FR 2287911 A1 19760514 FR 7531663 A 19751016 La présente invention concerne de nouveaux sulfates de pullulane et leurs sels, ainsi qu'"n procédé pour leur production. On sait que des sulfates cornus de polysaccharides ont un effet anti-ulcère peptique. Toutefois, ces sulfates ont parallèle nent un effet anticoagulant du sang tel qutils ne peuvent pas être utilisés en période d'hémorragie de l'ulcère et, pour cette raison, ils présentent de grands inconvénients pratiques dans leur emploi comme médicament anti-ulcéxeux. Par ailleurs, les sulfates connais de polysaccharides qui agissent comme médicaments anti-ulcéreux doivent être sulfatés au poin-t de contenir 12 à 18 % en poids environ de soufre. Par conséquent, des conditions difficiles et des durees prolongées de réfaction sont nécessaires pour synthétiser de tels sulfates de polysaccharides ayant une action anti--ulcéreuse par la mise en réaction de polysaccharides avec des agents sulfatants. Dans de semblables circonstances, il apparaît important, d'un point de me industriel, de mettre au point des médicaments anti-ulcéreux dépourvus d'action anticoagulante du sang et ayant un faible degré de sulfatation. . Eu égard à ce qui précède, les auteurs de la présente invention ont mené des études approfondies pour trouver de nouveaux sulfates de pullulane qui aient une forte action anti-ulcère peptique en dépit de leur bas degré de sulfatation, et qui aient néanmoins un faible effet anticoagulant du sang, ainsi qu'un procédé pour leur préparatior. Ilun des buts de l'invention est de fournir un sulfate de pullulane ou son sel. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de préparation d'un sulfate de pullulane ou de son sel, en faisant réagir un pullulane avec un agent sulfatant, de manière à sulfater le pullulane. D'autres buts et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante. Dans le cadre de la présente invention, le terme "sel" embrasse des sels de métaux alcalins tels que le sodium et le potassium, des sels de métaux alcalino-terreux tels que le magné sium ét le calcium, des sels d'a.mnonium, des sels d'aluminium et des sels mixtes de ceux-ci. le pullulane dont il est question dans la présente invention est un polymère linéaire supérieur dans lequel des unités de maltotriose, c'est-à-dire d'un trimètre du glucose, sont reliées à répétition par des liaisons alpha-1,6 qui sont différentes de celles dudit trière, et qui a la structure moléculaire représentée par la formule suivante où n indique le degré de polymérisation et est un nombre entier de 20 à 10 000. Bien que ce pullulane contienne des unités de glucose dans sa molécule, il est entièrement différent quant à sa structure moléculaire et très différent quant à ses propriétés de l'amidon, de l'amidon soluble, de l'amidon oxydé, de la dextrine, du dialdé- hyde-amidor, de l'amidon éthérifié, de l'amidon cationisé, de la cellulose, de l'alcoyl-cellulose, de l'hydroxyalcoyl-cellulose, de la carboxyméthyl-celitulose et de la gomine arabique qui sont les dérivés classiques du glucose se compos@nt principalement d'unités de glucose , de même que dans le cas du pullulane.Par exemple, le pullulane se dissout facilement dans l'eau froide et la solution résultante est stable pendant une période prolongée, si bien qu'on r' a jamais observé de gélification ou de phénomènes dits de "vieillissement". Diverses études menées par les auteurs de l'invention sur ce pullulane ont abouti à la découverte qu'un sulfate de pullulane pouvait être obtenu en faisant réagir le pullulane avec un agent sulfatant et qu'un sel de sulfate de pullulane pouvait entre obtenu par neutralisation de cet ester au moyen d'une substance alcaline. Pour pouvoir être efficaces comme médicament anti-ulcéreux, un sulfate connu de polysaccharide et son