FR 2272684 A1 19751226 FR 7500325 A 19750107 La présente invention concerne un nouveau procédé de fabrication d'une composition pharmaceutique, constituée par un antibiotique et un acide gras insaturé qui accroît considérablement l'action bacteriidede l'antibiotique, le but de l'invention étant d'augmenter l'action bactérindede l'antibiotique, cette action bactéricide etant obtenue par l'utilisation d'une dose très faible d'antibiotique, comparée à celle utilisée jusqu'ici, et de créer une action bactéricide accrue contre les micro-organismes qui ont développé une résistance aux antibiotiques, en utilisant pour ce faire une composition pharmaceutique d'un antibiotique extrêmement utile pour le traitement de nombreuses maladies provoquées par les bactéries qui prennent le gram et celles qui-ne le prennent pas. On a découvert que les antibiotiques dont l'action bactéricide,contre les bactéries qui prennent le gram et celles qui ne le prennent pas, est excellente, ont une action plus faible en présence de bactéries résistantes, et leur action bactéricide n'a pu être maintenue que par l'utilisation de hauts dosages Les inventeurs de la présente invention ont étudié l'action de substances naturelles, physiologiquement actives, en rapport avec l'action bactéricide de plusieurs antibiotiques contre les bactéries résistantes du type de celles qui prennent le gram et de celles quille prennent pas, et ils ont découvert qu'une composition pharmaceutique d'un antibiotique et d'un acide gras insaturé avait une excellente action bactéricide contre les bactéries résistantes ; ils ont alors établi le procédé de la présente invention. Le procédé de la présente invention va être expliqué en détail dans ce qui suit. I1 est reconnu qu'un acide gras a la propriété de dissoudre la paroi de la membrane de la cellule des bactéries qui prennent le gram, mais on ne connaît pas, jusqu'ici, son action sur les bactéries qui ne prennent pas le gram. La prépara tion pharmaceutique obtenue par le procédédela présente invention agit plus efficacement , non seulement contre les bactéries qui prennent le gram, mais aussi- contre celles qui ne le prennent pas, ce qui prouve bien qu'il ne s'agit pas seulement de l'action bactéricide de l'acide gras Comme ladite préparation utilise l'action pharmacologique d'un antibiotique et d'un acide gras non saturé spécifique, qui sera décrit dans la suite, et qui n'offre par lui-même aucun effet pharmaceutique et qui est utilisé selon un dosage tel qu'il n'a aucun effet pharmaceutique lorsqu'on le mélange à l'antibiotique, la propriété de l'invention ne résulte donc pas seulement de l'addition de l'action des deux substances. La substance antibiotique que lton utilise dans le procédé de la présente invention n'est pas limitée à un seul type d'antibiotiques ; à titre d'exemple, les antiviotiques suivants peuvent être cités : les compositions contenant de la pénicilline tels que la penicilline E et les pénicillines semi-synthétiques, les compositions de cépharosphorine C telle que la Céphazoline, les compositions macrolides telles que l'Erythromycine, les compositions contenant du chloramphénicol , tel que le thianphé- nicol, les compositions contenant de la tétracycline, telle que la tétracycline et d'autres antibiotiques tels que la streptomycine, la colistine, la bléomycine, la chromomycine A3 et la 5 fliuorouracil (5 FU). L'acide gras que l'on utilise dans le procéé-de la présente invention est un acide gras insaturé représenté par la formule générale CnH2n-aCOOR (dans laquelle R est de l'hydrogène. du sodium ou du potassium, n est un entier entre 13 et 21 (13 et 21 exclus) et a est un entier de valeur 1,3,5 ou 73 Les acides gras insaturés , représentés par cette formule générale sont des acides palmito-oléique, oléique, arachidonique, linolénique et linoléinique ou des mélanges de ces acides. En combinant chacun de ces acides