FR 2285142 A1 19760416 FR 7431469 A 19740918 La présente invention,réalisée au centre de Recherches Pierre Fabre, concerne l'isolement du principe actif du Siegesbeckia Orientalis ainsi que son application pharmaceutique et cosmétologique à l'édification de la trame du collagène dans le tissu conjonctif cicatriciel. Comme cela se trouvera révélé plus en détail dans la suite de la présente description, ce principe actif, eutrophique du tissu conjonctif, favorise la production d'un tissu normal. On rappelle que le Siegesbeckia Orientalis est une Composée de la tribu des Astérofdées,originaire d'Ethiopie et largement répandue au Japon, à Madagascar, en Australie ainsi que dans la presqu'!le Dekkan. Cette plante est également appelée "Satrike Aza M.arartra" à Madagascar,où elle pousse dans les terrains humides voisins des rizières et principalement dans les vallées. A la Réunion et à l1ile Maurice on la connatt sous des noms très divers, tels que par exemple "Herbe divine, Herbe de Flack, Collecolle, Guérit vite". Il s'agit d'une herbe annuelle originaire d'Abyssinie qui atteint généralement une hauteur comprise entre 40 cm et 1 m, et prend la forme d'une liane ou d'un arbuste buissonneux. Les feuilles de cette plante sont poisseuses et ses organes floraux contiennent un suc-gomme résineux d'odeur aromatique. Comme on le verra plus en détail ci-après, il a été mis en évidence que les propriétés reconnues à cette plante étaient dues essentiellement à une substance de structure diterpénique, parfaitement définie du point de vue chimique, appelée "darutoside". Le darutoside est le 16 bêta-D-glucoside de darutigénol, le darutigénol étant un diterpène trihydroxylé de formule Si l'on se réfère à une publication de l'Académie des Sciences (Comptes-Rendus, 244, pages 472 à 475, 21 janvier 1957), on constate que l'on a déjà proposé un procédé d'extraction du darutoside à partir du Siegesbeckia Orientalis séché.Ce schéma d'extraction antérieurement connu est du type suivant : la plante broyée est délipidée par l'éther de pétrole et épuisée par l'alcool absolu, puis ensuite par l'alcool à 75 '6. On concentre ensuite les extraits alcooliques, puis on procède à l'extraction des chlorophy7les à l'éther et enfin, après défécation à la chaux, on isole le glycoside brut. Le darutoside est alors extrait du précipité au moyen d'alcool absolu, puis recristallisé par concentration de ce solvant. On obtient ainsi le darutoside sous forme de paillettes incolores ayant un point de fusion compris entre 248 et 2500C, et un pouvoir rotatoire spécifiquediD D = - 370 ces paillettes contiennent une molécule de solvant de cristallisation (C26 H4408,C2H50H).Quand on cristallise le darutoside dans l'alcool à 50 96 on l'obtient sous forme de paillettes ayant un point de fusion de 2300C, contenant une molécule d'eau de cristallisation (C26H44080). L'analyse du darutoside ainsi obtenue révèle que son spectre ultra violet ne présente pas d'absorption notable au-dessus de 220 nm ; son spectre infra-rouge présente une forte bande (-OH) à 3330 cm'l et on constate qu'il n'y a pas de bande carbonyle dans la région voisine de 1700 de Par hydrolyse enzymatique avec de l'émulsine ou de l'élastérase.on libère du D-glucose et une génine ou aglycone qui est précisément le darutigénol (C20H3403 -P.F. 168-170 C). Ce type d'extraction antérieurement connue, bien qu'étant suffisante au laboratoire pour obtenir quelques grammes de darutoside, s'avère difficilement utilisable industriellement en raison du grand nombre d'extractions nécessitant l'utilisation de volumes importants de solvants inflammables. A la suite d'une recherche systématique guidée par la chromatographie en couche mince des extraits, la demanderesse a mis au point un procédé d'extraction extrêmement simple, ne comprenant pas d'étape dé délipidation à l'éther de pétrole, ni d'extraction des chlorophylles par l'éther éthylique, ni de défécation à la chaux. La technique opératoire faisant l'objet de la présente demande de brevet permet d'obtenir directement le darutoside à un titre de 98 à 100 %. Dans toute la suite de la présente description et dans les revendications annexées, on