FR 2241260 A1 19750321 FR 7412324 A 19740408 La présente invention a trait à un procède pour la conservation des extraits végétaux et animaux ou substances similaires, destinés en particulier à l'industrie alimentaire, grâce à un système protecteur antioxydant biologique, en particulier le système acide ascorbique-oxydase ascorbique. Elle se rapporte aussi aux produits ainsi obtenus, produits qui sont susceptibles d'une longue et parfaite conservation. Pour la conservation des produits alimentaires ou biologiques, en général, on sait qu'il existe actuellement divers procédés physiques, chimiques ou enzymatiques. Cependant, aucun de ceux-ci ne satisfait pleinement les exigences d'une conservation parfaite, inoffensive, simple et économique. C'est ainsi que la chaleur détruit les vitamines du produit à conserver, en altère le goût, entraîne une dépense non négligeable pour l'appareillage et l'énergie thermique. L'anhydride sulfureux, l'acide sulfureux et ses sels transforment l'odeur et le goût, impliquent un travail difficile en particulier pour la main-d'oeuvre, à cause de l'odeur et de l'agressivité de l'anhydride sulfureux lui-mme ; dans le cas de produits qui au cours du travail s'oxydent immédiatement par phénolase endogène, très active, on a besoin de quantités très élevées d'anhydride sulfureux pour réduire les composés oxydés ainsi formés et pour inhiber l'action de la phénolase présente. Demeure en outre le problème technique d'écarter l'anhydride sulfureux, ce qui est particulièrement difficile pour les produits qui ne doivent pas tre réchauffés. L'usage d'acides, comme le malique et le citrique, peut altérer le goût et produire un abaissement du pH, pas toujours souhaitable, et un alourdissement des dépenses. Mme l'acide ascorbique, avantageux à bien des égards, présente des inconvénients, comme on le verra plus loin. Enfin, mme les systèmes visant à éliminer l'oxygène par application du vide et sa substitution par un gaz inerte, sont difficiles et coûteux et ne permettent pas d'atteindre à des niveaux de vide ou à un déplacement d'oxygène suffisants dans des conditions économiques compétitives. Comme nous l'avons mentionné ci-dessus il y a un conservateur intéressant, de diffusion relativement récente, pour extraite végétaux, animaux et autres produits biologiques en solution ou suspension : c'est l'acide ascorbique, en tous points avantageux par rapport à l'anhydride sulfureux. Son mécanisme d'action comprend la réduction des produits (par exemple polyphénols) oxydés par la phénolase, laquelle phénolase opère une oxydation successive et une telle alternance d'oxydation et réduction se répète jusqu'à l'inactivation de la phénolase ; après quoi l'acide ascorbique reste présent comme protecteur réducteur d'une ultérieure oxydation et une diffusion de l'oxygène dans le milieu et sert en mme temps de vitamine, Ce procédé, toutefois, présente l'inconvénient de nécessiter une grande quantité d'acide ascorbique, ce qui, entre autres pourrait altérer le produit à protéger ; et son action protectrice n'est pas toujours efficace. En outre, existent des oxydases ascorbiques endogènes, qui peuvent oxyder l'acide ascorbique et par conséquent en éliminer l'action protectrice. Il était déjà connu que, dans la nature, dans les organes végétaux et microbiens, l'enzyme oxydase ascorbique présente est en mesure de catalyser la réaction de réduction de l'oxygène en présence d'acide ascorbique et homologues, selon la réaction suivante : acide ascorbique + 1/2 0 O. A. yDéhydroascorbique + H2 () (O. A. = oxydase ascorbique) C'est en partant d'une telle constatation que s'orientèrent les recherches pour l'étude de la possibilité d'application pratique d'une telle réaction dans le domaine de la conservation, en particulier des produits alimentaires, mais aussi biologiques en général, et que l'on arriva au résultat : surprenant de la présente invention et précisément à l'observation que, en associant a l'acide ascorbique l'oxydase-ascorbique, le système ainsi obtenu agit par l'élimination directe de l'oxygène (à la différence de l'acide ascorbique seul qui réduit les composants oxydés (par la phénolase) et non l'oxy- gène) et par conséquent empche l'action de la phénolase en la privant d'oxygène. Ce système acide ascorbique oxydase ascorbique laisse d'une part inaltéré, d'un point de vue physique et chimique, le produit qu'il protège, et d'autre part agit en quantité minime permettant une conservation des carac téristiques originales plus stable, meilleure et plus durable, à meilleur prix. I1 s'agit donc en pratique d'un catalyseur biologique (acide ascorbique-oxydase ascorbique) qui