FR 2299314 A1 19760827 FR 7503300 A 19750203 L'invention concerne un procédé de purification de l'insu- line-métal alcalin ou de l'insuline-ammonium, en utilisant la filtration sur gel à un '111 PH de 7,5 à 9,5 L'invention fournit un procédé de purification de l'insuline- métal alcalin ou de l'insuline-ammonium, qui consiste à faire gonfler un gel ayant à l'état sec un taux de récupération d'eau d'aù moins environ 4 % en poids et de diamètres de particule inférieurs à environ loo microns ; à garnir une colonne avec le gel gonflé ; à ajouter à la colonne garnie une solution aqueuse d'une insuline-métal alcalin ou d'insuline-ammonium ayant une pureté d'au moins environ 80 %, dans laquelle la concentration en insuline est comprise entre environ 1 et environ 8 X, poids/volume, la quantité totale d'insuline est suffisante pour fournir une charge dans la colonne comprise entre environ 0,8 et environ 6,7 grammes par litre de lit, et le pH de la solution est dans la gamme d'environ 7,5 à environ 9,5 ; et à éluer l'insuline de la colonne, à une température commise entre environ 5 et environ 300C, à l'aide d'un éluant aqueux ayant un pH dans la meme gamme que celle de la solution d'insuline. Depuis sa découverte en 1921 comme composant du pancréas, l'insuline a pris une importance mondiale dans le traitement du diabète sucré. Comme les modes opératoires d'extraction utilisés pour enlever 1' insuline du tissu pancréatique enlèvent également des quantités importantes de protéines autres que l'insuline, des efforts considérables ont été dépensés pour créer des procédés de purification de l'insuline , c'est-à-dire des procédés permettant de séparer l'insuline des protéines autres que l'insuline Plusieurs des procédés créés pour purifier l'insuline ont une importance industrielle. Parmi ces procédés industriellement importants, l'un des premiers utilise le phénomène général qu'une protéine a une solubilité minimale au point isoélectrique, les autres- -facteurs étant par ailleurs constants. Banting et al. décrivent dans le brevet des E.U.A. N0 1.469.994 un procédé de purification qui consiVe a faire précipiter à leur point isoélectrique les protéines autres que insuline contenues dans un extrait aqueux de pancréas. La précipitation isoélectrique de l'insuline à partir d'un extrait pancréatique aqueux d'un pH d'environ 4 à environ 7 a été ensuite décrite par Walden dans le brevet des E.U.A. NO 1.520.673. Dans un autre procédé ancien, on effectue la précipitation de l'insuline par l'addition d'une quantité suffisante d'un sel minéral. Murlin dans le brevet des E.U.A. NO 1.547.515 décrit le premier procédé de relargage de l'insuline d'un solvant d'extraction par addition de chlorure de sodium. Un procédé de relargage différentiel est décrit par Lautenschlager et al dans le brevet des E.U.A. N0 2.449.076, procédé qui comprend le relargage de l'insuline d'un extrait neutralisé par addition de chlorure de sodium, filtration, redissolution du résidu et nouveau relargage de l'insuline, mais avec une concentration en sel inférieure à celle utilisée dans la première étape de relargage. Un troisième procédé industriellement important de purification de l'insuline comprend la précipitation ou la cristallisation de l'insuline de la solution sous forme d'un complexe insuline ne-zinc. En général, l'insuline-zinc précipite à partir d'une solution aqueuse tamponnée contenant des ions zinc. Divers tampons ont été utilisés; par exemple Petersen dans le brevet des E.U.A. NO 2.626.228 utilise un tampon acide citrique-citrate. A l'heure actuelle les procédés industriels de purification de l'insuline utilisent typiquement les trois procédés pré cédents. Comme l'insuline-zinc est la forme la plus importante industriellement de l'insuline, la dernière étape de la purification de l'insuline est normalement une étape de cristallisation par le zinc. Cependant, on sait depuis quelques années que les protéines autres que l'insuline parmi lesquelles la pro-insuline et les protéines du type pro-insuline sont les plus importantes sont des composants mineurs des insulines-zinc industrielles. Bien que ces composés constituent généralement