principale de carbonate, du sucre brut ou la solution concentrée appauvrie en fructose. On introduit,dans des flacons à agitation de 500 ml, des portions de 20 ml de milieux de culture renfermant Une des sources principales de carbone 15 g/dl ci-dessus (en hexoses) NH NO 0,25 g/dl KH2P04 0,01 g/dl MgSO4,7H2O 0,25 g/dl MnS04,4H20 0,0005 g/dl ZnSO4,7H2O o, oool g/dl CuSO4X5H2O 0,00002 g/dl et on stérilise. On ensemence chaque milieu avec Aspergillus niger ATCC 6275 ou Aspergillus awamori FERM-P 3512 et on cultive à 30 C pendant 7 jours en agitant. Après culture on determine la concentration de l'acide citrique du bouillon et on obtient les résultats figurant dans le tableau I ci-après. TABLEAU I: Acide citrique Source de carbone A. niger A. awamori ATCC 6275 FERK-P 3512 Sucre brut 4,55 g/dl 3,34 g/dl Solution appauvrie 6,25 g/dl 4,26 g/dl en fructose EXEMPLE 2 On dilue de la melasse de canne à sucre en utilisant 2,3 litres d'eau par kg de mélasse, on ajuste le pH à 1,5 avec de l'acide sulfurique et on hydrolyse à 600C pendant 4 heures. On neutralise l'hydrolysat avec de l'hydroxyde de calcium et on sépare par filtration le precipité de sulfate de calcium. On obtient ainsi une solution de sucre inverti renfermant 9,95 g/dl de glucose et 11,25 g/dl de fructose. On refroidie 0 C, 3 litres de la solution de sucre inverti et on ajoute progressivement à la solution de l'hydroxyde de calcium à 307. renfermant 262 g de Ca(OH)2 (quantité molaire équivalant aux hexoses) en maintenant la température en dessous de 50C. Lorsqu on a ajouté 70% de la totalité de l'hydroxyde de calcium, on arrête l'addition et on amorce avec une petite quantité de cristaux du produit d'addition. Pour supprimer la sursaturation, on agite la solution ensemencée pendant 30 mn. Pendant l'agitation, de nombreux cristaux du produit d'addition précipitent. On ajoute progressivement en 1 heure les 30% restants d'hydroxyde de calcium et on agite encore la suspension pendant 30 mn. On sépare par filtration les cristaux du produit d'addition et on les lave à l'eau refroidie. On met les cristaux récupérés en suspension dans l'eau refroidie, on neutralise la suspension avec de l'acideailfurique et on élimine le précipité formé. La solution de fructose ainsi obtenue renferme 168 g de fructose et 6,4 g de glucose. Le rendement en fructose est de 50% On neutralise également la liqueur mère avec de l'acide sulfurique et on sépare le précipité. La solution appauvrie en fructose renferme 284 g de glucose et 159 g de fructose. On effectue des essais de production d'acide citrique par fermentation en opérant comme décrit dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on remplace le sucre brut et la solution concentrée appauvrie en fructose correspondante par de la mélasse de canne à sucre et la solution concentrée appauvrie en fructose correspondante. Les résultats des fermentations figurent dans la tableau Il ci-après. TABLEAU Il Acide citrique Source de carbone A. niger A. awamori ATCC 6275 FERM-P 3512 classe de canne sucre 4,42 gldl 2,82 g/dl Solution appauvrie en fructose 5,81 g/dl 3,84 g/dl EXEMPLE 3 On dilue de la mélasse de betteraves avec 2,5 litres d'eau par kg de mélasse; on ajuste le pH à 1,5 avec de l'acide sulfurique et on hydrolyse à 600C pendant 4 heures. On neutralise l'hydrolysat avec de l'hydroxyde de calcium et on sépare par filtration le précipité formé. On obtient une solution de sucre inverti renfermant 7,80 g/dl de glucose et 8,81 g/dl de fructose. On refroidit à OOC 3 litres de la solution de sucre inverti et on ajoute progressivement à la solution de l'hydroxyde de calcium à 30% renfermant 205 g de Ca(OH)2 (quantité molaire égale aux hexoses) en maintenant la température en dessous de 50C. Lorsqu'on a ajouté 70% de la quantité totale d'hydroxyde de calcium, on arrête l'addition et on amorce avec une petite quantité de cristaux du produit addition Pour supprimer la sursaturation, on agite la solution ensemencée pendant 30 mn. Pendant l'agitation, de nombreux cristaux du produit d'addition précipitent. On ajoute progressivement en 1 heure les 307. restants de l'hydroxyde dd calcium et on agite encore la suspension ainsi obtenue pendant 30 mn.On sépare par filtration les cristaux du produit d'addition et on