FR 2252350 A1 19750620 FR 7341662 A 19731122 L'invention est relative à un produit nouveau ayant une activite de polynucléotide phosphorylase, enzyme qui, dans la suite de l'exposé, sera désignée sous l'expression PNPase. De telles enzymes sont utiles pour la préparation ae polynucléotides : notamment les homopolynucléotides de poly(inosine monophosphate), de poly(cytidine monophosphate), de poly(adénosine monophosphate), de poly(uridine monophosphate, de poly(guanosine monophosphate) et de poly (xanthine monophosphate), généralement et respectivement appelés "Poly I", "Poly C", "Poly A", "Poly U", "Poly G" et "Poly X", par polymérisation enzymatique, respectivement, d'inosine diphosphate (IDP), de cytidine diphosphate (CDr), d'adénosine diphosphate (ADP), d'uridine diphosphate (UDF), de guanosine diphosphate et de xanthine diphosphate, en présence d'ions magnésium ou manganèse. Elles permettent également la préparation de copolynucléotides contenant des proportions variables d'au moins deux des bases précitées, y compris les copolymères ayant une teneur en G très élevée. De tels polymères, par exemple le "Poly I'' et le "Poly O", forment, lorsqu'ils sont mélangés en proportions équimoléculaires au sein d'un milieu présentant une concentration ionique suffisante,.des complexes bicaténaires, généralement appelés "Poly I:C", lesquels peuvent entre autres constituer des médicaments précieux pour le tràitement chimiothérapique de certaines formes de leucémie ou, dune façon plus générale, pour le renforcement des défenses immunitaires de l'organisme. L'invention concerne également un procédé pour la fabrication du nouveau produit à action enzymatique. Dans les conditions de polymérisation usuelles, l'enzyme est dissoute dans le~milieu de réaction, de sorte quelle ntest plus -récupérable à la fin de la réaction. Elle est même normalement détruite, lorsque. la réaction est arrêtée, ce qui représente un double inconvénient, tant du point de vue du coût extrêmement élevé de l'enzyme que de celui de la dégradation du produit de réaction qui résulte du processus d'inactivation de l'enzyme. En outre, les substances contaminantes qui accompagnent l'en- zyme perturbent la polymérisation. Par exemple, on peut distinguer deux classes de substances contaminantes d'une préparation enzymatique - la première classe comprend toutes les substances qui interviennent dans la réaction catalysée par la PNPase, - la seconde classe celles intervenant sur les produits de la réaction. On peut citer a) les inhibiteurs agissant directement sur l'enzyme, tels que les ions métalliques multivalents et les acides nucléiques; b) les enzymes dégradant les substrats, c'et-à-dire les nucléosides diphosphates tels que les phosphatases et les kinases; c) les ribonucléases dégradant le produit de la réaction (les polynucléotides) en engendrant des produits d'apparence'identique au produit initial si lton ne procède pas à des analyses physicochimiques et enzymatiques; car ces produits de dégradation correspondent à des chaines de longueur plus petite et de taille hétérogène; de plus, ils sont terminés par un groupement PO4 en extrémité 3' de la chaîne, ce qui interdit toute utilisation de ces molécules à des études enzymatiques comme amorceurs de syn-thèse des ribo- ou déoxynucléotides; de surcroît, ces produits de dégradation sont des inhibiteurs de la PNPase; d) les protéases qui dégradent la PNPase,-soit en inactivant, soit en la transformant en des espèces moléculaires actives, nean- moins pourvues d'un mécanisme différent de l'enzyme native, ce qui a pour conséquence l'obtention de polynucléotides peu homogènes en longueur. On a déjà proposé, pour remédier partiellement à ces inconvénients, de fixer certaines de ces enzymes sur un support insoluble. En utilisant l'enzyme ainsi fixée sur son support dans le milieu de réaction, il a certes été possible de récupérer l'enzyme à l'issue de la polymérisation. La fixation de l'enzyme contaminée ne permet pas de remédier aux inconvénients que causent les contaminants lorsque l'on utilise l'enzyme libre puisque les contaminants