FR 2311091 A1 19761210 FR 7614242 A 19760512 La présente invention concerne un procédé perfectionné de fermentation pour la production d'une matière à base de protéines, procédé dans lequel on utilise du méthane comme source de carbone et dans lequel la formation de mousse est soit supprimée soit réduite. La présente invention est également relative aux micro-organismes et aux mélanges de microorganismes a' utiliser dans ce procédé. On connaît des procédés pour la production d'une matière à base de protéines utilisant du méthane comme source de carbone. Dans de tels procédés, un micro-organisme utilisant du méthane est cultivé dans un bouillo2comprenant un milieu nutritif aqueux en présence de méthane et d'un gaz contenant de l'oxygène. Le bouillon est contenu dans un appareil de fermentation et est soumis à une agitation pendant l'opération. L'agitation peut être réalisée par le gaz ou le mélange de gaz appliqués au bouillon seul ou en combinaison avec un agitateur tel qu'une turbine. La présence de mousse dans les procédés de fermentation put entre une caractéristique indésirable. Dans les cas extrê- mes, l'accumulation de mousse dans l'appareil de fermentation est si importante que la mousse déborde. Dans tous les cas, la présence de mousse peut réduire l'efficacité de l'agitation et conduire à un manque d'homogénéité dans le bouillon, ce qui peut affecter la croissance et le rendement du processus de culWe . Diverses techniques chimiques et divers dispositifs ecaniques ont été proposés afin de régler la quantité de mousse dans les fermentations.A titre d'exemple, on a ajouté dans le bouillon des agents anti-mousse tels que de l'huile siliconée. Cependant, ces agents peuvent gener le métabolisme du processus de culture dans une mesure telle que le taux de production des cellules microbiennes soit réduit. En outre, l'agent anti-mousse peut entre transporté dans la biomasse produite par le procédé et peut la contaminer. On a proposé plusieurs dispositifs mécaniques pour régler la quantit de mousse mais ils ne sont pas totalement satisfaisants car ils sont comateux à installer et à utiliser et ils sont sujets à des pannes. On a trouvé que dans les procédés de production d'une matière à base de protéines dans lesquels le méthane est utilisé comme source de carbone, la foliation de mousse peut être rarticulièrement gênante. les substances favorisant l'apparition de mousse sont formées par le micro-organisme utilisant le éthane pendant la culture. Ces substances sont sécrétées dpns le bouillon par le micro-organisme vivant et y sont dispersées sous la forme de produits de lyse lorsque le microorganisme meurt. On a trouvé que le formation de mousse dans les ferrentations utilisant du méthane peut être supprimée ou réduite 1iar l'utilisation dans la culture du procédé de mélan- ges de souches de micro-organismes. la présente invention crée un procédé de production d'une matière à base de protéines utilisant du méthane comme source de carbone qui consiste à cultiver dans un bouillon comprenant un milieu nutritif aqueux, en présence de méthane et d'un gaz contenant de l'oxygène libre, un micro-organisme utilisant le méthane et au moins un micro-organisme qui peut utiliser les substances favorisant l'apparition de mousse formées par le micro-organisme utilisant le méthane. L'opération peut être soit discontinue soit continue. Il est préférable pour des raisons d'économie de travailler en continu sous des conditions constantes. Tout milieu aqueux qui est connu comme étant approprié pour la culture de micro-organismes utilisant du méthane est approprié pour être utilisé dans le procédé selon la présente invention. La source d'azote est habituellement une forme d'azote combinée, par exemple, des ions nitrate ou aiamonium. Cependant l'azote élémentaire tel que l'azote présent dans l'air convient lorsque le micro-organisme est capable d'utiliser cette source d'azote. les substances favorisant l'apparition de mousse sont habituellement des produits de lyse du micro-organisme utilisant le méthane. Ces substances sont des protéines, des lipides, des acides nucléiques et des hydrates de carbone. Le pH du bouillon pendant la culture peut être maintenu à une voleur comprise dans la gamme de 4,5 à 8,0 et notamment dans la gamme de 5,5 à 7,0. On peut ajouter au bouillon selon les besoins, pour maintenir le pH, un acide ou un alcali tel que, par exemple un hydroxyde d'un métal alcalin ou de l'am- monial ou de l'hydroxyde d'anmonilin. On préfère travailler à un pH de l'ordre de 6,5 et à une température d'environ 450C lorsque le micro-organisme utilisant le méthane est une souche de Methylococcus. Lorsque soit l'ammoniac, soit l'hydroxyde d'ammonium est utilisé pour régler le pH, les ions ammonium dans le bouillon peuvent également servir en tant que source d'azote. les ions ammonium peuvent empêcher ou réduire le taux de croissance du micro-organisme utilisant du méthane. En conséquence, la concentration en ammonium dans le bouillon ne doit pas dépasser avantageusement 100 milligrammes par litre et doit être compris, de préférence, dans la gamme de 2 à 50 milligrammes par litre. La température peut se situer dans la gamme de 300C à 550C, cependant le procédé est habituellement réalisé à une température comprise dans la gamme de 350C à 500C et, en particulier, dans la gamme de 450C à 500C. le méthane peut etre amené sous la forme de méthane ou d'un gaz contenant du méthane tel que, par exemple, du gaz naturel ou de gisement. le gaz contenant de l'oxygène libre est normalement de l'air. Lors d'une opération continue à des taux de production acceptables industriellement utilisant des mélanges méthane/air, la proportion de méthane amenée au bouillon est normalement de 16 volumes par rapport aux 84 volumes d'air. La proportion du méthane vis-à-vis de l'air peut être comprise dans la gamme de 8 à 40 volumes de méthane pour 92 à 60 volumes d'air. Lors de l'utilisation de mélanges gaz naturel/air, la proportion de gaz naturel amenée au bouillon est normalement de 17 volumes par rapport aux 83 volumes d'air. La proportion du gaz naturel par rapport à l'air peut être de 8,5 à 42 volumes de gaz naturel pour 91,5 à 58 volumes d'air. 