sel doivent être sulfatés de manière à contenir au moins 12 % en poids de soufre. Par contre, le nouveau sulfate de pullulane et son sel possèdent d'excellentes propriétés en tant que médicament anti-ulcéreux pourvu qu'ils soient sulfatés a un point tel qu'ils contiennent 5 0 en poids ou davantage de soufre.Ainsi, la présente invention offre ces avantages qu'il est extrêment facile de synthétiser le sulfate de pullulane et son sel qui possèdent d'excellentes propriétés en tant que médicament anti-ulcéreux en sulfatant le pullulane avec un agent de sulfatation, et qu'il ne se produit pratiquement pas de décomposition du pullulane et du produit de la réaction au cours de celle-ci. En outre, le sulfate de pullulane et son sel possèdent cette excellente propriété qu'ils ont beaucoup moins d'effets secondai-es d'anticoagulation du sang que les sulfates connus de polysaccharides. Comme on l'a indiqué ci-dessus, le nouveau sulfate de pullu- lane ou son sel est un excellent modicament anti-ulcéreux sus cep- tible d'être synthétisé facilement, si bien qu'il revêt une importance extrême du point de vue industriel. Le pullulane utilisable comme substance de départ dans le cadre de l'invention peut être par exemple isolé et récupéré sous la forme dtune substance visqueuse sécrétée dans une liqueur de culture d'une souche appartonant au genre Pullularia qui est un microorganisme incomplet. Plus précisement, une souche de l'espèce Pullularia pullulans est sournoise à une culture sous agitation à 24 C pendant 5 jours dans vn milieu contenant 10 % de sirop d'amidon (D.E. 42) ou de glucose, 0,5 % de K2HPO4, 0,1 % de NaCl, 0,02 % de MgSO4. 7H2O, 0,06 % de (NH4) 2SO4 et 0,04 % d'extrait de levure, le pullulane étant obtenu sous la forme d'une substance visqueuse qui est sécrétée par les cellules dans la liqueur de culture. Si necessaire, les cellules sont éliminées de la liqueur de culture par centrifugation et le liquide surnageant est soumis à une précipitation au méthanol et à une séparation, ce qui permet d'obtenir un pullulane purifié. Le pullulane varie quelque peu quant à ses propriétés physi- ques selon le e germe de souche utilisé. Nais dans le cadre de la présente invention, un pullulane préparé à partir d'une souche quelconque petit acore utilisé avec Il n'y a pas de limitation particulière quant au poids moléculaire du pullulane utilisé dans le cadre de l'invention, mais ce poids est compris de préférence entre 10 000 et 5 000 000. La sulfatation selon l'invention peut être effectuée d'après n importe quel procédé classique. Par exemple, on obtient les sulfates de pullulane en faisant réagir le pullulane avec un agent sulfatant tel que l'acide chlorosulfonique, l'anhydride sulfurique ou vn complexe pyridine-anhydride sulfurique en présence d'un solvant tel que la pyridine, le diméthylformamide, le formamide, le chloroforme ou 11 acide sulfureux liquide; avec un agent sulfatant tel que l'acide chlorosulfonloue ou similaire à l'état hydraté fortement alcalis; ; ou avec l'acide sulfurique concentré, ce qui donne lieu à la sulfatation de groupe hydroxyle primaires et secondaires du pullulane. La proportion de l'agent sulfatant à utiliser dans le cadre de l'invention est d'au moins 0,3 mole, de préférence de 0.3 à 20 moles par mole des unités de glucose du pullulane. Il nly a pas de limitation particulière quant à la température ou la durée adoptée pour la réaction de sulfatation selon l'invention, et on les fera de préférence varier d'après le type de l'agent sulfatant. Par exemple, dans le cas où le pullulane est mis en réaction avec un agent sulfatant -tel que l'acide chlorosulfonique, l'anhydride sulfurique ou un complexe pyridine-anhydride sulfurique en présence d'un solvant tel que la pyridine, le diméthylformamide, le formamide