FR 2284675 A1 19760409 FR 7522735 A 19750721 L'invention concerne un procédé pour préparer des c-clo- dextrines avec des rendements élevés et des durées de réaction plus courtes, par utilisation d'une solution aqueuse d'hydrolysat d'amidon de concentration élevée, lequel procédé procure des rendements stables et ne comporte pas les inconvénients opératoires liés a l'utilisation de solutions très concentrées. Les cyclodextrines également appelées cycloamylases ou dextrines de Schardinger, peuvent être produites a partir de l'amidon par l'action d'une enzyme connue sous le nom de transglycosylase de la cyclodextrine (amylase B. macerans) . La source de l'enzyme est habituellement une culture de Bacillus macerans. Ces cyclodextrines sont classées d'après leur nombre de molécules de glucose, et sont appelées a-cyclodextrine (6 molécules de glucose) , B-cyclo- dextrine (7 molécules de glucose), et y-cyclodextrine (8 molécules de glucose) Les méthodes de préparation de ces cyclodextrines sont décrites par exemple dans E.B. Tilden and C.S. Hudson, J. Am. Chem. Soc. 44, 1432 (1942), et D. French, J. Am. Chem. Soc., 71,- 353ffi949; Selon les méthodes décrites dans ces documents, on mélange un bouif lon de culture de Bacillus macerans avec une solution d'amidon pour effectuer une réaction enzymatique a 35-40 C. Cependant, lorsque la concentration en amidon de la solution réactionnelle dépasse 5% en poids, la viscosité de la solution augmente également.Il en résulte que la solution subit un phénomène de "retour en arrière" à la température de réaction utilisée et devient semi-solide. La ma tière semi-solide est difficile a manipuler et réduit de façon importante l'action de l'enzyme, ce qui amène une diminution du rendement en produit final.Pour cette raison, dans ces méthodes, la concentration maximale en produit de départ qu'on puisse mettre en oeuvre est de l'ordre de 5% en poids, et dans ces conditions, les procédés de l'état de la technique sont trop peu efficaces pour la production industrielle. En vue de remédier à ces inconvénients des méthodes connues, on a proposé des améliorations consistant à augmenter la concentration en produit de départ en utilisant un hydrolysat d'amidon, obtenu en hydrolysant de l'amidon avec une enzyme ou un acide jus qu' un D.E. (équivalent dextrose) de 15 ou ne dépassant pas 20, en tant que produit de départ, de manière à obtenir des cyclodex trines avec un bon rendement industriel. Selon l'une de ces propositions, donnée par le brevet japonais 2380/71, on hydrolyse tout d'abord partiellement de l'amidon avec une a-amylase ou un acide jusqu'à un D.E. ne dépassant pas 15, et on fait réagir une solution aqueuse de l-':hydrolysat d'amidon obtenu, d'un D.E. non supérieur à 15 et d'une concentration en amidon d'au moins 8%, avec une transglycosylase de la cyclodextrine en présence d'un complexant de la cyclodextrine (ou agent de précipitation). De même, le brevet EUA 3.425.910 (correspondant au brevet britannique 1.185.207, au brevet canadien 852.304 et au brevet français 1.541.526) propose d'utiliser dans un procédé similaire une solution aqueuse d'un hydrolysat d'amidon de D.E. non supérieur à 20. Des recherches portant sur la formation enzymatique des cyclodextrines utilisant une solution aqueuse d'un hydrolysat d'amidon ont démontré que même lorsqu'on utilise, avec la même concentration en hydrolysat d'amidon, des solutions aqueuses d'hydrolysats du même amidon, ayant le même équivalent dextrose, mais obtenus à partir de lots différents, les rendements en cyclodextrines obtenues par une réaction enzymatique effectuée dans les mêmes conditions varient de façon imprévisible, et sont peu reproductibles. Ceci est un grave inconvénient pour la mise en oeuvre industrielle de ces procédés. On a également constaté que lorsqu'on élève la concentration en hydrolysat d'amidon, dans les procédés expé rimentaux décrits ci-dessus, en vue d'une mise en oeuvre avantageuse de ces procédés sur le plan industriel, les rendements en cyclodextrines deviennent parfois inférieurs. Ce résultat, qui est très génant du point de vue des installations et des quantités à traiter dans un procédé industriel, figure également parmi les résultats des exemples du brevet japonais 2380/71 précité. Par exemple, dans l'essai V de ce brevet, un hydrolysat d'amidon d'un D.E. de 5 (valeur jugée préférable dans ce brevet) , obtenu en hydrolysant de l'amidon de pomme de terre avec une amylase de liquéfaction disponible sur le marché (Kleistase, marque déposée d'un produit de Daiwa Kas*$ Kabushiki Kaisha, Japon, 10000 unités) , est utilisé à une concentration de 11% en poids et mis à réagir à 370C pendant 4 jours en utilisant du trichloroéthylène comme complexant