FR 2332259 A1 19770617 FR 7624253 A 19760809 La présente invention concerne un procédé de synthèse des peptides et plus précisément des résines-peptides qui sont utiles pour la fabrication de peptides biologiquement actives. L'invention concerne également ces peptides en tant que nouveaux compo sés et des procédés pour leur fabrication. I1 a longtemps été connu que certaines substances naturelles biologiquement actives peuvent être obtenues à partir des glandes des animaux et ces substances ainsi obtenues étaient employées pour le traitement de maladies chez les gens. L'une de ces substances est l'hormone adrénocorticotropique habituellement désignée ACTH, qui pendant de nombreuses années a été obtenue à partir des glandes pituitaires des animaux, plus spécialement les glandes pituitaires des porcs et des bovins. L'obligation de collecter les glandes pituitaires relativement petites des animaux au moment où les animaux sont abattus, le nombre limité de ces glandes disponibles et les procédés de purification intense nécessaires pour produire des peptides qui peuvent être administreesà des hommes, sont des désavantages importants pour la préparation des hormones peptidiques naturelles à partir des glandes d'ani-maux. Durant de nombreuses années la technique a patiemment attendue la découverte de méthodes pratiques et de composés qui permettraient une synthèse commerciale de ces peptides telles que l'hormone ACTH à partir d'une origine autre qu'animale. Jusqu'à présent aucun composé ni méthode n'ont été découverts. L'hormone adrénocorticotropique (ACTH) a été identifiée comme ayant la structure suivante: Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 -Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-VaLys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-A1a-Glu- 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 -Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 où les abréviations Phe, elu, Leu, etc. constituent les différents groupements d'acides aminés dans la channe peptidique et les nombres représentent les positions des groupements d'acides aminés dans la channe selon la nomenclature acceptée. Voir la publication de Riniker dans Nature New Biology, 235, 114-115, (1972). I1 est un but principal de la présente invention de trouver des résines-peptides~intermédiaires à partir desquelles des peptides biologiquement actives peuvent être réalisées, plus spécialement des peptides ayant l'activité de l'hormone adrénocorticotropique, et pour réaliser des procédés efficaces pour la fabrication commerciale de ces peptides. D'autre buts spécifiques apparaitront aisément à la lumière de la description suivante: I1 existe certaines méthodes de laboratoire pour la synthèse de certaines peptides à channe d'acides aminés relativement courtes. Ces procédés sont décrits dans l'article de R.B. Merrifield intitulé "Solid Phase Peptidesynthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide" aux pages 2149 à 2154 dans le Vol. 85 de "Journal of the American Chemical Society" (1963) et dans la publication intitulée "Solid Phase Peptide Synthesis" par John W. Stewart et Janis D. Young, mais ces publications ne décrivent pas des résines-peptides comprenant des groupements d'acides aminés enchaînés selon la séquence décrite et du type décrit dans la présente invention. La synthèse totale de la présente invention comporte de nombreuses réactions avec de nombreuses résinespeptides intermédiaires qui sont formées et la description décrira ce procédé étape par étape en donnant la formule de structure, la description générale et des exemples spécifiques. D'une manière générale, une synthèse en phase solide est employée où une résine de polystyrène insoluble est chlorométhylée. Cette résine est couplée avec une première phényle alanine ensuite de l'acide glutamique et d'autres acides aminés de la channe, dans la séquence prescrite, en employant un système protecteur ou libérateur de l'amine active et comprenant des groupements carboxyles. Après le couplage du dernier acide aminé dans la channe, la résine est séparée de la chaI ne peptidique et les derniers groupements protecteurs sont enlevés: Préparation d'une résine insoluble La chlorométhylation de la résine est décrite par la réaction suivante: dans , dan la formule ci-dessus est la résine polystyrène insolu- ble qui est fabriquée sous forme de perles par la polymérization catalytique du styrène et du divinylbenzène.La résine est chlorométhylée en employant du chlorométhyl méthyl éther et un catalyseur de chlorure stannique. La réaction est illustrée par l'exemple sui vant: EXEMPLE 1 Un kg d'une résine de polystyrène, à dimensions de perles de 0,03-0,07 mm, réticulé avec du divinylbenzène à 2% était lavée avec trois volumes de chlorométhylène de deux litres. Les fines particules étaient séparées du chlorure de méthylène à chaque fois par drainage de celui-ci à la base. La résine était lavée avec des volumes de deux litres des solvants suivants par mise en suspension, agitation durant 10 minutes et filtration sur un Buchner à filtre en verre frité: deux volumes de tétrahydrofurane, deux volumes d'eau, un volume d'hydroxyde de sodium 1N, deux volumes d'eau, deux volumes de diméthylformamide, deux volumes de dioxane et trois volumes de méthanol. Cette résine lavée était séchée sous vide à 60 OC. Cing cents grammes de cette résine de polystyrène lavée étaient agités avec cinq litres d'une solution de chlorométhyl méthyl éther à température ambiante et ensuite la température était abaissée jusqu'à 0-50C au moyen d'un bain d'eau glacée. 