FR 2313941 A1 19770107 FR 7517900 A 19750609 la présente invention concerne l'immuno-globuline humaine antistaphylocoque et un procédé de fabrication de celle-ci. L'immuno-globuline anti staphylocoque est utilisée en thérapie, chirurgie, pédiatrie, obstétricie, gynécologie, oto-laryngologie, ophtalmologie, dermatologie pour le traitement des malades souffrant d'infections staphylocoques (septicémie staphylocoque, septico-pyémie, péritonite, pneumonie, endocardite, méningite, destruction staphylocoque des poumons, empyème, ostéomyélite, staphylodermie, affections staphylocoques des organes oto-rhinolaryngiques, ainsi que des affections aiguës purulentes staphylocoques localisées. A l'heure actuelle, on connaît la préparation de la gamma-globuline appliquée pour la prophylaxie de certaines maladies infectueuses. Le procédé d'obtention de la gamma-globuline consiste à fractionner le plasma sanguin de donneur à l'aide d'alcool éthylique elle le plasma, dans ce but, est refroidi jusqu'à la température de OOG et on additionne un tampon acétique dans une solution aqueuse d'alcool éthylique à 53,3%, jusqu a un pH de 7,2. Pendant l'addition de l'alcool éthylique, la température du mélange doit s'abaisser jusqu'à -2,50 ou -30G, Ta concentration finale de l'alcool éthylique dans le système s'évalue à 8%. Le précipité de fibrinogène déposé est extrait par centrifugeage.Au liquide surnageant on additionne de l'alcool éthyliqué à 53,3fi9, contenant un tampon acétique, jusqu a un pH de 6,9 et une concentration de l'alcool dans le mélange de 25%. La température du mélange est d'environ -5 C. La précipitation s'effectue deux fois. Les précipités isolés après la deuxième et la troisième précipitation sont traités à l'alcool éthylique jusqu'à une concentration de 17% de celui-ci dans le mélange, un pH de 5,2, à une température jusqu'à -60G. On sépare le précipité. le liquide surnageant est traité par l'alcool éthylique jusqu une concentration de 17% , le pH étant de 5,2, la température étant de -6 C. Le précipité déposé se compose principalement de gamma-globuline. Le précipité est séparé par centrifugeage à une température de -60C . Le pH-du liquide surnageant est porté jusqu'à la valeur de 7,4 + 0,2 par addition de bicarbonate de soude, et la concentration de l'alcool éthylique est portée à 20 ou 254fa en ajoutant de l'alcool éthylique à 95. La température est maintenu à environ Soc. Le précipité déposé se compose principalement de la partie la plus soluble de la gamma-globuline. Le précipité est séparé par centrifugeage à une température de -5 C. A partir de ce précipité, on prépare une solution contenant 16,5g de gamma-globuline dans 100 ml, et qui est stérilisée. la gamma-globuline préparée par le procédé connu, n'exerce pas d'action spécifique active contre différentes maladies infectueuses et particulièrement contre les infections staphylocoques. La gamma-globuline précitée contient des titres bas en anticorps alphaantitoxiques, anti-staphylococaes allant jusqu'à 4 ou 10 ME/ml ; de ce fait, elle n'exerce aucune action préventive active contre les infections staphylocoques, en particulier contre la septicémie staphylocoque. Le but de la présente invention est de remédier aux inconvénients précités. On s'est donc proposé, en augmentant la teneur en alpha-antitoxine staphylocoque de la fraction de gamma-globuline, d'obtenir une immuno-globuline humaine à action spécifique active contre les infections staphylocoques. la solution consiste en ce que l'immuno-globine humaine anti-staphylocoque, contenant la fraction der gamma-globuline, isolée dans le plasma sanguin d'homme en solution physiologique, ou isotonique, est constituée, selon l'invention de la fraction de gamma-globuline isolée dans le plasma sanguin d'homme, immunisé à l'anatoxine staphylocoque, à une teneur titrée de 50 à 640 WE/ml en alpha-antitoxine staphylacoque et en agglutinine contre les staphylocoques titrée jusqu'à 1:20480. Dans le procédé d'obtention de l'immuno-globuline précité par fractionnement du plasma sanguin à l'alcool éthylique à une température inférieure à ODC, avec séparation