FR 2283675 A1 19760402 FR 7430232 A 19740905 La présente invention a pour objet un nouveau composé antifibrinolytique de synthèse et son procédé de fabrication, ainsi que des médicaments contenant un tel composé à titre d'agent actif antifibrinolytique. On connaRt déjà des antifibrinolytiques de synthèse, qui sont des acides aminés dans lesquels la fonction amine est en position 6 par rapport à la fonction acide, et plus particulièrement, dans cette catégorie de composés, l'acide # aminocaproIque (ABAC) H2N-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH et l'acide trans aminométhyl-4-cyclohexane carboxylique (AMCHA) Le second de ces produits, 1'AMCHA, est environ huit fois plus actif que le premier, mais sa préparation pose des problèmes du fait que seul l'isomère trans est actif, ce qui donne lieu à des difficultés, soit d'orientation de la réaction, soit de séparation des isomères cis et trans lorsqu'ils sont obtenus concurremment.L'AEAC, nettement moins actif, est également assez difficile à préparer, son obtention ndeessitant des procédures compliquées, et notamment le recours à des résines échangeuses d'ions. Le besoin s t est donc fait sentir de rechercher d'autres aminoacides capables de jouer le rôle d'antifibrinolytiques, dont la synthèse ne présenterait pas les mêmes difficultés. I1 s'est avéré cependant qu'une telle recherche était loin de constituer une chose aisée du fait que, parmi la quantité considérable d'aminoacides analogues à ceux déjà connus comme présentant les propriétés antifibrinolytiques désirées, il en existe un très grand nombre pour lesquels ces propriétés sont, sinon inexistantes, tout au moins très faibles et en tous cas tout-à-fait insuffisamment marquées pour permettre d'envisager leur utilisation à titre de médicament, cette recherche étant encore compliquée par le fait que, pour un même composé présentant plusieurs isomères, optiques ou de position, il est fréquent, comme c'est notamment le cas pour 1'AMCHA ainsi qu'il a été précisé ci-dessus, qu'un seul des isomères, en l'occurrence l'isomère trans, soit actif. I1 a maintenant été découvert que l'on pouvait utiliser pratiquement, à titre de produit antifibrinolytique, l'acide ål-cis- (diméthyl-2,2- o(-aminoéthyl-3)-cyclobutane-acétique de formule soit tel quel, soit sous forme de son chlorhydrate. L'acide dl-cis(diméthyl-2,2- &alpha; -aminoéthyl-3)-cyclobutane acétique peut être obtenu notamment par oxydation de 1' d-pinène en acide pinonique au moyen de permanganate de potassium, ia fonction cétone de l'acide dl-pinonique étant ensuite transformée en oxime qui, par réduction, conduit à la fonction amine primaire (cf. M. HARISPE et col. Bull. Soc. Chim. Fr.,1950, 660). Lors de ltoxyda- tion permanganique, on obtient l'acide dl-pinonique sous forme cis. tartir de cet acide, on obtient facilement l'oxime correspondant par réaction avec le chlorhydrate d'hydroxylamine (cf. LE VAN THOI, Ann. Chim. 1955, 10,35). La réduction de l'oxime est de préférence réalisée par voie catalytique, en utilisant comme catalyseur le nickel de Raney, dans l'alcool saturé d'ammoniac à titre de solvant. L'acide acétique dl-cis (diméthyl-2,2- &alpha; -aminoéthyl3)-cyclobutane acétique est ensuite obtenu par évaporation à sec de la solution ammoniacale résultante, reprise à l'eau du résidu et évaporation.Cependant, cet acide est très soluble dans l'eau et son obtention à l'état pur est difficile à réaliser avec un bon rendement. Par contre, par acidification de la solution aqueuse de reprise, on obtient le chlorhydrate avec un bon rendement. On constate que le procédé conforme à l'invention,qui met en oeuvre comme matière première l'acide pinonique, facilement obtenu composé à partir de l' &alpha;-pinène, comme / naturel présent dans l'essence de térébenthine, est remarquablement simple et conduit directement, sans aucune difficulté ultérieure de séparation, à un produit directement utilisable à titre d'agent actif dans une