FR 2331017 A1 19770603 FR 7534186 A 19751107 La présente invention est relative à un procédé d'un dispositif pour la détermination et l'analyse du glucose. En particulier, la présente invention concerne l'analyse de glucose dans des fluides physiologiques tels que le sang et l'urine ainsi que dans d'autres milieux aqueux présentant un in téreAt médical et industriel. I1 existe un besoin important actuellement dans les milieux médicaux, d'une technique analytique rapide et précise en vue de déterminer la teneur en glucose dans le sérum du sang. Les récents progrès de la chimie des enzymes, ont concentré l'attention, sur le développement des méthodes analytiques du glucose, basées sur l'oxydation enzymatique du glucose en présence de glucose oxydase.Cette réaction correspond à l'équation suivante Gluco se+Oxygène Acide gluconique + Peroxyde d'hydrogène Cette équation est une représentation simplifiée de l'équilibre complexe qui existe entre les anomères alpha et beta du glucose, le peroxyde d'hydrogène, la glucolactone, l'acide gluconique en présence de la glucose oxydase, et suggère que la teneur en glucose peut Btre mesurée comme une fonction de la consommation d'oxygène ou de l'accroissement en peroxyde d'hydrogène ou en acide gluconique. De nombreuses méthodes basées sur cette équation, ont été décrites dans le passé. Comme il ressortira de la discussion qui suit, ces méthodes présentent des limites plus oumoins sérieuses qui font quelles soient peu applicables dans les laboratoires cliniques, De nombreuses techniques sont limitées de façon inhérente, par le transport de la masse soit d'oxygène ou de glucose à travers une membrane semi-perméable et par delà l'interface membrane/liquide. Une telle méthode décrite en particulier dans l'article intitulé "An Enzyme Electrode for the Ampetometric Determination of Glucose" par GoG Guilbauit et G.J. Lubrano paru dans Analytica Chimica Jacta, 64, (1973) 439-455 .Cet article décrit une électrode à enzyme, nour la détermination du glucose ar une mesure directe ampèronétrique du peroxyde dthydrogène. L'*lectrode enzymatique esG construite par immobilisation de la glucose oxydase dans Ou sous une membrane perinbable au glucose, sur une électrode polarographique Lorsque cette électrode est placée dans la solution de glucose, le glucose diffuse à travers la membrane, où il est oxydé par la glucose oxydase pour former du peroxyde d'hydrogène. Alors que ce dispositif est utilisable pour de nombreuses applications, il est limité par la perméabilité du glucose à travers la membrane. De plus l'immobilisation de la glucose oxydase directement sur l'électrode nécessite le remplacement ou la réparation de la structure de l'électrode complète, dans le cas où la glucose oxydase serait dénaturée. Ceci entrasse une perte de temps et est très onéreux, dans les laboratoires modernes analytiques, où l'on traite åournel- lement plusieurs centaines d'échantillons de sang le brevet des E.U.Â 3.539.455 décrit une autre méthode par électrode à membrane polarographique pour analyser le glucose. Suivant cette technique, le glucose présent dans le spécimen passe par perméabilité à travers une membrane pour réagir avec une solution confinée de glucose oxydase soluble pour former du peroxyde d'hydrogène, qui est mesuré par polarographie. Cette technique dépend de la membrane, est limitée et n'utilise pas les enzymes immobilisées. De nombreuses autres techniques polarographiques par membrane ont été proposées dans lesquelles l'oxydation enzymatique du glucose en acide gluconique et peroxyde d'hydrogène est mesurée comme une fonction de la quantité d'oxygène consommée. De telles techniques utilisent généralement une électrode du type à oxygène comportant une membrane du type décrit dans le brevet E.U.AQ n 24913.386 De telles techniques sont illustrées dans le brevet des E.U.A. 3.512.517 3.542.662 dans l'article '2A New principle 0f Enzymatic Analysis" de H.U. Bergmeyer et A. Hagen paru dans le Z. Anal. Chem. 261, 333-336, ('972) ; "The Enzyme Electrode de S.J. Updike et GoP. Hicks paru dans Nature, Vol. 214, 986-988, (1967) s "Studies on Conditions for the Polarographic Determination of Glucose with Glucose Oxidase" de M.Jemmali et R. Rodriquez-Xabana paru dans Clinica Chimica Acta, 42 (1972) 153-159 ; et "Immobilized Enzymes A Prototype Apparatus for Oxidase Enzymes in Chemical Analysis Utilizing Covalently Bound Glucose Oxidase" de N.K. Weibel, W. DritschilO, J.J. Bright, et A4E Humphrey paru dans the Analytical Biochemistry, 52, 402-414 (1973). Ces techniques de mesure sont limitées par la diffusion de l'oxygène à travers une membrane sélectivement perméable. Dans le brevet E.U.A. n 3 707.455, on décrit une méthode potentiométrique plutôt que polarographique, méthode dans laquelle le glucose passe par perméabilité à travers une membrane jusqu'à la chambre de réaction, contenant de la glucose oxydase soluble et l'accroissement résultant en acide gluconique et détecté par potentiométrie- D'autres techniques d'un intéret plus général qui permettent d'effectuer. des mesures du glucose comme une fonction de différentes autres réactions chimiques secondaires sont décrites dans les brevets E.U.Â0 n 3.591.480 ; 3.623.960 3.770.607 ; et dans les articles "Electrochemical-Enzymatic Analysis of Blood Glucose and Lactate" par DoL Williams, AR. Doig, Jr., et A. Korosi paru dans Analytical Chemistry, Vol. 42, N 1, (1970) ; "lon-Electrode Based Automatic Glucose Analysis System" par R.A. Lienado et G.