FR 2270245 A1 19751205 FR 7410325 A 19740326 La présente invention concerne un procédez de préparation des isomères L, D et DL de l'acide N- pp(2,4-diamino-6-ptéridinyle| méthylène Nlo méthyle-amino| -benzoyle-glutamique répondant à la formule I, utilisés comme médicaments dans le traitement du cancer. Il est connu de préparer l'acide N-p[(2,4-diamino-6- ptéridinyle)méthylène e -éthyle-aminol benzoyle-glutamique par un procédé en une seule étape, à savoir par condensation d'un sel de la 2,4,5,6-tétra-amino-pyrimidine avec l'acide N- p (N-méthyle amino)benzoyle L-glutamique, soit avec une 1,2-di-halogéno-propio- naldéhyde, soit avec une 1,1,3-tri-halogéno-acétone. Dans ces procé- dés, la réaction est effectuée en milieu aqueux a' un pH compris entre 3 et 4. Les rendements en produits purs, dans le cas de l'utilisation de la 1,2-di-halogéno-propionaldéhyde ne sont pas indiqués dans la littérature. Nos travaux nous ont permis de montrer que ce procédé présente des inconvénients, en ce sens que la condensation simultanée des trois composés, mène avec des rendements faibles, à un produit brut caractérisé par une faible teneur en composé I. La purification de ce produit brut impose l'utilisation de méthodes très laborieuses et qui ont l'inconvénient de faire encore baisser le rendement. Par le procédé qui utilise la 1,1,3-tri-chloro-acétone, on obtient le composé I brut avec une pureté de 70 s environ et avec un rendement de 46 %, c'est-à-dire un rendement total de 32 % par rapport a' l'acide N- p-(N-méthyle-amino) benzoyle -L-glutamique (voir B.M.Berezowski et al., Him.Pharm.Jur. 2 (12), 15 (1968) ). Selon cet article, apres une précipitation fractionnée et deux chromatographies successives sur colonne, on obtient le composé I avec une pureté de 90 % et avec un rendement de 6-7 %. Par contre, selon nos observations, ce produit est composé d'un mélange d'acide N-p [(2,4-diamino-6-ptéridinyle)méthylène N10-méthyle-aniino) benzoyleglutamique (I) et d'acide N-p[(2,4-diamino-7-ptéridinyle)méthylène N10-méthyle-amino]benzoyle-glutamique, mais seul le composé I est biologiquement actif. Aucun procédé de séparation de ces deux isomères n'est mentionné dans la littérature. La présente invention propose un nouveau procédé, particulièrement intéressant, présentant l'avantage de fournir, avec de meilleurs rendements, le composé I dépourvu de l'isomère-7 biologiquement inactif. Le procédé suivant l'invention consiste à synthétiser un des isomères L-, D- ou DL- du composé I en trois étapes, à'savoir 1) préparation de la 2,4-diamino-6-hydroxyméthyle-ptéridine, selon un nouveau procédé; 2) préparation d'une 2,4-diamino-6-halogénométhyle-ptéridine, en chauffant la 2,4-diamino-6-hydroxyméthyle-ptéridine avec un agent d'halogénation adéquat, tel que le chlorure de thionyle, le trichlorure de phosphore etc, dans un milieu organique inerte, tel que le chloroforme, le chlorure de méthylène etc, en présence d'une base organique, tel que la pyridine, la triéthylamine etc, â la température d'ébullition du solvant.Il convient d'utiliser un rapport mo laire dérivé ptéridinique / agent d'halogénation de 0,2 / 1 à 1,2 / 1 et un rapport molaire dérivé ptéridinique / base organique de 1 / 1 a 10 / 1. 3) préparation de l'acide N-p,4-diamino-6-ptéridinyle) méthylène N10-méthyle-aminoj benzoyle-glutamique , par condensation de la 2,4-diamino-6-halogénométhyle-ptéridine brute avec l'acide p-(N-méthyle-amino) benzoyle-glutamique, dans un milieu aqueux tam ponté, suivie de la purification du produit brut de réaction par des méthodes connues. La réaction de condensation peut être effectuée à des tempé- ratures très variables, dont dépend la durée de la réaction. Cette durée est de quelques heures à plusieurs dizaines d'heures. Généralement on opère entre 20 et 1000C, notamment