FR 2310753 A1 19761210 FR 7515404 A 19750516 La présente invention concerne un nouvel antibiotique à activités fongicide et antitumorale, ainsi que son procédé de préparation. Le nouvel antibiotique, objet de la présente invention, a été obtenu à partir d'utWcharnpignon appelé PENIOPHORA AFFINIS. né champignon producteur du composé de l'invention est un champignon supérieur PENIOPHORA AFFINIS (Burt.) BASIDIONYCETE HOMOBASIDIE APHYLLOPHORALE. Ce mycélium supérieur présente une croissance très rapide et affecte un aspect laineux blanc devenant par la suite légèrement ocracé. L'aspect microscopique du mycélium aérien se caractérise par la présence d'hyphes de 1,5 à 8 fi, à boucles assez rares (uniquement sur les hyphes larges) opposées ou groupées par trois ou même par quatre.La souche de ce champignon producteur dl nouveau composé selon la présente invention a fait l'objet d'un dépôt auprès de la Nycothèque du Laboratoire de Cryptogamie du Muséum National d'Histoire Naturelle (12, rue Buffon 75005 PARIS), où il a été enregistré sous le nO 2346. La présente invention concerne donc un nouveau composé dont la formule brute est C1H80, qui se présente sous la forme de cristaux fondant à 1650C et dont la masse moléculaire déterminée au spectre de masse, est égale à 212. A la suite des diverses expériences effectuées sur le composé de l'invention, ce dernier s'est avéré posséder de bonnes propriétés fongicides contre les champignons pathogènes de l'homme et de 11 animal, ainsi qu'une activité antitumorale. La présente invention concerne également un procédé de préparation du composé énoncé ci-dessus, caractérisé par le fait que l'on cultive PENIOPHORA AFFINIS dans un milieu de culture contenant au moins une source de carbone et au moins une source azote, et que l'on extrait le composé de l'invention à partir dudit milieu de culture. La souche de PENIOPHORA A FINIS doit être entretenue par repiquage environ tous les six mois sur un milieu L gélosé ou sur carottes en tube de Roux environ tous les ans. Le milieu L gélosé utilisé actuellement pour l'entretien de la souche de PENIOP5IQRk AFFINIS présente la composition suivante -: glucose pur 16,50g tartrate neutre d'aroeionium 0,15g extrait de malt 3,50g l.asparagine 0,50g hydrolysat de caséine 0,50g P04H2K 0,50g MgS04, 7H20 0,25g gélose 10,00g eau distillée q.s.p. 1 litre Conformément au procédé de l'invention, on fait donc crotre le mycélium dans un milieu de cultureau moins une source d'azote et au moins une source de carbone.Divers essais,effectués avec utilisation de différentes sources de carbone et d'azote, ont conduit à la conclusion que les meilleurs sources de carbone utilisables sont le glucose, le fructose, e mannitol et le mannose et les meilleures sources d'azote utilisables sont le tartrate d'ammonium, le citrate d'ammonium, le nitrate de sodium, l'asparagine, le tryptophane, l'hydrolysat de caséine et l'acide glutamique Les différents essais effectués ont montré que l'acide glutamique et l'hydrolysat de caséine sont des sources d'azote défavorables lorsque la source de carbone est choisie parmi le glucose, le fructose ou le mannitol.En conclusion, les meilleures sources de carbone sont a) le glucose si la source d'azote est choisie parmi - le tartrate d'ammonium, - le citrate d'ammonium, - le nitrate de sodium, - l'asparagine, et - le tryptophane. b) le fructose avec les mêmes sources d'azote que celles énumérées pour le glucose. c) le mannitol, mais uniquement si la source d'azote est le tryptophane. d) le mannose qui est particulièrement favorable avec les sources d'azote énumérées pour le glucose, mais qui donne également de bons résultats avec lthydro- lysat de caséine. D'autre part, le milieu de culture de PENIOPHORA AFFINIS contient également de façon avantageuse des facteurs de croissance qui peuvent être apportés, par exemple, par l'extrait de malt. De manière à améliorer encore la croissance du mycélium, on peut aussi ajouter un précurseur dans ledit