FR 2253828 A1 19750704 FR 7344286 A 19731211 La présente invention se rapporte à un procédé économique permettant la croissance de tout organisme monocellulaire dont on veut utiliser le protoplasme soit comme aliment, soit comme source de produits -imiques, dans un milieu nutritif aqueux en présence d'un hydrocarbure de pétrole et d'un gaz contenant de ltoxygène. Cette invention concerne un procédé de biosynthèse de protéines par fermentation, utilisant un système original de cultures multiétagées, mul ticourants;; On sait déjà cultiver des microorganismes sur substrats d'hydrates de carbone, tels que les mélasses, les hydrolysats de bois et le lactosérum des fromageries mais les besoins en oxygène des microorganismes pour croître aux dépens d'un substrat chimiquement réduit comme un hydrocarbure sont bien plus élevés que dans les cas connus précédemment cités. La culture de microorganismes en présence de composés hydrocarburés d'origine pétrolière n1 est pas non plus nouvelle. Un tel procédé a été décrit dans de nombreux travaux de chercheurs notamment par JUST, SCHNABEL et ULLMANN dans leur article intitulé "Culture submergée de levure et bactéries sur hydrocarbures" publié dans "Die Brauerei - Wissenschaftliche Beilagel', numéro 8, Août 1951. Ces trois chercheurs et bien d'autres ont fait rostre, avec succès, des levures et bactéries sur différents hydrocarbures en présence de milieux aqueux nutritifs et d'oxygènes Après de nombreux essais de culture continue, il est apparu qu'un procédé de production de biomasse devait au minimum assurer les fonctions suivantes 1/ la fonction de maintenance permettant a la souche de garder ses propriétés optimales et éventuellement de les améliorer, 2/ la fonction de production correspondant à un développement de la biomasse, 3/ la fonction de finition permettant d'obtenir les spécifications du point de vue substrat résiduel dans la biomasse et des améliorations sur le produit. Dans-les fermentations classiques ces trois fonctions sont réalisées dans un seul fermenteur ou parfois dans deux fermenteurs, le second correspondant å la finition. Ainsi, la demanderesse a décrit dans le brevet français nO 1 604 051 un procédé industriel perfectionné de culture de microorganismes consistant à mettre en contact, dans une première étape- (étape de croissance ou de produit tion), en présence d'un gaz contenant de l'oxygène molécul-atr#rune souche de microorganismes avec une charge hydrocarbonée liquide renfeiiant au moins 70 t:: en poids d'hydrocarbures paraffiniques linéaires et avec un-milieu aqueux nutritif renfermant au moins (a) une source d'azote et une source de phosphore assimilables, (b) des oligoéléments, (c) éventuellement des facteurs de croissance et (d) des éléments minéraux essentiels, à -récupérer les microorganismes ainsi cultivés et contenant encore une proportion mineure d'hydrocarbures, puis, dans une deuxième étape appelée maturation ou finition, à mettre en contact les microorganismes ainsi récupérés avec-un milieu aqueux nutritif incomplet. (Le milieu aqueux non nutritif ou incomplet était défini comme un milieu nutritif dépourvu de certains éléments indispensables au développement des microorganismes, par exemple des ions dont la nature dépendait de la souche de microorganismes cultivés).Selon d'autres procédés, l'étape de fìnition est faite en présence d'un milieu nutritif complet. Ces systèmes de culture en deux étapes donnent satisfaction dans uncertain nombre de cas, mais présentent néanmoins les défauts suivants Lorsqu'un contaminant (par exemple bactérie ou levure) néfaste pour la culture se présente dans le premier étage, la levure industrielle n'a pas d'autres recours que son taux de croissance pour échapper à l'envahissement; cela s'avère souvent insuffisant. Dans ce même étage, on est obligé de travailler dans des conditions physico-chimiques classiques, pour le pH qui doit permettre à la fois un bon taux de croissance et une bonne résistance à la contamination. En effet, tout dépassement de certaines conditions conduit à une altération des levures. Cette altération est souvent- irréversible,i et l'on est donc obligé d'assurer un nouveau démarrage de la culture. Ce système peut être-catastrophique au niveau industriel, où l'on ne peut démarrer une culture comme au laboratoire. Si l'on tient à' travailler en continu, on doit se résoudre à utiliser des conditions moins favorables à la production mais plus favorables aux cultures de longuesdurées. Il est facile de montrer qu'il est possible d'utiliser en culture, discontinue des conditions de milieu