FR 2323334 A1 19770408 FR 7627261 A 19760910 La présente invention concerne un procédé pour isoler des protéines très pures à partir de graines de colza. En En raison de la pénurie mondiale en protéines utilisables pour l'alimentation animale ou humaine, les graines oléagineuses,telles que les graines de soja, l'arachide et les graines de coton, acquièrent de plus en plus d'importance pour la production de protéines comestibles0 Jusqu'à présent le colza, Brassica napus, qui est la graine oléagineuse la plus importante des zones à climat tempéré, n'est guère utilisé pour la préparation de protéines car il y a, dans cette graine, des substances dan gereuses pour la santé, plus spécialement de l'acide érucique et des glucosinolates. La lise au point de nouvelles variétés dont les graines ne contiennent que de faibles quantités d'acide érucique et de glucosinolates conduit à une amélioration des propriétés nutritives et physiologiques des produits à base de colza.On cultive de plus en plus, surtout pour la production d'huile, une variété de colza d'hiver (Brassica napus, Lesira) pauvre en acide érucique et une variété de colza de printemps (Brassica napus, Erglu) pauvre en acide érucique et en gluco sinolates. Les huiles fournies par les graines de ces nouvelles variétés sont presque dépourvues d'acide érucique et leurs farines contiennent des quantités beaucoup plus faibles de glucosinolates, en comparaison des graines de colza ordinaires. D'après les estimations faites par l'organisation pour'la nourriture et l'agriculture (FAO) des Nations Unies on peut prévoir que la production des graines de colza atteindra à peu près 12 millions de tonnes par an à partir de 1980. Les nouvelles variétés de colza peuvent contri buer substantiellement à couvrir les besoins en protéines co itestibles à condition que soit trouvé un procédé idoine pour l'isolement des protéines du colza. Un procédé simple et ren table pour isoler, à l'échelle industrielle, les protéines contenues dans les graines de colza peut aider à satisfaire les besoins en protéines comestibles et, en outre, fournir une matière première intéressante pour l'industrie des matières plastiques. L'état de la technique dont part l'invention est exposé ci-dessous. Des concentrés protéiniques ayant une teneur en protéines de 50 à 60 * peuvent être préparés d'une manière simple à partir de graines de soja et d'autres graines oléagineuses,après décorticage des graines et extraction de l'huile. De meme on peut, à partir de graines de colza classiques, préparer des concentrés protéiniques correspondants par décorticage, déshuilage et extraction des glucosinolates ; les rendements ne sont que de 23 à 28 * par rapport au poids des graines. Les concentrés protéiniques provenant de grai nes de soja et de graines de coton, dans une très faible mesure aussi des graines de colza, trouvent une application comme nourriture pour animaux. Pour l'alimentation humaine et pour de nombreuses applications industrielles on a cependant besoin de protéines beaucoup plus pures, c'est-à-dire isolats protéiniques". L'isolement, à l'échelle industrielle, de protéines à partir de graines oléagineuses comprend les étapes importantes suivantes Les protéines sont d'abord extraites des graines déshuilées, à l'état de farine, au moyen d'eau ou de solutions aqueuses de sels ou d'alcalis. À partir des extraits on prépare ensuite les isolats protéiniques par lyophilisation, séchage ou précipitation. L'extraction des protéines est effectuée en un seul stade ou en plusieurs stades, au moyen d'un ou de plusieurs solvants. Ces façons d'opérer exigent des quantités considérables de solvants Si l'on veut que le rendement soit élevé. L'isolement des protéines à partir des extraits, par lyophilisation ou séchage, conduit à des produits qui, certes, renferment la totalité des protéines extraites mais qui- sont souillées par des substances non protéiniques provenant de la graine et du solvant. Le problème à résoudre était d'obtenir des isolats protéiniques convenant pour l'alimentation humaine qui soient dépourvus de glucides insolubles et, surtout, indigestes pour les enfants, ne contiennent