moins d'environ 8% en poids des insulines-zinc industrielles, on pense que certains de ces composés ont une nature antigene ou immunogène. Voir par exemple, Chance et al., Science, 161, 165 (1968) ; Steiner et al., Diabetes, 18, 725 (1968) ; Bromer, Bioscience, 20, 701 (1970) ; et Rubenstein, et al., Ann. Rev. Med., 22, 1 (1971). Donc à l'heure actuelle il existe encore le problème de l'élimination à une échelle industrielle des protéines autres que l'insuline à partir de l'insuline. Le terme "insuline" tel qu'utilisé ici comprend non seulement l'insuline en elle-même, mais également toutes les protéines du type insuline, comme la désamido-insuline. Comme l'insuline les protéines du type insuline ont des activités hypoglycémiantes similaires, il n'est généralement pas nécessaire de séparer l'insuline de toutes les autres protéines pancreatiques, c'est-à-dire qu'une insuline homogène n'est normalement pas nécessaire. On sait que des techniques de séparation de substances biologiques à une échelle analytique, comme l'électrophorêse et la chromatographie d'échange d'ion, permettent de séparer les composants non insuline du composant insuline des préparations industrielles (ou même brutes) d'insuline. Ces techniques permettent meme de séparer le composant insuline en insuline et en insuline désamidée. Cependant ces modes opératoires ont une utilité à grande échelle qui est aléatoire. Un mode opératoire que l'on peut plus facilement adapter à une grande échelle est la filtration sur gel (expression synonyme à chromatographie d'exclusion sur gel ou chromatographie par filtration sur gel). Dans ce procédé, on sépare les protéines sur une colonne contenant un gel qui a été réticulé d'une manière telle que des pores sont formés dans chaque particule de gel. Ces pores ont un volume mesurable fini qui est directement proportionnel au degré de gonflement du gel et inversement proportionnel au degré de réticulation. Comme les plus petites molécules ont un ac cès plus total à ces pores que les molécules plus grosses, le déplacement des plus petites molécules dans la colonne est gêné par rapport à celui des plus grosses molécules qui ont seulement un accès partiel ou nul aux pores. On a utilisé dans le passé la filtration sur gel pour purifier l'insuline. Dans la séparation de l'insuline à partir d'un pancréas de chat, onobtient l'insuline brute parextractionacide- alcool suivie d'une précipitation alcaline pour éliminer les ma tières inactives, concentration, précipitation au point isoélectrique, et finalement précipitation par relargage par le chlorure de sodium. On introduit alors l'insuline brute dans une colonne de gel de dextrane réticulé et on l'élue avec de l'acide acétique 1,0 M. Davoren, Biochim. Biophys. Acta, 63, 150 (1962). Dans la séparation de l'insuline à partir de poisson, on homogénéise les glandes dans l'eau et on fait précipiter les pro téines par une solution d'acide trichloro-acétique. On extrait le précipité avec un mélange acide-éthanol et on traite les extraits par le chlorure de méthylène pour éliminer les lipides. On sépare les solides restants et on les reprend dans de l'acide acétique à 5,0 M et on les filtre sur une colonne de gel de dextrane réticulé avec de l'acide acétique 5,0 M comme solvant d'élution. Humbel, Biochem. Biophys, Res. Commun., 12, 333 (1963).Des rendements d'environ 80% sont obtenus. I1 faut noter que Humbel indique que pour une bonne séparation de l'insuline et des autres protéines, les conditions d'élution doivent favoriser la dissociation des molécules d'insuline. I1 suggère en outre que l'acide acétique 1,0 M n'est pas un solvant satisfaisant car, selon Yphantis et Waugh (Biochim. Biophys. Acta, 26, 218 (1957) ), l'insuline nty est pas totalement dissociée. On filtre un extrait brut de pancréas de boeuf sur un gel de dextrane réticulé, selon Epstein, et al., Biochemistry, 2, 461 (1963). Le solvant d'élution est le bicarbonate d'ammonium 0,2 M, solvant qui a également été condamné par Humbel, voir ci-dessus. Epstein et al., indiquent un rendement d'environ 60%. L'insuline a même été séparée à partir de pancréas humain. Les glandes sont d'abord