empche l'oxydation des composants organiques en solution aqueuse, réalisant un système antioxydanr biologique contre les altérations organoleptiques (par exemple brunissements d'oxydation). En pratique, les réactions qui se déroulent en présence du système acide ascorbique-oxydase ascorbique, selon l'invention, sont les suivantes : (1) polyphénols (les polyphénols sont t des composés qui arrivent à se trouver en contact avec la phénolase, à la suite de l'homogénéisation, qui rompt les organisations cellulaires spécifiques qui les séparent dans le produit naturel) + oxygène + ph6nolase 20-quinones (2) acide ascorbique T oxygène oxydase ascorbique acide dehydroascorbique. en milieu fermé 2 La réaction (2) est accélérée par rapport à la réaction (1) avec l'adjonction d'une teneur plus élevée d'oxydase asorbique par rapport à la phénolase présente, et de ce fait l'oxygène est consumé et ne peut donc plus agir ; en pratique, on soustrait à la phénolase l'oxygène dissous dans le milieu aqueux (extrait végétal ou animal ou solution aqueuse d'origine orga- nique) et on en empche l'action. Cette élimination de l'oxygène du milieu empche aussi naturellement le fonctionnement des autres enzymes oxydasiques présentes, qui pourraient concourir à l'altération organoleptique des produits A conserver. De cette façon on obtient une protection efficace sans altérer aucunement la couleur et le goût naturel du produit original, protection facilement applicable avec des. installations déjà en place sur de grandes masses, et par conséquent, avantageuse du point de vue économique. Les ali- ments ainsi protégés sont qualitativement et quantitativement meilleurs et peuvent se conserver longuement s'ils sont enfermés dans une enveloppe imperméable à l'oxygène atmosphérique. Le système protecteur selon la présente invention est réalisable également avec les homologues de l'acide ascorbique (comme l'acide dextroascorbique, l'acide dextro-isoascorbique, l'acide dextro-glucoascorbique et les acides réductiques, ou bien avec des donneurs spécifiques d'hydrogène, oxydables par l'oxydase ascorbique (comme par exemple l'acide réductique) en quantité telle qu'ils consument tout l'oxygène du milieu et pourvu qu'ils aient les caractéristiques structurelles : a) posséder une forme anionique b) avoir un système conjugué c) tre oxydables à quinoxdes par semiquinoides d) contenir un atome avec une paire d'électrons non liés, diagonalement opposés à l'atome ayant un caractère anionique, et un tel atome doit tre à une dis & tance approximative de 5, 8-6, 2A par rapport à l'atome anionique, de telle façon qu'il y ait interaction avec des groupes placés 1 la surface de l'enzyme Les composés cités, et en particulier l'acide ascorbique, peuvent tre employés seuls ou mélangés avec leurs homologues. Dans le groupe des substances ci-dessus mentionnées, l'acide ascorbique s'est démontré particulièrement apte au but proposé et reste préférable soit par son coût modeste, soit parce qu'il est un produit naturel à action vi taminique., et par conséquent non toxique pour l'organisme animal, mme à doses élevées (1-10 g par jour). La quantité totale de conservatjeur peut tre introduite en plusieurs doses successives dans les extraits végétaux ou autres k protéger et les quantités employées au cours de l'opdration peuvent varier de 0, 001 mg ! ml à 10 mg/ml d'extrait. L'acide ascorbique peut tre ajouté en nem temps que l'enzyme oxydase ascrobique ou bien séparément. L'acide ascorbique et les homologues cités ci-dessus et les donneurs d'hydrogène ci-dessus décrits, peuvent tre employés dans n'importe quelle solution contenant de l'oxydase ascorbique et peuvent se présenter sous forme de granulés, en poudre, de lente solubilisation ou sous forme de cristaux. L'avantage de l'emploi de l'acide ascorbique est que celui-ci est parfaitement métabolisable par l'organisme humain et par conséquent ne produit pas une accumulation de produits qui puissent devenir toxiques. L'enzyme oxydase ascorbique peut tre libre ou bien rendue insoluble par des supports inertes comme la farine fossile, l'argile ou autres semblables. Afin de mieux illustrer le concept inventif de cette découverte on rapportera quelques exemples du processus suivi dans la réalisation de l'inven- tion elle-mme, et, pour une meilleure compréhension, la description en sera effectuée sur la base des dessins joints selon lesquels : -la figure 1 est une représentation schématique d'un appareil à usage de laboratoire ; -la figure 2 est une représentation schématique d'un appareil A semi-industriel ; -la figure 3 est un schéma de travail d'un suc comme décrit dans