FR 2309564 A1 19761126 FR 7514219 A 19750506 La présente invention concerne un procédé industriel stple, rapide et sflr pour la prdparation de l'hydroxocobalamine et de ses sels de haute pureté avec des rendements levés. L'HydroxocobalamIne peut entre cote nue à partir de la cyanocobalamine par différentes mdthodes comportant en général une réduction suivie d'une oxydation. R - Co - CN ~ réduction - Co Oxydati~~ef R-Co-0l Les méthodes connues jusqu'à présent, utilisent I) - pour la réduction soit de I1 hydrogène catalytique avec des catalyseurs tels que l'oxyde de platine, le palladium ou le nickel Ranay soit da l'hydrogène naissant produit par un mélange de métal et d'acide tels que : la poudre de zinc et l'acide chlorhydrique soit un réducteur tel que : le chlorure ferreux etc..... 2) - pour l'oxydation soit de l'air soit un mélange d'air et d'oxygène soit un oxydant tel que : le chlorure ferrique etc.... Ces méthodes ne donnent que des rendements relativement faibles car l'hydroxocobalamine obtenue est souvent souillée de cyanocobalamine non transformée et des impuretés acides en quantités trop importantes D'autre part, ces méthodes sont difficiles à mettre en pratique pour des applications industrielles du fait des réglages délicats. Elles sont souvent trop longues et comportent parfols des stades d'isolement du produit qui ne sont pas commodes à exécuter. Le procédé qui fait l'objet de la présente invention élimine tous les inconvénients précédents et permet la transformation de la cyano.-olamine en hydroxocoblaminede haute pureté, en quantité industrielle de façon sûre et rapide, avec un appareillage courant. Suivant l'inveltion, on fait la réduction de la cyanocobalamine par un borohydrure alcalin tel que : le boroiydrure de lithium, le borohydrure de potassium ou la borohydrure de sodium, en un minimum de temps à l'abri de l'air at accélérée par la présence d'une source ds lumière visible de forte intensité.. En effet, on a constaté que plus le temps de réduction est long, plus il y å d'impuretés acides. que si l'on ne prend pas la précaution de protéger le milieu réactionnel de l'air pendant la réduction, on a un taux élevé de cyanocobalamine non transformée (ou réformée) ou d'autrescobalamines. que la vitesse d la réduction est en fonction de l'intensité de la source lumineuse. Pour s'assurer que le milieu soit isolé de l'air atmosphérique, il faut que le réacteur soit bien étanche et qu'avant la réduction, on fasse un balayage avec des gaz inertes, tels qWe l'azote ou l'argon et que l'on maintienne un barbotage de tels gaz durant tout le temps de Ia réduction. Comme source de lumière, on utilise plusieurs projecteurs b ampoules ordinaires, centrés sur le milieu réactionnel. Le temps de réduction qui est conditionné par la vitesse d'introduction de l'acide chlorhydrique sur le mélange de cyanocobalamine et l'hydro- borure doit Cotre aussi bref que possible. Comme cette réaction est fortement exothermique et que le mélange réactionnel mousse beaucoup, on doit munirt le réacteur d'un refroidissement avec des réfrigérants énergiques tels que : l'azote liquide, le mélange trichîcréthyléne + neige carbonique, etc...., et d'une agitation efficace pour faire tomber la mousse et éviter les débordements (l'addition d'un anti-mousse n'est pas bénéfique). La réduction doit etre terminée en 5 à I 5 minutes et la température du milieu réactionnel doit entre maintenue entre 25 et 30 OC. l'oxydation de la cobalamine en -hydroxocobalamine est faite par barbotage, pendant 30 à 45 minutes du milieu réactionnel, par un courant d'oxygéne pur, à température ambiante. En précipitant le produit obtenu par de l'acétone et en le lavant avec un mélange d'eau et