75 grammes de chlorure stannique anhydre dans 925 ml d'une solution de chlorométhyl méthyl éther à la température de la glace étaient ajoutés et le mélange agité dans le bain de glace durant deux heures. La résine était filtrée sur un Buchner à filtre en verre frité et était ensuite lavée avec des volumes de deux litres des solvants suivants: 25% d'eau dans le dioxane, 25% d'acide chlorhydrique 2N dans le dioxane, de l'eau et deux fois avec du méthanol.La résine lavée était séchée sous vide à 45 - 50 OC. Par ce procédé la teneur habituelle en chlorure se situe entre 0,7 à 1,0 milli-équivalent par grammes. Estérification de la phénylalanine à la résine de polystyrène. Selon la synthèse de l'invention, la phénylalanine est d'abord liée à la résine de polystyrène. Ceci est décrit dans la réaction suivante: Réaction de couplage No.l. où Bz est une résine de polystyrène, BA est une base convenable telle que la triéthylamine, la diisopropylamine, la diisopropyléthylamine, ou un sel de métal alcalin, et P est un groupement protecteur d'acide aminé et de préférence est un groupement de butyloxycarbonyle tertiaire mais peut être par exemple un groupement amyloxycarbonyle (AMOC) ou o-nitrophénylsulfényle (NPS). Ainsi qu'il est montré dans la formule ci-des- sus. la tert-butyloxy-l-phénylalanine est fixée à la résine chlorométhylée en présence d'un accepteur d'acide. Cette réaction est décrite dans l'exemple II suivant. EXEMPLE II Cinquante grammes de résine de polystyrène chlorométhylée préparée comme décrit ci-dessus ayant une teneur en chlore de 0,74(meq) par gramme (37 mey de chlore) et 19,6 grammes de BOC-l-phénylalanine (74 meq), étaient agités dans 150 ml d'alcool absolu et ensuite 9,77 ml de triéthylamine (72 meq) étaient ajoutés et le mélange chauffé à reflux en agitant durant 24 heures. Le mélange était refroidi, filtré sur un Buchner à filtre en verre frité et lavé sur le Buchner avec deux volumes de 500 ml des solvants suivants: deux fois avec de l'alcool dénaturé 3A, deux fois avec du dioxane, deux fois avec de l'alcool dénaturé 3A, deux fois avec de l'eau, deux fois avec du méthanol. La résine était séchée sous vide à 40 à 450C. L'analyse de détermination de l'azote montrera des valeurs variant entre 0,50 à 0,70 meq par gramme. Lorsque le groupement protecteur BOC était enlevé avec de l'acide trifluoroacétique ainsi qu'il est décrit ci-après et la résine titrée pour déterminer les groupements aminés terminaux, il a été trouvé que ces échantillons approchaient 0,38 meq par gramme. Enlèvement des groupements protecteurs La résine-peptide obtenue est appelée composé No. 1. La libération de la fonction amine de la phénylalanine est réalisée par enlèvement du groupement protecteur en employant un acide convenable tel que l'acide trifluoroacétique ou l'acide chlorhydrique. Le sel d'amine résultant est ensuite neutralisé par traitement avec une base organique forte. Un exemple spécifique de ce procédé est donne dans l'exemple 3. EXEMPLE 3 Un échantillon de 25 grammes d'une résine BOC-phénylalanine préparée dans l'exemple 2 était placé dans un récipient d'une dispositif de synthèse des peptides. L'échantillon était lavé deux fois avec des volumes de 125 mîde chlorure de méthylène durant deux minutes à chaque fois, 125 ml d'une solution d'acide trifluroacétique à 50 % dans du chlorure de méthylène étaient ajoutés et le mélange réagit durant 30 minutes. Après filtration, la résine était lavée avec trois volumes de 125 ml de chlorure de méthylène, deux volumes de méthanol et trois volumes de chloroforme, chaque traitement durant deux minutes. La neutralisation était réalisée au moyen d'une réaction de cinq minutes avec 125 ml d'une solution à 10% de triéthylamine et de chloroforme. La résine était alors lavée trois fois avec 125 ml de chloroforme et trois fois avec 125 ml de chlorure de méthylène. Couplage avec de l'acide glutamique Dans la reactlon cl-aessus LA represente un agent de couplage qui de préférence est la dicyclohexylcarbodiimide (DCC) mais peut être tout agent de couplage qui forme des liaisons peptidiques tel que les diimides, les azides, les esters actifs, et les anhydrides. Le terme Bz représente un grou pement benzyle, ou un dérivée du groupement benzyle, tel que par exemple les groupements, p-méthoxybenzyle, p-chlorobenzyle, p-nitrobenzyle, ou benzhydryle. Les symboles OR , BA, P, CA et Bz ont les significations respectives décrites ci-dessus ou ailleurs dans la description et les revendications. Etant donné que la formule donnée ci-dessus commence à être encombrante, elle peut être réécrite de la façon suivante: où Phe représente le chainon phényle/Glu représente le chainon acide glutamique et P et Bz sont définis précédemment. Cette nomenclature simplifiée sera utilisée ci-après pour toutes les réactions. En réalisant la réaction P,Bz et l'acide glutamique peuvent être combinés comme dans le cas du BOC-1- g-benzyl- glutamate et ceci peut être ajouté à la résine-phénylalanine libérée et le couplage peut être réalisé par addition de DCCY Ce couplage est ensuite suivi d'une séparation du groupement protecteur comme il vient d'être décrit en se référant à la résine peptide-phénylalanine. Le produit obtenu après cette séparation a la formule suivante: (Composé No. 2) I1 est admis que cette résine-peptide a été réalisée pour la première fois dans la présente invention et elle constitue un chainon important pour la synthèse de l'hormone ACTH. En outre, on comprendra qu'il est important que la réaction de couplage soit complète et il a été trouvé par l'essai à la ninhydrine par E. Kaiser, R. Colescott, C. Bossinger et P. Cook, dans Anal. Biochem. 