désignera le produit obtenu par la mise en oeuvre du procédé de l'invention par la dénomination "darutoside". Il se présente alors sous une forme amorphe et peut bien entendu être cristallisé selon des techniques bien connues, par exemple dans méthanol à 5Q 5o. La présente invention concerne donc un procédé d'extrac- tion du principe actif du Siegesbeckia Orientalis, qui se caractérise par les étapes successives suivantes - le Siegesbeckia Orientalis, après avoir été finement pulvérisé, est épuisé à chaud par un solvant organique approprié, principalement choisi parmi les alcanols comportant un nombre d'atomes de carbone compris entre I et 5 - on procède à une séparation et à une extraction du marc, puis l'on traite la solution alcoolique restante par du charbon actif de manière à en éliminer les pigments - on procède à une concentration de la solution ainsi décolorée, puis le résidu provenant de cette opération de concentration est solubilisé dans l'eau - on précipite le "darutoside" par addition d'une base forte ; et - on purifie, on neutralise et on sèche le précipité de "darutoside" ainsi obtenu Selon une autre caractéristique de l'invention, le principe actif est précipité par addition d'un agent alcalin. Le "darutoside tel qu'il est obtenu par le procédé ci-dessus se présente sous la forme d'une poudre blanche, de saveur très avère, soluble dans l'méthanol et que l'on peut caractériser par les résultats d'analyses suivants P.F. = 230-235C E Le spectre infra-rouge révèle la présence des bandes d'absorption suivantes : (-OH) à 3400 cm-1 ; (-C-O-C-) à 1070 cm-1 et (OH primaire) à 1020 cm-1. L'analyse élémentaire a conduit aux résultats suivants C = 62,55 s et H = 9,05 X (les pourcentages théoriques sont les suivants C = 62,15 W et H = 9,16 W). Les réactions colorées suivantes ont également conduit à un résultat positif : réaction de Liebermann ; SBCl3 ; tétranitrométhane ; vanilline chlorhydrique. Selon une variante du procédé de l'invention, il est parfaitement possible, après séparation et'extraction du marc, de procéder à un recyclage de ce dernier, c'est-à-dire à conduire une nouvelle étape d'extraction dudit marc. Selon un mode préférentiel de mise en oeuvre du procédé de l'invention, le Siegesbeckia Orientalis est finement pulvérisé de manière à lui conférer une granulométrie comprise entre C,3 mm et 1 mm. Selon un mode particulier de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, I'opération de concentration de la solution décolorée consiste en une évaporation sous vide à extrait mou. Enfin, selon une autre variante du procédé de l'invention-le précipité de "darutoside" séché ainsi obtenu peut'être soumis à une opération de recristallisation, par exemple dans l'alcool absolu ou dans des mélanges hydro-alcooliques. La présente invention concerne également l'application du produit, obtenu par la mise en oeuvre du procédé énoncé précédemment, en tant que médicament. En effet; comme on le verra par la suite et contrairement à ce qui était dit antérieurement, notamment par une publication de thèse de A.Diara en 1g62, il a été mis en évidence que les propriétés reconnues au Siegesbeckia Orientalis était dues essentiellement au "darutoside". A 11 époque il avait été d'ailleurs très étonnant de constater que le darutoside, parfaitement défini par A. Diara, ait été formellement reconnu comme non responsable de l'activité du Siegesbeckia Orientalis. Cette publi cation précise en effet que zanni "ni le darutoside, ni son aglycone ne présentent d'activité biologique ; il ne serait donc pas responsable des propriétés curatives du Siegesbeckia Crientalis" (thèse de A.Diara, 1962, page 5). Le procédé selon l'invention sera expliqué ci-après plus en détail à l'aide des exemples non limitatifs suivants Exemple 1. On broie finement 1 kg de Siegesbeckia Orientalis que l'on épuise par décoctions successives avec 8,5 litres, puis 5 litres de n-butanol. Après séparation du marc, les extraits réunis sont traités par du charbon actif, concentrés solubilisés dans 1 litre d'eau. De la solution limpide ainsi obtenue on précipite le "darutoside" par addition de 150 ml de soude. Après filtration