FR 2311007 A1 19761210 FR 7514696 A 19750512 La présente invention est relative à un procédé de préparation de la 4-hydroxy L (-) proline, plus couramment dénommée L hydroxyproline. Les procédés de préparation de la L hydroxyproline sont nombreux et peuvent être classés en plusieurs groupes. Dans un premier groupe, on réalise la synthèse du composé. En raison des deux atomes de carbone asymétriques, on obtient un mélange de 4 isomères : L et D hydroxy-proline, L et D allohydroxyproline dont la séparation est difficile. Dans un second groupe de procédés, on réalise l'isolement de la L-hydroxyproline à partir d'hydroxysats de gélatine par précipitation. L'arginine est d'abord précipitée, le plus souvent par l'acide 2,4-dinitro-l-naphtol-7-sulfonique (acide flavianique). On élimine ensuite les acides aminés les plus gênants : lysine et histidine à l'état de phosphotungstates, et/ou glycocolle par l'alcool méthylique. L'hydroxyproline peut alors être précipitée à l'état de reineckate ou de picrate, le composé obtenu devant ensuite être décomposé. La précipitation à l'état de N-acétyl-Obenzoylhydroxyproline a aussi été décrite. Ces procédés sont difficiles à mettre en oeuvre et emploient des produits coûteux et de grandes quantités de solvants. Un troisième groupe de procédés consiste à traiter un hydrolysat de gélatine par le nitrite de sodium. Tous les acides aminés sont détruits par désamination, et donc irrécupérables, sauf la proline et l'hydroxyproline qui sont nitrosées. Cette étape pose des problèmes de sécurité et d'environnement, de même que la suivante qui est la dénitrosation. Aucune technique permettant industriellement l'isolement de l'hydroxypSoline à l'aide d'échangeurs d'ions n'a été décrite à notre connaissance. On connaît cependant des méthodes de séparation d'acides aminés qui devraient pouvoir être appliquées à la séparation d'hydroxyproline. Les principales sont énumérées ci-dessous. Une première technique consiste à faire passer l'hydrolysat de protéine sur des colonnes d'échangeurs, le plus souvent carboxyliques, tamponnés à des pH de l'ordre de 3 à 7 par des acétates, citrates ou autres sels. Ceci permet de ne retenir à chaque fois que un ou quelques acides aminés, en fonction de la résine, du pH et de la force ionique du tampon. Toutefois, si les tampons rendent les échangeurs d'ions plus sélectifs, ils en di minuent beaucoup la capacité, ce qui oblige à en utiliser de très grands volumes. Une seconde technique consiste à fixer tous les acides aminés sur un échangeur acide et à réaliser une élution sélective par des tampons de pH et de force ionique constante ou croissante, ou parfois par un acide ou une base. Les volumes d'échangeurs sont ici encore très grands, et on n'obtient que des solutions diluées, contenant le plus souvent en quantités importantes les ions ayant servi à l'élution. Ce principe a surtout donné lieu à des applications analytiques. Enfin, il existe une technique "par déplacement, décrite par J.R. BENDALL, Nature (1947) vol. 160 p. 374 et S.M. PARTRIDGE Biochem. Jour. (1952) vol. 51 p. 628 dans laquelle un hydrolysat débarrassé des acides aminés aromatiques est fixé sur un échangeur fortement acide sous forme hydrogène de façon à utiliser la moitié ou les deux tiers de la capacité totale. On élue alors à la soude très diluée pour obtenir des acides aminés partiellement séparées. Si dans cette technique le volume d'échangeur est notablement diminué, il reste que l'élimination des acides aminés aromatiques exige de très grandes quantités de noir actif, et que les produits recueillis snnt très dilués. Comme pour les deux précédentes, cette technique n'a jamais été appliquée avec succès à la préparation de l'hydroxyproline. La présente invention a pour but de remédier aux inconvénients mentionnés ci-dessus en fournissant un procédé de préparation de l'hydroxyproline n'utilisant que des volumes réduits d'échangeurs d'ions sans emploi de tampons, et permettant d'utiliser éventuellement comme produits de départ des produits pauvres en collagène qui ne pouvaient pas convenir jusqu'à présent à la fabrication de l'hydroxyproline. La présente invention a pour objet un procédé de préparation de la L (-) hydroxyproline, caractérisé en ce qu'on décolore un hydrolysat de protéine contenant du collagène, on fait passer la solution obtenue sur un échangeur