ou le chloroforme, la réaction est menée de préférence à une température comprise entre 0 et 80 C pendant 1 à 36 h.Dans le cas où l'on utilise acide sulfureux liquide et l'anhydride sulfurique ou l'acide chlorosulfonique, la réaction est menée de préférence à une température comprise entre -15 et -30 C pendant 1 à 36 h. Dans le cas où l'on utilise l'acide sulfurique concentré, la réaction est menée de préférence à une température comprise entre -500 et +10 C pendant 1 à 36 h. Il est évidemment possible de procéder à la sulfatation, môme dans des conditions qui se situent en dehors des plages indiquées cidessus. Toutefois, si la réaction est menée à une température plus élevée pendant une période de temps plus longue, des réactions secondaires, sous forme de décomposition du pullulane ou de désul- fatation du produit de la réaction, ont tendance à se produire et exercent une forte influence sur le rendement et le degré de sulfa- tation du produit. Le sulfate de pullulane obtenu de la manière indiquée cidessus est mis sous forme d'une solution aqueuse, puis soumis à un traitement de salification; plus précisélent, l'ester est dissous dans une solution noueuse d'une substance alcaline telle que l'hy- droxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de magnesium ou l'hydroxyde de baryum jusqu'à ce que son pH soit compris entre 7 et 12, puis la solution est verne dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone ou un solvant organique similaire miscible avec la solution aqueuse et, dans ces conditions, on peut obtenir un précipité blanc du sel sodique, potassique, calcique, magnésique ou barytique du sulfate de pullulane respectivement. Par ailleurs, le sulfate de pullulane ou son sel sodique, potassique, calcique, mangésique ou barytique, obtenu ae la manière décrite ci-dessus, est mis sous forme d'une solution aqueuse dans laquelle est alors incorporée une solution préparée en ajoutant un acide ou une substance alcaline à de l'aluminium métallique ou à un sel d1aluminium tel que l'hydroxyde d'aluminium, le chlorure d'aluminium, le sulfato d'alumiuium ou le dihydroxychlorure d'aluminium de manière régler le pH de la solution entre 3,3 et 6,0 environ, ce qui permet d'obtenir un précipité blanc de sel aluminique du sulfate de pullulane. Belon mi autre mode de réalisation, le sulfate de pullulane ou son sel hydrosoluble, comme par exemple le sel sodique, potas situe ou calcique, est mis sous forme d'une solution aqueuse à laquelle sont alors incorporées une solution aqueuse contenant un ion aluminium, préparée en ajoutant un acide ou une substance alcaline à l'aluminium métallique ou à un sel d'aluminium tel que l'hydroxyde d'aluminium, le chlorure d'aluminium ou le sulfate d'aluminium de manière à régler le pH de la solution entre 3,3 et 6,0 environ, ainsi qu'une solution aqueuse contenant un ion magné sium, préparée en ajoutant un acide ou une substance alcaline au magnésium métallique ou à un sel de magnésium tel que l'hydroxyde de magnésium, le ch].orure de magnésium ou le sulfate de magnésium de manière à régler le p11 de la solution entre ,3 et 6,0 environ, ce qui permet d' obtenir un sel aluminique-magnésique mixte du sulfate de pullulane. Le nouveau sulfate de pullulane ou son sel ainsi obtenu contient 5 à 20 % en poids de soufre et son action anticoagulente du sang, mesurée d'après la méthode de détermination quantitative à l'héparine définie par la pharmacopée du Japon, oscille entre 1/3C et 1/7 de celle de l'héparine servant de produit étalon et elle est donc faible pour un sulfate de polysaccharide. Par contre, il a été constaté que l'ester ou son sel avait une action extreme- ment forte contre l'ulcère peptique.Par exemple, les sels sodiques de sulfate de pullulane, obtenus dans les exemples décrits