FR 2258447 A1 19750818 FR 7401689 A 19740118 La présente invention concerne une amélioration du procédé de culture de micro organismes par l'utilisation d'une colonne de fermentation à bulles. La culture de micro-organismes au moyen d'une colonne de fermentation à bulles est généralement effectuée en introduisant dans le milieu de culture contenu dans l'appareil à fermentation une quantité d'air appropriée, au moyen de buses d'injection d'air. Le milieu de culture est donc agité en mêle temps qu'il est mélange avec l'air injecté. Ensuite, après la croissance des micro-organismes, on enlève de l'appareil à fermentation le liquide de culture contenant les micro-organismes, on sépara les micro-organismes du liquide de culture, et la liqueur usée est évacuée hors de l'appareillage servant à la culture. On explique généralisement la réussite de cette méthode de culture des micro-organismes par le fait que l'oxygène contenu dans les bulles est dissous dans le milieu de culture grâce à l'agitation, atteint les celles des micro- organismes, et contribue, avec dlautres éléments nutritifs contenus-dans le milieu de culture, à la croissance des micro-organismes. Par exemple, dans le cas de la culture de levures des Un technique antérieùre, la vitesse superficielle du gaz d'aération est babituellement située entre 5 et 10 cm/s. Même dans le cas de fermentation sur hydrocarbure, employànt par exemple un substrat constitué par une substance @@gère et hydrophobe teLe que la paraffine normale, la culture peut être effectués avec une vitesse superficielle du gaz située entre 7 et 10 cals, dans le cas de levure de boulanger, la culture est.généralement effectuée avec une vitesse superficielle du gaz située entre 7 et 10 cm/s.Cependant, ces cultures ent toujours accompagnées d'une production de mousses, on a jusqu'à présent surtout utilisé dans la pratique un quelconque agent anti-mousse (ou un dispositif anti-mousse), afin des lutter contre la production de mousses et de la restreindre. Bien que la quantité de mousses produite dans ces cultures varie avec le type et la phase de la culture, les ennuis décrits ci-dessous se produiront si l'on ne prend pas les mesures appropriées de lutte contre cette production de mousses.En d'autres termes, on admet que le procédé classique dans lequel la vitesse superficielle du gaz est fixée habituellement entre 5 et 10 cm/s est, en pratique, satisfaisant du point de vue du mélangeage de la solution de culture. Cependant, il présente l'inconvénient important de rendre le milieu moussant, ces qui @e traduit par la formation d'une couche de mousse dans la partie supérieure de l'appareil è fermentation, laquelle mousse se développe progressivement et déborde de 1 appareil à fermentation, Ce phénomène est dû à la production de gaz tels que le dioxyde de carbone, etc, qui accompagne la croissance des micro-organismes, et aux substances produites par leur métabolisme. Si l'on ne prend pas de mesure appropriée pour lutter contre la production d'un tel volume de mousses, non seulement les effets de l'agitation deviendront insuffisants, mais de plus la couche de mousses adsorbera les micro-organismes, les maintiendra en surface, ce qui se traduira par une importante inhibition de la croissance des cellules et par une détérioration extrémement importants de leurs taux de croissance dues à l'apparition d'inégalités concernant la composition de la solution de culture et la concentration des micro-organismes. En conséquence, il faut donc choisir le volume de l'appareil à fermentation en fonction du volume important de mousses produites, mais une telle contre-mesure n'est absolument pas avantageuse, ni du point de vue de la capacité de l'appareil, ni en ce concerne l'adoption d'un procédé de culture en continu. On a jusqu'à présent proposé une grande variété de contra-mesures physiques et chimiques permettant de lutter contre la production (établie ci-dessus) d'un volume important de mousses. Par exemple. , dans le cas d'une culture de levure de boulanger, on a proposé l'emploi d'agents anti-mousses