et lavage jusqu'à neutralité on obtient un produit blanc, qui, séché à 65 sous vide pèse 147 g, ce qui correspond à un rendement de 1,27 '6. Le point de fusion, déterminé au Banc Kofler, du produit ainsi obtenu est de 2340C. Exemple 2. Les parties aériennes de Siegesbeckia Orientalis (2 kg) sont finement broyées et épuisées par 10 litres de méthanol à ébullition. On procède à une séparation ainsi qu'à une nouvelle extraction du marc au moyen de 8 litres de méthanol. Les solutions alcooliques restantes sont réunies puis décolorées au charbon actif et enfin traitées de façon analogue à l'exemple î. Ce mode opératoire conduit à la préparation de 28,4 g de produit, ce qui correspond à un rendement de 1,42 %. Le point de fusion du produit ainsi obtenu, déterminé au Banc Kofler, est de 2330C. Exemple 3. Dans cet exemple, on part de la plante entière qui est pulvérisée et extraite par l'isopropanol bouillant à raison de 6 litres par kg de Siegesbeckia Orientalis. La solution alcoolique ainsi obtenue est décolorée comme précédemment, concentrée par une opération d'évaporation sous vide à extrait mou,-puis reprise dans l'eau. Le "darutoside" est précipite par addition de potasse et isolé par centrifugation. il est remis en suspension dans l'eau, dont le pH est ajusté à 7, par exemple, par addition -d'acide chlorhydrique. Le "darutoside" est alors filtré, puis lavé sur le filtre jusqu'à élimination complète de tous les ions Cl . il est enfin-séché sous vide à une température de 1200C. Le rendement de ce procédé de préparation est de 1,4 % et le point de fusion, déterminé sur Banc Kofler, du produit ainsi obtenu est de 2330C. Exemple 4. 10 kg de Siegesbeckia Orientalis convenablement broyés, c'est-à-dire présentant une granulométrie comprise entre 0,3 mm et 1 mm, sont épuisés à l'ébullition par 50 litres d'éthanol pendant 1 heure. Après filtration, le marc est soumis à une seconde extraction conduite dans les mêmes conditions par 40 litres d'éthanol. Les deux solutions alcooliques ainsi obtenues sont réunies et traitées à 11 ébullition par du charbon actif pendant 10 à 15 minutes. La solution ainsi décolorée est soumise à une opération de concentration par évaporation sous vide à extrait mou et le résidu est alors solubilisé dans l'eau. Par addition de 1,5 litre de soude on fait précipiter le "darutoside". Ce dernier est alors isolé et traité comme indiqué dans les exemples précédents. Ce mode opératoire permet d'obtenir 160 g de produit ce qui correspond à un rendement de 1,6 %.Le point de fusion du produit ainsi obtenu est de 2350C. Ce produit peut être recristallisé dans l'alcool absolu ou dans des mélanges hydroalcooliques. On notera que dans le cas d'une recristallisation dans l'éthanol à 50S, le produit obtenu se présente sous la forme de belles paillettes blanches. L'analyse du produit obtenu, après cette recristallisation dans méthanol à 50 9b, a conduit aux résultats suivants P.F. = 2350C Analyse élémentaire : C = 62,55 et H = 9,05 (pourcentages théoriques : C = 62,15% et H = 9,16 %) Spectre infra-rouge : les bandes d'absorption principales se situent à 1040 cm-1, 1160 cm-1, et 3400 cm-1. Réactions colorées : coloration violette à la réaction de Liebermann ; et coloration rose avec H2S04 Le principe actif du Siegesbeckia Orientalis, isolé conformément à la présente invention, presente une action théra peutique et cosmétologique favorisant l'édification de la trame du collagène dans le tissu conjonctif cicatriciel. En effet, comme cela ressort des études pharmacologiques effectuées sur le produit obtenu conformément à la présente invention, ce principe actif, eutrophique du tissu conjonctif, favorise la production parfaite et régulière d'un tissu normal. Le produit obtenu conformément au procédé selon la présente invention qui est destiné à entrer, à titre d'agent actif, dans des compositions pharmaceutiques, se révèle peu toxique et son index thérapeutique (rapport entre la dose léthale 50 et la dose efficace 50) est de ce fait excessivement intéressante. Les études toxicologiques et pharmacologiques effectuées sur le produit obtenu Far le procédé de l'invention ont conduit aux résultats suivants I. Etude de la toxicologie et de la tolérance 1.