FR 2333516 A1 19770701 FR 7536749 A 19751201 La présente invention concerne la production de virus dans des cultures de tissus, au moyen d'un milieu chimiquement défini. L'expression "milieu chimiquement défini" est utilisée dans le domaine de la culture de tissus et en virologie pour désigner des milieux de culture de composition chimique connue, à la fois quantitativement et qualitativement, par opposition à des milieux naturels ou non définis contenant des produits naturels tels que du sérum animal, des extraits d'embryons,des hydrolysats de levure, etc., de constitution chimique inconnue ou imparfaitement connue. On connaît un certain nombre de milieux chimiquement définis. La plupart de ces milieux sont des solutions d'agents nutritifs, par exemple hydrates de carbone, lipides et aminoacides, et de vitamines, de sels et de minéraux, et contiennent souvent d'autres agents nutritifs tels que les bases puriques, le triphosphate d'adénosine, etc. Lesdits milieux sont généralement utilisés sous forme d'une solution, dans une solution saline équilibrée (plus brièvement ci-après BSS), clest-å-dire une solution équilibrée en quantité et en proportion en ce qui concerne les espèces ioniques, de manière à présenter un pH, une teneur en matières minérales, une pression osmotique, etc., physiologiquement acceptables. Un certain nombre de BSS song largement utilisées, et l'on citera par exemple, les BSS de Hank, de Earle, la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, la solution saline de Puck, et d'autres. Un certain nombre de milieux chimiquement définis sont de meme largement utilisés, et lton citera par exemple le milieu 199 de Morgan, Morton et Parker, Proc. Soc.Exper. Blol.f Med. 73 1-8 (1950) ; le Eagle Basal Medium, Science 122 : 501-4 (1955) ; Science 123 : 845-7 (1956) ; Eagle, et col, J. Biol. Chem. 226 191-206 (1957) ; le Eagle Minimum Essential Medium, Eagle, Science 130 : 432-7 1959) ; le Trowell Medium T8, Exper. Cell Res. 16 : 118-147 (1959) ; le Waymouth iB 75211 Sodium, J. Nat. Cancer Inst. 22 : 1003-17 (1959) ; le Puck N 16 Puck, Cieciura et coll J. Exper. Med. 108 : 945-956 (1958) et Neuman et Tytell, Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 104 : 252-256 (1960). Des détails de la préparation et de la formulation de tels milieux peuvent etre trouvés dans la littérature classique, par exemple Handbook of Cell and Organ Culture, Merchant, Kahn and Murphy, Burgess Publ. Co., Minneapolis (1960) ; et dans In Vitro Monograph n 1, A Survey of Commercially Available Tissue Culture Media, Helen C. Morton, In vitro (J. Tissue Culture Association), Vol. 6, na 2, pages 89-108 (1970). En dehors de la classification des milieux on tînt que "milieux définis" ou "non définis", on classe également ces milieux, de manière schématique, en se référant à leur aptitude a permettre la proli fixation et le métabolisme cellulaires. Les milieux qui permettent le métabolisme des cellules à un niveau convenant à de nomhreuses utilisations, y compris la production de virus mais qui soit ne permettent pas une prolifération cellulaire importante, soit ne permettent qu'une prolifération très limitée, sont désignés par "milieux de conservation". Des milieux qui permettent la prolifération cellulaire sont généralement désignés par "milieux de croissance".La plupart des milieux de croissance- ont pour base uns BSS ou un milieu chimiquement défini auquel on n ajouté 1 ou plusieurs produits naturels, habituellement du sérum animal. Des milieux typiques de croissance comprennent soit le Basal Medium de Eagle, soit le milieu 199,complémenté par 10 a 20 X0 de sérum animal complet une BSS et 40% de sérum ; et une BSS à 40 % et 40 % de sérum et 20 % d'extrait d'embryons. Quelques milieux chimiquement définis, ne contenant pas de protéines, peuvent être utilisés comme milieux de croissance pour un certain nombre de types de cellules (Katsuta and Takaoka, Methods in Cell Biology VI, Prescott, Academic Press (1973),Chapitre g. Cependant, pour la croissance de cellules primaires dans des cultures de tissus, et pour des cultures de tissus à tres grande échelle pour la production de vaccins, il s'est. révélé nécessaire d'ajouter un sérum. Les désavantages de l'utilisation d'un sérum dans la production de vaccins sont bien connus. Un sérum convenable est difficile et coûteux å obtenir, à conserver et à utiliser ; il représente une source de protéines étrangères non souhaitables qui peuvent être introduites dans le vaccin final ; sa composition varie d'un lot à un autre ; et il représente enfin une source potentielle de contaminaFion des virus ou du mycoplasme. (Esber et coll., J. National Cancer Institute, 50 : 559-62 (1973), Barile et Kerne, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 138 : 432-7 (1971) ; Nerril et coll., In Vitro, 8 : 91-3 (1972,'j. L'invention utilise un milieu contenant de l'insuline. On connalt différents milieux contenant de l'insuline, ces milieux étant utilisés. Les milieux de croissance contenant du sérum contiennent généralement quelque insuline, naturellement présente dans le sérum en quantités non contrôlables et variables. D'autres milieux comprennent le Trowell T-8, voir ci-dessus, le "Serum Free Medium" de Neuman et Tytell, voir ci-dessus, le milieu de Frenkel, Am. J. Vet. Res., Vol. XI 371-373 (1950) et Vol. XII, 187-90 (1951), et le Waymouth MAB 87/3,Tissue Culture, Ramakrishnan ed., Junk, The Hague (1965) page 168. On se référera également aux brevets des Etats-Unis d'Amérique n 3 196 077 et 3 655 873, et à Katsuka et Takaoka, voir ci-dessus, tableau II. Le milieu de Frenkel contient environ 0,9 unité d'insuline par litre; le milieu de Trowell contient environ 50 ingil, et contient une quantité minimale de zinc ; le milieu de Waymouth contient 8 mg/1. Le milieu de Neuman et Tytell contient 1 mg d'insuline par litre (I mg d'insuline correspond à plus de 20 unités, selon la pharmacopée britannique (British Pharmacopoeia, 1973, 246). Bien que de tels milieux aient eu de nombreuses utilisations, il ne se sont pas révélés être entièrement satisfaisants pour des utilisations à grande échelle, par exemple la production de vaccins ou les cultures de tissus primaires à grande échelle. ta protaminelzinefinsuline (plus brievement ci-après "PZI") peut généralement etre obtenue sous forme d'une solution stérile, dans un tampon aqueux d'insuline modifiée par le chlorure de zinc et la protamine. La suspension de PZI contient d'environ 0,2 à environ 0,25 ng de zinc et d'environ 1,0 à environ 1,7 mg de protamine pour 100 unités d'insuline, et la suspension présente un pH compris entre environ 6,9 et 7,4 (on se référera par exemple à la pharmacopée des Etats-Unis d'Amérique,United States Pharmacopeia, XVIII, (1970) pages 335-336 ; et à la pharmacopée britannique, British Pharmacopeia, 1973, 246).. Le produit est commercialisé sous une forme convenant à l'injection chez les etres humains, et l'on utilise de préférence cette forme dans l'invention. On sait que la PZI diffère profondément, en ce qui concerne son action biolvgique, d'autres formes d'insuline (Remington's Pharmaceu- tical Sciences, Thirteenth, Ed., Mack Pub. Co. Easton, Fa. chapitre 62, pages 1048-9 (1965)) 0n se référera également au Merck Index, Eighth Ed., Merck ? CO., Inc. Rahway, N. J. page 879 (1968) ; J. Pharmacol. Exptl. Therap. 