ultérieure de la fraction de gamma-globuline, par épuration et dilution de celle-ci dans une solution physiologique ou isotonique, selon l'invention on utilise le plasma du sang de donneurs immunisés à l'anatoxine staphylocoque par introduction successive au veneur d'anatoxine staphylocoque en doses de 1,0 ; 1,0 et 2,Oml avec un-intervalle de 7 Jours entre les injections d'anatoxine. L' immuno-globuline humaine anti staphylocoque proposée a été essayée sur des animaux et dans les conditions cliniques sur des hommes. Les études expérimentales sur les animaux ont montré que l'action préventive de l'immuno-globine antistaphylocoque contre les infections staphylocoques est de 3 -fois plus élevée que celle de la gamma-globuline non-spécifique ordinaire. L'immuno-globuline antistaphylocoque proposée est titrée de 50 à 640 ME/ml en alpha-antitoxine et de 1:20480 en agglutinine contre les aphylocoques, ce qui dépasse notablement le titrage en alpha-antitoxine dans la gamma-globuline ordinaire dont le titre en n " antitoxine est de 4 à 1Q MEgml. LXaetion préventive de l'immuno-globuline antistaphylocoque contre les infections staphylocoques est plus forte que celle de la gamma-blobuline non-spécifique. Ceci est confirmé par les observations cliniques lors des traitements des malades atteints de septicémie staphylocoque. La dose unique curative de l'immuno-globine antistaphylocoque, à titre de 100 ME/ml d'alpha-antitoxine, a été administrée aux enfants à raison de 3 ml d'une solution à 10 et de 6 ml d'une solution à 10g pour les malades adultes. La préparation a été introduite par injection intramusculaire une fois par jour dans un ou deux jours. le cours du traitement comporte trois à cinq injections de la dose curative de la préparation. Dans les cas graves de l'infection staphylocoque généralisée, 1 'immuno-globuline antistaphylocoque est administrée Jusqu'à 10 doses curatives. Les observations ont montré que sous l'action de ltimmuno-ilobuline antistaphylocuqe, la température des malades s'est rapidement abaissée, les phénomènes de toxémie ont diminué, le cours de la septicémie staphylocoque aiguë a été coupé, l'état général des malades s'est sensiblement amélioré, les analyses du sang se sont normalisées graduellement ; lors d'ensemencements réitérés après la cure spécifique, on n'a pas décelé dans le sang des malades de staphylocoques pathogènes. 50 malades atteints de septicémie staphylocoque se trouvaient sous surveillance. Parmi eux, 35 enfants et 15 adultes. Parmi les 35 enfants malades, la thérapie spécifique à l'aide de l'immuno-globuline antistaphylocoque a été effectuée sur 26 nouveaux-nés prématurés et sur 9 enfants d'un age différent. La septicémie staphylocoque chez ces malades se déroulait tres gravement. Grace à la thérapie spécifique à l'aide de l'immunoglobuline antistaphylocoque, 40 malades parmi les 50 malades atteints de speticémie staphylocoque se sont rétablis, 10 ont eu une issue léthaXe (parmi eux deux malades sont décédés par suite des maladies principales). La léthalité totale- causée par la septicémie staphylocoque est de 16*, alors que d'après les données bibliographiques, la léthalité causée par la septicémie staphylocoque au cours de la thérapie complexe, y compris les antibiotiques, elle est comprise entre 50 et 70in, Le procédé de préparation de l'immuno-globuline précitée est réalisé de manière suivante. On choisit le contingent nécessaire de donneurs volontaires agies de 20 à 40 ans. Les donneurs subissent préalablement un contrôle médical, de laboratoire et sérologique conformément aux instructions concernant les donneurs de sang et de l'exécution de la plasmaphérèse. Si les indices hémablogiques et biochimiques sont -normaux, on accomplit l'immunisation des donneurs à l'anatoxine staphylocoque par injections subcutanées dans la partie sousscapulaire en doses de 1,0 ; 1,0 et 2,0 ml avec un intervalle de 7 jours entre les injections d'anatoxine. 