Â. Rechnitz paru dans Analytical Chemistry, Vol. 45, n 13, (l973) ; et "Enzyme Electrode for Glucose Based on an Solide Membrane Sensor" par G. Nagy, LH. Von Storp , et G.G Guilbault paru dans Analytica Chimica Acta, 66, (1973), 443-455. Dans les systèmes polarographiques décrits ci-dessus, de l'art antérieur, destinés à mesurer le glucose et danslesquels la teneur en peroxyde d'hydrogène est déterminée directement, on utilise toujours une membrane en raison des interférences possibles et du risque d'empoisonnement de l'électrode, avec des matériaux extérieurs présents dans le spécimen. La présente invention a pour objet une technique analytique pour mesurer le glucose par détermination polarographique directe du peroxyde d'hydrogène,et qui ne nécessite pas l'utilisation d'une membrane. Suivant la présente invention, un petit échantillon de glucose comparé par rapport au volume d'un courant de diluant aqueux et tamponné circulant à flux continu passe à travers une chambre de réaction contenant un lit de glucose oxydase immobilisée et y est oxydé en peroxyde d'hydroène, puis passe par perméabilité ou par persoîatioa à travers ledit lit.La chambre de réaction a une entrée pour l'échantillon et une sortie pour le produit de rea'cti. Le courant contenant le produit de réaction passe de la chambre dans la cellule polarographique. I1 résulte un contact d'une durée courte, entre les électrodes et l'échantillon de glucose l'interférence de l'électrode et l'empoisonnement peuvent de ce fait être considérés comme négligeables, de sorte qu'il n'est pas nécessaire d'utiliser une membrane. La réponse de l'électrode est plus rapide et la sensibilité et la reproductibilité est accrue dans la présente invention, comparées aux procédés, qui sont limités par une étape de diffusion par membrane. Ainsi la présente invention permet de remédier aux inconvénients de l'art antérieur en utilisant un appareillage et une méthode d'analyse du glucose par oxydation de celui-ci, dans un lit de glucose oxydase immobilisée pour former du peroxyde d'hydrogène et ltacide gluconiques et consistant à déterminer directement par polarographie le peroxyde d'hydrogêne résultant dans une cellule polarographique, puis à convertir la mesure polarographique en équivalent en glucose dans l'échantillon original. L'une des caractéristiques essentielles de la présente invention est que le lit de glucose oxydase immobilisée est séparé physiquement de la cellule polarographique. Ceci représente une amélioration remarquable des électrodes enzymatiques du type discuté ci-dessus dans lesquelles le peroxyde d'hydrogène devait passer par perméabilité à travers une membrane couvrant la partie sensible de l'électrode polarographique. La présente invention sera décrite ci-dessous dans plus de détails par référence aux dessins dans lesquels la figure 1 est un diagramme schématique du procédé de mise en oeuvre de la présente invention, les figures 2 et 3 sont des diagrammes schématiques illustrant les détails de la cellule polarographique qui peuvent titre utilisées dans le procédé illustré par la figure le En se référant maintenant à la figure 1, un spécimen aqueux contenant du glucose circule dans une chambre de réaction contenant un lit de glucose oxydase immobilisée où ledit lit est maintenu pendent une durée et à une température suffisante pour oxyder le glucose en acide gluconique et en peroxyde d'hydrogène.La chambre de réaction est équipée d'une entrée du spécimen et d'une sortie du produit de réaction De façon typique cette oxydation est terminée en l'espace de quelques secondes à 30 minutes ou plus à des températures comprises entre 0 C et environ 50 Co Une durée de moins d'une minute à température ambiante est habituellement suffisante pour l'oxydation du glucose. En raison du fait que l'oxydation du glucose est plus efficace lorsqu'elle s'effectue dans une gamme de pH comprise entre 4 et 8, l'échantillon de glucose,avant le contact avec la glucose oxydase est dilué avec un diluant aqueux qui est tamponné pour maintenir le pH dans la gamme prévue, dans laquelle la glucose oxydase est la plus efficace pour ltoxyda- tion du glucose.Le pH diluant tamponné est compris de préférence entre 5 et 7 e Des diluants tamponnés aqueux particulièrement adéquats sont des solutions d'acétate de sodium et d'acide acétique D'autres tampons acceptables comprennent le citrate de sodium , d'autres phosphates hydrosolubles et des sels de phtaîates à des concentrations de 0,001 à 0,5 M, L'oxygène nécessaire dans la réaction d'oxydation est fourni par la concentration d'oxygène qui est normalement dissoute dans les spécimens de glucose et le diluant tamponné à température ambiante0 Cette concentration permet généralement d'obtenir assez d'oxygène pour oxyder suffisamment le glucose pour avoir une détection satisfaisante et reproductible par polarographie. I1 n'est pas nécessaire que tout le glucose soit oxydé pour former du peroxyde d'hydrogène. I1 est uniquement nécessaire que le pourcentage de conversion soit sflr et reproductible en passant d'échantillons standards à des échantillons inconnus dans des conditions données de laboratoire. Ainsi une valeur reproductible de 60 % de conversion de glucose permet d'obtenir une réponse polarographique précise tant pour l'étalonnage que pour l'analyse0 Dans- les mises en oeuvre préférées, tout le glucose est oxydé pour produire du peroxyde d'hydrogène , de sorte que toute erreur de variation possible dans le-taux de conversion de l'échantillon est éliminé Pour obtenir une telle conversion complète de glucose, il peut etre nécessaire de fournir de l'oxygène à partir d'une source extérieure (par exemple par barbotage d'oxygène ou d'un gaz contenant de 11 oxygène) si on le désire mais ceci est rarement requise De légères fluctuations peuvent se présenter dans la concentration d'oxygène dissous dans l'échantillon de glucose et le diluant tamponné en fonction des modifications de pression ou de température. De telles fluctuations sont mineures et la présence de suffisamment d'oxygène est assurée lorsqu'on utilise la méthode de détection, des échantillons ayant les dimensions et les concentrations prévues dans la présente demande.Ceci est un important avantage par rapport aux méthodes mesurant le glucose comme