FR 2307542 A1 19761112 FR 7511493 A 19750414 La présente invention a pour objet une nouvelle préparation immunostimulante, constituée par une association de corps bactériens inactivés et lysés appartenant à six espèces choisies et différentes de bactéries, à savoir Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Raemophilus influenzae, Diplococcus pneumoniae, Branhamella catarrhalis et Serratia marcescens. Le renforcement des défenses immunitaires par des procédés de vaccination antimicrobienne polyvalente est généralement recommandé dans les infections et tout particulièrement dans les infections du rhino-pharynx et des voies respiratoires profondes, surtout quand elles deviennent chroniques. Parmi les multiples possibilités de lutte contre l'infection dont dispose l'organisme et, notamment, l'appareil respiratoire, l'intervention du système réticulo-endothélial (S.R.E.) représentée, en particulier, par les macrophages, apparat cqmme prédominante. D'autre part, la production d'interféron permet de lutter contre les maladies à virus. La nouvelle préparation immunostimulante, objet de l'invention, comprend donc des espèces microbiennes stimulant activement le S.R.E. et la production d'interféron. Elle permet ainsi de mettre ltorganisme en meilleur état de défense immunitaire, tant bactérienne que virale ; sur les six espèces qui entrent dans sa composition, trois dominent la flore bactérienne responsable des infections pulmonaires : ce sont Haemophilus influenzae, Diplococcus pneumoniae et Branhamella catarrhalis ; les trois autres ont été retenues pour leur forte activité immunostimulante. Pour deux des espèces de bactéries utilisées, Branhamella catarrhalis et Serratia marcescens, il n'existe pas de sérotype décrit. Par contre, pour les quatre autres, on a trouvé que la forme préférée de la préparation comprenait des espèces de type sérologique caractérisé avec précision, c'esta-dire Staphylococcus aureus de type 11, Pseudomonas aeruginosa de type 10, Haemophilus influenzae de type b et Diplococcus pneumoniae de type I. Plus précisément, la formule de choix de la nouvelle préparation immuno- stimulante est composée de souches bactériennes sélectionnées, en particulier pour leur faible pouvoir sensibilisant, qui sont - Staphylococcus aureus, sérotype 1 1, souche 13/II (collection du laboratoire de la demanderesse), - Pseudomonas aeruginosa, sérotype 10, souche A 22 I.P. (I.P. = collections de l'institut Pasteur, Paris), - Haemophilus influenzae, sérotype b, souche 52.152 I.P., - Diplococcus pneumoniae, sérotype I, souche 692 I.P., - Branhamella catarrhalis, souche 52.178 I.P., - Serratia marcescens, souche 5.814 I.P. Les quantités des germes de ces souches, utilisées en association, peuvent varier entre certaines limites. Ce sont, par exemple, pour une prise unitaire humaine - 200 à 300 millions de germes, de préférence 225 à 275 millions pour Staphylococcus aureus, - 150 à 200 millions de germes, de préférence 175 à 225 millions pour Pseudomonas aeruginosa et Diplococcus pneumoniae, - 75 à 125 millions de germes, de préférence 85 à 115 millions, pour Haemophilus influenzae et Branhamella catarrhalis, et 120 à 180 millions de germes, de préférence 135 à 165 millions pour Serratia marcescens. Les quantités les plus favorables de germes de ces souches, dans les limites mentionnées ci-dessus, sont celles rassemblées dans le tableau I. Elles ont été déterminées à la suite d'une étude portant sur la tolérance et l'activité immunostimulante. Les proportions des diverses souches, exprimées en pourcentage du poids sec de la préparation totale, peuvent également varier entre certaines limites. Elles sont de - 20 à 33 %, de préférence 25 à 28 % pour Staphylococcus aureus et Diplococcus pneumoniae, - 22 à 36 %, de préférence- 25 à 33 % pour Pseudomonas aeruginosa, = 4 à 7 %, de préférence 4,5 à 6 % pour Haemophilus influenzae et Serratia marcescens, et 5 à 10 %, de préférence 6,5 à 8,5 7. pour Branhamella catarrhalis. Les pourcentages de choix sont également rassemblés dans le tableau I. Celui-ci présente la composition préférée d'une prise unitaire humaine de la préparation immunostimulante selon l'invention. I1 