FR 2294715 A1 19760716 FR 7441714 A 19741217 Lorsque l'on désire obtenir des produits à activité antibiotique, on prend en général comme modele la polymixine qui est un polypeptide contenant entre autres des acides aminés basiques et un acide gras. VOGLER et ses collaborateurs ont montré que les plus actifs étaient des dipeptides acylés pour lesquels l'acide aiiné basique est la Lysine homologue supérieur de l'acide &alpha;- Y- diaminobutyrique contenu dans la polymixine et l'acide gras est un acide aliphatique linéaire possédant de 14 à 18 atomes de carbone. D'autre part, la fonction carboxylique doit autre bloquée pour augmenter la basicité du peptide. le nouveau peptide selon la présente invention qui a été préparé possède l'enchaînement lysine-lysine mais à la place d'utiliser des acides gras linéaires, on a utilisé pour l'obtention du peptide de l'invention un acide gras ramifié : l'acide diméthyl-2, 2' - palmitique ou DMP dont la formule développée est: L'emploi de cet acide se justifie par les fait suivants: - cet acide possède une chaine de 16 carbones qui doit donner au peptide l'activité antibiotique optimum, - l'addition de deux radicaux méthyles augmente la liposolubilité, - les acides gras ranifiés en sont dégradés plus lentement que les acides linéaires, - enfin, l'acide A-T lui-même possède des propriétés antibacté riennes. La fonction acide terminale a été bloquée par une fonction ester méthylique et le peptide a été cristallisé sous forme de chlorhydrate. La formule du peptide est donc DMP - lys-lys-OMe, ?HCl où DMP signifie acide diméthyl-2, 2' palmitique, lys = lysine et OMe est un groupe méthoxy. METHODE DE SYNTHESE. 1 - Synthèse des matières premières. L'acide diméthyl-2,2' diméthylpalmitique 6 est synthétisé selon une méthode connue de la littérature. L'isobut & ophénone 3 préparée par addition selon FRIEDEL et CRAFTS du benzène sur le chlorure de l'acide isobutyrique 2 en présence de chlorure d'aluminium est rarifiée par addition du bromure de tétradécane en présence d'amidure de sodium. Un deuxième traitement par l'amidure de sodium transforme l'isobutyrophénone ramifiée 4 en amide 5 . L'amide est hydrolysé par un mélange de H2S04 et CH3COOH en acide 6 qui est purifié par distillation. ( Voir tableau I page 14 pour les formules de réaction ) Synthèse de la N-&alpha;-formyl-N-#-phtaloyl-L-lysine 71 Pour bloquer la fonction #-NH2 de la lysine, on a utilisé le radical phtaloyle qui résiste à l'hydrolyse acide et s'élimine facilement à l'hydrazine, tandis que pour la fonction &alpha;-NH2 on a utilisé le radical formyle qui s'élimine facilement par hydrolyse acide douce. Le radical phtaloyle est introduit à l'aide de N-éthoxycarbonylphtalimide selon la méthode de NEFKENS après avoir formé un complexe cuivrique 8 entre la fonction carboxylique et la fonction &alpha; aminée de la L-lysine. Le radical formyle est additionné par l'intermédiaire de l'anhydride mixte d'acide acétique et d'acide fornique selon la méthode de SHEEMAN.Le composé N-&alpha;formyl-N-#phtaloyle-L-lysine 11 est un composé nouveau. ( Voir tableau II page 15 pour les formules de réaction ) Principe de la synthèse du peptide acylé 17 La fonction acide de la N-t-pht, lys 10 est estérifiée par de l'alcool méthylique anhydre saturé en acide chlorhydrique gazeux. Pour former la liaison peptidique entre les deux restes lysyles, nous avons fait réagir deux moles de Pht-lys dont l'une a une fonction amine