FR 2312261 A1 19761224 FR 7516882 A 19750529 L'invention, due à M. CHEVANCE du C.N.R.S. et M. HANNOUN de l'INSTITUT PASTEUR, est relative à un procédé pour engendrer et développer une réponse immunitaire d'un sujet vis-à-vis d'antigènes et notamment d'antigènes associés a des agents pathogènes, ledit procédé étant appliqué au niveau des muqueuses du sujet et notamment celles des voies respiratoires supérieures. L'invention est également relative à une présentation pharmaceutique pour la mise en oeuvre du procédé susdit. I1 a été suggéré que des mécanismes immunitaires locaux pourraient jouer un rôle important dans'la défens de l'organisme contre ces maladies. Ces-mécanismes immunitaires locaux ne soht cependant pas toujours sollicités très énergiquement par l'injection de ces mêmes agents immunogènes par voie général, lesquels mettent essentiellement en jeu la production d'anticorps sériques. Il a certes déjà été proposé de protéger des sujets, notamment l'homme, à l'égard de certaines maladies, plus particulièrement celles qui sont contractées par l'intermédiaire des voies respiratoires, en ayant recours à la mise en contact, avec les muqueuses des voies respiratoires, plus particulièrement lesniuqueuses nasales du sujet, de certains agents immunogènes, notamment des vaccins inactivés, susceptibles d'induire la production d'anticorps actifs à l'égard des antigènes responsables de ces maladies. Pour la réalisation de cette mise en contact, on peut avoir recours à la projection d'aérosols, ou à l'instil lation.de solutions contenant l'agent immunogène, au contact de ces mUqueuses. Mais on sait que, dans les conditions qui ont été décrites jusqu'à ce jour, il a en général été difficile, sinon impossible, de provoquer des réponses immunitaires suffisamment efficaces par contact direct des agents immunogènes avec les muqueuses des voies respiratoires, de sorte que ce mode d'administration n'a gùe're, jusqu'à ce jour, été envisagé dans l & pratique. L'invention a donc pour but de remédierà ces difficultés, et plus-particulièrement de rendre les procédés d'immunisation par contact d'un agent immunogène avec les muqueuses et notamment celles des voies respiratoires, et plus particulièrement en core -avec les muqueuses nasales, plus efficaces qu'ils ne l'étaient jusqu'à ce jour ; elle a également pour but de mieux solliciter à la fois les mécanismes immunitaires locaux et d'engendrer des rè'ponses immunitaires générales qui puissent, dans de nombreux cas, se comparer avantageusement en qualité et intensité avec celles qui peuvent être obtenues par la voie générale, notamment par injection de ces mêmes agents immunogènes. Le procédé selon l'invention pour produire et favoriser une réponse immunitaire chez un sujet à l'égard d'antigènes, notamment de ceux qui sont responsables des maladies susceptibles d'être contractées par l'intermédiaire des voies respiratoires, est caractérisé en ce que, dans une première étape dite de "préstimulation", on amène au contact d'une muqueuse, notamment des voies respiratoires, et plus particulièrement d'une muqueuse nasale, un agent préstimulant, supportable par la muqueuse, susceptible, lorsqu'il est maintenu pendant un temps suffisamment long au contact de cette muqueuse, de contribuer à l'apparition, voire à la multiplication, dans le tissu de la muqueuse, du nombre des cellules immunoccmpétentes, notamment des plasmocytes, cette mise en contact étant effectivement réalisée pendant un temps suffisant pour obtenir cet effet, et en ce que, dans une seconde étape dite "étape d'immunisation", séparée de la première étape par un intervalle de temps suffisant à la production de l'effet sus-indiqué, on réalise la mise en contact de cette même muqueuse avec l'agent immunogène. Au niveau de l'étape de "préstimulation", on notera que l'on peut utiliser tout agent préstimulant susceptible, en particulier au niveau de la muqueuse nasale, de ne pas affecter ou d'affecter partiellement les cils vibratils et d'induire une augmentation du nombre des cellules caliciformes, bien entendu tout en restant supportable par la muqueuse. Une catégorie d'agents préstimulants préférés comprend des liquides aqueux contenant des corps chimiques pharmaceutiquement acceptables et conférant à ces liquides une osmolarité se situant entre environ 80 et environ 250 milliosmoles et un pH compris entre-environ 5,8 et environ 7,2. Parmi ces liquides, on cite les solutions salines hypotoniques. En particulier, on peut avoir recours à des eaux thermales. On peut également avoir recours à des