FR 2343429 A1 19771007 FR 7606677 A 19760309 La présente invention réalisée au centre de recherche de l'Office de la Recherche Scientifique et Technique Outre-Mer PA9XIS-VIIIèm.e et au centre de recherche d 14institut National de la Recherche Chimique Appliquée de Vert-Le-Petit, concerne l'enrichissement en protéinesde produit comestibles solides et notamment des produits et sous produits de l'industrie agricole alimentaire. La pénurie mondiale de protéines alimentaires est préoccupante et ne peut manquer de s'aggraver à brève échéance. En effet la croissance démographique actuelle implioue une augmentation de plus en plus importante de la consommation de viande et de protéines végétales et on s' accorde à penser que dans de nombreux pays ni les importations ni l'accroissement des productions nationales de protéines a'origine végétale ou animale ne suffi ront à couvrir ces besoins. I1 est donc nécessaire d'envisager les possibilités offertes par les protéines non conventionnelles et tout particulièrement par les protéines de microorganismes tels que les bactéries, les algues, les levures et les champignons microscopiques que nous appelerons ci-après moisissures. La production industrielle de levures et de bactéries à partir d'hydrocarbure est déjà une réalité. Elle repose sur la culture en milieu liquide de microorganisme sur des substrats industriels dérivés du pétrole (paraffine et méthanol). Après croissance ces microorganismes sont séparés du substrat liquide et séchés pour fournir un concentré de protéinn titrant 45 à 65 % de protéines. Ce concentré est essentiellement destiné à compléter les rations alimentaires animales. La mise en oeuvre de tels procédés fait appei à une technologie relativement complexe nécessitant des investissements très élevés.L'optimisation de cette production conduit à la mise en place d'installationade tarl- les importantes et à la construction de véritables complexes in dustriels. En outre ce type d'usine produit des effluents souvent très polluants dont le traitement- avant rejet peut outre très onéreux. Une autre possibilité pour préparer des protéines alimentaies de microorganismes consiste à utiliser des substrats comestibles de type agricole, pauvres en protéines mais riches en calories (féculents, produits amylacés ou cellulosiques) et à cultiver des microorganismes sur ce substrat carboné afin d'ob tenir un produit suffisamment riche en protéines pour qu'il puisse outre consommé tel quel ou après dessication globale. Il s'agit donc en fait d'enrichir directement le produit agricole en protéines de microorganismes. Contrairement auxproductions industrielles de microorganismes il est intéressant dans ce cas de développer une technologie suffisamment simple pour qu'il soit possible de réaliser des unités de production de taille modeste permettant la mise en place d'un système intégré regroupant la culture du substrat agricole, l'en- richissement en protéines dudit substrat et l'utilisation du produit obtenu pour l'alimentation animale. Toutefois il faut constater que les seuls procédés développés dans cette optique (Voir par exemple le brevet français 129 2238) ont été des procédés en milieu liquide qui présentent les mêmes inconvénients que les procédés industriels précédents : - dimension importante des installations pour des raisons d'optimisation - appareillage coûteux notamment pour l'agitation et l'aération du milieu de culture - dépense énergétique importante pour la récolte et la dessication des milieux après culture ; et - pollution par les affluents de ces procédés, en outre dans le cas particulier ou l'on traite des résidus agricoles le coût de transport des matières premières jusqu'à l'usina rend souvent le prix de revient du produit prohibitif. Enfin lorsque dans ce type de procédé on utilise comme mi croovganismes des bactéries ou des levures il est nécessaire de prévoir également une étape de destruction de la membrane pour rendre le produit digestible ; par contre si l'on utilise comme microorganismes des moisissures qui sont directement digestibles l'agitation ne peut être maintenue qu'au prix d'une dépense énergétique importante tant le produit devient épais. Il était donc intéressant de rechercher une technique permettant de pallier les inconvénients de ce type de culture. Dans cette optique la culture en milieu solide se présente comme une voie prometteur mais n'a pas connu de développement ailleurs que dans les techniques classiques de laboratoire car le rendement de l'opération étant fonction de la surface de contact du milieu avec l'air il ne semble pas possible