particulières, qu'il est ensuite impossibled'appliquer à-la culture continue en raison de l'influence du nombre-de générations infiniment supérieur dans ce dernier cas. Cet inconvénient qui peut affecter les performances d'ùne souche està mettre au passif de la culture continue. Dans un ordre d'idées sensiblement différent bien que résultant dune même cause, il est connu qu'une culture fonctionnant dans des conditions physi co-chimiques stables et -dans un milieu de composition constante peut subir une évolution conduisant finalement à un lavage (c'est-à-dire destruction de la souche) au bout d'un temps plus ou moins long. Cette évolution peut être irré versible. Il en résulte qu'il n'est pas d'autre solution que d'arrêter la cul turc et de la démarrer à nouveau. Les arrêts, s'ils deviennent fréquents, affec teront l'économie du procédé. La présente invention décrit un système de culture qui permet depallier à la plupart de ces inconvénients, et qui en plus a permis de découvrir des ap plications encore plus inattendues. Les auteurs de la présente invention ont découvert que la dissociation des fonctions essentielles (fonctions de maintenance, de production et de fini tion) en trois appareils différents apportait un certain nombre d'avantages importants. En particulier dans l'étape de production, on peut travailler- à une température et un pH plus élevés qu'à l'habitude, pendant de longues durées, sans affecter les performances de la souche. Le premier réacteur assure la fonction de maintenance; son rôle est de maintenir la souche dans les meilleures conditions possibles, même si ces-con dit ions sont légèrement plus coûteuses que celles du réacteur de production, et de fournir au réacteur de production le microorganisme dans des conditions idéales de culture. Du fait de sa taille faible, la répercussion sur le fonc tionnement global est peu importante. Le deuxième réacteur assure la fonction de production; les conditions dans ce fermenteur seront les plus économiques possibles du point de vue des transferts d'oxygène et d'hydrocarbure . Le temps de séjour étant court, les conditions de milieu seront telles que la levure n'y pourrait pas survivre de 'nombreuses générations sans apport de levure fraîche provenant du premier fer menteur. il diffère maintenant partiellement du réacteur de production classi.- que puisqu'on ajoute constamment de la levure fraîche; on travaille à tempéra turc plus élevée que dans la réaction de maintenance. Le p11 peut également être ,plus élevé. Le troisième fermenteur assure la finition; son rôle est d'épuiser le substrat-en améliorant la qualité du produit. Ajoutons que le premier et le second réacteurs peuvent être séparés par - des fermenteurs dont le rôle est seulement d'augmenter la capacité, si le rap port du volume du réacteur principal de production (Vp) est très supérieur à celui du réacteur de maintenance (Vm). Le rapport des volumes entre réacteur de maintenance et réacteur de production est généralement compris entre 1 et 1/20 et de préférence entre 1/4 et 1/10. Le rapport de volume du fermenteur d'augmentation de capacité (Vc) (ou du dernier des fermenteurs traversé par la charge s'il y en a plusieurs) au réacteur de production (Vp) est compris en général entre 1/20 et 1, de préférence entre 1/10- et 1/2. L'ensemble de ces fermenteurs- en série forme une culture continue multi-étagée, multicourants. Les auteurs de l'invention ont en effet découvert que si deux réac teurs placés en série et fonctionnant en continu, le premier assurant la pro duction de la biomasse, et le second de volume plus faible permettant la fini tion du produit, ntapportent pas une marge beaucoup plus- grande de fonctionne ment qu'une culture monoétagée, une série de trois réacteurs au moins, placés en série de façon que le dernier réacteur soit celui de finition, le premier soit celui de maintenance, les autres étant ceux de production, permettait une très grande fourchette de possibilités, et en particulier il a été surprenant de constater qu'il était alors possible de résoudre tous les inconvénients -évoqués ci-dessus.