libre 12 (la fonction acide libre étant estérifiée) et l'autre une fonction acide libre Il (la fonction amide étant forEylée), en présence dtune mole de dicyclohexylcarbodiinide. Cette addition a lieu avec un renderent de 70 % et le produit voulu est séparé par cristallisation des produits de départ et de la dicyclohexylurée.Après avoir éliminé le radical formyle par hydrolyse acide, la fonction amine libérée est acyle par le chlorure de l'acide DIS . Les radicaux phtaloyles protégeant les deux fonctions # - aminées des deux restes lysyles sont éliminés par l'hydrazine à froid et le produit obtenu est transformé en chlorhydrate qui est purifié par cristallisation. ( Voir tableau III page 16 pour les formules de réaction) PARTIE EXPERIMENTALE. Synthèse de l'isobutyrophénone 5 88 g (1 mole) d'acide isobutyrique 1 sont chauffés à reflux 1 heure avec 150 g (1,25 mole) deS3C12. Après élimination de l'éxcès de SOCl2 par distillation, le chlorure de l'acide isobutyrique 2 est distillé à 92 C sous pression atmosphérique, Rdt=80% 112 g (0,84 mole) de AlCl3 sont agités dans 185 cm3 de benzène distillé sur Na, 83 g (0,8 mole) de chlorure de l'acide isobutyrique 2 sont additionnés lentement en 2 heures en amorçant la réaction avec un bec bunzen. Après la fin de l'addition, on chauffe 30 mn. Le liquide obtenu, refroidi est versé lentement dans un erlenmeyer contenant 1 litre d'eau glacée. La phase organique est extraite au benzène, lavée séchée sur NaC2O4; on obtient un liquide incolore ; Ebmm C = 108/20 ; n = 1,5145 ; Rdt = 65 5. Synthèse de la diméthyl-2,2' hexadécanophénone 4 24 g (0,15 mole) d'isobutyrophénone 3 sont ajoutés lenteient à 6,5 g (0,16 mole) de NaRE2 dans 100 cm3 de benzène séché sur sodium. Après 1 heure de reflux, 44,5 g (0,16 mole) de bromure de tétradécane sont ajoutés goutte à goutte, puis le mélange est chauffé à reflux 48 h. Après refroidissement, il est versé sur 200 cm3 de CH3COOH à 10 %, le e précipité de NaBr se dissout et la phase benzènique est extraite à l'éther, lavée trois fois à l'eau et séchée sur Na2SO4.La diméthyl-2,2'-hexadécano phénone 4 est distillée ; on obtient un liquide incolore ; Ebmm C = 190/1,5 ; n = 1,4858 ; Rdt = oe %. Synthèse de l'acide diméthyl-2, 2'-palmitique 6 30 g (0,096 mole) du produit précédent sont chauffés à reflux 14 h. avec 50 cm3 de toluène séché sur Na et 3,9 g (0,1 mole) de Nanh2. Après le refroidissement et addition de 100 cm3 AcOH à 10 %, on extrait la phase organique à l'éther. Après évaporation des solvants, les cristaux de l'amide 5 obtenus sont recristallises dans le toluène ; on obtient une aiguille blanche ; F=87 C; Rdt=73 . 19 g de l'amide de l'acide 2, 2'-palmitique 5 (0,07 mole) sont chauffés à reflux avec 50 cm3 de CH3COOH, 30 cm3 d'H2SO4 et 30 cm3 d'eau. Après refroidissement, l'acide 6 est extrait à l'éther, la phase éthérée est lavée jusqu'à pH neutre et sé chée au sur Na2SO4. le solide obtenu est distillé ; Ebmm C = 184/2 ; F = 4200 ; Rdt = 91,,r j cristaux blancs. Synthèse de la N-#-phtaloyl-lysine 10 18,25 g de lys, HCl (C,1 mole) sont dissous dans 150 cm3 d'eau contenant 8 g de soude (0,2 mole). Cn ajoute ensuite 12,5 g de Cu SO4 (0,05 mole) dissous dans 50 cm3 d'eau ; il se forme le sel de Cu de la lysine 8. Cn ajoute ensuite 10 g de NaHCO3 (0,12 mole) dans 20 cm3 d'eau et 25 g (0,11 mole) de cabothoxy- phtalimide. Après 4 heures d'agitation, les cristaux formés 9 sont essorés, lavés à l'eau, CH2Cl2, EtOH et