d'obtenir, à quantité de substrat sec égal, un rendement en protéines égal ou mÇme simplement voisin de celui de la culture liquide par la mise en oeuvre d'un procédé en milieu solide. En outre, il n'existe pas jusqu'à présent un procédé simple et peu coûteux permettant d'éliminer la contamination de la culture par d'autres microorganismes et permettant en outre d'empêcher la sporulation des microorganismes, sporulation qui conduit à un produit difficilement commercialisable. Or la présente invention propose un procédé de culture en milieu solide dont le rendement en protéines est pratiquement le même que celui des procédés en milieu liquide et dans lequel la contamination et la sporulation sont éliminées par un moyen simple ; ce procédé peut en outre être mis en oeuvre dans des unités de petites dimensions avec un nombre de manipulations préalables très faible. Pour ce faire la présente invention propose un procédé pour l'enrichissement en protéines de substrats comestibles dans lequel : - ledit substrat sous formé divisée est additionné d'agent de culture - le mélange obtenu est aggloméré et ensemencé à l'aide d'au moins une souche de moisissure aérobie, non pathogène et non toxique ; - les agglomérats obtenus sont placésdans un réacteur pourvu d'un dispositif d'aération continue forcée ; - les agglomérats sont incubés - après incubation les agglomérats enrichis en protéines fongiques sont récupérés. Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon la présente invention le substrat comestible est un produit ou un sous produit de l'industrie agricole alimentaire et'plus particulièrement un produit amylacé tel que les graines de céréales, les farines de céréales et autres résidus de l'industrie céréalière, la.pomme de terre, le manioc, la patate douce, le riz, le tapioca, la banane et ses écarts de triage, etc. Dans ce cas, la (ou les moisissures) utilisée est choisie parmi les moisissures à activité amylolytique, assimilant les sucres et est de préférence choisie parmi les genres AsperRillus, Rhizopus, Penicirlium et Mucor, par exemple les espèces Aspergillus, niger, Aspergillus oryzae, mucor racemosus, et hizous oryzae. Parmi ces genres et ces espèces on utilise de préférence les souches présentant une activité amylolytique élevée, une croissance rapide sur le substrat même à pH acide et une teneur élevée du mycelium en protéines. lie substrat lorsqu'il est sous forme solide peut outre mis sous forme divisée par broyage. Le mélange obtenu est aggloméré par un procédé quelconque mais qui de préférence devra conserver aux agglomérats obtenus une certaine porosité. Ainsi dans le mode de mise en oeuvre préféré u procédé selon la présente invention le broyat est aggloméré en présence d'une solution aqueuse contenant éventuellement des agents de culture, puis la pâte obtenue est tamisée pour se présenter sous forme de grains qui ont de préférence un diamètre inférieur à 4 mm. Dans ce mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention la structure granulaire poreuse avec des grains de faible diamètre constitue une caractéristique tout à fait intéressante par le fait que les grains ainsi formés - constituent un garnissage de choix pour des colonnes réactionnelles ;; - présentent lorsqu'ils sont empilés une structure poreuse permettant la pénétration du mycelium des moisissures dans et autour des grains - présentent une grande surface de contact avec l'air mais - présentent toutefois des interstices de amension très faible qui empêche la sporulation et qui en outre permet en limitant le débit de l'aération d'assurer la croissance des moisissures sans permettre un bon développement des bactéries ou des levures-dont les besoins en oxygène sont en général supé rieurs- à ceux des moisissures. Lacontamination pourra en outre être encore limitée par une méthode chimique comme nous le verrons ci-après. Les agents de culture utilisés seront essentiellement des composés azotésen particulier des sels minéraux azotés tels que les sels àtammonium, les sulfates ou phosphates par exemple, ou des composés organiques tels que l'urée. On peut également pré voir d'introduire des olîgoéléments tels que des sels de magné- sium. Ces agents de culture seront toutefois choisis de préférence en fonction d'un critère particulier qul est leur pouvoir tampon, en effet il a été constaté qu'il était excessivement intéressant que les agglomérats conditionnés présentent un pH acide en particulier un pH inférieur à 4. En effet, à cette valeur du pH la moisissure continue à se déelopper de façon satisfaisante alors que la croissance des bactéries