tels que de huiles de silicons, qui se sont révélés entre tràs efficaces. Cependant, le coût relativement élevé de ces agents anti-mousses se répercute sérieusement sur le prlx des produits, et de plus, les propriétés chimiques de ces agents anti-mousses s'opposent sauvent au métabolisme de la levure et diminùent le rendement. Dans le demaine des dispcsitifs de lutte mécanique centre les mousses, n emplois surtout des dispositifs spéciaux destinées à "casser" les mousses, le le le séparateur gaziliquide (par exemple le dispositif de lutte contre les mousses décrit dans le brevet japonais n 16527/1966 l'appareil à fermentation aérobis décrit dans le brevet japonais n 2604/1964) dans laquelle on introduit la couche de mousses mélangés à du liquide de culture, et qui sont extérieurs à l'appareil de fermentation. Cependant, les appareils classiques tels que ledit séparateur gaz/liquide étant construits spécialement, ils présentent les défauts d'un coût de construction elevé, et de possibilités de panne supplémentaires. De plus, leur éffet anti-accuse n'est pas toujours satisfaisant. D'autre part, cela n'empêche pas le coût de la construction de l'appareil à fermentation associé à ces appareils d^etre assez élevé, car la construction de l'appareil à fermentation doit ménager llespace nécessaire à l'expansion de la couche de mousses produite. La demanderesse, poursuivant des recherches destinées éliminer les défauts décrits ci-dessus de la technique antérieure, a découvert selon l'invention que la vitesse de l'air introduit (vitesse superficielle du gaz), et qui constitue le moteur de l'agitation, est étroitement liée au phénomène de production dé mousse et au phénomène de disparition des mousses résultait de l'immersion de ces mousses dans le liquide de culture. L'un des objets de l'invention est de proposer un procédé de culture de micro-organismes, ne produisant aucune couche de mousses ou, le cas échéant, ne produisant qu'une très mince couche de mousses, et permettant une culture satisfaisante des micro-organismes. Un autre objet de l'invention est de proposer un procédé de culture de microorganismes aboutissant à une culture satisfaisante sans avoir recours à un quelconque agent anti-mousses ou un quelconque dispositif anti-mousses. Un autre objet de lYinvention est encore de proposer un procédé de culture de micro-organismes5 aboutissant à une culture satisfaisante et de court relativement bas. En d'autres termes, l'invention est destinée à proposer un procédé de culture de micro-organismes caractérisé en ce que, au moment de la culture de ces micro-organismes dans une colonne de fermentation à bulles on réalise une culture régulière des micro-organismes en empêchant la formation d'une couche de mousses grâce au contrôle de la vitesse de l:air injecté (vitesse superficielle du gaz), cette vitesse devant être située entre 14 et 32 cm/s. Dans le procédé selon l'invention decritcl-dessus la culture est effectuée avec une vitesse superficielle du gaz située dans la plage de vitesses mentionnée ci-dessus, et ce même au début de la culture; il a été confirmé qu'une quelconque modification de la vitesse superficielle du gaz à l'intérieur de cette plage n'entraîne aucune formation d une couche de mousse inhibitrice de la culture considérée5 et qu'en conséquence la culture se développe de façon satisfaisante. La raison pour laquelle le choix d'une vitesse super ficielle du gaz dans la plage mentionnée ci-dessus empêche de façon t efficaces par rapport à la technique antérieure, la formation d'une couche demouC,,-es nlest pas encore clairement dégagée, mais il est possible de raisenner grossièrement comme suit. Plus la quantité d'air injecté augmente, plus l'effet d'agitation et l'effet anti-mousses augmentent et plus, d'autre part, les irrégularités de distribution en densité de la solution de culture et l'absorption de cellules sur la couche de mousse diminuant da façon remarquable.Lorsque la vitesse superficielle du gaz dupasse 32 cs/s; l'effet anti-mousses augmente évidement de façon considérable, mais