FR 2257577 A1 19750808 FR 7401320 A 19740115 La présente invention concerne des procédés de préparation d'acides biliaires pratiquement purs, à partir de leurs sources naturelles. Plus particulièrement, l'invention concerne de nouveaux procédés de production d'acides biliaires pratiquement purs et, en particulier diacide dihydroxy-3a,7a (5ss)cholanique, à partir de leurs sources animales naturelles. Les acides biliaires sont des stéroïdes naturels qui sont syn thétisés naturellement par divers animaux. Les plus courants de ces acides biliaires naturels sont ceux ayant la structure suivante où R représente un radical carboxy et où des substituants hydroxy peuvent être en position 3,7 et/ou 12, selon acide biliaire particulier. Dans la nature, les acides biliaires sont synthétisés par le foie des animaux et font partie de la bile, qui est un liquide sécrété par le foie etwevacué dans l'intestin de l'animal. Les acides biliaires sont les constituants principaux de la bile, et ils sont généralement produits en nombre et en quantité variables par les différents animaux et ils sont tous incorporés à la bile.Parmi les acides biliaires courants d'origine animale figurent l'acide dihydroxy-3t,7e (5)cholanique; l'acide trihydroxy-3a, 7a, 12a (5B)cholanique et l'acide dihydroxy-3a,l2a(5)cholanique Du fait que la bile des animaux renieripe tous ces acides biliaires et de nombreux autres constituants tels que par exemple des pigments, des lipides et des matières protéiques, il est à ce jour malaisé et non économique d'isoler un acide biliaire particulier de la bile animale et, par conséquent, on préparait par synthèse, à partir de divers précurseurs, de nombreux acides biliaires individuels, bien qu'ils existent naturellement de façon assez abondante.De plus, à ce jour, il était impossible de produire certains acides biliaires sous une forme suffisamment pure pour divers usages, tels que par exemple la thérapeutique. La demanderesse a découvert un procédé permettant de produire de façon économique et efficace, à partir de la bile animale naturelle, des acides biliaires individuels sous forme pratiquement pure. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé économique de production d'acide dihydroxy-3a,7a (5ss)cholanique pratiquement pur à partir de la bile animale. On entend ici par "pratiquement pur" une pureté chimique supérieure à 99,0t, démontrée par les techniques d'analyse classiques admises. A ce jour, il était impossible de produire des acides biliaires pratiquement purs directement à partir de la bile animale naturelle. Les animaux qu'on peut utiliser comme source de bile animale naturelle dans l'invention sont ceux dont la bile est riche en l'acide biliaire désiré. Parmi ces animaux figurent des oiseaux, tels que les poulets, les dindes, les oies, les faisans; les hiboux et les canards; des mammifères tels que les boeufs, les rats, les cobayes, les ours et les porcs; les poissons tels que la morue, le mulet, les anchois,-etc. La source particulièrement préférée de bile naturelle est constituée par les animaux dont la bile renferme,comme constituant principal, l'acide biliaire dihydroxylé désiré, parmi lesquels figurent des oiseaux tels que les poulets, les dindes, les oies et les canards. Le procédé de l'invention comporte plusieurs stades utilisant,comme matière de départ, une bile animale appropriée. On peut recueillir la bile animale, par exemple la bile de poulet ou de dinde, de façon connue quelconque convenant à une personne expérimentée, en prenant les précautions habituelles pour éviter d'endommager ou de détériorer la bile animale de départ. Pour que le procédé de l'invention soit couronné de succès, il nécessite deux modes opératoires principaux de traitement de la bile animale naturelle, permettant d'obtenir l'acide biliaire pratiquement pur désiré. Le premier de ces modes opératoires consiste à éliminer, de la bile animale naturelle, les impuretés indésirables et les autres matières étrangères telles que les pigments, les lipides et les substances protéiques qu'on y rencontre. le second de ces modes opératoires est l'isolement et la purification de l'acide biliaire désiré, après élimination de toutes les impuretés indésirables. On peut réaliser l'élimination des impuretés indésirables de la bile animale naturelle, telles que les pigments biliaires, les impuretés lipidiques et similaires, selon plusieurs procédés nouveaux. Un de ces procédés consiste en une extraction au solvant direct des impuretés, avec un solvant organique capable de solubiliser les acides biliaires de la bile, dans lequel les impuretés sont insolubles, par exemple un alcool tel que le méthanol ou l'éthanol; une cétone telle que l'acétone, ou un acide tel que l'acide acétique; et d'autres solvants semblables. Les impuretés indésirables, par suite de leur insolubilité dans le solvant, précipitent dans la solution et on peut les éliminer par simple filtration.Bien que ce procédé ait donné des résultats assez satisfaisants, on a constaté qu'en pratique il n'éliminait pratiquement pas toutes les impuretés et qu'une purification complémentaire est nécessaire pour obtenir l'élimination de pratiquement toutes les matières indésirables de la bile. Un autre procédé d'élimination des impuretés indésirables nécessite une hydrolyse modérée préalable de la bile naturelle, par exemple par traitement avec une base telle qu'une base à métal alcalin tel que l'hydroxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium.On neutralise ensuite le produit hydrolysé et on l'extrait avec un système solvant approprié, par exemple un mélange de chloroforme et de méthanol où les acides biliaires de la bile sont solubles dans un des solvants, mais non les impuretés, ce qui provoque la séparation des impuretés dans un des solvants du système, et permet de les éliminer avec ce solvant. Ce proeédebien bien qu'il soit plus satisfaisant que celui précédemment indiqué, ntest pas non plus capable d'éliminer la totalité des impuretés de la bile naturelle, et fine-*purification additionnelle est nécessaire pour qu'on obtienne les produits finals optimaux de l'invention. On peut utiliser,dans la pratique de l'invention, un autre procédé dsélimination des impuretés de la