une fonction de la perte d' oxygène Le rapport de dilution du spécimen de glucose dans le diluant tamponné, varie avec la concentration de glucose dans les spécimens. Pour des liquides biologiques tels que le sang ou l'urine, ayant une concentration inconnue, dans la gamme de concentrations prévisibles, la dilution de 2,5 microlitres de spécimen dans un flux de diluant tamponné circulant à une vitesse de 0,1 à 5 et de préférence 0,1 à 2 ml par minute est bien adaptée pour une réponse polarographique significative. Habituellement, pour des raisons d'efficacité et d'économie, on utilise un petit échantillon de glucose (environ entre 2 à 10 microlitres) qui est injecté dans un flux de diluant tamsonné circulant à une vitesse de 0,1 à 10 ml par minute en vue de l'introduction dans le lit de glucose oxydase immobilisée. Le diluant tamponné est mis en circulation par une petite pompe de mesure usuelles En plus du tampon ,il est souhaitable d'additionner les sels tels que du chlorure de potassium ou du chlorure de sodium qui ont pour but d'établir le potentiel de référence lorsqu'on utilise des électrodes de référence au chlorure d'argent-argent contenant l'échantillon comme solution de remplis sae, Un inhibiteur bactérien peut titre incorporé dans le diluant tamponné pour retarder l'interférence avec les bactéries. Toutes les méthodes connues pour immobiliser la glucose oxydase sur un support insoluble en vue de former un lit de glucose oxydase immobilisée peuvent dtre utilisées dans la mise en oeuvre pratique de la présente invention Par exemple, la glucose oxydase peut être couplée par covalence à un support en verre poreux , par l'intermédiaire d'un agent de couplage qui est un sylane portant un groupement fonctionnel amino comme décrit dans l'article "Immobilized Enzymes A prototype Apparatus for Oxydase Enzyme in Chemical Analysis Utilizing Covalently Bound Glucose Oxidase", par M.K. Weibel et al, paru dans Analytical Biochemistry, 52, 402-414 (1973); la glucose oxydase peut titre immobilisée sur une colonne chargée comme décrit dans l'article "Un nouveau principe d'analyse Enzymatique" par H.V. Bergmeyer et A. Hagh paru dans Z. Anal. Chem. 261, 333-336 (1972) ; la glucose oxydase peut être immobili sée sur des polymères acryliques comme décrit dans l'article : "Electrodes Enzymatiques pour le glucose basé sur une membrane sensible à l'iodure" par G. Nagy et al paru dans Analytica Chemisa Acta, 66, (1973), 443-455 ; la glucose oxydase peut également titre immobilisée dans un gel de polyacrylamide tel que décrit dans l'article "Une électrode enzymatique pour la détermination ampérométrique du glucose, par G.Guilbault et al, paru dans Analytica Chemica Acta 64, (1973), 439-455 et dans le brevet des E.U.A. 3.542.662 ; la glucose oxydase peut également être immobilisée sur de l'alumine au nickel-silice tel que décrit dans l'article "Immobilisation de glucose oxydase sur de l'alumine nickel-silice par W.M. Herring et al, paru dans Biotechnology and Bioengineering, Vol. XIV, pages 975-984 (1972); et la glucose oxydase peut etre enfin immobilisée avec du bromure de cyanogène suivant la méthode décrite dans le brevet E.U.A. 3.645.852 ayant pour titre "Procédé permettant de lier des produits solubles dans l'eau et des protéines solubles dans l'eau à des polymères insolubles dans 11 eau en utilisant des halogénures de cyanogène1 par R. Axen, J Porath et E Ernbach. Les divulgations effectuées par ces références sont incorporées dans la présente demande.Ainsi, en formant le lit de glucose oxydase immobilisée, la sélection du support s'effectue à partir de matériaux tels que le verre poreux, les oxydes réfractaires poreux de préférence sous forme de particules tels que l'alumine,le titane, la zircone .la silice, la magnésie, le talc, la thorine, les frittes de verre, la porcelaine en particules,les oxydes réfractaires compacts et frittés des argiles,des polymères insolubles dans l'eau. L'immobilisation de la glucose oxydase sur ces supports par des moyens chimiques,phyxiquess est bien connve dans l'art antérieur. la seule exigence est que le lit soit perméable à ltécbantillon en ayant un rapport surface spFcifique/vlume élevé, de façon i avoir un contact adéquat entre la glucose oxydase et l'échantillon de glucose. Un lit de glucose oxydase immobilisé sur un support en forme de particules inertes po reuses,fibreuses/,elifiées est préféré dans ce but.Lorsqu'on utilise des oxydes réfractaires en forme de particules, la granulométrie des particules et le pourcentage de porosité ne sont pas particulièrement critiques, aussi longtemps qu'un contact adéquat entre glucose et glucose oxydase est maintenu.Une porosi- té volumétrique comprise entre environ 10 ffi et environ 60 * avec des diamètres moyens de pores compris entre 0,01 et 10 microns (diamètre) se sont révélées etre particulièrement efficaces et facilement accessibles. Les oxydes réfractaires en forme de particules ayant un diamètre de particule compris entre environ 1 et 1000 microns,sont facilement accessibles , et un diamètre des particules compris entre environ 100 microns et 400 microns est plus particulièrement pratique dans le procédé suivant la présente invention. Après l'oxydation du glucose dans le lit de glucose oxydase immobilisée, le mélange réactionnel résultant circule vers la cellule polarographique. Selon la présente invention, le diluant aqueux tamponné est pompé de façon continue à travers la chambre de réaction contenant le lit de glucose oxydase immobilisée et la cellule polarographique . Le spécimen de glucose est injecté à partir d1 une seringue hypodermique dans le lit de glucose oxydase immobilisée à travers un dispositif d'injection qui peut entre sous la forme d'un "T" mélangeur ayant un diaphragme en caoutchouc. Le glucose qui est oxydé en circulant à travers et en passant par perméabilité à travers le lit de glucose oxydase