composition pharmaceutique antifibrinolytique. L'invention a également pour objet de telles compositions comprenant, à titre d'agent actif, l'acide dl-cis-(diméthyl-2,2 Oc -aminoéthyl-3)-cyclobutane acétique ou son chlorhydrate, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable. Les exemples ci-après précisent la mise-en oeuvre du procédé de fabrication du produit selon l'invention, ainsi que les résultats des essais relatifs aux propriétés pharmacologiques de ce produit. EXEMPLE 1 Préparation de l'acide dl-cis(diméthyl-2,2-&alpha;-aminoéthyl-3-)cyclobu- tane acétique. a) Préparation de l'oxime de l'acide dl-cis-pinonique Une solution de 4,5g de chlorhydrate d'hydroxylamine dans 10 ml d'eau est ajoutée à 10g d'acide dl-cis-pinonique en solution dans 25 ml d'eau. 5g de carbonate de sodium sont ensuite ajoutés sous agitation; le mélange est abandonné pendant 1 à 2 heures.Il s'est alors formé une masse visqueuse partiellement cristallisée, qui est isolée, puis solubilisée dans l'éther. La solution est séchée, dvaporée, et la substance reprise par l'alcool méthylique. Par évaporation, -il se forme 8,4g (rendement = 78%) de cristaux d'oxime, F = 1500C. b) Préparation de l'acide dl-cis-(diméthyl-2,2-&alpha;aminoéthyl-3) cyclobutane acétique. Dans un autoclave de 125 cm3 on place 2g d'oxime, 40 ml d'éthanol absolu saturé d'ammoniac par un long barbotage préalable, et 2g de nickel de Raney. Après fermeture, une pression d'hydrogène de 50kg/cm2 est établie dans l'autoclave qui est placé sur un appareil à secousses et chauffé à 800 pendant 6 h. Après refroidissement et retour à la pression normale, le nickel est éliminé du mélange réactionnel par filtration sur verre fritté. c) Préparation du chlorhydrate. La solution aqueuse est soumise à une évaporation sous pression réduite, le résidu est repris par un minimum d'eau, puis acidifié par HC1N versé goutte à goutte, pendant que commence une précipitation de cristaux blancs. Après évaporation, on recueille 1,5g de cristaux de chlorhydrate de l'aminoacide; F = 2600c (Rendement = 68%). L'analyse élémentaire a donné les résultats suivants C H N - O Cl calculés pour C10H19NO2,HCl 54,17 8,57 6,32 14,44 16,03 trouvés 53,89 8,59 6,72 14,47 15,95 d) Préparation de l'aminoacide libre. Le résidu résultant de l'évaporation à sec est dissous dans un minimum d'eau tiède, puis abandonné à une lente évaporation, après laquelle on recueille 1g de cristaux blancs de l'aminoacide libre; F = 2550C (Rendement = 45%). L'analyse élémentaire a donné les résultats suivants C H N O % calculéspour. C10H19NO2 64 > 90 10,25 7,56 17,30 trouvés 64,36 9,89 7,55 18,12 EXEMPLE 2 Détermination du pouvoir antifibrinolytique On a déterminé le pouvoir antifibrinolytique de l'acide obtenu à l'exemple 1 par la méthode de caillot radioactif, par comparaison avec 1'AEAC. Cette méthode consiste fondamentalement à former un caillot radioactif, à le placer dans une solution comportant un système d'activation de la lyse et, soit l'inhibiteur de référence soit l'inhibiteur à doser, à mesurer, dans les deux cas, la radioactivité libérée en un temps donné et à comparer les résultats. Pour sa mise en oeuvre, on a utilisé, comme système d'activation de la lyse, un culot d'euglobulines formé à partir d'une fraction du même plasma que celui qui est coagulé pour former le caillot. Ledit culot est ajouté à ce plasma avant coagulation. Le protocole expérimental est le suivant 10 Préparation du caillot Le sang employé est un mélange de sang frais provenant de cinq à huit donneurs bénévoles à qui on a prélevé 20 ml environ. Le plasma est séparé par centrifugation à 1500 tours/mn pendant 10 minutes, il est divisé en deux parties égales. a) Préparation du culot d'euglobulines (première partie du plasma). On constitue une gamme de tubes de plastique dans lesquels on place successivement 0,5 ml de plasma 9,3 ml d'eau 0,2 ml d'acide acétique à 1%. Puis on centrifuge à 40C à 6000 tours/mn pendant 15 minutes. I1 se