FR 2258175 A1 19750818 FR 7402195 A 19740123 La présente invention, réalisée au centre de recherche Pierre Fabre, concerne un procédé de purification des hétérosides -stéroliques, en particulier des hétérosides stéroliques extraits des rhizomes de Ruscus aculeatus L. (encore appelé petit houx"), et également 11 obtention d'extraits de Ruscus aculeatus L. ayant un titre défini en hétérosides stéroliques. tes rhizomes de Ruscus aculeatus L. contiennent différents principes actifs dont le groupe le plus important est constitué par les hétérosides stéroliques à action veinotonique, qui, par hydrolyse, conduisent aux prosapogénines et aux génines. Les pharmacopées n'exigent aucun titre en principe actif des extraits végétaux, il en résulte des variations assez sensibles dans la teneur en hétérosides stéroliques des extraits fluides de Ruscus type Codex. Ainsi, selon les origines de la plante et la période de la récolte, les écarts peuvent varier de 0,45 à 1,20 g d'hétérosides stéroliques pour 100 g d'extraits type Codex, ce qui conduit à des variations correspondantes dans les activités thérapeutiques de ces extraits. Pour remédier à cet inconvénient, il était donc indispensable de mettre au point des extraits fluides, des extraits mous et des extraits secs de Ruscus, titrés en principes actifs, dont les effets et les propriétés pharmacologiques seraient bien définis et constants. Afin de pouvoir obtenir facilement de tels extraits titrés, la présente invention propose un procédé de purification conduisant à des poudres d'hétérosides stéroliques pratiquement purs à 100 ci et à des solutions ou produits intermédiaires de compositions définies, en particulier des extraits contenant 20, 50 ou 80 * d'hétérosides stéroliques. il existe déjà de nombreux procédés permettant d'obtenir les hétérosides stéroliques de Ruscus aculeatus L. plus ou moins purs, en particulier des procédés de précipitation par changement de solvant, des méthodes d'absorption par des produits tels que la silice, l'alumine, la magnésie, lekieselgur, le noir animal, des méthodes d'extraction solide-liquide utilisant des solvants peu polaires tels que le benzène, l'éther de pétrole, le chloroforme, et enfin, des procédés d'extraction liquide-liquide. aucun des procédés de la technique antérieure n'a, jusqu'ici, permis d'obtenir des hétérosides stéroliques très purs avec un bon rendement et dans des conditions facilement industrialisables. Ceci est dû, en particulier, au fait que les hétérosides stéroliques, de parleur structure chimique, sont dotés de propriétés tensio-actives non négligeables, ce qui se traduit par une très grande facilité à former des associations avec des substances variées, et, en particulier, dans les extractions de type liquide-liquide, la présence d'un agent tensio-actif peut perturber de façon importante le déroulement de ltextraction en modifiant les caractéristiques des interfaces, par exemple. La présente invention concerne un procédé de purification mettant en oeuvre une extraction liquide-liquide, dans des conditions telles que l'on obtient un rendement très important en hétérosides stéroliques avec des puretés pour les hétérosides stéroliques de l'ordre de 100 0. Pour cela, la présente invention pro-pose un procédé de purification des hétérosides stéroliques, en particulier des hétérosides stéroliques de Ruscus aculeatus L., par extraction liquide-liquide, caractérisé en ce que l'on extrait une phase organique contenant, au moins, un solvant des hétérosides stéroliques (butanol), par une phase aqueuse dont le pli est ajusté à 13 ou plus à l'aide d'une base, en ce que les hétérosides stéroliques sont en solution dans l'une des deux phases avant l'extraction et en ce qu'après décantation, on sépare les hétérosides stéroliques obtenus de la phase organique. La présente invention est fondée sur la.découverte que l'utilisation d'une phase aqueuse, à un pH supérieur à 13, permet, par rapport aux procédés dans lesquels on extrait