FR 2319903 A1 19770225 FR 7623612 A 19760802 La présente invention concerne un procédé pour effectuer des analyses cliniques et chimiques pour la détermination dé la nature du mouvement ou vitesse de réaction dans les interactions entre une substance à examiner et un réactif spécifique de celle-ci7 par exemple entre des molécules, ions, molécules biologiques et, plus particulièrement entre des antigènes et des anticorps. On sait que l'interaction antigène-anticorps ou enzyme-substrat était déterminé jusqu'à présent par des méthodes biologiques telles que I) réactions d'immunoagglutination, 2) réactions dtimmunoprécipitation. 3) réactions de neutralisation de l'activité d'un antigène, 4) réactions de fixation du complément. Toutes ces réactions ont été utilisées avec des méthodes extrêmement diverses. Dans le cas d'antigènes incomplets (aptènes), les réactions dont il est question ci-dessus ne sont le plus souvent pas applicables si l'on n'a pas cours à des méthodes indirectes telles que l'étude du pouvoir bloquant de l'aptène sur la population d'anticorps. La même chose est valable pour les réactions qui impliquent des anticorps monovalents, connue par exemple dans l'essai de Coombs indirect. On a prouvé par ailleurs qu'en général les interactions entre les antigènes moléculaires ou corpuscu lairds et les anticorps correspondants, ou entre les enzymes et les substrats, comportent une variation d'enthalpie dite tonalité thermique. Ce paramètre n'a pas été utilisé jusqu' présent pour l'appréciation des réactions immunitaires et, plus particulièrement, dans les applications chimiques de ces réactions. L'invention a donc pour objet la mise au point d'un procédé qui,non seulement soit applicable à n'importe quel antigène et notamment aussi aux antigènes incomplets, mais qui se révèle particulièrement simple et rationnel. L'invention a également pour objet d'exploiter délibérément tes variations d'enthalpie que l'on rencontre dans toutes les réactions décrites précédemment entre les diverses substances. Plus particulièrement, le procédé selon l'invention pour effectuer des analyses chimiques et cliniques consiste à mettre en contact une substance à étudier avec un réactif spécifique du type qui produit, sous l'effet de ce contact, une variation d'enthalpie, à mesurer la variation d'enthalpie et à transformer la valeur mesurée en un signal. Selon l'invention, la substance étudiée est avantageusement un antigène ou une enzyme et le réactif spécifique est un anticorps ou un substrat. Selon un mode de mise en oeuvre, le procédé consiste à conjuguer d'abord la substance étudiée avec des molécules d'un "support" antigène. I1 est possible ainsi d'étendre l'application du procédé de l'invention à des substances exemptes de pouvoir antigène. Selon l'invention, le procédé est applicable,soit en phase homogene,soit en phase hétérogène. L'invention concerne également un appareil pour la mise en ceuvre de ce procédé; qui comprend au moins une chambre thermostatique destinée à recevoir la substance étudiée et dans laquelle est inséré un support creux portant à l'extérieur la substance de comparaison et à l'intérieur duquel est placé un détecteur thermo-électrique de haute sensibilité, disposé dans un circuit électrique qui comprend : une source de courant électrique, des moyens pour transformer le signal transmis par le détecteur en une information et, éventuellement, des moyens pour amplifier ledit signal; Puisque, selon l'invention, on prévoit de mesurer la tonalité thermique qui existe entre une substance étudiée et un réactif spécifique qui remplit le rale de substance de comparaison et, plus particulièrement, la tonalité thermique entre les antigènes compiets et incomplets et les anticorps complets et incomplets, il est possible de déterminer l'interacti entre la molécule d'antigène et la molécule d'anticorps indépendamment de la conséquence que comporte cetce réaction. L'invention permet donc une application universelle pour les diverses déterminations. Parmi les multiples applications en toxicologie clinique, on citera celle concernant au moins les médicaments possédant un pouvoir antigène. Pour les médicaments sans pouvoir antigène, on peut les conjuguer avec des molécules de "support" antigène. C'est le cas,par exemple,de la mannitine,que l'on conjugue avec l'albumine. L'invention a donc pour objet l'obtention d'un immunosérum chez l'animal contre le médicament à fonction antigène ou de conjuguer le médicament avec un antigène, pour effectuer ensuite la détermination de la réaction antigène-anticorps avec les autres phases de l'invention décrites, pour déterminer des traces du médicament considéré dans les tissus ou dans les liquides organiques de l'animal soumis à l'essai. On souligne que la