FR 2285080 A1 19760416 FR 7431589 A 19740918 La présente invention concerne un procédé d'obtention de protéines d'organismes unicellulaires à partir de substrate amylacés, par exemple à partir de pommes de terre. On sait que les protéines sont des constituants essentiels de la matière vivante dont elles représentent en moyenne 50 % du poids sec. Ces protéines jouent un rôle fondamental dans l'établissement de la structure et dans le fonctionnement cellulaire, car elles sont les instruments moléculaires grâce auxquels l'information générique peut s'exprimer. Les protéines sont des macromolécules constituées par l'enchaînement de molécules élémentaires : les acides aminés. Les sources essentielles des protéines pour l'alimentation animale et humaine sont bien connues. On citera, à titre d'exemple : les protéines d'origine végétale que l'on trouve dans toutes les plantes et en particulier dans les légumineuses et les céréales, ainsi que les protéines d'origine animale telles que celles contenues dans le lait, la viande, les oeufs, etc.. Le développement de plus en plus important de la consommation d'aliments carnes par l'homme a provoaué une intensification de l'élevage et par voie de conséquence, la recherche de sources abondantes de protéines pour l'alimentation animale. On s'est tourné tot d'abord vers l'utilisation des tourteuax de graines oléagineusse (soja, tournesol, etc.), puis les recherches se sont orientées vers la production de "protéines d'organismes unicellulaires" (P.O.U.). Ces microorganismes présentent en effet un certain nombre d'avantages essentiels: - leurs croissance est très rapide ; - le rendement substrats/protéines est supérieur à celui des autres organismes ; - leurs production peut être industrialisée. Il exeste trois groupes principaux de microorganismes; les bactéries, les levures et les champignong (moisissures). Jusqu'à présent, les efforts ont surtout porté sur la préparation des P.O.U. en utilisant des levures. Comme on le sait, les levures sont des microorganismes qui, au cours de leur croissance végétative , se reproduisent sous forme de cellules ovales individualisées. leur utilisation dans ltalimentation remonte aux temps les plus lointains, puis qu'elles sont à la base de la fabrication du pain, de la bière et du vin. leur utilisation directe dans l'alimentation, comme source de protéines, remonte au début du 20ème siècle. Elles ont été cultivées sur différents substrats, tels que'mélasses, lac toséruz!, liqueurs bisulfitiques, hydrolysats de bois et effluents divers. La présente invention a pour but de -fournir de nouvelles sources de protéines et elle vise plus particulièrement, comme substrat, les substrats amylacés tels que les pommes de terre, en raison surtout des qualités intrinsèques de ces substrats qui sont riches en amidon. l'utilisation de 1 t amidon pour la préparaticn d'un milieu de culture producteur de protéines peut s'envisager selon deux voies différentes, à savoir: mettre en oeuvre des souches de mi oroorganismes possédant des amylases et-donc directement capables d'utiliser le substrat; réaliser une hydrolyse de l'amidon et cultiver, sur le glucose résultant-de cette hydrolyse,une souche particulière. les critères permettant de réaliser le choix d'une telle souche sont essentiellement : une croissance rapide, une possibi lité de récupération aisée, une bonne teneur en protéines et une absence de toxicité les germes amylolytiques se rencontrent essentiellement parmi les bactéries et les moisissures. les premières, si elles possèdent généralement un temps de division très courts ont2 par contre, une taille assez faible qui rend malaisée leur récupéra tion et pose en outre certains problèmes, au niveau de la toxicité. les seconaes, assez souvent riches en protéines, ont par contre des temps de génération assez longs et, sauf pour quelques espèces, sont de culture assez difficile, du fait de leur nature filamenteuse.Par contre, les levures rassemblent la plupart des qualités décrites précédemment, à savoir : un temps de géné ration relativement