avec un antibiotique, on peut obtenir une composition pharmaceutique convenable, en jouant sur leur concentration respective. On va décrire en détail les raisons du choix des acides gras insaturés spécifiques mentionnés précédemment Dsaprès les expériences accomplies sur des acides gras insaturés comportant de 3 à 22 atomes de carbone, et en variant la concentration de l'acide gras insaturé par rapport à une quantité définie d'un antibiotique, les acides gras insaturés comportant de 14 à 22 atomes de carbone se sont révélés efficaces lorsqu'on les a utilisés en préparation pharmaceutique. L'acide gras insaturé comprenant 18 atomes de carbone s'est révélé efficace par lui-même à la concentration inhibitoire minimale de 0,5 mg/ml, mais est déjà efficace à la concentration de 0,015 mg/ml, lorsqu'il est utilisé dans la préparation pharmaceutique.L'acide gras insaturé comportant 20 atomes de carbone est efficace par lui-même à la dose de 0,5 Mg/ml, mais il est efficace , dans la composition pharmaceutique, à la concentration de 0,03 mg/ml. L'acide g-ras insaturé comportant 14 atomes carbone a une concentration inhibitoire minimum de 0,125 mg/ml employé seul, et l'acide gras insaturé comportant 22 atomes de carbone n'a aacun effet bactéricide, qutil soit seul ou dans la composition pharmaceutique, si bien que les acides gras insaturés comportant 1-4 ou 22 atomes de carbone ne c-onviennent pas à la composition pharmaceutique de la présente invention. En conséquence, les acides gras insaturés que l'on peut utiliser dans la composition pharmaceutique de la présente invention doivent être compris danszle domaine allant de C14 à C22, C14 et C22 exclus et i-es acides gras insaturés en dessous de C14 et au-dessus de C22 ne peuvent pas être utilisés. Lorsque les acides gras insaturés, compris entre C14 et C22, sont utilisés avec un antibiotique dans une composition pharmaceutique, dans un dosage tel qulil n'a aucun effet pharmaceutique si on l'utilise seul, ils exercent une excellente action bactéricide, en concentration faible de moins de 0,03 mg/ml. Le mécanisme d'action de ces acides n'est pas encore expliqué clairement, mais on considère que c'est un effet pharmacologique spécifique de l'antibiotique additionné d'un tel acide gras non saturé. La composition pharmaceutique de la présente invention exerce une action bactéricide prononcée contre les types de staphylocoques résistant à une basse concentration de 0,08 unité. Par exemple,une injection d'une préparation composée de pénicilline et d'un acide gras non saturé mentionné- précédemment, dans un abcès intradermique de souris (staphylocoques résistant à la pénicilline) a eu pour résultat une diminution importante de l'abcès plus importante que celle obtenue par la pénicilline seule. Ceci prouve que la composition pharmaceutique de la présente invention augmente l'action bactéricide, ion seulement in vitro, mais aussi in vivo. En conséquence, la composition de la présente invention est très utile et peut être utilisée lors d'infections d'etres humains. Les concentrations du mélange d'antibiotique et d'acide gras non saturé mentionnées plus haut, formant la composition pharmaceutique d'après le procédé de la présente inven tion,sont déterminsspar le pouvoir de l'antibiotique, et il n'y a pas de limite précise et rédhibitoire, mais géndralement le dosage des deux substances requis pour empêcher le développement des organismes d'essai est le suivant : pour 20 unités de pénicilline, il suffit d'environ 0,015 mg d'acide gras non saturé, tel que l'acide linolénique. Pour obtenir la composition pharmaceutique de la présente invention, on utilise le procédé décrit dans ce qui suit On dissout, par exemple, îg de poudre de pénicilline G potassée dans 2 ml d'eau distillée dont le pH est ajusté entre 6,8 et 8,5 ; on ajoute îg de linolénate de sodium, on refroidit le récipient à 0 C et on remue le