FR 2262993 A1 19751003 FR 7407433 A 19740305 la présente invention à la realisation de laquelle ont participé Messieurs Jean FLORENT, Jean LUNEL et Madame Danise MANCY, concerne une nouvelle substance antibiotique designée ci-après par le numéro 31.359 RP, ses sels métalliques et ses sels avec les bases azotées, son procédé de préparation et les compositions qui la contiennent. Le 31.559 RP présente un intérêt tout particulier par suite de l'activité anticoccidienne qu'il manifeste à côté de son activite antibacterienne et de son activité antimalarique. Le 31.559 RP peut entre obtenu à partir des milieux de culture appropriés d'un nouveau microorganisme identifié plus complètement ci-apres, appartenant au genre Streptomyces et désigné par l'appellation Streptomyces hygroscopicus DS 24.367 (NRRL 5787). Le 31.559 RP contient du carbone, de l'hydrogène et de l'oxygène. La composition élementaire de son sel de sodium est voisine de : C % = 62,3 H % = 8,8 0 % = 24,3 Na % = 2,9 Son équivalent neutre (déterminé par dosage du sel de sodium en milieu acétique par l'acide perchlorique) est de 836 et la formule brute probable du sel de sodium est C44 H73 013 Na . Le sel de sodium du 31.559 RP est en outre caractérisé par les propriétés physico-chimiques suivante : - aspect poudre microcristalline blanche. - solubilité : - pratiquement insoluble dans l'eau - peu soluble dans les solvants hydrocarbonés tels que l'hexane - soluble dans les alcools tels que le méthanol, les cétones telles que l'acétone, dans la diméthylformamide et l'acétate d'éthyle - facilement soluble dans les solvants chlorés tels que le chlorure de méthylène et le chloroforme - point de fusion (déterminé au banc Kofler) : 220 C (décomposition) - pouvoir rotatoire : (c = 1,050 % , méthanol) [&alpha;]D20 = +51,2 # 1 [&alpha;]43520 = + 101 # 1,5 [&alpha;]36520 = + 167 # 2 - spectre ultra-violet : (détermination à partir d'une solution à 0,950 mg/ml dans l'éthanol) pas d'absorption caractéristique jusqu'à 210 Tri. - spectre infra-rouge : (détermination à partir de comprimés en mélange avec KBr). Ce spectre est représente par la figure 1 dans laquelle on a porté en abscisses, d1une part les longueurs dlondes exprimées en microns (échelle supérieure) et d'autre part les nombres d'ondes en cm-1 (échelle inférieure) et en ordonnées les densités optiques. Dans le tableau I, on indique les principales bandes d'absorption infra-rouge pour ce produit exprimées en nombre d'ondes (cm-1). TABLEAU I 3430 F 1372 ép. 1090 ép. 775 ép. 3180 F 1362 ép. 1072 F 765 ép. 2970 tF 1350 ép. 1065 ép. 748 m 2935 F 1335 ép. 1040 F 705 m 2925 ép. 1298 ép. 1018 F 655 ép. 2880 F 1292 m 1000 ép. 635 m 2825 m 1260 ép. 985 F 610 f 2600 ép. 1238 F 968 tF 590 tf 2060 tf 1220 ép. 940 F 570 ép. 1945 tf 1200 F 928 n 565 f 1850 tf 1190 ép. 912 F 550 f 1760 tf 1185 ép. 890 m 535 f 1730 tf 1170 F 870 F 500 tf 1630 ép. 1152 f 852 m 482 tf 1590 F 1140 ép. 828 m 420 m 1450 F 1115 F 815 ép. 378 f 1398 F 1108 ép. 792 ép. 350 m 1380 F 1092 tF 788 m tF = très forte F = forte n = moyenne f = faible tf = très faible ép.= épaulement Le sel de sodium du 31.559 RP peut être encore caractérisé par chromatographie ascendante sur couche mince de gel de silice en utilisant deux systèmes de mélange de solvants : - 1) acétate d'éthyle, cyclohexane, eau, butanol (50-50-25-5 en volumes) dans ce système, le sel de sodium du 31.559 RP a un Rf de 0,5. - 2) chlorure de méthylène, néthanol (94-5 en volumes) : dans ce système le sel de sodium du 31.559 RP a un Rf de 0,7. - activité bactériostatique in vitro la 31.559 RP montre une activité bactériostatique qui stexerce en particulier sur certaines bactéries prenant la coloration de Gram. L'activité bactériostatique du sel de sodiun du 31.559 RP vis-à- vis d'un certain nombre de germes a été déterminée par une des métbodes