-L'agencement selon l'invention est illustré par la figure 1. Ces résultats selon l'invention sont obtenus en opérant suivant les étapes précisées ci-dessous, c'est-à-dire 1/ la mise en contact dans le réacteur de maintenance d'une souche de microorganismes et d'un gaz contenant de l'oxygène moléculaire avec une charge hydrocarbonée renfermant de préférence, enpoids, au moins 70 % et plus parti culièrement au moins 85 % de paraffines linéaires, et avec un milieu aqueux nu- nutritif; le- contact est d'une durée variable, par exemple de l'ordre de quel quels heures, de la semaine, du mois ou de l'année. Le milieu aqueux renfermera avantageusement I a) une source d'azote et une sourie de phosphore assimiIables, b) des oligoéléments, c) éventuellement des facteurs de croissance i--d)- des éléments minéraux essentiels additionnels. Le gaz renfermant de l'oxygène moléculaire est utilisé par exemple sous une pression absolue comprise entre 0,8 et 20 atmosphères. 2/ la mise en contact, dans au moins un réacteur de production, de llef- fluent du réacteur de maintenance et d'un gaz contenant de l'oxygène moléculai re avec une charge hydrocarbonée renfermant, en générai?, en poids, au moins 70 % et de préférence au moines 85 7. de paraffines linéaires, et avec un milieu aqueux nutritif; on assure un temps de séjour (le temps de séjour est l'inver se du taux de dilution, lequel est le-rapport, pour une zone de fermentation donnée : Débit d'introduction, ou de soutirage, du milieu de fermentation expri mé en volume par heure/volume de réacteur) dans le ou les réacteurs de produc tion tel que l'on effectue-un nombre limité de générations.En général, le temps de séjour est compris entre 1 et 10 heures, voire entre 1 heure 30 et 5 heures. De préférence, le nombre des réacteurs de production est au moins égal à I et au plus égal à 5. A ce stade, on réalise éventuellement la séparation dlune phase enri chie en microorganismes contenant des hydrocarbures adsorbés, de la majeure partie, au moins, du milieu nutritif aqueux et des hydrocarbures non consommés lorsque ceux-ci sont présents sous forme d'une-phase séparée; cette séparation peut etre réalisée selon tout procédé connu, par exemple par- décantation, fil tration et/ou centrifugation; les microorganismes obtenus sont envoyés dans le réacteur de finition. On peut d'ailleurs envoyer dans le réacteur de fini tion, directement, l'effluent du réacteur de production. 3/ La mise en contact dans un réacteur de finition des microorganismes obtenus précédemment avec un gaz contenant de ltoxygène moléculaire. On assure dans ce fermenteur un temps de séjour de, par exemple, une demi-heure à 3 heu res pour obtenir un épuisement satisfaisant de l'hydrocarbure résiduel. On n'a Joute pas ici de charge fraîche hydrocarbonée sauf éventuellement en quantité réduite pour éliminer les mousses. Ultérieurement, on procède à la séparation des microorganismes ainsi obtenus par tout moyen connu. Avantageusement, la première étape est effectuée en discontinu et la deuxième en continu. D'une maniere plus précise les conditions opératoires sont de préfé encre les suivantes 1/ Dans la première étape, selon le microorganisme utilisé, la température est maintenue de préférence entre 25 et 450 C. et plus particulièrement entre 30 et 400 C, le pH est inférieur à 7 et maintenu de préférence entre 2,5 et 5. Cette dernière condition est réalisée, par exemple, par des injections continues ou périodiques de solutions alcalines, par exemple d'ammoniaque, puisque le métabolisme tend à acidifier la culture. La coupe hydrocarbonée utilisée comme charge peut être obtenue par déparaffinage d'une coupe hydrocarbonée telle qu'un gas-oil, un fuel-oil ou une huile lubrifiante, c'est-à-dire d'hydrocarbures renfermant au moins 9 atomes de carbone par molécule. + La source d'azote peut se présenter sous forme d'ions ammonium NHq, d'ions nitrate N03 ou sous forme d'urée, la source de phosphore sous forme d'ions phosphates; les oligoéléments, c'est-à-dire des ions de métaux et-mé- talloîdes nécessaires en très faible quantité, par exemple le fer et le cuivre, se trouvent à l'état de traces; les facteurs de croissance sont des composés du type vitamines B obtenues par exemple sous forme d'extraits de levures; les éléments minéraux essentiels autres que les précédents se présentent habituellement sous la forme d'ions; ces éléments minéraux essentiels dépendent de la souche de microorganismes cultivés. Les divers éléments du milieu aqueux nutritif sont bien connus des spécialistes et l'on trouvera de nombreux exemples de milieux aqueux nutritifs dans la littérature et les brevets antérieurs. I1 est facile de vérifier, par un essai préalable simple de culture, si ces milieux sont parfaitement adaptés à la culture de tel ou tel microorganisme. Par exemple, le milieu nutritif pourra contenir, comme autres éléments minéraux essentiels, du potassium, du soufre, par exemple sous forme d'ions sulfates, et du magnésium, et aussi du sodium, du calcium et des ions chlorure. I1 est possible, dans cette première étape, de ne pas ajouter de souche fraîche, dans la zone de maintenance, après l'addition de souche initiale. 