milieu.de culture. Le procédé depréparation de l'invention peut par exemple se subdiviser en les diverses étapes suivantes 10/ Préparation de la'tête de cuve" Un fragment du mycélium est transféré du milieu L gélosé dans 25 ml d'un milieu L liquide contenu dans un Erlenmeyer. Le milieu L liquide présente la même composition que le- milieu L gélosé, exception faite de la gélose qui a été supprimée. On prépare alors plusieurs Erlenmeyers qui sont mis à incuber pendant environ 15 à 21 jours (cette durée étant fonction de la pousse du mycélium) dans une chambre obscure en les maintenant à une température constante d'environ 240C, le degré hygrométrique étant sensiblement égal à 70 ,'. 20/ Culture proprement dite de PENIOPHORA AFFINIS Après croissance du mycélium, le contenu de chaque Erlenmeyer est broyé dans un homogénéiseur N.S.T. dont la vitesse de rotation est égale à environ Il 000 tours/minute. L'homogénéisat est ensuite transvasé dans un ballon de 6 litres contenant 4 litres du milieu L liquide précédemment décrit. Dans chacun de ces ballons de 6 litres, on transvase le contenu broyé de 2 à 3 Erlenmeyers. Les ballons en question sont munis chacun d'une tubulure destinée à permettre un barbotage d'air, ce qui assure l'agitation et l'oxygénation du milieu de culture. La température de culture est de préférence environ égale à 240C. Au bout de 25 jours, le milieu est broyé puis filtré, le filtrat pouvant alors être lyophilisé. Cette opération de lyophilisation n'est cependant pas indispensable ; il est en effet parfaitement possible d'extraire le produit actif directement à partir du jus de culture. 30/ Extraction du produit actif Cette opération est par exemple effectuée par extraction liquide-liquide au moyen d'éther, à raison de 3 à 4 litres d'éther par litre de jus de culture. Cette opération d'extraction est avantageusement effectuée de façon continue. L'éther est placé dans un réservoir surélevé par rapport à l'appareil d'extraction qui est constitué par un cylindre dont le fond est muni d'une plaque poreuse et qui comporte à son bord supérieur un tube d'écoulement. Le jus de culture est placé dans ce cylindre et l'éther pulvérisé par la plaque poreuse traverse la couche aqueuse, puis est recueilli par ledit tube d'écoulement. L'éther d'extraction est lavé à l'eau distillée à raison de 20 ml d'eau distillée par litre d'éther, et les phases éthérées sont concentrées sous pression réduite jusqu'à ce qu'elles atteignent un volume sensiblement égal au quart de leur volume initial. Ce concentrat est alors séché sur sulfate de soude anhydre puis les phases éthérées concentrées et séchées sont évaporées à sec sous vide, de manière-à obtenir un résidu sec. Selon une mise en oeuvre avantageuse du procédé de l'invention, on soumet alors ledit résidu sec à une opération de purification. Pour ce faire, le résidu sec est dissous dans le méthanol raison de deux parties de résidu sec pour une partie de méthanol. Si la totalité du résidu se dissout dans le méthanol, on ajoute 9 volumes de benzène. Si la dissolution dans sle méthanol ntest pas totale, on filtre le mélange obtenu et on rajoute 9 volumes de benzène au filtrat. La solution obtenue dans le mélange méthanol-benzène est alors chromatographiéesur colonne de silice Merck 60 RR. 40/ Exemple de purification par chromatographie Pour traiter 2g de l'extrait sec préalablement obtenu,-on utilise une colonne chromatographique d'une hauteur de 40 cm et de 2 cm de diamètre. La colonne est remplie auxtrois quarts avec le mélange benzène-méthanol(90-10). Dans ce même mélange solvant, on met en suspension la silice 60 HR. La suspension homogène ainsi obtenue est versée dans la colonne Après sédimentation de la silice, la solution benzène-méthanol est aspirée. Cette-opération est réitérée jusqu'à ce que l'on obtienne une hauteur de 40 cm. Sur la colonne ainsi préparée,on verse l'extrait sec dissous dans le mélange benzène-méthanol (90-10). L'éluant utilisé est toujours constitué