FR 2293408 A1 19760702 FR 7439686 A 19741204 La présente invention est relative à un procédé de marquage isotopique au deutérium ou au tritium de substances organiques. Phus précisément, elle concerne le marquage de substances solubles dans l'eau et possédant soit des liaisons simples, soit des liaisons multiples, si toutefois ces der nières sont protégeables par exemple par formation d'un composé d'addition. On sait qu'il est possible d'effectuer le marquage de substances organiques par voie chimique. Cependant, les synthèses chimiques nécessitent pour la plupart l'utilisation d'intermédiaires possèdant une liaison éthylénique et les échanges isotopiques de nature chimique exigent des conditions de température, de pH souvent limitantes. De ce fait, le marquage par voie chimique ne peut concerner qu'un nombre réduit de substances organiques. On sait également que, dans le but de permettre le marquage d'une gamme supérieure de substances organiques incluant les substances biologiques, une méthode d'échange isotopique par exposition à un courant gazeux de tritium a -été mise au point et exposée notamment dans le Journal of the American Chemical Society de 1957 (volume 79, p. 1013).Mais, malgré divers perfectionnements apportés à cette méthode, tels que l'adjonction, au système substance-gaz, d'une énergie d'activation extérieure comme par exemple une décharge électrique, une irradiation y ou ultraviolette, l'utilisation d'un métal, une importante dégradation radiolytique de la substance à marquer - ne peut pas être évitée et la grande durée des expérimentations ne peut pas être diminuée. Le procédé conforme à l'invention pallie justement les inconvénients rappelés ci-dessus et permet d'effectuer le marquage au deutérium ou au tritium d'un grand nombre de substances organiques, solubles dans l'eau et pouvant posséder des liaisons doubles ou triples si ces dernières sont protégeables, avec une très faible dégradation radiolytique et ceci, de manière simple et aisée pour une courte durée des expérimentations. Le procédé de marquage selon l'invention se caractérise en ce que, dans une première étape, on irradie une solution deutérée ou tritiée en absence d'oxygène renfermant la substance à marquer en mélange avec au moins un mercaptan solubie dans l'eau, et en ce que dans une deuxième étape on sépare le mercaptan et on récupère la substance marquée. Ce procédé, utilisant comme intermédiaire un Fmer- captan scluble dans l'eau, a l'avantage de permettre le marquage isotopique de nombreuses substances organiques pour lesquelles certains des hydrogènes ne pouvaient pas être échangés avec les techniques antérieures. En outre, il présente également l'avantage de ne requérir, pour l'isolement de la substance marquée, que des techniques usuelles et de permettre la récupération de l'eau lourde et de l'eau tritiée. Ce procédé peut être réalisé avec de courtes durées d'expérimentations car les propriétés spécifiques de la fonction thiol d'un mercaptan sont bien adaptées à la fonction de transfert d'lqn atome de deutérium ou de tritium sur la substance à marquer qui est attribuée, dans ce procédé, au mercaptan entrant en réaction. En effet, dans le cas d'une deutération, comme d'ailleurs dans le cas d'une tritiatipn, le processus réactionnel de la première étape est le suivant : au sein de la solution deutérée contenant la substance à marquer et un mercaptan approprié, l'hydrogène de la fonction thiol du mercaptan est rapidement remplacé par un atome de deutérium, puis gâce.à l'irradiation de cette solution, des sites radicalaires sont créés sur la substance à marquer, après arrachement d'un de ses protons par les radicaux. OH. engendrés par la radiolyse de l'eau et enfin, grâce à l'aptitude que présente la liaison S-D précédemment créée à se rompre homolytiquement, l'atome de deutérium est transféré sur les sites radicalaires de la substance à marquer. Etant donné les différentes étapes du transfert d'un atome de deutérium ou de tritium opéré par le mercaptan, 11 convient de noter qu il est possible de mettre successivement en solution deutérée le mercaptan puis la substance à marquer, ce qui revient à remplacer l'hydrogène de la fonction thiol du mercaptan avant que ce dernier ne soit mis en mélange avec la substance à marquer. Au regard du mécanisme rappelé ci-dessus, mettant en évidence le rôle joué par le mercaptan selon la caractéristique essentielle du procédé, il convient de remarquer qu'il est préférable d'utiliser le mercaptan à une concentration au moins égale à celle de la substance à marquer. De plus, sachant que la quantité de substances récupérée par le procédé, objet de l'invention, est directement liée, pour une quantité initiale donnée de la substance à marquer, à la dose d'irradiation et à l'enrichissement isotopique de l'eau lourde ou de l'eau tritiée, des conditions d'exécution préférentielles mais non limitatives peuvent être retenues pour la mise en oeuvre dudit procédé. Puisque la présence du mercaptan, dans la solution de la substance à marquer, permet d'utiliser des doses d'irradiation importantes, ces dernières sont choisies les plus grandes possibles et les rayonnements utilisés sont, par préférence, des rayonnements X, a, ss ou y. Parmi les mercaptans, susceptibles de faciliter le marquage de substances par le procédé, on peut citer les mercaptans dérivés d'une amine telle que la cystéamine ou bien les mercaptans dérivés d'un acide aminé tel que, par exemple, la cystéine. Le schéma de mise en oeuvre du procédé est le suivant lors de la premiere étape on prépare, dans un premier temps, une solution deutérée ou tritiée renfermant la substance à marquer et au moins un mercaptan approprié, cette solution étant telle que la concentration en mercaptan est au moins égale à celle de la substance à marquer, puis dans un deuxième temps on irradie la solution ainsi constituée. Pour cette première étape, l'utilisation d'un rayonnement y tel que celui du 60Co est particulièrement approprié pour le marquage de substances osidiques en mélange dans une solution deutérée ou