faiblement basique pour retenir les acides glutamique et aspartique et les anions minéraux, puis on fait passer la solution sortant du premier échangeur sur un échangeur fortement acide disposé en une quantité calculée pour retenir de 75% à 95% des acides aminés présents dans la solution, on recueille la solution par passage d'eau sur l'échangeur, on concentre la solution à 180 - 350 g/l d'hydroxypro line, et de préférence 230 à 280 g/l, on la décolore et on cristallise après acidification à pH 3,8 - 4,6 pour récupérer l'hydroxyproline pure sous forme de cristaux. Les produits de départ sont préparés par hydrolyse de la matière première dans le cas ou celle-ci est une protéine. La gélatine donne les meilleurs rendements. Mais une des originalités du procédé est qu'il permet d'utiliser des protéines industrielles assez pauvres en collagène (et donc en hydroxyproline) et pouvant être riches en impuretés minérales ou non. La transformation préalable de la peau ou des jus de cuisson d'os en gélatine est inutile. Des sous-produits industriels à base de peau, voire même des cartilages, peuvent servir de matière première. Des hydrolysats de collagène, même très impurs, sont utilisables sans hydrolyse préalable et constituent donc une excellente matière première. L'hydrolyse peut être effectuée par n'importe quel acide fort, comme par exemple les acides chlorhydrique ou sulfurique. De nombreux procédés sont connus. On peut alors éliminer l'acide, en totalité ou en partie, par une méthode connue telle qu'une concentration sous vide pour l'acide chlorhydrique, et une précipitation à la chaux pour l'acide sulfurique. Cette élimination n'est pas obligatoire. I1 faut cependant, soit par élimination, soit par dilution, amener la concentration en acide en dessous de 4 N et de préférence en dessous de 2,5 N. Selon l'invention, on réalise tout d'abord une décoloration à l'aide d'un charbon actif ou de préférence par passage sur une résine décolorante. On peut utiliser à cet effet par exemple une résine duolite S 30, ou duolite ES 861, de la société DIA-PROSIM, 107, rue Edith Cavell 94 Vitry. La décoloration n'est pas absolument nécessaire à ce stade, mais elle présente l'avantage de protéger les autres résines situées en aval, et tend à améliorer l'efficacité des purifications effectuées par ces résines. Par ailleurs, il est possible de réaliser cette étape de décoloration à un autre stade du procédé ou de réaliser ure ou plusieurs décolorations supplémentaires. On fait alors passer l'hydrolysat sur un échangeur d'anions de faible polarité, c'est-à-dire faiblement basique, mis préalablement sous forme OH. Cet échangeur retient totalement l'acide ayant servi à l'hydrolyse, ou ce qui en est resté après élimination. De plus, il retient au moins les deux tiers des acides glutamique et aspartique, et de préférence les 9/10e. L'échangeur faiblement basique peut être par exemple une résine duolite A 366 de DIA PROSIM ou une Amberlite IR 45 de la société ROHM & HAAS. I1 sera avantageusement réparti en deux colonnes fonctionnant en série. L'avantage principal d'une faible polarité pour l'échangeur d'anions est que la régénération est moins onéreuse que dans le cas d'une forte polarité, alors que l'efficacité du traitement est parfaitement suffisante. La solution est alors passée sur un échangeur de cations, qui doit être obligatoirement de forte polarité. Il est toutefois possible de rendre sa régénération plus économique en le protégeant par un échangeur faiblement acide, disposé immédiatement en amont. Celui-ci fixe les cations qui sont les plus difficiles à déplacer lorsqu'ils sont fixés sur un échangeur fort. On peut utiliser dans ce rôle de protecteur une résine Amberlite IRC 50 de ROHM & HAAS ou Duolite C 464 de DIA PROSIM. Le régénérant,lors de la phase de régénération,passera en sens inverse de la solution à traiter, c'est-à-dire en commençant par l'échangeur fort. L'échangeur de cations de forte polarité (fortement acide) est capable de retenir tous les acides aminés,s'il est en quantité suffisante. I1 s'agit ici de limiter la quantité d'échangeur de façon à ce qu'il soit saturé avant d'avoir fixé tous les acides aminés introduits. Le volume exact dépend de la capacité de l'échangeur, qui varie souvent d'un lot à l'autre, de la teneur de l'hydrolysat en cations, de la présence de l'échangeur de protection