par le mélange benzène-m-thanol. Les produits d'élution sont recueillis dans un collecteur de fractions réglé à 200 gouttes par tube, et il a été vérifié que le produit actif selon l'invention était ap proxiaativement collecté entre le 15ème et le 50ème tube. Le contenu de ces tubes est alors lentement concentré, à l'abri de la lumière, dans une chambre froide maintenue à une température environ égale à 40C. La mise en oeuvre de ce procédé selon l'invention permet ainsi d'obtenir le produit actif cristallisé dans le contenu des tubes situé environ entre le 2SBme et le 3oème.Les autres tubes, bien que contenant le composé de l'invention ne conduisent pas directement à la formation de cristaux. Le contenu des tubes nOS 15 à 26 et 36 à 50 est alors retraité en vue d'obtenir une cristallisation. Le composé actif selon l'invention a fait l'objet de diverses analyses physico-chimiques qui ont conduit aux résultats suivants. Les cristaux obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention après culture de PENIOPHORA AFFINIS et extraction du composé actif présente une couleur rouge-orangé cette couleur fonce à la lumière. Le point de fusion des cristaux obtenus, déterminé au bloc Maquenne, est de 1650C. La température de décomposition du produit selon l'invention est égale environ à 1690C. La masse moléculaire du composé, déterminée à partir du spectre de masse, est égale à 212. D'autre part, le spectre de masse donne une composition centésimale qui répond à la formule brute C13H803. Solubilité du produit obtenù Le composé selon l'invention est soluble dans le metha- nol et dans le mélange benzène-méthanol (90-10), il est peu soluble dans l'acétone, et insoluble dans l'eau ainsi que dans le chloroforme. La chromatographie ascendante en couche mince effectuée sur plaque de silice terce fluorescente, en utilisant le mélange benzhne-métacol (90-lC) comme éluant, conduit à un coefficient de migration Rf = 0,2. On a d'autre part, effectué sur le composé de l'invention différents spectres qui ont été reproduits sur les dessins annexés, sur lesquels - la figure 1 représente le spectre tJ.V. du composé selon l'invention en solution méthanolique - les figures 2 et 3 représentent le spectre I.R. effectué sur ie composé de l'invention en phase KBr ; et - la figure 4 représente le spectre R.M.N. du composé selon l'invention obtenu en utilisant le méthanol deutéré (CD3OD) comme solvant.La référence utilisée est le T.M.S L'analyse de ces spectres a permi d'arriver aux conclusions suivantes a) le specre infra-rouge (figures 2 et 3) Fréquence des principaux Liaisons correspondantes pics d'absorption pics d'absorption 3240 cm -O-H 2200 cm -C-C 1700 cm 1 > C=0 1620 cm , 1250 cm1 i --6-o b) le spectre R.M.N. (figure 4) L'étude de spectre R.M.N. révèle la présence d'un noyau benzénique portant un groupement CH2, ainsi que la présence d'un groupement OH. A la lumière de l'ensemble des résultats énumérés pré cédemment,les demandeurs ont conclu , sans pour autant vouloir être liés par cette interprétation, que la formule développée du composé selon l'invention est très vraisemblablement la suivante On énoncera ci-après quelques unes des expériences faites sur le composé selon l'invention, de manière à bien mettre en évidence son activité biologique. Recherche de l'activité du lyophilisat du milieu de culture contenant PENIOPHORA AFFINIS 1 erience in vitro Cette première expérience consiste à tester l'activité biologique du composé selon l'invention sur une souche de Candida albicans isolée à partir d'une mycose humaine ét entretenue par repiquage mensuel sur Sabouraud solide en tube sans antibiotique. A partir de cette culture en milieu solide, on ensemence, pour les essais, sur milieu de Sabouraud liquide, puis on laisse Candida albicans se développer pendant environ 18 heures. 