bile naturelle. Ce procédé consiste tout d'abord à soumettre, à une hydrolyse modérée, la bile naturelle brute avec une base telle qu'une base à métal alcalin, par exemple lthydroxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium, à neutraliser la solution hydrolysée obtenue, puis à déshydrater cette solution, par exemple par séchage par pulvérisation, Iyophilisation, séchage au tambour, séparation par membrane ou séchage par congélation. Bien que l'hydrolyse puisse etre utile pour éliminer certaines impuretés, dans certains cas, par exemple dans le cas de la bile de poulet ou de dinde, J demanderesse a découvert qu'on peut supprimer cette hydrolyse et déshydrater la bile animale naturelle dans le premier stade du procédé. La suppression de cette hydrolyse dans ce cas n'a pas d'effet nuisible sur la qualité et le caractère du produit final. Dans le mode opératoire préféré de l'invention, on déshydrate tout d'abord la bile animale naturelle brute, selon l'un quelconque des procédés bien connus, tels que ceux précédemment énumérés On préfère réaliser la déshydratation par séchage par congélation ou lyophilisation, bien que les autres procédés bien connus fournissent également des rendements aussi satisfaisants. On estérifie ensuite la bile naturelle- déshydratée obtenue, par exemple par traitement avec un agent d'estértfication approprié. L'agent d'estérification qu'on peut utiliser dans la pratique de l'invention peut varier selon l'animal dont provient la bile naturelle.De préférence, l'agent d'estérification utilisé dans l'invention est un alcool qui peut etre un alcool hydrocarboné ou un alcool substitué Parmi les alcools qu'on peut utiliser comme agent d'estérification, on peut citer les alcools insaturés ou saturés tels que les alcanols, par exemple le méthanol, le propanol, ou le butanol; des alcénols, par exemple l'éthénol ou le propénol; des alcools cycliques, par exemple le cyctohexanol ou le cyclooctanol; des alcools aryliques, par exemple le phénol, l'alcool benzylique, l'alcool cinnamylique, et d'autres agents d'extérification-de type alcool.De plus, les alcools de l'invention peuvent être susbtitués ounon substitués et renfermer des substituants tels que des halogénures, par exemple des chlorures ou des bromures ou du soufre-ou de l'oxygène, sans qu'on s'écarte pour cela de l'invention.On obtient une estérification particulièrement satisfaisante de la bile naturelle, en-la traitant avec un agent d'estérification alkylique tel qu'un agent d'estérification méthylique, par exemple le méthanol, dans un milieu acide tel qu'un acide minéral, par exemple l'acide sulfurique. Lorsqu'on peut utiliser un agent d'estérification alkylique dans l'invention, on peut également utiliser d'autres agents-d'alkylation. Ainsi, on peut également utiliser des agents d'alkylation tels que le diazométhane. L'estérification de la bile naturelle fournit les esters, par exemple les esters alkyliques, des impuretés biliaires telles que les pigments, etc., ce qui les rend apparemment solubles dans certains solvants organiques et insolubles dans d'autres. Egalement,les acides biliaires présents dans la bile sont solubles dans certains solvants et non dans d'autres. En soumettant la composition estérifiée à l'action d'un système solvant approprié, on peut séparer les acides biliaires des impuretés. Dans les systèmes solvants satisfaisants qu'on peut utiliser dans l'invention, figurent des solvants organiques hydrocarbonés halogénés tels que le chloroforme, le chlorure de méthylène, le dichlorure d'éthylene, des solvants organiques aromatiques tels que le benzène, le toluène et similaires et des solvants organiques tels que des alcools, par exemple le méthanol et l'éthanol, des alcanes tels que l'hexane ou l'heptane, des cétones telles que l'acétone, la benzophénone ou la cyclohexanone, des éthers tels que l'éther méthylique ou éthylique, des acides carboxyliques tels que l'acide acétique et d'autres solvants organiques appropriés semblables.Dans la pratique de llinvention, un système solvant satisfaisant est constitué dtau moins deux phases, les impuretés biliaires étant solubles dans une des phases et ces impuretés étant insolubles dans les phases restantes. Inversement, la fraction d'acide biliaire désiré de la bile doit etre insoluble dans la phase où les impuretés sont solubles en étant soluble dans les phases restantes.0n peut utiliser de façon satisfaisante,dans la pratique de l'invention, un système solvant constitué des phases suivantes : hydrocarbure halogéné/alcool, par exemple chloroformelméthanol, chloroforme/éthanol, chlorure de méthylène/méthanol; solvant organique aromatique/alcool, par exemple toluène/méthanol, benzène/méthanol, solvant organique aromatique/alcane, par exemple benzène/hexane, toluène/hexane; éther/alcool, par exemple éther méthylique/méthanol; hydrocarbure halogéné/cétone, par exemple chloroforme/acétone; et d'autres systèmes solvants organiques que l'homme de l'art peut choisir dans la pratique de l'invention-selon les indications précédemment fournies. On peut obtenir les résultats les plus économiques dans la pratique de l'invention, lorsque le système solvant utilisé est constitué d'une phase d'hydrocarbure halogéné et d'une phase d'alcool. Plus particu lièrement, un système solvant constitué d'un hydrocarbure halogéné, par exemple le chloroforme, et d'un alcool, par -exemple le méthanol, stest révélé fournir des résultats très satisfaisants dans la pratique de l'invention. La fraction d'acide biliaire de la bile brute n'est pas soluble dans la phase de solvant hydrocarboné halogéné, tandis qu'il s'est révélé > de façon inattendue, que pratiquement toutes les impuretés estérifiées le sont. Egalement, dans la pratique de lrinvention fournissant les meilleurs résultats, il est souhaitable de traiter la bile déshydratée dans des conditions pratiquement anhydres. Il semble que la présence de quantités nettes d'eau dans la bile ou dans sa mise en oeuvre ultérieure fournisse un produit de qualité relativement peu satisfaisante. Le mélange vigoureux des solvants et de la bile5 et l'addition d'une phase de séparation au système, Si on le désire, provoquent une séparation complète des phases, l'une