de la cyclodextrine. On obtient des cyclodextrines avec un rendement de 58%.D'autre part si on répète la réaction ci-dessus, mais avec une concentration en hydrolysat d'amidon de 35% en poids, le rendement en cyclodextrines tombe à 35% en poids. En outre, l'exemple II du brevet EUA 3425910 précité montre que lorsqu'on utilise un hydrolysat d'amidon ayant un D.E. de 2,0 (d l'intérieur d'une plage, allant d'environ 0,5 a environ 6, que ce brevet juge préférable) en concentration plus forte, le rendement en cyclodextrines augmente, mais celui-ci n'est que de 52% après avoir fait réagir une solution aqueuse de l'hydrolysat d'amidon, d'une concentration de 34g/100 cm3, à 50-C pendant une durée aussi longue que 7 jours, en utilisant du toluène comme complexant de la cyclodextrine. I1 faut encore noter que, dans ces procédés connus, lorsqu'on utilise des concentrations plus fortes en hydrolysat d'ai- don en vue d'une mise en oeuvre industrielle avantageuse du procédé, des valeurs de D.E. élevées provoquent une diminution des-ren- dements en cyclodextrines. Ceci implique que si on veut utiliser l'hydrolysat d'amidon à une concentration élevée, il faut que le D.E. de 1'hydrolysat d'amidon soit bas. Ceci est une cause très probable de difficultés opératoires. L'Essai V du brevet. japonais cité indique les résultats obtenus en faisant varier la valeur de D.E. à la concentration élevée de 308 en poids.Ces résultats mon- trent que l'opération est difficile avec un D.E. de 5; avec un D.E. de 10, le rendement en cyclodextrines est de 45%, et lorsque le D.E. est de 18, le rendement tombe à 30%. L'Exemple III du brevet EUA cité donne les résultats d'essais effectués en utilisant un hydrolysat d'amidon en concentration de 34g/100 cm de la solution réactionnelle et en faisant varier le D.E. de l'hydrolysat de 0,4 à 25,5. Ces résultats démontrent que lorsqu'on conduit la réaction en utilisant du toluène comme complexant de la cyclodextrine, à 50 C et pendant respectivement 4 et 7 jours dans les deux cas, le rendement en cyclodextrines diminue lorsque les valeurs de D.E. augmentent et la chùte de rendement est brutale. Par exemple, le rendement en cyclodextrines, si on part d'un hydrolysat d'amidon d'un D.E. de 1,0 et d'une concentration de 34 g/100 cm3 de la solution reaationnelle est de '45% au bout de 4 jours de réaction et de 51% au bout de 7 jours.Cependant, si le D.E. de l'hydrolysat est de 12,0, la concentration restant la même, le rendement tombe à 17% au bout de 4 jours de réac- tion et à 22 % au bout dé 7 jours. Comme on l'a indiqué plus haut, lorsqu'on utilise directement de l'amidon comme produit de départ, la concentration maximale en amidon qu'on puisse mettre en oeuvre est de 5%, une augmentation de la concentration provoque des perturbations opératoires et des rendements faibles. I1 est clair que dans le cas où on utilise des hydrolysats d'amidon, les mêmes perturbations vont apparaître si leurs valeurs de D.E. sont faibles et se rapprochent de celle de l'amidon. Par exemple, si on utilise un hydrolysat d'amidon ayant un D.E. d'environ 10, on peut maintenir l'hydrolysat à l'état dissous à une concentration de plus de 45g/100 cm3. Cependant, avec un D.E. de 2, la concentration maximale est de l'ordre de 20g/100 cm , et il est difficile de former des solutions ayant une concentration plus élevée. De plus, lorsque le substrat a un D.E. faible, une matière collante insoluble, ou une fine matière insoluble se forme au cours de la réaction, et provoque une diminution brutale de l'aptitude à la filtration de la solution réactionnelle. Cette mauvaise aptitude à la filtration ne peut même pas être amé liorée par chauffage de la solution réactionnelle, et gêne les opérations de purification des cyclodextrines. Des recherches ont été faites pour remédier aux différentes difficultés rencontrées dans l'utilisation d'hydrolysats d'amidon, telles que l'instabilité des rendements, la diminution des rendements consécutive à l'utilisation d'hydrolysats d'amidon très concentrés, la nécessité de longues durées de réaction, et la forte réduction des rendements provoquée par l'utilisation d'hydrolysats d'amidon de D.E. élevés. On a découvert qu'il existe une condition extrêmement importante concernant les quantités totales de maltose et de glucose dans l'hydrolysat d'amidon, condition qui avait été complètement négligée jusqu'à présent, et que, lorsque la quantité totale de maltose et de glucose dans un hydrolysat d'amidon d'un D.E. non supérieur à 20 dépasse environ 5% en poids, rapporté au poids de lthydrolysat, il se produit une forte diminution du rendement en cyclodextrines, comme on va le voir ci-apres dans les exemples comparatifs. Ainsi, on a trouvé qu'on