est bien entendu que les proportions et quantités de germes retenues sont liées aux souches et que, pour des souches différentes de bactéries de même espèce et de même sérotype, elles pourront varier dans une certaine mesure. Tableau 1 Bactéries Formule pour une prise unitaire humaine Nombre de Poids sec correspondant Espèce Sérotype Souche germes (tillions) en 118 en pourcentag Staphylococ- cus aureus 1 1 13/II(collec 250 50 ?6,3 tion du labo- ratoire de la demanderesse) Pseudomonas aeruginosa 1 O A 22 IP 200 55 29 Haeiophilus b 52.152 IP* 100 10 5,2 influenzae l Diplococcus I 692 IP * 200 50 26,3 pneuSoniae l Branhamella * Catarrhalis - 52.178 IP 100 15 7,9 Serratia * - 5.814 IF 150 10 5,2 marcescens TOTAL 1.000 190 100(99,9) I P = Institut Pasteur (Collections) Pour obtenir la préparation immunostimulante selon l'invention, on réalise la suite d'opérations ci-après I) Inactivation des bactéries. Celles-ci peuvent être tuées de diverses manières, par exemple par radiations ionisantes, par processus chimique (emploi, notai-ent, de ss-propiolactone) ou, le plus couramment, par chauffage. C'est ce dernier procédé qui a été choisi. 2) Lavage des germes morts avec, de préférence, du sérum physiologique stérile. 3) Lyse de ces germes. La lyse peut être effectuée par un moyen physique, chimique ou enzymatique. On préfère la lyse par broyage, car elle permet de libérer le maximum d'antigènes tout en respectant au mieux leur structure. Le degré de broyage est rlgoureusement réglé en fonction de contrôles effectués par centrifugation dans un gradient de Saccharose, le critère choisi étant la disparition de la bande correspondant aux germes entiers. 4) Mélange des germes lysés dans les proportions voulues. 5) Lyophilisation. Après vérification de sa faible toxicité (dose maximale i.p. tolérée chez la souris C D 1 = 180 mg/kg), une préparation itimmo-stimulante selon l'invention, correspondant aux souches et proportions rassemblées dans le tableau 1, a été soumise à une série d'expériences visant à démontrer, en particulier 1) le caractère synergique de la composition, 2) la stimulation de l'activité collotdopexique du S.R.E., 3) la stimulation de la production d'interféron, 4) l'augmentation de la résistance des animaux de laboratoire à une infec tion expérimentale. Toutes ces épreuves ont été réalisées sur la souris C D 1 et l'activité de la préparation immunostimulante de l'invention (appelée ci-aprbs Composition I) a été comparée à celle de trois préparations connues qui sont la Composition II Staphylococcus aureus sérotypes I, Il, III, 4 et 18 8 parties en poids Pseudomonas aeruginosa types I, 6 et 11 8 parties en poids Escherichia Coli 0111 ; B 4, 086 B 7, 0127 ;B 8 8 parties en poids Diplococcus pneumoniae, types 1, 2, 4 et 19 4 parties en poids Streptococcus pyogenes Gr A types, 1,4,12,Gr C,type 21 4 parties en poids Streptococcus faecalis Gr D 4 parties en poids Proteus vulgaris 0 x 19 4 parties en poids Neisseria Catarrhalis 4 parties en poids Haemophilus influenzae type b 2 parties en poids Klebsiella pneumoniae type B 2 parties en poids la Composition III Neisseria Catrrhalis 6,25 x 1010 germes Haemophilus influenzae 3 x 1010 germes Kl ebsiella pneumoniae 3 x 1010 germes Staphylococcus aureus 3 x 1010 germes faisant un poids total de 112 mg. et la Composition IV Lysat bactérien antigènique de Streptococcus 0,8 ml Staphylococcus 0,4 ml Diplococcus pneumoniae 0,4 ml Klebsiella pneumoniae 0,4 ml Raemophilus influenzae 0,4 ml Neisseria catarrhalis 0,4 ml Pseudomonas aeruginosa 0,4 ml Escherichia Coli 0,4 ml Proteus mirabilis 0,4 ml dans un volume total de 20 ml tN total = 2,32 mg ] Dans les expériences comparatives, les compositions I, II et III ont toujours été utilisées poids égal. La comparaison entre les compositions I et IV a été effectuée sur des poids d'azote égaux. Caractère synergique de la Composition I Les effets stimulants sur la défense antimicrobienne aspécifique ont été étudiés par la méthode de BIOZZI, BENACERRAF, STIFFEL et HALPERN (Comptes-rendus Soc. Biol. 1954, 148, 431), basée sur la stimulation de la collotdopexie des particules de carbone collotdal par les cellules du système