FR 2257306 A1 19750808 FR 7400949 A 19740111 La présente invention concerne la production d'interféron à l'échelle industrielle en utilisant un procédé de culture des cellules en suspension. L'interféron est habituellement produit par l'induction de cellules animales développées par culturesen monocouches. Ce procédé d'induction permet d'obtenir des préparatiom d'interféron de titre élevé. Cependant, les cultures en monocouches ne se prêtent pas facilement à une production à l'échelle industrielle. Elles présentent une limitation inhérente a la taillespuisque les cellules se développent sur une surface solide et que, aeln d'obtenir un taux adéquat d'oxygénation pour la croissance cellulaire, il est nécessaire d'avoir un rapport élevé de la surface cellulaire au volume du milieu. Cette technique de culture comporte également un grand nombre d'opérations nécessitant des manLpulations très spécialisées, chacune comportant un risque de contamination On sait cependant que les cellules animales peuvent etre développées en culture en suspension dans une cuve unique, avec agitation, et en quantité virtuellement illimitée.L'oxygénation, le pB, et l'apport d'élémentsnutritifspeuvent etre automatiquement contrtlés pour obtenir des populations cellulaires plus nombreuses et une utilisation plus efficace du milieu nutritif que dans le cas des cultures en monocouches. Pour ces raisons, on a essayé pendant ces dernières années de produire des préparations d'interféron de titre élevé par culture en suspension; mais ces essais n'ont pas réussi, car les quantités d'interféron produites étaient faibles et ne présentaient par conséquent pas d'intérêt du point de vue de la production d'interféron à ltéchelle industrielle. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir, en culture en suspension, des taux d'interféron aussi élevés que ceux obtenus avec les memes cellules développées en monocouches Le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes - on cultive une souche cellulaire se développant en ligne continue,en suspension, dans une grande cuve de culture avec agitation, jusqu'a ce qu'on ait atteint la densité de saturation; - après addition å la culture cellulaire d'une petite dose d'interféron, spécifique de l'espèce à laquelle appartiennent les cellules commence l'étape d'amorçage, caractérisée par l'addition au début de cette étape de L-glutamine au milieu de culture pour maintenir les cellules dans un état métabolique actif, essentiel à la production maximale de l'interféron;; - a la fin de l'étape d'amorçage, on arrête l'agitation de sorte que les cellules se séparent par sédimentation par gravité et on aspire le liquide surnageant sous vide; - le culot cellulaire est remis en suspension dans une suspension très concentrée de virus inducteur, dans un volume aussi faible que possible, pendant l'étape d'adsorption; - après l'étape d'adsorption, le virus inducteur est éliminé par centrifugation, de façon à autre récupéré et réutilisé dans une autre opération; - le culot cellulaire remis en suspension est soumis à l'action d'inhibiteurs métaboliques pendant plusieurs heures; - après élimination des inhibiteurs par centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans le milieu nutritif sans sérum, et l'interféron se développe pendant l'étape dtincubation;; - les cellules sont séparées par sédimentation par gravité; - on récolte l'interféron produit dans le liquide surnageant qui peut etre concentré et purifié par les méthodes habituelles. Le procédé de l'invention, qui est caractérisé par la combinaison des étapes énumérées ci-dessus,présente également certaines caractéristiques particulières a l'une ou l'autre de ces étapes Tout d'abord l'addition de L-glutamine au début de l'étape d'amorçage est destinée à maintenir les cellules dans un état métabolique actif et est essentielle la production maximale d'interféron. D'autre part, l'étape d'adsorption du virus inducteur sur les cellules est caractérisée par le fait que les cellules sont remises en suspension dans un volume aussi faible que possible d'une