FR 2283676 A1 19760402 FR 7430233 A 19740905 La présente invention a pour objet un nouveau composé antifibrinolytique de synthèse et son procédé de fabrication, ainsi que des médicaments contenant un tel composé à titre d'agent actif antifibrinolytique. On connaît déja des antifibrinolytiques de synthèse, qui sont des acides aminés dans lesquels la fonction amine est en position 6 par rapport a la fonction acide, et plus particulièrement, dans cette catégorie de composés, l'acide # aminocap@ïque (AEAC). H2N-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH et l'acide trans aminométhyl-4-cyclohexane carboxylique (AMCHA) Le second de ces produits, 1'AMCHA, est environ huit fois plus actif que le premier, mais sa préparation pose des problèmes du fait que seul l'isomère trans est actif, ce qui donne lieu a des difficultés, soit d'orientation de la réaction, soit de séparation des isomères cis et trans lorsqu'ils sont obtenus concurremment. L'AEAC, nettement moins actif, est également assez difficile a préparer, son obtention necessitant des procédures compliquées, et notamment le recours à des résines échangeuses d'ions. Le besoin s'est donc fait sentir de rechercher d'autres amino-acides capa bles de jouer le rôle d'antifibrinolytiques dont la synthèse ne présenterait pas les mêmes difficultés. I1 stest avéré cependant qu'unie telle recherche était loin de constituer une chose aisée du fait que, parmi la quantité considérable d'amino-acides analogues a ceux déjà connus cotie présentant les propriétés antifibrisnolytiques désirées, il en existe un très grand nombre pour lesquels ces propriétés sont, sinon inexistantes, tout au moins très faibles et en tous cas tout a fait insuffisamment marquées pour permettre d'envisager leur utilisation a titre de médicament, cette recherche étant encore compliquée par le fait que, pour un même composé présentant plusieurs isomères, optiques ou de position, il est fréquent, comme c'est notamment le cas pour 1'AMCHA ainsi qu'il a été précisé ci-dessus, qu'un seul des isomères, en l'occurence l'isomère trans, soit actif. I1 a maintenant été découvert que l'on pouvait utiliser pratiquement, a titre de produit antifibrinolytique, l'acide alpha; &alpha; -amino-campholique de formule soit tel quel soit)sous forme de son chlorhydrate, ou, de préférence, de son dihydrate. L'acide&alpha;-aminocampholique est connu en lui-même et plusieurs procédés ont été décrits pour sa préparation. Toutefois, à l'occasion des recherches ayant abouti a la présente invention, un procédé nouveau, au moins dans sa phase finale, a été mis au point, ce procédé conduisant directement à ltobten- tion de l'acidea(-aminocampholique dihydraté qui, lui, constitue un produit nouveau. Ce procédé comporte de façon connue en elle-même, l'utilisation, comme matière première, du camphre que l'on transforme en isonitrosocamphre qui est à son tour transformé en nitrile de I'acide d-camphorique que l'on reduit pour aboutir au produit final désiré. Les deux premiers stades de ce procédé ont été réalisés par des moyens connus, à savoir l'action du sodium et du nitrite d'amyle, pour obtenir l'isonitrosocamphre à partir du camphre (cf. L. CLAISEN et col. Liebigs Ann. Chem. 1917 95, 65) et celle du pentachlorure de phosphore pour le passage de l'isonitrosocamphre au nitrile (cf. ODDO et col. Gazz. Chim. Ital. 1896, 26, 409 et ROPE et col. Berichte, 1907, 40 4311). Par contrepour la réduction du nitrile, alors qu'il avait été antérieurement fait usage de la technique à l'alcool sodium, il a été fait application d'une réduction catalytique dans l'ammoniaque, le catalyseur utilisé étant le nickel de Raney. On obtient ainsi directement l'acideot-aminocampholique dihydrate ou le chlorhydrate dudit acide. Le procédé conforme à l'invention pour la préparation de l'acide i-amino campholique sous forme de son dihydrate par transformation du camphre en isonitrosocamphre, puis transformation de ce dernier en nitrile de l'acideo(-campho- rique, qui est ensuite réduit, consiste fondamentalement