réticulo-endothélial chez la souris. Dans une série homogène de six expériences comportant chacune 4 groupes de 20 souris, les animaux ont été traités respectivement par 1" - sérum physiologique (groupe témoins), 2" - une des 6 souches bactériennes, 30 - une composition contenant les 5 autres souches, 40 - la préparation complète contenant les 6 souches Les préparations ont été administrées par voie intra-péritonéale à une dose représentant dans chaque cas l'équivalent de la quantité du ou des germes considérés dans une dose de 40 tig de la préparation complète. La détermination de l'activité collotdopexique a été effectuée 24 heures après l'administration. Les résultats de ces expériences (tableau 2) montrent que certains constituants individuels exercent une action assez marquée, alors que d'autres exercent une action modeste ou même nulle. Les compositions contenant 5 constituants exercent toujours une action beaucoup plus marquée. Cependant l'effet maxi- mal est toujours obtenu par administration de-la composition complète contenant les 6 constituants, l'action de cette dernière est toujours supérieure à celle des compositions contenant 5 constituants, même lorsque l'action du 6ème cons tituant, administré individuellement, est nulle ou pratiquement nulle. Tableau 2 n Variation de I'index collodopexique en -pourcentage (a) I Compataisons S. aureus P' Aerugi- R. influ D. pneumo B.catar S.mar Composant indivi- NS NS NS N + 26 + 163 + 9 + 12 0 + 5u duei/Tém > ins Préparation com portant les 5 au- Ht m HI H( + 102 + 134 + 106 + 124 + 151 + 118 tres composants / Témoins plète / Témoins + 150 + 169 + 138 + 194 + 169 + 194 (a) Les comparaisons statistiques ont été effectuées par la méthode de DUNNETT. J. dm. Stat. Ass. 1955, 50, 1096. Les degrés de signification ont été indiqués en utilisant la notation suivante N S p > 0,5 * 0,01 Activité colîotdopexiciue du S.R.E. : effets de la Composition I et comparaisons avec celle des Compositions Il III et IV Cette activité a été appréciée, chez la souris, selon la technique de BIOZZI et coll. (référence citée) La Composition I a été comparée, dans trois expériences différentes, respectivement à la composition II (cf. tableau 3), à la composition III (cf. tableau 4) et à la composition IV (cf. tableau 5) ; les diverses préparations ont été administrées par voie intrapéritonéale, à 3 doses, à des groupes de 20 souris et l'index collotdopexique a été déterminé 24 heures après l'administration (deux doses pour la préparation IV). Les résultats de ces trois expériences montrent que l'activité de la Composition I se révèle, à toutes les doses utilisées, tres supérieure à celle des Compositions II,IXI et IV ; les augmentations de l'index collotdopexique obtenues avec la Composition I sont systématiquenent supérieures à celles obtenues avec les trois autres préparations. Tableau 3 Index colloidopexique Traitement voie Dose Nombre Index K (a) Pourcentage intrapéritonéale g / souris d'animaux d'augmentation par rapport aux témoins Sérum physiologique (témoins) 20 0,0332 - ;; 12,5 19 0,0893 ** 169 Composition I 25 20 0,1001 201 50 19 0,1126 * 239 12,5 20 0,0659 98 Composition II 25 19 0,0725 118 50 18 0,0780 135 (a) Les comparaisons statistiques ont été effectuées selon DURENT (réfé- rence citée). Les degrés de significations, notés comme dans le tableau 2, concernent les comparaisons avec le groupe recevant la même dose de Composition Il. Tableau 4 index colloïdopexique Traitement voie Dose Nombre Pourcentage intrapéritonéale Ag / souris d'animaux Index K (a) d'augmentation par rapport aux témoins Sérum physiologique (témoins) 20 0,0346 - NS 12,5 19 0,0754 118 Composition I 25 20 0,1047 ** 203 50 20 0,0944 * 173 12,5 19 0,0657 90 Composition III 25 18 0,0719 108 50 19 0,0723 109 (a) Les comparaisons statistiques ont été effectuées selon DUNNETT (référen- ce citée). Les degrés de signification, notés comme dans le tableau 2, concernent les comparaisons avec le groupe recevant la même dose de Composition III. Tableau 5 Traitement voie en Dose Index collotdopexique intrapéritoné- en ;g d'a- en Ag de Nombre Pourcentage ale zote/souris tion lyo- d'animaux Index K d'augmentation