- Toxicité aiguë du Earutoside" hez i souris a) voie buccale. Le test a porté sur les doses de 5 g par kg et de 3g par kg. L'essai a été mené sur deux lots homogènes de 20 souris mâles et femelles , de même provenance, d'un poids moyen de 20g, recevant une alimentation standard. Les résultats ont été réunis dans le tableau suivant Nombre d'animaux Doses mâles femelles Mortalité Pourcentage 5 g/kg 10 10 0/20 O 3 g/kg 10 10 Qj20 O il convient de noter que l'accroissement pondéral a été jugé comme étant parfaitement normal b) voie sous-cutanée L'essai a porté sur deux lots homogènes de 20 souris mâles et femelles.Les résultats ont été consignés dans le tableau ci-après : Nombre d'animaux Doses mâles femelles mortalité Pourcentage 3 g/kg 10 10 0 0 5 g/kg 10 10 O 0 Dans cet autre essai l'accroissetn6nt pondéral a également été parfaitement normal. En conclusion, la toxicité aiguë du principe actif du Siegesbeckia Orientalis,extrait conformément à la présente invention,a été nulle pour la souris-mâle et femelle de 20 g jusqu'à la dose de 5 g par kg, administre per os et par voie souscutanée. 2.- Tolérance La tolérance a été testéeJpour le"darutoside"obtenu conformément à la présente invention, sur cinq cobaye8 albinos adultes. L'application du produit à 1, 3 et 10 % dans un excipient neutre sur le flanc préalablement tondu, trois fois par semaine et durant deux semaines, n'a provoqué aucune réaction cutanée appréciable. La tolérance occulaire a été effectuée sur des lapins albinos et sur des souris. Après instillation dans le sac con oonctival de deux gouttes de solution (de concentration variant de 3 à 10 W), on observe le comportement de l'animal pendant trois minutes.-Pour ce produit testé aucune différence n'a été observée par rapport à un lot d'animaux témoins. Des tests épicutanés ont été conduits sur des lapins de race néozélandaise ; après avoir tondu les flancs on procède à des égratignures du stratum cornéum, les résultats évalués dtaprès l'échelle de Draize ont montré que pour ce produit l'in dice- d'irritation était nul. Les tests intradermiques ont été effectués par injection de 0,2 ml de solution à 1 ,0 de produit dans l'huile d'olive. Les injections sont répétées tous les jours sur les flancs prélablement tondus de cobayes ; après deux semaines de repos une in jection semblable est faite au-dessus de la zone des inJections précédentes. On compare alors la hauteur, le diamètre et la couleur des réactions. Toutes les observations effectuées montrent qu'il nty a ni irritation primaire ni phénomène de sensibilisation. En- conclusion, l'étude de la sensibilisation cutanée, de la tolérance occulaire, des tests épicutanés et des tests intradermiques, dans nos conditions expérimentales a permis de mettre en évidence la bonne tolérance du produit obtenu conformément à la présente invention. II. Pharmacologie. L'activité du Earutosidena été étudiéesur des plaies expérimentales du rat, ses lésions comportant une perte de substance relativement étendue. 1.- Matériels et méthode utilisés pour conduire l'étude pharmacologique. a) technigue opératoire. Le dos des rats est épilé 24 heures avant la blessure expérimentale. Sous une légère anesthésie à l'éther et après désinfection soigneuse de la peau, on dessine dans la région dorsale moyenné, sous la pointe de l'omoplate, un carré de 1,5cm de côté. Cette surface est ensuite découpée en ayant soin d'exciser l'épiderme, le derme et le fascia musculaire sous-cutané. La plaie ainsi obtenue présente une perte de substance à bords nets. b) mesure de la vitesse de~cicatrisation. L'évolution de la cicatrisation est appréciée par planimétrie. Les mesures sont effectuées régulièrement tous les 2 Jours jusqu'à l'obtention d'une cicatrisation complète. c) Etude histologique et histochimiqueL du tissu de réparation. Le tissu cicatriciel est prélevé en fin de traitement après obtention de la cicatrisation complète. Les colorations spécifiques du tissu conjonctif sont appliquées, cette étude est complétée par des réactions histochimiques qui permettent d'ap- précier.la composition de ce tissu nouvellement