FR 2318878 A1 19770218 FR 7523164 A 19750724 La présente invention est relative à un procédé de préparation enzymatique d'acide chondrodtine sulfurique et/ou de ses sels à partir de cartilages bruts. L'acide chondrottine sulfurique est, comme on le sait, un mucopolysac -charide ou glycosaminoglycane, présentant un caractère acide fortement mar qué et se trouvant essentiellement dans les cartilages, le collagène, les zones d'ossification et les os en voie de croissance, où il est fortement associé aux glycoprotéines. Le problème posé est par conséquent; de séparer ledit acide chondrottine sulfurique desdites protéines, sans toutefois rompre la liaison polyosidique-reliant le groupement acide D-glucuronique aux groupements N-acétyl-D-galactosamine, dont la fonction alcoolique est estérifiée en position 4 ou 6 par un groupement-SO3H. Pour préparer l'acide chondrostine-sulfurique, on connais plusieurs procédés opérant par voie chimique ou par voie enzymatique. On connait ainsi un -procédé de préparation -d'acide chondrottine sulfurique, mettant en oeuvre une hydrolyse alcaline des cartilages de mammifères nettoyés et finement broyés au préalable, ladite hydrolyse étant suivie d'une addition d'acide acétique-et d'une séparation de l'acide ne sulfurique enrésultant. Ce procédé présente toutefois l'-inconvénient de conduire à un -mélange de chondrottine, d'acide chondrottine sulfurique et de protéines et nécessite un traitement mécanique préalable des cartilages, compliqué et onéreux au point de vue industriel. Pour remédier à ces iw onvénients, la demanderesse avait mis au point un procédé décrit dans son brevet français 73 42 220, permettant de préparer de l'acide chondroitine sulfurique à un degré de -pureté ê-levé, et consistant essentiellement à traiter thermiquement les cartilages bruts puis à procé -der subséquemment àl'hydrolyse alcaline des'produits en résultant. On connaît d'autre part, un procédé de préparation par voie enzyme tique consistant essentiellement à effectuer une digestion papainique de -cartilages de requins, Ce procédé présente toutefois l'inconvénient d'entre très long et d'avoir un -rendennt tres faible. En effet, on -retrouve à la suite du traitement papainique, des cartilages non fluidifiés, c'est-àdire dans lesquels l'acide chondroitine sulfurique est encore lié aux protéoglycanes, et le procédé de récupération de l'acide chondroïtine sulfurique présente de nombreuses difficultés en taison-de la présence de résidus gras. la demanderesse a-wis au point maintenant, ce qui fait l'objet de la présente invention, un procédé de préparation enzymatique de l'acide chondreitine sulfurique ne présentant pas les inconvénients susnommés, et permettant d'obtenir ledit acide, de façon particulièrement économique et avec un rendement élevé. L'acide chondrottine sulfurique obtenu par le procédé objet de la présente invention a,en effet, un degré de pureté remarquable, et il est caractérisé notamment par l'absence de protéines et d' ions 'sulfate" libres. Le procédé ledit dans la présente demande est essentiellement carecté- risé par le fait que l'on effectue une attaque enzymatique modulée dans le temps des cartilages bruts ; ce procédé consiste d effectuer un premier traitement par un enzyme ayant pour fonction essentielle de nettoyer le cartilage en surface et de préparer structurellement ledit cartilage à l'attaque enzymatique ultérieure, et dans un second temps, à traiter le cartilage ainsi préparé par un enzyme ayant pour fonction de libérer l'acide chondroïtine sulfurique des protéoglycanes auxquels il est lié, sans rompre les liaisons polyosidiques de la molëcule d'acide chondroitine sulfurique.Ce traitement enzymatique est suivi d'un traitement -de finition comportant essentiellement des phases de précipitation et de filtration successives destinées à isoler l'acide chondroïtine sulfurique pur. On entend par cartilages bruts dans la suite de la description, des cartilages de mammifères ou due sélaciens récupérés apres abattage, et en particulier des trachées de boeuf n'ayant subi aucun traitement préalable pour les débarrasser de leur graisse. Le procédé consiste donc à traiter préalablement des trachées par un enzyme ayant pour fonction essentielle de nettoyer et de préparer au point de vue structurel, les cartilages en vue du traitement enzymatique