34, 595-98 (1970) qu'il est possible de déterminer lorsque la réaction de couplage est suffisamment complète. Si l'essai à la ninhydrine est négatif on peut procéder à la libération de la résine-peptide et passer à la réaction de couplage suivante. Si l'essai à la ninhydrine est pasitif, l'étape de couplage doit être répétee jusqu'à ce que l'essai à la ninhydrine soit finalement négatif. Ce qui suit sont des exemples spécifiques de ce couplage de l'acide glutamique: EXEMPLE 4 A la résine-phénylaline libérée comprenant 10,7 meq de groupements aminés était ajoutée une solution de 15 millimoles ( un excès d'environ 50%)de BOC-l-r-benzyl-glutamate dans 100 ml de chlorure de méthylène. Après deux minutes une solution de 15 meq de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) était ajoutée et le mélange agité durant 45 minutes. Le produit était filtré et lavé deux fois à chaque fois avec des volumes de 125 ml de chloroforme et de chlorure de méthylène. L'essai à la ninhydrine était réalisé sur un échantillon de 3-5 mg de ce produit de réaction de la résine-peptide et il a été négatif. La résine était ensuite libérée comme décrit dans l'exemple 3. EXEMPLE 4A Deux gammes de résine-phénylalanine étaient libérés et neutralisés comme décrit précédemment. Trois millimoles de NPS-l-g-benzyl glutamate dissous dans 25 ml de chlorure de méthylène étaient ajoutés suivi par trois millimoles de dicyclohexylcarbodiimide. Le mélange était agité durant 1 heure, filtré et lavé avec deux volumes de chlorure de méthylène, deux volumes de méthanol et trois volumes de chlorure de méthylè- ne. EXEMPLE 4 B Au lieu du groupement NPS danslqxemple 4A on peut employer un groupement AMOC dans les mêmes quantités et des résultats sensiblement identiques peuvent être espérés. EXEMPLE 4 C Au lieu de BOC-1- t-benzylglutamåte on peut employer 15 millimoles de BOC-1- -p-bromobenzy Ig lutamate et la réaction est réalisée de la même façon que dans l'exemple 4. Dans ce cas il est obtenu un produit où le groupement Bz est un groupement p-bromobenzyle. Après libération et neutralisation on obtient un composé 2 identique à celui obtenu dans l'exemple 4. EXEMPLE 4D Dans l'exemple 4 lé groupement Bz est un groupement benzyle. On peut le remplacer par l'un quelconque des différents groupements suivants: p-méthoxybenzyle, p-chlorobenzyle, p-nitrobenzyle ou benzylhydryle dans le composé BOC-l-i-benzyl- glutamate, et le procédé reste identique à celui de l'exemple 4 pour obtenir un produit de réaction où le groupement Bz est un groupement p-méthoxybenzyle, p-chlorobenzyleZ p-nitrobenzyle, ou benzhydryle. Après libération et neutralisation il est obtenu dans chaque cas le composé 2, c'est-à-dire le même que celui obtenu dans l'exemple 4. Le tableau suivant donne la liste des séries d'acides aminés fixés dans chaque réaction 2 à 39 indiquant la position de la chaine où la fixation est réalisée et indiquant le réactif employé avec les groupements protecteurs carboxyles préférés. TABLEAU I Numéro de Position Amino Acide Groupements Amino Acides la réaction No à fixer avec groupements protec teurs préférés 2 38 acide glutamique BOC-1- > -benzyl glutama te 3 37 leucine BOC-l-leucine hydrate 4 36 proline BOC-l-proline 5 35 p-hénylalanine BOC-l-phénylalanine 6 34 alanine BOC-l-alanine 7 33 acide glutamique BOC-1- & benzyl-gluta- mate 8 32 alanine BOC-l-alanine 9 31 sérine BOC-O-benzyl-l-sérine 10 30 acide glutamique BOC-l-g-benzi glutamate 11 29 acide aspartique BOC-1- F -benzyl-asparta- te 12 28 glutamique acide BOC-1- &gamma; ;-benzyl glutamate 13 27 alanine BOC-l-alanine 14 26 glycine BOC-glycine 15 25 asparagine BOC-l-asparagine-p-nitro phénylester 16 24 proline BOC-l-proline 17 23 tyrosine BOC-l-tyrosine (20% dimethylformamide pour mise en solution 18 22 valine BOC-l-valine 19 21 lysine BOC-2-chlorocarbo-benzyl oxy-1-lysine (10% dimé thylformamide pour mise en solution.) TABLEAU I (suite) Numéro de Position Amino Acide Groupements Amino Acides la réaction No à fixer avec groupements protec teurs préférés 20 20 valine BOC-l-valine 21 19 proline BOC-l-proline 22 18 arginine BOC-l-tosylarginine (20% dimethylformamide pour mise en solution) 23 17 arginine BOC-l-tosylarginine (20% diméthylformamide pour mise en solution) 24 16 lysine BOC-2-chlorocarbo benzyloxy-l-lysine (10% diméthylformamide pour mise en solution) 25 15 lysine BOC-2-chlorocarbo benzyloxy- 2 -lysine (10% diméthylformamide pour mise en solution) 26 14 glycine BOC-glycine 27 13 valine BOC-l-valine 28 12 proline BOC-l-proline 29 11 lysine BOC-2-chlorocarbo benzyloxy-l-lysine (10% dimethylformamide pour mise en solution) 30 10 glycine BOC-glycine 31 9 tryptophane BOC-l-tryptophane (58 diméthylformamide pour mise en solution) 32 8 arginine BOC-l-tosylarginine (20% diméthylformamide pour mise en solution) 33 7 phenylalanine BOC-l-phénylalanine (pour mise en solution) 34 6 histidine BOC-im-carbobenzyloxy l-histidine 35 5 acide glutamique BOC-1- t-benzylglutamate TABLEAU I (suite) Numéro de Position