suspension très concentrée de virus inducteur; cela a pour objet d'augmenter le contact entre le virus inducteur et les cellules, la concentration des cellules, et la concentration du virus étant toutes deux très élevées dans la suspension. Cette caractéristique est essentielle pour la production, partir de culture en suspension, de titres d'interféron aussi élevés que ceux obtenus dans les cultures en monocouches.On utilise-un volume de suspension virale qui est ainsi le 1/100e du volume de culture primitif de façon à obtenir une multiplicité d'infection égale a l'unit'é.e volume d'induction est critique 9 si on le réduit meme de moitié (c'est-a-dire au 1/200eu volume de culture primitif) il est difficile de remettre les cellules en suspension, ce qui a pour conséquence une perte importante des cellules; d'autre part, si on accroît le volume d'induction, il en résulte une réduction de la quantité d'interféron produite. Une autre caractéristique du procédé selon l'invention est le fait que le virus inducteur, séparé par centrifugation des cellules après l'étape d'adsorption, peut Être récupéré et réutilisé plus de huit fois dans des opérations ultérieures sans perte de sa capacité d'induction. Cela représente une économie importante, å l'échelle industrielle, du virus inducteur Enfin, le fait que les cellules sont séparées par sédimentation par simple gravité, dans deux des étapes du procédé, ctest-a-dire après l'étape d'amorçage et après I'étape d'incubation, rend le procédé très intéressant sur le plan industriel, puisque toutes les opérations peuvent Être effectuées automatiquement à l'aide de pompes mécaniques. Cela évite la nécessité d'opérateurs très spécialisés et réduit grandement les risques de contamination. Le procédé selon l'invention a été mis au point pour la préparation,d'une part,de l'interféron de souris et,d'autre part, de l'interféron humain, à partir, dans le premier cas, de cellules de souristransfor- mées par le virus sarcome, désignées cellules C-243-3 et, dans le deuxième cas, de cellules lymphoblastiques humaines désignées cellules ULR-4. Mais ce procédé peut également Être utilisé pour la production d'autres types d'interféron, par exemple:spécifiques de l'espèce porcine, de l'espèce bovine, et de l'espèce féline, si l'on dispose de lignées cellulaires appartenant à ces espèces et susceptibles de se multiplier en culture en suspension. Les exemples ci-après sont destinés S irlustrer la préparation dtinterferon de souris et d'interféron-humain, selon le procédé de l'invention, mais ne sont pas limitatifs. EXEMPLE 1 Procédé de préparation d'interféron de souris, par culture en suspension, L'étape de culture des cellules s'effectue dans une cuve de culture de 28 litres,avec agitation mécanique. La vitesse d'agitation mécanique est critique; elle est de 50 tr/mn. Si la vitesse d'agitation est trop élevée, les cellules sont tuées par cisaillement mécanique; si elle est trop lente, la culture est insuffisamment oxygénée. Des cellules de souris C 243-3 sont ensemencées à une concentration de 2 x W5 cellules par ml dans un milieu minimal essentiel de Eagle, modifié par Joilik, snpplémenté par 1070 de sérum de veau, et cultive X 370C. Pour une croissance optimale, le pll doit Être maintenu a une valeur de 7,2. Dans les conditions optimales, la densité de saturation cellulaire est obtenue pour une concentration de 1,5 x 106 cellules par ml Cette densité de saturation est atteinte après 48 h de croissance. On ajoute alors a la culturee petite dose d'amorçage d'interféron de souris, c'est- -dire 50 unités d'interféron de souris par ml. On ajoute également à la culture, de la L-glutamine a raison de 0,5 mg/ml pour maintenir les cellules dans un état métabolique actif. On laisse l'étape d'amorçage se poursuivre pendant 18 h 9 37OC. Douze heures après le début de l'amorçage, on stoppe l'agitation et on laisse les cellules se déposer par gravité pendant les 6 h restantes. On a montré que 6 h sont nécessaires pour obtenir une sédimentation complète des cellules. 