une phase aqueuse contenant les hétérosides stéroliques et dont le pH est normalement voisin de la neutralité, de conserver un coefficient de partage des hétérosides stéroliques excellent, tout en augmentant de façon considérable la solubilité, dans la phase aqueuse, des impuretés associées en général aux hétérosides stéroliques. On -conçoit alors aisément, compte tenu de ce qui précède, que la présente invention englobe à la fois les procédés dans lesquels les hétérosides stéroliques sont en solution aqueuse et sont extraits par la phase organique alors que les impuretés sont maintenues en solution aqueuse, et les procédés dans lesquels les hétérosides stéroliques sont en solution dans le solvant organique, les impuretés étant extraites par la solution aqueuse tandis que les hétérosides stéroliques sont maintenus dans la phase organique Dans un mode de réalisation préféré du procédé selon la présente invention, la phase aqueuse contenant les hétérosides stéroliques utilisés lors de l'extraction liquide-liquide est la solution obtenue par traitement des rhizomes de Ruscus aculeatus L. bruts ou de préférence sous forme-finement divisée, par de l'eau sous pression avec chauffage après séparation du marc et concentration éventuelle de la solution surnageante jusqu'à une teneur de 50 ffi en matière sèche, le pH de la solution ainsi obtenue étant rendu égal ou supérieur à 13 à l'aide d'une base. Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la phase organique contenant les hétérosides stéroliques qui subit l'extraction liquide-liquide est obtenue par extraction des rhizomes de Ruscus aculeatus t. bruts par de l'eau sous pression avec chauffage.comme précédemment, décantation de la phase surnageante, concentration éventuelle puis extraction .une ou plusieurs fois par un solvant des hétérosides stéroliques de ladite phase ou concentrat, ceci sans que le pH de la solution aqueuse ait été rendu basique. La phase organique qui subira l'extraction liquide-liquide de purification est constituée par la réunion des phases organiques de l'extraction précédente. Dans d'autres modes de réalisation du procédé selon la présente invention, on prépare des poudres titrant 20 4E, ou 80 % d'hétérosides stéroliques que l'on redissout ensuite, si on le désire, dans l'eau ou- un solvant des hétérosides stéroliques afin de constituer la phase aqueuse ou organique qui subira l'extraction liquide-liquide de purification après ajustage, s'il s'agit d'une phase aqueuse, du pH à 13 ou plus. Dans l'un de ces modes de réalisation on prépare une poudre titrant 20 ffi d'hétérosides stéroliques à partir d'une solution concentrée titrant environ 50 'de de matière sèche obtenue par le procédé déjà décrit, par atomisation de cette dernière solution. Dans un autre mode de réalisation, on prépare une poudre titrant 80 ffi d'hétérosides stéroliques par extraction des rhizomes de Ruscus aculeatus L. par de l'eau sous pression avec chauffage, séparation du marc, concentration éventuelle, extraction une ou plusieurs fois de la solution surnageante avec un solvant des hétérosides stéroliques, concentration des extraits organiques réunis par évaporation, et atomisation de la solution concentrée pour obtenir la poudre titrant 80 % (1'hétérosides stéroliques. Il est également intéressant de concentrer les phases organiques obtenues, sur de l'eau, jusqu'à obtention d'une phase aqueuse exempte de butanol, et, par atomisation de cette phase aqueuse d'obtenir une poudre titrant 50 % d'hétérosides stéroliques. tes différentes solutions ou poudres intermédiaires ainsi obtenues font également partie de la présente invention. Les bases utilisées pour ajuster le pH de la solution aqueuse à 13 ou plus sont choisies, de,preférence, parmi les hydroxydes de métaux alcalins ou alcalino-terreux, en particulier la soude ou la potasse, mais il est entendu que d'autres bases sont utilisables, pourvu qu'en solution aqueuse elles puissent conduire à un pH de l'ordre de 13. Le