renfermant les impuretés indésirables, et l'autre renfermant la fraction d'acide biliaire Parmi les composés qu'on peut utiliser comme phase de séparation, si on le désire, on peut citer les acides minéraux dilués, par exemple les acides chlorhydrique ou sulfurique ou l'eau. Ainsi, on peut éliminer toutes les impuretés qui se retrouvent dans une phase de solvant, en ne conservant que la solution de l'acide biliaire débarassée des impuretés, qu'on soumet à la purification complémentaire ci-après. Ce procédé d'élimination des impuretés indésirables de la bile naturelle constitue le procédé le plus préférable dans'la pratique de l'invention, et il s'est révélé fournir les produits finals les plus satisfaisants.En pratique, la demanderesse a découvert qu'alors que la phase de solvant renfermant les impuretés a une coloration verdâtre foncé ou noir verdâtre, la phase de solvant renfermant les acides biliaires est presque limpide comme de l'eau et ne renferme pratiquement pas de quantité détectable d'inpuretés indésirables telles que des pigments. Dans 18 nature, les acides biliaires naturels sont soue forme d'une conjugaison peptidique, c'est-à-dire que l'organisme de l'animal les a conjugués à des amino-acides. Les deux amino-acides principaux avec lesquels les acides biliaires naturels d'origine animale sont conjugués sont la glycine et la taurine. Dans le cas des acides biliaires conjugués à la glycine, la demanderesse a découvert qu'une légère variante du procédé d'élimination des impuretés et des pigments de la bile naturelle précédemment indiqué fournit également des résultats satisfaisants. La demanderesse a également découvert un autre procédé permettant d'éliminer pratiquement tous les pigments et les autres impuretés indésirables des acides biliaires conjugués à la glycine, sans sortir du cadre de l'invention. On amène la bile naturelle pratiquement à sec, et on l'estérifie commè précédemment indiqué, cependant on laisse l'estérification se poursuivre jusqu'à ce que la fraction de pigment, la fraction des autres impuretés et la fraction d'acide biliaire de la bile naturelle soient toutes sous leur forme estérifiée.~Qn peut également utiliser,dans ce mode opératoire, les agents d'estérification précédemment cités. On soumet ensuite la bile naturelle ainsi totalement estérifiée à une réaction d'hydrolyse sélective qui hydrolyse uniquement la fraction d'acide biliaire estérifiée de la bile-natu- relle.On peut réaliser cette hydrolyse sélective, en soumettant la bile esté- rifiée à des réactions -d'hydrolyse courantes, en présence d'un tampon ajustant le pH à une valseur appropriée. On peut réaliser cette hydrolyse sélective, en maintenant le pH du mélange de la réaction d'hydrolyse à une valeur, soit fortement basique, soit fortement acide, par exemple à un pH d'environ 9 à 12 ou d'environ I à 3, en réglant en conséquence les conditions d'hydrolyse, comme il est connu de 'l'homme de l'art.On ppursuit la réaction d'hydrolyse sélective jusqu'à ce que la fraction d'acide biliaire estérifiée de la bile soit hydrolysée en acides libres, puis on soumet la bile hydrolysée obtenue à la séparation au solvant précédemment indiquée, pour obtenir la phase de -solvant désirée-renfermant pratiquement la totalité des pigments et la phase de solvant renfermant la fraction d'acide biliaire débarrassée des impuretés de la bile naturelle On peut soumettre la phase de solvant renfermant les acides biliaires à un traitement complémentaire selon l'invention, pour obtenir les produits finals désirés. 9n peut donc neutraliser la solution renfermant les acides biliaires et chasser le solvant par évaporation, en obtenant une composition d'acide biliaire brute qu'on peut soumettre à un traitement complémentaire, comme indiqué ci-après. On peut ensuite traiter la composition d'acide biliaire brute ainsi-abtenue-pour obtenir l'acide, biliaire final pur de l'invention. Un procédé qu'on peut utiliser consiste à hydrolyser la composition d'acide biliaire brute pour décomposer les conjugués dlamino-acides éventuels, qui constituent' la forme naturelle sous laquelle on rencontre les acides biliaires. On peut réaliser cette hydrolyse en traitant la compowition d'acide biliaire par un agent d'hydrolyse, par exemple une base à métal alcalin tel que l'hydroxyde de potassium ou l'hydroxyde de' sodium.On peut ensuite acidi fier la matière hydrolysée, par exemple- en la traitant avec un acide minéral tel que l'acide 'chlorhydrique ou l'acide sulfurique, et extraire la solution acidifiée -avec un solvant organique approprié tel que l'acétate d'éthyle, l'éther éthylique, l'éther isopropylique ou l'éther diisopropylique, et amenersà sec la solution obtenue pour-obtenir un résidu brut des acides biliaires libres On peut ensuite estérifier le résidu brut par traitement avec un agent d'estérification approprié.De préférence, l'agent d'estérification approprié fournit un produit estérifié wlkylique-et peut etre un alcool hydro carboné, substitué ou non substitué. Parmi les alcools qui se sont révélés donner des résultats satisfaisants, on peut citer des alcools saturés ou insaturés tels que des alcanols, par exemple le méthanol, le propanol, le butanol; des alcénols, par exemple le propénol; dec cycloalcanols, par exemple le cyclohexanol; des alcools aryliques, par exemple le phénol, l'alcool benzylique, alcool cinnamylique et d'autres alcools semblables. De plus, les alcools utilisés peuvent etre substitués ou non substitués et,par par conséquent, peuvent renfermer des substituants moléculaires tels que des halogènes comme le chloreoule brame oe le soufre. sans altération des bons résultats obtenus. De plus, on peut utiliser autres agents d'estérification dans l'estérification ci-dessus, en particulier dans le cas où on désire une estérification alkylique du substrat. On peut donc utiliser également avec succès dans l'invention des agents d'estérification alkyliques tels que le diazométhane et d'autres agents semblables connus. De préférence, dans la pr-atique de l'invention, on soumet le résidu brut obtenu ci-dessus à une estérification alkylique, bien qu'on puisse également utiliser les-autres esters. On soumet ensuite ce résidu brut à une estérification alkylique, par