FR 2262511 A1 19750926 FR 7406981 A 19740301 La présente invention est relative à un nouveau vaccin contre la maladie à virus de cloison et des volatiles proches de l'Oie tels que canards de Barbarie, par exemple, ainsi qu'au procédé de préparation de ce vaccin. La maladie à virus de l'Oison est une affection d'allure épizootique,très contagieuse - également connue sous les noms d llhépato-néphrite-ascite de llOison", dtthépatite à virus de l'Oison" ou encore de "peste de l'Oison" - qui fait peser une lourde menace sur l'élevage de l'oie tant en France que dans d'autres pays dlEurope tels que la Hongrie, l'Allemagne, la Hollande et l'italie. En effet, cette maladie contagieuse est très mesure trière car elle frappe, selon les années, de 50 à 90 % des élevages d'oies et se termine par la mort des malades dans 50 à 80 % des cas.Outre le taux de mortalité élevé qu'entralne cette épizootie, elle provoque chez les animaux qui guérissent et survivent à cette maladie, des troubles divers tels que retards de croissance, mauvais emplumement, difficultés de gavage, qui représentent un préjudice économique important. De plus, les sujets survivants restent de redoutables porteurs de virus, qui contribuent à la propagation de la maladie. Enfin, la reproduction des animaux guéris est dangereuse, puisque l'agent responsable est transmis par ltoeuf, qui constitue ainsi également une source de contagion. Les inventeurs ont pu mettre en évidence dans le cadre de leurs travaux,qué la maladie des Oisons se présente sous deux formes 10 - une forme précoce, atteignant les oisons agés de 6 à 30 jours 20 - une forme tardive, touchant les oisons plus agés ou les jeunes adultes, de 5 semaines à 3 mois. La maladie sévit la plupart du temps au printemps, à -cause du caractère saisonnier de la reproduction de l'oie. Elle apparat en général au mois de Mars, avec les premières éclosions, atteint un maximum au cours de la deuxième quinzaine du mois d'Avril, puis diminue progressivement pour disparaître au début du mois de Juillet. 1Q - La forme précoce de la maladie peut évoluer sous trois formes : - une forme aiguë ou suraigue - une forme subaigus - une forme chronique ou inapparente. - La forme aiguë ou suraiguë est caractérisée par une incuba tion et une évolution courtes et brutales. Les symptômes et les lésions sont peu nets, fugaces, parfois même totale ment absents. Elle atteint des oisons très jeunes (8 à 15 jours) et ne peut apparaître qu'après un choc ou une per turbation physiologiques tels que mauvaise hygiène, trans- port, erreur d'alimentation, refroidissement.... Elle se termine par la mort dans la totalité des cas. - La forme subaiguë, caractérisée par une évolution plus len te, offre à l'observation, des symptômes et des lésions multiples, difficilement dissociables, au moins dans la phase terminale, et dominés par un syndrome d'hépato néphrite-ascite. Elle atteint des oisons âgés de 15 à 30 jours. Le taux de mortalité est variable, compris généralement entre 20 et 70 %. Chez les oisons survivants, la maladie évolue vers une guérison spontanée, mais les oisons demeurent cepen dant fragiles et sujets à des troubles de croissance impor tants. - La forme chronique évolue sans symptôme apparent, les ani maux parvenus à l'âge adulte constituant de redoutables porteurs de virus. 20 - La forme tardive se présente comme une affection épizootique sévissant sous deux formes, la forme aiguë et la forme chro nique, cette dernière étant,de loin, la plus fréquente - La forme aiguë atteint les oisons âgés de 4 à 5 semaines et se présente en réalité comme une forme de transition entre la forme subaiguë de la maladie précoce et la forme chroni que de la maladie tardive. Elle est caractérisée par un syndrome hépatonéphritique associé à une entérite hémorra gique au niveau des portions terminales de l'intestin. Elle se termine par la mort dans la majorité des cas. - La forme chronique frappe les jeunes adultes de un mois et demi à deux mois. Elle est caractérisée par une évolution sournoise, totalement inapparente, et par une mort brutale de sujets qui avaient, quelques heures plus tat, toutes les apparences de la bonne santé. Elle est dominée par un syn drome hépatique chronique associé à des troubles hémorra giques. La maladie se termine par la mort dans 50 a 60 % des cas. Les symptômes de la maladie virale de l'Oison sont différents selon que l'on considère la forme précoce ou'la forme tardive de la maladie. Forme précoce La forme aigus de la maladie présente une évolution très rapide, souvent foudroyante. Les oisons, âgés de 6 à 10 jours, maigrissent très rapidement, l'animal s'isole du troupeau et reste le plus souvent