FR 2247470 A1 19750509 FR 7336427 A 19731012 La présente invention concerne un perfectionnement à la rdalisation de réactions enzymatiques, et plus particulièrement des réactions en présence d'enzymes fixees sur des supports soli des. Elle comprend un nouveau procéda pour la réalisation de dif férentes opérations enzymatiques, ainsi que des dispositifs utiles pour ce procédé. T'industrie applique, depuis longtemps, différentes dias tases pour la préparation de certaines substances, le plus souvent alimentaires ; dans ces opérations, l'enzyme est en général utili sée en milieu homogène, du moins macroscopiquement ; il en résulte une consommation assez forte d'enzyme, celLe-ci restant dans le produit de la réaction, ce qui dtailleurs n'est pas très heureux pour la pureté du produit obtenu. Pour ces raisons, on a cherché å fixer des enzymes sur des supports solides et à travailler en milieu hét8rogène, de façon à pouvoir séparer le solide porteur de l'enzyme, après la réaction, afin de le réutiliser.Des tenta tives-, dans ce sens, ont tout particulièrement porté sur la présure utilisée à la coagulation du lait, en fromagerie, parce que cette enzyme-devient de moins en moins accessible à l'heure actuellee Des travaux intéressants ont été effectués dans cette voie parM.10 GREEN et G. CRUTCHFIELD (Biochem. Journ. 1969- p. 183-190). Ces auteurs ont essayé la coagulation ù lait en présence de la présure ou de la chymotrypsine fixée sur l'agarose et sur la cellulose. Ils ont appliqué le principe du travail en deux temps s d'abord protéo lyse à une température inférieure à 10oC, ensuite la coagulation à température plus élevée.Cependant, les résultats de ces tentatiyes ont été assez décevants, parce qu'on a constaté que l'enzyme passait en solution dans le lait et, d'autre part, les appareils - en particulier colonnes - chargés de solide renfermant lJenzyme, se bouchaient trop rapidement. La présente invention apporte un perfectionnement pour la rdalisation des opérations exposées ci-dessus, en évitant les lnconvénients-précités. En effet, le nouveau procédé suivant l'invent ion permet d-'obtenir la coagulation d'une quantité de lait beaucoup plus grande, par unité de poids de présure, qu'il n'est possible d'avoir avec la méthode classique où l'enzyme est dissoute directement dans le lait, Un autre avantage important de l'invention est la possi- biiitéxqutelle offre de fabriquer des fromages ne contenant pas de )présure ; on obtient ainsi un produit fromager tout à fait nouveau, intéressant tant par son goOt que par sa meilleure conservation.L' invention s'applique d'ailleurs à bien d'autres enzymes susceptibles d'être fixées sur un support solide. Le procédé et les dispositifs correspondants, suivant l'invention, présentent également l'avantage de ne pas souffrir de colmatages, bouchages, et pertes de matières. Le nouveau procédé suivant l'invention, pour la rdali- sation de réactions enzymatiques, dans-un liquide, en présence d' une enzyme fixée sur un support solide, effectué en deux stades, d'abord h basse température, ensuite à une température plus élevée, est caractérisé en ce que les température et durée du premier stade sont réglées de façon à ce que la réaction enzymatique ne soit pas terminée au cours de ce stade. Autrement dit, lorsque, par exemple, ladite réaction enzymatique consiste en l'hydrolyse de la matière traitée, cette hydrolyse ne doit pas etre complètement achevée au cours du premier stade opératoire, qui a lieu à la température la plus basse. Dans le cas très important de la coagulation du lait par la présure, le premier stade opératoire doit avoir lieu à une température de l'ordre de 04 à 280C et, de préférence, entre 5 et 200C ; le second stade est généralement réalisé entre 304 et 600C, ou mieux entre 35 et 450C ; conformément à ltinvention, la protéo- lyse de la caséine du lait ne doit pas Qtre complètement terminée au moment où l'on passe du premier au second de ces stades ; suivant la température du premier stade, la durée de celui-ci est réglée de telle manière que la protéolyse de la caséine soit seulement partielle, notamment d'environ 15 à 95% et, de préférence, 50 à 80%, tant que le liquide se trouve au contact des particules solides renfermant l'enzyme. C'est donc une caséine incomplètement protéolysée qui est soumise, suivant la présente invention, au chauffage coagulant du second stade opératoire. Lorsque la réaction enzymatique est conduite suivant le nouveau procédé, défini ci-dessus, non seulement aucun colmatage du support-solide de l'enzyme et des appareils ne se produit, mais, de plus, l'activité enzymatique baisse beaucoup plus lentement que dans l'art antérieur. Bien que le-nouveau procédé s'aPplique' aux différents~ complexes d'enzymes fixées sur des supports solides, connus, il donne des résultats particulièrement remarquables, lorsque l'enzyme est fixée sur une cellulose à teneur convenable en lignine, en particulier 5 à 25% de cette dernière, qui fait l'objet de la demande de brevet du même jour, intitulé "Enzyme fixée sur support solide ". A titre d'exemple, on peut utiliser des supports de cellulose traitee par un agent de chloration en présence de pyridine, comme décrit dans les exemples de la demande de brevet n 72 40492 du 15 Novembre 1972 de la demanderesse. Le procédé suivant l'invention peut être mis en oeuvre en discontinu, en semi-continu ou en continu, ce dernier mode étant particulièrement intéressant au point de vue industriel0 Le principe des dispositifs suivant l'invention, pour le travail en semi-continu ou continu, est représenté sur les dessins annexés. Fig. 1 est un schéma d'une installation pour opérations se mi- continue s. Fig. 2 représente, schématiquement, une installation permettant des réactions enzymatiques continues. Fig. 3 est une variante constituée par un réacteur servant en même temps de décanteur. Sur la fig. 1, le bac 1 sert au stockage de la matière traitée, en particulier du lait ; il est muni d'un agitateur et de moyens de refroidissement 11 pour ramener son contenu à la température voulue, suffisamment basse, correspondant au premier s-tade de ltopérationO~Le fond du bac 1 communique avec le réacteur 2 contenant ltenzyme supportée par un solide C'et dans ce réacteur 2, muni d'un agitateur approprié, que lton fait agir l'enzyme sur du produit refroidi, venu du bac 1. Eventuellement, des moyens de refroidissement supplémentaires sont encore prévus dans le réacteur. Après un temps de contact bien déterminé, dans le réacteur 2, la suspension de l'enzyme supportée, dans le liquide à traiter, est transférée dans le système de séparation 3 qui peut etre constitué par un ou plusieurs décanteurs, centrifugeurs ou/et filtres. Après la séparation du solide dans le système 3, le solide contenant l'enzyme est recyclé dans le réacteur 2, pour y titre mélangé avec une nouvelle portion de liquide venant de 1. La phase liquide, séparée en 3, est envoyée dans le récipient 4 pour y être réchauffée à la temperature du second stade opératoire et maintenue à cette température pendant une durée déter minee0 Dans le cas du lait, 4 est un appareil de coagulation, d'où le coagulum est, par la suite, retiré à la manière connue et séparé du sérum. L'appareil de la fig. 1 peut éventuellement travailler en continu, le liquide, partiellement transformé par l'enzyme, étant continuellement soutiré et introduit dans le séparateur 3, avec un débit bien déterminé, tandis que l'enzyme supportée est recyclée en continu dans le réacteur 2 par la conduite 5. Le schéma de la fig. 2 montre une installation où un bac d'alimentation 1, du méme type que celui de la fig.1, est relié par l'intermédiaire d'une pompe doseuse 6 au bas d'une colonne 7 renfermant un garnissage d'enzyme supportée par un solide, formant un lit fixe ; le liquide à traiter circule de bas en haut de la colonne 7 pour être transféré, par une canalisation 9, dans un récipient 8 similaire à celui qui est désigne par 4 à la fig. 1 ; dans le cas du lait, 8 est un appareil de coagulation correspondant au second stade opératoire, à température plus élevée, alors que la colonne 7 remplace le réacteur 2 et sert au premier stade réactionnel, à plus basse température. Sur la canalisation 9, on a prévu une dérivation de prise d'échantillon, permettant de surveiller le degré de réaction atteint dans la colonne 7, notamment le degré de protéolyse du liquide entrant dans le récipient 8. Le dispositif de la fig. 2 peut éventuellement être agencé en vue d'une circulation du liquide du haut en bas, dans la colonne 7e La variante de la fig. 3 illustre un appareil particulier, pour opérations continues. Elle représente seulement le réacteur et les moyens de séparation de l'enzyme supportée, c'est-à-dire un dispositif remplaçant les organes 2, 3 et 5 de la fig.1. Dans un récipient cylindrique 12, plonge coaxialement un cylindre 13 ouvert en haut et en bas.Le compartiment formé par l'intérieur du cylindre 13 reçoit le liquide à traiter par une conduite 14 ; ce liquide est agité au moyen de l'agitateur 15, présentant avantageusement la forme d'une vis d'Archimède ; cette vis remet continuellement en suspension, dans du liquide arrivant par 14, les particules d' enzymes supportées, qui tendent à se déposer dans la région 17, au fond de l'appareil.A l'extérieur du cylindre 13, dans le réacteur 12, le liquide se décante et monte vers la sortie 16, au fur et à mesure que le liquide frais arrive par 14 : le liquide quittant le