FR 2255309 A1 19750718 FR 7441875 A 19741218 La présente invention concerne un procédé'de purification de coenzyme A. Elle a plus particulièrement trait à la purification des formes oxydée et réduite du coenzyme A. Dans le présent mémoire, 12 expression "coenzyme A réduith désigne le coenzyme A ayant un groupe mercapto libre dans sa molécule, ctest-à-dire le composé représenté par la formule (I) donnée ci-après. Par contre, ltexpression "coenzyme A oxyd6" désigne un dimère du type disulfure du coenzyme A réduit, c'est-à-dire le composé représenté par la formule (II) donnée ci-après. L'expression "coenzyme A total" désigne un lange des formes réduite et oxydée du coenzyme A. rJL &num;A9 9/ -P-OCH, I' ss cOmI22cO2csii 5 coenzyme A réduit O 0t 0 H1-0 o clIi CHQH OO2CH2COMI22 H Cil) 2 coenzyme A oxydé I1 est connu que le coenzyme A (désigné ci-après par le symboletCoAn pour plus de commodité) est un facteur important dans la biosynthèse des sucres, des glucides, des stéroïdes et des caroténoSdes, et qu'il est contenu dans diverses cellules vivantes telles que levures, bactéries et tissus animaux. On sait également que le CoA, dans une solution brute préparée à partir de ces cellules vivantes qui le contiennent, existe sous des formes oxydée et réduite ainsi qutà l'état d2un disulfure formé avec un thiol tel que la cystéine ou le glutathion. On connatt déjà certains procédés de purification du CoA. Dans l'un de ces procédés, le CoA est purifié par traitement d'une solution brute de CoA avec un sel de métal lourd (par exemple un sel mercurique, un sel de plomb, d'argent ou de baryum), l'acide phosphotungstique ou un solvant organique (par exemple l'acétone). Dans un autre procédé, le CoA est purifié par adsorption sur du charbon ou par chromatographie sur une colonne de résine d'échange anionique. Parmi ces procédés, on utilise le plus souvent la chromatographie sur colonne d'échangeur anionique. Toutefois, les procédés connus sont désavantageux du point de vue commercial.Dans le procédé chromatographique, par exemple, il est difficile dtisoler le CoA en un fort rendement et avec un haut degré de pureté d'une solution brute de CoA qui contient diverses substances analogues à ce coenzyme, par exemple ses formes réduite, oxydée et disulfurée avec la cystéine et/ou d'autres~thiolso En particulier, dans le procédé chromatographique, il est presque impossible d'isoler le CoA réduit de sa solution brute, avec un haut degré de pureté. Cela est db au fait que CoA réduit adsorbé sur la colonne de l'échangeur anionique a un comportement semblable à celui des nucléosides et des nucléotides, notamment des nucléotides tels que 1'AXP, qui sont naturellement contenus dans la solution de CoA brute. L'invention a pour but d'offrir un procédé simple et pratique pour la purification de CoA. Ce procédé permet d'isoler l'une ou 12 autre des formes réduite et oxydée du CoA en un fort rendement et avec un haut degré de pureté d'une solution brute de CoA contenant diverses impuretés (par exemple des nucléosides, des nucléotides) ainsi que des composés analogues au CoA tels que les formes oxydée, réduite et disulfurées avec des thiols (par exemple la cystéine et le glutathion) du CoA. Toutes les opérations de purification sont conduites par adsorp tion de tous les composés analogues au CoA mentionnés ci-dessus sur un échangeur anionique insoluble dans l'eau. Ce procédé permet d'éliminer aisément de la solution brute de CoA les nucléosides, nucléotides et autres impuretés contenus naturellement dans cette solution. Les dérivés analogues au CoA tels que ses formes oxydée, réduite et disulfurées avec la cystéine ou le glutathion sont séparés - sous l'une des formes oxydée ou réduite du CoA par passage sous cette forme desdits composés analogues D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre. Selon l'un des aspects de la présente invention, on obtient une solution de CoA oxydé avec un haut degré de pureté par (a) mise en contact d'une solution brute de CoA avec un échangeur anionique insoluble dans liteau pour fixer le CoA par adsorption sur cet échangeur ; (b) traitement de l'échangeur anionique insoluble dans l'eau avec un agent réducteur pour transformer le CoA en CoA réduit ; (c) lavage de l'échangeur anionique insoluble dans l'eau jusqu'à ce que l'excès d'agent réducteur et Iesthiols étrangers au CoA en soient éliminés ; (d) traitement de ltéchangeur anionique insoluble dans l'eau avec un agent oxydant pour transformer le CoA réduit en CoA oxydé ; (e) lavage-de l'échangeur anionique insoluble dans l'eau jusqu'à ce que l'excès d'agent oxydant et les impuretés contenus dans la solution brute de CoA en soient-éliminés ; puis (f) élution du CoA oxydé de l'échangeur anionique insoluble dans liteau. Selon un autre aspect de l'invention, une solution de CoA réduit est obtenue avec un haut degré de pureté par (a)-mise en contact dtune solution brute de CoA avec un échangeur anionique insoluble dans 1' eau pour fixer le CoA par adsorption sur cet échangeur ; (b) traitement de l'échangeur anionique insoluble dans l'eau avec un agent-réducteur pour transformer le CoA en CoA réduit ; (c) lavage de l'échangeur anionique insoluble dans l'eau jusqu'à ce que ltexcès d'agent réducteur et lesthiols étrangers au CoA en soient éliminés ;,cl) traitement de l'échangeur anionique insoluble dans l'eau avec un agent oxydant pour transformer le CoA réduit en CoA oxydé ; (e) lavage de 12 échangeur anionique insoluble dans l'eau jusqu'à ce que l'excès d'agent oxydant et les impuretés contenus dans la solution brute de CoA en aient été éliminés ; (g) nouveau traitement de l'échan- geur