FR 2287238 A1 19760507 FR 7434368 A 19741011 La présente invention concerne de nouveaux agents de vaccination contre la brucellose animale ou humaine, et les vaccins contenant ces agents. Sous ses différentes formes (B.abortus, B.melitensis, B.suis, etc.), la brucellose atteint bovins, ovins, porcins, caprins, et même l'homme par l'intermédiaire des animaux contaminés. Cette infection ne fait l'objet d'une vaccination préventive systématique que dans quelques pays et, pour cette raison, le risque d'épidémie est toujours présent. Pour lutter la brucellose, on dispose à l'heure actuelle de différents vaccins qui prevent se classer en trois catégories: - des vaccins constitués d'une souche bactérienne vivante, par exemple la souche b.19 (NCTC n 8038), - des vaccins constitués de bactéries en phase lisse (S), tuées, provenant par exemple de la souche 16M (NCTC n 10094), - tes vaccins constitués de bactéries en phase rugueuse (R), provenant par exemple de la souche 45-20 (Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Grande-Bretagne). Il est bien connu que la distinction entre bactéries en phase liasse S ou rugueuse R tient à l'apparence des colonies des bactéries. Les bactéries er: phase rugueuse sont obtenues par mutation partir des bactéries en physe lisse par des cultures en surie au laboratoire. Les indications 3 et R correspondent aux termes anglais "smooth" et "rough". Les bactéries en phase S sont recouvertes d'une couche de lipopolysaccharides. Ces vaccins présentent certains inconvénients. tes vaccins des deux premiers types mentionnés ci-dessus induisent, chez l'animal ou chez le patient, la synthèse d'anticorps de même nature que ceux qu'induisent l'infection elle-même. Ces anticorps sont générateurs de réactions plus ou moins violentes 'hypersensibilité qui peut 8tre la cause de graves accidents. Dan ces conditions, des vaccinations périodiques de rappel, effectuées de façon systématique, requièrent des analyses préalables dont les coûts viennent s'ajouter à ceux de la vaccination proprement dite. Par ailleurs, les animaux traites par ces vaccins présentent pendant un temps plus ou moins long des réponses positives aux réactions sérologiques classiques utilisées pour le diagnostic. Il n'est donc pas possible, par ces méthodes, de distinguer un animal vacciné d'un animal infecté. Ce problème prend toute son importance quand on sait que la prophylaxie officielle réglememtaire impose, en cas d'épidémie, l'abattage ou la mi.se hors commerce des animaux infectés. les vaccins du troisième type, préparés à partir de bactéries en phase R, tuées, ne présentent pas les inconvénients indiqués précédemment, ou du moins ces incoeivénients sont-ils ramenés à un niveau tel qu'ils peuvent être négligés. Malheureusement, ces vaccins ne produisent qu'un effet immunisant très insuffisant. la présente invention a pour but de fournir de nouveaux vaccins qui, tout en étant,sensiblement aussi actifs que les meilleurs vaccins connus, n'entraînent pratiquement pas de réaction dthyper- sensibilité lorsqu'ils sont administrés à l'homme ou à l'animal, et n'induisent practiquement pas de réponse positive lors de la mise en oeuvre des réactions sérologiques classiques de diagnostic sous des doses autorisant une protection efficace. les agents immunisants selon l'invention sont constitués par des enveloppes cellulaires de Brucella, vidées de leur contenu cytoplasmique, et sensibleraent exempts de protéines libres, de lipides libres et d'acides nucléiques, ou par des fragments de ces enveloppes, ou parois, de ces bactéries. Ces enveloppes ou ça-rois sont obtenues à partir de cultures de Brucella, notamment dans les conditions suivantes. Les bactéries de culture de Brucella sont d'abord soumises à des traitements mécani- Ces de rupture de leurs parois, ou de broyage Ces enveloppes ou parois sont ensuite traitées avec des enzymes permettant la destruo- tion des acides nucléiques (désoxyribonucléase, ribonucléase, etc.). Ces enveloppes ou parois sont également traitées avec des agents permettant l'élimination des protéines et lipides libres faisant normalement partie des parois de Brucella, notamment par traitement avec une solution aqueuse