FR 2350845 A1 19771209 FR 7626253 A 19760831 L'invention concerne un produit conjugué pour la suppression des anticorps réaginiques chez une personne allergique à la pénicilline, ainsi qutun procédé de préparation de ce produit conjugué. Dans les pays développés, 1 à 5 ffi de la population sont allergiques à la pénicilline. Quand on leur administre de la pénicilline, ces sujets risquent d'avoir un choc anaphylactique ou de présenter des éruptions ou divers autres symptômes d'hypersensibilité à la pénicilline. Les diverses réactions d'allergie à la pénicilline ont pour agents intermédiaires différents types d1anti- corps, les réactions du "type innédiat" étant dues à des anticorps réaginiques appelés anticorps IgE. Le groupe benzylpénicilloyle (3PO) est apparu comme le déterminant immunogène principal de 1 'hy- persensibilité à la pénicilline. La formation d'anticorps IgE anti-BPO est principalement déclenchee par le groupe hapténique BPO.Par lui-meme, l'haptène BPO ne cause pas la formation de l'IgE, mais il le fait lorsqu'il est conjugué avec des impuretés ou additifs macromoléculaires dans la préparation de pénicilline ou avec les protéines ou constituants tissulaires du patient luimême. Le produit conjugué de BPO dans l'organisme stimule la production d'anticorps anti-EPO par les cellules lymphoîdes. Ces anticorps se fixent à des mastocytes et à des basophiles. Lorsqu'on administre ensuite de la pénicilline, il se forme à nouveau des produits conjugués de EPO polyvalents qui se fixent aux anticorps IgE anti-EPO portés par les mastocytes ou les basophiles. Cette interaction anticorps-antigène a pour effet de ponter ou de réticuler les anticorps IgE anti-BPO fixés aux mastocytes ou basophiles, ce qui apparat titre la condition préalable pour que la cellule libère les granules contenant de lthistsmine et d'autres composés pharmacologiquement actifs, ce qui conduit à la réaction inflammatoire qui est à la base de la manifestation allergique. On a employé diverses méthodes pour le traitement de ces réactions allergiques. Une méthode pharmacologique consiste à administrer des antihistaminiques. Une autre méthode, basée sur des principes immunochimiques, consiste à administrer un composé formé du déterminant allergène sous la forme d'un dérivé univalent stable qui est incapable de se combiner aux constituants de l'hôte pour former des allergènes polyvalents.Ces dérivés peuvent se fixer à chacun des sites de fixation d'antigènes des anticorps IgE individuels fixés aux mastocytes ou aux basophiles, ce qui a poureffet de bloauer les sites de fixation d'antigènes de l'anticorps, empêchant ensuite leur fixation à des molécules polyvalentes, ce qui fait que le déclenchement de la libération de granules par les cellules est rendu impossible. Toutefois, aucun de ces traitements n'empêche la formation d'une nouvelle quantité d'anticorps IgE lors d'une nouvelle exposition à l'allergène. En ce qui concerne spécialement les allergies à la pénicilline, la dernière méthode citée a été utilisée par Â.L. de Weck et est décrite dans une publication de A.L. de Weck et al., 1973, intitulée "Inhibition of allergic reactions by monovalent haptens in Mechanisms in Allergy. Reagin-mediated Hypersensiti vity", édité par L. Goodfriend, A.H. Sehon et R.P. Orange, page 323, Carcel Dekker, Inc., New York, E.U.A.. Le dérivé univalent de pénicilline, la benzylpénicilloyl-formyllysine (3PO-LYS) a été préparé synthétiquement.On l'a alors administré au patient et on a trouvé qu'il bloquait les sites de fixation d'antigènes des anticorps IgE anti-BPO. Il entravait ainsi le pontage, par des produits conjugués polymères de BPO, des anticorps fixés aux mastocytes ou aux basophiles. Toutefois, cette méthode est simplement thérapeutique et n'empoche pas la formation d'anticorps IgE anti BPO si l'on administre ultérieurement de