anionique insoluble dans l'eau avec un agent réducteur pour transformer le CoA oxydé en CoA réduit ;4h) lavage de l'échangeur anionique insoluble dans l'eau jusqu ce que l'excès d'agent réducteur en ait été éliminé ; puis (i) élution du CoA réduit de l'échangeur anionique insoluble dans l'eau. La solution brute de CoA que l'on peut utiliser dans la présente invention consiste en extraits de cellules vivantes contenant du CoA, par exemple de micro-organismes et de tissus animaux producteurs de CoA. Par exemple, l'extrait débarrassé des cellules d'un micro-organisme producteur de CoA peut être utilisé avantageusement comme solution brute de CoA dans le procédé de l'invention. De tels extraits peuvent entre partiellement purifiés avant l'utilisation dans le procédé de l'invention.De plus, l'extrait exempt de cellules du micro-organisme producteur de CoA peut entre obtenu par des opérations connues, par exemple par filtration ou centrifugation du bouillon de fermentation d'un micro-organisme producteur de CoA ou en soumettant un tel micro-organisme à un traitement thermique, une homogénéisation, un traitement de destruction par les ultrasons ou un traitement de lysozyme (voir "Methods in Enzymology", Academic Press Inc., New York, volume 1, page 51 (1955)). Des exemples avantageux de micro-organismes producteurs de CoA que l'on peut utiliser à cette fin comprennent Sarcina lutea IAM (Institute of Applied Microbiology, Tokyo University, Japon) 1099, Sarcina aurantiaca IAM 1059, Sarcina aurantiaca IFO (Institute for Fermentation, Osaka, Japon) 3064, Micrococcus rubens IFO 3768, Microbaoterium flavum IAM 1642, Brevibacterium ammoniagenes IAN 1641, Corynebacterium alcanophilum nov. sp. ATCC 21071 et Pseudomonas alcanolsytica nov. Sp. ATCC 21034. On peut se procurer tous ces micro-organismes auprès des instituts qui les détiennent. Toutefois, sous ce rapport, il y a lieu de remarquer que la présente invention n'est pas limitée aux espèces de micro-organismes mentionnées ci-dessus. L'utilisation d'ex- traits exempts de cellules obtenus à partir de tous microorganismes producteurs de CoA entre dans le cadre de la présente invention. L'échangeur anionique insoluble dans l'eau que l'on peut utiliser dans la présente invention consiste en une résine d'échange anionique fortement basique, une résine d'échange anionique faiblement basique, la diéthylaminoéthylcellulose, le diéthylaminoéthyldextrane, l'épichlorhydrine, la triéthyl aminocellulose, etc.A titre d'exemple plus particulier, une résine d'échange anionique fortement basique que l'on peut utiliser avantageusement dans la présente invention consiste en un trialkylaminopolystyrène réticulé avec du divinylbenzène, du type vendu dans le commerce sous les marques "Amberlite IRA400" (capacité d'échange ionique : 1,4 meq/ml, de la firme Rohm & Haas Company), "Amberlite IRA-402" (capacité d'échange ionique : 1 , 25 meq/ml, de la firme Rohm & Haas Company), "Amberlite IRA-405" (capacité d'échange ionique : 1,6 meq/ml, de la firme Rohm & Eaas Company), "Diaion SA 10A" (capacité d'échange ionique supérieure à 1,2 meq/ml, de la firme Slitsubishi Chemical Co.), "Dowex 1 x 2" (capacité d'échange ionique :1,53 meq/ ml, de la firme Dow Chemical Co.), "Dowex 1 x 16" (capacité d'échange ionique : 1,33 meq/ml, de la firme Dow Chemical Co.), "Duolite ES 109" (capacité d'échange ionique : 1,4 meq/ml, de la firme Diamond Shamrock Chem.) ; et un N-hydroxyéthyl-N,N- diaikylaminopolystyrène réticulé avec du divinylbenzène, du type vendu par exemple sous les marques "Amberlite IRA-410" (capacité d'échange ionique : 1,35 meq/ml, de la firme Rohm & BR Haas Company), "Amberlite iRA-91 O (capacité d'échange ionique : 1,1 meq/ml, de la firme Rohm & Haas Company), "Diaion SA 20A" (capacité d'échange ionique supérieure à 1 ,3 meq/ml, de la firme Mitsubishi Chemical Co.), "Dowex 2 x 4" (capacité d'échange ionique : 1,33 meq/ml, de la firme Dow Chemical Co.).Des exemples convenables de résines d'échange anionique faiblement basiques comprennent un aminopolystyrène réticulé au divinylbenzène du type "Amberlite IR-45" (capacité d'échange ionique : 1,9 meq/ ml,de la firme Rohm & Haas Co.) ; un diméthylaminopolystyrène réticulé au divinylbenzène, par exemple "Amberlite IRA-93" (capacité d'échange ionique : 1,4 meq/ml, de la firme Rohm & BR Haas Co.) ; un produit de condensation d'épichlorhydrine et d'ammoniac tel que Dowex 44" (de la firme Dow Chemical Co.) et une résine d'echange anionique aminophénolique telle que Duolite A-2" (capacité d'échange ionique : 2,3 meq/ml, de la firme Diamond Shamrock Chem.).Des exemples convenables de diéthylaminoéthylcellulose comprennent la "DEAE-cellulose" (capacité d'échange ionique : 0,9 meq/ml, de la firme Brown Company). En outre, le produit "DEAE-Sephadex A-25" ou A-50 (capacité d'échange ionique : 3,5 meq/ml, de la firme Pharmacia Fine Chemicals) est avantageusement utilisé comme diéthylamino- éthylcellulose et le produit "ECDEORA-cellulose" (capacité d'échange ionique : 0,25 meq/ml, de la firme Brown Company) peut entre utilisé comme produit de condensation d'épichlorhydri ne et de triéthylaminocellulose. L'étape d'adsorption (c'est-à-dire l'étape a) du procédé de l'invention est facile à mettre en oeuvre par contact de la solution brute de CoA-avec l'échangeur anionique insoluble dans l'eau. Par exemple, l'échangeur anionique insoluble dans l'eau est mis en suspension dans la solution brute de CoA. La suspension est agitée à la température ambiante pendant un certain temps,puis filtrée pour récupérer l'échangeur anionique insoluble dans l'eau. A titre de variante, l'adsorption peut sistre conduite