58, 78 (1936), et aux brevets des Etats-Unis d'Amérique n 2 143 591 et 2 179 384. L'invention concerne des cultures de tissus et la propagation de virus dans des cultures de tissus, et en particulier dans des milieux chimiquement définis. L'invention concerne plus particulièrement des cultures de tissus et la propagation de virus dans des cultures de tissus, dans le cas où des cellules animales croissent dans des cultures de tissus, au moyen d'un milieu de conservation de cultures de tissus qui comprend une petite quantité de PZI favorisant la croissance. L'invention comprend également un nouveau milieu comprenant une quantité de PZI favorisant la croissance, ainsi qu'un vaccin obtenu par ce procédé. La demanderesse a découvert selon l'invention que l'addition de PZI à des milieux de cultures de tissus, en particulier des milieux chimiquement définis, conduit à des résultats bénéfiques inattendus en ce qui concerne la fixation cellulaire améliorée, la croissance améliorée des cellules, à la fois qualitativement et quantitativement, l'augmentation de vie des monocouches cellulaires des cultures de tissus, dans d'excellentes conditions, et les améliorations de la production de vaccins à virus dans de telles cellules de cultures de tissus. L'invention permet la production de cellules animales et de vaccins à virus dans des cultures de tissus, en l'absence totale de compléments chimiquement non définis, tels que du sérum animal, des extraits d'embryons, et analogues, et conduit à des résultats notablement améliorés, compatibles avec des opérations industrielles. Le milieu selon l'invention est un milieu de conservation de cultures de tissus, stérile et chimiquement défini, qui comprend de la PZI à l'état dispersé, en quantité favorisant de façon importante la croissance cellulaire animale dans les cultures de tissus. La quantité optmaîe de PZI à ajouter dans des cas particuliers peut varier en fonction de paramètres tels que le type des cellules, le type du milieu chimiquement défini, le pH (qui affecte également la solubilité de la PZI), les conditions d'incubation, etc. Dans des cas particuliers, les quantités à utiliser pour obtenir les meilleurs résultats peuvent être facilement-dutenninées par des essais classiques permettant de déterminer statistiquement une amélioration importante de la croissance.Par exemple, on peut effectuer une comparaison de milieux contenant différents taux de PZI et du milieu de conservation lui-même. En général, on améliore la croissance pour des concentrations en PZI représentant d'environ 0,05 à environ 0,5 unité PZI par millilitre de milieu final de cultures de tissus.Des quantités notablement inférieures de PZI, par exemple 0,01 unité/l sont généralement in -suffisantes pour favoriser la croissance, et des quantités notablement supérieures, par exemple 0,7 unité, ou plus, par litre, ne conduisent généralement pas à une amélioration supplémentaire, l'excès de PZT p être néfaste On préfère une concentration en PZT comprise entre environ 0,075-0,1 et environ 0,2-0,3 unité par millilitre Dans un mode particulier de réalisation, le ai lien contient également une quantité supplémentaire de glucose, favorisant la croissance, en dehors de la PZT.La quantité supplémentaire de glucose utilisée est généralement la quantité conduisant à une concentration finale en glucose (y compris le glucose du milieu de conservation > comprise entre environ 1150 et environ 2000 mg/1, ou plus. Dans un autre mode de réalisation, le milieu contient une petite quantité de pyruvate, environ 5,50/ug/ml. Le milieu de conservation peut être un quelconque milieu de conservation de cultures de tissus, tel que la milieu 199, le Eagle Basal Medium, le Eagle's Minimum Essential Medium, etc. ; les nombreuses xodifications possibles d'un tel milieu, ou un milieu de lorlulation particulière. Bien qu'il soit essentiel que le milieu soit un milieu apportant des agents nutritifs suffisants (sels, vitamines, hydrates de carbone, lipides, aminoacides, etc.) pour permettre un métabolisme cellulaire coutinu, il n'est cependant pas essentiel que le milien permette une prolifération rapide des cellules en question.C'est-à-dire que le milien sans PZT doit déja être lui-même un milleu de couservation pour les cellules dont il est question, bien que ce milieu n'ait pas a- être capable de servir seul de milien de erdissanet pour lesdites cellules. Le milieu peut également êtr un milieu permettant la croissance, l'invention conduisant dans un tel cas des résultats améliorés. Le milleu doit contenit moins d'environ 0,05 unité/millilitre de matières contenant de l'insuline, autres que la PZI, et contient de préférence PZI comme seule source d'insuline décelable. Eien que l'invention psisse être mise en oenvre avec un milieu chimiquementun défini, un tel milieu conduit à une diei- nution ou à la perte des avantages apportés par l'invention. Par exemple, les avantages concernant la prodoction de virus et celles dans un système chimiquement défini sont incompatibles avec l'utilisation de substances non définies telles que le sérum. En conséquence, le milien doit être un milieu ne contenant pas de fluides biologiques de composition ] chimiquement indéfinie par exemple sérum, plasma, fluide amniotique, extraits d'embryons etc., et ce milieu doit être de préférence un milieu chimiquement défini.L'aspect chimique et les quantités de tous les composants du milieu seront ensuite prédéterminés Lors de la formulation du milieu selon l'invention, le PZI est ajouté aux ingrédients du milieu de conservationA'une quelconque manière convenable, permettant de disperser le PZI dans le milieu, étant entendu que le caractere stérile est préservé, et que l'on évite les conditions capables de dénaturer le PZI Selon un ode opératoire pratique et préféré, on formule un milieu de conservation chimiquement défini, on le stérile @ l'autoclave, ou par filtration stérile, ou par ces deux techniques, et l1on ajoute le PZI sous forme dune suspension injectable conforme aux instructions de la pharmacopée des Etats-Unis d'Amérique, tamponnée, aqueuse. L'addition est convenablemers- effectuée par addition de la suspension de PZI a d'environ 5 a 15 volumes du milieu1 agitation du mélange durant quelques heures (par exemple 1 a 3 h) à une température comprise entre environ 20 et 40 C, puis addition d'un milieu de conservation supplémentaire pour obtenir la composition finale pouvant être utilisée Le nouveau milieu est utilisé selon l'invention par inoculation du milieu selon l'invention par des cellules destinées s croître dans les cultures de tissus, et incubation des cellules et du milieu dans des conditions conduisant h la croissance cellulaire dans les cultures de tissus. L'incubation est généralement effectuée dans des conditions de pH (généralement 7,1-72 à 7,5-7,6), de température (généralement environ 28-40 C, de préférence environ 35-38 C), d'irradiation, d'asepsie, d'oxygénation, etc., que l'on sait convenir aux types de cellules utilisées.L'incubation pent être effectuée dans un récipient quelconque convenable, par exemple des flacons de verre ou des flacons en verre/mêtal non toxiques ou en natière plastique de polymère orgamique, ou dans des récipients de propagation pour cultures de tissus et obtient une fixation cellulaire rapide, généralemnt au moins 50-70 @ des cellules se fixant à la surface du récipient après une incubation de 15 a 30 ma Une prolifération excellente et rapide est généralement mise en évidence en 2 à 5 jours après l'ensemencement, c'est-à-dire le début de 1' incubation. Lorsqu'on doit effectuer la propagation de virus conne cela est le cas pour la production de vaccins, l'incubation de cellules et du milieu contenant la PZI est ponrsnivie jusqu'à ce que l'on obtienne un taux souhaité, prédéterminé, de croissance cellulaire (par exemple fin de la "phase logarithmique" de la croissance cellulaire obtention de 90 à 100 7 de réunion des monocouches cellulaires, etc.). Le milieu contenant le PZI est ensuite enlevé par des techniques classiques, par exemple par décantation, aspiration ou analogue, et est remplacé par un milieu de conservation chimiquement défini ne devant pas contenir de PZI ; les cellules sont inoculées par les virus d'ensemencement ; les cellules, les virus et le milieu de conservation ne contenant pas de PZI sont incubés dans des conditions conduisant à la propagation des virus, jusqu'a ce que lon obtienne un taux de propagation important du virus ; on récupère ensuite le virus par des techniques classiques. L'élimination du milieu contenant la PZI, au moment de l'ensemencement par le virus, réduit les risques de sur-prolifération cellulaire, et réduit également la quantité de PZI restante, passant dans le vaccin final. Bien que le milieu de remplacement puisse être caractérisé comme "ne contenant pas de EZI", on comprendra qu'une certaine quantité de PZI reste généralement dans les cellules lors de la production des virus.La concentration résiduelle en PZI est généralement inférieure aux valeurs qui conduiraient à un quelconque effet néfaste important sur l'administration du vaccin ; et cette concentration peut être encore réduite par lavage ou rinçage des cellules par un milieu frais ne contenant pas de PZI, avant l'addition du milieu de remplacement et l'ensemencement En général, la concentration en PZI est faible, et est comprise entre une valeur inférieure à la quantité pouvant être chiffrée par des essais radioimmunologiques (et donc inférieure aux taux normaux minimums dans le sérum humain, environ 4fu.unites C0,000 004j par milIiIitre) et des quantités comprises entre environ 0,05 et environ 0,5 unité par millilitre dans le milieu de PZI fraîchement préparé, une diminution d'environ 25-75 % étant enregistrée après une croissance cellulaire de 24 à 72 h ; on note de nouveau une diminution jusqu'à une valeur comprise entre la valeur inférieure décelable et d'environ 50 à environ 400-environ 10001u.unités (0,000 050 à 0,0004 unité) par millilitre durant la propagation du virus et la récupération des virus. Les vaccins obtenus par le procédé selon I'invention, avec ou sans lavage des cellules après élimination du milieu contenant la PZI, et avant l'ensemencement par les virus peuvent contenir d'environ 4 (ou moins) à environ 1000/u.unités de PZI par millilitre. Bien que ce domaine de concentration se trouve au-dessus des taux normaux d'insuline dans le sérum humain (environ 4-25/u,unités par millilitre) il se trouve loin au-dessous des concentrations dans les suspensions de PZI pour injection, c'est-à-dire 40, 80 ou 100 unités par millilitre, et ces concen trations sont insuffisantes pour conduire à des effets physiologiques importants lorsqu'on utilise un vaccin injectable.Les vaccins obtenus par le procédé selon l'invention contiennent de préférence, outre la dose immunisante de virus, le résidu physiologiquement acceptable de cellules de cultures de tissus, et de milieu de conservation, provenant de l'opération de prélèvement, et contient également éventuellement des stabilisants ou des adJuvants, une quantité de PZI comprise entre la quantité décelable par radjoimmunologie ou une technique équivalente et une concentration maximale physiologiquement acceptable pourune injection sans effets physiologiques néfastes importants dus à la PZI. La concentration est de manière convenable comprise entre environ 4 (ou moins) et 1000 lu unités de PZI par millilitre de vaccin final sous forme dosée. Les vaccins à virus obtenus selon l'invention comprennent (1) le virus, généralement un virus vivant atténué capable d'immuniser des sujets sans provoquer l'apparition de symptômes importants de la maladie correspondante, ni d'importants effets secondaires; (2) des adjuvants éventuels pharmaceutiquement acceptables tels que des tampons, des stabili sants tels que lactose-glutamate (brevet des Etats-Unis d'Amérique n" 3 133 861), des sucres, du phosphate de glutamine ou albumine (brevet des Etats-Unis d'Amérique nO 3 401 084 et 3 555 149) et, pour injection, un fluide pharmaceutiquement acceptable permettant l'injection, par exemple une eau stérile sans pyrogenes ou une solution saline isotonique ; et (3) un reste pharmaceutiquement acceptable provenant de la production et de la récupération du vaccin.Le reste de récupération consiste généralement en un mélange chimiquement non défini contenant des ingrédients métabolisés du milieu de conservation de cultures de tissus, utilisés durant la production du virus ; des produits du métabolisme cellulaire une petite quantité de débris cellulairesqui n'est pas éliminée lors de la récupération du vaccin et lors des opérations de clarification ; et de l'insuline résiduelle provenant de l'étape de croissance inItiale des cellules dans le milieu contenant la PZI. Le vaccin selon l'invention ne contient pratiquement pas de matières exogènes chimiquement indéfinies. C'est-à-dire que le vaccin ne contient pas de matières biologiques chimiquement non définies décelables par l'analyse, autres que celles résultant de la croissance et du métabolisme des cellules et de la prolifération du virus. Par exemple, un vaccin produit dans une culture de tissus d'embryons de poulets ne contient pas de quantités décelables de composants du sérum bovin. D'après ce qui précède, on voit que l'invention peut être facilement mise en oeuvre pour la production de vaccins et de cellules dans des cultures de tissus, dans un large domaine, par utilisation des techniques classiques de cultures de tissus et d'obtention de vaccins. L'invention convient tout particulièrement pour la production de nouvelles compositions de vaccins à virus vivant contenant la PZI résiduelle de la manière indiquée ci-dessus, et peut être utilisée aussi bien pour des systèmesoeîlulaires de mammifères ou d'oiseaux. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description détaillée qui en est donnée ci-dessous. Les exemples suivants illustrent l'application de l'invention au moyen de cellules d'embryons de poulets primaires dans des cultures de tissus, le vaccin W virus contenant le virus vivant, atténué, de la rubéole (souche Schwarz). D'autres exemples' concernent des cellules d'embryons de canards3 de foies de lapins; de foies de singes ; et d'autres virus, des oreillons, de la rubéole, de la poliomyélite, etc. Dans les exemples, le milieu 199 complet ("M-l99") de Morgan, Morton et Parker, Proc. Soc. Exp. Biol. et Med. 73 : 1-8 (1950), ainsi que la BSS de Hank sont généralement utilisés comme milieu de conservation chimiquement défini. Les cellules de cultures de tissus d'embryons de poulets sont préparées à partir d'oeufs ne contenant pas de RIF (facteur d'interférence de Rous) par des techniques classiques} par exemple : on enlève les yeux, le bec et les pattes arrière ; on lave ; on hache ; on traite à la trypsine ; on filtre ; on centrifuge pour séparer les cellules de la solution de trypsine, et l'on met les cellules en suspension dans m milieu frais. D'autres systèmes cellulaires sont préparés par des techniques classiques. Etant donné qu'à la fois les techniques de préparation du milieu et des cellules sont bien connues, on ne les décrira pas ici en détail. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1. Implantation et croissance des cellules : On prépare une suspension de cellules au moyen d'embryons de poulets de 12 jours, que l'on traite à la trypsine durant 2 h à 370C, et que l'on met en suspension dans une BSS de Hank en concentration d'environ 3 x 105 cellules/ millilitre . On prépare une série de flacons 3 de verre pour cultures de tissus, de 946,34 cm . Dans chaque flacon on introduit 75 ml de milieu stérile M-199. Différents ingrédients complémentaires pour essai sont introduits dans différents flacons appartenant à différents groupes d'essai, à raison de trois flacons par groupe > et les flacons sont ensuite ensemencés par la suspension de cellules. Les cellules subissent une incubation à 36,5-37 C. Après 48 h, on décante le milieu et on le remplace par du milieu frais M-199 contenant la BSS de Hank, mais sans composant complémentaire d'essai. Les cellules sont observées chaque jour. L'aspect général des cellules (par exemple "E" = excellent ; "G" = bon ; "F" = passable ; "P" = médiocre, etc.) et le pourcentage de surface couverte par les couches monocellulaires regroupées sont indiqués dans le tableau I, ci-après. Les résultats indiqués dans le tableau I, ci-après montrent l'amélioration de croissance cellulaire obtenue grâce a l'invention à la fois par des couches monocellulaires très bien formées se regroupant rapidement, et par la persistance de la couche monocellulaire durant plusieurs jours sans rétraction. Ces résultats révèlent également l'amélioration par rapport au M-l99 utilisé seul, ou au M-l99 contenant l'insuline classique. Exemple 2. On suit un mode opératoire semblable à celui de l'exemple 1. On prépare une série de flacons pour culturels, contenant chacun 75 ml du milieu M-199. Différents composants complémentaires sont ajoutés dans les flacons, et l'on ensemence ensuite le milieu d'essai avec 1,7 ml, par flacon, d'une suspension de cellules d'embryons de poulets contenant 3 x 105 cellules/millilitre. Les flacons ainsi préparés sont soumis à une incubation à 370C, et liron effectue une observation journalière durant 10 jours, puis à des intervalles plus longs, sur 10 jours. Le M-199 contenant 0,1 % de glucose conduit à une croissance lente, correspondant à C/3O et F/30 respectivement le premier et le deuxième jour, cette appréciation étant portée à E/90 au neuvième jour et atteignant E/100 aux douzième, quatorzième et vingtième ours. Le M-L9 contenant 2 Z Q ci-après "confluence" ou "regroupement". de sérum foetal de veau correspond à E/90 au troisième jour, E/100 aj jours 4 à 8, la rétraction cellulaire commençant au neuvième jour et le décollement des cellules de la surface du flacon étant trop importants pour permettre une appréciation aux douzième, quatorzième et vingtième jours. le M-199 contenant 10 unités de PZI par flacon (0,13 unité de PZI par millilitre) et 0,25 % de glucose ajouté en poids donne d'excellents résultats, l'appréciation étant de E/100 à partir du quatrième jour (et même du deuxième-troisième jour dans quelques flacons) et restant invariable durant la totalité de l'essai Un milieu identique contenant 0,267 unité de PZI/millilitre et 0,25 % de glucose correspond à l'appréciation G/100 aux jours 5-7 et E/100 au htièmejour et ensuite. Pour 0,40 unité de PZI par millilitre et 0,25 7 de glucose ajouté, l'appréciation est de G/100 aux jours 5-7; G-Ej100 aux jours 8-10, 12 et 14 ; et tombe à F-G/90 au vingtième jour. Pour 0,53 unité de PZI par millilitre et-0,25 7. de glucose ajouté, l'appréciation est de F1100 au cinquième jour,est portée à G/100 aux jours 6-10, 12 et 14, et tombe au vingtième jour à G/95. La croissance cellulaire dans le H-199 n'ayant reçu comme composant complémentaire que 0,267 unité de PZI par millilitre correspond à G/95 aux jours 4 et 5, G/100 aux jours 6 et 7, et E/100 au huitième jour et ensuite. La croissance cellulaire dans du M-199 n'ayant-reçu comme complément que 0,267 unité d'insuline par millilitre correspond à E/95 aux jours 5 et 6 et E/100 au septième jour et ensuite. La même quantité de complément du type insuline, avec addition de 2,5/ug de sulfate de protamine par millilitre, correspond à G/100 ou G-E/100 aux jours 5-9 et ensuite à E/100.Des quantités supérieures de sulfate de protamine ne semblent pas être particulièrement utiles ; des concentrations de 5 et 101ug/ml,et la même quantité d'insuline, conduisent à une surface totalement couverte (E/100 ou G/100) seulement après le dixième jour. Au cours d'un essai semblable, le M-199 complété seulement par du sulfate de protamine se révèle être toxique pour les cellules de cultures de tissus d'embryons de poulets. Exemple 3. Pour effectuer les essais de l'exemple 2, on prépare et l'on ensemence par des cellules deux groupes de flacons supplémentaires pour cultures. Les milieux d'essai utilisés sont les suivants (A) M-l99 + 2 7. de sérum foetal de veau et (B) M-199 + 0,267 unité de PZI par millilitre. Ces groupes A et B subissent une incubation de 24 h à 37 C, et l'on sépare ensuite les milieux d'essai d'avec les cellules fixées, et on remplace par du M-199 ne contenant ni sérum de complément ni PZI. On reprend l'incubation à 32 C. Le second jour après l'implantation des cellules, 24 h après le changement de milieu, les cellules sont ensemencées par le virus de la rubéole, vivant, de souche Schwarz, atténué. Aux jours 7, 8, 9 et 10, on récolte le virus dans chaque flacon de chaque groupe.Des récoltes journalières pour chaque groupe A ou B sont rassemblées, et l'on filtre les virus regroupés. Pour le groupe A, les titres journaliers sont respectivement de 4 > 1 > 4,1, 4,4, 4,8 et 5,0. Pour le groupe B, les titres journaliers correspondants sont 3,9, 4,6, 4,6 et 5,5. Le titre du virus est exprimé comme étant le logarithme à base 10 du nombre de doses infectant à 50 % la culture de tissus (DICT ), 50 présentes par millilitre. Exemple 4.