et levures est complètement inhibée. Or, il est intéressant de pouvoir maintenir le pH à une valeur déterminée préalablement qui permet tout en limitant la croissance bactérienne et la croissance des levures de ne pas géner la'croissance de la moisissure qui lors de son développement a tendance à acidifier le milieu. C'est pourquoi les agents de culture seront choisis de manière à tamponner le pH des agglomérats.Pour cela on utilisera par exemple comme source d'azote le phosphate d'ammonium ou bien un mélange de sulfate d'ammonium et d'urée, ceci permet en utilisant une quantité d'urée -correspondant à 20 ou 30 yo de l'apport d'azote total par exemple une régulation autogène du pH qui partant d'un produit conditionné à pH 4,5 maintient le pH des agglomérats à une valeur de 3,5 environ en cours d'incubation. Pour conditionner le pH des agglomérats à une valeur inférieure à 4 on utilisera de préférencé lors de l'agglomération une solution aqueuse acide, acidifiéepar un acide quelconque de préférence un acide minéral ouaaCi:ique, 3e pH des so2iitn étant de l'or- dre de 3 ce qui conduit au produit conditionné de pH 4,5. Au cours de l'incubation le pH pourra ainsi s'acidifier jusqu'à une valeur de l'ordre de 3,5 à 4 (mesuré pour 10 g de produit dans 100 ml d'eau). L'ensemencement des agglomérats est effectué de préférence par un ensemencement uniforme à l'aide de spores de la souche de moisissure utilisée. Lors de l'agglomération des mélanges la quantité d'eau uti lisée constitue un paramètre important de l'incubation elle devra être telle que les agglomérats obtenus contiennent de 35 à 70 eó d'eau et de préférence de 50 à 55 5' d'eau. En effet avec des agglomérats trop secs la croissance du mycelium est ralentie et au-dessus de 55 20 d'eau au départ l'enrichisseraent en protéines n'augmente pas sensiblement par contre les risques de contaminations bactériennes sont plus élevés surtout pendant les quelques premières heures d'incubation représentant la phase de germination des spores. Au cours de l'incubation il se produit d'ailleurs une humidification progressive du produit et en partant d'un taux d'humidité de 50 2vó on obtient un produit enrichi contenant environ 63 % d'eau. Cette humidification n'est d'ailleurs pas liée à la seule perte de poids sec car la quantité d'eau totale dans l'é- chantillon augmente en fonction de l'enrichissement en protéines et la croissance du mycelium et provient vraisemblablement de l'eau métabolique produite lors de la dégradation du glucose. Le réacteur utilisé pour l'incubation peut présenter une forme quelconque et être réalisé en un matériau également quelconque dans la mesure où celui-ci n'est pas corrodé par les produits de la réaction, mais on utilisera de préférence des réacteurs allongés de type colonne de réaction qui facilitatl'aé- ration forcée et limiStla surface de contact avec l'air extérieur. Le réacteur devra être muni d'un dispositif d'aération forcée continue et de préférence cette aération forcée devra être réalisée avec de l'air humide de préférence de l'air saturé en eau. Cette aération peut être réalisée par de nombreux dispositifs simples par exemple en insufflant danse réacteur de l'air comprimé ayant barbotté dans leau ou à travers une colonne d'humidification. Le débit d'aération sera de préférence compris entre 0,1 et 0,5 1 d'air/h.g d'agglomérat et sera en général de l'ordre de 0,2 l/h.g. La forme et le conditionnement des agglomérats assurent une excellente circulation d'un flux d'air saturé en eau et l'aération forcée continue évite la dessication ou l'humidification du' produit fermenté, permet un bon transfert d'oxygène et permet en outre d'évacuer les calories produites par l'incubation. Le petit diamètre des agglomérats permet un tassement régulier dans le réacteur qui évite la sporulation même avec des moisissures qui ont une très forte tendance à sporuler sur milieu solide. Dans le cas ou l'on désire augmenter la porosité des agglomérats entre eux on peut introduire d'autres substrats comestibles solides dans le réacteur par exemple des morceaux du substrat non broyé ou d'autres produits solides tels que des coques d'arachides par exemple. Ce procédé conduit à un produit comestible qui est envahi par le mycelium qui se développe aussi bien à l'intérieur qu'à la surface des grains qui. se trouvent ainsi reliés entre eux, ce qui conduit à une masse solide spongieuse et aérée du produit enrichi en protéines. Ainsi dans un mode de mise en oeuvre intéressant du procedé selon I présente invention lorsque le produit comestible utilisé est un produit amylacé