sur colonne. Par exemple, l'échangeur anionique insoluble dans l'eau est chargé dans une colonne et la solution brute de CoA est amenée à passer sur la colonne à un débit correct.Par l'une ou l'autre de ces opérations, tous les composés analogues au CoA (par exemple CoA oxydé, CoA réduit, disulfures de CoA et de thiols tels que cystéine ou glutathion) contenus dans la solution brute de CoA sont adsorbés sur ltéchnngeur anionique insoluble dans l'eau. Dans la mise en oeuvre de l'opération d'adsorption, il est avantageux d'utiliser une solution brute de CoA dont la force ionique est comprise entre 0,005 et 0,04, notamment entre 0,01 et 0,02. Lorsquela force ionique de la solution brute de CoA est supérieure à 0,04, il est donc recommandé de diluer cette solution avec de l'eau avant l'opération d'adsorption.Par ailleurs, lorsque la solution brute de CoA a une force ionique inférieure à 0,005, on peut y ajouter un électrolyte inerte tel que le chlorure de sodium de manière que sa force ionique soit ajustée entre 0,01 et 0,02. Lorsque les dérivés analogues au CoA sont entièrement adsorbés sur ltéchangeur anionique insoluble dans l'eau, ce dernier est lavé à 12 eau et avec une solution aqueuse (pH 2-7) dont la force ionique est comprise entre 0,005 et 0,04, notamment entre 0,01 et 0,02. Le traitement de 12 échangeur anionique insoluble dans l'eau avec l'agent réducteur (ctest-à-dire l'étape b) est conduit à un pH de 4à 8, notamment à un pH égal à 7. L'agent réducteur utilisé dans la présente invention ne doit pas Qtrre adsorbé sur l'échangeur anionique insoluble dans liteau. Le 2 mercapto-éthnnol, le dithiothréitol et le dithioérythritol sont des exemples d'agents réducteurs qui satisfont à cette condition. Par exemple, lorsque le traitement de l'étape b est conduit sur colonne, une solution aqueuse contenant 0,1 à 1 % en poids/volume de dithiothréitol, une solution aqueuse à-10-30 % en poids/volume de 2-mercapto-éthanol et une solution aqueuse à 0,1-1 ffi en poids/volume de dithioérythritol sont avantageusement utilisées comme solution de l'agent réducteur que l'on fait passer sur la colonne d'échangeur anionique. 1l est préférable de conduire le traitement de l'étape b dans une solution aqueuse dont la force ionique n1 est pas supérieure à 0,05 et est comprise notamment entre 0,02 et 0,05. Par le traitement de l'étape b, le CoA oxydé adsorbé sur l'échangeur anionique insoluble dans 12 eau est transformé en CoA réduit. En mtme temps, par le traitement de l'étape d, des disulfures de CoA et de thiols tels que la cystéine et le glutathion, adsorbés sur l'échangeur anionique insoluble dans l'eau, sont décomposés en deux corps autres que CoA, ctest-à-dire la forme réduite de CoA et son dérivé de thiol. Après le traitement conformément à l'opération d, l'échangeur anionique insoluble dans liteau est lavé avec. une solution aqueuse (pH 2-7) dont la force ionique est comprise entre 0,02 et 0,05, en sorte que l'excès d'agent réducteur et les composés de thiol autres que la forme réduite de CoA sont entratnés de l'échangeur anionique insoluble dans l'eau. Le traitement de ltéchangeur anionique insoluble dans l'eau avec l'agent oxydant (ctest-à-dire l'étape d) est conduit à un pH compris entre 3 et 8, notamment un pH égal à 7. L'agent oxydant utilisé dans la présente invention ne doit pas entre adsorbé sur l'échangeur anionique insoluble dans l'eau. Le peroxyde d'hydrogène et le triiodure de potassium sont des exemples représentatifs d'agents oxydants qui satisfont à cette condition. Par exemple, on utilise avantageusement à cette fin une solution aqueuse à 0,1-t % en poids/volume de peroxyde d'hydrogène ou une solution aqueuse à 1-4 % en poids/ volume de triiodure de potassium.Il est avantageux de conduire le traitement de l'étape d dans une solution aqueuse de force ionique non supérieure à 0,5,et notamment comprise entre 0,05 et 0,5. Par ce traitement, la forme réduite de CoA adsorbé sur l'échangeur'anionique insoluble dans l'eau est transformée en CoA oxydé. Après la fin du traitement conf-crme à l'étape d comme indiqué ci-dessus, ltéchangeur anionique insoluble dans 12 eau est lavé avec un solvant aqueux, pH 2-7. Il est avantageux que le solvant aqueux utilisé comme solvant de lavage dans l'étape e ait une force ionique qui varie entre 0,06 et 0,7 en fonction de l'échangeur anionique insoluble dans l'eau que liron utilise.Par exemple, lorsqu'on utilise la diéthylaminoéthylcellulose comme échangeur anionique insoluble dans l'eau, un solvant aqueux (pH 2-7) de force ionique égale à 0,06-0,1 est avantageusement utilisé comme solvant de lavage dans l'étape e. Par contre, un solvant aqueux (pH 2-7) de force ionique comprise entre 0,4 et 0,6 est avantageusement utilisé comme solvant de lavage dans le cas du produit Amberlite IRA-93. En outre, des solvants aqueux (pX 2-7) de force ionique respective comprise entre 0,2 et 0,3 ; 0,2 et 0,3 ; 0,08 et 0,12 ; et 0,5 et 0,7 sont utilisés comme solvant de lavage pour les produits "Dowex 1 x 2", "Dowex 44", "DEAE-Sephadex" et "ECTEORA-cellu- losen. La solution de CbÂ oxydé est obtenue avec un haut degré de pureté par élution du CoA oxydé de l'échangeur anionique insoluble dans l'eau obtenu dans 12 étape e. Un solvant aqueux (pH 2-7) de force ionique égale à 0,2-1,2 est utilisé comme solvant d'élution dans l2étape f. Toutefois, sous ce rapport, il y a lieu de remarquer que la force ionique dudit solvant d2élution doit entre supérieure d'environ 0,05 à 1,0 unité à celle du solvant de lavage utilisé dans l'étape e.Par exemple, lorsque la diéthylaminoéthylcellulose est utilisée comme échangeur anionique insoluble dans 12 