court, une taille suffisante pour ne pas soulever de graves difficultés de récupération, une division sous forme unicellulaire, une teneur en protéines satisfaisante et, pour un grand nombre d'entre elles, une absence totale de toxicité (vérifié par de longues périodes d'utilisation dans l'alimentation animaie et parfois mEme humaine). Or, il se trouve que l'on ne connaît que peu de levures amyloytiques (Endomycopsis fibuliger, Saccharomyces diastations) et encore leur activité est-elle assez faible et nécessiterait des études génétiques longues et aléatoires pour être améliorée. Compte tenu de ce qui précède l'invention fournit alors un nouveau procédé d'obtention des protéines comportant deux stades essentiels, à savoir, l'hydrolyse de l'amidon contenu dans le substrat amylacé et la culture dune souche spécifique de levure. Suivant une caractéristique de l'invention la souche spécifique de levure est Candida utilis". Suivant un mode de - réalisation possible de l'invention on procède d'abord,en un stade séparé, à lthydrolyse de l'amidon, puis on procède à la culture de la. levure sur le milieu provenant de i'hydrolyse. L'hydrolyse de l'amidon peut s'envisager de deux manières différentes :hydrolyse par voie ehimique ou hydrolyse par voie enzymatique. l'hydrolyse par voie chimique présente certains inconvé nients - elle nécessite l'utilisation de matériaux spéciaux per mettant de supporter les conditions d'hydrolyse, c'est-à- dire notamment de résister à des phénomènes de corrosion, du fait que l'on doit généralement opérer à température relativement élevée (1100C) en présence d'un acide (H2S04) pendant une durée relativement longue (de l'ordre de 2 heures); - elle provoque un noircissement du milieu dû probablement à des réactions de Maillard entre les sucres et les acides aminés;; - outre le fait que ces réactions ainsi que l'utilisation de températures élevees provoquent une perte de gluccse, la coloration brune se retrouve dans les cellules en fin de culture des levures, ce qui fournit un composé foncé peu engageant. Or le procédé de ia présente invention est caractérisé par le fait que l'hydrolyse de ltamidon est réalisée par voie enzymatique. Suivant d'autres caractéristiques - les enzymes hydrolysant l'amidon sont choisies parmi les amyloglucosidases libérant directement du glucose; - l'amyloglucosidase convenant selon l'inventIon est choisie parmi les amyloglucosidases provenant d'une souche dthspergillus niger présentant une zones d'activité pour une température comprise entre 300 et 650C ( de préférence 600C) et pour un pH compris entre 7 et 6 (de préférence 4,5); - avant sont utilisation le substrat amylacé est cuit pour provoquer d'une part la dégradation des parois cellulaires et la libération des grains d'amidon et, d'autre part, la dissociation de ces grains en permettant lthydrolyse enzymatique;; - la cuisson est réalisée entre 1000 et 1100C pendant une durée comprise entre 15 minutes et 1 heure; - après cuisson, le substrat est broyé finement; - le milieu à traiter est additionné des éléments indispensables à la synthèse des constituants de la cellule de levure; - les éléments indispensables sont lrazote, le phosphore et le potassium; - l'azote est ajouté sous forme de sulfate d'ammonium et d'ammoniaque, le phosphore et le potassium sous forme de phosphate monopotassique; - la culture de la levure se fait sous agitation par voie aérobie et à une température comprise entre 250 et 400 C; ; - la culture est réalisée de façon continue par introduction permanente de milieu frais coDpensé par un prélèvement équivalent de milieu épuisé contenant les levures, la quantité de milieu frais apportée par heure étant déterminée par le temps de rétention désiré qui peut varier de 2 heures à 4 heures; - le milieu épuisé issu du stade de fermentation est centrifugé et la crème de levure est recueillie et séchée; le milieu de culture surnageant contenant encore du glucose est recyclé en le chargeant avec une nouvelle quantité de substrat. Suivant un autre mode de réalisation de 12 invention, lthydrolyse et la fermentation se font dans le fermenteur lui- même. Dans cc cas, l'enzyme est introduite dans le fermenteur en même temps que le substrat, les levures consommant le glucose au fur et à mesure de sa libération. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront plus clairement de la description qui va suivre et notamment des exemples c.-après donnés à titre illustratif et nullement limitatif dans le cas particulier de la pomme de terre prise comme substrat amylacé Exemple 1 Hydrolyse discontinue suivie d'une culture continue. Substrat -: pommes de terre de consommation susceptibles de libérer 160 g de glucose/kg. les pommes de terre sont lavées et coupées en cubes de 3 cm de côté, recouvertes d'eau et cuites 1 h à 110 C. A la fin de la cuisson, elles sont broyées avec un mixer et on ajoute de liteau du robinet pour obtenir finalement 1 kg de pommes de terre pour 5 litres de milieu. le milieu est ajusté à pH 4,5, par addition de HCl. Hydrolyse Lthydrolyse est réalisée par addition de 500 mg dtamylo glucosidase industrielle ("Amygase 200 AGN" commercialisée par la Société RAPIDASE) par 5 1 de milieu (soit 100 mg/l). Conditions d'hydrolyse - température : 600C - pH : 4,5 - Temps : 4 neures. Cette hydrolyse est réalisée sous agitation permanente. En fin dthydrolyse le milieu contient 32 g de glucose/litre. le milieu est additionné de 2 g/l de (NH4)2SO4 et 2 g/l de H2KPO4. Culture Le milieu maintenu sous agitation est introduit dans le fermenteur continu à l'aide d'une pompe doseuse à raison de 450 ml/h pour un fermenteur de capacité utile de 1 1. La fermentation se fait dans les conditions suivantes - levure Candida utilis en quatité de : 109 microorganis mes par ml. - température : 300C - aération : 2 1 drair/mn - agitation : 1 000 t/mn - pH : régulé à 3,5 par addition automatique d'ammoniaque, - addition automatique d'antimousse : huile de colza. le temps de rétention dans le fermenteur est de 2 h 15. L'ensemble de fermentation est placé sur une balance dont le bras commande le fonctionnement de la pompe de prélèvement. le volume constant est donc maintenu par un poids constant. le milieu épuisé est recueilli et centrifugé. Le culot de cellules est séché par lyophilisation. Dans ces conditions on trouve des traces de substrat dans lteffluent de fermentation. Les rendements obtenus sont les suivants 1 litre de milieu contient 21 g de produit sec, dont la teneur en protéines est de 52 %, soit 10,9 g de protéines/litre. Ces rendements sont maintenus après 500 heures de fermentation. Exemple 2 Hydrolyse continue suivie d'une fermentation continue. les pommes de terre sont cuites et broyées dans les corldi- tions décrites à l'exemple 1, mais le volume final est de 4 litres pour 1 kg de pommes de terre. Dès la fin du broyage, on ajoute 2,5 g de (NH4)2SO4 par litre et 2,5 g de X2E PO4 par litre. le pH est ajusté à 4 par addition dtHCl. Le milieu ainsi préparé est introduit à raison de 320 ml/h dans un récipient dthydrolyse. Dans le meme temps, on introduit dans ce récipient une solution dtamyloglucosidase à 1,5 g/l à raison de 80 ml/h, soit une concentration d'enzyme de 300 mg/l. Le temps de rétention dans ce récipient d'hydrolyse est dde 1 h à 2 h 30 ; la température s'y trouve maintenue à 50 C. Le mil-ieu hydrolysé est prélevé automatiquement et introduit dans le fermenteur lui-mme. les conditions de fermentation sont les mêmes que dans l'exemple 1 à ltexception du temps de rétention qui est 2 h 30. J Dans ces conditions les rendements obtenus sont les mêmes que précédemment. La culture réalisée de façon continue présente, par rapport à une fermentation discontinue, les avantages suivants - le fermenteur peut être équipé pour fournir en permanence les conditions optimales de croissance du fait qu'il fonctionne en régime stationnaire0 Par contre, dans un fermenteur en discontinu, il faut prévoir une agitation et une aération suffisantes pour la dernière phase de la culture; - la fermentation continue ne nécessite la préparation que drune seule pré-culture au moment de la mise