l'exemple 6. Pour les expériences qu'on va rapporter on a fait usage d'un appareil constitué d'un récipient de verre 1, muni d'une bride 2 qui permet de fermer hermétiquement à épreuve-de gaz le récipient, Une telle bride est adaptée au couvercle de verre 3 ; la tenue est assurée par deux anneaux munis de vis et contre-vis, pourvus de deux papillons de façon à permettre la fermeture à la main. Le couvercle présente à sa partie supérieure un entonnoir 5 avec un robinet à 2 branches, de verre 5, qui permet de fermer hermétiquement le récipient. Le récipient de verre possède trois robinets pour le pressage des gaz, dont deux inférieurs (A, B) et un troisième (5) déjà cité. La disposition des robinets A et B permet de produire un tourbillon, et par conséquent un lavage complet de l'atmosphère présente dans le récipient. Un quatrième robinet C est mis u fond et sert a vider le récipient. Dans les expériences faites en laboratoire (figure 1), on peut introduire par l'entonnoir 4 d'abord indifféremment ou l'acide ascorbique ou l'enzyme et, en soulevant le couvercle, on introduit le à protéger en mme temps respectivement que l'enzyme ou l'acide ascrobique ; on ferme ensuite hermétiquement le couvercle et on agite ; on lave le récipient en éliminant l'oxygène de 1'espace au-dessus du liquide, par exemple avec de l'azote introduit en A et refoulé en B ; on ferme les robinets A et B, et on fait passer dans le récipient l'acide ascorbique (ou respectivement l'enzyme) ; la réaction suivante est presque instantanée et la masse se décharge de C dans lepasteurisateur (non représenté). Sur la figure 2, le récipient 1 dans lequel se produit la réaction est d'un seul bloc, avec deux robinets A et B décalés dans la position et le branchement, comme dans la figure 1, de façon à produire un tourbillon au passage de l'azote. La masse traitée se décharge par le bas (C) ; le col de l'entonnoir descend jusque dans la partie supérieure interne du récipient 1. EXEMPLE 1 On prépare un jus de pomme, avec l'homogénéisation de 1/2 kg de pommes pelées, sans trognon et traitées dans un homogénéisateur à couteaux, contenant de l'eau + acide ascorbique (0,1 mg/ml-10 mg/ml) ; la solution aqueuse peut tre sucrée avec 1-40 de saccharose, glucose ou autre substance permise par les lois en vigueur Après l'homogénéisation, l'homogénéisé (700 ml) est versé dans l'appareil par l'embout supérieur et on ajoute l'oxydase de l'acide ascorbique (0,01-0 ; mg de protéine enzymatique), libre ou associée à un support. Après l'addition de l'enzyme, la suspension est agitée avec un agitateur et le récipient est fermé hermétiquement. Les robinets sont alors ouverts et l'on fait passer le gaz inerte de lavage (azote) Après quelques minutes, le récipient est fermé. Dans de telles conditions, ou bien après remplissement de confections fermées, le jus reste de couleur stable et la conservation après pasteurisation peut astre extrmement prolongée. On ne vérifie aucun brunissement enzymatique dans du matériel ainsi conservé. EXEMPLE 2 L'homogénéisé de 1/2 kg de banane auquel on a ajouté de l'acide ascorbique et de l'eau sucrée, selon les modalités précédemment décrites, est mis dans le récipient déjà décrit. On ajoute 0,1-10 mg d'oxydase ascorbique et on agite pendant quelques minutes après l'addition d'acide ascorbique. Le récipient est lavé par atmosphère inerte et puis fermé hermati- quement. Le robinet du fond est ouvert et l'homogénéisé est versé dans des récipients fermés, aptes à la pasteurisation, qui doit tre rapide et non prolongée dans le temps. Le matériel ainsi conserve garde sa couleur originale et ses caractérisciques organoleptiques pendant longtemps, sans laisser apparaître le brunissement dû à l'enzyme phénolasique. EXEMPLE 3 On ajoute au jus obtenu de la pression de dix citrons, 1 mg d'acide ascorbique et le pH du jus est porté à 4 avec du citrate de calcium et du gluconate de sodium. Le tout est mis dans le récipient et on ajoute de l'oxydase ascorbique (1 mg-100 mg) selon les modalités déjà décrites et dans un récipient fermé. On lave ensuite l'atmosphère supérieure avec un gaz inerte. Après ce traitement, le liquide est versé dans un récipient adéquat à fermeture hermétique pour la pasteurisation. Le dosage des constituants naturels dans le jus pasteurisé démontre une teneur égale à celle déterminée dans le jus frais, et le produit ainsi traité présente une couleur naturelle. Aucun brunissement enzymatique ne se manifeste Le produit peut tre longuement conservé dans de telles conditions. EXEMPLE 4 A un extrait de pulpe de pche ou bien de légumes divers (aubergines, carottes, épinards, etc.) on ajoute de