forme un culot blanchâtre d'euglobulines, le surnageant est éliminé; l'intérieur du tube, au-dessus du culot, est séché à l'aide d'une compresse montée ou par retournement pendant plusieurs minutes. b) Préparation du plasma enrichi en fibrinogène marqué (deuxième partie du plasma). Le fibrinogène marqué à l'iode I125 est livré par le centre National de Transfusion Sanguine (Laboratoire des Radio-Isotopes). Un flacon contient 1 ml de fibrinogène qui possède une radioactivité de 100 curies; on ajoute 0,5ml de cette solution dans 30 ml de plasma. Cette nouvelle solution radioactive est agitée doucement. c) Formation du caillot. Chaque culot d'euglobulines est repris par 0,5 ml de plasma radioactif et agité doucement jusqu'à dissolutionJpuis la solution est versée dans un tube à hémolyse en verre de 5 ml. On ajoute 0,5 ml d'une solution de chlorure de calcium M/40 et on plonge jusqu'au fond une tige de verre maintenue dans l'axe du tube. Tous les tubes sont placés pendant 1 heure dans un bain marie à 370C. Au bout de ce temps la coagulation a eu lieu et le caillot est rétracté. En maintenant le tube penché et en imprimant à la tige de verre un mouvement circulaire, parallèlement à la paroi intérieur du tube, on détache le caillot qui reste solidaire de la tige de verre. d) Lavage du caillot. Chaque caillot porté par la tige de verre est introduit dans un autre tube contenant 1 ml de tampon véronal-acétate obtenu à partir de la solution-mère suivante acétate de sodium CH3COONa,3H20 9a714g diéthylbarbiturate de sodium 14,714g eau pour préparation injectable q.s. 500 ml Cette solution étant employée sous la forme ci-après solution-mère 50 ml solution de chlorure de sodium à 9/co 900 ml solution d'acide chlorhydrique O, lN 45 ml le pH étant ajusté à 7,4 + 0,05. Tous les tubes ainsi préparés sont maintenus pendant une nuit à 40C. Après cette immersion les caillots se trouvent "lavés1, de toute radioactivité n'appartenant pas au substrat solide. 2 Lyse du caillot a) Préparation des milieux de lyse. On constitue une série de tubes de plastique de 5 ml, numérotés, et dans lesquels on introduit 0,8 ml de solution tampon véronal-acétatea 0,1 ml d'une solution de streptokinase à 2000 U.I/ml de sérum physiologique, 0,1 ml - d'une solution tampon dans les tubes témoins, - d'une solution d'AEAC dans les tubes de référence, - d'une solution d'inhibiteur à doser dans les tubes de mesure. L'AEAC et les inhibiteurs à doser sont utilisés en solution à 10-1 et 10-2 mole/litre de solution tampon; compte-tenu des quantités de solution utilisées, les concentrations dans le milieu de lyse sont de 10 2 et 10 mole/litre. b) conduite de la lyse - lavage du caillot. Un caillot est immergé dans chaque tube. Tous les tubes sont maintenus au bain-marie à 37 C pendant 4 heures. On vérifie alors que la lyse des caillots dans les tubes témoins, qui ne contiennent pas d'inhibiteurs, est pratiquement totale. On réalise une série de tubes numérotés de façon identique, on introduit dans chacun d' eux - 1 ml de solution tampon - le caillot qui reste dans le tube de la première série qui porte le même numéro. Les tubes qui contiennent les caillots sont maintenus à 4 C pendant 2 heures. La solution dans laquelle ils ont été immergés est versée dans le tube de même numéro contenant le milieu où a été effectuée la lyse. La solution constituée par la réunion de ces deux phases liquides contient toute la radioactivité libérée par la lyse du caillot. Le caillot est laissé dans le tube de lavage qui ne contient plus de liquide. 