FR 2270892 A1 19751212 FR 7416598 A 19740514 La présente invention a trait à un procédé de préparation de virus modifies de vertébrés, aux virus modifiés de vertébrés obtenus selon ce procédé ainsi qu'aux préparations antigèniques et aux vaccins réalisés à partir de ces virus. La production de virus de vertébrés, destines principalement à permettre la fabrication de vaccins, s'effectue actuellement en assurant la réplication des virus sur des cellules animales par exemple sur des animaux, sur des oeufs embryonnés, ou encore sur des cultures cellulaires d'origine humaine ou animale. L'approvisionnement en telles cellules pose un problème important qui se répercute naturellement sur le prix de revient qui se trouve encore augmenté du fait que ces cultures sur cellules animales mettent souvent en jeu des techniques difficiles. En outre les virus qui sont finalement récoltes après culture sur de tels supports, soulèvent de nombreux problèmes d'utilisation et des doutes quant à leur caractère inoffensif pour les sujets vaccinés. Ces problèmes sont liés, soit à la cellule hote qui peut être porteuse dlun matériel génétique viral ou amoral auquel le vacciné est sensible, soit au virus lul-meme dont la virulence peut avoir été exacerbée par la culture, dans le cas des vaccins vivants attenués. L'invention se propose de remedier à ces inconvénients et de fournir un nouveau procédé de préparation de virus qui soit d'une mise en oeuvre facile, d'un prix de revient peulevé et qui, tout en supprimant les risques inhérents à l'utilisation de cellules animales, permettent d'obtenir de nouveaux virus à pouvoir virulent atténué ou annulé pour le receveur, tout en conservant les caractéristiques antigèniques intéressantes. L'invention a pour objet un procédé de préparation de nouveaux virus, caractérisé par le fait qu'on met en contact une suspension de virus de vertébrés avec des cellules de levures convenables dans un milieu de culture ; que l'on place ce mélange en incubation, et que l'on récolte le virus obtenu. La culture s'effectue de préférence en plusieurs sous-cultures dont le nombre est de préférence au moins égal à 5 et par exemple de l'ordre de 20 Dans un mode de mise en oeuvre préféré, on effectue la culture de virus sur des cellules végétales mono-cellulaires, par exemple du genre Saccharomyces telles que l'espèce Saccharomyces cerevisiae. A titre non limitatif, on peut également effectuer des cultures sur des cellules appartenant au genre Candida. Parmi les virus susceptibles d'être ainsi cultivés, on trouve notamment les adénovirus, le virus vaccinal, l'herpès virus,le virus du Sarcome de Rous, le poliovirus, le virus de la rage, le virus de la rougeole, les virus de la grippe, le virus de la maladie de Newcastle, les virus de l'hépatite. Le virus de départ peut avantageusement être un virus de col lection ou fraichement isolé mais en variante on peut également utiliser des virus existants déjà modifiés Le milieu de culture contenant les cellules végétales est destiné à permettre la multiplication des cellules végétales, La détermination de ce milieu est extrêmement facile pour l'homme de l'Art, tant entendu que, pour permettre la culture virale, le milieu doit présenter les caractéristiques suivantes pH compris entre 6 et 8. Température comprise entre 300C et 370C La durée d'incubation est de préférence, pour chaque sous culture, comprise entre 72 et 120 heures. Les levures infectées présentent des modifications de taille, de fermentexibilité des sucres, de la faculté d'assimilation des sucres ou de celle des nitrates. A l'examen en microscopie élec tronique elles montrent la présence de particules virales caracté ristiques. L'invention a également pour objet les virus modifiés obtenus par le procédé de preparation précité a partir de souches initiales de virus de vertebrés. Les virus selon l'invention qui sont des mutants des virus de vertébrés initiaux, se caractérisent par une atténuation considé rable du pouvoir virulent grâce à la réalisation d'une nouvelle nucléo-protéine par assemblage de l'acide nucléique viral initial avec une protéine spécifique de la cellule hâte. L'invention a également pour objet les préparations antigeni ques et les vaccins obtenus a l'aide des virus selon l'invention. La préparation d'un tel vaccin peut être effectuée en utili sant directement les cellules végétales infectées, inactivées ou non, ou bien en variante, en séparant par des procédés habituels de séparation de virus, les virus d'avec les cellules et en puri fiant les virus, par exemple par -centrifugation ou ultra-filtra tion. L' invention a notamment pour objet les vaccins contre les adénovirus, virus vaccinal, virus du Sarcome de Rous, poliovirus, herpès virus, virus de la rage, virus de la rougeole, virus grippaux, virus de la maladie de Newcastle, virus de l'hépatite. En utilisant des virus préparés selon l'invention à partir de cellules cancéreuses animales, on peut également préparer selon l'invention des vaccins contre les maladies cancéreuses. Les préparations antigèniques et les vaccins selon l'invention, sont remarquables, d'une part par leur pouvoir immunisant sur l'organisme receveur, d'autre part par leur très faible virulence dans cet organisme. Ces vaccins sont également remarquables par leur non toxicité aux doses de vaccination et l'absence d'effets secondaires, due principalement au fait que les seuls contaminants éventueliement présents sont des cellules végétales ou des débris de telles cellules. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparai tront à la lecture de la description suivante faite à titre d'exemple non limitatif. Exemple I : Préparation d'un vaccin anti-herpès simplex administrable per os. Le virus de départ utilisé est l'herpès simplex type Il. On prépare une suspension de levure dans un milieu de culture de la façon suivante - un volume de solution Eagle est additionné de 1 % de glucose, de solution HEPES 0,03 M, d'antibiotiques, de 0,5 % d'extrait frais de levure. Le pH est ajusté à 6,5. On mélange un volume de suspension virale avec un volume de suspension de levure pour avoir 100 particules virales pour une levure. On effectue une préincubation à 200C pendant deux heures, à la suite de quoi on ajoute du milieu de culture pour avoir environ 5 x 105 cellules par millilitre. On effectue une incubation à 350C en culture stationnaire pendant 72 heures Après cette incubation, on effectue le prélèvement des levures infectées que l'on soumet à un lavage en eau physiologique et on les met à nouveau en culture à la densite initiale de 5x105 cellules par millilitre. On continue de cette façon les sous-cultures en série. On constate au cours des différentes sous-cultures des modifications c-Y-=ologiques, cytochimiques, biochimiques et immunologiques Ainsi au microscope optique, on peut constater une augmentation d'environ 26 % du rayon moyen des levures infectées. On constate également après coloration une augmentation de la teneur en acides nucléiques et la présence d'inclusions. L'examen au microscope électronique met en évidence dans les levures infectées, des particules sphériques semblables au virus infectant, de 60 à 80 nm, à la limite de la paroi cellulaire. La cinétique de croissance des levures infectées est également modifiée, le temps de doublement de la population de levure étant inférieur à celui du doublement des levures non infectées. De même, le poids des levures infectées augmente. Les analyses chimiques révèlent que la quantité d'acide nucléi- que s'accroît L'existence des virus est également révélée par L'inoculation du surnageant infectant des levures sur des cultures de cellules ou des membres chlorioallantoldiennes d'oeufs embryonnés (MCA). Ces tests sont avantageusement utilisés pour déterminer la sousculture finale. Ces tests ont permis de donner les résultats suivantes 3ème sous-culture Le surnageant est traité deux minutes aux ultra-sons sur billes de verre, puis on effectue une inoculation sur MCA. Après 72 heures d'incubation les MCA présentent un oedème et des poxes caractéristiques de l'herpes. 5ème sous-culture : L'inoculation sur MCA après traitement aux ultra-sons pendant 2 minutes donne les résultats suivants Après le ler passage : RFC (Fixation du complément = O) MCA = oedème Après 2ème passage : RFC = 1/20 MCA = oedème Après le 3ème passage : RFC = 1/20 MCA = pustules et on observe un effet cytopathogène sur des cultures cellulaires Ber21. Après le 4ème passage : RFC = 1/320 MCA = pustules et l'effet cytopathogène est vérifié sur BHK2l. 15eme sous-culture : L'inoculation sur MCA d'oeufs embryonnés donne les résultats suivants ler passage : RFC = 0 MCA = négatif 2ème passage : RFC = 0 MCA = oedème 3ème passage 1/2En MCA = pustules et l'effet cytopathogène est vérifié sur cellules BHK21. 22ème sous-culture : On constate encore des résultats similaires. La 20ème sous-culture est choisie comme lot de semence. La culture suivante est destinée à la production du vaccin et est effectuée dans un fermenteur. Une fois la culture arrêtée les levures sont lavées en eau physiologique et conservees 400 jusqu! l'emploi. Le vaccin anti-herpès simplex est constitué par les levures infectées lavées. Le vaccin a été administré per os aux lapins à la dose d'environ 10g poids sec par lapin; Les lapins vaccinés ont été protégés lors d'une inoculation virulente sur la cornée de 200 DCP50. Les lapins témoins non vaccinés ont subi lors de cette inoculation une kerato-conjonctivite suivie de cécité. On a également vacciné des hamsters per os à la dose de 3g poids sec par hamster. Les hamsters vaccinés ont été soumis à une inoculation intra-cérébrale de 10 doses léthales de virus herpès simplex. Seules les hamsters vaccinés ont survécu. Exemple II : Préparation de virus vaccinal Dans un milieu de cultures identiques à l'exemple I, contenant des levures de Saccharomyces cerevisiae à la concentration de 5x 105/ml, on aJoute une suspension de virus vaccinal pour avoir environ 100 particules virales pour une levure.On effectue une pré-incubation de 30 