FR 2259364 A1 19750822 FR 7502418 A 19750127 Ltinvention concerne un procédé de mise en évidence de la gonadotrophine chorionique, basé sur le test d inhibition de l'hémagglutination passive Le procédé de l'invention con vient donc au diagnostic de la grossesse. Dans le cas des tests d'inhibition de lthémagglutina- tion passive, une quantité donnée de ltéchantillon qui doit entre soumis au test est mélangée avec une quantité prédéter minée d'un anticorps de l'antigène à détecter et avec un in dicateur immunologique comprenant un véhicule dans lequel l'antigène à mettre en évidence est incorporé.L'indicateur immunologique a une composition telle qu'il se produit une hémagglutination visible par contact d'un anticorps avec l'an tigene incorporé dans le véhicule, Etant donne que ltaffinité de l'anticorps pour l'antigène libre est supérieure à celle de l'anticorps pour l'antigène incorporé dans un véhicule, l'hémagglutination ne se produit que lorsque la quantité d'antigène contenue dans l'échantillon est inférieure à cel le nécessaire â la réaction avec la totalité de l'anticorps présent.Les tests d'inhibition de l'hémagglutination mettant en oeuvre des indicateurs immunologiques de ce type sont dits passifs. Mdme lorsqu'on observe une hémagglutination vi subie, le complexe d'hémagglutination résulte d'une réaction immunologique entre l'anticorps et un antigene incorporé dans un vehicule plutôt qu'entre l'anticorps et le véhicule lui même. @ Dans les tests d'inhibition de l'hémagglutination pas sive du type habituel et destinés à la mise en évidence de ia gonadotrophine chorionique, le pH du mélange d'échantil lon, d'antisérum et d'indicateur varie dans des proportions importantes, esseiitiellement selon le pH de l'échantillon qui est habituellement de l'urine Chez l'homme,le pH de l'urine varie d'un sujet à l'autre entre 4 et 9.Les brevets des E tats-Unis d'Amérique n 3 236 732, 3 548 051 et 3 639 558 dé crivent des procédés connus de tests d'inhibition de l'hémag- glutination passive pour la mise en évidence de la gonadotro phine chorionique,mais ces procédés ne tiennent pas compte de effet du pH Les procédés connus donnent un nombre notable de resultats négatifs erronés et, en conséguence, ne permettent pas un diagnostic satisfaisant de la grossesse. Bien que des chercheurs aient étudié l'effet du pH sur dfau- tres types de systèmes dthémagglutination (par exemple du type décrit dans "The Journal of Immunology" Vol. 104 (1970) page 818), dont les mécanismes sont nettement différents de celui du système d'inhibition de l'hémagglutination passive, la technique antérieure né comporte aucune référence concernant le rôle du pH dans les tests d'inhibition de l'hémagglu- tination passive. Selon l'invention, le pH du mélange réactionnel a un effet notable sur la fréquence des résultats négatifs erronés dans les tests d'inhibition de l'hémagglutination passive concernant la gonadotrophine chorionique. On n'obtient des résultats précis et reproductibles que lorsque le pH du mélange réactionnel qui contient ltéchantillon dourine, 12anti- corps et l'indicateur est compris entre environ 5,5 et 6,5. La fréquence des résultats négatifs erronés dus à une agglutination qui n'est pas spécifique augmente nettement en dehors de cette plage de pH. Ltinvention améliore nettement les tests dtinhibition de l'hémagglutination passive concernant la gonadotrophine chorionique et permet un diagnostic précis de la grossesse.Selon le procédé de l'invention, la mise en évidence de gonadotrophine chorionique dans un échantillon d'urine comprend la mise en contact de cet échantillon avec une quantité prédéterminée d'un anticorps de la gonadotrophine chorionique et un indicateur du type habituel de l'hémag- glutination passive, le mélange ainsi obtenu contenant l'uri- ne, l'anticorps et l'indicateur, et ce mélange ayant un pH réglé entre environ 5,5 et 6,5, la valeur aptimale étant de l'ordre de 60 En conséquence, la gonadotrophine chorionique peut être mise en évidence par une composition dressai qui comprend un indicateur immunologique du type habituel, une quantité prédéterminée d'un anticorps de la gonadotrophine chorionique et une quantité d'un tampon approprié qui ajuste le pH du mélange obtenu par combinaison de la composition dressai et d'un échantillon d'urine, à une valeur comprise dans la plage voulue. Le pH du melange d'urine, d'anticorps et d'indicateur peut etre ajusté à une valeur comprise dans la plage voulue selon différents procédés. Un premier procédé comprend le mélange de l'échantillon d'urine, de ltantisérum et de l'in- dicateur, puis l'addition d'une quantité appropriée d'un acide ou d'une base sous forme solide ou en solution aqueuse. Cependant, dans