de dilution courament employées à cet effet. Pour chaque germe on a déterminé la plus petite concentration de substance active qui, dans des conditions définies, empoche tout développement visible dans un bouillon nutritif approprié. las résultats des diverses déterminations sont rassemblés dans le tableau II ci-après où les concentrations bactériostatiques minimales sont exprimées en microgr@nmes de substances par 2 N de milieu d'essai TABLEAU II Concentrations minimeles Organismes bactériens essayés bactériostatique@ (en g/cm3) Staphylococcus aureus, souche 209 P - ATCC 6538 P 0,8 Staphylococcus aureus, souche Smith 2,5 Sarcina lutea - ATCC 9341 1,9 Streptococcus faecalis - ATCC 8043 0,5 Streptococcus pyogenes hemolyticus, souche Dig 7 (Institut Pasteur) 0,8 Diplococcus pneumoniae, souche Til (Institut Pasteur) 0,2 Neisseria catarrhalis (A 152, Institut Pasteur) 50 Bacillus subtilis - ATCC 6633 0,8 Bacilles cereus - ATCC 6630 0,5 Mycobacterium species - ATCC 607 25 Escherichia coli - ATCC 9637 > 150 Shigella dysenteriae, Shiga L (Institut Pasteur) > 150 Salmonella paratyphi A (souche Lacasse, Institut Pasteur) > 150 Salmonella schottmuelleri (paratyphi B), (souche Fougenc, Institut Pasteur) > 150 Proteus vulgaris > 150 Pseudomonas aeruginosa > 150 Toxicité Chez le poussin, la dose létale 50 % (DL50) du sel de sodium du 31.559 RP est de 150 mg/kg p.o. en administration unique. Activité anticoccidienne L'activité anticoccidienne du sel de sodium du 31.559 RP a été déterminée chez le poussin infesté notemment par Eineria tenella et Eimeria acervulina. L'activité anticoccidienne du sel de sodium du 31.559 RP incorporé à la nourriture se manifeste à des concentrations non toxiques comprises entre 0,005 et 0,04 Z en poids de produit contenu dans l'aliment. Activité antlmalarique Le sel de sodium du 31.559 RP manifeste également une activité antimalarique vis-à-vis des infestations expérimentales à plasmodium du poussin et de la souris. L'organisme producteur de l'antibiotique 31.559 RP est une souche de streptomyces qui a été isolée à partir dtun échantillon de terre prélevé en Inde, et à laquelle a été attribué le numéro DS 24.367. Un échantillon de cet organisme a été déposé au Northern Regional Research Laboratory de lU. S. Department of Agriculture à Peoria, 111. (Etats-Unis) où il a été enregistré sous la référence NRRL 5787. Cette souche se rattache à l'espèce Streptorzyces hygroscopicus dont les caractéristiques essentielles ont été définies par H.D. TRESNER et E.J. BACKUS (Applied Microbiology, 4 243.250, 1956) et par S.A. WAKSMAN (The Actinomycetes, II, The Williams and Wilkins Company, Baîttiore, 1961, p. 230-231). Ctest pourquoi elle a été désignée par l'appellation Streptomyces hygroscopicus? souche DS 24.367. Streptonyces hygroscopicus DS 243-67 présente en effet les trois caractères suivants, qui correspondent à ceux par lesquels ll.D. TRESNER et E.J. BACKUS ainsi que S.A. WAKSMUN définissent l'espèce Streptomyces hygroscopicus a) ses sporophores se terminent d'une manière générale en spirales serrées ayant un enroulement de quelques tours ;; ces sporophores spiralées sont habituellement groupés le long d'un filenent en formant des grappes plus ou moins allongées b) son mycélium aérien sporulé, lorsqutil est arrivé à un bon stade de développement, montre une coloration gris. foncé correspondant à celle montrée par l'espèce Streptomyces hygroscopic@s c) sur certains milieux de culture permettant un bon développement du mycélium aérien, apparition par vieillissement dans les surfaces sporulées de zones noirest brillantes, d'aspect humides caractéristiques de l'espèce Streptomyces hygroscopicus. Streptomyces hygroscopicus DS 24.367 forme des spores ovales à cylindriques, mesurant environ 0,8 à 1,0 1 0,6 à 0,8 p. I1 se développe bien à 250C, moins