FR 2336926 A1 19770729 FR 7700181 A 19770105 la présente invention concerne des compositions pharmaceutiques contenant de l'acide ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzotque ou un de ses sels ou esters d'alkyle inférieur, utiles pour le traitement des maladies vasculaires chez les mammifères. La demande de brevet français n" 70 30 660,au nom de la société demanderesse et de la société Takeda Chemical Industries, Limited,décrit l'acide ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzotque et ses sels comte antiseptiques utiles pour les aliments, etc. La demande de brevet japonais publiée n" 16 169/73 (voir Chemical Abstracts, volume 80, page 56460u (1974) décrit également l'acide ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzorque et ses sels d'alkyle comme intéressants dans la lutte contre diverses maladies du ver à soie. La demanderesse a découvert selon l'invention que l'acide ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzotque et ses sels, par exemple ses sels de sodium, potassium, calcium, baryum ou ammonium, et ses esters d'alkyle inférieur, par exemple les esters de méthyle, éthyle, propyle et butyle, sont des médicaments utiles pour le traitement des maladies vasculaires, telles qu'artériosclérose, infarctus cardiaque, angine de poitrine, infarctus cérébral, hémorragie cérébrale, infarctus rénal, hypertension, claudication intermittente ou thrombose. Les composés préférés sont l'acide ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzotque et le ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzoate d'éthyle. On prépare les composés de l'invention, par exemple, de la manière suivante. Préparation de l'acide ditertiobutyl-35 dihydroxy-2.6 benzoSque A une solution de 5 g de ditertiobutyl-4,6 résorcinol dans 12 ml de méthylformamide, on ajoute 1,56 g de carbonate de potassium anhydre. On fait passer du dioxyde de carbone dans le mélange placé au bain d'huile, en chauffant à 1800C et en agitant pendant 7 h. On ajoute au mélange résultant 50 ml d'eau et on agite le mélange pendant un moment. Après filtration, on lave le résidu à l'eau. On réunit l'eau de lavage et le filtrat et on ajuste le mélange à pH 1-1,5 par l'acide chlorhydrique : il se forme un précipité jaunâtre. On recristallise le précipité dans un alcool aqueux pour obtenir 1,5 g d'acide ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzoSque sous forme de cristaux jaune pale, F. 173,5"C, avec décomposition. Préparation du ditertiobutyl-35 dihydroxy-2 6 benzoate d'éthyle A un mélange de 30 g d'acide ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzoïque et 11,4 g dlhydrogénocarbonate de sodium dans 300 ml d'acétone, on ajoute 21 g de sulfate de diéthyle en chauffant au reflux avec agitation pendant 20 h. Après avoir ajouté 1000 ml d'eau au mélange de réaction, on separe le précipité par filtration et on le lave à l'eau. La recristallisation dans l'éthanol donne le ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzoate d'éthyle, F. 105-1060C. Les composés selon l'invention sont utiles pour traiter les maladies vasculaires telles que l'artériosclérose ou la thrombose, comme indiqué, par exemple, par la série d'essais suivante. (1) Effet sur la peroxydation des lipides (a) Préparation de microsomes On prépare des microsomes selon la méthode de R. Kato dans "Journal of Biochemistry (Japan)", volume 59, pages 574-583 (1966). On utilise des rats mâles de souche Wistar nourris ad libitum, pesant 160-250 g. On sacrifie les animaux par excision de la carotide, on retire immédiatement les foies, on les pèse et on les lave avec une solution glacee de chlorure de sodium à 1,15 70. On rince ensuite les foies et on les homogénéise dans 4 volumes de la solution de chlorure de potassium avec un homogénéiseur en verre-Téflon. On centrifuge le produit homogénéisé à 9000 g pendant 20 mn, et on centrifuge à nouveau la liqueur surnageante résultante à 105 000 g pendant 60 mn. On met en suspension la pastille microsomale, équivalant à 1 g (poids de matière sèche), dans 4 ml de la solution de chlorure de potassium, la concentration de protéine étant d'environ 5 mg/ml.On utilise dans chaque expérience des microsomes fraichement préparés. On détermine la protéine microsomale par la méthode 0. H. Lowry et col. dans " Journal of Biological Chemistry", volume 193, pages 265-275 (1951). (b) Peroxydation des lipides induite par l'acide ascorbique On effectue l'incubation pour la peroxydation des lipides induite par l'acide ascorbique selon la méthode de C. D. Klaassen et col. dans "Biochemical Pharmacology", volume 18, pages 2019-2027 (1969), avec, toutefois, une légère modification. Le mélange de réaction contient du tampon au phosphate de potassium (pH 7,4) 60.10-3 du chlorure de potassium 45.10 3 M, de l'acide ascorbique 100.10'6 M, du sulfate ferreux 