'agitation peut provenir uniquement du méthane ou du gaz contenant du méthane et du gaz contenant de 1'oxygène libre amené dans le bouillon. Cependant, un agitateur peut être employé. Lorsqu'on utilise une turbine, des vitesses de rotation typiques peuvent être comprises dans la gamme de 100 à 3000 tours par minute. Lors de la mise en oeuvre du procédé, le milieu nutritif aqueux contenant les produits nutritifs, nécessités par le micro-organisme utilisant du méthane pour la croissance, peut être inoculé avec un melaiige de micro-organismes comprenant un micro-organisme utilisant le méthane et un ou plusieurs micro-organismes qui peuvent utiliser les substances favorisant l'apparition de mousse, formées par le micro-organisme utilisant le méthane et la culture ,est commencée en présence de méthane et d'un gaz contenant de l'oxygène, habituellement de l'air. A titre de variante, le milieu peut être inoculé à une culture pure d'un micro-organisme utilisant du méthane et la culture peut être commencée sous des conditions non aseptiques. Un ou plusieurs micro-organismes qui peut ou qui peuvent utiliser les substances favorisant l'apparition de mousse, formées par le micro-organisme utilisant le méthame,se développent naturellement sous ces conditions à mesure que la croissance du micro-organisme utilisant du méthane se poursuit. Lors d'une opération normale, la proportion autant au nombre de cellules du micro-organisme utilisant du méthane présentes dans le bouillon par rapport au nombre'de cellules du micro-organisme ou des micro-organismes qui peut ou qui peuvent utiliser les substances favorisant l'apparition de mousse peut être comprise dans la gamme de 40 à98% et notamment dans la gamme de 80 à 9%. La proportion des cellules du microorganisme ou des micro-organismes qui peut ou qui peuvent utiliser les substances favorisant l'apparition de mousse semble augmenter avec des variations dans les conditions de travail oui conduisent à une lyse des cellules du micro-organisme utilisant le méthane. Tout micro-organisme utilisant du méthane peut être employé dans le procédé selon la présente invention. Le microorganisme peut être avantageusement un élément du groupe Methylomonas, Methylobacter, Methylosinus ou Nethylococcus comme décrit par Whittenbury et Collaborateurs dans : " Journal of General Microbiology (1970) Vol, 61 page 213. Un groupe particulièrement préféré est Methylococcus (Whittenbury). Une espèce préférée est Methylococcus capsulatus. Cette espèce fut décrite tout d'aoord par J.W. Foster et R.H. Davis dans "J. Bacteriology 1966,Vol.91, page 1924,,et ensuite par Wittenbury et Collaborateurs dans "J. Gen.Microbiology" 1970, Vol. 61, page 205.Un micro-organisme particulièrement convenable est la souche Foster et Davis de Methylococcus capsulatus qui a été déposée à la collection de cultures "American Type Culture Collection " où elle porte le numéro 19069. Une autre souche particulièrement convenable de Methylococcus a été déposée au rational Collection of Industrial Bacteria, kberdeen, Ecosse " où elle a reçu le numéro NCIB 10856. Le Methylcoccus capsulatus numéro NCIB 10856 est une nouvelle souche oui a été isolée dans les laboratoires de la demande- resse à partir d'un échantillon de sol.Sauf les exceptions mentionnées ci-après, les caractéristiques physiologiques et morphologiques de la souche numéro NCIB 10856 sont les mêmes que celles de la souche ATCC numéro 19069. La nouvelle souche NCIB 10856 diffère de la souche connue ATCC 19069 en ce qu'elle donne lieu à une productivité supérieure et un meilleur rendement que la souche ATCC 19069 dans une culture continue. Les deux souches forment une matière capsulaire de polysaccharides extra-cellulaires mais la nouvelle souche produit moins de matière capsulaire que la souche connue. La nouvelle souche peut être séparée plus facilement par centrifugation du bouillon qui la contient que la souche ATCC 19069 On suppose que cette caractéristique est due à la plus petite quantité de matière capsulaire produite. Le micro-organisme qui peut utiliser les substances favorisant l'apparition de mousse peut être un ou plusieurs des éléments du genre Acinetobacter, Alcaligenes, Agrobacterium Moraxella, Pseudomonas, Flavobacterium; Bacillus, Microccus ou Pediococcus. Jusqu'à LcOO/o du nombre total des cellules microbiennes présentes dans le bouillon peuvent être constituées d'une ou plusieurs bactéries utilisant des substances favorisant l'apparition de mousse qui sont choisies à partir du genre Acinetobacter, Alcaligenes, Agrobacterium, Moraxella ou Pseudomonas. les bactéries utilisant les substances favorisant l'apparition de mousse des genres Flavobacterium, hrcillus, Micrococcus et Pediococcus sont le plus souvent présentes selon une proportion représentant jusqu'à 1% du nombre total des cellules. Le micro-organisme utilisant les substances favorisant l'apparition de mousse est avantageusement un élément du genre Acinetobacter, Alcaligenes, Agrobacterium, Moraxella ou Pseudomonas. Des exemples de ces micro-organismes oui ont été isolés dans les laboratoires de la demanderesse et déposés au "National Collection of Industrial Bacteria (NCIb) Aberdeen, Ecosse " sont une souche de Moraxella NCIB numéro 11135, une souche d'Alcaligenes, d'Agrobacterium ou de Pseudomonas