immobilisée se transforme en peroxyde d'hydrogène et acide gluconique qui restent dans le spécimen comme produits réactionnels. Ces produits réactionnels s'écoulent ensuite dans la cellule polarographique lorsque le peroxyde d'hydrogène est détecté par polarographie, par contact direct avec les électrodes de polarographie . La réponse polarographique à partir de la mesure de peroxyde d'hydrogène est effectuée par un dispositif de mesure courant tel qu'un dispositif permettant de suivre le courant. Cette valeur est ensuite convertie en équivalait glucose obtenu dans le spécimen original. L'équivalent glucose du spécimen original, est reporté en milligrammes de glucose par 100 ml (mg en poids) de spécimen.Ces unités sont usuelles dans les applications cliniques. Deux mises en oeuvre des cellules polarographiques utilisées dans le procédé illustré dans la figure 1 sont représentées schématiquement dans les figures 2 et 3. Ces cellules sont appelées cellules t flux" (terme anglais nflow- through") en raison du fait que l'échantillon analysé, circule de façon continue à travers la cellule. Dans la figure 2, le corps de la cellule 10 est constitué par un matériau isolant électriquement inerte et rigide tel que du verre ou du plastique. Les plastiques en polyméthylméthacrylate ont été trouvés comme étant parfaitement satisfaisants pour ce type de cellule. Le corps de la cellule 10 est muni d'un passage étroit 11 à travers lequel le spécimen du mélange réactionnel contenant le peroxyde d'hydrogène pénètre dans la cavité de la cellule 150 La cavité 15 a des dimensions telles à assurer un contact effectif entre l'échan- t llon et les électrodes polarographiques, en minimisant le volume perdu. La cellule utilisée dans les exemples, est plastique et a une cavité ayant environ 2,34 mm de largeur, 11,17 mm de longueur et 4,68 mm de profondeur. L'électrode entre par le dessus de la cellule et est positionnée sur la longueur. Sur la figure 2, un ensemble de deux électrodes polarographiques 12 et 13 est monté dans le corps de cellule 10, de sorte que les extrémités sensibles soient en contact direct avec les spécimens dags la cavité 15 l'électrode 12 fonctionne comptage tant comme électrode que comme électrode de référence. l'élec- trode 12 est d'un modèle usuel et peut être un fil d'argent recouvert par du chlorure d'argent ou au calomel. L'électrode d'argent chlorure d'argent de référence est préférée en raison du fait que l'échantillon qui est à mesurer peut fonc- tionner comme solution de remplissage de l'électrode de réfé rence, en y incorporant des ions chlorure. D'autres types d'électrodes de référence utilisant leur propre solution de remplissage peuvent être utilisés. l'électrode 12 est connectée à une source du potentiel DC constant (habituellement 0,6 volt comme dans les procédés polarographiques usuels) i L'électrode 13 est l'électrode de travail et se présente sous forme d'un fil de platine, de palladium, d'or, de graphite ou de carbone, ou d'autres matériaux conducteurs inertes. Le peroxyde d'hydrogène présent dans le spécimen dépolarise bien les électrodes polarographiques et le flux de courant, qui est mesuré par le dispositif de mesure du courant, au voltage précitées proportionnel à la concentration de peroxyde d'hydrogène. Ce courant est converti en équivalent de glucose contenu dans le spécimen original. Dans la cellule polarographique représentée par la figure 2, l'électrode de référence peut également fonctionner comme électrode de comptage et participe à la réaction d'oxydation réduction qui s'effectue dans la cellule. La chute IR, n'est pas compensée et la différence de potentiel entre l'électrode de référence et l'électrode de travail peut changer. La cellule de la figure 3 est préférée par rapport à celle de la figure 2. Dans la cellule de la figure 2 l'électrode de référence est la seule autre électrode présente dans le circuit de telle sorte que le courant est forcé à passer à travers cette électrode. Ceci peut entraSner une variation dans la différence de potentiel entre les deux électrodes, variation due à la chute IR à travers l'échantillon. De plus, lorsqu'une électrode de référence au chlorure d'argent-argent est utilisée, le chlorure d'argent peut éventuellement être détruit par une réaction d'oxydoréduction. Ainsi, l'utilisation d'une telle cellule même lorsque l'électrode est positionnée très près par rapport à l'électrode de travail ne donne pas des résultats aussi précis que ceux de la cellule de la figure 3. Lorsqu'on utilise la cellule de la figure 3, dans un laboratoire équipé de façon usuelle, un détecteur de pic et un circuit d'échantillonnage et de maintien peuvent être utilisés pour mesurer le courant maximum au-dessus de la ligne de base de courant Cette différence est proportionnelle à la concentration de peroxyde d'hydrogène dans le spécimenS et de ce fait, proportionnelle à la concentration en glucose. Dans une cellule polarographique préférée telle que représentée par la figure 3 la cellule polarographique est potentiostatique, cette méthode est dite polarographie à trois électrodes comme décrite dans l'article t'Ba Renaissance en Analyse polarographique etvoltanétrique" par Jud B. Flato, paru dans Analytical Chemistry, vol. 44, septembre 1972, dont le contenu est incorporé dans la présente demande. La figure 3 a un corps de cellule 10 , une cavité 15 comme la cellule de la figure 2. La cellule de la figure 3 est équipée avec une électrode de référence 23 sous forme d'un fil d'argent positionné de façon aussi proche que possible de l'électrode de travail 21, qui est un fil de platine. Le potentiel appliqué ( + 0,6 volt DC) est appliqué à l'entrée d'un amplificateur de contrôle 30 auquel est connectée l'électrode de référence 23 par l'intermédiaire d'un dispositif de contrtle du voltage 31. La sortie de l'amplificateur de centrale 30 est connectée à