éther ; m = 27,5 g ; Rit = 91 %. les 25 g de sel de Cu de la Pht. Lys 9 sont dissous dans 250 cm3 d'eau et 30 cm3 HCl au Bain Marie à 50 C. Passage pendant 1 heure d'un courant de H2S, le CuS formé est filtré sur HYLFO SUPER CELL. Dans le filtrat incolore, le passage d'un courant de HCl gazeux fait précipiter le chlorhydrate ; m = 22 g ; Rît = 79 %. Après addition d d'une quantité stoechiométrique de NaHC03 on obtient des cristaux de N- #-phtaloyl-lysine 10 ; m = 18 g ; Rit = 66 % (à partir de la lys, HCl) ; F = 260 - 265 C ; +20 (C = 0,6 DMF). Synthèse de la N -&alpha; formyl - N - E - phtaloyl - 1 - Lysine 11 Dans un ballon à trois cols, on refroidit 105 cm3 d'acide formique à 98 en 30 mn, on ajoute 35 cm3 d'anhydride acétique puis 12,4 g (0,05 mole) de Pht. lys. sèche qui se dissout. Après 30 mn de réaction à 0 C et 1 heure 30 à température ambiante, on-ajoute 50 cm3 de glace puis on évapore sous vide à 40OÇ les solvants, le résidu est recristallisé dans l'eau. Cristaux blancs. Rdt = 78 % ; F = 17800 ; = + 200 + 2,5 (c = 0,2 EtOH). Synthèse de l'ester méthylique de la N - E - phtaloyl lysine 12 8 g de Pht. Lys. 10 sont mis en suspension dans 200 cm3 de LeOH absolu saturée en Hl Gazeux, Après 72 heures de chauffage à 60 C à l'abri de l'humidité, l'alcool est concentré de moitié. Cette solution est additionnée du même volune d'éther sec, l'ester cristallisé lentement au froid sous forme d'aiguilles. Rit = 80 56 ; F = 146 - 150 C ;[&alpha;] = + 12,3 (c = 2, eau). Synthèse de N -&alpha;- formyl - N - E - phtaloyl - L - Lys - N E - phtaloyl - L - Lys - OC H3 13 680 mg (2 x 10-3 mole) de Pht - lys - OC H3 12 sont dis- sous à froid dans 4 cm3 de DMP, addtionnés de 0,29 cm3 de Et3N. Le précipité formé est filtré. 608 mg (2 10-3 mole) de Pht Lys - F 11 sont dissous à froid en 15 mn dans 2 cm3 de DMF à froid et additionnés à la solution précédente, le mélange est refroidi à 0 C puis additionné de 412 mg (2 x 10-3 mole) de DCCD, dans 1 cm3 de DMF. la réaction dure 16 heures à + 4 C. Après 1 heure, il commence à se former un- précipité de DCCU. Après 16 heures de réaction, le précipité de DCCU est filtré, le filtrat est additionné de 40 cm3 de NaCl aqueux à 5 ct, il se forme un précipité qui est essore et séché. Recristallisation dans AcOEt. Rdt = 72 % ; F = 106 C. Synthèse de N - E - phtaloyl - L - lys - N - E - phtaloyl L - Lys - OCH3 14 472 mg (0,8 x 10-3 mole) du peptide phtaloylé sont mis en suspension dans 30 cm3 EtOR 98 et 2,5 cm3 HCl 12 N. Agitation 24 heures. Après avoir concetré l'alcool? addition d'éther sec, il se forme des cristaux qui sont recristallisés dans EtOH 95 / éther. Rdt = 85 %; F = 205 C. Synthèse de N -&alpha; - DMP - N - E - phtaloyl - L - Lys - N E - phtaloyl - L - lys - OCH3 15 700 mg de DMP dans 10 cm3 de CH2 C12 sont additonnés de 20 mg de Pcl5, chauffage 15 mn au bain d'huile à 60 C, Pcl5 disparaît. Evaporation sous vide de CH2 C12 et POC 13. Il reste un solide qui est dissous dans 20 cm3 de T H F et refroidi à - 15 C. 50 mg de dipeptide 14 sont dissous dans 30 ml de m H F à chaud; après refroidissement, addition de 0,5 cm3 de Et3N, le précipité obtenu est filtré et; le filtrat est refroidi. Addition à 0 C et goutte à goutte du chlorure de DMP dans le filtrat ci-dessus et agitation 2 heures à température am- biante. Le précipité de Et3N, HCl à nouveau formé est filtré et le THF est évaporé à sec ; il reste une huile très soluble dans AcCET et éther qui cristallise