entre 45 et 750C, mais la meilleure façon de conduire la réaction consiste à augmenter graduellement la température de 200C jusqu'a' 750C dans l'espace de 50 heures En ce qui concerne le pH, on effectue la réaction en milieu aqueux acide tamponné, avantageusement à un pH compris entre 3 et 60 Par le procédé selon l'invention, on obtient le composé I avec une pureté de 95 % (déterminée par chromatographie et spectro photométrie), sans trace de l'isomère-7, avec un rendement de 10 à 15 % par rapport à l'acide N- p(N-iaéthyle-amino) benzoyle-glutamique. En ce qui concerne la synthèse de la 2,4-diamino-6-hydroxy- méthyle-ptéridine, la meilleure méthode parmi plusieurs procédés de préparation, consiste dans la condensation du chlorhydrate de la 2,4,5,6-tétra-amino-pyrimidine avec la 1,3-dihydroxy-acétone, en présence de cystéine et en utilisant l'air comme agent oxydant. L'inconvénient majeure de ce procédé est la nécessité d'utiliser une 1,3-dihy-droxy-acétone totalement dépourvue de méthyle-glyoxale, ce dernier, dans les conditions de la réaction, conduisant à la forma- tion de la 2,4-diamino-6-méthyle-ptéridine. La purification de la 1,3-dihydroxy-acétone est une opération laborieuse, qui consiste à transformer celle-ci en composé bisulfitique, à procéder å une purification intermédiaire, retransformer ledit composé E sulfitique en cétone et à purifier finalement par distillation sous un vide très poussé. Le procédé conformément à l'invention ne présente pas ces inconvénients. On obtient la 2,4-diamino-6-hydroxyméthyle-ptéridine par condensation d'un sel de la 2,4,5,6-tétra-amino-pyrimidine avec la l,3-dihydroxy-acétone sous la forme du composé bisulfitique, en milieu aqueux tamponné, en présence de certains thioalcools, tel que le chlorhydrate de cystéine, avec barbotage d'un courant continu d'air et en présence de bioxyde de sélénium qui joue le roule d'agent oxydant. Les températures réactionnelles peuvent varier dans une assez large gamme, jusqutà la température d'ébullition du solvant, mais on opère de préférence à la température ambiante. Dans ce cas, la durée de la réaction est d'environ 24 heures. Il est avantageux d'ajouter l'agent oxydant au milieu réactionnel en au moins 2 fois, la première addition se faisant au début de la réaction et la seconde quelques heures après. En ce qui concerne le pH du milieu réactionnel, on opère avantageusement en tamponnant la solution aqueuse à un pH compris entre 3 et 7,5, au moyen d'un acétate d'un métal alcalin. I1 convient aussi, d'utiliser un rapport molaire sel de la 2,4,5,6-tétra amino-pyrimidine / composé bisulfitique de la 1,3-di-hydroxy-acétone de 0,2/1 à 1/1. La présente invention est illustr par les exemples suiyants qui ne sauraisten limiter la portée. Exemple 1. a) Préparation de la 2,4-diamino-6-hydroxvméthvle- ptéridine. A une suspension de 7 6 g de sulfate de 2,4,5,6-tétraamino-pyrimidine dans 104 ml-d'eau, chauffée à 70-800C, on ajoute sous agitation 6,4 g de chlorure de baryum dihydraté, dissout dans une quantité minimum d'eau chaude. La suspension est agitée pendant 30 minutes à la même température, puis filtrée. Le précipité de sulfate de baryum est lavé deux fois avec 26 ml d'eau à 700C et le filtrat qui contient le chlorhydrate de la 2,4,5,6-tétra-amino-pyrimidine est dilué avec de l'eau, jusqu'S un volume final de 400 ml. Dans un tricol à réaction, de 2 1, muni d'un agitateur et d'un système de barbotage, on introduit une solution de 128 g d'acétate de sodium dans 390 il d'eau. On dissout dans cette solution, à la température ambiante, 19,6 g de composé bisulfitique de la 1,3dihydroxy-acétone (dépourvue de méthyle-glyoxale) et 4,6 g de chlorhydrate de cystéine. On ajoute à cette solution, sous agitation énergique et barbotage d'air, les 400 ml de solution du chlorhydrate de la 