en route; - dans le cas de levures qui se multiplient à un pH très bas, il - y a peu de risques de contamination, du fait que les autres microorganismes et les bactéries en particulier, ne se développent pas à des PH acides aussi bas;; - 8til se produit des mutations dans la souche, seuls les mutants ayant un temps de génération inférieur à celui de la souche initiale pourront se développer et les autres qui n'ont pas eu le temps de se développer, seront lessivés. Pour la production des P.O.U., on a intérêt à disposer de cellules ayant les temps de génération les plus courts possibles; - tous les équipements annexes nécessaires à la fermentation (tels que les centrifugeuses, les pompes, etc...) peuvent être choisis pour un débit déterminé et être utilisés à leur rendement optimum; - enfin le procédé de fermentation continue, pour une capacité de production donnée, exige un dimensionnement bien plus faible de l'installation. I1 va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limitatif et que toute mo dification utile pourra y être apportée sans sortir de son cadre tel que défini par les revendications ci-après. REVENDICATIONS 1 - Procédé d'obtentioen de protéines d'organismes unicellulaires à partir de substrats amylacés, procédé caractérisé par le fait qu'il consiste à hydrolyser l'amidon contenu dans le substrat amylacé et à cultiver, sur le milieu obtenu , une souche spécifique de levure. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le substrat amylacé est de la pomme de terre. 3 - Procédé selon la revendiaation 1 ou 2, caractérisé par le fait que la souche spécifique de levure est Candida utilis. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'hydrolyse de l'amidon est réali sée par voie enzymatique. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que les enzymes servant à l'hydrolyse de l'amidon sont choisies parmi les amyloglucosidases libérant directement du glucose. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l'amyloglucosidase provient d'une souche dVAspergillus niger, présentant une zone d'activité pour une température comprise entre 300 et 650C, de préférence 600 C, et pour un pH compris entre 3 et 6, de préférence 4,5. 7 - Procédé selon leune quelconque desrevendications 1 à 6, caractérisé par le fait que le substrat amylacé estt cuit pour provoquer d'une part la dégradation des parois cellulaires et la libération de grains d'amidon et, d'autre part, la dissociation de ces grains pour enpermettre lthydrolyse enzymatique. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que la cuisson est réalisée entre 1000 et 1100C pendant une durée comprise entre 15 minutes et 1 heure. 9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait qutaprès cuisson, le substrat est broyé finement et le milieu à traiter est additionné des éléments indispensables à la synthèse des constituants de la cellule de levures, ces éléments tant ltazote, le phosphore et le potassium. 10 - Procédé selon la revendicatiorA 9, caractérisé par le fait que l'azote est ajouté sous forme de sulfate d'ammonium et d'ammoniaque, le phosphore et le potassium sous forme de phosphate monopotassique Il - Procédé selonl'une quelconque des revendications 1 à 10 ,caractérisé par le falt que la culture de la levure se fait sous agitation, par voie aérobie et à une température comprise entre 250 et 4O0C. i 12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé par le fait que la culture est réalisée de façon continue par introduction permanente du milieu frais compensé par un prélèvement équivalent du milieu épuisé contenant les levures et que le temps de rétention varie entre 2 et 4 heures. 13 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que le milieu épuisé issu du stade de culture est centri- fugué et la crème de levure est recueillie et séchée, alors que le milieu de culture surnageant contenant encore du glucose est recyclé. 14 - Procédé selon l'ure quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé par le fait que l'hydrolyse et la culture se font dans le fermenteur lui-même.