FR 2316140 A1 19770128 FR 7521096 A 19750704 Tous les bactériologistes qui travaillent avec des germes anaérobies savent bien que lorsque le milieu de culture solide à employer ne se trouve pas parfaitement réduit, par suite d'une conservation en anaérobiose défectueuse et par conséquent d'une réoxydation du milieu, le développement des micro-organismes anaérobies stricts,ne tolérant pas l'oxygène, se trouve en difficulté et est quelquefois totalement empeché. Afin de pallier cet inconvénient et en même temps de ne pas être obligé de préparer fréquemment ces milieux solides pour anaérobiose, on a inventé les milieux dit P.R.A.S. (préréduits anaérobiquement et stérilisés) qui permettent d'atteindre le but poursuivi, mais leur technique de préparation exige du matériel et des manipulations d'une certaine complexftéMOORE W.E.C."Techniques for routine culture of fastidious anaerobes" - Int. J. Syst. Bacteriol.(i966) 16, 173-90; HUNGATE RE "The anaerobic mesophilic cellulolytic bacteria" - Bact. Rev.(1950) 14, 1-4g. La présente invention a pour but de diminuer cette complexité du matériel comme des manipulations. A cet effet, elle a pour objet un dispositif de bouchage pour tube à essais destiné à contenir plus spécialement un milieu de culture èn anaérobiose, ce dispositif étant adapte à la technique de remplissage du tube et assurant l'étanchéité du tube rempli et la bonne conservation de l'état d-e réduction de son contenu, au cours du stockage, avant utilisation, et en cours d'utilisation, après ensemencement du milieu de culture avec des micro-organismes anaérobies. Ce dispositif, associé à un tube à essais à col fileté connu en soi, est caractérisé en ce qu'il se compose, d'une part, d'un bouchon cylindrique souple d'un diamètre sensiblement égal au diamètre interne du col du tube à essais, présentant à sa partie inférieure au moins deux nervures annulaires superposées, entaillées de rainures transversales, et pourvu, au-dessus d'une partie cylindrique destinée à être appliquée contre la paroi interne du tube à essais et surmontant la région nervurée, d'une collerette d'appui sur le sommet du col du tube, d'autre part, d'une capsule rigide taraudée s'engageant sur le bouchon et se vissant sur le col fileté du tube de telle sorte que son fond vienne s'appliquer sur ladite collerette et la presse contre le sommet du tube. le bouchon souple est, par exemple, en caoeitchouc, de préférence en caoutchouc de silicone qui résiste à la chaleur; il peut être en tout autre élastomère naturel ou synthétique résistant à la chaleur, tel que "Viton", 'Néoprène" et similaire- Quant à la capsule rigide, elle peut être en métal, en plastique rigide ou en toute autre matière rigide taraudable. lesdites rainures transversales des nervures annulaires sont avantageusement disposées en chicane d'une nervure a l'autre, pour assurer une meilleure résistance du bouchon souple. Si le bouchon comporte, au-dessus de la collerette, un appendice facilitant la préhension, le fond de la capsule est percé de façon que la capsule puisse être enfilée sur cet appendice. L'étanchéité du bouchage est assurée par le contact entre la partie cylindrique du bouchon surmontant les nervures et la surface interne du col du tube et par la collerette du bouchon, comprimée par la capsule sur le sommet du tube. Be fines nervures ou rainures d'étanchéité connues en soi peuvent encore être prévues sur ladite partie cylindrique et sous ladite collerette. Ce dispositif de bouchage offre les possibilités sui vantes l) Emploi avec les tubes à essais couramment utilisés dans tous les laboratoires pour des travaux bactériologiques de routine, c'est-à-dire les tubes de 160 x 16 mm à col fileté. 2) Stérilisations multiples quand le bouchon est fabriqué en caoutchouc aux silicones, car il conserve alors ses propriétés entre -800C et + 2200C. 3) Entrée de gaz dans le tube sur lequel le bouchon se trouve placé et sortie de gaz hors de ce tube, par les nervures annulaires rainurées transversalement du bouchon, avant l'enfoncement complet de celKui-ci. 4) Création avec une relative facilité, dans les simples tubes à essais ordinaires contenant un milieu de culture solide, de l'état de réduction en anaérobiose, qui est maintenu pendant la stérilisation et après celle-ci, pendant un temps prolongé. 