homogénéisées et extraites. Un fractionnement par le sulfate d'ammonium élimine une certaine quantité de matériaux inactifs. Puis on fait précipiter l'insuline, d'abord avec du chlorure de sodium puis en utilisant une technique de précipitation au point isoélectrique. On dissout l'insuline résultante dans de l'acide acétique 0,5 N et on la filtre sur un gel de dextrane réticulé. On transforme ensuite l'insuline filtrée en insuline-zinc. Jackson, et al., Diabetes, 18, 206 (1969). Le rende- ment en insuline après filtration sur gel est environ 60%. Enfin, la filtration sur gel et la chromatographie d'échange d'ion ont été combinées par Schlichtkrull et al., dans le brevet Sud-Africain NO 69/5280 (pour un brevet équivalent voir le brevet Belge NO 737.257). Dans l'exemple comportant seulement une filtration sur gel (Exemple 1), l'insuline-zinc est filtrée sur une colonne de gel de dextrane réticulé avec un rendement de 80%. Le solvant d'élution est l'acide acétique 1,0 M. Il faut noter que Schlichtkrull et al. trouvent nécessaire, après filtration, d'effectuer un relargage, une précipitation au point isoélectrique et une cristallisation par le zinc de manière à obtenir l'insulinezinc. Chacune des applications de la technique antérieure de la filtration sur gel à la purification de l'insuline a entrainé une perte importante d'insuline. En outre, d'après la technique antérieure, il n'y a aucune indication fiable qu'on n'obtienne que de l'insuline (y compris les protéines du type insuline comme décrit ci-avant) comme résultat de l'utilisation de la filtration sur gel. En général, on peut utiliser dans le procédé de la présente invention un quelconque gel gonflable à l'eau qui convient à l'utilisation avec les solutés de protéine. Cependant, un tel gel doit avoir à l'état sec ou non gonflé un taux de récupération d'eau d'au moins environ 4% en poids, par rapport au poids du gel sec, et des diamètres de particule inférieurs à environ 100 microns. De préférence, le taux de récupération d'eau du gel doit être compris entre environ 4 et environ 98%, et de préférence entre environ 5 et 20%. De préférence, les diamètres des particules du gel sec doivent être inférieurs à environ 80 microns ; une gamme particulièrement utile de diamètres de particule va d'environ 20 à environ 80 microns. Des exemples des gels appropriés comprennent, entre autres, l'amidon (y compriS l'amidon de mals), le galactomannane réticulé, le dextrane réticulé, l'agar-agar ou gélose, les polyacylamides, les copolymères d'acylamide et de méthylène bis-acrylamide, les copolymères de méthylène bis-acrylamide avec le vinyléthylcarbitol et avec la vinylpyrrolidone, etc... Les gels préférés sont les dextranes réticulées, comme la série Sephadex fabriquée et vendue par Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, N.J., U.S.A. Le type de colonne utilisé dans le procédé n'est pas déterminant. Le choix de la hauteur, du diamètre, de la configuration de la colonne dépend des paramètres de fonctionnement utilisés. Evidemment, lorsque la hauteur de la colonne augmente le débit diminue ; en d'autres termes, la contre-pression de la colonne est directement proportionnelle à la hauteur de la colonne. Pour cette raison, on préfère une configuration de colonne empilée, comme la colonne à sections Pharmacia Sectional Column KS-370. Dans un but de production normale, un empilement de six sections convient parfaitement. Pour l'approximation, on peut effectuer une purification satisfaisante de l'insuline à des charges de colonne d'environ 4,5 grammes d'insuline-métal alcalin ou d'insuline-ammonium par litre de lit, charge qui est nettement préférée. Cependant,la charge de la colonne peut de manière générale etre comprise entre environ 0,8 et environ 6,7 grammes par litre de lit, bien que la gamme préférée soit d'environ 3,5 à environ 5,0 grammes par litre de lit. Evidemment, les conditions optimales seront déterminées facilement pour une quelconque colonne donnée. Le gel peut etre gonflé et la colonne garnie à l'aide du gel gonflé selon l'un quelconque des divers procédés connus-de l'homme de l'art. En général, le gel sera gonflé dans