eau, on doit avoir recours à un solvant d'élution consistant en un solvant aqueux (pH 2-7) dont la force ionique est comprise entre 0,15 et 0,25. Par contre, on doit utiliser un solvant aqueux (pH 2-7) de force ionique comprise entre 0,4 et 0,6 comme solvant d'élu- tion lorsqu'on a recours au produit "Amberlite TRA~93t. En outre, des solvants aqueux (pli 2-7) de force ionique respective égale à 0,4-0,6, 0,4-0,6, 0,25-0,35 et 0,8-1,2 doivent entre utilisés comme solvants d'élution pour les produits "Dowex 1 x 2", nDowet 44", "DEAE-Sephadex" et "ECTEORA-cellulose". La solution de CoA réduit est obtenue avec un haut degré de pureté par (g) traitement de l'échangeur anionique insoluble dans 12 eau (c'est-à-dire 12 échangeur anionique obtenu dans l'étape e) avec un agent réducteur pour transformer le CoA oxydé en OoA réduit ; (h) lavage de 12 échangeur anionique insoluble dans l'eau ; puis (i) élution du CoA réduit de l'échan- geur anionique insoluble dans l'eau. Généralement, il est préférable de laver l'échangeur anionique de l'étape g avec de l'eau avant l'étape g et de poursuivre ce lavage jusqu'à ce que la force ionique des effluents soit inférieure à 0,1 et notamment inférieure à 0,05.Le traitement de l'échnngeur anionique insoluble dans l'eau avec l'agent réducteur (c'est-à-dire l'étape g) et le lavage subséquent (c'est-à-dire l'étape h) peuvent entre conduits en suivant le même mode opératoire que pour les étapes b et c. L'élution du CoA réduit de l'échangeur anionique insoluble dans l'eau (c'est-à-dire l'opération i) est effectuée de manière classique. Le solvant aqueux que l'on utilise comme solvant de lavage dans ltétape e peut entre utilise comme solvant d'élution dans 12 étape o. Dans la mise en oeuvre du procédé de l'invention.- comme décrit ci-dessus, la force ionique de la solution aqueuse de l'agent réducteur ou oxydant et la force ionique du solvant aqueux utilisé comme solvant de lavage ou d'élution sont faciles à ajuster en jouant sur la quantité d'un sel que lton y dissout. Divers sels peuvent être utilisés pour ajuster la force ionique. Des sels que l'on peut utiliser avantageusement à cette fin comprennent, par exemple, des chlorures métalliques tels que le8 chlorures de sodium, potassium et lithium, des sulfates métalliques tels que le sulfate dtammonium, des phosphates métalliques tels que le phosphate monosodique, le phosphate disodique, le phosphate monopotassique, le phosphate dipotassique, le phtalate acide de potassium, le citrate de sodium, l'acétate de sodium, le maléate de sodium, le sel de sodium du barbital, le chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, le chlorhydrate de 2-amino-2-méthyl-1,3-propane-diol, le carbonate de sodium et le succincte de sodium. Selon un autre aspect du procédé de l'invention, un extrait de CoA brut que liron tire de tissus animaux (par exemple de foies de porc) ou le bouillon de fermentation d'un microorganisme producteur de CoA peut astre aisément purifié. De plus, une solution surnageante ou un filtrat que l'on obtient en centrifugeant ou en filtrant- le bouillon de fermentation traité à la chaleur d'un micro-organisme producteur de CoA peut ttre utilisé comme solution brute de CoA de la présente invention. Une solution de CoA que l'on obtient par purification de ladite solution surnageante ou dudit filtrat avec un charbon actif peut aussi etre utilisée comme solution- brute de CoA de l'invention. Lt invention e-st illustrée par les exemples suivants, donnés à titre non limitatif. l'analyse- quantitative du CoA réduit à laquelle il est fait allusion dans le présent mémoire a été effectuée par spectrophotométrie par la méthode enzymatique utilisant la phosphotransacétylase ("Method of Enzymatic Analysis", Academic Press Inc., New York, page 512 (1963)). L'analyse quantitative du CoA total est effectuéeen présence de cystéine par la méthode de Stadtman et collaborateurs ("J. Biol. Chem." 191 (1951), 365) en utilisant la phosphotransacétylase.La pureté du CoA est calculée d'après la formule suivante Quantité de CoA réduit ou total titrée par la méthode enzymatique mentionnée ci Pureté (%) = dessus des sus x 100 de de CoA total cal culée d'après la densité optique à 258 m En outre, la force ionique d'une solution a été évaluée d'après la conductivite électrique spécifique de cette solution à 250 C, par rapport à une solution étalon de chlorure de sodium. Exemple 1 Préparation d'une solution de CoA brut On charge~et on stérilise dans un fermentateur de 300 litres de capacité, 400 litres d'un milieu aqueux nutritif (pE 7,0) contenant 10 % en poids/volume de glucose, 2,2 % en poids/volume d'extrait soluble de maïs, 1,35 % en poids/volume de peptone, 0,5 % en poids/volume de phosphate monopotassique, 0,5 % en poids/volume de phosphate dipotassique, 0,1 % en poids/ volume de sulfate de magnésium hepta-hydraté, 1,0 % en poids/ volume d'acétate d'ammonium et 0,05 Ag/ml de biotine.On ajoute au milieu nutritif 1 litre d'une culture d'ensemencement que l'on obtient en cultivant Sarcina lutea IAN 1099 pendant 72 heures dans un milieu aqueux contenant les mêmes ingrédients que ci-dessus. Le milieu nutritif est cultivé à 300C pendant 72 heures dans des conditions d'aération (50 litres/minute) et d'agitation (200 tr/mn). Une solution aqueuse contenant 2 mg/ml de pantothénate de calcium, 1 mg/ml d'adénine et 2 mghml de chlorhydrate de cystéine est ajoutée au milieu nutritif pour ajuster son volume total à 110 litres.Ensuite, le milieu est encore cultivé à 300C pendant 20 heures sous aération (55 litres/ minute) et agitation (400 tr/mn). Le bouillon de fermentation ainsi obtenu est chauffé