FR 2311759 A1 19761217 FR 7516055 A 19750523 La présente invention a pour objet un procédé amélioré de dégradation biologique de solutions diverses contenant des phénols (phénol, crésols, xylénol, pyrocatechol...) et son application à la biodégradation des eaux résiduaires riches en ces dits phénols. Les phénols et ses dérivés sont rejetés par de nombreux effluents résiduaires d'industries chimiques, cokeries, distilleries de goudron, fabrique de matières plastiques, de matières explosives. Ces substances posent de graves problèmes car leur toxicité est très élevée. Ainsi à dose de 5 mg/l, les phénols traditionnellement rejetés sont mortels pour la faune; à dose de 0,2 mg/l, ils altèrent le goût des poissons. Il est donc capital de limiter le rejet de ces produits dans les cours d'eau en essayant de les récupérer par des procédés chimiques à l'usine ou de les biodégrader dans les stations d'épuration. L'élimination des phénols par voie physico-chimique consiste généralement en une oxydation. Les procédés d'acidification et de floculation n'ayant qu'une portée limitée, ne sont plus utilisés que comme prétraitement avant oxydation. L'oxydation se fait soit paru'eau oxygénée, le permanganate de potassium, le peroxyde de chlore, soit encore par l'ozone. Ces procédés se révèlent très codteux. On peut encore utiliser comme agent oxydant le chlore, mais la mise en oeuvre du procédé est alors délicats et une faible partie seulement du réactif est consommée par les phénols. En ce qui concerne les procédés biologiques, de nombreuses souches ont été étudiées en vue de leur utilisation dans les stations d'épuration. Il apparatt très difficile d'obtenir une souche suffisamment performante, ce qui implique en plus de l'adaptation de la souche aux phénols, la dilution des eaux résiduaires. Les souches les plus utilisées sont les Pseudomonas, mais il est difficile d'obtenir dans des délais raisonnables la dégradation des phénols à plus de 40 à 50 mg/l. La demanderesse a découvert un nouveau microorganisme Nocardia Sp. B87 capable de réaliser par la mise en oeuvre de moyens simples, la dégradation de quantités importantes de phénols à des vitesses considérablement plus élevées que celles des procédés décrits jusqu'ici. Les quantités de phénol dégradées peuvent atteindre 3 g/l. En outre, les cellules du microorganisme revendiqué sont préalablement adaptées aux phénols puis transformées en cellules sèches revivifiables. D'où une très grande facilité d'emploi et l'entrée en action immédiats du microorganisme. L'objet de l'invention est réalisé par une première phase d'adaptation de la souche Nocardia Sp. B87 aux phénols, puis par une phase de production de cel lules. Les cellules obtenues sont ensuite déshydratées. Elles peuvent alors ttre utilisées à la dégradation des phénols. La quantité de cellules sèches utilisées dans la mise en oeuvre du procédé varie bien sûr en fonction de la quantité de phénols à dégrader, mais reste faible, étant donné la très grande activité de la souche Nocardia Sp. 1387. Pour une eau de cokerie traditionnelle, les cellules revivifiables sont utilisées en quantité allant de 10 à 3000 mg de poudre de cellules sèches par litre de milieu (l mg de poudre contient 10 cellules), préférentiellement 108 à 2.108 cellules/ml de milieu. La comparaison des vitesses de dégradation du phénol, des crésols, du xylénol par la souche Nocardia Sp. B87 est illustrée par le tableau suivant Activités comparées à celle obtenue pour le phénol Phénol 100 % o-crésol 38 - 5 % m-crésol 30 - 5 % 17 p-crésol 17 - 3 % Xylénol Le microorganisme Nocardia Sp. B87 a été isolé à Nesle dans la Somme à partir d'échantillons de terre. Les caractéristiques données ici permettent de décrire la souche B87 comme faisant partie du genre Nocardia. Par contre, ces caractéristiques ne correspon dent exactement à aucune des espèces du genre Nocardia décrites dans le Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 8th Edition. Elles ne correspondent pas non plus aux caractéristiques des souches déjà décrites comme susceptibles de métaboliser les