cals s'accompages d'un bouillament du à l'action dita "d'entraînement de l'air", ce bouillonnament devenant violent et causant de talles projections qu'une grande quantité du liquide sort de l'appareil 8 fermentation, tandis que d'autre part l'efficacité de l'aération diminue à cause du ittirage'i ; de telles vitesses ne snt donc pas souhaitables. D'autre part, lorsque la vitesse superficialle du gaz est inférieurs à l4 cm/s, le courant gaseux ne peut pas contribuer à l'effet anti-mousses. Cala étant, la vitesse superficielle approprié du gaz que l'on doit employer dans la présente invention, se situe entre 14 et 32 cm/s. La forme de la colonne de fermentation à bulles utilisable seln l'invention n'est pas restrictive , et de nombreuses modifications de la colonne à bulles sont également possibles. Parmi les micro-organismes utilisables dans le procédé selon l'invention et en plus des levures, on citat les bactéries les champignons, les actinomyces, les algues, etc. En conséquence, le cadre des réactions possibles n'est pas limité aux réactins de fermentation utilisant le sucre et la pétrcle, comme dans les expériences et les modes de réalisation suivants. Les avantages de l'invention sont rassemblés ci-dessous. 1) La lutts anti-mousses étant même dans la colonne, Il @@@@ apparaillage supplémentaire (qui se traduirait par une élévation du coût des produits, comme lorsque la lutte anti-mousses est menée hore de la colonne au moyen d'un dispositif anti-mousses) n'est nécessaire. t) Lorsque lise emplois le procédé selon l'invention, le volume utile de l'appareil à fermentation deviant beaucoup plus avantageux : il atteint 40 % al-:;rs qu'il était habituallement limité à 25 7. du volume total de l'appareil à fermentation, dans les appareils classiques. 3 Le procédé est simplifié car il ne nécessite ni agent anti-mousses ri appareil anti-mousses, et les risquas de Panne sont ainsi fortament diminués. 4) Le procédé selon l'invention est très avantageux du point de von industrial car un peut empêcher la formation d'une couche de mousses et éliminer les défauts dés à une réaction biochmique. D autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris å la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation et en se référant à la figure annexée, qui représente des courbes expérimentales illustrant la relation existant entre la rétention de gaz dans une colonne de fermentation à bulles, et la vitesse superficialle du gaz. Les essais at les modes de réalisation selon lìnvention sont décrins ci-dessus. Le symbols % signifie "pourcentage en poids". ESSAI 1. On remplit d'eau une colonne de fermentation à bulles munie d'une buse d'introduction d'air annulaire (ci-dessous plus brièvement buse annulaires), et on compare la vitesse superficialls du gaz et la rétention de gaz. Le diamètre intérieur de l'appareil à fermentation est de 19,4 cm, et sa hauteur est de 300 cm. vitesse superfi- cielle 7,1 10,1 15,2 18,2 21,2 25,2 31,5 du gaz (cm/a) rétention dù-gaz 0,152 0,176 0,203 0,219 0,231 0,248 0,262 Si l'on augmente la vitesse superficielle du gaz, n cbserve une augmentation de la rétention de gaz. La relaticn qui existe entre la vitesse superficielle du gaz et la rétention du gaz est illustrée par la courbe 3 dans la figure annexés. ESSAI 2. L'appareil à fermentation employé dans l'essai 1 est rempli par un milieu de culture, et on ccmpare la vitesse superficielle du gaz et la rétention du gaz. vitesse superficielle 6,9 9,8 14,8 17,8 24,0 vitesse super rétention d gaz 0,174 0,219 0,237 0,262 0,291 Si l'on augmente la-vitesse superficielle du gaz3 cn observe comme dans ltessai 1 une augmentation de la rétention du gaz. Dans ce cas, la rétention de gaz est quelque peu supérieure à la rétention de gaz dans l'eau ESSAI 3. On prépare un mélange eauflevure dans une colonne de fermentation à bulles munie d'une buse, et l'on compare la vitesse superficielle du gaz et la rétention du gaz. La concentration en levure est de 1,1 7., par rapport au poids sec. Dans ce cas, on n'observe pas de croissance de la levure. Diamètre