FR 2310772 A1 19761210 FR 7515400 A 19750516 La présente invention concerne un vaccin contre la varicelle et des procédés pour la préparation dtun tel vaccin. En particulier, l'invention concerne un vaccin inoffensif à virus de varicelle atténué vivant et un procédé tour produire le vaccin par propagation en série du virus de la varicelle dans des systèmes de culture de cellules. La varicelle, ou petitelvowante, est une maladie très contagieuse principalement de ltenfance. La maladie est caractérisée typiquement par de la fièvre et l'apparition d'une éruption de taches qui évolue rapidement en passant par les stades de formation de papules et de vésicules. La guérison se produit habituellement sans complications, mais la maladie même dans sa forme bénigne est peu agréable à voir et peut causer un nombre consi érable de cicatrices résultant de vésicules rompues. Dans certains cas, la maladie peut être très sévère en ce qu'une pneumonie de varicelle primaire peut se produire chez des enfants ou des adultes.Des complications au système nerveux central comme une ataxie cérébelleuse aigre avec tremblements et hypotie musculaire peuvent préoéder, accompagner ou suivre l'infection de varicelle. Plus rarement, il y a implication généralisée du système nerveux central avec hemorragie, infiltration périvasculaire de cellules rondes et démyélinisation. De la névrite et de la myélite peuvent se produire aussi. Les complications cutanées peuvent aussi etre ennuyeuses avec apparition de lésions hémorragiques, bulbeuses ou gangréneuses. Ainsi, la prévention de la maladie par vaccination est justifiée pour éviter ces éventualités, et la présente invention a pour but de fournir à cet effet un vaccin inoffensif, à virus de varicelle atténué vivant et un procédé pour sa préparation. Plusieurs chercheurs, dans le passé, ont tenté la vaccinations de volontaires humains sensibles, avec des résultats variables en ce qui concerne la "prise" du vaccin et beaucoup de désagréments concernant l'efficacité de protection. Toutefois, il n'y a pas eu d'effets fâcheux importants, en dépit du fait que ces vaccinations essayées concernaient des volontaires sensibles avec le virus complètement virulent dans du liquide vésiculaire provenant de cas de varicelle-zona. La technique antérieure a rapporté la propagation de la va ricelle dans divers systèmes de culture de cellules comme de l'amnios humain, des fibroblastes d'embryon humain, des cellules HeLa et de la thyroSde humaine, mais antérieurement à la présente invention on pensait généralement que la seule source de virus de varicelle exempt de cellules viable était le liquide vésiculaire. Caunt et autres, Journal of Hygiene, 62, 413-424 (1964) ont rapporté l'isolement de virus exempt de cellule à partir de tissu de thyroSde humaine et Brunell, Virology, 31, 732-4 (1967) décrit l'isolement de virus exempt de cellules à partir de fibroblastes d' d'embryon humain. Le liquide vésiculaire est évidemment une source de virus vivant qui ne convient pas pour la production d'un vaccin en raison de la quantité limitée disponible et de la virulence. Le tissu thyroïde humaine est une ligne de cellules humaines primaires et est donc inacceptable pour la propagation et l'atténuation de virus pour la production de vaccins à virus vivant. D'une manière surprenante, on a maintenant découvert qu'un passage sans cellules peut etre obtenu dans des préparations de culture de tissus appropriés, qu'un virus de varicelle extracellulaire vivant utile comme antigène peut étre obtenu en quantité, et qu'un vaccin atténué vivant contre la varicelle qui causera chez l'homme une réponse d'anticorps contre un virus de varicelle virulent sans causer les manifestations cliniques sévères de la maladie peut être préparé à partir du virus précédent. Le procédé selon l'invention comprend le passage en série de virus de varicelle virulent dans un système de culture de tissu. Ce système de culture de tissu peut entre un système apporprié quelconque pour la production de vaccin et connu comme entretenant le développement du virus, comme des souches de cellules diploïdes humaines telles que par exemple WI-38 et MRC-5, des souches de cellules diploIdes animales (rhésus foetal) et des cellules primaires d'origine simienne. Les systèmes préférés sont des systèmes de tissu