à opérer la téduction dudit nitrile par voie catalytique en milieu ammoniacal, le catalyseur de réduction étant de préférence le nickel de Raney, sous une pression et à une tempéra- ture supérieures à la normale, après quoi on évapore à sec la solution ammoniacale résultante, on reprend le résidu à l'eau et on laisse évaporer. I1 se forme ainsi des cristaux de dihydrate de l'acidec4-aminocampholique. Si l'on désire obtenir le chlorhydrate, on ajoute de l'acide chlorhydrique à l'eau de reprise de la solution ammoniacale, le chlorhydrate qui précipite étant ensuite purifié par recristallisation dans l'eau. Toutefois, le rendement de cette opération est faible. On constate que le procédé conforme à l'invention, qui met en oeuvre comme matière première le camphre que l'on trouve en abondance sur le marché est remarquablement simple et conduit directement, sans aucune difficulté ultérieure de séparation, à un produit directement utilisable à titre d'agent actif dans une composition pharmaceutique antifibrinolytique. L'invention a également pour objet de telles compositions comprenant, a titre d'agent actif, l'acide3(-aminocampholique, son chlorhydrate, de préférence son dihydrate, et un véhicule pharmaceutique acceptable. Les exemples ci-après précisent la mise en oeuvre du procédé de fabrication conforme à l'invention, ainsi que les résultats des essais relatifs aux propriétés pharmacologiques du produit conforme à l'invention. EXEMPLE 1 Préparation du dihydrate de l'acide O(-aminocampholique a) Préparation de l'isonitrosocamphre Dans un appareillage isolé de l'atmosphère et préalablement balayé par un courant d'azoteson verse une solution de 50 g de camphre dans 250 ml d'éther anhydre qui recouvre 7,6 g de sodium en fils. Le réacteur est plongé dans un bain d'eau glacée, puis on ajoute goutte à goutte, en agitant, 38,5 g de nitrite d'amyle. La solution devient pâteuse et colorée, l'agitation est maintenue pendant le retour à température normale puis la solution est abandonnée pendant 12 heures. Apres s'être assuré qu'il ne reste pas de sodium n'ayant pas réagi, on verse par petites portions 150 mi d'eau. La solution aqueuse est plusieurs fois épuisée à l'éther ; l'éther dissous est chassé par barbotage d'un courant d'air. La solution aqueuse est alors filtrée, puis neutralisée exactement par une solution d'acide acétique au demi versée goutte à goutte ; cela entraîne la préci- pitation de 24,9 g de cristaux, F : 1250C (rendement 41 Z) constitués par un mélange des deux formes stables et instables de l'isonitrosocamphre. La précipitation commence pendant l'addition de l'acide acétique ; les premiers cristaux qui se forment (6,5 g) sont jaune vif et fondent a 1650C ; ils sont constitués par le dérivé sodé de l'isonitrosocamphre. Lors de la recristallisation la solution est acidifiée et la forme sodée est en totalité transformée en isonitrosocanphre. b) transformation de l'isonitrosocamphre en nitrile de l'acideo 10 g d'isonitrosocamphre sont placés ensolution dans 250 ml d'éther anhydre; 12 g de pentachlorure de phosphore sont ajoutés par petites portions. La solution devient pâteuse et il se produit un dégagement de gaz chlorhydrique ; lorsqu'il est terminé, on abandonne la solution pendant 4 à 5 heures, puis on refroidit énergiquement le ballon réactionnel avant d'ajouter 150 ml d'eau glacée. La phase organique est séparée par décantation puis le solvant est évaporé. La pâte résiduelle est solubilisée dans 100 ml d'ammoniaque concentrée puis filtriée. L'acidification par addition d'acide chlorhydrique concentré provoque la précipitation de 4,2 g de fins cristaux blancs F = 1450C de nitrile de l'acide i -cawphorique (rendement : 42 Z). c) Réduction du nitrile de l'acide -camphorique en acide&alpha;-aminocampholique dihydraté Dans un autoclave de 125 cm3 on place 2 g de nitrile de l'acide &alpha;-campho- rique, 40 m1 d'eau, 10 ml d'ammoniaque concentrée (d = 0,92) et 2 g de nickel de Raney. Après fermeture, on porte la pression d'hydrogène à 70 kg/cm2 et l'autoclave