220 mg de lyophilisat, correspondant à 10 ml du milieu deculturedu mycélil1m detENIOPHORA AFFINIS, sont dissous dans 10 ml d'eau stérile en tube stérile. Parallèlement on place dans un tube stérile 10 ml de milieu L liquide (précédemment défini) qui n'a pas été ensemencé. Dans ces deux tubes on introduit une goutte de culture de Candida albicans. Après 24 heures on place une goutte de chaque tube dans une cellule de blalassez. Les spores de Candida albicans apparaissent sous la forme d'élements ovoïdes de 2 à 3 pm de diamètre avec un centre réfringent présentant quelques bourgeons mais pas de filaments. On observe, dans le tube témoin la présence de 400 levures environ sur le quadrillage de la cellule. Dans le tube contenant le lyophilisat, on constate qu'il n'y a pas de levure. ?ar une technique analogue on a répété cette expérience,et constaté que le composé selon-l'invention présentait une action fongicide sur les différents champignons pathogènes suivants Absidia corymbifera Epidermophyton floccosum Microsporum audouini Microsporum canis Trychophyton interdigitale Trychophyton mentagrophytes Trychophyton rubrum Trychophyton sabouraudi Trychophyton schbrleini Trychophyton tonsurans Aspergillus nidules Scopulariopsis brevicaulis Gebtrichum candidum Cryptococcus neoformans. Il convient également de noter que le composé selon l'invention s'est avéré présenter une action fongicide sur Aspergillus fumigatus et Aspergillus niger, cette action étant toutefois moins marquée que les précédentes. L'action fongicide de ce lyophilisat a été comparé à celle du chloruré mercurique sur Candida albicans et Candida tropicalis. Pour ce faire, on a dissous dans 25 ml de milieu L liquide, d'une part, 5 mg du lyophilisat selon l'invention et, d'autre part, 100 mg de HgCl2. Après avoir ensemencé les champignons pathogènes Candida albicans et Candida tropicalis, on a constaté qu'aux concentrations précitées, l'action fongicide du lyophilisat était bien supérieure à celle du chlorure mercurique. 2) Expérience in vivo Pour conduire cette expérience on utilise des souris Swiss mâles infectÉes par Candida albicans, les souris Swiss mâles étant plus sensibles~que les souris femelles. A partir-d'un repiquage de 18 heures de Candida albicans sur milieu de Sabouraud liquide, on réalise une suspension de cellules de Candida albicans dans 1 t eau salée stérile à 5 ; de Nazi, de façon à obtenir une densité de 106~cellules au cm3. On inocule alors 0,5 cm3 de cette suspension par voie intrapéritonéale à des souris de.20g. Cette candidose expérimentale évolue en plusieurs temps: - au bout de 72 heures les souris se déplacent difficiliement, leur arrière-train est contracté et des signes d'atteintes rénales seanifestent par mictions rares,puis nulles. - vérs le cinquième jours apparaissent des signes encéphaliques. Les souris sautent en se cognant au couvercle de la cage, et 80 % de ces souris inclinent la tête de côté. Suspendues par la queue, elles tournent sur ellesmêmesdans le sens où la tête est inclinée. - on observe enfin une cachexie, puis la mort intervient n 12 à 20 jours. 40 souris infectées sont réparties par randomisation en deux lots de 20 souris, dont le premier lot sert de témoin et le second est traité par injection intra-péritonéale d'une suspension contenant 5,2 mg de lyophilisat par souris de 20g. Le traitement est renouvelé chaque jours après l'injection in- fectante. Les résultats ont été consignés sur le tableau cidessous Souris témoins 100 -- de mort en 25 jours Souris traitées 1 mort en 15 jours 30 % de mort en 25 jours 70 70 % de survivants Remarque : Aucune des souris traitees, même parmi celles qui sont mortes n'a présenté les symptômes de candidose. Recherche de l'activité antitumorale Pour conduire cette- expérience, on a inoculé par voie intrapéritonéale des cellules de la tumeur ascitique d'Ehrlich à des souris Swiss. Le traitement est identique à celui de la candidose. Cette inoculation a été faite sur deux lots de 10 souris chacun, un lot traité, et l'autre jouant le rôle de témoin.Les résultats obtenus ont été consignés dans le tableau ci-dessous Souris témoins 