les lave à l'eau refroidie. On met les cristaux récupérés en suspension dans l'eau refroidie, on neutralise la suspension avec de l'acide sulfurique et on sépare le précipité forme. La solution de fructose ainsi obtenue renferme 169 g de fructose (rendement : 64%) et 6,3 g de glucose. On neutralise également la liqueur mere avec de l'acide sulfurique et on élimine le précipité. La solution appauvrie en fructose renferme 220 g de glucose et 87 g de fructose. On effectue des essais de production d'acide citrique par fermentation en opérant comme décrit dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on remplace le sucre brut et la solution concentrée appauvrie en fructose correspondante par la mélasse de betteraves et la solution concentrée appauvrie en fructose correspondante. Les résultats des fermentations figurent dans le tableau III ci-après. TABLEAU tii Acide citrique Source de carbone A. ~~~ A. niger A. awamori ATCC 6275 FERM-P 3512 Mélasse de bette raves 3,48 gldl 1,64 g/dl Solution appauvrie en fructose 4,52 g/dl 2,85 g/dl EXEMPLE 4 On dilue de la mélasse de raffinerie en utilisant 2,2 litres d'eau par kg de mélasse, on ajuste le pH à 1,5 avec de l'acide sulfurique et on hydrolyse å 60"C pendant 4 heures.On neutralise l'hydrolysat avec de l'hydroxyde de calcium et on sépare par filtration le précipité de sulfate de calcium. On obtient donc une solution de sucre inverti. On refroidit à 0 C 3 kg de la solution de sucre inverti renfermant 300 g de fructose et 300 g de glucose et on ajoute progressivement une solution å 305 d'hydroxyde de calcium renfermant 296 g de Ca(OH)2 en maintenant la température en dessous de 50C. Lorsqu'on a ajouté 60% de la quantité totale d'hydroxyde de calcium, on amorce avec une petite quantité de cristaux du produit d'addition. On ajoute progressivement les 40% restants d'hydroxyde de calcium et on agite encore la suspension obtenue pendant 30 mn. On sépare par filtration les cristaux du produit d'addition et on les lave à l'eau refroidie. On met les cristaux recueillis en suspension dans lweau et on refroidit la suspension à OOC. On neutralise la suspension à un pH inférieur b 10 en introduisant du dioxyde de carbone gazeux z o0c. On sépare par filtration le précipité de carbonate de calcium et on concentre a 558 g le filtrat dont le pH est d'environ 8,5. La solution concentrée renferme 201 g de fructose et 22 g de glucose. On traite la solution concentrée avec une résine échangeuse de cations fortement acide et une résine échangeuse d'anions faiblement basique et on la décolore avec du charbon actif. On concentre la solution décolorée et on obtient une solution incolore dont la concentration en fructose est d'environ 70%. On neutralise également la liqueur mère un pH inférieur à 10 en introduisant du dioxyde de carbone gazeux à 0 C. Le pH de la liqueur mere neutralisée est d'environ 8,5. On concentre la liqueur mère neutralisée et on obtient une solution appauvrie en fructose renfermant 69 g de fructose, 249 g de glucose et 289 g de carbonate de calcium. On effectue trois essais de fermentation en utilisant la mélasse de raffinerie, le melange de mélasse de raffinerie et de carbonate de calcium et la solution appauvrie en fructose comme sources principales de carbone. On prépare des portions de 20 ml de milieux de culture ayant la composition suivante Une des sources principales de carbone ci-dessus 10 g/dl (en hexoses) dans le cas du mélange avec le carbonate de calcium, la concentration en Caca, est également de 10 g/dl Extrait de levure 0,4 g/dl DL-mé thionine 0,01 g/dl Biotine 100 7/1 Chlorhydrate de thiamine 100 y/l on les introduit dans des flacons à agitation de 500 ml et on stérilise. On ensemence chaque milieu avec Candida citroformans FERM-P 3397 et on cultive à 300C pendant 3 jours en agitant. Après culture, on détermine la concentration en acide citrique du bouillon et on obtient les résultats qui figurent dans le tableau IV ci-après. TABLEAU IV Source de carbone Acide citrique Mélasse de raffinerie 4,2 g/l Né lasse de raffinerie et Cal03 38,6 g/l Solution appauvrie en fructose 46,3 g/l EXEMPLE 5 On obtient des cristaux du produit d'addition du fructose et de l'hydroxyde de calcium à partir de la mélasse de canne b sucre en