FR 2316964 A1 19770204 FR 7522011 A 19750711 L'invention concerne un agent pour combattre les effets nocifs des irradiations chez les êtres vivants. Des études antérieures ont montré qu'il est possible de combat tre les effets nocifs des irradiations en injectant à des souris, soumises à ces radiations, des lipopolysaccharides (IPS) extraits de bactéries à gram négatif. On sait par ailleurs que les lipopolysaccharides en question sont, au moins en grande partie, responsables des propriétés toxiques des parois des bactéries qui les renferment. Compte tenu de cette toxicité, l'emploi des LPS pour lutter contre les effets des radiations est très limité. L'invention a donc pour but de fournir un nouvel agent de protection et de lutte contre les effets des radiations qui ne présente pas l'inconvénient mentionné ci-dessus. L'agent de protection et de lutte contre les effets nocifs des irradiations chez les êtres vivants est constitué par le produit, dénommé ci-après PS, qui est obtenu à partir des susdits LPS, après séparation de la majeure partie et, de préférence, de la quasi-totalité de la teneur initiale en lipides de ces LPS. tes constituants essentiels de cet agent sont donc constitués par les polysaccharides initialement contenus dans les 19S ou par des fractions de ces po lysaccharide s. Parmi ces produits, on retrouve ceux qui sont caractérisés par la composition chimique suivante et par les propriétés physiques, chimiques, biologiques ou pharmacologiques explicitées ci-après. Ils contiennent - d'environ 50 à environ 70 ffi en poids d'hydrates de carbone, - d'environ 1 à environ 8 % en poids d'hexosamines, - d'environ 0,2 à environ 0,5 % en poids de phosphore, - d'environ 1 à environ 5 % en poids de composés aminés, parmi les quels environ 1 à 2 % d'acides aminés, - moins de 1 % et de préférence pas d'acides gras ou lipides. Il est soluble dans l'eau. te poids moléculaire des produits obtenus par dialyse est compris entre environ 8000 et environ 35000, souvent de tordre de 10000. Il n'est pas toxique. Il exerce une action de stimulation à l'égard de la multiplication des cellules souches de la moelle in vitro. Il réagit avec les anticorps d'un antisérum, obtenu à partir d'un animal à sang chaud, mis en contact avec la bactérie à gram négatif ou avec le IPS dont est originaire le produit utilisé. I1 exerce un effet de protection d'animaux à sang chaud contre les effets nuisibles induits par l'irradiation de ces animaux par des radiations létales. tes principes actifs de médicament selon l'invention sont obtenus, dans les conditions qui seront rappelées plus loin, à partir de lipopolysaccharides (LPS), eux-m8mes extraits à partir des parois cellulaires des bactéries gram négatif. Dans ce qui suit, on désgne par lipopolysaccharide (LPS) les extraits obtenus à partir de parois cellulaires des bactéries gram négatif. tes LPS sont des composés bien connus de la littérature. Beurs propriétés, en particulier pharmacologiques, ont fait l'objet de nombreuses études et publications. tes LPS peuvent être isolés de toutes façons connues, par exemple au moyen de techniques d'extraction par solvants, éventuellement suivies d'opérations de purification (voir par exemple Büderitz et col. Min. N.Y. Bcad. Sci. 133:349, 1966). L'obtention du PS à partir des LPS peut être réalisée par hydrolyse acide de celui-ci, ce qui entratne la précipitation des fractions lipidiques dans le milieu. Cette hydrolyse doit être conduite avec précaution. Pour parvenir à scinder les LPS, la réaction doit notamment être effectuée à des pH compris entre environ 1 et environ 4, et de préférence entre 1 et 3. Si l'on utilise de l'acide chlorhydrique pour cette opération, on prendra de préférence une solution 0,1 à 1 IT. La température de la réaction doit être comprise entre environ 30 et environ 1000C pour une opration effectuée à la pression atmosphérique. La durée de la réaction est d'autant plus rapide quton opère à température plus élevée.La durée de l'hy- drolyse est soumise à deux exigences opposées ; d'une part, l'hy- drolyse doit entre suffisante pour que le LPS soit effectivement scindé en lipides et polysaccharides ; d'autre part, l'hydrolyse ne doit pas se prolonger jusqu'à une dégradation des polysaccharides jusqu'à un degré entraînant la perte des propriétés protectrices à l'égard des irradiations. Un mode de détermination de la progression de la réaction met par exemple en jeu l'apparition d'insolubles constitués par les lipides libérés. La durée de la réaction se situe entre environ 30 mn et 72 h, selon l'agent acide d'hydrolyse et la température utilisés. La scission peut être obtenue également par passage d'une solution de LPS sur une résine échangeuse