FR 2244170 A1 19750411 FR 7430154 A 19740905 La présente invention concerne un procédé de dosa De chimique par colorimétrie spécifique, utilisant le marquage par un colorant de la substance à doser ou du réactif spécifique et une méthode de mesure optique. Ce procédé est applicable pour des dosa ses dans les domaines minéral, organique, médical et biologique, en particulier aux réactions immunologiques. Ce nouveau procédé -implique des notions déjà con-'- nues. On connaît en effet l'existence de réactifs spécifiques don nant une combinaison stable préférentielle avec des substances miérafles organiques ou biologiques ; les plus intéressants de ces réactifs spécifiques sont d'origine biologique : il s'agit par exemple d'anticorps, de récepteurs cellulaires de substances hormonales, de protéines spécifiques d'une molécule biologique (par e exempte le facteur intrinseque pour la vitamine B 12) ou d'un ion (par exemple la transferrine pour le fer), les lectlnes a et certains agents chélatants.On connaît aussi des matières colorantes naturelles ou de synthèse permettant de marquer par une liaison covalente ces réactifs~ spécifiques, sans modifier fondamentalement leurs propriétés. Cette addition directe ou indirecte de matière colorante au réactif spécifique peut modifier la vitesse de réaction, mais non la spécificité de celui-ci. Enfin, on connaît aussi des phases solides (poudres, plaquettes, parois du tube de réaction, etc) sur lesquelles il est possible de greffer des réactifs appropriés, donc qui peuvent servir de support solide à un réactif ou à une substance. Depuis 1961, Berson et Yalow (Colloque de l'Agence Internationale de l'Energie Atomique, 1970 ; IAEA-SM-NY/1O6)ont développé une méthode dite radioimmunologique ou radioimmunoessai, utilisant la réaction d'un anticorps spécifique avec la substance à doser, la mesure quantitative étant effectuée grâce au marquage de la substance à doser ou de 11 anticorps au moyen d'un radioisotope. Cette méthode utilise le principe de l'analyse par compétition ou par saturation Ce principe consiste à faire entrer en compétition, vis-à-vis d'un réactif spécifique, la substance à doser et une substance identique à la substance à doser marquée par un radioisotope ; la substance identique sera définie plus loin. Lorsque la réaction ä atteint un stade suffisant, le réactif n'ayant pas réagi est généralement séparé, et la radioactivité des deux fractions mesurées. Un étalonnage préalable permet de quantifier la réaction, en opérant pour cet étalonnage et pour le dosage dans des conditi ons strictement identiques. Cette voie analytique est intéressante pour utiliser des réactions chimiques spécifiques d'association, qui sont relativement lentes en raison de la taille des molécules mises en jeu et de leur faible concentration.Comme dans toute ré action chimique suivant la loi d'action de masse, la vitesse de réaction varie exponentiellement avec la concentration des réactifs on choisit un temps de réaction tel que, pour ce temps la vitesse varie rapidement avecla concentration, afin que la sensibilité soit maximum. Pratiquement, la réaction est arrêtée quand elle a atteint de 20 à 50 % environ de la valeur d'équilibre. C'est ainsi que l'on peut définir ce qui sera appelé dans la description "valeur convenable", ou "niveau -suffisant" -pour ce qui est de la valeur atteinte en fin de réaction. Une substance identique peut etre définie dune fa çon générale comme suit : il s'agit d'une substance qui peut entrer en compétition avec la substance à doser pour- former une combinaison avec le réactif spécifique ; cette combinaison doit être de me me nature que celle obtenue à partir de la substance à doser, et doit suivre, comme la combinaison obtenue avec la substance à doser la loi d'action de masse ; la constante d'équilibre doit enfin être identique, ou voisine, à celle obtenue avec la substance à doser. Une autre technique, dite immunofluorescence appliquée en immuno logie cellulaire, utilise fe marquage d'un anticorps, tette fois au moyen dtune substance fluorescente ; cette technique mise au point par Coons (General Cytpchemicals Methods, vol.l, p.400, Acad Press N.Y.1958), a pour but de détecter sous unmicroscope les anticorps marqués après réaction spécifique avec un antigène ; ce n'est donc pas une méthode de dosage. La méthode de dosage radioimmunologique présente l'inconvénient de nécessiter des précautions pour les manipulations des radioisotopes, ainsi qu'un appareillage complexe. C'est pourquoi le but de la présente invention est de fournir une méthode d'analyse simple, dans laquelle le marquage radioactif est remplacé par un marquage au moyen d'une matière colorante ; dans cette nou velle méthode, un peu moins sensible par contre, la mesure peut être effectuée approximativement "à l'oeil'1 ave une gamme étalon, ou plus précisément au moyen dtun colorimètre. L'objet de la présente invention consiste en un procédé de dosage chimique par colorimétrie spécifique,caractérisé par le fait qu'on lie une