- Croissance cellulaire à grande échelle : On prépare un pré-mélange de PZI par addition de 20 ml de PZI, à 100 unités par millilitre, à 180 ml de M-199, et par agitation de 2 h a la température ambiante, voisine de 25 C. La concentration finale de PZI dans le pré-mélange est ainsi de 10 unités par millilitre. Un concentré de cellules d'embryons de poulets (CEC) est préparé à partir d'embryons de ll jours par trypsinisation à 370C et lavage dans le M-199. On prépare 330 ml de suspension contenant environ 3,0 x 107 cellulesimillilitre. Le pré-mélange de PZ1, le concentré CEC, et le milieu M-199 sont mélangés dans une série d'opérations séparées, dans des conteneurs doseurs séparés de 4 I ; on répartit ensuite des parties aliquotes de 75 ml, de chaque conteneur, dans des flacons de verre de 946,34 cm et l'on effectue une incubation des cellules à 370C. On observe la morphologie des cellules et le pourcentage de regroupement de la couche cellulaire. On effectue également des contrôles en utilisant le.M-199 et le M-199 additionné de sérum foetal de veau à 2 %. Dans tous les cas, les proportions de composants sont choisies de manière à conduire à 1,5 ml de concentré CEC (4,5 x 107 cellules) pour 75 ml contenus dans le flacon, et 1 ml de concentré de PZI (10 unités) pour 75 ml contenus dans le flacon, la concentration finale en PZI étant de 0,133 unité par millilitre. Avec le M-199 utilisé seul) la morphologie cellulaire est toujours médiocre, et le regroupement n'augmente que de 10 % au premier jour, à 40 7 au quatrième jour. Avec le M-199 et du sérum foetal de veau à 2 % , la morphologie est passable le premier jour, avec 20 % de regroupement, passant à 30-40 % au deuxième et A 60 Z au troisième jour. La morphologie est passable à bonne au quatrième jour, et le regroupement de la couche cellulaire est de 75-85 %. Lorsque les composants sont mélangés dans un récipient en Pyrex de 4 1 par addition tout d'abord du concentré CEC au M-l99, puis addition du pré-mélange de PZI au mélange, on observe un regroupement à 75 % et une bonne morphologie cellulaire, le premier jour après l'introduction des fraction aliquotes par gravité. Cette appréciation reste valable pour le second jour. Des résultats semblables sont obtenus avec répartition sous pression des fractions aliquotes dans les flacons de culture en verre, et l'on observe un regroupement à 60 % et une bonne morphologie, 1 jour après la répartition dans des flacons en matière plastique Faucon. Lorsque l'on inverse l'ordre d'addition du pré-mélange de PZI et du concentré CEC, c'est-à-dire PZI avant CEC, on observe une morphologie passable à bonne et un regroupement de 60 à 70 % au bout d'un jour, que l'on ait introduit les composants par gravité ou sous pression. Le troisième jour, la confluence est de 70-75 % avec une bonne morphologie cellulaire. Dans deux autres essais, les composants sont mélangés avec addition des cellules en dernier. Dans l'un des essais, on utilise un récipient de 4 1 en acier inoxydable ; dans l'autre essai, le mélange est effectué dans un récipient en matière plastique Falcon. Dans les deux cas, on obtient une morphologie passable à bonne et 45 à 65 Z de confluence, au bout d'un jour d'incubation. Dans d'autres essais, des cellules d'embryons de poulets sont ensemencées dans un dispositif de propagation ou masse de cultures de tissus, présentant une feuille interne de polystyrène en spirale en tant que zone de fixation des cellules primaires et surface de croissance (Dyna Cell, Cooke Laboratory Products, Alexandria, Virginie). On effectue la croissance des cellules dans du M-199 contenant 0,13 unité de PZI par millilitre, pour achever pratiquement le regroupement, puis l'on ensemence par des virus de la rougeole et l'on effectue une incubation par du H-199 ne contenant pas de PZI. La replication des virus est ex Qllente. Exemple 5. Production de virus de la rougeole Pour la préparation de vaccins à virus de la rougeole, dans des fibroblastes d'embryons de poulets dont la croissance est effectuée dans un milieu ne contenant pas de sérum, on prépare les milieux suivants A. Milieu de croissance M-199-M-l99 avec la BSS de Hank, contenant 0,350 g de bicarbonate de sodium par litre. B. Milieu de conservation M-199-M-l99 avec la BSS de Hank, plus 1 g de bicarbonate de sodium par litre. C. Solution de L-glutamine, 10 mg de L-glutamine par litre de solution B. D. Solution de pyruvate de sodium, 5,5 mg de solution de pyruvate par litre de solution B. E. Solution de L-thyroxine, 12,5/ug de L-thyroxine par litre de solution B. F. Pré-mélange de PZI, 10 unités de PZI par millilitre, préparé comme dans l'exemple 4. G. D-glucose-solution à 20 % dans de l'eau doublement distillée, passée à l'autoclave à 121 C durant 15 mn pour y être stérilisée. H. Suspension de fibroblastes d'embryons de poulets dans du M-199 2,7 x 107cellules par millilitre. On prépare trois suspensions cellulaires en masse, et cn les répartit dans des flacons de verre de 946,34 cm , de la manière suivante : Suspension en masse n 1 : ("FCS" ; milieu de sérum foetal de veau) 2450 ml de A, avec 50 ml de sérum foetal de veau, et 60 ml de H. On agite modérement durant 15 mn avant d'effectuer la répartition. Suspension en masse n02 : ("PZI" ; protaminelzinc/insuline) 2400 ml de A ; 18,75 ml de G ; 12,5 ml de C ; 12,5 ml de D ; 60,0 ml de H et 33,3 ml de F (pré-mélange de PZI). On agite modérément durant 15 mn avant d'effectuer la répartition. Le glucose ajouté conduit à une concentration finale en glucose d'environ 0,25 % en poids. Suspension en masse n 3 : ("PZIT" ; milieu de PZI contenant de la thyroxine). 2400 mi de A, 18,75 ml de G ; 12,5 ml de C et 12,5 ml de D ; 50,0 ml de E ; 60,0 ml de H > et 33,3 ml de F. On agite modérément durant 15 mn avant d'effectuer la répartition. On effectue une incubation des cellules à 37 C jusqu'à ce que l'on obtienne dans chaque flacon un regroupement à 100 Z des couches * Solution saline de base. cellulaires, ce qui représente 24 h dans tous les cas. Les flacons contenant la suspension en masse nO 1 sont ensemences par le virus après 24 h ; les flacons contenant les suspensions en masse nO 2 et 3 sont ensemencés après 48 h. L'ensemencement par le virus est effectué par aspiration du milieu sans la couche cellulaire ; remplacement du milieu par 100 ml de solution B contenant 105,4 DICT50 de virus atténué vivant de la rougeole : et incubation des flacons à 32 C. On récupère les virus 7 jours plus tard et une seconde récolte est effectuée à partir des flacons du groupe n l et du groupe n03, trois jours après la première récolte. Exemple 6. On reprend le mode opératoire de l'exemple 5, mais l'on effectue la propagation des virus de la rougeole dans une culture de tissus de fibroblastes d'embryons de poulets, la croissance ayant été effectuée dans des milieux FCS, PZI et PZIT. On observe des couches monocellulaires regroupées à environ 95-100 % après 48 h d'incubation à 36,5-37 C. A ce moment, on- enlève les milieux par aspiration, et l'on introduit 100 ml de milieu de conservation M-199 (solution B de l'exemple 5), conjointement avec des virus de la rougeole, d'ensemencement. Les flacons infectés sont incubés à 320C et l'on observe les effets cytopathiques et le titre du virus. On trouvera dans le tableau II, ci-après les résultats d'une série de tels essais. Différents groupes de flacons sont infectés par différents virus de la rougeole, d'ensemencement, indiqués par Sl et S2 dans le tableau II, ci-après. Le titre est exprimé en logarithme à base 10 du nombre de DICT50 par 0,5 ml. L'effet cytopathique "CPE" est indiqué numériquement par une échelle allant de O (pas d'effet visible) à 4 (couche cellulaire détruite). Lorsque deux lectures sont indiquées pour le même jour, elles sont effectuées à environ 7 h d'intervalle. Les résultats du tableau II, ci-après montrent que les titres de vaccins à virus obtenus par croissance de cellules dans des milieux PZI et PZIT ne contenant pas de sérum sont supérieurs aux titres obtenus dans le milieu FCS, avec environ un facteur 10. Ce tableau montre également que les titres maxima des vaccins obtenus dans les milieux ne contenant pas de sérum sont généralement égaux ou supérieurs aux titres obtenus dans le système FCS, et que les maxima de titres sont généralement conservés plus longtemps que dans le système FCS. Exemple 7.