peut améliorer la stabilité des rendements. en utilisant des hydrolysats d'amidon ayant un D.E. non supérieur a 20 et satisfaisant à la condition concernant la quantité totale de maltose et de glucose qu'ils contiennent. On a constaté en outre qu'il existe une relation particu lièvre entre la concentration en hydrolysat d'amidon et la quantité de transglycosylase de la cyclodextrine et qu'en effectuant la réaction de façon à remplir la condition suivante CR # 194/#S dans laquelle S est la concentration (en g/100 cm de la solution réactionnelle) en hydrolysat d'amidon en démarrage de la réaction et est un nombre positif compris entre 10 et 50, et CR est le nombre d'unités de la transglycosylase de la cyclodextrine par gramme de l'hydrolysat d'amidon, on peut supprimer les inconvénients résidant dans les faibles rendements et les longues durées de réaction nécessaires, consécutifs à l'utilisation d'hydrolysats d'amidon en--concentrastion élevée, et on peut éviter la diminution des rendements provoquée par l1utili- sation d'hydrolysats de valeur de D.E. élevée dans une solution aqueuse concentrée, comme on va le voir par les exemples comparatifs ci-après. Aucun des exemples des brevets japonais et EUA cités ne respecte la relation ci-dessus, et dans ces exemples, CR est beaucoup plus petit que 194./T On a également constaté que lorsque, dans les procédés connus, on utilise des hydrolysats d'amidon de valeur de D.E. éle- vée, et en concentration élevée, il se produit une forte diminution du rendement en cyclodextrine, mais que, lorsque la relation ci-dessus est respectée, un tel inconvénient n'apparat pratiquement pas, même avec de fortes concentrations en hydrolysat. Ceci confirme que lorsque la quantité totale de maltose et de glucose dans l'hydrolysat d'amidon et les conditions exprimées dans la relation ci-dessus restent à l'intérieur des plages définies dans la présenteinvention, les inconvénients résultant de l'utilisation d'hydrolysats d'amidon peuvent être éliminés, et il devient possible de produire industriellement des cyclodextrines dans d'excellentes conditions. Par conséquent, l'invention a pour objet un procédé de préparation de cyclodextrines, dans lequel on fait réagir une so lution aqueuse d'un hydrolysat d'amidon ayant un D.E. non supérieur à 20 avec la transglycosylase de la cyclodextrine en présence d'un complexant de la cyclodextrine, et qui ne comporte pas les inconvénients des procédés connus. D'autres objets et avantages de l'invention ressortiront plus clairement de la description suivante. Selon l'invention, on conduit la réaction de préparation des cyclodextrines dans des conditions telles que i) la quantité totale de maltose et de glucose contenue dans l'hy drolysat d'amidon au début de la réaction ne soit pas supérieure à 5% en poids, rapportés au poids de l'hydrolysat, et ii)la quantité de transglycosylase de la cyclodextrine dans la solution réactionnelle satisfasse la relation suivante CR - 194/je (1) dans laquelle S est la concentration (en g/lOOcm3de la solution réactionnelle) en hydrolysat d'amidon au démarrage de la réaction et est un nombre positif com pris entre 10 et 50, et CR est le nombre d'unités de transglycosylase de la cyclodextrine par gramme de 1 'hydrolysat. L'hydrolysat d'amidon utilisé dans le procédé selon l'invention est obtenu de façon connue, par exemple par chauffage d'amidon en présence d'un acide tel que l'acide chlorhydrique, ou par hydrolyse d'amidon par une a-amylase telle que Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger. La composition du saccharide dans l'hydrolysat obtenu varie en fonction du procédé d'hydrolyse et des conditions d'hydrolyse. On a trouvé que lorsqu'on fait agir la transglycosylase de la cyclodextrine sur différents hydrolysats d'amidon d'un D.E. compris entre 5 et 20 et préparés suivant différents procédés, le rendement en cyclodextrines varie dans de larges proportions en fonction des quantités de glucose et de maltose contenues dans les hydrolysats, même lorsque les substrats d'hydrolysat d'amidon ont les mêmes valeurs de D.E. Par exemple, on a constaté que lorsque la quantité totale de glucose et de maltose dans l'hydrolysat d'amidon ne dépasse pas 5% en poids, on peut obtenir des cyclodextrines avec un rendement de 30 à 70% par rapport au poids du produit de départ, mais que lorsque la quantité totale dépasse 5% en poids, le rendement diminue brutalement, et que lorsque la quantité totale est de 20% en poids, le rendement en cyclodextrines ne dépasse pas 15 %. On observe un tel phénomène même lorsqu'on ajoute du maltose et/ou du glucose à un hydrolysat d'amidon ne contenant pratiquement pas de maltose ni de glucose avant de l'utiliser dans la réaction; et