matière colorée à un réactif spécifique de la substance à doser ou à une substance identique, pour le ré actif spécifique, à la substance à doser ; qu'on fixe le réactif spécifique-ou la substance identique sur une phase solide ; qu'on fait réagir par compétition la substance à doser en solution et la substance identique avec le réactif spécifique,puis qu'on effectue une mesure optique sur la solution colorée par comparaison avec des solutions étalons, après séparation de la phase solide. La base essentielle de l'invention réside dans le fait de modifier le réactif d'une substance à doser en un réactif coloré, de telle manière qu'en utilisant une méthode de séparation pour éliminer l'excès de réactif, une lecture optique soit possible La modification du réactif en réactif coloré s'ef fectue de plusieurs manières : en fixant le colorant sur le réac tif spécifique ou en le fixant préalablement sur une molécule por teuse qui sera ensuite liée par covalence au réactif spécifique. Les matières colorantes doivent être modifiées, si leur solubilité n'est pas suffisante, compte tenu du.fait que la réaction s'effectue en milieu aqueux, en greffant sur celle-ci des groupes hydrophiles ou en les enrobant complètement avec une cou che hydrophile. Cette addition de matière colorante modifiée ou non au réactif spécifiqu peut modifier sa vitesse de réaction, mais non sa spécificité. Il est ainsi possible de brancher 100 molécu les de rouge congo par molécule d'anticorps aans modifier sa spécificité, mais en abaissant sa vitesse réactionnelle. Cet anticorps devient alors un réactif colorimétrique. Le colorant peut aussi être attaché à une molécule identique pour le réactif spécifiqueàla substance à doser. Afin que la coloration de la solution de dosage soit proportionnelle à la concentration de la substance à aoser, l'excès de réactif n'ayant pas réagi doit être éliminé; cette sé paration a lieu au moyen d'une phase solide sur laquelle a été greffée une substance identique à la substance à doser, le greffage conservant la réactivité de cette substance. -Lorsque le colorant est accroché sur une molécule identique, pour le réactif spécifique, à la substance à doser, la séparation de l'excès de molécule identique colorée est effectuée par une phase solide sur laquelle a été branché le réactif spécifique. Dans tous les cas, cette phase so- lide est constituée par une macromolécule naturelle ou- de synthèse sur laquelle les réactifs sont fixés par covalence. Dans le cas où le. colorant est fixé préalablement sur une molécule porteuse, le grossissement de celle-ci ainsi que l'augmentation du nombre de molécules de colorant par molécule porteuse, permet d'obtenir une grande sensibilité. Ceci est particulièrement- utile lorsqu'on désire employer comme réactif coloré une substance identique colorée, alors que cette substance est de petite taille, comme cela est le cas pour les hormones stéroïdes. Il est aussi possible de doser simultanément plusieurs substances en attachant un réactif coloré déterminé à un réactif spécifique déterminé, et à condition que les réactifs colorés aient des bandes d'absorption distinctes. L'utilisation de substances fluorescentes est également possible. D'une façon générale, le procédé d'analyse s'effectue en deux étapes : premièrement une phase dite réactive pendant laquelle a lieu la réaction entre le réactif spécifique et la molécule à doser ; deuxièmement une phase dite séparative pendant laquelle ltexcès de réactif est élimine par fixation sur une phase solide. Ces deux phases ne sont pas nécessairement amenées à leur terme, mais les conditions générales (température, concentration des réactifs, durée, agitation,) doivent être identiques dansles réactions effectuées pour l'étalonnage et celles effectuées pour les analyses proprement dites. Les anticorps étant les réactifs spécifiques actuellement les plus faciles à obtenir, leur utilisation est prise en exemple, pour la description détaillée de la colorimétrie spécifique. Dans ce cas, la méthode est appelée photo-immunologie. Un anticorps est une gammaglobutine obtenue en provoquant chez un animal une réaction immunologique de défense contre la molécule à doser (antigène). Un anticorps ne se définit pas pJndéralement, car le nombre et la spécificité des sites immunoré- actifs peuvent varier d'une préparation d'anticorps à une autre, ais par sa constante d'affinité (ou constante d'équilibre de la réaction antigène-anticorps) et par sa spécificité (définie quanti tativement par les constantes d'équilibre des réactions avec les substances voisines.) Dans les cas où le réactif spécifique est un anticorps, la définition de la substance identique peut être complétée, ainsi : pour l'anticorps, la substance identique doit être immunologiquement identique mais peut être chimiquement différen ; par exemple, un anticorps anti-HCG (hormone chorionique gonadotropique) peut être également sensible à lthormone lutéinisante et à l'hor- none folliculo-stimulante (LH ou FSH), et 11 une quelconque de