90 à 95% du milieu nutritif épuisé sont aspirés sous vide. Le milieu résiduel contenant les cellules est centrifugé sous 2 000 g pendant 10 mn. Le culot cellulaire obtenu est remis en suspension dans une suspension de virus vivants de la maladie de Newcagtle, de souche Hertz, pour avoir une multiplicité d'infection de 1 dans un volume égal au 1/100e du volume de culture primitif. Par exemple, les cellules contenues dans 10 litres de liquide de culture initiale sont remises en suspension dans 100 mi de suspension de virus de maladie de Newcastle. Ce volume d'induction est critique et ne peut Stre,ni réduit, ni augmenté, sans inconvénient. La suspension de virus de la maladie de Newcastle est préparée par ultracentrifugation de liquide allantotque, les culot de virus étant remis en suspension dans du milieu minimal de Eagle à la concentration voulue. Après une retape d'adsorption de I h, les cellules sont sédimentées par centrifugation a 2 000 g pendant 10 mn et le virus inducteur est récupéré et stocké -700C jusqulà réutilisation. Les cellules séparées sont remises en suspension å une concentration de 107 cellules/ml dans un milieu essentiel minimal de Eagle avec 25 de sérum de veau. Cette concentration cellulaire n'est pas critique et peut Être accrue jusqu'à 5 x 107 cellules/ml si on le désire (c'est-a-dire que 6 litres de cellules, à une concentration de 1 x 106 cellules/ml, peuvent Être réduits à 1 litre ou mÊme 500 ml). On ajoute a la suspension cellulaire lOZg/ml de cyclohexamide et on agite les cellules comme préalablement décrit pendant 3 h, temps au bout duquel on ajoute 3 ug/mld1actinomYcine D. Après 2 h supplémentaires, les inhibiteurs sont éliminés par centrifugation A 2 000 g pendant 10 mn. I1 n'est pas nécessaire de laver le culot cellulaire. Le culot cellulaire est remis en suspension dans un volume de milieu nutritif sans sérum égal au volume de culture primitif, et incube pendant 18 h avec agitation. Au cours de cette étape d'incubation, l'agitation n'est pas critique. Les cellules sont ensuite laissées à sédimenter par gravité pendant 6 h, comme après l'étape d'amorçage. On aspire le liquide surnageant contenant I'llterféron et on concentre par fractionnement au sulfate d'ammonium pH 2, avec une récu pération de 100%. Cette étape staccompagne d'une purification importante. On a obtenu ainsi régulièrement des préparations d'interféron titrant 128 000 unités de référence internationales par ml. Dans de nombreux exemples, on a méme obtenu des titres de 512 000 unités par ml et 20 000 ml de cette préparation peuvent facilement Être produits par semaine par un seul technicien. La préparation d'interféron peut facilement autre concentrée cent fois par fractionnement au sulfate d'ammonium avec une récupération de 100%; on obtiendra ainsi 200 ml d'interféron ayant un titre de 1,28 x 107 unités par ml, par semaine. EXEMPLE 2 Préparation d'interféron humain. Un procédé identique à celui de l'exemple 1 a été mis en oeuvre pour obtenir de l'interféron humain à partir de cellules Iymphoblastiques humaines, désignées cellules ULR-4 La culture initiale des cellules s'effectue dans les mÊmes -conditions que celle des cellules de souris,C 243-3 et la densité de saturation est atteinte à une concentration de 1 x 106 cellules ULR-4 par ml. Les autres étapes s'effectuent de façon identique à celle de l'exemple 1. Par ce procédé, on obtient des préparations titrant 640 unités d'interféron humain par ml. En fait, cette lignée cellulaire est une faible productrice d'interféron puisque, dans les conditions habituellement connues, elle ne donne que 20 a 40 unités d'interféron par ml. Mais cette lignée cellulaire a été utilisée parce qu'elle est facilement disponible, et parce qu'elle permettait de montrer que le procédé selon l'invention est applicable å la production d'interféron humain. Pour exploiter de f-açon optimale le procédé selon l'invention pour la production d'interféron humain, il serait nécessaire de sélectionner, parmi les lignées cellulaires humaines actuellement connues, une lignée productrice de taux élevésdtinterféron. Ainsi, le procédé selon