ce cas, le pH initial du mélange réactionnel doit obligatoirement entre mesuré, sa valeur déterminant le choix d'un acide ou d'une base et la quantité de acide ou de la base qui doit être ajoutée, étant donné que le pH de urine varie d'un sujet à l'autre. Le procédé préféré pour ajuster le pH du mélange d'urine, d'anticorps et d'indicateur comprend la mise en contact du mélange avec un tampon0 Etant donné que le pH moyen de l'urine est compris entre 4 et 9, différents tampons peuvent entre utilisés pour ajuster le pH dune quantité connue d'urine à une valeur comprise dans la plage voulue, ces tampons étant connus.Le tampon spécifique utilisé doit entre en quantité telle qu'il modifie le pH et compense le pouvoir tampon de l'échantillon d'urine. Evidemment, les tampons qui, en raison de leur nature chimique, augmentent la fréquence des résultats negatifs erronés méme lorsque le pH est compris entre 5,5 et 6,5 ne conviennent pas. Les tampons avantageux sont ceux dont le pH est compris entre environ 5,5 et 6,50 Des tampons avantageux selon l'invention sont1 par exemple, les tampons au morpholino-éthanesulfonates au phosphate, au maléate, au succinate, au borates et au ci ratez Ces tampons comprennent un composant acide et un composant basique ou un sele Le pH du tampon peut entre ajusté en faisant varier les proportions des deux composants. Un tampon particulièrement avantageux est l'acide morpholino-éthanesul- fonique ajusté avec une base simple, telle que l'hydroxyde de sodium. Un des procédés de mise en contact du mélange réactionnel d'inhibition avec un tampon, selon le procédé de l'invention, comprend l'addition au mélange d'une quantité convenable d'un tampon qui permet d'ajuster le pH du mélange à une valeur comprise dans la plage voulue0 Selon ce procédé, le tampon peut entre sous forme soit d'un solide, soit d'une solution aqueuse.Un autre procédé comprend le mélange 'une quants té convenable d'un tampon avec au moins un des composants du mélange réactionnel dtinhibition avant l'association des composants du mélange, le tampon permettant d'ajuster le pH du mélange préparé ultérieurement à une valeur comprise dans la plage voulue. L'antisérum et/ou l'indicateur peuvent être liquides, par exemple sous forme d'une solution ou d'une suspension aqueuse, ou sous forme solide ou sèche, par exemple lyophilisés. Lorsqutau moins un de ces composants est sous forme solide ou sècheg le tampon peut entre incorporé par exemple par mélange du ou des composants avec le tampon et lyophilisation du mélange.L'antisérum et l'indicateur sont avantageusement lyophilisés, car sous cette forme ils sont faciles à manipuler et à conserver La lyophilisation de lin- dicateur à un pH supérieur à 6,5, généralement de l'ordre de 7,4,améliore la stabilité de ce composant à l'état lyophilisé. Ainsi, lorsque le tampon est avantageusement incorporé avec l'un des composants sous forme lyophilisée, le composant choisi est, de préférence, l'antisérum plut8t que l'in- dicateur. Ltantisérum et l'indicateur sont de préférence conservés séparément jusqu'à la préparation du mélange réactionnel. Lorsqu'ils sont mélangés prématurément, les anticorps et l'indicateur sensibilisés à l'antigène se lient l'un à l'autre de façon réversible, même lorsqu'ils sont à l'état lyophilisé, cette liaison augmentant le temps nécessaire à la réaction d'inhibition. L'antiserum et l'indicateur lyophilises peuvent avantageusement entre placés dans des cavités distinctes d'une capsule de réaction construite de telle sorte que, lors de 11 addition de l'échantillon d'urine dans la capsule, le mélange réactionnel est préparé simplement par agitation de cette capsule La préparation et l'utilisation d'une capsule de ce type sont décrites dans les exemples suivants. Tout indicateur immunologique du type habituel qui comprend de la gonadotrophine chorionique incorporée dans une matière de support et qui peut participer à une hémagglutination passive, convient selon l'invention. Le support comprend généralement des globules rouges sanguins traités ou non, par exemple par une solution de formaldéhyde ( "Formaline" ).Au cours de la préparation du réactif ou de l'indicateur immunologique, l'antigène de la gonadotrophine chorionique peut t- tre fixé par une liaison covalente au support, soit directement, soit indirectement par lintermédiaire d'un agent de copulation0 Un autre procédé connu d'incorporation de la gonadotrophine chorionique à un support comprend la mise en contact de ce support avec l'acide tannique et l'absorption de la gonadotrophine chorionique sur le support tanné. Les brevets des Etats-Unis d'Amérique n 3 236 732, 3 548 051 et 3 639 558 précités décrivent des exemples de procédés de tests