mentionné ci-dessus. Le calcul doit être fait pour que 75 à 95% des acides aminés introduits soient fixés. On retiendra de préférence de 75 à 85% dans le cas d'une matière première très riche en hydroxyproline comme un hydrolysat de gélatine, et de 85 à 95% dans le cas d'une matière première pauvre en hydroxyproline. Comme échangeur fortement acide, on peut utiliser par exemple une résine Duolite C 25 D fournie par DIA PROSIM ou une résine Amberlite IR 120 fournie par ROHM & HAAS. La capacité de ces résines est de lwordre de 2 équivalents par litre. Il en faut 2,5 à 6 litres pour traiter 1000 grammes d'acides aminés. Un trop grand volume de résine fortement acide conduit à un rendement en hydroxyproline faible ou nul ; par contre, un défaut de résine conduit à un enrichissement trop faible pour que la cristallisation du produit obtenu donne un produit suffisamment pur. I1 est trop difficile d'obtenir à la fois un bon rendement et un fort taux de purification si la résine n'est contenue que dans une seule colonne. Deux colonnes égales donnent de bons résultats mais on préfère utiliser une première colonne de capacité plus grande que la deuxième. L'échangeur de cation est utilisé sous forme H+ On n'utilise aucun tampon ou réactif d'élution qui nécessite une séparation ultérieure. I1 convient de régler de façon très précise la quantité d'acides aminés introduits sur l'échangeur de cation. En effet, une variation du taux d'humidité de la matière première, ou une perte de solution à un stade précédent peuvent conduire à l'inconvénient signalé précédemment en ce qui concerne l'excès ou le défaut de résine. I1 est possible, pour remédier à cet inconvénient, de contrôler par exemple la quantité d'acides aminés introduite. Dans le cas d'un excès, on oeut éliminer la quantité supplémentaire ou, dans le cas d'un défaut, on peut compléter à une teneur constante en azote aminé par addition d'ammoniaque. La régénération des échangeurs ne pose pas de problèmes particuliers. On emploie généralement la soude ou l'ammoniaque de 1 à 4 N pour l'échangeur basique, l'acide chlorhydrique ou sulfurique de 1,5 à 4 N éventuellement précédé par une élution à l'ammoniaque pour le ou les échangeurs acides, et enfin la soude ou l'ammoniaque de 0,3 à 3 N, éventuellement suivie par 0,2 à 2 moles/l d'acide chlorhydrique pour la résine adsorbante. La solution obtenue après passage sur la résine fortement acide est de couleur jaune paille, présente un pH de 3,8 à 5 et de préférence de 3,9 à 4,5, et cnntient, en fonction notamment de la dilution de l'hydrolysat, de 5 à 40 g/l d'hydroxyproline et de préférence de 20 à 35 g/l. Si les opérations précédentes ont été correctement réalisées, et notamment si la quantité d'acides aminés à traiter par litre d'échangeur a été bien calculée, l'éluat contient, pour 100 grammes d'acides aminés, de 30 à 60 grammes d'hydroxyproline, et de préférence 35 à 50 grammes. Avant l'étape de cristallisation, il est nécessaire de concentrer, et en général de décolorer, l'ordre de ces deux opérations n'étant pas déterminant. Il est possible de faire une pré- concentration suivie d'une décoloration et d'une concentration finale. On concentre jusqu'àobtention d'une solution faiblement colorée en jaune contenant d'environ 180 à 350 g/l d'hydroxyproline, et de préférence de 230 à 270 g/l environ. S'il y a lieu, on acidifie le concentrat avec une faible quantité d'acide acétique ou formique, de façon à obtenir un pH de 3,8 à 4,6, et de préférence de 4 à 4,3. Cette acidification n'est pas toujours nécessaire. La cristallisation est réalisée par addition d'un alcool, tel que l'alcool éthylique ou méthylique. On peut utiliser également un mélange d'alcools, et notamment des deux précédents. Pour un volume de concentrat, on emploie de 1 à 4 volumes d'alcool, et de préférence de 2 à 3 volumes. On filtre la suspension de cristaux, de préférence après 12 à 48 heures d'attente en chambre froide entre zéro et + 100C. Les cristaux sont lavés par un solvant volatil miscible à l'eau, tel qu'un des alcools ou leur mélange cités ci-dessus. Ils sont ensuite essorés et séchés soit sous vide, soit en étuve ventilée entre 40 et 110 C. Le séchage n'a pas besoin d'être poussé à fond, car une recristallisation est généralement nécessaire. Elle est réalisée comme la première cristallisation, après mise en solution des