à environ 900C pendant 10 minutes. puis centrifugé. On fait passer 100 litres de la solution sur rageante obtenue sur une colonne garnie de 32 litres de charbon actif. Après lavage avec 15P litres d'eau, la colonne est éluée avec une solution aqueuse d'acétone et d'ammoniac (40 % d'acétone : 28 ffi d'ammoniac = 100 : 1 en volume) et on recueille un effluént contenant le CoA. L'effluent ainsi obtenu est concentré sous pression réduite pour chasser 11 acétone et l'ammoniac. Ensuite, le pH de l'effluent concentré est ajusté à 3 avec de l'acide chlorhydrique concentré. On obtient 20 litres d'une solution de CoA brut. La solution contient au total 60 g de CoA (pureté : 5 %). Exemple 2 Purification du CoA oxydé à l'aide de "DEAE-cellulose" On lave correctement avec de-ltacide chlorhydrique millinormal une colonne garnie de 16 litres de "DEAE-cellulose". On dilue litres d'une solution de CoA brut préparée conformé- ment à l'exemple 1 avec de l'eau pour ajuster la force ionique de la solution- à 0,02. La solution diluée de CoA brut est chargée sur la colonne de "DEAE-cellulose" mentionnée ci-dessus. Ensuite, la colonne est lavée successivement avec 70 litres d'eau et 50 litres de solution aqueuse de chlorure de lithium (pli 3, force ionique 0,02). On fait passer sur la colonne 40 litres d'une solution aqueuse à 20 % de 2-mercapto-éthanol (pH 6,5, force ionique 0,02), de manière à transformer en CoA réduit tout le CoA adsorbé sur la colonne de "DEAE-cellulose". On lave la colonne avec une solution aqueuse de chlorure de lithium (pX 3, force ionique 0,02) jusqu'à ce que l'effluent donne une réaction négative avec le nitroprussiate. On fait passer sur la colonne 40 litres d'une solution aqueuse à 1 % de peroxyde d'hydrogène (pE 8, force ionique 0,03) de manière à transformer le CoA réduit en CoA oxydé. On lave la colonne avec 240 litres d'une solution aqueuse de chlorure de lithium (pH 4, force ionique 0,1) pour enlever le peroxyde d'hydrogène et les impuretés adsorbés sur la colonne de "DEAE-cellulose". Ensuite, on élue la colonne avec une solution aqueuse de chlorure de lithium (pH 4, force ionique 0,3) et on recueille 20 litres d'effluent contenant le CoA oxydé. L'effluent ainsi recueilli est concentré à un volume de 2 litres sous pression réduite. On ajoute à lteffluent concentré 20 litres d'un mélange à 10:1 d'acétone et de méthanol pour précipiter le CoA oxydé. Le précipité est recueilli par filtration. Il est ensuite dissous dans 500 ml d'eau et la solution est additionnée de 5 litres d'un mélange à 10:1 d'acétone et de méthanol pour reprécipiter le CoA oxydé Cette opération est répétée deux fois pour éliminer l'excès de chlorure de lithium. Ensuite, la solution aqueuse de CoA oxydé est lyophilisée, en sorte luron obtient le CoA oxydé (sous la forme. du sel de lithium). Le rendement exprimé en CoA total (base libre) est de 21,9 g (73 %) ; la pureté est de 100 %. Exemple 3 Purification du CoA réduit au moyen de "DEAE-cellulose" On lave correctement à l'acide chlorhydrique mi normal une colonne garnie de 16 litres de nDEAE-celluloset'. On dilue avec de l'eau 10 litres d'une solution de CoA brut préparée conformément à l'exemple 1 pour ajuster sa force ionique à 0,02. On fait passer la solution diluée de CoA brut sur la colonne de "DEA-cellulose" mentionnée ci-dessus. Ensuite, on lave la colonne successivement avec 70 litres d'eau et 50 litres d'une solution aqueuse de chlorure de lithium (pH 3, force ionique 0,02). On fait passer sur la colonne 40 litres d'une solution aqueuse à 20 % de 2-mercapto-éthanol (pH 6,5, force ionique 0,02) de manière à transformer en CoA réduit tout le CoA adsorbé sur la colonne de nDEAE-cç11ulose't. On lave la colonne avec une solution aqueuse de chlorure de lithium (pE 3,force ionique 0o02) jusqu'à ce que l'effluent donne une réaction négative au nitroprussiate. On fait passer sur la colonne 40 litres d'une solution aqueuse à 1 % de peroxyde d'hydrogène (pH 7, force ionique 0,03) de manière à transformer le CoA réduit en CoA oxydé. On lave la colonne avec 240 litres d'une solution aqueuse de chlorure de lithium (pH 4, force ionique 0,1) pour éliminer le peroxyde d'hydrogène et les impuretés adsorbés sur la colonne de nDEAR-ce11ulose". On lave ensuite cette dernière avec de l'eau jusqu'à ce que la force ionique de l2effluent soit inférieure à 0,02.On fait passer sur la colonne 40 litres d'une solution aqueuse à 20 % de 2-mercaptoéthanol (pH 6,5, force ionique 0,02) de manière à transformer le CoA oxydé en CoA produit. On lave la colonne avec 120 litres d'une solution aqueuse de chlorure de lithium (pH 3, force ionique 0,02). Ensuite, on élue la colonne avec une solution aqueuse de chlorure de lithium (pH 3, force ionique 0,1) et on recueille 40 litres d'effluent contenant le CoA réduit. L'effluent ainsi recueilli est traité avec un mélange d'acétone et de méthanol comme décrit dans l'exemple 2, puis il est lyophilisé, en sorte qu'on obtient le CoA réduit (sel de lithium). Le rendement calculé en CoA total (sur base libre) est de 20,4 g (68 %). La pureté en CoA total est de 100 %. La pureté en CoA réduit est de 97 %. Exemple 4 Purification du CoA oxydé, à l'aide de "Dowex 1 x 2" correctement On lave/a l'acide chlorhydrique décinormal une colonne garnie de 5 litres de "Dowex 1 x 2". On dilue 5 litres d'une solution de CoA brat préparée conformément à l'exemple 1 avèc de l'eau pour ajuster sa force ionique à 0,05. La solution diluée de CoA brut est- chargée sur la colonne de "Dowex 1 x 2" mentionnée ci-dessus. Ensuite, la colonne est lavée successivement avec 15 litres d'eau et 15 litres d'une solution aqueuse de chlorure