FR 2277564 A1 19760206 FR 7521595 A 19750709 La présente invention concerne un procédé de dosage immunologique utilisant un système hétérologue d'anticorps ou d'antigènes. Le procédé selon l'invention permet d'éliminer complètement les réactions croisées dans les méthodes immunologiques. Le procédé selon l'invention utilise un système hétérologue d'anticorps ou d'antigènes et non pas un système homologue tel qu'utilisé antérieurement. Un exemple d'une application spécifique d'une méthode dans laquelle on peut mettre en oeuvre la présente invention concerne la technique de dosage radio-immunologique en phase solide dans le but de mesurer les niveaux d'antigène associé à l'hépatite dans le sérum.Dans une telle méthode, on obtient à partir d'une espèce d'animal, tel que le cobaye, un anticorps utilisé pour revêtir la phase solide et fixer n'importe quel antigène associé à l'hépatite qui peut etre présent dans le sérum, tandis que l'on obtient à partir d'une deuxième espèce d'animal, telle que l'espèce humaine, l'anticorps marqué, utilisé pour fournir une indication de la présence de l'antigène dans le sérum. On peut appliquer ce concept à d'autres systèmes qui peuvent utiliser un système anticorps ou antigène à deux phases, par exemple les antigènes avec deux ou plus de deux sites réactifs, c'est-à-dire les protéines, les peptides, les enzymes, les hormones, les virus, les bactéries et similaires ou les systèmes qui utilisent une réaction anticorps à deux phases tel que l'anticorps fluorescent, l'immuno-enzyme, les anticorps avec des radicaux libres et les nucléides radio-actifs et non radio-actifs. On peut réaliser la détection de molécules actives immunologiquement en utilisant des agents de marquage convenables qui comportent des substances détectables physiquement telles que les substances suivantes, c'est-à-dire les produits chimiques fluorescents, les isotopes radio-actifs, etc. Bien que l'on ait déjà proposé des méthodes pour déterminer la présence de molécules actives immunologiquement telles que les virus intacts, les bactéries, les protéines, les carbohydrates, les hormones et similaires, il n'existe toutefois pas une méthode simple mais cependant sensible ainsi qu'un appareil pour déterminer la présence de ces matériaux. On a déjà utilisé des anticorps marqués pour identifier des antigènes variés. Il est bien connu que chaque anticorps a un antigène correspondant et qu'un anticorps spécifique à un antigène se rattache à cet antigène chaque fois qutil est mis en présence de l'anticorps.Si l'on isole un anticorps connu pour etre spécifique d'un antigène particulier d'une partie de globuline de sérum ou de plasma d'un animal porteur qui a été stimulé pour produire cet anticorps, on peut ainsi le marquer ou l'étiqueter par des moyens connus en unissant l'anticorps avec un agent marquant. De tels agents marquants comportent des substances détectables physiquement telles que les substances chimiques fluorescentes, les isotopes radio-actifs et similaires. Jusqu'à présent, il n'était pas facile de détecter les agents de l'hépatite virale, qui est une maladie relativement commune, au moyen d'un test sensible qui soit à la fois spécifique et reproductible pour déterminer rapidement si oui ou non les sérums d'un patient ou d'un donneur contiennent l'antigène associé à l'hépatite ou les anticorps. On a développé dans le passé des techniques de dosage radio-immunologique pour des systèmes variés antigène-anticorps, mais ces techniques, telles que décrites dans les articles de Kevin Catt et coll. dans the Journal of Biochemistry, 1966, volume 100, pages 31c et 33c et dans Science, volume 158, page 1570, 1967, sont en fait des techniques de dosage radio-immunologique selon lesquelles la quantité d'antigène présent est grossièrement inversement proportionnelle à la quantité de radiation émise par le matériau traceur. Ces procédés nécessitent l'utilisation de tables de correspondance qui rendent généralement les résultats moins reproductibles et souvent inexacts. Wide, Karolinska Symposia, Zist Symposia, 23-25 septembre, 1969, University Hospital, Upsila, Suède, pages 207-214 décrit un dosage radio-immunologique selon lequel on absorbe un allergène sur un polymère plastique et on lie immunochimiquement une réagine sur l'allergène en phase solide et, ensuite, l'antiréagine marquée ou non marquée est liée à la réagine. De façon similaire, C. M. Ling et L. R. Overby dans le Journal of Immunology,volume 109, octobre 1972 décrit une méthode de diagnostic pour le dosage radio immunologique d'antigènes et de leurs anticorps qui fournit une mesure directe.Avec cette méthode, telle qu'appliquée à un procédé pour déterminer la présence d'antigène associé à l'hépatite, on ajoute un échantillon de sérum à un tube revetu au préalable de l'anticorps associé à l'hépatite et on laisse