sont aussi fixés et conservent toute leur activité néfaste. On a cependant constaté que, dans le cadre de l'invention, tous ces inconvénients se trouvaient éliminés lorsque l'on a recours à une polynucléotide phosphorylase d'origine bien déterminée fixée sur un support également bien déterminé. te produit selon l'invention consiste en une PNPase extraite de E.coli et fixée sur le support connu sous le nom de sépharose. On a en effet constaté qu'une PNPase purifiée de B.coli peut être récupérée du milieu après les réactions de polymérisation qui ont été évoquées plus haut, et est complètement dépourvue des inconvénients également mentionnés plus haut et qui étaient attribués aux contaminants. tes polynucléotides obtenus sont parfaitement omogènes. Leurs extrémités en 3' sont occupées par des groupements -OH libres. Il est également remarquable de constater que la totalité de l'activité enzymatique de la préparation libre est préservée après la fixation sur la sépharose. D'autres caractéristiques de l'invention apparaltront encore au cours de la description qui suit d'un exemple décrivant l'ex- traction de l'enzyme à partir de E.coli et sa fixation sur sépharose. A - EXTRACTION DE L'ENZYME Environ 200 g de E.coli B, en pâte essorée, sont mis en suspension dans 200 ml de tampon. Le tampon utilisé pour la purification peut être composé de différentes substances. Il a un pH compris entre 7 et 9 et contient - 1 mM de MgCI2, - 1 mM d'un thiol du type mercaptoéthanol ou dithiothréitol (DTT), - 2,2 mM a 'un inhibiteur de protéases, tel que le phénylméthylsulfonylfluorure (PMSF). Comme exemple on peut utiliser un tampon Tris-ECl 20-50 mM, à pH 7,5-8. C'est à ce pH que l'enzyme conserve le mieux son activité. Broyage et centrifugation La suspension bactérienne est sounise à une opération de broyage pour extraire les protéines cellulaires, notamment au moyen d'un broyeur du type Manton-Gaulin. L'extrait acellulaire ainsi obtenu est très visqueux, ceci étant dû à.la présence du DNA que l'on dégrade par l'addition de 1 mg de DNase. Après 15 minutes à OOC, la suspension rendue fluide est centrifugée à 105.000 g pendant 2 heures pour réaliser une sédimentation des débris membranaires et des ribosomes. Dialyse te surnageant obtenu est dialysé contre le tampon Tris-HOl, pH 8, contenant 1 mM de DTT et 2,15 mM de PMSF, pendant une nuit (ou pendant quelques heures avec rechange à trois reprises du tampon). Ce surnageant dialysé (290 ml) contient 43,2 mg de protéines/ ml, soit 12,5 g au total, et a une activité totale se situant entre 15.000 et 25.000 unités enzymatiques selon les lots de bactéries. A ce dialysat de protéines non sédimentables, après centrifugation à 105.000 g pendant 2 heures, on ajoute 11 mi de NaCl 4 M afin de l'amener à une concentration en NaCl de 0,15 Il. On rappellera à ces stade que l'uni'e enzymatique correspond à la dose nécessaire de protéine pour produire en 60 minutes, à 3700, la polymérisation de I pmole d'ADP (ou d'UDP); ou la libération de 1 Eunole d'ADP (ou d'UDP) dans les mêmes conditions au cours de la phosphorylase du polynucléotide correspondant. Chromatographie sur DEAE cellulose Cette solution est adsorbée dans une colonne (dimension 1700 cm3) de DEAE cellulose (par exemple DE 52 Whatman), préalablement équilibrée avec un tampon Tris- HCl, pH 8, 20 mM, contenant 1 mM de DTT et 0,15 M de NaCl. Une fois les 300 ml de solution passés, entratnant les protéines non adsorbées, les protéines adsorbées sur la colonne de DEAE cellulose, à cette molarité de sel et àce pH, sont éluées par un tampon Tris-HCl, pH 8, 20 mM, NaCl 0,3 M et DTT 1 mM. La totalité de l'activité de la PNP apparaît dans le volume d'élution entre 600 ml et 1100 ml, le pic d'activité sesituant entre 800 et 1000 ml. Dans cet exemple, c'est cette fraction de 200 ml qui va être reprise dans les opérations suivantes. Précipitations au sulfate d'ammonium tes protéines contenues dans ces 200 ml sont précipitées par l'addition de sulfate d'ammonium à raison de 560 mg par ml, le pH étant maintenu à 8 avec NH4OH. La précipitation est complète à 4 C au bout