exemple par traitement avec un agent d'estErification alkylique tel que le méthanol dans un milieu acide, par-exemple l'acide sulfurique ou le diazométhane dans l'éther,-pour obtenir les esters alkyliques des acides biliaires. On peut ensuite soumettre ces esters alkyliques à une extraction sur colonne, par exemple dans une colonne d'alumine, en utilisant un système solvant approprié tel qu'un mélange d'acétate d'éthyle et de benzène, pour obtenir l'ester alkylique brut de l'acide biliaire désiré tel que l'acide dihydroxy 3a,7a (5s)cholani-que. Par solution complémentaire avec un système solvant approprié, par exemple un mélange de méthanol et dlacétate d'éthyle, on obtient une quantité additionnelle -d'ester- alkylique brut de l'acide dihydroxy-3at,7a (5ss)cholanique combiné dans le cas où la bile provient du poulet ou-de dinde, avec l'ester alkylique de l'acide trihydroxy-3a,7a,12a (5Bchoianique. On peut ensuite recycler ce second éluat dans la colonne d'extraction--et, en utilisant un système-solvant approprié, par exemple un mél-ange d'acétate d'éthyle et de benzène, obtenir des quantit-é,complémentaires de l'ester alkylique brut de l'acide dihydroxy-3a,7a (55)cholanique. On hydrolyse ensUite l'ester allylique brut obtenu de l'acide biliaire désiré, par exemple par traitement avec une base appropriée telle qu'une base à métal alcalin comme l'hydroxyde de potassium ou l'hydroxyde de sodium, et on extrait le produit acidifié obtenu par un solvant approprié, on filtre et on sèche. On traite ensuite le résidu-obtenu avec un solvant approprié tel que l'acétate d'éthyle, à température élevée, puis on constate, après refroi dissement, que la solution obtenue renferme de l'acide dihydroxy-3a,7a (5ss)cholanique pratiquement pur cristallisé qu'on peut récupérer par filtration. Le procédé suivant permet d'obtenir des acides biliaires pratiquement purs. Après hydrolyse du résidu débarrassé des impuretés obtenu comme précédemment indiqué, pour obtenir le résidu brut d'acides biliaires libres, on peut traiter ce résidu d'acides biliaires brut selon un procédé réalisant une précipitation sélective d'un sel biliaire de I'acide biliaire, de façon à obtenir directement l'acide biliaire désiré. Après élimination des impuretés et hydrolyse des acides biliaires conjugués à un peptide, on traite la solution obtenue renfermant les acides biliaires libres par un sel approprié qui provoque la précipitation différentielle sélective d'un sel biliaire dans un solvant approprié. En d'autres termes, on dbit employer un sel approprié qui provoque la formation de: sels d'acides biliaitesslibres qui possèdent des solubilités différentielles dans un solvant choisi. Ainsi lorsque les acides biliaires libres sont l'acide dihydroxy-3a,7a (7ss?cholanique et l'acide trihydroxy 5,7a,12a (5B)cholanique, comme ctest le cas dans la bile du poulet, de la dinde et de l'oie, le sel approprié qu'on peut utiliser est un sel conférant aux sels d'acides biliaires obtenus des-solubilités différentielles dans un solvant particulier. Les sels qui se sont révélés utilisables dans la pratique de l'invention sont des sels des métaux du groupe IIa.Les sels des métaux du groupe lia qu'on peut utiliser dans la pratique de l'invention sont les sels de baryum, strontium et calcium, par exemple les halogénures de métaux du groupe fIa tels que les chlorures comme le chlorure de baryum ou les acétates des métaux du groupe lia ou les nitrates des métaux du groupe IIa. On traite la composition d'acide biliaire libre par un-sel de métal du groupe IIa approprié, par exemple le chlorure de baryum, tout d'abord en solution aqueuse pour former les sels d'acides biliaires, puis dans un solvant approprié ot l'un des sels biliaires obtenus est soluble, tandis que l'autre ne l'est pas. Dans le cas des acides biliaires dérivant de la bile de poulet ou de dinde, on peut utiliser le chlorure de baryum et un solvant organique tel qu'un alcool comme le méthanol. On sépare ainsi le sel d'acide biliaire désiré, qu'on peut traiter ensuite par un acide tel qu'un acide minéral , par exemple l'acide chlorhydrique, pour le dissocier et obtenir l'acide biliaire libre pratiquement pur désiré. On peut de plus purifier, si on le désire, l'acide biliaire pratiquement pur obtenu comme produit final, par exemple par recristallisation dans un solvant approprié, puis le sécher en obtenant le produit final de l'invention, constitué de l'acide biliaire libre pratiquement pur. De plus, on peut utiliser, dans la pratique de l'invention, divers autres solvants organiques appropriés dans lesquels les sels biliaires de métal du groupe IIapnientet une solubilité différentielle, ce qui permet leur séparation. Le spé-cialiste peut facilement déterminer les solvants organiques qu'on peut ainsi utiliser dans la pratique de l'invention et qui sont constitués de solvants organiques tels que l'acétate d'éthyle, l'hexane et acide acétique entre autres et qu'on peut utiliser de façon satisfaisante. De plus, le sel biliaire produit simultanément et qu'on n'a pas séparé et purifié et qui, dans le cas de la bile de poulet, est l'acide trihydroxy-3a,7a,12a (5B)cholanique, peut également être purifié et traité selon des modes opératoires bien connus, pour obtenir l'acide biliaire libre correspondant. Lorsqu'on l'a isolé sous forme libre, cet acide,qui dans le cas de la bile de poulet, est l'acide trihydroxy-3a,7a,12a (5B)cholanique, peut etre traité par exemple selon le procédé décrit par Feiser et Coll. dans le volume 72 de Journal of the American Chemical Society, page 5530 (1950), pour obtenir des quantités additionnelles de l'acide dihydroxy-3a,7a (5B)cholanique. Bien que la description générale de l'invention ait été limitée au traitement d'une bile naturelle renfermant des quantités importantes d'acide dihydroxy-3a,5a (58)cholanique, il est évident que son principe et sa mise en oeuvre ne sont pas-limités à une telle bile naturelle et qu'ils B i appliquent de façon générale à toutes les biles naturelles.La demanderesse a découvert qu'après des modifications mineures, que l'hoinrne de l'art peut facilement déterminer, de la présente description, le procédé de détermination des impuretés indésirables de la bile naturelle