solvant des hétérosides stéroliques est, de préférence, choisi parmi les alcools aliphatiques pas ou peu miscibles avec l'eau (ou une solution aqueuse à pH supérieur à 13), et est en particulier le n-butanol, toutefois, les solvants connus des hétérosides stéroliques sont également utilisables dans le procédé selon la présente invention. Selon la présente invention, on utilisera de préférence le solvant des hetérosides stéroliques pur, mais il peut être utilisé en mélange avec un solvant inerte ou faiblement polaire ou bien on peut utiliser un mélange de solvants des hétérosides stéroliques. Il doit être évidemment compris que l'extraction liquide-liquide selon l'invention peut être réitérée, ainsi, il est possible d'extraire une phase aqueuse contenant les hétérosides stéroliques plusieurs fois par un -solvant organique mais il est possible également d'extraire une phase aqueuse contenant les hétérosides stéroliques puis de réextraire la phase organique ainsi obtenue par une solution de base à pi 13 afin de parfaire la purification, toutes les combinaisons sont possibles et entrent dans le cadre de la présente invention. Après décantation, les hétérosides stéroliques purifiés sont séparés de la phase organique par des méthodes qui sont connues. Toutefois, dans tous les cas il sera bon de prévoir un lavage à l'eau de la phase organique afin d'éliminer la base qui est inévitablement entrainée lors de l'extraction, il peut même, dans certains-cas, être nécessaire d'éliminer les traces de la base à l'aide d'une colonne échangeuse d'ions contenant une résine acide du type Amberlite IRC 50 par exemple. Lorsque la phase organique a été débarrassée de la base entraînée, on procède de préférence à une concentration jusqu'à un début de précipitation puis le concentrat est laissé au repos à basse température pendant quelques heures puis filtré, lavé et séché, de préférence par chauffage sous vide ; lorsque le solvant employé est du n-butanol, on peut utiliser, à titre d'exemple, une température de séchage de l'ordre de 100 C sous 15 mm de mercure. La poudre obtenue dans ces conditions présente un titre en hétérosides stéroliques voisin de 100 %. te rendement global de l'opération est de l'ordre de 50 à 80 *. Dans une variante du procédé de concentration, on peut effectuer la concentration de la phase organique sur de l'eau, la solution aqueuse d'hétérosides stéroliques ainsi obtenue peut alors entre atomisée de façon à obtenir une poudre avec un rendement e-t un titre semblables à ceux décrits précédemment. Pour l'utilisation thérapeutique il est particulièrement intéressant de préparer une solution éthanolique titrant 2 ffi d'hétérosides stéroliques. Cette solution peut être obtenue aisément à partir des poudres purifiées titrant 100 * d'hétérosides stéroliques par simple dilution, mais il est possible d'obtenir évidemment une telle solution à partir des poudres intermédiaires. Il est également possible de préparer directement une solution éthanolique titrant au voisinage de 2 7t d'hétérosides stéroliques en reprenant le concentrat contenant 50 go de matière sèche par de ltéthanol à 960 puis en décantant. Il est, en général, intéressant de titrer les solutions thérapeutiques préparées, même si ell-es ont été obtenues par dilution d'une poudre titrant normalement 100 d'hétérosides stéroliques. Pour cela, on utilise, de préférence, le processus expérimental suivant Dosage Dans une fiole jaugée à 100 cm3 on introduit une prise d'essai exactement pesée de 0,020 g d'hétérosides stéroliques témoins, on dissout cette prise d'essai dans de l'acide sulfurique concentré puis on complète au volume. On laisse reposer la solution pendant au moins 1 heure (cette solution sera appelée I). Dans une autre fiole jaugée à 100 cm3 on introduit une prise d'essai d'extrait de Ruscus exactement pesée, voisine de 0,050 g (obtenue par dessication d'une solution aqueuse ou organique). On ajoute à cette prise d'essai de l'acide sulfurique concentré et l'on agite jusqu'à dissolution, le volume est ensuite complété à 100 cm3. Cette solution est mise au repos pendant au moins 1 heure (cette solution sera appelée II). A l'aide de la solution I on prépare la gamme étalon suivante :1 2 3 4 5 Solution I . 