dlinhibition de l'hémagglutination passive et les composés utilisés au cours de ces procédés. Les réac-- tifs immunologiques et leurs procédés de préparation, les procédés d'isolement des antisérums de la gonadotrophine chorionique, les procédés de combinaison de ltéchantillon d'urie, de ltantisérum et de l'indicateur et analogues, décrits antérieurement, peuvent entre utilisés selon l'invention. Le procédé de l'invention permet de mieux ajuster le pH du mélange réactionnel d'inhibition à une valeur comprise entre environ 5,5 et 6,5. Les exemples suivants illustrent l'invention. EXEMPLE 1 Cet exemple décrit un procédé de préparation d'une ma tière qui convient à un test dtinhibition de l'hémagglutina- tion passive dans le cas de la gonadotrophine chorioniqu humaine. On prépare selon le procédé décrit dans le brevet des Etats-Unis dtAmérique n 3 453 363 des antisérums de la gonadotrophine chorionique humaine On prépare selon le procédé décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 236 732 précité un indicateur immunologique qui comprend de la gonadotrophine chorionique humaine, couplée chimiquement à des érythrocytes de moutons traités par une solution de formaldéhyde. On remet en suspension 11élément conjugué sensibilisé ainsi obtenu à une concentration de 1,75% en poids/ poids dans une solution aqueuse qui contient 0,11% d'acide diéthylbarbiturique, 0,07% de diéthylbarbiturate de sodium, 1,6% de chlorure de sodium et 6% de saccharose.On dilue dans une solution aqueuse qui contient 0,06% d'acide diéthylbarbi- turique, 0,04% de diéthylbarbiturate de sodium, 0,85% de chlo @@ de saccnarose rure de sodium/et 2% de sérum de lapin, une quantité prédéter- minée d'un antisérum de la gonadotrophine chorionique humaine, cette quantité correspondant au titre particulier de gonadotrophine chorionique humaine soumise à l'essai. On place dans la cavité peu profonde d'une capsule réactionnelle du type décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 415 361, 0,25 cm3 de la suspension d'indicateur et on refroidit au préalable à environ -620C. On place 0,4 cm3 de la solution d'antisérum dans la cavité profonde de la capsule réaction- nelle refroidie.On lyophilise ensuite le contenu de la capsule jusqu'à ce que la teneur en humidité soit inférieure à 2%o EXEMPLE 2 Cet exemple décrit les procédés utilisés au cours du test dtinhibition de l'hémagglutination passive pour la comparaison des fréquences des résultats négatifs erronés à dif férents pH, en présence de différentes tampons a0 Procédé de référence A titre de référence, on n'utilise pas de tampon pour ajuster le pH du mélange d'urine, d'anticorps et d'indicateur. Ce procédé correspond, en conséquence, aux procédés connus. On place dans une capsule rlsessai préparée comme décrit dans exemple 1, une goutte d'eau et une goutte d'urine. On ferme hermétiquement la capsule, on agite vigoureusement et on laisse reposer pendant environ une heure. Un test positif comprend la formation d'un anneau de cellules qui se déposent au fond de la capsule, la présence de gonadotrophine chorionique dans l'urine donnant un résultat positif inhibant l'agglutination entre le composé conjugué sensibilisé et l'antisérum, et provoquant la sedimentation des cellules sensibilisées qui ne sont pas agglutinées, au fond de la capsule, Un test négatif correspond à 11 absence de formation d'un anneau, l'agglutination qui s'est produite ne permettant pas aux cellules sensibilisées de sédimenter au fond de la capsule. b. Procédé de l'invention0 On répète le mode opératoire décrit dans le paragraphe a mais on ajuste le pH du mélange réactionnel d'urine, d'anticorps et d'indicateur à une valeur comprise entre environ 5,5 et 6,5, soit en remplaçant la goutte d'eau par une goutte d'une solution tampon convenable, soit en remplaçant l'a- cide diéthylbarbiturique, le barbiturate de sodium et le chlorure de sodium de la solution diluée d'antisérum de l'exemple 1, par une solution tampon convenable.Il faut remarquer que le mélange d'acide diéthylbarbiturique et de barbiturate de sodium est lui-mtme un tampon dont le pouvoir est si faible qu'il n'a pratiquement aucun effet sur les urine EXEMPLE 3 Cet exemple met en évidence la diminution notable du nombre de résultats négatifs erronés lorsque le pH du mélange d'urine, dtanticorps-et d'indicateur est ajusté à environ G par addition de différentes solutions tampons à ce me lange. On soumet au test les urines de 46 femmes enceintes selon le procécé de référence décrit dans le paragraphe a de l'exemple 2 On soumet également ces urines au test selon le procédé de l'invention décrit dans le paragraphe b de ltexem- ple 2, selon lequel on ajoute une goutte de tampon au phosphate 