- On reprend le mode opératoire de l'exemple 6, en utilisant des fibroblastes d'embryons de poulets : embryons de 9 ou 11 jours, trypsinisés durant 30 mn à 37 C ; on utilise le milieu PZI et le virus d'ensemencement S2 de l'exemple 6, ainsi qu un troisième virus d'ensemencement, le virus S3. Avec le virus S2 et les cellules d'embryons de 11 jours, on obtient un titre de virus de 4,3 au sixième jour, et des titres de 4,24,9 sont obtenus journellement jusqu'au dixième jour. Avec le virus S3, les titres sont compris entre 4 > 2 et 4,6 du sixième au dixième jour. Dans des cellules d'embryons de 9 jours, le titre avec le virus S2 atteint 4,4 au sixième jour et des titres de 4,8-5,3 sont obtenus aux jours 7-9. Au douzième jour, on obtient un titre de 5,2, dans des cellules semblables, le titre avec le virus S3 étant de 4,6 après 5 jours, et étant porté à 5,2-5,9 au sixième et septième jours à 6,0 au huitième jour, lorsque la culture supplémentaire est achevée. On peut obtenir des résultats semblables en utilisant des virus vivants des oreillons (souche Jeryl Lynn), au lieu de virus de la rougeole. On se référera au brevet des Etats-Unis d'Amérique n0 3 555 149. Exemple 8. En utilisant le milieu PZI décrit ci-dessus, on effectue la propagation de virus de la rougeole de souche Schwarz dans une culture de tissus CEG. Trois lots, utilisant trois lots de virus d'ensemencement, sont utilisés, et des échantillons sont prélevés aux fins d'analyse de l'insuline par essais radioimmunologiques, à différents moments de 1' opération. Le milieu de maintenance chimiquement défini, milieu-199, seul ou ensemencé avec des cellules d'embryons de poulets, et les virus d'ensemencement, se révèlent tous contenir moins de 4/u. unités d'insuline par millilitre. Le milieu M-199 contenant PZI, ensemencé par des cellules d'embryons de poulets, contient environ 0,15 unité par millilitre, cette valeur diminuant à environ 0,07 unité par millilitre après 48 h d'incubation. A titre de comparaison, 2 lots de sérum foetal bovin se révèlent contenir 5,3 et 7 7,3/u.unités par millilitre, tandis qu'un milieu M-199 chimiquement non défini, contenant de plus du sérum de veau a 2 %, contient moins de 4/ unités par millilitre. Les vaccins finalement récoltés se révèlent contenir -environ 374 > 95 et 357/u.unités d'insuline par millilitre (moyenne sur deux mesures). Pour les titres obtenus, t.ne dose typique est de 0,5 ml. Exemple 9.- On utilise l'invention pour produire des virus de la rubéole, dans des embryons de canards, au moyen d'un mode opératoire semblable, on se référera au brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 401 084. On prépare des embryons de canards de 10 jours , on les trypsinise à 37 C durant 50 mn, on centrifuge, on lave et l'on suspend dans du M-l99 contenant 0 > 007 % de NaHC03. On prépare un milieu PZI au moyen de 901 ml de M-199 semblable, 13 ml d'un pré-mélange PZI selon l'exemple 4, et 61 ml de la suspension cellulaire. La suspension de cellules et du milieu de PZI sont répartis dans des flacons de cultures de tissus en verre de 946,34 cm . et dans des récipients pour cultures de tissus en polystyrène, de 75 cm2 > et l'on incube à 37 C. On note qu'au moins 75 % des cellules sont fixées à la surface du récipient en environ 3 h.Au contraire, une incubation cémoin dans le M-199 contenant de plus du sérum de veau à 2 % révèle une fixation de 25 7. au même moment Après une incubation de 18 h, les cellules d'embryons de canards dans le milieu PZI présentent un regroupement de 80-90 %, avec une répartition très uniforme, et les cellules témoin dans le milieu contenant le sérum de veau, présentent un regroupement de 60-70 %. 42 h après l'implantation, les cellules d'embryons de canards dans le milieu PZI présentent un regroupement de 100 %. On décante le milieu et on le remplace par du M-199 contenant une BSS de Earle, et 2200 mg de NaHC03 par litre de pH 7,6. Cinq flacons sont infectés par un vaccin commercial à virus de la rubéole, de souche HPV-77 adaptée par cinq passages à la croissance sur des cellules de canards (Meruvax Merck Sharp @ Dohme) et cinq flacons sont ensemencés par un vaccin a virus de la rubéole, de la souche Cendehill (normalement propagé dans une culture de tissus de foies de lapins). L'ensemencement par le virus est effectué par reconstitution de cinq ampoules de dose unique de virus d'embryons de canards lyophilisé dans 2,5 ml de milieu de conservation, et melange du mélange résultant avec 500 ml du milieu de conservation. On utilise 100 ml de la dilution de virus par flacon. L'ensemencement par le virus de souche Cendehill est effectué de manière semblable. Le virus est récolté journellement à partir du quatrième jour et jusqu'au huitième jour. Exemple 10. Le milieu selon l'invention est utilisé pour des cultures de tissus de foies de lapins, utilisées pour la production de la souche Cendehill de vaccins de virus vivant de la rubéole. Les foies sont enlevés de manière aseptique chez des lapins de 21 jours, hachés , lavés dans un milieu de conservation M-199, trypsinisés et centrifugés. Les cellules centrifugées sont lavées deux fois dans le M-199 et mises en suspension dans le M-199 par des techniques classiques. Les cellules sont ensemencées dans des flacons pour 2 cultures de tissus de polystyrène de 75 cm-, en concentration d'environ 1,6 x 107 cellules par flacon, avec du M-199 complémenté par une BSS de Hank et 1 g de Nal1C03 par litre, et par du glucose jusqu'a concentration finale de 2,5 g/l, par 28/ug de pyruvate de sodium et 150/ g de L-glutamine par ml. La suspension de cellules d'ensemencement dans ledit milieu présente une concentration finale de 5 x 105cellules par millilitre. On ajoute un pré-mélange de PZI selon exemple 4 pour obtenir une concentration finale en PZI de 0,13 unité par millilitre. On incube les cellules et le milieu à 37"C durant 4 jours, et l'on remplace ensuite le milieu de PZI par le même milieu de conservation, mais ne contenant pas de PZI. Le milieu de conservation est remplacé ensuite tous les deux jours. On atteint un regroupement complet au cinquième jour, et les cellules dont la croissance a été effectuée dans le milieu de PZI conservent un aspect épithélial pratiquement pur, même après 14 jours de cultures de tissus. On peut obtenir de bons rendements en vaccins à virus de la rubéole, par croissance de cellules de foies de lapins dans des cultures de tissus, ainsi que cela a été décrit ci-dessus, décantation du milieu PZI après qutun regroupement praLîquement total ait été obtenu (entre environ le quatrième et le septième jour.), ensemencement des cellules par un virus vivant atténué de la rubéole (souche Cendehill) addition d'un milieu de conservation de remplacement7 et incubation de 3 à 5 jours jusqu'à obtention d'une bonne prolifération du virus. Exemple 11. Des cellules d'embryons de poulets, du M-l99 et un pré-mélange de PZI sont préparés pratiquement comme dans les exemples 1-4. Les cellules sont implantées en concentration de 6 x 105 cellules par millilitre dans le M-199 contenant une concentration finale en PZI de 0,133 unité par millilitre. 