NCIB numéro 11136, une souche d'dlcaligenes, d'Agrobacterium ou de Pseudomonas NCIB numéro 11137, une souche d'Alcaligenes ou de Pseudomonas NCIS numéro 11138, une souche d'Alcaligenes NCIB numéro 11139, une souche dthcinetobacter NCIB numéro 11140, une souche d'Alcaligenes, d'Agrobacterium ou de Pseudomonas NCIB numéro 11141 et une bactérie en forme de bâtonnets variables à coloration Gram non identifiée NCIB numéro 11134. Ces souches sont identifiées en utilisant des essais bactériologiques habituels selon les ouvrages : Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8ème Edition; Skerman, " The Genera of Bacteria, 2ème Edition, Williams et Wilkins CO., Baltimore ; "Identification of Medical Bacteria ",C owan et Steel, Cambridge University Press 1966 et " The Distribution and Identification of Non-Fermenting Bacteria" J.J.J. Snell, Public Health Laboratory Service Monograph, Series number 4, H.M.S.O., Londres.Les micro-organismes utilisant les substances favorisant l'apparition de mousse peuvent être employés seuls ou en combinaison. L'invention est représentée et décrite en détail dans les exemples non limitatifs ci-après. EXEMPLE 1 On cultive, dans cinq litres (volume de travail) dtun bouillon qui est contenu dans un appareil de fermentation a une capacité de sept litres, un mélange de bactéries se composant d'une souche de bactérie Methylococcus capsulatus ATCC 19069 utilisant du méthane et de l'azote élémentaire et de bactéries qui peuvent utiliser les substances favorisant l'apparition de mousse, formées par Methylococcus. L'opération est continue et non aseptique. Le bouillon est maintenu à une température de 450 C. L'agitation est obtenue par une turbine tournant à une vitesse de 1000 tours par minute. On ajoute un milieu nutritif aqueux frais au bouillon selon un taux de dilution de 0,18h . Le milieu présente la composition suivante: KH2P 4 175,0 milligrammes Na2HPO4, 12H20 150,0 MgSO4, 7H20 85,0 milligrammes CaC12 (anhydre) 20,0 CuSO4, %H2O 2,0 FeSO4, 7H20 ZnS04, 7H20 0,5 MnSO4, H2O 0,5 CoCl2, 6H2O 0,02 Na2MoO4, 21120 0,2 n Eau distillée quantité suffisante pour un litre. le p11 est ajusté à 6,4 en utilisant une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium2,0 N. L'azote est amené sous la forme d'hydroxyde d'ammonium et d'air. La quantité d'hydroxyde d'ammonium amenée au bouillon est suffisante pour satisfaire à 95% du besoin en azote des bactéries présentes. Les 5% restants sont satisfaits par l'azote élémentaire présent dans l'air. Le méthane est amené à un débit de 6 volumes par volume par heure et l'air à un débit de 24 volumes par volume par heure. La fermentation est stable et donne,sous une opération à conditions constantes, une densité cellulaire de 3,4 grammes par litre et une productivité d'environ 0,61 gramme par litre par heure. Dans tous les exemples, le poids des cellules est exprimé en tant que le poids sec. On n'observe pas de formation de mousse par les bactéries. On double la concentration du milieu nutritif aqueux et de l'hydroxyde d'ammonium amené au bouillon. Il en résulte une augmentation de la densité cellulaire selon une valeur de 6,5 grammes par litre et une productivité de 1,17 grammes par litre par heure. On n'observe pas la formation de mousse par les bactéries. La population bactérienne présente dans le bouillon se compose d'environ 85% quant au nombre des cellules de la souche de bactérie Methylococcus capsulatus ATCC 19069 utilisant le méthane et l'azote élémentaire et d'environ 15% quant au nombre de cellules d'un mélange de bactéries n'utilisant pas le méthane. Les bactéries n'utilisant pas le méthane sont isolées en diluant un échantillon du bouillon selon un facteur de 108, en étalant l'échantillon dilué sur de la gélose " Plate Count Agar" (Difco Laboratories) et en laissant incuber pendant quarante huit heures à 450C 90US des conditions aérobies en l'absence de méthane. Des colonies seules sont enlevées de la gélose et cultivées de manière répétée sur uli milieu frais jusqu'à l'obtention d'une culture pure.Les cultures de bactéries isolées de cette façon ont été déposées au "National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, Ecosse n où elles ont reçu 1's numéros suivants : 11135, 11136, 11137, 11138, 11139, 11140 et 11141. les bactéries sont ensuite identifiées selon les ouvrages: "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8ème Edition", Skerman " The Genera of Bacteria 2ème Edition Williams et Wilkins Co, Baltimore"; Cowan et Steel t'Identifi- cation of Medical Bacteria ", Cambridge University Press 1966 et " the Distribution and Identification of Non-Fermenting Bacteria", J.J.J.Snell, Public Health Laboratory Service Monograph series number 4, H.M.S.O, Londrès Les résultats obtenus à partir de ces essais sont indiqués au tableau 1 ciaprès. le mélange des bactéries n'utilisant pas le méthane consiste en 3% quant au nombre de cellules d'une souche de bactérie NCIB 11134 en forme de bâtonnets variables à coloration Gram non identifiée et en 125' quant au nombre d'un mélange constitué d'une souche Moraxella NCIB numéro 11135, d'une souche d'hlcaligenes, de Pseudomonas ou d'Agrobacterium NCIB numéro 11136, d'une souche de Pseudomonas ou d'Alcaligenes NCIB numéro 11138, d'une souche d'Alcaligenes NCIB numéro 11139, d'une souche d'Acinetobacter NCIB numéro 11140, d'une souche de Pseudomonas, d'Alcaligenes ou d'Agrobacterium NCIB numéro 11141. A titre de comparaison, on effectue un essai pour réaliser une fermentation sous des conditions identiques à celles décrites plus haut sauf que la culture est mise en oeuvre sous des conditions aseptiques et le seul micro-organisme présent est la souche de bactérie Methylococcus capsulatus ATCC numéro 19069 utilisant du méthane et de