le milieu d'élution. Ou bien, on peut gonfler le gel dans de l'éthanol aqueux à 30 %, décanter les fines et remplacer le milieu de gonflement par le milieu d'élution. De manière générale, on dissout l'insuline-métal alcalin ou l'insuline-ammonium dans de l'eau distillée et on ajuste le pH comme on le désire avec une base diluée ou un tampon organique dilué. Les bases appropriées comprennent l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, l'hydroxyde de lithium, l'hydroxyde d'ammonium, etc... On préfère l'hydroxyde de sodium. Des exemples des tampons organiques appropriés compren -; l'hydirox--de de sodium-glycine, le tris tris(hydroxy-méthyl)- aminométhane, etc... En général, on peut préparer par l'un quelconque des procédés connus l'insuline-métal alcalin ou l'insuline-ammonium. On préfère cependant que l'insuline-métal alcalin ou l'insuline-amm;o- nium soit préparée par le procédé du brevet des E.U.A.N 3.719.655. Comme indiqué ci-avant, cependant ladite insuline doit avoir une pureté d'au moins environ; 80 %. c'est-à-dire que la teneur en insu line, comprenant les protéines du type insuline ayant une activité hypoglycémiante, doit être au moins environ 80% des protéines totales présentes. La concentration en insuline-métal alcalin ou en insulineammonium de la solution d'insuline introduite dans la colonne doit être, comme indiqué ci-avant, d'environ 1 à environ 8% poids/volume. La concentration préférée est d'environ 4 à environ 6%. Pour des résultats satisfaisants, l'insuline-metal alcalin ou l'insuline-ammonium doit être dissoute dans un volume de solvant qui est inférieur au volume de séparation, décrit ci-dessous. En chromatographie, le coefficient de distribution Kd est défini comme le rapport de la concentration en soluté dans la phase mobile à la concentration en soluté dans la phase stationnaire. En filtration sur gel, la phase mobile est le solvant se déplaçant dans l'espace vide entre les particules de gel et la phase stationnaire est le solvant imbibé dans les particules de gel, c'està-dire emprisonné dans les pores que contient chaque particule de gel. Ainsi, Kd désigne la fraction de solvant imbibé dans laquelle un soluté peut pénétrer. On peut exprimer le volume d'élution Ve d'un soluté en fonction de Kd selon l'équation Ve = VO + Kd ' Vi où Vo est le volume de vide de la colonne et V est le volume de solvant imbibé. Si l'on sort Kd, l'équation devient Si l'on suppose que la densité de l'eau est l'unité, V. = a.Wr, où a est le poids du gel sec et Wr est le taux de récupération d'eau. Ainsi, Kd devient que l'homme de l'art peut déterminer de manière expérimentale. Ensupposant qu'une solution contient deux solutés, le volume d'élution pour chaque soluté est exprimé comme suit V ' = V + K 'V. e o d i Ve" - Vo + Kd "V. Le volume de séparation Vs est la différence entre les volumes d'élution des deux solutés Vs = V e - V e VS = (Kdll Kd')Vi D'après ce qui précède, on voit que le degré de séparation de deux ou plusieurs solutés dépend en partie de la charge de la colonne. Lorsque la quantité de soluté de poids moléculaire inférieur approche la limite des pores accessible, la séparation entre les deux solutés doit nécessairement diminuer. Dans les limites de charge indiquées comme faisant partie de la présente invention, le degré de séparation peut varier. Dans certains cas une charge de colonne plus élevée peut etre choisie pour équilibrer la séparation et la productivité. Comme indiqué ci-avant, le milieu d'élution peut avoir un pH compris entre environ 7,5 et environ 9,5. Habituellement, le milieu d'élution peut etre une solution aqueuse de la meme base ou meme tampon que celui utilisé dans la préparation de la solution d1 insuline. Si on le désire, le solvant d'élution peut contenir jusqu'à environ 0,02 mole par litre de sel minéral, comme le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure d'ammonium, etc... La concentration préférée est 0,01 M et le sel préféré est le chlorure de sodium. L'utilisation d'un tel sel est préférée pour améliorer la séparation et pour empecher les substances basiques d'etre absorbées par le gel. L'élution de la colonne peut