incuber à température ambiante. Durant l'incubation, on relie l'antigène associé à I'hépatite, s'il est présent dans l'échantillon de sérum à tester, à l'anticorps sur les parois du tube. On vide ensuite le tube et on le lave en laissant seulement l'antigène-anticorps lié, sur les parois. On ajoute dans le tube un anticorps spécifique marqué avec I125 et on laisse incuber. Durant l'incubation, l'anticorps marqué avec I125 se lie avec l'antigène préalablement lié. Après avoir vidé et lavé le tube, on mesure la radio-activité restante.La comparaison avec des échantillons de contrôle permet de déterminer si l'échantillon de sérum testé contient l'antigène associé à l'hépatite. Avec cette méthode, on utilise un système homologue selon lequel à la fois les deux réactifs anticorps sont obtenus à partir dune source de cobaye. Les méthodes immunologiques telles que décrites ci-dessus présentent très souvent des problèmes spécifiques, étant donné que l'antisérum à l'état brut peut réagir avec les antigènes que l'on ne désirerait pas mesurer. Ceci arrive parce que l'impureté de llantisérum ou de l'antigène dans certains cas où l'échantillon à tester est sensible à l'espèce de l'anticorps plus qu'à l'anticorps lui-mEme; en outre, il peut arriver des réactions croisées, ce qui provoque ltobtention de résultats erronés. De tels problèmes peuvent devenir très importants dans les méthodes immunologiques très sensibles et lton doit prendre beaucoup de précautions pour minimiser de telles réactions croisées.Des exemples de telles précautions sont par exemple la neutralisation de substances réagissant de façon croisée ou leur absorption ou la mise en oeuvre d'échantillons de contrôle convenables. Malgré ces précautions, il apparait toujours des réactions croisées dans de telles méthodes et, dans le cas du test de l'hépatite, par exemple, on peut obtenir des valeurs positives. Par contre, le procédé selon l'invention appliqué à des méthodes immunologiques permet d'éliminer pratiquement complètement les réactions croisées. Selon le procédé de la présente invention, on utilise un système hétérologue d'anticorps ou d'antigènes et non-pas un système homologue tel qu'utilisé antérieurement. La présente invention sera décrite plus spécialement en faisant référence à une technique de dosage radio itirninologique en phase solide pour mesurer les niveaux dans le sérum d'antigène associé à l'hépatite, bien que le procédé selon l'invention soit également applicable à d'autres systèmes qui peuvent utiliser un système anticorps ou antigène à deux phases. En résumé, on utilise un antisérum pour un antigène associé à l'hépatite obtenu à partir d'une espèce d'animal tel que le cobaye pour revetir la phase solide, et on l'utilise ainsi pour fixer l'antigène au cours de la première étape du procédé; on utilise ensuite au cours de la seconde étape un anticorps marqué purifié obtenu à partir d'une autre ou d'une seconde espèce animale, telle que l'espèce humaine. I1 y a en fait essentiellement deux raisons qui rendent un tel système hétérologue hautement spécifique. a) une substance qui réagit de façon croisée avec des protéines d'une espèce, c'est-à-dire un anticorps de cobaye, ne réagira probablement pas de façon croisée avec des protéines d'une autre espèce, c'est-à-dire un anticorps humain; et b) on expose chaque espèce à des antigènes étrangers ou indésirés durant son temps de vie par l'intermédiaire des infections, etc. mais la probabilité pour qu'un seul réactif croisé réagisse avec deux protéines d'espèce animale différente est très limitée. C.M. Ling et R.L. Overby dans the Journal of Immunology, volume 109, n04, octobre 1972 dans un article intitulé "Prédominance de l'antigène du virus B de l'hépatite, tel que révélé par le dosage direct radio-immun avec un anticorps I", décrivent un système homologue. Cet article concerne un test radio-immun direct à deux étapes utilisé pour détecter le l'antigène associé au virus B de l'hépatite dans un sérum ou un plasma humain. Ce procédé nécessite l'utilisation de tubes en polypropylène revêtus avec un sérum de cobaye hyperimmun et une globuline immun antigène spécifique du virus B de l'hépatite marqué à l'iode125 et l'on obtient ainsi un système homologue cobaye-cobaye.En utilisant le test décrit ci-dessus, on obtient des résultats qui montrent que les réactions croisées sont relativement fréquentes en système homologue pour dépister l'antigène de l'hépatite, par contre, si l'on utilise le système hétérologue selon lequel le tubej le lit, le disque en plastique, ou une autre phase solide sont revêtus d'un anticorps de cobaye, tandis que l'on utilise un anticorps humain marqué au cours de la seconde étape du procédé à la place d'un anticorps de cobaye, on n'observe pas de réaction croisée, ceci étant confirmé sur 75.000 échantillons testés lors d'essais