formé. )- methodeshistologiques Coloration de Masson, coloration de Nallory, coloration de Van Greson et coloration au bleu Azan. 2)- réactions histochimiques. réaction de Hale pour le MPS, réaction au bleu de tolui dine, réaction au bleu aldan (pH 0,5 et pH 2,5) orcéine pour la mise en évidence des fibres en élastine. d) Espèce animale, conditions de stabulation. Les plaies sont réalisées sur des rats Wistar mâles de poids homogène (150 g). Après l'intervention, les sujets sont isolés dans des cages individuelles stériles. Tous les animaux reçoivent la même alimentation synthétique U.A.R. e) Répartition des animaux, posologie. Les animaux sont groupés par lots de 10 suJets de poids aussi comparable que possible ; un groupe de 10 rats reçoit le darutoside, un autre groupe de 10 rats est utilisé à titre de témoins. La posologie quotidienne est de 1 g par rat et le traitement est appliqué 6 jours par semaine. 2.- Résultats. a) vitesse de cicatrisation. Sur le plan-planimétrique, les vitesses de cicatrisation dans le lot traité et le lot témoin sont comparables. La cicatrisation complète est obtenue après un traitement d'une durée de 20 jours. Cependant l'aspect clinique de la cicatrice est très différent dans le lot traité avec le"darutoside" En effet, le tissu qui comble la perte de substance est plus régulier et plus souple que celui observé dans le tissu témoin. Les cicatrices des plaies traitées par le"darutoside" sont fines, ne présentent pas de rétraction et sont parfaitement élastiques. D'après ces résultats, le"darutoside" agit sur l'édification de la tram? de collagène dans le tissu conjonctif cicatriciel et favorise la production régulière d'un tissu normal. b) données de l'examen histologique et de l'etude histochimigue du tissu de réqaration. i)-plaies témoins. Le tissu cicatriciel est très dense et riche en fibres de collagène, ces dernières constituant une trame fibreuse ramifiée et épaisse. Le revêtement épithélial recouvre complètement la cicatrice ; il tire son origine des bourrelets épidermiques qui bordent la cicatrice. il convient de remarquer que lton ne tnsve pesdbtibresd'élastine au sein du tissu cicatriciel. p)-plaies traitées. Le tissu de réparation des plaies traitées revêt un aspect régulier, les fibres de collagène étant ordonnées entre les lèvres de la plaie. C'est précisément cette régularité qui est responsable de la formation d'un tissu de réparation souple et très régulier. Entre les fibres de collagène, les réactions histochimiques révèlent la présence de MPS et il convient de noter qu'on ne trouve pas de fibres d'élastine. La souplesse du tissu de réparation est due à la répartition harmonieuse de la perte de substance qui possède une teneur en collagène équilibrée avec le taux de iPS. Les résultats très probants obtenus à la suite des essais pharmacologiques sur le produit obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, ainsi que la non agressivité cutanée ont permis de réaliser les essais cliniques suivants. Ces essais cliniques ont porté sur la mise en évidence des propriétés eutrophiques du tissu conJonctif du produit selon l'inven tion. 'A ce titre, il s'est avéré utilisable de façon très satisfaisante dans le traitement des brûlures, des plaies traumatiques ou opératoires, des cicatrices vicieuses, des chélofdes, des escarres, des vergétures. Les compositions pharmaceutiques contenant à titre de principe actif le produit obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention sont utilisables en médecine humaine ou vétérinaire et peuvent se présenter sous une forme convenant à lladeinistration par voie orale, par voie parente- rale, par voie rectale, ou par voie topique qui d'ailleurs se.