ceci confirme donc qu'il existe une relation étroite entre la quantité totale de glucose et de maltose dans l'hydrolysat d'amidon et le rendement en cyclodextrines. On suppose que la diminution du rendement en cyclodextrines, consécutives à la présence de glucose et/ou de maltose, vient du fait que les réactions de transgly- cosylation autres que la cyclisation sont favorisées par la présence de glucose et/ou de maltose. On connait un procédé qui consiste à réaliser la réaction cidessus en présence d'un complexant de la cyclodextrine, tel que le trichloroéthylène ou le l-décanol, qui forme un composé d'inclusion très faiblement soluble dans le système réactionnel par réaction avec la cyclodextrine, en vue de rendre prépondérante une réaction de formation de cyclodextrines. On a cependant constaté, de façon inattendue, que l'influence de la quantité totale de maltose et de glucose dans l'hydrolysat se manifeste également en présence d'un tel complexant de la cyclodextrine. Par conséquent, dans le procédé selon l'invention, on fait réagir une solution aqueuse d'un hydrolysat d'amidon ayant un D.E. non supérieur à 20, de préférence compris entre 7 et 15, avec la transglycosylase de la cyclodextrine en présence d'un complexant de la cyclodextrine, après avoir ajuste la quantité totale de maltose et de glucose dans l'hydrolysat d'amidon à une valeur non supérieu- re à 5% en poids par rapport au poids de l'hydrolysat. En général , dans les réactions enzymatiques, la concentration en enzyme n'influe pas sur la valeur d'équilibre finale de la réaction, et on a pensé qu'une réaction de formation de cyclodextrines utilisant la transglycosylase de la cyclodextrine obéirait à cette loi communément admise en présence d'un promoteur de la réac- tion tel que le trichloroéthylène ou 1-décanol. Cependant des recherches approfondies ont montré que la transglycosylase de la cyclodextrine-ne suit pas du tout la loi ci-dessus.On a fait réagir des hydrolysats d'amidon d'un D.E. compris entre 5 et 20, obtenus par différents procédés, avec la transglycosylase de la cyclodextrine en présence d'un complexant de la cyclodextrine, avec des concentrations variables en hydrolysat (substrat) et en transglycosylase de la cyclodextrine, et on a examiné les quantités de cyclodextrines formées. On a constaté que la valeur d'équilibre finale de la réaction est liée dans une certaine mesure à la quantité d'enzyme par unité de volume de la solution réactionnelle et à la quantité d'enzyme par unité de poids du substrat. Mais la relation n'est pas linéaire. On effectue la réaction à 450C, pendant 90 heures, en présence de trichloroéthylène, en utilisant un hydrolysat d'amidon ayant un D.E. de 10,2 et contenant une quantité totale de glucose et de maltose de 2,1% en poids, la concentration en substrat étant 3 de 40g/100 cm , et on examine le rendement maximal atteint au cours de la réaction en faisant varier la quantité de l'enzyme ajoutée. Les résultats figurent au Tableau 1 ci-après. TABLEAU 1 Quantité d'enzyme Quantité d'enzyme Rendement en (Nombre d'unités (Nombre d'unités/g de cyclodextrines pour 10cm de substrat) (% rapporté au solution substrat) réactionnelle 60 15 23,7 180 45 53,1 360 90 56,2 Même lorsqu'on prolonge la durée de réaction, le rendement ne peut augmenter davantage. D'autres recherches détaillées reposant sur le fait évo qué ci-dessus ont permis de découvrir que pour obtenir des cyclodextrines de bonne pureté, avec des rendements élevés et stables et en peu de temps, par le procédé consistant à faire réagir un hydrolysat d'amidon ayant un D.E. élevé et en concentration élevée, il fallait que la quantité d'enzyme au démarrage de la réaction soit conforme à la relation (1). Ceci est confirmé par le fait que lorsque CR est inférieur à 194 1W, le rendement en cyclodextrines diminue brutalement et la réaction devient très instable, et que même lorsqu'on maintient constantes différentes conditions de réaction, le rendement varie largement, et la reproductibilité des rendements est mauvaise. Pour cette raison, la réaction dans le procédé selon l'invention est conduite dans des conditions qui satisfont la relation (1) Les hydrolysats d'amidon contenant une quantité totale de maltose et de glucose ne dépassant pas 5% en poids peuvent être préparés en choisissant de façon appropriée les conditions d'hydrolyse dans les procédés d'hydrolyse connus précités. Ou bien on peut les préparer en traitant l'hydrolysat par l'oxydase du gluco- se, ou en cultivant un ferment tel que Saccharomyces cerevisiae dans 1'hydrolysat de manière à réaliser une assimilation préalable du glucose et du maltose. Dans le procédé selon l'invention, la concentration en hydrolysat d'amidon de la