s'applique de façon générale à toutes les biles animales naturelles et que, par conséquent, on peut utiliser le procédé d l'invention pour séparer et-purifier les acides biliaires naturels renfermes dans les hiles naturelles provenant du boeuf, du porc, de l'opossum, du mouton et de lthomme. Lorsqu'on applique l'invention aux matières premières naturelles contituées par les biles des animaux précédemment indiqués et d'animaux de laboratoire tels que le rat, le cobaye, et similaires, on obtientode façon tout aussi satisfaisante, les acides biliaires pratiquement purs qui sont le but de l'invention. Les acides biliaires pratiquement purs qu'on obtient et en particulier l'acide dihydroxy-3a,7a (5p)cholanique constituent les acides biliaires les plus purs que l'on connaisse. On a déterminé la pureté par chromatographie en couche mince, chromatographie gaz-liquide et point de fusion, et constaté qu'elle est supérieure à 99% et les points de fusion semblent être plus élevés que ceux indiqués dans la littérature, ce qui indique que le produit final a une pureté extraordinaire. Evidemment, dans les applications où les composés peuvent avoir une utilisation médicale, la pureté du produit est d'une importance capitale. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 On ajoute 10 mi de bile de vésicule de poulet à 200 mi de méthanol chaud en agitant. Après refroidissement, on sépare par filtration le précipité obtenu et on évapore la solution alcoolique à sec à 600C sous vide. On dissout ensuite le résidu sec obtenu dans 25 ml d'une solution aqueuse à 10% d'hydroxyde de sodium et on autoclave la solution sous 0,96 bar pendant 3 heures. On refroidit ensuite la solution au bain-marie glacé, on acidifie à pH 1,0 avec de l'acide chlorhydrique 4N et on extrait quatre fois par 50 mi d'acétate d'éthyle. On lave les fractions de solvant organique avec de l'eau au voisinage de la neutralité et on sèche sur sulfate de sodium. On sépare ensuite par filtration la phase organique et on évapore à sec.On dissout ensuite le produit obtenu dans 25 mi de méthanol anhydre renfermant 2% d'acide sulfurique concentré, on laisse reposer pendant une nuit et on ajoute un volume égal dteau. On extrait ensuite la solution obtenue trois fois par 50 ml d'un mélange 1/2 1/2enveluned'éther éthylique et de benzène et on combine les phases organiques, on leK lave avec :5 ml d'eau, 5 mt de bicarbonate de sodium saturé et encore trois fois avec 25 ml d'eau. On sèche la solution sur sulfate de sodium, on filtre et on évapore à sec. On dissout ensuite le résidu -obtenu -dans 50 ml d'un mélange 1/9 en volume d'acétate -d' thyle et de benzène et on le place :sur une colonne de 200 g d'alumine d'activité 111. On lave la colonne avec 400 mi. d'un mélange 3/7 en volume d'acétate d'éthyle et de benzène pour éliminer les impuretés colorées. On sépare ensuite de la colonne l'éthet méthylique de l'acide dihydroxy-3a,7a (5)cholanique en utilisant 800 mi d'un mélange 4/6 en volume d'acétate d'éthyle et de benzène et on évapore le solvant dans l'air à 600C. On dissout ensuite le résidu dans 50 ml d'une solution d'hydroxyde de potassium à 5% dans le méthanol, et on chauffe à 600C pendant-une heure. On refroidit la solution obtenue au bain-marie glacé et on l'acidifie à pH 1,0 avec de l'acide chlorhydrique 4N. On dilue la solution acide obtenue avec 100 ml d'eau et on extrait quatre fois avec 75 mi d'éther éthylique et on lave la solution éthérée par de l'eau jusqu'à pH 5,0, on sèche sur sulfate de sodium, on filtre et on évapore à sec. On dissout le résidu dans 30 mi d'acétate d'éthyle chaud et on laisse reposer à température ordinaire. Le refroidissement provoque une cristallisation et, après filtration sur entonnoir de Büchner en s' aidant du vide et séchage sous vide pendant une nuit, on obtient 447 mg d'acide dihydroxy-3a,75 (5B)cholanique fondant à 142-1440C. Ce produit se révèle etre pur par analyse par chromatographie en couche mince en utilisant la phase supérieure d'un système solvant cons titué d'un mélange 5/5/1 en volume de toluène d'acide acétique et d'eau et de l'acide sulfurique à 50% dans l'eau comme agent de détection.Le rendement calculé est de 54,7% Exemple 2 On sèche5 par lyophilisation, 50 ml de bile brute de vésicule biliaire de poulet, en obtenant une poudre seche noir verdâtre. On dissout ensuite ce produit dans 100 ml de méthanol anhydre et on chauffe la solution au voisinage de l'ébullition. On filtre ensuite la solution chaude et on lave le précipité vert par 10 mi de méthanol anhydre chaud et on le rejette. On combine le méthanol de lavage à la solution dans le méthanol de départ, on ajoute 2 ml d'acide sulfurique concentré et on laisse reposer la solution pendant une nuit à la température ordinaire. On introduit ensuite la solution dans une ampoule à décanter renfermant 200 ml de chloroforme et 20 ml d'eau, et on agite l'ampoule pendant une minute pour permettre la séparation des phases. La couche chloroformique~inférieure a une couleur verdâtre foncé et renferme la totalité du pigment et les autres impuretés, tandis que la couche alcoolique supérieure est limpide comme de l'eau et renferme: la fraction d'acide biliaire. On sépare la couche chloroformique qu'on rejette. Exemple 3 On seche,par lyophilisation, 50 ml de-bile brute de poulet, en obtenant une poudre sèche noir verdâtre. On dissout ce produit dans 100 mi de méthanol et on chauffe la solution au voisinage de l'ébullition, puis on la filtre. On rejette le précipité noir verdâtre obtenu. On traite la solution méthanolique filtre par 5 g d'hydroxyde-de potassium qu'on ajoute a la température ordinaire et en agitant, et on laisse reposer la solution pendant une nuit, puis on la neutralise en agitant par de l'acide sulfurique concentré. Lorsqu'on atteint la neutralité, on ajoute 2 ml d'acide sulfurique concentré et on laisse reposer la solution pendant une nuit à la température ordinaire.On refroidit ensuite la solution au bain-marie glacé avec 20 mi d'eau glacée et on ajoute goutte à goutte une solution saturée de bicarbonate de sodium, jusqu'àceqi' on atteigne un pH de 8,09,0. On filtre alors la solution et on l'introduit dans une ampoule à aécanter renfermant 200 ml de chloroforme et 20 ml