Amino Acide Groupement Amino Acides la réaction No à fixer avec groupements protec teurs ~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~ préféras 36 4 méthionine BOC-l-méthionine 37 3 sérine BOC-O-benzyl-l-sérine 38 2 tyrosine BOC-l-tyrosine (20% diméthylformamide pour mise en solution) 39 1 sérine BOC-O-benzyl-l-sérine Ainsi qu'il a été décrit en se référant à la fixation de l'acide glutamique dans la réaction No. 2, chaque réaction successive pour fixer un autre groupement d'acide aminé comporte le même procédé où la résine-peptide préparée auparavant est couplée avec un autre groupement d'acide aminé tout en étant protégée par un groupement protecteur, ensuite la peptide couplée est séparée du groupement protecteur et neutralisée.Plus spécifiquement les étapes suivantes peuvent dans le cas de chaque réaction être comme suit: Couplage: 15 millimoles de l'acide BOC-aminé convenable (0,43 équivalents en excès dans 100 ml de chlorure de méthylène) 15 millimoles de dicyclohexylcarbodiimide (agent de couplage) dans 15 ml de chlorure de méthylène- 40 minutes de durée de réaction 2 x 125 ml - lavage au chloroforme - 2 minutes chaque fois 2 x 125 ml chlorure de méthylène - deux minutes chaque fois. Séparation des groupement protecteur: 2 x 125 ml-lavages au chlorure de méthylène deux minutes chaque fois. traitement à l'acide trifluoroacétique à 50 % dans du chlorure de méthylène- 5 minutes avec 125 ml traitement à l'acide trifluoroacétique à 50% dans du chlorure de méthylène - 25 minutes à 125 ml 3 x 125 ml - lavages au chlorure de méthylène deux minutes chaque fois. 2 x 125 ml - lavages au méthanol - 2 minutes chaque fois 3 x 125 ml - lavages au chloroforme - deux minutes chaque fois. Neutralisation: 2 x 125 ml - 10% de triéthylamine dans le chloro forme - 5 minutes chaque fois. 4 x 125 ml-lavages au chloroforme - deux minutes chaque fois. Les procédés pour réaliser le couplage, la séparation du groupement protecteur et la neutralisation dans chacune des réactions 3 à 39 peuvent être identiques comme il a été décrit précédemment en rapport avec la réaction 2 à l'exception que les changements suivants sont apportés. Ainsi qu'il est décrit précédemment le composé No. 2 qui est le produit de la réaction No. 2 (après libération et neutralisation) est: le composé No 3 est le résultat de la réaction No. 3 est: le composé No. 4 est le produit de la réaction No. 4 : le composé No. 5 est le produit de la réaction No. 5: Cette série se poursuit jusqu'à la fixation de 1' Asn en position 25. A ce moment le--couplage au moyen de l'agent DCC ne peut être employé à cause d'une réaction secondaire qui détruit une partie de l'asparagine de sorte qu'à cette position l'acide aminé est couplé sous forme d'un "ester actif". La résine-peptide séparée de ses groupements protecteur est agitée avec un ester actif d'asparagine par exemple le p-nitrophényl ester, i1ortho-nitrophényl ester ou le pentachlorophényl ester. Ce couplage est décrit dans l'exemple 5, EXEMPLE 5 La résine-peptide représentée par le composé No.14 obtenu par la réaction No 14 ( après libération et neutralisation) était lavée avec trois volumes de diméthylformamide durant deux minutes chaque fois, Trois millimoles de BOC-l-asparagine-p nitrophényl ester dissous dans 15 ml de dimethylfermamide étaient agités avec la résine durant 16 heures,ensuite lavés avec trois volumes de diméthylformamide, trois volumes de méthanol et trois volumes de chlorure de méthylène. EXEMPLE 5 A Au lieu du p-nitrophényl ester de l'exemple 5, soit l'ortho-nitrophényl ester soit le penta-chlorophényl ester peuvent être employés et la réaction est réalisée comme décrit dans l'exemple 5 pour réaliser le couplage de l'asparagine. Le couplage en position 25, par l'ester actif est suivi par l'enlèvement des groupements protecteurs et la neutralisation habituels et on obtient une résine-peptide No. 15 qui est représentée par la formule suivante: Dans les réactions Nos. 17 et 38, aux positions 23 et 2, respectivement, où la tyrosine est fixée il est préférable de n'employer aucun groupement protecteur sur le groupement phénolique hydroxylé de la tyrosine ou on peut employer un groupement protecteur benzyle ou un dérivé d'un groupement benzyle. Le symbole Y signifie qu'il n'y a pas de groupements protecteursou qu'il y a un groupement benzyle ou un dérivé du benzyle. La formule de structure du composé No 17 est comme suit: Dans la réaction No. 19, dans la position No. 21 où la lysine est fixée, il est préférable d'employer, un groupement protecteur de l'epsilon amine, le groupement 2-chlorocarbobenzyloxy ( C1-CBZ) mais on peut également employer un groupement carbobenzyle (CBZ), un groupement bromocarbobenzyloxy, un groupement 2, 4-dichlorocarbobenzyloxy, ou un groupement trifluoroacétyle ( TFA). Le symbole V indique que l'agent protecteur Y est l'un des groupements cités ci-dessus. Ce protecteur Y est employé également pour fixer la lysine dans chacune des réactions No. 24,25 29 aux positions No. 16, 15 et ll respectivement. La formule de structure du composé Nos.. 19 formée par la réaction No. 19 est comme suit: Pour le couplage de l'acide aminé arginine dans la réaction No. 22 à la position 18, il est préférable d'employer un agent protecteur du groupement tosyle (p-toluène sulfonyle) mais on peut également utiliser un groupement nitré, et dans la formule, on emploie le symbole T pour représenter