bien à 370C, et pas à 50 C. Il ne forme pas de pigment mélanique sur les milieux organiques, ne produit pas H2S, liquéfie la gélatine, réduit fortement les nitrates en nitrites, hydrolyse l'amidon et utilise la cellulose. Za procédé de préparation du 31.559 RP consiste essentiellement à cultiver Streptomyces hygroscopicus DS 24.367 ou ses mutants producteurs sur un milieu et dans des conditions appropriés et à séparer le produit formé au cours de la culture. La culture de Streptonyces hygroscopicus DS 24.367 peut Qtre effectuée par toute méthode de culture aérobie en surface ou en profondeur mais cette dernière est à préférer pour des raisons de commodité. On utilise à cette fin les différents types d'appareils qui sont d'un usage courant dans 11 industrie des fermentations. On peut en particulier adopter la marche suivante pour la conduSte des opérations Streptomyces hygroscopicus DS 24.367 - stock culture sur gélose culture en fiole agitée culture inoculun en fermenteur culture de production en fermenteur te milieu de fernentation doit contenir essentiellement une source de carbone et une source d'azote assimilables, des éléments minéraux, en particulier des chlorures, et éventuellement des facteurs de croissance, tous ces éléments pouvant entre apportés sous forme de produits bien définis ou par des mélanges complexes, tels qu'on en rencontre dans des produits biologiques d'origines diverses. Corme sources de carbone assimilable, on peut utiliser des hydrates de carbone tels que le glucose, le maltose, les dextrines, l'amidon ou d'autres substances hydrocarbonées comte des sucres alcools (glycérol) ou conme certains acides organiques : acides lactique, citrique. Certaines huiles animales ou végétales comme lthuile de lard ou l'huile de soja peuvent remplacer avantageusement ces différentes sources hydrocarbonées, ou leur être adjointes. Les sources convenables d'azote assimilable sont extrêmement variées. Elles peuvent entre des substances chiniques très simples conne les sels minéraux ou organiques dammonium, l'urée, certains acides aminés. Elles peuvent aussi être apportées par des substances complexes contenant principalement l'azote sous forme protidique : caséine, lactaîbumine, gluten et leurs hydrolysats, farine de soja, dtarachides de poisson, extraits de viande, de levure, distillers' solubles, corn-steep. Parni les éléments minéraux ajoutés, certains peuvent avoir un effet tampon ou neutralisant comme les phosphates alcalins ou alcalinoterreux ou les carbonates de calcium ou de magnésium. D'autres apportent l'équilibre ionique nécessaire au développement de Streptomyces hygroscopicus DS 24.367 et à 11 élaboration du 31.559 RP comme les chlorures et sulfates des métaux alcalins et alcalino-terreux. Enfin certains agissent plus spécialement comne activateurs des réactions métaboliques de Streptonyces hygroscopicus DS 24.367, ce sont les sels de zinc, de cobalt, de fer, de cuivre, de manganèse. la pH du milieu de fermentation de départ de la culture doit Qtre conpris entre 5,8 et- 7,8 et de préférence entre 6,2 et 7,4. La tempé- rature optimale pour la fermentation est comprise entre 25 et 300C, mais une production satisfaisante est obtenue pour des températures comprises entre 23 et 33 C. L'aération de la fernentation peut varier entre des valeurs assez larges. On a cependant trouvé que des aérations de 0,3 à 3 litres d'air par litre de bouillon et par minute conviennent particulièrement bien. Le rendement maximal en 31.559 RP est obtenu après 2 à 8 jours de culture, ce temps dépendant essentiellement du milieu utilisé. D'après ce qui précède, on conquit que les conditions générales de la culture de Streptonyces hygroscopicus DS 24.367 pour la production du 31.559 RP peuvent varier dans une large mesure et être adaptées à chaque nécessité particulière. Le 