FR 2297905 A1 19760813 FR 7600870 A 19760114 L'objet de la présente invention se rapporte à des solutions liquides de scintillation et à leur utilisation dans le dénombrement par liquide de scintillation d'émissions en provenance d'un matériau radioactif. De façon plus spécifique, l'invention a essentiellement pour objet des solutions liquides de scintillation particulièrement appropriées dans le cas d'échantillons radioactifs présents sur des filtres ou écrans. Le dénombrement ou comptage par liquide de scintillation est un type dtessai ou test analytique qui a été utilisé pour de nombreuses applications dans le domaine de la recherche biologique, et il constitue un procédé extrêmement efficace de détection d'une ra diation.de faible énergie telle que 14C et . L'un des avantages essentiels par rapport à d'autres procédés de détection de radiations consiste en ce que lsé- chantillon est placé à l'intérieur du détecteur, tandis que dans les autres procédés l'échantillon radioactif est seulement au voisinage de l'échantillon et doit passer à travers une barrière (par exemple de l'air ou un milieu gazeux) ce qui empoche les-émissions de 3H ou de d'atteindre le détecteur.Avec un comptage par liquide de scintillation, la radiation a davantage de chance d'entre détectée puisqu'elle se trouve à l'inté- rieur du détecteur. Dans le coaptage par scintillation, de nombreuses expériences biochimiques rendent nécessaire l'utilisation de filtres à membrane ou diaphragme pour enfermer la matériau radioactif. Lesdits filtres, ainsi que l'échantillon radioactif, sont disposés dans un dispositif de comptage par liquide de scintillation pour détection de la radioactivité. Jusqu'à ce jour, l'utilisation-de tels filtres à l'intérieur du dispositif de comptage par liquide de scintillation a entraîné des problèmes qui ont eu une incidence négative sur l'efficacité du comptage de radiations. Tout d'abord, certaines radiations potentielles sont absorbées par le filtre et ne sont pas comptées par le détecteur.Deuxièmement, le matériau radioactif en solution est dénombré selon un taux de rendement différent de. celui relatif à la masse du matériau adhérant enoore---au--filtrou présent à sa surface. L'un des objets de la présente invention consiste à trouver une réponse à ces problèmes permettant ainsi de réaliser un rendement de comptage maximum pour les échantillons radioactifs présents sur les filtres lors du comptage par liquide de scintillation. Les problèmes précités, aigri que d'autres encore, ont été résolus dans le cadre de la présente invention qui prévoit une solution de scintillation liquide à cinq composants. Cette solution peut entre mise en oeuvre dans un compteur par liquide de soin- tillation et elle aura pour effet do dissoudre 1e-fiI- tre et/ou de le rendre transparent. En dissolvant le filtre ou en le rendant transparent, les comptages de radioactivité dans l'échantillon sent libérés du filtre et on peut obtenir un rendement de comptage supérieur.En outre, la solution présente un rendement de comptage élevé pour 3H, une grande résistance à la luminescence chimique, et elle est capable d'émulsifier des échantillons biologiques tels que des protéines, des acides nucléiques et des composés organiques. La solution de la présente invention remplit également bien ses fonctions dans des dispositifs de comptage réfrigérés et à température ambiante. En particulier, la solution liquide de scintillation qui fait l'objet de la présente invention comprend (1) un solvant de scintillation, (2) un solu-t;9 primaire de scintillation, (3) un soluté de scintillation 8econdaire, (4) une variété de surfactants essentiellement différents, et (5) un agent dissolvant et/ou rendant transparent le filtre. L'invention sera mieux comprise à l'aide de la description détaillée qui va suivre des processus suivis dans le cadre de l'invention ainsi que des réactifs utilisés, cette description étant damnée uniquement à titre d'illustration êt ne présentant en aucune manière un caractère limitatif. La solution liquide de scintillation de l'invention représ ente un perfectionnement par rapport à toute autre solutio4itilisée à ce jour dans un appareil de comptage à scintillation liquide. Elle diffère