0,05 M à pH 6 dans la capsule à la place de la goutte d1eau. On soumet au test une deuxième série d'urines de 30 femmes enceintes, selon le même mode operatoire et, outre le tampon au phosphate, on utilise également des solutions 0,1 M, 0,2 M et 0,4 M dtacide morpholino-éthanesulfonique, (MES) dont le pH est ajusté à 6.On soumet au test une troisième série d'urines de 19 femmes enceintes selon le procédé de référence et le procédé de llinvention en utilisant des solutions- tampons 0,2 M de maléate ajustée à un pH de 6,0. On soumet au test une quatrieme série d'urines de 7 femmes enceintes,selon le procédé de l'invention et avec des solutions tampons de citrate, de succinate et.de maléate 0,2 M dont le pH est ajusté à 6. On soumet enfin au test une cinquième série d'urines de 172 femmes enceintes, selon le procédé de référence et le procédé de l'invention, avec des solutions tampons MES 0,2 M dont le pH est ajusté à 6. On obtient les résultats suivants: Séries 1 2 3 4 5 Nombre total d'échantillons 46 30 19 7 172 H20 (contrôle) 27 12 8 48 Nombre de phosphate 0,05 M 7 3 résultats MES 0,1 M O négatifs MES 0,2 M 1 12 erronés MES 0,4 M 1 maléate 0,2 M 1 1 succinate 0,2 M 3 citrate 0,2 M 3 EXEMPLE 4 Cet exemple montre qu'en ajustant le pH du mélange d'u- rine, d'anticorps et dtindicateur à une valeur comprise entre environ 5,5 et 6,5,on elimine la quantité notable de résul- tats négatifs erronés. On soumet au test une série d'urines de 6 femmes enceintes selon le procédé de référence décrit dans Be paragraphe a de l'exemple 2. On mesure le pH de chaque urine. On soumet également à un test selon le procédé de l'invention la même série d'urines, comme décrit dans le paragraphe b de l'exem- ple 2, dans lequel on remplace la goutte d'eau ajoutée dans la capsule d'essai par une goutte d'acide morpholino-éthanesulfonique 0,1 M dont le pH est ajusté à 5,0, 5,5 ou 6. On obtient les résultats suivants: n0 de l'é- pH de Résultat Résultat selon le procédé chantillon l'échan- selon le utilisant le tampon MES tillon procédé pH 5,0 pH 5,5 pH 6, de réfé rence 1 6,4 + - + + 2 7,5 - - + + 3 7,2 - - + + 4 7,4 - + + + 5 7,2 - - + + 6 7,4 - - + + Lorsqu'on exprime les données en nombres de résultats négatifs erronés par nombre total d'échantillons, en fonction du pH du mélange réactionnel d'inhibition, on obtient le tableau suivant qui montre l'avantage de l'application du test à un pH compris entre environ 5,5 et 6,5: Nombre de résultats négatifs erronés pH par nombre total d'échantillons 4/6 5,0 0/6 5,5 0/6 6,0 0/1 6,4 2/2 7,2 2/2 7,4 1/1 7,5 il va de soi que la présente invention a été décrite à titre purement indicatif mais nullement limitatif et qu'on pourra lui apporter de nombreuses modifications sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS lo Procédé de mise en évidence de la gonadotrophine chorionique dans figurine, qui comprend la mise en contact de l'urine soumise au test avec un anticorps de la gonadotrophine chorionique et un indicateur dçhémagglutination passive, 11 ensemble constituant un mélange réactionnel, procédé carac térisé en ce quril consiste à ajuster le pH du mélange réactionnel à une valeur comprise entre environ 5,5 et 6,5. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le pH du mélange réactionnel est ajusté au moyen d'un tampon0 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ce tampon a un pH compris entre environ 5,5 et 6,5. 4o- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le tampon comprend un acide choisi parmi l'acide morpholino-éthanesulfonique, l'acide borique, l'acide maléique, acide succinique et l'acide citrique 50- Composition pour la mise en évidence de la gonadotrophine chorionique dans l'urine, caractérisée en ce qutel- le comprend un anticorps de la gonadotrophine chorionique, un indicateur d'hémagglutination passive et un tampon ajustant le pH du mélange réactionnel obtenu par mise en contact de la composition avec l'urine soumise au test à une valeur comprise entre 5,5 et 6,5 60- Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'anticorps et le tampon sont mélangés et sont isoles de l'indicateur. 7.- Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'anticorps et le tampon mélangés sont lyophilisés. 8.- Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que le tampon a un pH compris entre 5, et 6X5. 9o Composition selon la revendication 59 caractérisée en ce que le tampon comprend un acide choisi parmi l'acide morpholino-éthanesulfonique, l'acide borique, l'acide maléique, l'acide succinique et acide citrique. 10.- Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'indicateur comprend un véhicule choisi parmi les globules rouges sanguins traités ou non par une solution de formaldéhyde,