FR 2242089 A1 19750328 FR 7429806 A 19740902 La présente invention a pour objet un produit à activité cytostatique et stimulateur de croissance, et son procédé de préparation. On sait que les moisissures de la famille des aspergillaeées sont des agents pathogènes pour lthomme, et produisent des toxines à pouvoir carcinogène élevé Des études sur la souche "Aspergillus flavus" productrice de l'aflatoxîne carcinogène, ou plus exactement-d'un mélange des aflatoxines B1, B2, G1, et G2, ont abouti à des conclusions surprenantes. En étudiant la toxicité de ce mélange à des doses 100 LL (léthales à 100fui) administrées à des rats âgés de 12 heures, on a constaté que tous les animaux mouraient en 24 heures.Mais si on administrait à des rats du même age des doses très faibles du même mélange (50 pg par dose) provoquant un type d1intoxica- tion chronique du foie, avec formation subséquente dthépatomes, ce groupe de jeunes rats se développait notablement plus vite qu'un groupe témoin n'ayant pas reçu de toxines. Dans d'autres expériences, le mélange (à dose 50 DL) a été introduit dans la chambre à air d'oeufs fertiles de poules de la race Rhode lsland rouge. Sur un groupe des poulets correspondants; on remarqua un développement anormal des os longs. Les jeunes coqs par exemple arrivaient à atteindre la taille de dindons. Ces expériences sur-de jeunes rats et sur des poulets permettent de conclure que le mélange d'aflatoxines, administré à des doses très faibles (g et sous-multiples), non seulement n'est pas toxique pour les macro-organismes, mais se comporte au contraire comme un facteur stimulant de la croissance. Dans d'autres expériences, on a employé le mélange pour stimuler des macro-organismes dans le but de leur conférer une résistance accrue à des facteurs externes, en particulier aux cellules tumorales FDX-LEW. La tumeur FDX-LEW est provoquée par "Pemidextran Spofa" dans une souche LEW, aboutissement d'une longue lignée consanguine. Elle a été retransmise pendant plus de 3 années par le procédé du trocart sur des porteurs de la souche originale consanguine, dont l'isohistogénéité a été vérifiée, par la sérologie d'une part, et par la transplantation d'autre part. Dans le cas de la transmission par le procédé du trocart (3 fragments de tissu tumoral de 2 mm sur 2 mm), les porteurs meurent dans l'espace d'un mois. Cette tumeur est léthale à 100 pour les porteurs de la souche tEW (300 porteurs environ ont été étudiés). Après explantation, elle se développe bien comme souche stabilisée "in vitro", et la dose de 1.103 cellules FDX-LEW est léthale à 100 pour des porteurs syngènes. Sur le plan histologique, la tumeur apparat comme un sarcome à cellule en fuseau dédifférencié, avec production de fibres minces. Cette caractéristique histologique persiste même dans des transmissions plus importantes, aussi bien par transmission donneur-récepteur que par -transmis- sion par cultures de tissus. Cette tumeur a été transplantée sur 44 rats, divisés en 6 groupes de 3 à 10 sujets. Un groupe formé de 10 rats a été gardé comme témoin. Dans la 4e semaine de développement de la tumeur, les rats étant déjà près de leur fin, deux de ces dix rats ont été opérés, les autres étant sacrifiés. Bes 34 autres rats ont reçu des doses très faibles du mélange d'aflatoxines par voie sous-cutanée, dans l'atne, la plupart après 8à 10 jours de développement visible de la tumeur FDX-IEW. Ces très faibles doses ont été administrées chaque semaine, avec les résultats ci-après: Sur un premier groupe de 9 rats, le mélange a été administré 7 jours seulement après l'implantation des cellules de la tumeur, c'est-à-dire à un moment où celle-ci n'était pas développée, et pas encore palpable.La dose a été renouvelée 3 jours après. Sur 4 des rats, la tumeur ne se développa à aucun degré. Elle se développa sur les 5 autres, mais en restant notablement plus petite que sur le groupe témoin, où son développement n'était pas influencé par un facteur externe. Après la 3e dose du mélange, les tumeurs, qui avaient cessé de se développer, furent excisées sur 3 rats, et on mit en route un "traitement", en l'espèce l'administration de faibles doses du mélange d'aflatoxines. Les suites post-opératoires furent satisfaisantes, les plaies guérissant rapidement. Sur les deux derniers rats, on se contenta d'appliquer le "traitement". Non seulement la tumeur cessa de se développer, mais il y eut une régression, d'abord lente, puis complète de la tumeur. Dans une seconde expérience, on implanta la même quantité de tumeur FDX-LEW par la méthode du trocart à un groupe de 10 rats. Au bout de 13 jours, la tumeur étant déjà développée, on administra la première dose du mélange d'aflatoxines. 