dreau, et on agite pendant 2 minutes pour permettre la séparation des phases. La couche chloroformique inférieure est due couleur verdâtre et renferme le pigment et les lipides constituant les impuretés indésirables, tandis que la couche méthanolique supérieure est presque limpide comme de liteau et renferme les acides biliaires. Exemple 4 On agite 50 mi de bile fraîchede vésicule de poulet avec 2 g d'hydroxyde de sodium jusqu a dissolution et on laisse reposer pendant une nuit. On refroidit alors la solution au bain-marie glacé et on ajoute goutte à goutte de l'acide chlorhydrique 4N en agitant, jusqu'à ce que le pH soit inférieur à 2,0. On ajoute alors encore 1 ml d'ac-ide chlorhydrique concentré. On ajoute en agitant, à la solution obtenue, du diméthoxypropane à raison de 9 ml par mi de solution, en opérant à la température ordinaire et on poursuit l'agitation pendant une heure, puis on laisse reposer la solution pendant une nuit.On refroidit ensuite la solution au bain-marie glacé, on ajoute 10 mi d'eau glacée, puis une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium, jusqu'à ce que le pH soit alcalin. On filtre la solution obtenue et on l'introduit dans une ampoule à décanter renfermant 200 ml de chloroforme et on agite pendant une minute, puis on laisse les phases se séparer. La phase chloroformique inférieure renferme les impuretés indésirables, on la soutire et on la rejette. La couche incolore supérieure renferme les acides biliaires dans un mélange de méthanol aqueux et d'acétone. Exemple 5 On concentre par distillation la solution limpide obtenue dans l'exemple 2 ci-dessus, pour chasser la plupart des solvants organiques. On dilue la solutionaqueuse résiduelle renfermant les acides biliaires conjugués aux peptides avec de l'eau renfermant suffisamment d'hydroxyde de sodium pour qu'on obtienne 100 mi de solution à 10% dthydroxyde de sodium. On autoclave la solution alcaline incolore obtenue sous une pression de 0,96 bar pendant 3heures, puis on refroidit au bain-marie glacé la solution hydrolysée obtenue et on l'acidifie avec de l'acide chlorhydrique 4N qu'on ajoute goutte à goutte en agitant, en obtenant un précipité gommeux jaune clair. On filtre le précipité5 on le lave à l'eau, puis on le dissout dans 80 mi d'une solution aqueuse à 10% d'hydroxyde d'ammonium en agitant, puis on le chauffe au voisinage de l'ébullition.On ajoute goutte à goutte,à la solution agite 40 ml d'une solution de chlorure de baryum à 10%, en obtenant un précipité cristallin blanc. On sépare le précipité par filtration, on le lave par le méthanol et on le sèche sous vide à 600C en obtenant un sel brut de baryum d'acide dihydroxy-3a,7a (58)cholanique pesant 4,9 g selon met ensuite en suspension dans 100 ml d'acétate d'éthyle. On ajoute ensuite 100 ml d'acide chlorhydrique 3N et on agite le système à 3 phases jusqu dissolution du précipité. On sépare la couche d'acétate éthyle, on lave la couche aqueuse acide par 50 ml d'acétate d'éthyle et on combine les portions d'acétate d'éthyle.On lave par de l'eau jusqu'à neutralité la solution combinée d'acétate d'éthyle et on sèche sur sulfate de sodium, puis on rejette les couches aqueuses. On évapore ensuite l'acétate d'éthyle de la solution obtenue et on dissout le résidu dans 100 ml de méthanol et on ajoute en agitant 10 mi d'une solution à 10% de chlorure de baryum, puis on ajoute en agitant goutte à goutte 1 ml d'hydroxyde d'ammonium concentré. On porte à ébullition la solution obtenu, on laisse refroidir à la température ordinaire et on filtre. On vérifie que la précipitation du filtrat est complète, en ajoutant une solution de chlorure de baryum et on traite comme ci-dessus le précipité éventuellement formé, pour obtenir une quantité additionnelle de précipité qu'on ajoute au précipité d'origine, puis on lave le produit combiné par le méthanol et on sèche sous vide à 600C, en obtenant un sel brut de baryum de l'acide dihydrxy-3t,7a (5ss)cholanique pesant 4,1 g. On agite le sel de baryum brut ainsi obtenu avec ;00 ml d'acide chlorhydque 3N et 100 ml d'acétate d'éthyle, jusqu'à dissolution complète. On laisse les phases se séparer, on sépare la phase d'acétate d'éthyle, on lave la couche aqueuse acide par l'acétate d'éthyle et on combine les portions d'acétate d'éthyle, on lave à neutralité par l'eau et on sèche sur sulfate de sodium.On rejette les couches aqueuses. On évapore à un volume de 40 mi, à 500 50oC, avec un courant d'air, la solution d'acide dihydroxyEa7a (5ss)cholanique dans l'acétate d'éthyle, lavée et séchée ainsi obtenue. On refroidit alors la solution à 4"C et on ajoute de llhexane normal à 40C jusqu'à ce que la solution devienne légèrement trouble. On laisse reposer pendant une nuit à 40C la solution dans l'acétate d'éthyle et l'hexane normal, ce qui provoque la cristallisation sur les parois du ballon de l'acide dihydroxy-3a,7 (5)cholanique pur. On recueille les cristaux par filtration et on lave par l'hexane normal, on sèche sous vide à 600C en obtenant 3,2 g d'acide dihydroxy-3a,7a (5ss) cholanique pur (pur à 99,0% par chromatographie gaz-liquide) ayant un point de fusion de 14e1420C. On peut réaliser une purification complémentaire du produit en reprenant les modes opératoires décrits dans les exemples 6 à 9 ci-après. Exemple 6 On dissout dans l'acétate d'éthyle,auquel on a ajouté de l'hexane normal, le produit obtenu dans l'exemple 5 et on soumet la solution à une distribution à contre-courant à 5 plateaux avec 25 ml d'une solution aqueuse à 70% d'acide acétique et 40 mi d'éther isopropylique à 40% en volume dans l'hexane normal. L'acide biliaire purifié obtenu se trouve dans la phase d'éther isopropylique d'où on peut le récupérer par évaporation. Exemple 7 On peut réaliser une purification complémentaire du produit obtenu dans l'exemple 5 ci-dessus, par chromatographie de partage en colonne, sur des colonnes de Celite renfermant de l'acide acétique à 70% comme phase stationnaire et un mélange à 40% d'éther isopropylique et de n-hexane comme phase mobile. Un colonne de 100 g purifie 1 g d'acide biliaire brut. Exemple 8 On peut réaliser une purification complémentaire du produit obtenu dans l'exemple 5 ci-dessus, par chromatographie d'adsorption sur alumine