l'acide ascorbique, avec ou sans substance sucrante. On traite l'extrait comme on l'a déjà décrit, avec de l'oxydase ascorbique (1 mg-100 mg ? et on le met dans l'appareil précé- demment décrit ; on lave ensuite l'atmosphère avec le gaz inerte. Après le traitement le suc est mis dans des récipients hermétiquement fermés et soumis à la pasteurisation. Le matériel ainsi traité se conserve longtemps sans présenter d'altérations dues à la phénolase ou à des brunissements enzymatiques. EXEMPLE 5 10 q, de bananes, à un degré de maturation commercial, épluchées, sont passés à travers un pressoir continu à pas de vis constant et une profondeur de filet décroissante de l'introduction à la sortie. La purée ainsi obtenue contient un certain pourcentage d'air s'étant incorporé dans le passage à travers l'appareil au cours de l'opération ou provenant du fruit lui-mme. Une telle quantité d'air, dissous dans la substance, est normalement suffisante pour qu'agissent les phénolasesendogènsdu fruit. En effet, l'enzyme catalyse (en 2-3 heures au plus) des réactions de brunissement telles qu'elles altèrent, de façon plus ou moins intense, la couleur et le goût de la purée. Grâce à la technologie expérimentée selon cette invention, il est possible de produire du suc de banane de couleur blanche stable, avec des caractéristiques de goût et d'arôme semblables à celles du fruit frais. Avant d'tre pressée, la banane est immergée dans une solution de 1% d'acide ascorbique. A la purée ainsi obtenue et recueillie dans un récipient A on ajoute et mélange une solution de saccharose, 5 g, Vitamine C 100 mg, par litre d'eau. Le produit fluide ainsi obtenu est immédiatement passé dans un récipient de réaction du type habituellement utilisé comme désaérateur (figure 3). On y introduit par B une solution aqueuse de l'enzyme oxydase ascorbique, dans une concentration variable entre 2 et 100 mg, de préférence entre 5 et 30 mg, par quintal de produit, selon les caractéristiques de la matière première et de l'opération. Le suc est ensuite passé dans un récipient fermé (C) où il reste 2 minutes, poussé par une motopompe et sous vide, et pénètre ensuite dans l'homogénéisateur par aspiration (D) et puis dans le pasteurisateur (non représenté) pour le traitement thermique de stabilisation. A la sortie du pasteurisateur, le jus est mis en botte ou en bouteille à la température de 70 C en présence d'azote. I1 est ensuite refroidi sous une pluie d'eau. En opérant comme décrit ci-dessus, par voie catalytique selon l'in- vention, et en privant la masse du produit de l'oxygène selon les schémas de réaction enzymatique exposés, au lieu de la désaération physique insuffisante, jusqu'alors pratiquée, on obtient les meilleurs résultats. Enfin les hautes températures de pasteurisation utilisées pour la stabilisation du produit final se sont révélées aptes à rendre complètement inactifs les enzymes présents et à les dénaturer. Le contenu résiduel en acide ascorbique est résulté de mg 3%. Après un mois de conservation à 30 C aucune perte sensible n'a été notée. Le produit ainsi obtenu peut tre conservé pendant une période supérieure à un an et conserve sans altération les caractéristiques organoleptiques du produit frais. En effet, au teintomètre de Levibond des échantillons additionnés de O. A. ont donné après 30 jours de conservation à 30 C, des valeurs équivalences au blanc ivoire. EXEMPLE 6 Le procédé a été appliqué avantageusement aussi au jus de citron. Avant l'opération l'acidité du jus de citron a été tamponné avec du citrate de calcium ou du gluconate de soude à pH 4, 00, sans ajouter de saccharose. Le produit fini, traité comme précédemment, se présente de couleur jaune citron et reste inaltéré, dans les confections fermées sous azote, pendant au moins 6-12 mois. EXEMPLE 7 L'arôme naturel de nombreux produits végétaux est obtenu industriellement par un procédé de pression de fruit ou du végétal d'homogénéisation et de successive concentration de l'extrait aromatique. On peut conserver un tel extrait pendant des périodes de temps qui vont de quelques mois à un an, avec l'addition d'acide ascorbique et en appliquant toutes les mesures propres à éviter le contact de l'oxygène. Malgré de telles précautions, après un an environ, l'extrait concentré acquiert une couleur et un goût désagréables qui ne feront qu'empirer avec le temps. O n v a ra pp ort er un exemple qui a pour but de mettre en évidence les avantages obtenus avec la méthode de l adJonction de l'oxydase ascorbique selon l'invention. Cinq quintaux de framboises, obtenus de produits frais, achetés au marché, sont passés à la machine et le jus, après élimination