FR 2269960 A1 19751205 FR 7334328 A 19730925 La présente invention a trait a de nouveaux médicaments destines a la stimulation des réponses immunitaires des organismes récepteurs. On sait que les mécanismes de défense de L'organisme, bravement résumés en immunité hunorale et en immunité cellulaire, interviennent pour éliminer les corps étrangers qui pourraient :tre nuisibles, tels que notamment les micro-organismes (bactéries, rickettsies, virus, champignons, protozoaires ou métazoaires) et les cellules anormales, y compris les cellules néoformées potentiellement ou effectivement aptes à devenir une "tumeur". La notion de surveillance immunologique qui a été maintenant établie montre notamment qu'il existe des liens entre.la diminution naturelle ou provoquée de la ré activité immunologique et l'accroissement du risque de cancer. Par ailleurs un certain nombre de maladies sont dûes, de façon bien connue t a des modificationsdu fonctionnement du système immunologique ou accompagnent de telles modifications, notamment les maladies auto-lmmanes, maladies par Ùnmun-complexes, intoxications, septicémies, etc... On a aéja expérimenté ou utilisé un asséz grand nombre de substances susceptibles d'augmenter la réactivité immunologique des sujets récepteurs, cette stimulation de l'immunité correspondant a une importante gamme d'antigènes. A titre d'exemple on peut citer le B.C.G. utilisé dans le cas des leucémies lympho- Ides ou des lymphomes, des extraits de M. tuberculosis, de C-parvam, de Brucella, etc... Ces substances présentent cependant divers inconvénients. En particulier elles sont souvent toxiques. Elles provoquent à divars degrés l'effet l'producteur de granulome local" et, d'une façon générale, l'ignorance de leur nature exacte et les conditions difficiles de leur préparation rendent compliquées une experimen- tation systématique et une bonne reproductibilité des résultats cliniques. Les nouveaux médicaments selon l'invention remédient à ces inconvénients et possèdent une toxicité très faible et dans certains cas nulle. Certains au moins des médicaments ont une action antitoxique sur l'organisme. Ils sont dénués de l'effet "producteur de granulome local". L'administration des médicaments selon l'invention a pour effet une stimulation de la réponse immunologique spécifique de l'organisme en cas d'introduction d'un antigène. Ces médicaments agissent selon le cas sur la production d'anticorps et sur l'immunité cellulaire et,' due façon générale sur ces deux aspects de l'immunité. Ils permettent de rétablir une réactivité immunologique normale chez des patients dont l'activité immunitaire a été diminuée de façon naturelle ou provoquée. Les nouveaux vaccins selon l'invention sont susceptibles d'un assez grand nombre d'applications thérapeUtiques. Ils sont notamment utilisables dans l'immunothérapie des cancers pour rétablir une réactivité immunologique normale. Ils sont également utilisables dans la prévention des cancers par immunothérapie des sujets immunologiquement déficients, notamment les personnes agées et les personnes qui ont été soumises à des thérapeutiqùes immunodépressives telles que rayons ionisants, antimétaboliques, antimitodiques. Les médicaments selon llinvention sont également applicables à la restauration de l'immunité amoindrie par l'age (immunosenescence), par un déficit naturel ou par une modification grave de l'état général. Les nouveaux médicaments selon l'invention peuvent également tette utilisés pour l'immunothérapie des brûlures. Les nouveaux médicaments immunostimulants, sont caractérisés par le fait qu'ils comprennent un ou plusieurs thiols mi neuraux absents en tant que constituants normaux des êtres