d'ions du type résine cationique fortement acide. Sont utilisables toutes résines porteuses de groupements acides, tels que par exemple -SO3H, qui correspondent à des acides qui, s'ils étaient dissous dans l'eau, pourraient conférer aux so- lutions aqueuses obtenues un pH compris dans les intervalles susindiqués. D'une façon générale, la quantité d'acide (ou de résine) doit être suffisante pour permettre une hydrolyse du tPS au bout d'un temps de contact raisonnable. Elle ne doit pas dépasser celle qui entraînerait une dégradation trop rapide et complète des polysaccha- rides. tes normalités des solutions doivent, d'une façon générale, être comprises entre 0,1 et 1. Lorsqu'il s'agit de résine, on en utilise des quantités correspondantes, déterminées par le nombre d'équivalents des fonctions acides portées par unité de poids de résine. On utilise de préférence des acides sans effet dégradant vis-à-vis des polysaccharides à réduire. Des acides préférés sont 11 acide chlorhydrique et l'acide acétique. Au terme de l'opération de scission du IPS, on se trouve en présence d'une solution contenant essentiellement des polysaccharides dérivés des parties polysaccharidiques du lPS initial, et d'un précipité en suspension dans la solution des parties lipidiques du meme tPS. ta séparation de la fraction solide peut entre effectuée de toutes les façons connues et notamment par centrifugation. Pour isoler le polysaccharide contenu dans la solution aqueuse, on procédera tout d'abord à une neutralisation de la solution acide débarrassée de la fraction lipidique. Cette neutralisation peut avantageusement être réalisée par addition d'une résine basique. Dans ce cas, après l'opération de neutralisation, on élimine la résine par filtration et on récupère le PS par lyophilisation. On peut aussi neutraliser la solution à l'aide d'une solution alcaline minérale et, si besoin, ensuite éliminer les ions métalliques par dialyse contre de l'eau distillée. te PS peut également être précipité hors de la solution aqueuse par addition d'alcool. La purification du PS qui contient une faible proportion de sel peut être poussée davantage en renouvelant l'opération de précipitation, après redissolution dans l'eau. Avantageusement, on a de toute façon recours à une opération de dialyse, notammert Pour éliminer les fractions contenues dans le PS obtenu et ou ont des poids moléculaires inférieurs à environ 8000. te procédé d'extraction de PS qui a été décrit ci-dessus est d'une application générale au tPS obtenu à partir de toute bactérie à gram négati,. Il peut arriver que certains xPS contiennent certaines toxines en petites quantités qui, si elles n'étaient pas éliminées avant l'étape d'hydrolyse acide, pourraient se retrouver dans la fraction polysaccharidique finale. Dans ce cas, il est souhaitable de soumettre le LPS utilisé à un traitement préalable par l'alcool, tel que le méthanol ou l'méthanol (mise en suspension du tPS dans l'alcool), puis de soumettre la suspension obtenue à une ultérieure centrifvgation, notamment de 100.000 g ou davantage pendant 2 à 3 heures. Les fractions PS isolées comme il a été décrit précédemment présentent de remarquables propriétés pharmacologiques. La fraction PS joue un rôle important dans les mécanismes de défense immunitaires. Elle permet notamment de rétablir cette défense immunitaire lorsque celle-ci dispara t, par exemple à la suite d'un traitement-de radiothérapie. Toujours pour ce même rôle, elle peut avantageusement faire partie de compositions immunostimulantes. La fraction PS a montré également des effets de stimulation sur la formation de cellules souches de la moelle osseuse. Ces essaims ont été effectués sur des cellules de souris suivant la méthode de Metcalf et Moore ("Haemopoietic Cells", American Elsevier Publ. Co., New York, pages 33-37, 1971). Enfin, dans la lutte contre les effets nocifs des irradiations, par exemple des rayons X, la fraction PS s'est révélée un agent de protection ou de traitement particulièrement intéressant. Il est aussi important de souligner que ces produits, contrairement aux tPS dont ils sont issus, sont non toxiques et, en particulier, ne produisent, lorsqu'ils sont injectés, aucune réaction néfaste d'hypersensibilité. On a pu montrer, en particulier, que le PS ne contient pratiquement pas d'endotoxines, moins de 0,001 % en poids (détermination faite notamment par la méthode de Levin décrite dans N. Engl. J, Med. 283:1313, 1970). tes fractions PS peuvent être lyophilisées. Dans le cas de l'application thérapeutique du PS, son mode d'administration préféré à des patients est sous forme de solution ou suspension au sein d'un véhicule physiologiquement supportable, stérile, isotonique (par exemple sérum isotonique glucosé ou solution de chlorure de sodium- isotonicine). Le médicament ainsi obtenu est appliqué avec avantage, notamment dans le traitement de patients traités par des rayonnements ou soumis à une chimiothérapie antitumorale à l'aide de produits immunosuppresseurs, dans le but de restaurer les réponses immuni- taires que ces traitements tendent à affaiblir chez ces patients. Le médicament selon l'invention est aussi avantageusement administré à titre préventifs. Les exemples qui suivent donnent avec plus de détails des modes de préparation de fractions PS, ainsi que quelques-unes de leurs propriétés pharmacologiques significatives. 