ces deux hormones peut être utilisée comme substance identique pour la ECG, à condition que les constantes d'équilibre des réactions anticorps-HCG et anticorps-LH par exemple soient voisines. Cas de l'utilisation de l'antigène coloré (sub stance à doser colorée) Les modalités d'attachement du colorant à l'antigène sont différentes selon que cet antigène est de petite ou de grande taille : au-dessous d'une masse moléculaire de 50000, il est préférable d'attacher le colorant par l'intermédiaire d'une macromolécule naturelle ou de synthèse hydrosoluble, d'une taille convenable pour que celle-ci puisse porter le nombre de molécules de co formant suffisant pour atteindre la sensibilité de dosage souhaitée. Le colorant peut être choisi parmi la liste offerte par la chimie des colorants : on peut faire appel à des colorant naturellement hydrosolubles, ou au contraire prendre un colorant spécialement intéressant à cause de sa grande vivacité, et y rajouter des groupes hydrophiles pour à la fois faciliter le couplage et rendre le colorant hydrosoluble. Pratiquement, on préfère utiliser les colorants hydrosolubles, comme les protoporphyrines, le rouge congo (dérivé azoïque), la fuchsine (dérivé du triarylmétha ne) l'alizarine saphirol B (dérivé de 1' anthraquinone), etc.. La cou- leur de ces produits peut de plus être modifiée ou renforcée par des couplages.Comme colorant non hydrosoluble, les phtalocyanines sont particulièrement intéressantes en raison de leur grande vivacité ; on peut utiliser un dérivé tétraarboxylé (brevet U.S. 2. 213.726) ou tétraminé (brevet U.S. 2.280.072) ; à partir du dérivé têtracarboxylé par exemple, on peut préparer un composé plus soluble en le couplant à un groupe amine de la lysine. Certains colorants (en particulier les azoïques et les phtalocyanines) s'absorbent très facilement sur la plupart des supports solides d'origine racromoléculaire et il convient à ce moment de rajouter sur la mofécule de colorant suffisamment de groupes hydrosolubles pour l'enrober totalement et éviter ce phénomène. La liaison entre le colorant et l'antigène doit être covalente pour être solide : une technique simple consiste à utiliser les méthodes de couplage utilisées dans la chimie des po lypeptides & à partir drun groupe carboxyle et drun groupe amine qui peuvent être les groupes solubilisants rajoutés au colorant. Ces méthodes (méthode à la glutaraldéhyde, méthode à la carbodiimide) conviennent parfaitement quand la macromolécule sur laquelle on greffe le colorant est de nature polypeptidique comme l'albumine. On peut faire appel à toutes les ressources de la synthèse organique et constituer par exemple des liaisons du type éther, cet exemple n'étant pas limitatif. Dans le cas où le colorant est d'abord attaché à une macromolécule naturelle ou de synthèse hydrosoluble, le même type de réaction chimique peut être utilisé pour attacher la macromolécule ainsi colorée à l'antigène. Dans tous les cas il est important roque cette réaction de couplage de l'antigène avec le colorant. (ou le groupe de colorants) ait lieu en des sites non immunologiquement réactifs ; à ce point de vue, la méthode qui consiste à préparer d'abord une macromolécule fortement colorée et à la fixer en un seul point à 11 antigène donne une meilleure garantie ; on peut également procéer de la manière suivante : les sites immunogènes sont protégés par. couplage à l'anticorps approprié qui lui-même pour des facilités de séparation a été lié par covalence à une phase solide ; on effectue alors la réaction de couplage avec le colorant (ou le-groupe de colorants) puis on libère antigène de son anticorps selon des ethniques connues. La préparation de la phase solide séparative stef- fectue à partir d'une substance macromoléculaire insoluble dans le milieu aqueux du dosage ; cette phase doit porter des groupes ré actionnels afin de faciliter la fixation covalente de l'anticorps spécifique. Les produits commerciaux comme la cellulose pour chro matographie, le "biogel" ou le nséphadex" peuvent convenir ; mais aussi des polymères de synthèse ou naturels (tels que les polyami des ou le polyvinyle) sur lesquels ont été rajoutés les groupes fonctionnels nécessaires au couplage avec l'anticorps. La forme physique de cette phase solide peut être très diverse : paroi du tube réactionnel, ou plaquette ou poudre, etc. La nature de la macromolécule qui peut servir d'in termédiaire pour fixer les molécules de colorant peut être aussi très diverse : elle doit être hydrosoluble, comporter des groupes réactionnels pour faciliter les réactions de couplage avec le co lorant et avoir une dimension suffisante pour fixer facilement le nombre de molécules de colorant souhaité. Elle peut être une ma cromolécule d'origine naturelle, comme l'albumine ou une globullne, ou une macromolécule de synthèse comme un dextran ou un acide amfné polymérisé (polglysine, polyglycine, etc,). La chimie des macromo lécules offre un grand choix de possibilités. La méthode de dosage proprement dite utilise donc une