7 jours après la fin de l'immunisation, on effectue le contrôle du sérium sanguin des donneurs afin de déceler la présence de 1 1alpha-antitoxine staphylocoque. Les donneurs ayant un titre en alpha-antitoxine staphylocoque non inférieur à 5 du par Q1 de sérium sanguin sont admis à la plasmaphérèse dans le but d'obtenir un plasma antistaphylocoque hyperinmun. La teneur en alpha-antitoxine staphylocoque du sérium sanguin des donneurs, immunisés à l'anatoxine staphylocoque, est déterminée à l'aide de la réaction de neutralisation de la lysie des érythrocytes de lapins. Au cours de cette réaction, on utilisela méthode de la neutralisation des propriétés hémolytiques de l'alpha-toxine staphylocoque, dont t h est exactement déterminé. La toxine staphylocoque, appliquée pour la standardisation, est diluée à l'aide d'une solution physiologique dans un rapport de 2 h/5. La plasmaphérèse est réalisée selon une méthode généralement connue. Selon cette méthode, l'obtention du plasma antistaphylocoque est effectuée dans un système stérile fermé, avec mise en oeuvre de sachets doublés en matières plastiques. La plasmaphérèse est accomplie sur les donneurs 2 à 4 fois par mois avec un Intervalle de 7 à 14 jours. D'après cette méthode, on obtient chaque fois du donneur jusqu'à 250 ml de plasma immun -antistaphylocoque. Le plasma immun est conserve jusqu'au fonctionnement à l'état congelé dans des sachets en matières plastiques à une température de -20 à -300C. Pour extraire la fraction de gamma-globuline du plasma antistaphylocoque, on fractionne le plasma à l'aide de l'alcooléthylique à des températures au-dessous de zéro. Au premier stade de fractionnement, on extrait le fibrinogène. Au second stade de fractionnement, on effectue la précipitation des globulines. A ce stade de fractionnement, le précipité contient la majeure quantité des béta - et gamma-globulines. Le précipité de fraction contenant, à part les bétaet gamma-globulines, de la prothrombine, de la profibrinolysine et d'autres protéines est utilisé pour un fractionnement ultérieur. Au troisième stade de fractionnement du plasma, on extrait la prothrombine. Avec les précipités des fractions du second et du troisième stade on forme une suspension en volume équivalent à l'aide d'une solution de chlorure de sodium à 2% refroidie jusqu'à OOC. On additionne à la suspension obtenue 1,5 volume (d'après le poids du précipité) d'eau distillée refroidie jusqu'à OOC. Le pH de la suspension est de 5,0 à 5,1. Dans ce but, on mesure le volume du mélange obtenu et on y additionne en mélangeant une solution-tampon d'acétate refroidie jusqu'à 0 C à raison de 1,5 1 par 1 de suspension (11,5 ml de solution bimclaire de CH COOH, 11,5 ml de solution bimolaire de CK3COONa). Le mélange est maintenu à OOC pendant 12 heures. tans ces conditions la prothrombine précipite, on la sépare par centrifugeage sur une supercentrifuge à 20.000 tr/mn et à OOC, tandis que le produit de centrifugeage est utilisé dans la fabrication de l'immono-globuline et de la fibrinolysine. Au cours du quatrième et du cinquième stade de fractionnement du plasma, on extrait l'immuno-globuline antistaphylocoque. On additionne au produit de centrifugeage à OOC un volume équivalent d'alcool à 26 refroidi jusqu'à une température de -30C ; le pH du mélange est corrigé par une solution unipolaire de NaOH ou de HCl jusqu une valeur de 5,0 à 5,1. Lors de l'addition de l'alcool, la température du mélange baisse de O à -40C. Dans ces conditions se précipitent les bétaglobulines, les lipoïdes, la profibrinolysine et une petite partie de la gamma-globuline. Le précipité est séparé sur une supercentrifuge à une température de -40C et est utilisé dans la production de la fibrinolysine. Le produit de centrifugeage est filtré sur la pite à papier à une température de -3 à -50C, jusqu'à obtention d'un filtrat transparent. On augmente le pH jusqu'à 6,9-7,0 en ajoutant dans le filtrat transparent une solution unimolaire de Na003. On additionne, ensuite, de l'alcool à 96% refroidi Jusqu'à une température de -150C, à raison de 0,16 ml par 1 de solution, ce qui équivaut à une concentration à 25% d'alcool dans le mélange. La température de ce mélange doit entre à -9 a. Dans ces conditions l'wnmuno-globuline est précipitée et séparée sur une