de la partie solide, est soumis à la concentration dans un concentrateur d'où le jus est aspiré dans les appareils de conservation au moyen d'un tube. L'enzyme oxydase ascorbique (50 mg pour 4 q d'extraits) est versée dans un récipient placé en aval des ballons des concentrateurs et on ajoute au jus de l'acide ascorbique (3 mg/ml). Le jus est concentré jusqu'à 20% de résidu et conservé dans un récipient fermé. Après un an de conservation, le produit apparaît inaltéré de couleur et de goût, avec des caractéristiques organoleptiques semblables à celles du fruit frais. Des épreuves de conservation jusqu'à 12-20 mois et plus ont donné des résultats analogues. Comme il résulte des exemples rapportés ci-dessus, le produit obtenu après traitement avec le système acide ascorbique-oxydase ascorbique selon cette invention, est à la fin stabilisé par pasteurisation qui a pour but de prévenir la contamination par des microorganismes et de rendre les enzymes inactifs. Il est possible toutefois, de recourir, pour la stabilisation, à d'autres techniques comme la congélation, la stérilisation par la chaleur, la déshy- dratation ou la lyophilisation. Bien que la présente invention ait été décrite comme applicable à la conservation des produits alimentaires, son application ne doit pas se limiter à ce domaine. Elle pourrait se démontrer utile dans d'autres cas où se présentent des problèmes analogues, d'élimination de l'oxygène dissous dans un liquide (solutions, suspensions, masses gélatineuses et autres) en systèmes fermés : comme par exemple dans le domaine des cosmétiques, d'opérations en anaérobiose (par exemple purification des enzymes) de la conservation de préparations biologiques, soit animales, soit végétales, de préparatiors enzymatiques, dans la mise en boite de produits et ainsi de suite. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la conservation d'extraits végétaux, animaux et semblables, caractérisé en ce que l'on ajoute au milieu liquide à protéger un système biologique enzymatique apte à éliminer l'oxygène présent dans le milieu, système constitué d'un donneur spécifique d'hydrogène et d'oxydase ascorbique, le donneur d'hydrogène présentant : les caractéristiques structurales suivantes : a) forme anionique, b) présence d'un système conjugué, c) oxydabilité à quinoides par semiquinoïdes, d) présence d'un atome avec une paire d'élec- trons non liés diagonalement opposés à l'atome à caractère anionique, et situés à une distance approximative de, 8-6, 2A, par rapport à l'atome anio- nique, de façon à donner lieu à interaction avec les groupes placés à la superficie de l'enzyme ; ledit procédé étant en outre caractérisé en ce que l'on stabilise le produit ainsi traité, après avoir chassé l'oxygène présent au-dessus de la couche liquide, de préférence avec la pasteurisation. 2. Procédé pour la conservation des extraits végétaux, animaux et semblables, selon la revendication 1, caractérisé en ce que le donateur d'hy drogène est l'acide ascorbique. 3. Procédé pour la conservation d'extraits végétaux, animaux et semblables, selon la revendication 1, caractérisé en ce que le donneur d'hydrogène est choisi parmi l'acide dextro-ascorbique, l'acide dextro-isoascorbique, l'acide dextro-glucoascorbique et acides réductiques. 4. Procédé pour la conservation d'extraits végétaux, animaux et semblables selon la revendication 1, caractérisé en ce que le donneur d'hydrogène est ajouté au produit à conserver en mme temps que l'oxydase ascorbique, 5. Procédé pour la conservation d'extraits végétaux, animaux et semblables, selon la revendication 1, caractérisé en ce que le donneur d'hydro- gène est ajouté après l'oxydase ascorbique. 6. Procédé pour la conservation d'extraits végétaux, animaux et semblables, selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité totale prévue du donneur d'hydrogène est ajoutée en doses partielles successives à l'oxydase ascorbique. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'oxydase ascorbique est introduite insolubilisée sur un support inerte, 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'oxydase ascorbique est introduite en quantité comprise entre 0,001 mg et 100 mg par kg de produit et l'acide ascorbique en quantité comprise entre 0,01 mg et 50 mg. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on introduit aussi de petites quantités de sucres dans la composition du conservateur. 10. Produits constitués d'extraits végétaux, animaux et autres semblables, aptes à une longue conservation caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par le procédé décrit dans l'une quelconque des revendications précédentes.