possibilité d'application de e procédé repose sur sa très grande sensibilité, sa spécificité élevée et sa rapidité élevée. Etant donné que le procédé repose sur une détermination simultanée sur le témoin et les échantillons, il est utilisable également dans les systèmes antigène-anticorps non purifiés avec le même crédit. D'autres applications du procédé de l'invention sont l'étude des interactions enzyme-substrat et des interactions virus-cellule hots (avec référence en particulier aux transformations oncogènes). D'autres applications concernent la mesure des interactions de membranes cellulaires ou de groupes spécifiques de celles-ci, avec des médicaments qui sont en mesure de pénétrer dans les cellules, par exemple les lectines (phytohémoagglutinine avec des lymphocytes thymiques, concanavaline A avec des cellules tumorales). Une autre application est l'utilisation de ce procédé comme essai immunologique de la grossesse, mettant à profit l'interaction entre les hormones contenues dans l'urine de la fende enceinte et les anticorps spécifiques contre ces hormones. Une autre application est la détermination des enzymes présentes dans les liquides organiques, utilisant l'interaction qui a lieu entre diverses enzymes et leurs substrats spécifiques. Ces caractéristiques et avantages de linvantion apparattront plus clairement & la lecture de la description qui suint en référence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 est une coupe verticale longitudinale schématique, selon la ligne A-A de la figure 2,d'un appareil de mesure à deux complexes de comparaison, utilisable par exemple pour la détermination des groupes sanguins ; - la figure 2 la vue en plan de l'appareil représenté à la figure I ; - la figure 3 est une coupe axiale agrandie d'un élément de support du cylindre portant la substance de comparaison et de l'élément thermosensible contenu dans celui-ci ; et - la figure 4 est le schéma électrique du circuit associé au groupe des figures 1 et 2. L'appareil représenté à la figure 1 comporte une enveloppe thermostatique 1 formant récipient qui contient un corps 2 façonné de manière à définir entre les éléments 1 et 2 un espace vide fermé 3 communiquant avec l'extérieur par une goulotte d'entrée 4 et une goulotte de sortie 5 (figure 2) reliées avec une installation de conditionnement pouvant alimenter l'espace 3 avec un fluide, par exemple de l'eau, à une température préétablie. Deux cellules cylindriques jumelles 5a et 5b formées dans le corps 2 sont reliées entre elles par leur partie inférieure à une conduite transversale 6 qui aboutit à une conduite verticale 7 ouverte à sa partie supérieure. Les chambres ou cellules 5 (5a et 5b dans le mode de réalisation représenté à la figure 1) communiquent à leur partie supérieure avec des chambres cylindriques 5a' et 5b' de rayon supérieur. Chaque chambre 5 est destinée à contenir un élément 8 (8a et 8b) dans la figure 1 de forme sensiblement complémentaire, en ce sens que l'on prévoit un intervalle réduit entre la paroi intérieure de chaque chambre S et la paroi exterieure de l'élément 8 correspondant.Chaque élément 8 (figure 3) comprend un cylindre creux inférieur 9 en aluminium muni extérieurement de cannelures ou cavités 9a pour favoriser l'adhérence, oxydé anodiquement et fixé un support supérieur 10 plus large, tandis qu'un joint annulaire 11 est monté entre les deux parties 9 et 10 pour fermer de manière étanche à sa partie supérieure la cellule 5 correspondante. Le support 10 et le cylindre 9 qu'il supporte comportent une conduite axiale formée par deux zones cylindriques 13 et 14 dans lesquelles pénètre la sonde 15 dont l'élément sensible 16 se trouve à l'intérieur du cylindre 9, sonde qui est reliée aux conducteur électriques 17. Dans le mode de réalisation représenté dans les figures 1 et 3, sont prévus des complexes de comparaison 8a et gb relies aux éléments thermosensibles 16 on a représenté respectivement par 17a et 17b les conducteurs qui sont reliés par le circuit représenté à la figure 4 à un appareil enregistreur 18. Ce circuit comprend une source d'énergie, par exemple une batterie 19, des résistances 20, des potentiomètres 21 et d'autres résistances 22 des deux mailles du réseau relatif à chacun des dispositifs détecteurs 8a et 8b. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 Détermination des groupes sanguins On prépare trois cylindres 9 bien lavés et que l'on fait sécher sous vide ; on applique sur l'un d'eux une solution de sérum anti-A en couche d'une épaisseur de 0,25 mm ; sur le second une couche de solution de sérum anti-B et, sur le troisième, une couche de solution de sérum anti-AB, de manière que la solution couvre uniformément la surface extérieure des cylindres 9. On place les cylindres 9 sous vide afin de faire absorber uniformément le réactif dans la surface d'oxyde d'aluminium formant le cylindre. Après quelques heures sous vide, on installe les supports 9 dans l'appareil représenté aux figures 1 à 3. On prélève 1 ml de sang entier que l'on introduit à travers la conduite 7 qui remplit le conduit 6 et les cellules 5 (Sa et 5b). En utilisant le support traité avec le sérum anti-A, si l'échantillon de sang est du groupe A, on détermine une tonalité thermique qui est décelée à travers l'élément thermosensible 9 correspondant tandis que, si le sang injecté est du groupe B, il n'y aucune tonalité thermique. En utilisant le support traité avec le sérum anti-B, si le sang injecté est du groupe A il nty a aucune tonalité thermique.Si lesang injecté est du groupe B, on note par contre une tonalité thermique avec le support qui porte le sérum anti-B. Onpeut rendre le système plus facilement utilisable en montant, au lieu d'une cellule, plusieurs cellules correspondant à autant de canaux de l'appareil d'enregistrement 18. Si on utilise, par exemple, deux cellules comme dans l'appareil représenté dans les figures 1 à 3 on monte dans les cellules 5a et 5b un support traité respectivement avec du sérum anti-A et du sérum anti-B.Si on injecte 1 ml de sang dans les cellules, s'il s'agit de sang dugroupe A, on a un signal Qui mesure la tonalité thermique du processus d'interaction dans la cellule dont le support a été traité avec le sérum anti4;de manière analogue, en ce qui concerne le cas du sang du groupe B, on aura un signal seulement pour les cellules contenant le support traité avec du sérum anti-B. Si llon obtient un signal des deuxcellules, on se trouve en présence de sang du groupe AB. Si l'on n'obtient aucun signal, on est en présence de sang du groupe O.Dans le cas de la détermination du facteur Rh ou des sousgroupes sanguins, le mode opératoire est identique, avec cette seule différence que le support 9 doit être traité avec le sérum sélectif pour la détermination à effectuer. EXEMPLE 2 Détermination de réactions catalysées par la lactate-déshydrogénase LDH Les réactions du pyruvate en lactate en présence de nicotineadéninedinucléotide (forme réduite) NADH sont catalysées par la LDH. On mesure la tonalité thermique (d H) du procédé de réduction du pyruvate en lactate et de l'oxydation de NADH en NAD, catalysée par la LDH. Toutes les réactions sont effectuées dans le tampon au phosphate 0,5 M à pH 7,5 IF 0,05. On injecte l'enzyme (lactate-déshydrogénase LDH) dans la cellule, dans laquelle se trouve un mélange de NADB et de pyruvate, thermostatée à 250C. Le pic obtenu dans l'enregistrement est fonction de la variation d'enthalpie liée à la réaction. Ou effectue I'étalonnage des surfaces des pics en effectuant dans la cellule dans les mêmes condition: une réaction de neutralisation HCl-NaOH. A partir de- la surface du pic, on remonte donc à l'enthalpie de la réaction NADH + H2P04 + pyruvate LDH' NAD+ + HP04 + lactate. 4 Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau ci-dessous. Pyruvates Kilocalories Déviation Nombre de mesures millimoles par mole de pyruvate 2,0 - 13,4 0,3 5 3,0 - 14,6 0,7 5 4,0 - 14,3 0,4 5 5,0 - 14,1 0,8 r 6,0 - 13,2 0,5 5 moyenne - 14,0 0,5 5 EXEMPLE 3 Réaction irmnunologique de la gestation On se base sur la détermination de la présence de gonadotropine (Ag) dans les urines au moyen d'anticorps (Ac) obtenue chez l'animal. On fait adsorber le sérum contenant les anticorps sur le support-d'aluminium anodisé comme décrit à l'exemple 1 ; on place le support dans la cellule qui est thermostatée et on injecte l'urine à étudier. L'apparition d'un pic dans l'enregistrement indique la présence de gonadrotropine dans les urines et, par conséquent, l'existence de la gestation. Le système est extremement sensible et on peut également l'utiliser quand le test normal d'agglutination donne des résultats douteux, à cause de la faible concentration de gonadrotropine dans les urines. En résumés le procédé selon l'invention peut être utilisé - pour la détermination des groupes sanguins, du facteur Rh et des sous-groupes sanguins au moyen de la détection de la tonalité thermique de la réaction antigène-anticorps, en utilisant des sérums, quel que soit leur mode d'obtention, - pour la détermination et l'identification des plasmoprotéines humaines ou animales au moyen d'antisérums spécifiques ou non spécifiques, - pour le diagnostic rhumatologique, la détermination de la protéine C-réactive, du facteur rhumatotde, du titre dAantistaphylo- lysine et du titre d'antistreptolysine, au moyen d'antisérums spécifiques ou non- spécifiques, - en bactériologie pour toutes les recherches dans lesquelles interviennent des réactions antigène-anticorps ou dans lesquelles intervient