centrifuge. Le précipité d'immuno-globuline humide purifiée est pesé, dissout dns une solution physiologique stérile dans un rapport de 1 : 1,5 ; la solution est conditionnée par 200 ml dans des flacons de 500 ml, puis elle est congelée à une température de -35 à -40 C et est séchée par lyophilisation. A partir de l'immuno-globuline séchée, on prépare une solution à 10% en diluant la poudre sèche dans de l'eau apyrogène distillée dont la quantité doit être équivalente à celle de la solution physiologique ajoutée au précipité humide avant le séchage. On additionne 0,9 g de chlorure de sodium dans 100 g de poudre sèche. La teneur en protéine de la solution obtenue est définie à l'aide d'un réfractomètre et, Si nécessaire, elle est corrigée à l'aide de la solution physiologique jusqu iot 1% en poids. La solution obtenue est filtrée dans un pré-box sur de la pate à papier et dans un box à travers des bougies céramiques stérilisantes sous vide. La solution stérile est répartie par 3 ml dans des ampoules qui sont soudées. On obtient à partir de 1 1 de plasma 8 à 10 doses d'immuno-globuline antistaphylocoque. Dans 1; préparation finie, on détermine le pourcentage en protéine, la stérilité, la pyrogénité, la toxicité et la pureté de la fraction par électrophorèse sur papier. L' immuno-globulime antistaphylocoque retenue représente une solution transparente ou légèrement opalescente, incolore ou de couleur jaune pale. L'immuno-globuline antistaphylocoque doit être spécifique stérile, inoffensive et apyrogène. Elle est titrée à au moins 50 ME d'anticorps anti-alpha-toxiques antistaphylocoques par ml d'après la réaction de neutralisation de l'action hémolytique de l'alpha-toxine staphylocoque sur les érythrocytes du lapin. La teneur en protéines de la solution d'immunoglobuline antistaphylocoque doit correspondre à 1 g1s. La teneur en fraction de gamma-globuline, définie par la méthode de l'électro-phorèse, ne doit pas être inférieure à 97% de la quantité de protéines totales. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description, qui va suivre, d'un exemple non limitatif d'obtention de 1' immuno-globuline himaine antistaphyloc oque conforme à l'invention. EXEMPLE Pour obtenir l'immuno-gllbuline antistaphylocoque, on choisit le contingent nécessaire de donneurs volontaires agés de 20 à 40 ans. Les donneurs subissent le contrôle médical indispensable conformément aux exigences des instructions de don de sang et de la plasmaphorèse. Ensuite les donneurs sont immunisés à l'antitoxine staphylocoque adsorbée selon le schéma 1,0 ; 1,0 et 2,0 ml avec un intervalle de 7 jours entre les injections de l'antigène. Si le sang des donneurs contient plus de 5 ME/ml d'alpha-antitoxine staphylocoque lors de la réaction de neutralisation des propriétés hémolytiques de l'alpha-toxine staphylocoque, les donneurs. sont admis à 11 opération de plasmaphérèse pour obtenir et accumuler la quantité nécessaire de plasma antistaphylocoque hyperimmun.Le plasma obtenu est conservé avant le fractionnement dans des sachets en matière plastique à l'étant congelé à une température de -20 à -300C. Pour extraire la fraction de gamma-globuline, 10 1 de plasma anti staphylocoque hyperimmun indiqué sont traités à l'alcool éthylique jusqu'à une concentration de 8 d'alcool dans le plasma, à une température de -3 C, le pH étant de 7,20 Le fibrinogène précipité est alors évacué. Le liquide surnageant est traité à l'alcool éthylique Jusqu a une teneur de 2500 en celui-ci du mélange à une température de -50C, à pH de 6,9. Le dépôt formé contient la quantité principale des gamma- et béta-globulines. Le précipité est séparé, et le liquide surnageant est à nouveau traité à l'alcool éthylique. Avec les résidus de la seconde et de la troisième précipitation, en quantité de 500 g, on prépare une suspension dans 500 ml d'une solution à 2* de chlorure de sodium, refroidie Jusqu a O C.On additionne à la suspension obtenue 750 ml d'eau distillée, refroidie jusqu'à 000. On mesure le volume du mélange obtenu et on additionne en mélangeant une solution tampon d'acatate, refroidie jusqu'à OOC (11,5 ml d'une