bouillante de dodécylsulfate. Dans le cas des bactéries du type S, on peut également, si besoin, soumettre les enveloppes ou parois à des traitements permettant l'élimination des lipopolysaccharides externes; par exemple par lavage à chaud avec de l'eau additionnée d'un produit tensioactif. les résidus des enveloppes et parois bactériennes ainsi rácu- pérée paraissent essentiellement constitués, comme le montrent les résultate des analyses chimiques, de composés présentant une structure de peptidoglycanes- sur lesquels sont liés de façon cova- lente des polysaccharides. Il va de soi que a portée de l'invention n'est pas liée à la détermination précise de la structure de ces parois bactériennes. tes bactéries, dont les parois peuvent être utilisées pour préparer les vaccins selon l'invention, peuvent appartenir aux différents types B.abortus, BOmelitensis, B.suis,B.ovis. Les vaccins préparés à partir d'un type de souche doivent encore, de préférence, protéger de façon non spécifique contre les bactéries d'un autre type. Il est particulièrement important que le vaccin retenu protège simultanément contre le BOabortus et le B.melitensis qui sont la cause de la majorité des cas de brucellose. Des souches préférées pour la préparation des vaccins selon l'invention sont B.abortus - B.19, National Animal Disease Laboratory, Ames, Iowa (U.S.A0) NCTC n 8038 - 99 S, Central Veterinary Laboratory, Weybridge (Grande-Bretagne); - 2308, Bureau of Animal Industry, Beltsville (U.S.A.) (Diaz et Ca, J. Bact. 1968, 95, 618) ; - 45-20, Central Veterinary Laboratory, Weybridge (Grande-Bretagne); B.meiitensis - 53 H 38, souche isolée par R.M. Castaneda, Mexico, n 6148, déte nue par le Laboratoire des Brucelloses, Institut de Biologie, Montpellier (France) - 57 n 38 R, mutant R obtenu au iaboratoire ; - 115 R, Bureau of Animal Industry, Beltsville (U.S.A.) (Diaz et Co., J.Bact. 1968, 95,618) ; - 16 M, NCTC n 10094 ; B.suis 1350, NCTC n 10316 B.ovis, souche isolée en France et identifiée au laboratoire (n du labo : PA-38). l'invention concerne également les vaccins et les compositions de vaccins contenant les agents immunisants décrits ci-dessus. De telles compositions contiennent de façon préférée, en plus de l'agent immunisant, des adjuvants tels que les adjuvants huileux. Des adjuvants huileux préférés sont constitués de dilaurate-de sorbitan, d'un mélange de dilaurate de sorbitan et d'étende polyéthylène glycol, d'huile de paraffine, tels que ceux connus sous les noms commerciaux respectifs de Arlacel A5, Tween 20.33 et Bayol F QS 100 ml. Ces adjuvants ont été décrits en particulier par C.L.J. Colas et al. (J. Pharmacol. 20, supplO 1968, p. 265-315). les divers constituants du vaccin sont avantageusement mis en suspension ou en émulsion dans de l'eau. Les vaccins selon l'invention sont administrables par injection. Les doses utilisées varient, bien entendu, suivant les traitements. De façon générale, celles-ci doivent être aussi faibles que possible. La dose d'agent immunisant peut varier de 10 à 1000 /ug suivant les animaux traités, avec des valeurs préférées de l'ordre de 100/ug pour les ovins, et de 200/ug pour les bovins. D'autres caractéristiques de l'invention apparattront encore au cours de la description d'un exemple de préparation des agents immunisants conformes à l'invention, et de l'étude des propriétés de ces agents par comparaison avec les propriétés des vaccins antérieurs. PréDaration des agents immunisants Des bactéries B.abortus 99 S et B.melitensis 16 MS sont cultivées en fermenteur pendant 24 à 32 heures à 37 C. les bactéries sont tuées, récoltées par centrifuation et lavées une fois à l'eau distillée stérile à 40C. les bactéries sont ensuite placées dans un broyeur à billes de verre (diamètre des billes 0,17 à 0,18 mm). Les celles broyées sont traitées à la désoxyribonucléase et ribonucléase. On élimine ainsi les acides nucléiques. On sépare et on récupère les parois cellulaires par centrifugation (1 heure à-10000 g et à 40C), les parois récupérées sont mises en suspension dans l'eau à raison de 10 ml pour 10 g de parois. La suspension est versée goutte à goutte dans 60 mi d'une solution aqueuse bouillante de dodécylsulfate