phénols. Il s'agit donc d'une espèce nouvelle non décrite, capable de dégrader phénol, ortho, méta, para crésols, xylénol, pyrocatéchol... Description de la souche Nocardia B87 Caractères morphologiques Culture sur gélose : colonies rondes, bombées, luisantes, rose clair. Culture en milieu liquide : Bacilles assez courts, irréguliers de 3,5 x 1,5 je environ, parfois formant des channes allongées; ni spores; ni capsules; ramifiés à leé- tat jeune. Coloration de Gram : positive (négative à ltétat très jeune ramifié). Caractères physicochimiques et culturaux Pousse en présence de phénol juaqu'à 3,5 g/l n m-crésol n 1 g/l Température de culture 28 - 30 OC Mobilité : Type respiratoire : aérobie strict Oxydase : Métabolisme : (Hugh - Leifson) : inactif Klogler : lactose glucose gaz H~S 2 Réduction des nitrates : + Liquéfaction de la gélatine : Production d'indole Production de NH3 Utilisation du citrate Lait : lentement alcalinisé Réaction de Voges-Proskauer Réaction au rouge de méthyle Arginine-dihydrolase + Ornithine décarboxylase Lysine décarboxylase - Utilisation des sucres (milieu liquide) Levulose + Saccharose Maltose Galactose Mannitol + Xylose Raffinose Arabinose Inositol - Les exemples suivants, sans litre limitatifs, vont montrer tout l'intérêt de la découverte revendiquée. Exemple NO 1 Précaration de cellules sèches revivifiables de la souche Nocardia SD. D87 - Préoaration de la souche en vue de la production des cellules Stade 1 La souche B87 est cultivée en tube de gélose nutritive inclinée pendant 24 H à 30 OC. Chaque tube contient 10 ml de gélose ayant la composition du milieu A ajustée à pH = 7 et stérilisée 20 mn à 120 OC. Stade 2 Après incubation de la gélose, on ensemence un milieu dont la composition est celle du milieu B (pH compris entre 7,7 et 8, avant stérilisation pendant 20 mn à 121 C). Pour inoculer 100 ml du milieu B placé dans un erlen de 500 ml, on utilise un tube entier de gélose. On laisse incuber pendant 10 H à 30 OC sur shaker rotatif (180 t/mn). Le taux résiduel de phénol doit etre environ 0. Stade 3 On ensemence alors un milieu de préculture dont la composition est celle du milieu C. L'ensemencement se faisant dans les conditions suivantes = 100 ml d'inoculum (stade 2), pour 1 litre de milieu de préculture dans un erlen de 6 litres. On laisse incuber 14 H à 30 C sur shaker rotatif (180 t/mn). Le taux résiduel de phénol doit Entre voisin de 0. Le pH final est 6,90; la DO (1/10 en cuve de 10 mm à 650 ssy) = 0,23; le nombre de germes est : 3.109/ml. - Production des cellules 35 1 de milieu de culture (milieu D) contenus dans une cuve inox de 100 1, sont stérilisés par passage de vapeur à 120 OC pendant 20 mn. Le volume du milieu de culture après stérilisation est de 45 1. On inocule alors 5 l du bouillon de préculture. On laisse incuber pendant 24 à 26 H à 30 OC. L'agitation est de 90 t/mn, l'aération de 20 l/mn/1O0 1 de milieu, la pression intérieure de 500 g. On laisse évoluer le pH. En fin de fermentation, le taux résiduel de phénol est inférieur à 50 mg/l, le pH est 7,5, la Do (au 1/10 à 650 mais égale à 0,20 et le nombra total de germes/ml est 5.109. Dans une cuve inox de 1000 1, on introduit 360 l de milieu D que l'on stérilise par contact sans modification de volume. On inocule alors 40 l de la culture précédente. On laisse incuber à 30 OC sous agitation (50 t/mn) et aération (20 l/mn/100 l milieu), en laissant évoluer le pH de 16 à 46 H, on alimente avec une solution de phénol à 12,5 g/l de façon à maintenir un taux résiduel moyen de 300 - 100 mg/l en phénol. Cette alimentation est arrêtée un peu avant la fin de la culture de façon à obtenir das le bouillon final un taux de phénol le plus bas possible. Les caractéristiques du bouillon final sont les suivantes : Nombre de germes : 2 à 4.109 DO (1/10 à 650 m > ï) 2 1 Phénol résiduel C 300 mg/l Phénol consommé 2 3,5 g/l de mont récolté Phénol total consommé 2 2000 g Volume final 2 530 l - Production de cellules sèches revivifiables Elles peuvent litre préparées de 2 manières Procédé 1 On traite les 500 l de bouillon de culture obtenu