prostré, le bec posé sur le sol. Il est bientôt incapable de se déplacer et reste couché sur le côté, très amaigri, présentant une diarrhée claire très fluide. Il meurt en ou 48 heures dans un coma rappelant le coma urémique des Mammifères. A l'autopsie, on note le plus souvent une décoloration en plaques du myocarde, associée à des traces hémorragiques éparses. Le foie montre des traînées ou des plaques décolorées, jaune ocre ou jaune pâle avec de nombreuses hémorragies sous-capsulaires, particulièrement sur les marges des lobes. Les reins sont congestionnés et hémorragiques a la coupe. Le pancréas, de façon très inconstante, est hypertrophié avec de nombreuses hémorragies en "pire de puce" et l'on peut parfois noter des lésions d'en termite hémorragique violente. La forme subaigu! de la maladie évolue plus lentement et peut se diviser en trois phases : la phase de début, la phase d'état et la phase terminale. - La phase de début est bien souvent très difficile à déceler le seul symptôme est en effet un arrêt de croissance sur des -animaux qui, par ailleurs, vivent normalement. Mais très rapi dement le sujet malade grossit moins vite que le sujet sain. Il présente un retard de croissance qui s'accentue de jour en jour et il devient tres facile de reconnaître les oisons malades dans une bande d'animaux du même âge. Ce signe marque la fin de la phase de début ; les oisons sont alors âgés de 15 & à 1 jours. - La phase d'état débute par une amplification du retard de crois sance, le poids pouvant être inférieur de 50 a 80 p 100 à ce lui de l'animal normal. On note en même temps des pertes anor males de duvet, particulièrement au niveau de l'abdomen, du dos et du bord antérieur des ailes. De plus, l'oison, qui se nourrit normalement présente une soif intense qui augmente à mesure que la maladie évolue. Cette phase peut durer jusqu'à l'âge d1unmois. - La maladie se termine, dans 70 à 80 p. 100 des cas par une guérison spontanée. L'animal comble lentement son retard de croissance mais reste plus fragile. Il présente souvent des dé fauts d'emplumement et reste sujet à des accidents nombreux, notamment au moment du gavage. Dans 20 à 30 p. 100 des cas, le retard de croissance s'accentue. L'animal maigrit, ne mange plus et boit beaucoup. Rapidement on peut le voir s'isoler du troupeau ; il présente des troubles locomoteurs, montrant souvent une attitude caractéristique qualifiée de "position assise", immobile en équilibre sur ses pattes et son croupion. Bientôt, la locomotion devient de plus en plus difficile puis impossible. L'animal est piétiné et frappé par ses congénères et meurt dans un état de cachexie avancée, l'abdomen distendu par une ascite très importante. Les lésions de la forme subaiguë sont très nombreuses et intéressent tous les organes de la cavité thoracique et abdominale. Les muscles du squelette sont soit-décolorés et jaunâtres, soit très congestionnés Le coeur baigne dans un exsudat péricardique abondant. Il est hypertrophié et décoloré. Le foie est généralement hypertrophié. Il est mou et friable et présente de nombreuses lésions de dégénérescence en plaques et des hémorragies sous-capsulaires. Le pancréas est hémorragiqueainsi que la rate. L'intestin montre des lésions d'entérite hémorragique ou d'entérite chronique. Le rein enfin est soit congestionné et hypertrophié, soit hypertrophié et entièrement décoloré,selon le stade de la maladie. Entre ces deux types de-lésions, il est possible de trouver tous les intermédiaires. Il faut noter de plus que les organes sont souvent noyés dans un liquide d'ascite clair et abondant, de couleur jaune paille, et recouverts d'un abondant dépôt de fibrine. On rencontre ces lésions au stade final de la maladie, sur des oisons âgés de 3 semaines à 1 mois. Forme tardive Les symptômes sont différents selon que l'on considère la forme aigu ou la forme chronique. - Forme aiguë : La maladie débute, sur des oisons âgés de 3 & BR 4 semaines, par un retard de croissance beaucoup plus discret que dans la forme précoce de la maladie. Puis, brusquement et sans présenter d'autres symptômes, les oisons meurent, générale- ment sans présenter l'amaigrissement qui caractérise la forme aigue de la maladie précoce : examen du cadavre permet de no- ter un amaigrissement beaucoup moins important que dans la for me correspondante de la maladie précoce où l'état cachectique est souvent impressionnant. Le tableau nécropsique est dominé par un syndrome hémorragique caractéristique des affections virales à allure septicémique.On peut observer des lésions de périhépatite avec une congestion intense et des hémorragies sous-capsulaires étendues formant parfois de grosses