de celles de I'art antérieur en ce qu'on a recours à plusieurs surfactants sensiblement différents en combinaison avec un agent dissolvant et /ou rendant transparent le filtre. Conformément à l'invention, le solvant liquide de scintillation reçoit de l'énergie d'un isotope émetteur (3H ou 14C) présent dans l'échantillon radioactif. Lorsque ceci se produit, les molécules du solvant entrent dans un état d'agitation ('est-à-dire que les électrons adoptent un niveau d'énergie plus élevé). La molécule du soluté primaire absorbe de l'énergie en provenance des molécules agitées du solvant, pour réémettre ensuite cette anergie sous forte de lumière, selon une longueur d'onde compatible avec la réponse d'un photomultiplicateur. Les solutés secondaires font de mime, mais à des longueurs d'onde plus élevées. Attendu que la plupart des échantillons biologiques se présentent en solution aqueuse et que le procédé par liquide de scintillation requiert un solvant aromatique, il est nécessaire de prévoir un procédé de solubilisation (un ou plusieurs surfactants) afin de disperser la phase aqueuse dans la phase organique pour obtenir une phase homogène pour le comptage. Sans le recours à un agent solubilisant, les solvants organiques ne sont pas miscibles à l'eau. L'agent solubilisant préféré de la présente invention est constitué dJune variété de surfactants sensiblement différents. De plus, l'agent dissolvant le filtre et/ou le rendant transparent dissout et /ou rend transparent le filtre à membrane maintenant I échantillon radlo- actif, favorisant de ce fait la libération ou la rupture de liaisons moléculaires entre le filtre et 1'echan- tillon. Tous ces ingrédients sont inertes en ce qui concerne leur réactivité chimique les uns par rapport aux autres ainsi que par rapport aux composants du transfert d'énergie entrainant la chemiluminescence ou luminescence chimique, la fluorescence ou la phosphorescence. Le solvant liquide de scintillation est le principal élément constitutif de la composition de l1in- vention. Le-solvant liquide de scintillation est mis en oeuvre pour dissoudre la totalité des quatre autres composants présents dans la solution. Ledit solvant doit aussi présenter un tel degré de pureté qu'il ait un faible mouvement propre et offre un rendement de comptage élevé lorsqu'il est utilisé dans le dispositif à liquide de scintillation. les solvant préférés sont le toluène et le xylène. % ce teint de vue, le toluène offre un taux élevé de rendement de comptage par rapport au cott intrinsèque ainsi qu"aux caractéristiques de non- explosivité et de non-tosicité.La quantité du solvant doit être suffisante pour permettre l'interaction entre les solutés de scintillation et les émissions en provenance de 11 échantillon radioactif lorsqu'on ajoute l'échantillon à la solution. Les solutés primaires (connus également en tant que fluors primaires de scintillation) sont des solutés aromatiques fluorescents. Ils sont de préférence solubles dans le solvant et ne viennent pas interférer avec les diverses actions des autres constituants. Les solutés primaires de scintillation préférés de l'invention sont le PP0, c'est-à-dire le 2,5-Diphényloxazole, et le Butai PBD, c'est-à-dire le 2-4'-t-Butylphényl-5-(4"-biphényl)-l,D,4-oxydiazole. Celui que l'on préfbEe absolument est le premier cité parce qu'il est très soluble, présente un grand pouvoir émissif en ce qui concerne les photons, est stable et bon marché. Les solutés primaires de scintillation doivent être présents dans des quantités suffisantes pour donner une scintillation que l'on puisse soumettre au comptage, dans la solution lors de l'addition de l'é- chantillon radioactif à ladite solution. La quantité préférée de PP0 dans la solution est comprise entre 6,5 et 5,5 mol. g/litre de solution et la quantité préférée de Butyl PBD est comprise entre 8,5 et 7,5 mol.g / litre. Les solutés secondaires de scintillation (connus sous l'appellation de fluors secondaires) sont des solutés aromatiques fluorescents possédant des spectres de fluorescence à des longueurs d'onde plus élevées que les fluors primaires. Les solutés liquides de scintillation secondaires préférés de l'invention sont le POPOP/1,4-Bis[2-(5-Phenyloxazoyl)]-benzène. Le