philiséel par rapport Souris aux témoins Sérum physiolo gique (témoins) - - 36 0,0304 1,34 12,5 30 0,0663 127 Composition I 2,68 25 31 0,0760 150 1,34 121,5 31 0,0571 88 Composition IV 2,68 243 33 0,0659 117 Les comparaisons statistiques n'ont pas pu être effectuées, par suite des différenees pondérales considérables entre les doses injectées des Compositions I et IV. Ces différences sont dues au fait que, dans cette expérience,on a utilisé, comme point de comparaison, la teneur en azote ; mais il est bien évident que la stimulation du S.R.E. par la composition IV peut être également provoquée par des facteurs autres que les composés azotés. Production d'interféron sérique ; effets de la Composition I et comparaison avec la Composition III L'activité sur la production d'interféron a été recherchée, chez la souris, par une technique classique, en utilisant le système , cellules L de sourisvirus de la stomative vésiculeuse et en comptant les plages de cytolyse formées, selon la méthode de DULMECC0 (Proc. Nat. Acad. Sci. 1952, 38, 747). L'activité de la Composition I a été comparée à celle de la Composition III, sur des lots de 10 animaux, 2, 4 et 6 heures après injection de doses égales de ces préparations. Les résultats de cette expérience sont rassemblés dans le tableau 6. Ils montrent que les deux préparations déterminent une production d'interféron, mais celle-ci se révèle beaucoup plus importante avec la Composition I qu'avec la Composition III : le rapport des activités est de '3/1 au moment de llac- tion maximale. Tableau 6 Quantité d'interféron (a) (b) Traitement Dose en Unités/ml ) de sérum au bout de voie intrapéritonéale souris 2h 4h 6h Sérum physiologique (té ins) Composition I 200 330 47 15 Composition III 200 100 23 10 (a) Dans cette expérience, les comparaisons statistiques n'ont pas été possi bles car les sérums ont été groupés en pools pour obtenir des quantités suffisantes. (b) 1 unité = quantité d'interféron nécessaire pour provoquer une inhibition de 50 Z du développement viral. Résistance à l'infection expérimentale Elle a été recherchée vis-à-vis de deux germes naturellement pathogènes pour la Souris : Salmonella typhi-murium et Diplococcus pneumoniae. a) Salmonella typhi-murium - Les souris (10 par groupe) ont été infectées par voie intrapéritonéale avec 100.000 germes de Salmonella typhi-murium (souche C5 de la collection du professeur LE MINOR, maintenue virulente par passages sur souris), 48 heures après l'injection, par la même voie, de 50, 200 ou 400 Ag/souris de la Composition I. Les témoins recevaient du sérium physiologique au lieu de Composition I. On a noté la mortalité quotidiennement pendant 21 jours. A la fin de cette période, il ne restait que 10 Z de survivants chez les témoins alors que 50 à 70 Z des souris traitées avaient résisté à l'infection. b) Diplococcus pneumoniae. On a réalisé l'infection des souris (10 animaux par groupe) avec 10 DL 50 de D. pneumoniae (souche 692 de l'Institut Pasteur, sérotype I, maintenue virulente par passages sur Souris). Les animaux traités ont reçu la Composition I par voie intrapéritonéale, 48 h. avant l'in fection, les témoins ont reçu à la place du sérum physiologique. La mortalité a été notée quotidiennement pendant 8 jours. A la fin de cette période, il ne restait que 20 Z de survivants chez les témoins, alors que 90 Z des souris traitées par 100 Ag ou 200 Ag/animal de Composition I avaient résisté à l'infection. Le résultat des expériences montre que la préparation inrnmostimulante selon l'invention peut être utilisée en médecine humaine et vétérinaire pour la thérapeutique anti-infectieuse en général et plus particulièrement pour le traitement des infections de l'arbre respiratoire. L'administration se fera par voie endo-nasale (sous forme d'aérosol ou de gouttes) ou par voie orale (sous forme de comprimés, dragées, capsules, gélules, solutés buvables). La posologie quotidienne, pour un adulte, est de 1 à 6 prises d'une dose correspondant par exemple à la composition indiquée dans le tableau I (1000 millions de germes par prise). Des périodes de repos entre des séries de plusieurs jours de traitement peuvent être avantageuses. Revendications 1) Préparation immunostimulante destiné à la thérapeutique humaine et vétéri naire constituée par une association de corps bactériens inactivés et lysés appartenant à six espèces choisies et différentes de bactériens, à savoir Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Diplo coccus pneumoniae, Branhamella catarrhalis et Serratia marcescens. 