cliniques. I1 est évident que l'utilisation de n'importe quelle combinaison hétérologue d'anticorps radiomarqués en phase solide permettra d'éviter les réactions croisées; par exemple, les systèmes homme-cobaye, lapin-homme, chèvre-lapin, etc. Bien que l'on décrive la présente invention en relation avec la détection de l'antigène de l'hépatite par un dosage radio-immunologique, il est clair que la caractéristique de la présente invention est également utilisable à d'autres systèmes qui peuvent employer un système anticorps ou antigène à deux phases, par exemple les antigènes avec deux ou plus de deux sites réactifs, c'est-à-dire les protéines, les peptides, les enzymes, les hormones, les virus, les bactéries et similaires ou les systèmes qui utilisent une réaction anticorps à deux phases, tels qu'un anticorps fluorescent, uneimmuno-enzyme, les anticorps avec des radicaux libres et les nucléides radio-actifs et non radio-actifs.On peut réaliser la détection de molécules actives immunologiquement en utilisant des agents de marquage convenables qui incluent notamment des substances détectables physiquement, telles que les substances chimiques fluorescentes, les isotopes radio-actifs, etc. Dans les cas où l'on utilise un isotope radio-actif 125 comme agent marquant, on préfère utiliser l'iode compte tenu de sa période avantageuse, mais l'on peut utiliser également d'autres radionucléides, tels que l'iode131, le phosphore32 et lue tritium en tant qu'agents marquants pour marquer les réactifs. On décrit ci-dessous le système hétérologue selon la présente invention en conjonction avec une technique de dosage radio-immunologique en phase solide dans le but de-mesurer les niveaux dans le sérum d'antigène associé à l'hépatite en utilisant essentiellement les procédés et méthodes mentionnés par Ling et Overby dans l'article indiqué ci-dessus. Dans- tous les essais suivants, on utilise des lits en plastique revêtue d'anticorps de cobaye. On ajoute le sérum à tester et,durant l'incubation, on fixe à l'anticorps n'importe quel antigène provenant du sérum. Quand on ajoute un anticorps humain marqué à l'iode125, on lie n'importe quel antigène sur le lit en créant une combinaison anticorps humain marqué-antigèneanticorps. Après lavage, on mesure la radio-activité résiduelle et, à l'intérieur de certaines limites, plus la quantité d'antigène dans le sérum est grande-et plus le comptage final est élevé. Dans ce qui suit, on illustre un procédé pour effectuer les essais indiqués, les réactifs utilisés sont les suivants 1.Echantillon de contrôle humain négatif (plasma humain recalcifié non réactif vis-à-vis de l'antigène associé à l'hépatite et de l'anticorps associé k l'hépatite). On utilise 0,1% de nitrure de sodium comme agent de conservation. 2. Echantillon humain de contrôle positif (plasma humain réactif vis-à-vis de l'antigène associé à l'hépatite). On utilise un tampon 0,01 molaire TRIS (hydroxyméthyl)aminométhane contenant 4% d'albumine de sérum bovin utilisé comme diluant pour ajuster l'activité et l'on utilise également 0,1% de nitrure de sodium en tant qu'agent de conservation. 3. Anticorps associé à l'hépatite marqué par un radio-isotope (antigène Anti-Australia I125, humain). On utilise un tampon 0,005 molaire TRIS (hydroxyméthyl)aminométhane contenant 50% de sérum de veau, 2% de sérum humain normal et 0,5% d'albumine de sérum bovin utilisé comme diluant pour ajuster l'activité et l'on ajoute également 0,1% de nitrure de sodium en tant qu'agent de conservation. 4. Lits revetus d'anticorps associé à l'hépatite (cobaye) (lits de polystyrène revêtus avec un anticorps cobaye associé à l'hépatite). A partir de ces réactifs et matériaux, on peut réaliser un nécessaire pour la mise en oeuvre de l'essai, un tel nécessaire pour réaliser 100 essais contient 100 lits, revêtus avec l'anticorps associé à l'hépatite (antigène Anti-Australia) (cobaye); 2 flacons (chacun de 10 ml), d'anticorps associé à l'hépatite (antigène I125 Anti-Australia, humain), approximativement 7 microcuries par flacon; 1 flacon (5 ml) d'échantillon de contrôle négatif (non réactif pour l'antigène associé à l'hépatite); 1 flacon (3 ml) d'échantillon de contrôle positif (positif pour l'antigène associé à l'hépatite); 2 plateaux de réaction présentant chacun 20 cavités et des tubes de comptage. L'essai -est conduit de la façon suivante on place un lit revêtu d'anticorps cobaye à l'intérieur d'une cavité du plateau et ceci pour chaque échantillon à tester. En utilisant une pipette de précision, on ajoute 0,2 ml de sérum (ou de plasma recalcifié) et l'on incorpore les échantillons de contrôle positifs et négatifs dans leurs cavités respectives. Le lit revêtu d'anticorps doit être complètement entouré de sérum. On dispose un couvercle sur le plateau et on fait incuber les plateaux à 450C pendant 2 h. A la