vivants, comprenant environ entre 16 et 40 % de soufre dans la molécule, ladite molécule présentant une cyclisation ou étant èyclisable. Lesdites molécules possèdent un poids moléculaire faible dont le domaine sera défini par l'indication, à titre d'exemple, de certains thiols minéraux constituant ou faisant partie des médicaments selon l'invention. Dans un mode de mise en oeuvre préféré un médicament selon l'invention, dosé pour son administration, par exemple chez llhomme, comprend une quantité de thiol minéral, exprimée enmg par kg d'organisme receveur, suffisante pour que l'index de stimulation, ramené à la souris et obtenu en divisant le nombre de plaques compté pour 108 cellules nucléées de la rate de souris après stimulation et injection d'hématies'de mouton, par le nombre de plaques obtenues après injection des hématies de mouton seules soit supérieur ou égal à 1,6. D'une façon générale ladite dose est égale de préférence à au moins 1 mg/kg. Les médicaments ainsi constitués selon l'invention comprennent de préférence l'un au moins des composés suivants - le diéthyldithiocarbamate de soude de préférence à des doses de 10 à 25 mg/kg - le thiomalate de soude, de préférence à des doses de 0,6 à 10 mg/kg - le thiosulfate de soude -le métabisulfite de soude - la methimazole (mercaptométhylimidazole) -le thiophène -la thioguanine - le thiosemicarbazine - la phénothiazine - le thiouracile Dans une variante de l'invention les nouveaux médicaments précités peuvent comprendre, en dehors desdits thiols minéraux, une certaine quantité de theophylline ou d'un composé aminophylline analogue. La quantité de thiol minéral dans le médicament dosée est telle que l'index de stimulation-est au moines égal - 1,6. La dose de diéthyldithiocarbamate de soude ainsi que celle de thiomalate de soude est de préférence comprise entre 1,25 et 25 mg/kg. On va maintenant, à titre d'exemple, decrire l'action desdits médicaments sur la réponse immunitaire de la souris. Les expériences permettant la détermination de l'index de stimulation (IS) ont été établies par le comptage des plaques d'hémolyse de rate de souris, localisées en gel selon une technique dérivée de la méthode originale de JERNE. Cette méthode en soi classique permet de relever l'activité des lymphocytes B (produc- tion d'anticorps) comme des lymphocytes T (immunité cellulaire et induction de la production d'anticorps). L'index IS est obtenu en divisant le nombre de plaques comptées pour 108 cellules nucléées de la rate après und administration de globules rouges de mouton et du médicament selon l'invention, par le nombre de plaques obtenues après injection des hématies de mouton seules, toujours pour 10 cellules nucléées. On considère, par l'analyse statistique des résultats, qu'une valeur de IS#1,6 correspond à une stimulation effective de l'immunité alors qu'une valeur de IS#0,60 correspond à une inhibition. EXEMPLE I On utilise des groupes de cinq souris femelles de laboratoire CI-1 (Rivers) pesant 20 - 1 g et on inocule lesdites souris par voie intraveineuse avec 108 hématies de mouton. Certains groupes de souris sont alors conservés comme contrôle de l'activité de l'antigène. D'autres groupes reçoivent simultanément, mais séparément par voie sous cutanée, des doses différentes par groupe, de thiols minéraux, les doses s'échelonnant de 0,625 mg/kg à 25 mg/kg. Deux jours après les injections d'antigènes et de thiol, les souris sont sacrifiées et les rates examinées. A cet effet on mélange dans une boite de Petri de 100 mm de diamètre, 2 ml de milieu de Eagle gélosé à 0,8 % contenant 3,5 x 108 hématies de mouton et 0,2 ml de milieu de Eagle non gélosé contenant en suspension homogène