l'invention pourrait Être utilisé pour la préparation d l'échelle industrielle de grandes quantités d'interféron humain de titre élevé. L'interféron ainsi préparé à partir de lignées continues de cellules humaines, et purifié de façon convenable, pourrait Être utilisé dans le traitement de maladies, mettant notamment la vie en danger, telles que néoplasmes et infections virales généralisées. Le procédé selon l'invention peut également Être utilisé pour la production de grandes quantités d'interféron pour la médecine vétérinaire. Cette application du procédé est d'une grande importance puisqu'elle permettrait d'obtenir une thérapeutique ou une prophylaxie efficaces contre un grand nombre de maladies du bétail, préjudiciables l'économie, telles que fièvre aphteuse et peste bovine. REVEND I CA T I ON S hrocédé de préparation d'interféron de titre élevé par culture de cellules, d'abord traitées par l'interféron spécifique de l'espèce à laquelle appartiennent les cellules, en présence d'un virus inducteur, caractérisé en ce que la culture des cellules d'une lignée continue, pendant la période d'amorçage et pendant la période d'induction est effectuée en suspension. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes a) après avoir développé, par culture en suspension, une lignée cellulaire continue jusqu'a la densité de saturation du milieu en cellules, on ajoute au milieu de culture une dose amorçage d'interféron spécifique de l'espèce à laquelle appartiennent les cellules, et suffisawment de L-glutamine pour maintenir les cellule; dans un état metabolique actif, et on laisse L'amorçage se poursuivre pendant plusieurs heures å 370C, avec agitation convenable b) on arrte'l'agitation et sépare, par sédimPntation, les cellules du liquide surnageant ; c) le culot de cellules est remis en suspension dans le plus petit volume possible dlune suspension très concenttée de virus inducteur, et on laisse les cellules en contact avec le virus pendant 1 h environ et, après cette étape d'adsorption, on élimine le virus inducteur par centrifugation d) on expose ensuite les cellules k des inhibiteurs métaboliques, de manière connue, pendant plusieurs heures, puis on élimine les inhibiteurs par centrifugation ; e) les cellules sont remises en suspension dans un milieu nutritif sans sérum dans lequel on les laisse incuber pendant 15 à 20 h ; f) on sépare les cellules par sédimentation et le liquide surnageant qui contient l'interféron est récolte, puis concentré et purifié par des procédés connus. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que, au cours des étapes b et f, on laisse les cellules se sédimenter par simple gravité et, une fois le culot de cellules formé, on le sépare du liquide surnageant en aspirant celui-ci sous vide 4. Procédé selon l'une des reeendications 1 à 3* caractérisé en ce que > pour effectuer l'étape dtadsorptòn les cellules sont remises en suspension dans un volume égal au 1/100e du volume de milieu de culture initial, d'une suspension de virus inducteur de concentration telle que l'on ait une multiplicite dlinfection Egale à l'unité. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on utilise un virus inducteur, récupéré après l'étape d'adsorption c d'une opération précédente, le virus pouvant être réutilisé plus de 8 fois sans perdre de sa capacité d'induction. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 å 5, caractérisé en ce mulon prepare l'interféron spécifique de souris 9 partir d'une lignée continue de cellules dites cellules C 243-3. 7. Procédé selon llune des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on prépare l'interféron spécifique de l'homme à partir d'une lignée continue de cellules lymphoblastiques dites cellules ULR-4. 8. Procédé selon l'une des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que, pendant llétape a, selon la revendication 2, on agite mécaniquement le milieu de culture une vitesse de 50 tr/mn. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 j 8, caractérisé en ce mulon utilise comme virus inducteur le virus de la maladie de Newcastle.