2) Préparation immunostimulante selon la revendication 1), caractérisée par le fait que Staphylococcus aureus est de sérotype 11, Pseudomonas aeruginosa de type 10, Haemophilus influenzae de type b et Diplococcus pneumoniae de type I. 3) Préparation immunostimulante selon l'une quelconque des revendications 1) ou 2), caractérisée par le fait qutelle est constituée par les six souches sui vantes : Staphylococcus aureus type 11 souche 13/II (collection du Labora toire de la demanderesse), Pseudomonas aeruginosa type 10 sonche A 22 I.P., Haemophilus influenzae type b souche 52152 I.P., Diplococcus pneumoniae ty pe I souche 692 I.P., Branhamella catarrhalis souché 52178 I.P. et Serratia marcescens, souche 5814 I.P. 4) Préparation immunostimulante selon la revendication 3), caractérisée par le fait que les quantités de germes de ces souches, utilisés en association, sont comprises entre 200 9 300 millions de germes pour Staphylococcus au reus, 150 à 200 millions de germes pour Pseudomonas aeruginosa et Diplococ cus pneumoniae, 75 à 125 millions de germes pour Haemophilus influenzae et Branhamella catarrhalis ; 120 à 180 millions de germes, pour Serratia mar cescens. 5) Préparation immunostimulante selon la revendication 4) caractérisée par le fait que ces quantités de germes sont comprises entre 225 et 275 millions pour Staphylococcus aureus, 175 et 225 millions pour Pseudomonas aerugino sa et Diplococcus pneumoniae, 85 et 115 millions pour Haemophilus influen zae et Branhamella catarrhalis et 135 et 165 millions pour Serratia marces cens. 6) Préparation immunostimulante selon l'une quelconque des revendications 3) à -5), caractérisée par le fait que les proportions des diverses souches, ex primées en pourcentage du poids sec de la préparation totale sont de 20 à 33 Z pour Staphylococcus aureus et Diplococcus pneumoniae, 22 à 36 Z pour Pseudomonas aeruginosa, 4 à 7 Z pour Haemophilus influenzae et Serratia marcescens et 5 à 10 Z pour Branhamella catarrhalis. 7) Préparation immunostimulante selon la revendication 6) caractérisée par le fait que ces proportions sont comprises entre 25 et 28 Z pour Staphylococcus aureus et Diplococcus pneumoniae, 25 à 33 5o pour Pseudomonas aeruginosa, 4,5 à 6 Z pour Haemophilus influenzae et Serratia marcescens et 6,5 à 8,5 Z pour Branhamella catarrhalis. 8) Préparation immunostimulante selon les revendications 5) et 7), caractérisée par le fait que la composition d'une prise unitaire humaine est la suivante Staphylococcus aureus 250 millions de germes soit 50 Ag et 26,3 Z (en poids sec), Pseudomonas aeruginosa 200 millions de germes soit 55 Ag et 29 Z (en poids sec), Haemophilus influenzae 100 millions de germes soit 10 g et 5,2 Z (en poids sec), Diplococcus pneumoniae 200 millions de germes soit 50 Ag et 26,3 Z (en poids sec), Branhamella catarrhalis 100 millions de germes soit 15 Ag et 7,9 Z (en poids sec), Serratia marcescens 150 millions de germes soit 10 Ag et 5,2 Z (en poids sec). 9) Mode d'obtention de la préparation immunostimulante selon l'une quelconque des revendications 1) à 8) par la suite d'opérations ci-apres : inactiva tion des bactéries, lavage des germes tués, lyse de ces germes, mélange de ccux-ci dans les proportions choisies et lyophilisation. 10) Mode d'obtention selon la revendication 9) caractérisé par le fait que l'i nactivation des bactéries est obtenue par un procédé thermique. 11) Mode d'obtention selon la revendication 9) caractérisé par le fait que la lyse des germes est effectuée par broyage. 12) Préparation immunostimulante selon l'une quelconque des revendications 1) à 8) dans une présentation destinée à l'administration par voie endonasale. 13) Préparation immunostimulante selon l'une quelconque des revendications 1) à 8), dans une présentation destinée à l'administration par voie orale.