celui-ci est cuit à la vapeur pour obtenir l'éclatement des parois cellulaires et la libération des grains d'amidon ; le produit est ensuite séché par un.courant d'air chaud et sec puis réduit en poudre. Dans le volume d'eau nécessaire pour amener le produit à l'humidité désirée (40 à 65 56) on dissout les sels minéraux indispensables à la croissance du mycelium (phosphate de potassium, sulfate d'ammonium, urée) et on ensemence à l'aide de spores. Le pH est ajusté à 3 et le liquide obtenu. est ajouté progress-ivement à la farine qui est malaxée de façon àcbtenir une pâte homogène.Celle-ci est passée à travers un tamis dont 11 ouverture des mailles est 4 mm. On obtiént alors un produit granuleux que l'on-peut transférer dans le réacteur. Par exemple, ce réacteur peut se présenter sous la forme d'éléments allongés en forme de tube comme ceux de la figure 1 qui comportent une partie de réaction proprement dite 1 contenant des agglomérats 2 et un dispositif d'aération forcée par de l'air humide 3. La partie de réaction proprement dite t est constituée par un tube en verre ouvert aux deux extrémités dont l'une des extrémités 4 comporte un support perforé 5 destiné à soutenir les agglomérats, l'extrémité 4 plongeant par un embout dans le dispo- sitif d'aération 3 constitué par un tube en verre 6 contenant de l'eau dans laquelle on fait buller de l'air comprimé par un aju- tage 7 l'air ainsi saturé d'eau est ensuite forcé à travers l'extrémité 4 de la portion 1 du réacteur et à travers la masse des agglomérats.La partie supérieure 8 de la portion I est recouverte par un disque d'obturation 9 qui laisse circuler l'air et empêche la sporulation en surface. Le réacteur tel qu'il vient d'être décrit a été utilisé pour la mise en oeuvre de l'invention sous forme d'une batterie de 24 de ces réacteurs ayant une hauteur totale de 27 cm et un diamètre de l'ordre de 22 mm. Les essais ont porté sur l'enrichissement du manioc en utilisant une souche d'Aserillus niger sélectionnée pour ses caractéristiques utiles dans la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention. Les tubercules entiers de manioc sont cuits à la vapeur 15 mn à 1100C. Le produit ainsi obtenu est séché et broyé pour oDtenir une farine contenant environ 8 56 d'eau. On prépare une solution aqueuse permettant d'amener le produit aggloméré à une humidité de 50 56 et qui contient 5 g de phosphate monopotassique, 11,25 g de sulfate d'ammonium et 1,7 g d'urée pour 100 g de farine (ceci corresppnd à 25 56 d'azote apporté sous forme d'urée). On ajoute I'inoculum de spores d'Aspergillus niger et le pli de la solution est ajusté à 3 à l'aide d'un acide. Le liquide est ajouté progressivement à la farine jusqu'à obtention d'une pâte homogène que l'on agglomère par tamisage pour obtenir des agglomérats présentant un diamètre inférieur à 4 mm. Les agglomérats obtenus sont introduits à raison de 20 g pour chacun des 24 éléments du réacteur qui sont alors placés dans un bain marie à 300C pour démarrer l'incubation. L'aération est réglée à4 l/h par élément (0,2 l/h.g). On détermine les différentes données de la réaction eré- levant à chaque fois 4 éléments. La figure 2 annexée montre l'évolution des différents paramètres de la réaction en fonction du temps, la courbe i montre l'évolution du taux de protéine en fonction du temps, la courbe 2 l'évolution du taux d'humidité, la courbe 3 les variations du pH, la courbe 4 les variations du taux de sucre et la courbe 5 la variation du poids sec. L'étude comparative de ces courbes montre qu'il existe un optimum du procédé qui est atteint après environ 30 heures le produit enrichi à ce stade comptant 17 56 de protéines et 26 56 de sucre par rapport au poids sec.En tenant compte des pertes de poids et pour 100 g de farine au départ on obtient 76 g de produit sec enrichi contenant 13,5 g de protéine (mesurée suivant la méthode de LOWRY avec le réactif de Folin oiocalteu) et 19,8 g de sucre résiduel. On obtient ainsi un ren dement de transformation des sucres en protéines de 17 %, tout à fait comparable au rendement obtenu avec la mAme souche cultivée en milieu liquide aéré. Des essais ont égalent été réalisés avec dtautres souches de moisissures en particulier avec un Rhizonus oryzae CBS 329 47 qui ont conduit à des enrichissements correspondant respectivement à 51,83 et 57 56 de ceux obtenus avec AsPergillus niger. D'autres essais réalisés avec les souches suivantes Aspergillus oryzae CBS 125 59 Rhizotus oligosporus CBS 324 35 Nucor racemosus C3S 115 08 ont également donné des résultats satisfaisants. Des essais réalisés en utilisant