pas de substances nuisibles pour la santé, ni de constituants conférant une odeur non recherchée, ni de substances amères, ni d'autres impuretés pouvant avoir des inconvénients dans l'alimentation humaine, et permettent également un mélange avec d'autres produits alimentaires en vue de l'augmentation de la teneur en protéines. Ce problème est résolu grâce au procédé qui fait I'objet de l'invention. Il s'agit d'un procédé d'obtention d'isolats protéiniques à partir de graines de colza, en continu ou en discontinu, procédé selon lequel on extrait par dissolution les protéines de graines de colza dégraissées, par extraction à contre-courant au moyen d'eau à pH 7 ou au moyen de solutions aqueuses d'hydroxyde de sodium ou d'hydroxyde de potassium à un pH de 7,5 à 10, de préférence de 9, on précipite successivement à partir de l'extrait isolé, en deux étapes consécutives, par addition progressive d'un acide minéral, par exemple d'acide chlorhydrique, à un pH de 5 à 6,5, de préférence de 5,7 à 6,0, un isolat protéinique I, puis, à un pH de 3,0 à 4,0, de préférence de 3,6 un isolat protéinique II , on lave avec de l'eau et/ou avec un solvant organique et, après filtration ou centrifugation, on sèche de ma nière connue. Les avantages les plus importants du procédé par extraction à contre-courant sont les suivants - il donne un rendement d'extraction en protéines d'environ 95 * , - il ne nécessite que de faibles quantités de sol vants et d'agents chimiques, cela en raison de l'u- tilisation optimale du solvant - il permet d'opérer, au choix, en continu ou en discontinu - il ne nécessite qu'une faible surface dans l'atelier ; - l'équipement en matériel est réduit - les frais de fonctionnement de l'installation sont limités. Les avantages les plus importants de la précipitation des protéines par étapes à différents pH sont les suivants - récupération presque totale des protéines à par tir des extraits pour une faible consommation d'agents chimiques et d'énergie - mise en oeuvre d'un mode opératoire continu ou discontinu - production de plusieurs types de protéines - haute teneur en protéines (95 e%) des isolats - teneur faible, non dangereuse, des isolats en glucosinolates - bonne composition des isolats en amino-acides. lies isolats protéiniques sont clairs, ils n'ont pas d'odeur et ils n'ont qu'un léger gout ; ils conviennent aussi bien pour l'alimentation, humaine ou animale, que pour diverses applications industrielles. Le procédé conforme à 11 invention peut entre exécuté sur une grande échelle parce que chacune des deux étapes opératoires1 à savoir l'extraction des protéines à contrecourant à partir des graines dégraissées et la précipitation des protéines dans l'extrait, peut être effectuée en continu. Le rendement total en isolats protéiniques est très élevé car les deux étapes opératoires donnent des rendements presque quantitatifs. Le fait d'associer, en un procédé intégré, l'extraction à contre-courant à la précipitation des protéines par étapes contribue à abaisser le coût de la préparation des isolats protéiniques à partir de graines de colza. Le produit solide qui reste après ltextrac- tion des protéines a une teneur élevée en fibres et peut etre utilisé par exemple comme matière de charge. Le liquide qui reste après la précipitation des protéines peut servir, du fait de sa teneur élevée en glucides, dans l'industrie de la fermentation. Le procédé de l'invention est un procédé intégré qui représente un important progrès technique dans l'ob- tention de protéines à partir de graines de colza. L'association de deux étapes opératoires, à savoir l'extraction des protéines à contre-courant à partir de la farine dégraissée et la précipitation des protéines par étapes dans l'extrait à différents pH, est absolument nouvelle. Les exemples suivants illustrent la présente invention. EXEMPT 1: La technique à suivre pour l'extraction à contre-courant de protéines à partir de graines de colza déshuilées est représentée schématiquement sur le dessin annexé. Au moyen d'une solution 0,02 N d'hydroxyde de sodium on extrait quatre échantillons (de chacun 250 g) de farine de colza (Erglu) déshuilée à