3) Comptage de la radioactivité - Pourcentage de lyse Les tubes qui contiennent la phase liquide sont placés dans un appareil de mesure de rayonnement radio-actif. On note le nombre de coups par minute enregistré par l'appareil, soient RL1 RL2, $RLn, ces valeurs. Tous les tubes qui contiennent les caillots sont également placés dans l'appareil. Soient RCl , R62 , RCn les valeurs notées. Le pourcentage de lyse du caillot placédans le tube N n a pour valeur Onétablit, pour chaque série de tubes, à savoir les tubes témoins, les tubes de référence et les tubes de mesure, la moyenne des pourcentages de lyse P1, P2 .... Pn. Soient xt, xr et xd ces moyennes. Le pourcentage d'inhibition y d'un composé donné, pour lequel le pourcentage de lyse moyen est x est donné par la relation xt - x y = x 100 xt Si l'on convient de donner la valeur 100 au pouvoir antifibrinolytique de l'inhibiteur de référence (dans le présent exemple, 1'AEAC), pour lequel le pourcentage dtinhibition est yr, le pouvoir antifibrinolytique z de l'inhibiteur à doser, pour lequel le pourcentage d'inhibition est yd peut stexprimer par la relation yd z = x 100 yr On a appliqué l'essai ci-dessus défini pour la détermination du pouvoir antifibrinolytique de l'acide dl-cis(diméthyl-2,2- -&alpha;-aminoéthyl-3) cyclobutane acétique par rapport à celui de 1'AEAC. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau ci-après. On constate que l'acide faisant l'objet de l'invention a un pouvoir antifibrinolytique du même ordre que celui de 1'AEAC, et même légèrement supérieur,- tandis que pour les autres produits existantes, ce pouvoir est de très loin inférieur, sinon pratiquement inexistant. EXEMPLE 3 Essais de tolérance Divers essais de tolérance de l'acide dl-cis-(diméthyl-2,2-G aminoéthyl-3-cyclobutane acétique ont été effectués chez le rat. Le produit en solution dans l'eau a été administré, par sondage gastrique, à 8 rats pesant en moyenne 150g, pendant 15 jours, à dose quotidienne de 7,5 millimoles/kg/jour (2 ingestionsde 1 ml d'une solution aqueuse à 12,5 mg/ml), soit une dose environ 3 fois supérieure aux doses thérapeutiques maximales de l'AEAC,qui est d'activité comparable (200 à 300 mg/kg/j, soit 1,5 à 2,6 mMoles/kg/ j > . Un lot témoin de 8 rats de même poids moyen a reçu simplement de l'eau à titre de contr81e. Au bout des 15 jours d'ingestion et de 15 jours subséquents d'observation, on nta constaté, dans tous les cas, aucun symptome d'intolérance. On voit que ni pendant la période d'administration, ni pendant la période d'observation, les animaux n'ont présenté de symptome d'intolérance. En résumé, le composé conforme à l'invention, ctest-à-dire acide dl-cis-(diméthyl-2,2- t -aminoéthyl-3) cyclobutane acétique, tout en présentant une activité équivalente à celle de 1'AEAC, produit actuellement utilisé en thérapeutique à titre dtantifibri- nolytique, est considérablement plus facile à synthétiser que les antifibrinolytiques déjà connus et ne possède aucune toxicité même à des doses doubles ou triples de celles devant être normalement utilisées. On peut envisager l'emploi de l'acide en question ou de son chlorhydrate à des doses de 180 à 320 mg/kg/jour, sous forme de solution dans un liquide isotonique, par voie orale ou intraveineuse. TABLEAU I Détermination du pouvoir antifibrinolytique 1 170 rl O t)d m k & 9 k t o > z O O a a, Sk O 0 cD 7P O ;;f C1 k Od I d P 4k li d d vS o des X tés z n H$n O H tR k rlcO cX, -c rc C- E Q a3 et inhibiteurs à AEAC et autres .......... Q, d cU ~ Q O > > =P U % de lyse X d!inhibi pouvoir E C de n QX :tion . tion C figo .. 78-x l00:.z=oe7100 4 t 78 (D(D inhibiteur O 85 Q h s o n Ma Ok O 0 D - I . ..... de ré- : : : : : P > YI) O > rl O V 45 : 76 > 5 : 100 4t 0 R O O n e = dlcis(diméthyl-2, z: t : : : m o s 4t aminoéthyl-3)cyolo-: h . F : butane acétique : ........ ......... + e2 B 10 o d H H S X É O h LN O (3 1Y s E oD Cvl H a > I h t o t n h h &commat;,E h o 45 S X t 4 Q R ,1 0 4 U Us0 V g V g twS O H i BNQ REVENDICATIONS i. ; titre de médicament, l'acide dl-cis(diméthyl-2,2-&alpha;-ami- noéthyl-3)-cyclobutane acétique de formule soit tel quel, soit sous forme de son chlorhydrate. 2. Médicament antifibrinolytique caractérisé en ce qutil comprend, à titre d'agent actif, l'acide dl-cis (diméthyl-2,2-&alpha;- aminoéthyl-3)-cyclobutane acétique ou son chlorhydrate, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.