taches noires à la surface du foie. L'organe hypertrophié, est mou et friable ; il s'écrase très facilement sous le doigt et présente alors un-aspect caractéristique de purée rouge violacée. On note également des lésions d'entérite hémorragique localisées aux portions terminales de l'intestin et au caecum, avec par fois des caillots de sang non digéré. Au niveau du mésentère, des hémorragies en nappe, plus ou moins étendues, ainsi que des épaississements oedémateux sont fréquents. La rate est petite et décolorée. Les reins sont fortement congestionnés, de couleur rouge violacée et ils sont hypertrophiés. On note fréquemment des dépôts d'urate abondants.Enfin, les organes sont noyés dans un liquide d'ascite épais et gélatineux. - Forme chronique : Elle est tout aussi brutale que la formé aigu! et seules les lésions observées à l'autopsie attestent une évolution souvent très longue. Les seuls symptômes que l'on peut observer de façon inconstante sont des signes nerveux ca ractérisés par une démarche difficile et ébrieuse. L'oison s'arrête fréquemment et semble être dans l'impossibilité de se maintenir sur ses pattes de façon normale. Il repose sur le sol par la totalité du tarse, les pattes écartées comme pour maintenir un équilibre instable, la pointe du bec posée sur le sol et les ailes étendues. Cette position est souvent qualifiée de "position sur trois points. Les lésions, comme pour la forme aiguè,sont celles d'une mala die virale septicémique. Le foie est hypertrophié et conges tionné, mou et friable. Les lésions d'entérite hémorragique, qui débutent toujours dans les portions terminales de l'intes tin, tendent à "remonter11 à mesure que la maladie évolue et pattes gnent fréquemment le duodénum sur les oisons de 2 à 3 mois. On rencontre alors tous les types de lésions, depuis la simple congestion de la muqueuse au niveau du duodénum, jusausà l'éro sion complète avec présence de sang en nature dans le gros in testion et le caecum. Le péritoine et le mésentère sont infiltrés par un liquide de consistance plus ou moins gélatineuse qui donne au cadavre un aspect "humide" caractéristique. La rate, petite et décolorée dans la forme aiguë à la suite des hémorragies brutales, peut être au contraire hypertrophiée et de couleur violacée dans les formes à évolution longue. Les reins sont congestionnés et on peut noter des dépôts d'urate importants. -Enfin, lorsque l'évolution est très longue on observe des lésions de congestion pulmonaire et de myocardite avec hyper- trophie du muscle cardiaque qui est mou, décoloré et affaissé. -On observe alors un exsudat péricardique important. Des études réalisées au Laboratoire par les Inventeurs ont peu mis à ceux-ci d'établir des techniques de transmission de la maladie à l'animal sensible, à l'aide d'un broyat d'organes virulents et de reproduire ainsi une maladie expérimentale parfaitement iaen- tique à la maladie naturelle. Des passages en série sur Oison ont également été effectués avec,pour conséquence, une augmentatnon du taux de mortalité. Enfin, l'inoculation par voie intramusculaire à des oisons, de broyats d'organes filtrés sur des filtres type SEITZ EKS 2 a également provoqué chez les oisons inoculés, la reproduction d'une maladie expérimentale identique à la maladie naturelle.Ces études ont fait apparaître que l'agent responsable de la maladie est un virus,dont la nature a été précisée par isolement du virus à partir d'organes (notamment de foies) d'oisons malades ou morts, puis passages sur des cultures cellulaires, suivis du titrage des virus jusqu'à obtention d'un effet cytopatnogéne. Au cours de ces études, deux virus ont été successivement isolés et entretenus en cultures cellulaires d'embryons d'oie, les virus w et 6 Les études réalisées au Laboratoire (colorations histologiques des effets cytopathogènes, test à l'éther, filtration, microscopie électronique) ont montré que - le virus X est un adénovirus qui, bien que pathogène pour l'animal, ne semble jouer aucun rôle dans l'étiologie de la maladie à virus de l'Oison - le virus 13, , entretenu par des passages successifs en cultures cellulaires de fibroblastes d'oie et transmis à des oisons de cinq jours, a permis de reproduire une maladie expérimentale parfaitement identique à la maladie naturelle. Les propriétés de ce virus , à savoir - L'inhibition de sa lultiplication par la 5-iodo-2' déoxyuridine (I.U.D.R.) - Sa résistance à l'éther - Sa taille : 20 nm (déterminée par filtration et par micros copie électronique) - Sa forte thermorésistance - Sa multiplication dans le noyau des cellules (effet cyto pathogène au microscope électronique) permettent de le ranger dans le groupe des