phase solide sur laquelle a été fixée par covalence l'anti corps : celui-ci doit être au préalable purifié par une des métho des connues en immunologie (précipitation ou immunosorbent) avant d'être couplé à la phase solide préalablement définie selon une des méthodes déj à utilisées (glutaraldéhyde, carbodiimide ou bro mure de cyanogène.). Cette-fixation de l'anticorps diminue sa vi- tesse réactionnelle ainsi que sa capacité de fixation mais conser ve intactes ses caractéristiques de spécificité. Avec lesssdeux réactifs préparés selon les procédés qui viennent d'être définis (réactif coloré et phase solide), le dosage proprement dit s'effectue selon une procédure tout à fait parallèle à la procédure employée en radioimmunnuessai et appelée a nalyse par compétition ou par saturation - dans le milieu à doser est rajoutée une quantité de molécule colorée identique, pour l'anticorps, à la substance à doser, quantité nettement inférieure à la quantité à doser.On ra Joute ensuite l'anticorps lié à la phase solide, en quantité insuf fisante pour fixer la totalité de la molécule à doser , la moléculè à doser ainsi que la molécule colorée identique vont se lier partiellement à la phase solide : la quantité liée à la phase solide dépendra bien sûr des conditions de la réaction (concentration, température, durée, agitation) mais en gardant constants les trois derniers paramètres, elle sera proportionnelle à la concentration, donc à la quantité à doser La molécule identique colorée ne réagira pas exactement comme la molécule à doser, mais à condition de faire un étalonnage préalable, la quantité fixée sur la phase solide pourra servir à mesurer la quantité de molécule à doser, car la vitesse de réaction de cette molécule colorée sera, entre autre, fonction de la capacité réactionnelle de la phase solide, plus ou moins saturée par la molécule à doser. La base essentielle de cette méthode est un étalonnage, dans des conditions opératoires strictement identiques à celles du dosage, à l'aide de solutions étalons de la substance à doser. On opère de la manière suivante : à une quantité constante (et en défaut) de phase solide dans différents tubes sont ajoutées des quantités croissartes de substance identique à la substance à doser et des quantités constantes mais nettement plus faibles de substance identique colorée. Quand la réaction a atteint un niveau suffisant (la solution est agitée pendant ce temps pour faciliter le cok tact avec la phase solide), on décante, et la couleur du surnageant est mesurée par exemple par sa densité optique.On dispose ainsi d'une courbe étalon en fonction des quantités croissantes et connues de substance à doser, sur laquelle on reportera la valeur lue pour le dosage. Le mode opératoire est identique pour la solution à doser; on remplace simplement la solution étalon par un volume égal de solution à doser. Le mode de lecture optique peut être très divers, depuis une simple appréciation à l'oeil Jusqu'S un tracé complet de spectre d'absorption. Cette méthode permet une appréciation aussi bien qualitative que quantitative. Cependant, lorsqu'il s'agit d'un dosage dans un liquide biologique (et en particulier dans le sérum ou l'urine), deux types d'interférences peuvent gêner le dosage :d'abord, la phase réactive peut être genre si la substance à doser est elle même engagée dans une combinaison assez stable avec un composant du fluide biologique examiné La décomposition préalable de ce complexe est nécessaire : elle est possible selon des techniques connues et publiées. Par ailleurs, les composants du fluide biologique considéré (et en particulier dansle sérum ou l'urine) peuvent avoir des propriétés optiques contrariant la lecture colorimétrique; le procéde suivant permet d'éviter cet inconvénient en modifiant légèrement le procédé d'analyse par compétition précédemment décrit. Cette modification consiste à utiliser les propriétés séparatives de la phase solide sur laquelle a été fixé ltanti corps. On opère alors de la manière suivante A l'échantillon de liquide biologique à doser (après qu'il ait subi le traitement préalable, dont il a été question pré cédemment) est ajoutée d'abord la phase solide couplée à l'anti corps préférence une quantité en défaut, comme dans le cas de 11 analyse par compétition ; quand a réaction a atteint un niveau suffisant (et bien avant que l'anticorps soit saturé) le liquide biologique est décanté et la phase solide peut être lavée si nécessaire ; on ajoute alors à la phase solide une solution d'antigène colore qui réagit à son tour avec les sites restés libres de I'anticorps, et avec une vitesse proportionnelle à la quantité de sites libres. Après un temps suffisant de réactiona celle-ci est arrotée par décantation et la densité optique de la solution peut é- tre mesurée et reportée, comme précédemment, sur une courbe étalon établie avec des solutions de concentration connue de la substance à doser Dans ce nouveau procédé, qui est décrit ici pour la première fois, la compétition entre la