20.10-6 M et les microtomes (environ 0,5 mg de protéine/ml). On effectué les incubations à 370C dans l'air dans un bain d'eau agité (60 coups/mn) pendant 60 mn. On dissout les composés essayés dans l'éthanol à 99,5 % et on ajoute au mélange de réaction avant l'incubation. La concentration finale de l'éthanol est inférieure à I %, ce qui n'influe pas notablement sur la peroxydation des lipides. On détermine la quantité de malonaldéhyde formée pendant l'incubation à 535 nm dans un spectrophotomètre Ritachi par la méthode à l'acide thiobarbiturique décrite par M. Comporti et col. dans "Enzymologia", volume 29, pages 185-204 (1965). On calcule la CI50 (10 -6 M), concentration inhibitrice de la peroxydation des lipides, d'après l'absorption de l'extrait de lipide. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau I ci-dessous. TABLEAU I Concentration inhibitrice de la peroxydation des lipides 10'6 I Compose CI50 (10 Ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzoate d'éthyle > 100 Acide ditertiobutyl-3,5 dthydroxy-2,6 benzotque 30 (2) Effet sur l'artériosclérose expérimentale On mesure les effets sur l'artériosclérose expérimentale selon une modification de la méthode de P. Constantinides dans "Experimental Atherosclerosis", pages 49-56 (Elsevier Publlshing Company, 1965). On administre à un groupe de cinq rats mules Sprague-Dawley 400 000 U.I./kg de poids corporel/jour de vitamine D2 par une sonde gastrique pendant 5 jours successifs. On évalue macroscopiquement les lésions artérielles induites sur une échelle graduée de O k 4 comme ci-dessous Echelle Degré de lésion artérielle O pas de lésion observée 1 zone de lésions légères inférieure k 1/5 2 zone de lésions modérées inférieure à 1/2 3 zone de lésions modérées supérieure à 1/2 ou zone de lésions graves inférieure A1/2 4 zone de lésions graves supérieure à 1/2 On calcule le pourcentage d'amélioration d'après la valeur moyenne des notes. Ensuite, selon 1 méthode de S. Bloom et col. décrite dans "American Journal of Pathology', volume 69 > pages 459 à 470 (1972), op mesure la concentration de calcium dans le myocarde et on détermine le pourcentage d'amélioration. A des rats males Sprague-Dawley pesant 200-250 g > on administre oralement une solution du composé essayé dans un véhicule (eau contenant 0,5 a de méthylcellulose). On administre oralement aux animaux témoins 1 ml du véhicule jusqu'à ce que l'on trouve que la concentration de calcium chez les animaux ayant reçu le véhiculé seul ne change pas avec la durée d'administration et ne se distingue pas de la concentration en calcium d'animaux non traités.A divers instants après l'administration, on anesthésie les animaux à l'éther et on retire le coeur battant. On dissèque les ventricules débarrassés du péricarde, des oreillettes et des grands vaisseaux, on lave rapidement au sérum physiologique, on tamponne pour sécher et on place dans des creusets en céramique préalablement pesés. On place les creusets dans un four à moufle froid dont on élève la température 6000C en 2 h. On laisse ensuite refroidir les creusets lentement. On dissout la cendre résultante dans une solution d'acide chlorhydrique 2N contenant 3 Z en poids par volume de lanthane jusqu'à un volume final de 10 ml dans-des fioles volumétriques en verre.On détermine la teneur en calcium de ces échantillons dans un spectromètre d'absorption atomique Perkin-Elmer en comparant leurs valeurs d'absorption à 422,7 nm avec celles obtenues pour une série de solutions étalonnées. On lave tous les récipients en verre et en plastique par l'acide nitrique concentré. La seule exposition des échantillons au contact du verre est la courte durée de séjour dans les fioles volumétriques de 10 ml. On prépare des solutions étalonnées de calcium à la m & e concentration d'acide chlorhydrique et de lanthane que les solutions inconnues. On conserve les solutions étalonnées dans des recipients en polyéthyîène et on les contre périodiquement au moyen d'un étalon fratchement préparé. On distille tout l'acide chlorhydrique dans des bouteilles en polyéthylene lavées 9 l'acide chlorhydrique. Les résultats obtenus sont rassemblés dans les tableaux II et III ci-après. TABLEAU II Degré d'artériosclérose Composé Dose (mg/kg) Degré d'artériosclérose Pourcentage d'amélioration A 100 1,2 Témoin - 2,5 52% B 50 1,8 Témoin - 3,5 49 % TABLEAU III Teneur en calcium dans le myocarde Teneur an calcium Composé Dose (mg/kg) (millimole/kg de Pourcentage d'amélioration myocarde A 100 2,3 Témoin 100 19,3 93 % B 50 14,2 Témoin - 36,2 63 % Les composés A et B sont les suivants A : ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzoate d'éthyle B : acide ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzotque (3) Effet sur l'agglutination des plaquettes induite par le collagène A un groupe de cinq rats mules Sprague-Dawley