FR 2250745 A1 19750606 FR 7340091 A 19731112 Les méthodes de dosage immunologique d'hormones sont basées sur la propriété que possède une hormone donnée de Jouer le r81e d'antigène dans une réaction Immunologique donnée. Sur la base de ce principe, on a récemment mis au point des méthodes de dosage radio-immunologique dans lesquelles on fait incuber une quantité inconnue d'une hormone non marquée (stable) qu'il s'agit de déterminer - en présence d'une quantité connue de la même hormone masquée - avec une quantité appropriée d'un antisérum spécifique.Ainsi, on peut facilement estimer une quantité inconnue d'hormone d'après le comptage radioactif du complexe antigène-anticorps, par comparaison avec une caurbetémoin que l'on a établie précédemment en utilisant des quantités connues de l'antisérum spécifique, de l'hormone stable et de l'hormone marquée, les hormones stable et marquée ayant participé proportionnellement (c'est-à-dire en proportion de leurs quantités respectives) à la formation du complexe antigène-anticorps. Evidemment, le comptage radioactif du complexe antigène-anticorps est inversement proportionnel à la quantité d'hormone stable ajoutée au mélange réactionnel, les quantités d'antisérum et d'hormone marquée restant inchangées. Une méthode de dosage radio-immunologique destinée à titrer les hormones stéroïdes et basées sur l'utilisation de composés conjugués stéroïde-tyrosinate de méthyle marqués par 125I a été suggérée par Oliver et al., J. Clin. Investig. 47, 1035 (1968) et décrite particulièrement dans son application à la mesure de taux pharmacologiques de digitoxine dans le sérum humain. Quand on l'applique au dosage radio-immunologique de la testostérone, cette méthode prévoit la synthèse du testoste- rone-3-(O-carboxyméthyl)-oxime-tyrosinate de méthyle (appelé ci-après T-3-TME), son marquage par 125I dans le noyau phénolique de la tyrosine et son utilisation comme haptène radioactif dans la réaction radio-immunologique. Midgley et al., Recent Progresse in Hormone Research, 27, 235 (1971) ont montré que l'activité molaire relative du T-3-TME dans le dosage radioimmunologique de la testostérone-3 vaut 0,7 fois celle de la testostérone. Cela signifie que, bien qu'un stéroïde conjugué comme le T-3-vMR ne puisse pas se combiner à un anticorps exactement comme un stéroïde natif, les différences sont faibles. Vu ce qui précède, l'utilité du stéroSde conjugué T-3-TME dans le dosage radio-immunologique de la testostérone apparaît nettement. La synthèse du T-3-TME n'a pas été décrite spécifique- ment. Le aeul procédé suggéré est le procédé au chloroformiate d'isobutyle (anhydride mixte) décrit par Qliver et al. pour la sythèse du composé conjugué du 3-O-succinyl-digitoxigénine tyrosinase de méthyle. Toutefois, quand on applique le procédé à anhydride mixte à la synthèse du T-3-TME, on ne peut obtenir aucun rendement détectable de produit. Selon l'invention, on fait réagir la testostérone3-(O-carboxyméthyl)-oxime et le tyrosinate de méthyle en présence de N.N-dicyclohexylcarbodiimide dans un solvant apolaire pour obtenir le composé conjugué TME désiré avec un rendement élevé0 Les conditions opératoires préférées sont les suivantes : des quantités équimolaires des réactifs, un léger excès molaire de N,N-dicyclohexylcarbodiimide, des solvants apolaires tels que le chlorure de méthylène, le N,N-diméthylformamide et le chloroforme, et des températures de réaction de O à 25 C environ, de préférence de 1000 environ. Une fois la réaction achevée, on évapore le solvant et on purifie le résidu par recristallisation. L'exemple non limitatif suivant illustre le procédé de l'invention. Exemple A une suspension agitée de 2,31 g de chlorhydrate de tyrosinate de méthyle dans 80 ml de chlorure de méthylène, on ajoute 1,4 ml de triéthylamine et, 30 minutes plus tard, 3,61 g de testostérone-3-(O-carboxyméthyl)-oxime. On refroidit le mélange à -10 C, on ajoute 2,47 g de N,N-dicyclohexylcarbodiimide, on porte à +10 C et on maintient à cette température pendant 24 heures.Après filtration et évaporation sous vide jusqu'à siccité, on dissout le réaidu semi-solide dans 50 ml d'éthanol à 50 %, on filtre et on évapore le filtrat sous vide jusqu'à siccité pour obtenir un résidu huileux que l'on précipite sous forme de solide cristallin en ajoutant environ 20 ml d'eau distillée à une solution que l'on a obtenue en dissolvant le résidu dans 10 ml d'éthanol à 95 %. Rendement : 2,15 g (40 %) de testostérone-3-(O-car boxyméthyl)-oxime-TME cristallin, fondant entre 94 et 950C après recristallisation dans de l'éthanol aqueux. Analyse pour C31H42O6N2 : Calculée : C 69,12 %; H 7,86 %; N 5,20 %. Trouvée : C 68,95 %; H 8,36 ;N 5,06 %. Les spectres ultra-violet et infra-rouge concordent entièrement avec la structure prévue du T-3-TME. On marque le produit obtenu comme ci-dessus avec 125I selon les enseignements de Greenwood et alo, Biochem. J. 89, 114 (1963) pour obtenir un réactif convenant au dosage radioimmunologique de la testostérone-3 et ayant une grande activité spécifique. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de testostérone-3-(0- carboiyméthyl)-ozime-tyrosinate de méthyle, caractérisé en ce qu'on fait réagir de la testostérone-3-(O-carboxyméthyl)-oxime et du tyrosinate de méthyle en présence de N,li-dicyclohexyl- carbodiimide dans un solvant apolaire à une température de O à 250C, on évapore le solvant et on cristallise le résidu brut. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme solvant du chlorure de méthylène, du N, N-diméthylformaxaide ou du chloroforme. 30 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait réagir des quantités équimolaires de testosté- rone-3-(O-carboxyméthyl)-oxime et de tyrosinate de méthyle en présence d'un léger excès molaire de N,N-dicyclohexylcarbodiimide. 40 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on recristallise le résidu brut à partir d'éthanol aqueux. 5. Le testostérone-3-(O-carboxyméthyl)-oxime-tyrosinate de méthyle produit par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.