0 5 ml 12,5 ml 20 ml 25 ml :S04H2 concentré, qsp 100 ml mg d'hétérosides stéroliques: 0 1 2,5 4 5 % ml de solution sulfurique 0 1 2,5 4 5 : ml. de solution sulfurique On mesure la densité optique de chacune des solutions étalons par rapport à un blanc et l'on représente graphiquement les variations de la densité optique en fonction de la concentration.Par mesure de la densité optique de la solution II, on en déduit sa concentration en hétérosides stéroliques et après calcul, celle de l'extrait. Connaissant la concentration de l'extrait, il est alors facile d'ajuster,par exemple, sa teneur en hétérosides stéroliques à 2 %. tes exemples qui suivent sont donnés dans le but d'illustrer les caractéristiques et avantages particuliers de l'invention mais ne la limitent aucunement. Exemple 1 Obtention d'un concentrat titrant 50 ffi d'extrait sec a) Extraction Dans un réacteur en acier inox on procède à l'extrac- tion de 150 kg de rhizomes de Ruscus finement broyés (granulométrie 1 mm) par 2 000 1 d'eau déminéralisée à 110 C. La pression est de 0,5 bar ; la vitesse d'agitation de 50 t/mn ; l'extraction dure 1 heure. Après refroidissement, on décante sur un décanteur type Westfalia SDA 230 à une vitesse de 5 500 t/mn pendant 45-50 mn. On clarifie alors les jus sur un clarificateur type SAMR 3036 jusqu'à l'obtention d'une solution limpide. b) Concentration On procède ensuite à une concentration sous vide dans un appareil à double effet jusqu'à l'obtention d'un concentrat titrant 50 % d'extrait sec (concentrat A). Exemple 2 Préparation d'une poudre d'hétérosides stéroliques purifies On ajuste le pH d'un concentrat obtenu par le procédé de l'exemple 1 à 13 à l'aide d'une solution de soude N. La solution basique ainsi obtenue est extraite volume à volume, trois fois de suite, par du n-butanol. Les impuretés fortement colorées apparaissent après décantation dans la phase aqueuse, tandis que les hétérosides stéroliques restent dans la phase organique. Les phases butanoliques réunies sont lavées à l'eau puis traitées au noir animal afin d'éliminer les dernières impuretés colorées. Cette phase organique est concentrée jusqu'à début de précipitation, le concentrat est laissé au repos à + 5tC pendant 4 heures puis filtré, lavé et séché à 1000C sous un vide de 1-5 mm de mercure. Les analyses donnent les résultats suivants titre de la poudre en hétérosides stéroliques : 98-100 , rendement de l'opération : 50-70 %. Exemple 3 Obtention d'une poudre titrant environ 20 % d'hétérosides stéroliques L'extrait concentré obtenu à l'exemple 1 est desséché par atomisation en observant les paramètres suivants .-température d'entrée de l'air : 2000C, . température de sortie : 950C, . vitesse de turbine : 16 000 t/mn. On obtient ainsi un atomisat titrant environ 20 %d'hétérosides stéroliques, le rendement par rapport au poids de rhizomes étant d'environ 18 à 20 %. Exemple 4 Obtention d'une poudre titrant environ 80 fui d'hétérosides stéroliaues te concentrat obtenu à l'exemple 1 est soumis à trois extractions butanoliques successives à la température ambiante. L'extrait butanolique qui en résulte est alors concentré dans un évaporateur à plaque avant d'être desséché par atomisation en respectant les paramètres suivants . température d'entrée de l'air : 2000C, . température de sortie : 1000C, . vitesse de turbine : 22 000 t/mn. Exemple 5 Obtention d'une poudre titrant environ 50 % d'hétérosides stéroliques A partir du concentrat obtenu à l'exemple 1 on procède à quatre extractions successives par le butanol. Les phases butanoliques sont réunies et concentrées sur de l'eau jusqu'à obtention d'une phase aqueuse exempte de butanol. L'atomisation de cette phase-aqueuse permet d'obtenir un extrait titré