l'hexane, désignés par les-nombres I à IV. Dans chacune des quatre étapes, désignées par les lettres À à D, on extrait le premier échantillon avec 6250 ml de solvant frais, le rapport de la matière solide au solvant étant de 1:25. L'extraction est effectuée à la température ambiante, pendant 10 minutes, à l'aide d'un homogénéiseur tournant à grande vitesse. On filtre ensuite les échantillons sous pression réduite, à travers un drap de coton. À chaque fois le filtrat provenant d'un échantillon est utilisé, après mesure du volume (après prélèvement d'une fraction déterminée pour le dosage de l'azote), pour l'extraction du prochain échantillon.Au commencement de chacune des étapes on place l'échantillon de tête de étape précédente à la fin de cette étape. On réunit les extraits des quatre étapes (pH 9,2), on centrifuge l'extrait global pendant 15 minutes à une accélération de 5000 x g et on le conserve à 50C. Les 25 litres de solution 0,02 N d'hydroxyde de sodium mis en jeu fournissent une quantité totale de 23 litres d'extrait. lies résultats de l'extraction à contrecourant sont consignés dans le tableau I (voir ci-dessous) Le pourcentage de l'azote contenu dans la farine (azote de la farine) qui a été extrait à partir de chacun des échantillons est calculé à partir de la somme de l'azote contenu dans les protéines extraites et de la somme de l'azote qui se trouvait à l'origine dans les échantillons. le pourcentage de l'azote total de la farine qui a été extrait dans les différentes étapes est calculé à partir de la teneur en azote des extraits protéiniques provenant des quatre échantillons dans l'étape envisagée, et de la somme des teneurs initiales en azote des quatre échantillons. Les résultats montrent qu'une extraction à contre-courant comportant quatre étapes permet d'extraire à peu près 94 % % de l'azote contenu dans la farine. T A B L E A U Extraction à contre-courant des protéines contenues dans de la farine de colza dégraissée. Etape de l'extrac- Echantillon Azote de la Total de l'azote tion farine de la farine extrait extrait % % I 67,1 A II 12,0 III 31,1 34,1 IV 26s0 II 90,6 3 III 49,1 30,8 IV 48,8 I 71,0 III 83,4 C IV 81,9 20,3 I 82,1 II- 93,1 IV 97,2 D I 92,0 8,6 II 94,2 III 91,2 I1 est manifeste que l'extraction de protéines à contre-courant, telle qu'elle vient d'être décrite, du fait qu'elle donne des rendements en protéines élevés et qu'elle ne consomme qu'une faible quantité de solvants, offre de grands avantages en comparaison de l'extraction par étapes. Un autre avantage du procédé d'extraction à contre-courant réside dans le fait que, grâce à l'emploi de suspensions concentrées, la quantité des matieres qui se trouvent en traitement reste faible malgré le débit élevé. Le produit qui reste après l'extraction à contre-courant renferme 4,0 % de protéines. ainsi que 21,7 % de fibres et 12,9 % d'eau. En vue de précipiter les protéines on transvase l'extrait protéinique global (23 litres) dans un récipient en acier résistant aux acides. Cet extrait, qui contient des protéines, des glucides, des glucosinolates et des matières minérales, a un pH de 9,2. On porte le pH de cette solution à 6,0 par addition de 93 ml d'acide chlorhydrique. ó N, ce qui fait précipiter une fraction protéinique. lie précipité de protéines se dépose en 2 heures. On fait passer le liquide surnageant, par aspiration, dans un deuxième récipient. On centri fuge le précipité pendant 10 minutes sous une accélération de 5000 x g et on joint le liquide surnageant à la solution dans le deuxième récipient. Les protéines ainsi isolées sont lavées avec 400 ml d'eau.Le liquide de lavage est également ajouté à la solution dans le deuxième récipient. Le précipité protéinique lavé à l'eau est lavé à deux reprises avec chaque fois 400 ml d'acétone et l'isolat protéinique I est séché à l'air à la température ambiante. L'isolat protéinique I (220 g) est gris clair et il n'a pratiquement pas de goût. La solution qui se trouve dans le second réci pient et qui est composée du liquide surnageant après précipitation de l'isolat protéinique I et des liquides de lavage, a un pH de 6,2. On l'ajuste à pH 3,6 par addition d'acide chlorhydrique 