le groupement tosyle ou nitré.Le groupement de protection T est également employé pour joindre l'arginine dans la réaction 23 en position 17, et dans la réaction 32 en position 8. La formule de structure pour le composé No. 32 formé dans la réaction No. 22 est comme suit: Pour le couplage de l'histidine dans la réaction No. 34 dans la position 6, il est préférable d'employer un groupement carbobenzyloxy (CBZ) mais on peut également utiliser les groupements protecteurs tosyle, dinitrophényle, benzyle, un dérivé benzylique ou aucun groupement protecteur. Le symbole W est employé pour indiquer que soit aucun groupement protecteur n'est utilisé soit un de ceux mentionnés ci-dessus. Les symboles T, Y, Vet W ont les significations données ci-dessus ou ailleurs dans la description. La formule de structure du composée No. 34 formée par la réaction No. 34 est comme suit: Après fixatIon de la sérine dans la réaction 39, dans la position No 1 selon le procédé et la séquence décrite, ci-dessus et séparation du groupement protecteur et neutrisation de la résine peptideoeuplée, on obtient le composé No. 39 qui a la formule: Après chaque réaction de couplage et avant la libéra tion de la résine-peptide, il est préférable d'appliquer I' essai à la ninhydrinee qui -n'est pas toujours négatif ce qui nécessitait une répétition de la réaction de couplage dernièrement réalisée. Par exemple, il a été trouvé que lorsque 25 grammes de BOC-phénylalanine -résine étaient soumis aux réactions 2 à 39 du tableau I le composé résultant No 39 (après libération neutra- lisation et séchage sous vide) pesait 53,0 grammes. Après la synthèse de la résine-peptide et la fixation de tous les groupements d'amino-acides voulus dans la séquence souhaitée, la résine-peptide, après les étapes habituelles de separation des groupements protecteurs et de neutralisation peut être traiteepour enlever la résine et le restant des groupements protecteurs. La résine est la plupart de tous les groupements protecteurs peuvent être enlevés de façon convenable par un traitement à l'acide fluorhydrique.La formule de cette réaction de séparation est comme suit: Réaction 40 où V est autre que TFA. Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 -Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu- 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 -Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe 31 32 33 34 35 36 37 38 39 qui sera appelé composé 40. Quand V dans la formule de réaction représent TFA, le produit de la réaction est: TFA Sernlyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Yal-Gly- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 -Asp-Glu-Ser-Ala-Gu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 (Composé 41) L'exemple 6 suivant donne une illustration spécifique de la réaction de séparation mentionnée ci-dessus où V est un groupement autre que TFA. EXEMPLE 6 Deux grammes d'un composé 39 étaient placés dans un récipient Kel-F avec 2 ml d'anisole et 10 ml d'acide fluorhydrique étaient ajoutés par distillation. Le mélange était agité à 00C durant 1 heure. L'acide fluorhydrique était enlevé par distillation sous vide, le résidu etait lavé quatre fois avec de l'acétate d'éthyle suivi d'une extraction avec de l'acide acétique glacial. L'extrait à l'acide acétique était lyophilysé pour donner 0,86 grammes d'une poudre blanche. Ce procédé enlève la peptide de la résine et enlève également tous les groupements protecteurs des acides aminés. L'exemple 7 suivant donne une illustration spécifique de la réaction de séparation citée ci-dessus où V représente le groupement TFA. EXEMPLE 7 Deux grammes de résine-peptide ACTH ci-dessus étaient disposés dans un récipient Kel-F avec deux ml d'anisole et 10 ml d'acide fluorhydrique anhydre étaient ajoutés par la distillation. Le mélange était agité à OOC durant une heure. L'acide fluohydrique était- enlevé par distillation sous vide, le résidu était lavé quatre fois avec de l'acétate d'éthyle suivi par extraction à l'acide acétique glacial. L'extrait à l'acide acétique glacial était lyophilisé pour donner 867 mg d'une poudre blanche. Ce procédé enlève la peptide de la résine et sépare également tous les groupements protecteurs les acides amenés bifonctionnels à l'exception du groupement protecteur trifluoroacétyle sur les chainons lysine. Néanmoins ce produit est appelé peptide TFA-ACTH. La peptide TFA-ACTH était soumise à un traitement à l'hydroxyde d'ammonium pour enlever les groupements trifluoroacétyle des chainons lysines. 380 mgr de TFA-ACTH étaient ajoutés avec 100 ml d'hydroxyde d'ammonium 4 N contenant 0,1% de mercap- toUthanol durant 16 heures. Ceci crée une ACTH brute qui avait une activité de 40 unités par mg lorsqu'elle était essayée selon le procédé de 1'U.S.P. I1 a en outre été découvert une synthèse d'une hormone active de 1'ACTH d'une séquence décrite par T.H. Lee, A.B. Lerner et V. Buettner-Janusch, L.J. Biol. Chem. 236,2970 (1961) (séquence glutamine) qui, il est admis, est une amélioration par rapport à la séquence asparagine de l'hormone ACTH dont la synthèse a été décrite ci-dessus. Cette peptide est plus facile à purifier et est plus stable en milieu alcalin que la peptide comportant la séquence asparagine. Cet synthèse comporte le couplage d'un acide aminé différent au moment de certaines réactions de couplage. Ces différences seront plus aisément comprises en se référant