réacteur en 16 est supposé avoir séjourné suffisamment longtemps au contact des particules (représentées sous la forme de points) d' enzyme supportée par un solide, dans la partie inférieure 17 du ré cipient 12. Cette -durée de séjour est, bien entendu, réglée par le débit en 14, en fonction de la température adoptée. Le liquide partiellement transformé, s'écoulant en 16, passe dans un appareil de second stade, comme 4 de la figO1 ou 8 de la fig. 2.Dans cette variante, le liquide s'écoulant en 16 peut avoir atteint la transformation complète, notamment hydrolyse ou protéolyse, mais, pour que le principe de l'invention soit respecté J1 ne faut cependant pas que le degré de transformation de 100%/atteint dans le réacteur 12 à un niveau où il y a encore des particules solides d'en- zyme. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs qui suivent. EXEMPLE 1 En appliquant un appareil du type de la fig0 1, à l'échelle de laboratoire, on mettait, dans le réacteur 2, 2,5 l de lait maintenu à 209C, et on effectuait une série de 12 opérations successives, discontinues, de la façon suivante, Dans la première charge de 2,5 1 de lait, on a ajouté 16g de cellulose activée par du SOCS2 en présence de pyridine, comme indiqué dans l'exemple I de la demande de brevet 72 40492, cette cellulose ayant fixé 0,12 ml de présure à la suite d'une opération suivant ltexemple VI de la demande précitée. auprès 40 minutes d'agitation du lait avec les -particules de cellulose-présure, la protéolyse de la caséine a atteint 75% de sa valeur d'équilibre. On a alors séparé le lait de la cellulose par décantation suivie d'essorage ; la cellulose était lavée à 11 eau sur l'essoreuse, puis remise en suspension dans une nouvelle portion de 2,5 1 de lait frais, et cette suspension était de nouveau maintenue à X)OC sous agitation, pendant 40 minutes, dans le réacteur 2, comme dans la première opération. Cette opération ayant été répétée 12 fois, on a chaque fois déterminé l'activité de la cellulose-présure réutilisée, en pour cent de l'activité initiale, le lait séparé étant chaque fois coagulé rapidement à 60ex. On a alors constaté que, pendant les 8 premières opérations successives, l'activité de la présure supportée a baissé progressivement de 100% à 86% ; la chute de l'activité a été plus sensible pour les opérations de la 9ème à la 12ème, l'activité finale étant de 60%. Si l'on ne prend en considération que les premières 8 opérations, chacune avec une protéolyse de-75% seulement, mais une coagulation complète, on constate que 20 1 de lait ont pu être traités en 5h20 mn (8 fois 40 minutes) avec les mimes 16 g de cellulose contenant 0,12 ml de présure. Or, il s'agit d'une présure industrielle qui, en coagulation classique, en milieu homogène, permet de traiter 10 000 1 de lait par litre de présure en 40 minutes à 35cl, c' est-à-dire qui aurait conduit à la coagulation de 0,8 1 de lait. On voit que le procédé, suivant l'invention, a donné un rendement d'environ 17 fois plus fort (20 1 au lieu de 1,2 1) que ne donnerait la méthode classique. EXEMPLE 2 La coagulation du lait en 2 stades a été effectuée avec l'appareil de la fig. 3 remplaçant le système 2,3,5 de la fig.1, l'opération étant conduite en continu. Le réacteur 12 contenait 8 g de cellulose de la rafle de maIs sur laquelle était fixé 0,04 g de présure industrielle (cette cellulose-présure a été préparée comme décrit dans la demande de ce jour intitulée "Enzyme fixée sur support solide".). On a fait passer dans l'appareil 0,63 1 de lait par heure (soit 0,42 1 par 40 minutes) à 15on. L'opération s'effectuait, comme expliqué plus haut, à propos de la fig.3. La région 17 des particules de cellulose s'étendait sur environ le tiers de la hauteur du bac 12 ; à cet endroit, le degré de protéolyse de la caséine atteignait environ 80%, tandis que le lait traité quittait le bac 12, au niveau 16, avec un degré de protéolyse très voisin de 100%. Le lait s'écoulant ainsi était très rapidement coagulé à 37 C dans le récipient 4 (voir fig.1). On a ainsi traité 35 1 de-lait en 55 h 1/2 avec les mimes 8 g de cellulose renfermant 0,04Xg de présure. Or, par la méthode classique, les 0,04 g de présure auraient été nécessaires pour coaguler 0,4 1 de lait ; comme, suivant l'invention, on a pu avec cette méme quantité d'enzyme coaguler 35 1, il en résulte que le procédé de l'invention est fois plus efficace que l'emploi de la présure libre. EXEMPLE 3 Dans un appareil de laboratoire, suivant la fig.2, on a utilisé une colonne 7 de 57 cm de haut, de 2,5 cm de diamètre, présentant un volume total de 280 m10 Cette colonne contenait 232 g de cellulose de la rafle de maTs, sur laquelle on avait fixé de la présure, comme dans l'exemple 2. Le volume utile de