une variation d'enthalpie; sérologie de la syphilis,du du coli, de la leptospire, de la selmonella, de la chigella, des streptocoques, etc" r en virologie povr toutes les recherches dans lesquelles inter vieniient aes réactions antigene-anticorps ou bien dans lesquelles inter-- vient une variation d'entalpide, Virologie de la rougeole de la partie. de la rubéole de la rage > de l'influenza, etc., - en parasitologie pour toutes les recherches dans lesquelles interviennent des réactions antigène-anticorps ou dans lesquelles interviennent une variation d'entalpie: parasitologie de I'échinocoque, du toxoplasme etc., - dans la chimie clinique et l'enzymologie pour toutes les réactions dans lesquelles intervient l'interaction enzyme substrat ou encore dans la réaction où intervient l'enzyme ou une variation d'enthalpie, - dans le diagnostic d'allergies chaque fois que lton cherche à déterminer la présence chez le patient d'anticorps et de certains antigènes et aptènesJ - en pharmacologie chaque fois que l'on veut déterminer les substances ayant des propriétés d'antigine, ou des substances qui, conjugées avec une protéine convenable, peuvent fonctionner comme des aptènes. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de mise en oeuvre décrits ci-dessus à titre d'illustrations et que l'homme de l'art peut y apporter des modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour effectuer des analyses cliniques et chimiques, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact une substance étudiée et un réactif spécifique du type qui produit par l'effet de ce contact une variation d'entalpie, à desceller la variation d'entalpie et à la transformer la valeur de cette variation en un signal. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite substance à étudier est un antigène et ledit réactif spécifique est un anticorps. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite substance d étudier est une enzyme et ledit réactif spécifique est un substrat. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, avant ladite phase de mise en contact, on conjugue avec une molécule d'un support antigène une substance à étudier dénuée de pouvoir antigène. 5. Procédé selon la revendication 1, pour la détermination des groupes sanguines, du facteur Rh et des sous-groupes sanguins par la détection de la tonalité athermique, caractérisé en ce que l'on utilise comme anticorps des sérums soumis à un traitement quelconque. 6. Procédé selon la revendication 1, pour la détermination et l'édentification des plasmo-protéines humaines ou animales caractérisé en ce que lion utilise comme éléments de comparaison des antisérums spécifiques ou non-spécifiques obtenus de manière quelconque. 7. - Procédé selon la revendication 1, pour le diagnostic rhumatologique et la détermination de la protéine C-réactive du facteur rhumatosde, du titre d'antistaphilolysine et du titre d'antispretolisine, caractérisé en ce qu'on utilise communément deux comparaisons des antisérums spécitifiques ou non-spécifiques obtenus de manière quelconque. 8. Appareil pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une chambre thermostatique destinée à recevoir la substance étudiée et dans lequelle est introduit un support creux portant sur sa surface extérieure le réactif spécifique et à l'intérieur duquel est placée une sonde thermoélectrique de sensibilité élevée, faisant partie d'un circuit électrique qui comprend une source de courant électrique, des moyens pour transformer le signal transmis par la sonde en une information et éventuellement des moyens pour amplifier ledit signal. 9. Appareillage selon la revendication 5, caractérisé en ce que le support du réactif spécifique est constitué par un cylindre d'aluminium anodisés présentant des aspérités sur sa surface externe et à l'intérieur duquel est placée une sonde terminée par un élément thermosensible, ledit cylindre étant soutenu par un élément de support, un joint annulaire étant intercalé entre ledit élément de support et ledit cylindre pour fermer de manière étanche la cellule contenant la substance étudiée. 10. Appareil selon la revendication 9, caractérisé en ce que la chambre thermostatique comprend un élément en forme de botte et un élément intérieur qui en combinaison avec celui-ci définit un espace vide communiquant avec une conduite de conditionnement et d'entrée d'un fluide à température pré-établie, en particulier de l'eau. 11. Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'élément intérieur comprend une conduite centrale d'entrée de la substance à examiner, relié par des ramifications transversales au fond de plusieurs cellules dans lesquelles sont introduits lesdits supports contenant des éléments thermosensibles et montés de manière amovible.