etre effectuée à des températures comprises entre environ 5 et environ 300C. De préférence,la température de traitement sera la température ambiante ou une température inférieure. On suit le cours de l'élution par un quelconque moyen ap proprié. Un procédé particulièrement utile consiste cependant à mesurer l'absorption ultra-violette à 280 mw de chaque fraction. On réunit les fractions représentant le composant insuline purifiée désiré et onlestransforme généralement en insuline-zinc. Comme indiqué précédemment, l'insuline-zinc est la forme la plus importante de l'insuline. En conséquence, l'insuline-mé- tal alcalin ou llinsuline-ammonium de pureté élevée obtenue par le procédé sera généralement transformée en insuline-zinc. La transformation en insuline-zinc est de préférence effectuée à pH 6,0 en présence d'un tampon acétate d'ammonium. Il n'est pas nécessaire de séparer du milieu d'élution l'insuline-metal alcalin ou l'insuline-ammonium, ou de concentrer la solution d'insuline purifiée avant de la cristalliser à l'aide de zinc.Un avantage du présent procédé est que l'insuline en solution telle qu'éluée est suffisamment concentrée pour qu'une précipitation au point isoélectrique ou une précipitation par un sel ne soit pas nécessaire, bien que l'on puisse utiliser ces modes opératoires si on le désire. L'insuline-zinc ainsi obtenue a une pureté améliorée par suite du procédé. On peut montrer par plusieurs méthodes cette pureté améliorée. On peut analyser l'insuline-zinc directement pour déterminer les composants du type protéine non insuline, comme la pro-insuline et le glucagon. La présence de protéines de poids moléculaire élevé, qui comprennent typiquement la protaminase qui est une enzyme protéolytique, peut être déterminée en mesurant la stabilité d'une suspension d'insuline-protamine à tem pérature élevée ; si de la protaminase est présente, le complexe insuline-protamine se dissociera en raison de la dégradation de la protamine. On peut mesurer les propriétés physiques, comme la so lubilité de l'insuline-zinc à un pH neutre et la coloration de la solution résultante. Enfin, on peut mesurer l'activité spécifique de l'insuline par des effets biologiques et immunologiques. Enraison de sa purete accrue, l'insuline-zinc obtenue après mise en oeuvre du procédé, est un matériau indiqué pour la formulation de diverses formes pharmaceutiques de l'insuline, par exemple l'insuline normale, l'isophane-insuline, la protamine-insuline-zinc, la suspension d'insuline-zinc, la globine-insuline, etc... En outre, l'insuline-zinc plus pure permet la préparation d'une insuline neutre qui est plus stable que l'insuline acide les impuretés qui jusqu'à présent étaient présentes dans l'insu line-zinc précipitent souvent partiellement à un pH neutre.Ces impuretés comprennent souvent des enzymes qui dégradent l'insuline, comme la trypsine et la chymotrypsine, ce qui diminue la puissance de la préparation d'insuline. L'insuline-zine plus pure permet également la formulation de préparations d'insuline de porc et de boeuf à action étendue, sans la purification supplémentaire qui était nécessaire jusqu a présent. Enfin, la préparation de lgisophane-insuline à partir de l'insuline-zinc plus pure demande moins de protamine car l'absence des impuretés protéinées acides permet l'utilisation de la seule quantité de protamine nécessaire pour faire précipiter l'insuline. On peut combiner le procédé comme on le désire avec d'autres modes opératoires de purification. Par exemple, on peut soumettre la solution d'insuline-métal alcalin ou d'insuline-ammonium à une ou plusieurs opérations de filtration avant d'effectuer la filtration sur gel. On peut également soumettre l'insuline éluée ne ou plusieurs opérations de filtration avant la trans forma- tion en insuline-zinc. LXEMp:LE On met en suspension dans de l'eau distillée 5,33 g d'insuline-sodium de boeuf ayant une puissance de 26,4 unités/mg et une teneur en pro-insuline de 7,2 % en poids. On ajoute jusqu'a un pH de 9,0 de l'hydroxyde de sodium dilué. Le volume de la solution résultante est 100 ml. On- équilibre dans de l'hydroxyde de sodium aqueux ayant un pH de 