à la table II suivante qui décrit les réactions de couplage de la synthèse de la séquence de la glutamine lorsqu'on utilise les groupements protecteurs préférés indiqués. TABLEAU II Numéro de Position Amino Acide Groupements d'amino acides réaction No à fixer avec les groupements protec 3- ~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~ teurs préférés 10 30 glutamine BOC-l-glutamine-p-nitrophény- lester 11 29 acide aspar- BOC-1-g -benzyl aspartate tique 12 28 acide gluta- BOC-1- t -benzyl glutamate mique 13 27 glycine BOC-glycine TABLEAU II (suite) Numéro de Position Amino Acide Groupements d'amino acides réaction No à fixer avec les groupements pro tecteurs tecteurs préférés 14 26 alanine BOC-l-alanine 15 25 acide aspartique BOC-1- 2-benzyl aspartate 16 24 proline BOC-l-proline 17 23 tyrosine BOC-1-tyrosine (20% dimé thylformamide pour mise en solution) 18 22 valine BOC-l-valine 19 21 lysine BOC-e-trifluoroacétyle-l lysine (5% diméthylforma mide pour mise en solution) 20 20 valine BOC-l-valine 21 19 proline BOC-l-proline 22 18 arginine BOC-l-tosylargimine (20% diméthyl-formamide pour mise en solution) 23 17 arginine BOCtl-tosylarginine (20% diméthylformamide pour mise en solution) 24 16 lysine BOC-e-trifluoracétyl-l- lysine (5%diméthyl-forma mide pour mise en solution) 25 15 lysine BOC-e-trifluoracétyl-l- lysine (5% diméthylformami de pour mise en solution) 26 14 glycine BOC-glycine 27 13 valine BOC-l-valine 28 12 proline BOC-l-proline 29 11 lysine BOC-e-trifluoracétyl-l- lysine (5% dimethylforma- mide pour mise en solution) 30 10 glycine BOC-glycine 31 9 tryptophane BOC-l-tryptophane 32 8 arginine BOC-l-tosylarginine (20% diméthylformamide pour mise en solution) 33 7 phénylalanine BOC-l-phénylalanine TABLEAU II Numéro de Position Amino Acide Groupements d'amino acides réaction No à fixer avec les groupements protec teurs teurs préférés 34 6 histidine BOC-Im-carbobenzyloxy-l-hi- stidine 35 5 acide glutami- BOC-1-t -benzylglutamate que 36 4 méthionine BOC-l-méthionine 37 3 sérine BOC-O-benzyl-l-sérine 38 2 tyrosine BOC-l-tyrosine (20% diméthyl formamide pour mise en solu tion 39 1 sérine BOC-O-benzyl-1-sérine * Les réactions 2 à 9 aux positions 39 à 31 sont précisément identiques à celles données dans le tableau No. I. Ainsi qu'on peut le voir dans le tableau ci-dessus, la synthèse améliorée selon la présente invention diffère en ce que des- groupements aminés différents sont fixés aux positions 30,27, 26 et 25 dans la chaîne des acides aminés. Les composées 1 à 9 de cette synthèse sont les mêmes que les composés 1 à 9 de la synthèse décrite précédemment, mais dans la réaction No. 10 ou Gln remplace Glu, le composé résultant sera appelé 10 A et a la formule suivante: bans la réaction No, 13, ou Gly remplace Ala, le composé résultant appelé composé 13A a la formule: ,dans la réaction No. 14, ou Ala remplace Gly la résine-peptide résultante appelée 14A a la formule suivante: ,dans la réaction No 15 ou Asp remplace Asn, la résine-peptide résultante appelée composé 15A a la formule suivante:: et la réaction de couplage finale No 39 donne une résine-peptide appelée composé 39 A et a la formule: Lorsque le composé 39A (ou V représent TFA) est soumis à un traitement à l'acide fluorhydrique il devient: -Asp-Gln-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 (composé 41A) et lorsqu'il est traité avec une base aqueuse convenable telle que la pipéridine ou l'hydroxyde d'ammonium pour enlever les groupements TFA, il devient:: Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 -Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gly-G1u-Asp-G1n- 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 -Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe 31 32 33 34 35 36 37 38 39 (Composé 42) Dans le cas où V représente un autre groupement que TFA, et lorsque le composé 39A est soumis à un traitement à l'acide fluorhydrique, ce composé devient un composé 42 ayant la structure donnée ci-dessus Le compose 42 peut être purifié comme il est décrit en se référant au composé 40 et il a été trouvé qu'il avait une activité biologique similaire à celle de l'hormone ACTH. EXEMPLE 8 Dans cet exemple spécifique, est derritela synthèse sur une échelle moyenne, du composé 42 et sa purification pour obtenir une hormone ACTH biologiquement efficace. 25 grs de BOC-phénylalanine-résine préparés selon la réaction No. I décrite précédemment, étaient disposés dans un récipient de réaction pour la synthèse de la peptide connuesous la désignation commerciale Schwarz-Mann, Inc. de Orangeburg New York. Cet appareil peut être utilisé pour une synthèse automatique des peptides. La résine employée avait une équivalence de 0,397 meq/gm et un total 9,927 milliéquivalents.Les systèmes de couplage, de séparation des groupements protecteurs et de neutralisation étaient comme suit: Couplage: 25 millimoles de l'acide aminé convenable (1,5 équivalents en excès) dissous dans 25 ml de diméthylformamide, 25 ml d'anisole, 25 grs d'uré thane et 75 ml de chlorure de méthylène-lO minutes d'agitation 25 millimoles de dicyclohexylcarbodiimide dans 70 ml de trichloroéthylène - durée de réaction avec agitation : 45 minutes 3 x 150 ml - chlorure de méthylène - 2 minutes chaque fois 3 x 150 ml - méthanol - deux minutes chaque fois 2 x 150 ml - trichloréthylène- deux minutes chaque fois Séparation des groupements protecteurs: 2 x 150 ml - lavage au trichloroéthylène- deux minutes chaque fois 75 ml d'une solution de 20 % de phénol dans 4N-HC1 dioxane + 75 ml d'acide trichloroacétique à 50% dans du trichloroéthylène avec 4% de mercap toéthanol durant 30 minutes. 