intérieur de l'appareil à fermentation : 15,0 cm. Hauteur de l'appareil à fermentation : 300 cm. vitesse superficielle du gaz (cm/s) 5,3 9,8 14,3 17,6 18,6 rétention du gaz 0,075 0,126 0,153 0,155 0,154 Dans ce cas, la rétention de gaz est plutôt inférieure à celle observée au cours de l'essai 1. Cet essai prouve qu'une levure qui ne se développe pas n'entraîne jamais une production de mousses. ESSAI 4. On prépare un mélange levure/milieu de culture dans l'appareil à fermentation employé dans l'essai 1, et l'on compare la vitesse superficielle du gaz et la rétention du gaz. De plus, en évalue la répartition en densité, dans l'appareil à fermentation, de bas en haut. La cencentraticn initiale en levure est située entre 1,0 et 1,1%, par rapport au poids sac, et est située entre 1,9 et 2,0%, au miment de la mesure. Dans ce cas, -n observe une croissance de la levure améliorée. vitesse superficialle du gaz (cm/a) 10,0 14,9 18,1 21,2 25,0 32,0 rétention du gaz 0,803 0,612 0,637 0,614 0,632 0,610 On note une grande différence de rétention du gaz selon que la vitesse superficielle du gaz est 10,0 cm/s, ou selon que cette vitesse est de 14,9 cm/s. Lorsque la vitesse superficielle du gaz est supérieure à 14,9 cm/s, la rétention de gaz se maintient à un faible v a l e u r. Cette relation est illustrée par la courbe 1 de la figure annexés.Lorsque la vitesse superficielle du gaz est supérieure à 14,9 cm/s, la densité maximale est 0,65, et la densité minimals est 0,25, tandis que lorsque la vitesse superficielle du gaz est de 10 cm/s, la densité maximals est 0,65 et la densité minimale est 0,05 ; il est évident que lorsque la vitesse superficielle du gaz est située entre' plus de 14,9 cm/s et 25,0 cmjs, la variation de densité dans la colonne diminue fortenent. Dans ce dom@ion de vitesses, la circulation de liquide dans la colonne est violente, et l'on n'observe pas de couche de mousse persistante à la surface Ou liquide. Le terme "densité" designe ici la densité du liquide compte tenu de l'air en mouvement, et cette densité est exprimés on g par ml. On introduit un détergent dans l'appareil à fermentation employé dans l'essai 1, et l'on compare la vitesse superficielle du ga et la rétention du gaz. La concentration du détergent est : 1O mg/l de liquide. vitesse superficielle du gaz (cm/s) 7,1 8.1 10,1 5,2 18,2 rétention du gaz 0,508 0,471 0,474 0,413 0,410 vitesse superficielle du gaz (cm/s) 21,2 24,3 28,0 32,0 rétention du gaz 0,377 0,377 0,372 0,370 Lorsque.Ia vitesse superficielle du gaz dépasse 15,2 cm/s, la rétention du gaz est inférieure à environ 0,4, et lorsque la vitesse superficielle du gaz est inférieure à 10,1 cm/s, la rétention du gaz eat d'environ 0,5. Même lorsqu'un utilise un détergent comme substance moussante, ne contenant pas d'organismes on observa une relation analogue e celle observée dans l'essai 4, dans lequel on employait une substance moussante contenant des organismes.Cette relation est décrite par la courbe 2 de la figure annexée. Il est évident d'après les essais précédents que lorsque l'on effectte une culture de levure par circulation d'air dans une colonne de fermentation à bulles avec une vitesse superficielle du gaz située entre plus de 14,9 cm/s et 32 cm/s, la couche de mousse peu abondante formés à la partie supérieure de l'appareil à fermentation est suffisamment agitée pour se mélanger avec le liquide de la partie inférieure de l'appareil, la circulaticn du liquide dans la colonne étant si rapide que les incon vénients qui pourraient résulter de l'adsorptien de la flottation, etc, des cellules de levure n'apparaissent pas; on peut donc prévoir une croissance très satisfaisante de la levure. Les exemples suivants illustrant l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1. On emploie une colonne de fermentation à bulles munie d'une buse annulaire, de diamètre intérieur 19,4 cm, et de hauter 300 cm, et l'on introduit dans cet appareil à fermentation 29 litres d'un milieu d culture préparé en dissolvant 3 g d'urée, 2,5 g de diphosphate de p-tastium, 1 g de sulfate de