mélange dans un mélangeur (à moins de 0 C) opérant à 1000 tours par minute, pendant 1 minute. Puis on lyophilise le mélange dans un lyophilisateur à une température de piège de -400C, pendant 24 heures, et on obtient ainsi en fin d'opération la préparation en poudre recherchée. Cette préparation en poudre a un pouvoir de 300 000 unités par mg, ce qui équivaut à une augmentation d'environ 300 par rapport au pouvoir de 1 667 unités/mg de ladite pénicilline base.0n peut obtenir une préparation liquide en ajoutant 10g d'acide linolénique, stérilisé sous haute pression, à 120 C pendant 20 minutes, et refroidi à température ambiante, à îg de poudre de pénicilline G potassée, et en mélangeant et homogénéisant le tout par ultrasons (20 KHz) à moins de OOC. Cette préparation liquide a un pouvoir de 300.000 unités/mg ,environ 300 fois plus grand que celui des 1.667 unités/mg de la composition initiale. Le procédé de la présente invention va être décrit à l'aide des exemples pratiques suivants Exemple 1 On a utilisé , comme antibiotique, 200.000 unités de pénicilline G potassée (Tadeka Chem. Ind., Japon). On a dissout cette pénicilline dans 10 ml d'eau distillée, puis on a dissou-s 0,1 ml de cette solution dans 10 ml d'eau pour obtenir une solution de 200 unités /mg. On a dissous 10 mg de linolénate de sodium dans 1 ml d'eau distillée.D'autre part, on a dissous 12,5 g du coeur d'un milieu de culture infusé (Nissui Seiyaku, Tokyo) contenant 0,125 % d'agar dont le pH était ajusté à 7,4, dans 500 ml d'eau distillée par chauffage, et l'on a versé la solution dans des éprouvettes stérilisées à raison de 0,8 ml dans chaque éprouvette ; on a ajouté 0,1 ml de la solution de linolénate mentionné dans une double série, chacune des éprouvettes d'une série étant numérotée de I à 9, comme indiqué sur le tableau 1. L'éprouvette 10 est une éprouvette contre qui ne contient pas de linolénate de sodium. En préparant ces séries, on a fait varier la concentration de pénicilline dans 9 séries, l'une d'entre elles étant sans pénicilline .Cela fait un total de 100 éprouvettes.Ces mélanges avec et sans linolénate ont été stérilisés sous haute pression (1200C pendant 10 minutes), refroidis à 500C et placés dans un bain de 500C. Avec la solution contenant 200 unités/mg de la solution de pénicilline mentionnée précédemment, on a réalisé des séries diluées deux fois à partir de 20ml et on a ajouté 0,1 ml de chaque dilution dans chaque éprouvette. On a ajouté à chacune des éprouvettes 0,01B2 -ml de staphylocoque doré sstaphy- lococcus aurens) du type Komiya, infusé au coeur d'un bouillon de culture pendant 18 heures, mélangé avec un mélangeur thermique et cultivé dans un incubateur à 370C pendant 24 heures. On a donné des normes d'appréciation d'action dans les notes en bas du tableau 1. L'activité bactéricide de la composition pharmaceutique avec des quantités variées d'acide linoléniqueindiquées, s'est révélée la suivante : alors qu'il n'y a pas d'activité bactéricide dans 20 unités de pénicilline seule, une addition de 0,0156 mg d'acide linoléique a enrayé la croissance des bactéries, et cette dernière a été complètement inhibée lorsqu'on a ajouté û,125 mg d'acide linolénique, même en utilisant la plus basse unité de pénicilline, c'bst-à-dire 0,078 unité). Exemple 2 Afin d'examiner les effets de la composition pharmaceutique sur la croissance des organismes d'essai, les staphylocoques dorés du type Komiya, on a préparé des mélanges à partir du coeur du bouillon de culture infusé de l'exemple 1, auquel on a ajouté (1) 0,025 mg/ml d'acide linolénique, (2) 2 unités par ml de pénicilline, et (3) 0,025 mg/ml d'acide linolénique et deux unités par ml de pénicilline. On a préparé, comme contrôle, le produit auquel on a ajouté une solution physiologique saline. On a ajouté à chacun de ces produits, une goutte (0,0182 ml) de l'organismes d'essai cultivé dans le coeur du produit