solution bimolaire de CH3COOH, 11,5 ml d'une solution bimolaire de CH3COO Na) à raison de 1,5 1 par litre de suspension La suspension a un pH de 5 à 5,1. le mélange est maintenu à 0 O pendant 12 heures. Dans ces conditions il se forme un précipité de prothrombines, qui est séparé à 0 C par centrifugeage sur une supercentrifuge à 20.000 tr/mn Le produit de centrifugeage, en quantité de 4 1 est traité par un volume équivalent d'alcool à 26%, refroidi jusqu'à 30C ; le pH du mélange est corrigé à l'aide d'une solution unimolaire de NaOH ou de HC1 jusqu'à un pH de 5 à 5,1. Lors de l'addition de l'alcool, la température du mélange baisse de 0 à -40C. Dans ces conditions précipitent les béta-globulines, les lipoRdes, la profibrinolysine et une petite partie de gamma-globuline. Le précipité séparé sur une supercentrifuge à une température de -4 C est utilisé dans la préparation de la fibrinolysine. Le produit de centrifugeage est filtré sur la pate à papier à une température de -3 à -5 C jusqu'à l'obtention d'un filtrat transparent. On augmente jusqu 6,9-7,0 le pH du filtrat transparent à l'aide d'une solution unimolaire de NaHC03. On additionne, ensuite, l'alcool à 96% refroidi Jusqu'à -15 C à raison de 0,16 1 par litre de solution, ce qui augmente la concentration de l'alcool à ?55ù dans le mélange. La température de ce mélange doit être égale à -90C, Dans ces conditions on sépare le précipité d'immuno-globuline. le précipité d'immuno-globuline purifiée humide, en quantité de 150 g dissout dans une solution stérile physiologique dans un rapport de 1:1,5, est conditionné par 200 ml dans des flacons de 500 ml, congelé à une température de -35 à 400C et séché par lyophilisation dans des cuves. A partir de l'îmmuno-globuline antistaphylocoque. séchée, on prépare une solution à 10% ou à 16% dans de l'eau distillée apyrogène. Pour 100 g de poudre sèche, on additionne 0,9 g de chlorure de sodium. La teneur en protéine de la solution obtenue est définie au réfractomètre et, si nécessaire, elle est corrigée à l'aide d'une solution physiologique Jusqu'à 10t La solution obtenue est filtrée dans un pré-box sur la pate à papier et dans un box à travers des bougies céramiques stérilisants sous vide. La solution stérile de l'immuno-globuline ntistaphylocoque est conditionnée par 3 ml dans des ampoules qui sont soudées. A partir de 10 1 de plasma immun on prépare 80 à 100 doses d'immuno-globuline antistaphylocoque. Dans les séries de la préparation obtenue, 1 ml d'immuno-globuline antistaphylocoque contient 50 à 640 unités antitoxiques (ME) et des agglutinines contre les staphylocoques titrées Jusqu'à t:20480. Les séries de l'immuno-globuline antistaphylocoque sont stériles, apyrogènes, non-toxiques et spécifiquement actives. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation décrit et représenté qui nta été donné qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens decrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esrrit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. REVENDICATIONS 1. Immuno-globuline humaine antistaphylocoque, contenant une fraction de gamma-globuline isolée dans du plasma sanguin d'homme, dans une solution physiologique ou isotonique, caractérisée en ce qu'elle est composée d'une fraction de gammaglobuline, isolée dans du plasma sanguin d'homme immunisé à l'anatoxine staphylocoque ayant une teneur en alpha-antitoxine staphylocoque titrée de 50 à 640 ME/ml et en agglutinines contre les staphylocuques titrées Jusqu'à 1:20480. 2. Procédé d'obtention de l'immuno-globuline humaine anti staphylocoque selon la revendication 1, par fractionnement du plasma sanguin à l'alcool éthylique à une température inférieure à OOC avec séparation ultérieure de la fraction gamma-globuline suivie d'une purification, d'un séchage et d'une dilution dans une solution physiologique ou isotonique, caractérisé en ce qu'on utilise le plasma isolé dans le sang de donneurs immunisés à l'anatoxine staphylocoque par injection successive de celle-ci au donneur en doses de 1,0 ; t,O et 2 ml avec un intervalle de 7 Jours entre les injections d'anatoxine.