ou les solutés de scintillation secondaires doivent être présents en quantité suffisante pour que, en combinaison avec les solutés primaires de scintillation, on puisse obtenir une scintillation capable d'entre comptée dans la solution lorsque lton y ajoute l'échantillon radioactif. Les quantités préférées de POPOP et de Diméthyl POPOP sont comprises entrs-O,65 et 0,55 mol.gflitre de solution. Il faut recourir à une variété de surfactants sensiblement différents pour disperser la phase aqueuse et la phase organique en une phase homogène, afin de procéder au comptage par liquide de scintillation. L'expression "surfactants sensiblement différents1 s'entend pour signifier soit (1) que l'un des surfac- tants est de préférence soluble dans l'hl e, tandis qu'un autre est de préférence soluble dans 11 eau, (2) que les surfactants appartiennent à des familles chimiques différentes (par exemple la partie polaire de a molécule d'un surfactant est une partie carboxyle tandis que l'autre est une partie sulfonate), (3) que les surfactants sont de différents types quant à l'effet tensio-actif, par exemple un est un surfactant anionique et Autre un surfactant non-ionique, ou bien (4) que l'un des surfactants agit comme agent de dispersion tandis que l'autre se comporte comme agent réducteur de tension superficielle, La variété préférée de surfactants sensiblement différents peut être trouvée dans une composition solvant e aqueuse appelée Bio-Solv# BBS-3 fabriquée par Beckman Instruments, Inc. qui contient des molécules avec un groupe polaire (soluble dans l'eau) et un groupe non-polaire (soluble dans une phase organique). Cette composition contient deux surfactants différents - dont environ 50;; sont constitués de Triton X-100 (isooetyl-phénol- polyoxyéthanol) fabriqué par Rohm et Haas, les 50% environ restants étant l'Aérosol MA-80 (sodium dihexyl sulfo-succinate) fabriqué par EicKesson Chemical.La quantité des divers surfactants sensiblement différents doit se trouver en excès par rapport à la quantité nécessaire pour rendre le mélange stable quant à la thermodynamique et pour entraîner une miscibilité totale des liquides aqueux et organiques. Avec le solvant Bio-Sol $, les quantités préférées sont comprises entre 95 et 105 ml/litre de solution de scintillation. in outre, les solvants Bio-Solémulsifient les protéines, les acides nucléiques et les autres composés organiques et permet l'utilisation de ces substances dans l'échantillon radioactif. L'agent dissolvant et/ou rendant transparent le filtre que lton utilise dans le cadre de la présente invention facilite la rupture des liaisons chimiques à l'intérieur du filtre. "Dissolvar,t" signifie ici que le filtre à membrane perd son intégrité physique ou structurelle et se dissout dans la solution de scintillation. "Rendant transparent" signifie que i. filtre à membrane ne perd pas son intégrité, mais que la lumière peut passer au travers et que tout isotope radioactif en contact avec ledit filtre sera compté avec le mdme pouvoir que les isotopes radioactifs qui ne se trouvent pas à son contact mais sont présents dans la solution. Les filtres dont il est question dans le cadre de l'in vention comprennent n'importe quels filtres ordinaires à membrane vendus dans le commerce et utilisés à ce jour (par exemple Ni11ipore et Sartorius). Normalement, ces filtres sont constitués de nitrate de cellulose, d'acétate de cellulose ou bien d'une composition nitrate de cellulose/ acétate de cellulose. Dans le cadre de la présente invention, les filtres à membrane se rontiiaisément dissoute en vingt minutes. L'agent préféré pour dissoudre et/ou rendre transparent le filtre sont les éthers cycliques.Parmi eas,-l'agent préféré de l'invention est le tétrahydrofuranne. Ce dernier composé effectuera la dissolution des filtres en nitrate de cellulose ainsi que des filtres mixtes nitrate de cellulose / acétate de cellu- lose et rendra transparent les filtres en acétate de cellulose. Ledit agent doit être présent dans la solution en quantité suffisante polar remplir ces fonctions. En ce qui concerne le tétrahydrofuranne, les quantités préférées sont comprises entre 95 et 105 ml/litre de solution. La solution de scintillation de