fin de ces 2 h, on enlève les plateaux et on enlève le couvercle. On rince chaque cavité et chaque lit avec un total de 5 ml d'eau distillée ou désionisée. On répète le procédé de lavage une fois de plus. A l'aide d'une pipette de précision, on ajoute à chaque cavité d'incubation 0,2 ml d'anticorps (humain) associé à l'hépatite et marqué à l'iode125, et l'on vérifie que le lit revêtu de l'anticorps est bien complètement entouré par la solution d'anti corps marqué. On rajoute un couvercle sur le plateau et on laisse incuber les plateaux à 450C pendant 1 h. Au bout de 1 h, on enlève le couvercle et on aspire la solution d'anticorps de chacune des cavités après que l'on a rincé les cavités ainsi que les lits revetus de l'anticorps qu'elles contiennent en utilisant un total de 5 mi d'eau distillée ou désionisée, comme décrit précédemment.On transfère ensuite les lits des cavités dans des tubes de comptage convenablement identifiés, lesdits tubes étant placés dans des compteurs à scintillation gamma convenables du type creux et l'on détermine le comptage. On détermine la présence ou l'absence d'antigène associé à l'hépatite en comparant le nombre de coups nets par minute de l'échantillon inconnu par rapport au nombre de coups nets par minute des moyennes de l'échantillon de contrôle négatif multiplié par le facteur 2,1. On considère comme positifs vis-à-vis de l'antigène associé à l'hépatite les échantillons inconnus dont le comptage net est supérieur à la valeur moyenne à retrancher établie avec l'échantillon de contrôle négatif. La valeur moyenne des échantillons de contrôle positifs devrait être au moins cinq fois plus importante que les moyennes de l'échantillon de contrôle négatif. Si ce n'est pas le cas, l'essai doit être considéré comme suspect et on doit le refaire à nouveau. Calcul et détermination de la valeur à retrancher 1. Calcul de la moyenne de-l'échantillon de contrôle négatif. a) Exemple Echantillon de contrOle négatif Comptage des coups nets par minute n (CCM) 1 380 2 400 3 410 4 375 5 350 6 390 7 400 Total 2.705 2705 Total des CCM nets = = 386 CCM nets (moyens) 7 b) Elimination des valeurs aberrantes --------------------------------- Méthode. On écarte les valeurs individuelles dans les échantillons de contrôle négatifs qui tombent en dehors de la limite 0,5 à 1,5 fois la moyenne. Exemple 0,5 x 386 = 193 et 1,5 x 386 = 579. Ce qui donne l'intervalle : 193 CCX à 579 CCM. * Dans l'exemple, aucun échantillon de contrôle négatif n'a été rejeté comme aberrant. c) On doit réviser par conséquent la moyenne de l'échantillon de contrôle négatif. Toutes les valeurs de l'échantillon de contrôle négatif doivent tomber dans l'intervalle 0,5 à 1,5 fois la moyenne de contrôle. Si plus d'une valeur se trouve en dehors de cet intervalle, on doit rechercher des défaillances techniques. 2. Calcul -de la valeur moyenne à retrancher (voir note): a) On multiplie la moyenne nette de contrôle négatif, 386 CCX par le facteur 2,1. b) La valeur à retrancher calculée est par conséquent de 811 CCX. c) Les échantillons inconnus pour lesquels le comptage net est supérieur à la valeur à retrancher doivent être considérés comme positifs vis-à-vis de l'antigène associé à l'hépatite. Note : Beaucoup de compteurs gammas n'ont pas la possibilité de soustraire automatiquement le bruit de fond. Dans ce cas, de façon à pouvoir soustraire manuellement le bruit de fond pour chaque échantillon, on peut comparer les coups par minute de l'échantillon non corrigé avec une valeur à retrancher modifiée de la façon suivante (Moyenne du contrôle négatif - le bruit de fond) x 2,1 + le bruit de fond = la valeur à retrancher. Exemple Moyenne brute du contrôle négatif = 436 CCM. Bruit de l'instrument = 50 CCM. Valeur à retrancher = (436 - 50) x 2,1 + 50 = 861 CCM. Des échantillons présentant un comptage brut supérieur à 861 CCX doivent être considérés comme réactifs vis-à-vis de l'antigène associé & l'hépatite. 3. Calcul du rapport du contrôle positif sur le contrôle négatif. a) On divise la valeur moyenne du contrôle positif par la valeur moyenne du contrôle négatif après correction pour le bruit de fond Moyenne nette du contrôle positif = rapport P/N Moyenne nette du contrôle négatif b) Ce rapport doit être d'au moins 5, sinon essai doit être considéré comme suspect et refait. Exemple Valeur moyenne nette du contrôle positif = 5906 CCM. Valeur moyenne nette du contrôle négatif = 386 CCM. Rapport P/N = 5906 = 15,3 386 L'essai est acceptable et le résultat peut être considéré comme correct. Les données et résultats suivants indiquent la sensibilité d'un système hétérologue aussi bien que ses propriétés de minimiser les réactions croisées. Le tableau I ci-après démontre la propriété pour un système anticorps à deux espèces ou hétérologue de distinguer l'antigène B de l'hépatite des réactions positives