est placé sur un appareil à secousses et chauffé à 450C pendant 6 heures. Après refroidissement et retour à la pression normale, le nickel est éliminé du mélange réactionnel par filtration sur verre fritté. Le résidu blanc, pulvérulent, est dissous dans un minimum d'eau tiède et la solution est abandonnée à pression et température ordinaires pendant 4 à 7 jours ; on recueille alors 1,7 g de cristaux en forme de longues lamelles incolores F = 232-2340C (rendement : 85 %). L'analyse élémentaire a donné les résultats suivants C H N O % calcule pour C10H19NO2,2H20 54,26 10,40 6,34 29,00 Z trouvé 53,82 10,40 6,30 29,16 EXEMPLE 2 Préparation du chlorhydrate de l'acide &alpha; -aminocampholique On procède comme à l'exemple 1, jusques et y compris la réduction du nitrile par le nickel de Raney en solution ammoniacale. La solution aqueuse est soumise à une évaporation sous pression réduite, le résidu, débarrassé de l'ammoniac, est repris par un peu d'eau puis acidifié par une solution d'acide chlorhydrique au demi versée goutte à goutte. La nouvelle solution est filtrée pour éliminer d'éventuelles traces de nitrile non réduit ; le filtrat est abandonné à une évaporation lente, qui entraîne l'apparition de 1,6 g de cristaux blancs. Après deux recristallisations dans l'eau on recueille 0,5 g de cristaux F = 250 (décomposition) de chlorhydrate d'acide 'acideO(-aminocamphoîique. On peut constater d'après les exemples précédents que la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, est dans l'un et l'autre cas, extrêmement simple. L'acideD(-aminocampholique peut être obtenu très facilement par neutralisation du chlorhydrate selon les techniques connues. Dans les applications pratiques, on préfère utiliser le dihydrate. EXEMPLE 3 Détermination du pouvoir antifibrinolytique On a déterminé le pouvoir antifibrinolytique du dihydrate de l'acide &alpha; -aminocampholique par la méthode du caillot radioactif, par comparaison avec 1'AEAC. Cette méthode consiste fondamentalement à former un caillot radioactif, à la placer dans une solution comportant un système d'activation de la lyse et, soit l'inhibiteur de référence soit l'inhibiteur à doser, à mesurer, dans les deux cas la radioactivité ,libérée en un temps donné et à comparer les résultats. Pour sa mise en oeuvre, on a utilisé, comme cystème d'activation de la lyse un culot d'euglobulines formé à partir d'une fraction du même plasma que celui qui est coagulé pour former le caillot. Ledit culot est ajouté à ce plasma avant coagulation. Le protocole expérimental est le suivant 10 Préparation du caillot Le sang employé est un mélange de sang frais provenant de cinq à huit donneurs bénévoles à qui on a prelevé 20 ml environ. Le plasma est séparé par centrifugation à 1500 tours/min. pendant 10 minutes, il est divisé en deux parties égales. a) Préparation du culot d'euglobulines (première partie du plasma) On constitue une gamme de tubes de plastique dans lesquels on place successivement 0,5 ml de plasma 9,3 ml d'eau 0,2 ml d'acide acétique à 1% Puis on centrifuge à 40C à 6000 tours/min. pendant 15 minutes. I1 se forme un culot blanchâtre d'euglobulines, le surnageant est éliminé ; l'inte- rieur du tube, au dessus du culot, est séché à l'aide d'une compresse montée ou par retournement pendant plusieurs minutes. b) Préparation du plasma enrichi en fibrinogène marqué (deuxième partie du plasma) Le fibrinogène marqué à l'iode i125 est livré par le Centre National de Transfusion Sanguine (Laboratoires des Radio Isotopes). Un flacon contient 1 ml de fibrinogène qui possède une radioactivité de 100 P curies ; on ajoute 0,5 ml de cette solution dans 30 ml de plasma. Cette nouvelle solution radioactive est agitée doucement. c) Formation du caillot Chaque culot d'euglobulines est repris par 0,5 ml de plasma radioactif et agite doucement jusqu'à dissolution, puis la solution est versée dans un tube à hémolyse en verre de 5 ml. On ajoute 0,5 ml d'une solution de chlorure de calcium M/40 et on plonoe jusqu'au fond une tige de verre