par addion d'hexane. Rdt = 70 %. Synthèse de N -&alpha; - DMP - L - Lys - L - Lys - OCH3 16 4 500 mg (5 x 10-4 mole) de peptide phtaloyl 15 sont dissous dans 30 cm3 d'hydrazine à 1/100 dans EtOH 95 (6 x 10-3 mole). Après 24 heures de réaction à température ambiante, l'alcool est évaporé sous vide et le résidu séché sur P205 pour éliminer l'hydrazine. Le résidu est acidifié à pH = 3 par addition de CH3 COOH, le phtalhydrazide précipité est filtré et le filtrat est évaporé à sec et séché. Il est lavé à AcOEt pour éliminer te phtalhydrazide restant puis additionné d'éther saturé en HCl gazeux. On obtien ainsi 17 cristaux blancs. Rdt = 46 %; F = 280 C (MEOH abs, éther sec) (MEOH, acétone) [&alpha;] = -6 # 0,5 (c = 1, MEOH). TOXICITE AIGUE La toxicité aiguë a étA étudiée chez la souris male de race swiss d'un poids moyen de 20 g. Quatre lots de 10 souris ont reçu par voie veineuse et sous un volume de 0,5 ml, les différentes concentrations du produit en solution aqueuse, soit 20 - 40 - 80 - 160 mg/kg. La du re d'injection était de 30 secondes. Les observations portant sur la mortalité ont té effectuées pendant cinq jours. En traçant la droite dose-répone sur papier logarithmie robabilité, La dose léthale 50 est de 60 mg/kg Le tableau suivant résume les résultats obtenus Doses (mg/kg) Pourcentage de mortalité 20 o % 40 # 0 % 80 90 % 160 100 % Le 0 % et 100 % ont été corrigés selon les formules habituelles O % = 100 (0,25 / n) - 25 100 % = 100 [(n - 0,25)] = 97,5 n ESSAIS DE TOLERANCE DETERMINATION DE L'IRRITATION OCCULAIRE: Cet essai a été effectué sur cinq lapins albinos mâles de 2,5 kg environ, conformément à la méthode,officielle de la Législation Française. L'oeil droit de chaque animal a été instillé avec 0,1 ml d'une solution aqueuse du produit a 0,2 % Les observations portant sur le degré de l'irritation ont été effectuées, un - deux - trois - quatre et sept fois après l'opération, et les lésions éventuelles évaluées selon une échelle numérique. Cornée ~ degré d'opacité (0 à 4) surface n (0 à 4) Iris = " n (O à 2) Conjonctive = Rougissement (0 à 3) chemosis (0 à 4) larmoiement (O à 3) RESULTATS Le produit à la concentration de 0,2 %, ne produit aucune irritation oculaire. L'échelle numérique pour. tous les lapins est égale à O et pendant toute la période des observations. ACTIVITE ANTIBACTERIENNE MATERIEL ET METHODES L'activité Bactériostatique a été étudiée par la méthode des dilutions en milieu liquide en déterminant la concentration minima inhibitrice. Les souches bactériennes utilisées étaient les suivantes ( STAPHYLOCOCUS AUREUS S 108 ( STAPHYLOCOCUS AUREUS S 30 ( STREPTOCOCUS Gr. D S 19 ( STREPTOCOQUE Gr. A S 107 GRAS POSITIF ( DIPLOCOCCUS PNEtWONIAE ( type I S 92 ( BACILLUS SUBTILIS ( forme végétative S 312 ( BACILLUS SUBTILUS ( spores S 12 ( ESCHERICHIA COLI S 54 ( KLEBSIELLA PNEUMONIAE S 31 ( PROMEUS VULGARIS S 28 ( MORAXELLA GLUCIDOLYTICA S 106 GRAM NEGATIF ( SHIGELIA SONNEI S 177 ( SALMONELLA TYPHI MURIUM S 284 ( NEISSERIA PERFLAVA S 103 ( PSEUDOMONAS PYOCYANAE S 76 2 souches de levures ont été étudiées - CANDIDA ALBICANS S 119 - SACCHAROMYCES CEREVISIAE S 1 L'Activité Bactéricide a été étudiée sur un milieu gélosé par la méthode dite "des contacts", en évaluant le pourcentage des survivants par rapport à un témoin en fonction du temps. Les souches bactériennes étudiées STAPHYLOCOCCUS AUREUS S 30 STREEDOCOCCUS Gr. A S 107 STREPTOCOCCUS Gr. D S 19 ESCHERICHIA COLI S 