sélectif ultérieur. Un enzyme présentant la fonction susnommée est par exemple,de façon préférentielle, la pepsine;mais bien entendu, on peut employer tout autre enzyme répondant à cette définition, et n'attaquant pas les protéoglycanes présents dans le cartilage. Ce traitement enzymatique est effectué sous agitation à une temps rature voisine de la température optimale d'action de l'enzyme, soit environ 40 à 450C dans le cas de la pepsine, pendant une durée comprise entre 2-et 5 heures. Au cours de ce procédé, on -traite plus particulièrement des trachées brutes (telles- que par exemple des trachées de boeuf découpées éventuellement en-tronçons de-15 à 20 cm) avec de l'eau additionnée de l'enzyme répondant à la définition sus-indiquée (tel qu'en particulier la pepsine), en-présence d'un acide minéral ou organique (tel-que par exemple l'acide chlorhydrique), et éventuellement des dajuvants de flottation des graisses. Le rapport en poids de l'eau aux cartilages traités est comprit entre 1 et 4. La -quantitX d'enzymes ayant--la- fonction- susnommée est com prise entre 0,1 et 5 g/kg de cartilages traités ; l'acide minéral ou organique est additionné à une quantité telle que l'on obtient un pH compris entre environ 1 et 3, et de préférence compris entre 1,5 et 2. Ce procédé de traitement enzymatique peut etre effectué en une ou plusieurs étapes et peut consister, par exemple, à procéder à un premier traitement enzymatique tel que défini ci-dessus, à éliminer l'eau et la graisse résultante, à rincer éventuellement l'ensemble, puis à retraiter, après rinçage, les cartilages avec l'enzyme de la même façon que précédemment, puis à éliminer par décantation de la même façon que précédemment, l'eau et la graisse et à rincer l'ensemble avec de l'eau chaude à une température -d'en- viron 80 à 900C. On a constaté que l'on peut récupérer ainsi des trachées débarrassées de leur graisse, égouttées, gonflées d'eau-et ayant une apparence modifiée par rapport -aux cartilages initiaux. Cette structure nouvelle peut stexpliquer, sans que cette interprétation soit limitative, par le fait que le traitement enzymatique a permis d'éliminer toutes les graisses et notamment les graisses présentes entre les tuniques du cartilage, et de modifier la structure meme de la surface -dudit cartilage qui est plus relâchée. Le second traitement enzymatique est effectué par un enzyme ayant pour fonction essentielle de libérer l'acide chondroïtine sulfurique des protéoglycanes auxquels il est lie, sans détruire toutefois la la liaison polyosidique de la molécule d'acide chondroïtine sulfurique elle-même. Ce traitement -este-asentiellement caractérisé par le fait qu!il s'effectue. à sec, c'est-à-dire sans addition d'eau autre que celle présente dans les cartilages eux-mêmes. A titre d'enzymes utilisables préférentiellement dans le -procédé décrit dans la présente invention, on peut citer la papaine pré- sentant la fonction susnommée, mais on peut également utiliser d'autres enzymes répondant à cette définition. L'hydrolyse enzymatique ainsi définie, et en particulier papainique, est effectuée essentiellement dans une cuve thermostatée à double agitateur. La température est maintenue entre environ 70 et 90 C. L'agitation est-effectuée, d'une part, grâce à un agitateur lent de mélange, et d'autrepart grâce à un agitateur très rapide jouant en plus 9e roule de broyeur. Ce -traitement enzymatique s'effectue dans un milieu tamponné à un pH sensiblement neutre et compris entre environ 6,5 et 7,5 et té préférence égal à environ 6,5. Le pH est ajusté par une solution alcaline et de préférence -une lessive de soude. On utilise environ 0,5 à 5 g et plus particulièrement entre 1 et 3 g dudit enzyme par--kg de cartilage brut. La duree de l'hydrolyse est comprise entre environ 5 et 10 heures, et de préférence entre 7 et 9 heures. Au bout de cette durée, l'hydrolyse est arrêtée, par addition de carbonate de calcium et elevation de température jusqu'à un niveau compris entre 85 et 950C. L'acide chondroîtine sulfurique est récupéré suivant des procédés connus en eux-memes, tels que par exemple le procédé de finition décrit dans le brevet 73 42 220 de la demanderesse. On peut également procéder de la façon suivante pour récupérer l'acide chondrottine sulfurique : on additionne de préférence un adjuvant de filtration au