la pénicilline au patient. Dans deux articles publiés dans The Journal of Immunology, volume 114, n 2, partie 2, février 1975, pages 829 et 837 respectivement, les demandeurs ont décrit leurs travaux visant à mettre au point un traitement pour la suppression définitive de la formation d'anticorps de la classe IgE contre le groupe 2,4-dinitrophényle (DNP) chez des animaux de laboratoire, par administration de produits conjugués de DliP et d'un véhicule non immunogène, à savoir la '(-globuline de l'animal. Dans les travaux décrits, il était nécessaire de sensibiliser d'abord l'animal au DNP. Le traitement ultérieur par le produit conjugué entraînait la suppres- sion de la formation d'anticorps réaginiques anti-DI. On a trouvé maintenant qu'en choisissant judicieusement un produit conjugué de BPO et d'un véhicule non immunogène approprié, il est possible de supprimer la formation d'anticorps réaginiques IgE anti-3POO En conséouence, l'invention a pour objet un produit conjugué, propre à supprimer la formation d'anticorps réaginiques chez un hôte, formé par des groupes benzylpénicilloyle et la &gamma; -globuline de l'hôte et qui contient en moyenne 4,3 à 19 groupes benzylpénicilloyle par molécule de d -globuline. En outre, l'invention a pour objet un procédé de préparation du produit conjugué, selon lequel on fait réagir de la pénicilline sur-la &gamma; -globuline de l'hôte en des proportions appropriées, e;l présence d'un sel, à un pH d'environ 9,8. En outre, l'invention a pour objet un procédé de suppression de la formation d'anticorps réaginiques anti-3PO chez une personne sensible à la pénicilline, qui consiste à injecter au patient le produit conjugué, d'une manière pharmaceutiquement acceptable. Le véhicule non immunogène préféré est la &gamma; -globuline de l'hôte, car elle evite l'introduction de tout corps étrsn- ger à l'hôte. Les groupes benzylpénicillovle doivent entre présents dans le produit conjugué à raison de 4,3 à 19 groupes en moyenne par molécule de g -globuline. On a trouvé que lorsque le nombre est inférieur à 4,3 environ, le produit conjugué ne supprime que partiellement la réponse réaginique anti-EPO. Les produits conjugués contenant plus de 19 groupes environ perdent leur capacité tolérogène et il semble cue cela soit dû à une modification prononcée de la molécule de &gamma; -globuline. Le nombre préféré de groupes BPO est de 9 à 12. La réaction de la pénicilline et de la &gamma; -globuline s'effectue en présence d'un sel approprié qui permet à la réaction de s'effectuer à un pH de 9,8 environ. Des sels appropriés sont le carbonate de potassium, le carbonate de sodium et les tampons carbonate de sodium-bicarbonate de sodium. On comprendra mieux l'invention à la lecture de la description suivante et des dessins annexés, sur lesquels La figure 1 est un graphique montrant la réponse réaginique primaire à un produit conjugué de BPO et d'ovalbumine (OV), soit BP04-0A. La figure 2, un graphique montrant l'effet de la dose de produit conjugué; et La figure 3,un graphique montrant l'effet de la densité d'épitopes, c'est-à-dire du nombre de groupes BPO combinés par molécule de g -globuline. On a testé le produit conjugué de l'invention sur des souris males F1 consanguines de 8 à 12 semaines (C57BL/6 x DBA/2). Il a été nécessaire d'induire une sensibilité à la pénicilline chez les souris et on l'a fait en injectant aux souris par voie intrapéritonéale (i.p.) un antigène immunisant. La préparation de cet antigène immunisant est décrite à l'exemple suivant. Exemple On fait réagir à 370O pendant 24 heures, 250 mg de pénicilline G (sel de potassium, Pfizer Co. Ltd.) avec 500 mg d'ovalbumine (OA) dans 25 ml de carbonate de potassium 0,5M. On sépare la pénicilline n'ayant pas réagi du produit conjugué PBO4-OA formé par filtration à travers une colonne de gel "Sephadex G-25" équilibré