solution aqueuse peut être quelconque pourvu que l'hydrolysat puisse se dissoudre dans l'eau, mais en production industrielle, on préfère une concentration aussi élevée que possible. Par exemple, la concentration préférée est d'au moins environ 30g/lOOcm3 de la solution réactionnelle. Le complexant de la cyclodextrine utilisé dans le procédé selon l'invention peut être tout composé capable de former un complexe pouvant précipiter ou un composé d'inclusion par réaction avec la cyclodextrine obtenue. Comme exemples d'un tel complexant, on peut citer le trichloroéthylène, le tétrachloroéthane, le toluène, le cyclohexane, le bromobenzène, le tétrachlorure de carbone, le chloroforme, le benzène, le disulfure de carbone, le p-xylène, l'éthylbenzène, le p-cymène, le cyclohexanol, le l-heptanol, l'hexane, le l-décanol et le l-nonanol . Le complexant sera choisi de façon apprQpriee en fonction du type désiré - -- de cyclodextrine. Par exemple/de l-decanol ou de l-nonanol donnera de l'a-cyclodextrine de façon prépondérante. Avec l'hexane, le trichloroéthylène ou le toluène, on obtiendra surtout de la ss-yclcr dextrine. Avec du tétrachloroéthane ou du l-heptanol, on obtiendra simultanément de l'&alpha;- et de la ss-cyclodextrine. Le pH de la solution réactionnelle et la température de réaction seront choisis de façon appropriée en fonction de la plage de pH et de la température de réaction optimales pour la transglycosylase de la cyclodextrine. Par exemple, dans le cas de Bacillus macerans, le pH optimal est compris entre environ 5 et 7, et la températurejde réaction est comprise entre environ 40 et 50 C. Une optimale durée de réaction suffisante ou le procédé selon l'invention est comprise entre environ 24 et 60 heures. La durée de réaction peut dépasser 60 heures, mais le rendement en cyclodextrines n'en sera pas augmenté. La transglycosylase de la cyclodextrine utilisée dans l'invention peut être obtenue par exemple de la manière suivante. On utilise un milieu de culture contenant 3% de son de blé et 0,5 % de carbonate de calcium, avec ou sans quantités appropriées de sources d'azote organiques ou minérales telles qu'extrait de viande, infusion de mais ou sulfate d'ammonium ou une source de carbone telle que de l'amidon. On inocule au milieu de culture Bacillus macerans qu'on cultive de façon aérobie à 370C pendant 2 à 4 jours. La matière insoluble est ensuite chasse par centrifugation, et le liquide qui surnage peut être utilisé dans la réaction comme solution d'enzyme brute, soit directement soit en la concentrant sous pression réduite. On peut aussi, avant d'utiliser le liquide qui surnage, lui ajouter un agent de précipitation tel que l'isopropanol pour faire précipiter et recueillir l'enzyme. Les exemples suivants illustrent l'invention de façon plus détaillée. Dans les exemples, les quantités de glucose, de maltose d'a- et de ss-cyclodextrine sont déterminées de la façon suivante. Glucose déterminé par la méthode Tauber-Kleiner Maltose déterminé par une méthode de chromatographie au carbone a- et S--cclodextrines- déterminées par une méthode enzymatique(Kobayashi et autres, Proceedings of the Symposium on Amylase, Japon, Vol.8, page 29(1973)) On réalise une analyse par chromatographie en couche mince enutilisant une couche mince de cellulose micro-cr-istalline, et on développe l'échantillon par un mélange butanol/éthanol/eau (4:3:5), puis on pulvérise une solution d'iode pour détecter les cyclodextrines. L'unité de transglycosylase de cyclodextrine est déterminée selon la méthode suivante conformément à la méthode Tilden Hudson (J. Bacteriol.,43, 527(1942). On ajoute 1,0 cm3 d'une solution d'une enzyme dans l'eau distillée à un mélange de 1,5 cm3 d'une solution aqueuse à 4% d'amidon soluble et de 0,5cm3 d'un tampon 0,1 M d'acétate (pH 5,5), et on maintient le mélange à 450C pendant 30 minutes. (Même lorsque la température est de 40 C, il n'y a pratiquement pas de modification dans l'activité de l'enzyme). Ensuite, on ajoute 100 mm de la solution réactionnelle ci-dessus à 40 mm d'une solution d'iode O,lN. On laisse tomber 1 mm3 du mélange obtenu sur une plaque de verre, on sèche a 20-25C, à une humidité relative de 50 à 60%,et on observe au microscope. La quantité minimale de l'enzyme dans laquelle un cristal aciculaire peut encore être observé au microscope est définie comme l'unité. Exemple 1 et Exemple Comparatif 1 On cultive Aspergillus Niger dans un milieu liquide contenant de l'amidon de pomme de terre comme principale source de carbone. On élimine les cefliles par filtration, et on utilise le filtrat com- me solution d'enzyme. On fait réagir la solution d'enzyme avec de l'amidon de pomme de terre pour former une solution d'hydrolysat d'amidon. On