infusé pendant 20 heures, et on a cultivé le mélange en le remuant dans un bain d'eau à 370C ; on a mesuré la densité optique de cette culture à 620 nm. Les résultats sont indiqués dans le tableau 2 joint. Comme il apparaît d'après ce tableau, la densité optique de la culture était de 1,158 lorsqu'on a ajouté de l'acide linolénique, légèrement plus basse que celle du contrôle ; la densité optique de la culture comprenant de la pénicilline était également plus basse, atteignant 1,124 , mais celle de la composition pharmaceutique était de 0,169, c'ist-à-dire extrêmement basse puisqu'elle correspondait à un dixième de la valeur dà contrôle Exemple 3 Afin d'examiner les effets de la composition pharmaceutique sur les Proteus vulqaris du type 100 (0), au lieu des staphylocoques dorés du type Komiya, on a effectué les mesures de densité optique de la même manière que pour l'exemple 2, et on a obtenu les résultats représentés sur le tableau 3 ci-joint. Comme il apparaît d'après ce tableau, la densité optique de la culture après 5 heures était de 0,378 dans le contrôle et 0,356 dans la culture comprenant du linolénate, presqu'inchangée, et légèrement plus basse , 0,307, lorsqu'pn a ajouté de la pénicilline. Au contraire, lorsqu'on a utilisé la composition pharmaceutique, on a obtenu une densité optique de 0,173, c'est-à-dire la moitié de la densité de la culture contenant de la pénicilline. Exemple 4 Les expériences ont été poursuivies de la même manière que pour les exemples 1, 2 et 3, sauf qu'on a utilisé de l'acide palmito-oléique, de l'acide oléique, de l'acide arachidonique ou de l'acide linoléique, à la place de l'acide linolénique.Les résultats se sont avérés les mêmes que ceux des exemples 1, 2 et 3. Exemple 5 On a dissous lg de sulfate de streptomycine (Kyowa Kogyo, Tokyo) dans 10 ml d'eau distillée, puis on a dissous 0b1 ml de cette solution dans 10 ml d'eau pour obtenir une solution de 1 mg/ml. En utilisant le même procédé que pour l'exemple 1, on a dilué 0,1 ml de cette solution de streptomycine diluée dans une double série de 9 éprouvettes. Les expériences ont été conduites de la même manière que celle décrite dans l'exemple 1, et les résultats obtenus apparaissent ssrle tableau 4. Comme il apparaît d'après ce tableau, les bactéries croissent en présence de 3,125erg de streptomycine seule, mais si l'on ajoute une petite quantité, 0,0020 mg d'acide linolénique, la croissance est complètement inhibée. Si l'on ajoute à une concentration faible de O,75yg de streptomycine, une faible concentration de Tordre de 0,0020 mg d'acide linolénique,la croissance des bactéries est ctimplètement inhibée. L'utilisation des acides palmito-oléique, oléique, arachidonique ou linolénique (acides gras insaturés) dans la composition pharmaceutique, donnent les mêmes résultats que le précédent acide linolénique. Exemple 6 Or) a examiné l'effet amélioré de l'action bactéricide d'une préparation pharmaceutique de pénicilline et d'acide linolénique décrite dans l'exemple 1, contre lesstaphilocoques résistant à la pénicilline, et,- comme on l'a représenté sur la figure 1, on a observé une action bactéricide complète avec une basse concentration de 0,015 m/ml d'acide linolènque dans une haute concentration de 20 unités de pénicilline et, lorsqu'on a utilisé une concentration de pénicilline de 2,5 unités, il a fallu 0,125 mg/ml d'acide linolénique pour obtenir une action bactéricide complète .Ces résultats indiquent qu'on obtient une action bactéricide complète contre les organismes d'essai, même en utilisant une faible concentration de l'acide gras non saturé mentionné précédemment, et cela même avec une faible concentration de pénicilline. Dans ce cas, 20 unités de- pénicilline n'ont aucune action bactéricide contre les organismes d'essai pas plus l'acide linoléique , même à la forte concentration de 0,5 mg/ml, lorsqu'ils sont employés seuls. Exemple 7 