dans du sérum physiologique tamponné au phosphate. On détermine le rapport molaire BPO:OA par titrage quantitatif avec une solution de chlorure mercurique. On introduit par voie i.p. chez la souris l'antigène SP04-OA ainsi formé, sous la forme d'une suspension de 1 ou 10 g de BPO4-OA et de 1 mg d'Al(OH)3 dans t ml de sérum physiologique. La réponse réaginique primaire type à BPO4-Ca est illustrée par la figure 1. Pour déterminer les taux d'anticorps IgE anti-BPO et d'anticorps IgE anti-OA, on utilise les réactions classiques d'anaphylaxie cutanée passive (PCA) qui emploient BPO17-BGG (&gamma;-globu- line bovine) et OA pour déclencher ces réactions chez les souris sensibilisées. On notera que les réponses primaires maximales à BPO comme à OA sont observées le 14ème jour après la sensibilisation des souris et que la réponse à OÂ est un peu plus forte qu'à PO. La préparation du produit conjugué de l'invention est illustrée par les exemples suivants Exemple 2 On fait réagir à 40C, pendant 30 minutes, 60 mg de pénicilline G avec 50 mg de &gamma; &gamma; - globuline de souris (M KG) en pré- sence deux volume total de 10 ml de carbonate de potassium 0,5M. On sépare la pénicilline n'ayant pas réagi du BPO12-M &gamma; qui s'est formé, par filtration à travers du gel "Sephadex G-25" Squilibré dans du sérum physiologique tamponné au phosphate. Exemple 3 On fait réagir à 40C, pendant 30 minutes, 25 mg de pénicilline G avec 50 mg de M &gamma; G en présence d'un volume total de 6,6 ml de carbonate de potassium O,5M. On sépare la pénicilline n'ayant pas réagi du BPO9-M &gamma; G qui s'est formé, par filtration à travers du gel "Sephadex G-25" équilibré dans du sérum physiologique tamponné au phosphate. De façon analogue, on prépare d'autres produits conjugués BPOx-M&gamma;G diverses valeurs de x, par exemple s=1, x=2,9, x=4,3, z=11, x=19 et x=31, en réglant convenablement la concentration de pénicilline G et en laissant la réaction se poursuivre pendant des durées différentes. Pour déterminer le niveau de dosage optimal qui réaliserait la suppression de l'induction de la réponse réaginique anti-BPO, on fait des essais en utilisant divers dosages de ayant Les souris reçoivent des injections intraveineuses de BPO12-M&gamma;G à des doses de 100, 200, 300 ou 1000 g par souris, 4 heures avant l'injection i.p. de 10 g de l'antigène sensiblisant BPO4-OÂ, en présence de 1 mg d'hydroxyde d'aluminium dans 0,5 ml de sérum physiologique.Les résultats sont représentés sur la figure 2 et indiquent que 11 administration d'une dose de 200 g ou davantage de BPO12-M&gamma;G par souris entrains la suppression complète de l'apparition de la réponse IgE anti-BPO, tandis que la réponse IgE anti-0Â n'est nullement affectée. Les expériences ci-dessus montrent que l'on peut empecher ou supprimer l'induction de la réponse réaginique anti-BPO en injectant le produit conjugué de l'invention avant d'administrer le EP04-0A à une dose sensibilisante. On a fait alors des essais pour déterminer si l'administration du produit conjugué de l'invention ferait disparaitre une réponse IgE anti-EPO en cours résultant d'une sensibilisation préalable des animaux à la pénicilline. Evidemment, ce dernier aspect est le plus important si l'on veut mettre au point un traitement efficace des individus allergiques qui auraient besoin de ce traitement après sensibilisation au BPO mais avant exposition à la pénicilline. À cet effet, on commence par sensibiliser des souris par voie i.p. avec 10 g de BPO4-OA en présence d'hydroxyde d'aluminium. Un groupe de souris reçoit quatre injections i.v. jour naliere de 500 g de BPO9-M&gamma; &gamma; G, à partir du 24ème jour qui suit la sensibilisation. Un autre groupe de souris reçoit quatre injec tione i.v. de 500 e g de BP09-M G chacune à des intervalles d'une semaine, à partir du 14ème jour qui suit la