Parvovirus. Des essais de prophylaxie médicale de la maladie virale de l'Oison ont été tentés, à l'aide de sérums de convalescents ou d'aniflaux guéris. Toutefois il s'agit de sérums préparés par des vétérinaires sur les lieux même de l'épidémie, selon des techni qa-es très artisanales, qui s 'ils donnent des résultats qui ont pu être qualifiés d'intéressants, ne sont pas des sérums industriels et ne résolvent donc pas le problème posé, de façon reproductible et à grande échelle (cf M. COUDERT, G. DANNACHER, M. FEDIDA et Mme M. PEILLON, Rec. Méd. Vét. Tome CXLIX, février 1973). Il a par ailleurs été proposé un procédé de préparation d'un "Vaccin pour l'immunisation d'oiseaux contre l'hépatite des oies" (cf demande de Brevet Français NO 71.23981 du 30 juin 1971) qui donne lieu à des vaccins virulents ou atténués qui ont pour principaux inconvénients celui de ne pas assurer une immunisation dans tous les cas, et celui de ne pas être stables La présente invention a en conséquence pour but de pourvoir à un vaccin contre la maladie à virus (parvovirus) de l'oison qui répond mieux aux nécessités de la pratique que le vaccin précé gemment proposé, notamment en ce qu'il est constitué par un vaccin inactivé et stabilisé, dépourvu d'effets nocifs, assurant une inaunisation dans tous les cas des animaux traités, et dont la stabilité dans le temps est excellente, le vaccin conforme à la présente invention étant apte à être préparé à l'échelle in dustrielle. La présente invention a pour objet un nouveau vaccin contre la maladie à virus (parvovirus) de l'Oison, caractérisé en ce qu'il contient des virus inactivés et stabilisés obtenus à partir d'organes d'animaux présentant les symptômes et les lésions de la maladie et/ou de souches isolées des virus. Selon un mode de réalisation avantageux du vaccin conforme à la présente invention, celui-ci est stabilisé à pH 7,5 - 8. Selon un autre mode de réalisation avantageuxdu vaccin confos me à la présente invention, celui-ci contient un agent d'inactivation approprié, avantageusement constitué par de la t-propiolactone. Selon encore un autre mode de réalisation .avantageux du vaccin conforme à la présente invention, celui-ci contient un agent antiseptique approprié, avantageusement constitué par du merthiolate, par exemple. Selon un mode de réalisation-préféré du vaccin conforme à la présente invention, ce dernier est mis sous une forme aisément administrable par voie parentérale, par association avec un adjuvant approprié, tel qu'hydroxyde d'aluminium, par exemple. Conformément à l'invention, le vaccin contre la maladie à virus (parvovirus) de l'Oison présente un titre en virus inactivés~ et stabilisés d'au moins 106 DI50 inactivés par ml. Selon l'une de ses dispositions préférées, le vaccin conforme à la présente invention comprend des cultures de virus obtenus par inoculation sur des cultures cellulaires telles que des primo-cultures d'embryons d'oie ou de canard de Barbarie. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un nouveau vaccin contre la maladie à virus (parvovirus) de l'Oison, tel que défini ci-dessus, lequel procédé est caractérisé en ce que - l'on réalise, au cours d'un premier stade, la multiplication de virus obtenus par prélèvement d'organes sur des animaux présen tant les symptômes et les lésions de la maladie virale de l'Oison ou de souches virulentes isolées, sur des cultures cel lulaires d'embryons d'oie ou de Canard de Barbarie - au cours d'un second stade, les cultures de virus obtenues, dont le- titre est supérieur à 106 DI50 / ml) sont soumises à un processus d'inactivation à l'aide d'un agent d'inactivation approprié tel que la p-propiolactone, par exemple, dans des conditions de pH strictement contrôlées, - après quoi, le vaccin inactivé obtenu est stabilisé par addition d'un tampon approprié, après lui avoir éventuellement ajouté un agent antiseptique et/ou un adjuvant, et dans des conditions de de PH strictement contrôlées. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de préparation du nouveau vaccin, le processus d'inactivation des culture de virus est réalisé en deux stades successifs, séparés par un ajustement du pH du milieu à 7 - 7,5. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé conforme à la présente invention, la stabilisation du vaccin inactivé est réalisée dans des conditions de pH comprises entre 7,5 et 8. Une disposition particulière de l'invention prévoit la mise en oeuvre d'un agent de stabilisation essentiellement constitué par un tampon approprié de stabilisation du pH dans la zone de pH admissible pour ces vaccins, entre 7,5 et 8. Conformement à cette disposition , l'on a avantage à mettre en oeuvre des tampons utilisés dans les cultures cellulaires, du type de ceux compris dans le groupe qui inclut, par exemple, les tampons HEPES ( ou acide N-2-hydroxyéthyl-pipérazine N-2- éthane-sulfonique), TRIS Ïou tris (hydroxymathyl) aminométha ne /, les tampons à base de bicarbonate, les tampons constitués par du glycocolle et du chlorure de sodium, les tampons MES ( ou acide 2-(N-Morpholino)Ethane sulfonique, ADA (ou acide N-(2-Ace- tamido )Imidiacetique,ACES (ou acide N-(Acetamido)ImidiacetiqueP BES (ou acide (N,N Bis ( 2 Hydroxyethyl)- 2 Aminoethanesulfonique, TES ( ou acide N-Tris ( Hydroxymethyl) Methyl-2-Aminoethane Sul fonique. Conformément à l'une des modalités d'exécution du procédé de préparation du nouveau vaccin, l'ajustement du pH au cours des différents stades du procédé est réalisé à l'aide d'une solution normale de soude. La présente invention a également pour objet l'application du vaccin, à la prévention de la maladie à virus (parvovirus) de l'Oison, ches l'Oison et chez les volatiles de familles voisines telles que le Canard de Barbarie, et plus généralement chez les animaux atteints de-la maladie'virale de l'Oison. L'on opère, de préférence, dans La préparation du vaccin inactivé, stabilisé conforme à l'invention comprend avantageusement les stades suivants PREPARATION DU VACCIN INACTIVE, STABILISE 1. Primo-cultures-de cellules d'embryons d'Oie ou de Canard de Barbarie Des embryons d'Oie ou de Canard de Barbarie âgés de lîà 14 jours sont prélevés, hachés finement et digérés par de la trypsine (0,2 % dans une solution de HANKS sans calcium ni magnésium). Les cellules obtenues sont mises en suspension (400 000 à 500 000 cellules/ml) dans un milieu comprenant - milieu à l'hydrolysat de caséine à base de EARLE (C03NaH 1,10 g) + solution de HANKS (à parties égales) + 5 % de sérum de veau inactivé.La suspension cellulaire ainsi réalisée est distribuée dans des tubes (16/160), des boites Falcon (250 et 3Q ml) ou des boîtes de Roux (l litre). Après 48 heures d'incubation à 370C, on obtient une couche cellulaire continue convenant aux inoculations virales. La sensibilité des cultures diminuant avec l'age, il est préférable de ne pas utiliser de cultures âgées de plus de 48 heures. Avant utilisation, ce milieu est enlevé et remplacé par le suivant milieu basal de EAGLE (BME) (C03NaH : 2,20 g) + 2 % de sérum de veau inactivé + 2 % de liquide amniotique de bovin. Les cellules d'embryon d'Oie se maintiennent ainsi en bon état pendant plus de 15 jours à 37,5 OC. 2. Isolement du matériel infectieux Le matériel infectieux destiné à être inoculé aux cultures cellulaires est constitué par des prélèvements de foie et de rate effectués sur des oisons malades ou morts, soit dans des conditions naturelles, soit dans des conditions expérimentales après inoculation. Il peut également être constitué par des souches de virus isolées précédemment. Dans le cas où l'on utilise des organes prélevés, ils sont finement broyés et dilués au 1/10 dans du tampon phosphate isotonique M/90 à pH 7,4. Après centrifugation à 5 000 tours par minute pendant environ 15 à 20 minutes, le surnageant, avantageusement additionné d'antibiotiques, est filtré sur membrane "Millipore" de 0,45 ji et soit inoculé aux cultures cellulaires, soit conservé à une température de -700C. Il constitue la souche virulente d'origine. 3. Culture du virus Quarante-huit heures après la mise en culture des cellules, le virus est inoculé à ces dernières ; il peut être inoculé non dilué à des cultures cellulaires dont le milieu vient d'être changé, ou bien il peut être inoculé sur le tapis cellulaire sans milieu. Dans ce dernier cas, les bottes de Roux pourvues d'un tapis cellulaire confluent sont vidées. Elles sont inoculées avec 10 ml de virus au 1/10 (virus titrant 106 à 107 D.I.50/ml). La culture est alors placée à l'étuve pendant 30 à 45 minutes en remuant l'inoculum toutes les 10 minutes. Le milieu est ensuite complété à raison de 90 ml du milieu BME précédermnent décrit. Dans les deux jours qui suivent, on constate une certaine prolifération des cellules musculaires qui dessinent sur le tapis cellulaire des filaments réfringeants plus ou moins abondants. L'effet cytopathogène se traduit par un aspect granuleux peu spécifique du tapis cellulaire avec ensuite lyse complète des cellules épithéliales situées entre les fibres musculaires. Ce résultat est atteint au bout de 3 à 4 jours. 