6 N. Ce changement de pH fait précipiter une fraction supplémentaire de protéines. On laisse le précipité se déposer pendant 4 heures, puis on sépare par aspiration le liquide surnageant. On lave le précipité protéinique une fois avec 200 ml d'eau et à deux reprises avec chaque fois 200 ml d'acétone. L'isolat protéinique il est séché à l'air a' la température ambiante.Cet isolat protéinique II (77 g) est blanc et presque sans goût. Les rendements an isolats protéiniques I et II, calculés en pourcentages par rapport aux protéines contenues dans la farine (N x 6,25), sont indiqués ci-dessous. Isolat protéinique I ss Isolat protéinique II Total % % % Rendement 65,2 22,9 88,1 Le rendement total des deux isolats est de 88,1 %. On donne ci-dessous, dans le tableau II, quelques caractéristiques des isolats protéiniques de colza. T À B L E A U Il Analyse des isolats protéiniques de colza (B. napus, Erglu) Isolat protéini- Isolat protéini que I que II Humidité % 10,5 8,1 Protéines (par rapport au poids sec) X 92,9 98,6 Lipides % 0,00 0,00 Cendres * -0,70 0,31 Fibres brutes % 0,06 0,02 Glucosinolates % traces traces Mousse statique (Sigma) 310 395 Ces valeurs montrent que les isolats protéiniques sont très purs. Ils ne contiennent que peu de cendres et de fibre-s et ils sont pratiquement dépourvus de glucosinolates et-d'autres constituants toxiques. Les valeurs Sigma montrent que les deux isolats de graines de colza ont une stabilité de mousse plus de deux fois supérieures à celle des protéines de soja partiellement dégradées que l'on trouve ordinairement dans le commerce. Les analyses portant sur la composition en amino-acides des deux isolats révèlent une haute teneur en lysine. L'isoleucine, qui est considérée comme l'amino-acide limitant dans la farine de colza, se trouve, dans les isolats, en des concentrations plus élevées que dans la matière de départ. Cet exemple montre que l'on peut obtenir des isolats protéiniques purs, de teinte claire et presque sans goût, ayant une bonne composition en amino-acides, à partir de graines de colza (Erglu), cela avec un rendement élevé, par l'association de l'extraction à contre-courant et de la précipitation par étapes. EXEMPTE 2 L'extraction à contre-courant (voir le dessin annexé) est effectuée également avec une grande quantité de farine de colza (Lesira) déshuilée à l'hexane. On extrait quatre échantillons (de chacun 1250 grammes) de cette farine avec, dans chaque étape, 25 litres d'une solution 0,2 N d'hydroxyde de sodium, le rapport entre la quantité de matière solide et la quantité de sol- vant étant de 1:20. On filtre la suspension sous une pression de 3 atmosphères. Les résultats de l'extraction à contrecourant sont indiqués dans le tableau III ci-dessous. Le pourcentage de l'azote total extrait dans chacune des étapes dé l'extraction a été calculé à partir de la somme des teneurs en azote des extraits protéiniques de chacun des échantillons dans l'étape envisagée et de la somme des teneurs initiales en azote des quatre échantillons. (voir tableau III page suivante) T A B L E A U III Extraction à contre-courant des protéines du colza (B. napus, Lesira) Etape d'extraction Azote de la farine extrait total A 49,2 B 27,2 C ~ 14,4 D 1 ,9 Ces résultats montrent que même lorsqu'on opère sur une quantité relativement grande de farine de colza, pour un rapport farine/solvant de 1:20, on parvient à atteindre un taux d'efficacité élevé de l'extraction à contre-courant pour la dissolution des protéines.Au moyen d'une quantité minimale de solvant on a extrait au total 93 * de l'azote protéinique que contenait la farine. On centrifuge les extraits combinés des quatre étapes (91 litres) à 5.000 x g et on recueille dans un réciplent l'extrait global. la précipitation par étapes, de même que le lavage et le séchage du précipité protéinique déposé, est effectuée de la manière décrite à l'exemple 1, avec le meme rapport entre la quantité d'eau et la quantité d'acétone. L'extrait, dont le pR est de 9,2, est porté à pH 5,7 par addition de 391 ml d'acide chlorhydrique 6 N, ce qui fait précipiter l'isolat protéinique I. On porte ensuite à pH 6, par addition de 378 