d'acétone en proportions convenables on obtient de façon commode de l'hydroxocobalamine chlorhydrate d'une pureté très convenable pour l'utilisation thérapeutique. Pour avoir d'autres sels d'hydroxocobalamine de pureté plus élevée tels que acétatè, sulfate, nitrate etc.... on fait passer une solution aqueuse de l'hydroxocobalamine chlorhydrate, successivement. - sur une colonne de diméthylaminoéthyl cellulose pour débarasser de l'acidité et des impuretés acides - puis sur une colonne de carboxyméthyl cellulose qui retient l'hydroxocobalamine base et laisse passer la cyanocobalamine résiduelle et autres cobalamines qui sont ainsi éliminées. On élue ensuite l'hydroxocobalamine base purifiée avec une solution d'acide choisi pour obtenir une solution du sel désiré de haute pureté. La précipitation de la solution éluée se fait avec l'acétone comme précédemment. Le séchage se fait à la température ambiante sous vide, en présence d'agents dessicateurs énergiques tels que : l'andydride phosphorique, la potasse etc.... Pour obtenir des sels d'acides peu solubles dans l'eau tels que l'acide orotique, l'acide aspartique etc , on fait passer par exemple l'acétate purifié sur le dimêthylaminoéthyl cellulose de façon à obtenir de l'hydroxocobalamine base quton fait ensuite réagir avec l'acide choisi en quan titré stéochiométrique. t'invention est illustrée par les exemples suivants donnés à titre non limitatif Exemple I - Hydroxocobalamine chlorhydrate Dans un réacteur en verre de 75 litres, bien étanche dont le dégagement débouche sur une colonne de piégeage d'acide cyanhydrique et ayant un agitateur efficace et un bain de refroidissement à l'azote liquide, on dissout I335 g (I mole) de cyanocobalawine dans 14 litres d'eau déminéralisée. On fait un balayaged'azote pour éliminer l'air du réacteur et on ajoute d'un seul coup une solution de 539 g (IO moles) de borohydrure de potassium dissous dans un litre 5 de lessive de soude O.IN. Puis sous l'action catalysatrice ds 4 lampes de 1000 Watts et en atintenant un barbotage régulier d'azote, on introduit le plus rapidemant possible 2 litres 200 d'acide chlorhydrique 6N. Sous l'action conjuguée du bain de refroidissement à l'azote liquide qui permet de maintenir la température du milieu réactionnel à 25-279Cet de l'agitateur qui fait tomber la mousss, cette introduction d'acide peut se faire en IO minutes. L'introduction d'acide chlorhydrique terminée, on éteint les lampes, mais continue le barbotage d'azote pendant dix minutes pour éliminer compléte- ment l'acide cyanhydrique formé. Puis on substitue, l'azote à l'oxygène pur et on prolonge le barbotage d'oxygéne pendant 30 minutes à température ambiante. A la finde cette période, on verse le mélange réactionnel dans I40 litres d'acFton3, agite doucement pendant une heure, essore le précipité formé le lave avec un mélange de I4 litres d'acétone + 2 litres d'eau déminéralisée, sèche le précipité essoré et lavé, à température ambiante, sous vide en présence d'anhydride phosphorique pendant 24 h. On obtient I268 g d'bydroxocobalamine chlorhydrate ayant les caractéristiques suivantes - titre.(calculé sur produit anhydre) : 97-98 7. - impuretés acides t I à I,5 X - humidité : 6 à 8 % Exemple 2 Purification et trans formation de I' hydr oxocoba lamine chlorhdrate en hydroxocobalamine acétate. On dissout I kg d'hydroxocobalamine chlorhydrate dans 20 litres d'eau déminéralisée et on fait passer cette solution successivement d'abord dans une colonne de IO kg diméthylamineéthyl cellulose, puis dans une deuxième colonne de IO kg de carboxyméthyl cellulose. La première colonne retent l'acide chlorhydrique et les impuretés acides. La deuxième colonne retient l'hydroxocobalamine bass et laisse passer les autres cobalamines indésirables. On élue a-lors l'hydroxocohalamine base débarrassée de ses impuretés par une solution aqueuse à IO % d'acide acétique. On précipite l'éluat dans IO volutes d'acétone, essore, lave, sèche sous vide à température ambiante, en présence d'anhydride phosphorique, pendant 24 heures. O n obtient 980 grammes dthydroxocoba-lamine acétate ayant les ractéristiques suivantes - titre (calculé sur produit anhydre) . 