testiculaire de singe et de tissu de poumon foetal humain diploïde comme WI-38 préparés par des techniques connues. La culture est mise à incuber à 30-380C, de préférence à 32-360C environ pendant 3 à 10 jours environ. La durée réelle de l'incubation varie et elle est déterminée par l'importance de la propagation virale comme indiqué par observation microscopique (par exemple CPE). L'inoculum peut titre une suspension de cellules infectées ou un virus libéré par des techniques classiques (par exemple "sonication"). quand le degré approprié d'infectivité est observé, habituellement après 10 à 40 passages en série environ du virus, les fluides d'entretien sont éliminés aseptiquement. Il y a lieu de noter que le nombre de passages en série nécessaire peut dépendre du produit isolé particulier ou de la source de virus utilisé dans la préparation du vaccin. Les feuilles de cellules sont ensuite rincées plusieurs fois avec une solution physiologique exempte de sérum comme un tampon phosphate, une solution saline (PBS) ou une solution de sels équilibrés de Hanks. Un stabilisant approprié tel qu'une composition constituée de sucrose, d'albumine, de glutamine et de phosphate (SPGA) ou l'équivalent est ajouté à raison d'un volume compris entre 5 et 30 % environ du volume du liquide initial. Les cellules infectées sont enlevées de la surface du récipient et passées dans le milieu stabilisant par des moyens appropriés (par exemple congélation-décongélation ou raclage des cellules). Les suspensions stabilisant-cellules sont ensuites rassemblées et les cellules infectées sont encore détruites par des moyens appropriés comme par traitement ultra-sonore ou"sonication'2. La suspension à cellules détruites résultante est ensuite clarifiée pour élimination des débris de cellules de manière qu'on obtienne une préparation de virus exempte de cellules. La préparation de virus résultante est ensuite subdivisée dans un récipient approprié pour distribution comme vaccin. La dose peut être comprise entre 0,1 et 2,0 cm3 environ contenant de 100 à 1000 unités infectées environ dans des ampoules scellées à la flamme, ou sous la forme d'un produit séché par congélation dans des flacons bouchés, pret pour reconstition dans de l'eau stérile. L'administration peut etre effectuée par scarification (incisions multiples) ou par des voies intradermiques ou sous cutanées. Le virus d'ensemencement pour le procédé ci-dessus est isolé dans le liquide vésiculaire provenant d'un cas clinique de varicelle et conservé dans un bouillon d'infusion de veau à -700C. Exemple 1 Vaccin vivant atténué exempt de cellules contre la varicelle préparé par 20 passages en série dans WI-38 On conduit comme suit 19 passages en série de virus de varicelle dans une culture de tissu WI-38 L'isolement initial du virus de varicelle est effectué à partir d'un échantillon de liquide vésiculaire provenant d'un enfant atteint de varicelle clinique. L'échantillon de liquide vésiculaire est recueilli dans du bouillon d'infusion de veau et conservé à -700C ; au moment de l'isolement, l'échantillon est décongelé, dilué avec un volume égal de bouillon d'infusion de veau contenant 100 mcg de néomycine et 100 mcg de polymixine par cm3 et mis à incuber pendant 30 minutes à 250C.L'échantillon est inoculé dans des cultures de cellules WI-38 bien établies d'origine diploïde foetale humaine eut mis à incuber à 320C, cela constituant le premier passage d'un groupe de sous-cultures en série. On observe une cytopathologie progressive typique de la varicelle et quand elle est suffisamment avancée (13 jours après l'inoculation), on décante les liquides se trouvant au-dessus et les cellules infectées sont récoltées par trypsinisation. Après élimination de la trypsine par centrifugation, les cellules sont remises en suspension, comptées et re-inoculées à un groupe frais de cultures de cellules WI-38, ce qui constitue le deuxième passage en série à 320C. Les passages suivants de suspensions de cellules infectées continuent de la même manière. Le passage du virus pourrait aussi être commencé à partir de suspensions de cellules infectées conservées à -700C avec des additifs protecteurs cryogéniques comme du glycérol, du sorbitol ou du DMSO, connus comme maintenant la viabilité des cellules. En utilisant une suspension de cellules infectées