l'azote élémentaire. Gn réalise une opération continue selon un taux de dilution de O,18h avec une densité cellulaire d'environ 3,3 grammes par litre et une productivité d'environ 0,59 gramme par litre par heure. La fermentation n'est pas stable en raison de la quantité de mousse formée par la culture. La présence de cette mousse provoque des difficultés pour contrôler les paramètres dans l'appareil de fermentation et on ne peut donc pas obtenir le taux de dilution envisagé ainsi qu'une opération sous des conditions constantes.La mousse réduit également l'efficacité du pompage selon une mesure telle qu'on ne peut pas maintenir un travail constant. On double la concentration du milieu nutritif amené au bouillon. il en résulte une augmentation dans la densité cellulaire selon une valeur de 5,5 grammes par litre. Cette augmentation de la densité cellulaire est suivie par une formation de mousse incontrôlable ayant pour consécuence la fin de la fermentation. Ceci démontre que la présence d'un mélange de micro-organisme réduit suffisamment la formation de mousse pour une opération continue satisfaisante. TABLEAU 1 Caractéristiques 11134 11135 1. Aspect microscopique Bâtonnets 0,35-0,5 x 1-1,25 Bâtonnets 0,35-0,5 x Extrémités arrondies, côtes 1,25 - 1,5 , côtrés parallè parallèles, certains sont lé- les, apparaissant seuls. gèrement incurvés, seuls, cuel ques chaînes peuvent comportes jusqu'à huit cellules. 2. Morphologie des colonies-GYLA Rondes, uniformes, brillantes, Rondes, uniformes, brillan Diamètre 2 - 3 mm, protubérances tes, aigulles faiblement marge entière, beige avec centre convexes, marge entière, jaunâtre. brun pâle translucide, colo nies dures noyées dans la gélose. -NA Comme GYLA mais translucides Comme GYLA mais d'un avec une couleur gris opaque. diamètre de 1 mm. 3. Coloration Gram-Méthode A V -Méthode B - 4. O/F glucose F NR 5. Notilité + 6. Arginine - 7. Sel d'ammonium-Sucres-Maltose - 8. -Ethanol - - TABLEAU 1 (suite) 9. Tween 80 hydrolyse + 10. Gélatine liquéfaction - 11. ONPG - 12. Oxydase - Plaque + + - Papier filtre + + 13. Croissance sur de la gélose Mac Conkey - 14. Malonate w + 15. Croissance dans du cyanure de potassium - 16. Uréase + 17. Caséinase - 18. Catalase - 19. Hydrogène sulfuré - 20. Indole - 21. Acétyl-méthyl-carbinol - 22. Réduction en nitrates + + 23. Sensibilité à 2,5 u i dans la pénicilline - 24. Croissance anaérobie GYLA w Croissance anaérobie MJE gélose + 0,2 % glucose - 25. Croissance sur MJE gélose dans 50% méthane - i TABLEAU 1 (suite) 26. Croissance sur MJE dans de la vapeur de butanol i 27. Croissance sur MJE dans de la vapeur d'acétone - 28.Croissance sur MJE dans de la vapeur de méthanol - 29. Croissance sur MJE dans de la vapeur d'éthanol - 30. Croissance sur MJE dans de la vapeur d'éthane - 31. Croissance sur MJE dans de la vapeur de formaldéhyde - 32. Croissance sur MJE dans de la vapeur d'acide formique - 33. Croissance sur MJE dans gélose + 0,2% glucose(poids/volume) - + 34. Croissance dans MJE liquide sans rajout - 35. Croissance dans MJE liquide + 0,2% glucose w 36. Croissance dans MJE liquide + 0,2% arabinose w w 37. Croissance dans MJE liquide + 0,2% galactose - - TABLEAU 1 (suite) 38. Croissance dans MJE liquide + 0,2% lactose w 39. Croissance dans MJE liquide + 0,2% xylose - 40. Croissance dans MJE liquide + 0,2% sucrose - 41. Croissance dans MJE liquide + 0,2% mannitol - 42. Croissance dans MJE liquide + 0,2% glycérol + 43.Croissance dans MJE liquide + 0,2% salicine - 44. Croissance dans MJE liquide + 0,2% lévulose - i 45. Présence de flagelles (par microscopie électronique) 1 latéral NT 46. Sporulation sur milieux contenant du manganèse - 11136 11137 1. Aspect microscopique Bâtonnets 0,35-0,5 Bâtonnets 0,5 x 1-1,5 , x1,25 , extrémités extrémités arrondies, côtés arrondies, seuls ou parallèles. en paires. 2. Morphologie des colonies - GYLA rondes, uniformes, rondes, devenant mal défi étincelantes, diamètre nies, étalement,étincelantes TABLEAU 1 (suite) 1-2 mm (occasionnelle- mucilagineuses, faible ment 2-3mm), faiblement ment convexes, beige. convexes, marge entière, beige. -NA rondes, uniformes, rondes, uniformes, bril brillantes, se réunissant lantes, faiblement conve facilement, 1 mm, gris xes, 1mm, grisâtre. translucide. 3. Coloration Gram - méthode A coloration irrégulière Coloration v plus sombre aux bipôles - méthode B - v 4. O/F gluclose Alk Alk 5. Motilité (+) + 6. Arginine - 7. Sel d'ammonium - Sucres-Maltose - 8. Ethanol - 9. Tween 80 hydrolyse - 10. Gélatine liquéfaction - 11. ONPG - 12. Oxydase-plaque + + -papier filtre - + TABLEAU 1 (suite) 13. Croissance sur de la gélose Mac Conkey - 14. Malonate + + 15. Croissance dans du cyanure de potassium - 16. Uréase + + 17. Caséinase - 18. Catalase + + 19. Hydrogène sulfuré - 20. Indole - 21. Acétyl-Méthyl-carbinol - 22. Réduction en nitrates - 23. Sensibilité à 2,5 u i dans la pénicilline - 24. Croissance anaérobique GYLA - MJE gélose + 0,2% glucose - 25. Croissance sur MJE gélose dans 50 % méthane - 26. Croissance sur MJE dans de la vapeur de butanol - 27. Croissance sur MJE dans de la vapeur d'acétone - 28.Croissance sur MJE dans de la vapeur de méthanol - - TABLEAU 1 (suite) 29. Croissance sur MJE dans de la vapeur d'éthanol - 30. Croissance sur MJE dans de la vapeur d'éthane - 31. Croissance sur MJE dans de la vapeur de formaldéhyde - 32. Croissance sur MJE dans de la vapeur d'acide formique - 33. Croissance sur MJE dans gélose + 0,2% glucose (poids/volume) + + 34. Croissance dans MJE liquide sans rajout - 1 35. Croissance dans MJE liquide + 0,2% glucose + + 36. Croissance dans MJE liquide + 0,2% arabinose + + 37. Croissance dans MJE liquide + 0,2% galactose + + 38. Croissance dans MJE liquide + 0,2% lactose + + 39. Croissance dans MJE liquide + 0,2% xylose - + 40. Croissance dans MJE liquide + 0,2% sucrose 1 w 41. Croissance dans MJE liquide + 0,2% mannitol - w 42. Croissance dans MJE liquide + 0,2% glycérol + + 43.Croissance dans MJE liquide + 0,2% salicine + w 44. Croissance dans MJE liquide + 0,2% lévulose + + 45. Présence de flagelles (par microscopie élec tronique) 1 ou 2 latérales 46. Sporulation sur milieux à base de manganèse - - TABLEAU 1 (suite) 11138 11139 1. Aspect microscopique Bâtonnets 0,5 x 1,5- Bâtonnets pléomor 2 , seuls ou en paires, phiques, extrémités certains en chaînes arrondies, côtés courtes. parallèles, appa raissant seuls. 