sensibilisation primaire Toutes les souris reçoivent une deuxième injection i.p. sensibilisante de 10 g de SP04-OA et d'hydroxyde d'aluminium le 42ème jour. Les réponses réaginiques observées à EPO et OA sont indiquées au Tableau 1. TABLEAU 1 - Suppression d'une réponse IgE anti-BPO en cours Draitement(a) Jours après Titre PCÂ administration Anti-BP0 Anti-OÀ Souris sensibilisées soumises à BP04-0A (b) 7 710 2 500 14 750 1 800 21 640 1 540 Souris sensibilisées 7 10 40 1 620 tions par jour de BPO9-M&gamma;G et soumisce 21 > 10 1 660 à SP04-OA (c) Souris sensibilisées 7 (tO 2 560 ayant reçu 4 injections 14 > 10 1 780 par semaine de BPO9-M&gamma;; G et soumisse à 21 > 10 1 200 BPO4-OA (d) (a) toutes les souris ont été sensibilisées par voie i.p. avec 10 g de SP04-OA en présence d'Al(OH)3 avant le traitement. (b) les souris sensibilisées ont reçu par voie i.p. 10 g de BP04-0A en présence d'Al(OH)3 le 42ème jour (c) 24 jours après la sensibilisation, les souris ont reçu des injections i.v. de 500 P g de BPO9-M&gamma;G pendant 4 jours consé cutifs et on leur a administré par voie i.p. 10 r g de BP04-OA en présence d'Al(OH)3 le 42ème jour. (d) les souris sensibilisées ont reçu par voie i.v. des injec tions hebdomadaires de 500 g de BPO9-M&gamma; &gamma; G pendant 4 semaines consécutives, à partir du 14ème jour après la sensibilisation primaire, puis on les a soumises à 10 g de SP04-OA en présen ce d1Al(OH)3 le 42ème jour. On notera d'après ces résultats que le traitement de souris sensibilisées par l'une ou l'autre méthode avec du BPO9-M&gamma;G abolit leur potentiel à présenter une réponse secondaire anti-BPO, sans affecter la réponse anti-véhicule. Dans une autre expérience, on a trouvé que l'on peut aussi réaliser la suppression de la réponse en cours par une seule dose de 500 P g du produit conjugué, injectée par voie i.v. un mois après la sensibilisation primaire. On a fait alors une expérience pour déterminer si l'état de non réponse des cellules de rate de souris désensibili sées, induit par l'administration de BPO12M&gamma;G, pouvait se maintenir après transfert à des sujets irradiés aux rayons X. On transfère à des sujets irradiés aux rayons x (550 R) des cellules de rate (5 x 107) provenant de souris soit sensibilisées, soit désensibilisées, qui ont reçu, respectivement, soit une dose sensibilisante de 10 g de SP04-OA avec de l'hydroxyde d'aluminium, soit une injection i.v. de 1 mg de BPO12-M&gamma;G en même temps qu'une injection i.p. de 10 g de 3P04-0A et d'hydroxyde d'aluminium, 18 jours avant de les sacrifier.On a désensibilisé le troisième groupe d'animaux en leur administrant une dose de t mg de BPO12-M YG, 14 jours après les avoir sensibilisés par une injection i.p. de 10 g de BPO4-OA en présence d'hydroxyde d'aluminium. On sacrifie alors les animaux 4 jours plus tard pour prélever leur rate. Immédiatement après le transfert de cellules, on applique à tous les sujets l'injection immunisante standard de 10 g de SP04-OA et d'hydroxyde d'aluminium et, deux jours plus tard, on les saigne.D'après les titres PCA du sérum des souris irradiées qui ont reçu les cellules de rate des trois groupes de souris, indiqués au Tableau II, il est évident que, bien que les cellules de rate d'animaux sensibilisés, en l'absence de tout trai- tement désenbilisant, donnent une réponse IgE anti-3PO secondaire quand les sujets sont soumis à hP04-0A en présence d'hydroxyde d'aluminium, l'état de non réponse des cellules désensibilisées se maintient chez les sujets. Tableau II - maintien de la tolérance BPO-spécifique dans le transfert adoptif de cellules Sujets récepteurs Titre PVA (a) Anti-3PO ssnti-OA cellules sensibilisées (b) 640 1 760 cellules désensibilisées (c) > 10 1 660 cellules provenant de souris désensibilisées 4 jours avant d'être sacrifiées (d) 50 1 820 (a) on détermine les titres PCA 14 jours