minutes à 200C suivie d'une centrifugation et de deux lavages à la suite de quoi on effectue une resuspension dans un milieu de cultures frais suiviedlune incubation de 72 heures à 35 C. Chacune des sous-cultures suivantes s'effectue en cen trifugeant et lavant les cellules de la sous-culture précédente qui sont remises en suspension dans un milieu frais de cultures à raison de 0,2 millilitre de suspension provenant du lavage pour 10 millilitres de milieu de cultures, chaque sous-culture durant 72 heures à 350C. Des effets de modifications cytologiques, cytochimiques, biochimiques et immunologiques de la levure, analogues à l'exemple I, sont constatés. A la 14ème sous-culture : On effectue une inoculation sur MCA d'oeufs embryonnés. Le ler passage est négatif. Le 2ème passage montre un oedème et quelques pustules non caracte ristiques. Le 3ème passage montre des pustules caractéristiques et le titrage après le 4ème passage donne une concentration de 1,6 x 108 U.I. par millilitre. A la 28ème sous-culture : L'inoculation donne un oedème en résultat du 1er passage, des pustules caractéristiques après le 2ème passage et un titrage de 1 x 10 U.I par millilitre après le 3ème passage. Exemple III : Préparation du vaccin anti-leucose aviaire administrable per os. Une suspension de levures de Saccharomyces cerevisiae identique aux exemples I et II reçoit une suspension de virus de sarcome de Rous de façon a avoir 100 particules virales par cellule. Une préincubation de 30 minutes est effectuée à la suite de quoi on effectue une centrifugation suivie de deux lavages, les cellules étant alors remises en suspension dans un milieu de cultures frais pour incubation de 72 heures à 350C. Chaque sous-culture suivante est effectuée dans les mêmes conditions , 0,2 millilitre de suspension obtenue étant chaque fois remis en suspension dans 10 millilitres de milieu de cultures. Le contrôle à la 14eme sous-culture par inoculation sur MCA d'oeufs embryonnés donne les résultats suivants : Le ler passage est négatif. Après le 2ème passage on observe un léger épaississement de la MCA; Le 3ème passage montre les pustules non caractéristiques le 4ème passage permet de montrer des pustules caractéristiques et l'inoculation de culture cellulaire d'embryons de poulet montre les nombreux foyers de transformation. Après la 16ème sous-culture : le contrôle donne les résultats suivantes : ler et 2ème passage négatifs Le 3ème passage montre des pustules caractéristiques et de nombreux foyers de transformation sur les cultures cellulaires d'embryons de poulet et il en est de même pour le 4ème passage. Pour préparer le vaccin anti-leucose, on utilise comme lot de semence la 20ème sous-culture, la culture suivante destinée a la production du vaccin étant effectuée dans un fermenteur. Le vaccin obtenu a été administré per os à des poulets à la dose de 3g poids sec par poulet Les poulets vaccinés sont ensuite inoculés avec des cellules tumorales de sarcome de Rous dans l'aile. Les poulets vaccinés ont développé des tumeurs qui ont cependant guéri spontanément après 7 à 10 jours alors que les poulets non vaccinés ont développé de grosses tumeurs et n'ont pas survécu. REVENDICATIONS 1. Procedé de préparation de virus modifiés de vertebrés, caractérisé par le fait qu'on met en contact une suspension de virus de vertébrés avec des cellules de levures dans un milieu de culture, que l'on place le mélange en incubation et que l'on récolte le virus obtenu. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on effectue un nombre de sous-cultures au moins égal à 5. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que l'on utilise des cellules végétales du genre Saccharomyces. 4* Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'on utilise l'espèce Saccharomyces cerevisiae. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que la suspension de virus de vertébrés comprend des virus choisis dans le groupe formé par les adénovirus, le virus vaccinal, l'herpès virus, le virus du sarcome de nous, les poliovirus, le virus de la rage, le virus de la rougeole, les virus de la grippe, le virus de la maladie de Newcastle, et les virus de l'hépatite. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que le pH du milieu est compris entre 6 et 8, que la température est comprise entre 300 et 370C. 7. Procédé. selon la revendication 6, caractérisé par le fait que la température est de l'ordre de 350C. 8. Procédé selon l'une quelconque-des revendications 1 a 7, caractérisé par le fait que la durée de chaque sous-culture est comprise entre 72 et 120 heures. 9. Virus modifié obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10. Vaccins et préparations antigèniques, caractérisés par le fait qu'ils contiennent au moins un virus selon la revendication 9. 11. Vaccins selon la revendication 10, caractérisés par le fait qu'ils comprennent des cellules de levures infectées. 12 Vaccins selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisés par le fait qu'ils comportent un virus séparé d'avec les cellules.