4. Récolte et titrage de virus Au bout de 3 à 4 jours, les boites de Roux sont congelées (-400C) et décongelées pour faire éclater les cellules infectées. Le milieu de culture est recueilli et centrifugé à 3 000 tours/ minute pendant 15 minutes. Le surnageant est alors titré de la manière suivante Des tubes de cultures cellulaires âgées de 48 heures sont vidés et leur milieu est remplacé par le BME. Le virus est dilué de 10 en 10 et inoculé aux tubes de culture à raison de 0,1 ml par tube. Les tubes sont placés à l'étuve (37 à 390C) en portoirs stationnaires. Il est souvent utile d'effectuer un changement de milieu après 7 jours. Le titre final (toujours calculé et rapporté au ml) est lu au bout de 12 à 14 jours. Les titres obtenus sont de llordre de lu6'5 à 107'5 D.I.50/ml. 5. Première inactivation L'on ajoute à la culture de virus une solution à 10 % de ss -propiolactone, à raison de 1 % en volume par rapport au volune de la culture de virus. Le tube, placé 370C pendant une heure environ, est agité à plusieurs reprises pendant le temps d'inactivation. 6. Deuxième inactivation Le pH du contenu du tube est rajusté~à pli 7-7,5 par addition de soude normale, puis on lui ajoute une solution à 10 49 dess -propiolactone. Le tube est-placé à 370C pendant une heure environ et agité à plusieurs reprises. La concentration finale eng -propiolactone du milieu, après les deux inactivations, est avantageusement de l'ordre de 1 : 2000. Après la deuxième inactivation, l'on vérifie que le produit est bien inactivé, par prélèvement d'un échantillon de celui-ci et inoculation à des tubes de culture. 7. Adionction d'adjuvant A la suite de la deuxième inactivation, le pH est réajus- té à pH 7-7,5 par addition de soude normale, puis on ajoute au produit inactivé, -de l'hydroxyde d'alumine à pH 7,5, préalablement sterilisé à l'autoclave. 8. Adionction dun antiseptiaue L'on ajoute alors un antiseptique tel que du merthiolate, par exemple, en solution à 1 96. 9. Stabilisation du produit La stabilisation est réalisée par addition au produit d'un tampon avantageusement, mais non limitativement,constitué par le tampon connu sous le nom de "Tampon HEPES", qui est de I 'acide N-2-hydroxyéthyl-pipérazine-N-2-éthane-sulfonique. Le pHdu produit stabilisé est de 7,5-8, réausté, au besoin, par addition de soude normale. Le vaccin est ensuite conditionné en flacons, après contrôle de sa stérilité bactérienne. Il est conservé à + 4-C et sa validité est d'au moins 6 mois. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortent de la description qui va suivre. La présente invention vise, en particulier. les nouveaux vaccins contre la maladie à virus de l'Oison et leurs procédés de préparation, conformes aux dispositions qui précèdent, ainsi que les moyens propres à la mise en oeuvre des procédés cidessus, les installations de fabrication des vaccins conformes à la présente invention, et les procédés d'ensemble, de même que les chaines de fabrication, dans lesquels sont inclus les procédés et les installations conformes à la présente invention. L'invention pourra être mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère i un exemple de préparation du nouveau vaccin conforme à la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que cet Exemple est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont il ne constitue en aucune manière une limitation. EXEMPLE Les virus cultivés comme décrit plus haut sont inactivés et stabilisés pour donner lieu à un vaccin contre la maladie virale de l'Oison. Ce vaccin est préparé comme suit l. Première inactivation A 100 ml de virus placés dans un flacon on ajoute 1 ml deF -propiolactone diluée à 10 % dans de l'eau distillée. Le flacon est agité soigneusement, placé à 370C pendant une heure, et agité à plusieurs reprises pendant le temps d'inactivation. 2. Deuxième inactivation Le pH du contenu du flacon est ramené à 7-7,5 par addition de soude normale (0,5 ml environ), après quoi l'on ajoute 0,5 ml d'une solution à 10 % deg-propiolactone. La concentration finale en -propiolactone du contenu du flacon est de l : 2000 à l'issue de la deuxième inactivation. Après la deuxième inactivation, on prélève un échantillon du produit et on vérifie l'inactivation par inoculation à des tubes de culture. 3. Adionction d'adjuvant Le pH est ramené à 7-7,5 par addition de-soude normale (0,6 ml environ) et on ajoute 25 ml d'hydroxyde d'alumine à pH 7,5, préalablement stérilisé à l'autoclave. 4. Adionction d'un agent antiseptique L'on utilise de préférence, comme agent antiseptique, du merthiolate, qui est ajouté à raison de 1,25 ml d'une solution à 1% de merthiolate. 