de lithium (pK 2,5, force ionique 0,05).On fait passer sur la colonne 10 litres d'une solution aqueuse à.2 % de dithiothréitol (pH 7,0, force ionique 0,02), de manière à transformer en CoA réduit la totalité du CoA adsorbé sur la colonne de "Dowex .1 x 2". On lave la colonne avec une solution aqueuse de chlorure de lithium dans l'acide chlorhydrique O,OlN (pH 2,0, force ionique 0,05) jusqu'à ce que lfeffluent donne une réaction négative avec le nitroprussiate. On fait passer sur la colonne 10 litres d'une solution laqueuse à 2 % de triiodure de potassium (pH 7,5, force ionique 0,04), de manière à transformer le CoA réduit en CoA oxydé.On lave la colonne avec 60 litres d'une solution aqueuse de chlorure de lithium dans l'acide chlorhydrique 0,01N (pli 2,0, force ionique 0,25) pour éliminer le triiodure de potassium et les impuretés adsorbés sur la colonne de "Dowex 1 x 2n. Ensuite, on élue la colonne avec une solution aqueuse de chlorure de lithium dans l'acide chlorhydrique 0,01N (pli 2,0, force ionique 0,5) et on recueille 8 litres d'effluent contenant le CoA oxydé. L1effluent ainsi recueilli est concentré à un volume de 2 litres sous pression réduite. L'effluent concentré est ensuite traité comme décrit dans l'exemple 2, en sorte qu'on obtient le CoA oxydé (sel de lithium). Le rendement calculé est de 10,5 g (70 %) en ce qui concerne le CoA total (base libre). La pureté est de 100 %. Exemple S Purification du CoA réduit avec le produit "Dowex 1 x 2" On lave correctement une colonne garnie de 5 litres de "Dovex 1 x 2" avec de l'acide chlorhydrique centinormal. On dilue avec de l'eau 5 litres d'une solution de CoA brut préparée conformément à exemple 1 pour ajuster sa force ionique à 0,05. La solution diluée de CoA brut est chargée sur la colonne de "Dowes t x 2" mentionnée ci-dessus. Ensuite, la colonne est lavée successivement avec 15 litres d1eau et 15 litres d'une solution aqueuse de chlorure de lithium dans l'acide chlorhydrique 0,01N (pE 2,0, force ionique 0,05).On fait passer sur la colonne 10 litres d'une solution aqueuse à 2 % de dithiothréitol (pE 7, force ionique 0,02), de manière à transformer en CoA réduit tout le CoA adsorbé sur la colonne de "Dowex 1 x 2". On lave la colonne avec une solution aqueuse de chlorure de lithium dans l'acide chlorhydrique 0,01N (pE 2,9, force ionique 0,05) jusqu'à ce que l'effluent donne une réaction négative avec le nitroprussiate. On fait ensuite passer sur la colonne 10 litres d'une solution aqueuse à 2 % de triiodure de potassium (pli 7,5, force ionique 0,04) de manière à transformer le CoA réduit en CoA oxydé.On lave la colonne avec 60 litres d'une solution aqueuse de chlorure de lithium dans l'acide chlorhydrique 0,01N (pE 2,0, force ionique 0,25) pour éliminer le triiodure de potassium et les impuretés adsorbés sur la colonne de 11Dowex 1 x 21 On lave ensuite la colonne avec de i 'eau jusqu'à ce que sa force ionique soit inférieure à 0,1. On fait passer sur la colonne 10 litres dtune solution aqueuse à 2 % de dithiothrditol (pX 7,0, force ionique 0,02), de manière à transformer en Cod réduit le CoA oxydé. On lave la colonne avec 30 litres d'une solution aqueuse de chlorure de lithium dans l'acide chlorhydrique 0,01N (pH 2,0, force ionique 0,05).On élue ensuite la colonne avec une solution aqueuse de chlorure de lithium dans l'acide chlorhydrique 0,01N (pH 2,0, force ionique 0,2) et on recueille 12 litres d'effluent contenant le CoA réduit. L'effluent ainsi recueilli est concentré à un volume de 1 litre par lyophilisation puis traité comme décrit dans l'exemple 2, en sorte qu'on obtient le CoA réduit (sel de lithium). Le rendement exprimé en CoA total (base libre) est de 9,9 g (66 %). La pureté, en CoA total, est de 98 fui a pureté, en CoA'réduit, est de 94 %. Exemple 6 Purification du CoA oxydé avec le produit "DEAE-Sephadex Â-25" On dilue avec de l'eau 10 litres d'une solution de CoA brut préparée conformément à l'exemple 1 pour ajuster sa force ionique à 0,02. 15 litres de "DEAE-Sephadex A-25", préalablement soumis à un lavage correct avec de l'acide chlorhydrique millinormal, sont ajoutés à la solution diluée de CoA brut. Le mélange est agité à la température ambiante pendant 5 heures. Le "DEAE-Sephadeg Q-25" est récupéré sous la forme d'une phase solide par filtration du mélange. Ensuite, le filtrat est encore versé sur la phase solide de "DEAE-Sephadex A-25", de manière à fixer par adsorption le CoA restant dans le filtrat sur le produit "DEAE-Sephadex A-25". Ce dernier, après récupération, est mis en suspension dans 50 litres d'une solution aqueuse de chlorure de lithium (pX 2,5, force ionique 0,02), la suspension est agitée à-la température ambiante pendant 1 heure puis elle est filtrée (cette opération est répétée jusqu'à ce que la matière non adsorbée sur "DEAE-Sephadex A-25" soit complètement enlevée). Le produit "DEtE-Sephadex A-25" ainsi obtenu est mis en suspension dans 50 litres d'eau. On ajoute du 2-mer-capto-éthanol à la suspension de manière que la concentration finale en 2-mercapto-éthanol soit égale à 20 % en poids/volume. Après avoir ajusté le pli de la suspension à 8, on agite cette dernière à la température ambiante pendant 2 heures. Ensuite, on récupère le produit "DEAE-Sephadex A-25" sous la forme d'une phase solide en filtrant la suspens ion, et on verse encore le filtrat sur la phase solide de "DEAE-Sephadex A-25". La totalité du CoA adsorbé sur "DEAE-Sephadex A-25" est transformée en CoA réduit par les opérations mentionnées ci-dessus.Le "DEAE- Sephadèx A-25" récupéré est mis en suspension dans 50 litres d'une solution aqueuse de chlorure de lithium (pH 2,5, force