à 4 r. On laisse refroidir et on maintient la suspension en agitant pendant 12 heures. Les résidus de parois cellulaires sont séparés et récupérés par centrifugation à 10500O g pendant 30 minutes.On lave le produit à l'eau. Dans les études qui suivent, le produit obtenu par la méthode décrite ci-dessus, à partir de B.melitensis 14 NS et qui représente 4 ç en poids des bactéries initiales, est dénommé fraction 7. De même, le produit obtenu à partir de B.abortus 99 S, qui représente 3 c en poids des bactéries initiales, est dénommé fraction 8. Effet immunisant des agents selon l'invention L'efficacité des vaccins constitués à partir des fractions 7 et 8 a été comparée à celle des vaccins usuels contenant des bactéries entières. les vaccins de comparaison étaient ceux corresoon- dant aux souches B.19, H 38 (du commerce), H 38 (vaccin à base de bactéries entières préparé au laboratoire), 45-20 et B.115 R. On a également comparé les vaccins selon l'invention à l'extreit de Brucella nommé ci-après fraction 4. Cet extrait est-obtenu à partir de B.melitensis 16 M, par la méthode de Westphal modifiée par Redfearn (Ph. D.Thesis, 1960, University of Wisconsin). Selon ces auteurs, on effectues l'extraction au moyen d'un mélange eauphénol. La fraction ainsi récupérée est constituée par des lipopolysaccharides. Les essais comparatifs ont été conduits sur des souris CD 1 d'un poids de 20 à 22 g. Les souris ont été vaccinées par injection sous-cutanée. Un sois après la vaccination, les souris ont été inoculées par voie intrapéritonéale avec 2.105 Brucella abortus de souche 544 (ATCC n 15804 et NCTC n 10093). Quinze jours après l'inoculation, on a dénombré les Brucella dans la rate des souris. On a mentré, par ailleurs, que cette mesure traduit de faç cohérante l'efficacité du vaccin. Chaque essai a été effectué sur un lot de six souris ; les rézultants indiqués ci-après correspondent à la moyenne des valeurs pour chaque lot. Pour constituer des témoine, on a injecté, à trois groupes de huit sourie, une dispersion d'un adjuvant paraffinique dans de l'eau. En ce qui concerne les fractions 4, 7et 8, elles ont été ad ministrées dans une émulsion constituée à partir d'un adjuvant paraffinique et d'enu, à raison d'un volume d'adjuvant par volume de fraction ; le volume total injecté a été de 0,2 ml. Le tableau donne, pour les différents essais, le logarithme de la valeur moyenne du nombre de Brucella par rate de souris en fonction de la dose de vaccin. Les doses sont données en nombre de Brucella ou en équivalent de Brucella entrant dans la composition du vaccin (dose d'extrait obtenu à partir du nombre correspondant de Brucella). On a indiqué entre parenthèses les poids correspondant aux doses exprimées en équivalent de Brucella pour la frac- tion 8. Tableau 1 Dose de vaccin Témoin en nombre Vaccins Fractions de Brucella H38 H38 ou équivalent B.19 (L) (C) 45-20 B115R 4 7 8 106 1.11 5,45 107 1,94 # # 108(0,34/ug) 2,15 2,96 2,50 5,71 4,26!4,68 4,64 3,14 5,86 10#(3,4/ug) 1,69 2,52 3,06 3,53 3,91 3,97 3,56 2,84 1010(3,4/ug) 2,41 2,68 3,50 3,50 3,96 3,14 2,86 5,95 1011(3,4/ug) 2,68 2,78 3,97 2,91 2,77 2,64 Dans le tableau ci-dessus, ilapparait que le vaccin le plus efficace est le B.19. Ce vaccin ne satiseit cependant pas aux conditions fixées par l'invention, car il induit une production importante d'anticorps. tes vaccins 45-20 et B 115 R, correspondant à des souches ru gueuses, sont peu efficaces. Les fractions 7 et 8, constituant les vaccins selon l'invention, donnent une protection comparable à celle que l'on obtient avec les vaccins traditionnels constitues de bactéries S entières et tuées. La fraction 4 confère une protection faible. De façon surpre nantie, on a constaté que l'association des fractions 4 et 8, oui présentent chacune un effet immunisant, ne produit pas une améliorationde la protection par rapport à celle que l'on obtient avec la fraction 8 seule. C'est ce qu'indique le tableau suivant, dans lequel sont donnés les résultats d'essais conduits comme prácédemment sur des lots de souris vaccinées avec différentes doses de fraction 8 seule, ou en association avec 20/ug de la fraction 4. Les résultats sont indiqués en log du