2/ Dans la deuxième étape, les microorganismes se développent, ctest-à-dire qu'ils croissent et se multiplient à un rythme avantageusement contrôlé par la quantité d'hydrocarbures paraffiniques linéaires apportés par la charge. Les conditions expérimentales sont sensiblement les mêmes qu'en première étape mais la température est plus élevée de 2 à 60 C..et le pH peut être plus -élevé environ de + 0,1 à + 3. On peut également se permettre de limiter les quantités de sels utilisés et en particulier celles des sels les plus croûteux, le phosphore notamment, à cause de la limitation voulue en acides nucléiques. Pour la mise en oeuvre de cette deuxième étape, on peut utiliser tout appareil facilitant le contact desdites phases, par exemple un appareil tel que décrit dans le brevet français 1 529 536 ou, de préférence, dans le brevet français 1 603 547. 3/ L'étape de finition faisant l'objet de la quatrième étape peut être mise en oeuvre dans un appareil identique ou différent de celui utilisé pour la deuxième étape, l'objectif étant permettre en contact les microorganismes provenant des étapes précédentes avec un gaz contenant de l'oxygène moléculairemet un milieu aqueux nutritif. On précisera ici que par microorganismes utilisables selon l'invention, on entend les levures, les bactéries et lesmoisissures ou leurs mélanges. A titre d'exemples non limitatifs de ces trois catégories de microorganismes, on citera a/ Parmi les levures - La famille des Endomycetaceae et plus particulièrement la sous-famille des Saccharomycetoideae à laquelle appartiennent les genresPichia, Hansenula, Debaryomyces, la sous-famille des Lipomycetoideae et notamment le genre Lipomyces. - La famille des Cryptococcaceae, plus particulièrement la sous-famille des Rhodotoruloideae dont le genre Rhodotorula, la sous-familie des Cryptococcoideae dont les genres Torulopsis et Candida. On citera plus particulièrement les genres Candida lypolytica, Tropical-is et Guillermondii. b/ Parmi les bactéries - L'ordre des Pseudomonadales, notamment la famille Pseudomonadaceae dont le genre Pseudomonas et parmi celui-ci les espèces - Pseudomonas fluorescens, - Pseudomonas ovalis, - Pseudomonas cruciviae. - L'ordre des Eubacteriales, dont la famille Achromobacteraceae et notamment le genre Achromobacter, le genre Flavobacterium dont les es pèches - Flavobacterium aquatile, - Flavobacterium lutescens - Flavobacterium marinum, la famille des Micrococcaceae notamment-les espèces Micrococcus luteus et Micro coccus flavus, la famille des Brevibacteriaceae dont le genre Brevibacterium. - - L'ordre des Actinomycetales dont les familles Mycobacteriaceae et Actinomycetaceae. c/ Parmi les moisissures - La famille des Mucoracées dont le genre Rhizopus, - La'famille des Aspergillales dont les genres Aspergillus et Penicill ium. En général1 sur 100 volumes d'hydrocarbure frais admis dans le système selon l'invention, 5 à 30 volumes sont envoyés dans le stade de maintenance, 60 à 95 volumes sont injectés directement dans le stade de production; O à 10 volumes environ sont envoyés directement dans le stade de finition pour éventuellement supprimer les mousses qui se forment. La figure jointe à la présente demande iLlustre l'enchaînement des opérations telles que précisées précédemment. Le réacteur de maintenance 6 est alimenté par un gaz contenant de l'oxy- gène moléculaire (ligne 4), par un milieu aqueux nutritif (ligne 5) et par la charge hydrocarbonée (lignes 1 et 2). L'effluent du réacteur de maintenance est envoyé par la ligne 7 dans le-réacteur de production 8, alimenté en gaz contenant de l'oxygène (ligne 9), en milieu aqueux nutritif (ligne 10) et en charge hydrocarbonée (lignes 1 et 3). I1 peut y avoir plusieurs réacteurs du type 8. Le rapport en poids de la charge hydrocarbonée arrivant par la conduit te -2 dans le réacteur 6 à la charge hydrocarbonée arrivant par la conduite 3 dans le réacteur 8 est généralement compris entre environ 1/2 et 1/20.L'efflu en du réacteur 8 est injecté par la ligne 11 dans le réacteur de finition 12, alimenté par la ligne 13 en gaz contenant de l'oxygène (éventuellement entre les réacteurs 8-et 12 on peut réaliser une séparation éventuelle d'une phase enrichie en microorganismes de la majeure partie du milieu nutritif aqueux et des hydrocarbures non consommés). Par la ligne 14, on soutire l'effluent, Le milieu aqueux nutritif a été introduit par la conduite 16 et éventuellement de faibles quantités d'hydrocarbure par