de quelques heures, ou d'une nuit pour la commodité. Le précipité protéique est recueilli par centrifugation à 30.000 g/30 minutes. La solution de sulfate d'ammonium est soigneusement prélevée. Le culot solide est repris par un tampon Tris-HCl 20 mM et la solution est dialysée contre le même tampon pour dlimi- ner le sulfate d'ammonium. Le dialysat (193 ml contenant 4,6 g de protéines) est fraction né par précipitations successives au sulfate d'ammonium. Aux 193 ml de solution, on ajoute doucement 35,1 g de sulfate d'ammonium, on laisse équilibrer pendant 30 minutes à 4 C. Le précipité formé est écarté par centrifugation à 30.000 g/30 minutes. Au surnageant ainsi obtenu, on ajoute 16,6 g de sulfate d'ammonium. Après 30 minutes d'agitation à 4 C, le précipité est recueilli par centrifugation comme précédemment. Le culot protéique contient la majeure partie de l'activité PNPase (le surnageant contient encore 1/4 de l'activité qui être récupéré par addition de 43 g de sulfate d'amonium). Le culot protéique est repris par 35 ml d'un tampon Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM, contenant 0,25 NaCl. La solution est ensuite dialysée contre le même tampon toute la nuit. Le dialysat (40 ml) contient 1,6 g de protéines et 24.000 unités de PHPase. Chromatographie sur DEAE-Sephadex A 50 Cette solution protéique, diluée trois fois avec son tampon, est ensuite appliquée sur une colonne de DEAE Sephadex A 50 (65 cm x 2,75 cm, diamètre 5,5 cm, volume 1540 ml), préalablement équilibrée avec un tampon Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM et NaCl 0,25 M. La vitesse de passage est de 1 ml/minute. Une fois l'adsorption terminée, I'élution des protéines est réalisée par un gradient linéaire de Tris-HCl, pH 7,5, -20 mM, NaCl 0,25 M et Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM, NaCl 0,4 M (2 litres de chaque solution). L'activité enzymatique apparaît dans le liquide d'élution à partir de 2.150 ml et est complètement éluée au volume de 2.500 ml (correspondant à 0,35 M NaCI). La fraction active (environ 20.000 unités) contient 150 mg de protéines (ce qui correspond donc à une activité d'environ 133 u/mg de protéine). Ces protéines très enrichies en PNPase sont concentrées par précipitation au sulfate d'ammonium à 80 % de saturation. Une fois repris par un tampon Tris-HOl, ER 7,5, 20 mM, l'activité enzymati- que est entièrement stable pendant douze mois. Elle est conservée entre -80 et -200C. Filtration sur Sephades G 200 La purification finale de la PNPase s'effectue par petites fractions, à 11 aide d'une filtration sur tamis moléculaire. On utilise une colonne de Sephadex G 200 (60 cm x 0 4 cm, volume 830 cm ). Le Sephadex est prégonflé dans Tris-HCl, pH 7,5, 20 m, NaCl 0,1 M et équilibré dans la colonne avec le tampon Tris-HCl 20 mM. 10 à 30 mg de protéines enrichies en PNPase citée ci-dessus peuvent être déposés sur la colonne Sephadex G 200 et élués-par le tampon Tris-HCl 20 mM, pH 7,5-. L'enzyme sort de la colonne juste avant le pic principal des protéines inactives. Si l'on prend seulement le pic d'activité PNPase, on obtient une enzyme d'activité spécifique supérieure à 1000 (1200- - 1500 u/mg). On obtient ainsi la PNPase pratiquement homogène que l'on peut vérifier sur gel polyacrylamide par électrophorèse. Une bande de protéine principale correspondant à l'activité enzymatique matérialisée par la formation in situ d'un polynucléotide lorsque l'on incube le gel contenant l'enzyme dans un mélange de polymérisation et que l'on peut mettre en évidence par coloration spécifique à l'aide d'acridine orange. L'enzyme ainsi obtenue a un poids moléculaire de 200.000 + 10 , et est composée de deux sous-unités de 95.000 t 5 %. Elle est exemnte de nucléases, kinases, phosphatases, protéases. Elle est homogène comme on peut le verifier sur gel polyacrylamide et par ultracentrifugation. C'est une enzyme native, ayant un mécanisme dit asynchrone ou processif. B - FIXATION DE L'ENZYME SUR SEPHAROSE 4B (liaisons de covalence)K La fixation s'effectue en deux étapes 1) activation de la sépharose par le bromure de cyanogène, 