mélange résultant du second traitement enzymatique et l'on transfère le jus d'hydrolyse dans une cuve tampon après passage par un prefiltre destiné à éliminer les petites particules pouvant rester en suspension. On porte la température du mélange résultant de l'hydrolyse à environ 80 C et l'on fait passer ce mélange dans un filtre tel que par exemple un filtre presse à chambre avec plaque de papier ou feutre lavable. On procéde ensuite à un rinçage par injection d'eau-et essorage.Le jus d'hydrolyse ainsi filtre et le liquide de rinçage passent ensuite à travers un changeur de tempEra- ture destiné à les refroidir jusqu'd environ 20 C, afin d'éviter une altera- tion de l'acide chondroïtine sulfuriqué lors de l'addition acide. Le melan- ge résultant est addition d'un acide minéral tel que par exemple l'acide chlorhydrique en quantité suffisante pour obtenir un pH compris entre environ 1,5 et 2,5, et de préférence égal a environ 2.On additionne ensuite un alcool tel que par exemple l'éthanol à 97 , afin de précipiter l'acide chondroïtine sulfurique sous agitation violente, dans un rapport d'alcool pur et jus filtre acide compris entre 1 et 1,5. I1 se forme ainsi, après addition de l'alcool susmentionné, un précipité- d'acide chondroitine sulfur-ique contenant environ 80 % d'eau ; ce précipité est remis en suspension au sein d'un décanteur dans de l'alcool, de préférence de l'éthanol à 60n, qui permet d'é- liminer l'excès d'acide chlorhydrique et les chlorures, sous agitation très forte, pendant environ 5 à 30 minutes, et de préférence pendant environ 10 minutes.Le précipité est rincé à un alcool tel que l'éthanol puis essoré et remis en solution dans une solution aqueuse d'acetate de sodium, puis repre- capité par de l'alcool tel que l'éthanol à 97 , homogénéisé et séparé dans un décanteur, rëempStd par de l'alcool de préférence de l'éthanol d 800C en une ou plusieurs fois, essoré, et rdempâte à deux reprises dans de l'alcool, de préférence de l'éthanol à 97 . Le précipité est recueilli, puis essoré et sé- che en étuve et broyé éventuellement avec un broyeur en atmosphère sèche et propre au point de vue bactériologique. Un autre procédé d'obtention de l'acide chondroitine sulfurique consiste à filtrer la solution résultant de l'hydrolyse, après adjonction éventuelle d'un agent de clarification et de filtration, contribuant à accé lérer et à parfaire la filtration puis à additionner un agent de pré- cipitation de l'acide chondrditine sulfurique tel qu'un alcool inférieur comme l'éthanol sous agitation vive. On utilise de préférence environ 1,3 volumes d'alcool pour environ 1 volume de filtrat. Le mélange ainsi obtenu est abandonné à la suite dans une cuve de décantation. La phase claire surnageant est éliminée après le dépôt du précipité qui est isolé par réempotage par de l'éthanol, lavage et essorage sur Buchner. I1 est également possible de faire précéder la phase de précipitation décrite ci-dessus par une concentration du filtrat d'environ 2,5 fois à température voisine de 50 C, puis à soumettre le concentrat,ainsi obtenu comme précédemment, à précipitation, décantation, réempétage, lavage et essorage. L'acide chondroitine sulfurique peut également etre obtenu après le traitement susmentionné par passage sur un échangeur de cations fortement acide, après mise en solution à environ 10 à 12 Z de l'acide chon -drottine sulfurique sous forme de sel obtenu ci-dessus, dans le but de retenir les acides aminés encore présents dans la solution. De tels échangeurs cationiques, utilisables dans le procédé suivant l'invention, sont de préférence des échangeurs du groupe à noyau sulfonique tel qu'en particulier l'AMBERLITE JR 120 de forme H+. On peut également faire précéder-ou suivre- le traitement sur échan -geur cationique,d'un-passage sur un adsorbant tel que les adsorbants à base de résines diverses, comme par exemple des résines à base de silicones, d'alumine, de magnésie, de kaolin ou de charbon actif. Une autre variante de préparation de l'acide chondroitine sulfurique consiste à faire intervenir le-passage sur résine cationique fortement acide après la phase d'hydrolyse, la phase intermédiaire de neutralisation des sels d'acide chondrottine-sulfurique étant supprimée dans ce cas. Bien évidemment, il peut hêtre nécessaire et même utile de répéter plusieurs fois les