la ligne 15. L'originalité de cette invention découle donc de l'effet surprenant de l'adjonction d'un réacteur de maintenance, avec en particulier aussi élimination totale des possibilités de contamination. Ce phénomène est du essen- tiellement au fait que l'adjonction en continu de la levure fraîche dans le réacteur de production permettait une augmentation de taux de croissance appa-. rent conduisant a l'elimination systématique de tout contaminant. D'autre part, un autre avantage de ce système réside dans le fait que dans le réacteur de production, "l'histoire" (son évolution) du microorganisme n'est plus un élément déterminant. En effet, le temps de séjour d'une levure arrivant dans ce fermenteur est de courte durée (quelques générations); de ce fait, il est possible de lui appliquer des conditions physico-chimiques de culture impossibles à appliquer dans un fermenteur de production classique. Les auteurs ont été surpris de constater que l'on pouvait en particulier cultiver à-des températures très élevées (supérieures à l'optimum) ou encore à des pH et rH, impossibles à utiliser normalement. I1 en résulte un gain sur le max (donc sur le rendement), et une économie sur la réfrigération. En effet comme on peut opérer à une température supérieure à l'optimum, il n1 est plus besoin de refroidir le réacteur avec la même intensité que dans les procédés extérieurs où il fallait maintenir le réacteur à une température moins élevée; d'où une économie en eau, économie capitale pour les pays généralement pauvres en eau où sont appelés à fonctionner de tels procédés selon l1inven- tion (Pays du Moyen Orient, Iran par exemple, etc...) Par exemple, il est surprenant de trouver qu'il est possible de travailler à des températures de l'or- dre de 5 C. supérieures à la température optimum. Un autre avantage de ce procédé, et non des moindres est la possibilité de fonctionner dans le réacteur de production dans des conditions de milieu très particulières sans affecter la physiologie du microorganisme. En effet, compte tenu de l'appoint de levure fraîche, on peut cultiver dans le fermenteur de production sans un grand nombre d'éléments indispensables à la croissance du fait du faible nombre de générations qui s'y effectuent. Il est étonnant de constater par exemple que le fer, pourtant indispensable àla croissance (on le mettra dans le réacteur de maintenance) pourra être exclu du milieu du réacteur de production sans perte de rendement. I1 en résulte une amélioration de la qualité nutritionnelle du produit. En outre, ne pas mettre de fer dans l'étape de production permet d'obtenir des microorganismes pauvres en fer > ce qui est important pour certaines applications spécifiques. Ainsi les veaux de boucherie (viande blanche) doivent être alimentés par de la nourriture renfermant peu de fer. Ils pourront donc être nourris avec des levures préparées selon la méthode de l'invention. On peut aussi réduire les teneurs en phosphore dans le réacteur de production. Cet élément indispensable à la croissance coûte cher. L'utilisation du système prévu consiste-à enrichir en phosphore la levure dans l'étape de maintenance. Elle sera alors capable avec un appoint beaucoup plus faible de pousser sans perte de rendement dans le réacteur de production, ce qui permettra une économie de phosphore; Mais une deuxième conséquence a été observée la baisse du taux d'acides nucléiques. En effet, en présence d'un faible taux de phosphore, les protéines sont synthétisées normalement pendant quelques générations mais les acides nucléiques dans une moindre mesure; de préférence on utilise un taux de phosphore voisin de la moitié de ia stoechiométrie dans la réaction de production.On considère généralement que la concentration stoechiométrique en phosphore dans une levure, est égale environ à 2,5 X en poids de levure. On observe des résultats analogues en réduisant,dans le réacteur de production, la teneur des facteurs de croissance dont le prix peut être limitatif d'un procédé. Ce système permet de résoudre cette gifficulté. I1 s'agit par exemple d'extrait de levure, et de vitamines : thiamine, biotine, acide panthoténique, etc... Enfin, une autre application extrêmement importande de ce système de culture est le gain énorme de fiabilité du procédé. En effet, on a pu observer avec surprise qu'un fermenteur de production complété par un réacteur de maintenance présentait une fiabilité totale grâce aux possibilités de changements de fermenteur aussi fréquents qu'il est nécessaire. On a pu observer en effet, que le problème de l'évolution de la culture