75 ml de la suspension cellulaire résultante 3 sont introduits dans des flacons de verre de @@@@ cm , et l'on effectue une incubation de 48-72 h à 37 C. A ce moment, le regroupement et la morphologie sont excellents. Les flacons sont ensuite ensemencés par un virus vivant atténué des oreillons (souche Jeryl Lynn) au moyen de 2 ml par flacon d'une dilution au 1/250e dans le M-199 d'un virus d'ensemencement de titre voisin de 106 DICT50 par 0,5 ml.L'ensemencement par le virus est effectué directement après élimination du milieu de PZI dans une série de flacons, et après élimination du milieu de PZI suivie d'un rinçage de la monocouche cellulaire, une fois, par environ 75 ml de M-l99 sans FZI, dans une seconde série de flacons. Les cellules infectées sont incubées à 370C dans du M-199 frais ne contenant pas de PZI. L'observation des effets cytopathologiques (CPE) de l'infection par les virus des oreillons est effectuée le quatrième jour après l'ensemencement par le virus. Le virus est récolté au quatrième jour, et deux fois par jour, jusqu'S ce que le CPE atteigne la valeur 4+ (dans une échelle allant de O à 4+), par récupération du milieu de culture et remplacement de ce milieu par du M-199 frais.Les titres sont compris entre 105,3 -106,0 DICT50 par 0,5 ml. Il n'apparaît pas de différence importante entre les cellules rincées après élimination du milieu de PZI et celles ensemencées sans lavage ni rinçage. Une répétition de ces opération conduit a des résultats semblables, de 3 à 6 récoltes étant obtenues pour chaque flacon. Exemple 12. On effectue une opération comme dans l'exemple Il, en utilisant des virus atténués de la rougeole. On obtient des résultats semblables excellents dans une série utilisant une etape de lavage avant l'ensemencement par le virus, et dans une série pour laquelle on n'effectue pas de lavage. Exempte 13. Des foies de singes africains (tercopithecus sabaeus") sont trypsinisés à 37 C durant 4 h et sont implantés en concentration de 3,2 x 105 cellules par millilitre dans du M-l99 contenant 0,13 unité de PZI par millilitre. La technique utilisée est semblable à celle décrite dans les exemples ll et 12. 20 mn après répartition dans les flacons, un examen au microscope montre que au moins 50 % des cellules sont fixées au verre. On effectue une incubation à 370C, car les cellules de foies de.singes primaires sont connues pour croître difficilement dans des cultures de tissus, et le milieu M-199 contenant la PZI est remplacé par du M-199 frais et de la PZI, après 48 h, et de nouveau 3 jours plus tard.Un regroupement de 95 % est observé après une incubation de 8 jours, et à ce moment, on enlève le milieu contenant la PZI. Les cellules sont ensuite ensemencées par un virus atténué vivant de la poliomyélite, le virus (2) de la poliomyélite, à raison de 0,4 ml de virus d'ensemencement (dilution au î/îoo ) par flacon. Les cellules et les virus subissent ensuite une incubation dans 100 ml de M-l99 ne contenant pas de PZI, à 37 C, ce qui permet la propagation des virus, et leur récolte. Après 48 h, on atteint des titres de 1,75-1,8x105 PFU (unités de formation de plaques) par millilitre,ces valeurs passant à 2,3-2,4 x 105 PFU/ml après 72 h d'incubation. Exemple 14. En opérant d'une manière décrite ci-dessus, on fait croître des cellules d'embryons de poulets en couches monocellulaires regroupées dans du M-l99 contenant de la PZI, durant 3 jours. Le M-199 contenant de la PZI est ensuite remplacé par du M-199, à raison de 100 ml par flacon, et l'on introduit des virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) à raison de 1000 DICT50 par flacon. Après 20 h d'une incubation supplémentaire à 370 37 C, on note une prolifération importante du virus, qui est déterminée par les effets cytopathologiques.Le CPE est affecté de l'indice 4 à ce moment (dans une échelle de O à4+).Le CPE est de 3 pour des cellules ayant subi une croissance semblable, et infectées par du VSV, mais avec utilisation de M-l99 contenant du sérum de veau à 2 7. au lieu de M-199 contenant de la PZI. Les titres de VSV après 20 h, dans les cellules ayant effectuées la croissance dans le M-199 contenant la PZI, sont de 1,36-2,36 x 106 PFU/ml. Parmi d'autres exemples d'application de l'invention, on peut citer à titre non limitatif la production de virus de la rage dans des cellules d'embryons de poulets ayant effectué une croissance dans une culture de tissus, au moyen d'un milieu ne contenant pas de sérum, de préférence le H-l99, contenant de la PZI (on se référera au -brevet des Etats-Unis d'Amérique n -3 255 080) ; la production de virus de l'hépatite infectieuse canine dans une culture de tissus de foies de porcs ou une culture de tissus de foies de chiens (on se référera aux brevets des Etats-Unis d'Amérique n 2 915 436 et 3 000 788); la production de virus de la rhinotrachéite bovine infectieuse, de la diarrhée chez les bovins, et du virus paragrippal (para influenza "PI-3") dans une culture de tissus de foies de bovins (on se référera aux brevets des Etats-Unis d'Amérique nO 2 941 925 et 2 934 473) ; la production du virus grippal (influenza) dans une culture de tissus d'embryons de poulets ; et la production de virus de la rage dans une culture de tissus de foies de bovins (on se référera au brevet des Etats-Unis d'Amérique n" 3 585 266). TABLEAU I Composant complémentaire Résultats après .... -jours d'incubation 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Aucun - N-199 seul G/30 G/30 G/40 F/50 F/100 F-G/70 F/90 G/90 F/100 Sérum foetal de veau à 2 % G/50 G/70 G/90 F/100 F/100 F/100 F/100 F/100* F/100* PZI 0,2 u/ml** G/50 G/70 G-F/90 F/100 F/100 F/100 F/100 F/100 F/100 PZI 0,2 u/ml plus 0,2 u/ml G/70 F/80 G/80 F/80 F/80 F-G/90 F-G/90 F-G/90 a,outée au deuxième jour Aucun F/20 F/30 F/30 F/30 F/30 F/30 F/70 F/70 Sérem foetal de veou à 2 % G/50 C/70 E/95 E/100 E/100* PZI 0,2 u/ml G/50 G/70 G/80 G/85 E/100 G/100 E/100 @/100 Insuline 0,2 u/ml F/20 F/20 G/40 G/30 F/70 G/70 G/75 G/90 * Rétraetion (Sépatation de la conchellulaire de la surface du flacon pour culture de tissus). Les quatre premiers milieux sont ensemencés par 1,5 ml de suspension de ceilules par flacon, et les quatre suivants sont ensemencés 24 h plus tard par 2,0 ml de la même suspension par flacon. ** PZI = protamine/zine/insuline ; u = unité TABLE II - EXEMPLE 6 Virus Milieu de d'ensemeneroissance cement 5 jours 6 jours 7 jours 8 jours 9 jours 10 jours 11 jours 12 jours FCS S1 Titre 4,6 4,8 4,7 5,0 5,0 4,7 4,5 4,5 CPE 1- 1- 1- 1- 1 2+ 3 @ 4 FCS S2 Titre 3,8 4,3 4,5 5,5 5,1 4,7 4,6 3,8 CPE 0 1- 1- 1 1 2 3 4 PZI S1 Titre 4,7 5,0 5,6 5,9 6,4 6,3 6,4 CPE 1- 1 2 2 3 3 4 PZI S2 Titre 3,6 4,2 4,3 5,2 5,5 1 5,5 5,2 5,4 5,6 5,6 5,7 CPE 0 1- 1- 1- 1 2- 2 3 3 3 4 PZIT S1 Titre 4,8 5,4 5,5 5,7 CPE 1 2 3 3+ PZIT S2 Titre 3,8 4,3 4,4 5,4 5,8 5,8 5,7 CPE 0 1- 1- 1-2 3 3 4 REVEND I CATI ON S 1. Milieu de croissance pour cultures de tissus, caractérisé en ce qu'il contint, à l'état dispersé, une quantité de protamine/zinci insuline favorisant la croissance. 2. Milieu selon la revendication 1, caractérisé en ce qu consiste en un milieu de conservation de cultures de tissus contenant la protamine/zinc/insuline à l'état dispersé. 3. Milieu selon la revendication 2, caractérisé en ce que le milieu de conservation est un milieu chimiquement défini. 4. Milieu selon la revendication 2, caractérisé en ce que le milieu, en dehors de la protaminelzinc/insuline, ne contient pratiquement pas de protéines. 