2. Morphologie des colonies -GYLA Rondes, uniformes, rondes, uniformes, étincelantes, points étincelantes, faible aiguille, faiblement ment convexes, 2-3 mm, convexes, marge entière, se réunissent facile beige opaque ment, entières, crème. -NA Comme GYLA mais blanc/ comme GYLA mais se gris réunissent moins, plus ou moins trans lucides, grisâtre avec centre enfoncé. 3. Coloration Gram-méthode A + méthode B Coloration irrégu lière v 4. O/F Glucose Alk Alk 5. Motilité + + 6. Arginine - 7. Sel d'ammonium-Sucres-Maltose - 8. Ethanol + 9. Tween 80 hydrolyse - + TABLEAU 1 (suite) 10. Gélatine liquéfaction - 11. ONPG - 12. Oxydase-plaque + + -papier filtre 13. Croissance sur de la gélose Mac Conkey - + 14. Malonate + + 15. Croissance dans du cyanure de potassium - 16. Uréase - 17. Caséinase - 18. Catalase + + 19. Hydrogène sulfuré - 20. Indole - 21. Acétyl-méthyl-carbinol - 22. Réduction en nitrates + w 23. Sensibilité à 2,5 u i dans la pénicilline - 24. Croissance anaérobie GYLA - Croissance anaérobie MJE gélose + 0,2% glucose - 25. Croissance sur MJE gélose dans 50% méthane - 26. Croissance sur MJE dans de la vapeur de butanol - 27. Croissance sur MJE dans de la vapeur d'acétone - 28.Croissance sur MJE dans de la vapeur de méthanol - 29. Croissance sur MJE dans de la vapeur de éthanol - 30. Croissance sur MJE dans de la vapeur d'éthane - 31. Croissance sur MJE dans de la vapeur de formaldéhyde - 32. Croissance sur MJE dans de la vapeur d'acide formique - - TABLEAU 1 (suite) 33. Croissance sur MJE dans gélose + 0,2% glucose (poids/volume) - 1 34. Croissance dans MJE liquide sans rajout - 35. Croissance dans MJE liquide + 0,2% glucose - 1 36. Croissance dans MJE liquide + 0,2% arabinose + w 37. Croissance dans MJE liquide + 0,2% galactose w 1 38. Croissance dans MJE liquide + 0,2% lactose - 39. Croissance dans MJE liquide + 0,2% xylose - 40. Croissance dans MJE liquide + 0,2% sucrose - 41. Croissance dans MJE liquide + 0,2% mannitol - 42. Croissance dans MJE liquide + 0,2% glycérol - + 43. Croissance dans MJE liquide + 0,2% salicine - 44. Croissance dans MJE liquide + 0,2% lévulose - + 45. Présence de flagelles (par microscopie élec tronique) 1 polaire NT 46. Sporulation sur milieux à base de manganèse - 11140 11141 1. Aspect microscopique Bâtonnets pléomophiques, Bâtonnets 0,35 côtes parallèles arrondis x 1,75 , côtesités certains en chaînes non parallèles. 2. Morphologie des colonies -GYLA rondes, uniformes,bril- Mal définies, fai lantes, faiblement conve- blement convexes, xes, marge plus ou moins étincelantes, entière, 2 mm, centre mucoïdes, beige translucide, crème opaque. TABLEAU 1 (suite) -NA Comme GYLA mais centre mucoïdes se réunis translucide, marge oc- sant, étincelants, casionnellement irré- grisâtres. Colonie gulière. ocasionnellement en aiguille. 3. Coloration Gram-méthode A Coloration irréguliére v v méthode B Coloration irréguliére v Coloration irrégu lière v 4. O/F Glucose Alk Alk 5. Motilité + + 6. Arginine - 7. Sel d'ammonium-Sucres-Maltose - 8. Ethanol - 9. Tween 80 hydrolyse + 10. Gélatine liquéfaction - 11. ONPG - 12. Oxydase-plaque - + -papier filtre - 13. Croissance sur de la gélose Mac Conkey + 14. Malonate + + 15. Croissance dans du cyanure de potassium - 16. Uréase - + 17. Caséinase - - TABLEAU 1 (suite) 18. Catalase + + 19. Hydrogène sulfuré - 20. Indole - 21. Acétyl-méthyl-carbinol - 22. Réduction en nitrates - 23. Sensibilité à 2,5 u i dans la pénicilline - 24. Croissance anaérobie GYLA - Croissance anaérobie MJE gélose + 0,2% glucose - 25. Croissance sur MJE gélose dans 50% méthane - 26. Croissance sur MJE dans de la vapeur de butanol - 27.Croissance sur MJE dans de la vapeur d'acétone - 28. Croissance sur MJE dans de la vapeur de méthanol - 29. Croissance sur MJE dans de la vapeur de éthanol - w 30. Croissance sur MJE dans de la vapeur d'éthane - w 31. Croissance sur MJE dans de la vapeur de formaldéhyde - 32. Croissance sur MJE dans de la vapeur d'acide formique - + 33. Croissance sur MJE dans gélose + 0,2% glucose (poids/volume) - 34. Croissance dans MJE liquide sans rajout - 35. Croissance dans MJE liquide + 0,2% glucose 1 + 36. Croissance dans MJE liquide + 0,2% arabinose w + 37. Croissance dans MJE liquide + 0,2% galactose - + 38. Croissance dans MJE liquide + 0,2% lactose - 39. Croissance dans MJE liquide + 0,2% xylose - - TABLEAU 1 (suite) 40. Croissance dans MJE liquide + 0,2% sucrose - 41. Croissance dans MJE liquide + 0,2% mannitol + w 42.Croissance dans MJE liquide + 0,2% glycérol + 43. Croissance dans MJE liquide + 0,2% salicine - 44. Croissance dans MJE liquide + 0,2% lévulose w 45. Présence de flagelles (par microscopie élec tronique) NT 2 ou plusieures latérales. 