ionique 0,02), et la suspension est agitée à la température ambiante pendant 1 heure puis filtrée (cette opération est répétée jusqu'à ce que le filtrat donne une réaction négative avec le nitroprussiate. Le "DEAE-Sephades A-25" ainsi obtenu est mis en suspension dans 50 litres d'eau. On ajoute une solution aqueuse de peroxyde dthydrogène à la suspension dé manière que la concentration finale du peroxyde d'hydrogène soit égale à 1 % en poids/volume. Après avoir ajusté son EH à 7, on agite la suspension à la température ambiante pendant 2 heures.Ensuite, on récupère le "DEAE-Sephadex A-25" sous la forme d'une phase solide par filtration de la suspension et on verse encore le filtrat sur la phase solide de11DRAE-Sephadex A-25'1. Le CoA réduit adsorbé sur "DEA-Sephadex" est ainsi transformé en CoA oxydé. Le produit "DEAE-Sephadex A-25" récupéré est mis en suspension dans 50 litres d'une solution aqueuse de chlorure de lithium (pH 2,5, force ionique 0,1), la suspension est agitee à la température ambiante pendant 2 heures puis elle est filtrée (cette opération est répétée jusqu'à ce que le peroxyde d'hydrogène et les autres impuretés soient totalement éliminés. Le produit "DEAE-Sephadex A-25" ainsi obtenu est mis en suspension dans 20 litreÇd'une solution aqueuse de chlorure de lithium (pH 3, force ionique 0,5), la suspension est agitée pendant 3 heures puis elle est filtrée pour recueillir le filtrat contenant le CoA oxydé. Après répétition de cette opération, le filtrat ainsi obtenu est traité comme décrit dans l'exemple 2, et on obtient ainsi le CoA oxydé (sous la forme du sel de li thium). le rendement calculé, exprimé en CoA total (base libre), est de 18 g (60 %). La pureté est égale à 97 %. RJNDIOATI0NS 1. Procédé pour séparer le coenzyme A oxydé, sous une forme très pure, d'une solution de coenzyme A brut, procédé caractérisé par le fait qu'il consiste (a) à faire entrer une solution de coenzyme A en contact avec un échangeur anionique insoluble dans l'eau de manière à fixer le coenzyme A par adsorption sur ltéchnngeur ; (b) à traiter l'échangeur anionique insoluble dans liteau avec un agent réducteur pour transformer le coenzyme A en coenzyme A réduit ; (c) à laver 12 échangeur anionique insoluble dans 12 eau jusqu'à ce que l'excès d'agent réducteur et les composés thioliques étrangers au coenzyme A en soient éliminés; (d) à traiter l'échangeur anionique insoluble dans l'eau avec un agent oxydant pour transformer le coenzyme A réduit en coenzyme A oxydé ; (e) à laver l'échangeur anionique insoluble dans l'eau jusqu'à ce que l'excès d'agent oxydant et d'autres impuretés en soient éliminés ; et (f) à éluer le coenzyme A oxydé de l'échangeur anionique insoluble dans liteau. 2. Procédé de séparation du coenzyme A réduit, sous une forme très pure, d'une solution de coenzyme A brut, procédé caractérisé par le fait qutil consiste (a) à faire entrer une solution de coenzyme A en contact avec un échangeur anionique insoluble dans l'eau de manière que le coenzyme A soit fixé par adsorption sur ltéchangeur (b) à traiter l'échangeur anionique insoluble dans l'eau avec un agent réducteur pour transformer le coenzyme h en coenzyme A réduit ; (c) à laver l'échan- geur anionique insoluble dans l'eau jusqu'à ce que ltexces d'agent réducteur et les composés thioliques étrangers au coenzyme A en soient élimanés;(d) à traiter l'échangeur anionique insoluble dans l'eau avec un agent oxydant pour transformer le coenzyme A réduit en-coenzyme A oxydé ; (é) à laver l'échangeur anionique insoluble dans 12 eau jusqu'à ce que l'excès d'agent oxydant et d'autres impuretés en soient éliminés ; (f) à traiter l'échan- geur anionique insoluble dans l'eau - de nouveau avec un agent réducteur pour transformer le coenzyme A oxydé en coenzyme A réduit ; (g) à laver l'échangeur anionique insoluble dans l'eau jusqu'à ce que l'excès d'agent réducteur en soit éliminé ; et (h) à éluer le coenzyme A réduit de l'échangeur anionique insoluble dans l'eau. 3. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que la solution de coenzyme A est l'extrait exempt de cellules d'un micro-organisme producteur de coenzyme A. 4. Précédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que l'échangeur anionique insoluble dans l'eau est choisi entre une résine d'échange anionique fortement basique, une résine d'échange anionique faiblement basique, la diéthylaminoéthylcellulose, le diéthylaminoéthyldextrane et le dérivé d'épichlorhydrine de la triéthylaminocellulose. 5. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que l'opération (a) est conduite en utilisant une solution de coenzyme A de force ionique comprise entre 0,005 et 0,04 et l'échangeur anionique insoluble dans l'eau que l'on obtient dans l'étape (a) est lavé successivement avec de l'eau et une solution aqueuse (pH 2-7) de force ionique comprise entre 0,005 et 0,04 avant l'utilisation dans l'étape (b). 6. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que le traitement de i' échangeur anionique insoluble dans l'eau avec l'agent réducteur est conduit à un pli de 4 à 8 et l'agent réducteur est choisi entre le 2-mercapto-éthanol, le dithfothréitol et le dithioérythritol. 7. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait qu'il consiste à utiliser comme agent réducteur une solution aqueuse à 0,1-1 % en poids/volume de dithiothréitol (pE 4-8), une solution aqueuse à 1-0-30 % en poids/volume de 2-mercapto-éthanol (pli 4-8) ou une solution aqueuse à 0,1-1 % en poids/volume de dithioérythritol (pH 4-8) dont la force ionique n'est pas supérieure à 0,05. 8. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que le lavage de l'échangeur anionique insoluble dans l'eau sur lequel le coenzyme A réduit est fixez par adsorption, est effectué en utilisant une solution aqueuse (pH 2-7) de force ionique égale à 0,02-0,05. 9. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que le traitement de l'échangeur anionique insoluble dans liteau avec l'agent oxydant est effectué à un pli de 3-8 et l'agent oxydant consiste en peroxyde d'hydrogène ou en triiodure de potassium. 10. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait qu'il consiste à utiliser comme agent oxydant une solution aqueuse à 0,1-1 % en poids/volume de peroxyde d'hydrogène (pH 3-8) ou une solution aqueuse à 1-4 % en poids/volume de triiodure de potassium (pli 3-8)dont la force ionique est égale à 0,05-0,5. Il. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par- le fait que le lavage de l'échangeur anionique insolubIe dans l'eau dans l'étape (e) est effectue en utilisant une solution aqueuse (pE 2-7) de force ionique égale à 0,06-0,7. 12. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que ltélution du coenzyme oxydé A de l'échangeur anionique insoluble dans l'eau est effectuée en utilisant une solution aqueuse (p9 2-7) dont la force ionique est comprise entre 0,2 et 1,2 et est supérieure de 0,05 à 1,0 unité à celle du solvant de lavage utilisé dans l'étape (e). 13. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait que ltélution du coenzyme A réduit de l'échangeur anionique insoluble dans l'eau est effectuée en utilisant un solvant aqueux (pH 2-7) dont la force ionique est comprise entre 0,06 et 0,7, 14. Procédé de purification de coenzyme A oxydé, caractérisé par le fait qu'il consiste :: (a) à faire entrer l'extrait exempt de cellules force ionique 0,005 à 0,04) d'un micro-organisme producteur de coenzyme A en contact avec un échangeur anionique insoluble dans l'eau choisi entre une résine d'échange ionique fortement basique, une résine d'échange anionique faiblement basique, la diéthylsmino-éthylcellulose, le diéthylaminoéthyldextrane et le dérivé d'épichlorhydrine de la triéthanolaminocellulose à laver l'échangeur anionique insoluble dans l'eau avec de l'eau et une solution aqueuse (pH 2-7) de force ionique égale à 0,005-0,04 ;; (b) à traiter l'échangeur anionique insoluble dans l'eau avec la solution aqueuse (pH 4-8, force ionique 0,020,05)d'un agent réducteur (c) à laver l'échangeur anionique insoluble dans l'eau avec une solution aqueuse (pH 2-7) de force ionique égale à 0,02-0,05 jusqu'à ce que I'excès d'agent réducteur et les composés thioliques étrangers au coenzyme A en soient éliminés (d) à traiter l'échangeur anionique insoluble dans l'eau avec la solution aqueuse (pH 3-8, force ionique 0,050,5) d'un agent oxydant (e) à laver 12 échangeur anionique insoluble dans l'eau avec un solvant aqueux (pli 2-7) de force ionique égale à 0,06-0,7 jusqu'à ce que l'excès d'agent oxydant et d'autres impuretés en soient éliminés ; puis (f) à faire entrer l'échangeur anionique insoluble dans 11 eau en contact avec un solvant aqueux (pH 2-7, force ionique 0,2-1,2, cette force ionique étant supérieure de 0,05 à 1,0 unité à celle du solvant de lavage utilisé dans l'étape (e)) pour en éluer le coenzyme A oxydé. 15. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé par le fait que l'agent réducteur est choisi entre le 2-mercaptoéthanol, le dithiothréitol et le dithioérythritol, et l'agent oxydant est le peroxyde d'hydrogène ou le triiodure de potassium. 16. Procédé de purification de-coenzyme A réduit, caractérisé par le fait qu'il consiste (a) à faire entrer l'extrait exempt de cellules (force ionique 0,005-0,04) d'un micro-organisme producteur de coenzyme A en contact avec un échangeur anionique insobluble dans l'eau choisi entre une résine d'échange anionique fortement basique, une résine d'échange anionique faiblement basique, la,diéthyl- aminoéthylcellulose, le diéthylaminoéthyldextrane et le dérivé d'épichlorhydrine de la triéthanolaminocellulose ; à laver l'échangeur anionique insoluble dans l'eau avec de l'eau et une solution aqueuse (pH 2-7) de force ionique égale à 0,0050,04 (b) à traiter l'échangeur anionique insoluble dans l'eau avec la solution aqueuse (pH 4-8, force ionique 0,020,05) d'un agent réducteur (c) à laver l'échangeur anionique insoluble dans 12 eau avec une solution aqueuse (pE 2-7) de force ionique égale à 0,02-0,05 jusqu'à ce que l'excès d'agent réducteur et les composés thioliques étrangers au coenzyme A en soient éliminés ; (d) à traiter ltéchnngeur anionique insoluble dans liteau avec la solution aqueuse (pH 3-8, force ionique 0,05-0,5) d2un agent oxydant ;; (e) à laver l'échangeur anionique insoluble dans 12 eau avec un solvant aqueux Crli 2-7) de force ionique égale à 0,06-0,7 jusqu ce que l'excès d'agent oxydant et d'autres impuretés en soient éliminés ; à laver encore ltéchnngeur snio- nique insoluble dans 12 eau avec de l'eau jusqu ce que la force ionique de 1' effluent soit inférieure à 0,1 (f) à traiter l'échangeur anionique insoluble dans l'eau avec la solution aqueuse (pH 4-8, force ionique 0,020,05) d'un agent réducteur ; (g) à laver l'échangeur anionique insoluble dans lteau jusqu'à ce que l'excès d'agent réducteur soit éliminé ; puis (h) à faire entrer ltéchangeur anionique insoluble dans l'eau en contact avec un solvant aqueux (pH 2-7) de force ionique égale à 0,06-0,7 pour en éluer le coenzyme A réduit. 17. Procédé suivant la revendication 16, caractérisé par le fait que l'agent réducteur est choisi entre le 2-mercaptoéthanol, le dithiothréitol et le dithioérythritol, et l'agent oxydant est le peroxyde d'hydrogène ou le triiodure de potassium.