fausses. On a sélectionné 18 échantillons au hasard à partir de sérum réactif B vis-à-vis de l'hépatite qui ont été antérieurement identifiés comme des réactifs faux vis-à-vis de réactifs homologues cobaye-cobaye dans plusieurs laboratoires au moyen de méthodes de neutralisation spécifiques. Les données incluent 5 échantillons confirmés positifs et 5 échantillons négatifs en tant qu'exemples comparatifs. On définit une réaction positive comme étant une réaction pour laquelle on mesure la radio-activité dans l'échantillon inconnu en coups par minute (CCX), ce nombre de coups étant plus de 2,1 fois plus grand que la radio-activité moyenne mesurée sur les échantillons de contrôle négatifs. Ainsi, dans la méthode de dosage direct radio-inmunolo- gique avec des anticorps homologues (par exemple cobaye-cobaye), des échantillons positifs vrais et faux réagissent à la fois et on ne peut pas les différencier les uns des autres. Toutefois, le système hétérologue (par exemple anticorps chimpanzé-cobaye) permet de détecter tous les vrais échantillons positifs, mais aucun des échantillons positifs faux ne réagissent. Le tableau II ci-après illustre à titre d'exemple l'efficacité d'un système anticorps hétérologue utilisé dans une méthode de dosage direct radio-immunologique dans le but d'effectuer un essai de diagnostic de l'antigène du virus B de l'hépatite. On dépiste pour l'anti gène.B de l'hépatite 9.782 échantillons consécutifs de sangs de donneurs en utilisant une méthode de dosage direct radio-lmmunologique telle que décrite par Ling et Overby en utilisant un système anticorps homologue (cobaye-cobaye) et un système anticorps hétérologue (homme-cobaye). La méthode de dosage radio-immunologique homologue permet de détecter 65 donneurs positifs, mais 10 d'entre eux présentent des réactions positives fausses lorsque l'on effectue d'autres essais de neutralisation.Par contre, le système de dosage radio-immunologique hétérologue conforme à la présente invention permet de. détecter 63 positifs, c'est-à-dire les 55 positifs déterminés par la méthode homologue et 8 de plus, chacun d'entre eux étant bien confirmé comme positif par les méthodes de neutralisation. On a déterminé la sensibilité relative du procédé de dosage radio-immunologique selon l'invention vis-à-vis d'autres méthodes de test de l'antigène associé à l'hépatite en effectuant une évaluation à l'aveugle de sérums humains positifs à l'antigène associé à l'hépatite et d'antigènes purifiés (sous-classes ad et ay), préparés à partir de sérums positifs à l'antigène dilués en série deux fois dans du sérum humain normal, On utilise les moyennes de la dilution la plus élevée détectée comme positive par quatre laboratoires individuels de façon à comparer la sensibilité des méthodes. Dans les tableaux Il, IV et V ci-après, on indique les dilutions maximales- détectées par le système de dosage radio-immunologique hétérologue selon l'invention (DRI hétérologue); un système de dosage radio-immunologique homologue (DRI homologue), tel que décrit par Ling et Overby; un système d'essai à hémagglutination passif inversé (HAPI); l'électrophorèse par comptage (EPC); et la rhéophorèse (RHEO). Ces données montrent que le procédé de dosage radio-immunologique selon l'invention est de 250 à 1.000 fois plus sensible que le EPC et le RBEO et de 2 à 16 fois plus sensible que le système similaire homologue ou que le système d'hémagglutination passif inversé. On montre dans le tableau V ci-après la possibilité du système hétérologue radio-immunologique selon l'invention de détecter l'antigène associé à l'hépatite dans les spécimens de donneurs d'une banque de sang comparée à un système homologue similaire, par rapport à la méthode dthémagglutination passive inversée et par rapport à 1'EPC. Ces données comportent 5.344 échantillons de plasma obtenus à partir de donneurs de sang consécutifs et 13.896 sérums de donneurs de sang consécutifs obtenus à partir de quatre banques de sang. Tous les spécimens positifs à l'antigène associé à l'hépatite détectés par EPC sont également détectés par les autres méthodes. Ces données montrent que le système hétérologue radio-immunologique permet de détecter sept fois plus d'échantillons positifs à l'antigène associé à l'hépatite que le système homologue DRI, huit fois plus que la méthode d'hémagglutination passive et inversée et trente-deux fois plus que 1'EPC. Le procédé DRI hétérologue permet de détecter environ 44% en plus de spécimens positifs à l'antigène associé à l'hépatite que 1'EPC. Les essais suivants illustrent la spécificité du système de dosage radio-mmnnologique hétérologue conforme à l'invention. On détermine le pourcentage des spécimens trouvés comme réactifs selon la méthode de dépistage DRI hétérologue et le pourcentage de ces spécimens considérés comme réactifs et contenant l'antigène