l'électrode de comptage 20 qui est un fil en platine. Suivant ce dispositif, aucun courant ne s'écoule à travers l'électrode de référence 23 et un potentiel suffisamment compensateur est appliqué à 1' électrode de comptage 20 pour maintenir la différence de potentiel entre l'électrode de référence 23 et l'électrode de travail 21. L'électrode de travail 21 est connectée à un dispositif de mesure du courant petit et usuel qui permet d'obtenir une mesure de courant, qui est convertie en équivalent en glucose dans le spécimen original. D'autres électrodes conventionnelles telles que décrites en faisant référence à la figure 2 peuvent être utilisées dans la mise en oeuvre de la cellule illustrée par la figure 3 si on le désire. Dans les figures 1, 2, 3 ci-jointes A indique le diluant tamponné, B l'échantillon de glucose C le lit de glucose oxydase tamponné D la cellule polarographique E le résidu de l'échantillon F l'indication en glucose G le potentiel appliqué H le dispositif de mesure du courant I entrée de l'échantillon J la sortie de l'échantillon Dans les exemples qui suivent qui sont destinés a i'lus- trer 1'in'rezition sans pour autant présenter un caractère limitatif les parties sont des parties en poids et les pourcentages sont des pourcentages en poids et toutes les températures sont exprimées en degrés C à moins de mention contraire, Exemple 1 Partie A Glucose oxydase immobilisée sur une poudre d'alumine Un gramme d'alumine en particules est lavé complètement avec de l'eau distillée. L'alumine en particules a une granulométrie de module compris entre 28 et 24 et un diamètre moyen de pore de 0,1 à O,2 micron. Cinquante milligrammes de glucose oxydase (de la Worthingon Biochemical Corporation) ayant une activité de 140 anisés International milligramme) sont additionnés à de l'alumine en forme de particules et humides dans 40 ml d'une solution aqueuse qui a été tamponnée à un pH de 5,5 avec un tampon standard comprenant un mélange de dihydrogéno phosphate de potassium et de hydrogéno phosphate disodique. Le mélange résultant est agité lentement pendant une demi-heure à 6-80C pour absorber l'enzyme. A ce mélange on additionne un réactif réticulant préparé en mélangeant 20 ml de méthanol, 10 ml d'eau distillée et 0,15 ml d'acide chlorhydrique concentré, 0,15 ml d'acide chlorhydrique-concentré ; 0,08 ml de diamino propane et 0,02 ml de dibromoéthane. Le mélange combiné d'alumine, de glucose oxydase et de réactif réticulant est agité doucement avec un agitateur magnétique à une température de 6 - 80C pendant une nuit pour immobiliser la glucose oxydase sur l'alumine. Le produit composite glucose oxydase immobilisé/alumine résultant est lavé avec environ 2 litres d'eau distillée et stocké dans de-lleau distillée. Partie B Essai du produit composite glucose oxydase immobilisé/ alumine. L'activité catalytique de la glucose oxydase immobilisée par alumine de la partie A , est calculée à partir de la vitesse d'-oxzdation du P-D-glucose en acide gluconique par la para-benzoquinone en présence du produit composite glucose oxydase/alumineO La réaction est représentée par la formule ss-D-glucose+p-benzoquinone+H2O Glucose acide gluconique + hydroquinone La réaction est suivie par une mesure potentiométrique de la modifIcation de la concentration en hydroquinone dans le temps. Une électrode détectrice en platine (modèle Beckman 39273) est utilisée avec l'électrode de référence à double jonction au calomel-argent/chlorure argent (modèle Orion 90-20-00).Les solutions standards destinées à étalonner le système d'électrode sont préparées à partir de l'hydroquinone avec environ un excès 100 molaire de para-benzoquinone présent également dans les solutions aqueuses. Un graphe d'éta lonnageest tracé en marquant les concentrations d'hydroquinone en fonction à la lecture en millivolts sur le potentiomètre. Le milieu réactionnel dans lequel l'oxydation du glucose s'effectue est une solution aqueuse qui est 0,1 molaire en dextrose et 0,01 molaire en tampon phosphate à un pH de 5,5. I1 est agité pendant une nuit de façon à obtenir un équilibre entre 1' et la -v-glucose. Une quantité suffisante de parabenzoquinone et d'hydroquinone est additionnée de façon à avoir une concentration de 1,0 x 10 X et 1,0 x 10-4M de ces deux composants. Une quantité connue de produit composite glucose oxydase/alumine est additionnée à un volume déterminé du mélange du milieu réactionnel et la modification dans le potentiel de l'électrode immergée dans la solution1 est suivi dans le temps en utilisant un système d'électrode décrit ci-dessus.A partir de la lecture de la modification du potentiel en millivolts, la concentration correspondante en hydroquinone est déterminée à partir du graphe d'étalonnage et l'on porte les points sur la courbe représentant la concentration de la solution d'essai en fonction du temps. La pente initiale de cette courbe représente la vitesse d'oxydation du ss-D-glucose catalysé par l'en- syme immobilisée. L'activité est calculée à partir de la re lacion suivante Activité = Vitesse d'oxydation Volume alumine En utilisant cette procédure, le produit composite glucose oxydase/alumine de la partie A a été découvert comme ayant une activité de 995 unités Internationales de glucose oxydase par millilitre de produit composite glucose oxydase/alumine.Dix jours après et après avoir été stockée dans l'eau distillée à 400 , l'activité est de 825 unités internationales de glucose oxydase par millilitres de produit composite glucose oxydase/alumine. L'activité en unités internationales biologiques a été définie comme étant la quantité d'enzymes actives converties en substrat à une vitesse de 1 micromole par minute. Partie C Préparation d'un lit glucose oxydase immobilisé destiné à titre utilisé suivant le procédé décrit dans la figure 1 Une colonne en verre de 50 mm en borosilicate ayant un diamètre intérieur de 2,8 mm , un diamètre extérieur de 6 mm est préparée. Un disque en nylon de module 17 (AFROR) est attaché à une extrémité de la colonne. Le produit composite glucose oxydase immobilisé par alumine décrit dans la partie A, est chargé de façon à remplir le tube. L'ensemble glucose oxydase/alumine se tasse dans la colonne par gravité et l'autre extrémité de la colonne est également munie d'un disque en nylon de module 17 (AFNOR) après le remplissage de la colonne.Le volume dii produit composite glucose oxydase/alumine est d'envi rot0,3 cm3. Les extrémités de la colonne sont munies de tubes en plastique en forme ue 'e" pour permettre l'injection de l'échantillon. Le T d'injection est muni avec une membrane en caoutchouc pour permettre l'injection de l'échantillon au moyen d'une aiguille hypodermique. Partie D Analyse du glucose Un diluant tamponné pour l'échantillon de glucose est préparé à partir de 50 ml d'une solution aqueuse saturée de 2-chloro-4-phe'nylphénol ; 10 ml de chlorure de potassium 1,0 N ; 8,2 g (0,10 mole) d'acétate de sodium ; suffisamment d'acide acétique à 1,C M pour ajuster le pH à 5,6 et de l'eau supplémentaire de façon à avoir 1 litre de la solution Le tampon est de ce fait environ 0,1 molaire en acétate 0,OaLmolaire en chlorure de potassium et contient une trace de bactéricide, le 2-chloro-4-phénylphénol. La cellule polarographique est celle représentée sur la figure 3 et décrite ci-dessus. Les électrodes sont connectées à un analyseur polarographique (par modèle 174) La solution standard utilisée pour étalonner la cellule polarographique est une solution aqueuse de glucose 0,01 molaire et est 0,1 molaire en chlorure de sodium, lorsqu'elle est utilisée comme solution de remplissage de l'électrode de référence. Les deux produits chimiques sont de qualité réactif. La solution standard est préparée bien en avance de son utilisation de façon à assurer l'équilibre chimique. Exprimé en termes usuellement utilisés dans les laboratoires cliniques, cette électrode standard représente une concentration en glucose de 180 mg de glucose par 100 ml d'échantillon (c'est-àdire 180 mg % de glucose). Le diluant tamponné est pompé à travers l'appareil décrit dans la figure 1 à la vitesse de 1,0 ml/mn. Ceci produit un courant de base d'environ un nanoampère. Un échantillon de 3,0 microlitres d'une solution standard de glucose O,1C M , est injectée avec une aiguille hypodermique à travers le rj d"in- jection dans la colonne contenant l'enzyme immobilisée comme représenté dans la figure 1. Le courant s'accroSt rapidement jusqu'à un courant maximum de 250 nanoampères pendant une période de 10 secondes et puis décrit à nouveau rapidement pendant une période de 30 secondes jusqu'à une valeur approchant à la valeur de base.Le facteur d'étalonnage du courant par rapport à la concentration est de ce fait de 1,39 nanoampères par mg % de glucose pour un échantillon de trois microlitres. Dix spécimens de 3,0 microlitres d'un sérum de sang standard (considéré comme contenant 83,5 mg * de glucose) sont injectés de façon séquentielle dans un flux de diluant tamponné, circulant à travers un lit de glucose oxydase immobilisée, le peroxyde est analysé par polarographie comme décrit ci-dessus, et les lectures effectuées sur le dispositif de contrôle du courant sont enregistrées en utilisant le facteur d'étalonnage pour convertir le courant en concentration. Les échantillons contiennent une valeur moyenne de 80 ml de glucose par 100 ml de spécimen (80 mg %) avec un coefficient de variance de 0,7 %. Un second échantillon de sérum de sang standard non normal (considéré comme contenant 197 mg % de glucose) est analysé par le procédé ci-dessus. A partir de 20 analyses au total une valeur moyenne de 200,5 mg de glucose/100 ml est obtenue avec un coefficient standard de variance de 1,3 %. Exemple II Partie A Préparation de glucose oxydase immobilisée Cinq grammes d'alumine en particules, ayant une granulométrie de module 24-23 (AFNOR) d'un diamètre moyen de pore de 0,1 à 0,2 micron sont séchés par chauffage-à 10600C pendant deux heures. Après -refroidissement, l'alumine est plongée dans HC1 à l,C N pendant 2 à 4 heures puis lavé avec de l'eau distillée pour éliminer l'air absorbé. L'alumine lavée est placée dans un récipient contenant environ 10 ml d'un tampon au phosphate 0,01 M (pH 6,0). La glucose oxydase est additionnée comme dans l'exem- ple 1 (250 mg) à l'alumine en particules avec suffisamment d'eau distillée, de façon à amener le volume du mélange à environ 40 ml. Le mélange glucose oxydase/alumine est agité lentement avec un agitateur magnétique à température ambiante pendant environ une- demi-heure. Un réactif réticulant est préparé à partir de 20 ml de méthanol, 10 ml d'eau et 0,15 ml d'acide chlorhydrique concentré, 0,05 ml de diaminopropane et 3 ml d'une solution à 10 % en poids de gluteraldéhyde. Ce réactif est additionné goutte à goutte au mélange glucose oxydase/alumine. L'addition est faite à la température ambiante et le mélange réactionnel final est maintenu au repos pendant une nuit à 0 C. I1 est ensuite lavé avec une solution tampon au phosphate 0,01M (pH 5,5), puis stocké dans de l'eau distillée jusqu'à ce qu'il soit utilisé. Le procédé utilisé est le m8me que celui décrit dans l'exemple I, partie 3. L'activité trouvée est d'environ 150 unités internationales par millilitre de glucose oxydase/alumine. Partie B Analyse du glucose Un lit de glucose oxydase immobilisée est preparé comme décrit dans l'exemple 1 en utilisant le produit composite glucose oxydase/alumine décrit dans la partie A ci-dessus. Le procédé de standardisation du système analytique est essentiellement le même que celui décrit dans la partie B de l'exemple I . La vitesse de flux du diluant tamponné est de l,0ml/mn , celui-ci a la même composition que dans l'exemple I. Une solution de glucose standard de 3,0 microlitres (contenant 180 