9,0 un gel de dextrane réticulé ayant un taux de récupération d'eau de 5 % et des tailles de particules de 20 à 80 . On utilise le gel gonflé pour garnir anx colonne de 4,0 x 4,30 cm ayant un volume de lit de 540 ml On ajoute à la colonne une portion de 40 ml de la solution d'insuline.Puis on élue la colonne avec de l'hydroxyde de sodium aqueux à pH 9,0, en recueillant des fractions d'environ 6,5 ml. On suit l'élution en mesurant l'absorption ultraviolette à 280 m. On réunit les fractions correspondant au composant insuline et on les acidifie à pH 3,0 avec de l'acide chlorhydrique 6 N. On filtre la solution résultante, on ajoute du chlorure de zinc et on sépare l'insuline-zinc à pH 6,0 dans un tampon acétate d'ammonium. On obtient 1,83 g d'insuline-zinc, ce qui correspond à un rendement de 82,5 % par rapport à la substance de départ. L'insuline a une puissance de 26,8 unités/mg et une teneur en pro-insuline inférieure à 0,05 % en poids , la récupération par rapport aux unités d'insuline est 83,8 %. On transforme directement une portion de 37,5 ml de la solution d'insuline initiale en insuline-zinc comme décrit précédemment, sans passer par l'étape de filtration sur gel. On obtient 1,87 g (rendement de 90,1 %) d'insuline-zinc ayant une teneur en pro-insuline de 5,4 % en poids. REVEND ICAT IONS 1. Procédé de purification de l'insuline-métal alcalin ou de l'insuline-ammonium, qui consiste : à faire gonfler un gel ayant à l'état sec un taux de récupération d'eau d'au moins environ 4 % en poids et des diamètres de particule inférieurs à environ 100 microns ; à garnir une colonne avec le gel gonflé ; à ajouter à la colonne garnie une solution aqueuse d'insuline-métal alcalin ou d'insuline-ammonium ayant une pureté d'au moins environ 80 %, dans laquelle la concentration en insuline est comprise entre environ 1 et environ 8 % poids/volume, la quantité totale d'insuline est suffisante pour donner une charge de colonne comprise entre environ 0,8 et environ 6,7 grammes par litre de lit, et le pH de la solution est dans la gamme d'environ 7,5 à environ 9,5 ; et à éluer l'insuline de la colonne à une tempéra ture comprise entre environ 5 et environ 3O0C, à l'aide d'un éluant aqueux dont le pH est dans la meme gamme que eelle de la solution d'insuline. 2. Procédé selon la revendication 1, où ledit gel a un taux de récupération d'eau compris entre environ 4 et environ 98 %. 3. Procédé selon la revendication 2, où ledit gel a un taux de récupération d'eau compris entre environ 5 et environ 20 %. 4. Procédé selon la revendication 3, où ledit gel est un dextrane réticulé. 5. Procédé selon la revendication 4, où ledit gel a un taux de récupération d'eau environ 5 %. 6. Procédé selon la revendication 5, où les diamètres de particule dudit gel sont compris entre environ 20 et environ 80 microns. 7. Procédé selon la revendication l, où la charge de la colonne est comprise entre environ 3,5 et environ 5a0 grammes par litre de lit. 8. Procédé selon la revendication 7, où la charge de la colonne est environ 4,5 grammes par litre de lit. 9. Procédé selon la revendication l, caracet-erisé en ce que l'agent d'élution contient un sel minéral à une concentration allant jusqu'à environ 0,02 M. lO. Procédé selon la revendication 9, où le sel minéral est présent à une concentration d'environ 0,01 M. 11. Procédé selon la revendication 10, où ledit sel minéral est le chlorure de sodium. 12. Procédé selon la revendication 1, où lzélution est effectuée à la température ambiante. 13. Procédé selon la revendication 1, où l'élution est effectuée à 50C. 14. Procédé de purification d'insuline-sodium de boeuf qui consiste : à faire gonfler un gel de dextrane réticulé ayant un taux de récupération d'eau de 5 % et des diamètres de particule compris entre 20 et 80 microns ; à garnir une colonne de 4,0 cm x 43,0 cm ayant un volume de lit de 540 ml à l'aide du gel gonflé ; à ajouter à la colonne garnie une solution aqueuse d'insuline-sodium de boeuf ayant une concentration en insuline de 5,5 % et un pH de 9 9 et à éluer l'insuline de la colonne à la température ambiante avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à pH 9.