du 19 ème passage comme virus d'ensemencement, un vaccin vivant atténué exempt de cellules contre la varicelle est préparé comme suit Des cultures de cellules WI-38 sont préparées dans des flacons en verre roulés en utilisant du EB1.E, une préparation du commerce de milieu d'Eagle dans une solution de sels de base d'Earle contenant 10 W de sérum de foetus de veau non chauffé comme milieu de culture. Deux jours après la plantation, on se débarasse du milieu de culture et les cultures dans des flacons sont inoculées avec environ 2 x 106 cellules infectées par flacon et on introduit de nouveau 100 cm3 de EBE contenant 2 56 de sérum de veau agamma inactivé. Trois jours après l'inoculation, on ajoute encore au système 100 cm3 de EMBUE contenant 2 56 de sérum de veau agamma inactivé. L'incubation est effectuée à 320C dans un appareil oscillant. Sept jours après l'ensemencement , les cultures en flacons sont rincées deux fois avec une solution saline au tampon phosphate, 100 cm3 par rinçage. On ajoute dans chaque flacon 16 cm3 de stabilisant SPGA. Le stabilisant SPGA a la composition suivante Sucrose 74,621 grammes Phosphate monopotassique 0,45 grammes Phosphate dipotassique 1,35 gramme L-glutamate monosodique 0,956 gramme Albumine humaine (solution à 29 56 d'albumisol) 40 cm3 Eau distillée stérile q.s pour 1 litre On prépare le stabilisant en dissolvant les ingrédients dans 800 cm3 d'eau distillée stérile et on porte le volume à 1 litre avec de l'eau distillée supplémentaire. Le pH de la composition doit être compris entre 6,9 et 7,1. De la néomycine à une concentration de 50 mcg/cm3 est incorporée dans tes milieux de culture, de rinçage, d'entretien et de stabilisant.Les titrages d'infectivité de chaque récolte sont effectués dans des cultures de cellules WI-38. Après addtion du stabilisant, les contenus des flacons individuels sont congelés en coquille" dans un bain C02-alcool (-700C environ). Les contenus congelés des flacons sont rapidement décongelés avec agitation énergique, ce qui désagrège partiellement la feuille de cellules et libère les cellules dans le stabilisant fluide. On rassemble les contenus des flacons, on prélève des échantillons pour détermination de la stéralité et de l'infectivité (déterminations effectuées après "sonication" discontinue d'un petit échantillon) et on conserve le produit à -700C dans un congélateur fonctionnant mécaniquement. Trois semaines plus tard, quand les essais préliminaires de stérilité et d'infectivité sont satisfaisants, les suspensions stabilisantcellules combinées sont rapidement déconge lées et transférées à un appareil de sonication à écoulement. En variante, le stockage de la suspension combinée stabilisant-cellules à -700C peut être omis et la préparation conti nuée par le traitement ultra-sonore à écoulement et le remplissage peut être terminée en une seule opéràtion continue. L'appareil de traitement ultra-sonore à écoulement a les composants suivants 1) Disrupteur de cellule de traitement ultra-sonore et accessoires (wattmètre, corne de disrupteur à prise de 1,27 cm et accéssoire pour écoulement continu en acier inoxydable) 2) Récipient spécial en verre Pyrex de quatre litres avec enveloppe d'eau 3) Echangeur de chaleur en tube d'acier inoxydable, enroulé en hélice et chemisé 4) Bain réfrigéré et circulateur 5) Débitmètre ; et 6) Micro-pompe, à vitesse variable. Les conditions opératoires sont les suivantes 1) Puissance consommée : 120 watts comme indiqué sur l'accessoire wattmètre à ultrasons 2) Débit : 150 cm3/min (mesuré sur le débitmètre et réglé extérieurement par la micro-pompe) ; 3) Cycles de traitement ultra-sonore : quatre, par exemple volume total déplacé quatre fois à travers le sonicateur ; et 4) Température opératoire : 0-40C. L'accessoire pour écoulement continu, le récipient de retenue de quatre litres, l'échangeur de chaleur, le débitmètre et l'aspiration de la micro-pompe sont assemblés en une unité et stérilisés. Les connexions extérieures entre le bain réfrigéré en circulation et les portions chemisées de l'appareil permettent que l'appareil entier soit refroidi à 0-40C et maintenu à cette température pendant toute la sonication Après le traitement ultra-sonore qui entrasse la destruction de la quasi-totalité des cellules, le vaccin en vrac préclarifié est soumis à des