mg % de gucose) donne lieu à une lecture de 590 nanoampères. te facteur dt ftalonnage est ainsi de 3,28 nanoampères par milligramme iS de glucose pour un échanti llon de 3 microlitrea. Dix spécimens de 3,0 microlitres d'échantillon de sérum de sang standard (considéré comme contenant 83,5 mg de glucose par 100 ml) sont injectés de façon séquentielle dans le lit de glucose oxydase immobilisée tel que défini ci-dessus, et lton lit l'intensité correspondante. En utilisant le facteur d'étalonnage pour convertir le courant en concentration en glucose, les échantillons tels qu'analysés contiennent une valeur moyenne de 82 mg de glucose par 100 ml avec un coefficient de variance de 1,5 % . Un second échantillon de sérum de sang standard non normal (considéré comme contenant 197 mg * de glucose) est analysé comme ci-dessus. A partir d'un nombre total de 10 tests on obtient une valeur moyenne de 197,2 mg de glucose par 100 ml avec un coefficient de variance de 1,0 % Exemple III Partie A Préparation de glucose oxydase immobilisée Cinq grammes d'alumine en forme de particules ayant une granulométrie de module 25-24 (AFIiOR) et un diamètre moyen des pores de 0,1 à 0,2 micron Solit chauffés à 11500C pendant 2 heures. Après refroidissement l'alumine en forme de particules est plongée dans HC1 1,0 N pendant une nuit.Il est ensuite lavé avec de l'eau distillée placé dans un bécher avec 50 ml d'un tampon au phosphate 0,001 (pH 6,0) pendant une demi-heure avant l'addition de 25 ml d'une solution de glucose oxydase. La glucose oxydase (Asparilligus niger) (obtenue de Pierce Chemical Company) en solution tamponnée (pH 4,0) a une activité de 1000 unités internationales par millilitre. Le mélange glucose. oxydase/alumine est agité lentement pendant une demi-heure à 3 - 80C. Un agent réticulant est préparé par mélange de 20 ml de méthanol, 0,01 ml de diaminopropane, 0,15 ml de HCl concentré,0,03 ml de dibromoéthane et 10 ml d'eau. Ce réactif est additionné à une vitesse de 0,15 à 0,20 ml/mn au mélange glucose oxydase/alumine tout en agitant avec un agitateur magnétique et en maintenant la température à 3 - 80C pendant 16 à 20 heures. Le produit composite résultant glucose oxydase immobilisé par alumine est lavé avec 2 litres d'eau distillée et stocké dans de l'eau distillée jusqu'à ce qutil soit essayé. Le procédé utilisé dans essai est le m8me que celui décrit dans l'exemple I .L'activité de l'échantillon est de 2300 unités internationales par millilitre du produit composite glucose oxydase immobilisée/alumine. Partie B Analyse du glucose Un lit de glucose oxydase immobilisée est préparé comme décrit dans l'exempte I en utilisant le produit composite de glucose oxydase/alumine décrit dans la partie A ci-dessus. Le volume de la colonne dans ce cas est uniquement de 0,2 cm3 Le procédé de standardisation pour le système analytique est essentiellement le même que celui décrit dans la partie D -de l'exemple I . La vitesse du flux du milieu tamponné de la composition de l'exemple I est de 0,7 mlg/mn . Un échantillon de 2,5 microlitres d'une solution standard de glucose contenant 180 mg % de glucose donne un courant de 250 nanoampères. le facteur d'étalonnage est de 0,83 nanoampère/mg de glucose pour un échantillon de 2,5 microlitres. Neuf spécimens séparés de 2,5 microlitres chacun d'échantillon de sang standard, sont injectés séquentiellement dans le lit de glucose oxydase immobilisée comme décrit ci-dessus et on enregistre les courants correspondants. En utilisant le facteur d'étalonnage pour convertir le courant en concentration en glucose, ces échantillons ont été trouvés comme ayant une valeur moyenne de 79,7 mg de glucose par 100 ml avec un coefficient de variance de 1,5 % . La valeur réelle est de 83,5 mg de glucose par 100 ml. Un second échantillon de sérum de sang standard non normal contenant 197 mg * de glucose est analysé comme cidessus à partir d'un essai,au total on obtient une valeur moyenne de 205,6 mg de glucose par 100 ml avec un coefficient standard de variance de 1,3 % Les résultats similaires sont obtenus par le procédé ci-dessus destiné à l'analyse du glucose, lorsque le lit du glucose oxydase immobilisé est préparé en immobilisant la glucose oxydase sur un polydextrane réticulé obtenu de Pharmacia Fine Chemicals Inc. et vendu sous le nom de Sephadex G-200 Un échantillon de 1,25 mg de polydextrane est lavé avec 2 litres d'eau distillée et un gel uniforme est préparé en mélangeant avec de l'eauX 4 g de bromure de cyanogène sont écrasés dans un mortier et transférés rapidement dans le gel de polydextrane.Le pH du gel dispersé est rapidement ajusté à environ 10,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 3N et maintenu à ce pH par une addition graduelle d'hydroxyde de sodium 3N. Périodiquement de la glace écrasée préparée à partir d'eau désionisée est additionnée pour maintenir la température du mélange réactionnel à environ 200C, L'introduction de la base est stoppée lorsqu'il n'y a plus de modification du pH et lorsque les cristaux de bromure de cyanogène sont consommés. Le mélange est agité de façon continuelle pendant toute la réaction. Un total d'environ 13 ml d'hydroxyde de sodium est requis. Une grande quantité de glace est additionnée et le mélange est transféré dans l'entonnoir filtrant en verre fritté. Le produit est lavé sous vide en utilisant tout d'abord 300 ml d'un tampon de 0,01 M de tris (hydroxyméthyl)aminométhane (ajusté à un pH de 7 avec HG1) et puis par 300 ml d'un tampon au phosphate 0,01 M de pH 5,6. Les deux solutions de lavage ont été refroidies au préalable dans un bain de glace. Le fond de l'entonnoir équipé du dispositif de filtrage est ensuite fermé avec un film de cire. Au polydextrane activé avec du bromure de cyanogène résultant dans l'entonnoir filtrant, on additionne une solution froide de 50 ml de glucose oxydase dans 20 ml d'un tampon au phosphate 0,01M (pH 5,6). Le produit résultant est agité avec une baguette de verre dans l'entonnoir filtrant et puis transféré à un bêcher. Le lavage du polydextrane activé par du bromure de cyanogène est le mélange subséquent avec la solution de glucose oxydase sur l'entonnoir, et fait très rapidement, c'est-à-dire dans un temps total d'environ 90 secondes. Le mélange glucose oxydase/polydextrane est agité lentement avec un agitateur magnétique pendant 16 à 20 heures à 0 C. I1 est ensuite lavé avec 1 à 2 litres d'eau distillée et stocké dans une solution à 0,1 M d'un tampon au phosphate tE 5,6 Après 65 jours, l'activité est de 450 unités internationales par millilitre de gel composite de glucose oxydase/ polydextrane. Le gel composite glucose oxydase/polydextrane est introduit dans une colonne et le spécimen de glucose analysé comme dans l'exemple I. On obtient également des résultats similaires à ceux du procédé ci-dessus pour l'analyse du glucose, lorsque le lit d'enzyme immobilisé comprend la glucose oxydase immobilisée sur une résine échangeuse d'anions sous forme de particules poreuses. La résine utilisée est la forme chlorure d'un copolymère styrbne-divinylbenzène portant des groupes échangeurs d'ions d'amines quaternaires (obtenu des Laboratoires Bio-Rad sous l'appellation AG-MP-1). Un échantillon de 250 mg de la résine anionique est agité vigoureusement avec 30 ml de tampon de borate de sodium à 0,10 M pH 8,5.. I1 est ensuite centrifugé pendant 20 minutes à 12.000 tours/ Les surnageants sont décantés et le procédé de lavage est répété deux fois. Un lavage final est effectué de la même façon en utilisant un tampon à l'acétate 0,10 M pH 5,0 La résine lavée est dispersée dans environ 50 ml de tampon à l'acétate et agité lentement pendant 15 à 20 minutes à 5 - 100C avant d'additionner 100 mg de glucose oxydase de façon graduelle. A ce mélange on additionne ensuite 0,5 ml de dibromopropane dissous dans 2 ml d'acétone. Ce mélange final est agité lentement pendant 1 heure à 5 - 100C. Le produit réactionnel est centrifugé. 120 tours/mn et les surnageants sont séparés. Le produit composite glucose oxydase/résine échangeuse d'ions est traité ensuite avec 40 ml d'une solution tampon à l'acétate (pH 5,0) et 0,5 molaire en aminoéthanol. I1 est ensuite agité pendant 1 heure à 00C/filtré et lavé avec 1 ou 2 litres d'eau désionisée distillée dans laquelle il est ensuite stocké à 40C. Après une semaine, l'activité est de 15 unités internationales par millilitre de produit composite glucose oxydase immobilisée/résine. Le gel composite est charge dans une colonne et des spécimens de glucose sont analysés comme décrit dans l'exemple 1. REVEND I CAT I0N 1. Procédé pour déterminer la teneur en glucose dans un spécimen aqueux contenant du glucose caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes - dilution dudit spécimen dans un diluant tamponné aqueux tamponne ayant un pH compris entre 4 et environ 8, - passage du spécimen dilué dans un lit de glucose oxydase immobilisé sur un support solide - maintien en contact dudit spécimen dilué avec ladite glucose oxydase pendant une durée suffisante pour oxyder ledit glucose en peroxyde d'hydrogène - élimination du mélange réactionnel résultant dudit lit ;; - passage du mélange réactionnel résultant en contact direct avec un ensemble d'électrodes polarographiques - détermination par polarographie du peroxyde dthydro- gène dans ledit mélange réactionnel pendant qu'il est en contact direct avec lesdites électrodes de polarographie, pour produire un courant électrique proportionnel à la concentration en peroxyde hydrogène dans ledit spécimen - détermination dudit courant électrique et traduction dudit courant, en concentration de glucose dans ledit spécimen. 2.-- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que tout le glucose est oxydé pour former du peroxyde d'hydrogène. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit diluant tamponné aqueux est tamponné à un pH compris entre 5 et 7. 4-. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit spécimen aqueux contenant du glucose est du sérum de sang. 5. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé par le fait que ledit support solide est un oxyde réfractaire en forme de particules. 6. Dispositif pour déterminer le glucose dans un spécimen aqueux contenant du glucose caractérisé par le fait qu'il comprend en combinaison une chambre de réaction contenant un lit de glucose oxydase immobilisé sur un support solide , ladite chambre de réaction ayant un dispositif d'entrée du spécimen et un dispositif de sortie pour les produits de réaction, une cellule polarographique interconnectée avec ladite sortie des produits de réaction, ladite cellule comprenant une chambre d'échantillon tubulaire ayant une entrée et une sortie d'échantillon, ladite chambre étant équipée d'un ensemble d'électrodes polarographiques positionnées de telle façon à assurer une communication électrique directe avec l'échantillon présent dans ladite chambre, lesdites électrodes étant connectées électriquement en vue d'une réponse ampérométrique au courant électrique créé dans ladite cellule. 7. Dispositif selon la revendication 6 caractérisé par le fait que l'ensemble des électrodes comprend trois électrodes qui sont une électrode de travail, une électrode de comptage et une électrode de référence. 8. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé par le fait que ledit ensemble d'électrodes comprend une électrode de référence d'une électrode de travail. 9. Dispositif selon la revendication 7 caractérisé par le fait que ladite électrode de travail est en platine, que ladite électrode de comptage est en platine et que ladite électrode de référence est en argent couvert par du chlorure d'argent. 10. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé par le fait que ledit support solide comprend un oxyde réfractaire en particules.