acide, ayant une activité de V. On dissout l'acide biliaire brut dans l'acétate d'éthyle ou dans l'acétone et on fait passer la solution à travers la eoîonneqiadsrbeles impuretés et laisse passer la solution d'acide biliaire pur. Exemple 9 On peut estérifier l'acide biliaire brut obtenu dans l'exemple 4 ci-dessus, par le diazométhane ou le méthanol dans l'acide sulfurique comme décrit dans l'exemple 1 ci-dessus, puis purifier le produit esté rifié sur une colonne d'alumine, comme indiqué dans l'exemple 1 ci-dessus. Exemple 12 On reprend le mode opératoire de l'exemple 5, jusqu'à l'obtention de 4,9 g du sel brut sec de baryum de l'acide dihydroxy-3a,7a (5ti)cholanique. On ajouteensuitq à ce produit brut, 100 ml de méthanol absolu et on chauffe la solution au voisinage de l'ébullition en agitant, jusqu'd ce que le produit brut soit complètement dissous. On refroidit ensuite la solution chauffée, en obtenant des cristaux. On filtre la solution et on la sèche en obtenant le sel de baryum de l'acide dihydroxy-3a,7a (5B)cholanique pesant 4,0 g, ce sel de baryum étant d'une pureté supérieure à 98%. On agite ensuite le sel de baryum ainsi obtenu avec 100 mi d'acide chlorhydrique 3N et 100 ml d'acétate d'éthyle jusqu'à dissolution complète.On laisse les phases se séparer, on sépare la phase d'acétate d'éthyle, on lave la phase aqueuse acide par l'acétate d'6thyle, on combine les portions -d'acétate d'éthyle, on lave à neutralité par l'eau et on sèche sur sulfate de sodium. On évapore ensuite à un volume de 45 ml, à SO0C, sous un courant d'air, la solution d'acétate d'éthyle lavée et séchée, on refroidit la solution obtenue à environ 40C et on la maintient à cette température pendant une nuit en provoquant la cristallisation d'acide dihydroxy-3a,7a (5p)chôlanique pur. On recueille les cristaux et on les sèche sous vide en obtenant 3,1 g d'acide dihydroxy-3a,7a (5)cholanique (pur à plus de 99,05 par chromatographie gaz-liquide) > ayant un point de fusion de 141-1430C. On peut également reprèdre, avec succès, le mode opératoire cidessus, en remplaçant le méthanol absolu, utilisé comme solvant, par des quantités équivalentes d'éthanol anhydre, d'acétone ou. d'acide acétique. Eoemee,ll, On reprend le mode opératoire de l'exemple 5, si ce n'est qu'on remplace l'hexane normal par des quantités équivalents d'heptane normal, d'octane normal ou de pentane normal, en obtenant des résultats semblables. Exezele 12 On reprend le mode opératoire de l'exemple 2, si ce ntest qu'on remplace la bile de vésicule de poulet par de la bile naturelle d'anchois, de morue ou de mouton, en obtenant une solution limpide de couleur claire débarrassée pratiquement des impuretés et renfermant pratiquement tous les acides biliaires de la bile correspondante. Exemple 13 On reprend le mode opératoire des exemples 1, 2, 3, 4 et 5, si ce n'est qu'on remplace la bile de vésicule de poulet par de la bile de vésicule de dinde, d'oie ou de canard, en obtenant des résultats équivalents. Exemple 14 On lyophilise 50 ml de bile brute de porc en obtenant-une poudre jaune verdâtre clair. On dissout ce produit dans le méthanol anhydre, on chauffe et on filtre, On ajoute une quantité additionnelle de méthanol et on traite la solution méthanolique par de l'acide sulfurique, jusqu'à estérification complète du produit biliaire. On soumet ensuite la bile estérifiée à une hydrolyse sélective par traitement avec une base à métal alcalin, à température élevée, en présence d7un tampon alcalin, en maintenant le pH du milieu réactionnel entre 10 et 11. On laisse la réaction d'hydrolyse se poursuivre jusqu'à ce que la fraction d'acide biliaire de la bile soit hydrolysée.On introduit ensuite la bile ayant subi l'hydrolyse sélective dans une ampoule à décanter renfermant 200 mi de chloroforme et 20 mi d'eau, et on agite l'ampoule pendant une minute-pour permettre la séparation des phases. La couche chîoroformique inférieure a une-couleur jaune verdatre intense et renferme pratiquement la totalité du pigment et des autres impuretés, tandis que la phase alcoolique supérieure est jaune clair limpide, et renferme la fraction d'acide biliaire de la bile. On prélève;r cSuche chloroformique qu'on rejette. En reprenant le mode opératoire de l'exemple 5, mais en remplaçant la solution de l'exemple 2 par la solution jaune clair obtenue ci-dessus, on obtient l'acide biliaire libre désiré. Exemple 15 En reprenant le mode opératoire de l'exemple 2, mais en remplaçant le méthanol par dès quantités équivalentes d'hexane, d'éther diméthylique, d'acétone ou d'acide acétique, on obtient des résultats équivalents. Exemple 16 En reprenant le mode opératoire de l exemple 2 nais en remplaçant le chloroforme par des quantités équivalentes de toluène de chlorure de méthylène, de benzène ou de chlorure d!éthylène, on obtient des résultats équivalents. Bien entendu, diverses modificationc peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs, sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1 Procédé de production d'acides biliaires pratiquement purs à partir de bile animale3 caractérisé en ce qu'il consiste à - a) extraire les acides biliaires naturels de la bile animale naturelle par traitement avec un système solvant organique à plusieurs phases, dans une des phases duquel les acides biliaires sont solubles et les pigments et impuretés naturels de la bile sont insolubles et dans les autres phases duquel ces impuretés et pigments sont solubles et ces acides biliaires sont insolubles -b) hydrolyser les acides biliaires extraits ; -c) estérifier les acides biliaires hydrolysés obtenus; -d) isoler l'acide biliaire estérifié désiré ; et -e) récupérer l'acide biliaire libre pratiquement pur. 2. Procédé de production d'acides biliaires pratiquement purs à partir d'une bile animale naturelle, caractérisé en ce qu'il consiste à -a) extraire la fraction d'acides biliaires de la bile animale naturelle, par traitement avec un système solvant organique à plusieurs phases dans une des phases duquel la fraction d'acides biliaires est soluble et les pigments et autres impuretés naturels sont insolubles, et dans les autres phases duquel la fraction d'acides biliaires n'est pas soluble et les pigments et autres impuretés sont solubles; -b) traiter les acides biliaires extraits pour obtenir les acides biliaires libres correspondants ;; -c) traiter les acides biliaires libres parsun sel de métal du groupe IIa pour obtenir les sels d'acides biliaires du métal du groupe IIa correspondant -d) traiter ces sels d'acides biliaires de métal du groupe IIa par un solvant organique dans lequel ces sels d'acides biliaires présentent des solubilités différentielles, pour provoquer la séparation du sel d'acide biliaire désiré; -e) récupérer le sel d'acide biliaire désiré séparé et dissocier ce sel pour obtenir l'acide biliaire libre désiré ; et -f) récupérer cet acide biliaire libre. 