prélèvements d'échantillons pour con trdle et essais de sécurité. Le vaccin restant est clarifié par filtration à.travers une bougie filtrante en verre fritté de 2,54 cm x 20,32 cm de porosité moyenne (15 microns) et recueilli dans un récipient pré-refroidi. Avant utilisation, la bougie filtrante est préparée avec un litre de stabilisant. Des échantillons sont prélevés après la clarification pour des essais de sécurité sur des animaux et un échantillon de 50 cm3 est centrifugé et le sédiment est remis en suspension dans 0,5 cm3 de stabilisant (concentré au coefficient 100) et transféré sur des lamelles de verre pour examen microscopique en ce qui concerne la présence de cellules intactes. On n'en observe aucune. Le vaccin final contre la varicelle, vivant et exempt de cellules, est distribué en quantités de 0,7 à 1,2 cm2 et congelé à -700C ou congelé à -700C dans des flacons à bouchon de caoutchouc pour préservation ultérieure par lyophilisation, en utilisant des techniques bien connues de l'homme de l'art comme celles décrites par Calnek et autres dans Applied Microbiology, nov 1970, vol 20, nO 5, pages 723-726. L'infectivité a été démontrée dans des préparations de vaccin congelées par voie humide (- 700C) ou lyophilisées pendant au moins six mois après la préparation. Une forme de dosage commode peut être préparée en reconstituant la matière lyophilisée à la quantité initiale (0,7 - 1,2 cm2) par l'addition d'eau distillée stérile et en utilisant de 0,1 à 1,0 cm3 environ de cette matière reconstituée peur administration parentérale comme vaccin contre la varicelle. La forme du vaccin congelée par voie humide qui contient de 0,7 à 1,2 cm3 de vaccin peut être décongelée avant utilisation, une dose de 0,1 à 1,0 cm3 environ du vaccin étant administrée par voie parentérale. Exemple 2 Vaccin vivant atténué exempt de cellules contre la varicelle préparé par 15 passages en série dans WI-38 Un vaccin vivant atténué exempt de cellules contre la varicelle est préparé en utilisant sensiblement le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, à ceci près qu'on effectue un total de 15 passages dans une culture de tissu WI-38. Exemple 3 Vaccin vivant atténué exempt de cellules contre la varicelle préparé par 15 passages en série dans WI-38 Un vaccin atténué exempt de cellules contre la varicelle est préparé en utilisantli8nioeeomepnsatoire décrit décrit dans les exemples 1 et 2, à ceci près qu'auprès six passages en série à 320C, une nouvelle série de passages à 360C est commencée au septième passage et continuée à 360C jusqu'au quatorzième passage inclus pour préparation d'un vaccin au quinzième passage. Exemple 4 Vaccin vivnt atténué exempt de cellules contre la varicelle préparé par 20 nassazes en série dans lI-38 Un vaccin vivant atténué exempt de cellules contre la varicelle est préparé en utilisant sensiblement le mode opératoire décrit dans les exemples 1 et 3, à ceci près qu'après le sixième passage à 320C, une nouvelle série de passages à 360C est commencée au septième passage et continuée à 36 C jusqu'au dix-neuvième passage inclus pour préparation d'un vaccin au vingtième passage. Exemple 5 Vaccin vivant atténué exempt de cellules contre la varicelle préparé par 30 passapes en série dans Wl-38 Un vaccin vivant atténué exempt de cellules contre la varicelle est préparé en utilisant sensiblement le mode opératoire décrit dans les exemples 1 et 3, à ceci près qu'après six passages en série à 320C, une nouvelle série de passages à 360C est commencée au septième passage et continuéé à 360C jusqu'au vingt-neuvième passage inclus pour préparation d'un vaccin au trentième passage. Exemple 6 Vaccin vivant atténué exempt de cellules contre la varicelle préparé par 40 passages en série dans WI-38 Un vaccin vivant atténué exempt de cellules contre la varicelle est préparé en utilisant sensiblement le mode opératoire décrit dans les exemples 1 et 3, à ceci près qu'après six passages- à 320C, une nouvelle série de passages à 360C est commencée au septième passage et continuée à 360C jusqutau trente-newmepessage inclus pour préparation d'un vaccin au quarantième passage. Exemple 7 Vaccin vivant atténué exempt de cellules contre la varicelle préparé par 20 passages en série dans une culture de tissu de cellules testiculaires de singe. Un vaccin vivant atténué