et bien dispersée le cinquième de la pulpe splénique d'une souris. Après solidification du milieu et incubation de 1 h à 370 C, on répartit à la surface de chaque bote 1,5 ml de C' de cobaye dilué au 1/5ème en tampon veronal de Mayer et l'on porte à nouveau pour 1 h à 370C. La fixation sur l'antigène (hématies de mouton) des anticorps diffusés autour des cellules formatrices et l'effet cytotoxique subséquent de C' créent des plaques d'hémolyse.Ces plaques sont repérées, comptées et leur nombre apporté à 108 cellules spléniques nucléées, en même temps qu'est calculé ltécart-type. Les résultats obtenus sont visibles sur le tableau N I ci-dessous. INDEX DE STIMULATION PAR INJECTION SOUS CUTANEE DU PRODUIT EN MEME TEMPS (SIMULTANE) QUE L'ANTIGENE INTRAVEINEUX TABLEAU 1 Thiols Doses 0,625 1,25 2,5 5 12,5 25 Diéthyldithiocarbamate de soude 0,9 2,5 2,5 2 3,5 Thiomalate de soude 2,6 3,1 3,9 Cystine 0,98 Cystéine 0,98 Méthionine . :1,1 : : : : : Thiamine :0,98 :o,g8: 0,98: 1,2 : Thiosulfate de soude 3,5 2,5 Metabisulfite de soude 3,4 2,5 2,9 Thiophène 3,2 1,1 0,55 Methimazole :5,6 :7,3 : 2,6 Thioguanine 0,9 1,7 5,1 Thiouracile 1,8 2,6 1,1 Phenothiazine : :3,5 : 053 : Thiosemicarbazine ;1,67 :1,65: 4,2 : 1,9 : : : On voit sur le tableau I que pour 1 dose de 0,625 mg/kg une action immunostimulante est déjà présente pour le métabisulfite de soude, le methimazole, le thiouracile et le thiosemicarbazine. Pour 1 dose de 1 mg/kg l'action immunostimulante est obtenue pour la quasi totalité des thiols. A partir de doses de 2,5 mglkg certains thiols deviennent moins actifs, toutefois le diéthyldithiocarbamate de soude, le thiomalate de soude, le thiosulfate de soude, notamment, sont actifs à des doses supérieures pouvant aller jusqu'a 25 mg/kg pour le diéthyldithiocarbamate de soude qui n'est d'ailleurs pas toxique à cette dose. On a également étudié, à titre de comparaison, l'index de stimulation de thiol organique telle que la cystine, la cystéine, la methionine et la thiamine. Aux différentes doses envisagées ces composés ne sont pas actifs. EXEMPLE 2 Dans cet exemple des souris ont été traitées de façon analogue à celles de exemple 1, à la seule différence que les souris ont subi l'inoculation du diéthyldithiocarbamate de soude 18 heures avant l'inoculation de l'antigène. Les résultats sont les suivants INDEX DE STIMULATION LE PRODUIT ETANT INJECTE 18 HEURES AVANT L'ANTIGENE TABLEAU 2 Produit Doses (mg/kg) : :0,625 : 2,50 : 5,0 : 14,5 : 25 Diéthyldithiocarbamate : de soude 4,4 2,45 1,2 3,8 4,7 EXEMPLE 3 Les memes essais que dans l'exemple 1 ont été effectués sur des souris a l'exception du fait que les thiols ont été injectés 6 heures après l'inoculation de l'antigène (tableau 3), et dans une seconde série d'essais 24 heures après l'inoculation de l'antigène (tableau 4). Toutes les doses employées sont efficaces pour le thiomalate de soude de même que pour le diéthyldithiocarbamate de soude. INDEX DE STIMULATION PAR INJECTION SOUS CUTANEE DU PRODUIT 6 HEURES APRES L'ANTIGENE TABLEAU 3 Produit Doses (mg/kg) 0,625 1,25 : 2,5 : 5 :12,5 : 25 : Thiomalate de soude :5,8 : : 4,2 : 3,8: 3,0 : 2,7 : Diéthyldithiocarbamate : : de soude :0,45 : : 2,10: 3,8: 6,2 3,1 Thiosulfate de soude 3,5 2,5 : Metabisulfite de soude : : 2,0 : Cystine 1 : Cystéine : : 1 Thiamine 1,2 INDEX DE STIMULATION PAR INJECTION SOUS CUTANEE DU PRODUIT 24 HEURES APRES L'ANTIGENE TABLEAU 4 : Produit Doses (mg/kg) : :0,625: 1,25: 2,5 : 5 :12,5 : 25 :Diéthyldithiocarbamate : : : de soude 3,2 1,4 1,6 3,1 4,0 EXEMPLE 4 Dans cet exemple on a étudié l'faction du diéthyldithiocarbamate de soude sur la réponse immunologique des souris agées. Des souris CD-1 femelles, horsWdtâge (agées de