la présente invention est supérieure aux autres solutions de scintillation disponibles dans le commerce que lton peut utiliser avec des filtres à membrane, cette supériorité tenant aux raisons suivantes: (a) elle permet de compter les isotopes avec une puissance de comptage supérieure aux autres, c'est-à-dire qu'elle permet de compter des matériaux à DH avec un rendement de comptage jusqutà à 40%, (b) elle dissoudra et/ou rendra transparents tous, ou au moins la plupart, des filtres à membrane disponibles dans le commerce, (c) elle n'est pas susceptible de constituer des trassSerts d'énergie provo- quant la chemiluminescence, la fluorescence ou la phosphorescence, (d) elle peut émulsifier des protéines, des acides nucléiques et autres composés organiques qui sont normalement présents dans les échantillons biologiques et qui viennent interférer avec le comptage par scintillation s1 ils ne sont pas placés dans une phase homogène et (e) elle offre une très grande souplesse d'utilisation en ce quelle peut opérer dans des dispositifs de comptage fonctionnant à la température ambiante et aussi réfrigérés. L'invention sera mieux comprise à Laide de 1'exemple détaillé qui~va~suivre d'un mode de réalisa- tion préféré de l'invention qui n'est donné ici qu'à titre d'illustration. Exemple On a préparé la solution liquide de scintillation suivante: toluène (qualité de scintillation) PPO 6,0 m.g POP0P Dimêthyle 0,6 m.g Bio-Solv# BBS-3 100 ml Tétrahydrofuranne 100 ml Les quatre derniers composants précités ont été dissouts dans une quantité suffisante de toluène pour mener à bien cette dissolution, après quoi on a rajouté davantage de toluène de façon à former un litre de solution. ---- On a ajouté un échantillon biologique contenant du 3E et présent sur un filtre à membrane présen- tant une composition du type nitrate de cellulose à 10,0 ml de la solution de scintillation précitée. Après un laps de temps de vingt minutes avec quelques agitations, le filtre de nitrate de cellulose était complètement dissout dans la solution. Le mélange a alors été placé dans un disposi de conptago par scintillation liquide. Il s'est avéré que le rendement de comptage de l'échantillon était compris entré 30 et 40'. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation décrit et illustré qui nta été donné qu'à titre d'exemple, l'invention comprenant tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont réalisées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. REVENDICATIOPFS 1. Solution liquide de scintillation, carac 'égrisée en ce qu'elle comprend un mélange de (a) un solvant liquide de scintillation, (b) un soluté primaire de seintillation, (c) un soluté secondaire de scintillation, (d) une variété de surfactants sensiblement diffé rents, (e) un agent de dissolution et de transparence. 2. Solution liquide de scintillation selon 1s revendication 1, caractérisée en ce que l'agent de dissolution et de transparence est un éther cyclique. 3. Solution liquide de scintillation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le solvant de scintillation est du toluène. 4. Solution liquide de scintillation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le soluté primaire de scintillation est du PPO. 5. Solution liquide de scintillation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le soluté secondaire de scintillation est du POPOP Diméthyle. 6. Solution liquide de scintillation selon la revendication 2, caractérisée en ce que la variété de surfactants sensiblement différents est constituée par duisooctylphénol-polyéthoxyéthanol et du sodium dihexyl sulfosuccinate. 7. solution liquide de scintillation selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'agent de dis solution et de transparence est le tétrahydrofuranne. 8 Solution liquide de scintillation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le solvant de scintillation est le toluène, le soluté primaire de scintillation est le PPO, le soluté secondaire de scintillation est le ropop- Diméthyle, la variété de surfactants sensiblement différents est constituée dtissooctylphénol- polyéthoxyéthanol et de sodium dihexyl sulfosuccinate, et l'agent de dissolution et de transparence est le tétrahydrofuranne.