après le transfert des cellules à des sujets irradiés (550 R); au moment du transfert, chaque sujet reçoit une injection i.p. sensibilisante de îOfAg de BPO4-OA en présence d'Al(OH)3. (b) cellules de rate de souris sensibilisées 18 jours avant le transfert de cellules. (c) cellules de rate de souris ayant reçu 1 mg de BPO12-M&gamma; G et une dose i.p. sensibilisante de 10 g de BPO4-OA en présence 18 jours avant le sacrifice. (d) cellules de rate souris ayant reçu une dose sensibilisante i.p. de 10 g de SP04-OA en présence d'Al(O avant le irans- fert de cellules et une injection i.v. de 1 mg de BPO12-M&gamma; G 4 jours avant le sacrifice. Comme on l'a déjà dit. les groupes BPO doivent entre présents dans le produit conjugué à raison de 4,3 à 19 groupes en moyenne par molécule de {-globuline. Pour établir cela, on injecte par voie i.v. des produits conjugués à nombre différent de groupes BPO (densité d'épitopes) combinés à la molécule de &gamma;-glo- buline à des groupes de souris (1 mg de chaque produit conjugué par souris). Quatre heures plus tard, on administre aux souris une injection i.p. de la dose sensibilisante standard de IOrg de BP04-OÂ mélangé à 1 mg d'hydroxyde d'aluminium.En outre, pour démonter que certains de ces produits conjugués ont la propriété de supprimer la réponse réaginique anti-BPO, on sensibilise les animaux par 10 g de BP04-OA en présence d'hydroxyde d'aluminium 4 semaines plus tard. Tableau III - L'effet de la densité d'épitopes sur les propriétés immunologiques des produits conjugués BPOx-M&gamma;G Traitement des Jours après Titre PCA anti-BPO animaux par (a) l'immunisation primaire ou primaire secondaire secondaire BPO1-M&gamma;G 7 > 10 1 080 14 380 1 500 21 350 980 BPO2,9-M&gamma;G 7 > 10 760 14 14 334 1 350 21 180 880 BPO4,3-M&gamma;G 7 > 10 330 14 90 460 21 > 10 230 BPO11-M&gamma;G 7 > 10 100 14 25 120 21 > 10 64 BPO19-M&gamma;G G 7 ( 10 250 14 80 280 21 BPO31-M&gamma;;G 7 > 10 810 14 > 90 1 210 21 9 10 640 Témoin (b) 7 > 10 810 14 350 1 410 21 290 890 (a) des groupés de souris reçoivent, le jour 0, des injections i.v. de 1 mg des différents produits conjugués à nombre varia ble de groupes EPO combinés par molécule isologue de &gamma; -globu- line et, 4 heures plus tard, on administre à toutes les souris par voie i.p. la dose sensibilisante standard de 10 P g de BPO4-OA mélangé à 1 mg d'Al(OH)3. On mesure la réponse réagi nique anti-3PO primaire au bout de 7, 14 et 21 jours.Le 28ème jour, toutes les souris reçoivent par voie i.p. une deuxième dose sensibilisante normale de 10 g de EP04-OA avec 1 mg d'Al(OH3) et on mesure à nouveau la réaction réaginique secon daire au bout de 7, 14 et 21 jours. (b) les souris témoins reçoivent seulement la dose sensibilisante de 1Og de SP04-OA en présence d'Al(OH)3, les jours O et 28. Comme l'illustre le Tableau III, le produit conjugué à teneur modérée en haptène, BPO11WM gG est la plus efficace car, outre qu'il supprime l'induction de la réponse anti-BPO primaire, il a pour effet que les souris ne répondent que faiblement à l'injection sensibilisante secondaire. les produits conjugués à faible teneur en haptène telles que BrO1-M &gamma; G et 3P02,9-M gG n1 ont pas d'influence sur la réponse réaginique anti-EPO primaire ou secondaire.Toutefois, l'administration de BPO4,3-M&gamma;G ou BPO10-M&gamma; G cause une suppression partielle de la réponse réaginique anti-BPO primaire et les animaux restent partiellement sans réponse, mdme après l'injection sensibilisante secondaire de BP04- OA. Le produit conjugué à haute teneur en haptène, BPO31-M&gamma;G, ne cause qu'une suppression partielle apparente de la réponse IgE primaire anti-BPO car les souris qui ont reçu ce produit développent une réponse IgE secondaire.Cela indique que les produits conjugués à forte teneur en haptène sont non-tolérogènes. Aucun des produits conjugués