10) PréParation des fractions lipidiques et PS On isole des lipopolysaccharides des souches bactér ernes S.minnesota 1114 et de Serr.marcescens 08 par extraction au moyen d'un mélange eau-phénol, suivant la méthode de Büderitz et col. (réf. déjà citée). te LPS obtenu est purifié par précipitation au moyen de méthanol et récupéré par ultracentrifugation. te LPS purifié est hydrolysé pendant 35 mn par une solution IN d'acide chlorhydrique à la température d'ébullition. Le précipité lipidique formé est centrifugé à 5000 g pendant 30 mn. On récupère ainsi une solution acide de PS, d'une part, et-un-précipité lipidique, dtautre part. La solution est neutralisée par addition de résine "Dowex 1". Après élimination de la résine par filtration, le filtrat est lyophilisé. La solution obtenue susdite peut aussi être dyalisée pour éliminer les contaminants de faible poids moléculaire. Ainsi a-t-on dialysé la solution à travers une membrane, commercialisée sous la désignation "AMICON P10", qui ne laisse pas passer des particules ayant un poids moléculaire inférieur à 10000. La composition chimique globale du produit actif obtenu après dialyse était la suivante : - 54 % d'hydrates de carbone (déterminés par la méthode au phénol et à l'acide sulfurique), - 2,37 % d'hexosamines (mesurées par le procédé Rondle-Morgan), - 0,6 % de phosphore, - 0,7 fo d'azote. Une teneur en acides gras dans un échantillon de 2 mg n'a pas pu être détectée. 20) Détermination de l'effet de stimulation sur des colonies de cellules de moelle osseuse La méthode utilisée pour cet essai est celle de Metcalf et Moere. tes préparations de PS, de fractions lipidiques ou de LPS sont injectées de façon intrapéritonéale à des souris ICR âgées de 2 à 3 mois. Chaque composé est injecté à raison de 20/ug par souris. Deux heures après l'injection, les souris sont sacrifiées. On récupère le sang par ponction cardiaque. Après 2 h de repos à température ambiante, on récupère le sérum sanguin par centrifugation, puis on filtre. Par ailleurs, la moelle osseuse fémorale des souris est récu porée dans un milieu E 1010. On ajuste la concentration cellulaire à 2,5 x 107 par ml. On ajoute 1/10 ml de cette préparation à 10 ml d'un mélange constitué, à volumes égaux, de milieu Eagle (E 2020) et d'une solution d'agar-agar à 0,6 %. On introduit dans un récipient de Falcon 1 ml du mélange résultant et 50/ul du sérum préparé précédemment. ta culture est effectuée dans un incubateur à C02, à 370 C, en atmosphère humide saturée. Après 7 jours de culture, on dénombre les colonies cellulaires. tes résultats obtenus sont donnés dans le tableau suivant. Préparation injectée Numération i.p. LPS(a) 262 + 14 ps(b) 250 + 15 Lipide(o) 96 # 10 Sérum physiologique 45 # 5 a LPS extrait de S.minnesota 1114 b PS obtenu par hydrolyse de a (c) lipide obtenu par hydrolyse de (a) Le tableau précédent montre, par rapport au témoin constitué par le résultat obtenu par injection d'une solution saline isotonique, que l'injection de PS selon l'invention a un effet stimulant sur la croissance des cellules de la moelle osseuse. La fraction lipidique ne présente pas cette propriété de façon significative. 3 ) Effet protecteur contre les rayone X Pour cet essai, des souris ICR reçoivent par injection intrapéritonéale 10 ou 100 g de LPS, PS et de lipide provenant de l'hy- drolyse. Tous ces extraits proviennent de S.minnesota 1114. On fait varier l'intervalle de temps séparant l'irradiation de l'injection, celle-ci étant faite avant ou après l'irradiation. ta J ose dtirra- diation des souris est de 700R. Cette dose correspond à un taux de létalité de 100 % pour des souris témoins irradiées dans des conditions analogues et ne subissant aucune injection (la dose létale DL50/30 est de 565 R, toujours dans les mêmes conditions). Les résultats de ces essais sont donnés dans les figures î à 5. Ces figures indiquent - figure I, le pourcentage de variation, en jours (T), de survie (%) pour des souris traitées par 10/ug de LPS, PS, de lipide (désigné par LIP), 48 h avant irradiation - figure 2, les conditions sont identiques à celles de la figure 1, mais la dose injectée est de 100/ug - figure 3, le pourcentage de survie des souris est indiqué en fonction de l1intervalle de temps (IT), en jours, séparant l'injection de l'irradiation (injection de 10 g). Les résultats donnés dans les figures 1 à 3 montrent les effets remarquables de diminution de la létalité pour les souris traitées par les fractions PS par rapport aux souris non traitées ou traitées avec la fraction lipidique. 