1 mort le 12ème jour (ascite 8 morts le 13ème jour # cancéreuse) 1 mort le 16ème jour Souris traitées 2 morts le 25ème jour (ascite cancé 2 morts le 28ème jour ( pas d'ascite 6 survivants Remarque : Les souris survivantes ont été considérées comme guéries après 6 mois de survie. Diverses expériences ont également été conduites sur le composé cristallisé lui-même, parmi lesquelles on ne rapportera ci-après qu'un seul test mettant en évidence l'activité antibiotique du composé cristallisé selon l'invention. Les cristaux obtenus conformément au procédé selon l'invention sont dissous dans l'alcool méthylique. Des disques de papiers B.B.L. de 6 mm de diamètre sont plongés dans cette solution et séchés à température ambiante. Parallèlement, une souche de Candida albicans, en phase exponentielle de développement en milieu liquide, est additionnée d'eau distillée stérile à raison de 10 cm3 d'eau pour 10 cm3 de culture, puis le mélange est centrifugé à petite vitesse. Dans ce culot les levures sont comptées à la cellule de Malassez et on dilue ce culot à l'aide d'eau distillée de façon à obtenir avec le diluat une dizaine de levures par cellule de Malassez. On ensemence 5 cm3 de cette dilution sur la surface d'une boite de Pétri de 9 cm de diamètre et contenant, sous une épaisseur de 0,5 cm le milieu solide suivant - casitone Difco 9g - glucose pur 20g - extrait de levure Difco 5g - Citrate de sodium î0g - Phosphate monosodique îg - Phosphate disodique îg - gélose 20g - Eau distillée q.s.p. 1 litre Les disques préparés à partir de cette solution méthanolique de cristaux sont posés à 15 mm de la périphérie de la boite de Pétri à raison de 4 disques par boîte.On laisse alors diffuser pendant 30 minutes à la température ambiante, puis les boites sont placées à une température de 370C pendant une durée de 16 à 18 heures. On observe alors que le diamètre de la zone circulaire dsinhibition est d'environ 25 à 28 mm. L'ensemble des -expériences rapporté ci-dessus montre que le composé selon la présente invention présente d'une part une activité antifongique et d'autre part une activité antitumorale. Les compositions pharmaceutiques contenant , à titre de principe actif, le composé selon l'invention et ses dérivés physiologiquement acceptables, sont utilisables en médecine humaine ou vétérinaire et peuvent se présenter sous une forme convenant à l'administration par voie topique, par voie orale, par voie parentérale ou par voie rectale, C'est ainsi que le composé selon ltinvention et ses dérivés physiologiquement acceptables peuvent constituer le principe actif de compositions pharmaceutiques destinées au traitement des maladies provoquées par des champignons blastosporés du genre Candida eut au-tres champigncns pathogènes.ivant que la mycose à traiter se présente sous la forme d'affections locales, telles que le muguet ou autres manifestations muqueuses, cutanées, digestives ou pulmonaires, ou sous la forme d'affections générales telles qu'une septicémie à Candida albicans et certaines blastomycoses, on choisira plus particulièrement l'un ou l'autre des modes d'administration précités. C'est ainsi que, dans le cas d'une candidose buccale qui est en train de gagner la muqueuse digestive par voie descendante et qui se manifeste par une stomatite érythémateuse, une languede chàt et des signes de généralisation, un traitement sous la forme de collutoires contenant le principe actif selon l'invention à une dose de 1 %0 conduit à une involution immédiate de la mycose. REVENDICATIONS 1. - A titre de produit industriel nouveau, un composé caractérisé par le fait que sa formule brute est C13H803, qu'il se présente sous la forme de cristaux dont le point de fusion, déterminé au bloc Maque-nne, est de 1650C, et par le fait que sa masse moléculaire, déterminée à partir du spectre de masse, est égale à 212. 2.- Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que sa chromatographie ascendante en couche mince sur plaque de silice, avec comme éluant le mélange benzène-méthanol (90-10) conduit à un coefficient de migration Rf = 0,2. 