46. Sporulation sur milieux à base de manganèse - - Explications des abréviations utilisées dans le tableau 1 ci-dessus. + réaction positive - réaction négative v variable w faible i non concluant F réaction de fermentation dans le milieu NR pas de réaction Alk essai aérobie en tube à réaction alcaline (+) certaines des cellules observées mais non la majorité sont mobiles (motilité) (NT) non éprouvé O/F oxydation/fermentation GYLA glucose-levure-lemco-gélose glucose 5g peptone 10 g extrait de levure (Difco) 5 g lab lemco 10 g gélose 20 g eau distillée 1000 ml autoclave à 1210C pendant quinze minutes NA gélose nutritive (oxolde CM3) MJE milieu minéral (solide et liquide) Composition Solution A Phosphate di-acide de potassium KH2PO4 16 g Phosphate acide disodique Na2HPO4, 12H20 11,6 g Eau distillée 100 ml Solution B Nitrate de sodium SaN03 11,8 g Eau distillée 100 ml Solution C Sulfate ferreux FeSO4, 7H2O 1,4 g Eau distillée 100 ml Solution D Sulfate de magnésium MgS04, 7R20 8 g Nitrate de calcium Ca(NO3)2,4H2O 2,5 g Sulfate de cuivre CuSO4, 5H20 0,4 g Sulfate de zinc ZnS04,7H20 0,034 g Sulfate de manganèse MnSO4,H2O 0,030 g Molybdate de sodium Na2MoO4,2H2O 0,024 g Eau distillée 600 ml Solution E Les solutions A à D sont stérilisées par une fil tration sur membrane et sont conservées en tant que quatre solutions de réserve stériles concentrées. Le milieu liquide nJE est obtenu en mélangeait 10 ml de solution A, 10 ml de solution B, 1 ml de solution C et 1,5 ml de solution D, en ajoutant de l'eau d'appoint pour obtenir un volume de 1 litre et en traitant ce milieu à l'autoclave à 1210C pendant quinze minutes. Le milieu solide MJE est obtenu en ajoutant 10g de gélose "Difco Noble ager" au milieu liquide MJE préparé comme décrit plus haut avant son traitement à l'autoclave. Coloration Gram (a) La méthode A est décrite dans "Laboratory Methode in Micro biology" harrigan, W.F. et No Cance, M.E. Academic Press, (1966). (b) La méthode B est telle que celle décrite dans "Methods for the morphological examination et aerobic Coryneform bacteria. Sampling-microbiological monitoring of environ nements". Curr, G.L. et Keddie, R.M. Societe for Applied Bacteriology Technical series N-7, Academic Press (1975). Motilité. Les cultures sont examinées pour -la motilité après une croissance pendant dix-huit heures à 300C sur des fragments NA. La base de chaque fragment est immergée dans de l'eau distillée stérile. La partie qui croît après incubation est prélevée de l'interface air-eau et est examinée par microscopie à contact de phase. Milieu à base de manganèse pour la sporulation - parties NA auxquelles on a ajouté 2 g d'ions Mn++ par ml (sous la forme de sulfate de manganèse). Les cultures reçoivent une incubation pendant une durée pouvant représenter jusqu'à quatorze jours à 300C et sont ensuite colorées pour les spores. Les cultures sont ensuite éprouvées pour la viabilité après une exposition à 800C pendait dix minutes. Le processus pour les autres essais est décrit dans Cowan, S.T. et Steel, K.J. "Manual for the identification of medical bacteria", Cambridge University Presse (1966) EXEI'JPlE 2 On ajoute 450G ml d'un milieu nutritif aqueux stérile dans un appareil de fermentation stérile d'une capacité de sept litres. Le milieu nutritif aqueux présente la composition décrite plus haut à l'exemple 1 sauf qu'il contiert 1.77C mg par litre d'acide nitrique.L'appareil de fermentation reçoit l'inoculation de 500 ml d'une culture pure se d'veloppant d'une manière active d'une souche de micro-organismes Nethylo coccus capsulatus ATCC numéro 19069 utilisant du méthane et de l'azote élémentaire et est ensuite mis en fonctionnement de façon aseptique sous des conditions discontinues avec une vitesse d'agitation de 500 tours par minute, un taux a'aération de dix volumes par volume par heure et un débit de circulation du méthane de dix volumes par volume par heure. Le pH du bouillon est maintenu à 6,5 par l'addition d'une solution d'hydroxyde de sodium 1,0 N ou d'une solution d'acide sulfurique 3,6 N selon les besoins.Lorsque la densité des cellules atteint 1,G g par litre, la vitesse d'agitation est augmentée à~1000 tours par minute. On réalise alors une opération continue à un taux de dilution de 0,05 h . le taux de dilution est augmenté à 0,1 h -I après douze heures d'opération en continu et,après douze heures supplémentaires, le taux d'aération est accru à vingt-quatre volumes par volume par heure et le débit d'alimentation de méthane à six volumes par volume par heure. Après quinze heures supplémentaires, le taux de dilution est augmenté à 0,18 h La densité des cellules est de 3,3 g par litre et le taux de production est environ de 0,59 g par litre par heure. L'opération est instable en raison de la présence de a mousse formée par la culture. Cette mousse empêche une opération sous des conditions constantes. A ce stade, on abandonne les conditions aseptiques et,après deux heures d'opération sous des conditions non aseptiques, la mousse commence à diminuer et plusieurs souches différentes de bactéries apparaissent dans le bouillon. Après vingt-quatre heures supplémentaires, une opération sous des conditions constantes est possible avec une densité des cellules de 3,4 grammes par litre et un taux de production d'environ 0,61 gramme par litre par heure. On ne constate pas la formation de mousse. Une analyse du bouillon donne une population bactérienne qui est identique à celle de l'exemple 1. Cet exemple démontre que la formation de la mousse peut être réduite efficacement par la présence d'un mélange de micro-organismes. EXEMPLE 3 On ajoute dans la cuve d'un appareil de fermentation, d'une capacité de sept litres, 4,5 litres d'un milieu nutritif aqueux présentant la composition suivante HNO3 3500,0 mg KH2PO4 350,0 mg Na2HPO4, 12H20 )'OO,G mg MgSO4,7H2O 170,0 mg CaC12(anhydre) 40,0 mg CuSO4,5H2O 4,0 mg FeSO4,7H2O 15,0 mg ZnSO4, ?H20 1,0 mg MnSO4,H2O 1,0 mg CoCl2 ,6H20 0,04 m Na2MoO4,2H2O 0,4 mg Eau distillée auantité suffisante pour un litre. Le pH du milieu est ajusté à 6,4 par l'addition d'hydroxyde de sodium aqueux 2,0 N. L'appareil de fermentation reçoit alors l'inoculation de 500 ml d'une culture à croissance