Les essais de sensibilité de la composition pharmaceutique selon l'invention ont été effectués en utilisant les staphylocoques dorés du type Komiya et les Proteus vulqaris (du type résistant à la pénicilline) comme organismes d'essai, et un produit du coeur d'une infusion d'agar additionné de 0,25 mg/ml d'acide linolénique et de tétracycline, érythromycine, chloramphénicol ou céphazoline. Les essais de sensibilité ont été effectués avec du Tridisk (Eiken Kagaku, Tokyo) et les appréciations données après une culture de 20 heures. Comme il apparaît d'après lestahlmux 5-et5bis,l'utilisaton de la composition pharmaceutique de la présente invention procure un diamètre de la zone d'inhibition plus grand que celui obtenu avec l'utilisation d'un antibiotique seul, et la différence est prononcée. Exemple 8 L'effet de la composition pharmaceutique selon la présente invention comprenant de la bléomycine et du linolénate de sodium contre les tumeurs ascites (carcinome d'Ehrlich- )chez la souris a été examiné et les résultats sont indiqués sur le tableau 6 ; aucune augmentation de poids liée à un grossissement de la tumeur n'a été observé sous l'action de la présente composition pharmaceutique. (1)30 g de néomycine avec 1 mg de linolénate de sodium dans 0,5 mg de solution aqueuse à 0,85 % de chlorure de sodium par souris et par jour, (2)30fg de bléomycine dans 0,5 mg de solution aqueuse à 0,85 % de chlorure de sodium par souris et par jour, (3)0,5 mg d'une solution aqueuse de 0,85 % de chlorure de sodium par souris et par jour. Exemple 9 L'effet d'une composition pharmaceutique selon la présente invention comprenant du 5 Fluorouracil (5 FU) et du linolénate de sodium contre les tumeurs ascites (carcinome d'Ehrlich) chez la souris est explicité sur le tableau 7 joint.Aucune augmen tation de poids due à la croissance d'une tumeur n'a été observée avec la composition chimique ci-dessus. (1) 5 mg de 5 FU avec 1 mg de linolénate de sodium dans une solution aqueuse à Oj85 % de NaCl par kilogramme de souris et par jour; (2) 5 mg de 5 FU dans 0,5 mg de solution aqueuse à 0,85 de NaCl par kilogramme de souris et par jour. Sur la figure 1, on a représenté l'effet bactéricide de la composition pharmaceutique selon l'invention sur ltorganisme de contrôle. Tableau I Acide lino- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 lenique unités mg/ml de pénicilline 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,03125 0,015625 0,0078 0,0039 0,0020 0 20 - - - - - - # # # # 10 - - - - - # # # # # 5 - - - - - # # # # # 2,5 - - - - - # # # # # 1,25 - - - - - # # # # # 0,625 - - - - - # # # # # 0,3125 - - - - - # # # # # 0,15625 - - - - # # # # # # 0,078125 - - - # # # # # # # 0 # # + + + # # # # # (Note) #: trés bonne croissance #: bonne croissance +: croissance moyenne #: croissance faible -: pas de croissance TABLEAU 2 Temps de culture 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Linolénete de sodium 0 0.050 0.090 0.083 0.128 0.228 0.386 0.688 1.158 Penicilline 0 0.000 0.000 0.000 0.012 0.036 0.178 0.364 1.124 Composition pharmaceu- 0 0.060 0.101 0.102 0.116 0.123 0.159 0.149 0.169 tique de la présente invention Contrôle 0 0.060 0.101 0.036 0.158 0.342 0.718 1.178 1.678 Tableau 3 Temps de culture 0 1 2 3 4 5 Linolénate de sodium.. 0 0.001 0.003 0.023 0.132 0.356 Pénicilline .......... 0 0.005 0.013 0.031 0.111 0.307 Composition pharmaceu tique selon la pré sente invention ...... 0 0.001 0.006 0.030 0.070 0.173 Contrôle ............. 