associé à l'hépatite selon la méthode confirmatoire en essayant 31.319 sérums au cours d'une investigation clinique effectuée dans sept banques de sang. Les résultats de ces essais sont consignés dans le tableau VII ci-après. Les données du tableau VII ci-après indiquent que la non-spécificité causée par les réactions Lnmunologiques croisée avec la méthode radio-immunologique hétérologue selon l'invention n'existe pas. Selon ces données, environ 0,1% ou 1,3Z des 1.000 échantillons constituaient un essai positif non réexécutable, étant donné qu'il y avait eu une erreur de manipulation sur le dépistage unique initial. En recommençant le test sur les échantillons positifs initialement dépistés et en effectuant par la suite une neutralisation confirmatoire, on constate que tous les échantillons positifs pouvant être à nouveau testés avaient été neutralisés avec succès, ce qui démontre qu'aucun échantillon positif faux n'a été dépisté par la méthode radio-immunologique hétérologue. On conduit les étapes d'incubation selon la présente invention à température ambiante, bien qu'un léger chauffage à environ 350C puisse etre utilisé de façon à raccourcir le temps d'incubation. Dans la mesure où il est souhaitable que le temps d'incubation soit plus court de façon à réduire le temps total pour la mise en oeuvre du procédé, on peut grandement réduire le temps d'incubation en augmentant la température de la réaction d'environ 35 à environ 550C, plus spécialement de 38 à 50"C. On préfère utiliser une température d'environ 45"C. Si l'on utilise les températures plus élevées indiquées ci-dessus, on peut effectivement réduire le temps d'incubation à environ 10 mn à 3 h, alors qu'il est nécessaire d'utiliser entre 12 et 18 h en général pour effectuer la première incubation à température ambiante.On peut conduire la deuxième incubation au cours de laquelle on met en contact l'échantillon à tester avec l'antigène ou l'anticorps marqué, durant une période plus courte que la première incubation. Il est préférable normalement d'utiliser des périodes d'incubation courtes de façon à achever rapidement la méthode de dosage. Lors du ramassage et de l'utilisation de sang humain par exemple, 2 ou 3 h de période d'incubation permettent le ramassage, l'essai et l'utilisation du sang, toutes ces opérations étant effectuées le même jour. Toutefois, il est clair que les périodes d'incubation ne sont absolument pas critiques pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Ainsi, on peut faire varier les conditions de mise en oeuvre de l'essai telles que les temps d'incubation tout en produisant des résultats satisfaisants. TABLEAU I S-DRI avec une souche S-DRI avec deux souches de l'anticorps (homologue) de l'anticorps (hétérologue) Echantillon n CCM/CNx** CCM/CNx Positifs vrais 1 18,9* 51,7* 2 20,3 43,5 3 18,9 50,8 4 9,1 14,4 5 22,3 55,1 Négatifs 1 1,0 0,9 2 0,9 0,9 3 1,0 1,0 4 1,1 0,8 5 0,8 0,8 TABLEAU I (suite 1) S-DRI avec une souche S-DRI avec deux souches de l'anticorps (homologue) de l'anticorps (hétérologue) Echantillon n CCM/CNx ** CCM/CNx Positifs faux 1 18,2 0,7 2 18,6 1,1 3 11,9 1,1 4 7,4 1,0 5 10,4 1,1 6 14,4 0,9 7 13,8 0,9 8 18,9 0,9 9 17,0 0,9 10 10,2 0,9 11 4,4 1,0 12 3,4 1,1 13 5,3 1,1 14 5,4 1,1 TABLEAU I (suite 2) S-DRI avec une souche S-DRI avec deux souches de l'anticorps (homologue) de l'anticorps (hétérologue) Echantillon n CCM/CNx ** CCM/CNx Positifs faux 15 11,9 0,9 16 6,8 0,9 17 7,5 0,9 18 10,6 1,1 * Rapports de l'échantillon au négatif plus grandsque 2,1 sont considérés comme positifs (vrais ou faux). ** CCM/CNx : nombre de coups par minute de l'échantillon divisé par le nombre de coups par TABLEAU II Echantillons positifs à l'hépatite trouvés dans 9.782 sangs de donneurs. (1) (1) Au moyen de DRI direct Au moyen de DRI direct (anticorps homologues) (anticorps hétérologues) Nombre total de (2) positifs ABHg détecté par dépistage 65 63 (3) Fositifs confirmés à l'ABHg 55 63 Positif faux 10 0 (1) DRI = dosage radio-immunologique (2) (2) ABHg = antigène B associé à l'hépatite (cobaye) (3) = confirmés par neutralisation spécifique avec un anti-ABHg humain. TABLEAU III Dilution maximale des sérums positifs pour chaque essai à l'antigène détecté associé à l'hépatite. Identification DRI DRI du sérum et sous- Hétérologue Homologue HAPI EPC RHEO classe 1 (ad) 1:65.536 1:32.768 1:16.384 1:256 1:256 2 (ad) 1:16.384 1:4.096 1:2.048 1:32 1:32 3 (ad) 1:32.768 1:8.192 1:8.192 1:128 1:128 4 (ay) 1:16.384 1:1.024 1:1.024 1:64 1:64 5 (ay) 1:4.096 1:512 1:512 1:8 1:8 6 (ay) 1:2.048 1:512 1:256 1:16 1:16 TABLEAU IV Antigène purifié associé à l'hépatite ( g/ml) (sous-classe ad) détecté par chaque essai. Hétérologgne Homologue HAPI Concentration DRI DRI (Inverse du EPC RHEO ( g/ml) (CCM/CNx) (CCM/CNx) titre) (+/0) (+/0) 5,120 - 15,3 # 128 + + 2,560 - 12,2 # 128 + + 1,280 - 14,1 # 128 0 