opérations mentionnées ci-dessus. L'acide chondrottine sulfurique ainsi obtenu(ou l'un de sessels et notamment des sels pharmaceutiquement utilisables) présente des réactions négatives à l'acide trichloracétique et à la réaction du biuret,- iiquant ltabsence de matières protidiques dans le produit. - L'étude par spectrophotométrie infra-rouge montre des bandes caractéristiques de l'acide chondroitine sul furique. Le procédé de préparation enzymatique de l'acide chondroStine sulfu -riqua'- suivant l'invention, peut fonctionner par exemple -en continu. Une mise en oeuvre-particulière du procédé suivant l'invention peut s'effectuer de la façon -suivante en faisant référence à la figure unique: - On introduit dans une cuve à double diamètre (1) présentant à sa par tie inférieure une double enveloppe(2) thermostatée, des trachées brutes, de l'eau, un acide fort tel que l'acide chlorhydrique et le premier enzyme, ainsi qu'un agent de flottation tel que du polystyrène expansé. - A la fin du traitement enzymatique, on enlève l'agent de flottation en surface par un dispositif de ratissage (3) et l'on injecte de l'eau chaude pår(4)dans le bas de la cuve. Ce traitement s'effectue sous agitation lente par l'agitateur (5) - Après rinçage et égouttage, on additionne le second enzyme et un me- lange tampon aux trachées traitées présentes dans la cuve (1). en chauffant le bas de la cuve (1)par le systbme thermostaté (2), on effectue une-agitation lente par l'agitateur (6)et une agitation plus rapide par l'agitateur (7) qui a également un rôle de broyage, - Après le second traitement enymatique et addition éventuelle d'un adjuvant de filtration, on refoule le mélange hydrolysé dans la cuve (9) après passage sur le préfiltre (8) Le mélange est maintenu sous agitation par l'agitateur(lO)dans cette cuve. - On fait ensuite passer dans le filtre (12) la solution refroidie au préalable par passage dans l'échangeur (11). - La solution filtrée par passage dans le filtre(lt est introduite après passage dans l'échangeur (13) dans la cuve (14), où s'effectue la précipitation sous agitation violente à l'aide-de l'agitateur (15). Après precipi- tation, on fait passer grâce a la pompe (16), le mélange homogénéisé dans le décanteur centrifuge k bol plein (17). - On fait passer- ensuite dans la cuve (19) à l'aide de la pompe (18) le précipité (contenant environ 80 % d'eau), préalablement remis en suspension dans le liquide de rinçage approprié, et on le soumet b une agitation puissante par l'intermédiaire de l'agitateur O) - On renvoie par 1' intermédiaire de le, pompe (21) 1e mélange dans le décanteur a bol plein (17) pour séparation.On remet le précipité en solution d'acétate de sodium et on transvase j nouveau dans la cuve(l9); on effectue une nouvelle précipitation à l'alcool suivie d'une nouvelle séparation dans le décanteur (17), le précipité étant alors recueilli puis réempâté par l'alcool a plusieurs reprises, puis broyé dans les dispositifs appropriés pour obtenir une poudre blanche. Les exemptes suivants sont destinés à illustrer l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 1 130 kg de trachée de boeuf réputées propres et nettoyées au stade abattoir sont découpées grossièrement en tronçons de 15 à 20 cm et sont traiter pendant 1 h 30 par 2 500 1 d'eau b une température de 40-45 C, additionnés de 26 litres d'acide chlorhydrique (technique) et de 2,260 kg de pepsine de titré 200. Après agitation pendant une heure et demie, on procede à la vidange de ia cuve par aspiration supérieure au-moyen d'une pompe équipée d'une crépine, suivie d'un rinçage à l'eau -chaude, à raison d'environ 1000 litres d'eau à 80 - 90 C. Après élimination de l'eau du premier rinçage, on ajoute à nouveau 2500 litres d'eau à 40-45 C avec la sème quantité d'acide chlorhydrique et 1,7 kg de pepsine. On traite à nouveau comme précédemment sous agitation,et l'on procéde à nouveau à une décantation supérieure et un rinçage final par environ 2 000 litres d'eau à 80 - 90 C. On récupère ainsi 770 kg de trachées propres, égouttées mais gonflées d'eau, ayant une apparence modifiée. Les trachées ainsi traitées sont -ensuite soumises à une hydrolyse papainique dans une cuve thermostatée à double agitateur, équipée d'un agitateur lent de mélange et d'un agitateur très rapide tournant à 1500 tours/minute à turbine défloculeuse