ne se posait plus. Les auteurs ont maintenu des cultures pendant plusieurs années, avec une fiabilité totale. Dans une installation de laboratoire, pilote ou industrielle, il est avantageux d'opérer avec un rapport de volume du réacteur de production au réacteur de finition compris en général entre 1 et 10, et plus précisément entre 2 et 3. EXEMPLE I : (exemple comparatif) La charge hydrocarbonée est une coupe de n-paraffines (C13- C18 ) de composition suivante (en poids) C12 0,2 C13 3,20 % Cl-4 25,60 % C15 30,60 % cl6 24,80 % C17 14,30 % Cl8 1,30 % La charge renferme moins de 2 70 en poids dtisoparaffines et de naphtènes et moins de 100 ppm. d'hydrocarbures aromatiques. Une culture continue est effectuée dans un système à deux étages (production et finition). Une souche de Candida Tropicalis (I.F.P. -114) est incubée pendant 24 heures dans une fiole de Fernbach contenant du milieu aqueux nutritif comportant 2 % en poids de la coupe de n-paraffines C13 - C18. La composition pondérale du milieu aqueux nutritif est la suivante phosphate acide d'ammonium 2,9 g sulfate de magnésium 0,9 g chlorure de potassium 1,32 g extrait de levure (facteur de 0,1 g croissance) eau de source (contenant des 300 g oligoéléments) eau distillée : complément à 1000 g. (soit environ 700 g). L'inoculum (200 cc) sert à ensemencer un réacteur contenant 5 litres de milieu aqueux nutritif. Ce réacteur, dit de produetion, est agité et -aéré énergiquement et permet la régulation du pH à 3,5 et de la température à 35 - C. Après vingt quatre heures de culture, on démarre le fonctionnement continu par injection de milieu frais et d'hydrocarbure définis ci-dessus (1,40 1/heure de milieu frais et 12,5 g/heure d'hydrocarbure) et soutirage de l'effluent de façon que le volume reste constant. Lorsque la culture est stabilisée au temps de séjour choisi, soit 3,5 heures, on injecte l4effluent- dans un deuxième fermenteur dit de finition d'un volume utile de 2 litres avec un temps de séjour de 1,4 heures, le pu étant 3,5 et la température 35" C. On n'envoile sensiblement pas d'hydrocarbure frais, sauf si nécessaire pour éliminer les mousses. -l On utilise un milieu contenant 0,8 mgl de fer dans le stade de production. Après finition lavage sans solvants et séchage, le taux de fer de levures est de 280 ppm, le rendement de 105 7. , exprimé en kg de levure par kg d'hydrocarbure contaminé, le taux de protéines de 55 %, calculé à partir de l'analyse de l'azote par la méthode de Kjeldhal (N x 6,25). Le taux d'acide nucléique est de 8,2 7.. EXEMPLE Il Une culture continue est effectuée dans des conditions semblables à celles de l'exemple l, mais le réacteur de production est alimenté en continu par un réacteur de maintenance de Vm = 1 litre, où le pH est 3,2 et- la température 35 C. On introduit dans le réacteur de maintenance 2 g/h de la charge hydrocarbonée. Ce réacteur est ensemencé avec un inoculum préparé comme dans l'exemple 1. Le temps de séjour dans le fermenteur de maintenance est de 3,5 heures. Il est de 2,5 heures dans le réacteur de production et de 1 heure dans le réacteur de finition. Dans le réacteur de production, on introduit 10 g/heure de la charge hydrocarbonée; dans ce réacteur ainsi que dans le réacteur de finition, le pH est 3,5 et la température 380 C. Le milieu frais injecté dans le réacteur de maintenance contient 0,8 mgl 1 de ferle milieu injecté dans le réacteur de production contient -l également 0,8 mgl de fer. Le produit final après lavage sans solvants et séchage conduit à un rendement de 110 %, un taux de protéines de 57 %, un taux d'acides.nucîétques de 8,2 %. En outre, dans cet exemple, on réalise des-éco- nomies très importantes doleau : puisque le réacteur de production fonctionne à 380 C, il n'y a pas à le refroidir aussi rigoureusement que s'il fonctionnait à 350 C; doù une économie en eau. EXEMPLE III : (exemple comparatif) Une culture continue est conduite dans les mêmes conditions que dans l'exemple II. Mais, dans le réacteur de maintenance, on élève la température à 380 C, soit 2 degrés au-dessus de la température optimum de la souche utilisée (I.F.P; 114). Au bout de 8 jours de culture, celle-ci est lavée dans ces réacteurs (c'est-à-dire la culture disparaît, car elle ne supporte pas Ia tem pérature prolongée de 380 C.) EXEMPLE IV Une culture continue est réalisée dans les conditions de l'exemple II, mais dans ce cas, le milieu injecté dans le réacteur de production ne contient pas de fer. On observe dans ces conditions une parfaite stabiIité du réacteur de production. Au bout de 200 heures de culture, le rendement