54 PSEUDONONIAE PYOCYANEA S 76 RESULTATS ACTIVE BACTERIOSTATIQUE EN MILLIEU LIQUIDE SOUCHES C M I g/ml STAPHYLOCOCCUS AUREUS S 108 6,25 STAPHYLOCOCCUS AUREUS S 30 25 STREPTOCOCCUS Gr. D S 19 12,5 STREPTOCOCCUS Gr. h S 107 6,25 DIPLOCOCCUS PNEUMONIAE type I S 92 6,25 BACILLUS SUBTILIS forme végétative S 312 # 15 BACILLUS SUBTILIS spores S 312 6,25 ESCHERIOHIA COLI S 54 50 KLEBSIELLA PNEUMONIAE S 31 50 PROTEUS VULGARIS S 28 500 MORAXELLA GLUCIDOLYTICA S 106 12,5 SHIGELLA SONNEI S 177 12,5 SALMONELLA TYPHIS MURIUM S 284 50 NEISSERIA PERFLAVA S 103 6,25 PSEUDOMONAS PYOCYANAE S76 12,5 CANDIDA ALBICANS 62,5 SACCHAROMYCES CEREVISIAE 25 ACTIVITE BACTERICIDE POURCENTAGE DE SURVIVENUS "mp= t Temps de contact Conc. (en en min.) finale 1' 5' 10' 30' GERi Es S?hPHYLOCOCCUS AU EUS 100vug/ml 1 O O O S 30 100Oyg/ml O O O O STREPTOCOCCUS Gr. A 25 > ug/ml 10 0,1 0 O S 107 500g/ml O O O 0 STRE$0COCCUS Gr. D S 19 50 > ug/ml 100 10 1 0,1 ESOHERICHIA COLI 200 mol 100 100 100 100 S 54 2000 g/ml 1 0,1 O O I PSSUDOMONAS PYOOYÂNAE S 76 500/g/ml O O O O ETUDE DE LA BIODEGRADABILITE A/ EFFET DE LA TRYPSINE ET DE LA PEPSINE ZODE OPERATOIRE 1 - Solution de trypsine à 370 50 mg de peptide (0,1 %) 2,5 mg de trypsine (0,005 %) (rapport enzyme substrat 1/20) 50 ml de tampon phosphate pff = 7 ; 0,2 M 2 - Solution de pepsine à 370 50 mg de peptide (0,1 %) 5 mg de pepsine (0,01 %) 50 ml de tampon citrate à pH f 2,2 3 - Solution témoin de lysine à 91,3 mg/100 ml ou 10 x 10-7 équivalent de NH dans 0,1 ml ; dilué de 1 à 10 fois pour obtenir une courbe étalon; 4 - Solution de ninhydrine 500 mg de ninhydrine, 15 cm3 de méthylcellosolve, 10 cm3 de tampon acétate pH 5,5 et 4 fl 5 - Dosage à la ninhydrine (11) 0,1 cm3 d'une solution contenant de 1 à 10 x 10-7 NH2 1 goutte d'acide ascorbique à 100 mg/100 cm3 d'eau 1 cm3 du réactif à la ninhydrine Agiter et porter au bain marde bouillant 15 mn. Refroidir et ajouter 5 cm3 de EtOR au froid. Agiter et mesurer immédiatement à 550 nm, 6 - Chromatographie sur feuille de plastique recouverte de Kieselgel GF 254 dans le solvant butanol acide acétique - eau 4-1-5, pen dant 40 mn. Révélation à la ninhydrine 7 - Pour chaque manipulation, au temps 0, 10, 20, 40, 60, 120, 240 mn, 6 h, 12 h, 24 h, on effectue une chromatographie et un dosage à la ninhydrine de la solution étudiée et d'une solution témoin ne contenant pas le peptide compa rativement à une solution de lysine de concentration connue. RESULTATS Une solution du peptide dans un tampon a été incubée en présence de pepsine ou de trypsine dans les conditions optima de pH, tenpérature et concentration. Les résultats sont observés d'une part par chromatographie sur plaque, d'autre part par dosage à la ninhydrine des fonctions NH2. La pepsine même après 24 h, est sans effet sur l'ester méthylique de la lysine et sur le peptide de l'invention La trypsine hydrolyse totalement l'ester méthylique de la lysine dès son addition (moins de 1 mn). Elle hydrolyse également la fonction ester méthylique du peptide très rapidement puis hydrolyse la fonction amide du peptide en 30 mn environ en donnant en chromatographie une tache de Rf correspondant à celui de la lysine et une autre tache de Rf inconnue attribuée à DMp-Lys. B/ EFFET DES SUCS GASTRIQUE ET INTESTINAL 1) ETUDE CHIMIQUE Solution utilisée suc intestinal artificiel pH = 8,07 suc gastrique artificiel pH = 1,26 5 5 mg peptide dans 1 cm3 tampon phosphate pH = 7 5 5 mg peptide dans 1 cm3 ROI