cristaux dans l'eau de façon à obtenir une concentration de 180 à 400 g/l d'hydroxyproline, et de préférence 250 à 350 g/l. Une décoloration, par exemple au charbon actif, est généralement utile avant l'addition d'alcool. A côté de l'hydroxyproline, ce procédé permet de récupérer des sous-produits intéressants, tant dans les eaux mères de cristallisation que dans l'éluat des échangeurs. Un hydrolysat de collagène exempt de sels minéraux et appauvri en acides glutamique et aspartique et en hydroxyproline est obtenu par élution de l'échangeur fortement acide par de l'ammoniaque 0,5 N à 3 N et concentration sous vide de l'éluat. I1 peut être fractionné ou utilise tel quel. Les exemples suivants sont donnés à titre d'illustration de la présente invention. EXEMPLE 1 Dans un autoclave muni d'un agitateur, on introduit 250 litres d'eau, 250 kg d'acide sulfurique technique et 250 kg de colle de peau. On chauffe pour maintenir une pression de 1 bar pendant 8 heures à l'intérieur de l'autoclave. Le lendemain, on soutire 550 litres de liquide noir que l'on dilue à 1800 litres, et que l'on additionne de 20 kg de diatomite, puis on filtre. Le filtrat passe successivement sur 4 colonnes montées en série et contenant dans l'ordre 500 litres de duolite S 30, 1100 litres de duolite A 366, 1100 litres à nouveau de duolite A 366, et 820 litres d'Amberlite IR 120. Lorsque tout le filtrat a été introduit, on pousse à l'eau jusqu'à sortie des aminoacides. On obtient environ 1000 litres de solution contenant 85 kg de matière sèche dont 23 kg d'hydroxyproline. On envoie la solut ion sur une colonne contenant 270 litres d'Amberlite IR 120 et on pousse à l'eau. On obtient 570 litres contenant 12,5 kg d'hydroxyproline, et 28 kg de matière sèche. Cette solution est concentrée sous vide jusqu'à un volume de 45 litres, décolorée à 800C par 500 grammes d'acticarbone 2S, et filtrée. Après lavage du gâteau de noir, on obtient 48 litres de solution. On cristallise par addition de 120 litres de méthanol on laisse reposer quelques heures et porte en chambre froide jusqu'au surlendemain. On filtre sous vide, lave les cristaux avec 20 litres environ de méthanol, essore à fond et sèche. On obtient 8,8 kg de produit contenant 5 à 10% de proline, 3 à 5% de glycine et 0,5 à 1% d'alanine. I1 est dissout dans 22 litres d'eau, additionné de 350 g d'acticarbone et de 30 ml d'acide formique pour obtenir un pH de 4,2,chauffé à 700 et filtré. Après lavage du noir, on obtient 30 litres de solution qu'on cristallise par addition de 75 litres de méthanol. Les cristaux sont lavés au méthanol et sé chés. On obtient 6,5 kg d'hydroxyproline. EXEMPLE 2 On opère de façon identique à l'exemple 1, mais on supprime la colonne de 270 litres d'Amberlite IR 120. Les solutions sont regroupées par 3 opérations successives, et passées ensemble sur la colonne de 820 litre. EXEMPLE 3 On opère de façon analogue à l'exemple 1, mais la solution passe directement de la première à la seconde colonne d'IR 120, sans avoir été recueillie ni dosée. EXEMPLE 4 On opère comme à l'exemple 1, mais après avoir recueilli les acides aminés non fixés sur les colonnes de résine IR 120, on élue les acides aminés fixés par de l'ammoniaque 2 N : 1200 litres pour la première colonne, 400 litres pour la seconde. Les éluats sont recueillis par fractions, et on détermine le rapport des concentrations hydroxyproline/acides aminés totaux. Les fractions les plus riches peuvent être cristallisées à condition que leur mélange contienne plus de 38 à 40% d'hydroxyproline. Les autres fractions seront soit recyclées avec le lot suivant sur la colonne de 270 litres d'Amberlite IR 120 (teneur supérieure à 20% d'hydroxyproline), soit mélangées à un jus d'hydrolyse (teneur de 10 à 20%), soit utilisées pour la préparation de sous-produits (teneur inférieure à 10%). Ce procédé donne un rendement amélioré de 20% environ. EXEMPLE 5 Identique à l'un quelconque des exemples précédents, mais on recycle les eaux-mères de cristallisation après distillation de l'alcool. Celles de première cristallisation sont introduites dans le jus d'hydrolyse suivant. Celles de recristallisation sont jointes à la solution à cristalliser de l'opération suivante. EXEMPLE 6 Identique à l'un quelconque des exemples 1 à 5, mais les eaux-mères des cristallisations sont passées sur une résine IR 120, à raison de 150 