est de 110 %, le taux de protéines de 58 %, le taux d'acides nucléiques de 8,2 %. Le produit final contient 65 ppm. de fer. EXEMPLE t : t V La même opération que dans l'exemple II est effectuée avec C. typolitica I.F.P. 29, en maintenant le réacteur de maintenance à 300 C (température optimum de la souche), et le réacteur de production à 350 C. Les rendements et taux de protéines sont supérieurs à ceux obtenus dans une culture normale à 30 C. (Rendement = 110 % - Taux de protéines = 59 %, taux d'acides nucléiques 8,3 % au lieu de respectivement 107%, 56% et 8,3. EXEMPLE VI Une -culture continue est réalisée dans les conditions de culture données dans l'exemple II. Par contre, au lieu d'utiliser dans l'étage de production des facteurs de croissance, comme dans tous les exemples précédents (100 mgl d'extrait de levure) on ne maintient l'extrait de levure que dans le réacteur de maintenance. Dans ces conditions, on observe un rendement de 112 % et un taux de protéines de 58 70. L'économie est de 80 % dans ce cas sur le prix des facteurs de croissance. Dans une culture normale, sans extrait de levure, on observerait un lavage total au bout de 24 heures (c'est-à-dire la disparition de la cultureau bout de 24 heures). EXEMPLE VII Une culture continue est réalisée dans les conditions de la culture de l'exemple II. Le réacteur de maintenance est alimenté par le milieu complet utilisé dans les exemples précédents, notamment en phosphore et en fer. Mais dans le milieu d'appoint auréacteur de production on diminue le taux de phosphore de manière à- se trouver à un taux voisin de la moitié de la concentration stoechiométrique. Après stabilisation de la culture, la biomasse sortant du fermenteur de finition est lavée sans solvants et séchée. Le produit obtenu avec un rendement de 107 % contient 56 % de protéines mais seulement 5,5 % d'acides nuclé tiques. EXEMPLE -V III Une culture continue est réalisée avec le système décrit dans l'exemple II, mais au lieu de maintenir dans le réacteur de maintenance le temps de séjour à 3,5 heures, on le fixe à 3,2 heures, la concentration cellulaire res tant la même. En fixant le temps de séjour, dans l'étage de production, égal à celui de l'exemple II, l'effet de maintenance permet d'obtenir un taux de croissance dans cet étage supérieur. Après stabilisation, lavage et séchage, on obtient une biomasse avec un rendement de 122 %, et un taux de protéines de 57,5 %. (Taux en-acides nucléiques : 8,2 %). EXEMPLE IX : (exemple comparatif) Une culture continue est réalisée avec le système décrit dans l'exemple I, mais avec une souche de C. lypolitica I.F.P. 29, sensible à la contam-i- nation. On opère à pH 3,5 et à 350 C. (La température optimum de la souehe est 30 C.). Après 2 jours de culture et stabilisation du système, les performances obtenues sont voisines de celles obtenues avec C. tropicalis 114. Après 4 jours de cultute, on observe un début de contamination par une levure contaminante. Après 8 jours, il est impossible de maîtriser le problème. EXEMPLE X On cultive la souche de l'exemple IX non plus comme dans 1'exemple IX mais comme dans l'exemple II, avec un réacteur de maintenance. Dans le réacteur de maintenance, la température est 300 C et le pH 3,2; dans les-réaçteurs de production et finition, la température est 350 C et le pH 3,5. Au bout de 4 jours, on retrouve les performances obtenues dans l'exem- ple V et qui sont les suivantes Rendement = 110 % . Taux de protéines = 59 % Au bout de 8 jours; on voit apparaître les contaminants décrits dans l'exemple IX dans le fermenteur de maintenance. Si on remplace ce fermenteur par un autre, fraîchement démarré, on observe que le réacteur dé production reste stérile, on prend soin de changer le réacteur de maintenance tous les 8- - 10 jours. Après 1000 heures de culture, le réacteur de production toujours stérile est arrêté et le produit, après finition, lavage et séchage est obtenu avec un rendement de 107 ut un taux-de protéines de 58 %. EXEMPLE XI Une culture continue est effectuée dans les conditions de Itexemple X mais après 8 jours de culture, alors que la contamination commence à apparaître dans le réacteur de production, on ne change pas le réacteur de maintenance. Au bout de 12 jours de culture, la contamination dans le réacteur de production atteint 22 %. A ce moment on change Ie réacteur de maintenance de manière à injecter une culture fraîche. Au bout du 18eme jour, la contamination a disparu du réacteur de production. Les performances obtenues en rendement et taux de protétines sont comparables à celles de la culture