nombre moyen de Brucella dans la rate Tableau 2 Fraction 8 Fraction 4 dose en/ug 0 20/ug 34 2,25 1,80 3,4 1,82 2,35 0,34 3,30 3,06 0 4,16 3,10 tes fractions 7 et 8, constituant les vaccins selon l'inven- tion, sont efficaces même à de faibles doses. Pour le cas des souris, une dose de 0,34/ug (soit 108 équivalent-bactérie) est suffisante, comme le montre le tableau 1. La mise en oeuvre de méthodes classiques de séro-agglutination et de fixation du complément, et d'essais, également classiques, de mise en évidence de réaction d'hypersensibilité immédiate et retardée ont permis de montrer que les fractions 7 et 8 n'induisent sensiblement aucune réaction sérologique positive et ne provoquent pratiquement pas d'hypersenaibilité immédiate ou retardée. IntersPécificité de la protection On a déjà signalé l'importance, pour un vaccin, de protéger simultanément contre les B.abortus et B.melitensis. Comme on l'a montré précédemment, le vaccin peut être fabriqué à partir d'une souche de l'une ou l'autre espèce (ou d'un mélange des deux). Il était en conséquence important de vérifier l'inter- spécificité de la protection, c'est-à dire si un vaccin fabriqué à partir de Bmelitensis protégeait contre B.melitensis et B.abortus ou seulement contre le premier ; de la même manière, si un vaccin fait à partir de B.abortus protégeait contre 3.abortus et B.meli- tensis. Dans les essais précédents, les fractions 7 (souche 16 M, B.melitensis) et 8 (99 S, B.abortus) protégeaient contre la souche 544 (B.abortus). On a donc éprouvé la protection résultant de la vaccination de la souris par la fraction 8 (13.abortus) contre l'infection due à B.melitensis (souche H 38)o L'expérience a porté sur quatorze souris, dont sept témoins et sept vaccinées à la dose de 34/ug de fraction 8 (dose équivalentbactérie de 1010). les autres conditions sont inchangées. Ces essais font apparattre les résultats suivants (moyennes des log du nombre de Brucella dans les rates des souris) : - témoin 6,47 - vacciné 4,53. Un vaccin conforme à l'invention et préparé à partir d'une souche d'un des deux groupes, abortus et melitensis, protège donc contre les infections causées par les bactéries des deux groupes. Durée de l'immunité Une autre caractéristique importante des vaccins est la durée de la protection qu'ils confèrent. Pour cette raison, on a effectué une série d'essais pour déterminer l'efficacité de la protection quatre mois après la vaccination. Des lots de six souris ont eté vaccinées avec des doses de 0,34 et 3,4 g (108 et 109 équivalent-bactérie) de fraction 8. Les souris témoins recevaient une dose ne contenant que l'adjuvant. Un mois et quatre mois après la vaccination, les souris étaient inoculées avec la souche. 544 comme précédemment. Les résultats suivants indiquent le log du nombre moyen de Brucella par rate : un mois quatre mois témoin 5,57 5,46 vacciné 0,34 g 3,3 2,64 vacciné 3,41ug 2,8 2,41 On constate que, quatre mois après la vaccination, l'immunité obtenue se maintient à son niveau primitif. Dans le cas des souris, ce résultant montre la bonne permanence de l'immunité. Protection obtenue sur le cobaye les essais suivants ont été effectués pour confirmer les. re- sultats obtenus sur les souris. Par ailleurs, l'expérimentation sur le cobaye des vaccins arltibrucel]iques-sert de référence, dans de nombreux pays, pour déterminer l'efficacité des vaccins az-tibrucel- liques. Le modèle expérimental du Codex anglais est le plus usuel. C'est ce modèle qui a été retenu pour les essais. On a cependant utilisé une dose d'inoculation dix fois plus élevée que celle du Codex, et chaque dose a été essayée sur six cobayes au lieu de qua tre Drois vaccins ont été étudiés - le vaccin Il 38, comme référence, - le vaccin contenant la fraction 7 (16 M, 3.melitensis) - la fraction 4. Ces vaccins ont été utilisés à trois doses, i08, 19 et 1010 en équivalent-bactérie. L'inoculation a en lieu quarante jours après la vaccination, par voie intramusculaire, avec la souche B.abortus 544, à la dose de 4,4.104 bactéries. les cobayes sont. autopsiés trente-cinq jours après l'inocula- tion.. On a compté les Brucella dans la rate et les ganglions suivants : axillaires, préoruraux. cervicaux, mésentériques