substance à doser et la substance colorée nta plus lieu simultanément, mais elle demeure réelle et aboutit au même résultat, à savoir que la coloration finale de a solution est proportionnelle à la concentration de substance dans la solution à doser. I1 convient de rappeler à nouveau que toute la validité du dosage repose sur un étalonnage effectué dans des conditions strictement identiques à celles du dosage proprement dit. Cas de l'utilisation de l'anticorps coloré (réactif spécifique coloré) Dans le cas-où il est préférable de marquer l'an ticorps au lieu de la substance à doser, le colorant peut être branché directement sur l'anticorps 'par une des réactions classiques de la synthèse organique, et plus particulièrement de la synthèse peptidique. On peut également, comme pour l'antigène coloré, coupler d'abord le colorant sur une macromolécule, puis coupler ceS te macromolécule colorée à l'anticorps. L'ensemble des remarques faites précédemment concernant le choix du colorant, le choix de la macromolécule porteuse, le type de liaison entre colorant, macromolécule porteuse et antigène s'appliquée également aux combinaisons avec 1' anticorps. De même, les remarques faites pour la phase solide couplée à l'anticorps s'appliquent à la phase solide utilisée ici comportant une substance identique (pour l'anticorps) couplée à cette phase solide. Si l'on désire avoir un grand nombre de molécules colorantes par molécule d'anticorps, il est préférable de bloquer préalablement les sites immunologiquement réactifs de l'anticorps par une réaction antigène-anticorps, l'antigène étant préalablement lié par covalence à une phase solide. La décomposition du complexe antigène-anticorps s'effectue ensuite selon des méthodes connues. Le procédé d'analyse utilise donc dans ce cas, un réactif coloré qui est un anticorps coloré, et une phase solide sur laquelle est fixée l'antigène (ou la substance identique, pour 1'anticorps, à la substance à doser.) Dans le milieu à doser est rajoutée une quantité d'anticorps coloré qui peut être inférieure ou supérieure à la quan tité théorique nécessaire pour fixer la quantité à doser : il convient, de toute façon, de fixer les conditions de réaction de telle manière que l'anticorps ne soit pas saturé (et même soit assez loin de la saturation) quand on débute la deuxième phase qui consiste à faire réagir l'excès d'anticorps avec un antigène fixé sur phase solide. I1 est d'ailleurs possible d'étabLir une compétition véritable pour l'anticorps coloré entre l'antigène à doser et celui fixé sur phase solide en introduisant simultanément les deux réactifs. cette procédure est cependant moins sensible que la précédente. Cpmme dans les cas précédemment décrits, un étalon nage préalable, dans les mêmes conditions que le dosage proprement dit, devra etre fait avec des solutions d'antigène de concentrations connues. De même, lorsqu'il s'agit d'un dosage dans un fluide biologique, dont les composants peuvent gêner la lecture optique du résultat, on peut utiliser un procédé modifié selon le schéma suivant A la solution à doser est rajoutée une quantité d'- anticorps non coloré qui peut être inférieure ou supérieure à la quantité théorique nécessaire pour fixer la quantité à doser ; il convient en effet simplement que la réaction antigène-anticorps ne soit pas totale lorsque débute la deuxième phase du dosage qui consiste à raire réagir l'excès d'anticorps avec un antigène fixé sur une phase solide.Là égalsBent,la réaction doit laisser des sites antigèniques libres pour que la troisième phase puisse se dérouler; après décantation de la solution à doser (et lavage si nécessaire) la phase solide est mise en contact avec une solution d'anticorps coloré qui va réagir avec cette phase solide plus ou moins vite selon le nombre de sites antigéniques libres. Il s'agit donc-en fait d'un dosage "par retour" qui utilise les propriétés séparatives de la phase solide. Les remarques précédemment faites sur la nécessité d'un étalonnage dans des conditions identiques au dosage s'appliquent également ici. Ce procédé est décritici pour la première fois. Les deux procédés qui viennent d'être décrits, avec leurs variantes comportant une étape séparative permettant de faciliter la lecture optique du résultat ne doivent pas être considérés comme limitatifs ; en effet, d'autres procédés selon les mêmes principes sont possibles. Par exemple, on peut utiliser le procédé suivant dans le cas d'un liquide biologique gênant pour la lecture optique : l'anticorps coloré est ajouté à la solution à doser, puis, lorsque la réaction antigène-anticorps a atteint un niveau suffisant, la phase solide portant l'antigène est rajoutée ; quand la réaction avec cette phase solide a atteint le niveau déterminé, le surnageant est décanté, puis après lavage si nécessaire, l'anticorps coloré fixé sur la phase solide peut être alors solubilisé selon des procédés connus,et cette solution peut servir à une mesure optique, à condition toutefois de rétablir un pi convenable pour cette- lect