0 0.001 0.005 0.045 0.143 0.379 TABLEAU 4 Acide linoléni- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 que mg/ml Streptomycine (pouvoir) ( g) 0.5000 0.2500 0.1250 0.0625 0.0312 0.0156 0.0078 0.0039 0.0020 0 3.125 - - - - - - - - - # 1.5125 - - - - - - - - - # 0.75125 - - - - - - - - - # 0.375625 - - - - - - + + + + (Note) # : Très bonne croissance # :Bonne croissance + : Croissance ordinaire # : Légère croissance - : Pas de croissance Tableau 5 (Les valeurs indiquent le diamètre de la zone d'inhibition) Staphilocoqus doré Proteus vulgaris du type komiys Typs de boîte Milieu Forte Moyenne Faible Forte Moyenne Faible de Pétri concen- concen- concen- concen- concen- concen tration tration tration tration tration tration Tétraycline Sans addition 1.8 cm 1.7 cm 1.4 cm 0 cm 0 cm 0 cm Addition 2.3 2.2 1.7 0 0 0 Erythromicine Sans addition 2.0 1.7 1.4 0 0 0 Addition 2.7 2.5 2.0 0 0 0 Chloremphenicol Sans addition 1.7 1.4 0.8 1.3 0 0 Addition 2.6 2.0 1.6 1.6 1.1 0 Caphezoline Sans addition 2.0 1.6 1.3 0 0 Addition 3.6 3.2 3.0 1.5 0.9 0 Tableau 5 bis (Concentration de l'antibiotique dans la boîte de Pétri) Type de boîte Forte Moyenne Faible de Pétri concentration concentration concentration ( g) ( g) ( g) Tetracycline 30 10 5 Erythromycine 10 2 0.5 Chloramphenicol 30 10 5 Cephazoline 25 10 5 Tableau 6 Poids du corpe en gramme (valeur moyenne sur 10 souris) Durée d'observation en jour 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 Composition pharmaceutique 27 28 28 28 28 29 29 29 29 29 29 29.5 selon l'invention (1) Bléomycine (2) 27 29.5 30 30 31 31 31.5 32 35 37 38 40 Contrôle (3) 27 28 29.5 30 33 33.5 35 38 42 42 46 52 Tableau 7 Poids du corps en gramme (moyenne sur 10 souris) Durés d'observation en jour 0 1 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Composition pharmaceutique selon 25 25,5 26 26 26 28 28 28 28 28 28,5 29 l'invention (1) 5 FU (2) 25 25 26 26 27 27 29 30 31 33 35 38 Contrôle (3) 25 25 26 26 28 30 32 32 35 38 40 44 REVENDICATIONS 1. Procédé pour augmenter l'activité antimicrobienne d'un antibiotique, caractérisé en ce qu'on ajoute, à un antibiotique, un acide gras insaturé dont la chaîne comporte entre 14 et 22 atomes de carbone, ou des sels correspondant si ces acides acceptables en pharmacie, ou un mélange,de tels acides, de tels sels, ou des acides et des sels. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antibiotique est choisi dans le groupe constitué par les compositions de pénicilline, les compositions de cépharosphorine, les compositions de macrolides, les compositions de chloramphénicol, les compositions de tÉtracycline, les compositions de streptomycine, les compositions de colistine et autres compositions réalisées par mélange de ces dernières. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en c e que l'acide gras non saturé est représenté par la formule générale CnH2n aCOOR dans laquelle Fit de l'hydrogène, du sodium ou du potassium , n est entier compris entre 13 et 21 (13 et 21 exclus) et a est un enter de valeur 1,3,5 ou 7. 4. Composition pharmaceutique à action antimicrobienne améliorée, caractérisée en ce qutEiLle -comprend un antibiotique ou un mélange diantibiotiques et un acide gras insaturé comportant de 14 à 22 atomes de carbone, ou des sels correspondants acceptables en pharmacie ou un mélange de ces acides et/ou de ces sels. 5. Composition pharmaceutique selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'antibiotique est choisi dans les groupe constitué par les compositions de pénnicilline, les compositions de cépharosphorine, les compositions de macrolide, les compositions de chloramphénicol, les compositions de tétracycline, les compositions de streptomycine, es compositions de colistine, de bléomy-cine, de chromonycne A3 et de 5 fluorouracil (5FU) et d'autres compositions réalisées par mélanges de ces compositions. 6. Composition-pharmaceutique selon la revendication 4, caractérisé en ce que Acide gras non saturé est représenté par la formule générale C H COOR dans laquelle R est de l'hydre n 2n-a gène, du sodium ou du potassium, n est un entier entre 13 et 21 (13 et 21 exclus) et a est un entier de valeur de 1,3,5 ou 7. 7. Composition pharmaceutique selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'on ajoute en outre un excipient pharmaceutiquement acceptable.