précédemment, sur une centrifugeuse à assiettes (10 000 g), équipée en clarificateur, sous une alimentation de 100 l/H et une température de 15 06. On obtient 14 l de cellules centrifugées et 86 l de bouillon clarifié par heure. Aux 70 l de cellules centrifugées, on ajoute 35 Kg de sulfate d'ammonium (500 g/l). La température est inférieure ou égale à 15 OC. Les cellules centrifugées, ainsi floculées sont traitées sur un filtre rotatif à précouche (adjuvant silice: de 0,1 m2. La vitesse du tambour est de 45 t/H, la coupe de 8 mm/H et le débit de filtration de 400 l/H/m2 (soit un peu moins de 2 H pour les 70 l de cellules centrifugées floculées à partir des 500 l de bouillon de départ). On obtient 5 Kg de cellules humides à 55 % d'extrait sec. Le séchage peut se faire à 40 OC sous vide ou à l'air pulsé sec jusqu'à obtention d'une poudre,(ex- trait sec 2 95 %). On obtient donc 3 Kg de cellules sèches ayant les caractéristiques suivantes : Phénol 10 mg/g Germes revivifiables 1 à 5.108 par mg. Procédé 2 On sépare les cellules du bouillon de fermentation et on les flocule au sulfate dtammonium comme dans le procédé 1. Les cellules centrifugées et floculées sont traitées sur un filtre à pression de 0,33 m2 avec un débit de 25 l/H/m2. On obtient ainsi 2,7 Kg de cellules humides (extrait sec 60 à 65 %). Les cellules sont séchées comme dans le procédé 1. On obtient 1,8 Kg de poudre ayant les caractéristiques suivantes Phénol 15 mg/g Extrait sec # 95 % Germes revivifiables/mg : 3,5.108 à 1,1.109 Exemple No 2 10 On inocule avec environ 10 cellules (correspondant à 100 mg de poudre), 100 mi d'un milieu ayant la composition du milieu G, le phénol est dégradé totalement en 24 heures. Exemple ND 3 On utilise le meme milieu que précédemment, mais avec 2 g/l de peptone pancréatique et 1200 mg/l de phénol. Le taux d'inoculation est le même. La dégradation totale du phénol est obtenue au bout de 20 heures. Exemple NO 4 On utilise le mbme milieu avec 2 g/l de peptone mais seulement 1000 mg/l de phénol. Après 14 H d'incubation, on transfère à raison de 20 % dans le méme milieu ne contenant pas de peptone, mais 2000 mg/l de phénol. La dégradation totale du phénol est obtenue au bout de 24 heures. Exemple NO 5 10 On inocule toujours à raison de 10 cellules/100 mi une eau de raffinerie re- constituée, ayant la composition du milieu H. Il est à noter que ce milieu ne contient aucun sel minéral autre que ceux contenus normalement dans les effluents de cokerie. La dégradation totale des phénols est obtenue en 6 heures. Exemple ND 6 On inocule au meme taux que précédemment une eau de cokerie reconstituée ayant la composition du milieu I. La destruction totale des phénols est obtenue en 4 jours. Exemple NO 7 Utilisation des cellules sèches revivifiables à la déoradation des phénols en station d'épuration. Les tests ont été effectués sur une maquette de station d'épuration constituée de deux parties : une cuve aérée, d'un volume de 3 litres et un décanteur d'un volume de 2 litres. Le niveau supérieur de la cuve aérée est relié au fond du décanteur par l'intermédiaire d'un trop plein permettant le recyclage continu des boues (définition de cette maquette dans "Détermination de la biodégrada bilité des agents de surface synthétiques anioniques", rapport OCDE 1971). Le fonctionnement de la station. se fait en 2 étapes : - Etape de formation des boues La station est remplie par 5 l de milieu E auquel on ajoute 5 g de phénol (soit 1 g/l) et 2 g de cellules sèches à 3 à 5.108 germes/mg (soit 0,4 g/l). Le phénol est dosé 2 à 3 fois par jour dans le milieu. Dès que sa teneur tombe au-dessous de 300 mg/l, on alimente l'appareil avec une "eau de cokerie reconstituée à raison de 1600 ml/24 H (l'eau de cokerie reconstituée a la composition du mi lieu F) jusqu'à ce que la teneur en phénol de l'affluent remonte à 1 g/l. Le système est alors remis en circuit fermé, jusqu'à obtenir à nouveau une teneur en phénol inférieure à 300 mg/l. On réalimente à nouveau en continu et ainsi de suite. Au cours de cette étape, la station est réensemencée 3 fois par semaine avec 0,4 g/l