98 - 99 % - autres cobalamines .... O ou traces - impuretés acides .............................. 0,5 à 0,8 % - humidité 6 ..................................... 6 à 8 % Exemple 3 : Hydroxocobalamine base purifiée. On dissout un kilo d'hydroxocobalamine acétate purifiée dans IO lItres d'eau déminéralisée. On fait passer cette solution sur une colonne de IO kgs de diméthylaminoéthyl cellulose. On recueille la solution d'hydroxocobalmine base qui passe et on la précipite dans IO volumes d'acétone. On obtient 950 grammas d'hydroxocobalamine base ayant à peu près la même pureté que celle da l'hydroxocobalamine acétate utilisée. Exemple 4 : Hydroxocobalamine orotate. On dissout I346 g (I mole) de base purifiée dans IO litres d'eau déminéralisée. On ajoute à la solution obtenue, I74 g (I mole) d'acide orotique monohydrate et on chauffe doucement au bain marie jusqu'à solubilisstion totale. Après refroidissement, on filtre et précipite le filtrat dans 100 litres d'acétone. On essore, lave à l'acétone, sèche à température ambiante, sous vide; en présence d'anhydride phosphorique pendant 24 heures. On obtient I420 g d'orotate dthydroxocobalamina ayant à peu près les mêmes caractéristiques de pureté que celles de l'hydroxocobalamine base utilisée R EV E N D I C A T I O N S I. Procédé de préparation d'hydroxocobalamine et de ses sels par réduction puis oxydation de cyanocobalamine afin d'obtenir le chlorhydrate d'hydroxocobalamIne que l'on peut éventuellement transformer en hydroxocobala- mine base et/ou en un autre sel de l'hydroxocobalamine caractérise en ce que la réduction de la cyanocobalamina s'effectue à l'abri de l'oxygène, à une température d'environ 25 à 30 C par addition rapide d'acide chlorhydrique à un mélan- ge aqueux de cyanocobalamine et d'un borohydrure alcalin ; alors que le milieu réactionnel est éclairé par une source lumineuse. 2. Procédé selon la revendication T caractérisé en ce que le mélan- ge aqueux da cyanocobalamine et de borohydrure alcalin comporte environ I oIe de cyanocobalamine pour IO moles de borqhydrure. 3. Procédé selon l'une des revendications I et 2 caractérisé en ce que le mélange réactionnel obtenu à la fin de la réaction de réduction est soumis à une oxydation par barbotage, dans ledit milieu réactionnel à température ambiante pendant environ 30 à 45 minutes, d'un courant d'oxygène pur. 4. Procédé de production du sel acétate d'hydroxocobalamine à par tir de chlorhydrate d'hydroxocobalamine caractérisé en ce que l'on fait passer ledit chlorhydrate- sur une colonne contenant de la diméthylaminoéthyl cellulose puis sur une colonne contenant de lacarboxyméthyl cellulose, colonne dont on extrait l'acétate d'hydroxocobalamine par élution de l'hydroxocobalamine à l'aide d'une solution aqueuse d'acide acétique. 5. Procédé de préparation d'hydroxocobalamine base à partir d'acétates d'hydroxycobalamina caractérisé en ce que l'on fait passer ledit acétate d'hydroxocobalamine dans une colonne contenant de la diméthylaminoéthyl cellulose. 6. Procédé de préparation de sels divers d1hydroxocobalamine à partir de l'hydroxocobalamine base caracterisé en ce que l'on fait agir en solution aqueuse des quantités sensiblement équimoliculaire d'hydroxocobalamine et de l'acide choisi.