BPOx-M &gamma;G essayés n'a d'effet sur la réponse réaginique anti-OA. Pour simplifier la présentation des résultats du Tableau III, les réponses réaginiques anti BPO secondaires maximales détectées le 42ème jour pour les différents groupes de souris recevant des produits conjugués BPO-M hG à différente densité d'épitopes, sont portées sur la figure 3, sous la forme de pourcentages du titre PCÂ des souris sensibilisées témoins; la capacité tolérogène des t-globulines à teneur modérée en haptène (BPO4,3-M&gamma;G, BPO11-M &gamma;G et BPO19-M&gamma;G) est ainsi bien évidente. De ce qui précède, on peut conclure que le produit conjugué de l'invention supprime la formation d'IgE par les cellules lymphoides et on suppose que cela s'effectue par l'interaction des anticorps IgE fixés à la membrane cellulaire et du produit conjugué ici décrit, ce qui rend la cellule incapable de produire des anticorps IgE anti-SPO supplémentaires. L'homme de l'art comprendra que le traitement d'autre humains au moyen du produit conjugué de l'invention diffère notablement à plusieurs égards. On utilisera le produit conjugué dans le traitement d'humains qui sont déjà sensibles à la pénicilline et, ainsi, les étapes de sensibilisation utilisées chez la souris ne seront pas applicables. En outre, il est prévu que les humains réagiront de la façon allergique typique à l'histamine libérée par les mastocytes et les basophiles lors de l'injection du produit conjugué, alors que les souris ne présentent pas de telles réactions.Il est donc évident qu'un traitement thérapeutique comportant l'immunosuppression des anticorps IgE anti-SPO chez l'homme par administration de produits conjugués de BPO et de &gamma; -globulines humaines pourrait nécessiter : (1) l'administration simultanée de médicaments antiallergiques ou (2) l'administration de produits conjugués monovalents du type SPO-ELYS décrit plus haut, ou (3) les deux à la fois. En outre, sur la base des faits présentés tant pour le système d'anticorps DNP-IgE que pour le système d'anticorps EPO-IgE, on suppose que ce traitement pourrait s'étendre à la suppression d'allergies à d'autres molécules d'antibiotiques par administration de produits conjugués de d -globulines humaines et de molécules de l'antibiotique en question. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un produit conjugué non immunogène propre à supprimer la formation d'anticorps réaginiques chez un hôte, caractéris en ce que l'on fait réagir de la pénicilline, en présence d'un sel, à un pH d'environ 9,8, avec de la i-globuline de l'hôte, en des proportions telles que le produit conjugué obtenu comprenne 4,3 à 19 groupes benzylpénicilloyle par molécule de i -globuline. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la pénicilline est présente en une proportion telle que le produit conjugué comprenne 9 à t2 groupes benzylpénicilloyle par molécule de Y -globuline. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le sel est le carbonate de potassium, le carbonate de sodium ou un mélange de carbonate de sodium et de bicarbonate de sodium. 4. Produit conjugué utile pour supprimer la formation d'anticorps réaginiques chez un hôte, caractérisé en ce qu'il est formé de groupes benzylpénicilloyle conjugués à de la &gamma;-globu- line de l'hôte, le produit conjugué contenant une moyenne de 4,3 à 19 groupes benzylpénicilloyle par molécule de &gamma; -globuline. 5. Produit conjugué selon la revendication 4, caractérisé en ce que le produit conjugué contient une moyenne de 9 à 12 groupes benzylpénicilloyle par molécule de &gamma; -globuline. 6. Procédé pour supprimer la formation d'anticorps anti-benzylpénicilloyle chez une personne sensible à la pénicilline, caractérisé en ce que l'on injecte à la personne, d'une façon pharmaceutiquement acceptable, un produit conjugué selon la revendication 1 ou 2.