porte la solution à ébullition pour activer l'enzyme, et on la sèche par pulvérisation pour obtenir une poudre d'hydrolysat d'amidon (I) ayant un D.E. de 15,0 et contenant 1,9% en poids de glucose et 6,1% en poids de maltose. Par ailleurs, on prépare une dextrine (II) ayant un D.E. de 12,0 et contenant 2,3% en poids de maltose (le glucose n'était pas décelable) en utilisant une amylase de liquéfaction de Bacillus subtilis. On ajoute 100 g de (I) ou de (II) à 190 cm3 d'une solution d'enzyme brute (40 unités /cm3) de Bacilus macerans préparée selon la méthode précitée dans un milieu de culture contenant du son de blé pour former une solution ayant une concentration en substrat de 40g/100 cm3. On ajoute à la solution 20cm3 de trichloroéthylène ou de 1-décanol, comme complexant de la cyclodextrine, et on fait réagir le mélange, tout en agitant, à 450C pendant 48 heures en maintenant le pH de la solution à 6,1. Après la réaction, on élimine le trichlo- roéthylène ou le 1-iRnnol par distillation, et- on détermine quantitativement les cyclodextrines. Les résultats figurent au Tableau 2 ci-aprds. TABLEAU 2 Essai Substrat Complexant de la cyclodextrine Type D.E. CR 194/#S Trichloroéthylène 1-Décanol rendement rendement rendement rendement en | en en en &alpha;-CD Ex.1 I 15,0 76 31 trace 33,5 24,0 2,2 Ex. compar 1 II 12,0 76 31 trace 51,2 35,8 3,1 a-CD=a-cyclodextrine, ss-CD=ss-cyclodextrine Les rendements en cyclodextrines sont exprimés en % rapporté au poids du substrat. Après la réaction, on traite le mélange réactionnel obtenu en utilisant du trichloroéthylène comme complexant de la cyclodextrine pour éliminer le trichloroéthylène par distillation à la vapeur, et on b refroidit pour obtenir des cristaux. On recristallise les cristaux à partir de l'eau pour récupérer une poudre de B-cyclo- dextrine. Le poids de la poudre ainsi récupérée est de 26,5 g dans le cas du substrat (I) et de 42,8 g dans le cas du substrat (II). La pureté de ces poudres, examinée par chromatographie en couche mince et par des essais enzymatiques est presque de 100 %. Lorsqu'on utilise du l-décanol comme complexant de la cyclodextrine, on ajoute un excès de cyclohexane au mélange réactionnel après l'élimination du l-décanol. On soumet le mélange à une centrifugation. On récupère le précipité, et on le met en suspension dans l'eau. On chasse le cyclohexane par distillation à la vapeur, et on fait évaporer l'eau à siccité pour obtenir une poudre brute. On recristallise deux fois la poudre brute à partir de l'eau. Le poids de la poudre d'a-cyclodextrine obtenue est de 18,6g dans le cas du substrat (I) et de 28,2g dans le cas du substrat (II). Exemples 2 à 4 et Exemples comparatifs 2 à 4 On hydrolyse partiellement une suspension dans l'eau d'amidon de pomme de terre une a-amylase de liquéfaction de Bacillus subtilis. On sèche l'hydrolysat par pulvérisation, et on le lave avec de l'éthanol à 90% pour obtenir une dextrine d'un D.E. de 9,5 mais ne contenant pas de glucose ni de maltose. On ajoute des quantités déterminées de glucose et de maltose à la dextrine obtenue. On ajoute 19cm de la solution d'enzyme brute (40 unités/cm ) préparée à l'Exemple 1 à 10g du mélange obtenu(substrat)pour former une solution d'une concentration de 4og/ 100cm3. Ensuite, on ajoute 2cm3 de trichloroéthylène ou de 1-decanol à la solution, et on fait réagir le mélange à 450C pendant 50 heures en maintenant le pH de la solution à 6,3.On chasse ensuite le trichloroéthylène ou le 1-décano' par distillation, et on analyse le mélange réactionnel obtenu pour déterminer le rendement en cyclodextrine. Les résultats obtenus figurent au Tableau 3 ci-aprds. TABLEAU 3 Essai Quantités de glucose D. E. CR 194/#S Rendement Rendement et de maltose ajou- en ss-CD en &alpha;-CD tees (% en poids avec du avec du rapporté au saccha- trichloro- l-décanol ride total) éthylène comme com comme com- plexant (% plexant(% en poids Glucose Maltose en poids rapporté rapporté au au subs trat) Ex.2 O O 9,5 76 31 58,8 38,3 2 0 11,3 " " 55,3 36,1 Ex.4 1 3 11,6 n 52,7 36,0 Ex.Comp.2 3 3 13,4 " " 42,1 25,1 Ex.Comp.3 5 1 14,4 " " 37,5 23,4 Ex.Comp.4 5 5 16,1 " " 30,0 19,7 Exemple 5 et Exemple comparatif 5 On ajoute 100cm3 d'une culture de Saccharomyces cerevisiae, cultivée pendant 12 heures dans un milieu de culture contenant principalement du glucose, à une solution de 400g de l'hydrolysat d'amidon (I) utilisé dans l'Exemple I.dans 660 cm3 d'eau, et on ajuste le pH de la solution à 5,5 par de l'acide acétique. On fait ensuite incuber la solution pendant 30 heures pour assimiler le glucose et le maltose qu'elle contient.Une séparation par centrifugation donne une solution claire de dextrine d'un D.E. de 10,6 et contenant 0,2% en poids