FR 2313054 A1 19761231 FR 7517167 A 19750602 La présente invention se rapporte à une nouvelle substance à activité biologique appelOeacide phénopicolinique et à des procédés pour sa production et sa préparation. L'acide phénopicolinique a la structure suivante La présente invention comprend l'acide phénopicolinique et ses sels sous forme de solutions diluées, sous forme de concentrés bruts, sous forme de solides bruts, sous forme de solides purifiés et sous des formes cristallines pures. Alors que les demanderesses réalisaient des travaux de recherche pour obtenir de nouvelles substances à activité biologique d'origine microbienne, les demanderesses ont trouvé qu'une nouvelle substance à activité biologique, inhibant une activité enzymatique de la dopamine f3-hydroxylase et ayant un efret hypotensir puissant, quiLbs ont appelé "acide phénopicolinique", est accumuli dans un bouillon de culture d'un microorganisme appartenant au genre Paecilomyces. La souche typique produisant l'acide phénopicolinique a été isolée à partir d'un sol par les demanderesses et appelée Paecilomyces sp. AF 2562.Cette couche a été déposée à 1'Institut de Recherche sur les Fermentations, Office des Sciences et des Technologies Industrielles, Ministère du Commerce et de l'industrie Internationaux suivant le numéro de dép8t 2355. Le même champignon a été ultérieurement déposé à l'American Type Culture Collection avec le numéro de dépôt ATCC 20463. Les demanderesses ont réalisé des travaux de recherche ultérieurs quant aux procédés de production et de récupération de cette substance à partir du bouillon de culture. Par la suite, elles sont alors arrivées à la présente invention. La souche Paecilomyces sp. AF 2562 présente les propriétés microbiologiques suivantes (I) Caractéristiques de culture sur divers milieux (270C, 2 semaines)et morphologie (1) Agar-agar-extrait de malt : bonne croissance, mycélium cotonneux de couleur blanche à marron clair; à l'envers : coloration marron clair ; couleur dans le milieu de culture : marron clair. (2) Pomme de terre-glucose-agar-agar : bonne croissance; mycélium cotonneux à coloration blanche à marron clair; à l'envers marron clair; couleur dans le milieu de culture : jaune. (3) Agar-agar de Czapek : bonne croissance; partie centrale de la colonie cotonneuse, à coloration blanche à orangée claire et partie périphérique s'étalant finement ; à l'envers coloration marron; couleur dans le milieu de culture : jaune clair. (4) Agar-agar de Sabouraud : bonne croissance; mycélium cotonneux à coloration blanche à légèrement marron; à l'envers coloration marron avec ondulation; couleur dans le milieu de culture : marron (5) Agar-agar - farine d'avoine : croissance plutôt mauvaise ; mycélium blanc s'expansant sur une surface d'agar-agar de façon relativement faible; à l'envers : coloration jaune clair, couleur dans le milieu de culture : jaune clair. (6) Agar-agar. d'YpSs : bonne croissance ; mycélium cotonneux à coloration blanche à marron clair; à l'envers : coloration marron avec ondulation; couleur dans le milieu de culture marron jaunâtre. Dans chacun des milieux précédents, la formation de spores est bonne, les mycéliunnaériens se développent bien et on observe des ramifications irrégulières. Les conidiophores stélèvent à partir des mycélium aériens ou des mycéliums végétatifs. 1 à 5 phialides longs (10 - 20/ ), qui s'amincissent peu à peu vers le sommet, sont fréquemment verticillés. Les phialospores sont extrudées à partir du sommet des phialides et reposent les unes sur les autres en étant élargies sur le côté et irrégulièrement déplacées, pour former de longues chastes. Quelquefois, elles se rassemblent pour former des globes. Elles sont cylindriques avec des extrémités arrondies de 3 à 5/ de long et de 1,5 à 2 / de large, et ne présentent pas de cloison. (II) Propriétés physiologiques (1) Conditions de croissance pH : croissance à un pH de 2 à 12, le pH optimum étant 5 à 6. Température : croissance à 10 - 35 C, la température optima étant dans l'intervalle de 20 à 270C. (2) Utilisation de source de carbone 3 % d'une source de carbone indiquée ci-dessus ont été ajoutés à un milieu liquide contenant 0,5 ffi de polypeptone et 0,1 % d'extrait de levure, et une culture avec agitation a été réalisée à 27"C, ce qi entraînait l'état de croissance suivant des cellules: glucose : ++ (bonne croissance) Galactose : ++ (bonne croissance) i3annose : ++ (bonne croissance) Fructose : ++ (bonne croissance) Saccharose : ++ (bonne croissance) Ilaltose : ++ (bonne croissance) Lactose : ++ (bonne croissance) Dextrine : ++ (bonne croissance) Amidon soluble : ++ (bonne croissance) Glycérol : ++(bonne croissance) Sorbitol : + (croissance modérée) Cellulose : + (croissance modérée) Inuline : + (croissance modérée) Huile de soja : ++ (bonne croissance) Acide tartrique : + (croissance peu développée) Acide citrique : + (croissance peu développée) Acide succinique : + (croissance peu développée) Acide fumarique : + (croissance peu développée) quand la présente souche est examinée, en se basant sur les observations présentées ci-dessus, à la lumière de l'ouvrage Illustra ted Genera of Imperfect Fungi de H. L. Barnett, 3ème édition 1972, et de l'ouvrage the Genera of Hyphomycetes from Soil de G.L. Barron, il apparat que la présente souche appartient au genre Paecilomyces. En conséquence, les demanderesses ont nommé cette souche "Paecilomyces sp. AF 2562". La souche déposée comme on l'a indiqué ci-dessus est un cas typique du microorganisme qui peut être utilisé dans la présente invention. N'importe laquelle des souches appartenant au genre Paecilomyces et capable de produire de l'acide phénopicolinique peut entre employée dans la présente invention. On a trouvé que certaines des souches mutantes artificielles, formées en irradiant ces souches par des rayons ultraviolets ou en les traitant par une substance mutagène chimique, telle que la nitrosoguanidine, et des éspèces mutantes naturelles de ces souches avaient une activité de production d'acide phénopicolinique et ces espèces mutantes peuvent être également utilisées dans la présente invention. Pour la production d'acide phénopicolinique selon la présente invention, n'importe quelle souche produisant de l'acide phénopicolinique appartenant au genre Paecilomyces est cultivée en utilisant des procédés connus pour cultiver des microorganismes. On peut adopter dans la présente invention soit un procédé de culture dans un milieu liquide, soit un procédé de culture dans un milieu solide. Dans le cas du procédé de culture dans un milieu liquide, la culture peut être réalisée de manière stationnaire ou en secouant ou avec aération. En général, un procédé de culture avec secouage ou un procédé de culture avec agitation et aération dans un milieu liquide est adopté dans la présente invention. De nombreux milieux couramment utilisés pour la culture de microorganismes peuvent être employés dans la présente invention. Plus spécifiquement, comne source de carbone, on peut employer par exemple, des saccharides tels que le glucose, le galactose, le fructose, le mannose, le lactose, le mélibiose, la dextrine, l'amidon, la glycérine et le sorbitol, et des huiles et des graisses animales et végétales telles que l'huile de soja et le saindoux. Comme source d'azote, on peut employer, par exemple, un extrait de levure, un extrait de viande, de la poudre de soja, de la poudre de graines de coton, de la liqueur de mais macérée, des aminoacides tels que l'acide glutamique, l'acide aspartique, la tyrosine et la phénylalanine, des sels de ces aminoacides, l'urée, des sels d'ammonium et des nitrates.En outre, des sels minéraux de l'acide phosphorique, de magnésium, de calcium, de sodium, de potassium, de fer, et de manganèse et analogues et des quantités peu importantes de produits nutritifs tels que des vitamines peuvent être ajoutés de manière facultative. De plus, des cellules de microorganismes telles que de la levure et des corps de plantes ou d'animaux, ou leurs extraits, peuvent être ajouts éventuellement. I1 est po8sible d'augmenter la quantité formée des produits recherchés en ajoutant à un milieu de culture de l'acide cinnamique, de l'acide p-hydroxycinnamique, un acide cinnamique halogéné, de l'alcool cynnamylique ou un dérivé simple, par exemple un sel ou un ester,de ces produits. Bien sur, ces ingrédients ou ces additifs de culture peuvent strie ajoutés en cours de culture. Les conditions de culture telles que le pH du milieu de culture, la température de culture et la période de culture peuvent être modifiées de manière facultative dans des gammes fournissant le produit recherché. La culture est de préférence réalisée à 20-3O0C, pendant 2 à 10 