2 x 150 ml - chloroforme- 2 minutes chaque fois 2 x 150 ml - méthanol - deux minutes chaque fois 3 x 150 ml - chloroforme - deux minutes chaque fois Neutralisation: 1 x 150 ml solution de 10 % de triéthylamine dans chloroforme - 10 minutes 4 x 150 ml - chloroforme -deux minutes chaque fois Les -acides aminés étaient couplés dans l'ordre décrit dans le tableau II et en employant les mêmes groupements protecteurs combinés aux acides aminés décrits dans le tableau II. Dans la réaction 10 en position 30, la résine était lavée trois fois avec du diméthylformamide et après neutralisation -25 millimoles de BOC-l-glutamine-p-nitrophénylester dissous dans 150 ml de diméthylformamide contenant 1% d'acide acétique étaient ajoutés et on permettait de réagir durant 16 heures. On lavait alors la résine avec trois volumes de diméthylformamide, deux minutes chaque fois, avec deux volumes de méthanol, deux minutes chaque fois et avec trois volumes de trichloroéthylène deux minutes chaque fois. La résine était soumise à l'essai à la ninhydrine après chaque couplage et ceci donnait un résultat positif lors de la réaction 17 mais donnait un résultat négatif lorsque cette réaction a été répétée. A la fin des 39 réactions de couplage et après séparation des groupements protecteurs, neutralisation finale et séchage sous vide, le rendement était de 40,5 grammes. On faisait réagir deux grammes de résine-peptide protégée par des groupements protecteurs avec de l'acide fluorhydrique et de l'anisole comme décrit précédemment. Le rendement était de 822 mgs de peptides comportant toujours des groupements protecteurs TFA. Une séparation de similaire des groupements pro tecteurçdonnaient 1,685 mg. Pour purifier la peptide, 1,35 grammes de peptide séparée de la résine mais contenant toujours ses groupements protecteurs TFA étaient agités avec 135 ml d'une solution 0,2 molaire de pipéridine contenant 0,1t de mercaptoéthanol durant deux heures. Ce mélange était lyopholisé pour donner un solide blanc. Le mélange était dissous dans 100 ml d'eau et son pH était ajusté à 4,5 avec de l'acide acétique et absorbé sur une colonne de carboxyméthyl cellulose de 750 ml de volume. Des impuretés étaient éluées avec 18 volumes d'un tampon d'acétate d'ammonium à pH 6,7. Le pic de l'hormone ACTH active était alors élué avec 11,5 mmho de tampons à pH 6,7. Les fractions actives étaient lyophilisées et libérées de leur sel sous une colonne de G-25 Sephadex. Le rendement de la poudre blanche lyophilisée était de 361mg. La poudre avait une activité ACTH de 92 + 11 unités par mg et avait une composition correcte d'acides aminés. EXEMPLE 9 Dans cet exemple spécifique est décrite la synthèse à grande échelle d'un composé 41A et sa purification pour obtenir une hormone ACTH biologiquement efficace. 116,5 grammes de BOC-phénylalanine-résine étaient disposés danssun réacteur spécial. Cette résine avait un titre de 0,57 megXgm ou un titre total de 66,4 meq. Dans cette synthèse le couplage, la séparation des groupements protecteurs et la neutralisation étaient réalisés comme suit: Couplage:: 133 millimoles d'acides aminés-BOC convenables (i équivalent en excès) dissous dans 600ml de chlorure méthylène-agitation 10 minutes) 133 millimoles de dicyclohéxylcarbodiimide dans 133 ml de chlorure de méthylène- durée de réaction 45 minutes 2 x 750 ml - chlorure de méthylène - 2 minutes chaque fois 2 x 750 ml - méthanol - 2 minutes chaque fois 3 x 750 ml - chlorure de méthylène - deux minutes chaque fois Séparation des groupements protecteurs:: 2 x 750 ml - chlorure de méthylène - deux minutes chaque fois mélange 50-50 d'acide trifluoroacétique et de chlorure de méthylène- 30 minutes 750 ml 3 x 750 ml - chlorure de méthylène - deux minutes chaque fois 3 x 750 ml - méthanol - deux minutes chaque fois Neutralisation 2 x 750 ml - solution de 10% de triéthylamine dans chloroforme 5 minutes chaque fois 2 x 750 ml - chloroforme - 2 minutes chaque fois 2 x 750 ml - chlorure de méthylène - deux minutes chaque fois La séquence des acides aminés, les groupements aminés et les groupements protecteurs combinés et les procédés suivis étaient les mêmes que dans l'exemple 8. L'essai à la ninhydrine était appliqué après chaque réaction de couplage et il a été trouvé positif à chacune de réactions 2,22 et 23 mais dans chaque cas l'essai était négatif après répétition de la réaction de couplage. Dans la réaction No. 10 en position 30, le couplage comportait l'utilisation du p-nitrophénylester actif comme dans l'exemple 8. Le rendement en résine-peptide (composé Loto. 39A) après la fin de la réaction 39 ou couplage,séparation des groupements protecteurs, neutralisation, séchage sous vide, était de 316 grammes. Séparation: 100 grammes de résine-peptide ci-dessus étaient disposés dans un récipient Kel-F de grande dimension avec 5 grammes de diéthioérythritol et 100 ml d'anisole, Environ 350 ml d'acide fluorhydrique anhydre étaient ajoutés par distillation et le mélange était agité à OOC durant 20 minutes. Ensuite l'acide fluorhydrique était enlevé par distillation sous vide.Le résidu était lavé quatre fois avec des volumes de 1 litre d'acétate d'éthyle suivi par extraction de l'acide acétique