0 0,640 103,8 11,3 # 128 0 0 0,320 79,7 13,6 # 128 0 0 0,160 49,1 15,6 64 0 0 0,080 46,1 11,3 64 0 0 0,040 23,9 6,2 32 0 0 0,020 11,3 4,2 16 0 0 0,010 7,2 3,2 0 0 0,005 3,7 1,7 0 0 0.0025 2,2 1,6 0 0 0,0013 1,7 0,9 0 0 TABLEAU V Antigène purifié associé à l'hépatite ( g/ml) (sous-classe ad) détecté par chaque essai Hétérologue Homologue HAPI Concentration DRI DRI (inverse du EPC RHEO ( g/ml) (CCM/CNx) (CCM/CNx) titre) (+/0) (+/0) 5,120 - 16,3 # 128 + + 2,560 - 14,8 # 128 + + 1,280 - 15,2 # 128 0 0 0,640 61,1 14,5 # 128 0 0 0,320 68,6 7,7 64 0 0 0,160 39,9 8,9 32 0 0 0,080 28,7 4,2 16 0 0 0,040 15,6 2,5 0 0 0,020 11,2 1,9 0 0 0.010 5,0 1,7 0 0 0.005 3,0 1,5 0 0 0.0025 2,7 1,2 0 0 0,0013 1,8 0,8 0 0 TABLEAU VI Détection par DRI hétérologue, DRI homologue, HAPI, et EPC, de l'antigène associé à l'hépatite chez des donneurs de sang consécutifs. Source Nombre DRI DRI d'échantillons d'essais Hétérologue Homologue HAPI EPC Echantillons de plasma (voloutaires et commerciaux) 5344 34(0,64%) 34(0,64%) 34(0,64%) 25(0,47%) Banque de sang 1 (volontaires) 1019 4(0,39%) 3(0,29%) 3(0,29%) 3(0,29%) Banque de sang 2 (volontaires) 1471 0 0 0 0 Banque de sang 3 (volontaires) 1017 3(0,29%) 3(0,29%) 3(0,29%) 3(0,29%) Banque de sang 4 (volontaires et commerciaux) 10,389 65(0,63%) 58(0,56%) 57(0,55%) 42(0,40%) Total 19,240 106(0,55%) 98(0,51%) 97(0,50%) 73(0,38%) TABLEAU VII Pourcentage des échantillons réactifs hétérologues confirmés comme positifs pour l'antigène associé à l'hépatite. Dépistage positif Dépistage positif pouvant Positif confirmé Dépiatage négatif être recommencé 169 (0,54%) 127 (0,41%) 127 (0,41%) 31,150 (99,46%) REVENDICATIONS 1. Procédé pour dépister la présence d'antigènes ou leurs anticorps dans un échantillon inconnu, caractérisé en ce qu'on utilise un système hétérologue desdits antigènes ou desdits anticorps et en ce qu'il comporte les étapes suivantes : (a) on met en contact ledit échantillon inconnu avec un antigène ou son anticorps fixé sur un appareil d'essai de façon à obtenir une couche dudit antigène ou de son anticorps, ledit antigène ou son anticorps étant obtenu à partir d'une première espèce d'animal; (b) on fait incuber ledit échantillon inconnu une première fois tout en étant en contact avec ladite couche; (c) on enlève ledit appareil ayant une couche dudit antigène ou son anticorps de l'échantillon inconnu;; (d) on met en contact ladite couche avec un matériau présentant un agent de marquage, ledit matériau étant choisi parmi ledit antigène ou son anticorps sous réserve que,si ladite couche est ledit antigène, ledit matériau marqué est également ledit antigène et, si ladite couche est ledit anticorps, ledit matériau marqué est également ledit anticorps, ledit antigène marqué ou son anticorps étant obtenu à partir d'une seconde espèce d'animal; (e) on fait incuber ladite couche une deuxième fois tout en étant en contact avec ledit matériau marqué; et (f) on examine ledit appareil pour détecter la présence du matériau marqué de façon à déterminer la présence dudit antigène ou de son anticorps dans l'échantillon inconnu. 2. Procédé pour déterminer la présence d'antigènes ou de leurs anticorps dans un échantillon inconnu, caractérisé en ce que l'on utilise un système hétérologue desdits antigènes ou de leurs anticorps dans une méthode de dosage direct radio-immunologique comportant les étapes suivantes:: (a) on met en contact ledit échantillon inconnu avec un antigène ou son anticorps fixé sur un appareil d'essai de façon à obtenir une couche dudit antigène ou de son anticorps, ledit antigène ou son anticorps étant obtenu à partir d'une première espèce d'animal; (b) on fait incuber ledit échantillon inconnu une première fois tout en étant en contact avec ladite couche; (c) on enlève ledit appareil ayant une couche dudit antigène ou son anticorps de l'échantillon inconnu;; (d) on aet en contact ladite couche avec un matériau marqué radio-activement choisi parmi ledit antigène ou son anticorps sous réserve que si ladite couche est ledit antigène, ledit matériau marqué radioactivement est également ledit antigène et si ladite couche est ledit anticorps, ledit matériau marqué radio-activement est également ledit anticorps, ledit antigène marqué radio-activement ou son anticorps étant obtenu à partir d'une seconde espèce d'animal; (e) on fait incuber une seconde fois ladite couche tout en étant en contact avec ledit antigène marqué radio-activement ou son anticorps; et (f) on mesure la radiation émise à partir dudit appareil de telle sorte que l'on puisse déterminer la présence dudit antigène ou de son anticorps dans l'échantillon inconnu. 