4 jours après, le développement était visiblement arrêté. Les tumeurs furent excisées sur 5 rats, sur lesquels on commença le "traitement." Les 5 autres rats furent soumis seulement au traitement. 26 jours après la première administration sous-cutanée du mélange, la totalité des tumeurs (100%) avait complètement disparu. Ces expériences furent répétées trois fois. Les mêmes ré sultats furent obtenus sur 15 rats. Là encore, la totalité des tumeurs FDX-LEW (100%) avait disparu après le "traitement". L'aflatoxine étant connue comme agent biologique carcinogène très puissant, on fit l'autopsie de 3 rats appartenant au groupe "chronique", c'est-à-dire -servant de sujets d'intoxication chronique du foie, donc de groupe témoin. Chacun des rats "chroniques" reçut 16 très petites doses d'aflatoxines, donc plus de 3 fois la-dose reçue par les rats ''a tumeurs". Leurs organes ne montraient à l'autopsie, à 11 échelle macroscopique, pas de changements pathologiques. Les examens microscopiques et histologiques du foie ne révélaient pas d'altération notable. Parallèlement à cette expérience, une autre fut entreprise, avec injection du mélange d'aflatoxines dans la chambre à air d' oeufs de poules Rhode-Island rouges. On utilisa le même mélange d'aflatoxines, contenant 50% de B1. Dans la première partie de cette expérience, concernant la toxicité biologique, les aflatoxines furent diluées, de façon que la solution type contienne une dose de 0,048 pg par oeuf, soit 50% de la dose léthale d'å- près la norme de la B1. Cette DL 50 du mélange fut introduite dans les oeufs aux 72e, 96e, 120e, 144e, 216e, et 240e heures de l'incubation. I1 fut constaté que la réaction des embryons aux doses indiquées était particulièrement nette à la 72e et à la 96e heure d'incubation. Les oeufs incubés pendant 72 heures furent divisés en trois groupes Le Groupe 1 reçut 0,046 pg par oeuf deB1 standard. Le Groupe Il reçut par oeuf, soit 0,10 Fg (10), soit 0,20 rg (20) du mélange contenant 80% dtaflatoxine B1. Le Groupe III était le groupe témoin, composé de 10) Desoeufs non perforés ; 20) Des oeufs perforés, avec solvant en quantité égale à celle utilisée pour la dissolution de la toxine. Comme solvant, on utilisait 0,1 ml d'dbool concentré, avec addition de la quantité voulue~d'eau distillée pour obtenir, par injection la dose calculée, Les toxines étant introduites dans la chambre à air des oeufs, et les perforations obturées à la paraffine stérile, les oeufs furent laissés pendant une heure à la température ambiante en position verticale, puis placés en couveuse en position horizontale. Les oeufs étaient vérifiés après 4, 6 et 14 jours. Les morts étaient enlevés et examinés au point de vue histologicue. Les constatations furent les suivantes Groupe I (B1 standard): Légers changements toxiques dans le foie. Groupe II ; 1 ) et 20) (mélange des aflatoxines) : RypXrE- mie du foie, avec vacuolisation nettement marquée d'hépatocytes du type stéatose à gros éléments, et changements toxiques marquée Ces-constatations montrent que le mélange considéré des aflatoxines est en fait fortement toxique. En même temps que l'expérience de toxicité, on a effectué un essai biologique de tératogénie. On a utilisé les mêmes pro- cédés, mais avec des doses notablement plus faibles. Dans legra- pe ayant reçu, à la 72e et à la96e heure d'incubation, 0,01 W par oeuf du mélange, donc 0,008 Fg d'aflatoxine B1, il fut constaté que les poussins couvés avaient subi des changements mor- phologiques. En effet 10) La couleur du plumage avait notablement changé (albinisme) cette caractéristique ne se modifiant pas, même au bout de 6 mois 20) La portion tibiotarsienne de la patte gauche était notablement raccourcie, au point que les poussins ne pouvaient plu-s se tenir sur leurs pattes. Un autre groupe ayant reçu la même dose d'aflatoxines, mais au bout de 120, 144 et 216 heures d'incubation, avait également son plumage beaucoup plus clair,-mais les pattes beaucoup plE8 fortes que celles du groupe témoin. Sa croissance était aussi beaucoup plus rapide, et à six mois la taille des sujets était très supérieure à la normale. Ce groupe fut conservé pour d'autres études génétiques. On peut conclure de ces constatations que le mélange des aflatoxines, administré d'une part à de jeunes rats, et d'autre part à des poulets, à de très faibles doses et à des périodes convenables du développement ; non seulement n'est pas toxique, mais au contraire est