jouant le rôle de broyeur. L'hydrolyse papaïnique est mise en route par addition de 1,130 kg de papaïne brute dispersée dans 7 litres d'un mélange tampon de -pH 6,5, en présence d'EDTA et de cystéine. La temperature-est maintenue à 70-75 C et le pH à 6,5 - 7 par-addition de 8 litres de lessive de soude à 8-10 % en plusieurs fois. L'hydrolyse est arrêtée 16 heures après par addition de 5 kg de carbonate de calcium, et élévation de la température à 85 C. Le volume final est de 560 litres. La solution résultante est additionnée ensuite d'un adjuvant de filtration usuel. La solution résultante de l'hydrolyse et contenant l'adjuvant de fil- tration est portée à 800 C, puis injectée dans un filtre presse à chambre avec plaques de papier. On effectue un rinçage par injection d'eau en une quantité suffisante -pour récupérer un volume -équivalent au volume initial, c'est-à-dire dans environ 1000 litres pour 2 tonnes de trachées. Le jus d'hydrolyse et le liquide de rinçage sont ensuite -amenés à passer à travers un échangeur de.tem- pérature, destiné à refroidir ledit mélange aux environs de 200C pour éviter une altération de l'acide chondrottine sulfurique lors de l'addition d'acide. On additionne à ce mélange de l'acide chlorhydrique en quantité suffisante pour obtenir un pH-compris entre 1,9-et 2. On ajoute -ensuite de l'ethanol, environ 1200 litres d'éthanol à 970 sous agitation violente. Il se forme un précipité d'acide chondroïtine sulfurique contenant environ 80 % d'eau, ce qui représente environ 200 à 300 kg équivalant 'à 50 kg ou 60 kg d'acide chondroïtine sulfurique. Le précipité est remis en suspension,directement dans le décanteur, dans de l'éthanol à 60 qui permet d'éliminer l'excès d'acide chlorhydrique et les chlorures sous agitation très forte pendant 10 minutes On utilise environ 300 litres d'alcool dans ce traitement.Le précipité ainsi ebtenu est rincé à l'alcool à 60 , essoré et remis en solution dans une solu tion aqueuse saturée d'acétate de sodium. La solution -ainsi obtenue est trans vasée dans une autre cuve où l'on procède à une nouvelle précipitation par de l'alcool à 97 . Le precipitë est agité à l'homogénéiseur, séparé dans un décanteur, réempâté par de l'alcool à 80 en une ou deux fois, essoré et rêempSté enfin à deux reprises dans l'alcool à 970 pour le durcir et le sè- cher. Le précipite est recueilli et séché en étuve, puis broyé sur un broyeur à marteau dans une atmosphère sèche et avec toutes les précautions nécessaires pour garantir une propreté bactériologique.On -obtient ainsi de l'acide chondroitine sulfurique pur présentant une réaction négative au biuret avec un rendement de l'ordre de 3,3 % par rapport a-u poids de cartilage brut initial. EXEMPLE 2 1 250 kg de ttachées de boeuf réputées propres,nettoyées au stade abattoir, découpées grossièrement pour une partie seulement, sont placées dans 3 900 litres d'eau à 40-45 C contenant 4 litres d'acide chlorhydrique technique et 0,625 kg de pepsine et environ 2 kg d'adjuvant de flottation des graisses, tel que du polystyrène expansé; Après une heure d'agitation sans arrêter le mélangeur, on procède au ratissage de adjuvant chargé de graisses et d'impuretés diverses remontées en surface en raison de la température du liquide et de l'action dé l'enzyme. On ajoute ensuite une nouvelle portion d'enzyme (environ 1,3 kg) et d'adjuvants -de flottation,(environ 2 kg) sans changement du bain de traitement. Apres 90 minutes d'agitation, on procède à un nouveau ratissage de l'adjuvant chargé d'impuretés; puis à la vidange de la cuve. Le rinçage est ensuite effectué avec 2000 litres d'eau à 60-650C. On utilise environ pour l'ensemble de l'opération 6000 litres d'eau. On récupère ainsi 670 kg de trachées égouttées présentant un aspect semblable à celui de l'exemple 1. Ces trachées sont ensuite soumises à l'hydrolyse papainique dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, avec 1,250 kg de papaine en suspension dans 8 litres d'un tampon à pH-6,5 en présence de cystéine et de EDTA. L'hydrolyse,sx,pée après 12 heures, est -complète, et l'on procéde à la concentration de la solution d'hydrolyse par évaporation à 85-90 C sous agitation. Une fois le volume ramené à 430 litres, on arrête l'évaporation. On obtient environ un rapport de 1 litre de solution pour 2 kg de trachées nettoyées et