jours, à un pH de 3 à 7. Quand la culture est réalisée à la manière indiquée précédemment, de l'acide phénopicolinique est formé et accumulé dans le bouillon de culture. Cette substance peut être rassemblée à partir du filtrat de culture ou des mycéliums. Dans le cas de culture sur un milieu liquide, la substance recherchée est présente principalement dans la partie liquide du bouillon de culture. En conséquence, dans ce cas, après achèvement de la culture, la partie liquide est de préférence séparée du bouillon de culture. La séparation peut facilement être réalisée par filtration en utilisant un produit aidant la filtration, tel que celui dit Celite. La récupération de la substance recherchée à partir du filtrat peut être réalisée en combinant de façon appropriée des moyens courants pour la séparation et la purification de substances organiques à partir d'un bouillon de culture, telle que l'adsorption-désorption en utilisant une résine échangeuse d'ions, une extraction par solvant organique et une chromatographie par adsorption.Plus spécifiquement, on fait passer le filtrat séparé du bouillon de culture, ou le liquide contenant la substance recherchée, à travers une colonne remplie d'une résine fortement acide, échangeuse de cations, telle que celle dite Dowex 50W (type H) et Amberlite IRC-120 (type H) ou une résine basique échangeuse d'anions, telle que la diéthylaminoéthylcellulose (type OH) et le produit dit Amberlite IR-45 (type OH), pour amener ainsi la substance recherchée à être adsorbée sur cette résine échangeuse d'ions; la substance recherchée est éluée avec une solution d'un acide d'un alcali ou d'un sel.Le pH du filtrat séparé du bouillon de culture ou de la solution aqueuse contenant la substance recherchée est rendu acide et l'on extrait avec un solvant organique, tel que l'acétate d'éthyle et le butanol, et, de ce fait, la substance recherchée est transférée dans la couche de solvant organique. Lorsque cette couche de solvant organique est séparée et concentrée sous pression réduite on peut obtenir la substance recherchée brute. La purification de ce produit brut peut être réalisée en l'amenant à s'adsorber sur une colonne remplie d'un produit adsorbant tel que l'alumine et le gel de silice, et en développant la colonne avec du benzène, du chloroforme, de l'acétate d'éthyle, du méthanol ou de l'ammoniaque diluée ou un mélange convenable de ces pro duits. Quand l'effluent contenant la substance recherchée est concentré sous pression réduite et qu'on laisse ce concentré reposer dans un emplacement frais, la substance recherchée est récupérée sous la forme de cristaux bruts jaune clair. La recristallisation de ces cristaux bruts dans un solvant convenable tel que le méthanol donne des cristaux incolores de la substance recherchée, l'acide phénopicolinique. Les propriétés physicochimiques de l'acide phénopicolinique préparé selon le procédé de la présente invention sont les suivantes L'acide phénopicolinique purifié est formé de cristaux incolores ayant un point de fusion de 222 à 2260C. La substance contient du carbone, de lthydrogène, de l'azote et de ltoxygène, et les résultats de l'analyse élémentaire sont les suivants c = 68,06, H = 5,13 , N = 6,20 ffi D'après les résultats du spectre de masse du produit méthylé, on a trouvé que le poids moléculaire est 229. En conséquence, la substance a pour formule moléculaire C13Hll07N La présente invention sera maintenant décrite en relation avec les dessins ci-joints dans lesquels La figure 1 représente des courbes de spectre d'absorption dans l'ultraviolet de la substance dite AF 2562 dans HC1 IN et dans NaOH EN. La figure 2 représente une courbe de spectre d'absorption dans l'infrarouge de la substance dite AF 2562, déterminée suivant le procédé utilis-ant des tablettes de bromure de potassium; et La figure 3 représente un spectre d'absorption de résonance magnétique nucléaire de l'acide phénopicolinique, déterminé par rapport à la solution dans la deutérométhanol, où l'extrémité droite de la courbe supérieure est reliée à l'extrémité gauche de la courbe inférieure. Le spectre d'absorption dans l'ultraviolet de la substance est présenté sur la figure 1. L'absorption maxima est observée à 217 mS ( = 11,1 x 19) dans HC1 1N, et on n'observe pas de maximum mais des épaulements sont présents à environ 277 m/ et 300 m," dans NaOH