31.559 RP peut être isolé des morts de fermentation de la manière suivante : Le moût est filtré à un pH acide, généralement compris entre 3 et 6 et de préférence voisin de 5. L'activité retenue dans le gêteau de filtration en est extraite à l'aide dt un solvant approprié, alcool inférieur, par exemple le méthanol ou un solvant chloré tel que le chlorure de méthylène. Après un traftenent alcalin appropriétle 31.559 RP peut être isolé sous forme de sel de sodium à partir des solutions mentionnées ci-dessus par cristallisations après concentration sous pression réduite éventuellement suivie dtune dilution par un non-solvant ou un mauvais solvant et d'un séjour en chanbre froides Le 31.559 RP ou son sel de sodium peut entre purifie par les méthodes classiques en usage, telIe que la cristallisation, la chromatographie sur divers agents adsorbants ou la distribution à contre-courant. L'exemple suivant, donné à titre non limitatif, montra comnent 11 invention peut être mise en pratique. Exemple A) - Fermentation On charge dans un fermenteur de 170 litres : - peptone .o 1200 g - extrait de levure ... 600 g - glucose monohydraté ... 1200 g - gélose ... 240 g - eau de ville complément pour ... 110 litres Le pH est ajusté à 7,30 par addition de 70 cm3 de soude 10 N. On stérilise le milieu par barbotage de vapeur à 1220C pendant 40 minutes. Après refroidissement du fait de la condensation de la vapeur au cours de la stérilisation, le volume du bouillon est de 120 litres et le pH est de 6,65. On ensemence alors avec 200 cm3 dune culture en erlenmeyer agité du Streptomyces hygroscopicus DS 24.367. La culture est développée à 270C pendant 25 heures en agitant et en aérant avec de l'air stérile ; elle est alors convenable pour l'ensemencement de la culture productrice. La culture productrice est effectuée dans un fermenteur de 600 litres chargé avec les substances suivances: distillers' solubles ... 2 kg - haricots en grains ... 10 kg - glycérine ... 6 kg - chlorure de sodium ... 2 kg - solution de chlorure de cobalt hexa hydraté, à 20 g/I 0,4 litre - eau de ville q.s.p. ... 365 litres Le pH du milieu est ajusté à 7 > 50 par addition de 200 cn3 de soude 10 N, puis on stérilise le bouillon par barbotage de vapeur à 1220C pendant 40 minutes.Après refroidissement, du fait de la condensation de la vapeur au cours de la stérilisation, le volume du bouillon est de 390 litres ; il est complété à 400 litres par addition de 10 litres de solution aqueuse stérile contenant : - glucose monohydraté e.. 4 kg Le pH du milieu est égal à 6,65 ; on ensemence avec 40 litres de la culture inoculum en fermenteur de 170 litres décrite ci-dessus. La culture est développée à 270C durant 113 heures en agitant avec une turbine tournant à 205 tours/minute et en aerant avec un volume dtair stérile de 20 m3/h. En fin d'opération, le pH de la culture est de 7,65 et le volume de 360 litres. B) - Extraction indiqué précédemment 400 litres de moût obtenu comme/sont amenés à pli 5 par addition de 2,8 litres d'une solution d'acide chlorhydrique 6 N puis agités pendant une deni-heure. Après addition de 20 kg d'adjuvant de filtration, le moût est filtré sur filtre-presse et le g8teau de filtration est lavé sur le filtre par 100 litres d'eau dont le pli est ajusté à 5 par une solution d'acide chlorhydrique 6 N. te filtrat et le lavage sont éliminés. Le gâteau de filtration est délité dans 300 litres de méthanol 9 le mélange obtenu ajusté à pH 7 par addition de 200 cm3 de soude 6 N et agité pendant une demi-heure Le mélange est filtré sur filtre-presse et le gât@au de filtration lavé sur le filtre par 80 litres de méthanol. Le filtrat et le lavage sont réunis et concentrés sous pression réduite (5 à 10 mm de mercure) de façon à obtenir 30 litres de concentrat aqueux. Ce concentrat est ajusté à pH 3 par