- ble s'avérer comme la plus intéressante. Les formes convenables pour l'administration per os sont par exemple, les comprimés, les granulés, les capsules dures ou molles, les comprimés dragéifiés, les ampoules buvables etc. Les compositions administrables par voie parentérale, c'est-à-dire aussi bien par injection, sous-cutané, intraveineuse, intramusculaire et intrasternale ou des techniques d'infusion ou d'implantation peuvent se présenter sous forme de préparation stérile telle que les solutions, des suspensions ou des émulsions aqueuses contenant des agents de suspension, de dispersion, ou des mouillants tels que définis ci-dessus. Les compositions pharmaceutiques conformes à la présente invention destinées à l'administration par voie topique sont par exemple les pommades, les crèmes, les gels, les lotions, les ovules, etc. Bien entendu, la présente invention ne se limite pas, par exemple en ce qui concerne le procédé d'isolement du principe actif du Siegesbeckia Orientalis, aux exemples indiqués précédemment. Il est en effet parfaitement possible, sans pour autant sortir du cadre de l'invention, d'imaginer diverses variantes de ce procédé. C'est ainsi que, si dans la présente description il a été préconisé dtutiliser, pour épuiser le Siegesbeckia Orientalis, des solvants choisis parmi le groupe comprenant les alcanols dont le nombre d'atomes de carbone est compris entre 7 et 5, tels que par exemple le méthanol, méthanol, le n-butanol, et isopropanol, d'autres solvants tels que le tétrahydrofuranne, le dioxanne, l'acétate de méthyiN l'acétate d'éthyiX la méthyléthyl-acétone ainsi que l'acétone se sont également révélés,dans la pratique,comme étant tout à fait satisfaisants. REVENDICATIONS 1 - Procédé d'extraction du principe actif du Siegesbeckia Orientalis, caractérisé par le fait que l'on réalisé successivement les étapes suivantes : - on pulvérise finement le Siegesbeckia Orientalis puis on l'épuise à chaud, de préférence à l'ébullition grâce à un solvant organique approprié - on procède à une séparation et à une extraction du marc, puis on traite la solution alcoolique restante de manière à en éliminer les pigments - on procède à une concentration de la solution alcoolique ainsi décolorée puis le résidu provenant de cette opération de concentration est solubilisé dans l'eau - on précipite le "darutoside" par addition d'une base forte telle que par exemple NaOH ou KOH ; et - on neutralise, on cristallise et on sèche le précipité ainsi obtenu. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le traitement destiné à éliminer les pigments de la solution alcoolique restante consiste en un traitement par du charbon actif. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que le principe actif est précipité par addition d'un agent alcalin. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le Siegesbeckia Orientalis est pulvérisé de manière à atteindre une granulométrie comprise entre 0,3 mm et 1 mm. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'épuisement du Siegesbeckia Orientalis, préalablement finement pulvérisé, est obtenu par une ou plusieurs décoctions successives. 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que le solvant approprié utilisé pour l'épuisement du Siegesbeckia Orientalis est choisi parmi le groupe comprenant les alcanols dont le nombre d'atomes de carbone est compris entre 1 et 5, tels que par exemple le méthanol, l'éthanol, le n-butanol et l'isopropanol, ainsi que le tétra hydrofuranne, le dioxanne, l'acétate de méthyle, l'acétate d'éthyle, la méthyléthyl-acétone et l'acétone. 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que l'opération de concentration de la solution décolorée consiste en une évaporation sous vide à extrait mou. 8 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que le précipité de "darutoside" final obtenu est soumis à une opération de cristallisation ultérieure, par exemple dans méthanol à 50 56. 9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que les cristaux de "darutoside" ainsi obtenus sont soumis à une opération de recristallisation, par exemple dans l'alcool absolu ou dans des mélanges hydro-alcooliques. 10 - A titre de composé nouveau, le produit obtenu par la mise en oeuvre du procédé conformément à l'une des revendications 1 à 9. Il - Composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle contient, en plus des additifs et des supports habituels, à titre d'agent actif, le produit selon la revendication 10. 12 - A titre de médicament nouveau, le produit obtenu par la mise en oeuvre du procédé conformément à l'une des revendications 1 à 9.