magnésium cristallin 0,1 g de liqueur de macération de mats et 50 g de dextrcse cristallin par litre de milieu de culture. On ajoute de plus de la levure de boulanger (germes). La hauteur de liquide à ce moment est de 100 en. La concentration en cellules est de 1,05 %, par rapport au poids sec. On effectue la culture avec une vitesse superficielle du gaz de 14,9 cm/s, en insufflant de l'air dans l'appareil en fermentation au moyen de la buse à air consistant en 99 orifices de 2 mm de diamètre, installés à la partie inférieure de la colonne à bulles, et alimentée sous une pression manométrique d'environ 0,1 kg/cm2 Durant la culture, on maintiens la température à 32 C, et le-pH entre 4,0 et 4,2 Au début de la culture, l'épaisseur de liquide est 208 cm, la rétention du gaz est 0,520, et la densité moyanne du liquide dans la coibrlne est 0,480 g/ml. Après 5 h de culture, la concentration en cellules est devenue 1,88 %, par rapport au poids ses.A ce moment, l'épaisseur de. liquide atteint 258 cm, et cn n observe aucune fermation de couche de mousse De plus, la rétention de gaz est 0,613 a la densité moyenne du liquide dans la colonne est 0,387 giml. EXEMPLE 2. On effectue une cùlture de la même manière. que dans l'exemple 1, sauf en ce que l'on fixe la vitesse superficielle du gaz à une valeur supérieure (24,95 cm/s), au moyen d'une augmentation de la quantité d'air insufflée. Aprés 55 mm de fonctionnement, l'épaisseur de la couche liquide atteint 254 cm. La rétention de gaz est de 0,606, ct la densité moyenne du liquide dans la colonne est de 0,394 g/ml. EXEMPLE 3. On effectue une culture de la mEme manière que lors de l'exemple 2, sauf en ce que l'on fixe la vitesse superficielle du gaz e une-valeur inférieure (7 cm/s). en diminuant la quantité d'air insufflé Après 25 mn de fonctionnement, les mousses produites de façon continue débordant au sommat de la colonne, un équilibre étant atteint envirsn 5 mm plus tard La quantité totale de liquide perdu par débordement est de 6,0 kg. L'épaisseur de la couche liquide restant dans la colonne est d'environ 300 cm, la rétention du gaz est de 0,852, et la densité moyenre du liquide dans la c-l:cne est de 0,148 g/ml. EXEMPLE 4. On effectue, dans le méme appareil à fermentation que celui utilisé dans l'exemple 1, une culture de la levure pour fermentation sur pétrole Candida tropicalis TAM 4862. On prépare le milieu de culture de la même façon que dans l'exemple 1, sauf en ce que l'on utilise e la place du dextrose cristallin, de la paraffine normale à raison de 12 g/l de milieu de culture, cette quantité de paraffine étant divisée en 4 doses que l'on utilise en fonction de la croissance des cellules. Au début de la culture, la quantité de milieu de culture liquide est de 29 litres, et ltépaisseur de la couche liquide est 100 cm. Du fait de l'aération par de ltair insufflé au moyen d'une buse installée à la partie inférieure de la colonne, et alimentée scus une pression maximétrique de 0,09 kg/cm2, la vitesse superficielle du gaz étant de 18,9 cm/s, l'épaisseur de la couche liquide atteint 170 cm A ce moment, ia concentration en cellules est de 0,04 %, par rapport au poids sec. Après 24 h de culture, la concentration en cellules atteint 0,786 %, par rapport au poids sat A ce n ment, l'épaisseur de la couche liquide atteint 223 cm. La rétention de gaz est 0,551, et la densité moyenne du liquide est 0,449 g/ml On maintient durant la culture la densité moyenne du milieu de culture liquide entre 0,6 et 0,45 g/ml, et on n'observe aucune formation de couche de mousses. Bien entendu, diverses modifications peuvent etre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui vienment d'être décrite uniquement à titres d'examples nou limitatifs sans sortir du grade de l'invention. R E V E N D I C A T I O N Procédé de culture de micro-organismes carctérisé au ce que, lorsque l'on effectue une culture de micro-organismes au moyen d'une colonne de fermentation à bulles, la vitesse de l'air insufflé est maintenue entre 14 et 32 cm/s, ladite vitesse étant la vitesse superficielle du gaz