à 50 % d'hétérosides stéroliques. Exemple 6 Obtention d'une poudre d'hétérosides stérolipues purifiés A partir de l'extrait butanolique obtenu à l'exemple 4, on réalise une extraction liquide-liquide par une solution de soude à pH 13 qui dissout les impuretés associées à lthétéroside stérolique. La- phase organique alors obtenue est lavée à l'eau afin d'éliminer la majeure partie de la soude qui a pu s'y dissoudre puis la solution organique est passée-sur une colonne de résine échangeuse d'ions du type Amberlite IRC 50. L'éluat est ensuite concentré jusqu'à début de précipitation puis filtré, lavé et séché comme dans l'exemple 2. La poudre blanche obtenue contient les hétérosides stéroliques à l'état pur. Le rendement de l'opération est de l'ordre de 55 à 75 %. Exemple 7 On opère comme dans l'exemple ?, mais au lieu de concentrer la phase organique finale obtenue dans l'exemple 2, on effectue une concentration sur de l-'eau ; la solution aqueuse alors obtènue est atomisée. Les hétérosides stéroliques contenus dans l'atomisat sont obtenus à l'état pur (98 à 100 %). Comme il est possible de le constater, les différentes étapes du procédé selon la présente invention sont facilement industrialisables, en particulier les extractions liquideliquide peuvent être réalisées à l'aide d'un des nombreux appareils disponibles industriellement pour la mise en oeuvre de cette technique, notamment des extracteurs de type mélangeur-décanteur, extracteur à contre-courant et autres. La réalisation de telles opérations en continu ne pose aucun problème, ce qui rend le procédé d'autant plus intéressant sur le plan industriel tes hétérosides stéroliques ainsi obtenus sont utilisables à titre de médicaments, en particulier comme veino-toniques. étude pharmacologique et clinique L'extrait fluide utilisé pour cette étude est titré à 2 % d'hétérosides stéroliques. La toxicité aiguë des extraits à 2 % d'hétérosides stéroliques est des plus réduite et elle est pratiquement celle d'une solution alcoolique à 50 %. Après administration per os, prolongée pendant un mois (toxicité subchronique), il n'a pas été possible, lors de l'autopsie (rats Wistar), de relever des anomalies macroscopiques et histologiques au niveau des viscères. La moyenne des courbes pondérales des animaux traités a été presque superposable à celle des animaux témoins. Action anti-inflammatoire On provoque chez le rat un oedème à la carragénine dans la patte ; les animaux traités par 0,5 à 1 ml/kg d'extraits de Ruscus aculeatus L. administrés per os voient leur oedème regresser 2 à 3 heures après l'administration les pourcentages de diminution ont été trouvés proportionnels aux doses et en tous cas valables sur le plan statistique. Les extraits expérimentés en clinique sous forme de préparations orales et rectales ont donné des résultats très intéressants dans le traitement des syndrômes variqueux et pré-variqueux et le syndrôme des "jambes lourdes". La posologie moyenne a été de 1,5 ml d'extrait par jour. Dans le cas de la crise hémorroïdaire aiguë, des résultats excellents ont été obtenus avec une posologie d'attaque de trois fois 1,5 à 2 ml par jour. De très bons résultats ont été également obtenus avec des formes composées dans lesquelles avec l'extrait de Ruscus aculeatus L. étaient administrés simultanément le couple vitaminique P et C et un salidiurétique. Les différents produits employés n'ont jamais donné lieu à des intolérances et ont surtout donné des résultats thérapeutiques constants. REVEND ICAT IONS 1) Procédé de purification des hétérosides stéroliques, notamment des hétérosides stéroliques de Ruscus aculeatus B., par extraction liquide-liquide, caractérisé en ce que l'on extrait une phase organique alcoolique par une phase aqueuse dont le pH est ajusté à 13 ou plus à l'aide d'une base, en ce que les hétérosides stéroliques sont en solution dans l'une des deux phases avant ltextraction et en ce qu'après décantation, on sépare les hétérosides stéroliques de la phase organique. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'avant Itextraction les hétérosides stéroliques sont en solution dans la phase aqueuse. 3) Procédé selonla revendication 1, caractérisé en ce qu'avant l'extraction les hétérosides stéroliques sont en solution dans la phase organique. 4) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la phase aqueuse utilisée est une solution obtenue par extraction des rhizomes de Ruscus aculeatus L. par de l'eau sous pression avec chauffage, après séparation du marc et après ajustage du pi de la solution obtenue à 13 ou plus à l'aide d'une base. 5) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'on prépare un concentrat aqueux titrant environ 50 9 de matière sèche par extraction des rhizomes de Ruscus aculeatus S. par de l'eau sous pression avec chauffage, séparation du marc et- concentration de la solution jusau'à ce qu'elle titre 50 do de matière sèche, ce concentrat constituant alors la phase aqueuse à extraire 6) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on prépare une poudre titrant 20 c, d'hétérosides stéroliques par extraction des rhizomes de Ruscus aculeatus L. par de l'eau sous pression avec chauffage,-séparation du marc, concentration du surnageant jusqu'à 50 $ de .matière sèche et atomisation du concentrat, ladite poudre contenait alors 20 $ d'hétérosides stércliques et pouvant ensuite etre remise en solution dans l'eau-ou dans une phase alcoolique pour constituer la phase à extraire. 7) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la phase organique utilisée est obtenue par extraction des rhizomes de Ruscus aculeatus L. bruts par de l'eau sous pression avec chauffage, puis extraction de la solution aqueuse ainsi obtenue à l'aide d'un solvant alcoolique, laphase solvant ainsi obtenue constituant la phase organique à extraire. -, 8) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l-'on extrait les rhizomes de Ruscus aculeatus t. par de l'eau sous pression avec chauffage, concertration du surnageant puis en ce que l'on réalise une extraction liquide-liquide du concentrat obtenu par un solvant des hétcro3ides stéroll.ues et en ce que l'on atomise les phases organiques réunies pour obtenir une pouce titrant 80 % d'hétérosides stéroliques, ladite poudre pouvant être remise en solution dans l'eau ou dans un solvant alcoolique pour constituer la phase à extraire. 9) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on extrait les rhizomes de Ruscus aculeatus t. par de l'eau sous pression avec chauffage, en ce que l'on concentre le surnageant puis en ce que lton réalise une extraction liquide-liquide du concentrat obtenu par un solvant des hétérosides stéroli1ues et en ce que l'on concentre la phase solvant obtenue sur de l'eau jusqu a obtention d'une phase aqueuse exelmlpte-ae solvant puis en ce que l'on atomise la phase aqueuse obtenue pour donneur une poudre titrant 50 % d'hétérosides stéroliques, ladite poudre pouvant être remise en solution dans l'eau ou dans un solvant alcoolique pour constituer la phase à extraire. 10) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on extrait les rhizomes de Ruscus aculeatus t. par de l'eau sous pression avec chauffage, en ce que lton concerte le surnageant et en ce que l'on extrait le concentrat avec l'alcool éthylique à 960 pour obtenir une solution alcoolique titrant 2 % d'llétérosi.des stéroliques. 11) Procédé selon l'une des revendications 1 à10, caractérisé en ce que la base utilisée est un hydroxyde de métal alcalin ou alcalins-terreux. 12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la base utilisée est la soude ou la potasse. 13) Procédé selon l'une~des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le solvant alcoolique utilisé est le n-butanol. 14) Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que les hétérosides stéroliques sont séparés de la phase organique par concentration de la phase organique jusqu'à précipitation des hétérosides stéroliques.