5. Stabilisation du vaccin On ajoute 1,25 ml de tampon HEPES lM et on rétablit le pH à 7,5-8 à l'aide de soude normale (0,5 à 1 ml). L'on obtient un vaccin qui titre plus de 106 D.I.50/ Jml et avantageusement de î06,5 à 107' D.I.50/ml. Après avoir effectué un contrôle de la stabilité bactérienne du vaccin, on le conditionne et on le conserve à une température de l'ordre de 4 C. Sa stabilité est très grande, et en tout état de cause supérieur à six mois. L'efficacité du vaccin conforme à la présente invention a été testée et mise en évidence sur des élevages d'oisons au cours d'expérimentations dont il est rendu compte ci-après. ï. EFFICACITE SUR LE TERRAIN Environ 60 oisons d'âges différents ont été vaccinés dans des exploitations où la maladie sévit habituellement sous forme tardive, (4ème à 6ème semaine) car les animaux sont sérumisés dans les 2 ou 3 jours suivant la naissance. Dans chaque exploitation, les animaux ont été divises en 2 lots, un lot vacciné et un lot témoin, avec les résultats suivants : 1) Oisons de moins de 15 ours : la vaccination est sans effet bénéfique. La mortalité est même plus élevée chez les vaccinés. 2) Oisons plus âgés (3,4,5 semaines) : la mortalité est de 40 % chez les témoins (220 animaux) et de 10 % chez les vaccinés (30 animaux). Il est probable que la présence d'anticorps sériques inhibe la vaccination chez les animaux de moins de 15 jours. Chez les autres (3,4,5 semaines) les résultats sont encourageants si lton tient compte de la sérumisation effectuée peu après la naissance et des difficultés rencontrées généralement dans l'immunisation des jeunes. Il - ACTIVITE AU LABORATOIRE A/ sur le lapin Des lapins sont vaccinés par injection intramusculaire de 2 ml de vaccin puis rechargés à raison de 1 ml chaque semaine par voie intraveineuse. En même temps que chaque injection vaccinale, on effectue une prise de sang destinée à la recherche des anticorps par séro-neutralisation. Dès la troisième injection de vaccin, le sérum à 1 % 4 5 neutralise 10 à 10 D.I.5 de virus. B/ Sur l'oie Des oies dépourvues d'anticorps sont choisies dans une exploitation des Landes indemne de la maladie depuis plusieurs années. Les animaux sont déclarés indemnes d'anticorps lorsque, par la méthode de séro-neutralisation à sérum fixe, leur sérum dilué à 1 % ne neutralise pas le virus 8 . Ces oies sont alors vaccinées à raison de 2 ml par voie sous-cutanée, avec rappel de 2 ml un mois plus tard Un échantillon de sérum est prélevé trois semaines après la première injection et les anticorps sont recherchés. Les sérums dilués à l % neutralisent 102 à 103 D.I. 50 de virus Les résultats obtenus après prélèvement d'autres échan tillons de sérum 15 jours après l'injection de rappel, sont en cours de collecte, dans le cadre d'une expérimentation plus étendue au cours de laquelle seront étudiés, lors de la saison de ponte des oies, la teneur du jaune d'oeuf en anticorps et l'état de protection des oisons issus des oeufs d'oies immunisées comme décrit ci-dessus. Le nouveau vaccin conforme à la présente invention présen te un certain nombre d'applications qui sont d'un grand intéret dans la prévention de la maladie virale des Oisons, permettant ainsi d'exempter les élevages d'oies des risques d'épizooties qui pesaient sur eux, et des conséquences économiques liées à des épizooties aussi meurtrières que celles provoquées par la maladie virale de l'Oison. C-'est ainsi que le vaccin conforme à la présente inven tion s'applique à - l'hyperimmunisation des oies productrices de sérum spécifique: en effet, lors de la production de sérum hyperimnun sur lapin, le vaccin inactivé et stabilisé conformément à la présente invention a donné des résultats notablement supérieurs à ceux obtenus avec le virus virulent connu (séroneutralisation et fixation du complément). - la vaccination des oies pondeuses (deux injections à un mois d'intervalle) avec rappel peu avant la saison de ponte: en effet, on sait que les jaunes des oeufs pondus par les oies hyperimmunisées sont riches en anticorps (le jaune dilué à l X neutralise 103 à lot D.I.50 de virus) et que les oisons issus de ces oeufs sont protégés contre la maladie naturelle et contre une inoculation expérimentale. Cette méthode de vaccination s'impose par le fait que les oisons naissent infectés et qu'il est impossible de les vacciner avant l'éclo sion de la maladie (1ère semaine). - la vaccination des oisons, qu'il est préférable de ne pas réaliser avant l'age de 3 à 4 semaines lorsque ces oisons sont issus de mères vaccinées ou lorsqu'ils ont reçu du sérum à la naissance: en effet, dans ces deux cas, la présence d'anticorps acquis passivement s'oppose au développement d'une immunité vaccinale. - la vaccination des Canards de Barbarie : en effet, cette affec tion à parvovirus sévit également dans les élevages de Canards de Barbarie. Il résulte de la description qui précède que quels que soient les modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application adoptés, l'on obtient de nouveaux vaccins contre la maladie à virus (parvovirus) de l'Oison, ainsi que leurs procédés de préparation, lesquels vaccins présentent par rapport aux vaccins proposés précédemment, des avantages importants et notamment les avantages suivants : - ils présentent une grande spécificité d'action ; - ils présentent un titre standardisé et une grande stabilité dans le temps ; - ils peuvent être fabriqués à l'échelle industrielle et leur efficacité est plus grande et plus générale que celle des vaccins proposés précédemment. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir 3 l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre ni de la portée de la présente invention - REVENDICATIONS 10 - Nouveau vaccin contre la maladie à virus (parvovirus) de l'Oison, caractérisé en ce qu'il contient des virus inactivés et stabilisés obtenus à partir d'organes d'animaux présentant les symptômes et les lésions de la maladie et/ou de souches isolées des virus. 20 - Vaccin selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'il est stabilisé à pH 7,5 - 8. 3 - Vaccin selon l'une quelconque des Revendications 1 et 2, caractérisé en ce culil contient un agent d'inactivation approprié, avantageusement constitué par de de la p-propiolactone. 40 - Vaccin selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il contient un agent antiseptique approprié, avantageusement constitué par du merthiolate. 50 - Vaccin selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est mis sous une forme aisément administrable par voie parentérale, par association avec un adjuvant approprié, tel qulhydroxyde dtaluminium par exemple. 60 - Vaccin selon l'une quelconque des Revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il présente un titre en virus inactivés et stabilisés dut au moins 106 DI50 inactivés par mi. 70 - Vaccin selon l'une quelconque des Revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend des cultures de virus obtenues par inoculation sur des cultures cellulaires telles que des primo-cultures d'embryons d'oie ou de canard de Barbarie. 80 - Procédé de préparation du vaccin selon l'une quelconque des Revendications 1 à 7, caractérisé en ce que - l'on réalise, au cours d'un premier stade, la multiplication de virus obtenus par prélèvement d'organes sur des animaux pré sentant les symptômes et les lésions de la maladie virale de l'Oison ou de souches virulentes isolées, sur des cultures cellulaires d'embryons d'oies ou de canard de Barbarie - au cours d'un second stade, les cultures de virus obtenues, dont le titre est supérieur à 106 DI50 / ml sont soumises à un processus d'inactivation à l'aide d'un agent d'inactivation approprié tel que la 9-propiolactone, par exemple, dans des conditions de pH strictement contrôlées, - après quoi, le vaccin inactivé obtenu est stabilisé par addi tion d'un tampon approprié, après lui avoir éventuellement ajouté un agent antiseptique et/ou un adjuvant, et dans des conditions de pH strictement contrôlées. 90- Procédé selon la Revendication 8, caractérisé en ce que le processus d'inactivation des cultures de virus est réalisé en deux stades successifs séparés par un ajustement du pH du milieu à 7-7,5 10 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications 8 et 9, caractérisé en ce que le processus de stabilisation du vaccin est réalisé en mettant en oeuvre un agent de stabilisation essentiellement constitué par un tampon approprié de stabilisation du pH dans la zone de pH admissible pour ces vaccins. 11 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications 8 à 10, caractérisé en ce que la stabilisation du vaccin inactivé est réalisée dans des conditions de pH comprises entre 7,5 et 8. 120- Procédé selon la Revendication 10, caractérisé en ce que le tampon de stabilisation est choisi parmi les tampons compris dans le groupe qui inclut, par exemple, les tampons HEPES (ou acide N-2-hydroxyéthyl-pipérazine-N-2-éthane sulfoni- que), TRIS fou tris(hydroxyméthyl)nitrométhane7, les tampons à base de bicarbonate, les tampons constitués parCLz 9ocaLle et du chlorure de sodium, les tampons MES, ADA, ACES, BES, TES. 130- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 8 à 12, caractérisé en ce que l'ajustement du pH au cours des différents stades du procédé est réalisé à l'aide d'une solution normale de soude. 14 - Application du vaccin selon l'une quelconque des Revendications l à 7, à la prévention de la maladie à virus (parvovirus) de l'Oison, chez l'Oison et chez les volatiles de familles voisines telles que le Canard de Barbarie, et plus généralement chez les animaux atteints de la maladie virale de l'Oison.