addition de 290 cm3 d'acide chlorhydrique 6 N, puis agité pendant 10 minutes en présence de 30 litres de chlorure de méthylène. las deux phases sont séparées. On extrait encore deux fois selon ce procédé la phase aqueuse par 30 litres de chlorure de méthylène à chaque fois. tes trois extraits chlorométhyléniques sont réunis et agités avec 9 litres d'eau en acidifiant jusqu'à obtention de pH 3 dans la phase aqueuse (20 cn3 d'acide chlorhydrique 6 N). La phase organique est séparée et lavée par 18 litres d'eau, en ajoutant de la soude jusqdà obtention de pH 9t5 dans la phase aqueuse (20 cm3 de soude 6 N). La phase chlorométhylénique est concentrée sous pression réduite (5 à 10 mm de mercure) jsqu'au volume de 1 litre. C) - Purification Le concentré chlorométhylénique obtenu précédemment est versé lentement dans 170 litres d'hexane à la température ambiante. La solution est filtrée, on sépare ainsi 63 g d'un insoluble inactif. la filtrat est concentré sous pression réduite (5 à 10 mm de mercure) jusqu'à un volume de 0,5 litre environ. Gette solution est agitée pendant 2 heures à la température de 0 C puis on laisse reposer 24 heures à + 4 C. Les cristaux obtenus sont isolés par centrifugation de la solution puis lavés par 250 cm3 dthexane à 44 C et sechés sous pression réduite. On isole ainsi 103 g du sel de sodium du 3I.559 RF. D) - Recristallisation 57 g du sel de sodium du 31,559 RP précédemment obtenu sont mis en solution dans 1,2 litre d'acétone et agités pendant 15 minutes. On ajoute 2,5 g de noir décolorant lavé à acide chlorhydrique, puis agite à nouveau pendant une denf-heure et enfin sépare le noir décolorant par filtration. Le filtrat agité lentement est additionné de 750 cm3 dteau distillée. La sel de sodium du 31.559 RP cristallise lentenent à la température de 0 C. Les cristaux sont isolés par filtration, lavés par 150 cm3 du mélange acétone/eau (50-50 en volumes) et séchés sous pression réduite à 35 C. On obtient 35 g du sel de sodium du 31.559 RF. Par concentration des eaux-mères à la moitié de leur volume ini tial, puis refroidissenent à 40C, on obtient à nouveau 13,2 g de sel de sodium du 31.559 RP. Un autre objet de la présente invention est constitué par les compositions anticoccidiennes qui contiennent le 31.559 RP ou ses sels métalliques ou sels avec les bases azotées et, plus particulièrement, par les aliments mixtes pour animaux ou les mélanges concentrés pour l'ali- mentation animale renfermant le 31.559 RP ou ses sels métalliques ou sels avec les bases azotées, éventuellement en présence dtun autre agent anticoccidien. La dose nécessaire pour produire un effet convenable peut naturel liement varier dans d'assez larges limites suivant la valeur des alinents euxmêmes. D'une façon générale, il suffit que les rations alimentaires mises à la disposition des animaux contiennent de 0,005 à 0,04 % en poids de 31.559 BP ou de ses sels métalliques ou sels avec les bases azotées. Le 31.559 RP ou ses sels métalliques ou sels avec les bases azotées peut entre réparti en dispersion uniforme dans les aliments composés complets aux doses ci-dessus. I1 peut titre réparti dans les aliments complémentaires, le plus souvent avec d'autres additifs tels que vitamines et sels minéraux. Ces aliments complémentaires peuvent entre soit mélangés à la ration, soit consommés tels quels, et représentent habituellement 5 à 20 % de la ration. Les "prémixes", utilisés pour la préparation des rations complètes ou des aliments complémentaires contiennent habituellement de 0,05 à 20 % de 31.559 RP ou de ses sels nétalliques ou sels avec les bases azotées dilué dans une charge alimentaire. Ils constituent un intermédiaire commode facilitant la répartition uniforme du produit actif dans les aliments. las prémixes eux-ntmes sont généralement obtenus à partir de concentrés qui