degraissées après la première partie du traitement. On récupère comme précédemment l'acide chondroïtine sulfurique de la solution résultant de l'hydrolyse. EXEMPLE 3 1 140 kg de trachées de b boeuf brutes non nettoyées au niveau abbatoir, accompagnées de viande et de morceaux de poumons ont été traitées selon le procédé décrit dans T'exemple précédent avec 2 fois 0,5 g/kg de- pepsine. Ce traitement demande 3 420 litres d'eau à 40-45 C pour l'hydrolyse pepsique proprement dte avec 36,3 litres d'acide chlorhydrique et 3,8 kg de polystyrène expansé et environ 2000 litres d'eau a 60-65 C pour le rinçage final. On obtient ainsi 757 kg-de trachées d'un aspect identique à celui des trachées de l'exemple 2. L'hydrolyse papainique, réalisée dans les condi tions habituelles avec 1040 g de papaine et 8 litres de solution tampon à base de cystéine et d'EDTA, est arrêtée après 12 heures. On n'a trouvé aucun résidu de cartilage non fluidifié. Le reste -du traitement est effectué comme -dans l'exemple 1. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'acide chondroitine sulfurique et de ses sels, caractérisé par le fait que l'on procède à un traitement enzymatique modulé dans le temps de cartilage bruts, suivi d'une récupération dudit acide par voie de précipitation. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le procédé de traitement enzymatique consiste å traiter dans un premier temps des cartilages bruts par un enzyme ayant pour fonction de nettoyer le cartilage en surface et de préparer structurellement ledit cartilage à l'attaque enzymatique ultérieure et, dans un second temps, à traiter ledit cartilage par un enzyme ayant pour fonction de libérer 1'ACS des protéoglycanes auxquels il est lié, sans rompre les liaisons polyosidiques de la molécule d'acide chondroitine sulfurique. 3. Procédé selon la revendication 2,. caractérisé par le fait que le premier enzyme est la pepsine. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que le second enzyme est la papatne. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé par le fait que l'on utilise 0,1 à 5 g de le premier enzyme par kg de cartilages bruts A traiter. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 ou 4, caractérisé par le fait que'on utilise 0,5 à 5 g du second enzyme par kg de cartilages bruts à traiter. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2, 3,5, caractérisé par le fait que le-premier traitement enzymatique est effectué à une température de 40 à 45"C pendant une durée comprise entre 2 et 5 heures. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2,3,5,7, caractérisé par le fait que le traitement enzymatique est effectué en milieu aqueux en présence d'un acide minéral ou organique. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le rapport en poids de l'eau au cartilage est compris entre 1 et 4. 10. Procédé selon les revendications 8 ou 9, caractérisé par le fait que l'on utilise une quantité d'acide telle que le pH est compris entre 1 et 3 et de préférence entre 1,5 et 2. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé par le fait que l'acide utilisé est l'acide chlorydrique. 12. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'on rince le cartilage traité avec de l'eau ayant une température comprise entre 80 et 130oc. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2, 4 et 6, caractérisé par le fait que le second traitement enzymatique est effectué à une température de 70 à 90 C. 14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé par le fait que ledit traitement peut être effectué sans -addition d'eau. 15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait que le traitement enzymatique est effectué en milieu tamponné ayant un pH compris entre 6,5 et 7,5. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que lton adapte Ie pH du milieu par de la lessive de soude. 17 Procédé selon l'une quelconque des revendications I3 à 16, caractérisé par le fait que le -traitement enzymatique est effectué pendant une durée de S à 10 heures et de préférence de 7 à 9 heures. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisé par lé fait que le traitement enzymatique est arrêté par addition de carbonate de soude et élévation de la température. 19. Procédé selon la revendication -18, caractérisé par le fait que la température finale est comprise entre 85 et 950C.