et iliaques. les résultats pour la rate sont donnés en moyenne du log du nombre de Brucella ; pour les ganglions, en-moyenne d'un index allant de 1 à 5 et correspondant à une réduction en classes sur une échelle logarithmique (1 = 1 à 5, 2 = 5 à 25-, 3 = 26 à 125, etc.). Ces résultats sont les suivants Doses Vaccin E 38 Fraction 7 Fraction 4 Témoins 108 rate 3,06 4,18 5,82 6,09 Ganglions 2,3 2,5 4,0 4,5 Rate 3,57 4,17 5,76 Ganglions 1,6 2,8 3,9 1010 Rate 5,04 ),83 5,92 ganglions 3,3 2,8 4,4 Ils montrent que 10) la fraction 4 ne confère aucune protection au cobaye, contrai remet à la souris 20) la fraction 7 confère une protection analoque à celle du vaccin référence, compte tenu des fluctuations dépendant de la dose de vaccin administrée En conclusion de ces essais, la présente invention propose des vaccins qui, d'une part, présentent un effet immunisant aussi bon ue. ceux Que i'on obtient ;-vec un vaccin traditionnel, tant pour l'efficacité, le dur:'e et l' 'interspécificité, mais en plus ils n'induisent pas de réactions sérologiques ou d'hypersensibilité. La vaccination des animaux avec de tels vaccins n'empêche plus la détection efficace des infections, dont pourraient être porteurs certains animaux, par les réactions sérologiques classiques. ta vaccination elle-mène eft dans danger, de sorte que l'on peut; sans difficulté procéder à des campagnes de vaccination périodiques, par exemple annuelles, en l'absence de toute nécessité de vérifier au préalable la présence ou non d'anticorps induits par des vaccinations ou infections préalables dans l'organisme des animaux à vacciner, à l'aide de techniques sérologiques ou de numéra- tions bactériennes classiques. Comne il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus~spécialement envisagés ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. RENDI CATI ONS 1 - Vaccin antibrucellique, caractérisé en ce qu'il est constitué par des enveloppes ou parois de bactéries du type Brucella, sensiblement exemptes de leur contenu cytoplasmique. 2 - Vaccin selon la revendieation 1, caractérisé en ce que les parois de Brucella sont dépourvues ou débarrassées de leur envelop- pe externe de lipopolysaccharides. 3 - Vaccin antibrucellique, caractérisé en ce qu'il est constitué de peptidoglyeanes sur lesquels sont liés de façon covalente des polysaccharides. 4 - Vaccin antibrucellique selon la revendication 1, caractérisé en ce que les parois des bactéries du type Brucella sont obte nues par un traitement comprenant le broyage des cellules, un lavage enzymatique pour la destruction des acides nucléiques, un lavage pour l'élimination des protéines et des lipides libres entrant dans la constitution des parois. 5 - Vaccin selon la revendication 4, caractérisé en ce que le lavage enzymatique est effectué à l'aide de désoxyribonucléase ou de ribonucléase, et que la délipidation-déprotéinisation est faite par lavage avec une solution bouillante de dodécylsulfate de sodium. 6 - Vaccin selon l'une a,uelconque des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que, lorsqu'on utilise une souche de Brucella du type S, on effectue en outre un lavage à chaud à l'aide d'eau additionnée d'un agent tensio-actif permettant l'élimination des lipopolysaccharides. 7 - Vaccin selon l'une quelconque des revendications 2 ou 6, caractérisé en ce que les parois des Drucella proviennent des bactérias de souche Brucella abortus 99 S. 8 - Vaccin selon l'une quelconque des revendications 2 ou 6, caractérisé en ce que les parois des Brucella proviennent des bactéries de souche Brucella melitensis 16 N. 9 - Vaccin dosé de façon à permettre l'administration de doses comprises entre 10 et 1000 /ug de peptldoglycanes-polysaccharides de Brucella. selon l'une quelconque des revendications 7 à 6. 10 - Composition de vaccin selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un adjuvant du type huileux. Il - Composition de vaccin selon la revendication 10, caracté-- riséeen ce que le-s peptidoglycanes-polysaccharides bactériens sont en suspension dans de liteaux 12 - Composition de vaccin selon la revendication 10, caractérisée en ce que l'adjuvant huileux estxsous forme d'émulsion aqueuse.