IN. Le spectre d'absorption dans l'infrarouge de la substance te? e que présenté sur la figure 2, et des absorptions sont obser- uvées à 3030, 1655, 1590, 15i5, 5440, 1385, 1305, 1280, 1245, 1230, 220, 1175, '12C, 825 et ROC cm-1. La substance r'a pas d'activité optique. Le spectre ce résonance magnétique nucléaire de la substance est tel que présenté sur la figure 3. La substance est soluble dans le méthanol et dans l'eau, faiblement soluble dans l'acétone, l'écate éthyle et le chloroforme, et insoluble dans le benzène et le n-hexane. En ce qui concerne ia réaction colorée, la substance décolore le permanganate de potassium et est positive vis-å-vis de la réaction de la ninhydrine, de la réaction de Millon et de la réaction du sulfate ferreux (solution dans l'acide acétique à 1 ). Une sclution aqueuse de la substance est incolore et acide. Comme cela apparaît d'après les propriétés physicochimiques précédentes, on a confirmé que i'acide phénopicolinique est une nouvelle substance à activité biologique et cet acide phénopicolinique a la structure suivante La substance a une activité biologique pour inhiber fortement la dopamine ss-hydroxylase des moelles surrénales de boeufs. Lorsque l'intensité de cette inhibition est mesurée selon le procédé de Nagatsu et collaborateurs décrit dans Chemical and Pharmaceutical bulletin, 17, 2377 (1969), on trouve que la concentration d'inhibition à 50 H et 8,9 x 10-9 g par ml (3,9 x 10-8 M). Cette inhibition n'est pas compétitrice par rapport à la tyramine mais est compétitrIce vis-à-vis de l'acide ascorbique et le coefficient d'inhibition est 5 x 10-9 M. L'effet hypotensif puissant de l'acide phénopicolinique a été observé dans une expérience sur les rats rendus spontanément hypertensifs. Lorsque l'on a administré par voie orale 50 mg/kg de l'acide phénopicolinique, la diminution de la pression du sang était 21, 16, et 23 ss respectivement au bout de 1, 3 et 5 heures après l'administration. La toxicité aiguë (DL50) de la substance est 354 mg/kg, lorsqu'elle est administrée à des souris du système dd par injection intrapéritonéale. EXEMPLE 1 Le Paecilomyces sp. AF 2562 a été cultivé pendant 3 semaines sur une partie inclinée en-agar-agar de Czapek. Chacun des 50 ballons à agitation, d'une capacité de 500 ml, a été pourvu de 100 ml de milieu de culture (pH : 6,6), contenant 3 ç de glucose, 0,5 ffi de polypeptone et 0,1 ss d'extrait de levure, et stérilisé à 1200C pendant 15 minutes. Des mycéliums coupés à partir du milieu de culture sur une partie inclinée ont été inoculés dans un des ballons indiqués ci-dessus, et la culture avec agitation a été réalisée à 300C pendant 2 jours. On a inoculé de façon aseptique, dans chacun des 49 ballons restants, 1 ml du bouillon de culture résultant et on a. cultivé avec agitation à 30t pendant 7 jours. Les bouillons de culture dans les ballons ont été combinés et filtrés pour retirer les mycéliums et on a obtenu 4,4 litres d'un filtrat. Le Filtrat a été appliqué à une colonne de 1 litre du produit dit Dowex 50W (type H), La résine échangeuse d'ions a été lavée à l'eau suffisamment et la substance recherchée a été éluée avec de l'ammoniaque 1N. La fraction active résultante (1,7 litre) a été concentrée sous pression réduite, le concentré a été dissous dans 100 ml d'eau et le pH réglé à 2,0. La solution aqueuse a été extraite trois fois avec une quantité égale d'acétate d'éthyle et les couches d'acétate d'éthyle ont été combinées et concentrées sous pression réduite.Le concentré a été dissous dans une petite quantité de méthanol et revêtu sur 2 g de gel de silice produit de la société dite Mallinckrodt Co), en retirant le méthanol. Le gel de silice indiqué ci-dessus a été entassé sur 500 ml d'une colonne de gel de silice remplie de chloroforme, et on a fait passer 1,5 1 de chloroforme à travers la colonne pour effectuer le lavage. Ensuite, le développement a été conduit avec le mélange chloroforme-méthanol (19 : 1). Les fractions actives ont été combinées et concentrées. Le concentré a été dissous dans une petite quantité de méthanol et appliqué à 200 ml d'une colonne d'alumine neutre (produit de la société dite Merck Co.) remplie de méthanol. On a fait passer 500 ml de méthanol à travers la colonne pour effectuer suffisamment le lavage, et le développement a été conduit avec le mélange méthanol-ammoniaque 4N (4 : 