décrite dans l'exemple X. EXEMPLE XII : (exemple comparatif) Une culture continue est effectuée dans les conditions de l'exemple I avec C. tropicalis. Au cours de la culture, on mesure a des temps déterminés, les rendements et taux de protéines. On observe les oscillations suivantes . Après 8 jours .................. R = 110 % - protéines % = 57 . Entre 8 et 21 jours .. R = 114 % - Pr % ...... = 58 . Entre 21 et 46 jours ; R = 98 % - Pr % ...... = 57 . Entre 46 et 108 jours ........... R = 115 % - Pr % ...... = 58 Ces oscillations du rendement affectent le processus industriel. EXEMPLE XIII On reprend l'exemple XII, en opérant avec un réacteur de maintenance, dans les conditions opératoires de -l'exemple II. On choisit, pour inoculer les fermenteurs, une souche de C. tropicalis isolée entre le 46 et 108eme jour, de préférence vers le 46ème jour. Le réacteur de maintenance est changé tous les 60 jours en utilisant cette souche. La culture reste stable. Au bout de 3000 heures, les rendements après finition, lavage et séchage sont de 112 %, le taux de protéines reste à 57 %. EXEMPLE XIV On répète l'exemple I et exemple II en recyclant vers le réacteur de production la totalité de l'effluent de la centrifugation qui est faite à la sortie du réacteur de finition. En répétant alors l'exemple I, cette varian -te perturbe le procédé alors qu'en répétant l'exemple Il, le procédé continue de marcher aussi bien que dans cet exemple Il. Il est possible de ne recycler qu'une partie seulement dudit effluent de centrifugation R E V E N D I C A T I O N S 1/ -.Procédé de production de microorganismes comprenant a-- la mise en contact dans une zone dite de maintenance, d'une souche de microorganismes et d'un gaz contenant de l'oxygène moléculaire avec une- charge hydrocarbonée et avec un milieu aqueux nutritif, b - la mise en contact, dans au moins une zone dite de production, de l'effluent de la zone de maintenance et d'un gaz contenant de l'oxy- gène moléculaire avec une charge hydrocarbonée et avec un milieu aqueux nutritif, à une température supérieure de 2 à 60 C. environ à la température de la zone de maintenance, c - la mise en contact, dans une zone dite de finition, des microorganis mes obtenus à étape précédente, avec un gaz contenant de l'oxygène moléculaire et un milieu aqueux nutritif et sans ajouter de quantités notables de charge hydrocarbonée fraîche. 2/ - Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le nombre de zones de production entre la zone de maintenance et la zone de fini tion est au moins égal à 1 et au plus égal à 5. 3/ - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé par le fait que le rapport des volumes entre la zone de maintenance et la zone de produc tion est comprise entre 1 et 1 20 4/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé par le fait que les temps de séjour sont compris entre . 1 heure et 10 heures dans l'étape de production . 0,5 heure et 3 heures dans l'étape de finition. 5/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé par le fait que le milieu aqueux nutritif alimentant la zone de. production ne renferme pas de fer. 61-- Procédé selon l'une des revendications de 1 à 5 caractérisé par le fait - d'opérer à-un pH, da ns la zone de production, supérieur de+ 0,1 à + 3uni- tés-environ au pH de la zone -de maintenance; 7/ - Procédé selon l'une des revendications de 1 à 6 caractérisé par le fait de cultiver dans la zone de production sans vitamines si on les maintient dans la zone de maintenance. 8/ - Procédé' selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé par le fait que la zone de maintenance fonctionne en discontinu. 9/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé par le fait que les microorganismes utilisés sont choisis parmi les moisissures, les bac téries et les levures. 10/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que l'on recycle vers la zone de production au moins une partie de l'effluent de la centrifugation réalisée à la sortie de la zone de finition. 11/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 10 dans lequel la zone de pro duction fonctionne en continu, la zone de maintenance étant chargée au tant de fois que nécessaire pour éliminer les contaminants éventuels 12/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 11 dans lequel, dans la zone de maintenance, il n y a pas addition de souche fraiche après l'addition initiale. 13/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, dans lequel le rapport des volumes entre la zone de maintenance et la zone de production est compri se entre l/l0'et 1/4.