contiennent de 99,9 à 20 % de 31.559 BP ou de ses sels métalliques ou sels avec les bases azotées additionné de dénaturants comestibles tels que colorants alimentaires, aromatisants, agents dispersants ou évitant l'agglomération et charges alimentaires. Les concentrés et préfixes sont généralement pulvérulents. Les aliments complémentaires et les aliments conposés complets peuvent être soit pulvérulents, soit sous forme de granulés prépares selon les techniques habituelles. L'exemple suivant, donné à titre non limitatif, illustre une composition selon l'invention Exenple : On prépare un aliment de base ayant la composition suivante - farine des issues de céréales ... 13,41 % - farine d'orge ... 13,41 % - farine de mars ... 13,41 % - farine de blé ... 31,32 % - farine de poisson ... 8,92 % - farine de soja ... 8,92 % - farine de fourrage déshydraté ... 4,56 % - extraits de levure ... 2,33 Z - lait sec en poudre ... 2,68 % - chlorure de sodium ... 0,09 % - chlorure de calcium ... 0,89 % - éléments minéraux ... 0,06 % - complexe vitsminique r vitamine A ... 4000 UI/kg vitamine D3 ... 1000 UI/kg chlorure de choline ... 11,5 mg/kg ribofiavine ... 2,24 mg/kg A cet aliment, on ajoute et répartit uniformément 0,02 % de sel de sodium du 31.559 RP. R E V E N D I C A T I O N S 1. Nouvelle substance antibactérienne et anticoccidienne désignée par le numéro 31.559 RP ainsi que ses sels métalliques et ses sels avec les bases azotées et dont le sel de sodium est caractérisé en ce que - c'est une poudre microcristalline blanche, pratiquement insoluble dans l'eau, peu soluble dans les solvants hydrocarbonés tels que l'hexane, soluble dans les alcools tels que méthanol, les cétones telles que l'acétone, soluble dans le diméthylformamide et l'acétate d'éthyle, facilement soluble dans les solvants chlorés tels que le chlorure de méthylène et le chloro- forme, - sa composition centésimale est voisine de C % = 63,2 H % = 8,8 0 % = 24,8 Na % =2,9 - son point de fusion est de 220 C (avec décomposition) - son pouvoir rotatoire t (c = 1,050 % - méthanol) [&alpha;]D20 = +51,2 # 1 [&alpha;]43620 = + 101 # 1,5 [&alpha;;]36520 = + 167 # 2 - il ne présente pas d'absorption caractéristique dans l'ultraviolet - son spectre infra-rouge présente des bandes d'absorption à r 3430, 3180, 2970, 2935, 2925, 2880, 2825, 2600, 2060, 1945 1850, 1760 1730, 1630, 1590, 1450, 1398, 1380, 1372, 1362, 1350, 1335, 1298, 1292, 1260, 1238, 1220, 1200, 1190, 1185, 1170, 1152, 1140, 1115, 1108, 1092, 1090, 1072, 1065, 1040, 1018, 1000, 985, 968, 940, 928, 912, 890, 870, 852, 828, 815, 792, 738, 775, 765, 748, 705, 655, 635, 610, 590, 570, 565, 550, 535, 500, 482, 420, 378, 350 chez - en chromatographie ascendante sar couche mince de gel de silice avec comne solvant le mélange acétate d'éthyle e cyclohexane - eau - butanol (50-50-25-5 en volumes) il y a un Rf de 0t5 et avec omme solvant le mélange chlorure de méthylène - méthanol (94/6 en volumes) un Rf de 0,7 - son activité anticoccidienne se manifeste chez le poussin à des concentrations minimales comprises entre 0,005 et 0,04 % en poids dans la nourriture. 2 i Un procédé de préparation du produit selon la revendication i et ses ses sels a caractérisé en ce que l'on cultive de façon aérobie Streptomyces hygroscopicus DS 24.367 (NRRL 5787), ou ses mutants producteurs, sur un milieu classique convenable et dans des conditions habituelles pour ce genre de culture puis sépare le 31.559 BP formé au cours de la culture éventuellement sous fonce d'un sel et le purifie. 3 - Compositions anticoccidiennes utilisables dans l'alimentation animale contenant le 31.559 BP etlou ses sels métalliques et sels avec les bases azotées, éventuellement en association avec d'autres agents anticoccidiens. 4 - la nouveau microorganisme Streptomyces hygroscopicus DS 24.367 (NRRL 5787).