glacial. L'extrait de l'acide acétique était lyophilisé pour donner 47,6 grammes d'une poudre blanche qui est le composé 41A comprenant toujours les groupements protecteurs TFA. 47,6 grammes de peptide-TFA (composé 41A) était agités durant 3 heures dans 5,5 litres d'une solution 0,2 molaire de pipéridine et une molaire d'urée contenant 0,1% de mercaptoéthanol. On a ajusté le pH de cette solution à 4,0 avec de l'acide acétique et on filtrait sur un filtre d'ouverture de pores de 0,22 microns. Cette solution était alors prête pour la purification. Purification: La peptide ACTH brute séparée de la résine et des groupements protecteurs étaient absorbée sur une colonne de carboxyméthyl cellulose avec un volume de 1800 ml. Les impuretés étaient éluées avec 44 litres d'un tampon d'acétate d'ammonium à PH 6,7 et 4,0 mmhos. Le pic ACTH était élué avec du tampon d'acétate d'ammonium à pH 7,5 et 4,0 mmhos et lyophilisé pour former une poudre blanche. Cette poudre était dissoute dans 400 ml d'acide acétique 0,5 molaire contenant 0,1% de mercaptoéthanol et passait sur une colonne de 16 litres de volume de Sephadex G-24 superfin. La pept tide contenant le pic était lyophilisée pour donner 7,19 grammes d'une poudre blanche dont la composition d'acides aminés était correcte et l'activité ACTH était de 82 + 7 unités par milligra.- me Bien entendu diverses modificatinns peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs et procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS: 1. Procédé pour la préparation de résines-peptides, carac térisé en ce qu'il consiste à coupler un composé de formule avec un anhydride de P-Bz-l-sérine pour produire un composé de formule ou Bz est un groupement benzoyle, p-méthoxybenzyle, p-chlorobenzyle, p-nitrobenzyle ou benzylhydryle, QR est une résine de polystyrène réticulée par du divinylbenzène Y est un groupement Bz ou H V est un groupement 2-chlorocarbobenbenzyloxy, carbobenzyloxy, 1-bromocarbobenzyloxy, 2-4-dichlo- i ro-carbobenzyloxy ou trifluoracétyle, T est un groupement tosyle ou nitré, W est un groupement carbobenzyloxy, tosyle, dinitro-! phényle, Bz ou H P est un groupement butyloxycarbonyle tertiaire, amyloxycarbonyle ou o-nitrophénylsulfényle. 2. Procedé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape supplémentaire de mettre le produit de la réaction obtenu selon la revendication 1 en contact avec un acide fluorhydrique anhydre pour enlever les groupementsCH2, Bz,T,Y, et W. 3. Procédé selon lesrevendicatio:sI et 2, caractérisé en ce que V est un groupement trifluoracétyle et comprenant l'étape supplémentaire de dissoudre le produit de la réaction obtenu selon la revendication 2 dans une base aqueuse pour enlever les groupements protecteurs trifluqracéytle. --- 4. Reste de polypeptide utilisable comme réactif intermédiaire dans la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'elle a la formule de structure: où Bz est un groupement benzyle, p-méthoxybenzyle, p-chlorobenzyle, p-nitrobenzyle ou benzylhydryle, et 0R est une résine de polystyrène réticulée avec du diinylbenzène. 5. Résine-peptide obtenue par synthèse à partir de la résine décrite selon la revendication 4 et utilisable comme réactif intermédiaire dans la mise en oeuvre du procécé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle a la structure NH2-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-CH2 - R Bz où Bz est un groupement benzyle, p-méthoxybenzyle, p-chlorobenzyle, p-nitrobenzyle ou benzylhydryle, et R est une résine de polystyrène réticulée avec du divinyl benzène. 6. Résine-peptide obtenue par synthèse à partir d'une résine selon la revendication 5 et utilisable comme réactif intermédiaire dans la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu elle a la structure où Bz est un groupement benzyle, p-méthoxybenzyle, p-chlorobenzyle, p-nitrobenzyle ou benzylhydryle, Y est Bz ou H V est un groupement 2-chlorocarbobenzyloxy, carboben zyloxy, 2-bromocarbobenzyloxy, 2-4-dichlorocarbo- 2-4-dichlorocarbo- benzyloxy ou trifluoracétyle, T est un groupement tosyle ou nitré. et est une résine de polystyrène réticulée avec du divinylbenzène. 7. Procédé pour la synthèse de la résine-peptide selon la revendication 4, caractérisb en ce qu'il comprend l'étape de couplage de NH2-Phe-CK2- 3 avec un anhydride de la formule pour produire le peptide P P est un groupement butyloxycarbonyb tefiåire, amyloxycarbonyb ou o-nitrophénylsulfényle, Bz est un groupement benzyle, p-méthoxybenzyle, p-chlorobenzyle, p-nitrobenzyle ou benzylhydryle et R est une résine de polystyrène réticulée par du divinylbenzène. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape supplémentaire de mettre le produit de réaction obtenu selon la revendication 7 en contact avec un acide pour enlever le groupement P. 9. Procédé selon la revendication 7 comprenant l'étape supplémentaire de couplage de avec un anhydride de P-l-leucine pour produire P est un groupement butyloxycarbonye tertiaire, amyloxycarbonyle ou o-nitrophénylsulfényle, Bz est un groupement benzoyle, p-méthoxybenzyle, p-chlorobenzyle, p-nitrobenzyle ou benzylhydryle et R est une résine de polystyrène réticulée par du divinylbenzène. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce ou'il comprend l'étape supplémentaire de mettre le produit de réaction obtenu selon la revendication 9 en contact avec un acide pour séparer le groupement P de ce produit de réaction.