un facteur de stimulation de la croissance. Ces résultats ont conduit les auteurs à l'idée d'utiliser le mélange des aflatoxines pour la stimulation des organismes adultes, afin d'augmenter leur résistance aux agents nocifs. L'un de ces agents peut être l'implantation sous-cutanée de cellules tumorales, induites par voie chimique. La caractéristique de la présente invention, c'est-à-dire du produit à action cytostatique et à effet stimulant sur la croissance, est que son composant actif est un mélange de 75 à 83% en poids d'aflatoxine B1, 5 à 8% d'aflatoxine B2, 10 à 15% d'aflatoxine G1, et 1,5 à 2,5% d'aflatoxie S2 administré en doses contenant des microgrammes et sous-multiples. Pour la préparation de ce mélange efficace d'aflatoxines, on utilise le procédé suivant La souche Aspergillus flavus est cultivée à 26-30 pendant 12à 14 jours sur du biscuit diététique broyé et humecté (2 parties en poids de biscuit pour une partie d'eau). Elle est ensuite extraite par le chloroforme. Après évaporation du chloroforme, l'extrait est précipité par l'hexane normal, et les aflatoxines obtenues sont introduites dans une colonne chromatographique garnie de gel de silice, d'oxyde d'aluminium et de sulfate de sodium anhydre. Elles sont éluées par l'éther -éthylique, puis par un- mélange chloroforme-méthanol.Après concentration de ltéluat dans une colonne chromatographique garnie de gel de silice, elles sont lavées avec un mélange chloroforme-méthanol, et on recueille les fractions fluorescentes à la lumière d'une lampe à radiations U.V. il a été trouvé que la culture de la souche Aspergillus flavus est réalisée au mieux avec l'emploi comme support dubis- cuit diététique, et dans des récipients à volume d'air important. I1 est évident que l'augmèntation de la surface de culture et- de la surface exposée à l'air, dans les récipients de culture et dans le biscuit poreux, a une grande importance. Le meilleur rendement obtenu a été de 1216 mg d'aflatoxines par kg de biscuit. Le rendement le plus élevé sur le substrat est obtenu au bout de 13 jours, soit 869 mg d'aflatoxines par kg -de biscuit. Au delà de 13 jours, le rendement en aflatoxines décrit. On décida donc d'effectuer la culture sur biscuit diététique humecté (suivant la norme tchécoslovaque 561105) avec autoclavage, dans des récipients à grand volume d'air, à 260 pendant 12 à 14 jours. L'extraction proprement dite de l'aflatoxine se fait au chloroforme à la température du laboratoire, et demande de 4 à 6 heures. Après dpuisement de la portion solide, le filtrat est concentré sous vide, puis précipité par le n.hexane, et l'aflatoxine brute est placée dans une colonne chromatographique garnie de gel de silice, d'alumine et de sulfate de sodium anhydre. Les aflatoxines sont ensuite éluées à l'éther éthylique, puis à nouveau par un mélange chloroforme-méthanol. -L'éluat est concentré dans une colonne chromatographique garnie de gel de silice.Les aflatoxines sont lavées au mélange chloroforme-étha- nol, et les fractions fluorescentes à la lumière d'une lampe à rayons U.V sont recueillies. On les évapore sous vide. Les aflatoxines purifiées cristallisent dans le benzène, l'éther et 1' éthanol. Dans un mélange efficace d'aflatoxines, la forme B1 est prépondérante. Selon la demandresse elle est obtenue par le procédé suivant * L'éluat condensé est lavé dans une colonne chromatographique avec un mélange chloroforme-n.hexane-pyridine, dans les -proportions 75 - 20 - 5. La fraction contenant l'aflatoxine B1 est évaporée et précipitée par l'éthanol. L'isolement de l'aflatoxine B1 à partir du mélange des aflatoxines est effectué au mieux par chromatographie sur gel de silice. En raison de la faible solubilité des aflatoxines dans les solvants courants, on doit choisir un système éluant dans lequel le principal constituant est le chloroforme. La pyridine a été trouvée utile comme augmentant le Rf des aflatoxines, et facili tant la séparation entre le groupe B1 B2 et le groupe G1-G2. 