3. Procédé pour déterminer la présence d'un anticorps capable d'être lié à deux antigènes associés dans un échantillon inconnu, caractérisé en ce qu'on utilise un système hétérologue dudit antigène dans une méthode de dosage radio-ittunologique comportant les étapes suivantes (a) on place ledit échantillon inconnu en contact avec un apps- reil présentant fixé sur lui un antigène dudit anticorps de façon à obtenir une couche dudit antigène, ledit antigène étant obtenu à partir d'une première espèce d'animal; (b) on fait incuber ledit échantillon inconnu une première fois tout en étant en contact avec ladite couche de façon à lier n'importe quel anticorps présent dans ledit échantillon inconnu sur ledit antigène;; (c) on lave ladite couche incubée de façon à enlever ledit échantillon inconnu et en laissant ledit anticorps lié audit antigène; (d) on met en contact ladite couche lavée avec un antigène purifié marqué avec un isotope radioactif, ledit antigène marqué ràdio-activement étant obtenu à partir d'une seconde espèce d'animal; (e) on fait incuber ladite couche lavée une seconde fois tout en étant en contact avec ledit antigène purifié marqué avec un isotope radioactif de façon à lier ledit antigène purifié audit anticorps lié audit antigène et pour produire une couche incubée marquée radio-activement; (g) on mesure la radiation élise à partir de ladite couche incubée marquée radio-activement de façon à déterminer la présence dudit anticorps dans l'échantillon inconnu. 4. Procédé pour déterminer la présence d'un antigène capable d'etre lié à deux anticorps associés dans un échantillon inconnu, caractérisé en ce qu'on utilise un système hétérologue des anticorps dans une méthode de dosage direct radio-immunologique comportant les étapes suivantes:: (a) on place ledit échantillon inconnu en contact avec un appareil ayant un anticorps dudit antigène fixé sur lui de façon à obtenir une couche dudit anticorps, ledit anticorps étant obtenu à partir d'une première espèce d'animal; (b) on laisse incuber ledit échantillon inconnu une première fois tout en étant en contact avec ladite couche de façon à lier n'importe quel antigène présent dans ledit échantillon inconnu sur ledit anticorps; (c) on lave ladite couche incubée de façon à enlever ledit échantillon inconnu et à laisser ledit antigène lié audit anticorps; (d) on met en contact ladite couche lavée avec un anticorps purifié marqué avec un isotope radioactif, l'anticorps radioactif marqué étant obtenu à partir d'une seconde espèce d'animal;; (e) on laisse incuber ledit revêtement lavé une seconde fois tout en maintenant en contact avec ledit anticorps purifié et marqué avec un isotope radioactif de façon à lier ledit anticorps purifié audit antigène relié audit anticorps et à produire une couche incubée marquée radioactivement; (f) on lave ladite couche incubée marquée radio-activement de façon à enlever n'importe quel anticorps purifié non relié; et (g) on mesure la radiation émise à partir de ladite couche incubée marquée radio-activement pour déterminer la présence dudit antigène dans l'échantillon inconnu. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit antigène et ses anticorps sont de l'antigène associé à l'hépatite et ses anticorps. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comporte en outre l'étape consistant à comparer la radiation émise à partir d'une couche incubée marquée radio-activement de l'étape (g) avec la radiation émise par un échantillon négatif préparé conformément aux étapes (a) à (g). 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'anticorps de l'étape (a) est obtenu à partir d'une source de cobaye et l'anticorps de l'étape (e) est obtenu à partir d'une source humaine. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que isotope radioactif est 1125. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'incubation de l'étape (b) est effectuée à partir d'environ 35 à environ 550C pendant un temps d'environ dix minutes à trois heures. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que lton effectue ladite incubation à une température d'environ 38 à 50 C. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'incubation est effectuée à environ 450C pendant un temps d'environ deux heures. 12. Nécessaire de diagnostic pour déterminer la présence d'antigène associé à l'hépatite dans un échantillon inconnu, caractérisé en ce qu'il comporte (a) un appareil a-yant un anticorps dudit antigène fixé sur lui de façon à obtenir une couche dudit anticorps, ledit anticorps étant obtenu à partir d'une première espèce d'animal; (b) une solution d'un anticorps dudit antigène marqué avec un isotope radioactif, ledit anticorps marqué radio-activement étant obtenu à partir d'une seconde espèce d'animal; (c) une solution d'un échantillon de contrôle négatif, non réactif vis-à-vis de l'antigène associé à l'hépatite; (d) une solution d'un échantillon de contrôle positive, positif vis-à-vis de l'antigène associé à l'hépatite; et (e) un réceptacle permettant de placer ledit appareil et lesdites solutions.