solutions isotoniques ou non isotoniques de glucides, de polysaccharides ou à des solutions ou suspensions de protéines, ou encore tout produit présentant une activité immunostimulante. Il va de soi que l'on peut également utiliser tout autre type d'agent susceptible de produire les mêmes effets, par exemple les gaz sulfureux tels qu'utilisés dans des cures ther males, voire des suspensions ou dispersions de solides finement pulvérisées au sein d'un véhicule liquide ou gazeux. La mise en contact de ces agents avec la muqueuse peut être effectuée de toute manière en soi connue, notamment par instillation de l'agent sous forme de liquide ou de suspension au sein d'un liquide, ou par l'intermédiaire d'une projection d'aérosol, par nébulisation ou atomisation. La prolongation du temps de contact, lorsqu'elle se révèle nécessaire, s'obtient aisément par une répétition des mises en contact. La deuxième étape du procédé selon l'invention implique l'administration, notamment par des moyens semblables à ceux utilisés pour la mise en oeuvre de la première étape, de l'agent immunogène au contact des muqueuses en question. L'intervalle de temps séparant la première étape de la seconde peut varier selon le type de l'agent utilisé au cours de la premièrè étape. Cet intervalle de temps, qui peut être déterminé expérimentalement, doit être au moins égal à celui qui est nécessaire pour produire des modifications de la muqueuse, du genre de celles qui ont été indiquées plus haut. On constate que la production accrue de plasmocytes ou analogues dans le tissu de la muqueuse persiste longtemps, de sorte que l'intervalle de temps séparant la première et la seconde étape ntest-en général pas critique.Dans le cas où la préstimulation aura eu pour effet d'engendrer une production légèrement accrue de mucus, on aura intérêt à ne mettre en oeuvre la seconde étape que lorsque la sécrétion de mucus aura retrouvé son niveau normal. A titre indicatif, on mentionnera que l'intervalle de temps qui peut séparer la fin de la première étape et le début de la seconde étape peut varier, par exemple, entre cinq et trente jours. L'agent immunogène peut être constitué par un antigène vaccinant spécifique, par exemple un virus grippal atténué ou tué, ou un antigène bactérien, ou par un agent de stimulation immunitaire non spécifique, notamment, mais non exclusivement, tel que ceux qui opt été décrits jusqu'à ce jour dansa littérature. Il va naturellement de soi que seuls peuvent être utilisés les agents immunogènes (spécifiques ou non spécifiques qui témoignent d'une innocuité suffisante, lorsqu'administrés par la voie préconisée par l'invention. Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention, on a recours à l'administration, soit au niveau de la première étape nt en me tes hue celle de l'agent de pre- stimulation, soit au niveau de la seconde étape et en er.-e temps que celle de l'agent immunogène, d'un agent adjuvant non spécifique de l'immunité, du type de ceux capables d'induire une multiplication de 1 production des anticorps par l'organisme de l'hôte, en réponse à l'introduction dans cet organisme d'un agent immunogène. Comme dans le première étape, on peut répéter, si besein, l'application de l'agent immunogène sur les muqueuses préalable- ment sensibilisées, jusqu'à ce que l'état de stimulation soit effectivement obtenu. Dans lc cas d'une stimulation effectuée au moyen d'un agent immunogène inducteur de la production d'anticorps efficaces cotre un antigène déterminé e decro de stimu- lation atteint peut, si besoin, être apprécié par l'apparition d'anticorps sériques et/ou locaux, notamment dans le mucus pré- levé au contact des muqueuses. L'invention concerne également l'association de l'agent de préstimulation et de l'agent immunogène, association qui, dans un mode de réalisation préféré de l'invention, fait l'objet d'une "présentation pharmaceutique" ou "kit". Une telle présentation comporte des récipients, notamment des flacons ou ampoules distincts contenant respectivement l'agent de préstimulation et l'agent immunogène, sous des -formes prêtes à l'administration par vaporisation, instillation, atomisation ou pulvérisation sur les muqueuses et notamment celles des voies respiratoires, en particulier sur les muqueuses nasales.Le cas échéant, les deux agents sont présentés sous la dorme de doses préétablies pour permettre leur administration directe par l'utilisateur (en une ou plusieurs fois, pour ce qui est de chacun de ces agents), en l'absence de toute nécessité de préparation extemporanée. Il