d'autres substrats agricoles en particulier des pommes de terre séchées complétés par des sels minéraux ont permis d'obtenir les enrichissements en protéines de l'ordre de 7 à 15 56 en utilisant la souche d'Aspergillus niger précédemment citée. Compte tenu de ce qui précède, la présente invention permet d'enrichir en protéines un substrat amylacé solide grâce à la croissance aérobie et au développement sélectif du mycelium d1une moisissure amylôlytique. Elle permet d'obtenir après 30 heures d'incubation, un produit structuré contenant 17 'A de protéines ou plus, ayant de bonnes qualités organoleptiques, Le procédé d'enrichissement fait appel à une technologie très simple qui permet d'envisager ltinstallation d'unités de production de taille modeste ne nécessitant pas des investisse- ments très importants. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la prépanition de produits destinés à l'alimentation humaine ou animale par enrichisement en protéines de substrats comestibles non cellulosiques, dans lequel - ledit substrat sous forme divisée est additionné d'agent de culture - le mélange obtenu est aggloméré et ensemencé à l'aide d'au moins une souche de moisissure aérobie, non pathogène et non toxique - les agglomérats obtenus sont placés dans un réacteur pourvu d'un dispositif d'aération continue forcée - les agglomérats sont incubés - après incubation les agglomérats enrichis en protéines fcngiques sont récupérés. 2. Procédé pour la préparation de produits destinés à l'alimentation humaine ou animale par enrichissement en protines de substrats comestibles non cellulosiques, dans lequel - ledit substrat solide est broyé - le broyat obtenu est éventuellement additionné d'agents de culture ; - le mélange obtenu est aggloméré et ensemencé à l'aide d'au moins une souche de moisissure aérobie, non pathogène et non toxique; - les agglomérats obtenus sont placés dans un réacteur pourra d'un dispositif d'aération forcée - les agglomérats sont incubés et - après ineubation les agglomérats enrichis en protéines fongiques sont récupérés. 3. Procédé selon L'une des revendications i et 2, caracté- risé en ce que ledit substrat comestible non cellulosique est constitué par un produit amylacé et que la moisissure utilisée est choisie parmi les souches de moisissures à activité amylolytique assimilant les sucres. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les souches de moisissures utilisées sont choisies parmi les genres Aspergillus, Penicillium, Rhizopus et -Ücor. 5. Procédé selon la revendication , caractérisé en ce que les souches de moisissures sont choisies parmi les espèces AsDergillus niger, Aspergillus oryzae, mucor racemosus, Rhizopus oryzae et Rhizopus oligosporus. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caracté risé en ce-que les agglomérats sont des grains ayant un diamètre inférieur à 4 mm. 7. Procédé selon l'une des revendications i à'6, caractérisé en ce que les agents de culture sont des conposés azotes. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les agents de culture sont choisisparmi les sels d'ammonium et l'urée 9. Procédé selon l'une des revendications 7 et 8, caractérisé en ce que les agents de culture sont choisis pour tamponner le pH des agglomérats. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9 > caracte- risé en ce que le mélange est aggloméré en présence d'eau, il . Procédé selon la revendication10, 10, caractérisé en oye que le pli de l'eau utilisée est inférieur à 5. 12. Procédé selon l'une des revendications 10 et 11, carac térisé en ce que l'eau est ajoutée en une quantité telle que la teneur en eau des agglomérats soit comprise entre 35 et 70 est en poids. 13.. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la quantité ajoutée est telle que la teneur en eau des aggloméré rats soit comprise-entre 50 et 55 % en poids. t4. Procédé selon lxune des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'ensemencement es-t effectué- à l'aide de spores. -1i, Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le substrat solide utilisé est préalablement cuit à la vapeur. 16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que l'aération forcée est effectuée par de l'air humide sous pression. 17. Procédé selon la revendication 16, carac-térisé en ce que l'aération est effectuée à raison de 0,1 à 0,5 l/h.g d'air glomérat, 18. Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce qu'on introduit dans le réacteur outre les agglomérats des produits solides comestibles destinés à servir de support. 19. Produits obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 18.