40) Détermination de la toxicité de la fraction PS Ces déterminations sont faites de façon traditionnelle par la détermination de la dose létale 50 (DL50) sur des souris et sur des embryons de poulets. Le détail de ces méthodes apparat notamment dans l'ouvrage "Basic Exercises in Immunochemistry" (Springer Verlag, New York, Heidelberg, 1969). tes résultats de ces déterminations pour les LPS et PS de S.minnesota 1114 et S.marcescens 08 sont donnés ci-après. DL50(a) DL50)b) (souris) (embryons) LPS (S.minn.) 450-500 0,015 PS (S.minn.) 4000 10 LPS (S.marc.) 350-450 0,003 PS (S.marc.) 4000 10 (a) en /ug/souris (b) en /ug/embryon Ces résultats montrent la très faible toxicité des fractions PS par rapport à celle des LPS. L'activité endotoxique du PS a aussi été étudiée en ayant recours au test d'ultrasensibilité du lysat de Stimulus, de alevin et col. (g. Engl. J. Ned. 283:1313, 1970). Le PS s'est révélé pratiquement exempt d'endotoxine (teneur inférieure à 0,01 %). il s'est révélé inactif dans les tests de toxicité de Shwartzman (réactivité de la peau) ou de pyrogénicité. Des résultats analogues à ceux qui viennent d'être présentés ont été également obtenus en utilisant les fractions PS provenant d'autres souches et, en particulier, des souches suivantes : phosa ; Serr,marcescens n 594 ; Serr.marcescens n 55 ; Serr,marcescens n 62. REVENDICATIONS 1 - Agent de protection et de lutte contre les irradiations chez les êtres vivants, constitué de polysaccharides, dénommé PS, obtenu à partir de lipopolysaccharides (LPS), eux-memes extraits de bactéries gram négatif après séparation de la majeure partie et, de préférence, de la quasi-totalité, de la teneur initiale en lipides desdits IPS. 2 - Agent de protection selon la revendication 1, caractérisé en ce que le poids moléculaire des constituants du PS, une fois purifié, est compris entre environ 8000 et 35000, et principalement de l'ordre de 10000. 3 - Agent de protection selon la revendicàtion 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il contient - d'environ 50 à 70 ç en poids d'hydrates de carbone, - d'environ 1 à 8 % en poids d'hexosamines, - d'environ 1 à 5 fo en poids de composés aminés parmi lesquels 1 à 2 % d'acides aminés, - moins de 1 % et de préférence pas d'acides gras ou lipides, et que sa teneur en phosphore est d'environ 0,2 à 0,5 % en poids. 4 - Agent de protection selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il provient de bactéries d'une des souches du groupe constitué par S,typhosa, Serr.marcescens n 594, Serr.marcescens n0 55, Serr.marcescens n0 62, S.minnesota 1114, Serr.marcescens 08. 5 - agent de protection selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est obtenu par hydrolyse acide de LPS de bactéries gram négatif, le pH étant compris entre environ 1 et 4, la température étant comprise entre environ 30 et environ 10000, la durée de l'hydrolyse étant suffisante pour que le EPS soit effectivement scindé en lipides, dlune part, et PS, d'autre part, sans toutefois se prolonger jusqu'à dégrader le PS, de telle sorte qu'il perde ses propriétés de protection contre les irradiations. 6 - Agent de protection selon la rc-vendication 5, caractérisé, en outre, en ce que les lipides sont éliminés de la solution d'hydrolyse, notamment par centrifugation, et que l'on élimine de la solution les produits solubles dont le poids moléculaire est in*é- rieur à environ 8000, par dialyse, 7 - Agent de protection selon la revendication 5 ou la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est isolé de la solution d'hydrolyse par lyophilisation. 8 - Agent de protection selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est purifié par dissolution du lyohilisat dans de lteau, et précipitation par addition d'alcool. 9 - Médicament caractérisé en ce qu'il contient une dose active d'un agent de protection selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, éventuellement avec d'autres substances actives, adjuvants et excipients0 10 - Médicament selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il contient l'agent de protection sous forme de solution au sein d'un véhicule physiologiquement supportable, stérile et isotonique.