tritiée avec un mercaptan dérivé d'un acide aminé tel que par exemple la cystéine. Ainsi, il est possible de limiter la durée d'irradiation à 24 h pour un débit de dose du rayonnement y du 60Co de 12.000 rad/mn, cette irradiation étant effectuée en absence d'oxygène.Lors de la deuxième étape, on procède successivement ou simultanément a la séparation du mercaptan et à la récupération de la substance marquée. Pour ce procédé, des techniques usuelles, adaptées aux réactifs en presence, peuvent permettre de récupérer 1R substance marquée avec un degré de pureté satisfaisant. Parfois il est possible d'liminer, en presque totalité le mercaptan et éventuellement son dimère avant de procéder à la récupération de la svbstan- ce marquée et ceci simplement par exemple par précipitation dans un solvant approprié. Quoi qu'il en soit, une chromatographie peut permettre d'isoler définitivement la substance marquée en la séparant d'éventuels isomères et du mercaptan si ce dernier n'avait pas été éliminé antérieurement ou ne l'avait été que partiellement. Bien que la mise en oeuvre du procédé objet de l'invention, tel qu'exposé ci-dessus dans ses grandes lignes, présente une grande souplesse quant au choix des concentrations respectives de la substance à marquer et de mercaptan, et quant à la valeur du débit de dose du rayonnement sélectionné pour irradier la solution, les exemples qui vont suivre, donnés à titre préférentiel mais non limitatif, permettent de mettre en évidence les conditions expérimentales favorables au marquage d'un composé osidique et d'un nucléoside. EXEMPLE 1 - Deutération du désoxy-2 ribose On irradie par les rayonnements du 60Co une solution deutérée en absence d'oxygène telle que 100 ml de cette solution contienne 265 mg de désoxy-2 ribose et 600 mg de cystéine. Après irradiation de cette solution en absence d'oxygène pendant 24 heures, pour un débit de dose de i2.000 rad/mn, on neutralise la solution au moyen de résine Dowex. Après neutralisation, considérée comme acquise au bout d'une demiheure, on évapore à sec l'ensemble des différents filtrats obtenus auprès séparation de la résine et lavage de cette dernière. Le résidu, obtenu a la suite du précédent traitement contient du désogy-2 ribose marqué en présence d'une certaine quantité de son isomère, le désoxy Lyxose ainsi que la cystéine dont une partie s'est dimérisée. A ce stade, dlfféreni-s traitements de ce résidu peuvent @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@-2 ribose purifié au maximum. On peut commencer par extraire a cystéine et son dimère par précipitation en reprenant le résidu dans 20 ml de méthanol, puis ensuite chromatographier l'huile obtenue après évaporation à sec du méthanol, ce qui permet l'isole-- ment du désoxy-2 ribose marqué. Grâce à une chromatographie sur couche mince, en présence du solvant constitué par le mélange d'acétate d'éthyle, d'isopropanol et d'eau, dont les pourcentages respectifs en volume sont de 75, 16 et 9. On récupère le composé osidique marqué, totalement séparé de son isomère et de la proportion de cystéine qui n'aurait pas précédemment précipité. Un tel schéma de mise en oeuvre permet d'aboutir au bilan suivant : le rendement en désoxy-ribose est de 34% et le taux de deutération exprimé globalement par rapport aux hydrogène s non échangeables par simple mise en solution deutérée est de 15%. EXEMPLE 2 - Deutération de la thymidine La thymidine étant un nucléoside renfermant une double liaison, le procédé est mis en oeuvre après transformation de ce nucléoside en hydroxy-6 dihydro-56 thymidine. Le mélange soumis à irradiation en absence d'oxygène est une solution deutérée 10 2 M en hydroxy-6 dihydro-56 thymidine et 2.10 2 M en cystéine. Après irradiation par les rayonnements y du 60Co dans les mêmes conditions expérimentales que celles qui ont été retenues dans l'exemple n0 I, on régénère la thymidine par traitement avec du méthanol saturé en ammoniac pendant 15 heures à température ambiante. La thymidine marquée est isolée par chromatographie. On obtient un rendement de 55% en thymidine et un taux global de deutération de 8% exprimé par rapport aux hydrogènes difficilement échangeables. I1 convient de noter que le procédé, tel que mis en oeuvre, permet le marquage préférentiel des hydrogènes de la partie osidique de ces composés. Le procédé, objet de l'invention, dont la mise en oeuvre demeure aisée pour le marquage de substances de nature plus complexe, peut avantageusement être utilisé pour des études aussi bien à caractère chimique que biochimique. Il peut par exemple faciliter des études de mécanismes réactionnels, des études de métabolisme ou encore d'enzymologie. REVENDICATIONS 1. Procédé de marquage isotopique au deutérium ou au tritium de substances solubles dans l eau et pos séant soit des liaisons simples, soit des liaisons multi ples progeables caractérisé en ce que dans une première étape on irradie en absence d'oxygène une solution deutérée ou tritium contenant la substance à marquer en mélange avec au moins un mercaptan soluble dans l'eau et en ce que dans une deuxième étape on sépare le mercaptan et on récupère la substance marquée. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mercaptan utilisé est un mercaptan dérivé d'un acide aminé. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mercaptan utilisé est un mercaptan dérivé d'une amine. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le mercaptan utilisé est la cystéine. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le mercaptan utilisé est la cystéamine. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration en mercaptan est au moins égale à celle de la substance à marquer. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on irradie le mélange avec un rayonnement y. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on irradie le mélange avec le rayonnement y du 60Co. 9 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on irradie le mélange avec un rayonnement B. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on irradie le mélange avec un rayonnement Q.