ci-après, ont été comparés, quant à leur effet d'inhibition de l'activité protéolytique de la pepsine @n titre, avec le sel sodique de l'héparine, le sel sodique du sulfate de dextrane et le sel aluminique du sulfate de saccharose, les résultats de cette comparaison étant présentés dans le tableau 1-. Il a donc été constaté que les sels sodiques de sulfate de pullulane, même ceux qui ont une faible teneur en soufre, ont un effet très intense à cet égard. Cet effet d'inhibition de l'activité protéolytique de la pepsine in vitre a été mesuré de la manière suivante. t ml d'une solution aqueuse contenant 1 mg/ml de pepsine, réglée au pH 1,6 per acide chlorhydrique, 1 ml d'une solution aqueuse contenant 1, 3 ou 5 mg/ml d'un échantillon et réglée au p11 1,6 par l'acide chlorhydrique ou 1 mi d'acide chlorhydrique au pH 1,6 servant de témoin ont été mis ni incuber à 37 C pendant 10 mn, puis ont été mélangés avec 1 ml d'une solution aqueuse de caséine à 2 %, réglée au pH 1,6 par l'acide chlorhydrique. On a fait réagir la solution mixte résultante pendant 20 mn exactement, puis on y a introduit 10 mi d'acide trichloracétique 0,4M pour mettre fin à la réaction. le précipité formé a été séparé par filtration et 1 ml du filtrat a été mélangé avec 5 ral d'une solution de carbonate de sodium 0,4M et 1 ml d'un réactif phénolique (1e5). On a laissé reposer le mélange résultant à 37 C pendant 2C mn, on l'a refroidi, puis on a mesuré sa capacité d'absorption à 660 . A titre de témoin pour la valeur mesurée, on a pris la valeur de chacune des solutions précitées qui avaient été mélangées avec de l'acide trichloracétique 0,4M avant le mélange avec la solution aqueuse de caséine à 2 %, puis on avait laissé se développer la couleur de la même manière que ci-dessus. A partir de la capacité d'absorption du mélange contenant l'échantillon, l'activité pepsinique résiduelle du mélange été calculée et représentée en pourcentage, en posant comme activité pepsinique à 100 à la capacité d'absorption du témoin. Tableau 1.- Comparaison de l'effet d'inhibition de l'activité protéolytique de la pepsine in vitro Activité pepsinique Quantité résiduelle (%) d'échantillon Teneur nécessaire Echantillon cn pour inhiber soufre 1 mg/ml 3 mg/ml 5 mg/ml l'activité à (%) @ @ @ 60 % Sel sodique d'héparine 11,3 78,8 42,3 26,7 2,0 Sel sodique de sulfate de dextrane 17,8 59,6 9,6 11,1 1,0 Sel aluminique de sulfate de saccharose (10) 82,6 70,1 51,5 4,1 Sel sodique de sulfate de pullulane (Exemple 1) 7,7 80,9 43,9 16,6 2,1 ( " 2) 15,0 60,3 13,9 8,5 1,0 ( " 3) 12,6 55,2 8,2 7,8 0,8 ( " 4) 10,7 56,3 4,9 10,3 0,8 En vue d'arrêter 11 évolution d'ulcères peptiques et/ou de les traiter chez des mammifères, par exemple des porcs et des entres humains, les sulfates de pullulane selon l'invention sont administrés par voie orale à une dose de 10 à 100 mg/kg/jour. A cette fin, les sulfates de pullulane sont combinés aux excipients ou adjuvants pharmaceutiques classiques pour doser des présentations unitaires se prôtarft à l'administration orale, par exemple des comprimés, des granules et des poudres, par un procédé connu en soi dans le domaine pharmaceutique. l'ors de la préparation de ces compositions, on peut combiner les sulfates de pullulane, si on le désire, avec d'autres agents anti-ulcéreux, par exemple des calmants du système nerveux central tels que tranquillisants, agents anti-cholinergiques, antiacides, agents anti-pepsiniques et agents de protection de la cellule muqueuse gastrique. Les sulfates de pullulane obtenus d'après l'invention peuvent Ntre utilisés en outre comme adjuvants pour des aliments, des échangeurs d'ions, des matières d'apprêt, etc. L'invention est ci-après illustrée par des exemples qui sont toutefois donnés à titre purement indicatif et ne limitent pas la portée