5) Fermeture hermétique des tubes en raison de la forme du bouchon et de la pression qui s'exerce sur sa collerette par le serrage de la capsule métallique vissée, qui lui est associée. 6) Conservation pendant longtemps, étant donné la bonne étanchéité assurée, du milieu de culture ainsi préparé, sans qu'il soit besoin de prendre des précautions particulières. 7) Culture des germes anaerobies en anaérobiose permanente. 8) Incubation en étuve normale du milieu ensemencé avec des micro-organismes anaérobies, sans autres précautions. En résumé, l'application de ce dispositif de bouchage permet de disposer avec une entière commodité des tubes à essais ordinaires chargés de milieu en anaérobiose et de les incuber avec facilité dans des étuves courantes pour micro-organismes aérobies. Une forme particulière d'exécution du dispositif de bouchage suivant l'inventionvaatre décrite ci-après, à titre purement indicatif et nullement limitatif, en référence au dessin annexé sur lequel ta figure 1 est une vue en élévation du bouchon souple du dispositif. La figure 2 est une vue en plan de dessous de ce bouchon. La figure 3 est une vue en coupe du dispositif de boucha; gei9onté sur le col fileté d'un tube à essais. te bouchon 1 en matière souple, par exemple en caoutchouc de silicone, est de forme généraaecylindrique. Il comprend une région inférieure 2 destinée à être enfoncée dans le col fileté 3 d'un tube à essais connu en soi 4, cette région étant limitée vers le haut par une collerette 5 destinée à venir reposer sur le sommet du col 3 du tube à essais. Au-dessus de la collerette 5, le bouchon 1 comporte un appendice 6 facilitant la prise et la manipulation du bouchon.Au-dessous de la collerette 5, le bouchon comprend une partie cylindrique 7 destinée à s'appliquer exactement contre la surface interne du col 3 du tube à essais, et, au-dessous de cette partie 7, deux nervures annulaires superposées 8, entaillées de rainures transversales 9, décalées d'une nervure à l'autre, de façon à former des chicanes pQxr le passage des gaz. Dans le mode de réalisation représenté au dessin, chaque nervure 8 présente trois rainures transversales 9 espacées angulairement de 1200, ce nombre et cet espacement n'étant aucunement limitatifs. te dispositif de bouchage comprend également une capsule rigide 10, par exemple en métal, taraudée en il à sa partie supérieure et dont le fond est percé en 12, pour permettre l'engagement de la capsule sur l'appendice 6 du bouchon. La figure 3 montre le dispositif en place sur le col 3 du tube à essais 4. La capsule 10 vissée sur le col fileté 3 du tube comprime la collerette 5 du bouchon sur le sommet du col du tube. L'étanchéité est assurée par cette collerette 5 formant joint et par le contact étroit entre la partie cylindrique 7 du bouchon et la surface interne également cylindrique du col du tube. L'inté rebat des nervures annulaires 8 et rainures transversales 9 est expliqué ci-après. La technique d'utilisation de ce dispositif de bouchage est simple. te milieu de culture est introduit à l'état liquéfié dans le tube à essais ouvert, où il se solidifie par refroidissement. Une fois le tube à essais rempli du milieu solide désiré pour culture anaérobie, le bouchon souple est entré partiellement dans le col du tube, jusqu'au niveau de la deuxième nervure annulaire; cette position permet, du fait de l'existence des rainures en chicane des nervures, l'entrée des gaz à l'intérieur du tube et leur sortie. Pour créer llétat de réduction en anaérobiose dans le milieu de culture ainsi qu' à l'intérieur du tube, on opère alors de la façon suivante: te bouchon ayant été placé comme susindiqué, on régénère le milieu de culture par~l'action d'un chauffage de 15 minutes au bain marie bouillant; le tube ainsi régénéré est immédiatement sorti du bain marie et refroidi brusquement dans un bain d'eau froide, puis il est placé dans une jarre, dans laquelle, après fermeture, on fait le vide; on rompt celui-ci par