à 6 cm3/1000 pH = 1,5 5 5 mg peptide dans 1 cm3 suc intestinal artificiel pH = 7,56 5 5 mg peptide dans 1 cm3 suc gastrique artificiel pH =1,06 Mode opératoire Incubation de chacune des solutions dans un bain-marie à 370 Prélèvement au bout de 15, 30, 60 mn, 2 h, 4 h, 6h, 8h. Dépôt sur plaque de chromatographie de 1 à 10 yl. Résultats qualitatifs Plaque plastique Kieselgel GF 254 - Merck - Dépôt de 1 l. Solvant butanol pyridine - cOH - eau 30/20/6/24 - 40 mn. Révélateur : ninhydrine pour les fonctions NH2 bleu de bromothymol pour l'acide gras. 10/ le suc gastrique ne se révèle pas à la ninhydrine le suc intestinal donne une tache Rf = 0,23. 20/ le peptide à un Rf de 0,68 30/ le suc gastrique est pratiquement sans action sur le peptide le suc intestinal l'hydrolyse en donnant une tache de lysine Rf = 0,16 + une autre tache Rf = 0,52. Pas de DMP, donc la coupure a lieu entre les deux restes lysyles DMP - lys/lys/OMe. 40/ Avec le suc intestinal, le résultat approximatif est 1 h apparition de lysine # SO % 3 h # 30% 6 h h ~ 40 40 % 24 h # 80 % Résultate quantitatifs Dépôt de 10 l sur plaque de verre recouverte de 0,25 mm de Kieselgel GF 254, séchée 1 h à l'étuve à 70 C ; migration 2 h 30 dans le solvant butanol - pyridine - AcOH - eau 30/20/6/24. Séchage des plaques 1 h. sous la hotte + 15 mn à 70 C. Vaporiser le réactif à la ninhydrine (1 g. ninhydryne + 180 cm3 acétone + 10 cm3 AcOH) sécher 10 mn à 70 C, vapori ser le réactif au nitrate de Cu (îcm3 de solution saturée de nitrate de Cu + 0,05 cm3 de HNO3 20 % et 100 cm3 acétone). Gratter les taches sur un papier lisse ; verser la poudre dans un tube, agiter avec 3 cm3 NaOE ; centrifuger ; décanter; recentrifuger ; doser à 505 nm au spectrophotomètre. Les Rf sont différents de ceux obtenus avec les plaques plastique MERCK et les produits sont moins bien séparés. D'autre part, le fond de la plaque est plus ou moins coloré en rose ce qui oblige à préparer un blanc pour chaque plaque. Les résultats ne sont pas très reproductibles, d'autant plus que la lysine a alors même Rf que le suc intestinal. I1 est nécessaire de procéder à une étude microbiologique, la lysine n'interférant pas dans le dosage. 2) ETUDE MICROBIOLOGIQUE MATERIEL & METHODES A/ Mise au point d'une technique microbiologique du dosage A l'aide d'une souche d'Escherichia Coli S 54 (0126 B16), nous avons réalisé en milieu liquide (bouillon tamponne de la Pharmacopée Française) une courbe d'étalonnage, en uti lisant des concentrations finales du produit égales à : O - 1,5 - 3 - 5 - 6 - t - 12 7g/ml. Après quatre heures de culture à 370, la courbe obtenue sur papier millimétré (ordonnées = Densité Optique) (abscisses = différentes concentrations) est une courbe signoïde comportant une partie rectiligne convenant parfaitement au dosage microbiologicue , cette courbe est représentée à la fig. 1 annexée. B/La biodégradabilité du produit a été étudiée à l'égard ( d'un suc intestinal artificiel et ( d'un suc gastrique artificiel dont la formule est la suivante a) SUC GASTRIQUE HCl pur........................... 6 ml Pepsine 7 g Eau distillée q.s.p.................... 1000 ml pH = 1,6 b) SUC INTESTINAL Carbonate monosodique 15 g. Pancréatine 3 g Taurocholate de sodium 5 g Eau distillée q.s.p 1 000 ml pH = 8 Les échantillons préparés ont été les suivants 1) Produit 0,010 g Suc gastrique q.s.p................. 10 ml 2) Produit 0,010 g Suc intestinal q.s.p 10 ml 3) Produit 0,01C g Tampon pH 1,6 q.s.p 10 ml 4) Produit 0,010 g Tampon pH 4,5 q.s.p 10 ml 5) Produit............................ 