aseptique d'une fiole sous agitation d'une souche Methylococcus capsulatus ATCC n 19069 et l'opération est commencée sous des conditions de développement discontinu à une vitesse d'agitation de 1000 tours par minute, une température de 45 C, un débit d'admission d'air de 10 volumes par volume par heure et un débit d'admission de méthane de 10 volumes par volume par heure. Le pH est réglé à 6,4 par l'addition d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 2,0 N ou d'une solution d'acide sulfurique 3,6 N ei utilisant un dispositif de dosage automatioue. Lorsque la densité des cellules atteint 2,0 grammes par litre, une opération continue est réalisée en amenant le milieu nutritif aqueux, de façon continue, dans le bouillon et en retirant le bouillon selon un taux qui maintient un volume de travail constant de cinq litres dans l'appareil de fermentation. Le taux de dilution initial est de O,05h .A mesure que la densité des cellules augmente, le taux de dilution, la vitesse d'agitation, le débit d'introduction du méthane et le débit d'introduction de l'air sont progressivement augmentés pour obtenir, après trente-six heures d'opération continue, un taux de dilution de 0,18h , une vitesse d'agitation de 2000 tours par minute, un débit d'admission d'air de quarante-huit volumes par volume par heure et un débit d'admission de méthane de douze volumes par volute par heure. A ce stade, le milieu nutritif aqueux est changé en celui qui ne contient pas d'acide nitrique. Le nouveau milieu présente la composition suivante KH2PO4 700 mg Na2HPO4,12H2O 600 mg MgSO4,7H2O 340 mg CaC12(anhydre) 80 mg CuSO4,5H2O 8 mg reSo4 ,17H20 30 mg ZnS04 ,7H20 2 mg MnSO4,H2O 2 mg CoCl2,6H2O 0,08 mg Na2NoO4,2H2O 0,8 mg Eau distillée quantité suffisante pour 1 litre. On ajoute séparément au bouillon de l'azote sous la forme d'hydroxyde d'ammonium. Le taux d'addition est suffisant pour qu'il couvre environ 95% de l'azote nécessaire pour la croissance du micro-organisme. Le taux est déterminé en estimant la densité des cellules de la culture se développant (par un procédé optique densimétrique) et en utilisant la densité des cellules pour mesurer le taux selon lequel l'azote a été incorporé dans la biomasse. Les 5% restants (approximativement) de l'azote nécessaire pour la croissance sont satisfaits par l'azote élémentaire présent dans l'air amené au bouillon. Après soixante heures supplémentaires, on obtient par une opération continue,sous des conditions constantes, une densité des cellules de 11,6? g de poids sec par litre et un débit de production de 2,1 g par litre par heure. On ne constate pas la formation de mousse par la culture. L'analyse des bactéries présentes dans le bouillon donne la même population que celle décrite à l'exemple 1. EXEMPLE 4 On répète le procédé décrit à l'exemple 3 sauf aue la souche de micro-organisme utilisant du méthane Methylococcus capsulatus ATCC numéro 19069 est remplacée par une nouvelle souche de Methylococcus capsulatus NCIB numéro 10856. La nouvelle souche est isolée d'un échantillon de sol. On obtient avec une opération continue, sous des conditions constantes, une densité des cellules de 13,14g de poids sec par litre par heure, ce qui correspond à un débit de production de 2,4 grammes par litre par heure. Il n'y a pas de production de mousse et l'analyse de la population bactérienne présente dans le bouillon indique qu'elle est identique à celle décrite à l'exemple 1 sauf que le micro-organisme utilisant le méthane est la souche Methylococcus capsulatus NCIB numéro 10856. Le bouillon cultivé à partir de l'appareil de fermentation lorsqu'il a reçu un traitement sous des conditions constantes est introduit dans une centrifugeuse à circulation continue Sharples Type 16 fonctionnant à 17.000 tours par minute. La centrifugation est réalisée selon deux débits différents d'ali- mentation, à savoir 571 ml par minute et 774 ml par minute. La concentration de la biomasse dans le bouillon introduit dans la centrifugeuse et la concentration de la biomasse dans l'effluent aqueux déchargé de la centrifugeuse sont mesurées conformément au poids des cellules sèches par litre. Le poids de la biomasse récupérée de la centrifugeuse est ensuite estimé à partir des mesures du poids des cellules sèches.Les résultats ainsi obtenus sont indiqués au tableau 2 ci-après. A titre de comparaison, le bouillon cultivé,conformément au procéda décrit à exemple ),est centrifugé sous des conditions identiques à celles décrites plus haut et les résultats ainsi obtenus sont indiqués au tableau 2 ci-après. Les résultats montrent que pratiquement toute la biomasse peut être récupérée par centrifugation du bouillon contenant la nouvelle souche Methylococcus capsulatus NCIB numéro 10856 tandis que seulement environ 97,5? de la biomasse peuvent entre récupérés du bouillon contenant la souche connue Methylo- coccus capsulatus ATCC numéro 19069. Les résultats démontrent également que,sous des conditions de travail identiques, la productivité de la nouvelle souche NCIB numéro 10856 est bien supérieure à celle de la souche connue ATC numéro 19069. En plus des caractéristiques décrites plus haut, la nouvelle souche présente un rendement supérieur sur le méthane que la souche connue. La nouvelle souche Methylococcus capsulatus NCIB numéro 10856 diffère également de la souche connue en ce qu'elle produit moins de matière à base de polysaccharides capsulaire par poids unitaire de biomasse que la souche connue ATCC numéro 19069. On suppose que les caractéristiques supérieures de centrifugation de la nouvelle souche sont dues à la quantité réduite de matière capsulaire produite par les microorganismes. TABLEAU 2 COMPARAISON DES RESULTATS DES CENTRIFUGATIONS OBTENUS AVEC UN BOUILLON CONTENANT