cette cellulose était de 232 g. La température,dans la colonne 7, étant réglée à 50C, on y faisait passer du lait avec un débit de 2400 ml/h. La coagulation du lait, ainsi prétraité à la présure sur cellulose, était effectuée dans le récipient 8 à 40oC. On a ainsi pu coaguler 204 litres de lait en 85 heures, avec la meme charge de cellulose-présure. La durée moyenne de coagulation, à la sortie de l'appareil, était de 40 minutes. Au cours d'essais similaires, avec des vitesses de passage différentes à travers la colonne 7, ce qui veut dire des taux de protéolyse à froid différents, on a constaté que les durées de coagulation en 8 variaient comme suit : taux de protéolyse 20% - temps de coagulation 60 mn n " 30% - n n 40 B n n 40% - n n 30 n n " 60% - n n 15 at n n 80% - n n 6 '1 Lorsque le complexe cellulose-présure a servi pendant un certain temps, il est bon de le régénérer par lavage avec une solution aqueuse saline, notamment de NaCl1 REVENDICATIONS 1. Procédé pour la réalisation de réactions enzymatiques, en mi lieu liquide, avec de ltenzyme fixée sur un support solide, en deux stades successifs, dont le premier à température relative ment basse, caractérisé en ce que le premier stade est conduit de telle façon que la réaction ne soit pas complète tant que le liquide est au contact de l'enzyme supportée par le solide. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction enzymatique, au cours du premier stade, n'atteint que 15 à 95% de l'équilibre et de préférence de 50 à 80% de celui ci. 3.. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la réaction enzymatique est une protéolyse et en particulier celle de la caséine du lait. 4. Procédé suivant une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le premier stade de protéolyse est effectué entre 0 et 280C et, de préférence, entre 5a et 209C, tandis que le second stade, de coagulation, a lieu entre 300 et 600C, de préférence entre 350 et 45CC. 5. Procédé suivant une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ltenzyme est employée sous sa forme fixée sur un support cellulosique préalablement traité au moyen d'un agent chlorant, en présence de pyridine. 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le solide sur lequel est fixée l'enzyme est une cellulose renfer mant 5 à 25% de lignine et en particulier la cellulose de la rafle du maTs. 7. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'une suspension d'enzyme fixée sur le solide, dans le liquide à traiter, est maintenue sous agitation, pendant le temps nécessaire à la réalisation du premier stade, sans dépasser 95% de transformation, et que le solide est ensuite séparé du liqui de et remis en suspension dans une portion fraiche de celui-ci. 80 Procédé suivant une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le liquide à traiter est, pendant le premier stade, passé à travers un lit fixe dtun solide sur lequel a été fixée ltenzyme. 90 Dispositif pour la réalisation du procédé suivant une des reven dications 1 à 7, caractérisé en ce qutil comprend, en combinai- son, un bac de stockage muni de moyens d'agitation et de refroi dissement, reliés à un réacteur pourvu de moyens d'agitation, la sortie de ce réacteur étant raccordée à un système de sé paration, en particulier décanteurs, centrifugeurs ou/et fil tres, dont l'espace de la phase liquide communique avec un ré cipient destiné à la réalisation du deuxième stade de l'opéra tion, tandis que 11 espace de la phase solide dudit système est relié, par des moyens de recyclage, au réacteur. 104 Dispositif pour la réalisation du procédé suivant la revendi- cation 8 > caractérisé en ce qutil comprend, en combinaison, un bac de stockage muni de moyens d'agitation et de refroidisse ment, le fond de ce bac communiquant par l'intermédiaire d'une pompe doseuse avec le bas d'une colonne à garnissage à lit fixe, le haut de la colonne étant relié à un récipient destiné à la réalisation du second stade de l'opération0 t1. Dispositif pour la réalisation du procédé suivant une des re vendications 1 à 8, de manière continue, caractérisé en ce qu'il est constitué par un réacteur jouant, en mtme temps, le rôle d'un décanteur. 12.Dispositif suivant la revendication 11, caractérisé en ce que le réacteur-décanteur est constitué par un récipient cylindri que, dans lequel-plonge, coaxialement un cylindre ouvert en haut et en bas, un agitateur et une canalisation d'arrivée de -liquide à traiter étant aménagés à l'intérieur de ce cylindre, tandis qu'unie tubulure de sortie de liquide se trouve dans la partie supériéure de la paroi latérale du récipient cylindri que. 13. Nouveau fromage, obtenu par le procédé suivant une des-revendi cations 1 à 92 caractérisé en ce qu'il est exempt de présure.