de l'invention. Exemple 1 A une dispersion de 25 g d'un pullulane (poids moléculaire, 150 000) dans 500 ml de pyridine, on ajoute progressivement 75 ml d'acide chlorosulfonique sous agitation à 20 C et on laisse réagir le mélange résultant sous agitation à 25 C pendant 4 h. A la fin de la réaction, le produit est dissous dans 350 mi d'eau froide. La solution résultante est réglée à un pH compris entre 7 et 10 avec de l'hydroxyde de sodium 1N pour former un sel sodique, puis elle est dialysée dans de la cellophane de dialyse. Le liquide de dialyse est versé-dans 2 litres de méthanol et un précipité se dépose.Ce précipité est recueilli et séché, et l'on obtient 29,3 g d'un sel sodique de sulfate de pullulane qui contient 7,7 % de soufre. Exeriule 2 A 300 ml de pyridine, on ajouto progressivement 75 mi d'acide chlorosulfonique sous agitation à 20 C. A cette solution, on ajoute progressivement 25 g d'un pullulane (poids moléculaire, 10 000) sous agitation à 70 C et on laisse le mélange résultant réagir sous agitation à 700C pendant 4 h. Puis le produit de la réaction est traité de la même manière que dans l'Exemple 1 et l'on obtient 66,4 g d'un sel sodique de sulfate de pullulane qui contient 15,0 % de soufre. Exemple 3 On répète l'Exemple 2, à cette éxception que le pullulane, d'un poids moléculaire de 10 000, est remplacé par un pullulane ayant un poids moléculaire de 89 000. Dans ces conditions, on obtient 58,9 g d'un sel sodique de sulfate de pullulanequi contient 12,6% desoufre. Exemple 4 On répète l'Exemple 2, à cette exception que le pullulane de poids moléculaire 10 000 est remplacé par un pullulane ayant Un poids moléculaire de 140 000. Dans ces conditions, on obtient 62,7 g d'un sel sodique de sulfate de pullulane qui contient 10,7 % de soufre. Exemple 5 A 750 g d'acide sulfureux liquide, refroidi à -400C par de la glace sèche-acétone, on ajoute 35 g d'anhydride sulfurique et 10 g de pullulane. On laisse réagir le mélange résultant sous agitation à une température comprise entre -20 et -15 C pendant 10 h, puis on le laisse reposer à la température ambiante pendant 18 h. Durant ce temps, l'acide sulfureux s'évapore et le produit de la réaction reste sous forme de précipité au fond. T,e précipité est récupéré par filtration, puis dissous dans 150 ml d'eau froide. A la solution résultante, on ajoute une solution aqueuse d'hydro- xyde de sodium jusqu'à un p11 de 10 et les matières insolubles sont extraites pa filtration. Puis le filtrat est versé da!ls 1 litre de méthanol et un précipité se dépose.Le précipité est récupéré par filtration, puis séché et l'on obtient 16,3 g d'un sel sodique de sulfate de pullulais qui contient 18,5 % de soufre Exemple 6 A une dispersion de 10 g d1un pullulane (poids moléculaire, 150 000) dans 100 ml de pyridine, on ajoute progressivement 40 g d'un complexe pyridine-anhydride sulfurique sous- agitation à 500C et on laisse réagir le mélange résultant sous agitation à 60 C. A l'achèvement de la réaction, le produit est refroidi à la glace pour éliminer la pyridine et le précipité résultant, comparable à une gelée d'amidon, est dissous dans l'eau froide. On règle à 7,5 le pH de la solution résultante par addition d'une solution aqueuse a'hydroxyde de sodium IN, puis on soumet la solution à une dialyse. Le liquide de dialyse est concentré, puis versé dans 1 litre d'éthanol et un précipité se dépose. Ce précipité est recueilli par filtration, puis séché et l'on obtient 26 g d'un sel sodique de sulfate de pullulane qui contient 17,3 % de soufre. Exemple 7 10 g d'un pullulane (poids moléculaire, 89 000) sont ajoutés à 80 mi d'acide sulfurique concentré à 95 , refroidis à -50C et le mélange résultant est agité pendant 2 h, y compris le temps nécessaire pour l'addition. A ce mélange, on ajoute 300 