3. Procédé d'élimination des pigments biliaires et des autres impuretés d'une bile animale naturelle, caractérisé en ce qu'il consiste à -a) déshydrater pratiquement cette bile animale naturelle -b) estérifier cette bile naturelle pratiquement déshydratée par traitement par un agent estérifiant organique approprié -c) soumettre cette bile animale naturelle estérifiée à l'action d'un système solvant organique à plusieurs phases dans une des phases duquel la fraction d'acides biliaires de la bile animale est soluble et les pigments et les autres impuretés. de la bile sont insolubles, et dans les phases restantes duquel ces pigments et autres impuretés sont solubles et la fraction d'acides biliaires est insoluble; et -d) séparer et récupérer la fraction d'acides biliaires pratiquement débarrassée des pigments et des impuretés de la bile animale naturelle. 4. Procédé de production d'acides biliaires pratiquement purs à partir- de bile naturelle, caractérisé en ce qu'il consiste à -a) pratiquement déshydrater ladite bile animale naturelle; -b) estérifier ladite bile animale naturelle déshydratée par traitement par un agent d'estérification organique convenable; -c) traiter ladite bile animale naturelle estérifiée par un système solvant organique à plusieurs phases, la fraction d'acides biliaires de ladite bile animale étant soluble dans une de ces phases, et les pigments et autres impuretés n'y étant pas solubles, et les pigments et autres impuretés étant solubles dans les phases restantes dans lesquelles la fraction d'acides biliaires n'est pas soluble; -d) séparer et à récupérer la fraction d'acides biliaires de la bile animale naturelle ne contenant pratiquement ni pigments ni impuretés; et. -e) traiter ladite fraction d'acides biliaires afin d'isoler et récupérer les acides biliaires élémentaires souhaités, pratiquement purs, de ladite fraction d'acides biliaires. 5. Procédé de production d'acides biliaires pratiquement purs à partir d'une bile animale naturelle, caractérisé en ce qu'il consiste à -a) déshydrater pratiquement la bile animale naturelle; -b) estérifier cette bile animale déshydratée par-traitement par un agent d 'estérification approprié; -c) soumettre la bile animale ainsi- estérifiée à l'action d'un système solvant organique à plusieurs phases dans'une des phases duquel 1a fraction d'acides-biliaires de la bile animale est soluble et les pigments et les autres impuretés de la bile ne sont pas solubles, et dans les phases restantes duquel les pigments et les autres impuretés sont solubles et la fraction d'acides biliaires est insoluble; -d) séparer et récupérer la fraction d'acides biliaires de la bile animale;; -e) traiter cette fraction d'acides biliaires par un sel de métal du groupe IIa approprié pour obtenir les sels d'acides biliaires de métal du groupe IIa correspondants; -f) traiter ces sels d'acides biliaires par un solvant organique dans lequel ces sels diacides biliaires présentent des solubilités différentielles pour provoquer la séparation du sel d'acide biliaire désiré; -g) récupérer le sel d'acide biliaire séparé et le soumettre à une dissociation par traitement par un acide minéral; et -h) récupérer l'acide biliaire libre désiré. 6. Procédé de production d'acide dihydroxy- 3 ,7 (5ss)cholanique pratiquement pur à partir d'une bile animale naturelle, caractérisé en ce qu'il consiste à -a) déshydrater pratiquement la bile animale naturelle provenant du poulet, de la dinde, de l'oie, du faisan, du pigeon ou du canard; -b) estérifier cette bile déshydratée par traitement avec un agent d'estérification organique approprié; -c)- soumettre la bile ainsi estérifiée à l'action d'un système solvant organique à plusieurs phases renfermant au moins delx phases, dans une des phases duquel la fraction d'acides biliaires de cette bile animale naturelle est soluble et les pigments et autres impuretés sont insolubles et dans les phases restantes duquel les acides biliaires sont insolubles et les pigments et autres impuretés sont solubles;; -d) séparer et récupérer la fraction d'acides biliaires de cette bile animale; -e) traiter les acides biliaires ainsi récupérés par un sel de métal du groupe IIa, choisi parmi le calcium, le baryum et le strontium, pour obtenir les sels d'acides biliaires de métal du groupe IIa correspondants; -f) traiter les sels d'acides biliaires de métal du groupe lia par un solvant organiquedans lequel le sel-de métal du groupe IIa de l'acide dihydroxy-3 ,7a t5ss)cholanique est insoluble et dans lequel les sels d'acides biliaires de métal du groupe IIa restants sont solubles; -g) récupérer le sel de métal du groupe IIa de l'acide dibydroxy-3a,7a (5p)cholanique et le soumettre à une dissociation par traitement avec un acide minéral; et -h) récupérer l'acide dihydroxy-3a,7a (5ss)cholanique libre obtenu. 7. Acide biliaire pratiquement pur, caractérisé en ce qu'on l'a préparé selon le procédé de la revendication 1. 8. Acide biliaire pratiquement pur, caractérisé en ce qu'on l'a préparé selon le procédé de la revendication 2. 9. Composition d'acides biliaires pratiquement débarrassée des pigments et des impuretés, caractérisée en ce qu'on l'a préparée selon le procédé de la revendication 3. 10. Acide biliaire pratiquement pur, caractérisé en ce qu'on l'a préparé selon le procédé de la revendication 4. 11. Acide biliaire pratiquement pur, caractérisé en ce qu on l'a préparé selon le procédé de la revendication 5. 12. Acide dihydroxy-3a7a (5ss)cholanique pratiquement pur, caractérisé en ce qu'on l'a préparé selon le procédé de la revendication 6.