opérant comme dans l'exemple 2, aux exceptions suivantes pres Exemple 2 Exemple 5 Dilution 2,3 1 d'eau/kg 1,6 1 d'eau/kg Solution de sucre Glucose 9,95 g/dl 9,92 g/dl inverti Fructose 11,25 g/dl 11,08 g/dl Hydroxyde de calcium (ajouté) 262 g 311 g On met les cristaux du produit d'addition en suspension dans de l'eau refroidie et on neutralise à un pH inférieur à 10 en introduisant du dioxyde de carbone gazeux à OOC. On sépare le précipité formé par filtration. Le filtrat renferme 166 g de fructose et 7,2 g de glucose. On neutralise également la liqueur mère à un pH inférieur à 10 en introduisant du dioxyde de carbone gazeux à 00C et on concentre. On obtient une solution appauvrie an fructose renfermant 149 g de fructose, 270 g de glucose et 318 g de carbonate de calcium. On effectue les essais de fermentation en opérant comme décrit dans l'exemple 4, si ce n'est qu'on remplace la mélasse de raffinerie et la solution appauvrie en fructose correspondante par la mélasse de canne sucre et la solution appauvrie en fructose correspondante. Les résultats des fermentations figurent dans le tableau V ci-apres. TABLEAU V Source de carbone Acide citrique Mélasse de canne b sucre 4,0 g/l Mélasse de canne à sucre et CaC03 36,2 gil Solution appauvrie en fructose 44,6 gil EXEMPLE 6 On prépare des cristaux du produit d'addition du fructose et de l'hydroxyde de calcium å partir de la mélasse de betteraves en opérant comme dans l'exemple 3, aux exceptions suivantes près Exemple 3 Exemple 6 Dilution 2,5 1 d'eau/kg 1,5 1 d'eau/kg Solution de sucre Glucose 7,80 g/dl 9,66 g/dl inverti Fructose inverti 8 > 81 g/dl 10,2 g/dl Hydroxyde de calcium (ajouté) 205 g 294 g On met les cristaux du produit d'addition en suspension dans de l'eau refroidie et on neutralise 9 un pH inférieur b 10 en introduisant du dioxyde de carbone gazeux OOC. On sépare par filtration le précipité forme.Le filtrat renferme 184 g de fructose et 7,95 g de glucose. On neutralise également la liqueur mère b un pH inférieur à 10 en introduisant du dioxyde de carbone gazeux à OOC, puis on concentre. On obtient 938 g de solution appauvrie en fructose renfermant 108 g de fructose, 267 g de glucose et 296 g de carbonate de calcium. On effectue les essais de fermentation en opérant comme décrit dans l'exemple 4, ai ce n'est qu'on remplace la mélasse de raffinerie et la solution appauvrie en fructose correspondante par la mélasse de betteraves et le solution appauvrie en fructose correspondante. Les résultats des fermentations figurent dans le tableau VI ci-après. TABLEAU VI Source de carbone Acide citrique Mélasse de bette raves 0,8 g/l Mélasse de bette raves et CaC03 5,2 g/l Solution appauvrie en fructose 9,8 g/l Bien entendu diverses modifications peuvent -etre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent dette décrits uniquement & titre d'exemples non limitatif s sans -sortir du cadre de l'inven ton. REVENDICATIONS 1 - Procédé de production d'acide citrique par fermentation, caractérise en ce qu'on mélange un hydrolysat d'un produit de la fabrication du sucre à partir de la canne à sucre ou de la betterave, renfermant du glucose et du fructose, avec de l'hydroxyde de calcium, pour former un précipité du produit d'addition avec le fructose, on separe le précipité, on neutralise la liqueur merle restante et on utilise la liqueur itTe restante comme source de carbone pour la fermentation. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit est un jus de canne à sucre ou de betterave, du sucre brut ou une mélasse. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la quantité d'hydroxyde de calcium est égale à 1,2 à 1,6 fois la quantité molaire du fructose. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on effectue la neutralisation en utilisant du dioxyde de carbone gazeux. 5 - Procedé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on élimine les ions calcium après la neutralisation. 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caracté- risé en ce qu'on effectue la fermentation en utilisant un micro-organisme appartenant aux genres Aspergillus ou Candida. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le.micro-organisme appartient aux espèces Aspergillus niger, Aspergillus awamori ou Candida .citroformans.