plus de 9 mois et pesant de 49 à 54 grammes) sont inoculées par la voie veineuse par 108 globules rouges de mouton. Les souris traitées par le diéthyldithiocarbamate de soude reçoivent 6 heures après. l'antigène les unes 2,5 mg/kg les autres 12,5 mg/kg de ce composé. Deux jours après l'injection d'antigène (hématies de mouton) les souris sont sacrifiées et leur rate examinée. Les résultats sont résumés au tableau 5. TABLEAU 5 Action sur les souris âgées CD-1 femelles, plus de 9 mois, 49 à 54 g. (10 souris par lot) Traitement PFC/î08 + SE aucun # 39 + 21 108 hématies 98 + 37 108 hématies + 2,5 mg/kg DEDTC 284 + 79 108 hématies + 12,5 mg/kg 316 + 58 Ces résultats montrent que l'administration de diéthyl dithiocarbamate de soude à des souris très âgées est capable d'augmenter selon la dose du traitement, de 2,9 à 3,2 fois plus leur potentiel immunitaire pratiquement aboli par l'immunisenescence. L'inoculation de ces sourisâgées élève leur réponse immunitaire à un niveau (316 plaques) voisin dé celui des souris jeunes adultes qui, injectées par la même quantité du même antigène donnent 380 plaques. EXEMPLE 5 Dans cet essai on a recherché l'influence de la théophylline sur la stimulation de l'immunité par l'un des thio-dérivés des médicaments selon l'invention à savoir le diéthyldithiocarbamate de soude. En effet la théophylline inhibe les phosphodierestases et stabilise le 3'5'-adenosine monophosphate cyclique (CAMP) en empêchant sa conversion. A cet effet on a compté les plaque d'hémolyse localisées en gel présentes dans la rate des souris traitées ou non par le diéthyldithiocarbamate de soude, associé ou non à la théophylline après injection intraveineuse de 108 hématies de mouton. Le comptage des plaques d'hémolyse a été effectué selon la technique déjà décrite. Les résultats sont représentés sur 1 tableau 6. TABLEAU 6 Action de la théophylline sur la stimulation par lé DEDTC CD-1 femelles, 20 g + 1. Traitement PFG/108 v SE aucun 28 + 5 108 hématies 852 + 104 108 hématies + théophylline 916 + 101 108 hématies ±0,625 mg/kg DEDTC 813 + 48 108 hématies + 2,5 mg/kg DEDTC 1965 + 96 108 hématies + 0,625 mg/kg DEDTC t théophylline 2003 + 91 108 hématies + 2,5 mg/kg DEDTC + théophylline 1906 + 103 Théophylline 200 ug ip. par souris. On voit sur ce tableau que la théophylline seule à la dose employée, ne modifie pas sensiblement le nombre des plaques des rates de souris. Le traitement des souris par 0,625 mg/kg de diéthyldithiocarbamate de soude et par 200 g par souris de théophylline augmente le pouvoir stimulant des médicaments. On peut en conclure que ce thio-minéral agit par ltintermédiaire du cycle de l'AMP qui pourrait servir de médiateur à ces actions stimulantes. EXEMPLE 6 Dans cette expérience on a étudié l'action sur la souris d'un médicament selon l'invention à base de diethyldithiocarbamate de soude lors d'une attaque toxique de la souris. Des souris femelles CD-1 de 20 + 1 g reçoivent une inoculation de 2,5 mg de toxine brucellique correspondant à la fraction "phénol" de brucella melitensis. On sait qu'une telle inoculation amène un net amaigrissement toxique des souris, (voir Renoux et Renoux, J. inf. Diseases, 1973, 127, 139). Un premier lot de souris inoculées est maintenu comme témoin de l'activité de la toxine. Un deuxième lot est traité par 2,5 mg/kg de diéthyldithiocarbamate de soude, 12 heures après l'inoculation de la toxine. Un autre lot est traité par 5 injections de la même quantité (2,5 mg/kg de diéthyldithio- carbamate de soude aux jours + 2, + 3, + 4, + 6, + 7 après inocu-lation de la toxine. Le lot N 1 consiste aux souris témoins rayant reçu qu'une inoculation. Un autre lot 5 est un témoin de l'action du diéthyldithiocarbamate de soude sur les souris sans inoculation de toxine, chaque souris recevant cinq injections dans les mêmes conditions,aux memes jours et heures que les souris du lot 4.Ces souris sont ent-etenues dans un air -conditionné à 240C et nourries d'aliments spéciaux sans antibiotiques. Le résultat est représenté sur la figure l qui montre en abscisse le temps en jours et en ordonnée l!