l'introduction d'un gaz inerte, comme par exemple de l'azote (N) ou de l'anhydride carbonique C02, pais de nouveau on fait le vide et on casse celuici, cela au moins trois fois consécutives. ta pression normale étant rétablie à l'intérieur de la jarre, on ouvre celle-ci et on procède immédiatement à l'enfoncement complet du bouchon dans tous les tubes, puis on-pose et on visse parfaitement la capsule métallique d'accompagnement et on procède à la stérilisation dans l'autoclave pendant 20 à 30 minutes à1150C. Une fois la stérilisation terminée, ces tubes ainsi pré- parés se trouvent en état de réduction en anaérobiose et ils sont stérilisés; ce sont des tubes à milieu dit P.R .A.S. Ils peuvent alors être employés ou etre conservés pour un usage ultérieur. Si ces tubes doivent etre utilisés immédiatement, on les étale à la sortie de l'autoclave pour étendre le milieu sous forme inclinée ou sous toute autre forme,comme par exemple en 1,tubes roulés" (on imprime un mouvement de rotation aux tubes dans lesquels le milieu gélosé a été porté à 45 C, ce qui plaque le milieu de culture contre la paroi du tube au cours du refroidissement). Si ces tubes doivent être conservés, on laisse le milieu se solidifier en culot et, au moment de l'emploi, on le fait fondre sous l'action de la chaleur dans un bain marie jusqu'à fusion de l'agar-agar,puis alors on fait le nécessaire pour donner au milieu la forme désirée. L'existence de résazurine dans le milieu permet de découvrir la réoxydation éventuelle du milieu et par conséquent la rupture de l'état de réduction en anaérobiose au moment de l'utilisation de ce tube après conservation. On ensemence le milieu de culture en germes anaérobies avec une anse métallique en fils de platine ou en fils nichrome (ensemenceur bactériologique), adaptée à un manche creux branché à une source de gaz neutre tel que l'azote, le C02, etc.. Pendant le cours délai d'ensemencement au moyen de l'anse métallique, on envoie dans le tube, par l'intermédiaire du manche creux, un balayage de gaz neutre. te tube est ensuite immédiatement refermé avec son bouchon et l'anaérobiose est conservée. Bien entendu, ce bouchon peut aussi etre employé sans capsule d'accompagnement pour boucher des tubes contenant un milieu de culture en aérobiose ainsi que pour d'autres usages dans lesquels les tubes doivent simplement être bouchés, sans qu'il y ait lieu d'empêcher l'entrée de l'air, mais son but véritable et son intéret majeur sont d'hêtre employé pour la création et le maintien de milieux de culture solides en état de réduction en anaérobiose avec les avantages énumérés ci-dessus qui en découlent. Des modifications de détail du domaine des équivalences techniques peuvent etre apportées à la structure décrite ci-dessus du dispositif de bouchage, sans que l'on sorte pour cela du domaine de l'invention. - REVENDICATIONS 1.- Dispositif de bouchage pour tube à essais ies- tiné notamment à contenir un milieu de culture en anaérobiose, le tube à essais ayant un col filetég caractérisé en ce qu'il se compose,d'une part, d'un bouchon cylindrique 1 souple d'un diamètre sensiblement égal au diamètre interne du col du tube à essais, présentant à sa partie inférieure au moins deux nervures annulaires 8 superposées , entaillées de rainures 9 transversales, et pourvu, au-dessus d'une partie cylindrique 7 destinée à etre appliquée contre la paroi interne du tube à essais et surmontant la région nervurée, d'une collerette 5 d'appui sur le sommet du col du tube, d'autre part, d'une capsule 10 rigide taraudée s'engageant sur le bouchon et se vissant sur le col fileté du tube de telle sorte que son fond vienne s'appliquer sur ladite collerette et la presse contre le sommet du tube. 2.- Dispositif suivant la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites rainures transversales sont disposées en chicane d'une nervure à l'autre. 3.- Dispositif suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit bouchon comporte, au-dessus de la collerette, un appendice facilitant la préhension et en ce que le fond de ladite capsule est percé de façon que la capsule puisse être enfilée sur cet appendice.