de glucose et 1,0% en poids de maltose. On ajoute 2g d'une poudre brute de transglycosylase de la cyclodextrine (8000 unités/g) obtenu en lyophilisant un filtrat d'une culture de Bacillus macerans, à 500 cm3 d'une solution de dextrine préparée comme ci-dessus. Après avoir ajusté le pH de la solution à 6,1, on ajoute 50 cm3 de l-décanol ou de trichloroéthylène. Le CR du mélange est de 80, et l'expression 194/1W vaut 31. On fait réagir le mélange à 450C pendant 48 heures. Lorsqu'on utilise du 1-decanol comme complexant de la cclodextrine, il se forme de 1' a-cyclodextrine avec un rendement de 36,0% par rapport à la dextrine. Avec du trichloroéthylène comme complexant, on obtient de la ss-cyclodextrine avec un rendement de 53,1% par rapport à la dextrine. A titre de comparaison, on dissout 200 g de l'hydrolysat d'amidon (I) (DE=15,0; CR=80;194 #S=31) dans 380cm3 d'eau, et on effectue la même réaction que ci-dessus. Avec du l-décanol, il se forme de l'-cyclodextrine avec un rendement de 22,3%, et avec du trichloroéthylène, le rendement en S-cyclodextrine est de 32,3%. Exemples 6 à 11 et Exemples comparatifs 6 à 8 On ajoute 0,1g d'une a-amylase de liquéfaction(10000 unités) de Bacillus subtilis à une suspension aqueuse à 30% d'amidon contenant lkg d'amidon de pomme de terre, et on chauffe le mélange jus qu'à environ 800C. On maintient le mélange à 1200C pendant 10 minutes dans un autoclave. La matière insoluble est éliminée par filtration, et on réduit le filtrat en poudre par une méthode de séchage par pulvérisation. On lave la poudre avec de l'éthanol pour obtenir une poudre de dextrine d'un D.E. de 9,7 et contenant 2,0% de maltose (le glucose n'est pas décelable). précitée La dextrine/est ajoutee, en concentration déterminée, a des solutions d'enzyme brutes de Bacillus macerans ayant différents nombres d'unités d'enzyme, obtenus par la méthode décrite utilisant un milieu de culture contenant du son de blé. On ajuste le pH de chacun des mélanges à 6,5, et on fait réagir à 450C pendant 48 heures en présence du trichloroéthylène. Après la réaction, on élimine le trichloroéthylène sur un bain-marie, et on détermine quantitativement la cyclodextrine obtenue. On concentre la solution qui reste après l'élimination du trichloroéthylène, et on la refroidit. On recristallise les cristaux obtenus à partir de l'eau et on obtient une poudre de ss-cyclodextrine. Les résultats obtenus figurent au Tableau 4 ci-après. TABLEAU 4 Nombre S CR Rendement Rendement D.E. d'uni- en cyclo- en poudre g/ unités/ tés de 194 dextrine de ss-CD 100 cm g de la so- (% en (% en substrat lution #S poids rap- poids rap d'enzyme porté au porté au brute substrat) substrat) (unit./cm ) Ex.Comp. 6 9,7 | 15 45 24 29 28,4 26 Ex. 6 W 30 45 49 29 53,9 50 Ex. 7 " 80 45 130 29 | 60,1 55 Ex.Comp. 7 " 10 30 27 35 35,5 31 Ex. 8 n 15 30 41 35 60,8 55 Ex. 9 " 80 30 219 35 61,2 56 Ex.Comp. 8 n 5 10 47 61 | 27,3 23 Ex. 10 n 15 10 141 61 57,4 51 Ex. 1l " 30 10 282 61 60,7 55 On analyse la solution qui reste après l'élimination du trichloroéthylène par chromatographie en couche mince. On observe un point jaune de ss-cyclodextrine, mais un point violet d' a-cyclo dextrine est seulenusrt à l'état de trace. Si on fait durer la réaction pendant 72 heures, on obtient pratiquement les mêmes résultats que ceux figurant au Tableau cidessus. On constate que l'équilibre de réaction est atteint au bout de seulement 48 heures. Exemples 12 à 17 et Exemples comparatifs 9 à 11 On prépare une poudre de dextrine ayant un D.E. de 10,5 et contenant 0,4% de glucose et 2,1 % de maltose à partir d'amidon de pomme de terre sensiblement de la manière décrite à l'Exemple 6. On dissout la dextrine obtenue, en concentration déterminée dans la solution d'enzyme brute utilisée à l'Exemple 6.0n ajuste le pH de la solution à 6,3 , puis on fait réagir la solution à 450C pendant 50 heures en présence de 1-décanol. Après la réaction, on élimine le l-décanol par distillation, et on détermine quantitativement la cyclodextrine. Les résultats figurent au Tableau 5 ciaprès. TABLEAU 5 Essai D.E. Nombre S CR 194 Reniement en cyclo d'uni- ( g/ unités/ dextrine (% en poids tés de 100cm ) g de #S rapporté au substrat) la so- substrats lution d'enzyme brute (unit./cm Ex.Comp. 10,5 15 45 24 29 24,2 Ex. 12 " 30 45 49 29 35,8 Ex. 13 " 80 45 130 29 37,2 Ex.Comp.30 " 10 30 27 35 28,3 Ex. 14 " 15 30 41 35 36,0 Ex. 15 " 80 30 219 35 38,1 5 10 47 61 22,2 Ex. 16 " 15 10 141 61 37,7 Ex. 17 " 30 10 282 61 38,7 On effectue une analyse par chromatographie en couche mince, et on constate un point violet d' a-cyclodextrine à tous les essais, mais on n'observe un point jaune caractéristique de la ss -cyclodextrine qu'à l'état de trace. Exemples 18 et 19 et