exempt de cellules est préparé en utilisant sensiblement le mode opératoire décrit dans l'Exemple 1, à ceci près qu'une culture connue de tissu de cellules testiculaires de singe est utilisée à la place du système de culture WI-38, avec un total de 20 passages en série. Exemple 8 Vaccin vivant'attenue exemnt de cellules contre la varicelle préparé par 20 passages en série dans une culture de tissu de cellules testiculaires de singe Un vaccin vivant atténué exempt de cellules contre la varicelle est préparé en utilisant sensiblement le mode opératoire décrit dans l'exemple 4, à ceci prcs qu'tune culture connue de tissu de cellules testiculaires de singe est utilisée à la place du système de culture sII-38, avec un total de 20 passages en série. R~VlNDICATIONS 1. - Un procédé de préparation d'un virus de varicelle vivant atténué, exempt de cellules, utile coite antigène dans un vaccin, qui suscitera chez lthomme une réponse d'anticorps contre un virus de varicelle virulent sans causer les manifestations cliniques sévères de la maladie, qui comprend le passage en série du virus virulent à 30-3SOC dans une préparation de culture de tissu choisie parmi des souches de cellules diploïdes humaines et animales et des cellules primaires d'origine simienne un nombre de fois suffisant pour atténuer le virus, suivi d'une séparation entre le virus atténué et la cellule infectée par traitement ultra-sonore en présence d'un stabilisant. 2. - Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la température est de 320C. 3. - Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la température est de 360C. 4. - Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la préparation de culture de tissu est constituée de souches de cellules diploïdes humaines. 5. - Un procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la souche de cellules diplordes humaines est du tissu de poumon de foetus humain. 6. - Un procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le tissu de poumon de foetus humain est du WI-38. 7. - Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la préparation de culture de tissu est constituée de cellules primaires d'origine simienne. 8t - Un procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les cellules primaires d'origine simienne sont du tissu testiculaire de singe. 9. - Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la préparation de culture de tissu est constituée d'une souche de cellules diploides animales. 10. - Un procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la souche de cellules diploTdes animales est du tissu foetal de rhésus. 11. - Un procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le stabilisant est de SPGA. 12. - Un vaccin vivant atténué exempt de-cellules contre la varicelle comprenant comme ingrédient essentiel une quantité immunologiquement efficace d'un virus de varicelle vivant atténué exempt de cellules préparé par un procédé comprenant le passage en série du virus virulent à 30-380C dans une préparation de culture de tissu choisie parmi des souches de cellules diploïdes humaines et animales et des cellules primaires d'origine simienne un nombre de fois suffisant pour atténuer le virus, suivie d'une séparation entre le virus atténué et la cellule infectée par traitement ultra-sonore en présence d'un stabilisant. 13 - Un vaccin selon la revendication 12, caractérisé en ce que la température est dé 32 C. 14 - Un vaccin selon la revendication 12, caractérisé en ce que la préparation de culture de tissu est constituée de souches de cellules diploSdes humaines. 15 - Un vaccin selon la revendication 14, caractérisé en ce que la souche de cellules diplordes humaines est du tissu de poumon de foetus humain. 16 - Un vaccin selon la revendication 15, caractérisé en ce que le tissu de poumon de foetus humain est du WI-38. i7 - Un vaccin selon la revendication 16, caractérisé en ce que le stabilisant est du SPGA. 18 - Un vaccin contre la varicelle selon la revendication 12, caractérisé en ce qutil est sous une forme congelée par voie humide. 19 - Un vaccin contre la varicelle selon la revendication 12, caractérisé en ce qutil est sous une forme lyophilisée. 20 - Un procédé pour obtenir l'immunité contre la varicelle, qui comprend l'administration du vaccin contre la varicelle selon la revendication 12.