pesant 300-350 g, on administre oralement 0,5 ml/100 g de poids corporel d'une suspension du composé essayé dans un véhicule (eau contenant 0,5 % de methylcellulose) pendant 5 jours. Une heure apres l'administration finale, on effectue sur les rats une opération abdominale sous anesthésie à l'éther. On obtient des échantillons de sang citraté à partir de l'aorte abdominale au moyen d'un injecteur siliconé. On centrifuge les échantillons à 1700 tr/mn pendant 3 mn. A 1,0 ml de plasma riche en plaquettes ainsi obtenu, on ajoute 0,01 ml (0,01 mg/ml) de suspension de collagène et 0,004 ml de solution de chlorure de calcium 0,25 M. On mesure l'intensité de l'agglutination induite par le collagène en utilisant un appareil de mesure d'agglutination des plaquettes selon la-méthode de G.V,R. Born décrite dans "Journal of Physiology", vourne 162J pages 67P-68P (1962). L'intensité d'agglutination est représentée par le temps qui s'écoule après addition de collagène jusqu'au début de 1 ' agglutination. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau IV ci-dessous. TABLEAU IV Composé Irosa (mg/ig) Durée avant agglutination(mn) A A 150 2,70 + 0,29 Témoin 1,65 + 0,30 Différences significatives par rapport au témoin, exprimées comme suit ap Le composé A est le ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzoate d'éthyle. (4) Toxicité aigus par voie orale On détermine la toxicité aigus par voie orale des composés de l'invention sur des souris males de souche dd Ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzoate d'éthyle > 2 000 mg/kg Acide ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2, 6 benzotque 800 mg/kg D'après divers essais, y compris ceux mentionnés ci-dessus, on peut administrer avec sécurité les composés de l'invention pour le traitement de maladies vasculaires chez les mammifères, soit seuls soit sous forme de préparations pharmaceutiques, avec un support classique approprié tel qu'un liant, par exemple sirop, gomme arabique, gélatine, sorbitol, gomme adragante ou polyvinylpyrrolidone, un agent diluant, par exemple le lactose, le saccharose, l'amidon de mats, le phosphate de calcium, le sorbitol ou la glycine, un agent lubrifiant, par exemple stéarate de magnésium, talc, polyéthyîèneglycol ou silice, un agent désagrégeant, par exemple amidon de pomme de terre, ou un agent mouillant, par exemple laurylsulfate de sodium, sans inconvénient pour les patients. La préparation pharmaceutique peut prendre n'importe quelle forme classique, telle que poudres, granulés, tablettes ou capsules pour l'administration orale. Exemples de compositions (a) Tablettes On prépare des tablettes dosées à 100 mg,ayant la composition suivante : Composé selon l'invention 100 mg Lactose 50 mg Amidon 23 mg Néthylcellulose 1 mg Talc 5 mg Stearate de magnésium 1 mg 180 mg On peut revêtir les tablettes de sucre de manière classique. (b) Capsules On prépare des capsules dosées a 100 mg,ayant la composition suivante Composé selon l'invention 100 mg Lactose 30 mg Amidon 18 mg Méthylcellulose 1 mg Stéarate de magnésium 1 mg 150 mg (c) Poudre On prépare une poudre dosée à 50 %,ayant la composition suivante Composé selon l'invention 50 % Lactose 49 % Méthylcellulose 1 % 100 % La dose journalière chez 1'ho-ie adulte souffrant de maladies vasculaires, telles qu'artériosclérose ou thrombose, est ordinairement d'environ 300 à 1500 mg pour l'administration orale, en dose unique ou fractionnée, mais elle peut varier avec l'âge, le poids corporel et/ou la gravité de l'état & traiter, ainsi que de la réponse à la médication. I1 est entendu que l'invention n'est pas limitée aux formes de réalisation décrites et l'homme de l'art pourra y apporter diverses modifications sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique, utile notamment pour le traitement des maladies vasculaires, caractérisée en ce qu'elle contient comme ingrédient actif l'acide ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzotque ou un de ses sels ou de ses esters d'alkyle inférieur en quantité efficace, en combinaison avec un support inerte acceptable pour l'usage pharmaceutique. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit ingrédient actif est l'acide ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzoïque. 3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit ingrédient actif est le ditertiobutyl-3,5 dihydroxy-2,6 benzoate d'éthyle. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'ingrédient actif est présent en quantité efficace pour le traitement de l'artériosclérose. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'ingrédient actif est présent en quantité efficace pour le traitement de la thrombose. 6. Forme pharmaceutique des compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la dose journalière est d'environ 300 à 1500 mg de l'ingrédient actif.