0,010 g Tampon pH 7 q.s.p 10 ml 6) Produit 0,010 g Tampon PH 8 q.s.p 10 ml Ces échantillons sont- laissés dans un Bain-Marie à 370 et des prélèvement sont régulièrement effectués au bout de 15 minutes - 30 minutes - 1 heure - 2 heures - 5 heures - 8 heures. Pour chaque prélèvement une évaluation quantitative a été réalisée par voie microbiologique. R E S U L T A T S Le tableau suivant indique les quantités retrouvées, exprimées en pourcentage pour chaque échantillon SUC SUC TAMPON TAMPON TAMPON TAMPON GASTRIQUE INTESTINAL pH 1,6 pH 4,5 pH 7 pH 8 15 minutes 98 o 98,3 98 70 62,3 30 minutes 101,3 0 104 87,6 68 66,3 1 heure 100,5 103 91 75 63,5 2 heures 97,5 O 101,5 91,5 70 67,5 5 heures 103 O 100,5 91,5 72,5 oe 8 heures # 99,5 O 99 91,5 78,5 67 CONCLUSIONS te produit n'est pas dégradé par l'action de la pepsine dans un suc gastrique artificiel. Par contre, le suc intestinal le dégrade rapidement (total après 15 minutes de contact). I1 faut noter également - l'influence du pH en milieux liquides - plus grande stabilité aux pH acides et tendance à la destruc tion aux pH alcalins. APPLICATIONS THERAPEUTIQUES te produit est un polypeptide de synthèse biodégrada- ble. $es propriétés essentielles sont une activité antibactérienne large, s'étendant aux microorganismes gram + et gram ainsi qu'aux levures et champignons. Sa biodégradabilité (en milieu intestinal) et sa bonne tolérance permettent une utilisation en thérapeutique anti-infectieuse de la peau et des muqueuses. Les formes pharmaceutiques peuvent être celles de la thérapeutique locale : pommades, lotions, collyres, collutoires tulles, gouttes nasales ou auriculaires. TABLEAU I Synthèse de l'acide diméthyl -2,2' - palmitique (D M P) 6 TABLEAU II Synthèse de la N -&alpha;- formyl - N - # - phtaloyl - L - lysine 11 TABLEAU III Schéma de la synthèse du dipeptide 17 10 Lys Pht KeOH + HC1 12 Bys - OMe Pht Pht-Lys-? + DCCD 11 13 F - lLys - Lys - OMe Pht Pht HC1 14 Lys - Lys- OMe .Pht DNP-OOOl 15 DMP - Lys - Lys ONe Pht Pht Pht E2 - NH2 I 16 J) - Lys - Lys OLe HC1 17 Dt Lys - LysONe, 2HC1 R E V E N D I C A T I O N S 1 - Nouveau peptide utilisable en thérapeuticue, caractérisé en ce qu'il renferme dans sa molécule un acide gras ramifié et un enchaînement lysine-lysine. 2 - Nouveau peptide utilisable en thérapeutique suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide gras ramifié est un acide comprenant de 14 à 18 atomes de carbone. 3 - Nouveau peptide utilisable en thérapeutique suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide gras ramifié est 1'acide diméthyl-2,2' palmitique ou I) dont la formule développée est : 4 - Nouveau peptide utilisable en thérapeutique suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il répond à la formule: DMP - lys-lys-CMe, 2EC1 dans laquelle DIS signifie acide diméthyl-2,2' palmitique, lys = lysine et OMe est un groupe méthoxy. 5 - Nouveau peptide utilisable en thérapeutique suivant la revendication l,-caractérisé en ce que l'enchaînement lysinelysine résulte de la réaction de deux moles de phtaloyl-lysines dont l'une a une fonction amine libre et l'autre une fonction acide libre en présence d'une mole de dicyclohexylcarbodiimide. 6 - Nouveau peptide utilisable en thérapeutique suivant la revendication 5, caractérisé en ce que les phtaloyl-lysines sont respectivement la N-&alpha;-formyl-N-#-phtaloyl-L-lysine et la N-E-phtaloyl-lysine estérifiée par de l'alcool méthylique anhydre saturé avec de l'acide chlorhydrique. 