LA SOUCHE METHYLOCOCUS CAPSULATUS ATCC NUMERO 19069 COMME DECRIT A L'EXEMPLE 3 ET UN BOUILLON CONTENANT LA SOUCHE METHYLOCOCUS CAPSULATUS NCIB NUMERO 10856 TEL QUE DECRIT DANS L'EXEMPLE 4. Débit 774 ml/mn Débit 571 ml/mn M. capsulatus M. capsulatus M. capsulatus M. capsulatus ATTC 19069 NCIB 10856 ATCC 19069 NCIB 10856 Concentration de la poids des biomasse dans le cellulose bouillon de culture séches 11,67 13,14 10,50 12,90 pénétrant dans la gramme par centrifugeuse litre Concentration de la poids des biomasse dans l'ef cellulose fluent quittant la séches 0,29 0,26 0,0015 centrifugeuse gramme par litre ***Récupération de poids des biomasse d'un litre cellulose de bouillon de séches 11,38 13,14 10,24 12,90 culture gramme ++récupération pourcentage 97,56 100 97,48 100 Perte pourcentage 2,44 0 2,52 0 Centrifugeuse: Sharples Type 16 vitesse fixée à 17.000 tours par minute (= 17000 g) REVENDICATIONS 1 - Procédé de production d'une matière à base de protéines en utilisant du méthane comme source de carbone, ledit procédé consistant à cultiver un micro-organisme utilisant du méthane dans un bouillon comprenant un milieu nutritif aqueux, en pré- sence de méthane et d'un gaz contenant de l'oxygène libre, caractérisé en ce que, en plus du micro-organisme utilisant le méthane, au moins un micro-organisme qui peut utiliser les substances favorisant l'apparition de-mousse, formées par le microorganisme utilisant le méthane, est présent dans le bouillon. 2 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme utilisant le méthane est un élément du groupe Methylomonas, Methylobacter, Methylosinus ou Methylococcus. 3 - Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le micro-organisme utilisant le méthane est une souche de Methylococcus capsulatus. 4 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le micro-organisme utilisant le méthane est la souche Methylococcus capsulatus NCIB numéro 10856. 5 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le micro-organisme utilisant du méthane peut utiliser de l'azote élémentaire en tant que source d'azote. 6 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le micro-organisme qui peut utiliser les substances favorisant l'apparition de mousse est un élément du genre Acinetobacter, Alcaligenes, Agrobacterium, Moraxella, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Micrococcus ou Pediococcus. 7 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'un mélange de micro-organismes qui peuvent utiliser les substances favorisant l'apparition de mousse est présent, le mélange comprenant un élément de chacun des genres Acinetobacter, Alcaligenes, Agrobacterium, Moraxella et Ps eudomonas. 8 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le micro-organisme qui peut utiliser des substances favorisant l'apparition de mousse est une souche d'une bactérie NCIB numéro 11134. 9- Procédé suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le micro-organisme qui peut utiliser les substances favorisant l'apparition de rousse est une souche Moraxella NCIB numéro 11135. 10 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le micro-organisme qui peut utiliser les substances favorisant l'apparition de mousse est une souche d'Alcaligenes, d'Agrobacterium ou de Pseudomonas NCIB numéro 11136. Il - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le micro-organisme qui peut utiliser les substances favorisant l'apparition de mousse est une souche d'Alcaligenes, d'Agrobacterium ou de Pseudomonas NCIB numéro 11137. 12 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le micro-organisme qui peut utiliser les substances favorisant l'apparition de mousse est ure souche d'Alcaligenes ou de Pseudomonas NCIB numéro 11138. 13 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le micro-organisme qui peut utiliser les substances favorisant l'apparition de mousse est une souche d'Alcaligenes NCIB numéro 11139. 14 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisé e ce que le micro-organisme qui peut utiliser les substances favorisant l'apparition de mousse est une souche d'4cinetobacter NCIB numéro 11140. 15 - Procédé suivant l'une des reverdications 1 à 5, caractérisé en ce que le micro-organisme qui peut utiliser les substances favorisant l'apparition de mousse est une souche d'Alcaligenes, d'Agrobacterium ou de Pseudomcnas NCIB numéro 11141. 16 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que la proportion quant au nombre de cellules du micro-organisme utilisant du méthane présent dans le bouillon par rapport au nombre de cellules du micro-organisme ou des micro-organismes qui peut ou qui peuvent utiliser les substances favorisant l'apparition de mousse est comprise dans la gamme de 40 à 98 %. 17 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce nue le pH du bouillon est d'une valeur comprise dans la gamme de 5,5 à 7,0. 18 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que la température du bouillon est d'une valeur comprise dans la gamme de 300C à 55 C. 19 - Procédé suivant l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que la concentration des ions ammonium dans le bouillon est comprise dans la gamme de 2 à 50 milligrammes par litre. 20 - La souche Methylococcus capsulatus NCIB numéro 10856. 21 - La souche de bactérie NCIB numéro 11134. 22 - La souche de Moraxella NCIB numéro 11135. 23 - La souche d'Alcaligenes, d'rgrobacterium ou de Pseudomonas NCIB numéro 11136. 24 - La souche d'Alcaligenes, d'Agrobacterium ou de Pseudomonas NCIB numéro 1113?. 25 - la souche d'Alcaligenes ou de Pseudomonas NCIB numéro III 38. 26 - La souche d'Alcaligenes NCIB numéro 11139. 27 - La souche d'Acinetobacter NCIB numéro 11140 28 - La souche d'Alcaligenes, d'Agrobacterium ou de Pseudomonas NCIB numéro 11141.