évolution en poids à partir du poids normal. On voit que les souris qui ont reçu l'endotoxine seule maigrissent de 4 g en-moyenne par rapport aux témoins1 soit une perte de poids d'environ 20 %. Les souris traitées par le thiol 12 heures après l'injection d'endotoxine ne maigrissent pas et dès le 20eme-jour ont une courbe de poids très nettement supérieure à celle des témoins. Les souris traitées au thiol aux jours 2, 3, 4, 6, 7 après l'injection de la toxine ne maigrissent pas et ont dès le 20ème jour une courbe de poids très fortement supérieure à celle des témoins. On voit ainsi que le diéthyldithiocarbamaté de soude possède une activité anti-toxique associée à un effet anabolisant -chez les souris. L'administration à des sujets humains desmédicaments selon l'invention peut par exemple être effectuée partie orale soit sous forme d'une solution du thiol à la dose inscrite, soit sous forme solide à l'aide d'un excipient de type classique. En variante l'administration peut s'effectuer par voie sous cutanée, le thiol étant de préférence dissous dans de l'eau physiologique. De façon préférée, l'administration du médicament dans le but de provoquer un relèvement de 1 immunité s'effectue en administrant au moins une dose par jour et ceci de'préférence durant des périodes de plusieurs jours ou plusieurs semaines. REVEND ICAT IONS 1. Nouveau médicament immunostimulant caractérisé par le fait qu'il comprend un ou plusieurs viols minéraux", absents en tant que constituants normaux des êtres vivants, comprenant environ entre 16 et 40 % de soufre dans la molécule, ladite molécule présentant une cyclisation ou étant cyclisable. 2. Médicament immunostimulant selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend une quantité de "thiol minéral", exprimée en mg/kg d'organisme receveur suffisante pour que l'index de stimulation, ramené à la souris et obtenu en divisant le nombre de plaques comptées pour 108 cellules nucléées de la rate de souris après stimulation et injection hématies de mouton, par le nombre de plaques obtenu par injection des hématies de mouton seules, soit supérieur ou égal a 1,6. 3. Médicament immunostimulant selon l'une quelconque des revendications l et 2, caractérisé par le fait qu'il comprend une quantité de "thiol minéral" dosée de préférence à au moins l mg/kg d'organisme receveur. 4. Médicament immunostimulant selon l'une quelconque des revendications l à 3, caractérisé par le fait-qu'il comprend llun au moins des composés pris dans le groupe constitué par le diéthyldithiocarbamate de soude, le thiomalate de soude, le thiosulfate de soude, le métabisulfite de soude, la méthimazole (mercapto methylimidazole), thiophène, thioguanine, le thiosemicarbazide, la phénothiazine, le thiouracile. 5. Médicament immunostimulant selon la revendication 4, caractérisé par le fait qu'il comprend du diéthyldithiocarbamate de soude en des quantités dosées entre 10 et 25 mg/kg d d'orgaisme receveur. 6. Médicament immunostimulant selon la revendication 4, caractérisé par le fait qu'il comprend du thiomalate de soude en des quantités dosées entre 0,6 et 10 mg/kg d'organisme receveur. 7. Médicament immunostimulant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il comprend en outre de la théophylline ou un composé aminophylline analogue.