7 - Nouveau peptide utilisable en thérapeutique suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la N-&alpha;-formyl-N-# phtaloyl-L-lysine résulte de la formylation de la fonction amine de la Nphtaloyl-lysine. 8 - Nouveau peptide utilisable en thérapeutique suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la N-9-phtaloyl-lysine est obtenue à partir de chlorhydrate de lysine réagissant avec du sulfate de cuivre afin d'avoir un complexe cuivrique, le radical phtaloyle étant ensuite introduit à l'aide de N-éthoxycar- bonylphtalimide, le sel de cuivre de la phtaloyl-lysine est dissous dans de l'eau et de l'acide chlorhydrique, de l'hydrogène sulfuré traverse le sel de cuivre, le précipité est filtré et le filtrat incolore reçoit le passage d'acide chlorhydrique gazeux qui fait précipiter la N-#-phtaloyl-lysine. 9 - Nouveau peptide utilisable en thérapeutique suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la molécule renfermant l'enchaînement lysine-lysine provenant de la N-#-phtaloyl-lysine estérifiée par de l'alcool méthylique anhydre saturé avec de l'a- cide chlorhydrique et de la N-forinylN-phtaloyl-L-lysine subit une hydrolyse acide pour éliminer le radical formyle. 10 - Nouveau peptide utilisable en thérapeutique suivant la revendication 9, caractérisé en ce que la molécule renfermant l'enchainement lysine-lysine ayant subit une hydrolyse acide est acylée par le chlorure de l'acide diméthyl-2,2' palmitique. 11 - Nouveau peptide utilisable en thérapeutique suivant la revendication 10, caractérisé en ce que les radicaux phtaloyles protégeant les deux fonctions #-aminées des deux restes lysyles sont éliminés par l'hydrazine à froid. 12 - Nouveau peptide utilisable en thérapeutique suivant la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est transformé en chlorhydrate qui est purifié par cristallisation. 13 - Nouveau peptide utilisable en thérapeutique suivant la revendication 4, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de synthèse biodégradable dont les propriétés essentielles sont une activité antibactérienne large s'étendant aux microorganismes gram positif et gram négatif ainsi au'aux levures et champignons. 14 - Nouveau peptide utilisable en thérapeutique suivant la revendication 4, caractérisé en ce que sa-biodégradabilité en milieu intestinal et sa bonne tolérance permettent une utilisation en thérapeutioue anti-infectieuse. de la peau et des muqueuses. 15 - Nouveau peptide utilisable en thérapeutique suivant la revendication 4, caractérisé en ce que ses formes pharmaceutiques peuvent être celles de la thérapeutique locale, pommades, lotions, collyres, collutoires, tulles, gouttes nasales ou auriculaires. 16 - Procédé d'obtention du nouveau peptide utilisable en théraneutique suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à associer un acide gras ramifié, à savoir, l'acide di-. méthyl 2, 2' palmitique qui a une chaste principale de 16 atomes de-carbone lui conférant une activité anti-bactérienne optimale, deux radicaux néthyles augmentant la linosolubilité et qui est dégradé plus lentement que les acides linéaires tout en possèdant lui-même des propriétés anti-bactériennes à un enchainement lysinelysine résultant de la réaction de deux moles de phtaloyl-lysine obtenues à partir de chlorhydrate de lysine.