exemple comparatif 12 On effectue la même réaction qu'à l'Exemple 12, en utilisant la poudre de dextrine préparée à l'Exemple 12 et ayant un D.E. de 10,5, mais en utilisant du tétrachloroéthane comme complexant de la cyclodextrine. Les résultats figurent au Tableau 6 ci-après. TABLEAU 6 Essai D.E. Nombre d'unités S CR 194 Rendement Rendement de la solution (g/100 (unités/g en &alpha;-CD en ss-CD d'enzyme brute cm ) de subs- #S (en poids (%en poids (unités/cm ) trat) rapporté rapporté au au substrat substrat Ex.Comp.12 10,5 10 40 19 31 17,6 10,9 Ex. 18 10,5 30 40 57 31 29,3 24,9 Ex. 19 10,5 80 40 152 31 20,4 37,9 EXEMPLE 20 On dissout 40 kg d'une dextrine en poudre, ayant un D.E. de 10,3 et contenant 0,3 % de glucose et 2,18 de maltose, obtenue en traitant de l'amidon de patate douce par de 1' a-amylase de liquéfaction, dans 76 dm3 d'une solution d'enzyme brute de Bacillus macerans ayant une activité de 80 unités/cm3. Après avoir ajusté le pH de la solution à 6,5, on ajoute à la solution 8 dm3 de trichloroéthylène. On agite le mélange à 450C pendant 45 heures (CR=152, 194 #S = 31). Par ailleurs, on ajoute 89 dm3 de la solution d'enzyme brute ci-dessus, d'une activité de 80 unités/cm3, à 18 kg d'un hydrolysat d'amidon ayant un D.E. de 2,4 et ne contenant pratiquement ni glucose ni maltose. Après avoir ajusté le pH de la solution à 6,5, on ajoute 8 dm3 de trichloroéthylène. On agite le mélange a 450C pendant 45 heures (CR=340, 194 #S = 46). Après la réaction, on chauffe le mélange réactionnel pour élimine le trichloroéthylène par distillation à la vapeur. Ensuite, on maintient le mélange réactionnel à 90-950C, et on le filtre à travers de la terre de diatomées en utilisant un filtre-presse. Lorsque le filtrat est la dextrine ayant un D.E. de 10,3, on obtient facilement un filtrat clair. On refroidit le filtrat à 50C, et on recueille les cristaux précipités par filtration puis on le recris tallise à partir de l'eau pour obtenir 19,8 kg de ss-cyclodextrine pure sous forme de poudre cristalliné. Le rendement est de 49,5% rapporté au poids du substrat. Par ailleurs, lorsqu'on utilise l'hydrolysat d'amidon ayant un D.E. de 2,4, on concentre le mélange réactionnel à la moitié de son volume initial après avoir éliminé le trichloroéthylène par distillation à la vapeur, et aussitôt après, on refroidit à 50C pour obtenir des cristaux. On dissout les cristaux dans l'eau, et on les filtre sur un filtre presse. On traite le filtrat de la même manière que ci-dessus et on obtient 8,8 kg de ss-cyclodextrine pure sous forme de poudre cristalline. Le rendement est de 48,9%, rapporté au poids du substrat. Exemple 21 et Exemple comparatif 13 On stérilise un milieu de culture contenant 1,2% d'amidon, 1,0% d'infusion de mals, 0,6% de sulfate d'ammonium et 0,3% de carbonate de calcium, on inocule Bacillus macérans au milieu et on le cultive dans des conditions aérobies pendant 1 à 3 jours à 370C pour former des solutions d'enzyme brutes contenant des nombres d'unité différents. On dissout 30 g d'un hydrolysat d'amidon, ayant un D.E. de 9,7 et contenant 2,0% de maltose (le glucose n'est pas décelable), dans 82 cm3 de chacune des solutions d'enzyme ci-dessus. Après avoir ajusté le pH de chacune des solutions à 6,5, on ajoute 10 cm3 de trichloroéthylène, et on agite le melange à 450C pendant 48 heures. Après la réaction, on détermine quantitativement la cyclodextrine. Les résultats figurent au Tableau 7 ci-après. Une analyse par chromatographie en couche mince montre que le produit est formé presque uniquement de ss-cyclodextrine. TABLEAU 7 ESSAI D.E. Activité de la CR 194 Rendement en cyclodex- solution d'enzyme (unités/g de #S trine(% rapporté en brute (unités/cm ) substrat) poids au substrat) Ex.Cbmp.13 9,7 10 27 35 31,2 Ex. 21 9,7 15 41 35 58,9 Ex. 22 9,7 30 82 35 62,0 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de cyclodextrine, caractérisé par le fait qu'on fait réagir une solution aqueuse d'un hydrolysat d'amidon ayant un D.E. non supérieur à 20 avec la transglycosylase de la cyclodextrine, la réaction étant conduite de telle manière que (i) la quantité totale de maltose et de glucose contenue dans l'hydrolysat d'amidon au démarrage de la réaction ne dépasse pas 5% en poids, rapportés au poids de l'hy drolysat d'amidon, et (ii) la quantité de transglycosylase de la cyclodextrine dans la solution réactionnelle satisfait la relation suivante CR = 194/ /y- dans laquelle S est la concentration en hydrolysat d'a- midon au démarrage de la réaction, exprimée en graninea par 100 cm3 de la solution réactionnelle, et est un nom bre positif compris entre 10 et 50, et CR est le nombre d'unités de transglycosylase de la cyclodextrine par gramme de l'hydrolysat d'amidon.