1). Les fractions actives ont été rassemblées et concentrées sous pression réduite. Le concentré a été dissous dans 50 ml d'eau et le pH réglé à 2,0.La solution aqueuse a été extraite 3 fois avec une quantité égale d'acétate d'éthyle, et les couches d'acétate d'éthyle ont été combinées et concentrées sous pression réduite pour rournir des cristaux blancs légèrement jaune tres. Les cristaux bruts ainsi obtenus ont été recristallisés dans du méthanol pour fournir environ 4 mg d'acide phénopicolinique sous forme de cristaux incolores. EXEMPLE 2 On a introduit dans chacune des 10 cuves de fermentation en acier inoxydable d'une capacité de 30 1, 20 1 d'un milieu de cul-. ture contenant 0,5 % de polypeptone, 0,1 ss d'extrait de levure et 0,05 % d'un agent d'enlèvement de mousse dit 'i 70 (produit de la société dite Shinetsu KaGaSu), et le milieu a été stérilisé à 12CC pendant 30 minutes. Après refroidissement, chaque cuve de fermenta- tion a été inoculée d'une manière aseptique avec deux ballons d'un bouillon de culture obtenu en cultivant avec agitation de la même manière que celle décrite dans l'exemple 1.La culture a été réalisée avec agitation à 250 tours par minute en introduisant de l'air en quantité de 25 ss en volume, en se basant sur le milieu dc culture, par minute. Un agent d'enlèvement de mousse a été ajouté si c'était nécessaire.La culture a été poursuivie pendant 3 Jours et le bouilion de culture a été filtré pour retirer les mycéliums. Ensuite, on a appliqué 160 litres de filtra t à une colonne de 10 litres en produit dit Dowex 5.i (type H) et on a lavé suffisamment avec 40 litres d'eau et a substance recherchée a eé éluée avec de l'ammoniaque 1N 60 1 de la fraction active ont été rassemblés, le pH a été réglé à 2,0 avec de l'aci- de chlorhydrique et le liquide a été extrait 3 fois avec un demi-volume d'acétate d'éthyle. les couches d'acétate d'éthyle ont été combinées et concentrées sous pression réduite. Le concentré a été dissous dans une petite quantité de méthanol et appliqué à une colonne de 1 1 d'alumine remplie de méthanol. La colonne a été lavée avec 5 1 ae méthanol-amnoniaque 4N (9 : 1), et la substance recherchee a été développée avec le mélange méthanol-ammoniaque 4N (4 : 1). La fraction active a été concentrée et dissoute dans 500 nil d'eau. Le pH de la solution a été réglé à 9,5 et la solution a été extraite avec une quantité égale d'acétate d'éthyle. La couche d'acé- tate d'éthyle a été évacuée, le pH de la couche aqueuse a été réglé à 2,0 et la couche aqueuse extraite 3 fois avec une quantité égale d'acétate d'éthyle. Les couches d'acétate d'éthyle ont été combinées et concentrées sous pression réduite. Le concentré a été dissous dans une petite quantité de méthanol et revêtu sur 20 g de gel de silice, en retirant le méthanol. Le gel de silice indiqué ci-dessus a été tassé sur une colonne de gel de silice de 1 1, remplie de chloroforme, et on a fait passer à travers la colonne 3 1 de chloroforme. Ensuite, le développement a été conduit avec du chloroforme-méthanol (19 : 1). Les fractions actives ont été rassemblées et concentrées sous pression réduite pour fournir des cristaux blancs légèrement jaunât;res. Les cristaux bruts ainsi obtenus ont été recristallisés dans du méthanol pour fournir environ 200 mg d'acide phénopicolinique sous la forme de cristaux incolores. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation quiviennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparattront à l'homme de l'art. REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation d'acide phénopicolinique ayant la formule caractérisé en ce qu'on cultive le Paecilomyces sp. AF 2552 (ATGC 20463) ou une souche productrice d'acide phénopicolinique, appartenant au genre Paecilomyces, dans des conditions aérobies, dans un milieu contenant une ou plusieurs sources de carbone assimi ladre et une ou plusieurs sources d'azote assimilable > et en ce qu'on isole l'acide phénopicolinique à partir du bouillon de culture. 2 - A titre de produit industriel nouveau, acide phénopicolinique obtenu par le procédé selon la revendication 1, et ses sels. 3 - Composition pharmaceutique, particulièrement employée comme agent inhibiteur de dopamine e-hydroxylase et comme agent hypotensif, caractérisée en ce qu'elle renferme de l'acide phénopicolinique ou un de ses sels comme ingrédient actif.