ture optique. Une autre variante peut utiliser 'un deuxième anti corps coloré, dirigé contre le premier anticorps ; on opère alors de la manière suivante à à la solution à doser est aJouté l'anti corps spécifique de la substance à doser en excès pour que la ré action antigène-anticorps soit la plus complète possible ; on ajou te alors le second anticorps coloré qui va précipiter le complexe antigène-anticorps préalablement formé ; ce précipité est séparé par centrifugation et décantation, puis resolubilisé pour mesurer la densité optique. Tout ce qui concerne les méthodes décrites ci-des sus dans le cas des anticorps est applicable à des procédés utili sant d'autres réactifs spécifiques. La présente invention sera de plus encore mieux illustrée par l'exemple particulier suivant : EXEMPLE Dosage de l'hormones chorionique gonadotropique (nommée ici HCG) dans l'urine. L'intérêt de la mesure urinaire de 1'HCG pour la détection précoce de la grossesse est bien connu : dès la fin de la cinquième semaine de grossesse, les taux de HCG atteingnent en effet 100 UI/ml et plus. - préparation de 1'H.CG colorée A A 1 mg d'HCG purifiée sont aJoutés 5 mg de rouge congo dissous dans 1 ml d'eau distillée, et 0,1 ml d'une solution de glutaraldéhyde à 40 %. Après 10 à 15 heures de contacts le pro-; duit..de réaction est-purifié, après dialyse, par passage sur phadex G50".~La première fraction colorée correspond au couplage de t CG avec du rouge congo partiellement polymérisé.Le dosage de ette fraction est effectué par radioimmunuessai : le rendement de couplage est d'environ 60 % en HCG ; par ailleurs, la coloration est nettement visiblé jusqu'à des concentrations pondérales 2e 10 nanogrammes par ml, mais la capacité de liaison avec l'anticorps de cette HCG colorée a diminué de 85 X sans que cela-gêne l'e::ploi de ce réactif pour le dosage photoimmunologique. - Préparation de l'anticorps sur phase solide La phase solide sur laquelle est fixée l'anticorps est préparée selon la technique d'Avrameas (S.Avrameas et T. Terniak, FEBS Letters, vol.23 (I), 24, 1972) modifiée pour diminuer la capacité de fixation de cette phase solide. 100 ml d'un tamis moléculaire (par exemple le "biogel") sont activés par 10 ml de glutaraldéhyde à 6 d en tampon phosphate à pH7. Après une nuit d'agitation, le gel est lavé 10 fois à l'eau distillée, puis, après une dernière centrifugation on ajoute 10 ml d'une solution tampon contenant 500 microgrammes de gammaglobuline anti-HCG purifiés par précipi+ation-au sulfate de sodium. Après 24 heures d'agitation, le gel est lavé plusieurs fois au sérum physiologique, puis une solution de 100 ml de lysine 0,1 M est ajoutée à pH=7,4 et agitée une nuit avec le el, qui est ensuite lavé au sérum physiologique, puis à la gly cine-HCL à pH=2,8, puis au tampon phosphate. Plusieurs lavages au sérum physiologique sont ensuite effectués. La capacité de fi xation de cette phase solide est de 4 microgrammes d'HCG par ml de gel. - Dosage de l'HCG urinaire Pour des concentrations d'HCG pouvant varier de 2 10 microgr. par ml d'urine, on peut suivre la procédure suivante : à 2,5 ml de biogel préparé selon la méthode décrite ci-dessus est ajouté un ml d'urine fraîche. Après une heure d'incubation, l'urine est décantée et le biogel est lavé deux fois au tampon nosphate pH=7,4. On ajoute alors I ml d'HCG colorée selon le procédéci-dessus > I ml d'une solution à 10 microgrammes par ml (concentration mesurée en capacité de fixation de l'anticorps) près I heure d'incubation, la solution est décantée et sa densité optique mesurée.On peut également comparer à l?oeil cette solution avec des solutions étalons qu'il faut de toute fa çon préparer pour l'établissement de la courbe étalon. I1 faut ajouter que les solutions en contact avec la phase solide contien nent un agent tensioactif (par exemple du tween), à une concentration de 5 pour mille, pour éviter l'absorption non spécifique de 1'HCG colorés sur la phase solide. Une courbe colorimétrque étalon est établie en remplaçant, dans la procédure décrite ci-dessus le ml d'urine par un millilitre d'HCG étalon à des concentrations allant de 2 à 10 microgrammes par ml, toutes -les autres conditions étant inchangées. D'autres exemples d'applications peuvent être cités dans le domaine de l'analyse biologique - dosage de la thyroxine par l'emploi de la TBG (thyrobinding-globuline), et de la triiodothyronine - dosage d'hormones stéroïdes comme l'aldostérone, la testostérone, la progestérone, ltoestradiol,etc. - dosage d'hormones polypeptidiques comme l'insu- line, l'hormone de la croissance, l'angiotensine, etc. - dosage d'anticorps comme les anticorps antiinsu line, d'antigènes comme l'antigène "Australia", de vitamines (A, B1, etc.), et d'enzymes. - dosages plus courants comme le cholestérol, l'a cide urique, certains sucres, la créatine, les acides amines, 1' albumine, etc.. Dans le domaine de l'analyse organique, quelques exemples d'applications du procédé selon l'invention peuvent aussi être cités, et plus particulièrement