5. Milieu selon le' revendication 1, caractérisé en ce que la protamine/zinc/insuline est pratiquement la seule source dtactivité d'insuline décelable. 6. Milieu selon la revendication I, caractérisé en ce qu'il z il contient d'environ 0,05 à environ 0,5 unité de protamine/zinc/insuline par millilitre. 7. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il consiste en un milieu de conservation de cultures de tissus chimiquement défini contenant d'environ 0,1 à environ 0,3 unité de protamine/zinc/insuline par millilitre, à l'état dispersé. 8. Milieu selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il contient d'environ 1 à environ 2 g de glucose par litre. 9. Milieu selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit milieu de conservation consiste en le milieu-199 (M-199). 10. Procédé permettant de préparer un milieu de croissance pour cultures, caractérisé en ce qu'il comprend l'addition à un milieu de conservation de cultures d'une quantité de protaminelzinclinsuline telle qu'elle favorise la croissance cellulaire. 11. - Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la protamine/zinc/insuline est ajoutée en quantité telle que l'on atteint une concentration d'environ 0,05 à environ 0,5 unité dans le milieu final de cultures de tissus. 12. Procédé comprenant l'inoculation d'un milieu de cultures de tissus par des cellules animales vivantes et l'incubation des cellules et du milieu dans la culture de tissus jusqu'd obtention d'une croissance cellulaire importante, caractérisé en ce que l'incubation est effectuée en présence d'une quantité de protamine/zinc/insuline telle qu'elle favorise-la croissance cellulaire, ce composé étant à l'état dispersé dans ledit milieu. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le milieu de cultures de tissus est un milieu de conservation chimiquement défini. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le milieu de cultures de tissus consiste en le milieu M-199 et, en dehors de la protamine/zinc/insuline, ne contient pratiquement pas de protéines décelables. 15. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend de plus l'élimination du milieu contenant la protamine/zincl insuline après que l'on ait obtenu une croissance cellulaire importante ; le remplacement dudit milieu par un milieu de conservation de cultures de tissus ne contenant pratiquement pas de protamine/zinc/insuline ; et la poursuite de l'incubation des cellules dans la culture de tissus. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend de plus l'ensemencement des cellules par un virus, après élimination du milieu contenant la protamineJzinc/insuliness et l'incubation des cellules et des virus en présence du milieu de conservation de cultures de tissus ne contenant pratiquement pas de protamine/zinc/insuline, jusqu'à ce que l'on obtienne une propagation importante des virus. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend de plus le lavage des cellules apres élimination du milieu contenant la protaminelzinc/însuline, et avant l'ensemencement des cellules par les virus. 18. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules de foies de lapins primaires, et le virus est le virus vivant atténué de la rubéole. 19. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules embryons de canards primaires, et le virus est le virus vivant atténué de la rubéole. 20. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules de foies de singes primaires et le virus est le virus vivant atténué de la poliomyélite. 21. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules d'embryons de poulets primaires. 22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que le virus est le virus vivant atténué de la rubéole. 23. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que le virus est le virus vivant atténué des oreillons. 24. Vaccin a virus, caractérisé en ce qu'il comprend un virus dont la propagation a eu lieu dans une culture de tissus, dans des cellules ayant effectué leur croissance dans une culture de tissus en présence d'une quantité de protamine/zinc/insuline telle qu'elle favorise la croissance et en ce qu'il comprend un reste pharmaceutiquement acceptable provenant de l'étape de récolte dudit virus séparé desdites cellules. 25. Vaccin selon la revendication 24, caractérisé en ce qutil contient d'environ 4 à environ 1000,u.unités d'activité d'insuline décelable par dose immunisante. 26. Vaccin à virus vivant atténué, caractérisé en ce qu'il comprend un virus vivant atténué obtenu par propagation dans une culture de tissus, dans des cellules dont la croissance a été effectuée dans une culture-de tissus, dans un milieu pour cultures de tissus, chimiquement défini, contenant une quantité de protamine/zinc/insuline > à l'état dispersé, telle qu'elle favorise la croissance, et dont on a enlevé ledit milieu contenant la protamine/zinc/insuline avant la propagation du virus ; et en ce qu'il comprend un reste pharmaceutique ment acceptable provenant de ltétape de récolte du virus. 27, Vaccin selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'il contient d'environ 4 à environ lO00/u.unités de protamine/zinc/ insuline par dose immunisante. 28. Vaccin selon la revendication 26, caractérisé en ce que le virus est le virus vivant atténué de la rubéole, dont la propagation est effectuée dans une culture de tissus d'embryons de poulets. 29. Vaccin selon la revendication 26, caractérisé en ce que le virus est le virus vivant atténué des oreillons, dont la propagation est effectuée dans une culture de tissus d'embryons de poulets. 30. Procédé permettant la croissance cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend l'inoculation d'un milieu de croissance de cultures de tissus par des cellules animales vivantes, ledit milieu de croissance étant un mélange intime des composants suivants (a) un milieu de conservation de cultures de tissus chimiquement défini, ne contenant pas de protéines, capable de maintenir le métabolisme desdites cellules, mais incapable de permettre la croissance desdites cellules en une couche monocellulaire pratiquement complete dans la cuture de tissus ; et (b) une quantité de protaminelzinc/insuline permettant d'obtenir un milieu final de croissance capable de permettre ladite croissance des dites cellules et l'incubation desdites cellules et dudit milieu de croissance dans la culture de tissus, dans des conditions conduisant à la croissance cellulaire. 31. Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que l'incubation est poursuivie jusqu'à ce que l'on obtienne une croissance cellulaire pratiquement totale, et en ce qu'il comprend de plus les étapes de séparation dudit milieu de croissance d'avec la couche monocellulaire résultante ; d'inoculation de la couche sonocellulaire par un virus capable de proliférer dans lesdites cellules ; et d'incubation de la couche monocellulaire et des virus en présence du milieu de conservation ne contenant pas de protéines. 32 s titre de néditaienta nouveaux, vsscinZ aclon 1 'une quelconque des revendications 24 à 29. 33. Compositions thérapeutiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins un vaccin selon la revendication 32 en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable. 34. Formes pharmaceutiques d'administration des compositions selon la revendication 33.