grammes d'acides aminés par litre de résine. A la sortie de la colonne, on obtient un mélange hydro-alcoolique débarrassé d'acides aminés, dont la distillation est facile. Les acides aminés sont élues par de l'ammoniaque 2 N, et les fractions obtenues sont utilisées en fonction de leur pureté comme dans l'exemple 4. EXEMPLE 7 L'hydrolyse est faite comme dans l'exemple 1. Sur les 550 litres de jus d'hydrolyse, on prélève 290 litres que l'on neutralise avec un lait de chaux, pour obtenir un pH de 7,3. On filtre et on lave le gâteau de sulfate de calcium à l'eau. On mélange le filtrat et le lavage à ce qui reste de jus d'hydrolyse non neutralisé. On obtient 750 litres contenant 1400 équivalents acides. Le lendemain, on ajoute 20 kg de diatomite, on filtre, puis on passe successivement sur 300 litres de résine Duolite S 30, 1000 litres de duolite A 366 répartie en deux colonnes ( 500 + 500) 1350 litres de résine Amberlite IR 120 en 2 colonnes (900 + 450). On obtient 400 litres contenant 9,5 kg d'hydroxyproline que l'on cristallise et recristallise comme dans les exemples cidessus pour obtenir 4,5 kg d'hydroxyproline. La colonne de 450 litres est éluée par 60 litres d'ammoniaque 2 N (élution très partielle) pour obtenir 380 litres d'éluat contenant 6 kg d'hydroxyproline et 19 kg d'autres acides aminés. Cet éluat est envoyé à la suite des eaux-mères de cristallisation sur une colonne de 200 litres d'IR 120. En éluant par 100 litres d'ammoniaque 2 N, on obtient 110 litres de solution contenant 6 kg d'hydroxyproline pour 9 kg d'autres acides aminés. I1 faut 3 cristallisations pour recueillir 2,3 kg d'hydroxyproline. EXEMPLE 8 Identique à l'exemple 1, mais la colonne de résine adsorbante S 30 est placée entre les deux colonnes de A 366. EXEMPLE 9 Identique à l'exemple 1, mais la colonne d'Amberlite IR 120 ne contient que 600 litres de résine au lieu de 820, et elle est précédée par une colonne contenant 200 litres de duolite C 464. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de la 4-hydroxy L-proline, caractérisé en ce qu'on décolore un hydrolysat de protéine contenant du collagène, on fait passer la solution obtenue sur un échangeur faiblement basique pour retenir les acides glutamique et aspartique et les anions minéraux, puis on fait passer la solution sortant du premier échangeur sur un échangeur fortement acide disposé en une quantité calculée pour retenir de 75% à 95% des acides aminés présents dans la solution, on recueille la solution par passage d'eau sur l'échangeur, on concentre la solution à 180 - 350 g/l d'hydroxyproline, et de préférence 230 à 280 g/l, on la décolore et on cristallise après acidification à pH 3,8 - 4,6 pour récupérer l'hydroxyproline pure sous forme de cristaux. 2. Procédé de préparation suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on décolore l'hydrolysat sur une résine décolorante ou du charbon actif. 3. Procédé de préparation suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la résine décolorante est une résine Duolite S 30 ou ES 861. 4. Procédé de préparation suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échangeur faiblement basique est une résine Duolite A 366 ou Amberlite IR 45. 5. Procédé de préparation suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échangeur fortement acide est une résine Duolite C 25 D ou Amberlite IR 120, utilisée à raison de 2,5 à 6 litres par kilogramme d'acides aminés. 6. Procédé de préparation suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on dispose un échangeur faiblement acide avant l'échangeur fortement acide. 7. Procédé de préparation selon la revendication 6, ca ractérisé en ce que la résine faiblement acide est une résine Amberlite IRC 50 ou une Duolite C 464. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la ou les étapes de décoloration peuvent être réalisées à toute étape précédant la cristallisation finale. 9. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on cristallise par addition de 1 à 4 volumes d'alcool et de préférence 2 A 3 volumes par volume de solution. 10 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé el ce que l'alcool est l'alcool méthylique ou éthylique ou leur mélange. Il - procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les acides aminés autres que 1'hydroxyproline fixés sur l'échangeur acide soit recueillis par élution à l'ammoniaque.