2 Le n.hexane est introduit comme composant retardant. Le meilleur système éluant contient le chloroforme, le n.hexane et la pyridine dans les proportions 7,5-2-0,5. Par une seule séparation chromatographique, on peut obtenir l'aflatoxine B1 à 98% de pureté. On peut introduire jusquà 1 g du mélange dans une colonne de 24 mm, garnie de 40 g de gel de silice. L'invention sera plus complètement expliquée par les exemples, nullement limitatifs, qui vont suivre. EXEMPLE 1 Préparation du mélange des aflatoxines B1, B2, G1, et G2 Du biscuit diététique (Norme tchécoslovaque 561105) est écrasé, mouillé à l'eau (2 parties de biscuit pour une partie dT eau) dans un récipient de culture, et passé 30 minutes à l'autoclave sous une atmosphère. Le récipient de culture est un pot émaillé, de 36 cm de diamètre, avec rebord. On y place 750 g de biscuit. Après refroidissement, le contenu du récipient est en- semencé avec une souche active d'Aspergillus flavus (ici la souche IMI 89 417). Elle estcultivée de 12 à 14 jours à 26-30 . A la fin de cette période, on verse du chloroforme sur le contenu du récipient. On mélange, et on extrait à la température du laboratoire pendant 6 à 20 heures. L'extrait chloroformique est épuisé et filtré. On évapore le chloroforme sous vide, et l'extrait concentré est préci- pité par 15 fois son volume de n.hexane. L'aflatoxine brute se présente-sous forme d'écailles jaunes. Elle est placée une nuit dans un réfrigérateur. Le gâteau de filtration est écarté. Les aflatoxines précipitées sont séparées, et on décante le n.hexane qui surnage. Après décantation, les aflatoxines sont dissoutes dans la quantité minimale de chloroforme, et- introduites dans une colonne chromatographique de 20 mm de diamètre, garnie sur une hauteur de 30 cm d'alumine pour chromatographie, d'activité II et III. La colonne est éluée, d'abord par 200 ml d'éther éthylique, puis à nouveau dans un récipient spécial par 400 ml d'un mélange chloroforme-méthanol dans les proportions 97-3. L'éluat chloroforme-méthanol est concentré sous vide et introduit dans une colonne chromatographique garnie de 30 g de gel de silice type H. La colonne est lavée avec un mélange chloroforme-métha- nol (97/3), et on recueille la fraction fluorescente à la lumière d'une lampe à rayons U.V. L'éluat est concentré, puis précipité à l'éthanol. La fraction cristallisée est filtrée et lavée à l'éther. On obtient des cristaux beige clair, qu'on laisse sécher à la température du laboratoire. Pour un kg de biscuit, on obtient un gramme du mélange d'aflatoxines, ayant comme composition approximative B1 = 74 à 83% ; B2 = 5 à 8 ; G1 = 11 à 14% j G2 = 1,5 à 2,5%, et contenant une faible proportion- d'impuretés non identifiées. EXEMPLE 2 Préparation de l'aflatoxine B1 1 On traite 2,6 kg de biscuit diététique comme à l'Exemple 1, à la seule différence que la colonne chromatographique est-la- vée avec un mélange chloroforme-n.hexane-pyridine, en proportions 75-20-5. On recueille des fractions successives dans un collecteur spécial, et on vérifie leur pureté. On utilise pour cette vérification le "Silufol" avec un mélange éluant.chloroforme-acé- tone dans le rapport 9 -1. Les fractions sélectionnées contenant l'aflatoxine El pratiquement pure sont décantées, concentrées par évaporation, et précipitées par l'éthanol. Le produit cristallin est lavé à l'éther, et laissé à sécher à la température du laboratoire. On obtient, par kg de biscuit, 1 gramme d'aflatoxine El sensiblement pure, avec une trace d'aflatoxine 32. REVEEDICATIONS 1. Produit à activité cytostatique et stimulateur de croissance, caractérisé en ce que son composant actif est un mélange formé, en poids, de : 75 à 83% dlaflatoxine B1, 5 à 8% d'aflatoxine B2, 10 à 15% d'aflatoxine G1, et 1,5 à 2,5% d'aflatoxine G2, ce mélange étant adapté à être administré en doses s'élevant à des microgrammes et sous-multiples. 2. Procédé pour la préparation du produit suivant la revendication 1, caractérisé par les opérations suivantes : a) culture de la souche "Aspergilus flavus à 26-300C pendant 12 à 14 jours sur le biscuit diététique broyé et humecté (deux parties en poids de biscuit pour une partie d'eau) ; b) extraction par le chloroforme, et évaporation du chloroforme ; c) précipitation de l'extrait par 1'hexane normal ; d) introduction des aflatoxines obtenues dans une colonne chromatographique garnie de gel de silice, d'oxyde d'aluminium et de sulfate de sodium anhydre ; e) élution par l'éther étylique, puis par un mélange chloroforme-méthanol f) ltéluat est concentré dans une colonne chromatographique garnie de gel de silice ; g) il est lavé par un mélange chloroforme méthanol et fractionné ; h) les fractions fluorescentes sous la lumière d'une lampe à rayons ultra-violets sont recueillies. 3. Procédé pour la préparation de l'aflatoxine B1 pure, caractérisé en ce qu'il dérive du procédé suivant la revendication 2, avec les modifications suivantes, à partir de l'opération g) ltéluat concentré est lavé dans une colonne chromatographique par un mélange chloroforme-hexane normal-pyridine en proportions 7520-5, et la fraction contenant l'aflatoxine B1 est évaporée et reprécipitée par l'éthanol.