le dosage de substances uti lisées comme médicaments, comme la digitoxine et l'acide acétyl salycilique ; ce type de dosage peut s'appliquer à des dosages de traces dans des milieux aqueux complexes. Enfin, comme exemple d'application du procédé dans le domaine de l'analyse minérale, on peut citer le cas du dosage du fer par l'emploi de la transferrine ou siderophiline comme ré actif spécifique. La base essentielle de la présente invention est donc axée sur la combinaison d'un réactif spécifique, d'un colo rant fixé sur ce réactif spécifique ou sur un autre réactif, et d'une phase solide séparative. Les procédés possibles font intervenir ces différents réactifs et la substance à doser dans des ordres différents. La phase dite séparative permet effectivement de séparer la substance à doser, ou un réactif proportionnel à la substance à doser, si la solution à doser présente des caractéristiques gênantes. Il convient également de rappeler la nonnécessité de laisser se poursuivre Jusqu'à leur terme les diverses réactions mises en jeu, la quantification pouvant être assurée par un étalonnage préalable. La méthode de dosage selon la présente invention peut être appliquée à de multiples -dosages grâce à un ensemble de réactifs appropriés et à des procédés d'analyse contenus dans des coffrets de réactifs pouvant être commercialisés. Les avantages principaux présentés par le procédé décrit, notamment par rapport à la méthode radioimmunologique, sont d'une part l'absence de radioactivité liée à un réactif, ra dioactivité demandant des précautions de manipulation et limitant la durée de vie de ce réactif, et d'autre part la facilité de lecture, une estimation approchée pouvant être de6Jà effectuée à 1'- oeil, grâce à une gamme étalon, et une mesure plus précise pouvant etre faite avec un colorimètre, instrument courant dans les laboratoires d'analyses. L'inconvénient, peu gênant dans les cas ha rituels, est une sensibilité moins grande. Une sensibilité inférieure au nanogramme par ml pourrait cependant théoriquement être atteintes mais au détriment dfune vitesse de réaction, donc d'une rapidité de dosage très réduite. I1 convient enfin de relever un autre caractère original de la présente invention : il s'agit de la fixation de la matière colorée sur le réactif spécifique, ou sur la substance identique, par l'entremise d'une macromolécule porteuse. REVENDICATION 1. Procédé de dosage chimique par colorimétrie spécifique, caractérisé par le fait qu'on lie une matière colorée à un réactif spécifique de la substance à doser ou à une substance identique pour le réactif spécifique à la substance à doser, qu'on fixe le réactif spécifique ou la substance identique sur une phase solide, qu'on fait réagir par compétition la substance à doser en solution et la substance identique avec le réactif spécifique, puis qu'on effectue une masure optique sur la solution colorée par comparaison avec des solutions étalons, après séparation de la phase solide. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on lie une matière colorée à une substance identique, qu'on fixe le réactif spécifique sur une phase solide, qu'on les ajoute à la solution à doser, puis qu'on effectue une mesure optique sur la solution contenant la partie de la substance identique colorée n'ayant pas réagi. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on lie une matière colorée au réactif spécifique, qu'on fixe une substance identique sur une phase solide, qu'onlesa Joute à la solution doser, puis qu'on effectue une mesure opti- que sur la solution contenant l'excès de réactif spécifique coloré. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on fixe le réactif spécifique sur une phase solide, qu'on ajoute à la solution à doser, qu'on sépare et lave la phase solide, qu'on la fait réagir avec une substance identique sur laquelle on a lié une matière colorante, puis qu'on effectue une mesure optique sur la solution contenant la partie de substance identique colorée n'ayant pas réagi. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on fixe une substance identique sur une phase so- lide, qu'on l'ajoute; ainsi que le réactif spécifique, à la solution à doser, qu'on sépare et lave la phase solide, qu'on fait réagir celle-ci avec le réactif spécifique auquel on a lié une matière colorée, puis qu'on effectue une mesure optique sur la solution contenant la partie du -réactif spécifique coloré n'ayant pas réagi. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on lie une matière colorée au réactif spécifique, qu'on fixe une substance identique sur une phase solide, qu'on les ajoute à la solution à doser, qu'on sépare et lave la phase solide, qu'on resolubilise le réactif coloré fixé alors sur la phase solide, puis qu'on effectue une mesure optique sur la solution obtenue, 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on fait réagir la substance à doser avec le réactif spécifique, qu'on ajoute au complexe ainsi formé un second réactif spécifique auquel on a lié une matière colorée pour précipiter ce complexe, qu'on sépare par centrifugation et décantation le précipité coloré obtenu, qu'on resolubilise celui-ci, puis quton effectue une mesure optique sur la solution obtenue. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le dosage de la substance à doser a lieu dans des conditions de température, de durée, de concentration des réactifs et d'agitation identiques aux conditions utilisées pour la préparation des solutions étalons. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on lie la matière colorée au réactif spécifique ou à une substance identique directement. 10. Procédé selon la revendication 1 et la reven -dication 9, caractérisé par le fait que la liaison entre la matière colorée et le réactif spécifique ou la substance identique est une liaison covalente. 11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on lie la matière colorée au réactif spécifique ou à une substance identique par l'entremise d'une molécule porteuse. 12. Procédé selon la revendication 1 et la revendication 11, caractérisé par le fait que la molécule porteuse est une macromolécule naturelle. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que la macromolécule naturelle est l'albumine. 14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que la macromolécule naturelle est la globuline. 15. Procédé selon la revendication 1 et la revendication 11, caractérisé par le fait que la molécule porteuse est une macromolécule de synthèse. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que la macromolécule de synthèse est un dextran. 17. Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait quelamacromolécule de synthèse est un acide aminé polymérisé. 18. Procédé selon la revendication 1 et la revendication 11, caractérisé par le fait que la liaison entre la molécule porteuse et le réactif spécifique est une liaison covalente. 19. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la matière colorée est soluble dans le. milieu aqueux du dosage. 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé par le fait que la matière colorée hydrosoluble est une protoporphyrine. 21. Procédé selon la revendication 19, caractérisé par le fait que la matière colorée hydrosoluble est le rouge congo. 22. Procédé selon la revendication 19, caractérisé par le fait que la matière colorée hydrosoluble est la fuchsine. 23. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on greffe un groupe hydrophile sur la matière colorée hydrophobe. 24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé par le fait que la matière colorée hydrophobe est une chtalocyanine 25. Procédé selon la revendication 23, caractérisé par le fait que la liaison entre le groupe hydrophile et la matière colorée hydrophobe est une liaison covalente. 26. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la phase solide est constituée par une macromolécule naturelle insoluble. 27. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la phase solide est constituée par une macromolécu le de synthèse insoluble. 28. Procédé selon les revendications 26 ou 27, caractérisé par le fait que la macromolécule est un polyamide. 29. Procédé selon la revendication 27 , caractérisé par le fait que la macromolécule de synthèse est un polymère -xinylique. 30. Procédé selon la revendication 27, caractérisé par le fait que la macromolécule de synthèse est un tamis moléculaire. 31. Procédé selon la revendication 27, caractérisé par le fait que la macromolécule de synthèse est de la cellulose, 32. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la liaison entre la phase - soii4e et le réactif spécifique ou une molécule identique est une liaison covalence. 33. Application du procédé selon la revendication 1, à une substance biologique contenue dans un fluide biologique. 34 Application selon la revendication 33, carac tarifée par le fait que la substance biologique à doser est un antigène et que le réactif spécifique est un anticorps. 35. Application selon la revendication 33,- caractérisée par le fait que la substance biologique à doser est un anticorps et que le réactif spécifique est un antigène. 36. Application selon la revendication 33, carac térisée par le fait que l'on bloque les sites imnamologiquement réactifs de l'anticorps par une réaction antigène-anticorps, l'an- tigène étant préalabXlement lie par covalence à une phase solide, que lton aJoute la matière colorante, puis que l'on décompose le complexe antigène-anticorps pour obtenir l'anticorps coloré; 37. Application selon la revendication 33, caractérisée par'le fait que la substance biologique à doser est l'hornone chorionique gonadotropique. 38. Application selon la revendication 33, et la revendication 37, garactérisée par le fait que le fluide biologique est l'urine. 39. Moyen pour la mise en oeuvre du procédé selon la revehdication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend un Jeu de réactifs. 40. Moyen selon la revendication 39, caractérisé par le fait que le jeu de réactifs est contenu dans un coffret.