maintenue dans l'axe du tube. Tous les tubes sont placés pendant 1 heure dans un bain-marie à 370C. Au bout de ce temps la coagulation a eu lieu et le caillot est rétracté. En main- tenant le tube penché et en imprimant à la tige de verre un mouvement circulaire parallèlement à la paroi intérieure du tube, on détache le caillot qui reste solidaire de la tige de verre. d) Lavage du caillot Chaque caillot porté par la tige de verre est introduit dans un un autre tube contenant 1 ml de tampon véronal-acétate obtenu -9 partir de la solution @ère suivante : acétate de sodium CH3COONa,3H2O 9,714 g diéthylbarbiturate de sodium 14,714 g eau pour préparation injectable q.s. 500 ml Cette solution étant employée sous la forme ci-après solution mère 50 m1 solution de chlorure de sodium à 9 /@@ 900 ol solution d'acide chlorhydrique 0,1 N 45 ml l@ pH étant ajusté à 7,4 # 0,05 Tous les tubes ainsi prparés sont maintenus pendant une niit s 4 C. Après cette immersion les caillots se trouvent "lavés" de toute radioactivité n'appartenant pas au substrat solide. 20 Lyse du caillot a) Préparation des milieux de lyse On constitue une série de tubes de plastique de 5 ml, numérotes, et dans lesquels on introduit 0,8 ml de solution tampon véronal-acétate 0,1 ml d'une solution de streptokinase à 2000 U.I /ml de sérum physiolo gique 0,1 ml - d'une solution tampon dans les tubes témoins - d'une solution d'AEAC dans les tubes de référence - d'une solution d'inhibiteur à doser dans les tubes de mesure L'AEAC et les inhibiteurs à doser sont utilisés en solution à 10 et 10 - nole/litre de solution tampon ; compte tenu des quantités de solution utilisées, les concentrations dans le milieu de lyse sont de 10-2 2 et 10 3 mole/ litre. b) Conduite de la lyse - lavage du caillot Un caillot est immergé dans chaque tube. Tous les tubes sont maintenus au bain-arie i 370C pendant 4 heures. On vérifie alors que la lyse des caillots dans les tubes témoins, qui ne contiennent pas d'inhibiteurs, est pratiquement totale. On réalise une série de tubes numérotés de façon identique, on introduit dans chacun d'eux ; - 1 ml de solution tampon - le caillot qui reste dans le tube de la premiere serie qui morte le même numéro. Les tubes qui contiennent les caillots sont maintenus à 40C pendant 2 heures. La solution dans laquelle ils ont été immergés est versée dans le tube de même numéro contenant le milieu où a été effectuée la lyse. La solution constituée par la réunion de ces deux phases liquides contient toute la radioactivité libérée par la lyse du caillot. Le caillot est laissé dans le tube de lavage qui ne contient plus de liquide. 30 Comptage de la radioactivité - Pourcentage de lyse Les tubes qui contiennent la phase liquide sont placés dans un appareil de mesure de rayonnement radioactif. On note le nombre de coups par minute enregistré par l'appareil, soient RLl, RL2s RLn ces valeurs. Tous les tubes qui contiennent les caillots sont également placés dans l'appareil, Soient RC1, RC2, RCn les valeurs notées. Le pourcentage de lyse du caillot placé dans le tube No n a pour valeur RLn p n = Ln x 100 kn On établit, pour chaque série de tubes, à savoir les tubes témoins, les tubes de référence et les tubes de mesure, la moyenne des pourcentages de lyse P1, P2 P . Pn Soient Xt, xr et xd ces moyennes.Le pourcentage dtinhibition y d'un compose donné, pour lequel le pourcentage de lyse moyen est x, est donné par la relation t x y = x 100 xt si l'on convient de donner la valeur 100 au pouvoir antifibrinolytique de l'inhibiteur de référence (dans le présent exemple, 1'AEAC), pour lequel le pourcentage d'inhibition est yr, le pouvoir antifibrinolytique z de l'inhibiteur à doser, pour lequel le pourcentage d'inhibition est yd peut s'exprimer par la relation : yd z = x 100 yr On a appliqué l'essai ci-dessus défini pour la détermination du pouvoir antifibrinolytique du dihydrate de l'acide &alpha; -aminocampholique par rapport à celui de 1'AEAC. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau ci-après. T A B L E A U I Détermination du pouvoir antifibrinolytique Comparaison des "pourcentages d'inhibition" obtenus à partir de quantités identiques d'inhibiteurs AEAC et autres inhibiteurs AEAC et autres inhibiteurs à 10-2 mole/litre à 10-3 mole/litre % de lyse % d'inhibi- pouvoir an- % de lyse % d'inhibi- pouvoir an (moyenne tion tifibrino- (moyenne) tion tifibrinox litique x litique 85-x 78-x y= 100 y= 100 85 y 78 y z= 100 z= 100 76,5 46 @uoun inhibiteur 85 78 EAC, inhibiteur de féféren- 20 76,5 100 42 46 100 @@ acide&alpha; -aminocampholique dihydraté 18,7 78 102 24,5 69 150 On constate que le dihydrate de l'acide&alpha; -aminocampholique a un pouvoir antifibrinolytique du morne ordre que celui de 1'AEAC, et même légèrement supérieur. EXEMPLE 4 Essais de tolérance Divers essais de tolérance du dihydrate de l'acide-aminocamphoIique ont été effectués chez la souris et chez le rat. Les produits en solution dans l'eau ont été administrés par sondage gastrique pendant 6 et 15 jours à des doses quotidiennes 2 et 3 fois supérieures aux doses thérapeutiques maximales de 1'AEAC qui est d'activité comparable. Des lots témoins ont reçu simplement de l'eau à titre de contrôle. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau II ci-après. On voit que ni pendant la période d'administration, ni pendant la période d'observation, les animaux n'ont présenté aucun symptome d'intolérance. En résumé, le composé conforme à l'invention, ctest-à-dire l'acide&alpha; -amino- campholique, en particulier sous forme dihydraté, tout en présentant une acti vité équivalente à celle de 1'AEAC, produit actuellement utilisé en thérapeutique à titre d'antifibrinolitique, est considérablement plus facile à synthétiser que les antifibrinolytiques déjà connus et ne possède aucune toxicité même à des doses doubles ou triples de celles devant être normalement utilisées. On peut envisager l'emploi du dihydrate en question à des doses de 180 à 320 mg/kg/jours, sous forme de solution dans un liquide isotonique, par voie orale ou intraveineuse. TABLEAU II Dihydrate de l'acide &alpha;-aminocampholique lots animaux administration observation résultat durée concentra- ingestions dose tion 1 6 souris 10g 6 jours 3mg/ml 4fois 0,25 1,5 mM/ 10 jours H2O ml kg/j 2 6 souris 10g 6 jours 5mg/ml 4 fois 0,25 2,25 mM/ 10 jours H2O ml kg/j AUCUN 3 6 souris 6 jours 10mg/ml 4 fois 0,25 4,5mM/kg/ 15 jours H2O ml j 4 8 souris 10g 6 jours - - - 15 jours SYMPTOME (témoins) 5 8 rats 150g 15 jours 12,5mg/ml 2 fois lml 7,5mM/kg/ 15 jours H2O j D'INTO7 9 rats 150g 15 jours - - - 15 jours LERANCE (témoins) Remarque : la dos@ thérapeutique de l'AEAC est de 200 à 300 mg/kg/j soit 1,5 à 2,6 m mole/kg/jour -REVENDICATIONS1. Dihydrate de 1'acide &alpha;-amino-campholique, de formule: 2. Médicament antifibrinolytique,caractérisé en ce qu'il comprend, à titre d'agent actif, l'acide -aminocampholique, son chlorhydrate ou, de préférence, son dihydrate, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 3. Procédé de fabrication du dihydrate de acide A-ami- nocampholique, par transformation du camphre en isonitrosocamphre, suivie de la transformation de ce dernier en nitrile de l'acide a-camphorique, qui est ensuite soumis à une réduction,caractérisé en ce que l'on opère cette réduction catalytique en milieu ammoniacal, le catalyseur de réduction étant de préférence le nickel de Raney, sous une pression et à une température supérieure à la normale, après quoi on évapore à sec la solution ammoniacale résultante, on reprend le résidu à l'eau et on laisse évaporer pour obtenir généralement le dihydrate recherché. 4. Procédé selon la revendication 3,caractérisé en ce quetpour obtenir le chlorhydrate de l'acide a-aminOcampholiqueon ajoute de l'acide chlorhydrique à l'eau de reprise de la solution ammoniacale, le chlorhydrate qui précipite étant ensuite purifié par recristallisation dans l'eau. 5.Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que pour obtenir l'acide a-aminocampholique lui-même,on neutralise le chlorhydrate de façon connue en elle-même.