3.- Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que son spectre U.V. dans le méthanol, son spectre I.R en phase KBr et son spectre R.M.N. obtenu en utilisant le méthanol deutéré comme solvant, sont tels que représentés aux dessins annexés. 4.- Composé selon les revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule développée suivante ainsi que ses dérivés. 5.- Procédé de préparation du composé tel que défini à la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on cultive PENIOPHORA AFFINIS dans un milieu de culture contenant au moins une source de carbone et au moins une source d'azote et en ce que l'on extrait ledit composé à partir du milieu de culture. 6.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le milieu de culture est un milieu de culture liquide dans lequel la source d'azote est choisie parmi les composés suivants : le tartrate d'ammonium, le citrate d'ammonium, le nitrate de sodium, l'asparagine, le tryptophane, lthydrolysat de caséine et la source de carbone est choisie parmi le glucose, le fructose, le mannitol et le mannose. 7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que si la source de carbone est constituée par le glucose, le fructose ou le mannitol, la source d'azote ne peut pas être l'acide glutamique et l'hydrolysat de caséine, que l'hydrolysat de caséine ne peut être utilisé en tant que source d'azote que si la source de carbone est constituée par le mannose, et que, si la source de carbone est le mannitol, on utilise uniquement le tryptophane comme source dlazote, 8.- Procédé selon l'une des revendications t à 7, caractérisé par le fait que le milieu de culture contient des facteurs de croissance pouvant par exemple être apportés par l'extrait de malt. 9.- Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé par le fait que l'extraction du composé de la revendication 1 à partir du milieu de culture de PENIOPHORA AFFINIS est obtenue par extraction liquide-liquide de préférence en utilisant l'éther comme solvant, ladite extraction étant avantageusement suivie d'une opération de purification. 10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que l'opération de purification est obtenue par chromatographie sur colonne de silice, l'éluant étant constitué par le mélange benzène-méthanol (90-10). 11.- Composé obtenu par un procédé consistant à cultiver PENIOPHORA AFFINIS dans un milieu de culture contenant au moins une source de carbone et au moins une source d'azote puis, à extraire ledit composé à partir du milieu de culture, ainsi que ses dérivés. 12.- Milieu de culture pour la préparation du composé selon la revendication 11, caractérisé par le fait qu'il se présente sous la fqrme d'un milieu de culture liquide dont la source de carbone est choisie parmi le glucose, le fructose, le mannitol et le mannose, dont la source d'azote est choisie parmi le tartrate d'ammonium, le citrate d'ammonium, le nitrate de sodium, l'asparagine, le tryptophane, l'hydrolysat de caséine et l'acide glutamique, et par le fait qu'il contient éventuellement des facteurs de croissance pouvant par exemple être apportés par l'extrait de malt. 13.-- A titre de produit industriel nouveau, le milieu de culture où s'est développé le mycélium de PENIOPHORA AFFI NIS. 14.- A titre de médicament nouveau le milieu de culture où s'est développé le mycélium de PENIOPHORA AFFINIS. 15.- A titre de médicament nouveau le compos-é selon l'une des revendications 1 à 4 et 91 ainsi que ses dérivés physiologiquement acceptables. 16.- Composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle contient à titre de principe actif le milieu de culture où s'est développé le mycélium de PENIOPHORA AFFINIS. 17.- Composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle contient à titre de principe actif le composé selon l'une des revendications 1 à 4 et 11, où l'un de ses dérivés physiologiquement acceptables.