de cellules sèches.La période de formation est considérée comme achevée lorsque le taux de phénol dans lteffluent reste constant. La durée de cette phase est de 3 semaines à 1 mois. - Etape d'épuration A la fin de l'étape de formation des boues, la dégradation du phénol compense l'alimentation. Au cours de l'étape d'épuration, ltalimentation en eau de cokerie" est permanente, le réensemencement devient hebdomadaire. Ainsi : deux maquettes de station d'épuration sont placées en série en fin de phase de formation des boues, et alimentées par liteau de cokerie précédeament définie. Pour un taux de phénol dans l'alimentation de 3 g/l et un débit d'alimentation de 180 ml/H, les résultats obtenus sont les suivants Temps de séjour moyen par station = 16 H Taux de phénol dans les affluents de la 1ère station : 800 mg/l Taux de phénol dans les effluents de la 2ème station : 50 à 80 mg/l Le taux de dégradation représente 98 % du phénol mis en oeuvre. La vitesse de dégradation est de 81 600 mg de phénol par jour et par m3 d'installation d'épuration. TABLEAU DES COMPOSITIONS DES MILIEUX Milieux A B C D E Beef extract 20 g 20 g Bacto peptone 20 g 20 g NaCl 5 g 1 g 5 g 0,25 g 0,125 g Agar 20 g 20 g Eau déminéralisée qsp 1000 ml KH2PO4 3,3 g 3,8 g 0,25 g NH4NO3 1 g 1 g 0,3 g MgSO4, 7H2O 0,25 g 0,25 g 0,125 g Solution oligoéléments 1 ml 1 ml 1 ml Phénol 600 mg 1 g 1 g Eau de ville qsp 1000 ml 1000 ml 1000 ml 1000 ml Peptone pancréatique 1 g MnSO4, H2O 5 mg FeCl3 (28 %) 0,2 ml Extrait de tarre 3 ml KNO3 0,3 g NH4Cl (NH4)2SO4 Ne2S NH4HCO3 KCN NH3 libre m-crésol CH3COONa o-crésol p-crésol 3-5-xylénol Hexane Essence NaCH3CO2 NH4OH TABLEAU DES COMPOSITIONS DES MILIEUX MILIEUX F G H I Beef extract Bacto peptone NaCl 0,125 g Agar Eau déminéralisée qsp KH2PO4 0,25 g NH4NO3 0,3 g 128 mg MgSO4, 7H2O 0,125 g Solution oligoéléments 1 ml Phénol 2,354 g 600 mg 6,4 mg 2615 mg Eau de ville qsp 1000 ml 1000 ml 1000 ml 1000 ml Peptone pancréatique 0,0025 g MnSO4, H2O FeCl3 (28 %) Extrait de terre 3 ml KNO3 0,3 g NH4Cl 9,62 g 9405 mg (NH4)2 SO4 1,107 g 1230 mg Na2 S 0,825 g 917 mg NH4HCO3 0,273 g 303 mg KCN 0,0027 g 3 mg NH3 libre 0,700 g m-crésol 0,784 g 2,6 mg 871 mg CH3COONa 0,949 g o-crésol 4,2 mg p-crésol 2,6 mg 3-5-xylénol 4,2 mg Hexane 10 mg Essence 40 mg NaCH3CO2 1055 mg NH4OH # pH = 8,6 Composition de la solution d'oliooéléments Pour 1 litre d'eau distillée qsp : FeSO4, 7H20 : 53 g; MnSOq, 7H20 : 7 g; ZnSO4, 7H20 : 0,1 g; CuS04, 5H2O : 0,05 g; H3B03 : 0,05 g; H2504 concentré : îml. Préparation de la solution d'extrait de terre 1 @ Kg de terre de jardin est mis à incuber 24 H dans 1 litre d'eau de ville, puis placé à l'autoclave pendant 1 H à 130 C avant litre filtré à chaud sur papier. R E V E N D I C A T I O N S 10/ Procédé de dégradation biologique de solutions contenant des phénols à l aide d'une souche de Nocardia désignée par Nocardia Sp. 1387, sous forme de poudre de cellules déshydratées revivifiables. 20/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche Nocardia Sp. BB7 est capable de dégrader les phénols dans une gamme de concentrations de 0 à 3000 mg/l. 30/ Procédé selon les revendications 1 et 2 caractérisé en ce que la souche Nocardia Sp. B 87 est cultivée dans un milieu contenant du phénol et que la biomasse ainsi produite est séparée du milieu de culture, puis déshydratée seule ou mélangée à des supports inertes en vue de o lobtention d'une poudre de cellu- les revivifiables utilisables comme ensemencement pour des stations d'épuration. 4 / Procédé selon les revendications 1 & 2 caractérisé en ce que les cellules sèches revivifiables de Nocardia Sp. B87 sont utilisées en quantités allant de 10 mg à 3 g de cellules/1 de milieu, préférentiellement de 108 à 2.108 cellules/ mi de milieu. 5 / Application du procédé selon les revendications 1, 2 & 3 à la dégradation biologique d'eaux résiduaires contenant des phénols et dérivés phénoliques et plus particulièrement à la dégradation biologique d'effluents d'industries chimiques, pétrolières, cokeries, distilleries de goudron, fabrique de matières plastiques, de matières explosives.