2,4,5,6-tétra-m4no-pyrisidine obtenue plus haut. Immédiatement après, on ajoute une solution de 8 g de bioxyde de sélénium dissout dans le minimum d'eau. On continue l'agitation et le barbotage d'air et après 4 heures on ajoute une nouvelle portion de solution aqueuse de 8 g de bioxyde de sélénium. On maintient le mélange réactionnel å la température ambiante- encore 20 heures. On refroidit la solution jusqu'à 1-40C en l'espace d'une heure. Le précipité formé est filtré, essoré, lavé avec des petites portions d'alcool éthylique refroidi, d'un mélange alcool éthylique éther éthylique (1/1) et d'éther éthylique, de nouveau bien essoré et séché sous vide à 500C pendant 24 heures. On obtient 3,8 g de 2,4-diamino-6-hydroxy-méthyle-ptéridine, ce qui correspond A un ren dement de 72 % par rapport au sel de la tétra-amino-pyrimidine. b) Préparation de la 2,4-diamino-6-chloromethyle- ptéridine Dans un ballon à réaction muni d'un agitateur et d'un réfrigérent reflux, on introduit 175 ml de chloroforme anhydre, 7 g de 2,4-diamino-6-hydroxyméthyle-ptéridine séché et finement broyée, 2,1 mi de pyridine anhydre et 14 ml de chlorure de thionyle. Sous forte agitation, on porte la température du mélange au reflux et on maintient le reflux pendant une heure. On refroidit jusqu'à la température ambiante, on filtre le produit brut, on le lave avec une petite quantité de chloroforme anhydre et on le sèche à l'air sur le filtre. On obtient 8,4 g de produit chloré brut. c) Préparation de l'acide N- pp(2,4-diamlno-ó- ptéridinyle) méthylène N10 -méthyle- aminoi benzoyle -L~glutamique. Dans un ballon à réaction de 500 ml, muni d'un agitateur, d'un réfrigérent à reflux et d'un entonnoir à robinet, on prépare une solution de 20 g d'acétate de sodium dans 250 ml d'eau. On ajuste le pH de la solution a' 4, au moyen d'acide chlorhydrique N. Dans cette solution, on dissout 2,8 g d'acide N-p (N-méthyle-amino)benzoyle -L- glutamique. On ajoute goutte à goutte, sous forte agitation, en 11 espace d'une heure, une solution de 2 g de 2,4-diamino-6-chlorométhyle-ptéridine dans 15 ml d'acide formique concentré. On maintient le pH de la solution à 4, au moyen de petites quantités d'une solution normale d'hydroxyde de sodium. On continue la réaction à 450C pendant 40 heures, à 550C pendant 2 heures, à 650C pendant 2 heures et finalement à 750C pendant une heure. On sépare par filtration le solide ainsi obtenu et on le dissout dans 150 ml de solution de carbonate de sodium de pH 11-12. On porte la température de la solution à 600C et on ajuste à nouveau le pH à 12 au moyen du carbonate de sodium. La solution est filtrée, On ajuste le pH à 7, au moyen de HCl N et on laisse au repos pendant 24 heures à 40C. Dans la solution on introduit du charbon actif, on agite pendant 15 minutes et on filtre. On ajuste le pH du filtrat à 3-4 au moyen de HCl N et oh laisse au repos à 40C pendant la nuit. Le précipité est séparé par filtration, lavé avec 10 ml d'eau froide et avec 10 ml d'alcool éthylique refroidi. Le précipité bien essoré, est séché sous vide à 504C pendant 24 heures. On obtient 1,3 g de produit brut contenant environ 60 % d'acide N- p 0(2,4-diamino- 6-ptéridinyle)méthylène N10 -méthyle-amino]benzoyle-L-glutamique -(déterminé par chromatographie et spectrophotométrie). La purification de ce produit brut, effectuée par des méthodes décrites dans la littérature, conduit & un rendement globale de 10-15 % en acide N- p 62,4-diamino-6-ptéridinyle) méthylene NO méthyle-amino]benzoyle-L-glutamique avec une pureté supérieure à 95%. Exemple 2. On opère comme dans l'exemple 1, mais en utilisant dans la troisième étape (c), l'acide N- p(N-méthyle-amino)benzoyle-D-glutamique, les autres conditions opératoires restant inchangées. On obtient l'acide N-p-(2,4-diamino-6-ptéridinyle) méthylène N10 -méthyle amino3benzoyle-D-glutamique. Exemple 3. On opère comme dans l'exemple 1, mais en utilisant dans la troisième étape (c), l'acide N- p (N-méthyle-amino)benzoyle-DL glutamique, les autres conditions restant inchangées. On obtient 1' acide N- p[(2,4-diamino-6-ptéridinyle)méthylène N10 -méthyle-amino] benzoyle-DL-glutamique. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de l'acide N- p[(2,4-diamino-6- ptéridinyle) méthylène N10 -méthyle-amino] benzoyle-L-glutamique répondant à la formule I caractérisé en ce que la synthèse est réalisé en trois étapes, et qui consiste à traiter le composé de départ à savoir un sel de la 2,4,5,6-tétra-amino-pyrimidine avec de la 1,3-di-hydroxy-acétone sous forme de composé bisulfitique en présence d'un agent oxydant en solution aqueuse, puis à traiter la 2,4-diamino-6-hydroxyméthyle-ptéridi- ne ainsi obtenue avec un agent d'halogénation en présence d'une base organique dans un milieu organique inerte, et finalement à condenser la 2,4-diamino-6-halogénométhyle-ptéridine ainsi obtenue avec l'acide N- p (N-méthyle-amino) benzoyle-L-glutamique en milieu aqueux tamponné au moyen d'un acétate de métal alcalin, le produit brut de la réaction étant ensuite séparé par filtration et purifié par des méthodes décrites dans la littérature. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est appliqué à la préparation de l'acide N- p tt2,4-diaino-6-ptéridi- nyle) méthylène N10 -méthyle-amino] benzoyle-D-glutamique. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est appliqué à la préparation de l'acide N- p t(2,4-diomino-6-ptéridi- nyle) méthylène N10 -mêthyle-amino benzoyle-DL-glutamique. 4. Procédé selon ltune quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise comme agent oxydant le bioxyde de sélénium accompagné d'un barbotage d'air dans le milieu réactionnel 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on conduit la réaction entre le sel de la 2,4,5X6-tétra-amino-pyrimidine et le composé bisulfitique de la 1,3dihydroxy-acétone à des températures comprises entre environ 200C et 100 C. 6. Procédé selon l rune quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le pH du milieu réactionnel, pendant la réaction entre le sel de la 2s4,5s6-tétra-amino-pyrimidine et le composé bisulfitique de la 1,3-dihydroxy-acétone, est compris entre 3 et 7,5. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le rapport molaire entre le sel de la 2,4,5,6tétra-amino-pyrimidine et le composé bisulfitique de la 1,3-dihydroxyacétone est de 0,2/1 à 1/1. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que dans la seconde étape du procédé, on utilise comme agent d'halogénation, le chlorure de thionyle ou le trichlorure de phosphore. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que dans l'étape d'halogénation, on utilise comme base organique, la pyridine ou la tri-éthylamine. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la réaction d'halogénation est effectué au sein d'un solvant organique inerte, plus particulièrement dans du chloroforme ou du chlorure de méthylène. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la réaction d'halogénation est effectuée à la température d'ébullition du solvant. 12 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise un rapport molaire entre le dérivé ptéridinique et l'agent d'halogénation de 0,2/1 à 1,2/1 et un rapport molaire entre le dérivé ptéridinique et la base organique de 1/1 à 10/1. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la réaction finale de condensation est effectuée en milieu aqueux tamponné à un pH compris entre 3 et 6. -14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on conduit la réaction finale de condensation à des températures augmentant graduellement pendant la réaction de 200C à 1000C en l'espace de 50 heures.