2) fixation de la sépharose activée sur l'enzyme. Activation On centrifuge la pite d'origine de Sépharose 43 (à base principalement d'agarose polymérisée) à 50.000 g pendant 20 minutes. On lave à l'eau distillée le culot obtenu. Par exemple, à partir de 28 g de patte, il faut laver 4 fois avec 1 litre d'eau distillée (au total 4 litres). On essore sur verre fritté. tes 3 g de bromure de cyanogène (ClEBr) sont mis en suspension dans 100 ml d'eau, d'une part, et 28 g de sépharose humide mis en suspension dans 25 ml d'eau, d'autre part. On mélange les deux préparations avec agitation magnétique sous pH mètre dans un bain de glace. Le pH est maintenu à 10 par l'addition environ toutes les 5 secondes de NaOH 4 M à la pipette Pasteur. L'opération dure environ 10 minutes. On filtre sur verre fritté pour éliminer le bromure de cyanogène, puis on effectue des lavages au bicarbonate de sodium 1 M. Pour les 28 g de sépharose mis en oeuvre, il est nécessaire d'effectuer 8 lavages, chacun avec 200 ml de bicarbonate de sodium, de façon à ce que la totalité du bromure de cyanogène soit éliminée. On-essore sur verre fritté. On obtient 21,5 g de Sépharose 43 activée. On rince deux fois par du tampon PNP (Tris-HCl 10 mM, pH 8,2, MgCl2, 1 mM, DTT 1 mM). On essore à nouveau. La sépharose est prête pour 11 emploi. Fixation On utilise 2 g de -Sépharose 43 activée pour 2 mi de solution enzymatique à 500 g/ml de protéines, soit 500 unités d'activité enzymatique par gramme de sépharose. La suspension enzymatique est agitée pendant une nuit à + 4 C. On centrifuge à 30.000 g pendant 20 minutes. Le surnageant et le précipité sont dosés en protéines et en activité. Le culot est lavé de manière répétée (4 fois) avec du tampon PI%P avant usage. La totalité de l'activité enzymatique mise en oeuvre a été fixée. C - EXEMPLE D'APPLICATION DE LA PNPASE D'E.COII FIXEE SUR SEPHAROSE 4B POUR LA SYNTHESE D'ACIDE POLYURIDYLIQUE UDP de chez Yamasa, 1 g Tris-HCl, pH 8, 1-8, 2,2 N, 10 ml EDTA 0,1 N, 2 ml MgCH2 1 M, 1 ml Enzyme fixée sur sépharose activée à 580 u/g de sépharose, 1 g On travaille sur un volume final complété avec de l'eau bidistillée à 100 mi. On laisse incuber à 3700 dans un bain-marie agité. On suit la réaction par des dosages du phosphore inorganique libéré. On arrête la réaction par centrifugation du mélange à 30.000 g une fois le plateau atteint, ce qui permet de séparer 11 enzyme fixée sur sépharose du milieu réactionnel. On recupère le culot contenant l'enzyme fixée sur sépharose. le surnageant est constitué d'acide polyuridylique, du mélange réactionnel, dont les diphosphates non utilisés par la réaction. Au surnageant on ajoute 250 ml d'alcool éthylique refroidi à -20 C. On laisse la précipitation se faire à -200C, On centrifuge ensuite à 30.000 g. On recueille le précipité, dissous dans un volume minimum d'eau (15 ml pour les quantités mises en oeuvre). On passe la solution sur une colonne de Séphadex G 50, préalablement gonflée et équilibrée avec de l'eau bidistillée. Le pic dtexclusion est constitué d'acide polyuridylique et llon obtient 430 mg de poly U apprécié par dosage spectrophotométrique à 261 nm. REVENDICATIONS 1 - PNPase native ayant un poids moléculaire de 200.000 + 10 étant composée de deux sous-unités de 5.000 + 5 %, exempte de nu cléases, kinases, phosphatases et protéases. 2 - PNPase pure extraite de E.coli. 3 - PNPase selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle a été extraite de E.coli B. 4 - Produit ayant une activité de nucléotide phosphorylase, caractérisé en ce qu'il est constitué par une PNPase selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, fixée sur un support de sépharose. 5 - Application de la PRSase selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou du produit selon la revendication 4 à la synthèse d'homopolynucléotides ou de copolynucléotides par mise en contact des monomères correspondants en présence d'ions magnésium ou manganèse. 6 - Application selon la revendication 5, caractérisée en ce que le monomère mis en oeuvre est au moins en partie constitué par le guanosine diphosphate.