va de soi que l'agent de préstimulation ou l'agent de st-mulation immunitaire peut, dans tous les cas et si besoin, être associe à un véhicule pharmaceutiquement acceptable, permettant les susdits modes d'administration. Eventuellement l'agent de préstimulation et/ou l'agent de stimulation immunitaire peuvent être mélangés avec un agent décongestionnant et/ou un antigène local. D'autres caractéristiques de l'invention apparaitront encore au cours de la description plus détaillée d'exemples mettant en évidence la nature des résultats qui peuvent être obtenus par l'application du procédé selon l'invention. Exemple 1 Des lots de lapins ont été soumis à un traitement consis tant en nébulisations et instillations nasales d'eau thermale hypotonique. L'eau thermale utilisée est celle du Mont-Dore (source César). Le traitement est effectué quotidiennement pen dant 21 jours. Les études cytologiques effectuées au décours de ce traitement ont permis de constater des modifications des mu queuses nasales. près ce traitement énergique de préstimulation et une periode de repos de durée variable, on a étudié la réaction des animaux à un agent immunogène instillé par voie nasale. On a choi si, à cet effet, la peroxydase dont on sait qu'elle détermine la formation d'anticorps qui se prêtent à un marquage. Dans ces essais, l'instillation de peroxydase est-faite à raison d'une t ut pendant 5 jours, puis à raison d'une instillation par semaine. Les doves-de peroxydase instillées varient entre 8 et 18 mg. Après quelques jours, les animaux sont sacrifiés et on étudie des coupes de muqu%a nasale. L'étude de ces coupes est seite au microscope électronique, aprés avoir révélé la présence des s anticorps antiperoxydase par traitemént au tétraoxyde d'os- et et à la diaminobenzidine, selon la technique décrite par Avrameas (Bull. Soc, Chiez Biol. (1968), 50, 1169-78). La tableau donne -les différentes conditions dans les es les essais ont été conduits après le traitement de préstimulation dont il a été question plus haut. Pour chaque essai, ce tableau indique : le temps écoulé entre la fin du traitement de préstimulation et le sacrifice des animaux, le temps écoulé entre la fin des instillations de peroxydase et le sacrifice des animaux, - In quantité totale de peroxydase instillée pour chaque animal. Sacrifice Dernière Quantité totale nombre de jours instillation de peroxydase après préstimulation avant le sacrifice instillée 58 jours 2 jours av. sacrif. 8 mmg 72 jours 2 jours av. sacrif. 9,5 mmg 79 jours 2 jours av. sacrif. 10,5 mmg 100 jours 3 jours av. sacrif. 13 mmg 100 jours 3 jours av. sacrif. 13 mmg 134 jours 8 jours av. sacrif. 18 mmg Des animaux témoins subissant le même traitement, à l'ex- ception de l'étape de préstimulation, ne présentent aucun marquage cytoplasmique dans les coupes de muqueuses. On n déduit, par conséquent, l'absence de cellules productrices d'anticorps antiperoxydase dans ces tissus Au contraire, les cellules mmu- nocompétentes des muqueuses des animaux ayant subi la préstimulation présentent toutes un marquage positif. Cet exemple montre l'efficacité du traitement de préstimulation sur la réponse immunitaire de la muqueuse soumise à 1 1agent immunogène. Exemple 2 On a déterminé l'efficacité du procédé selon l'invention sur la vaccination antigrippale par voie nasale. 'essai a été effectué sur des lapins. Les animaux testés ont subi un traitement de préstimulation. Ce traitement consiste en instillations nasales quotidiennes d'une solution aqueuse à 4 g/l de chlorure de sodium. Les instillations sont effectuées pendant 6 jours consécutifs. Après un temps de repos de 4 à 12 jours, les lapins sont vaccinés par instillation de vaccin antigrippal monovalent inactivé. Le vaccin utilisé est de souche A/Hong-Kong/1/68/(M3N2) et présente un titre de 1200 UI/0,5 ml. Les instillations de vaccins sont faites à raison d'une par jour pendant 6 jours. 10 Jours après la fin de la vaccination, on a déterminé le taux d'anticorps dans les liquides de rinçage de l'épithélium nasal et celui des anticorps sériques. Le titrage a été effectué par la méthode d'inhibition de l'hémagglutination. Le tableau suivant indique les résultats obtenus pour a) des lapins n'ayant subi aucun traitement, b) des lapins ayant subi la vaccination sans traitement de pré stimulation. c) des lapins ayant subi le traitement de préstimulation avant la vaccination. Anticorps dans liquide de Anticorps sériques Lapins lavage de la muqueuse nasale a 28 - 28 @ 160 - 260 b 42- 40-12- 40-85-85 200-260-260-590-590 16- 10-21-3-85-14 c 180-180-62-350 12.500-12.000-2.2Ce 2.200 On constate que la quantité d'anticorps chez les lapins ayant subi le procédé de traitement selon l'invention est très supérieur à celui des lapins n'ayant subi que la vaccination seule. Le procédé selon l'invention est appliqué à la prévention par vaccination des maladies causées par des antigènes notamment bactériens, viraux ou parasitaires, plus particulièrement de celles qui sont contractées par l'intermédiaire des voies respiratoires. En particulier, le procédé selon l'invention est applicable à la prévention de la grippe. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes. REVENDICATIONS 4 - Procédé pour produire et favoriser une réponse immunitaire Chez un sujet à l'égard d'antigènes, notamment de ceux qui sont responsables des maladies susceptibles d'être contractées par des muqueuses, caractérisé en ce que, dans une première étape dite de "préstimulation", on amende au contact d'une muqueuse, un agent dit préstimulant, supportable par la muqueuse, susceptible, lorsqu'il est tenu pendant un temps suffisamment long au contact de cette muqueuse, de contrlSl~eK l'apparition, voire à la multiplication, dans le tissu de la muqueuse, du nombre des cellules immunocompétentes, notamment des plasmocytes, cette mise en contact étant effectivement rea- lisée pendant un temps suffisant pour obtenir cet effet, et e ce que, dans une seconde étape dite "étape d'immunisation", sparée de la première étape par un intervalle de temps suffisant à la production de l'effet sus-indiqué, on réalise la mise en contact de l'agent immunogène avec cette même murueuse. 2 - Procédé selon la revendicatlon 1, caractérisé en ce que l'on opère au niveau des muqueuses respiratoires et notamment de la muqueuse nasale. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent préstimulant est susceptible, au niveau de la muqueuse, d'affecter partiellement les cils vibratils et d'induire une augmentation du nombre des cellules caliciformes, bien entendu tout en restant supportable par la muqueuse. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendicatlons 1 et 3, caractérisé en ce que l'agent préstimulant est constitué par une solution aqueuse non isotonique et notamment hynotonique. 5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'agent de préstimulation est constitué par un liquide, notamment une solution aqueuse, présentant une osmolarité se situant entre environ 80 et environ 250 milliosmoles et un pH compris entre environ 5,8 et environ 7,2. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'agent de prnstimulation est constitué par une solution aqueuse saline hypotonique. 7 - Procédé selon 1'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'agent de préstimulation est une eau thermale. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'agent de préstimulation est l'eau thermale du Mont-Dore. 9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'agent de préstimulation est constitué par une solution ou une suspension en milieu aqueux de glucides, de polysaccharides ou de protéines ou un agent d'immuni section non specifique. 10 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'agent immunogène est cons titubé par un antigène vaccinant spécifique, d'origine virale ou bactérienne, ou parasitaire, ou par un agent d'immunisation non spécifique. Il - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé encre que l'agent immunogène est un vaccin antigrippal. 12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'on administre, soit en même temps que l'agent de préstimuiation,soit-en même temps que l'agent immunogène, un agent adjuvant de l'immunité non spécifique. l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'intervalle de temps qui sépare la fin de la-première étape et le début de la seconde étape varie entre Set 30 jours @@@@ 14 -Association d'un agent de préstimulation et d'un agent immunogène, respectivement conformes à ceux visés dans les revendications 1 à 11. 15 - Présentation pharmaceutique de l'association selon la revendication 14, contenant l'agent de préstimulation et l'agent immunogène dans des flacons respectivement différents, sous des formes prêtes à l'administration par vaporisation, instillation, atomisation ou pulvérisation au niveau d'une muqueuse et notamment celles des voies respiratoires, notamment nasales. 16 - Présentation pharmaceutique selon la revendication 15, caractérisée en ce que l'on ajoute à l'agent de préstimula- tion des additifs tels que des agents décongestionn & ts ou antiseptiques locaux..