ml d'éther sous refroidissement de manière à ne pas dépasser 10 C et le produit de la réaction se dépose sous forme d'un précipité. Le préci- pité est récupéré par filtration et lavé à l'éther pour donner une poudre blanche. Cette poudre est dissoute dans 100 g d'eau glacée et le pH de la solution résultante est réglé à 7,0 par addition d'une solution d'hydroxyde de sodium. Puis les matières insolubles sont extraites de la solution par filtration et le filtrat est soumis à une dialyse.Le liquide de dialyse est versé dans 500 mi d'éthanol et un précipité se dépose. Le précipité est récupéré par filtration, puis séché et l'on obtient 7,6 g d1un sel sodique de sulfate de pullulane qui contient 4,0 % de soufre. Exemple 8 A une solution de 10 g du sel sodique de sulfate de pullulane obtenu dans l'Exemple 3 dans 400 ml d'eau, on ajoute progressive- ment sous agitation une solution préparée en dissolvant, dans 500 mi d'eau, 14 g d'un composé obtenu en traitant 1 mole d'hydroxyde d'aluminium par 0,5 mole d'acide chlorhydrique, d'o@ il résulte que la solution mixte résultante se trouble immédiatement et un précipité e dépose. Dans ce cas, le pH de la solution est 4,8. Après avoir agité la solution à la température ambiante pendant 30 rs, on récupère le précipité par filtration, on le lave à l'eau et on le sèche pour obtenir 12,4 g d'un sel aluminique de sulfate de pullulane qui contient 12,7 % d'aluminium et 8,8 % de soufre. - R E V E N D I C A T I O N S 1. Sulfate de pullulane ou son sel. 2. Sulfate de pullulane ou son sel, caractérisé en ce qu'il contient 5 à 20 ffi en poids de soufre. 3. Sulfate de pullulane ou son sel, caractérisé en ce qu'il contient un pullulane qui a un poids moléculaire compris entre 10 000 et 5 000 000. 4. Sulfate de pullulane, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un sel sodique, potassique, magnésique, calcique, ammonique ou aluminique ou d'un sel mixte de ceux-ci. 5. Procédé de préparation d'un sulfate de pullulane ou de son sel, caractérisé en ce qu'un pullulane est sulfaté avec un agent sulfatant en présence ou en l'absence d'un solvant et, si nécessaire, est en outre soumis à un traitement de salification. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le solvant est la pyridine, le diméthylformamide ou le chloroforme et en ce que l'agent sulfatant est l'acide chlorosulfonique, l'anhydride sulfurique ou mi complexe pyridine anhydride sulfurique. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la sulfatation est effectuée à une température de réaction comprise entre 0 et 800C pendant une durée de réaction de 1 à 36 h. 8. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le solvant est l'acide sulfureux liquide et l'agent sulfatant est l'anhydride sulfurique ou l'acide chlorosulfonique. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la sulfatation est effectuée à une température de la réaction comprise entre -15 et -30 C pendant une durée de réaction de 1 à 36 h. lo Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'agent sulfatant est l'acide sulfurique. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la sulfatation est effectuée à une température de la réaction comprise entre Soc et +10 C pendant une durée de réaction de 1 à 36 h. 12. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'agent sulfatant est utilisé dans une proportion de 0,3 à 20 moles par mole des unités de glucose du pullulane. 13. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle est formée d'une dose thérapeutiquement active d'au moins un sulfate de pullulane ou de l'un de ses sels non toxiques acceptables pharmaceutiquement, et d'un excipient ou diluant acceptable pharmaceutiquement. 14. Application dé la composition pharmaceutique selon la revendication 15 au traitement de l'ulcère peptique.