ml d'acide chlorhydrique 6 N, la solution globale constituée du liquide surnageant et de l'eau de lavage on fait ainsi précipiter l'isolat protéinique II. L'isolat protéinique I séché à l'air (1168 g) est gris clair et l'isolat protéinique II séché à l'air (287 g) est blanc. Les deux isolats sont pratiquement dépourvus de goût. Les rendements en isolats protéiniques, calculés en pourcentages de la protéine (pourcentage d'azote protéinique x 6,25) dans la farine, s-ont indiqués ci-dessous-. Isolat protéini- Isolat protéini- Total que I que II % % % Rendement 73,2 18,0 91,2 Le rendement total pour les deux isolats est de 91,2 %. On donne, dans le tableau IV ci-dessous, quelques caractéristiques des deux isolats protéiniques. e A B L E .s U IV Analyse des isolats protéiniques de colza (B. napus, Besira) Isolat protéini- Isolat protéini que I que II Humidité % 7s3 7,2 Protéines * (par rapport au poids sec) 99,6 99,3 Lipides % traces traces Cendres % 0,04 0,09 Fibres brutes % traces traces Glucosinolates % traces traces Mousse statique (Sigma) 411 450 Ces résultats analytiques montrent que les isolats sont presque exclusivement constitués de protéines. Ils ne renferment qu'une petite quantité de cendres et ne contiennent pratiquement ni fibres, ni lipides, ni glucosinolates, ni d'autres substances toxiques. Les valeurs Sigma montrent que les deux isolats de graines de colza ont une stabilité de mousse trois fois plus élevée que celle des protéines de soja partiellement dégradées que l'on trouve dans le commerce. Les analyses portant sur les amino-acides montrent que les isolats ont une bonne composition en aminoacides.Ils renferment plus d'isoleuclne que la farine dont on s'est servi comme matiere-de départ. lies essais de-nourriture effectués sur des poussins montrent que les valeurs de croissance des isolats protéiniques sontcomprises entre 2,6 et 3,2, tandis que la valeur de croissance de la protéine du lait (caséine) est de 2,5. Il peut être souhaitable, dans certains cas, d'isoler plus de deux fractions protéiniques. Pour cela on ajoute par étapes une solution d'électrolyte à l'extrait, en ajustant plusieurs pH entre 6,5 et 3 ; on isole ensuite les isolats protéiniques en séparant le précipité qui s'est formé, par filtration ou centrifugation, on les lave et on les sèche. Dans des cas exceptionnels on a la possibilité, sans sortir du cadre de la présente invention, de modifier le procédé à contre-courant de la façon suivante on dissout la totalité des protéines par une seule extraction ou par des extractions répétées, chaque fois avec de l'eau à un pH 7,0 ou avec des solutions aqueuses dlhydroxyde de sodium ou d'hydroxyde de potassium à un pH de 7,5 à 10. le principe de l'invention peut également s'appliquer, sous réserve de modifications appropriées, à l'isolement de protéines à partir de graines oléagineuses autres que les graines de colza. R E V z N D I C A e I O N S 1 Procédé d'obtention d'isolats protéiniques à partir du colza, les matières premières utilisées étant les résidus de pressage ou les gruaux d'extraction ou les farines d'extraction restant après le déshuilage, procédé caractérisé en ce qu'on extrait par dissclution, en continu ou en discontinu, les protéines à partir des graines de colza dégraissées, par extraction à contre-courant avec de l'eau à pH 7 ou avec des solutions aqueuses à un pH de 7,5 à 10, de préférence de 9, dans l'extrait obtenu on fait précipiter deux fractions protéiniques, en deux étapes successives, par addition progressive d'un acide minéral, tel que l'acide chlorhydrique, d'abord à un pH de 5 à 6,5, de préférence de 5,7 à 6 (isolat protéinique I), puis à un pH de 3,0 à 4,0, de préférence de 3,6 (isolat protéinique II), on lave au moyen d'eau ou d'un solvant organique et, après filtration et/ou centrifugation, on sèche de manière connue. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait précipiter plus de deux isolats protéiniques à partir de l'extrait, en ajoutant par étapes une solution d'électrolyte avec, à chaque fois, réglage d'un pH différent compris entre 6,6 et 3,0, on lave et, après filtration ou centrifugation, on sèche de manière connue.